Регламент (ЕО) № 440/2008 на Комисията от 30 май 2008 година за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH) (текст от значение за ЕИП)
Grade B
mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.
Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/bg
Contents
- Preamble
- ANNEX
- А.1.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.4.4.
- 1.5. ТАБЛИЦА: ПРИЛОЖИМОСТ НА МЕТОДИТЕ А. Б. В. Г.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.1.1.
- 1.6.1.2. Апаратура
- 1.6.2.
- 1.6.4.
- 4.(1)(2)(3)(4)
- А.2.
- 1.
- 1.4.
- 1.5. Таблица 1 Сравнение на методите
- 1.6.
- 1.6.4.
- 1.6.6.
- 2. Таблица 2 Коефициенти за температурна корекция fT
- А.З.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 3. Таблица 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Приложимост на методите
- 3. Таблица 1.4.1.1.1.4.1.2. Приложимост на методите а)
- 3. Таблица 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Приложимост на методите а)
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
- А.4.
- 1.
- 1.4.
- 1.5.1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.2.
- 1.6.2.2.
- 1.6.4.
- 1.6.4.2.
- 1.6.5.
- 1.6.6.
- 1.6.6.1. Инертен газ:
- 1.6.6.2. Приготвяне на колоната за насищане:
- а)
- б)
- 1.6.7.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
- А.5.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.4.
- 1.6.4.1.
- 1.6.4.1.3. Фигура Измервателно тяло
- 1.6.4.2.
- 1.6.4.2.2. Инсталиране
- а)
- б)
- 2. Таблица Коригиране на измереното п овърхностно напрежение Само за водни разтвори, ρ = 1 g/cm3
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)
- A.6.
- 1.
- 1.4.
- 1.5.
- 1.6.
- 1.6.3.
- 1.6.3.2. Процедура на изпитване:
- 1.6.3.3. Апаратура
- 1.6.3.4. Апаратура (вж. фигури 4 и 3)
- 1.6.4.
- 2.
- 3.
- А.8.
- 1.
- 1.3. Метод на разклащането в стъкленица
- 1.4.
- 1.5.
- 1.5.1. Метод на разклащането в стъкленица
- 1.5.2. Метод на разклащането в стъкленица
- 1.5.3. Метод на разклащането в стъкленица
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.2.1.
- 1.6.2.3.
- 1.6.3.
- 1.6.3.1. Апаратура
- 1.6.3.2. Изчисляване на мъртвото време t0
- 2. Метод на разклащането в стъкленица
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
- А.9.
- 1.
- 1.5.
- 1.6.
- 1.6.3.
- 1.6.3.2. Апарат на Абел:
- А.10.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 3.
- А.11.
- 1.
- 1.6.
- A.12.
- 1.
- 1.3.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.2.
- 1.6.3.
- 1.6.4.
- А.13.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2. а)
- 2.
- A.14.
- 1.
- 1.1. а)
- 1.4.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.2.
- 1.6.2.2. а)
- 1.6.3.
- 1.6.3.2. а)
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)
- А.15.
- 1.
- 1.6.
- А.16.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 4.
- Фигура 1 Модел на измервателния куб с дължина на страната 20 mm
- Фигура 2 Типична крива температура/време
- А.17.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.2.
- 3.
- 3.2. а)
- А.18.
- 1.
- 1.6.
- 2.
- 2.2.
- 3.(1)(2)(3)(4)
- A.19.
- 1.
- 1.6.
- 2.
- 2.2.
- 3.(1)(2)(3)(4)
- А.20.
- 1.
- 1.5.
- 1.5.4.
- 2.
- 3.
- 3.1.
- A.21.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.1.2.
- 2.
- 2.1. Таблица 1 Примерни резултати
- 3.
- 3.2. а)
- 4.
- Фигура 1 Съд под налягане
- Фигура 2 Поддържащ стенд
- Фигура 3 Система на запалване
- 1.
- 2.
- 4.
- 1.2. За твърди вещества
- Допълнение 1 Изчислителен метод
- ВЪВЕДЕНИЕ
- ИЗЧИСЛИТЕЛЕН МЕТОД
- ИЗЧИСЛИТЕЛНА ПРОЦЕДУРА
- ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
- ПРЕПРАТКИ
- Допълнение 2
- Фигура 1 Апаратура за определяне кривата на налягането на парите по динамичния метод
- Фигура 2а Апаратурата за определяне кривата на налягането на парите по статичния метод (при използване на U-образен манометър)
- Фигура 2б Апаратура за определяне кривата на налягането на парите по статичния метод (при използване на индикатор за налягането)
- Фигура 3 Изотенископ (виж препратка 7)
- Фигура 4 Апаратура за определяне кривата на налягането на парите по метода с везна за парно налягане
- Фигура 5 Примерна апаратура за изпаряване при ниско налягане по ефузионния метод при обем на ефузионната клетка 8 cm
- Фигура 6а Пример на поточна система за определяне на налягането на парите по метода с насищане на инертен газ
- Фигура 6б Пример на система за определяне на налягането на парите по метода с насищане на инертен газ — с капилярка, разположена след камерата за насищане
- Фигура 7 Пример на експериментална установка за метода с въртящ се ротор
- Фигура 8 Пример на измерителна глава с въртящ се ротор
- Фигура 1 Метод на елуиране от колона с рециркулационна помпа
- Фигура 2 Типична микроколона
- Фигура 3 Типична микроколона
- Фигура 4 Метод на елуиране от колона с нивелиращ съд
- МЕТОДИ ЗА ОЦЕНКА Предварителна преценка на коефициента на разпределение
- ИЗЧИСЛИТЕЛНИ МЕТОДИ Принцип на изчислителните методи
- π-метод на Ханш
- Метод на Рекер
- Метод на Ханш и Лео
- Комбиниран метод
- i)
- ii)
- iii)
- iv)
- Фигура Матрица и спомагателни приспособления за приготвяне на купчинката от веществото
- Фигура Апаратура
- Пример за спецификация на материалите за изпитването на термичната чувствителност (вж. DIN 1623) (1)(2)(3)
- Фигура 1 Апарат за измерване на термичната чувствителност
- Фигура 2 Изпитване на термичната чувствителност
- Фигура 3 Калибриране на скоростта на нагряване за изпитването на термичната чувствителност
- Фигура 4 Апарат за изпитване на удар
- Фигура 5 Апарат за чувствителност при триене
- Фигура Матрица и спомагателни приспособления за приготвяне на купчинката
- 1.1.1.1.2.1.3.1.4.
- 3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
- ЧАСТ Б МЕТОДИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ТОКСИЧНОСТТА И ДРУГИ ЕФЕКТИ ВЪРХУ ЗДРАВЕТО
- ОБЩО ВЪВЕДЕНИЕ А.
- i)
- ii)
- Б.1А.
- 1.
- 1.4.
- 1.5.
- 1.5.3.
- 1.6.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
- Б.1Б.
- 1.
- 1.4.
- 1.5.
- 1.6.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
- Б.2.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.3. а)
- 3.
- 3.1. а)
- Б.3.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.3. Оценка на токсичното действие при другия пол
- 3.
- Б.4.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 2.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
- Таблица I Образуване на еритема и есхара Образуване на едем СКАЛА НА КОЖНИТЕ ПРОМЕНИ
- Б.5.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.4.2.3.
- 1.4.2.7.
- 2.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
- Таблица 1 СКАЛА НА ОЧНИТЕ УВРЕЖДАНИЯ
- Роговица
- Ирис
- Конюнктиви
- Хемоза
- Б.6.
- 1.
- 1.5.
- 1.5.1.
- 1.5.1.2.
- 1.5.1.3.
- 1.5.2.
- 1.5.2.2.
- 1.5.2.3.
- 3. Доклад за теста (GМРТ и Вuehleг test)
- Б.7.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.2.
- 1.4.3.
- 3. ДОКЛАД ЗА ТЕСТА
- Б.8.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.3. а)
- 3.
- 3.1.
- pt_2 а)
- Б.9.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.3.
- 3.
- Б.10.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.4.3.
- 2.
- 3. ДОКЛАД ЗА ТЕСТА
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
- Б.11.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.5.
- 2.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
- Б.12.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.5.
- 1.5.2. а)
- 2.
- 3. ДОКЛАД ЗА ТЕСТА
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
- Б.13/14.
- 1.
- 1.5.
- 1.5.1.
- 1.5.2.
- 2.
- 3. ДОКЛАД ЗА ТЕСТА
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
- Б.15.
- 1.
- 1.6. Подготовка
- Метаболитно активиране
- Експериментални щамове
- Среди
- Използване на положителни и отрицателни контроли
- Експозиционна концентрация
- Условия за инкубиране
- Честоти на спонтанните мутации
- Брой на повторенията
- 3.
- Б.16.
- 1.
- 1.6. Подготовка
- Метаболитно активиране
- Експериментални щамове
- Среди
- Използване на положителни и отрицателни контроли
- Експозиционни концентрации
- Условия за инкубиране
- Спонтанни честоти на митотичните рекомбинации
- Брой на повторенията
- 3.
- Б.17.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.4.3.
- 2.
- 3. ДОКЛАД ЗА ТЕСТА
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
- Б.18.
- 1.
- 1.6. Подготовка
- Брой на културите
- Използване на положителни и отрицателни контроли
- Експозиционни концентрации
- Клетки
- Метаболитно активиране
- Приготвяне на култури
- Третиране на културите с изпитваното вещество Първични хепатоцити от плъх
- Авторадиографски изследвания
- Измервания с LSC
- 2.
- 3.
- Б.19.
- 1.
- 1.6. Условия на изпитване
- Брой на културите
- Използване на положителни и отрицателни контроли
- Експозиционни концентрации
- Приготвяне на култури
- Третиране
- Отлепване на клетки
- Приготвяне и оцветяване на хромозоми
- Анализ
- 3.
- Б.20.
- 1.
- 1.6. Подготовка
- Източници
- Изпитвано вещество
- Брой на животните
- Начин на прилагане
- Използване на отрицателни и положителни контроли
- Нива на експозиция
- 3.
- Б.21.
- 1.
- 1.6. Подготовка
- Клетки
- Среда
- Изпитвано вещество
- Метаболитно активиране
- Използване на отрицателни и положителни контроли
- Експозиционни концентрации
- 3.
- Б.22.
- 1.
- 1.6. Подготовка
- Начин на прилагане
- Експериментални животни
- Брой и пол
- Използване на отрицателни и положителни контроли
- Нива на дозиране
- Гранично изпитване
КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ,
като взе предвид Договора за създаване на Европейската общност,
като взе предвид Регламент (EО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета от 18 декември 2006 г. относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH), за създаване на Европейска агенция по химикали, за изменение на Директива 1999/45/EО и за отмяна на Регламент (EИО) № 793/93 на Съвета и Регламент (EО) № 1488/94 на Комисията, както и на Директива 76/769/EИО на Съвета и директиви 91/155/EИО, 93/67/EИО, 93/105/EО и 2000/21/EО на Комисията, и по-специално член 13, параграф 3 от него,
като има предвид, че:
(1) В съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на общностно равнище следва да се приемат методи за изпитване за целите на изпитванията на вещества, когато подобни изпитвания се изискват, за да се събере информация за характерните свойства на веществата.
(2) Директива 67/548/ЕИО на Съвета от 27 юни 1967 г. за сближаването на законовите, подзаконовите и административните разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества посочва в приложение V методите за определяне на физикохимичните свойства, токсичността и екотоксичността на веществата и препаратите. Приложение V към Директива 67/548/ЕИО се заличава с Директива 2006/121/ЕО на Европейския парламент и на Съвета, считано от 1 юни 2008 г.
(3) Методите за изпитване, съдържащи се в приложение V към Директива 67/548/ЕИО, следва да бъдат включени в настоящия регламент.
(4) Настоящият регламент не изключва прилагането на други методи на изпитване, при условие че те се прилагат в съответствие с член 13, параграф 3 от Регламент (ЕО) № 1907/2006.
(5) Принципите на заместване, намаляване и усъвършенстване на използването на животни в процедури следва да бъдат взети предвид изцяло при изготвянето на методи на изпитване, по-специално в случаите, когато са налице подходящи одобрени методи, които да заместят, намалят или усъвършенстват изпитванията с животни.
(6) Разпоредбите на настоящия регламент са в съответствие със становището на комитета, създаден съгласно член 133 от Регламент (ЕО) № 1907/2006,
ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ:
Член 1 Методите на изпитване, които следва да се прилагат за целите на Регламент (ЕО) № 1907/2006, са посочени в приложението към настоящия регламент.
Член 2 Когато е целесъобразно, Комисията ще преразгледа методите на изпитване, съдържащи се в настоящия регламент, с цел заместване, намаляване или усъвършенстване на изпитванията върху гръбначни животни.
Член 3 Всички позовавания на приложение V към Директива 67/548/ЕИО се тълкуват като позовавания на настоящия регламент.
Член 4 Настоящият регламент влиза в сила в деня след публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз.
Той се прилага от 1 юни 2008 г. Съставено в Брюксел на 30 май 2008 година. За Комисията Stavros Dimas Член на Комисията
ANNEX
ПРИЛОЖЕНИЕ ЧАСТ А: МЕТОДИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ФИЗИКОХИМИЧНИ СВОЙСТВА
А.1. ТЕМПЕРАТУРА НА ТОПЕНЕ/ЗАМРЪЗВАНЕ
А.1.
1. МЕТОД Повечето от описаните методи се основават на Ръководството за провеждане на изпитвания на ОИСР (1). Основните принципи са дадени в препратки (2) и (3).
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Описаните методи и апаратура се прилагат за определяне на температурата на топене на веществата без никакви ограничения относно тяхната степен на чистота. Изборът на метода зависи от природата на веществото, което трябва да се изследва. По тази причина ограничаващият фактор ще бъде свързан с това, дали веществото може да се приведе в прахообразно състояние (лесно или трудно) или не. За някои вещества е по-подходящо да се определя температурата на замръзване или втвърдяване. Ето защо в този метод са включени стандарти и за тези определения. Когато, поради по-особените свойства на веществото, определянето на гореспоменатите параметри е по-трудно, може да се определи точката на застиване.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Температурата на топене се определя като температурата, при която се извършва фазовият преход от твърдо към течно състояние при атмосферно налягане; тази температура напълно съответства на температурата на замръзване. Фазовият преход при много вещества се извършва в температурен интервал, наричан интервал на топене. Превръщане на мерните единици (К към oС) t = Т - 273,15 t Целзиева температура, градус Целзий (oС) Т термодинамична температура, Келвин (К)
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Не във всички случаи, когато се изследва ново вещество, е необходимо да се използват вещества за сравнение. Преди всичко те трябва да служат за периодична проверка на действието на метода и да позволяват сравнение с резултатите, получени по други методи. Някои калибровъчни вещества са изброени в препратка (4).
1.4. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАТЕЛНИЯ МЕТОД Определя се температурата (температурният интервал) на фазовия преход от твърдо към течно или от течно към твърдо състояние. На практика, когато се нагрява/охлажда проба от изследваното вещество при атмосферно налягане, се определят началната температура на топене/замръзване и температурата в последната фаза на топенето/замръзването. Описани са пет типа методи, а именно — капилярен метод, методи с горещи подложки, методи за определяне на температурата на замръзване, методи на термичния анализ и определяне на точката на застиване (разработен за нефтени масла). В някои случаи е по-подходящо вместо температурата на топене да се измери температурата на замръзване.
1.4.
1.4.1. Метод с капилярка
1.4.1.
1.4.1.1. Устройства за температура на топене с течностна баня Малко количество от фино стритото вещество се поставя в капилярка и се стръсква в плътна маса. Капилярката се нагрява заедно с термометър. Повишаването на температурата се регулира така, че да не надвишава 1 К/min по време на самото топене. Определят се началната и крайната температура на топене.
1.4.1.2. Устройства за температура на топене с метален блок Както е описано в 1.4.1.1, но капилярката и термометърът са разположени в нагрят метален блок и могат да се наблюдават през отвори в блока.
1.4.1.3. Отчитане с фотоклетка Пробата в капилярката се нагрява автоматично в метален цилиндър. С помощта на отвор в цилиндъра светлинен лъч се насочва през веществото към прецизно калибрирана фотоклетка. В процеса на топене оптичните свойства на повечето вещества се променят от непрозрачно към прозрачно. Интензитетът на светлината, която достига до фотоклетката, се увеличава и тя изпраща сигнал за спиране към цифровия индикатор, отчитащ температурата на платинов съпротивителен термометър, разположен в нагревателната камера. Този метод не е подходящ за някои силнооцветени вещества.
1.4.2. Горещи подложки
1.4.2.
1.4.2.1. Кофлеров апарат с гореща пръчка Кофлеровият апарат с гореща пръчка използва две парчета метал с различна топлопроводимост, нагрявани електрически, с пръчка, направена така, че температурният градиент да е почти линеен по дължината ѝ. Температурата на горещата пръчка може да се изменя по дължината и между 283 и 573 К се отчита със специално устройство, включващо плъзгач с показалец и етикети, направени специално за дадената пръчка. За да се определи температурата на топене, веществото се разстила на тънък пласт направо по повърхността на горещата пръчка. След няколко секунди се появява рязка разделителна линия между течната и твърдата фаза. Температурата на разделителната линия се отчита, като стрелката се нагласява да лежи върху нея.
1.4.2.2. Микроскоп за стапяне Използват се няколко вида горещи масички за микроскопа, които служат за определяне на температурата на топене на съвсем малки количества от веществото. При повечето от горещите масички температурата се измерва с чувствителна термодвойка, но понякога се използват и живачни термометри. Типичният апарат за температура на топене с микроскоп с гореща масичка има нагревателна камера, съдържаща метална плочка, върху която пробата се поставя на стъкло. В центъра на металната плочка има отвор, през който навлиза светлината от осветителното огледало на микроскопа. Когато се използва, камерата е затворена със стъклена пластинка, така че да се изолира въздухът около пробата. Нагряването на пробата се регулира с реостат. За много точни измервания на оптически анизотропни вещества може да се използва поляризирана светлина.
1.4.2.3. Менискусен метод Този метод се използва специално за полиамиди. Визуално се определя температурата, при която се измества менискусът от силиконово масло, поставено между горещата подложка и покривното стъкло, което се поддържа от пробния образец от полиамид.
1.4.3. Метод за определяне на температурата на замръзване Пробата се слага в специална епруветка и се поставя в апарат за определяне на температурата на замръзване. По време на охлаждането пробата се разбърква внимателно без прекъсване, а температурата се измерва на подходящи интервали от време. Когато температурата остане постоянна при няколко последователни измервания, тази температура (коригирана с грешката на термометъра) се отчита като температура на замръзване. Трябва да се избягва преохлаждането, като се поддържа равновесие между твърдата и течната фаза.
1.4.4. Термичен анализ
1.4.4.
1.4.4.1. Диференциален термичен анализ (ДТА) При тази техника се прави запис на разликата в температурите на веществото и на сравнителния материал като функция от температурата, като веществото и сравнителният материал са подложени на една и съща контролирана температурна програма. Когато пробата претърпява преход, свързан с промяна на енталпията, тази промяна се проявява като ендотермично (топене) или екзотермично (замръзване) отклонение от основната линия на записа на температурата.
1.4.4.2. Диференциална сканираща калориметрия (ДСК) При тази техника се прави запис на разликата в подадената енергия към веществото и към сравнителния материал като функция от температурата, като веществото и сравнителният материал са подложени на една и съща контролирана температурна програма. Тази енергия представлява енергията, необходима да се установи нулева температурна разлика между веществото и сравнителния материал. Когато пробата претърпява преход, свързан с промяна на енталпията, тази промяна се регистрира като ендотермично (топене) или екзотермично (замръзване) отклонение от основната линия на записа на топлинния поток.
1.4.5. Точка на застиване Този метод е разработен за нефтени масла и е подходящ за маслообразни вещества с ниски температури на топене. След предварително нагряване пробата се охлажда с определена скорост и характеристиките ѝ на течливост се изследват на интервали от 3 К. Най-ниската температура, при която все още се наблюдава движение на веществото, се отчита като точка на застиване.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Приложимостта и точността на различните методи, които се използват за определяне на температурата на топене/интервала на топене, са дадени в следните таблици:
1.5. ТАБЛИЦА: ПРИЛОЖИМОСТ НА МЕТОДИТЕ А. Б. В. Г.
Капилярни методи Метод за измерване Вещества, които могат да се разпрашават Вещества, които се разпрашават трудно Температурен интервал Оценка на точността Съществуващ стандарт Устройства за температура на топене с водна баня да само в известна степен от 273 до 573 K ±0,3 К JIS K 0064 Устройства за температура на топене с метален блок да само в известна степен от 293 до > 573 К ±0,5 K ISO 1218 (E) Отчитане с фотоклетка да няколко с допълнителни приспособления от 253 до 573 K ±0,5 K Методи с горещи подложки и методи със замразяване Метод за измерване Вещества, които могат да се разпрашават Вещества, които се разпрашават трудно Температурен интервал Оценка на точността Съществуващ стандарт Кофлер с гореща пръчка да не от 283 до > 573 K ± 1К АNSI/ASTM D 3451-76 Микроскоп за стапяне да само в известна степен от 273 до > 573 K ±0,5 K DIN 53736 Менискусен метод не специално за полиамиди от 293 до > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Методи за температура на замръзване да да от 223 до 573 K ±0,5 K например BS 4695 Термичен анализ Метод за измерване Вещества, които могат да се разпрашават Вещества, които се разпрашават трудно Температурен интервал Оценка на точността Съществуващ стандарт Диференциален термичен анализ да да от 173 до 1273 K до 600 K ±0,5 K до 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Диференциална сканираща калориметрия да да от 173 до 1273 K до 600 K ±0,5 K до 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Точка на застиване Метод за измерване Вещества, които могат да се разпрашават Вещества, които се разпрашават трудно Температурен интервал Оценка на точността Съществуващ стандарт Точка на застиване за нефтени масла и маслени субстанции за нефтени масла и маслени субстанции от 223 до 323 K ±3,0 K ASTM D 97-66
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДИТЕ Процедурите на почти всички методи за изпитване са описани в международни и национални стандарти (вж. допълнение 1).
1.6.
1.6.1. Методи с капилярна тръбичка При бавно повишаване на температурата фино разпратените вещества обикновено преминават през фазите на топене, показани на фигура 1.
1.6.1.
Фигура 1 Фаза А Фаза B Фаза C Фаза D Фаза E Фаза А (Начало на топенето): фини капчици полепват равномерно по вътрешната стена на капилярката. Фаза B появява се просвет между пробата и вътрешната стена, който се дължи на свиване на стопилката. Фаза C свитата проба започва да се свлича надолу и да се втечнява. Фаза D на повърхността се образува напълно оформен менискус, но значително количество от пробата все още е в твърдо състояние. Фаза E (Крайна фаза на топенето): вече няма твърди частици. При определяне на температурата на топене се отчитат температурата в началото на топенето и тази в крайната му фаза.
1.6.1.1. Прибори за определяне на температурата на топене в апарат с течностна баня На фигура 2 е показан един тип стандартизиран апарат за температура на топене, изработен от стъкло (JIS K 0064); всички размери са в милиметри.
1.6.1.1.
Фигура 2 A: Измервателен съд B: Запушалка C: Вентилационен отвор D: Термометър E: Спомагателен термометър F: Течност за банята G: Стъклена капилярка, дължина от 80 до 100 mm, вътрешен диаметър 1,0 ± 0,2 mm, дебелина на стената от 0,2 до 0,3 mm H: Странична тръба
Течност за банята:
Трябва да се избере подходяща течност. Изборът на течността зависи от температурата на топене, която трябва да се определя: например течен парафин — за температури на топене не по-високи от 473 К, силиконово масло — за температури на топене не по-високи от 573 К. За температури на топене над 523 К може да се използва смес, която се състои от три части сярна киселина и две части калиев сулфат (масово съотношение). Ако се използва такава течност, трябва да се вземат подходящи предпазни мерки.
Термометър:
Могат да се използват само такива термометри, които съответстват на изискванията на посочените по-долу или на еквивалентни стандарти: АSТМ Е 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.
Процедура на измерване:
Сухото вещество се стрива на фин прах в хаванче и се поставя в капилярка, запоена от едната страна, така че нивото на запълване да е приблизително 3 mm, след като веществото се сбие в плътна маса. За да се получи равномерно уплътнена проба, капилярката трябва да се пуска от височина около 700 mm през вертикална стъклена тръба върху часовниково стъкло. Напълнената капилярка се поставя в банята, така че средната част на живачния резервоар на термометъра да се допира до нея в областта, където е разположена пробата. Обикновено капилярката се въвежда в апарата около 10 К преди да се достигне температурата на топене. Течността в банята се нагрява по такъв начин, че покачването на температурата да е приблизително 3 K/min. Течността трябва да се разбърква. При около 10 К под очакваната температура на топене скоростта на покачване на температурата се регулира така, че да не надвишава 1 K/min.
Изчисления:
Температурата на топене се изчислява, както следва: Т = TD+0,00016 (ТD – ТЕ) n където: Т коригираната температура на топене в К ТD температурата, отчетена по термометъра D в К ТЕ температурата, отчетена по термометъра Е в К n броя деления на живачната нишка на термометър D при нивото на потапяне на ствола му.
1.6.1.2. Уреди за измерване на температурата на топене в метален блок
1.6.1.2. Апаратура
Тя се състои от:
цилиндричен метален блок, чиято горна част е куха и образува камера (вж. фигура 3),
метална запушалка с два или повече отвори, които позволяват капилярките да се монтират в металния блок,
нагревателна система за металния блок, осигурена например от електрическо съпротивление, включено в блока,
реостат за регулиране на входното напрежение (ако се използва електрическо нагряване),
четири прозорчета от термоустойчиво стъкло на страничните стени на камерата, диаметрално разположени и под прав ъгъл едно спрямо друго. Пред едно от тези прозорчета се монтира окуляр за наблюдение на капилярката. Другите три прозорчета се използват за осветяване на вътрешността на апарата с помощта на лампи,
капилярка от термоустойчиво стъкло, запоена в единия край (вж. 1.6.1.1).
Термометър:
Вижте стандартите, посочени в 1.6.1.1. Могат да се прилагат и термоелектрически измервателни устройства със съпоставима точност.
Фигура 3 Термометър Капилярна тръбичка Метална запушалка Окуляр Електрическо съпротивление Метален нагревателен блок
1.6.1.3. Отчитане с фотоклетка Апаратура и процедура: Апаратът се състои от метална камера с автоматична нагревателна система. Три капилярки се напълват, както е описано в 1.6.1.1, и се поставят в пещта. Може да се направят няколко линейни покачвания на температурата за калибриране на апарата и подходящото температурно покачване се нагласява електрически на предварително подбрана постоянна линейна скорост. Записващите устройства показват действителната температура на пещта и температурата на веществото в капилярката.
1.6.2. Горещи подложки
1.6.2.
1.6.2.1. Кофлер с гореща пръчка Вж. допълнението.
1.6.2.2. Топилен микроскоп Вж. допълнението.
1.6.2.3. Менискусен метод (полиамиди) Вж. допълнението. Скоростта на нагряване при температурата на топене трябва да е по-ниска от 1 K/min.
1.6.3. Методи за определяне на температурата на замръзване Вж. допълнението.
1.6.4. Термичен анализ
1.6.4.
1.6.4.1. Диференциален термичен анализ Вж. допълнението.
1.6.4.2. Диференциална сканираща калориметрия Вж. допълнението.
1.6.5. Определяне на точката на застиване Вж. допълнението.
2. ДАННИ В някои случаи е необходима корекция на термометъра.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ По възможност протоколът от изпитването трябва да включва следната информация: Като температура на топене се съобщава средноаритметичното от най-малко две измервания, които са в обхвата на оценката на точността (вж. таблиците). Ако разликата в температурите на началната и крайната фаза на топенето е в границите на точността на метода, температурата в крайната фаза на топенето се приема за температура на топене на веществото; в другия случай трябва да се съобщят и двете температури. Ако веществото се разлага или сублимира, преди да се достигне температурата на топене, трябва да бъде указана температурата, при която се наблюдава този ефект. Всяка информация и бележки, свързани с интерпретацията на резултатите, трябва да се отразят в протокола, особено онези, които се отнасят до примесите и физичното състояние на веществото.
използван метод,
точна спецификация на веществото (вид и примеси) и предварителни стъпки на пречистване, ако има такива,
оценка на точността.
4.(1)(2)(3)(4)
ПРЕПРАТКИ OИCP, Paris, 1981, Test Guideline 102, решение на Съвета C(81) 30 окончателен. IUPAC, B. Le Neidre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics. Butterworths, London 1975, vol. II, 803—834. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.
А.2. ТЕМПЕРАТУРА НА КИПЕНЕ
А.2.
1. МЕТОД Повечето от описаните методи се основават на Ръководството за провеждане на изпитвания на ОИСР (1). Основните принципи са дадени в препратки (2) и (3).
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Описаните тук методи и апаратури могат да се прилагат за течности и нискотопими вещества, ако те не претърпяват химична реакция, преди да се достигне температурата им на кипене (например автоокисление, прегрупировка, разграждане и др.). Методите могат да се прилагат за чисти и за непречистени течни вещества. Акцентира се на методите, които използват отчитане с фотоклетка и термичен анализ, защото те позволяват да се определят както температурата на кипене, така и температурата на топене. Нещо повече, измерванията може да се извършват автоматично. Динамичният метод има това предимство, че може да се използва и за определяне на парното налягане, а и не е необходимо температурата на кипене да се коригира към нормално налягане (101,325 kРа), защото то може да се задава по време на измерването с маностат. Забележки: Влиянието, което примесите оказват върху определянето на температурата на кипене, зависи в голяма степен от природата на тези примеси. Когато в пробата има летливи примеси, които могат да повлияят на резултатите, веществото може да се пречисти.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Нормалната температура на кипене е температурата, при която налягането на наситените пари над течността е 101,325 kРа. Ако температурата на кипене не се измерва при нормално атмосферно налягане, зависимостта на парното налягане от температурата може да се опише с уравнението на Клаузиус-Клапейрон: log p = Δ Hv2,3 RT+const. където: р парното налягане на веществото в паскали ΔHV неговата топлина на изпарение в J mol-1 R универсалната моларна газова константа = 8,314 J mol-1 K-1 Т термодинамичната температура в K Температурата на кипене се определя спрямо външното налягане по време на измерването. Превръщане на мерните единици Налягане (единици: kРа) 100 kPa 1 bar = 0,1 MPa (bar все още е разрешена единица, но не се препоръчва) 133 Pa 1 mm Hg = 1 Тоrr (единиците mm Hg и Тоrr не са позволени) 1 atm стандартна атмосфера = 101325 Ра (единицата atm не е позволена) Температура (единици: K) t = T – 273,15 t Целзиева температура, градус Целзий (oС) Т термодинамична температура, Келвин (K)
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Не във всички случаи, когато се изследва ново вещество, е необходимо да се използват вещества за сравнение. Преди всичко те трябва да служат за периодична проверка на действието на метода, а също и да позволяват да се прави сравнение с резултатите, получени по други методи. Някои калибровъчни вещества могат да бъдат намерени в методите, изброени в допълнението.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА Пет от методите за определяне на температурата на кипене (интервала на кипене) се основават на измерване на температурата на кипене, останалите два метода се основават на термичен анализ.
1.4.
1.4.1. Определяне с помощта на ебулиометър Поначало ебулиометрите са предназначени за определяне на молекулното тегло по нарастването на температурата на кипене, но те също са подходящи и за точни измервания на самата температура на кипене. Един съвсем просто устроен апарат е описан в ASTM D 1120-72 (вж. допълнението). В този апарат течността се нагрява в равновесни условия при атмосферно налягане, докато започне да кипи.
1.4.2. Динамичен метод Този метод включва измерване на температурата на повторна кондензация на парите с помощта на подходящ термометър в обратния хладник по време на кипенето. При този метод може да се изменя налягането.
1.4.3. Дестилационен метод за температура на кипене Този метод включва дестилация на течността, измерване на температурата на повторна кондензация на парите и определяне на количеството на дестилата.
1.4.4. Метод по Сиволобоф (Siwoloboff) Пробата се нагрява в епруветка, поставена в течността на нагревателна баня. В епруветката с пробата е потопена запоена капилярка, която съдържа въздушно мехурче в долната си част.
1.4.5. Отчитане с фотоклетка По принципа на Сиволобоф се провежда автоматично фотоелектрично измерване, като се използва увеличаващият се брой мехурчета.
1.4.6. Диференциален термичен анализ При тази техника се прави запис на разликата в температурите на веществото и на сравнителния материал като функция от температурата, докато веществото и сравнителният материал са подложени на една и съща контролирана температурна програма. Когато пробата претърпява преход, свързан с промяна на енталпията, тази промяна се отбелязва като ендотермично отклонение (кипене) от основната линия на записа на температурата.
1.4.7. Диференциална сканираща калориметрия При тази техника се прави запис на разликата в подадените енергии към веществото и към сравнителния материал като функция от температурата, докато веществото и сравнителният материал са подложени на една и съща контролирана температурна програма. Тази енергия представлява енергията, необходима да се установи нулева температурна разлика между изследваното вещество и сравнителния материал. Когато пробата претърпява преход, свързан с промяна на енталпията, тази промяна се отбелязва чрез ендотермично отклонение (кипене) от основната линия на записа на топлинния поток.
1.5. Таблица 1 Сравнение на методите
КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Приложимостта и точността на различните методи за определяне на температурата на кипене/интервала на кипене са дадени в таблица 1. Метод на изпитване Оценка на точността Съществуващ стандарт Ебулиометър ±1,4 K (до 373 K) ±2,5 K (до 600 K) ASTM D 1120-72 Динамичен метод ±0,5 K (до 600 K) Дестилационен процес (област на кипене) ±0,5 K (до 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 По Сиволобоф ± 2 K (до 600 K) Отчитане с фотоклетка ±0,3 K (при 373 K) Диференциална термична калориметрия ±0,5 K (до 600 K) ±2,0 K (до 1273 K) ASTM E 537-76 Диференциална сканираща калориметрия ±0,5 K (до 600 K) ±2,0 K (до 1273 K) ASTM Е 537-76
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДИТЕ Начините на работа при някои от методите са описани в международни и национални стандарти (вж. допълнението).
1.6.
1.6.1. Ебулиометър Вж. допълнението
1.6.2. Динамичен метод Вж. метод А.4 за определяне на парното налягане. Записва се температурата на кипене, която се наблюдава при приложено налягане от 101,325 kРа.
1.6.3. Дестилационен процес (интервал на кипене) Вж. допълнението
1.6.4. Метод по Сиволобоф Пробата се нагрява в апаратурата за определяне на температура на топене в епруветка с диаметър приблизително 5 mm (фигура 1). На фигура 1 е показан един тип стандартизиран апарат за температури на топене и кипене (JIS K 0064) (направен от стъкло; всички размери са в милиметри). В тръбата за пробата се поставя капилярка (кипяща капилярка), запоена на разстояние около 1 cm над долния край. Нивото, до което се запълва с изследваното вещество, е такова, че запоената част на капилярката да се намира под повърхността на течността. Тръбата с пробата, съдържаща кипящата капилярка, се закрепва или към термометъра с гумена лента, или се фиксира с подпора отстрани (вж. фигура 2). Фигура 2 Принцип по Сиволобоф Фигура 3 Модифициран принцип Течността за банята се избира според температурата на кипене. При температури до 573 K може да се използва силиконово масло. Течен парафин може да се използва само до 473 K. Отначало нагряването на течността в банята трябва да се нагласи така, че скоростта на повишаване на температурата да е 3 K/min. Течността на банята трябва да се разбърква. При около 10 K под очакваната температура на кипене нагряването се забавя, така че скоростта на повишаване на температурата да не надвишава 1 K/min. C приближаването до температурата на кипене от кипящата капилярка бързо започват да се появяват мехурчета. Температурата на кипене е тази температура, когато при моментно охлаждане веригата от мехурчета се прекъсва и течността в капилярката започва внезапно да се покачва. Показанието на термометъра в този момент представлява температурата на кипене на веществото. При модифицирания принцип (фигура 3) температурата на кипене се определя в капилярка за температура на топене. Капилярката се изтегля на дължина около 2 cm в единия край, така че да образува остър връх (а), и се засмуква малко количество от пробата. Отвореният край на изтънената капилярка се затваря чрез стопяване така, че в края да се разположи малко въздушно мехурче. При нагряването в апарата за температура на топене (b) въздушното мехурче се разширява. Температурата на кипене съответства на температурата, при която тапата, образувана от веществото над въздуха, достигне до нивото на течността на банята (с).
1.6.4.
Фигура 1 A: Измервателен съд B: Запушалка C: Вентилационна тръбичка D: Термометър E: Спомагателен термометър F: Течност на банята G: Епруветка за пробата, максимум 5 mm външен диаметър; съдържа капилярка с дължина приблизително 100 mm; приблизителен вътрешен диаметър 1 mm и приблизителна дебелина на стената от 0,2 до 0,3 mm H: Странична тръба
1.6.5. Отчитане с фотоклетка Пробата се нагрява в капилярка във вътрешността на нагрят метален блок. През подходящ отвор в блока се насочва светлинен лъч, който преминава през веществото и попада върху прецизно калибрирана фотоклетка. В процеса на повишаване на температурата на пробата от кипящата капилярка се появяват единични въздушни мехурчета. Когато се достигне температурата на кипене, броят на мехурчетата нараства много. Това води до промяна в интензитета на светлината, регистрирана от фотоклетката, и изпраща сигнал за застопоряване на показанието на индикатора, който отчита температурата на платинов съпротивителен термометър, разположен в блока. Този метод е особено подходящ, защото позволява измервания при температури под стайната до 253,15 K (- 20 oС), без да се налагат промени в апарата. Приборът просто трябва да се постави в охлаждаща баня.
1.6.6. Термичен анализ
1.6.6.
1.6.6.1. Диференциален термичен анализ Вж. допълнението.
1.6.6.2. Диференциална сканираща калориметрия Вж. допълнението.
2. Таблица 2 Коефициенти за температурна корекция fT
ДАННИ При малки отклонения от нормалното налягане (максимум ± 5 kРа), температурите на кипене се нормализират към Тn с числовото уравнение на Сидни Юнг: Tn = T + (fT × Δp) където: Δp (101,325 - p) [отбележи знака] р измереното налягане в kРа fT скоростта на промяна на температурата на кипене с налягането в K/kРа Т измерената температура на кипене в K Тn температурата на кипене, коригирана към нормално налягане в K Коефициентите на температурната корекция, fT и уравненията за тяхното приблизително определяне за много вещества са включени в споменатите по-горе международни и национални стандарти. Например методът в DIN 53171 дава следните груби корекции за разтворители, включени в бои: Температура Т (K) Корекционен коефициент fT (K/kРа) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ По възможност при отчитане на резултатите от изпитването трябва да се включи следната информация: Като температура на кипене се съобщава средноаритметичното от най-малко две измервания, които са в границите на оценката на точността (вж. таблица 1). Трябва да се укажат както измерените температури на кипене и тяхната средна стойност, така и налягането(ията) в kРа, при което(ито) са проведени измерванията. За предпочитане е наляганията да са близки до нормалното атмосферно налягане. Цялата информация и бележките относно интерпретацията на резултатите трябва да се докладват и особено онези, които са свързани с примесите и физичното състояние на веществото.
използван метод,
точна спецификация на веществото (вид и примеси) и предварителни етапи на пречистване, ако има такива,
оценка на точността.
4.(1)(2)(3) ПРЕПРАТКИ ОИСР, Paris, 1981, Test guideline 103, решение на Съвета C(81) 30 окончателен. IUPAC, B. Le Neidre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Burretworths, London, 1975, vol. II. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.
А.З.
ОТНОСИТЕЛНА ПЛЪТНОСТ
1. МЕТОД Описаните методи се основават на Ръководството за провеждане на изпитвания на ОИСР (1). Основните принципи са дадени в препратка (2).
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Описаните методи за определяне на относителната плътност са приложими за твърди и течни вещества без всякакво ограничение с оглед на тяхната степен на чистота. Различните методи, които могат да се използват, са дадени в таблица 1.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Относителната плътност D420 на твърди вещества и течности представлява съотношението между масата на даден обем от веществото, което ще се изследва, определена при 20 oС, и масата на същия обем вода, определена при 4 oС. Относителната плътност е безразмерна величина. Плътността на едно вещество р е частното на масата m и обема v. В системата SI плътността р се изразява в kg/m3.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ (1) (3) Не е необходимо да се използват вещества за сравнение във всички случаи, когато се изследва ново вещество. Преди всичко те трябва да служат за периодична проверка на действието на метода и да позволяват да се правят сравнения с резултатите, получени по други методи.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДИТЕ Използват се четири класа методи.
1.4.
1.4.1. Методи, основани на силата на изтласкване
1.4.1.
1.4.1.1. Ареометър (за течни вещества) Достатъчно точни и бързи измервания на плътността могат да се получат с плаващи ареометри, които позволяват плътността на дадена течност да се изчисли от дълбочината на потапяне по показанията на градуирана скала.
1.4.1.2. Хидростатична везна (за течни и твърди вещества) За определяне на плътността може да се използва разликата в теглата на изследваната проба, измерени във въздуха и в подходяща течност (например вода). За твърди вещества измерената плътност е представителна само за конкретната проба, с която е извършено измерването. За определяне на плътността на течности тяло с известен обем v се претегля отначало на въздуха и след това в течността.
1.4.1.3. Метод с потопено тяло (за течни вещества) (4) При този метод плътността на дадена течност се определя от разликата в резултатите, получени при претеглянето на течността преди и след потапянето на тяло с известен обем в нея.
1.4.2. Пикнометрични методи За твърди вещества или течности могат да се използват пикнометри с различни форми и с известни обеми. Плътността се изчислява от разликата в теглата на празния и пълния пикнометър и неговия известен обем.
1.4.3. Пикнометри с въздушно сравняване (за твърди вещества) Плътността на дадено твърдо вещество с произволна форма може да се измери при стайна температура с помощта на пикнометър с въздушно сравняване. Обемът на веществото се измерва на въздуха или в инертен газ в цилиндър с променлив калибриран обем. За да се изчисли плътността, след като приключи измерването на обема се прави едно измерване и на масата.
1.4.4. Осцилиращ денситометър (5) (6) (7) Плътността на дадена течност може да се измери с осцилиращ денситометър. Механичен осцилатор, конструиран под формата на U-образна тръба, се привежда в трептене при резонансната честота на осцилатора, която зависи от масата му. Въвеждането на проба променя резонансната честота на осцилатора. Апаратът трябва да се калибрира с помощта на две течности с известни плътности. Препоръчително е тези течни вещества да се подберат така, че плътностите им да покриват обхвата, в който ще се извършва измерването.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Приложимостта на различните методи, които се използват за определяне на относителната плътност, е показана в таблицата.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДИТЕ В допълнението са дадени като примери стандарти, в които може да се направи справка за допълнителни технически подробности. Изпитванията трябва да се извършват при 20 oС, като се правят поне по две измервания.
2. ДАННИ Вж. стандартите.
3. Таблица 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Приложимост на методите
ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ По възможност протоколът от изпитванията трябва да включва следната информация: Относителната плътност D204 трябва да се съобщава по начина, определен в 1.2, заедно с физичното състояние на измерваните вещества. Цялата информация и бележките относно интерпретацията на резултатите трябва да се включат в протокола, особено онези, които са свързани с примесите и физичното състояние на веществото. Метод на измерване Плътност Максимален възможен динамичен вискозитет Съществуващи стандарти твърди вещества течности Хидрометър да 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Хидростатична везна да ISO 1183 (A) да 5 Pa s ISO 901 и 758 Метод с потопено тяло да 20 Pa s DIN 53217 Пикнометър ISO 3507 да ISO 1183 (B) NF T 20-053 да 500 Ра s ISO 758 Пикнометър с въздушно сравняване да DIN 55990 Teil 3, DIN 53243 Осцилиращ денситометър да 5 Pa s
използван метод,
точна спецификация на веществото (вид и примеси) и предварителни етапи на пречистване, ако има такива.
3. Таблица 1.4.1.1.1.4.1.2. Приложимост на методите а)
твърди вещества
б)
течности
3. Таблица 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Приложимост на методите а)
твърди вещества
б)
течности
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
ПРЕПРАТКИ ОИСР, Paris, 1981, Test Guideline 103, решение на Съвета C(81) 30 окончателен. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ. New York, 1959, vol. I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and Applied Chemistry, 1976, vol. 48, 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Fluessigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 427—430. Leopold, H., Die digitale Messung von Fluessigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297—302. Baumgarten, D., Fullmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei fluessigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauerwissenschaft, 1976, vol. 9, 253—255.
А.4. ПАРНО НАЛЯГАНЕ
А.4.
1. МЕТОД Повечето от описаните методи се основават на Ръководството за провеждане на изпитвания на ОИСР (1). Основните принципи са дадени в препратки (2) и (3).
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ За провеждането на това изпитване е полезно да се знае предварителна информация върху структурата, температурата на топене и температурата на кипене на веществото. Не съществува единствена измервателна процедура, приложима за целия обхват от парни налягания. Затова се препоръчва да се използват няколко метода за измерване на парното налягане от < 10-4 до 105 Ра. Примесите обикновено влияят върху парното налягане до степен, която зависи значително от вида им. Когато в пробата има летливи примеси, които биха могли да повлияят на резултата, веществото може да се пречисти. Също така може да е подходящо да се укаже и парното налягане на материала с техническа степен на чистота. В някои от описаните тук методи се използват апарати с метални части; това трябва да се има предвид, когато се изследват вещества с корозивно действие.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Парното налягане на едно вещество е налягането на наситените пари над твърдото или течното вещество. В условията на термодинамично равновесие парното налягане на чистото вещество зависи само от температурата. Трябва да се използва SI-единицата за налягане, която е Паскал (Ра). Мерните единици, употребявани в миналото, и техните коефициенти на превръщане са следните: 1 Torr (≡ 1 mm Hg) = 1,333 × 102 Ра 1 атмосфера = 1,013 × 105 Ра 1 bаr = 105 Ра SI-единицата за температура е Келвин (K). Универсалната моларна газова константа R е 8,314 J mol-1 K-1. Зависимостта на парното налягане от температурата се описва с уравнението на Клаузиус-Клапейрон: log p = Δ Hv2,3 RT+const. където: р парното налягане на веществото в паскали ΔHV неговата топлина на изпарение в J mol-1 R универсалната моларна газова константа в J mol-1 K-1 Т термодинамичната температура в K
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Не е необходимо да се използват вещества за сравнение във всички случаи, когато се изследва ново вещество. Преди всичко те трябва да служат за периодична проверка на действието на метода, както и да позволяват сравнение с резултатите, получени по други методи.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДИТЕ Предложени са седем метода за определяне на парното налягане, които могат да се прилагат в различни обхвати от парни налягания. Във всеки метод парното налягане се определя при няколко температури. В ограничен температурен интервал логаритъмът от парното налягане на едно чисто вещество е линейна функция на обратната стойност на температурата.
1.4.
1.4.1. Динамичен метод При динамичния метод се измерва температурата на кипене, която се отнася за дадено налягане. Препоръчителен обхват: от 103 до 105 Ра. Този метод се препоръчва също и за определяне на нормалната температура на кипене и е приложим за тази цел до 600 K.
1.4.2. Статичен метод При статичния метод се определя парното налягане, което се установява в една затворена система при дадена температура в условията на термодинамично равновесие. Този метод е подходящ за еднокомпонентни и многокомпонентни твърди и течни вещества. Препоръчителен обхват: от 10 до 105 Ра. Ако се вземат предпазни мерки, горепосоченият метод може да се използва и в областта от 1 до 10 Ра.
1.4.3. Изотенископ Този стандартизиран метод също е статичен, но обикновено не е подходящ за многокомпонентни системи. Допълнителна информация можете да намерите в ASTM метод D-2879-86. Препоръчителен обхват: от 100 до 105 Ра.
1.4.4. Ефузионен метод: везна за парно налягане Определя се количеството вещество, което напуска една клетка за единица време през отвор с известен размер в условията на вакуум, така че връщането на веществото в клетката да е пренебрежимо малко (например чрез измерване на импулса, който парната струя генерира върху чувствителна везна, или чрез измерване на загубата на тегло). Препоръчителен обхват: от 10-3 до 1 Ра.
1.4.5. Ефузионен метод: по загубата на тегло или чрез улавяне на изпареното вещество Методът се основава на измерване на масата от изпитваното вещество, която изтича под формата на пари за единица време от Кнудсенова клетка (4) през микроотверстие в условията на свръхвакуум. Масата на изтеклите пари може да се получи или като се определи загубата на маса от клетката, или чрез кондензация на парите при ниска температура и определяне на количеството на изпареното вещество, като се използва хроматографски анализ. Парното налягане се из0числява чрез прилагане на зависимостта на Херц-Кнудсен. Препоръчителен обхват: от 10-3 до 1 Ра.
1.4.6. Метод с насищане на газ Поток от инертен газ носител се пропуска над веществото по такъв начин, че да се насити с неговите пари. Количеството на пренесения материал от известно количество газ носител може да се измери или като се събере в подходящ уловител, или с помощта на присъединена последователно аналитична техника. След това, това количество се използва, за да се изчисли парното налягане при дадена температура. Препоръчителен обхват: от 10-4 до 1 Ра. Ако се вземат предпазни мерки, този метод може да се прилага също и в областта от 1 до 10 Ра.
1.4.7. Въртящ се ротор В измерителния уред с въртящ се ротор същинският измервателен елемент е малко стоманено топче, което е окачено в магнитно поле и се върти с висока скорост. Налягането на газа се изчислява от забавянето на стоманеното топче, което зависи от натиска върху него. Препоръчителен обхват: от 10-4 до 0,5 Ра.
1.5.1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7.
КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Различните методи за определяне на парното налягане са сравнени по тяхната приложимост, повторяемост, възпроизводимост, обхват на измерване и съществуващ стандарт. Това е направено в следната таблица. Метод на измерване Вещества Оценка на повторяемостта Оценка на възпроизводимостта Препоръчителен обхват Съществуващ стандарт Твърди вещества Течности Динамичен метод Нискотопими да до 25 % до 25 % от 103 Ра до 2 × 103 Ра — от 1 до 5 % от 1 до 5 % от 2 х 103 Ра до 105 Ра — Статичен метод да да от 5 до 10 % от 5 до 10 % от 10 Ра до 105 Ра NFT 20-048 (5) ASTM-D 2879-86 Изотенископ да да от 5 до 10 % от 5 до 10 % от 102 Ра до 105 Ра — Ефузионен метод: везна за парно налягане да да от 5 до 20 % до 50 % от 10-3 до 1 Ра NFT 20-047 (6) Ефузионен метод: загуба на тегло да да от 10 до 30 % — от 10-3 до 1 Ра — Метод с насищане на газ да да от 10 до 30 % до 50 % от 10-4 до 1 Ра — Метод с въртящ се ротор да да от 10 до 20 % — от 10-4 до 0,5 Ра —
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДИТЕ
1.6.
1.6.1. Динамично измерване
1.6.1.
1.6.1.1. Апаратура Измервателната апаратура по принцип се състои от съд за кипене с присъединен към него стъклен или метален хладник (фигура 1), устройство за измерване на температурата и устройство за регулиране и измерване на налягането. Един типичен измервателен апарат, показан на схемата, е направен от термоустойчиво стъкло и е съставен от пет части: Голямата, отчасти двойностенна тръба, се състои нагреваема връзка на шлиф с кожух, хладник, охладителен съд и входен отвор. Стъкленият цилиндър с помпа на Котрел е монтиран в зоната за кипене на тръбата и има груба повърхност от грапаво стъкло, за да се избегнат тласъците при кипенето. Температурата се измерва с подходящ термочувствителен елемент (например съпротивителен термометър, изолирана термодвойка), вкаран в апарата до точката на измерването (№ 5, фигура 1) през подходящ вход (например връзка с мъжки шлиф). Направени са необходимите връзки към устройствата за регулиране и измерване на налягането. Разширение, което действа като буферен обем, е свързано към измервателния апарат с помощта на капилярна тръба. Съдът, в който става кипенето, се загрява с нагревателен елемент (например патронен нагревател), въведен в стъкления апарат от долната му страна. Необходимият за нагряването ток се настройва и регулира с термодвойка. Нужният вакуум в диапазона от 102 Ра до около 105 Ра се създава с вакуумпомпа. Използва се подходящ клапан за дозиране на въздуха или азота, чрез които се регулира налягането (измервателен обхват приблизително 102 до 105 Ра) и за вентилация. Налягането се измерва с манометър.
1.6.1.2. Процедура на измерване Парното налягане се измерва, като се определя температурата на кипене на пробата при няколко определени налягания между грубо 103 и 105 Ра. Ако при постоянно налягане температурата също не се променя, това показва, че е достигната температурата на кипене. С този метод не могат да се измерват вещества, които образуват пяна. Веществото се поставя в чистия сух съд за пробата. Проблеми могат да възникнат с веществата, които не са в прахообразно състояние, но в някои случаи те могат да се решат, като се нагрее охладителният кожух. След напълване на съда апаратът се затваря плътно при фланеца и веществото се дегазира. След това се наглася на най-ниското желано налягане и се включва нагряването. В същото време температурният сензор се свързва със записващо устройство. Равновесието е достигнато, когато при постоянно налягане се отчита една и съща температура на кипене. Особено много трябва да се внимава кипенето да не става на тласъци. Освен това в охладителя трябва да се извършва пълна кондензация на парите. Когато се определя парното налягане на нискотопими твърди вещества, трябва да се вземат мерки да не се блокира кондензаторът. След като се регистрира тази равновесна точка, уредът се наглася на по-високо налягане. Процесът продължава по този начин, докато се достигне налягане от 105 Ра (общо приблизително от 5 до 10 измервателни точки). За проверка равновесните точки трябва да се повторят и при намаляване на налягането.
1.6.2. Статично измерване
1.6.2.
1.6.2.1. Апаратура Апаратът се състои от контейнер за пробата, нагревателна и охладителна система за регулиране на температурата на пробата и за измерване на температурата. Апаратът също включва и прибори за регулиране и измерване на налягането. Фигури 2а и 2б илюстрират основните използвани принципи. Камерата за пробата (фигура 2а) е ограничена от едната страна от подходящ високовакуумен клапан. Към другата му страна е прикрепена U-образна тръба, която съдържа подходяща манометрична течност. Единият край на U-образната тръба се разклонява към вакуумпомпата, цилиндъра с азот или вентилационния клапан и към манометъра. Вместо U-образна тръба може да се използва манометър с индикатор за налягане (фигура 2б). За да се регулира температурата на пробата, съдът с пробата заедно с клапана и U-образната тръба (или манометъра) се поставят в баня, в която температурата се поддържа постоянна с точност ±0,2 K. Измерванията на температурата стават върху външната стена на съда, съдържащ пробата, или вътре в самия съд. За обезвъздушаване на апаратурата се използва вакуумпомпа с охлаждащ уловител за парите преди нея. При метод 2а парното налягане на веществото се измерва индиректно, като се използва нулев индикатор. При това се отчита фактът, че плътността на течността в U-образна тръба се променя, ако температурата се измени значително. В зависимост от обхвата на налягането и химичните отнасяния на веществото, като нулеви индикатори в U-образната тръба могат да се използват следните течности: силиконови течности, фталати. Изпитваното вещество не бива да се разтваря забележимо или да реагира с течността в U-образната тръба. В областта от нормалното въздушно налягане до 102 Ра в манометъра може да се използва живак, докато силиконовите течности и фталатите са подходящи за използване под 102 Ра до 10 Ра. Нагреваемите мембранни капацитивни манометри могат да се прилагат дори под 10-1 Ра. Съществуват и други типове манометри, които могат да се ползват под 102 Ра.
1.6.2.2. Процедура на измерване Преди измерването всички компоненти на апаратурата, показана на фигура 2, трябва основно да се почистят и подсушат. При метод 2а U-образната тръба се напълва с избраната течност, която трябва да се дегазира при повишена температура преди да започне отчитането. Изпитваното вещество се поставя в апарата, който се затваря и температурата се намалява достатъчно, за да може да се дегазира. Температурата трябва да е достатъчно ниска, за да осигурява пълно изпомпване на въздуха, но в случай на многокомпонентна система тя не бива да променя състава на материала. Ако е необходимо, равновесието може да се установи по-бързо чрез разбъркване. Пробата може да се преохлади с помощта например на течен азот (като се внимава да се избегне кондензацията на въздуха или на помпената течност) или със смес от етанол и сух лед. За нискотемпературни измервания се използва баня с регулируема температура, свързана с хладилен ултратермостат. Клапанът над съда с пробата се отваря и в продължение на няколко минути се засмуква, за да се отстрани въздухът. След това клапанът се затваря и температурата на пробата се понижава до най-ниското желано ниво. Ако е необходимо, операцията по дегазирането трябва да се повтори няколко пъти. Когато пробата се нагрява, налягането на парите се увеличава. Това променя равновесието на течността в U-образната тръба. За да се компенсира тази промяна, в апарата през клапан се въвежда азот или въздух, докато течността в индикатора на налягането отново достигне нулата. Необходимото за това налягане може да се отчете с прецизен манометър при стайна температура. Това налягане съответства на парното налягане на веществото при дадената температура на измерване. Метод 2б е подобен, но парното налягане се отчита директно. Температурната зависимост на парното налягане се определя на подходящи малки интервали (приблизително от 5 до 10 измервателни пункта общо), докато се достигне желаният максимум. За проверка отчитането при ниски температури трябва да се повтори. Ако стойностите, измерени при това повторно отчитане, не съвпадат с кривата, получена при повишаване на температурата, това може да се дължи на една от следните причини:
1.6.2.2.
1. Пробата все още съдържа въздух (например високовискозните материали) или нискокипящи вещества, които се отделят при нагряването и могат да се отстранят чрез засмукване след допълнително преохлаждане.
2. Температурата на охлаждане не е достатъчно ниска. В този случай като охлаждащ агент трябва да се използва течен азот. Ако причината е 1 или 2, измерванията трябва да се повторят.
3. Веществото претърпява химична реакция в изследвания температурен интервал (например разграждане, полимеризация).
1.6.3. Изотенископ Пълно описание на този метод може да се намери в препратка (7). Принципът на измервателното устройство е показан на фигура 3. Подобно на статичния метод, описан в 1.6.2, изотенископът е подходящ за изследване на твърди вещества и на течности. Когато се изпитват течности, самото вещество служи за флуид в спомагателния манометър. В изотенископа се поставя количество от течността, достатъчно да запълни резервоара и късото коляно на манометъра. Изотенископът се присъединява към система за вакуум и се обезвъздушава, след което се запълва с азот. Евакуацията и прочистването на системата се повтарят два пъти, за да се отстрани остатъчният кислород. Напълненият изотенископ се поставя в хоризонтално положение, така че пробата да се разстеле на тънък пласт в резервоара за пробата и в зоната на манометъра (U-образна част). Налягането на системата се намалява до 133 Ра и пробата внимателно се нагрява до малко преди да закипи (отстраняване на разтворените фиксирани газове). След това изотенископът се поставя в такова положение, че пробата да се върне в резервоара и в късото коляно на манометъра, докато и двете се запълнят изцяло с течност. Налягането се поддържа, както за дегазиране; изтегленият край на резервоара за пробата се нагрява с малък пламък, докато отделената пара се разшири достатъчно, за да измести част от пробата от горната част на резервоара и рамото на манометъра към манометричната зона на изотенископа, като по този начин се създава изпълнено с пари и свободно от азот пространство. След това изотенископът се поставя в баня с постоянна температура и налягането на азота се регулира, докато се изравни с това на пробата. Равновесното налягане се отчита в манометричната зона на изотенископа. При равновесие парното налягане на азота е равно на парното налягане на веществото. При твърди вещества в зависимост от обхвата от налягания и температури се използват манометричните течности, посочени в 1.6.2.1. С дегазираната течност на манометъра се запълва едно разширение върху дългото рамо на изотенископа. След това твърдото вещество, което ще бъде изпитвано, се поставя в резервоара и се дегазира при повишаване на температурата. После изотенископът се накланя така, че течността в манометъра да навлезе в U-образната тръба. Измерването на парното налягане като функция от температурата се прави, както е описано в 1.6.2.
1.6.4. Ефузионен метод: везна за измерване на парно налягане
1.6.4.
1.6.4.1. Апаратура В препратка (1) са описани няколко варианти на апаратурата. Описаната тук апаратура илюстрира основния принцип (фигура 4). На фигура 4 са показани главните компоненти на апаратурата, която включва: високовакуумен контейнер от неръждаема стомана или стъкло, устройства за създаване и измерване на вакуума и вградени приспособления за измерване на парното налягане с везна. В апаратурата са включени следните вградени приспособления:
изпарителна пещ с фланец и въртящ се вход. Изпарителната пещ представлява цилиндричен съд, направен например от мед или от химически устойчива сплав с добра топлопроводимост. Също така може да се използва и стъклен съд с медна стена. Пещта има диаметър приблизително от 3 до 5 cm и е висока от 2 до 5 cm. За преминаването на потока от парите са направени от един до три отвора с различни размери. Пещта се нагрява или с нагревателна плоча отдолу, или с нагревателна спирала по външната стена. За да се избегне разсейването на топлината към основната плоча, нагревателят се прикрепя към нея с помощта на метал, който има ниска топлопроводимост (никелово-сребърна или хромово-никелова стомана), например никелово-сребърна тръба, прикрепена към въртящия се вход, ако се използва пещ с няколко отвора. Този начин на свързване има това предимство, че позволява да се използва медна пръчка. Медната пръчка дава възможност охлаждането да става с охлаждаща баня от външната страна,
ако капакът на медната пещ има три отвора с различни размери, разположени на 90o един спрямо друг, могат да се покрият няколко области от парни налягания в целия обхват на измерване (отворите са приблизително от 0,30 до 4,50 mm в диаметър). Големите отвори се използват за ниски парни налягания и обратно. Като се върти пещта, може да се нагласи желаният отвор или междинното положение на парния поток (отвор на пещта-преграда-блюдо на везната) и така потокът от молекули се насочва или отклонява през отвора на пещта към блюдото на везната. За измерване на температурата на веществото в подходяща точка се поставя термодвойка или съпротивителен термометър,
над преградата се намира блюдото, което е част от високочувствителна микровезна (вж. по-долу). Блюдото на везната е приблизително 30 mm в диаметър. Подходящ материал за направата му е алуминий със златно покритие,
блюдото на везната е заобиколено от цилиндрична охладителна кутия, направена от бронз или мед. В зависимост от типа на везната охладителната кутия има отвори за рамото на везната и един преграден отвор за потока от молекули. Тя трябва да гарантира пълна кондензация на парите върху блюдото. Разсейването на топлината към външната среда се осигурява например от медна пръчка, свързана с охладителната кутия. Пръчката е насочена към основната плоча и е термично изолирана от нея, например с тръба от хромово-никелова стомана. Пръчката е потопена в Дюаров съд, съдържащ течен азот под основната плоча, или течният азот циркулира през пръчката. По този начин охладителната кутия се поддържа при температура приблизително – 120 oС. Блюдото на везната се охлажда изключително чрез излъчване и е достатъчно надеждно за изследваната област от налягания (охлаждането става приблизително 1 час преди началото на измерването),
везната е разположена над охладителната кутия. Подходящи везни са например високочувствителната двураменна електронна микровезна (8) или високочувствителният прибор с подвижна намотка (виж ОИСР Ръководство за изпитване 104, издание от 12.5.1981 г.),
основната плоча също включва електрически връзки за термодвойки (или съпротивителни термометри) и нагревателни реотани,
вакуумът в съда се създава от парциална вакуумпомпа или от високовакуумна помпа (необходимият вакуум от приблизително 1 до 2 x 10-3 Ра се получава след 2 часа изпомпване). Налягането се регулира с подходящ йонизационен манометър.
1.6.4.2. Процедура на измерване Съдът се напълва с изследваното вещество и капакът се затваря. Преградата и охлаждащата кутия се плъзгат напряко на пещта. Апаратът се затваря и вакуумпомпите се включват. Крайното налягане преди да започнат измерванията трябва да е приблизително 10-4 Ра. Охлаждането на охладителната кутия започва при 10-2 Ра. След като се достигне нужният вакуум, започва калибровъчната серия при най-ниската желателна температура. Нагласява се съответният отвор на капака; потокът на парите преминава през преградата направо над отвора и удря охладеното блюдо на везната. Блюдото трябва да е достатъчно голямо, за да може целият поток, насочен през преградата, да попадне върху него. Моментът на потока на парите действа като сила на натиск върху блюдото на везната и молекулите кондензират по охладената повърхност. Моментът и едновременната кондензация произвеждат сигнал върху записващото устройство. Оценката на сигналите осигурява два вида информация: p = G 2 π RT×103M където: G скоростта на изпарение (kg s-1 m-2) M моларната маса (g mol-1) T температурата (K) R универсалната моларна газова константа (J mol-1 K-1) р парното налягане (Ра) След като се достигне нужният вакуум, серията от измервания започва при най-ниската измервателна температура. При следващите измервания, температурата се увеличава на малки интервали, докато се достигне максималната ѝ желана стойност. След това пробата се охлажда отново, при което може да се отчете втора крива на парното налягане. Ако втората крива не потвърждава резултатите от първата, е възможно веществото да се разлага в температурния обхват на измерването.
1.6.4.2.
1. В описания тук апарат парното налягане се определя направо от момента върху блюдото на везната (за това не е необходимо да се знае молекулното тегло (2). Когато се оценяват показанията на записващото устройство, трябва да се вземат предвид и геометричните фактори, като отвора на пещта и ъгъла на молекулния поток.
2. Едновременно може да се измери и масата на кондензата и от нея може да се изчисли скоростта на изпарение. Парното налягане може също да се изчисли от скоростта на изпарение и молекулното тегло, като се използва уравнението на Херц (2):
1.6.5. Ефузионен метод — чрез загуба на тегло
1.6.5.
1.6.5.1. Апаратура Ефузионният апарат се състои от следните основни части: На фигура 5 е показан като пример алуминиев вакуумен резервоар с електрическо нагряване, с 4 ефузионни клетки от неръждаема стомана. Тънък лист от неръждаема стомана с дебелина около 0,3 mm, на който има ефузионно отверстие с диаметър от 0,2 до 1,0 mm, е прикрепен към ефузионната клетка посредством решетъчен капак.
резервоар, който може да се термостатира и обезвъздушава и в който са разположени ефузионните клетки,
високовакуумна помпа (например дифузионна или турбомолекулярна помпа) с вакуумметър,
уловител на парите, за който се използва течен азот или сух лед.
1.6.5.2. Процедура на измерване Сравнителното и изпитваното вещество се поставят в отделни ефузионни клетки, металната диафрагма с отверстието се осигурява с помощта на решетъчния капак и всяка от клетките се претегля с точност до 0,1 mg. Клетката се поставя в термостатирания апарат, който се вакуумира, докато налягането достигне стойност, по-малка от една десета от очакваното налягане. На определени интервали от време – между 5 и 30 часа, в апарата се пропуска въздух и чрез повторно претегляне се определя масата, която е загубила клетката. За да е сигурно, че резултатите не са повлияни от летливи примеси, клетката се претегля на точно определени интервали от време. Така се проверява дали ефузионната скорост е постоянна през най-малко два такива интервала. Парното налягане р в ефузионната клетка се дава със следното уравнение: p = mKAt2 π R TM където: р парното налягане (Ра) m масата на веществото, напускащо клетката за време t (kg) t времето (s) A площта на отвора (m2 К корекционния коефициент R универсалната газова константа (J mol-1 K-1) Т температурата (K) M молекулната маса (kg mol-1) Корекционният коефициент К зависи от съотношението между дължината и радиуса на цилиндричното отверстие: Съотношение 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 К 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Горното уравнение може да се запише така: p = E m(r)tTM(r) където E = 1KA2πR и представлява ефузионната константа на клетката. Тази ефузионна константа на клетката Е може да се определи със сравнително вещество (2,9), като се използва следното уравнение: E = p(r)tmM(r)T където: р(r) парното налягане на сравнителното вещество (Ра) М(r) молекулната маса на сравнителното вещество (kg х mol-1)
1.6.6. Метод с насищане на газ
1.6.6.
1.6.6.1. Апаратура Типичната апаратура, която се използва за провеждането на това изпитване, обхваща голям брой компоненти. Тези компоненти са дадени на фигура 6а и са описани по-долу (1).
1.6.6.1. Инертен газ:
Газът носител не бива да реагира химически с изпитваното вещество. Обикновено азотът е подходящ за тази цел, но в някои случаи може да е необходимо да се използват други газове (10). Използваният газ трябва да е сух (виж фигура 6а, ключ 4: сензор за относителна влажност).
Регулиране на потока:
Необходима е подходяща система за регулиране на газа, която да осигури постоянен предварително подбран поток през колоната за насищане.
Уловители на парите:
Те зависят от характеристиките на конкретната проба и от избрания метод за анализ. Парите трябва да се задържат количествено под форма, която позволява последващо анализиране. За някои изследвани вещества са подходящи уловители с течности като хексан или етилен гликол. За други може да са приложими твърди адсорбенти. Алтернатива на улавянето на парите и следващият им анализ са директните аналитични техники (като хроматографията), които се включват веднага след апаратурата. Те могат да се използват за определяне количеството на материала, пренесен от известно количество газ носител. Освен това може да се измерва и загубата на маса от пробата.
Топлообменник:
За измервания при различни температури може да се наложи в апаратурата да се включи и топлообменник.
Колона за насищане:
Изпитваното вещество се отлага из разтвор върху подходящ инертен носител. Покритият носител се насипва в колоната за насищане, чиито размери и дебит трябва да са такива, че да осигуряват пълното насищане на газа носител. Колоната за насищане трябва да е термостатирана. При измервания над стайната температура областта между насищащата колона и уловителя трябва да се нагрява, за да се избегне кондензацията на изпитваното вещество. За да се намали масовият транспорт вследствие на дифузията, след насищащата колона може да се постави капилярка (фигура 6б).
1.6.6.2. Процедура на измерване
1.6.6.2. Приготвяне на колоната за насищане:
Разтвор на изпитваното вещество в леснолетлив разтворител се прибавя към достатъчно количество носител. Трябва да се добави достатъчно количество от изпитваното вещество, за да се поддържа насищането през цялото време на измервателната процедура. Разтворителят се изпарява напълно на въздух или в ротационен изпарител и добре смесеният материал се насипва в колоната за насищане. След термостатиране на пробата през апарата се пропуска сух азот.
Измерване:
Уловителите или включеният в линията детектор се свързват към изходящата линия от колоната и започва да се отчита времето. Дебитът на потока се проверява в началото и на равни интервали от време, докато трае измерването. За целта се използва филм-дебитомер (със сапунена ципа) или се правят непрекъснати измервания с мас-дебитомер. Трябва да се измерва налягането на изхода от колоната. Това може да се направи по следните начини: Времето, необходимо да се събере достатъчно количество от изпитваното вещество за различните аналитични методи, се определя с предварителни опити или чрез изчисления. Като алтернатива на събирането на вещество за последващо анализиране може да се използва последователно свързана към апаратурата количествена аналитична техника (например хроматография). Преди да се изчисли парното налягане при дадена температура, трябва да се направят предварителни изпитвания, за да се определи максималният дебит на потока, при който газът носител изцяло ще се насити с парите на веществото. Това става със сигурност, ако газът носител преминава през колоната достатъчно бавно, така че по-малкият дебит на потока да не дава по-големи стойности на парното налягане при изчисленията. Специфичният аналитичен метод се определя в зависимост от природата на изпитваното вещество (например газова хроматография или гравиметрия). Определя се количеството вещество, пренесено от известно количество газ носител.
а)
като се включи манометър между колоната за насищане и уловителите (това може да не даде добри резултати, защото така се увеличават мъртвият обем и повърхността на адсорбция); или
б)
като се определя падът на налягането през дадената улавяща система като функция от дебита на потока за всеки отделен опит (това може да не дава задоволителни резултати при уловителите с течност).
1.6.6.3. Изчисляване на парното налягане Парното налягане се изчислява от плътността на парите W/V по уравнението: p = WV × RTM където: р парното налягане (Ра) W масата на изпареното вещество (g) V обема на наситения газ (m3) R универсалната моларна газова константа (J mol-1 K1-) Т температурата (K) M моларната маса на изпитваното вещество (g mol-1) Измерените обеми трябва да се коригират за разликите в температурата и налягането между дебитомера и термостатираната колона. Ако дебитомерът е разположен успоредно на пароуловителя, е необходимо да се изчислят корекциите за всеки изпарен компонент в уловителя (1).
1.6.7. Въртящ се ротор (8, 11, 13)
1.6.7.
1.6.7.1. Апаратура Техниката с въртящ се ротор може да се провежда с вискозиметър с въртящ се ротор, както е показано на фигура 8. Схематичен чертеж на експерименталната установка е показан на фигура 7. Измервателната апаратура обикновено се състои от измервателна глава с въртящ ротор, разположена в термостатиран съд (температурата се регулира в рамките на 0,1oС). Контейнерът с пробата се поставя в термостатиран съд (регулиране на температурата до 0,01oС); всички останали части на установката се държат при по-висока температура, за да се избегне кондензацията. Приспособление с високовакуумна помпа е свързано към системата чрез високовакуумни клапани. Измервателната глава с въртящ се ротор се състои от стоманено топче (от 4 до 5 mm в диаметър), поставено в тръба. Топчето е окачено и стабилизирано в магнитно поле, за което обикновено се използва комбинация от постоянни магнити и регулиращи бобини. Топчето се привежда във въртеливо движение от въртящите се полета, създадени от намотките. Измервателни намотки, които отчитат винаги наличната слаба несиметрична намагнитеност на топчето, позволяват да се измери неговата скорост на въртене.
1.6.7.2. Процедура на измерване Когато топчето достигне дадена скорост на въртене v(o) (обикновено около 400 оборота в секунда), задвижването му се прекратява и скоростта му започва да намалява поради триенето с газовете. Падането на скоростта на въртене се измерва като функция от времето. Понеже триенето, дължащо се на магнитното окачване, е незначително в сравнение с триенето на газа, налягането на газа р се дава с уравнението: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) където: c— средна скорост на газовите молекули r радиус на топчето ρ масова плътност на топчето σ коефициент на тангенциалния импулсен пренос (с = 1 за идеално сферична повърхност на топчето) t време v(t) скорост на въртене след време t v(0) начална скорост на въртене. Уравнението може да се запише и така: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 където tn, tn–1 са времената, необходими за даден брой n завъртания. Тези интервали от време са последователни и tn > tn–1. Средната скорост на газовата молекула c— се дава с: c— = 8 RTπ M12 където: T температурата R универсалната моларна газова константа M моларната маса.
2. ДАННИ Парното налягане при всеки от описаните методи трябва да се определи поне при две температури. За да се провери дали кривата на парното налягане е линейна, за предпочитане е да се направят три или повече измервания в областта от 0 до 50 oС.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Докладването на резултатите от измерването трябва, ако е възможно, да включва следната информация: Ако се наблюдава преход (промяна в състоянието, разграждане), трябва да се отбележи следната информация: Цялата информация и бележките, свързани с интерпретацията на резултатите, трябва да се включат в протокола, особено когато става дума за онечиствания или за физичното състояние на веществото.
използван метод,
точна спецификация на веществото (вид и примеси) и предварителни етапи на пречистване, ако има такива,
най-малко две стойности на парното налягане и температурата, за предпочитане в областта от 0 до 50 oС,
всички необработени данни,
кривата на зависимостта на log p от 1/Т,
изчисление на парното налягане при 20 или 25 oС.
естество на промяната,
температура, при която се извършва промяната при атмосферното налягане,
парно налягане при 10 и 20 oС под температурата на прехода и 10 и 20 oС над тази температура (освен ако преходът е от твърдо към газообразно състояние).
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
ПРЕПРАТКИ ОИСР, Paris, 1981, Test Guideline 104, решение на Съвета C(81) 30 окончателен. Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II. R.Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593. NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa — Static method. NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa — Vapor pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standart test method for vapour pressure — tempetature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Roehl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol. (A), 1987, vol. 5 (4), 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I. J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics, 1975, vol. 7, 1173. B. F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435. G. Gomsa, J. K. Fremerey and B. Lindenau, J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), 642. G. Reich, J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148. J. K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol. (A), 1985, vol. 3 (3), 1715.
А.5. ПОВЪРХНОСТНО НАПРЕЖЕНИЕ
А.5.
1. МЕТОД Описаните методи се основават на Ръководството на ОИСР за провеждане на изпитвания (1). Основните принципи са дадени в препратка (2).
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Описаните методи се прилагат за изпитване на повърхностното напрежение на водни разтвори. Преди да се извършат тези изпитвания, е полезно да има предварителна информация за разтворимостта във вода, структурата, хидролизните свойства и критичната концентрация на мицелообразуване на веществото. Описаните по-долу методи са приложими за повечето химични съединения без каквито и да било ограничения, свързани с тяхната степен на чистота. Измерването на повърхностното напрежение с тензиометър с пръстен е ограничено до водни разтвори с динамичен вискозитет по-нисък от 200 mPa s.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Енталпията на единица площ от свободната повърхност се нарича повърхностно напрежение. Повърхностното напрежение се измерва в: N/m (SI-единица) или mN/m (SI-подединица) 1 N/m = 103 DYN/cm 1 mN/m = 1 DYN/cm в излязлата от употреба система CGS.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Не е необходимо да се използват вещества за сравнение във всички случаи, при които се изпитва ново вещество. Те трябва преди всичко да служат за периодична проверка на действието на метода, както и да позволяват сравнение с резултатите, получени по други методи. В препратки (1) и (3) са дадени сравнителни вещества, които покриват широк обхват от повърхностни напрежения.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДИТЕ Методите се основават на измерването на максималната сила, която трябва да се приложи вертикално върху скоба или пръстен, намиращи се в контакт с повърхността на изпитваната течност, поставена в измервателен съд, за да се отделят от повърхността ѝ, или върху пластинка, единият край на която се допира до повърхността, за да се прекъсне образуваният филм. Веществата, които се разтварят във вода до концентрация най-малко 1 mg/l, ce изпитват във воден разтвор само при една концентрация.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Методите могат да осигурят по-висока точност от тази, която вероятно се изисква при полеви измервания.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДИТЕ Приготвя се разтвор на веществото в дестилирана вода. Концентрацията на този разтвор трябва да бъде 90 % от концентрацията на наситения разтвор на веществото във вода; когато разтворимостта на веществото надвишава 1 g/l, при изпитванията се използва разтвор с концентрация 1 g/l. Не е необходимо да се извършват изпитвания върху вещества, чиято разтворимост във вода е по-ниска от 1 mg/l.
1.6.
1.6.1. Метод с използване на пластинка Виж ISO 304 и NF T 73-060 (Повърхностноактивни вещества — определяне на повърхностното напрежение чрез изтегляне на течни филми).
1.6.2. Метод с използване на скоба Виж ISO 304 и NF T 73-060 (Повърхностноактивни вещества — определяне на повърхностното напрежение чрез изтегляне на течни филми).
1.6.3. Метод с използване на пръстен Виж ISO 304 и NF T 73-060 (Повърхностноактивни вещества — определяне на повърхностното напрежение чрез изтегляне на течни филми).
1.6.4. Метод на ОИСР с хармонизиран пръстен
1.6.4.
1.6.4.1. Апаратура За това изпитване могат да се използват тензиометри. Те се състоят от следните елементи:
подвижна масичка за пробата,
система за измерване на силата,
измервателно тяло (пръстен),
измервателен съд.
1.6.4.1.
1.6.4.1.1. Подвижна масичка за пробата Подвижната масичка е предназначена да поддържа измервателния съд с контролируема температура, в който е поставена течността за изпитване. Тя е монтирана на стенд заедно със системата за измерване на силата.
1.6.4.1.2. Система за измерване на силата Системата за измерване на силата (виж фигурата) е разположена над масичката за пробата. Грешката при измерването на силата не бива да надвишава ± 10-6 N, което съответства на грешка в границите на ±0,1 mg при измерване на масата. В повечето случаи измервателната скала на разпространените в търговската мрежа тензиометри е калибрирана в mN/m, така че повърхностното напрежение може да се отчита направо в mN/m с точност 0,1 mN/m.
1.6.4.1.3. Измервателно тяло (пръстен) Пръстенът обикновено се прави от платиново-иридиева жица с дебелина около 0,4 mm и обиколка 60 mm. Пръстенът се провесва в хоризонтално положение от метална ос и монтираща скоба, направена от жица, така че да се осигури връзката с измервателната система (вж. фигурата).
1.6.4.1.3. Фигура Измервателно тяло
(всички размери са дадени в милиметри) Oc Скоба за монтиране Пръстен
1.6.4.1.4. Измервателен съд Измервателният съд, съдържащ разтвора за изпитване, е стъклен съд, чиято температура може да се контролира. Той трябва да е проектиран така, че по време на измерването температурата на изпитвания разтвор и на газовата фаза над него да остава постоянна, а пробата да не може да се изпарява. Допуска се използването на цилиндрични стъклени съдове с вътрешен диаметър не по-малък от 45 mm.
1.6.4.2. Подготовка на апаратурата
1.6.4.2.
1.6.4.2.1. Почистване Стъклените съдове се почистват внимателно. Ако е необходимо, те се измиват с гореща бихромна смес, след това със сироповидна фосфорна киселина (от 83 до 98 тегл. % Н3РО4), основно се изплакват с течаща вода и накрая се измиват с бидестилирана вода до неутрална реакция. След това се подсушават или се изплакват с част от течната проба, която подлежи на изпитване. Пръстенът първо се изплаква основно с вода, за да се отстранят всички разтворими във вода вещества. После за кратко се потапя в бихромна смес, измива се с бидестилирана вода до неутрална реакция и накрая се загрява за малко над метанолов пламък. Забележка: Замърсяванията от вещества, които не се разтварят или разрушават от бихромната смес и от фосфорната киселина, като силиконовите материали, трябва да се отстранят с помощта на подходящ органичен разтворител.
1.6.4.2.2. Калибриране на апаратурата Подготовката на апаратурата се състои в проверка на нулевата точка и настройване на показанията на инструмента, което да позволи провеждането на достоверни измервания в mN/m.
1.6.4.2.2. Инсталиране
Апаратурата трябва да се нивелира с помощта, например, на спиртен нивелир върху основата на тензиометъра, като се регулират нивелиращите винтове на основата.
Нагласяване на нулата
След монтирането на пръстена върху апаратурата и преди потапянето му в течността показанието на тензиометъра трябва да се нулира и да се провери дали пръстенът е разположен успоредно на повърхността на течността. За тази цел течната повърхност може да се използва като огледало.
Калибриращи процедури
Действителното пробно калибриране може да се извърши с помощта на една от следните две процедури:
а)
Чрез масата: при процедурата се използват тежести с определено тегло (между 0,1 и 1,0 g), разположени върху пръстена. Калибрационният коефициент Фа, с който се умножават всички показания на инструмента, се определя по следното уравнение (1): Φa=σrσa (1) където: σr=mg2b (mN/m) m масата на допълнителната тежест (g) g земното ускорение (981 cm s-2 при морското равнище) b средната обиколка на пръстена (cm) σа показанието на тензиометъра след поставянето на тежестта върху пръстена (mN/m).
б)
Чрез вода: използва се чиста вода, чието повърхностно напрежение например при 23 oС е равно на 72,3 mN/m. Тази процедура се изпълнява по-бързо, отколкото калибрирането с тежести, но винаги съществува опасност повърхностното напрежение на водата да не е истинското поради наличието на следи от повърхностноактивни вещества като замърсители. Калибрационният коефициент Фb, по който трябва да се умножават всички показания на инструмента, се определя по следното уравнение (2): Φb=σoσg (2) където: σo стойността на повърхностното напрежение на водата, дадена в препратката (mN/m) σg измерената стойност на повърхностното напрежение на водата (mN/m) като и двете се взимат при една и съща температура.
1.6.4.3. Подготовка на пробите Приготвят се водни разтвори с необходимите концентрации от изпитваните веществата, които не съдържат неразтворени вещества. Разтворът трябва да се поддържа при постоянна температура (±0,5oС). Тъй като повърхностното напрежение на разтвора в измервателния съд се променя с течение на времето, трябва да се направят няколко измервания през различни интервали от време и да се начертае крива, показваща зависимостта на повърхностното напрежение от времето. Когато не се наблюдават повече изменения, се счита, че е достигнато равновесното състояние. Прахът и газообразните замърсявания от други вещества пречат на измерването. Затова трябва да се работи под защитен похлупак.
1.6.5. Условия на изпитването Изпитването се извършва при 20 oС, като температурата се контролира с точност от ±0,5oС.
1.6.6. Провеждане на изпитването Изпитваният разтвор се прехвърля в добре почистен измервателен съд, като се внимава да не се образува пяна. След това съдът се поставя върху масичката на измервателната апаратура. Горният край на масичката заедно с измервателния съд се повдига, докато пръстенът се потопи под повърхността на разтвора. После горният край на масичката се сваля постепенно и равномерно (със скорост приблизително 0,5 cm/min), така че пръстенът да се отдели от повърхността. Това продължава до достигане на максималната стойност на силата. Течният слой, прикрепен към пръстена, не бива да се отделя от него. След приключване на изпитването пръстенът отново се потапя под повърхността и измерването се повтаря, докато се достигне постоянна стойност на повърхностното напрежение. При всяко определяне трябва да се записва времето от момента на прехвърлянето на разтвора в измервателния съд. Отчита се максималната сила, необходима за отделянето на пръстена от повърхността на течността.
2. Таблица Коригиране на измереното п овърхностно напрежение Само за водни разтвори, ρ = 1 g/cm3
ДАННИ За да се изчисли повърхностното напрежение, отчетеното показание на апаратурата в mN/m първо се умножава по калибрационния коефициент Фа или Фb в зависимост от използваната процедура на калибриране. Така се получава стойност, която е само приблизителна и се нуждае от корекции. Харкинс и Джордан (4) са определили емпирично корекционните коефициенти за измерените стойности на повърхностното напрежение по метода на пръстена. Тези стойности зависят от размерите на пръстена, плътността на течността и нейното повърхностно напрежение. Тъй като определянето на корекционния коефициент по таблиците на Харкинс и Джордан за всяко отделно измерване е много трудоемък процес, при изчисляването на повърхностното напрежение на водни разтвори може да се използва улеснена процедура, която отчита от таблица направо коригираната стойност на повърхностното напрежение. (Когато отчетените при опита стойности се намират между посочените в таблицата, се прилага интерполация). R = 9,55 mm (среден радиус на пръстена) r = 0,185 mm (радиус на проводника, от който е направен пръстенът) Отчетена стойност в резултат от изпитването (mN/m) Коригирана стойност (mN/m) Калибриране с тежести (вж. 1.6.4.2.2, буква a) Калибриране с вода (вж. 1.6.4.2, буква б) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Тази таблица е съставена въз основа на данни от корекциите на Харкинс и Джордан. Тя е подобна на таблицата в стандарта DIN 53914 за вода и водни разтвори (плътност ρ = 1 g/cm3 и се отнася за пръстен с размери R = 9,55 mm (среден радиус на пръстена) и r = 0,185 mm (радиус на проводника на пръстена). Таблицата предоставя коригираните стойности на повърхностното напрежение за изпитвания, проведени след калибриране с тежести или след калибриране с вода. Без предварително калибриране повърхностното напрежение може да се изчисли по следната формула: σ=f × F4πR където: F силата, измерена с динамометър, в точката на прекъсване на филма R радиуса на пръстена f корекционния коефициент (1).
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ С РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ ИЗПИТВАНЕТО По възможност протоколът с резултатите от изпитването трябва да включва следната информация:
използван метод,
тип на използвания разтвор,
точно определение на веществото (вид и примеси),
резултати от изпитванията: повърхностно напрежение (отчетено) — включват се показанията при отделните измервания и тяхната средноаритметична стойност, както и коригираната средна стойност (в която са взети под внимание типът на оборудването и корекционната таблица),
концентрация на разтвора,
температура на изпитването,
време на престояване на разтвора; по-точно времето между приготвянето и измерването на разтвора,
описание на зависимостта на повърхностното напрежение от времето след прехвърлянето на разтвора в измервателния съд,
трябва да се докладват цялата информация и бележките върху интерпретацията на резултатите, особено онези, които са свързани с примесите и физичното състояние на веществата.
3.2. АНАЛИЗИРАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Като се има предвид, че повърхностното напрежение на водата е 72,75 mN/m при 20 oС, веществата с повърхностно напрежение, по-ниско от 60 mN/m, определено при условията на този метод, трябва да се разглеждат като повърхностноактивни вещества.
4.(1)(2)(3)(4)
ПРЕПРАТКИ ОИСР, Paris, 1981, Test Guideline 115, решение на Съвета C(81) 30 окончателен. R. Weissberger ed.; Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. Harkins, W. D., Jordan, H. F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, vol. 52, 1751.
A.6. РАЗТВОРИМОСТ ВЪВ ВОДА
A.6.
1. МЕТОД Описаният метод се основава на Ръководството за провеждане на изпитвания на ОИСР (1).
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ За провеждането на това изпитване е полезно да има предварителна информация за структурната формула, парното налягане, дисоциационната константа и хидролизата (като функция от рН) на веществото. Не съществува универсален метод, с който да се покрие целият обхват от разтворимости във вода. Двата метода за изпитване, описани по-долу, покриват цялата област от разтворимости, но не могат да се използват за летливи вещества: Разтворимостта на изпитваното вещество може значително да се повлияе от присъствието на примеси.
единият метод, който се прилага към почти чисти вещества с ниски разтворимости (< 10-2 грама на литър), стабилни във вода, се нарича метод на елуиране от колона,
другият метод, който се прилага към почти чисти вещества с по-високи разтворимости (> 10-2 грама на литър), стабилни във вода, се нарича метод на стъкленицата.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Разтворимостта във вода на едно вещество се определя като масовата концентрация на наситения разтвор на веществото във вода при дадена температура. Разтворимостта във вода се дава в единици маса за обем разтвор. Мерната единица в системата SI е kg/m3 (може също да се използва и грам на литър).
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Не е необходимо да се използват вещества за сравнение във всички случаи, когато се изпитва ново вещество. Преди всичко те трябва да служат за периодична проверка на действието на метода и да позволяват сравнение с резултатите, получени по други методи.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Приблизителното количество на пробата и времето, необходимо за достигане на масовата концентрация на насищане, трябва да се определят с просто предварително изпитване.
1.4.
1.4.1. Метод на елуиране от колона Този метод се основава на елуиране на изпитваното вещество с вода от микроколона, запълнена с инертен носител, например стъклени перли или пясък, покрит с излишък от изпитваното вещество. Разтворимостта във вода се определя, когато масовата концентрация на елуата стане постоянна. Това се изразява като плато в кривата на зависимостта на концентрацията от времето.
1.4.2. Метод на стъкленицата При този метод веществото (твърдите вещества трябва да се привеждат в прахообразно състояние) се разтваря във вода при температура, малко по-висока от температурата на изпитването. Когато се достигне насищането, сместа се охлажда и се държи при температурата на изпитването, като се разбърква колкото е необходимо до достигане на равновесие. Също така изпитването може да се проведе и направо при желаната температура, ако с помощта на подходящи проби се докаже, че е достигнато равновесие. След това с подходящ аналитичен метод се определя масовата концентрация на веществото във водния разтвор, който не бива да съдържа неразтворени частици.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО
1.5.
1.5.1. Повторяемост При метода на елуиране от колона е възможно да се получат разлики < 30 %; за метода на стъкленицата трябва да се наблюдават разлики < 15 %.
1.5.2. Чувствителност Тя зависи от аналитичния метод, но трябва да могат да се определят масови концентрации до 10-6 грама на литър.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
1.6.
1.6.1. Условия на изпитването За предпочитане е изпитването да се провежда при 20 ±0,5oС. Ако температурната зависимост на разтворимостта е > 3 % на oС, изпитването трябва да се направи при още две температури, които да са поне с 10 oС над и под първоначално подбраната температура. В този случай точността, с която се поддържа температурата, трябва да бъде ±0,1oС. Избраната температура трябва да се поддържа постоянна във всички свързани части на оборудването.
1.6.2. Предварително изпитване Към приблизително 0,1 g от пробата (твърдите вещества трябва да са в прахообразно състояние), поставена в градуиран цилиндър от 10 ml със стъклена запушалка, при стайна температура се прибавят нарастващи обеми дестилирана вода, както е показано в таблицата: 0,1 g разтворими в x ml вода 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Приблизителна разтворимост (грама на литър) > 1000 от 1000 до 200 от 200 до 100 от 100 до 50 от 50 до 10 от 10 до 1 < 1 След всяко прибавяне на посоченото количество вода сместа се разклаща силно в продължение на 10 минути и визуално се проверява за наличието на неразтворени частици. Ако след прибавянето на 10 ml вода пробата или частици от нея останат неразтворени, опитът трябва да се повтори в мерителен цилиндър от 100 ml c по-големи обеми вода. При по-ниски разтворимости времето, необходимо за разтваряне на веществото, трябва да е значително по-дълго (трябва да се предвидят поне 24 часа). Приблизителната разтворимост се дава в таблицата под онзи обем добавена вода, при който настъпва пълното разтваряне на пробата. Ако веществото все още очевидно не е разтворено, трябва да се предвидят повече от 24 часа (максимум 96 часа) или да се предприеме ново разреждане, за да се разбере кой от двата метода — методът на елуиране от колона или методът на стъкленицата — трябва да се приложи.
1.6.3. Метод на елуиране от колона
1.6.3.
1.6.3.1. Носител, разтворител и елуиращ агент При метода на елуиране от колона носителят трябва да бъде инертен. Материалите, които могат да се използват като носители, са стъклени перли или пясък. За да може изпитваното вещество да се отложи върху носещия материал, се използва подходящ летлив разтворител с аналитична степен на чистота. Като елуиращ агент се използва вода, бидестилирана в стъклен или кварцов апарат. Забележка: Не бива да се ползва вода, взета направо от органичен йонообменник.
1.6.3.2. Натоварване на веществото върху носителя Приблизително 600 mg от носещия материал се претеглят и прехвърлят в облодънна колба от 50 ml. Подходящо количество от изпитваното вещество се претегля и разтваря в избрания разтворител. Част от този разтвор се прибавя към носещия материал. Разтворителят трябва да се изпари напълно, например с ротационен изпарител. В противен случай, поради ефектите на разпределение на повърхността на носителя, колоната няма да може да се насити с вода. Натоварването на носещия материал може да създаде проблеми (неверни резултати), ако изпитваното вещество се отлага под формата на масло или в различно кристално състояние. Проблемът трябва да се разгледа експериментално и подробностите да се опишат в протокола. Натовареният с веществото носител се оставя да се просмуче за около два часа в около 5 ml вода, след което суспензията се поставя в микроколоната. Също така е възможно сухият носител, натоварен с веществото, да се насипе в предварително запълнената с вода микроколона и да се изчака около два часа, докато се достигне равновесие.
1.6.3.2. Процедура на изпитване:
Елуирането на веществото от носещия материал може да се извърши по един от следните два начина:
рециркулационна помпа (вж. фигура 1),
нивелиращ съд (вж. фигура 4).
1.6.3.3. Метод на елуиране от колона с рециркулационна помпа
1.6.3.3. Апаратура
На фигура 1 е показано схематично подреждането на апаратите в една типична за целта система. На фигура 2 е показана подходяща микроколона; колоната може да има произволни размери, стига те да покриват изискванията за възпроизводимост и чувствителност на метода. В колоната трябва да е предвидено входно разширение, което може да поема поне пет пъти по-голям обем вода от обема на колоната и в което да могат да се поставят най-малко пет проби. От друга страна, размерът може да е и по-малък, в случай че се използва разтворител, който да замести първоначалните пет обема, предназначени за отстраняване на примесите. Колоната трябва да се свърже с рециркулационна помпа, с която може да се контролира подаването на потоци от приблизително 25 ml/h. Помпата се свързва чрез съединения, направени от политетрафлуороетилен (P.T.F.E.) и/или стъкло. При събирането на колоната и помпата трябва да се предвидят приспособления за отбиране на проби от изходния поток и за изравняване на налягането във входното пространство с атмосферното. Пълнителят в колоната лежи върху малка тапа (5 mm) от стъклена вата, която служи и за филтруване на твърдите частици. Рециркулационната помпа може да бъде например перисталтична или мембранна помпа (трябва да се вземат мерки помпата да не се замърсява и/или да не абсорбира веществото от тръбата).
Процедура на изпитване
Потокът през колоната се стартира. Препоръчително е да се работи при скорост на потока приблизително 25 ml/h (за описаната тук колона това съответства на 10 обема на колоната за час). Първите пет обема (минимум) се изхвърлят, за да се отстранят разтворимите във вода примеси. След това рециркулационната помпа се пуска да работи, докато се установи равновесие. Настъпването на равновесието се определя по пет последователни проби, чиито концентрации, взети в произволен ред, не се различават една от друга с повече от ± 30 %. Тези проби трябва да се отбират на интервали от време, не по-малки от времето, необходимо за преминаването на 10 колонни обема от елуиращия агент.
1.6.3.4. Метод на елуиране от колона с нивелиращ съд
1.6.3.4. Апаратура (вж. фигури 4 и 3)
Нивелиращ съд: свързването към нивелиращия съд се прави, като се използва шарнир от шлифовано стъкло, който е свързан чрез тръбички от политетрафлуороетилен (P.T.F.E.). Препоръчително е да се работи при приблизителна скорост на потока от 25 ml/h. Последователни фракции от елуата се събират и анализират по избрания метод.
Процедура на изпитване
Разтворимостта във вода се определя по онези фракции от елуата, чиито концентрации са постоянни (± 30 %) при най-малко пет последователни пробоотбора. И в двата случая (при използването на рециркулационна помпа и на нивелиращ съд), трябва да се направи второ измерване при скорост на потока, два пъти по-малка от първата. Ако резултатите от двата опита са съвместими, изпитването се счита за успешно; ако при по-малка скорост на потока се получи по-висока стойност за разтворимостта, скоростта на потока отново се намалява наполовина и това продължава, докато при две последователни изпитвания се получи една и съща разтворимост. И в двата случая (при използването на рециркулационна помпа и на нивелиращ съд) отбраните фракции трябва да се проверяват за наличието на колоидни частици чрез изпитване за Тиндалов ефект (разсейване на светлината). Наличието на такива частици прави резултатите невалидни и изпитването трябва да се повтори, след като се подобри филтруването от колоната. Трябва да се записва рН на всяка проба. При същата температура трябва да се направи още едно изпитване.
1.6.4. Метод на стъкленицата
1.6.4.
1.6.4.1. Апаратура За метода на стъкленицата са необходими следните материали:
обичайните лабораторни прибори и стъклария,
приспособление, в което разтворите могат да се разбъркват при контролирани постоянни температури,
центрофуга (за предпочитане термостатирана), и
оборудване за аналитични изпитвания.
1.6.4.2. Процедура на изпитване Количеството вещество, необходимо да насити желания обем вода, се изчислява при предварителните изпитвания. Необходимият обем вода зависи от аналитичния метод и от областта, в която се намира разтворимостта. Около пет пъти по-големи количества материал от определените по-горе се претеглят и се поставят в три стъклени съда, снабдени със стъклени запушалки (например центрофужни епруветки или колби). След това съдовете се затварят и съдържанието им се размесва при 30 oС (трябва да се използват клатачни машини или бъркалки, които могат да работят при постоянна температура, например магнитна бъркалка в термостатирана водна баня). След един ден един от съдовете се взима и чрез периодично разклащане се темперира отново за 24 часа, но при температурата на изпитването. След това съдържанието на съда се центрофугира също при температурата на изпитването и концентрацията на изпитваното вещество в бистрата водна фаза се определя с подходящ аналитичен метод. Другите две стъкленици се обработват по същия начин след първоначално темпериране при 30 oС, продължаващо съответно два и три дни. Ако резултатите за концентрацията при поне два от съдовете съвпадат с исканата точност, изпитването се счита за сполучливо. Ако резултатите от съдове 1, 2 и 3 показват тенденция към нарастване на получените стойности за разтворимостта, цялото изпитване трябва да се повтори при по-продължителни времена за темпериране. Измервателната процедура може да се провежда също и без предварителна инкубация при 30 oС. За да се определи скоростта, с която се установява равновесието на насищане, се вземат проби, докато времето на разбъркване спре да влияе върху концентрацията на изпитвания разтвор. Трябва да се записва рН на всяка проба.
1.6.5. Анализ За тези определения се предпочита специфичен за дадено вещество аналитичен метод, тъй като малки количества от разтворените примеси могат да доведат до големи грешки в измерената величина на разтворимостта. Примери за такива методи са газова или течна хроматография, титрувални методи, фотометрични методи, волтаметрични методи.
2. ДАННИ
2.
2.1. МЕТОД НА ЕЛУИРАНЕ ОТ КОЛОНА При всяко изпитване трябва да се изчислява средната стойност на най-малко пет последователни проби, взети в платото на насищане, както и стандартното отклонение. Резултатите трябва да се дават в единици маса за обем разтвор. Сравняват се средните стойности, получени при две изпитвания с различни скорости на потока. Те трябва да се различават с по-малко от 30 %.
2.2. МЕТОД НА СТЪКЛЕНИЦАТА Дават се индивидуалните резултати за всяка от трите стъкленици. Онези резултати, които се считат за еднакви (с разлика по-малка от 15 %), се осредняват и получената средна стойност се дава в единици маса за обем разтвор. Когато разтворимостта е много голяма (> 100 g/l), се налага превръщането на единиците за маса в единици за обем, като се използва плътността.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. МЕТОД НА ЕЛУИРАНЕ ОТ КОЛОНА Протоколът с резултатите от изпитването трябва по възможност да включва следната информация:
резултатите от предварителното изпитване,
точното определение на веществото (вид и примеси),
индивидуалните концентрации, скорости на потока и рН за всяка проба,
средните стойности и стандартните отклонения на най-малко пет проби от платото на насищане при всеки опит,
средната стойност на два последователни успешни опита,
температурата на водата по време на насищането,
използваният метод за анализ,
природата на носещия материал,
натоварването на носещия материал,
използваният разтворител,
данните за химичната неустойчивост на веществото в процеса на изпитването и използвания метод,
всяка информация относно интерпретиране на резултатите, особено онази, която се отнася до примесите и физичното състояние на веществото.
3.2. МЕТОД НА СТЪКЛЕНИЦАТА Протоколът с резултатите от изпитването трябва по възможност да включва следната информация:
резултатите от предварителното изпитване,
точното определение на веществото (вид и примеси),
индивидуалните резултати от аналитичните определения, както и средната стойност в случаите, когато за всяка колба е определена повече от една стойност,
рН на всяка проба,
средната стойност за различните колби, които са дали близки резултати,
температурата на изпитването,
аналитичният метод,
данните за химичната неустойчивост на веществото в процеса на изпитването и използвания метод,
всяка информация относно интерпретирането на резултатите, особено онази, която се отнася до примесите и физичното състояние на веществото.
4.(1)(2)(3) ПРЕПРАТКИ ОИСР, Paris, 1981, Test Guideline 105, решение на Съвета C(81) 30 окончателен. NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method. NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.
А.8. КОЕФИЦИЕНТ НА РАЗПРЕДЕЛЕНИЕ
А.8.
1. МЕТОД Методът на разклащането в стъкленица се основава на Ръководството за провеждане на изпитвания на ОИСР (1).
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ За провеждането на това изпитване е полезно да има предварителна информация за структурната формула, дисоциационната константа, разтворимостта във вода, хидролизата, разтворимостта в n-октанол и повърхностното напрежение на веществото. Изпитванията върху вещества, които могат да се йонизират, трябва да се провеждат в нейонната им форма (свободна киселина или свободна база). Тя се получава с помощта на подходящ буфер с рН, най-малко една единица по-ниско (свободна киселина) или по-високо (свободна база) от рК на веществото. Този изпитвателен метод обхваща две отделни процедури: метод на разклащането в стъкленица и високочувствителна течна хроматография (HPLC). Първият метод се прилага, когато стойността на log Pow (вижте по-долу при определенията) попада в областта от — 2 до 4, а вторият — в областта от 0 до 6. Преди да се проведе някоя от двете експериментални процедури, трябва да се направи предварителна оценка на коефициента на разпределение. Методът на разклащането в стъкленица се прилага само за абсолютно чисти вещества, разтворими във вода и n-октанол. Той не може да се използва за повърхностноактивни вещества (за които трябва да се предостави изчислена стойност или приблизителна оценка, основана на разтворимостите им в n-октанол и във вода, получени поотделно). Методът на HPLC не може да се прилага за силни киселини и основи, метални комплекси, повърхностноактивни материали или вещества, които реагират с елуиращия агент. За такива вещества трябва да се предостави изчислена стойност или приблизителна оценка, основана на разтворимостите им в n-октанол и във вода, получени поотделно. Методът на HPLC е по-малко чувствителен към присъствието на примеси в изпитваното вещество, отколкото методът на разклащането в стъкленица. Независимо от това и при този метод в някои случаи присъствието на примеси може да доведе до трудно интерпретиране на резултатите, защото определянето на пиковете става несигурно. За смеси, които дават недобро разделяне на пиковете, трябва да се посочват горната и долната граница на log P.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Коефициентът на разпределение (Р) се дефинира като съотношението между равновесните концентрации (сi) на разтвореното вещество в двуфазна система, която се състои от два практически несмесващи се разтворителя, в случая n-октанол и вода: pow=cn-октанолcвода Следователно коефициентът на разпределение (Р) представлява съотношение между две концентрации и обикновено се дава във формата на логаритъм при основа 10 (log P).
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ
1.3. Метод на разклащането в стъкленица
Когато се изпитва ново вещество, не във всички случаи е необходимо да се използват вещества за сравнение. Преди всичко те трябва да служат за периодична проверка на действието на метода и да позволяват сравнение с резултатите, получени по други методи.
HPLC метод
За да се установи съотношението, в което се намират данните за дадено вещество, получени по метода на HPLC, и неговата Р стойност, трябва да се начертае калибрационна графика на log Р спрямо хроматографските данни. За целта се използват най-малко 6 точки, получени от сравнителни вещества. Подборът на подходящи сравнителни вещества остава на грижата на потребителя. Когато е възможно, поне едно съединение за сравнение трябва да има Pow, по-високо от това на изпитваното вещество, а друго съединение за сравнение да има Pow, по-ниско от това на изпитваното вещество. За стойности на log P по-малки от 4 калибрирането трябва да се основава на данни, получени по метода на разклащането в стъкленица. За стойности на log P по-големи от 4 калибрирането трябва да се базира на утвърдени литературни данни, ако те се съгласуват с изчислените стойности. По-висока точност може да се постигне, ако се изберат сравнителни вещества, подобни по структура на изпитваното вещество. В литературните източници (2) и (3) могат да се намерят обширни списъци със стойностите на log Pow за много групи от химични вещества. Ако не могат да се открият данни за коефициентите на разпределение на вещества, които са подобни по структура на изпитваното, може да се направи по-общо калибриране, като се използват други съединения за сравнение. В допълнение 2 е даден списък от вещества, които се препоръчват като сравнителни, а също и техните Pow стойности.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА
1.4.
1.4.1. Метод на разклащането в стъкленица За да се намери коефициентът на разпределение, трябва да се достигне равновесие между всички взаимодействащи компоненти на системата и да се определят концентрациите на разтвореното вещество в двете фази. Изучаването на литературата по този въпрос показва, че за решаването на проблема — тоест смесването на двете фази и последващото им разделяне с цел определяне на равновесната концентрация на изпитваното вещество — могат да се използват няколко различни техники.
1.4.2. Метод на HPLC Изпитването с HPLC ce провежда в аналитични колонки с търговски пълнител, състоящ се от дълги въглеводородни вериги (например С8, C18), химически свързани към силициев диоксид. Химичните вещества, инжектирани в такава колонка, се придвижват по дължината ѝ с различна скорост поради различната степен на разпределение между подвижната фаза и неподвижната въглеводородна фаза. Смесите от химични вещества се елуират по реда на тяхната хидрофобност, като разтворимите във вода вещества се елуират първи, а разтворимите в мазнини вещества се елуират последни в съответствие с техните коефициенти на разпределение между въглеводородната и водната фаза. Това позволява да се установи връзка между времето на задържане в такава колонка (с обърната фаза) и коефициента на разпределение n-октанол/вода. Коефициентът на разпределение се извежда от коефициента на пропускане k, който се дава с израза: k=tr-toto където tr = времето на задържане на изпитваното вещество в колоната, a t0 = средното време, необходимо на една молекула от разтворителя да премине през колоната (мъртво време). Не е необходимо да се прилагат количествени аналитични методи. Нужно е само да се определят времената на елуиране.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО
1.5.
1.5.1. Повторяемост
1.5.1. Метод на разклащането в стъкленица
За да се постигне точно определяне на коефициента на разпределение, трябва да се направят по две изпитвания при три различни експериментални условия, които могат да се задават, като се променя количеството на изпитваното вещество, както и съотношенията между обемите на разтворителите. Определените стойности за коефициента на разпределение, изразени в десетични логаритми, трябва да попадат в областта ±0,3 логаритмични единици.
Метод на HPLC
За да се увеличи достоверността на резултатите, трябва да се правят по две изпитвания. Стойностите на log P, получени при отделните изпитвания, трябва да попадат в областта ±0,1 логаритмични единици.
1.5.2. Чувствителност
1.5.2. Метод на разклащането в стъкленица
Областта, в която може да се използва методът, се определя от ограниченията на аналитичната процедура. Тя трябва да позволява оценка на стойностите на log Pow в областта от – 2 до 4 (в някои случаи, като се подберат условията, тази област може да се разшири до log Pow = 5), като концентрациите на разтвореното вещество във всяка от двете фази не надвишават 0,01 мола на литър.
Метод на HPLC
Методът на HPLC позволява коефициентите на разпределение да се определят в областта на log Pow от 0 до 6. Обикновено коефициентът на разпределение на едно вещество може да се прецени с точност до ± 1 логаритмична единица от стойността, получена по метода с разклащане на стъкленица. Типичните корелации могат да се намерят в литературните източници (4) (5) (6) (7) (8). По-висока точност се постига, когато корелационните графики се базират на подобни по структура съединения (9).
1.5.3. Специфичност
1.5.3. Метод на разклащането в стъкленица
Законът на Нернст за разпределението се отнася само за разредени разтвори при постоянна температура, налягане и рН. Той се прилага само за чисти вещества, разпределени между два чисти разтворителя. Резултатите могат да се повлияят, ако се окаже, че в едната или и в двете фази има няколко различни разтворени вещества. Дисоциацията или асоциацията на разтворените молекули води до отклонения от Закона на Нернст за разпределението. Тези отклонения се откриват по това, че коефициентът на разпределение започва да зависи от концентрацията на разтвора. Този метод не може да се прилага, без да се нанасят корекции за вещества, които могат да преминават в йонно състояние, поради многобройните равновесия, които се установяват в системата. За такива вещества вместо вода могат да се използват буферни разтвори; рН на буфера трябва да се различава от рКа на веществото с поне една рН единица и винаги трябва да се внимава дали това рН е приложимо за дадената среда.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
1.6.
1.6.1. Предварителна оценка на коефициента на разпределение За предпочитане е коефициентът на разпределение да се намери чрез изчислителни методи (вж. допълнение 1) или когато е възможно, от съотношението на разтворимостите на изпитваното вещество в чистите разтворители (10).
1.6.2. Метод на разклащането в стъкленица
1.6.2.
1.6.2.1. Подготовка n-октанол: определянето на коефициента на разпределение трябва да се извършва в реактив с висока аналитична степен на чистота. Вода: трябва да се използва дестилирана или бидестилирана в стъклен или кварцов съд вода. Ако е оправдано, за вещества, които имат йонна форма, вместо вода се използват буферни разтвори. Забележка: Не бива да се използва вода, взета направо от йонообменник.
1.6.2.1.
1.6.2.1.1. Предварително насищане на разтворителите Преди определянето на коефициента на разпределение двете фази на системата от разтворители трябва взаимно да се наситят, като се разклащат при температурата на изпитването. За да се направи това, е добре в два големи лабораторни съда да се поставят съответно n-октанол с висока степен на чистота и вода, към всеки съд да се добави достатъчно количество от другия разтворител и съдовете да се разклащат в продължение на 24 часа на механична клатачка. След това те се оставят да престоят достатъчно дълго, така че фазите да се разделят и да се постигне състоянието на насищане.
1.6.2.1.2. Подготовка за изпитването Целият обем на двуфазната система трябва да запълни почти изцяло измервателния съд. Това ще помогне да се избегне загубата на материал чрез изпарение. Съотношението на обемите на разтворителите и количеството вещество, които ще се използват при изпитването, се определят от следните фактори: Извършват се три изпитвания. При първото се използва изчисленото обемно съотношение на n-октанола към водата; при второто това съотношение се разделя на две; при третото отношението се умножава по две (например 1:1, 1:2, 2:1).
предварителната оценка на коефициента на разпределение (вж. по-горе),
минималното количество от изпитваното вещество, необходимо за провеждането на аналитичната процедура, и
ограничението за максималната концентрация във всяка от фазите, което е 0,01 мола на литър.
1.6.2.1.3. Изпитвано вещество Приготвя се сток-разтвор в n-октанола, наситен с вода. Концентрацията на този разтвор трябва да се определи с висока точност, преди той да се използва за определяне на коефициента на разпределение. Разтворът се съхранява при условия, осигуряващи стабилността му.
1.6.2.2. Условия на изпитването Температурата на изпитването трябва да се поддържа постоянна (± 1 oС) и да бъде в интервала от 20 до 25 oС.
1.6.2.3. Процедура на изпитването
1.6.2.3.
1.6.2.3.1. Установяване на равновесието на разпределение За всяко изпитване при дадени условия трябва да се приготвят по два изпитвателни съда, съдържащи необходимото точно премерено количество от двата разтворителя, заедно с нужното количество сток-разтвор. Фазите на n-октанола трябва да се премерят по обем. Измервателните съдове се поставят в подходяща клатачна машина или се разклащат на ръка. Ако се използва центрофужна епруветка, препоръчително е тя да се завърта бързо на 180o около напречната ѝ ос, така че задържаният въздух да преминава през двете фази. Опитът е показал, че 50 такива завъртания обикновено са достатъчни да се достигне равновесието на насищане. За по-голяма сигурност е добре да се направят 100 завъртания за пет минути.
1.6.2.3.2. Разделяне на фазите Когато е необходимо, разделянето на фазите се постига, като сместа се центрофугира. Това се прави на лабораторна центрофуга, в която се поддържа стайна температура, или ако се използва центрофуга без температурен контрол, центрофужните епруветки трябва да се темперират при температурата на изпитването поне един час преди анализа.
1.6.2.4. Анализ За да се определи коефициентът на разпределение, е необходимо да се измери концентрацията на изпитваното вещество във всяка от фазите. Това може да се направи, като се вземе аликвотна част от отделните фази във всяка епруветка при всяко измерване и тя се анализира с помощта на избраната процедура. Трябва да се изчисли общото количество вещество в двете фази и да се сравни с първоначално въведеното количество. Пробата от водната фаза трябва да се вземе така, че рискът от замърсяване със следи от n-октанол да е минимален. За целта може да се използва стъклена спринцовка с подвижна игла. Първоначално спринцовката се запълва частично с въздух. Въздухът внимателно се изпуска, докато иглата преминава през слоя от n-октанол. Със спринцовката се поема необходимият обем от водната фаза. След това тя бързо се изважда от разтвора и иглата се отстранява. Тогава съдържанието на спринцовката може да се използва като проба от водната фаза. Концентрацията в двете разделени фази се определя за предпочитане по метод, специфичен за веществото. Примери за подходящи аналитични методи са следните:
фотометрични методи,
газова хроматография,
високочувствителна течна хроматография.
1.6.3. Метод на HPLC
1.6.3.
1.6.3.1. Подготовка
1.6.3.1. Апаратура
Необходим е течен хроматограф, снабден с помпа за равномерно подаване на течности и подходящо отчитащо устройство. Препоръчва се да се използва инжекционен клапан с инжекционни скоби. Присъствието на полярни групи в неподвижната фаза може значително да влоши действието на HPLC-колоната. Затова неподвижната фаза трябва да има минимален процент от полярни групи (11). Могат да се използват търговските пълнители от микрочастици за обърнати фази или готови напълнени колони. Между инжекционната система и аналитичната колона може да се постави предпазна колона.
Подвижна фаза
Като елуиращи разтворители (които се дегазират преди употреба) се използват метанол и вода със степени на чистота за колонна хроматография. Прилага се изократно елуиране. Съотношенията метанол/вода трябва да предвиждат минималното съдържание на вода да бъде 25 %. Обикновено сместа метанол-вода 3:1 (v/v) е подходяща за елуиране на съединения с log P = 6 в рамките на един час при скорост на потока = 1 ml/min. За вещества с по-високи стойности на log P може да се наложи намаляване на времето за елуиране (също и на сравнителните вещества), като се намали полярността на подвижната фаза или дължината на колоната. Веществата с много ниска разтворимост в n-октанол често дават необичайно ниски стойности на log Pow по метода на HPLC; пиковете на тези вещества понякога се появяват с фронта на разтворителя. Това вероятно се дължи на факта, че процесът на разпределение е твърде бавен, за да се достигне равновесие за времето, което обикновено се предвижда за разделянето чрез HPLC. Възможно е, като се намали скоростта на потока и/или съотношението метанол/вода, да се достигне до получаването на достоверна величина. Както изпитваните, така и сравнителните вещества трябва да са разтворими в подвижната фаза в концентрации, достатъчни да позволят изпитването им. Използването на добавки към сместа от метанол и вода се разрешава само в изключителни случаи, тъй като те променят свойствата на колоната. За получаването на хроматограми с добавки задължително се използва отделна колона от същия тип. Ако сместа метанол-вода не е подходяща, може да се използва смес от друг органичен разтворител и вода, например етанол-вода или ацетонитрил-вода. Стойността на рН на елуиращия агент е важна за съединенията, които могат да преминават в йонна форма. Тя трябва да бъде в работната рН-област на колоната, която обикновено е между 2 и 8. Препоръчва се използването на буфери. Трябва да се внимава да се избегне утаяването на соли и замърсяването на колоната, което може да се получи при някои смеси органичен разтворител/буферен разтвор. Измерванията с HPLC с неподвижна фаза на базата на силициев диоксид при рН над 8 не се препоръчват, тъй като употребата на алкална подвижна фаза може да доведе до бързо влошаване на качествата на колоната.
Разтворени вещества
Сравнителните вещества трябва да бъдат с възможно най-голяма степен на чистота. Ако е възможно, веществата, които ще се изпитват, и тези, които ще се използват за калибриране, се разтварят в подвижната фаза.
Условия на измерването
Температурата по време на измерването не бива да се променя с повече от ± 2 K.
1.6.3.2. Измерване
1.6.3.2. Изчисляване на мъртвото време t0
Мъртвото време t0 може да определи, като се използва или хомоложна серия (например n-алкилметил кетони), или органични съединения, които не се задържат (например тиоуреа или формамид). С помощта на хомоложна серия, мъртвото време t0 ce изчислява, като поредица от най-малко седем члена на хомоложния ред се инжектира в колоната и се определят съответните времена на задържане. Времената на задържане tr(nc+1) ce нанасят на графика като функция на tr(nc), a отрязъкът а и наклонът b ce определят по регресионното уравнение: tr(nc + 1) = a + b tr(nc) където nс = броя въглеродни атоми. Тогава мъртвото време се дава с: to = a/(1 - b)
Калибрационна графика
Следващата стъпка е да се построят корелационни криви на log k към log p за подходящи сравнителни вещества. На практика серия от 5 до 10 сравнителни вещества, чийто log p е близо до очакваната област, се инжектират едновременно и времената им на задържане се определят за предпочитане на записващ интегратор, свързан към измерителната системата. Съответните логаритми от коефициента на пропускане, log k, се изчисляват и нанасят като функция от log p, определен по метода на разклащането в стъкленица. Калибрирането се прави през равномерни интервали поне веднъж дневно, така че да се отчитат възможните изменения в работата на колоната.
Определяне на коефициента на пропускане на изпитваното вещество
Изпитваното вещество се инжектира в колоната с колкото е възможно по-малко количество от подвижната фаза. Определя се времето на задържане (два пъти), което позволява да се изчисли коефициентът на пропускане k. Коефициентът на разпределение на изпитваното вещество може да се получи от корелационната графика на сравнителните вещества. За много ниски или много високи коефициенти на разпределение се налага да се извърши екстраполация. В тези случаи трябва да се внимава за границите на достоверност на регресионната права.
2. ДАННИ
2. Метод на разклащането в стъкленица
Надеждността на определените стойности на Р може да се провери, като се сравнят средните стойности от двукратните определения и средната стойност, получена от целия опит.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Протоколът с резултатите трябва по възможност да включва следната информация:
точното описание на веществото (вид и примеси),
когато гореспоменатите методи не могат да се приложат (например при повърхностноактивни вещества), трябва да се представи стойност, изчислена посредством разтворимостите в n-октанол и във вода, намерени поотделно,
цялата информация и бележките относно интерпретирането на резултатите, особено онези, свързани с примесите и физичното състояние на веществото.
резултатите от предварителните изпитвания, ако има такива,
температурата на изпитването,
данните за аналитичната процедура, с която са определяни концентрациите,
времето и скоростта на центрофугиране, ако е провеждано такова,
намерените концентрации в двете фази при всяко измерване (това означава, че се представят общо 12 концентрации),
теглото на изпитваното вещество, обемът на отделните фази във всеки от измервателните съдове и изчисленото общо количество изпитвано вещество, което присъства във фазите след достигането на равновесие,
изчислените стойности на коефициента на разпределение (Р) и тяхната средна стойност за отделните изпитвания, проведени при дадени условия, както и средната стойност за всички опити. Ако има предположение, че коефициентът на разпределение зависи от концентрацията, това също трябва да се отбележи в протокола,
съобщава се стандартното отклонение на индивидуалните Р стойности от средната стойност,
средната стойност на Р от всички изпитвания трябва да се изрази и като десетичен логаритъм,
изчисленото теоретично Pow, когато тази величина е била определена или когато измерената стойност е > 104,
рН на използваната вода, както и това на водната фаза по време на изпитването,
ако са използвани буфери, трябва да се даде обосновка защо вместо вода е използван буфер, неговият състав, концентрацията и рН, рН на водната фаза преди и след изпитването.
резултатите от предварителните изпитвания, ако има такива,
изпитваните и сравнителните вещества и тяхната степен на чистота,
температурната област на изпитванията,
рН, при което са правени изпитванията,
детайлно описание на аналитичната и предпазната колона, подвижната фаза и средствата, с които са провеждани изпитванията,
данните за времето на задържане и литературни стойности на log P на сравнителните вещества, използвани за калибриране,
данните за направената регресионна права (log k към log P),
данните за средното време на задържане и за интерполираната log P стойност на изпитваното съединение,
описанието на оборудването и условията на работа,
профилите на елуирането,
количествата на изпитваното и на сравнителните вещества, въведени в колоната,
мъртвото време и как е измерено.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
ПРЕПРАТКИ ОИСР, Paris, 1981, Test Guideline 107, решение на Съвета C(18) 30 окончателен. C. Hansch and A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A. J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medical Chemistry Project, 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundstroem and K. Sundh-Nygaerd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. W. E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. J. E. Haky and A. M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. S. Fujisava and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339. R.F. Rekker and H. M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR, 1985. Chemical products for industrial use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method. C. V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1 459. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. C. Hansch, A. Leo, S. H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani and E. J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1 207. W. B. Neely, D. R. Branson and G. E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1 113. D. S. Brown and E. W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. J. K. Seydel and K. J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Activitaetvon Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984. Y. C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978. N. S. Nirrlees, S. J. Noulton, C. T. Murphy, P. J. Taylor, J. Мed. Chem., 1976, vol. 19, 615.
А.9. ТОЧКА НА ВЪЗПЛАМЕНЯВАНЕ
А.9.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Преди да се проведе това изпитване, е полезно да има предварителна информация за запалимостта на веществото. Изпитвателната процедура се прилага за течни вещества, чиито пари могат да се възпламенят от източници на възпламеняване. Методите за изпитване, изброени в този текст, дават достоверни резултати само за онези обхвати от точки на възпламеняване, които са посочени в отделните методи. При подбора на метода трябва да се предвиди възможността за химична реакция между веществото и държателя на пробата.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Точката на възпламеняване е най-ниската температура, коригирана към налягане 101,325 кРа, при която една течност, в условията на метода, отделя пари в такова количество, че в измервателния съд се получават запалими пари или смес, запалима на въздух. Единици: oС t = T – 273,15 (t в oC и T в K)
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Не във всички случаи, когато се изпитва ново вещество, е необходимо да се използват вещества за сравнение. Преди всичко те трябва да служат за периодична проверка на действието на метода и да позволяват сравняване с резултатите, получени по други методи.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА Веществото се поставя в изпитвателен съд и се нагрява или охлажда до температурата на изпитване по начина, който е описан при отделните методи за изпитване. Правят се опити за запалване на веществото, за да се разбере дали пробата може да се възпламени при дадената температура.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО
1.5.
1.5.1. Повторяемост Повторяемостта е различна в зависимост от областта, в която се намира точката на възпламеняване и от използвания метод за измерването ѝ; максимум 2oС.
1.5.2. Чувствителност Чувствителността зависи от използвания метод на изпитване.
1.5.3. Специфичност Специфичността на някои от методите е ограничена до няколко обхвата от точки на възпламеняване и е свързана с данните за самото вещество (например висок вискозитет).
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
1.6.
1.6.1. Подготовка Проба от изпитваното вещество се поставя в изпитвателния апарат съгласно 1.6.3.1 и/или 1.6.3.2. С оглед на безопасността се препоръчва при този метод да се употребяват само проби с малък размер — до 2 cm3, от горива или токсични вещества.
1.6.2. Условия на изпитването Доколкото е съобразно с оглед на безопасността, апаратът трябва да се постави на място, където не става течение.
1.6.3. Извършване на изпитването
1.6.3.
1.6.3.1. Равновесен метод Вж. ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.
1.6.3.2. Неравновесен метод
1.6.3.2. Апарат на Абел:
Вж. BS 2000 част 170, NF M 07-011, NF T 66-009.
Апарат на Абел-Пенски:
Вж. EN 57, DIN 51755 част 1 (за температури от 5 до 65 oС), DIN 51755 част 2 (за температури под 5 oС), NF M 07-036.
Апарат на Таг:
Вж. ASTM D 56.
Апарат на Пенски-Мартенс:
Вж. ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M 07-019.
Забележки:
Когато точката на възпламеняване, определена по неравновесния метод от 1.6.3.2, се окаже 0 ± 2 oС, 21 ± 2 oС или 55 ± 2 oС, тя трябва да се потвърди със същия апарат по равновесния метод. В протокола се посочват само методите, чрез които се определя температурата, при която е измерена точката на възпламеняване. За да се определи точката на възпламеняване на вискозни течности (бои, лепила и други подобни), съдържащи разтворители, се използват само апарати и методи за изпитване, подходящи за определяне на точката на възпламеняване на вискозни течности. Вж. ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 част 1.
2. ДАННИ
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Протоколът с резултатите от изпитването трябва по възможност да включва следната информация:
точно определение на веществата (вид и примеси),
съобщава се използваният метод, както и всички възможни отклонения от него,
резултатите и всички допълнителни бележки относно тяхното интерпретиране.
4. ПОЗОВАВАНИЯ Няма.
А.10. ЗАПАЛИМОСТ (ТВЪРДИ ВЕЩЕСТВА)
А.10.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Преди да се проведе това измерване, е полезно да има предварителна информация за потенциалните експлозивни свойства на веществото. Методът трябва да се прилага само върху прахообразни, зърнести или пастообразни вещества. За да не бъдат включвани всички вещества, които могат да се запалват, а само онези, които горят бързо или чието поведение при горене по някакъв начин е особено опасно, за леснозапалими се считат само веществата със скорост на изгаряне, по-висока от някаква гранична стойност. Особено опасно е, ако накаляването до бяло се разпространи през разпрашен метал, защото гасенето на пожара е свързано с много трудности. Разпрашените метали се считат за леснозапалими, ако поддържат разпространението на накаляването през масата си в рамките на определено време.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Време на изгаряне, изразено в секунди.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма определени.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА Веществото се формова в непрекъсната лента или ако е прахообразно, се насипва под формата на лента, дълга около 250 mm. Провежда се предварителен скрийнинг, за да се определи дали при запалване с газова горелка горенето се разпространява с пламък, или започва тлеене. Ако в рамките на определено време горенето се разпространи до над 200 mm от дължината на лентата, се провежда пълната програма за измерване на скоростта на изгаряне.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Не са определени.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
1.6.
1.6.1. Предварителен скрийнинг-метод Веществото се формова в непрекъсната лента или се насипва под формата на купчинка с дължина 250 mm, ширина 20 mm и височина 10 mm върху плоча от негорящ непорьозен материал с ниска топлопроводимост. Горещият пламък на газовата горелка (с минимален диаметър 5 mm) ce допира до единия край на лентата, докато пудрата се запали или най-много за 2 минути (5 минути за разпрашени метали или метални сплави). Трябва да се проследи дали горенето се разпространява до 200 mm от дължината на лентата в рамките на 4 минути (или 40 минути за разпрашени метали). Ако веществото не се запали или не разпространява горенето (чрез изгаряне с пламък или чрез тлеене) до 200 mm от лентата за по-малко от 4 минути (или 40 минути), веществото не се счита за високозапалимо и не е необходимо да се провеждат повече измервания. Ако веществото разпространява горенето на 200 mm дължина за по-малко от 4 минути (или 40 минути за разпрашени метали), трябва да се приложи описаната по-долу процедура (точка 1.6.2 и следващите).
1.6.2. Измерване на скоростта на горене
1.6.2.
1.6.2.1. Подготовка Прахообразните или зърнести вещества се насипват свободно в матрица с дължина 250 mm и триъгълно напречно сечение с височина на вътрешната част 10 mm и ширина 20 mm. От двете страни на матрицата надлъжно се монтират две метални пластини като латерални ограничители. Те изпъкват с 2 mm над горния край на триъгълното сечение (фигура). След това матрицата се пуска три пъти от височина 2 cm върху твърда повърхност и при необходимост се допълва догоре. После латералните ограничители се махат и излишното вещество се изважда. Върху матрицата се поставя плоча от негорящ непорьозен материал с ниска топлопроводимост, приспособлението се обръща и матрицата се отстранява. Пастообразните вещества се разстилат върху плочата от негорящ гладък материал с ниска топлопроводимост под формата на въже с дължина 250 mm и напречно сечение около 1 cm2.
1.6.2.2. Условия на изпитването Ако изпитваното вещество е чувствително към влага, изпитването трябва да се извърши колкото е възможно по-бързо след неговото изваждане от контейнера.
1.6.2.3. Провеждане на изпитването Купчинка от веществото се поставя напречно на въздушния поток във вентилационен шкаф. Скоростта на въздуха трябва да е достатъчно висока, за да се избегне излитането на парите в лабораторията, и не бива да се променя по време на изпитването. Около апарата се издига защитен екран. Горещият пламък от газова горелка (с минимален диаметър 5 mm) ce използва за запалването на купчината от единия край. Когато купчината изгори до дължина 80 mm, ce измерва скоростта на изгаряне на следващите 100 mm. Изпитването се провежда шест пъти (освен ако по-рано не се наблюдава положителен резултат), като всеки път се използва чиста студена плоча.
2. ДАННИ За изчисленията се използват времето на изгаряне, получено от предварителния скрийнинг (1.6.1) и най-краткото време на изгаряне от най-много шест изпитвания (1.6.2.3).
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗМЕРВАНЕТО Протоколът с резултатите от изпитването трябва по възможност да съдържа следната информация:
точно определение на веществото (вид и примеси),
описание на изпитваното вещество, неговото физично състояние, включително съдържанието на влага,
резултати от предварителния скрийнинг и от измерването на скоростта на изгаряне, ако е правено такова,
всички допълнителни бележки относно интерпретирането на резултатите.
3.2. ИНТЕРПРЕТИРАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Прахообразните, зърнестите или пастообразните вещества трябва да се считат за леснозапалими, ако времето на изгаряне, получено при някое от изпитванията съгласно изпитвателната процедура, описана в 1.6.2, е по-малко от 45 секунди. Разпрашените метали или метални сплави се считат за леснозапалими, ако могат да се възпламенят и пламъкът или зоната на реакцията се разпространяват по цялата дължина на образеца за 10 минути или по-малко.
4. ПРЕПРАТКИ NF T 20-042 (SEPT 85), Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.
А.11. ЗАПАЛИМОСТ (ГАЗОВЕ)
А.11.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Този метод позволява да се определи дали газовете, смесени с въздух при стайна температура (до 20 oС) и атмосферно налягане, са запалими и ако е така, в каква област от концентрации става запалването. Смесите с нарастващи концентрации на изпитвания газ във въздух се подлагат на действието на електрическа искра и се наблюдава дали следва запалване.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Областта на запалимост представлява областта от концентрации между горната и долната граница на експлозивност. Горната и долната граница на експлозивност са онези граници на концентрацията на запалимия газ при смесването му с въздуха, при които не се наблюдава разпространяване на пламък.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Не са определени.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА Концентрацията на газа във въздух се увеличава постепенно, като на всяка стъпка сместа се подлага на действието на електрическа искра.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Не са дадени.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
1.6.
1.6.1. Апаратура Измервателният съд представлява изправен стъклен цилиндър с минимален вътрешен диаметър 50 mm и минимална височина 300 mm. Запалителните електроди са разделени на разстояние от 3 до 5 mm и са разположени на височина 60 mm от дъното на цилиндъра. Цилиндърът е снабден с отвор за намаляване на налягането. Апаратът трябва да бъде защитен с екран, за да се ограничат щетите при експлозия. Като средство за запалване се използва стояща индукционна искра с продължителност 0,5 sec, която се генерира от трансформатор за високо напрежение с изходно напрежение от 10 до 15 kV (максимална входна мощност 300 W). Пример за подходящ апарат е описан в препратка (2).
1.6.2. Условия на изпитването Изпитването трябва да се провежда при стайна температура (около 20 oС).
1.6.3. Провеждане на изпитването Смес от газ и въздух с известна концентрация на газа се въвежда в стъкления цилиндър с помощта на пропорционираща помпа. През сместа се прекарва искра и се наблюдава дали пламъкът се отделя самостоятелно от източника на възпламеняване и дали се разпространява независимо. Концентрацията на газа се променя на стъпки от 1 об. %, докато протече запалването по описания по-горе начин. Ако химичната структура на газа показва, че той може да не е запалим и ако стехиометричната му смес с въздуха може да се пресметне, е необходимо да се изпитват на стъпки от 1 % само смеси с концентрации на газа до 10 %, следователно стехиометричният състав е над 10 %.
2. ДАННИ За определянето на това свойство единствената полезна информация е наличието на разпространение на пламъка.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Протоколът с резултатите от изпитването трябва по възможност да съдържа следната информация:
точно определение на веществото (вид и примеси),
описание и размери на използвания апарат,
температурата, при която е проведено изпитването,
измерени концентрации и получени резултати,
резултат от изпитването: незапалим газ или леснозапалим газ,
ако е направено заключението, че газът не е запалим, трябва да се съобщи обхватът от концентрации, в който е проведено изпитването на стъпки от 1 %,
да се отчете цялата информация и всички бележки, свързани с интерпретирането на резултатите.
4.(1)(2) ПРЕПРАТКИ NF T 20-041 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W. Berthold, B. Conrad, T. Grewer, H. Grosse. Einer Standart-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, 126-127. Wortmann, T. Rekker und H. Schacke. 'Entwicklung.
A.12. ЗАПАЛИМОСТ (ПРИ КОНТАКТ С ВОДА)
A.12.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Този метод за изпитване може да се използва, за да се определи дали реакцията на дадено вещество с вода или влажен въздух води до появата на опасно количество от един или няколко газа, които може да се окажат леснозапалими. Методът може да се прилага както за твърди, така и за течни вещества. Той не се прилага за вещества, които се запалват спонтанно при контакт с въздуха.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Леснозапалими: веществата, които при контакт с вода или влажен въздух отделят леснозапалими газове в опасни количества с минимална скорост 1 литър/kg за един час.
1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА Веществото се изпитва съгласно описаната по-долу последователност от стъпки; ако при някоя стъпка протече запалване, не са необходими повече изпитвания. Ако е известно, че веществото не реагира бурно с вода, се продължава до стъпка 4 (1.3.4).
1.3.
1.3.1. Стъпка 1 Изпитваното вещество се поставя в плитък съд, съдържащ дестилирана вода, при 20 oС и се наблюдава дали отделеният газ се запалва или не.
1.3.2. Стъпка 2 Изпитваното вещество се поставя на филтърна хартия, която плува на повърхността на съд, напълнен с дестилирана вода, при 20 oС и се наблюдава дали отделеният газ се запалва. Филтърната хартия е необходима само да задържа веществото на едно място, така че да се увеличи вероятността от запалване.
1.3.3. Стъпка 3 Прави се купчинка от изпитваното вещество с височина приблизително 2 cm и диаметър 3 cm. В купчинката се капват няколко капки вода и се наблюдава дали отделеният газ се запалва.
1.3.4. Стъпка 4 Изпитваното вещество се смесва с дестилирана вода при 20 oС и скоростта на отделяне на газ се измерва в продължение на седем часа на едночасови интервали. Ако скоростта на отделяне на газа е променлива или нараства в края на седемчасовия период, времето на изпитване трябва да се удължи до максимум пет дена. Изпитването се прекратява в момента, в който скоростта на отделяне надвиши 1 литър/kg за час.
1.4. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Не са определени.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Не са дадени.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
1.6.
1.6.1. Стъпка 1
1.6.1.
1.6.1.1. Условия на изпитването Изпитването се провежда при стайна температура (около 20 oС).
1.6.1.2. Провеждане на изпитването Малко количество (приблизително 2 mm в диаметър) от изпитваното вещество се поставя в плитък съд с дестилирана вода. Следи се: i) дали се отделя газ, и ii) дали газът се запалва. Ако се наблюдава запалване на газа, не са необходими повече изпитвания на веществото, защото то се определя като опасно.
1.6.2. Стъпка 2
1.6.2.
1.6.2.1. Приспособление за изпитване Филтърна хартия се поставя да легне на повърхността на дестилирана вода в подходящ съд, например изпарителен съд с диаметър 100 mm.
1.6.2.2. Условия на изпитването Изпитването се провежда при стайна температура (около 20 oС).
1.6.2.3. Провеждане на изпитването Малко количество от изпитваното вещество (приблизително 2 mm в диаметър) се поставя в центъра на филтърната хартия. Следи се: i) дали се отделя газ, и ii) дали газът се запалва. Ако се наблюдава запалване на газа, не са необходими повече изпитвания на веществото, защото то се определя като опасно.
1.6.3. Стъпка 3
1.6.3.
1.6.3.1. Условия на изпитването Изпитването се провежда при стайна температура (около 20 oС).
1.6.3.2. Провеждане на изпитването Оформя се купчинка от изпитваното вещество с височина приблизително 2 cm и диаметър 3 cm, на върха на която се прави вдлъбнатина. Във вдлъбнатината се прибавят няколко капки вода и се следи: i) дали се отделя газ, и ii) дали газът се запалва. Ако се наблюдава запалване на газа, не са необходими повече изпитвания на веществото, защото то се определя като опасно.
1.6.4. Стъпка 4
1.6.4.
1.6.4.1. Апаратура Апаратурата се приготвя, както е показано на фигурата.
1.6.4.2. Условия на изпитването Проверява се дали контейнерът с веществото съдържа прахообразни частици с размери < 500 μm. Ако прахът е повече от 1 тегл. % от общото количество или веществото е ронливо, цялото вещество трябва да се стрие на прах преди изпитването, така че при съхранение или работа с него да няма възможност за намаляване на размера на частиците. В противен случай веществото се изпитва така, както е получено. Изпитването се провежда при стайна температура (около 20 oС) и атмосферно налягане.
1.6.4.3. Провеждане на изпитването От 10 до 20 ml вода се поставят в делителната фуния на апарата. Десет грама от веществото се слагат в коничната колба. Обемът на отделения газ може да се измерва с някое подходящо приспособление. Запушалката на делителната фуния се маха, за да може водата да влиза в коничната колба, и часовникът се пуска. Отделеният газ се измерва на всеки час в продължение на седем часа. Ако по време на този период отделянето на газ е неравномерно или ако в края на периода скоростта на отделяне нараства, изпитването трябва да продължи до максимум пет дена. Ако в даден момент от изпитването скоростта на отделяне на газа надвиши 1 литър/kg за час, изпитването се прекратява. Изпитването се провежда три пъти. Ако химичната природа на газа не е известна, той трябва да се анализира. Когато газът съдържа леснозапалими компоненти и не е известно дали цялата смес не е леснозапалима, трябва да се приготви смес със същия състав и да се изпита по метод А.11.
2. ДАННИ Веществото се счита за опасно, ако:
при някоя от стъпките на изпитвателната процедура настъпи спонтанно запалване, или
има отделяне на запалим газ със скорост, по-голяма от 1 литър/kg вещество за един час.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Протоколът с резултатите от изпитването трябва по възможност да съдържа следната информация:
точно определение на веществото (вид и примеси),
детайлно описание на първоначалното приготвяне на изпитваното вещество,
резултати от изпитванията (стъпки 1, 2, 3 и 4),
химична природа на отделения газ,
скорост на отделяне на газа, ако е била изпълнена стъпка 4 (1.6.4),
всички допълнителни бележки, свързани с интерпретирането на резултатите.
4.(1)(2) ПРЕПРАТКИ Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
А.13. ПИРОФОРНИ СВОЙСТВА НА ТВЪРДИ ВЕЩЕСТВА И ТЕЧНОСТИ
А.13.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Процедурата за изпитване се прилага за твърди и течни вещества, които се запалват спонтанно на стайна температура (около 20 oС), малко след като са влезли в контакт с въздуха. Веществата, които трябва да бъдат изложени на въздух за часове или дни при стайна температура или при нарастващи температури преди да се запалят, не са обект на изпитване по този метод.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Счита се, че пирофорни свойства притежават вещества, които се запалват или овъгляват при условията, описани в 1.6. Самозапалването на течности може да се изпитва също и по метод А.15 Температура на самозапалване (течности и газове).
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Не са определени.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА Веществото, твърдо или течно, се смесва с инертен носител и се привежда в контакт с въздуха при температурата на околната среда за период от пет минути. Ако течните вещества не се запалят, те се абсорбират върху филтърна хартия и се излагат на въздух при температурата на средата (около 20 oС) за пет минути. Ако твърдото вещество или течността се запалят или ако течността се запали или овъгли филтърната хартия, веществото се счита за пирофорно.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Повторяемост: с оглед на безопасността един положителен резултат се счита за достатъчен за причисляване на веществото към пирофорните вещества.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.6.
1.6.1. Апаратура Порцеланова чашка с диаметър към 10 cm се запълва с диатомит до височина приблизително 5 mm при стайна температура (около 20 oС). Забележка: Диатомитът или друго подобно леснодостъпно инертно вещество се приема за представител на почвата, върху която изпитваното вещество може да се разлее в случай на злополука. За изпитването на течности, които не се запалват на въздуха, ако са в контакт с инертен носител, е необходимо да се използва суха филтърна хартия.
1.6.2. Провеждане на изпитването
1.6.2. а)
Прахообразни твърди вещества От 1 до 2 cm3 от изпитваното вещество се изсипват от височина около 1 m върху негоряща повърхност и се наблюдава дали веществото се запалва по време на падането или в рамките на пет минути след това. Процедурата се повтаря шест пъти, освен ако преди това не настъпи запалване.
б)
Течности Около 5 cm3 от изпитваната течност се изливат в предварително приготвена порцеланова чашка и се наблюдава дали веществото ще се запали в рамките на пет минути. Ако след шесткратно повторение на тази процедура не настъпи запалване, се провежда следното изпитване: 0,5 ml от изпитваната проба се изпръскват от спринцовка върху нагъната филтърна хартия и се следи дали филтърната хартия ще се запали или ще се овъгли в рамките на пет минути след прибавянето на течността. Опитът се повтаря три пъти, освен ако запалването или овъгляването на хартията не настъпи по-рано.
2. ДАННИ
2.
2.1. ОБРАБОТВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Изпитването се прекратява веднага след получаване на положителен резултат при някой от опитите.
2.2. ОЦЕНКА НА ДАННИТЕ Ако веществото, смесено с инертен носител, се запали до пет минути след като е изложено на въздуха или ако течността овъгли или изгори филтърната хартия до пет минути след като е накапана върху нея и изложена на въздуха, съответното вещество се счита за пирофорно.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Протоколът с резултатите трябва по възможност да съдържа следната информация:
точно определение на веществото (вид и примеси),
резултати от изпитванията,
всички допълнителни бележки, свързани с интерпретирането на резултатите.
4.(1)(2) ПРЕПРАТКИ NF T 20-039 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.
A.14. ЕКСПЛОЗИВНИ СВОЙСТВА
A.14.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Методът предоставя експериментална схема, предназначена да определи дали дадено твърдо или пастообразно вещество е експлозивно, когато е подложено на действието на пламък (термична чувствителност) или на удар, или триене (чувствителност към механични въздействия) и дали дадена течност може да експлодира под действието на пламък или при удар. Методът се състои от три части: Методът осигурява данни за оценка на вероятността да се причини експлозия чрез някое обичайно въздействие. Той не е предназначен да установява дали веществото може да експлодира при всякакви условия. Методът е подходящ за определяне дали едно вещество е експлозивно (термична и механична чувствителност) при точно определените условия, посочени в директивата. Той се базира на различни типове апарати, широко използвани в много страни (1), които обикновено дават значими резултати. Трябва да се признае, че методът не е окончателен. При него може да се използва и алтернативна апаратура, освен описаната, в случай че тя е международно утвърдена и може да се направи адекватна връзка между получените резултати и тези, получени с установената апаратура. Когато достъпните термодинамични данни (например топлина на образуване, топлина на разлагане) и/или отсъствието на някои функционални групи (2) в структурната формула показват извън всякакво съмнение, че веществото не може да се разлага бързо с отделяне на газове или освобождаване на топлина (т.е. материалът не е експлозивен), не е необходимо да се провеждат изпитвания. За течностите не се изисква изпитване на механична чувствителност при триене.
1.1. а)
изпитване на термичната чувствителност (1);
б)
изпитване на механичната чувствителност при удар (1);
в)
изпитване на механичната чувствителност при триене (1).
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Експлозивни: за експлозивни се считат вещества, които могат да експлодират при действието на пламък или които са чувствителни към удар или триене в определената апаратура (или проявяват по-голяма механична чувствителност от 1,3-динитробензена в алтернативна апаратура).
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ За методите с триене и удар като сравнително вещество се използва кристален 1,3-динитробензен с техническа чистота, пресят до размер на частиците 0,5 mm. За втората серия от изпитвания с триене и удар се използва перхидро-1,3,5-тринитро-1,3,5-триазин (RDX, хексоген, циклонит — CAS 121-82-4), прекристализиран от воден цеклохексанон, пресят във влажно състояние през 250 μm, съхраняван над сито от 150 μm и изсушен при 103 ± 2oС (за 4 часа).
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА За да се определят условията за безопасното провеждане на трите изпитвания на чувствителността, е необходимо да се проведат предварителни изпитвания.
1.4.
1.4.1. Определяне на условията за безопасна работа (3) С оглед на безопасността преди провеждането на основните изпитвания много малки проби (около 10 mg) от веществото се подлагат на нагряване на открито с газова горелка, на удар в някакъв подходящ по форма апарат и на триене с дървен чук върху наковалня или в каква да е по форма фрикционна машина. Целта е да се установи дали веществото е толкова чувствително и експлозивно, че предписаните изпитвания, по-специално тези за термичната чувствителност, трябва да се провеждат със специални предпазни мерки, така че да се избегне нараняването на оператора.
1.4.2. Термична чувствителност Методът включва нагряване на веществото в стоманена тръба, закрита с пластинки с отвори с различен диаметър на дупките, при което се определя дали веществото може да експлодира в условията на интензивно нагряване в затворено пространство.
1.4.3. Механична чувствителност (удар) Методът включва подлагане на веществото на удар с точно определена маса, която се пуска върху него от определена височина.
1.4.4. Механична чувствителност (триене) Методът включва подлагане на твърдото или пастообразно вещество на триене между стандартни повърхности при определени условия на натиск и относителна скорост на движение.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Не са дадени.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
1.6.
1.6.1. Термична чувствителност (ефект от пламък)
1.6.1.
1.6.1.1. Апаратура Апаратът се състои от стоманена тръба за еднократна употреба със затварящи приспособления за многократна употреба (фигура 1), инсталирана в нагревателно защитно устройство. Всяка тръба е направена от лист закалена стомана (вж. допълнението) и има вътрешен диаметър 24 mm, дължина 75 mm и дебелина на стената 0,5 mm. На отворения край на тръбите са монтирани фланци, които позволяват затварянето на тръбите с перфорирани плочи. Приспособлението за затваряне се състои от плочка с централен отвор, устойчива на високо налягане, закрепена здраво за тръбата с помощта на винтово съединение от две части (гайка и резбована втулка). Гайката и резбованата втулка са направени от хромово-магнезиева стомана (вж. допълнението), която не дава искри до 800 oС. Плочките с отворите са с дебелина 6 mm и са направени от термоустойчива стомана (вж. допълнението). Те могат да имат различен диаметър на отворите.
1.6.1.2. Условия на изпитването Обикновено веществата се изпитват във вида, в който са получени, макар че в някои случаи, например ако са пресовани, в отлята форма или сбити по някакъв друг начин, може да се наложи да се натрошат преди изпитването. За твърдите вещества количеството материал, което ще се използва при всяко изпитване, се определя като се използва двуетапна подготвителна процедура. Празна тръба се напълва с 9 cm3 вещество, което се трамбова със сила 80 N, приложена към цялото напречно сечение на тръбата. За по-голяма безопасност или ако физичната форма на пробата може да се промени при натиск, могат да се използват други способи за пълнене на тръбата, например ако веществото е много чувствително на триене, трамбоването не е подходящо. Ако материалът се свие, се прибавя още от него и отново се трамбова, докато тръбата се изпълни до височина 55 mm от горния край. Определя се масата на веществото, необходима да запълни тръбата до това ниво (55 mm). Още на два пъти се прибавя по толкова вещество, което се трамбова също със сила 80 N. След това се прибавя още материал чрез трамбоване или ако е необходимо, се изважда, докато тръбата се напълни на височина 15 mm от горния край. Провежда се второ пробно пълнене на тръбата, като се започне с една трета от количеството, използвано за запълването ѝ при първата проба Прибавя се още два пъти същото количество вещество при трамбоване с 80 N и нивото на веществото се нагласява на 15 mm от горния край, като се добавя или изважда от материала. При следващите изпитвания се използва количеството вещество, определено при второто пробно пълнене на тръбата. Тръбата се пълни, като на три пъти се прибавят равни количества вещество и всеки път обемът на веществото се довежда до 9 cm3 чрез натиск с каквато сила е необходима. (Процедурата може да се улесни, като се използват ограничителни пръстени.) Течностите и геловете се изсипват в тръбата до височина 60 mm, като се внимава, особено при геловете, да не се образуват кухини. Долният край на резбованата втулка се приплъзва върху тръбата, поставя се подходяща плочка с отвор и след като се смаже с малко масло на основата на молибденов дисулфид, гайката се затяга. Важно е да се провери да няма от изпитваното вещество между фланеца и пластинката, а също и в гънките на резбата. Нагряването става с пропан от индустриална бутилка, снабдена с регулатор на налягането (60 до 70 mbar) през дозатор. Пропанът се разпределя равномерно (което се разбира визуално, като се наблюдават пламъците на горелките) чрез тръба с разклонения към четирите горелки. Горелките са разположени около изпитателната камера, както е показано на фигура 1. Четирите горелки общо изразходват около 3,2 литра пропан на минута. Могат да се използват и други горивни газове и горелки, но скоростта на нагряване трябва да бъде такава, каквато е описана на фигура 3. При всички апарати скоростта на нагряване трябва да се проверява периодично, като се използват тръби, напълнени с дибутилфталат, както е отбелязано на фигура 3.
1.6.1.3. Провеждане на изпитванията Всяко изпитване се провежда, докато тръбата се пръсне на парчета. Ако това не стане, нагряването продължава не повече от пет минути. Изпитването, което довежда до фрагментиране на тръбата на три или повече парчета (в някои случаи парчетата са свързани помежду си с тънки ивици метал, както е показано на фигура 2), се отчита като експлозия. За изпитване, при което се получават по-малко парчета или изобщо не настъпва фрагментация, се счита, че не е довело до експлозия. Най-напред се прави серия от три изпитвания с плочки с диаметър на отворите 6,0 mm. Ако не се получи експлозия, се провежда втора серия от три изпитвания с диаметър на отвора 2,0 mm. Ако по време и на двете серии от изпитвания се получат експлозии, не се правят повече изпитвания.
1.6.1.4. Оценка на резултатите Изпитването се счита за положително, ако и при двете описани по-горе серии от изпитвания се получат експлозии.
1.6.2. Механична чувствителност (удар)
1.6.2.
1.6.2.1. Апарат (фигура 4) Най-важните части на един типичен апарат с падащ чук са следните: блок от лята стомана с основа, наковалня, колона, водачи, подвижни тежести, устройство за освобождаване и държател на пробата. Стоманената наковалня с размери 100 mm (диаметър) х 70 mm (височина) е завинтена за горния край на стоманен блок с размери 230 mm (дължина) х 250 mm (ширина) х 200 mm (височина), който има излята основа с размери 450 mm (дължина) х 450 mm (ширина) х 60 mm (височина). Колона, направена от закалена стоманена тръба без спойки, е закрепена здраво с държател, завинтен към задната част на стоманения блок. Четири винта задържат апарата към монолитен бетонен блок с размери 60 х 60 х 60 cm, така че водещите релси да са съвършено вертикални и подвижните тежести да падат свободно (използват се тежести от 5 и 10 kg, направени от плътна стомана). Удрящата повърхност на тежестите е от закалена стомана, HRC от 60 до 63 и има минимален диаметър 25 mm. Измерваната проба е затворена в ударно устройство, съставено от два коаксиални цилиндъра от плътна стомана, разположени един над друг в кух цилиндричен водещ жлеб (също от стомана). Стоманените цилиндри трябва да бъдат с диаметър 10 (-0,003, -0,005) mm и височина 10 mm, да имат полирани повърхности, заоблени краища (радиус на кривината 0,5 mm) и твърдост на HRC от 58 до 65. Кухият цилиндър трябва да бъде с външен диаметър 16 mm, полиран отвор от 10 (+0,005, +0,010) mm и височина 13 mm. Ударното устройство е монтирано върху междинна наковалня (26 mm диаметър и 26 mm височина), направена от стомана и центрована с помощта на пръстен с отвори, които позволяват изпускането на парите.
1.6.2.2. Условия на изпитването Обемът на пробата трябва да бъде 40 mm3 или да е подходящо подбран при използването на алтернативни апарати. Твърдите вещества се измерват в сухо състояние и трябва да се подготвят по следния начин: Веществата, които се доставят в пастообразна форма, се изпитват в сухо състояние. Ако това не е възможно, трябва да се отстрани колкото може по-голямо количество от разредителя. Течностите се изпитват като между долния и горния стоманен цилиндър се оставя пролука от 1 mm.
1.6.2.2. а)
стритите вещества се пресяват през сито с размер на отворите 0,5 mm; целият материал, преминал през ситото, се използва за изпитването;
б)
пресованите, излети или сбити по друг начин вещества се натрошават на малки парченца и се пресяват; пресетите частици с размери между 0,5 и 1 mm в диаметър се използват при изпитването и се смятат за представителна фракция на първоначалното вещество.
1.6.2.3. Провеждане на изпитванията Провежда се серия от шест изпитвания, като тежест с тегло 10 kg ce пуска от височина 0,40 m (40 J). Ако при тези шест опита се получи експлозия, се провежда нова серия, също от шест изпитвания, но като маса с тегло 5 kg ce пуска от височина 0,15 m (7,5 J). В друг апарат пробата се сравнява с избрано сравнително вещество, като се използва предварително установена процедура (например техниката up-and-down или друга).
1.6.2.4. Оценка на резултатите Резултатите от изпитванията се считат за положителни, ако протече експлозия (избухване в пламъци или изгърмяване се равняват на експлозия) поне веднъж при някой от опитите с утвърдения апарат, или ако пробата е по-чувствителна от 1,3-динитробензен или от циклонит при алтернативен начин на изпитване.
1.6.3. Механична чувствителност (триене)
1.6.3.
1.6.3.1. Апарат (фигура 5) Фрикционният апарат се състои от основна плоча, излята от стомана, върху която е монтирано фрикционното устройство. То се състои от фиксиран порцеланов пестик и подвижна порцеланова плочка. Порцелановата плочка е поставена в шейна, която се движи в два водача. Шейната е свързана с електромотор чрез свързващ лост, ексцентрик и подходяща зъбна предавка, така че порцелановата плочка да се придвижва само един път назад и напред под пестика на разстояние 10 mm. Порцелановият пестик може да се натовари например със 120 или 360 нютона. Плоската порцеланова плочка се изработва от бял технически порцелан (грапавост от 9 до 32 μm) и е с размери 25 mm (дължина) х 25 mm (ширина) х 5 mm (височина). Цилиндричният порцеланов пестик също се прави от бял технически порцелан и е дълъг 15 mm, диаметърът му е 10 mm, краищата му са грапави и имат сферична форма с радиус на кривината 10 mm.
1.6.3.2. Условия на изпитването Обемът на пробата трябва да бъде 10 mm3 или друг подходящ за алтернативния апарат. Твърдите вещества се измерват в сухо състояние и се подготвят, както следва: Веществата, които обикновено се доставят в пастообразна форма, се изпитват, ако е възможно, в сухо състояние. Ако веществото не може да се приготви в сухо състояние (след отстраняване на максималното възможно количество от разредителя), то се изпитва под формата на филм с дебелина 0,5 mm, ширина 2 mm и дължина 10 mm, направен в матрица.
1.6.3.2. а)
стритите вещества се пресяват през сито с размер на отворите 0,5 mm; целият материал, преминал през ситото, се използва за измерването;
б)
пресованите, излети или сбити по друг начин вещества се натрошават на малки парченца и се пресяват; пресетите частици с размери < 0,5 mm в диаметър се използват при изпитването.
1.6.3.3. Провеждане на изпитванията Порцелановият пестик се довежда върху изпитваната проба и се натоварва. По време на изпитването грапавините на порцелановата плочка трябва да са разположени напряко на посоката на движението. Трябва да се внимава за следното: пестикът да се опира върху пробата, под него да има достатъчно количество изпитван материал и плочката да се придвижва правилно под пестика. Пастообразните вещества се нанасят върху плочката с помощта на уред с дебелина 0,5 mm и прорез с размери 2 х 10 mm. Порцелановата плочка трябва да изминава 10 mm напред и назад под пестика за време 0,44 секунди. Всяка от повърхностите на плочката и на пестика се използва само веднъж; двата края на всеки пестик служат за два опита, а всяка от двете повърхности на плочката служи за три опита. Провежда се серия от шест измервания с товар от 360 N. Ако по време на тези шест опита се получи положителен резултат, се провежда серия от нови шест измервания при натоварване 120 N. При други апарати пробата се сравнява с избрано сравнително съединение, като се използва утвърдена процедура (например техниката up-and-down или друга).
1.6.3.4. Оценка на резултатите Резултатът от изпитването се смята за положителен, ако се получи експлозия (пращене и/или гръм или избухване в пламъци са равносилни на експлозия) поне веднъж при всеки от опитите с утвърдената фрикционна апаратура, или ако задоволява еквивалентните критерии при алтернативно изпитване.
2. ДАННИ По принцип се счита, че едно вещество е експлозивно по смисъла на директивата, ако е получен положителен резултат при изпитването на термичната чувствителност или на чувствителността при удар или при триене.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ИЗПИТВАНЕ Протоколът от изпитването трябва по възможност да съдържа следната информация:
вид, състав, чистота, съдържание на влага и т.н. на изпитваното вещество,
физична форма на пробата и дали тя е била натрошавана, чупена и/или пресявана,
наблюдения по време на изпитванията на термичната чувствителност (например маса на пробата, брой на фрагментите и др.),
наблюдения при изпитването на механичната чувствителност (образуване на значително количество дим или пълно разлагане с взрив, пламъци, искри, гърмеж, прашене и т.н.),
резултати от всеки вид изпитвания,
ако е използван алтернативен апарат, трябва да се представи научна обосновка, както и доказателство за корелацията между резултатите, получени с утвърдения апарат, и тези, получени с еквивалентния апарат,
всички полезни коментари, като например позоваване на изпитвания на подобни продукти, които може да се отнасят до правилното интерпретиране на резултатите,
всички допълнителни бележки, свързани с интерпретирането на резултатите.
3.2. ИНТЕРПРЕТИРАНЕ И ОЦЕНКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ В протокола от изпитванията трябва да са посочени всички резултати, които са сметнати за погрешни, аномални или непредставителни. Ако някой от резултатите е отхвърлен, трябва да се даде обяснение, както и резултатите от всички алтернативни или спомагателни изпитвания. В случай че отхвърлянето на даден аномален резултат не може да се обясни, той трябва да се приеме за действителен и да се използва при класифицирането на веществото.
4.(1)(2)(3)(4)
ПРЕПРАТКИ Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K. H. and Swart, K. H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 и 30-42. NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of explosion risk.
А.15. ТЕМПЕРАТУРА НА САМОЗАПАЛВАНЕ (ТЕЧНОСТИ И ГАЗОВЕ)
А.15.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Това изпитване не се отнася за експлозивни вещества, както и за веществата, които се самозапалват при контакт с въздуха на стайна температура. Процедурата за изпитване е приложима за газове, течности и пари, които в присъствието на въздух могат да се запалят от нагорещена повърхност. Температурата на самозапалване може да бъде понижена значително при използване на примеси с каталитични свойства, от материала на нагорещената повърхност или поради това, че обемът на измервателния съд е твърде голям.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Степента на самозапалване се изразява чрез температурата на самозапалване. Температурата на самозапалване е най-ниската температура, при която изпитваното вещество се запалва, смесвайки се с въздух при условията, определени в метода.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Веществата за сравнение са посочени в стандартите (вж. 1.6.3). Преди всичко те трябва да служат за периодична проверка на ефикасността на метода, както и да позволяват сравнение с резултатите, получени по други методи.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА Методът определя минималната температура на вътрешната повърхност на затворен съд, която води до запалването на газ, пара или течност, впръскани в съда.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Точността зависи от областта, в която се намира температурата на самозапалване, както и от използвания метод за изпитване. Чувствителността и специфичността зависят от използвания метод за изпитване.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
1.6.
1.6.1. Апаратура Апаратурата е описана в метода, посочен в 1.6.3.
1.6.2. Условия на изпитването Проба от изпитваното вещество се изпитва по метода, посочен в 1.6.3.
1.6.3. Провеждане на изпитването Вж. IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF Т 20-037.
2. ДАННИ Записват се температурата на изпитването, атмосферното налягане, използваното количество от пробата и времето до момента на запалването.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Протоколът с резултатите от изпитването трябва по възможност да съдържа следната информация:
точно идентифициране на веществото (вид и примеси),
количество на пробата; атмосферното налягане,
използван апарат,
резултати от изпитванията (температури, при които са проведени изпитванията, резултати, свързани със запалването; съответни времена до запалването),
всички допълнителни бележки, свързани с интерпретирането на резултатите.
4. ПРЕПРАТКИ Няма.
А.16. ОТНОСИТЕЛНА ТЕМПЕРАТУРА НА САМОЗАПАЛВАНЕ НА ТВЪРДИ ВЕЩЕСТВА
А.16.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Това изпитване не се отнася за експлозивни вещества, както и за вещества, които се самозапалват при контакт с въздух на стайна температура. Целта на това изпитване е да се осигури предварителна информация за самозапалването на твърдите вещества при повишаване на температурата. Ако топлината, която се отделя при взаимодействие на веществото с кислород или при екзотермичното му разлагане, не се разсейва достатъчно бързо в околната среда, се получава самонагряване, което води до самозапалване. Следователно самозапалване настъпва, когато скоростта на топлопроизводството е по-висока от скоростта на топлоотделянето. Процедурата за изпитване се използва като предварителен скрийнинг-метод за твърди вещества. Като се има предвид сложната същност на процесите на запалване и изгаряне на твърди вещества, определената по този метод температура на самозапалване трябва да се използва само за сравнителни цели.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Температурата на самозапалване, получена по този метод, е минималната температура на околната среда в oС, при която определено количество вещество ще се запали при определени условия.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА Определено количество от изпитваното вещество се поставя в пещ при стайна температура; записва се крива температура/време, регистрираща условията в средата на пробата, докато температурата на пещта се повиши до 400 oС (или до точката на топене на веществото, ако тя е по-ниска) при скорост на повишаване 0,5 oC/min. Във връзка с целта на това изпитване температурата на пещта, при която температурата на пробата достигне 400 oС чрез самонагряване, се нарича температура на самозапалване.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
1.6.
1.6.1. Апаратура
1.6.1.
1.6.1.1. Пещ Температурно програмирана лабораторна пещ (вместимост около 2 литра), снабдена с устройство за въздушна циркулация и обезопасена срещу експлозии. За да се избегне потенциалната опасност от взрив, отделените при разлагането на веществото газове не бива да влизат в контакт с електронагревателните елементи.
1.6.1.2. Куб от телена мрежа Парче от телена мрежа с размер на отворите 0,045 mm, направена от неръждаема стомана, се изрязва по начина, показан на фигура 1. Мрежата се сгъва под формата на куб с открит горен край и се закрепва с тел.
1.6.1.3. Термодвойки Подходящи термодвойки.
1.6.1.4. 3аписващо устройство Двуканално записващо устройство от 0 до 600 oС или за съответното напрежение.
1.6.2. Условия на изпитването Веществата се изпитват във вида, в който са получени.
1.6.3. Провеждане на изпитването Кубът се напълва с изпитваното вещество, стръсква се внимателно и се прибавя още вещество, докато се напълни догоре. След това кубът се окачва в центъра на пещта при стайна температура. Едната от термодвойките се поставя в центъра на куба, а другата — между куба и стената на пещта, за да се отчита температурата на пещта. Температурите на пещта и на пробата се записват непрекъснато, докато температурата на пещта се повишава до 400 oС или до точката на топене (ако е по-ниска) при скорост на повишаване 0,5 oC/min. Когато веществото се запали, термодвойката, поставена в него, ще покаже много рязко повишаване на температурата над тази на пещта.
2. ДАННИ За оценяване се използва температурата на пещта, при която температурата на пробата достигне 400 oС чрез самонагряване (вж. фигура 2).
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Протоколът с резултатите от изпитването трябва по възможност да съдържа следната информация:
описание на изпитваното вещество,
резултати от изпитванията, включително кривата температура/време,
всички допълнителни бележки, свързани с интерпретирането на резултатите.
4. ПРЕПРАТКИ NF T 20-036 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.
4.
Фигура 1 Модел на измервателния куб с дължина на страната 20 mm
Фигура 2 Типична крива температура/време
Температура на пробата Температура на пещта Температура на запалване време
А.17. ОКСИДИРАЩИ СВОЙСТВА (ТВЪРДИ ВЕЩЕСТВА)
А.17.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Преди да се проведе това изпитване, ще е от полза да има предварителна информация за евентуалните експлозивни свойства на веществото. Методът е неприложим за течности, газове, експлозивни или леснозапалими вещества, както и за органични пероксиди. Провеждането на това изпитване не е необходимо, когато проучването на структурната формула показва без съмнение, че веществото не реагира екзотермично с горивни материали. За да се разбере дали изпитването трябва да се провежда при специални мерки за сигурност, е необходимо да се направи предварително изпитване.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Време на изгаряне: реакционното време в секунди, необходимо на зоната, в която протича реакцията, да премине по цялата дължина на образеца в съответствие с процедурата, описана в 1.6. Скорост на изгаряне: изразява се в милиметри за секунда. Максимална скорост на изгаряне: най-високата стойност на скоростта на изгаряне, получена при смеси, съдържащи от 10 до 90 тегл. % окислител.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ За изпитването, както и за предварителното изпитване, като вещество за сравнение се използва бариев нитрат с аналитична чистота. Приготвената съгласно точка 1.6 смес от бариев нитрат и прахообразна целулоза се използва като смес за сравнение. Тя има максимална скорост на изгаряне (обикновено това е смес, съдържаща 60 тегл. % бариев нитрат).
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА С оглед на безопасността се провежда предварително изпитване. Ако предварителното изпитване покаже ясно, че изпитваното вещество притежава оксидиращи свойства, не е необходимо да се провеждат повече изпитвания. В противен случай веществото се подлага на пълната процедура за изпитване. При пълното изпитване изпитваното вещество и определено горивно вещество се смесват в различни съотношения. След това от всяка смес се оформя купчинка, която се запалва от единия край. Така определената максимална скорост на изгаряне се сравнява с тази на сравнителната смес.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Всеки метод на стриване и смесване се приема за валиден, в случай че максималната скорост на изгаряне при шест отделни опита се различава от средноаритметичната с не повече от 10 %.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
1.6.
1.6.1. Подготовка
1.6.1.
1.6.1.1. Изпитвано вещество Размерът на частиците на изпитваното вещество се намалява до < 0,125 mm по следния начин: веществото се пресява, остатъчната фракция се стрива и тази процедура се повтаря, докато цялата проба премине през ситото. Може да се използват всякакви методи на стриване и пресяване, стига те да са в съответствие с критериите за качество. Преди да се приготви сместа, веществото се суши при 105 oС до достигане на постоянно тегло. Ако температурата на разлагане на изпитваното вещество е по-ниска от 105 oС, то се суши при подходяща по-ниска температура.
1.6.1.2. Горивно вещество Като горивно вещество се използва прахообразна целулоза. Целулозата трябва да бъде от вид, използван за тънкослойна или за колонна хроматография. Целулоза с дължини на нишките, по-големи от 85 % между 0,020 и 0,075 mm, е подходяща за целта. Разпрашената целулоза се прокарва през сито с размер на порите 0,125 mm. По време на цялото изпитване се използва една и съща партида целулоза. Преди приготвянето на сместа прахообразната целулоза се суши при 105 oС до постоянно тегло. Ако при предварителното изпитване се използва дървесно брашно, то трябва да се приготви от влажна дървесина, като се събере порцията, която преминава през сито с размер на отворите 1,6 mm, разбърква се добре и се суши 4 часа при 105 oС на пласт, не по-дебел от 25 mm. След това се охлажда и се съхранява до употребата в обезвъздушен контейнер, запълнен колкото е възможно повече. За предпочитане е да се използва в рамките на 24 часа след сушенето.
1.6.1.3. Източник на възпламеняване Като източник на възпламеняване се използва горещ пламък от газова горелка (минимален диаметър 5 mm). Ако се използва друг източник (например при изпитване в инертна атмосфера), той трябва да се опише и използването му да се обоснове.
1.6.2. Провеждане на изпитването Забележка: Смесите от окислители и целулоза или дървесно брашно трябва да се третират като потенциално експлозивни и с тях да се работи със съответното внимание.
1.6.2.
1.6.2.1. Предварително изпитване Сухото вещество се смесва добре с изсушената целулоза или дървесно брашно в тегловно съотношение 2 към 1 и сместа се оформя като малка конусовидна купчинка с размери 3,5 cm (диаметър на основата) х 2,5 cm (височина). Оформянето на купчинката става чрез пълнене и трамбоване в конусообразна матрица (например лабораторна стъклена фуния със запушен ствол). Купчинката се поставя върху хладка незапалима гладка плоча с ниска топлопроводимост. Изпитването се провежда във вентилационен шкаф, както е описано в 1.6.2.2. Източникът на възпламеняване се допира до конуса. Интензивността и продължителността на получената реакция се наблюдават и записват. Ако реакцията е бурна, веществото се счита за оксидиращо. В случай че резултатът буди съмнение, е необходимо да се проведе цялата поредица от процедури, описана по-долу.
1.6.2.2. Последователност на изпитвателните процедури Приготвят се смеси от сухото вещество и целулозата със съдържание на сухо вещество от 10 до 90 тегл. %, като концентрацията на веществото нараства с по 10 % при всяка следваща смес. В случай че резултатите са на границата на две концентрации, за да се получи по-точна стойност на максималната скорост на изгаряне, трябва да се приготвят и смеси с междинно съдържание. Купчинката се оформя с помощта на матрица. Матрицата е направена от метал, има дължина 250 mm, триъгълно напречно сечение с височина 10 mm и вътрешна ширина 20 mm. От двете страни на матрицата в надлъжна посока се монтират две метални пластинки като латерални ограничители, които изпъкват с по 2 mm над горния край на триъгълното сечение (вж. фигурата). В това приспособление се насипва свободно малък излишък от сместа. След като матрицата се пусне веднъж от височина 2 cm върху твърда повърхност, излишното вещество се изстъргва с помощта на наклонен лист, латералните ограничители се снемат и останалият прах се заглажда с валяк. След това върху матрицата се поставя плоча от незапалим непорьозен материал с ниска топлопроводимост, приспособлението се обръща и матрицата се отстранява. Купчинката се поставя срещу въздушен поток във вентилационен шкаф. Скоростта на въздушния поток трябва да е достатъчно висока, за да се избегне проникването на дим в лабораторията. Тя не бива да се променя по време на изпитването. Около апарата се издига защитен екран. Тъй като целулозата, както и някои изпитвани вещества, са хигроскопични, изпитването трябва да се проведе колкото е възможно по-бързо. Единият край на купчинката се запалва чрез допиране на пламък. След като зоната на реакцията се разпространи на първоначално разстояние от 30 mm, ce измерва времето на реакцията за следващите 200 mm. Провежда се изпитване със сравнително вещество и поне по едно изпитване със смесите на веществото с целулоза с концентрации в определената област. Ако максималната скорост на изгаряне се окаже значително по-висока от тази на сместа за сравнение, изпитването се прекратява; в противен случай то се провежда по пет пъти за всяка от трите смеси с най-високи скорости на изгаряне. Ако има съмнение, че полученият положителен резултат не е реален, изпитването трябва да се повтори, като вместо целулоза се използва инертно вещество с подобен размер на частиците, например кизелгур. Също така изпитването на сместа (изпитвано вещество-целулоза) с най-висока скорост на изгаряне трябва да се повтори в инертна атмосфера (< 2 об. % съдържание на кислород).
2. ДАННИ От съображения за безопасност като характеристика за оксидиращите свойства на изпитваното вещество се приема максималната скорост на изгаряне, а не средната стойност на скоростта на изгаряне. За оценяване се използва най-високата стойност на скоростта на изгаряне, получена след шест опита с определена смес. Начертава се графика на най-високите стойности на скоростта на изгаряне за всяка смес към концентрациите на окислителя. От графиката се снема максималната скорост на изгаряне. Шестте измерени стойности на скоростта на изгаряне, получени при един опит със сместа с най-висока скорост на изгаряне, не трябва да се различават от средноаритметичната стойност с повече от 10 %; в противен случай методите на стриване и смесване трябва да се подобрят. Сравнява се получената максимална скорост на изгаряне с тази на сравнителното вещество (вж. 1.3). Ако изпитванията се провеждат в инертна атмосфера, максималната скорост на реакцията се сравнява с тази на сместа за сравнение също в инертна атмосфера.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Протоколът от изпитването трябва по възможност да съдържа следната информация:
вид, състав, чистота, влагосъдържание и т.н. на изпитваното вещество,
всяка обработка на изпитваното вещество (например стриване, сушене и т.н.),
източник на възпламеняване, използван при изпитването,
резултати от изпитванията,
начин на протичане на реакцията (например пламък, горящ на повърхността, изгаряне в цялата маса на веществото, информация, свързана с продуктите на изгарянето),
всички допълнителни бележки относно интерпретацията на резултатите, включително описание на интензивността на реакцията (пламъци, искри, дим, бавно тлеене и т.н.) и приблизителната продължителност, получена при предварителния скрийнинг, както за изпитваното, така и за сравнителното вещество,
резултати от изпитвания с инертно вещество, ако има такива,
резултати от изпитвания в инертна атмосфера, ако има такива.
3.2. АНАЛИЗ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Едно вещество се счита за оксидиращо, когато: За да се избегне получаването на неверни положителни резултати, получените при изпитване на смесеното с инертен материал вещество и/или при изпитване в инертна атмосфера данни също трябва да се вземат предвид при интерпретиране на резултатите.
3.2. а)
при предварителното изпитване е протекла бурна реакция;
б)
при провеждането на пълното изпитване максималната скорост на изгаряне на изпитваните смеси е по-голяма или равна на максималната скорост на изгаряне на сместа целулоза-бариев нитрат, използвана за сравнение.
4. ПРЕПРАТКИ NF T 20-035 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.
А.18. СРЕДНО БРОЙНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО И РАЗПРЕДЕЛЕНИЕ НА МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО НА ПОЛИМЕРИ
А.18.
1. МЕТОД Този хроматографски метод с гел инфилтрация е точно копие на метода ОИСР TG 118 (1996 г.). Основните принципи и по-подробна техническа информация са дадени в препратка (1).
1.
1.1. УВОД Тъй като свойствата на полимерите са много разнообразни, не e възможно да се опише един-единствен метод, установяващ точно условията за сепарация и оценка, който да обхваща възможностите и спецификата, които се получават при сепарацията на полимерите. В частност сложните полимерни системи често не се поддават на хроматография с гел инфилтрация (GPC). Когато GPC е неприложима, молекулното тегло се определя с помощта на други методи (виж допълнението). В такива случаи пълните подробности и оценката се правят на базата на използвания метод. Описаният метод се базира на DIN стандарта 55672 (1). В този DIN стандарт може да се намери подробна информация как да се извършат изпитванията и как да се оценят данните. В случай че са необходими модификации на експерименталните условия, тези промени трябва да бъдат оправдани. Могат да се използват и други стандарти, ако са напълно подходящи. Описаният метод използва проби от полистирол с позната полидисперсност за калибровка и може да се наложи да бъде променен, с цел да бъде подходящ за определени полимери, например водоразтворими полимери и полимери с дълги разклонени вериги.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Средното бройно молекулно тегло Мn и средното тегловно молекулно тегло Mw ce определят с помощта на следните уравнения: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi където: Hi = нивото на детекторния сигнал от базовата линия на обема на задържане Vi, Mi = молекулното тегло на полимерната фракция при обема на задържане Vi, и n = броя на точките с данни. Широчината на разпределение на молекулното тегло, която е мярка за дисперсността на системата, се изразява чрез съотношението Mw/Mn.
1.3. ЕТАЛОННИ ВЕЩЕСТВА Тъй като GPC е относителен метод, трябва да се извърши калибровка. За целта обикновено се използват полистиролови стандарти с линеен строеж и тясно разпределение, с известни средни молекулни тегла Мn и Mw и известно молекулно тегловно разпределение. Калибрационната крива може да се използва само при определяне на молекулното тегло на непозната проба, ако условията за разделяне на пробата и стандартите са били подбрани по идентичен способ. Една установена връзка между молекулното тегло и елуиращия обем е валидна само при специфичните условия на даденото изпитване. Условията включват преди всичко температурата, разтворителя (или сместа от разтворители), хроматографските условия и сепарационната колона или система от колони. Молекулните тегла на пробата, определени по този начин, са относителни стойности и се описват като полистиролови еквивалентни молекулни тегла. Това означава, че в зависимост от структурните и химическите различия между пробата и стандартите, молекулните тегла могат да се отклоняват от абсолютните стойности в по-голяма или по-малка степен. Ако се използват други стандарти, например полиетиленгликол, полиетиленов окис, полиметил метакрилат, полиакрилна киселина, трябва да се посочи причината за това.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА Както разпределението на молекулното тегло на пробата, така и нейните средни молекулни тегла (Mn, Mw) могат да се определят чрез GPC. GPC е специален тип течна хроматография, при която пробата се сепарира според хидродинамичните обеми на отделните съставни части (2). Сепарацията се извършва, като пробата преминава през колона, която е пълна с порест материал, обикновено органичен гел. Малките молекули могат да проникват през порите, докато големите молекули не могат. Следователно пътеката на по-големите молекули е по-къса и те елуират първи. Молекулите със среден размер проникват през някои от порите и елуират по-късно. Най-малките молекули, със среден хидродинамичен радиус, по-малък от този на порите на гела, могат да проникват през всички пори. Те елуират последни. В идеалния случай сепарацията се контролира изцяло от размера на молекулните видове, но на практика е трудно да се избегнат поне някои от абсорбционните ефекти, които смущават процеса. Неравномерната облицовка на колоната и мъртвите обеми могат да влошат ситуацията (2). Детекцията се извършва например чрез рефрактивен индекс или UV-абсорбция и се получава проста крива на разпределението. За да се прибавят обаче действителните стойности на молекулните тегла към кривата, е необходимо да се калибрира колоната, като през нея се пуснат полимери с познато молекулно тегло и в идеалния случай, с доста широка подобна структура, например различни полистиролови стандарти. Резултатът е типична крива на Gaussian, на места изкривена от малка опашка по посока на страната с ниско молекулно тегло, като вертикалната ос показва количеството по тегло на различните елуирани видове молекулни тегла, а хоризонталната ос показва регистрираното молекулно тегло.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Повторяемостта (относителното стандартно отклонение — Relative Standard Deviation (RSD) на елуиращия обем трябва да бъде по-добра от 0,3 %. Желаната повторяемост на анализа трябва да се гарантира чрез корекция през вътрешен стандарт, ако хроматограмата се оценява в зависимост от времето и не отговаря на горепосочените критерии (1). Полидисперсностите зависят от молекулните тегла на стандартите. В случая с полистироловите еталони типичните стойности са: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Мр е молекулното тегло на еталона при максималния пик)
1.6. ОПИСАНИЕ НА ИЗПИТВАТЕЛНИЯ МЕТОД
1.6.
1.6.1. Подготовка на стандартните полистиролови разтвори Полистироловите стандарти се разтварят чрез внимателно смесване в избрания елуент. При подготовката на разтворите трябва да се вземат предвид препоръките на производителя. Концентрациите на избраните стандарти зависят от различни фактори, например обем на инжектиране, вискозитет на разтвора и чувствителност на аналитичния детектор. Максималният обем на инжектиране трябва да се адаптира към дължината на колоната, с цел да се избегне претоварване. Типичните обеми на инжектиране за аналитична сепарация чрез GPC с колона 30 cm х 7,8 mm обикновено са между 40 и 100 μl. Възможни са и по-големи обеми, но те не трябва да превишават 250 μl. Оптималното съотношение между обема на инжектиране и концентрацията трябва да се определи преди действителната калибровка на колоната.
1.6.2. Подготовка на разтвора проба Принципно при подготовката на разтворите проби се прилагат същите изисквания. Мострата се разтваря в подходящ разтворител, например тетрахидрофуран (THF), чрез старателно разклащане. Тя не трябва при никакви обстоятелства да се разтваря с помощта на ултразвукова баня. Когато е необходимо, разтворът проба се пречиства през мембранен филтър с размер на порите между 0,2 и 2 μm. Присъствието на неразтворени частици трябва да се отчете във финалния протокол, тъй като тези частици може да се дължат на високомолекулни видове. Трябва да се използва подходящ метод за определяне процента на теглото на разтворените частици. Разтворите трябва да се използват в рамките на 24 часа.
1.6.3. Апаратура Трябва да се гарантира, че GPC системата е инертна по отношение на използваните разтворители (например чрез използване на стоманени капиляри за THF-разтворителя).
резервоар за разтворител,
дегазатор (когато е уместно),
помпа,
гасител на пулсации (когато е уместно),
инжекторна система,
хроматографски колони,
детектор,
разходомер за дебит (когато е уместно),
процесор-рекордер за данни,
съд за отпадъци.
1.6.4. Система за инжектиране и подаване на разтворител Към колоната се подава определен обем разтвор на пробата, автоматично или ръчно, в строго определена зона. Твърде бързото издърпване или натискане на буталото на помпата, ако се прави ръчно, може да причини промени в наблюдаваното разпределение на молекулното тегло. Системата за подаване на разтворител трябва, доколкото е възможно, да няма пулсации, включвайки гасител на пулсации в идеалния случай. Дебитът е от порядъка на 1 ml/min.
1.6.5. Колона В зависимост от пробата полимерът може да се охарактеризира или с помощта на проста колона, или чрез няколко колони, свързани последователно. На пазара се предлагат порести материали за колони с определени свойства (например размер на порите, лимити на изключване). Изборът на сепарационен гел или на дължина на колоната зависи както от свойствата на пробата (хидродинамични обеми, разпределение на молекулното тегло), така и от специфичните условия за сепарация като разтворител, температура и дебит (1) (2) (3).
1.6.6. Теоретични пластини Колоната или комбинацията от колони, използвани за сепарация, трябва да се охарактеризират чрез броя на теоретичните пластини. Това включва, в случая на THF като елуиращ разтворител, подаване на разтвор на етилбензол или друг подходящ неполярен разтвор към колона с позната дължина. Броят на теоретичните пластини се определя чрез следното уравнение: N=5,54VeW1/22 или: N=16VeW2 където: N броя на теоретичните пластини Ve елуиращия обем при максималния пик W пика на широчината на базовата линия W1/2 пиковата широчина при половин височина.
1.6.7. Сепарационна производителност Освен броя на теоретичните пластини, който е количество, определящо широчината на зоната, известна роля играе и сепарационната производителност, която се определя от стръмността на калибрационната крива. Сепарационната производителност на една колона се получава от следната зависимост: Vey, Mx-Vey(10Mx)площма на напречномо сечение на колоната≥6,0 cm2cm3 където: Vey, Mx елуиращия обем за полистирол с молекулно тегло Мх Vey(10Mx) елуиращия обем за полистирол с 10 пъти по-голямо молекулно тегло. Резолюцията на системата обикновено се определя, както следва: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 където: Ve1, Ve2 елуиращите обеми на двата полистиролови стандарта в максималния пик W1, W2 пиковите широчини в базовата линия M1, M2 молекулните тегла в максималния пик (трябва да се различават с коефициент 10). R-стойността на системата колони трябва да бъде по-голяма от 1,7 (4).
1.6.8. Разтворители Всички разтворители трябва да бъдат с висока чистота (за THF ce използва чистота 99,5 %). Резервоарът за разтворител (ако е необходимо в атмосфера от инертен газ) трябва да е достатъчно голям за калибровката на колоната и няколко анализа на проби. Разтворителят трябва да се дегазира, преди да бъде транспортиран през помпата.
1.6.9. Температурен контрол Температурата на критичните вътрешни компоненти (инжекторна верига, колони, детектор и тръбна инсталация) трябва да бъде постоянна и съвместима с избора на разтворител.
1.6.10. Детектор Предназначението на детектора е да отчита количествено концентрацията на пробата, елуирала от колоната. С цел да се избегне ненужното разширяване на пиковете, обемът на кюветката на детекторната клетка трябва да се поддържа възможно най-малък. Той не трябва да бъде по-голям от 10 μ1, освен при разсейване и детектори за вискозитет. За детекция обикновено се използва диференциална рефрактометрия. Въпреки това, ако специфичните свойства на пробата или на елуиращия разтвор го изискват, може да се използват други видове детектори, например UV/VIS, IR, детектори за вискозитет и т.н.
2. ДАННИ И ОТЧИТАНЕ
2.
2.1. Данни Подробните оценъчни критерии, както и изискванията относно събирането и обработката на данни, са посочени в DIN стандарт (1). За всяка проба трябва да се извършат два независими опита. Те се анализират индивидуално. При всяко измерване се обезпечават Mn, Mw, Mw/Mn и Мр. Необходимо е изрично да се посочи, че измерените стойности са относителни стойности, еквивалентни на молекулните тегла на използвания стандарт. След определяне на обемите на задържане или времената на задържане (които може да са коригирани чрез вътрешен стандарт), регистрираните Мр стойности (Мр като максимален пик на калибрационния стандарт) се изчертават спрямо едно от тези количества. Необходими са поне две калибрационни точки за десет молекулни тегла и поне пет измервателни точки за цялата крива, които трябва да покриват очакваното молекулно тегло на пробата. Прекъсващата точка с нискомолекулно тегло на калибрационната крива се определя от n-хексилбензола или друг подходящ неполярен разтворител. Бройните и тегловните средни молекулни тегла обикновено се определят с помощта на електронна обработка на данните, на базата на формулите в точка 1.2. В случай че се използва ръчна цифровизация на данните, може да се обърнете към ASTM D 3536-91 (3). Кривата на разпределението трябва да се направи под формата на таблица или като диаграма (диференциална честота или сума на процентите спрямо отчетените М). При графичното представяне една декада от молекулни тегла трябва да има около 4 cm широчина и максималният пик да има около 8 cm височина. При интегрални криви на разпределение разликата в ординатата между 0 и 100 % трябва да бъде около 10 cm.
2.2. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Протоколът от изпитването трябва да включва следна информация:
2.2.
2.2.1. Изпитвано вещество
налична информация за изпитваното вещество (идентичност, добавки, примеси),
описания на обработката на пробата, наблюдения, проблеми.
2.2.2. Оборудване
резервоар за елуент, инертен газ, дегазиране на елуента, състав на елуента, примеси,
помпа, гасител на пулсации, инжекторна система,
сепарационни колони (производител, пълна информация за характеристиките на колоните, като размер на порите, вид на сепарационния материал, брой, дължина и ред на използваните колони),
брой на теоретичните пластини на колоната (или комбинацията от колони), сепарационна производителност (резолюция на системата),
информация за симетрията на пиковете,
температура на колоната, вид на температурния контрол,
детектор (принцип на измерване, тип, обем на кюветката),
разходомер, ако се използва (производител, принцип на измерване),
система за записване и обработка на данните (хардуер и софтуер).
2.2.3. Калибровка на системата
подробно описание на метода, използван за построяване на калибрационната крива,
информация за критериите за качество при този метод (например корелационен коефициент, квадратична сума на грешките и т.н.),
информация за всички екстраполации, допускания и приближения, направени по време на експерименталната процедура, а също и за оценката и обработката на данните,
всички измервания, използвани за построяване на калибрационната крива, трябва да са документирани в таблица, която включва следната информация за всяка калибрационна точка:
име на пробата,
производител на пробата,
характерни стойности на стандартите Мр, Mn, Mw и Mw/Mn, дадени от производителя или получени при последващи измервания, заедно с подробностите за метода на определяне,
инжекторен обем или инжекторна концентрация,
стойност на Мр, използвана за калибровка,
елуиращ обем или коригирано време на задържане, измерено в максималния пик,
Мр, изчислено при максималния пик,
процентна грешка на изчисленото Мр и калибрационната стойност.
2.2.4. Оценка
оценка на база време: методи, използвани за обезпечаване на необходимата възпроизводимост (метод на корекция, вътрешен стандарт и т.н.),
информация дали оценката е била извършена на базата на елуиращия обем или на базата на времето на задържане,
информация за лимитите на оценката, ако пикът не е напълно анализиран,
описание на методите за изглаждане, ако са използвани такива,
подготовка и предварителни процедури преди обработката на пробата,
наличие на неразтворени частици, ако има,
инжекторен обем (μ1) и инжекторна концентрация (mg/ml),
наблюдения, посочващи ефекти, които водят до отклонения от идеалния GPC профил,
подробно описание на всички модификации в изпитвателните процедури,
подробности за диапазоните на грешките,
всякаква друга информация и наблюдения, подходящи за интерпретация на резултатите.
3.(1)(2)(3)(4)
ПРЕПРАТКИ DIN 55672, 1995. Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, 1979. Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, 1991. Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography – GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, 1992. Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
A.19. НИСКОМОЛЕКУЛНО ТЕГЛОВНО СЪДЪРЖАНИЕ НА ПОЛИМЕРИ
A.19.
1. МЕТОД Този хроматографски метод с гел инфилтрация е точно копие на метода ОИСР TG 119 (1996 г.). Основните принципи и по-подробна техническа информация са дадени в препратките.
1.
1.1. УВОД Тъй като свойствата на полимерите са много разнообразни, не е възможно да се опише един-единствен метод, установяващ точно условията за сепарация и оценка, който да обхваща възможностите и спецификата, които се получават при сепарацията на полимерите. По-специално сложните полимерни системи често не се поддават на хроматография с гел инфилтрация (GPC). Когато GPC е неприложима, молекулното тегло се определя с помощта на други методи (вж. допълнението). В такива случаи пълните подробности и оценката се правят на базата на използвания метод. Описаният метод се базира на DIN стандарта 55672 (1). В този DIN стандарт може да се намери подробна информация как да се извършат изпитванията и как да се оценят данните. В случай че са необходими модификации на условията на изпитване, тези промени трябва да бъдат оправдани. Могат да се използват и други стандарти, ако са напълно подходящи. Описаният метод използва проби от полистирол с позната полидисперсност за калибровка и може да се наложи да бъде променен, с цел да бъде подходящ за определени полимери, например водоразтворими полимери и полимери с дълги разклонени вериги.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Нискомолекулното тегло условно се определя като молекулно тегло под 1000 далтона. Средното бройно молекулно тегло Мn и средното тегловно молекулно тегло Mw ce определят с помощта на следните уравнения: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1HixMiΣni=1Hi където: Hi нивото на детекторния сигнал от базовата линия на обема на задържане Vi, Mi молекулното тегло на полимерната фракция при обема на задържане Vi, и n броя на точките с данни. Широчината на разпределение на молекулното тегло, която е мярка за дисперсността на системата, се изразява чрез съотношението Mw/Mn.
1.3. ЕТАЛОННИ ВЕЩЕСТВА Тъй като GPC е относителен метод, трябва да се извърши калибровка. За целта обикновено се използват полистиролови стандарти с линеен строеж и тясно разпределение, с познати средни молекулни тегла Мn и Mw и познато молекулно тегловно разпределение. Калибрационната крива може да се използва само при определяне на молекулното тегло на непозната проба, ако условията за разделяне на пробата и стандартите са били подбрани по идентичен способ. Една установена връзка между молекулното тегло и елуиращия обем е валидна само при специфичните условия на даденото изпитване. Условията включват преди всичко температурата, разтворителя (или сместа от разтворители), хроматографските условия и сепарационната колона или система от колони. Молекулните тегла на пробата, определени по този начин, са относителни стойности и се описват като полистиролови еквивалентни молекулни тегла. Това означава, че в зависимост от структурните и химическите различия между пробата и стандартите, молекулните тегла могат да се отклоняват от абсолютните стойности в по-голяма или по-малка степен. Ако се използват други стандарти, например полиетиленгликол, полиетиленов окис, полиметил метакрилат, полиакрилна киселина, трябва да се посочи причината за това.
1.4. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАТЕЛНИЯ МЕТОД Както разпределението на молекулното тегло на пробата, така и нейните средни молекулни тегла (Mn, Mw) могат да се определят чрез GPC. GPC е специален тип течна хроматография, при която пробата се сепарира според хидродинамичните обеми на отделните съставни части (2). Сепарацията се извършва, като пробата преминава през колона, която е пълна с порест материал, обикновено органичен гел. Малките молекули могат да проникват през порите, докато големите молекули не могат. Следователно пътят на по-големите молекули е по-къс и те елуират първи. Молекулите със среден размер проникват през някои от порите и елуират по-късно. Най-малките молекули, със среден хидродинамичен радиус, по-малък от този на порите на гела, могат да проникват през всички пори. Те елуират последни. В идеалния случай сепарацията се контролира изцяло от размера на молекулните видове, но на практика е трудно да се избегнат поне някои от абсорбционните ефекти, които смущават процеса. Неравномерната облицовка на колоната и мъртвите обеми могат да влошат ситуацията (2). Детекцията се извършва например чрез рефрактивен индекс или UV-абсорбция и се получава проста крива на разпределението. За да се прибавят обаче действителните стойности на молекулните тегла към кривата, е необходимо да се калибрира колоната, като през нея се пуснат полимери с известно молекулно тегло и в идеалния случай с доста широка подобна структура, например различни полистиролови стандарти. Резултатът е типична крива на Gaussian, на места изкривена от малка опашка по посока на страната с ниско молекулно тегло, като вертикалната ос показва количеството по тегло на различните елуирани видове молекулни тегла, а хоризонталната ос показва регистрираното молекулно тегло. Съдържанието на нискомолекулно тегло се получава от тази крива. Изчислението може да бъде точно само ако нискомолекулните видове реагират еквивалентно на база маса спрямо полимера като цяло.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Повторяемостта (относителното стандартно отклонение — Relative Standard Deviation (RSD) на елуиращия обем трябва да бъде по-добра от 0,3 %. Желаната повторяемост на анализа трябва да се гарантира чрез корекция през вътрешен стандарт, ако хроматограмата се оценява в зависимост от времето и не отговаря на горепосочените критерии (1). Полидисперсностите зависят от молекулните тегла на стандартите. В случая с полистироловите еталони типичните стойности са: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000< Mp< 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Мр е молекулното тегло на еталона при максималния пик)
1.6. ОПИСАНИЕ НА ИЗПИТВАТЕЛНИЯ МЕТОД
1.6.
1.6.1. Подготовка на стандартните полистиролови разтвори Полистироловите стандарти се разтварят чрез внимателно смесване в избрания елуент. При подготовката на разтворите трябва да се вземат предвид препоръките на производителя. Концентрациите на избраните стандарти зависят от различни фактори, например обем на инжектиране, вискозитет на разтвора и чувствителност на аналитичния детектор. Максималният обем на инжектиране трябва да се адаптира към дължината на колоната, с цел да се избегне претоварване. Типичните обеми на инжектиране за аналитична сепарация чрез GPC с колона 30 cm х 7,8 mm, са обикновено между 40 и 100 μl. Възможни са и по-големи обеми, но те не трябва да превишават 250 μl. Оптималното съотношение между обема на инжектиране и концентрацията трябва да се определи преди действителната калибровка на колоната.
1.6.2. Подготовка на разтвора проба Принципно при подготовката на разтворите проби се прилагат същите изисквания. Мострата се разтваря в подходящ разтворител, например тетрахидрофуран (THF), чрез старателно разклащане. Тя не трябва при никакви обстоятелства да се разтваря с помощта на ултразвукова баня. Когато е необходимо, разтворът проба се пречиства през мембранен филтър с размер на порите между 0,2 и 2 μm. Присъствието на неразтворени частици трябва да се отчете във финалния протокол, тъй като тези частици може да се дължат на високомолекулни видове. Трябва да се използва подходящ метод за определяне процента на теглото на разтворените частици. Разтворите трябва да се използват в рамките на 24 часа.
1.6.3. Корекция на съдържанието на примеси и добавки Обикновено не се налага корекцията на съдържанието на видове с M < 1000 поради приноса от присъстващите неполимерни специфични компоненти (например примеси и/или добавки), освен ако измереното съдържание вече е < 1 %. Това се постига чрез пряк анализ за полимерния разтвор или GPC елуат. В случаите, когато елуатът, след преминаване през колоната, е твърде разреден за по-нататъшен анализ, той трябва да се концентрира. За целта може би ще е необходимо да се изпари елуатът до изсушаване и да се разтвори отново. Концентрацията на елуата трябва да се извърши при условия, които да не допускат никакви промени в елуата. Обработката на елуата след GPC зависи от използвания аналитичен метод за количествено определяне.
1.6.4. Апаратура GPC-апаратурата се състои от следните компоненти: Трябва да се гарантира, че GPC системата е инертна по отношение на използваните разтворители (например, чрез използване на стоманени капиляри за THF-разтворителя).
резервоар за разтворител,
дегазатор (ако е необходимо),
помпа,
гасител на пулсации (ако е необходимо),
инжекторна система,
хроматографски колони,
детектор,
разходомер за дебит (ако е необходимо),
процесор-рекордер за данни,
съд за отпадъци.
1.6.5. Система за инжектиране и подаване на разтворител Към колоната се подава определен обем разтвор на пробата или автоматично, или ръчно в строго определена зона. Твърде бързото издърпване или натискане на буталото на помпата, ако се прави ръчно, може да причини промени в наблюдаваното разпределение на молекулното тегло. Системата за подаване на разтворител трябва, доколкото е възможно, да няма пулсации, включвайки гасител на пулсации в идеалния случай. Дебитът е от порядъка на 1 ml/min.
1.6.6. Колона В зависимост от пробата полимерът може да се охарактеризира или с помощта на проста колона, или чрез няколко колони, свързани последователно. На пазара се предлагат порести материали за колони с определени свойства (например размер на порите, лимити на изключване). Изборът на сепарационен гел или на дължина на колоната зависи както от свойствата на пробата (хидродинамични обеми, разпределение на молекулното тегло), така и от специфичните условия за сепарация, като разтворител, температура и дебит (1) (2) (3).
1.6.7. Теоретични пластини Колоната или комбинацията от колони, използвана(и) за сепарация, трябва да се охарактеризира(т) чрез броя на теоретичните пластини. Това включва, в случая на THF като елуиращ разтворител, подаване на разтвор на етилбензол или друг подходящ неполярен разтвор към колона с известна дължина. Броят на теоретичните пластини се определя чрез следното уравнение: N=5,54VeW1/22 или N=16VeW2 където: N броя на теоретичните пластини Ve елуиращия обем при максималния пик W пика на широчината на базовата линия W1/2 е пиковата широчина при половин височина
1.6.8. Сепарационна производителност Освен броя на теоретичните пластини, който е количество, определящо широчината на зоната, известна роля играе и сепарационната производителност, която се определя от стръмността на калибрационната крива. Сепарационната производителност на една колона се получава от следната зависимост: VeyMx-Vey(10Mx)площма на напречномо сечение на колоната≥6,0cm2cm3 VeyMx елуиращия обем за полистирол с молекулно тегло Мх Vеу(10Мх) елуиращия обем за полистирол с 10 пъти по-голямо молекулно тегло. Резолюцията на системата обикновено се определя, както следва: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 където, Ve1, Ve2 елуиращите обеми на двата полистиролови стандарта в максималния пик W1, W2 пиковите широчини в базовата линия M1, M2 молекулните тегла в максималния пик (трябва да се различават с коефициент 10). R-стойността на системата колони трябва да бъде по-голяма от 1,7 (4).
1.6.9. Разтворители Всички разтворители трябва да бъдат с висока чистота (за THF ce използва чистота 99,5 %). Резервоарът за разтворител (ако е необходимо в атмосфера от инертен газ) трябва да е достатъчно голям за калибровката на колоната и няколко анализа на проби. Разтворителят трябва да се дегазира, преди да бъде транспортиран през помпата.
1.6.10. Температурен контрол Температурата на критичните вътрешни компоненти (инжекторна верига, колони, детектор и тръбна инсталация) трябва да бъде постоянна и съвместима с избора на разтворител.
1.6.11. Детектор Предназначението на детектора е да отчита количествено концентрацията на пробата, елуирала от колоната. С цел да се избегне ненужното разширяване на пиковете, обемът на кюветката на детекторната клетка трябва да се поддържа възможно най-малък. Той не трябва да бъде по-голям от 10 μl, освен при разсейване и детектори за вискозитет. За детекция обикновено се използва диференциална рефрактометрия. Въпреки това, ако специфичните свойства на пробата или на елуиращия разтвор го изискват, може да се използват други видове детектори, например UV/VIS, IR, детектори за вискозитет и т.н.
2. ДАННИ И ОТЧИТАНЕ
2.
2.1. ДАННИ Подробните оценъчни критерии, както и изискванията относно събирането и обработката на данни, са посочени в DIN стандарт (1). За всяка проба трябва да се извършат два независими опита. Те се анализират индивидуално. При всички случаи е важно да се определят също данните от контролните опити, обработени при същите условия както пробата. Необходимо е изрично да се посочи, че измерените стойности са относителни стойности, еквивалентни на молекулните тегла на използвания стандарт. След определяне на обемите на задържане или времената на задържане (които може да са коригирани чрез вътрешен стандарт), регистрираните Мр стойности (Мр като максимален пик на калибрационния стандарт) се изчертават спрямо едно от тези количества. Необходими са поне две калибрационни точки за една декада молекулни тегла и поне пет измервателни точки за цялата крива, които трябва да покриват очакваното молекулно тегло на пробата. Прекъсващата точка с нискомолекулно тегло на калибрационната крива се определя от n-хексилбензола или друг подходящ неполярен разтворител. Частта от кривата, съответстваща на молекулни тегла под 1000, се определя и коригира, както е необходимо за примеси и добавки. Елуиращите криви обикновено се оценяват чрез електронна обработка на данните. В случай че се използва ръчна цифровизация на данните, може да направите справка в ASTM D 3536-91 (3). Ако в колоната се задържи някакъв неразтворим полимер, неговото молекулно тегло вероятно ще бъде по-високо от това на разтворимата фракция и ако не се отчете, ще резултира в надценяване на съдържанието на нискомолекулно тегло. В допълнението е дадено ръководство за съдържание на нискомолекулно тегло за неразтворим полимер. Кривата на разпределението трябва да се направи под формата на таблица или като диаграма (диференциална честота или сума на процентите спрямо отчетените М). При графичното представяне една декада от молекулни тегла трябва да има около 4 cm широчина и максималният пик да има около 8 cm височина. При интегралните криви на разпределение разликата в ординатата между 0 и 100 % трябва да бъде около 10 cm.
2.2. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Протоколът от изпитването трябва да включва следна информация:
2.2.
2.2.1. Изпитвано вещество
налична информация за изпитваното вещество (идентичност, добавки, примеси),
описания на обработката на пробата, наблюдения, проблеми.
2.2.2. Оборудване
резервоар за елуент, инертен газ, дегазиране на елуента, състав на елуента, примеси,
помпа, гасител на пулсации, инжекторна система,
сепарационни колони (производител, пълна информация за характеристиките на колоните, като размер на порите, вид на сепарационния материал, брой, дължина и ред на използваните колони),
брой на теоретичните пластини на колоната (или комбинацията от колони), сепарационна производителност (резолюция на системата),
информация за симетрията на пиковете,
температура на колоната, вид на температурния контрол,
детектор (принцип на измерване, тип, обем на кюветката),
разходомер, ако се използва (производител, принцип на измерване),
система за записване и обработка на данните (хардуер и софтуер).
2.2.3. Калибровка на системата
подробно описание на метода, използван за построяване на калибрационната крива,
информация за критериите за качество при този метод (например корелационен коефициент, квадратична сума на грешките и т.н.),
информация за всички екстраполации, допускания и приближения, направени по време на изпитвателната процедура, а също и за оценката и обработката на данните,
всички измервания, използвани за построяване на калибрационната крива, трябва да са документирани в таблица, която включва следната информация за всяка калибрационна точка:
име на пробата,
производител на пробата,
характерни стойности на стандартите Мр, Mn, Mw и Mw/Mn, дадени от производителя или получени при последващи измервания, заедно с подробностите за метода на определяне,
инжекторен обем или инжекторна концентрация,
стойност на Мр, използвана за калибровка,
елуиращ обем или коригирано време на задържане, измерено в максималния пик,
Мр, изчислено при максималния пик,
процентна грешка на изчисленото Мр и калибрационната стойност.
2.2.4. Информация за съдържанието на полимер с нискомолекулно тегло
описание на методите, използвани в анализа, и начина, по който са проведени изпитванията,
информация за процента на съдържанието на видове полимери с нискомолекулно тегло (т/т), отнесен към общата проба,
информация за примесите, добавките и други неполимерни видове, в тегловен процент, отнесен към общата проба.
2.2.5. Оценка
оценка на база време: всички методи, използвани за обезпечаване на необходимата възпроизводимост (метод на корекция, вътрешен стандарт и т.н.),
информация дали оценката е била извършена на базата на елуиращия обем, или на базата на времето на задържане,
информация за лимитите на оценката, ако пикът не е напълно анализиран,
описание на методите за изглаждане, ако са използвани такива,
подготовка и предварителни процедури преди обработката на пробата,
наличие на неразтворени частици, ако има,
инжекторен обем (μl) и инжекторна концентрация (mg/ml),
наблюдения, посочващи ефекти, които водят до отклонения от идеалния GPC-профил,
подробно описание на всички модификации в изпитвателните процедури,
подробности за диапазоните на грешките,
всякаква друга информация и наблюдения, подходящи за интерпретация на резултатите.
3.(1)(2)(3)(4)
ПРЕПРАТКИ DIN 55672, 1995. Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds., 1979. Modem Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, 1991. Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography — GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, 1992. Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
А.20. ПОВЕДЕНИЕ НА РАЗТВАРЯНЕ/ЕКСТРАКЦИЯ НА ПОЛИМЕРИ ВЪВ ВОДА
А.20.
1. МЕТОД Описаният метод е точно копие на преработената версия на ОИСР TG 120 (1997 г.). По-подробна техническа информация е дадена в препратка (1).
1.
1.1. УВОД За някои полимери, като емулсионните полимери например, вероятно ще бъде необходима първоначална подготвителна работа, преди да се използва описаният по-долу метод. Този метод не е приложим за течни полимери и за полимери, които взаимодействат с вода при условията на изпитването. Когато методът не е практичен или възможен, поведението на разтваряне/екстракция може да се изследва чрез други методи. В такива случаи трябва да се дадат пълни подробности и причини за използвания метод.
1.2. ЕТАЛОННИ ВЕЩЕСТВА Няма.
1.3. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАТЕЛНИЯ МЕТОД Поведението на разтваряне/екстракция на полимерите във водна среда се определя с помощта на метода на стъкленицата (вижте А.6 Разтворимост във вода, метод на стъкленицата) с модификациите, описани по-долу.
1.4. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.5. ОПИСАНИЕ НА ИЗПИТВАТЕЛНИЯ МЕТОД
1.5.
1.5.1. Оборудване За метода се изисква следното оборудване:
устройство за надробяване, например мелница за производство на частици с определен размер,
апаратура за разбъркване с възможност за температурен контрол,
мембранна филтърна система,
подходящо аналитично оборудване,
стандартизирани сита.
1.5.2. Подготовка на пробата Представителната проба първо се довежда до размер на частиците между 0,125 и 0,25 mm с помощта на подходящи сита. Може да е необходимо да се извърши охлаждане за устойчивостта на пробата или за процеса на смилане. Материалите с каучуково естество се раздробяват при температурата на течния азот (1). Ако не се получи фракция с желания размер на частиците, трябва да се предприемат действия за намаляване на размера на частиците доколкото е възможно и резултатът да се отчете. В протокола е необходимо да се посочи начинът, по който раздробената проба е съхранявана преди изпитването.
1.5.3. Процедура Три проби по 10 g от изпитваното вещество се претеглят във всеки един от трите съда, снабдени със стъклени запушалки, и към всеки съд се добавят по 1000 ml вода. Ако се докаже, че количеството от 10 g е непригодно, се използва следващото най-голямо количество и обемът вода се напасва съответно. Съдовете се запушват плътно и след това се разбъркват при 20 oС. За целта се използва прибор за разбъркване или разклащане, който да работи при постоянна температура. След период от 24 часа съдържанието на всеки съд се центрофугира или филтрира и концентрацията на полимера в бистрата водна фаза се определя чрез подходящ аналитичен метод. Ако няма подходящи аналитични методи за водната фаза, общата разтворимост/екстракция може да се изчисли от сухото тегло на филтърния остатък или центрофугираната утайка. Обикновено е необходимо да се разграничат количествено примесите и добавките, от една страна, и нискомолекулните видове, от друга. При гравиметричното определяне е важно също да се извърши контролно (празно) изпитване без изпитвано вещество, за да се отчетат остатъците, които се появяват при процедурата на изпитването. Поведението на разтворимост/екстракция на полимерите във вода при 37 oС и рН 2 и рН 9 се определя по същия начин, както описания по-горе за провеждането на изпитването при 20 oС. Стойностите за рН могат да се постигнат чрез добавяне или на подходящи буферни разтвори, или на подходящи киселини или основи, като солна киселина, оцетна киселина, аналитичен натриев или калиев хидроокис или NH3. В зависимост от използвания метод за анализ трябва да се извършат едно или две изпитвания. Когато са налице достатъчно специфични методи за директен анализ на водната фаза за полимерния компонент, едно изпитване като описаното по-горе би било достатъчно. Ако обаче не са налице такива методи и определянето на поведението на разтворимост/екстракция на полимера се ограничава до индиректен анализ чрез определяне само на общото съдържание на въглерод (TOC) на водния екстракт, трябва да бъде проведено допълнително изпитване. Това допълнително изпитване също трябва да бъде извършено три пъти, като се използват 10 пъти по-малки проби от полимера и същите количества вода, като тези, използвани в първото изпитване.
1.5.4. Анализ
1.5.4.
1.5.4.1. Изпитване, проведено с един обем проба Съществуват методи за директен анализ на полимерните компоненти във водната фаза. Алтернативно може да се използва и индиректният анализ на разтворени/екстрахирани полимерни компоненти чрез определяне на общото съдържание на разтворими части и коригиране за неполимерни специфични компоненти във водната фаза. Възможно е да се извърши анализ на водната фаза за общите полимерни видове: или чрез достатъчно чувствителен метод, например: или чрез вакуумно изпарение до изсушаване на водния екстракт и спектроскопен (IR, UV и т.н.) или AAS/ICP анализ на остатъка. Ако анализът на водната фаза като такъв не е приложим, водният екстракт трябва да се екстрахира с органичен разтворител, който не се смесва с вода, например хлориран въглеводород. Разтворителят се изпарява и остатъкът се анализира, както е описано по-горе, за оповестеното съдържание на полимера. Всички компоненти в този остатък, идентифицирани като примеси или добавки, трябва да се извадят за целите на определянето на степента на разтворимост/екстракция на самия полимер. Когато присъстват относително големи количества от такива материали, може би ще е необходимо да се направи анализ на остатъка, например HPLC или GC анализ, за да се разграничат примесите от мономера и присъстващите видове, получени от мономера, така че да бъде определено истинското съдържание на последния. В някои случаи може да е достатъчно просто изпаряване на органичния разтворител до изсушаване и претегляне на сухия остатък.
TOC, използващ изваряване на персулфат или дихромат, за да се получи СО2, последван от изчисление чрез IR или химичен анализ,
атомна абсорбционна спектрометрия (AAS) или нейния индуктивно куплиран плазмен (ICP) емисионен еквивалент за силиций или полимери, съдържащи метали,
UV-абсорбция или спектрофлуорометрия за арилни полимери,
LC-MS за нискомолекулни проби,
1.5.4.2. Изпитване, проведено с два различни обема проба Всички водни екстракти се анализират за TOC. Извършва се гравиметрично определяне на неразтворената/неекстрахиралата част на пробата. Ако след центрофугирането или филтрирането на съдържанието на всеки съд полимерните остатъци останат залепнали към стената на съда, съдът трябва да се изплаква с филтрата, докато се изчисти от всички видими остатъци. След това филтратът отново се центрофугира или филтрира. Остатъците, останали върху филтъра или в центрофугиращата тръба, се изсушават при 40 oС във вакуум и се претеглят. Сушенето продължава, докато се достигне постоянно тегло.
2. ДАННИ
2.
2.1. ИЗПИТВАНЕ, ПРОВЕДЕНО С ЕДИН ОБЕМ ПРОБА Индивидуалните резултати за всяка от трите колби и средните стойности се посочват и изразяват в единици за маса/обем на разтвора (обикновено mg/1) или за маса на полимера (обикновено mg/g). Освен това се посочва загубата на тегло на пробата (изчислена като тегло на разтвора, разделено на началното тегло на пробата). Трябва да се изчислят и относителните стандартни отклонения (RSD). Посочват се индивидуалните цифри за общото количество вещество (полимер + съществени добавки и т.н.) и само за полимера (т.е. след изваждане на участието от такива добавки).
2.2. ИЗПИТВАНЕ, ПРОВЕДЕНО С ДВА РАЗЛИЧНИ ОБЕМА ПРОБА Индивидуалните TOC-стойности на водните екстракти на две тройни изпитвания и средната стойност за всяко изпитване се посочват като единици за маса/обем на разтвора (обикновено mgС/l), както и като единици за маса/тегло на първоначалната проба (обикновено mgС/g). Ако няма разлика между резултатите при най-високото и най-ниското съотношение проба/вода, това може да означава, че всички ектрахируеми компоненти наистина са били екстрахирани. В такъв случай обикновено не е необходим директен анализ. Индивидуалните тегла на остатъците се посочват и изразяват в процент от началните тегла на пробите. Средните стойности се изчисляват за всяко изпитване. Разликите между 100 и процентите, които се получават, представляват процента на разтворения и екстрахирал материал в първоначалната проба.
3. ОТЧИТАНЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Протоколът от изпитването трябва да включва следна информация:
3.1.
3.1.1. Изпитвано вещество
налична информация за изпитваното вещество (идентичност, добавки, примеси, съдържание на нискомолекулни видове).
3.1.2. Условия на изпитването
описание на използваните процедурите и условията на изпитването,
описание на аналитичните методи и методите за детекция.
3.1.3. Резултати
резултати за разтворимост/екстрахируемост в mg/1; индивидуални усреднени стойности за изпитването на екстракция при различните разтвори, с разбивка за съдържание на полимер и примеси, добавки и т.н.,
резултати за разтворимост/екстрахируемост в mg/g на полимера,
TOC-стойности на водни екстракти, тегло на разтвора и изчислените проценти, ако са измерени,
рН на всяка проба,
информация за контролните стойности,
когато е необходимо, указания за химичната неустойчивост на изпитваното вещество, както по време на процеса на изпитване, така и по време на аналитичния процес,
цялата информация, която е важна за интерпретацията на резултатите.
4. ПРЕПРАТКИ DIN 53733, 1976. Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.
A.21. ОКСИДИРАЩИ СВОЙСТВА (ТЕЧНОСТИ)
A.21.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Този метод за изпитване е предназначен за измерване на потенциала на вещество в течно състояние да повишава степента си на изгаряне или на интензивността на изгаряне на запалимите вещества, или да образува смес със запалимо вещество, която може спонтанно да се възпламени при пълно смесване на двете вещества. Той се основава на метода на ООН за оксидиращи течности (1) и е еквивалентен на него. Въпреки това, тъй като методът А.21 е предназначен преди всичко да отговори на изискванията на Регламент (ЕО) № 1907/2006, се изисква да се направи сравнение само с едно вещество за сравнение. Може да се наложи провеждането на допълнителни изпитвания и сравнения с други вещества за сравнение, когато се очаква резултатите от изпитването да бъдат използвани за други цели. Този метод не може да бъде използван, когато изследването на структурната формула установи по безспорен начин, че веществото не може да реагира екзотермично със запалим материал. Полезно е, преди провеждане на изпитването, да има предварителна информация за евентуалните експлозивни свойства на веществото. Този метод не може да бъде приложен за твърди вещества, газове, експлозивни или силнозапалими вещества, или органични пероксиди. Провеждането на това изпитване не е необходимо, когато вече има резултати за изпитваното вещество по метода на ООН за оксидиращи течности (1).
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ Средно време за повишаване на налягането е средноаритметичната стойност от измерените времена, за които изпитваната смес предизвиква повишаване на налягането от 690 kРа до 2070 kРа над атмосферното налягане.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Като вещество за сравнение се използва воден разтвор 65 тегл. % на азотната киселина (х.ч.а). В случаите, когато лицето, провеждащо изпитването, предполага, че резултатите от това изпитване може да бъдат използвани за други цели, може също да се проведе едно изпитване с други допълнителни вещества за сравнение.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Течността, която ще бъде изпитвана, се смесва в тегловно съотношение 1:1 с фиброзна целулоза и се вкарва в съд под налягане. Ако по време на смесването или при въвеждането ѝ в реактора възникне спонтанно запалване, не е необходимо по-нататъшно изпитване. Ако по време на провеждане на изпитването не възникне спонтанно запалване, сместа се нагрява в съда под налягане, докато налягането не нарасне от 690 kРа до 2070 kРа над атмосферното налягане, и се отчита средното време за повишаване на налягането. То се сравнява със средното време за повишаване на налягането на смес в съотношение 1:1 на веществото(ата) за сравнение и целулозата.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО В серии от по пет опита за едно вещество следва резултатите да не се различават с повече от 30 % от средноаритметичната стойност. Резултатите, които се различават с повече от 30 % от стойността, се пренебрегват, процедурите по смесване и напълване се оптимизират и изпитването се повтаря.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.6.
1.6.1. Подготовка
1.6.1.
1.6.1.1. Запалими вещества Като запалим материал се използва изсушена фиброзна целулоза с нишки с дължина между 50 и 250 μm и среден диаметър 25 μm. Материалът се суши до достигане на постоянно тегло на слоя с дебелина не повече от 25 mm при 105 oС в продължение на 4 часа и се оставя в сушилня в присъствие на консервант, докато изстине и стане подходящ за използване. Съдържанието на вода в сухия остатък целулоза не следва да надвишава 0,5 % сухо тегло. Ако е необходимо, времето на сушене се удължава до достигане на тези параметри. По време на изпитването трябва да се използва целулоза от една проба.
1.6.1.2. Апаратура
1.6.1.2.
1.6.1.2.1. Съд под налягане Изисква се съд под налягане. Съдът представлява цилиндричен стоманен съд под налягане с дължина 89 mm и външен диаметър 60 mm (вж. фигура 1). Двете повърхности са свързани с противоположните си страни (намалявайки напречното сечение на съда до 50 mm), за да се подобри прикрепването, докато се монтират пожарният хидрант и пробката с вентилационния отвор. Съдът, който има отвор с диаметър 20 mm, е вътрешно вдълбан във всеки край до такава дебелина, че там да бъде поставена едноинчова тръба по британския стандарт (BSP) или метричния еквивалент. Приспособлението за повишаване на налягането, под формата на разклонение (коляно), е завинтено към извивката на съда под налягане на 35 mm от единия край и е на 90o спрямо механично обработените повърхности. Вдлъбнатината за него е с дълбочина 12 mm и е вътрешно резбована, за да приеме 1/2" BSP (или метричния еквивалент) външно резбования край на разклонението. Ако е необходимо, се използва инертно уплътнение, за да се осигури неподвижна газонепропусклива свръзка. Разклонението продължава 55 mm след тялото на съда под налягане и има 6 mm отвор. Краят на разклонението е вжлебен и е предназначен да приеме датчика за налягане във вид на диафрагма. За измерване на налягането може да бъде използван всякакъв уред, при условие че не може да бъде повлиян от горещи газове или разграждащи се продукти и може да отговори на повишаващото се налягане в интервала 690-2070 kРа в рамките на не повече от 5 ms. Най-отдалеченият от разклонението край на съда под налягане е близо до пожарния хидрант, който е свързан с два електрода — единия изолиран от, а другия заземен към тялото на хидранта. Другият край на съда под налягане е близо до предпазната мембрана (предпазваща от налягане приблизително 2200 kРа), здраво неподвижно закрепена за спирателния клапан, който има 20 mm отвор. Ако е необходимо, се използва уплътнение от инертен материал с пожарния хидрант, за да се осигури непропусклива за газове неподвижна сглобка. Поддържащ стенд (фигура 2) поддържа апаратурата на подходящата височина през периода на използването ѝ. Обикновено той се състои от мека стоманена плоска основа с размери 235 mm × 184 mm × 6 mm и една 185-милиметрова дълга квадратна куха част с размери 70 mm × 70 mm × 4 mm. Частта е скосена от всяка от двете срещуположни страни в единия край по дължината на квадратната куха част, така че да се получи структура с две допълнителни плоски подпори, надхвърлящи с 86 mm дължината на цялата част. Краищата на тези плоски подпори са прорязани под ъгъл 60o към хоризонтала и са заварени към повърхността на основата. Прорезът с размери 22 mm ширина х 46 mm дълбочина се обработва от едната страна на по-горния край на основната част, така че когато монтираният съд под налягане е по-надолу, пожарният хидрант да спре първи в частта, поддържаща кутията, а коляното е разположено в прореза. Стоманен детайл с размери 30 mm ширина и 6 mm дебелина е заварен към по-ниската вътрешна повърхност на кутията и действа като дистанционен елемент (раздалечител). Два 7-милиметрови винта с крилчати глави, поставени на срещуположната повърхност, задържат неподвижен на място съда под налягане. Две стоманени шини с ширина 12 mm и дебелина 6 mm, заварени към стената на детайлите, допиращи се към основата на кутията, поддържат отдолу съда под налягане.
1.6.1.2.2. Система за запалване Системата за запалване се състои от 25 cm дълга Ni/Сr жица с диаметър 0,6 mm и съпротивление 3,85 ohm/m. Жицата се намотава чрез използване на пръчка с диаметър 5 mm под формата на спирала и се прибавя към електродите на пожарния хидрант. Спиралата следва да е с някоя от конфигурациите, показани на фигура 3. Разстоянието между дъното на съда и долната повърхност на запалващата спирала следва да бъде 20 mm. Ако електродите не са подвижни, краищата на запалващата жица между серпентината и дъното на съда следва да бъдат изолирани с керамична обвивка. Жицата се загрява чрез постоянен електроизточник, осигуряващ поне 10 А ток.
1.6.2. Извършване на изпитването Апаратурата, цялостно сглобена с датчик за налягане и нагряваща система, но без позиционирана предпазна мембрана, се поддържа от пожарен хидрант в долния край. 2,5 g от изпитваната течност се смесват с 2,5 g изсушена целулоза в чаша от химично стъкло чрез използване на стъклена пръчка за разбъркване. За осигуряване на безопасност смесването следва да бъде извършвано при наличието на защитна преграда между оператора и сместа. Ако сместа се запали по време на смесването или разбъркването, не е необходимо изпитването да се провежда докрай. Сместа се вкарва на малки порции в съда под налягане и следва да сте сигурни, че тя се натрупва около запалващата спирала и прави добър контакт с нея. Важно е спиралата да не се изкриви по време на процеса на натрупване, тъй като това може да доведе до погрешни резултати. Предпазната мембрана е поставена в готовност и спирателният клапан е завинтен плътно. Напълненият съд се премества до поддържащия пожарен стенд, предпазната мембрана следва да бъде поставена най-отгоре в подходящ армиран смукателен (вентилационен) шкаф или в камерата за изгаряне. Електроенергия се доставя чрез свързване на пожарния хидрант с външен източник и се пуска ток със сила 10 А. Времето между започването на смесването и включването към енергоизточник не следва да надвишава 10 минути. Сигналът, получаван чрез датчика за налягане, се записва от подходяща за целта система, която позволява едновременно оценяването и генерирането на траен запис на получения времеви контур на налягането (напр. свързани самопишещо и графично устройство). Сместа се нагрява, докато предпазната мембрана се пробие или докато изминат поне 60 секунди. Ако предпазната мембрана не се разкъса, сместа трябва да бъде оставена да се охлади, преди апаратурата внимателно да бъде демонтирана, като се вземат предпазни мерки срещу евентуално поставяне под налягане. Извършват се пет опита с изпитваното вещество и веществото(ата) за сравнение. Отчита се времето за повишаване на налягането от 690 kРа до 2070 kРа над атмосферното налягане. Изчислява се средното време за повишаване на налягането. В някои случаи веществата могат да генерират повишено налягане (твърде високо или твърде ниско), получено в резултат на химични реакции, които не определят окислителните свойства на веществото. В тези случаи може да се наложи изпитването да се повтори с инертно вещество, напр. диатомит (кизелгур), вместо целулоза, за да се изясни същността на реакцията.
2. ДАННИ Времето за повишаване на налягането за изпитваното вещество и веществото(ата) за сравнение. Времето за повишаване на налягането при изпитвания с инертно вещество, ако се провеждат такива.
2.
2.1. Таблица 1 Примерни резултати
ОБРАБОТВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Изчисляват се средните времена за повишаване на налягането за изпитваното вещество и за веществото(ата) за сравнение. Изчислява се средното време за повишаване на налягането от изпитванията с инертно вещество (ако са провеждани такива). Примери за някои резултати са представени в таблица 1. Вещество Средно време за повишаване на налягането за смес 1:1 с целулоза (ms) Амониев бихромат, наситен воден разтвор 20800 Калциев нитрат, наситен воден разтвор 6700 Железен нитрат, наситен воден разтвор 4133 Литиев перхлорат, наситен воден разтвор 1686 Магнезиев перхлорат, наситен воден разтвор 777 Никелов нитрат, наситен воден разтвор 6250 Азотна киселина, 65 % 4767 Перхлорна киселина, 50 % 121 Перхлорна киселина, 55 % 59 Калиев нитрат, 30 % воден разтвор 26690 Сребърен нитрат, наситен воден разтвор Натриев хлорат, 40 % воден разтвор 2555 Натриев нитрат, 45 % воден разтвор 4133 Инертно вещество Вода:целулоза
3. ОТЧИТАНЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Протоколът от изпитването следва да съдържа следната информация:
идентичност, състав, чистота и т.н. на изпитваното вещество;
концентрация на изпитваното вещество;
процедура за сушене на използваната целулоза;
съдържание на вода в използваната целулоза;
резултати от измерванията;
резултати от изпитванията с инертно вещество, ако има такива;
изчислени средни стойности на времето за повишаване на налягането;
всички отклонения от този метод и причините за тях;
цялата допълнителна информация или бележки, свързани с интерпретирането на резултатите.
3.2. ИНТЕРПРЕТИРАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Резултатите от изпитването се оценяват въз основа на: Течно вещество се счита за окислител, когато: За да се избегнат неверни положителни резултати, ако е необходимо, резултатите, получени при изпитването на веществото с инертен материал, също могат да се вземат под внимание при интерпретирането на резултатите.
3.2. а)
наличието на спонтанно запалване на сместа от изпитваното вещество и целулозата; и
б)
сравнението между средното време, за което налягането се е повишило от 690 kРа до 2070 kРа, и това при веществото(ата) за сравнение.
а)
смес в съотношение 1:1 от масата на веществото и на целулозата се самозапали спонтанно; или
б)
смес в съотношение 1:1 от масата на веществото и на целулозата покаже средно време за повишаване на налягането, по-малко или равно на средното време за повишаване на налягането на смес в съотношение 1:1 от масата на 65 тегл. % воден разтвор на азотна киселина и целулоза.
4. ПРЕПРАТКИ Препоръки при транспорт на опасни стоки, ръководство за изпитвания и критерии. Трето преработено издание. Публикация на ООН №: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999 г., стр. 342. Метод О.2: Изпитване на оксидиращи течности. Забележка: може да бъде използвана всяка от тези конфигурации.
4.
Фигура 1 Съд под налягане
(А) Тяло на съда под налягане (Б) Предпазна мембрана със спирателен клапан (В) Пожарен хидрант (Г) Мек оловен пръстен (Д) Предпазна мембрана (Е) Разклонение (коляно) (Ж) Глава на датчика за налягане (3) Шайба (И) Изолиран електрод (Й) Заземен електрод (К) Изолация (Л) Стоманен конус (М) Уплътнение на спираловидния канал
Фигура 2 Поддържащ стенд
Фигура 3 Система на запалване
(А) Запалваща спирала (Б) Изолация (В) Електроди (Г) Пожарен хидрант
Допълнение За допълнителни технически детайли може да се направи справка например със следните стандарти.
1. Капилярни методи
1.
1.1. Приспособления за измерване на температурата на топене в течна баня ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals (Стандартен метод за изпитване на относителната начална и крайна точка на топене и областите на топене на органични химикали) ВS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range (Метод за определяне на точка на топене и/или интервал на топене) DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapilarverfahren (Определяне на интервала на топене на смоли по капилярен метод) JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products (Методи за изпитване на точката на топене на химически продукти)
1.2. Приспособления за измерване на температурата на топене в метален блок DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen (Визуално определяне на температурата на топене на частичнокристални пластмаси) ISO 1218 (E) Plastics — Polyamides — Determination of melting point (Пластмаси — полиамиди — определяне на точка на топене)
2. Нагорещени подложки
2.
2.1. Гореща пръчка на Кофлер ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings (Стандартни препоръчителни практики за изпитване на полимерни прахообразни покрития)
2.2. Микроскоп за точка на топене DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen (Визуално определяне на температурата на топене на частичнокристални пластмаси)
2.3. Менискусен метод (полиамиди) ISO 1218 (E) Plastics — Polyamides — Determination of melting point (Пластмаси — полиамиди — определяне на точка на топене) ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials (Стандартни характеристики на материали за шприцоване под налягане и екструдиране на основата на ацетални смоли) NF T 51-050 Resines de polyamides. Determination du point de fusion. Methode du menisque (Полиамидни смоли. Определяне на точка на топене. Менискусен метод)
3. Методи за определяне на температурата на замръзване ВS 4633 Method for the determination of crystallizing point (Метод за определяне на точката на кристализация) ВS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) (Метод за определяне на точката на топене на нефтен парафин (крива на охлаждане) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen (Определяне на точката на замръзване на авиационни бензини, автомобилни бензини и моторни бензоли) ISO 2207 Cires de petrole: determination de la temperature de figeage (Нефтен восък: определяне на точката на замръзване) DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren (Определяне на точката на застиване на мастни киселини) NF T 60-114 Point de fusion des paraffines (Точка на топене на парафини) NF T 20-051 Methode de determination du point de cristallisation (point de congelation) (Метод за определяне на точката на кристализация (точката на замръзване)) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point (Метод за определяне на точката на замръзване)
4. Термичен анализ
4.
4.1. Диференциален термичен анализ ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis (Стандартен метод за оценка на термичната устойчивост на химикали чрез методите на диференциалния термичен анализ) ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis (Стандартни определения на термините, отнасящи се до термичния анализ) ASTM 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data (Стандартна практика за докладване на данни от термичния анализ) DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe (Термичен анализ. Основни понятия)
4.2. Диференциална сканираща калориметрия ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis (Стандартен метод за оценка на термичната устойчивост на химикали чрез методите на диференциалния термичен анализ) ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis (Стандартни определения на термините, отнасящи се до термичния анализ) ASTM 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data (Стандартна практика за докладване на данни от термичния анализ) DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe (Термичен анализ. Основни понятия)
5. Определяне на точката на застиване NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite — Monstememing en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils (Стандартен метод за определяне на точката на застиване на нефтени масла) ISO 3016 Petroleum oils — Determination of pour point. (Нефтени масла — определяне на точката на застиване)
Допълнение За допълнителни технически детайли може да се направи справка например със следните стандарти:
1.1.1. Ебулиометър Уреди за измерване на температурата на кипене с течна баня ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes (Стандартен метод за определяне на температурата на кипене на антифриз за двигатели)
2. Дестилационен процес (интервал на кипене) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) Метод за изпитване на дестилацията (дестилационен добив и дестилационен обхват) ВS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products (Метод за определяне на дестилацията на нефтени продукти) BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics (Метод за определяне на дестилационни характеристики) DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes (Разтворители за лакобояджийски материали, определяне хода на дестилацията) NF T 20-608 Distillation: determination du rendement et de l'intervalle de distillation (Дестилация: определяне на добива и на дестилационния интервал)
3. Диференциален термичен анализ и диференциална сканираща калориметрия ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis (Стандартен метод за оценка на термичната устойчивост на химикали чрез методите на диференциалния термичен анализ) ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis (Стандартни определения на термините, отнасящи се до термичния анализ) ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data (Стандартна практика за докладване на данни от термичен анализ) DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe (Термичен анализ: основни понятия).
Допълнение За допълнителни технически детайли може да се направи справка например със следните стандарти:
1. Методи със сила на изтласкване
1.
1.1. Ареометър DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions (Ареометър; основни инструкции); DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use (Част I: Ареометри за плътност: конструкция, настройка и употреба); Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation (Част II: Ареометри за плътност; стандартизирани размери, обозначаване); Part III: Use and test (Част III: Употреба и методи за изпитване). ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose (Лабораторна стъклария: ареометри с общо предназначение); NF T 20-050 Chemical products for industrial use — Determination of density of liquids — Areometric method (Химични продукти за индустриална употреба — определяне плътността на течности — ареометричен метод); DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers (Лабораторна стъклария: широкообхватни хидрометри);
1.2. Хидростатична везна
1.2. За твърди вещества
ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of рlastics excluding cellular plastics (Метод А: Методи за определяне на плътността и относителната плътност на пластмаси с изключение на пенопластмаси) ; NF T 20-049 Chemical products for industrial use — Determination of the density of solids other than powders and cellular products — Hydrostatic balance method (Химични продукти за индустриална употреба. Определяне плътността на твърди вещества с изключение на прахообразни и разпенени продукти — метод с хидростатична везна); ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement (Относително тегло и плътност на пластмаси чрез изместване); DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density (Изследване на пластмаси и еластомери; определяне на плътността);
За течни вещества
ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density (Изпитване на минерални масла и свързани с тях материали; определяне на плътността); ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 и ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method (Плътност, специфично тегло или API относително тегло на суров нефт и течни нефтени продукти чрез хидрометричен метод); ВS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method (Плътност, специфично тегло или API относително тегло на суров нефт и течни нефтени продукти чрез хидрометричен метод);
1.3. Метод с потопено тяло DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method (Изпитване на бои, лакове и подобни материали за покрития; определяне на плътността; метод с потопено тяло)
2. Пикнометрични методи
2.
2.1. За течни вещества ISO 3507 Pycnometers (Пикнометри); ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC (Течни химични продукти; определяне на плътността при 20 oС); DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) (Пикнометър на Гей-Люсак (за нелетливи течности, които не са много вискозни)); DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100.10-6 m2 s-1 at 15 oC) (Пикнометър на Липкин (за течности с кинематичен вискозитет, по-малък от 100.10-6 m2 s-1 при 15 oС)); DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) (Пикнометър на Шпренгел (за течности както в DIN 12798)); DIN 12801 Reischauer pyenometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00.10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC) (Пикнометър на Райшауер (за течности с кинематиченвискозитет по-малък от 100.10-6 m2 s-1 при 20 oС, приложим по-специално също и за въглеводороди и водни разтвори, както и за течности с по-високо налягане на парите, приблизително 100 kPa при 90 oС)); DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) (Пикнометър на Хубард (за вискозни течности от всички типове, които нямат много високо налягане на парите, по-специално също и за бои, лакове и битуми)); DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) (Пикнометър на Бингам (за течности както в DIN 12801)); DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol — water mixture) (Пикнометър на Йолм (по-специално за смес етанол—вода)); DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) (Пикнометър с вграден термометър и странична капилярна тръбичка (за течности, които не са твърде вискозни)); DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer (Изпитване на бои, лакове и подобни продукти; определяне на плътността чрез пикнометър); DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density (Точка 7: Изследване на минерални масла и свързаните с тях продукти; определяне на плътността); ASTM D 297 Section 15: Rubber products — chemical analysis (Част 15: Каучукови продукти — химичен анализ); ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds (Метод С: Халогенирани органични съединения); ВS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) (Метод за определяне на специфичното тегло и плътността на нефтени продукти (метод с градуиран двукапилярен пикнометър); ВS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary — stoppered pycnometer method (Метод за определяне на относителната плътност и плътността на нефтени продукти с капилярка — метод със запушен пикнометър); NF Т 20-053 Chemical products for industrial use — Détermination of density of solids in powder and liquids — Pyknometric method (Химични продукти за индустриална употреба — определяне на плътността на твърди вещества в прахове и течности — пикнометричен метод);
2.2. За твърди вещества ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics (Метод В: Методи за определяне на плътността и относителната плътност на пластмаси с изключение на разпенени пластмаси); NF Т 20-053 Chemical products for industrial use — Détermination of density of solids in powder and liquids — Pyknometric method (Химични продукти за индустриална употреба — определяне на плътността на твърди вещества в прахове и течности — пикнометричен метод); DIN 19683 Determination of the density of soils (Определяне на плътността на почви)
3. Пикнометър с въздушно сравняване DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte (Част 3: Изпитване на лакове и бои и подобни материали за покрития; прахообразен лак; определяне на плътността); DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung (Лакобояджийски материали; хлорсъдържащи полимери; изпитване).
Допълнение 1 Изчислителен метод
ВЪВЕДЕНИЕ
Изчислените стойности на парното налягане могат да се използват:
за да се прецени кой от използваните експериментални методи е подходящ,
да се получи оценка или граничните стойности в случаите, когато експерименталният метод не може да се приложи по технически причини (включително когато парното налягане е много ниско),
да помогнат да се разпознаят онези случаи, в които е оправдано да не се проведе експериментално измерване, тъй като най-вероятно парното налягане е < 10-5 Ра при температурата на околната среда.
ИЗЧИСЛИТЕЛЕН МЕТОД
Парното налягане на течности и твърди вещества може да се изчисли, като се използва модифицираната корелация на Уотсън (а). Експериментално е необходимо да се определи само точката на кипене при нормални условия. Методът е приложим върху цялата област от парни налягания от 105 до 10-5 Ра. Подробна информация за метода е дадена в Наръчник на методите за изчисляване на химични свойства (б).
ИЗЧИСЛИТЕЛНА ПРОЦЕДУРА
Според (б), парното налягане се изчислява, както следва: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb където: Т температурата, за която се изчислява парното налягане Тb точката на кипене при нормални условия Pvp парното налягане при температура Т ΔHvb топлината на изпарение ΔZb коефициента на свиваемост (оценен на 0,97) m емпиричен коефициент, зависещ от физичното състояние при интересуващата ни температура. По-нататък Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb където KF е емпиричен коефициент, отчитащ полярността на веществото. В препратка (б) са дадени коефициентите KF за няколко типа съединения. Доста често могат да се намерят данни, в които точката на кипене е дадена при понижено налягане. В такъв случай, според (б), парното налягане се изчислява така: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 където T1 е точката на кипене при пониженото налягане Р1.
ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
Когато се използва изчислителен метод, в протокола с резултатите трябва да се включи съответната документация от изчисленията.
ПРЕПРАТКИ
(а) K. M. Watson, Ind. Eng. Chem., 1943, vol. 35, 398.
(б) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.
Допълнение 2
Фигура 1 Апаратура за определяне кривата на налягането на парите по динамичния метод
1 = Термодвойка 2 = Вакуумен буферен обем 3 = Прибор за измерване на налягането 4 = Вакуум 5 = Точка на измерване 6 = Нагревателен елемент около 150 W
Фигура 2а Апаратурата за определяне кривата на налягането на парите по статичния метод (при използване на U-образен манометър)
1. Изпитвано вещество 2. Парна фаза 3. Високовакуумен клапан 4. U-видна тръба (спомагателен манометър) 5. Манометър 6. Температурна баня 7. Прибор за измерване на температурата 8. Към вакуум помпата 9. Вентилационен отвор
Фигура 2б Апаратура за определяне кривата на налягането на парите по статичния метод (при използване на индикатор за налягането)
1. Изпитвано вещество 2. Парна фаза 3. Високовакуумен клапан 4. Прибор за измерване на налягането 5. Индикатор за налягане 6. Температурна баня 7. Устройство за измерване на температурата
Фигура 3 Изотенископ (виж препратка 7)
1. Към системата за контролиране и измерване на налягането 2. Тръба с външен диаметър 8 mm 3. Сух азот в системата за регулиране на налягането 4. Пари на пробата 5. Малък заострен край 6. Течна проба
Фигура 4 Апаратура за определяне кривата на налягането на парите по метода с везна за парно налягане
1. Изпитвано вещество 2. Парна фаза с поток от пари 3. Изпарителна пещ с въртящ се вход 3a. Капак на пещта с отвор 4. Нагряване (охлаждане) на пещта 5. Измерване температурата на пробата 6. Охладителна кутия 7. Преграда 8. Охлаждаща пръчка за охладителната кутия 9. Блюдо на везната 10. Микровезна 11. Към записващото устройство 12. Към високо-вакуумната помпа
Фигура 5 Примерна апаратура за изпаряване при ниско налягане по ефузионния метод при обем на ефузионната клетка 8 cm
1 Връзка към вакуума 2 Отвори за платинов съпротивителен термометър или за измерване и контролиране на температурата (2) 3 Капак за вакуум-резервоара 4 О-пръстен 5 Алуминиев вакуумен резервоар 6 Устройство за инсталиране и изваждане на ефузионните клетки 7 Решетъчен капак 8 Крилчати гайки (6) 9 Болтове (6) 10 Ефузионни клетки от неръждаема стомана 11 Тръбни нагреватели (6)
Фигура 6а Пример на поточна система за определяне на налягането на парите по метода с насищане на инертен газ
Отвор Колектор 1 = Регулатор на потока 2 = Топлообменник 3 = Иглени вентили 4 = Сензор за относителна влажност 5 = Колона за насищане 6 = Свръзки от политетрафлуоретен (тефлон) 7 = Дебитомер 8 = Барботьор (абсорбер) 9 = Маслен уловител 10 = Барботьор с порьозна пластинка
Фигура 6б Пример на система за определяне на налягането на парите по метода с насищане на инертен газ — с капилярка, разположена след камерата за насищане
1. Термокондуктивен мас - дебитомер 2. Манометър 3. Термостатирана камера 4. Серпантина за термостатиране на газа-носител 5. Термометър (Рt 100) 6. Камера за насищане на газа 7. Капилярка 8. Абсорбционни съдове 9. Газов разходомер 10. Охлаждаем уловител
Фигура 7 Пример на експериментална установка за метода с въртящ се ротор
Апаратура за определяне налягането на парите А. Сензорна глава на въртящия ротор В. Клетка с пробата С. Термостат D. Вакуумна линия (турбопомпа) Е. Въздушен термостат
Фигура 8 Пример на измерителна глава с въртящ се ротор
1. Топче 2. Вакуумирано тръбовидно удължение на 6 3. Постоянни магнити (2) 4. Намотки (2) за вертикална стабилизация 5. Задвижващи намотки (4) 6. Свързващ фланец
Допълнение
Фигура 1 Метод на елуиране от колона с рециркулационна помпа
Дебитометьр Микроколона Термостатирана циркулационна пр помпа Thermostatically controlled circulating pump Рециркулацио нна помпа Двупосочен кран за отбиране на проби
Фигура 2 Типична микроколона
(всички размери са в милиметри) (Връзка за шлифования стъклен) Входно пространство Вътрешна част 5 Външна част 19 Тапа от стъклена вата Двупосочен спирателен кран
Фигура 3 Типична микроколона
(всички размери са в милиметри) (Входно пространство лен) Вътрешн Вътрешна част 5 Външна част 19 Двупосочен спирателен кран
Фигура 4 Метод на елуиране от колона с нивелиращ съд
1 = Нивелиращ съд (например стъкленица с обем 2,5 литра) 2 = Колона (виж Фигура 3) 3 = Колектор за фракциите 4 = Термостат 5 = Тефлонови тръбички 6 = Шлифован стъклен шарнир 7 = Водна линия (между термостата и колоната; вътрешен диаметър приблизително 8 mm)
Допълнение 1 МЕТОДИ ЗА ИЗЧИСЛЯВАНЕ/ПРИБЛИЗИТЕЛНА ОЦЕНКА
ВЪВЕДЕНИЕ
Общо въведение към изчислителните методи, както и различни данни и примери, са дадени в Ръководството с методи за определяне на химични свойства (а). Изчислените стойности на Pow могат да се използват:
за да се определи кой от експерименталните методи е по-подходящ (методът на разклащането в стъкленица се прилага в областта: log Pow = - 2 до 4, а методът на HPLC — в областта: log Pow = 0 до 6),
за да се изберат подходящи условия на изпитването (например сравнителни вещества за HPLC-процедурите, съотношение n-октанол/вода за метода на разклащането в стъкленица),
като вътрешнолабораторна проверка за възможни експериментални грешки,
за да се осигури приблизителна оценка на Pow в случаите, когато експерименталните методи не могат да се приложат по технически причини.
МЕТОДИ ЗА ОЦЕНКА Предварителна преценка на коефициента на разпределение
Стойността на коефициента на разпределение може да се оцени приблизително, като се използват разтворимостите на изпитваното вещество в чистите разтворители. За тази цел се пресмята: Pприбл = насимен cn-октанолнасимена cвода
ИЗЧИСЛИТЕЛНИ МЕТОДИ Принцип на изчислителните методи
Всички изчислителни методи се основават на формалното фрагментиране на молекулата на подходящи подструктури, за които са известни надеждни стойности на log Pow. След това log Pow на цялата молекула се изчислява, като се сумират стойностите на съответните фрагменти и се прибавят корекционни членове, отчитащи вътрешномолекулните взаимодействия. Списък с константите на фрагментите и корекционните членове може да се намери в литературните източници (б) (в) (г) (д), някои от които редовно се осъвременяват (б).
Критерии за качество
По принцип надеждността на изчислителния метод се намалява с усложняването на изпитваното съединение. В случаите на прости молекули с ниски молекулни тегла и една или две функционални групи могат да се очакват отклонения от 0,1 до 0,3 логаритмични единици в стойностите на log Pow, получени по различни методи на фрагментиране и измерената стойност на тази величина. Когато молекулите са по-сложни, грешката става по-голяма. Тя зависи от надеждността и достъпността на фрагментационните константи, както и от възможността да се разпознаят вътрешномолекулните взаимодействия (например водородни връзки). Тя зависи също и от правилното използване на корекционните членове (този проблем отпада, ако се използва компютърният софтуер CLOGP-3) (б). За съединения, които могат да преминават в йонно състояние, е важно да бъдат пресметнати правилно зарядът и степента на йонизацията.
Изчислителни процедури
π-метод на Ханш
Първоначалната константа за хидрофобен заместител π, въведена от Фуджира и сътрудници (е), е дефинирана като: πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH) където Pow (PhX) е коефициентът на разпределение на ароматното производно, а Pow (PhH) е този на основното съединение. Например: πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71 Съответно на названието си, π-методът се прилага предимно за ароматни съединения. Стойностите π на голям брой заместители са дадени в таблици в (б), (в) и (г). Te се използват за изчисляване на log Pow зa ароматни молекули или ароматни субструктури.
Метод на Рекер
Според Рекер (ж) стойността на log Pow ce изчислява така: log Pow=Σi ai fi+Σj(корекуцоннцме щенове) Където fj представляват константите на различни молекулни фрагменти, а аi — честотата, с която те се срещат в изпитваната молекула. Корекционните членове могат да се представят като интегрален множител на една обща константа Сm (така наречената магическа константа). Фрагментационните константи fj и Cm ce определят от списък от 1054 експериментално получени стойности на Pow (825 съединения), като се използва мултипликационен регресионен анализ (в) (з). Определянето на членовете, отчитащи вътрешномолекулните взаимодействия, става по редица от правила, описани в препратки (д) (з) (и).
Метод на Ханш и Лео
Според Ханш и Лео (в), стойността на log Pow ce изчислява по уравнението: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj където fi представляват константите на различни молекулни фрагменти, Fj – корекционните членове, а а и b са съответните честоти, с които се срещат тези фрагменти. Изведени от експерименталните стойности на Pow по принципа на пробата и грешката, са получени списъци от стойностите на атомни и групови фрагменти, както и списъци с корекционните членове Fj (така наречените фактори). В (а) и (в) са предложени корекционните членове за няколко различни класа. Доста трудоемко и бавно е да се вземат под внимание всички правила и корекционни параметри. Затова са разработени софтуерни продукти (б).
Комбиниран метод
Изчисляването на log Pow за сложни молекули може значително да се подобри, ако молекулата се раздели на по-големи структури, за които могат да се намерят точни log Pow стойности или от таблици (б) (в), или от собствени измервания. Такива фрагменти (например хетероцикли, антрахинон, азобензен) могат да се комбинират с π-стойностите на Ханш или с фрагментационните константи на Рекер и Лео.
Забележки:
i)
Изчислителните методи могат да се прилагат само за съединения, които преминават частично или напълно в йонно състояние, където е възможно да се предвидят необходимите корекционни фактори.
ii)
Ако може да се предположи наличието на вътрешномолекулни водородни връзки, трябва да се прибавят съответните корекционни членове (прибл. от +0,6 до +1,0 log Pow единици) (а). Данни за присъствието на такива връзки могат да се получат от пространствени модели или от спектроскопски данни за молекулата.
iii)
Ако са възможни няколко тавтомерни форми, за основа на изчисленията се взема най-вероятната форма.
iv)
Внимателно трябва да се следят промените, които се правят в списъците от константи на фрагментите.
Отчитане на резултатите
Когато се използват методи за изчисляване или приблизителна оценка, в протокола трябва по възможност да се включи следната информация:
описание на веществото (смес, примеси и т.н.),
признаци за възможни вътрешномолекулни водородни връзки, за дисоциация, поява на заряд или някакви други необичайни ефекти (напр. тавтомерия),
описание на изчислителния метод,
указание какви бази данни са използвани или предоставяне на такива,
особености при подбора на фрагментите,
разбираема документация от изчисленията.
ПРЕПРАТКИ
(а) W. J. Lyman, W. F. Rehl and D. H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.
(б) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremon, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP - 3).
(в) C. Hansch, A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
(г) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.
(д) F. Rekker, H. M., de Kort, E. J. Med. Chem. - Chill. Ther., 1979, vol. 14, 479.
(е) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Am. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.
(ж) R. F. Rekker, The hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.
(з) C. V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.
(и) R. A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington DC, 1984, Symposium Series 255, p. 225.
Допълнение 2 Препоръчвани сравнителни вещества за метода на HPLC
№ Сравнително вещество log Pow рКа 1 2-бутанон 0,3 2 4-ацетилпиридин 0,5 3 Анилин 0,9 4 Ацетанилид 1,0 5 Бензилов алкохол 1,1 6 р-метоксифенол 1,3 pKa = 10,26 7 Феноксиоцетна киселина 1,4 рКа = 3,12 8 Фенол 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-динитрофенол 1,5 pKa = 3,96 10 Бензонитрил 1,6 11 Фенилацетонитрил 1,6 12 4-метилбензилов алкохол 1,6 13 Ацетофенон 1,7 14 2-нитрофенол 1,8 рКа = 7,17 15 3-нитробензоена киселина 1,8 pKa = 3,47 16 4-хлороанилин 1,8 рКа = 4,15 17 Нитробензен 1,9 18 Канелен алкохол 1,9 19 Бензоена киселина 1,9 рКа = 4,19 20 р-крезол 1,9 pKa = 10,17 21 Канелена киселина 2,1 pKa = 3,89 цис 4,44 транс 22 Анизол 2,1 23 Метилбензоат 2,1 24 Бензен 2,1 25 3-метилбензоена киселина 2,4 pKa = 4,27 26 4-хлорфенол 2,4 рКа = 9,1 27 Трихлороетилен 2,4 28 Атрацин 2,6 29 Етилбензоат 2,6 30 2,6-дихлоробензонитрил 2,6 31 3-хлорбензоена киселина 2,7 pKa = 3,82 32 Толуен 2,7 33 1-нафтол 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-дихлоранилин 2,8 35 Хлорбензен 2,8 36 Алил-фенил етер 2,9 37 Бромбензен 3,0 38 Етилбензен 3,2 39 Бензофенон 3,2 40 4-фенилфенол 3,2 pKa = 9,54 41 Тимол 3,3 42 1,4-дихлорбензен 3,4 43 Дифениламин 3,4 pKa = 0,79 44 Нафтален 3,6 45 Фенилбензоат 3,6 46 Изопропилбензен 3,7 47 2,4,6-трихлорфенол 3,7 рКа = 6 48 Бифенил 4,0 49 Бензилбензоат 4,0 50 2,4-динитро-6-sес.-бутилфенол 4,1 51 1,2,4-трихлрбензен 4,2 52 Додеканова киселина 4,2 53 Дифенилов етер 4,2 54 n-бутилбензен 4,5 55 Фенантрен 4,5 56 Флуорантен 4,7 57 Дибензил 4,8 58 2,6-дифенилпиридин 4,9 59 Трифениламин 5,7 60 ДДТ 6,2 Други сравнителни вещества с нисък log Pow 1 Никотинова киселина -0,07
Допълнение
Фигура Матрица и спомагателни приспособления за приготвяне на купчинката от веществото
(всички размери са в милиметри) Formos ilgis: 250 mm Medžiaga: aliuminis
Допълнение
Фигура Апаратура
Допълнение
Пример за спецификация на материалите за изпитването на термичната чувствителност (вж. DIN 1623) (1)(2)(3)
Тръба: спецификации на материалите № 1.0336.505 g Плочка с отверстия: спецификация на материалите № 1.4873 Резбована втулка и гайка: спецификация на материалите № 1.3817
Фигура 1 Апарат за измерване на термичната чувствителност
(всички размери са в милиметри) Фиг. 1а Стоманена тръба и спомагателни приспособления (1) тръба (1a) външен фланец (2) резбована втулка; резба с ниска степен на триене (3) плочка с отвор а = 2,0 или 6,0 mm в диаметър (4) гайка Ь = 10 mm в диаметър (5) повърхност с жлебове (6) две плоскости за гаечен ключ размер 41 Фиг. 1б Нагревателни и защитни приспособления (7) две плоскости за гаечен ключ размер 36 (8) камера, предпазваща от летящи парчета (9) два подпорни лоста за тръбата (10) сглобена тръба (11) място на задната горелка; останалите горелки се виждат (12) контролна дюза
Фигура 2 Изпитване на термичната чувствителност
(примери за фрагментиране) Няма експлозия Няма експлозия Експлозия Експлозия Експлозия Експлозия
Фигура 3 Калибриране на скоростта на нагряване за изпитването на термичната чувствителност
Температура (°C) Време (сек.) Крива температура/време, получена при нагряването на дибутилфталат (27 cm3) в затворена тръба (с плоча с отвор 1,5 mm) посредством пропанов пламък със скорост 3,2 l/min. Температурата е измерена с хромалумелова термодвойка, обшита с неръждаема стомана с диаметър 1 mm и разположена централно на разстояние 43 mm под пръстена на тръбата. Скоростта на нагряване между 135 oС и 285 oС трябва да бъде между 185 и 215 K/минута.
Фигура 4 Апарат за изпитване на удар
(всички размери са в милиметри) (1) основа, 450 × 450 × 60 (2) стоманен блок 230 × 250 × 200 (3) наковалня 100 диаметър × 70 (4) колона (5) междинен напречен елемент (6) два водача (7) зъбчата рамка (8) градуирана скала (9) падащ чук (падаща маса) (10) подпорно и освобождаващо устройство (11) локализираща плоча (12) междинна наковалня (заменяема), 26 диаметър × 26 (13) локализиращ пръстен с отвори (14) ударно устройство Фиг. 4а Падащ чук, отпред и отстрани, общ изглед Фиг. 46 Падащ чук, долна част
Продължение
Фиг. 4г Ударно устройство за течни вещества Фиг. 4в Устройство за удар върху вещества в прахообразна или пастообразна форма (1) стоманен цилиндър (2) водещ пръстен за стоманените цилиндри (3) локализиращ пръстен с отвори (a) вертикален срез (b) хоризонтален срез (4) гумен пръстен (5) течност (40 mm3) (6) пространство без течност Фиг.4д Чук (падаща маса от 5 kg) (1) висящ кран (2) приспособление за маркиране на височината (3) позиционен жлеб (4) цилиндрична ударна глава (5) запиращо езиче
Фигура 5 Апарат за чувствителност при триене
Фигура 5а Фрикционен апарат; вертикален и хоризонтален изглед (1) стоманена основа (2) подвижна шейна (3) порцеланова плочка, 25 × 25 × 5 mm, закрепена на шейната (4) фиксиран порцеланов пестик, 10 диаметър × 15 mm (5) изпитвано вещество, приблизително 10 mm3 (6) държач за пестика (7) товарно рамо (8) противотежест (9) копче за включване и изключване (10) колело за нагласяване на шейната на стартова позиция (11) посока към електродвигателя Фиг. 5б Стартова позиция на пестика върху пробата
Допълнение
Фигура Матрица и спомагателни приспособления за приготвяне на купчинката
(всички размери са в милиметри) Дължина на матрицата: 250 mm Материал: алуминий
Допълнение Примери за други методи за определяне на средното бройно молекулно тегло (Мn) за полимери
Хроматографският метод с гел инфилтрация (GPC) е предпочитаният метод за определяне на Мn, особено когато има набор от стандарти, чиято структура е сравнима с полимерната структура. Независимо от това, било поради практически трудности при използването на GPC, или поради очакването, че веществото няма да отговори на задължителните критерии за Мn (което води до потвърждаване), се срещат алтернативни методи, като например:
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
Употреба на колигативни свойства Ебулиоскопия/криоскопия: включва измерване на повишаването на точката на кипене (ебулиоскопия) или понижаването на точката на замръзване (криоскопия) на разтворител при прибавяне на полимер. Този метод се базира на факта, че ефектът от разтворения полимер върху точката на кипене/замръзване на течността зависи от молекулното тегло на полимера (1) (2). Приложимост: Мn < 20000. Понижаване на парното налягане: включва измерване на парното налягане на избрана еталонна течност преди и след прибавянето на определени количества полимер (1) (2). Приложимост: Мn < 20000 (теоретично; на практика обаче е лимитирана стойност). Мембранна осмометрия: основава се на принципа на осмозата, т.е. естествената тенденция на молекулите на разтворителя да преминават през полупропускливата мембрана от разреден към концентриран разтвор, за да се получи равновесие. При изпитването разреденият разтвор е с нулева концентрация, докато концентрираният разтвор съдържа полимера. Ефектът на преминаване на разтворителя през мембраната причинява разлика в налягането, която зависи от концентрацията и молекулното тегло на полимера (1) (3) (4). Приложимост: Mn между 20000 и 200000. Осмометрия в нарова фаза: включва сравнение на скоростта на изпаряване на чист аерозолен разтворител спрямо поне три аерозола, съдържащи полимера в различни концентрации (1) (5) (6). Приложимост: Мn < 20000.
2. Анализ на групата, прекъсваща нарастването на веригата За да се използва този метод, са необходими както познания за общата структура на полимерите, така и за естеството на групите, прекъсващи нарастването на веригата (която трябва да се разграничава от основния скелет например по NMR или титруване/дериватизация). Определянето на молекулната концентрация на прекъсващите групи, присъстващи в полимера, може да доведе до стойност за молекулното тегло (7) (8) (9). Приложимост: Мn до 50000 (с намаляваща надеждност).
3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
Препратки Billmeyer, F. W. Jr., 1984. Textbook of Polymer Science, 3rd Ed., John Wiley, New York. Glover, C. A., 1975. Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, 1979. Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H., 1989. Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52. ASTM 3592-77, 1977. Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C. E. M., 1989. Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schrîder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., 1989. Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R. G., 1975. End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al., 1990. Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.
Допълнение Ръководство за коригиране на нискомолекулното съдържание за присъствието на неразтворим полимер
Когато в една проба присъства неразтворим полимер, това резултира в загуба на маса по време на GPC-анализа. Неразтворимият полимер необратимо се задържа върху колоната или филтъра за пробата, докато разтворимата част преминава през колоната. В случая, когато може да се изчисли или измери нарастването (dn/dc) на рефрактивния индекс на полимера, е възможно да се изчисли и загубата на маса на пробата в колоната. В този случай се прави корекция с помощта на външна калибровка със стандартни материали с познати концентрация и dn/dc, за да се калибрира реакцията на рефрактометъра. В дадения тук пример е използван поли(метилметакрилат) (рММА) стандарт. При външна калибровка за анализ на акрилни полимери един рММА стандарт с позната концентрация в тетрахидрофуран се анализира чрез GPC и получените данни се използват за намиране на константата на рефрактометъра съгласно уравнението: K = R/(C × V × dn/dc) където: K рефрактометричната константа (в μVs/ml) R реакцията на рММА стандарта (в μVs) С концентрацията на рММА стандарта (в mg/ml) V инжекторния обем (в ml), и dn/dc нарастването на рефрактивния индекс за рММА в тетрахидрофуран (в ml/mg). Следните данни са типични за един рММА стандарт: R 2937891 С 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 х 105 ml/mg Резултантната стойност K, 3,05 х 1011, се използва за изчисляване на теоретичната детекторна реакция, ако 100 % от инжектирания полимер е елуирал през детектора.
ЧАСТ Б МЕТОДИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ТОКСИЧНОСТТА И ДРУГИ ЕФЕКТИ ВЪРХУ ЗДРАВЕТО
ОБЩО ВЪВЕДЕНИЕ А.
ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПРОУЧВАНОТО ВЕЩЕСТВО Преди началото на всяко едно проучване на токсичност следва да се знае съставът на проучваното вещество, включително основните примеси, както и съответстващите физикохимични свойства, включително стабилност. Физикохимичните свойства на проучваното вещество предоставят важна информация за избор на пътя на прилагане на веществото, за проектиране на всяко отделно проучване, както и за начина на работа и съхранение на проучваното вещество. Създаването на аналитичен метод за количествено и качествено определяне на проучваното вещество (включително основните примеси, при възможност) в средата за дозиране, както и в биологичния материал, следва да предхожда началото на проучването. Цялата информация, отнасяща се до идентифицирането, физикохимичните свойства, чистотата и поведението на проучваното вещество, следва да бъде включена в доклада за теста.
Б.
ГРИЖИ ЗА ЖИВОТНИТЕ Строгият контрол на условията на заобикалящата среда и техниката за добри грижи към животните са основни изисквания за тестовете върху токсичност.
i)
Условия на отглеждане Условията на средата в стаите или определените места на експерименталните животни следва да бъдат подходящи за проучваните видове. Подходящи условия за плъхове, мишки и морски свинчета са стайна температура – 22o С ± 3o С при относителна влажност от 30 до 70 %; за зайците температурата следва да бъде 20 + 3o С при относителна влажност от 30 до 70 %. Някои експериментални техники са особено чувствителни към температурните ефекти, ето защо в такива случаи в описанието на тестовия метод се посочват всички подробности за подходящите условия. Във всички изследвания за токсични ефекти температурата и влажността следва да се мониторират, записват и включат в окончателния доклад на проучването. Осветлението е изкуствено, последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. Подробностите, свързани с начина на осветление, се записват и включват в окончателния доклад на проучването. Ако няма други изисквания, специални за метода, животните могат да се отглеждат индивидуално или в клетки на малки групи от един и същи пол; при групово отглеждане не бива да има повече от пет животни в клетка. В докладите за експериментални животни е важно да се посочат видът на клетката и броят на животните, обитаващи всяка една клетка, както по време на излагане на действието на химическото вещество, така и в последвалия период на наблюдение.
ii)
Условия на хранене Диетата следва да отговаря на всички хранителни изисквания на видовете, участващи в теста. При прилагане на проучваните вещества в храната на животните хранителната стойност на последната може да бъде намалена поради взаимодействие между веществото и хранителните съставки. Възможността за такава реакция следва да се отчита при интерпретиране на резултатите от теста. Уместно е да се използват конвенционални лабораторни храни при неограничено количество вода за пиене. Изборът на храната се влияе от необходимостта да се осигури подходяща смес за проучваното вещество при прилаганата му по този метод. Хранителните примеси, за които се знае, че влияят на токсичността, не бива да присъстват в интерфериращи концентрации.
В.
АЛТЕРНАТИВНО ТЕСТВАНЕ Европейският съюз се е ангажирал с насърчаване на развитието и узаконяването на алтернативни техники, които могат да предоставят същото ниво на информация, както и настоящите тестове с животни, но използват по-малко животни, причиняват по-малко страдание или изобщо избягват употребата на животни. След като станат достъпни, тези методи трябва да се имат предвид винаги, когато е възможно, за характеризиране на риска и последваща класификация и етикетиране на съществени рискове.
Г.
ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ При оценка и интерпретация на тестовете следва да се има предвид границата на областта, до която резултатите от проучванията сред животни и in vitro могат да бъдат директно екстраполирани към човека. Ето защо данните за наличие на странични ефекти при хората, където ги има, могат да се използват за потвърждение на опитните резултати.
Д.
ПРЕПРАТКИ Повечето от тези методи са създадени в рамките на програмата на ОИСР за изработване на ръководство за тестове и следва да се прилагат в съгласие с принципите за добрата лабораторна практика, така че да се осигури възможно най-широко взаимно приемане на данните. Допълнителна информация може да се намери в препратките на ръководството на ОИСР, както и в съответната литература, публикувана на други места.
Б.1А. ОСТРА ОРАЛНА ТОКСИЧНОСТ — ПРОЦЕДУРА С ФИКСИРАНИ ДОЗИ
Б.1А.
1. МЕТОД Този метод за изпитване е еквивалентен на ОИСР ТG 420 (2001).
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ При традиционните методи за оценяване на остра токсичност като краен резултат се достига до смърт на използваните животни. През 1984 г. бе предложен нов подход за тестване на остра токсичност от Британското токсикологично дружество, основаващ се на определяне на поредица от нива с фиксирани дози (1). При този подход се избягва смъртта на животните в края на експериментите и се разчита изпяло на наблюдението за ясни признаци за токсичност във всяка поредица от нива с фиксирани дози. След направените в Обединеното кралство (2) и международните (3) изследвания in vivo за утвърждаване процедурата бе одобрена като метод за изпитване през 1992 г. Впоследствие статистическите възможности на процедурата с фиксирани дози са оценени чрез използването на математически модели в поредица от изследвания (4) (5) (6). Едновременно, изследванията in vivo и тези чрез създаване на модели показват, че процедурата е репродуктивна, използва по-малко животни и причинява по-малко страдание от традиционните методи и дава възможност да се категоризират веществата по начин, подобен на този при другите методи за изпитване на остра токсичност. Насоки за избор на най-подходящия метод за изследване с определена цел могат да бъдат намерени в Ръководството за провеждане на изследвания на остра орална токсичност (7). Това ръководство също съдържа допълнителна информация за провеждането и интерпретирането на метода за изследване Б.1А. В този метод по принцип се използват само дози с умерена токсичност и следва да се избягва прилагането на дози, за които се очаква да са летални. Така също дози, за които е известно, че могат да причинят болка и страдание поради корозивни или силно дразнещи въздействия, не следва да бъдат прилагани. Умиращите животни или животните, очевидно изпитващи болка или показващи признаци на дълбоко и продължително страдание, се убиват по хуманен начин и се вземат предвид при интерпретирането на резултатите по същия начин, както животните, умрели по време на експеримента. Критериите за вземане на решение да бъде убито умиращо или дълбоко страдащо животно и насоките за разпознаване на предвидима или предстояща смърт са предмет на отделно ръководство (8). Методът осигурява информация за опасните свойства и позволява веществото да бъде категоризирано и класифицирано съгласно Глобалната система за хармонизиране (GHS) на класификацията на химични вещества, които причиняват остра токсичност (9). Лабораториите за изпитване следва да вземат предвид цялата налична информация за изпитваното вещество преди провеждане на експеримента. Такава информация включва идентичността и химичната структура на веществото; неговите физикохимични свойства; резултатите от всякакви други in vitro или in vivo токсикологични изпитвания на веществото; токсикологичните данни за структурно близки вещества и очакваната(ите) употреба(и) на веществото. Тази информация е необходима, за да се удостовери напълно, че това изпитване е свързано със защитата на човешкото здраве и ще бъде от полза при избора на подходяща начална доза.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Остра орална токсичност: отнася се до онези вредни ефекти, които се появяват в резултат на орален прием на еднократна доза вещество или многократни дози, давани в рамките на 24 часа. Бавна смърт означава, че животното не умира или не се проявяват признаци, че умира в рамките на 48 часа, но умира по-късно през 14-дневния период на наблюдение. Доза е количеството на приетото вещество за тестване. Дозата се изразява като маса на тестваното вещество за единица тегло на изследваното животно (напр. mg/kg). Доказана токсичност е общоприет термин, описващ ясните признаци на токсичност вследствие на приемане на изпитваното вещество (вж. (3) например), такива че при приемане на следваща най-висока фиксирана доза могат да бъдат очаквани всякакви признаци на дълбока болка и продължителни дълбоки страдания, терминално състояние (критериите са представени в Ръководството за хуманен край (8) или вероятна смърт на повечето животни. GHS: Глобална система за хармонизиране на класификацията на химични вещества и смеси. Съвместна дейност на ОИСР (човешко здраве и околна среда), Комитета на ООН от експерти в областта на транспортирането на опасни стоки (физикохимични свойства) и МОТ (опасни комуникации) и координирана чрез Междуорганизационната програма за правилно управление на химикалите (IOМС). Неизбежна смърт: когато животното умира или се очаква настъпването на смъртта преди следващото планирано време за наблюдение. Признаците, които показват това състояние при гризачите, могат да включват конвулсии, латерално положение, отпуснатост и треперене. (Вж. Ръководството за хуманен край (8) за повече подробности.) LD50 (средна летална доза) е статистически получена еднократна доза на вещество, за което може да се очаква, че ще причини смърт при 50 % от животните, когато бъде въведено в тях по орален път. Стойността LD50 се изразява за определени периоди като масата на изпитваното вещество за единица тегло на изследваното животно (mg/kg). Ограничена доза: отнася се до доза, при която има по-високо ограничаване при изследването (2000 или 5000 mg/kg). Настъпване на смърт: оставане в терминално състояние или неспособност да оцелее, дори ако се приложи лечение. (Вж. Ръководството за хуманен край (8) за повече подробности.) Предсказуема смърт: присъствие на клинични признаци, които показват, че ще настъпи смърт в един предстоящ период от време преди планирания край на експеримента, например: неспособност да се достигне вода или храна. (Вж. Ръководството за хуманен край (8) за повече подробности.)
1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Групи животни от един и същ пол са дозирани чрез прилагане на поетапна процедура чрез използване на фиксирани дози от 5, 50, 300 и 2000 mg/kg (по изключение може да бъде приложена допълнителна фиксирана доза от 5000 mg/kg, вижте точка 1.6.2). Нивото на началната доза е определено въз основа на зрителни изследвания, като се очаква дозата да предизвика някои признаци на токсичност, без да причинява дълбоки токсични ефекти или смърт. Клиничните признаци и условията, свързани с болка, страдание и неизбежна смърт, са подробно описани в отделно ръководство на ОИСР (8). Следващи групи животни могат да бъдат дозирани с по-високи или по-ниски фиксирани дози в зависимост от присъствието или отсъствието на признаци за отравяне или смърт. Тази процедура продължава до достигане на дозата, причиняваща доказана токсичност, или дотогава, докато бъде идентифицирана смъртта на животното или не се наблюдават ефекти при най-високата доза, или когато се появят смъртни случаи при най-ниската доза.
1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.4.
1.4.1. Избор на животински видове Предпочитаният вид от групата на гризачите е плъх, въпреки че могат да бъдат използвани и други видове гризачи. Обикновено се използват животни от женски пол (7). Причината за това е, че изследванията в научната литература от конвенционални изпитвания на LD50 показват, че обикновено има малка разлика в междуполовата сетивност, но в случаите, при които се наблюдават различия, женските индивиди като цяло са малко по-чувствителни (10). Въпреки това, ако познанията за токсикологичните и токсикокинетичните свойства на структурно близки химикали показват, че има вероятност мъжките индивиди да са по-чувствителни от женските, тогава се използват екземпляри от този пол. Когато изпитването се провежда върху мъжки индивиди, трябва да бъде предоставено адекватно обяснение за това. Обикновено в лабораторните опитни постановки следва да се използват здрави млади полово зрели животни. Женските индивиди следва да не са раждали и да не са бременни. Всяко животно, при започване на дозирането му, следва да бъде на възраст между 8 и 12 седмици и теглото му да попада в интервала ± 20 % от средното тегло на всички предварително дозирани животни.
1.4.2. Условия за отглеждане и хранене Температурата в стаята на опитните животни следва да бъде 22 oС (± 3 oС). Въпреки че относителната влажност следва да бъде поне 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 %, освен при почистване на стаята, целта е да се постигне 50—60 % относителна влажност. Светлината следва да бъде изкуствена, с редуващи се 12 часа светъл период, 12 часа тъмен период. За хранене могат да бъдат използвани конвенционалните лабораторни диети с неограничен достъп до питейна вода. Животните могат да бъдат групирани в клетките по доза, но броят на животните в клетка не трябва да възпрепятства точните наблюдения на всяко животно.
1.4.3. Подготовка на животните Животните са произволно избрани, маркирани, за да е възможно индивидуалното им идентифициране, и поставени в клетките си поне 5 дни преди започване на дозирането, за да се аклиматизират към лабораторните условия.
1.4.4. Подготовка на дозите Най-общо изпитваните вещества трябва да бъдат приемани в постоянен обем в обхвата на дозите, които се изпитват чрез вариране в концентрацията на дозирания препарат. Когато крайният продукт, който трябва да бъде изпитван, е под формата на течност или смес обаче, за последващата оценка на риска от това вещество може да бъде по-подходящо изпитваното вещество да се употребява неразредено, т.е. при постоянна концентрация, което е и изискване от страна на някои регулаторни органи. Във всеки случай, обемът на максималната доза за администриране не трябва да бъде завишаван. Максималният обем на течността, която може да бъде приета наведнъж, зависи от размера на изследваното животно. При гризачи обикновено обемът не надвишава 1 ml/100 g телесно тегло: обаче в случай на водни разтвори може да се приемат 2 ml/100 g телесно тегло. Във връзка с изготвянето на дозирани препарати се препоръчва, където е възможно, да се използва воден разтвор/суспензия/емулсия, следван първо от разтвор/суспензия/емулсия в масло (напр. царевично масло) и след това по възможност от разтвор при други разтворители. Трябва да се знаят токсикологичните характеристики на разтворителите, с изключение на водата. Дозите не трябва да бъдат приготвяни дълго време преди приемането им, освен когато е известно и доказано, че препаратът ще остане стабилен и в добро състояние през времето, в което ще бъде използван.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.
1.5.1. Приемане на дозите Изпитваното вещество се приема на еднократни дози, чрез изкуствено хранене, в стомашния тръбопровод или чрез подходяща интубационна канюла. При извънредни обстоятелства, при които приемането на еднократна доза не е възможно, дозата може да бъде давана на по-малки части през период, който не може да превишава 24 часа. Преди дозирането животните следва да бъдат поставени на ограничен режим на хранене за известно време (напр. на плъховете не следва да се дава храна, а само вода през нощта преди експеримента; на мишките в продължение на 3—4 часа не следва да се дава храна, а само вода). След периода на постене животните трябва да бъдат претеглени и изпитваното вещество – приложено. След като веществото бъде прието, може да не се дава храна в следващите 3—4 часа при плъховете или 1—2 часа при мишките. Когато дозата се приема на части, в определен период от време може да се наложи да се осигури храна и вода на животните в зависимост от продължителността на периода.
1.5.2. Зрително изследване Целта на зрителното изследване е да подпомогне избора на подходящата начална доза за основното изследване. Изпитваното вещество се приема от отделните животни последователно по начина, показан на графичните алгоритми в приложение 1. Зрителното изследване приключва, когато може да бъде взето решение за първоначалната доза в основното изследване (или ако смъртта е настъпила при най-ниската фиксирана доза). Началната доза за зрителното изследване се избира от нивата на фиксираната доза: 5, 50, 300 и 2000 mg/kg. Като основа се взема дозата, при която се очаква проява на доказана токсичност, когато е възможно, на база доказателство от in vivo и in vitro данни за същия химикал или за структурно близки химикали. При липсата на такава информация началната доза е 300 mg/kg. Следва да има поне 24-часов период между дозирането на всяко животно. Всички животни следва да бъдат наблюдавани поне 14 дни. По изключение и само когато е оправдано от определени регулаторни нужди, може да бъде приложена допълнителна фиксирана доза с по-високо ниво 5000 mg/kg (вж. приложение 3). По причини, свързани с хуманното отношение към животните, изследването на животни в категория 5 на GHS в обхвата 2000—5000 mg/kg е нежелателно и следва да се има предвид само когато съществува голяма вероятност резултатите от такова изследване да имат практическо значение за опазване здравето на хората или животните, или за околната среда. В случаите, когато животното, изследвано при най-ниското ниво с фиксирана доза (5 mg/kg) при провеждане на зрителното изследване, умре, при нормалната процедура изследването приключва и веществото се отнася към категория 1 на GHS (както е показано в приложение 1). Обаче, ако се изисква последващо потвърждаване на класифицирането, може да се предвиди евентуална допълнителна процедура, както следва. Второ животно се дозира с 5 mg/kg. Ако и второто животно умре, тогава категория 1 в GHS се потвърждава и изследването незабавно се прекратява. Ако второто животно оцелее, тогава максимум три допълнителни животни биват дозирани с по 5 mg/kg. Тъй като ще съществува висок риск от смъртност, тези животни следва да бъдат дозирани по начин, целящ опазване на хуманното отношение към животните. Времевият интервал между дозирането на всяко животно следва да бъде достатъчен, за да се установи, че предишното животно вероятно ще оцелее. Ако се установи втора смърт, дозирането следва да бъде незабавно преустановено и следващите животни не се дозират. Заради появата на втори смъртен случай (независимо от броя на изследваните животни в периода на приключването), попадащ в резултат А (два или повече смъртни случаи), следва правилото за класифициране на приложение 2 при 5 mg/kg фиксирана доза (категория 1, ако има два или повече смъртни случаи или категория 2, ако няма повече от 1 смъртен случай). Освен това приложение 4 дава насоки за класифициране по системата на ЕС, докато бъде въведена новата система GHS.
1.5.3. Основно изпитване
1.5.3.
1.5.3.1. Брой животни и нива на дозиране След изпитване с началното ниво на дозиране действието, което трябва да се извърши, е показано чрез графичния алгоритъм в приложение 2. Изисква изпълнението на едно от следните действия: да се прекрати всяко изпитване и да се определи, след класифициране, подходящият клас на опасност; да се проведе изпитване при по-висока фиксирана доза или изпитване при по-ниска фиксирана доза. Въпреки това, за защита на животните, нивото на дозата, причинила смърт при зрителното изследване, не се повтаря при основното изследване (вж. приложение 2). Опитът показва, че най-вероятният резултат при нивото на началната доза е, че веществото може да бъде класифицирано и не е необходимо по-нататъшно изследване. Обикновено се използват общо пет животни от един и същ пол при всяко изследвано ниво на дозата. Едно от петте животни, което е било използвано при зрителното изследване, се дозира заедно с четирите останали животни (освен, по изключение, ако използваното ниво на дозата при основното изследване не е било включено в зрителното изследване). Интервалът от време между дозирането на всяко ниво се определя от началото, продължителността и остротата на токсичните признаци. Третирането на животните със следваща доза следва да бъде забавено, докато се докаже, че животните, приели определената доза по-рано, ще оцелеят. Препоръчва се да има период от 3 или 4 дни между дозирането на всяко ниво, ако е нужно, за да има възможност за наблюдения върху забавената токсичност. При необходимост времевият интервал може да бъде регулиран, напр. в случай на незавършен отговор. Когато се обмисля прилагането на по-високата фиксирана доза 5000 mg/kg, се следва процедурата, представена в приложение 3 (вж. също точка 1.6.2).
1.5.3.2. Ограничено изпитване Ограниченото изпитване се използва предимно в случаите, при които експериментаторът разполага с информация, съгласно която изпитваният материал по всяка вероятност не е токсичен, т.е. проявява токсичност само над нормативно ограничените дози. Информация за токсичността на изпитвания материал може да бъде събрана от познания за подобни тествани съединения или подобни тествани смеси или продукти, като се вземат предвид идентичността и процентното съдържание на съединенията, за които е известно, че са токсикологически значими. В случаите, когато има малко или няма информация за токсичността на материала или когато се очаква изпитваният материал да бъде токсичен, трябва да бъде проведено основното изследване. Прилага се нормалната процедура, като началната доза при зрително изследване е 2000 mg/kg (или по изключение 5000 mg/kg), последвана от дозиране на допълнителни четири животни на това ниво на ограниченото изпитване по това ръководство.
1.6. НАБЛЮДЕНИЯ Животните се наблюдават индивидуално след поне еднократно дозиране през първите 30 минути, периодично през първите 24 часа, с повишено внимание през първите 4 часа и ежедневно след това, през общо 14-дневен период от време, освен когато е необходимо да бъдат извадени от експеримента и убити по хуманен начин по причини, свързани с хуманното отношение към животните, или когато са намерени мъртви. Продължителността на наблюдението обаче не следва да бъде строго фиксирана. Тя следва да се определя въз основа на токсичните реакции, началното време и продължителността на периода за възстановяване и може да бъде увеличена, когато се сметне за необходимо. Периодите от време, в които се появяват и изчезват признаците на токсичност, са важни, особено ако има тенденция токсичните признаци да бъдат забавени (11). Всички наблюдения систематично се записват, с отделни записи, направени за всяко животно. Допълнителни изследвания са необходими, ако животните продължат да показват признаци на токсичност. Наблюденията следва да включват промените в кожата и козината, очите и лигавиците, и също респираторната, циркулационната, автономната и централната нервна система, соматомоторна активност и моделите на поведение. Следва да бъде обърнато внимание на наблюденията за треперене, конвулсии, слюноотделяне, диария, летаргия, сън и кома. Следва да бъдат взети предвид принципите и критериите, резюмирани в Ръководството за хуманен край (8). Животните, намерени в терминално състояние, и животните, показващи дълбока болка или трайни признаци на дълбоко страдание, следва да бъдат хуманно убити. Когато животните са убити по хуманни причини или са намерени мъртви, следва да бъде записано времето на смъртта им, колкото е възможни по-точно.
1.6.
1.6.1. Телесно тегло Индивидуалното тегло на животните следва да бъде измервано в кратък интервал от време преди приемането на изпитваното вещество и поне веднъж седмично след това. Промените в теглото следва да бъдат изчислявани и записвани. В края на експеримента оцелелите животни се претеглят и след това хуманно се убиват.
1.6.2. Патология Всички изследвани животни (включително умрелите по време на експеримента или извадените от експеримента животни по причини, свързани с хуманното отношение към животните) следва да бъдат подложени на цялостна аутопсия. Всички цялостни патологични изменения във всяко животно следва да бъдат записани. Микроскопските изследвания на органите показват доказателствата за цялостна патология при животните, оцелели 24 часа или повече след първоначалното дозиране, и също могат да допринесат за получаването на полезна информация.
2. ДАННИ Следва да бъдат осигурени индивидуални данни за всяко животно. Освен това всички данни следва да бъдат обобщени в таблична форма, показваща броя на използваните животни във всяка от изследваните групи, броя на животните, проявяващи признаци за токсичност, броя на животните, намерени мъртви по време на изследването или убити по хуманни причини, времето на настъпване на смъртта на животинския индивид, описание и развитие във времето на токсичните ефекти и обратимостта им, както и заключенията от аутопсията.
3. ОТЧИТАНЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Протоколът от изпитването по целесъобразност трябва да включва следната информация:
Изпитвано вещество:
физична форма, чистота и, където е подходящо, физикохимични свойства (включително изомеризация);
данни за идентичността, включително САS номер.
Разтворител (ако има такъв):
обосноваване на избора на разтворител, ако е различен от вода.
Изследвани животни:
използвани видове/породи;
микробиологично състояние на животните, когато е известно;
брой, възраст и пол на животните (включително, при необходимост, обосноваване използването на мъжки индивиди вместо женски);
водоизточник, условия за отглеждане, диета и т.н.
Условия на експеримента:
подробности за формулирането на изпитваното вещество, включително подробности за физичното състояние на приемания материал;
подробности, свързани с приемането на изпитваното вещество, обеми на дозите и време на дозиране;
подробности във връзка с качеството на храната и водата (включително вид/източник на диетата, водоизточник);
обосновка на избора на началната доза.
Резултати:
таблици/диаграми на получените данни и ниво на дозата за всяко животно (т.е. при които животното показва признаци на токсичност, включително смърт, природа, острота и продължителност на ефектите);
таблици/диаграми на телесното тегло и на измененията в него;
индивидуални тегла на животните в деня на дозиране, през седмични интервали след това и по време на смърт или убиване;
дата и време на смъртта, ако умрат преди програмираното унищожаване;
развитие във времето от първоначалното появяване на признаци за токсичност и дали са били обратими при всяко животно;
заключения при аутопсията и хистопатологични заключения за всяко животно, ако има такива.
Дискусия и интерпретиране на резултатите.
Заключения.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
ПРЕПРАТКИ British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85—92. Van den Heuvel, M. J., Dayan, A. D. and Shillaker, R. O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279—291. Van den Heuvel, M. J., Clark, D. G., Fielder, R. J., Koundakjian, P. P., Oliver, G. J. A., Pelling, D., Tomlinson, N. J. and Walker, A. P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469—482. Whitehead, A. and Curnow, R. N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313—324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315—323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183—196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-№-24-№-0,FF.html]. Lipnick, R. L., Cotruvo, J. A., Hill, R. N., Bruce, R. D., Stitzel, K. A., Walker, A. P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J. A. and Myers, R. C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223—231. Chan P. K and A. W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology . 3 rd Edition. A. W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.
Б.1Б. ОСТРА ОРАЛНА ТОКСИЧНОСТ — МЕТОД КЛАС ОСТРА ТОКСИЧНОСТ
Б.1Б.
1. МЕТОД Този метод за изпитване е еквивалентен на ОИСР ТG 423 (2001)
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Методът при клас остра токсичност (1), представен с това изследване, е поетапна процедура, при която се използват по 3 животни от един и същ пол на всеки етап. В зависимост от смъртността и/или състоянието на предстояща смърт при животните може да се наложи средно на 2—4 стъпки да бъде взето решение относно острата токсичност на изпитваното вещество. Тази процедура е репродуктивна, използва много малко животни и дава възможност за категоризиране на веществата по начин, подобен на този при други методи за изпитване за остра токсичност. Методът при клас остра токсичност се основава на биометрични оценки (2)(3)(4)(5) с фиксирани дози, подходящо отделени, за да може едно вещество да бъде категоризирано за целите на класифицирането и оценката на риска. Методът, който е одобрен през 1996 г., е широко утвърден in vivo спрямо LD50 данните, получени от публикуваните национални (6) и международни (7) изследвания. Насоките за избор на най-подходящият метод за изпитване с определена цел се намират в Ръководството за изпитване на острата орална токсичност (8). Това ръководство съдържа също допълнителна информация за провеждането и интерпретирането на метода за тестване Б.1б. Изпитваните вещества, в дози, за които е известно, че могат да причинят болка и страдание поради корозивно или силно дразнещо действие, не следва да бъдат прилагани. Умиращи животни или животни, очевидно изпитващи болка или показващи признаци на дълбоко и продължително страдание, биват хуманно убивани и също се вземат предвид при интерпретирането на резултатите, по същия начин както животните, умрели по време на експеримента. Критериите за вземане на решение да бъде убито умиращо или дълбоко страдащо животно и насоки за разпознаване на предсказуема или предстояща смърт са обект на отделно ръководство (9). При този метод се използват предварително определени дози и резултатите позволяват веществото да бъде категоризирано и класифицирано съгласно Глобалната система (GНS) за хармонизиране на класификацията на химични вещества, които причиняват остра токсичност (10). По принцип методът цели изчисляването на точната LD50, но позволява установяването на определени области на експозиция, в които се очаква леталност, доколкото смъртност като пропорционално съотношение при животните се достига едва в самия край на това изследване. Методът позволява определяне стойността на LD50 само когато в резултат от прилагането на най-малко две дози се постига ръст на смъртността, по-висок от 0 % и по-нисък от 100 %. Използването на избрани предварително определени дози, независимо от изпитваното вещество, с класифициране, което е категорично свързано с броя на наблюдаваните животни в различните етапи, подобрява възможността за последователно и многократно докладване на резултатите между отделните лаборатории. В лабораторията за изследване следва да се вземе предвид цялата налична информация за изследваното вещество преди провеждане на експеримента. Такава информация включва идентичност и химична структура на веществото; неговите физикохимични свойства; резултатите от всякакви други in vivo или in vitro токсикологични изпитвания на веществото; токсикологични данни за структурно близки вещества и очаквана(и) употреба(и) на веществото. Тази информация е необходима, за да се удостовери напълно, че това изпитване е свързано със защитата на човешкото здраве и ще бъде от полза при избора на най-подходящата начална доза.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Остра орална токсичност: отнася се до онези вредни ефекти, които се появяват в резултат на орален прием на еднократна доза вещество или многократни дози, давани в рамките на 24 часа. Бавна смърт: означава животното да не умира или да не се проявят признаци на смърт в рамките на 48 часа, но да умре по-късно, през 14-дневния период на наблюдения. Доза: е количеството прието изпитвано вещество. Дозата се изразява като маса на изпитваното вещество за единица тегло на изследваното животно (напр. mg/kg). GНS: Глобална система за хармонизиране на класификацията на химични вещества и смеси. Съвместна дейност на ОИСР (човешко здраве и околна среда), Комитета на ООН от експерти в областта на транспортирането на опасни стоки (физикохимични свойства) и МОТ (опасни комуникации) и координирана чрез Междуорганизационната програма за правилно управление на химикалите (IOМС). Неизбежна смърт: когато животното умира или се очаква настъпването на смърт преди следващото планирано време за наблюдение. Признаците, показващи това състояние при гризачи, могат да включват конвулсии, латерално (странично) положение, лежане и треперене. (Вж. Ръководството за хуманен край (9) за повече подробности.) LD50 (средна летална орална доза): е статистически получена еднократна доза на вещество, за която може да се очаква, че ще причини смърт при 50 % от животните, когато бъде въведена в тях по орален път. Стойността LD50 се изразява за периоди като масата на изпитваното вещество за единица тегло на изследваното животно (mg/kg). Ограничена доза: отнася се до доза с по-голямо ограничение при изследването (2000 или 5000 mg/kg). Настъпване на смърт: оставане в терминално състояние или неспособност да се оцелее, дори ако се приложи лечение. (Вж. Ръководството за хуманен край (9) за повече подробности.) Предсказуема смърт: присъствие на клинични признаци, които показват, че е налице смърт в определен предстоящ период от време преди планирания край на експеримента, например: неспособност да се достигне вода или храна. (Вж. Ръководството за хуманен край (9) за повече подробности.)
1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ Принцип на метода за изследване е, че въз основа на поетапна процедура, при която се използват минимален брой животни на етап, се получава допълнителна информация за острата токсичност на изследваното вещество, която дава възможност за неговото класифициране. Веществото се приема по орален път на постъпване от група експериментални животни в една от определените дози. Веществото се изпитва чрез прилагане на поетапна процедура, като на всеки етап се използват по три животни от един и същ пол (обикновено женски индивиди). Наличието или отсъствието на смъртни случаи, свързани с веществото на един етап, е определящо за дозирането на следващия етап, т.е.: Подробностите около провеждането на процедурата за изпитване са описани в приложение 1. Методът дава възможност да се вземе решение относно класифицирането на изследваното вещество и да бъде причислено към един от поредицата токсикологични класове чрез определяне на точните стойности на LD50.
не са необходими допълнителни изследвания;
дозиране на три допълнителни животни със същата доза;
дозиране на три допълнителни животни с по-високо или по-ниско ниво на дозата.
1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.4.
1.4.1. Избор на животински видове Предпочитаният вид от групата на гризачите е плъх, въпреки че и други видове гризачи могат да бъдат използвани. Обикновено се използват животни от женски пол (9). Причина за това е, че изследванията в научната литература чрез конвенционални тестове с LD50 показват, че независимо от малката разлика в междуполовата сетивност в случаите, при които се наблюдават различия, женските индивиди като цяло са малко по-чувствителни (11). Въпреки това, ако познанията за токсикологичните и токсикокинетичните свойства на близки по структура химически вещества показват, че има вероятност мъжките индивиди да са по-чувствителни от женските, тогава се използват животни от този пол. Когато изпитването се провежда върху мъжки индивиди, то следва да бъде подходящо обосновано. Използват се здрави млади полово зрели животни от най-често употребяваните за лабораторни изследвания видове. Женските индивиди следва да не са раждали и да не са бременни. Всяко животно в началото на дозирането му следва да бъде на възраст между 8 и 12 седмици и теглото му следва да попада в интервала ± 20 % от средното тегло на всички дозирани преди това животни.
1.4.2. Условия за отглеждане и хранене Температурата в стаята на опитните животни следва да бъде 22 oС (± 3 oС). Въпреки че относителната влажност следва да бъде поне 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 % освен при почистване на стаята, като целта е да се постигне 50—60 % относителна влажност. Светлината следва да бъде изкуствена, с редуващи се 12 часа светъл период, 12 часа тъмен период. За хранене могат да бъдат използвани конвенционалните лабораторни диети с неограничен достъп до питейна вода. Животните могат да бъдат групирани в клетките по доза, но броят на животните в клетка не трябва да възпрепятства точните наблюдения върху всяко животно.
1.4.3. Подготовка на животните Животните са произволно избрани, маркирани, за да е възможно индивидуалното им идентифициране, и държани в клетките си поне 5 дни преди дозирането, за да се аклиматизират към лабораторните условия.
1.4.4. Подготовка на дозите Най-общо изпитваните вещества следва да бъдат приемани в постоянен обем в рамките на дозите, които се изпитват чрез изменения в концентрацията на дозирания препарат. Когато обаче крайният продукт, който трябва да бъде изследван, е под формата на течност или смес, за последващата оценка на риска от това вещество може да се окаже по-подходяща употребата му в неразредено състояние, т.е. при постоянна концентрация, което е и изискване от страна на някои регулаторни органи. Във всеки случай обемът на максималната доза за администриране не следва да бъде завишаван. Максималният обем на течността, която може да бъде въвеждана наведнъж, зависи от големината на изследваното животно. При гризачи обикновено обемът не надвишава 1 ml/100 g телесно тегло: обаче в случай на водни разтвори може да се приемат 2 ml/100 g телесно тегло. Във връзка с изготвянето на дозирани препарати се препоръчва, където е възможно, да се използва воден разтвор/суспензия/емулсия, следван първоначално от разтвор/суспензия/емулсия в масло (напр. царевично масло), а след това е възможен разтвор в други разтворители. Следва да се знаят токсикологичните характеристики на разтворителите с изключение на водата. Дозите следва да бъдат приготвяни кратко време преди приемането им, освен когато е известно, че препаратът остава стабилен и в добро състояние през периода, в който се използва.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.
1.5.1. Приемане на дозите Изпитваното вещество се приема на еднократни дози чрез принудително хранене или с подходяща интубационна канюла. При извънредни обстоятелства, при които приемането на еднократна доза не е възможно, дозата може да бъде давана на по-малки части през период, който не може да превишава 24 часа. Преди дозирането животните следва да бъдат поставени на ограничен режим на хранене за известно време (напр. на плъхове следва да не се дава храна, но не и вода през нощта преди експеримента; на мишки в продължение на 3—4 часа следва да не се предоставя храна, но не и вода). След периода на постене, животните следва да бъдат претеглени и изпитваното вещество да бъде приложено. След като веществото бъде прието, може да не се предоставя храна в следващите 3—4 часа при плъхове или 1—2 часа при мишки. Когато дозата се приема на части в определен период от време, може да се наложи да бъдат осигурени храна и вода на животните в зависимост от продължителността на периода.
1.5.2. Брой на животните и нива на дозите Във всеки етап се използват по три животни. Нивото на дозата, която ще бъде използвана като начална доза, се избира от едно от четирите фиксирани нива: 5, 50, 300 и 2000 mg/kg телесно тегло. Нивото на началната доза следва да бъде такова, при което вероятността да причини смърт при някое от дозираните животни е най-висока. Графичните алгоритми на приложение 1 описват процедурата, която трябва да бъде следвана за всяка от началните дози. Освен това приложение 4 дава насоки за класифициране по системата на ЕС, докато бъде въведена новата система GHS. Когато по наличната информация се предполага, че смъртност при начално дозиране с най-високото ниво (2000 mg/kg телесно тегло) е малко вероятна, тогава се прилага ограничено изпитване. Когато няма информация за изпитваното вещество, с цел хуманно отношение към животните се препоръчва за начална доза да се използва 300 mg/kg телесно тегло. Интервалът от време между третирането на групите се определя от началото, продължителността и остротата на токсичните признаци. Третирането на животните със следваща доза следва да бъде забавено, докато не се докаже, че дозираните по-рано животни са останали живи. По изключение и само когато е оправдано от определени регулаторни нужди, може да бъде приложена допълнителна фиксирана доза с по-високо ниво 5000 mg/kg телесно тегло (вж. приложение 2). По причини, свързани с хуманното отношение към животните, изследването на животни в категория 5 от GHS в обхвата 2000—5000 mg/kg е нежелателно и следва да се има предвид само когато съществува голяма вероятност резултатите от такова изследване да имат практическо значение за опазване здравето на хората или животните или околната среда.
1.5.3. Ограничено изпитване Ограниченото изпитване се използва предимно в случаите, при които извършващият опитите разполага с информация, съгласно която изследваният материал по всяка вероятност не е токсичен, т.е. проявява токсичност само над нормативно ограничените дози. Информация за токсичността на изпитвания материал може да бъде получена от познания за подобни изпитани съединения или подобни изпитани смеси или продукти, като се вземат предвид идентичността и процентното съдържание на съставките, за които е известно, че са с токсикологично значение. В случаите, когато има малко или няма информация за неговата токсикологичност, или при които се очаква изпитваният материал да бъде токсичен, следва да се провежда основното изследване. При ниво на еднократна доза 2000mg/kg телесно тегло може да бъде проведено ограничено изследване на 6 животни (по три животни на етап). По изключение може да бъде проведено ограничено изследване на три животни при ниво на еднократната доза 5000 mg/kg (вж. приложение 2). Ако има смъртни случаи, свързани с веществото, може да се окаже необходимо следващите изследвания да се проведат при по-ниски нива на дозиране.
1.6. НАБЛЮДЕНИЯ Животните се наблюдават индивидуално, след поне еднократно дозиране през първите 30 минути, периодично през първите 24 часа, с повишено внимание през първите 4 часа и ежедневно след това през общо 14-дневен период от време, освен когато е необходимо да бъдат извадени от експеримента и убити по хуманен начин по причини на хуманно отношение към животните, или са намерени мъртви. Продължителността на наблюдението обаче не следва да бъде строго фиксирана. Тя следва да се определя въз основа на токсичните реакции, началния момент и продължителността на периода за възстановяване и може да бъде увеличена, когато се сметне за необходимо. Периодите от време, в които се появяват и изчезват признаците на токсичност, са важни, особено ако има тенденция токсичните признаци да бъдат забавени (12). Всички наблюдения систематично се записват, с отделни записи, направени за всяко животно. Допълнителни изследвания ще бъдат необходими, ако животните продължат да показват признаци на токсичност. Наблюденията следва да включват промените в кожата и козината, очите и лигавицата и също дихателната, кръвоносната, автономната и централната нервна система, соматомоторната активност и моделите на поведение. Вниманието следва да бъде насочено към наблюдения на треперене, конвулсии, слюноотделяне, диария, летаргия, сън и кома. Следва да бъдат взети предвид принципите и критериите, резюмирани в Ръководството за хуманен край (9). Животните, намерени в терминално състояние, и животните, показващи дълбока болка или непрекъснати признаци на дълбоко страдание, следва да бъдат убити по хуманен начин. Когато животните са убити по хуманни причини или са намерени мъртви, времето на смъртта им следва да бъде записано колкото е възможно по-точно.
1.6.
1.6.1. Телесно тегло Индивидуалното тегло на животните следва да бъде измервано в кратък интервал от време преди приемането на изпитваното вещество и поне веднъж седмично след това. Промените в теглото следва да бъдат изчислявани и записвани. В края на експеримента оцелелите животни се претеглят и след това се убиват по хуманен начин.
1.6.2. Патология Всички изследвани животни (включително умрелите по време на експеримента или извадените от експеримента животни по причини на хуманно отношение към животните) следва да бъдат подложени на цялостна аутопсия. Всички цялостни патологични изменения във всяко животно следва да бъдат записани. Микроскопските изследвания на органите, даващи доказателства за цялостна патология при животните, оцелели 24 часа или повече след първоначалното дозиране, също могат да допринесат за получаването на полезна информация.
2. ДАННИ Следва да бъдат осигурени индивидуални данни за всяко животно. Освен това всички данни следва да бъдат обобщени в таблична форма, показваща броя на използваните животни във всяка от изследваните групи, броя на животните, проявяващи признаци за токсичност, броя на животните, намерени мъртви по време на изследването или убити по хуманни причини, времето на настъпване на смъртта на животинския индивид, описание и развитие във времето на токсичните ефекти и обратимостта им, както и заключенията от аутопсията.
3. ОТЧИТАНЕ
3.
3.1. Протокол от изпитването Протоколът от изпитването по целесъобразност следва да включва следната информация:
Изпитвано вещество:
физична форма, чистота и, където е подходящо, физикохимични свойства (включително изомеризация);
данни за идентичността, включително САS номер.
Разтворител (ако има такъв):
обосноваване на избора на разтворител, ако е различен от вода.
Изследвани животни:
използвани видове/породи;
микробиологично състояние на животните, когато е известно;
брой, възраст и пол на животните (включително, при необходимост, обосноваване на използването на мъжки индивиди вместо женски);
водоизточник, условия за отглеждане, диета и т.н.
Условия на експеримента:
подробности за формулирането на изпитваното вещество, включително подробности за физичното състояние на приемания материал;
подробности, свързани с приемането на изпитваното вещество, обеми на дозите и време на дозиране;
подробности във връзка с качеството на храната и водата (включително вид/източник на диетата, водоизточник);
обосновка на избора на началната доза.
Резултати:
таблици/диаграми на получените данни и ниво на дозата за всяко животно (т.е. при които животното показва признаци на токсичност, включително смърт; природа, острота и продължителност на ефектите);
таблици/диаграми на телесното тегло и на измененията в него;
индивидуални тегла на животните през деня на дозиране, на седмични интервали след това и при смърт;
дата и време на смъртта, ако умрат преди приключване на програмата;
развитие във времето от първоначалното появяване на признаци за токсичност и дали е имало обратимост за всяко животно;
заключения при аутопсията и хистопатологични заключения за всяко животно, ако има такива.
Дискусия и интерпретиране на резултатите.
Заключения.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
ПРЕПРАТКИ Roll R., Hцfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86 Roll R., Riebschlflдger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitдt von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336—341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559—610 Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729—734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129—134 Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method — An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455—470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659—670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-№-24-№-0,FF.html] Lipnick R. L., Cotruvo, J. A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel K. A., Walker A. P., Chu I; Goddard M., Segal L., Springer J. A. and Myers R. C. (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223—231. Chan P. K. and A. W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A. W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
Б.2. ОСТРА ТОКСИЧНОСТ (ИНХАЛАТОРНА)
Б.2.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Полезно е да има предварителна информация за разпределението на частиците по размери, както и за парното налягане, температурата на топене, температурата на кипене, точката на възпламеняване и експлозивните свойства (когато могат да намерят приложение) на изпитваното вещество. Виж също общо въведение към част Б (А).
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Виж общо въведение към част Б (Б).
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Няколко групи от експериментални животни се подлагат на въздействието на изпитваното вещество за определен период от време, при нарастващи концентрации, като за всяка група се използва една концентрация. След това се провеждат наблюдения върху ефектите и случаите на смърт. Животните, умрели по време на изпитването, се подлагат на аутопсия. Оцелелите животни в края на изпитването също се аутопсират. Животните, които показват тежки и трайни симптоми на стрес и болка, може да се наложи да бъдат убити по безболезнен начин. Дозирането на изпитваните вещества по начин, за който се знае, че причинява значителна болка и стрес поради разяждащи или остро дразнещи въздействия, няма нужда да се прилага.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.6.
1.6.1. Подготовка Животните се настаняват и хранят при експерименталните условия най-малко пет дни преди началото на опита. Преди изпитването на случаен принцип се подбират здрави млади животни и се разпределят в съответния брой групи. Няма нужда животните да се подлагат на симулирана (предварителна) експозиция, освен ако това не е включено в изискванията към използвания тип апаратура за експониране. Твърдите изпитвани вещества следва да се стрият до получаването на частици с подходящ размер. Когато е необходимо, към изпитваното вещество може да се прибави подходящ носител, който ще помогне да се получи нужната концентрация на веществото в атмосферата. В такива случаи следва да се предвиди контролна група за носителя. Ако за улесняване на дозирането се използва носител или други добавки, за тях следва да е известно, че нямат токсични ефекти. За тази цел могат да се използват данни, получени при предишни опити.
1.6.2. Условия на изпитването
1.6.2.
1.6.2.1. Опитни животни Плъховете са предпочитаният вид за този опит, освен ако няма други данни. Използват се обичайните лабораторни породи. В началото на изпитването диапазонът на масата на животните не бива да надвишава ± 20 % спрямо съответната средна стойност за всеки от половете.
1.6.2.2. Брой и пол При всяка концентрация се използват най-малко 10 гризачи (пет женски и пет мъжки). Женските не бива да са раждали, нито да са бременни. Забележка: При опитите за остра токсичност с животни от по-висш разред от гризачите следва да се обмисли използването на по-малък брой животни. Дозите следва да се подберат внимателно, като се полагат усилия да не се надвиши умерено токсичната доза. При тези изпитвания следва да се избягва въвеждането на летални дози от веществото.
1.6.2.3. Концентрации на експозицията Концентрациите следва да бъдат достатъчно на брой (поне три) и да са правилно разпределени, така че да се получат групи от животни с определен обхват от токсични въздействия и степени на смъртност. Данните следва да бъдат достатъчни за начертаването на крива концентрация/смъртност и, където е възможно, да позволят приемливо определяне на стойността на LC50.
1.6.2.4. Гранично изпитване Ако експозицията на пет мъжки и пет женски опитни животни на 5 mg/l газ или 5 rug/l аерозол на течни или твърди вещества в продължение на четири часа дневно в рамките на 14 дни не предизвиква смъртност, свързана с третирането, по-нататъшно изследване се смята за ненужно. В случаи, когато изследваното вещество има физикохимична характеристика (включително експлозивни свойства), непозволяваща достигане на тези концентрации, то се прилага максимално постижимата технически концентрация на изследваното вещество.
1.6.2.5. Време на експозицията Периодът на експозицията следва да бъде четири часа.
1.6.2.6. Апаратура Опитите с животните се провеждат в апаратура за инхалации, проектирана така, че да поддържа динамичен въздушен поток (поне 12 смени на въздуха за един час), да осигурява подходящо съдържание на кислород и равномерно разпределение на веществото в атмосферата за експозиция. Когато се използва камера, нейната конструкция следва да е такава, че да свежда до минимум струпването на животните и да осигурява максимално тяхната експозиция чрез вдишване на изпитваното вещество. Основно правило за осигуряването на стабилна атмосфера в камерата е общият обем на опитните животни да не е по-голям от 5 % от обема на камерата. Могат да се използват индивидуални камери, които да обхващат устата и носа, само главата или цялото тяло. Първите два вида камери спомагат да бъде сведено до минимум поемането на веществото по други пътища.
1.6.2.7. Период на наблюдение Периодът на наблюдение следва да бъде най-малко 14 дни. Продължителността на наблюденията обаче не бива да е строго фиксирана. Тя се определя от токсичните реакции, скоростта, с която те настъпват, и времетраенето на възстановителния период. Така периодът на наблюдение може да се удължи, докогато се сметне за необходимо. Времето, за което се появяват и изчезват симптомите на токсичното действие, както и времето на смъртта са много важни, особено когато съществува тенденция към забавяне на смъртния изход.
1.6.3. Процедура Животните се претеглят малко преди експозицията. Те се подлагат на въздействието на изпитваното вещество при съответната концентрация за период от четири часа, който се отчита след нагласяването на концентрацията в камерата. Времето за постигане на нужната концентрация в камерата следва да бъде кратко. Температурата по време на изпитването следва да се поддържа в интервала 22 ± 3 oС. В идеалния случай относителната влажност следва да бъде между 30 и 70 %, но понякога (например при изпитването на някои аерозоли) това не може да се постигне. Поддържането на малко по-ниско налягане в камерата (< 5 mm воден стълб) би предотвратило изтичане на изпитваното вещество в околната среда. По време на експозицията на животните не бива да се дават храна и вода. Следва да се използват подходящи системи за създаване и контрол на атмосферата за изпитването. Тези системи следва да осигуряват колкото е възможно по-бързото постигане на стабилни условия на експозицията. Камерата следва да е така проектирана и с нея да се работи по такъв начин, че да се поддържа равномерно разпределение на изпитваното вещество в обема на камерата. Провеждат се следните измервания или наблюдения: Наблюдения се провеждат както по време на експозицията, така и след това. Те се записват системно, като се води индивидуален протокол за всяко животно. През първия ден наблюденията се правят много често. Обстоен клиничен преглед следва да се прави поне един път на всеки работен ден. Другите наблюдения се правят ежедневно, като се предприемат мерки за свеждане до минимум на загубата на животни от изпитването, например аутопсия или замразяване на животните, намерени мъртви, и изолиране или умъртвяване на слабите или умиращите животни. Наблюденията следва да включват промените на кожата и козината, очите, лигавиците, измененията в дихателната, кръвоносната, автономната и централната нервна система, както и соматомоторната активност и поведението на животните. Особено внимание следва да се обърне на наблюденията на дишането, треморите, конвулсиите, слюноотделянето, диария, летаргия, сън и кома. Времето на смъртта следва да се записва колкото е възможно по-точно. Масата на всяко животно се определя по веднъж на седмица след експозиция и при настъпването на смъртта. Животните, умрели по време на изпитването, както и оцелелите до края на експеримента се подлагат на аутопсия, като особено внимание се обръща на измененията в горните и долните дихателни пътища. Записват се всички видими макроскопски патологични изменения. Където е нужно, следва да се вземат тъкани за хистопатологично изпитване.
1.6.3. а)
на дебита на въздушния поток (постоянно);
б)
на действителната концентрация на изпитваното вещество. Тя се измерва в зоната на дишане поне три пъти по време на експозицията (при някои атмосфери, например аерозоли във високи концентрации, може да е необходимо по-често контролиране на концентрацията). По време на експозицията концентрацията не бива да варира с повече от ± 15 % от средната стойност. При някои аерозоли обаче това ниво на контрол не може да се постигне. В такива случаи се налага да се приемат по-широки граници на вариране на концентрациите. При аерозолите следва да се провеждат анализи на размера на частиците толкова често, колкото е необходимо (поне един път за всяка група животни);
в)
на температурата и влажността (ако е възможно, непрекъснато).
2. ДАННИ Данните се обобщават в табличен вид. За всяка група от опитни животни те следва да показват: брой на животните в началото на изпитването, време на смъртта на всяко животно, брой на животните, показали други симптоми на токсичното действие, описание на токсичните ефекти и находките при аутопсията. Когато времето на преживяване е по-дълго от един ден, следва да се изчисляват и записват промените в телесната маса. Животните, които са умъртвени по хуманни съображения поради свързани с веществото признаци на стрес и болка, се отчитат като умрели в резултат на въздействието на веществото. Стойността на LС50 се определя по утвърдения метод. Оценката на данните следва да включва връзката (ако има такава) между експозицията на животното и проявите и степента на всички аномалии, включително тези в поведението, клиничните аномалии, видимите поражения, промените в телесната маса, смъртността и другите ефекти на токсичното действие.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Протоколът от изпитването следва по възможност да съдържа следната информация: Данни за експозицията. Данните за експозицията следва да се представят в табличен вид, като се представят със средните си стойности и измерените отклонения (например стандартното отклонение) и, ако е възможно, да включват:
вид, порода, източник, условия на околната среда, диета и т.н.;
условия на изпитването: описание на апаратурата за експозиция, в това число конструкцията, типа, размерите, източника на въздух, системата за получаване на аерозоли, метода за кондициониране на въздуха и метода за разполагане на животните в камерата (когато е използвана камера). Също следва да се описват техническите средства за измерване на температурата, влажността и концентрацията на аерозола, както и разпределението на частиците по размери.
3.1. а)
дебитите на въздушния поток през апаратурата за инхалиране;
б)
температурата и влажността на въздуха;
в)
номиналните концентрации (общото количество изследвано вещество, подадено в апаратурата за инхалиране, разделено на обема въздух);
г)
природата на носителя (ако е използван);
д)
действителните концентрации в изпитваната зона на дишане;
е)
масовия среден аеродинамичен диаметър (ММАD) и геометричното стандартно отклонение (СSD);
ж)
периода за влизане на апаратурата в режим;
з)
периода на експозиция;
таблични данни за отговора по пол и ниво на експозицията (например брой животни, които са умрели или са били убити по време на изпитването; брой животни, показващи признаци на токсично действие; брой животни, подложени на експозиция);
времена на смъртта по време на експозицията или след нея, причини и използвани критерии за умъртвяването по хуманни съображения;
всички наблюдения;
стойността на LС50 за всеки от половете, определена в края на наблюдателния период (като се посочи и методът на изчисляване);
95 % интервал на достоверност за LС50 (където може да се предостави);
крива доза/смъртност и наклон на кривата (където е възможно да се измери в зависимост от метода на определянето);
находки при аутопсията;
всички хистопатологични находки;
обсъждане на резултатите (особено внимание се обръща на ефекта, който оказва умъртвявянето на животни по хуманни съображения по време на изпитването върху изчислената стойност на LС50);
интерпретиране на резултатите.
3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТИРАНЕ Вж. Общо въведение, част Б, буква Г.
4. ПРЕПРАТКИ Вж. Общо въведение, част Б, буква Д.
Б.3. ОСТРА ТОКСИЧНОСТ (ДЕРМАЛНА)
Б.3.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Вж. Общо въведение, част Б, буква А.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Вж. Общо въведение, част Б, буква Б.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Изпитваното вещество в нарастващи дози се нанася върху кожата при няколко групи експериментални животни, като за всяка група се използва по една доза. След това се провеждат наблюдения върху вредните ефекти и смъртните случаи. Животните, умрели по време на изпитването, се подлагат на аутопсия. Оцелелите животни се аутопсират в края на изпитването. Животните с остри и продължителни симптоми на болка и стрес може да се наложи да бъдат убити по безболезнен начин. Не бива да се прилага дозиране на изследваните вещества по начини, за които е известно, че причиняват силна болка и стрес, поради характерни за тях ефекти на разяждане или силно дразнене.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.6.
1.6.1. Подготовка Животните се разполагат по клетки и се държат и хранят в експериментални условия най-малко пет дни преди началото на експеримента. Преди изпитването млади, полово зрели животни в добро здравословно състояние се подбират по произволен начин и се разпределят на групи. Приблизително 24 часа преди опита козината по гръбната (дорзалната) част на тялото се отстранява чрез подрязване или бръснене. Следва да се внимава да не се охлузи кожата, защото това би могло да промени нейната пропускливост. За прилагането на изпитваното вещество е необходимо да се почистят най-малко 10 % от повърхността на тялото. При изпитването на твърди вещества (които може да се приведат в прахообразно състояние) веществото следва добре да се омокри с вода или, ако е необходимо, с подходящ носител, за да се осигури добър контакт с кожата. Ако се използва носител, следва да се има предвид неговото влияние върху проникването на веществото през кожата. По принцип течните вещества се прилагат без разреждане.
1.6.2. Условия на изпитването
1.6.2.
1.6.2.1. Опитни животни Могат да се използват плъхове или зайци в зряла възраст. Възможно е използването и на други видове животни, но за това е необходима обосновка. Използват се обикновените лабораторни породи. Вариациите в телесната маса на животните в началото на изпитването не бива да надвишават ± 20 % от съответната средна стойност за всеки от двата пола.
1.6.2.2. Брой и пол При всяко ниво на дозиране се използват най-малко пет животни. Всички те следва да са от един и същи пол. Женските не бива да са раждали, както и да не са бременни. Ако има информация, че един от двата пола проявява значително по-висока чувствителност, то се използват животни от този пол. Забележка: При изследванията за остра токсичност с животни от по-висш разред от гризачите, следва да се обмисли употребата на по-малък брой животни. Дозите следва да се подбират внимателно, като се полагат усилия да не се надвишават умерено токсичните дози. При тези изпитвания се избягва прилагането на летални дози от веществото.
1.6.2.3. Нива на дозите Те следва да са достатъчно на брой (поне три) и да са правилно разпределени количествено, така че при изпитването да се получат групи от животни с определен обхват от токсични ефекти и нива на смъртност. При определянето на нивата на дозите следва да се вземат под внимание всички ефекти на дразнене и разяждане на кожата. Данните следва да са достатъчни за получаването на крива доза/отговор и, когато е възможно, да позволяват приемливо определяне на LD50.
1.6.2.4 .Гранично изпитване С помощта на описаните по-горе процедури може да се проведе гранично изпитване с една доза на ниво най-малко 2000 mg/кg телесна маса върху група от 5 мъжки и 5 женски животни. Ако това доведе до смъртност, свързана със съединението, може да се реши провеждане на пълното изследване.
1.6.2.5. Период на наблюдение Периодът на наблюдение следва да бъде най-малко 14 дни. Продължителността на наблюдението обаче не бива да се фиксира точно. Тя се определя от реакциите на токсичното въздействие, скоростта, с която те настъпват, и времетраенето на възстановителния период. Така тя може да се удължи, докогато се сметне за необходимо. Времето, за което се появяват и изчезват симптомите на токсичното действие, тяхната продължителност и моментът на смъртта са важни, особено когато съществува тенденция към забавяне на смъртния изход.
1.6.3. Процедура Животните се разполагат по клетки индивидуално. Изпитваното вещество се нанася равномерно върху площ около 10 % от общата повърхност на тялото. При силно токсичните вещества покритата повърхност от тялото може да бъде и по-малка, но при всички случаи покриването следва да стане на колкото е възможно по-тънък и равномерен пласт. Изпитваните вещества се поддържат в контакт с кожата с помощта на марлена превръзка и лепенки, които не предизвикват дразнене. Времетраенето на експозицията е 24 часа. Мястото на прилагане следва да се покрие допълнително по подходящ начин, така че марлята и веществото да са добре закрепени и да се избегне възможността животното да погълне веществото. За тази цел може да се използват приспособления за ограничаване на движенията, но пълното обездвижване на животното не е препоръчително. В края на експозиционния период останалото вещество се отстранява, като кожата се почиства с вода (ако е възможно) или по друг подходящ начин. Наблюденията се записват системно в реда, в който са направени. За всяко животно се води индивидуален протокол. През първия ден наблюденията се провеждат често. Поне веднъж на всеки работен ден се прави обстоен клиничен преглед. Останалите наблюдения се провеждат ежедневно, като се прави всичко възможно загубата на животни да бъде сведена до минимум, например аутопсия или замразяване на животните, намерени мъртви, и изолиране или умъртвяване на слабите или умиращите животни. Наблюденията следва да включват: промени в козината, третираната кожа, очите и лигавиците, както и на дихателната, кръвоносната, автономната и централната нервна система, соматомоторната активност и поведението на животните. Особено внимание следва да се обръща за тремори, конвулсии, слюноотделяне, диария, летаргия, сън и кома. Времето на смъртта се записва колкото е възможно по-точно. Животните, умрели по време на изпитването, както и оцелелите до края на изпитването се подлагат на аутопсия. Записват се всички видими патологични изменения. Когато е необходимо, някои тъкани се вземат за хистопатологично изследване.
1.6.3. Оценка на токсичното действие при другия пол
След приключването на опита с единия пол група от най-малко пет животни от другия пол също се подлага на третиране. Така може да се разбере дали животните от този пол не са забележимо по-чувствителни към изпитваното вещество. В отделни случаи е оправдано използването на по-малък брой животни. Когато има адекватна информация, показваща, че животните от изследвания пол са много по-чувствителни, то експериментирането с другия пол може и да не се прави.
2. ДАННИ Данните се обобщават в табличен вид като за всяка група животни се показват: брой на животните в началото на изпитването, време на смъртта на всяко животно поотделно, брой животни с други признаци на токсично въздействие, описание на тосичните ефекти и находките при аутопсията. Индивидуалните телесни маси на животните се определят и записват непосредствено преди прилагането на изпитваното вещество, по един път на седмица след това и при смъртта. Когато времето на преживяване е по-голямо от един ден, измененията в теглото на животните се изчисляват и записват. Животните, убити по хуманни съображения заради стреса и болката, свързани с въздействието на веществото, се отчитат като случаи на смърт, причинена от веществото. Стойността на LD50 следва да се определи по утвърдения метод. Оценката на данните следва да включва преценка на зависимостта (ако има такава) между експозицията на животните и появата и остротата на всички аномалии, включително в поведението и клиничните аномалии, видимите поражения, промените в телесната маса, смъртността и всички останали токсикологични ефекти.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Протоколът от изпитването следва по възможност да съдържа следната информация:
вид, порода, източник, условия на средата, диета и т.н.;
условия на изпитването (включително метод за почистване на кожата и вид на превръзката: оклузивна (запушваща) или неоклузивна);
нива на дозите (с носителите, ако са използвани, и концентрациите);
пол на третираните животни;
таблични данни за отговора по пол и ниво на дозата (т.е. брой на животните, умрели или убити по време на опита; брой на животните със симптоми на токсично действие; общ брой на животните);
време на смъртта след дозирането; причини и критерии за умъртвяването на животни по хуманни съображения;
всички наблюдения;
стойност на LD50 за пола, подложен на цялостно изследване, определена на четиринадесетия ден, и метод на определянето ѝ;
95 % интервал на достоверност за LD50 (където може да се предостави);
крива доза/смъртност и наклон на кривата (където методът позволява да се определи);
находки при аутопсията;
всички хистопатологични находки;
резултатите от всички направени изпитвания върху другия пол;
обсъждане на резултатите (особено внимание се обръща на ефекта, който умъртвяването на животните по хуманни съображения по време на изпитването оказва върху изчислената стойност на LD50);
интерпретиране на резултатите.
3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТИРАНЕ Вж. Общо въведение, част Б, буква Г.
4. ПРЕПРАТКИ Вж. Общо въведение, част Б, буква Д.
Б.4. ОСТРА ТОКСИЧНОСТ: КОЖНО ДРАЗНЕЩО/КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ
Б.4.
1. МЕТОД Този метод е еквивалентен на метод ОECD ТG 404 (2002).
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ При подготовката на този осъвременен метод специално внимание беше обърнато на възможностите за усъвършенстване във връзка с осигуряване хуманно отношение към опитните животни и с цялостната оценка на съществуващата информация за изпитваното вещество с цел избягване на ненужно изпитване върху опитни животни. При този метод се препоръчва, преди да се пристъпи към теста in vivo за оценка на корозивно/дразнещо действие на веществото, да се извърши анализ на съществуващите данни за химичното вещество, които имат отношение към това действие. Когато липсват достатъчно данни, те могат да се получат чрез извършване на последващо проучване (1). Стратегията на изследване включва извършване на валидирани и утвърдени изследвания in vitro и е представена като приложение към този метод. Освен това се препоръчва, когато е възможно, при първоначалното изследване in vivo веществото да се прилага на животното в трите тестови апликации последователно, а не едновременно. За целите и на научната стойност на проучването, и на хуманното отношение към животните следва да не се пристъпва към изпитване in vivo, преди да бъдат анализирани и оценени всички налични данни във връзка с потенциалното корозивно/дразнещо действие на веществото върху кожата. Тези данни включват доказателства от съществуващи проучвания върху хора и/или лабораторни животни, сведения за корозивно/дразнещо действие на едно или повече вещества с подобен химичен строеж или смеси от такива вещества, данните за висока киселинност или алкалност на веществото (2)(3), както и резултатите от валидирани и утвърдени изследвания in vivo или ех vivo (4)(5)(5а). Този анализ следва да доведе до намаляване на необходимостта от извършване на изследвания in vivo за оценка на дразнещо/корозивно действие на веществата върху кожата, за които вече съществуват достатъчно данни от други проучвания относно тези ефекти. Като приложение към този метод е изложена препоръчителна стратегия за последователно изпитване, която включва извършването на валидирани и утвърдени in vitro или ех vivo изпитвания за оценка на корозивно/дразнещо действие. Стратегията е разработена и единодушно препоръчана от участниците в семинар на ОECD (6) и е приета като препоръчителна стратегия за изпитване в рамките на Глобалната система за хармонизиране на класификацията на химични вещества (GНS) (7). Препоръчва се тази стратегия да бъде приложена, преди да се предприеме in vivo изпитване. За нови вещества стратегията представлява препоръчителният подход за поетапно изпитване с цел получаване на достоверни научни данни за корозивното или дразнещото действие на веществото. За съществуващи вещества с недостатъчно данни за корозивно/дразнещо действие върху кожата стратегията следва да се прилага, когато се провеждат проучвания, за да се получат липсващите данни. Използването на друга стратегия или процедура за изпитване или решението да не се прилага поетапен подход за изпитване следва да бъдат обосновани. Когато оценката за корозивно/дразнещо действие не може да бъде извършена чрез анализ на данните в съответствие със стратегията за последователно изпитване, следва да се пристъпи към in vivo изпитване (вж. приложението).
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Кожно дразнене е предизвикването на обратимо увреждане на кожата след прилагането на дадено химично вещество за период до 4 часа. Корозивно действие върху кожата е предизвикването на необратимо увреждане на кожата, а именно видима некроза на епидермиса и дермата след прилагането на дадено химично вещество за период до 4 часа. Характерните прояви на корозивно действие включват язви, кървене, а до края на 14-дневния период на наблюдение се появяват промени в цвета на кожата, области с пълна алопеция и цикатрикси. При съмнение за вида на увреждането следва да се извърши хистопатологично изследване.
1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Изпитваното вещество се прилага еднократно върху кожата на опитно животно. Участък от кожата на животното, който не е третиран, служи като контрола. През определени интервали от време се отчита и оценява степента на дразнещо/корозивно действие. Наблюдаваните ефекти се описват подробно, за да може да се извърши цялостната им оценка. Продължителността на наблюдението следва да бъде достатъчно голяма, за да може да се установи дали ефектите са обратими или не. Животните, които показват трайни признаци на тежък стрес и/или болка, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин и тези ефекти да се вземат под внимание при оценката на веществото. Критериите за вземане на решение за умъртвяване по хуманен начин на животните, които изпитват тежко страдание и са в терминално състояние, са посочени в препратка (8).
1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.4.
1.4.1. Подготовка на in vivo изпитването
1.4.1.
1.4.1.1. Избор на вида опитни животни Предпочитаният вид опитни животни са зайците албиноси. Използват се млади, здрави, полово зрели животни. Използването на други животински видове следва да бъде обосновано.
1.4.1.2. Подготовка на животните Приблизително 24 часа преди изпитването козината от дорзалната част на тялото на животните се отстранява чрез подстригване или бръснене. При подстригването или бръсненето кожата не следва да се охлузва. Използват се само животни без наранявания или заболявания на кожата. В козината на някои породи зайци има гъсто окосмени участъци, които са по-забележими през определени периоди от годината. Изпитваните вещества следва да не се прилагат върху участъците с гъсто окосмяване.
1.4.1.3. Условия на отглеждане и хранене Животните следва да бъдат разпределени в отделни клетки. В помещението на зайците следва да се поддържа температура 20 oС (±3 oС). Стойностите на относителната влажност не следва да бъдат по-ниски от 30 % и е желателно да не превишават 70 % освен при почистване на помещението. Целта следва да бъде относителната влажност да се поддържа в интервала 50—60 %. Осветлението следва да бъде изкуствено, като се редуват 12 часа светлина и 12 часа тъмнина. При храненето се прилагат обичайните лабораторни диети с неограничен достъп до питейна вода.
1.4.2. Процедура на изпитването
1.4.2.
1.4.2.1. Прилагане на изпитваното вещество Изпитваното вещество се нанася върху малък участък от кожата (около 6 cm) и се покрива с марля. Марлята се прикрепва с помощта на лепенка, която не предизвиква дразнене на кожата. Когато не е възможно директно третиране (напр. при течности или някои пастообразни вещества), изпитваното вещество се нанася първо върху марлята, след което марлята се поставя върху кожата. През периода на експозиция марлята следва да се задържи в контакт с кожата, без да е притисната силно, с помощта на подходяща полуоклузивна превръзка. Когато изпитваното вещество се нанася върху марлята, тя следва да бъде прикрепена към кожата по такъв начин, че да се осигури плътен контакт и равномерно разпределение на веществото върху третирания участък. Достъпът на животното до марлята и поглъщането или вдишването на изпитваното вещество следва да бъде предотвратен. Течните вещества най-често се използват, без да се разреждат. Когато се изпитва твърдо вещество (което може да се стрие на прах, ако това е необходимо), то следва да се навлажни с възможно най-малкото количество вода (или, при нужда, друг подходящ носител), което е достатъчно, за да се постигне плътен контакт с кожата. Когато се използва друг носител освен водата, той следва да не оказва влияние върху кожното дразнене, предизвикано от изпитваното вещество, или влиянието му следва да бъде минимално. В края на периода на експозиция (обикновено 4 часа) остатъкът от веществото се отстранява от кожата, когато това е възможно, с вода или подходящ разтворител, без да се променя видът на кожната реакция или да се нарушава целостта на епидермиса.
1.4.2.2. Дози Върху кожния участък се нанасят 0,5 ml от течни химични вещества или 0,5 g от твърди или пастообразни химични вещества.
1.4.2.3. Първоначално изпитване (in vivo изпитване за дразнещо/корозивно действие върху кожата с използване на едно опитно животно). Препоръчва се in vivo изпитването да се извърши първоначално върху едно опитно животно, особено в случаите, когато се предполага, че веществото проявява корозивно действие. Този подход е в съответствие със стратегията за последователно изпитване (вж. приложение 1). Когато въз основа на анализа на съществуващите данни се прецени, че веществото проявява корозивно действие, не е необходимо по-нататък то да се изпитва върху лабораторни животни. За повечето химични вещества, за които се предполага, че са корозивни, най-често не е необходимо да се извършва in vivo изпитване. Въпреки това в случаите, когато се прецени, че са необходими допълнителни данни поради недостатъчни доказателства, може да се извърши изпитване върху животни в ограничен обем, като се използва следният подход: веществото се прилага върху едно и също животно последователно до 3 пъти. Първия път превръзката и марлята се отстраняват след три минути. Ако не се наблюдава значителна кожна реакция, веществото се прилага втори път за един час. Ако наблюденията на този етап показват, че експозицията може да продължи 4 часа, като се спази принципът за хуманно отношение към животните, веществото се нанася трети път за четири часа, след което се оценява степента на реакцията. Когато след една от трите последователни апликации се открие корозивен ефект, изпитването се прекратява веднага. Когато след нито една от апликациите не се наблюдава корозивен ефект, опитното животно се проследява в продължение на 14 дни, освен ако на по-ранен етап не се появят корозивни промени. В случаите, когато не се очаква изпитваното вещество да прояви корозивно действие, но може да предизвика дразнене, третирането се провежда върху едно животно с една апликация за четири часа.
1.4.2.4. Потвърдително изпитване (in vivo изпитване за кожно дразнещо действие с използване на допълнителни опитни животни). Когато при първоначалното изпитване не се установява корозивен ефект, наблюдаваните прояви на дразнене или отрицателната реакция следва да бъдат потвърдени, като се извърши еднократно третиране на най-много две допълнителни животни за 4 часа. Ако при първоначалното изпитване са отчетени прояви на дразнене, потвърдителното изпитване може да се извърши последователно с използване на едно или две опитни животни или едновременно върху двете опитни животни. Когато по изключение не е проведено първоначално изпитване, могат да се третират две или три животни, като на всяко животни се прави по една апликация за 4 часа. Когато се използват две животни и при двете се наблюдава една и съща реакция, не е необходимо по-нататъшно продължаване на изпитването. В обратния случай се третира и трето допълнително животно. При получаване на противоречиви резултати може да се наложи използването на още допълнителни животни.
1.4.2.5. Период на наблюдение Продължителността на периода на наблюдение следва да бъде достатъчна за пълната оценка на обратимостта на наблюдаваните ефекти. Въпреки това изпитването следва да се прекрати във всеки момент, когато животните покажат трайни признаци на силна болка или стрес. Обикновено за да се установи дали ефектите са обратими, животните се наблюдават в продължение на 14 дни след прекратяване на експозицията. Ако преди края на 14-дневния период се установи, че промените са обратими, изпитването се прекратява в момента, когато това е установено.
1.4.2.6. Клинични наблюдения и оценка на кожните реакции Всички животни се преглеждат за признаци на еритема и едем и реакциите се оценяват 60 минути, а след това 24, 48 и 72 часа след прекратяването на експозицията. При първоначалното изпитване върху едно животно третираният участък се преглежда и веднага след отстраняването на превръзката и марлята. Кожните промени се класифицират и отчитат според скалата, дадена в таблица 1. Когато до 72-рия час не може да се определи дали настъпилото увреждане на кожата е проява на дразнещо или корозивно действие, наблюдението продължава до 14-ия ден, за да се оцени дали промените са обратими. Освен признаците на дразнене следва да се опишат подробно и всички локални токсични прояви (напр. изсушаване на кожата) и системни неблагоприятни ефекти (напр. клинични симптоми на отравяне, промени в телесната маса). Когато е необходимо да се изяснят противоречиви резултати, следва да се използва хистопатологично изследване. Класифицирането на кожните промени е субективен процес. За да се постигне съответствие в оценките при класифицирането на кожните промени и да се подпомогнат лабораториите, в които се провеждат изпитвания, и лицата, които наблюдават животните и оценяват намерените промени, персоналът, извършващ наблюдението, е необходимо да бъде добре обучен да прилага класификационната скала (вж. таблицата по-долу). Може да се използва и илюстрирано ръководство за класифициране на проявите на кожно дразнене и други увреждания (9).
2. ДАННИ
2.
2.1. ПРЕДСТАВЯНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ В отчета за изпитването получените резултати следва да се обобщят в табличен вид. Той следва да включва всички данни, посочени в точка 3.1.
2.2. ОЦЕНКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ Баловата оценка на кожното дразнене следва да се разглежда във връзка с вида, тежестта и обратимостта или необратимостта на уврежданията. Индивидуалната балова оценка не е единственият критерий за определяне на дразнещите свойства на изпитваното вещество, тъй като се оценяват и други ефекти на веществото. Вместо това индивидуалният бал следва да се разглежда като стойност, която се оценява съвместно с всички други наблюдения от проучването. При оценката на дразнещия ефект следва да се има предвид дали кожните увреждания са обратими или не. Когато промени като алопеция (в ограничени участъци), хиперкератоза, хиперплазия и излющване на кожата се задържат до края на 14-дневния период на наблюдение, изпитваното вещество следва да се класифицира като дразнещо.
3. ДОКЛАДВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ОТЧЕТ ЗА ИЗПИТВАНЕТО Отчетът за изпитването следва да включва следната информация:
Обосновка за провеждане на in vivo изпитване: резултати от анализа на съществуващите данни, включително резултатите от прилагането на стратегията за последователно изпитване:
описание на съответните данни от предишни изпитвания;
данни, получени при всеки етап от стратегията за изпитване;
описание на извършените in vitro изпитвания, включително подробно представяне на процедурите на изпитване и резултатите за изпитваните и референтните химични вещества;
анализ на съществуващите данни с оглед преценка на необходимостта от извършване на in vivo проучване.
Изпитвано вещество:
данни за идентифициране на химичното вещество (напр. CAS номер, източник, чистота, известни примеси, номер на партидата);
физична природа и физикохимични свойства (напр. рН, летливост, разтворимост, стабилност);
при изпитване на смеси се представят данни за качествения състав на сместа и процентното съдържание на компонентите ѝ.
Носител (ексципиент):
химично идентифициране, концентрация (където е необходимо), използван обем;
обосновка за избора на носителя.
Опитни животни:
използван вид/порода, обосновка за използване на други животински видове/породи освен зайци албиноси;
брой на животните от всеки пол;
индивидуална телесна маса на всяко животно в началото и в края на изпитването;
възраст на животните в началото на проучването;
източник за доставка на животните, условия на отглеждане, диета и т.н.
Условия на изпитването:
начин за подготовка на кожния участък за третиране;
описание на материалите, използвани при апликацията на веществото и приготвянето на превръзката, и на начина на поставяне на превръзката;
описание на подготовката на изпитваното вещество за нанасяне и на нанасянето и отстраняването му.
Резултати:
таблица с баловите оценки на проявите на дразнещо/корозивно действие за всяко животно във всички моменти на отчитане;
описание на всички наблюдавани увреждания;
описание в разказна форма на вида и степента на наблюдаваните прояви на дразнене/корозивно действие, както и на хистопатологичните заключения;
описание на други неблагоприятни локални (напр. отстраняване на мазнините на кожата) и системни ефекти освен проявите на кожно дразнене и корозивно действие.
Обсъждане на резултатите.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
ПРЕПРАТКИ Barratt, M. D., Castell, J. V., Chamberlain, M., Combes, R. D., Dearden, J. C., Fentem, J. H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410—429. Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19—26. Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709—720. ECETOC (1990) Monograph №.15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2.Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483—524. Testing Method B.40 Skin Corrosion. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22—24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment №.19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Може да се получи от секретариата на OECD].
Таблица I Образуване на еритема и есхара Образуване на едем СКАЛА НА КОЖНИТЕ ПРОМЕНИ
Отсъствие на еритема … 0 Много слаба еритема (едва забележима) … 1 Добре изразена еритема … 2 Умерена до тежка еритема … 3 Тежка еритема (силно зачервяване — с цвят на цвекло) до образуване на есхара, което не позволява да се отчете балът на еритемата … 4 Максимален бал — 4 Отсъствие на едем … 0 Много слаб едем (едва забележим) … 1 Лек едем (границите на едемния участък са видимо повдигнати и се очертават ясно) … 2 Умерено изразен едем (подуване около 1 мм) … 3 Тежък едем (подуване повече от 1 мм, което обхваща участък, по-голям от третирания) … 4 Максимален бал — 4 Когато е необходимо да се изяснят противоречиви резултати, може да се проведе хистопатологично изследване.
Б.5. ОСТРА ТОКСИЧНОСТ: ОЧНО ДРАЗНЕЩО/КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ
Б.5.
1. МЕТОД Този метод е еквивалентен на ОECD TG 405 (2002)
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ При подготовката на този осъвременен метод специално внимание е отделено на възможностите за усъвършенстване на метода посредством оценка на пялата съществуваща информация за изпитваното вещество с оглед избягване на ненужно изпитване върху лабораторни животни. В този метод се препоръчва, преди да се пристъпи към in vivo изпитването за оценка на острото корозивно/дразнещо действие върху очите, да се извърши анализ на съществуващите данни за химичното вещество (1), които имат отношение към тези ефекти. Когато липсват достатъчно данни, се препоръчва те да бъдат получени чрез извършване на последователно изпитване (2)(3). Стратегията за изпитването включва извършването на валидирани и утвърдени in vitro изпитвания и е изложена като приложение към този метод. Също така се препоръчва, преди да се вземе решение за провеждане на in vivo изпитване за очно дразнещо/корозивно действие, да се проведе in vivo изпитване за оценка на кожното дразнещо/корозивно действие, въз основа на което може да се предвиди корозивният ефект върху очите. В интерес както на научната стойност на проучването, така и на хуманното отношение към лабораторните животни е да не се взима решение за провеждане на in vivo изпитване, преди да бъдат анализирани и оценени всички налични данни във връзка с потенциалното корозивно/дразнещо действие на веществото върху очите. Тук се включват данни от съществуващи проучвания върху хора и/или лабораторни животни, данни за корозивно/дразнещо действие на едно или повече вещества с подобен химичен строеж или смеси от такива вещества, данни за висока киселинност или алкалност (4)(5), както и резултати от валидирани и утвърдени in vitro или ех vivo методи за оценка на дразнещо/корозивно действие върху кожата (6) (6а). Проучванията могат да бъдат извършени преди анализа на съществуващите данни или в резултат от този анализ. За някои вещества анализът може да покаже необходимост от извършване на in vivo изпитване за оценка на потенциалното дразнещо/корозивно действие върху очите. Във всички тези случаи, преди да се вземе решение за провеждане на това изпитване, се препоръчва да се извърши in vivo изпитване на дермалните ефекти на веществото и оценка на резултатите от него съгласно метод Б.4 (7). Прилагането на анализа на съществуващите данни и стратегията за последователно изпитване следва да доведе до намаляване на необходимостта от извършване на in vivo изпитвания за очно корозивно/дразнещо действие на веществата, за които съществуват достатъчно събрани данни от други проучвания. In vivo изпитване за оценка на очното корозивно/дразнещо действие може да се проведе, когато потенциалното очно корозивно/дразнещо действие не може да се оцени чрез прилагане на стратегията за последователно изпитване дори след извършването на in vivo изпитване за кожно дразнещо/корозивно действие. В приложението към този метод е представена препоръчителна стратегия за последователно изпитване, която включва прилагането на валидирани in vitro или ех vivo методи за оценка на корозивно/дразнещо действие. Стратегията е разработена и единодушно препоръчана от участниците в семинар на ОECD (8) и е приета като препоръчителна стратегия за изпитване в рамките на Глобалната система за хармонизиране на класификацията на химични вещества (GSH) (9). Препоръчва се тази стратегия за изпитване да се приложи, преди да се проведе in vivo изпитване. За нови вещества стратегията представлява препоръчителният подход за поетапно изпитване с цел получаване на достоверни научни данни за корозивно/дразнещо действие. За съществуващи вещества с недостатъчно данни за кожно и очно корозивно/дразнещо действие стратегията следва да се приложи, за да се получат липсващите данни. Използването на друга стратегия или процедура за изпитване или решението да не се прилага поетапният подход за изпитване следва да бъдат обосновани.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Очно дразнене е предизвикването на промени в окото след прилагане на изпитваното вещество върху предната очна повърхност, като промените се възстановяват напълно до 21-вия ден след третирането. Корозивно действие върху очите е предизвикването на увреждане на тъканите на окото или сериозно увреждане на зрението вследствие прилагането на изпитваното вещество върху предната очна повърхност, като увреждането не се възстановява напълно до 21-вия ден след третирането.
1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Изпитваното вещество се прилага еднократно върху едно от очите на опитното животно, а окото, което не е третирано, служи като контрола. През определени интервали от време се отчита и оценява степента на дразнещо/корозивно действие върху конюнктивата, роговицата и ириса. Други ефекти върху очите, както и неблагоприятни системни ефекти също се описват с оглед извършването на цялостна оценка на токсичното действие. Продължителността на наблюдението следва да бъде достатъчно голяма, за да може да се отчете дали наблюдаваните ефекти са обратими или не. Животните, които показват трайни признаци на тежък стрес и/или болка в който и да е момент от изпитването, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин и наблюдаваните ефекти да се вземат под внимание при оценката на веществото. Критериите за вземане на решение за умъртвяване по хуманен начин на животните, които изпитват тежко страдание и се намират в терминално състояние, са посочени в препратка (10)
1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.4.
1.4.1. Подготовка на in vivo изпитването
1.4.1.
1.4.1.1. Избор на вида опитни животни Предпочитаните опитни животни са зайците албиноси. Използват се млади, здрави, полово зрели животни. Използването на други животински видове следва да бъде обосновано.
1.4.1.2. Подготовка на животните Двете очи на всяко експериментално животно, което е избрано за евентуално включване в изпитването, следва да се прегледат през последните 24 часа преди началото му. Животните, при които се установяват признаци на очно дразнене, очни дефекти или предшестващо увреждане на роговицата, не следва да се използват.
1.4.1.3. Условия на отглеждане и хранене Животните следва да бъдат разпределени в отделни клетки. В помещението, в което се намират зайците, следва да се поддържа температура 20 oС (± 3 oС). Стойностите на относителната влажност следва да не са по-ниски от 30 % и е желателно да не превишават 70 % освен по време на почистване на помещението. Целта е относителната влажност да се поддържа в интервала 50—60 %. Осветлението следва да бъде изкуствено, като се редуват 12 часа светлина и 12 часа тъмнина. При храненето се прилагат обичайните лабораторни диети с неограничен достъп до питейна вода.
1.4.2. Процедура на изпитването
1.4.2.
1.4.2.1. Прилагане на изпитваното вещество Изпитваното вещество следва да се постави в конюнктивалната торбичка на едното око на всяко от животните след леко издърпване на долния клепач по-напред от очната ябълка. След това двата клепача се държат долепени за около една секунда, за да може цялото поставено количество от веществото да се задържи в контакт с окото. Другото око не се третира и служи за контрола.
1.4.2.2. Промивка Очите на опитните животни не следва да се промиват в продължение най-малко на 24 часа след прилагане на веществото, освен в случаите, когато веществото е в твърдо агрегатно състояние (виж точка 1.4.2.3.2) и когато корозивният или дразнещият ефект се проявява непосредствено след третирането. Промивка може да се направи на 24-ия час след третирането, ако е необходимо. Използването на допълнителна група животни за изследване влиянието на промивката не се препоръчва, освен ако не е достатъчно обосновано от научна гледна точка. Когато е необходимо използването на допълнителна група, тя следва да включва два заека. Условията за извършване на промивката следва да се документират внимателно, включително дата и час, състав и температура на разтвора за промиване и използвано количество от него, продължителност и скорост на промиването.
1.4.2.3. Дози
1.4.2.3.
1.4.2.3.1. Изпитване на течности Когато се изпитват течни вещества, третирането се извършва с количество от 0,1 ml. Вещества, които се употребяват под формата на спрей, следва да не бъдат прилагани директно върху окото чрез пръскане. В този случай част от течността следва да се изпръска и да се събере в контейнер, след което от нея се взема необходимото количество от 0,1 ml и се поставя в окото.
1.4.2.3.2. Изпитване на твърди вещества Когато се изпитват твърди, пастообразни вещества и вещества, съставени от дребни частици, се прилага количество с обем 0,1 ml или маса не повече от 100 mg. Материалът, който се изпитва, следва да бъде стрит до фин прах. Обемът на прахообразното твърдо вещество следва да бъде измерен след леко уплътняване, например чрез почукване върху съда, в който се извършва измерването. Когато твърдото вещество не се е отстранило от окото по естествен път при първото отчитане на наблюдаваните промени (един час след третирането), окото може да се изплакне с физиологичен разтвор или дестилирана вода.
1.4.2.3.3. Изпитване на аерозоли При всички веществата, които се прилагат като спрей (спрей с помпа или аерозол), се препоръчва част от течността да се изпръска в контейнер и от нея да се вземе количеството, необходимо за третиране на окото. Изключение се прави само за вещества в аерозолни флакони под налягане, които не могат да се съберат по този начин, поради това че се изпаряват. В тези случаи окото следва да се придържа отворено и изпитваното вещество се поставя директно върху предната му повърхност с едно изпръскване в продължение на около една секунда. Флаконът се държи пред окото на разстояние 10 cm. Разстоянието може да варира в зависимост от налягането на аерозола и неговия състав. Изпръскването под налягане следва да се извърши внимателно, за да не се увреди окото. В някои случаи може да бъде необходимо да се оцени потенциалът за механично увреждане на окото от налягането на аерозола. Оценка на дозата от аерозола, с която е третирано окото, може да бъде направена чрез следната процедура: веществото се напръсква върху тегловна хартия през отвор с размерите на окото на заека, поставен непосредствено пред хартията. Чрез разликата в теглото на хартията преди и след напръскването се определя приблизително количеството, което би попаднало върху окото. За летливи вещества вместо тегловна хартия може да се използва контейнер. Изпръсканото в него количество се определя чрез претегляне на контейнера преди и след изпразването му.
1.4.2.4. Първоначално изпитване (in vivo изпитване за оценка на очно дразнещо/корозивно действие с използване на едно опитно животно) В съответствие със стратегията за последователно изпитване (вж. приложение 1) се препоръчва in vivo изпитването да се извърши първоначално върху едно опитно животно. Когато това изпитване се проведе съгласно описаната процедура и резултатите показват, че веществото може да прояви корозивно или изразено дразнещо действие върху очите, не следва да се извършва по-нататъшно изпитване за оценка на очното дразнещо/корозивно действие.
1.4.2.5. Местна упойка Необходимостта от използване на местни анестетици се преценява конкретно за всеки отделен случай. Когато анализът на съществуващите данни показва, че изпитваното вещество може да причини болка или при първоначалното изпитване се появява болка, преди третирането може да се приложи местен анестетик. Видът, концентрацията и дозата на анестетика следва да се подберат внимателно, така че употребата му да не доведе до промяна в реакцията към изпитваното вещество. Контролното око се третира с анестетика по същия начин.
1.4.2.6. Потвърдително изпитване (in vivo изпитване за оценка на очно дразнещо действие с използване на допълнителни опитни животни). Когато при първоначалното изпитване не се наблюдава корозивен ефект, дразнещият ефект или негативният резултат следва да се потвърдят, като се третират най-много две допълнителни животни. Ако при първоначалното изпитване се установява силно изразено дразнещо действие и при потвърдителното изпитване се очаква силно изразен (необратим) ефект, се препоръчва потвърдителното изпитване да се извърши чрез последователно третиране (върху едно животно и след това при необходимост — върху още едно животно) вместо едновременно върху двете допълнителни животни. Когато при второто третирано животно се наблюдава корозивен или силно изразен дразнещ ефект, изпитването се прекратява. При поява на слаб или умерен дразнещ ефект може да се наложи използването на допълнителни опитни животни, за да се потвърдят тези резултати.
1.4.2.7. Период на наблюдение Продължителността на периода на наблюдение следва да бъде достатъчна за цялостната оценка на степента и обратимостта на наблюдаваните ефекти. Въпреки това изпитването следва да се прекрати във всеки момент, когато опитните животни покажат трайни признаци на силна болка или стрес (9). Обикновено за да се установи дали ефектите са обратими, животните следва да се наблюдават в продължение на 21 дни след прилагането на веществото. Ако преди края на 21-дневния период се установи, че промените са обратими, изпитването се прекратява в момента, когато това е установено.
1.4.2.7.
1.4.2.7.1. Клинично наблюдение и оценка на очните реакции Очите се преглеждат на 1-вия, 24-ия, 48-ия и 72-рия час след прилагането на изпитваното вещество. Наблюдението не следва да продължава по-дълго от необходимото за получаване на достатъчно ясна и пълна информация. Животните, които показват трайни признаци на силна болка или стрес, следва да бъдат умъртвени незабавно по хуманен начин и тези ефекти да се вземат под внимание при оценката на веществото. Опитните животни със следните очни увреждания, настъпили след третирането, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин: перфорация на роговицата или язви, засягащи значителна част от роговицата, включително стафилома; кръв в предната камера на окото; помътняване на роговицата от четвърта степен, коетс персистира за 48 часа; отсъствие на реакция на светлината (промени в ириса от втора степен), което персистира за 72 часа; язви на конюнктивата; некроза на конюнктивата или мигателните ципи; влажна некроза. Умъртвяването се налага, защото тези лезии най-често са необратими. Опитните животни, при които не се развиват очни лезии, следва да бъдат умъртвени не по-рано от 3 дни след третирането. Опитни животни с леко до умерено изразени лезии следва да се наблюдават, докато лезиите отзвучат или в продължение на 21 дни, след което изпитването се прекратява. Наблюдението следва да се извърши на 7-ия, 14-ия и 21-вия ден след третирането, за да се прецени състоянието на получените лезии и тяхната обратимост или необратимост. При всяко наблюдение следва да се отчита степента на очните реакции (за конюнктива, роговица и ирис) (таблица 1). Всички други очни лезии (например панус, пигментиране) или неблагоприятни системни ефекти също следва да се опишат. Прегледът на очните реакции може да се улесни чрез използване на бинокулярна лупа, ръчна шпалт-лампа, биомикроскоп или друг подходящ уред. След отчитане на наблюденията на 24-ия час очите могат допълнително да се изследват с помощта на флуоресцеин. Оценката и степенуването на очните промени е субективен процес. За да се постигне съответствие в оценките при класифицирането на очните промени и да се подпомогнат лабораториите, в които се провеждат изпитвания, и лицата, които наблюдават животните и оценяват намерените промени, персоналът, извършващ наблюдението, следва да се обучи добре да прилага класификационната скала.
2. ДАННИ
2.
2.2. ОЦЕНКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ Баловата оценка на очното дразнене следва да се разглежда заедно с вида, тежестта и обратимостта или необратимостта на настъпилите лезии. Индивидуалната балова оценка не е единственият критерий за определяне на дразнещите свойства на изпитваното вещество, той като се оценяват и други ефекти на веществото. Вместо това индивидуалният бал следва да се разглежда като стойност, която има съдържание само когато е подкрепена от пълното описание и оценка на всички наблюдения.
3. ДОКЛАДВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ОТЧЕТ ЗА ИЗПИТВАНЕТО Отчетът за изпитването следва да включва следната информация:
Обосновка на извършеното in vivo изпитване: резултати от анализа на съществуващите данни от предишни изпитвания, включително резултатите от прилагането на стратегията за последователно изпитване:
описание на съществените данни от предишни изпитвания;
данни, получени при всяка стъпка от стратегията за изпитване;
описание на извършените in vitro изпитвания, включително подробно представяне на процедурите за изпитване и резултатите, получени при прилагане на изпитваните и референтните химични вещества;
описание на проведеното in vivo изпитване за оценка на кожно дразнещо/корозивно действие и на получените резултати;
анализ на съществуващите данни с оглед преценка на необходимостта от извършване на in vivo проучване.
Изпитвано вещество:
данни за идентифициране на химичното вещество (напр. CAS номер, източник, чистота, известни примеси, номер на партидата);
физична природа и физикохимични свойства (напр. рН, летливост, разтворимост, стабилност, химична реакция с вода);
при изпитване на смеси следва да се представят данни за качествения състав на сместа и процентното съдържание на компонентите ѝ;
когато се използва местен анестетик, за него се представят данни за идентичност, чистота, вид, доза, възможност за взаимодействие с изпитваното вещество.
Носител:
химично идентифициране, концентрация (когато е необходимо), използван обем;
обосновка за избора на носителя.
Опитни животни:
вид/порода, обосновка за използване на други животински видове/породи освен зайци албиноси;
възраст на животните в началото на проучването;
брой на животните от всеки пол в опитните и контролните групи (когато се изисква);
индивидуална телесна маса на всяко животно в началото и в края на изпитването;
източник за доставка на животните, условия на отглеждане, диета и т.н.
Резултати:
описание на методите за изследване на очния статус, използвани при характеризирането и степенуването на очните промени във всеки момент на отчитане (напр. използване на ръчна шпалт-лампа, биомикроскоп, флуоресцеин и др.);
представяне в табличен вид на данните за проявите на дразнещо/корозивно действие за всяко животно във всички моменти на отчитане до отстраняването на животното от изпитването;
описание в разказна форма на вида и степента на наблюдаваните прояви на дразнещо/корозивно действие;
описание на всички други очни лезии (например васкуларизация, образуване на панус, адхезии, пигментиране);
описание на неблагоприятни локални ефекти освен очните лезии, както и на неблагоприятни системни ефекти и хистопатологични наблюдения, ако такива са налице.
Обсъждане на резултатите.
3.2. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Екстраполацията на резултатите от проучванията на очното дразнене върху лабораторни животни е валидна само в ограничена степен. В много случаи зайците албиноси са по-чувствителни от хората към вещества с очно дразнещо или корозивно действие. При интерпретацията на данните следва внимателно да се прецени и изключи възможността дразненето да е предизвикано вторично вследствие на инфекция.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
ПРЕПРАТКИ Barratt, M. D., Castell, J. V., Chamberlain, M., Combes, R. D., Dearden, J. C., Fentem, J. H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410—429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C. Dossou, K. G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K. C., Hill, R. N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem.Toxicol 35, 159—164. Worth A. P. and Fentem J. H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161—177. Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H.(1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro ,2, 19—26. Neun, D. J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227—231. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Edsaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483—524. Testing Method B.40. Skin Corrosion. Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22—24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment №.19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
Таблица 1 СКАЛА НА ОЧНИТЕ УВРЕЖДАНИЯ
Роговица
Помътняване: степен на плътност (отчитането се извършва за участъка с най-плътно помътняване) Отсъствие на улцерация или помътняване … 0 Разпръснати или дифузни зони на помътняване (изключва се лекото замъгляване на нормалния блясък); детайлите на ириса са ясно различими … 1 Ясно различима полупрозрачна зона; детайлите на ириса са леко замъглени … 2 Зона със седефен цвят; детайлите на ириса не се забелязват; големината на зеницата се определя трудно … 3 Непрозрачна роговица; ирисът не се различава през помътнената роговица … 4 Максимален бал: 4 vide
Ирис
Без промени … 0 Забележимо увеличени гънки, конгестия, оток, умерена перикорнеална хиперемия; ирисът реагира на светлина (вялата реакция се смята за признак на увреждане) … 1 Кръвоизлив, разрушаване на нормалната структура, което е видимо макроскопски, или липса на реакция на светлина … 2 Максимален бал: 2
Конюнктиви
Еритем (отнася се за палпебралната и булбарната конюнктива, като се изключват роговицата и ирисът) Нормални кръвоносни съдове … 0 Хиперемия на някои кръвоносни съдове … 1 Дифузно кървавочервено оцветяване; отделните кръвоносни съдове са трудно различими … 2 Дифузно тъмночервено оцветяване … 3 Максимален бал: 3
Хемоза
Подуване (отнася се за конюнктивата на клепачите и/или мигателните ципи) Липсва подуване … 0 Наличие на подуване, забелязва се известна разлика спрямо нормалното състояние … 1 Ясно изразено подуване с частично обръщане на клепачите … 2 Подуване със затворени приблизително наполовина клепачи … 3 Подуване със затворени повече от наполовина клепачи … 4 Максимален бал: 4
Б.6. КОЖНА СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ
Б.6.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Забележки: Чувствителността и възможността на тестовете да определят потенциалните за човека кожни сенсибилизиращи агенти се считат за важни качества в системата за класификация на токсичността, отнасяща се до общественото здраве. Не съществува един-единствен тест-метод, който адекватно да идентифицира всички вещества, способни да сенсибилизират кожата на човек, и който да е подходящ за всички. При избора на тест следва да се имат предвид фактори като физични характеристики на веществото, включително способността му да премине през кожата. Разработени са два вида тестове, използващи морски свинчета: тестовете с адювант, в които състоянието на алергия се потенциира от разтваряне или суспендиране на проучваното вещество в цялостния адювант на Freunds (FСА), и тестове без адювант. Тестовете с адювант изглеждат по-точни при предсказване на възможните кожни сенсибилизиращи ефекти на дадено вещество у човека, отколкото методите, неизползващи адюванта на Freunds, и затова са предпочитаните методи. Максимизиращият тест с морски свинчета (GРМТ) е широко употребяван тест с адювант. Въпреки че се използват и някои други методи за откриване потенциала на веществото да предизвика реакция на кожна сенсибилизация, GРМТ се смята за предпочитаната адювантна техника. Неадювантните тестове, притежаващи много химични класове (предпочитаният е тестът на Вuehlег) се смятат за по-малко чувствителни. В определени случаи може да има достатъчно причини за избор на теста на Вuehlег, който включва по-скоро локално приложение, отколкото интрадермални инжекции, използвани в максимизиращия тест с морски свинчета (GРМТ). При използване на теста на Вuehlег следва да се даде научно обяснение. Максимизиращият тест с морски свинчета (GРМТ) и тестът на Вuehlег са описани в настоящия метод. Може да се използват и други методи, само ако са добре потвърдени и научно обосновани. Ако се получи положителен резултат в стандартен скриниращ тест, проучваното вещество може да бъде обявено за потенциален сенсибилизиращ агент и няма да бъде необходимо продължаване на теста с морски свинчета. Ако резултатът в този тест е отрицателен, то тестът с морски свинчета следва да се продължи според процедурата, описана в настоящия метод. Вж. също Общо въведение, част Б
1.2. ДЕФИНИЦИИ Кожна сенсибилизация: (алергичен контактен дерматит) имунологично медиирана кожна реакция към вещество. При човека отговорите се характеризират със сърбеж, еритем, оток, папули, везикули, були или комбинация от всички тях. При други видове реакциите може да са различни и да се наблюдава само еритем и оток. Индукционна експозиция: експериментално излагане на субекта на действието на проучваното вещество с намерението да се индуцира състояние на хиперсензитивност. Период на индукция: период с продължителност най-малко една седмица, последвал индукционната експозиция, през който може да се развие състояние на хиперсензитивност. Провокационна експозиция: експериментално излагане на предварително третиран с проучваното вещество субект, след периода на ииндукция, с цел определяне дали субектът реагира по типа на хиперсензитивност.
1.3. РЕФЕРЕНТНИ ВЕЩЕСТВА Чувствителността и достоверността на използваните експериментални техники следва да бъдат проверявани на всеки шест месеца с помощта на вещества, за които се знае, че притежават слаби до умерени свойства да предизвикват кожна сенсибилизация. В добре проведения тест за слаби/умерено силни сенсибилизиращи агенти следва да се очаква отговор от поне 30 % в теста с адювант и поне 15 % в неадювантния тест. Предпочитат се следните вещества: САS номера ЕINECS номера ЕINECS имена Общоприети имена 101-86-0 202-983-3 2-хексил-З-фенилпроп-2-енал (хексилинамалдехид) 2-хексил-3-фенилпроп-2-енал (хексилинамалдехид) 149-30-4 205-736-8 бензотиазол-2-тиол (меркаптобензотиазол) каптакс 94-09-7 202-303-5 бензокаин нордкаин Съществуват обстоятелства, при които могат да се използват и други контролни вещества, стига те да отговарят на горните критерии и за тях да е дадено съответно обяснение.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ИЗПИТВАНЕ В началото опитните животни се излагат на действието на проучваното вещество посредством вътрекожни инжекции и/или епидермално прилагане (индукционна експозиция). След период на почивка от 10 до 14 дни (период на индукция), по време на който може да се развие имунен отговор, животните се подлагат на провокационна доза. Сравнява се обхватът и степента на кожна реакция към провокационното излагане при опитните животни с тази, показана от контролите, които претърпяват същото третиране по време на индукция и са подложени на провокация.
1.5. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДИТЕ НА ИЗПИТВАНЕ Ако се наложи отстраняване на проучваното вещество, това следва да се извърши с вода или друг подходящ разтворител, без да се промени съществуващият (наличният) отговор или целостта на епидермиса.
1.5.
1.5.1. Максимизиращ тест с морски свинчета (GРМТ)
1.5.1.
1.5.1.1. Подготовка Здрави млади, полово зрели морски свинчета албиноси се аклиматизират в продължение на поне 5 дни преди теста към лабораторните условия. Преди теста животните се подбират случайно и се разпределят в групите за третиране. Отстраняването на козината става чрез подстригване, бръснене или при възможност химическа депилация, в зависимост от използвания тест-метод. Следва да се внимава да не се увреди кожата. Животните се претеглят преди началото на теста и в неговия край.
1.5.1.2. Условия за провеждане на теста
1.5.1.2.
1.5.1.2.1. Опитни животни Обикновено се използват лабораторни породи от морски свинчета албиноси.
1.5.1.2.2. Брой и пол Могат да се използват мъжки и/или женски животни. Ако се използват женски, те следва да нямат партньор и да не са бременни. Използват се минимум по 10 животни в третираните групи и поне 5 в контролната група. Ако се използват по-малко от 20 опитни и 10 контролни морски свинчета и не е възможно да се направи изводът, че проучваното вещество е сенсибилизиращ агент, силно се препоръчва тестване на допълнителен брой животни, така че общият брой да бъде поне 20 опитни и 10 контролни животни.
1.5.1.2.3. Дозови нива Концентрацията на проучваното вещество, използвано за индукционна експозиция, следва да бъде системно добре толерирано и би следвало да представлява най-високата концентрация, която предизвиква леко до умерено кожно дразнене. Концентрацията, използвана за провокационно излагане, следва да бъде най-високата не предизвикваща дразнене доза. При необходимост подходящата концентрация може да се определи чрез пилотно проучване, използващо две или три животни. За тази цел следва да се отдаде внимание (предпочитание) на използването на животни, третирани с FСА.
1.5.1.3. Процедура
1.5.1.3.
1.5.1.3.1. Индукция Ден 0 за третираната група Поставят се три двойки вътрекожни инжекции с обем 0,1 ml в областта на рамото, което следва да се почисти от козина, така че всяко едно убождане от двойката да лежи от всяка страна на срединната линия. Инжекция 1: в отношение 1:1 смес (об/об) FСA/вода или физиологичен разтвор. Инжекция 2: проучваното вещество в избраната концентрация, поставено в подходяща среда. Инжекция 3: проучваното вещество в избраната концентрация, поставено в съотношение 1:1 смес (об/об) FCА/вода или физиологичен разтвор. В инжекция 3 водноразтворимите вещества се разтварят във водната фаза преди смесването им с FСА. Мастноразтворимите или неразтворимите вещества се суспендират в FСА преди смесването им с водната фаза. Крайната концентрация на проучваното вещество следва да бъде еднаква с използваната в инжекция 2. Инжекции 1 и 2 се поставят близо една до друга, възможно най-близо до главата, докато № 3 се поставя към най-долната (каудалната) част на опитната област. Ден 0 на контролната група Поставят се три двойки вътрекожни инжекции с обем 0,1 m1 в същите области както на третираните животни. Инжекция 1: в отношение 1:1 смес (об/об) FСА/вода или физиологичен разтвор. Инжекция 2: неразредена среда. Инжекция 3: съотношение 50 % т/об от средата в отношение 1:1 смес (об/об) FСА/вода или физиологичен серум. Ден 5—7 на третираната и контролната група Около двадесет и четири часа преди локално (местно) приложената индукция, ако веществото не е кожен дразнител, мястото за опит, след добро подстригване и/или бръснене, се третира с 0,5 ml 10 % натриев лаурил сулфат във вазелин с цел създаване на местно дразнене. Ден 6—8 на третираната група Мястото за опита отново се почиства от козина. Филтърна хартия (2 × 4 см), добре натоварена с проучваното вещество в подходяща среда, се поставя на опитното място и се оставя в тесен контакт чрез оклузивна превръзка в продължение на 48 часа. Изборът на средата следва да се обоснове. Твърдите вещества се пулверизират и инкорпорират в подходяща среда. Ако е необходимо, течните вещества могат да се прилагат неразредени. Ден 6—8 на контролната група Мястото за опит се почиства отново от козината. Средата се поставя самостоятелно по подобен начин на опитното място и се поддържа в контакт с помощта на оклузивна превръзка в продължение на 48 часа.
1.5.1.3.2. Провокация Ден 20—22 на третираната и контролната група Хълбоците на третираните и контролните животни се почиства от козина. Част от пластир или цяла превръзка, натоварена с проучваното вещество, се прилага на единия хълбок на опитното животно и при необходимост част от пластир, натоварен само със средата, може да се постави на другия хълбок. Пластирите се поддържат в контакт чрез оклузивни превръзки в продължение на 24 часа.
1.5.1.3.3. Наблюдение и степенуване: третирана и контролна група Препоръчва се сляпото наблюдение на опитните и контролните животни. Ако е необходимо да се изяснят резултатите, получени по време на първата провокация, следва да се обсъди втора провокация (т.е. репровокация), около една седмица след първата, при възможност с нова контролна група. Повторната провокация може да се извърши и с първата контролна група. Всички кожни реакции, както и всяко необичайно явление, включително системни реакции, резултат на индукционни или провокационни процедури, следва да се наблюдават и записват според скалата за степени на Маgnusson/Kligman (вж. допълнението). За да се уточнят съмнителните резултати, може да се проведат и други процедури, като напр. хистопатологично изследване, измерване на дебелината на кожната гънка.
около 21 часа след премахване на пластира мястото за провокация се почиства и се подстригва и/или бръсне добре и при необходимост се депилира;
около 3 часа по-късно (приблизително 48 часа след началото на провокационното прилагане) се наблюдава кожната реактивност и данните се записват според степените, показани в допълнението;
около 24 часа след това наблюдение се извършва второ (72 часа) и отново данните се записват.
1.5.2. Тест на Buehler
1.5.2.
1.5.2.1. Подготовка Здрави млади, полово зрели морски свинчета албиноси се аклиматизират в продължение на поне 5 дни преди теста към лабораторните условия. Преди теста животните се подбират случайно и се разпределят в групите за третиране. Отстраняването на козината става чрез подстригване, бръснене или при възможност чрез химическа депилация, в зависимост от използвания тест-метод. Следва да се внимава да не се увреди кожата. Животните се претеглят преди началото на теста и в неговия край.
1.5.2.2. Условия за провеждане на теста
1.5.2.2.
1.5.2.2.1. Опитни животни Обикновено се използват лабораторни породи от морски свинчета албиноси.
1.5.2.2.2. Брой и пол Могат да се използват мъжки и/или женски животни. Ако се използват женски, те следва да нямат партньор и да не са бременни. Използват се минимум 20 животни в третираната група и поне 10 в контролната.
1.5.2.2.3. Дозови нива Концентрацията на проучваното вещество, използвано за индукционна експозиция, следва да бъде възможно най-високата концентрация, която предизвиква умерено, но не значително кожно дразнене. Концентрацията, използвана за провокационно излагане, следва да бъде най-високата непредизвикваща дразнене доза. При необходимост подходящата концентрация може да се определи чрез пилотно проучване, използващо две или три животни. За водноразтворимите проучвани вещества е подходящо да се използва вода или недразнещ разтвор на сърфактант като среда. За другите проучвани вещества се предпочита 80 % етанол/вода за индукцията и ацетон за провокацията.
1.5.2.3. Процедура
1.5.2.3.
1.5.2.3.1. Индукция Ден 0 на третираната група Единият хълбок се почиства от козина (ниско подстриган). Пластирът, предназначен за теста, следва да бъде добре натоварен с проучваното вещество в подходяща среда (изборът на средата следва да се обоснове; при необходимост течните вещества могат да се прилагат неразредени). Пластирът за опита се поставя на опитното място и се оставя в тесен контакт с кожата чрез оклузивна превръзка в продължение на 6 часа. Системата с пластири за опита следва да бъде оклузивна. Подходящо е използването на памучен тампон — кръгъл или правоъгълен по форма, с площ около 4—6 cm2. Предпочита се използването на специални задържащи превръзки, с които да се постигне максимална оклузия. Ако се използва бинтоване, е възможно да се наложи допълнително излагане на действието на веществото. Ден 0 на контролната група Единият хълбок се почиства от козина (ниско подстриган). Прилага се само средата по начин, подобен на описания за третираната група. Пластирът за опита се поставя на опитното място и се оставя в тесен контакт с кожата чрез оклузивна превръзка в продължение на 6 часа. Ако се покаже, че не е необходимо включването на фалшива контролна група, може да се използва началната. Ден 6—8 и 13—15 на третираната и контролната група Извършва се същият начин на прилагане както в ден 0, на същото опитно място (при необходимост почистено от козина), на същия хълбок — на ден 6—8 и отново на ден 13—15.
1.5.2.3.2. Провокация Ден 27—29 на третираната и контролната група Нетретираният хълбок на третираните и контролните животни се почиства от косми (ниско подстригване). Поставя се част или целият оклузивен пластир, съдържащ съответното количество проучвано вещество в максимално недразнеща концентрация, върху задната част на нетретирания хълбок на третираните и контролните животни. Ако е уместно, се поставя също и част или целият оклузивен пластир, натоварен само със средата, върху предната част на нетретирания хълбок, както на третираните, така и на контролните животни. Пластирът се оставя в тесен контакт с кожата чрез подходяща превръзка в продължение на 6 часа.
1.5.2.3.3. Наблюдение и степенуване Препоръчва се сляпото наблюдение на опитните и контролните животни. Ако е необходимо да се изяснят резултатите, получени по време на първата провокация, следва да се обсъди втора провокация (т.е. репровокация) около една седмица след първата, при възможност с нова контролна група. Повторната провокация може да се извърши и с първата контролна група. Всички кожни реакции, както и всяко необичайно явление, включително системни реакции, резултат на индукционни или провокационни процедури, следва да се наблюдават и записват според степенната скала на Маgnusson/Kligman (вж. допълнението). За са се уточнят съмнителните резултати, може да се проведат и други процедури, като напр. хистопатологично изследване, измерване на дебелината на кожната гънка.
около 21 часа след премахване на пластира мястото за провокация се почиства от козина;
около 3 часа по-късно (приблизително 30 часа след прилагане на пластира за провокация) се наблюдава кожната реактивност и данните се записват според степените, показани в допълнението;
около 24 часа след тридесетте часа на наблюдение (около 54 часа след прилагане на пластира за провокация) отново се наблюдава кожната реактивност, отново данните се записват.
2. ДАННИ (GРМТ И BUEHLER) Данните следва да се обобщят в таблична форма, показваща кожните реакции на всяко едно животно при всяко наблюдение.
3. ДОКЛАДВАНЕ (GРМТ И ВUEHLER) Ако скриниращото изследване се проведе преди теста с морски свинчета, следва да се приложи описанието или позовавания към теста (напр. изследване на регионарните лимфни възли (LLNА), тест за подуване ушите на мишките (МЕSТ), включващи подробности от процедурата, както и получените резултати за проучваното и референтните вещества.
3. Доклад за теста (GМРТ и Вuehleг test)
Докладът за теста следва да включва, по възможност, следната информация:
Опитни животни:
използвана порода морски свинчета;
брой, възраст и пол на животните;
източник, условия на отглеждане, хранене и т.н.;
индивидуалното тегло на животните в началото и в края на теста.
Условия за провеждане на теста:
техника за подготовка на мястото за прилагане на пластира;
подробно описание на естеството на използваните пластири и техники за прилагането им;
резултати от пилотно проучване, даващо обосновка на използваните в теста концентрации за индукция и провокация;
подробно описание на подготовката на проучваното вещество, начина на прилагане и отстраняването му;
обосновка на избора на среда;
концентрации на проучваното вещество и средата в стадий на индукция и провокация, както и общото количество вещество, приложено при индукцията и провокацията.
Резултати:
обобщение на резултатите от последната проверка за чувствителност и достоверност (вж. 1.3), включително информация относно използваните вещество, концентрация и среда;
за всяко животно, включително скала за степенуване;
подробно описание на същността и степента на наблюдаваните ефекти;
всички хистопатологични резултати.
Обсъждане на резултатите.
Изводи.
4. ПРЕПРАТКИ Този метод е еднакъв с OECD ТG 406.
Б.7. ТОКСИЧНОСТ НА ПОВТАРЯЩА СЕ (ОРАЛНА) ДОЗА (28 ДНИ)
Б.7.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Вж. Общо въведение, част Б.
1.2. ДЕФИНИЦИИ Вж. Общо въведение, част Б.
1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ИЗПИТВАНЕ Проучваното вещество се прилага орално, ежедневно, в постепенно нарастващи дози на няколко групи експериментални животни, една доза на група в продължение на 28 дни. По време на периода на прилагане животните се наблюдават отблизо — всеки ден — за признаци на токсичност. Животните, които умрат или бъдат убити по време на теста, се аутопсират, при завършване на теста преживелите животни се убиват и също се аутопсират. Настоящият метод поставя ударение предимно върху неврологичните ефекти като специфична крайна цел, като се подчертава необходимостта от внимателно клинично наблюдение, така че да се получи възможно най-пълна информация. Методът следва да идентифицира химичните вещества с невротоксичен потенциал, което да даде основания за по-нататъшно задълбочено изследване в този аспект. В допълнение, методът може да посочи имунологични ефекти, както и токсичност върху репродуктивните органи.
1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА НА ИЗПИТВАНЕ
1.4.
1.4.1. Подготовка Здрави млади, полово зрели животни се подбират случайно и се разпределят в контролна и третирана група. Клетките се подреждат така, че да бъдат сведени до минимум възможните ефекти, дължащи се на местоположението на клетката. Животните се идентифицират поотделно и се отглеждат в клетките им в продължение на поне пет дни преди началото на проучването с цел аклиматизация към лабораторните условия. Проучваното вещество се прилага чрез сонда или с храната. Методът на орално прилагане зависи както от целта на изследването, така и от физичните/химичните свойства на веществото. При необходимост проучваното вещество се разтваря или суспендира в подходяща среда. Препоръчва се при възможност най-напред да се обсъди употребата на воден разтвор/суспензия, последвана от разтвор/емулсия в мазнина (напр. царевично олио) и накрая — разтвор в други среди. Ако разтворителят не е вода, следва да се знаят токсичните характеристики на средата. Следва да се определи стабилността на проучваното вещество в използваната среда.
1.4.2. Условия за провеждане на теста
1.4.2.
1.4.2.1. Опитни животни Плъховете са предпочитан вид, въпреки че се използват и други видове. На изследване се подлагат обичайно използвани лабораторни породи. Женските следва да нямат партньор и да не са бременни. Дозирането следва да започне възможно най-бързо след отбиването и във всеки случай преди животните да навършат деветседмична възраст. В началото на проучването различията в теглото на използваните животни следва да бъдат минимални и да не надхвърлят ± 20 % от средното за всеки пол тегло. Ако се провежда проучване за повтаряща се орална доза като предхождащо продължително проучване, предпочита се използването на животни от една и съща порода и в двете проучвания.
1.4.2.2. Брой и пол За всяко ниво на доза следва да се използват най-малко 10 животни (пет женски и пет мъжки). Ако междувременно се планира убиване на животни, броят на участващите следва да се увеличи в зависимост от броя на животните, предвидени да бъдат убити преди завършване на проучването. В допълнение, може да бъде третирана сателитна група от 10 животни (пет за всеки пол) с високи нива на доза в продължение на 28 дни, да бъде наблюдавана за обратимост, персистиране или забавена поява на токсичните ефекти до 14 дни след завършване на третирането. Използва се и сателитна група от 10 контролни животни (пет животни от всеки пол).
1.4.2.3. Нива на доза Обикновено се използват поне три опитни групи и една контролна. Животните от контролната група се гледат по същия начин както участващите в опитната група, с изключение на третирането с проучваното вещество. Ако за прилагането на проучваното вещество се използва среда, то контролната група следва да получи средата в най-големия използван обем. Ако въз основа на оценката на останалите данни не се очакват странични ефекти при доза 1000 mg/kg телесно тегло дневно, може да се проведе тест за определяне на граница. Ако няма на разположение подходящи данни, може да се проведе проучване за обхват, което да подпомогне определянето на използваните дози. Нивата на доза се подбират, като се имат предвид всички налични данни относно токсичност и (токсо-) кинетика на проучваното вещество или свързани с него вещества. Целта при избор на най-високата доза е индуциране на токсични ефекти, но не смърт или тежко страдание. След това се подбират постепенно намаляващи нива на доза с оглед установяване на всеки един свързан с дозата отговор, както и достигане на най-ниско ниво на доза, при което не се наблюдават странични ефекти (NOAEL). Дву- до четирикратни интервали обикновено са оптимални за подреждане на намаляващи нива на доза, прибавянето на четвърта опитна група често е за предпочитане пред използването на много големи интервали (напр. повече от фактор 10) между дозирането. За веществата, приложени чрез храната или питейната вода, е важно да се знае, че включените количества проучвано вещество не взаимодействат с нормалния хранителен или воден баланс. При прилагане на проучваното вещество с храната може да се използва или постоянна хранителна концентрация (ррm), или постоянно ниво на доза по отношение теглото на животното; използваният вариант следва да се отбележи точно. Ако веществото се прилага чрез сонда, дозата следва да се прилага по едно и също време всеки ден, както и да се адаптира така, че да поддържа постоянно ниво на доза при наличното тегло на животното. При използване на проучване с повтаряща се доза като предхождащо продължително проучване следва да се използва една и съща диета и в двете проучвания.
1.4.2.4. Тест за определяне на граници Ако тест при ниво на доза от поне 1000 mg/kg телесно тегло дневно или при прилагане с храна или питейна вода — на еквивалентна концентрация в храната или питейната вода (основаваща се на определяне на телесното тегло), използвайки процедурите, описани в настоящото проучване, не предизвикват видими токсични ефекти и ако не се очаква токсичност, изхождайки от данните за структурно свързани вещества, то тогава е необходимо да се обмисли извършването на пълно проучване, използващо три нива на доза. Прилага се тестът за определяне на граници, освен ако излагането на хора показва необходимост от използване на по-високо ниво на доза.
1.4.2.5. Период на наблюдение Периодът на наблюдение е 28 дни. Животните от сателитната група, определени за проследяване, следва да се наблюдават в следващите 14 дни, без да бъдат третирани, за да се открият късно появили се персистиране или възстановяване от токсичните ефекти.
1.4.3. Процедура Животните се дозират с проучваното вещество ежедневно в продължение на 7 дни всяка седмица за период от 28 дни; употребата на режим на дозиране от 5 дни седмично следва да се обоснове. При прилагане на проучваното вещество чрез сонда това става като една-единствена доза посредством стомашна сонда или съответно интубационна канюла. Максималното количество течност, което може да се приложи еднократно, зависи от размера на опитното животно. Обемът не бива да надминава 1 ml/100 g телесно тегло освен в случай на водни разтвори, където могат да се използват до 2 ml/100 g телесно тегло. С изключение на дразнещите или корозивните вещества, които нормално разкриват обострените ефекти при високи концентрации, променливостта на проучваното вещество следва да бъде сведена до минимум чрез адаптиране на концентрацията, така че да осигури постоянен обем на всички дозови нива.
1.4.3.
1.4.3.1. Общи наблюдения Общи клинични наблюдения следва да бъдат извършвани поне един път дневно, за предпочитане по едно и също време всеки ден и имайки пред вид връхния момент за поява на очакваните ефекти след дозиране. Записва се здравното състояние на животните. Поне два пъти дневно всички животни се преглеждат за заболеваемост и смъртност. Умиращите животни и тези, изпитващи тежък дистрес или болка, следва да бъдат отстранени, когато бъдат забелязани, хуманно убити и аутопсирани. За всички животни следва да се провежда внимателен клиничен преглед – веднъж преди първото излагане (да даде възможност за сравнение между субектите) и поне една седмица по-късно. Тези прегледи следва да се извършват извън домашната клетка, на стандартна площадка, за предпочитане всеки път по едно и също време. Наблюденията се записват внимателно, предпочита се използването на цифрова (балова) оценка, изрично определена от тестващата лаборатория. Следва да се положат достатъчно усилия, така че да бъдат осигурени минимални различия в условията на теста, както и извършване на наблюденията предимно от хора, неинформирани за третирането. Отбелязваните симптоми следва да включват, но не и да се ограничат до промяна в кожата, козината, очите, мукозните мембрани (лигавиците), поява на секреция и екскреция, както и автономна активност (напр. сълзене, пилоерекция — настръхване на козината, промяна в големината на зениците, необичаен начин на дишане). Следва да се запишат и промени в походката, стойката и отговор към общуването, както и наличие на клонични или тонични движения, стереотипни (напр. прекалено перене, повтарящо се ходене в кръг) или необичайно поведение (напр. самоизяждане — изяждане на части от тялото, ходене назад). По време на четвъртата седмица на излагане следва да се проведе оценка на сензорната реактивност към различни видове стимули (напр. слухови, зрителни и проприоцептивни), оценка на силата на захвата и двигателната активност. Повече подробности относно процедурите, които биха могли да бъдат проведени, са дадени в литературата (вж. Общо въведение, част Б). Функционалните наблюдения, проведени по време на четвъртата седмица на излагане, могат да бъдат пропуснати, ако проучването се извършва като предварително към следващо подостро (90-дневно) проучване. В този случай функционалните наблюдения се включват в това проучване и проследяване. От друга страна, наличните данни от функционалните наблюдения от проучването с повтарящи се дози могат да увеличат възможността за избор на нива на доза за следващото подостро проучване. По изключение функционалните наблюдения могат да бъдат пропуснати и за групи, които показват по друг начин признаци на токсичност — до степен, при която има значително взаимодействие с функционалните изяви на теста.
1.4.3.2. Телесно тегло и консумация на храна/вода Всички животни се претеглят поне един път седмично. Измерването на консумираните храна и вода се прави поне един път седмично. Ако проучваното вещество се прилага с питейната вода, консумацията на питейна вода следва да се измерва поне един път седмично.
1.4.3.3. Хематология В края на опитния период следва да се извършат следните хематологични изследвания: хематокрит, концентрация на хемоглобина, брой на еритроцитите, общ брой и диференциално броене на левкоцитите, брой на тромбоцитите, както и измерване на времето на кървене. Кръвните проби се вземат поименно преди или като част от процедурата по убиване на животните, като се съхраняват при определени условия.
1.4.3.4. Клинична биохимия Клинико-биохимични изследвания за определяне на основните токсични ефекти върху тъканите, и по-специално върху бъбреците и черния дроб, следва да се извършват върху кръвни проби, получени от всички животни преди или като част от процедурата за убиване на животните (независимо от намерените умиращи и/или междувременно убити). Препоръчва се една нощ гладуване за животните, на които ще се изследва кръвна захар. Изследванията на плазма и серум следва да включват серумен натрий, калий, кръвна захар, общ холестерол, урея, креатинин, общ белтък и албумини, поне два ензима, показателни за хепатоцелуларни ефекти (като аланин аминотрансфераза, аспартат аминотрансфераза, алкална фосфатаза, гама глутамил транспептидаза и сорбитол дехидрогеназа). Определянето на допълнителни ензими (от чернодробен и друг произход), както и жлъчни киселини може да даде допълнителна полезна информация при определени обстоятелства. Възможно е през последната седмица на проучването да бъдат проведени следните анализи на урината, като се използва събиране на урината по часове: вид, обем, осмолалитет или специфично тегло, рН, съдържание на белтък, глюкоза и кръв/кръвни клетки. В допълнение, следва да се обмислят и проучвания за изследване на серумни маркери за обща тъканна увреда. Други тестове, които следва да се проведат, ако известните свойства на проучваното вещество могат или се предполага, че повлияват свързаните метаболитни профили, са серумен калций, фосфор, триглицериди на гладно, специфични хормони, метхемоглобин и холинестераза. Необходимо е да бъдат идентифицирани за вещества от определени категории или за всеки отделен случай. В заключение, необходим е гъвкав подход в зависимост от породите и наблюдаваните и/или очакваните ефекти от дадено вещество. Ако анамнестичните основни данни са недостатъчни, следва да се обмисли определяне на хематологичните и клинико-лабораторните биохимични променливи преди началото на дозирането.
1.4.3.5. Макроскопска дисекция (аутопсия) Всички животни, участващи в проучването, се подлагат на подробна макроскопска дисекция, която включва внимателно изследване на външната повърхност на тялото, всичките му отверстия, както и черепната, гръдната и коремната кухина с тяхното съдържимо. Черният дроб, бъбреците, надбъбречните жлези, тестисите, епидидимиса, тимуса, далака, мозъка и сърцето на всички животни се почистват от каквато и да е допълнителна тъкан, ако е необходимо, и се претеглят възможно най-бързо след дисекцията с цел избягване на изсъхване. Следните тъкани се фиксират във възможно най-подходяща среда както за вида тъкан, така и за последващото хистопатологично изследване: всички макроскопски увреждания, мозък (представителните области, включително главен мозък, малък мозък и моста), гръбначен мозък, стомах, тънко и дебело черво (включително Пайеровите плаки), черен дроб, бъбреци, надбъбречни жлези, далак, сърце, тимус, щитовидна жлеза, трахея и бели дробове (запазени чрез инфлация на фиксатор, след което поставени в имерсия), полови жлези, допълнителни полови органи (напр. матка, простатна жлеза), пикочен мехур, лимфни възли (за предпочитане един лимфен възел в близост до мястото на прилагане и втори, отдалечен от мястото на прилагане, представителен за изследване на системните ефекети), периферни нерви (нервус ишиадикус или нервус тибиалис) — препоръчва се близо до мускула, както и срез от костен мозък (или, като алтернатива, костномозъчен аспират, прясно фиксиран). Клиничните и други данни могат да наложат изследване и на други тъкани. Уместно е да се запазят и всички други органи, смятани за таргетни въз основа на вече познати свойства на проучваното вещество.
1.4.3.6. Хистопатологично изследване Извършва се пълно хистопатологично изследване на запазените органи и тъкани на всички животни в контролната група и групите, получили високи дози от проучваното вещество. Тези изследвания следва да обхванат и животни от всички други дозови групи, ако бъдат установени промени, свързани с третирането, в групата с висока доза. Изследват се всички макроскопски увреждания. Когато се използва сателитна група, хистопатологични изследвания се извършват върху тъкани и органи, идентифицирани като показали ефекти в третираните групи.
2. ДАННИ Предоставят се индивидуалните данни за животните. В допълнение всички данни се обобщават в таблична форма, показваща за всяка опитна група: броя на животни в началото на теста, броя на животните, показали симптоми на токсичност, описание на наблюдаваните симптоми на токсичност, включително време на настъпване, продължителност и тежест на токсичните ефекти, броя на животните, намерени мъртви по време на теста или убити по хуманни съображения, броя на животните с увреждания, вид на уврежданията и процент на животните, показали определен тип увреждания. При възможност числовите резултати следва да бъдат оценени чрез съответни и общоприети статистически методи. Статистическите методи се подбират по време на проектиране на проучването.
3. ДОКЛАДВАНЕ
3. ДОКЛАД ЗА ТЕСТА
Докладът за теста следва да съдържа по възможност следната информация:
Опитни животни:
използвани видове/породи;
брой, възраст и пол на животните;
източник, условия на отглеждане, хранене и т.н.;
индивидуално тегло на животните в началото на теста, след което веднъж седмично, както и при завършване на теста.
Условия на теста:
обосновка за избор на средата, ако не е вода;
—обосновка на избора на доза;
подробности относно състава на проучваното вещество/приготвяне на храната, постигната концентрация, стабилност и хомогенност на приговянето;
подробности относно прилагане на проучваното вещество;
превръщане на концентрацията на проучваното вещество в храна/питейна вода (ррm) в същинската доза (mg/kg телесна маса дневно), ако е уместно;
подробности относно качество на храната и водата.
Резултати:
телесно тегло/промени в телесното тегло;
при необходимост — консумирана храна и вода;
данни относно реакции на токсичност според пол и ниво на доза, включително симптоми на токсичност;
същност, тежест и продължителност на клиничните наблюдения (обратимост на наблюдаваното или не);
сензорна активност, сила на захвата и оценка на двигателната активност;
хематологични тестове със съответните им начални стойности;
клинико-биохимични тестове със съответните им начални стойности;
телесно тегло при убиване на животното и данни за теглото на отделните органи;
находки от дисекцията;
подробно описание на всички хистопатологични находки;
данни за абсорбция, ако са налични;
при възможност — статистическа обработка на резултатите.
Обсъждане на резултатите.
Изводи.
4. ПРЕПРАТКИ Този метод е еднакъв с OECD ТG 407.
Б.8. ТОКСИЧНОСТ (ИНХАЛАТОРНА) С МНОГОКРАТНИ ДОЗИ (28-ДНЕВНО)
Б.8.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Необходимо е да се получи предварителна информация относно размера на разпръскваните частици, парния натиск, точката на топене, точката на кипене, точката на запалване и експлозивност (ако е приложимо) на веществото. Вж. Общо въведение, част Б, буква А.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Вж. Общо въведение, част Б, буква Б.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА Отделни групи от опитни животни се експонират на изследваното вещество в градуиращи концентрации за период от 28 дни, като за всяка група животни се използва определена концентрация. Ако е необходимо, може да се добави подходящ носител, който да улесни получаването на подходяща концентрация на веществото във въздуха в камерата. В този случай следва да се използва контролна група, експонирана на носителя. По време на експеримента животните се наблюдават ежедневно за откриване на признаци на токсичност. Животните, починали по време на експеримента, както и тези, преживели до края на опита, се аутопсират.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
1.6.
1.6.1. Подготовка Животните се държат в условията на експериментално отглеждане и хранене най-малко пет дни преди експеримента. Преди експеримента млади и здрави животни се подбират на случаен принцип и се разпределят съгласно изисквания брой в групи. Ако е необходимо, може да се добави подходящ носител, който да улесни получаването на подходяща концентрация на веществото във въздуха в камерата. В случай че се използват разтворители с оглед улесняване на дозировката, то за тях следва да е известно, че не предизвикват токсични ефекти. Използването на данни от историческа контрола е допустимо, стига да се сметне за подходящо.
1.6.2. Условия на опита
1.6.2.
1.6.2.1. Опитни животни Предпочитан животински вид са плъховете, освен ако няма контраиндикации. Използват се обичайните лабораторни породи и за двата пола, като в началото на опита допустимата разлика в теглото на животните не следва да надвишава ± 20 % от средната стойност за групата.
1.6.2.2. Брой и пол на животните Най-малко 10 гризачи (пет мъжки и пет женски) се използват за всяко ниво на концентрация. Женските не следва да са чифтосани или бременни. Ако се предвижда убиване на животни по време на опита, групите следва да бъдат допълнително попълнени с предвидения брой. Освен това една сателитна (допълнителна) група от 10 животни (по пет от двата пола) се експонират на най-високата концентрация от изследваното вещество в продължение на 28 дни и се наблюдават за развитие на обратими, персистиращи или по-късно проявяващи се токсични ефекти 14 дни след приключване на опита. Получените резултати се сравняват с допълнителна контролна група от десет животни (по пет от двата пола).
1.6.2.3. Концентрации Използват се най-малко три концентрации и една контрола. При използване на носител се използва и контролна група, изложена на действието на носителя в концентрация, отговарящи на концентрацията на носителя в най-високо експонираната група. С изключение на експозицията на изпитваното вещество, животните от контролните групи се отглеждат по идентичен начин на опитните. Най-високата концентрация следва да предизвиква токсични ефекти и да не предизвиква летален изход. Ако все пак тази концентрация води до леталитет, то той следва да бъде минимален. Най-ниската концентрация не следва да предизвиква токсични ефекти. Теоретично междинната концентрация би следвало да предизвиква минимални токсични ефекти. Ако се използват повече от една междинна концентрация, те следва да позволяват отчитането на степенни разлики в токсичните ефекти. При ниските и междинните групи, както и при контролната смъртните случаи следва да бъдат малко, което позволява добра оценка на резултатите.
1.6.2.4. Продължителност на въздействие Продължителността на експонирането следва да е шест часа дневно, но при определени условия може да се използва и друга продължителност.
1.6.2.5. Апаратура Животните следва да се изследват с апаратура, предназначена да поддържа динамичен въздушен поток, с най-малко 12 подавания на час, с оглед осигуряването на подходящо съдържание на кислород в опитната атмосфера и равномерна експозиция в атмосферата на въздушната камера. Когато се използва въздушна камера, тя следва да е с дизайн, който да не допуска струпването на животните и да оптимизира експонирането им на изследваното вещество. Като общо правило за осигуряване на стабилност на атмосферата общият обем на опитните животни не следва да надвишава 5 % от обема на камерата. Може да се използва орално-назално експониране, експониране на цялата глава или на цялото тяло в индивидуални клетки. Първите два способа се прилагат, когато се цели намаляване до минимум на приема на изследваното вещество чрез останалите пътища.
1.6.2.6. Период на наблюдение Опитните животни се наблюдават ежедневно за признаци на токсичност по време на целия опит и на възстановителния период. Отбелязва се времето на настъпване на смъртта, както и това на появата и изчезването на токсичните ефекти.
1.6.3. Процедура Животните се експонират на опитното вещество от пет до седем дни в седмицата, за период от 28 дни. Животните от всички сателитни групи се проследяват допълнителни 14 дни, през които те не се третират, за отчитане на обратимостта или персистирането на токсичните ефекти. Температурата, при която се провежда опитът, следва да се поддържа 22 ± 3 oС. Теоретично влажността следва да бъде между 30 и 70 %, но на практика това е трудно постижимо. Поддържането на леко отрицателно налягане вътре в камерата ще предотвратява изтичането на изследваното вещество в околната среда. По време на експонирането не се дават храна и вода. Използва се динамична инхалаторна система с подходяща система за аналитичен контрол на концентрацията. За определяне на подходящите концентрации се препоръчва да се направи предварителен тест. Въздушният поток следва да бъде изчислен по начин, осигуряващ хомогенни условия за експониране в камерата. Системата следва да осигури максимално бързото постигане на оптималните условия на опита. Измервания или мониторинг се извършват на следните параметри: По време и след експонирането се провеждат наблюдения, които систематично се записват. Всяко животно се проследява индивидуално. Всички животни се наблюдават ежедневно, като установените признаци на токсичност се записват, включително времето на тяхната поява, тежест и продължителност. Наблюденията следва да включват промени в кожата, козината, очите, лигавиците, дишането, кръвообращението, вегетативната и централната нервна система, двигателната активност и начина на поведение. Телесната маса следва да бъде измервана веднъж седмично. Препоръчва се консумацията на храна да се измерва веднъж седмично. Редовните наблюдения на животните са необходими, за да се осигури, че животните не са отпаднали от експеримента в резултат на канибализъм, автолиза или неправилно разположение в камерите. В края на експеримента всички животни от несателитните групи се аутопсират. Болните животни, животните, показали признаци на силна болка или стрес, следва да бъдат отстранени от експеримента веднага щом бъдат забелязани, хуманно убити и аутопсирани. В края на опита на всички животни, включително и контролните се провеждат следните изследвания: При необходимост за адекватна токсикологична оценка могат да се проведат и други изследвания, като определяне на калций, фосфор, хлориди, калий, глюкоза, липиди, хормони, основи/бази баланс, метахемоглобин и активност на холинестераза.
1.6.3. а)
ниво на въздушния поток (постоянно);
б)
концентрацията на изследваното вещество в зоната на дишане. Концентрацията не следва да варира повече от ± 15 % от средната стойност по време на експонирането. При някои аерозоли обаче е допустимо отклонение от тази величина. По време на експеримента концентрациите в камерите следва да се поддържат постоянни. Задължително следва да се прави анализ на размера на частиците поне веднъж седмично за всяка изследвана концентрация;
в)
температурата и влажността (постоянно, при възможност).
i)
хематологични: хематокрит, концентрация на хемоглобин, общ брой еритроцити, общ и диференциален брой левкоцити, кръвосъсирващ потенциал;
ii)
клинико-лабораторни и биохимични, които включват определянето в кръвта на най-малко един от параметрите за чернодробна и бъбречна функция: аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, уреа, албумин, креатинин, общ билирубин и общ белтък.
1.6.3.1. Макроскопски оглед Всички животни, участвали в опита, се подлагат на пълен макроскопски оглед. Черният дроб, бъбреците, надбъбречните жлези, белите дробове и тестисите се претеглят веднага след аутопсията, за да се избегне изсъхването им. Органи и тъкани (респираторен тракт, черен дроб, бъбреци, слезка, тестиси, надбъбречни жлези, сърце и всички други органи, показващи големи патологични изменения или промени в размера) се съхраняват в подходяща среда с оглед евентуални бъдещи хистопатологични изследвания. Белите дробове следва да се извадят невредими, да се претеглят и третират с подходящ фиксатор за запазване на структурата им.
1.6.3.2. Хистопатологични изследвания Хистопатологични изследвания се провеждат върху фиксирани органи и тъкани от контролата и опитната група, експонирана на най-високата концентрация. Органите и тъканите, при които се установяват изменения, дължащи се на изпитваното вещество, се изследват и при животните от групите, третирани с по-ниска концентрация. Животните от сателитните групи също се изследват хистологично, като се обръща внимание на органите и тъканите, показали изменения при другите групи.
2. ДАННИ Данните се представят в таблична форма, като се посочват броят на животните във всяка група в началото на опита и броят на животните с всеки отделен вид увреждане. Всички получени резултати се обработват с подходящ статистически метод. Всички признати статистически методи могат да бъдат използвани.
3. ДОКЛАДВАНЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО По възможност протоколът от изпитването следва да съдържа:
вид, порода, източник, околна среда, хранителен режим и др.;
опитни условия: Описание на апаратурата, включително вид, тип, размери, източник на въздухоподаване, система за генериране на аерозолите, метод на отглеждане на животните, както и разполагането им в камерата. Следва да се опише апаратурата за измерване на температурата, влажността и аерозолната концентрация. Данни за експонирането: Данните за експонирането следва да бъдат отразени в таблици, представени със средни стойности и отклонения. Таблиците следва да съдържат:
3.1.
pt_2 а)
дебит на въздушния поток през апаратурата за инхалации;
б)
температура и влажност на въздуха;
в)
номинални концентрации (общото количество на изпитваното вещество, подадено в инхалационната апаратура, разделено на обема на въздуха);
г)
природа на носителя (ако е използван);
д)
действителни концентрации в зоната на дишане;
е)
масов медианен аеродинамичен диаметър (MMAD) и геометрично стандартно отклонение (GSD);
данни за отговора на токсичното въздействие по пол и концентрация;
време на смъртта през периода на изпитването или дали животните са преживели до края;
описание на токсичните или други ефекти; ниво, при което няма ефекти;
времето, в което е забелязан всеки аномален признак, и неговото следващо развитие;
данни за храната и телесната маса;
използвани хематологични анализи и резултатите от тях;
клинични биохимични анализи и резултатите от тях;
находки при аутопсията;
детайлно описание на всички хистопатологични находки;
статистическа обработка на резултатите (където е възможна);
обсъждане на резултатите;
интерпретиране на резултатите.
3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ Вж. Общо въведение, част Б, буква Г.
4. ПРЕПРАТКИ Вж. Общо въведение, част Б, буква Д.
Б.9. ТОКСИЧНОСТ (ДЕРМАЛНА) С МНОГОКРАТНИ ДОЗИ (28 ДНИ)
Б.9.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Вж. Общо въведение, част Б, буква А.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Вж. Общо въведение, част Б, буква Б.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Изпитваното вещество се прилага ежедневно в продължение на 28 дни върху кожата, в нарастващи дози при няколко групи експериментални животни, като за всяка група се използва по една доза. По време на експозицията животните се наблюдават всеки ден за появата на симптоми на токсичното действие. Животните, умрели по време на изпитването, се подлагат на аутопсия, а преживелите се аутопсират в края на изпитването.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.6.
1.6.1. Подготовка Животните се настаняват и хранят в лабораторни условия най-малко пет дни преди началото на изпитването. Преди изпитването млади здрави животни се избират по случаен начин и (също случайно) се разпределят на експериментални и контролни групи. Малко преди началото на изпитването се подстригва козината по гръбната част на тялото. Козината може и да се обръсне, но това се прави около 24 часа преди изпитването. Обикновено се налага ежеседмично подстригване или бръснене на козината, като се внимава да не се охлузи кожата. За прилагането на изпитваното вещество следва да се почистят не по-малко от 10 % от повърхността на тялото. За точното определяне на площта от тялото, която следва да се почисти от косми, а също и на размера на покритието е необходимо за се вземе предвид телесната маса на животното. При изпитването на твърди вещества (които могат да се стрият до прахообразно състояние, ако се сметне за необходимо) изпитваното вещество следва добре да се омокри с вода или с подходящ носител, което осигурява добър контакт с кожата. Течните вещества по принцип се прилагат без разреждане. Веществото се прилага ежедневно по пет до седем дни в седмицата.
1.6.2. Условия на изпитване
1.6.2.
1.6.2.1. Опитни животни Може да се използват полово зрели плъхове, зайци или морски свинчета. Употребата на други видове е също възможна, но следва да се обоснове. В началото на изпитването интервалът в който варират масите на животните, не бива да е по-голям от ± 20 % от съответната средна стойност.
1.6.2.2. Брой и пол При всяко ниво на дозиране се използват най-малко 10 животни (пет женски и пет мъжки) със здрава кожа. Женските не бива да са раждали, нито да са бременни. Ако е планирано част от животните да бъдат убивани на междинни етапи от експеримента, първоначалният брой животни следва да се увеличи с толкова, колкото ще бъдат убити преди края на изпитването. Освен това сателитна група от 10 животни (по пет от двата пола) може да се третира с високо ниво на дозата за 28 дни. В продължение на 14 дни след това при тази група се провеждат наблюдения за случаи на обратимост, задържане или забавяне на токсичните ефекти. Използва се също и сателитна контролна група от 10 животни (по пет от двата пола).
1.6.2.3. Нива на дозите Необходими са най-малко три нива на дозите и една контрола или контрола с носител (ако е използван носител). Експозиционният период следва да бъде поне по шест часа на ден. Прилагането на изпитваното вещество следва да става по едно и също време на деня; интервалите между експозициите се регулират (на една или две седмици), така че да се поддържа постоянно ниво на дозата спрямо телесната маса на животните. Животните от контролната група се третират по същия начин, както и тези от експерименталните групи с тази разлика, че при тях не се прилага изпитваното вещество. Когато за улеснение на дозирането е използван носител, животните от контролната група се третират с носителя по същия начин, както и животните от третираните групи, като количеството на приложения носител съвпада с това, получавано от групата с най-високо ниво на дозата. Най-високото ниво на дозиране следва да води до появата на токсични ефекти, но не и (или не в големи размери) да предизвиква смъртта на животните. При най-ниското ниво на дозата не бива да се наблюдават никакви признаци на токсично действие. Когато съществува използваема оценка за експозицията при хора, най-ниското ниво следва да я надвишава. В идеалния случай междинното ниво на дозата следва да води до минимални видими токсични ефекти. Ако се използват повече от една междинна доза, то техните нива следва да са правилно разпределени в количествено отношение, така че да се получи градация на токсичните ефекти. Случаите на смърт в групите с ниско и междинно ниво на дозата, както и в контролните групи следва да са минимален брой, което би позволило съдържателна оценка на резултатите. Ако прилагането на изпитваното вещество предизвиква силно дразнене на кожата, концентрациите се намаляват, което може да доведе до намаление или отсъствие на другите ефекти от токсичното действие при високи нива на дозата. Нещо повече, ако кожата е силно разранена, то е необходимо изпитването да се прекрати и да се предприеме нов опит при по-ниски концентрации.
1.6.2.4. Гранично изпитване Ако предварителното изпитване при ниво на дозата 1000 mg/kg или при по-висока доза, свързана с възможна експозиция на хора (ако е известна), не доведе до токсични ефекти, то повече изпитвания могат да се смятат за излишни.
1.6.2.5. Период на наблюдение Експерименталните животни се наблюдават всеки ден за симптоми на токсичното действие. Записват се времето на смъртта, както и времената на поява и изчезване на симптомите.
1.6.3. Процедура Животните следва да се разположат в индивидуални клетки. Третирането с изпитваното вещество в идеалния случай става по седем дни в седмицата в продължение на 28 дни. Животните от всички сателитни групи, предназначени за продължителни наблюдения, се оставят без третиране още 14 дни, при което се проследява възстановяването от токсичните симптоми или тяхното устойчиво задържане. Времето за експозиция следва да бъде поне шест часа на ден. Изпитваното вещество се прилага на равномерен слой върху площ приблизително 10 % от телесната повърхност. При вещества с висока токсичност покритата площ може да бъде и по-малка, но във всички случаи тя следва да се покрие с колкото е възможно по-тънък и равномерен пласт. По време на експозицията изпитваното вещество се задържа в контакт с кожата с помощта на марлена превръзка и лепенка, която не дразни кожата. Мястото на прилагане на веществото се покрива допълнително по подходящ начин, така че превръзката и веществото да се задържат стабилно и освен това да се предотврати поглъщането на веществото от животното. За целта могат да се използват приспособления за ограничаване на движенията, но пълното обездвижване не се препоръчва. Може да се използва и защитен обездвижващ нашийник. В края на периода на експозиция останалото изпитвано вещество се отстранява, ако може, с вода или кожата се почиства по друг подходящ начин. Провежда се ежедневно наблюдение на всички животни и симптомите на токсичното действие се записват заедно с времето на появата им, техните острота и продължителност. Наблюденията следва да включват изменения в кожата и козината, очите и лигавиците, както и промените в дихателната, кръвоносната, автономната и централната нервна система, соматомоторната активност и поведението. Масата на животните следва да се измерва всяка седмица. Препоръчва се също всяка седмица да се измерва и консумацията на храна. Редовното наблюдаване на животните е необходимо и за да се избегне загубата на животни по такива причини, като канибализъм, автолиза на тъканите или неправилно положение в клетката. В края на проучвателния период всички оцелели животни от основните (несателитните) третирани групи се подлагат на аутопсия. Умиращите животни, както и животните с признаци на тежък стрес или болка следва да се отстраняват от изпитването в момента, в който са забелязани, да бъдат убивани безболезнено и подлагани на аутопсия. Изброените по-долу анализи се правят в края на теста на всички животни, включително тези от контролните групи: Други анализи, които може да са необходими за правилната токсикологична оценка, са следните: калций, фосфор, хлориди, натрий, калий, глюкоза при гладуване, анализ на липиди, хормони, киселинно-основен баланс, метхемоглобин и холинестеразна активност. Когато е необходимо, за разширяване на изпитванията върху наблюдаваните ефекти може да се включат и допълнителни клинични биохимични анализи.
1.6.3.
1) хематологични анализи, които да включват най-малко хематокрит, концентрация на хемоглобина, брой на еритроцитите, общо и диференциално броене на левкоцитите и измерване потенциала на съсирване;
2) клинична биохимия на кръвта, в това число поне по един параметър за чернодробна и бъбречна функция: серумна аланин аминотрансфераза (първоначално известна като глутамат пируват трансаминаза), серумна аспартат аминотрансфераза (първоначално позната като глутамат оксалоацетат трансаминаза), карбамиден азот, албумин, кръвен креатинин, общ билирубин и общ белтък в серума.
1.6.4. Аутопсия Всички животни, участвали в изпитването, следва да се подложат на пълна макроскопска аутопсия. Най-малко черният дроб, бъбреците, надбъбречните жлези и тестисите се претеглят във влажно състояние, колкото е възможно по-бързо след дисекцията (така че да не изсъхват). Някои органи и тъкани, т.е. нормална и третирана кожа, черен дроб, бъбрек, слезка, тестиси, надбъбречни жлези, сърце и критични органи (т.е. онези органи, които показват видими поражения или изменения в размерите) следва да се запазят в подходяща среда за възможно бъдещо хистопатологично изпитване.
1.6.5. Хистопатологично изпитване В групата с високо ниво на дозата, както и в контролната група се правят хистопатологични изпитвания на запазените органи и тъкани. Органите и тъканите, които показват дефекти, свързани с действието на изпитваното вещество при най-високата доза, следва да се изпитват и във всички групи с по-ниски нива на дозиране. При хистологичното изпитване на животните от сателитната група особено внимание се отделя на онези органи и тъкани, при които са наблюдавани ефекти в останалите третирани групи.
2. ДАННИ Данните се обобщават в таблична форма, като за всяка изпитвана група се дават броят на животните в началото на изпитването и броят на животните, показали различните видове увреждания. Всички наблюдавани резултати се обработват с подходящ статистически метод. Може да се използва всеки от общоприетите статистически методи.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Протоколът от изпитването следва по възможност да съдържа следната информация:
данни за животните (вид, порода, източник, условия на средата, диета и др.);
условия на изпитване (включително видът на превръзката: оклузивна или неоклузивна);
нива на дозиране (в това число и носителя, ако е използван) и концентрации;
когато е възможно, се указва и нивото, при което не се наблюдават ефекти;
данни за отговора на токсичното действие по пол и доза;
време на смъртта в процеса на изпитването или дали животните са преживели до края на изпитването;
токсични или други ефекти;
време на наблюдаване на всеки аномален признак и неговото следващо развитие;
данни за храната и телесната маса;
използвани хематологични анализи и резултатите от тях;
използвани клинични биохимични анализи и резултатите от тях;
находки при аутопсията;
детайлно описание на всички хистопатологични находки;
статистическа обработка на резултатите (когато е възможна);
обсъждане на резултатите;
интерпретиране на резултатите.
3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТИРАНЕ Вж. Общо въведение, част Б, буква Г.
4. ПРЕПРАТКИ Вж. Общо въведение, част Б, буква Д.
Б.10. МУТАГЕННОСТ — ТЕСТ ИН ВИТРО ЗА ХРОМОЗОМНИ АБЕРАЦИИ ПРИ БОЗАЙНИЦИ
Б.10.
1. МЕТОД Настоящият метод е изцяло подобен на теста in vitro за хромозомни аберации при бозайници на OECD TG 473 от 1997 г.
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Целта на теста in vitro за хромозомни аберации е да се идентифицират агентите, причиняващи структурни хромозомни аберации в култивирани клетки от бозайници (1) (2) (3). Структурните аберации могат да бъдат два типа: хромозомни и хроматидни. При повечето химични мутагени индуцираните аберации са от хроматиден тип, но се срещат също и аберации от хромозомен тип. Увеличение в полиплоидията може да е показателно за това, че един химикал има потенциал да предизвиква геномни аберации. Все пак настоящият метод не е предназначен да измерва геномни аберации и не се използва рутинно за тази цел. Хромозомните мутации и свързаните с тях събития са причината за много генетични болести при човека, а има реални доказателства, че хромозомните мутации и свързаните с тях събития, които водят до промени в онкогените и тумороподтискащите гени на соматични клетки, участват в причиняването на рак при хора и опитни животни. За in vitro теста за хромозомни аберации могат да се използват култури на доказани клетъчни линии, клетъчни щамове или първични клетъчни култури. Клетките се избират въз основа на способността на растеж в културата, стабилността на кариотипа, броя на хромозомите, хромозомното разнообразие и спонтанната честота на хромозомни аберации. Тестове, провеждани in vitro, no принцип изискват използването на екзогенен източник на метаболична активация. Тази система на метаболична активация не може изцяло да възпроизведе in vivo условията при бозайници. Следва внимателно да се избягват условия, които биха довели до положителни резултати, неотразяващи свойствена мутагенност и които биха могли да възникнат от промени на рН, осмотично налягане или високи нива на цитотоксичност (4) (5). Настоящият тест се използва за откриване на евентуални мутагени и канцерогени при бозайници. Много съединения, които са положителни в настоящия тест, са канцерогени за бозайници; все пак няма идеално съответствие между настоящия тест и канцерогенността. Съответствието зависи от химичния клас, а се появяват все повече доказателства, че съществуват канцерогени, които не се откриват с настоящия тест, тъй като очевидно те действат чрез други механизми, различни от прякото увреждане на ДНК. Вижте също Общо въведение, част Б.
1.2. ДЕФИНИЦИИ Хроматиден тип аберация: структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване на единични хроматиди или разкъсване и повторно съединяване между хроматиди. Хромозомен тип аберация: структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване, или разкъсване и повторно съединяване на двата хроматида от една и съща страна. Ендоредупликация: процес, при които след период S на ДНК репликация ядрото не навлиза в митоза, а започва друг S период. Резултатът е хромозоми с 4, 8, 16, … хроматиди. Празнина: ахроматично увреждане, по-малко от ширината на един хроматид с минимална несъосност на хроматидите. Митотичен индекс: съотношението на клетки в метафаза, разделени на броя клетки, наблюдавани в клетъчна популация; показател за степента на пролиферация на тази популация. Гсномна аберация: промяна в броя на хромозомите в сравнение с нормалния брой, характерен за използваните клетки. Полиплоидия: множимо на хаплоидния брой хромозоми (n), различно от диплоидния брой (т.е. 3n, 4n и т.н.). Структурна аберация: промяна в хромозомната структура, която се открива при микроскопско изследване на етапа на метафаза на клетъчното деление, наблюдавана във вид на заличавания и фрагменти, вътрешнохромозомни или междухромозомни изменения.
1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ТЕСТА Клетъчни култури се подлагат на въздействието на тестваното вещество със и без метаболична активизация. На предварително определени интервали след експозицията на клетъчните култури към тестваното вещество те се третират с блокиращо метафазата вещество (напр. Колцемид® или колхицин), събират се, оцветяват се и метафазните клетки се анализират под микроскоп за наличието на хромозомни аберации.
1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА НА ТЕСТА
1.4.
1.4.1. Подготовка
1.4.1.
1.4.1.1. Клетки Могат да се използват разнообразни клетъчни линии, щамове или първични клетъчни култури, включително и човешки клетки (напр. фибробласти от китайски хамстер, лимфоцити от периферна кръв на хора или други бозайници).
1.4.1.2. Хранителни среди и условия за отглеждане на културата При отглеждането на културата следва да се използват подходящи хранителни среди и инкубационни условия (носители на културата, концентрация на СО2, температура и влажност). Доказаните клетъчни линии и щамове следва да се проверяват редовно за стабилност на модалния хромозомен брой и отсъствие на микоплазмено замърсяване, а ако са замърсени, не следва да се използват. Следва да се знае нормалното време на клетъчен цикъл при клетките и използваните условия за отглеждане на културата.
1.4.1.3. Приготвяне на културите Установени клетъчни линии и щамове: от изходни култури се размножават клетки, посяват се в хранителна среда с такава гъстота, че културите да не достигат точката на сливане преди времето на обиране, и се инкубират при 37 oС. Лимфоцити: цялостна кръв, третирана с антикоагулант (напр. хепарин), или сепарирани лимфоцити, получени от здрави субекти, се добавят към хранителната среда, съдържаща митоген (напр. фитохемаглутинин), и се инкубират при 37 oС.
1.4.1.4. Метаболична активация Клетките следва да се излагат на тестваното вещество както в присъствието, така и в отсъствието на подходяща система за метаболична активация. Най-често използваната система е постмитохондрична фракция (S9) с добавка на ко-фактор, приготвена от черните дробове на гризачи, третирани с ензимно индуциращи реактиви, като Ароклор 1254 (6) (7) (8) (9) или смес от фенобарбитон и β-нафтофлавон (10) (11) (12). Постмитохондричната фракция обичайно се използва в концентрации с обхват от 1 до 10 % v/v в последната тестова среда. Състоянието на система за метаболична активация може да зависи от изпитвания химикал. В някои случаи може да е подходящо да се прилага повече от една концентрация на постмитохондрична фракция. Редица разработки, включително изграждането на клетъчни линии чрез генно инженерство, изразяващи специфични активизиращи ензими, могат да осигурят възможности за ендогенна активация. Изборът на използваните клетъчни линии следва да е научно обоснован (напр. чрез приложимостта на изоензим цитохром Р450 за метаболизма на тестваното вещество).
1.4.1.5. Тествано вещество/подготовка Твърдите вещества за теста следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители и, ако е необходимо, да се разредят преди третирането на клетките. Течните тествани вещества могат да се добавят директно към тестовите системи и/или да се разредят преди третирането. Следва да се използват пресни препарати на тестваното вещество, освен ако данните за устойчивостта му не показват, че може да се съхранява.
1.4.2. Условия за провеждане на теста
1.4.2.
1.4.2.1. Разтворител/носител Не следва да има съмнения за химическа реакция на разтворителя/носителя с тестваното вещество и той следва да е съвместим с оцеляването на клетките и активността на S9. Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им в теста следва да се подкрепи от данни за съвместимостта им. Препоръчва се винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтворител/носител. При тестването на вещества, нестабилни във вода, използваните органични разтворители не следва да съдържат вода. Водата може да се отстрани чрез добавянето на молекулно сито.
1.4.2.2. Концентрации на експозицията Измежду критериите, които следва да се имат предвид при определянето на най-високите концентрации, са цитотоксичността, разтворимостта в тестовата система и промените в рН или осмотичното налягане. Цитотоксичността следва да се определи със и без метаболична активация в главния експеримент, като се използва подходяща индикация на клетъчната цялост и растеж, като степен на сливане, количества жизнеспособни клетки или митотичен индекс. Може да бъде полезно, ако се определят цитотоксичността и разтворимостта в предварителен експеримент. Следва да се използват най-малко три концентрации, които могат да бъдат подложени на анализ. Там, където се среща цитотоксичност, тези три концентрации следва да покриват обхват от максимална до слаба или липса на токсичност; това обикновено означава, че концентрациите следва да се различават с коефициент не повече от 2 до √10. В момента на събиране на реколтата най-високата концентрация следва да показва значително намаляване на степента на сливане, клетъчния брой или митотичния индекс (всички са повече от 50 %). Митотичният индекс е само едно косвено мерило за цитотоксичните/цитостатичните ефекти и зависи от времето след третирането. Все пак митотичният индекс е приложим за суспензионни култури, при които други начини на измерване на токсичността могат да се окажат неудобни и непрактични. Информацията за клетъчната кинетика, като например средно генерационно време (СГВ), може да се използва като допълваща информация. СГВ обаче е едно общо средно число, което не винаги е показателно за съществуването на забавени субпопулации, а дори съвсем малко увеличение на средното генерационно време може да се свърже с особено голямо забавяне на времето на оптимален добив на аберации. За относително нецитотоксични вещества максималната тестова концентрация следва да е 5μl/ml, 5 mg/ml или 0,01 М, в зависимост от това коя е най-ниска. За относително неразтворими вещества, които не са токсични в концентрации, по-ниски от неразтворимата концентрация, най-високата използвана доза следва да е в концентрация над границата на разтворимост в последната хранителна среда в края на периода на третиране. В някои случаи (напр. когато токсичността се получава само с концентрация, по-висока от най-ниската неразтворима концентрация), препоръчително е тестът да се провежда при повече от една концентрация с видимо утаяване. Полезно би било разтворимостта да се прецени в началото и в края на обработването, тъй като разтворимостта може да се измени по време на курса на експозиция в тестовата система поради наличието на клетки, серум S9 и др. Неразтворимостта може да се установи и с просто око. Преципитатът не следва да пречи на отчитането.
1.4.2.3. Отрицателни и положителни контроли Във всеки експеримент следва да се включат паралелни положителни и отрицателни (разтворител или носител) контроли, със и без метаболична активация. Когато се прилага метаболична активация, химикалът за положителен контрол следва да е такъв, че да изисква активация, за да произведе мутагенна реакция. За извършване на положителни контроли следва да се използва известен еластоген при нива на експозиция, при които се очаква да се достигне репродуцируемо и забележимо увеличение спрямо фон, показващ нагледно чувствителността на тестовата система. Концентрациите на положителен контрол следва да са така избрани, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на четящото устройство идентичността на кодираните предметни стъкла. Примерите за положителни контролни вещества включват: Метаболична активация Вещество CAS № Einecs № Отсъствие на екзогенна метаболична активация Метил метансулфонат 66-27-3 200-625-0 Етил метансулфонат 62-50-0 200-536-7 Етил нитрозокарбамид 759-73-9 212-072-2 Митомицин С 50-07-7 200-008-6 4-нитрохинолин-N-оксид 56-57-5 200-281-1 Наличие на екзогенна метаболична активация бензо[а]пирен 50-32-8 200-028-5 Циклофосфамид Циклофосфамид монохидрат 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Могат да се използват други подходящи положителни контролни вещества. За положителна контрола следва да се взема предвид използването на химикали, принадлежащи към химичен клас, когато такива са налични. Отрицателните контроли, състоящи се само от разтворител или носител в средата, в която се извършва обработването, и третирани по същия начин като културите, които се обработват, следва да се включат за всяко прибиране на клетъчна реколта. В допълнение към това следва също да се използват нетретирани контроли, освен ако няма контролни данни от предишни изследвания, показващи, че от избрания разтворител не се предизвикват делеционни или мутагенни ефекти.
1.4.3. Процедура
1.4.3.
1.4.3.1. Третиране с тестваното вещество Пролифериращите клетки се обработват с тестваното вещество при наличието и при отсъствието на метаболична активационна система. Третирането на лимфоцити следва да започне около 48 часа след митогенната стимулация.
1.4.3.2. Нормално за всяка концентрация следва да е използването на дубликатни култури, а те са силно препоръчителни и за отрицателни/разтворителни контролни култури. Когато на базата на данни от предишни изследвания може да се демонстрира минимално вариране между дубликатни култури (13) (14), би могло да се приеме използването на една култура за всяка концентрация. Газообразни или летливи вещества следва да се тестват чрез подходящи методи, като например в запечатани носители на културата (15) (16).
1.4.3.3. Време за събиране на реколтата от културата В първия експеримент клетките следва да се експонират на въздействието на тестваното вещество както със, така и без метаболична активация, в продължение на 3 до 6 часа и да се вземе проба след време, равно на около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането (12). Ако тази процедура дава отрицателни резултати както със, така и без активация, следва да се извърши допълнителен експеримент без активация, с непрекъснато третиране до вземането на проба след време, равно на около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл. Някои химични вещества могат по-лесно да се различат при периоди на обработване/вземане на проба, по-дълги от 1,5 пъти от продължителността на клетъчния цикъл. Отрицателните резултати с метаболична активация следва да се потвърдят за всеки случай поотделно. В случаите, когато се смята, че не е необходимо потвърждаването на отрицателни резултати, това следва да е обосновано.
1.4.3.4. Подготовка на хромозомите Клетъчните култури се третират с Колцемид ® или колхицин обикновено в продължение на 1 до 3 часа преди събирането на реколтата. Всяка клетъчна култура се обира и обработва отделно за подготовката на хромозомите. Подготовка на хромозомите включва хипотонично третиране на клетките, фиксиране и оцветяване
1.4.3.5. Анализ Всички предметни стъкла, включително и тези на положителните и отрицателните контроли, следва да се кодират независимо едно от друго преди микроскопския анализ. Тъй като процедурите на фиксиране водят често до разкъсване на част от метафазните клетки със загуба на хромозоми, отчетените клетки следва да съдържат известен брой центромери, равен на модалния брой ± 2 за всички клетъчни типове. Следва да се отчетат най-малко 200 добре разнесени метафази за всяка концентрация и контрола, разделени поравно между дубликатите, ако това е приложимо. Този брой може да се намали, когато се наблюдава голям брой аберации. Въпреки че целта на теста е да се открият структурни хромозомни аберации, от значение е да се регистрират полиплоидия и ендоредупликация, когато тези събития се наблюдават.
2. ДАННИ
2.
2.1. ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ Експерименталната единица е клетката и по тази причина следва да се оценява процентът на клетки със структурна(и) хромозомна(и) аберация(и). Следва да се изготвят списъци на различни типове структурни хромозомни аберации с техния брой и честоти при експерименталните и контролните култури. Празнините се отбелязват отделно и се протоколират, но по принцип не се включват в общата честота на аберациите. Следва също да се документират съпътстващите измервания на цитотоксичността за всички третирани и отрицателни контролни култури в главните опити за аберации. Следва да се осигурят данни за отделните култури. Освен това всички данни следва да се резюмират в табличен вид. Няма изискване за потвърждаване на ясна положителна реакция. Двузначните резултати следва да се изяснят чрез допълнително тестване, като за предпочитане е условията на опита да се модифицират. Необходимостта от потвърждаване на отрицателни резултати е разгледана в т. 1.4.3.3. Изменението на параметрите на изследването с цел разширяване на обхвата на изследваните условия следва да се има предвид при последващите експерименти. Параметрите на изследването, които могат да се изменят, включват границите на концентрацията и условията на метаболична активация.
2.2. ОЦЕНКА И ТЪЛКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Има няколко критерия за определяне на положителен резултат, като например увеличение, свързано с концентрацията, или репродуцируемо увеличение в броя на клетки с хромозомни аберации. Първо, следва да се вземе предвид биологичната значимост на резултатите. При оценката на резултатите от теста биха могли да се използват статистически методи (3) (13). Статистическата значимост не следва да е единственият решаващ фактор за положителна реакция. Едно увеличение в броя на полиплоидни клетки може да показва, че тестваното вещество е способно да инхибира митотични процеси и да индуцира многобройни хромозомни аберации. Увеличение в броя на клетки с ендоредуплицирани хромозоми може да е показателно за способността на тестваното вещество да инхибира прогресията на клетъчния цикъл (17) (18). Тествано вещество, за което резултатите не удовлетворяват горните критерии, се смята немутагенно в настоящата система. Въпреки че повечето опити дават ясно положителни или отрицателни резултати, в редки случаи получените данни изключват възможността да се направи категорична преценка за активността на тестваното вещество. Резултатите могат да останат неясни или под въпрос, независимо от това колко пъти е повторен опитът. Положителните резултати от теста ин витро за хромозомни аберации показват, че тестваното вещество индуцира структурни хромозомни аберации в култивирани соматични клетки на бозайници. Отрицателните резултати показват, че при условията на теста изследваното вещество не предизвиква хромозомни аберации в култивирани соматични клетки на бозайници.
3. ДОКЛАДВАНЕ
3. ДОКЛАД ЗА ТЕСТА
Докладът за теста следва да съдържа следната информация:
Разтворител/носител:
обосновка за избора на носител,
разтворимост и стабилност на тестваното вещество в разтворител/носител, ако са известни.
Клетки:
тип и източник на клетки,
кариотипни особености и дали използваният тип клетки е подходящ,
отсъствие на микоплазма, ако е приложимо,
информация за продължителността на клетъчния цикъл,
пол на кръвните донори, цялостна кръв или изолирани лимфоцити, използван митоген,
брой на пасажи, ако е приложим,
методи за поддържане на клетъчна култура, ако са приложими,
модален брой на хромозомите.
Условия за провеждане на теста:
идентичност на веществото, блокиращо метафазата, концентрация и времетраене на експозицията на клетките,
основна причина за избора на концентрации и брой култури, в т.ч. напр. цитотоксични данни и ограничения за разтворимостта, ако са налични,
състав на средите, СО2 концентрация, ако са приложими,
концентрация на тестваното вещество,
общ обем на носителя и тестваното вещество,
температура на инкубация,
време на инкубация,
времетраене на третирането,
гъстота на клетките при посяване, ако е необходимо,
тип и състав на система за метаболична активация, в.т.ч. критериите за приемливост,
положителни и отрицателни контроли,
методи на подготовка на предметно стъкло,
критерии за отчитане на аберации,
брой на анализираните метафази,
методи за измерване на токсичността,
критерии за приемане на проучванията за положителни, отрицателни или двузначни,
Резултати:
признаци на токсичност, напр. степен на сливане, данни за клетъчния цикъл, клетъчно броене, митотичен индекс,
признаци на утаяване,
данни за рН и осмотичното налягане на средата за тестване, ако са определени,
дефиниция за аберации, в т.ч. празнини,
брой на клетки с хромозомни аберации и тип на хромозомните аберации, дадени отделно за всяка третирана и контролна култура,
изменения в полиплоидията, ако се наблюдават,
взаимоотношение доза/реакция, при възможност,
статистически анализ, ако има такъв,
данни от паралелни отрицателни (разтворител/носител) и положителни контроли,
данни от предишни изследвания от отрицателни (разтворител/носител) и положителни контроли, с обхвати, средни стойности и стандартни отклонения.
Обсъждане на резултатите.
Заключения.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
ПРЕПРАТКИ Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, w: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1—29. Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427—432. Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cellS: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1—175. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147—204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, pp. 297—305. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347—364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173—215. Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83—90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, pp. 277—290. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175—177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85—88. Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241—261. Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, w: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141—154. Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139—149. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91—103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795—801. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha- radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403—413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362—1364
Б.11. МУТАГЕННОСТ — ТЕСТ IN VIVO ЗА ХРОМОЗОМНИ АБЕРАЦИИ В КОСТНИЯ МОЗЪК НА БОЗАЙНИЦИ
Б.11.
1. МЕТОД Настоящият метод е изцяло подобен на теста за хромозомни аберации в костния мозък на бозайници на OECD TG 475 от 1997 г.
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Тестът in vivo в микроядрата на клетки от бозайници се използва за откриване на структурни хромозомни аберации, индуцирани от тествано вещество в клетки от костен мозък на животни, обикновено гризачи (1) (2) (3) (4). Структурните хромозомни аберации могат да бъдат два вида: хромозомни или хроматидни. Едно увеличение в полиплоидията би могло да показва, че дадено химично вещество има потенциал да предизвиква геномни аберации. С повечето химични мутагени се предизвикват аберации от хроматиден тип, но хромозомният тип аберации също се срещат. Хромозомните аберации и свързаните с тях събития са причината за генетични болести у човека, а има реални доказателства, че хромозомните мутации и свързаните с тях събития, причиняващи промени в онкогените и тумороподтискащите гени, участват в причиняването на рак на хора и експериментални системи. В настоящия тест обикновено се използват гризачи. Обект на настоящия тест е тъканта на костният мозък, тъй като последният представлява високо васкуларизирана тъкан и съдържа популация от бързо циклиращи клетки, които могат лесно да се изолират и обработят. Други видове и тъкани не са обекти на настоящия метод. Настоящият тест за хромозомни аберации е от специално значение за оценка на мутагенната опасност, поради това че позволява разглеждане на фактори на in vivo метаболизма, фармакокинетиката и процесите на ДНК репарация, въпреки че те варират при различните видове и тъкани. Тест in vivo е също полезен за по-нататъшното изследване на мутагенния ефект, установен чрез тест in vitro. Ако има доказателства, че тестваното вещество или реактивен метаболит няма да достигнат до тъканта, която е обект на изследване, не е подходящо да се използва в настоящия тест. Вижте също Общо въведение, част Б.
1.2. ДЕФИНИЦИИ Хроматиден тип аберация: структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване на единични хроматиди или разкъсване и повторно съединяване между хроматиди. Хромозомен тип аберация: структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване или разкъсване и повторно съединяване на двата хроматида на същата страна. Ендоредупликация: процес, при който след период S на ДНК репликация ядрото не навлиза в митоза, а започва друг S период. Резултатът е хромозоми с 4, 8, 16, ... хроматиди. Празнина: ахроматично увреждане, по-малко от ширината на един хроматид с минимална несъосност на хроматида(ите). Геномна аберация: промяна в броя на хромозомите в сравнение с нормалния брой, характерен за използваните клетки. Полиплоидия: кратно число на хаплоидния брой хромозоми (n), различно от диплоидния брой (т.е. 3n, 4n и т.н.). Структурна аберация: промяна в хромозомната структура, която се открива чрез микроскопско изследване на етапа на метафаза на клетъчното деление, наблюдавана във вид на заличавания и фрагменти, вътрешнохромозомни или междухромозомни изменения.
1.3 ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ТЕСТА Животни се излагат на тестваното вещество по подходящ начин и се убиват в подходящи моменти след обработването. Преди убиването животните се третират с блокиращ метафазата агент (напр. колхицин или Колцемид®). След това се приготвя хромозомен препарат от клетки на костния мозък, оцветява се и клетките в метафаза се анализират за хромозомни аберации.
1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА НА ТЕСТА
1.4.
1.4.1. Подготовка
1.4.1.
1.4.1.1. Подбор на животински вид Обичайно използваните животни са плъхове, мишки и китайски хамстери, въпреки че всеки подходящ вид бозайник би могъл да се използва. Следва да се вземат общо използваните лабораторни щамове на млади, здрави, пораснали животни. В началото на изследването вариациите в теглото на животните следва да са минимални и да не превишават ± 20 % от средното тегло на всеки пол.
1.4.1.2. Условия на отглеждане и хранене Прилагат се общите условия в Общото въведение към част Б, въпреки че следва да се цели влажността на въздуха да е 50—60 %.
1.4.1.3. Подготовка на животните Здрави, млади, пораснали животни се определят произволно за контролните и опитните групи. Клетките следва да се подредят така, че да се намалят до минимум евентуалните ефекти от разполагането им. На животните се дава уникална идентифакация. Животните се аклиматизират към лабораторните условия поне пет дни.
1.4.1.4. Приготвяне на дози Твърдите вещества за теста следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители и, при необходимост, да се разредят преди даване на дозата на животните. Течните вещества за теста могат да се дават директно или да се разредят преди дозиране. Следва да се използват пресни препарати на тестваното вещество, освен ако данните за устойчивостта му не показват, че може да се съхранява.
1.4.2. Условия за провеждане на теста
1.4.2.
1.4.2.1. Разтворител/носител Разтворителят/носителят не следва да предизвиква токсично въздействие с използваните нива на дозиране, а също така не следва да има съмнения за химическа реакция между него и тестваното вещество. Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им в теста следва да се подкрепи от данни за съвместимостта им. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтворител/носител.
1.4.2.2. Контроли Във всеки тест следва да се включват паралелни положителни и отрицателни (разтворител/носител) контроли за всеки пол. Като се изключи третирането с тестваното вещество, животните в контролните групи следва да се третират по един и същи начин, както животните от опитните групи. Положителните контроли следва да произвеждат структурни аберации in vivo при нива на експозиция, при които се очаква да се постигне забележимо увеличение спрямо дадения фон. Положителните контролни дози следва да са така избрани, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на четеца идентичността на кодираните предметни стъкла. Приемливо е положителните контроли да се прилагат по различен начин от тестваното вещество и да им се взема проба само еднократно. За положителна контрола може да се разглежда използването на химикали, принадлежащи към химичен клас, когато такива са налични. Примерите за положителни контролни вещества включват: Вещество САS № ЕINECS № Етил метасулфонат 62-50-0 200-536-7 Етил нитрозокарбамид 759-73-9 212-072-2 Митомицин С 50-07-7 200-008-6 Циклофосфамид Циклофосфамид монохидрат 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Триетиленмеламин 51-18-3 200-083-5 За всяко вземане на проби следва да се включват отрицателните контроли, третирани само с разтворител или носител, а за всичко останало третирани както опитните групи, освен ако няма приемлива изменчивост между животните и честотите на клетки с хромозомни аберации са доказани с контролни данни от предшестващи изследвания. Ако за отрицателни контроли се прилага еднократно вземане на проби, най-подходящият момент е първото вземане на проба. Освен това следва също да се използват нетретирани контроли, освен ако няма данни от предшестващи изследвания или публикувани контролни данни, показващи, че няма никакви вредни или мутагенни ефекти, предизвикани от избрания разтворител/носител.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.
1.5.1. Брой и пол на животните Всяка група от животни, с които се извършват опити, и всяка контролна група включват поне пет животни за анализ от един и същ пол. Ако по времето на изследването има налични данни от изследвания на същия вид и по същия начин на експозиция, които показват, че няма значителни разлики между половете по отношение на токсичността, то тестването на един пол ще бъде достатъчно. Когато експозицията на хора спрямо химически вещества може да е в специфична зависимост от пола, като например към някои фармацевтични агенти, тестът следва да се проведе с животни от подходящия пол.
1.5.2. График на обработване За предпочитане е тестваните вещества да се въвеждат чрез еднократно третиране. Тестваните вещества могат също да се въвеждат като доза на отделни части, т.е. две обработвания в един и същи ден, разделени от не повече от няколко часа, за да се улесни прилагането на голям обем материал. Други режими на дозиране следва да са научно обосновани. Пробите следва да се вземат в два отделни момента след третирането в един ден. За гризачи първият интервал на вземане на проба е 1,5 пъти от продължителността на нормалния клетъчен цикъл (който нормално е 12—18 часа) след третирането. Тъй като времето за поемането и метаболизма на тестваното вещество, както и за ефекта му върху кинетиката на клетъчния цикъл може да повлияе на оптималното време за откриване на хромозомни аберации, препоръчва се и вземане на по-късна проба 24 часа след първата проба. Ако се използват режими на дози за повече от един ден, следва да се взема една проба 1,5 пъти продължителността на нормалните клетъчни цикли след последното третиране. Преди убиването животните се инжектират интраперитонеално с подходяща доза на блокиращ метафазата агент (напр. Колцемид® или колхицин). След това, след подходящ интервал от време от животните се взема проба. За мишки този интервал е приблизително 3—5 часа; за китайски хамстери — около 4—5 часа. Клетките се събират от костния мозък и се анализират за хромозомни аберации.
1.5.3. Нива на дозиране Ако се извършва изследване за обхват, поради това че няма подходящи данни в наличност, то следва да е в същата лаборатория, като се използва същият вид, щам, пол и режим на третиране както в главното изследване (5). Ако има токсичност, за първото вземане на проба се използват три нива на дозиране. Тези нива на дозиране следва да включват обхват от максимална до слаба токсичност или липса на токсичност. При вземане на проба на по-късен етап следва да се прилага само най-високата доза. Най-високата доза се дефинира като доза, създаваща признаци на такава токсичност, че от по-високи нива на дозиране, базирани на същия режим, би могло да се очаква да доведат до леталност. Вещества със специфични биологични активности при ниски, нетоксични дози (като хормони и митогени) могат да бъдат изключения от критериите за определяне на дозата и следва да се оценяват за всеки конкретен случай. Най-високата доза може също да се дефинира като доза, която показва известни признаци на токсичност в костния мозък (напр. намаляване на митотичния индекс с повече от 50 %).
1.5.4. Граничен тест Ако тест с едно ниво на дозиране от минимум 2000 mg/kg телесно тегло при еднократно третиране или две третирания в един и същи ден не дава забележими токсични ефекти, а не би могло да се очаква генотоксичност на базата на данни от структурно свързани вещества, то тогава пълно изследване с три нива на дозиране може да не се смята за необходимо. За по-дълготрайни изследвания граничната доза е 2000 mg/kg/телесно тегло на ден за период на третиране до 14 дни и 1000 mg/kg/телесно тегло на ден за период на третиране, по-дълъг от 14 дни. Очакваната експозиция при хора може да покаже необходимост в граничния тест да се използва по-високо ниво на дозиране.
1.5.5. Администриране на дозите Тестваното вещество обикновено се дава със стомашна сонда, като се използва тръба или подходяща интубационна канюла, или чрез интраперитонеална инжекция. Други начини на експозиция биха били приемливи, ако могат да се обосноват. Максималният обем течност, който може да се вкара еднократно със стомашна сонда или инжекция, зависи от големината на опитното животно. Обемът не следва да превишава 2m1/100g телесно тегло. Обеми, по-високи от тези, следва да се обосноват. С изключение на дразнещи или корозивни вещества, които нормално дават изострящи ефекти при по-високи концентрации, варируемостта на тестовия обем следва да се сведе до минимум чрез регулиране на концентрацията с цел осигуряване на постоянен обем на всички нива на дозиране.
1.5.6. Подготовка на хромозомитe Непосредствено след убиването на животните костният мозък се извлича, експонира се в хипотоничен разтвор и се фиксира. След това клетките се разнасят върху предметни стъкла и се оцветяват.
1.5.7. Анализ Митотичният индекс следва да се определи като мярка на цитотоксичност в най-малко 1000 клетки на едно животно за всички опитни животни (включително и положителните контроли) и животни, които не са подлагани на опити, с отрицателни контроли. За всяко животно следва да се анализират най-малко 100 клетки. Този брой би могъл да се намали, когато се наблюдава висок брой аберации. Всички предметни стъкла, включително и тези на положителните и отрицателните контроли, следва да се кодират поотделно преди анализа под микроскоп. Тъй като процедурите по подготовка на предметно стъкло често водят до разкъсване на част от метафазите със загуба на хромозоми, отчетените клетки следва да съдържат известен брой центромери, равни на броя 2n ± 2.
2. ДАННИ
2.
2.1. ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ Данните за всяко от животните следва да се представят в таблица. Експерименталната единица е животното. За всяко изследвано животно отделно се оценяват броят на отчетените клетки, броят на аберации на клетка и процентът на клетки със структурна(и) хромозомна(и) аберация(и). Следва да се показват различните типове структурни хромозомни аберации с броя и честотота им за групите, при които се извършват опити, и за контролните групи. Празнини се регистрират отделно и се докладват, но принципно не се включват в общата честота на аберациите. Ако няма факти за разлика в реакцията между половете, данните от двата пола могат да се комбинират за статистическия анализ.
2.2. ОЦЕНКА И ТЪЛКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Има няколко критерия за определяне на положителен резултат, като например свързано с дозата увеличение в относителния брой на клетки с хромозомни аберации, или явно увеличение в броя на клетки с аберации в групата с еднократна доза и еднократно вземане на проба. Първо следва да се вземе предвид биологичната значимост на резултатите. Статистически методи може да се използват като помощно средство за оценката на резултатите от теста (6). Статистическата значимост не следва да е единственият решаващ фактор за положителна реакция. Двузначните резултати следва да се изяснят чрез още тестове, като за предпочитане е да се изменят условията на експеримента. Увеличение в полоплоидията може да е показателно за това, че тестваното вещество има потенциала да индуцира геномни хромозомни аберации. Увеличение в ендоредупликацията може да показва, че тестваното вещество е в състояние да инхибира прогресията на клетъчния цикъл (7) (8). Тествано вещество, за което резултатите не отговарят на горните критерии, се смята за немутагенно при настоящия тест. Въпреки че повечето опити дават ясно положителни или отрицателни резултати, в редки случаи наборът данни изключва възможността да се направи категорична преценка за активността на тестваното вещество. Резултатите могат да останат неясни или под въпрос, независимо от това колко пъти е извършен опитът. Положителните резултати от теста in vivo за хромозомни аберации показват, че тестваното вещество предизвиква структурни хромозомни аберации в костния мозък на тествания вид. Отрицателните резултати показват, че при условията за провеждане на теста тестваното вещество не предизвиква хромозомни аберации в костния мозък на тествания вид. Следва да се обсъди вероятността тестваното вещество или метаболитите му да достигнат общото кръвообращение или по-конкретно тъканта, която е обект на тестването (напр. системна токсичност).
3. ДОКЛАДВАНЕ
3.
3.1. ДОКЛАД ЗА ТЕСТА Докладът за теста следва да включва следната информация:
Разтворител/носител:
обосновка за избора на носител,
разтворимост и стабилност на тестваното вещество в разтворител/носител, ако са известни.
Опитни животни:
вид/щам,
брой, възраст и пол на животните,
източник, условия на отглеждане, начин на хранене и др.,
индивидуално тегло на животните в началото на теста, в т.ч. обхват на телесното тегло, средни стойности и стандартно отклонение за всяка група.
Условия за провеждане на теста:
положителни и отрицателни (носител/разтворител) контролни данни,
данни от изследването за установяване на обхват, ако е проведено,
основна причина за избора на нивото на дозата,
подробности за приготвянето на тестваното вещество,
подробности за администрирането на тестваното вещество,
основна причина за начина на администриране,
методи за проверка на достигането на тестваното вещество до общото кръвообращение или тъкан, която е обект на тестването, ако са приложими,
преминаване от концентрация (ррm) на тестваното вещество в храната/питейната вода към действителната доза (mg/kg телесно тегло), ако е приложимо,
подробности за качеството на храната и водата,
подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби,
методи на измерване на токсичността,
идентичност на блокиращото метафазата вещество, концентрация и времетраене на третирането,
методи на приготвяне на предметно стъкло,
критерии за отчитане на аберации,
брой на анализирани клетки/животно,
критерии за определяне на изследванията като положителни, отрицателни или двузначни.
Резултати:
признаци на токсичност,
митотичен индекс,
тип и брой на аберациите, дадени отделно за всяко животно,
общ брой на аберациите на група със средни стойности и стандартни отклонения,
брой клетки с аберации на група със средни стойности и стандартни отклонения,
изменения в полиплоидията, ако се наблюдават,
взаимоотношение доза/реакция, където е възможно,
статистически анализи, ако има такива,
паралелни отрицателни контролни данни,
исторически отрицателни данни от предишни изследвания с обхвати, средни стойности и стандартни отклонения,
паралелни положителни контролни данни.
Обсъждане на резултатите.
Заключения.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
ПРЕПРАТКИ Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, w: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D.C., pp. 275—306. Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In vivo Cytogenetic AssayS: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157—165. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, w: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115—141. Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305—312. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313—319. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, w: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184—232. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403—413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362—1364.
Б.12. МУТАГЕННОСТ — IN VIVO МИКРОЯДРЕН ТЕСТ НА ЕРИТРОЦИТИ ОТ БОЗАЙНИЦИ
Б.12.
1. МЕТОД Настоящият метод е изцяло подобен на микроядрен тест на еритроцити от бозайници на OECD TG 474 от 1997 г.
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Микроядрен тест in vivo на еритроцити от бозайници се използва за откриване на увреждания, предизвиквани от тестваното вещество, на хромозомите или митотичния апарат на еритробласти чрез анализ на еритроцити, така както са взети като проби от клетки в костния мозък и/или периферната кръв на животни, обичайно гризачи. Целта на микроядрения тест е да се идентифицират вещества, причиняващи цитогенно увреждане, което води до образуването на микроядра, съдържащи изоставащи хромозомни фрагменти или цели хромозоми. Когато еритробласт на костен мозък се развие в полихроматичен еритроцит, главното ядро се екструдира, а всяко образувано вече микроядро може да изостане в иначе обезядрената цитоплазма. Онагледяването на микроядрата се улеснява в тези клетки, тъй като на тях им липсва главното ядро. Увеличаването на честотата на полихроматични еритроцити с микроядра в третираните животни е показател за индуцирано хромозомно увреждане. В настоящия тест обикновено се използва костният мозък на гризачи, тъй като в тази тъкан се произвеждат полихроматични еритроцити. Измерването на незрели (полихроматични) еритроцити с микроядра в периферна кръв е еднакво приемливо във всеки вид, при който неспособността на далака да отстранява еритроцити с микроядра е изявена или който е показал адекватна чувствителност да открива агенти, причиняващи структурни или геномни хромозомни аберации. Микроядрата могат да бъдат разграничени чрез редица критерии. Те включват идентификация на наличието или отсъствието на кинетохорна или центромерна ДНК в микроядрата. Честотата на незрели (полихроматични) еритроцити с микроядра е главнита крайна точка. Броят на зрели (нормохроматични) еритроцити в периферната кръв, съдържащи микроядра измежду даден брой зрели еритроцити, може също да се използва като крайна точка за анализа на опита, когато животните се третират в продължение на четири или повече седмици. Настоящият микроядрен тест in vivo на еритроцити от бозайници е особено важен за оценка на мутагенната опасност, поради това че дава възможност за разглеждане на фактори на процесите in vivo на метаболизма, фармакокинетиката и възстановителните процеси в ДНК, въпреки че те могат да варират според вида, тъканта и генетичните крайни точки. Анализ чрез тест in vivo е полезен и за по-нататъшното изследване на мутагенния ефект, установен чрез система in vitro. Ако има доказателства, че тестваното вещество или реактивен метаболит няма да достигнат до тъкан, която е обект на анализ, не е подходящо да се използва настоящият тест. Вижте също Общо въведение, част Б.
1.2. ДЕФИНИЦИИ Цeнтромeра (Кинетохора): област(и) на хромозомата, с която(които) вретеновидни фибри се свързват по време на клетъчното деление, като така позволяват методично придвижване на дъщерните хромозоми към полюсите на дъщерните клетки. Микроядра: малки ядра, отделни от главното ядро и в допълнение към него, на клетките, произведени по време на телофазата на митоза (мейоза) чрез изоставащи хромозомни фрагменти или цели хромозоми. Нормохроматичен еритроцит: зрял еритроцит, на който му липсват рибозоми и може да бъде отличен от незрели, полихроматични еритроцити чрез оцветявания, селективни за рибозоми. Полихроматичен еритроцит: незрял еритроцит в междинен етап на развитие, който все още съдържа рибозоми и следователно може да бъде отличен от зрели нормохроматични еритроцити чрез оцветявания, селективни за рибозоми.
1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ТЕСТА Животните се експонират на въздействието на тестваното вещество по подходящ начин. Ако се използва костен мозък, животните се убиват в подходящи моменти след третирането, костният мозък се извлича, а препаратите се изготвят и оцветяват (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Когато се използва периферна кръв, кръвта се взема в подходящи моменти след третирането, а препаратите за намазка се изготвят и оцветяват (4) (8) (9) (10). За опити с периферна кръв следва да мине възможно най-малко време между експозицията и обирането на реколтата от клетки. Препаратите се анализират за наличие на микроядра.
1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА НА ТЕСТА
1.4.
1.4.1. Подготовка
1.4.1.
1.4.1.1. Подбор на животинския вид Ако се използва костен мозък, препоръчват се мишки или плъхове, въпреки че всеки подходящ вид от бозайници би могъл да се използва. Когато се използва периферна кръв, препоръчват се мишки. Все пак всеки подходящ вид от бозайници би могъл да се използва, при условие че това е вид, в който далакът не отстранява еритроцити с микроядра, или вид, показал адекватна чувствителност за откриване на агенти, които причиняват структурни или геномни хромозомни аберации. За теста следва да се вземат общо използваните лабораторни щамове на млади, здрави животни. В началото на изследването вариациите в теглото на животните следва да са минимални и да не превишават ± 20 % от средното тегло на всеки пол.
1.4.1.2. Условия на отглеждане и хранене Прилагат се общите условия в Общото въведение към част Б, въпреки че целта е влажността на въздуха да е 50—60 %.
1.4.1.3. Подготовка на животните Здрави млади животни се отделят на произволен принцип за контролните и опитните групи. На животните се дава уникална идентифакация. Животните са аклиматизират към лабораторните условия поне пет дни. Клетките следва да се подредят така, че да се намалят до минимум евентуалните ефекти от разполагането им.
1.4.1.4. Приготвяне на дози Твърдите вещества за теста следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители и, при необходимост, да се разредят преди даване на дозата на животните. Течните вещества за теста могат да се дозират директно или да се разредят преди дозиране. Следва да се използват пресни препарати на тестваното вещество, освен ако данните за устойчивостта му не показват, че може да се съхранява.
1.4.2. Условия за провеждане на теста
1.4.2.
1.4.2.1. Разтворител/носител Разтворителят/носителят не следва да има токсично въздействие при използваните нива на дозиране, а също така не следва да предизвиква съмнения за химическа реакция между него и тестваното вещество. Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им в теста следва да се подкрепи от данни за съвместимостта им. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтворител/носител.
1.4.2.2. Контроли Във всеки тест следва да се включват паралелни положителни и отрицателни (разтворител/носител) контроли за всеки пол. Като се изключи третирането с тестваното вещество, с животните в контролните групи следва да се борави по един и същи начин както с животните от групите, с които се извършват опити. Положителните контроли следва да произвеждат микроядра in vivo при нива на експозиция, при които се очаква да се постигне забележимо увеличение спрямо съответния фон. Положителните контролни дози следва да са така избрани, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на четеца идентичността на кодираните предметни стъкла. Приемливо е положителните контроли да се администрират по различен начин от тестваното вещество и да им се взема проба само еднократно. Освен това за положителна контрола следва да се смята използването на химикали, принадлежащи към химичен клас, когато такива са налични. Примерите за положителни контролни вещества включват: Вещество САS № ЕINECS № Етил метансулфонат 62-50-0 200-536-7 N- етил -N-нитрозокарбамид 759-73-9 212-072-2 Митомицин С 50-07-7 200-008-6 Циклофосфамид 50-18-0 200-015-4 Циклофосфамид монохидрат 6055-19-2 Триетиленмеламин 51-18-3 200-083-5 За всяко вземане на проби следва да се включват отрицателните контроли, третирани само с разтворител или носител, а за всичко останало третирани както опитните групи, освен ако няма приемлива изменчивост между животните и честотите на клетки с микроядра са доказани с контролни данни от предишни изследвания. Ако за отрицателни контроли се прилага еднократно вземане на проби, най-подходящият момент е първият. Освен това следва също да се използват необработени контроли, освен ако няма контролни данни от предишни изследвания или публикувани контролни данни, които показват, че няма никакви вредни или мутагенни ефекти, предизвикани от избрания разтворител/носител. Ако се използва периферна кръв, проба преди третирането може да е приемлива в качеството на паралелна отрицателна контрола, но само при кратките изследвания на периферна кръв (напр. 1—3 третирания), когато резултантните данни са в очаквания обхват за контрола от предишни изследвания.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.
1.5.1. Брой и пол на животните Всяка група за опити и всяка контролна група следва да включват поне пет анализируеми животни от един пол (11). Ако по времето на изследването има налични данни от изследвания на същия вид и чрез същия начин на експозиция, които показват, че няма значителни разлики между половете по отношение на токсичността, то тестването на един пол ще бъде достатъчно. Когато експозицията на хора спрямо химически вещества може да е в специфична зависимост от пола, като например с някои фармацевтични агенти, тестът следва да се проведе с животни от подходящия пол.
1.5.2. График на обработване Не може да се препоръча стандартен график на обработване (т.е. едно, две или повече третирания на 24-часови интервали). Пробите от обширни режими на дози са приемливи, доколкото е демонстриран положителен ефект за настоящото изследване, или за изследване с отрицателен ефект, доколкото е демонстрирана токсичността или е използвана граничната доза и дозирането е продължило до времето на вземане на проба. Тестваните вещества могат също да се администрират като разделена доза, т.е. две третирания в един и същи ден, разделени от не повече от няколко часа, за да се улесни даването на голям обем материал. Тестът може да се извърши по два начина: Когато е уместно, може да се използва друг график на вземане на проби.
1.5.2. а)
животните се третират веднъж с тестваното вещество. Проби от костен мозък се вземат най-малко два пъти, като се започне не по-рано от 24 часа след третирането, но не повече от 48 часа след третирането, на подходящи интервали между пробите. Вземането на проби по-рано от 24 часа след третирането следва да бъде обосновано. Проби от периферна кръв се вземат най-малко два пъти, като се започне не по-рано от 36 часа след третирането, на подходящи интервали след първото, но не повече от 72 часа. Когато се разпознае положителна реакция след едно вземане на проба, не се изисква допълнително вземане на проба;
б)
ако се прилагат две или повече обработвания на ден (напр. две или повече третирания на 24-часови интервали), следва да се вземат проби веднъж между 18-ия и 24-ия час след последното третиране за костния мозък и веднъж между 36-ия и 48-ия час след последното третиране за периферната кръв (12).
1.5.3. Нива на дозиране Ако се извършва изследване за обхват, поради това че няма в наличност подходящи данни, то следва да се извърши в същата лаборатория, като се използва същият вид, щам, пол и режим на третиране, който се използва и в главното изследване (13). Ако има токсичност, за първото вземане на проба се използват три нива на дозиране. Тези нива на дозиране следва да включват обхват от максимална до слаба токсичност или липса на токсичност. При вземане на проба на по-късен етап е необходимо да се прилага само най-високата доза. Най-високата доза се дефинира като доза, създаваща признаци на такава токсичност, че от по-високи нива на дозиране, базирани на същия режим, би могло да се очаква да доведат до леталност. Вещества със специфични биологични активности при ниски, нетоксични дози (като хормони и митогени) могат да бъдат изключения по отношение на критериите за определяне на дозата и следва да се оценяват за всеки конкретен случай. Най-високата доза може също да се дефинира като доза, която показва известни признаци на токсичност в костния мозък (напр. намаляване на съответната част от незрели еритроцити спрямо общия брой еритроцити в костния мозък или периферната кръв).
1.5.4. Граничен тест Ако тест с едно ниво на дозиране от минимум 2000 mg/kg телесно тегло при еднократно третиране или две третирания в един и същи ден не дава забележими токсични ефекти, а генотоксичност не би могла да се очаква на базата на данни от структурно свързани вещества, то тогава пълно изследване с три нива на дозиране може да не се смята за необходимо. За по-дълготрайни изследвания граничната доза е 2000 mg/kg/телесно тегло/ден за период на третиране до 14 дни и 1000 mg/kg/телесно тегло/ден за период на третиране, по-дълъг от 14 дни. Очакваната експозиция към хора може да покаже, че е необходимо в граничния тест да се използва по-високо ниво на дозиране.
1.5.5. Администриране на дозите Тестваното вещество обикновено се дава със стомашна сонда, като се използва тръба или подходяща интубационна канюла, или чрез интраперитонеална инжекция. Други начини на експозиция биха били приемливи, ако могат да се обосноват. Максималният обем течност, който може да се вкара еднократно със стомашна сонда или инжекция, зависи от големината на опитното животно. Обемът не следва да превишава 2 ml/100g телесно тегло. Използването на обеми, по-големи от тези, следва да бъде обосновано. С изключение на дразнещи или корозивни вещества, които нормално дават изострящи ефекти при по-високи концентрации, променливостта на тестовия обем следва да се сведе до минимум чрез регулиране на концентрацията с цел осигуряване на постоянен обем на всички нива на дозиране.
1.5.6. Подготовка на костния мозък/кръвта Клетките на костния мозък обичайно се вземат от бедрените кости или от тибиите (големите пищяли) непосредствено след убиването на животното. Според общоприетата практика клетките се изваждат от бедрените кости или от тибиите, подготвят се и се оцветяват по установените методи. Периферната кръв се взема от опашната вена или друг подходящ кръвоносен съд и незабавно се оцветява суправитално (8) (9) (10), или се приготвят препарати за намазка, след което се оцветяват. Използването на специфични оцветители за ДНК (напр. акридин оранжево (14) или Хьохст 33258 плюс пиронин-Y (15) може да елиминира някои от аретафктите, свързани с използването на оцветител, което не е специфично за ДНК. Това предимство не изключва използването на конвенционални багрила (напр. Гиемса). Могат също да се използват допълнителни системи (напр. целулозни колони за отстраняване на клетки с ядра (16), при условие че е доказано, че тези системи работят адекватно в лабораторното приготвяне на микроядра.
1.5.7. Анализ Пропорцията на незрелите от общо (незрели + зрели) еритроцити се определя за всяко животно, като се отброяват общо най-малко 200 еритроцити за костен мозък и 1000 еритроцити за периферна кръв (17). Всички предметни стъкла, включително и тези за положителни и отрицателни контроли, следва да се кодират поотделно преди анализа под микроскоп. Най-малко 2000 незрели еритроцити на животно се изследват за разпространението на незрели еритроцити с микроядра. Допълнителна информация може да се получи чрез изследване на зрели еритроцити за микроядра. Когато се анализират предметни стъкла, пропорцията незрели от общия брой еритроцити не следва да е по-малко от 20 % от контролната стойност. Когато животните се третират непрекъснато в течение на четири или повече седмици, най-малко 2000 зрели еритроцити на животно могат също да се изследват за разпространението на микроядра. Приемливи алтернативи на ръчния анализ са системите за автоматизиран анализ (анализ на изображението и поточен цитометричен анализ на клетъчни суспензии), ако са подходящо обосновани и валидирани.
2. ДАННИ
2.
2.1. ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ Индивидуалните данни за животните следва да се представят в таблица. Експерименталната единица е животното. За всяко изследвано животно следва да се дават отделно броят на отчетените незрели еритроцити, броят на незрелите еритроцити с микроядра и броят на незрелите спрямо общото количество на еритроцитите. Когато животните се третират непрекъснато в течение на четири или повече седмици, данни за зрелите еритроцити следва също да се дадат, ако са събрани. Пропорцията на незрелите спрямо общия брой на еритроцитите и, ако се смята за приложимо, процентът на еритроцитите с микроядра, се посочва за всяко животно. Ако няма факти за разлика в реакцията между половете, данните от двата пола могат да се комбинират за статистическия анализ.
2.2. ОЦЕНКА И ТЪЛКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Има няколко критерия за определяне на положителен резултат, като свързано с дозата увеличение на броя клетки с микроядра или явно увеличение на броя клетки с микроядра в група с еднократна доза и еднократно вземане на проба. Първо следва да се разгледа биологичната значимост на резултатите. При оценката на резултатите от теста като помощно средство може да се използват статистически методи (18) (19). Статистическата значимост не следва да е единственият решаващ фактор за положителна реакция. Двузначните резултати следва да се изяснят чрез допълнително тестване, като за предпочитане е да се изменят условията на експеримента. Тествано вещество, за което резултатите не отговарят на горните критерии, се смята за немутагенно при настоящия тест. Въпреки че повечето експерименти дават ясно положителни или отрицателни резултати, в редки случаи наборът данни изключва възможността да се направи категорична преценка за активността на тестваното вещество. Резултатите могат да останат двузначни или под въпрос, независимо от това колко пъти е повторен опитът. Положителните резултати в микронуклеарния тест показват, че веществото индуцира микроядра, които са резултат от хромозомно увреждане или увреждане на митотичния апарат в еритробластите на опитния вид. Отрицателните резултати показват, че при условията за провеждане на теста тестваното вещество не създава микроядра в незрелите еритроцити на тествания вид. Следва да се обсъди вероятността тестваното вещество или метаболитите му да достигнат общото кръвообращение или конкретно тъканта, която е обект на изследване (напр. системна токсичност).
3. ДОКЛАДВАНЕ
3. ДОКЛАД ЗА ТЕСТА
Докладът за теста следва да включва следната информация:
Разтворител/носител:
обосновка за избора на носител,
разтворимост и стабилност на тестваното вещество в разтворител/носител, ако са известни.
Опитни животни:
вид/щам,
брой, възраст и пол на животните,
източник, условия на отглеждане, начин на хранене и др.,
индивидуално тегло на животните в началото на теста, в т.ч. обхват на телесното тегло, средни стойности и стандартно отклонение за всяка група.
Условия за провеждане на теста:
положителни и отрицателни (носител/разтворител) контролни данни,
данни от изследването за установяване на обхват, ако е проведено,
основна причина за избора на нивото на дозата,
подробности за приготвянето на тестваното вещество,
подробности за администрирането на тестваното вещество,
основна причина за начина на администриране,
методи за проверка на достигането на тестваното вещество до общото кръвообращение или прицелната тъкан, ако са приложими,
преминаване от концентрация (ррm) на тестваното вещество в храната/питейната вода към действителната доза (mg/kg телесно тегло), ако е приложимо,
подробности за качеството на храната и водата,
подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби,
методи на приготвяне на предметно стъкло,
методи на измерване на токсичността,
критерии за отчитане на незрели еритроцити,
брой на анализирани клетки/животно,
критерии за отчитане на изследванията като положителни, отрицателни или двузначни.
Резултати:
признаци на токсичност,
пропорция на незрелите еритроцити от общия брой еритроцити,
брой на незрелите еритроцити с микроядра, посочен отделно за всяко животно,
средна стойност ± стандартно отклонение на незрелите еритроцити с микроядра на група,
взаимоотношение доза/реакция, където е възможно,
статистически анализи, ако има такива,
паралелни отрицателни данни и отрицателни данни от предишни изследвания,
паралелни положителни контролни данни.
Обсъждане на резултатите.
Заключения.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
ПРЕПРАТКИ Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187—190. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9—15. Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123,pp. 61—118. Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29—80. MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating ErythrocyteS: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, w: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. Elsevier, Amsterdam, pp. 555—558. MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103—112. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513 —522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245—249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83—98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 53—159. Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. (1994), in Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293—304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313—319. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313—319. Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241—247. MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, pp. 269—275. Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91—104. Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97—99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, w: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part 1, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115—141. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, w: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184—232.
Б.13/14. МУТАГЕННОСТ — БАКТЕРИИ ЗА ТЕСТВАНЕ НА ОБРАТНИ МУТАЦИИ
Б.13/14.
1. МЕТОД Настоящият метод е изцяло подобен на бактериалния тест за обратни мутации на ОECD TG 471 от 1997 г.
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Бактериалният тест за обратни мутации използва изискващи аминокиселина щамове на Salmonella typhimurium и на Escherichia coli, за да се открият точкови мутации, състоящи се в заместване, добавяне или делеция на една или няколко ДНК базови двойки (1) (2) (3). Принципът на настоящия бактериален тест за обратни мутации се състои в това, че той открива мутации, които обръщат мутациите, налични в тестваните щамове, и възстановяват функционалните способности на бактериите да синтезират основна аминокиселина. Ревертантните бактерии се откриват по способността им да растат при отсъствието на аминокиселина, изисквана от родителския тестван щам. Точковите мутации са причината за много човешки генетични заболявания и има фактически доказателства, че точковите мутации в онкогени и туморопотискащи гени на соматични клетки участват в образуването на тумори у хора и експериментални животни. Бактериалният тест за обратни мутации е бърз, евтин и относително лесен за провеждане. Много от тестваните щамове имат няколко характеристики, които ги правят по-чувствителни за откриване на мутации, включително реагиращи секвенции на ДНК в положение на реверсия, повишена клетъчна пропускливост към големи молекули и елиминиране на системи за репарация на ДНК или увеличаването на репарационните процеси на ДНК, при които са възможни грешки. Специфичността на тестваните щамове може да даде полезна информация за типовете мутации, които се индуцират от генотоксични агенти. За бактериалните тестове за обратни мутации съществува огромна база данни с резултати за голямо разнообразие от структури, а също така са разработени и добре установени методологии за тестване на химикали с различни физикохимични свойства, в т.ч. летливи съединения. Вижте също Общо въведение, част Б.
1.2. ДЕФИНИЦИИ Тест за обратни мутации в Salmonella typhimurium или Escherichia coli открива мутация в нуждаещия се от аминокиселина щам (съответно хистидин или триптофан), за да се получи независим от външна доставка на аминокиселина щам. Мутагени — заместители на основна двойка, са агенти, причиняващи основна промяна в ДНК. В реверсивен тест тази промяна може да възникне от страната на първоначалната мутация или от втора страна в бактериалния геном. Фреймшифт мутагени са агенти, предизвикващи добавянето или делецията на една или повече основни двойки в ДНК, като по този начин се променя четящата рамка в РНК.
1.3. НАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ Бактериалният тест за обратни мутации използва прокариотни клетки, които се различават от клетките на бозайниците по фактори, като поглъщане, метаболизъм, хромозомна структура и ДНК репарационни процеси. Провежданите тестове in vitro по принцип изискват използването на екзогенен източник на метаболична активация. Системите in vitro за метаболична активация не могат изцяло да имитират условията in vivo на бозайниците. Следователно тестът не осигурява пряка информация за мутагенната и канцерогенната сила на дадено вещество при бозайници. Бактериалният тест за обратни мутации обикновено се използва като първоначално откриване на генотоксична дейност, и в частност на дейност, индуцираща точкова мутация. Обширна база данни е показала, че много химикали, които са положителни при настоящия тест, също проявяват мутагенна активност при други тестове. Има примери за мутагенни агенти, които не се откриват с настоящия тест; причините за тези недостатъци могат да се припишат на специфичното естество на установената крайна точка, разлики в метаболичната активация или разлики в бионаличността. От друга страна, факторите, които подобряват чувствителността на бактериалния тест за обратни мутации, могат да доведат до надценяване на мутагенна активност. Бактериалният тест за обратни мутации може да не е подходящ за оценката на някои класове химични вещества, например някои съединения с високо бактерицидно съдържание (напр. някои антибиотици) и тези, за които се смята (или се знае), че си взаимодействат конкретно със системата на клетъчна репликация у бозайниците (напр. някои инхибитори на топоизомеразата и някои нуклеозидни аналози). В подобни случаи може би по-подходящи са тестовете за мутации при бозайници. Въпреки че много съединения, които са положителни в настоящия тест, са канцерогени за бозайниците, съответствието не е абсолютно. То зависи от химичния клас, а има канцерогени, които не се откриват с настоящия тест, тъй като те действат чрез други, негенотоксични механизми или механизми, които не се срещат в бактериалните клетки.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ТЕСТА Суспензии на бактериални клетки се експонират на въздействието на тестваното вещество с наличие и отсъствие на система за екзогенна метаболична активация. При метода с посяване на блюдо тези суспензии се смесват с пласт от агар и незабавно се посяват в блюдо върху минимална среда. При метода с предварително инкубиране сместа за обработване се инкубира и след това се смесва с пласт от агар, преди да се посее в блюдо върху минимална среда. При двата метода след два или три дни инкубация се преброяват ревертантните колонии и се сравняват с броя на спонтанни ревертантни колонии в контролни плочки с разтворител. Описани са няколко процедури за провеждането на бактериалния тест за обратни мутации. Измежду най-често използваните са методът с посяване в блюдо (1) (2) (3) (4), прединкубационният метод (2) (3) (5) (6) (7) (8), флуктуационният метод (9) (10) и суспензионният метод (11). Описани са и модификации за тестване на газове или пари (12). Описаните в метода процедури се отнасят главно за метода с посяване в блюдо и прединкубационния метод. Който и да е от тях е приемлив за провеждане на опити както със, така и без метаболична активация. Някои вещества могат да се открият по-ефикасно, като се използва прединкубационният метод. Тези вещества принадлежат към химични класове, включващи алифатни нитрозамини с къси вериги, двувалентни метали, алдехиди, азо багрила и диазо съединения, пиролизидинови алкалоиди, алилни съединения и нитросъединения (3). Признава се също, че някои класове мутагени не винаги се откриват със стандартните процедури, като метода на посяване в блюдо или прединкубационния метод. Те следва да се смятат за специални случаи и силно се препоръчва за откриването им да се използват други процедури. Следните специални случаи биха могли да бъдат идентифицирани (заедно с примери за процедурите, които биха могли да се използват за откриването им): азо багрила и диазо съединения (3) (5) (6) (13), газове и летливи химикали (12) (14) (15) (16) и гликозиди (17) (18). Отклонение от стандартната процедура следва да бъде научно обосновано.
1.5. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА НА ТЕСТА
1.5.
1.5.1. Подготовка
1.5.1.
1.5.1.1. Бактерии Свежи бактериални култури следва да се отглеждат до късната експоненциална или ранна стационарна фаза на растеж (приблизително 109 клетки на ml). He следва да се използват култури в късна стационарна фаза. От първостепенна важност е културите, използвани в опита, да съдържат висок титър жизнеспособни бактерии. Титърът може да се илюстрира с контролни данни от предишни изследвания за кривите на растежа или във всеки анализ на опита чрез определяне количествата на жизнеспособни клетки чрез експеримент с посев в блюдо. Препоръчителната температура на инкубация е 37 oС. Следва да се използват най-малко пет бактериални щама. Те включват четири щама на Salmonella typhimurium (TA 1535; TA 1537 или TA97a или TA97; TA98; и TA100), които са показали, че са надеждни и репродуктивно реагиращи между лабораториите. Тези четири щама на Salmonella typhimurium имат GC основни двойки на главната реверсивна страна и е известно, че те не биха могли да открият някои оксидиращи мутагени, напречно свързващи се агенти и хидразини. Подобни вещества могат да се открият с щамове на Escherichia coli WP2 или Salmonella typhimurium TA102 (19), които имат AT основна двойка на главната реверсивна страна. Следователно препоръчителната комбинация от щамове е: За да се открият напречно свързващи се мутагени, може би е за предпочитане да се включи ТА102 или да се добави щам of Escherichia coli с изобилие от ДНК репарации (напр. Escherichia coli WP2 или Escherichia coli WP2 (pKM101). Следва да се използват установените процедури за приготвяне на изходна култура, проверка на маркера и съхранение. Следва да се посочи необходимата за растеж аминокиселина за приготвянето на всяка замразена изходна култура (хистидин за щамове на Salmonella typhimurium и триптофан за щамове на Escherichia coli). По аналогичен начин следва да се проверят други фенотипни характеристики, а именно: наличието или отсъствието на плазмиди на R-фактор, при необходимост (т.е. устойчивост на ампицилин в щамовете ТА98, ТА100 и ТА97а или ТА97, WP2 uvrA и WP2 uvrA (pKM101), и устойчивост на ампицилин + тетрациклин в щам ТА 102); наличието на характерни мутации (т.е. rfa мутация в Salmonella typhimurium чрез чувствителност към кристално виолетово, и uvrA мутация в Escherichia coli или uvrB мутация в Salmonella typhimurium чрез чувствителност към ултравиолетова светлина) (2) (3). Щамовете следва също така да произвеждат спонтанни ревертантни колонии в блюдо в рамките на честотните обхвати, които се очакват от контролните данни, получени от предишни изследвания в лабораторията и, за предпочитане, в обхвата, описан в литературата.
Salmonella typhimurium TA1535, и
Salmonella typhimurium TA1537 или TA97 или TA97a, и
Salmonella typhimurium TA98, и
Salmonella typhimurium TA100, и
Escherichia coli WP2 uvrA, или Escherichia coli WP2 uvrA (pKM101), или Salmonella typhimurium TA102.
1.5.1.2. Среда Използва се подходящ минимален агар (напр. съдържащ минимална среда Е на Фьогел-Бонер и глюкоза), и пласт от агар, съдържащ хистидин и биотин или триптофан, за да се получат няколко клетъчни деления (1) (2) (9).
1.5.1.3. Метаболична активация Бактериите следва да се ескпонират на тестваното вещество, както при наличие, така и при липса на подходяща система за метаболична активация. Най-често използваната система е постмитохондрична фракция (S9) с добавка на ко-фактор, приготвена от черните дробове на гризачи, третирани с ензимно-индуциращи реактиви. като Ароклор 1254 (1) (2) или смес от фенобарбитон и ß-нафтофлавон (18) (20) (21). Постмитохондричната фракция обичайно се използва с концентрации в обхвата от 5 до 30 % v/v в сместа S9. Изборът и състоянието на системата за метаболична активация може да зависи от класа на тествания химикал. В някои случаи е подходящо да се използва повече от една концентрация на постмитохондрична фракция. За азо багрила и диазо съединения може да е по-подходяща редуцираща система за метаболична активация (6) (13).
1.5.1.4. Тествано вещество/приготвяне Твърдите вещества за теста следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители и, при необходимост, да се разредят преди третиране на клетките. Течните вещества за теста могат да се добавят директно към системите за тестване и/или да се разредят преди третиране. Следва да се използват пресни препарати на тестваното вещество, освен ако данните за устойчивостта му не показват, че може да се съхранява. Не следва да има съмнения за химическа реакция на разтворителя/носителя с тестваното вещество и той следва да е съвместим с оцеляването на бактериите и активността на S9 (22). Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им в теста следва да се подкрепи от данни за съвместимостта им. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтворител/носител. При тестването на вещества, нестабилни във вода, използваните органични разтворители не следва да съдържат вода.
1.5.2. Условия за провеждане на теста
1.5.2.
1.5.2.1. Тествани щамове (вж. 1.5.1.1)
1.5.2.2. Концентрация на експозиция Измежду критериите, които следва да се вземат предвид при определянето на най-високото количество на тестваното вещество, са цитотоксичността и разтворимостта в окончателната смес за третиране. Полезно би било да се определят токсичността и неразтворимостта в предварителен опит. Цитотоксичността може да се открие чрез намаляване на броя на ревертантните колонии, почистване или намаляване на фона, или степента на оцеляване на третираните култури. Цитотоксичността на едно вещество може да се промени в присъствието на системи за метаболична активация. Неразтворимостта следва да се оценява като утаяване в крайната смес при реални условия за провеждане на теста и е видима с просто око. Препоръчителната максимална тестова концентрация за разтворими нецитотоксични вещества е 5 mg/блюдо или 5 μl/блюдо. За нецитотоксични вещества, които не са разтворими при 5 mg/блюдо или 5 μl/блюдо, една или повече тествани концентрации следва да са неразтворими в крайната смес за третиране. Тествани вещества, които вече са цитотоксични под 5 mg/блюдо или 5 μl/блюдо, следва да се тестват до границата на цитотоксична концентрация. Преципитатът не следва да влияе на отчитането. Използват се най-малко пет различни, даващи възможност за анализ концентрации на тестваното вещество на приблизително полулогаритмични (т.e. √10) интервали между тестваните точки за начален опит. Могат да бъдат подходящи и по-малки интервали, когато се изследва реакция на концентрация. Тестване над концентрацията от 5 mg/блюдо или 5 μl/блюдо може евентуално да се извършва, когато се изследват вещества, съдържащи значителни количества потенциално мутагенни примеси.
1.5.2.3. Отрицателни и положителни контроли Във връзка с анализа на всеки отделен опит следва да се включват паралелни положителни и отрицателни (разтворител или носител) контроли със специфичен щам, както със, така и без метаболична активация. Следва да се избират положителните контролни концентрации, показващи ефективно провеждане на всеки опит. За тестове със система за метаболична активация референтното(ите) вещество(а) за положителни контроли се избира(т) въз основа на вида на използваните бактериални щамове. Следните вещества са примери за подходящи положителни контроли за тестове с метаболична активация: CAS № EINECS № Вещество 781-43-1 212-308-4 9,10-диметилантрацен 57-97-6 200-359-5 7,1 2-диметилбенз[а]антрацен 50-32-8 200-028-5 бензо[а]пирен 613-13-8 210-330-9 2-аминоантрацен 50-18-0 циклофосфамид монохидрат 6055-19-2 200-015-4 циклофосфамид Следното вещество е подходяща положителна контрола за метода с редуцираща метаболична активация: CAS № EINECS № Вещество 573-58-0 209-358-4 конгочервено Не следва да се използва 2-аминоантрацен като единствен показател за ефикасността на сместа S9. Ако се използва 2-аминоантрацен, всяка партида от S9 следва също да се характеризира с мутаген, изискващ метаболична активация от микрозомни ензими, напр., бензо[а]пирен, диметилбензантрацен. Следните вещества са примери на специфични по щам положителни контроли за тестове без система за екзогенна метаболична активация: CAS № EINECS № Вещество Щам 26628-22-8 247-852-1 натриев азид TA 1535 и TA 100 607-57-8 210-138-5 2-нитрофлуорен TA 98 90-45-9 201-995-6 9-амноакридин TA 1537, TA 97 и TA 97a 17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 и TA 97a 80-15-9 201-254-7 кумол хидроперокисид TA 102 50-07-7 200-008-6 митомицин С WP2 uvrA и TA 102 70-25-7 200-730-1 N-eтил-N-нитpo-N-нитрозогуанидин WP2, WP2uvrA и WP2uvrA (pKM101) 56-57-5 200-281-1 4-нитрохинолин-1-оксид WP2, WP2uvrA и WP2uvrA (pKM101) 3688-53-7 фурилфурамид (AF2) щамове, съдържащи плазмид Могат да се използват други референтни вещества за положителни контроли. За положителна контрола следва да се разглежда използването на химикали, принадлежащи към химичен клас, когато такива са налични. Следва да бъдат включени отрицателните контроли, състоящи се само от разтворител или носител в средата за третиране, и третирани по същия начин както опитните групи. В допълнение към това следва също да се използват нетретирани контроли, освен ако няма исторически контролни данни от предишни изследвания, показващи, че избраният разтворител не причинява вредни или мутагенни ефекти.
1.5.3. Процедура При метода на посяване в блюдо (1) (2) (3) (4) без метаболична активация се смесват обичайно 0,05 ml или 0,1 ml тестовите разтвори, 0,1 ml свежа бактериална култура (съдържаща около 108 жизнеспособни клетки) и 0,5 ml стерилен буфер с 2,0 ml слой от агар. За тест с метаболична активация се смесват обикновено 0,5 ml от сместа за метаболична активация, съдържаща адекватно количество постмитохондрична фракция (в границите от 5 до 30 % v/v в сместа за метаболична активация), със слой от агар (2,0 ml) заедно с бактериите и тестваното вещество/тестван разтвор. Съдържанието на всяка епруветка се смесва и изсипва върху повърхността на блюдо с минимален агар. Слоят от агар се оставя да се втвърди преди инкубацията. При прединкубационния метод (2) (3) (5) (6) тестваното вещество/тестваният разтвор се инкубира предварително с тествания щам (съдържащ около 108 жизнеспособни клетки) и стерилен буфер или система за метаболична активация (0,5 ml) обичайно за 20 или повече минути при 30—37 oС преди смесването със слоя от агар и изливането върху повърхността на блюдо с минимален агар. Обикновено 0,05 или 0,1 ml от тестваното вещество/тестван разтвор, 0,1 ml бактерии и 0,5 ml от S9 или стерилен буфер се смесват с 2,0 ml слой от агар. Епруветките се аерират по време на предварителната инкубация с шейкър. За адекватна оценка на променливостта при всяко ниво на дозиране се използват по три блюда. Използването на две блюда е приемливо, когато е научно обосновано. Загубата по невнимание на блюдо не обезсилва опита по необходимост. Газообразни или летливи вещества се изпитват чрез подходящи методи, като например в запечатани съдове (12) (14) (15) (16).
1.5.4. Инкубация Всички блюда на даден тест се инкубират при 37oС за 48—72 часа. След инкубационния период се преброяват ревертантните колонии на блюдо.
2. ДАННИ
2.
2.1. ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ Данните се представят като брой ревертантни колонии на блюдо. Също се дава броят ревертантни колонии както върху блюдата за отрицателни (контрола на разтворител и нетретирана контрола, ако се използва), така и за положителните контроли. Представят се броят на отделните блюда, средният брой ревертантни колонии на блюдо и стандартното отклонение за тестваното вещество и положителните и отрицателните (третирани и/или разтворител) контроли. Няма изискване за потвърждаване на явно положителна реакция. Резултатите, които не са категорични, следва да се изяснят с още тестове, като за предпочитане е да се изменят условията на експеримента. Отрицателните резултати следва да се потвърдят за всеки случай поотделно. В случаите, когато не се смята необходимо потвърждаването на отрицателни резултати, следва да се даде обосновка. Изменението на параметрите на изследването с цел разширяване на обхвата на оценяваните условия следва да се вземе под внимание при следващите експерименти. Параметрите на изследването, които биха могли да се променят, включват границите на концентрацията, метода на третиране (посев върху блюдо или течна прединкубация) и условията на метаболична активация.
2.2. ОЦЕНКА И ТЪЛКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Има няколко критерия за определяне на положителен резултат, като например увеличение на концентрацията спрямо тествания обхват и/или репродуцируемо увеличение при една или повече концентрации на броя на ревертантни колонии на блюдо в поне един щам със или без система за метаболична активация (23). Първо следва да се разгледа биологичната значимост на резултатите. При оценката на резултатите от теста биха могли да се използват статистически методи (24). Статистическата значимост не следва да е единственият решаващ фактор за положителна реакция. Тествано вещество, за което резултатите не отговарят на горните критерии, се смята за немутагенно в настоящия тест. Въпреки че повечето експерименти дават ясно положителни или отрицателни резултати, в редки случаи наборът данни изключва възможността да се направи категорична преценка за активността на тестваното вещество. Резултатите могат да останат двусмислени или под въпрос, независимо от това колко пъти е повторен опитът. Положителните резултати от бактериалния тест за обратни мутации показват, че веществото индуцира точкови мутации чрез заместване на бази или фреймшифтове в генома на Salmonella typhimurium и/или Escherichia соli. Отрицателните резултати показват, че при условията за провеждане на теста тестваното вещество не е мутагенно в тествания вид.
3. ДОКЛАДВАНЕ
3. ДОКЛАД ЗА ТЕСТА
Докладът за теста следва да включва следната информация:
Разтворител/носител:
обосновка за избора на носител,
разтворимост и стабилност на тестваното вещество в разтворител/носител, ако са известни.
Щамове:
използвани щамове,
брой на клетки на култура,
характеристики на щама.
Условия за провеждане на теста:
количество тествано вещество на блюдо (mg/блюдо или μl/блюдо) c основна причина за избора на доза и брой на блюдата на концентрация,
използвани среди,
тип и състав на системата за метаболична активация, в т.ч. критерии за приемливост,
процедури на третиране.
Резултати:
признаци на токсичност,
признаци на утаяване,
брой отделни блюда,
среден брой на ревертантните колонии на блюдо и стандартно отклонение,
взаимоотношение доза-реакция, където е възможно,
статистическа оценка, ако има такава,
паралелни отрицателни (разтворител/носител) и положителни контролни данни с обхват, средни стойности и стандартни отклонения,
—отрицателни (разтворител/носител) и положителни контролни данни от предишни изследвания, с обхват, средни стойности и стандартни отклонения.
Обсъждане на резултатите.
Заключения.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
ПРЕПРАТКИ Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347—364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173—215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217—233. Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69—240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, pp. 91—96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, w: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C, Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273—285. Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, w: Basic Mutagenicity TestS: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13—61. Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, pp. 167—177. Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, pp. 33—42. Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, w: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141—161. Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453—465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335—344. Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33—47. Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2—141. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249—258. Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421—441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780—3782. Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961—4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285—291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, w: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85—88. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175—177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343—350. Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83—91. Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, w: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, pp. 28—65.
Б.15. ИЗПИТВАНЕ ЗА МУТАГЕННОСТ И ПРЕСЯВАЩО ИЗПИТВАНЕ ЗА КАНЦЕРОГЕННОСТ ГЕННИ МУТАЦИИ — SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Б.15.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Вижте Общо въведение, част Б.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Вижте Общо въведение, част Б.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ За измерване продукцията на генни мутации, предизвикани от химични агенти със или без метаболитно активиране, могат да се използват разнообразни хаплоидни и диплоидни щамове на дрождите Saccharomyces cerevisiae. Използват се системите за прави мутации в хаплоидни щамове, например измерване на мутацията от червени, аденин зависими мутанти (ade-1, ade-2) към двойно аденин зависими бели мутанти, и селективни системи, например предизвикване на резистентност към канавнаин и циклохексимид. Най-широко утвърдената система за обратни мутации включва използването на хаплоидния щам XV 185—14С, който е носител на охра безсмислени мутации ade 2—1, arg 4—17, lys 1—1 и trp 5—48, които са обратими от мутагени за заместване на бази, които предизвикват специфични по място мутации или охра потискащи мутации. XV 185—14С е носител и на маркера his 1—7, променяща смисъла мутация, която е обратима главно от мутации на друго място, и маркера horn 3—10, който е обратим от мутагени, свързани с изместване на рамката. При диплоидните щамове на S. cerevisiae единственият широко използван щам е D7, който е хомозиготен по ilv 1—92.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.6. Подготовка
Разтворите на изпитваните химически вещества следва да бъдат приготвени непосредствено преди изпитването, като се използва подходящ носител. При органични съединения, които не са разтворими във вода, следва да се използва не по-концентриран от 2 % об/об разтвор на органични разтворители, като етанол, ацетон или диметилсулфоксид. Крайната концентрация на носителя не следва да оказва значимо влияние върху клетъчната жизнеспособност и растежните характеристики.
Метаболитно активиране
Клетките следва да бъдат подложени на експозиция на изпитваните химически вещества както в присъствие, така и в отсъствие на подходяща екзогенна система за метаболитно активиране. Най-често използваната система е допълнена с ко-фактор митохондриална фракция от черни дробове на гризачи, предварително обработени със средства за ензимна индукция. За метаболитно активиране може да бъде подходящо и използването на други видове, тъкани, постмитоходриални фракции или процедури.
Условия на изпитване
Експериментални щамове
При изпитвания за генни мутации най-широко се използват хаплоидният щам XV185-14C и диплоидният щам D7. Други щамове също могат да бъдат подходящи.
Среди
За определяне броя на преживелите микроорганизми и на мутантите се използват подходящи среди за култивиране.
Използване на положителни и отрицателни контроли
Паралелно следва да се използват положителни и отрицателни контроли и контроли за разтворителите. За всяка конкретна мутационна крайна точка следва да се използват подходящи химически вещества за положителни контроли.
Експозиционна концентрация
Следва да се използват поне пет концентрации, които са адекватно разделени една от друга. За токсичните вещества най-високата изпитвана концентрация не следва да понижава преживяемостта под 5 до 10 %. Относително неразтворимите във вода вещества следва да се изпитват до границата на разтворимостта им, като се използват подходящи процедури. За лесно разтворимите във вода нетоксични вещества високата концентрация следва да се определя за всеки конкретен случай.
Условия за инкубиране
Петриевите панички се инкубират в продължение на четири до седем дни при 28 до 30 oС на тъмно.
Честоти на спонтанните мутации
Следва да се използват субкултури с честоти на спонтанните мутации в рамките на приетия нормален диапазон.
Брой на повторенията
За изследване на прототрофи, получени посредством генна мутация, и за изследване на клетъчната жизнеспособност следва да се използват поне по три петриеви панички за всяка концентрация. При експерименти с маркери като horn 3—10 с ниска честота на мутациите броят на използваните петриеви панички следва да бъде увеличен, за да се обезпечат статистически значими данни.
Процедура
Третирането на щамовете S. Cerevisiae обикновено се извършва в течна среда с клетки в стационарна фаза или фаза на растеж. Първоначалните експерименти следва да се провеждат върху растящи клетки. На експозиция на изпитваното химическо вещество се подлагат 1 – 5 × 107 клетки/ml в продължение на не повече от 18 часа при 28 до 37 oС, като се разклащат. Когато е необходимо, по време на третирането се добавя адекватно количество система за метаболитно активиране. В края на третирането клетките се центрофугират, промиват се и се посяват върху подходяща среда за култивиране. След инкубиране на петриевите панички се отчитат преживяемостта и предизвикването на генни мутации. Ако първият експеримент е отрицателен, тогава следва да се проведе втори експеримент, като се използват клетки в стационарна фаза. Ако първият експеримент е положителен, това се потвърждава с помощта на подходящ независим експеримент.
2. ДАННИ Данните следва да бъдат представени в табличен вид, като се отбелязват броят на преброените колонии, броят на мутантите, преживяемостта и честотата на мутациите. Всички резултати следва да бъдат потвърдени в независим експеримент. Данните следва да бъдат оценени с помощта на подходящи статистически методи.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Ако е възможно, протоколът от изпитването съдържа следната информация:
използван щам,
условия на изпитването, клетки в стационарна фаза или фаза на растеж, състав на средите, температура и продължителност на инкубирането, система за метаболитно активиране,
условия на третиране, нива на експозиция, процедура и продължителност на третирането, температура на третиране, положителни и отрицателни контроли,
брой на преброените колонии, брой на мутантите, преживяемост и честота на мутантите, връзка между доза и отговор, ако е необходимо, статистическа оценка на данните,
обсъждане на резултатите,
интерпретиране на резултатите,
3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТИРАНЕ Вижте Общо въведение, част Б.
4. ПРЕПРАТКИ Вижте Общо въведение, част Б.
Б.16. МИТОТИЧНИ РЕКОМБИНАЦИИ — SАССНАRОМУСЕS СЕREVISIAE
Б.16.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Вижте Общо въведение, част Б.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Вижте Общо въведение Част Б.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Митотичната рекомбинация при Saccharomyces сеrevisiae може да бъде открита между гените (или по-общо, между гена и неговия центромер) и в рамките на отделните гени. Първото явление се нарича кросинговър и води до получаване на реципрочни продукти, докато второто най-често не е реципрочно и се нарича генна конверсия. Кросинговърът обикновено се изследва посредством получаване на рецесивни хомозиготни колонии или сектори в хетерозиготен щам, докато генната конверсия се изследва посредством получаване на прототрофни ревертанти, получени в ауксотрофен хетероалелен щам и носещи два различни дефектни алела на един и същ ген. Най-широко използваните за откриване на митотична генна конверсия щамове са D4 (хетероалелен по аdе 2 и trр 5), D7 (хетероалелен по trp 5), ВZ34 (хетероалелен по arg 4) и JD1 (хетероалелен по his 4 и trp 5). Митотичният кросинговър, от който се получават червени и розови хомозиготни сектори, може да се изследва при D5 или при D7 (като се измерват и митотичната генна конверсия, и обратната мутация при ilv 1—92), като и двата щама са хетероалелни за комплементните алели на adе 2.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.6. Подготовка
Разтворите на изпитваните химически вещества и съединенията за сравнение следва да бъдат приготвени непосредствено преди изпитването, като се използва подходящ носител. При органични съединения, които не са разтворими във вода, следва да се използва не по-концентриран от 2 % об/об разтвор на органични разтворители, като етанол, ацетон или диметилсулфоксид. Крайната концентрация на носителя не следва да оказва значимо влияние върху клетъчната жизнеспособност и растежните характеристики.
Метаболитно активиране
Клетките следва да бъдат подложени на експозиция на изпитваните химически вещества както в присъствие, така и в отсъствие на подходяща система за метаболитно активиране. Най-често използваната система е допълнена с ко-фактор митохондриална фракция от черни дробове на гризачи, предварително обработени със средства за ензимна индукция. За метаболитно активиране може да бъде подходящо и използването на други видове, тъкани, постмитохондриални фракции или процедури.
Условия на изпитване
Експериментални щамове
Най-често използвани са диплоидните щамове D4, D5, D7 и JD1. Може да е целесъобразно използването на други щамове.
Среди
За определяне на преживяемостта и честотата на митотичните рекомбинации се използват подходящи среди за култивиране.
Използване на положителни и отрицателни контроли
Паралелно следва да се използват положителни и отрицателни контроли и контроли за разтворителите. За всяка конкретна рекомбинантна крайна точка следва да се използват подходящи химически вещества за положителни контроли.
Експозиционни концентрации
Следва да се използват поне пет концентрации на изпитваното вещество, които са адекватно разделени една от друга. Сред факторите, които следва да се вземат предвид, са клетъчната токсичност и разтворимостта. Най-ниската концентрация не следва да оказва влияние върху клетъчната жизнеспособност. За токсичните химически вещества най-високата изпитвана концентрация не следва да понижава преживяемостта под 5 до 10 %. Относително неразтворимите във вода химически вещества следва да се изпитват до границата на разтворимостта си, като се използват подходящи процедури. За лесно разтворимите във вода нетоксични вещества високата концентрация следва да се определя за всеки конкретен случай. Клетките могат да бъдат подложени на експозиция на изпитваните химически вещества в стационарна или растежна фаза за периоди с продължителност до 18 часа. При продължителни периоди на третиране обаче културите следва да бъдат огледани микроскопски за образуване на спори, чието присъствие прави изпитването невалидно.
Условия за инкубиране
Петриевите панички се инкубират на тъмно за четири до седем дни при 28 до 30 oС. Петриевите панички, използвани за изследване на червени и розови хомозиготни сектори, получени посредством митотичен кросинговър, следва да бъдат съхранявани в хладилник (около 4 oС) за допълнителни един до два дни преди отчитането, за да се даде възможност за развитие на съответните пигментирани колонии.
Спонтанни честоти на митотичните рекомбинации
Следва да се използват субкултури с честоти на спонтанните митотични рекомбинантни мутации в рамките на приетия нормален диапазон.
Брой на повторенията
За изследване на прототрофи, получени посредством генна мутация, и за изследване на клетъчната жизнеспособност следва да се използват поне по три петриеви панички за всяка концентрация. При изпитване на рецесивни хомозиготи, получени посредством митотичен кросинговър, броят на петриевите панички следва да бъде увеличен, за да се осигури адекватен брой колонии.
Процедури
Третирането на щамовете S. Сerevisiае обикновено се извършва в течна среда с клетки в стационарна фаза или фаза на растеж. Първоначалните експерименти следва да се провеждат върху растящи клетки. На експозиция на изпитваното химическо вещество се подлагат 1 – 5 × 107 клетки/ml в продължение на не повече от 18 часа при 28 до 37 oС, като се разклащат. Когато е необходимо, по време на третирането се добавя адекватно количество система за метаболитно активиране. В края на третирането клетките се центрофугират, промиват се и се посяват върху подходяща среда за култивиране. След инкубиране петриевите панички се отчитат за преживяемост и предизвикване на митотична рекомбинация. Ако първият експеримент е отрицателен, следва да се проведе втори експеримент, като се използват клетки в стационарна фаза. Ако първият експеримент е положителен, това се потвърждава с помощта на независим експеримент.
2. ДАННИ Данните следва да бъдат представени в табличен вид, като се отбелязват броят на преброените колонии, броят на рекомбинантите, преживяемостта и честотата на рекомбинантите. Резултатите следва да бъдат потвърдени в независим експеримент. Данните следва да бъдат оценени с помощта на подходящи статистически методи.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Ако е възможно, протоколът от изпитването съдържа следната информация:
използван щам,
условия на изпитването, клетки в стационарна фаза или фаза на растеж, състав на средите, температура и продължителност на инкубирането, система за метаболитно активиране,
условия на третиране, експозиционна концентрация, процедура и продължителност на третирането, температура на третиране, положителни и отрицателни контролни групи,
брой на преброените колонии, брой на рекомбинантите, преживяемост и честота на рекомбинациите, ако е необходимо, връзка между доза и отговор, статистическа оценка на данните,
обсъждане на резултатите,
интерпретиране на резултатите,
3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТИРАНЕ Вижте Общо въведение, част Б.
4. ПРЕПРАТКИ Вижте Общо въведение, част Б.
Б.17. МУТАГЕННОСТ — IN VITRO ТЕСТ ЗА КЛЕТЪЧНИ ГЕННИ МУТАЦИИ ПРИ БОЗАЙНИЦИ
Б.17.
1. МЕТОД Настоящият метод е изцяло подобен kd теста in vitro за клетъчни генни мутации при бозайници на ОИСР ТG 476 от 1997 г.
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Тестът in vitro за клетъчни генни мутации при бозайници може да се използва за откриване на генни мутации, индуцирани от химични вещества. Подходящи клетъчни линии са L5178Y на миши лимфомни клетки, линиите СНО, СНО-АS52 и V79 на клетките на китайски хамстер и ТК6 на човешки лимфобластоидни клетки (1). В тези клетъчни линии най-често използваните генетични крайни точки измерват мутацията на киназата на тимидина (ТК) и трансферазата на хипокснатин-гуанин фосфорибозил (НРRТ), както и трансген от трансферазата на ксантин-гуанин фосфорибозил (ХРRТ). Тестовете за мутации на ТК, НРRТ и ХРRТ откриват различни спектри на генетични събития. Автозомното разполагане на ТК и ХРRТ може да даде възможност за откриването на генетични събития (напр. големи делеции), които не се забелязват на локуса на НРRТ върху X хромозоми (2)(3)(4)(5)(6). В теста in vitro за клетъчни генни мутации при бозайници могат да се използват култури на установени клетъчни линии или клетъчни щамове. Клетките се избират въз основа на способността за растеж в дадена култура и устойчивостта в честотата на спонтанните мутации. Тестовете in vitro по принцип изискват екзогенен източник на метаболична активация. Тази система за метаболична активация не може изпяло да имитира условията in vivo при бозайниците. Следва да се избягват условия, които биха довели до резултати, неотразяващи присъща мутагенност. Положителни резултати, които не отразяват присъща мутагенност, могат да възникнат от промени в рН, осмотично налягане или високи нива на цитотоксичност (7). Настоящият тест се използва за откриване на евентуални мутагени и канцерогени. Много съединения, които са положителни в настоящия тест, са канцерогени за бозайници; все пак няма идеално съответствие между настоящия тест и канцерогенността. Съответствието зависи от химичния клас, а има все повече доказателства за това, че съществуват канцерогени, които не се откриват чрез настоящия тест, защото вероятно те действат чрез други, негенотоксични механизми или механизми, отсъстващи в бактериалните клетки(6). Вижте също Общо въведение, част Б.
1.2. ДЕФИНИЦИИ Мутация в поколението напред: генна мутация от родителския тип на мутанта, от който възниква изменение или загуба на ензимна активност на функцията на кодирания протеин. Мутагени — заместители на основна двойка: вещества, които причиняват заместване на една или няколко основни двойки в ДНК. Фрeймшифт мутагени: вещества, които причиняват добавяне или делеция на една или много основни двойки в ДНК молекула. Време на фенотипно изразяване: период, през който непроменените генни продукти са изчерпани от новомутиралите клетки. Мутантна честота: броят на наблюдаваните мутантни клетки, разделен на броя на жизнеспособните клетки. Относителен общ растеж: увеличение в броя на клетките за период време в сравнение контролна популация клетки; изчислен като продукта от суспензионния растеж спрямо в отрицателната контрола, умножен по ефективността (к.п.д.) на клониране спрямо отрицателна контрола. Относителен суспензионен растеж: увеличение в броя на клетките за период на изразяване спрямо отрицателната контрола. Жизнеспособност: ефективността на клониране на третираните клетки по време на посяването в блюдо в селективни условия след периода на изразяване. Оцеляване: ефективността на клониране на третираните клетки, когато са посети в блюдо в края на периода на третиране; оцеляването обикновено се изразява по отношение на оцеляването в контролната клетъчна популация.
1.2. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА ТЕСТА Клетките с дефицит от тимидин киназа (ТК) поради мутацията ТК+/- —> ТК-/- са устойчиви на цитотоскичните ефекти на пиримидиновия аналог трифлуороитимидин (ТFТ). Клетките с изобилие от тимидин киназа са чувствителни към ТFТ, което причинява инхибиране на клетъчния метаболизъм и спира по-нататъшното клетъчно деление. Така мутантните клетки са способни да пролиферират в присъствието на ТFТ, докато нормални клетки, съдържащи тимидин киназа, не са. Аналогично, клетките с дефицит от НРRТ или ХРRТ се избират според устойчивостта им към 6-тиогуанин (ТG) или 8-азагуанин (АС). Следва внимателно да се подходи към свойствата на тестваното вещество, ако базов аналог или съединение се тестват в някой от тестовете за клетъчни генни мутации при бозайници. Например, следва всяка съмнителна селективна токсичност, предизвикана от тестваното вещество за мутантни или немутантни клетки, да бъде проучена. Следователно характеристиките на селекционната система/агент следва да се потвърдят, когато се тестват химикали, структурно свързани със селективния агент (8). Клетки в суспензия или еднослойна култура се излагат на тестваното вещество, със и без метаболична активация, за подходящ период от време и се субкултивират, за да се определи цитотоксичността и да се даде възможност за фенотипно изразяване преди селекцията на мутанти (9) (10) (11) (12) (13). Цитотоксичността обикновено се определя чрез измерване на относителната ефективност на клониране (оцеляване) или относителния общ растеж на културите след периода на третиране. Третираните култури се поддържат в среда на растеж за достатъчен период от време, характерен за всеки избран локус и клетъчен тип, за да се осигури почти оптимално фенотипно изразяване на индицираните мутации. Мутантната честота се определя чрез посяване на известни количества клетки в среда, съдържаща селективния агент, за да се открият мутантни клетки, и в среда без селективен агент, за да се определи ефективността на клониране (оцеляване). След подходящ инкубационен период колониите се преброяват. Мутантната честота се получава от броя на мутантни колонии в селективна среда и броя на колониите в неселективна среда.
1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА НА ТЕСТА
1.4.
1.4.1. Подготовка
1.4.1.
1.4.1.1. Клетки За настоящия тест има в наличност разнообразни клетъчни типове, включително и субклони на L5171Y, СНО, СНО-АS52, V79 или ТК6 клетки. Типовете клетки, използвани в настоящия тест, следва да са показали чувствителност към химични мутагени, висока ефективност на клониране и стабилна честота на спонтанни мутации. Клетките следва да се проверят за замърсяване на микоплазмата и ако са замърсени, не следва да се използват. Тестът следва да се провежда с предварително определени чувствителност и енергия. Броят клетки, култури и концентрации на тестваното вещество следва да отразяват тези дефинирани параметри (14). Минималният брой жизнеспособни клетки, оцеляващи от третирането и използвани на всеки етап на теста, следва да се базира на честотата на спонтанни мутации. Една принципна насока е да се използва брой клетки, който е равен най-малко на 10 пъти реципрочната стойност на честотата на спонтанни мутации. Все пак препоръчително е да се използват поне 106 клетки. Следва да има съответстващи данни от предишни изследвания за използваната клетъчна система, които да свидетелстват за последователност при провеждането на теста.
1.4.1.2. Среда и условия за отглеждане на културите Следва да се използват подходяща хранителна среда и инкубационни условия (носители на културата, температура, концентрация на СО2 и влажност на въздуха). Видовете хранителна среда следва да се подберат в съответствие със селективните системи и типа клетки на теста. Особено важно е условията за отглеждане на културите да се подберат така, че да осигуряват оптимален растеж на клетките по време на периода на изразяване и способност за образуване на колонии както за мутантни, така и за немутантни клетки.
1.4.1.3. Приготвяне на културите Размножават се клетки от изходни култури, посяват се в хранителна среда и се инкубират при 37 oС. Преди употребата им в настоящия тест може да се окаже необходимо културите да се почистят от съществуващи преди това мутантни клетки.
1.4.1.4. Метаболична активация Клетките следва да се експонират на тестваното вещество както в наличието, така и в отсъствието на подходяща система за метаболична активация. Най-често използваната система е постмитохондрична фракция (89) с добавка на ко-фактор, приготвена от черните дробове на гризачи, третирани с ензимно индуциращи реактиви, като Ароклор 1254 (15) (16) (17) (18) или смес от фенобарбитон и ß-нафтофлавон (19) (20). Постмитохондричната фракция обикновено се използва с концентрации в обхвата от 1 — 10 % V/V в последната среда на теста. Изборът и състоянието на системата за метаболична активация може да зависи от класа на тествания химикал. В някои случаи би било подходящо да се използва повече от една концентрация на постмитохондрична фракция. Редица разработки, включително и създаването на генно конструирани клетъчни линии, изразяващи специфични активизиращи ензими, могат да осигурят потенциал за ендогенна активация. Изборът на клетъчни линии за теста следва да е научно обоснован (напр. чрез значението на изоензим цитохром Р450 за метаболизма на тестваното вещество).
1.4.1.5. Подготовка на тестваното вещество Твърдите вещества за теста следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители и, ако е необходимо, да се разредят преди третиране на клетките. Течните вещества за теста могат да се добавят директно или да се разредят преди третиране. Следва да се използват пресни препарати на тестваното вещество, освен ако данните за стабилността му не показват, че може да се съхранява.
1.4.2. Условия за провеждане на теста
1.4.2.
1.4.2.1. Разтворител/носител Не следва да съществуват съмнения за химическа реакция на разтворителя/носителя с тестваното вещество и той следва да е съвместим с оцеляването на клетките и активността на S9. Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им в теста следва да се подкрепи от данни за съвместимостта им. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтворител/носител. При тестването на вещества, нестабилни във вода, използваните органични разтворители не следва да съдържат вода. Водата може да се отстрани чрез добавянето на молекулно сито.
1.4.2.2. Концентрации на експозиция Измежду критериите, които следва да се имат предвид при определянето на най-високите концентрации, са цитотоксичността, разтворимостта в тестовата система и промените в рН или осмотичното налягане. Цитотоксичността следва да се определи със и без метаболична активация в главния експеримент, като се използва подходяща индикация на клетъчната цялост и растеж като относителна ефективност на клониране (оцеляване) или относителен общ растеж. Може би ще е полезно да се определи цитотоксичността и разтворимостта в предварителен експеримент. Следва да се използват най-малко четири анализируеми концентрации. Там, където се среща цитотоксичност, тези концентрации следва да покриват обхват от максимална до слаба токсичност или липса на токсичност; това обикновено означава, че концентрациите следва да се различават с коефициент не повече от 2 до √10. Ако максималната концентрация е базирана на цитотоксичност, то резултатът следва да е приблизително 10—20 % (но не по-малко от 10 %) относително оцеляване (относителна ефективност на клониране) или относителен общ растеж. За относително нецитотоксични вещества, максималната тестова концентрация следва да е 5 mg/ml, 5 μl/ml, или 1,01 М, в зависимост от това коя е най-ниска. Относително неразтворимите вещества следва да се тестват до или над границата им на разтворимост при условията на отглеждане на културата. Доказателствата за неразтворимост следва се определят в последната среда на третиране, на която са експонирани клетките. може да бъде да се определи разтворимостта в началото и края на третирането, тъй като тя може да се промени в течение на експонирането в тестваната система поради присъствието на клетки, 89, серум и др. Неразтворимостта може да се установи с просто око. Утайката не следва да пречи на отчитането.
1.4.2.3. Контроли Паралелни положителни и отрицателни (разтворител или носител) контроли, както със, така и без метаболична активация, следва да се включат във всеки експеримент. Когато се използва метаболична активация, химикалът за положителните контроли следва да е от такъв вид, че да изисква активация, за да произведе мутагенна реакция. Примерите за положителни контролни вещества включват: Състояние на метаболична активация Локус Вещество САS № Einecs № Отсъствие на екзогенна метаболична активация НРRТ Етил метансулфонат 62-50-0 200-536-7 Етил нитрозокарбамид 759-73-9 212-072-2 ТК (малки и големи колонии) Метил метансулфонат 66-27-3 200-625-0 ХРRТ Етил метансулфонат 62-50-0 200-536-7 Етил нитрозокарбамид 759-73-9 212-072-2 Наличие на екзогенна метаболична активация НРRТ 3-метилхолантрен 56-49-5 200-276-4 ]N-нитрозодиметиламин 62-75-9 200-549-8 7,12-диметилбензантрацен 57-97-6 200-359-5 ТК (малки и големи колонии) Циклофосфамид 50-18-0 200-015-4 Циклофосфамид монохидрат 6055-19-2 Бензо[а]пирен 50-32-8 200-028-5 3-метилхолантрен 56-49-5 200-276-5 XPRT N-нитрозодиметиламин (за високи нива на S-9) 62-75-9 200-549-8 Бензо[а]пирен 50-32-8 200-028-5 Могат да се използват други подходящи референтни вещества за положителни контроли, напр. ако една лаборатория има база данни от предишни изследвания за 5-бромо 2'-деоксиуридин (CAS № 59-14-3, EINECS № 200-415-9), това рефрентно вещество би могло също да се използва. Следва да се има предвид използването на химикали за положителна контрола, принадлежащи към химичен клас, когато такива са налични. Следва да се включат отрицателните контроли, състоящи се само от разтворител или носител в средата за третиране и третирани по същия начин както опитните групи. В допълнение към това следва също да се използват нетретирани контроли, освен ако няма контролни данни от предишни изследвания, показващи, че избраният разтворител не причинява делеционни или мутагенни ефекти.
1.4.3. Процедура
1.4.3.
1.4.3.1. Третиране с тестваното вещество Пролифериращи клетки се експонират на въздействието на тестваното вещество както със, така и без метаболична активация. Експозицията следва да е за подходящ период от време (обикновено 3—6 часа е ефективният период). Времето на експозиция може да обхване един или повече клетъчни цикли. За всяка тествана концентрация може да се използват две или една третирана култура. Когато се използва по една култура, броят на концентрациите следва да се увеличи, за да се осигури адекватен брой култури за анализ (напр. най-малко осем анализируеми концентрации). Отрицателните (разтворител) контролни култури следва да са две. Газообразните или летливи вещества следва да се тестват чрез подходящи методи, като например в запечатани носители на културата (21) (22).
1.4.3.2. Измерване на оцеляването, жизнеспособността и честотата на мутантите В края на периода на експозиция клетките се промиват и култивират, за да се определи оцеляването и да се даде възможност за изразяване на мутантния фенотип. Измерването на цитотоксичността чрез определяне на относителната ефективност на клониране (оцеляване) или относителния общ растеж на културите обикновено започва след периода на третиране. Всеки локус изисква точно определено минимално време за почти оптимално изразяване на фенотипа на новоиндуцираните мутанти (HPRT и XPRT изискват поне 6—8 дни, а ТК — поне два дни). Клетките се отглеждат в среда със и без селективен(и) агент(и) за определяне на бройките мутанти и съответно на ефективността на клониране. Измерването на жизнеспособността (използвано за изчисляване на честотата на мутантите) започва в края на времето на изразяване чрез култивиране в блюдо в неселективна среда. Ако тестваното вещество е положително в теста L5178Y ТК+/-, сортирането на колониите следва да се извърши поне на една от тестваните култури (най-високата положителна концентрация) и на отрицателните и положителните контроли. Ако тестваното вещество е отрицателно в теста L5178Y ТК+/-, сортирането на колониите следва да се извърши на отрицателните и положителните контроли. В изследвания, използващи ТК6ТК+/-, може също да се направи сортиране на колониите.
2. ДАННИ
2.
2.1. ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ Данните следва да обхващат цитотоксичността и жизнеспособността, броя на колониите и честотите на мутантите за третираните и контролни култури. В случай на положителна реакция в теста L5178Y ТК+/- колониите се отчитат, като се използват критериите за малки и големи колонии при поне една концентрация на тестваното вещество (най-високата положителна концентрация) и на отрицателните и положителните контроли. Молекулното и цитогенетичното естество на мутантите както от големите, така и от малките колонии е изследвано в детайли (23) (24). В теста ТК+/- колониите се отчитат с помощта на критериите за колонии с нормален растеж (големи) и бавен растеж (малки) (25). Мутантните клетки, претърпели най-обширното генетично увреждане, имат удължени времена за удвояване и поради това образуват малки колонии. Това увреждане типично варира по мащаб от загубите на целия ген до кариотипно видими хромозомни аберации. Индуцирането на мутанти на малки колонии се свързва с химикали, индуциращи едри хромозомни аберации (26). По-малко засегнатите мутантни клетки растат с темпове, подобни на тези на родителските клетки и формират големи колонии. Следва да се посочи оцеляването (относителни ефективности на клониране) или относителният общ растеж. Честотата на мутантите следва да се изрази като брой на мутиралите клетки спрямо броя на оцеляващите клетки. Посочват се данните за отделните култури. Освен това всички данни се резюмират в таблица. Няма изискване за потвърждаване на ясна положителна реакция. Двузначните резултати следва да се изяснят чрез допълнително тестване, като за предпочитане е да бъдат изменени условията на извършване на опита. Отрицателните резултати следва да се потвърдят за всеки случай поотделно. В случаите, когато не се смята необходимо потвърждаването на отрицателни резултати, следва да се даде обосновка. Няма изискване за потвърждаване на ясна положителна реакция. Следва да се предвиди изменение в параметрите на изследване, за да се разширят условията, при които се прави оценка, при последващи опити или двузначните или отрицателните резултати. Параметрите на изследването, които биха могли да се изменят, обхващат границите на концентрацията и условията на метаболична активация.
2.2. ОЦЕНКА И ТЪЛКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Има няколко критерия за определяне на положителен резултат, като например увеличение, свързано с концентрацията, или репродуцируемо увеличение на честотата на мутантите. Първо следва да се разгледа биологичната значимост на резултатите. При оценката на резултатите от теста биха могли да се използват статистически методи. Статистическата значимост не следва да е единственият решаващ фактор за положителна реакция. Тествано вещество, за което резултатите не удовлетворяват горните критерии, се счита немутагенно в настоящата система. Въпреки че повечето опити дават ясно положителни или отрицателни резултати, в редки случаи наборът данни изключва правенето на категорична преценка за активността на тестваното вещество. Резултатите могат да останат двузначни или под въпрос, независимо от това колко пъти е повторен опитът. Положителните резултати от теста in vitro за клетъчни генни мутации при бозайници показват, че тестваното вещество индуцира генни мутации в използваните в теста култивирани клетки на бозайници. Най-значима е положителната реакция на концентрация, която е репродуцируема. Отрицателните резултати показват, че при условията на теста тестваното вещество не предизвиква генни мутации в използваните в теста култивирани клетки на бозайници.
3. ДОКЛАДВАНЕ
3. ДОКЛАД ЗА ТЕСТА
Докладът за теста следва да включва следната информация:
Разтворител/носител:
обосновка за избора на носител,
разтворимост и стабилност на тестваното вещество в разтворител/носител, ако са известни.
Клетки:
тип и източник на клетки,
брой клетъчни култури,
брой клетъчни пасажи, ако е приложим,
методи за поддържане на клетъчна култура, ако е приложимо,
отсъствие на микоплазма.
Условия за провеждане на теста:
основна причина за избора на концентрации и броя на култури, в т.ч. напр. данни за цитотоксичността и граници на разтворимост, ако са налични,
състав на средите, СО2 концентрация,
концентрация на тестваното вещество,
обем на носителя и добавеното тествано вещество,
температура на инкубация,
време на инкубация,
времетраене на третирането,
гъстота на клетките по време на третиране,
тип и състав на системата за метаболична активация, в т.ч. критерии за приемливост,
положителни и отрицателни контроли,
продължителност на периода на изразяване (в т.ч. брой на посетите клетки и субкултури и графици на подхранване, ако са уместни),
селективни агенти,
критерии за приемане на тестовете за положителни, отрицателни или двузначни,
използвани методи за преброяване на жизнеспособните и мутиралите клетки,
кои дефиниции за размера и типа на колониите са взети предвид (в т.ч. критерии за малки и големи колонии, както е уместно).
Резултати:
признаци на токсичност,
признаци на утаяване,
данни за рН и осмотичното налягане по време на експозицията към тестваното вещество, ако са определени,
размер на колониите, ако са отчетени поне за отрицателни и положителни контроли,
адекватност на лабораторията за откриване на мутанти от малки колонии със системата L5178Y ТК+/-, когато е уместно,
взаимоотношение доза-реакция, където е възможно,
статистически анализи, ако има такива,
паралелни отрицателни (разтворител/носител) и положителни контролни данни,
отрицателни (разтворител/носител) и положителни контролни данни от предишни изследвания с обхвати, средни стойности и стандартни отклонения,
честота на мутантите.
Обсъждане на резултатите.
Заключения.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
ПРЕПРАТКИ Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindal, K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E. .Y. and Malling H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306—1312. Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, pp. 467—485. Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394—403. Aaron, C. S., and Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT AssayS: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res. 223, pp. 121—128. Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, pp. 235—239. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, pp. 147—204. Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225—251. Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical AgentS: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17—36. Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C, Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135—141. Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid CellS: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9—17. Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133—147. Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for the L5178Y/TK+/- — TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, w: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239—268. Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, w: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, pp. 66—101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome- Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, pp. 365—373. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, pp. 347—364. Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/ – Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res. 59, pp. 61—108. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173—215. Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, pp. 175—177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85—88. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91—103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795—801. Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51—55. Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C, Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluoronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK+/- — Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161—174. Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res. 229, pp. 89—102. Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- - 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, pp. 609—614.
Б.18. УВРЕЖДАНЕ И РЕПАРАЦИЯ НА ДНК — НЕПЛАНИРАН СИНТЕЗ НА ДНК — КЛЕТКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ (IN VITRO)
Б.18.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Вижте Общо въведение, част Б.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Вижте Общо въведение, част Б.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Изпитването за непланиран синтез на ДНК (UDS) измерва синтеза за репарация на ДНК след изрязване и отстраняване на последователност от ДНК, която съдържа участъка с повреда, предизвикана от химични или физични агенти. Изпитването се базира на включването на маркиран с тритий тимидин 3H-TdR) в ДНК на клетки от бозайници, които не са във фаза S на клетъчния цикъл. Навлизането на 3H-TdR може да бъде определено с помощта на авторадиография или посредством течно сцинтилационно броене (LSC) на ДНК от третираните клетки. Културата на клетките от бозайници, освен ако не се използват първични хепатоцити от плъх, се третира с изпитвания агент със и без екзогенна система за метаболитно активиране. UDS може да се измерва и в in vivo системи.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.6. Подготовка
Изпитваните химически вещества и веществата за сравнение следва да бъдат приготвени в средата за растеж или разтворени или суспендирани в подходящи носители и после да бъдат разредени допълнително в средата за растеж, която се използва при изпитването. Крайната концентрация на носителя не следва да оказва влияние върху жизнеспособността на клетките. При изпитването могат да се използват първични култури от хепатоцити на плъх, човешки лимфоцити или постоянни клетъчни линии (например човешки диплоидни фибробласти). Клетките следва да бъдат подложени на експозиция на изпитваното химическо вещество както в присъствие, така и в отсъствие на подходяща система за метаболитно активиране.
Условия на изпитване
Брой на културите
За всяка експериментална точка са необходими поне две клетъчни култури за авторадиография и шест култури (или по-малко, ако е научно оправдано) за LSC UDS изпитвания.
Използване на положителни и отрицателни контроли
Във всеки експеримент следва да бъдат включени паралелни положителни и отрицателни (нетретирани и/или с носител) контроли със и без метаболитно активиране. Примери за положителни контроли за изследване на хепатоцити от плъх са 7,12-диметилбензантрацен (7,12-DMBA) или 2-ацетиламинофлуорен (2-AAF). При постоянни клетъчни линии пример за положителна контрола е 4-нитроквинолин-N-оксид (4-NQO), както за авторадиографски, така и за LSC изследвания, проведени без метаболитно активиране. N-диметилнитрозаминът представлява пример за положително контролно съединение, когато се използват системи за метаболитно активиране.
Експозиционни концентрации
Следва да се използват множество концентрации на изпитваното вещество в диапазон, който е адекватен за определяне на отговора. Най-високата концентрация следва да предизвиква известни токсични за клетката ефекти. Относително неразтворимите във вода съединения следва да се изпитват до границата на разтворимостта си. За лесно разтворимите във вода нетоксични химически вещества високата концентрация на изпитваните химически вещества следва да се определя за всеки конкретен случай.
Клетки
При поддържане на културите следва да се използват подходящи среди за растеж, концентрация на СО2, температура и влажност. Постоянните клетъчни линии следва да се проверяват периодично за заразяване с Mycoplasma.
Метаболитно активиране
При първични култури от хепатоцити не се използват системи за метаболитно активиране. Постоянните клетъчни линии и лимфоцитите се подлагат на експозиция на изпитваното вещество както в присъствие, така и при липса на подходяща система за метаболитно активиране.
Процедура
Приготвяне на култури
Постоянните клетъчни култури се получават от изходни култури (например чрез трипсинизация или отделяне), посети в съдове за култивиране при подходяща плътност и инкубирани при 37 oС. Краткотрайните култури от хепатоцити на плъх се създават чрез даване възможност на прясно дисоциирани в подходяща среда хепатоцити да се закрепят към растежната повърхност. Култури от човешки хепатоцити се създават с помощта на подходящи техники.
Третиране на културите с изпитваното вещество Първични хепатоцити от плъх
Прясно изолирани хепатоцити от плъх се третират с изпитваното вещество в среда, съдържаща 3H-TdR, в продължение на подходящ по продължителност период от време. В края на третирането от средата се отстраняват клетките, които след това се измиват, фиксират и изсушават. Предметните стъкла се потопяват в авторадиографска емулсия (алтернативено може да се използва филм с отлепващ се слой), експонират се, проявяват се, оцветяват се и се преброяват.
Постоянни клетъчни линии и лимфоцити
Авторадиографски техники: Клетъчните култури се подлагат на експозиция на изпитваното вещество за периоди с подходяща продължителност, последвани от третиране с 3H-TdR. Времената зависят от естеството на веществото, активността на метаболизиращите системи и типа клетки. За да се открият пиковете на UDS, 3H-TdR следва да бъде добавен едновременно с изпитваното вещество или в рамките на няколко минути след експозицията на изпитваното вещество. Изборът между тези две процедури ще зависи от възможните взаимодействия между изпитваното вещество и 3H-TdR. За да се направи разлика между UDS и полуконсервативната репликация на ДНК, последната следва да бъде потисната, например чрез използване на среда с дефицит на аргинин, ниско съдържание на серум или чрез хидроксиурея към средата за култивиране. LSC измервания на UDS: Преди третиране с изпитваното вещество навлизането на клетки в S- фазата следва да бъде блокирано, както е описано по-горе. След това клетките следва да бъдат подложени на експозиция на изпитваното химическо вещество, както е описано при авторадиографията. В края на инкубирането ДНК следва да бъде извлечена от клетките и следва да се определят общото съдържание на ДНК и степента на включване на 3H-TdR. Следва да се отбележи, че когото при горепосочените техники се използват човешки лимфоцити, потискането на полуконсервативната репликация на ДНК в нестимулирани култури не е необходимо.
Анализ
Авторадиографски изследвания
При определяне на UDS в клетки от култура не се броят ядрата във фаза S. Следва да се преброят поне по 50 клетки от всяка концентрация. Преди преброяването предметните стъкла следва да бъдат кодирани. На всяко предметно стъкло следва да се преброят по няколко разделени на голямо разстояние едно от друго случайни полета. Количеството на включения в цитоплазмата 3H-TdR следва да бъде определено посредством преброяване на три цитоплазмени полета с размер колкото ядро от всяка преброена клетка.
Измервания с LSC
При всяка концентрация и при контролите за изследване на непланирания синтез на ДНК чрез измервания с LSC следва да се използва адекватен брой култури. Всички резултати следва да бъдат потвърдени в независим експеримент.
2. ДАННИ Данните следва да бъдат представени в табличен вид.
2.
2.1. АВТОРАДИОГРАФСКИ ИЗСЛЕДВАНИЯ Степента на включване на 3H-TdR в цитоплазмата и броят на гранулите, открити в клетъчното ядро, следва да бъдат регистрирани поотделно. За да се опише разпределението на степента на включване на 3H-TdR в цитоплазмата и броя на гранулите за ядро, може да се използват средната стойност и стойностите на медианата и модата.
2.2. ИЗМЕРВАНИЯ С LSC За измерванията с LSC включването на 3H-TdR следва да се отчита като dpm/μg ДНК. Средната стойност на dpm/μg ДНК със стандартното отклонение може да се използват за описване на разпределението на включването. Данните следва да бъдат оценени с помощта на подходящи статистически методи.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Ако е възможно, протоколът от изпитването съдържа следната информация:
използваните клетки, плътността и броя на пасажите при третирането, броя на клетъчните култури,
методите, използвани за поддържане на клетъчните култури, включително средата, температурата и концентрациите на СО2,
изпитваното вещество, носителя, концентрациите и обосновката за избор на концентрации, използвани при изпитването,
подробности за системите за метаболитно активиране,
схема на третирането,
положителни и отрицателни контроли,
използваната авторадиографска техника,
процедурите, използвани за блокиране влизането на клетките в S-фаза,
процедурите, използвани за извличане на ДНК и за определяне на общото съдържание на ДНК при измерването с LSC,
когато е възможно, връзката доза/отговор,
статистическа оценка,
обсъждане на резултатите,
интерпретиране на резултатите.
3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТИРАНЕ Вижте Общо въведение част Б.
4. ПРЕПРАТКИ Вижте Общо въведение част Б.
Б.19. ИЗПИТВАНЕ IN VITRO ЗА ОБМЕНИ НА СЕСТРИНСКИ ХРОМАТИДИ
Б.19.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Вижте Общо въведение част Б.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Вижте Общо въведение част Б.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Изпитването за обмени на сестрински хроматиди (SСЕ) представлява краткотрайно изпитване за откриване на реципрочни обмени на ДНК между две сестрински хроматиди в удвояваща се хромозома. SСЕ представляват обмена на продукти от репликацията на ДНК в предполагаеми хомоложни локуси. Предполага се, че процесът на обмен включва разкъсване и след това повторно съединяване на ДНК, въпреки че е известно малко за молекулната му основа. Откриването на SСЕ изисква средство за диференциално маркиране на сестринските хроматиди и това може да бъде постигнато посредством включване на бромодеоксиуридин (BrdU) за два клетъчни цикъла в хромозомната ДНК. Клетките на бозайниците се подлагат in vitro на експозиция на изпитваното химическо вещество със и без екзогенна система за метаболитно активиране на при бозайници, ако е необходимо, и се култивират в продължение на два цикъла на репликация в среда, съдържаща BrdU. След третиране на клетките със средство, потискащо делителното вретено (например колхицин), за да се натрупат клетки в подобен на метафаза етап от митозата (с-метафаза), те се отлепват и от хромозомите се приготвят препарати.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
При изпитването могат да се използват първични култури, (човешки лимфоцити) или постоянни клетъчни линии (например яйчникови клетки от китайски хамстер). Клетъчните линии трябва да се проверяват за заразяване с Мусорlаsта.
Трябва да се използват подходящи среди за култивиране и условия за инкубиране (т.е. температура, съдове за култивиране, концентрации на СО2 и влажност).
Изпитваните вещества могат да бъдат приготвени в средите за култивиране или да бъдат разтворени или суспендирани в подходящи носители преди третирането на клетките. Крайната концентрация на носителя в системата за култивиране не трябва да оказва значително влияние върху жизнеспособността или скоростта на растеж на клетките и ефектите върху честотата на обмена на сестрински хроматиди трябва да бъде мониториран посредством контрол за разтворителя.
Клетките трябва да бъдат подложени на експозиция на изпитваното вещество както в присъствие, така и в отсъствие на екзогенна система за метаболитно активиране при бозайници. Алтернативно, когато се използват клетки с вътрешна метаболитна активност, скоростта и естеството на активността трябва да бъдат подходящи за изпитвания клас химически вещества.
1.6. Условия на изпитване
Брой на културите
За всяка експериментална точка трябва да се използват най-малко по две култури.
Използване на положителни и отрицателни контроли
Във всеки експеримент трябва да бъдат включени положителни контроли, като се използва както пряко действащо съединение, така и съединение, което изисква метаболитно активиране. Трябва да се използват и контроли за носителя. Следват примери за вещества, които могат да бъдат използвани като положителни контроли: Когато е целесъобразно, може да се включи допълнителна положителна контрола със същия клас химически вещества, както изпитваното.
съединение с пряко действие:
етилметансулфонат,
съединение с непряко действие:
циклофосфамид.
Експозиционни концентрации
Трябва да се използват поне три концентрации, които са адекватно разделени една от друга. Най-високата концентрация трябва да предизвиква значителен токсичен ефект, но все пак трябва да дава възможност за осъществяването на адекватна клетъчна репликация. Относително неразтворимите във вода вещества трябва да се изследват до границата на разтворимостта си, като се използват подходящи процедури. За лесно разтворимите във вода нетоксични вещества високата изпитвана концентрация трябва да се определя за всеки конкретен случай.
Процедура
Приготвяне на култури
Постоянните клетъчни култури се получават от изходни култури (например чрез трипсинизиране или отделяне), посети в съдове за култивиране при подходяща плътност и инкубирани при 37 oС. За еднослойните култури броят на клетките за съд за култивиране трябва да бъде коригиран така, че културите да не се сливат над 50 % в момента на отлепват. Алтернативно, клетките могат да бъдат използвани в суспензионна култура. Културите от човешки лимфоцити се получават от хепаринизирана кръв, като се използват подходящи техники и се инкубират при 37 oС.
Третиране
Клетките в експоненциален стадий на растеж се подлагат на експозиция на изпитваното вещество за период с подходяща продължителност. В повечето случаи един до два часа могат да бъдат ефективни, но в определени случаи продължителността на третирането може да бъде удължена до два пълни клетъчни цикъла. Клетките без достатъчна вътрешна метаболитна активност трябва да бъдат подложени на експозиция на изпитваното химическо вещество както в присъствие, така и в отсъствие на подходяща система за метаболитно активиране. В края на експозицията клетките се измиват напълно от изпитваното вещество и се култивират в продължение на два цикъла на репликация в присъствието на ВrdU. Като алтернативна процедура клетките могат да бъдат подложени на експозиция едновременно на изпитваното химическо вещество и на ВrdU в продължение на пълното време на култивиране на два клетъчни цикъла. Културите от човешки лимфоцити се третират, когато се намират в полусинхронно състояние Клетките се анализират при второто им деление след третирането, като най-чувствителните етапи от клетъчния цикъл трябва да бъдат подложени на експозиция на химическото вещество. С всички култури, към които се добавя ВrdU, трябва да се работи на тъмно или при матова светлина от лампи с нажежени жички до отлепването на клетките, за да се намали до минимум фотолизата на съдържащата ВrdU ДНК.
Отлепване на клетки
Клетъчните култури се третират с инхибитори на делителното вретено (например колхицин) един до четири часа преди отлепването. Всяка култура се отлепва и обработва поотделно за приготвяне на хромозоми.
Приготвяне и оцветяване на хромозоми
Хромозомните препарати се приготвят с помощта на стандартни цитогенетични техники. Оцветяването на предметните стъкла, за да се демонстрират SCEs може да се направи с помощта на няколко техники (например метод с флуоресценция плюс Giemsa).
Анализ
Броят на анализираните клетки трябва да се базира на спонтанната честота на SСЕ в контролата. Обикновено за SСЕs се анализират най-малко 25 добре разгърнати метафази за култура. Преди анализа предметните стъкла се кодират. При човешки лимфоцити се анализират само метафази, които съдържат 46 центромера. При постоянни клетъчни линии се анализират само метафази, които съдържат ± 2 от модалния брой. Трябва да се посочи дали центромерното превключване на маркера се брои за SСЕ или не. Резултатите трябва да бъдат потвърдени в независим експеримент.
2. ДАННИ Данните трябва да бъдат представени в табличен вид. За всички третирани и контролни култури поотделно трябва да се дадат броят на обмените на сестрински хроматиди във всяка метафаза и броят на обмените на сестрински хроматиди за хромозома във всяка метафаза. Данните трябва да бъдат оценени с помощта на подходящи статистически методи.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Ако е възможно, протоколът от изпитването съдържа следната информация:
използваните клетки, методите за поддържане на клетъчната култура,
условия на изпитване: състав на средите, концентрация на СО2, концентрация на изпитваното вещество, използван носител, температура на инкубиране, продължителност на третирането, използван инхибитор на делителното вретено, неговата концентрация и продължителността на третирането с него, тип на използваната система за метаболитно активиране, положителни и отрицателни контроли,
брой на клетъчните култури за една експериментална точка,
подробности за техниката, използвана за приготвяне на предметни стъкла,
брой на анализираните метафази (данните се дават поотделно за всяка култура),
среден брой SСЕ за клетка и за хромозома (данните се дават поотделно за всяка култура),
критерии за отчитане на SСЕ,
обосновка за избора на доза,
когато е необходимо, връзката доза/отговор,
статистическа оценка,
обсъждане на резултатите,
интерпретиране на резултатите.
3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТИРАНЕ Вижте Общо въведение част Б.
4. ПРЕПРАТКИ Вижте Общо въведение част Б.
Б.20. ИЗПИТВАНЕ ЗА ПОЛОВО СВЪРЗАНА РЕЦЕСИВНА ЛЕТАЛНОСТ ПРИ DROSOPHILA MELANOGASTER
Б.20.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Вижте Общо въведение част Б.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Вижте Общо въведение част Б.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма.
1.4. ПРИНЦИПИ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Изпитването за полово свързана леталност (SLRL) при Drosophila те1апоgaster открива появата на мутации, точкови мутации и малки делеции в зародишната линия на насекомото. Това изпитване представлява метод за изследване за прави мутации, с който може да се направи пресяващо изпитване за мутации при около 800 локуса в X-хромозомата, като това представлява около 80 % от всички локуси в Х-хромозомата. X-хромозомата представлява около една пета от целия хаплоиден геном. Мутациите в Х-хромозомата на Drosophila те1апоgaster са фенотипно изявени при мъжките индивиди, които са носители на мутантния ген. Когато мутацията е летална в хомозиготно състояние, за присъствието ѝ се съди по липсата на единия от двата класа мъжко потомство, които нормално се получават от хетерозиготно женско насекомо. При изпитването SLRL се използват тези факти с помощта на специално маркирани и подредени хромозоми.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.6. Подготовка
Източници
Могат да се използват мъжки насекоми от добре дефинирани източници на насекоми от див тип и женски от източник на вида Muller-5. Могат да се използват и други съответно маркирани източници на женски насекоми с множество инвертирани Х-хромозоми.
Изпитвано вещество
Изпитваните вещества трябва да бъдат разтворени във вода. Веществата, които са неразтворими във вода, могат да бъдат разтворени или суспендирани в подходящи носители (например смес от етанол и Тween-60 или 80), а след това да бъдат разтворени във вода или физиологичен разтвор преди прилагането. Трябва да се избягва използването на диметилсулфоксид като носител.
Брой на животните
Изпитването трябва да бъде проектирано с предварително определена чувствителност и възможности. Наблюдаваната честота на спонтанните мутации при съответната контрола ще окаже силно влияние върху броя на третираните хромозоми, които трябва да бъдат анализирани.
Начин на прилагане
Експозицията може да бъде орална, чрез инжектиране или чрез експозиция на газове или пари. Подхранване с изпитваното вещество може да се направи със захарен разтвор. Когато е необходимо, веществата могат да бъдат разтворени в 0,7 % разтвор на NaCl и да бъдат инжектирани в гръдния кош или корема.
Използване на отрицателни и положителни контроли
Трябва да бъдат включени отрицателни (за носителя) и положителни контроли. Обаче ако съществуват подходящи исторически контролни данни, паралелни контроли не са необходими.
Нива на експозиция
Трябва да се използват три нива на експозиция. За предварителна оценка може да се използва едно ниво на експозиция на изпитваното вещество, като това ниво представлява максималната поносима концентрация или нивото, което води до някакви признаци на токсичност. За нетоксичните вещества, трябва да се използва експозиция на максималната възможна концентрация.
Процедура
Мъжките насекоми див тип (на възраст три до пет дни) се третират с изпитваното вещество и се чифтосват поотделно с по-голям брой девствени женски насекоми от вида Muller-5 или от друг подходящо маркиран (с множество инвертирани Х-хромозоми) вид. Женските се заместват с нови девствени женски насекоми на всеки два до три дни, за да се покрие целият цикъл на зародишните клетки. Потомството на тези женски се оценява за леталност, съответстваща на ефектите върху зрялата сперма, сперматидите от средна или късна фаза, ранните сперматиди, сперматоцитите и сперматогониите по време на третирането. Хетерозиготните женски насекоми от поколението F1 от горните кръстосвания се чифтосват поотделно (т.е. една женска за флакон) със своите братя. В поколението F2 всяка култура се отчита за липса на мъжки насекоми от див тип . Ако изглежда, че една култура е възникнала от женско насекомо от поколение F1, което носи летален признак в родителската Х-хромозома (т.е. не се наблюдават мъжки насекоми с третираната хромозома), дъщерите на тази женска със същия генотип трябва да бъдат изследвани, за да се уверим, че леталният признак се повтаря в следващото поколение.
2. ДАННИ Данните трябва да бъдат представени в табличен вид, за да бъде показан броят на изследваните Х-хромозоми, броят на безплодните мъжки насекоми и броят на хромозомите с летален признак при всяка експозиционна концентрация и за всяко чифтосване на всяко третирано мъжко насекомо. Трябва да бъде даден броят на клъстерите. Тези резултати трябва да бъдат потвърдени в отделен експеримент. За оценка на изпитванията за полово свързана леталност трябва да се използват подходящи статистически методи. Образуването на клъстери от рецесивни летални признаци, произхождащи от едно мъжко насекомо, трябва да се вземат предвид и да се оценят с подходящ статистически метод.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Ако е възможно, протоколът от изпитването съдържа следната информация:
източник: използваните източници/видове и породи Drosophila, възрастта на насекомите, броят на третираните мъжки насекоми, броят на стерилните мъжки насекоми, броят на постоянните култури от поколение F2, броят на културите F2 без потомство, броят на хромозомите, носещи летален признак, открити на всеки стадий от развитието на зародишните клетки,
критериите за определяне размера на третираните групи,
условия на изпитване: подробно описание на схемата за третиране и вземане на проби, нивата на експозиция, данните за токсичността, ако е необходимо, отрицателните (за разтворителя) и положителните контроли,
критерии за отчитане на леталните мутации,
връзката контакт/ефект, когато е възможно,
оценка на данните,
обсъждане на резултатите,
интерпретиране на резултатите.
3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТИРАНЕ Вижте Общо въведение част Б.
4. ПРЕПРАТКИ Вижте Общо въведение част Б.
Б.21. ИЗПИТВАНИЯ IN VITRO ЗА ТРАНСФОРМАЦИИ В КЛЕТКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ
Б.21.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Вижте Общо въведение част Б.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Вижте Общо въведение част Б.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ За откриване на фенотипни изменения in vitro, предизвикани от химични вещества, свързани с in vivo злокачествена трансформация, могат да бъдат използвани системи за култивиране на клетки от бозайници. Често използваните клетки са СЗН10T1/2, 3Т3, SНЕ, плъх на Fisher и при изпитванията се разчита на измененията в клетъчната морфология, образуването на огнища и закрепването в полутвърд агар. Съществуват по-рядко използвани системи, които откриват други физиологични и морфологични изменения в клетките след експозиция на канцерогенни химически вещества. Никоя от изпитваните in vitro крайни точки няма установена механистична връзка с рака. Някои от изпитваните системи могат да долавят туморни промотори. Клетъчната токсичност може да се определя чрез измерване на ефекта на изпитвания материал върху способността за образуване на колонии (ефективност на клониране) или скоростта на растеж на културите. За да се измери клетъчната токсичност, трябва да се установи дали експозицията на изпитваното химическо вещество е свързано с токсикологични ефекти, но не може да се използва за изчисляване на честотата на трансформациите при всички изпитвания, защото някои могат да включват продължително инкубиране и/или повторно посяване/пресяване.
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.6. Подготовка
Клетки
В зависимост от използваното трансформационно изпитване съществуват разнообразни клетъчни линии или първични клетки. Изследователят трябва да бъде сигурен, че всички клетки при провежданото изпитване демонстрират подходящи фенотипни изменения след експозиция на известни канцерогени и че изпитването в лабораторията на изследователя е с доказана и документирана валидност и надеждност.
Среда
Трябва да е използват среди и експериментални условия, които са подходящи за използваното трансформационно изпитване.
Изпитвано вещество
Изпитваните вещества могат да бъдат приготвени в средите за култивиране или да бъдат разтворени или суспендирани в подходящи носители преди третирането на клетките. Крайната концентрация на носителя в системата за култивиране не трябва да оказва влияние върху жизнеспособността, скоростта на растеж на клетките или честотата на трансформациите.
Метаболитно активиране
Клетките трябва да бъдат подложени на експозиция на изпитваното вещество както в присъствие, така и в отсъствие на подходяща система за метаболитно активиране. Алтернативно, когато се използват клетки, които притежават вътрешна метаболитна активност, трябва да бъде известно, че естеството на активността е подходящо за изпитвания клас химически вещества.
Условия на изпитване
Използване на отрицателни и положителни контроли
Във всеки експеримент трябва да бъдат включени положителни контроли, като се използва както пряко действащо съединение, така и съединение, което изисква метаболитно активиране. Трябва да се използват и отрицателни контроли (за носителя). Следват примери за вещества, които могат да бъдат използвани като положителни контроли: Когато е целесъобразно, трябва да се включи допълнителна положителна контрола със същия химически клас, както изпитваното съединение.
Пряко действащи химически вещества:
етилметансулфонат,
β-пропиолактон,
Съединения, изискващи метаболитно активиране:
2-ацетиламинофлуорен,
4-диметиламиноазобензен,
7,12-диметилбензантрацен.
Експозиционни концентрации
Трябва да се използват няколко концентрации на изпитваното вещество. Тези концентрации трябва да предизвикат токсичен ефект, свързан с концентрацията, като най-високата концентрация води до ниско ниво на преживяемост, а преживяемостта при най-ниската концентрация е приблизително същата, както при отрицателната контрола. Относително неразтворимите във вода вещества трябва да се изпитват до границата на разтворимостта им, като се използват подходящи процедури. За лесно разтворимите във вода нетоксични вещества високата изпитвана концентрация трябва да се определя за всеки конкретен случай.
Процедура
Клетките трябва да бъдат подложени на експозиция с подходяща продължителност в зависимост от използваната експериментална система, а това може да включва повторно дозиране, придружено с промяна на средата (и, ако е необходимо, прясна смес за метаболитно активиране), ако експозицията е продължителна. Клетките без достатъчна вътрешна метаболитна активност трябва да бъдат подложени на експозиция на изпитваното вещество както в присъствие, така и в отсъствие на подходяща система за метаболитно активиране. В края на експозицията клетките се промиват напълно от изпитваното вещество и се култивират при условия, които са подходящи за появата на трансформирания фенотип, който се мониторира, и се определя честотата на трансформацията. Всички резултати се потвърждават в независим експеримент.
2. ДАННИ Данните следва да бъдат представени в табличен вид и могат да бъдат в различна форма според използваното изпитване, например брой на петриевите панички, положителни петриеви панички или брой на трансформираните клетки. Когато е целесъобразно, преживяемостта следва да се изрази като процент от контролните нива, а честотата на трансформациите да се изрази за брой преживели клетки. Данните следва да бъдат оценени с помощта на подходящи статистически методи.
3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
3.
3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО Ако е възможно, протоколът от изпитването съдържа следната информация:
използван тип клетки, брой на клетъчните култури, методи за поддържане на клетъчните култури,
условия на изпитване, концентрация на изпитваното вещество, използван носител, времето на инкубиране, продължителност и честота на третирането, плътност на клетките по време на третирането, тип на използваната екзогенна система за метаболитно активиране, положителни и отрицателни контролни групи, спецификация на мониторирания фенотип, използвана селективна система (ако е необходимо), обосновка за избор на дозата,
използван метод за пресмятане броя на жизнеспособните и трансформираните клетки,
статистическа оценка,
обсъждане на резултатите,
интерпретиране на резултатите,
3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТИРАНЕ Вижте Общо въведение, част Б.
4. ПОЗОВАВАНИЯ Вижте Общо въведение, част Б.
Б.22.
1. МЕТОД
1.
1.1. ВЪВЕДЕНИЕ Вижте Общо въведение, част Б.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Вижте Общо въведение, част Б.
1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ Няма.
1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Доминантната леталност предизвиква ембрионална или фетална смърт. Предизвикването на доминантна леталност чрез контакт с химично вещество показва, че веществото е оказало влияние върху зародишната тъкан на изпитвания вид. Общоприето е, че доминантната леталност се дължи на увреждане на хромозомите (структурни или бройни аномалии). Ембрионалната смърт, ако женските индивиди са третирани, може да бъде и в резултат на токсични ефекти. Обикновено мъжките животни се подлагат на експозиция на изпитваното съединение и се чифтосват с нетретирани девствени женски индивиди. Различните стадии на развитието на зародишните клетки могат да бъдат изпитвани поотделно с помощта на последователни чифтосвания. Нарастването на броя на мъртвите имплантирани зародиши за женски индивид в третираната група в сравнение с броя на мъртвите имплантирани зародиши за женски индивид в контролната група отразява постимплантационната загуба. Предимплантационната загуба може да бъде оценена въз основа на броя на жълтите тела или чрез сравняване на общия брой имплантирани зародиши за женски индивид в третираната и контролната група. Общата доминантна леталност представлява сумата от пред- и постимплантационната загуба. Изчисляването на общата доминантна леталност става чрез сравняване на броя живи имплантирани зародиши за женски индивид в експерименталната група и броя на живите имплантирани зародиши за женски индивид в контролната група. Намаляването на броя на имплантираните зародиши през определени интервали може да се дължи на убиване на клетки (т.е. на сперматоцити и/или сперматоонии).
1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО Няма.
1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
1.6. Подготовка
Когато е възможно, изпитваните вещества следва да бъдат разтворени или суспендирани в изотоничен физиологичен разтвор. Неразтворимите във вода химически вещества могат да бъдат разтворени или суспендирани в подходящи носители. Използваният носител не следва да оказва влияние върху изпитваното химическо вещество, нито да предизвиква токсични ефекти. Следва да се използват прясно приготвени препарати от изпитваните химически вещества.
Условия на изпитване
Начин на прилагане
Обикновено изпитваното съединение следва да се приложи еднократно. Въз основа на токсикологичната информация може да се използва схема за многократно третиране. Обичайните начини на прилагане са чрез орално интубиране или интраперитонеално инжектиране. Може да са целесъобразни други начини на прилагане.
Експериментални животни
Като експериментални видове се препоръчват плъхове или мишки. Здрави, напълно полово съзрели животни се избират по случаен признак и се разпределят в третирана и контролна група.
Брой и пол
Следва да се използва адекватен брой третирани мъжки индивиди, като се вземат предвид спонтанните колебания в оценяваната биологична характеристика. Избраният брой следва да се базира на предварително определената чувствителност на откриването и възможностите. Например при типично изпитване броят на мъжките индивиди във всяка дозирана група следва да бъде достатъчен, за да се осигурят между 30 и 50 бременни женски индивиди за чифтосване.
Използване на отрицателни и положителни контроли
Обикновено във всеки експеримент следва да се включат паралелни положителни и отрицателни (за носителя) контроли. Когато съществуват приемливи положителни контролни резултати от наскоро проведени в същата лаборатория експерименти, тези резултати могат да бъдат използвани вместо паралелна положителна контрола. Положителните контролни вещества следва да се използват при подходяща ниска доза (например метил метансулфонат (ММS) интраперитонеално в доза 10 mg/kg), за да се демонстрира чувствителността на изпитването.
Нива на дозиране
Нормално следва да се използват три нива на дозиране. Високата доза следва да предизвиква признаци на токсичност или намалена плодовитост при третираните животни. В определени случаи може да е достатъчно едно-единствено ниво на дозиране.
Гранично изпитване
Нетоксичните вещества следва да бъдат изпитвани при 5 g/kg при еднократно прилагане и при 1 g/kg на ден при многократно прилагане.
Процедура
Съществуват няколко схеми за третиране. Най-широко се прилага еднократното прилагане на изпитваното вещество. Могат да се използват други схеми за третиране. Отделните мъжки индивиди се чифтосват последователно с едно или две нетретирани девствени женски животни на подходящи интервали след третирането. Женските индивиди следва да бъдат оставени с мъжките животни в продължение поне на един цикъл на разгонване или докато се осъществи чифтосване, което се определя по наличието на сперма във влагалището или на вагинална запушалка. Броят на чифтосванията след третирането зависи от схемата на третиране и следва да осигури вземане на проби от всички стадии на развитие на зародишните клетки. Женските индивиди се пожертват през втората половина на бременността и съдържанието на матката се изследва, за да се определи броят на мъртвите и живите имплантирани зародиши. Могат да се изследват яйчниците, за да се определи броят на жълтите тела.
2. ДАННИ Данните следва да бъдат представени в табличен вид, за да покажат броя на мъжките индивиди, броя на бременните женски и броя на женските животни, които не са бременни. Поотделно следва да се отчетат резултатите от всяко чифтосване, включително идентичността на всеки мъжки и женски индивид. За всеки женски индивид следва да се регистрират седмицата на чифтосването, нивото на дозиране, получено от мъжките, честотата на живите имплантирани зародиши и на мъртвите имплантирани зародиши. Изчисляването на общата доминантна леталност се базира на сравняване на броя живи имплантирани зародиши за женски индивид в експерименталната група към броя на живите имплантирани зародиши за женски индивид в контролната група. Анализира се съотношението на живите към мъртвите имплантирани зародиши от третираната група, сравнено със същото съотношение от контролната група, за да се отбележи постимплантационната загуба. Данните се регистрират като ранни и късни смъртни случаи, като от таблиците това следва да става ясно. Ако се оценява предимплантационната загуба, тя следва да бъде съобщена. Предимплантационната загуба може да бъде изчислена като несъответствие между броя на жълтите тела и броя на имплантираните зародиши или като намаляване на средния брой имплантирани зародиши за матка в сравнение с контролните чифтосвания. Данните се оценяват с помощта на подходящи статистически методи.
вид, порода, възраст и тегло на използваните животни, броя на животните от всеки пол в експерименталната и контролната група,
изпитваното вещество, носителя, изследваните нива на дозиране и обосновката за избор на доза, отрицателните и положителните контроли, данните за токсичността,
начина и схемата на третиране,
схемата на чифтосване,
използвания метод за определяне дали е осъществено чифтосване,
времето на пожертване,
критериите за отчитане на доминантната леталност,
когато е необходимо, връзката доза/отговор,
статистическа оценка,
3217 more provisions are not shown here; each has its own address.