Kommissionens forordning (EF) Nr. 440/2008 af 30. maj 2008 om fastlæggelse af forsøgsmetoder i henhold til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) Nr. 1907/2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH) (EØS-relevant tekst)
Karakter B
afledt af udgiverens opmærkning. En karakter siger, hvordan et dokuments struktur er hentet, ikke hvor pålidelig loven er.
Adresse https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/da
Indhold
- Indledning
- ANNEX
- BILAG DEL A: METODER TIL BESTEMMELSE AF FYSISK/KEMISKE EGENSKABER
- A.1.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.4.4.
- 1.5. TABEL: METODERNES ANVENDELIGHED A. B. C. D.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.1.1.
- 1.6.1.2. Apparat:
- 1.6.2.
- 1.6.4.
- 4.(1)(2)(3)(4)
- A.2.
- 1.
- 1.4.
- 1.5. Tabel 1 Sammenligning af metoderne
- 1.6.
- 1.6.4.
- 1.6.6.
- 2. Tabel 2 Temperaturkorrektionsfaktorer fT
- A.3.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Metodernes anvendelighed
- 3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2. Metodernes anvendelighed a)
- 3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Metodernes anvendelighed a)
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
- A.4.
- 1.
- 1.4.
- 1.5. Tabel 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Kvalitetskriterier
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.2.
- 1.6.2.2.
- 1.6.4.
- 1.6.4.2.
- 1.6.5.
- 1.6.6.
- 1.6.6.1. Inert gas:
- 1.6.6.2. Klargøring af mætningskolonnen:
- a)
- b)
- 1.6.7.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
- A.5.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.4.
- 1.6.4.1.
- 1.6.4.1.3. Figur Målelegeme
- 1.6.4.2.
- 1.6.4.2.2. Opstilling:
- a)
- b)
- 2. Tabel Korrektion af den målte overfladespænding Kun for vandige opløsninger, p = 1 g/cm3
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)
- A.6.
- 1.
- 1.4.
- 1.5.
- 1.6.
- 1.6.3.
- 1.6.3.2. Testprocedure:
- 1.6.3.3. Apparatur
- 1.6.3.4. Apparatur (se figur 4 og 3)
- 1.6.4.
- 2.
- 3.
- A.8.
- 1.
- 1.3. Rystekolbemetoden
- 1.4.
- 1.5.
- 1.5.1. Rystekolbemetoden
- 1.5.2. Rystekolbemetoden
- 1.5.3. Rystekolbemetoden
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.2.1.
- 1.6.2.3.
- 1.6.3.
- 1.6.3.1. Apparatur
- 1.6.3.2. Beregning af dødtiden to
- 2. Rystekolbemetoden
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
- A.9.
- 1.
- 1.5.
- 1.6.
- 1.6.3.
- 1.6.3.2. Abel apparat:
- A.10.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 3.
- A.11.
- 1.
- 1.6.
- A.12.
- 1.
- 1.3.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.2.
- 1.6.3.
- 1.6.4.
- A.13
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2. a)
- 2.
- A.14.
- 1.
- 1.1. a)
- 1.4.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.2.
- 1.6.2.2. a)
- 1.6.3.
- 1.6.3.2. a)
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)
- A.15.
- 1.
- 1.6.
- A.16.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 4.
- Figur 1 Tegning af 20 mm testterning
- Figur 2 Typisk temperatur/tid-kurve
- A.17.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.2.
- 3.
- 3.2. a)
- A.18.
- 1.
- 1.6.
- 2.
- 2.2.
- 3.(1)(2)(3)(4)
- A.19.
- 1.
- 1.6.
- 2.
- 2.2.
- 3.(1)(2)(3)(4)
- A.20.
- 1.
- 1.5.
- 1.5.4.
- 2.
- 3.
- 3.1.
- A.21.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.1.2.
- 2.
- 2.1. Tabel 1 Eksempler på resultater
- 3.
- 3.2. a)
- 4.(1)
- Fig. 1 Trykbeholder
- Fig. 2 Stativ
- Fig. 3 Tændsystem
- Tillæg Der findes supplerende tekniske oplysninger i nedenstående standarder.
- 1.
- 2.
- 4.
- 1.2. For faste stoffer
- Tillæg 1 Estimeringsmetode
- INDLEDNING
- ESTIMERINGSMETODE
- FREMGANGSMÅDE VED BEREGNINGEN
- RAPPORT
- HENVISNINGER
- Tillæg 2
- Figur 1 Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter den dynamiske metode
- Figur 2a Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter den statiske metode (med U-rørsmanometer)
- Figur 2b Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter den statiske metode (med trykindikator)
- Figur 3 Isoteniskop (se reference 7)
- Figur 4 Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter metoden med damptryksvægt
- Figur 5 Eksempel på apparat til fordampning ved lavt tryk ved effusionsmetoden, med et effusionscellevolumen på 8cm3
- Figur 6a Eksempel på et strømningssystem til bestemmelse af damptryk efter gasmæmingsmetoden
- Figur 6b Eksempel på et system til bestemmelse af damptryk efter gasmætningsmetoden med kapillarrør anbragt efter mætningskammeret
- Figur 7 Eksempel på forsøgsopstilling til metoden med roterende kugle Damptryksapparat
- Figur 8 Eksempel på målehoved med roterende kugle
- Figur 1 Kolonne-eluerings metoden med recirkulationspumpe
- Figur 2 En typisk mikrokolonne
- Figur 3 En typisk mikrokolonne
- Figur 4 Kolonne-eluerings- metoden med niveau beholder
- ESTIMERINGSMETODER Foreløbigt skøn over fordelingskoefficienten
- BEREGNINGSMETODER Princippet bag beregningsmetoderne
- Hanschs π-metode
- Rekkers metode
- Hansch-Leos metode
- Kombineret metode
- i)
- ii)
- iii)
- iv)
- Figur Form og tilbehor til fremstilling af volden
- Figur Apparatur
- Eksempel på materialespecifikation for varmefølsomhedstesting (se DIN 1623) (1)(2)(3)
- Figur 1 Apparat til testing for varmefølsomhed
- Figur 2 Test for varmefølsomed
- Figur 3 Kalibrering af opvarmingshastigeden ved test af varmefølsomed
- Figur 4 Apparat til slagprøvning
- Figur 5 Apparat til friktionsfølsomhed
- Figur Form og tilbehor til fremstilling af provolden
- 1.1.1.1.2.1.3.1.4.
- 3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
- DEL B METODER TIL BESTEMMELSE AF TOKSICITET OG ANDRE SUNDHEDSVIRKNINGER
- GENEREL INDLEDNING A.
- i)
- ii)
- B.1.A.
- 1.
- 1.4.
- 1.5.
- 1.5.3.
- 1.6.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
- B.1.B.
- 1.
- 1.4.
- 1.5.
- 1.6
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
- B.2.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.3. a)
- 3.
- 3.1. a)
- B.3.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.3. Vurdering af toksiciteten hos det modsatte køn
- 3.
- B.4.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 2.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
- Tabel I Erythem og escharadannelse Ødemdannelse KLASSIFICERING AF HUDREAKTIONER
- B.5.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.4.2.3.
- 1.4.2.7.
- 2.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
- Tabel I KLASSIFICERING AF ØJENSKADER
- Cornea
- Iris
- Conjunctivae
- Chemosis
- B.6.
- 1.
- 1.5.
- 1.5.1.
- 1.5.1.2.
- 1.5.1.3.
- 1.5.2.
- 1.5.2.2.
- 1.5.2.3.
- 3. Forsøgsrapport (GPMT og Buehlertest)
- B.7.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.2.
- 1.4.3.
- 3. FORSØGSRAPPORT
- B.8.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.3. a)
- 3.
- 3.1.
- pt_2 a)
- B.9.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.3.
- 3.
- B.10.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.4.3.
- 2.
- 3. TESTRAPPORT
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
- B.11.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.5.
- 2.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
- B.12.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.5.
- 1.5.2. a)
- 2.
- 3. TESTRAPPORT
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
- B.13/14.
- 1.
- 1.5.
- 1.5.1.
- 1.5.2.
- 2.
- 3. TESTRAPPORT
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
- B.15.
- 1.
- 1.6. Forberedelser
- Metabolisk aktivering
- Teststammer
- Medier
- Negative og positive kontroller
- Eksponeringskoncentrationer
- Inkubationsbetingelser
- Spontane mutationsfrekvenser
- Antal parallelle plader
- 3.
- B.16.
- 1.
- 1.6. Forberedelser
- Metabolisk aktivering
- Teststammer
- Medier
- Negative og positive kontroller
- Eksponeringskoncentrationer
- Inkubationsbetingelser
- Spontane mitotiske rekombinationsfrekvenser
- Antal parallelle plader
- 3.
- B.17.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.4.3.
- 2.
- 3. TESTRAPPORT
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
- B.18.
- 1.
- 1.6. Forberedelser
- Antal kulturer
- Negative og positive kontroller
- Eksponeringskoncentrationer
- Celler
- Metabolisk aktivering
- Forberedelse af kulturer
- Eksponering af kulturerne for teststoffet Primærkulturer af rottehepatocytter
- Autoradiografisk måling
- LSC-måling
- 2.
- 3.
- B.19.
- 1.
- 1.6. Forsøgsbetingelser
- Antal kulturer
- Positiv og negativ kontrol
- Eksponeringskoncentrationer
- Dyrkning
- Eksponering
- Høst af celler
- Kromosompræparering og farvning
- Analyse
- 3.
- B.20.
- 1.
- 1.6. Forberedelser
- Stammer
- Teststof
- Antal
- Administrationsmåde
- Negative og positive kontroller
- Eksponeringskoncentrationer
- 3.
- B.21.
- 1.
- 1.6. Forberedelser
- Celler
- Medium
- Teststof
- Metabolisk aktivering
- Positive og negative kontroller
- Eksponeringskoncentrationer
- 3.
- B.22.
- 1.
- 1.6. Forberedelser
- Administrationsmåde
- Forsøgsdyr
- Antal og køn
- Negative og positive kontroller
- Dosisniveauer
- Grænsetest
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,
under henvisning til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 af 18. december 2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH), om oprettelse af et europæisk kemikalieagentur og om ændring af direktiv 1999/45/EF og ophævelse af Rådets forordning (EØF) nr. 793/93 og Kommissionens forordning (EF) nr. 1488/94 samt Rådets direktiv 76/769/EØF og Kommissionens direktiv 91/155/EØF, 93/67/EØF, 93/105/EF og 2000/21/EF, særlig artikel 13, stk. 3, og
ud fra følgende betragtninger:
(1) I henhold til forordning (EF) nr. 1907/2006 skal der på EU-plan fastlægges forsøgsmetoder til undersøgelse af stoffer, hvis forsøg er påkrævet til fremskaffelse af oplysninger om stoffers iboende egenskaber.
(2) I Rådets direktiv 67/548/EØF af 27. juni 1967 om tilnærmelse af lovgivning om klassificering, emballering og etikettering af farlige stoffer indeholder bilag V metoderne til bestemmelse af stoffers og præparaters fysisk-kemiske egenskaber, toksicitet og økotoksicitet. Ved direktiv 2006/121/EF er bilag V til direktiv 67/548/EØF udgået med virkning fra den 1. juni 2008.
(3) Forsøgsmetoderne i bilag V til direktiv 67/548/EØF bør indarbejdes i denne forordning.
(4) Denne forordning udelukker ikke, at der anvendes andre testmetoder, når blot deres anvendelse er i overensstemmelse med artikel 13, stk. 3, i forordning 1907/2006.
(5) Ved udformningen af forsøgsmetoderne bør der i fuldt omfang tages hensyn til principperne om at erstatte, begrænse og raffinere brugen af dyr i procedurer, især når der bliver rådighed over validerede metoder, som kan erstatte, begrænse eller raffinere dyreforsøg.
(6) De i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra det udvalg, der er nedsat ved artikel 133 i forordning (EØF) nr. 1907/2006 —
UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:
Artikel 1
De forsøgsmetoder, der skal anvendes i forbindelse med forordning (EF) nr. 1907/2006, er fastlagt i bilaget til nærværende forordning.
Artikel 2
Kommissionen revurderer efter behov forsøgsmetoderne i denne forordning med henblik på at erstatte, begrænse eller raffinere forsøg med hvirveldyr.
Artikel 3
Alle henvisninger til bilag V til direktiv 67/548/EØF skal betragtes som henvisninger til nærværende forordning.
Artikel 4
Denne forordning træder i kraft dagen efter offentliggørelsen i Den Europæiske Unions Tidende.
Den anvendes fra den 1. juni 2008. Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat. Udfærdiget i Bruxelles, den 30. maj 2008. På Kommissionens vegne Stavros Dimas Medlem af Kommissionen
ANNEX
BILAG DEL A: METODER TIL BESTEMMELSE AF FYSISK/KEMISKE EGENSKABER
A.1. SMELTE-/FRYSEPUNKT
A.1.
1. METODE De fleste af de beskrevne metoder er baseret på OECD-testvejledningen (1). Grundprincipperne er anført i henvisning (2) og (3).
1.
1.1. INDLEDNING De beskrevne metoder og apparater kan anvendes til bestemmelse af smeltepunktet for kemiske stoffer uanset renheden. De beskrevne metoder og apparater kan anvendes til bestemmelse af smeltepunktet for kemiske stoffer uanset renheden. Valg af metode afhænger af arten af det stof, der skal undersøges. Det er således afgørende, om stoffet let, vanskeligt eller slet ikke kan pulveriseres. For nogle stoffer er bestemmelse af fryse- eller størkningspunkt mere hensigtsmæssigt, og der er i denne metode medtaget standarder for sådanne bestemmelser. Hvis det som følge af stoffets særlige egenskaber er umuligt at bestemme nogen af ovenstående parametre, kan det være hensigtsmæssigt at bestemme et flydepunkt.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Smeltepunktet defineres som den temperatur, ved hvilken faseovergangen fra fast til flydende tilstand finder sted ved atmosfæretryk, og denne temperatur svarer i det ideale tilfælde til temperaturen ved frysepunktet. Da faseovergangen for mange stoffer finder sted over et temperaturinterval, beskrives den ofte som smeltepunktsintervallet. Enhedsomregning (K til oC) t = T – 273,15 t er temperaturen i grader celsius ( oC) T er temperaturen i kelvin (K)
1.3. REFERENCESTOFFER Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest bruges til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnået med andre metoder. Der er i henvisningerne (4) angivet nogle referencestoffer.
1.4. METODENS PRINCIP Temperaturen (temperaturintervallet) for faseovergangen fra fast til flydende tilstand eller fra flydende til fast tilstand bestemmes. I praksis bestemmes temperaturen ved begyndende smeltning/frysning og ved endelig smeltning/frysning under opvarmning/afkøling af en prøve af stoffet ved atmosfæretryk. Der er beskrevet fem typer metoder: kapillarmetoder, varmebordsmetoder, frysepunktsbestemmelser, termoanalyse og flydepunktsbestemmelse (som udviklet til mineralolier). Det kan i nogle tilfælde være mere hensigtsmæssigt at bestemme frysepunktet end smeltepunktet.
1.4.
1.4.1. Kapillarmetode
1.4.1.
1.4.1.1. Smeltepunktsapparater med væskebad En lille mængde af det findelte stof fyldes i et kapillarrør og pakkes tæt. Røret opvarmes sammen med et termometer, og temperaturstigningen indstilles til mindre end ca. 1 K/min under den egentlige smeltning. Temperaturen ved begyndende og endelig smeltning bestemmes.
1.4.1.2. Smeltepunktsapparater med metalblok Som beskrevet under 1.4.1.1 bortset fra, at kapillarrøret og termometeret er anbragt i en opvarmet metalblok og kan iagttages gennem huller i blokken.
1.4.1.3. Bestemmelse med fotocelle Prøven i kapillarrøret opvarmes automatisk i en metalcylinder. En lysstråle sendes via et hul i cylinderen gennem stoffet og ind på en nøjagtigt indstillet fotocelle. De fleste stoffers optiske egenskaber ændres under smeltning fra at være uigennemsigtige til gennemsigtige. Derved øges den lysmængde, som når frem til fotocellen, og der sendes et stopsignal til en digitalindikator, som viser temperaturen af et platinmodstandstermometer anbragt i varmekammeret. Denne metode kan ikke anvendes for visse stærkt farvede stoffer.
1.4.2. Varmeborde
1.4.2.
1.4.2.1. Koflers varmebænk Koflers varmebænk består af to elektrisk opvarmede metalstykker med forskellig varmeledningsevne og er udformet sådan, at dens temperaturgradient i længderetningen er næsten lineær. Varmebænken kan spænde over temperaturområdet fra 283 K til 573 K og er forsynet med en særlig anordning til temperaturaflæsning, som består af en skyder med en viser, og en fane, og som er særligt udformet til den enkelte bænk. Smeltepunktet bestemmes ved, at det pågældende stof lægges i et tyndt lag direkte på bænkens overflade, hvorefter der på få sekunder opstår en skarp skillelinje mellem flydende og fast fase. Temperaturen på skillelinjen aflæses ved at indstille viseren på denne.
1.4.2.2. Smeltemikroskop Der anvendes en række varmeborde med mikroskop til smeltepunktsbestemmelser på meget små stofmængder. I de fleste varmeborde måles temperaturen med et følsomt termoelement, men undertiden anvendes også kviksølvtermometre. Et typisk smeltepunktsapparat, bestående af varmebord med mikroskop, er udstyret med et varmekammer indeholdende en metalplade, hvorpå prøven anbringes i en slæde. I midten af metalpladen er der et hul, hvorigennem der kan sendes lys fra mikroskopets belysningsspejl. Når apparatet er i brug, er kammeret lukket med en glasplade for at forhindre luftens adgang til prøven. Opvarmningen af prøven reguleres med en rheostat. Kræves meget nøjagtige målinger kan der for optisk anisotrope stoffer anvendes polariseret lys.
1.4.2.3. Meniskmetoden Denne metode anvendes kun for polyamider. Den temperatur, ved hvilken forskydningen af en silikonoliemenisk, som er indesluttet mellem et varmebord og et dækglas hvilende på polyamid-prøveemnet, iagttages visuelt.
1.4.3. Metode til bestemmelse af frysepunkt Prøven anbringes i en særlig type reagensglas og anbringes i et apparat til bestemmelse af frysepunkt. Prøven afkøles under stadig langsom omrøring, og temperaturen måles med passende mellemrum. Når temperaturen er konstant ved flere aflæsninger, anføres denne temperatur (korrigeret for termometerfejl) som frysepunktet. Underafkøling skal undgås ved, at der opretholdes ligevægt mellem den faste fase og væskefasen.
1.4.4. Termoanalyse
1.4.4.
1.4.4.1. Differential termoanalyse (DTA) Ved denne metode registreres temperaturforskellen mellem stoffet og et referencemateriale som funktion af temperaturen, imedens stoffet og referencematerialet følger samme temperaturprogram. En faseovergang i stoffet ledsaget af en enthalpiændring viser sig ved en endoterm (smeltning) eller exoterm (frysning) afvigelse fra den registrerede grundlinje.
1.4.4.2. Differential scanning kalorimetri (DSC) Ved denne metode registreres forskellen i den energimængde, der tilføres stoffet og et referencemateriale, som funktion af temperaturen, imedens stoffet og referencematerialet følger samme temperaturprogram. Denne forskel svarer til den energimængde, der er nødvendig for at opretholde en temperaturforskel på nul mellem stoffet og referencematerialet. En faseovergang i stoffet ledsaget af en enthalpiændring viser sig ved en endoterm (smeltning) eller exoterm (frysning) afvigelse fra den registrerede grundlinje.
1.4.5. Flydepunkt Denne metode er udviklet til mineralolier og er egnet til olieagtige stoffer med lavt smeltepunkt. Efter først at være opvarmet afkøles prøven med en bestemt hastighed, og dens flydeegenskaber undersøges med 3 K's mellemrum. Den laveste temperatur, ved hvilken der kan iagttages bevægelse i stoffet, registreres som flydepunktet.
1.5. KVALITETSKRITERIER Anvendelighed og nøjagtighed for de forskellige metoder til bestemmelse af smeltepunkt/smeltepunktsinterval er angivet i følgende tabel:
1.5. TABEL: METODERNES ANVENDELIGHED A. B. C. D.
Kapillarmetoder Målemetode For stoffer, som kan pulveriseres For stoffer, som ikke let pulveriseres Temperaturområde Skønnet nøjagtighed Foreliggende standard Smeltepunkts-apparater med væskebad ja enkelte 273 til 573 K ±0,3 K JIS K 0064 Smeltepunkts-apparater med metalblok ja enkelte 293 til > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Bestemmelse med fotocelle ja adskillige ved hjælp af særligt udsryr 253 til 573 K ±0,5 K Varmeborde og frysemetoder Målemetode For stoffer, som kan pulveriseres For stoffer, som ikke let pulveriseres Temperaturområde Skønnet nøjagtigned Foreliggende standard Koflers varmebænk ja nej 283 K til > 573 K ±1,0 K ANSI/ASTM D 345176 Smekemikroskop ja enkelte 273 K til > 573 K ±0,5 K DIN 53736 Meniskmetode nej kun for polyamider 293 K til > 573 K ±0,5 K IS0 1218 (E) Frysepunktsmetoder ja ja 223 K til 573 K ±0,5 K f.eks. BS 4695 Termoanalyse Målemetode For stoffer, som kan pulveriseres For stoffer, som ikke let pulveriseres Temperaturområde Skønnet nøjagtighed Foreliggende standard Differential termoanalyse ja ja 173 K til 1273 K op til 600 K ±0,5 K op til 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Differential scanning kalorimetri ja ja 173 K til 1273 K op til 600 K ±0,5 K op til 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Flydepunkt Målemetode For stoffer, som kan pulveriseres For stoffer, som ikke let pulveriseres Temperaturområde Skønnet nø-jagtighcd Foreliggende standard Flydepunkt for mineralolier og olieagtige stoffer for mineralolier og olieagtige stoffer 223 K til 323 K ±0,3 K ASTM D 97-66
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE Fremgangsmåden er for næsten alle undersøgelsesmetoderne beskrevet i internationale og nationale standarder (se tillægget).
1.6.
1.6.1. Kapillarrørsmetoder Fint pulveriserede stoffer udviser ved langsom opvarmning sædvanligvis et smeltningsforløb som vist på figur 1.
1.6.1.
Figur 1 Trin A Trin B Trin C Trin D Trin E Trin A (begyndende smeltning): Små dråber fordeler sig jævnt over kapillarrørets indervæg. Trin B Der opstår et mellemrum mellem prøven og indervæggen som følge af prøvens skrumpning under smeltningen. Trin C Den indskrumpne prøve begynder at synke ned på bunden og blive flydende. Trin D Der dannes en ubrudt væskeoverflade, men en væsentlig del af prøven består stadig af fast stof. Trin E (endelig smeltning): Der er ingen faste partikler. Under smeltepunktsbestemmelsen noteres temperaturerne ved begyndende og endelig smeltning.
1.6.1.1. Smeltepunktsapparater med væskebad Figur 2 viser en type standardiseret smeltepunktsapparat (JIS K 0064). Apparatet er fremstillet af glas, og alle mål er angivet i mm.
1.6.1.1.
Figur 2 A: Målebeholder B: Prop C: Udluftningshul D: Termometer E: Hjælpetermometer F: Badvæske G: Kapillarrør af glas; længde 80-100 mm; indre diameter 1,0 ± 0,2 mm; vægtykkelse 0,2-0,3 mm H: Siderør
Badvæske:
Der vælges en passende væske. Valget afhænger af, hvor højt et smeltepunkt der skal bestemmes, f.eks. paraffinolie for smeltepunkter op til 473 K og silikonolie for smeltepunkter op til 573 K. For smeltepunkter over 523 K kan der anvendes en blanding af 3 dele svovlsyre og 2 dele kaliumsulfat (masseforhold). Anvendes denne blanding, skal der træffes passende sikkerhedsforholdsregler.
Termometer:
Man bør kun anvende termometre, som opfylder kravene i de følgende eller tilsvarende standarder: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.
Fremgangsmåde:
Det tørre stof pulveriseres fint i en morter og fyldes i kapillarrøret, som er lukket i den ene ende, således at fyldningshøjden er ca. 3 mm efter tæt pakning. For at opnå en ensartet pakket prøve lader man kapillarrøret falde fra en højde af ca. 700 mm gennem et lodret glasrør ned på et urglas. Det fyldte kapillarrør anbringes i badet, således at den midterste del af termometerets kviksølvbeholder berører den del af kapillarrøret, som prøven befinder sig i. Sædvanligvis anbringes kapillarrøret i apparatet, når badets temperatur er ca. 10 K under smeltepunktet. Badvæsken opvarmes med en temperaturstigning på ca. 3 K/min under omrøring af væsken. Når temperaturen er ca. 10 K under det forventede smeltepunkt, indstilles temperaturstigningen til højst 1 K/min.
Beregning:
Smeltepunktet beregnes således: T = TD + 0,00016 (TD – TE) n hvor: T korrigeret smeltepunktstemperatur i K TD temperaturaflæsning af termometer D i K TE temperaturaflæsning af termometer E i K n antallet af gradinddelinger på den udestående del af termometer D's kviksøjle.
1.6.1.2. Smeltepunktapparatar med metalblok
1.6.1.2. Apparat:
Dette består af:
en cylindrisk metalblok, hvis øverste del er hul og danner et kammer (se figur 3)
en metalprop med to eller flere huller, som muliggør anbringelse af rør i metalklodsen
et opvarmningssystem for metalklodsen, f.eks. i form af en elektrisk modstand indbygget i blokken
en rheostat til regulering af energitilførslen, hvis der anvendes elektrisk opvarmning
fire vinduer af varmeresistent glas i kammerets sidevægge, anbragt diametralt og vinkelret på hinanden. Foran et af disse vinduer er der anbragt en lup til iagttagelse af kapillarrøret. De tre andre vinduer tjener til belysning af indersiden af kammeret ved hjælp af lamper
et kapillarrør af varmeresistent glas lukket i den ene ende (se 1.6.1.1).
Termometer:
Se standarderne i 1.6.1.1. Termoelektriske måleinstrumenter med tilsvarende nøjagtighed kan også anvendes.
Figur 3 termometer kapillarrør metalprop lup lampe elektrisk modstand opvarmningsblok i metal
1.6.1.3. Bestemmelse med fotocelle Apparat og fremgangsmåde: Apparatet består af et metalkammer med et automatisk opvarmningssystem. Tre kapillarrør fyldes som i 1.6.1.1 og anbringes i ovnen. Der er mulighed for flere lineære temperaturstigninger til kalibrering af apparatet, og temperaturstigningen indstilles elektrisk til en passende forudvalgt konstant og lineær hastighed. Skrivere viser den øjeblikkelige ovntemperatur og temperaturen af stoffet i kapillarrørene.
1.6.2. Varmeborde
1.6.2.
1.6.2.1. Koflers varmebænk Se tillæg.
1.6.2.2. Smeltemikroskop Se tillæg.
1.6.2.3. Meniskmetode (polyamider) Se tillæg. Opvarmingshastigheden ved smeltepunktet skal være mindre end 1 K/min.
1.6.3. Metoder til bestemmelse af frysepunkt Se tillæg.
1.6.4. Termoanalyse
1.6.4.
1.6.4.1. Differential termoanalyse Se tillæg.
1.6.4.2. Differential scanning kalorimetri Se tillæg.
1.6.5. Bestemmelse af flydepunkt Se tillæg.
2. DATA I visse tilfælde er termometerkorrektion nødvendig.
3. RAPPORTERING Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger: Som smeltepunkt anføres gennemsnittet af mindst to målinger, der ligger inden for den skønnede nøjagtighed (jf. tabellerne). Hvis forskellen mellem temperaturen ved begyndende og endelig smeltning ligger inden for metodens nøjagtighed, angives temperaturen ved den endelige smeltning som smeltepunktet; i modsat fald angives begge temperaturer. Hvis stoffet dekomponerer eller sublimerer, inden smeltepunktet er nået, anføres den temperatur, hvor dette fænomen er iagttaget. Alle oplysninger og bemærkninger af betydning for vurdering af resultaterne især vedrørende urenheder og stoffets fysiske tilstand skal anføres.
anvendt metode
nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder) og eventuelt indledende oprensningstrin
den skønnede nøjagtighed.
4.(1)(2)(3)(4)
HENVISNINGER OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.
A.2. KOGEPUNKT
A.2.
1. METODE Flertallet af de beskrevne metoder er baseret på OECD-testvejledningen (1). Grundprincipperne er anført i henvisning (2) og (3).
1.
1.1. INDLEDNING De her beskrevne metoder kan anvendes for alle væsker og lavtsmeltende stoffer, forudsat at der ikke indtræder nogen kemisk reaktion under kogepunktet (f.eks. autooxidation, omlejring eller nedbrydning). Metoderne kan anvendes for alle væsker uanset renheden. De metoder, hvor der benyttes bestemmelse med fotocelle, og de, der er baseret på termoanalyse, fremhæves specielt, da de kan benyttes til bestemmelse af både smelte- og kogepunkt. Desuden kan disse målinger udføres automatisk. Den dynamiske metode har den fordel, at den også kan benyttes til bestemmelse af damptryk, og det er ikke nødvendigt at korrigere kogepunktstemperaturen til standardtryk (101,325 kPa), da standardtrykket kan indstilles med en pressostat under målingen. Bemærkninger: Urenheders indflydelse på kogepunktsbestemmelsen afhænger stærkt af deres art. Hvis der i prøven er flygtige urenheder, som vil kunne få indflydelse på resultaterne, kan stoffet eventuelt renses.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Standardkogepunktet defineres som den temperatur, ved hvilken en væskes damptryk er 101,325 kPa. Måles kogepunktet ikke ved standardatmosfæretryk, kan damptrykkets afhængighed af temperaturen beskrives ved Clausius-Clapeyrons ligning: log p = Δ Hv2,3 RT+ konstant hvor: P stoffets damptryk i pascal ΔHv stoffets fordampningsvarme i J mol-1 R gaskonstanten = 8,314 J mol-1 K-1 T den absolutte temperatur i K Kogepunktet opgives i forhold til det aktuelle tryk under målingen. Omregninger Tryk (enhed kPa) 100 kPa 1 bar = 0,1 MPa (bar er stadig tilladt, men anbefales ikke) 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (enhederne mm Hg og Torr er ikke tilladt). 1 atm standardatmosfære = 101325 Pa (atm-enheden er ikke tilladt). Temperatur (enhed: K) t = T – 273,15 t er temperaturen i grader celsius ( oC) T er termodynamisk temperaturen i kelvin (K)
1.3. REFERENCESTOFFER Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt stof undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnået med andre metoder. Der er i de metoder, der er anført i tillægget, angivet nogle referencestoffer.
1.4. METODENS PRINCIP Der er fem metoder til bestemmelse af kogepunkt (kogepunktsinterval), som er baseret på måling af den temperatur, ved hvilken prøven koger, og to metoder baseret på termoanalyse.
1.4.
1.4.1. Bestemmelse ved hjælp af ebulliometer Ebullitometre blev oprindeligt udviklet til molekylvægtsbestemmelse via kogepunktsforhøjelse, men de er også velegnede til nøjagtige kogepunktsbestemmelser. Et meget enkelt apparat er beskrevet i ASTM D 1120-72 (se tillæg). I dette apparat opvarmes væsken under ligevægtsbetingelser ved atmosfæretryk, indtil den koger.
1.4.2. Dynamisk metode Ved denne metode måles dampens fortætningstemperatur ved hjælp af et egnet termometer anbragt i tilbagesvaleren under kogning. Trykket kan varieres ved denne metode.
1.4.3. Destillationsmetode til bestemmelse af kogepunkt Ved denne metode destilleres væsken, og dampens fortætningstemperatur samt destillatmængden måles.
1.4.4. Siwoloboffs metode En prøve opvarmes i et prøverør, som er nedsænket i et varmebad. Et tilsmeltet kapillarrør med en luftboble i den nederste ende er nedsænket i prøverøret.
1.4.5. Bestemmelse med fotocelle Der foretages automatisk fotoelektrisk måling af opstigende bobler under anvendelse af Siwoloboffs princip.
1.4.6. Differential termoanalyse Ved denne metode registreres temperaturforskellen mellem stoffet og et referencemateriale som funktion af temperaturen, imedens stoffet og referencematerialet følger samme temperaturprogram. En faseovergang i stoffet ledsaget af en enthalpiændring viser sig ved en endoterm afvigelse (kogning) fra den registrerede grundlinje.
1.4.7. Differential scanning kalorimetri Ved denne metode registreres forskellen i den energimængde, der tilføres stoffet og et referencemateriale, som funktion af temperaturen, imedens stoffet og referencematerialet følger samme temperaturprogram. Denne forskel svarer til den energimængde, der er nødvendig for at opretholde en temperaturforskel på nul mellem stoffet og referencematerialet. En faseovergang i stoffet ledsaget af en enthalpiændring viser sig ved en endoterm afvigelse (kogning) fra den registrerede grundlinje.
1.5. Tabel 1 Sammenligning af metoderne
KVALITETSKRITERIER Anvendelighed og nøjagtighed for de forskellige metoder til bestemmelse af kogepunkt/kogepunktsinterval er angivet i tabel 1. Målemetode Skønnet nøjagtighed Foreliggende standard Ebulliometer ±1,4 K (op ril 373 K) ±2,5 K (op til 600 K) ASTM D 1120-72 Dynamisk metode ±0,5 K (op til 600 K) Destillationsforløb (kogepunktsinterval) ±0,5 K (op til 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Siwoloboff's metode ± 2 K (op til 600 K) Bestemmelse med fotocelle ±0,3 K (ved 373 K) Differential termoanalyse ±0,5 K (op til 600 K) ±2,0 K (op til 1273 K) ASTM E 537-76 Differential scanning kalorimetri ±0,5 K (op til 600 K) ±2,0 K (op til 1273 K) ASTM E 537-76
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE Nogle af metodernes fremgangsmåder er beskrevet i internationale og nationale standarder (se tillæg).
1.6.
1.6.1. Ebulliometer Se tillæg.
1.6.2. Dynamisk metode Se metode A.4 til bestemmelse af damptryk. Den kogetemperatur, der iagttages ved et tryk på 101,325 kPa, noteres.
1.6.3. Destillationsforløb (kogepunktsinterval) Se tillæg.
1.6.4. Siwoloboffs metode Prøven opvarmes i et smeltepunktsapparat i et prøverør med en diameter på ca. 5 mm (figur 1). Figur 1 viser en model af et standardiseret smelte- og kogepunktsapparat (JIS K 0064) (fremstillet af glas, alle mål i millimeter). Et kapillarrør, som er tilsmeltet ca. 1 cm over den nederste ende, anbringes i prøverøret. Der fyldes så meget prøve i, at den tilsmeltede del af kapillarrøret befinder sig under væskeoverfladen. Prøverøret med kapillarrøret fastgøres til termometeret med en elastik eller fastholdes støttet fra siden (se figur 2). Figur 2 Siwoloboff's princip Figur 3 Modificeret princip Badvæsken vælges under hensyntagen til kogepunktet. Ved en temperatur på op til 573 K kan der benyttes silikonolie. Flydende paraffin må kun anvendes op til 473 K. Badvæsken opvarmes først med en hastighed på 3 K pr. minut under omrøring. Ca. 10 K under det forventede kogepunkt sænkes varmetilførslen, så temperaturstigningen bliver mindre end 1 K pr. minut. Når temperaturen nærmer sig kogepunktet, begynder der at strømme bobler ud af kapillarrøret. Kogepunktet er den temperatur, hvor boblestrømmen under et kortvarigt temperaturfald standser og væsken begynder at stige op i kapillarrøret. Termometeraflæsningen viser stoffets kogepunkt. I det modificerede princip (figur 3) bestemmes kogepunktet i et smeltepunktskapillarrør. Det trækkes ud til en ca. 2 cm lang tynd spids (a), og en smule af prøven suges op heri. Den åbne ende af det tynde kapillarrør tilsmeltes, så der dannes en lille luftboble ved enden. Ved opvarmning i smeltepunktsapparatet (b) udvider luftboblen sig. Kogepunktet ligger ved den temperatur, hvor stofproppen når op i højde med badvæskens overflade (c).
1.6.4.
Figur 1 A: Målebeholder B: Prop C: Udluftning D: Termometer E: Hjælpetermometer F: Badvæske G: Prøverør, ydre diameter maks. 5 mm, med ca. 100 mm langt kapillarrør med indre diameter maks. 1 mm og vægtykkelse ca. 0,2-0,3 mm H: Siderør
1.6.5. Bestemmelse med fotocelle Prøven opvarmes i et kapillarrør i en opvarmet metalblok. Via passende huller i blokken sendes der en lysstråle gennem stoffet ind til en nøjagtigt kalibreret fotocelle. Medens temperaturen i prøven stiger, undviger der enkelte bobler fra kapillarrøret. Når kogepunktet er nået, vokser antallet af bobler voldsomt. Herved ændres intensiteten af det lys, som fotocellen modtager, så der sendes et stopsignal til den indikator, der viser temperaturen af et platinmodstandstermometer, der er anbragt i blokken Denne metode er særlig anvendelig, da den kan benyttes til bestemmelser under stuetemperatur ned til 253,15 K (– 20 oC) uden ændringer ved apparaturet. Instrumentet skal blot anbringes i et kuldebad.
1.6.6. Termoanalyse
1.6.6.
1.6.6.1. Differential termoanalyse Se tillæg.
1.6.6.2. Differential scanning kalorimetri Se tillæg.
2. Tabel 2 Temperaturkorrektionsfaktorer fT
DATA Ved små afvigelser fra standardtryk (maks. ± 5 kPa) korrigeres kogepunktstemperaturerne ved hjælp af Sidney-Youngs ligning: Tn = T + (fT x Δp) hvor Δ p (101,325 – p) [bemærk fortegnet] p trykket målt i kPa fT kopepunktets ændring med trykker i K/kPa T målt kogepunkt i K Tn kogepunkt i K, korrigeret til standardtryk I ovennævnte nationale og internationale standarder findes der temperaturkorrektionsfaktorer fT for mange stoffer og udtryk til tilnærmelse af dem. Eksempelvis anføres i DIN 53171 følgende grove korrektioner for opløsningsmidler i maling: Temperatur T korrektionsfaktor fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
3. RAPPORTERING Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger: Som kogepunkt anføres gennemsnittet af mindst to målinger, der ligger inden for den skønnede nøjagtighed (jf. tabel 1). De målte kogetemperaturer og gennemsnittet heraf skal anføres, og det tryk, hvorved målingerne er foretaget, opgives i kPa. Trykket skal helst ligge nær standardatmosfæretryk. Alle oplysninger og bemærkninger af betydning for vurdering af resultaterne især vedrørende urenheder og stoffets fysiske tilstand skal anføres.
anvendt metode
nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder) og eventuel indledende rensning
den skønnede nøjagtighed.
4.(1)(2)(3) HENVISNINGER OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, volume II. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.
A.3. RELATIV MASSEFYLDE
A.3.
1. METODE De beskrevne metoder er baseret på OECD-testvejledningen (1). Grundprincipperne er anført i henvisning (2).
1.
1.1. INDLEDNING De beskrevne metoder til bestemmelse af relativ massefylde kan anvendes for faste stoffer og væsker uanset renheden. De forskellige metoder, som kan anvendes, er anført i tabel 1.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Den relative massefylde, D420, af faste stoffer og væsker er forholdet mellem massen af et rumfang af det undersøgte stof bestemt ved 20 oC og massen af det samme rumfang vand bestemt ved 4 oC. Den relative massefylde er dimensionsløs. Massefylden, P, af et stof er dets masse m divideret med dets rumfang v. Massefylden, P, opgives i kg/m3 (SI-enheder).
1.3. REFERENCESTOFFER (1) (3) Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnået med andre metoder.
1.4. METODERNES PRINCIP Der benyttes fire typer metoder.
1.4.
1.4.1. Opdriftsmetoder
1.4.1.
1.4.1.1. Aræometer (for væsker) Der kan opnås tilstrækkelig nøjagtige og hurtige massefyldebestemmelser med aræometre, hvor massefylden af en væske udledes af flydehøjden ved aflæsning på en skala.
1.4.1.2. Hydrostatisk vægt (for væsker og faste stoffer) Forskellen mellem massen af en prøve i henholdsvis atmosfærisk luft og en passende væske (f.eks. vand) kan anvendes til at bestemme dens massefylde. For faste stoffer er den fundne massefylde kun repræsentativ for den bestemte prøve, som er anvendt til bestemmelsen. Til bestemmelse af væskers massefylde vejes et legeme med kendt rumfang v først i atmosfærisk luft og dernæst i væsken.
1.4.1.3. Metode med nedsænket legeme (for væsker) (4) Ved denne metode bestemmes en væskes massefylde ud fra forskellen mellem resultaterne af vejning af væsken før og efter nedsænkning af et legeme med kendt rumfang her.
1.4.2. Pyknometermetoder Pyknometre af forskellig udformning og med kendt rumfang kan anvendes for faste stoffer og væsker. Massefylden beregnes ud fra masseforskellen mellem det fulde og det tomme pyknometer og dets kendte rumfang.
1.4.3. Luftsammenligningspyknometer (for faste stoffer) Massefylden af et fast stof i enhver form kan bestemmes ved stuetemperatur med et gassammenligningspyknometer. Rumfanget af en prøve af stoffet måles i atmosfærisk luft eller i en inaktiv luftart i en beholder med korrigeret rumfangsinddeling. Til beregning af massefylden foretages efter rumfangsbestemmelsen en bestemmelse af prøvens masse.
1.4.4. Oscillerende densitometer (5) (6) (7) Massefylden af en væske kan bestemmes med et oscillerende densitometer. En mekanisk oscillator i form af et U-rør sættes i svingning ved sin resonansfrekvens, der afhænger af dens masse. Når der indføres en prøve heri, ændres oscillatorens resonansfrekvens. Apparatet kalibreres med to væsker med kendt massefylde. Disse stoffer vælges fortrinsvis således, at deres massefylde ligger i hver sin ende af det pågældende måleområde.
1.5. KVALITETSKRITERIER Anvendeligheden af de forskellige metoder, der anvendes til bestemmelse af den relative massefylde, er opstillet i tabellen.
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE Tillægget indeholder en liste over nogle standarder, hvorfra yderligere tekniske detaljer kan hentes. Målingerne skal udføres ved 20 oC, og der foretages mindst to bestemmelser.
2. DATA Se standarderne.
3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Metodernes anvendelighed
RAPPORTERING Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger: Den under 1.2 definerede relative massefylde D204 rapporteres tillige med det undersøgte stofs fysiske tilstand. Alle oplysninger og bemærkninger af betydning for vurdering af resultaterne, især vedrørende urenheder og stoffets fysiske tilstand, skal anføres. Målemetode Massefylde Maksimal dynamisk viskositet Foreliggende standarder fast stof væske Aræometer ja 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Hydrostatik vægt ja ISO 1183 (A) ja 5 Pa S ISO 901 og 758 Metode med nedsænket legeme ja 20 Pa s DIN 53217 Pyknometer ISO 3507 ja ISO 1183 (B), NF T 20-053 ja 500 Pa s ISO 758 Luftssammenligningspyknometer ja DIN 55990 Teil 3, DIN 53243 Oscillerende densitometer ja 5 Pa s
anvendt metode
nøjagtig beskrivelse af stoffet (art og urenheder) og eventuel indledende rensning.
3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2. Metodernes anvendelighed a)
faste stoffer
b)
væsker
3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Metodernes anvendelighed a)
faste stoffer
b)
væsker
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
HENVISNINGER OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.II, 427-430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717 - 726. Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.
A.4. DAMPTRYK
A.4.
1. METODE Flertallet af de beskrevne metoder er baseret på OECD-testvejledningen (1). Grundprincipperne er anført i henvisning (2) og (3).
1.
1.1. INDLEDNING Ved udførelse af denne test er det nyttigt at have forhåndsoplysninger om stoffets struktur, smeltepunkt og kogepunkt. Der findes ikke en enkelt metode, som kan anvendes i hele damptryksområdet. Derfor anbefales der flere forskellige metoder til måling af damptryk fra < 10-4 til 105 Pa. Urenheder vil normalt påvirke damptrykket; denne påvirkning afhænger stærkt af urenhedens art. Er der i prøven flygtige urenheder, der kunne tænkes at påvirke resultatet, kan man rense stoffet. Det kan også være hensigtsmæssigt at oplyse damptrykket for den tekniske kvalitet. I nogle af de her beskrevne metoder anvendes der apparatur med metaldele; der skal tages hensyn hertil, når der udføres test med ætsende stoffer.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Et fast eller flydende stofs damptryk defineres som mætningstrykket over stoffet. I termodynamisk ligevægt er et rent stofs damptryk kun en funktion af temperaturen. Den SI-enhed for tryk, som anvendes, er pascal (Pa). Nedenfor er anført nogle enheder, som tidligere har været anvendt, og deres omregningsfaktorer: 1 Torr (≡ 1 mm Hg) = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfære = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa SI-enheden for temperatur er kelvin (K). Gaskonstanten R er 8,314 J. mol-1. K-1. Damptrykkets afhængighed af temperaturen beskrives ved Clausius-Clapeyrons ligning: log p = Δ Hv2,3 RT = konstant hvor: p stoffets damptryk i pascal ΔHv stoffets fordampningsvarme i J. mol-1 R gaskonstanten i J. mol-1. K-1 T den absolutte temperatur i K
1.3. REFERENCESTOFFER Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnået med andre metoder.
1.4. TESTMETODERNES PRINCIP Der foreslås syv metoder til bestemmelse af damptryk, som hver kan bruges i forskellige damptryksintervaller. Ved hver metode bestemmes damptrykket ved flere forskellige temperaturer. I et begrænset temperaturinterval er logaritmen til damptrykket af et rent stof en lineær funktion af den reciprokke værdi af temperaturen.
1.4.
1.4.1. Dynamisk metode Ved den dynamiske metode måles den kogetemperatur, der svarer til et specificeret tryk. Anbefalet område: 103 til 105 Pa. Denne metode anbefales også til bestemmelse af kogepunkt og kan anvendes til dette formål op til 600 K.
1.4.2. Statisk metode Ved den statiske metode bestemmes damptrykket i et lukket system, der er i termodynamisk ligevægt ved en specificeret temperatur. Metoden er egnet til faste stoffer og væsker, som består af en eller flere komponenter. Anbefalet område: 10 til 105 Pa. Med den fornødne omhu kan metoden også anvendes i området fra 1 til 10 Pa.
1.4.3. Isoteniskop Denne standardiserede metode er også en statisk metode, men den kan normalt ikke anvendes til flerkomponentsystemer. Der kan søges yderligere oplysninger i ASTM D 2879-86. Anbefalet område: 100 til 105 Pa.
1.4.4. Effusionsmetode: damptryksvægt Den stofmængde, der forlader en celle pr. tidsenhed gennem en åbning af kendt størrelse, bestemmes under vakuum, så den mængde stof, der vender tilbage til cellen, er ubetydelig (f.eks. ved måling af den impuls, en dampstråle udøver på en følsom vægt, eller ved måling af vægttabet). Anbefalet område: 10-3 til 1 Pa.
1.4.5. Effusionsmetode: vægttab eller opfangning af damp Metoden er baseret på bestemmelse af den mængde teststof, der under ultravakuum strømmer ud af en Knudsen-celle (4) gennem en mikroåbning pr. tidsenhed i gasform. Massen af den udsivede damp kan konstateres enten ved at bestemme cellens vægttab eller ved at kondensere dampen ved lav temperatur og bestemme den fordampede mængde stof ved kromatografisk analyse. Damptrykket beregnes ved anvendelse af Hertz-Knudsen-relationen. Anbefalet område: 10-3 til 1 Pa.
1.4.6. Gasmætningsmetode Der ledes en strøm af inaktiv bæregas hen over stoffet på en sådan måde, at den mættes med dampen. Den stofmængde, en kendt bæregasmængde transporterer, kan enten måles ved opsamling i en passende fælde eller ved in-line analyse. Herudfra kan damptrykket ved en given temperatur beregnes. Anbefalet område: 10-4 til 1 Pa. Med den fornødne omhu kan metoden også anvendes i området fra 1 til 10 Pa.
1.4.7. Roterende kugle I denne metode er det egentlige måleorgan en lille stålkugle, der svæver i et magnetfelt og roterer med høj hastighed. Gastrykket udledes af den trykafhængige bremsning af stålkuglen. Anbefalet område: 10-4 til 0,5 Pa.
1.5. Tabel 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Kvalitetskriterier
KVALITETSKRITERIER I følgende tabel er de forskellige metoder til bestemmelse af damptryk sammenlignet med hensyn til anvendelse, repeterbarhed, reproducerbarhed, måleområde og foreliggende standard. Målemetode Stoffer Skønnet repeterbarhed Skønnet reproducerbarhed Anbefalet område Foreliggende standard faste væsker Dynamisk metode lavtsmeltende ja op til 25 % op til 25 % 103 Pa til 2 x 103 Pa — 1 til 5 % 1 til 5 % 2 x 103 Pa til 105 Pa — Statisk metode ja ja 5 til 10 % 5 til 10 % 10 Pa til 105 Pa NFT 20-048 (5) Isoteniskop ja ja 5 til 10 % 5 til 10 % 102 Pa til 105 Pa ASTM-D 2879-86 Effusionsmetode: damptryksvægt ja ja 5 til 20 % op til 50 % 10-3 Pa til 1 Pa NFT 20-047 (6) Effusionsmetode: vægttab ja ja 10 til 30 % — 10-3 Pa til 1 Pa — Gasmætningsmetode ja ja 10 til 30 % op til 50 % 10-4 Pa til 1 Pa — Roterende kugle 10 til 20 % — 10-4 Pa til 0,5 Pa —
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE
1.6.
1.6.1. Dynamisk måling
1.6.1.
1.6.1.1. Apparatur Måleinstrumentet består typisk af en kogebeholder med tilsluttet køler fremstillet af glas eller metal (figur 1), udstyr til måling af temperaturen og udstyr til regulering og måling af trykket. Et typisk måleudstyr som det på skitsen viste er fremstillet af varmebestandigt glas og består af fem dele: Et stort delvis dobbeltvægget rør bestående af en slibsamling, en køler, en kølebeholder og et indløb. Der er monteret en glascylinder med en Cottrell-pumpe på rørets kogesektion, og dens overflade er ru, så stødkogning undgås. Temperaturen måles med en egnet temperaturføler (f.eks. modstandstermometer eller termoelement med kappe), som er ført ind i instrumentet helt til målepunktet (figur 1, nr. 5) gennem en passende åbning (f.eks. udvendigt slib). Der foretages de fornødne tilslutninger til det udstyr, hvormed trykket reguleres og måles. Bulben, der fungerer som stødpudevolumen, er forbundet med måleinstrumentet med et kapillarrør. Kogebeholderen opvarmes med et varmeelement (f.eks. varmepatron), der er indført i glasapparaturet nedefra. Den nødvendige strømstyrke indstilles og reguleres via et termoelement. Det påkrævede vakuum på mellem 102 og ca. 105 Pa skabes med en vakuumpumpe. Der benyttes en passende ventil til regulering af trykket med luft eller nitrogen (måleområde ca. 102 til 105 Pa) og til udluftning. Trykket måles med et manometer.
1.6.1.2. Fremgangsmåde ved målingen Damptrykket måles ved, at prøvens kogepunkt bestemmes ved forskellige specificerede tryk mellem ca. 103 og 105 Pa. En ikke-stigende temperatur ved konstant tryk viser, at kogetemperaturen er nået. Skummende stoffers damptryk kan ikke måles ved denne metode. Stoffet anbringes i testkammeret, der skal være rent og tørt. Det kan være vanskeligt med ikke-pulverformige faste stoffer, men det kan undertiden hjælpe at opvarme kølekappen. Når kammeret er fyldt, samles apparatet, og stoffet afgasses. Derpå indstilles der på det laveste ønskede tryk, og der tændes for opvarmningen. Samtidig tilsluttes temperaturføleren til en skriver. Der er nået ligevægt, når der registreres konstant kogetemperatur ved konstant tryk. Det skal nøje påses, at der ikke forekommer stødkogning. Desuden skal der ske fuldstændig kondensation på svaleren. Ved bestemmelse af damptryk af lavtsmeltende faste stoffer, skal man omhyggeligt sørge for, at svaleren ikke tilstoppes. Når ligevægtspunktet er registreret, indstilles der til et højere tryk. Der fortsættes på samme måde, indtil 105 Pa er nået (ca. 5 til 10 målepunkter i alt). Som kontrol gentages ligevægtspunkterne ved aftagende tryk.
1.6.2. Statisk måling
1.6.2.
1.6.2.1. Apparatur Apparaturet består af en beholder til prøven og et opvarmnings- og afkølingssystem til regulering og måling af prøvens temperatur. Apparaturet omfatter desuden instrumenter til indstilling og måling af trykket. Figur 2a og 2b viser grundprincipperne. Testkammeret (figur 2a) er på den ene side afgrænset af en passende højvakuumventil og på den anden side forbundet med et U-rør, der indeholder en egnet manometervæske. Den anden ende af U-røret er tilsluttet til vakuumpumpen, nitrogenflasken eller udluftningsventilen og et manometer. I stedet for U-røret kan der anvendes en trykmåler med separat viser (figur 2b). Prøvens temperatur styres ved, at testkammeret med ventil og U-rør eller trykmåler anbringes i et bad, der holdes ved konstant temperatur ±0,2 K. Temperaturmålingerne udføres på ydersiden af testkammerets væg eller i selve testkammeret. Der benyttes en vakuumpumpe med frysefælde til evakuering af apparatet. I metode 2a måles stoffets damptryk indirekte ved hjælp af en nulindikator. Der tages derved hensyn til, at massefylden af væsken i U-røret ændrer sig, hvis der sker store temperaturændringer. Følgende væsker er egnede som nulindikatorer i U-røret og vælges under hensyntagen til trykområdet og teststoffets kemiske egenskaber: siliconevæsker og phthalater. Teststoffet må ikke kunne opløses væsentligt i eller reageres med U-rørvæsken. I manometre kan der bruges kviksølv i området fra normalt lufttryk til 102 Pa, mens siliconevæsker og phthalater er egnede fra 102 ned til 10 Pa. Varmebestandige membrankondensatormanometre kan endda benyttes under 10-1 Pa. Der findes også andre trykmålere, der kan bruges under 102 Pa.
1.6.2.2. Fremgangsmåde ved målingen Før målingen skal alle dele af det i figur 2 viste apparat rengøres og tørres omhyggeligt. Ved metode 2a fyldes U-røret med den valgte væske, der afgasses ved høj temperatur, inden der foretages aflæsninger. Teststoffet anbringes i apparatet, som samles, hvorefter temperaturen sænkes tilstrækkeligt til afgasning. Temperaturen skal være så lav, at luften suges ud, men der må ikke for flerkomponentsystemers vedkommende ske nogen ændring af materialets sammensætning. Om nødvendigt kan indstillingen af ligevægt fremskyndes ved omrøring. Prøven kan underafkøles med f.eks. flydende nitrogen (pas på kondensation i luften og pumpevæsken) eller en blanding af ethanol og tøris. Til lavtemperaturmålinger benyttes et temperaturreguleret bad forbundet med en ultrakryomat. Idet ventilen over testbeholderen står åben, suges der i flere minutter, så luften fjernes. Derefter lukkes ventilen, og prøvens temperatur sænkes til den laveste ønskede. Om nødvendigt gentages afgasningen flere gange. Når prøven opvarmes, stiger damptrykket, hvorved væsken i U-røret ændrer ligevægtsstilling. Som kompensation ledes der nitrogen eller luft ind i apparatet via ventilen, indtil trykindikatorvæsken atter er på nul. Det tilsvarende tryk kan aflæses på et præcisionsmanometer ved stuetemperatur. Dette tryk svarer til stoffets damptryk ved den pågældende måletemperatur. Metode 2b er en lignende metode, men damptrykket aflæses direkte. Damptrykkets temperaturafhængighed bestemmes med passende små intervaller (ca. 5 til 10 målepunkter) op til det ønskede maksimum. Som kontrol gentages lavtemperaturmålingerne. En eventuel afvigelse mellem de nye målinger og den kurve, der er fundet ved stigende temperatur, kan skyldes:
1.6.2.2.
1. at prøven stadig indeholder luft (f.eks. meget tyktflydende materialer) eller lavtkogende stoffer, som er frigjort under opvarmningen og kan fjernes ved sugning efterfulgt af endnu en underafkøling
2. at afkølingstemperaturen ikke er lav nok. I så fald benyttes der flydende nitrogen som kølemiddel I tilfælde 1 og 2 må målingerne gentages
3. at der sker en kemisk reaktion i stoffet i det undersøgte temperaturinterval (f.eks. dekomponering eller polymerisering).
1.6.3. Isoteniskop Henvisning (7) indeholder en fuldstændig beskrivelse af denne metode. Måleanordningens princip fremgår af figur 3. Isoteniskopet er i lighed med den under 1.6.2 beskrevne metode egnet til undersøgelse af såvel faste stoffer som væsker. Ved måling på væsker, tjener stoffet selv som hjælpemanometervæske. Der anbringes en sådan mængde af stoffet i isoteniskopet, at kuglen og den korte arm af manometersektionen er fyldt. Isoteniskopet forbindes med et vakuumsystem, evakueres og fyldes med nitrogen. Evakueringen og rensningen af systemet gentages to gange, så alt resterende oxygen fjernes. Det fyldte isoteniskop anbringes vandret, så prøven fordeler sig i et tyndt lag i kuglen og manometersektionen (U-delen). Trykket i systemet reduceres til 133 Pa, og prøven opvarmes forsigtigt, indtil den netop koger (fjernelse af opløste fikserede gasser). Isoteniskopet anbringes nu således, at prøven atter befinder sig i kuglen og manometerets korte arm og begge er helt fyldt med væske. Der opretholdes samme tryk som ved afgasning; kuglens udtrukne spids opvarmes med en lille flamme, indtil den dannede damp udvider sig tilstrækkeligt til, at en del af prøven presses ud af kuglens øvre del og manometerarm og ud i isoteniskopets manometersektion, hvorved der opstår et dampfyldt nitrogenfrit rum. Isoteniskopet anbringes dernæst i et bad med konstant temperatur, og nitrogentrykket indstilles til det er lig med prøvens tryk. At der er trykligevægt fremgår af isoteniskopets manometersektion. Ved ligevægt er nitrogenens damptryk lig med stoffets damptryk. Ved måling på faste stoffer benyttes en af de i 1.6.2.1 nævnte manometervæsker, alt efter tryk- og temperaturområde. Der fyldes afgasset manometervæske ind i en udvidelse på isoteniskopets lange arm. Derefter anbringes det faste teststof i kuglen og afgasses ved høj temperatur. Dernæst hældes isoteniskopet således, at manometervæsken kan strømme ind i U-røret. Måling af damptrykket som funktion af temperaturen foregår som under 1.6.2.
1.6.4. Effusionsmetoden: damptryksvægt
1.6.4.
1.6.4.1. Apparatur I henvisning (1) er der beskrevet forskellige versioner af apparaturet. Det her beskrevne apparatur illustrerer det generelle princip (figur 4). Figur 4 viser apparaturets hovedkomponenter: en højvakuumbeholder af glas eller rustfrit stål, udstyr til generering og måling af vakuum og indbyggede komponenter til måling af damptryk på en vægt. Apparaturet indeholder følgende indbyggede komponenter:
en fordampningsovn med flange og drejelig gennemføring. Fordampningsovnen er en cylindrisk beholder fremstillet i f.eks. kobber eller en godt varmeledende kemisk bestandig legering. Der kan også benyttes en glasbeholder med kobbervæg. Ovnen har en diameter på ca. 3 til 5 cm og en højde på 2 til 5 cm. Der er en til tre åbninger af forskellig størrelse til dampstrømmen. Ovnen opvarmes enten med en varmeplade underneden eller med en varmespiral omkring ydersiden. For at undgå bortledning af varme til grundpladen er varmeaggregatet fastgjort hertil med et metal med ringe varmeledningsevne (nikkel/sølv eller chromnikkelstål), f.eks. et nikkel/sølv-rør fastgjort til en drejelig gennemføring, hvis der benyttes en ovn med flere åbninger. En sådan opstilling har den fordel, at der kan indstikkes en kobberstang, så der kan køles udefra med et kuldebad
hvis der i ovnens kobberlåg er tre åbninger anbragt med 90o i forhold til hinanden, kan forskellige damptryksintervaller inden for det totale måleområde dækkes (åbninger med diameter mellem ca. 0,30 og 4,50 mm). De store åbninger benyttes til lave damptryk og omvendt. Ved drejning af ovnen kan den ønskede åbning eller en mellemstilling i dampstrømmen (ovnåbning — skærm — vægtskål) indstilles, så molekylestrømmen frigøres eller afbøjes af ovnåbningen og rammer vægtskålen. Stoffets temperatur måles med et termoelement eller et modstandstermometer anbragt et passende sted
over skærmen befinder sig vægtskålen på en meget følsom mikrovægt (se nedenfor). Vægtskålen er ca. 30 mm i diameter. Forgyldt aluminium er et egnet materiale
vægtskålen er omgivet af en cylindrisk kølekappe af messing eller kobber. Afhængigt af vægttypen er den forsynet med åbninger for vægtbjælken og en skærmåbning til molekylestrømmen, og den skal garantere fuldstændig kondensering af dampen på vægtskålen. Varmen bortledes til omgivelserne f.eks. med en kobberstang, der er forbundet med kølekappen. Denne stang er ført gennem grundpladen og isoleret herfra, f.eks. med et rør af chromnikkelstål. Den nedsænkes i et dewarkar med flydende nitrogen under grundpladen, eller der ledes flydende nitrogen gennem stangen. Herved holdes kølekappen på en temperatur på ca. – 120 oC. Vægtskålen køles udelukkende ved stråling, hvilket er tilfredsstillende i det pågældende trykinterval (afkøling ca. 1 time før målingerne påbegyndes)
vægten er anbragt over kølekappen. En højfølsom toarmet elektronisk mikrovægt (8) eller et meget følsomt drejespoleinstrument (se OECD Test Guideline 104, udgave af 12.5.1981) er eksempler på egnede vægte)
på grundpladen findes ligeledes de elektriske tilslutninger for termoelementer (eller modstandstermometre) og varmelegemer
der frembringes et vakuum i beholderen med enten en partiel vakuumpumpe eller en højvakuumpumpe (der kræves et vakuum på ca. 1 til 2 × 10–3 Pa, hvilket opnås efter 2 timers pumpning). Trykket reguleres med et egnet ioniseringsmanometer.
1.6.4.2. Fremgangsmåde ved målingen Teststoffet fyldes i beholderen, som lukkes med låget. Skærmen og kølekappen skubbes på plads over ovnen. Apparatet lukkes, og vakuumpumperne startes. Sluttrykket skal være ca. 10–4 Pa, før målingerne påbegyndes. Afkøling af kølekappen sættes i gang ved 10-2 Pa. Når det krævede vakuum er nået, startes kalibreringsrækken ved den laveste temperatur. Der indstilles på den pågældende åbning i låget, og dampstrømmen passerer gennem skærmen direkte over åbningen og rammer den afkølede vægtskål. Vægtskålen skal være så stor, at hele den dampstrøm, der ledes gennem skærmen, rammer den. Dampstrømmens impuls overfører en kraft til vægtskålen, og molekylerne kondenserer på dens kolde overflade. Impulsen og den samtidige kondensation frembringer et signal på skriveren. Ved vurdering af signalerne kan der uddrages to oplysninger: p = G 2 π RT×103M hvor G fordampningshastigheden (kg s-1 m-2) M molekylmassen (g mol-1) T temperaturen (K) R gaskonstanten (Jmol-1 K -1) p damptrykket (Pa) Når det ønskede vakuum er nået, påbegyndes måleserien ved den laveste ønskede måletemperatur. Videre målinger foretages ved, at temperaturen hæves i små spring, indtil den højeste ønskede temperatur er nået. Dernæst afkøles prøven igen, og der optegnes endnu en kurve over damptrykket. Bekræfter de sidste resultater ikke de første, kan det skyldes, at stoffet dekomponerer i det undersøgte temperaturområde.
1.6.4.2.
1. Med det her beskrevne apparatur bestemmes damptrykket direkte ud fra den impuls, der overføres til vægtskålen (hertil er det ikke nødvendigt at kende molekylvægten (2)). Ved vurdering af aflæsningerne må der tages hensyn til geometriske faktorer, såsom ovnåbningen og molekylestrømmens vinkel.
2. Kondensatets masse kan måles samtidig, og herudfra kan fordampningshastigheden beregnes. Endvidere kan damptrykket beregnes ud fra fordampningshastigheden og molekylvægten ved hjælp af Hertz' ligning (2).
1.6.5. Effusionsmetode — vægttab
1.6.5.
1.6.5.1. Apparatur Et effusionsapparat består af følgende basiskomponenter: Som eksempel er der i figur 5 vist en elektrisk opvarmet vakuumbeholder af aluminium med fire effusionsceller af rustfrit stål. Den rustfrie stålfolie af ca. 0,3 mm's tykkelse har en effusionsåbning på 0,2 til 1,0 mm i diameter og er fastgjort til effusionscellen med et låg med gevind.
en beholder, der kan termostateres og evakueres, og hvori effusionscellerne placeres
en højvakuumpumpe (f.eks. diffusionspumpe eller turbomolekylarpumpe) med vakuummeter
en frysefælde med flydende nitrogen eller tøris.
1.6.5.2. Fremgangsmåde ved målingen Referencestoffet og teststoffet fyldes i hver effusionscelle, metalmembranen med åbningen fastgøres ved hjælp af låget med gevind, og hver celle vejes med en nøjagtighed på 0,1 mg. Cellen anbringes i det termostaterede apparat, som derefter evakueres til et tryk, der er mindre end en tiendedel af det forventede. Med på forhånd fastsatte tidsintervaller på mellem 5 og 30 timer lukkes der luft ind i apparatet, og effusionscellernes massetab bestemmes ved vejning. For at sikre at resultaterne ikke påvirkes af flygtige bestanddele, vejes cellen med faste mellemrum, så det kan kontrolleres, at fordampningshastigheden er konstant over mindst to tidsintervaller. Damptrykket p i effusionscellen er givet ved: p = mKAt2 π R TM hvor p damptrykket (Pa) m massen af den stofmængde, der forlader cellen i tidsrummet t (kg) t tiden (s) A hullets areal (m2) K korrektionsfaktor R gaskonstanten (Jmol-1 K -1) T temperaturen (K) M molekylmassen (kg mol-1) Korrektionsfaktoren K afhænger af forholdet mellem den cylindriske åbnings længde og radius: forhold 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Ovenstående ligning kan omskrives til: p = E mtTM hvor E = 1KA2πR er effusionscellekonstanten. Denne effusionscellekonstant kan bestemmes ved hjælp af referencestoffer (2,9) ud fra følgende ligning: E = p(r)tmM(r)T hvor p(r) referencestoffets damptryk (Pa) M(r) referencestoffets molekylmasse (kg × mol-1)
1.6.6. Gasmætningsmetode
1.6.6.
1.6.6.1. Apparatur Et typisk apparat til udførelse af denne prøvning består af de komponenter, der er vist i figur 6a og beskrevet nedenfor (1).
1.6.6.1. Inert gas:
Bæregassen må ikke reagere kemisk med teststoffet. Det er normalt tilstrækkeligt at anvende nitrogen til dette formål, men undertiden kan der kræves andre gasser (10). Den anvendte gas skal være tør (se figur 6a, nr. 4: føler for relativ fugtighed).
Strømningsregulering
Der kræves et velegnet gasreguleringssystem for at sikre konstant og valgbar gennemstrømningshastighed gennem mætningskolonnen.
Fælder til opsamling af damp:
Disse afhænger af den aktuelle prøves egenskaber og af den valgte analysemetode. Dampen skal indfanges kvantitativt og i en form, som tillader efterfølgende analyse. Til visse stoffer vil fælder, der indeholder væsker såsom hexan eller ethylenglycol, være velegnede. Til andre vil der kunne anvendes faste absorptionsmidler. Som alternativ til opsamling af damp og efterfølgende analyse kan der benyttes in-line analyseteknikker, som f.eks. chromatografi, til kvantitativ bestemmelse af den mængde materiale, som en kendt mængde bæregas fører med sig. Desuden kan prøvens massetab måles.
Varmeveksler:
Til målinger ved forskellige temperaturer kan det være nødvendigt at indsætte en varmeveksler i opstillingen.
Mætningskolonne:
Teststoffet overføres til en egnet inaktiv bærer fra en opløsning. Den coatede bærer pakkes i mætningskolonnen; dennes dimensioner og gennemstrømningshastigheden skal afpasses således, at man er sikker på, at bæregassen bliver mættet. Mætningskolonnen skal være termostateret. Ved målinger over stuetemperatur skal stykket mellem mætningskolonnen og fælderne opvarmes, så kondensation af teststoffet undgås. For at mindske massetransport ved diffusion kan der anbringes et kapillarrør efter mætningskolonnen (figur 6b).
1.6.6.2. Fremgangsmåde ved målingen
1.6.6.2. Klargøring af mætningskolonnen:
En opløsning af teststoffet i et meget letflygtigt opløsningsmiddel blandes med en passende mængde af bæreren. Der skal være tilstrækkeligt med teststof til, at der finder mætning sted under hele testens varighed. Opløsningsmidlet afdampes fuldstændigt i luft eller i en rotationsfordamper, og efter omhyggelig blanding fyldes materialet på mætningskolonnen. Efter at prøven er termostateret, ledes der tør nitrogen gennem apparatet.
Måling:
Fælderne eller in-line detektoren forbindes med kolonnens afgangsrør, og tiden registreres. Gennemstrømningshastigheden kontrolleres i begyndelsen og med regelmæssige mellemrum under forsøget ved anvendelse af en boblemåler (eller kontinuerligt med en massestrømsmåler). Trykket ved mætningskolonnens afgangsåbning skal måles. Dette kan ske ved: Den tid, der kræves til opsamling af den mængde teststof, der er nødvendig til de forskellige analysemetoder, bestemmes ved forforsøg eller skønnes. Som alternativ til opsamling af stoffet til senere analyse kan der benyttes kvantitative in-line analyseteknikker (f.eks. chromatografi). Før beregning af damptrykket ved en given temperatur udføres der forforsøg til bestemmelse af den maksimale flowhastighed, hvor bæregassen mættes fuldstændigt med stofdampe. Dette sikres ved at lede bæregassen så langsomt gennem mætningskolonnen, at en lavere hastighed ikke giver større beregnet damptryk. Den specifikke analysemetode vil afhænge af arten af teststof, der undersøges (f.eks. gaschromatografi eller gravimetri). Den mængde stof, som et kendt rumfang bæregas fører med sig, bestemmes.
a)
enten at indsætte en trykmåler mellem mætningskolonnen og fælderne (hvilket kan være utilfredsstillende på grund af øget dødvolumen og større adsorptionsflade)
b)
eller at bestemme trykfaldet over det bestemte fældesystem, der benyttes, som funktion af gennemstrømningshastigheden i et særskilt forsøg (hvilket kan være lidet tilfredsstillende for væskefælder).
1.6.6.3. Beregning af damptryk Damptrykket beregnes ud fra dampens massefylde W/V ved hjælp af ligningen: p = WV × RTM hvor: P damptrykket (Pa) W massen af den stofmængde, der er fordampet (g) V rumfang mættet gas (m3) R gaskonstanten (Jmol-1 K-1) T temperaturen (K) M teststoffets molekylmasse (g mol-1) De målte rumfang skal korrigeres for temperaturforskelle mellem flowmeteret og den termostaterede mætningskolonne. Hvis flowmeteret er placeret efter dampfælden, kan det være nødvendigt at korrigere for eventuelt fordampede bestanddele fra fælden (1).
1.6.7. Roterende kugle (8, 11, 13)
1.6.7.
1.6.7.1. Apparatur Metoden kan udføres ved hjælp af en viskositetsmåler med roterende kugle som vist på figur 8. Figur 7 viser forsøgsopstillingen skematisk. Måleopstillingen består typisk af et målehoved med roterende kugle anbragt i et termostateret hus (kontrolleret inden for 0,1 oC). Testbeholderen er ligeledes anbragt i et termostateret hus (kontrolleret inden for 0,01 oC), og alle opstillingens komponenter holdes ved en højere temperatur for at undgå kondensation. Systemet er ved hjælp af højvakuumventiler forbundet med en højvakuumpumpe. Målehovedet består af en stålkugle (4 til 5 mm diameter) i et rør. Kuglen holdes stabilt svævende af et magnetfelt, sædvanligvis ved en kombination af permanentmagneter og styrespoler. Kuglen sættes i rotation ved hjælp af roterende felter, der frembringes af spolerne. Rotationshastigheden måles med detektorspoler, der måler den svage tværmagnetisering af kuglen, der altid vil være til stede.
1.6.7.2. Fremgangsmåde ved målingen Når kuglen har opnået en bestemt rotationshastighed v(o) (normalt omkring 400 omdrejninger pr. sekund), afbrydes energitilførslen, og gasfriktionen begynder at decelerere kuglens rotation. Rotationshastighedstabet måles som funktion af tiden. Da friktionen i det magnetiske ophæng er ubetydelig sammenlignet med gasfriktionen, er gastrykket givet ved udtrykket: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) hvor c— gasmolekylernes gennemsnitshastighed r kuglens radius ρ kuglens massefylde σ koefficient for tangential impulsoverførsel ((ε = 1 for en ideal kugleflade t tiden v(t) rotationshastigheden efter tiden t v(o) begyndelsesrotationshastigheden Dette udtryk kan også omskrives til p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 hvor tn, og tn - 1 er den tid, der kræves til et givet antal omdrejninger N. Disse tn og tn-1 følger lige efter hinanden, og tn > t n - 1. Gasmolekylernes gennemsnitshastighed c— er givet ved c— = 8 RTπ M12 hvor: T temperaturen R gaskonstanten M molekylmassen
2. DATA Damptrykket bestemt ved en hvilken som helst af de ovenfor beskrevne metoder bør bestemmes ved mindst to temperaturer. Tre eller flere er ønskelige i området 0 til 50 oC, så damptrykkurvens linearitet kan kontrolleres.
3. RAPPORTERING Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger: Hvis der er iagttaget omdannelse (ændring i tilstandsform eller dekomponering), skal følgende oplysninger fremgå: Alle oplysninger og bemærkninger af betydning for vurdering af resultaterne, især vedrørende urenheder og stoffets fysiske tilstand, skal anføres.
anvendt metode
nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder) og eventuel indledende rensning
mindst to værdier for damptryk og temperatur, helst i området mellem 0 og 50 oC
alle rådata
en afbildning af log p mod 1/T
et skøn over damptrykket ved 20 eller 25 oC.
ændringens art
den temperatur, hvor ændringen sker ved atmosfæretryk
damptrykket ved 10 og 20 oC under overgangstemperaturen og ved 10 og 20 oC over denne temperatur (medmindre overgangen er fra fast stof til gas).
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
HENVISNINGER OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593. NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa — Static method. NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa — Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure — temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987,'VoI. 5 (4), 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173. B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435. G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, Vol. 17 (2), 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, voI. 20 (4), 1148. J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, Vol. 3 (3), 1715.
A.5. OVERFLADESPÆNDING
A.5.
1. METODE De beskrevne metoder er baseret på OECD-testvejledningen (1). Grundprincipperne er anført i henvisning (2).
1.
1.1. INDLEDNING De beskrevne metoder anvendes til måling af vandige opløsningers overfladespænding. Ved udførelsen af denne test er det nyttigt at have forhåndsoplysninger om stoffets vandopløselighed, struktur, hydrolyseegenskaber og kritiske koncentrationer for micelledannelse. De følgende metoder kan anvendes for de fleste kemiske stoffer uanset renheden. Måling af overfladespænding ved ringtensiometermetoden er begrænset til vandige opløsninger med en dynamisk viskositet på mindre end ca. 200 mPa s.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Den frie overfladeenthalpi pr. overfladearealenhed betegnes som overfladespændingen. Overfladespændingen angives i: N/m (SI-enhed) eller mN/m (SI-underenhed) 1 N/m = 103 dyn/cm 1 mN/m = 1 dyn/cm i det gamle cgs-system
1.3. REFERENCESTOFFER Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnået med andre metoder. Referencestoffer, som dækker et bredt udvalg af overfladespændinger, er angivet i henvisning (1) og (3).
1.4. METODERNES PRINCIP Metoderne er baseret på måling af den største kraft, der skal udøves lodret på en stigbøjle eller ring i kontakt med væskeoverfladen af en prøve i et målekar, for at denne kontakt brydes, eller den lodrette kraft, som skal udøves på en plade, hvis ene kant er i kontakt med prøvens overflade, for at den dannede hinde brydes. Stoffer, hvis opløselighed i vand er mindst 1 mg/l, testes i vandig opløsning ved én koncentration.
1.5. KVALITETSKRITERIER Disse metoder kan give større nøjagtighed, end der må forventes krævet ved miljøvurderinger.
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE Der fremstilles en opløsning af stoffet i destilleret vand. Koncentrationen af denne opløsning skal være 90 % af stoffets mætningskoncentration i vand; er denne koncentration større end 1 g/l, benyttes der en koncentration på 1 g/l til testen. Stoffer med en opløselighed i vand på mindre end 1 mg/l behøver ikke at testes.
1.6.
1.6.1. Plademetoden Se ISO 304 og NF T 73-060 (Surface active agents — determination of surface tension by drawing up liquid films).
1.6.2. Stigbøjlemetoden Se ISO 304 og NF T 73-060 (Surface active agents — determination of surface tension by drawing up liquid films).
1.6.3. Ringmetoden Se ISO 304 og NF T 73-060 (Surface active agents — determination of surface tension by drawing up liquid films).
1.6.4. OECD-harmoniseret ringmetode
1.6.4.
1.6.4.1. Apparatur Kommercielt tilgængelige tensiometre er tilstrækkelige til denne måling. De består af følgende dele:
bevægeligt prøvebord
kraftmålingssystem
målelegeme (ring)
målekar.
1.6.4.1.
1.6.4.1.1. Bevægeligt prøvebord Det bevægelige prøvebord anvendes til understøttelse af det termostaterede målekar, som rummer den væske, der skal undersøges. Sammen med kraftmålingssystemet er det monteret på et stativ.
1.6.4.1.2. Kraftmålingssystem Kraftmålingssystemet (se figuren) er placeret over prøvebordet. Usikkerheden ved kraftmålingen må ikke overstige ± 10–6 N, svarende til en usikkerhed på ±0,1 mg ved en vejning. Oftest er måleskalæn på de kommercielt tilgængelige tensiometre inddelt i mN/m, således at overfladespændingen direkte kan aflæses i mN/m med en nøjagtighed på 0,1 mN/m.
1.6.4.1.3. Målelegeme (ring) Ringen er sædvanligvis fremstillet af en platin-iridium-tråd med en tykkelse på ca. 0,4 mm og en middelomkreds på 60 mm. Trådringen er ophængt vandret fra en metalstang og en trådbærearm, som danner forbindelsen til kraftmålingssystemet (se figuren).
1.6.4.1.3. Figur Målelegeme
(alle dimensioner er i mm) Bærearm Stang Ring
1.6.4.1.4. Målekar Målekarret, som rummer testopløsningen, skal være et termostateret glaskar. Det skal have en sådan form, at temperaturen af testopløsningen og gasfasen herover er konstant under målingen, og at prøven ikke kan fordampe. Cylindriske glaskar med en indre diameter på mindst 45 mm er acceptable.
1.6.4.2. Klargøring af apparatet
1.6.4.2.
1.6.4.2.1. Rengøring Glaskar rengøres omhyggeligt. Om nødvendigt vaskes de først med varm chromsvovlsyre og dernæst med en tyktflydende phosphorsyreopløsning (83 til 98 w/w % H3PO4). Herefter skylles omhyggeligt i ledningsvand og endelig vaskes i redestilleret vand til neutral reaktion. Til sidst tørres karrene, eller de skylles i noget af den prøvevæske, som skal måles. Ringen renses først grundigt i vand, så alle vandopløselige stoffer fjernes. Derefter nedsænkes den et øjeblik i chromsvovlsyre, skylles i redestilleret vand til neutral reaktion og opvarmes til sidst et øjeblik over en methanolflamme. Bemærk: Forurening med stoffer, som ikke opløses eller destrueres af chromsvovlsyre eller phosphorsyre, som f.eks. silikoner, fjernes ved hjælp af et passende organisk opløsningsmiddel.
1.6.4.2.2. Kalibrering af apparatet Apparatet klargøres ved, at nulpunktet justeres, og apparatet indstilles til pålidelig aflæsning i mN/m.
1.6.4.2.2. Opstilling:
Apparatet skal stilles i vater, f.eks. ved hjælp af et vaterpas på tensiometrets fod, idet man justerer stilleskruerne.
Nulpunktsindstilling:
Efter montering af ringen i apparatet, men inden den nedsænkes i væsken, skal tensiometerviseren indstilles på nul, og man kontrollerer, at ringen er parallel med væskeoverfladen. Til dette kan væskeoverfladen anvendes som et spejl.
Kalibreringer:
Prøvekalibreringen kan udføres ved en af de følgende to metoder:
a)
ved hjælp af lodder: dette er en fremgangsmåde, hvor ryttere af kendt masse mellem 0,1 og 1,0 g anbringes på ringen. Kalibreringsfaktoren Φa, som alle instrumentaflæsninger skal multipliceres med, bestemmes ifølge ligning (1). Φa=σrσa (1) hvor: σr=mg2b(mN/m) m rytterens masse (g) g tyngdeaccelerationen (981 cm s-2 ved havoverfladen) b ringens middelomkreds (cm) σa tensiometeraflæsningen efter anbringelse af rytteren på ringen (mN/m).
b)
ved hjælp af vand: dette er en fremgangsmåde, hvor der anvendes rent vand, hvis overfladespænding ved f.eks. 23 oC er 72,3 mN/m. Denne fremgangsmåde er hurtigere at udføre end vægtkalibreringen, men der er altid risiko for, at vandets overfladespænding er ændret ved forurening med spor af overfladeaktive stoffer. Kalibreringsfaktoren, Φb, som alle instrumentaflæsninger skal multipliceres med, bestemmes ifølge ligning (2). Φb=σoσg (2) hvor: σo litteraturværdi for vands overfladespænding (mN/m) σg målt værdi for vands overfladespænding (mN/m) ved samme temperatur
1.6.4.3. Testforberedelse Der fremstilles vandige opløsninger med passende koncentrationer af de stoffer, som skal undersøges. Opløsningerne må ikke indeholde uopløst stof. Opløsningerne holdes ved konstant temperatur (±0,5 oC). Idet en opløsnings overfladespænding ændres i målekarret med tiden, må der foretages adskillige målinger på forskellige tidspunkter, og der afsættes en kurve, der viser overfladespændingen som funktion af tiden. Når overfladespændingen ikke ændres yderligere, er ligevægtstilstanden nået. Støv og gasformig forurening med andre stoffer forstyrrer målingen, hvorfor arbejdet bør udføres under et beskyttende dække.
1.6.5. Testbetingelser Målingerne foretages ved ca. 20 oC, og temperaturen skal holdes inden for ±0,5 oC.
1.6.6. Udførelse af testen De opløsninger, som skal måles, fyldes i det omhyggeligt rengjorte målekar, idet man undgår skumning. Målekarret anbringes på apparatets prøvebord. Bordet med målekarret hæves, indtil ringen er nedsænket fuldstændigt i den opløsning, som skal måles. Derefter sænkes bordet jævnt og gradvis (med en hastighed på ca. 0,5 cm/min) for at løsrive ringen fra overfladen, indtil den største kraft er nået. Det væskelag, som hænger ved ringen, må ikke fjernes fra denne. Når målingen er udført, nedsænkes ringen atter i væsken, og målingen gentages, indtil der opnås konstante værdier for overfladespændingen. Den tid, der er gået fra overførsel af opløsningen til målekarret og til selve målingen udføres, noteres ved hver bestemmelse. Aflæsningerne skal foretages ved den største kraft, som kræves til løsrivning af ringen fra væskeoverfladen.
2. Tabel Korrektion af den målte overfladespænding Kun for vandige opløsninger, p = 1 g/cm3
DATA For at beregne overfladespændingen skal den værdi, som er aflæst i mN/m på apparatet, først multipliceres med kalibreringsfaktoren Φa eller Φb (afhængigt af den anvendte kalibreringsmetode). Dette giver en værdi, som kun gælder tilnærmelsesvis, og som derfor kræver korrektion. Harkins og Jordan (4) har empirisk bestemt korrektionsfaktorer for værdier af overfladespændingen, som er bestemt med ringmetoden; disse faktorer afhænger af ringens dimensioner, væskens massefylde og dens overfladespænding. Da det er besværligt for hver enkelt måling at bestemme korrektionsfaktoren ud fra Harkins og Jordans tabeller for at beregne overfladespænding, kan man for vandige opløsninger benytte en forenklet metode, hvor de korrigerede værdier for overfladespændingen direkte aflæses i den nedenstående tabel (der anvendes interpolation til aflæsninger, som ligger mellem tabelværdierne). R = 9,55 mm (gennemsnitlig ringradius) r = 0,185 mm (ringtrådens radius) Eksperimentel værdi (mN/m) Korrigeret værdi (mN/m) kalibrering med lodder (se 1.6.4.2.2. a)) kalibrering med vand (se 1.6.4.2.2. b)) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Denne tabel er udarbejdet på basis af Harkins-Jordan korrektioner, og ligner den, der er i DIN-standarden (DIN 53914) for vand og vandige opløsninger (massefylde ρ = 1 g/cm3) og for en kommerciel tilgængelig ring med dimensionerne R = 9,55 mm (middelringradius) og r = 0,185 mm (ringtrådens radius). Tabellen angiver korrigerede værdier for overfladespændingsmålinger, der er foretaget efter kalibrering med lodder eller vand. Alternativt kan overfladespændingen uden forudgående kalibrering beregnes efter følgende formel: σ=fxF4πR hvor: F kraften målt på dynamometeret, idet hinden brydes R ringens radius f korrektionsfaktoren (1)
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:
anvendt metode
anvendt type vand eller opløsning
nøjagtig specifikation af stoffet (identitet og urenheder)
måleresultater: overfladespænding (aflæsning) med angivelse af både de enkelte målinger, deres middelværdi og den korrigerede middelværdi (med hensyn til apparatfaktoren og korrektionstabellen)
opløsningens koncentration
testtemperaturen
den anvendte opløsnings alder, og specielt den tid, der er forløbet mellem fremstillingen af opløsningen og målingen
beskrivelse af overfladespændingens tidsafhængighed efter overførsel til målekarret
alle oplysninger og bemærkninger af betydning for vurdering af resultaterne, især vedrørende urenheder og stoffets fysiske tilstandsform.
3.2. FORTOLKNING AF RESULTATERNE På baggrund af vands overfladespænding på 72,75 mN/m ved 20 oC anses stoffer med en overfladespænding på mindre end 60 mN/m bestemt ved denne metode for at være overfladeaktive.
4.(1)(2)(3)(4)
HENVISNINGER OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.
A.6. VANDOPLØSELIGHED
A.6.
1. METODE De beskrevne metoder er baseret på OECD-testvejledningen (1).
1.
1.1. INDLEDNING Ved udførelse af denne test er det nyttigt at have forhåndsoplysninger om stoffets strukturformel, damptryk, dissociationskonstant og hydrolyse (som funktion af pH). Der findes ikke én enkelt metode, der dækker hele området af vandopløselighed. De to testmetoder, der er beskrevet nedenfor, dækker hele opløselighedsområdet, men egner sig ikke til flygtige stoffer De undersøgte stoffers vandopløselighed kan i betragtelig grad afhænge af tilstedeværelsen af urenheder.
en, der kan anvendes til stoffer, som i det væsentlige er rene, med lav opløselighed (< 10-2 g/l), og som er stabile i vand, betegnet kolonne-eluerings-metoden
en der kan anvendes til stoffer, som i det væsentlige er rene, med større opløselighed (> 10-2 g/l), og som er stabile i vand, betegnet kolbe-metoden.
1.2. DEFINITION OG ENHEDER Et stofs opløselighed i vand angives ved mætningskoncentrationen af stoffet i vand ved en given temperatur. Opløseligheden i vand angives i enheden masse pr. rumfang opløsning. SI-enheden er kg/m3 (g/l kan også anvendes).
1.3. REFERENCESTOFFER Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnået med andre metoder.
1.4. PRØVNINGSMETODENS PRINCIP Ved en simpel foreløbig test undersøges, omtrentligt hvor meget materiale og hvor lang tid der kræves til at nå mætningskoncentrationen.
1.4.
1.4.1. Kolonne-eluerings-metoden Denne metode er baseret på eluering af det undersøgte stof med vand fra en mikrokolonne, der indeholder et inert bæremateriale såsom glaskugler eller sand, belagt med overskud af teststof. Vandopløseligheden bestemmes, når koncentrationen i eluatet bliver konstant. Dette fremkommer som et koncentrationsplateau som en funktion af tiden.
1.4.2. Kolbe-metoden Ved denne metode opløses stoffet (faste stoffer pulveriseres) i vand ved en temperatur noget over testningstemperaturen. Når mætning er opnået, afkøles blandingen til testningstemperatur og holdes der under omrøring så længe, som det er nødvendigt for at opnå ligevægt. Alternativt kan målingen foretages direkte ved testningstemperaturen, hvis det ved passende prøvetagning godtgøres, at mætningsligevægten er nået. Derefter bestemmes massekoncentrationen af stoffet i den vandige opløsning, der ikke må indeholde uopløste partikler, ved en passende analysemetode.
1.5. KVALITETSKRITERIER
1.5.
1.5.1. Repeterbarhed For kolonne-eluerings-metoden er det muligt at opnå < 30 %; for kolbe-metoden bør den være < 15 %.
1.5.2. Følsomhed Denne afhænger af analysemetoden, men det er muligt at bestemme så lav en massekoncentration som 10-6 g/l.
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN
1.6.
1.6.1. Testbetingelser Testen udføres helst ved 20 oC ±0,5 oC. Hvis der er mistanke om, at opløseligheden er temperaturafhængig (> 3 % pr. oC) udføres der også undersøgelser ved to andre temperaturer, der er mindst 10 oC over og under den først valgte temperatur. I så tilfælde må temperaturkontrollen være ±0,1 oC. Den valgte temperature bør holdes konstant i alle relevante dele af udstyret.
1.6.2. Indledende test Til ca. 0,1 g af prøven (faste stoffer må være pulveriserede) i et 10 ml måleglas med glasprop sættes stigende mængder destilleret vand ved stuetemperatur, efter de i tabellen nedenfor angivne trin. 0,1 g stof opløselig i x ml vand 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 omtrentlig opløselighed (g/l) > 1000 1000-200 200-100 100-50 50-20 10-1 <1 Efter hver tilsætning af den angivne mængde vand til blandingen omrystes der kraftigt i 10 minutter, og det undersøges visuelt, om der er noget uopløst af prøven tilbage. Hvis prøven eller dele af prøven forbliver uopløst, efter at der er tilsat 10 ml, gentages forsøget i et 100 ml måleglas med en større vandmængde. Ved lavere opløseligheder kan den tid, der kræves til opløsning af et givet stof, være betragteligt længere (der bør ventes mindst 24 timer). Den anslåede opløselighed er angivet i tabellen under det rumfang af tilsat vand, der netop forårsagede en fuldstændig opløsning af prøven. Hvis stoffet stadig er tilsyneladende uopløst, øges henstandstiden ud over de 24 timer (højst 96 timer), eller der foretages yderligere fortynding, så det kan afgøres, om det er kolonne-eluerings- eller kolbe-metoden, der skal anvendes.
1.6.3. Kolonne-eluerings-metoden
1.6.3.
1.6.3.1. Bæremateriale, opløsningsmiddel og elueringsmiddel Bærematerialet til kolonne-eluerings-metoden skal være inert. Mulige materialer, der kan anvendes, er glaskugler og sand. Der anvendes et passende flygtigt opløsningsmiddel af analysekvalitet til at overføre teststoffet til bærematerialet. Som opløsningsmiddel anvendes der vand, der er dobbelt destilleret i glas- eller kvartsapparatur. Bemærk: Vand direkte fra en organisk ionbytter må ikke anvendes.
1.6.3.2. Afsætning på bærematerialet Ca. 600 mg bæremateriale afvejes og overføres til en 50 ml rundbundet kolbe. En passende, afvejet mængde af prøven opløses i det valgte opløsningsmiddel. En passende mængde af denne opløsning sættes til bærematerialet. Opløsningsmidlet skal afdampes fuldstændigt, f.eks. i en rotationsinddamper; i modsat fald vil der ikke kunne opnås mætning af bærematerialet med vand som følge af fordelingseffekter på overfladen af bærematerialet. Afsætningen på bærematerialet kan give problemer (fejlagtige resultater), hvis det undersøgte stof afsættes som en olie eller i en anden krystalstruktur. Dette problem må undersøges eksperimentelt, og resultaterne rapporteres. Det behandlede bæremateriale henstilles til kvældning i ca. to timer i ca. 5 ml vand, hvorefter suspensionen overføres til mikrokolonnen. Alternativt kan det tørre behandlede bæremateriale hældes i mikrokolonnen, der er fyldt med vand, og derefter henstå i ca. to timer til opnåelse af ligevægt.
1.6.3.2. Testprocedure:
Elueringen af stoffet fra bærematerialet kan udføres på en af de to forskellige måder:
med recirkulationspumpe (se figur 1)
med niveaubeholder (se figur 4).
1.6.3.3. Kolonne-eluerings-metoden med recirkulationspumpe
1.6.3.3. Apparatur
Et typisk system er vist skematisk i figur 1. En egnet mikrokolonne er vist i figur 2, om end en hvilken som helst størrelse kan anvendes, forudsat at den opfylder kriterierne for reproducerbarhed og følsomhed. Kolonnen skal have et head-space på mindst fem bed-volumen vand og kunne rumme mindst fem prøver. Alternativt kan størrelsen reduceres, hvis der tilsættes opløsningsmiddel som erstatning for de første fem bed-rumfang, der fjernes med urenheder. Kolonnen skal forbindes til en recirkulationspumpe, der kan reguleres til en strømningshastighed på ca. 25 ml/h. Pumpen forbindes med tilslutning af polytetrafluorethylen (PTFE) og/eller glas. Kolonnen og pumpen skal, når de er forbundet, give mulighed for udtagning af prøver af den eluerede væske og for indstilling af head-space-ligevægt ved atmosfæretryk. Kolonnematerialet holdes oppe med en lille (5 mm) prop af glasuld, der også fungerer som filter for partikler. Recirkulationspumpen kan f.eks. være en slangepumpe (man må være omhyggelig med ikke at få kontaminering af og/eller sorption på slangematerialet) eller en membranpumpe.
Fremgangsmåde ved målingen
Væskestrømmen gennem kolonnen startes. Det anbefales at bruge en strømningshastighed på ca. 25 ml/h (hvilket svarer til ca. ti bed-rumfang pr. time for den beskrevne kolonne). De første fem bed-rumfang (minimum) bortkastes, så vandopløselige urenheder fjernes. Derefter kører recirkulationspumpen, til der er opnået ligevægt, defineret ved at fem på hinanden følgende prøver giver koncentrationer, der ikke afviger mere end ± 30 % på tilfældig måde. Disse prøver bør være adskilt fra hinanden ved tidsintervaller, der svarer til et gennemløb af mindst ti bed-rumfang af opløsningsmiddel.
1.6.3.4. Kolonne-eluerings-metoden med niveaubeholder
1.6.3.4. Apparatur (se figur 4 og 3)
Niveaubeholder: Forbindelsen til niveaubeholderen etableres ved at anvende et glasslibovergangsstykke, der tilsluttes med en PTFE-slange. Det anbefales, at der anvendes en gennemstrømningshastighed på ca. 25 ml/time. Successive fraktioner af eluatet opsamles og analyseres efter den valgte metode.
Fremgangsmåde ved målingen
De fraktioner fra det midterste elueringsområde, hvor koncentrationerne er konstante (± 30 %) i mindst fem på hinanden følgende prøver, anvendes til at bestemme opløseligheden i vand. I begge tilfælde (anvendelse af recirkulationspumpe eller niveaubeholder) udføres endnu et forsøg med halvt så høj gennemstrømningshastighed som det første. Hvis resultaterne fra de to forsøg stemmer overens, er testen tilfredsstillende; hvis der er en større opløselighed ved den lavere hastighed, må halveringen af gennemstrømningshastigheden fortsættes, indtil to på hinanden følgende forsøg giver samme opløselighed. I begge tilfælde (anvendelse af recirkulationspumpe eller niveaubeholder) kontrolleres fraktionerne for tilstedeværelse af kolloidt materiale ved hjælp af Tyndall-effekten (lysspredning). Tilstedeværelse af sådanne partikler gør resultaterne ubrugelige, og testen må gentages efter forbedring af kolonnens filtreringsformåen. pH i alle prøver registreres. Der udføres endnu et forsøg ved samme temperatur.
1.6.4. Kolbe-metoden
1.6.4.
1.6.4.1. Apparatur Til kolbe-metoden kræves følgende udstyr:
normalt laboratorieglasudstyr og -instrumentering
udstyr til rystning/omrøring af opløsninger ved kontrolleret konstant temperatur
eventuelt en centrifuge (helst termostateret) til emulsioner og
udstyr til analytisk bestemmelse.
1.6.4.2. Fremgangsmåde ved målingen Den mængde materiale, der er nødvendig for at mætte det ønskede rumfang vand, anslås ud fra den foreløbige test. Det fornødne rumfang vand vil afhænge af den analytiske metode og opløselighedsområdet. Ca. fem gange den mængde stof, der er bestemt ovenfor, afvejes i hver af tre beholdere med glasprop (f.eks. centrifugeglas eller kolber). Det valgte rumfang vand sættes til hver beholder, og beholderne lukkes helt tæt. De lukkede beholdere rystes/omrøres derefter ved 30 oC. (Der anvendes ryste- eller omrørerudstyr, som kan operere ved konstant temperatur, f.eks. magnetomrøring i et termostatbad). Efter en dag fjernes én af beholderne, og den henstilles til opnåelse af ligevægt i 24 timer ved den ønskede temperatur og lejlighedsvis omrystning. Indholdet i beholderen centrifugeres derefter ved testtemperaturen, og koncentrationen af stoffet i den klare vandige fase bestemmes med en passende analysemetode. De andre to kolber behandles på samme måde efter forudgående opnåelse af ligevægt ved 30 oC i henholdsvis to og tre dage. Hvis koncentrationsresultaterne fra mindst to af beholderne opfylder den krævede reproducerbarhed, er testen tilfredsstillende. Hvis resultaterne fra beholder 1, 2 og 3 viser en stigende tendens, gentages hele forsøget under anvendelse af længere tider til opnåelse af ligevægt. Måleproceduren kan også udføres uden forudgående henstand ved 30 oC. Der opnås et skøn over, hvor hurtigt mætningsligevægten indstiller sig, ved udtagning af prøver, indtil omrøringstiden ikke længere indvirker på prøveopløsningens koncentration. pH i alle prøver registreres.
1.6.5. Analyse Der foretrækkes en stofspecifik analysemetode til disse bestemmelser, eftersom små mængder af opløselige urenheder kan forårsage store fejl i den målte opløselighed. Eksempler på sådanne metoder er gas- eller væskechromatografi, titreringsmetoder, fotometriske metoder og voltametriske metoder.
2. DATA
2.
2.1. KOLONNE-ELUERINGS-METODEN Middelværdien samt standardafvigelsen for mindst fem på hinanden følgende prøver taget ved mætningsplateauet udregnes for hvert forsøg. Resultaterne anføres i masseenhed pr. volumenenhed opløsning. Gennemsnittene fra to forsøg med forskellige strømningshastigheder sammenlignes, og repeterbarheden skal være bedre end 30 %
2.2. KOLBE-METODEN De enkelte resultater skal angives for hver af de tre kolber, og for de resultater, der skønnes at være konstante (repeterbarhed bedre end 15 %), beregnes gennemsnittet, og det angives i masseenhed pr. volumenenhed opløsning. Dette kan kræve omregning af masseenhed til volumenenhed ved hjælp af massefylden, hvis opløseligheden er meget høj (> 100 g/l).
3. RAPPORTERING
3.
3.1. KOLONNE-ELUERINGS-METODEN Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:
resultaterne af den foreløbige test
nøjagtig specifikation af stoffet (identitet og urenheder)
koncentration, gennemstrømningshastighed og pH for hver enkelt prøve
middelværdi og standardafvigelse for mindst fem prøver fra mætningsplateauet fra hvert forsøg
gennemsnittet af to successive, acceptable forsøg
vandtemperaturen under mætningsprocessen
den anvendte analysemetode
arten af det anvendte bæremateriale
afsætning på bærematerialet
anvendt opløsningsmiddel
tegn på eventuel kemisk ustabilitet af stoffet under testen og den anvendte metode
alle oplysninger af betydning for vurdering af resultaterne, især vedrørende urenheder og stoffets fysiske tilstandsform.
3.2. KOLBEMETODEN Testrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:
resultaterne af den foreløbige test
nøjagtig specifikation af stoffet (identitet og urenheder)
de enkelte analyseresultater og gennemsnittet, når der er bestemt mere end én værdi for hver kolbe
pH i hver prøve
gennemsnitsværdien for de forskellige kolber, der stemte overens
analysetemperaturen
den anvendte analysemetode
tegn på eventuel kemisk ustabilitet af stoffet under testen og den anvendte metode
alle oplysninger af betydning for vurdering af resultaterne, især vedrørende urenheder og stoffets fysiske tilstandsform.
4.(1)(2)(3) HENVISNINGER OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method. NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.
A.8. FORDELINGSKOEFFICIENT
A.8.
1. METODE Den beskrevne rystekolbemetode er baseret på OECD-testvejledningen (1).
1.
1.1. INDLEDNING Ved udførelse af denne test er det nyttigt at have forhåndsoplysninger om stoffets strukturformel, dissociationskonstant, vandopløselighed, hydrolyse, opløselighed i n-octanol og overfladespænding. Målinger på ioniserbare stoffer udføres på den ikke-ioniserede form (fri syre eller fri base) dvs. ved anvendelse af en passende buffer med en pH-værdi på mindst 1 enhed under (fri syre) eller over (fri base) stoffets pK-værdi. Testmetoden omfatter to særskilte fremgangsmåder — rystekolbemetoden og højtydende væskekromatografi (HPLC). Førstnævnte er brugbar, når værdien af log Pow (se definitionerne nedenfor) ligger mellem — 2 og 4, og sidstnævnte i området mellem 0 og 6. Førend nogen af fremgangsmåderne påbegyndes, foretages der er foreløbigt skøn over fordelingskoefficienten. Rystekolbemetoden kan kun benyttes for stoffer, der i alt væsentligt er rene, og som er opløselige i vand og n-octanol. Den kan ikke anvendes til overfladeaktive materialer (for hvilke der anføres en beregnet værdi eller et skøn baseret på opløseligheden i henholdsvis n-octanol og vand). HPLC-metoden kan ikke benyttes til stærke syrer og baser, metalkomplekser, overfladeaktive stoffer og stoffer, der reagerer med elueringsmidlet. For sådanne materialer anføres der en beregnet værdi eller et skøn baseret på opløseligheden i henholdsvis n-octanol og vand. HPLC-metoden er mindre følsom end rystekolbemetoden over for urenheder i teststoffet. Ikke desto mindre kan urenheder i visse tilfælde vanskeliggøre fortolkningen af resultaterne på grund af usikker tilforordning af toppene. For blandinger med et uopløst bånd anføres en øvre og nedre grænse for log P.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Fordelingkoefficienten (P) defineres som forholdet mellem ligevægtskoncentrationerne (ci) af et stof, der er opløst i et tofasesystem bestående af to stort set ublandbare opløsningsmidler. I tilfældet n-octanol og vand: pow=cn-octanolcvand Fordelingskoefficienten (P) er derfor et forhold mellem to koncentrationer og opgives ofte som titalslogaritmen (log P).
1.3. REFERENCESTOFFER
1.3. Rystekolbemetoden
Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnået med andre metoder.
HPLC-metoden
For at kunne korrelere målte HPLC-data for et stof med dets P-værdi må der fastlægges en kalibreringskurve for log P mod kromatografiske data, som er baseret på mindst seks referencepunkter. Det er op til brugeren at vælge de egnede referencestoffer. Så vidt muligt skal der være mindst ét referencestof med en Pow-værdi, der ligger over teststoffets, og mindst ét med en Pow-værdi under teststoffets. For værdier af log P under 4 kan kalibreringen baseres på data opnået med rystekolbemetoden. For værdier af log P over 4 kan kalibreringen baseres på validerede litteraturværdier, hvis de stemmer overens med beregnede værdier. Af hensyn til nøjagtigheden anbefales at vælge referencestoffer, der strukturmæssigt ligner teststoffet. Der foreligger omfattende lister med værdier for log Pow for mange grupper af kemikalier (2)(3). Hvis der ikke foreligger data om fordelingskoefficienter for strukturmæssigt beslægtede stoffer, kan der bruges en mere generel kalibrering foretaget med andre referencestoffer. Der er i tillæg 2 en liste over anbefalede referencestoffer og deres Pow-værdier
1.4. METODENS PRINCIP
1.4.
1.4.1. Rystekolbemetoden For at kunne bestemme fordelingskoefficienten må der opnås ligevægt mellem alle komponenterne i systemet, og koncentrationerne af de i de to faser opløste stoffer må bestemmes. En gennemgang af litteraturen herom har vist, at der kan benyttes en række forskellige teknikker til at løse dette problem, dvs. omhyggelig blanding af de to faser og bestemmelse af ligevægtskoncentrationen af det undersøgte stof efter adskillelse af faserne.
1.4.2. HPLC-metoden HPLC udføres på analytiske kolonner pakket med en kommercielt tilgængelig fast fase indeholdende lange kulbrintekæder (f.eks. C8, C18) kemisk bundet til silica. Indsprøjtes der kemikalier på en sådan kolonne, vil de vandre gennem den med forskellig hastighed, da deres fordeling mellem den mobile fase og den stationære kulbrintefase ikke er den samme. Kemikalieblandinger elueres i rækkefølge efter hydrofobicitet, idet de vandopløselige kemikalier elueres først og de olieopløselige sidst, alt efter deres kulbrinte/vand-fordelingskoefficient. Derved kan sammenhængen mellem retentionstiden på en sådan kolonne (med omvendt fase) og n-octanol/vand-fordelingskøfficienten fastslås. Fordelingskoefficienten udledes af kapacitetsfaktoren k, der er givet ved udtrykket: k=tr-toto hvor tr er teststoffets retentionstid og to er den tid, et opløsningsmiddelmolekyle i gennemsnit bruger på at komme gennem kolonnen (kolonnens dødtid). Der kræves ikke kvantitative analysemetoder, og det er kun nødvendigt at bestemme retentionstiderne.
1.5. KVALITETSKRITERIER
1.5.
1.5.1. Repeterbarhed
1.5.1. Rystekolbemetoden
For at opnå en tilstrækkeligt nøjagtig fordelingskoefficient foretages der dobbeltbestemmelse under tre forskellige testbetingelser, hvor både stofmængden og forholdet mellem opløsningsmidlerne kan varieres. De fundne værdier af fordelingskoefficienten skal, når de udtrykkes som titalslogaritmer, ligge inden for et interval på ±0,3.
HPLC-metoden
For at øge tilliden til målingen foretages der dobbeltbestemmelse. Værdier af log P beregnet ud fra de enkelte målinger skal ligge inden for et interval på ±0,1.
1.5.2. Følsomhed
1.5.2. Rystekolbemetoden
Metodens måleområde afgrænses af analysemetodens påvisningsgrænse. Den skal tillade bestemmelse af værdier for log Pow i området fra 2 til 4 (under visse omstændigheder op til 5), når koncentrationen af opløst stof ikke er større end 0,01 mol pr. liter i nogen af faserne.
HPLC-metoden
Med HPLC-metoden kan der skønnes fordelingskoefficienter i log Pow-området fra 0 til 6. Normalt kan en forbindelses fordelingskoefficient skønnes med en afvigelse på mindre end ± 1 fra den værdi, der opnås med rystekolbemetoden. Typiske korrelationer fremgår af henvisning (4)(5)(6)(7)(8). Der kan normalt opnås større nøjagtighed, hvis der anvendes korrelationskurver bestemt med strukturmæssigt beslægtede referencestoffer (9).
1.5.3. Specificitet
1.5.3. Rystekolbemetoden
Nernsts fordelingslov gælder kun for fortyndede opløsninger ved konstant temperatur, tryk og pH. Den gælder kun for et enkelt stof, der er fordelt mellem to rene opløsningsmidler. Hvis der forekommer flere opløste stoffer i den ene eller i begge faser samtidig, kan dette påvirke resultaterne. Dissociering eller associering af de opløste molekyler resulterer i afvigelser fra Nernsts fordelingslov. At fordelingskoefficienten afhænger af opløsningens koncentration er tegn på en sådan afvigelse. På grund af de mange involverede ligevægte, må metoden ikke anvendes på ioniserbare stoffer uden korrektion. For sådanne stoffer kan det overvejes at benytte bufferopløsninger i stedet for vand; i så fald skal bufferens pH ligge mindst 1 enhed fra stoffets pKa, og dette pH's relevans for miljøet skal overvejes
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN
1.6.
1.6.1. Indledende skøn over fordelingskoefficienten Der kan dannes et skøn over fordelingskoefficienten enten ved beregning (se tillæg 1), hvilket foretrækkes, eller i givet fald ud fra teststoffets opløselighed i de rene opløsningsmidler (10).
1.6.2. Rystekolbemetoden
1.6.2.
1.6.2.1. Forberedelser n-octanol: bestemmelsen af fordelingskoefficienten udføres med reagenser af analysekvalitet. vand: der anvendes vand, som er destilleret eller dobbeltdestilleret i glas- eller kvartsapparatur. Til ioniserbare forbindelser benyttes der bufferopløsninger i stedet for vand, hvis der er gode grunde hertil. Bemærk: Der må ikke bruges vand taget direkte fra en ionbytter.
1.6.2.1.
1.6.2.1.1. Formætning af opløsningsmidlerne Før en fordelingskoefficient bestemmes, mættes hver af de faser, der indgår i opløsningsmiddelsystemet, med den anden fase ved rystning ved forsøgstemperaturen. Hertil er det praktisk at ryste to store standflasker med henholdsvis n-octanol af analysekvalitet og vand med tilstrækkelig meget af det andet opløsningsmiddel på et mekanisk rysteapparat i 24 timer, og derefter lade dem henstå så længe, at faserne skiller og der er opnået mætning.
1.6.2.1.2. Forberedelse af testen Testbeholderen skal være næsten helt fyldt af tofasesystemet. Derved hindres materialetab ved fordampning. Stofmængder og volumenforhold fastlægges på grundlag af: Der udføres tre test. I den første bruges det beregnede volumenforhold mellem n-octanol og vand; i den anden divideres dette forhold med 2, og i det tredje multipliceres det med 2 (f.eks. 1:1, 1:2 og 2:1).
det foreløbige skøn over fordelingskoefficienten (se ovenfor)
den mængde teststof, der mindst kræves til analysen
en øvre koncentrationsgrænse på 0,01 mol/l for begge faser.
1.6.2.1.3. Teststof Der fremstilles en stamopløsning i n-octanol, der på forhånd er mættet med vand. Denne stamopløsnings koncentration bestemmes nøjagtigt, inden den anvendes til bestemmelse af fordelingskoefficienten. Den opbevares under betingelser, hvor den er stabil.
1.6.2.2. Testbetingelser Testtemperaturen skal holdes konstant (± 1 oC) og ligge mellem 20 og 25 oC.
1.6.2.3. Fremgangsmåde ved målingen
1.6.2.3.
1.6.2.3.1. Opnåelse af fordelingsligevægt For hver af testbetingelserne benyttes der to testbeholdere, der hver indeholder den nødvendige nøjagtigt afmålte mængde af de to opløsningsmidler og den nødvendige mængde stamopløsning. n-octanolfaserne afmåles volumetrisk. Testbeholderne kan enten anbringes i et egnet rysteapparat eller rystes i hånden. Når et centrifugeglas benyttes, anbefales en hurtig 180o drejning om tværaksen af glasset, hvorved den indespærrede luft stiger op gennem de to faser. Erfaringen viser, at 50 sådanne drejninger normalt er tilstrækkeligt til, at fordelingsligevægten indtræder. For en sikkerheds skyld anbefales det at foretage 100 drejninger i løbet af 5 minutter.
1.6.2.3.2. Faseadskillelse Blandingen kan om nødvendigt centrifugeres, så faserne adskilles. Det gøres i en laboratoriecentrifuge ved stuetemperatur; hvis der benyttes en centrifuge uden temperaturregulering, henstår centrifugeglassene i én time ved testtemperaturen til opnåelse af ligevægt før analyse.
1.6.2.4. Analyse Til bestemmelse af fordelingskoefficienten må koncentrationen af teststoffet i begge faser bestemmes. Det kan gøres ved, at der for hver testbetingelse udtages en delprøve af hver fase fra hvert glas, som analyseres ved den valgte metode. Den samlede mængde stof i begge faser beregnes og sammenlignes med den oprindeligt tilsatte stofmængde. Prøven af vandfasen udtages på en sådan måde, at risikoen for, at den indeholder spor af n-octanol, bliver minimal, nemlig med en glasinjektionssprøjte. Fra starten skal sprøjten være delvis fyldt med luft, som langsomt trykkes ud, medens kanylen føres ned gennem n-octanollaget. En passende mængde af vandfasen suges op i sprøjten, som hurtigt trækkes op af opløsningen, og kanylen fjernes. Sprøjtens indhold kan nu benyttes som den vandige prøve. Koncentrationen i de to adskilte faser skal helst bestemmes ved en stofspecifik metode. Eksempelvis er følgende analysemetoder egnede:
fotometriske metoder
gaskromatografi
højtydende væskekromatografi (HPLC).
1.6.3. HPLC-metoden
1.6.3.
1.6.3.1. Forberedelser
1.6.3.1. Apparatur
Der kræves en væskekromatograf med pulsationsfri pumpe og passende detektionssystem. Det anbefales at bruge injektionsventil med injektionsspiral. Polære grupper i den stationære fase kan nedsætte HPLC-kolonnens ydeevne væsentligt. Derfor må stationære faser have det lavest mulige procentindhold af polære grupper (11). Der kan anvendes kommercielle mikroniserede pakkematerialer med omvendt fase eller færdigpakkede kolonner. Der kan eventuelt anbringes en beskyttelseskolonne mellem injektionssystemet og analysekolonnen.
Mobil fase
Der anvendes methanol og vand af HPLC-kvalitet til fremstilling af elueringsvæsken, som afgasses før brugen. Der benyttes isokratisk eluering. Den anvendte methanol/vand-blanding skal indeholde mindst 25 % vand. Til eluering af forbindelser med en log P på 6 på én time ved en flowhastighed på 1 ml/min vil en blanding af methanol og vand i forholdet 3:1 (v/v) typisk være tilfredsstillende. For forbindelser med en høj log P-værdi kan det være nødvendigt at nedsætte elueringstiden (også for referencestofferne) ved at benytte en mindre polær mobil fase eller en kortere kolonne. Stoffer med meget lav opløselighed i n-octanol har tendens til at give unormalt lave værdier for log Pow med HPLC-metoden; undertiden følger sådanne forbindelsers toppe opløsningsmiddelfronten. Dette skyldes sandsynligvis, at fordelingsprocessen er for langsom til, at der opnås ligevægt inden for den tid, en HPLC-adskillelse normalt tager. I så fald kan nedsættelse af flowhastigheden og/eller mindskelse af methanol/vand-forholdet være et virkningsfuldt middel til at opnå en pålidelig værdi. Både teststof og referencestoffer skal være opløselige i den mobile fase i en så høj koncentration, at de kan påvises. Der må kun undtagelsesvis benyttes tilsætningsstoffer til methanol/vand-blandingen, da tilsætningsstoffer vil ændre kolonnens egenskaber. Til kromatogrammer med tilsætningsstoffer skal der altid anvendes en separat kolonne af samme type. Hvis methanol/vand ikke er egnet, kan der anvendes andre blandinger af vand og organiske opløsningsmidler, f.eks. ethanol/vand eller acetonitril/vand. For ioniserbare stoffer er elueringsvæskens pH kritisk. Det skal ligge inden for kolonnens driftsområde, som normalt er fra 2 til 8. Det anbefales at anvende buffer. Man må være omhyggelig med at undgå saltudfældning og ødelæggelse af kolonnen, hvilket kan forekomme med visse blandinger af organisk fase og buffer. Det tilrådes ikke at foretage HPLC-målinger med silicabaserede stationære faser med pH over 8, da alkalisk mobil fase kan føre til, at kolonnens ydeevne hurtigt falder.
Opløste stoffer
Referencestoffer skal være af renest mulige kvalitet. Til testnings- og kalibreringsformål opløses stofferne om muligt i den mobile fase.
Testningsbetingelser
Under målingen må temperaturen ikke variere med mere end ± 2 K.
1.6.3.2. Måling
1.6.3.2. Beregning af dødtiden to
Dødtiden to kan bestemmes enten med en homolog række (f.eks. n-alkylmethylketoner) eller med organiske stoffer, der ikke holdes tilbage (f.eks. thiourinstof eller formamid). Til beregning af dødtiden to ud fra en homolog række, indsprøjtes der mindst syv elementer af en homolog række, og retentionstiderne bestemmes. Bruttoretentionstiderne tr (n c + 1) afbildes mod tr(n c), og i regressionsligningen: tr (n c + 1) = a + b tr (n c) bestemmes afskæringen a og hældningskoefficienten b (nc = antallet af kulstofatomer). Dødtiden er da givet ved: to = a/(l -b)
Kalibreringskurve
Næste trin består i at konstruere en korrelationskurve af log k mod log P for passende referencestoffer. I praksis indsprøjtes der samtidig mellem fem og ti standardreferencestoffer, hvis log P ligger i det forventede område, og retentionstiderne bestemmes, helst med en integrationsskriver, der er koblet til detektionssystemet. De tilsvarende logaritmer til kapacitetsfaktorerne, log k, beregnes og afsættes mod den log P, der er bestemt ved rystekolbemetoden. Kalibreringen foretages regelmæssigt, mindst én gang dagligt, så der kan tages højde for eventuelle ændringer i kolonnens ydeevne.
Bestemmelse af teststoffets kapacitetsfaktor
Teststoffet indsprøjtes som en så lille mængde mobil fase som mulig. Retentionstiden bestemmes (dobbeltbestemmelse), hvorved kapacitetsfaktoren k kan beregnes. Ud fra korrelationskurven over referencestofferne kan teststoffets fordelingskoefficient interpoleres. Ved meget lave og meget høje fordelingskoefficienter er det nødvendigt at ekstrapolere. I sådanne tilfælde må man være særlig opmærksom på regressionslinjens konfidensgrænser.
2. DATA
2. Rystekolbemetoden
De målte P-værdiers pålidelighed kan kontrolleres ved sammenligning af gennemsnittet af dobbeltbestemmelserne med det samlede gennemsnit.
3. RAPPORTERING Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:
nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)
en beregnet værdi eller et skøn baseret på de enkelte opløseligheder, hvis metoderne ikke kan anvendes (f.eks. overfladeaktivt materiale)
alle oplysninger og bemærkninger af betydning for vurdering af resultaterne især vedrørende urenheder og stoffets fysiske tilstand.
resultatet af et eventuelt indledende skøn
den temperatur, som bestemmelsen er foretaget ved
data om de analysemetoder, der er benyttet til koncentrationsbestemmelser
eventuel centrifugeringstid og -hastighed
målte koncentrationer i begge faser for hver bestemmelse (der skal således rapporteres i alt 12 koncentrationer)
massen af teststof, det anvendte volumen af hver fase i hver testbeholder og den samlede beregnede mængde teststof i hver fase efter indstilling af ligevægt
den beregnede værdi for fordelingskoefficienten (P) og gennemsnittet for hvert sæt testbetingelser samt gennemsnittet af samtlige bestemmelser. Eventuelle tegn på, at fordelingskoefficienten er koncentrationsafhængig anføres i rapporten
de enkelte P-værdiers standardafvigelse fra gennemsnittet
gennemsnitsværdien af P fra alle bestemmelser anføres tillige som titalslogaritmen
den beregnede teoretiske værdi af Pow, når denne værdi er bestemt eller når den målte værdi er > 104
pH af det anvendte vand og af vandfasen under forsøget
begrundelse for anvendelse af buffere i stedet for vand, deres sammensætning, koncentration og pH, samt vandfasens pH før og efter forsøget.
resultatet af et eventuelt foreløbigt skøn
test- og referencestoffer og deres renhedsgrad
det temperaturinterval, som bestemmelserne er foretaget ved
det pH, som bestemmelserne er foretaget ved
detaljerede oplysninger om analyse- og beskyttelseskolonne, mobil fase og detektionssystem
retentionsdata og litteraturværdier for log P for referencestoffer benyttet ved kalibrering
detaljerede oplysninger om den fittede regressionslinje (log k mod log P)
gennemsnitlige retentionsdata og interpoleret log P-værdi for teststoffet
beskrivelse af udstyr og driftsbetingelser
elueringsprofiler
den mængde test- og referencestof, der er indført i kolonnen
dødtiden og hvordan den er målt.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
HENVISNINGER OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984. Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Base1, 1978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.
A.9. FLAMMEPUNKT
A.9.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Ved udførelse af denne test er det nyttigt at have forhåndsoplysninger om stoffets brændbarhed. Metoden kan anvendes for væsker, hvis dampe kan antændes af en antændelseskilde. De opregnede testmetoder er kun pålidelige i de flammepunktsintervaller, der er anført ved de enkelte metoder. Ved valg af metode skal det tages med i overvejelserne, om der kan ske en kemisk reaktion mellem stoffet og testbeholderen.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Flammepunktet er den laveste temperatur, korrigeret til et tryk på 101,325 kPa, ved hvilken en væske under de i metoden fastsatte betingelser udvikler dampe i en sådan mængde, at de danner en brændbar blanding med luft i testbeholderen. Enheder: oC t = T – 273,15 (t er i oC og T er i K)
1.3. REFERENCESTOFFER Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnået med andre metoder.
1.4. METODENS PRINCIP Stoffet anbringes i en testbeholder og opvarmes eller afkøles til testtemperaturen efter den fremgangsmåde, der er beskrevet i den enkelte testmetode. Der udføres antændelsesforsøg til konstatering af, om prøven antændes ved testtemperaturen eller ikke.
1.5. KVALITETSKRITERIER
1.5.
1.5.1. Repeterbarhed Repeterbarheden varierer alt efter flammepunktsområdet og den anvendte metode; højst 2 oC.
1.5.2. Følsomhed Følsomheden afhænger af den anvendte testmetode.
1.5.3. Specificitet Nogle af testmetoderne er begrænset til et bestemt flammepunktsinterval, og deres specificitet afhænger af andre stofegenskaber (f.eks. høj viskositet).
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN
1.6.
1.6.1. Forberedelser Der anbringes en prøve af stoffet i testapparatet efter 1.6.3.1 og/eller 1.6.3.2. Af sikkerhedshensyn anbefales det, at der kun anvendes en lille test, dvs. ca. 2 cm3, af energirige og giftige stoffer.
1.6.2. Testbetingelser For så vidt som det er foreneligt med sikkerhedskravene, skal apparatet anbringes et trækfrit sted.
1.6.3. Udførelse af testen
1.6.3.
1.6.3.1. Ligevægtsmetoden Se ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523 og ISO 3679.
1.6.3.2. Ikke-ligevægtsmetoden
1.6.3.2. Abel apparat:
Se BS 2000 part 170, NF M07-011 og NF T66-009.
Abel-Pensky apparat:
Se EN 57, DIN 51755 part 1 (for temperaturer fra 5 oC til 65 oC), DIN 51755 part 2 (for temperaturer under 5 oC) og NF M07-036.
Tag apparat:
Se ASTM D 56.
Pensky-Martens apparat:
See ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34 og NF M07-019.
Bemærkninger:
Hvis der ved en ikke-ligevægtsmetode i 1.6.3.2 findes et flammepunkt på 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC eller 55 ± 2 oC, skal det bekræftes ved en ligevægtsmetode med samme apparat. Til anmeldelsesformål kan der kun bruges metoder, der giver flammepunktstemperaturen. Til bestemmelse af flammepunktet af tyktflydende opløsningsmiddelholdige væsker (maling, lim og lignende) må der kun benyttes apparater og testmetoder, der er egnede til bestemmelse af tyktflydende væskers flammepunkt. Se ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523 og DIN 53213 part 1.
2. DATA
3. RAPPORTERING Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger
nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)
angivelse af den anvendte metode samt eventuelle afvigelser herfra
resultaterne og supplerende bemærkninger af betydning for vurdering af dem.
4. HENVISNINGER Ingen.
A.10. ANTÆNDELIGHED (FASTE STOFFER)
A.10.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Ved udførelse af denne test er det nyttigt at have forhåndsoplysninger om stoffets eventuelle eksplosive egenskaber. Testen udføres kun på stoffer, der foreligger som pulver, granulat eller pasta. For ikke at medtage alle stoffer, der kan antændes, men kun dem, der brænder hurtigt eller på en måde, der er særlig farlig, anses kun de stoffer, hvis forbrændingshastighed overstiger en vis værdi, for at være let antændelige. Det kan være særlig farligt, hvis forglødning kan fortsætte gennem metalpulver, da en brand er vanskelig at slukke. Metalpulver, hvori forglødningen kan udbrede sig i et bestemt tidsrum, anses for let antændelige.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Forbrændingstiden udtrykkes i sekunder.
1.3. REFERENCESTOFFER Ikke specificeret.
1.4. METODENS PRINCIP Stoffet anbringes i en ca. 250 mm lang ubrudt stribe, og der foretages en indledende screeningstest til bestemmelse af, om der efter antænding med en gasflamme sker en forbrænding, der breder sig med åben flamme eller ved glødning. Hvis forbrændingen breder sig mere end 200 mm hen ad striben i løbet af et bestemt tidsrum, udføres der et komplet testprogram til bestemmelse af forbrændingshastigheden.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ingen anført.
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN
1.6.
1.6.1. Indledende screeningprøve Stoffet anbringes på en ikke-brændbar ikke-porøs dårligt varmeledende plade i en ca. 250 mm lang, 20 mm bred og 10 mm høj ubrudt stribe. En gasflamme (mindste diameter 5 mm) holdes hen til den ene ende af striben, indtil pulveret bryder i brand, dog højst 2 minutter (5 minutter for pulver af metal og metallegeringer). Det noteres, om forbrændingen breder sig 200 mm hen ad striben i løbet af testperioden på 4 minutter (40 minutter for metalpulver). Hvis stoffet ikke bryder i brand eller forbrændingen ikke med åben flamme eller ved glødning breder sig 200 mm hen ad striben i løbet af testperiodens 4 minutter (40 minutter), anses stoffet ikke for at være let antændeligt, og yderligere testning er ikke påkrævet. Hvis forbrændingen i stoffet breder sig 200 mm hen ad striben på mindre end 4 minutter eller mindre end 40 for metalpulver, gennemføres nedenstående test (1.6.2).
1.6.2. Test af forbrændingshastigheden
1.6.2.
1.6.2.1. Forberedelse Stoffer, der foreligger som pulver eller granulat, fyldes løst i en 250 mm lang form, der har trekantet tværsnit med indvendig højde 10 mm og bredde 20 mm. På hver side af formen i længderetningen er der anbragt en metalplade, der rager 2 mm op over det trekantede tværsnits overkant (se figuren). Derefter lader man tre gange formen falde ned på et fast underlag fra 2 cm's højde. Om nødvendigt fyldes formen op igen. Sidestykkerne fjernes, og overskydende materiale skrabes af. Der lægges en ikke-brændbar ikke-porøs dårligt varmeledende plade oven på formen, det hele vendes om, og formen fjernes. Pasta-agtige stoffer bredes ud på en ikke-brændbar ikke-porøs dårligt varmeledende plade i en 250 mm lang pølse med et tværsnit på ca. 1 cm2.
1.6.2.2. Testbetingelser Er stoffet følsomt over for fugt, gennemføres testen så hurtigt som muligt efter, at stoffet er taget ud af beholderen.
1.6.2.3. Udførelse af prøvningen Volden anbringes i et stinkskab på tværs af luftstrømmen. Lufthastigheden skal være tilstrækkelig til at forhindre, at røgen slipper ud i laboratoriet, og må ikke ændres under prøvningen. Omkring apparatet opstilles der en skærm til beskyttelse mod træk. Volden antændes i den ene ende med en gasflamme (diameter mindst 5 mm). Når forbrændingen har forplantet sig 80 mm, måles udbredelseshastigheden over de næste 100 mm. Testen udføres seks gange, hver gang med en ren kold plade, medmindre der observeres et positivt resultat tidligere.
2. DATA Forbrændingstiden fra den indledende screeningstest (1.6.1) og den korteste forbrændingstid i op til seks test (1.6.2.3) er relevante for vurderingen.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:
nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)
en nøjagtig beskrivelse af det testede stof, dets fysiske tilstandsform og dets fugtindhold
resultaterne af den indledende screeningstest og af testen af forbrændingshastigheden, hvis den er udført
alle yderligere bemærkninger af betydning for vurdering af resultaterne.
3.2. FORTOLKNING AF RESULTATERNE Stoffer, der foreligger i form af pulver, granulat eller pasta, anses for at være let antændelige, hvis forbrændingstiden i nogen af de test, der er udført efter 1.6.2, er mindre end 45 sekunder. Pulver af metal eller en metallegering anses for at være let antændeligt, hvis det kan antændes og flammen eller reaktionszonen forplanter sig over hele testen på 10 minutter eller derunder.
4. HENVISNINGER NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.
A.11. ANTÆNDELIGHED (GASSER)
A.11.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Med denne metode kan det bestemmes, om en gas blandet med luft ved stuetemperatur (ca. 20 oC) og atmosfæretryk kan antændes, og i så fald i hvilket koncentrationsområde. Blandinger med stigende koncentrationer af prøvegassen med luft påvirkes med en elektrisk gnist, og det iagttages, om der sker antændelse.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Området for antændelighed er koncentrationsområdet mellem den nedre og den øvre eksplosionsgrænse. Nedre og øvre eksplosionsgrænse er de koncentrationsgrænser for den antændelige gas i blanding med luft, ved hvilke der ikke sker nogen flammeudbredelse.
1.3. REFERENCESTOFFER Ikke specificeret.
1.4. METODENS PRINCIP Koncentrationen af gassen i luft øges trinvis, og blandingen påvirkes ved hvert trin med en elektrisk gnist.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ikke anført.
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN
1.6.
1.6.1. Apparatur Testbeholderen er en opretstående glascylinder med en indre diameter på mindst 50 mm og en højde på mindst 300 mm. Antændelseselektroderne er placeret 60 mm over cylinderens bund med en indbyrdes afstand på 3 til 5 mm. Cylinderen er forsynet med en trykaflastningsåbning. Apparatet skal afskærmes, så eventuelle eksplosionsskader begrænses. Som antændelseskilde anvendes en stående induktionsgnist med en varighed på 0,5 sek. Den dannes af en højspændingstransformator med en sekundærspænding på 10 til 15 kV (største tilførte effekt 300 W). I henvisning (2) er der vist et eksempel på et egnet apparat.
1.6.2. Testbetingelser Testen skal udføres ved stuetemperatur (ca. 20 oC).
1.6.3. Udførelse af testen Ved hjælp af doseringspumper ledes en gas/luftblanding med kendt koncentration ind i glascylinderen. Blandingen påvirkes med en gnistudladning, og det iagttages, om der ved antændelseskilden opstår en flamme, som forplanter sig af sig selv. Gaskoncentrationen varieres i intervaller på 1 vol. %, indtil der sker antændelse som beskrevet ovenfor. Hvis det ud fra kendskab til gassens kemiske struktur må formodes, at gassen ikke kan antændes, og sammensætningen af den støkiometriske blanding med luft kan beregnes, behøver man kun at afprøve blandinger fra 10 % under til 10 % over det støkiometriske blandingsforhold.
2. DATA Den eneste information, der er relevant for bestemmelse af denne egenskab, er, om der forekommer flammeudbredelse.
3. RAPPORTERING Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger
nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)
beskrivelse af det anvendte apparat med angivelse af dimensioner
den temperatur, som testen er udført ved
de afprøvede koncentrationer og de opnåede resultater
testens resultat: ikke-antændelig eller let antændelig gas
konkluderes det, at gassen er ikke-antændelig, anføres det koncentrationsområde, hvor prøvning med 1 % intervaller har fundet sted
alle oplysninger og bemærkninger, der er relevante for fortolkningen af resultaterne.
4.(1)(2) HENVISNINGER NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, 126-127.
A.12. ANTÆNDELIGHED (KONTAKT MED VAND)
A.12.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Denne testmetode kan anvendes til bestemmelse af, om et stof ved reaktion med vand udvikler farlige mængder gas, der eventuelt er let antændelig. Testmetoden kan anvendes til både væsker og faste stoffer. Den kan ikke anvendes til stoffer, der spontant bryder i brand, når de kommer i kontakt med luften.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Let antændelig: stoffer, som ved kontakt med vand eller fugtig luft udvikler let antændelige gasser i farlige mængder, dvs. mindst 1 liter/kg pr. time.
1.3. METODENS PRINCIP Testen foregår trinvis som beskrevet nedenfor; testen kan afbrydes, når der sker antænding. Hvis det vides, at stoffet ikke reagerer voldsomt med vand, kan man begynde med trin 4 (1.3.4).
1.3.
1.3.1. Trin 1 Teststoffet anbringes i et kar med destilleret vand ved 20 oC, og det konstateres, om den udviklede gas bryder i brand.
1.3.2. Trin 2 Teststoffet anbringes på et stykke filtrerpapir, der flyder på overfladen i en skål med destilleret vand ved 20 oC, og det konstateres, om den udviklede gas bryder i brand. Filtrerpapiret tjener udelukkende til at holde stoffet samlet på ét sted for at øge chancerne for antændelse.
1.3.3. Trin 3 Teststoffet arrangeres i en ca. 2 cm høj bunke med en diameter på ca. 3 cm. Der tilsættes et par dråber vand til bunken, og det konstateres, om den udviklede gas bryder i brand.
1.3.4. Trin 4 Teststoffet blandes med destilleret vand ved 20 oC, og gasudviklingens hastighed måles hver time over en periode på 7 timer. Hvis hastigheden efter 7 timer er uregelmæssig eller stigende, forlænges måleperioden, dog højst til 5 dage. Testen kan afbrydes, hvis hastigheden på noget tidspunkt overstiger 1 liter/kg pr. time.
1.4. REFERENCESTOFFER Ikke specificeret.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ikke anført.
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE
1.6.
1.6.1. Trin 1
1.6.1.
1.6.1.1. Testbetingelser Testen udføres ved stuetemperatur (ca. 20 oC).
1.6.1.2. Udførelse af testen En lille mængde af teststoffet (ca. 2 mm i diameter) anbringes i et kar med destilleret vand. Det noteres, i) om der udvikles gas, og ii) om gassen bryder i brand. Hvis gassen bryder i brand, behøves der ikke yderligere testning, idet stoffet anses for farligt.
1.6.2. Trin 2
1.6.2.
1.6.2.1. Apparatur Et stykke filtrerpapir anbringes fladt flydende på overfladen af destilleret vand i en egnet beholder, f.eks. en afdampningsskål med en diameter på 100 mm.
1.6.2.2. Testbetingelser Testen udføres ved stuetemperatur (ca. 20 oC).
1.6.2.3. Udførelse af testen En lille mængde af teststoffet (ca. 2 mm diameter) anbringes midt på filtrerpapiret. Det noteres, i) om der udvikles gas, og ii) om gassen bryder i brand. Hvis gassen bryder i brand, behøves der ikke yderligere testning, idet stoffet anses for farligt.
1.6.3. Trin 3
1.6.3.
1.6.3.1. Testbetingelser Testen udføres ved stuetemperatur (ca. 20 oC).
1.6.3.2. Udførelse af testen Teststoffet anbringes i en ca. 2 cm høj bunke på ca. 3 cm i diameter med en fordybning i toppen. Der anbringes et par dråber vand i fordybningen, og det noteres, i) om der udvikles gas, og ii) om gassen bryder i brand. Hvis gassen bryder i brand, behøves der ikke yderligere testning, idet stoffet anses for farligt.
1.6.4. Trin 4
1.6.4.
1.6.4.1. Apparatur Der anvendes et apparat som vist på figuren.
1.6.4.2. Testbetingelser Det undersøges visuelt, om beholderen med teststof indeholder pulver på under 500 μm (partikelstørrelse). Hvis pulver udgør mere end 1 % (w/w) af den samlede prøve eller prøven er smuldrende, formales hele testen til pulver inden testen, så der tages hensyn til reduktion af partikelstørrelsen under opbevaring og håndtering; i alle andre tilfælde undersøges testen i den stand, hvori den er modtaget. Testen udføres ved stuetemperatur (ca. 20 oC) og atmosfæretryk.
1.6.4.3. Udførelse af testen Der anbringes 10-20 ml vand i apparatets tildrypningstragt og 10 g stof i den koniske kolbe. Den udviklede gasmængde kan måles ved enhver egnet metode. Tildrypningstragtens hane åbnes, så vandet løber ned i kolben, og et stopur startes. Gasudviklingen måles hver time over en periode på 7 timer. Hvis gasudviklingen er uregelmæssig i denne periode eller stiger hen mod periodens slutning, fortsættes målingerne i op til 5 døgn. Hvis gasudviklingen på noget tidspunkt kommer over 1 liter/kg pr. time, kan testen afbrydes. Testen gentages yderligere to gange. Hvis gassens kemiske sammensætning ikke er kendt, foretages der en analyse af den. Hvis gassen indeholder let antændelige bestanddele, og det ikke vides, om hele blandingen er let antændelig, fremstilles der en blanding med samme sammensætning, som test efter metode A.11.
2. DATA Stoffet anses for farligt, hvis
det spontant bryder i brand på noget trin af testen eller
der udvikles brændbar gas i større mængde end 1 liter/kg pr. time.
3. RAPPORTERING Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger
nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)
eventuel forbehandling af teststoffet
resultatet af testen (trin 1, 2, 3 og 4)
den udviklede gas' kemiske sammensætning
gasudviklingshastigheden, hvis trin 4 (1.6.4) udføres
alle yderligere bemærkninger, der er relevante for fortolkningen af resultaterne.
4.(1)(2) HENVISNINGER Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
A.13 VÆSKERS OG FASTE STOFFERS PYROFORISKE EGENSKABER
A.13
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Testmetoden kan anvendes for væsker og faste stoffer, der i små mængder spontant bryder i brand kort tid efter at være kommet i kontakt med luften ved stuetemperatur (ca. 20 oC). Stoffer, der skal udsættes for luftens påvirkning i flere dage eller timer ved stuetemperatur, førend der sker antændelse, omfattes ikke af denne testmetode.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Stoffer anses for at være selvantændelige, hvis de bryder i brand eller forkuller under betingelserne i 1.6. Det kan også være påkrævet at undersøge væskers selvantændelse med metode A.15 Selvantændelsestemperatur (væsker og gasser).
1.3. REFERENCESTOFFER Ikke specificeret.
1.4. METODENS PRINCIP Stoffet, fast eller flydende, blandes med en inaktiv bærer og bringes i kontakt med luften ved stuetemperatur i 5 minutter. Væsker, der ikke bryder i brand, absorberes dernæst på filtrerpapir og udsættes for luftens påvirkning ved omgivende temperatur (ca. 20 oC) i 5 minutter. Flydende og faste stoffer, der bryder i brand, og væsker, der bryder i brand eller får filtrerpapiret til at forkulle, anses for at være selvantændelige.
1.5. KVALITETSKRITERIER Repeterbarhed: på grund af den sikkerhedsmæssige betydning er et enkelt positivt resultat tilstrækkeligt til, at stoffet anses for selvantændeligt.
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6.
1.6.1. Apparatur Der fyldes et ca. 5 mm tykt lag diatoméjord i en porcelænsskål med en diameter på ca. 10 cm ved stuetemperatur (ca. 20 oC). Bemærk: Diatoméjord eller et andet tilsvarende inaktivt stof, som er let at få fat i, antages at repræsentere den jord, som teststoffet kunne blive spildt på i tilfælde af uheld. Der behøves tørt filtrerpapir til test af væsker, som ikke bryder i brand ved kontakt med luften, når de er blandet med et inaktivt bæremateriale.
1.6.2. Udførelse af testen
1.6.2. a)
Faste stoffer i pulverform Fra en højde af ca. 1 m hældes 1-2 cm3 af pulveret ned på en ikke-brændbar flade, og det iagttages, om stoffet bryder i brand under faldet eller inden for 5 minutter derefter. Testen udføres seks gange, medmindre der sker antændelse.
b)
Væsker Ca. 5 cm3 af testvæsken hældes ud i den klargjorte porcelænsskål, og det iagttages, om stoffet bryder i brand, inden der er gået 5 minutter. Hvis der ikke sker antændelse i nogen af de seks forsøg, udføres følgende forsøg: Med en injektionssprøjte sprøjtes 0,5 ml af prøven ud på et bøjet stykke filtrerpapir, og det iagttages, om der inden for 5 minutter sker antændelse eller forkulning af filtrerpapiret. Forsøget udføres 3 gange, medmindre der sker antændelse eller forkulning.
2. DATA
2.
2.1. BEHANDLING AF RESULTATERNE Testen kan afbrydes, så snart et af forsøgene giver positivt resultat.
2.2. EVALUERING Hvis stoffet bryder i brand inden 5 minutter efter, at det er tilsat til en inaktiv bærer og blevet udsat for luftens påvirkning, eller hvis en væske får et stykke filtrerpapir til at forkulle eller bryde i brand, inden 5 minutter efter at stoffet er tilsat og blevet udsat for luftens påvirkning, anses stoffet (væsken) for at være selvantændeligt.
3. RAPPORTERING Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger
nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)
resultaterne af testen
alle yderligere bemærkninger, der er relevante for fortolkningen af resultaterne.
4.(1)(2) HENVISNINGER NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.
A.14. EKSPLOSIVE EGENSKABER
A.14.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Metoden indeholder et testsystem til bestemmelse af, om et fast eller pastaagtigt stof frembyder eksplosionsfare, når det udsættes for påvirkning med en flamme (varmefølsomhed) eller ved slag eller friktion (følsomhed over for mekanisk påvirkning), og om en væske frembyder eksplosionsfare, når den udsættes for påvirkning med en flamme eller ved slag. Metoden består af tre dele: Metoden giver data til vurdering af sandsynligheden for, at der ved visse almindelige påvirkninger fremkaldes en eksplosion. Metoden tilsigter ikke at fastslå, om stoffet overhovedet kan bringes til at eksplodere. Metoden er egnet til bestemmelse af, om et stof frembyder en eksplosionfare (varmefølsomhed og mekanisk følsomhed) under de særlige betingelser, der er specificeret i direktivet. Metoden er baseret på en række apparattyper, som i vidt omfang anvendes internationalt (1), og som sædvanligvis giver brugbare resultater. Det erkendes, at metoden ikke er definitiv. Der kan benyttes andet apparatur end det specificerede, forudsat at det er internationalt anerkendt, og at de fundne resultater kan korreleres til resultater opnået med det specificerede apparatur. Testen behøver ikke at udføres, hvis det på grundlag af foreliggende termodynamiske oplysninger (f.eks. dannelsesvarme eller dekomponeringsvarme) og/eller en strukturformel, hvori visse reaktive grupper (2) ikke indgår, må anses for hævet over enhver rimelig tvivl, at stoffet er ude af stand til hurtig dekomponering ledsaget af gasudvikling eller varmefrigørelse (dvs. at stoffet ikke frembyder nogen eksplosionsfare). For væsker kræves der ikke test for friktionsfølsomhed.
1.1. a)
en test for varmefølsomhed (1)
b)
en test for følsomhed over for slagpåvirkning (1)
c)
en test for følsomhed over for friktionspåvirkning (1).
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Eksplosiv: Stoffer, som kan eksplodere ved flammepåvirkning, eller som er følsomme over for slag eller friktion (eller mere følsomme over for mekanisk påvirkning end 1,3-dinitrobenzen i et alternativt apparat).
1.3. REFERENCESTOFFER 1,3-dinitrobenzen, teknisk krystallinsk produkt, sigtet på 0,5 mm sigte, til friktions- og slagpåvirkningsmetoden. Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX, hexogen, cyclonite — CAS 121-82-4), omkrystalliseret i vandig cyclohexanon, vådsigtet på 250 μm sigte og tilbageholdt på en 150 μm sigte, tørret ved 103 ± 2 oC (i 4 timer) til anden række friktions- og slagprøvninger.
1.4. METODENS PRINCIP Der kræves indledende testning til bestemmelse af, hvordan de tre følsomhedstest kan udføres under betryggende forhold.
1.4.
1.4.1. Test for sikker håndtering (3) Af sikkerhedshensyn foretages der før den egentlige test en indledende test bestående i, at en meget lille testmængde (ca. 10 mg) opvarmes fritliggende i en gasflamme, og påvirkes med slag i et passende apparat og ved friktion ved hjælp af en hammer mod en ambolt eller et andet friktionsapparat. Formålet er at fastslå, om stoffet er så følsomt og eksplosivt, at den foreskrevne følsomhedstest, især for varmefølsomhed, må udføres under iagttagelse af særlige forholdsregler, så operatøren ikke kan komme til skade.
1.4.2. Varmefølsomhed (virkningen af en flamme) Metoden består i opvarmning af stoffet i et stålrør, der er lukket med en mundingsplade. Ved hjælp af mundingsplader med forskellige huldiametre kan det bestemmes, om stoffet er tilbøjeligt til at eksplodere under stærk varmepåvirkning og veldefineret indeslutningsgrad.
1.4.3. Mekanisk følsomhed (slag) Metoden består i, at stoffet udsættes for et slag med et specificeret lod, der falder fra en specificeret højde.
1.4.4. Mekanisk følsomhed (friktion) Metoden består i, at et fast eller pastaagtigt stof udsættes for friktion mellem standardoverflader med specificeret belastning og ved specificeret relativ bevægelse.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ikke anført.
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE
1.6.
1.6.1. Varmefølsomhed (virkningen af en flamme)
1.6.1.
1.6.1.1. Apparatur Apparaturet består af et engangsstålrør med lukkeanordning (figur 1) anbragt i en opvarmnings- og beskyttelsesanordning. Røret er af dybtrukket stålplade (se tillægget) og har en indvendig diameter på 24 mm, en længde på 75 mm og en godstykkelse på 0,5 mm. Røret har i den åbne ende en flange, så det kan lukkes med mundingspladen ved hjælp af en todelt forskruning (møtrik og krave med gevind). Mundingspladen er trykmodstandsdygtig og har et hul i midten. Møtrikken og kraven med gevind er fremstillet i chrom-manganstål (se tillægget), som er gnistfrit op til 800 oC. Der foreligger mundingsplader med en række forskellige huldiametre, som er fremstillet i 6 mm tykt varmebestandigt stål (se tillægget).
1.6.1.2. Testbetingelser Normalt testes stoffet i den tilstand, hvori det er modtaget, men i visse tilfælde, f.eks. hvis det foreligger i presset, støbt eller anden kompakt form, kan det være nødvendigt at knuse stoffet før testen. For faste stoffer bestemmes den mængde materiale, der skal anvendes til testen, ved en to-trins procedure. Først fyldes der i et tareret rør 9 cm3 af stoffer, som nedstampes med en kraft på 80 N fordelt over hele rørtværsnittet. Af sikkerhedshensyn eller i tilfælde, hvor stoffet kan ændre fysisk form ved kompression, kan der benyttes andre påfyldningsmetoder; eksempelvis er stampning ikke egnet, hvis stoffet er meget friktionsfølsomt. Hvis materialet kan komprimeres, tilsættes der mere og stampes, indtil røret er fyldt til en højde af 55 mm fra overkanten. Den samlede mængde, der er brugt til fyldning af røret til denne højde, bestemmes, og der tilsættes endnu 2 portioner, som stampes med en kraft på 80 N. Der tilsættes materiale med stampning eller fjernes materiale, så røret er fyldt til 15 mm fra overkanten. Det andet trin foregår ved, at der først tilsættes og stampes en tredjedel af den samlede mængde, der blev brugt til det første trin. Der tilsættes endnu 2 portioner med stampning med 80 N, og materialets højde i røret justeres til 15 mm fra overkanten ved tilsætning eller fjernelse af materiale. Til hvert forsøg anvendes den mængde fast stof, der er fundet ved dette andet trin; påfyldningen sker i 3 lige store portioner, der hver komprimeres til 9 cm3 med den fornødne kraft. (Dette gøres lettest ved anvendelse af afstandsringe). Væsker og geler fyldes i røret til en højde af 60 mm, idet det for gelernes vedkommende nøje påses, at der ikke dannes luftbobler. Kraven med gevind føres op om røret nedefra, den valgte mundingsplade indsættes, og møtrikken strammes efter smøring med et molybdænsulfidbaseret smøremiddel. Det er yderst vigtigt at kontrollere, at der hverken har sat sig stof mellem flangen og pladen eller i gevindet. Opvarmningen sker med propan, der fra en industriel trykflaske med trykregulator (60-70 mbar) ledes gennem en måler og fordeles ligeligt til 4 brændere gennem en manifold (hvilket kontrolleres ved visuel inspektion af brændernes flammer). Brænderne er placeret omkring prøvekammeret som vist på figur 1. De 4 brænderes samlede forbrug er på ca. 3,2 liter propan pr. minut. Der kan anvendes andre brændstoffer og brændere, men opvarmningshastigheden skal være som specificeret i figur 3. Uanset det anvendte apparatur skal opvarmningshastigheden regelmæssigt kontrolleres med dibutylphthalatfyldte rør, som vist på figur 3.
1.6.1.3. Udførelse af testene Hver test varer, indtil røret enten sønderdeles eller røret har været opvarmet i 5 minutter. En test, hvorved røret sønderdeles i tre eller flere fragmenter, som eventuelt hænger sammen med smalle metalstrimler som vist på figur 2, vurderes som en eksplosion. En test, der fører til færre fragmenter eller ingen fragmentering, betragtes ikke som en eksplosion. Der udføres først tre test med en mundingsplade med et 6,0 mm hul, og opnås der ingen eksplosion, udføres endnu tre test med en mundingsplade med et 2,0 mm hul. Finder der eksplosion sted under én af disse forsøgsrækker, er yderligere testning ikke påkrævet.
1.6.1.4. Evaluering Testens resultat anses for positivt, hvis der sker eksplosion i én af ovennævnte forsøgsrækker.
1.6.2. Mekanisk følsomhed (slag)
1.6.2.
1.6.2.1. Apparatur (figur 4) Hoveddelene af et typisk faldhammerapparat er en støbt stålblok med bundplade, ambolt, stander, styr, faldlodder, frigørelsesmekanisme og prøveholder. Stålambolten på 100 mm (diameter) × 70 mm (højde) er skruet fast oven på en stålblok på 230 mm (længde) × 250 mm (bredde) × 200 mm (højde) med støbt bundplade på 450 mm (længde) × 450 mm (bredde) × 60 mm (højde). En stander bestående af et sømløst trukket stålrør er fastgjort i en holder, der er fastskruet bag på stålblokken. Apparatet er forankret til en massiv betonklods på 60 × 60 × 60 cm med fire skruer, så styrene er fuldstændig lodrette og faldlodderne kan falde frit. Der findes lodder på 5 og 10 kg fremstillet i massivt stål. Loddernes slaghoved er af hærdet stål, HRC 60 til 63, og har en diameter på mindst 25 mm. Testen er indeholdt i en slaganordning bestående af to massive stålcylindre anbragt koaksialt over hinanden i en hul cylindrisk styrering af stål. Stålcylindrene skal have en diameter på 10 (-0,003, -0,005) mm og en højde på 10 mm og have polerede endeflader, afrundede kanter (krumningsradius 0,5 mm) og en hårdhed på HRC 58 til 65. Den hule cylinder skal have en udvendig diameter på 16 mm, en poleret udboring på 10 (+0,005, +0,010) mm og en højde på 13 mm. Slaganordningen samles på en mellemambolt (diameter 26 mm, højde 26 mm) af stål og centreres med en ring, hvori der er huller til bortledning af eksplosionsprodukterne.
1.6.2.2. Testbetingelser Testvolumenet skal være på 40 mm3 eller det volumen, der passer til et alternativt apparat. Faste stoffer testes i tør tilstand og forberedes således Stoffer, som normalt forekommer i pastaform skal om muligt testes i tør tilstand og under alle omstændigheder efter fjernelse af størst mulig mængde opløsningsmiddel. Ved test af væsker er der en afstand på 1 mm mellem den øverste og den nederste stålcylinder.
1.6.2.2. a)
stoffer i pulverform sigtes (0,5 mm sigte); alt hvad der passerer gennem sigten bruges til testen
b)
stoffer, der foreligger i presset, støbt eller anden kompakt form, findeles og sigtes; sigtefraktionen fra 0,5 mm til 1 mm diameter bruges til testen og skal være repræsentativ for det oprindelige stof.
1.6.2.3. Udførelse af testen Der udføres seks forsøg, hvor 10 kg's loddet falder fra en højde af 0,40 m (40 J). Forekommer der eksplosion i et af de 6 forsøg med 40 J, udføres der en ny række på seks forsøg, hvor et 5 kg's lod falder fra en højde af 0,15 m (7,5 J). I andre apparater sammenlignes prøven med det valgte referencestof ved hjælp af en fastlagt procedure (f.eks. up-and-down teknik).
1.6.2.4. Evaluering Testresultatet anses for positivt, hvis der sker eksplosion (opflamning og knald betragtes som eksplosion) i mindst ét af forsøgene med det specificerede slagapparat, eller hvis prøven er mere følsom end 1,3-dinitrobenzen eller RDX i en alternativ slagtest.
1.6.3. Mekanisk følsomhed (friktion)
1.6.3.
1.6.3.1. Apparatur (figur 5) Friktionsapparatet består af en støbt bundplade af stål, hvorpå friktionsanordningen er monteret. Den består af en fastsiddende porcelænsstift og en bevægelig porcelænsplade. Porcelænspladen fastholdes i en slæde, der glider på to styr. Slæden er via en forbindelsesstang, en krumtap og et passende gear forbundet med en elmotor, således at porcelænspladen bevæges 10 mm frem og tilbage under porcelænsstiften én gang. Porcelænsstiften kan belastes f.eks. med 120 eller 360 newton. Porcelænspladerne er flade og er fremstillet af hvidt teknisk porcelæn (ruhed 9 til 32 μm) og har dimensionerne 25 mm (længde) × 25 mm (bredde) × 5 mm (højde). Den cylindriske porcelænsstift, der ligeledes er fremstillet af hvidt teknisk porcelæn, har en længde på 15 mm, en diameter på 10 mm og ru kugleformede endeflader med en krumningsradius på 10 mm.
1.6.3.2. Testbetingelser Prøvevolumenet skal være på 10 mm3 eller det volumen, der passer til et alternativt apparat. Faste stoffer testes i tør tilstand og forberedes således: Stoffer, som normalt forekommer i pastaform skal om muligt testes i tør tilstand. Hvis stoffet ikke kan tørres, skal pastaen (efter fjernelse af størst mulig mængde opløsningsmiddel) testes som et 0,5 mm tykt lag med en bredde på 2 mm og en længde på 10 mm, der udlægges med en skabelon.
1.6.3.2. a)
stoffer i pulverform sigtes (0,5 mm sigte); alt hvad der passerer gennem sigten bruges til testen
b)
stoffer, der foreligger i presset, støbt eller anden kompakt form, findeles og sigtes; sigtefraktionen < 0,5 mm diameter bruges til testen.
1.6.3.3. Udførelse af testen Porcelænsstiften anbringes på prøven, og belastningen påsættes. Ved udførelse af testen skal skuremærkerne på porcelænspladen vende på tværs af bevægelsesretningen. Det må nøje påses, at der er tilstrækkeligt testmateriale under stiften, og at pladen bevæger sig korrekt under stiften. Til anbringelse af pastaagtige stoffer på pladen anvendes der en 0,5 mm tyk skabelon med et åbent felt på 2 × 10 mm. Porcelænspladen skal bevæge sig 10 mm frem og tilbage under porcelænsstiften i løbet af 0,44 sekunder. Hver del af porcelænspladen og -stiften må kun bruges én gang; de to ender af en stift kan bruges til to forsøg og de to flader af en plade kan hver bruges til tre forsøg. Der udføres seks forsøg med en belastning på 360 N. Forekommer der eksplosion i et af disse seks forsøg, udføres der en ny række på seks forsøg med en belastning på 120 N. I andre apparater sammenlignes prøven med det valgte referencestof ved hjælp af en fastlagt procedure (f.eks. up-and-down teknik).
1.6.3.4. Evaluering Testresultatet anses for positivt, hvis der sker eksplosion (knitren og/eller knald eller opflamning betragtes som eksplosion) i mindst ét af forsøgene med det specificerede friktionsapparat, eller hvis de tilsvarende kriterier i en alternativ friktionstest er opfyldt.
2. DATA Principielt anses et stof for at være eksplosionsfarligt i direktivets forstand, hvis der ved testen for varme-, slag- eller friktionsfølsomhed opnås et positivt resultat.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. PRØVNINGSRAPPORTEN Prøvningsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:
teststoffets betegnelse, sammensætning, renhed, fugtindhold mv.
prøvens fysiske tilstandsform samt oplysning om, om den er knust, findelt og/eller sigtet
iagttagelser under testen for varmefølsomhed (f.eks. testmasse, antal fragmenter mv.)
iagttagelser under testen for mekanisk følsomhed (f.eks. dannelse af væsentlige røgmængder eller fuldstændig dekomponering uden knald, flammer, gnister, knitren mv.)
resultaterne af hver forsøgstype
videnskabelig begrundelse for eventuel anvendelse af et alternativt apparat, samt godtgørelse af korrelationen mellem resultaterne med det specificerede apparat og resultaterne med et tilsvarende apparat
nyttige bemærkninger, såsom henvisning til forsøg med lignende produkter, som kan være relevante for korrekt fortolkning af resultaterne
alle yderligere bemærkninger, der er relevante for fortolkning af resultaterne.
3.2. FORTOLKNING OG EVALUERING AF RESULTATERNE I testrapporten skal alle resultater, der anses for ukorrekte, unormale eller ikke-repræsentative, nævnes. Hvis der skal ses bort fra nogle af resultaterne, skal dette forklares og resultaterne af supplerende eller alternativ test oplyses. Kan der ikke redegøres for et unormalt resultat, skal det tages for pålydende, og stoffet skal klassificeres i overensstemmelse hermed.
4.(1)(2)(3)(4)
HENVISNINGER Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 and 30-42. NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of explosion risk.
A.15. SELVANTÆNDELSESTEMPERATUR FOR VÆSKER OG GASSER
A.15.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Eksplosive stoffer og stoffer, der spontant bryder i brand i kontakt med luften, underkastes ikke denne test. Testproceduren kan anvendes for gasser, væsker og dampe, som kan antændes af en hed overflade under tilstedeværelse af luft. Selvantændelsestemperaturen kan påvirkes betydeligt i nedadgående retning af katalytiske urenheder, af overfladematerialet og af en større testbeholder.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Tendensen til selvantændelse udtrykkes ved selvantændelsestemperaturen. Selvantændelsestemperaturen er den laveste temperatur, ved hvilken teststoffet bryder i brand i blanding med luft under de i testmetoden definerede betingelser.
1.3. REFERENCESTOFFER I standarderne (se 1.6.3) er der nævnt referencestoffer. De skal først og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater opnået med andre metoder.
1.4. METODENS PRINCIP Ved metoden bestemmes den laveste temperatur af den indvendige overflade af et lukket rum, ved hvilken en gas, damp eller væske, der sprøjtes ind i rummet, bryder i brand.
1.5. KVALITETSKRITERIER Repeterbarheden afhænger af området for selvantændelsestemperaturen og af den anvendte testmetode. Følsomheden og specificiteten afhænger af den anvendte testmetode.
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN
1.6.
1.6.1. Apparatur Apparaturet er beskrevet i den metode, der henvises til i 1.6.3.
1.6.2. Testbetingelser En prøve af stoffet testes i overensstemmelse med den metode, der henvises til i 1.6.3.
1.6.3. Udførelse af testen Se IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056 og NF T 20-037.
2. DATA Testtemperaturen, atmosfæretrykket, den anvendte mængde prøvemateriale og tidsrummet, indtil der sker antændelse, registreres.
3. RAPPORTERING Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger
nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)
den anvendte testmængde og atmosfæretrykket
det anvendte apparatur
måleresultaterne (testtemperatur, resultaterne af antændelsen og det hertil svarende tidsrum)
alle yderligere oplysninger, der er relevante for fortolkningen af resultaterne.
4. HENVISNINGER Ingen.
A.16. RELATIV SELVANTÆNDELSESTEMPERATUR FOR FASTE STOFFER
A.16.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Eksplosive stoffer og stoffer, der spontant bryder i brand i kontakt med luften, underkastes ikke denne test. Formålet med denne test er at fremskaffe foreløbige oplysninger om faste stoffers selvantændelighed ved høj temperatur. Hvis den varme, der udvikles enten ved stoffets reaktion med luften eller ved eksoterm dekomponering, ikke bortledes hurtigt nok til omgivelserne, sker der en opvarmning, der fører til selvantændelse. Selvantændelse kan derfor finde sted, når varmeproduktionen sker hurtigere end varmeafgivelsen. Testmetoden egner sig til foreløbig screening af faste stoffer. Da antændelse og forbrænding af faste stoffer er meget kompleks, bør den selvantændelsestemperatur, der bestemmes ved denne metode, kun benyttes til sammenligningsformål.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Den selvantændelsestemperatur, der bestemmes ved denne metode, er den laveste omgivende temperatur udtrykt i oC, hvorved en bestemt mængde af et stof bryder i brand under veldefinerede betingelser.
1.3. REFERENCESTOF Ingen.
1.4. METODENS PRINCIP En bestemt mængde af teststoffet anbringes i en ovn ved stuetemperatur; medens ovntemperaturen hæves med 0,5 oC/min til smeltepunktet, dog højst til 400 oC, registreres temperaturen midt i prøven som funktion af tiden. I forbindelse med denne test benævnes den ovntemperatur, ved hvilken prøvens temperatur når op på 400 oC ved selvopvarmning, selvantændelsestemperaturen.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN
1.6.
1.6.1. Apparatur
1.6.1.
1.6.1.1. Ovn En temperaturprogrammeret laboratorieovn (volumen ca. 2 liter) med fri konvektion og eksplosionsaflastning. For at imødegå enhver eksplosionsfare må eventuelle dekomponeringsgasser ikke kunne komme i berøring med varmelegemet.
1.6.1.2. Terning af ståltrådsnet Et stykke ståltrådsnet med maskevidden 0,045 mm skæres ud efter tegningen i figur 1. Det foldes til terninger, hvor den ene side er åben, og fastholdes med ståltråd.
1.6.1.3. Termoelementer Egnede termoelementer.
1.6.1.4. Skriver En to-kanals skriver, der er kalibreret op til 600 oC eller en tilsvarende spænding.
1.6.2. Testbetingelser Stoffer testes i den form, de modtages i.
1.6.3. Udførelse af testen Terningen fyldes med teststoffet, og der bankes let på den under tilsætning af mere af stoffet, indtil den er helt fyldt. Dernæst ophænges terningen midt i ovnen ved stuetemperatur. Det ene termoelement anbringes midt i terningen, det andet mellem terningen og ovnvæggen til måling af ovntemperaturen. Ovntemperaturen og prøvetemperaturen registreres løbende, mens ovntemperaturen hæves til 400 oC, dog højst til stoffets smeltepunktet, med en hastighed på 0,5 oC/min. Antændelse af stoffet vil vise sig som en meget stejl temperaturstigning i prøven sammenlignet med ovntemperaturen.
2. DATA Den ovntemperatur, ved hvilken prøven som følge af selvopvarmning når op på en temperatur på 400 oC, er relevant for evaluering (se figur 2).
3. RAPPORTERING Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:
en beskrivelse af teststoffet
måleresultaterne, herunder temperatur/tid-kurven
alle yderligere bemærkninger, der er relevante for fortolkningen af resultaterne.
4. HENVISNINGER NF T 20-036 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.
4.
Figur 1 Tegning af 20 mm testterning
Figur 2 Typisk temperatur/tid-kurve
prøvens temperatur ovntemperatur antændelses-temperatur
A.17. OXIDERENDE EGENSKABER (FASTE STOFFER)
A.17.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Ved udførelse af denne test er det nyttigt at have forhåndsoplysninger om stoffets eventuelle eksplosive egenskaber. Denne test kan ikke anvendes på væsker, gasser, eksplosive og yderst let antændelige stoffer samt organiske peroxider. Det er ikke nødvendigt at udføre denne test, hvis det på grundlag af strukturformelen kan godtgøres, at stoffet med stor sandsynlighed ikke kan reagere eksotermt med et brændbart materiale. Der udføres en indledende test til konstatering af, om den egentlige test skal udføres under iagttagelse af særlige forsigtighedsregler.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Reaktionstid: den reaktionstid i sekunder, der kræves, for at reaktionszonen breder sig hen ad en vold, efter den fremgangsmåde, der er beskrevet i 1.6. Reaktionshastighed: udtrykkes i millimeter pr. sekund. Største reaktionshastighed: den største af de reaktionshastigheder, der bestemmes med blandinger indeholdende 10 til 90 vægtprocent af det oxiderende stof.
1.3. REFERENCESTOF Som referencestof til testen og screeningstesten benyttes bariumnitrat (analysekvalitet). Referenceblandingen er den blanding af bariumnitrat og pulveriseret cellulose, fremstillet efter 1.6, som har den største reaktionshastighed (normalt en blanding indeholdende 60 vægtprocent bariumnitrat).
1.4. METODENS PRINCIP Af sikkerhedshensyn udføres der en indledende screeningstest. Viser denne indledende test klart, at stoffet har oxiderende egenskaber, behøves der ikke yderligere testing. Er dette ikke tilfældet, underkastes stoffet en fuldstændig test. Ved den fuldstændige test blandes teststoffet og et veldefineret brændbart stof i forskellige forhold. Hver blanding arrangeres i en vold, der antændes i den ene ende. Den største målte reaktionshastighed sammenlignes med referenceblandingens største reaktionshastighed.
1.5. KVALITETSKRITERIER Alle påkrævede formalings- og blandemetoder kan anvendes under den forudsætning, at den største reaktionshastighed i hver af de seks enkeltforsøg ikke afviger fra det aritmetiske gennemsnit med mere end 10 %.
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN
1.6.
1.6.1. Forberedelse
1.6.1.
1.6.1.1. Teststof Prøven reduceres til en partikelstørrelse på < 0,125 mm på følgende måde: Teststoffet sigtes, hvorefter den tilbageholdte fraktion formales, og denne fremgangsmåde gentages, indtil hele testmængden har passeret sigten. Alle formalings- og sigtemetoder, der opfylder kvalitetskriterierne, kan anvendes. Før fremstilling af blandingen tørres stoffet ved 105 oC til konstant vægt. Hvis teststoffets dekomponeringstemperatur er lavere end 105 oC, tørres stoffet ved en passende lavere temperatur.
1.6.1.2. Brændbart stof Som brændbart stof anvendes der pulveriseret cellulose af den type, der bruges til tyndtlagskromatografi eller søjlekromatografi. En type, hvor 85 % af fibrene har en længde på mellem 0,020 og 0,075 mm, har vist sig egnet. Cellulosepulveret sigtes på en sigte med en maskevidde på 0,125 mm. Der bruges cellulose fra samme batch til hele testen. Før fremstilling af blandingen tørres cellulosepulveret ved 105 oC til konstant vægt. Hvis der benyttes savsmuld til den indledende test, fremstilles dette ved opsamling af den fraktion, der passerer gennem en sigte med maskevidden 1,6 mm, omhyggelig blanding og tørring ved 105 oC i 4 timer i et højst 25 mm tykt lag. Efter afkøling opbevares savsmuldet i en lufttæt beholder, der fyldes så meget som praktisk muligt, indtil der bruges, helst inden 24 timer efter tørringen.
1.6.1.3. Antændelseskilde Som antændelseskilde anvendes der en gasflamme (diameter mindst 5 mm). Anvendes der en anden antændelseskilde (f.eks. ved test i inert atmosfære), skal dette begrundes og kilden beskrives i rapporten.
1.6.2. Udførelse af testen Bemærk: Blandinger af oxiderende stoffer med cellulose eller savsmuld skal betragtes som potentielt eksplosive og behandles med passende forsigtighed.
1.6.2.
1.6.2.1. Indledende test 2 vægtdele tørret stof blandes omhyggeligt med 1 vægtdel tørret cellulose eller savsmuld, og der tildannes en lille kegleformet bunke af blandingen med en grundfladediameter på 3,5 cm og en højde på 2,5 cm, ved at fylde blandingen løst i en kegleformet form (f.eks. en laboratorietragt med tilproppet stilk). Bunken anbringes på en kold ikke-brændbar ikke-porøs dårligt varmeledende plade. Testen udføres i stinkskab på samme måde som testen i 1.6.2.2. Antændelseskilden bringes i berøring med bunken. Den efterfølgende reaktions voldsomhed og varighed iagttages og registreres. Hvis reaktionen er voldsom, skal stoffet anses for oxiderende. Hvis resultatet på nogen måde er tvetydigt, skal den nedenfor beskrevne fuldstændige udbredelsestest udføres.
1.6.2.2. Udbredelsestest Der fremstilles en række blandinger af oxiderende stof og cellulose indeholdende fra 10 til 90 vægtprocent oxiderende stof og med intervaller på 10 vægtprocent. I grænsetilfælde anvendes der blandinger derimellem, så den største reaktionshastighed bestemmes mere nøjagtigt. Volden tildannes ved hjælp af en 250 mm lang metalform, der har trekantet tværsnit med indvendig højde 10 mm og bredde 20 mm. På hver side af formen i længderetningen er der anbragt en metalplade, der rager 2 mm op over det trekantede tværsnits overkant (se figuren). Denne indretning fyldes løst med et lille overskud af blandingen. Efter at man har ladet formen falde ned på et fast underlag fra 2 cm's højde en gang, skrabes overskuddet af med en skråtstillet plade. Sidestykkerne fjernes, og det resterende pulver glattes ud med en valse. Der lægges en ikke-brændbar ikke-porøs dårligt varmeledende plade oven på formen, det hele vendes om, og formen fjernes. Volden anbringes i et stinkskab på tværs af luftstrømmen. Lufthastigheden skal være tilstrækkelig til at forhindre, at røgen slipper ud i laboratoriet, og må ikke ændres under testen. Omkring apparatet opstilles der en skærm til beskyttelse mod træk. Da cellulose og visse teststoffer er hygroskopiske, skal testen udføres så hurtigt som muligt. Volden antændes i den ene ende ved berøring med en flamme. Når reaktionszonen har forplantet sig 30 mm, måles dens udbredelseshastighed over de næste 200 mm. Testen udføres med referencestoffet og mindst én gang med hver af blandingerne af teststof med cellulose. Hvis den fundne største reaktionshastighed er væsentligt større end referenceblandingens, kan testen afbrydes; i modsat fald gentages forsøget fem gange med hver af de tre blandinger, der giver den største reaktionshastighed. Hvis der er mistanke om, at der er fremkommet et falsk positivt resultat, gentages testen med et inert materiale med tilsvarende partikelstørrelse i stedet for cellulosen, f.eks. kiselgur. Alternativt kan den blanding af teststof og cellulose, som har den højeste reaktionshastighed, testes i inert atmosfære (< 2 % v/v oxygen).
2. DATA Af sikkerhedshensyn anses den største reaktionshastighed — og ikke gennemsnittet — for at være den karakteristiske oxiderende egenskab ved det undersøgte stof. Den højeste værdi af reaktionshastigheden af en serie på seks forsøg med en given blanding er relevant for vurderingen. Hver enkelt blandings højeste reaktionshastighed afbildes mod koncentrationen af oxiderende stof. Den største reaktionshastighed aflæses på kurven. De seks værdier af reaktionshastigheden, som er fundet med den blanding, der har den største reaktionshastighed, må ikke afvige fra det aritmetiske gennemsnit med mere end 10 %; i modsat fald må formalings- og blandemetoderne forbedres. Den fundne største reaktionshastighed sammenlignes med referenceblandingens største reaktionshastighed (se 1.3). Hvis der udføres test i inert atmosfære, sammenlignes den største reaktionshastighed med referenceblandingens største reaktionshastighed bestemt i inert atmosfære.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:
det undersøgte stofs identitet, sammensætning, renhedsgrad, vandindhold, m.v.
eventuel behandling af prøven (f.eks. formaling eller tørring)
den benyttede antændelseskilde
måleresultaterne
reaktionsforløbet (f.eks. forbrænding med flammer fra overfladen, gennembrænding af hele materialet og oplysninger om forbrændingsprodukter)
alle yderligere bemærkninger, der er relevante for fortolkningen af resultaterne, herunder en beskrivelse af reaktionens voldsomhed (flamme, gnister, røg, ulmen, m.v.) og omtrentlige varighed i den indledende sikkerheds/screeningstest, både af test- og referencestoffet
resultaterne af test med et inert stof
eventuelle resultater af test i inert atmosfære.
3.2. FORTOLKNING AF RESULTATERNE Et stof skal anses for oxiderende, hvis For at undgå falske positive resultater skal de resultater, der opnås ved test af stoffet med et inert materiale og/eller i inert atmosfære, også tages i betragtning ved fortolkningen af resultaterne.
3.2. a)
der sker voldsom reaktion under den indledende test
b)
den største reaktionshastighed af de blandinger, der er undersøgt ved fuldstændig testning, er højere end eller lige så høj som referenceblandingens (dvs. cellulose og bariumnitrat) største reaktionshastighed.
4. HENVISNINGER NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.
A.18. POLYMERERS ANTALSMIDDELMOLEKYLVÆGT OG MOLEKYLVÆGTSFORDEL ING
A.18.
1. METODE Denne gelpermeationskromatografiske metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 118 (1996). Grundprincipper og yderligere tekniske oplysninger findes i henvisning (1).
1.
1.1. INDLEDNING Da polymerer kan have vidt forskellige egenskaber, er det umuligt at beskrive én metode med nøjagtig angivelse af alle betingelser for adskillelse og evaluering, som dækker alle tænkelige særtilfælde, der kan forekomme under adskillelse af polymerer. Især er komplekse polymersystemer ofte uegnede til gelpermeationskromatografi (GPC). Er det ikke praktisk muligt at foretage GPC, kan molekylvægten bestemmes ved andre metoder (se tillægget). I så fald skal der gives en begrundelse for valget af metode og en fuldstændig beskrivelse af den. Den beskrevne metode er baseret på DIN-standard 55672 (1). Heri findes der detaljerede oplysninger om, hvordan forsøgene udføres, og hvordan dataene evalueres. Hvis det bliver nødvendigt at ændre på forsøgsbetingelserne, skal disse ændringer begrundes. Der kan benyttes andre standarder, hvis der gives nøjagtige henvisninger dertil. I den beskrevne metode benyttes der polystyrenprøver med kendt polydispersitet til kalibrering; for visse polymerer, f.eks. vandopløselige polymerer og langkædede forgrenede polymerer, kan det være nødvendigt at ændre på dette.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Antalsmiddelmolekylvægten Mn og vægtmiddelmolekylvægten Mw bestemmes ved følgende udtryk: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi hvor Hi er detektorsignalets højde over basislinjen ved retentionsvolumen Vi Mi er molekylvægten af polymerfraktionen ved retentionsvolumen Vi n er antallet af datapunkter. Bredden af molekylvægtsfordelingen, som er et mål for systemets dispersitet, er givet ved forholdet Mw/Mn.
1.3. REFERENCESTOFFER Da GPC er en relativ metode, må der foretages en kalibrering. Hertil benyttes der normalt lineære polystyrenstandarder med kendte middelmolekylvægte Mn og Mw og kendt snæver molekylvægtsfordeling. Kalibreringskurven kan kun benyttes til bestemmelse af molekylvægten af den ukendte prøve, hvis der er valgt identiske betingelser for separation af prøven og standarden. Den sammenhæng mellem molekylvægt og elueringsvolumen, der bestemmes, gælder kun for de særlige betingelser ved det bestemte forsøg. Disse betingelser er først og fremmest temperatur, opløsningsmiddel (eller opløsningsmiddelblanding), kromatograferingsbetingelser og adskillelseskolonne eller -kolonnesystem. Den molekylvægt, der på denne måde bestemmes for prøven, er relativ og betegnes polystyrenækvivalent molekylvægt. Det betyder, at molekylvægten kan afvige mere eller mindre fra den absolutte værdi, afhængigt af strukturmæssige og kemiske forskelle mellem standard og prøve. Hvis der benyttes en anden standard, f.eks. polyethylenglycol, polyethylenoxid, polymethylmethacrylat eller polyacrylsyre, skal dette begrundes.
1.4. TESTMETODENS PRINCIP Både molekylvægtfordelingen og middelmolekylvægten af prøven (både Mn og Mw) kan bestemmes ved GPC. GPC er en særlig type væskekromatografi, hvor prøvens bestanddele adskilles efter hydrodynamisk volumen (2). Adskillelsen sker, mens prøven passerer gennem en kolonne med porøst materiale, typisk en organisk gel. Små molekyler kan trænge ind i porerne, mens store molekyler ikke kan. På denne måde får de store molekyler en kortere vejlængde, så de elueres først. Mellemstore molekyler trænger ind i nogle af porerne og elueres senere. De mindste molekyler, hvis hydrodynamiske radius er mindre end gelens porer, kan trænge ind i alle porer og elueres sidst. I den ideelle situation er kun molekylernes størrelse bestemmende for adskillelsen, men i praksis er det umuligt helt at undgå interferens fra absorption. Uensartet kolonnepakning og dødvolumener kan forværre dette forhold (2). Detektoren arbejder med f.eks. brydningsindeks eller UV-absorption og giver en simpel fordelingskurve. For at få hæftet faktiske molekylvægtsværdier på kurven, må kolonnen kalibreres ved at lede polymerer med kendt molekylvægt og helst stort set samme struktur, f.eks. forskellige polystyrenstandarder, gennem den. Resultatet er typisk en gauss-kurve, undertiden trukket ud i en lille hale i den lavmolekylære ende, hvor den lodrette akse viser mængden (i vægt) af de forskellige eluerede molekyler, og den vandrette akse viser logaritmen til molekylvægten.
1.5. KVALITETSKRITERIER Repeterbarheden (den relative standardafvigelse) bør være mindre end 0,3 % for det eluerede volumen. Den krævede repeterbarhed for analysen skal sikres ved korrektion med intern standard, hvis et kromatogram evalueres tidsafhængigt og ikke opfylder ovennævnte kriterium (1). Polydispersiteten afhænger af standardernes molekylvægt. For polystyrenstandarder er følgende værdier typiske: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp er standardens molekylvægt ved toppens maksimum)
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6.
1.6.1. Fremstilling af standardopløsninger af polystyren Polystyrenstandarderne opløses ved omhyggelig blanding med det valgte elueringsmiddel. Ved fremstillingen skal der nøje tages hensyn til producentens anvisninger. Hvilken koncentration der vælges, afhænger af forskellige faktorer, f.eks. injektionsvolumen, opløsningens viskositet og detektorens følsomhed. Det maksimale injektionsvolumen skal tilpasses til kolonnens længde, så man undgår overbelastning. Typisk er injektionsvolumen for en GPC-kolonne på 30 cm × 7,8 mm normalt mellem 40 og 100 μl til analytisk separation. Større rumfang kan tillades, men det bør ikke overstige 250 μl. Det optimale forhold mellem injektionsvolumen og koncentration må fastlægges inden den egentlige kalibrering af kolonnen.
1.6.2. Fremstilling af testopløsning I princippet gælder der samme krav ved fremstilling af testopløsningen. Prøven opløses i et egnet opløsningsmiddel, f.eks. tetrahydrofuran (THF), ved omhyggelig omrystning. Der må under ingen omstændigheder benyttes ultralydbad til opløsningen. Om nødvendigt kan testopløsningen renses på membranfilter med en porestørrelse mellem 0,2 og 2 μm. I den endelige rapport skal det oplyses, om der er uopløste partikler til stede, idet det kan skyldes højmolekylære bestanddele. Der benyttes en egnet metode til at bestemme den procentvise vægtmængde af de uopløste partikler. Opløsningerne benyttes inden for et døgn.
1.6.3. Apparatur Det skal sikres, at GPC-systemet er ufølsomt over for de anvendte opløsningsmidler (f.eks. ved brug af kapillarrør af stål til THF).
opløsningsmiddelbeholder
afgasningsapparat (hvis påkrævet)
pumpe
pulsdæmper (hvis påkrævet)
injektionssystem
kromatografikolonner
detektor
flowmeter (hvis påkrævet)
skriver/databehandlingsenhed
affaldsbeholder.
1.6.4. Injektions- og opløsningsmiddeltilførselssystem Der sættes et veldefineret volumen af prøveopløsningen på kolonnen, enten med en autosampler eller manuelt i en skarpt afgrænset zone. For hurtig tilbagetrækning eller indtrykning af stemplet i injektionssprøjten ved manuel indsprøjtning kan medføre ændringer i den iagttagne molekylvægtsfordeling. Systemet for tilførsel af opløsningsmiddel skal så vidt muligt være pulsationsfrit, helst indeholde en pulsdæmper. Flowet skal være omkring 1 ml/min.
1.6.5. Kolonne Afhængigt af prøven karakteriseres polymeren enten på en enkelt kolonne eller på flere serieforbundne kolonner. I handelen fås en række porøse kolonnematerialer med veldefinerede egenskaber (f.eks. porestørrelse og øvre og nedre grænse). Valget af separationsgel og kolonnelængde afhænger af prøvens egenskaber (hydrodynamisk volumen og molekylvægtsfordeling) og af de specifikke adskillelsesbetingelser såsom opløsningsmiddel, temperatur og flowhastighed (1) (2) (3).
1.6.6. Teoretiske bunde Den kolonne eller kolonnekombination, der benyttes til adskillelse, skal karakteriseres ved antallet af teoretiske bunde. Ved brug af THF som opløsningsmiddel gøres dette ved, at man sætter en opløsning af ethylbenzen eller et andet passende ikke-polært opløst stof på en kolonne af kendt længde. Antallet af teoretiske bunde er givet ved følgende udtryk: N=5,54VeW1/22 eller N=16VeW2 hvor N er antallet af teoretiske bunde Ve er elueringsvolumenet ved toppens maksimum W er toppens bredde ved basislinjen W1/2 er toppens bredde i halv højde
1.6.7. Adskillelseseffektiviteten Ud over antallet af teoretiske bunde, som er en størrelse, der bestemmer båndbredden, spiller også adskillelseseffektiviteten en rolle, og den bestemmes ved kalibreringskurvens stejlhed. En kolonnes adskillelseseffektivitet er givet ved følgende sammenhæng: Ve,Mx-Ve,(10Mx)Kolonnens tværsnit≥6,0 cm3cm2 hvor Ve, Mx er elueringsvolumenet for polystyren med molekylvægten Mx Ve,(10.Mx) er elueringsvolumenet for polystyren med en ti gange så høj molekylvægt Systemets adskillelsesevne defineres normalt som følger: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 hvor Ve1 og Ve2 er elueringsvolumen for de to polystyrenstandarder ved toppenes maksimum W1 og W2 er toppenes bredde ved basislinjen M1 og M2 er molekylvægtene ved toppenes højde (normalt en forskel på en faktor 10). R-værdien for kolonnesystemet bør være større end 1,7 (4).
1.6.8. Opløsningsmidler Alle opløsningsmidler skal være af høj renhed (for THF en renhedsgrad på 99,5 %). Opløsningsmiddelbeholderen (om nødvendigt med inert atmosfære) skal rumme tilstrækkelig meget til, at kolonnen kan kalibreres, og der kan analyseres flere prøver. Opløsningsmidlet skal afgasses, inden det pumpes videre til kolonnen.
1.6.9. Temperaturregulering Temperaturen i de kritiske komponenter (injektionssløjfe, kolonner, detektor og rør og slanger) skal være konstant og passe til det valgte opløsningsmiddel.
1.6.10. Detektor Detektoren har til formål at give et kvantitativt mål for koncentrationen af teststoffet i eluatet fra kolonnen. For at gøre den uundgåelige forbredning af toppene mindst mulig skal detektorcellens volumen være så lille som muligt. Det må ikke være større end 10 μl, undtagen for detektorer baseret på lysspredning og viskositet. Sædvanligvis benyttes der differentialrefraktometri til detektering. Hvis særlige egenskaber ved prøve eller elueringsmiddel kræver det, kan der benyttes andre detektortyper, f.eks. UV/VIS-, IR- eller viskositetsdetektor.
2. DATA OG RAPPORTERING
2.
2.1. DATA Der henvises til DIN-standarden (1) for så vidt angår detaljerede evalueringskriterier og krav til dataindsamling og -behandling. Der udføres to uafhængige forsøg med hver prøve. De analyseres hver for sig. Mn, Mw, Mw/Mn og Mp anføres for hver måling. Det skal udtrykkelig anføres, at de målte værdier er relative værdier svarende til den benyttede standards molekylvægt. Efter at retentionsvolumen eller retentionstid (eventuelt korrigeret ved hjælp af intern standard) er bestemt, afbildes værdier af log Mp (Mp er maksimum for kalibreringsstandardens top) mod en af disse størrelser. Der kræves mindst to kalibreringspunkter i hver molekylvægtsdekade og mindst fem målepunkter for hele kurven; sidstnævnte bør spænde over prøvens formodede molekylvægt. Slutpunktet i kalibreringskurvens lavmolekylære ende fastlægges ved n-hexylbenzen eller et andet passende ikke-polært stof. Antals- og vægtmiddelmolekylvægten bestemmes i reglen ved elektronisk databehandling på grundlag af udtrykkene i punkt 1.2. Til brug for manuel behandling er der yderligere oplysninger i ASTM D 3536/91 (3). Fordelingskurven skal forelægges i form af en tabel eller en figur (frekvens eller kumulativ sum mod log M). I en grafisk fremstilling skal en molekylær dekade normalt svare til ca. 4 cm i bredden, og den maksimale tophøjde skal være ca. 8 cm høj. I tilfælde af en integreret fordeling skal forskellen mellem 0 og 100 % på ordinaten være ca. 10 cm.
2.2. TESTRAPPORT Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:
2.2.
2.2.1. Teststof:
foreliggende oplysninger om teststoffet (identitet, tilsætningsstoffer, urenheder)
beskrivelse af behandling af prøven, iagttagelser, problemer.
2.2.2. Instrumenter:
beholder til elueringsmiddel, inert gas, afgasning af elueringsmiddel, elueringsmidlets sammensætning, urenheder
pumpe, pulsdæmper, injektionssystem
separationskolonner (fabrikat, alle specifikationer for kolonnen, såsom porestørrelse og separationsmaterialets art, samt antal, længde og rækkefølge af de anvendte kolonner)
antal teoretiske bunde i kolonnen (eller kolonnekombinationen), adskillelseseffektivitet (systemets adskillelsesevne)
oplysninger om toppenes symmetri
kolonnetemperatur, temperaturregulering
detektor (måleprincip, type, cellevolumen)
eventuelt flowmeter (fabrikat, måleprincip)
dataopsamlings- og databehandlingssystem (hardware og software).
2.2.3. Kalibrering af systemet:
detaljeret beskrivelse af den metode, der er benyttet til fremstilling af kalibreringskurven
oplysninger om kvalitetskriterier for metoden (f.eks. korrelationskoefficient, sum af afvigelsers kvadrater)
oplysninger om alle ekstrapoleringer, forudsætninger og tilnærmelser, der er gjort under forsøget og dataevalueringen og -behandlingen
alle målinger, der er benyttet til fremstilling af kalibreringskurven, skal dokumenteres i en tabel, som indeholder følgende oplysninger om hvert enkelt kalibreringspunkt:
prøvens navn
fabrikant
karakteristiske værdier af parametrene Mp, Mn, Mw og Mw/Mn, som oplyst af fabrikanten eller udledt ved efterfølgende målinger samt detaljerede oplysninger om målemetoden
injektionsvolumen og -koncentration
benyttet Mp-værdi ved kalibrering
elueringsvolumen eller korrigeret retentionstid målt ved topmaksimum
Mp-værdi beregnet ved topmaksimum
procentvis fejl på den beregnede Mp-værdi og kalibreringsværdien.
2.2.4. Evaluering:
evaluering på tidsbasis: angivelse af, hvilke metoder der benyttes til at sikre den krævede reproducerbarhed (korrektionsmetode, intern standard, m.v.)
oplysninger om, om evalueringen er foretaget på grundlag af elueringsvolumen eller retentionstid
oplysninger om begrænsningerne for evalueringen, hvis en top ikke er fuldstændigt analyseret
beskrivelse af eventuelle udglatningsmetoder
procedurer for tilberedning og forbehandling af prøven
tilstedeværelse af eventuelle uopløste partikler
injektionsvolumen (μl) og injektionskoncentration (mg/ml)
iagttagelser, der tyder på afvigelser fra den ideelle GPC-profil
detaljeret beskrivelse af alle ændringer i testproceduren
detaljerede oplysninger om usikkerhedsintervaller
alle øvrige oplysninger og iagttagelser, der er relevante for fortolkningen af resultaterne.
3.(1)(2)(3)(4)
HENVISNINGER DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
A.19. POLYMERERS INDHOLD AF LAVMOLEKYLÆRE BESTANDDELE
A.19.
1. METODE Denne gelpermeationskromatografiske metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 119 (1996). Grundprincipper og yderligere tekniske oplysninger findes i henvisningerne.
1.
1.1. INDLEDNING Da polymerer kan have vidt forskellige egenskaber, er det umuligt at beskrive én metode med nøjagtig angivelse af alle betingelser for adskillelse og evaluering, som dækker alle tænkelige særtilfælde, der kan forekomme under adskillelse af polymerer. Især er komplekse polymersystemer ofte uegnede til gelpermeationskromatografi (GPC). Er det ikke praktisk muligt at foretage GPC, kan molekylvægten bestemmes ved andre metoder (se tillægget). I så fald skal der gives en begrundelse for valget af metode og en fuldstændig beskrivelse af den. Den beskrevne metode er baseret på DIN-standard 55672 (1). Heri findes der detaljerede oplysninger om, hvordan forsøgene udføres, og hvordan dataene evalueres. Hvis det bliver nødvendigt at ændre på forsøgsbetingelserne, skal disse ændringer begrundes. Der kan benyttes andre standarder, hvis der gives nøjagtige henvisninger dertil. I den beskrevne metode benyttes der polystrenprøver med kendt polydispersitet til kalibrering; for visse polymerer, f.eks. vandopløselige polymerer og langkædede forgrenede polymerer, kan det være nødvendigt at ændre på dette.
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Lavmolekylære bestanddele defineres arbitrært som bestanddele med en molekylvægt på mindre end 1000 dalton. Antalsmiddelmolekylvægten Mn og vægtmiddelmolekylvægten Mw bestemmes ved følgende udtryk: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi hvor HI er detektorsignalets højde over basislinjen ved retentionsvolumen Vi Mi er molekylvægten af polymerfraktionen ved retentionsvolumen Vi, og n er antallet af datapunkter Bredden af molekylvægtsfordelingen, som er et mål for systemets dispersitet, er givet ved forholdet Mw/Mn.
1.3. REFERENCESTOFFER Da GPC er en relativ metode, må der foretages en kalibrering. Hertil benyttes der normalt lineære polystyrenstandarder med kendte middelmolekylvægte Mn og Mw og kendt snæver molekylvægtsfordeling. Kalibreringskurven kan kun benyttes til bestemmelse af molekylvægten af den ukendte prøve, hvis der er valgt identiske betingelser for separation af prøven og standarden. Den sammenhæng mellem molekylvægt og elueringsvolumen, der bestemmes, gælder kun for de særlige betingelser ved det bestemte forsøg. Disse betingelser er først og fremmest temperatur, opløsningsmiddel (eller opløsningsmiddelblanding), kromatograferingsbetingelser og adskillelseskolonne eller -kolonnesystem. Den molekylvægt, der på denne måde bestemmes for prøven, er relativ og betegnes polystyrenækvivalent molekylvægt. Det betyder, at molekylvægten kan afvige mere eller mindre fra den absolutte værdi, afhængigt af strukturmæssige og kemiske forskelle mellem standard og prøve. Hvis der benyttes en anden standard, f.eks. polyethylenglycol, polyethylenoxid, polymethylmethacrylat eller polyacrylsyre, skal dette begrundes.
1.4. TESTMETODENS PRINCIP Både molekylvægtfordelingen og middelmolekylvægten af prøven (både Mw og Mn) kan bestemmes ved GPC. GPC er en særlig type væskekromatografi, hvor prøvens bestanddele adskilles efter hydrodynamisk volumen (2). Adskillelsen sker, mens prøven passerer gennem en kolonne med porøst materiale, typisk en organisk gel. Små molekyler kan trænge ind i porerne, mens store molekyler ikke kan. På denne måde får de store molekyler en kortere vejlængde, så de elueres først. Mellemstore molekyler trænger ind i nogle af porerne og elueres senere. De mindste molekyler, hvis hydrodynamiske radius er mindre end gelens porer, kan trænge ind i alle porer og elueres sidst. I den ideelle situation er kun molekylernes størrelse bestemmende for adskillelsen, men i praksis er det umuligt helt at undgå interferens fra absorption. Uensartet kolonnepakning og dødvolumener kan forværre dette forhold (2). Detektoren arbejder med f.eks. brydningsindeks eller UV-absorption og giver en simpel fordelingskurve. For at få hæftet faktiske molekylvægtsværdier på kurven, må kolonnen kalibreres ved at lede polymerer med kendt molekylvægt og helst stort set samme struktur, f.eks. forskellige polystyrenstandarder, gennem den. Resultatet er typisk en gauss-kurve, undertiden trukket ud i en lille hale i den lavmolekylære ende, hvor den lodrette akse viser mængden (i vægt) af de forskellige eluerede molekyler, og den vandrette akse viser logaritmen til molekylvægten. Af denne kurve udledes indholdet af lavmolekylære bestanddele. Beregningen er kun nøjagtig, hvis de lavmolekylære bestanddele modsvarer polymeren som helhed på massebasis.
1.5. KVALITETSKRITERIER Repeterbarheden (den relative standardafvigelse) bør være mindre end 0,3 % for det eluerede volumen. Den krævede repeterbarhed for analysen skal sikres ved korrektion med intern standard, hvis et kromatogram evalueres tidsafhængigt og ikke opfylder ovennævnte kriterium (1). Polydispersiteten afhænger af standardernes molekylvægt. For polystyrenstandarder er følgende værdier typiske Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 Mp et standardens molekylvægt ved toppens maksimum)
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6.
1.6.1. Fremstilling af standardopløsninger af polystyren Polystyrenstandarderne opløses ved omhyggelig blanding med det valgte elueringsmiddel. Ved fremstillingen skal der nøje tages hensyn til producentens anvisninger. Hvilken koncentration der vælges, afhænger af forskellige faktorer, f.eks. injektionsvolumen, opløsningens viskositet og detektorens følsomhed. Det maksimale injektionsvolumen skal tilpasses til kolonnens længde, så man undgår overbelastning. Typisk er injektionsvolumen for en GPC-kolonne på 30 cm × 7,8 mm normalt mellem 40 og 100 μl til analytisk separation. Større rumfang kan tillades, men det bør ikke overstige 250 μl. Det optimale forhold mellem injektionsvolumen og koncentration må fastlægges inden den egentlige kalibrering af kolonnen.
1.6.2. Fremstilling af testopløsning I princippet gælder der samme krav ved fremstilling af testopløsningen. Prøven opløses i et egnet opløsningsmiddel, f.eks. tetrahydrofuran (THF) ved omhyggelig omrystning. Der må under ingen omstændigheder benyttes ultralydbad til opløsningen. Om nødvendigt kan testopløsningen renses på membranfilter med en porestørrelse mellem 0,2 og 2 μm. I den endelige rapport skal det oplyses, om der er uopløste partikler til stede, idet det kan skyldes højmolekylære bestanddele. Der benyttes en egnet metode til at bestemme den procentvise vægtmængde af de uopløste partikler. Opløsningerne benyttes inden for et døgn.
1.6.3. Korrektion for indhold af urenheder og additiver Det er normalt nødvendigt at korrigere indholdet af bestanddele med M < 1000 for bidrag fra ikke-polymere bestanddele (f.eks. urenheder og/eller additiver), medmindre der allerede er målt et indhold på < 1 %. Dette gøres ved direkte analyse på polymeropløsningen eller GPC-eluatet. Hvis eluatet efter passage af kolonnen er for fortyndet til yderligere analyse, må det koncentreres. Det kan være nødvendigt at inddampe eluatet til tørhed og genopløse det. Eluatet skal koncentreres på en sådan måde, at der med sikkerhed ikke sker ændringer i det. Behandlingen af eluatet efter GPC-trinnet vil afhænge af, hvilken analysemetode der anvendes til kvantitativ bestemmelse.
1.6.4. Apparatur GPC-udstyr bestående af følgende komponenter: Det skal sikres, at GPC-systemet er ufølsomt over for de anvendte opløsningsmidler (f.eks. ved brug af kapillarrør af stål til THF).
opløsningsmiddelbeholder
afgasningsapparat (hvis påkrævet)
pumpe
pulsdæmper (hvis påkrævet)
injektionssystem
kromatografikolonner
detektor
flowmeter (hvis påkrævet)
skriver/databehandlingsenhed
affaldsbeholder
1.6.5. Injektions- og opløsningsmiddeltilførselssystem Der sættes et veldefineret volumen af prøveopløsningen på kolonnen, enten med en autosampler eller manuelt i en skarpt afgrænset zone. For hurtig tilbagetrækning eller indtrykning af stemplet i injektionssprøjten ved manuel indsprøjtning kan medføre ændringer i den iagttagne molekylvægtsfordeling. Systemet for tilførsel af opløsningsmiddel skal så vidt muligt være pulsationsfrit, helst indeholde en pulsdæmper. Flowet skal være omkring 1 ml/min.
1.6.6. Kolonne Afhængigt af prøven karakteriseres polymeren enten på en enkelt kolonne eller på flere serieforbundne kolonner. I handelen fås en række porøse kolonnematerialer med veldefinerede egenskaber (f.eks. porestørrelse og øvre og nedre grænse). Valget af separationsgel og kolonnelængde afhænger af prøvens egenskaber (hydrodynamisk volumen og molekylvægtsfordeling) og af de specifikke adskillelsesbetingelser såsom opløsningsmiddel, temperatur og flowhastighed (1) (2) (3).
1.6.7. Teoretiske bunde Den kolonne eller kolonnekombination, der benyttes til adskillelsen, skal karakteriseres ved antallet af teoretiske bunde. Ved brug af THF som opløsningsmiddel gøres dette ved, at man sætter en opløsning af ethylbenzen eller et anden passende ikke-polært opløst stof på en kolonne af kendt længde. Antallet af teoretiske bunde er givet ved følgende udtryk: N=5,54VeW1/22 eller N=16VeW2 hvor, N er antallet af teoretiske bunde Ve er elueringsvolumenet ved toppens maksimum W er toppens bredde ved basislinjen W1/2 er toppens bredde i halv højde
1.6.8. Adskillelsereffektiviteten Ud over antallet af teoretiske bunde, som er en størrelse, der bestemmer båndbredden, spiller også adskillelseseffektiviteten en rolle, og den bestemmes ved kalibreringskurvens stejlhed. En kolonnes adskillelseseffektivitet er givet ved følgende sammenhæng: Ve,Mx-Ve,(10Mx)Kolonnens tværsnit≥6,0cm3cm2 hvor Ve, Mx er elueringsvolumenet for polystyren med molekylvægten Mx Ve,(10.Mx) er elueringsvolumenet for polystyren med en ti gange så høj molekylvægt Systemets adskillelsesevne defineres normalt som følger: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 hvor Ve1 og Ve2 er elueringsvolumen for de to polystyrenstandarder ved toppenes maksimum W1 og W2 er toppenes bredde ved basislinjen M1 og M2 er molekylvægtene ved toppenes højde (normalt en forskel på en faktor 10). R-værdien for kolonnesystemet bør være større end 1,7 (4).
1.6.9. Opløsningsmidler Alle opløsningsmidler skal være af høj renhed (for THF en renhedsgrad på 99,5 %). Opløsningsmiddelbeholderen (om nødvendigt med inert atmosfære) skal rumme tilstrækkelig meget til, at kolonnen kan kalibreres, og der kan analyseres flere prøver. Opløsningsmidlet skal afgasses, inden det pumpes videre til kolonnen.
1.6.10. Temperaturregulering Temperaturen i de kritiske komponenter (injektionssløjfe, kolonner, detektor og rør og slanger) skal være konstant og passe til det valgte opløsningsmiddel.
1.6.11. Detektor Detektoren har til formål at give et kvantitativt mål for koncentrationen af teststoffet i eluatet fra kolonnen. For at gøre den uundgåelige forbredning af toppene mindst mulig skal detektorcellens volumen være så lille som muligt. Det må ikke være større end 10 μl, undtagen for detektorer baseret på lysspredning og viskositet. Sædvanligvis benyttes der differentialrefraktometri til detektering. Hvis særlige egenskaber ved prøve eller elueringsmiddel kræver det, kan der benyttes andre detektortyper, f.eks. UV/VIS-, IR-eller viskositetsdetektor.
2. DATA OG RAPPORTERING
2.
2.1. DATA Der henvises til DIN-standarden (1) for så vidt angår detaljerede evalueringskriterier og krav til dataindsamling og -behandling. Der udføres to uafhængige forsøg med hver prøve. De analyseres hver for sig. Det er i alle tilfælde vigtigt også at bestemme data for blindprøver, der er behandlet på samme måde som prøven. Det skal udtrykkelig anføres, at de målte værdier er relative værdier svarende til den benyttede standards molekylvægt. Efter at retentionsvolumen eller retentionstid (eventuelt korrigeret ved hjælp af intern standard) er bestemt, afbildes værdier af log Mp (Mp er maksimum for kalibreringsstandardens top) mod en af disse størrelser. Der kræves mindst to kalibreringspunkter i hver molekylvægtsdekade og mindst fem målepunkter for hele kurven; sidstnævnte bør spænde over prøvens formodede molekylvægt. Slutpunktet i kalibreringskurvens lavmolekylære ende fastlægges ved n-hexylbenzen eller et andet passende ikke-polært stof. Den del af kurven, der svarer til molekylvægte under 1000, bestemmes og korrigeres efter behov for urenheder og additiver. Elueringskurverne evalueres i reglen ved elektronisk databehandling. Til brug for manuel behandling er der yderligere oplysninger i ASTM D 3536-91 (3). Uopløselig polymer, der måtte være tilbageholdt på kolonnen, vil efter al sandsynlighed have en molekylvægt, der er større end den opløselige fraktions, så hvis den lades ude af betragtning, vil indholdet af lavmolekylære bestanddele blive anslået for højt. I tillægget er der en vejledning i, hvordan indholdet af lavmolekylære bestanddele korrigeres for uopløselig polymer. Fordelingskurven skal forelægges i form af en tabel eller en figur (frekvens eller kumulativ sum mod log M). I en grafisk fremstilling skal en molekylær dekade normalt svare til ca. 4 cm i bredden, og den maksimale tophøjde skal være ca. 8 cm høj. I tilfælde af en integreret fordeling skal forskellen mellem 0 og 100 % på ordinaten være ca. 10 cm.
2.2. TESTRAPPORT Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:
2.2.
2.2.1. Teststof:
Foreliggende oplysninger om teststoffet (identitet, tilsætningsstoffer, urenheder)
Beskrivelse af behandling af prøven, iagttagelser, problemer.
2.2.2. Instrumenter:
Beholder til elueringsmiddel, inert gas, afgasning af elueringsmiddel, elueringsmidlets sammensætning, urenheder
Pumpe, pulsdæmper, injektionssystem
Separationskolonner (fabrikat, alle specifikationer for kolonnen, såsom porestørrelse og separationsmaterialets art, samt antal, længde og rækkefølge af de anvendte kolonner)
Antal teoretiske bunde i kolonnen (eller kolonnekombinationen), adskillelseseffektivitet (systemets adskillelsesevne)
Oplysninger om toppenes symmetri
Kolonnetemperatur, temperaturregulering
Detektor (måleprincip, type, cellevolumen)
Eventuelt flowmeter (fabrikat, måleprincip)
Dataopsamlings- og databehandlingssystem (hardware og software).
2.2.3. Kalibrering af systemet:
Detaljeret beskrivelse af den metode, der er benyttet til fremstilling af kalibreringskurven
Oplysninger om kvalitetskriterier for metoden (f.eks. korrelationskoefficient, sum af afvigelsers kvadrater
Oplysninger om alle ekstrapoleringer, forudsætninger og tilnærmelser, der er gjort under forsøget og dataevalueringen og -behandlingen
Alle målinger, der er benyttet til fremstilling af kalibreringskurven, skal dokumenteres i en tabel, som indeholder følgende oplysninger om hvert enkelt kalibreringspunkt:
prøvens navn
fabrikant
karakteristiske værdier af parametrene Mp, Mn, Mw, og Mw/Mn, som oplyst af fabrikanten udledt ved efterfølgende målinger samt detaljerede oplysninger om målemetoden
injektionsvolumen og -koncentration
benyttet Mp-værdi ved kalibrering
elueringsvolumen eller korrigeret retentionstid målt ved topmaksimum
Mp-værdi beregnet ved topmaksimum
procentvis fejl på den beregnede Mp-værdi og kalibreringsværdien.
2.2.4. Oplysninger om indholdet af lavmolekylære bestanddele:
beskrivelse af de metoder, der er benyttet til analysen, og hvordan forsøgene er udført
oplysninger om det procentvise indhold (w/w) af lavmolekylære bestanddele i forhold til hele prøven
oplysninger om urenheder, additiver og andre ikke-polymere bestanddele i vægtprocent i forhold til hele prøven
2.2.5. Evaluering:
Evaluering på tidsbasis: angivelse af, hvilke metoder der benyttes til at sikre den krævede reproducerbarhed (korrektionsmetode, intern standard, m.v.)
Oplysninger om, om evalueringen er foretaget på grundlag af elueringsvolumen eller retentionstid
Oplysninger om begrænsningerne for evalueringen, hvis en top ikke er fuldstændigt analyseret
Beskrivelse af eventuelle udglatningsmetoder
Procedurer for tilberedning og forbehandling af prøven
Tilstedeværelse af eventuelle uopløste partikler
Injektionsvolumen (μl) og injektionskoncentration (mg/ml)
Iagttagelser, der tyder på afvigelser fra den ideelle GPC-profil
Detaljeret beskrivelse af alle ændringer i testproceduren
Detaljerede oplysninger om usikkerhedsintervaller
Alle øvrige oplysninger og iagttagelser, der er relevante for fortolkningen af resultaterne.
3.(1)(2)(3)(4)
HENVISNINGER DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
A.20. POLYMERERS OPLØSELIGHED/EKSTRAHERBARHED I VAND
A.20.
1. METODE Den beskrevne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 120 (1997). Yderligere tekniske oplysninger findes i henvisning (1).
1.
1.1. INDLEDNING For visse polymerer, f.eks. emulsionspolymerer, kan det være nødvendigt at gøre yderligere forberedelser, inden den nedenfor beskrevne metode kan benyttes. Metoden kan ikke anvendes for flydende polymerer og polymerer, der kan reagere med vand under testbetingelserne. Når metoden ikke er bekvem eller er umulig at benytte, må opløseligheden/ekstraherbarheden undersøges ved andre metoder. I så fald skal gives alle detaljer og en begrundelse for valget af metode.
1.2. REFERENCESTOFFER Ingen.
1.3. TESTMETODENS PRINCIP Polymerers opløselighed/ekstraherbarhed i vandigt medium bestemmes ved hjælp af kolbemetoden (jf. A.6 Vandopløselighed — kolbemetoden) med de i det følgende beskrevne ændringer.
1.4. KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.5. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.5.
1.5.1. Udstyr Der er brug for følgende udstyr til metoden:
findelingsapparat, f.eks. mølle, til fremstilling af partikler med kendt størrelse
rysteapparat med mulighed for temperaturregulering
membranfilter
egnet analyseudstyr
standardsigter
1.5.2. Prøveforberedelse En repræsentativ prøve skal først findeles til en partikelstørrelse mellem 0,125 og 0,25 mm bestemt med passende sigter. Af hensyn til prøvens stabilitet, kan køling være påkrævet under formalingen. Materialer af gummiagtig karakter kan knuses ved flydende nitrogens temperatur (1). Hvis det ikke er muligt at nå ned på den krævede partikelstørrelse, skal der tilstræbes den mindst mulige partikelstørrelse, og det opnåede resultat anføres. Det oplyses i rapporten, hvordan den findelte prøve har været opbevaret indtil udførelse af testen.
1.5.3. Fremgangsmåde Der afvejes 3 prøver på hver 10 g af teststoffet i 3 glaskolber med glasprop, og der tilsættes 1000 ml vand til hver kolbe. Hvis det ikke er praktisk muligt at håndtere 10 g af polymeren, anvendes den største mængde, der kan håndteres, og vandmængden reduceres tilsvarende. Kolberne lukkes tæt til og omrystes ved 20 oC. Der benyttes en anordning, der kan arbejde ved konstant temperatur. Efter 24 timer centrifugeres eller filtreres indholdet af hver enkelt kolbe, og polymerkoncentrationen i den klare vandfase bestemmes med en passende analysemetode. Findes der ingen passende analysemetoder for vandfasen, kan den samlede opløselighed/ekstraherbarhed skønnes ud fra den tørre vægt af filterkagen eller bundfaldet fra centrifugeringen. Normalt er det nødvendigt at skelne kvantitativt mellem urenheder og additiver på den ene side og lavmolekylære forbindelser på den anden side. Ved gravimetrisk bestemmelse er det ligeledes vigtigt at medtage en blindprøve uden teststof, så der tages højde for restmateriale hidrørende fra forsøgets udførelse. Polymerers opløselighed/ekstraherbarhed i vand ved 37 oC ved pH 2 og pH 9 kan bestemmes som beskrevet ved udførelse af eksperimentet ved 20 oC. pH indstilles ved hjælp af egnede bufferopløsninger, syrer eller baser, f.eks. saltsyre, eddikesyre, natrium- eller kaliumhydroxid af analysekvalitet eller ammoniak. Der udføres en eller to prøver, afhængigt af den benyttede analysemetode. Når der findes tilstrækkelig specifikke metoder til direkte analyse af vandfasen for polymerkomponenten, skulle én prøve som ovenfor beskrevet være tilstrækkeligt. Hvis der derimod ikke findes sådanne metoder og polymerens opløselighed/ekstraherbarhed må bestemmes indirekte ved analyse af det vandige ekstrakts indhold af organisk kulstof i alt (TOC), bør der udføres endnu en prøve. Prøven bør gentages endnu en gang, denne gang med en ti gange mindre polymermængde men samme vandmængde som ved den første prøve.
1.5.4. Analyse
1.5.4.
1.5.4.1. Test udført med kun én prøvestørrelse I nogle tilfælde findes der metoder til direkte analyse af polymerkomponenter i vandfasen. Alternativt kan man overveje indirekte at analysere for opløste/ekstraherede polymerkomponenter ved at bestemme den samlede mængde opløste bestanddele og korrigere for ikke-polymerspecifikke komponenter. Analyse af vandfasen for samtlige polymerforbindelser kan foretages ved enten en tilstrækkelig følsom metode, f.eks. eller ved vakuuminddampning af det vandige ekstrakt til tørhed og analyse af remanensen ved spektroskopi (IR, UV m.v.) eller AAS/ICP. Hvis det ikke er praktisk muligt at gennemføre en analyse af selve vandfasen, ekstraheres vandekstraktet med et organisk opløsningsmiddel, der ikke er blandbart med vand, f.eks. en chloreret kulbrinte. Derefter afdampes opløsningsmidlet, og remanensen analyseres som ovenfor for indhold af den pågældende polymer. Bestanddele i denne remanens, som identificeres som urenheder eller additiver, fratrækkes, når selve polymerens opløselighed/ekstraherbarhed beregnes. Når der er forholdsvis store stofmængder til stede, kan det være nødvendigt at foretage f.eks. HPLC- eller GC-analyse af remanensen for at skelne urenheder fra monomere og monomerderivater, så det virkelige indhold af sidstnævnte kan bestemmes. I nogle tilfælde vil simpel afdampning af det organiske opløsningsmiddel og vejning af den tørre remanens være tilstrækkeligt.
TOC-bestemmelse ved nedbrydning til CO2 med persulfat eller dichromat efterfulgt af måling ved IR eller kemisk analyse
atomabsorptionsspektrometri (AAS) eller induktivt koblet plasmaemissionsspektrometri (ICP) for silicium- eller metalholdige polymerer
UV-absorption ellerr spektrofluorimetri for arylpolymerer
LC-MS for lavmolekylære prøver
1.5.4.2. Test udført med to forskellige prøvestørrelser Alle vandige ekstrakter analyseres for TOC. Der foretages gravimetrisk bestemmelse af den del af prøven, der ikke er gået i opløsning. Hvis der efter centrifugering eller filtrering af de enkelte kolbers indhold stadig sidder polymerrester fast på kolbens væg, skylles kolben med filtratet, indtil der ikke længere er synlige rester i kolben. Derefter centrifugeres eller filtreres filtratet igen. Filterkagen eller bundfaldet fra centrifugeringen tørres ved 40 oC under vakuum og vejes. Tørringen fortsættes til konstant vægt.
2. DATA
2.
2.1. TEST UDFØRT MED KUN ÉN PRØVESTØRRELSE Resultaterne for hver enkelt kolbe og gennemsnittet for de 3 kolber anføres i masseenheder pr. volumen opløsning (typisk mg/l) eller masse pr. masse polymerprøve (typisk mg/g). Desuden anføres prøvens vægttab (beregnet som vægten af det opløste stof divideret med prøvens begyndelsesvægt). De relative standardafvigelser (RSD) beregnes. Der anføres enkelttal for den samlede stofmængde (polymer + nødvendige additiver) og for polymer alene (dvs. efter subtraktion af bidraget fra disse additiver).
2.2. TEST UDFØRT MED TO FORSKELLIGE PRØVESTØRRELSER De enkelte TOC-værdier for de vandige ekstrakter fra de to tredobbeltforsøg og gennemsnitsværdien for hvert forsøg anføres i masseenheder pr. volumen opløsning (typisk mg C/l) eller masse pr. masse polymerprøve (typisk mg C/g). Ingen forskel mellem resultaterne for højt og lavt forhold mellem prøve og vand er tegn på, at alle ekstraherbare komponenter faktisk er ekstraheret. I så fald er direkte analyse normalt ikke påkrævet. Vægten af hver enkelt remanens anføres, også i procent af den oprindelige prøve. Der beregnes et gennemsnit for hvert forsøg. Det procentvise indhold af opløselige og ekstraherbare stoffer i den oprindelige prøve er givet ved forskellen mellem 100 og de fundne procenttal.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. TESTRAPPORT Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:
3.1.
3.1.1. Teststof:
Foreliggende oplysninger om teststoffet (identitet, tilsætningsstoffer, urenheder, indhold af lavmolekylære bestanddele).
3.1.2. Forsøgsbetingelser:
beskrivelse af den anvendte fremgangsmåde og forsøgsbetingelserne
beskrivelse af analyse- og detekteringsmetoder.
3.1.3. Resultater:
resultaterne for opløselighed/ekstraherbarhed i mg/l; enkeltværdier og gennemsnit for ekstraktionsforsøgene i de forskellige opløsninger, opdelt på polymer og urenheder, additiver m.v.
resultaterne for opløselighed/ekstraherbarhed i mg/g polymer
TOC-værdier for vandige ekstrakter, vægt af opløst stof og beregnet procentværdi, hvis målt
pH af hver enkelt prøve
oplysninger om blindprøver
oplysninger om teststoffets eventuelle kemiske ustabilitet både under testproceduren og under analyseringen
alle oplysninger, der har betydning for fortolkning af resultaterne.
4. HENVISNINGER DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen fur Prufzwecke.
A.21. OXIDERENDE EGENSKABER (VÆSKER)
A.21.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Formålet med denne metode er måling af væskers potentiale for forøgelse af brændbare stoffers forbrændingshastighed eller -intensitet, eller deres potentiale for sammen med et brændbart stof at danne en selvantændelig blanding, når de to stoffer blandes grundigt. Metoden bygger på FN's prøve for oxiderende væsker (1) og er ækvivalent med denne. Da nærværende metode A.21 imidlertid primært er bestemt til at opfylde kravene i forordning (EF) nr. 1907/2006, kræves kun sammenligning med ét referencestof. Forventes prøvningsresultaterne anvendt til andre formål, kan sammenligning med flere referencestoffer dog være nødvendig. Denne prøve kræves ikke udført, når det af strukturformlen uden rimelig tvivl fremgår, at stoffet er ude af stand til at reagere eksotermt med et brændbart materiale. Før prøven udføres, vil det være nyttigt at råde over foreløbige oplysninger om stoffets eventuelle potentielle eksplosionsfarlighed. Denne prøve finder ikke anvendelse på faste stoffer, gasser, eksplosive eller letantændelige stoffer samt organiske peroxider. Denne prøve kræves ikke udført, når prøvningsresultater for prøvestoffet foreligger fra FN-prøven for oxiderende væsker (1).
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Den gennemsnitlige trykstigningstid er gennemsnitsværdien af de ved prøvningen foretagne målinger af den tid, det tager prøveblandingen at frembringe en trykstigning fra 690 kPa til 2070 kPa over atmosfære-trykket.
1.3. REFERENCESTOF Som referencestof anvendes 65 % (w/w) salpetersyre (analytisk kvalitet). Hvis forsøgslederen forventer, at prøveresultaterne senere kan tænkes anvendt til andre formål, kan også andre referencestoffer om ønsket afprøves.
1.4. PRØVNINGSMETODENS PRINCIP Prøvevæsken blandes med fibercellulose i masseforholdet 1:1 og overføres til en trykbeholder. Forekommer der under blanding eller overføring selvantændelse, er yderligere prøvning unødvendig. Hvis selvantændelse ikke opstår, gennemføres hele prøven. Blandingen opvarmes i en trykbeholder, og gennemsnitstiden for en trykstigning fra 690 kPa til 2070 kPa over atmosfæretrykket beregnes. Resultatet sammenholdes med den gennemsnitlige trykstigningstid for blandingen af referencestof og cellulose i forholdet 1:1.
1.5. KVALITETSKRITERIER I en serie bestående af 5 forsøg på samme stof må ingen resultater afvige mere end 30 % fra det aritmetiske gennemsnit. Resultater, som afviger over 30 % fra gennemsnittet, skal kasseres, blandings- og påfyldningsproceduren forbedres, og prøvningen gentages.
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN
1.6.
1.6.1. Forberedelse
1.6.1.
1.6.1.1. Brændbart stof Tørret fibercellulose med fiberlængde mellem 50 og 250 μm og gennemsnitsdiameter 25 μm anvendes som brændbart stof. Dette tørres til konstant vægt i et højst 25 mm tykt lag ved 105 oC i 4 timer og opbevares i exsikkator med tørremiddel, indtil det er afkølet og klart til brug. Vandindholdet i den tørrede cellulose skal være under 0,5 % på tør massebasis. Om nødvendigt forlænges tørretiden for at opnå dette. Der skal anvendes cellulose fra samme batch under hele prøven.
1.6.1.2. Apparatur
1.6.1.2.
1.6.1.2.1. Trykbeholder Prøvningen skal udføres med en trykbeholder. Beholderen er en cylindrisk trykbeholder af stål med længde 89 mm og Ø udvendig 60 mm (se figur 1). To modstående flader af beholderen er bearbejdet (således at beholderens tværsnit er reduceret til 50 mm) for at lette fastholdelsen under montering af tændrør og udluftnings-prop. Beholderen, hvis boring er Ø 20 mm, er indvendigt falset i hver ende til en dybde af 19 mm og forsynet med gevind til isætning af 1'' britisk standardrør (BSP)eller tilsvarende metrisk størrelse. Et trykudtag i form af et siderør er skruet ind i beholderens hvælvede overflade 35 mm fra den ene ende og i en vinkel på 90o med de bearbejdede overflader. Til montering af siderøret er udført en 12 mm dyb boring med gevind til ½'' BSP (eller tilsvarende metrisk størrelse) på enden af siderøret. Om nødvendigt anvendes en pakning af inaktivt materiale for at sikre gastæt samling. Grenrøret rager 55 mm uden for trykbeholderens hus og har en boring på 6 mm. Enden af siderøret er falset og forsynet med gevind for tilslutning af tryk-transducer af membrantypen. Enhver trykmåleanordning kan anvendes, forudsat at den ikke påvirkes af de varme gasser eller nedbrydningsprodukter og reagerer på en trykstigning på 690-2070 kPa inden for højst 5 ms. Den ende af trykbeholderen, som er længst fra siderøret, lukkes med et tændrør, som er monteret med to elektroder, hvoraf den ene er isoleret fra rørets hus, og den anden er jordforbundet til huset. Den modsatte ende af trykbeholderen lukkes med en sprængskive (sprængningstryk ca. 2200 kPa), som fastholdes af en låseprop med boring Ø 20 mm. Om nødvendigt anvendes til tændrøret en pakning af inaktivt materiale for at sikre gastæt samling. Et stativ (figur 2) holder enheden i korrekt stilling under brug. Stativet består sædvanligvis af en fod af blødt stål med målene 235 mm × 184 mm × 6 mm og et 185 mm langt stykke firkantet hulprofil 70 mm × 70 mm × 4 mm. I den ene ende af hulprofilen bortskæres en del af hver af to modstående sider, således at man opnår en struktur, som har to ben med flade sider og opadtil fortsætter i et 86 mm langt stykke intakt kasseprofil. Enderne af disse flade sider skæres af i en vinkel på 60o med det vandrette plan og svejses fast på fodpladen. I den ene side af fodstykkets øverste ende foretages en 22 mm bred og 46 mm dyb udfræsning, som giver plads til siderøret, når trykbeholderen med tændrøret først sænkes ned i kasseprofilstativet. Forneden på kasseprofilens indvendige overflade fastsvejses et stykke stål med bredde 30 mm og tykkelse 6 mm, der fungerer som afstandsstykke. Til fastholdelse af trykbeholderen anvendes to 7 mm fingerskruer, som sidder i skruehuller i den modstående flade. Nedefra støttes trykbeholderen af to 12 mm brede bånd af 6 mm tykt stål, fastsvejst på sidestykkerne, som ligger op ad kasseprofilens nederste ende.
1.6.1.2.2. Tændsystem Tændsystemet består af en 25 cm lang Ni/Cr ledning Ø 0,6 mm med en modstand på 3,85 ohm/m. Ledningen er spiralviklet ved hjælp af en stang Ø 5 mm og fastgjort til tændrørets elektroder. Spiralen skal være udformet på en af de i figur 3 viste måder. Afstanden fra beholderens bund til tændspolens underside skal være 20 mm. Er elektroderne ikke justerbare, skal enderne af tændtråden mellem spolen og beholderens underside være isoleret med en keramisk foring. Ledningen opvarmes af en konstant strømforsyning, som kan yde mindst 10 A.
1.6.2. Prøvens udførelse Apparatet, komplet med tryktransducer og opvarmningssystem, men uden sprængskive, anbringes under-støttet med tændrøret nedad. I et bægerglas blandes 2,5 g af prøvevæsken med 2,5 g tørret cellulose ved hjælp af en glasspatel. Mens blandingen finder sted, skal der være anbragt sikkerhedsskærm mellem operatøren og blandingen. Hvis der under blanding eller overføring sker selvantændelse, er yderligere prøvning unødvendig. Blandingen påfyldes trykbeholderen i små portioner ved at banke let, idet man sørger for at blandingen pakkes tæt omkring tændspolen og har god kontakt til denne. Det er vigtigt at spolen ikke forvrides under denne pakkeproces, da prøvningen ellers kan give forkerte resultater. Sprængskiven sættes på plads, og låseproppen skrues forsvarligt fast. Den fyldte beholder overføres til støttefoden med sprængskiven opad; støttefoden skal anbringes i et passende armeret stinkskab eller en brandcelle. Strømforsyningen tilsluttes tændrørets udvendige klemmer, og der påføres 10 A. Tiden fra sammenblandingen påbegyndes til strømmen sluttes, må ikke overstige 10 minutter. Tryktransducerens signal registreres på et passende system, hvormed den opnåede trykprofil både kan vurderes og optegnes permanent (f.eks. en transientoptager koblet til en punktskriver). Blandingen opvarmes, indtil sprængskiven brydes, eller til der er gået mindst 60 s. Hvis sprængskiven ikke brydes, lader man blandingen afkøle, før apparatet forsigtigt adskilles, efter at der er truffet forholdsregler over for eventuelt overtryk. Der udføres 5 prøver med prøvestof og referencestof(fer). Den tid, det tager trykket at stige fra 690 kPa til 2070 kPa over atmosfæretrykket, noteres. Den gennemsnitlige trykstigningstid beregnes. I visse tilfælde kan et stof frembringe en trykstigning (for høj eller for lav), som skyldes kemiske reaktioner, der ikke karakteriserer stoffets oxiderende egenskaber. I så fald kan det være nødvendigt at gentage prøven med et inaktivt stof, f.eks. diatoméjord (kiselgur), i stedet for cellulose for at klarlægge reaktionens art.
2. DATA Trykstigningstider for både prøvestof og referencestof(fer). Trykstigningstider for eventuelle prøver udført med inaktivt stof.
2.
2.1. Tabel 1 Eksempler på resultater
BEHANDLING AF RESULTATER De gennemsnitlige trykstigningstider for prøvestof og referencestof(fer) beregnes. Den gennemsnitlige trykstigningstid for eventuelle prøver udført med inaktivt stof beregnes. I tabel 1 er givet nogle eksempler på resultater. Stof Gennemsnitlig trykstigningstid for en 1:1 blanding med cellulose (ms) Ammoniumdichromat, mættet vandig opløsning 20800 Calciumnitrat, mættet vandig opløsning 6700 Ferrinitrat, mættet vandig opløsning 4133 Lithiumperchlorat, mættet vandig opløsning 1686 Magnesiumperchlorat, mættet vandig opløsning 777 Nikkelnitrat, mættet vandig opløsning 6250 Salpetersyre, 65 % 4767 Perchlorsyre, 50 % 121 Perchlorsyre, 55 % 59 Kaliumnitrat, 30 % vandig opløsning 26690 Sølvnitrat, mættet vandig opløsning Natriumchlorat, 40 % vandig opløsning 2555 Natriumnitrat, 45 % vandig opløsning 4133 Inaktivt stof Vandxellulose
3. RAPPORT
3.
3.1. PRØVNINGSRAPPORT Prøvningsrapporten skal indeholde følgende oplysninger:
det afprøvede stofs identitet, sammensætning, renhed mv.
prøvestoffets koncentration
metode benyttet til tørring af den anvendte cellulose
vandindholdet i den anvendte cellulose
måleresultaterne
resultater af eventuelle prøvninger med inaktivt stof
beregnede gennemsnitlige trykstigningstider
eventuelle afvigelser fra denne metode og begrundelsen derfor
alle supplerende oplysninger og bemærkninger, som er relevante for fortolkningen af resultaterne.
3.2. FORTOLKNING AF RESULTATERNE Prøvningsresultaterne bedømmes på grundlag af: Et væskeformigt stof anses for oxiderende, når: For at undgå falske positive resultater må bedømmelsen af resultaterne om nødvendigt også inddrage resultaterne af prøvning af stoffet med inaktivt materiale.
3.2. a)
om blandingen af prøvestof og cellulose selvantænder, og
b)
sammenholdelse af den gennemsnitlige tid, der går til en trykstigning fra 690 kPa til 2070 kPa, med den tilsvarende værdi for referencestoffet (-stofferne).
a)
en blanding af stoffet og cellulose i masseforholdet 1:1 selvantænder, eller
b)
den gennemsnitlige trykstigningstid af en blanding af prøvestoffet og cellulose i masseforholdet 1:1 højst er lig den gennemsnitlige trykstigningstid for en blanding af 65 % (w/w) vandig salpetersyre og cellulose i masseforholdet 1:1.
4.(1) HENVISNINGER Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids. Note: Begge disse opstillinger kan bruges.«
4.(1)
Fig. 1 Trykbeholder
(A) Trykbeholderlegeme (B) Låseprop for sprængskive (C) Tændrør (D) Blød blyskive (E) Sprængskive (F) Siderør (G) Tryktransducerhoved (H) Skive (J) Isoleret elektrode (K) Jordforbundet elektrode (L) Isolering (M) Stålkonus (N) Skiveforvridende rille
Fig. 2 Stativ
Fig. 3 Tændsystem
(A) Tændspole (B) Isolering (C) Elektroder (D) Tændrør
Tillæg Der findes supplerende tekniske oplysninger i nedenstående standarder.
1. Kapillarmetoder
1.
1.1. Smeltepunktsapparater med væskebad ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapilarverfarehn JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products.
1.2. Smeltepunktsapparater med metalblok DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determination of melting point
2. Varmeborde
2.
2.1. Koflers varmebænk ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings
2.2. Smeltemikroskop DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen.
2.3. Meniskmetode (polyamider) ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Resines de polyamides. Determination du point de fusion methode du menisque
3. Metoder til bestemmelse af frysepunkt BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de petrole: determination de la temperature de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsiiuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Methode de determination du point de cristallisation (point de Congelation ISO 1392 Method for the determination of the freezing point
4. Termoanalyse
4.
4.1. Differential termoanalyse ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
4.2. Differential scanning kalorimetri ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
5. Bestemmelse af flydepunkt NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du petrole: Point de trouble et point d'ecoulement limite — Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils — Determination of pour point
Tillæg Der findes supplerende tekniske oplysninger i nedenstående standarder
1.1.1. Ebulliometer Smeltepunktsapparater med væskebad ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes
2. Destillationsforløb (kogepunktsinterval) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation:determination du rendement et de l'intervalle de distillation
3. Differential termoanalyse og differential scanning kalorimetri ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
Tillæg Der findes supplerende tekniske oplysninger i nedenstående standarder:
1. Opdriftsmetoder
1.
1.1. Aræometer DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Chemical products for industrial use — Determination of density of liquids — Areometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers
1.2. Hydrostatisk vægt
1.2. For faste stoffer
ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Chemical products for industrial use — Determination of the density of solids other than powders and cellular products — Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density
For væsker
ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 og ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
1.3. Metode med nedsænket legeme DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method
2. Pyknometermetoder
2.
2.1. For væsker ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10-6 m2 s-1 at 15 oC) DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC) DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol — water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products — chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary — stoppered pycnometer method NF T 20-053 Chemical products for industrial use — Determination of density of solids in powder and liquids — Pyknometric method
2.2. For faste stoffer ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-053 Chemical products for industrial use — Determination of density of solids in powder and liquids — Pyknometric method DIN 19683 Determination of the density of soils
3. Luftsammenligningspyknometer DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung
Tillæg 1 Estimeringsmetode
INDLEDNING
Man kan benytte beregnede værdier for damptrykket til:
at beslutte, hvilken af forsøgsmetoderne der er egnet
at foretage et skøn eller at fastsætte en grænseværdi, når man af tekniske årsager (herunder tilfælde, hvor damptrykket er meget lavt) ikke kan benytte eksperimentelle metoder
at konstatere, i hvilke tilfælde det er berettiget at undlade eksperimentelle målinger, fordi damptrykket sandsynligvis vil være < 10-5 Pa ved stuetemperatur.
ESTIMERINGSMETODE
Væskers og faste stoffers damptryk kan skønnes ved hjælp af den modificerede Watson-korrelation (a). Det eneste nødvendige eksperimentelle data er kogepunktet. Metoden kan benyttes i trykintervallet fra 10-5 Pa til 10 Pa. I Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b) findes der nærmere oplysninger om metoden.
FREMGANGSMÅDE VED BEREGNINGEN
Ifølge (b) beregnes damptrykket således: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb hvor T = den pågældende temperatur Tb = kogepunktet Pvp = damptrykket ved temperaturen T ΔHvb = fordampningsvarmen ΔZb = en sammentrykkelighedsfaktor (ansættes til 0,97) m = en empirisk faktor, der afhænger af tilstandsformen ved den pågældende temperatur Yderligere haves Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb hvor KF er en empirisk faktor, der tager hensyn til stoffets polaritet. I henvisning (b) er der en liste med KF-faktorer for flere typer forbindelser. Ofte forligger der data, hvor kogepunktet ved reduceret tryk er opgivet. I sådanne tilfælde kan man efter (b) beregne damptrykket således: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1mT1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 hvor T1 er kogepunkter ved det reducerede tryk P1.
RAPPORT
Når estimeringsmetoden benyttes, skal rapporten indeholde fyldestgørende dokumentation af beregningen.
HENVISNINGER
(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, 398.
(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.
Tillæg 2
Figur 1 Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter den dynamiske metode
1 = Termoelement 2 = Vakuumstødpuderumfang 3 = Trykmåler 4 = Vakuum 5 = Målepunkt 6 = Varmeelement ca. 150 W
Figur 2a Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter den statiske metode (med U-rørsmanometer)
1. Teststof 2. Dampfase 3. Højvakuumventil 4. U-rør (hjælpemanometer) 5. Manometer 6. Temperaturbad 7. Temperaturmåleanordning 8. Til vakuumpumpe 9. Udluftning
Figur 2b Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter den statiske metode (med trykindikator)
1. Teststof 2. Dampfase 3. Højvakuumventil 4. Trykmåler 5. Trykindikator 6. Temperaturbad 7. Temperaturmåleanordning
Figur 3 Isoteniskop (se reference 7)
1. Til system for trykregulering og -måling 2. Rør med ydre diameter 8 mm 3. Tør nitrogen i tryksystem 4. Dampe af prøven 5. Lille spids 6. Flydende prøve
Figur 4 Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter metoden med damptryksvægt
1. Teststof 2. Dampfase med dampstrøm 3. Fordampningsovn med drejelig gennemføring 3a. Ovnlåg med åbning 4. Opvarmning (afkøling) af ovn 5. Måling af prøvens temperatur 6. Kølekappe 7. Skærm 8. Kølestang til kølekappegennemføring 9. Vægtskål 10. Mikrovægt 11. Til skriver 12. Til højvakuumpumpe
Figur 5 Eksempel på apparat til fordampning ved lavt tryk ved effusionsmetoden, med et effusionscellevolumen på 8cm3
1 Forbindelse til vakuum 2 Huller til platinmodstandstermometer eller temperaturmåling og -regulering (2) 3 Låg til vakuumbeholder 4 O-ring 5 Vakuumbeholder af aluminium 6 Anordning til anbringelse og fjernelse af effusionsceller 7 Låg med gevind 8 Vingemøtrikker (6) 9 Bolte (6) 10 Effusionsceller af rustfrit stål 11 Opvarmningspatroner (6)
Figur 6a Eksempel på et strømningssystem til bestemmelse af damptryk efter gasmæmingsmetoden
Vent Manifold 1 = Flowregulator 2 = Varmeveksler 3 = Nåleventiler 4 = Føler for relativ fugtighed 5 = Mætningskolonner 6 = PTFE-samlinger 7 = Flowmeter 8 = Fælde (absorber) 9 = Oliefælde 10 = Boblerør af glasfritte
Figur 6b Eksempel på et system til bestemmelse af damptryk efter gasmætningsmetoden med kapillarrør anbragt efter mætningskammeret
1. Termisk masseflowmeter 2. Manometer 3. Kammer med temperaturstyring 4. Termostateringsspiral til bæregas 5. Termometer (Pt 100) 6. Gasmætningskammer 7. Kapillarrør 8. Absorptionsbeholdere 9. Gasmåler 10. Kuldefælde
Figur 7 Eksempel på forsøgsopstilling til metoden med roterende kugle Damptryksapparat
A. Målehoved med roterende kugle B. Prøvecelle C. Termostat D. Vakuumrør (turbopumpe) E. Lufttermostat
Figur 8 Eksempel på målehoved med roterende kugle
1. Kugle 2. Evakueret rørformet forlængelse af 6 3. Permanentmagneter (2) 4. Spoler (2) for vertikal stabilisering 5. Drivspoler (4) 6. Tilslutningsflange
Tillæg
Figur 1 Kolonne-eluerings metoden med recirkulationspumpe
Ligevægt til atmosfæren Flowmeter Mikrokolonne Termostatstyret cirkulationspumpe Recirkulationspumpe To-vejs hane til prøveudtagning
Figur 2 En typisk mikrokolonne
(alle dimensioner er i mm) Forbindelse til glasslib Headspace Indvendig: 5 Udvendig: 19 Glasuldsprop To-vejs hane
Figur 3 En typisk mikrokolonne
(alle dimensioner er i mm) Forbindelse til glasslib Headspace Indvendig: 5 Udvendig: 19 Hane
Figur 4 Kolonne-eluerings- metoden med niveau beholder
1 = Niveaubeholder (f.eks. 2,5 l standflaske) 2 = Kolonne (se figur 3) 3 = Fraktionssamler 4 = Termostat 5 = Teflonslange 6 = Glasslibforbindelse 7 = Vandslange (mellem termostat og kolonne, indre diameter: ca. 8 mm)
Tillæg 1 Metoder til beregning/estimering
INDLEDNING
I Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) er der en generel indføring i beregningsmetoder samt data og eksempler. Beregnede værdier for Pow kan benyttes:
til at afgøre, hvilken forsøgsmetode der er mest velegnet (rystekolbemetoden: log Pow — 2 til 4; HPLC-metoden: log Pow 0 til 6)
til at vælge de bedste forsøgsbetingelser (f.eks. referencestoffer til HPLC-metoden og volumenforholdet mellem n-octanol og vand til rystekolbemetoden)
som intern laboratoriekontrol for eventuelle forsøgsfejl
til at give et skøn over Pow i de tilfælde, hvor man af tekniske årsager ikke kan anvende eksperimentelle metoder.
ESTIMERINGSMETODER Foreløbigt skøn over fordelingskoefficienten
Der kan foretages et skøn over værdien af fordelingskoefficienten ved hjælp af teststoffets opløselighed i de rene opløsningsmidler: Hertil benyttes: Pestimate = saturation cn-octanolsaturation cwater
BEREGNINGSMETODER Princippet bag beregningsmetoderne
Alle beregningsmetoder er baseret på formel fragmentering af molekylet i passende delstrukturer, for hvilke man har pålideligt kendskab til log Pow-bidrag. Log Pow for hele molekylet beregnes dernæst som summen af fragmentværdierne plus summen af korrektionsudtryk for intramolekylære vekselvirkninger. Der foreligger lister over fragmentkonstanter og korrektionsudtryk (b)(c)(d)(e). Nogle af dem ajourføres regelmæssigt (b).
Kvalitetskriterier
Sædvanligvis aftager beregningsmetodens pålidelighed med, at det undersøgte stofs kompleksitet stiger. For simple molekyler med lav molekylvægt og en eller to funktionelle grupper kan der forventes en afvigelse på 0,1 til 0,3 mellem resultatet af forskellige fragmenteringsmetoder og den målte værdi for log Pow. Fejlmargenen kan være større for mere komplekse molekyler. Den afhænger af, om der foreligger fragmentkonstanter og hvor pålidelige de er, samt af, om intramolekylære vekselvirkninger (f.eks. hydrogenbindinger) erkendes, og om korrektionsudtrykkene anvendes korrekt (mindre problematisk med computerprogrammet CLOGP-3) (b). For ioniserbare forbindelsers vedkommende har det stor betydning, at ladningen eller ioniseringsgraden bedømmes korrekt.
Fremgangsmåde ved beregningen
Hanschs π-metode
Den oprindelige konstant for hydrofobe substituenter, π, som indførtes af Fujita m.fl. (f), defineres ved πx = log Pow (PhX) – log Pow (PhH) hvor Pow (PhX) er fordelingskoefficienten for et aromatisk derivat og Pow(PhH) er stamforbindelsens fordelingskoefficient (f.eks. πCl = log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6) = 2,84 – 2,13 = 0,71). Ifølge sin definition gælder π-metoden navnlig for aromatisk substitution. Der findes tabeller med π-værdier for en lang række substituenter (b)(c)(d). De benyttes til beregning af log Pow for aromatiske molekyler og delstrukturer.
Rekkers metode
Efter Rekker (g) beregnes værdien af log Pow således: log Pow=Σi ai fj+Σj (vekselvirkningsudtryk) hvor fi er de forskellige molekylfragmentkonstanter og ai er den hyppighed, hvormed de forekommer i det pågældende molekyle. Korrektionsudtrykkene kan udtrykkes som et heltalsmultiplum af én enkelt konstant Cm (den såkaldte magiske konstant). Fragmentkonstanterne fi og Cm er bestemt på grundlag af en liste med 1054 eksperimentelt bestemte værdier af Pow (825 forbindelser) ved hjælp af flerdimensional regressionsanalyse (c)(h). Vekselvirkningsudtrykkene bestemmes efter faste regler, der er beskrevet i henvisning (e)(h)(i).
Hansch-Leos metode
Efter Hansch og Leo (c) beregnes værdien af log Pow således: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj hvor fi er de forskellige molekylfragmentkonstanter, Fj er korrektionsudtrykkene, og ai, og bj er de hertil hørende hyppigheder. Ud fra eksperimentelt bestemte værdier af Pow har man ved at prøve sig frem kunnet opstille en liste over atom- og gruppefragmentværdier og en liste over korrektionsudtryk Fj (såkaldte faktorer). Korrektionsudtrykkene er ordnet i flere forskellige klasser (a)(c). Det er forholdsvis kompliceret og tidkrævende at tage hensyn til alle regler og korrektionsudtryk. Der er udviklet edb-programmer hertil (b).
Kombineret metode
Beregningen af log Pow for komplekse molekyler kan forbedres betydeligt, hvis molekylet deles op i større delstrukturer, som man har pålidelige log Pow-værdier for, enten fra tabeller (b)(c) eller fra egne målinger. Sådanne fragmenter (f.eks. heterocykliske forbindelser, anthraquinon, azobenzen) kan dernæst kombineres med Hanschs π-værdier eller Rekkers eller Leos fragmentkonstanter.
Bemærkninger
i)
Beregningsmetoderne kan kun anvendes på helt eller delvis ioniserede forbindelser, hvis de nødvendige korrektionsfaktorer kan tages i betragtning.
ii)
Hvis der må antages at forekomme intramolekylære hydrogenbindinger, må det hertil svarende korrektionsudtryk (ca. +0,6 til +1,0 log Pow-enheder) lægges til (a). Rumlige modeller og spektroskopiske data kan afsløre, om der kan være tale om sådanne bindinger i molekylet
iii)
Hvis flere tautomere former er mulige, benyttes den mest sandsynlige form som grundlag for beregningen.
iv)
Man skal nøje følge med i revisioner af lister over fragmentkonstanter.
Rapport
Ved anvendelse af beregningsmetoder skal testrapporten om muligt indeholde følgende oplysninger:
beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)
angivelse af alle muligheder for intramolekylære hydrogenbindinger, dissociation, ladning eller andre særlige forhold (f.eks. tautomeri)
beskrivelse af beregningsmetoden
identifikation af de anvendte datas oprindelse
særlige valg af fragmenter
udtømmende dokumentation af beregningen.
HENVISNINGER
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chill. Ther. 1979, vol. 14, 479.
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol.1.
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.
(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.
Tillæg 2 Anbefalede referencestoffer til HPLC-metoden
nr. referencestof logow pKa 1 2-butanon 0,3 2 4-acetylpyridin 0,5 3 anilin 0,9 4 acetanilid 1,0 5 benzylalkohol 1,1 6 p-methoxyphenol 1,3 pKa = 10,26 7 phenoxyeddikesyre 1,4 pKa = 3,12 8 phenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrophenol 1,5 pKa = 3,96 10 benzonitril 1,6 11 phenylacetonitril 1,6 12 4-methylbenzylalkohol 1,6 13 acetophenon 1,7 14 2-nitrophenol 1,8 pKa = 7,17 15 3-nitrobenzoesyre 1,8 pKa = 3,47 16 4-chloranilin 1,8 pKa = 4,15 17 nitrobenzen 1,9 18 kanelalkohol 1,9 19 benzoesyre 1,9 pKa = 4,19 20 p-cresol 1,9 pKa = 10,17 21 kanelsyre 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 anisol 2,1 23 methylbenzoat 2,1 24 benzen 2,1 25 3-methylbenzoesyre 2,4 pKa = 4,27 16 4-chlorphenol 2,4 pKa = 9,1 27 trichlorethylen 2,4 28 atrazin 2,6 29 ethylbenzoat 2,6 30 2,6-dichlorbenzonitril 2,6 31 3-chlorbenzoesyre 2,7 pKa = 3,82 32 toluen 2,7 33 1-naphthol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dichloranilin 2,8 35 chlorbenzen 2,8 36 allylphenylether 2,9 37 brombenzen 3,0 38 ethylbenzen 3,2 39 benzophenon 3,2 40 4-phenylphenol 3,2 pKa = 9,54 41 thymol 3,3 42 1,4-dichlorbenzen 3,4 43 diphenylamin 3,4 pKa = 0,79 44 naphthalen 3,6 45 phenylbenzoat 3,6 46 isopropylbenzen 3,7 47 2,4,6-trichlorphenol 3,7 pKa = 6 48 biphenyl 4,0 49 benzylbenzoat 4,0 50 2,4-dinitro-6-sec-butylphenol 4,1 51 1,2,4-trichlorbenzen 4,2 52 dodecansyre 4,2 53 diphenylether 4,2 54 n-butylbenzen 4,5 55 phenanthren 4,5 56 fluoranthen 4,7 57 dibenzyl 4,8 58 2,6-diphenylpyridin 4,9 59 triphenylamin 5,7 60 DDT 6,2 Andre referencestoffer med lav log Pow 1 nikotinsyre -0,07
Tillæg
Figur Form og tilbehor til fremstilling af volden
(alle mal i millimeter) Formens længde: 250 mm Materiale: aluminium
Tillæg
Figur Apparatur
Tillæg
Eksempel på materialespecifikation for varmefølsomhedstesting (se DIN 1623) (1)(2)(3)
Rør: Materialespecifikation nr. 1.0336.505 g Mundingsplade: Materialespecifikation nr. 1.4873 Krave med gevind og møtrik: Materialespecifikation nr. 1.3817
Figur 1 Apparat til testing for varmefølsomhed
(alle dimensioner i mm) Fig. 1a Stålrør og tilbehør (1) rør (1a) udvendig flange (2) krave med lavfriktionsgevind (3) mundingsplade a = 2,0 eller 6,0 mm diameter (4) møtrik b - 10 mm diameter (5) rejfet kant (6) 2 spændflader til 41 mm nøgle Fig. 1b Opvarmnings- og beskyttelsesanordning (7) 2 spændflader til 36 mm nøgle (8) sprængstyksikkert kammer (9) 2 bærestænger til røret (10) samlet rør (11) bageste brænders position; de andre brændere er synlige (12) vågeflamme
Figur 2 Test for varmefølsomed
Eksempler på fragmentering Ingen eksplosion Ingen eksplosion Eksplosion Eksplosion Eksplosion Eksplosion
Figur 3 Kalibrering af opvarmingshastigeden ved test af varmefølsomed
Temperatur (°C) Tid (sekunder) Kurve over temeraturforløbet mod tiden ved opvarmning af dibutylphthalat (27 cm3 i et lukket rør (mundingslade med 1,5 mm hul) med et propanflow på 3,2 litter/minut. Temperaturen er målt med chromel/alumel-termoelement med 1 mm indkapsling i rustfrit stål, anbragt central 43 mm under rørets overkant. Mellen 135 oC og 285 oC skal opvarmningshastigheden være 185-215 K/minut.
Figur 4 Apparat til slagprøvning
(alle dimensioner i mm) (1) bundplade, 450 x 450 x 60 (2) stålblok, 230 x 250 x 200 (3) ambolt, 100 (diameter) x 70 (4) stander (5) mellemtravers (6) 2 styr (7) tandstang (8) skala (9) faldhammer (faldlod) (10) fastholdelses- og frigørelsesanordning (11) holdeplade (12) mellemambolt (udskiftelig) 26 (diameter) x 26 (13) holdering med åbninger (14) slaganordning Figur 4a. Faldhammer, forfra og fra siden, oversigtstegning Figur 4b. Faldhammer, nederste del
Fortstat
Figur. 4d. Slaganordning for væsker Figur. 4c. Slaganordning for stoffer, der foreligger i form af pulver eller pasta (1) stålcylindre (2) styrering for stålcylindrene (3) holdering med åbninger (a) lodret snit (b) plan (4) gummiring (5) væske (40 mm3) (6) væskefrit rum Figur. 4e. Hammer (faldlod på 5 kg) (1) ophængningstap (2) højdemærke (3) styrefals (4) cylindrisk slaghoved (5) bagslagshage
Figur 5 Apparat til friktionsfølsomhed
Figur 5a. Friktionsapparat – vertikalprojektion og grundrids (1) bundplade af stål (2) slæde (3) porcelænsplade 25 x 25 x 5 mm fastholdt på slæden (4) fast porcelænsstift, 10 (diameter) x 15 mm (5) prøve, ca. 10 mm3 (6) stiftholder (7) belastningsarm (8) kontravægt (9) afbryder (10) hjul til indstilling af slæden i udgangsstillingen (11) til elmotor Figur 5b. Stiftens udgangsposition på prøven
Tillæg
Figur Form og tilbehor til fremstilling af provolden
(alle dimensioner i mm)
Tillæg Eksempler på andre metoder til bestemmelse af antalsmiddelmolekylvægt (Mn) for polymerer
Gelpermeationskromatografi er den foretrukne metode til bestemmelse af Mn, især når der er rådighed over et sæt standarder med tilnærmelsesvis samme struktur som den pågældende polymer. Hvis der er praktiske problemer med at udføre GPC, eller hvis der allerede er en formodning om, at stoffet ikke kan opfylde det fastsatte Mn-kriterium (og dette ønskes bekræftet), er der alternative metoder til rådighed, f.eks.:
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
Brug af kolligative egenskaber Ebullioskopi/kryoskopi består i at måle et opløsningsmiddels kogepunktsforhøjelse (ebullioskopi) eller frysepunktssænkning (kryoskopi), når polymeren tilsættes. Metoden bygger på, at den opløste polymers indvirkning på væskens kogepunkt/frysepunkt afhænger af dens molekylvægt (1) (2). Anvendelsesområde: Mn < 20000. Damptrykssænkning består i at måle damptrykket af en valgt referencevæske før og efter tilsætning af en kendt mængde polymer (1) (2). Anvendelsesområde: Mn < 20000 (teoretisk; i praksis dog af begrænset værdi). Membranosmometri bygger på det osmotiske princip, dvs. opløsningsmiddelmolekylers naturlige tendens til at passere gennem en semipermeabel membran fra en tynd til en mere koncentreret opløsning for at etablere ligevægt. Ved testen har den tynde opløsning en koncentration på nul, mens den mere koncentrerede opløsning indeholder polymeren. Opløsningsmidlets bevægelse gennem membranen giver en trykforskel, der afhænger af polymerens koncentration og molekylvægt (1) (3) (4). Anvendelsesområde: Mn < 20000-200000. Vapour Phase Osmometry Gasfaseosmometri består i at sammenligne fordampningshastigheden i en ren opløsningsmiddelaerosol med mindst tre aerosoler, der indeholder den pågældende polymer i forskellige koncentrationer (1) (5) (6). Anvendelsesområde: Mn < 20000.
2. Endegruppeanalyse For at kunne bruge denne metode skal man have kendskab både til polymerens overordnede struktur og til kædetermineringsgruppernes karakter (endegrupperne skal kunne skelnes fra hovedskelettet ved f.eks. NMR eller titrering/derivatisering). Ved bestemmelse af den molekylære koncentration af endegrupper i polymeren kan man nå frem til en værdi for molekylvægten (7) (8) (9). Anvendelsesområde: Mn op til 50000 (idet pålideligheden aftager).
3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
Henvisninger Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York. Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.
Tillæg Vejledning i, hvordan indholdet af lavmolekylære bestanddele korrigeres for uopløselig polymer
Indhold af uopløselig polymer i prøven vil medføre et vist massetab under GPC-analysen. Den uopløselige polymer tilbageholdes irreversibelt på kolonnen eller prøvefiltret, mens den opløselige del af prøven passerer gennem kolonnen. Hvis tilvæksten i polymerens brydningsindeks (dn/dc) kan skønnes eller måles, kan man få et skøn over, hvor stor en masse der er gået tabt på kolonnen. I så fald foretages korrektionen ved hjælp af en ekstern kalibrering med standardmaterialer med kendt koncentration og dn/dc, så refraktometerets udslag kalibreres. I nedenstående eksempel er der benyttet en standard af poly (methylmethacrylat) (pMMA). Ved ekstern kalibrering med henblik på analyse af acrylpolymere analyseres en pMMA-standard med kendt koncentration i tetrahydrofuran ved GPC, og de fremkomme data benyttes til bestemmelse af refraktometerkonstanten efter følgende udtryk: K = R/(C × V × dn/dc) hvor K er refraktometerkonstanten (i mikrovolt-sekund/ml) R er pMMA-standardens udslag (mikrovolt-sekund) C er pMMA-standardens koncentration (i mg/ml) V er injektionsvolumenet (i ml), og dn/dc er brydningsindekstilvæksten for pMMA i tetrahydrofuran (i ml/mg) Følgende data er typiske for en pMMA-standard: R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 × 10-5 ml/mg Den fremkomne K-værdi på 3,05 × 1011 benyttes derefter til beregning af det teoretiske detektorudslag, hvis 100 % af polymeren elueres gennem detektoren.
DEL B METODER TIL BESTEMMELSE AF TOKSICITET OG ANDRE SUNDHEDSVIRKNINGER
GENEREL INDLEDNING A.
BESKRIVELSE AF TESTSTOFFET Teststoffets sammensætning, herunder de vigtigste urenheder, og dets relevante fysisk-kemiske egenskaber, herunder dets stabilitet, skal være kendt forud for enhver undersøgelse af toksicitet. Teststoffets fysisk-kemiske egenskaber giver en række vigtige oplysninger for valget af administrationsmåde, udformningen af hver enkelt undersøgelse samt håndtering og opbevaring af teststoffet. Forud for undersøgelsen bør der udvikles en analysemetode til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af stoffet (herunder vigtige urenheder, såfremt dette er muligt) i doseringsmediet og i det biologiske materiale. Alle oplysninger om teststoffets identitet, fysisk-kemiske egenskaber, renhed og adfærd medtages i testrapporten.
B.
PASNING AF DYR Ved toksicitetstest er det afgørende, at der føres nøje kontrol med testmiljøet, og at dyrene passes korrekt.
i)
Miljø Miljøet i forsøgsstalde og -bure skal afpasses efter dyrearten. For rotter, mus og marsvin er en rumtemperatur på 22 ± 3 oC og en relativ luftfugtighed på 30-70 % passende; for kaniner bør temperaturen være på 20 ± 3 oC og den relative luftfugtighed på 30-70 %. Nogle forsøgsteknikker er særlig følsomme over for temperaturafvigelser, og i sådanne tilfælde indeholder beskrivelsen af testmetoden nærmere oplysninger om passende forsøgsbetingelser. Ved alle undersøgelser af toksiske virkninger skal temperaturen og luftfugtigheden kontrolleres, registreres og anføres i den afsluttende forsøgsrapport. Der bør anvendes kunstig belysning, som følger en rytme med 12 timers lys og 12 timers mørke. Oplysninger om belysningsrytmen registreres og anføres i den afsluttende forsøgsrapport. Medmindre andet er angivet i metoden, kan dyrene opbevares i bure hver for sig eller i små grupper af samme køn, dog højst fem dyr pr. bur. I rapporter over dyreforsøg er det vigtigt at anføre, hvilken type bure der er anvendt, og hvor mange dyr der har været i hvert bur, såvel under eksponering for det kemiske stof som i en efterfølgende observationsperiode.
ii)
Fodring Foderet skal opfylde alle de ernæringskrav, som den pågældende art af forsøgsdyr stiller. Hvis teststofferne indgives med foder, kan reaktioner mellem teststoffet og foderbestanddele medføre, at næringsværdien nedsættes. Muligheden af en sådan reaktion skal tages i betragtning, når forsøgsresultaterne fortolkes. Der kan anvendes normalt laboratoriefoder med ubegrænset forsyning af drikkevand. Valget af foder kan afhænge af, at teststoffet skal kunne iblandes foderet på passende måde, hvis teststoffet indgives med foderet. Forureninger i foderet, som vides at influere på toksiciteten, må ikke forefindes i interfererende koncentrationer.
C.
ALTERNATIV TESTNING Den Europæiske Union har sat sig som mål at udvikle og validere alternative metoder, som kan give oplysninger på samme niveau som de nuværende dyreforsøg, men som anvender færre dyr, forårsager mindre smerte, eller hvor brugen af dyr fuldstændig kan undgås. Efterhånden som sådanne metoder udvikles, skal de så vidt muligt tages i anvendelse i forbindelse med risikobeskrivelse og efterfølgende klassifikation og etikettering baseret på den potentielle fare ved de pågældende stoffer.
D.
VURDERING OG FORTOLKNING Ved vurdering og fortolkning af resultaterne af dyreforsøg og in vitro-undersøgelser skal der tages hensyn til, at der er grænser for, i hvilket omfang de kan ekstrapoleres direkte til mennesker, dokumentation for skadelige virkninger på mennesker, hvor sådan foreligger, skal derfor anvendes til at bekræfte testresultaterne.
E.
HENVISNINGER De fleste af disse metoder er udviklet inden for rammerne af OECD's program for retningslinjer for forsøgsvirksomhed (OECD-Test Guidelines) og bør udføres i overensstemmelse med principperne for god laboratoriepraksis, så der kan opnås størst mulig gensidig accept af data. Yderligere oplysninger kan findes i henvisningerne i OECD-retningslinjerne og relevant litteratur, der er offentliggjort andetsteds.
B.1.A. AKUT ORAL TOKSICITET — FASTDOSISMETODEN
B.1.A.
1. METODE Denne forsøgsmetode svarer til OECD TG 420 (2001)
1.
1.1. INDLEDNING I traditionelle metoder til bestemmelse af akut giftighed anvendes dyrenes død som effektparameter. I 1984 foreslog British Toxicology Society en ny metode til bestemmelse af akut giftighed, baseret på administration af stoffet i en række faste dosisniveauer (1). Med denne metode undgik man at anvende dyrenes død som effektparameter, men støttede sig i stedet til observation for tydelige tegn på toksicitet ved et af en række faste dosisniveauer. Efter in vivo-validering, dels i Det Forenede Kongerige (2), dels internationalt (3), blev metoden indført som forsøgsmetode i 1992. Efterfølgende er de statistiske egenskaber af fastdosismetoden evalueret ved hjælp af matematiske modeller i en række undersøgelser (4}(5)(6). Tilsammen har in vivo-undersøgelser og modelforsøg vist, at metoden er reproducerbar, kræver færre dyr og medfører færre lidelser end traditionelle metoder, og at den gør det muligt at rangordne stofferne på tilsvarende måde som andre metoder til bestemmelse af akut giftighed. Vejledning i valg af den mest hensigtsmæssige forsøgsmetode til et givet formål kan findes i Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (7). Samme dokument indeholder desuden supplerende oplysninger om udførelse og fortolkning af forsøg efter metode B.1.A. Undersøgelsens princip indebærer, at der i hovedundersøgelsen kun anvendes moderat toksiske doser, og at man undgår at administrere doser, som forventes at være dødelige. Ligeledes undgår man at administrere doser, der vides at medføre udtalt smerte og lidelse pga. ætsende eller stærkt irriterende virkning. Dyr, som er moribunde, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og vedvarende lidelser, skal aflives humant og betragtes ved fortolkningen af forsøgsresultaterne på samme måde som dyr, der er døde under forsøget, Kriterierne for aflivning af moribunde eller stærkt lidende dyr samt vejledning i at fastslå forudsigelig eller forestående død er genstand for en særskilt vejledning (8). Metoden giver oplysninger om de farlige egenskaber og gør det muligt at rangordne og klassificere stofferne efter det globale harmoniserede system (GHS) til klassificering af kemiske stoffer med akut toksisk virkning (9). Testlaboratoriet bør inden forsøgets udførelse gennemgå alle foreliggende oplysninger om teststoffet. Sådanne oplysninger omfatter stoffets identitet og kemiske struktur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af andre in vitro- eller in vivo-tokstcitetsundersøgelser af stoffet, toksikologiske data for strukturelt beslægtede stoffer, samt stoffets forventede anvendelse(r). Disse oplysninger er nødvendige for til alle parters tilfredshed at godtgøre, at forsøget har betydning for beskyttelsen af menneskers sundhed, og vil desuden være nyttige ved valg af passende startdosis.
1.2. DEFINITIONER Akut oral toksicitet: de sundhedsmæssigt uønskede virkninger, som optræder efter oral indgift af en enkelt dosis af et teststof eller efter flere doser indgivet i løbet af 24 timer. Forsinket død: det forhold, at dyret ikke inden for 48 timer dør eller fremtræder moribund, men dør senere inden for den 14 dage lange observationsperiode. Dosis: den mængde teststof, som indgives. Dosis angives som vægtmængde teststof pr. vægtenhed forsøgsdyr (f.eks. mg/kg). Synlig toksicitet: et generelt udtryk, som angiver klare tegn på toksicitet efter indgift af teststoffet (eksempler herpå findes i (3)), således at der ved den næsthøjeste faste dosis enten kan forventes svære smerter og vedvarende tegn på svære lidelser, moribund status (kriterier herfor er beskrevet i Humane Endpoints Guidance Document (8)), eller størstedelen af dyrene forventes at dø. GHS: Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures. Et fælles projekt mellem OECD (sundhed og miljø), FN's ekspertudvalg vedrørende transport af farligt gods (fysisk-kemiske egenskaber) og ILO (faremærkning og -angivelse), koordineret af Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC). Overhængende død: det forhold, at moribund tilstand eller død forventes at indtræffe inden næste planlagte observationstidspunkt. Som tegn på denne tilstand i gnavere kan nævnes kramper, sideleje, liggende stilling og tremor. LD50(middel letaldosis): den statistisk beregnede enkeltdosis af et teststof, som ved oral indgift kan forventes at medføre døden hos 50 % af dyrene, LD50-værdien angives som vægtmængde teststof pr, vægtenhed kropsvægt af forsøgsdyret. Grænsedosis: en dosis, som danner øvre grænse for testen (2000 eller 5000 mg/kg). Moribund tilstand: en tilstand, hvor dyret er døende eller ikke vil overleve, selv om det behandles (se nærmere i Humane Endpoint Guidance Document (8)). Forudsigelig død: tilstedeværelse af kliniske tegn, som antyder, at døden vil indtræffe på et kendt tidspunkt før forsøgets planlagte afslutning, f.eks. at dyret er ude af stand til at bevæge sig hen til vand eller føde (se nærmere i Humane Endpoint Guidance Document (8)).
1.3. PRINCIP FOR TESTMETODEN Grupper af dyr af samme køn modtager trinvis stigende faste doser på 5, 50, 300 og 2000 mg/kg (undtagelsesvis kan anvendelse af en yderligere fast dosis på 5000 mg/kg overvejes, se punkt 1.6.2). På grundlag af en forundersøgelse vælges begyndelsesdosis som den dosis, der forventes at frembringe nogen tegn på toksicitet uden at medføre svær toksisk effekt eller dødelighed. De kliniske tegn og forhold, der er forbundet med smerte, lidelse og forestående død, er detaljeret beskrevet i en separat OECD-vejledning (8). Yderligere grupper af dyr kan behandles med højere eller lavere faste doser. Denne procedure fortsættes, indtil man har fastlagt den dosis, som medfører synlig toksicitet eller højst ét dødsfald, eller der ikke ses nogen effekt af den højeste dosis, eller der optræder dødsfald ved den laveste dosis.
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.4.
1.4.1. Valg af dyreart Den foretrukne gnaverart er rotter, men en anden gnaverart kan anvendes. Sædvanligvis anvendes hundyr (7). Baggrunden herfor er, at litteraturundersøgelser af konventionelle LD50-forsøg viser, at de to køn sædvanligvis ikke udviser stor forskel i følsomhed, men hvis der er forskel, er hundyr sædvanligvis lidt mere følsomme end handyr (10). Foreligger der imidlertid for strukturelt beslægtede stoffer oplysninger om toksikologiske eller toksikokinetiske egenskaber, som tyder på, at hanner må forventes at være mere følsomme end hunner, bør handyr anvendes. Udføres forsøget i hanner, skal fyldestgørende begrundelse herfor gives. Der anvendes raske unge dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. Hvert dyr skal ved doseringens begyndelse være mellem 8 og 12 uger gammelt, og dets vægt afvige højst ± 20 % fra gennemsnitsvægten af eventuelle tidligere behandlede dyr.
1.4.2. Opstaldning og fodring Temperaturen i forsøgsdyrsrummet skal være 22 oC (± 3 oC). Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og bør ikke være over 70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50-60 % bør tilstræbes, Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand, Dyrene i en given dosisgruppe kan være anbragt i samme bur, men antallet af dyr i buret må ikke bevirke, at det er vanskeligt at observere de enkelte dyr.
1.4.3. Klargøring af dyrene Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres, og holdes i burene i mindst fem døgn forud for doseringen, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne.
1.4.4. Tilberedning af doser Sædvanligvis bør teststoffet administreres i samme volumen på alle de anvendte dosisniveauer, idet man varierer koncentrationen i præparatet. Når det førdige testpræparat eller den færdige testblanding er flydende, kan anvendelse af ufortyndet teststof, dvs. med konstant koncentration, være mest relevant for den efterfølgende risikovurdering af stoffet, og nogle myndigheder stiller da også krav herom, I begge tilfælde må det maksimale volumen for indgift ikke overskrides. Den maksimale væskemængde, som kan indgives ad gangen, afhænger af forsøgsdyret størrelse, Til gnavere må rumfanget normalt ikke overskride 1 ml/100 g kropsvægt, ved vandige opløsninger kan det dog overvejes at anvende 2 ml/100 g kropsvægt. Ved formulering af doseringspræparatets anbefales det så vidt muligt at benytte en vandig opløsning/suspension/emulsion, efterfulgt (i prioriteret rækkefølge) af en opløsning/suspension/emulsion i olie (f.eks, majsolie) og derefter eventuelt en opløsning i andre vehikler. For andre vehikler end vand skal vehiklets toksiske egenskaber være kendt, Doserne skal tilberedes kort før indgift, medmindre præparatets holdbarhed inden for anvendelsesperioden kendes og er godtgjort at være tilfredsstillende.
1.5. FREMGANGSMÅDE
1.5.
1.5.1. Administration of doserne Teststoffet indgives som enkeltdosis med gastrisk sonde eller et passende intubationsrør. Kan den pågældende stofmængde ikke indgives som enkeltdosis, kan den undtagelsesvis indgives opdelt i få enkelte dele af den samlede dosis over en periode på højst 24 timer. Dyrene skal være fastende inden doseringen (f.eks. skal rotter natten over ikke have foder, men adgang til vand; mus skal i 3-4 timer ikke have foder, men adgang til vand), Efter fasteperioden vejes dyrene, og teststoffet indgives. Når stoffet er indgivet, kan dyrene unddrages føde i yderligere 3-4 timer for rotter og 1-2 timer for mus. Når en dosis indgives delt over et vist tidsrum, kan det afhængigt af dette tidsrum være nødvendigt at give dyrene foder og adgang til vand.
1.5.2. Forundersøgelse Forundersøgelsen har til formål at bestemme en passende startdosis i hovedundersøgelsen. Teststoffet indgives sekventielt til de enkelte dyr som angivet i skemaerne i bilag 1. Forundersøgelsen afsluttes, når det kan afgøres, hvilken startdosis der skal anvendes i hovedundersøgelsen (eller når der er et dødsfald ved den laveste faste dosis). Startdosis til forundersøgelsen vælges blandt de faste dosisniveauer 5, 50, 300 og 2000 mg/kg som den dosis, der forventes at medføre synlig toksicitet, om muligt baseret på dokumentation i form af in vivo- og in vitro-data for samme kemiske stof og for strukturelt beslægtede stoffer. I mangel af sådanne oplysninger anvendes en startdosis på 300 mg/kg. Doseringerne af de enkelte dyr finder sted med et interval på mindst 24 timer. Alle dyr observeres i mindst 14 dage. Undtagelsesvis, og kun når det kan begrundes konkret ud fra myndighedsregler, kan det overvejes at anvende et supplerende højeste fast dosisniveau på 5000 mg/kg (se bilag 3). Af dyrevelfærdsmæssige grunde anbefales det at undgå testning i området svarende til 2000-5000 mg/kg i GHS kategori 5, og dette bør kun overvejes, når det er overvejende sandsynligt, at resultaterne af et sådant forsøg have direkte relevans for beskyttelsen af menneskers eller dyrs sundhed eller miljøet. Hvis et dyr dør ved den laveste faste dosis (5 mg/kg) i forundersøgelsen, er fremgangsmåden normalt at standse forsøget og indplacere stoffet i GHS kategori 1 (som vist i bilag 1). Hvis klassificeringen kræves nærmere bekræftet, kan man dog frivilligt vælge følgende supplerende procedure: Endnu et dyr doseres med 5 mg/kg. Hvis dette dyr dør, vil det bekræfte GHS kategori 1, og undersøgelsen standses straks. Hvis dyret overlever, kan yderligere højst tre dyr behandles med 5 mg/kg. På grund af den høje dødsrisiko bør disse dyr af dyrevelfærdsmæssige grunde doseres sekventielt. Tidsrummet mellem doseringen af de enkelte dyr skal være tilstrækkeligt til at fastslå, at det foregående dyr må forventes at overleve. Indtræffer der endnu et dødsfald, skal doseringen straks indstilles, og ingen yderligere dyr doseres, Da optræden af endnu et dødsfald (uanset det testede antal dyr på ophørstidspunktet) falder ind under udfald A (to eller flere dødsfald), følger man klassificeringsreglen i bilag 2 ved fast dosis 5 mg/kg (dvs. kategori 1. hvis der er to eller flere dødsfald, og kategori 2 hvis der er højst et dødsfald), Derudover indeholder bilag 4 vejledning i, hvordan man foretager klassificeringen i EU's system, indtil det nye GHS er indført.
1.5.3. Hovedundersøgelsen
1.5.3.
1.5.3.1. Antal dyr og dosisniveauer De enkelte trin, der skal følges efter testning ved startdosis, er angivet i skemaerne i bilag 2. Der skal vælges en af følgende tre muligheder: enten afbrydelse af forsøget og tilordning af stoffet til den pågældende fareklasse, eller testning ved et højere fast dosisniveau, eller testning ved et lavere fast dosisniveau. Af hensyn til dyrenes beskyttelse vil et dosisniveau, der medførte død i forundersøgelsen, ikke blive gentaget i hovedundersøgelsen (se bilag 2). Erfaringen viser, at det mest sandsynlige udfald ved startdosisniveauet er, at stoffet kan klassificeres, uden at yderligere testning er nødvendig. For hvert af de undersøgte dosisniveauer vil der normalt blive anvendt i alt fem dyr af ét køn. De fem dyr består af det dyr fra forundersøgelsen, som blev doseret ved det valgte dosisniveau, samt yderligere fire dyr (undtagen når et af hovedundersøgelsens dosisniveauer undtagelsesvis ikke indgik i forundersøgelsen). Tidsintervallet mellem doseringerne på hvert niveau bestemmes ud fra de toksiske symptomers indsætten, varighed og sværhed. Behandlingen af dyrene ved næste dosering skal vente, indtil det kan antages, at de tidligere doserede dyr vil overleve. Det anbefales, at man om nødvendigt lader gå 3-4 dage mellem doseringerne på hvert dosisniveau for at få den nødvendige tid til at iagttage en eventuel forsinket toksisk virkning. Tidsintervallet kan korrigeres til en passende størrelse, f.eks. hvis den opnåede respons er inkonklusiv. Overvejes det at anvende en fast højeste dosis på 5000 mg/kg, følger man proceduren i bilag 3 (se også punkt 1.6.2).
1.5.3.2. Grænsetest Grænsetesten anvendes fortrinsvis i situationer, hvor forsøgslederen har oplysninger om, at teststoffet må forventes at være atoksisk, dvs, kun er toksisk i doser over de grænsedoser, der er fastsat i bestemmelserne. Oplysninger om teststoffets giftighed kan fås ud fra viden om tilsvarende testede stoffer eller tilsvarende testede blandinger eller produkter, idet der tages hensyn til art og procentuelt indhold af de stoffer, der vides at være af toksikologisk betydning, Når der foreligger få eller slet ingen oplysninger om teststoffets toksicitet, eller når stoffet forventes at være toksisk, skal hovedundersøgelsen udføres. Når den normale fremgangsmåde følges, vil en startdosis ved forundersøgelsen på 2000 mg/kg (eller undtagelsesvis 5000 mg/kg) efterfulgt af en dosering af fire yderligere dyr tjene som grænsetest med henblik på denne guideline.
1.6. OBSERVATIONER Efter doseringen iagttages dyrene enkeltvis mindst én gang i de første 30 minutter, og periodisk de første 24 timer, under særlig opmærksomhed de første 4 timer, derefter dagligt, gennem i alt 14 dage, bortset fra tilfælde, hvor dyrene må tages ud af undersøgelsen og aflives humant af dyrevelfærdsmæssige grunde eller findes døde. Imidlertid bør observationsperioden ikke fastsættes ufravigeligt, Den bør fastlægges ud fra de toksiske reaktioners indsætten og restitutionsperiodens længde og kan således forlænges, når det skønnes nødvendigt. Tidspunkterne for toksiske symptomers indsætten og forsvinden er vigtige, navnlig hvis der er tendens til forsinkede toksiske symptomer (11), Alle observationer registreres systematisk, og der føres individuel protokol for hvert dyr. Viser dyrene fortsat tegn på toksicitet, vil supplerende observationer være nødvendige. Observationerne skal omfatte forandringer i hud, pels, øjne og slimhinder, respirationssystem, kredsløb, autonomt nervesystem og centralnervesystem, samt somatomotorisk aktivitet og adfærdsmønster. Man skal være opmærksom på, om der kan iagttages tremor, kramper, spytflåd, diarré, sløvhed, søvn og koma. De principper og kriterier, der er sammenfattet i Humane Endpoints Guidance Document, skal ligeledes tages i betragtning (8). Dyr, som findes at være moribunde, og dyr, som udviser svære smerter eller vedvarende tegn på svære lidelser, skal aflives humant. Når dyr aflives af humane grunde eller findes døde, skal dødstidspunktet registreres så nøjagtigt som muligt.
1.6.
1.6.1. Kropsvægt Vægten af hvert enkelt dyr bestemmes kort før indgift af teststoffet og derefter mindst én gang om ugen. Vægtændringer beregnes og registreres. Ved forsøgets slutning vejes de overlevende dyr, som derefter aflives humant.
1.6.2. Patologi Alle forsøgsdyr (herunder dem, der dør under forsøget eller tages ud af forsøget af dyrevelfærdsmæssige grunde) underkastes makroskopisk undersøgelse. Alle makroskopiske patologiske forandringer registreres for hvert dyr. For dyr, som overlever i 24 timer eller længere efter den første dosering, kan man endvidere overveje mikroskopisk undersøgelse af organer, som udviser makroskopiske patologiske forandringer, da dette kan give nyttige oplysninger.
2. DATA Der skal forefindes data for de enkelte dyr. Derudover opstilles i tabelform for hver forsøgsgruppe oplysninger om antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr, som viser tegn på toksisk virkning, antal dyr, som er fundet døde under forsøget eller aflivet af humanitære grunde, dødstidspunkt for de enkelte dyr, beskrivelse af toksiske virkninger og disses tidsmæssige forløb og reversibilitet, samt obduktionsfund.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal indeholde følgende oplysninger, når de er relevante:
Teststof:
fysisk tilstand, renhed og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber (herunder isomeri)
identifikationsdata, herunder CAS-nummer.
For eventuelt vehikel:
begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand.
For forsøgsdyrene:
den anvendte art/stamme
dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes
dyrenes antal, alder og køn (og, i givet fald, begrundelse for brug af handyr i stedet for hundyr)
oprindelse, opstaldning, foder osv.
Forsøgsbetingelser:
enkeltheder vedrørende teststoffets formulering, herunder beskrivelse af den fysiske tilstand af det indgivne materiale
oplysninger om administrationen af teststoffet, herunder doseringsvolumen og doseringstidspunkt
oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder foderets art og oprindelse, vandets oprindelse)
begrundelse for valg af startdosis.
Resultater:
opstilling i tabelform af effekter og dosisniveau for hvert dyr (dvs, dyr, som viser tegn på toksicitet, herunder mortalitet, og virkningernes art, sværhed og varighed)
opstilling i tabelform af kropsvægt og ændringer i kropsvægt
de enkelte dyrs vægt på doseringsdagen, derefter med én uges mellemrum, samt på døds- eller aflivningstidspunktet
dato og klokkeslæt for dyrets død, hvis denne indtræder før den planlagte aflivning
for hvert dyr, toksiske virkningers indsætten, tidsforløb og hvorvidt de er reversible
for hvert dyr, obduktionsfund og, i givet fald, histopatologiske fund.
Diskussion og fortolkning af resultater.
Konklusioner,
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
HENVISNINGER British Toxicology Society Working Party on Toxicitiy (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92. Van den Heuvel. M.J., Dayan. A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291. Van den Heuvel, M..J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Petling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002), Statistical evaluation of the revised fixed dose procediire.-Hum, Exp. Toxicol., 21, 183-196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.ll [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231. Chan P.K and A.W. Haves (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology . 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd New York, USA.
B.1.B. AKUT ORAL TOKSICITET — AKUT TOKSICITETSKLASSEMETODEN
B.1.B.
1. METODE Metoden svarer til OECD TG 423 (2001).
1.
1.1. INDLEDNING Akut toksisitetsklassemetoden (1) er en trinvis metode, hvor der anvendes tre dyr af samme køn på hvert trin. Afhængigt af dyrenes dødelighed og/eller moribunde tilstand kræves i gennemsnit 2-4 trin til vurdering af den akutte toksicitet af et teststof. Metoden er reproducerbar, kræver meget få dyr og gør det muligt at vurdere stofferne efter giftighed på tilsvarende måde som andre metoder til bestemmelse af akut toksicitet. Akut toksicitetsklassemetoden bygger på biometriske vurderinger (2)(3)(4)(5) med faste doser, der er spredt således, at et stofs giftighed kan bestemmes med henblik på klassificering og risikovurdering, Metoden blev indført i 1996 og er blevet grundigt valideret in vivo over for LD50-data fra litteraturen, både nationalt (6) og internationalt (7). Vejledning i valg af den mest hensigtsmæssige forsøgsmetode til et givet formål kan findes i Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8). Samme dokument indeholder desuden supplerende oplysninger om udførelse og fortolkning af forsøg efter metode B.1.B. Man behøver ikke indgive stofferne i doser, der vides at medføre udtalt smerte og lidelse på grund af ætsende eller stærkt irriterende virkning. Dyr, som er moribunde, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og vedvarende lidelser, skal aflives humant og betragtes ved fortolkningen af forsøgsresultaterne på samme måde som dyr, der er døde under forsøget. Kriterierne for aflivning af moribunde eller stærkt lidende dyr samt vejledning i at fastslå forudsigelig eller forestående død er genstand for en særskilt vejledning (9). Metoden giver oplysninger om de farlige egenskaber og gør det muligt at vurdere stofferne efter giftighed og klassificere stofferne efter det globale harmoniserede system (GHS) til klassificering af kemiske stoffer med akut toksisk virkning (10). I princippet er metoden ikke beregnet til bestemmelse af en nøjagtig LD50-værdi, men giver mulighed for at fastlægge nogle eksponeringsintervaller, inden for hvilke der forventes dødelighed, idet død af en del af dyrene fortsat er testens vigtigste effektparameter. For at en LD50-værdi kan bestemmes med metoden, skal mindst to dosisniveaer resultere i større dødelighed end 0 % og lavere end 100 %. Ved at benytte en række på forhånd fastlagte doser, uafhængigt af teststoffet, og ved eksplicit at basere klassifikationen på antal dyr, der observeres i forskellige tilstande, får laboratoriet bedre mulighed for at opnå sammenhængende og repeterbare resultater. Testlaboratoriet bør inden forsøgets udførelse gennemgå alle foreliggende oplysninger om teststoffet. Sådanne oplysninger omfatter stoffets identitet og kemiske struktur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af eventuelle andre in vivo og in vitro toksicitetsundersøgelser af stoffet, toksikologiske data for strukturelt beslægtede stoffer, samt stoffets forventede anvendelse(r). Disse oplysninger er nødvendige, for at det til alle parters tilfredshed kan godtgøres, at forsøget har betydning for beskyttelsen af menneskers sundhed, og vil desuden være nyttige ved valg af den bedst egnede startdosis.
1.2. DEFINITIONER Akut oral toksicitet: de sundhedsmæssigt uønskede virkninger, som optræder efter oral indgift af en enkelt dosis af et stof eller efter flere doser indgivet i løbet af 24 timer. Forsinket død: det forhold, at dyret ikke inden for 48 timer dør eller fremtræder moribund, men dør senere inden for den 14 dage lange observationsperiode. Dosis: den mængde teststof, som indgives. Dosis angives som vægtmængde teststof pr. vægtenhed forsøgsdyr (f.eks. mg/kg). GHS: Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures. Et tælles projekt mellem OECD (sundhed og miljø), FN's ekspertudvalg vedrørende transport af farligt gods (fysisk-kemiske egenskaber) og ILO (faremærkning og -angivelse) koordineret af Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC). Overhængende død: det forhold, at moribund tilstand eller død forventes at indtræffe inden næste planlagte observationstidspunkt. Som tegn på denne tilstand i gnavere kan nævnes kramper, sideleje, liggende stilling og tremor (Se nærmere i Humane End point Guidance Document (9)). LD50 (middel oral letaldosis): den statistisk beregnede enkeltdosis af et teststof, som ved oral indgift kan forventes at medføre døden hos 50 % af dyrene. LD50-værdien angives som vægtmængde teststof pr. vægtenhed kropsvægt af forsøgsdyret (mg/kg). Grænsedosis: en dosis, som danner øvre grænse for testen (2000 eller 5000 mg/kg). Moribund tilstand: en tilstand, hvor dyret er døende eller ikke vil overleve, selv om det behandles (se nærmere i Humane Endpoint Guidance Document (9)). Forudsigelig død: tilstedeværelse af kliniske tegn. Som antyder, at døden vil indtræffe på et kendt tidspunkt før forsøgets planlagte afslutning; f.eks. at dyret er ude af stand til at bevæge sig hen til vand eller føde (se nærmere i Humane Endpoint Guidance Document (9)).
1.3. PRINCIP FOR TESTMETODEN Metoden bygger på en trinvis fremgangsmåde, hvor der på hvert trin anvendes det mindst mulige antal dyr, og man opnår tilstrækkelig information om teststoffets akutte giftighed til, at det kan klassificeres. Stoffet gives oralt til en gruppe forsøgsdyr ved en af de fastlagte doser. Stoffet testes ved en trinvis fremgangsmåde, hvor der på hvert trin anvendes tre dyr af samme køn (normalt hunner). Stofrelateret dødelighed (eller fravær heraf) af de behandlede dyr på det ene trin bestemmer næste trin, dvs.: Detaljer vedrørende testmetoden er beskrevet i bilag 1. Metoden giver mulighed for vurdering af stoffets klassificering i en af de toksicitetsklasser, der er bestemt ved fast afgrænsede LD50-værdier.
ingen yderligere testning nødvendig
dosering af yderligere tre dyr med samme dosis
dosering af yderligere tre dyr på næste højere eller lavere dosisniveau.
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.4.
1.4.1. Valg af dyreart Den foretrukne gnaverart er rotter, men andre gnaverarter kan anvendes. Sædvanligvis anvendes hundyr (9). Baggrunden herfor er, at litteraturundersøgelser af konventionelle LD50-forsøg viser, at de to køn sædvanligvis ikke udviser stor forskel i følsomhed, men hvis der er forskel, er hundyr sædvanligvis lidt mere følsomme end handyr (11). Foreligger der imidlertid for strukturelt beslægtede stoffer toksikologiske eller toksikokinetiske oplysninger, som tyder på, at hanner må forventes at være mere følsomme end hunner, bør handyr anvendes. Udføres forsøget i hanner, skal fyldestgørende begrundelse herfor gives. Der anvendes raske unge dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. Hvert dyr skal ved doseringens begyndelse være mellem 8 og 12 uger gammelt, og dets vægt afvige højst ± 20 % fra gennemsnitsvægten af eventuelle tidligere doserede dyr.
1.4.2. Opstaldning og fodring Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 oC (± 3 oC). Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og bør ikke være over 70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand. Dyrene i en given dosisgruppe kan være anbragt i samme bur, men antallet af dyr i buret må ikke vanskeliggøre observation af de enkelte dyr.
1.4.3. Klargøring af dyrene Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres, og holdes i burene i mindst 5 døgn forud for doseringen, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne.
1.4.4. Tilberedning af doser Sædvanligvis anvendes samme volumen til indgift af teststoffet på alle de anvendte dosisniveauer, idet man varierer koncentrationen i det indgivne præparat. Er det færdige produkt eller den færdige blanding flydende, kan anvendelse af ufortyndet teststof, dvs. med konstant koncentration, være mest relevant for den efterfølgende risikovurdering af stoffet, og af nogle myndigheder stilles da også krav herom. I begge tilfælde må det maksimale volumen for indgift ikke overskrides. Den maksimale væskemængde, som kan indgives ad gangen, afhænger af forsøgsdyret størrelse. Til gnavere må rumfanget normalt ikke overskride 1 ml/100 g kropsvægt. ved vandige opløsninger kan det dog overvejes at anvende 2 ml/100 g kropsvægt. Ved formulering af doseringspræparatet anbefales det så vidt muligt at benytte en vandig opløsning/suspension/emulsion, efterfulgt (i prioriteret rækkefølge) af en opløsning/suspension/emulsion i olie (f.eks. majsolie) og derefter eventuelt en opløsning i andre vehikler. For andre vehikler end vand skal vehiklets toksiske egenskaber være kendt. Doserne skal tilberedes kort før indgift, medmindre præparatets holdbarhed inden for anvendelsesperioden kendes og er godtgjort at være tilfredsstillende.
1.5. FREMGANGSMÅDE
1.5.
1.5.1. Administration of doserne Teststoffet indgives ved gavage som én enkelt dosis med gastrisk sonde eller et passende intubationsrør. Er det ikke muligt at indgive den pågældende stofmængde som en enkelt dosis, kan den undtagelsesvis undtagelsesvis indgives opdelt i få enkelte dele af den samlede dosis over en periode på højst 24 timer. Dyrene skal være fastende inden doseringen (f.eks. skal rotter natten over ikke have foder, men adgang til vand. mus skal i 3-4 timer ikke have foder, men adgang til vand). Efter fasteperioden vejes dyrene, og teststoffet indgives, Når stoffet er indgivet, kan dyrene unddrages føde i yderligere 3-4 timer for rotter og 1-2 timer for mus. Når en dosis indgives delt over et vist tidsrum, kan det alt efter dette tidsrum være nødvendigt at give dyrene foder og adgang til vand.
1.5.2. Antal dyr og dosisniveauer Der anvendes tre dyr til hvert trin. Som startdosis anvendes et af fire faste niveauer, 5, 50, 300 og 2000 mg/kg kropsvægt. Som startdosis skal anvendes den, der med størst sandsynlighed forventes at fremkalde dødelighed i nogle af de doserede dyr. I skemaerne i bilag 1 beskrives den procedure, der skal følges for hver startdosis. Derudover giver bilag 4 vejledning i, hvordan man foretager klassificeringen i EU's system, indtil det nye GHS er indført. Når de foreliggende oplysninger tyder på, at der næppe kan forventes dødelighed ved den højeste startdosis (2000 mg/kg kropsvægt), skal der udføres en grænsetest. Når der ikke foreligger nogen oplysninger om teststoffet, anbefales 300 mg/kg kropsvægt som startdosis af dyrevelfærdsmæssige grunde. Tidsintervallet mellem doseringerne på hvert niveau bestemmes ud fra de toksiske symptomers indsætten, varighed og sværhed. Behandlingen af dyrene ved næste dosering skal vente, indtil det er sikkert, at de tidligere doserede dyr vil overleve. Undtagelsesvis, og kun når det kan begrundes konkret ud fra myndighedsregler, kan det overvejes at anvende et supplerende højeste fast dosisniveau på 5000 mg/kg (se bilag 2), Af dyrevelfærdsmæssige grunde anbefales det at undgå testning i området svarende til GHS-kategori 5 (2000-5000 mg/kg), som kun bør overvejes, når resultaterne af et sådant forsøg med overvejende sandsynlighed ventes at få direkte relevans for beskyttelsen af dyrs eller menneskers sundhed eller miljøet.
1.5.3. Grænsetest Grænsetesten anvendes fortrinsvis i situationer, hvor forsøgslederen har oplysninger om, at teststoffet må forventes at være atoksisk, dvs. kun er toksisk i doser over de grænsedoser, der er fastsat i bestemmelserne. Oplysninger om teststoffets toksicitet kan fås ud fra viden om tilsvarende testede stoffer eller tilsvarende testede blandinger eller produkter, idet der tages hensyn til art og procentuelt indhold af de stoffer, der vides at være af toksikologisk betydning. Når der kun foreligger få eller slet ingen oplysninger om teststoffets toksicitet, eller når stoffet forventes at være toksisk, bør hovedundersøgelsen udføres. Der kan udføres en grænsetest ved ét dosisniveau på 2000 mg/kg kropsvægt med seks dyr (tre dyr på hvert trin). Undtagelsesvis kan der i grænsetesten anvendes et dosisniveau på 5000 mg/kg kropsvægt med tre dyr (se bilag 2). Hvis dette medfører teststofrelateret mortalitet, kan yderligere testning på næste lavere dosisniveau være nødvendig.
1.6 OBSERVATIONER Efter doseringen iagttages dyrene enkeltvis mindst én gang i de første 30 minutter, og periodisk de første 24 timer, under særlig opmærksomhed de første 4 timer, derefter dagligt, gennem i alt 14 dage, bortset fra tilfælde, hvor dyrene må tages ud af undersøgelsen og aflives humant af dyrevelfærdsmæssige grunde eller findes døde. Imidlertid bør observationsperioden ikke fastsættes ufravigeligt. Den fastlægges ud fra de toksiske reaktioners indsætten og restitutionsperiodens længde og kan således forlænges, når det skønnes nødvendigt. Tidspunkterne for toksiske symptomers indsætten og forsvinden er vigtige, navnlig hvis der er tendens til forsinkede toksiske symptomer (12). Alle observationer registreres systematisk i og der føres individuel protokol for hvert dyr. Viser dyrene fortsat tegn på toksicitet, vil supplerende observationer være nødvendige, Observationerne skal omfatte forandringer i hud, pels, øjne og slimhinder, respirationssystem, kredsløb, autonome nervesystem og centralnervesystem, samt somatomotorisk aktivitet og adfærdsmønster. Man skal være opmærksom på, om der kan iagttages tremor, kramper, spytflåd, diarré, sløvhed, søvn og coma. Ligeledes skal der tages hensyn til principperne og kriterierne i Humane Endpoints Guidance Document (9). Dyr, som findes at være moribunde, og dyr, som udviser svære smerter eller vedvarende tegn på svære lidelser, skal aflives humant. Når dyr aflives af humane grunde eller findes døde, skal dødstidspunktet registreres så nøjagtigt som muligt.
1.6
1.6.1. Kropsvægt Vægten af hvert enkelt dyr bestemmes kort før indgift af teststoffet og derefter mindst én gang om ugen. Vægtændringer beregnes og registreres. Ved forsøgets slutning vejes de overlevende dyr, som derefter aflives humant.
1.6.2. Patologi Alle forsøgsdyr (herunder dem, der dør under forsøget eller tages ud af forsøget af dyrevelfærdsmæssige grunde) underkastes makroskopisk undersøgelse. Alle makroskopiske patologiske forandringer registreres for hvert dyr. Endvidere kan det overvejes at foretage mikroskopisk undersøgelse af organer, som udviser makroskopiske forandringer, da dette kan give nyttige oplysninger.
2. DATA Der skal forefindes data for de enkelte dyr. Derudover opstilles i tabelform for hver forsøgsgruppe antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr, som viser tegn på toksisk virkning, antal dyr, som er fundet døde under forsøget eller aflivet af humanitære grunde, dødstidspunkt for de enkelte dyr, beskrivelse af toksiske virkninger og disses tidsmæssige forløb og reversibilitet, samt obduktionsfund.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. Forsøgsrapport Forsøgsrapporten skal indeholde følgende oplysninger, når de er relevante:
For teststoffet:
fysisk tilstand, renhed og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber (herunder isomeri)
identifikationsdata, herunder CAS-nummer.
For eventuelt vehikel:
begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand.
For forsøgsdyrene_
den anvendte art/stamme
dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes
dyrenes antal, alder og køn (og, i givet fald, begrundelse for brug af handyr i stedet for hundyr)
oprindelse, opstaldning, foder osv.
Forsøgsbetingelser:
enkeltheder vedrørende teststoffets formulering, herunder beskrivelse af det indgivne materiales fysiske tilstand;
oplysninger om administrationen af teststoffet, herunder doseringsvolumen og doseringstidspunkt:
oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder foderets art og oprindelse, vandets oprindelse)
begrundelse for valg af startdosis.
Resultater:
opstilling i tabelform af effekter og dosisniveau for hvert dyr (dvs. dyr, som viser tegn på toksicitet, herunder mortalitet; og virkningernes art, sværhed og varighed)
opstilling i tabelform af kropsvægt og ændringer i kropsvægt
de enkelte dyrs vægt på doseringsdagen, derefter med én uges mellemrum, samt på døds- eller aflivningstidspunktet
dato og klokkeslæt for dyrets død, hvis denne indtræder før den planlagte aflivning
for hvert dyr, toksiske virkningers indsætten, tidsforløb og hvorvidt de er reversible
for hvert dyr, obduktionsfund og, i givet fald, histopatologiske fund.
Diskussion og fartolkning af resultater.
Konklusioner.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
HENVISNINGER Roll R., Hiifer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86. Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität van Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Tosic- Class Method — An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R.L, Cotnivo. J.A, Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel K.A., Walter A.P. Chu I: Goddard M, Segal L., Springer J.A. and Myers R.C. (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles und Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd, New York, USA.
B.2. AKUT TOKSICITET (INHALATION)
B.2.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Det er nyttigt at have forhåndsoplysninger om stoffets partikelstørrelsesfordeling, damptryk, smeltepunkt, kogepunkt, flammepunkt og eventuelle eksplosive egenskaber. Se også den generelle indledning til del B (punkt A).
1.2. DEFINITIONER Se den generelle indledning til del B (punkt B).
1.3. REFERENCESTOFFER Ingen.
1.4. TESTMETODENS PRINCIP Flere grupper forsøgsdyr udsættes i en angivet periode for teststoffet i graduerede koncentrationer, idet der anvendes en bestemt koncentration til hver enkelt gruppe. Der foretages observationer af virkningerne, herunder død. Dyr, der dør under forsøget, obduceres. Ved slutningen af forsøget aflives og obduceres overlevende dyr. Det kan være nødvendigt, at dyr, der viser vedvarende symptomer på stærk smerte eller lidelse, aflives på human måde. Undersøgelse af stoffer på en måde, som på grund af deres ætsende eller lokalirriterende egenskaber vides at volde betydelig smerte og lidelse, er ikke påkrævet.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6.
1.6.1. Forberedelser Dyrene holdes under forsøgsbetingelser med hensyn til miljø og fodring i mindst fem dage, inden forsøget påbegyndes. Unge, sunde, kønsmodne rotter fordeles randomiseret i det nødvendige antal grupper, inden forsøget sættes i gang. De behøver ikke udsættes for simuleret eksponering, medmindre dette indiceres af den type eksponeringsudsryr, der anvendes. Det kan være nødvendigt at mikronisere faste teststoffer for at opnå en passende partikelstørrelse. Om nødvendigt kan der tilsættes et egnet vehikel til teststoffet, således at der opnås en passende koncentration af teststoffet i luften. I så tilfælde skal der i forsøget indgå en kontrolgruppe, der udsættes for vehiklet. Hvis der anvendes et vehikel eller andre tilsætningsstoffer for at lette doseringen, skal det være påvist, at de ikke har nogen toksisk virkning. Her kan tidligere data benyttes.
1.6.2. Forsøgsbetingelser
1.6.2.
1.6.2.1. Forsøgsdyr Rotter er de foretrukne forsøgsdyr, medmindre der foreligger kontraindikationer. Der benyttes rotter af almindeligt anvendte stammer. For såvel han- som hunrotter gælder det, at vægten af de anvendte dyr ikke må variere mere end ± 20 % fra en rimelig gennemsnitsvægt ved forsøgets begyndelse.
1.6.2.2. Antal og køn Der anvendes mindst ti gnavere (fem hunner og fem hanner) til hvert koncentrationsniveau af stoffet. Hunnerne må ikke have født og må ikke være drægtige. Bemærk: Ved anvendelse af højere dyr end gnavere til undersøgelse af akut toksicitet skal det overvejes, om antallet af dyr kan nedsættes. Doserne skal fastlægges med omhu, og man skal bestræbe sig på ikke at benytte højere doser end moderat toksiske doser. I sådanne undersøgelser bør indgift af dødelige doser af teststoffet undgås.
1.6.2.3. Eksponeringskoncentrationer Der anvendes et tilstrækkeligt antal dosisniveauer, mindst tre, og disse skal være valgt således, at der opnås en graduering af de toksiske virkninger og dødeligheden i testgrupperne. Der skal være tilstrækkelige data til, at der kan optegnes en dosis-virkningskurve og om muligt foretages en rimelig bestemmelse af LC50.
1.6.2.4. Grænsetest Hvis en eksposition af fem han- og fem hundyr på 20 mg/l af et stof på gasform eller 5 mg/l af en aerosol eller et fint fordelt stof i fire timer, eller — hvis dette ikke kan lade sig gøre some følge af fysiske eller kemiske egen skaber (herunder eksplosive) ved teststoffet — den højest opnåelige koncentration ikke har teststofrelateret dødelig virkning inden for 14 dage, kan yderligere forsøg betragtes som overflødige.
1.6.2.5. Eksponeringstid Eksponeringsperioden er fire timer.
1.6.2.6. Udstyr Dyrene testes med inhalationsudstyr, der er udformet således, at der kan opretholdes en dynamisk luftcirkulation med et luftskifte på mindst 12 gange pr. time samtidig med et tilstrækkeligt iltindhold og jævn fordeling af eksponeringsluften. Benyttes der eksponeringskammer, skal det være således indrettet, at forsøgsdyrene sammenklumpes mindst muligt og eksponeres mest muligt for teststoffet ved inhalation. Den generelle regel for sikkerhed for stabil atmosfære er, at dyrenes totale volumen ikke må overstige 5 % af eksponeringskammerets volumen. Eksponeringen kan foregå gennem mund-næse, hovedet alene eller ved kamre til hele kroppen; ved anvendelse af de to første muligheder opnår man, at optagelsen af teststoffet ad andre veje minimeres.
1.6.2.7. Observationsperiode Observationsperioden skal være mindst 14 dage. Observationsperiodens varighed bør dog ikke fastsættes rigoristisk, men bestemmes ud fra de toksiske reaktioner, hvornår disse indtræder, og restitutionsperiodens længde; den kan således forlænges, såfremt det anses for nødvendigt. Tidspunktet for, hvornår symptomer på toksicitet erkendes og forsvinder, samt dødstidspunktet er vigtige, navnlig hvis der er tendens til, at der indtræffer sene dødsfald.
1.6.3. Fremgangsmåde Kort før eksponeringen vejes dyrene, hvorefter de udsættes for testkoncentrationen i det pågældende eksponeringsudstyr i fire timer, efter at der er opnået ligevægtskoncentration i kammeret. Ligevægten skal opnås hurtigt. Temperaturen holdes under forsøget på 22 oC ± 3 oC. Under ideelle forhold skal den relative luftfugtighed holdes på mellem 30 % og 70 %, men i visse tilfælde (f.eks. ved test af visse aerosoler) kan det være praktisk uigennemførligt. Udsivning af teststof til omgivelserne kan forhindres ved, at der i kammeret holdes et svagt undertryk (≤ 5 mm vandsøjle). Der gives hverken foder eller vand under eksponeringen. Der anvendes passende systemer til generering og kontrol af testatmosfæren. Systemet skal sikre stabile eksponeringsforhold så hurtigt som muligt. Kammeret skal være konstrueret og kunne betjenes på en sådan måde, at testatmosfæren hele tiden er ensartet fordelt i kammeret. Der foretages målinger eller kontrol af: Under og efter eksponering foretages der systematiske observationer, som registreres for hvert enkelt dyr. Observationerne skal foretages hyppigt i løbet af den første dag. Der skal foretages en grundig klinisk undersøgelse mindst én gang hver arbejdsdag. Herudover bør dyrene dagligt observeres, så det mindst mulige antal dyr går tabt for undersøgelsen, dvs. at dyr, der findes døde, obduceres eller nedkøles, og at svage eller døende dyr isoleres eller aflives. Inspektion af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels, øjne og slimhinde, derudover åndedræt og kredsløb, det autonome og centrale nervesystem, den motoriske aktivitet og adfærdsmønsteret. Der bør navnlig foretages en omhyggelig observation af respiration, rystelser, kramper, spytflåd, diarré, apati, søvn og bevidstløshed. Dødstidspunktet noteres med størst mulig nøjagtighed. Forsøgsdyrenes individuelle vægt bestemmes ugentligt og på dødstidspunktet. De dyr, der dør under forsøget, og de, der overlever til forsøgets afslutning, obduceres med særlig opmærksomhed rettet mod eventuelle ændringer i de øvre og nedre luftveje. Alle makroskopisk-patologiske forandringer registreres. På indikation udtages der vævsprøver til histopatologisk undersøgelse.
1.6.3. a)
lufthastighed (kontinuerligt)
b)
den faktiske koncentration af teststoffet målt i opholdsarealet mindst tre gange under eksponeringen (for nogle atmosfærers vedkommende, f.eks. aerosoler med høje koncentrationer, kan hyppigere kontrol være påkrævet). Koncentrationen må under eksponeringsperioden ikke variere mere end ± 15 % fra den gennemsnitlige koncentration. Det kan dog være umuligt at opnå en sådan grad af kontrol med visse aerosoler, og i så tilfælde kan større udsving accepteres. For aerosoler skal partikelstørrelsen analyseres så ofte, som det er nødvendigt (mindst én gang pr. forsøgsgruppe)
c)
temperatur og luftfugtighed, om muligt kontinuerligt.
2. DATA Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antal dyr ved begyndelsen af forsøget, dødstidspunkt for de enkelte dyr, antal dyr, der udviser andre symptomer på toksicitet, beskrivelse af toksiske virkninger og obduktionsfund. Vægtændringer beregnes og registreres for alle dyr, der lever mere end en dag efter eksponeringen. Aflivning af dyr på human måde på grund af lidelse og smerte fremkaldt af teststoffet registreres som teststofrelaterede dødsfald, LC50 bestemmes efter en anerkendt metode. Evaluering af data bør omfatte sammenhæng, hvis en sådan findes, mellem dyrenes eksponering for teststoffet og hyppighed og grad af alle forandringer, herunder adfærdsmæssige og kliniske symptomer, makroskopisk-patologiske forandringer, ændringer i legemsvægt, dødelighed og eventuelle andre toksiske virkninger.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger: Eksponeringsdata: Disse skal opstilles i tabelform med angivelse af middelværdier og et mål for variationen (standardafvigelser) og i videst muligt omfang omfatte:
dyreart/stamme, herkomst, miljøbetingelser, foder osv.
forsøgsbetingelser: beskrivelse af eksponeringsudstyret, herunder udformning, type, dimensionering, luftkilde, system til frembringelse af aerosoler, metode til konditionering af luften og den måde, hvorpå dyrene holdes i et eksponeringskammer, når et sådant benyttes. Apparatur til måling af temperatur, fugtighed og aerosolers koncentration og partikelstørrelsesfordeling skal beskrives
3.1. a)
lufthastigheden gennem inhalationsudstyret
b)
luftens temperatur og fugtighed
c)
nominelle koncentrationer (total mængde teststof tilført inhalationsudstyret, divideret med lufrvolumen)
d)
type vehikel, hvor et sådant er anvendt
e)
faktiske koncentrationer i opholdsarealet under forsøget
f)
massemedianen af den aerodynamiske diameter (MMAD) og den geometriske standardafvigelse (GSD)
g)
periode til ligevægtsindstilling
h)
eksponeringsperiode
tabelopstilling over reaktioner efter køn og eksponeringsniveau (d.v.s. antal dyr eksponeret; antal dyr, der er døde eller aflivet under forsøget; antal dyr, der har vist sympromer på toksicitet)
dødstidspunktet under eller efter eksponering; begrundelse og kriterier for human aflivning af dyr
alle observationer
LC50 for hvert køn bestemt ved afslutningen af observationsperioden (med angivelse af beregningsmetode)
95 % konfidensinterval for LC50 (hvor det er muligt)
dosis/dødelighedskurve og hældning (hvor beregningsmetoden muliggør det)
obduktionsfund
eventuelle histopatologiske fund
diskussion af resultaterne (med særlig opmærksomhed på, hvordan human aflivning af dyr under forsøget kan have indvirket på den beregnede LC50)
fortolkning af resultaterne.
3.2. VURDERING OG FORTOLKNING Se den generelle indledning til del B (punkt D).
4. HENVISNINGER Se den generelle indledning til del B (punkt E).
B.3. AKUT TOKSICITET (DERMAL)
B.3.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Se den generelle indledning til del B (punkt A).
1.2. DEFINITIONER Se den generelle indledning til del B (punkt B).
1.3. REFERENCESTOFFER Ingen.
1.4. TESTMETODENS PRINCIP Teststoffet påføres huden på flere grupper af forsøgsdyr i graduerede doser, idet der anvendes en bestemt dosis til hver enkelt gruppe. Der foretages observationer af virkningerne, herunder død. Dyr, der dør under forsaget, obduceres. Ved slutningen af forsøget aflives og obduceres overlevende dyr. Det kan være nødvendigt, at dyr, der viser vedvarende symptomer på stærk smerte eller lidelse, aflives på human måde. Undersøgelse af stoffer på en måde, som på grund af deres ætsende eller lokalirriterende egenskaber vides at volde betydelig smerte og lidelse, er ikke påkrævet.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6.
1.6.1. Forberedelser Dyrene holdes under forsøgsbetingelser med hensyn til miljø og fodring i mindst fem dage, inden forsøget påbegyndes. Unge, sunde, kønsmodne dyr fordeles randomiseret i forsøgsgrupper, inden forsøget sættes i gang. Ca. 24 timer før forsøget påbegyndes, klippes eller barberes dyrene på ryggen. Under denne procedure må man passe på ikke at beskadige huden, da det kan ændre dens permeabilitet. Mindst 10 % af legemets overflade skal gøres klar til påføring af teststoffet. Ved testning af faste stoffer, som i givet fald kan pulveriseres, skal teststoffet fugtes tilstrækkeligt med vand eller om nødvendigt med et passende vehikel, så der sikres god kontakt med huden. Hvis der anvendes et vehikel, bør man tage hensyn til, om vehiklet har indflydelse på hudens permeabilitet for teststoffet. Flydende teststoffer påføres normalt ufortyndet.
1.6.2. Forsøgsbetingelser
1.6.2.
1.6.2.1. Forsøgsdyr Der kan anvendes voksne rotter eller kaniner. Der kan anvendes andre dyrearter, men i så fald skal dette være begrundet. Der benyttes dyr af almindeligt anvendte stammer. For begge køn af forsøgsdyr gælder det, at vægten af de anvendte dyr ikke må variere mere end ± 20 % fra en rimelig gennemsnitsvægt ved forsøgets begyndelse.
1.6.2.2. Antal og køn Der anvendes mindst fem dyr (af samme køn) til hvert dosisniveau. Hunnerne må ikke have født og må ikke være drægtige. Foreligger der oplysninger om, at et bestemt køn er væsentligt mere følsomt, benyttes der dyr af dette køn. Bemærk: Ved anvendelse af højere dyr end gnavere til undersøgelse af akut toksicitet skal det overvejes, om antallet af dyr kan nedsættes. Doserne skal fastlægges med omhu, og man skal bestræbe sig på ikke at benytte højere doser end moderat toksiske doser. I sådanne undersøgelser bør indgift af dødelige doser af teststoffet undgås.
1.6.2.3. Dosisniveauer Der anvendes et tilstrækkeligt antal dosisniveauer, mindst tre, og disse skal være valgt således, at der opnås en graduering af de toksiske virkninger og dødeligheden i testgrupperne. Der bør ved valg af dosis tages hensyn til eventuelle hudirriterende eller ætsende virkninger. Der skal være tilstrækkelige data til, at der kan optegnes en dosis-virkningskurve og om muligt foretages en rimelig bestemmelse af LD50.
1.6.2.4. Grænsetest Der kan med en gruppe på fem dyr af hvert køn udføres en grænsetest med en dosis på mindst 2000 mg/kg legemsvægt efter den ovenfor beskrevne procedure. Optræder der teststofrelaterede dødsfald, kan gennemførelse af en fuldstændig undersøgelse komme i betragtning.
1.6.2.5. Observationsperiode Observationsperioden skal være mindst 14 dage. Observationsperiodens varighed bør dog ikke fastsættes rigoristisk, men bestemmes ud fra de toksiske reaktioner, hvornår disse indtræder, og af restitutionsperiodens længde; den kan således forlænges, såfremt det anses for nødvendigt. Tidspunktet for, hvornår symptomer på toksicitet erkendes og forsvinder, samt dødstidspunktet er vigtige, navnlig hvis der er tendens til, at der indtræffer sene dødsfald.
1.6.3. Fremgangsmåde Dyrene holdes i hver sit bur. Teststoffet påføres jævnt over et område, som svarer til ca. 10 % af den samlede legemsoverflade. Med stærkt toksiske stoffer kan der anvendes et mindre område, men stoffet bør påføres så tyndt og ensartet og over så stor en del af området som muligt. Teststoffet skal holdes i kontakt med huden ved hjælp af en porøs gazeforbinding og en ikke-hudirriterende klæbestrimmel i en eksponeringsperiode på 24 timer. Teststedet skal desuden tildækkes på en sådan måde, at gazeforbindingen og teststoffet holdes sikkert på plads, så at dyrene ikke kan indtage teststoffet. Der kan anvendes andre foranstaltninger, som forhindrer dyrene i at indtage teststoffet; dog kan fuldstændig immobilisering ikke anbefales. Ved eksponeringsperiodens afslutning fjernes tilbagesiddende teststof, idet der f.eks. anvendes vand eller et andet egnet middel til at rense huden. Der foretages systematiske observationer, som registreres for hvert enkelt dyr. Observationerne skal foretages hyppigt i løbet af den første dag. Der skal foretages en grundig klinisk undersøgelse mindst én gang hver arbejdsdag. Herudover bør dyrene dagligt observeres, så det mindst mulige antal dyr går tabt for undersøgelsen, dvs. at dyr, der findes døde, obduceres eller nedkøles, og at svage eller døende dyr isoleres eller aflives. Inspektionen af dyrene skal omfatte forandringer i pels, behandlet hud, øjne og slimhinder, derudover åndedræt og kredsløb, det autonome og centrale nervesystem, den motoriske aktivitet samt adfærdsmønsteret. Der bør foretages omhyggelig observation af rystelser, kramper, spytflåd, diarré, apati, søvn og bevidstløshed. Dødstidspunktet skal noteres så præcist som muligt. De dyr, der dør under forsøget, og de, der overlever til forsøgets afslutning, obduceres. Alle makroskopisk-patologiske forandringer registreres. På indikation udtages der vævsprøver til histopatologisk undersøgelse.
1.6.3. Vurdering af toksiciteten hos det modsatte køn
Efter afslutning af undersøgelsen med det ene køn testes en gruppe på fem dyr af det modsatte køn, så det konstateres, om dyr af dette køn er væsentligt mere følsomme over for teststoffet. I enkelte tilfælde kan anvendelse af færre dyr være velbegrundet. Foreligger der tilstrækkelige oplysninger om, at dyr af det køn, der er testet, er væsentligt mere følsomme, er test med dyr af det modsatte køn ikke påkrævet.
2. DATA Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antal dyr ved begyndelsen af forsøget, dødstidspunkt for de enkelte dyr, antal dyr, der udviser andre symptomer på toksicitet, beskrivelse af toksiske virkninger og obduktionsresultater. Dyrenes individuelle vægt bestemmes og registreres, kort før teststoffet påføres, derefter ugentligt og endelig på dødstidspunktet. Vægtændringer beregnes og registreres for alle dyr, der lever mere end én dag efter påføringen af teststoffet. Aflivning af dyr på human måde på grund af lidelse og smerte fremkaldt af teststoffet registreres som teststofrelaterede dødsfald. LD50 bestemmes efter en anerkendt metode. Evaluering af data bør omfatte sammenhæng, hvis en sådan findes, mellem dyrenes eksponering for teststof og hyppighed og grad af alle forandringer, herunder adfærdsmæssige og kliniske symptomer, makroskopisk-patologiske forandringer, ændringer i legemsvægt, dødelighed og eventuelle andre toksiske virkninger.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:
dyreart/stamme, herkomst, miljøbetingelser, foder osv.
forsøgsbetingelser (herunder hvordan huden er renset og forbindingstypen; med eller uden okklusion)
dosisniveauer (med angivelse af typen af vehikel, hvor et sådant er anvendt, samt koncentration)
forsøgsdyrenes køn
tabelopstilling over reaktioner efter køn og dosis (dvs, antal dyr, der er døde eller aflivet under forsøget; antal dyr, der har vist symptomer på toksicitet; antal eksponerede dyr)
dødstidspunktet efter eksponeringen, begrundelse og kriterier for human aflivning af dyr
alle observationer
LD50 for det køn, der har været genstand for en fuldstændig undersøgelse, bestemt efter 14. dag med angivelse af beregningsmetode
95 % konfidensinterval for LD50 (hvor det er muligt)
dosis/dødelighedskurve og hældning, hvor beregningsmetoden muliggør det
obduktionsfund
eventuelle histopatologiske fund
resultater af forsøg med det modsatte kan
diskussion af resultaterne (med særlig opmærksomhed på, hvordan human aflivning af dyr under forsøget kan have indvirket på den beregnede LD50)
fortolkning af resultaterne.
3.2. VURDERING OG FORTOLKNING Se den generelle indledning til del B (punkt D).
4. HENVISNINGER Se den generelle indledning til del B (punkt E).
B.4. AKUT TOKSICITET: HUDIRRITATION/ÆTSNING
B.4.
1. METODE Metoden er ækvivalent med OECD TG 404 (2002),
1.
1.1. INDLEDNING Ved udarbejdelse af denne ajourførte metode er der lagt særlig vægt på mulige forbedringer, dels vedrørende dyrevelfærd, dels vedrørende hensyntagen til alle foreliggende oplysninger om teststoffet for at undgå unødvendige forsøg med laboratoriedyr, I metoden indgår en anbefaling om, at man før iværksættelse af den beskrevne in vivo-test for ætsning/irritation fremkaldt af stoffet gennemfører en weight-of-the-evidence-analyse af foreliggende relevante data, Er de foreliggende data utilstrækkelige, kan de udbygges ved sekventiel testning (1). Den anbefalede testningsstrategi, som omfatter validerede og anerkendte in vitro-test, er givet som bilag til denne metodebeskrivelse. Når det er hensigtsmæssigt, anbefales det desuden, at man i den indledende in vivo-test anbringer de tre testlapper successivt i stedet for samtidigt på dyret. Både den videnskabelige kvalitet og dyrenes velfærd fremmes ved, at in vivo-test ikke udføres, før alle relevante data om stoffets potentielle hudætsende eller irriterende egenskaber er vurderet ved weight-of-the-evidence-analyse. Sådanne data består af dokumentation fra foreliggende undersøgelser i mennesker og/eller laboratoriedyr, dokumentation for ætsende/irriterende virkning af et eller flere strukturelt beslægtede stoffer eller af blandinger af sådanne stoffer, data, som viser at stoffet er stærkt surt eller alkalisk (2)(3), og resultater af validerede og anerkendte in vitro- eller ex vivo-test (4)(5)(5a). En sådan analyse skulle mindske behovet for in vivo-testning for hudætsende/irriterende virkning af stoffer, som allerede er tilstrækkelig undersøgt i andre undersøgelser vedrørende disse to endepunkter. En foretrukken testningsstrategi, som indebærer udførelse af validerede og anerkendte in vitro- eller ex vivo-test for ætsning/irritation, er medtaget som bilag til denne metodebeskrivelse, Strategien blev udviklet på en OECD-workshop (6) og enstemmigt anbefalet af deltagerne heri, og den er vedtaget som anbefalet testningsstrategi i det globalt harmoniserede system for klassificering af kemiske stoffer (GHS) (7). Skønt sekventiel testning ikke indgår som en del af testmetode B.4, anbefales det at følge denne testningsstrategi før iværksættelse af in vivo-forsøg, For nye stoffer anbefales den trinvise testningsstrategi til at indhente videnskabeligt forsvarlige oplysninger om stoffets ætsende/irriterende virkning. For eksisterende stoffer, som ikke er tilstrækkelig undersøgt for hudætsning/irritation, bør strategien anvendes til at supplere de mangelfulde data. Anvendes en anden testningsstrategi eller -metode, eller beslutter man sig for ikke at følge den trinvise testningsstrategi, bør dette begrundes. Hvis de ætsende eller irriterende egenskaber ikke kan bestemmes ved weight-of-the-evidence-analyse i henhold til den sekventielle testningsstrategi, bør in vivo-testning overvejes (jf. bilaget).
1.2. DEFINITIONER Hudirritation: fremkaldelse af reversibel skade på huden ved applikation af teststoffet i indtil fire timer. Hudætsning: fremkaldelse af irreversibel skade på huden, dvs, synlig nekrose gennem epidermis og ned i dermis efter applikation af teststoffet i indtil fire timer. Typiske ætsningsreaktioner er sår, blødning, blodige skorper, efter 14 dages observation affarvning som følge af blegning af huden, hele områder med alopeci samt ardannelse. Tvivlsomme læsioner bør overvejes vurderet ved histopatologisk undersøgelse.
1.3. METODENS PRINCIP En enkelt dosis af teststoffet påføres på huden af et forsøgsdyr; de ubehandlede hudområder af dyret tjener som kontrol. Graden af irritation/ætsning bestemmes og klassificeres med de foreskrevne intervaller og beskrives yderligere, således at virkningerne evalueres komplet. Undersøgelsen skal strække sig over tilstrækkelig lang tid til, at de iagttagne virkningers reversibilitet eller irreversibilitet kan vurderes. Dyr, som viser tegn på stærk lidelse og/eller smerte i nogen del af forsøget, aflives humant, og teststoffet vurderes tilsvarende, Kriterier for afgørelsen om human aflivning af døende og stærkt lidende dyr kan findes i henvisning (8).
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.4.
1.4.1. Forberedelse til in vivo-forsøget
1.4.1.
1.4.1.1. Valg af dyreart Det fortrukne forsøgsdyr er albinokaninen, og der anvendes raske unge kønsmodne dyr. Anvendes andre arter, skal der fremlægges begrundelse herfor.
1.4.1.2. Forberedelse af dyrene Ca. 24 timer før forsøget fjernes pelsen ved tæt klipning af dyrenes ryg. Der drages omsorg for at undgå beskadigelse af huden, og kun dyr med sund, intakt hud må anvendes. Visse kaninstammer har pletter med tæt hårvækst, som er mere eller mindre fremtrædende, afhængigt af årstiden. Sådanne områder med tæt hårvækst må ikke anvendes som testområder.
1.4.1.3. Miljøbetingelser og fodring Dyrene holdes i hver sit bur. Temperaturen i forsøgslokalet skal være 20 oC (± 3 oC) for kaniner. Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og må ikke være over 70 %, hvilket dog ikke gælder under under rengøring af lokalet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder og fri adgang til drikkevand.
1.4.2. Prøveprocedure
1.4.2.
1.4.2.1. Applikation af teststoffet Teststoffet påføres på et lille område (ca. 6 cm2) af huden og dækkes med en gazelap, som holdes på plads med en ikke-hudirriterende klæbestrimmel. Hvis der anvendes flydende eller pastaagtige teststoffer, kan det være nødvendigt at påføre teststoffet på gazelappen, og derefter placere lappen på huden. I ekspositionsperioden bør teststoffet holdes i løs kontakt med huden ved hiælp af en passende semiokklusiv forbinding. Hvis teststoffet påføres på gazelappen, skal denne fastgøres til huden, således at der er god kontakt og ensartet fordeling af stoffet på huden. Dyret må ikke have adgang til gazelappen og skal være forhindret i at kunne indtage eller inhalere teststoffet. Væskeformige teststoffer anvendes sædvanligvis ufortyndet. Ved testning af faste stoffer som — hvis det er hensigtsmæssigt — kan pulveriseres, skal teststoffet fugtes tilstrækkeligt med den mindst mulige mængde vand eller om nødvendigt med et passende vehikel for at sikre god kontakt med huden. Anvendes andre vehikler end vand, må dette kun have minimal indflydelse på teststoffets hudirriterende virkning. Ved slutningen af ekspositionsperioden, som normalt er fire timer, fjernes tilbagesiddende teststof, så vidt muligt ved hjælp af vand eller et egnet oplysningsmiddel, idet man skal undgå at påvirke det fremkomne respons eller beskadige epidermis.
1.4.2.2. Dosisniveau Testarealet påføres 0,5 ml flydende eller 0,5 g fast eller halvflydende teststof.
1.4.2.3. Indledende test (in vivo-hudirritations/ætsningstest i ét dyr) Det anbefales kraftigt, at in vivo-testen indledende kun udføres i ét dyr, navnlig når stoffet mistænkes for at have potentiale for ætsning. Dette er i overensstemmelse med den sekventielle testningsstrategi (jf. bilag 1). Når et stof er bedømt som ætsende på grundlag af weight-of-the-evidence-analyse, kræves ikke yderligere dyreforsøg. For størstedelen af de stoffer, som mistænkes for at være ætsende, er yderligere in vivo-testning sædvanligvis unødvendig. I tilfælde, hvor der menes at være behov for supplering af mangelfulde data, kan en begrænset testning i dyr gennemføres med følgende fremgangsmåde: Der anbringes successivt indtil tre prøvelapper på dyret. Den første lap fjernes efter tre minutter. Ses ingen alvorlig hudirritation, anbringes endnu en prøvelap, som fjernes efter en time. Viser iagttagelserne på dette trin, at ekspositionen humant kan udvides til fire timer, anbringes en tredje lap, som fjernes efter fire timer, hvorpå responset vurderes. Iagttages en ætsende virkning efter nogen af de tre sekventielle ekspositioner, afsluttes forsøget straks. Iagttages ingen ætsende virkning, efter at den sidste lap er fjernet, observeres dyret i 14 dage, medmindre der udvikler sig ætsning på et tidligere tidspunkt. I tilfælde, hvor teststoffet ikke forventes at frembringe ætsning, men kan være irriterende, anbringes en enkelt lap på ét dyr i fire timer.
1.4.2.4. Verifikationstest (in vivo-hudirritationstest i flere dyr) Er der ikke iagttaget ætsende virkning i det indledende forsøg, skal den irriterende eller negative respons verificeres i indtil to yderligere dyr, hver med én lap, ved en ekspositionsperiode på fire timer. Iagttages en irriterende virkning i det indledende forsøg, kan verifikationsforsøget udføres sekventielt eller ved eksposition af yderligere to dyr samtidigt. Er det indledende forsøg undtagelsesvis ikke udført, kan to-tre dyr behandles med en enkelt lap, som fjernes efter fire timer. Anvendes to dyr som begge udviser samme respons, er yderligere testning unødvendig. I modsat fald udføres forsøget også på det tredje dyr. Er responset usikkert, kan det være nødvendigt at evaluere resultaterne ved brug af flere dyr.
1.4.2.5. Observationsperiode Undersøgelsen skal strække sig over tilstrækkelig lang tid til, at de iagttagne virkningers reversibilitet eller irreversibilitet kan vurderes. Forsøget skal imidlertid afsluttes, når som helst dyrene viser vedvarende tegn på stærk smerte eller lidelser. For at bestemme reversibiliteten af virkningerne skal dyrene iagttages indtil 14 dage efter fjernelse af lapperne. Iagttages reversibilitet inden 14 dage, afsluttes forsøget på dette tidspunkt.
1.4.2.6. Kliniske iagttagelser og klassificering af hudreaktioner Alle dyr undersøges for tegn på erythem og ødem, og responset tildeles score-værdi ved 60 minutter og derefter ved 24, 48 og 72 timer efter fjernelse af lappen. Til det indledende forsøg i ét dyr undersøges testområdet desuden straks efter fjernelse af lappen. Hudreaktioner klassificeres og registreres efter inddelingen i nedenstående tabel. Er der hudskade, som ikke kan identificeres som irritation eller ætsning ved 72 timer, kan det være nødvendigt at fortsætte iagttagelsen indtil dag 14 for at fastslå reversibiliteten af virkningerne. Foruden iagttagelsen for irritation skal alle lokale toksiske virkninger, således tab af hudens fedtstofindhold, og alle systemiske bivirkninger (f.eks. kliniske symptomer på toksicitet samt kropsvægt), beskrives fuldstændigt og registreres. Til afklaring af en usikker respons bør histopatologisk undersøgelse indgå i vurderingen. Klassificering af hudrespons er nødvendigvis subjektiv. For at give en mere ensartet klassificering af hudresponset og for at bistå prøvningslaboratorierne og dem, som foretager og fortolker iagttagelserne, må iagttagelserne foretages af personer, som er tilstrækkelig fortrolige med det anvendte score-system (se nedenstående tabel). Det kan være nyttigt at anvende en illustreret vejledning i klassificering af hudirritation og andre læsioner (9).
2. DATA
2.
2.1. PRÆSENTATION OF RESULTATER Undersøgelsens resultater, som sammenfattes i tabelform i den endelige testrapport, skal dække alle punkter i afsnit 3.1.
2.2. VURDERING AF RESULTATER Score-værdierne for hudirritation vurderes i tilknytning til læsionernes art, sværhedsgrad og reversibilitet eller manglende reversibilitet. De enkelte score-værdier repræsenterer ikke en absolut standard for et stofs irritationsfremkaldende egenskaber, da andre virkninger af teststoffet ligeledes vurderes. I stedet må de enkelte score-værdier betragtes som vejledende værdier, som skal evalueres sammen med alle undersøgelsens øvrige fund. Hudlæsionernes reversibilitet skal tages i betragtning ved bedømmelse af irritationsrespons. Hvis respons som alopeci (af et begrænset område) hyperkeratose, hyperplasi og skældannelse persisterer indtil slutningen af den 14-dags observationsperiode, anses teststoffet for irriterende.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal indeholde følgende oplysninger:
Rationale for in vivo-testning: weight-of-evidence-analyse af allerede foreliggende testdata, herunder resultater af den sekventielle testningsstrategi:
beskrivelse af relevante oplysninger fra foreliggende tidligere forsøg
oplysninger, som fremgår af de enkelte trin i testningsstrategien
beskrivelse af udførte in vitro-test med detaljeret beskrivelse af de anvendte metoder samt resultater opnået med prøve- og reference stof
weight-of-the-evidence-analyse med henblik på udførelse af in vivo-undersøgelse.
Prøvestof:
identifikationsoplysninger (f.eks. CAS-nummer, oprindelse, renhed, kendte urenheder, batch-nummer)
fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. pH. flygtighed, opløselighed, stabilitet)
for blandinger, sammensætning og relativ procentdel af bestanddelene.
Vehikel:
identifikation, koncentration (i givet fald), anvendt volumen
begrundelse for valg af vehikel.
For forsøgsdyrene:
anvendt art/stamme, rationale for anvendelse af andre dyr end albinokaniner
antal dyr af hvert køn
de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse og slutning
alder ved forsøgets begyndelse
dyrenes oprindelse, forsøgsbetingelser, kost osv.
Omstændigheder ved forsøget:
teknik ved præparation af anbringelsesstedet for lapperne
enkeltheder vedrørende anvendte lapmaterialer og teknik ved anbringelse af lappen
enkeltheder vedrørende præparation og påføring og fjernelse af teststoffet.
Resultater:
opstilling i tabelform af score-værdier for irritation/ætsning for hvert dyr ved alle måletidspunkter
beskrivelse af alle iagttagne læsioner
forklarende beskrivelse af art og grad af den iagttagne irritation eller ætsning, samt eventuelle histopatologiske fund
beskrivelse af andre skadelige lokale (f.eks. tab af hudens fedtindhold) og systemiske virkninger foruden hudirritation eller ætsning.
Diskussion af resultater
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
HENVISNINGER Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain: M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner I., Giuliani, A., Grav, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, VL (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720. ECETOC (1990) Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Bruxelles. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M. Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483-524. Forsøgsmetode B.40 Hudætsning. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Afholdt i Solna, Sverige, den 22.-24. januar 1996 (http://wwwl.oecd1.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, som vedtaget på det 28. fælles møde mellem OECD's kemikalieudvalg og arbejdsgruppe vedrørende kemikalier, november 1998 (http://wwwl.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition. Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Satety Publitations. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances. Washington, DC, august 1990. [kan rekvireres fra OECD's sekretariat].
Tabel I Erythem og escharadannelse Ødemdannelse KLASSIFICERING AF HUDREAKTIONER
Intet erythem … 0 Meget let erythem (knapt diagnosticerbart) … 1 Veldefineret erythem … 2 Moderat til svært erythem … 3 Svært erythem (oksekødsfarvet) til escharadannelse, som umuliggør klassificering af erythemet … 4 Maksimumværdi: 4 Intet ødem … 0 Meget let ødem (næppe synligt) … 1 Let ødem (tydeligt afgrænset hævet område) … 2 Moderat ødem (hævet ca. 1 mm) … 3 Svært ødem (hævet mere end 1 mm og udstrækning ud over det eksponerede område) … 4 Maksimumværdi: 4 Til afklaring af usikre responser kan histopatologisk undersøgelse foretages.
B.5. AKUT TOKSICITET, ØJENIRRITATION
B.5.
1. METODE Metoden er ækvivalent med OECD TG 405 (2002).
1.
1.1. INDLEDNING Ved udarbejdelse af denne ajourførte metode er der lagt særlig vægt på de forbedringer, som kan opnås ved at vurdere alle foreliggende oplysninger om teststoffet med henblik på at undgå unødvendige forsøg med laboratoriedyr og dermed komme betænkeligheder omkring dyrenes velfærd i møde. I metoden indgår en anbefaling om, at der før iværksættelse af den beskrevne in vivo-test for akut øjenirritation/ætsning udføres en weight-of-the-evidence-analyse (1) af foreliggende relevante data, Er de foreliggende data utilstrækkelige, anbefales det, at de suppleres ved sekventiel testning (2)(3). Den anbefalede testningsstrategi, som omfatter validerede og anerkendte in vitro-test, er givet som bilag til denne metodebeskrivelse, Derudover anbefales det at udføre en in vivo-test for hudirritation/ætsning med henblik på at kunne forudsige ætsning af øjet, før en in vivo-øjentest overvejes gennemført. Både den videnskabelige kvalitet og dyrenes velfærd fremmes ved, at in vivo-test ikke udføres, før alle relevante data om stoffets potentielle øjenætsende eller -irriterende egenskaber er vurderet ved weight-of-the-evidence-analyse, Sådanne data består af dokumentation fra foreliggende undersøgelser i mennesker og/eller laboratoriedyr, dokumentation for ætsende/irriterende virkning af et eller flere strukturelt beslægtede stoffer eller af blandinger af sådanne stoffer, data, som viser at stoffet er stærkt surt eller alkalisk (4)(5), og resultater af validerede og anerkendte in vitro- eller ex vivo-test for hudætsning og -irritation (6)(6a). Undersøgelserne kan enten have været udført inden en weight-of-the-evidence-analyse eller efterfølgende som resultat heraf. For visse stoffer kan en sådan analyse vise, at der er behov for in vivo-undersøgelser af stoffets potentiale for ætsning/irritation af øjnene, I alle sådanne tilfælde skal man, før en in vivo-øjentest påtænkes, helst først udføre en undersøgelse af stoffets virkninger på hud in vivo og vurdere denne i henhold til forsøgsmetode B.4 (7). Anvendelse af weight-of-the-evidence-analyse og sekventiel testningsstrategi skulle mindske behovet for in vivo-testning for ætsende/irriterende virkning på øjet af stoffer, som allerede er tilstrækkelig undersøgt i andre undersøgelser. Kan stoffets potentiale for ætsning eller irritation af øjet ikke bestemmes ved den sekventielle testningsstrategi, selv efter udførelse af en in vivo-undersøgelse af hudætsning og irritation, kan der udføres en in vivo-test for ætsning/irritation af øjet. En anbefalet testningsstrategi, som indebærer udførelse af validerede og anerkendte in vitro- eller ex vivo-test for ætsning/irritation, er medtaget som bilag til denne metodebeskrivelse. Strategien blev udviklet på en OECD-workshop (8) og enstemmigt anbefalet af deltagerne heri, og den er vedtaget som anbefalet testningsstrategi i det globalt harmoniserede system for klassificering af kemiske stoffer (GHS) (9). Skønt sekventiel testning ikke indgår som en del af testmetode B.4, anbefales det at følge denne testningsstrategi, før in vivo-forsøg iværksættes, For nye stoffer anbefales den trinvise testningsstrategi til at indhente videnskabeligt forsvarlige oplysninger om stoffets ætsende/irriterende virkning. For eksisterende stoffer, som ikke er tilstrækkelig undersøgt for øjenætsning/irritation, bør man følge denne strategi for at supplere de mangelfulde data, Anvendes en anden testningsstrategi eller -metode, eller beslutter man sig for ikke at følge den trinvise testningsstrategi, bør dette begrundes.
1.2. DEFINITIONER Øjenirritation er frembringelse af forandringer i øjet, som opstår efter påføring af et teststof på øjets anteriore overflade, og som er fuldt reversible inden for 21 dage efter påføring. Ætsning af øjet er frembringelse af vævsbeskadigelse i øjet eller alvorlig fysisk synsnedsættelse, som opstår efter påføring af et teststof på øjets anteriore overflade, og som ikke er fuldt reversibel inden for 21 dage efter påføring.
1.3. TESTMETODENS PRINCIP En enkelt dosis af teststoffet påføres dyrets ene øje; det ubehandlede øje tjener som kontrol. Graden af øjenirritation/ætsning vurderes ved tildeling af score-værdier til læsionerne af conjunctiva, cornea og iris med bestemte intervaller, Andre virkninger på øjet og systemiske negative virkninger beskrives ligeledes, således at man har en fuldstændig bedømmelse af virkningerne. Undersøgelsen skal strække sig over tilstrækkelig lang tid til, at virkningernes reversibilitet eller irreversibilitet kan vurderes. Dyr, som viser tegn på stærk lidelse og/eller smerte i nogen del af forsøget, aflives humant, og teststoffet vurderes tilsvarende, Kriterier for human aflivning af døende og stærkt lidende dyr kan findes i reference (10).
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.4.
1.4.1. Forberedelse til in vivo-forsøget
1.4.1.
1.4.1.1. Valg af art Det foretrukne forsøgsdyr er albinokaninen, og der anvendes raske unge kønsmodne dyr. Anvendes andre arter, skal der fremlægges begrundelse herfor.
1.4.1.2. Forberedelse af dyrene På hvert af de foreløbigt udvalgte dyr undersøges begge øjne højst 24 timer før testen begynder. Dyr, som udviser øjenirritation eller øjendefekter, eller som i forvejen har beskadiget cornea, må ikke anvendes.
1.4.1.3. Miljøbetingelser og fodring Dyrene holdes i hver sit bur. Temperaturen i forsøgslokalet skal være 20 oC (± 3 oC) for kaniner. Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke være over 70 %, hvilket dog ikke gælder under rengøring af lokalet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder og fri adgang til drikkevand.
1.4.2. Prøveprocedure
1.4.2.
1.4.2.1. Applikation af teststoffet Teststoffet anbringes i conjunctivalsækken af det ene øje på hvert dyr, idet det nederste øjenlåg forsigtigt trækkes lidt ud fra øjeæblet. Derefter holdes øjenlågene sammen i ca. et sekund for at forhindre, at noget af stoffet løber ud. Det ubehandlede øje fungerer som kontrol.
1.4.2.2. Skylning I mindst 24 timer efter instillation af teststoffet må der ikke foretages skylning af forsøgsdyrenes øjne, bortset fra faststof (jf. punkt 1.4.2.3.2) eller i tilfælde af øjeblikkeligt indsættende ætsende eller irriterende virkning. Ved 24 timer kan øjet skylles, hvis det anses for hensigtsmæssigt. Anvendelse af en satellitgruppe af dyr til undersøgelse af virkningen af skylningen kan ikke anbefales, medmindre det er videnskabeligt begrundet, Er en satellitgruppe nødvendig, skal den bestå af to kaniner. Skylningsomstændighederne skal nøje dokumenteres, således skylningstidspunkt, skyllevæskens sammensætning og temperatur samt skylningens varighed, anvendt væskevolumen og -hastighed.
1.4.2.3. Dosisniveau
1.4.2.3.
1.4.2.3.1 Undersøgelse af væsker Ved undersøgelse af flydende stoffer anvendes 0,1 ml. Der må ikke anvendes pumpespray til direkte instillation af stoffet i øjet. I stedet sprøjtes væske ud af sprayflasken og opsamles i et kar, før der instilleres 0,1 ml i øjet.
1.4.2.3.2. Undersøgelse af faste stoffer Ved undersøgelse af faste stoffer, pastaer og fintfordelte faste stoffer anvendes et volumen på 0,1 ml eller en vægtmængde på højst 100 mg. Prøvestoffet rives til finkornet støv. Partiklernes volumen måles efter let sammenpresning, f.eks. frembragt ved små slag på målekarret. Er det faste teststof ikke forsvundet fra dyrets øje ad naturlig vej på det første observationstidspunkt 1 time efter behandlingen, kan øjet skylles med saltvand eller destilleret vand.
1.4.2.3.3. Undersøgelse af aerosoler Det anbefales, at alle pumpesprayprodukter og aerosoler opsamles før instillation i øjet. Som eneste undtagelse gælder stoffer, som er under tryk i aerosolbeholder og ikke kan opsamles på grund af fordampning. I sådanne tilfælde holdes øjet åbent, og teststoffet administreres i øjet med et enkelt pust på ca. ét sekund fra en afstand af 10 cm direkte foran øjet. Afstanden kan variere afhængigt af trykket i aerosolbeholderen og dens indhold. Der må drages omsorg for at undgå skade på øjet som følge af trykket i spraydåsen. I visse tilfælde kan der være brug for at vurdere potentialet for mekanisk skade på øjet forårsaget af forstøvningens styrke. Den afgivne dosis fra aerosolbeholderen kan vurderes ved at simulere prøven på følgende måde: Stoffet sprøjtes på vejepapir gennem en åbning af størrelse som et kaninøje placeret umiddelbart foran papiret. Papirets vægtforøgelse anvendes som omtrentligt mål for den mængde, der tilføres øjet ved forstøvning. For flygtige stoffer kan dosis vurderes ved vejning af den modtagende beholder før og efter udtagning af teststof.
1.4.2.4. Indledende test (in vivo-øjenirritations/ætsningstest i ét dyr Som nævnt i den sekventielle teststrategi (se bilag 1), anbefales det stærkt, at in vivo-testen indledende udføres i kun ét dyr. Viser denne test, at stoffet virker ætsende eller stærkt irriterende på øjet ved brug af den beskrevne fremgangsmåde, bør der ikke udføres yderligere test for øjenirritation.
1.4.2.5. Lokalanæstetika Der kan anvendes lokalanæstetika efter stillingtagen i hvert enkelt tilfælde. Hvis weight-of-the-evidence-analysen viser, at stoffet har smertevoldende potentiale, eller hvis den indledende testning viser, at der vil komme en smertefuld reaktion, kan der bruges et lokalanæstetikum før instillation af teststoffet. Art, koncentration og dosering af lokalanæstetikum bør vælges omhyggeligt med henblik på at sikre, at dets anvendelse ikke medfører forskelle i reaktionen på teststoffet. Kontroløjet lokalbedøves på tilsvarende måde.
1.4.2.6. Verifikationstest (in vivo-øjenirritationstest i yderligere dyr) Har det indledende forsøg ikke vist ætsende virkning, bør det irriterende eller negative respons verificeres i indtil to yderligere dyr. Iagttages der i det indledende forsøg en svær irriterende virkning, som tyder på, at der måske kan forventes en stærk (irreversibel) virkning i verifikationsforsøget, anbefales det at udføre dette sekventielt i ét dyr ad gangen frem for at eksponere yderligere to dyr samtidig. Udviser det andet dyr ætsning eller svær irritation, standses forsøget. Til verifikation af en svag eller moderat irritationsrespons kan det være nødvendigt at anvende yderligere dyr.
1.4.2.7. Observationsperiode lagttagelsesperioden skal være tilstrækkelig lang til, at de iagttagne virkningers omfang og reversibilitet kan vurderes fuldt ud. Forsøget skal dog afsluttes, når som helst dyrene viser vedvarende tegn på stærk smerte eller lidelser (9). For at bestemme reversibiliteten af virkningerne skal dyrene sædvanligvis iagttages indtil 21 dage efter administration af teststoffet. Iagttages reversibilitet inden 21 dage, afsluttes forsøget på dette tidspunkt.
1.4.2.7.
1.4.2.7.1. Kliniske iagttagelser og klassificering af øjenreaktioner Øjnene undersøges 1, 24, 48 og 72 timer efter påføring af teststoffet. Dyrene skal ikke forblive længere i forsøget, end indtil dette har har givet definitive oplysninger. Dyr, som viser tegn på stærk lidelse og/eller smerte i nogen del af forsøget, skal omgående aflives humant, og teststoffet vurderes tilsvarende, Når følgende øjenlæsioner optræder efter instillation af teststoffet, skal dyret aflives humant: perforation af cornea eller nævneværdig ulceration af cornea, herunder staphylom; blod i forreste øjenkammer; uklarhed af cornea af grad 4, persisterende i 48 timer; manglende reaktion på lys (irisrespons grad 2), persisterende i 72 timer; ulceration af conjunctivaslimhinden; nekrose af conjunctivae eller blinkhinde; rynker i cornea. Begrundelsen herfor er, at sådanne læsioner sædvanligvis er irreversible. For dyr, som ikke udvikler øjenlæsioner, kan forsøget afsluttes tidligst 3 dage efter instillation, Dyr med lette til moderate læsioner observeres, indtil læsionerne forsvinder, eller i 21 dage, på hvilket tidspunkt forsøget afsluttes, På dag 7, 14 og 21 foretages observation til bestemmelse af læsionernes status og reversibilitet eller irreversibilitet. Graden af øjenreaktion (conjunctivae, cornea and iris) registreres ved hver undersøgelse (tabel I). Alle andre læsioner i øjet (f.eks. pannus, farvning) og systemiske negative virkning skal ligeledes rapporteres. Undersøgelse af reaktionerne kan lettes ved brug af lup-briller, håndspaltelampe, binokulært mikroskop eller andre hensigtsmæssige hjælpemidler. Efter registrering af observationerne i 24 timer kan øjnene undersøges yderligere med fluorescein. Klassificeringen af øjenrespons er nødvendigvis subjektiv. For at give en mere ensartet klassificering af øjenresponset og for at bistå prøvningslaboratorieme og dem, som foretager og fortolker iagttagelserne, må iagttagelserne foretages af personer, som er tilstrækkeligt fortrolige med det anvendte score-system. Klassificeringen af øjenrespons foretages blindt.
2. DATA
2.
2.2. VURDERING AF RESULTATER Score-værdierne for øjenirritation vurderes i tilknytning til læsionernes art, sværhedsgrad og reversibilitet eller manglende reversibilitet, De enkelte score-værdier repræsenterer ikke en absolut standard for et stofs irritationsfremkaldende egenskaber, da de også omfatter andre virkninger af teststoffet. I stedet må de enkelte score-værdier betragtes som vejledende værdier, som kun er meningsfulde, når de støttes af en fuldstændig beskrivelse og evaluering af alle observationer.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal indeholde følgende oplysninger:
Rationale for in vivo-testning: weight-of-the-evidence-analyse af allerede foreliggende testdata, herunder resultater af den sekventielle testningsstrategi
beskrivelse af relevante oplysninger fra foreliggende tidligere forsøg
oplysninger afledt af de enkelte trin i testningsstrategien
beskrivelse af udførte in vitro test med detaljeret beskrivelse af de anvendte metoder og resultater opnået med prøve- og referencestof
beskrivelse af den udførte in vivo-undersøgelse af hudirritation/ætsning med angivelse af opnåede resultater
weight-of-the-evidence-analyse med henblik på udførelse af in vivo-undersøgelse.
Prøvestof:
identifikationsoplysninger (f.eks, CAS-nummer, oprindelse, renhed, kendte urenheder, batch-nummer)
fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. pH, flygtighed, opløselighed, stabilitet, reaktion med vand)
for blandinger, sammensætning og relativ procentdel af bestanddelene
hvis et lokalanæstetikum benyttes, identifikation, renhed, art, dosis og potentiel interaktion med teststoffet.
Vehikel:
identifikation, koncentration (i givet fald), anvendt volumen
begrundelse for valg af vehikel.
For forsøgsdyrene:
anvendt art/stamme, rationale for anvendelse af andre dyr end albinokaniner
hvert dyrs alder ved forsøgets begyndelse
antal dyr af hvert køn i testgruppe og kontrolgruppe (hvis nødvendigt)
de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse og slutning
oprindelse, miljøbetingelser, kost osv.
Resultater:
beskrivelse af den anvendte metode til fastlæggelse af irritationsscore på hvert observationstidspunkt (f.eks. håndspaltelampe, binokulært mikroskop, fluorescein)
angivelse i tabelform af irritations/ætsningsresponsdata for hvert dyr på hvert observationstidspunkt, indtil dyret ophører med forsøget
forklarende beskrivelse af grad og art af den iagttagne irritation eller ætsning
beskrivelse af alle andre iagttagne læsioner i øjet (f.eks. karindvækst, pannusdannelse, adhæsion, farvning)
beskrivelse af ikke-okulære lokale og systemiske negative virkninger og eventuelle histopatologiske fund.
Diskussion af resultater.
3.2. FORTOLKNING AF RESULTATER Resultaterne af øjenirritationsundersøgelser i laboratoriedyr kan kun i begrænset omfang overføres til mennesker. I mange tilfælde er albinokaniner mere følsomme end mennesker for øjenirriterende eller -ætsende stoffer. Fortolkning af data skal ske med forbehold, så man undgår at medtage irritation forårsaget af sekundær infektion.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
HENVISNINGER Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L., Giuliani, A. Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410- 429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164. Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies, ATLA 27, 161-177. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26. Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483-524. Forsøgsmetode B.40 Hudætsning. Forsøgsmetode B.4. Akut toksicitet: Hudirritation/ætsning. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Afholdt i Solna, Sverige, den 22.-24. januar 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, som vedtaget på det 28. fælles møde mellem OECD's kemikalieudvalg og arbejdsgruppe vedrørende kemikalier, november 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
Tabel I KLASSIFICERING AF ØJENSKADER
Cornea
Uklarhed: graden af uklarhed aflæses i det tætteste område Ingen ulceration eller uklarhed … 0 Spredte eller diffuse uklare områder (ikke bestående i en let mattering af den normale glans); detaljer i iris klart synlige … 1 Let skelneligt halvgennemsigtigt område; detaljerne i iris let slørede … 2 Område med perlemorsglans; ingen detaljer i iris synlige; pupilstørrelse kan knapt skelnes … 3 Cornea uklar; iris ikke skelnelig gennem uklarheden … 4 Maksimum: 4 NOTER
Iris
Normal … 0 Markant fordybede rugae, kongestion, hævelse, moderat hyperæmi omkring cornea; eller injektion; iris reagerer på lys (træg lysreaktion anses for en virkning) … 1 Blødning, massiv ødelæggelse, eller ingen reaktion på lys … 2 Maksimum: 2
Conjunctivae
Rødme (af conjunctiva palpebrae og conjunctiva bulbi; bortset fra cornea og iris) Normal … 0 Nogle blodkar hyperæmiske (injektion) … 1 Diffus, blodrød farve; de enkelte kar ikke let skelnelige … 2 Diffus oksekødsfarvet … 3 Maksimum: 3
Chemosis
Hævelse (om øjenlåg og/eller blinkhinder) Normal … 0 Nogen unormal hævelse … 1 Tydelig hævelse med delvis udkrængning af øjenlåg … 2 Hævelse med øjenlåg omtrent halvt lukket … 3 Hævelse med øjenlåg mere end halvt lukket … 4 Maksimum: 4
B.6. HUDSENSIBILISERING
B.6.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Bemærkninger: I et system for klassifikation af den toksicitet, der er relevant for folkesundheden, er det af stor betydning at have følsomme test, som kan afsløre stoffer, der kan virke hudsensibiliserende på mennesker. Der findes ikke én enkelt testmetode, hvorved man med sikkerhed kan identificere alle stoffer, som kan virke hudsensibiliserende på mennesker, og som kan anvendes til alle stoffer. Der skal ved valg af test tages hensyn til en række faktorer såsom stoffets fysiske egenskaber, herunder dets evne til at trænge gennem huden. Der er udviklet to testtyper med anvendelse af marsvin: adjuvanstypen, hvor en allergisk tilstand forstærkes, når teststoffet opløses eller opslæmmes i Freunds komplette adjuvans (FCA), og typen uden adjuvans. Test af adjuvanstypen vil normalt forudsige et stofs sandsynlige hudsensibiliserende virkning hos mennesker mere præcist end de metoder, hvor der ikke benyttes Freunds komplette adjuvans, og bliver derfor foretrukket. Maksimeringstest på marsvin (Guinea-Pig Maximization Test — GPMT) er en meget anvendt test af adjuvanstypen. Skønt en række andre metoder kan benyttes til at undersøge et stofs potentielle hudsensibiliserende virkning, er GPMT den foretrukne metode af adjuvanstypen. Test uden adjuvans (hvor Buehlertesten er den foretrukne) bliver for mange kemiske stofgrupper anset for at være mindre følsom. Der kan i visse tilfælde, være gode grunde til at vælge Buehlertesten med lokal påføring i stedet for den intradermale injektion, der benyttes i maksimeringstesten på marsvin. Der skal gives en videnskabelig begrundelse for anvendelse af Buehlertesten. I denne metode beskrives maksimeringstesten på marsvin (GPMT) og Buehlertesten. Der kan anvendes andre metoder, forudsat at de er tilstrækkeligt validerede, og at valget er videnskabeligt begrundet. Hvis testresultatet i en af de anerkendte screeningstest er positivt, er det tilladt at betegne stoffet som potentielt sensibiliserende og det er måske ikke nødvendigt at udføre yderligere marsvineforsøg. Hvis stoffet er negativt i en af de anerkendte screeningsmetoder, skal der udføres en marsvinetest, hvor der bruges de fremgangsmåder, der er beskrevet i denne testmetode. Se også den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Hudsensibilisering: (allergisk kontaktdermatitis) er en immunologisk hudreaktion på et stof. Hos mennesker kan reaktionerne være karakteriseret ved kløen, erytem, ødem, papler, vesikler, blærer eller en kombination heraf. Andre arter kan have andre reaktioner f.eks. kun erytem og ødem. Induktionseksponering: eksperimentel eksponering af et individ for et teststof med henblik på fremkaldelse af hypersensibel tilstand. Induktionsperiode: tidsrum på mindst en uge efter en induktionseksponering, under hvilken en hypersensibel tilstand kan være opstået. Provokationseksponering: eksperimentel eksponering — efter en induktionsperiode — af et tidligere behandlet individ for et teststof til konstatering af, om individet reagerer hypersensibelt.
1.3. REFERENCESTOFFER Den anvendte forsøgsmetodes følsomhed og pålidelighed vurderes hver sjette måned med anvendelse af stoffer, der vides at have mildt til moderat hudsensibiliserende egenskaber. I en velgennemført test bør der for mildt/moderat sensibiliserende stoffer ventes en reaktion på mindst 30 % i en adjuvanstest og mindst 15 % i en test uden adjuvans. Følgende stoffer foretrækkes: CAS-nummer Einecs-nummer Einecs-navn Fælles navn 101-86-0 202-983-3 α-hexylkanelaldehyd α-hexylkanelaldehyd 149-30-4 205-736-8 benzothiazol-2-thiol (mercaptobenzothiazol) kaptax 94-09-7 202-303-5 benzocain norcain Under visse omstændigheder vil andre kontrolstoffer, der opfylder de ovennævnte kriterier, kunne anvendes, såfremt valget heraf kan begrundes.
1.4. TESTMETODENS PRINCIP Forsøgsdyrene udsættes først for teststoffet med intradermale injektioner og/eller epidermal applikation (induktionseksponering). Efter en hvileperiode på 10-14 dage (induktionsperiode), hvor der kan udvikle sig immunrespons, udsættes dyrene for en provokationsdosis. Omfanget og graden af hudens reaktion på provokationseksponeringen i forsøgsdyrene sammenlignes med resultater fra kontroldyr, der har fået placebo-behandling i induktionsperioden og dernæst er eksponeret for provokationsdosis.
1.5. BESKRIVELSE AF TESTMETODERNE Hvis det anses for nødvendigt at fjerne teststoffet, bør dette gøres med vand eller et passende opløsningsmiddel, uden at den fremkaldte reaktion ændres eller overhuden beskadiges.
1.5.
1.5.1. Maksimeringstest på marsvin (Guinea-Pig Maximization Test — GPMT)
1.5.1.
1.5.1.1. Forberedelser Unge, sunde, kønsmodne albinomarsvin tilvænnes laboratoriebetingelserne i mindst fem dage forud for testen. Før forsøget begyndes, fordeles dyrene randomiseret i behandlingsgrupper. Behåring fjernes ved klipning, barbering eller eventuelt med kemiske midler, afhængigt af testmetode. Huden må ikke irriteres. Dyrene vejes, inden forsøget påbegyndes, og ved forsøgets afslutning.
1.5.1.2. Forsøgsbetingelser
1.5.1.2.
1.5.1.2.1. Forsøgsdyr Der benyttes albinomarsvin af almindeligt anvendte stammer.
1.5.1.2.2. Antal og køn Der kan anvendes handyr og/eller hundyr. Hvis der benyttes hundyr, må de ikke have født, og de må ikke være drægtige. Forsøgsgruppen skal bestå af mindst ti dyr og kontrolgruppen af mindst fem dyr. Hvis der anvendtes mindre end tyve forsøgsmarsvin og ti kontrolmarsvin og det ikke er muligt at konkludere, at teststoffet er sensibiliserende, anbefales det stærkt at teste stoffet i yderligere dyr, så der i alt er tale om mindst tyve forsøgsdyr og ti kontroldyr.
1.5.1.2.3. Dosisniveauer Den koncentration af teststoffet, der anvendes ved hver induktionseksponertng, må ikke forårsage systemiske gener og skal være den størst mulige, der forårsager mild til moderat hudirritation. Provokationskoncentrationen skal være den størst mulige, der ikke femkalder hudirritation. Hvis nødvendigt kan de relevante koncentrationer bestemmes ved hjælp af en pilotundersøgelse med to eller tre dyr. Det bør overvejes at bruge FCA-behand! ede dyr til dette formål.
1.5.1.3. Fremgangsmåde
1.5.1.3.
1.5.1.3.1. Induktion Dag 0 — forsøgsgruppe Tre intradermale injektioner på 0,1 ml gives parvis i skulderpartiet — hvorfra hårlaget er fjernet — således, at hvert injektionspar består af en injektion på hver side af midterlinjen. Injektion 1: en blanding i forholdet 1:1 (volumenprocent) af FCA/vand eller fysiologisk saltopløsning. Injektion 2: teststoffet i et passende vehikel i den udvalgte koncentration. Injektion 3: teststoffet i den valgte koncentration i en blanding i forholdet 1:1 (volumenprocent) FCA/vand eller fysiologisk saltopløsning. I injektion 3 opløses vandopløselige stoffer i vandfasen før de blandes med FCA. Fedtopløselige eller uopløselige stoffer opslæmmes i FCA forud for blanding med den vandige fase. Teststoffets slutkoncentration skal være den samme som i injektion 2. Injektion 1 og 2 placeres tæt på hinanden og nærmest ved hovedet, mens injektion 3 placeres i den bageste del af testområdet. Dag 0 — kontrolgruppe Tre intradermale injektioner på 0,1 ml gives parvis på samme måde som for forsøgsdyrene. Injektion 1: en blanding i forholdet 1:1 (volumenprocent) FCA/vand eller fysiologisk saltopløsning. Injektion 2: det ufortyndede vehikel. Injektion 3: en 50 vægtprocent formulering af vehiklet i en blanding i forholdet 1:1 (volumenprocent) af FCA/vand eller fysiologisk saltopløsning. Dag 5-7 — forsøgsgruppe og kontrolgruppe Hvis stoffet ikke er hudirriterende, fremkaldes der, ca. 24 timer inden den lokale induktionsapplikation, en lokal irritation ved behandling af testområdet med 0,5 ml 10 % natriumlaurylsulfat i vaseline, efter klipning og/eller barbering. Dag 6-8 — forsøgsgruppe Testområdet klippes. Et stykke filtrerpapir (2 × 4 cm) gennemvædes med teststoffet, der er blandet med et passende vehikel, og anbringes på testområdet og fastholdes med en okklusiv forbinding i 48 timer. Valget af vehikel skal begrundes. Faste stoffer pulveriseres og inkorporeres i et passende vehikel. Væske kan eventuelt anvendes direkte. Dag 6-8 — kontrolgruppe Testområdet klippes. Vehikel alene anbringes på tilsvarende måde på testområdet og fastholdes med en okklusiv forbinding i 48 timer.
1.5.1.3.2. Provokation Dag 20-22 — forsøgs- og kontrolgruppe Både i forsøgsgruppen og i kontrolgruppen befries dyrenes flanke for hår. På forsøgsdyrenes ene side anbringes en lap eller en kapsel med teststoffet, og, hvis det er relevant, kan der også anbringes en lap eller en kapsel med rent vehikel på den anden side. Lapperne holdes i kontakt med huden i 24 timer med en okklusiv forbinding.
1.5.1.3.3. Observation og scoring: forsøgs- og kontrolgruppe Blindlæsning af forsøgs- og kontroldyrene anbefales. Hvis det er nødvendige at uddybe resultaterne af den første provokationseksponering, bør det overvejes at foretage endnu en provokationseksponering (dvs. en fornyet provokation), eventuelt med en ny kontrolgruppe, ca. 1 uge efter den første eksponering. En fornyet provokation kan også foretages på den oprindelige kontrolgruppe. Alle hudreaktioner og alle usædvanlige virkninger, herunder systemiske reaktioner, af både induktions- og provokationseksponeringen skal observeres og registreres i henhold til Magnusson/Kligmans scoringsskala (se tillægget). Andre teknikker, f.eks. histopatologisk undersøgelse og måling af hudfortykkelse, kan benyttes til afklaring af tvetydige reaktioner.
ca. 21 timer efter at lappen er fjernet, renses provokationsområdet og befries om nødvendigt for hår
ca. 3 timer senere (ca. 48 timer efter påføring af provokationsdosis) observeres hudens reaktion, som registreres efter den scoringsskala, der er vist i tillægget
ca. 24 timer efter denne observation foretages endnu en observation (72 timer), som registreres.
1.5.2. Buehlertest
1.5.2.
1.5.2.1. Forberedelser Unge, sunde, kønsmodne albinomarsvin tilvænnes laboratoriebetingelserne i mindst fem dage forud for testen. Før forsøget begyndes, fordeles dyrene randomiseret i behandlingsgrupper. Behåring fjernes ved klipning, barbering eller eventuelt med kemiske midler, afhængigt af testmetode. Huden må ikke irriteres. Dyrene vejes, inden forsøget påbegyndes, og ved forsøgets afslutning.
1.5.2.2. Forsøgsbetingelser
1.5.2.2.
1.5.2.2.1. Forsøgsdyr Der benyttes albinomarsvin af almindeligt anvendte stammer.
1.5.2.2.2. Antal og køn Der kan anvendes handyr og/eller hundyr. Hvis der benyttes hundyr, må de ikke have født, og de må ikke være drægtige. Forsøgsgruppen skal bestå af mindst 20 dyr og kontrolgruppen af mindst 10 dyr.
1.5.2.2.3. Dosisniveauer Der vælges en så høj koncentration af teststoffet for hver induktionseksponering, at der fremkaldes en mild, men ikke overdreven irritation. Provokationskoncentrationen bør være den størst mulige, der ikke fremkalder irritation. Hvis nødvendigt kan de relevante koncentrationer bestemmes ved hjælp af en pilotundersøgelse med to eller tre dyr. For vandopløselige teststoffer kan der som vehikel bruges vand eller en fortyndet, ikke-irriterende opløsning af et overfladeaktivt stof. For andre teststoffer foretrækkes 80 % ethanol/vand til induktionseksponering og acetone til provokationseksponering.
1.5.2.3. Fremgangsmåde
1.5.2.3.
1.5.2.3.1. Induktion Dag 0 — forsøgsgruppe Dyrene befries for hår (klippes tæt) på den ene flanke. Testlappesystemet skal være gennemvædet med teststoffet i et egnet vehikel (valg af vehikel skal begrundes; væsker kan eventuelt anvendes direkte). Testlappesystemet anbringes på testområdet og fastholdes i kontakt med huden med en okklusiv lap eller kapsel og en passende forbinding i seks timer. Testlappesystemet skal være okklusivt. Et stykke gaze er passende: det kan være rundt eller firkantet, af en størrelse på ca. 4-6 cm2. For at sikre okklusion foretrækkes det, at dyrenes bevægelsesfrihed begrænses med passende midler. Hvis der anvendes bandage, kan yderligere eksponering være nødvendig. Dag 0 — kontrolgruppe Dyrene befries for hår (klippes tæt) på den ene flanke. Vehiklet alene anbringes på testområdet på tilsvarende måde som for forsøgsgruppen. Testlappesystemet fastholdes i kontakt med huden med en okklusiv lap eller kapsel og en passende forbinding i seks timer. Hvis det kan påvises, at der ikke er behov for en placebo-kontrolgruppe, kan en ikke forud testet kontrolgruppe (naive control group) bruges. Dag 6-8 og 13-15 — forsøgs- og kontrolgruppen På dag 6-8 og igen på dag 13-15 foretages samme påføring som på dag 0 på samme testområde (om nødvendigt befriet for hår).
1.5.2.3.2. Provokation Dag 27-29 — forsøgs- og kontrolgruppe Både i forsøgsgruppen og i kontrolgruppen befries dyrene for hår (klippes tæt) på den anden flanke. Bagest på flanken på forsøgs- og kontroldyrene anbringes en okklusiv lap eller kapsel med en passende mængde teststof i den højest mulige koncentration, der ikke fremkalder irritation. Hvis det er relevant, anbringes desuden en okklusiv lap eller kapsel med vehikel alene forrest på flanken på såvel forsøgs- som kontroldyr. Lapper og kapsler fastholdes i kontakt med huden med en passende forbinding i seks timer.
1.5.2.3.3. Observation og scoring Blindlæsning af forsøgs- og kontroldyrene anbefales. Hvis det er nødvendigt at uddybe resultaterne af den første provokationseksponering, bør det overvejes at foretage endnu en provokationseksponering (dvs. en fornyet provokation), eventuelt med en ny kontrolgruppe, ca. en uge efter den første eksponering. En fornyet provokation kan også foretages på den oprindelige kontrolgruppe. Alle hudreaktioner og alle usædvanlige virkninger, herunder systemiske reaktioner, af både induktions- og provokationseksponeringen skal observeres og registreres i henhold til Magnussen/Kligmans scoringsskala (se tillægget). Andre teknikker, f.eks. histopatologisk undersøgelse og måling af hudfortykkelse, kan benyttes til afklaring af tvetydige reaktioner.
ca. 21 timer efter at lappen er fjernet, befries provokationsområdet for hår
ca. tre timer senere (ca. 30 timer efter påføring af provokationslap) observeres hudens reaktion, og denne registreres i henhold til den scoringsskala, der er vist i tillægget
ca. 24 timer efter observationen efter 30 timer (dvs. 54 timer efter påføring af provokationslap) observeres hudens reaktioner igen og registreres.
2. DATA (GPMT og Buehlertest) Data opstilles i tabelform, som angiver hudens reaktion ved hver enkelt observation af hver enkelt dyr.
3. RAPPORTERING (GPMT og Buehlertest) Hvis der udføres en screeningtest inden marsvinetesten, skal der sammen med de resultater, der er opnået med test- og referencestofferne, gives en beskrivelse af eller henvisning til testen (f.eks. Mouse Ear Swelling Test (MEST)), herunder oplysninger om fremgangsmåde.
3. Forsøgsrapport (GPMT og Buehlertest)
Forsøgsrapporten skal om muligt indholde følgende oplysninger:
Forsøgsdyr:
anvendt marsvinestamme
dyrenes antal, alder og køn
herkomst, laboratoriemiljø, foder osv.
hver enkelt dyrs vægt ved forsøgets begyndelse.
Forsøgsbetingelser:
metode til forberedelse af stedet for anbringelse af lap
oplysninger om anvendte lapmaterialer og metode til anbringelse af lapper
resultat af forundersøgelse med konklusioner om de induktions- og provokationskoncentrationer, der skal anvendes i testen
oplysninger om teststoffets tilberedning, påføring og fjernelse
begrundelse for valg af vehikel
de vehikel- og teststofkoncentrationer, der er anvendt til induktions- og provokationseksponering, og den samlede mængde stof, der er anvendt til induktion og provokation.
Resultater:
resumé af resultaterne af den seneste følsomheds- og pålidelighedskontrol (jf. 1.3), herunder oplysninger om anvendt stof, koncentration og vehikel
oplysninger om observationerne af hver enkelt dyr, herunder scoringssystem
beskrivende redegørelse for de observerede virkningers art og styrke
eventuelle histopatologiske fund.
Diskussion af resultaterne
Konklusioner
4. HENVISNINGER Denne metode svarer til TG 406 fra OECD.
B.7. TOKSICITET VED GENTAGEN DOSERING (28 DAGE, ORAL)
B.7.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Se den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Se den generelle indledning til del B.
1.3. TESTMETODENS PRINCIP Teststoffet indgives oralt dagligt i graduerede doser til grupper af forsøgsdyr, idet der gives en bestemt dosis til hver gruppe gennem en periode på 28 dage. I eksponeringsperioden observeres dyrene hver dag omhyggeligt for tegn på toksicitet. Dyr, der dør eller aflives under forsøget, obduceres, og de overlevende dyr aflives og obduceres ved forsøgets afslutning. Med denne metode lægges der større vægt på neurologiske effekter som et specifikt endepunkt; dyrene skal underkastes omhyggelige kliniske observationer med henblik på indhentning af flest mulige oplysninger. Metoden tager sigte på at identificere kemiske stoffer med neurotoksisk potentiale, som i givet fald bør undersøges nøjere. Herudover kan metoden vise, om der er tegn på immunologiske effekter og toksicitet for kønsorganerne.
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.4.
1.4.1. Forberedelser Unge, sunde, kønsmodne dyr fordeles randomiseret i kontrol- og forsøgsgrupper. Burene bør anbringes således, at mulige virkninger som følge af burenes placering minimeres. Dyrene mærkes individuelt og tilbringer mindst fem dage i deres bure forud for forsøgets påbegyndelse, så de tilvænnes laboratoriebetingelserne. Teststoffet indgives med mavesonde, i foderet eller i drikkevandet, afhængigt af formålet med forsøget og stoffets fysisk-kemiske egenskaber. Om nødvendigt opløses eller opslæmmes teststoffet i et egnet vehikel. Det anbefales, at der så vidt muligt anvendes en vandig opløsning/opslæmning og, hvis dette ikke er muligt, en opløsning/emulsion i olie (f.eks. majsolie) eller eventuelt en opløsning i andre vehikler. Ikke-vandige vehiklers toksiske egenskaber skal være kendt. Teststoffets stabilitet i vehiklet bør bestemmes.
1.4.2. Forsøgsbetingelser
1.4.2.
1.4.2.1. Forsøgsdyr Rotten er den foretrukne gnaverart, skønt andre gnaverarter kan anvendes. Der benyttes unge, sunde rotter af almindeligt anvendte laboratoriestammer. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. Dosering bør påbegyndes tidligst muligt efter fravænning og under alle omstændigheder, inden rotterne er ni uger gamle. Ved forsøgets begyndelse skal vægten af de anvendte dyr variere mindst muligt og ikke mere end ± 20 % af gennemsnitsvægten af hvert køn. Hvis en undersøgelse med gentagen oral dosis gennemføres som en forundersøgelse forud for en langtidsundersøgelse, bør der så vidt muligt anvendes dyr fra samme stamme og herkomst i begge undersøgelser.
1.4.2.2. Antal og køn Der anvendes mindst ti dyr (fem hunner og fem hanner) ved hvert dosisniveau. Hvis der ifølge forsøgsprotokollen skal aflives dyr under forsøget, skal det oprindelige antal dyr forøges med det antal dyr, der påregnes aflivet. Man kan samtidig udsætte en satellitgruppe på ti dyr (fem af hvert køn) for den højeste dosis i 28 dage og gennem en periode på 14 dage efter forsøget observere, om der er reversible, varige eller forsinkede toksiske virkninger. Der anvendes tillige en satellitgruppe på ti kontroldyr (fem af hvert køn).
1.4.2.3. Dosisniveauer Der anvendes generelt mindst tre forsøgsgrupper og en kontrolgruppe. Dyrene i kontrolgruppen behandles nøjagtigt som dyrene i forsøgsgrupperne, bortset fra indgiften af teststoffet. Hvis der anvendes et vehikel til indgift af teststoffet, skal kontrolgruppen indgive vehiklet det største af de anvendte volumina. Hvis der ud fra andre data ikke kan ventes virkninger ved en dosis på 1000 mg/kg legemsvægt/dag, kan der gennemføres en grænsetest. Foreligger der ikke passende data, kan der udføres en range finding -undersøgelse til bestemmelse af de doser, der skal anvendes. Dosisniveauerne udvælges under hensyntagen til eventuelle foreliggende data om teststoffet eller beslægtede stoffers toksicitet og (toksiko)kinetik. Den højeste dosis vælges med henblik på fremkaldelse af toksiske effekter, men ikke død eller alvorlig lidelse. Normalt vælges en faldende række dosisniveauer til påvisning af eventuelt dosisafhængigt respons og niveau, hvor skadelige effekter ikke kan observeres ved det laveste dosisniveau (NOAEL). Det optimale interval mellem to doser er ofte en faktor på 2-4, og tilføjelse af en fjerde forsøgsgruppe er ofte at foretrække frem for anvendelse af meget store intervaller (f.eks. mere end en faktor på 10) mellem dosisniveauerne. For stoffer, der indgives med foder eller drikkevand, er det vigtigt at sikre, at de anvendte mængder af teststoffet ikke har indflydelse på den normale ernærings- eller væskebalance. Hvis teststoffet indgives med foderet, kan man enten anvende en konstant koncentration i foderet (ppm) eller en konstant dosering i forhold til dyrenes vægt; det benyttede alternativ bør specificeres. Hvis teststoffet indgives med mavesonde, gøres dette på samme tidspunkt hver dag. Doserne justeres, så de er konstant i forhold til dyrenes legemsvægt. Hvis en undersøgelse med gentagen dosis anvendes som en forundersøgelse forud for en langtidsundersøgelse, bør foderet være det samme i begge undersøgelser.
1.4.2.4. Grænsetest Hvis en test med et dosisniveau på mindst 1000 mg/kg legemsvægt/dag eller, ved indgift gennem foder eller drikkevand, en tilsvarende procentdel i foderet eller drikkevandet (baseret på bestemmelse af legemsvægten), udført efter nedenstående fremgangsmåde, ikke fremkalder erkendbare toksiske virkninger, og hvis der ikke på grundlag af data fra strukturelt beslægtede stoffer kan ventes toksiske virkninger, kan en fuldstændig undersøgelse med anvendelse af tre dosisniveauer betragtes som unødvendig. I dette tilfælde bør grænsetesten anvendes, medmindre human eksponering viser, at der er behov for anvendelse af et højere dosisniveau.
1.4.2.5. Observationsperiode Observationsperioden varer 28 dage. En eventuel satellitgruppe beregnet til opfølgningsobservationer holdes i yderligere 14 dage uden indgift af teststof, således at det kan registreres, om der er forsinkede, vedvarende eller reversible toksiske virkninger.
1.4.3. Fremgangsmåde Dyrene indgives teststoffet dagligt syv dage om ugen i en periode på 28 dage; fem dages dosering pr. uge skal begrundes. Hvis teststoffet indgives med sonde, skal dette gøres i en enkelt dosis med anvendelse af mavesonde eller passende intubationsrør. Det maksimale væskevolumen, som kan indgives ad gangen, afhænger af forsøgsdyrets størrelse. Volumen bør ikke overstige 1 ml/100 g legemsvægt, undtagen for vandige opløsninger, hvor 2 ml/100 g legemsvægt kan anvendes. Med undtagelse af irriterende eller ætsende stoffer, som normalt vil afsløre stærkere virkninger med højere koncentrationer, bør variationen i testvolumen minimeres ved at justere koncentrationen således, at der sikres en konstant volumen ved alle dosisniveauer.
1.4.3.
1.4.3.1. Generelle observationer Der foretages generelle kliniske observationer mindst én gang om dagen, om muligt på det eller de samme tidspunkter hver dag og under hensyntagen til, hvornår de forventede virkninger efter dosering er stærkest. Dyrenes sundhedstilstand registreres. Dyrene observeres for sygelighed og dødelighed mindst to gange om dagen. Døende og stærkt lidende dyr fjernes, så snart de observeres, aflives humant og obduceres. Én gang før den første eksponering (med henblik på individbaserede sammenligninger) og mindst én gang om ugen derefter foretages der indgående kliniske observationer af alle dyrene. Med henblik på disse observationer tages dyrene ud af deres egne bure og anbringes i et standardindelukke. Observationerne udføres om muligt på samme tidspunkt hver gang. De registreres omhyggeligt, om muligt med anvendelse af scoringssystemer, hvis anvendelse skal være klart defineret af forsøgslaboratoriet. Det er vigtigt at sikre, at forsøgsbetingelserne varierer minimalt, og at observationerne om muligt foretages af observatører, der ikke har kendskab til behandlingen. Observationerne bør bl.a. være rettet mod ændringer i hud, pels, øjne, slimhinder, forekomst af sekretion, ekskretion og autonom aktivitet (f.eks. tåreflod, strittende hårlag, pupilstørrelse, usædvanligt respirationsmønster). Tillige registreres ændringer i gang, holdning og reaktion på håndtering såvel som forekomsten af kloniske eller toniske bevægelser, stereotyp optræden (f.eks. overdreven soignering, stadig kredsen i cirkelbevægelser) eller mærkelig adfærd (f.eks. automutilation, baglæns gang). I den fjerde eksponeringsuge vurderes reaktiviteten over for sensoriske stimuli af forskellig art (f.eks. auditive, visuelle og proprioceptive stimuli), gribestyrke og motorisk aktivitet. Litteraturen indeholder yderligere oplysninger om de undersøgelsesmetoder, der kan anvendes (se den generelle indledning til del B). Funktionelle observationer i den fjerde eksponeringsuge kan udelades, hvis undersøgelsen gennemføres som en forundersøgelse til en efterfølgende undersøgelse af subkronisk toksicitet (90 dage). I så fald medtages de funktionelle observationer i den opfølgende undersøgelse. På den anden side kan data vedrørende funktionelle observationer fra undersøgelsen med gentagen dosis lette valget af dosisniveauer for en efterfølgende undersøgelse af subkronisk toksicitet. I undtagelsestilfælde kan funktionelle observationer ligeledes udelades for grupper, der viser så tydelige tegn på toksicitet, at det i signifikant grad ville indvirke på resultaterne af den funktionelle test.
1.4.3.2. Legemsvægt og indtagelse af føde/vand Alle dyrene vejes mindst én gang om ugen. Indtagelsen af føde og vand måles mindst én gang om ugen. Hvis teststoffet indgives via drikkevandet, bør indtagelsen af vand ligeledes måles mindst én gang om ugen.
1.4.3.3. Hæmatologi Følgende hæmatologiske undersøgelser foretages ved forsøgsperiodens afslutning: hæmatokrit, hæmoglobinkoncentration, erythrocyttælling, total og differential leucocyttælling, blodpladetælling og en måling af koaguleringsevne/tid. Der tages blodprøver fra et bestemt, angivet sted, lige inden eller i forbindelse med aflivning af dyrene; prøverne opbevares under passende betingelser.
1.4.3.4. Klinisk biokemi Klinisk-biokemiske bestemmelser med henblik på undersøgelse af vigtige toksiske virkninger i væv, og navnlig i nyrer og lever, foretages med blodprøver, der udtages fra alle dyr lige inden eller i forbindelse med dyrenes aflivning (bortset fra dem, der er fundet døende og/eller som er aflivet under forsøget). Det anbefales at dyrene faster natten over forud for blodprøvetagning. Undersøgelser af plasma eller serum skal omfatte natrium, kalium, glukose, total kolesterol, urinstof, kreatinin, total protein og albumin, mindst to enzymer, hvis forekomst kan være tegn på hepatocellulære effekter (f.eks. alanin aminotransferase, aspartat aminotransferase, alkalisk phosphatase, gamma glutamyl transpeptidase og sorbitol dehydrogenase). Målinger af yderligere enzymer (fra lever eller andre organer) og galdesyrer kan under visse omstændigheder give nyttige oplysninger. Følgende urinanalyser kan eventuelt udføres i forsøgets sidste uge til bestemmelse af: udseende, volumen, osmolalitet eller specifik vægtfylde, pH, protein, glukose og blod/blodceller. Endvidere bør det overvejes at gennemføre undersøgelser af serummarkører for generelle vævsskader. Andre bestemmelser, der bør foretages, hvis teststoffets kendte egenskaber kan eller forventes at kunne indvirke på tilsvarende metaboliske funktioner, omfatter kalcium, fosfat, triglycerider ved faste, visse hormoner, methæmoglobin og cholinesterase. Disse forhold undersøges for stoffer i bestemte stofgrupper eller fra tilfælde til tilfælde. Der er generelt brug for en fleksibel fremgangsmåde, afhængigt af dyreart og de observerede og/eller forventede effekter ved et givet stof. Hvis der ikke foreligger passende data fra tidligere undersøgelser, bør det overvejes at bestemme hæmatologiske og klinisk biokemiske variable, inden eksponering påbegyndes.
1.4.3.5. Makroskopisk undersøgelse Alle forsøgsdyrene underkastes en fuldstændig og tilbundsgående makroskopisk undersøgelse, der omfatter omhyggelig undersøgelse af kroppens ydre, alle åbninger samt af kraniehule, brysthule og bughule og indholdet heraf. Lever, nyrer, binyrer, testes, bitestikler, thymus, milt, hjerne og hjerte fra alle dyr befries for alt vedhængende væv og vejes hurtigst muligt efter udtagning, så udtørring undgås. Følgende væv præserveres i det bedst egnede fikseringsmiddel både med hensyn til vævstype og den påtænkte efterfølgende histopatologiske undersøgelse: alle makroskopiske læsioner, hjerne (repræsentative regioner, herunder cerebrum, cerebellum og pons), rygmarv, mavesæk, tyktarm og tyndtarm (herunder Peyerpletter), lever, nyrer, binyrer, milt, hjerte, thymus, skjoldbruskkirtel, spiserør og lunger (præserveret ved oppumpning med fikseringsmiddel og efterfølgende immersion), gonader, sekundære kønsorganer (f.eks. uterus, prostata), urinblære, lymfeknuder (om muligt en lymfeknude, der har berøring med indgiftsvejen, og en anden lymfeknude langt fra indgiftsvejen, som kan vise systemiske virkninger), perifer nerve (ischias- eller tibianerven), om muligt tæt på musklen, og et knoglemarvssnit (eller som alternativt et nyligt præpareret knoglemarvsaspirat). De kliniske og øvrige resultater kan vise, at der er behov for at undersøge yderligere væv. Også organer, der på grundlag af teststoffets kendte egenskaber kan forventes at være målorganer, præserveres.
1.4.3.6. Histopatologisk undersøgelse Der foretages en fuldstændig histologisk undersøgelse af de præserverede organer og væv fra alle dyr i kontrolgruppen og i højdosisgruppen. I disse undersøgelser inddrages dyr fra alle de andre dosisgrupper, hvis der i højdosisgruppen observeres eksponeringsrelaterede ændringer. Alle makroskopiske læsioner undersøges. Bruges der en satellitgruppe, udføres der en histopatologisk undersøgelse af væv og organer, der udviser toksisk virkning i de øvrige grupper.
2. DATA Der tilvejebringes data for hvert enkelt dyr. Derudover opstilles alle data i tabelform, som for hver gruppe viser antallet af dyr ved begyndelsen af forsøget, antallet af dyr, der er fundet døde under forsøget eller aflivet af humane årsager, og tidspunktet for dødsfald eller human aflivning, antal dyr, der viser tegn på toksicitet, en beskrivelse af de observerede tegn på toksicitet, herunder tidspunktet for de toksiske virkningers indtræden, varigheden og styrke, antallet af dyr, der udviser læsioner, typen af læsioner, og procentdelen af dyr, der udviser hver enkelt type læsion. Numeriske resultater vurderes om muligt med en passende og generelt accepteret statistisk metode. De statistiske metoder udvælges i forbindelse med forsøgets tilrettelæggelse.
3. RAPPORTERING
3. FORSØGSRAPPORT
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:
Forsøgsdyr:
anvendt art/stamme
dyrenes antal, alder og køn
herkomst, laboratoriemiljø, foder osv.
hvert enkelt dyrs vægt ved forsøgets påbegyndelse, herefter med ugentlige mellemrum og ved forsøgets afslutning.
Forsøgsbetingelser:
begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand
begrundelse for valg af dosisniveau
oplysninger om formulering af teststof eller tilblanding heraf i foderet, opnået koncentration, foderblandingens stabilitet og homogenitet
oplysninger om stoffets indgift
omregning af teststoffets koncentration (ppm) i foder/drikkevand til faktisk dosis (mg/kg/legemsvægt/dag), hvis relevant
oplysninger om foder- og vandkvalitet.
Resultater:
legemsvægt/ændringer i legemsvægt
foderindtagelse og vandindtagelse, hvis relevant
oplysninger om toksiske reaktioner efter køn og dosis, herunder tegn på toksicitet
de kliniske observationers art, styrke og varighed, reversible og ikke-reversible
vurdering af sanseevne, gribestyrke og motorisk aktivitet
hæmatologiske test med relevante referenceværdier
klinisk-biokemiske test med relevante referenceværdier
legemsvægt ved aflivning og organvægte
obduktionsfund
en detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund
oplysninger om absorption, hvis disse foreligger
statistisk behandling af resultaterne, hvis relevant.
Diskussion af resultaterne
Konklusioner
4. HENVISNINGER Denne metode svarer til TG 407 fra OECD.
B.8. TOKSICITET VED GENTAGEN DOSERING (28 DAGE, INHALATION)
B.8.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Det er nyttigt at have forhåndsoplysninger om stoffets partikelstørrelsesfordeling, damptryk, smeltepunkt, kogepunkt, flammepunkt og eventuelle eksplosive egenskaber. Se også den generelle indledning til del B (punkt A).
1.2. DEFINITIONER Se den generelle indledning til del B (punkt B).
1.3. REFERENCESTOFFER Ingen.
1.4. TESTMETODENS PRINCIP Flere grupper af forsøgsdyr udsættes i 28 dage dagligt i en angivet periode for teststoffet i graduerede koncentrationer, idet hver gruppe eksponeres for en bestemt koncentration.Anvendes der et vehikel til at frembringe en passende koncentration af teststoffet i luften, bør der i forsøget indgå en kontrolgruppe, der udsættes for vehiklet alene. I eksponeringsperioden observeres dyrene dagligt for symptomer på toksisk virkning. Dyr, der dør under forsøget, obduceres, og ved forsøgets afslutning aflives og obduceres de overlevende dyr.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6.
1.6.1. Forberedelser Dyrene holdes under forsøgsbetingelser med hensyn til miljø og fodring i mindst fem dage, inden forsøget begyndes. Unge sunde dyr fordeles randomiseret i det fornødne antal grupper. Om nødvendigt kan der tilsættes et egnet vehikel til teststoffet, således at der opnås en passende koncentration af teststoffet i luften. Hvis der anvendes et vehikel eller andre tilsætningsstoffer for at lette doseringen, skal det være påvist, at de ikke har nogen toksisk virkning. Her kan tidligere data benyttes.
1.6.2. Forsøgsbetingelser
1.6.2.
1.6.2.1. Forsøgsdyr Rotter er de foretrukne forsøgsdyr, medmindre der foreligger kontraindikationer. Der benyttes unge sunde rotter af almindeligt anvendte stammer. Ved forsøgets begyndelse må vægten af de anvendte dyr ikke variere mere end ± 20 % fra en rimelig gennemsnitsvægt.
1.6.2.2. Antal og køn Der anvendes mindst ti dyr (fem hunner og fem hanner) i hver forsøgsgruppe. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. Hvis der påregnes aflivning af dyr under forsøget, skal det oprindelige antal dyr forøges med det antal dyr, man påregner at aflive i løbet af forsøget. Man kan samtidig udsætte en satellitgruppe på ti dyr (fem af hvert køn) for den højeste koncentration i 28 dage og gennem en periode på 14 dage efter forsøget observere, om der er reversible, varige eller sent opståede toksiske virkninger. Der anvendes tillige en satellitgruppe på ti kontroldyr (fem af hvert køn).
1.6.2.3. Eksponeringskoncentrationer Der skal anvendes mindst tre koncentrationsniveauer og en kontrolgruppe eller en vehikelkontrolgruppe (svarende til koncentrationen af vehiklet i højeste dosisniveau), såfremt der benyttes vehikel. Dyrene i kontrolgruppen behandles nøjagtigt som dyrene i forsøgsgrupperne, bortset fra inhalation af teststoffet. Den højeste koncentration bør have toksisk virkning, men kun medføre få eller ingen dødsfald. Der må ikke være tegn på toksisk virkning ved den laveste koncentration. Hvis der foreligger en anvendelig vurdering af menneskers eksponering for stoffet, skal den laveste koncentration overskride denne eksponering, Middelkoncentrationen skal helst frembringe så svage observerbare toksiske virkninger som muligt. Hvis der anvendes mere end tre koncentrationer, bør de vælges således, at der opnås graduering af de toksiske virkninger. I grupperne med lav og middel koncentration og i kontrolgrupperne skal dødeligheden holdes på et lavt niveau, så der bliver mulighed for en meningsfuld vurdering af resultaterne.
1.6.2.4. Eksponeringstid Den daglige eksponenngsperiode er seks timer, men det kan være nødvendigt at benytte kortere eller længere perioder for at imødekomme specielle krav.
1.6.2.5. Udstyr Dyrene testes med inhalationsapparatur, der er udformet således, at der kan opretholdes en dynamisk luftcirkulation med et luftskifte på mindst 12 gange pr. time samtidig med et tilstrækkeligt iltindhold og jævn fordeling af eksponeringsluften. Benyttes der eksponeringskammer, skal det være således indrettet, at forsøgsdyrene sammenklumpes mindst muligt og eksponeres mest muligt for teststoffet ved inhalation. Den generelle regel for sikkerhed for stabil atmosfære er, at dyrenes totale volumen ikke må overstige 5 % af eksponeringskammerets volumen. Eksponeringen kan foregå gennem mund-næse, hovedet alene eller ved kamre til hele kroppen; ved anvendelse af de to første muligheder opnår man, at optagelsen af teststoffet ad andre veje minimeres.
1.6.2.6. Observationsperiode Dyrene observeres dagligt for symptomer på toksiske virkninger i hele forsøgsperioden og restitutionsperioden. Dødstidspunkt og tidspunkter for toksicitetssymptomers fremkomst og forsvinden registreres.
1.6.3. Fremgangsmåde Dyrene eksponeres for teststoffet dagligt 5-7 dage om ugen i en periode på 28 dage. En eventuel satellitgruppe beregnet til opfølgningsobservationer holdes i yderligere 14 dage, efter at eksponering for teststoffet er ophørt, således at det kan registreres, om toksiske virkninger er reversible, eller om de vedvarer. Temperaturen under forsøget holdes på 22 oC ± 3 oC. Under ideelle forhold skal den relative luftfugtighed holdes på mellem 30 % og 70 %, men i visse tilfælde (f.eks. ved testning af visse aerosoler) kan det være praktisk uigennemførligt. Udsivning af teststof til omgivelserne kan forhindres ved, at der i kammeret holdes et svagt undertryk (≤ 5 mm vandsøjle). Der gives hverken foder eller vand under eksponeringen. Der anvendes et dynamisk inhalatianssystem med et passende analytisk kontrolsystem til sikring af eksponeringskoncentrationen. Det anbefales at foretage en prøvetest for at finde frem til passende eksponeringskoncentrationer. Lufthastigheden tilpasses, således at der er ensartede forhold i hele eksponeringskammeret. Systemet skal være af en sådan beskaffenhed, at der så hurtigt som muligt opnås stabile eksponeringsbetingelser. Der foretages måling og kontrol af: Under og efter eksponering foretages der systematiske observationer, som registreres for hvert enkelt dyr. Alk dyr observeres dagligt, og toksicitetssymptomer registreres, herunder hvornår disse symptomer optræder første gang, hvor længe de varer, og hvor kraftige de er. Inspektionen af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels, øjne og slimhinder, åndedræt og kredsløb, det autonome og det centrale nervesystem, den motoriske aktivitet og adfærdsmønsteret. Dyrene vejes én gang om ugen. Det anbefales, at der også holdes regnskab med den ugentlige fødeindtagelse. Dyrene observeres med jævne mellemrum, så dyr ikke går tabt for undersøgelsen på grund af f.eks. kannibalisme, autolyse af væv eller forveksling. Ved forsøgets slutning aflives og obduceres alle overlevende dyr med undtagelse af dem i satellitgruppen. Døende dyr og dyr, der viser symptomer på stærk smerte eller lidelse, fjernes, så snart de iagttages, hvorefter de aflives på human måde og obduceres. Ved forsøgets afslutning skal alle dyr inklusive kontrolgruppen underkastes følgende undersøgelser: Andre bestemmelser, der kan være påkrævet for en fyldestgørende toksikologisk vurdering, er calcium, phosphor, chlorid, natrium, kalium, glucose efter faste, lipidanalyser, hormoner, syre/basebalance, methæmoglobin og cholinesteraseaktivitet. Der kan udføres yderligere klinisk biokemiske analyser, hvor det skønnes nødvendigt for en videre undersøgelse af de observerede virkninger.
1.6.3. a)
lufthastighed (kontinuerlig)
b)
den faktiske koncentration af teststoffet målt i opholdsarealet. Koncentrationen må under den daglige eksponeringsperiode ikke variere mere end ± 15 % fra gennemsnitskoncentrationen. Det kan være umuligt at opnå en sådan grad af kontrol med visse aerosoler, og i så tilfælde kan større udsving accepteres. Koncentrationerne bør fra dag til dag holdes så konstante som muligt under hele forsøgets forløb. For aerosoler analyseres partikelstørrelsen mindst en gang ugentligt pr. forsøgsgruppe
c)
temperatur og luftfugtighed, om muligt kontinuerligt.
i)
hæmatologisk analyse omfattende mindst hæmatokrit, hæmoglobinkoncentration, erythrocyttælling, total og differential leucocyttælling og et mål for koaguleringsevnen
ii)
klinisk biokemisk blodanalyse omfattende mindst én lever- og nyrefunktionsparameter: serum alanin aminotransferase (ALAT), serum aspartat aminotransferase (ASAT), urinstof, albumin, kreatinin, total bilirubin og total serumprotein.
1.6.3.1. Makroskopisk undersøgelse Alle forsøgsdyrene underkastes en fuldstændig makroskopisk undersøgelse. Lever, nyrer, binyrer, lunger og testes vejes så hurtigt som muligt efter udtagning, så udtørring undgås. Væv og organer (luftveje, lever, nyrer, milt, testes, binyrer, hjerte og organer, der udviser makrokopiske læsioner eller størrelsesforandringer) opbevares i et passende medium med henblik på eventuel senere histopatologisk undersøgelse. Lunger udtages hele og intakte, vejes og behandles med et passende fixativ for at sikre, at lungestrukturen bevares.
1.6.3.2. Histopatologisk undersøgelse Der foretages en histologisk undersøgelse af præpareret væv og organer fra dyrene i kontrolgruppen samt i den gruppe, der har været udsat for den højeste koncentration. Observeres der i gruppen med den højeste koncentration vævs- eller organdefekter, som kan tilskrives teststoffet, undersøges de samme væv og organer i grupperne med lavere koncentration. Dyrene i en eventuel satellitgruppe underkastes en histologisk undersøgelse, især de væv og organer, der udviser toksisk virkning i de øvrige grupper.
2. DATA Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antal dyr ved begyndelsen af forsøget, og for hver type af læsion det antal dyr, der udviser den pågældende læsion. Evaluering af samtlige observationer skal baseres på en passende statistisk metode. Alle anerkendte statistiske metoder kan anvendes.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:
dyreart/stamme, herkomst, miljøbetingelser, foder osv.
forsøgsbetingelser: Beskrivelse af eksponeringsudstyret, herunder udformning, type, dimensionering, luftkilde, system til frembringelse af aerosoler, metode til konditionering af luften, behandling af udpumpet luft og den måde, hvorpå dyrene holdes i et eksponeringskammer, når et sådant benyttes. Apparatur til måling af temperatur, fugtighed og i givet fald aerosolkoncentrationens stabilitet eller partikelstørrelse skal beskrives. Eksponeringsdata: Disse skal opstilles i tabelform med angivelse af middelværdier og et mål for variationen (f.eks. standardafvigelser) og i videst muligt omfang omfatte:
3.1.
pt_2 a)
lufthastighed gennem inhalationsudstyret
b)
luftens temperatur og fugtighed
c)
nominelle koncentrationer (total mængde teststof tilført inhalationsapparaturet, divideret med luftvolumen)
d)
type vehikel, hvor et sådant er anvendt
e)
faktiske koncentrationer i opholdsarealet under forsøget
f)
massemedianen af den aerodynamiske diameter (MMAD) og den geometriske standardafvigelse (GSD)
oplysninger om toksisk reaktion opdelt efter køn og koncentration
angivelse af dyrenes dødstidspunkt under forsøget eller overlevelse til forsøgets slutning
beskrivelse af toksiske og andre virkninger; nuleffektniveau
for hvert enkelt abnormitetstegn det tidspunkt, hvor det er observeret, og dets senere udvikling
foder- og legemsvægt
hæmatologiske analyser og samtlige resultater
klinisk-biokemiske analyser og samtlige resultater
obduktionsfund
detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund
eventuel statistisk behandling af resultaterne
diskussion af resultaterne
fortolkning af resultaterne.
3.2. VURDERING OG FORTOLKNING Se den generelle indledning til del B (punkt D).
4. HENVISNINGER Se den generelle indledning til del B (punkt E).
B.9. TOKSICITET VED GENTAGEN DOSERING (28 DAGE, DERMAL)
B.9.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Se den generelle indledning til del B (punkt A).
1.2. DEFINITIONER Se den generelle indledning til del B (punkt B).
1.3. REFERENCESTOFFER Ingen.
1.4. TESTMETODENS PRINCIP Teststoffet påføres dagligt huden i graduerede doser på grupper af forsøgsdyr, idet der anvendes en bestemt dosis til hver gruppe gennem en periode på 28 dage. I eksponeringspenoden observeres dyrene dagligt for symptomer på toksisk virkning. Dyr, der dør under forsøget, obduceres, og ved forsøgets afslutning aflives og obduceres de overlevende dyr.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6.
1.6.1. Forberedelser Dyrene holdes under forsøgsbetingelser med hensyn til miljø og fodring i mindst fem dage, inden forsøget påbegyndes. Unge sunde dyr fordeles randomiseret i forsøgs- og kontrolgrupper, inden forsøget sættes i gang. Kort før forsøget indledes, klippes dyrene på ryggen. Såfremt dyrene barberes, bør det ske ca. 24 timer, inden forsøget indledes. Klipningen eller barberingen må som regel gentages med en uges mellemrum. Man må ved klipning og barbering passe på ikke at beskadige huden. Mindst 10 % af kroppens overflade klargøres til påføring af teststoffet. Ved afgørelse af, hvilket og hvor stort et område der skal klippes, bør der tages hensyn til dyrets vægt. Ved testning af faste stoffer, som i givet fald kan pulveriseres, skal teststoffet fugtes tilstrækkeligt med vand eller om nødvendigt med et passende vehikel, så der sikres god kontakt med huden. Flydende teststoffer påføres normalt ufortyndet. Teststoffet påføres dagligt 5-7 dage om ugen.
1.6.2. Forsøgsbetingelser
1.6.2.
1.6.2.1. Forsøgsdyr Der kan anvendes voksne rotter, kaniner eller marsvin. Der kan også anvendes andre dyrearter, men i så fald skal det begrundes. Ved forsøgets begyndelse må vægten af de anvendte dyr ikke variere mere end ± 20 % fra en rimelig gennemsnitsvægt.
1.6.2.2. Antal og køn Der anvendes mindst ti dyr (fem hunner og fem hanner) med sund hud til hvert dosisniveau. Hunnerne må ikke have født og må ikke være drægtige. Hvis der påregnes aflivning af dyr under forsøget, skal det oprindelige antal dyr forøges med det antal dyr, man påregner at aflive i løbet af forsøget. Man kan samtidig udsætte en satellitgruppe på ti dyr (fem af hvert køn) for den højeste dosis i 28 dage og gennem en periode på 14 dage efter forsøget observere, om der er reversible, varige eller forsinkede toksiske virkninger. Der anvendes tillige en satellitgruppe på ti kontroldyr (fem af hvert køn).
1.6.2.3. Dosisniveauer Der skal anvendes mindst tre dosisniveauer samt en kontrolgruppe eller en vehikelkontrolgruppe, såfremt der benyttes vehikel. Eksponeringsperioden er på mindst seks timer dagligt. Teststoffet påføres på omtrent samme tidspunkt hver dag, og doserne justeres med jævne mellemrum (én gang eller to gange om ugen), så de er konstante i forhold til dyrenes legemsvægt. Dyrene i kontrolgruppen behandles nøjagtigt som dyrene i forsøgsgrupperne, bortset fra påføring af teststoffet. Hvis der anvendes et vehikel til at lette doseringen, skal vehikelkontrolgruppen eksponeres på samme måde som forsøgsgrupperne og påføres samme mængde vehikel som den gruppe, der modtager den højeste dosis. Den højeste dosis bør have toksisk virkning, men kun medføre få eller ingen dødsfald. Det laveste dosisniveau bør ikke have nogen toksisk virkning overhovedet. Hvis der foreligger en anvendelig vurdering af menneskers eksponering for stoffet, skal det laveste dosisniveau overskride denne eksponering. Middeldosis skal helst frembringe så svage observerbare toksiske virkninger som muligt. Hvis der anvendes mere end tre dosisniveauer, bør de vælges således, at der opnås graduering af de toksiske virkninger. I grupperne med lav og middel dosis og i kontrolgrupperne skal dødeligheden holdes på et lavt niveau, så der bliver mulighed for en meningsfuld vurdering af resultaterne. Hvis påføring af teststoffet forårsager alvorlig hudirritation, sænkes koncentrationen, hvilket kan medføre, at andre toksiske virkninger på det højeste dosisniveau svækkes eller forsvinder. Hvis huden er blevet alvorligt beskadiget, kan det være nødvendigt at afslutte forsøget og foretage et nyt forsøg med lavere koncentrationer.
1.6.2.4. Grænsetest Hvis der i en indledende undersøgelse med en dosis på 1000 mg/kg legemsvægt eller en større dosis fastsat ud fra kendskab til den eksponering, mennesker kan blive udsat for, ikke konstateres nogen toksisk virkning, kan yderligere test betragtes som unødvendige.
1.6.2.5. Observationsperiode Dyrene observeres dagligt for symptomer på toksicitet. Dødstidspunkt og tidspunkter for toksicitetssymptomers fremkomst og forsvinden registreres.
1.6.3. Fremgangsmåde Dyrene holdes i hvert sit bur. Den ideelle dosering består i påføring af teststoffet syv dage om ugen i en periode på 28 dage. En eventuel satellitgruppe beregnet til opfølgningsobservationer holdes i yderligere 14 dage uden påføring af teststof, således at det kan registreres, om toksiske virkninger er reversible, eller om de vedvarer. Den daglige eksponeringsperiode er på mindst seks timer. Teststoffet påføres jævnt over et område, som svarer til ca. 10 % af den samlede legemsoverflade. Med stærkt toksiske stoffer kan der anvendes et mindre område, men stoffet skal påføres så tyndt og ensartet over en så stor del af området som muligt. Teststoffet skal holdes i kontakt med huden ved hjælp af en porøs gazeforbinding og en ikke-hudirriterende klæbestrimmel. Teststedet skal desuden tildækkes på en sådan måde, at gazeforbindingen og teststoffet holdes sikkert fast, så at dyrene ikke kan indtage teststoffet. Der kan anvendes andre foranstaltninger, som forhindrer dyrene i at indtage teststoffet; dog kan fuldstændig immobilisering ikke anbefales. Alternativt kan der benyttes en beskyttelseskrave. Ved eksponeringsperiodens afslutning fjernes tilbagesiddende teststof, idet der f.eks. anvendes vand eller et andet egnet middel til at rense huden. Alle dyr observeres dagligt, og toksicitetssymptomer registreres, herunder hvornår disse symptomer optræder første gang, hvor længe de varer, og hvor kraftige de er. Inspektion af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels, øjne og slimhinder, åndedræt og kredsløb, det autonome og centrale nervesystem, den motoriske aktivitet og adfærdsmønsteret. Dyrene vejes én gang om ugen. Det anbefales, at der også holdes regnskab med den ugentlige fødeindtagelse. Dyrene observeres med jævne mellemrum, så dyr ikke går tabt for undersøgelsen på grund af f.eks. kannibalisme, autolyse af væv eller forveksling. Ved forsøgets slutning aflives og obduceres alle overlevende dyr med undtagelse af dem i satellitgrupperne. Døende dyr og dyr, der viser symptomer på stærk smerte eller lidelse, fjernes, så snart de iagttages, hvorefter de aflives på human måde og obduceres. Ved forsøgets afslutning skal alle dyr inklusive kontrolgruppen underkastes følgende undersøgelser: Andre bestemmelser, der kan være påkrævet for en fyldestgørende toksikologisk vurdering, er calcium, phosphor, chlorid, natrium, kalium, glucose efter faste, lipidanalyser, hormoner, syre/basebalance, methæmoglobin og cholinesteraseaktivitet. Der kan udføres yderligere klinisk-biokemiske analyser, hvor det skønnes nødvendigt for videre undersøgelse af observerede virkninger.
1.6.3.
1) hæmatologisk analyse omfattende mindst hæmatokrit, hæmoglobinkoncentration, erythrocyttælling, total og differential leucocyttælling og et mål for koaguleringsevnen
2) klinisk biokemisk blodanalyse omfattende mindst en lever- og nyrefunktionsparameter: serum alanin aminotransferase (ALAT), serum aspartat aminotransferase (ASAT), urinstof, albumin, kreatinin, total bilirubin og total serumprotein.
1.6.4. Makroskopisk undersøgelse Alle forsøgsdyrene underkastes en fuldstændig makroskopisk undersøgelse. Lever, nyrer, binyrer og testes vejes så hurtigt som muligt efter udtagningen, så udtørring undgås. Væv og organer, dvs. normal og eksponeret hud, lever, nyrer, milt, testes, binyrer, hjerte og målorganer (dvs. organer, der udviser makroskopiske læsioner eller forandringer i størrelse), opbevares i et passende medium med henblik på eventuel senere histopatologisk undersøgelse.
1.6.5. Histopatologisk undersøgelse Der foretages en histologisk undersøgelse af præpareret væv og organer fra dyrene i kontrolgruppen samt i den gruppe, der har været udsat for den største dosis. Observeres der i gruppen med den højeste dosis vævs- eller organdefekter, som kan tilskrives teststoffet, undersøges de samme væv og organer i grupperne med lavere dosis. Dyrene i satellitgruppen underkastes en histologisk undersøgelse, især de væv og organer, der udviser virkning i de øvrige grupper.
2. DATA Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antallet af dyr ved begyndelsen af forsøget, og for hver type læsion det antal dyr, der udviser den pågældende læsion. Evaluering af samtlige observationer skal baseres på en passende statistisk metode. Alle anerkendte statistiske metoder kan anvendes.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:
dyreart/stamme, herkomst, miljøbetingelser, foder osv.
forsøgsbetingelser (herunder forbindingstypen: med eller uden okklusion)
dosisniveauer (med angivelse af vehikel, hvor et sådant er anvendt) samt koncentration
nuleffektniveau, hvor det er muligt
oplysninger om toksiske reaktioner opdelt efter køn og dosis
angivelse af dyrenes dødstidspunkt under forsøget eller overlevelse til forsøgets slutning
toksiske og andre virkninger
for hvert enkelt abnormitetstegn det tidspunkt, hvor det er observeret, og dets senere udvikling
foder- og legemsvægt
hæmatologiske analyser og samtlige resultater
klinisk-biokemiske analyser og samtlige resultater
obduktionsfund
detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund
eventuel statistisk behandling af resultaterne
diskussion af resultaterne
fortolkning af resultaterne.
3.2. VURDERING OG FORTOLKNING Se den generelle indledning til del B (punkt D).
4. HENVISNINGER Se den generelle indledning til del B (punkt E).
B.10. MUTAGENICITET — IN VITRO-TEST FOR KROMOSOMABERRATIONER I CELLER FRA PATTEDYR
B.10.
1. METODE Denne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 473 In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test (1997).
1.
1.1. INDLEDNING Formålet med in vitro-testen for kromosomaberrationer er at påvise, om et stof eller andet forårsager strukturelle kromosomafvigelser i dyrkede pattedyrceller (1) (2) (3). Der er to typer strukturændringer, kromosomtypen og kromatidtypen. De fleste kemiske mutagener forårsager ændringer af kromatidtypen, men også ændringer af kromosomtypen forekommer. Ploiditetsforøgelse kan være tegn på, at et kemisk stof er i stand til at fremkalde antalsafvigelser. Den foreliggende metode er imidlertid ikke beregnet til at påvise antalsafvigelser og benyttes ikke rutinemæssigt til dette formål. Kromosommutationer og lignende er årsag til mange genetiske sygdomme hos mennesker, og meget tyder på, at kromosommutationer og lignende, som ændrer på onkogener og tumorsuppressorgener i somatiske celler, medvirker ved induktion af kræft hos mennesker og i forsøgsdyr. I in vitro-testen for kromosomaberrationer kan der benyttes kulturer af etablerede cellelinjer, cellestammer eller primære cellekulturer. Cellerne udvælges på grundlag af deres vækstegenskaber ved dyrkning, karotypens stabilitet, kromosomtal, kromosomdiversitet og hyppighed af spontane kromosomaberrationer. Ved udførelse af in vitro-test er det i reglen nødvendigt at benytte en exogen kilde til metabolismeaktivering. Et sådant metabolismeaktiveringssystem kan ikke fuldstændig efterligne betingelserne i et levende pattedyr. Man må omhyggeligt undgå betingelser, som fører til et positivt resultat, der ikke skyldes selve mutageniciteten, men kan være forårsaget af ændringer i pH eller osmolalitet eller høj cytotoksicitet (4) (5). Testen benyttes til at screene for stoffer, der kan være mutagene eller carcinogene hos pattedyr. Mange af de stoffer, der giver positivt resultat med denne test, er kræftfremkaldende hos pattedyr, men der er ikke fuldstændig korrelation mellem testen og carcinogenicitet. Korrelationen afhænger af den kemiske sammensætning, og der er stadig tydeligere tegn på, at nogle carcinogener ikke påvises ved denne test, fordi de lader til at virke ved andre mekanismer end direkte beskadigelse af dna. Se også den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Aberration af kromatidtypen: beskadigelse af kromosomstrukturen i form af brud på enkeltkromatider eller brud på og sammenføjning af kromatider. Aberration af kromosomtypen: beskadigelse af kromosomstrukturen i form af brud på — eller brud på og sammenføjning af — begge kromatider på samme sted. Endofordobling: en proces, hvorved cellekernen efter en S-fase i dna-replikationen ikke fortsætter over i mitosen, men påbegynder endnu en S-fase. Resultatet er kromosomer med 4, 8, 16, ... kromatider. Gap: en akromatisk beskadigelse, som er mindre end ét kromatid bred, og hvor forskydning af kromatiderne er minimal. Mitoseindeks: forholdet mellem antallet af celler i metafase og det samlede antal celler i en population; det viser populationens formeringsgrad. Antalsafvigelse: ændring i kromosomtallet i forhold til det for de pågældende celler normale antal. Polyploidi: et multiplum af det haploide kromosomtal (n), som ikke er det diploide tal (dvs. 3n, 4n osv.). Strukturel ændring: ændring i kromosomstrukturen, som kan iagttages ved mikroskopi i celledelingens metafase i form af deletioner og fragmenter, intrachange og interchange.
1.3. TESTMETODENS PRINCIP Cellekulturer udsættes for teststoffet både med og uden metabolismeaktivering. Efter forud fastsatte tidsrum efter at være udsat for teststoffet behandles kulturerne med et metafasestandsende stof (f.eks. Colcemid® eller colchicin), hvorefter de høstes og farves; dernæst undersøges metafasecellerne mikroskopisk for forekomst af kromosomaberrationer.
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.4.
1.4.1. Præparater
1.4.1.
1.4.1.1. Celler Der kan benyttes en række forskellige cellelinjer, -stammer og primære cellekulturer, herunder humane celler (f.eks. fibroblaster fra kinesisk hamster eller perifere blodlymfocytter fra det perifere blod hos mennesker eller andre pattedyr).
1.4.1.2. Substrater og dyrkningsforhold Til vedligeholdelse af kulturerne benyttes der egnede dyrkningssubstrater og inkuberingsbetingelser (dyrkningsflaskcr, CO2-koncentration, temperatur og luftfugtighed). Etablerede cellelinjer og -stammer kontrolleres regelmæssigt for stabilt karakteristisk kromosomtal og mycoplasmakontaminering; i tilfælde af kontaminering anvendes kulturen ikke. Cellernes normale cyklustid og dyrkningsbetingelserne skal være kendt.
1.4.1.3. Fremstilling af kulturer Etablerede cellelinjer og -stammer: Celler udtages fra stamkulturer og udsås i dyrkningssubstrat med en sådan tæthed, at kulturerne ikke flyder sammen inden høst, og inkuberes ved 37 oC. Lymfocytter: fuldblod, der er behandlet med antikoaguleringsmiddel (f.eks, heparin), eller lymfocytter fra sunde individer tilsættes til dyrkningssubstratet, der indeholder et mitogen (f.eks. phytohæmagglutinin), og inkuberes ved 37 oC.
1.4.1.4. Metabolismeaktivering Cellerne udsættes for teststoffet både med og uden et egnet metabolismeaktiveringssystem. Det mest almindeligt anvendte system er en cofaktorsuppleret postmitokondriefraktion (S9), der fremstilles af levere fra rotter, der har været behandlet med enzyminducerende stoffer såsom Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9), eller en blanding af phenobarbiton og β-naphthoflavon (10) (11) (12). Postmitokondriefraktionen anvendes normalt i en koncentration på 1-10 % (v/v) i det færdige testsubstrat. Et metabolismeaktiveringssystems beskaffenhed kan afhænge af, hvilken kemisk klasse teststoffet tilhører. I nogle tilfælde vil det være hensigtsmæssigt at benytte postmitokondriefraktion i mere end én koncentration. Nogle udviklingstendenser, f.eks. genetisk konstruktion af cellelinjer, der udtrykker specifikke aktiverende enzymer, kan rumme potentiale for endogen aktivering. Valget af en bestemt cellelinje skal begrundes sagligt (f.eks. ved, at cytochrom P450-coenzymet er relevant for teststoffets metabolisme).
1.4.1.5. Teststof/testpræparat Teststoffer i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløsningsmidler eller bærestoffer og fortyndes passende inden behandling af cellerne. Teststoffer i væskeform kan enten tilsættes direkte til testsystemet eller fortyndes inden behandlingen. Der benyttes frisk fremstillede teststofpræparater, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.
1.4.2. Testbetingelser
1.4.2.
1.4.2.1. Opløsningsmiddel/bærestof Der må ikke være mistanke om, at opløsningsmiddel/bærestof reagerer kemisk med teststoffet, og opløsningsmiddel/bærestof må hverken hæmme cellernes overlevelse eller S9-aktiviteten. Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, skal brugen af dem underbygges med kompatibilitetsdata. Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem. Ved undersøgelse af stoffer, der er ustabile i vand, skal de organiske opløsningsmidler være vandfrie. Vand kan fjernes med tilsætning af molekylsi.
1.4.2.2. Eksponeringskoncentrationer Stoffets cytotoksicitet, dets opløselighed i testsystemet samt ændringer i pH og osmolalitet er blandt de kriterier, der skal tages hensyn til ved valg af højeste koncentration. Cytotoksiciteten bestemmes med og uden metabolismeaktivering i hovedforsøget ved hjælp af en passende indikator for celleintegritet og -vækst, f.eks. konfluens, antal levedygtige celler eller mitoseindeks. Det kan være hensigtsmæssigt at bestemme cytotoksicitet og opløselighed ved et indledende forsøg. Der benyttes mindst tre analyserbare koncentrationer. Hvis der er tale om cytoksicitet, skal koncentrationerne dække et interval fra største toksicitet til ringe eller ingen toksicitet; det betyder normalt, at koncentrationerne højst er adskilt med en faktor mellem 2 og √10. På højsttidspunktet skal konfluens, celleantal eller mitoseindeks være faldet signifikant ved den højeste koncentration (mere end 50 %). Mitoseindekset er kun et direkte mål for cytotoksisk/cytostatisk virkning og afhænger af, hvor lang tid der er forløbet efter behandlingen. Mitoseindeks er dog acceptabel for dyrkning i rystekolber, hvor andre toksicitetsmål er besværlige eller ubrugelige i praksis. Oplysninger om cellecyklens kinetik, såsom den gennemsnitlige generationstid (AGT), kan benyttes som supplerende information. AGT er imidlertid et overordnet gennemsnit, der ikke altid afslører forsinkede subpopulationer, og selv en lille forøgelse af den gennemsnitlige generationstid kan føre til en meget betydelig forsinkelse af tidspunktet for optimalt udbytte af aberrationer. For stoffer, der er forholdsvis ikke-cytotoksiske, må testkoncentrationen højst være 5 μl/ml, 5 mg/ml eller 0,01 M (den laveste af de tre). For forholdsvis uopløselige stoffer, der ikke er toksiske ved koncentrationer under opløselighedsgrænsen, skal der som højeste dosis benyttes en koncentration, der er højere end opløselighedsgrænsen i det samlede dyrkningssubstrat ved behandlingens afslutning. I nogle tilfælde (f.eks. når toksicitet kun optræder over den laveste koncentration med uopløselighed) tilrådes det at gennemføre testen ved mere end én koncentration med synlig udfældning. Det kan være hensigtsmæssigt at bedømme opløseligheden både ved behandlingens begyndelse og afslutning, eftersom opløseligheden kan ændre sig under eksponeringen i testsystemet som følge af, at der er celler S9. serum mv. til stede. Uopløselighed kan iagttages med det blotte øje. Bundfald må ikke have indflydelse på bedømmelsen.
1.4.2.3. Negative og positive kontrolprøver I alle forsøg medtages der sideløbende både positive og negative (opløsningsmiddel eller bærestof) kontrolprøver, såvel med som uden metabolismeaktivering. Når der benyttes metabolismeaktivering, bør der som positivt kontrolkemikalie anvendes et, der kræver aktivering for at virke mutagent. 1 positive kontrolprøver benyttes der et kendt clastogen i en mængde, der forventes at give reproducerbar og påviselig forøgelse i forhold til baggrundsværdierne, hvorved testsystemets følsomhed godtgøres. Der vælges sådanne koncentrationer i de positive kontrolprøver, at virkningerne er tydelige, uden dog at de kodede objektglas' identitet umiddelbart afsløres for den, der aflæser dem. Nedenfor er opregnet eksempler på positive kontrolstoffer: Metabolismeaktivering Stof CAS nr. Einecs nr. Ingen exogen metabolismeaktivering Methylmethansulfonat 66-27-3 200-625-0 Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 Ethylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 4-Nitroquinoline-N-oxid 56-57-5 200-281-1 Exogen metabolismeaktivering Benzo[a]pyrene 50-32-8 200-028-5 Cyclophosphamid Cyclophosphamidmonohydrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Der kan benyttes andre egnede stoffer til positiv kontrol. Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede stoffer. Der skal i hver høst indgå negative kontrolprøver, hvor behandlingsmediet kun består af opløsningsmiddel eller bærestof, og som behandles på samme måde som de øvrige kulturer. Desuden skal der være ubehandlede kontrolprøver, medmindre der foreligger tidligere opnåede kontroldata, der viser, at det valgte opløsningsmiddel ingen skadelige eller mutagene virkninger har.
1.4.3. Fremgangsmåde
1.4.3.
1.4.3.1. Behandling med teststof Celler under formering behandles med teststoffet med og uden tilstedeværelse af et metabolismeaktiveringssystem. Behandling af lymfocytter påbegyndes ca. 2 døgn efter stimulering med mitogen.
1.4.3.2. Der benyttes normalt dobbeltbestemmelse ved hver koncentration, hvilket også stærkt tilrådes for negative kontrolprøver (kontrolprover med opløsningsmiddel). Hvis det på grundlag af tidligere forsøg kan godtgøres, at forskellen mellem dobbeltbestemmelser (13) (14) er minimal, kan enkeltbestemmelse ved hver koncentration accepteres. Gasformige og flygtige stoffer testes ved en egnet metode, f.eks. i forseglede dyrkningsflasker (15) (16).
1.4.3.3. Høst af kulturer I det første forsøg udsættes cellerne for teststoffet både med og uden metabolismeaktivering i 3-6 timer, og der udtages prøve efter et tidsrum, der svarer til ca.1,5 gange cellecykluslængden, regnet fra behandlingens begyndelse (12). Fører denne protokol til negativt resultat både med og uden aktivering, udføres endnu et forsøg, denne gang med kontinuerlig behandling indtil prøveudtagning efter et tidsrum, der svarer til ca. 1,5 gange en normal cellecyklus. Nogle kemiske stoffer er det lettere at bestemme ved behandlings/prøveudtagningstider på mere end 1,5 gange cellecyklussen. Negativt resultat med metabolismeaktivering skal bekræftes i hvert enkelt tilfælde. Anses bekræftelse af negative resultater ikke for nødvendige, skal dette begrundes.
1.4.3.4. Kromosompræparering Cellekulturerne behandles med Colcemid® eller colchicin normalt 1-3 timer før høst. Høst og kromosompræparering skal foregå særskilt for hver enkelt kultur. Kromosompræpareringen består i hypotonisk behandling af cellerne, fiksering og farvning.
1.4.3.5. Analyse Alle objektglas, herunder positive og negative kontrolprøver, kodes uafhængigt inden mikroskoperingen. Da fikseringen ofte medfører, at en del af metafasecellerne går i stykker, og kromosomerne går tabt, bør bedømte celler indeholde et antal centromerer svarende til kromosomtallet ± 2 for alle celletyper. Der skal bedømmes mindst 200 vel fordelte metafaser pr. koncentration og kontrolgruppe, ligeligt fordelt mellem eventuelle dobbeltprøver. Dette antal kan sættes ned, hvis der iagttages høje aberrationstal. Selv om testens formål er at påvise ændringer i kromosomstrukturen, er det vigtigt også at notere polyploidi og endofordobling, hvis dette konstateres.
2. DATA
2.
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER Da cellen er forsøgets måleenhed, bedømmes det, hvilken procentdel af cellerne der har ændret kromosomstruktur. Forskellige strukturændringer noteres med antal og hyppighed for både forsøgs- og kontrolkulturer. Gaps noteres særskilt og registreres, men medregnes normalt ikke i den samlede aberrationshyppighed. Sideløbende målinger af cytotoksicitet for alle behandlede og negative kontrolkulturer i hovedforsøget registreres ligeledes. Dataene præsenteres for hver enkelt kultur. Desuden sammenfattes alle data i tabelform. Der findes ingen krav til verifikation af et klart positivt resultat. Tvetydige resultater bør afklares ved yderligere undersøgelser, helst med ændrede forsøgsbetingelser. Der er redegjort for behovet for bekræftelse af negative resultater i punkt 1.4.3.3. Ved opfølgende forsøg kan man overveje at ændre på undersøgelsens parametre, så de bedømte forsøgsbetingelser udvides. Blandt de undersøgelsesparametre, der kan ændres på, er koncentrationernes spredning og metabolismeaktiveringen.
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER Der findes en række kriterier for opnåelse af et positivt resultat, f.eks. en koncentrationsafhængig forøgelse eller en reproducerbar forøgelse af antallet af celler med kromosomaberrationer. Der bør i første række ses på resultaternes biologiske relevans. Statistiske metoder kan benyttes som hjælpemiddel ved evalueringen af testresultaterne (3) (13). Statistisk signifikans bør ikke være den eneste faktor, der afgør, om resultatet bedømmes som positivt. En forøgelse i antallet af polyploide celler kan være tegn på, at teststoffet er i stand til at inhibere mitoseprocesser og fremkaldte kromosomantalsafvigelser. En forøgelse af antallet af celler med endofordoblede kromosomer kan være tegn på, at teststoffet kan inhibere cellecyklussens forløb (17) (18). Et teststof, der ikke opfylder ovennævnte kriterier, anses ikke for mutagent i dette system. De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i sjældne tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvetydigt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages. Et positivt resultat af en in vitro-test for kromosomaberrationer viser, at teststoffet fremkalder ændringer i kromosomstrukturen i dyrkede somatiske celler fra pattedyr. Et negativt resultat viser, at teststoffet under testbetingelserne ikke fremkalder ændringer i kromosomstrukturen i dyrkede somatiske celler fra pattedyr.
3. RAPPORTERING
3. TESTRAPPORT
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:
Opløsningsmiddel/bærestof:
begrundelse for valg af bærestof
teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof, hvis den kendes
Celler:
celletype og -kilde
den valgte celletypes karyotypiske karakteristika og egnethed
eventuelt fravær af mycoplasma
oplysninger om cellecyklussens længde
bloddonorers køn. fuldblod eller fraseparerede lymfocytter samt benyttet mitogen
eventuelt antal passager
eventuelle metoder til vedligehold af cellekulturer
normalt kromsomtal
Testbetingelser:
det metafasestandsende stofs betegnelse og koncentration og længden af cellernes udsættelse for stoffet
begrundelse for valg af koncentrationer og antal kulturer, herunder f.eks. eventuelle cytotoksicitetsdata og opløselighedsbegrænsninger
substratsammensætning og eventuel CO2-koncentration
teststoffets koncentration
volumen af tilsat bærestof og teststof
inkuberingstemperatur
inkuberingstid
behandlingens varighed
celletæthed ved udsåning, hvis det er relevant
metabolismeaktiveringssystemets type og sammensætning, herunder acceptkriterier
positive og negative kontrolprøver
metoder til præparering af objektglas
kriterier for bedømmelse af aberrationer
antal analyserede metafaser
metoder til måling af toksicitet
kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ eller tvetydig
Resultater:
tegn på toksicitet, f.eks. konfluens, cellecyklusdata, celletælling og mitoseindeks
tegn på udfældning
data om pH og osmolalitet i behandlingsmediet, hvis disse værdier er målt
definitioner af aberrationer, herunder gaps
antal celler med kromosomaberrationer og typen af disse, anført særskilt for hver behandlet kultur og kontrolkultur
eventuel iagttaget ændring i ploidigrad
dosis/respons-sammenhæng, når det er muligt
eventuelle statistiske analyser
data for sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) og positive kontrolprøver
data for tidligere negative (opløsningsmiddel/bærestof) og positive kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit og standardafvigelser
Diskussion af resultaterne
Konklusioner
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
HENVISNINGER Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender. A, (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29. Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5. Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford. pp. 427-432. Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S, Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, M.A., Andersen, G. and Zeiger, E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutaden 10 (suppl. 10), pp. 1-175. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPLMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268. pp. 297-305. Arnes, B.N., McCann, J,. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron, D.M. and Arnes, B.N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215. Natarajan. A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, J. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, pp. 277-290. Elliot, B.M., Combes. R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D,G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclar 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Berid, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activalion in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M. Jr., Iven, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241-261. Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from in Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mulagenicity Test Data, Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154. Soper, K.A. and Galloway, S.M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139-149. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.I., Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mulation Res., 119, pp. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.
B.11. MUTAGENICITET — IN VIVO-TEST FOR KROMOSOMABERRATIONER I KNOGLEMARV HOS PATTEDYR
B.11.
1. METODE Denne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 475 Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test (1997).
1.
1.1. INDLEDNING In vitro-testen for kromosomaberrationer hos pattedyr benyttes til at påvise, om et teststof forårsager strukturelle kromosomafvigelser i knoglemarvceller hos dyr, normalt gnavere (1) (2) (3) (4). Der er to typer strukturændringer, kromosomtypen og kromatidtypen. Ploiditetsforøgelse kan være tegn på, at et kemisk stof er i stand til at fremkalde antalsafvigelser. De fleste kemiske mutagener forårsager ændringer af kromosomtypen, men også ændringer af kromatidtypen forekommer. Kromosommutationer og lignende er årsag til mange genetiske sygdomme hos mennesker, og meget tyder på, at kromosommutationer og lignende, som ændrer på onkogener og tumorsuppressorgener i somatiske celler, medvirker ved induktion af kræft hos mennesker og i forsøgssystemet. Der benyttes rutinemæssigt gnavere i denne test. Knoglemarv er målvævet i denne test, da det er et væv med høj vaskularisation og består af celler med kort cyklustid, som er lette at isolere og behandle. Metoden omfatter ikke andre arter og væv. Denne test for kromosomaberrationer er særlig relevant for en vurdering af risikoen for mutationsfremkaldelse, da den giver mulighed for at tage sådanne faktorer som in vivo-metabolisme, farmakokinetik og DNA-reparationsprocesser i betragtning, selv om de kan variere fra art til art og fra væv til væv. En in vivo-test er ligeledes nyttig til yderligere undersøgelse af mutagene virkninger, der er påvist ved en in vitro-test. Hvis der er grund til at tro, at teststoffet eller en reaktiv metabolit ikke vil nå frem til målvævet, er denne test ikke egnet. Se også den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Aberration af kromatidtypen: beskadigelse af kromosomstrukturen i form af brud på enkeltkromatider eller brud på og sammenføjning af kromatider. Aberration af kromsomtypen: beskadigelse af kromosomstrukturen i form af brud på — eller brud på og sammenføjning af — begge kromatider på samme sted. Endofordobling: en proces, hvorved cellekernen efter en S-fase i DNA-replikationen ikke fortsætter over i mitosen, men påbegynder endnu en S-fase. Resultatet er kromosomer med 4, 8, 16, ... kromatider. Gap: en akromatisk beskadigelse, som er mindre end ét kromatid bred, og hvor misalignment af kromatiderne er minimal. Antalsafvigelse: ændring af kromosomtallet i forhold til det for de pågældende celler normale antal. Polyploidi: et multiplum af det haploide kromosomtal (n), som ikke er det diploide tal (dvs. 3n, 4n osv.). Strukturel ændring: ændring i kromosomstrukturen, som kan iagttages ved mikroskopi i celledelingens metafase i form af deletioner og fragmenter, intrachange og interchange.
1.3. TESTMETODENS PRINCIP Dyrene udsættes for teststoffet på passende måde og aflives efter passende tidsrum efter eksponeringen. Inden aflivningen behandles dyrene med et metafasestandsende stof (f.eks. colchicin eller Colcemid®). Der fremstilles derefter præparater af knoglemarvceller, som farves, og metafasecellerne undersøges for kromosomaberrationer.
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.4.
1.4.1. Præparater
1.4.1.
1.4.1.1. Valg af dyreart Der benyttes sædvanligvis rotter, mus og kinesiske hamstere, selv om andre egnede pattedyrarter kan benyttes. Der bør anvendes almindeligt brugte laboratoriestammer af unge sunde voksne dyr. Ved undersøgelsens begyndelse bør vægtvariationen mellem dyrene være mindst mulig og ikke over ±20 % af gennemsnitsvægten for hvert køn.
1.4.1.2. Miljø og fordring Der gælder de almindelige forhold som beskrevet i den generelle indledning til del B, blot bør der tilstræbes en fugtighed på 50-60 %.
1.4.1.3. Forberedelse af dyrene Der udvælges tilfældigt sunde unge voksne dyr til kontrol- og behandlingsgruppen. Burene bør anbringes på en sådan måde, at deres placering får mindst mulig indvirkning. Dyrene identificeres entydigt. Dyrene tilvænnes til laboratorieforholdene i mindst fem dage.
1.4.1.4. Fremstilling uf doser Teststoffer i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløsningsmidler eller bærestoffer og fortyndes passende, inden de gives til dyrene. Teststoffer i væskeform kan enten gives direkte til dyrene eller fortyndes først. Der benyttes frisk fremstillede teststofpræparater, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.
1.4.2. Testbetingelser
1.4.2.
1.4.2.1. Opløsningsmiddel/bærestof Opløsningsmiddel/bærestof må ikke have toksiske virkninger ved de benyttede doser og må ikke mistænkes for at reagere kemisk med teststoffet. Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, skal brugen af dem underbygges med kompatibilitetsdata. Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem.
1.4.2.2. Kontrolgrupper I alle forsøg medtages der sideløbende både positive og negative (opløsningsmiddel eller bærestof) kontrolgrupper af begge køn. Bortset fra behandling med teststof skal dyrene i kontrolgrupperne behandles på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne. Positive kontrolprøver skal frembringe strukturelle ændringer in vivo ved en dosis, der forventes at give en påviselig forøgelse i forhold til baggrundsværdierne. Der vælges sådanne doser i de positive kontrolprøver, at virkningerne er tydelige, uden dog at de kodede objektglas' identitet umiddelbart afsløres for den, der aflæser dem. Det kan accepteres, at den positive kontrol indgives på anden måde end teststoffet, og at der kun foretages én prøveudtagning. Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede stoffer. Nedenfor er opregnet eksempler på positive kontrolstoffer: Stof CAS nr. Einecs nr. Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 Ethylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 Cyclophosphamid Cyclophosphamidmonohydrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Triethylenmelamin 51-18-3 200-083-5 Der skal ved hver prøveudtagning indgå negative kontrolgrupper, som kun er behandlet med opløsningsmiddel eller bærestof, og ellers behandlet på samme måde som behandlingsgrupperne, medmindre tidligere kontroldata har vist en acceptabel variation mellem dyr og hyppighed af celler med kromosomafvigelser. Hvis der kun udtages én negativ kontrolprøve, er det mest hensigtsmæssigt at gøre det ved første prøveudtagning. Desuden skal der være ubehandlede kontrolgrupper, medmindre der foreligger tidligere opnåede eller offentliggjorte kontroldata, der viser, at det valgte opløsningsmiddel/bærestof ingen skadelige eller mutagene virkninger har.
1.5. FREMGANGSMÅDE
1.5.
1.5.1. Dyrenes antal og køn Hver behandlet gruppe og kontrolgruppe skal bestå af mindst fem analyserbare dyr af hvert køn. Hvis der på det tidspunkt, hvor undersøgelsen foretages, foreligger data fra undersøgelser med samme dyreart og med samme indgiftsmåde, som viser, at der ikke er nogen væsentlig toksicitetsforskel mellem de to køn, er test med kun ét køn tilstrækkeligt. Hvis udsættelsen af mennesker for det kemiske stof er kønsspecifik, som det f.eks. er tilfældet med visse farmaceutiske stoffer, skal testen udføres med dyr af det pågældende køn.
1.5.2. Behandlingsplan Teststofferne indgives fortrinsvis i en enkelt dosis. De kan også indgives i to deldoser, dvs. to behandlinger samme dag med kun nogle få timers interval, hvorved det bliver lettere at indgive et større materialevolumen. Indgift på anden måde skal begrundes sagligt. Der udtages prøver på to tidspunkter efter endagsbehandling. For gnavere udtages første prøve normalt 1,5 normal cellecykluslængde (som normalt er 12-18 timer) efter behandlingen. Da det optimale tidspunkt for påvisning af kromosomaberrationer kan afhænge af, hvor lang tid der er påkrævet for optagelse og metabolisme af teststoffet, og af teststoffets indvirkning på cellecyklussens kinetik, anbefales det at udtage endnu en prøve 24 timer efter den første. Indgives stoffet over mere end én dag, udtages der blot én prøve, når der er gået 1,5 normal cellecykluslængde efter den sidste behandling. Inden aflivningen gives dyrene en intraperitoneal injektion med en passende dosis metafasestandsende stof (f.eks. Colcemid® eller colchicin). Der udtages prøve af forsøgsdyrene efter et passende tidsrum. For mus er dette tidsrum ca. tre-fem timer, for kinesisk hamster ca. fire-fem timer. Cellerne høstes fra knoglemarven og analyseres for kromosomaberrationer.
1.5.3. Dosisniveauer Hvis der gennemføres en forprøve til bestemmelse af dosisinterval, fordi der ikke foreligger nogen egnede data, bør den udføres i samme laboratorium med samme art, stamme, køn og behandlingsmåde, som agtes benyttet i hovedundersøgelsen (5). Er der tale om toksicitet, benyttes der tre dosisniveauer for første prøveudtagningstidspunkt. Disse dosisniveauer skal dække et interval fra maksimal toksicitet til næsten ingen eller ingen toksicitet. Ved den efterfølgende prøveudtagning behøves kun den højeste dosis benyttet, Den højeste dosis defineres som den dosis, der fremkalder sådanne tegn på toksicitet, at højere dosis med samme indgiftsmønster må forventes at medføre død. Stoffer med specifik biologisk aktivitet ved lav ikke-toksisk dosis (f.eks. hormoner og mitogener) kan danne undtagelser fra disse dosisfastsættelseskriterier og bør evalueres individuelt. Højeste dosis kan også defineres som en dosis, der i nogen grad udviser tegn på toksicitet i knoglemarven (f.eks. mitoseindeks nedsat med mere end 50 %).
1.5.4. Grænsetest Hvis der ved en test med én dosis på mindst 2000 mg/kg legemsvægt indgivet på én gang eller i to omgange samme dag ikke kan iagttages nogen toksiske virkninger, og hvis man på grundlag af data om strukturmæssigt beslægtede stoffer ikke forventer gentoksicitet, kan en fuldstændig undersøgelse med tre dosisniveauer anses for unødvendig. For længerevarende undersøgelser er grænsedosis på 2000 mg/kg legemsvægt pr. dag for behandlinger over højst 14 dage og på 1000 mg/kg legemsvægt pr. dag for behandlinger over mere end 14 dage. Den forventede eksponering af mennesker kan foranledige, at der benyttes en højere dosis i grænsetesten.
1.5.5. Indgift af doser Teststoffet indgives normalt ved tvangsfodring med sonde eller en passende intubationskanyle eller ved intraperitoneal injektion. Andre indgiftsmåder kan accepteres, hvis de kan begrundes. Hvor stor en væskemængde der kan indgives ad gangen ved tvangsfodring eller injektion, afhænger af forsøgsdyrenes størrelse. Mængden bør højst være på 2 ml pr. 100 g legemsvægt. Anvendelse af større rumfang skal begrundes. Bortset fra lokal-irriterende og ætsende stoffer, som normalt vil have kraftigere virkninger ved højere koncentrationer, bør testvolumenet variere så lidt som muligt, idet koncentrationen justeres, så volumenet bliver det samme ved alle dosisniveauer.
1.5.6. Præparering af kromosomer Umiddelbart efter aflivningen udtages knoglemarven, som udsættes for hypotonisk væske og fikseres. Derefter stryges cellerne ud på objektglas og farves.
1.5.7. Analyse Mitoseindekset bestemmes som udtryk for cytotoksiciteten i mindst 1000 celler pr. dyr for alle behandlede dyr (inkl. positive kontroldyr) og ubehandlede (negative) kontroldyr. For hvert dyr bør mindst 100 celler analyseres. Dette antal kan sættes ned, hvis der iagttages et stort antal aberrationer. Alle objektglas, herunder positive og negative kontrolprøver, kodes uafhængigt inden mikroskoperingen. Da præpareringen af objektglas ofte medfører, at en del af metafasecellerne går i stykker og kromosomerne går tabt, bør bedømte celler indeholde et antal centromerer svarende til kromosomtallet 2n ± 2.
2. DATA
2.
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER Data for de enkelte dyr præsenteres i tabelform. Forsøgsenheden er et dyr. For hvert dyr registreres antallet af bedømte celler, antallet af aberrationer pr. celle og den procentdel af cellerne, der har kromosomaberrationer. Forskellige typer strukturelle kromosomændringer skal anføres med antal og hyppighed for behandlingsgrupper og kontrolgrupper. Gaps registreres særskilt og oplyses, men medregnes ikke generelt i den totale aberrationshyppighed. Hvis der ikke er tegn på forskellig reaktion hos de to køn, kan dataene samles med henblik på statistisk analyse.
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER Der findes en række kriterier for at afgøre, om et resultat er positivt, f.eks. en dosisafhængig forøgelse af andelen af celler med kromosomaberrationer eller en tydelig forøgelse af antallet af celler med aberrationer hos en enkeltdosisgruppe på et bestemt prøveudtagningstidspunkt. Der bør i første række ses på resultaternes biologiske relevans. Statistiske metoder kan benyttes som hjælpemiddel ved evalueringen af testresultaterne (6). Statistisk signifikans bør ikke være den eneste faktor, der afgør, om resultatet bedømmes som positivt. Tvetydige resultater bør afklares ved yderligere test, helst med ændring af forsøgsbetingelserne. En forøgelse af ploiditetsgraden kan være tegn på, at teststoffet er i stand til at fremkalde kromosomantalsafvigelser. En forøget endofordobling kan være tegn på, at teststoffet kan inhibere cellecyklussens forløb (7) (8). Et teststof, der ikke opfylder ovennævnte kriterier, anses ikke for mutagent i dette system. De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i sjældne tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvetydigt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages. Et positivt resultat af en in vivo-test for kromosomaberrationer viser, at teststoffet fremkalder kromosomaberrationer i knoglemarven hos den undersøgte art. At negativt resultat viser, at teststoffet under testbetingelserne ikke fremkalder kromosomaberrationer i knoglemarven hos den undersøgte art. Sandsynligheden for, at teststoffet eller dets metabolitter når frem til det almindelige kredsløb eller specifikt til målvævet (f.eks. systemisk toksicitet), bør diskuteres.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. TESTRAPPORT Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:
Opløsningsmiddel/bærestof:
begrundelse for valg af bærestof
teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof, hvis den kendes
Forsøgsdyr:
anvendt art/stamme
antal dyr samt deres alder og køn
oprindelse, miljø, føde mv.
de enkelte dyrs vægt ved testens begyndelse, samt interval, gennemsnit og standardafvigelse for legemsvægten for hver enkelt gruppe
Testbetingelser:
positive og negative (bærestof/opløsningsmiddel) kontrolgrupper
data fra en eventuel forprøve til bestemmelse af dosisinterval
begrundelse for valg af dosisniveau
detaljerede oplysninger om præparering af teststoffet
detaljerede oplysninger om indgift af teststoffet
begrundelse for indgiftsvej
eventuelle metoder til kontrol af, at teststoffet er nået frem til det almindelige kredsløb eller målvævet
eventuel omregning fra teststofkoncentration (ppm) i føde/drikkevand til faktisk dosis (mg pr. kg legemsvægt pr. dag)
detaljerede oplysninger om føde- og vandkvalitet
detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan
metoder til måling af toksicitet
det metafasestandsende stofs betegnelse og koncentration og behandlingens varighed
metoder til præparering af objektglas
kriterier for bedømmelse af aberrationer
antal analyserede celler pr. dyr
kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ eller tvetydig
Resultater:
tegn på toksicitet
mitoseindex
antal aberrationer og type. anført særskilt for hvert dyr
samlet antal aberrationer pr. gruppe med gennemsnit og standardafvigelse
antal celler med aberrationer pr. gruppe med gennemsnit og standardafvigelse
eventuel iagttaget ændring i ploiditetsgrad
dosis/respons-sammenhæng, når det er muligt
eventuelle statistiske analyser
data for sideløbende negative kontrolprøver
data for tidligere negative kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit og standardafvigelser
data for sideløbende positive kontrolprøver
Diskussion af resultaterne
Konklusioner
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
HENVISNINGER Adler, L.D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry (eds.). IRL Press, Oxford. Washington D.C., pp. 27 5-306. Preston. R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H. McFee, A.F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157-165. Richold, M., Chandly, A., Ashby, J., Gatehouse D.G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D.J. Kirkland, (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New Cork, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Tice, R.R. Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Paccierotti, F., Preston, R.J., Romagna F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312. Fielder, R.J., Alleen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in in Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319. Lovell, D.P., Andersen, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res. 119, pp. 403-413. Huang. Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1363-1 364.
B.12. MUTAGENICITET — IN VIVO-TEST FOR MIKROKERNER I ERYTHROCYTTER HOS PATTEDYR
B.12.
1. METODE Denne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 474 Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test (1997).
1.
1.1. INDLEDNING In vivo-testen for mikrokerner hos pattedyr benyttes til påvisning af skader, som teststoffet har forvoldt på kromosomer eller mitoseapparatet i erythroblaster, ved analyse af erythrocytter i prøver fra knoglemarv og/eller det perifere blod hos dyr, sædvanligvis gnavere. Formålet med mikrokernetesten er at påvise stoffer, der forvolder cytogenetiske skader, som medfører dannelse af mikrokerner indeholdende tiloversblevne kromosomfragmenter eller hele kromosomer. Når en erythroblast i knoglemarven udvikler sig til en polykromatisk erythrocyt, udstødes cellekernen, og en eventuel dannet mikrokerne kan blive tilbage i det ellers kernefri cytoplasma. I disse celler er mikrokerner let synlige, da de ellers ikke har nogen kerne. Forøget forekomst af polykromatiske erythrocytter med mikrokerne hos behandlede dyr er tegn på inducerede kromosomskader. I denne test benyttes der rutinemæssigt knoglemarv hos gnavere, da der i dette væv produceres polykromatiske erythrocytter. Måling af umodne (polykromatiske) erythrocytter med mikrokeme i det perifere blod kan også accepteres i andre arter, hvor det er vist, at milten ikke kan fjerne erythrocytter med mikrokerner, eller at deres følsomhed over for stoffer, der forårsager strukturelle eller antalsmæssige kromosomaberrationer, er tilstrækkelig. Mikrokerner kan genkendes på en række kriterier, bl.a. om der er en DNA-centromer til stede. Det vigtigste endpoint er hyppigheden af umodne (polykromatiske) erythrocyter med mikrokerne. Det antal modne (normokromatiske) erythrocytter i det perifere blod, som indeholder mikrokerner, ud af et givet antal modne erythrocytter kan også benyttes som endpoint for testen, når dyrene behandles kontinuerligt i mindst fire uger. Denne in vivo-test for mikrokerner hos pattedyr er særlig relevant for vurdering af den reelle mutagenitetsfare, idet den tager højde for sådanne faktorer som in vivo-metabolisme, farmakokinetik og DNA-reparationsprocesser, selv om disse kan variere fra art til art, væv til væv og genetisk endpoint til genetisk endpoint. En in vivo-test er ligeledes nyttig til yderligere undersøgelse af mutagene virkninger, der er påvist ved en in vitro-test. Hvis der er grund til at tro, at teststoffet eller en reaktiv metabolit ikke vil nå frem til målvævet, er denne test ikke egnet. Se også den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Centromer: region(er) af et kromosom, hvortil tentrådene er påhæftet under celledeling, således at datterkromosomerne kan ordnes i forhold til dattercellernes poler. Mikrokerner: små ekstrakerner, der er adskilt fra cellens hovedkerne, og som dannes under mitosens telofase (meiose) ud fra efterladte kromosomfragmenter eller hele kromosomer. Normochromatisk erythrocyt: moden erythrocyt. der mangler ribosomer og kan skelnes fra umodne polykromatiske erythrocytter ved ribosomselektiv farvning. Polychromatisk erythocyt: umoden erythrocyt på et udviklingsmellemstadium, som stadig indeholder ribosomer og derfor kan skelnes fra modne normokromatiske erythrocytter ved ribosomselektiv farvning.
1.3. TESTMETODENS PRINCIP Dyrene udsættes for teststoffet på passende måde. Hvis der benyttes knoglemarv, aflives dyrene på et passende tidspunkt efter behandlingen, hvorefter knoglemarven udtages, og der fremstilles præparater og farves (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Hvis der benyttes perifert blod, tages der blodprøver på et passende tidspunkt efter behandlingen, hvorefter der fremstilles udstrygningspræparater og farves (4) (8) (9) (10). I undersøgelser med perifert blod bør der gå så kort tid som muligt mellem sidste eksponering og cellehøst. Præparaterne analyseres for tilstedeværelse af mikrokerner.
1.4. BESKRIVELSE AE TESTMETODEN
1.4.
1.4.1. Præparater
1.4.1.
1.4.1.1. Valg af dyreart Der anbefales mus eller rotter, hvis der bruges knoglemarv, selv om andre egnede pattedyrarter kan benyttes. Bruges der perifert blod, anbefales mus. Dog kan enhver egnet pattedyrart benyttes, hvis dens milt ikke kan fjerne erythrocytter med mikrokerne, eller hvis den er vist at være tilstrækkelig følsom til at påvise stoffer, der forårsager strukturelle eller antalsmæssige kromosomaberrationer. Der bør anvendes almindeligt brugte laboratoriestammer af unge sunde dyr. Ved undersøgelsens begyndelse bør vægtvariationen mellem dyrene være mindst mulig og ikke over ± 20 % af gennemsnitsvægten for hvert køn.
1.4.1.2. Miljø og fodring Der gælder de almindelige forhold som beskrevet i den generelle indledning til del B, blot bør der tilstræbes en fugtighed på 50-60 %.
1.4.1.3. Forberedelse af dyrene Der udvælges tilfældigt unge sunde voksne dyr til kontrol- og behandlingsgruppen. Dyrene identificeres entydigt. Dyrene tilvænnes til laboratorieforholdene i mindst fem dage. Burene bør anbringes på en sådan måde, at deres placering får mindst mulig indvirkning.
1.4.1.4. Fremstilling af doser Teststoffer i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløsningsmidler eller bærestoffer og fortyndes passende, inden de gives til dyrene. Teststoffer i væskeform kan enten gives direkte til dyrene eller fortyndes først. Der benyttes frisk fremstillede teststofpræparater, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.
1.4.2. Testbetingelser
1.4.2.
1.4.2.1. Opløsningsmiddel/bærestof Opløsningsmiddel/bærestof må ikke have toksiske virkninger ved de benyttede doser og må ikke mistænkes for at reagere kemisk med teststoffet. Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, skal brugen af dem underbygges med kompatibilitetsdata. Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem.
1.4.2.2. Kontrolgrupper I alle forsøg medtages der sideløbende både positive og negative (opløsningsmiddel eller bærestof) kontrolgrupper af begge køn. Bortset fra behandling med teststof skal dyrene i kontrolgrupperne behandles på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne. Positive kontrolprøver skal frembringe mikrokerner in vivo ved en dosis, der forventes at give en påviselig forøgelse i forhold til baggrundsværdierne. Der vælges sådanne doser i de positive kontrolprøver, at virkningerne er tydelige, uden dog at de kodede objektglas' identitet umiddelbart afsløres for den, der aflæser dem. Det kan accepteres, at den positive kontrol indgives på anden måde end teststoffet, og at der kun foretages én prøveudtagning. Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede stoffer. Nedenfor er opregnet eksempler på positive kontrolstoffer: Stof CAS nr. Einecs nr. Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 N-ethyl-N-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 Cyclophosphamid Cyclophosphamidmonohydrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Triethylenmelamin 51-18-3 200-083-5 Der skal ved hver prøveudtagning indgå negative kontroldyr, som kun er behandlet med opløsningsmiddel eller bærestof og ellers behandlet på samme måde som behandlingsgrupperne, medmindre tidligere kontroldata har vist en acceptabel variation mellem dyr indbyrdes og acceptabel hyppighed af celler med mikrokerner. Hvis der kun udtages én negativ kontrolprøve, er det mest hensigtsmæssigt at gøre det ved første prøveudtagning. Desuden skal der være ubehandlede kontrolgrupper, medmindre der foreligger tidligere opnåede eller offentliggjorte kontroldata, der viser, at det valgte opløsningsmiddel ingen skadelige eller mutagene virkninger har. Hvis der benyttes perifert blod, kan en forbehandlingsprøve også accepteres som sideløbende negativ kontrolprøve, men kun i de korte undersøgelser (f.eks. 1-3 behandlinger), når de opnåede resultater ligger inden for det forventede interval for den forudgående kontrolprøve.
1.5. FREMGANGSMÅDE
1.5.
1.5.1. Dyrenes antal og køn Hver behandlet gruppe og kontrolgruppe skal bestå af mindst fem analyserbare dyr af hvert køn (11). Hvis der på det tidspunkt, hvor undersøgelsen foretages, foreligger data fra undersøgelser med samme dyreart og med samme indgiftsmåde, som viser, at der ikke er nogen væsentlig toksicitetsforskel mellem de to køn, er test med kun ét køn tilstrækkelig. Hvis udsættelsen af mennesker for det kemiske stof er kønsspecifik, som det f.eks. er tilfældet med visse farmaceutiske stoffer, skal testen udføres med dyr af det pågældende køn.
1.5.2. Behandlingsplan Der kan ikke anbefales nogen standardbehandlingsplan (dvs. 1, 2 eller flere behandlinger med 24 timers mellemrum). Prøver fra længdervarende indgiftsplaner er acceptable, når blot der i undersøgelsen er påvist en positiv virkning eller — for en negativ undersøgelse — der er påvist toksicitet, eller grænsedosis har været anvendt, og når indgiften er fortsat indtil prøveudtagningen. Prøvestoffet kan også indgives i to deldoser, dvs. to behandlinger samme dag med kun nogle få timers interval, hvorved det bliver lettere at indgive et større materialevolumen. Testen kan udføres på følgende to måder: Derudover kan der udtages prøver på andre tidspunkter, hvis det er relevant.
1.5.2. a)
Dyrene behandles med teststoffet én gang, Der udtages prøver af knoglemarv mindst to gange, første gang tidligst 24 timer efter behandlingen, med passende intervaller mellem prøverne, sidste prøve dog senest 48 timer efter behandlingen. Prøveudtagning tidligere end 24 timer efter behandlingen skal begrundes. Der udtages prøver af perifert blod mindst to gange, tidligst 36 timer efter behandlingen og med passende intervaller efter den første prøve, sidste prøve dog senest efter 72 timer. Når der i en prøve er konstateret positiv reaktion, er yderligere prøveudtagning ikke nødvendig.
b)
Benyttes der to eller flere daglige behandlinger (f.eks. to eller flere behandlinger med 24 timers mellemrum) udtages der for knoglemarvs vedkommende prøver én gang mellem 18 og 24 timer efter den sidste behandling, og for perifert blods vedkommende én gang mellem 36 og 48 timer efter den sidste behandling (12).
1.5.3. Dosisniveauer Hvis der gennemføres en forprøve til bestemmelse af dosisinterval, fordi der ikke foreligger nogen egnede data, bør den udføres i samme laboratorium med samme art, stamme, køn og behandlingsmåde som agtes benyttet i hovedundersøgelsen (13). Er der tale om toksicitet, benyttes der tre dosisniveauer for første prøveudtagningstidspunkt. Disse dosisniveauer skal dække et interval fra maksimal toksicitet til næsten ingen eller ingen toksicitet. Ved den efterfølgende prøveudtagning behøves kun den højeste dosis benyttet. Den højeste dosis defineres som den dosis, der fremkalder sådanne tegn på toksicitet, at højere dosis med samme indgiftsmønster må forventes at medføre død. Stoffer med specifik biologisk aktivitet ved lav ikke-toksisk dosis (f.eks. hormoner og mitogener) kan danne undtagelser fra disse dosisfastsættelseskriterier og bør evalueres individuelt. Højeste dosis kan også defineres som en dosis, der i nogen grad udviser tegn på toksicitet i knoglemarven (f.eks. en nedsættelse af andelen af umodne erythrocytter i forhold til totale erythrocytter i knoglemarv eller perifert blod).
1.5.4. Grænsetest Hvis der ved en test med én dosis på mindst 2000 mg p. kg legemsvægt indgivet på én gang eller i to omgange samme dag ikke kan iagttages nogen toksiske virkninger, og hvis man på grundlag af data om strukturnæssigt beslægtede stoffer ikke forventer gentoksicitet, kan en fuldstændig undersøgelse med tre dosisniveauer anses for unødvendig, for længerevarende undersøgelser er grænsedosis på 2000 mg pr. kg legemsvægt pr. dag for behandlinger over højst 14 dage og på 1000 mg pr. kg legemsvægt pr. dag for behandlinger over mere end 14 dage. Den forventede eksponering af mennesker kan foranledige, at der benyttes en højere dosis i grænsetesten.
1.5.5. Indgift af doser Teststoffet indgives normalt ved tvangsfodring med sonde eller en passende intubationskanyle eller ved intraperitoneal injektion. Andre indgiftsmåder kan accepteres, hvis de kan begrundes. Hvor stor en væskemængde, der kan indgives ad gangen ved tvangsfodring eller injektion, afhænger af forsøgsdyrenes størrelse. Mængden bør højst være på 2 ml pr. 100 g legemsvægt. Anvendelse af større rumfang skal begrundes. Bortset fra lokalirriterende og ætsende stoffer, som normalt vil have kraftigere virkninger ved højere koncentrationer, bør testvolumenet variere så lidt som muligt, idet koncentrationen justeres, så volumenet bliver det samme ved alle dosisniveauer.
1.5.6. Præparering af knoglemarv/blod Knoglemarvceller udtages normalt fra lårben eller skinneben umiddelbart efter aflivningen. Sædvanligvis udtages cellerne fra lårben eller skinneben, hvorefter de præpareres og farves med velkendte metoder. Perifert blod udtages fra halevenen eller et andet egnet blodkar. Blodlegemerne farves straks supravitalt (8) (9) (10), eller der fremstilles udstrygningspræparater, der derefter farves. Ved at bruge en DNA-specifik farvning (f.eks. acridinorange (14) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)) kan man undgå nogle af de artifakter, der optræder ved ikke-DNA-specifik farvning. Denne fordel udelukker ikke, at der benyttes konventionelle farvestoffer (f.eks. Giemsa). Supplerende systemer (f.eks. cellulosekolonner til fjernelse af kerneindeholdende celler (16)) kan også benyttes, forudsat at de er påvist at fungere tilfredsstillende ved præparering af mikrokerner i laboratoriet.
1.5.7. Analyse For hvert dyr bestemmes andelen af umodne erythrocytter i forhold til det samlede antal (umodne og modne) erythrocytter, idet der tælles mindst 200 erythrocytter i alt for knoglemarv og 1000 erythrocytter for perifert blod (17). Alle objektglas, herunder positive og negative kontrolprøver, kodes uafhængigt inden mikroskoperingen. For hvert dyr bedømmes mindst 2000 umodne erythrocytter for forekomst af umodne etythrocytter med risikokerner. Der kan opnås yderligere information ved bedømmelse af modne erythrocytter for indhold af mikrokerner. Ved analyse af objektglas må andelen af umodne erythrocytter i forhold til totale erythrocytter ikke være mindre end 20 % af kontrolværdien. Når dyrene behandles kontinuerligt i fire uger eller derover, kan også mindst 2000 modne erythrocytter pr. dyr bedømmes for forekomst af mikrokerner. Systemer til automatisk analyse (billedanalyse og flow-cytometri af celleopslæmninger) er acceptable som alternativer til manuel evaluering, hvis de er behørigt begrundet og valideret.
2. DATA
2.
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER Data for de enkelte dyr præsenteres i tabelform. Forsøgsenheden er et dyr. For hvert dyr registreres antallet af bedømte umodne erythrocytter, antallet af umodne erythrocytter med mikrokerne og antallet af umodne erythrocytter i forhold til det samlede antal erythrocytter. Hvis dyrene behandles kontinuerligt i mere end fire uger, anføres også dataene for modne erythrocytter, hvis de foreligger. Andelen af umodne erythrocytter i forhold til totale erythrocytter oplyses for hvert dyr, og, hvis det skønnes hensigtsmæssigt, procentdelen af erythrocytter med mikrokerne. Hvis der ikke er tegn på forskellig reaktion hos de to køn, kan dataene samles med henblik på statistisk analyse.
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER Der findes en række kriterier for at afgøre, om et resultat er positivt, f.eks. en dosisafhængig forøgelse af antallet af celler med mikrokerner eller en tydelig forøgelse af antallet af celler med mikrokerner hos en enkeltdosisgruppe på et bestemt prøveudtagningstidspunkt. Der bør i første række ses på resultaternes biologiske relevans. Statistiske metoder kan benyttes som hjælpemiddel ved evalueringen af testresultaterne (18) (19). Statistisk signifikans bør ikke være den eneste faktor, der afgør, om resultatet bedømmes som positivt. Tvetydige resultater bør afklares ved yderligere test, helst med ændring af forsøgsbetingelserne. Et teststof, der ikke opfylder ovennævnte kriterier, anses ikke for mutagent i dette system. De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i sjældne tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvetydigt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages. Et positivt resultat af mikrokernetesten viser, at teststoffet fremkalder mikrokerner, som følge af beskadigelse af kromosomer eller mitoseapparat hos erythroblaster i den undersøgte art. Et negativt resultat viser, at teststoffet under testbetingelserne ikke fremkalder mikrokerner hos umodne erythrocytter i den undersøgte art. Sandsynligheden for, at teststoffet eller dets metabolitter når frem til det almindelige kredsløb eller specifikt til målvævet (f.eks. systemisk toksicitet), bør diskuteres.
3. RAPPORTERING
3. TESTRAPPORT
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:
Opløsningsmiddel/bærestof:
begrundelse for valg af bærestof
teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof, hvis den kendes
Forsøgsdyr:
anvendt art/stamme
antal dyr samt deres alder og køn
oprindelse, miljø, føde mv.
de enkelte dyrs vægt ved testens begyndelse, samt interval, gennemsnit og standardafvigelse for legemsvægten for hver enkelt gruppe
Testbetingelser:
positive og negative (bærestof/opløsningsmiddel) kontrolgrupper
data fra en eventuel forprøve til bestemmelse af dosisinterval
begrundelse for valg af dosisniveau
detaljerede oplysninger om præparering af teststoffet
detaljerede oplysninger om indgift af teststoffet
begrundelse for indgiftsvej
eventuelle metoder til kontrol af at teststoffet er nået frem til det almindelige kredsløb eller målvævet
eventuel omregning fra teststofkoncentration (ppm) i føde/drikkevand til faktisk dosis (mg pr. kg. legemsvægt pr. dag)
detaljerede oplysninger om fode- og vandkvalitet
detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan
metoder til præparering af objektglas
metoder til måling af toksicitet
kriterier for bedømmelse af umodne erythrocytter med mikrokerner
antal analyserede celler pr. dyr
kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ eller tvetydig
Resultater:
tegn på toksicitet
andel af umodne erythrocytter i forhold til total erythrocytter
antal umodne erythrocytter med mikrokerner, anført særskilt for hvert dyr
gennemsnit ± standardafvigelse for umodne erythrocytter med mikrokerner for hver gruppe
dosis/respons-sammenhæng, når det er muligt
anvendte statistiske analyser og metoder
data for sideløbende og tidligere negative kontrolprøver
data for sideløbende positive kontrolprøver
— Diskussion af resultaterne
— Konklusioner
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
HENVISNINGER Heddle, J.A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mulation Res., 31, pp. 9-15. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M, Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61-118. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C, Salamone, M.F. and Heddie, J.A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80. MacGregor, J.T. Schlegel, R. Choy. W.N., and Wehr, C.M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, cd. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp., 555-558. MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite. M., Margolin, G.H., Ramel, C, Salamone, M.F., Tice, R.R. and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R. and Shelby, M.E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res. 245, pp. 245-249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 15 3-159. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), In Vivo, Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312. pp. 293-304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313-319. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R.. Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis. 7, pp. 313-319. Hayashi, M., Sofuni, T, and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Eriythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res. 120, pp. 269-275. Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104. Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res. 347, pp. 97-99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, in: D.J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committe on Guidelines for Mutagenicity Testing Report, Part 1, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
B.13/14. MUTAGENICITET — TILBAGEMUTATIONSTEST MED BAKTERIER
B.13/14.
1. METODE Denne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 471 Bacterial Reverse Mutation Test (1997).
1.
1.1. INDLEDNING I tilbagemutationstesten med bakterier benyttes der aminosyrekrævede stammer af Salmonella typhimurium og Escherichia coli til at påvise punktmutationer med substitution, addition eller deletion af et eller nogle få dna-basepar (1) (2) (3). Princippet i denne tilbagemutationstest med bakterier er, at den påviser mutationer, som tilbagemuterer mutationer i teststammerne og dermed sætter bakterien i stand til at syntetisere en essentiel aminosyre. Revertantbakterierne påvises ved deres evne til at vokse uden den aminosyre, som den oprindelige teststamme kræver. Punktmutationer er årsagen til mange genetiske sygdomme hos mennesker, og der er meget, der tyder på, at punktmutationer i onkogener og tumorsuppressorgener i somatiske celler spiller en rolle for dannelse af tumorer hos mennesker og i forsøgsdyr. Tilbagemutationstesten med bakterier er hurtig, billig og forholdsvis let at udføre. Mange teststammer har forskellige egenskaber, der gør dem mere følsomme til påvisning af mutationer, bl.a. responsive dna-sekvenser på reversionsstedet, høj cellepermeabilitet for store molekyler og manglende dna-reparationssystemer eller forstærkede fejlbehæftede dna-reparationsprocesser. Teststammernes specificitet kan give nyttige oplysninger om, hvilke typer mutationer et gentoksisk stof inducerer. Der findes en meget stor database med resultater for en lang række strukturer med tilbagemutationstest med bakterier, og der er udviklet veletablerede metodologier for test af kemikalier med forskellige fysiske og kemiske egenskaber, herunder flygtige forbindelser. Se også den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER En tilbagemutationstest med enten Salmonella typhimurium eller Escherichia coli påviser mutation i en aminosyrekrævende stamme (histidin eller tryptophan) til en stamme, der er uafhængig af tilførsel af aminosyren udefra. Mutagener for baseparsubstitution er stoffer, der forårsager en baseændring i dna'et. I en tilbagemutationstest kan denne ændring ske samme sted som den oprindelige mutation eller et andet sted i bakteriens genom. Læserammemutagener er stoffer, der medfører insertion eller deletion af et eller flere basepar i dna'et, således at RNA'ets læseramme ændres.
1.5. INDLEDENDE OVERVEJELSER I tilbagemutationstesten med bakterier benyttes der prokaroytiske celler, som adskiller sig fra pattedyrceller med hensyn til f.eks. optagelse, metabolisme, kromosomstruktur og dna-reparationsprocesser. In vitro-test kræver normalt en exogen kilde til metabolismeaktivering. In vitro-metabolismeaktiveringssystemer kan ikke fuldstændig efterligne in vivo-forholdene i pattedyr. Testen vil derfor ikke give direkte oplysninger om et stofs mutagene og carcinogene potentiale i pattedyr. Tilbagemutationstesten med bakterier anvendes generelt til en indledende screening for gentoksiske virkninger og, især, punktmutationsinducerende aktivitet. Det er ved hjælp af en omfattende database påvist, at mange kemiske stoffer, som giver positivt resultat i denne test, også har mutagen virkning i andre test. Der findes mutagene stolfer, der ikke er påvist ved denne test; årsagen hertil kan tilskrives det påviste endpoints specifikke karakter, forskelle i metabolismeaktivering og forskelle i biotilgængelighed. På den anden side kan faktorer, der øger tilbagemutationstestens følsomhed, føre til et for højt skøn over stoffets mutagene aktivitet. Tilbagemutationstesten med bakterier kan være uegnet til evaluering af bestemte klasser af kemiske stoffer, f.eks. stærkt baktericide forbindelser (f.eks. visse antibiotika) og forbindelser, der antages (eller vides) at gribe specifikt ind i pattedyrcellers replikationssystem (f.eks. visse topoisomeraseinhibitorer og visse nucleosidanaloger). I sådanne tilfælde kan mutationstest i pattedyr være mere velegnede. Selv om mange af de stoffer, der er positive i denne test, er kræftfremkaldende hos pattedyr, er korrelationen ikke fuldstændig. Den afhænger af den kemiske klasse, og der findes carcinogener, der ikke påvises ved denne test, fordi de virker via andre ikke-gentoksiske mekanismer eller mekanismer, der ikke findes i bakterieceller.
1.4. TESTMETODENS PRINCIP Opslæmninger af bakterieceller udsættes for teststoffet med og uden et exogent metabolismeaktiveringssystem. Ved pladeinkorporeringsmetoden blandes disse opslæmninger med en topagar og hældes ud på et minimalsubstrat. Ved præinkubationsmetoden inkuberes behandlingsblandingen, hvorefter den blandes med topagar inden udhældning på minimalsubstrat. For begge metoders vedkommende tælles revertantkolonierne efter to-tre dages inkubation, og der sammenlignes med antallet af spontane revertantkolonier på kontrolpladerne med opløsningsmiddel. Der er beskrevet en række fremgangsmåder for udførelse af tilbagemutationstesten med bakterier, Blandt de mest almindeligt benyttede er pladeinkorporeringsmetoden (1) (2) (3) (4), præinkubationsmetoden (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluktuationsmetoden (9) (10) og suspensionsmetoden (11). Der er beskrevet modifikationer til test af gasser og dampe (12). De i denne metode beskrevne fremgangsmåder vedrører især pladeinkorporeringsmetoden og præinkubationsmetoden. De er begge acceptable til udførelse af forsøgene både med og uden metabolismeaktivering. Nogle stoffer, bl.a. kortkædede alifatiske nitrosaminer, divalente metaller, aldehyder, azofarvestoffer og diazoforbindelser, pyrollizidinalkaloider, allylforbindelser og nitroforbindelser (3), kan mest effektivt påvises ved præinkubationsmetoden. Det er også kendt, at visse klasser af mutagener ikke altid påvises ved standardmetoder som f.eks. pladeinkorporeringsmetoden og præinkubationsmetoden. Sådanne tilfælde bør betragtes som særtilfælde, og det anbefales kraftigt at anvende alternative metoder til påvisning i disse tilfælde. Følgende særtilfælde er konstateret (samt eksempler på fremgangsmåder, der kan benyttes til påvisning): azofarvestoffer og diazoforbindelser (3) (5) (6) (13), gasser og flygtige stoffer (12) (14) (15) (16) og glycosider (17) (18), Afvigelser fra standardmetoden skal begrundes sagligt.
1.5. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.5.
1.5.1. Præparater
1.5.1.
1.5.1.1. Bakterier Friske bakteriekulturer fremdyrkes til den sidste del af den eksponentielle fase eller til begyndelsen af den stationære fase (ca. 109 celler pr. ml). Kulturer sidst i den stationære fase bør ikke benyttes. Det er vigtigt, at de kulturer, der benyttes i forsøgene, har et højt indhold af levedygtige bakterier. Titeren kan godtgøres enten ved hjælp af tidligere kontroldata for vækstkurver eller ved bestemmelse af antallet af levedygtige celler i det enkelte forsøg ved udpladning. Som inkubationstemperatur anbefales 37 oC. Der skal benyttes mindst fem bakteriestammer, deriblandt fire stammer af S. typhimurium (TA1535; TA1537 eller TA97a eller TA97; TA98; og TA100), som er påvist at være pålidelige, og hvis respons er reproducerbar mellem laboratorier. Disse fire S. typhimurium-stammer har GC-basepar på de primære reversionssted, og det vides, at de ikke altid påviser visse oxiderende mutagener, tværbindende stoffer og hydraziner. Sådanne stoffer kan påvises med E. coli WP2-stammer eller S. typhimurium TA102 (19), som har AT-basepar på det primære reversionssted. Derfor kan følgende kombination af stammer anbefales: For at kunne påvise tværbindende mutagener kan det foretrækkes at vælge TA102 eller at tilføje en DNA-reparationsdygtig stamme af E. coli (f.eks. E. coli WP2 eller E. coli WP2 (pKM101)). Der benyttes anerkendte metoder til stamkulturfremstilling, markørverifikation og opbevaring. For hver enkelt frosset kulturpræparat påvises den aminosyrebetingede vækst (histidin for S. typhimurium-stammer og tryptophan for E. coli-stammer). Andre fænotypiske egenskaber skal kontrolleres på lignende måde, således tilstedeværende eller manglende R-faktorplasmider, når det er relevant (dvs. ampicillinresistens hos TA98-stammen, TA-100- og TA97a- eller TA97-stammcn, WP2 uvrA-stammen og WP2 uvrA (pKM101)-stammen, samt ampicillin- og tetracyclinresistens hos TA102-stammen), tilstedeværelse af karakteristiske mutationer (dvs. rfa-mutation hos S. typhimurium ved hjælp af følsomhed over for krystalviolet og uvrA-mutation hos E. coli eller uvrB-mutation hos S. typhimurium ved hjælp af følsomhed over for ultraviolet lys) (2) (3). Stammerne skal ligeledes give kimtal for spontane revertanter inden for den hyppighed, der må forventes ud fra laboratoriets hidtidige kontroldata, og helst inden for den hyppighed, der er angivet i litteraturen.
S. typhimurium TA 1535, og
S. typhimurium TA 1537, TA97 eller TA97a, og
S. typhimurium TA98, og
S. typhimurium TA100, og
E. coli WP2 uvrA, eller E. coli WP2 uvrA (pKM101) eller S. typhimurium TA102.
1.5.1.2. Substrat Der benyttes en egnet minimalagar (f.eks. med Vogel-Bonner minimalsubstrat E og glucose) og en topagar med histidin og biotin eller tryptophan, så der tillades nogle få celledelinger (1) (2) (9).
1.5.1.3. Metabolismeaktivering Bakterierne udsættes for teststoffet både med og uden et egnet metabolismeaktiveringssystem. Det mest almindeligt anvendte system er en cofaktorsuppleret postmitokondriefraktion (S9), der fremstilles af levere fra rotter, der har været behandlet med enzyminducerede stoffer såsom Aroclor 1254 (1) (2) eller en blanding af phenobarbiton og β-naphthoflavon (18) (20) (21). Postmitokondriefraktionen anvendes normalt i en koncentration på 5-30 % (v/v) i S9-blandingen. Valg af metabolismeaktiveringssystem og dets beskaffenhed kan afhænge af, hvilken kemisk klasse teststoffet tilhører. I nogle tilfælde vil det være hensigtsmæssigt at benytte postmitokondriefraktion i mere end én koncentration. For azofarvestoffer og diazoforbindelser kan et reduktivt metabolismeaktiveringssystem være mere velegnet (6) (13).
1.5.1.4. Teststof/testpræparat Teststoffer i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløsningsmidler eller bærestoffer og fortyndes passende inden behandling af bakterierne. Teststoffer i væskeform kan enten tilsættes direkte til testsystemet eller fortyndes inden behandlingen. Der benyttes frisk fremstillede teststofpræparater, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel. Der må ikke være mistanke om, at opløsningsmiddel/bærestof reagerer kemisk med teststoffet, og opløsningsmiddel/bærestof skal være kompatibel med bakteriernes overlevelse og S9-aktiviteten (22). Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, skal brugen af dem underbygges med kompatibilitetsdata. Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem. Ved undersøgelse af stoffer, der er ustabile i vand, skal de organiske opløsningsmidler være vandfrie.
1.5.2. Testbetingelser
1.5.2.
1.5.2.1. Teststammer (se punkt 1.5.1.1)
1.5.2.2. Eksponeringskoncentration Stoffets cytotoksicitet og dets opløselighed i den endelige testblanding er blandt de kriterier, der skal tages hensyn til ved valg af højeste koncentration. Det kan være hensigtsmæssigt at bestemme toksicitet og opløselighed ved et indledende forsøg. Cytotoksicitet kan påvises ved et fald i antallet af revertantkolonier, ved en opklaring eller hæmning af baggrundsvæksten eller ved graden af overlevelse i de behandlede kulturer. Et stofs cytotoksicitet kan ændres ved, at der er metabolismeaktiveringssystemer til stede. Uopløselighed bedømmes ved, at der med det blotte øje kan iagttages udfældning i slutblandingen under de faktiske forsøgsbetingelser. Der anbefales en maksimal testkoncentration af opløselige ikke-cytotoksiske stoffer på 5 mg/plade eller 5 μl/plade. For ikke-cytotoksiske stoffer, der ikke er opløselige med 5 mg/plade eller 5 μl/plade, skal en eller flere af de undersøgte koncentrationer være uopløselig i slutblandingen. Teststoffer, der er cytotoksiske allerede under 5 mg/plade eller 5 μl/plade. testes op til den cytotoksiske koncentration. Bundfald må ikke have indflydelse på bedømmelsen. Der benyttes mindst fem forskellige analyserbare koncentrationer af teststoffer med en afstand på ca. en halv logaritme (√10) mellem koncentrationerne i det indledende forsøg. Ved undersøgelse af en koncentration/respons-sammenhæng kan mindre intervaller være hensigtsmæssigt. Test ved koncentrationer over 5 mg/plade eller 5 μl/plade kan tages under overvejelse, når bedømmelsen vedrører stoffer med et betydeligt indhold af potentielt mutagene urenheder.
1.5.2.3. Negative og positive kontrolprøver I alle forsøg medtages der sideløbende både positive og negative (opløsningsmiddel eller bærestof) stammespecifikke kontrolprøver, såvel med som uden metabolismeaktivering. Der vælges en sådan koncentration i den positive kontrol, at det enkelte forsøg effektivitet godtgøres. Ved forsøg med metabolismeaktivering udvælges positive kontrolreferencestoffer ud fra den valgte type bakteriestamme. Nedenfor er der eksempler på stoffer, som er egnede som positive kontrolstoffer i forsøg med metabolismeaktivering: CAS nr. Einecs nr. Stof 781-43-1 212-308-4 9,10-dimethylanthracen 57-97-6 200-359-5 7,1 2-dimethylbenz[a]anthracen 50-32-8 200-028-5 benzo[a]pyren 613-13-8 210-330-9 2-aminoanthracen 50-18-0 cyclophosphamid 6055-19-2 200-015-4 cyclophosphamidmonohydrat Følgende stof er egnet som positivt kontrolstof ved reduktiv metabolismeaktivering: CAS nr. Einecs nr. Stof 573-58-0 209-358-4 Congo-rødt 2-aminoanthracen bør ikke anvendes som eneste indikator for, om .S9-blandingen er effektiv. Hvis der benyttes 2-aminoanthracen, skal hver batch af S9 tillige karakteriseres med et mutagen, der kræver metabolismeaktivering med mikrosomenzymer, f.eks, benzo[a]pyren eller dimethylbenzanthracen. Nedenfor er der eksempler på stoffer til brug som stammespecifikke positive kontrolstoffer i forsøg uden exogen metabolismeaktivering: CAS nr. Einecs nr. Stof Stamme 26628-22-8 247-852-1 natriumazid TA 1535 og TA 100 607-57-8 210-138-5 2-nitrofluoren TA 98 90-45-9 201-995-6 9-aminoacridin TA 1537, TA 97 og TA 97a 17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 og TA 97a 80-15-9 201-254-7 cumenbydroperoxid TA 102 50-07-7 200-008-6 mitomycin C WP2 uvrA og TA 102 70-25-7 200-730-1 N-ethyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin WP2, WP2 uvrA og WP2 uvrA (pKM101) 56-57-5 200-281-1 4-nitroquinolin-l-oxid WP2, WP2 uvrA og WP2 uvrA (pKM101) 3688-53-7 furylfuramid (AF2) plasmidholdige stammer Der kan benyttes andre egnede referencestoffer til positiv kontrol. Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede stoffer. Der skal indgå negative kontrolprøver, der kun består af opløsningsmiddel eller bærestof uden teststof, og som behandles på samme måde som de øvrige testgrupper. Desuden skal der være ubehandlede kontrolprøver, medmindre der foreligger tidligere opnåede kontroldata, der viser, at det valgte opløsningsmiddel ingen skadelige eller mutagene virkninger har.
1.5.3. Fremgangsmåde Ved pladeinkorporeringsmetoden (1) (2) (3) (4) uden metabolismeaktivering blandes normalt 0,05 ml eller 0,1 ml testopløsning, 0,1 ml frisk bakteriekultur (indeholdende ca. 108 levedygtige celler) og 0,5 ml steril buffer med 2,0 ml topagar. Ved forsøg med metabolismeaktivering blandes normalt ca. 0,5 ml metabolismeaktiveringsblanding, indeholdende en passende mængde postmitokondriefraktion (5-30 % (v/v) i metabolismeaktiveringsblandingen), med topagaren (2,0 ml), bakterierne og teststoffet/testopløsningen. Indholdet i de enkelte glas blandes og hældes ud over overfladen på en minimalagarplade. Topagaren henstilles til størkning inden inkubering. Ved præinkubationsmetoden (2) (3) (5) (6) forinkuberes teststof/testopløsning sammen med teststammen (indeholdende ca. 108 levedygtige celler) og steril buffer eller metabolismeaktiveringssystemet (0,5 ml) normalt i 20 minutter ved 30-37 oC, inden der blandes med topagaren, og blandingen hældes ud på overfladen af en minimalagarplade. Normalt blandes 0,05 ml eller 0,1 ml teststof/testopløsning, 0,1 ml bakteriekultur og 0,5 ml S9-blanding eller steril buffer med 2,0 ml topagar. Glassene bør under forinkuberingen beluftes i rysteapparat. Til forsvarlig bestemmelse af variationen udføres der tredobbelt udpladning ved hvert dosisniveau. Dobbelt udpladning kan accepteres, hvis den begrundes sagligt. Tab af en plade af og til gør ikke nødvendigvis testen ubrugelig. Gasformige og flygtige stoffer testes ved en egnet metode, f.eks. i forseglede dyrkningsflasker (12) (14) (15) (16).
1.5.4. Inkubering Alle plader i hvert forsøg inkuberes ved 37 oC i 48-72 timer. Efter inkuberingen tælles antallet af revertantkolonier pr. plade.
2. DATA
2.
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER Dataene forelægges som antallet af revertantkolonier pr. plade. Også antallet af revertantkolonier på både negative (opløsningsmiddelkontrol og en eventuel ubehandlet kontrol) og positive kontrolplader oplyses. Tallene for hver enkelt plade, gennemsnittet af revertantkolonier pr. plade og standardafvigelsen opgives for teststoffet og for positive og negative kontrolplader (ubehandlede og/eller med opløsningsmiddel). Der findes ingen krav til verifikation af et klart positivt resultat. Tvetydige resultater bør afklares ved yderligere undersøgelser, helst med ændrede forsøgsbetingelser. Negative resultater bekræftes efter en vurdering af de enkelte tilfælde. Anses bekræftelse af negative resultater ikke for nødvendige, skal dette begrundes. Ved opfølgende forsøg kan man overveje at ændre på undersøgelsens parametre, så de bedømte forsøgsbetingelser udvides. Blandt de undersøgelsesparametre, der kan ændres på, er koncentrationernes spredning, behandlingsmetoden (pladeinkorporering eller væske-præinkubation) og metabolismeaktiveringen.
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER Der findes en række kriterier for, om der er opnået et positivt resultat, f.eks. en koncentrationsafhængig forøgelse af antallet af revertantkolonier pr. plade i det undersøgte interval og/eller en reproducerbar forøgelse af antallet af revertantkolonier pr. plade ved en eller flere koncentrationer, for mindst én stamme med eller uden metabolismeaktivering (23). Der bør i første række ses på resultaternes biologiske relevans. Statistiske metoder kan benyttes som hjælpemiddel ved evalueringen af testresultaterne (24). Statistisk signifikans bør dog ikke være den eneste faktor, der afgør, om resultatet bedømmes som positivt. Et teststof, der ikke opfylder ovennævnte kriterier, anses ikke for mutagent i denne test. De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i sjældne tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvetydigt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages. Et positivt resultat af en tilbagemutationstest med bakterier viser, at teststoffet fremkalder punktmutationer ved basesubstitution eller læserammeforskydning i genomet hos Salmonella typhimurium og/eller Escherichia coli. Et negativt resultat viser, at teststoffet under testbetingelserne ikke er mutagent i den undersøge organisme.
3. RAPPORTERING
3. TESTRAPPORT
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:
Opløsningsmiddel/bærestof:
begrundelse for valg af bærestof
teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof, hvis den kendes
Stammer:
anvendte stammer
antal celler pr. kultur
karakteristika for stammen
Testbetingelser:
mængde teststof pr. plade (mg/plade eller μl/plade) med begrundelse for valg af dosis og pladeantal pr. koncentration
anvendte substrater
metabolismeaktiveringssystemets type og sammensætning, herunder acceptkriterier
behandlingsmetoder
Resultater:
tegn på toksicitet
tegn på udfældning
kimtal for de enkelte plader
gennemsnitligt antal revertantkolonier pr. plade og standardafvigelsen
dosis/respons-sammenhæng, når det er muligt
eventuelle statistiske analyser
data for sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) og positive kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit og standardafvigelser
data for tidligere negative (opløsningsmiddel/bærestof) og positive kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit og standardafvigelser
Diskussion af resultaterne
Konklusioner
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
HENVISNINGER Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron, D.M. and Arnes, B.N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173-215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt. S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233. Kier, L.D., Brusick, D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans. K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V. (1986). The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69-240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto. Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, pp. 91-96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285. Gatehouse. D.G. Rowland. I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61. Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (198 7), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. food Safety. 8. pp. 167-177. Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutations Res., 38, pp. 33-42. Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, \V. and Ramel, C, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161. Thompson, E.D. and Melampy, P.J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453-465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335-344. Prival, M.]., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughan, V.L. (1984), Mutagenicity of Benzidinc and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47. Zeiger, E., Anderson B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen. 19, pp. 2-141. Simmon, V., Kauhanen K. and Tardiff, R.G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology. D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258. Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.,G. and Claxton, L.D, (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis. 9, pp. 421-441. Matsushima, T., Matsumoto, A. Shirai, M.. Sawamura, M. and Sugimura T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salomonella typhimurium. Cancer Res., 39, pp. 3780-3782. Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Arnes, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dictary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wcdd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella lyphimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285-291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Tatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in viiro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Arnes, B.N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350. Claxton, L.D., Allen J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91. Mahon, G.A.T. Green, M.H.L, Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D.J., Cambridge University Press, pp. 28-65.
B.15. MUTAGENICITETSTESTNING OG SCREENING FOR KARCINOGENICITET GENMUTATION — SACCHAROMYCES CEREVlSIAE
B.15.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Se den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Se den generelle indledning til del B.
1.3. REFERENCESTOFFER Ingen.
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN En række forskellige haploide og diploide stammer af gæren Saccharomyces cerevisiae kan anvendes ved undersøgelse af genmutationer, som induceres af kemiske stoffer med og uden metabolisk aktivering. Man har anvendt fremadmutationssystemer med haploide stammer f.eks, ved bestemmelse af mutation fra røde, adeninafhængige mutanter (ade-1, ade-2) til dobbelt adeninafhængige hvide mutanter og selektive systemer som induktion af canavanin-resistens og cycloheximid-resistens. Det bedst validerede tilbagemutationssystem bygger på anvendelse af den haploide stamme XV185-14C, der er bærer af ochre nonsensemutationerne ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 og trp 5-48, og som muterer tilbage med baseparsubstitutionsmutagener, der inducerer punktmutationer eller ochre suppressormutationer. XV185-14C er også bærer af his 1-7 markøren, som er en missense-mutation, der hovedsagelig muterer tilbage ved mutationer i andre loci, og markøren hom 3-10, der muterer tilbage med frameshift-mutagener. Den eneste bredt anvendte diploide stamme af S. cerevisiae er D7, der er homozygot i ilv 1-92.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6. Forberedelser
Opløsninger af teststof og kontrol fremstilles umiddelbart inden testen under anvendelse af et passende vehikel. Hvis der anvendes organiske kemiske forbindelser, som er uopløselige i vand, kan organiske opløsningsmidler som ætanol, acetone eller dimetylsulfoxid (DMSO) bruges i koncentrationer på op til 2 % v/v. Koncentrationen af vehiklet bør ikke medføre nogen ændring i cellevitalitet og vækstkarakteristika.
Metabolisk aktivering
Cellerne eksponeres for teststoffet både med og uden tilsætning af et passende eksogent metabolisk aktiveringssystem. Det hyppigst anvendte system består af en co-faktorberiget postmitochondrisk fraktion af lever fra gnavere, som er forbehandlede med enzyminducerende stoffer. Andre dyrearter, væv, postmitochondriske fraktioner eller fremgangsmåder kan også være egnede til metabolisk aktivering.
Forsøgsbetingelser
Teststammer
Den haploide stamme XV 185-14C og den diploide stamme D7 er de hyppigst anvendte i genmutationsundersøgelser. Også andre stammer kan være egnede.
Medier
Ved bestemmelse af overlevelsesgrad og antal mutanter anvendes passende kulturmedier.
Negative og positive kontroller
Sideløbende med testkulturerne dyrkes positive kontrolkulturer, ubehandlede kontrolkulturer og kontrolkulturer med det anvendte opløsningsmiddel. Der anvendes egnede positive kontrolstoffer for hvert enkelt genetisk endpoint.
Eksponeringskoncentrationer
Der anvendes mindst fem forskellige koncentrationer af teststoffet med passende intervaller mellem koncentrationerne. Når der testes toksiske stoffer, bør den højeste koncentration ikke reducere overlevelsesgraden til mindre end 5 til 10 %. Stoffer, som er relativt uopløselige i vand, testes under anvendelse af passende fremgangsmåder op til opløselighedsgrænsen. Den højeste koncentration af ikke-toksiske teststoffer, som er frit opløselige i vand, fastlægges fra stof til stof.
Inkubationsbetingelser
Pladerne inkuberes i fire til syv dage mellem 28 og 30 oC i mørke.
Spontane mutationsfrekvenser
Der anvendes subkulturer med spontane mutationsfrekvenser, som ligger inden for de almindeligt accepterede områder.
Antal parallelle plader
Der anvendes mindst tre parallelle plader for hver koncentration ved bestemmelsen af prototrofer, som er fremkommet ved genmutation, og af cellernes levedygtighed. Når man tester markører, der som hom 3-10 har en lav mutationsfrekvens, må antallet af plader forøges, således at der kan tilvejebringes en statistisk relevant mængde data.
Fremgangsmåde
Stammer af S. cerevisiae eksponeres normalt ved test i væske, hvortil der anvendes enten celler i stationærfase eller celler i vækstfase. Indledende undersøgelser bør udføres med celler i vækstfase, 1-5 × 107 celler pr. ml eksponeres for teststoffet i op til 18 timer ved 28 til 37 oC under omrystning. Hvis det er nødvendigt, tilsættes en passende mængde metabolisk aktiveringssystem under eksponeringen. Efter eksponeringen centrifugeres og vaskes cellerne, hvorefter de udsås på et egnet kulturmedium. Når inkubationen er slut, registreres induktionen af genmutationer og antal overlevende på hver plade. Hvis den første undersøgelse er negativ, bør en anden udføres under anvendelse af celler i stationærfase. Hvis den første undersøgelse er positiv, skal det efterprøves i et passende uafhængigt forsøg.
2. DATA Data opstilles i tabelform. Antal optalte kolonier, antal mutanter, overlevelsesfrekvens samt mutationsfrekvens angives. Alle resultater efterprøves i et uafhængigt forsøg, Evalueringen af data baseres på passende statistiske metoder.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:
den anvendte stamme
forsøgsbetingelser: celler i stationær fase eller vækstfase, mediernes sammensætning, inkubationstemperatur og -periode, metabolisk aktiveringssystem
eksponeringsbetingelser: eksponeringskoncentrationer, fremgangsmåde og varighed, eksponeringstemperatur, positive og negative kontroller
antal optalte kolonier, antal mutanter, overlevelses- og mutationsfrekvens, om muligt dosis-responsforhold, statistisk evaluering af data
diskussion af resultaterne
fortolkning af resultaterne.
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING Se den generelle indledning til del B.
4. HENVISNINGER Se den generelle indledning til del B.
B.16. MITOTISK REKOMBINATION — SACCHAROMYCES CEREVISIAE
B.16.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Se den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Se den generelle indledning til del B.
1.3. REFERENCESTOFFER Ingen.
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN Der kan hos Saccharomyces cerevisiae konstateres mitotisk rekombination mellem gener (eller mere generelt mellem et gen og dets centromer) og inden for det samme gen. Den førstnævnte form kaldes mitotisk overkrydsning og frembringer reciprokke typer, mens den sidstnævnte som oftest ikke er reciprok og kaldes genbytning. Overkrydsning bestemmes almindeligvis ved frembringelse af recessive homozygote kolonier eller sektorer i en heterozygot stamme, mens genbytning bestemmes ved frembringelse af prototrofe revertanter i en auxotrof heteroallel stamme, som bærer to forskellige, defekte alleler af det samme gen. De hyppigst anvendte stammer ved undersøgelse af mitotisk genbytning er D4 (med heteroallele ade 2 og trp 5), BZ34 (med heteroallel arg 4), D7 (med heteroallel trp 5) og JD1 (med heteroallele his 4 og trp 5). Mitotisk overkrydsning, som frembringer røde og lyserøde sektorer, kan undersøges i D5 og D7 (der også kan bruges til bestemmelse af mitotisk genbytning og tilbagemutation af ilv 1-92), idet begge stammer bærer heteroallele komplementære alleler til ade 2.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6. Forberedelser
Opløsninger af teststof og kontrol- eller referencestoffer fremstilles umiddelbart inden testen under anvendelse af et passende opløsningsmiddel. Hvis der anvendes organiske kemiske forbindelser, som er uopløselige i vand, kan organiske opløsningsmidler som ætanol, acetone eller dimetylsulfoxid (DMSO) bruges i koncentrationer på op til 2 % v/v. Koncentrationen af vehiklet bør ikke medføre nogen ændring i cellevitalitet og vækstkarakteristika.
Metabolisk aktivering
Cellerne eksponeres for teststof både med og uden tilsætning af et passende eksogent metabolisk aktiveringssystem. Det hyppigst anvendte system består af en co-faktorberiget postmitochondrisk fraktion af lever fra gnavere, som er forbehandlede med enzyminducerende stoffer. Andre dyrearter, væv, postmitochondriske fraktioner eller fremgangsmåder kan også være egnede til metabolisk aktivering.
Forsøgsbetingelser
Teststammer
De hyppigst anvendte stammer er de diploide D4, D5, D7 og JD1. Også andre stammer kan være egnede.
Medier
Ved bestemmelse af overlevelsesgrad og mitotisk rekombinationsfrekvens anvendes passende kulturmedier.
Negative og positive kontroller
Sideløbende med testkulturerne dyrkes positive kontrolkulturer, ubehandlede kontrolkulturer og kontrolkulturer med det anvendte opløsningsmiddel. Der anvendes egnede positive kontrolstoffer for hvert enkelt genetisk endpoint.
Eksponeringskoncentrationer
Der anvendes mindst fem forskellige koncentrationer af teststoffet med passende intervaller mellem koncentrationerne. Herunder må man tage hensyn til faktorer som cytotoksicitet og opløselighed. De laveste koncentrationer bør ikke have nogen indvirkning på cellernes levedygtighed. Når der testes toksiske stoffer, bør den højeste koncentration ikke reducere overlevelsesgraden til mindre end 5 til 10 %. Stoffer, som er relativt uopløselige i vand, testes under anvendelse af passende fremgangsmåder op til opløselighedsgrænsen. Den højeste koncentration af ikke-toksiske teststoffer, som er frit opløselige i vand, fastlægges fra test til test. Celler i stationær fase eller vækstfase kan eksponeres for teststoffet i op til 18 timer. Benyttes der lange eksponeringsperioder, bør kulturerne dog undersøges mikroskopisk for sporedannelse, idet disses tilstedeværelse gør testen værdiløs.
Inkubationsbetingelser
Pladerne inkuberes i fire til syv dage mellem 28 og 30 oC i mørke. Plader, som anvendes til bestemmelse af røde og lyserøde homozygote sektorer, der er frembragt ved mitotisk overkrydsning, opbevares i køleskab (omkring 4 oC) i yderligere en til to dage inden optælling for at muliggøre udvikling af de rene pigmenterede kolonier.
Spontane mitotiske rekombinationsfrekvenser
Der anvendes subkulturer med spontane mitotiske frekvenser, som ligger inden for de almindeligt accepterede områder.
Antal parallelle plader
Der anvendes mindst tre parallelle plader for hver koncentration ved bestemmelsen af prototrofer, som er fremkommet ved mitotisk genbytning, og af cellernes levedygtighed. Når man tester recessive homozygoter, som er frembragt ved mitotisk overkrydsning, forøges antallet af plader, således at der opnås et passende antal kolonier.
Fremgangsmåde
Stammer af S. cerevisiae eksponeres normalt ved test i væske, hvortil der anvendes enten celler i stationær fase eller celler i vækstfase. Indledende undersøgelser bør udføres med celler i vækstfase. 1-5 × 107 celler pr. ml eksponeres for teststoffet i op til 18 timer ved 28 til 37 oC under omrystning. Under eksponeringen tilsættes en passende mængde metabolisk aktiveringssystem. Efter eksponeringen centrifugeres og vaskes cellerne, hvorefter de udsås på et egnet kulturmedium. Når inkubationen er slut, registreres induktionen af mitotisk rekombination og antal overlevende på hver plade. Hvis den første undersøgelse er negativ, bør en anden udføres under anvendelse af celler i stationær fase. Hvis den første undersøgelse er positiv, skal det efterprøves i et passende uafhængigt forsøg.
2. DATA Data opstilles i tabelform. Antal optalte kolonier, antal rekombinanter, overlevelsesgrad samt rekombinationsfrekvens angives. Alle resultater efterprøves i et uafhængigt forsøg. Evalueringen af data baseres på passende statistiske metoder.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:
den anvendte stamme
forsøgsbetingelser: celler i stationær fase eller vækstfase, mediernes sammensætning, inkubationstemperatur og -periode, metabolisk aktiveringssystem
eksponeringsbetingelser: eksponeringskoncentrationer, fremgangsmåde og varighed, eksponeringstemperatur, positive og negative kontroller
antal optalte kolonier, antal rekombinanter, overlevelses- og rekombinationsfrekvens, om muligt dosis/responsforhold, statistisk evaluering af data
diskussion af resultaterne
fortolkning af resultaterne.
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING Se den generelle indledning til del B.
4. HENVISNINGER Se den generelle indledning til del B.
B.17. MUTAGENICITET — IN VITRO-TEST FOR GENMUTATION I PATTEDYRCELLER
B.17.
1. METODE Denne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 476 In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997).
1.
1.1. INDLEDNING In vitro-testen for genmutation i pattedyrceller kan benyttes til at påvise genmutationer, som induceres af kemiske stoffer. Blandt egnede cellelinjer er muselymfomceller L5178Y, cellelinjerne CHO, CHO-AS52 og V79 fra kinesisk hamster og humane lymfoblastceller TK6 (1). I disse cellelinjer benyttes som genetiske end-points almindeligvis bestemmelse af mutationer ved thymidin-kinase (TK), hypoxantin-guanin-fosforibosyl-transferase (HPRT) og et transgen af xanthin-guanin-fosforibosyl-transferase (XPRT). I TK-, HPRT- og XPRT-mutationstestene påvises forskellige spektre af genetiske hændelser. Med TK og XPRT kan der på grund af deres autosomale placering påvises genetiske hændelser (f.eks. større deletioner), der ikke kan påvises ved HPRT-locus'et på X-kromosomer (2) (3) (4) (5) (6). I in vitro-testen for genmutation i pattedyrceller kan der benyttes kulturer af etablerede cellelinjer eller cellestammer. Cellerne udvælges på grundlag af deres vækstegenskaber ved dyrkning og den spontane mutationsfrekvens' stabilitet. Normalt kræver en in vitro-test, at der benyttes en exogen metabolismeaktivering. Et sådant metabolismeaktiveringssystem kan ikke fuldstændigt efterligne forholdene i pattedyr in vivo. Man må omhyggeligt undgå forhold, der fører til resultater, der ikke afspejler egentlig mutagenicitet. Positive resultater, der ikke afspejler egentlig mutagenicitet, kan være forårsaget af ændringer i pH eller osmolalitet eller høj cytotoksicitet (7). Testen benyttes til screening for stoffer, der kan være mutagene eller carcinogene hos pattedyr. Mange af de stoffer, der er positive ved denne test, er carcinogene hos pattedyr, men korrelationen mellem denne test og carcinogenicitet er ikke fuldstændig. Den afhænger af den kemiske klasse, og stadig mere tyder på, at der findes carcinogener, der ikke påvises ved denne test, fordi de tilsyneladende virker gennem andre ikke-gentoksiske mekanismer eller mekanismer, der ikke findes i bakterieceller (6). Se også den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Fremadmutation: En genmutation fra forældretypen til mutanten, som medfører ændring i eller tab af det kodede proteins enzymaktivitet. Basesubstitutionsmutagen: Et stof, der fremkalder substitution af et eller flere DNA-basepar. Læserammemutagen: Et stof, der fremkalder addition eller deletion af et eller flere basepar i DNA-molekylet. Fænotypeekspressionsperiode: Et tidsrum, hvorunder uændrede genprodukter gradvis forsvinder fra nylig muterede celler. Mutanthyppighed: Antallet af observerede mutantceller divideret med antallet af levedygtige celler. Relativ total vækst: Forøgelsen af celleantallet i et tidsrum, sammenlignet med en kontrolpopulation af celler: beregnes som produktet af suspensionsvæksten i forhold til den negative kontrol og klondannelseseffektiviteten i forhold til den negative kontrol. Relativ suspensionsvækst: Forøgelsen af celleantallet i ekspressionsperioden i forhold til den negative kontrol. Levedygtighed: De behandlede cellers klondannelseseffektivitet på tidspunktet for selektiv udpladning efter ekspressionsperioden. Overlevelse: De behandlede cellers klondannelseseffektivitet ved udpladningen efter behandlingsperioden; overlevelsen udtrykkes normalt i forhold til overlevelsen i kontrolcellepopulationen.
1.3. TESTMETODENS PRINCIP Celler, som mangler thymidinkinase TK på grund af fremadmutationen TK+/– → TK–/–, er resistente over for de cytotoksiske virkninger af pyridinanalogen trifluorthymidin (TFT). Celler, som har thymidinkinase, er følsomme over for TFT, som inhiberer cellemetabolismen og standser den videre celledeling. Det betyder, at mutantceller kan formere sig under tilstedeværelse af TFT, mens normale celler, der indeholder thymidinkinase, ikke kan. På tilsvarende måde kan celler, der mangler HPRT eller XPRT, udvælges ved deres modstandsdygtighed over for henholdsvis 6-thioguanin (TG) og 8-azaguanin (AG). Hvis der i en af genmutationstestene med pattedyrceller testes et stof, der er baseanalogt med det selektive stof eller beslægtet hermed, må der først ses nøje på teststoffets egenskaber. Eksempelvis bør enhver mistanke om, at teststoffet har selektiv toksicitet over for mutantceller og ikke-mutantceller, undersøges. Det vil sige, at det selektive system/stofs egnethed skal bekræftes, når der testes stoffer, der kemisk er beslægtet med det selektive stof (8). Celler i suspensionskultur eller enkeltlagskultur udsættes for teststoffet både med og uden metabolismeaktivering i et passende tidsrum, hvorefter der ved dyrkning i subkultur påvises cytotoksicitet og gives mulighed for fænotypeekspression, inden mutanterne udvælges (9) (10) (11) (12) (13). Cytotoksiciteten bestemmes sædvanligvis ved at måle kulturernes relative klondannelseseffektivitet (overlevelse) eller deres relative totale vækst efter behandlingsperioden. De behandlede kulturer holdes så lang tid i vækstmediet, afhængigt af hvert valgt locus og celletype, at fænotypeekspressionen af inducerede mutationer bliver næsten optimal. Mutanthyppigheden bestemmes ved udsåning af et kendt antal celler i et medium, der indeholder det selektive stof, til påvisning af mutantceller og i et medium uden selektivt stof til bestemmelse af klondannelseseffektiviteten (levedygtigheden). Efter en passende inkuberingstid tælles kolonierne. Mutanthyppigheden afledes af antallet af mutantkolonier i det selektive medium og antallet af kolonier i det ikke-selektive medium.
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.4.
1.4.1. Præparater
1.4.1.
1.4.1.1. Celler En lang række cellelinjer lader sig anvende i denne test, herunder subkloner af L5178Y, CHO, CHO-AS52, V-79 og TK6-celler. For de celletyper, der benyttes i denne test, bør der være påvist følsomhed over for kemiske mutagener, høj klondannelseseffektivitet og stabil spontan mutationshyppighed. Cellerne bør kontrolleres for forurening med mycoplasma og bør ikke anvendes, hvis de er forurenet. Testen bør tilrettelægges med forud fastlagt følsomhed og styrke. Antallet af celler, kulturer og koncentrationer af teststof bør afspejle disse valgte parametre (14). Det mindste antal levedygtige celler, der overlever behandling og benyttes i testens faser, baseres på den spontane mutationshyppighed. Som rettesnor kan der anvendes et celleantal, der er mindst ti gange den reciprokke spontane mutationshyppighed. Det anbefales dog, at der mindst anvendes106 celler. Der skal foreligge tilstrækkelige historiske data om cellesystemet til at dokumentere, at testen har konstant høj effektivitet.
1.4.1.2. Medier og dyrkningsbetingelser Der benyttes egnede dyrkningsmedier og inkuberingsbetingelser (dyrkningsbeholdere. temperatur, CO2-koncentration, luftfugtighed). Medier vælges efter, hvilke selektive systemer og celletyper der benyttes i testen. Det er især vigtigt at vælge sådanne dyrkningsbetingelser, at både mutantcellers og ikke-mutantcellers vækst og kolonidannelse bliver optimal under ekspressionsperioden.
1.4.1.3. Fremstilling af kulturer Cellerne opformeres fra stamkulturer, udsås i dyrkningsmedium og inkuberes ved 37 oC. Det kan være nødvendigt at rense kulturerne for allerede-eksisterende mutanter, inden de benyttes i denne test.
1.4.1.4. Metabolismeaktivering Cellerne udsættes for teststoffet både med og uden et egnet metabolismeaktiveringssystem. Det mest almindeligt anvendte system er en cofaktorsuppleret postmitokondriefraktion (S9), der fremstilles af levere fra rotter, der har været behandlet med enzyminducerende stoffer såsom Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) eller en blanding af phenobarbiton og β-naphthoflavon (19) (20). Postmitokondriefraktionen anvendes normalt i en koncentration på 1-10 % (v/v) i det færdige testsubstrat. Valget af metabolismeaktiveringssystem og dets beskaffenhed kan afhænge af, hvilken kemisk klasse teststoffet tilhører. I nogle tilfælde vil det være hensigtsmæssigt at benytte postmitokondriefraktion i mere end én koncentration. Nogle udviklingstendenser, f.eks. genetisk konstruktion af cellelinjer, der udtrykker specifikke aktiverende enzymer, kan rumme potentiale for endogen aktivering. Valget af en bestemt cellelinje skal begrundes sagligt (f.eks. ved, at cytochrom P450-coenzymet er relevant for teststoffets metabolisme).
1.4.1.5. Teststof/testpræparat Teststoffer i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløsningsmidler eller bærestoffer og fortyndes passende inden behandling af cellerne. Teststoffer i væskeform kan enten tilsættes direkte til testsystemet eller fortyndes inden behandlingen. Der benyttes frisk fremstillede teststofpræparater, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.
1.4.2. Testbetingelser
1.4.2.
1.4.2.1. Opløsningsmiddel/bærestof Der må ikke være mistanke om. at opløsningsmiddel/bærestof reagerer kemisk med teststoffet, og opløsningsmiddel/bærestof må hverken hæmme cellernes overlevelse eller S9-aktiviteten. Benyttes der andre opløsningsmiddel/bærestoffer end de velkendte, skal brugen af dem underbygges med kompatibilitetsdata. Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem. Ved undersøgelse af stoffer, der er ustabile i vand, skal de organiske opløsningsmidler være vandfrie. Vand kan fjernes ved tilsætning af molekylsi.
1.4.2.2. Eksponeringskoncentrationer Stoffets cytotoksicitet, dets opløselighed i testsystemet samt ændringer i pH og osmolalitet er blandt de kriterier, der skal tages hensyn til ved valg af højeste koncentration. Cytotoksiciteten bestemmes med og uden metabolismeaktivering i hovedforsøget ved hjælp af en passende indikator for celleintegritet og -vækst, f.eks. relativ klondannelseseffektivitet (overlevelse) eller relativ total vækst. Det kan være hensigtsmæssigt at bestemme cytotoksicitet og opløselighed ved et indledende forsøg. Der benyttes mindst fire analyserbare koncentrationer. Hvis der er tale om cytotoksicitet, skal koncentrationerne dække et interval fra største toksicitet til ringe eller ingen toksicitet; det betyder normalt, at koncentrationerne højst er adskilt med en faktor mellem 2 og √10. Hvis den højeste koncentration er baseret på cytotoksicitet, bør den føre til en relativ overlevelse (relativ klondannelseseffektivitet) eller relativ total vækst på ca. 10-20 % (ikke under 10 %). For stoffer, der er forholdsvis ikke-cytotoksiske, må testkoncentrationen højst være 5 mg/ml, 5 μl/ml eller 0,01 M (den laveste af de tre). Forholdsvis uopløselige stoffer testes op til eller over opløselighedsgrænsen ved dyrkningsbetingelserne. Tegn på uopløselighed bør konstateres i det endelige behandlingsmedium, som cellerne udsættes for. Det kan være hensigtsmæssigt at bedømme opløseligheden både ved behandlingens begyndelse og afslutning, eftersom opløseligheden kan ændre sig under eksponeringen i testsystemet som følge af, at der er celler, S9, serum mv. til stede. Uopløselighed kan iagttages med det blotte øje. Bundfald må ikke have indflydelse på bedømmelsen.
1.4.2.3. Kontrolprøver I alle forsøg medtages der sideløbende både positive og negative (opløsningsmiddel eller bærestof) kontrolprøver, såvel med som uden metabolismeaktivering, Når der benyttes metabolismeaktivering, bør der som positivt kontrolkemikalie anvendes et, der kræver aktivering for at virke mutagent. Nedenfor er opregnet eksempler på positive kontrolstoffer. Metabolismeaktivering Locus Stof CAS nr. Einecs nr. Ingen exogen metabolismeaktivering HPRT Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 Ethylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 TK (små og store kolonier) Methylmethansulfonat 66-27-3 200-625-0 XPRT Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 Ethylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 Exogen metabolismeaktivering HFRT 3-methylcholanthren 56-49-5 200-276-4 N-nitrosodimethylamin 62-75-9 200-549-8 7,1 2-dimethylbenzanthracen 57-97-6 200-359-5 TK (små og store kolonier) Cyclophosphamid 50-18-0 200-015-4 Cyclophosphamidmonohydrat 6055-19-2 Benzo[a]pyren 50-32-8 200-028-5 3-methylcholanthren 56-49-5 200-276-5 XPRT N-nitrosodimethylamin (ved højt indhold af S9) 62-75-9 200-549-8 Benzo[a]pyren 50-32-8 200-028-5 Der kan benyttes andre egnede stoffer til positiv kontrol, f.eks. kan et laboratorium, der har en historisk database over 5-brom-2'-deoxyuridin (CAS nr. 59-14-3, Einecs nr. 200-415-9), også benytte dette referencestof. Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede stoffer. Der skal indgå negative kontrolprøver, hvor behandlingsmediet kun består af opløsningsmiddel eller bærestof, og som behandles på samme måde som de øvrige kulturer. Desuden skal der være ubehandlede kontrolprøver, medmindre der foreligger tidligere opnåede kontroldata, der viser, at det valgte opløsningsmiddel ingen skadelige eller mutagene virkninger har.
1.4.3. Fremgangsmåde
1.4.3.
1.4.3.1. Behandiing med teststof Celler under formering udsættes for teststoffet både med og uden metabolismeaktivering. Eksponeringen skal vare en passende tid (normalt har tre-fem timer den fornødne virkning). Eksponeringen kan strække sig over én eller flere cellecyklusser. Ved hver undersøgt koncentration benyttes der enten en eller to behandlede kulturer. Benyttes der kun én kultur, øges antallet af koncentrationer, således at der bliver tilstrækkeligt mange kulturer til analyse (dvs. mindst otte analyserbare koncentrationer). Der bør anvendes to negative kontrolkulturer (opløsningsmiddel). Gasformige og flygtige stoffer testes ved en egnet metode, f.eks. i forseglede dyrkningsflasker (21) (22).
1.4.3.2. Måling af overlevelse, levedygtighed og mutanthyppighed Efter eksponeringen vaskes cellerne og dyrkes med henblik på at bestemme overlevelsen og give mulighed for ekspression af mutantfænotypen. Måling af cytotoksicitet ved bestemmelse af kulturernes relative klondannelseseffektivitet (overlevelse) eller relative totale vækst påbegyndes normalt efter behandlingsperioden. Hvert locus har et fast mindste tidsrum, som kræves til nær optimal fænotypeekspression af nyligt inducerede mutanter (HPRT og XPRT kræver mindst seks-otte dage og TK mindst to dage). Cellerne dyrkes i medier med og uden selektivt stof med henblik på bestemmelse af henholdsvis antallet af mutanter og klondannelseseffektiviteten. Måling af levedygtigheden (der benyttes til beregning af mutanthyppigheden) påbegyndes efter ekspressionstiden ved udpladning på ikke-selektivt medium. Hvis teststoffet reagerer positivt i L5178Y TK+/–-testen, bestemmes kolonistørrelsen i mindst en af testkulturerne (den højeste positive koncentration) og i de positive og negative kontrolkulturer. Hvis teststoffet reagerer negativt i L517SY TK+/–-testen, bestemmes kolonistørrelsen i de positive og negative kontrolkulturer. Også ved undersøgelser med TK6TK+/– kan kolonistørrelsen bestemmes.
2. DATA
2.
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER Dataene skal omfatte bestemmelse af cytotoksicitet og levedygtighed, kimtælling og mutanthyppighed for de behandlede kulturer og kontrolkulturerne. I tilfælde af positiv reaktion i L5178Y TK+/–-testen, bedømmes kolonierne ud fra kriterier om små og store kolonier ved mindst én koncentration af teststoffet (højeste positive koncentration) og med den negative og positive kontrol. Den molekylære og cytogenetiske natur af mutanter i både store og små kolonier er udforsket detaljeret (23) (24). I TK+/–-testen bedømmes kolonierne efter kriterier for normalt voksende (store) og langsomt voksende (små) kolonier (25). De mutantceller, der har de mest alvorlige genetiske skader, har længere fordoblingstider og danner derfor mindre kolonier. Sådanne skader ligger typisk fra tab af hele genet til karyotypisk synlige kromosomaberrationer. Induktion af mutanter i små kolonier har været tilskrevet kemikalier, der fremkalder kromosomaberrationer, der kan ses med det blotte øje (26). Mindre alvorligt berørte mutantceller vokser med omtrent samme hastighed som modercellerne og danner store kolonier. Overlevelsen (den relative klondannelseseffektivitet) eller den relative totale vækst skal oplyses. Mutanthyppigheden opgives som antallet af mutantceller i forhold til antallet af overlevende celler. Der anføres data for hver enkelt kultur. Derudover sammenfattes alle data i tabelform. Der findes ingen krav til verifikation af et klart positivt resultat. Tvetydige resultater bør afklares ved yderligere undersøgelser, helst med ændrede forsøgsbetingelser. Negative resultater bekræftes efter en vurdering af de enkelte tilfælde. Anses bekræftelse af negative resultater ikke for nødvendigt, skal dette begrundes. Ved forsøg til opfølgning af tvetydige eller negative resultater bør man overveje at ændre på undersøgelsens parametre, så de bedømte forsøgsbetingelser udvides. Blandt de undersøgelsesparametre. der kan ændres på, er koncentrationernes spredning og metabolismeaktiveringen.
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING Af RESULTATER Der findes en række kriterier for, om der er opnået et positivt resultat, f.eks. en koncentrationsafhængig eller reproducerbar forøgelse af mutanthyppigheden. Der bør i første række ses på resultaternes biologiske relevans. Statistiske metoder kan benyttes som hjælpemiddel ved evalueringen af testresultaterne. Statistisk signifikans bør ikke være den eneste faktor, der afgør, om resultatet bedømmes som positivt. Et teststof, der ikke opfylder ovennævnte kriterier, anses ikke for mutagent i denne test. De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i sjældne tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvetydigt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages. Et positivt resultat af en in vitro-test for genmutation i pattedyrceller viser, at teststoffet fremkalder genmutationer i de benyttede dyrkede pattedyrceller. En positiv koncentrationsafhængig reproducerbar respons er mest sigende. Et negativt resultat viser, at teststoffet under testbetingelserne ikke fremkalder genmutationer i de benyttede dyrkede pattedyrceller.
3. RAPPORTERING
3. TESTRAPPORT
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:
Opløsningsmiddel/bærestof:
begrundelse for valg af opløsningsmiddel/bærestof
teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof, hvis den kendes.
Celler:
celletype og -ilde
antal cellekulturer
eventuelt antal passager
eventuelle metoder til vedligehold af cellekultur
fravær af mycoplasma
Testbetingelser:
begrundelse for valg af koncentrationer og antal kulturer, herunder f.eks. eventuelle cytotoksicitetsdata og opløselighedsbegrænsninger
substratsammensætning og eventuel CO2-koncentration
teststoffets koncentration
volumen af tilsat bærestof og teststof
inkuberingstemperatur
inkuberingstid
behandlingens varighed
celletæthed under behandlingen
metabolismeaktiveringssystemets type og sammensætning, herunder acceptkriterier
positive og negative kontrolprøver
ekspressionsperiodens længde (herunder antal udsåede celler, subkulturer og eventuel feeding)
selektive agenser
kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ eller tvetydig
metoder til tælling af levedygtige celler og mutantceller
definition af kolonier, hvor størrelse og type lægges til grund (herunder kriterier for, hvilke kolonier der er små og store)
Resultater:
tegn på toksicitet
tegn på udfældning
data om pH og osmolalitet under udsættelsen for teststoffet, hvis disse værdier er målt
kolonistørrelse, hvis den er bedømt, i hvert fald for negative og positive kontrolkulturer
laboratoriets kapacitet til at påvise mutanter i små kolonier med L 5178Y TK+/–-systemet
dosis/respons-sammenhæng, når det er muligt
eventuelle statistiske analyser
data for sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) og positive kontrolprøver
data for tidligere negative (opløsningsmiddel/bærestof) og positive kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit og standardafvigelser
mutanthyppighed
Diskussion af resultaterne
Konklusioner
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
HENVISNINGER Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (eds.) (1987), Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E.H.Y. and Malling, H.V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II.. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sri. USA, 61, pp. 1306-1312. Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res., 94, pp. 467-485. Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394-403. Aaron, C. S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res., 223, pp. 121-128. Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M, Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.. 312, pp. 235-239. Scott. D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204. Clive, D., McCuen, R. Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251. Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environment Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 196, pp. 17-36. Li. A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C, Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Cuanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135-141. Liber, H.I., Yandell, D.W. and Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Lod in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res. 216, pp. 9-17. Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and 1CR 191-Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133-147. Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984), Procedures for the L5178Y/TK+/– — TK+/– Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268. Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M, Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland D.J., ed., Cambridge University Press, pp. 66-101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res., 46, pp. 36 5-37 3. Arnes, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, pp. 347-364. Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat Res., 59, pp. 61-108. Maron, D.M. and Arnes, B.N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215. Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.C, Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot. R.M. (eds.) Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L, Schaich, K.M, (eds.), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801. Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sti. USA. 87, pp, 51-55. Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C. Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161-174. Yandell, D.W., Dryja, T.P. and I.ittle, J.B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res., 229, pp. 89-102. Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- — 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis 5, pp.609-614.
B.18. DNA-SKADE OG DNA-REPARATION — UNSCHEDULED DNA SYNTHESIS — PATTEDYRCELLER IN VITRO
B.18.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Se den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Se den generelle indledning til del B.
1.3. REFERENCESTOFFER Ingen.
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN Ved Unscheduled DNA Synthesis (UDS) test undersøges dna-reparationen efter bortskæring og fjernelse af skader, som er induceret af kemiske eller fysiske agentia. Testen bygger på inkorporering af tritiummærket thymidin (3H-TdR) i pattedyrcellers dna, når disse celler ikke er i S-fase. Optagelsen af 3H-TdR kan måles ved autoradiografi eller væskescintillationstælling (LSC) af dna fra de eksponerede celler. Medmindre der anvendes primærkulturer af rottehepatocytter, eksponeres dyrkede pattedyrceller for teststoffet med og uden et eksogen metabolisk aktiveringssystem. UDS-test kan også foretages i in vivo-systemer.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6. Forberedelser
Teststof samt kontrol- og referencestoffer tilsættes kulturmediet eller opløses eller suspenderes i egnede vehikler og tilsættes derefter kulturmediet inden testen. Den derved opnåede vehikelkoncentration bør ikke påvirke cellernes levedygtighed. Der kan anvendes primærkulturer af rottehepatocytter, humane lymfocytter eller etablerede cellelinjer (f.eks. humane diploide fibroblaster). Cellerne eksponeres for teststoffet med og uden et passende metabolisk aktiveringssystem.
Forsøgsbetingelser
Antal kulturer
Ved autoradiografisk påvisning af UDS anvendes mindst to og ved LSC seks kulturer (eller mindre hvis det er videnskabeligt begrundet) for hvert eksperimentelt punkt.
Negative og positive kontroller
Der foretages sideløbende både positiv og negativ (ubehandlet og/eller vehikel) kontrol med og uden metabolisk aktivering i hvert forsøg. Som positiv kontrol ved anvendelse af rottehepatocytter kan f.eks. benyttes 7,12-DMBA (7,12-dimetylbenzanthracen) eller 2-AAF (2-acetylaminofluoren). Som positiv kontrol ved anvendelse af etablerede cellelinjer kan f.eks. benyttes 4-NQO (4-nitroquinolin-N-oxid) både i forbindelse med autoradiografisk registrering og LSC uden metabolisk aktivering. Når der anvendes metaboliske aktiveringssystemer kan f.eks. N-dimetylnitrosamin benyttes til positiv kontrol.
Eksponeringskoncentrationer
Der anvendes en række forskellige koncentrationer af teststoffet over et interval, som dækker alle påvirkninger. Den højeste koncentration bør have en vis cytotoksisk virkning. Stoffer, som er relativt uopløselige i vand, testes op til opløselighedsgrænsen. Den højeste koncentration af ikke-toksiske teststoffer, som er frit opløselige i vand, fastlægges fra test til test.
Celler
Der benyttes passende vækstmedier, CO2-koncentration, temperatur og fugtighed til opretholdelse af kulturerne. Det undersøges regelmæssigt, om etablerede cellelinjer er kontamineret med mycoplasma.
Metabolisk aktivering
Der anvendes ikke metaboliske aktiveringssystemer i forbindelse med primærkulturer af hepatocytter. Etablerede cellelinjer og lymfocytter eksponeres for teststoffer både med og uden et passende metabolisk aktiveringssystem.
Fremgangsmåde
Forberedelse af kulturer
Etablerede cellelinjer fremstilles på basis af stamkulturer (f.eks. ved trypsinering eller afrystning) og udsås med passende tæthed i dyrkningsskåle, hvorefter de inkuberes ved 37 oC. Primære rottehepatocytkulturer etableres, når hepatocytter umiddelbart efter isolering anbringes i et passende medium og får lov til at hæfte sig til den voksende overflade. Humane lymfocytkulturer dyrkes under anvendelse af dertil egnede teknikker.
Eksponering af kulturerne for teststoffet Primærkulturer af rottehepatocytter
Rottehepatocytter eksponeres for teststoffet kort tid efter isolering i et passende tidsrum i et medium, som indeholder 3H-TdR. Efter eksponeringen fjernes cellerne fra mediet, hvorefter de vaskes, fikseres og tørres. Pladerne dyppes i en autoradiografisk emulsion (alternativt kan stripping -film anvendes) og eksponeres, fremkaldes, farves og tælles.
Etablerede cellelinjer og lymfocytter
Autoradiografisk teknik: Cellekulturerne eksponeres først for teststoffet i et passende tidsrum og derefter for 3H-TdR. Eksponeringsperioderne afhænger af stofferne, de metaboliske aktiveringssystemer og celletyperne. Eksponeringen for 3H-TdR bør enten foregå samtidig med eksponeringen for teststoffet eller få minutter efter, således at UDS måles på det tidspunkt, hvor aktiviteten er størst. Valget mellem de to fremgangsmåder afhænger af risikoen for interaktion mellem teststoffet og 3H-TdR. Det er muligt at skelne mellem UDS og semi-konservativ dna replication, idet den sidstnævnte proces inhiberes ved anvendelse af f.eks. argininfattige medier, et lavt serumindhold eller tilsætning af hydroxyurinstof til kulturmediet. LSC-måling af UDS: Inden eksponering for teststoffet blokeres cellernes overgang til S-fasen som tidligere beskrevet. Derefter eksponeres cellerne på samme måde som ved den autoradiografiske teknik. Umiddelbart efter inkubationen ekstraheres cellernes dna og det totale dna-indhold samt mængden af inkorporeret 3H-TdR måles. Når de nævnte teknikker anvendes på humane lymfocytter, er det unødvendigt at hæmme den semi-konservative dna replication, med mindre der er tale om stimulerede kulturer.
Analyse
Autoradiografisk måling
Ved måling af UDS i dyrkede celler medregnes kerner i S-fasen ikke. Der tælles mindst 50 celler pr. koncentration. Objektglassene kodes før tællingen. På hvert glas tælles en række forskellige tilfældigt valgte områder med stor indbyrdes afstand. Mængden af inkorporeret 3H-TdR i cytoplasmaet bestemmes ved tælling i tre områder på størrelse med kernen i hver optalt celles cytoplasma.
LSC-måling
Ved LSC-måling af UDS anvendes et passende antal kulturer pr. koncentration og pr. kontrolforsøg. Alle resultater efterprøves i et uafhængigt forsøg.
2. DATA Data opstilles i tabelform.
2.
2.1. AUTORADIOGRAFISK MÅLING Mængden af inkorporeret 3H-TdR i cytoplasmaet og antallet af korn, som registreres i cellekerneområdet, anføres separat. Fordelingen af mængden af inkorporeret 3H-TdR i cytoplasmaet og antallet af korn pr. kerne kan beskrives ved hjælp af middel, median og modus.
2.2. LSC-MÅLING Ved LSC-måling angives 3H-TdR indlejringen som dpm/μg dna. Indlejringsfordelingen kan beskrives ved hjælp af middel dpm/μg dna med tilhørende standardafgivelse. Evalueringen af data baseres på passende statistiske metoder.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:
de anvendte celler, tæthed og antal passager på eksponeringstidspunktet, antal cellekulturer
metoder til opretholdelse af cellekulturer, herunder medium, temperatur og CO2-koncentration
teststof, vehikel, koncentrationer og begrundelse for valget af de anvendte koncentrationer
detaljerede oplysninger om de metaboliske aktiveringssystemer
eksponeringsplan
positiv og negativ kontrol
den anvendte autoradiografiske teknik
fremgangsmåde ved blokering af cellernes overgang til S-fasen
fremgangsmåde ved ekstration af dna og bestemmelse af det totale dna-indhold ved LSC-målingen
om muligt dosis-responsforhold
statistisk evaluering
diskussion af resultaterne
fortolkning af resultaterne.
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING Se den generelle indledning til del B.
4. HENVISNINGER Se den generelle indledning til del B.
B.19. SØSTERKROMATID OMBYTNING (SCE) IN VITRO
B.19.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Se den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Se den generelle indledning til del B.
1.3. REFERENCESTOFFER Ingen.
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN Søsterkromatid ombytning (SCE) test er en korttidstest, som anvendes til påvisning af reciprok udveksling af DNA mellem de to søsterkromatider i et kromosom under replikation. Ved SCE sker der en udveksling af dna replikationsprodukter ved tilsyneladende homologe loci. Udvekslingsprocessen bygger antageligt på brud og genforening af dna-kæder, men dens molekylære grundlag er næsten ukendt. For at kunne påvise SCE er det nødvendigt at differentialmærke søsterkromatiderne, hvilket kan gøres ved at inkorporere bromdeoxyuridin (BrdU) i kromosomernes dna gennem to cellecykler. Pattedyrceller eksponeres in vitro for teststoffet med og uden et eksogent metabolisk aktiveringssystem fra pattedyr, hvis dette skønnes relevant, og dyrkes gennem to cellecykler i et medium, som indholder BrdU. Cellerne behandles med en tentrådsinhibitor (f.eks. colchicin) med henblik på at akkumulere celler på et metafaselignende trin i mitosen (c-metafase), hvorefter de høstes og præpareres til kromosomanalyse.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
Der kan anvendes primærkulturer (humane lymfocytter) eller etablerede cellelinjer (f.eks. Chinese Hamster Ovary celler). Ved anvendelse af cellelinjer bør det undersøges, om kulturen er kontamineret med mycoplasma.
Der anvendes egnede kulturmedier og inkubationsbetingelser (temperatur, dyrkningsskåle, CO2-koncentration og fugtighed).
Teststoffet tilsættes kulturmediet eller opløses eller suspenderes i et egnet vehikel, inden cellerne eksponeres. Den derved opnåede koncentration af vehikel i testkulturen bør ikke påvirke cellernes levedygtighed eller vækstrate og en mulig påvirkning af SCE-frekvensen kontrolleres ved dyrkning af en kontrolkultur i opløsningsmidlet.
Cellerne eksponeres for teststoffet både med og uden et eksogent metabolisk aktiveringssystem fra pattedyr. Når der benyttes celletyper med endogen metabolisk aktivering, bør aktiveringsform og -hastighed være egnet til den kemiske stofklasse, der testes.
1.6. Forsøgsbetingelser
Antal kulturer
Der anvendes mindst to parallelle kulturer for hvert eksperimentelt punkt.
Positiv og negativ kontrol
Som positiv kontrol anvendes i hvert enkelt forsøg både en direkte virkende kemisk forbindelse og en forbindelse, som kræver metabolisk aktivering. Desuden foretages vehikelkontrol. Følgende kemiske forbindelser kan f.eks. anvendes til positiv kontrol: Når det skønnes relevant, bør der foretages supplerende positiv kontrol med anvendelse af en kemisk forbindelse af samme kemiske stofklasse som teststoffet.
direkte virkende forbindelse:
ætylmetansulfonat
indirekte virkende forbindelse:
cyclofosfamid.
Eksponeringskoncentrationer
Der anvendes mindst tre koncentrationer af teststoffet med passende intervaller mellem koncentrationerne. Den højeste koncentration bør have en tydelig toksisk virkning, men den må ikke forhindre den nødvendige celledeling. Stoffer, som er relativt uopløselige i vand, testes under anvendelse af passende fremgangsmåder op til opløselighedsgrænsen. Den højeste koncentration af ikke-toksiske teststoffer, som er frit opløselige i vand, fastlægges fra test til test.
Fremgangsmåde
Dyrkning
Cellelinjer etableres på basis af stamkulturer (f.eks. ved trypsinering eller afrystning) og udsås med passende tæthed i dyrkningsskåle, hvorefter de inkuberes ved 37 oC. Når der er tale om monolagskulturer, justeres antallet af celler pr. kulturskål, således at kulturerne på høsttidspunktet højst dækker 50 % af vækstarealet. Cellerne kan også dyrkes i suspension. Humane lymfocytkulturer dyrkes under anvendelse af dertil egnede teknikker på basis af hepariniseret blod og inkuberes ved 37 oC.
Eksponering
Celler i eksponentiel vækstfase eksponeres for teststoffet i et passende tidsrum. Som oftest vil en eller to timer være tilstrækkeligt, men i nogle tilfælde kan eksponeringsperioden udvides til at dække to fulde cellecykler. Celler, hvis endogene metaboliske aktivering er utilstrækkelig, eksponeres både med og uden tilsætning af et passende metabolisk aktiveringssystem. Efter eksponeringen vaskes cellerne frie for teststof og dyrkes gennem to cellecykler i et medium, som indeholder BrdU. Alternativt kan cellerne eksponeres for teststoffet og BrdU samtidigt gennem en periode svarende til to cellecykler. Humane lymfocytter eksponeres, mens de befinder sig i semisynkron tilstand. Cellerne analyseres under deres anden deling efter eksponeringen, hvilket sikrer, at eksponeringsperioden dækker størstedelen af de følsomme faser i cellecyclus. Alle kulturer, som er tilsat BrdU, opbevares og manipuleres i mørke eller svagt lys fra glødelamper frem til cellerne høstes for at minimere fotolysen af dna, som indeholder BrdU.
Høst af celler
Cellekulturerne behandles med en tentrådsinhibitor (f.eks. colchicin) en til fire timer, før de høstes. Høst og kromosompræparering foregår særskilt for hver enkelt kultur.
Kromosompræparering og farvning
Ved kromosompræpareringen anvendes cytogenetiske standardteknikker. Farvning på objektglas med henblik på at påvise SCE kan foretages på en række forskellige måder (f.eks. fluorescens plus Giemsafarvning).
Analyse
Antallet af celler, som underkastes analyse, baseres på den spontane SCE-frekvens i kontrolforsøg. Normalt undersøges mindst 25 velpræparerede metafaser pr. kultur for SCE. Objektglassene kodes før analysen. Ved analyse af humane lymfocytter medtages kun metafaser med 46 centromerer. Ved analyse af etablerede cellelinjer medtages kun metafaser med det modale antal centromerer ± 2. Det anføres, hvorvidt ombytning i mærkningen omkring centromeret betragtes som SCE. Resultaterne efterprøves i et uafhængigt forsøg.
2. DATA Data opstilles i tabelform. Antal SCE pr. metafase og antal SCE pr. kromosom anføres separat for alle eksponerede kulturer og kontrolkulturer. Evalueringen af data baseres på passende statistiske metoder.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:
de anvendte celler, metoder til opretholdelse af cellekulturer
forsøgsbetingelser: mediernes sammensætning, CO2-koncentration, teststofkoncentration, det anvendte vehikel, inkubationstemperatur, eksponeringsperiode, den anvendte tentrådsinhibitor plus oplysninger om koncentration og behandlingens varighed, det anvendte metaboliske aktiveringssystem, positiv og negativ kontrol
antal cellekulturer pr. eksperimentelt punkt
detaljerede oplysninger om objektpræpareringsteknikken
antal analyserede metafaser (separate oplysninger for hver enkelt kultur)
gennemsnitligt antal SCE pr. celle og pr. kromosom (data angives separat for hver kultur)
SCE-registreringskriterier
begrundelse for valget af doser
om muligt dosis-responsforhold
statistisk evaluering
diskussion af resultaterne
fortolkning af resultaterne.
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING Se den generelle indledning til del B.
4. HENVISNINGER Se den generelle indledning til del B.
B.20. KØNSBUNDET RECESSIV LETAL TEST — DROSOPHILA MELANOGASTER
B.20.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Se den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Se den generelle indledning til del B.
1.3. REFERENCESTOFFER Ingen.
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN Ved kønsbundet recessiv letal test (SLRL) under anvendelse af Drosophila melanogaster undersøges forekomsten af både punktmutationer og mindre tabsmutationer hos insektets afkom. Der er tale om en fremadmutationstest, hvorved det er muligt at screene ca. 800 loci på X-kromosomet med henblik på registrering af mutationer. Dette antal udgør ca. 80 % af alle X-kromosomets loci. X-kromosomet udgør omkring en femtedel af den samlede haploide kromosommængde. Mutationer i Drosophila melanogasters X-kromosom kommer fænotypisk til udtryk hos hanner, som er bærere af det muterede gen. Når mutationen under hemizygote betingelser er letal, konstateres dette som fravær af en af de to typer hanner, der normalt findes i en heterozygot huns afkom. I SLRL-testen udnyttes dette forhold ved hjælp af specielt arrangerede kromosomer med særlige markører.
1.5 KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6. Forberedelser
Stammer
Der kan anvendes hanner af veldefinerede vildtypestammer og hunner fra Muller-5-stammen. Hunner fra andre stammer med passende mærkning og multipelt inverterede X-kromosomer kan også anvendes.
Teststof
Teststoffet opløses i vand. Stoffer, som er uopløselige i vand, kan opløses eller suspenderes i egnede bærestoffer (f.eks, en blanding af ætanol og Tween-60 eller -80) og derefter fortyndes i vand eller saltvand inden indgift. Dimetylsulfoxid bør ikke benyttes som bærestof.
Antal
Testen udformes således, at testfølsomhed og -specificitet er fastlagt på forhånd. Den spontane mutationsfrekvens, som registreres i kontrolforsøg, vil være af stor betydning for antallet af eksponerede kromosomer, der skal analyseres.
Administrationsmåde
Eksponeringen kan foregå ved oral indgivelse, injektion eller ved udsættelse for gasser eller dampe. Teststoffet kan eventuelt indgives i en sukkeropløsning. Om nødvendigt kan det opløses i en 0,7 % NaCl-opløsning og injiceres i thorax eller abdomen.
Negative og positive kontroller
Der foretages negativ (vehikel) og positiv kontrol. Hvis der foreligger egnede historiske kontroldata fra laboratorieforsøg, er det imidlertid ikke nødvendigt at foretage sideløbende kontrol.
Eksponeringskoncentrationer
Der anvendes tre eksponeringskoncentrationer. Til en foreløbig vurdering kan anvendes en enkelt koncentration, som enten kan være den højeste koncentration, insekterne kan tåle, eller en koncentration, som forårsager nogen grad af toksisk virkning. Ved ikke-toksiske stoffer eksponeres for de størst mulige koncentrationer.
Fremgangsmåde
Vildtypehanner (tre til fem dage gamle) eksponeres for teststoffet og parres enkeltvis med flere jomfruelige hunner fra Muller-5-stammen eller fra andre stammer med passende markører (multipelt inverterede X-kromosomer). Hunnerne udskiftes med nye jomfruelige hunner hver anden eller hver tredje dag, indtil hele kønscellecyklus er dækket. Hunnernes afkom registreres med henblik på konstatering af letale effekter, som svarer til eksponeringens virkning på henholdsvis modne sædceller, spermatider i sene stadier eller middelstadier, spermatider i tidlige stadier, spermatocytter og spermatogonier. Heterozygote F1-hunner fra de ovennævnte krydsninger parres individuelt (dvs. en hun pr. glas) med deres brødre. I F2-generationen registreres hver bestand med henblik på konstatering af fravær af vildtypehanner. Hvis en bestand er afkom af en F1-hun, som synes at bære et letalt gen i det parentale X-kromosom (dvs. der optræder ingen hanner med det eksponerede kromosom), testes døtre af denne hun med samme genotype med henblik på konstatering af, om den letale effekt gentages i næste generation.
2. DATA Data opstilles i tabelform. Antal testede X-kromosomer, antal ufrugtbare hanner og antal letale kromosomer anføres for hver eksponeringskoncentration og for hver enkelt af de eksponerede hanners parringsperioder. Ligeledes anføres antal klynger af forskellig størrelse pr. han. Alle resultater efterprøves i et uafhængigt forsøg. Evalueringen af kønsbunden recessiv letal test baseres på passende statistiske metoder. I tilfælde af ophobning af generationer med recessive letale gener, som stammer fra en enkelt han, registreres disse og evalueres på et passende statistisk grundlag.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:
stammer: de anvendte Drosophila-stammer, insekternes alder, antal eksponerede hanner, antal sterile hanner, antal etablerede F2-bestande, antal F2-bestande uden afkom, antal kromosomer med letale gener på hvert kønscellestadium
kriterier for fastlæggelse af størrelsen af de eksponerede grupper
forsøgsbetingelser: detaljeret beskrivelse af eksponerings- og stikprøvetagningsplan, eksponeringskoncentrationer, toksicitetsdata, negativ (opløsningsmiddel) og positiv kontrol, såfremt der foretages kontrol
kriterier for registrering af letale mutationer
om muligt dosis-responsforhold
statistisk evaluering
diskussion af resultaterne
fortolkning af resultaterne.
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING Se den generelle indledning til del B.
4. HENVISNINGER Se den generelle indledning til del B.
B.21. CELLETRANSFORMATIONSTEST — PATTEDYRCELLER IN VITRO
B.21.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Se den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Se den generelle indledning til del B.
1.3. REFERENCESTOFFER Ingen.
1.4. PRINCIPPER FOR TESTMETODEN Kulturer af pattedyrceller kan anvendes til påvisning in vitro af fænotypiske forandringer, som induceres af kemiske forbindelser, der forbindes med maligne transformationer in vivo. Hyppigt anvendte celletyper er C3H10T1/2, 3T3, SHE, Fischer-rotte, og testene bygger på forandringer i cellemorfologien, vækstevnen eller forankringsevnen i blød agar. Der findes også mindre hyppigt anvendte systemer, som bruges til undersøgelse af andre fysiologiske eller morfologiske forandringer i celler som følge af eksponering for karcinogene kemiske forbindelser. Der er ikke beskrevet nogen direkte virkningsmekanistisk forbindelse mellem cancer og de genetiske endpoints, der anvendes i disse in vitro test. Nogle af testsystemerne kan anvendes til påvisning af tumorpromotorer. Den cytotoksiske effekt kan bestemmes ved måling af teststoffets påvirkning af evnen til at danne kolonier (kloningsstyrken) eller af kulturernes vækstrater. Formålet med at måle den cytotoksiske effekt er at konstatere, om eksponeringen for teststoffet er toksikologisk relevant, men kan ikke benyttes til beregning af transformationsfrekvensen i alle test, eftersom nogle kræver lang inkubationstid og/eller overførsel til nye plader.
1.5. KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6. Forberedelser
Celler
Der kan anvendes en række forskellige cellelinjer eller primærceller, afhængigt af hvilken transformationstest der foretages. Forsøgslederen må sikre, at de anvendte celler undergår relevante fænotypiske forandringer efter eksponering for kendte karcinogener, og forsøgslederens eget laboratorium må have påvist og dokumenteret den anvendte tests validitet og pålidelighed.
Medium
Der anvendes medier og forsøgsbetingelser i overensstemmelse med den anvendte transformationstest.
Teststof
Teststoffet tilsættes kulturmediet eller opløses eller suspenderes i et egnet vehikel, inden cellerne eksponeres. Den derved opnåede vehikelkoncentration bør ikke påvirke cellernes levedygtighed, vækstrate eller transformationsfrekvens.
Metabolisk aktivering
Cellerne eksponeres for teststoffet både med og uden et eksogent metabolisk aktiveringssystem fra pattedyr. Når der benyttes celler med endogen metabolisk aktivering, bør det være påvist, at aktiveringsformen egner sig til den form for kemisk forbindelse, der testes.
Forsøgsbetingelser
Positive og negative kontroller
Som positiv kontrol anvendes i hvert enkelt forsøg både en direkte virkende kemisk forbindelse og en forbindelse, som kræver metabolisk aktivering. Desuden foretages negativ (vehikel) kontrol. Følgende kemiske forbindelser kan f.eks. anvendes til positiv kontrol: Når det skønnes relevant, bør der foretages supplerende positiv kontrol med anvendelse af en forbindelse af samme kemiske stofklasse som teststoffet.
direkte virkende forbindelser:
etylmetansulfonat
β-propiolacton
forbindelser som kræver metabolisk aktivering:
2-acetylaminofluoren
4-dimetylaminoazobenzen
7,12-dimetylbenzanthracen.
Eksponeringskoncentrationer
Der anvendes en række forskellige koncentrationer af teststoffet, således at der frembringes koncentrationsafhængige toksiske virkninger. Den højeste koncentration bør medføre en lav overlevelsesgrad, og overlevelsesgraden ved den laveste koncentration bør være af samme størrelsesorden som ved det negative kontrolforsøg. Stoffer, som er relativt uopløselige i vand, testes under anvendelse af passende fremgangsmåder op til opløselighedsgrænsen. Den højeste koncentration af ikke-toksiske teststoffer, som er frit opløselige i vand, fastlægges fra test til test.
Fremgangsmåde
Cellerne eksponeres i en passende periode afhængig af det anvendte testsystem. Dette kan indebære gentagne doseringer med udskiftning af medium (og om nødvendigt ny metabolisk aktivering), hvis der er tale om langvarig eksponering. Celler, hvis endogene metaboliske aktivering er utilstrækkelig, testes både med og uden et passende metabolisk aktiveringssystem. Efter eksponeringen vaskes cellerne frie for teststof, hvorefter de dyrkes med henblik på at lade den transformerede fænotype, testen bygger på, komme til udtryk og med henblik på bestemmelse af transformationsfrekvensen. Alle resultater efterprøves i et uafhængigt forsøg.
2. DATA Data opstilles i tabelform og kan foreligge i forskellige former afhængigt af den anvendte test. Der kan f.eks. være tale om optælling på plader, registrering af positive plader eller antal transformerede celler. Når det er relevant, udtrykkes overlevelsesgraden som en procentdel af overlevelsen i kontrolforsøgene, og transformationsfrekvensen udtrykkes som antal transformerede celler pr. overlevende. Evalueringen af data baseres på passende statistiske metoder.
3. RAPPORTERING
3.
3.1. FORSØGSRAPPORT Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:
den anvendte celletype, antal cellekulturer, metoder til opretholdelse af cellekulturer
forsøgsbetingelser: teststofkoncentration, anvendt vehikel, inkubationstemperatur, inkubationstid, eksponeringens varighed og frekvens, celletæthed under eksponeringen, det anvendte eksogene metaboliske aktiveringssystem, positive og negative kontroller, specifikation af den fænotype testen bygger på, det anvendte selektive system (hvis et sådant er anvendt), begrundelse for valget af doser
metoder til registrering af levedygtige og transformerede celler
statistisk evaluering
diskussion af resultaterne
fortolkning af resultaterne.
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING Se den generelle indledning til del B.
4. HENVISNINGER Se den generelle indledning til del B.
B.22.
1. METODE
1.
1.1. INDLEDNING Se den generelle indledning til del B.
1.2. DEFINITIONER Se den generelle indledning til del B.
1.3. REFERENCESTOFFER Ingen.
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN Dominante letale virkninger forårsager, at fostret dør. Nå der ved eksponering for kemiske forbindelser induceres dominante letale mutationer, er dette et tegn pi, at forsøgsdyreartens kønscellevæv er blevet afficeret. Der er bred enighed om, at dominante letale gener opstår på grund af kromosomskader (strukturelle og numeriske anomalier). Hvis eksponerede hunners afkom dør på det embryonale stade, kan dette også skyldes toksiske virkninger. Normalt eksponeres hanner for teststoffet, hvorefter de parres med ueksponerede jomfruelige hunner. Kønscellernes forskellige stadier kan undersøges separat ved anvendelse af på hinanden følgende parringsperioder. Forøgelsen af antallet af døde implantater pr. hun i den eksponerede gruppe i forhold til antallet af døde implantater pr. hun i kontrolgruppen er udtryk for den letale virkning efter implantation. Den letale virkning før implantation kan vurderes på grundlag af optælling af corpora lutea eller ved sammenligning af det totale antal implantater pr. hun i de eksponerede grupper og kontrolgruppen. Den totale dominante letale virkning er summen af de letale virkninger før og efter implantation. Beregningen af den totale dominante letale virkning baseres på sammenligning af antallet af levende implantater pr. hun i forsøgsgruppen og antallet af levende implantater pr. hun i kontrolgruppen. Fald i antallet af implantater i bestemte tidsperioder kan skyldes celledrab (af spermatocytter og/eller spermatogonier).
1.5. KVALITETSKRITERIER Ingen.
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN
1.6. Forberedelser
Hvis det er muligt, opløses eller suspenderes teststoffet i fysiologisk saltvand. Kemiske forbindelser, som er uopløselige i vand, opløses eller suspenderes i egnede vehikler. Det anvendte vehikel bør ikke interferere med teststoffet eller have nogen toksisk virkning. Testopløsningen anvendes umiddelbart efter fremstillingen.
Forsøgsbetingelser
Administrationsmåde
Normalt gives hele dosis på en gang. Der kan også anvendes dosering ad flere gange, når der er toksikologisk begrundelse herfor. Sædvanligvis indgives teststoffet ved oral intubering eller intraperitoneal injektion. Der kan også benyttes andre former for indgift.
Forsøgsdyr
Rotter eller mus anbefales som forsøgsdyr. Sunde og fuldt kønsmodne dyr fordeles randomiseret i forsøgs- og kontrolgrupper.
Antal og køn
Der anvendes et passende antal hanner under hensyntagen til den spontane variation i den biologiske egenskab, der danner grundlag for testen. Det valgte antal baseres på den på forhånd fastlagte testfølsomhed og signifikansstyrke. I et typisk forsøg vil antallet af hanner være tilstrækkeligt til, at mellem 30 og 50 hunner bliver drægtige i hver parringsperiode.
Negative og positive kontroller
Normalt foretages sideløbende positiv og negativ (vehikel) kontrol i hvert forsøg. Når der foreligger acceptable positive kontrolresultater fra nyligt foretagne forsøg i samme laboratorium, kan disse dog anvendes i stedet for sideløbende positiv kontrol. Positive kontrolstoffer anvendes i tilstrækkeligt lave doser (f.eks. MMS, i.p., 10 mg/kg) til at vise testens følsomhed.
Dosisniveauer
Der anvendes normalt tre forskellige dosisniveauer. Den største dosis bør forårsage tegn på toksisk virkning eller nedsætte de eksponerede dyrs fertilitet. I nogle tilfælde vil et enkelt højt dosisniveau være tilstrækkeligt.
Grænsetest
Når der er tale om ikke-toksiske stoffer, testes en enkeltdosis på 5 g/kg eller gentagen indgift af 1 g/kg/dag.
Fremgangsmåde
Der kan anvendes flere forskellige doseringsskemaer. Normalt gives hele dosis på en gang, men andre skemaer lader sig også anvende. Hannerne parres efter doseringen individuelt med en eller to ikke-doserede jomfruelige hunner i på hinanden følgende perioder af passende længde. Hunnerne placeres hos hannerne i en periode svarende til mindst en ægcyklus, eller indtil parringen har fundet sted, hvilket konstateres ved tilstedeværelse af sperma i vagina eller en vaginalprop. Antallet af parringer efter doseringen fastlægges på grundlag af doseringsskemaet, som skal sikre, at alle kønscellestadier er repræsenteret efter doseringen. Hunner aflives i anden halvdel af drægtighedsperioden, og uterus' indhold undersøges med henblik på bestemmelse af antallet af levende og døde implantater. Ovarierne undersøges med henblik på bestemmelse af antallet af corpora lutea.
2. DATA Data opstilles i tabelform med angivelse af antal hanner samt antal drægtige og ikke drægtige hunner. Resultaterne af hver enkelt parring, herunder identificering af hver enkelt han og hun anføres individuelt. For hver hun anføres parringsuge, hannens dosis og antallet af levende og døde implantater. Beregningen af den totale dominante letale virkning baseres på sammenligning af antallet af levende implantater pr. hun i forsøgsgruppen og antallet af levende implantater pr. hun i kontrolgruppen. Forholdet mellem døde og levende implantater i forsøgsgruppen sammenlignes med forholdet i kontrolgruppen med henblik på bestemmelse af den letale virkning efter implantation. Hvis data registreres som tidlige og sene dødsfald, skal dette fremgå af tabellerne. Hvis der foretages vurdering af den letale virkning før implantation, anføres denne. Den letale virkning før implantation kan beregnes som forskellen mellem antallet af corpora lutea og antallet af implantater eller som et lavere gennemsnitligt antal implantationer pr. uterus i forhold til kontrolparringerne. Evalueringen af data baseres på passende statistiske metoder.
dyreart, stamme, de anvendte dyrs alder og vægt, antal dyr af hvert køn i forsøgs- og kontrolgrupperne
teststof, bærestof, de anvendte dosisniveauer og begrundelse for valget af disse, negativ og positiv kontrol, toksicitetsdata
administrationsmåde og doseringens varighed
parringsskema
metode til konstatering af, om parring har fundet sted
aflivningstidspunkt
kriterier for registrering af dominante letale gener
om muligt dosis-responsforhold
statistisk evaluering
3221 bestemmelser mere vises ikke her; hver har sin egen adresse.