Cirkulære om mikrobiologiske undersøgelser af levnedsmidler
Karakter C
genskabt fra tekst. En karakter siger, hvordan et dokuments struktur er hentet, ikke hvor pålidelig loven er.
Adresse https://gelex.eu/eli/DK/regulation/mt/1996/179@1997-09-25/da
I medfør af § 55, stk. 2 i lov nr. 310 af 6. juni 1973 om levnedsmidler m.m. som ændret ved lov nr. 351 af 9. juni 1993 og § 93 i bekendtgørelse nr. 1053 af 18. marts 1995 om levnedsmiddelhygiejne og egenkontrol m.v. fastsættes:
§ 1.
Stk. 1. Dette cirkulære omfatter mikrobiologiske undersøgelser i forbindelse med tilsyn og kontrol med virksomheder, der er autoriseret i henhold til levnedsmiddellovens § 31, samt virksomheder der er godkendt eller registreret i henhold til levnedsmiddellovens § 34.
§ 2.
Stk. 1. Ved mikrobiologiske undersøgelser af råvarer, halvfabrikata og færdigvarer og ved rengøringskontrolundersøgelser og screeningsprojekter skal fremgangsmåden i bilag 1 og bestemmelserne i §§ 3-7 iagttages.
§ 3.
Stk. 1. Som obligatoriske parametre ved mikrobiologiske undersøgelser af råvarer, halvfabrikata og færdigvarer skal de parametre, som er anført i bilag 2 anvendes.
§ 4.
Stk. 1. Ved indikationsbaserede mikrobiologiske undersøgelser af råvarer, halvfabrikata og færdigvarer anbefales en eller flere af de parametre, som er anført i bilag 3.
§ 5.
Stk. 1. Ved indikationsbaserede mikrobiologiske undersøgelser i forbindelse med holdbarhedsundersøgelser og rengøringskontrolundersøgelser anbefales fremgangsmåden i bilag 3.
§ 6.
Stk. 1. Ved udtagning, opbevaring og mærkning af prøver til mikrobiologiske undersøgelser skal reglerne i bilag 5 følges.
§ 7.
Stk. 1. Ved mikrobiologiske undersøgelser skal de metoder, som er beskrevet i bilag 6 anvendes.
Stk. 2. Efter drøftelse med Levnedsmiddelstyrelsen i hvert enkelt tilfælde kan andre ligeværdige metoder dog anvendes.
§ 8.
Stk. 1. Dette cirkulære skal anvendes fra 1. januar 1997.
Underskrift 1
Levnedsmiddelstyrelsen, den 14/11/1996 Ole Kopp Christensen / Henrik G. Jensen INDHOLDSFORTEGNELSE BILAG 1. FREMGANGSMÅDE VED MIKROBIOLOGISKE UNDERSØGELSER AF LEVNEDSMIDLER 1.1 Kontrolundersøgelser 1.1.1 Obligatoriske parametre 1.1.2 Indikationsbaserede parametre 1.2 Screeningsprojekter initieret af Levnedsmiddelstyrelsen 1.3 Meddelelse af resultat 1.4 Område BILAG 2. OBLIGATORISKE PARAMETRE 2.1 Kød og kødvarer 2.1.1 Kød og kødprodukter, ikke varmebehandlede 2.1.2 Kød og kødprodukter, varmebehandlede 2.1.3 Saltede, ikke varmebehandlede kødprodukter med en vandaktivitet over 0,94 2.1.4 Saltede, ikke varmebehandlede kødprodukter med en vandaktivitet under 0,94 2.2 Fisk og fiskevarer 2.2.1 Ferske fisk 2.2.2 Udskæringer af fersk, hakket fiskekød m.m. 2.2.3 Varmebehandlede fiskevarer 2.2.4 Røgede samt gravade fiskevarer 2.3 Frugt, grøntsager og produkter heraf 2.3.1 Ubehandlet frugt og grønt, tørrede frugter, marmelade, oliven m.m. 2.3.2 Snittede og/eller emballerede rå grøntsager 2.3.3 Varmebehandlede grøntsagsprodukter 2.4 Vin, øl og mineralvand 2.5 Saft og saftprodukter 2.6 Kage-, dessert- og konsumisprodukter 2.7 Mayonnaise, mayonnaisesalater og dressing 2.7.1 Mayonaise og dressing 2.7.2 Mayonaisesalater indeholdende kød 2.7.3 Mayonaisesalater indeholdende fisk 2.7.4 Mayonaisesalater indeholdende vegetabilier 2.7.5 Mayonaisesalater indeholdende pasta 2.8 Krydderier, ikke afkimede 2.9 Mælk og mælkeprodukter 2.9.1 Ost og osteprodukter 2.9.2 Mælk og øvrige mælkeprodukter 2.10 Ammemælk, pasteuriseret 2.11 Færdigretter BILAG 3. INDIKATIONSBASEREDE PARAMETRE 3.1 Levnedsmiddelgrupper 3.1.1 Kød og kødvarer 3.1.2 Fisk og fiskevarer 3.1.3 Frugt, grøntsager og produkter heraf 3.1.4 Vin, øl og carboniseret mineralvand 3.1.5 Saft og saftprodukter 3.1.6 Kage-, dessert- og konsumisprodukter 3.1.7 Mayonnaise, mayonnaisesalater og dressing 3.1.8 Krydderier, ikke afkimede 3.1.9 Mælk og mælkeprodukter 3.1.10 Ammemælk, pasteuriseret 3.2 Holdbarhedsundersøgelser 3.3 Rengøringskontrolundersøgelser BILAG 4. OPHÆVET BILAG 5. PRØVEUDTAGNING 5.1 Udtagning af prøver 5.2 Prøveudtagningsteknik 5.3 Prøveudtagningsrapport BILAG 6. METODER 6.1 Forhandling af prøver 6.1.1 Metodik 6.1.2 Prøvemængde 6.1.3 Forbehandling af dybfrosne levnedsmidler 6.2 Sensorisk undersøgelse 6.2.1 Subjektiv sensorisk undersøgelse 6.2.2 Objektiv sensorisk undersøgelse 6.3 Metoder for mikrobiologiske analyser 6.3.1 Bacillus cereus 6.3.2 Bakteriesporetal 6.3.3 Brochothrix thermosphacta 6.3.4 Termofile Campylobacter 6.3.5 Clostridium perfringens 6.3.6 Coliforme bakterier 6.3.7 Enterobacteriaceae 6.3.8 Enterococcer 6.3.9 Gærsvampe 6.3.10 Kim på blod agar 6.3.11 Kimtalsbestemmelse 6.3.12 Lactobaciller 6.3.13 Listeria monocytogenes 6.3.14 Mælkesyrebakterier 6.3.15 Proteolytiske bakterier 6.3.16 Udgået 6.3.17 Salmonella 6.3.18 Skimmelsvampe og gær 6.3.19 Svovlbrinteproducerendebakterier i fisk 6.3.20 Staphylococcus aureus 6.3.21 Sulfitreducerende clostridier 6.3.22 Termotolerante coloforme bakterier 6.3.23 Vibrio parahaemolyticus 6.3.24 Yersinia enterocolitica 6.3.25 Aeromonas 6.4 Tælling og angivelse af kimtal 6.4.1 Tælling af mikroorganismer 6.4.2 Beregning af kimtal 6.4.3 Angivelse af kimtal 6.5 Øvrige metoder 6.5.1. pH 6.5.2 aw 6.5.3 Histamin
BILAG 1. FREMGANGSMÅDE VED MIKROBIOLOGISKE UNDERSØGELSER AF LEVNEDSMIDLER
Mikrobiologiske undersøgelser af levnedsmidler inden for levnedsmiddellovens område er enten kontrolundersøgelser eller overvågningsundersøgelser (screeningsundersøgelser).
1.1 Kontrolundersøgelser
Når der gennemføres en mikrobiologisk kontrolundersøgelse på en prøve, gøres dette med to sæt parametre: Obligatoriske parametre og indikationsbaserede parametre. Disse to parametersæt bruges på følgende måde:
1.1.1 OBLIGATORISKE PARAMETRE
De obligatoriske parametre - der fremgår af bilag 2 - skal som minimum medtages ved mikrobiologisk analyse af de prøver, der ligger inden for rammen af minimumsprøveudtagningen jf. Levnedsmiddelstyrelsens cirkulære nr. 229 af 23. december 1993 om tilsyn og kontrol med levnedsmiddelvirksomheder m.m. - herefter benævnt kontrolcirkulæret. Når tilsynsmyndigheden skønner det relevant for kontrollens udførelse, medtages relevante indikationsbaserede parametre sammen med de obligatoriske parametre.
Er der i tilsynsmyndighedens kontrolaktivitetsplan fastsat en større prøveudtagningsfrekvens end den mindste prøveudtagningsfrekvens jf. kontrolcirkulæret, kan tilsynsmyndigheden ved disse prøveudtagninger vælge at se bort fra de obligatoriske parametre i analyseprogrammet og sammensætte et analyseprogram efter bilag 3 - indikationsbaserede parametre.
De obligatoriske parametre revurderes årligt på grundlag af tilgængelige oplysninger om forekomsten af levnedsmiddelrelaterede sygdomsfremkaldende mikroorganismer i alle led af produktion, omsætning og indtagelse.
Tilsynsvejledningerne for de autoriserede virksomheder kan omfatte undersøgelser, som ikke fremgår af bilagene.
1.1.2 Indikationsbaserede parametre
De indikationsbaserede parametre - som fremgår af bilag 3 - omfatter både kimtal og patogene mikroorganismer.
De indikationsbaserede undersøgelser tænkes anvendt, når tilsynsmyndigheden finder konkrete forhold der kræver denne kontrol, eller erfaringen med den enkelte virksomhed specielt tilsiger denne særlige kontrol iværksat med det formål at kontrollere specifikke problemstillinger ved virksomhedens produktion og håndtering af levnedsmidler. Det er således ikke hensigten med de indikationsbaserede undersøgelser, at tilsynsmyndigheden forud fastsætter et generelt rutinevalg af indikationsbaserede parametre.
Ved prøveudtagninger inden for minimumsprøveudtagningsfrekvensen, kan de indikationsbaserede parametre anvendes som et supplement til de obligatoriske parametre, når dette skønnes relevant.
Ved prøveudtagninger, som ligger over minimumprøveudtagningsfrekvensen, kan de indikationsbaserede parametre anvendes som et supplement til eller helt erstatte de obligatoriske parametre.
Ved kontrolundersøgelserne vælger tilsynsmyndigheden frit i disse parametre, så der fastsættes et analyseprogram, der er relevant for den udtagne prøve.
Til de indikationsbaserede undersøgelser hører både undersøgelser for hygiejneparametre og undersøgelser for sygdomsfremkaldende mikroorganismer. Opmærksomheden henledes på, at kontrollen af patogener ønskes intensiveret - og at kontrollen derfor i videst muligt omfang ønskes baseret på disse parametre.
For de sygdomsfremkaldende mikroorganismer gives en kort beskrivelse af forskellige indikationsforhold i bilag 3.
1.2 Screeningsprojekter initieret af Levnedsmiddelstyrelsen
Screeningsprojekter (overvågningsundersøgelser) anvendes både til at kortlægge mikrobiologiske problemstillinger og til over tid at følge udviklingen i forekomsten af patogene mikroorganismer.
Screeningsundersøgelser gennemføres flere gange om året som hovedregel efter en forud fastlagt plan. Screeningerne kan være lokale eller landsdækkende og inddrage nogle eller alle levnedsmiddelkontrolenheder. Screeningsundersøgelserne har til formål at belyse relevante mikrobiologiske problemstillinger eller følge udviklingen over tid af relevante levnedsmidlers mikrobiologiske status. Undersøgelserne søges tilrettelagt på en sådan måde, at det enkelte laboratorium vil kunne opretholde en rutine på flest mulige parametre.
Levnedsmiddelstyrelsen udarbejder - efter drøftelse med tilsynsmyndighederne - hvert år inden den 1. oktober en samlet plan over det næste års screeningsprojekter. Der kan herudover i løbet af året forekomme screeningsprojekter, som det - efter drøftelse med tilsynsmyndighederne - skønnes nødvendigt at gennemføre. Der tænkes her på projekter nødvendiggjort af akut opståede problemer, hvor en afklaring her og nu er påkrævet.
Levnedsmiddelstyrelsen udarbejder projektbeskrivelse for den enkelte screeningsundersøgelse og orienterer de deltagende laboratorier om undersøgelsens indhold og om den praktiske gennemførelse.
Levnedsmiddelstyrelsen udarbejder efter hver undersøgelse en rapport, som indeholder en resultatvurdering. Resultater af gennemførte screeningsundersøgelser vil indgå i vurderingen ved revision af obligatoriske og indikationsbaserede parametre.
Også data fra kontrolundersøgelserne vil via et indberetningssystem blive nyttiggjort til landsdækkende overvågning af levnedsmidlernes mikrobiologiske kvalitet.
1.3 Meddelelse af resultat
Resultatet af laboratorieanalyserne samt tilsynsmyndighedens bemærkninger meddeles den virksomhed, hvor prøven er udtaget. Såfremt levnedsmidlet er tilvirket i en anden virksomhed end den, hvor prøven er udtaget, og undersøgelsen giver anledning til bemærkninger af sundhedsmæssig betydning, der kan henføres til produktionsvirksomheden, meddeles resultatet endvidere til den myndighed, der fører tilsyn med den pågældende virksomhed.
Tilsynsmyndigheden skal efter anmodning fra Levnedsmiddelstyrelsen indberette oplysninger om de foretagne undersøgelser samt resultaterne heraf.
1.4 Område
Bilag 1-4 henvender sig specielt til leevnedsmiddeltilsynet og bilag til det mikrobiologiske laboratorium.
BILAG 2. OBLIGATORISKE PARAMETRE
I dette bilag angives de parametre, som det er obligatorisk at undersøge for ved kontrol i forbindelse med prøveudtagninger, der ligger indenfor minimumprøveudtagningsfrekvensen jf. kontrolcirkulæret. Efter tilsynsmyndighedens faglige vurdering kan der på samme prøve på indikation gennemføres analyser for yderligere mikrobiologiske parametre. For sådanne indikationsbaserede parametre henvises til bilag 3.
Bilaget er opdelt i relevante levnedsmiddelgrupper og undergrupper. For hver gruppe angives de parametre, som en undersøgelse af produkter inden for gruppen skal omfatte.
Visse produkter kan ikke indplaceres i de anførte levnedsmiddelgrupper. For sådanne produkttyper må tilsynsmyndigheden selv sammensætte et relevant program.
For at sikre en løbende vurdering af forekomsten af patogener skal de obligatoriske undersøgelser inden for de forskellige virksomhedskategorier spredes så jævnt som muligt over hele året.
2.1 Kød og kødvarer
2.1.1 Kød og kødprodukter, ikke varmebehandlede
Hele kødstykker
Produkteksempler: Udskæringer, indmad, marineret kød.
Ingen obligatoriske parametre
Hakket kød
Produkteksempler: Hakket kød, rørt fars
Organoleptisk undersøgelse
Salmonella
Aerobt kimtal, 25 grader C
Fjerkræ
Produkteksempler: Helt fjerkræ, udskæringer, hakket fjerkræ
Organoleptisk undersøgelse
Salmonella
Aerobt kimtal, 25 grader C
2.1.2 Kød og kødprodukter, varmebehandlede
Produkteksempler: Wienerpølser, kogt skinke, rullepølse og andre pålægsvarer.
Organoleptisk undersøgelse
Aerobt kimtal, 25 grader C.
Produkter der er håndterede efter varmebehandling
Produkteksempler: Udskivede pålægsvarer
Organoleptisk undersøgelse
Salmonella.
Listeria monocytogenes. Der anvendes semikvantitativ metode. Produkter, hvor der er krav om fravær af L. monocytogenes, undersøges dog med anvendelse af kvalitativ metode.
Aerobt kimtal, 25 grader C.
2.1.3 Saltede, ikke varmebehandlede kødprodukter med en vandaktivitet over 0,94
Produkteksempler: Spegepølse, bacon, rå hamburgerryg, spegeskinke, filet.
Organoleptisk undersøgelse
Salmonella
Staphylococcus aureus.
Listeria monocytogenes (semikvantitativ bestemmelse)
2.1.4 Saltede, ikke varmebehandlede kødprodukter med en vandaktivitet under 0,94
Produkteksempler: Spegepølse.
Organoleptisk undersøgelse
2.2 Fisk og fiskevarer
2.2.1 Ferske fisk
Ingen obligatoriske undersøgelser.
2.2.2 Udskæringer af fersk fisk, hakket fiskekød og skaldyr
Produkteksempler: Rå fiskefiletter, fiskefars
Organoleptisk undersøgelse
Listeria monocytogenes (semikvantitativ bestemmelse)
Kimtal 21 grader C i Jern agar
Ved bestemmelse af kimtal i MA-pakkede ferske saltvandsfisk og fiskevarer benyttes Long and Hammer's medium inkuberet ved 15 grader C (se 6.3.11.1).
2.2.3 Varmebehandlede fiskevarer
Produkteksempler: Fiskepatee, rejer.
Organoleptisk undersøgelse
Listeria monocytogenes. Der anvendes semikvantitativ metode. Produkter, hvor der er krav om fravær af L. monocytogenes, undesøges dog med anvendelse af kvalitativ metode. Listeriaundersøgelse kan udelades på gennemvarmede, ikke håndterede produkter.
Kimtal 21 grader C i Jern agar (alternativt kan aerobt kimtal, 25 grader C benyttes).
2.2.4 Røgede samt gravade fiskevarer
Produkteksempler: Røgede sild, fersk røget laks, gravad laks.
Organoleptisk undersøgelse
Listeria monocytogenes (semikvantitativ bestemmelse)
Kimtal 21 grader C i Jern agar.
2.3 Frugt, grøntsager og produkter heraf
2.3.1 Ubehandlet frugt og grønt, tørrede frugter, marmelade, olien m.v.
Ingen obligatoriske undersøgelser.
2.3.2 Snittede og/eller emballerede rå grøntsager
Produkteksempler: Snittede blandede salater i detailemballage, bønnespirer.
Organoleptisk undersøgelse
Listeria monocytogenes (Semikvantitativ bestemmelse)
Frøspirer undesøges tillige for Salmonella.
2.3.3 Varmebehandlede grøntsagsprodukter
Produkteksempler: Vegatabilske færdigretter, grøntsagspatee.
Organoelptisk undersøgelse
Listeria monocytogenes. Der anvendes semikvantitativ metode. Produkter, hvor der er krav om fravær af L.monocytogenes, undersøges dog med anvendelse af kvalitativ metode. Listeriaundersøgelsen kan udelades på gennemvarmede, ikke håndterede produkter.
Clostridium perfringens eller sultitreducerende Clostridier
Bacillus cereus
Aerobt kimtal 25 grader C.
2.4 Vin, øl og mineralvand
Igen obligatoriske undersøgelse
2.5 Saft og saftprodukter
Ingen obligatoriske undersøgelse
2.6 Kage-, dessert- og konsumisprodukter
Produkteksempler: Kagecreme, flødeskum, fromage, budding og soft-ice.
Organoseptisk undersøgelse
Bacillus cereus
Termotolerante coliforme bakterier
Aerobt kimtal 25 grader C.
2.7 Mayonnaise, mayonaisesalater og dressing
2.7.1 Mayonaise og dressing
Organoleptisk undersøgelse
pH
2.7.2 Mayonaisesalater indeholdende kød
Organoleptisk undersøgelse
Salmonella
Listeria monocytogenes. Der anvendes semikvantitativ metode. Produkter, hvor der er krav om fravær af L. monocytogenes, undersøges dog med anvendelse af kvalitativ metode.
Aerobt kimtal 25 grader C
2.7.3 Mayonaisesalater indeholdende fisk
Organoleptisk undersøgelse
Listeria monocytogenes. Der anvendes semikvantitativ metode. Produkter, hvor der er krav om fravær af L. monocytogenes, undersøges dog med anvendelse af kvalitativ metode.
Aerobt kimtal 25 grader C
2.7.4 Mayonaisesalater indeholdende vegetabilier
Organoleptisk undersøgelse
Listeria monocytogenes. Der anvendes semikvantitativ metode. Produkter, hvor der er krav om fravær af L. monocytogenes, undersøges dog med anvendelse af kvalitativ metode.
Bacillus cereus
Aerobt kimtal 25 grader C
2.7.5 Mayonaisesalater indeholdende pasta
Organoleptisk undersøgelse
Bacillus cereus
Staphylococcus aureus
Aerobt kimtal 25 grader C
2.8 Krydderier, ikke afkimede
Produkteksempler: Sort peber, carry mv.
Organoleptisk undersøgelse
2.9 Mælk og mælkeprodukter
2.9.1 Oste og osteprodukter
Organoleptisk undersøgelse
Listeria monocytogenes (kvalitativ bestemmelse)
Staphylococcus aureus
2.9.2 Mælk og øvrige mælkeprodukter
Ingen obligatoriske undersøgelser.
2.10 Ammemælk, pasteuriseret
Ingen obligatoriske undersøgelser.
2.11 Færdigretter
Produkteksempler: Spiseklare gryderetter, sovse, supper, andre ikke håndterede varmebehandlede levnedsmidler.
Organoleptisk undersøgelse
Listeria monocytogenes. Der anvendes semikvantitativ metode. Produkter, hvor der er krav om fravær af L.
monocytenes, undersøges dog med anvendelse af kvalitativ metode. Listeriaundersøgelsen kan udelades på gennemvarmede produkter.
Clostridium perfringens eller sulfitreducerede Clostridier
Bacillus cereus
Aerobt kimtal, 25 grader C
BILAG 3. INDIKATIONSBASEREDE PARAMETRE
I dette bilag gives der forslag til parametre, som kan medtages ved den indikationsbaserede undersøgelse. Sådanne undersøgelser kan danne grundlag for en mere detaljeret vurdering af produkternes mikrobiologiske status.
Bilaget er opdelt i levnedsmiddelgrupper og undergrupper, som stort set svarer til opdelingen i bilag 2. I bilaget gives endvidere anvisninger på gennemførelse af holdbarhedsundersøgelser og rengørings-kontrolundersøgelser.
De indikationsbaserede parametre kan anvendes på samme prøve som et supplement til de obligatoriske undersøgelser eller selvstændigt i forbindelse med analyse af prøver udtaget ud over frekvensen for minimumsprøvetagninger jf. kontrolcirkulæret.
Forhold, som kan give anledning til anvendelse af indikationsbaserede undersøgelse, er f.eks. mistanke om uhensigtsmæssig behandling eller håndtering af levnedsmidler, som ikke kan afsløres ved tilsynet. Endvidere kan der være behov for opfølgende eller dokumenterende undersøgelser ved mistanke om, at sygdom er opstået på grund af levnedsmidler, ved klager og i forbindelse med driftskontrol m.m. Ved de indikationsbaserede undersøgelser kan tilsynsmyndigheden frit sammensætte et undersøgelsesprogram, der belyser den aktuelle problemstilling.
Tilsynsmyndigheden kan iværksætte andre undersøgelser end de i bilaget foreslåede, hvis der er behov for det.
Kontrollen med patogener ønskes opprioriteret. Derfor bør der medtages analyser direkte for patogener, hvor det er mistanken om denne type forurening, der ønskes kontrolleret.
Hygiejneparametre
Ved hygiejneparametre forstås undersøgelse for indikatororganismer eller andet, der er relevant for den pågældende produkttype og for analysens formål. Eksempler er aerobt kimtal, mælkesytredannende bakterier, coliforme bakterier, termotolerante coliforme bakterier, enterococcer, Brochothrix thermosphacta og gær- og skimmelsvampe.
Sygdomsfremkaldende mikroorganismer
I ikke varmebehandlede kødvarer kan det afhængigt af kødets oprindelse og risiko for krydskontaminering være relevant ud over undersøgelse for Salmonella at undersøge for andre sygdomsfremkaldende mikroorganismer som f.eks. Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica og Campylobacter.
I situationer, hvor der er risiko for krydskontaminering af varmebehandlede produkter fra alle typer råvarer kan det være relevant at undersøge for Listeria monocytogenes., I situationer, hvor der er særlig risiko for krydskontaminering fra råt kød, især fjerkræ, kan det endvidere være relevant at analysere for Campylobacter. Ved mistanke om, at personer med hudlæsioner har håndteret varmebehandlede produkter, er det relevant at analysere for Staphylococcus aureus. Ved mistanke om afkølingsfejl eller opbevaring ved for høj temperatur af sammenkogte kød- og grøntsagsretter eller produkter med ikke afkimede krydderier er det relevant at analysere for Clostridium perfringens og Bacillus cereus. Det samme gælder varmebehandlede produkter, der opbevares varmeholdte ved for lav temperatur.
Det er relevant at undersøge for Listeria monocytogenes og Yersinia enterocolitica i fersk kød og behandlede kødvarer, som er pakket med en teknik, der har til hensigt at forlænge produkternes holdbarhed, f.eks. modificeret atmosfære pakning og vakuum pakning.
3.1 Levnedsmiddelgrupper
3.1.1 Kød og kødvarer
3.1.1.1 Kød og kødprodukter, ikke varmebehandlede
Hygiejneparametre
Sygdomsfremkaldende mikroorganismer.
3.1.1.2 Kød og kødprodukter, varmebahendlede
Hygiejneparametre
Sygdomsfremkaldende mikroorganismer.
3.1.1.3 Saltede, ikke varmebehandlede kødprodukter
Hygiejneparametre
aw/saltprocent
pH (fermeterede produkter)
Sygdomsfremkaldende mikroorganismer.
3.1.2 Fisk og fiskevarer
Organoleptisk undersøgelse
Hygiejneparametre
Sygdomsfremkaldende mikroorganismer.
Hygiejneparametre
Ved bestemmelse af kimtal benyttes Jern agar ved 21 grader C (specifikke fordærvelsesbakterier). Ved bestemmelse af kimtal i MA-pakkede ferske saltvandsfisk og fiskevarer benyttes Long and Hammer's medium ved 15 grader C (se 6.3.11.1). I øvrigt benyttes hygiejneparametre som beskrevet i indledningen til bilag 3.
Sygdomsfremkaldende mikroorganismer
I fisk kan der, hvor det skønnes at være relevant, analyseres for Salmonella, Listeria monocytogenes og Vibrio spp.
3.1.3 Frugt, grøntsager og produkter heraf
Organoleptisk undersøgelse
aw (tørrede produkter)
pH (syrnede produkter).
3.1.4 Vin, øl og carboniseret mineralvand
Organoleptisk undersøgelse
pH
Hygiejneparametre: For frisktappede produkter kimtal.
Der henvises i øvrigt til bekendtgørelse om naturlig mineralvand (nr. 463 af 5. september 1984).
3.1.5 Saft og saftprodukter
Organoleptisk undersøgelse
Gær og skimmel
pH.
3.1.6 Kage-, dessert og konsumisprodukter
Hygiejneparametre
Sygdomsfremkaldende mikroorganismer.
Sygdomsfremkaldende mikroorganismer
Som supplement til de obligatoriske undersøgelser for Bacillus cereus og Staphylococcus aureus, kan det ved mistanke om risiko for krydssmitte fra rå æg være relevant at undersøge for Salmonella.
3.1.7 Mayonnaise, mayonnaisesalater og dressing
Hygiejneparametre
Sygdomsfremkaldende mikroorganismer.
Sygdomsfremkaldende mikroorganismer
I mayonnaise og mayonnaisesalater vil de obligatoriske undersøgelser for Salmonella, Bacillus cereus og Listeria monocytogenes på produkter fremstilles i detailvirksomheder som regel være dækkende med hensyn til sygdomsfremkaldende mikroorganismer.
3.1.8 Krydderier, ikke afkimede
3.1.9 Mælk og mælkeprodukter
Der henvises til Veterinærdirektoratets regler om undersøgelser af disse levnedsmidler.
3.1.10 Ammemælk, pasteuriseret
Organoleptisk undersøgelse
Hygiejneparametre
Sygdomsfremkaldende mikroorganismer.
Sygdomsfremkaldende mikroorganismer
Ved mistanke om utilstrækkelig varmebehandling af ammemælk vil det være relevant at undersøge for Staphylococcus aureus samt for hæmolytiske streptokokker.
3.2 Holdbarhedsundersøgelser
Holdbarhedsundersøgelse foretages på færdigpakkede levnedsmidler forsynet med datoen for mindste holdbarhed, »Mindst holdbar til« eller »Sidste anvendelsesdato« med det formål at vurdere den hygiejniske og sundhedsmæssige kvalitet af levnedsmidlet ved holdbarhedstidens udløb.
Oplysningen »Mindst holdbar til« eller »Sidste anvendelsesdato« angiver den dato til og med hvilken produktet efter korrekt opbevaring har bevaret sine specifikke egenskaber.
Prøver til holdbarhedsundersøgelse udtages som hovedregel på den virksomhed, hvor levnedsmidlet er færdigpakket, og transporten til laboratoriet skal ske under iagttagelse af den foreskrevne opbevaringstemperatur. Hvis der er indikation herfor, kan der også udtages prøver, som ikke er færdigpakkede i den pågældende virksomhed. Prøver opbevares på laboratoriet i ubrudt forbrugerpakning ved den opbevaringstemperatur, som er anført på pakningen indtil holdbarhedstidens udløb.
Undersøgelsen består i en bedømmelse af den organoleptiske tilstand, og ved vurderingen heraf er det vigtigt at skelne mellem kvalitetsfaktorer og sådanne forhold, som kan tilskrives holdbarhedsmæssige forandringer. En vare kan eksempelvis tilsigtet have en syrlig smag, hvilket ikke må bedømmes som en fejl med holdbarhedsmæssig årsag. Holdbarhedsundersøgelsens resultat kan derfor med fordel altid sammenlignes med bedømmelse af en initialprøve samt videre, når dette skønnes nødvendigt, suppleres med en bedømmelse af prøver opbevaret i en del af holdbarhedsperioden.
Organoleptiske forandringer er begrundet i enzymatisk aktivitet af oftest mikrobiel oprindelse, og i tilfælde af væsentlige afvigelser i forhold til initialprøven bør supplerende mikrobiologiske parametre indgå i undersøgelsen af holdbarhedsprøverne. Supplerende undersøgelser kan omfatte mikroorganismer med høj biologisk aktivitet f.eks. Brochlthrix thermosphacta, gær, proteolytiske bakterier, Shewanella putrefaciens o.a., afhængig af den organoleptiske tilstand og levnedsmidlets art. Der bør desuden foretages en mikroskopisk undersøgelse.
Den organoleptiske vurdering af holdbarhedsundersøgelsen bør mindst omfatte bedømmelse af udseende, lugt og evt. smag.
Holdbarhedsundersøgelsen omfatter evt. også undersøgelse for forekomst af sygdomsfremkaldende mikroorganismer. Man skal være opmærksom på, at f.eks. Listeria monocytogenes i visse levnedsmidler vil kunne opformeres til et uacceptabelt niveau uden at medføre erkendelige organoleptiske forandringer.
3.3 Rengøringskontrolundersøgelser
Som angivet i NMKL nr. 5, 4. udg., 1987, idet det dog i visse tilfælde kan være en fordel at anvende kommercielt fremstillede rengøringskontrolsystemer.
BIlAG 5. PRØVEUDTAGNING
5.1 Udtagning af prøver
Prøver til laboratorieundersøgelse udtages som led i tilsynsmyndighedens tilsyn og kontrol med levnedsmiddelvirksomhederne.
Prøverne skal udtages af personale ansat ved levnedsmiddelkontrolenhederne. Prøveudtageren skal være instrueret om, hvorledes prøverne skal udtages. Der bør være en repræsentant fra virksomheden til stede under prøveudtagningen.
Hvis virksomheden ønsker det, skal der tages en kontraprøve, som virksomheden kan anvende til at efterprøve tilsynsmyndighedens analyseresultat. Kontraprøven skal opbevares, analyseres m.v. efter anvisning af tilsynsmyndigheden.
Prøveudtagningen kan omfatte prøver af færdigvarer, halvfabrikata, råvarer, emballage samt prøver til undersøgelse af inventar og redskaber.
Prøvens størrelse skal være sådan, at de undersøgelser, der foreskrives i nærværende cirkulære, kan gennemføres. Af ikke færdigpakkede levnedsmidler udtages normalt mindst 200 g. Prøven udtages, således, at den så vidt muligt er repræsentativ for hele levnedsmidlet.
Ved vurdering af et parti, kan det være nødvendigt at lade prøven bestå af flere stikprøveenheder. Der henvises til NMKL rapport nr. 2, 1983, vedr. udtagning af stikprøveenheder og delprøver af levnedsmidler til mikrobiologiske undersøgelser samt til kapitlerne 11-26 i »Microorganisms in Foods 2, Sampling for microbiological analysis: Principles and specific applications«, ICMSF 1986, der omhandler prøveudtagningsplaner for forskellige levnedsmiddeltyper.
5.2 Prøveudtagningsteknik
Personale, der foretager prøveudtagning, skal være orienteret om principperne for korrekt udtagning af prøver.
Beholdere og udstyr, der anvendes ved prøveudtagning, skal være rene, tørre og sterile. Sterilisering skal foretages ved autoklavering ved 121 grader C i 15 minutter, tørsterilisering ved 170 grader C i minimum 1 time eller tilsvarende. Kommercielt tilgængelige sterile prøvebeholdere, spatler, skeer og andet udstyr kan anvendes.
Prøvebeholderen skal umiddelbart før eller efter prøveudtagningen mærkes på en holdbar måde, således at den pågældende prøve kan identificeres eentydigt.
Prøver skal transporteres til laboratoriet så hurtigt som muligt. Under transporten skal prøverne opbevares, så de ikke udsættes for forurening fra omgivelserne. Prøverne skal under transporten opbevares ved en temperatur på 0-5 grader C, og prøver af frosne produkter skal opbevares nedfrosset indtil analyse.
Let-fordærvelige prøver, der ikke kan analyseres umiddelbart efter ankomsten til laboratoriet, skal opbevares ved 0-2 grader C.
Prøver må højst opbevares i 24 timer fra ankomsten til laboratoriet til analysen påbegyndes.
5.3. Prøveudtagningsrapport
Der skal ved hver prøveudtagning udarbejdes en prøveudtagningsrapport, som skal indehole mindst følgende oplysninger:
a) Eentydig nummerering
b) Virksomheden, hvor prøven er udtaget
c) Virksomheden, hvor produktet er fremstillet.
d) Årsagen til prøveudtagningen.
e)Prøvetype/tilstrækkelige oplysninger til eentydig identifikation.
f) Fremstillingstidspunktet hvis muligt og angivet holdbarhed.
g) Opbevaringsforhold i virksomheden - herunder temperatur for køle- og frostvarer.
h) Hvor i produktionsforløbet prøven er udtaget, hvis det er relevant for vurdering af prøven.
i) Dato og klokkeslet for prøvetagningen.
j) Dato og klokkeslet for modtagelsen af prøven på laboratoriet.
k) Evt. identifikation af levnedsmiddelparti
l) Prøveudtagerens navn.
BILAG 6. METODER
Dette bilag indeholder metoder for undersøgelse af de parametre, som er angivet i bilag 2 og 3.
Mange af metoderne henviser til metoder publiceret af Nordisk Metodik-Komitee for Levnedsmidler, NMKL, med eventuelle præciseringer og tilføjelser.
Metoderne er angivet i alfabetisk rækkefølge.
De i cirkulæret anførte metoder er gældende indtil andet angives ved skrivelse fra Levnedsmiddelstyrelsen.
Alternative metoder må anvendes efter godkendelse fra Levnedsmiddelstyrelsen.
Substrater, der varierer i sammensætning fra den anviste opskrift, må anvendes efter Levnedsmiddelstyrelsens tilladelse. Kommercielle substrater skal fremstilles efter fabrikantens anvisninger.
Tolerancer for inkubationsbetingelser og pH i substrater er generelt:
For lufttermostater: +/- 1,0 grader C
For vandbadstermostater: +/- 0,2 grader C
Ved autoklavering: +/- 2,0 grader C
For pH i substrater (incl. fortyndingsvæske): +/- 0,2
For inkubationstider:
- 24 timer +/- 3 timer
- 48 timer +/- 4 timer
- 72 timer +/- 6 timer
Tolerancerne er i overensstemmelse med den reviderede »Handledning i kvalitetssakring for mikrobiologiske laboratorier«, NMKL-rapport nr. 5, 2. udgave, 1994. Tolerancerne er gældende generelt, medmindre andet er præciseret i nærværende cirkulære. Hvis en mere snæver tolerance er angivet for et givet kommercielt substrat, skal denne dog overholdes.
Smeltede substrater skal opbevares i vandbad ved 45-48 grader C
Anvendelse af positiv kontrol
Ved en undersøgelse for patogener, hvor der anvendes flydende opformering, skal der medtages en positiv kontrol for at sikre, at den anvendte teknik og de anvendte medier fungerer tilfredsstillende. Kontrollen udføres ved, at den pågældende mikroorganisme opslemmes i en passende koncentration i et passende medium, hvorefter hele analysen, inclusive alle opformeringstrin, udføres. Et passende medium kan være normal fortyndingsvæske, eller bedre, en levnedsmiddelprøve, der vil give en mere realistisk kontrol.
6.1 Forbehandling af prøver
6.1.1 Metodik
Som anført i NMKL nr. 91, 2. udg. 1988.
6.1.2 Prøvemængde
Det må tilstræbes at tage mindst 5-10 g prøve i arbejde ved undersøgelse. Ved undersøgelse for specifikke patogene mikroorganismer kan det være foreskrevet at tage andre prøvemængder i arbejde.
6.1.3 Forbehandling af dybfrosne levnedsmidler
Dybfrosne levnedsmidler optøes i køleskab ved højst 5 grader C. Prøven tages i arbejde så hurtigt, at en repræsentativ delprøve kan udtages. Optøningsproceduren skal være tilendebragt inden for højst 24-26 timer. Løs-frosne prøver, hvor optøning ikke er nødvendig, kan direkte tages i arbejde.
6.2 Sensorisk undersøgelse
En sensorisk undersøgelse og vurdering udgør et vigtigt led ved gennemførelse af en laboratoriemæssig undersøgelse af et levnedsmiddel. Objektive analyser, som omfatter mikrobiologiske, kemiske og fysiske undersøgelser, er ofte ikke tilstrækkelige for en vurdering af levnedsmidlets sundhedsmæssige og hygiejniske kvalitet, men må suppleres med en sensorisk bedømmelse.
For visse levnedsmidler er en sensorisk analyse ofte tilstrækkelig for kontrolmyndighedens vurdering af et levnedsmiddel. Dette gælder f.eks. ved undersøgelse af friske frugter og visse produkter heraf.
Såfremt der ved den indledende sensoriske bedømmelse af et levnedsmiddel er konstateret en abnorm tilstand, f.eks. abnorm lugt, kan objektive analyser medvirke til en nærmere opklaring af årsagsforholdene og som dokumentation, men er egentlig ikke påkrævet for vurderingen af levnedsmidlets hygiejnisk/sundhedsmæssige kvalitet.
6.2.1 Forhold af betydning for undersøgelsen
Den sensoriske bedømmelse udføres i tilslutning til den laboratoriemæssige analyse og skal indeholde en bedømmelse af levnedsmidlets udseende, farve, konsistens, lugt og eventuelt smag. Smagsmæssig bedømmelse udelades hvis der er mistanke om tilstedeværelse af mulige sygdomsfremkaldende agentiae. Vurderingen foretages i relation til en »normaltilstand«, hvorfor det er vigtigt, at der til brug for bedømmelsen er erhvervet et grundigt kendskab til produkternes normale karakteristika.
En sensorisk bedømmelse er behæftet med usikkerhed på grund af, at den indeholder et subjektivt skøn, og forskelle i ydre vilkår kan endvidere øge denne usikkerhed.
For at reducere en uheldig virkning af de ydre vilkårs indflydelse på bedømmelsen bør laboratoriet indføre en række praktiske regler for bedømmelsens udførelse. Af sådanne regler kan nævnes:
- Bedømmelsen bør optimalt foretages af flere personer, som gennem erfaring og optræning har opnået et kendskab til levnedsmidlets normale sensoriske karakteristika.
- Bedømmelsen bør fra gang til gang foretages under de samme lokalemæssige forhold, herunder lys og temperaturforhold, og uden at der i lokalet er forstyrrende fremmede lugte og i øvrigt under rolige betingelser. Minds 1 time før analysens gennemførelse bør der ikke indtages nyddelsesmidler, mad eller lignende, der kan påvirke (bedøve) smagsevnen, ligesom også håndvask med sæbe lige før undersøgelsen forstyrrer denne.
- Lugtbedømmelsen bør normalt foretages ved stuetemperatur, og det er en fordel, at prøverne i forvejen er varmet op til denne temperatur. Ofte kan man dog med fordel lugtbedømme den samme vare både i kold tilstand (frossen eller kølet), og efter at denne har antaget stuetemperatur. Lugtbedømmelse foretages bedst på friske brud- eller snitflader. Mange af de kemiske forbindelser, der er ansvarlige for dårlig lugt, er luftarter med lavt damptryk, der kan erkendes allerede på frosne eller kølede levnedsmidler. Ved undersøgelse af vakuumpakkede kødvarer kan der ofte ved pakkens åbning konstateres en karakteristisk »poselugt«, som kan forsvinde, efter at pakken har været åbnet 10-15 minutter. »Poseluft« behøver ikke at betyde, at varen er mikrobielt fordærvet.
6.2.2 Undersøgelsens gennemførelse
Prøvens udseende
Undersøgelsen omfatter en bedømmelse af prøvens farve, konsistens, forekomst af eventuelle defekter m.v. Det bemærkes, om levnedsmidlets overflade er fugtig, slimet, indtørret, smudskontamineret, belagt med udfældninger (f.eks. saltudslag), mugpletter eller lignende. For visse levnedsmidler bør der foretages en vurdering af såvel overflade som dybde.
Bedømmelse af konsistens og tekstur kan være særlig værdifuld for vurdering af den sensoriske kvalitet af f.eks. kød, fersk fisk, pølser samt visse frugter og grøntsager.
Lugt
Afvigende lugt skyldes ofte dannelse af flygtige nedbrydningsprodukter, hvorved levnedsmidlet kan få en lugt, der, afhængig af mikrofloraen, kan være sur, stikkende, frugtagtig, blomsteragtig, acetonelignende, kemikalieagtig, ammoniakalsk eller putrid m.m.
Afvigende lugtforekomst kan imidlertid også skyldes f.eks. medikamentel behandling, restforekomst af kemikalier eller kønslugt hos slagtedyr.
I tilfælde, hvor mistanke om afvigende (abnorm) lugt foreligger i kød- og fedtprøver, bør den umiddelbare undersøgelse suppleres med en koge- og/eller stegeprøve.
Kogeprøve
Udføres bedst ved at anbringe terninger af prøven i kogekolbe (f.eks. 300 ml erlenmeyerkolbe). Der tilsættes så meget vand, at prøvematerialet netop dækkes, og kolben pålægges et urglas, hvorefter kolben opvarmes til svag kogning.
Man lugter til dampene i kolbens hals efter opvarmningens afslutning og efter delvis afsvaling.
Stegeprøve
Udføres ved stegning på omhyggelig rengjort pande eller i øvrigt efter producentens anvisning og uden anvendelse af fedtstof.
6.3 Metoder for mikrobiologiske analyser
Aeromonas
Se 6.3.25
6.3.1 Bacillus cereus
Metodik
Som anført i NMKL nr. 67, 3. udgave, 1993.
Ved undersøgelse af levnedsmidler, som formodes at have højt indhold af gramnegative bakterier, kan Blod agar tilsættes 25 i.e. Polymyxin B-sulfat eller 75 i.e. Kolistin sulfat pr. ml.
6.3.2 Bakteriesporetal
Metodik
Den forbehandlede delprøve (10-1 fortynding) varmebehandles i vandbad ved 80,0 +/- 1,0 grader C i 10 minutter.
Videre 10 folds fortyndinger fremstilles ud fra denne jfr. 6.1.
Aerobe sporedannende bakterier: Der udsås af passende fortyndinger i Blodagar jfr. 6.3.10.
Dyrkning: 30,0 grader C i indtil 8 døgn.
Sulfitreducerende clostridier: Der udsås 1 ml af passende fortyndinger i Jern-sulfit agar (se NMKL nr. 56, 3. udgave, 1994).
Dyrkning: 37,0 grader C i indtil 8 døgn.
Andre ikumbationsbetingelser kan anvendes, når der er behov for dette.
6.3.3 Brochothrix thermosphacta
Metodik
Som anført i NMKL nr. 141, 1991.
Forbehandling af prøven kan fortages som anført i NMKL nr. 91, 2. udgave, 1988.
6.3.4 Termofile Campylobacter
Metodik
Som anført i NMKL nr. 119, 2. udgave, 1990, med følgende præciseringer:
Til de termofile Campylobacter regnes primært Campylobacter jejuni subsp. jejuni, Campylobacter coli og Campylobacter lari.
Pkt. 5.1
Substraternes pH skal være 7,4+/-0,2. Som alternativ til hesteblod kan kalveblod anvendes. Citrastabiliseret blod kan anvendes som alternativ til defibrineret blod.
Pkt. 9.1
Ved præopformeringen inkuberes 25 gr prøve i 225 ml Prestonbouillon. Præopformeringboullion inkuberer ved 34,0+/-0,5 grader C i 24-48 timer.
Pkt. 9.2
Modified Charcoal - Cefoperazone - Desoxycholate - Agar (mCCDA), erstatter brugen af Preston - og CBFS agar. mCCDA findes kommercielt tilgængelig.
Pkt. 9.5
Præsumptive Campylobacter rendyrkes på blodagar (Base 2).
Pkt. 9.6
Indoxyl acetat hydrolyse.
Med henblik på at opnå yderligere sikkerhed i differentieringen mellem de tre »termofile« species af Campylobacter (C. jejuni, C. coli og C. lari) kan der udføres en test for indoxyl acetat hydrolyse . I denne test vil C. jejuni og C. coli være positive mens C. lari vil være negativ.
Materialer
Indoxyl acetat (Sigma I-3500)
Acetone
Concentration disks 1/2' (Difco 1571-33)
Destilleret vand
Der fremstilles en 10 % (vægt/volument) opløsning af indoxyl acetat i acetone. Hver disk påsættes 25 microl af denne opløsning. Diskene lufttørres ved stuetemperatur. Efter tørring kan diskene opbevares mørkt i en lufttæt beholder ved 4 grader C. De imprægnerede disks er holdbare i mindst 6 mdr., hvis de opbevares mørkt og fugtfrit ved 4 grader C.
Fremgangsmåde
Med podenål overføres kolonimasse til en indoxyl acetat imprægneret disk. Der påsættes herefter 1 - 2 dråber destilleret vand. Reaktionen aflæses efter 10 min..
Aflæsning
Indoxyl acetat positiv: Udvikling af blå/grøn farve efter 10 min.
Indoxyl acetat negativ: Ingen farveændring efter 10 min.
Pkt. 9.6.1
Ved udførelse af test for hippurat-hydrolyse overføres rigelig kolonimasse til Na-hippuratopløsningen.
FLOW DIAGRAM FOR PÅVISNING AF TERMOFILE CAMPYLOBACTER --------------------------- ------------------------------- Flydende levnedsmidler Centrifugering eller f.eks. mælk, vand filtrering gennem 0,45 my eller 0,22 my membranfiltre --------------------------- ------------------------------- --------------------------- ------------------------------- Faste læevnedsmidler med Prestonbouillon, lavt indhold af Campylo- 42,0 +/- 0,5 grader C i 24-48 bacter timer 250 ml flaske m. tætslut- 25 g prøve tilsættes 225 ml tende låg el. mikroaerofil atm. Prestonbouillon --------------------------- ------------------------------- --------------------------- ------------------------------- Prøver med forventet højt Modificeret CCDA agar. indhold af Kraftig udsæd. 42,0 +/- 0,5 Campylobacter grader C i 24-48 t. Microaerofil atm. --------------------------- ------------------------------- ----------------------------------- Fasekontrast-mikroskopi af suspekte kolonier. Eller farvning med 2% karbolfuksin i 5 minutter. ----------------------------------- ------------------------------ Rendyrkning Blodagar 42,0 +/- 0,5 grader C 20-24 t. Mikroaerofil atm. ------------------------------ ------------------------------ Verifikation Katalase + Cytochromoxidase + ------------------------------ ----------------------------------------------- hippurat indoxylacetat nalidixin hydrolyse hydrolyse følsomhed Biokemisk C. jejuni + + + differen- C. coli - + + tiering C. lari - - - -----------------------------------------------------------
6.3.5 Clostridium perfrigens
Metodik
Som anført i NMKL nr. 95, 2. udgave, 1985, med følgende bemærkninger:
Pkt. 3 og 7.4
Kolonier på blod agar er mellemstore, hvælvede, regelmæssigt cirkulære og omgivet af en karkteristisk dobbelzone hæmolyse bestående af en indre opklaret, forårsaget af thetatoxin og en ydre inkomplet forårsaget af alfatoxin.
Pkt. 6.
Vegetative celler dør relativt hurtigt ved kold opbevaring og især ved frysning. Det er derfor vigtigt at prøver udtaget i forbindelse med forgiftningsudbrud undersøges så hurtigt som muligt.
6.3.6 Coliforme bakterier
Metodik
Som anført i NMKL nr. 44, 4. udgave, 1995.
6.3.7 Enterobacteriacea
Metodik
Som anført i NMKL nr. 144, 1992, med følgende bemærkninger.
Pkt. 8.3
Konfirmering udføres, når dette er ønskeligt eller nødvendigt.
6.3.8 Enterococcer
Metodik
Som anført i NMKL nr. 68, 2. udgave, 1992.
6.3.9 Gær og skimmel
Metodik
Som anført i NMKL nr. 98, 3. udgave, 1995, med følgende ændringer:
Forbehandling af prøven kan foretages som anført i NMKL nr. 91, 2. udgave, 1988.
Undersøges alene for gær kan substratet OGYE (Oxytetracylin-Glucose-Yeats-extract) agar med følgende sammensætning benyttes:
Gærekstrakt 5,0 g Glucose 20,0 g Biotin 0,0001 g Agar 12,0 g Destilleret vand ad 1.000 ml pH (brugsfærdigt substrat) 7,0
Opvarm til alle ingredienser er opløst. Fordel på flasker med 100-200 ml i hver og autoklaver ved 115 grader C i 10 minutter.
Til det smeltede, til 50 grader C nedkølede substrat, tilsættes før brug 1 ml oxytetracylinopløsning, der fremstilles ved at opløse 100 mg oxytetracylin i 10 ml destilleret vand som derefter sterilfiltreres.
Dyrkning
25,0 grader C i 5 døgn.
6.3.10 Kim på blodagar
metodik
Der anvendes dybde- eller overfladesæd i blodagar (BA) med følgende sammensætning:
Papton 10,0 g Kødekstrakt 5,0 g Natriumklorid 7,0 g Agar 15,0 g Destilleret vand ad 1.000 ml pH (brugsfærdigt substrat) 7,2
Bestanddelene opløses under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, overføres substratet til mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 15. minutter.
Den af Veterinærdirektoratet foreskrevne blodagar kan også anvendes.
Til det smeltede og til 45-48 grader C afkølede substrat tilsættes 5-8% sterilt, stabiliseret eller defibrineret kalveblod samt evt. 45 i.e. Polymyxin B-sulfat eller 75 i.e. Kolistin sulfat pr. ml.
Såfremt blokpladerne skal anvendes specielt til at påvise gram-positive hæmolytiske bakterier, kan de gram-negative stavbakterier hæmmes ved tilsætning af Polymyxin B-sulfat som oven for anført. Hvis blodpladerne derimod skal anvendes til en generel vurdering af mikrofloraen i et levnedsmiddel anvendes BA uden hæmmende stoffer.
Dyrkning
37,0 grader C i 24-48 timer.
Andre inkubationsbetingelser kan anvendes når der er behov for dette.
Aflæsning
Aflæsning og vurdering af hæmolytiske bakterier foretages efter 24 og 48 timer. Kimtallet aflæses efter 48 timer.
Hovedgrupperne af den fremvoksende mikroflora vurderes og sammenholdes med øvrige kimtal. Såfremt hæmmende stoffer ikke er anvendt, kan samtlige kolonier tælles, og resultatet anvendes som et 37 grader C kimtal. Hæmolytiske bakterier kan tælles, og arten af de dominerende typer evt. angives efter fornøden identifikation.
6.3.11 Kimtalsbestemmelse
Kimtalsbestemmelse kan omfatte:
- Aerobt kimtal
- Antal psykotrofe bakterier
- Fremmede kim
- Kim på blod agar
6.3.11.1 Aerobt kimtal
Metodik
Som anført i NMKL nr. 86, 2. udgave, 1986. Bestemmelse af total kimtal udføres ved anvendelse af Plate Count agar, inkuberet ved 25,0 grader C i 3 døgn. Ved aflæsning foretages, udover tælling af antallet af kolonier, en vurdering af floraens sammensætning. Afvigelser fra normalfloraen noteres.
Aerobt kimtal i fisk og fiskevarer
Som anført i NMKL nr. 96, 2. udgave, 1994 med rettelsesblad af december 1994.
Inkubation kan foretages ved 21 grader C
Aerobt kimtal i MA-pakkede fersk fisk og fiskevarer
Modificeret-atmosfære-pakket ferske saltvandsfisk og fiskevarer skal undersøges ved overfladeudsæd på Long and Hammer agar med 1% NaCl. Årsagen til at dette medium skal benyttes, er at floraen i disse varer domineres af fordærvelsesbakterien Photobacterium phosphoreum, som ikke er i stand til at vokse på jernagar.
Metodik
Der anvendes overfladeudsæd på Long and Hammer (1% NaCl) agar med følgende sammensætning:
Proteose-pakton (Difco 0120-17-6) 20,0 g Gelatine 40,0 g K2HPO4 1,0 g NaCl 10,0 g Agar 15,0 g Dstilleret vand ad 1000 ml pH (brugsfærdigt substrat) 7,0
Bestanddelene opløses under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, omhældes substratet på mindre falsker, der autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.
Ferricitrat tilsættes til der færdige substrat til en konventration på 0,25 g/l i det færdige substrat. Denne koncentration opnås ved at tilsætte 0,25 ml af en 10% opløsning pr. 100 ml færdigt substrat.
Dyrkning
15 grader C i 5 døgn.
Aflæsning
Efter endt inkubation tælles kolonier.
6.3.11.2 Psykrotrofe bakterier
Metodik
Som anført i NMKL nr. 74, 2. udgave, 1989.
6.3.11.3 Fremmede kim
Metodik
Der anvendes dybdeudsæd i Sukkerfri-pepton agar med følgende sammensætning:
Pepton (kulæhydratfri) 7,5 g Trypton (kulhydratfri) 7,5 g Natriumklorid 5,0 g Agar 15,0 g Dstilleret vand ad 1.000 ml pH (brugsfærdigt substrat 7,6
Bestanddelene opløses evt. under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, omhældes substratet på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.
Substratet er kommercielt tilgængeligt.
Dyrkning
25,0 grader C i ca. 72 timer.
Aflæsning
Alle kolonier undtagen pin-point kolonier tælles.
Man skal være opmærksom på, at en evt. ikke-mikroaerofil del af starterkulturen vil have gode vækstbetingelser på en sukkerfri agar. Vurdering af resultatet er derfor vanskelig med mindre staterkulturens sammensætning er kendt.
Andre inkubationsbetingelser kan anvendes når der er behov for dette.
6.3.11.4 Direkte Epifluorescens Filter Teknik (DEFT)
Metodik
Som anført i NMKL nr. 137, 1990.
6.3.12 Lactobaciller
Der findes i dag ikke metoder til undersøgelse for lactobaciller specifikt. Der henvises til afsnit 6.3.14 Mælkesyrebakterier.
6.3.13 Listeria monocytogenes
Metodik
Som anført i NMKL nr. 136, 1990, med følgende præciseringer.
Pkt. 6.5
Alternativt til den foreskrevne BA kan tynde blodplader med bundlag benyttes. Disse fremstilles på følgende måde:
Hæld 10 ml smeltet og afkølet blodagar base uden blodtilsætning op i en petriskål. Efter størkning, og medens agaren stadig er varm, påhældes 6 ml blodagar, som fordeles jævnt. Pladerne opbevares i køleskab i plastpose. Disse tynde blodagarplader kan afsløre Listerias Beta-hæmolyse, der undertiden kan være meget svag.
Hæmolysen hos L. monocytegenes kan være meget svag og kan evt. kun ses under selve kolonien, hvorfor denne bør fjernes på et repræsentativt antal kolonier for at bedre vurderingen.
Pkt. 9.4.7
CAMP-test kan udelades.
AccuProbe
Alternativt til den traditionelle identifikation kan AccuProbe anvendes.
Semi-kvantitativ bestemmelse
Er der tale om kvantitativ bestemmelse af L. monocytogenes i relation til kontrol af fastlagte grænseværdier, kan direkte udsæd på det stærkt selektive substrat, Oxford agar, ikke anbefales, da et mere eller mindre betydende og uforudsigeligt drab af Listeria vil forekomme. Et negativt fund ved en sådan metode må derfor ikke tillægges nogen betydning.
Ved kvantitativ undersøgelse for L. monocytogenes, i sammenhænge hvor der er fastlagte grænseværdier, skal følgende semikvantitative metode derfor benyttes:
5-10 gram levnedsmiddel stormacheres med 9 dele fysiologisk kogsaltopløsning med pepton, hvorefter en 10-folds fortyndingsrække fremstilles. 1.0 ml fra hver fortynding overføres til 9 ml LB I til undersøgelse for indhold af L. monocytogenes efter NMKL forskrift nr. 136 med ovennævnte modifikationer. Fravær af L. monocytogenes ved udsæd fra 10exp-1 fortyndingen (den stormacherede prøve) svarer til, at bakterien ikke påvises i 0.1 gram og dermed har en forekomst på < 10/gram. Påvises L. monocytogenes ikke ved udsæd fra 10exp-2 fortyndingen har bakterien tilsvarende en forekomst på < 100/gram.
FLOW DIAGRAM FOR PÅVISNING AF LISTERIA MONOCYTOGENES -------------------------------------------- Selektiv opformering: 25 g prøve tilsættes 225 ml LB-I 30,0 grader C i 24 +/- 2 t. -------------------------------------------- -------------------------------------------- 0,1 ml LB-I podes i 10 ml LB-II 30,0 grader C i 24 +/- 2 t. -------------------------------------------- -------------------------------------------- Subkultivering Oxford-agar, evt. suppleret med Palcar-agar 37,0 graer C i 24 og 48 t +/- 2 t -------------------------------------------- -------------------------------------------- Rendyrkning Blod-agar mindst 10 suspekte Listeria kolonier (Beta-hæmoplytiske) 37,0 grader C i 24-48 t. -------------------------------------------- -------------------------------------------- BHI agar (eller anden non-selektiv agar uden blod) 37,0 grader C ca. 20 t. -------------------------------------------- -------------------------------------------- Gram positiv Katalase positiv Bevægelig: Paraplyvækst i halvflydende agar, eller direkte Mikroskopi: Tumlende bevægelser -------------------------------------------- -------------------------------------------- CAMP-test (kan udelades) Kulhydratforgæring: Rhamnose positive Xylose negativ 37,0 grader C 1-7 dage (Verifikationen kan afsluttes efter 24-48 timer, hvis isolatet er Rhamnose-positivt) --------------------------------------------
6.3.14 Mælkesyrebakterier
Gruppen af mælkesyrebakterier er ikke helt veldefineret. Den omfatter lactobaciller, carnobakterier, pediococcer, lactococcer og Leuconostoc, hvorimod tilhørsforholdene for bl.a. enterococcer, aerococcer og bifidobakterier diskuteres. Mælkesyrebakterier er grampositive, oftest katalasenegative, ubevægelige, ikke sporedannende og fermenterer kulhydrater med mælkesyre som hovedprodukt.
For alle medier anbefalet til selektiv dyrkning af bakterier indenfor mælkesyrebakteriegruppen, kan der være problemer i form af for kraftig eller for svag selektivitet, idet vækstbetingelser er til stede for beslægtede bakterier, som f.eks. Enterococcer, Brochothrix og Listeria.
Fortolkningen af høje mælkesyrebakteriekimtal kan således støttes af andre kimtal som f.eks. enterococcer og Brochothrix samt eventuelt periodevis basal identifikation af den fremvoksede flora.
Metodik
Som anført i NMKL nr. 140, 1991 med følgende ændringer:
I stedet for MRS-S agar anvendes NAP agar.
Ved NAP agar anvendes APT agar som basissubstrat og efterfølgende tilsætning af de inhiberende stoffer.
Basissubstrat - APT agar:
Papton 12,5 g Gærekstrakt 7,5 g Glukose 10,0 g NaCl 5,0 g tri-Natriumcitrat 5,0 g di-kaliumhydrogenfosfat (K2HPO4) 5,0 g Tween 80 0,2 g Magnesiumsulfat 0,8 g Manganklorid 0,14 g Jern(II)-sulfat 0,04 g Thiamindiklorid 0,0001 g Agar 13,5 g Destilleret vand 1000 ml pH (brugsfærdigt substrat) 6,7
Bestanddelene kvælder i vandet i mindst 10 min. og opløses derefter fuldstændigt i det destillerede vand under opvarmning. Substratet overføres til flasker med 200 ml agar, der autoklaveres ved 121 grader C i 15 min.
Såfremt agaren skal anvendes til at undersøge drikkevarer, kan der tilsættes yderligere 1% fructose for at tilpasse substratets sammensætning til produktet.
Inden brug tilsættes pr. 200 ml smeltet og til 50 grader C afkølet substrat:
1) 1 ml sterilfiltreret 12% (w/v) natriumnitritopløsning (12 g natriumnitrit + destilleret vand ad 100 ml).
2) 1 ml sterilfiltreret 0,2% (w/v) actidionopløsning (= cycloheximid) (200 mg cychloheximid + destilleret vand ad 100 ml).
3) 1 ml sterilfiltreret polymyxin-B-opløsning med 5000 IU/ml (fremstilling afhængig af den deklarerede aktivitet af polymyxin-B).
Opløsning 1) og 2) kan opbevares 3 uger på køl. Opløsning 3) kan opbevares 1 uge på køl.
Der anvendes dybdeudsæd med dæklag eller inkubering af pladerne, der i så fald kan være overfladeudsået i 5-10% CO2-atmosfære.
Dyrkning
25,0 grader C i 3 døgn
Aflæsning
Der tælles på plader af passende fortyndinger.
På NAP agar tælles samtlige kolonier, dog undtaget typiske kolonier af Bacillus-arter og gær, der kan vokse på substratet. Brochothrix kan i visse tilfælde vokse på substratet uden at kunne skelnes kolonimorfologisk, men der er ikke påvist en eentydig sammenhæng mellem forekomst af Brochothrix i produktet og på NaP-pladerne. Brochothrix kan skelnes fra mælkesyrebakterier ved rendyrkning på APT-plader, katalasetest (20% v/v H2O2) og mikroskopi. Brochorhrix e katalasepositiv på APT-agar, ubevægelig og stavformet (polymorf).
6.3.15 Proteolytiske bakterier
Metodik
Der anvendes dybdesæd i Gelatine agar med følgende sammensætning:
Neopepton 4,0 g Gærekstrakt 1,0 g Gelatine 10,0 g Agar 10,0 g Destilleret vand 1.000 ml pH (brugsfærdigt substrat) 7,2
Bestanddelene opløses under opvarmning, og substratet ophældes på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 grader C i 15 minutter.
Sulfosalicylsyre reagens:
Sulfosalicylsyre 20,0 g Destilleret vand ad 100 ml
Sulfosalicylsyre reagens kan opbevares i 1 måned ved max. 5 grader C.
Dyrkning
25,0 grader C i 48 timer.
Aflæsning
Efter endt inkubation overhældes pladen med 3-4 ml sulfosalicylsyre reagens og henstår ca. 5 minutter. Samtlige kolonier, der er omgivet af en klar zone, tælles som proteolytiske.
6.3.16 Udgået
6.3.17 Salmonella
6.3.17.1
Som anført i NMKL nr. 71, 4. udgave, 1991, med følgende præciseringer:
Pkt. 4.2.4
Kommercielle præparationer af RV-medier skal indeholde 29 g magnesiumklorid, 6H2O/liter, svarende til 13.58 g vandfrit magnesiumklorid / liter. (Oxoid CM 669 er derfor ikke anvendeligt).
Pkt. 7.4
Som fast selektivt substrat/indikativt substrat benyttes enten brilliantgrønt-fenolrødt (BLSF/BG) agarplader, Rambach agar plade eller xylose-lactose-desoxycholat (XLD) agar. Inkubation ved 37,0 grader C i 18-24 timer. Ved mistanke om S. dublin (prøver indeholdende oksekød) må ikke benyttes Rambach agar alene, da denne serotype her udviser ukarakteristisk vækst. Kommercielle substrater er tilgængelige.
På BLSF vil ikke påvises laktosepositive Salmonella, mens XLD er mindre selektiv end BLSF og evt. vil medføre et lidt højere antal biokemiske verifikationer. Rambach har i undersøgelser vist sig på højde med eller lidt bedre end XLD og BLSF, men Pseudomonas og Acinetobacter kan give suspekte positive reaktioner ligesom enkelte Salmonelle serotyper lejlighedsvis kan udvise atypisk farvereaktion (bl.a. S dublin og S. typhimurium).
Pkt. 7.5
Rambach agarpladen: Røde, svagt rosa kolonier bedømmes som Salmonella suspekte.
Pkt. 7.6
Fra de selektive/indikative agarplader udtages suspekte kolonier, der efter rendyrkning på non-selektiv agar, stikkes i TSJ og Lysin jern agar. Typisk reaktion rød/gul/luft/sværtning i TSJ og purpur/purpur/luft/sværtning i Lysin jern agar. Atypiske reaktioner kan forekomme.
Biokemisk karakterisering kan alternativt foretages med API 20E systemet. Hafnia alvii kan give falsk positiv reaktion (hyppigt som S. choleraesuis). Hafnia alvii kolonier fremstår med takket vækst og let ujævn overflade og lugter lidt »hengemt« og adskiller sig derfor morfologisk fra Salmonella. S. choleraesuis er sorbitol positiv, og adskiller sig hermed fra Hafnia alvii. I tvivlstilfælde indsendes kulturen til serotypning
Objektglasagglutination
Såfremt kolonierne på grundlag af disse biokemiske undersøgelser stadig må anses for salmonella-suspekte, kan foretages agglutinationsprøve med polyvalent Salmonella-O-antiserum. Såfremt agglutinationsprøven giver positiv reaktion, skal det sikres, at den pågældende stamme ikke er spontan agglutinabel ved afprøvning af reaktionen i fysiologisk kogsaltopløsning.
Det bemærkes, at en negativ agglutinationsprøve kan forekomme for Salmonella som følge af, at antigengenkendelsen hos det polyvalente Salmonella-O-antiserum er begrænset til de almindeligst forekommende typer. Sortering må derfor ikke foregå ved agglutination alene.
Serotypning
Den isolerede bakteriestamme indsendes til serotypning på Statens Veterinære Serumlaboratorium med oplysning om oprindelse.
Kopi af følgeseddel indsendes til levnedsmiddelstyrelsen, således at styrelsen kan indhente isolatet på SVS.
FLOW DIAGRAM OVER ISOLATION AF SALMONELLA EFTER NMKL 71 ------------------------------------------ Præopformering Peptonvands buffer 1 del prøve + 9 dele buffer mindst 25 g prøve. 37,0 grader C i 18-24 t. ------------------------------------------ ------------------------------------------ Selektiv opformering Rappaport-Vassiliadis bouillonm (RV). 0,1 ml præopformeringsbouillon podes i 10 ml RV. 41,5 grader C +/- 0,5 grader C (luftinkubator i 18-24 t, eller 42,0 +/- 0,2 grader C (vandbad) i 18-24 t. ------------------------------------------ ------------------------------------------ Selektiv indikativ BLSF (BG agar) evt. tilsat teepol og/ dyrkning på fast substrat eller Rambach agar. og/eller XLD agar 37,0 grader C i 18-24 t. ------------------------------------------ ------------------------------------------ Rendyrkning Udsæd på non-selektiv agar af 2-4 suspekte kolonier. 37,0 grader C i 18-24 t. ------------------------------------------ ------------------------------------------ Verifikation Alle inkuberes ved 37,0 grader C TSJ agar 24-48 t. Lysin jern agar, 18-24 t. evt. sorbitol Alternativ karekterisering kan foretages med API 20E. Polyvalent Salmonella O antiserum ------------------------------------------ ------------------------------------------ Serotypning Isolerede stammer indsendes til serotypning på Statens Veterinære Serumlaboratorium. Kopi af følgeseddel indsendes til Levnedsmiddelstyrelsen. ------------------------------------------
6.3.17.2 Modified Semisolid Rappaport-Vassiliadis (MSRV) til påvisning af Salmonella Anvendelsesområde
Metoden bør ikke benyttes til levnedsmidler, der har været nedfrosne i mere end 3 måneder.
Princip
MSRV er et halvflydende selektivt medium til isolering af bevægelige Salmonella spp. fra levnedsmidler. MSRV tillader, p.g.a. sit lave agarindhold (0.3%), sværmning af bevægelige bakterier samtidig med at RV mediets selektive egenskaber overfor Salmonella udnyttes.
Fra en præopformerings-kultur dråbeinokuleres på den halvflydende agar. En Salmonella suspekt reaktion ses ved dannelse af en sværmezone omkring udsædsstedet.
Salmonella pullorum/gallinarum er ubevægelige og vil ikke kunne påvises med MSRV metoden. Lejlighedsvis kan Salmonella udvise nedsat bevæglighed. SVS-Kbh anvender MSRV rutinemæssigt i kombination med anden diagnostik og har indtil nu ikke observeret eksempler på manglende bevægelighed. RV mediet har været forbundet med forringet påvisning af Salmonella dublin, men SVS har fundet, at alle veterinære isolater af Salmonella dublin har kunnet påvises på MSRV såvidt.
Metodik
Prøveforberedelse og præopformering foregår som for NMKL 71, 4. udgave med evt. cirkulæremodifikationer.
MSRV medium fremstilles som MSRV basissubstrat med efterfølgende tilsætning af Novobiocin.
MSRV Medium Base Tryptose 4,59 g Kasein hydrolysat 4,59 g Natrium klorid 7,34 g Kalium dihydrogen fosfat 1,47 g Magnesium klorid (anhydr.) 10,93 g Malakit grøn oxalat 0,037 g Agar 2,7 g Destilleret vand ad 1000 ml pH 5,2
Selective Supplement
Novobiocin tilsættes til en koncentration på 20 mg/l i det færdige substrat.
De ophældte plader skal have en tykkelse på 4-5 mm. Efter ophældning afkøles og lufttørres pladerne ca. 1 time ved stuetemperatur med låget på skrå. Agaren er halvflydende og pladerne skal stables retvendt. Ved den rette konsistens vil agaren dirre ved at knipse på siden af petriskålen.
Salmonella adabraka punktinokuleres fra opformeringskultur som positiv kontrol.
MSRV-mediet er kommercielt tilgængeligt.
Podning af MSRV-agar
Præopformeringskulturen omrystes let før udtagning. Overfør 3 dråber (i alt 0,1 ml) præopformeringskultur til en stuetempereret MSRV-plade. Prøverne afsættes i et triangulært mønster i tre enkeltliggende dråber på overfladen af MSRV-pladen, med omtrent lige stor afstand mellem de enkelte dråber og pladens sider.
Dyrkning
Der inkuberes i 18-24 timer ved 41,5+/-0,5 grader C. Bemærk, at inkubationstid over 24 timer kan medføre uspecifik sværmning, samt at højere temperatur end 42 grader C vil beskadige bakteriernes flagelfunktion, med manglende sværmning til følge. En lavere temperatur end 41,5 grader C øger antallet af prøver med sværmning af ikke-salmonella bakterier.
Aflæsning
Gennemfaldende lys letter aflæsningen. En tydelig lys zone af bakterier, der er sværmet ud fra en eller flere af de afsatte dråber, er indikation på, at der er Salmonella i prøven. Ingen tegn på sværmning og vækst ud over grænserne for de afsatte dråber aflæses som en negativ reaktion. Aflæsning skal foregå indenfor 1 time efter at pladen er taget ud af inkubatoren.
Verifikation
Med en podenål stikkes til bunden af MSRV-pladen i yderkanten af sværmezonen med efterfølgende udstrygning på en af følgende indikative plader BLSF-agar, XLD-agar eller Rambach-agar. Bemærk, at enkelte andre enterobacteriaceae, bl.a. enterobacter cloacae kan sværme på MSRV.
Den videre verifikation foretages i henhold til NMKL nr 71, 4. udgave med evt. cirkulære modifikationer.
6.3.17.3 EiaFoss metoden til påvisning af salmonella
EiaFoss Salmonella type nr. 451500, Foss Electric A/S kan anvendes til påvisning af Salmonella i fersk kølet og frossen kød, herunder fersk kølet og frossen fjerkræ, samt i varmebehandlede kødprodukter og varmegehandlet fjerkræ.
Metoden udføres efter producentens anvisninger. Vær opmærksom på at producentens krav til minimums og maximums opvarmningstider overholdes. Følgende temperaturafvigelser på inkubationstemperaturer accepteres:
===================================================================== Fase Anbefalet temperatur Accepteret variation --------------------------------------------------------------------- Forbehandling/ + 37,0 grader C +/- 1,0 grader C varmeskab --------------------------------------------------------------------- Opformering/ + 41,0 grader C +/- 0,5 grader C varmeskab --------------------------------------------------------------------- Postopformering i + 42,0 grader C +/- 0,2 grader C =====================================================================
Hurtigmetode
Alternativt kan visse hurtigmetoder anvendes efter særlig godkendelse fra Levnedsmiddelstyrelsen.
6.3.18 Skimmelsvampe og gær (se 6.3.9)
6.3.19 Svovlbrinteproducerende bakterier i fisk.
Metodik
Som anført i NMKL nr. 96, 2. udgave, 1994 med rettelsesblad af december 1994. Forskriften med hensyn til hydrogensulfidproducerende bakterier følges.
Inkubation kan foretages ved 21 grader C. Se iøvrigt 6.3.11.1.
Aflæsning
Som udtryk for totalkimtallet tælles samtlige kolonier uanset kolonifarve.
Antallet af sorte kolonier er et udtryk for indholdet af svovlbrinteproducerende bakterier, der i fersk fisk ofte domineres af Shewanella putrefaciens. Svovlbrinteproducerende bakterier omfatter dog også medlemmer af familierne Enterobacteriaceae og Vibrionaceae, der i nogen grad ses i letkonserverede fiskeprodukter (f.eks. letrøgede og gravede fisk).
6.3.20 Staphylococcus aureus
Metodik
Som anført i NMKL nr. 66, 2. udgave, 1992.
6.3.21 Sulfitreducerende clostridier
Metodik
Som anført i NMKL nr. 56, 3. udgave, 1994.
6.3.22 Termotolerante coliforme bakterier
Metodik
Som anført i NMKL nr. 125, 3. udgave 1996.
Såfremt der ved undersøgelse af fisk og fiskevarer kræves en lavere detektionsgrænse, kan NMKL nr. 96, 2. udgave, 1994, (MPN-teknik med lauryl-sulfat bouillon) anvendes.
6.3.23 Vibrio parahamolyticus
Metodik
Som anført i NMKL nr. 97, 1982 (preliminær metode) med følgende præciseringer:
Aflæsning
Ved kvantitative undersøgelser opgives resultatet efter anvisningerne i pkt. 8.4. efter fornøden identifikation. Ved kvalitative undersøgelser angives resultatet som påvist/ikke påvist i den undersøgte prøvemængde efter fornøden identifikation.
6.3.24 Yersinia enterocolitica
Som anført i NMKL nr. 117, 3. udgave, 1996.
Ved rutinemæssige undersøgelser kan undersøgelsesprogrammet begrænses således:
Efter 1 uges kuldeopformering i PSB efteerfulgt af 4 dages opformering i MRB subkultiveres på CIN agar. Herved reduceres antalles af subkultiveringer til en enkelt.
Suspekte isolater indsendes til Levnedsmiddelstyrelsen, mikrobiologisk sektion, men henblik på verifikation og serotypning.
FLOW DIAGRAM OVER ISOLATION AF YERSINIA ENTEROCOLITICA FRA LEVNEDSMIDLER: --------------------------------------------------------------------- 25-50 g levnedsmiddel homogeniseres i stormacher og tilsættes PSB i forholdet 1:9. I visse levnedsmidler med kraftig kontaminationsflora 1:99 (2,5 g levnedsmiddel til 247,5 ml PBS). Præopformering ved stuetemperatur (22-25 grader C) i 3 timer --------------------------------------------------------------------- ---------------------------------- ----------------------------- 1. subkultur: Præopformeringskulturen Udsæd på CIN agar. kulddeopformeres ved 4 Inkubering ved 30,0 grader C i grader C i 3 uger 20-24 t. ---------------------------------- ----------------------------- ----------------------------------------------------------- Selektiv opformering: Efter 8 dages kuldeopformering overføres efter grundig blanding 0,1 til 10 ml MRB. Inkubering ved 22-25 grader C i 4 døgn ----------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------- 2. subkultur: Udsæd på CIN agar fra MRB. Inkubering ved 30,0 grader C i 20-24 t. ----------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------- 3. subkultur: Efter 3 ugers kuldeopformering udsås på CIN. Inkubering 30,0 grader C i 18-24 timer. Det anbefales at pode i MRB (som trin 3-4) forinden udsæd på CIN. --------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------- Fra 1., 2. og 3. subkultur overføres 4-5 typiske kolonier til BS agar. Inkubering ved 30,0 grader C i 12-24 t. --------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------- Indledende biokemisk karakterisering: Gule, sakkarose pos. kolonier testes i: Urinstof, TSJ (37 grader C 18-24 t.), halvflydende agar ved 20-22 grader C og 37,0 grader C i 18-24 t. --------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------- Endelig biokemisk og serologisk identifikation: Verifikation og biotyping. Suspekte isolater indsendes til LST til verifikation. ---------------------------------------------------------------------
6.3.25 Aeromonas
Som anført i NMKL nr. 150, 2. udgave, 1995.
6.4 Tælling og angivelse af kimtal
6.4.1 Tælling af mikroorganismer
De kvantitative mikrobiologiske analysemetoder foreskriver normalt det mindste og det største antal kolonier, som skal være vokset frem på petriskåle eller i glas, for at disse kan anvendes ved tælling og beregning af kimtal. Dette antal vil normalt være mellem 25 og 250 kolonier pr. plade eller glas, for visse indikative substrater dog ofte væsentligt færre.
Der henvises i øvrigt til »Handledning i kvalitetssakring for mikrobiologiske laboratorier«. NMKL-rapport nr. 5, 2. udgave, 1994.
6.4.2 Beregning af kimtal
Ved enkeltundersøgelser tælles kolonier på den plade, som er egnet til tælling. Kimtallet udtrykket som antallet af kolonier divideret med prøvemængden spredt på pladen.
Kimtallet beregnes ved:
C1 + C2 + ...+Cn Kimtallet = ---------------- V1 + V2 + ... Vn
hvor C1, C2, ..... Cn er antallet af kolonier talt i fortyndingerne V1, V2, ..... Vn.
Eksempel
Ved dybdeudsæd er der i 1 ml fra henholdsvis 10exp-3 og 10exp-4 fortynding talt 128 og 20 kolonier i PCA ved 25 grader i 3 døgn.
128 + 20 Totalkimtal = ----------------- = 135.000/g 140.000 g 10exp-3 + 10xp-4
6.4.3 angivelse af kimtal
Indholdet af mikroorganismer i en prøve angives som antal pr. ml eller gram, idet antallet angives med 2 betydende cifre.
Der henvises i øvrigt til NMKL-rapport nr. 5, 2. udgave 1994
6.5 Øvrige metoder
6.5.1 pH
Metodik
Faste prøver homogeniseret, f.eks. ved brug af blender. Tørre levnedsmidler opblandes med lige dele vand inden pH-måling foretages. Når prøven opblandes med vand skal denne henstå i 10 minutter ved den temperatur hvorved målingen foretages, inden måling foretages.
Der henvises i øvrigt til ISO 2917, 1. udgave 1974.
6.5.2 aw
Metodik
Vandaktiviteten bestemmes som angivet i NMKL nr. 104, 984.
6.5.3 Histamin
Metodik
Histamin bestemmes semikvantitativt som angivet i NMKL nr. 118, 1988.
Histamin bestemmes kvantitativt som angivet i NMKL nr. 99, 1981.