Κανονισμός (εκ) αριθ. 440/2008 Της επιτροπής της 30ής Μαΐου 2008 για καθορισμό των μεθόδων δοκιμής κατ’ εφαρμογή του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1907/2006 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, για την καταχώριση, την αξιολόγηση, την αδειοδότηση και τους περιορισμούς των χημικών προϊόντων (REACH) (Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ)
Grade B
mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.
Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/el
Contents
- Preamble
- ANNEX
- Α.1.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.4.4.
- 1.5. ΠΙΝΑΚΑΣ: ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Α. Β. Γ. Δ.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.1.1.
- 1.6.1.2. Συσκευή:
- 1.6.2.
- 1.6.4.
- 4.(1)(2)(3)(4)
- A.2.
- 1.
- 1.4.
- 1.5. Πινακας 1: Σύγκριση των μεθόδων
- 1.6.
- 1.6.4.
- 1.6.6.
- 2. Πίνακας 2 Συντελεστές διόρθωσης θερμοκρασίας (fT)
- A.3.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 3. ΠΙΝΑΚΑΣ: 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ
- 3. ΠΙΝΑΚΑΣ: 1.4.1.1.1.4.1.2. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ
- 3. ΠΙΝΑΚΑΣ: 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
- A.4.
- 1.
- 1.4.
- 1.5. Πινακας 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Ποιοτικά κριτήρια
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.2.
- 1.6.2.2.
- 1.6.4.
- 1.6.4.2.
- 1.6.5.
- 1.6.6.
- 1.6.6.1. Αδρανές αέριο:
- 1.6.6.2. Προπαρασκευή της στήλης κορεσμού:
- α)
- β)
- 1.6.7.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
- Α.5.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.4.
- 1.6.4.1.
- 1.6.4.1.3. Εικόνα Σώμα μέτρησης
- 1.6.4.2.
- 1.6.4.2.2. Συναρμολόγηση:
- α)
- β)
- 2. Πίνακας Διόρθωση της μετρηθείσας επιφανειακής τάσεως Μόνο για υδατικά διαλύματα, ρ = 1 g/cm3
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)
- A.6.
- 1.
- 1.4.
- 1.5.
- 1.6.
- 1.6.3.
- 1.6.3.2. Διαδικασία δοκιμής:
- 1.6.3.3. Συσκευή
- 1.6.3.4. Συσκευή (βλέπε εικόνες 4 και 3)
- 1.6.4.
- 2.
- 3.
- A.8.
- 1.
- 1.3. Μέθοδος ανακινούμενης φιάλης
- 1.4.
- 1.5.
- 1.5.1. Μέθοδοι ανακινούμενης φιάλης
- 1.5.2. Μέθοδος ανακινούμενης φιάλης
- 1.5.3. Μέθοδοι ανακινούμενης φιάλης
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.2.1.
- 1.6.2.3.
- 1.6.3.
- 1.6.3.1. Συσκευή
- 1.6.3.2. Υπολογισμός του νεκρού χρόνου t0
- 2. Μέθοδος ανακινούμενης φιάλης
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
- A.9.
- 1.
- 1.5.
- 1.6.
- 1.6.3.
- 1.6.3.2. Συσκευή ABEL:
- Α.10.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 3.
- A.11.
- 1.
- 1.6.
- A.12.
- 1.
- 1.3.
- 1.6.
- 1.6.1
- 1.6.2.
- 1.6.3.
- 1.6.4.
- A.13.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2. α)
- 2.
- A.14.
- 1.
- 1.1. α)
- 1.4.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.2.
- 1.6.2.2. α)
- 1.6.3.
- 1.6.3.2. α)
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)
- A.15.
- 1.
- 1.6.
- Α.16.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 4.
- Εικόνα 1 Υπόδειγμα κύβου ελέγχου 20 mm
- Εικόνα 2 Τυπική καμπύλη θερμοκρασίας/χρόνου
- Α.17.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.2.
- 3.
- 3.2. α)
- Α.18.
- 1.
- 1.6.
- 2.
- 2.2.
- 3.(1)(2)(3)(4)
- A.19.
- 1.
- 1.6.
- 2.
- 2.2.
- 3.(1)(2)(3)(4)
- A.20.
- 1.
- 1.5.
- 1.5.4.
- 2.
- 3.
- 3.1.
- A.21. Ι.
- 1.6.
- 1.6.1.
- 1.6.1.2.
- 2.
- 2.1 Πίνακας 1 Παραδείγματα αποτελεσμάτων
- 3.
- 3.2 α)
- 4.(1)
- Εικόνα 1 Δοχείο πίεσης
- Εικόνα 2 Υποστάτης
- Εικόνα 3 Σύστημα ανάφλεξης
- 1.
- 2.
- 4.
- 1.2. Για στερεές ουσίες
- Προσάρτημα 1 Μέθοδος εκτίμησης
- ΕΙΣΑΓΩΓΗ
- ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ
- ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΥ
- ΕΚΘΕΣΗ
- ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
- Προσάρτημα 2
- Εικόνα 1 Συσκευή προσδιορισμού της καμπύλης τάσεως ατμών κατά τη δυναμική μέθοδο
- Εικόνα 2α Συσκευή προσδιορισμού της καμπύλης τάσεως ατμών σύμφωνα με τη στατική μέθοδο (χρησιμοποιώντας μανόμετρο σχήματος σωλήνα U)
- Εικόνα 2β Συσκευή προσδιορισμού της καμπύλης τάσης ατμών σύμφωνα με τη στατική μέθοδο (χρησιμοποιώντας δείκτη πίεσης)
- Εικόνα 3 Ισοτενισκόπιο (βλέπε υποσημείωση 7)
- Εικόνα 4 Συσκευή προσδιορισμού της καμπύλης τάσης ατμών σύμφωνα με τη μέθοδο του ζυγού τάσης ατμών
- Εικόνα 5 Παράδειγμα συσκευής για εξάτμιση σε χαμηλή πίεση με τη μέθοδο της διάχυσης, με κύτταρο διάχυσης όγκου 8 cm3
- Εικόνα 6α Παράδειγμα συστήματος ροής για τον προσδιορισμό της τάσης ατμών με τη μέθοδο κορεσμού αερίου
- Εικόνα 6β Παράδειγμα συστήματος για τον προσδιορισμό της τάσης ατμών με τη μέθοδο κορεσμού αερίου, με ένα τριχοειδές τοποθετημένο μετά από το θάλαμο κορεσμού
- Εικόνα 7 Παράδειγμα της πειραματικής διάταξης για τη μέθοδο στροβιλιζόμενης σφαίρας
- Εικόνα 8 Παράδειγμα μετρητικής κεφαλής στροβιλιζόμενης σφαίρας
- Εικόνα Ι Μέθοδος έκλουσης στήλης με αντλία ανακύκλωσης
- Εικόνα 2 Μια τυπική μικροστήλη
- Εικόνα 3 Μια τυπική μικροστήλη
- Εικόνα 4 Μέθοδος έκλουσης στήλης με δοχείο ισοστάθμισης
- ΜΕΘΟΔΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΥ Αρχή των μεθόδων υπολογισμού
- Μέθοδος με το π του HANSCH
- Μέθοδος Rekker
- Μέθοδος Hansch-Leo
- Συνδυασμένη μέθοδος
- i)
- ii)
- iii)
- iv)
- Εικόνα Καλούπι και εξαρτήματα για την παρασκευή της στήλης
- Εικόνα Συσκευή
- Παράδειγμα προδιαγραφής υλικού για τη δοκιμή θερμικής ευαισθησίας (βλέπε DIN 1623) (1)(2)(3)
- Εικόνα 1 Συσκευή δοκιμής θερμικής ευαισθησίας
- Εικόνα 2 Δοκιμή θερμικής ευαισθησίας
- Εικόνα 3 Βαθμονόμηση ταχύτητας θέρμανσης για τη δοκιμή θερμικής ευαισθησίας
- Εικόνα 4 Συσκευή δοκιμής κρούσης
- Εικόνα 5 Συσκευή ευαισθησίας σε τριβή
- Εικόνα Καλούπι και εξαρτήματα για την ετοιμασία της στήλης
- 1.1.1.1.2.1.3.1.4.
- 3.(1)(2)(3)(4)(5)(1) (6)(7)(8)(9)
- ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.
- i)
- ii)
- Β.1α.
- 1.
- 1.4
- 1.5
- 1.5.3
- 1.6
- 3
- 4(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
- Β.1β.
- 1.
- 1.4
- 1.5
- 1.6
- 3.
- 4(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
- Β.2.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.3.
- 3.
- 3.1.
- Β.3.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.3. Εκτίμηση τοξικότητας στο άλλο φύλο
- 3.
- Β.4.
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 2.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
- ΠΙΝΑΚΑΣ 1 Ερύθημα και σχηματισμός εσχάρας Οίδημα ΔΙΑΒΑΘΜΙΣΗ ΤΩΝ ΔΕΡΜΑΤΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ
- Β.5.
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.4.2.3
- 1.4.2.7
- 2.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
- Πίνακας Ι ΔΙΑΒΑΘΜΙΣΗ ΤΩΝ ΟΦΘΑΛΜΙΚΩΝ ΚΑΚΩΣΕΩΝ
- Κερατοειδής
- Ίριδα
- Επιπεφυκός
- Χήμωση
- Β. 6
- 1.
- 1.5.
- 1.5.1.
- 1.5.1.2.
- 1.5.1.3.
- 1.5.2.
- 1.5.2.2.
- 1.5.2.3.
- 3. Έκθεση δοκιμής (ΔΜΙΧ και δοκιμή Buehler)
- Β.7
- 1.
- 1.4.
- 1.4.2.
- 1.4.3.
- 3. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ
- Β.8.
- 1.
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.3.
- 3.
- 3.1.
- pt_2 α)
- Β.9.
- 1
- 1.6.
- 1.6.2.
- 1.6.3.
- 3.
- Β.10.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.4.3.
- 2.
- 3. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
- Β.11.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.5.
- 2.
- 3. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
- B.12.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.5.
- 1.5.2. α)
- 2.
- 3 ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
- Β.13/14.
- 1.
- 1.5.
- 1.5.1.
- 1.5.2.
- 2.
- 3. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
- Β.15.
- 1.
- 1.6. Προετοιμασία
- Μεταβολική ενεργοποίηση
- Στελέχη δοκιμασιών
- Μέσον καλλιέργειας
- Χρήση αρνητικών και θετικών ελέγχων
- Συγκέντρωση έκθεσης
- Συνθήκες επώασης
- Συχνότητες αυθόρμητης μετάλλαξης
- Αριθμός επαναλήψεων
- 3.
- Β.16.
- 1.
- 1.6. Προετοιμασία
- Μεταβολική ενεργοποίηση
- Στελέχη δοκιμασιών
- Μέσον καλλιέργειας
- Χρήση αρνητικών και θετικών μαρτύρων
- Συγκέντρωση έκθεσης
- Συνθήκες επώασης
- Συχνότητες αυθόρμητου μιτωτικού ανασυνδυασμού
- Αριθμός επαναλήψεων
- 3.
- B.17.
- 1.
- 1.4.
- 1.4.1.
- 1.4.2.
- 1.4.3.
- 2.
- 3. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
- Β.18
- 1.
- 1.6. Προετοιμασία
- Αριθμός καλλιεργειών
- Χρήση αρνητικών και θετικών ελέγχων με μάρτυρες
- Συγκέντρωση έκθεσης
- Κύτταρα
- Μεταβολική ενεργοποίηση
- Παρασκευή καλλιεργειών
- grp_2 Κατεργασία των καλλιεργειών με τη δοκιμαζόμενη ουσία
- Αυτοραδιογραφικοί προσδιορισμοί
- Προσδιορισμοί με LSC
- 2.
- 3.
- Β.19
- 1.
- 1.6. Συνθήκες δοκιμασίας
- Αριθμός καλλιεργειών
- Χρήση θετικών και αρνητικών ελέγχων με μάρτυρες
- Συγκέντρωση έκθεσης
- Παρασκευή καλλιεργειών
- Αγωγή
- Συλλογή των κυττάρων
- Ετοιμασία χρωμοσωμάτων και χρώση
- Ανάλυση
- 3.
- B.20
- 1.
- 1.6. Προετοιμασία
- Βασικές καλλιέργειες
- Δοκιμαζόμενη ουσία
- Αριθμός ζώων
- Οδός χορήγησης
- Χρήση αρνητικών και θετικών δοκιμασιών με μάρτυρες
- Επίπεδο έκθεσης
- 3.
- Β.21
- 1.
- 1.6. Προετοιμασία
- Κύτταρα
- Μέσον καλλιέργειας
- Δοκιμαζόμενη ουσία
- Μεταβολική ενεργοποίηση
- Χρήση θετικών και αρνητικών ελέγχων (μάρτυρες)
- Συγκεντρώσεις έκθεσης
- 3.
- Β.22
- 1.
- 1.6. Προετοιμασία
- Οδός χορήγησης
- Πειραματόζωα
- Αριθμός και φύλο
- Χρήση αρνητικών και θετικών ελέγχων (μάρτυρες)
- Επίπεδα δόσεων
- Οριακή δοκιμασία
Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,
Έχοντας υπόψη: τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας,
τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 1907/2006 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, της 18ης Δεκεμβρίου 2006, για την καταχώριση, την αξιολόγηση, την αδειοδότηση και τους περιορισμούς των χημικών προϊόντων (REACH) και για την ίδρυση του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Χημικών Προϊόντων καθώς και για την τροποποίηση της οδηγίας 1999/45/EΚ και για την κατάργηση του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 793/93 του Συμβουλίου και του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1488/94 της Επιτροπής καθώς και της οδηγίας 76/769/ΕΟΚ του Συμβουλίου και των οδηγιών της Επιτροπής 91/155/ΕΟΚ, 93/67/ΕΟΚ, 93/105/ΕΚ και 2000/21/ΕΚ, και ιδίως το άρθρο 13 παράγραφος 3,
Εκτιμώντας τα ακόλουθα:
(1) Κατ’ εφαρμογή του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1907/2006, θεσπίζονται μέθοδοι δοκιμής σε κοινοτικό επίπεδο για τους σκοπούς δοκιμής επί υλικών, όποτε οι δοκιμές αυτές απαιτούνται για την άντληση πληροφοριών σχετικά με τις εγγενείς ιδιότητες των ουσιών.
(2) Η οδηγία 67/548/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 27ης Ιουνίου 1967, περί προσεγγίσεως των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων που αφορούν στην ταξινόμηση, συσκευασία και επισήμανση των επικινδύνων ουσιών, καθορίζει, στο παράρτημα V, μεθόδους προσδιορισμού των φυσικοχημικών ιδιοτήτων, της τοξικότητας και της οικοτοξικότητας ουσιών και παρασκευασμάτων. Με την οδηγία 2006/121/ΕΚ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου καταργείται, από 1ης Ιουνίου 2008, το παράρτημα V της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ.
(3) Οι μέθοδοι δοκιμής που περιέχονται στο παράρτημα V της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ θα πρέπει να ενσωματωθούν στον παρόντα κανονισμό.
(4) Ο παρών κανονισμός δεν αποκλείει τη χρήση άλλων μεθόδων δοκιμής, υπό τον όρο ότι αυτή διενεργείται σύμφωνα με το άρθρο 13 παράγραφος 3 του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1907/2006.
(5) Στο σχεδιασμό των μεθόδων δοκιμής πρέπει να συνεκτιμώνται πλήρως οι αρχές της αντικατάστασης, της μείωσης και του εξευγενισμού της χρήσης ζώων στις αντίστοιχες διαδικασίες, ιδιαίτερα όταν καθίστανται διαθέσιμες κατάλληλες επικυρωμένες μέθοδοι ώστε να αντικαθίσταται, να μειούται ή να εξευγενίζεται η διεξαγωγή δοκιμών σε ζώα.
(6) Οι διατάξεις του παρόντος κανονισμού είναι σύμφωνες με τη γνώμη της επιτροπής που συγκροτήθηκε δυνάμει του άρθρου 133 του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1907/2006,
ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:
Άρθρο 1 Οι μέθοδοι δοκιμής που εφαρμόζονται για τους σκοπούς του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1907/2006 παρατίθενται στο παράρτημα του παρόντος κανονισμού.
Άρθρο 2 Η Επιτροπή επανεξετάζει, κατά περίπτωση, τις μεθόδους δοκιμής που περιέχονται στον παρόντα κανονισμό, με σκοπό την αντικατάσταση, τη μείωση και τον εξευγενισμό των δοκιμών σε σπονδυλωτά ζώα.
Άρθρο 3 Κάθε παραπομπή στο παράρτημα V της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ νοείται ως παραπομπή στον παρόντα κανονισμό.
Άρθρο 4 Ο παρών κανονισμός αρχίζει να ισχύει την επομένη της δημοσίευσής του στην Επίσημη Εφημερίδα της Ευρωπαϊκής Ένωσης.
Εφαρμόζεται από την 1η Ιουνίου 2008. Βρυξέλλες, 30 Μαΐου 2008. Για την Επιτροπή Σταύρος Δημασ Μέλος της Επιτροπής
ANNEX
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΜΕΡΟΣ Α: ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΩΝ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ
Α.1. ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΤΗΞΕΩΣ/ΠΗΞΕΩΣ
Α.1.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Οι περισσότερες από τις περιγραφόμενες μεθόδους βασίζονται στην κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ (1). Οι βασικές αρχές δίδονται στις παραπομπές (2) και (3).
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι μέθοδοι και τα όργανα που περιγράφονται, εφαρμόζονται για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας τήξεως ουσιών, χωρίς οποιοδήποτε περιορισμό ως προς το βαθμό καθαρότητας τους. Η επιλογή της μεθόδου εξαρτάται από τη φύση της ουσίας που πρόκειται να εξετασθεί. Κατά συνέπεια, σαν περιοριστικός παράγοντας για την επιλογή θεωρείται το αν η ουσία μπορεί να κονιοποιηθεί εύκολα, δύσκολα ή καθόλου. Για μερικές ουσίες, είναι προτιμότερος ο προσδιορισμός της θερμοκρασίας πήξεως ή στερεοποίησης και γι' αυτό το λόγο, στη μέθοδο αυτή, περιελήφθησαν και τα πρότυπα για τους προσδιορισμούς αυτούς. Όταν, λόγω κάποιων συγκεκριμένων ιδιοτήτων της ουσίας, καμία από τις ανωτέρω παραμέτρους δεν μπορεί να μετρηθεί εύκολα, το σημείο ροής μπορεί να είναι κατάλληλο.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Ως θερμοκρασία τήξεως ορίζεται η θερμοκρασία στην οποία λαμβάνει χώρα η μετάβαση από τη στερεά στην θερμοκρασία τήξεως ή πήξεως. Δεδομένου ότι η μετατροπή φάσης πολλών ουσιών λαμβάνει χώρα σε μία περιοχή θερμοκρασιών, συχνά χαρακτηρίζεται ως περιοχή πήξεως. Μετατροπή μονάδων (Κ σε oC) t = Τ -273,15 t θερμοκρασιακή κλίμακα Κελσίου, βαθμός Κελσίου ( oC) Τ θερμοδυναμική θερμοκρασία, Κέλβιν (Κ)
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Δεν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μία νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κυρίως για να ελέγχεται κατά διαστήματα η μέθοδος που εφαρμόζεται και για να γίνεται δυνατή η σύγκριση με τα αποτελέσματα από άλλες μεθόδους. Μερικές ουσίες βαθμονόμησης (calibration) αναφέρονται στη βιβλιογραφία (4).
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ Προσδιορίζεται η θερμοκρασία (περιοχή θερμοκρασίας) μετάβασης από τη στερεά στην υγρά κατάσταση ή από την υγρά στη στερεά κατάσταση. Στην πράξη, κατά τη θέρμανση/ψύξη ενός δείγματος της υπό δοκιμή ουσίας υπό ατμοσφαιρική πίεση, προσδιορίζονται οι θερμοκρασίες της αρχής τήξεως/πήξεως και της τελικής φάσης τήξεως/πήξεως. Περιγράφονται πέντε τύποι μεθόδων, συγκεκριμένα η μέθοδος τριχοειδούς, μέθοδοι θερμών επιφανειών, προσδιορισμοί του σημείου πήξεως, οι μέθοδοι θερμικής ανάλυσης και ο προσδιορισμός του σημείου ροής (όπως αναπτύχθηκε για τα πετρελαιοειδή). Σε ορισμένες περιπτώσεις, μπορεί αν είναι σκόπιμο να μετρηθεί αντί της θερμοκρασίας τήξεως η θερμοκρασία πήξεως.
1.4.
1.4.1. Μέθοδος τριχοειδούς
1.4.1.
1.4.1.1. Συσκευή θερμοκρασίας τήξεως με υγρό λουτρό Μικρή ποσότητα της λεπτά κονιοποιημένης ουσίας φέρεται σε τριχοειδή σωλήνα και συμπιέζεται καλά. Ο σωλήνας θερμαίνεται, μαζί με ένα θερμόμετρο, και η άνοδος της θερμοκρασίας ρυθμίζεται σε λιγότερο από περίπου 1 K/min κατά τη διάρκεια της κυρίως τήξεως. Προσδιορίζονται η αρχική και η τελική θερμοκρασία τήξεως.
1.4.1.2. Συσκευή θερμοκρασίας τήξεως με μεταλλικό κορμό Όπως περιγράφεται στο 1.4.1.1, με τη διαφορά ότι ο τριχοειδής σωλήνας και το θερμόμετρο είναι μέσα σε ένα θερμαινόμενο μεταλλικό κορμό (θάλαμο) και η παρατήρηση γίνεται μέσα από τρύπες πάνω στο θάλαμο.
1.4.1.3. Ανίχνευση με φωτοκύτταρο Το δείγμα στον τριχοειδή σωλήνα θερμαίνεται αυτόματα σ' ένα μεταλλικό κύλινδρο. Μία δέσμη φωτός κατευθύνεται, μέσω της ουσίας, από μια τρύπα στον κύλινδρο, προς ένα, βαθμονομημένο με ακρίβεια, φωτοκύτταρο. Οι οπτικές ιδιότητες των περισσοτέρων ουσιών αλλάζουν από σκιερές σε διαφανείς όταν τήκονται. Η ένταση του φωτός που φθάνει στο φωτοκύτταρο αυξάνει και στέλνει σήμα stop στην ψηφιακή ενδεικτική διάταξη που διαβάζει τη θερμοκρασία ενός θερμομέτρου με αντίσταση από λευκόχρυσο, που βρίσκεται στο θάλαμο θέρμανσης. Η μέθοδος αυτή δεν είναι κατάλληλη για μερικές ισχυρά χρωματιστές ουσίες.
1.4.2. θερμές επιφάνειες
1.4.2.
1.4.2.1. θερμή ράβδος Kofler Η θερμή ράβδος Kofler χρησιμοποιεί δύο τεμάχια μετάλλου με διαφορετική θερμική αγωγιμότητα, που θερμαίνονται ηλεκτρικά, με τη ράβδο κατασκευασμένη κατά τρόπο ώστε η πτώση θερμοκρασίας να είναι σχεδόν γραμμική κατά την κατεύθυνση του μήκους της. Η θερμοκρασία της θερμής ράβδου μπορεί να κυμαίνεται από 2S3 Κ έως 573 Κ με ένα ειδικό εξάρτημα ανάγνωσης της θερμοκρασίας, που περιλαμβάνει ένα δρομέα με ένα δείκτη και μία κλίμακα σχεδιασμένη για τη συγκεκριμένη ράβδο. Για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας τήξεως, η ουσία τοποθετείται σε λεπτή στιβάδα απευθείας στην επιφάνεια της θερμής ράβδου. Σε λίγα δευτερόλεπτα σχηματίζεται μία λεπτή διαχωριστική γραμμή μεταξύ της άγρας και της στερεάς φάσης. Διαβάζεται η θερμοκρασία στη διαχωριστική γραμμή με την μετακίνηση του δείκτη πάνω στη γραμμή αυτή.
1.4.2.2. Μικροσκόπιο τήξεως Για τον προσδιορισμό θερμοκρασιών τήξεως με πολύ μικρές ποσότητες υλικού χρησιμοποιούνται διάφορα μικροσκόπια θερμών επιφανειών. Στις περισσότερες από τις θερμές επιφάνειες η θερμοκρασία μετριέται με ένα ευαίσθητο θερμοστοιχείο, αν και μερικές φορές χρησιμοποιούνται θερμόμετρα υδραργύρου. Ένα τυπικό μικροσκόπιο θερμών επιφανειών για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας τήξεως αποτελείται από ένα θερμαινόμενο θάλαμο, ο οποίος περιέχει μία μεταλλική πλάκα, στην οποία τοποθετείται το δείγμα πάνω σε ειδικό πλακίδιο. Στο κέντρο της μεταλλικής πλάκας υπάρχει μία τρύπα, που επιτρέπει την είσοδο του φωτός από το κάτοπτρο φωτισμού του μικροσκοπίου. Κατά τη χρήση, ο θάλαμος κλείνεται με μία γυάλινη πλάκα, που αποκλείει τον αέρα από το χώρο του δείγματος. Η θέρμανση του δείγματος ρυθμίζεται με ένα ροοστάτη. Για πολύ ακριβείς μετρήσεις σε οπτικά ανισότροπες ουσίες, μπορεί να χρησιμοποιηθεί πολωμένο φως.
1.4.2.3. Μέθοδος μηνίσκου Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται ειδικά για πολυαμίδια. Ο προσδιορισμός της θερμοκρασίας κατά την οποία γίνεται η μετατόπιση μηνίσκου από έλαιο σιλικόνης, που περικλείεται μεταξύ μιας θερμής επιφάνειας και μιας γυάλινης καλυπτρίδας, που στηρίζεται στο εξεταζόμενο δείγμα πολυαμιδίου, γίνεται οπτικά.
1.4.3. Μέθοδος προσδιορισμού της θερμοκρασίας πήξεως Το δείγμα φέρεται σε ειδικό δοκιμαστικό σωλήνα και τοποθετείται σε μία συσκευή προσδιορισμού της θερμοκρασίας πήξεως. Το δείγμα αναδεύεται ελαφρά και συνεχώς κατά τη διάρκεια της ψύξεως και η θερμοκρασία μετράται σε κατάλληλα χρονικά διαστήματα. Όταν η θερμοκρασία παραμείνει σταθερή κατά τη διάρκεια μερικών αναγνώσεων, αυτή η θερμοκρασία (διορθωμένη για θερμομετρικό σφάλμα) καταγράφεται ως η θερμοκρασία πήξεως. Πρέπει να αποφεύγεται υπερψύξη με τη διατήρηση ισορροπίας μεταξύ της στερεάς και της υγράς φάσης.
1.4.4. Θερμική ανάλυση
1.4.4.
1.4.4.1. Διαφορική θερμική ανάλυση (ΔΘΑ) Αυτή η τεχνική καταγράφει τη διαφορά θερμοκρασιών μεταξύ της ουσίας και ενός υλικού αναφοράς ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, ενώ η ουσία και το υλικό αναφοράς υποβάλλονται στο ίδιο ελεγχόμενο θερμοκρασιακό πρόγραμμα. Όταν το δείγμα υφίσταται μετατροπή που περιλαμβάνει αλλαγή ενθαλπίας, αυτή η αλλαγή καταδεικνύεται από μία ενδοθερμική (τήξη) ή εξωθερμική (πήξη) απόκλιση από τη βασική γραμμή της καταγραφόμενης θερμοκρασίας.
1.4.4.2. Θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης (ΘΑΣ) Αυτή η τεχνική καταγράφει τη διαφορά ενεργειακών απολαβών μιας ουσίας και ενός υλικού αναφοράς, σαν συνάρτηση της θερμοκρασίας, ενώ η ουσία και το υλικό αναφοράς υποβάλλονται στο ίδιο ελεγχόμενο θερμοκρασιακό πρόγραμμα. Η ενέργεια αυτή είναι αναγκαία για την επίτευξη μηδενικής θερμοκρασιακής διαφοράς μεταξύ της ουσίας και του υλικού αναφοράς. Όταν το δείγμα υφίσταται μετατροπή που περιλαμβάνει αλλαγή ενθαλπίας, η αλλαγή αυτή καταδεικνύεται από μία ενδοθερμική (τήξη) ή εξωθερμική (πήξη) απόκλιση από τη βασική γραμμή της καταγραφόμενης ροής θερμότητας.
1.4.5. Σημείο ροής Η μέθοδος αυτή αναπτύχθηκε για να χρησιμοποιηθεί σε πετρελαιοειδή και είναι κατάλληλη για ελαιώδεις ουσίες με χαμηλή θερμοκρασία τήξεως. Μετά από προκαταρκτική θέρμανση, το δείγμα ψύχεται με ένα συγκεκριμένο ρυθμό και εξετάζεται ανά διαστήματα 3 Κ ως προς τα χαρακτηριστικά ροής του. Ως σημείο ροής καταγράφεται η κατώτερη θερμοκρασία
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Το πεδίο εφαρμογής και η ακρίβεια των διαφόρων μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας τήξεως/περιοχή τήξεως αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα:
1.5. ΠΙΝΑΚΑΣ: ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Α. Β. Γ. Δ.
Μέθοδοι τριχοειδούς Μέθοδοι μέτρησης Ουσίες που κονιοποιούνται Ουσίες που δεν κονιοποιούνται εύκολα Περιοχή θερμοκρασίας Ορθότητα κατ’ εκτίμηση Υφιστάμενο πρότυπο Συσκευές θερμοκρασίας τήξεως με υγρό λουτρό ναι Μόνο σε μερικές 273 έως 573 Κ ±0,3 Κ JIS Κ 0064 Συσκευές θερμοκρασίας τήξεως με μεταλλικό κορμό (θάλαμο) ναι Μόνο σε μερικές 293 έως > 573 Κ ±0,5 Κ ISO 1218 (Ε) Προσδιορισμός με φωτοκύτταρο ναι Σε αρκετές με συσκευές προπροσαρμογής 253 έως 573 Κ ±0,5 Κ Θερμές επιφάνειες και μέθοδοι πήξεως Μέθοδος μέτρησης Ουσίες που μπορούν να κονιοποιούνται Ουσίες που δεν κονιοποιούνται εύκολα Περιοχή θερμοκρασίας Ορθότητα κατ’ εκτίμηση Υφιστάμενο πρότυπο Θερμή ράβδος Kofler ναι όχι 283 έως > 573Κ ±1,0 Κ ANSI/ASTM D 3451-76 Μικροσκόπιο τήξεως ναι Μόνο σε μερικές 273 έως > 573Κ ±0,5 Κ DIN 53736 Μέθοδος μηνίσκου Μέθοδοι όχι Ειδικά για πολυαμίδια 293 έως > 573Κ ±0,5 Κ ISO 1218 (Ε) θερμοκρασίας πήξεως ναι ναι 223 έως 573 Κ ±0,5 Κ π.χ. BS 4695 Θερμική ανάλυση Μέθοδος μέτρησης Ουσίες που μπορούν να κονιοποιούνται Ουσίες που δεν κονιοποιούνται εύκολα Περιοχή θερμοκρασίας Ορθότητα κατ’ εκτίμηση Υφιστάμενο πρότυπο Διαφορική θερμική ανάλυση ναι ναι 173 έως 1273 Κ έως τους 600 Κ ±0,5 Κ έως τους 1273 Κ ±2,0 Κ ASTME 537-76 Θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης ναι ναι 173 έως 1273 Κ έως τους 600 Κ ±0,5 Κ έως τους 1273 Κ ±2,0 Κ ASTME 537-76 Σημείο ροής Μέθοδος μέτρησης Ουσίες που μπορούν να κονιοποιούνται Ουσίες που δεν κονιοποιούνται εύκολα Περιοχή θερμοκρασίας Ορθότητα κατ’ εκτίμηση Υφιστάμενο πρότυπο Σημείο ροής Για πετρελαιοειδή και ελαιώδεις ουσίες Για πετρελαιοειδή και ελαιώδεις ουσίες 223 έως 323 Κ ±3,0 ASTM D 97-66
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Η τεχνική σχεδόν όλων των μεθόδων δοκιμής περιγράφεται σε εθνικά και διεθνή πρότυπα (βλέπε προσάρτημα 1).
1.6.
1.6.1. Μέθοδοι με τριχοειδή σωλήνα Οι λεπτά κονιοποιημένες ουσίες, όταν υποβάλλονται σε διαδικασία αργής ανύψωσης της θερμοκρασίας, εμφανίζουν συνήθως τα στάδια τήξεως που εμφανίζονται στην εικόνα 1.
1.6.1.
Εικόνα 1 Στάδιο Α Στάδιο Β Στάδιο Γ Στάδιο Δ Στάδιο Ε Στάδιο Α (Αρχή της τήξεως): Λεπτά σταγονίδια προσκολλώνται ομοιόμορφα στο εσωτερικό τοίχωμα του τριχοειδούς σωλήνα. Στάδιο Β Εμφανίζεται ένα διάκενο μεταξύ του δείγματος και του εσωτερικού τοιχώματος λόγω της συρρίκνωσης του τήγματος. Στάδιο Γ Το συρρικνωθέν δείγμα αρχίζει να καταρρέει και να υγροποιείται. Στάδιο Δ Στην επιφάνεια του δείγματος δημιουργείται ένας πλήρης μηνίσκος, σημαντική όμως ποσότητα του δείγματος παραμένει στερεά. Στάδιο Ε (Τελικό στάδιο τήξεως): δεν υπάρχουν καθόλου στερεά σωματίδια. Κατά τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας τήξεως καταγράφονται οι θερμοκρασίες στην αρχή της τήξεως και στο τελικό στάδιο.
1.6.1.1. Συσκευές θερμοκρασίας τήξεως με υγρό λουτρό Στην εικόνα 2 παρουσιάζεται ένας τύπος πρότυπης συσκευής θερμοκρασίας τήξεως κατασκευασμένης από γυαλί (JIS Κ 0064). Όλες οι διαστάσεις εκφράζονται σε mm.
1.6.1.1.
Εικόνα 2 A: Δοχείο μέτρησης. B: Πώμα. C: Αερισμός. D: Θερμόμετρο. E: Βοηθητικό θερμόμετρο. F: Υγρό λουτρό. G: Τριχοειδής σωλήνας κατασκευασμένος από γυαλί 80 έως 100 mm μήκος, 1,0 ± 0,2 mm εσωτερική διάμετρος, 0,2 έως 0,3 mm πάχος τοιχώματος. H: Πλευρικός σωλήνας.
Υγρό λουτρό:
Θα πρέπει να επιλέγεται το κατάλληλο υγρό. Η επιλογή του υγρού εξαρτάται από την, προς προσδιορισμό, θερμοκρασία τήξεως, π.χ. υγρή παραφίνη για θερμοκρασίες τήξεως όχι υψηλότερες από 473 Κ, έλαιο σιλικόνης για θερμοκρασίες τήξεως όχι υψηλότερες από 573 Κ. Για θερμοκρασίες τήξεως πάνω από 523 Κ, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μείγμα αποτελούμενο από τρία μέρη θειικού οξέος και δύο μέρη θειικού καλίου (κατά βάρος). Κατάλληλες προφυλάξεις θα πρέπει να λαμβάνονται εάν χρησιμοποιηθεί ένα τέτοιο μείγμα.
Θερμόμετρο:
Πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο εκείνα τα θερμόμετρα που είναι σύμφωνα με τις απαιτήσεις των ακόλουθων ή ισοδύναμων προτύπων: ASTM Ε 1-71, DIN 12770, JIS Κ 8001.
Διαδικασία:
Η ξηρά ουσία κονιοποιείται σε λεπτή μορφή σε ιγδίο και φέρεται στον τριχοειδή σωλήνα, συντετηγμένου στη μία άκρη, έτσι ώστε το ύψος της στάθμης της να είναι περίπου 3 mm μετά από καλή συμπίεση. Για να ληφθεί ένα ομοιόμορφα συμπιεσμένο δείγμα, ο τριχοειδής σωλήνας πρέπει να πέφτει από ένα ύψος περίπου 700 mm μέσω ενός κατακόρυφου γυάλινου σωλήνα, πάνω σε ένα γυαλί ρολογιού. Ο γεμισμένος τριχοειδής σωλήνας τοποθετείται στο λουτρό έτσι ώστε το μεσαίο τμήμα της λεκάνης υδραργύρου του θερμομέτρου να ακουμπά τον τριχοειδή σωλήνα στο τμήμα που ευρίσκεται το δείγμα. Συνήθως ο τριχοειδής σωλήνας εισάγεται στη συσκευή σε 10 Κ κάτω από τη θερμοκρασία τήξεως. Το υγρό λουτρό θερμαίνεται έτσι ώστε η ανύψωση της θερμοκρασίας να είναι περίπου 3 K/min. To υγρό πρέπει να αναδεύεται. Στους 10 Κ περίπου κάτω από την αναμενόμενη θερμοκρασία τήξεως ο ρυθμός ανύψωσης της θερμοκρασίας ρυθμίζεται σε ί K/min κατά ανώτατο όριο.
Υπολογισμός:
Ο υπολογισμός της θερμοκρασίας τήξεως γίνεται όπως παρακάτω: Τ = ΤD+0,00016 (TD - ΤΕ) n όπου: Τ διορθωμένη θερμοκρασία τήξεως σε Κ TD ένδειξη θερμοκρασίας θερμομέτρου D σε Κ ΤΕ ένδειξη θερμοκρασίας θερμομέτρου Ε σε Κ π αριθμός διαιρέσεων της υδραργυρικής στήλης του θερμομέτρου D στην εμβαπτισμένη λεκάνη.
1.6.1.2. Συσκευές θερμοκρασίας τήξεως με μεταλλικό κορμό
1.6.1.2. Συσκευή:
Η συσκευή αποτελείται από:
έναν κυλινδρικό μεταλλικό κορμό, το πάνω μέρος του οποίου είναι κοίλο και σχηματίζει ένα θάλαμο (βλέπε σχήμα 3),
ένα μεταλλικό πώμα, με δυο ή περισσότερες τρύπες, που επιτρέπουν να εισαχθούν σωλήνες μέσα στο μεταλλικό κορμό,
ένα σύστημα θέρμανσης, για το μεταλλικό κορμό, που επιτυγχάνεται για παράδειγμα με μία ηλεκτρική αντίσταση ενσωματωμένη στον κορμό,
ένα ροοστάτη για ρύθμιση της ισχύος, αν χρησιμοποιείται η ηλεκτρική θέρμανση,
τέσσερα παράθυρα, από γυαλί ανθεκτικό στη θερμότητα, πάνω στα όρθια τοιχώματα του θαλάμου, διαμετρικά τοποθετημένα σε ορθή γωνία μεταξύ τους. Εμπρός από το ένα από τα παράθυρα αυτά είναι στερεωμένος ένας προσοφθάλμιος φακός για παρατήρηση του τριχοειδή σωλήνα. Τα άλλα τρία παράθυρα χρησιμεύουν για το φωτισμό του εσωτερικού της διάταξης με λάμπες,
έναν τριχοειδή σωλήνα από γυαλί ανθεκτικό στη θερμότητα, κλειστό στη μία άκρη (βλέπε σημείο 1.6.1.1).
Θερμόμετρο:
Βλέπε τα πρότυπα που αναφέρονται στο 1.6.1.1. Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν και θερμοηλεκτρικές συσκευές μέτρησης με παρεμφερή ακρίβεια.
Εικόνα 3 Θερμόμετρο Τριχοειδής σωλήνας Μεταλλικό βύσμα Προσοφθάλμιος φακός Λάμπα Ηλεκτρική αντίσταση Θερμαινόμενος μεταλλικός κορμός
1.6.1.3. Προσδιορισμός με φωτοκύτταρο Συσκευή και διαδικασία: Η συσκευή αποτελείται από ένα μεταλλικό θάλαμο με αυτόματο σύστημα θέρμανσης. Τρεις τριχοειδείς σωλήνες γεμίζονται σύμφωνα με το σημείο 1.6.1.1 και τοποθετούνται στον κλίβανο. Αρκετές γραμμικές αυξήσεις της θερμοκρασίας είναι διαθέσιμες για τη βαθμονόμηση της συσκευής, και η κατάλληλη ανύψωση της θερμοκρασίας ρυθμίζεται ηλεκτρικά σε μία προεπιλεγμένη σταθερή και γραμμική ταχύτητα. Οι καταγραφείς δείχνουν την πραγματική θερμοκρασία του κλίβανου και τη θερμοκρασία της ουσίας στους τριχοειδείς σωλήνες.
1.6.2. Θερμές επιφάνειες
1.6.2.
1.6.2.1. Θερμή επιφάνεια Kofler Βλέπε προσάρτημα.
1.6.2.2. Μικροσκόπιο τήξεως Βλέπε προσάρτημα.
1.6.2.3. Μέθοδος μηνίσκου (πολυαμίδια) Βλέπε προσάρτημα. Η ταχύτητα θέρμανσης κατά τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας τήξεως θα πρέπει να είναι μικρότερη από 1 K/min.
1.6.3. Μέθοδοι προσδιορισμού της θερμοκρασίας πήξεως Βλέπε προσάρτημα.
1.6.4. θερμική ανάλυση
1.6.4.
1.6.4.1. Διαφορική θερμική ανάλυση Βλέπε προσάρτημα.
1.6.4.2. θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης Βλέπε προσάρτημα.
1.6.5. Προσδιορισμός του σημείου ροής Βλέπε προσάρτημα.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Σε ορισμένες περιπτώσεις είναι αναγκαία η διόρθωση του θερμομέτρου,
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατό, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες: Ως θερμοκρασία τήξεως αναφέρεται ο μέσος όρος δύο τουλάχιστον μετρήσεων που είναι μέσα στην περιοχή της υπολογισθείσας ακρίβειας(βλέπε πίνακες). Εάν η διαφορά μεταξύ της θερμοκρασίας στην αρχή και στο τελικό στάδιο τήξεως είναι μέσα στα όρια της ακρίβειας της μεθόδου, ως θερμοκρασία τήξεως λαμβάνεται η θερμοκρασία στο τελικό στάδιο τήξεως' διαφορετικά, καταγράφονται και οι δύο θερμοκρασίες. Αν η ουσία αποσυντίθεται ή εξαχνούται πριν από τη θερμοκρασία τήξεως, η θερμοκρασία στην οποία παρατηρείται το γεγονός αυτό πρέπει να αναφέρεται. Πρέπει να αναφέρονται όλες οι πληροφορίες και παρατηρήσεις που σχετίζονται με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.
Π χρησιμοποιηθείσα μέθοδος,
επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις) και τυχόν προκαταρκτικό στάδιο καθαρισμού,
εκτίμηση της ακρίβειας (accuracy).
4.(1)(2)(3)(4)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.
A.2. ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΖΕΣΕΩΣ
A.2.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Οι περισσότερες από τις περιγραφόμενες μεθόδους βασίζονται στην κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ (1). Οι βασικές αρχές δίδονται στις παραπομπές (2) και (3).
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι μέθοδοι και οι συσκευές που περιγράφονται εδώ μπορούν να χρησιμοποιηθούν για υγρές και χαμηλού σημείου τήξεως ουσίες, υπό την προϋπόθεση ότι οι ουσίες αυτές δεν εμφανίζουν χημικές αντιδράσεις σε θερμοκρασία κάτω της θερμοκρασίας ζέσεως (π.χ.: αυτοξείδωση, αναδιάταξη, αποικοδόμηση, κ.λπ.). Οι μέθοδοι μπορούν να εφαρμοσθούν τόσο σε καθαρές, όσο και σε μη καθαρές υγρές ουσίες. Έμφαση δίνεται στις μεθόδους που χρησιμοποιούν προσδιορισμό με φωτοκύτταρο και θερμική ανάλυση, διότι οι μέθοδοι αυτές επιτρέπουν τον προσδιορισμό τόσο της θερμοκρασίας τήξεως, όσο και της θερμοκρασίας ζέσεως. Επιπλέον, οι μετρήσεις μπορούν να γίνουν αυτόματα. Η δυναμική μέθοδος έχει το πλεονέκτημα ότι μπορεί επίσης να εφαρμοσθεί στον προσδιορισμό της τάσης ατμών και ότι δεν χρειάζεται να διορθώνεται η θερμοκρασία ζέσεως σε κανονική πίεση (101,325 kPa) διότι η κανονική πίεση μπορεί να ρυθμιστεί κατά τη διάρκεια της μέτρησης με ένα μανόμετρο. Παρατηρήσεις: Η επίδραση των προσμείξεων στον προσδιορισμό της θερμοκρασίας ζέσεως εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη φύση της πρόσμειξης. Όταν στο δείγμα υπάρχουν πτητικές προσμείξεις, πράγμα που μπορεί να επηρεάσει τα αποτελέσματα, η ουσία μπορεί να καθαριστεί.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Ως κανονική θερμοκρασία ζέσεως ορίζεται η θερμοκρασία στην οποία η τάση ατμών ενός υγρού είναι 101,325 kPa. Αν η θερμοκρασία ζέσεως δεν μετράται σε κανονική ατμοσφαιρική πίεση, η εξάρτηση της τάσης ατμών από τη θερμοκρασία μπορεί να περιγραφεί με την εξίσωση Clausius—Clapeyron: log p = Δ Hv2,3 RT+σταθερά όπου: p η τάση ατμών της ουσίας σε πασκάλ ΔΗν η θερμότητα εξατμίσεως σε J mol-1 R η παγκόσμια σταθερά των αερίων = 8,314 J mol-1 K-1 Τ η θερμοδυναμική θερμοκρασία σε Κ Κατά τη διάρκεια της μέτρησης η θερμοκρασία ζέσεως αναφέρεται σε σχέση με την ατμοσφαιρική πίεση. Μετατροπές: Πίεση (μονάδες: kPa) 100 kPa 1 bar = 0,1 MPa (το bar επιτρέπεται ακόμη, αλλά δεν συνιστάται) 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (οι μονάδες mm Hg και Torr δεν επιτρέπονται) 1 atm πρότυπη ατμόσφαιρα = 101325 Pa (η μονάδα atm δεν επιτρέπεται). Θερμοκρασία (μονάδες: Κ) t = Τ -273,15 t θερμοκρασία Κελσίου, βαθμός Κελσίου ( oC) Τ θερμοδυναμική θερμοκρασία, Κέλβιν (Κ)
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Δεν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μια νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κυρίως για να ελέγχεται κατά διαστήματα η απόδοση της μεθόδου και για να γίνεται δυνατή η σύγκριση με τα αποτελέσματα από άλλες μεθόδους. Μερικές ουσίες βαθμονόμησης μπορούν να βρεθούν στις μεθόδους που περιλαμβάνονται στο προσάρτημα.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ Πέντε μέθοδοι για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας ζέσεως (περιοχής ζέσεως) βασίζονται στη μέτρηση της θερμοκρασίας ζέσεως, ενώ δύο άλλες βασίζονται στη θερμική ανάλυση.
1.4.
1.4.1. Προσδιορισμός με τη χρήση ζεσεομέτρου Τα ζεσεόμετρα αναπτύχθηκαν αρχικά για τον προσδιορισμό του μοριακού βάρους από την ανύψωση της θερμοκρασίας ζέσεως, είναι όμως επίσης κατάλληλα και για ακριβείς μετρήσεις της θερμοκρασίας ζέσεως. Μία πολύ απλή συσκευή περιγράφεται στο ASTM D 1120-72 (βλέπε προσάρτημα). Στη συσκευή αυτή το υγρό θερμαίνεται κάτω από συνθήκες ισορροπίας σε ατμοσφαιρική πίεση μέχρι να αρχίσει να βράζει.
1.4.2. Δυναμική μέθοδος Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στη μέτρηση της θερμοκρασίας ανασυμπύκνωσης των ατμών με τη βοήθεια κατάλληλου θερμομέτρου στον κάθετο ψυκτήρα κατά το βρασμό. Η πίεση στη μέθοδο αυτή μπορεί να μεταβάλλεται.
1.4.3. Μέθοδος απόσταξης για τη θερμοκρασία ζέσεως Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην απόσταξη του υγρού και στη μέτρηση της θερμοκρασίας ανασυμπύκνωσης των ατμών και στον προσδιορισμό της ποσότητας του αποστάγματος.
1.4.4. Μέθοδος κατα Siwoloboff Δείγμα θερμαίνεται σε σωλήνα δείγματος που είναι βυθισμένος σε θερμό υδρόλουτρο. Στο σωλήνα του δείγματος βυθίζεται συντηγμένο τριχοειδές που περιέχει στο κάτω άκρο μία φυσαλίδα αέρα.
1.4.5. Προσδιορισμός με φωτοκύτταρο Ακολουθώντας την αρχή κατά Siwoboloff, εκτελείται αυτόματη φωτοηλεκτρική μέτρηση χρησιμοποιώντας τις ανερχόμενες φυσαλίδες.
1.4.6. Διαφορική θερμική ανάλυση Στην τεχνική αυτή καταγράφεται η διαφορά θερμοκρασιών μεταξύ της ουσίας και ενός υλικού αναφοράς ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, ενώ η ουσία και το υλικό αναφοράς υποβάλλονται στο ίδιο ελεγχόμενο θερμοκρασιακό πρόγραμμα. Όταν το δείγμα υφίσταται κάποια μετατροπή που περιλαμβάνει μεταβολή της ενθαλπίας, η μεταβολή αυτή καταδεικνύεται από μία ενδόθερμη απόκλιση (ζέση) από τη βασική γραμμή της θερμοκρασίας που έχει καταγραφεί.
1.4.7. Σάρωση διαφορική θερμιδομετρίας Στην τεχνική αυτή καταγράφεται η διαφορά ενεργειακής απολαβής μιας ουσίας και ενός υλικού αναφοράς ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, ενώ η ουσία και το υλικό αναφοράς υποβάλλονται στο ίδιο ελεγχόμενο θερμοκρασιακό πρόγραμμα. Η ενέργεια αυτή είναι η ενέργεια που χρειάζεται για την επίτευξη μηδενικής θερμοκρασιακής διαφοράς μεταξύ της ουσίας και του υλικού αναφοράς. Όταν το δείγμα υφίσταται κάποια μετατροπή που περιλαμβάνει μεταβολή της ενθαλπίας, η μεταβολή αυτή καταδεικνύεται από μία ενδόθερμη απόκλιση (ζέση) από τη βασική γραμμή της ροής θερμότητας που έχει καταγραφεί.
1.5. Πινακας 1: Σύγκριση των μεθόδων
ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Το πεδίο εφαρμογής και η ακρίβεια των διαφόρων μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας ζέσεως/περιοχής ζέσεως περιλαμβάνονται στον Πίνακα 1. Μέθοδος μέτρησης Εκτιμώμενη ακρίβεια Υπάρχον πρότυπο Ζεσεόμετρο ±1,4Κ(έως 373 Κ) ±2,5 Κ (έως 600 Κ) ASTM D 1120-72 Δυναμική μέθοδος ±0,5 Κ (έως 600 Κ) Μέθοδος απόσταξης (περιοχή ζέσεως) ±0,5 Κ (έως 600 Κ) ISO/R918, DIN 53171, BS 4591/71 Κατά Siwoloboff ± 2 Κ (έως 600 Κ) Προσδιορισμός με φωτοκύτταρο ±0,3 Κ (στους 373 Κ) Διαφορική θερμική θερμιδομετρία ±0,5 Κ (έως 600 Κ) ±2,0 Κ (έως 1273 Κ) ASTM E 537-76 Σάρωση διαφορικής θερμιδομετρίας +0,5 Κ (έως 600 Κ) ±2,0 Κ (έως 1273 Κ) ASTM E 537-76
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Η πειραματική διαδικασία μερικών από τις μεθόδους δοκιμής περιγράφεται σε διεθνή και εθνικά πρότυπα (βλέπε προσάρτημα).
1.6.
1.6.1. Ζεσεόμετρο Βλέπε προσάρτημα.
1.6.2. Δυναμική μέθοδος Βλέπε μέθοδο ελέγχου στο σημείο Α.4 για τον προσδιορισμό της τάσεως ατμών. Καταγράφεται η θερμοκρασία ζέσεως που παρατηρείται με εφαρμογή της πίεσης 101,325 kPa.
1.6.3. Διαδικασία απόσταξης (περιοχή ζέσεως) Βλέπε προσάρτημα.
1.6.4. Μέθοδος κατά Siwoloboff Το δείγμα θερμαίνεται σε συσκευή θερμοκρασίας τήξεως μέσα σε σωλήνα δείγματος, με διάμετρο περίπου 5 mm (εικόνα 1). Στην εικόνα 1 εικονίζεται ένας τύπος πρότυπης συσκευής θερμοκρασίας τήξεως και ζέσεως (JIS Κ 0064) (κατασκευασμένης από γυαλί, όλες οι διαστάσεις σε χιλιοστόμετρα). Ένας τριχοειδής σωλήνας (τριχοειδές ζέσεως), συντετηγμένος περίπου 1 cm πάνω από το κατώτατο σημείο του, φέρεται μέσα στο σωλήνα δείγματος. Το επίπεδο μέχρι το οποίο προστίθεται η ελεγχόμενη ουσία είναι τέτοιο ώστε η συντετηγμένη τομή του τριχοειδή σωλήνα να είναι κάτω από την επιφάνεια του υγρού. Ο σωλήνας δείγματος που περιέχει το τριχοειδές ζέσεως στερεώνεται είτε πάνω στο θερμόμετρο με έναν ελαστικό σύνδεσμο είτε σε ένα πλευρικό υποστήριγμα (βλέπε εικόνα 2). Εικόνα 2 Αρχή κατά Siwoloboff Εικόνα 3 Τροποποιημένη αρχή Το υγρό λουτρό επιλέγεται ανάλογα με τη θερμοκρασία ζέσεως. Για θερμοκρασίες μέχρι 573 Κ, μπορεί να χρησιμοποιηθεί έλαιο σιλικόνης. Υγρή παραφίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο μέχρι τους 473 Κ. Η θέρμανση του λουτρού θα πρέπει να ρυθμίζεται έτσι ώστε αρχικά η ανύψωση της θερμοκρασίας να γίνεται με ταχύτητα 3 K/min. Το λουτρό πρέπει να αναδεύεται. Στους 10 Κ περίπου κάτω από την αναμενόμενη θερμοκρασία ζέσεως, η θέρμανση ελαττώνεται έτσι ώστε η ταχύτητα ανύψωσης της θερμοκρασίας να είναι λιγότερο από 1 K/min. Όταν προσεγγίζεται η θερμοκρασία ζέσεως, από το τριχοειδές ζέσεως αρχίζουν να βγαίνουν με ταχύτητα φυσαλίδες. Η θερμοκρασία ζέσεως είναι η θερμοκρασία εκείνη στην οποία, σε στιγμιαία ψύξη, σταματάει η αλυσίδα των φυσαλίδων και αρχίζει να ανέρχεται ξαφνικά υγρό μέσα στο τριχοειδές. Η αντίστοιχη ένδειξη του θερμομέτρου είναι η θερμοκρασία ζέσεως της ουσίας. Στην τροποποιημένη αρχή (εικόνα 3) η θερμοκρασία ζέσεως προσδιορίζεται σε τριχοειδή σωλήνα θερμοκρασίας τήξεως. Ο σωλήνας αυτός καταλήγει σε ένα λεπτό άκρο μήκους περίπου 2 cm (α) και αναρροφάται μικρή ποσότητα του δείγματος. Το ανοικτό άκρο του λεπτού τριχοειδούς κλείνεται με σύντηξη έτσι ώστε να εγκλωβισθεί στην άκρη μία μικρή φυσαλίδα αέρα. Κατά τη θέρμανση στη συσκευή θερμοκρασίας τήξεως (b), η φυσαλίδα του αέρα διαστέλλεται. Η θερμοκρασία ζέσεως αντιστοιχεί στη θερμοκρασία στην οποία η υπό μορφή πώματος ουσία φθάνει στο επίπεδο της επιφάνειας του λουτρού (c).
1.6.4.
Εικόνα 1 Α: Δοχείο μέτρηση; Β: Πώμα C: Αερισμός D: Θερμόμετρο Ε: Βοηθητικό θερμόμετρο F: Υγρό λουτρό G: Σωλήνας δείγματος με εξωτερική διάμετρο 5 mm κατ’ ανώτατο όριο περιέχων τριχοειδή σωλήνα, μήκους περίπου 100 mm, εσωτερικής διαμέτρου περίπου 1 mm και πάχους τοιχώματος περίπου 0,2 έως 0,3 mm Η: Πλευρικός σωλήνας
1.6.5. Προσδιορισμός με φωτοκύτταρο Το δείγμα θερμαίνεται μέσα σε τριχοειδή σωλήνα σε θερμαινόμενο μεταλλικό κορμό (θάλαμο). Δέσμη φωτός κατευθύνεται, μέσω κατάλληλων οπών στον κορμό, διαμέσου της ουσίας ό ένα βαθμονομημένο με ακρίβεια φωτοκύτταρο. Κατά την αύξηση της θερμοκρασίας του δείγματος, από το τριχοειδές ζέσεως αναδύονται μεμονωμένες φυσαλίδες αέρα. Όταν η θερμοκρασία φθάσει στη θερμοκρασία ζέσεως ο αριθμός των φυσαλίδων αυξάνει σε μεγάλο βαθμό. Το γεγονός αυτό προκαλεί μεταβολή στην ένταση του φωτός, που καταγράφεται από ένα φωτοκύτταρο και δίνει σήμα stop στο δείκτη ανάγνωσης της θερμοκρασίας ενός θερμομέτρου με αντίσταση από λευκόχρυσο που βρίσκεται στον κορμό. Η μέθοδος αυτή είναι ιδιαίτερα χρήσιμη διότι επιτρέπει την πραγματοποίηση προσδιορισμών σε θερμοκρασίες κάτω από τη θερμοκρασία δωματίου και μέχρι τους 253,15 Κ (-20 oC) χωρίς καμία αλλαγή στη συσκευή. Συνεπώς το όργανο πρέπει να τοποθετήσει σε λουτρό ψύξης.
1.6.6. Θερμική ανάλυση
1.6.6.
1.6.6.1. Διαφορική θερμική ανάλυση Βλέπε προσάρτημα.
1.6.6.2. Σάρωση διαφορικής θερμιδομετρίας Βλέπε προσάρτημα.
2. Πίνακας 2 Συντελεστές διόρθωσης θερμοκρασίας (fT)
ΔΕΔΟΜΕΝΑ Για μικρές αποκλίσεις από την κανονική πίεση (μέγιστο ± 5 kPa), οι θερμοκρασίες ζέσεως ανάγονται σε κανονικές ΤΠ με τη βοήθεια της παρακάτω εξίσωσης αριθμών-τιμών του Sidney Young: Tn = Τ + (fT × Δ p) όπου: Δp (101,325 — p) [σημείωση συμβόλου] p μέτρηση πίεσης σε kPa, fT ταχύτητα μεταβολής της θερμοκρασίας ζέσεως με την πίεση σε K/kPa Τ μετρούμενη θερμοκρασία ζέσεως σε Κ Τn θερμοκρασία ζέσεως διορθωμένη σε κανονική πίεση σε Κ Οι συντελεστές διόρθωσης της θερμοκρασίας fT και οι εξισώσεις για τις προσεγγίσεις τους συμπεριλαμβάνονται στα διεθνή και εθνικά πρότυπα που προαναφέρθηκαν για πολλές ουσίες. Η μέθοδος DIN 53171, π.χ., μνημονεύει τις ακόλουθες κατά προσέγγιση διορθώσεις για διαλύτες που περιλαμβάνονται στα χρώματα: Θερμοκρασία Τ σε Κ Συντελεστής διόρθωσης fT σε K/kPa 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες: Ως θερμοκρασία ζέσεως αναφέρεται ο μέσος όρος δυο τουλάχιστον μετρήσεων που είναι μέσα στα όρια της εκτιμώμενης ακρίβειας (βλέπε Πίνακα 1). Πρέπει να δηλώνονται οι μετρηθείσες θερμοκρασίες ζέσεως και ο μέσος όρος τους, οι δε πιέσεις στις οποίες έγιναν οι μετρήσεις πρέπει να αναφέρονται σε kPa. Η πίεση θα πρέπει κατά προτίμηση να είναι κοντά στην κανονική ατμοσφαιρική πίεση. Πρέπει να αναφέρεται κάθε πληροφορία ή παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.
τη χρησιμοποιηθείσα μέθοδο,
επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις) και προκαταρκτικό στάδιο καθαρισμού, εφόσον υπάρχει,
εκτίμηση της ορθότητας.
4.(1)(2)(3) ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II. R. Weissbergcr ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd cd., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.
A.3. ΣΧΕΤΙΚΗ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ
A.3.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Οι περιγραφόμενες μέθοδοι βασίζονται στην κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ (1). Οι βασικές αρχές δίδονται στη βιβλιογραφία (2).
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΉ Οι μέθοδοι για τον προσδιορισμό της σχετικής πυκνότητας που περιγράφονται εδώ εφαρμόζονται σε στερεές και υγρές ουσίες, χωρίς οποιονδήποτε περιορισμό σχετικά με το βαθμό καθαρότητας τους. Οι διάφορες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται αναφέρονται στον πίνακα 1.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Σχετική πυκνότητα, D420 των στερεών ή των υγρών είναι ο λόγος της μάζας ενός όγκου της εξεταζόμενης ουσίας προσδιορισμένου στους 20 oC, προς τη μάζα ίσου όγκου νερού, προσδιορισμένου στους 4 oC. Η σχετική πυκνότητα δεν έχει διαστάσεις. Πυκνότητα, ρ, μιας ουσίας είναι το πηλίκον της μάζας, m, προς τον όγκο, ν. Η πυκνότητα, ρ, εκφράζεται, σε μονάδες SI, σε kg/m3.
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ (1) (3) Δεν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μία νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κυρίως για να ελέγχεται κατά διαστήματα η μέθοδος που εφαρμόζεται και για να γίνεται δυνατή η σύγκριση με αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Χρησιμοποιούνται τέσσερεις τάξεις μεθόδων.
1.4.
1.4.1. Μέθοδοι άνωσης
1.4.1.
1.4.1.1. Υδρόμετρο (για υγρές ουσίες) Ικανοποιητική ακρίβεια και γρήγοροι προσδιορισμοί της πυκνότητας επιτυγχάνονται με τα επιπλέοντα υδρόμετρα, τα οποία επιτρέπουν την εκτίμηση της πυκνότητας ενός υγρού από το βάθος που βυθίζονται και με ανάγνωση σε βαθμολογημένη κλίμακα.
1.4.1.2. Υδροστατικός ζυγός (για υγρές και στερεές ουσίες) Η διαφορά μεταξύ των βαρών ενός εξεταζόμενου δείγματος όταν μετριέται στον αέρα και σε κατάλληλο υγρό (π.χ. νερό) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της πυκνότητας του. Στα στερεά, η μετρούμενη πυκνότητα είναι αντιπροσωπευτική μόνο του συγκεκριμένου δείγματος. Για τον προσδιορισμό της πυκνότητας υγρών, σώμα γνωστού όγκου, ν, ζυγίζεται πρώτα στον αέρα και κατόπιν στο υγρό.
1.4.1.3. Μέθοδος βυθιζόμενου σώματος (για υγρές ουσίες) (4) Με τη μέθοδο αυτή, η πυκνότητα ενός υγρού προσδιορίζεται από τη διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων της ζύγισης του υγρού πριν και μετά τη βύθιση ενός σώματος γνωστού όγκου στο εξεταζόμενο υγρό.
1.4.2. Μέθοδοι πυκνομέτρου Για στερεά ή υγρά μπορούν να χρησιμοποιηθούν πυκνόμετρα διαφόρων σχημάτων με γνωστούς όγκους. Η πυκνότητα υπολογίζεται από τη διαφορά βάρους του γεμάτου και του άδειου πυκνόμετρου και. από το γνωστό όγκο του.
1.4.3. Συγκριτικά πυκνόμετρα αέρα (για στερεά) Η πυκνότητα ενός στερεού, οποιασδήποτε μορφής, μπορεί να μετρηθεί σε θερμοκρασία δωματίου με το συγκριτικό πυκνόμετρο αέρα. Ο όγκος μιας ουσίας μετριέται στον αέρα ή σε ένα αδρανές αέριο, σε έναν κύλινδρο μεταβλητά βαθμονομημένου όγκου. Για τον υπολογισμό της πυκνότητας γίνεται μια μέτρηση μάζας, αφού πρώτα γίνει η μέτρηση του όγκου.
1.4.4. Πυκνόμετρο ταλάντωσης (5) (6) (7) Η πυκνότητα ενός υγρού μπορεί να μετρηθεί με ένα πυκνόμετρο ταλάντωσης. Μηχανικός ταλαντωτής σε σχήμα σωλήνα U δονείται στη συχνότητα συντονισμού του ταλαντωτή που εξαρτάται από τη μάζα του. Η εισαγωγή του δείγματος αλλάζει τη συχνότητα συντονισμού του ταλαντωτή. Η συσκευή πρέπει να βαθμονομείται με δύο υγρές υκνότητες τους να καλύπτουν την περιοχή που πρόκειται να μετρηθεί.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Το πεδίο εφαρμογής των διαφόρων μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της σχετικής πυκνότητας παρατίθενται στον πίνακα.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Τα πρότυπα που δίνονται σαν παραδείγματα, και που πρέπει να συμβουλεύονται για πρόσθετες τεχνικές λεπτομέρειες, αναφέρονται στο προσάρτημα. Οι δοκιμές πρέπει να εκτελούνται στους 20 oC με διεξαγωγή τουλάχιστον δύο μετρήσεων.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Βλέπε πρότυπα.
3. ΠΙΝΑΚΑΣ: 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ
ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες·. Η σχετική πυκνότητα D204 πρέπει να αναφέρεται όπως ορίζεται στο 1.2, μαζί με τη φυσική κατάσταση της εξεταζόμενης ουσίας. Πρέπει να αναφέρεται κάθε πληροφορία και παρατήρηση που έχει σχέση με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας. Μέθοδος μέτρησης Πυκνότητα Μέγιστο δυνατό δυναμικό ιξώδες Υφιστάμενα πρότυπα στερεό υγρό Υδρόμετρο ναι 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Υδροστατικός ζυγός ναι ISO 1183 (A) ναι 5 Pa s ISO 901 και 758 Μέθοδος βυθισμένου σώματος ναι 20 Pa s DIN 53217 Πυκνόμετρο ISO 3507 ναι ISO 1183 (B), NF T 20-053 ναι 500 Pa s ISO 758 Συγκριτικό πυκνόμετρο αέρα ναι DIN 55990 τμήμα 3 DIN 53243 Πυκνόμετρο ταλάντωσης ναι 5 Pa s
χρησιμοποιηθείσα μέθοδο,
επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις) και καθαρισμού, εφόσον υπάρχει.
3. ΠΙΝΑΚΑΣ: 1.4.1.1.1.4.1.2. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ
(α) στερεά
(β) υγρά
3. ΠΙΝΑΚΑΣ: 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ
(α) στερεά
(β) υγρά
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ OECD, Paris, 198I, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. 1, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Fliissigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.11, 427-430. Leopold, H., Die digitaie Messung von Fiussigkeiten, Eiektronik, 1970, vol. 19, 297-302. Baumgarten, D., Fullmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flussigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.
A.4. ΤΑΣΗ ΑΤΜΩΝ
A.4.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Οι περισσότερες από τις περιγραφόμενες μεθόδους βασίζονται στην κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ (1). Οι βασικές αρχές δίδονται στα σημεία (2) και (3) της βιβλιογραφίας.
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Για την εκτέλεση της δοκιμής αυτής, χρήσιμο είναι να έχουμε προκαταρκτικές πληροφορίες για τη δομή, τη θερμοκρασία τήξεως και τη θερμοκρασία ζέσεως της ουσίας. Δεν υπάρχει ενιαία πειραματική διαδικασία μέτρησης που να μπορεί να εφαρμοσθεί σε όλη την κλίμακα των τιμών της τάσης ατμών. Συνεπώς, αρκετές μέθοδοι συνιστάται να χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση τάσεως ατμών στην περιοχή από < 10-4 έως 105 Pa. Οι προσμείξεις επηρεάζουν συνήθως την τάση ατμών και σε βαθμό που εξαρτάται ιδιαίτερα από το είδος της πρόσμειξης. Όταν στο δείγμα υπάρχουν πτητικές προσμείξεις, πράγμα που μπορεί να επηρεάσει το αποτέλεσμα, η ουσία μπορεί να καθαριστεί. Μπορεί επίσης να είναι σκόπιμο να προσδιορισθεί η τάση ατμών για το τεχνικό υλικό. Σε ορισμένες μεθόδους που περιγράφονται εδώ χρησιμοποιούνται συσκευές με μεταλλικά μέρη, πράγμα που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη όταν εξετάζονται διαβρωτικές ουσίες.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Ως τάση ατμών μιας ουσίας ορίζεται η πίεση κορεσμού πάνω από μία στερεά ή υγρά ουσία. Στη θερμοδυναμική ισορροπία, η τάση ατμών μιας καθαρής ουσίας είναι συνάρτηση μόνο της θερμοκρασίας. Η μονάδα πίεσης SI που θα πρέπει να χρησιμοποιείται είναι το πασκάλ (Pa). Μονάδες που έχουν χρησιμοποιηθεί ιστορικά, μαζί με τους συντελεστές μετατροπής τους, είναι: 1 Ton- (- 1 mm Hg) = 1,333 × 102 Pa 1 ατμόσφαιρα = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa Μονάδα θερμοκρασίας SI είναι το Κέλβιν (Κ). Η παγκόσμια σταθερά των αερίων R είναι 8,314 J mol-1 Kl-1. Η εξάρτηση της τάσης ατμών από τη θερμοκρασία περιγράφεται από την εξίσωση Clausius-Clapeyron: log p = Δ Hv2,3 RT+σταθερά όπου: p η τάση ατμών της ουσίας σε πασκάλ ΔΗv η θερμότητα εξατμίσεως της σε J mol-1 R η παγκόσμια σταθερά των αερίων σε J mol-1 Κ-1 Τ η θερμοδυναμική θερμοκρασία σε Κ
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Δεν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μια νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές πρέπει να χρησιμοποιούνται κυρίως για να ελέγχεται κατά διαστήματα η εφαρμοζόμενη μέθοδος και για να γίνεται δυνατή η σύγκριση με αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΔΟΚΙΜΗΣ Για τον προσδιορισμό της τάσης ατμών, προτείνονται επτά μέθοδοι που μπορούν να εφαρμοσθούν σε διάφορες περιοχές τάσης ατμών. Για κάθε μέθοδο, η τάση ατμών προσδιορίζεται σε διάφορες θερμοκρασίες. Σε μια περιορισμένη περιοχή θερμοκρασίας, ο λογάριθμος της τάσης ατμών μιας καθαρής ουσίας είναι γραμμική συνάρτηση του αντίστροφου της θερμοκρασίας.
1.4.
1.4.1. Δυναμική μέθοδος Στη δυναμική μέθοδο, μετριέται η θερμοκρασία ζέσεως που αντιστοιχεί σε μία ορισμένη πίεση. Συνιστώμενη περιοχή: 103 μέχρι 105 Pa. Η μέθοδος αυτή συνιστάται επίσης για τον προσδιορισμό της κανονικής θερμοκρασίας ζέσεως και για το σκοπό αυτό είναι χρήσιμη μέχρι τους 600 Κ.
1.4.2. Στατική μέθοδος Κατά τη στατική διαδικασία προσδιορίζεται, υπό θερμοδυναμική ισορροπία, σε μία ορισμένη θερμοκρασία, η τάση ατμών που αποκαθίσταται σε κλειστό σύστημα. Η μέθοδος αυτή είναι κατάλληλη για στερεά και υγρά που αποτελούνται από ένα και από πολλά συστατικά. Συνιστώμενη περιοχή: 10 έως 105 Pa. Η μέθοδος αυτή μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί και στην περιοχή από 1 έως 10 Pa υπό την προϋπόθεση να δοθεί κάποια ιδιαίτερη προσοχή.
1.4.3. Ισοτενισκόπιο Η πρότυπη αυτή μέθοδος είναι επίσης μία στατική μέθοδος αλλά συνήθως δεν προσφέρεται για συστήματα με πολλά συστατικά. Πρόσθετες πληροφορίες δίνονται στη μέθοδο ASTM D-2879-86. Συνιστώμενη περιοχή: από 100 έως 105 Pa.
1.4.4. Μέθοδος διάχυσης: ζυγός τάσης ατμών Προσδιορίζεται η ποσότητα ουσίας που εξέρχεται από ένα κύτταρο ανά μονάδα χρόνου μέσα από άνοιγμα γνωστού μεγέθους και υπό κενό έτσι ώστε η επίδραση της οποίας στο κύτταρο να είναι αμελητέα (π.χ. μετρώντας τον παλμό που παράγεται σε ένα ευαίσθητο ζυγό από ένα πίδακα ατμού ή μετρώντας την απώλεια βάρους). Συνιστώμενη περιοχή: 10-3 έως 1 Pa.
1.4.5. Μέθοδος διάχυσης: Προσδιορισμός μέσω της απώλειας βάρους ή παγίδευσης του εξατμισθέντος προϊόντος Η μέθοδος βασίζεται στον υπολογισμό της μάζας της εξεταζόμενης ουσίας που εξέρχεται ανά μονάδα χρόνου από ένα κύτταρο Knudsen (4) υπό μορφή ατμού, μέσω μικροσκοπικού ανοίγματος κάτω από συνθήκες υψηλού κενού. Η μάζα του ατμού που διαχέεται μπορεί να υπολογισθεί είτε προσδιορίζοντας την απώλεια μάζας του κυττάρου είτε συμπυκνώνοντας τον ατμό σε χαμηλή θερμοκρασία και προσδιορίζοντας την ποσότητα της εξατμισθείσας ουσίας χρησιμοποιώντας χρωματογραφική ανάλυση. Η τάση ατμών υπολογίζεται εφαρμόζοντας τη σχέση Hertz-Knudsen. Συνιστώμενη περιοχή: 10-3 έως 1 Pa
1.4.6. Μέθοδος κορεσμού αερίου Ρεύμα αδρανούς αερίου-φορέα διαβιβάζεται πάνω από την ουσία με τέτοιο τρόπο ώστε να γίνεται κορεσμένο ως προς τους ατμούς της. Η ποσότητα του υλικού που μεταφέρεται από γνωστή ποσότητα αερίου—φορέα μπορεί να μετρηθεί είτε συλλέγοντας το σε κατάλληλη παγίδα είτε με μια γνωστή αναλυτική τεχνική. Αυτό χρησιμοποιείται κατόπιν για τον υπολογισμό της τάσης των ατμών σε μία δεδομένη θερμοκρασία. Συνιστώμενη περιοχή: 10-4 έως 1 Pa. Η μέθοδος αυτή μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί και στην περιοχή 1 έως 10 Pa υπό την προϋπόθεση να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή.
1.4.7. Στροβιλιζόμενη μαγνητική σφαίρα Στο μετρητή στροβιλιζόμενης μαγνητικής σφαίρας, το πραγματικό στοιχείο μέτρησης είναι μία μικρή χαλύβδινη σφαίρα που αναρτάται σε ένα μαγνητικό πεδίο και στρέφεται με μεγάλη ταχύτητα. Η πίεση του αερίου υπολογίζεται από την επιβράδυνση της χαλύβδινης σφαίρας που εξαρτάται από την πίεση. Συνιστώμενη περιοχή: 10-4 έως 0,5 Pa.
1.5. Πινακας 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Ποιοτικά κριτήρια
ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Οι διάφορες μέθοδοι προσδιορισμού της τάσης ατμών συγκρίνονται μεταξύ τους σχετικά με το πεδίο εφαρμογής τους, την επαναληψιμότητα, την αναπαραγωγιμότητα, την περιοχή μέτρησης, το υφιστάμενο πρότυπο. Αυτό γίνεται στον ακόλουθο πίνακα. Μέθοδος μέτρησης Ουσίες Εκτιμώμενη επαναληψιμότητα(') Εκτιμώμενη αναπαραγωγιμότητα Συνιστώμενη περιοχή Υπάρχον πρότυπο στέρεα - υγρά Δυναμική μέθοδος Χαμηλή θερμοκρασία τήξεως ναι μέχρι 25 % μέχρι 25 % 103 Pa έως 2 × 103 Pa — 1 έως 5 % 1 έως 5 % 2 × 103 Pa έως 105aPa — Στατική μέθοδος ναι ναι 5 έως 10 % 5 έως 10 % 10 Pa έως 105 Pa NFT 20-048 (5) Ισοτενισκόπιο ναι ναι 5 έως 10 % 5 έως 10 % 102 Pa έως 10s Pa ASTM-D 2879-86 Μέθοδος διάχυσης: ζυγός τάσης ατμών ναι ναι 5 έως 20 % μέχρι 50 % 10-3 Pa έως 1 Pa NFT 20-047 (6) Μέθοδος διάχυσης: απώλεια βάρους ναι ναι 10 έως 30 % 10-3 Pa έως 1 Pa — Μέθοδος κορεσμού αερίου ναι ναι 10 έως 30 % μέχρι 50 % 10-4 Pa έως 1 Pa — Μέθοδος στροβιλιζόμενης σφαίρας ναι ναι 10 έως 20 % — 10-4 Pa έως 0,5 Pa —
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ
1.6.
1.6.1. Δυναμική μέτρηση
1.6.1.
1.6.1.1. Συσκευή Η συσκευή προσδιορισμού αποτελείται συνήθως από δοχείο ζέσεως με γυάλινο ή μεταλλικό ψυκτήρα (εικόνα 1), εξάρτημα μέτρησης της θερμοκρασίας και εξάρτημα ρύθμισης και μέτρησης της πίεσης. Μία τυπική συσκευή προσδιορισμού που εικονίζεται στο σχήμα είναι κατασκευασμένη από πυρίμαχο γυαλί και αποτελείται από πέντε μέρη: Ο μεγάλος σωλήνας με μερικώς διπλά τοιχώματα αποτελείται από μια εσμυρισμένη βαλβίδα, ένα ψυκτήρα, ένα δοχείο ψύξης και μία εισαγωγή. Ο γυάλινος κύλινδρος, με την αντλία Cottrell, είναι τοποθετημένος στο τμήμα ζέσεως του σωλήνα και έχει τραχεία επιφάνεια από τρίμματα γυαλιού προς αποφυγή εκτινάξεων κατά τη διάρκεια του βρασμού. Η θερμοκρασία μετριέται με κατάλληλο αισθητήρα θερμοκρασίας (π.χ. θερμόμετρο αντίστασης, θερμοστοιχείο επένδυσης) βυθισμένο στη συσκευή στο σημείο μέτρησης (σημείο 5, εικόνα 1) μέσω κατάλληλης εισαγωγής (π.χ. εσμυρισμένη σύνδεση). Στο εξάρτημα ρύθμισης και μέτρησης της πίεσης γίνονται οι κατάλληλες συνδέσεις. Η βαλβίδα, που παίζει το ρόλο ρυθμιστή του όγκου, συνδέεται με τη συσκευή μέτρησης μέσω τριχοειδούς σωλήνα. Το δοχείο ζέσεως θερμαίνεται με ένα θερμαντικό στοιχείο (π.χ. θερμομανδύα) που εισάγεται στη γυάλινη συσκευή από το κάτω μέρος. Το απαιτούμενο ρεύμα θέρμανσης παρέχεται και ρυθμίζεται μέσω θερμοστοιχείου. Το αναγκαίο κενό μεταξύ 102 Pa και 105 Pa περίπου, επιτυγχάνεται με μια αντλία κενού. Υπάρχει κατάλληλη βαλβίδα για την παροχή αέρα ή αζώτου για τη ρύθμιση της πίεσης (περιοχή μέτρησης περίπου 102 έως 105 Pa) και για αερισμό. Η πίεση μετριέται με μανόμετρο.
1.6.1.2. Διαδικασία μέτρησης Η τάση ατμών μετριέται προσδιορίζοντας τη θερμοκρασία ζέσεως του δείγματος σε διάφορες συγκεκριμένες πιέσεις μεταξύ περίπου 103 και 105. Σταθερή θερμοκρασία υπό σταθερή πίεση δείχνει ότι φθάσαμε στη θερμοκρασία ζέσεως. Με τη μέθοδο αυτή δεν μπορούν να εξετασθούν αφρίζουσες ουσίες. Η ουσία τοποθετείται σ' ένα καθαρό, ξηρό δοχείο δείγματος. Για μη κονιοποιημένα στερεά μπορεί να προκύψουν κάποια προβλήματα αλλά αυτά μπορούν, μερικές φορές, να λυθούν με θέρμανση του ψυκτήρα. Όταν πληρωθεί το δοχείο, η συσκευή κλείνεται αεροστεγώς με φλάντζα και η ουσία απαερώνεται. Η πίεση κατόπιν ρυθμίζεται στο χαμηλότερο επιθυμητό σημείο και τίθεται σε λειτουργία το σύστημα θέρμανσης. Ταυτόχρονα, ο αισθητήρας θερμοκρασίας συνδέεται με ένα καταγραφέα. Όταν υπό σταθερή πίεση σημειωθεί σταθερή θερμοκρασία ζέσεως τότε έχει επιτευχθεί ισορροπία. Ιδιαίτερη φροντίδα πρέπει να λαμβάνεται για να αποφεύγονται εκτινάξεις κατά τη διάρκεια του βρασμού. Όταν προσδιορίζεται η τάση ατμών στερεών χαμηλού σημείου τήξεως, πρέπει να λαμβάνεται φροντίδα να αποφεύγεται τυχόν φράξιμο του συμπυκνωτή. Μετά την καταγραφή αυτού του σημείου ισορροπίας, η πίεση ρυθμίζεται σε υψηλότερη τιμή. Η διαδικασία συνεχίζεται με τον ίδιο τρόπο μέχρις ότου να φθάσουμε στην τιμή των 105 Pa. (περίπου 5 έως 10 σημεία μέτρησης συνολικά). Στη δοκιμή ελέγχου, πρέπει να ακολουθηθεί αντίθετη πορεία μειώνοντας τις τιμές της πίεσης και επιτυγχάνοντας τα ίδια σημεία ισορροπίας.
1.6.2. Στατική ρύθμιση
1.6.2.
1.6.2.1. Συσκευή Η συσκευή περιλαμβάνει δοχείο δείγματος, σύστημα θέρμανσης και σύστημα ψύξης για τη ρύθμιση της θερμοκρασίας του δείγματος και τη μέτρηση της θερμοκρασίας. Η συσκευή περιλαμβάνει επίσης όργανα ρύθμισης και μέτρησης της πίεσης. Στις εικόνες 2α και 2β απεικονίζονται οι βασικές αρχές. Ο θάλαμος του δείγματος (εικόνα 2α) συνδέεται από τη μία πλευρά με μία κατάλληλη βαλβίδα υψηλού κενού. Από την άλλη πλευρά συνδέεται σωλήνας σχήματος U που περιέχει κατάλληλο μανομετρικό υγρό. Το ένα άκρο του U-οειδούς σωλήνα διακλαδίζεται προς την αντλία κενού, τον κύλινδρο αζώτου ή βαλβίδα εξαερισμού και ένα μανόμετρο. Αντί U-οειδούς σωλήνα μπορεί να χρησιμοποιηθεί μετρητής πίεσης με δείκτη πίεσης (εικόνα 2β). Για να ρυθμίζεται η θερμοκρασία του δείγματος, το δοχείο δείγματος με τη βαλβίδα και τον U-οειδή σωλήνα ή τον μετρητή πίεσης τοποθετείται σε λουτρό που διατηρείται σε σταθερή θερμοκρασία ±0,2 Κ. Οι μετρήσεις της θερμοκρασίας πραγματοποιούνται στο εξωτερικό τοίχωμα του δοχείου που περιέχει το δείγμα ή μέσα στο ίδιο το δοχείο. Για την εκκένωση της συσκευής χρησιμοποιείται αντλία κενού με παγίδα ψύξης αντίθετου ρεύματος. Στη μέθοδο 2α η τάση ατμών της ουσίας μετριέται έμμεσα χρησιμοποιώντας δείκτη μηδενός. Στην περίπτωση αυτή λαμβάνεται υπόψη το γεγονός ότι η πυκνότητα του υγρού στον U-οειδή σωλήνα μεταβάλλεται αν μεταβληθεί σημαντικά η θερμοκρασία. Ως δείκτες μηδενός για U-οειδή σωλήνα, ανάλογα με την κλίμακα πίεσης και τη χημική συμπεριφορά της εξεταζόμενης ουσίας, είναι κατάλληλα τα ακόλουθα υγρά: υδράργυρος, έλαια σιλικόνης, φθαλικά άλατα. Η υπό δοκιμή ουσία δεν πρέπει να διαλύεται σε μεγάλο βαθμό ή να αντιδρά με το υγρό του U-οειδή σωλήνα. Για το μανόμετρο ο υδράργυρος μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μία περιοχή κανονικής ατμοσφαιρικής πίεσης μέχρι 102 Pa, ενώ τα έλαια σιλικόνης και τα φθαλικά είναι κατάλληλα από 102 Pa μέχρι 10 Pa. Μπορούν ακόμη να χρησιμοποιηθούν σε τιμές κάτω των 10-1 Pa μανόμετρα μεμβράνης. Υπάρχουν και άλλοι μετρητές πίεσης που μπορούν να χρησιμοποιηθούν κάτω των 102 Pa.
1.6.2.2. Διαδικασία μέτρησης Πριν από τη διεξαγωγή της μέτρησης, όλα τα εξαρτήματα της συσκευής που εικονίζεται στην εικόνα 2 πρέπει να καθαρίζονται και να ξηραίνονται επισταμένα. Στη μέθοδο 2α, ο U-οειδής σωλήνας γεμίζεται με το επιλεγμένο υγρό, που πρέπει να απαερώνεται σε υψηλή θερμοκρασία πριν γίνουν οι μετρήσεις. Η υπό δοκιμή ουσία τοποθετείται στη συσκευή, που κατόπιν κλείνεται και η θερμοκρασία μειώνεται σε βαθμό επαρκή για απαέρωση. Η θερμοκρασία πρέπει να είναι αρκετά χαμηλή ώστε να εξασφαλίζεται ότι αναρροφάται ο αέρας, όμως — στην περίπτωση συστήματος πολλών συστατικών — δεν πρέπει να αλλοιώνεται η σύνθεση του υλικού. Εφόσον απαιτείται, η ισορροπία μπορεί να αποκαθίσταται γρηγορότερα με ανάδευση. Το δείγμα μπορεί να υπερψυχθεί με π.χ. υγρό άζωτο (προνοούμε ώστε να αποφευχθεί συμπύκνωση του αέρα ή υγρό αντλίας) ή μείγμα αιθανόλης και ξηρού πάγου. Για μετρήσεις σε χαμηλές θερμοκρασίες χρησιμοποιείται θερμοκρασιακά ρυθμιζόμενο λουτρό που συνδέεται με διάταξη υπέρψυξης. Με ανοικτή τη βαλβίδα πάνω από το δοχείο δείγματος, εφαρμόζεται για μερικά λεπτά αναρρόφηση για να απομακρυνθεί c αέρας. Η βαλβίδα κατόπιν κλείνεται και η θερμοκρασία του δείγματος μειώνεται στο χαμηλότερο επιθυμητό επίπεδο. Εφόσον απαιτείται, η απαέρωση πρέπει να επαναλαμβάνεται αρκετές φορές. Όταν το δείγμα θερμαίνεται η τάση ατμών αυξάνεται. Έτσι μεταβάλλεται η ισορροπία του υγρού στον U-οειδή σωλήνα. Για εξουδετέρωση αυτής της μεταβολής, άζωτο ή αέρας αφήνεται να εισέλθει στη συσκευή μέσω βαλβίδας μέχρι που ο δείκτης πίεσης (το υγρό) να είναι πάλι στο μηδέν. Η πίεση που απαιτείται για το σκοπό αυτό μπορεί να εξακριβωθεί με ένα μανόμετρο ακριβείας σε θερμοκρασία δωματίου. Η πίεση αυτή αντιστοιχεί στην τάση ατμών της ουσίας στη συγκεκριμένη αυτή θερμοκρασία μέτρησης. Η μέθοδος 2β είναι παρόμοια εκτός από το ότι η τάση ατμών μετράται απευθείας. Η εξάρτηση της τάσης ατμών από τη θερμοκρασία προσδιορίζεται σε κατάλληλα μικρά διαστήματα θερμοκρασίας (περίπου 5 έως 10 σημεία μέτρησης συνολικά) μέχρι το επιθυμητό ανώτατο σημείο. Αναγνώσεις σε χαμηλές θερμοκρασίες πρέπει να επαναλαμβάνονται ως δοκιμές ελέγχου. Αν οι τιμές που λαμβάνονται από τις επαναλαμβανόμενες αναγνώσεις δεν συμπίπτουν με την καμπύλη που λαμβάνεται όταν αυξάνεται η θερμοκρασία, αυτό μπορεί να οφείλεται σε έναν από τους ακόλουθους λόγους:
1.6.2.2.
1. Το δείγμα περιέχει ακόμη αέρα (π.χ. υλικά υψηλού ιξώδους) ή ουσίες χαμηλού σημείου ζέσεως, που απελευθερώνονται κατά τη θέρμανση και μπορούν να απομακρυνθούν με αναρρόφηση μετά από περαιτέρω υπέρψυξη.
2. Η θερμοκρασία ψύξης δεν είναι αρκετά χαμηλή. Στην περίπτωση αυτή, ως ψυκτικό μέσον χρησιμοποιείται υγρό άζωτο. Αν συμβαίνει είτε η πρώτη είτε η δεύτερη περίπτωση, οι μετρήσεις πρέπει να επαναληφθούν.
3. Η ουσία υφίσταται χημική αντίδραση στη διερευνώμενη περιοχή θερμοκρασιών (π.χ. αποσύνθεση, πολυμερισμό).
1.6.3. Ισοτενισκόπιο Πλήρης περιγραφή της μεθόδου αυτής υπάρχει στην παραπομπή (7). Η αρχή της συσκευής μέτρησης εμφανίζεται στην εικόνα 3. Όπως και η στατική μέθοδος που περιγράφεται στο σημείο 1.6.2, το ισοτενισκόπιο είναι κατάλληλο για τη διερεύνηση στερεών και υγρών. Στην περίπτωση των υγρών, σαν υγρό στο βοηθητικό μανόμετρο χρησιμεύει η ίδια η ουσία. Ποσότητα του υγρού, επαρκής για την πλήρωση της φούσκας και του μικρού σκέλους του μανομέτρου, φέρεται στο ισοτενισκόπιο. Το ισοτενισκόπιο συνδέεται με σύστημα κενού και εκκενώνεται, κατόπιν πληρούται με άζωτο. Η εκκένωση και ο καθαρισμός του συστήματος επαναλαμβάνεται δύο φορές για να απομακρυνθεί το εναπομένον οξυγόνο. Το γεμάτο ισοτενισκόπιο τοποθετείται σε οριζόντια θέση έτσι ώστε το δείγμα να απλωθεί σε μορφή λεπτής στιβάδας στη φούσκα και στο μανόμετρο (τμήμα U). Η πίεση του συστήματος ελαττώνεται στα 133 Pa και το δείγμα θερμαίνεται ήπια μέχρι μόλις να αρχίσει να βράζει (απομάκρυνση των διαλυμένων αερίων). Το ισοτενισκόπιο τοποθετείται κατόπιν έτσι ώστε το δείγμα να επιστρέφει στη φούσκα και στο κοντό σκέλος του μανομέτρου, έτσι ώστε και τα δύο να γεμισθούν τελείως με υγρό. Η πίεση διατηρείται όσο χρειάζεται για απαέρωση' το προεξέχον άκρο της φούσκας θερμαίνεται με μία μικρή φλόγα μέχρι που ο απελευθερούμενος ατμός του δείγματος να αυξηθεί αρκετά ώστε να εκτοπίσει μέρος του δείγματος από το πάνω μέρος της φούσκας και του μανομετρικού βραχίονα στο μανομετρικό τμήμα του ισοτενισκοπίου, δημιουργώντας ένα χώρο γεμάτο με ατμό και ελεύθερο από άζωτο. Το ισοτενισκόπιο τοποθετείται κατόπιν σε λουτρό σταθερής θερμοκρασίας, και η πίεση του αζώτου ρυθμίζεται μέχρις ότου η πίεση του να είναι ίση με την πίεση του δείγματος. Η εξίσωση των πιέσεων γίνεται αντιληπτή από το μανομετρικό τμήμα του ισοτενισκοπίου. Κατά την ισορροπία, η τάση ατμών του αζώτου είναι ίση με την τάση ατμών της ουσίας. Στην περίπτωση των στερεών, ανάλογα με την πίεση και τη θερμοκρασία, χρησιμοποιούνται τα μανομετρικό υγρά που αναφέρονται στο σημείο 1.6.2.1. Το απαερωμένο μανομετρικό υγρό φέρεται σε μια υποδοχή στο μικρό βραχίονα του ισοτενισκοπίου. Κατόπιν το διευρυνόμενο στερεό τοποθετείται στη φούσκα και απαερώνεται σε υψηλή θερμοκρασία. Ύστερα, το ισοτενισκόπιο τοποθετείται με κλίση έτσι ώστε το μανομετρικό υγρό να μπορεί να ρέει στον U-οειδή σωλήνα. Η μέτρηση της τάσης ατμών ως συνάρτηση της θερμοκρασίας πραγματοποιείται σύμφωνα με το σημείο 1.6.2.
1.6.4. Μέθοδος διάχυσης: ζυγός τάσης ατμών
1.6.4.
1.6.4.1. Συσκευή Στη βιβλιογραφία (1) περιγράφονται διάφορες παραλλαγές της συσκευής. Η συσκευή που περιγράφεται εδώ, περιγράφει τη γενική αρχή (εικόνα 4). Στην εικόνα 4 εικονίζονται τα κύρια μέρη της συσκευής, που περιλαμβάνει ένα δοχείο υψηλού κενού από ανοξείδωτο χάλυβα ή γυαλί, διάταξη παραγωγής και μέτρησης κενού και ενσωματωμένα εξαρτήματα για τη μέτρηση της τάσης ατμών σε ζυγό. Στη συσκευή περιλαμβάνονται τα ακόλουθα ενσωματωμένα εξαρτήματα:
Φούρνος εξάτμισης με δακτύλιο στεγανότητας και περιστροφική εισαγωγή. Ο φούρνος εξάτμισης είναι ένα κυλινδρικό δοχείο, κατασκευασμένο π.χ. από χαλκό ή από ένα ανθεκτικό στα χημικά αντιδραστήρια κράμα με καλή θερμική αγωγιμότητα. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί γυάλινο δοχείο με χάλκινο τοίχωμα. Ο φούρνος έχει διάμετρο περίπου 3 έως 5 cm και ύψος 2 έως 5 cm. Το ρεύμα ατμού διέρχεται από ένα έως τρία ανοίγματα διαφορετικών μεγεθών. Ο φούρνος θερμαίνεται είτε με μια θερμαντική πλάκα που είναι κάτω από αυτόν είτε με ένα πηνίο θέρμανσης τυλιγμένο στο εξωτερικό του. Για να εμποδιστεί η διάχυση της θερμότητας στην πλάκα της βάσης, ο φούρνος προσαρμόζεται στην πλάκα που χρησιμεύει ως βάση μέσω ενός μετάλλου χαμηλής θερμικής αγωγιμότητας (χάλυβας νικελίου-αργύρου ή χρωμίου-νικελίου), π.χ. ένα σωλήνα νικελίου-αργύρου προσαρμοσμένο σε μια περιστροφική εισαγωγή εφόσον χρησιμοποιείται φούρνος με ορισμένα ανοίγματα. Η διάταξη αυτή έχει το πλεονέκτημα ότι επιτρέπει την είσοδο μιας ράβδου από χαλκό. Αυτό επιτρέπει την ψύξη απέξω χρησιμοποιώντας ένα λουτρό ψύξης.
Αν το χάλκινο κάλυμμα του φούρνου έχει τρία ανοίγματα διαφόρων διαμέτρων υπό γωνία 90o το ένα προς το άλλο, μπορούν να καλυφθούν διάφορες περιοχές τάσης ατμών μέσα στα όρια της όλης περιοχής μέτρησης (ανοίγματα διαμέτρου μεταξύ 0,30 και 4,5 mm). Μεγάλα ανοίγματα χρησιμοποιούνται για χαμηλές τάσεις ατμών και αντίστροφα. Με την περιστροφή του φούρνου το επιθυμητό άνοιγμα ή μία ενδιάμεση θέση (άνοιγμα φούρνου — θώρακας — φάλαγγα ζυγού), μπορεί να έλθει στο ρεύμα του ατμού και το ρεύμα των μορίων ελευθερώνεται ή εκτρέπεται μέσω του ανοίγματος του φούρνου προς το δίσκο του ζυγού. Για να μετρηθεί η θερμοκρασία της ουσίας, τοποθετείται σε κατάλληλο σημείο ένα θερμοστοιχείο ή ένα θερμόμετρο αντίστασης.
Πάνω από το θώρακα υπάρχει ένας δίσκος ζυγού που ανήκει σε ένα μικροζυγό υψηλής ευαισθησίας (βλέπε πιο κάτω). Ο δίσκος του ζυγού έχει διάμετρο περίπου 30 mm. Κατάλληλο υλικό είναι το επιχρυσωμένο αλουμίνιο.
Ο δίσκος του ζυγού περιβάλλεται από ένα κυλινδρικό ορειχάλκινο ή χάλκινο δοχείο ψύξης. Ανάλογα με τον τύπο του ζυγού, έχει ανοίγματα για τη φάλαγγα του ζυγού και ένα άνοιγμα στο θώρακα για το ρεύμα των μορίων και θα πρέπει να εξασφαλίζει την πλήρη συμπύκνωση του ατμού στο δίσκο του ζυγού. Η διάχυση της θερμότητας προς τα έξω εξασφαλίζεται π.χ. με μια χάλκινη ράβδο που συνδέεται με το δοχείο ψύξης. Η ράβδος διέρχεται διαμέσου της πλάκας-βάσης και είναι θερμικά μονωμένη από αυτή, π.χ. με σωλήνα από χάλυβα χρωμίου-νικελίου. Η ράβδος βυθίζεται σε ένα δοχείο Dewar που περιέχει υγρό άζωτο, κάτω από την πλάκα-βάση ή διαμέσου της ράβδου κυκλοφορεί υγρό άζωτο. Το δοχείο ψύξης διατηρείται έτσι στους - 120 oC περίπου. Ο δίσκος του ζυγού ψύχεται αποκλειστικά με ακτινοβολία και είναι ικανοποιητικός για την εξεταζόμενη περιοχή πίεσης (ψύξη περίπου μία ώρα πριν από την έναρξη των μετρήσεων).
Ο ζυγός τοποθετείται πάνω από το δοχείο ψύξης. Κατάλληλοι για την περίπτωση ζυγοί είναι π.χ. οι ηλεκτρονικοί μικροζυγοί δύο βραχιόνων υψηλής ευαισθησίας (8) ή διατάξεις κινούμενου πηνίου υψηλής ευαισθησίας (βλέπε κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ 104. Έκδοση 12.05.81).
Η πλάκα που χρησιμεύει ως βάση περιλαμβάνει επίσης ηλεκτρικές συνδέσεις για θερμοστοιχεία (ή θερμόμετρα αντίστασης) και πηνία θέρμανσης.
Στο δοχείο παράγεται κενό χρησιμοποιώντας αντλία μερικού κενού ή αντλία υψηλού κενού (απαιτούμενο κενό περίπου 1 έως 2×10-3 Pa, που επιτυγχάνεται μετά από δύο ώρες άντληση). Η πίεση ρυθμίζεται με κατάλληλο μανόμετρο ιοντισμού.
1.6.4.2. Διαδικασία μέτρησης Το δοχείο πληρούται με την εξεταζόμενη ουσία και κλείνεται το κάλυμμα. Τοποθετούνται στο φούρνο ο θώρακας και ο ψυκτήρας. Η συσκευή κλείνεται και τίθενται σε λειτουργία οι αντλίες κενού. Η τελική πίεση πριν αρχίσουμε να παίρνουμε μετρήσεις θα πρέπει να είναι περίπου 10-4 Pa. Η ψύξη του δοχείου ψύξης αρχίζει στα 10-2 Pa. Όταν επιτευχθεί το απαιτούμενο κενό, αρχίζει η σειρά των μετρήσεων βαθμονόμησης στη χαμηλότερη απαιτούμενη θερμοκρασία. Κανονίζεται το αντίστοιχο άνοιγμα στο κάλυμμα, ο ατμός διέρχεται διαμέσου του θώρακα αμέσως πάνω από το άνοιγμα και κτυπά τον ψυχόμενο δίσκο του ζυγού. Ο δίσκος του ζυγού πρέπει να είναι αρκετά μεγάλος ώστε να εξασφαλίζεται η πρόσκρουση όλου του ρεύματος ατμού που περνάει από το θώρακα πάνω σ' αυτόν. Η ορμή του ατμού ενεργεί σαν δύναμη στο δίσκο του ζυγού και τα μόρια συμπυκνώνονται στην ψυχρή του επιφάνεια. Η ορμή και η ταυτόχρονη συμπύκνωση παράγουν στον καταγραφέα ένα σήμα. Η αξιολόγηση των σημάτων παρέχει δύο ειδών πληροφορίες: p = G 2 π RT×103M όπου: G ταχύτητα εξάτμισης (Kg s-1 m-2) Μ μοριακή μάζα (g mol-1) Τ θερμοκρασία (Κ) R παγκόσμια σταθερά των αερίων (J mol-1 Κ-1) p τάση ατμών (Pa) Αφού επιτευχθεί το αναγκαίο κενό, αρχίζει η σειρά των μετρήσεων στη χαμηλότερη επιθυμητή θερμοκρασία μέτρησης. Για περαιτέρω μετρήσεις, η θερμοκρασία αυξάνεται κατά διαστήματα μέχρι που να επιτευχθεί η μέγιστη επιθυμητή θερμοκρασιακή τιμή. Το δείγμα κατόπιν ψύχεται πάλι και μπορεί να χαραχθεί μία δεύτερη καμπύλη τάσεως ατμών. Αν η δεύτερη δοκιμή δεν επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα της πρώτης δοκιμής, τότε είναι πιθανόν η ουσία να αποσυντίθεται στη χρησιμοποιούμενη περιοχή θερμοκρασιών.
1.6.4.2.
1. Στη συσκευή που περιγράφεται εδώ, η τάση ατμών προσδιορίζεται απευθείας από την ορμή στο δίσκο του ζυγού [δεν είναι αναγκαίο να γνωρίζουμε γι' αυτό το μοριακό βάρος (2)]. Για την αξιολόγηση των ενδείξεων, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη και γεωμετρικοί παράγοντες όπως το άνοιγμα του φούρνου και η γωνία του μοριακού ρεύματος.
2. Μπορεί να μετρηθεί ταυτόχρονα η μάζα του συμπυκνωμένου και από αυτή μπορεί να υπολογισθεί η ταχύτητα εξάτμισης. Η τάση ατμών μπορεί επίσης να υπολογισθεί από την ταχύτητα εξάτμισης και το μοριακό βάρος χρησιμοποιώντας την εξίσωση Hertz (2).
1.6.5. Μέθοδος διάχυσης — Προσδιορισμός από την απώλεια βάρους
1.6.5.
1.6.5.1. Συσκευή Η συσκευή διάχυσης αποτελείται από τα ακόλουθα βασικά μέρη: Ως παράδειγμα, στην εικόνα 5 εικονίζεται μία ηλεκτρικά θερμαινόμενη δεξαμενή κενού από αλουμίνιο με 4 κύτταρα διάχυσης από ανοξείδωτο χάλυβα. Το φύλλο του ανοξείδωτου χάλυβα, πάχους περίπου 0,3 mm, έχει μία τρύπα διάχυσης διαμέτρου 0,2 έως 1,0 mm και συνδέεται με τα κύτταρα διάχυσης με ένα βιδωτό καπάκι.
μια δεξαμενή που μπορεί να θερμοστατηθεί και εκκενωθεί και στην οποία ευρίσκονται τα κύτταρα διάχυσης,
μία αντλία υψηλού κενού (π.χ. αντλία διάχυσης ή στροβιλομοριακή αντλία) με μετρητή κενού,
μία παγίδα, όπου χρησιμοποιείται υγροποιημένο άζωτο ή ξηρός πάγος.
1.6.5.2. Διαδικασία μέτρησης Φέρονται σε κάθε κύτταρο διάχυσης η εξεταζόμενη ουσία και η ουσία αναφοράς, το μεταλλικό διάφραγμα με την τρύπα ασφαλίζεται με το βιδωτό καπάκι και το κάθε κύτταρο ζυγίζεται με ακρίβεια 0,1 mg. To κύτταρο τοποθετείται στη θερμοστατημένη συσκευή, η οποία κατόπιν εκκενώνεται μέχρι κάτω από το ένα δέκατο της αναμενόμενης πίεσης. Σε καθορισμένες χρονικές στιγμές σε διάστημα από 5 έως 30 ώρες, εισάγεται αέρας στη συσκευή, και προσδιορίζεται με ξαναζύγισμα η απώλεια μάζας του κυττάρου διάχυσης. Για να εξασφαλισθεί ότι τα αποτελέσματα δεν επηρεάζονται από πτητικές προσμείξεις, το κύτταρο ξαναζυγίζεται σε καθορισμένες χρονικές στιγμές, για να ελεγχθεί αν η ταχύτητα εξάτμισης παραμένει σταθερή τουλάχιστον σε δύο τέτοιες χρονικές στιγμές. Η τάση ατμών ρ στο κύτταρο διάχυσης δίνεται από τον παρακάτω τύπο : p = mKAt2 π R TM όπου: p τάση ατμών (Pa) m η μάζα της ουσίας που εγκαταλείπει το κύτταρο κατά το χρονικό διάστημα t (kg) t χρόνος (s) A εμβαδόν της τρύπας (m2 Κ συντελεστής διόρθωσης R παγκόσμια σταθερά των αερίων (J mol-1 Κ-1) Τ θερμοκρασία (Κ) Μ μοριακή μάζα (kg mol-1) Ο συντελεστής διόρθωσης Κ εξαρτάται από τη σχέση του μήκους προς την ακτίνα της κυλινδρικής τρύπας: σχέση: 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 Κ: 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Η προηγούμενη εξίσωση μπορεί να γραφεί: p = E mtTM όπου E = 1KA2πR είναι η σταθερά τον κυττάρου διάχυσης. Η σταθερά αυτή του κυττάρου διάχυσης Ε μπορεί να προσδιορισθεί με ουσίες αναφοράς (2,9), χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: E = p(r)tmM(r)T όπου: p(r) η τάση ατμών της ουσίας αναφοράς (Pa) M(r) η μοριακή μάζα της ουσίας αναφοράς (Kgi-mol-1)
1.6.6. Μέθοδος κορεσμού αερίου
1.6.6.
1.6.6.1. Συσκευή Μία τυπική συσκευή που χρησιμοποιείται για την εκτέλεση της δοκιμής αυτής περιλαμβάνει διάφορα τμήματα που εικονίζονται στην εικόνα 6α και περιγράφονται κατωτέρω (1).
1.6.6.1. Αδρανές αέριο:
Το αέριο μεταφοράς δεν πρέπει να αντιδρά χημικώς με την εξεταζόμενη ουσία. Συνήθως, για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιείται άζωτο αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να απαιτούνται άλλα αέρια (10). Το χρησιμοποιούμενο αέριο πρέπει να είναι ξηρό (βλέπε εικόνα 6α, σημείο 4: αισθητήρας σχετικής υγρασίας).
Έλεγχος ροής:
Για να εξασφαλίζεται σταθερή και προκαθορισμένη ροή διαμέσου της στήλης κορεσμού, απαιτείται η χρησιμοποίηση κατάλληλου συστήματος ελέγχου αερίων.
Παγίδες συλλογής ατμών:
Οι παγίδες αυτές εξαρτώνται από τα χαρακτηριστικά του συγκεκριμένου δείγματος και από την επιλεγείσα μέθοδο ανάλυσης. Ο ατμός θα πρέπει να παγιδεύεται ποσοτικά και με τη μορφή που να επιτρέπει τη μετέπειτα ανάλυση. Για ορισμένες εξεταζόμενες ουσίες, κατάλληλες είναι παγίδες που περιέχουν υγρά όπως το εξάνιο ή η αιθυλενογλυκόλη. Για άλλες, μπορεί να χρησιμοποιούνται στερεά προσροφητικά υλικά. Ως εναλλακτική λύση αντί της παγίδευσης των ατμών και της μετέπειτα ανάλυσης, σύγχρονες αναλυτικές τεχνικές, μπορεί να χρησιμοποιούνται, όπως χρωματογραφία, για τον ποσοτικό προσδιορισμό του υλικού που μεταφέρεται από γνωστή ποσότητα αερίου μεταφοράς. Περαιτέρω, μπορεί να μετρηθεί η απώλεια μάζας του δείγματος.
Εναλλάκτης θερμότητας:
Για μετρήσεις σε διαφορετικές θερμοκρασίες, μπορεί να είναι αναγκαίο να συμπεριληφθεί στη διάταξη και εναλλάκτης θερμότητας.
Στήλη κορεσμού:
Η εξεταζόμενη ουσία εναποτίθεται από διάλυμα σε κατάλληλο αδρανές υπόστρωμα. Το υπόστρωμα συμπιέζεται στη στήλη κορεσμού, οι διαστάσεις της οποίας και η ταχύτητα ροής θα πρέπει να είναι τέτοιες ώστε να εξασφαλίζεται ο πλήρης κορεσμός του αερίου μεταφοράς. Η στήλη κορεσμού πρέπει να είναι θερμοστατημένη. Για μετρήσεις πάνω από τη θερμοκρασία δωματίου, το τμήμα μεταξύ στήλης κορεσμού και παγίδων θα πρέπει να θερμαίνεται για να παρεμποδίζεται η συμπύκνωση της εξεταζόμενης ουσίας. Για να μειώνεται η μεταφορά μάζας που επέρχεται με διάχυση, μπορεί να τοποθετηθεί ένας τριχοειδής σωλήνας μετά τη στήλη κορεσμού (εικόνα 6β).
1.6.6.2. Διαδικασία μέτρησης
1.6.6.2. Προπαρασκευή της στήλης κορεσμού:
Διάλυμα της εξεταζόμενης ουσίας σε πολύ πτητικό διαλύτη φέρεται σε κατάλληλη ποσότητα υποστρώματος. Θα πρέπει να προστίθεται επαρκής ποσότητα της εξεταζόμενης ουσίας ώστε να διατηρείται ο κορεσμός σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής. Ο διαλύτης απομακρύνεται τελείως με εξάτμιση στον αέρα ή με περιστροφική συσκευή εξάτμισης και το υλικό, αφού αναμειχθεί επισταμένα, προστίθεται στη στήλη κορεσμού. Αφού θερμοστατηθεί το δείγμα, διαβιβάζεται διαμέσου της συσκευής ξηρό άζωτο.
Μέτρηση:
Οι παγίδες ή ο χρησιμοποιούμενος ανιχνευτής συνδέονται με την έξοδο της στήλης και καταγράφεται ο χρόνος. Στην αρχή και σε τακτά χρονικά διαστήματα κατά τη διάρκεια του πειράματος ελέγχεται η ταχύτητα ροής χρησιμοποιώντας ένα φυσαλιδόμετρο (ή συνεχώς, με ροόμετρο μάζας). Στην έξοδο της στήλης πρέπει να μετριέται η πίεση. Αυτό μπορεί να γίνει είτε: Ο χρόνος που απαιτείται για τη συλλογή της ποσότητας της εξεταζόμενης ουσίας που είναι αναγκαία για τις διάφορες μεθόδους ανάλυσης προσδιορίζεται σε προκαταρκτικές δοκιμές ή κατ' εκτίμηση. Ως εναλλακτική λύση αντί της συλλογής της ουσίας για περαιτέρω ανάλυση, μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάποια σύγχρονη τεχνική ποσοτικής ανάλυσης (π.χ. χρωματογραφία). Πριν να υπολογισθεί η τάση ατμών σε μια δεδομένη θερμοκρασία, πρέπει να διεξαχθούν προκαταρκτικές δοκιμές για να προσδιορισθεί η μέγιστη ταχύτητα ροής με την οποία μπορεί να κορεσθεί πλήρως το αέριο μεταφοράς με τους ατμούς της ουσίας. Αυτό εξασφαλίζεται αν το αέριο μεταφοράς διαβιβασθεί διαμέσου της στήλης αρκετά αργά ώστε τυχόν χαμηλότερη ταχύτητα να μη παρέχει Η ενδεδειγμένη αναλυτική μέθοδος καθορίζεται από τη φύση της εξεταζόμενης ουσίας (π.χ. αέρια χρωματογραφία ή σταθμική μέθοδος). Προσδιορίζεται η ποσότητα ουσίας που μεταφέρεται από γνωστό όγκο αερίου μεταφοράς.
α)
παρεμβάλλοντας ένα μετρητή πίεσης μεταξύ της στήλης και των παγίδων (ο τρόπος αυτός μπορεί να μην είναι ικανοποιητικός διότι έτσι αυξάνεται ο νεκρός χώρος και η προσροφητική επιφάνεια) είτε
β)
προσδιορίζοντας την πτώση πίεσης κατά μήκος του χρησιμοποιούμενου συγκεκριμένου συστήματος παγίδευσης, σαν συνάρτηση της ταχύτητας ροής σε ξεχωριστό πείραμα (πράγμα που ενδέχεται να μην είναι πολύ ικανοποιητικό για υγρές παγίδες).
1.6.6.3. Υπολογισμός τάσης ατμών Η τάση ατμών υπολογίζεται από την πυκνότητα ατμών, W/V, με την παρακάτω εξίσωση: p = WV × RTM όπου: p τάση ατμών (Pa) W μάζα της εξεταζόμενης ουσίας που εξατμίζεται (g) V όγκος κορεσμένου αερίου (m3) R παγκόσμια σταθερά των αερίων (J mol-1 K-1) Τ θερμοκρασία (Κ) Μ μοριακή μάζα της εξεταζόμενης ουσίας (g mol-1) Οι μετρούμενοι όγκοι πρέπει να διορθώνονται για τυχόν διαφορές πίεσης και θερμοκρασίας μεταξύ του ροόμετρου και της θερμοστατημένης στήλης. Αν το ροόμετρο βρίσκεται μετά την παγίδα κατά τη διεύθυνση της ροής, μπορεί να χρειάζεται να γίνουν διορθώσεις για να ληφθούν υπόψη τυχόν εξατμιζόμενα συστατικά της παγίδας (1).
1.6.7. Στροβιλιζόμενη μαγνητική σφαίρα (8,11,13)
1.6.7.
1.6.7.1. Συσκευή Η τεχνική της στροβιλιζόμενης σφαίρας μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας το μετρητή ιξώδους με περιστρεφόμενη σφαίρα όπως εικονίζεται στην εικόνα 8. Στην εικόνα 7 εικονίζεται ένα σχηματικό διάγραμμα της πειραματικής εγκατάστασης. Η συσκευή μέτρησης αποτελείται συνήθως από μία κεφαλή μέτρησης με περιστρεφόμενη σφαίρα, τοποθετημένη μέσα σε θερμοστατημένο περίβλημα (που ρυθμίζεται με ακρίβεια 0,1 oC). To δοχείο που περιέχει το δείγμα τοποθετείται μέσα σε θερμοστατούμενο περίβλημα (ρυθμιζόμενο με ακρίβεια 0,01 oC) και όλα τα άλλα τμήματα της διάταξης διατηρούνται σε υψηλότερη θερμοκρασία για να παρεμποδίζεται η συμπύκνωση. Στο σύστημα συνδέεται διάταξη αντλίας υψηλού κενού μέσω βαλβίδων υψηλού κενού. Η κεφαλή του περιστρεφόμενης σφαίρας αποτελείται από μία χαλύβδινη σφαίρα (διαμέτρου 4 έως 5 mm) μέσα σε ένα σωλήνα. Η σφαίρα φέρεται και σταθεροποιείται σε ένα μαγνητικό πεδίο, χρησιμοποιώντας γενικά συνδυασμό μονίμων μαγνητών και πηνίων ελέγχου. Η σφαίρα εξαναγκάζεται να στροβιλίζεται υπό την επενέργεια περιστρεφόμενων πεδίων που παράγονται από πηνία. Πηνία ανάληψης, που καταμετρούν τον υπάρχοντα πάντοτε χαμηλό πλευρικό μαγνητισμό της σφαίρας, δίνουν τη δυνατότητα μέτρησης της ταχύτητας στροβιλισμού (περιστροφής).
1.6.7.2. Διαδικασία μέτρησης Όταν η σφαίρα φθάσει σε μια δεδομένη ταχύτητα περιστροφής ν(ο) (συνήθως γύρω στις 400 στροφές το δευτερόλεπτο), διακόπτεται η περαιτέρω λειτουργία και επέρχεται επιβράδυνση, λόγω τριβής του αερίου. Η πτώση της ταχύτητας περιστροφής μετριέται ως συνάρτηση του χρόνου. Δεδομένου ότι η τριβή που προκαλείται από τη μαγνητική αναστολή είναι αμελητέα σε σύγκριση με την τριβή του αερίου, η πίεση ρ του αερίου δίνεται από τον παρακάτω τύπο: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) οπού: c— η μέση ταχύτητα των μορίων του αερίου r η ακτίνα της σφαίρας p η πυκνότητα της μάζας της σφαίρας σ συντελεστής εφαπτομενικής ορμής (σ = 1 για ιδεώδη σφαιρική επιφάνεια της σφαίρας) t χρόνος v(t) ταχύτητα περιστροφής μετά από χρόνο t ν(ο) αρχική ταχύτητα περιστροφής Η εξίσωση αυτή μπορεί επίσης να γραφεί: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 όπου tn, tn-1 είναι οι χρόνοι που απαιτούνται για ένα δεδομένο αριθμό περιστροφών. Τα χρονικά αυτά διαστήματα tn και tn-1 διαδέχονται το ένα το άλλο, και tn > tn-1. Η μέση ταχύτητα των μορίων του αερίου c— δίνεται από τον παρακάτω τύπο: c— = 8 RTπ M12 όπου: Τ θερμοκρασία R παγκόσμια σταθερά των αερίων Μ μοριακή μάζα
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Η τάση ατμών, από οποιαδήποτε από τις προηγούμενες μεθόδους, θα πρέπει να προσδιορίζεται για δύο τουλάχιστον θερμοκρασίες. Στην περιοχή 0 έως 50 oC προτιμώνται τρεις ή περισσότερες μετρήσεις για να ελέγχεται η γραμμικότητα της καμπύλης της τάσης ατμών.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες: Αν παρατηρήθηκε κάποια μεταβολή (μεταβολή κατάστασης, αποσύνθεση), πρέπει να αναφέρονται οι ακόλουθες πληροφορίες: Πρέπει να αναφέρεται κάθε πληροφορία και παρατήρηση που έχει σχέση με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.
τη μέθοδο που χρησιμοποιήθηκε,
επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις) και προκαταρκτικό στάδιο καθαρισμού, εφόσον υπάρχει,
δύο τουλάχιστον τιμές τάσης ατμών και πίεσης, κατά προτίμηση στην περιοχή 0 έως 50 oC,
όλα τα προκαταρκτικά δεδομένα,
καμπύλη του log p συναρτήσει του 1/Τ,
μία κατ' εκτίμηση τιμή της τάσης ατμών στους 20 ή 25 oC.
φύση της μεταβολής,
θερμοκρασία στην οποία επέρχεται η μεταβολή υπό ατμοσφαιρική πίεση,
τάση ατμών σε 10 και 20 oC κάτω από τη θερμοκρασία μεταβολής και 10 και 20 oC πάνω από τη θερμοκρασία αυτή (εκτός κι αν η μεταβολή είναι από στερεό σε αέριο).
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neihdre,~B. Vodar, (Eds.)Γ Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593. NF Τ 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa — Static method. NF Τ 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa — Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, vol. 5 (4), 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173. B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435. G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148. J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 19S5, vol. 3 (3), 1715.
Α.5. ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΗ ΤΑΣΗ
Α.5.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Οι περιγραφόμενες μέθοδοι βασίζονται στην κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ (1). Οι βασικές αρχές δίνονται στη βιβλιογραφία (2).
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι περιγραφόμενες μέθοδοι εφαρμόζονται στη μέτρηση της επιφανειακής τάσης των υδατικών διαλυμάτων. Είναι χρήσιμο να υπάρχουν προκαταρκτικές πληροφορίες για τη διαλυτότητα στο νερό, το συντακτικό τύπο, τις ιδιότητες υδρόλυσης και την κρίσιμη συγκέντρωση για τη δημιουργία μικκυλίων της ουσίας πριν από την εκτέλεση αυτών των δοκιμών. Οι παρακάτω μέθοδοι είναι εφαρμόσιμες στις περισσότερες χημικές ουσίες, χωρίς οποιονδήποτε περιορισμό όσον αφορά το βαθμό καθαρότητας τους. Η μέτρηση της επιφανειακής τάσης με τη μέθοδο του μετρητή τάσης με δακτύλιο, περιορίζεται για τα υδατικά διαλύματα με δυναμικό ιξώδες μικρότερο των 200 m Pa S περίπου.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Η ελεύθερη επιφανειακή ενθαλπία ανά μονάδα επιφάνεια; αναφέρεται σαν επιφανειακή τάση. Η επιφανειακή τάση δίνεται σαν: N/m (μονάδα SI) ή mN/m (υπομονάδα SI) 1 N/m = 103 δύνες/cm 1 mN/m = 1 δύνη/cm στο σύστημα CGS που χρησιμοποιείτο παλαιά
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Δεν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μία νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές πρέπει να χρησιμοποιούνται κυρίως για να ελέγχεται κατά διαστήματα η μέθοδος που εφαρμόζεται και για να γίνεται δυνατή η σύγκριση με αποτελέσματα από άλλες μεθόδους. Στη βιβλιογραφία (1) και (3) δίνονται ουσίες αναφοράς που καλύπτουν μία μεγάλη περιοχή επιφανειακών τάσεων.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Οι μέθοδοι βασίζονται στη μέτρηση της μέγιστης δύναμης που απαιτείται να ασκηθεί κάθετα σ’ έναν αναβολέα ή σε ειδικό δακτύλιο που είναι σε επαφή με το εξεταζόμενο υγρό το οποίο βρίσκεται τοποθετημένο σε ένα δοχείο μέτρησης, με σκοπό την αποχώρισή του από αυτή την επιφάνεια ή σε ένα δίσκο, με τη μία πλευρά σε επαφή με την επιφάνεια, ώστε να επανέλθει κανονικά στη θέση της η μεμβράνη που σχηματίστηκε. Ουσίες διαλυτές στο νερό σε συγκέντρωση τουλάχιστον 1 mg/l εξετάζονται σε υδατικό διάλυμα σε μία μόνη συγκέντρωση.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Οι μέθοδοι αυτές είναι μεγαλύτερης ακρίβειας από αυτήν που φαίνεται να απαιτείται για περιβαλλοντική εκτίμηση.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Παρασκευάζεται διάλυμα της ουσίας σε απεσταγμένο νερό. Η συγκέντρωση του διαλύματος αυτού θα πρέπει να είναι το 90 % της διαλυτότητας κορεσμού της ουσίας σε νερό' όταν η συγκέντρωση κορεσμού υπερβαίνει το 1 g/l, χρησιμοποιείται συγκέντρωση 1 g/l για τη δοκιμή. Ουσίες με υδατοδιαλυτότητα μικρότερη από 1 mg/1 δεν απαιτείται να εξετάζονται.
1.6.
1.6.1. Μέθοδος δίσκου Βλέπε ISO 304 και NF Τ 73-060 (Επιφανειακά ενεργές ουσίες — Προσδιορισμός της επιφανειακής τάσης με σχηματισμό υγρών μεμβρανών).
1.6.2. Μέθοδος αναβολέα Βλέπε ISO 304 και NF Τ 73-060 (Επιφανειακά ενεργές ουσίες — Προσδιορισμός της επιφανειακής τάσης με σχηματισμό υγρών μεμβρανών).
1.6.3. Μέθοδος δακτυλίου Βλέπε ISO 304 και NF Τ 73-060 (Επιφανειακά ενεργές ουσίες — Προσδιορισμός της επιφανειακής τάσης με σχηματισμό υγρών μεμβρανών).
1.6.4. Εναρμονισμένη μέθοδος δακτυλίου του OOLA
1.6.4.
1.6.4.1. Συσκευή Οι μετρητές τάσης που κυκλοφορούν στο εμπόριο είναι κατάλληλοι για τη μέτρηση αυτή. Αποτελούνται από τα παρακάτω στοιχεία:
κινητό τραπέζι δείγματος,
σύστημα μέτρησης δύναμης,
σώμα μέτρησης (δακτύλιος),
δοχείο μέτρησης.
1.6.4.1.
1.6.4.1.1. Κινητό τραπέζι δείγματος Το κινητό τραπέζι δείγματος χρησιμοποιείται σαν υποστήριγμα για το δοχείο μέτρησης, ελεγχόμενης θερμοκρασίας, που περιέχει το υγρό που πρόκειται να εξεταστεί. Μαζί με το σύστημα μέτρησης της δύναμης, συναρμολογείται πάνω σε ένα βάθρο.
1.6.4.1.2. Σύστημα μέτρησης της δύναμης Το σύστημα μέτρησης της δύναμης (βλέπε εικόνα) είναι τοποθετημένο πάνω από το τραπέζι του δείγματος. Το σφάλμα μέτρησης της δύναμης δεν πρέπει να υπερβαίνει το ±0,6 mg, που αντιστοιχεί σε ένα όριο σφάλματος ±0,1 mg σε μια μέτρηση μάζας. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η κλίμακα μέτρησης των μετρητών τάσης που κυκλοφορούν στο εμπόριο βαθμολογείται σε mN/m, έτσι ώστε η επιφανειακή τάση να μπορεί να μετρηθεί απευθείας σε mN/m, με μια ακρίβεια 0,1 mN/m.
1.6.4.1.3. Σώμα μέτρησης (δακτύλιος) Ο δακτύλιος αποτελείται συνήθως από ένα σύρμα από κράμα λευκοχρύσου-ιριδίου πάχους 0,4 mm περίπου και μέσης περιφέρειας 60 mm. Ο συρμάτινος δακτύλιος κρέμεται οριζόντια από ένα μεταλλικό στέλεχος και από ένα συρμάτινο υποστήριγμα για να αποκαθίσταται η σύνδεση με το σύστημα μέτρησης της δύναμης (βλέπε εικόνα).
1.6.4.1.3. Εικόνα Σώμα μέτρησης
(Όλες οι διαστάσεις εκφρασμένες σε mm) Στέλεχος Υπpoστήριγμα Δακτύλιος
1.6.4.1.4. Δοχείο μέτρησης Το δοχείο μέτρησης που περιέχει το διάλυμα το οποίο πρόκειται να μετρηθεί θα είναι ένα γυάλινο δοχείο με ελεγχόμενη θερμοκρασία. Θα σχεδιαστεί έτσι ώστε κατά τη διάρκεια της μέτρησης η θερμοκρασία του εξεταζόμενου υγρού διαλύματος και η αέρια φάση πάνω από την επιφάνεια του να παραμένουν σταθερές και το δείγμα να μην μπορεί να εξατμίζεται. Κυλινδρικά γυάλινα δοχεία που έχουν εσωτερική διάμετρο όχι μικρότερη των 45 mm είναι αποδεκτά.
1.6.4.2. Προετοιμασία τη συσκευής
1.6.4.2.
1.6.4.2.1. Καθαρισμός Τα γυάλινα δοχεία πρέπει να καθαρίζονται προσεκτικά. Εάν είναι ανάγκη θα πρέπει να πλένονται με ζεστό χρωμοθειικό οξύ και μετά με πυκνό φωσφορικό οξύ (83 έως 98 % κατά βάρος H3PO4), να ξεπλένονται πλήρως με τρεχούμενο νερό και τελικά να πλένονται με διπλά απεσταγμένο νερό μέχρι να παρθεί ουδέτερη αντίδραση, στη συνέχεια να ξηραίνονται ή να ξεπλένονται με μέρος από το υγρό που πρόκειται να μετρηθεί. Ο δακτύλιος θα πρέπει αρχικά να ξεπλένεται πλήρως με νερό για την απομάκρυνση κάθε ουσίας διαλυτής στο νερό, να βυθίζεται για λίγο σε χρωμοθειικό οξύ, να πλένεται με διπλά απεσταγμένο νερό μέχρι να παρθεί ουδέτερη αντίδραση και τελικά να θερμαίνεται για λίγο πάνω από φλόγα μεθανόλης. Σημείωση: Οι τυχόν ουσίες που δεν διαλύονται ή δεν καταστρέφονται με χρωμοθειικό ή φωσφορικό οξύ, όπως οι σιλικόνες, θα πρέπει να απομακρύνονται με τη βοήθεια ενός κατάλληλου οργανικού διαλύτη.
1.6.4.2.2. Βαθμονόμηση της συσκευής Η βαθμονόμηση της συσκευής συνίσταται στην επαλήθευση του μηδενικού σημείου ρυθμίζοντας το έτσι ώστε η ένδειξη του οργάνου να επιτρέπει αξιόπιστο προσδιορισμό σε mN/m.
1.6.4.2.2. Συναρμολόγηση:
Η συσκευή θα πρέπει να οριζοντιώνεται, π.χ. με τη βοήθεια μιας στάθμης οινοπνεύματος στη βάση του μετρητή τάσης, ρυθμίζοντας τις βίδες οριζοντίωσης στη βάση.
Ρύθμιση του μηδενικού σημείου:
Μετά τη συναρμολόγηση του δακτυλίου στη συσκευή και πριν τη βύθιση του στο υγρό θα. πρέπει να ρυθμιστεί η ένδειξη του μετρητή τάσης στο μηδέν και να ελεγχθεί ότι ο δακτύλιος είναι παράλληλος προς την επιφάνεια του υγρού. Για το σκοπό αυτό, η υγρή επιφάνεια μπορεί να χρησιμεύσει ως καθρέφτης.
Βαθμονομήσεις:
Ο έλεγχος βαθμονόμησης μπορεί να γίνει με μία από τις δύο παρακάτω μεθόδους:
α)
Χρησιμοποίηση μιας μάζας: μέθοδος που χρησιμοποιεί ιππείς γνωστής μάζας μεταξύ 0,1 g και 1,0 g που τοποθετούνται πάνω στο δακτύλιο. Ο παράγοντας βαθμονόμησης Φ,, με τον οποίο πρέπει να πολλαπλασιάζονται όλες οι αναγνώσεις του οργάνου, θα πρέπει να καθορίζεται σύμφωνα με την εξίσωση (1): Φa=σrσa όπου: σr=mg2b (mN/m) m μάζα του ιππέα (g) g επιτάχυνση βαρύτητας (981 cm s-2 στην επιφάνεια της θάλασσας) b μέση περιφέρεια του δακτυλίου (cm1) σa ανάγνωση του μετρητή τάσης μετά την τοποθέτηση του ιππέα πάνω στο δακτύλιο (mN/m)
β)
Χρησιμοποίηση νερού: μέθοδος που χρησιμοποιεί καθαρό νερό, του οποίου η επιφανειακή τάση π.χ. στους 23 oC είναι ίση με 72,3 mN/m. Αυτή η μέθοδος εκτελείται πιο γρήγορα από τη βαθμονόμηση βάρους, αλλά υπάρχει πάντα ο κίνδυνος να αλλοιωθεί η επιφανειακή τάση του νερού από ίχνη επιφανειακά ενεργών ουσιών. Ο παράγοντας βαθμονόμησης Φb, με τον οποίο πρέπει να πολλαπλασιάζονται όλες οι ενδείξεις του οργάνου, πρέπει να προσδιορίζεται σύμφωνα με την εξίσωση (2): Φb=σoσg όπου: σ0 τιμή αναφερόμενη στη βιβλιογραφία για την επιφανειακή τάση του νερού (mN/m), σg μετρηθείσα τιμή της επιφανειακής τάσης του νερού (mN/m), και οι δύο στην ίδια θερμοκρασία.
1.6.4.3. Παρασκευή των δειγμάτων Θα πρέπει να παρασκευάζονται υδατικά διαλύματα των ουσιών που πρόκειται να εξεταστούν, χρησιμοποιώντας τις απαιτούμενες συγκεντρώσεις στο νερό και δε θα πρέπει να περιέχουν αδιάλυτες ουσίες. Το διάλυμα πρέπει να διατηρείται σε σταθερή θερμοκρασία (±0,5 oC). Εάν η επιφανειακή τάση ενός διαλύματος μέσα στο δοχείο μέτρησης μεταβάλλεται με το χρόνο, θα πρέπει να εκτελούνται μερικές μετρήσεις σε διάφορους χρόνους και να χαράσσεται μια καμπύλη της επιφανειακής τάσης ως συνάρτηση του χρόνου. Όταν δεν παρατηρείται περαιτέρω μεταβολή, έχει επιτευχθεί μια κατάσταση ισορροπίας. Σκόνη ή αέρια επιμόλυνση από άλλες ουσίες επηρεάζει τη μέτρηση. Γι' αυτό η εργασία θα πρέπει να γίνεται κάτω από προστατευτικό κάλυμμα.
1.6.5. Συνθήκες δοκιμής Η μέτρηση θα πρέπει να γίνει στους 20 oC περίπου με αποκλίσεις όχι μεγαλύτερες από ±0,5 oC.
1.6.6. Εκτέλεση της δοκιμής Τα διαλύματα που πρόκειται να μετρηθούν θα πρέπει να μεταφέρονται στο προσεκτικά καθαρισμένο δοχείο μέτρησης, προσέχοντας να αποφευχθεί τυχόν αφρισμός, και μετά το δοχείο μέτρησης θα πρέπει να τοποθετείται στο τραπέζι της συσκευής. Το πάνω μέρος του τραπεζιού με το δοχείο μέτρησης θα πρέπει να ανυψώνεται μέχρις ότου ο δακτύλιος να βυθιστεί κάτω από την επιφάνεια του διαλύματος που πρόκειται να μετρηθεί. Μετά θα πρέπει να χαμηλώνεται βαθμιαία και ομαλά (με μια ταχύτητα περίπου 0,5 cm/min) για να αποσπαστεί ο δακτύλιος από την επιφάνεια μέχρις ότου επιτευχθεί η μέγιστη δύναμη. Η υγρή στοιβάδα που είναι προσκολλημένη στο δακτύλιο δεν πρέπει να αποχωριστεί από το δακτύλιο. Μετά το τέλος των μετρήσεων, ο δακτύλιος θα πρέπει να βυθίζεται πάλι κάτω από την επιφάνεια και οι μετρήσεις να επαναλαμβάνονται μέχρις ότου επιτευχθεί μια σταθερή τιμή επιφανειακής τάσεως. Ο χρόνος από τη μεταφορά του διαλύματος στο δοχείο μέτρησης θα πρέπει να καταγράφεται για κάθε προσδιορισμό. Οι αναγνώσεις θα πρέπει να λαμβάνονται στη μέγιστη δύναμη που απαιτείται προκειμένου να αποσπαστεί ο δακτύλιος από την υγρή επιφάνεια.
2. Πίνακας Διόρθωση της μετρηθείσας επιφανειακής τάσεως Μόνο για υδατικά διαλύματα, ρ = 1 g/cm3
ΔΕΔΟΜΕΝΑ Προκειμένου να υπολογιστεί η επιφανειακή τάση, η τιμή ανάγνωσης, σε mN/m στη συσκευή, θα πρέπει να πολλαπλασιάζεται πρώτα με τον παράγοντα βαθμονόμησης Φa ή Φb (που εξαρτάται από τη μέθοδο βαθμονόμησης που έχει χρησιμοποιηθεί). Αυτό θα δώσει μια τιμή που ισχύει μόνο κατά προσέγγιση και γι’ αυτό απαιτείται διόρθωση. Οι Harkins και Jordan (4) έχουν εμπειρικά καθορίσει παράγοντες διόρθωσης για τις τιμές της επιφανειακής τάσης που μετράται με τη μέθοδο του δακτυλίου και που εξαρτώνται από τις διαστάσεις του δακτυλίου, την πυκνότητα του υγρού και την επιφανειακή του τάση. Επειδή είναι κουραστικό να προσδιορίζεται ο συντελεστής διόρθωσης από τους πίνακες των Harkins και Jordan για κάθε ξεχωριστή μέτρηση, προκειμένου να υπολογίζεται η επιφανειακή τάση στα υδατικά διαλύματα, μπορεί να χρησιμοποιείται η απλοποιημένη μέθοδος ανάγνωσης των διορθωμένων τιμών της επιφανειακής τάσης απευθείας από τον πίνακα που ακολουθεί. (Για αναγνώσεις που περιλαμβάνονται μεταξύ των τιμών του πίνακα θα χρησιμοποιείται η μέθοδος υπολογισμού ενδιάμεσων τιμών). R = 9,55 mm (μέση ακτίνα δακτυλίου), r = 0,185 mm (ακτίνα του σύρματος του δακτυλίου). Πειραματική τιμή (mN/m) Διορθωμένη τιμή (mN/m) Βαθμονόμηση μάζας [βλέπε σημείο 1.6.4.2.2.(α)] Βαθμονόμηση με χρήση νερού [Βλέπε σημείο 1.6.4.2.2.(β)] 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Ο πίνακας αυτός έγινε με βάση τη διόρθωση των Harkins-Jordan. Είναι παρόμοιος με εκείνον του DIN Standard (DIN 53914) για το νερό και τα υδατικά διαλύματα (πυκνότητα ρ = 1 g/cm3) και ισχύει για δακτύλιο του εμπορίου με διαστάσεις R = 9,55 mm (μέση ακτίνα δακτυλίου) και r = 0,185 mm (ακτίνα του σύρματος του δακτυλίου). Ο πίνακας παρέχει τις διορθωμένες τιμές για τις μετρήσεις της επιφανειακής τάσης που λαμβάνονται μετά από βαθμονόμηση με μάζα ή βαθμονόμηση με νερό. Εναλλακτικά, χωρίς την προηγούμενη βαθμονόμηση, η επιφανειακή τάση μπορεί να υπολογιστεί σύμφωνα με τον παρακάτω τύπο: σ=f × F4πR όπου: F η δύναμη που μετράται με δυναμόμετρο στο σημείο που θραύεται η μεμβράνη. R η ακτίνα του δακτυλίου, f ο συντελεστής διόρθωσης (1).
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
χρησιμοποιηθείσα μέθοδος,
τύπος του νερού ή του διαλύματος που χρησιμοποιήθηκε,
επακριβή καθορισμό της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις),
αποτελέσματα της μέτρησης: επιφανειακή τάση (ληφθείσα ένδειξη) που να περιλαμβάνει τόσο τις ληφθείσες ενδείξεις ξεχωριστά και τον αριθμητικό τους μέσο όρο όσο και το διορθωμένο μέσον όρο (λαμβάνοντας υπόψη το συντελεστή συσκευής και τον πίνακα διόρθωσης),
συγκέντρωση του διαλύματος,
θερμοκρασία τη δοκιμής,
παλαιότητα του χρησιμοποιηθέντος διαλύματος, ιδιαίτερα τον χρόνος μεταξύ παρασκευής και μέτρησης του διαλύματος,
περιγραφή της εξάρτησης από το χρόνο της επιφανειακής τάσης μετά τη μεταφορά του διαλύματος στο δοχείο μέτρησης,
κάθε πληροφορία και παρατήρηση που έχει σχέση με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων πρέπει να αναφέρεται, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.
3.2. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Λαμβάνοντας υπόψη ότι το απεσταγμένο νερό έχει επιφανειακή τάση 72,75 mN/m στους 20 oC, ουσίες που παρουσιάζουν επιφανειακή τάση μικρότερη από 60 mN/m στις συνθήκες της μεθόδου αυτής, θα πρέπει να θεωρούνται ως επιφανειακώς ενεργές ουσίες.
4.(1)(2)(3)(4)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Qrganic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Pubh, New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, vol. 52, 1751.
A.6. ΥΔΑΤΟΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ
A.6.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Οι περιγραφόμενες μέθοδοι βασίζονται στην κατευθυντήρια δοκιμασία του ΟΟΣΑ (1).
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Είναι χρήσιμο να υπάρχει προκαταρκτική πληροφορία για το συντακτικό τύπο, την τάση ατμών, τη σταθερά διάστασης και την υδρόλυση (σαν συνάρτηση του pΗ) της ουσίας για την εκτέλεση αυτής της δοκιμής. Δεν υπάρχει ενιαία μέθοδος που να καλύπτει όλη την περιοχή των διαλυτοτήτων στο νερό. Οι δύο μέθοδοι δοκιμής που περιγράφονται κατωτέρω καλύπτουν όλη την κλίμακα τιμών διαλυτότητας δεν έχουν όμως εφαρμογή σε πτητικές ουσίες: Η διαλυτότητα στο νερό της ελεγχόμενης ουσίας μπορεί να επηρεαστεί σημαντικά από την παρουσία ξένων προσμείξεων.
μία που εφαρμόζεται στις βασικά καθαρές ουσίες με χαμηλές διαλυτότητες (< 10-2 g/l) και που είναι σταθερές στο νερό, αναφέρεται σαν μέθοδος έκλουσης στήλης,
η άλλη, που εφαρμόζεται στις βασικά καθαρές ουσίες με υψηλότερες διαλυτότητες (> 10-2 g/l) και που είναι σταθερές στο νερό, αναφέρεται σαν μέθοδος φιάλης.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Η υδατοδιαλυτότητα μιας ουσίας ορίζεται σαν η συγκέντρωση της μάζας κορεσμού της ουσίας στο νερό σε δεδομένη θερμοκρασία. Η υδατοδιαλυτότητα εκφράζεται σε μονάδες μάζας κατ' όγκο διαλύματος. Η μονάδα SI είναι kg/m3 (μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν τα γραμμάρια ανά λίτρο).
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Δεν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μία νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κυρίως για να ελέγχεται κατά διαστήματα η εφαρμοζόμενη μέθοδος και για να γίνεται δυνατή η σύγκριση με αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Η κατά προσέγγιση ποσότητα του δείγματος και ο αναγκαίος χρόνος για να επιτευχθεί η συγκέντρωση της μάζας κορεσμού θα μπορούσε να προσδιοριστεί σε μια απλή προκαταρκτική δοκιμή.
1.4.
1.4.1. Μέθοδος έκλουσης στήλης Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην έκλουση της εξεταζόμενης ουσίας με νερό από μία μικροστήλη που γεμίζεται με ένα αδρανές υλικό σαν υπόστρωμα, όπως γυάλινα σφαιρίδια ή άμμος, καλυπτόμενο από μία περίσσεια της εξεταζόμενης ουσίας. Η υδατοδιαλυτότητα προσδιορίζεται όταν η μάζα του εκλούσματος είναι σταθερή. Αυτό φαίνεται από την οριζοντιοποίηση της καμπύλη; συγκέντρωσης σαν συνάρτηση του χρόνου.
1.4.2. Μέθοδος φιάλης Στη μέθοδο αυτή, η ουσία (τα στερεά πρέπει να κονιοποιούνται) διαλύεται σε νερό σε θερμοκρασία λίγο πάνω από τη θερμοκρασία δοκιμής. Όταν επιτευχθεί κορεσμός, το μείγμα ψύχεται και διατηρείται στη θερμοκρασία δοκιμής, αναδεύοντας όσο χρειάζεται ώστε να επιτευχθεί ισορροπία. Εναλλακτικά, η μέτρηση μπορεί να πραγματοποιηθεί απευθείας στη θερμοκρασία δοκιμής, αν εξασφαλισθεί με κατάλληλη δειγματοληψία ότι επιτεύχθηκε η ισορροπία κορεσμού. Στη συνέχεια, προσδιορίζεται με κατάλληλη αναλυτική μέθοδο, η κατά βάρος συγκέντρωση της ουσίας στο υδατικό διάλυμα, το οποίο δεν πρέπει να περιέχει καθόλου αδιάλυτα σωματίδια.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ
1.5.
1.5.1. Επαναληψιμότητα Για τη μέθοδο έκλουσης στήλης, μπορεί να ληφθεί < 30 % για τη μέθοδο φιάλης, θα πρέπει να επιτευχθεί < 15 %.
1.5.2. Ευαισθησία Αυτή εξαρτάται από τη μέθοδο ανάλυσης, μπορούν όμως να επιτευχθούν προσδιορισμοί κατά βάρος συγκέντρωσης μέχρι και 106 γραμμάρια ανά λίτρο.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Συνθήκες δοκιμής Η δοκιμή διεξάγεται κατά προτίμηση σε 20 ±0,5 oC Εάν υποψιαζόμαστε μια εξάρτηση της διαλυτότητας από τη θερμοκρασία (> 3 % ανά oC) , θα ήταν επίσης δυνατό να χρησιμοποιηθούν δυο άλλες θερμοκρασίες, τουλάχιστον 10 oC πάνω και κάτω από τη θερμοκρασία που είχε αρχικά επιλεγεί. Σε αυτή την περίπτωση ο έλεγχος της θερμοκρασίας θα ήταν ±0,1 oC. Η θερμοκρασία που έχει επιλεγεί θα μπορούσε να διατηρείται σταθερή σε όλα τα σχετικά μέρη της συσκευής.
1.6.2. Προκαταρκτική δοκιμή Σε ποσότητα 0,1 g περίπου δείγματος (οι στερεές ουσίες πρέπει να κονιοποιούνται) μέσα σε ογκομετρικό κύλινδρο των 10 ml με γυάλινο πώμα, προστίθενται αύξοντες όγκοι απεσταγμένου νερού σε θερμοκρασία δωματίου, σύμφωνα με τα στάδια του παρακάτω πίνακα: 0,1 g διαλυόμενα σε x ml νερού 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Κατά προσέγγιση διαλυτότητα (γραμμάρια ανά λίτρο) > 1000 1000 έως 200 200 έως 100 100 έως 50 50 έως 10 10 έως 1 < 1 Μετά από κάθε προσθήκη της ενδεικνυόμενης ποσότητας νερού, το μείγμα ανακινείται ισχυρά επί 10 λεπτά και ελέγχεται οπτικά για τυχόν αδιάλυτα μέρη του δείγματος. Αν, μετά από προσθήκη 10 ml νερού, το δείγμα ή μέρη αυτού παραμένουν αδιάλυτα, το πείραμα πρέπει να επαναληφθεί σε ογκομετρικό κύλινδρο 100 ml με μεγαλύτερες ποσότητες νερού. Σε χαμηλότερες διαλυτότητες, ο χρόνος που απαιτείται για να διαλυθεί μια ουσία μπορεί να είναι σημαντικά μεγαλύτερος (θα πρέπει να αφήνεται τουλάχιστον 24 ώρες). Η κατά προσέγγιση διαλυτότητα δίδεται στον πίνακα κάτω από τον όγκο του προστιθέμενου νερού στον οποίο επέρχεται πλήρης διάλυση της ουσίας. Αν η ουσία είναι ακόμη εμφανώς αδιάλυτη, θα πρέπει να αφήνεται περισσότερο από 24 ώρες (96 ώρες κατ’ ανώτατο όριο) ή θα πρέπει να επιχειρείται περαιτέρω αραίωση για να εξακριβώνεται αν θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί η μέθοδος έκλουσης στήλης ή η μέθοδος της φιάλης.
1.6.3. Μέθοδος έκλουσης στήλης
1.6.3.
1.6.3.1. Υλικό κλήρωσης, διαλύτης και υγρό έκλουσης Το υλικό πλήρωσης στη μέθοδο έκλουσης στήλης θα πρέπει να είναι αδρανές. Πιθανά υλικά που μπορούν να χρησιμοποιηθούν είναι γυάλινα σφαιρίδια και άμμος. Για τη μεταφορά της εξεταζόμενης ουσίας στο υλικό πλήρωσης θα πρέπει να χρησιμοποιείται κατάλληλος πτητικός διαλύτης αναλυτικής καθαρότητας. Σαν υγρό έκλουσης θα πρέπει να χρησιμοποιείται νερό διπλά απεσταγμένο σε γυάλινη ή χαλαζιακή συσκευή. Σημείωση: Δεν πρέπει να χρησιμοποιείται νερό απευθείας από οργανικό ιοντοανταλλάκτη.
1.6.3.2. Φόρτιση του ολικού πλήρωσης Ζυγίζονται περίπου 600 mg υλικού πλήρωσης και μεταφέρονται σε φιάλη των 50 ml με σφαιρικό πυθμένα. Κατάλληλη, ζυγισθείσα ποσότητα της εξεταζόμενης ουσίας διαλύεται στον επιλεγέντα διαλύτη. Κατάλληλη ποσότητα του διαλύματος αυτού προστίθεται στο υλικό πλήρωσης. Ο διαλύτης πρέπει να εξατμισθεί πλήρως, π.χ. σε περιστροφική συσκευή εξάτμισης' διαφορετικά, δεν επιτυγχάνεται κορεσμός του υλικού πλήρωσης με νερό εξαιτίας φαινομένων κατανομής στην επιφάνεια του υλικού πληρώσεως. Η φόρτιση του υλικού πλήρωσης μπορεί να προκαλέσει προβλήματα (εσφαλμένα αποτελέσματα) αν η εξεταζόμενη ουσία αποτεθεί σαν έλαιο ή διαφορετική κρυσταλλική φάση. Το πρόβλημα θα πρέπει να εξετάζεται πειραματικά και οι λεπτομέρειες να αναφέρονται. Το φορτισμένο υλικό πλήρωσης αφήνεται να εμποτισθεί για δύο περίπου ώρες σε 5 ml νερού και μετά το αιώρημα μεταφέρεται στη μικροστήλη. Εναλλακτικά, ξηρό φορτισμένο υλικό πλήρωσης μεταφέρεται στη μικροστήλη, η οποία έχει γεμίσει με νερό, και αφήνεται να ισορροπήσει για δύο ώρες περίπου.
1.6.3.2. Διαδικασία δοκιμής:
Η έκλουση της ουσίας από το υλικό πλήρωσης μπορεί να πραγματοποιηθεί με δύο διαφορετικούς τρόπους:
αντλία ανακύκλωσης (βλέπε εικόνα 1),
δοχείο ισοστάθμισης (βλέπε εικόνα 4).
1.6.3.3. Μέθοδος έκλουσης στήλης με αντλία ανακύκλωσης
1.6.3.3. Συσκευή
Στην εικόνα 1 απεικονίζεται σε σχηματική διάταξη ένα τυπικό σύστημα. Μία κατάλληλη μικροστήλη εμφανίζεται στην εικόνα 2, αν και κάθε μέγεθος είναι αποδεκτό, αρκεί να πληροί τα κριτήρια αναπαραγωγιμότητας και ευαισθησίας. Η στήλη θα πρέπει να διαθέτει στο πάνω μέρος ένα χώρο εισαγωγής με πενταπλάσιο τουλάχιστον όγκο από εκείνον της στήλης νερού και να μπορεί να συγκρατεί κατ' ελάχιστο πέντε δείγματα. Εναλλακτικά, το μέγεθος μπορεί να μειωθεί αν χρησιμοποιηθεί συμπληρωματικός διαλύτης για να αντικαταστήσει τους αρχικούς πέντε βασικούς όγκους που απομακρύνθηκαν με προσμείξεις. Η στήλη πρέπει να συνδέεται με αντλία ανακύκλωσης που να μπορεί να ελέγχει ροή αντιστοιχούσα σε περίπου 25 ml/ώρα. Η αντλία συνδέεται με συνδέσεις από πολυτετραφθοροαιθυλένιο (P.T.F.E) ή/και γυαλί. Κατά τη σύνδεση στήλης και αντλίας, θα πρέπει να προβλέπεται να υπάρχει δυνατότητα δειγματοληψίας του εκλούσματος και εξισορρόπηση της πίεσης του χώρου εισαγωγής με την ατμοσφαιρική πίεση. Το υλικό της στήλης υποστηρίζεται με ένα μικρό (5 mm} πώμα από υαλοβάμβακα, που χρησιμεύει επίσης και για τη διήθηση σωματιδίων. Η αντλία ανακύκλωσης μπορεί να είναι, για παράδειγμα, μια περισταλτική αντλία ή αντλία μεμβράνης (πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα για αποφυγή οποιασδήποτε μόλυνσης ή/και προσρόφησης με το υλικό του σωλήνα).
Διαδικασία μέτρησης
Αρχίζει η ροή διαμέσου της στήλης. Συνιστάται να χρησιμοποιείται μία ταχύτητα ροής περίπου 25 ml/ώρα (πράγμα που αντιστοιχεί σε 10 βασικούς όγκους/ώρα για την περιγραφείσα στήλη). Οι πέντε πρώτοι βασικοί όγκοι (τουλάχιστον) απορρίπτονται για να απομακρυνθούν οι υδατοδιαλυτές προσμείξεις. Μετά απ' αυτό, η αντλία ανακύκλωσης τίθεται σε λειτουργία μέχρι να αποκατασταθεί ισορροπία, όπως καθορίζεται από πέντε διαδοχικά δείγματα των οποίων οι συγκεντρώσεις δεν διαφέρουν πάνω από ± 30 % κατά τυχαίο τρόπο. Τα δείγματα αυτά θα πρέπει να χωρίζονται μεταξύ τους κατά χρονικά διαστήματα που αντιστοιχούν με το πέρασμα τουλάχιστον δέκα βασικών όγκων του υγρού έκλουσης.
1.6.3.4. Μέθοδος έκλουσης στήλης με δοχείο ισοστάθμισης
1.6.3.4. Συσκευή (βλέπε εικόνες 4 και 3)
Δοχείο ισοστάθμισης: Η σύνδεση με το δοχείο ισοστάθμισης γίνεται με τη χρησιμοποίηση ενός γυάλινου εσμυρισμένου συνδέσμου ο οποίος συνδέεται με σωληνώσεις PTFE. Συνιστάται η χρησιμοποίηση μιας ταχύτητας ροής περίπου 25 ml/ώρα. Θα συλλέγονται διαδοχικά κλάσματα έκλουσης και θα αναλύονται με τη μέθοδο που έχει επιλεγεί.
Διαδικασία μέτρησης
Για τον προσδιορισμό της υδατοδιαλυτότητας, χρησιμοποιούνται τα κλάσματα από τη μέση περιοχή του εκλούσματος στα οποία οι συγκεντρώσεις είναι σταθερές (± 30 %) σε πέντε τουλάχιστον διαδοχικά κλάσματα. Και στις δύο περιπτώσεις (αντλία ανακύκλωσης ή δοχείο ισοστάθμισης), πρέπει να εκτελείται μία δεύτερη δοκιμή με τη μισή από την πρώτη ταχύτητα ροής. Εάν τα αποτελέσματα των δύο πειραμάτων συμφωνούν, η δοκιμή είναι ικανοποιητική. Εάν υπάρχει μεγαλύτερη φαινομενική διαλυτότητα με τη χαμηλότερη ταχύτητα ροής, τότε η κατά το 50 % μείωση της ταχύτητας ροής πρέπει να συνεχιστεί, μέχρις ότου δύο διαδοχικά περάσματα δώσουν την ίδια διαλυτότητα. Και στις δύο περιπτώσεις (χρησιμοποιώντας μια αντλία ανακύκλωσης ή ένα δοχείο ισοστάθμισης) τα κλάσματα θα πρέπει να ελέγχονται για την παρουσία κολλοειδούς ουσίας με την εξέταση του φαινομένου Tyndall (διάχυση του φωτός). Η παρουσία τέτοιων σωματιδίων ακυρώνει τα αποτελέσματα και η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβάνεται, μεγαλώνοντας τη διηθητική δράση της στήλης. Το pH κάθε δείγματος θα πρέπει να καταγράφεται. Ένα δεύτερο πέρασμα θα πρέπει να εκτελείται στην ίδια θερμοκρασία.
1.6.4. Μέθοδος φιάλης
1.6.4.
1.6.4.1. Συσκευή Για τη μέθοδο φιάλης απαιτείται το παρακάτω υλικό:
κανονικός εξοπλισμός εργαστηρίου σε γυάλινα σκεύη και σε όργανα,
κατάλληλος μηχανισμός για την ανατάραξη των διαλυμάτων κάτω από ελεγχόμενες σταθερές θερμοκρασίες,
μια φυγόκεντρος (κατά προτίμηση θερμοστατούμενη), εάν κρίνεται αναγκαίο με γαλακτώματα και
εξοπλισμός για αναλυτικό προσδιορισμό.
1.6.4.2. Πορεία μέτρησης Η αναγκαία ποσότητα υλικού, για να κορεστεί ο επιθυμητός όγκος νερού, εκτιμάται από την προκαταρκτική δοκιμή. Ο όγκος του απαιτούμενου νερού θα εξαρτάται από την αναλυτική μέθοδο και από την περιοχή διαλυτότητας. Ζυγίζεται περίπου πέντε φορές η ποσότητα του υλικού που έχει καθοριστεί παραπάνω, σε κάθε ένα από τα τρία γυάλινα δοχεία με γυάλινα πώματα (π.χ. σωλήνες φυγοκέντρου, φιάλες). Ο όγκος νερού που έχει επιλεγεί προστίθεται σε κάθε δοχείο και τα δοχεία κλείνονται ερμητικά. Μετά τα κλειστά δοχεία αναταράσσονται στους 30 oC. (Θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ένας μηχανισμός ανατάραξης ή ανάδευσης ικανός να λειτουργεί σε σταθερή θερμοκρασία, π.χ. μαγνητικός αναδευτήρας σε ένα θερμοστατικά ελεγχόμενο υδρόλουτρο). Μετά από μία ημέρα το ένα από τα δοχεία απομακρύνεται και ισορροπείται ξανά για 24 ώρες στη θερμοκρασία του ελέγχου με ανάδευση από καιρού σε καιρό. Μετά τα περιεχόμενη του δοχείου φυγοκεντρούνται στη θερμοκρασία δοκιμής και η συγκέντρωση της ουσίας στην καθαρά υδατική φάση προσδιορίζεται με μια κατάλληλη αναλυτική μέθοδο. Οι άλλες δύο φιάλες υφίστανται την ίδια κατεργασία μετά από αρχική εξισορρόπηση στους 30 oC για δύο έως τρεις ημέρες, αντίστοιχα. Εάν τα αποτελέσματα της συγκέντρωσης από τα δύο τουλάχιστον τελευταία δοχεία συμφωνούν με την απαιτούμενη αναπαραγωγιμότητα, η δοκιμή είναι ικανοποιητική. Όλη η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβάνεται με μεγαλύτερους χρόνους εξισορρόπησης, εάν τα αποτελέσματα από τα δοχεία 1, 2 και 3 δείχνουν μια τάση αύξησης των τιμών. Η διαδικασία μέτρησης μπορεί επίσης να διεξαχθεί και χωρίς προεπώαση στους 30 oC. Για να εκτιμηθεί η ταχύτητα αποκατάστασης της ισορροπίας κορεσμού, λαμβάνονται δείγματα μέχρις ότου ο χρόνος ανάδευσης να μην επηρεάζει πλέον τη συγκέντρωση του διαλύματος που εξετάζεται. Το pH κάθε δείγματος πρέπει να καταγράφεται.
1.6.5. Ανάλυση Μια ειδική αναλυτική μέθοδος για την ουσία προτιμάται για τους προσδιορισμούς αυτούς, αφού μικρές ποσότητες διαλυτών ξένων προσμείξεων μπορούν να προκαλέσουν μεγάλα σφάλματα στη μετρούμενη διαλυτότητα. Παραδείγματα τέτοιων μεθόδων είναι: αέρια ή υγρή χρωματογραφία, μέθοδοι τιτλοδότησης, φωτομετρικές μέθοδοι, βολταμετρικές μέθοδοι.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ
2.
2.1. ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΣΤΗΛΗΣ Σε κάθε δοκιμή πρέπει να υπολογίζεται η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση από πέντε τουλάχιστον διαδοχικά δείγματα λαμβανόμενα από την περιοχή κορεσμού. Τα αποτελέσματα πρέπει να εκφράζονται σε μονάδες μάζας κατ' όγκο διαλύματος. Συγκρίνονται οι μέσοι όροι που υπολογίζονται από δύο δοκιμές με διαφορετικές τιμές ροής και θα πρέπει να παρουσιάζουν μία επαναληψιμότητα μικρότερη του 30 %.
2.2. ΜΕΘΟΔΟΣ ΦΙΑΛΗΣ Τα ξεχωριστά αποτελέσματα θα πρέπει να δίνονται για καθεμία από τις τρεις φιάλες και τα αποτελέσματα εκείνα που κρίνονται ότι είναι σταθερά (επαναληψιμότητα μικρότερη του 15 %) θα πρέπει να υπολογίζονται κατά μέσον όρο και να δίνονται σε μονάδες μάζας ανά όγκο διαλύματος. Αυτό μπορεί να απαιτήσει τη μετατροπή των μονάδων μάζας σε μονάδες όγκου, χρησιμοποιώντας την πυκνότητα όταν η διαλυτότητα είναι πολύ υψηλή (> των 100 g/l).
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΣΤΗΛΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
τα αποτελέσματα της προκαταρκτικής δοκιμής,
επακριβή καθορισμό της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις),
τις συγκεντρώσεις, τις ταχύτητες ροής και το pH κάθε δείγματος,
το μέσο όρο και την τυπική απόκλιση από πέντε τουλάχιστον δείγματα από την περιοχή κορεσμού κάθε περάσματος,
το μέσο όρο των δύο διαδοχικών, αποδεκτών περασμάτων,
τη θερμοκρασία του νερού κατά τη διαδικασία κορεσμού,
τη χρησιμοποιηθείσα μέθοδο ανάλυσης,
τη φύση του χρησιμοποιηθέντος υλικού πλήρωσης,
τη φόρτιση του υλικού πλήρωσης,
τον χρησιμοποιηθέντα διαλύτη,
ενδείξεις οποιασδήποτε χημικής αστάθειας της ουσίας κατά τη διάρκεια της δοκιμής και τη χρησιμοποιηθείσα μέθοδο,
κάθε πληροφορία σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.
3.2. ΜΕΘΟΔΟΣ ΦΙΑΛΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
τα αποτελέσματα της προκαταρκτικής δοκιμής,
επακριβή καθορισμό τη; ουσία; (ταυτότητα και προσμείξεις),
τους ξεχωριστούς αναλυτικούς προσδιορισμούς και το μέσο όρο όπου έχουν προσδιοριστεί περισσότερες της μιας τιμές για κάθε φιάλη,
το pH κάθε δείγματος,
το μέσο όρο των τιμών για τις διάφορες φιάλες που βρίσκονται σε συμφωνία,
τη θερμοκρασία ελέγχου,
τη χρησιμοποιηθείσα μέθοδο ανάλυσης,
ενδείξεις οποιασδήποτε χημικής αστάθειας της ουσίας κατά τη διάρκεια της δοκιμής και τη χρησιμοποιηθείσα μέθοδο,
κάθε πληροφορία σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.
4.(1)(2)(3) ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF Τ 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method NF Τ 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method
A.8. ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗΣ ΚΑΤΑΝΟΜΗΣ
A.8.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Η περιγραφόμενη μέθοδος της ανακινούμενης φιάλης βασίζεται στην κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ(1).
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Για την εκτέλεση της δοκιμής αυτής, χρήσιμο είναι να έχουμε προκαταρκτικές πληροφορίες για τη δομή, τη σταθερά διάστασης, την υδατοδιαλυτότητα, την υδρόλυση, τη διαλυτότητα σε n-οκτανόλη και την επιφανειακή τάση της ουσίας. Οι μετρήσεις σε ιονιζόμενες ουσίες θα πρέπει να εκτελούνται μόνο στη μη ιονισμένη μορφή τους (ελεύθερο οξύ ή ελεύθερη βάση) που παράγεται με τη χρησιμοποίηση κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος με pH τουλάχιστον κατά μία μονάδα κάτω (ελεύθερο οξύ) ή πάνω (ελεύθερη βάση) από το pΚ. Αυτή η μέθοδος περιλαμβάνει δύο ξεχωριστές διαδικασίες — τη μέθοδο ανακινούμενης φιάλης και την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Η πρώτη εφαρμόζεται όταν η τιμή του log Pow (βλέπε παρακάτω για ορισμούς) είναι στην περιοχή - 2 έως 4 και η δεύτερη στην περιοχή 0 έως 6. Πριν από την πραγματοποίηση οποιασδήποτε από τις πειραματικές διαδικασίες, θα πρέπει πρώτα να γίνεται μία προκαταρκτική εκτίμηση του συντελεστή κατανομής. Η μέθοδος της ανακινούμενης φιάλης εφαρμόζεται μόνο σε ουσιαστικά καθαρές ουσίες, διαλυτές στο νερό και σε n-οκτανόλη. Δεν έχει εφαρμογή σε επιφανειοδραστικές ουσίες (για τις οποίες θα πρέπει να προβλέπεται μία εξ υπολογισμού τιμή ή μία εξ εκτιμήσεως τιμή με βάση τις διαλυτότητες σε n-οκτανόλη και στο νερό). Η μέθοδος HPLC δεν έχει εφαρμογή σε ισχυρά οξέα και βάσεις, σε σύμπλοκα μετάλλων, σε επιφανειοδραστικές ουσίες ή σε ουσίες που αντιδρούν με το μέσον έκλουσης. Για τα υλικά αυτά, θα πρέπει να προβλέπεται μία δια υπολογισμού ή δια εκτίμησης τιμή με βάση τις διαλυτότητες σε n-οκτανόλη και στο νερό. Η μέθοδος HPLC είναι λιγότερο ευαίσθητη στην παρουσία προσμείξεων στην εξεταζόμενη ένωση απ' ό,τι η μέθοδος της ανακινούμενης φιάλης. Εντούτοις, σε ορισμένες περιπτώσεις οι προσμείξεις μπορεί να κάνουν δύσκολη την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, διότι ο διαχωρισμός των κορυφών είναι ασαφής. Για μείγματα που δεν παρέχουν καθορισμένη ζώνη, θα πρέπει να δηλώνεται ανώτερο και κατώτερο όριο log P.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Ως συντελεστής κατανομής (Ρ) ορίζεται ο λόγος των συγκεντρώσεων ισορροπίας (ci) μιας διαλελυμένης ουσίας σε ένα διφασικό σύστημα που αποτελείται από δύο σε μεγάλο βαθμό μη αναμείξιμους στην ουσία διαλύτες. Στην περίπτωση n-οκτανόλης και νερού: Pow=cn-οκτανόληςcνερού Κατά συνέπεια ο συντελεστής κατανομής (Ρ) είναι το πηλίκον δύο συγκεντρώσεων και δίνεται συνήθως με τη μορφή του δεκαδικού λογαρίθμου του (log Ρ).
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ
1.3. Μέθοδος ανακινούμενης φιάλης
Δεν απαιτείται να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μία νέα ουσία. Αυτές θα πρέπει κατά βάση να χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο κατά διαστήματα της μεθόδου και για να γίνεται σύγκριση με τα αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.
Μέθοδος HPLC
Για να συσχετισθούν τα δεδομένα, που λαμβάνονται από την HPLC, μιας ένωσης με την τιμή Ρ αυτής, πρέπει να χαραχθεί καμπύλη βαθμονόμησης τιμών log Ρ σαν συνάρτηση των χρωματογραφικών δεδομένων με τη χρησιμοποίηση, τουλάχιστον, 6 σημείων αναφοράς, Η επιλογή των κατάλληλων ουσιών αναφοράς εναπόκειται στον χρήστη. Όταν είναι δυνατό, τουλάχιστον μία ένωση αναφοράς θα πρέπει να έχει Pow μεγαλύτερη από εκείνη της εξεταζόμενης ουσίας και μία άλλη τιμή Pow κάτω από εκείνη της εξεταζόμενης ουσίας. Για τιμές log Ρ μικρότερες του 4, η βαθμονόμηση μπορεί να βασίζεται σε δεδομένα λαμβανόμενα από τη μέθοδο της ανακινούμενης φιάλης. Για τιμές log Ρ μεγαλύτερες από 4, η βαθμονόμηση μπορεί να βασίζεται σε έγκυρες βιβλιογραφικές τιμές αν αυτές συμφωνούν με τις τιμές που λαμβάνονται δια υπολογισμού. Για μεγαλύτερη ακρίβεια, είναι προτιμότερο να επιλέγονται ουσίες αναφοράς που σχετίζονται από πλευράς δομής με την εξεταζόμενη ουσία. Για πολλές ομάδες χημικών ουσιών υπάρχουν εκτεταμένοι πίνακες τιμών του log Pow (2) (3). Αν δεν υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία για τους συντελεστές κατανομής ουσιών σχετικών από πλευράς δομής, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία γενικότερη βαθμονόμηση, που να στηρίζεται σε άλλες ουσίες αναφοράς. Στο προσάρτημα 2 δίνεται πίνακας των ουσιών αναφοράς που συνιστώνται μαζί με τις Pow τιμές τους.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.4.
1.4.1. Μέθοδος ανακινούμενης φιάλης Για να προσδιορισθεί ο συντελεστής κατανομής, πρέπει να επιτευχθεί ισορροπία μεταξύ όλων των αντιδρώντων συστατικών του συστήματος και να προσδιορισθούν οι συγκεντρώσεις των ουσιών που είναι διαλυμένες στις δύο φάσεις. Μελέτη της βιβλιογραφίας στο θέμα αυτό δείχνει ότι για την επίλυση του προβλήματος αυτού, δηλ. την επισταμένη ανάμειξη των δύο φάσεων και στη συνεχεία το διαχωρισμό τους προκειμένου να προσδιορισθεί η συγκέντρωση ισορροπίας της εξεταζόμενης ουσίας, μπορούν να χρησιμοποιηθούν αρκετές διαφορετικές τεχνικές.
1.4.2. Μέθοδος HPLC Η HPLC διεξάγεται σε αναλυτικές στήλες που φέρουν μία στερεά φάση, διατιθέμενη στο εμπόριο, με μακριές αλυσίδες υδρογονανθράκων (π.χ. C8, Cl8) χημικώς ενωμένες με διοξείδιο του πυριτίου (silica). Οι χημικές ουσίες που φέρονται στη στήλη αυτή κινούνται κατά μήκος αυτής με διαφορετικές ταχύτητες εξαιτίας των διαφορετικών βαθμών κατανομής των, μεταξύ της κινητής φάσης και της υδρογονανθρακικής στατικής φάσης. Μείγματα χημικών ουσιών εκλούονται κατά σειρά υδροφοβίας, με τις υδατοδιαλυτές χημικές ουσίες να εκλούονται πρώτες και τις λιποδιαλυτές χημικές ουσίες τελευταίες, ανάλογα με το συντελεστή κατανομής τους σε υδρογονάνθρακα/νερό. Έτσι καθορίζεται η σχέση μεταξύ του χρόνου κατακράτησης στη στήλη αυτή (ανάστροφη φάση) και του συντελεστή κατανομής σε n-οκτανόλη/νερό. Ο συντελεστής κατανομής ευρίσκεται από τον παράγοντα χωρητικότητας k, που δίνεται από την έκφραση: k=tR-toto όπου, tR = χρόνος κατακράτησης της εξεταζόμενης ουσίας και t0 = μέσος χρόνος που χρειάζεται το μόριο ενός διαλύτη να περάσει από τη στήλη (νεκρός χρόνος). Ποσοτικές αναλυτικές μέθοδοι δεν απαιτούνται. Αναγκαίος είναι μόνον ο προσδιορισμός των χρόνων έκλουσης.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ
1.5.
1.5.1. Επαναληψιμότητα
1.5.1. Μέθοδοι ανακινούμενης φιάλης
Για να επιβεβαιωθεί η ορθότητα του συντελεστή κατανομής, πρέπει να εκτελούνται διπλοί προσδιορισμοί κάτω από τρεις διαφορετικές συνθήκες δοκιμής, στις οποίες μπορεί να διαφέρει τόσο η ποσότητα της εξεταζόμενης ουσίας, όσο και ο λόγος των όγκων των διαλυτών. Οι προσδιοριζόμενες τιμές του συντελεστή κατανομής που εκφράζονται υπό την μορφή κοινών λογάριθμών τους θα πρέπει να μη διαφέρουν περισσότερο από ±0,3 λογαριθμικές μονάδες.
Μέθοδος HPLC
Για να αυξηθεί η αξιοπιστία της μέτρησης, πρέπει να εκτελούνται διπλοί προσδιορισμοί. Οι τιμές του log Ρ που βρίσκονται από κάθε μέτρηση ξεχωριστά θα πρέπει να είναι μέσα στα όρια των ±0,1 λογαριθμικών μονάδων.
1.5.2. Ευαισθησία
1.5.2. Μέθοδος ανακινούμενης φιάλης
Η περιοχή μέτρησης της μεθόδου προσδιορίζεται από το όριο ανίχνευσης της αναλυτικής διαδικασίας. Το όριο αυτό θα πρέπει να επιτρέπει την εκτίμηση τιμών log PDW στην περιοχή από - 2 έως 4 (κατά περίπτωση, όταν το επιτρέπουν οι εφαρμοζόμενες συνθήκες, η κλίμακα αυτή μπορεί να επεκταθεί μέχρι log Pow = 5) όταν η συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας σε καθεμιά από τις φάσεις δεν είναι μεγαλύτερη από 0,01 mol ανά λίτρο,
Μέθοδος HFLC
Η μέθοδος HPLC δίνει τη δυνατότητα εκτίμησης των συντελεστών κατανομής των οποίων η τιμή του log Pow είναι στην περιοχή από 0 έως 6. Κανονικά, ο συντελεστής κατανομής μιας ένωσης μπορεί να εκτιμηθεί στα πλαίσια ± 1 λογαριθμικής μονάδας της τιμής της μεθόδου ανακινούμενης φιάλης. Τυπικοί συσχετισμοί μπορούν να βρεθούν στη βιβλιογραφία (4) (5) (6) (7) (8). Μεγαλύτερη ορθότητα μπορεί συνήθως να επιτευχθεί όταν οι καμπύλες συσχετισμού βασίζονται σε ουσίες αναφοράς σχετικές από πλευράς δομής (9).
1.5.3. Εξειδίκευση
1.5.3. Μέθοδοι ανακινούμενης φιάλης
Ο νόμος κατανομής του Nemst εφαρμόζεται μόνο σε σταθερή θερμοκρασία, πίεση και pH για αραιά διαλύματα. Εφαρμόζεται αυστηρά σε καθαρή ουσία διεσπαρμένη μεταξύ δύο καθαρών διαλυτών. Εάν στη μία ή και στις δύο φάσεις συναντώνται ταυτόχρονα περισσότερες διαφορετικές διαλυμένες ουσίες, αυτό μπορεί να επηρεάσει τα αποτελέσματα. Τυχόν διάσταση ή συνένωση των διαλυμένων μορίων έχει ως αποτέλεσμα αποκλίσεις από το νόμο κατανομής του Nernst. Οι αποκλίσεις αυτές καταδεικνύονται από το γεγονός ότι ο συντελεστής κατανομής καταλήγει να εξαρτάται από τη συγκέντρωση του διαλύματος. Εξαιτίας των πολλαπλών ισορροπιών που εμπερικλείει, η μέθοδος αυτή δεν θα πρέπει να εφαρμόζεται σε ενώσεις που ιονίζονται χωρίς να γίνεται κάποια διόρθωση. Σε περίπτωση τέτοιων ενώσεων θα πρέπει να εξετάζεται η χρήση ρυθμιστικών διαλυμάτων αντί του νερού' το pH του ρυθμιστικού διαλύματος θα πρέπει να απέχει τουλάχιστον 1 μονάδα pH από το pKa της ουσίας λαμβανομένης υπόψη και της σημασίας του pH αυτού για το περιβάλλον.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Προκαταρκτική εκτίμηση του συντελεστή κατανομής Ο συντελεστής κατανομής εκτιμάται κατά προτίμηση χρησιμοποιώντας μία μέθοδο υπολογισμού (βλέπε προσάρτημα 1), ή όπου είναι ενδεδειγμένο, από το λόγο των διαλυτοτήτων της εξεταζόμενης ουσίας στους καθαρούς διαλύτες (10).
1.6.2. Μέθοδος ανακινούμενης φιάλης
1.6.2.
1.6.2.1. Προπαρασκευή ν-οκτανόλη: Ο προσδιορισμός του συντελεστή κατανομής θα πρέπει να εκτελείται με αναλυτικά αντιδραστήρια υψηλής καθαρότητας. Νερό: Θα πρέπει να χρησιμοποιείται νερό απεσταγμένο ή διπλά απεσταγμένο σε γυάλινη ή χαλαζιακή συσκευή. Για ιονιζόμενες ενώσεις, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται, εφόσον δικαιολογείται, αντί του νερού ρυθμιστικά διαλύματα. Σημείωση: Δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται νερό λαμβανόμενο απευθείας από ιοντοανταλλάκτη.
1.6.2.1.
1.6.2.1.1. Προκορεσμός των διαλυτών Πριν από τον προσδιορισμό του συντελεστή κατανομής, οι φάσεις του συστήματος των διαλυτών κορένυνται αμοιβαία με ανατάραξη στη θερμοκρασία του πειράματος. Για να γίνει αυτό, είναι πρακτικό να αναταράσσονται δύο μεγάλες φιάλες αποθήκευσης με υψηλό βαθμό αναλυτικής καθαρότητας n-οκτανόλης ή νερού, η κάθε μία με αρκετή ποσότητα από τον άλλο διαλύτη, για 24 ώρες με ένα μηχανικό αναδευτήρα και μετά να αφήνονται σε ηρεμία για αρκετό χρόνο, μέχρι να χωριστούν οι φάσεις και να επιτευχθεί μία κατάσταση κορεσμού.
1.6.2.1.2. Προετοιμασία για τη δοκιμή Ο συνολικός όγκος του διφασικού συστήματος θα πρέπει να γεμίζει σχεδόν το δοχείο δοκιμής. Αυτό θα βοηθάει στο να προλαμβάνεται απώλεια του υλικού που οφείλεται σε πτητικότητα. II αναλογία όγκου και οι ποσότητες της ουσίας που χρησιμοποιούνται καθορίζονται από τα παρακάτω: Διεξάγονται τρεις δοκιμές. Στην πρώτη, χρησιμοποιείται η υπολογισθείσα κατ’ όγκο αναλογία n-οκτανόλης προς νερό στη δεύτερη, η αναλογία αυτή διαιρείται δια του δύο και στην τρίτη, η αναλογία αυτή πολλαπλασιάζεται με το δύο (π.χ. 1:1, 1:2, 2:1).
την προκαταρκτική εκτίμηση του συντελεστή κατανομής (βλέπε ανωτέρω),
την ελάχιστη ποσότητα που απαιτείται από τη εξεταζόμενη ουσία για την αναλυτική διαδικασία, και
τον περιορισμό μιας μέγιστης συγκέντρωσης και στις δύο φάσεις 0,01 mol/l.
1.6.2.1.3. Εξεταζόμενη ουσία Παρασκευάζεται διάλυμα για εναποθήκευση σε n-οκτανόλη προκορεσμένη με νερό. Η συγκέντρωση του εναποθηκευμένου διαλύματος θα πρέπει να προσδιορίζεται με ακρίβεια πριν να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του συντελεστή κατανομής. Το διάλυμα αυτό θα πρέπει να εναποθηκεύεται υπό συνθήκες που να εξασφαλίζουν τη σταθερότητα του.
1.6.2.2. Συνθήκες δοκιμής Η θερμοκρασία δοκιμής θα πρέπει να διατηρείται σταθερή (± 1 oC) και να βρίσκεται στην περιοχή από 20 έως 25 oC.
1.6.2.3. Διαδικασία μέτρησης
1.6.2.3.
1.6.2.3.1. Αποκατάσταση της ισορροπίας κατανομής Για κάθε μια από τις συνθήκες δοκιμής πρέπει να ετοιμάζονται διπλά δοχεία περιέχονται τις απαιτούμενες, και με ακρίβεια μετρημένες, ποσότητες των δύο διαλυτών μαζί με την αναγκαία ποσότητα του διαλύματος εναποθήκευσης. Οι φάσεις της n-οκτανόλης θα πρέπει να μετρούνται κατ’ όγκο. Τα δοχεία δοκιμής πρέπει να τοποθετούνται είτε σε κατάλληλο αναδευτήρα είτε να ανακινούνται με το χέρι. Όταν χρησιμοποιείται ο σωλήνας φυγοκέντρησης η μέθοδος που συνιστάται είναι να περιστρέφεται ο σωλήνας γρήγορα κατά 180o περί τον εγκάρσιο άξονα του έτσι ώστε αν υπάρχει παγιδευμένος αέρας να διαφεύγει από τις δύο φάσεις. Η εμπειρία έχει δείξει ότι 50 τέτοιες περιστροφές επαρκούν συνήθως για την αποκατάσταση της ισορροπίας κατανομής. Για να είμαστε σίγουροι, συνιστώνται 100 περιστροφές σε πέντε λεπτά.
1.6.2.3.2. Διαχωρισμός φάσεων Όταν είναι αναγκαίο, για να διαχωριστούν οι φάσεις, θα πρέπει να πραγματοποιείται φυγοκέντρηση του μείγματος. Αυτό πρέπει να γίνεται με εργαστηριακή φυγόκεντρο διατηρούμενη σε θερμοκρασία δωματίου, ή, αν χρησιμοποιείται μη ελεγχόμενη θερμοκρασιακά φυγόκεντρος, οι σωλήνες φυγοκέντρησης θα πρέπει να διατηρούνται στη θερμοκρασία δοκιμής για μία τουλάχιστον ώρα πριν από την ανάλυση προκειμένου να επέλθει θερμοκρασιακή εξισορρόπηση.
1.6.2.4. Ανάλυση Για τον προσδιορισμό του συντελεστή κατανομής είναι αναγκαίο να προσδιορίζονται οι συγκεντρώσεις της εξεταζόμενης ουσίας και στις δύο φάσεις. Αυτό μπορεί να γίνει λαμβάνοντας ένα μέρος από καθεμία από τις δύο φάσεις από κάθε σωλήνα για καθεμία συνθήκη δοκιμής και αναλύοντας αυτά με τη διαδικασία που έχει επιλεγεί. Η ολική ποσότητα της ουσίας που βρίσκεται και στις δύο φάσεις θα πρέπει να υπολογίζεται και να συγκρίνεται με την ποσότητα της ουσίας που είχε εισαχθεί αρχικά. Η λήψη των δειγμάτων από την υδατική φάση θα πρέπει να πραγματοποιείται με διαδικασία που να ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο να υπάρχουν ίχνη n-οκτανόλης: μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία γυάλινη σύριγγα με βελόνα που αποσπάται για τη δειγματοληψία της υδατικής φάσης. Η σύριγγα αρχικά θα πρέπει να γεμίζεται μερικά με αέρα. Ο αέρας θα πρέπει να εκδιώκεται σιγά, ενώ θα βυθίζεται η βελόνα στη στιβάδα οκτανόλης. Κατάλληλος όγκος υδατικής φάσης εισάγεται στη σύριγγα. Η σύριγγα αποσύρεται γρήγορα από το διάλυμα και η βελόνα αποσπάται. Τα περιεχόμενα της σύριγγας μπορούν τότε να χρησιμοποιηθούν σαν το υδατικό δείγμα. Η συγκέντρωση στις δύο χωριστές φάσεις θα πρέπει να προσδιορίζεται κατά προτίμηση με μία ειδική για την ουσία μέθοδο. Παραδείγματα αναλυτικών μεθόδων που μπορεί να είναι κατάλληλες είναι:
φωτομετρικές μέθοδοι,
αέρια χρωματογραφία,
υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης.
1.6.3. Μέθοδος HPLC
1.6.3.
1.6.3.1. Προετοιμασία
1.6.3.1. Συσκευή
Απαιτείται υγρή χρωματογραφία, εφοδιασμένη με μη παλμική αντλία και κατάλληλη διάταξη ανίχνευσης. Συνιστάται η χρησιμοποίηση βαλβίδας ένεσης με βρόχους (loops) ένεσης. Η παρουσία πολικών ομάδων στη στατική φάση μπορεί να επηρεάσει σοβαρά την απόδοση της στήλης HPLC. Κατά συνέπεια, οι στατικές φάσεις θα πρέπει να έχουν το ελάχιστο δυνατό ποσοστό πολικών ομάδων (11). Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διατιθέμενα στο εμπόριο λεπτά διαμερισμένα υλικά πλήρωσης ανάστροφης φάσης ή έτοιμες γεμισμένες στήλες. Μεταξύ του συστήματος ένεσης και της αναλυτικής στήλης μπορεί να τοποθετηθεί μία προφυλακτική στήλη.
Κινητή φάση
Για την παρασκευή του διαλύτη έκλουσης ο οποίος προηγουμένως απαερούται χρησιμοποιούνται μεθανόλη και νερό κατάλληλης καθαρότητας για HPLC. Πρέπει να χρησιμοποιείται ισοκρατική έκλουση. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται αναλογίες μεθανόλης/νερού με ελάχιστη περιεκτικότητα σε νερό 25 %. Συνήθως, μείγμα 3:1 (n/n) μεθανόλης-νερού είναι ικανοποιητικό για την έκλουση ενώσεων με log Ρ 6 μέσα σε μία ώρα, με ταχύτητα ροής 1 ml/λεπτό. Για ενώσεις υψηλού log Ρ μπορεί να απαιτείται μείωση του χρόνου έκλουσης (όπως και των ενώσεων αναφοράς) με μείωση της πολικότητας της κινητής φάσης ή του μήκους της στήλης. Ενώσεις με πολύ μικρή διαλυτότητα σε n-οκτανόλη έχουν την τάση να παρέχουν ασυνήθιστα χαμηλές τιμές log Ρ0 με τη μέθοδο HPLC οι κορυφές των ενώσεων αυτών ακολουθούν μερικές φορές το μέτωπο του διαλύτη. Αυτό οφείλεται πιθανά στο γεγονός ότι η διαδικασία κατανομής είναι πολύ αργή για την επίτευξη της ισορροπίας μέσα στον χρόνο που απαιτείται κανονικά για το διαχωρισμό με HPLC. Για την επίτευξη μιας αξιόπιστης τιμής, μπορεί να είναι αποτελεσματικό να μειωθεί η ταχύτητα ροής ή/και να ελαττωθεί η αναλογία μεθανόλης/νερού. Οι εξεταζόμενες και οι ουσίες αναφοράς θα πρέπει να είναι διαλυτές στην κινητή φάση σε βαθμό επαρκή για να μπορούν να ανιχνεύονται. Μόνο σε εξαιρετικές περιπτώσεις μπορεί να χρησιμοποιηθούν πρόσθετα με το μείγμα μεθανόλης/νερού, δεδομένου ότι τα πρόσθετα αλλάζουν τις ιδιότητες της στήλης. Για χρωματογραφήματα με πρόσθετα, είναι υποχρεωτικό να χρησιμοποιείται ξεχωριστή στήλη του ίδιου τύπου. Εάν το μείγμα μεθανόλης/νερού δεν είναι το ενδεδειγμένο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν μείγματα άλλων οργανικών διαλυτών με νερό, π.χ. αιθανόλη/νερό ή ακετονιτρίλιο/νερό. Το pH του μέσου έκλουσης είναι σημαντικό για τις ιονιζόμενες ενώσεις. Θα πρέπει να είναι μέσα στην περιοχή του pH λειτουργίας της στήλης, που συνήθως είναι μεταξύ 2 και 8. Συνιστάται η χρήση ρυθμιστικού διαλύματος. Πρέπει να λαμβάνεται πρόνοια να αποφεύγεται η καθίζηση αλάτων και η φθορά της στήλης γεγονός που συμβαίνει με ορισμένα μίγματα οργανικής φάσης/ρυθμιστικού διαλύματος. Δεν συνιστώνται οι μετρήσεις HPLC με στατικές φάσεις που έχουν σαν βάση silica για pH πάνω από 8, δεδομένου ότι η χρήση αλκαλικής κινητής φάσης μπορεί να προκαλέσει ταχεία ελάττωση της απόδοσης της στήλης.
Διαλυόμενες ουσίες
Οι ουσίες αναφοράς θα πρέπει να είναι της μεγαλύτερης διαθέσιμης καθαρότητας. Αν είναι δυνατόν, οι ενώσεις που χρησιμοποιούνται για τους σκοπούς της δοκιμής ή της βαθμονόμησης πρέπει να διαλύονται στην κινητή φάση.
Συνθήκες δοκιμής
Η θερμοκρασία κατά τη διάρκεια των μετρήσεων δεν θα πρέπει να διαφέρει περισσότερο από ± 2Κ.
1.6.3.2. Μέτρηση
1.6.3.2. Υπολογισμός του νεκρού χρόνου t0
Ο νεκρός χρόνος μπορεί να προσδιορισθεί χρησιμοποιώντας είτε μία ομόλογη σειρά (π.χ. n-αλκυλο μεθυλο κετόνες) είτε μη συγκροτούμενες οργανικές ενώσεις (π.χ. θειουρία η φορμαμίδιο). Για τον υπολογισμό του νεκρού χρόνου t0 με τη χρησιμοποίηση ομόλογης σειράς, εγχύεται μία ομάδα 7 τουλάχιστον μελών μιας ομόλογης σειράς και προσδιορίζονται οι αντίστοιχοι χρόνοι κατακράτησης. Οι μεικτοί χρόνοι κατακράτησης tr (nc + 1) σημειώνονται σαν συνάρτηση του tr(nc), και προσδιορίζονται το τμήμα α και η κλίση b της εξίσωσης αναγωγής: tr(nc + 1) = a + b tr(nc) (nc = αριθμός ατόμων άνθρακα). Ο νεκρός χρόνος t0 δίνεται κατόπιν με τον τύπο: t0 = α/(1 - b)
Καμπύλη αναφοράς
Το επόμενο βήμα είναι να χαραχθεί η καμπύλη των τιμών του log k σαν συνάρτηση του log Ρ για μερικές ουσίες αναφοράς. Στην πράξη, εγχύεται ταυτόχρονα μία ομάδα από 5 έως 10 πρότυπες ουσίες αναφοράς των οποίων ο log Ρ είναι της αναμενόμενης τάξης και προσδιορίζονται οι χρόνοι κατακράτησης, κατά προτίμηση με ένα καταγραφικό ολοκληρωτή συνδεόμενο με το σύστημα ανίχνευσης. Υπολογίζονται οι αντίστοιχοι λογάριθμοι των παραγόντων χωρητικότητας, log k, και σημειώνονται σαν συνάρτηση του log Ρ που προσδιορίζεται με τη μέθοδο της ανακινούμενης φιάλης. Η βαθμονόμηση εκτελείται σε τακτά χρονικά διαστήματα, τουλάχιστον μία φορά την ημέρα, ώστε να λαμβάνονται υπόψη οι πιθανές αλλαγές στην απόδοση της στήλης.
Προσδιορισμός τον παράγοντα χωρητικότητας της εξεταζόμενης ουσίας
Η εξεταζόμενη ουσία εγχύεται σε όσο το δυνατόν μικρότερη ποσότητα της κινητής φάσης. Προσδιορίζεται ο χρόνος κατακράτησης (δύο φορές), πράγμα που επιτρέπει τον υπολογισμό του παράγοντα χωρητικότητας k. Από την καμπύλη των ουσιών αναφοράς, μπορεί να υπολογισθεί ο συντελεστής κατανομής της εξεταζόμενης ουσίας. Για πολύ χαμηλούς και πολύ υψηλούς συντελεστές είναι αναγκαία η προεκβολή. Στις περιπτώσεις αυτές, πρέπει να λαμβάνεται ιδιαίτερη μέριμνα για τα όρια εμπιστοσύνης της γραμμής αναγωγής.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ
2. Μέθοδος ανακινούμενης φιάλης
Η αξιοπιστία των προσδιοριζόμενων τιμών Ρ μπορεί να ελεγχθεί κάνοντας σύγκριση του μέσου όρου των διπλών προσδιορισμών με το γενικό μέσον όρο.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις),
όταν οι μέθοδοι δεν έχουν εφαρμογή (π.χ. επιφανειοδραστικές ουσίες), πρέπει να παρέχεται μία τιμή, με υπολογισμό ή με εκτίμηση, με βάση τις διαλυτότητες σε n-οκτανόλη και νερό ανεξάρτητα,
κάθε πληροφορία και παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα σχετικά με τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας,
το αποτέλεσμα της προκαταρκτικής εκτίμησης, εφόσον υπάρχει,
θερμοκρασία του προσδιορισμού,
στοιχεία για τις αναλυτικές διαδικασίες που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων,
ο χρόνος και η ταχύτητα φυγοκέντρησης, εφόσον χρησιμοποιήθηκε,
οι μετρηθείσες συγκεντρώσεις και στις δύο φάσεις για κάθε προσδιορισμό (αυτό σημαίνει ότι πρέπει να αναφερθούν συνολικά II συγκεντρώσεις),
το βάρος της εξεταζόμενησ ουσίας, ο όγκος κάθε φάσης που χρησιμοποιήθηκε σε κάθε δοχείο δοκιμής και η ολική υπολογισθείσα ποσότητα εξεταζόμενης ουσίας σε κάθε φάση μετά την εξισορρόπηση,
οι υπολογισθείσες τιμές του συντελεστή κατανομής (Ρ) και ο μέσος όρος θα πρέπει να αναφέρονται για κάθε ομάδα συνθηκών δοκιμής όπως πρέπει να αναφέρεται και ο μέσος όρος για όλους τους προσδιορισμούς. Αν υπάρχει ένδειξη εξάρτησης του συντελεστή κατανομής από τη συγκέντρωση, αυτό πρέπει να δηλώνεται στην έκθεση,
η τυπική απόκλιση των ανεξάρτητων τιμών Ρ ως προς το μέσον όρο τους πρέπει επίσης να αναφέρεται,
ο μέσος όρος Ρ από όλους τους προσδιορισμούς θα πρέπει επίσης να εκφράζεται σαν ο δεκαδικός λογάριθμός του,
η υπολογισθείσα θεωρητική τιμή Pow εφόσον προσδιορίσθηκε ή όταν η μετρηθείσα τιμή είναι > 104,
το pH του χρησιμοποιηθέντος νερού και της υδατικής φάσης κατά τη διάρκεια του πειράματος,
αν χρησιμοποιήθηκαν ρυθμιστικά διαλύματα, αιτιολόγηση της χρήσης ρυθμιστικών διαλυμάτων αντί νερού, σύνθεση, συγκέντρωση και pH των ρυθμιστικών διαλυμάτων, pH της υδατικής φάσης πριν και μετά από το πείραμα.
το αποτέλεσμα τυχόν προκαταρκτικής εκτίμησης,
εξετασθείσες και ουσίες αναφοράς όπως και η καθαρότητα τους,
περιοχή θερμοκρασιών στην οποία έγιναν οι προσδιορισμοί,
pΗ στο οποίο έγιναν οι προσδιορισμοί,
λεπτομερή στοιχεία για την αναλυτική και προφυλακτική στήλη, την κινητή φάση και το μέσον ανίχνευσης,
στοιχεία κατακράτησης και βιβλιογραφικές τιμές log Ρ για τις ουσίες αναφοράς που χρησιμοποιήθηκαν στη βαθμονόμηση,
λεπτομερή στοιχεία για την καμπύλη αναγωγής (log k σαν συνάρτηση log Ρ),
δεδομένα μέσης κατακράτησης και ενδιάμεση τιμή log Ρ για την εξεταζόμενη ουσία,
περιγραφή του εξοπλισμού και των λειτουργικών συνθηκών,
περιγραφικά στοιχεία για την έκλουση,
ποσότητες της ελεγχόμενης ουσίας και της ουσίας αναφοράς που εισήχθησαν στη στήλη,
νεκρός χρόνος και πως μετρήθηκε.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansen and A.j. Leu, Suustituem Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979. Log Ρ and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundstrom and K. Sundh—Nygard, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219 (1981). B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band 1/1, 223-339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF Τ 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Set. Technol., 1974, voi. g, 1113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivitat von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984. Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel 1978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.
A.9. ΣΗΜΕΙΟ ΑΝΑΦΛΕΞΗΣ
A.9.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πριν από την εκτέλεση της δοκιμής αυτής, χρήσιμο είναι να υπάρχουν προκαταρκτικές πληροφορίες για την αναφλεξιμότητα της ουσίας. Η δοκιμή μπορεί να εφαρμοσθεί σε υγρές ουσίες των οποίων οι ατμοί μπορούν να αναφλέγουν από πηγές ανάφλεξης. Οι μέθοδοι δοκιμής που περιλαμβάνονται στο κείμενο αυτό είναι αξιόπιστες μόνο σε περιοχές σημείων ανάφλεξης που καθορίζονται στις συγκεκριμένες μεθόδους. Κατά την επιλογή της μεθόδου που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί, θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η πιθανότητα χημικών αντιδράσεων μεταξύ της ουσίας και του υποδοχέα του δείγματος.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Σημείο ανάφλεξης καλείται η χαμηλότερη θερμοκρασία, διορθωμένη για πίεση 101,325 kPa, στην οποία ένα υγρό εκλύει ατμούς, κάτω από τις συνθήκες που ορίζονται στη μέθοδο δοκιμής, σε τέτοια ποσότητα ώστε να παράγεται στο δοχείο δοκιμής αναφλέξιμο μείγμα ατμών/αέρα. Μονάδες: oC t = Τ -273,15 (t σε o C και Τ σε Κ)
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Δεν απαιτείται να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μία νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κατά βάση για να ελέγχεται κατά διαστήματα η εφαρμοζόμενη μέθοδος και για να γίνεται σύγκριση με αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Η ουσία τοποθετείται σε δοχείο δοκιμής και θερμαίνεται ή ψύχεται στη θερμοκρασία δοκιμής ανάλογα με τη διαδικασία που περιγράφεται στη συγκεκριμένη μέθοδο δοκιμής. Για να εξακριβωθεί αν το δείγμα ανεφλέγη ή όχι στη θερμοκρασία δοκιμής, διενεργούνται δοκιμές ανάφλεξης.
1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ
1.5.
1.5.1. Επαναληψιμότητα Η επαναληψιμότητα ποικίλλει ανάλογα με την περιοχή του σημείου ανάφλεξης και τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο δοκιμής κατά μέγιστο 2 oC.
1.5.2. Ευαισθησία Η ευαισθησία εξαρτάται από τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο δοκιμής.
1.5.3. Εξειδίκευση Η δυνατότητα εφαρμογής μερικών μεθόδων δοκιμής περιορίζεται σε συγκεκριμένες περιοχές σημείων ανάφλεξης και εξαρτάται από δεδομένα που σχετίζονται με την ουσία (π.χ. υψηλό ιξώδες).
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Προετοιμασίες Δείγμα της εξεταζόμενης ουσίας τοποθετείται σε μια συσκευή δοκιμής σύμφωνα με το σημείο 1.6.3.1. ή/και 1.6.3.2. Για λόγους ασφαλείας, συνιστάται να χρησιμοποιείται μέθοδος που απαιτεί μικρό δείγμα, περίπου 2 cm3, στην περίπτωση ενεργητικών ή τοξικών ουσιών.
1.6.2. Συνθήκες δοκιμής Η συσκευή θα πρέπει, στο βαθμό που συμβαδίζει με το θέμα της ασφάλειας, να τοποθετείται μακριά από ρεύματα αέρα.
1.6.3. Εκτέλεση της δοκιμής
1.6.3.
1.6.3.1. Μέθοδος ισορροπίας Βλέπε ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679,
1.6.3.2. Μέθοδος μη ισορροπίας
1.6.3.2. Συσκευή ABEL:
Βλέπε BS 2000 μέρος 170, NF MO7-011, NF T06-009.
Συσκευή Abel-Pensky:
Βλέπε ΕΝ 57, DIN 51755 μέρος 1 (για θερμοκρασίες από 5 έως 65 oC), DIN 51755 μέρος 2 (για θερμοκρασίες κάτω των 5 oC), NF MO7-036.
Συσκευή Tag:
Βλέπε ASTM D 56.
Συσκευή Pensky-Martens:
Βλέπε. ISO 2719, ΕΝ 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF MO7-019.
Παρατηρήσεις:
Όταν το σημείο ανάφλεξης, προσδιοριζόμενο με μια μέθοδο μη ισορροπίας όπως αναφέρεται στο 1.6.3.2., βρίσκεται να είναι 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC ή 55 ± 2 oC, θα πρέπει να επαληθεύεται με μια μέθοδο ισορροπίας χρησιμοποιώντας την ίδια συσκευή. Για γνωστοποίηση μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνον οι μέθοδοι που μπορούν να δώσουν τη θερμοκρασία του σημείου ανάφλεξης. Για τον προσδιορισμό του σημείου ανάφλεξης ιξωδών υγρών (βαφές, κόμμεα και παρόμοια) που περιέχουν διαλύτες, μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο συσκευές και μέθοδοι δοκιμών κατάλληλες για τον προσδιορισμό του σημείου ανάφλεξης ιξωδών υγρών. Βλέπε ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 μέρος 1.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
τις επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτοποίηση και προσμείξεις)·
η χρησιμοποιηθείσα μέθοδος θα πρέπει να δηλώνεται όπως επίσης και ενδεχόμενες αποκλίσεις·
τα αποτελέσματα και τυχόν πρόσθετες παρατηρήσεις σχετικές με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Ουδεμία.
Α.10. ΑΝΑΦΛΕΞΙΜΟΤΗΤΑ, ΣΤΕΡΕΑ
Α.10.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πριν από την εκτέλεση της δοκιμής αυτής, χρήσιμο είναι να υπάρχουν προκαταρκτικές πληροφορίες για τις δυνητικές εκρηκτικές ιδιότητες της ουσίας. Η δοκιμή αυτή θα πρέπει να εφαρμόζεται μόνο σε ουσίες με μορφή σκόνης, κόκκων ή πάστας. Για να μη περιληφθούν όλες οι ουσίες που μπορούν να αναφλέγουν αλλά μόνον εκείνες που καίγονται γρήγορα ή εκείνες των οποίων η συμπεριφορά όταν καίγονται είναι σε οποιαδήποτε περίπτωση ιδιαίτερα επικίνδυνη, θεωρούνται σαν λίαν εύφλεκτες μόνον οι ουσίες των οποίων η ταχύτητα καύσης υπερβαίνει μία ορισμένη οριακή τιμή. Ιδιαίτερα επικίνδυνη, λόγω των δυσκολιών που υπάρχουν στο σβήσιμο μιας τέτοιας φωτιάς, μπορεί να είναι η περίπτωση στην οποία η πυράκτωση διαδίδεται στη μάζα μιας μεταλλικής σκόνης. Οι μεταλλικές σκόνες θα πρέπει να θεωρούνται λίαν εύφλεκτες αν η πυράκτωση επεκτείνεται διαμέσου της μάζας τους μέσα σε ορισμένο χρονικό διάστημα.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Χρόνος καύσης εκφραζόμενος σε δευτερόλεπτα.
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑ Δεν καθορίζονται.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Η ουσία στρώνεται με τη μορφή συνεχούς λωρίδας ή γραμμής από σκόνη μήκους περίπου 250 mm και εκτελείται μία προκαταρκτική δοκιμή ελέγχου για να διαπιστωθεί αν, η έναυση με φλόγα αερίου, οδηγεί σε διάδοση της καύσης με φλόγα ή η ουσία σιγοκαίγεται. Εάν η διάδοση της καύσης σε μήκος 200 mm της γραμμής επέρχεται μέσα σε ορισμένο χρονικό διάστημα, τότε εκτελείται το πλήρες πρόγραμμα της δοκιμής για να προσδιορισθεί η ταχύτητα καύσης.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Δεν δηλώνονται.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Προκαταρκτική δοκιμή ελέγχου Η ουσία στρώνεται με τη μορφή συνεχούς λωρίδας ή γραμμής από σκόνη μήκους περίπου 250 mm, πλάτους 20 mm και ύφους 10 mm σε μία άκαυστη πλάκα, χωρίς πόρους και χαμηλής θερμοαγωγιμότητας. Στο ένα άκρο της γραμμής φέρεται θερμή φλόγα από καυστήρα αερίου (ελάχιστη διάμετρος 5 mm) μέχρι που η σκόνη να αναφλέγει ή για δύο λεπτά κατ' ανώτατο όριο (πέντε λεπτά για σκόνες μετάλλων ή μεταλλικών κραμάτων). Θα πρέπει να σημειωθεί αν η καύση διαδίδεται στα 200 mm της γραμμής μέσα σε χρονικό διάστημα τεσσάρων λεπτών δοκιμής (ή 40 λεπτών για μεταλλικές σκόνες;. Αν η ουσία δεν αναφλέγει και δεν διαδοθεί η καύση είτε με φλόγα είτε με σιγανή καύση σε μήκος 200 mm της γραμμής της σκόνης μέσα σε χρονικό διάστημα δοκιμής τεσσάρων λεπτών (ή 40 λεπτών), τότε η ουσία δεν θα πρέπει να θεωρείται σαν λίαν εύφλεκτη και δεν απαιτείται καμία περαιτέρω δοκιμασία. Αν η διάδοση της καύσης της ουσίας σε μήκος 200 mm της γραμμής επέρχεται σε λιγότερο από τέσσερα λεπτά ή σε λιγότερο από 40 λεπτά στην περίπτωση μεταλλικής σκόνης, θα πρέπει να πραγματοποιείται η δοκιμασία που περιγράφεται πιο κάτω (σημείο 1.6.2 και μετέπειτα).
1.6.2. Δοκιμή ταχύτητας καύσης
1.6.2.
1.6.2.1. Προετοιμασία Ουσίες με μορφή σκόνης ή κόκκων χύνονται χωρίς να συμπιέζονται μέσα σε ένα καλούπι μήκους 250 mm με τριγωνική διατομή εσωτερικού ύψους 10 mm και πλάτους 20 mm. Και στις δύο πλευρές του καλουπιού, κατά τη διαμήκη διεύθυνση, τοποθετούνται δύο μεταλλικές πλάκες σαν πλευρικά όρια που προεξέχουν 2 mm από την πάνω ακμή της τριγωνικής διατομής (εικόνα). Το καλούπι αφήνεται κατόπιν να πέσει τρεις φορές από ύψος 2 cm σε μια στερεή επιφάνεια. Αν χρειασθεί, το καλούπι γεμίζεται και πάλι. Οι πλευρικές πλάκες κατόπιν αφαιρούνται και η περίσσεια της ουσίας απομακρύνεται με ξύσιμο. Στο πάνω μέρος του καλουπιού τοποθετείται μία άκαυστη, χωρίς πόρους και χαμηλής θερμοαγωγιμότητας πλάκα, η διάταξη ανατρέπεται και το καλούπι απομακρύνεται. Οι ουσίες που έχουν τη μορφή πάστας απλώνονται σε μία άκαυστη, χωρίς πόρους και χαμηλής θερμοαγωγιμότητας πλάκα με τη μορφή σχοινιού μήκους 250 mm και διατομής περίπου 1 cm2.
1.6.2.2. Συνθήκες δοκιμής Στην περίπτωση ουσίας που είναι ευαίσθητη στην υγρασία, η δοκιμή πρέπει να εκτελείται όσο το δυνατόν γρηγορότερα μετά από την απομάκρυνση της από το δοχείο.
1.6.2.3. Εκτέλεση της δοκιμής Η στήλη της ουσίας φέρεται μέσα σε ένα απαγωγό. Η ταχύτητα του αέρα (το τράβηγμα) θα πρέπει να είναι αρκετή ώστε να εμποδίζεται η διαφυγή ατμών μέσα στο εργαστήριο ενώ δεν θα πρέπει να μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Γύρω από τη διάταξη πρέπει να τοποθετείται μια οθόνη ρεύματος. Η στήλη ανάβεται στο ένα άκρο της χρησιμοποιώντας τη θερμή φλόγα ενός καυστήρα αερίου (ελάχιστη διάμετρος 5 mm). Όταν η καύση έχει προχωρήσει σε μήκος 80 mm της στήλης, μετριέται η ταχύτητα καύσης στα επόμενα 100 mm. Η δοκιμή πραγματοποιείται έξι φορές, χρησιμοποιώντας κάθε φορά καθαρή κρύα πλάκα, εκτός κι αν παρατηρηθεί νωρίτερα κάποιο θετικό αποτέλεσμα.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Για την εκτίμηση λαμβάνονται υπόψη ο χρόνος καύσης από την προκαταρκτική δοκιμή ελέγχου (1.6.1) και ο βραχύτερος χρόνος καύσης στις μέχρι έξι δοκιμές (1.6.2.3).
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
τις επακριβείς προδιαγραφές ουσίας (ταυτοποίηση και προσμείξεις),
περιγραφή της εξεταζόμενης ουσίας, τη φυσική της κατάσταση συμπεριλαμβανόμενης και της περιεκτικότητας της σε υγρασία,
αποτελέσματα από την προκαταρκτική δοκιμή ελέγχου και από τη δοκιμή ταχύτητας καύσης, εφόσον υπάρχουν,
κάθε πρόσθετη παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.2. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΟΣ Οι ουσίες σε μορφή σκόνης, κόκκων ή πάστας πρέπει να θεωρούνται σαν λίαν εύφλεκτες όταν ο χρόνος καύσης σε οποιαδήποτε από τις δοκιμές που έγιναν σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στο 1.6.2 είναι μικρότερος από 45 δευτερόλεπτα. Οι σκόνες μετάλλων ή μεταλλικών κραμάτων θεωρούνται σαν λίαν εύφλεκτες όταν μπορούν να αναφλέγουν και η φλόγα ή η ζώνη αντίδρασης απλώνεται σε όλο το δείγμα μέσα σε δέκα λεπτά ή λιγότερο.
4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ NF Τ 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.
A.11. ΑΝΑΦΛΕΞΙΜΟΤΗΤΑ (ΑΕΡΙΑ)
A.11.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Με τη μέθοδο αυτή προσδιορίζεται το κατά πόσον αέρια αναμεμειγμένα με αέρα, σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20 oC) και υπό ατμοσφαιρική πίεση, είναι εύφλεκτα και, σε θετική περίπτωση, σε ποια περιοχή συγκεντρώσεων. Μείγματα αυξανόμενων συγκεντρώσεων του ελεγχόμενου αερίου με αέρα εκτίθενται σε ηλεκτρικό σπινθήρα και παρατηρείται εάν συμβαίνει έναυση.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Η περιοχή αναφλεξιμότητας είναι η περιοχή συγκέντρωσης μεταξύ των χαμηλότερων και των υψηλότερων ορίων έκρηξης. Τα χαμηλότερα και τα υψηλότερα όρια έκρηξης είναι εκείνα τα όρια συγκέντρωσης του εύφλεκτου αερίου, σε μείγμα με αέρα, στα οποία δεν συμβαίνει διάδοση της φλόγας.
1.3. ΟΥΣΙΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Δεν καθορίζεται.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Η συγκέντρωση αερίου στον αέρα αυξάνεται βαθμιαία και το μείγμα, σε κάθε στάδιο, εκτίθεται σε ηλεκτρικό σπινθήρα.
1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Δεν δηλώνονται.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Συσκευή Ως δοχείο δοκιμής χρησιμοποιείται όρθιος γυάλινος κύλινδρος με εσωτερική διάμετρο 50 mm κατ' ελάχιστο και ύψος 300 mm κατ' ελάχιστο. Τα ηλεκτρόδια έναυσης έχουν μεταξύ τους απόσταση 3 έως 5 mm και είναι τοποθετημένα 60 mm πάνω από τον πυθμένα του κυλίνδρου. Ο κύλινδρος φέρει άνοιγμα εκτόνωσης της πίεσης. Η συσκευή πρέπει να θωρακίζεται για να περιορίζεται οποιαδήποτε ζημιά από έκρηξη. Ως πηγή έναυσης χρησιμοποιείται σταθερός επαγωγικός σπινθήρας διάρκειας 0,5 δευτερολέπτων, που παράγεται από μετασχηματιστή υψηλής τάσης με τάση εξόδου 10 έως 15 KV (μέγιστη ισχύς εισόδου 300 W). Ένα παράδειγμα κατάλληλης συσκευής περιγράφεται στην παραπομπή (2).
1.6.2. Συνθήκες δοκιμής Η δοκιμή πρέπει να εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20 oC).
1.6.3. Εκτέλεση της δοκιμής Χρησιμοποιώντας αναλογικές αντλίες, εισάγεται στο γυάλινο κύλινδρο μείγμα γνωστής συγκέντρωσης αερίου σε αέρα. Διαμέσου του μίγματος διέρχεται σπινθήρας και παρατηρείται αν αποσπάται ή όχι από την πηγή έναυσης φλόγα και διαδίδεται ανεξάρτητα. Η συγκέντρωση του αερίου μεταβάλλεται κατά βαθμίδες της τάξης του 1 % κ.ο.κ. μέχρις ότου επέλθει ανάφλεξη όπως περιγράφεται πιο πάνω. Εάν η χημική δομή του αερίου καταδεικνύει ότι αυτό θα πρέπει να είναι μη εύφλεκτο και ότι μπορεί να υπολογισθεί η σύσταση του στοιχειομετρικού μείγματος με αέρα, τότε, κατά βαθμίδες της τάξης του 1 % χρειάζεται να εξετασθούν μόνο μείγματα που εμπίπτουν στην κλίμακα που αντιστοιχεί από 10 % κάτω έως 10 % πάνω από τη στοιχειομετρική σύσταση.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Η ύπαρξη διάδοσης της φλόγας είναι το μόνο σχετικό πληροφοριακό στοιχείο για τον προσδιορισμό της ιδιότητας αυτής.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
τις επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτοποίηση και προσμείξεις),
μια περιγραφή, με διαστάσεις, της χρησιμοποιηθείσας συσκευής,
τη θερμοκρασία στην οποία έγινε η δοκιμή,
τις συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν και τα ληφθέντα αποτελέσματα,
το αποτέλεσμα της δοκιμής: μη εύφλεκτο αέριο ή λίαν εύφλεκτο αέριο,
στην περίπτωση που συμπεραίνεται ότι το αέριο είναι μη εύφλεκτο, τότε θα πρέπει να δηλώνεται η περιοχή συγκεντρώσεων στην οποία πραγματοποιήθηκαν δοκιμές κατά βαθμίδες της τάξης του 1 %,
πρέπει να αναφέρεται κάθε πληροφορία και παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
4.(1)(2) ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ NF Τ 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse-Wortmann, T.Redeker und H.Schacke. Enrwicklung einer Standard—Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol 56, 2, 126-127.
A.12. ΑΝΑΦΛΕΞΙΜΟΤΗΤΑ (ΣΕ ΕΠΑΦΗ ΜΕ ΝΕΡΟ)
A.12.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αυτή η μέθοδος δοκιμής μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εξετασθεί αν η αντίδραση μιας ουσίας με νερό ή υγρό αέρα οδηγεί στην παραγωγή επικίνδυνων ποσοτήτων αερίου ή αερίων που μπορεί να είναι λίαν εύφλεκτα. Η μέθοδος δοκιμής μπορεί να εφαρμοστεί και σε στερεές όπως και σε υγρές ουσίες. Δεν εφαρμόζεται για ουσίες που σε επαφή με τον αέρα αναφλέγονται αυθόρμητα.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Λίαν εύφλεκτες: ουσίες οι οποίες σε επαφή με το νερό ή με υγρό αέρα, εκλύουν λίαν εύφλεκτα αέρια σε επικίνδυνες ποσότητες με ελάχιστη ταχύτητα 1 λίτρο/χιλιόγραμμο ανά ώρα.
1.3. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Η ουσία εξετάζεται σύμφωνα με τη σταδιακή διαδικασία που περιγράφεται πιο κάτω' αν σε κάποιο στάδιο επέρχεται ανάφλεξη, δεν χρειάζεται περαιτέρω εξέταση. Αν είναι γνωστό ότι η ουσία δεν αντιδρά βίαια με το νερό, τότε προχωρούμε στο στάδιο 4 (1.3.4).
1.3.
1.3.1. Στάδιο 1 Η εξεταζόμενη ουσία τοποθετείται σε δοχείο που περιέχει απεσταγμένο νερό στους 20 oC και σημειώνεται αν το παραγόμενο αέριο αναφλέγεται ή όχι.
1.3.2. Στάδιο 2 Η εξεταζόμενη ουσία τοποθετείται πάνω σε διηθητικό χαρτί που επιπλέει στην επιφάνεια δοχείου το οποίο περιέχει απεσταγμένο νερό στους 20 oC και σημειώνεται αν το παραγόμενο αέριο αναφλέγεται ή όχι. Το διηθητικό χαρτί χρησιμοποιείται απλά για να κρατήσει την ουσία σε μία θέση, πράγμα που αυξάνει τις πιθανότητες για ανάφλεξη.
1.3.3. Στάδιο 3 Η εξεταζόμενη ουσία διαμορφώνεται σε σωρό ύφους περίπου 2 cm και διαμέτρου 3 cm. Στο σωρό προσθέτονται λίγες σταγόνες νερό και σημειώνεται αν το παραγόμενο αέριο αναφλέγεται ή όχι.
1.3.4. Στάδιο 4 Η εξεταζόμενη ουσία ανακατεύεται με απεσταγμένο νερό 20 oC και μετριέται η παραγωγή αερίου για περίοδο επτά ωρών ανά διαστήματα μίας ώρας. Αν ο ρυθμός παραγωγής του αερίου, μετά το επτάωρο, είναι ασταθής ή αυξάνεται, η περίοδος μετρήσεων θα έπρεπε να επεκταθεί σε ένα μέγιστο χρόνο πέντε ημερών. Ο έλεγχος πρέπει να διακοπεί αν η παραγωγή αερίου υπερβεί το 1 λίτρο/χιλιόγραμμο ανά ώρα.
1.4. ΟΥΣΙΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Δεν καθορίζεται.
1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Δεν δηλώνονται.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ
1.6.
1.6.1 Στάδιο 1
1.6.1
1.6.1.1. Συνθήκες δοκιμής Η δοκιμή εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου {περίπου 20 oC).
1.6.1.2. Εκτέλεση της δοκιμής Μικρή ποσότητα της ελεγχόμενης ουσίας (διαμέτρου περίπου 2 mm) τοποθετείται σε δοχείο που περιέχει απεσταγμένο νερό. Θα πρέπει να σημειωθεί (ί) αν παράγεται κανένα αέριο και (Η) αν παρουσιάζεται ανάφλεξη του αερίου. Αν το αέριο αναφλέγει, δεν χρειάζεται περαιτέρω έλεγχος της ουσίας, δεδομένου ότι η ουσία θεωρείται επικίνδυνη.
1.6.2. Στάδιο 2
1.6.2.
1.6.2.1. Συσκευή Ένα διηθητικό χαρτί επιπλέει επίπεδο στην επιφάνεια απεσταγμένου νερού σε οποιοδήποτε κατάλληλο δοχείο, π.χ. ένα κρυσταλλωτήριο εξάτμισης διαμέτρου 100 mm.
1.6.2.2. Συνθήκες δοκιμής Η δοκιμή εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20 oC).
1.6.2.3. Εκτέλεση της δοκιμής Μικρή ποσότητα της εξεταζόμενης ουσίας (διαμέτρου περίπου 2 mm) τοποθετείται στο κέντρο του διηθητικού χαρτιού. Θα πρέπει να σημειωθεί (i) αν παράγεται κανένα αέριο και (ii) αν παρουσιάζεται ανάφλεξη του αερίου. Αν το αέριο αναφλέγει, δε χρειάζεται περαιτέρω έλεγχος της ουσίας, δεδομένου ότι η ουσία θεωρείται επικίνδυνη.
1.6.3. Στάδιο 3
1.6.3.
1.6.3.1. Συνθήκες δοκιμής Η δοκιμή εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20 oC).
1.6.3.2. Εκτέλεση της δοκιμής Η εξεταζόμενη ουσία γίνεται μία σωρός ύψους περίπου 2 cm και διαμέτρου 3 cm με κοίλωμα στην κορυφή. Προσθέτονται στο κοίλωμα μερικές σταγόνες νερού και σημειώνεται αν (i) παράγεται κανένα αέριο και (ii) αν συμβεί ανάφλεξη του αερίου. Αν το αέριο αναφλέγει, δε χρειάζεται περαιτέρω έλεγχος της ουσίας, δεδομένου ότι η ουσία θεωρείται επικίνδυνη.
1.6.4. Στάδιο 4
1.6.4.
1.6.4.1. Συσκευή Η συσκευή στήνεται όπως εικονίζεται στην εικόνα.
1.6.4.2. Συνθήκες δοκιμής Το δοχείο της εξεταζόμενης ουσίας ελέγχεται ως προς την τυχόν ύπαρξη σκόνης με μέγεθος σωματιδίων < 500 μm. Αν η σκόνη αποτελεί ποσοστό μεγαλύτερο από το 1 % w/w του συνόλου ή αν η σκόνη είναι εύθρυπτη, τότε η όλη ποσότητα της ουσίας θα πρέπει να αλέθεται σε μορφή σκόνης πριν από την δοκιμή, ώστε να μπορεί να επέλθει μείωση του μεγέθους των σωματιδίων κατά την αποθήκευση και χρησιμοποίηση διαφορετικά η ουσία πρέπει να εξετάζεται όπως παραλαμβάνεται. δοκιμή θα πρέπει να εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20 oC) και υπό ατμοσφαιρική πίεση.
1.6.4.3. Εκτέλεση της δοκιμής Στο σταγονομετρικό χωνί της συσκευής φέρονται 10 έως 20 ml νερό ενώ στην κωνική φιάλη τοποθετούνται 10 γραμμάρια της ουσίας. Ο όγκος του εκλυόμενου αερίου μπορεί να μετριέται με οποιοδήποτε κατάλληλο μέσον. Ανοίγεται η στρόφιγγα του χωνιού για να χυθεί το νερό μέσα στην κωνική φιάλη και τίθεται σε λειτουργία ένα χρονόμετρο με διακόπτη. Κάθε ώρα και για χρονικό διάστημα επτά ωρών μετριέται η έκλυση αερίου. Αν, κατά το χρονικό αυτό διάστημα, η έκλυση αερίου είναι ακανόνιστη ή αν, στο τέλος της χρονικής αυτής περιόδου, εμφανίζεται αυξανόμενος ρυθμός έκλυσης αερίου, τότε οι μετρήσεις θα πρέπει να συνεχισθούν για διάστημα πέντε ημερών. Εάν, κατά τη διάρκεια της μέτρησης, ο ρυθμός έκλυσης αερίου υπερβεί το 1 λίτρο/kg ανά ώρα, η δοκιμή μπορεί να διακόπτεται. Η δοκιμή αυτή θα πρέπει να εκτελείται τρεις φορές. Εάν η χημική ταυτότητα του αερίου είναι άγνωστη, τότε θα πρέπει να γίνεται ανάλυση του αερίου. Όταν το αέριο περιέχει λίαν εύφλεκτα συστατικά και είναι άγνωστο αν το όλο μείγμα είναι λίαν εύφλεκτο, πρέπει να παρασκευάζεται μείγμα με την ίδια σύσταση και να εξετάζεται σύμφωνα με τη μέθοδο Α.11.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Η ουσία θεωρείται σαν επικίνδυνη αν:
σε οποιοδήποτε στάδιο της διαδικασίας της δοκιμής επέλθει αυθόρμητη ανάφλεξη, ή
παρατηρηθεί έκλυση εύφλεκτου αερίου με ρυθμό μεγαλύτερο από 1 λίτρο/Kg της ουσίας ανά ώρα.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
τις επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτοποίηση και προσμείξεις),
λεπτομέρειες για οποιαδήποτε αρχική προετοιμασία της εξεταζόμενης ουσίας,
τα αποτελέσματα των δοκιμών (στάδια 1, 2, 3 και 4),
τη χημική ταυτότητα του εκλυόμενου αερίου,
την ταχύτητα έκλυσης του αερίου εφόσον εκτελεσθεί το στάδιο 4 (1.6.4),
κάθε πρόσθετη παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
4.(1)(2) ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF Τ 20-040 (SEPT 85). Chemical products lor industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
A.13. ΠΥΡΟΦΩΣΦΟΡΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΣΤΕΡΕΩΝ ΚΑΙ ΥΓΡΩΝ
A.13.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η δοκιμή έχει εφαρμογή σε στερεές και υγρές ουσίες, που αναφλέγονται αυθόρμητα, λίγη ώρα αφότου έλθουν σε επαφή με τον αέρα σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20 oC). Ουσίες που χρειάζεται να εκτεθούν στον αέρα επί ώρες ή ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου ή σε υψηλές θερμοκρασίες πριν να αναφλέγουν, δεν καλύπτονται από αυτή τη μέθοδο δοκιμής,
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Οι ουσίες θεωρούνται ότι είναι πυροφωσφορικές αν αναφλέγονται ή προκαλούν απανθράκωση κάτω από τις συνθήκες που περιγράφονται στο 1.6. Μπορεί επίσης να χρειασθεί να ελεγχθεί η αυτοαναφλεξιμότητα των υγρών χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Α.15 θερμοκρασία αυτοαναφλέξεως (υγρά και αέρια).
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Δεν καθορίζονται.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Η ουσία, στερεά ή υγρά, προστίθεται σε αδρανή φορέα και φέρεται σε επαφή με τον αέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για χρονικό διάστημα πέντε λεπτών. Αν οι υγρές ουσίες δεν αναφλέγονται, τότε αυτές προσροφούνται σε διηθητικό χαρτί και εκτίθενται στον αέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (περίπου 20 oC) για πέντε λεπτά. Αν μια στερεά ή υγρά ουσία αναφλέγεται, ή μια υγρά ουσία αναφλέγεται ή απανθρακώνει ένα διηθητικό χαρτί, τότε η ουσία θεωρείται σαν πυροφωσφορική.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Επαναληψιμότητα: εξαιτίας της σπουδαιότητας που παρουσιάζει σε σχέση με το θέμα ασφάλεια, και ένα μόνο θετικό αποτέλεσμα είναι αρκετό για να θεωρηθεί μία ουσία σαν πυροφωσφορική.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ
1.6.
1.6.1. Συσκευή Κάψα πορσελάνης με διάμετρο 10 cm περίπου γεμίζεται με γη διατομών μέχρι ένα ύφος περίπου 5 mm σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20 oC). Σημείωση: Η γη διατομών, ή οποιαδήποτε άλλη παρόμοια αδρανής ουσία που γενικά μπορεί να ληφθεί, πρέπει να θεωρείται σαν αντιπροσωπευτική του εδάφους στο οποίο μπορεί να χύνεται η εξεταζόμενη ουσία, σε περίπτωση ατυχήματος. Για την εξέταση υγρών που δεν αναφλέγονται σε επαφή με αέρα όταν ευρίσκονται σε επαφή με αδρανή φορέα, απαιτείται ξηρό διηθητικό χαρτί.
1.6.2. Εκτέλεση της δοκιμής
1.6.2. α)
Στερεά με μορφή σκόνης 1 έως 2 cm3 της εξεταζόμενης ουσίας χύνονται από ύψος 1 m περίπου πάνω σε μία άκαυστη επιφάνεια και παρατηρείται αν η ουσία αναφλέγεται κατά την απόχυση ή μέσα σε 5 λεπτά μετά την απόχυση. Η δοκιμή εκτελείται έξι φορές εκτός κι αν επέλθει ανάφλεξη.
β)
Υγρά Περίπου 5 cm3 του εξεταζόμενου υγρού χύνονται μέσα σε μια προετοιμασμένη κάφα πορσελάνης και παρατηρείται αν η ουσία αναφλέγεται μέσα σε 5 λεπτά. Εάν και στις έξι δοκιμές δεν επέλθει ανάφλεξη, εκτελούνται οι ακόλουθες δοκιμές: Δείγμα 0,5 ml της εξεταζόμενης ουσίας φέρεται με σύριγγα σε πτυχωτό διηθητικό χαρτί και παρατηρείται αν μέσα σε πέντε λεπτά από την προσθήκη του υγρού επέρχεται ανάφλεξη ή απανθράκωση του διηθητικού χαρτιού. Η δοκιμή εκτελείται τρεις φορές, εκτός κι αν το χαρτί αναφλέγει ή απανθρακωθεί.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ
2.
2.1. ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Αν σε κάποια από τις δοκιμές παρουσιάσει θετικό αποτέλεσμα, τότε η διαδικασία των δοκιμών μπορεί να διακοπεί.
2.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ Αν μία ουσία αναφλέγει μέσα σε πέντε λεπτά από την προσθήκη της σε αδρανή φορέα και την έκθεση της στον αέρα, ή εάν υγρά ουσία προκαλέσει ανάφλεξη ή απανθράκωση διηθητικού χαρτιού μέσα σε πέντε λεπτά από την προσθήκη και έκθεση της στον αέρα, τότε η ουσία αυτή χαρακτηρίζεται σαν πυροφωσφορική.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
τις επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτοποίηση και προσμείξεις),
τα αποτελέσματα των δοκιμών,
επιπρόσθετες παρατηρήσεις σχετικές με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, εφόσον υπάρχουν.
4.(1)(2) ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ NF Τ 20-039 {SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.
A.14. ΕΚΡΗΚΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ
A.14.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η μέθοδος παρέχει ένα σχήμα δοκιμής για να προσδιορισθεί αν μία στερεά ή πολτώδης ουσία παρουσιάζει κίνδυνο έκρηξης όταν υφίσταται την επίδραση φλόγας (θερμική ευαισθησία) ή κρούσης ή τριβής (ευαισθησία σε μηχανικά ερεθίσματα) και αν μία υγρά ουσία παρουσιάζει κίνδυνο έκρηξης όταν υφίσταται την επίδραση φλόγας ή κρούσης. Η μέθοδος περιλαμβάνει τρία μέρη: Η μέθοδος παρέχει στοιχεία για την εκτίμηση της πιθανότητας πρόκλησης έκρηξης μέσω ορισμένων κοινών ερεθισμάτων. Η μέθοδος δεν αποσκοπεί στο να διαπιστωθεί αν μία ουσία είναι ικανή να εκραγεί κάτω από οποιεσδήποτε συνθήκες. Η μέθοδος είναι κατάλληλη για να προσδιορισθεί αν μία ουσία παρουσιάζει κίνδυνο έκρηξης (θερμική και μηχανική ευαισθησία) κάτω από τις συγκεκριμένες συνθήκες που καθορίζονται στην οδηγία. Βασίζεται σ' ένα αριθμό τύπων συσκευών που χρησιμοποιούνται ευρέως διεθνώς (1) και που παρέχουν συνήθως σοβαρά αποτελέσματα. Αναγνωρίζεται ότι η μέθοδος δεν είναι καθοριστική. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί συσκευή διαφορετική από την καθοριζόμενη υπό την προϋπόθεση ότι αυτή αναγνωρίζεται διεθνώς και τα αποτελέσματα μπορούν να συσχετισθούν κατάλληλα με τα αποτελέσματα που παρέχει η προδιαγραφόμενη συσκευή. Οι δοκιμές δεν χρειάζεται να εκτελεστούν όταν τα διαθέσιμα θερμοδυναμικά δεδομένα (π.χ. η θερμότητα σχηματισμού, η θερμότητα αποσύνθεσης) ή/και η μη ύπαρξη ορισμένων δραστικών ομάδων (2) στο συντακτικό της τύπο πείθουν πέρα από κάθε αμφιβολία ότι η ουσία δεν μπορεί να υποστεί ταχεία αποσύνθεση με έκλυση αερίων ή απελευθέρωση θερμότητας (δηλ. το υλικό δεν παρουσιάζει κανένα κίνδυνο έκρηξης). Για τα υγρά δεν απαιτείται δοκιμή μηχανικής ευαισθησίας όσον αφορά την τριβή.
1.1. α)
δοκιμή θερμικής ευαισθησίας (1)·
β)
δοκιμή μηχανικής ευαισθησίας όσον αφορά την κρούση (1)·
γ)
δοκιμή μηχανικής ευαισθησίας όσον αφορά την τριβή (1).
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Εκρηκτικές: Ουσίες που μπορεί να εκραγούν υπό την επίδραση φλόγας ή που είναι ευαίσθητες σε κρούση ή τριβή στην προδιαγραφόμενη συσκευή (ή είναι περισσότερο ευαίσθητες μηχανικά από το 1,3-δινιτροβενζόλιο σε εναλλακτική συσκευή).
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ 1,3- δινιτροβενζόλιο, τεχνητό κρυσταλλικό προϊόν που μπορεί να διέρχεται από κόσκινο με οπές 0,5 mm, για τη μέθοδο της τριβής και της κρούσης. 1,3,5-τριαζίνη, εξαϋδρο-1,3,5-τρινιτρο- (RDX, εξογόνο, κυκλονίτης — CAS 121-82-4), ανακρυσταλλωμένη από υδατική κυκλοεξανόνη, διερχόμενη υπό υγρά μορφή από κόσκινο με οπές 250 μm και συγκροτούμενη από κόσκινο με οπές 150 μm, ξηραμένη δε στους 103 ± 2 oC (επί 4 ώρες) για τη δεύτερη σειρά δοκιμών τριβής και κρούσης.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Προκειμένου να διαμορφωθούν ασφαλείς συνθήκες για την πραγματοποίηση των τριών δοκιμών ευαισθησίας, απαιτούνται ορισμένες προκαταρκτικές δοκιμές.
1.4.
1.4.1. Δοκιμές ασφαλούς χειρισμού (3) Για λόγους ασφαλείας, πριν να εκτελεστούν οι βασικές δοκιμές, πολύ μικρά δείγματα (περίπου 10 mg) της ουσίας υποβάλλονται σε θέρμανση χωρίς περιορισμό σε φλόγα αερίου, σε κρούση σε οποιαδήποτε κατάλληλης μορφής συσκευή και σε τριβή χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σφυρί σε αμόνι ή οποιαδήποτε μορφή μηχανής τριβής. Σκοπός είναι να διαπιστωθεί αν η ουσία είναι τόσο ευαίσθητη και εκρηκτική ώστε οι καθοριζόμενες δοκιμές ευαισθησίας, ιδιαίτερα η δοκιμή της θερμικής ευαισθησίας, να πρέπει να εκτελεστούν με ιδιαίτερες προφυλάξεις ώστε να αποφευχθεί τραυματισμός του χειριστή.
1.4.2. Θερμική ευαισθησία Η μέθοδος περιλαμβάνει θέρμανση της ουσίας σε ένα χαλύβδινο σωλήνα, που κλείνεται με τρυπημένες πλάκες με οπές διαφορετικής διαμέτρου, για να διαπιστωθεί αν η ουσία μπορεί να εκραγεί κάτω από συνθήκες έντονης θέρμανσης και καθορισμένου περιορισμού χώρου.
1.4.3. Μηχανική ευαισθησία (κρούση) Η μέθοδος περιλαμβάνει κτύπημα της ουσίας από μία συγκεκριμένη μάζα που πέφτει από καθορισμένο ύψος.
1.4.4. Μηχανική ευαισθησία (τριβή) Η μέθοδος περιλαμβάνει την υποβολή στερεών ή πολτωδών ουσιών σε τριβή μεταξύ τυποποιημένων επιφανειών κάτω από καθορισμένες συνθήκες φορτίου και σχετικής κίνησης.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Δεν δηλώνονται.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Θερμική ευαισθησία (επίδραση φλόγας)
1.6.1.
1.6.1.1. Συσκευή Η συσκευή αποτελείται από ένα χαλύβδινο σωλήνα μιας χρήσης που κλείνεται με μια επαναχρησιμοποιούμενη διάταξη (εικόνα 1) και τοποθετείται μέσα σε μια θερμαντική και προστατευτική διάταξη. Κάθε σωλήνας είναι κατασκευασμένος από χαλύβδινο έλασμα με κυπελοειδή έλαση (βλέπε προσάρτημα) και έχει εσωτερική διάμετρο 24 mm, μήκος 75 mm και πάχος τοιχώματος 0,5 mm. Οι σωλήνες φέρουν στο ανοικτό άκρο φλάντζα ώστε να κλείνουν καλά με τη διάταξη κλεισίματος. Η διάταξη αυτή αποτελείται από μία, ανθεκτική στην πίεση τρυπητή πλάκα με μία τρύπα στο κέντρο, η οποία προσαρμόζεται σφικτά στο σωλήνα με τη βοήθεια ενός βιδωτού συνδέσμου που αποτελείται από δύο μέρη (παξιμάδι και κοχλιοτομημένο κολλάρο). Το παξιμάδι και το κοχλιοτομημένο κολλάρο είναι κατασκευασμένα από χρωμιομαγγανιούχο χάλυβα (βλέπε προσάρτημα) που μέχρι τους 800 oC δεν δημιουργεί σπινθήρα. Οι τρυπητές πλάκες έχουν πάχος 6 mm, είναι κατασκευασμένες από θερμοανθεκτικό χάλυβα (βλέπε προσάρτημα) και είναι διαθέσιμες με τρύπες διαφόρων διαμέτρων.
1.6.1.2. Συνθήκες δοκιμής Κανονικά η ουσία υποβάλλεται στη δοκιμή όπως έχει, αν και σε ορισμένες περιπτώσεις, π.χ. αν είναι συμπιεσμένη, χυτή ή με κάποιο άλλο τρόπο συμπυκνωμένη, μπορεί να χρειάζεται να υποβληθεί στη δοκιμή μετά από θρυμματισμό. Στα στερεά, η μάζα του υλικού που χρησιμοποιείται σε κάθε δοκιμή προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας μία διαδικασία ξηράς δοκιμής δύο σταδίων. Προζυγισμένος σωλήνας γεμίζεται με 9 cm3 ουσίας και η ουσία συμπιέζεται με δύναμη 80 Ν που εφαρμόζεται στην όλη διατομή του σωλήνα. Για λόγους ασφάλειας ή σε περιπτώσεις όπου η φυσική μορφή του δείγματος μπορεί να αλλοιωθεί με συμπίεση, μπορούν να χρησιμοποιηθούν άλλες διαδικασίες γεμίσματος' π.χ. αν η ουσία είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στην τριβή, τότε δεν προσφέρεται για συμπίεση. Αν το υλικό είναι συμπιέσιμο τότε προστίθεται κι άλλο και συμπιέζεται μέχρις ότου ο σωλήνας να γεμίσει μέχρι τα 55 mm από την κορυφή. Προσδιορίζεται η συνολική μάζα που χρησιμοποιείται για να γεμίσει ο σωλήνας μέχρι του επιπέδου των 55 mm και γίνονται δύο ακόμη προσθήκες, που κάθε μία συμπιέζεται με δύναμη 80 Ν. Κατόπιν, ανάλογα, είτε προστίθεται είτε αφαιρείται υλικό ώστε ο σωλήνας να παραμείνει γεμισμένος μέχρι τα 15 mm από την κορυφή. Εκτελείται μία δεύτερη ξηρά δοκιμασία, ξεκινώντας με μία συμπιεσμένη ποσότητα ίση με το ένα τρίτο της συνολικής μάζας που χρησιμοποιήθηκε κατά την πρώτη ξηρά δοκιμασία. Πραγματοποιούνται δύο ακόμη προσθήκες ουσίας με συμπίεση 80 Ν και το επίπεδο της ουσίας στο σωλήνα προσαρμόζεται στα 15 mm από την κορυφή προσθέτοντας ή αφαιρώντας ανάλογα υλικό. Η ποσότητα του στερεού που προσδιορίζεται στη δεύτερη ξηρά δοκιμασία χρησιμοποιείται για κάθε δοκιμή' το γέμισμα πραγματοποιείται σε τρεις ίσες ποσότητες, που κάθε μία συμπιέζεται μέχρι τα 9 cm3 με την απαιτούμενη γι' αυτό δύναμη. (Αυτό μπορεί να διευκολυνθεί χρησιμοποιώντας διαχωριστικούς δακτυλίους). Τα υγρά και οι πάστες φέρονται στο σωλήνα μέχρι ένα ύφος 60 mm προσέχοντας ιδιαίτερα τις πηκτές ουσίες για την αποφυγή δημιουργίας κενών. Το κοχλιοτομημένο κολλάρο τοποθετείται από κάτω στο σωλήνα, η κατάλληλη τρυπητή πλάκα εισάγεται και το παξιμάδι σφίγγεται αφού προστεθεί λίγο λιπαντικό από δισουλφίδιο του μολυβδαινίου. Ιδιαίτερη σημασία έχει να προσεχθεί ώστε μεταξύ της φλάντζας και της πλάκας, ή στο σπείρωμα, να μη παγιδευτεί καθόλου ουσία. Η θέρμανση επιτυγχάνεται με προπάνιο από βιομηχανική οβίδα, εφοδιασμένη με ρυθμιστή πίεσης (60 έως 70 mbar), μέσω μετρητή και το οποίο προπάνιο κατανέμεται σε ίσα μέρη (όπως διαπιστώνεται οπτικά παρατηρώντας τις φλόγες από τους καυστήρες) με μία πολλαπλή βάνα στους τέσσερεις καυστήρες. Οι καυστήρες τοποθετούνται γύρω από το θάλαμο δοκιμής όπως εικονίζεται στην εικόνα 1. Οι τέσσερεις καυστήρες έχουν συνολική κατανάλωση περίπου 3,2 λίτρα προπανίου ανά λεπτό. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά και άλλα αέρια ή καυστήρες, η θέρμανση όμως πρέπει να είναι αυτή που καθορίζεται στην εικόνα 3. Σ' όλες τις συσκευές, η θέρμανση πρέπει να ελέγχεται κατά διαστήματα χρησιμοποιώντας σωλήνες γεμισμένους με φθαλικό διβουτυλεστέρα όπως εικονίζεται στην εικόνα 3.
1.6.1.3. Εκτέλεση των δοκιμών Κάθε δοκιμή διαρκεί μέχρις ότου ο σωλήνας είτε θρυμματιστεί ή θερμανθεί επί πέντε λεπτά. Μια δοκιμή που έχει σαν αποτέλεσμα το θραύσιμο του σωλήνα σε τρία ή περισσότερα κομμάτια, τα οποία σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να συνδέονται το ένα με το άλλο με στενές λωρίδες μετάλλου, όπως εικονίζεται στην εικόνα 2, αξιολογείται σαν δοκιμή που έχει σαν αποτέλεσμα έκρηξη. Δοκιμή που καταλήγει σε λιγότερα θραύσματα ή κατά την οποία δεν δημιουργούνται καθόλου θραύσματα, θεωρείται σαν δοκιμή που δεν δίνει έκρηξη. Στην αρχή εκτελείται μία σειρά τριών δοκιμών με τρυπητή πλάκα διαμέτρου οπής 6,0 mm και, εφόσον δεν παρατηρηθούν εκρήξεις, εκτελείται μία δεύτερη σειρά τριών δοκιμών με τρυπητές πλάκες διαμέτρου οπής 2,0 mm. Εάν σε οποιαδήποτε από τις δύο σειρές δοκιμών παρατηρηθεί έκρηξη, δεν απαιτούνται άλλες δοκιμές.
1.6.1.4. Αξιολόγηση Το αποτέλεσμα της δοκιμής θεωρείται θετικό αν σε οποιαδήποτε από τις πιο πάνω σειρές δοκιμών, παρατηρηθεί έκρηξη.
1.6.2. Μηχανική ευαισθησία (κρούση)
1.6.2.
1.6.2.1. Συσκευή (εικόνα 4) Τα βασικά μέρη μιας τυπικής συσκευής πτώσης σφύρας είναι ένα μπλοκ από χυτό χάλυβα με βάση, αμόνι, στήλη, οδηγούς, πίπτοντα βάρη, διάταξη απελευθέρωσης και υποδοχή δείγματος. Το χαλύβδινο αμόνι διαμέτρου 100 mm και ύφους 70 mm βιδώνεται στο πάνω μέρος ενός χαλύβδινου μπλοκ ύψους 200 mm, μήκους 230 mm και πλάτους 250 mm με μία χυτή βάση μήκους 450 mm, πλάτους 450 mm και ύφους 60 mm. Σε υποδοχέα βιδωμένο στο πίσω μέρος του χαλύβδινου μπλοκ στερεώνεται μία στήλη, κατασκευασμένη από ελατό χάλυβα χωρίς ραφή. Η συσκευή στερεώνεται σε ένα στερεό συμπαγές τεμάχιο 60 x 60 χ 60 cm με τέσσερις βίδες, έτσι ώστε οι οδηγοί να είναι απολύτως κατακόρυφοι και τα βάρη να πέφτουν ελεύθερα. Χρησιμοποιούνται βάρη 5 και 10 χιλιόγραμμων, κατασκευασμένα από στερεό χάλυβα. Η κεφαλή κρούσης κάθε βάρους είναι από βαμμένο χάλυβα, HRC 60 έως 63, και έχει ελάχιστη διάμετρο 25 mm. Το εξεταζόμενο δείγμα τοποθετείται μέσα σε μία διάταξη κρούσης που αποτελείται από δύο ομοαξονικούς συμπαγείς χαλύβδινους κυλίνδρους, τον ένα πάνω στον άλλο, σε ένα κοίλο κυλινδρικό χαλύβδινο δακτύλιο/οδηγό. Οι συμπαγείς χαλύβδινοι κύλινδροι πρέπει να είναι διαμέτρου 10 (-0,003, -0,005) mm και ύψους 10 mm με γυαλισμένες επιφάνειες, στρογγυλεμένες ακμές (ακτίνα καμπυλώματος 0,5 mm) και σκληρότητας HRC 58 έως 65. Ο κοίλος κύλινδρος πρέπει να έχει εξωτερική διάμετρο 16 mm, στιλβωμένο διάτρημα 10 (+0,005, +0,010) mm και ύψος 13 mm. Η διάταξη κρούσης προσαρμόζεται σε ένα ενδιάμεσο αμόνι (26 mm διάμετρος και 26 mm ύψος) κατασκευασμένο από χάλυβα και κεντράρεται με ένα δακτύλιο με τρύπες για να μπορούν να διαφεύγουν οι καπνοί.
1.6.2.2. Συνθήκες δοκιμής Ο όγκος του δείγματος θα πρέπει να είναι 40 mm2 ή τέτοιος που να ταιριάζει σε οποιαδήποτε εναλλακτική συσκευή. Οι στερεές ουσίες πρέπει να υποβάλλονται στη δοκιμή σε ξηρά κατάσταση και να παρασκευάζονται με τον πιο κάτω τρόπο: Οι ουσίες που προμηθεύονται σε μορφή πάστας πρέπει να δοκιμάζονται κατά το δυνατόν σε στεγνή κατάσταση ή σε οποιαδήποτε περίπτωση, αφού αφαιρεθεί όσο το δυνατόν περισσότερη ποσότητα αραιωτικού. Οι υγρές ουσίες υποβάλλονται στη δοκιμή με διάκενο 1 mm μεταξύ του πάνω και του κάτω κυλίνδρου.
1.6.2.2. α)
οι ουσίες σε μορφή σκόνης κοσκινίζονται (μέγεθος οπών: 0,5 mm)· αυτό που περνάει από το κόσκινο χρησιμοποιείται για τη δοκιμή·
β)
οι συμπιεσμένες, χυτές ή κατ' άλλο τρόπο συμπυκνωμένες ουσίες θραύονται σε μικρά τεμάχια και κοσκινίζονται· για τη δοκιμή χρησιμοποιείται το κλάσμα κοσκινίσματος διαμέτρου 0,5 έως 1 mm το οποίο και θα πρέπει να είναι αντιπροσωπευτικό της αρχικής ουσίας.
1.6.2.3. Εκτέλεση δοκιμών Πραγματοποιείται μία σειρά έξι δοκιμών με πτώση της μάζας των 10 χιλιόγραμμων από 0,40 m (40 J). Εάν κατά τις έξι αυτές δοκιμές των 40 J παρατηρηθεί έκρηξη, πρέπει να εκτελεστεί ακόμη μία σειρά 6 δοκιμών, με πτώση της μάζας των 5 kg από 0,15 m (7,5 J). Σε άλλες συσκευές, το δείγμα συγκρίνεται με την επιλεγείσα ουσία αναφοράς χρησιμοποιώντας μία καθιερωμένη διαδικασία (π.χ. τεχνική του επάνω-κάτω, κλπ.).
1.6.2.4. Αξιολόγηση Το αποτέλεσμα της δοκιμής θεωρείται θετικό, αν παρατηρηθεί έκρηξη (σκάσιμο με φλόγα ή/και κρότο είναι ισοδύναμο με έκρηξη) σε μία τουλάχιστον από τις δοκιμές με την προδιαγεγραμμένη συσκευή κρούσης ή το δείγμα είναι πιο ευαίσθητο από 1,3-δινιτροβενζόλιο ή RDX σε εναλλακτικό τεστ κρούσης.
1.6.3. Μηχανική ευαισθησία (τριβή)
1.6.3.
1.6.3.1. Συσκευή (εικόνα 5) Η συσκευή τριβής αποτελείται από μία χαλύβδινη χυτή πλάκα σαν βάση στην οποία στερεώνεται η διάταξη τριβής. Αυτή αποτελείται από ένα σταθερό πάσσαλο πορσελάνης και κινούμενες πορσελάνινες πλάκες. Η πορσελάνινη πλάκα συγκρατείται σε ένα φορείο που κινείται σε δύο οδηγούς. Το φορείο συνδέεται με ένα ηλεκτρικό κινητήρα μέσω μιας συνδετικής ράβδου, μιας έκκεντρης τροχαλίας και κατάλληλης μετάδοσης κίνησης έτσι ώστε η πορσελάνινη πλάκα να κινείται, μια φορά μόνο, μπρος-πίσω κάτω από τον πάσσαλο πορσελάνης για διάστημα 10 mm. Ο πορσελάνινος πάσσαλος πρέπει να φορτισθεί, π.χ. με 120 ή 360 Ν. Οι επίπεδες πορσελάνινες πλάκες κατασκευάζονται από λευκή τεχνητή πορσελάνη (τραχύτητα 9 έως 32 μm) και έχουν διαστάσεις 25 mm (μήκος) × 25 mm (πλάτος) × 5 mm (ύψος). Ο κυλινδρικός πορσελάνινος πάσσαλος είναι επίσης κατασκευασμένος από λευκή τεχνητή πορσελάνη και έχει μήκος 15 mm, διάμετρο 10 mm και τραχείες σφαιρικές ακραίες επιφάνειες με ακτίνα καμπύλωσης 10 mm.
1.6.3.2. Συνθήκες δοκιμής Ο όγκος του δείγματος θα πρέπει να είναι 10 mm3 ή ο κατάλληλος για την εναλλακτική συσκευή όγκος. Οι στερεές ουσίες υποβάλλονται στη δοκιμή σε ξηρά κατάσταση και προετοιμάζονται όπως παρακάτω: Οι ουσίες που προμηθεύονται κανονικά σε μορφή πάστας πρέπει να δοκιμάζονται κατά το δυνατόν σε ξηρή κατάσταση. Αν μια ουσία δεν μπορεί να παρασκευαστεί σε ξηρή κατάσταση, η πάστα (αφού αφαιρεθεί όσο το δυνατόν περισσότερη ποσότητα αραιωτικού) υποβάλλεται σε δοκιμασία με τη μορφή φιλμ πάχους 0,5 mm, πλάτους 2 mm και μήκους 10 mm το οποίο παρασκευάζεται με κατάλληλο καλούπι.
1.6.3.2. α)
οι ουσίες με μορφή σκόνης κοσκινίζονται (μέγεθος οπών κοσκινού 0,5 mm) για τη δοκιμασία χρησιμοποιείται το κλάσμα που περνάει διαμέσου του κοσκινού·
β)
οι συμπιεσμένες, χυτέ; ή κατ' άλλον τρόπο συμπυκνωμένες ουσίες θραύονται σε μικρά τεμάχια και κοσκινίζονται για τη δοκιμή χρησιμοποιείται το κλάσμα κοσκινίσματος με διάμετρο < 0,5 mm.
1.6.3.3. Εκτέλεση των δοκιμών Ο πορσελάνινος πάσσαλος φέρεται πάνω στο δείγμα και εφαρμόζεται το φορτίο. Κατά την εκτέλεση της δοκιμής, τα σημάδια του σπόγγου της πορσελάνινης πλάκας πρέπει να είναι εγκάρσια προς τη διεύθυνση κίνησης. Πρέπει να φροντίζεται ώστε ο πάσσαλος να ακουμπά στο δείγμα, να υπάρχει αρκετό υλικό κάτω από τον πάσσαλο και η πλάκα να κινείται σωστά κάτω από τον πάσσαλο. Στην περίπτωση των ουσιών με μορφή πάστας, χρησιμοποιείται για την επίθεση της ουσίας στην πλάκα παχυμετρικό πάχους 0,5 mm με μία σχισμή 2 × 10 mm. Η πορσελάνινη πλάκα πρέπει να κινείται μπρος-πίσω σε μία απόσταση 10 mm κάτω από τον πάσσαλο σε χρονικό διάστημα 0,44 δευτερολέπτων. Κάθε τμήμα της επιφάνειας της πλάκας και του πασσάλου πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο μία φορά τα δύο άκρα κάθε πασσάλου εξυπηρετούν δύο δοκιμασίες και οι δύο επιφάνειες της πλάκας εξυπηρετούν καθεμιά τρεις δοκιμασίες. Εκτελείται μία σειρά έξι δοκιμών με φόρτιση 360 Ν. Εάν κατά τη διάρκεια των έξι αυτών δοκιμών έχουμε κάποιο θετικό αποτέλεσμα, πρέπει να εκτελείται μία ακόμη σειρά έξι δοκιμών με φόρτιση 120 Ν. Σε άλλες συσκευές, το δείγμα συγκρίνεται με την επιλεγείσα ουσία αναφοράς χρησιμοποιώντας μία καθιερωμένη διαδικασία (π.χ. τεχνική πάνω-κάτω, κ.λπ.).
1.6.3.4. Αξιολόγηση Το αποτέλεσμα της δοκιμής θεωρείται θετικό αν γίνει αντιληπτή έκρηξη (τριγμός ή/και κρότος ή σκάσιμο με φλόγα είναι ισοδύναμα με έκρηξη) τουλάχιστον μία φορά σε οποιαδήποτε από τις δοκιμές με την καθορισμένη συσκευή τριβής ή ικανοποιούνται τα ισοδύναμα κριτήρια σε εναλλακτική δοκιμή τριβής.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Κατά κανόνα, μία ουσία θεωρείται ότι παρουσιάζει κίνδυνο έκρηξης κατά την έννοια της οδηγίας, αν υπάρξει θετικό αποτέλεσμα στη δοκιμή θερμικής ευαισθησίας, κρούσης ή τριβής.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατό, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
ταυτότητα, σύνθεση, καθαρότητα, υγρασία, κλπ., της εξεταζόμενης ουσίας,
τη φυσική μορφή του δείγματος και αν έχει ή όχι, θρυμματισθεί, θραυσθεί ή/και κοσκινιστεί,
παρατηρήσεις κατά τη διάρκεια των δοκιμών θερμικής ευαισθησίας (π.χ. μάζα δείγματος, αριθμό θραυσμάτων, κλπ.),
παρατηρήσεις κατά τη διάρκεια των δοκιμών μηχανικής ευαισθησίας (π.χ. σχηματισμό σημαντικών ποσοτήτων καπνού ή πλήρη αποσύνθεση με κρότο, φλόγες, σπινθήρες, τριγμούς, κ.λπ.),
αποτελέσματα κάθε τύπου δοκιμής,
αν έχει χρησιμοποιηθεί εναλλακτική συσκευή, επιστημονική αιτιολόγηση, όπως επίσης και αποδείξεις συσχέτισης μεταξύ των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από την τυποποιημένη συσκευή και των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με την ισοδύναμη συσκευή,
κάθε χρήσιμο σχόλιο, όπως αναφορά σε δοκιμές με παρόμοια προϊόντα που μπορεί να είναι χρήσιμα για τη σωστή ερμηνεία των αποτελεσμάτων,
κάθε πρόσθετη παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.2. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Στην έκθεση δοκιμής θα πρέπει να αναφέρεται κάθε αποτέλεσμα που θεωρείται εσφαλμένο, ανώμαλο ή μη αντιπροσωπευτικό. Αν κάποιο από τα αποτελέσματα πρέπει να απορριφθεί, θα πρέπει να δίδεται μία εξήγηση και τα αποτελέσματα κάθε εναλλακτικής ή συμπληρωματικής δοκιμής. Κάθε ανώμαλο αποτέλεσμα, εκτός κι αν μπορεί να εξηγηθεί, πρέπει να γίνεται δεκτό κατ' ονομαστική τιμή και να χρησιμοποιείται για την ανάλογη ταξινόμηση της ουσίας.
4.(1)(2)(3)(4)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Brethenck, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol.3, 6-13 and 30-42. NF Τ 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of explosion risk.
A.15. ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΑΥΤΑΝΑΦΛΕΞΗΣ ΓΙΑ ΥΓΡΑ ΚΑΙ ΑΕΡΙΑ
A.15.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι εκρηκτικές ουσίες και οι ουσίες που αναφλέγονται αυθόρμητα σε επαφή με τον αέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος δεν θα πρέπει να υποβάλλονται στη δοκιμή αυτή. Η δοκιμή αυτή εφαρμόζεται σε αέρια, υγρά και ατμούς που, παρουσία αέρα, μπορούν να αναφλέγουν από μία θερμή επιφάνεια. Η θερμοκρασία αυτανάφλεξης μπορεί να μειωθεί σημαντικά εξαιτίας παρουσίας προσμείξεων που δρουν καταλυτικά, από το επιφανειακό υλικό ή εξαιτίας μεγαλύτερου όγκου του δοχείου δοκιμής.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Ο βαθμός αυτοαναφλεξιμότητας εκφράζεται με βάση τη θερμοκρασία αυτανάφλεξης. Θερμοκρασία αυτανάφλεξης είναι η χαμηλότερη θερμοκρασία στην οποία αναφλέγεται η εξεταζόμενη ουσία όταν αναμειγνύεται με αέρα υπό τις συνθήκες που καθορίζονται στη μέθοδο δοκιμής.
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Ουσίες αναφοράς αναφέρονται στα πρότυπα (βλέπε 1.6.3). Οι ουσίες αυτές θα πρέπει πρωταρχικά να χρησιμοποιούνται για να ελέγχεται η απόδοση της μεθόδου κατά διαστήματα και να γίνεται δυνατή η σύγκριση με αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Η μέθοδος προσδιορίζει την ελάχιστη θερμοκρασία της εσωτερικής επιφάνειας κλειστού χώρου που οδηγεί σε ανάφλεξη ενός αερίου, ατμών ή υγρού που εγχύεται στον κλειστό αυτό χώρο.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Η επαναληψιμότητα ποικίλλει ανάλογα με την περιοχή των θερμοκρασιών αυτανάφλεξης και με την χρησιμοποιούμενη μέθοδο δοκιμής. Η ευαισθησία και η εξειδίκευση εξαρτάται από τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο δοκιμής.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Συσκευή Η συσκευή περιγράφεται στη μέθοδο που αναφέρεται στο σημείο 1.6.3.
1.6.2. Συνθήκες δοκιμής Δείγμα της εξεταζόμενης ουσίας δοκιμάζεται σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρεται στο σημείο 1.6.3.
1.6.3. Εκτέλεση της δοκιμής Βλέπε IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF Τ 20-037.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Καταγράφεται η θερμοκρασία δοκιμής, η ατμοσφαιρική πίεση, η ποσότητα του χρησιμοποιούμενου δείγματος και ο χρόνος μέχρι να επέλθει ανάφλεξη.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
τις επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτοποίηση και προσμείξεις),
την ποσότητα του χρησιμοποιηθέντος δείγματος και την ατμοσφαιρική πίεση,
τη χρησιμοποιηθείσα συσκευή,
τα αποτελέσματα μετρήσεων (θερμοκρασία δοκιμής, αποτελέσματα που αφορούν την ανάφλεξη, αντίστοιχους χρόνους),
κάθε πρόσθετη παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Ουδεμία.
Α.16. ΣΧΕΤΙΚΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΑΥΤΑΝΑΦΛΕΞΗΣ ΓΙΑ ΣΤΕΡΕΑ
Α.16.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εκρηκτικές ουσίες και ουσίες που αναφλέγονται αυθόρμητα σε επαφή με τον αέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος δεν θα πρέπει να υποβάλλονται στη δοκιμή αυτή. Σκοπός της δοκιμής αυτής είναι να δίνει προκαταρκτικές πληροφορίες για την αυτοαναφλεξιμότητα των στερεών ουσιών σε υψηλές θερμοκρασίες. Αν η θερμότητα που αναπτύσσεται είτε από αντίδραση της ουσίας με οξυγόνο είτε από εξώθερμη αποσύνθεση δεν διαχέεται αρκετά γρήγορα στον περιβάλλοντα χώρο, επέρχεται αυτοθέρμανση που οδηγεί σε αυτανάφλεξη. Κατά συνέπεια, αυτανάφλεξη συμβαίνει όταν η ταχύτητα παραγωγής θερμότητας υπερβαίνει την ταχύτητα διάχυσης της θερμότητας. Η δοκιμή είναι χρήσιμη σαν μία προκαταρκτική ερευνητική δοκιμή για τις στερεές ουσίες. Εξαιτίας της πολύπλοκης φύσης της ανάφλεξης και καύσης των στερεών, η θερμοκρασία αυτανάφλεξης που προσδιορίζεται με τη μέθοδο της δοκιμής αυτής, θα πρέπει να χρησιμοποιείται για συγκριτικούς και μόνον σκοπούς.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Η θερμοκρασία αυτανάφλεξης, όπως λαμβάνεται κατά τη μέθοδο αυτή, είναι η χαμηλότερη θερμοκρασία περιβάλλοντος σε oC στην οποία ένας ορισμένος όγκος μιας ουσίας αυτοαναφλέγεται κάτω από καθορισμένες συνθήκες.
1.3. ΟΥΣΙΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Ουδεμία.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Ορισμένος όγκος της εξεταζόμενης ουσίας τοποθετείται σε φούρνο σε θερμοκρασία δωματίου' καταγράφεται η καμπύλη μεταβολής της θερμοκρασίας στο κέντρο του δείγματος ως συνάρτηση του χρόνου, ενώ η θερμοκρασία του φούρνου αυξάνεται στους 400 oC ή μέχρι του σημείου τήξεως αν αυτό είναι χαμηλότερο, με ρυθμό 0,5 oC/min. Για τον σκοπό της δοκιμής αυτής, η θερμοκρασία του φούρνου στην οποία η θερμοκρασία του δείγματος φτάνει τους 400 oC με αυτοθέρμανση, καλείται θερμοκρασία αυτανάφλεξης.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Ουδέν.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Συσκευή
1.6.1.
1.6.1.1. Φούρνος Εργαστηριακός φούρνος προγραμματιζόμενης θερμοκρασίας (όγκος περίπου 2 λίτρα), με φυσική κυκλοφορία αέρα και διέξοδο για περίπτωση έκρηξης. Για την αποφυγή πιθανού κινδύνου έκρηξης, αέρια προερχόμενα από τυχόν αποσύνθεση δεν πρέπει να μπορούν να έλθουν σε επαφή με τα ηλεκτρικά θερμαντικά στοιχεία.
1.6.1.2. Κύβος με συρμάτινο πλέγμα Τεμάχιο συρμάτινου πλέγματος από ανοξείδωτο χάλυβα με ανοίγματα 0,045 mm κόβεται σύμφωνα με το υπόδειγμα της εικόνας 1. Το πλέγμα διπλώνεται και στερεώνεται με σύρμα σε μορφή κύβου ανοικτού στο πάνω μέρος.
1.6.1.3. Θερμοστοιχεία Κατάλληλα θερμοστοιχεία.
1.6.1.4. Καταγραφέας Οποιοσδήποτε καταγραφέας δύο καναλιών βαθμονομημένος από 0 oC έως 600 oC ή αντίστοιχη τάση.
1.6.2. Συνθήκες δοκιμής Οι ουσίες εξετάζονται όπως παραλαμβάνονται.
1.6.3. Εκτέλεση της δοκιμής Ο κύβος γεμίζεται με την εξεταζόμενη ουσία και κτυπιέται ελαφρά, προσθέτοντας κι άλλη ουσία μέχρις ότου ο κύβος να γεμίσει τελείως. Ο κύβος κατόπιν κρεμιέται στο κέντρο του φούρνου σε θερμοκρασία δωματίου. Στο κέντρο του κύβου τοποθετείται ένα θερμοστοιχείο ενώ το άλλο τοποθετείται μεταξύ του κύβου και του τοιχώματος του φούρνου για την καταγραφή της θερμοκρασίας του φούρνου. Οι θερμοκρασίες του φούρνου και του δείγματος καταγράφονται συνεχώς ενώ η θερμοκρασία του φούρνου αυξάνεται στους 400 oC ή μέχρι του σημείου τήξεως αν αυτό είναι χαμηλότερο, με ρυθμό 0,5 oC/min. Όταν η ουσία αναφλέγεται, το θερμοστοιχείο του δείγματος δείχνει μία ιδιαίτερα οξεία αύξηση της θερμοκρασίας πάνω από τη θερμοκρασία του φούρνου.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Για την αξιολόγηση, σημασία έχει η θερμοκρασία του φούρνου στην οποία η θερμοκρασία του δείγματος φθάνει τους 400 oC με αυτοθέρμανση (βλέπε εικόνα 2).
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
περιγραφή της προς εξέταση ουσίας,
τα αποτελέσματα μετρήσεων συμπεριλαμβανομένης και της καμπύλης θερμοκρασίας/χρόνου,
κάθε πρόσθετη παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ NF Τ 20-036 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.
4.
Εικόνα 1 Υπόδειγμα κύβου ελέγχου 20 mm
Εικόνα 2 Τυπική καμπύλη θερμοκρασίας/χρόνου
Θερμοκρασία δείγματος Θερμοκρασία φούρνου Θερμοκρασία ανάφλεξης Χρόνος
Α.17. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ (ΣΤΕΡΕΑ)
Α.17.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πριν να εκτελεστεί αυτή η δοκιμή, χρήσιμο είναι να έχουμε προκαταρκτικές πληροφορίες για την τυχόν ύπαρξη Η δοκιμή αυτή δεν εφαρμόζεται σε υγρά, αέρια, εκρηκτικές ή λίαν εύφλεκτες ουσίες ή οργανικά υπεροξείδια. Η δοκιμή αυτή δεν χρειάζεται να εκτελείται όταν ο συντακτικός τύπος της ουσίας δείχνει πέρα από κάθε αμφιβολία ότι η ουσία δεν μπορεί να αντιδράσει εξώθερμα με ένα καύσιμο υλικό. Για να διαπιστωθεί αν η δοκιμή πρέπει να εκτελείται με κάποιες ειδικές προφυλάξεις, θα πρέπει να εκτελείται μία προκαταρκτική δοκιμή.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Χρόνος καύσης: ο χρόνος αντίδρασης, σε δευτερόλεπτα, που απαιτείται για να διαδοθεί η ζώνη αντίδρασης κατά μήκος μιας στήλης, σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στο σημείο 1.6. Ταχύτητα καύσης: εκφραζόμενη σε mm/s. Μέγιστη ταχύτητα καύσης: η υψηλότερη τιμή από τις ταχύτητες καύσης που λαμβάνονται με μείγματα που περιέχουν 10 % έως 90 % κατά βάρος οξειδωτικό.
1.3. ΟΥΣΙΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Ως ουσία αναφοράς για τη δοκιμή και την προκαταρκτική δοκιμή χρησιμοποιείται νιτρικό βάριο (αναλυτικού βαθμού καθαρότητας). Μείγμα αναφοράς είναι το μείγμα εκείνο νιτρικού βαρίου με κονιοποιημένη κυτταρίνη, που παρασκευάζεται σύμφωνα με το σημείο 1.6, το οποίο έχει τη μέγιστη ταχύτητα καύσης (συνήθως μείγμα με 60 % νιτρικό βάριο κατά βάρος).
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Για λόγους ασφάλειας εκτελείται μια προκαταρκτική δοκιμή. Όταν η προκαταρκτική δοκιμή δείχνει ξεκάθαρα ότι η εξεταζόμενη ουσία έχει οξειδωτικές ιδιότητες δεν απαιτείται περαιτέρω δοκιμασία. Σε αντίθετη περίπτωση, η ουσία θα πρέπει τότε να υποβάλλεται σε πλήρη δοκιμή. Στην πλήρη δοκιμή, αναμειγνύονται σε διάφορες αναλογίες η εξεταζόμενη ουσία και μία ορισμένη καύσιμη ουσία. Κατόπιν, σε κάθε μείγμα δίνεται η μορφή στήλης και η στήλη αναφλέγεται στη μια άκρη. Η προσδιοριζόμενη μέγιστη ταχύτητα καύσης συγκρίνεται με τη μέγιστη ταχύτητα καύσης του μείγματος αναφοράς.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Εάν είναι απαραίτητο, κάθε μέθοδος άλεσης και ανάμειξης θεωρείται κατάλληλη, εφόσον η διαφορά στη μέγιστη ταχύτητα καύσης στις έξι διαφορετικές δοκιμές δεν διαφέρει από τη μέση αριθμητική τιμή περισσότερο από 10 %.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Προετοιμασία
1.6.1.
1.6.1.1. Εξεταζόμενη ουσία Το εξεταζόμενο δείγμα μετατρέπεται σε σωματίδια μεγέθους < 0,125 mm με την ακόλουθη διαδικασία: η εξεταζόμενη ουσία κοσκινίζεται, το εναπομένον κλάσμα αλέθεται και η διαδικασία επαναλαμβάνεται μέχρις ότου να περάσει από το κόσκινο όλη η ουσία. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιαδήποτε μέθοδος άλεσης και κοσκινίσματος που ικανοποιεί τα ποιοτικά κριτήρια. Πριν από την παρασκευή του μείγματος, η ουσία ξηραίνεται στους 105 oC μέχρι σταθερού βάρους. Αν η θερμοκρασία αποσύνθεσης της εξεταζόμενης ουσίας είναι μικρότερη από 105 oC, η ουσία πρέπει να ξηρανθεί σε κατάλληλη χαμηλότερη θερμοκρασία.
1.6.1.2. Καύσιμη ουσία Ως καύσιμη ουσία χρησιμοποιείται σκόνη κυτταρίνης. Η κυτταρίνη θα πρέπει να είναι του τύπου εκείνου που χρησιμοποιείται για χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας ή χρωματογραφία στήλης. Έχει αποδειχθεί ότι είναι κατάλληλος εκείνος ο τύπος του οποίου τα μήκη των ινών σε ποσοστά μεγαλύτερο από 85 % είναι μεταξύ 0,020 και 0,075 mm. Η σκόνη κυτταρίνης διέρχεται από κόσκινο που έχει τρύπες μεγέθους 0,125 mm. Σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής πρέπει να χρησιμοποιείται η ίδια παρτίδα κυτταρίνης. Πριν από την παρασκευή του μείγματος, η σκόνη της κυτταρίνης πρέπει να ξηραίνεται στους 105 oC μέχρι σταθερού βάρους. Αν στην προκαταρκτική δοκιμή χρησιμοποιείται ξυλάλευρο, τότε παρασκευάζεται ξυλάλευρο από μαλακό ξύλο συλλέγοντας το κλάσμα που διέρχεται από κόσκινο με διάμετρο τρυπών 1,6 mm, ανακατεύοντας το καλά και κατόπιν ξηραίνοντας το στους 105 oC επί 4 ώρες σε στρώμα πάχους όχι περισσότερο από 25 mm. To προϊόν ψύχεται και φυλάσσεται σε αεροστεγές δοχείο που γεμίζεται όσο είναι πρακτικά δυνατό μέχρι τη χρησιμοποίηση του, κατά προτίμηση μέσα σε 24 ώρες από την ξήρανση.
1.6.1.3. Πηγή έναυσης Ως πηγή έναυσης θα πρέπει να χρησιμοποιείται θερμαντική φλόγα από καυστήρα αερίου (ελάχιστη διάμετρος 5 mm). Αν χρησιμοποιηθεί άλλη πηγή έναυσης (π.χ. όταν η δοκιμή πραγματοποιείται σε αδρανή ατμόσφαιρα), τότε θα πρέπει να αναφέρεται η περιγραφή και η αιτιολόγηση.
1.6.2. Εκτέλεση της δοκιμής Σημείωση: Μείγματα οξειδωτικών με κυτταρίνη ή ξυλάλευρο πρέπει να αντιμετωπίζονται ως πιθανά εκρηκτικά και ο χειρισμός τους να γίνεται με την πρέπουσα προσοχή.
1.6.2.
1.6.2.1. Προκαταρκτική δοκιμή Η ξηρανθείσα ουσία ανακατεύεται καλά με την ξηρανθείσα κυτταρίνη ή ξυλάλευρο υπό αναλογία εξεταζόμενης ουσίας προς κυτταρίνη ή ξυλάλευρο 2:1 κατά βάρος και το μίγμα μορφοποιείται σε μικρό σωρό κωνικού σχήματος διαστάσεων 3,5 cm (διάμετρος βάσης) × 2,5 cm (ύφος) χύνοντας το, χωρίς να το συμπιέσουμε, μέσα σε ένα καλούπι κωνικού σχήματος (π.χ. ένα εργαστηριακό γυάλινο χωνί με βουλωμένο το σωλήνα). Ο σωρός τοποθετείται σε μία κρύα, άκαυστη, χωρίς πόρους και χαμηλής θερμοαγωγιμότητας πλάκα. Η δοκιμή θα πρέπει να πραγματοποιείται μέσα σε απαγωγό όπως στο σημείο 1.6.2.2. Η πηγή έναυσης φέρεται σε επαφή με τον κώνο. Παρατηρούνται και καταγράφονται η ισχύς και η διάρκεια της προκύπτουσας αντίδρασης. Η ουσία θεωρείται οξειδωτική αν η αντίδραση είναι ισχυρή. Στην περίπτωση που το αποτέλεσμα αφήνει αμφιβολίες, τότε είναι αναγκαίο να εκτελείται όλη η διαδικασία δοκιμής που περιγράφεται πιο κάτω.
1.6.2.2. Διαδικασία δοκιμής Παρασκευάζονται μείγματα οξειδωτικού—κυτταρίνης που περιέχουν από 10 έως 90 % οξειδωτικό με διαδοχικές αυξήσεις 10 %. Σε οριακές περιπτώσεις, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται και ενδιάμεσα μείγματα οξειδωτικού/κυτταρίνης προκειμένου να μετρηθεί ακριβέστερα η μέγιστη ταχύτητα καύσης. Ο σωρός μορφοποιείται με τη βοήθεια καλουπιού. Το καλούπι είναι κατασκευασμένο από μέταλλο, έχει μήκος 250 mm και τριγωνική διατομή με εσωτερικό ύψος 10 mm και εσωτερικό πλάτος 20 mm. Στις δύο πλευρές του καλουπιού, κατά τη διαμήκη διεύθυνση, τοποθετούνται σαν πλευρικές περιοριστικές επιφάνειες δύο μεταλλικές πλάκες που προεξέχουν 2 mm από την πάνω ακμή της τριγωνικής διατομής (εικόνα). Η κατασκευή αυτή γεμίζεται χωρίς αυτό να πατηθεί με ελαφρά περίσσεια μείγματος. Αφού το καλούπι αφεθεί να πέσει μία φορά από ύψος 2 cm σε μία στερεή επιφάνεια, η παραμένουσα περίσσεια ουσίας απομακρύνεται με ξύσιμο με ένα φύλλο που μετακινείται λοξά. Οι πλευρικές περιοριστικές επιφάνειες απομακρύνονται και η παραμένουσα σκόνη λειαίνεται με τη βοήθεια κυλίνδρου. Στο πάνω μέρος του καλουπιού τοποθετείται τότε μία άκαυστη, χωρίς πόρους και χαμηλής θερμοαγωγιμότητας πλάκα, η συσκευή ανατρέπεται και το καλούπι απομακρύνεται. Ο σωρός τοποθετείται στο ρεύμα απαγωγού εστίας. Η ταχύτητα του αέρα πρέπει να είναι αρκετή ώστε οι καπνοί να εμποδίζονται να διαφεύγουν στο εργαστήριο και δεν θα πρέπει να μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Γύρω από τη συσκευή θα πρέπει να τοποθετείται ένας ανεμοθώρακας. Εξαιτίας της υγροσκοπικότητας της κυτταρίνης και ορισμένων εξεταζομένων ουσιών, η δοκιμή θα πρέπει να γίνεται όσο το δυνατόν γρηγορότερα. Η μία άκρη του σωρού αναφλέγεται ακουμπώντας εκεί τη φλόγα. Μετριέται ο χρόνος της αντίδρασης για μία απόσταση 200 mm, αφού η ζώνη αντίδρασης έχει μετακινηθεί σε μία αρχική απόσταση 30 mm. Η δοκιμή εκτελείται με την ουσία αναφοράς και μία τουλάχιστον φορά με καθεμία από τη σειρά των μειγμάτων της εξεταζόμενης ουσίας με την κυτταρίνη. Αν η μέγιστη ταχύτητα καύσης βρεθεί να είναι σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη του μείγματος αναφοράς, η δοκιμή μπορεί να διακοπεί' διαφορετικά, η δοκιμή θα πρέπει να επαναληφθεί πέντε φορές για καθένα από τα τρία μείγματα που εμφανίζουν τη μεγαλύτερη ταχύτητα καύσης. Αν υπάρχει η υποψία ότι το αποτέλεσμα είναι εσφαλμένα θετικό, τότε η δοκιμή θα πρέπει να επαναληφθεί χρησιμοποιώντας μία αδρανή ουσία με παρόμοιο μέγεθος σωματιδίων, όπως π.χ. kieselguhr, αντί της κυτταρίνης. Εναλλακτικά, το μείγμα εξεταζόμενης ουσίας/κυτταρίνης με τη μεγαλύτερη ταχύτητα καύσης, θα πρέπει να ξαναϋποβληθεί σε δοκιμή σε αδρανή ατμόσφαιρα (< 2 % v/v περιεκτικότητα σε οξυγόνο).
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Για λόγους ασφάλειας η μέγιστη ταχύτητα καύσης —όχι η μέση τιμή— θα πρέπει να θεωρείται ως χαρακτηριστική οξειδωτική ιδιότητα της εξεταζόμενης ουσίας. Για αξιολόγηση λαμβάνεται η μεγαλύτερη τιμή ταχύτητας καύσης από μία σειρά έξι δοκιμών ενός δεδομένου μείγματος. Χαράσσεται καμπύλη της μέγιστης τιμής ταχύτητας καύσης για κάθε μείγμα ως συνάρτηση της συγκέντρωσης του οξειδωτικού. Από την καμπύλη λαμβάνεται η μέγιστη ταχύτητα καύσης. Οι έξι τιμές ταχύτητας καύσης που λαμβάνονται από μία σειρά μετρήσεων του μείγματος με τη μέγιστη ταχύτητα καύσης, δεν πρέπει να διαφέρουν από τη μέση αριθμητική τιμή περισσότερο από 10 % διαφορετικά, πρέπει οι μέθοδοι άλεσης και ανάμειξης να βελτιωθούν. Συγκρίνεται η λαμβανομένη μέγιστη ταχύτητα καύσης με τη μέγιστη ταχύτητα καύσης του μίγματος αναφοράς (βλέπε σημείο 1.3). Αν οι δοκιμές διεξαχθούν σε αδρανή ατμόσφαιρα, η μέγιστη ταχύτητα αντίδρασης συγκρίνεται με την αντίστοιχη του μείγματος αναφοράς σε αδρανή ατμόσφαιρα.
3. ΕΚΘΕΣΗ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
την ταυτότητα, σύνθεση, καθαρότητα, υγρασία, κ.λπ., της εξεταζόμενης ουσίας,
κάθε επεξεργασία του δείγματος δοκιμής (π.χ. άλεση, ξήρανση, κ.λπ.),
την πηγή έναυσης που χρησιμοποιείται στις δοκιμές,
τα αποτελέσματα των μετρήσεων,
τον τρόπο αντίδρασης (π.χ. επιφανειακή καύση, καύση σε όλη τη μάζα, κάθε πληροφορία σχετικά με τα προϊόντα καύσης, κ.λπ.),
κάθε πρόσθετη παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, συμπεριλαμβανόμενης και μιας περιγραφής της ισχύος (καύση με φλόγα, με σπινθήρες, με καπνό, σιγανή καύση, κ.λπ.) και η κατά προσέγγιση διάρκεια στην προκαταρκτική δοκιμή ασφάλειας/διερεύνησης και τόσο για την εξεταζόμενη ουσία όσο και για την ουσία αναφοράς,
τα αποτελέσματα από δοκιμές με αδρανή ουσία, αν υπάρχουν,
τα αποτελέσματα από δοκιμές σε αδρανή ατμόσφαιρα, αν υπάρχουν.
3.2. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΟΣ Μία ουσία πρέπει να θεωρείται ως οξειδωτική ουσία όταν: Για να αποφευχθεί η συναγωγή εσφαλμένου θετικού αποτελέσματος, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται όταν εξετάζεται η ουσία αναμεμειγμένη με ένα αδρανές υλικό ή/και όταν εξετάζεται σε κάποια αδρανή ατμόσφαιρα θα πρέπει επίσης να λαμβάνονται υπόψη όταν ερμηνεύονται τα αποτελέσματα.
3.2. α)
στην προκαταρκτική δοκιμή, εμφανίζεται ισχυρή αντίδραση·
β)
στη ολοκληρωμένη δοκιμή, η μέγιστη ταχύτητα καύσης των εξεταζόμενων μειγμάτων, είναι μεγαλύτερη ή ίση με τη μέγιστη ταχύτητα καύσης του μείγματος αναφοράς κυτταρίνης και νιτρικού βαρίου.
4.1. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ NF Τ 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.
Α.18. ΑΡΙΘΜΗΤΙΚΟ — ΜΕΣΟ ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ ΚΑΙ ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΒΑΡΩΝ ΠΟΛΥΜΕΡΩΝ
Α.18.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Η χρωματογραφική αυτή μέθοδος διείσδυσης πηκτής αποτελεί αντιγραφή της OECD TGG 118 (1996). Οι βασικές αρχές και άλλες τεχνικές πληροφορίες παρέχονται στην παραπομπή 1.
1.
1.1. Εισαγωγή Επειδή οι ιδιότητες των πολυμερών διαφέρουν πάρα πολύ, είναι αδύνατον να περιγραφεί μία μοναδική μέθοδος στην οποία να καθορίζονται επακριβώς οι συνθήκες για τον διαχωρισμό και την αξιολόγηση που να καλύπτουν όλες τις πιθανότητες και ειδικές περιπτώσεις που συναντώνται στο διαχωρισμό πολυμερών. Συχνά μάλιστα, σε ορισμένα πολύπλοκα πολυμερών συστήματα, δεν μπορεί να εφαρμοστεί η χρωματογραφία διείσδυσης πηκτής (GPC). Όταν η GPC είναι πρακτικά ανεφάρμοστη, το μοριακό βάρος μπορεί να προσδιοριστεί με άλλες μεθόδους (βλέπε παράρτημα). Στις περιπτώσεις αυτές, θα πρέπει να δίδονται πλήρεις λεπτομέρειες και αιτιολόγηση για τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο. Η περιγραφόμενη μέθοδος βασίζεται στο πρότυπο DIN 55672 (1). Λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με την εκτέλεση των πειραμάτων και την αξιολόγηση των δεδομένων μπορούν να αναζητηθούν σε αυτό το πρότυπο DIN. Στην περίπτωση που χρειάζονται τροποποιήσεις των πειραματικών συνθηκών, οι αλλαγές αυτές πρέπει να αιτιολογούνται. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα πρότυπα, εφόσον όμως γίνεται πλήρης αναφορά σε αυτά. Στην περιγραφόμενη μέθοδο χρησιμοποιούνται δείγματα πολυστυρολίου γνωστής πολυδιασπαρσιμότητας για διακρίβωση ενώ μπορεί να χρειάζεται να τροποποιηθούν για να είναι κατάλληλα για ορισμένα πολυμερή, π.χ. υδατοδιαλυτά και διακλαδισμένα με μακριές αλυσίδες πολυμερή.
1.2. Ορισμοί και μονάδες Το αριθμητικό μέσο μοριακό βάρος Μη και το σταθμικό μέσο μοριακό βάρος Μ προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες εξισώσεις: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi όπου: Hi είναι το επίπεδο του σήματος του ανιχνευτή από τη βασική γραμμή για τον όγκο κατακράτησης Vi, Mi είναι το μοριακό βάρος του κλάσματος του πολυμερούς στον όγκο κατακράτησης Vi και n είναι ο αριθμός των σημείων δεδομένων. Το εύρος της κατανομής των μοριακών βαρών, το οποίο αποτελεί μέτρο της διασπαρσιμότητας του συστήματος, δίδεται από το λόγο Μw/Μn.
1.3. Ουσίες αναφοράς Επειδή η GPC είναι μία σχετική μέθοδος, πρέπει να γίνεται διακρίβωση. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται συνήθως πρότυπα πολυστυρολίου, κατανεμημένα σε μία στενή περιοχή με γραμμική διαμόρφωση. με γνωστά μέσα μοριακά βάρη Μη και Μw και γνωστή κατανομή μοριακών βαρών. Η καμπύλη διακρίβωσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον προσδιορισμό του μοριακού βάρους του άγνωστου δείγματος μόνον εάν οι συνθήκες για το διαχωρισμό του δείγματος και τα πρότυπα έχουν επιλεγεί με ταυτόσημο τρόπο. Κάθε προσδιοριζόμενη σχέση μεταξύ του μοριακού βάρους και του όγκου εκλούσεως είναι έγκυρη μόνον υπό τις συγκεκριμένες συνθήκες του συγκεκριμένου πειράματος. Στις συνθήκες περιλαμβάνονται, κυρίως η θερμοκρασία, ο διαλύτης (ή μείγμα διαλυτών), οι χρωματογραφικές συνθήκες και τ στήλη ή το σύστημα στηλών διαχωρισμού. Τα μοριακά βάρη του δείγματος που προσδιορίζονται με τον τρόπο αυτό είναι σχετικέ; τιμές και χαρακτηρίζονται ως ισοδύναμα μοριακά βάρη πολυστυρολίου. Αυτό σημαίνει ότι ανάλογα με τις δομικές και χημικές διαφορές μεταξύ του δείγματος και των προτύπων, τα μοριακά βάρη μπορούν να αποκλίνουν από τις απόλυτες τιμές κατά ένα μεγαλύτερο ή μικρότερο βαθμό. Εάν χρησιμοποιούνται άλλα πρότυπα, π.χ. πολυαιθυλενογλυκόλη, πολυαιθυλενοξείδιο, μεθακρυλικός πολυμεθυλεστέρας. πολυακρυλικό οξύ, θα πρέπει να δηλώνεται ο λόγος.
1.4. Αρχή της μεθόδου δοκιμής Και η κατανομή των μοριακών βαρών του δείγματος και τα μέσα μοριακά βάρη (Mw και Mη μπορούν να προσδιοριστούν χρησιμοποιώντας GPC. Η GPC είναι ένας ειδικός τύπος υγρής χρωματογραφίας στην οποία το δείγμα διαχωρίζεται ανάλογα με τους υδροδυναμικούς όγκους των επιμέρους συστατικών (2). Ο διαχωρισμός επιτελείται καθώς το δείγμα διέρχεται από στήλη γεμισμένη με πορώδες υλικό, συνήθως μία οργανική πηκτή. Τα μικρά μόρια μπορούν να διεισδύουν στους πόρους ενώ τα μεγάλα μόρια αδυνατούν. Έτσι η διαδρομή των μεγάλων μορίων είναι μικρότερη και εκλούονται πρώτα. Τα μεσαίου μεγέθους μόρια διεισδύουν κάπως στους πόρους και εκλούονται αργότερα. Τα μικρότερα μόρια, με μέση υδροδυναμική ακτίνα μικρότερη από τους πόρους της πηκτής μπορούν να διεισδύουν σε όλους τους πόρους. Αυτά εκλούονται τελευταία. Θεωρητικά, ο διαχωρισμός εξαρτάται αποκλειστικά από το μέγεθος των μορίων, στην πράξη όμως είναι δύσκολο να αποφευχθεί η παρεμβολή, τουλάχιστον σε κάποιο βαθμό, ορισμένων φαινομένων προσρόφησης. Η κατάσταση μπορεί να χειροτερεύσει από τυχόν μη ομοιόμορφη πλήρωση της στήλης και ύπαρξη κενών όγκων (2). Η ανίχνευση πραγματοποιείται με τη βοήθεια π.χ. του δείκτη διάθλασης ή της απορρόφησης στο LJV, λαμβάνεται δε μία καμπύλη απλής κατανομής. Εντούτοις, για να παρέχει η καμπύλη πραγματικές τιμές μοριακών βαρών, είναι αναγκαίο η στήλη να διακριβώνεται διοχετεύοντας μέσα από αυτή πολυμερή γνωστού μοριακού βάρους και. στην ιδανική περίπτωση, παρόμοιας όσο το δυνατόν δομής π.χ. διάφορα πρότυπα πολυστυρολίου Συνήθως λαμβάνεται μία καμπύλη Gauss, παραμορφωμένη μερικές φορές από μία μικρή ουρά προς την πλευρά των χαμηλών μοριακών βαρών. Ο κατακόρυφος άξονας δείχνει την κατά βάρος ποσότητα των με διάφορα βάρη εκλουόμενων κλασμάτων ενώ ο οριζόντιος άξονας δείχνει το λογαριθμικό μοριακό βάρος.
1.5. Κριτήρια ποιότητας Η επαναληψιμότητα (σχετική τυπική απόκλιση: ΣΤΑ) του όγκου έκλουσης θα πρέπει να είναι καλύτερη του 0,3 %. Εάν ένα χρωματογράφημα αξιολογείται σε εξάρτηση από το χρόνο και δεν πληροί το ανωτέρω αναφερθέν κριτήριο (1), η απαιτούμενη για την ανάλυση επαναληψιμότητα πρέπει να διασφαλίζεται διορθώνοντας την με ένα εσωτερικό πρότυπο. Οι πολυδιασπαρσιμότητες εξαρτώνται από τα μοριακά βάρη των προτύπων. Στην περίπτωση των προτύπων πολυστυρολίου οι συνήθεις τιμές είναι: Μp < 2000 Μw/Μn < 1,20 2000 < Μp < 10' Μw/Μn < 1,05 Μp > 106 Μw/Μn < 1,20 (Μp είναι το μοριακό βάρος του προτύπου στο ανώτατο σημείο της κορυφής).
1.6. Περιγραφή της μεθόδου δοκιμής
1.6.
1.6.1. Παρασκευή των πρότυπων διαλυμάτων πολυστυρολίου Τα πρότυπα πολυστυρολίου διαλύονται με επισταμένη ανάμειξη στο επιλεγμένο εκλουστικό μέσον. Κατά την παρασκευή των διαλυμάτων πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις των επιλεγόμενων προτύπων εξαρτώνται από διάφορους παράγοντες, π.χ. από τον όγκο έγχυσης, το ιξώδες του διαλύματος και την ευαισθησία του αναλυτικού ανιχνευτή. Ο μέγιστος όγκος έγχυσης πρέπει να προσαρμόζεται στο μήκος της στήλης για να αποφεύγεται τυχόν υπερφόρτιση. Οι συνήθεις όγκοι έγχυσης για αναλυτικούς διαχωρισμούς με GPC και στήλη 30 cm × 7,8 mm, είναι κανονικά μεταξύ 40 και 100 μl. Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν και μεγαλύτεροι όγκοι, αυτοί όμως δεν πρέπει να υπερβαίνουν τα 250 μl. Πριν από τη διακρίβωση της στήλης πρέπει να προσδιορίζεται ποια είναι η άριστη σχέση μεταξύ του όγκου έγχυση; και της συγκεντρώσεως.
1.6.2. Παρασκευή του διαλύματος του δείγματος Για την παρασκευή των διαλυμάτων του δείγματος ισχύουν κατ’ αρχήν οι ίδιες απαιτήσεις. Το δείγμα διαλύεται σε κατάλληλο διαλύτη, π.χ. τετραϋδροφουράνιο (THF), με προσεκτική ανακίνηση. Σε καμία περίπτωση δεν θα πρέπει να διαλύεται με χρήση λουτρού υπερήχων. Εφόσον απαιτείται, το διάλυμα του δείγματος καθαρίζεται μέσω φίλτρου μεμβράνης με μέγεθος πόρων μεταξύ 0,2 και 2 μm. Εάν υπάρχουν αδιάλυτα σωματίδια, αυτό πρέπει να αναγράφεται στην τελική έκθεση γιατί αυτά μπορεί να οφείλονται σε κλάσματα υψηλού μοριακού βάρους. Για τον προσδιορισμό του κατά βάρος ποσοστού των αδιάλυτων σωματιδίων θα πρέπει να χρησιμοποιείται μία κατάλληλη μέθοδος. Τα διαλύματα θα πρέπει να χρησιμοποιούνται μέσα σε 24 ώρες.
1.6.3. Συσκευές Πρέπει να διασφαλίζεται ότι το σύστημα GPC είναι αδρανές έναντι των χρησιμοποιουμένων διαλυτών (π.χ. χρησιμοποιώντας χαλύβδινα τριχοειδή για το διαλύτη THF).
δοχείο διαλύτη
απαεριωτής (όπου χρειάζεται)
αντλία
αποσβεστήρας παλμών (όπου χρειάζεται)
σύστημα εγχύσεως
στήλες χρωματογραφίας
ανιχνευτής
ροόμετρο (όπου χρειάζεται)
καταγραφέας-επεξεργαστής δεδομένων
δοχείο αποβλήτων.
1.6.4. Έγχυση και σύστημα παροχής διαλύτη Ορισμένος όγκος του διαλύματος του δείγματος φέρεται στη στήλη χρησιμοποιώντας είτε αυτόματο δειγματολήπτη είτε με τα χέρια σε μία επακριβώς καθορισμένη ζώνη. Εάν η εργασία γίνεται με τα χέρια. πρέπει να αποφεύγεται κάθε απότομο τράβηγμα ή πίεση του εμβόλου της σύριγγας γιατί κάτι τέτοιο μπορεί να προκαλέσει μεταβολές στη μετρούμενη κατανομή μοριακών βαρών. Τα σύστημα παροχής του διαλύτη θα πρέπει, όσο το δυνατόν, να μην επηρεάζεται θεωρητικά από παλμούς με τη βοήθεια ενός αποσβεστήρα παλμών. Η ταχύτητα ροής είναι της τάξης του 1 ml/mi n.
1.6.5. Στήλη Η αναγνώριση του πολυμερούς γίνεται, ανάλογα με το δείγμα, είτε με μία απλή στήλη είτε με περισσότερες από μία στήλες συνδεδεμένες διαδοχικά. Στο εμπόριο υπάρχουν διαθέσιμα αρκετά πορώδη για στήλες υλικά με καθορισμένες ιδιότητες (π.χ. μέγεθος πόρων, όρια αποκλεισμού). Η επιλογή της πηκτής διαχωρισμού ή του μήκους της στήλης εξαρτάται τόσον από τις ιδιότητες του δείγματος (υδροδυναμικός όγκος, κατανομή μοριακών βαρών) όσο και από τις ειδικές συνθήκες για το διαχωρισμό όπως ο διαλύτης, η
1.6.6. Θεωρητικές πλάκες Η στήλη ή ο συνδυασμός των στηλών που χρησιμοποιούνται για το διαχωρισμό πρέπει να χαρακτηρίζονται από τον αριθμό των θεωρητικών πλακών. Αυτό σημαίνει ότι στην περίπτωση όπου ως διαλύτης εκλούσεως χρησιμοποιείται THF, θα πρέπει να γίνεται φόρτιση στήλης γνωστού μήκους με διάλυμα αιθυλοβενζολίου ή άλλου κατάλληλου μη πολικού διαλυμένου σώματος. Ο αριθμός των θεωρητικών πλακών δίδεται από την ακόλουθη εξίσωση: N=5,54VeW1/22 ή N=16VeW2 όπου; Ν είναι ο αριθμός των θεωρητικών πλακών Ve είναι ο όγκος εκλούσεως στο ανώτατο σημείο της κορυφής W είναι το πλάτος της γραμμής βάσεως της κορυφής W1/2 είναι το πλάτος της κορυφής στο ήμισυ του ύψους της.
1.6.7. Ικανότητα διαχωρισμού Εκτός από τον αριθμό των θεωρητικών πλακών, που είναι ένα μέγεθος που προσδιορίζει το εύρος της ζώνης, ένα μέρος εξαρτάται και από την ικανότητα διαχωρισμού, μέγεθος που προσδιορίζεται από το βαθμό κλίσεως της καμπύλης διακριβώσεως. Η ικανότητα διαχωρισμού μίας στήλης βρίσκεται από την ακόλουθη σχέση: Ve,Mx-Ve,(10Mx)εμβαδόν εγκάρσιας διατομής στήλης≥6,0 cm3cm2 όπου, VeMx είναι ο όγκος εκλούσεως για πολυστυρόλιο με μοριακό βάρος ΜΧ Ve(10MΧ) είναι ο όγκος εκλούσεως νια πολυστυρόλιο με δεκαπλάσιο μοριακό βάρος. Η αναλυτική ικανότητα του συστήματος ορίζεται συνήθως ως εξής: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 όπου: Ve1, Ve2 είναι οι όγκοι εκλούσεως των δύο προτύπων πολυστυρολίου στο μέγιστο της κορυφής, W1 , W2 είναι τα πλάτη της κορυφής στη γραμμή βάσεως Μ1, Μ2 είναι τα μοριακά βάρη στο μέγιστο της κορυφής (που πρέπει να διαφέρουν κατά ένα συντελεστή 10). Η τιμή R για το σύστημα στηλών θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1,7 (4).
1.6.8 Διαλύτες Όλοι οι διαλύτες πρέπει να είναι υψηλής καθαρότητας (για το THF απαιτείται καθαρότητα 99,5 %). Το δοχείο του διαλύτη (το οποίο, εφόσον χρειάζεται, πρέπει να είναι σε ατμόσφαιρα αδρανούς αερίου) πρέπει να είναι αρκετά μεγάλο για τη διακρίβωση της στήλης και την ανάλυση αρκετών δειγμάτων Ο διαλύτης πρέπει να απαεριώνεται πριν μεταφερθεί στη στήλη μέσω της αντλίας.
1.6.9. Έλεγχος θερμοκρασίας Η θερμοκρασία των κρίσιμων εσωτερικών εξαρτημάτων (βρόχος εγχύσεως, στήλες, ανιχνευτής και σωληνώσεις) θα πρέπει να είναι σταθερή και κατάλληλη για τον επιλεγέντα διαλύτη.
1.6.10. Ανιχνευτής Σκοπός του ανιχνευτή είναι να καταγράφει ποσοτικώς τη συγκέντρωση του δείγματος που εκλούζεται από τη στήλη. Για να αποφεύγεται άσκοπη διεύρυνση των κορυφών, ο όγκος της κυψελίδας του ανιχνευτή πρέπει να είναι όσο το δυνατόν μικρότερος. Η τιμή του όγκου δεν θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 10 ml εκτός από την περίπτωση ανιχνευτών διάχυσης του φωτός και ιξώδους. Για την ανίχνευση χρησιμοποιείται συνήθως διαφορική διαθλασιμετρία. Εντούτοις, εφόσον το επιβάλλουν οι συγκεκριμένες ιδιότητες του δείγματος ή του διαλύτη εκλούσεως. μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλοι τύποι ανιχνευτών, π.χ. UV/VIS-, IR-, ανιχνευτές ιξώδους κ.λπ.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
2.
2.1. Δεδομένα Για τα λεπτομερή κριτήρια αξιολόγησης καθώς επίσης και τις απαιτήσεις που σχετίζονται με τη συλλογή και επεξεργασία των δεδομένων, θα πρέπει να γίνεται αναφορά στο πρότυπο DIN (1). Για κάθε δείγμα πρέπει να πραγματοποιούνται δύο ανεξάρτητα πειράματα και να γίνονται επιμέρους αναλύσεις. Σε κάθε μέτρηση πρέπει να παρέχονται τα Μ_, Μw, Mu/Μh και Μp και να αναφέρεται ρητώς, ότι οι μετρούμενες τιμές είναι σχετικές τιμές ισοδύναμε; με τα μοριακά βάρη του χρησιμοποιούμενου προτύπου. Μετά τον προσδιορισμό των όγκων κατακράτησης ή των χρόνων κατακράτησης (διορθωμένων πιθανόν με βάση ένα εσωτερικό πρότυπο), κατασκευάζεται γραφική παράσταση των τιμών log Μ (Μ είναι τα ανώτατα σημεία των κορυφών των προτύπων διακριβώσεως) συναρτήσει μίας από τις ποσότητες αυτές. Για κάθε δεκάδα μοριακών βαρών απαιτούνται τουλάχιστον δύο σημεία διακρίβωσης ενώ. για τη συνολική καμπύλη, απαιτούνται τουλάχιστον πέντε σημεία μετρήσεως, σημεία που θα πρέπει να καλύπτουν το εκτιμώμενο μοριακό βάρος του δείγματος. Το προς τα χαμηλά μοριακά βάρη ακραίο σημείο της καμπύλης διακριβώσεως ορίζεται από η-εξυλοβενζόλιο ή άλλη κατάλληλη μη πολική διαλυμένη ουσία. Το αριθμητικό μέσο και το σταθμικό μέσο μοριακό βάρος προσδιορίζονται εν γένει μέσω επεξεργασίας ηλεκτρονικών δεδομένων, με βάση τους τύπους του σημείου 1.2. Στην περίπτωση που χρησιμοποιείται διά χειρός ψηφιοποίηση, μπορεί κανείς να κάνει χρήση του ASTM D 3536-91 (3). Η καμπύλη κατανομής πρέπει να παρέχεται με τη μορφή πίνακα ή εικόνας (διαφορική συχνότητα ή αθροιστικά ποσοστά συναρτήσει του log Μ). Στη γραφική παράσταση, μία δεκάδα μοριακών βαρών θα πρέπει κανονικά να αντιστοιχεί σε πλάτος περίπου 4 cm ενώ το μέγιστο της κορυφής θα πρέπει να είναι σε ύψος περίπου 8 cm. Στην περίπτωση ολοκληρωμένων καμπυλών κατανομής η διαφορά στην τεταγμένη μεταξύ 0 και 100 % θα πρέπει να είναι περίπου 10 cm.
2.2. Έκθεση δοκιμής Στην έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνονται οι ακόλουθες πληροφορίες:
2.2.
2.2.1. Υπό δοκιμή ουσία
υπάρχουν στοιχεία για την υπό δοκιμή ουσία (ταυτότητα, πρόσθετα, προσμείξεις),
περιγραφή της κατεργασίας του δείγματος, παρατηρήσεις, προβλήματα.
2.2.2. Εξοπλισμός
περιέκτης εκλουστικού μέσου, αδρανές αέριο, απαερίωση του εκλουστικού μέσου, σύσταση του εκλουστικού μέσου, προσμείξεις,
αντλία, αποσβεστήρας παλμών, σύστημα εγχύσεως,
στήλες διαχωρισμού (κατασκευαστής, όλα τα σχετικά με τα χαρακτηριστικά των στηλών όπως μέγεθος πόρων, είδος υλικού διαχωρισμού κ.λπ., αριθμός, μήκος και σειρά των χρησιμοποιηθεισών στηλών),
αριθμός των θεωρητικών πλακών της στήλης (ή συνδυασμού), ικανότητα διαχωρισμού (αναλυτική ικανότητα του συστήματος),
πληροφορίες για τη συμμετρία των κορυφών,
θερμοκρασία στηλών, τρόπος ελέγχου της θερμοκρασίας,
ανιχνευτής (αρχή μετρήσεως, τύπος, όγκος κυψελίδας),
ροόμετρο, εφόσον χρησιμοποιείται (κατασκευαστής, αρχή μετρήσεως),
σύστημα καταγραφής και επεξεργασίας δεδομένων (υλικό και λογισμικό).
2.2.3. Διακρίβωση τον συστήματος
λεπτομερής περιγραφή της μεθόδου που χρησιμοποιείται για τη χάραξη της καμπύλης διακρίβωσης,
πληροφορίες για τα κριτήρια ποιότητας της μεθόδου (π.χ. συντελεστής συσχέτισης, άθροισμα σφαλμάτων τετραγώνων κ.λπ.),
στοιχεία σχετικά με κάθε περίπτωση παρέκτασης, υποθέσεων και προσεγγίσεων που έγιναν κατά την πειραματική διαδικασία και την αξιολόγηση και επεξεργασία δεδομένων,
Κάθε μέτρηση που χρησιμοποιείται για τη χάραξη της καμπύλης διακριβώσεως πρέπει να τεκμηριώνεται σε ένα πίνακα που να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία νια κάθε σημείο διακρίβωσης:
ονομασία του δείγματος,
παρασκευαστής του δείγματος,
χαρακτηριστικές τιμές των προτύπων Μp, Mn, Mw, Mw/Mn όπως δίδονται από τον κατασκευαστή ή λαμβάνονται από διαδοχικές μετρήσεις, μαζί με λεπτομέρειες για τη μέθοδο προσδιορισμού:
όγκος εγχύσεως και συγκέντρωση εγχύσεως,
τιμή Μp που χρησιμοποιείται νια τη διακρίβωση,
όγκος εκλούσεως ή διορθωμένος χρόνος κατακράτησης που μετράται στα ανώτατα σημεία των κορυφών,
Μp που υπολογίζεται στο ανώτατο σημείο της κορυφής,
ποσοστιαίο σφάλμα της υπολογιζόμενης τιμής Μp και της τιμής διακρίβωσης.
2.2.4. Αξιολόγηση
αξιολόγηση με βάση το χρόνο: μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για να διασφαλιστεί η απαιτούμενη αναπαραγωγιμότητα (μέθοδος διόρθωσης, εσωτερικό πρότυπο κ.λπ.),
πληροφορίες για το εάν η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε με βάση τον όγκο εκλούσεως ή το χρόνο κατακράτησης,
πληροφορίες σχετικά με τα όρια της αξιολόγησης εάν μία κορυφή δεν αναλύεται πλήρως,
περιγραφή μεθόδων αμβλύνσεως, εάν χρησιμοποιήθηκαν,
διαδικασία παρασκευής και προκατεργασίας του δείγματος,
η παρουσία αδιάλυτων σωματιδίων, εάν υπήρχαν,
όγκος εγχύσεως (ml) και συγκέντρωση εγχύσεως (mg/ml),
παρατηρήσεις που δείχνουν επιδράσεις που οδηγούν σε αποκλίσεις από το θεωρητικό προφίλ GPC,
λεπτομερή περιγραφή κάθε τροποποίησης των διαδικασιών δοκιμής,
λεπτομέρειες για τις περιοχές σφαλμάτων,
κάθε άλλη πληροφορία και παρατήρηση σχετικά με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.(1)(2)(3)(4)
ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Eutions-mittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exlcusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia. Pennsylvania. ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia. Pennsylvania.
A.19. ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΠΟΛΥΜΕΡΩΝ ΣΕ ΚΛΑΣΜΑΤΑ
A.19.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Η χρωμοτογραφική αυτή μέθοδος διείσδυσης πηκτής αποτελεί αντιγραφή της OECD TG 119 (1996). Οι βασικές αρχές και άλλες τεχνικές πληροφορίες παρέχονται στην παραπομπή 1.
1.
1.1. Εισαγωγή Επειδή οι ιδιότητες των πολυμερών διαφέρουν πάρα πολύ, είναι αδύνατον να περιγραφεί μία μοναδική μέθοδος στην οποία να καθορίζονται επακριβώς οι συνθήκες για τον διαχωρισμό και την αξιολόγηση που να καλύπτουν όλες τις πιθανότητες και ειδικές περιπτώσεις που συναντώνται στο διαχωρισμό πολυμερών. Συχνά μάλιστα, σε ορισμένα πολύπλοκα πολυμερών συστήματα, δεν μπορεί να εφαρμοστεί η χρωματογραφία διείσδυσης πηκτής (GPC). Όταν η GPC είναι πρακτικά ανεφάρμοστη, το μοριακό βάρος μπορεί να προσδιοριστεί με άλλες μεθόδους (βλέπε παράρτημα). Στις περιπτώσεις αυτές, θα πρέπει να δίδονται πλήρεις λεπτομέρειες και αιτιολόγηση. Η περιγραφόμενη μέθοδος βασίζεται στο πρότυπο DIN 55672 (1). Λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με την εκτέλεση των πειραμάτων και την αξιολόγηση των δεδομένων μπορούν να αναζητηθούν σε αυτό το πρότυπο DIN. Στην περίπτωση που χρειάζονται τροποποιήσεις των πειραματικών συνθηκών, οι αλλαγές αυτές πρέπει να αιτιολογούνται. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα πρότυπα, εφόσον όμως γίνεται πλήρης αναφορά σε αυτά. Στην περιγραφόμενη μέθοδο χρησιμοποιούνται δείγματα πολυστυρολίου γνωστής πολυδιασπαρσιμότητας για διακρίβωση ενώ μπορεί να χρειάζεται να τροποποιηθούν για να είναι κατάλληλη για ορισμένα πολυμερή, π.χ. υδατοδιαλυτά και διακλαδισμένα με μακριές αλυσίδες πολυμερή.
1.2. Ορισμοί και μονάδες Χαμηλό μοριακό βάρος ορίζεται αυθαίρετα ως το μοριακό βάρος το μικρότερο των 1000 dalton. Το αριθμητικό μέσο μοριακό βάρος (MJ και το σταθμικό μέσο μοριακό βάρος (Μ) προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες εξισώσεις: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi όπου: Hi είναι το επίπεδο του σήματος του ανιχνευτή από τη βασική γραμμή για τον όγκο κατακράτησης Vi, Μi είναι το μοριακό βάρος του κλάσματος του πολυμερούς στον όγκο κατακράτησης Vi και n είναι ο αριθμός των σημείων δεδομένων. Το εύρος της κατανομής των μοριακών βαρών, το οποίο αποτελεί μέτρο της διασπαρσιμότητας του συστήματος, δίδεται από τη σχέση Μw/Μn.
1.3. Ουσίες αναφοράς Επειδή η GPC είναι μία σχετική μέθοδος, πρέπει να γίνεται διακρίβωση. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται συνήθως πρότυπα πολυστυρολίου. κατανεμημένα σε μία στενή περιοχή με γραμμική διαμόρφωση. με γνωστά μέσα μοριακά βάρη Μn και Mw και γνωστή κατανομή μοριακών βαρών. Η καμπύλη διακρίβωσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον προσδιορισμό του μοριακού βάρους του άγνωστου δείγματος μόνον εάν οι συνθήκες για το διαχωρισμό του δείγματος και των προτύπων έχουν επιλεγεί με ταυτόσημο τρόπο. Κάθε προσδιοριζόμενη σχέση μεταξύ του μοριακού βάρους και του όγκου εκκλούσεως είναι έγκυρη μόνον υπό τις συγκεκριμένες συνθήκες του συγκεκριμένου πειράματος. Στις συνθήκες περιλαμβάνονται, κυρίως. η θερμοκρασία, ο διαλύτης (ή μείγμα διαλυτών), οι χρωματογραφικές συνθήκες και η στήλη ή το σύστημα στηλών διαχωρισμού. Τα μοριακά βάρη του δείγματος που προσδιορίζονται με τον τρόπο αυτό είναι σχετικές τιμές και χαρακτηρίζονται ως ισοδύναμα μοριακά βάρη πολυστυρολίου. Αυτό σημαίνει ότι ανάλογα με τις δομικές και χημικές διαφορές μεταξύ του δείγματος και των προτύπων, τα μοριακά βάρη μπορούν να αποκλίνουν από τις απόλυτες τιμές κατά ένα μεγαλύτερο ή μικρότερο βαθμό. Εάν χρησιμοποιούνται άλλα πρότυπα, π.χ. πολυαιθυλενογλυκόλη, πολυαιθυλενοξείδιο, μεθακρυλικός πολυμεθυλεστέρας, πολυακρυλικό οξύ, θα πρέπει να δηλώνεται ο λόγος.
1.4. Αρχή της μεθόδου δοκιμής Η κατανομή των μοριακών βαρών του δείγματος και τα μέσα μοριακά βάρη (Μw και Mn) μπορούν να προσδιοριστούν χρησιμοποιώντας GPC. Η GPC είναι ένας ειδικός τύπος υγρής χρωματογραφίας στην οποία το δείγμα διαχωρίζεται ανάλογα με τους υδροδυναμικούς όγκους των επιμέρους συστατικών (2). Ο διαχωρισμός επιτελείται καθώς το δείγμα διέρχεται από στήλη γεμισμένη με πορώδες υλικό, συνήθως μία οργανική πηκτή. Τα μικρά μόρια μπορούν να διεισδύουν στους πόρους ενώ τα μεγάλα μόρια αδυνατούν. Έτσι η διαδρομή των μεγάλων μορίων είναι μικρότερη και εκλούονται πρώτα. Τα μεσαίου μεγέθους μόρια διεισδύουν κάπως στους πόρους και εκλούονται αργότερα. Τα μικρότερα μόρια, με μέση υδροδυναμική ακτίνα μικρότερη από τους πόρους της πηκτής, μπορούν να διεισδύουν σε όλους τους πόρους. Αυτά εκλούονται τελευταία. Θεωρητικά, ο διαχωρισμός εξαρτάται αποκλειστικά από το μέγεθος των μορίων, στην πράξη όμως είναι δύσκολο να αποφευχθεί η παρεμβολή, τουλάχιστον σε κάποιο βαθμό, ορισμένων φαινομένων προσρόφησης. Η κατάσταση μπορεί να χειροτερεύσει από τυχόν μη ομοιόμορφη πλήρωση της στήλης και ύπαρξη κενών όγκων (2). Η ανίχνευση πραγματοποιείται με τη βοήθεια π.χ. του δείκτη διάθλασης η της απορρόφησης στο UV, λαμβάνεται δε μία καμπύλη απλής κατανομής. Εντούτοις, για να παρέχει η καμπύλη πραγματικές τιμές μοριακών βαρών, είναι αναγκαίο η στήλη να διακριβώνεται διοχετεύοντας μέσα από αυτή πολυμερή γνωστού μοριακού βάρους και, στην ιδανική περίπτωση, παρόμοιας όσο το δυνατόν δομής π.χ. διάφορα πρότυπα πολυστυρολίου. Συνήθως λαμβάνεται μία καμπύλη Gauss, παραμορφωμένη μερικές φορές από μία μικρή ουρά προς την πλευρά των χαμηλών μοριακών βαρών. Ο κατακόρυφος άξονας δείχνει την κατά βάρος ποσότητα των με διάφορα βάρη εκλουζόμενων κλασμάτων ενώ ο οριζόντιος άξονας δείχνει το λογαριθμικό μοριακό βάρος. Η περιεκτικότητα σε χαμηλού μοριακού βάρους κλάσματα λαμβάνεται από αυτή την καμπύλη. Ο υπολογισμός μπορεί να είναι ορθός μόνον εφόσον τα χαμηλού μοριακού βάρους κλάσματα έχουν ισοδύναμη κατά μάζα αντιστοιχία με το πολυμερές ως σύνολο.
1.5. Κριτήριο ποιότητας Η επαναληψιμότητα (σχετική τυπική απόκλιση: ΣΤΑ) του όγκου έκλουσης θα πρέπει να είναι καλύτερη του 0,3 %. Εάν ένα χρωματογράφημα αξιολογείται σε εξάρτηση από το χρόνο και δεν πληροί το ανωτέρω αναφερθέν κριτήριο (1), η απαιτούμενη για την ανάλυση επαναληψιμότητα πρέπει να διασφαλίζεται διορθώνοντας την με ένα εσωτερικό πρότυπο. Οι πολυδιασπαρσιμότητες εξαρτώνται από τα μοριακά βάρη των προτύπων. Στην περίπτωση των προτύπων πολυστυρολίου οι συνήθεις τιμές είναι: Μp < 2000 Μw/Mn < 1,20 2000 < Μ p < 10 Μw/Mn < 1,05 Μp > 10' Μw/Mn < 1,20 (Μp είναι το μοριακό βάρος του προτύπου στο ανώτατο σημείο της κορυφής).
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ
1.6.
1.6.1. Παρασκευή των πρότυπων διαλυμάτων πολυστυρολίου Τα πρότυπα πολυστυρολίου διαλύονται με επισταμένη ανάμειξη στο επιλεγμένο εκλουστικό μέσον. Κατά την παρασκευή των διαλυμάτων πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι οδηγίες του κατασκευαστή Οι συγκεντρώσεις των επιλεγόμενων προτύπων εξαρτώνται από διάφορους παράγοντες, π.χ. από τον όγκο έγχυσης, το ιξώδες του διαλύματος και την ευαισθησία του αναλυτικού ανιχνευτή. Ο μέγιστος όγκος έγχυσης πρέπει να προσαρμόζεται στο μήκος της στήλης για να αποφεύγεται τυχόν υπερφόρτιση. Οι συνήθεις όγκοι έγχυσης για αναλυτικούς διαχωρισμούς με GPC και στήλη 30 cm × 7,8 mm, είναι κανονικά μεταξύ 40 και 100 ml. Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν και μεγαλύτεροι όγκοι, αυτοί όμως δεν πρέπει να υπερβαίνουν τα 250 ml. Πριν από τη διακρίβωση της στήλης πρέπει να προσδιορίζεται ποια είναι η άριστη σχέση μεταξύ του όγκου έγχυσης και της συγκεντρώσεως.
1.6.2. Παρασκευή του διαλύματος του δείγματος Για την παρασκευή των διαλυμάτων του δείγματος ισχύουν κατ’ αρχήν οι ίδιες απαιτήσεις. Το δείγμα διαλύεται σε κατάλληλο διαλύτη, π.χ. τετραϋδροφουράνιο (THF), με προσεκτική ανακίνηση. Σε καμία περίπτωση δεν 5α πρέπει να διαλύεται με χρήση λουτρού υπερήχων. Εφόσον απαιτείται, το διάλυμα του δείγματος καθαρίζεται μέσω φίλτρου μεμβράνης με μέγεθος πόρων μεταξύ 0,2 και 2 μm. Εάν υπάρχουν αδιάλυτα σωματίδια, αυτό πρέπει να αναγράφεται στην τελική έκθεση γιατί αυτά μπορεί να οφείλονται σε κλάσματα υψηλού μοριακού βάρους. Για τον προσδιορισμό του κατά βάρος ποσοστού των αδιάλυτων σωματιδίων θα πρέπει να χρησιμοποιείται μία κατάλληλη μέθοδος. Τα διαλύματα θα πρέπει να χρησιμοποιούνται μέσα σε 24 ώρες.
1.6.3. Διόρθωση για να ληφθεί υπόψη η ύπαρξη προσθέτων και προσμείξεων Συνήθως είναι αναγκαίο να γίνεται διόρθωση της περιεκτικότητας σε κλάσματα με Μ < 1000 προκειμένου να ληφθεί υπόψη η παρουσία μη πολυμερών ειδικών συστατικών (π.χ. προσμείξεις ή/και πρόσθετα), εκτός κι αν η μετρούμενη περιεκτικότητα είναι ήδη < 1 %. Αυτό γίνεται με άμεση ανάλυση του διαλύματος του πολυμερούς ή του εκλούσματος GPC. Στις περιπτώσεις όπου το έκλουσμα, μετά τη διέλευση από τη στήλη, είναι πολύ αραιό για να μπορέσει να γίνει περαιτέρω προσδιορισμός, τότε αυτό πρέπει να συμπυκνώνεται. Μπορεί επίσης να χρειάζεται το έκλουσμα να εξατμιστεί μέχρι ξηρού και να επαναδιαλυθεί. Η συμπύκνωση του εκλούσματος πρέπει να γίνεται υπό συνθήκες που να διασφαλίζουν ότι δεν πρόκειται να υπάρξει καμία αλλαγή στο έκλουσμα. Η κατεργασία του εκλούσματος μετά το στάδιο της GPC εξαρτάται από τη μέθοδο που χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό.
1.6.4. Συσκευές Η συσκευή GPC συμπεριλαμβάνει τα ακόλουθα: Πρέπει να διασφαλίζεται ότι το σύστημα GPC είναι αδρανές έναντι των χρησιμοποιουμένων διαλυτών (π.χ. χρησιμοποιώντας χαλύβδινα τριχοειδή για το διαλύτη THF).
δοχείο διαλύτη
απαεριωτής (όπου χρειάζεται)
αντλία
αποσβεστήρας παλμών (όπου χρειάζεται)
σύστημα εγχύσεων
στήλες χρωματογραφίας
ανιχνευτής
ροόμετρο (όπου χρειάζεται)
καταγραφέας-επεξεργαστής δεδομένων
δοχείο αποβλήτων.
1.6.5. Έγχυση και σύστημα παροχής διαλύτη Ορισμένος όγκος του διαλύματος του δείγματος φέρεται στη στήλη χρησιμοποιώντας είτε αυτόματο δειγματολήπτη είτε με τα χέρια σε μία επακριβώς καθορισμένη ζώνη. Εάν η εργασία γίνεται με τα χέρια. πρέπει να αποφεύγεται κάθε απότομο τράβηγμα ή πίεση του εμβόλου της σύριγγας γιατί κάτι τέτοιο μπορεί να προκαλέσει μεταβολές στη μετρούμενη κατανομή μοριακών βαρών. Τα σύστημα παροχής του διαλύτη θα πρέπει, όσο το δυνατόν, να μην επηρεάζεται θεωρητικά από παλμούς με τη βοήθεια ενός αποσβεστήρα παλμών. Η ταχύτητα ροής είναι της τάξης του 1 ml/min.
1.6.6. Στήλη Η αναγνώριση του πολυμερούς γίνεται, ανάλογα με το δείγμα, είτε με μία απλή στήλη είτε με περισσότερες από μία στήλες συνδεδεμένες διαδοχικά. Στο εμπόριο υπάρχουν διαθέσιμα αρκετά πορώδη για στήλες υλικά με καθορισμένες ιδιότητες (π.χ. μέγεθος πόρων, όρια αποκλεισμού). Η επιλογή της πηκτής διαχωρισμού ή του μήκους της στήλης εξαρτάται τόσον από τις ιδιότητες του δείγματος (υδροδυναμικός όγκος, κατανομή μοριακών βαρών) όσο και από τις ειδικές συνθήκες για το διαχωρισμό όπως ο διαλύτης, η θερμοκρασία και η ταχύτητα ροής (Ι) (2) (3).
1.6.7. Θεωρητικές πλάκες Η στήλη ή ο συνδυασμός των στηλών που χρησιμοποιούνται για το διαχωρισμό πρέπει να χαρακτηρίζονται από τον αριθμό των θεωρητικών πλακών. Αυτό σημαίνει ότι στην περίπτωση όπου ως διαλύτης εκλούσεως χρησιμοποιείται THF, θα πρέπει να γίνεται φόρτιση στήλης γνωστού μήκους με διάλυμα αιθυλοβενζολίου ή άλλου κατάλληλου μη πολικού διαλελυμένου σώματος. Ο αριθμός των θεωρητικών πλακών δίδεται από την ακόλουθη εξίσωση: N=5,54VeW1/22 ή N=16VeW2 όπου: Ν είναι ο αριθμός των θεωρητικών πλακών Ve είναι ο όγκος εκλούσεως στο ανώτατο σημείο της κορυφής W είναι το πλάτος της γραμμής βάσεως της κορυφής W1/2 είναι το πλάτος της κορυφής στο ήμισυ του ύψους της.
1.6.8. Ικανότητα διαχωρισμού Εκτός από τον αριθμό των θεωρητικών πλακών, που είναι ένα μέγεθος που προσδιορίζει το εύρος της ζώνης, ένα μέρος εξαρτάται και από την ικανότητα διαχωρισμού, μέγεθος που προσδιορίζεται από το βαθμό κλίσεως της καμπύλης διακριβώσεως. Η ικανότητα διαχωρισμού μίας στήλης βρίσκεται από την ακόλουθη σχέση: Ve,Mx-Ve,(10Mx)εμβαδόν εγκάρσιας διατομής στήλης≥6,0cm3cm2 όπου: VeMx είναι ο όγκος εκλούσεως για πολυστυρόλιο με μοριακό βάρος Μχ Ve(10Mx) είναι ο όγκος εκλούσεως για πολυστυρόλιο με δεκαπλάσιο μοριακό βάρος. Η αναλυτική ικανότητα του συστήματος ορίζεται συνήθως ως εξής: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 όπου: Ve1, Ve2 είναι οι όγκοι εκλούσεως των δύο προτύπων πολυστυρολίου στο μέγιστο της κορυφής, W1, W2 είναι τα πλάτη της κορυφής στη γραμμή βάσεως Μ1, Μ2 είναι τα μοριακά βάρη στο μέγιστο της κορυφής (που πρέπει να διαφέρουν κατά ένα συντελεστή 10) Η τιμή R για το σύστημα στηλών θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1,7 (4).
1.6.9. Διαλύτες Όλοι οι διαλύτες πρέπει να είναι υψηλής καθαρότητας (για το THF απαιτείται καθαρότητα 99,5 %). Το δοχείο του διαλύτη (το οποίο, εφόσον χρειάζεται, πρέπει να είναι σε ατμόσφαιρα αδρανούς αερίου) πρέπει να είναι αρκετά μεγάλο για τη διακρίβωση της στήλης και την ανάλυση αρκετών δειγμάτων. Ο διαλύτης πρέπει να απαεριώνεται πριν μεταφερθεί στη στήλη μέσω της αντλίας
1.6.10. Έλεγχος θερμοκρασίας Η θερμοκρασία των κρίσιμων εσωτερικών εξαρτημάτων (βρόχος εγχύσεως, στήλες, ανιχνευτής και σωληνώσεις) 5α πρέπει να είναι σταθερή και κατάλληλη για τον επιλεγέντα διαλύτη.
1.6.11. Ανιχνευτής Σκοπός του ανιχνευτή είναι να καταγράφει ποσοτικώς τη συγκέντρωση του δείγματος που εκλούζεται από τη στήλη. Για να αποφεύγεται άσκοπη διεύρυνση των κορυφών, ο όγκος της κυψελίδας του ανιχνευτή πρέπει να είναι όσο το δυνατόν μικρότερος. Η τιμή του όγκου δεν θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 10 ml εκτός από την περίπτωση ανιχνευτών διάχυσης του φωτός και ιξώδους. Για την ανίχνευση χρησιμοποιείται συνήθως διαφορική διαθλασιμετρία. Εντούτοις, εφόσον το επιβάλλουν οι συγκεκριμένες ιδιότητες του δείγματος ή του διαλύτη εκλούσεως, μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλοι τύποι ανιχνευτών, π.χ. UV/VIS, IR, ανιχνευτές ιξώδους κ.λπ.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
2.
2.1. Δεδομένα Για τα λεπτομερή κριτήρια αξιολόγησης καθώς επίσης και τις απαιτήσεις που σχετίζονται με τη συλλογή και επεξεργασία των δεδομένων, θα πρέπει να γίνεται αναφορά στο πρότυπο DIN (1). Για κάθε δείγμα πρέπει να πραγματοποιούνται δύο ανεξάρτητα πειράματα και να γίνονται επιμέρους αναλύσεις. Σε όλες τις περιπτώσεις, παίζει σημαντικό ρόλο το να λαμβάνονται επίσης μετρήσεις και από τυφλά τα οποία έχουν υποβληθεί σε κατεργασία από τις ίδιες συνθήκες με εκείνες του δείγματος. Είναι αναγκαίο να αναφέρεται ρητώς, ότι οι μετρούμενες τιμές είναι σχετικές τιμές ισοδύναμες με τα μοριακά βάρη του χρησιμοποιούμενου προτύπου. Μετά τον προσδιορισμό των όγκων κατακράτησης ή των χρόνων κατακράτησης (διορθωμένων πιθανόν με βάση ένα εσωτερικό πρότυπο), κατασκευάζεται γραφική παράσταση των τιμών log Μ (Μ είναι τα ανώτατα σημεία των κορυφών των προτύπων διακριβώσεως) συναρτήσει μίας από τις ποσότητες αυτές. Για κάθε δεκάδα μοριακών βαρών απαιτούνται τουλάχιστον δύο σημεία διακρίβωσης ενώ, για τη συνολική καμπύλη, απαιτούνται τουλάχιστον πέντε σημεία μετρήσεως, σημεία που θα πρέπει να καλύπτουν το εκτιμώμενο μοριακό βάρος του δείγματος. Το προς τα χαμηλά μοριακά βάρη ακραίο σημείο της καμπύλης διακριβώσεως ορίζεται από η-εξυλοβενζόλιο ή άλλη κατάλληλη μη πολική διαλυμένη ουσία. Προσδιορίζεται το τμήμα της καμπύλης που αντιστοιχεί σε μοριακά βάρη κάτω του 1000 και διορθώνεται κατάλληλα ώστε να ληφθούν υπόψη τα πρόσθετα και οι προσμείξεις. Οι καμπύλες εκλούσεως αξιολογούνται εν γένει με επεξεργασία ηλεκτρονικών δεδομένων. Στην περίπτωση που χρησιμοποιείται διά χειρός ψηφιοποίηση, μπορεί κανείς να κάνει χρήση του ASTM D 3536-91 (3). Αν στη στήλη κατακρατηοεί τυχόν αδιάλυτο πολυμερές, το μοριακό του βάρος είναι πιθανό να είναι υψηλότερο από εκείνο του διαλυτού κλάσματος και εάν δεν ληφθεί υπόψη αυτό μπορεί να οδηγήσει σε υπερεκτίμηση της περιεκτικότητας σε κλάσματα χαμηλού μοριακού βάρους. Οδηγίες για τη διόρθωση της περιεκτικότητας σε κλάσματα χαμηλού μοριακού βάρους προκειμένου να ληφθεί υπόψη τυχόν αδιάλυτο πολυμερές δίδονται στο παράρτημα. Η καμπύλη κατανομής πρέπει να παρέχεται με τη μορφή πίνακα ή εικόνας (διαφορική συχνότητα ή αθροιστικά ποσοστά συναρτήσει του log Μ). Στη γραφική παράσταση, μία δεκάδα μοριακών βαρών θα πρέπει κανονικά να αντιστοιχεί σε πλάτος περίπου 4 cm ενώ το μέγιστο της κορυφής θα πρέπει να είναι σε ύψος περίπου 8 cm. Στην περίπτωση ολοκληρωμένων καμπυλών κατανομής η διαφορά στην τεταγμένη μεταξύ 0 και 100 % θα πρέπει να είναι περίπου 10 cm.
2.2. Έκθεση δοκιμής Στην έκθεση δοκιμή; πρέπει να περιλαμβάνονται οι ακόλουθες πληροφορίες:
2.2.
2.2.1. Υπό δοκιμή ουσία
υπάρχουν στοιχεία για την υπό δοκιμή ουσία (ταυτότητα, πρόσθετα, προσμείξεις)
περιγραφή της κατεργασίας του δείγματος, παρατηρήσεις, προβλήματα.
2.2.2. Εξοπλισμός
περιέκτης εκλουστικού μέσου, αδρανές αέριο, απαερίωση του εκλουστικού μέσου, σύσταση του εκλουστικού μέσου, προσμείξεις,
αντλία, αποσβεστήρας παλμών, σύστημα εγχύσεως,
στήλες διαχωρισμού (κατασκευαστής, όλα τα σχετικά με τα χαρακτηριστικά των στηλών όπως μέγεθος πόρων, είδος υλικού διαχωρισμού κ.λπ., αριθμός, μήκος και σειρά των χρησιμοποιηθεισών στηλών),
αριθμός των θεωρητικών πλακών της στήλης (ή συνδυασμού), ικανότητα διαχωρισμού (αναλυτική ικανότητα του συστήματος),
πληροφορίες για τη συμμετρία των κορυφών,
θερμοκρασία στηλών, τρόπος ελέγχου της θερμοκρασίας,
ανιχνευτής (αρχή μετρήσεως, τύπος, όγκος κυψελίδας),
ροόμετρο, εφόσον χρησιμοποιείται (κατασκευαστής, αρχή μετρήσεως),
σύστημα καταγραφής και επεξεργασίας δεδομένων (υλικό και λογισμικό).
2.2.3. Διακρίβωση του συστήματος
λεπτομερής περιγραφή της μεθόδου που χρησιμοποιείται για τη χάραξη της καμπύλης διακρίβωσης,
πληροφορίες για τα κριτήρια ποιότητας της μεθόδου (π.χ. συντελεστής συσχέτισης, άθροισμα σφαλμάτων τετραγώνων κ.λπ.),
στοιχεία σχετικά με κάθε περίπτωση παρέκτασης, υποθέσεων και προσεγγίσεων που έγιναν κατά την πειραματική διαδικασία και την αξιολόγηση και επεξεργασία δεδομένων,
κάθε μέτρηση που χρησιμοποιείται για τη χάραξη της καμπύλης διακριβώσεως πρέπει να τεκμηριώνεται σε ένα πίνακα που να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία για κάθε σημείο διακρίβωσης:
ονομασία του δείγματος,
παρασκευαστής του δείγματος,
χαρακτηριστικές τιμές των προτύπων Μ, Μ , Μ, Μ/Μη, όπως δίδονται από τον κατασκευαστή ή λαμβάνονται από διαδοχικές μετρήσεις, μαζί με λεπτομέρειες για τη μέθοδο προσδιορισμού,
όγκος εγχύσεως και συγκέντρωση εγχύσεως,
τιμή Μp που χρησιμοποιείται για τη διακρίβωση,
όγκος εκλούσεως ή διορθωμένος χρόνος κατακράτησης που μετράται στα ανώτατα σημεία των κορυφών,
Μ p που υπολογίζεται στο ανώτατο σημείο της κορυφής
ποσοστιαίο σφάλμα της υπολογιζόμενης τιμής Μ p και της τιμής διακρίβωσης.
2.2.4. Πληροφορίες για την περιεκτικότητα σε χαμηλού μοριακού βάρους πολυμερές
περιγραφή των μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση και του τρόπου με τον οποίο διεξήχθησαν τα πειράματα,
πληροφορίες σχετικά με το ποσοστό των χαμηλού βάρους κλασμάτων (w/w) σε σχέση με το συνολικό δείγμα,
πληροφορίες για τυχόν προσμείξεις, πρόσθετα και άλλες μη πολυμερείς ουσίες ως ποσοστό κατά βάρος του συνολικού δείγματος.
2.2.5. Αξιολόγηση
αξιολόγηση με βάση το χρόνο: μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για να διασφαλιστεί η απαιτούμενη αναπαραγωγιμότητα (μέθοδος διόρθωσης, εσωτερικό πρότυπο κ.λπ.),
πληροφορίες για το εάν η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε με βάση τον όγκο εκλούσεως ή το χρόνο κατακράτησης,
πληροφορίες σχετικά με τα όρια της αξιολόγησης εάν μία κορυφή δεν αναλύεται πλήρως,
περιγραφή μεθόδων αμβλύνσεως. εάν χρησιμοποιήθηκαν,
διαδικασία παρασκευή; και προκατεργασίας του δείγματος,
η παρουσία αδιάλυτων σωματιδίων, εάν υπήρχαν,
όγκος εγχύσεως (ml) και συγκέντρωση εγχύσεως (mg/ml),
παρατηρήσεις που δείχνουν επιδράσεις που οδηγούν σε αποκλίσεις από το θεωρητικό προφίλ GPC,
λεπτομερή περιγραφή κά3ε τροποποίησης των διαδικασιών δοκιμής,
λεπτομέρειες για τις περιοχές σφαλμάτων,
κάοε άλλη πληροφορία και παρατήρηση σχετικά με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.(1)(2)(3)(4)
ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ DIN 55672 (1995). Geidpermeationschromaiographie (GPC) luit Tetfahydrofuran (THF) als Elu-tionsmittel, Teil 1 Yau. W.W, Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography. J.Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystvrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia. Pennsylvania.
A.20. ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΔΙΑΛΥΣΕΩΣ/ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΩΝ ΣΕ ΝΕΡΟ
A.20.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Η περιγραφόμενη μέθοδος αποτελεί αντιγραφή της αναθεωρημένης έκδοσης του OECD TG 120 (1997). Περισσότερες τεχνικές πληροφορίες δίδονται στην παραπομπή (1).
1.
1.1. Εισαγωγή Για ορισμένα πολυμερή, όπως τα πολυμερή γαλακτώματος, πριν να χρησιμοποιηθεί η παρακάτω περιγραφόμενη μέθοδος μπορεί να χρειάζεται κάποια αρχική προκαταρκτική εργασία. Η μέθοδος δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε υγρά πολυμερή και σε πολυμερή που αντιδρούν με το νερό υπό τις συνθήκες της δοκιμής. Όταν η μέθοδος δεν είναι δυνατή ή πρακτικά εφαρμόσιμη, η συμπεριφορά διαλύσεως/εκχύλισης μπορεί να μελετηθεί με άλλες μεθόδους. Στις περιπτώσεις αυτές, θα πρέπει να δίδονται πλήρεις λεπτομέρειες και αιτιολόγηση της χρησιμοποιούμενης μεθόδου.
1.2. Ουσίες αναφοράς Καμία.
1.3. Αρχή της μεθόδου δοκιμής Η συμπεριφορά διαλύσεως/εκχύλισης των πολυμερών σε υδατικό μέσον προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της σφαιρικής φιάλης (βλέπε Α.6. Υδατοδιαλυτότητα — μέθοδος σφαιρικής φιάλης) με τις τροποποιήσεις που περιγράφονται παρακάτω.
1.4. Κριτήρια ποιότητας Κανένα.
1.5. Περιγραφή της μεθόδου δοκιμής
1.5.
1.5.1. Εξοπλισμός Για τη μέθοδο απαιτείται ο ακόλουθος εξοπλισμός:
συσκευή κονιορτοποίησης π.χ. αλεστικό μηχάνημα για την παραγωγή σωματιδίων γνωστού μεγέθους,
συσκευή ανακίνησης με δυνατότητα ελέγχου της θερμοκρασίας,
σύστημα με φίλτρο μεμβράνης,
κατάλληλος αναλυτικός εξοπλισμός,
τυποποιημένα κόσκινα.
1.5.2. Παρασκευή δείγματος Κατ' αρχήν πρέπει να λαμβάνεται ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα με μέγεθος σωματιδίων μεταξύ 0,125 και 0,25 mm χρησιμοποιώντας κατάλληλα κόσκινα. Για τη σταθερότητα του δείγματος ή για τη διαδικασία αλέσεως μπορεί να απαιτείται ψύξη. Υλικά ελαστικής φύσεως μπορούν να αλέθονται σε θερμοκρασία υγρού αζώτου (Γ). Εάν δεν μπορεί να ληφθεί το απαιτούμενο σε μέγεθος σωματιδίων κλάσμα, θα πρέπει να γίνεται όσο το δυνατόν μεγαλύτερη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων και να αναφέρεται στην έκθεση το αποτέλεσμα. Στην έκθεση πρέπει να αναφέρεται και ο τρόπος με τον οποίο το αλεσθέν δείγμα αποθηκεύτηκε πριν από τη δοκιμή.
1.5.3. Διαδικασία Σε τρεις φιάλες με γυάλινα πώματα ζυγίζεται σε κάθε μία από ένα δείγμα των 10 g της υπό δοκιμή ουσίας και σε κάθε φιάλη προστίθενται 1000 ml νερό. Εάν ο χειρισμός μίας τέτοιας ποσότητας 10 g πολυμερούς είναι πρακτικώς αδύνατος, θα πρέπει να χρησιμοποιείται η αμέσως επόμενη δυνατή μεγαλύτερη ποσότητα και να προσαρμόζεται ανάλογα ο όγκος του νερού. Οι Φιάλες πωματίζονται ερμητικά και στη συνέχεια ανακινούνται στους 20 oC. Θα πρέπει να χρησιμοποιείται συσκευή ανακίνησης ή ανάδευσης που να μπορεί να λειτουργεί σε σταθερή θερμοκρασία. Μετά από 24 ώρες, το περιεχόμενο κάθε φιάλης φυγοκεντρείται ή διηθείται και προσδιορίζεται η συγκέντρωση του πολυμερούς στη διαυγή υδατική Φάση με μία κατάλληλη αναλυτική μέθοδο. Εάν δεν υπάρχουν κατάλληλες αναλυτικές μέθοδοι για την υδατική φάση, η συνολική διαλυτότητα/εκχυλισιμότητα μπορεί να εκτιμηθεί από το ξηρό βάρος του υπολείμματος του φίλτρου ή του φυγοκεντρημένου ιζήματος. Συνήθως, είναι αναγκαίο να γίνεται ξεχωριστός ποσοτικός προσδιορισμός των προσμείξεων και προσθέτων αφενός και του χαμηλού μοριακού βάρους πολυμερούς αφετέρου. Στην περίπτωση σταθμικού προσδιορισμού, σημαντικό ρόλο παίζει επίσης να εκτελείται και ένα λευκό πείραμα χωρίς υπό δοκιμή ουσία για να υπολογίζονται τα υπολείμματα που προέρχονται από την πειραματική διαδικασία. Η συμπεριφορά διαλύσεως/εκχύλισης των πολυμερών στο νερό στους 37 oC σε pΗ2 και pΗ9 μπορεί να προσδιοριστεί όπως περιγράφτηκε για την διεξαγωγή του πειράματος στους 20 oC. Οι τιμές του pH μπορούν να επιτευχθούν με την προσθήκη είτε κατάλληλων ρυθμιστικών διαλυμάτων είτε με κατάλληλα οξέα ή βάσεις όπως το υδροχλωρικό οξύ, το οξικό οξύ, υδροξείδιο του νατρίου ή καλίου αναλυτικής καθαρότητας ή με ΝΗ3. Ανάλογα με τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο αναλύσεως, θα πρέπει να εκτελούνται μία ή δυο δοκιμές. Όταν για το πολυμερές υπάρχουν διαθέσιμες επαρκώς εξειδικευμένες μέθοδοι για την άμεση ανάλυση της υδατικής φάσης, αρκεί συνήθως μία δοκιμή όπως περιγράφεται παραπάνω. Εντούτοις, όταν δεν υπάρχουν διαθέσιμες τέτοιες μέθοδοι και ο προσδιορισμός της συμπεριφοράς διαλύσεως/'εκχυλίσεως του πολυμερούς περιορίζεται σε έμμεση ανάλυση με προσδιορισμό μόνον της συνολικής περιεκτικότητας του υδατικού εκχυλίσματος σε οργανικό άνθρακα (TOC), θα πρέπει να διεξάγεται και μία πρόσθετη δοκιμή. Η πρόσθετη αυτή δοκιμή θα πρέπει επίσης να γίνεται εις τριπλούν, χρησιμοποιώντας υποδεκαπλάσιου μεγέθους δείγμα πολυμερούς και τις ίδιες ποσότητες νερού με εκείνες που χρησιμοποιούνται στην πρώτη δοκιμή.
1.5.4. Ανάλυση
1.5.4.
1.5.4.1. Δοκιμή εκτελούμενη με δείγμα ενός μεγέθους Για την άμεση ανάλυση του πολυμερούς στην υδατική φάση ενδέχεται να υπάρχουν κάποιες διαθέσιμοι μέθοδοι. Εναλλακτικά, μπορεί να εξεταστεί επίσης και η εφαρμογή έμμεσης ανάλυσης του διαλελυμένου/εκχυλισμένου πολυμερούς, με τον προσδιορισμό της συνολικής περιεκτικότητας σε διαλυτά μέρη και διόρθωση της τιμής ώστε να ληφθούν υπόψη τα μη πολυμερή συστατικά. Ανάλυση της υδατικής φάσης για την ανεύρεση της συνολικής περιεκτικότητας σε πολυμερή μπορεί να γίνει: είτε με μία επαρκώς ευαίσθητη μέθοδο, π.χ.: είτε με εξάτμιση υπό κενό μέχρι ξηράνσεως του υδατικού εκχυλίσματος και φασματοσκοπική (IR, UV κ.λπ.) ή AAS/ICP ανάλυση του υπολείμματος. Εάν δεν είναι πρακτικώς δυνατή η ανάλυση της υδατικής φάσης με τον τρόπο αυτό. το υδατικό εκχύλισμα θα πρέπει να εκχυλίζεται με ένα μη αναμείξιμο με το νερό οργανικό διαλύτη π.χ. με κάποιο χλωριωμένο υδρογονάνθρακα. Ο διαλύτης κατόπιν εξατμίζεται και το υπόλειμμα αναλύεται ως ανωτέρω για την εύρεση της περιεκτικότητας του πολυμερούς. Τυχόν συστατικά του υπολείμματος αυτού που ταυτοποιούνται ως προσμείξεις ή πρόσθετα πρέπει να αφαιρούνται προκειμένου να προσδιοριστεί ο βαθμός διαλύσεως- εκχυλίσεως του ίδιου του πολυμερούς. Όταν υπάρχουν παρούσες σχετικά μεγάλες ποσότητες τέτοιων υλικών, μπορεί να είναι αναγκαίο το υπόλειμμα να υποβληθεί σε ανάλυση π.χ. με HPLC ή GC για τη διαφοροποίηση των προσμείξεων από το μονομερές και τις εκ του μονομερούς περιεχόμενες ουσίες έτσι ώστε να μπορεί να προσδιοριστεί η πραγματική συγκέντρωση του τελευταίου. Σε ορισμένες περιπτώσεις, μπορεί να αρκεί απλή εξάτμιση του οργανικού διαλύτη μέχρι ξηρού και ζύγιση του ξηρού υπολείμματος.
προσδιορισμό του TOC με διάσπαση με υπερθειικά ή διχρωμικά για τη λήψη CO, και εύρεση στη συνέχεια της περιεκτικότητας με IR ή με χημική ανάλυση,
φασματοφωτομετρία ατομικής απορρόφησης (AAS) ή την ισοδύναμη της ICP (Inductively Coupled Piasma) για πολυμερή που περιέχουν πυρίτιο ή μέταλλα,
απορρόφηση στο υπεριώδες ή φασματοφθορισμομετρία για ακρυλικά πολυμερή,
LC-MS για δείγματα χαμηλού μοριακού βάρους,
1.5.4.2. Δοκιμή εκτελούμενη με δύο διαφορετικά μεγέθη δειγμάτων Όλα τα υδατικά εκχυλίσματα αναλύονται για TOC. Εκτελείται σταθμικός προσδιορισμός στο αδιάλυτο/μη εκχυλισθέν μέρος του δείγματος. Εάν, μετά τη φυγοκέντρηση ή τη διήθηση του περιεχομένου κάθε Φιάλης, στο τοίχωμα της φιάλης παραμένουν προσκολλημένα υπολείμματα πολυμερούς, η φιάλη θα πρέπει να εκπλύνεται με το διήθημα μέχρις ότου στη φιάλη να μη φαίνεται ίχνος υπολείμματος. Ακολούθως, το διήθημα επαναφυγοκεντρείται ή επαναδιηθείται. Τα υπολείμματα που παραμένουν στο φίλτρο ή στο σωλήνα φυγοκεντρήσεως ξηραίνονται στους 40 oC υπό κενό και ζυγίζονται. Η ξήρανση συνεχίζεται μέχρις επιτεύξεως σταθερού βάρους.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ
2.
2.1. Δοκιμή εκτελούμενη με δείγμα ενός μεγέθους Θα πρέπει να δίδονται τα επιμέρους αποτελέσματα για κάθε μία από τις τρεις φιάλες και οι μέσες τιμές εκφρασμένες σε μονάδες μάζας κατ' όγκο του διαλύματος (συνήθως mg/1) ή σε μονάδες μάζας κατά μάζα του δείγματος του πολυμερούς (συνήθως mg/g). Επιπλέον, θα πρέπει να δίδεται και η απώλεια βάρους του δείγματος (υπολογιζόμενη ως βάρος του διαλελυμένου σώματος διηρημένο διά του βάρους του αρχικού δείγματος), ενώ θα πρέπει να υπολογίζονται και οι σχετικές τυπικές αποκλίσεις (ΣΤΑ). Επίσης θα πρέπει να δίδονται επιμέρους στοιχεία αφενός για το σύνολο της ουσίας (πολυμερές + βασικά πρόσθετα κ.λπ.) και αφετέρου αποκλειστικά και μόνο για το πολυμερές (δηλαδή έπειτα από αφαίρεση της συνεισφοράς των προσθέτων αυτών).
2.2. Δοκιμή εκτελούμενη με δύο διαφορετικά μεγέθη δειγμάτων Θα πρέπει να δίδονται οι επιμέρους τιμές TOC των υδατικών εκχυλισμάτων των δύο τριπλών πειραμάτων και η μέση τιμή για κάθε πείραμα, εκφρασμένες σε μονάδες μάζας κατ’ όγκο του διαλύματος (συνήθως mgC/1), καθώς επίσης και σε μονάδες μάζας ανά μονάδα βάρους του αρχικού δείγματος (συνήθως mgC/1). Εάν, μεταξύ των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται υπό την υψηλή και χαμηλή αναλογία δείγματος/νερού δεν υπάρχει καμία διαφορά, αυτό μπορεί να σημαίνει ότι εκχυλίστηκαν πράγματι όλα τα εκχυλίσιμα συστατικά. Σε μία τέτοια περίπτωση, δεν χρειάζεται κανονικά να πραγματοποιηθεί άμεση ανάλυση. Θα πρέπει να δίδονται τα επιμέρους βάρη των υπολειμμάτων εκφρασμένα ως εκατοστιαίο ποσοστό των αρχικών βαρών των δειγμάτων, ενώ ανά πείραμα θα πρέπει να υπολογίζεται η μέση τιμή. Οι διαφορές που βρίσκονται μεταξύ 100 και των εκατοστιαίων ποσοστών αντιπροσωπεύουν τα ευρεθέντα ποσοστά διαλυτού και εκχυλίσιμου υλικού στο αρχικό δείγμα.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΤΗΣ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. Έκθεση δοκιμής Στην έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνονται οι ακόλουθες πληροφορίες:
3.1.
3.1.1. Υπό δοκιμή ουσία
υπάρχουσες πληροφορίες για την υπό δοκιμή ουσία (ταυτότητα, πρόσθετα, προσμείξεις, περιεκτικότητα σε πολυμερές χαμηλού μοριακού βάρους).
3.1.2. Πειραματικές συνθήκες
περιγραφή των χρησιμοποιηθεισών διαδικασιών και των πειραματικών συνθηκών
περιγραφή των μεθόδων αναλύσεως και ανιχνεύσεως.
3.1.3. Αποτελέσματα
Αποτελέσματα διαλυτότητας εκχυλισιμότητας σε mg/1· επιμέρους και μέσες τιμές για δοκιμές εκχυλίσεως στα διάφορη διαλύματα, ξεχωριστά για την περιεκτικότητα σε πολυμερές και προσμείξεις. πρόσθετα κ.λπ.
Αποτελέσματα διαλυτότητας εκχυλισιμότητας σε mg/g πολυμερούς
Τιμές TOC των υδατικών εκχυλισμάτων, βάρος του διαλελυμένου σώματος και υπολογιζόμενα ποσοστά, εφόσον μετρήθηκαν
To pH κάθε δείγματος
Πληροφορίες για τις τιμές των λευκών δειγμάτων
Όπου απαιτείται, αναφορές στη χημική σταθερότητα της υπό δοκιμή ουσίας, τόσο κατά τη διάρκεια της διαδικασίας δοκιμής όσο και κατά τη διάρκεια της αναλυτικής διαδικασίας
Κάθε πληροφορία που έχει σημασία για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
4.(1) ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen fϋr Prϋfzwecke.
A.21. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ (ΥΓΡΑ)
A.21. Ι.
ΜΕΘΟΔΟΣ
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η παρούσα μέθοδο¦ δοκιμής σχεδιάστηκε για τη μέτρηση της εν δυνάμει ικανότητας μίας υγρής ουσίας να αυξήσει την ταχύτητα καύσης ή την ένταση καύσης μιας καύσιμης ουσίας ή να σχηματίσει μείγμα με μια καύσιμη ουσία το οποίο να αναφλέγεται αυθόρμητα. Όταν οι δύο ουσίες αναμειχθούν επισταμένως. Βασίζεται στη δοκιμή των HE για τα οξειδωτικά υγρά (1) και είναι ισοδύναμη με αυτή. Ωστόσο, δεδομένου ότι η παρούσα μέθοδος A-21 έχει σχεδιαστεί πρωταρχικώς για την εκπλήρωση των απαιτήσεων της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ, απαιτείται σύγκριση με μία μόνον ουσία αναφοράς. Μπορεί να είναι αναγκαίο να πραγματοποιηθεί δοκιμή και σύγκριση και με άλλες ουσίες αναφοράς, όταν τα αποτελέσματα της δοκιμής προβλέπεται να χρησιμοποιηθούν και για άλλους σκοπούς. Η παρούσα δοκιμή δεν εφαρμόζεται σε στερεά, αέρια, εκρηκτικές ή λίαν εύφλεκτες ουσίες ή οργανικά υπεροξείδια. Χρήσιμα είναι, πριν από την εκτέλεση της παρούσας δοκιμής, να έχουμε προκαταρκτικές πληροφορίες για τυχόν εν δυνάμει εκρηκτικές ιδιότητες της ουσίας. Η παρούσα δοκιμή δεν εφαρμόζεται σε στερεά, αέρια, εκρηκτικές ή λίαν εύφλεκτες ουσίες ή οργανικά υπεροξείδια. Η παρούσα δοκιμή δεν χρειάζεται να εκτελείται όταν υπάρχουν ήδη διαθέσιμα αποτελέσματα για την υπό δοκιμή ουσία από τη δοκιμή των HE για τα οξειδωτικά υγρά (1).
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Μέσος χρόνος αύξησης της πιέσεως είναι ο μέσος ορός των μετρούμενων χρόνων σε ένα υπό δοκιμή μείγμα για την αύξηση της πίεσης από 690 kPa σε 2070 kPa πάνω από την ατμοσφαιρική πίεση.
1.3. ΟΥΣΙΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Ως ουσία αναφοράς χρησιμοποιείται υδατικό διάλυμα 65 % w/w) νιτρικού οξέος (αναλυτικής καθαρότητας). Προαιρετικώς, εάν ο εκτελών το πείραμα προβλέπει ότι τα αποτελέσματα της παρούσας δοκιμής μπορεί ενδεχομένως να χρησιμοποιηθούν και για άλλους σκοπούς, μπορεί να είναι σκόπιμη η δοκιμασία και έναντι άλλων ουσιών αναφοράς.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΉΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ Το προς δοκιμή υγρό μειγνύεται σε αναλογία 1 προς 1 κατά βάρος, με ίνες κυτταρίνης και εισάγεται σε δοχείο πιέσεως. Εάν κατά τη διάρκεια της μείξεως ή της πλήρωσης επέλθει αυθόρμητη ανάφλεξη, δεν χρειάζεται περαιτέρω δοκιμασία. Εάν δεν επέλθει αυθόρμητη ανάφλεξη, τότε εκτελείται η πλήρης δοκιμή. Το μείγμα θερμαίνεται σε δοχείο πιέσεως και προσδιορίζεται ο μέσος χρόνος που απαιτείται για να αυξηθεί η πίεση από 690 kPa σε 2070 kPa πάνω από την ατμοσφαιρική. Η τιμή συγκρίνεται με το μέσο χρόνο αύξησης της πίεσης για μείγμα 1:1 της ή των ουσιών αναφοράς και κυτταρίνης.
1.5. ΚΡΙΤΉΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Σε μια σειρά πέντε δοκιμών για μια ουσία, κανένα αποτέλεσμα δεν θα πρέπει να διαφέρει περισσότερο από 30 % από τον αριθμητικό μέσο. Αποτελέσματα που διαφέρουν περισσότερο του 30 % από τον μέσον όρο θα πρέπει να απορρίπτονται, η διαδικασία μείξεως και πληρώσεως να βελτιώνεται και η δοκιμασία να επαναλαμβάνεται.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Παρασκευή
1.6.1.
1.6.1.1. Καύσιμη ουσία Ως καύσιμο υλικό χρησιμοποιείται ξηρά, ινώδης κυτταρίνη με μήκος ινών μεταξύ 50 και 250 μm και μέση διάμετρο 25 μm. Ξηραίνεται μέχρι σταθερού βάρους σε στιβάδα πάχους το πολύ 25 mm στους 105 oC για 4 ώρες και φυλάσσεται σε ξηραντήρα, με ξηραντικό, μέχρι να κρυώσει και να χρησιμοποιηθεί. Η περιεκτικότητα σε υγρασία της αποξηραμένης κυτταρίνης θα πρέπει να είναι κάτω του 0,5 % επί ξηράς μάζας. Εάν είναι ανάγκη, ο χρόνος ξήρανσης θα πρέπει να παρατείνεται μέχρι να επιτευχθεί το εν λόγω ποσοστό. Καθ’ όλη τη δοκιμή πρέπει να χρησιμοποιείται η ίδια παρτίδα κυτταρίνης.
1.6.1.2. Εξοπλισμός
1.6.1.2.
1.6.1.2.1. Δοχείο πιέσεως Απαιτείται δοχείο πιέσεως. Το δοχείο είναι χαλύβδινο κυλινδρικό δοχείο πιέσεως με μήκος 89 mm και εξωτερική διάμετρο 60 mm (βλέπε εικόνα 1). Εξ απεναντίας στο δοχείο υπάρχουν χαραγμένες δύο έδρες (με αποτέλεσμα τη μείωση της διατομής του δοχείου στα 50 mm) για να διευκολύνεται το πιάσιμο κατά την προσαρμογή του βύσματος πυροδότησης και του βύσματος της οπής εξαέρωσης. Το δοχείο, το οποίο φέρει οπή διαμέτρου 20 mm είναι αμβλυμμένο εσωτερικώς σε κάθε άκρο μέχρι βάθους 19 mm και σπειροτομημένο ώστε να δέχεται σωλήνα 1 (British Standard Pipe — BSP) ή αναλόγου κατά το μετρικό σύστημα διαμετρήματος. Στην καμπύλη επιφάνεια του δοχείου πιέσεως σε απόσταση 35 mm από το ένα άκρο και υπό γωνία 90 o σε σχέση με τις χαραγμένες έδρες βιδώνεται ένας απαγωγός πιέσεως ο οποίος έχει τη μορφή πλευρικού βραχίονα. Η εσοχή για την υποδοχή του έχει βάθος 12 mm και είναι σπειροτομημένη ώστε να δέχεται το σπείρωμα διαμετρήματος ½ ίντσας BSP (ή ισοδυνάμου διαμετρήματος στο μετρικό σύστημα) του άκρου του πλευρικού βραχίονα. Εάν είναι αναγκαίο προσαρμόζεται ένα αδρανές στεγανωτικό για διασφάλιση της αεροστεγανότητας. Ο πλευρικός βραχίονας εκτείνεται σε απόσταση 55 mm από το σώμα του δοχείου και φέρει οπή 6 mm. Το άκρο του πλευρικού βραχίονα είναι αμβλυμένο και σπειροτομημένο ώστε να δέχεται μορφοτροπέα πιέσεως τύπου διαφράγματος. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιαδήποτε διάταξη μέτρησης της πιέσεως, υπό την προϋπόθεση ότι δεν επηρεάζεται από τα θερμά αέρια ή από τα προϊόντα αποσύνθεσης και μπορεί να ανταποκριθεί σε ταχύτητες αύξησης της πίεσης 690-2070 kPa μέσα σε 5 ms. Το απώτερο από τον πλευρικό βραχίονα άκρο του δοχείου πιέσεως κλείνει με ένα βύσμα πυροδότησης εφοδιασμένο με δύο ηλεκτρόδια, το ένα μονωμένο και το άλλο γειωμένο στο σώμα του βύσματος. Το άλλο άκρο του δοχείου πιέσεως σφραγίζεται με ένα διαρρηγνυόμενο δίσκο (πίεση διαρρήξεως περίπου 2200 kPa), ο οποίος κρατιέται στη θέση του με ένα βύσμα συγκράτησης που φέρει οπή 20 mm. Εάν είναι αναγκαίο για το βύσμα πυροδότησης χρησιμοποιείται και ένα αδρανές στεγανωτικό για να διασφαλίζεται το αεροστεγές του δοχείου. Κατά τη διάρκεια της χρήσης το όλο σύστημα κρατιέται στη σωστή θέση με έναν υποστάτη (εικόνα 2). Αυτός συνήθως αποτελείται από μια πλάκα από μαλακό χάλυβα διαστάσεων 235 × 184 × 6 mm, που χρησιμεύει ως βάση και από ένα ευθύγραμμο στέλεχος μήκους 185 mm τετραγωνικής κοίλης διατομής (S.H.S.) 70 × 70 × 4 mm. Στο ένα άκρο του ευθύγραμμου στελέχους S.H.S. από κάθε μία από τις δύο εξ απεναντίας πλευρές, είναι αποκομμένο ένα τμήμα έτσι ώστε να δημιουργείται μια κατασκευή με δύο επίπεδα πλευρικώς σκέλη, πάνω από τα οποία υπάρχει ένα άθικτο κυτιοειδές τμήμα μήκους 86 mm. Τα άκρα των επίπεδων πλευρών είναι κομμένα κατά τρόπον ώστε ο σωλήνας να σχηματίζει γωνία 60o ως προς το οριζόντιο επίπεδο όταν έχει συγκολληθεί στην επίπεδη βάση. Σε μια πλευρά του πάνω άκρου της βάσης είναι χαραγμένη μια εγκοπή πλάτους 22 mm × 46 mm βάθος, έτσι ώστε όταν το σύστημα του δοχείου πιέσεως αρχίζει να κατεβαίνει, προηγουμένου του άκρου με το βύσμα πυροδότησης, προς το κυτιοειδές υποστήριγμα, ο πλευρικός βραχίονας να κάθεται στην εγκοπή. Στην κάτω εσωτερική επιφάνεια του κυτιόμορφου τμήματος υπάρχει συγκολλημένο ένα κομμάτι χάλυβα 30 mm πλάτους και 6 mm πάχους το οποίο δρα ως διαχωριστικό. Για τη συγκράτηση του δοχείου πιέσεως σταθερά στη θέση του, χρησιμοποιούνται δύο πεταλούδες 7 mm, ευρισκόμενες στην αντίθετη πλευρά. Στις πλευρές που καταλήγουν στη βάση του κυτιοειδούς τμήματος, είναι συγκολλημμένες δύο λωρίδες πλάτους 12 mm από χάλυβα πάχους 6 mm, που στηρίζουν το δοχείο πιέσεως από κάτω.
1.6.1.2.2 Σύστημα ανάφλεξης To σύστημα ανάφλεξης αποτελείται από σύρμα Ni/Cr μήκους 25 cm με διάμετρο 0,6 mm και ειδική αντίσταση 3,85 ohm/m. Το σύρμα είναι περιελιγμένο υπό μορφή πηνίου σε κυλινδρική ράβδο διαμέτρου 5 mm και συνδεδεμένο με τα ηλεκτρόδια του βύσματος πυροδότησης. Το πηνίο θα πρέπει να έχει μια από τις μορφές που εμφαίνονται στην εικόνα 3. Η απόσταση μεταξύ τον πυθμένα του δοχείου και της κάτω πλευράς του πηνίου ανάφλεξης θα πρέπει νια είναι 20 mm. Εάν δεν υπάρχει δυνατότητα προσαρμογής των ηλεκτροδίων τα άκρα του σύρματος ανάφλεξης μεταξύ του πηνίου και του πυθμένα του δοχείου θα πρέπει να μονώνονται με κεραμικό περίβλημα. Το σύρμα θερμαίνεται με σταθερή παροχή ρεύματος τουλάχιστον 10 Α.
1.6.2 Διεξαγωγή της δοκιμής Η διάταξη σε πλήρη συναρμολόγηση με τον μορφοτροπέα πιέσεως και το σύστημα θερμάνσεως αλλά χωρίς το διαρρηγνυόμενο δίσκο, στηρίζεται με το άκρο που φέρει το βύσμα πυροδότησης προς τα κάτω. 2,5 g του προς δοκιμή υγρού μειγνύονται με 2,5g ξηρής κυτταρίνης σε δοχείο ζέσεως χρησιμοποιώντας γυάλινη ράβδο ανάδευσης. Για ασφάλεια, η μείξη θα πρέπει νa γίνεται τοποθετώντας ένα προστατευτικό θώρακα μεταξύ χειριστή και μείγματος. Εάν το μείγμα αναφλέγει κατά τη διάρκεια της μείξης ή της πλήρωσης, δεν χρειάζεται περαιτέρω δοκιμασία. Το μείγμα προστίθεται στο δοχείο πιέσεως, σε μικρές ποσότητες, προσέχοντας ώστε το μείγμα να σωρεύεται γύρω από το πηνίο ανάφλεξης και να είναι σε καλή επαφή με αυτό. Είναι σημαντικό το πηνίο να μην παραμορφώνεται κατά τη διάρκεια της συσσώρευσης, καθώς κάτι τέτοιο μπορεί να, οδηγήσει σε εσφαλμένα αποτελέσματα. Ο διαρρηγνυόμενος δίσκος τοποθετείται στη θέση του και το βύσμα συγκράτησης βιδώνεται σφικτά. Το γεμάτο δοχείο μεταφέρεται στον υποστάτη για πυροδότηση, με το δίσκο από την πάνω πλευρά, ο οποίος υποστάτης θα πρέπει να βρίσκεται μέσα σε κατάλληλο θωρακισμένο αεριοαπαγωγό ή στοιχείο πυροδότησης. Η παροχή ρεύματος συνδέεται με τους εξωτερικούς ακροδέκτες του βύσματος πυροδότησης και εφαρμόζεται ρεύμα 10 Α. Το χρονικό διάστημα μεταξύ της έναρξης της μείξεως και της έναρξης παροχής ρεύματος δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα 10 λεπτά. Το παρεχόμενο από τον μορφοτροπέα πιέσεως σήμα καταγράφεται με κατάλληλο σύστημα το οποίο έχει τη δυνατότητα εκτίμησης και καταγραφής της λαμβανομένης εικόνας της πιέσεως συναρτήσει του χρόνου (π.χ. καταγραφέας μεταβατικών καταστάσεων συνδεδεμένος με καταγραφικό χαρτί). Το μείγμα θερμαίνεται μέχρι διαρραγής του δίσκου ή για διάστημα τουλάχιστον 60 s. Εάν ο δίσκος δεν διαρραγεί, το μείγμα θα πρέπει να αφήνεται να ψυχθεί πριν αποσυναρμολογηθεί προσεκτικά η συσκευή, λαμβάνοντας πρόνοια για το ενδεχόμενο να επέλθει αύξηση της πιέσεως. Εκτελούνται πέντε δοκιμές με την υπό δοκιμή ουσία και την ή τις ουσίες αναφοράς. Σημειώνεται ο χρόνος που απαιτείται για την αύξηση της πιέσεως από 690 kPa σε 2070 kPa πάνω από την ατμοσφαιρική. Υπολογίζεται ο μέσος χρόνος αύξησης της πιέσεως. Σε ορισμένες περιπτώσεις, ουσίες μπορεί να οδηγήσουν σε αύξηση πιέσεως (πολύ υψηλή ή πολύ χαμηλή) προκαλούμενη από χημικές αντιδράσεις μη χαρακτηριστικές των οξειδωτικών ιδιοτήτων της ουσίας. Στις περιπτώσεις αυτές μπορεί να είναι αναγκαίο να επαναληφθεί η δοκιμή με μια αδρανή ουσία, π.χ. γη διατόμων (kieselguhr), αντί κυτταρίνης για να διευκρινιστεί το είδος της αντίδρασης.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Χρόνοι αύξησης πιέσεως τόσο για την υπό δοκιμή ουσία, όσο και για την ή τις ουσίες αναφοράς. Χρόνοι αύξησης πιέσεως για τις δοκιμές με αδρανή ουσία, εφόσον γίνουν.
2.
2.1 Πίνακας 1 Παραδείγματα αποτελεσμάτων
ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Υπολογίζονται οι μέσοι χρόνοι αύξησης πιέσεως τόσο για την υπό δοκιμή, όσο και για την ή τις ουσίες αναφοράς. Υπολογίζεται ο μέσος χρόνος αύξησης πιέσεως για τις δοκιμές με αδρανή ουσία (εφόσον γίνουν). Ορισμένα παραδείγματα αποτελεσμάτων εμφαίνονται στον πίνακα 1. Ουσία Μέσος χρόνος αύξησης πιέσεως για μείγμα 1:1 μι κυτταρίνη (ms) Διχρωμικό αμμώνιο, κορεσμένο υδατικό διάλυμα 20800 Νιτρικό ασβέστιο, κορεσμένο υδατικό διάλυμα 6700 Νιτρικός σίδηρος ΙΙΙ, κορεσμένο υδατικό διάλυμα 4133 Υπερχλωρικό λίθιο, κορεσμένο υδατικό διάλυμα 1686 Υπερχλωρικό μαγνήσιο, κορεσμένο υδατικό διάλυμα 777 Νιτρικό νικέλιο, κορεσμένο υδατικό διάλυμα 6250 Νιτρικό οξύ 65 % 4767 Υπερχλωρικό οξύ, 50 % 121 Υπερχλωρικό οξύ, 55 % 59 Νιτρικό κάλιο, 30 % υδατικό διάλυμα 26690 Νιτρικός άργυρος, κορεσμένο υδατικό διάλυμα Χλωρικό νάτριο 40 % υδατικό διάλυμα 2555 Νιτρικό νάτριο, 45 % υδατικό διάλυμα 4133 Αδρανής ουσία Νερό:κυτταρίνη
3. ΕΚΘΕΣΗ
3.
3.1 ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ Στην έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνονται οι ακόλουθες πληροφορίες:
η ταυτότητα, η σύσταση, η καθαρότητα, κ.λπ. της υπό δοκιμή ουσίας,
η συγκέντρωση της υπό δοκιμή ουσίας,
η διαδικασία ξήρανσης της χρησιμοποιούμενης κυτταρίνης,
η υγρασία της χρησιμοποιούμενης κυτταρίνης,
τα αποτελέσματα των μετρήσεων,
τα αποτελέσματα δοκιμών με αδρανή ουσία εάν υπάρχουν,
οι υπολογισθέντες μέσοι χρόνοι αύξησης της πίεσης,
τυχόν παρεκκλίσεις από την παρούσα μέθοδο και οι λόγοι που τις επέβαλαν,
κάθε πρόσθετη πληροφορία ή παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.2 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Τα αποτελέσματα δοκιμής αξιολογούνται με βάση: Οι υγρές ουσίες πρέπει να θεωρούνται ως οξειδωτικές όταν: Για την αποφυγή εσφαλμένου θετικού αποτελέσματος εάν είναι αναγκαίο κατά την ερμηνεία των αποτελεσμάτων θα πρέπει επίσης να λαμβάνονται υπόψη και τα αποτελέσματα από δοκιμή της ουσίας με αδρανές υλικό.
3.2 α)
το εάν το μείγμα της υπό δοκιμή ουσίας και της κυτταρίνης αναφλέγεται αυθόρμητα, και
β)
τη σύγκριση του μέσου χρόνου που χρειάζεται για την αύξηση της πιέσεως από 690 kPa σε 2070 kPa με εκείνον της ή των ουσιών αναφοράς.
α)
μείγμα 1:1, κατά βάρος, της ουσίας και της κυτταρίνης αναφλέγεται αυθόρμητα, ή
β)
μείγμα 1:1 κατά βάρος της ουσίας και της κυτταρίνης εμφανίζει μέσο χρόνο αύξησης πιέσεως μικρότερο ή ίσο με το μέσο χρόνο αύξησης πιέσεως μείγματος 1:1 κατά βάρος υδατικού διαλύματος 65 % (w/w) νιτρικού οξέος και κυτταρίνης.
4.(1) ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria, 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342, Test 0.2: Test for oxidizing liquids. Σημείωση: Οποιοδήποτε από αυτά τα δύο συστήματα μπορεί να χρησιμοποιηθεί.
4.(1)
Εικόνα 1 Δοχείο πίεσης
(Α) Σώμα δοχείου πιέσεως (B) Βύσμα συγκράτησης δίσκου (C) Βύσμα πυροδότησης (D) Ροδέλα μαλακού μολύβδου (E) Διαρρηγνυόμενος δίσκος (F) Πλευρικός βραχίονας (G) Κεφαλή μορφοτροπέα πιέσεως (H) Ροδέλα (J) Μονωμένο ηλεκτρόδιο (K) Γειωμένο ηλεκτρόδιο (L) Μόνωση (M) Χαλύβδινος κώνος (N) Χαραγή οτρέβλωσης ροδέλας
Εικόνα 2 Υποστάτης
Εικόνα 3 Σύστημα ανάφλεξης
(Α) Πηνίο ανάφλεξης (Β) Μόνωοη (C) Ηλεκτρόδια (D) Βύσμα πυροδότησης
Προσάρτημα Για πρόσθετες τεχνικές πληροφορίες, μπορούν για παράδειγμα να χρησιμοποιηθούν τα ακόλουθα πρότυπα:
1. Μέθοδοι τριχοειδούς
1.
1.1. Συσκευές θερμοκρασίας τήξεως με υγρό λουτρό ASTM Ε 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung der Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren. JIS Κ 00-64 Testing methods for melting point of chemical products.
1.2. Συσκευές θερμοκρασίας τήξεως με μεταλλικό κορμό DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztempcratur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determination of melting point
2. Θερμές επιφάνειες
2.
2.1. Θερμή ράβδος Kofier ANSI/ASTM D 3451 76 Standard recommanded practices for testing polymeric powder coatings
2.2. Μικροσκόπιο τήξεως DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen.
2.3. Μέθοδος μηνίσκου (πολυαμίδια) ISO 1218 (Ε) Plastics — polyamides — determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resine injection moulding and extrusion mate-rials NT Τ 51-050 Resines de polyamides. Determination du point de fusion. Methode du me-nisque
3. Μέθοδοι για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας πήξεως BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax (cooling curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Moto-renbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage. DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsauren NF Τ 60-114 Point de fusion des paraffines NF Τ 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point.
4. Θερμική ανάλυση
4.
4.1. Διαφορική θερμική ανάλυση ASTM Ε 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM Ε 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM Ε 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
4.2. Θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης ASTM Ε 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM Ε 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM Ε 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
5. Προσδιορισμός του σημείου ροής ΝΒΝ 52014 Échantillonnage et analyse des produits du pétrole: point de trouble et point d'écoulement limité — Monstememing en ontleding van aardolieproducten: Troe-belingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils — Determination of pour point.
Προσάρτημα Για πρόσθετες τεχνικές πληροφορίες, μπορούν για παράδειγμα να χρησιμοποιηθούν τα ακόλουθα πρότυπα:
1. Ζεσεόμετρο ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes
2. Μέθοδος απόσταξης (περιοχή ζέσεως) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Losungmittel fur Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF Τ 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation
3. Διαφορική θερμική ανάλυση και σάρωση διαφορικής θερμιδομετρίας ASTM Ε 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM Ε 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM Ε 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe
Προσάρτημα Για πρόσθετες τεχνικές πληροφορίες, μπορούν για παράδειγμα να χρησιμοποιηθούν τα ακόλουθα πρότυπα:
1. Μέθοδοι άνωσης
1.
1.1. Υδρόμετρο DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part IIΙ: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF Τ 20-050 Chemical products for industrial use — Determination of density of liquids — Areometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers
1.2. Υδροστατικός ζυγός
1.2. Για στερεές ουσίες
ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics exciuuing ccnular plastics NF Τ 20-049 Chemical products for industrial use — Determination of the density of solids other than powders and cellular products — Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastometers; determination of density.
Για υγρές ουσίες
ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 and ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
1.3. Μέθοδος βυθιζόμενου σώματος DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method
2. Μέθοδοι πυκνομέτρου
2.
2.1. Για υγρές ουσίες ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Liplcin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10-6 m2 s-1 at 15 oC) DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC) DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol-water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillar)' side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products — chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method NF Τ 20-053 Chemical products for industrial use — Determination of density of solids in powder and liquids — Pyknometric method
2.2. Για στερεές ουσίες ISO 1183 Method Β: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics. NF Τ 20-053 Chemical products for industrial use — Determination of density of solids in powder and liquids — Pyknometric method DIN 19683 Determination of the density of soils
3. Συγκριτικό πυκνόμετρο αέρα DIN 55990 Part 3: Prufung von Anstrichstoffen und ahnlichen Beschichtungsstoffen; Pulver- lack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prufung
Προσάρτημα 1 Μέθοδος εκτίμησης
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Οι υπολογισμένες τιμές της τάσης ατμών μπορούν να χρησιμοποιηθούν:
για να αποφασισθεί ποια από τις πειραματικές μεθόδους είναι κατάλληλη,
για να υπάρχει μία εκτίμηση ή μία οριακή τιμή σε περιπτώσεις όπου η πειραματική μέθοδος δεν μπορεί να εφαρμοσθεί για τεχνικούς λόγους (συμπεριλαμβανομένων και των περιπτώσεων όπου η τάση ατμών είναι πολύ χαμηλή),
για να υποβοηθείται η αναγνώριση των περιπτώσεων εκείνων όπου δικαιολογείται η παράλειψη της πειραματικής μέτρησης διότι η τάση ατμών είναι πιθανόν να είναι < 10-5 Pa σε θερμοκρασία περιβάλλοντος.
ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ
Η τάση ατμών υγρών και στερεών μπορεί να εκτιμηθεί χρησιμοποιώντας την τροποποιημένη σχέση Watson (α). Τα μόνα πειραματικά δεδομένα που απαιτούνται είναι το κανονικό σημείο ζέσεως. Η μέθοδος μπορεί να εφαρμοσθεί σε περιοχή πιέσεων από 105 Pa έως 10-5 Pa. Λεπτομερείς πληροφορίες για τη μέθοδο δίδονται στο Handbook of Chemical Property Estimation Methods (β).
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΥ
Σύμφωνα με την υποσημείωση (β) η τάση ατμών υπολογίζεται όπως παρακάτω: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb όπου: Τ θερμοκρασία που ενδιαφέρει Tb κανονικό σημείο ζέσεως Ρvp τάση ατμών σε θερμοκρασία Τ ΔΗvb θερμότητα εξάτμισης ΔZb συντελεστής συμπιεστότητας (εκτιμούμενος σε 0,97) m εμπειρικός συντελεστής που εξαρτάται από τη φυσική κατάσταση στη θερμοκρασία που ενδιαφέρει Περαιτέρω Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb όπου KF είναι ένας εμπειρικός συντελεστής που έχει σχέση με την πολικότητα της ουσίας. Για ορισμένους τύπους ενώσεων, οι συντελεστές KF αναφέρονται στη βιβλιογραφία στην υποσημείωση (β). Αρκετά συχνά, υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα στα οποία δίνεται το σημείο ζέσεως υπό ελαττωμένη πίεση. Σε μια τέτοια περίπτωση, σύμφωνα με την υποσημείωση (β), η τάση ατμών υπολογίζεται όπως παρακάτω: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 όπου το Τ1 είναι το σημείο ζέσεως υπό ελαττωμένη πίεση Ρ1.
ΕΚΘΕΣΗ
Όταν χρησιμοποιείται η μέθοδος εκτίμησης, η έκθεση πρέπει να περιλαμβάνει συνοπτική τεκμηρίωση του υπολογισμού.
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, 398.
(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.
Προσάρτημα 2
Εικόνα 1 Συσκευή προσδιορισμού της καμπύλης τάσεως ατμών κατά τη δυναμική μέθοδο
1 = Θερμοστοιχείο 2 = Ρυθμιζόμενος όγκος κενού 3 = Βαλβίδα πίεσης 4 = Κενό 5 = Σημείο μέτρησης 6 = Θερμαντικό στοιχείο, περίπου 150 W
Εικόνα 2α Συσκευή προσδιορισμού της καμπύλης τάσεως ατμών σύμφωνα με τη στατική μέθοδο (χρησιμοποιώντας μανόμετρο σχήματος σωλήνα U)
1. Εξεταζόμενη ουσία 2. Φάση ατμών 3. Βαλβίδα υψηλού κενού 4. U-οειδής σωλήνας (βοη- 5. Μανόμετρο 6. Θερμοκρασιακό λουτρό 7. Διάταξη μέτρησης θερμοκρασίας 8. Προς αντλία κενού 9. Εξαερισμός θητικό μανόμετρο)
Εικόνα 2β Συσκευή προσδιορισμού της καμπύλης τάσης ατμών σύμφωνα με τη στατική μέθοδο (χρησιμοποιώντας δείκτη πίεσης)
1. Εξεταζόμενη ουσία 2. Φάση ατμών 3. Βαλβίδα υψηλού κενού 4. Μετρητής πίεσης 5. Δείκτης πίεσης 6. Θερμοκρασιακό λουτρό 7. Διάταξη μέτρησης θερμοκρασίας
Εικόνα 3 Ισοτενισκόπιο (βλέπε υποσημείωση 7)
1. Προς σύστημα ελέγχου και μέτρησης της πίεσης 2. Σωλήνας εξωτερικής διαμέτρου 8 mm 3. Ξηρό άζωτο στο σύστημα πίεσης 4. Ατμός δείγματος 5. Μικρό άκρο 6. Υγρό δείγμα
Εικόνα 4 Συσκευή προσδιορισμού της καμπύλης τάσης ατμών σύμφωνα με τη μέθοδο του ζυγού τάσης ατμών
1. Εξεταζόμενη ουσία 2. Φάση ατμού με ρεύμα ατμού 3. Φούρνος εξάτμισης με περιστροφική εισαγωγή 3a. Κάλυμμα φούρνου με άνοιγμα 4. Θέρμανση φούρνου (ψύξη) 5. Μέτρηση θερμοκρασίας δείγματος 6. Δοχείο ψύξης 7. Θώρακας 8. Ράβδος ψύξης για δοχείο ψύξης 9. Δίσκος ζυγού 10. Μικροζυγός 11. Προς καταγραφέα 12. Προς αντλία υψηλού κενού
Εικόνα 5 Παράδειγμα συσκευής για εξάτμιση σε χαμηλή πίεση με τη μέθοδο της διάχυσης, με κύτταρο διάχυσης όγκου 8 cm3
1 Σύνδεση με κενό 2 Υποδοχές για θερμόμετρο με αντίσταση λευκόχρυσου 3 Κάλυμμα για δεξαμενή κενού ανοξείδωτο χάλυβα 4 Δακτύλιος Ο 5 Δεξαμενή αλουμινίου κενού 6 Διάταξη για εγκατάσταση και απομάκρυνση των κυτάρρων διάχυσης 7 Κοχλιοτομημένο κάλυμμα 8 Παξιμάδι πεταλούδα (6) 9 Μπουλόνι (6) ή για μέτρηση και έλεγχο θερμοκρασίας (2) 10 Κύταρρα διάχυσης απο 11 Θερμαντικοί κάλυκες (6)
Εικόνα 6α Παράδειγμα συστήματος ροής για τον προσδιορισμό της τάσης ατμών με τη μέθοδο κορεσμού αερίου
Αέρος Βάση 1 = Ρυθμιστής ροής 2 = Εναλλάκτης θερμότητας 3 = Βελονοειδείς βαλβίδες 4 = Αισθητήρας σχετικής υγρασίας 5 = Στήλες κορεσμού 6 = Συνδέσεις PTFE 7 = Μετρητής ροής 8 = Παγίδα (προσροφητής) 9 = Παγίδα λαδιού 10 = Παραγωγή φυσαλλίδων
Εικόνα 6β Παράδειγμα συστήματος για τον προσδιορισμό της τάσης ατμών με τη μέθοδο κορεσμού αερίου, με ένα τριχοειδές τοποθετημένο μετά από το θάλαμο κορεσμού
1. Μετρητής ροής θερμικής μάζας 2. Μανόμετρο 3. Θάλαμος ελεγχόμενης θερμοκρασίας 4. Θερμοστατούμενο έλασμα για αέριο μεταφορέα 5. Θερμόμετρο (Ρt 100) 6. Θάλαμος κορεσμού αερίου 7. Τριχοειδές 8. Δοχεία απορρόφησης 9. Μετρητής αερίου 10. Ψυχρή παγίδα
Εικόνα 7 Παράδειγμα της πειραματικής διάταξης για τη μέθοδο στροβιλιζόμενης σφαίρας
Συσκευή τάσης ατμών A. κεφαλή αισθητήρα στροβιλιζόμενης σφαίρας B. κύταρρο δείγματος C. θερμοστάτης D. γραμμή κενού (στροβιλαντλία) E. θερμοστάτης αέρα
Εικόνα 8 Παράδειγμα μετρητικής κεφαλής στροβιλιζόμενης σφαίρας
1. Σφαίρα 2. Εκκενούμενη σωληνοειδής επέκταση της Φλάυτδας σύνδεσης 3. Μόνιμοι μαγνήτες (2) 4. Πηνία (2) για κάθετησταθεροποίηση 5. Πηνία οδηγοί (4) 6. Φλάντζα σύνδεσης
Προσάρτημα
Εικόνα Ι Μέθοδος έκλουσης στήλης με αντλία ανακύκλωσης
Ατμοσφαιρική εξισορρόπηση Μετρητής ροής Μικροστήλη Θερμοστατικα ελεγχόμενη αντλία κυκλοφορίας Αντλία ανακύκλωσης Διπλή βαλβίδα για δειγματοληψία
Εικόνα 2 Μια τυπική μικροστήλη
(Όλες οι διαστάσεις σε mm) Σύνδεση για γυάλινο εσμυρισμένο σύνδεσμο Χώρος εισαγωγής Εσωτερική διάμετρος 5 Εξωτερική διάμετρος 19 Βύσμα απο υαλοβάμβακα Βαλβίδα διπλής κατεύθυνσης
Εικόνα 3 Μια τυπική μικροστήλη
(Όλες οι διαστάσεις σε mm) Σύνδεση για γυάλινο εσμυρισμένο σύνδεσμο Χώρος εισαγωγής Εσωτερική διάμετρος 5 Εξωτερική διάμετρος 19 Βαλβίδα
Εικόνα 4 Μέθοδος έκλουσης στήλης με δοχείο ισοστάθμισης
1 = Δοχείο ισοστάθμισης (π. χ. χημική φιάλη 2,5 λίτρων) 2 = Στήλη (βλέπε σχήμα 3) 3 = Κλασματικός συλλέκτης 4 = Θερμοστάτης 5 = Σωλήνας από τεφλόν 6 = Γυάλινο βύσμα εσμυρισμένο 7 = Σωλήνας νερού (μεταξύ θερμοστάτη και στήλης, Εσωτερικής διαμέτρου 8 mm περίπου)
Προσάρτημα 1 ΜΕΘΟΔΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΥ/ΕΚΤΊΜΗΣΗΣ
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Μια γενική εισαγωγή στις μεθόδους υπολογισμού, στοιχεία και παραδείγματα παρέχονται στο Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). Οι δια υπολογισμού τιμές του Pow μπορούν να χρησιμοποιηθούν:
για να αποφασισθεί ποια από τις πειραματικές μεθόδους είναι η κατάλληλη (κλίμακα μεθόδου ανακινούμενης φιάλης: log Pow: - 2 έως 4, κλίμακα μεθόδου HPLC: log Pow: 0 έως 6),
για να επιλεγούν οι κατάλληλες συνθήκες δοκιμής (π.χ. ουσίες αναφοράς για τις διαδικασίες της HPLC, αναλογία όγκων η-οκτανόλης/νερού για τη μέθοδο της ανακινούμενης φιάλης),
ως εργαστηριακός εσωτερικός έλεγχος για πιθανά πειραματικά σφάλματα,
για την παροχή μιας εκτίμησης του Pow σε περιπτώσεις όπου οι πειραματικές μέθοδοι δεν μπορούν να εφαρμοσθούν για τεχνικούς λόγους.
ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ Προκαταρκτική εκτίμηση του συντελεστή κατανομής
Η τιμή του συντελεστή κατανομής μπορεί να εκτιμηθεί με τη χρησιμοποίηση των διαλυτοτήτων της εξεταζόμενης ουσίας στους σταθερούς διαλύτες: Γι’ αυτό: Pεκαμ. = cn-οκτανόλη κορεσμούcνερό κορεσμού
ΜΕΘΟΔΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΥ Αρχή των μεθόδων υπολογισμού
Όλες οι μέθοδοι υπολογισμού βασίζονται στη συμβατική κατάτμηση του μορίου σε κατάλληλα δομικά τμήματα με γνωστές αξιόπιστες μεταβολές του log Pow. Ο log Pow του όλου μορίου υπολογίζεται στη συνέχεια σαν το άθροισμα των αντίστοιχων τμηματικών του τιμών συν το άθροισμα των διορθωτικών όρων για ενδομοριακές αλληλεπιδράσεις. Υπάρχουν πίνακες σταθερών και διορθωτικών όρων για τμήματα (b)(c)(d)(e). Ορισμένοι ενημερώνονται τακτικά (b).
Ποιοτικά κριτήρια
Γενικά, η αξιοπιστία της μεθόδου υπολογισμού μειώνεται όσο αυξάνει η πολυπλοκότητα της υπό μελέτη ένωσης. Στην περίπτωση απλών μορίων με μικρό μοριακό βάρος και μία ή δύο λειτουργικές ομάδες, μπορεί να αναμένεται μια απόκλιση 0,1 έως 0,3 μονάδων του log Pow μεταξύ των αποτελεσμάτων των δια<(>όρων μεθόδων κατάτμησης και της μετρούμενης τιμής. Στην περίπτωση πολυπλοκότερων μορίων το περιθώριο σφάλματος μπορεί να είναι μεγαλύτερο. Αυτό εξαρτάται από την αξιοπιστία και την ύπαρξη σταθερών τμημάτων, όπως επίσης και από την ικανότητα αναγνώρισης ενδομοριακών αλληλεπιδράσεων (π.χ. δεσμοί υδρογόνου) και την ορθή χρήση των διορθωτικών παραγόντων (το πρόβλημα μειώνεται με το πρόγραμμα για υπολογιστή CLOGP-3) (b). Στην περίπτωση ιονιζόμενων ενώσεων σημαντικό ρόλο παίζει το να ληφθεί σωστά υπόψη το φορτίο ή ο βαθμός ιονισμού.
Διαδικασίες υπολογισμού
Μέθοδος με το π του HANSCH
Η πρωτογενής σταθερά υδρόφοβου υποκατάστατη, π, που εισήχθη από τους Fujita et al. (f) ορίζεται από: πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH) όπου Pow(PhH) είναι ο συντελεστής κατανομής ενός αρωματικού παραγώγου και Pow(PhH) ο συντελεστής κατανομής της μητρικής ένωσης (π.χ. πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71). Σύμφωνα με τον ορισμό της, η μέθοδος του π έχει εφαρμογή κυρίως σε περίπτωση αρωματικής υποκατάστασης. Οι τιμές του π για διάφορους υποκατάστατες υπάρχουν σε πίνακες (b)(c)(d). Χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό του log Pow για αρωματικά μόρια ή μέρη αυτών.
Μέθοδος Rekker
Σύμφωνα με τον REKKER (g), η τιμή του log Pow υπολογίζεται όπως παρακάτω: log Pow=Σi ai fi+Σj (όροι αλληλεπίδρασης) όπου το fi παριστάνει τις σταθερές των διάφορων μοριακών τμημάτων και ai τη συχνότητα με την οποία απαντώνται στο εξεταζόμενο μόριο. Οι διορθωτικοί παράγοντες μπορούν να εκφρασθούν σαν το ακέραιο πολλαπλάσιο μίας μόνης σταθεράς Cm (που καλείται κοινά μαγική σταθερά). Οι σταθερές τμημάτων fi και Cm προσδιορίστηκαν από ένα κατάλογο 1054 πειραματικών τιμών Pow (825 ενώσεις) χρησιμοποιώντας ανάλυση πολλαπλής αναγωγής (c) (h). Ο προσδιορισμός των όρων αλληλεπίδρασης διενεργείται σύμφωνα με κανόνες που περιγράφονται στη βιβλιογραφία (c) (h) (i).
Μέθοδος Hansch-Leo
Σύμφωνα με τους Hansch και Leo (c), η τιμή του log Pow υπολογίζεται από τον τύπο: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj όπου fi παριστάνει τις σταθερές των διαφόρων μοριακών τμημάτων, Fj τους διορθωτικούς παράγοντες και ai, Σ τις αντίστοιχες συχνότητες με τις οποίες απαντώνται. Με βάση πειραματικές τιμές Pow, προσδιορίσθηκαν εμπειρικά ένας κατάλογος ατομικών και ομαδικών τιμών τμημάτων και ένας κατάλογος διορθωτικών όρων Fj (που καλούνται κοινώς παράγοντες). Οι διορθωτικοί όροι ταξινομήθηκαν σε πολλές διαφορετικές τάξεις (α) (c). Είναι σχετικώς πολύπλοκο και χρονοβόρο να ληφθούν υπόψη όλοι οι κανόνες και οι διορθωτικοί όροι. Για τον λόγο αυτό έχουν αναπτυχθεί πακέτα λογισμικού (b).
Συνδυασμένη μέθοδος
Ο υπολογισμός του log Pow πολύπλοκων μορίων μπορεί να βελτιωθεί σημαντικά, αν το μόριο χωρισθεί σε μεγαλύτερα τμήματα για τα οποία υπάρχουν αξιόπιστες τιμές log Pow, είτε από πίνακες (b) (c) είτε από ίδιες μετρήσεις. Τα τμήματα αυτά (ετεροκυκλικοί δακτύλιοι, ανθρακινόνη, αζωβενζόλιο) μπορούν να συνδυασθούν κατόπιν με τις τιμές π της μεθόδου HANSCH ή με τις σταθερές του REKKER ή του LEO.
Παρατηρήσεις
i)
Οι μέθοδοι υπολογισμού μπορούν να εφαρμοσθούν σε μερικώς ή πλήρως ιονιζόμενες ενώσεις μόνον όταν είναι δυνατόν να ληφθούν υπόψη οι αναγκαίοι διορθωτικοί παράγοντες,
ii)
Αν μπορεί να προϋποτεθεί η ύπαρξη ενδομοριακών δεσμών υδρογόνου, πρέπει να προστεθούν οι αντίστοιχοι διορθωτικοί όροι (α) (περίπου +0,6 έως +1,0 log Pow μονάδες). Ενδείξεις για την παρουσία τέτοιων δεσμών μπορούν να ληφθούν από στερεοχημικά μοντέλα ή φασματοσκοπικά δεδομένα του μορίου,
iii)
Αν υπάρχει πιθανότητα ορισμένων ταυτομερών μορφών, σαν βάση του υπολογισμού θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί η πιο πιθανή μορφή,
iv)
Θα πρέπει να ακολουθούνται προσεκτικά οι αναθεωρήσεις των πινάκων των σταθερών τμημάτων.
Έκθεση
Όταν χρησιμοποιούνται μέθοδοι υπολογισμού/εκτίμησης, η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
περιγραφή της ουσίας (μείγμα, προσμείξεις, κ.λπ.),
υπόδειξη για την ενδεχόμενη ύπαρξη ενδομοριακού δεσμού υδρογόνου, διάστασης, φορτίου και οποιωνδήποτε άλλων μη συνηθισμένων φαινομένων (π.χ. ταυτομέρεια),
περιγραφή της μεθόδου υπολογισμού,
ταυτοποίηση ή παροχή βάσης δεδομένων,
ιδιαιτερότητες στην επιλογή των τμημάτων,
περιεκτική τεκμηρίωση του υπολογισμού.
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (cd.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log Ρ Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).
(c) C. Hansen, A.j. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
(d) A. Leo, C. Hansen, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther. 1979, vol. 14, 479.
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hanseh, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, 5175.
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12 1459.
(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.
Προσάρτημα 2 Συνιστώμενες ουσίες αναφοράς για τη μέθοδο HPLC
Αριθμός Ουσία αναφοράς log Pow pKa 1 2-Βουτανόνη 0,3 2 4-Ακετυλοπυριδίνη 0,5 3 Ανιλίνη 0,9 4 Ακεταντλίδιο 1,0 5 Βενζυλαλκοόλη 1,1 6 ρ-Μεθοξυφαινόλη 1,3 pKa = 10,26 7 Φαινοξυ οξικό οξύ 1,4 pKa = 3,12 8 Φαινόλη 1,5 pKa = 9,92 9 2.4-Δινιτροφαινόλη 1,5 pKa = 3,96 10 Βενζονιτρίλιο 1,6 11 Φαινυλακετονιτρίλιο 1,6 12 4-Μεθυλοβενζυλ αλκοόλη 1,6 13 Ακετοφαινόνη 1,7 14 2-Νιτροφαινόλη 1,8 pKa = 7,17 15 3-Νιτροβενζοϊκό οξύ 1,8 pKa = 3,47 16 4-Χλωρανιλίνη 1,8 pKa = 4,15 17 Νιτροβενζόλιο 1,9 18 Κινναμωμική αλκοόλη 1,9 19 Βενζοϊκό οξύ 1,9 pKa = 4,19 20 ρ-Κρεζόλη 1,9 pKa = 10,17 21 Κινναμωμικό οξύ 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Ανιοόλη 2,1 23 Βενζοϊκός μεθυλεστέρας 2,1 24 Βενζόλιο 2,1 25 3-Μεθυλοβενζοϊκό οξύ 2,4 pKa = 4,27 26 4-Χλωροφαινόλη 2,4 pKa = 9,1 27 Τριχλωραιθυλένιο 2,4 28 Ατραζίνη 2,6 29 Βενζοϊκός αιθυλεστέρας 2,6 30 2.6-Διχλωροβενζονντρίλιο 2,6 31 3-Χλωροβενζοϊκό οξύ 2,7 pKa = 3,82 32 Τολουόλιο 2,7 33 1-Ναφθόλη 2,7 pKa = 9,34 34 2.3-Διχλωροανιλίνη 2,8 35 Χλωροβενζόλιο 2,8 36 Αλλυλο-φαινυλαιθέρας 2,9 37 Βρωμοβενζόλιο 3,0 38 Αιθυλοβενζόλιο 3,2 39 Βενζοφαινόνη 3,2 40 4-Φαινυλοφαινόλη 3,2 pKa = 9,54 41 Θυμόλη 3,3 42 1.4-Διχλωροβενζόλιο 3,4 43 Διφαινυλαμίνη 3,4 pKa = 0,79 44 Ναφθαλένιο 3,6 45 Βενζοϊκός φαινυλεστέρας 3,6 46 Ισοπροπυλοβενζόλιο 3,7 47 2.4.6-Τριχλωροφαινόλη 3,7 pKa = 6 48 Διφαινυλιο 4,0 49 Βενζοϊκός βενζυλεστέρας 4,0 50 2.4-Δινιτρο-6 σε π-βουτυλοφαινόλη 4,1 51 1.2.4.-Τριχλωροβενζόλιο 4,2 52 Δωδεκανοϊκό οξύ 4,2 53 Διφαινυλαιθέρας 4,2 54 η-Βουτυλοβενζόλιο 4,5 55 Φαινανθρένιο 4,5 56 Φλουορανθένιο 4,7 57 Διβενζύλιο 4,8 58 2.6-Διφαινυλοπυριδίνη 4,9 59 Τριφαινυλαμίνη 5,7 60 DDT 6,2 Άλλες ουσίες αναφοράς χαμηλού log Pow 1 Νικοτινικό οξύ -0,07
Προσάρτημα
Εικόνα Καλούπι και εξαρτήματα για την παρασκευή της στήλης
(Όλες οι διαστάσεις σε mm) Μήκος καλουπιού: 250 mm Υλικό: αλουμίνιο
Προσάρτημα
Εικόνα Συσκευή
Προσάρτημα
Παράδειγμα προδιαγραφής υλικού για τη δοκιμή θερμικής ευαισθησίας (βλέπε DIN 1623) (1)(2)(3)
Σωλήνας: Προδιαγραφή υλικού αριθ. 1.0336.505 g Τρυπημένη πλάκα: Προδιαγραφή υλικού αριθ. 1.4873 Κοχλιοτομημένο κολλάρο και παξιμάδι: Προδιαγραφή υλικού αριθ. 1.3817
Εικόνα 1 Συσκευή δοκιμής θερμικής ευαισθησίας
(όλες οι διαστάσεις σε χιλιοστόμετρα) Εικ. 1α Χαλύβδινος σωλήνας και εξαρτήματα (1) σωλήνας (1a) εξωτερική φλάντζα (2) κοχλιοτομημένο κολλάρο σπείρωμα χαμηλής τριβής (3) τρυπημένη πλάκα α = 2,0 ή 6 mm διάμετρος (4) παξιμάδι β = 10 mm διάμετρος (5) λοξοτομημένη επιφάνεια (6) 2 παξιμάδια για κλειδί Νο 41 Εικ. 1β Προστατευτική καί θερμαντική διάταξη (7) 2 παξιμάδια για κλειδί Νο 36 (8) δοχείο αδιαπέρατο από θραύσματα (9) 2 ράβδοι υποστήριξης για το σωλήνα (10) συναρμολογημένος σωλήνας (11) θέση οπίσθιου καυστήρα. Οι άλλοι καυστήρες είναι ορατοί (12) πίδακας-πιλότος
Εικόνα 2 Δοκιμή θερμικής ευαισθησίας
Παραδείγματα θραυσματοποίησης Μη έκρηξη Μη έκρηξη Έκρηξη Έκρηξη Έκρηξη Έκρηξη
Εικόνα 3 Βαθμονόμηση ταχύτητας θέρμανσης για τη δοκιμή θερμικής ευαισθησίας
Θερμοκρασία (°C) Χρόνος (s) Καμπύλη θερμοκρασίας/χρόνου που λαμβάνεται θερμαίνοντας φθαλικό διβουτυλεστέρα (27 cm3) σε κλειστό (τρυπητή πλάκα 1,5 mm) σωλήνα χρησιμοποιώντας προπάνιο με ταχύτητα ροής 3,2 λίτρα ανά λεπτό. Η θερμοκρασία μετριέται με ένα θερμοστοιχείο χρωμίου/αλουμινίου σε θήκη από ανοξείδωτο χάλυβα διαμέτρου 1 mm, τοποθετημένο κεντρικά 43 mm κάτω από το περιστόμιο του σωλήνα. Η ταχύτητα θέρμανσης μεταξύ 135 και 285 oC θα πρέπει να είναι μεταξύ 185 και 215 K/min.
Εικόνα 4 Συσκευή δοκιμής κρούσης
(όλες οι διαστάσεις σε χιλιοστόμετρα) Εικ. 4α Συσκευή πίπτουσας σφύρας, εμπρόσθια και πλαγία όψη, γενική άποψη (1) βάση, 450 × 450 × 60 (2) χαλύβδινος κορμός, 230 × 250 × 200 (3) αμόνι, 100 διάμετρος × 70 (4) στήλη (5) μεσαίο εγκάρσιο στέλεχος (6) 2 οδηγοί (7) οδοντωτός κανόνας Εικ. 4β Πίπτουσα σφύρα, κάτω μέρος (8) βαθμολογημένη κλίμακα (9) πίπτουσα σφύρα (πίπτουσα μάζα) (10) διάταξη συγκράτησης και απελευθέρωσης (11) πλάκα στερέωσης (12) ενδιάμεσο αμόνι (εναλλάξιμο), 26 διάμετρος x 26 (13) δακτύλιος στερέωσης με τρύπες (14) διάταξη κρούσης
(Συνέχεια)
Εικ. 4γ Διάταξη κρούσης για ουσίες με μορφή σκόνης ή πάστας Εικ. 4δ Διάταξη κρούσης για υγρές ουσίες (1) χαλύβδινοι κύλινδροι (2) δακτύλιος οδηγός για χαλύβδινους κυλίνδρους (3) δακτύλιος τοποθέτησης με τρύπες (a) κατακόρυφη διατομή (b) επίπεδη (4) ελαστικός δακτύλιος (5) υγρή ουσία (40 mm3) (6) χώρος χωρίς υγρό Εικ. 4ε Σφύρα (πίπτουσα μάζα 5 Κg) (1) Πείρος ανάρτησης (2) δείκτης ύψους (3) χαραγή καθορισμού θέσης (4) κυλινδρική κεφαλή κρούσης (5) επαναφερόμενο μάνδαλο
Εικόνα 5 Συσκευή ευαισθησίας σε τριβή
Εικ. 5α Συσκευή τριβής Κάθετη και οριζόντια όψη (1) χαλύβδινη βάση (2) κινούμενο φορείο (3) πορσελάνινη πλάκα, 25 × 25 × 5 mm, συγκροτούμενη στο φορείο (4) σταθερός πορσελάνινος πασσαλίσκος, 10 διάμετρος × 15 mm (5) δείγμα υπό δοκιμή, περίπου 10 mm3 (6) υποδοχή πασσαλίσκου (7) βραχίονας φόρτισης (8) αντίβαρο (9) διακόπτης (10) τροχός για την τοποθέτηση του φορείου σε θέση εκκίνησης (11) διεύθυνση προς τον ηλεκρικό κινητήρα Εικ. 5β Αρχική θέση πασσάλου στο δείγμα
Προσάρτημα
Εικόνα Καλούπι και εξαρτήματα για την ετοιμασία της στήλης
(Όλες οι διαστάσεις εκφράζονται σε mm)
Προσάρτημα Παραδείγματα άλλων μεθόδων για τον προσδιορισμό του αριθμητικού μέσου μοριακού βάρους (Μη) για πολυμερή
Η μέθοδος που προτιμάται για τον προσδιορισμό του Μη, ιδιαίτερα όταν υπάρχει διαθέσιμη σειρά από πρότυπα των οποίων η δομή είναι συγκρίσιμη με τη δομή του πολυμερούς, είναι η χρωματογραφία διεισδύσεως πηκτής (GPC). Εντούτοις, όπου υπάρχουν πρακτικές δυσκολίες στη χρήση της GPC ή είναι εκ των προτέρων αναμενόμενο ότι η ουσία δεν θα πληροί κάποιο θεσπισμένο κριτήριο Μη (και το οποίο χρειάζεται επιβεβαίωση), υπάρχουν και εναλλακτικές διαθέσιμες μέθοδοι όπως
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
Χρήση φυσικοχημικών ιδιοτήτων Ζεσεοσκοπία/Κρυοσκοπία: Συνίσταται στη μέτρηση της ανύψωσης του σημείου ζέσεως (ζεσεοσκοπία) ή του υποβιβασμού του σημείου πήξεως (κρυοσκοπία) ενός διαλύτη, όταν προστίθεται το πολυμερές. Η μέθοδος βασίζεται στο γεγονός ότι η επίδραση του διαλυόμενου πολυμερούς στο σημείο ζέσεως/πήξεως του υγρού εξαρτάται από το μοριακό βάρος του πολυμερούς (1)(2). Δυνατότητα εφαρμογής: Μn < 20000. Υποβιβασμός της τάσεως ατμών: Συνίσταται στη μέτρηση της τάσεως ατμών ενός επιλεγμένου υγρού αναφοράς πριν και μετά την προσθήκη γνωστών ποσοτήτων πολυμερούς (1)(2). Δυνατότητα εφαρμογής: Μn < 20000 (θεωρητικά, αφού στην πράξη υπάρχει περιορισμός). Οσμομετρία μεμβράνης: Βασίζεται στην αρχή της όσμωσης δηλαδή της φυσικής τάσης των μορίων των διαλυτών να διέρχονται διαμέσου ημιπερατής μεμβράνης από ένα αραιό σε ένα πυκνό διάλυμα για την επίτευξη ισορροπίας. Στη δοκιμή, το αραιό διάλυμα έχει μηδενική συγκέντρωση, ενώ το πυκνό διάλυμα περιέχει το πολυμερές. Το γεγονός της διέλευσης του διαλύτη διαμέσου της μεμβράνης προκαλεί την ανάπτυξη διαφορικής πιέσεως που εξαρτάται από τη συγκέντρωση και το μοριακό βάρος του πολυμερούς (1)(3)(4). Δυνατότητα εφαρμογής Μn μεταξύ 20000 και 200000. Οσμομετρία φάσης ατμών: Συνίσταται στη σύγκριση της ταχύτητας εξατμίσεως αερολύματος καθαρού διαλύτη προς τρία τουλάχιστον αερολύματα που περιέχουν το πολυμερές σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (1) (5) (6). Δυνατότητα εφαρμογής Μ < 20000
2. Ανάλυση τερματικών ομάδων Για να χρησιμοποιηθεί η μέθοδος αυτή απαιτείται να είναι γνωστή τόσο η όλη δομή του πολυμερούς όσο και η φύση των τερματικών ομάδων της αλυσίδας (πράγμα που πρέπει να διακρίνεται από τον βασικό σκελετό με τη βοήθεια π.χ. NMR ή τιτλοδότησης/παραγωγοποίησης). Ο προσδιορισμός της μοριακής συγκεντρώσεως των τερματικών ομάδων που υπάρχουν στο πολυμερές μπορεί να οδηγήσει στην ανεύρεση μιας τιμής για το μοριακό βάρος (7)(8)(9). Δυνατότητα εφαρμογής: Μn μέχρι 50000 (με φθίνουσα αξιοπιστία).
3.(1)(2)(3)(4)(5)(1) (6)(7)(8)(9)
Παραπομπες Billmeyer. F.W. Jr.. (1984) Textbook of Polymeer Science. 3rd Edn., John Wiley, New York Glover. C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights. Part I, P.E.. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials. Philadelphia. Pennsvlvania. Coll. H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight. A.R. Cooper ed.. J. Wiley and Sons. pp. 25o2. ASTMD 3592-77. (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure. American Society for Testing and Materials, Philadelphia. Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry'. In: Determination of Molecular Weight A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schroder, E. Muller. G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag. Munich. Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S, et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.
Προσάρτημα Οδηγίες για τη διόρθωση της περιεκτικότητας σε κλάσματα χαμηλού μοριακού βάρους λόγω της παρουσίας αδιάλυτου πολυμερούς
Όταν σε ένα δείγμα υπάρχει αδιάλυτο πολυμερές, το γεγονός αυτό απολήγει σε απώλεια μάζας κατά τη διάρκεια της ανάλυσης GPC. Το αδιάλυτο πολυμερές κατακρατείται ανεπίστρεπτα στη στήλη ή στο φίλτρο του δείγματος ενώ το διαλυτό τμήμα του δείγματος διέρχεται διαμέσου της στήλης. Στην περίπτωση όπου μπορεί να εκτιμηθεί ή να μετρηθεί η διαφορική αύξηση (dn/dc) του δείκτη διαθλάσεως του πολυμερούς, μπορούμε να εκτιμήσουμε την απωλεσθείσα μάζα μείγματος τη στήλη. Στην περίπτωση αυτή, προβαίνουμε σε διόρθωση χρησιμοποιώντας μία εξωτερική διακρίβωση με πρότυπα υλικά γνωστής συγκεντρώσεως και dn/dc για τη διακρίβωση της απόκρισης του διαθλασιμέτρου. Στο παράδειγμα που ακολουθεί, χρησιμοποιείται πρότυπο πολύ (μεθακρυλικού μεθυλεστέρα) (ρΜΜΑ). Στην εξωτερική διακρίβωση για την ανάλυση ακρυλικών πολυμερών, αναλύεται με GPC ένα πρότυπο ρΡΜΜΑ γνωστής συγκεντρώσεως σε τετραϋδραφουράνιο και τα προκύπτοντα δεδομένα χρησιμοποιούνται για την εύρεση της σταθεράς του διαθλασιμέτρου σύμφωνα με την εξίσωση: Κ = R/(C × V × dn/dc) όπου Κ είναι η σταθερά διαθλασιμέτρου (σε microvolt.seconde/ml) R είναι η απόκριση του προτύπου pΜΜΑ (σε microvolt.second) C είναι η συγκέντρωση του προτύπου pΜΜΑ (σε mg/ml) V είναι ο όγκος εγχύσεως (σε ml) dn/dc είναι η διαφορική αύξηση του δείκτη διαθλάσεως για το pΜΜΑ σε τετραϋδροφουράνιο (σε ml/mg). Τα δεδομένα που ακολουθούν αποτελούν συνήθη δεδομένα για ένα πρότυπο pΜΜΑ R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 × 10-5 ml/mg. Η προκύπτουσα για το Κ τιμή (3,05 × 1011) χρησιμοποιείται κατόπιν για τον υπολογισμό της θεωρητικής απόκρισης του ανιχνευτή εφόσον μέσω του ανιχνευτή έχουν εκλουστεί το 100 % του εγχυθέντος πολυμερούς.
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΜΕΡΟΣ Β: ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΑΛΛΩΝ ΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΣΤΗΝ ΥΓΕΙΑ
ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.
ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗΣ ΟΥΣΙΑΣ Η σύνθεση της ελεγχόμενης ουσίας, συμπεριλαμβανομένων των κυριότερων προσμείξεων και οι σχετικές φυσικοχημικές ιδιότητές της, συμπεριλαμβανομένης της σταθερότητας, πρέπει να είναι γνωστές πριν από την έναρξη οποιασδήποτε μελέτης τοξικότητας. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες της ελεγχόμενης ουσίας, παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για την επιλογή της οδού χορήγησης, τη σχεδίαση κάθε ιδιαίτερης μελέτης, το χειρισμό και τη φύλαξη της ελεγχόμενης ουσίας. Η ανάπτυξη αναλυτικής μεθόδου γιο τον ποιοτικό Και ποσοτικό προσδιορισμό της ελεγχόμενης ουσίας (συμπεριλαμβανομένων των κυριότερων προσμείξεων, εάν είναι δυνατόν) στο μέσο χορήγησης των δόσεων, καθώς επίσης και στο βιολογικό υλικό. θα πρέπει να προηγείται από την έναρξη της μελέτης. Όλα τα στοιχεία σχετικά με την ταυτότητα, τις φυσικοχημικές ιδιότητες, την καθαρότητα και την συμπεριφορά της ελεγχόμενης ουσίας πρέπει να περιλαμβάνονται στην έκθεση της δοκιμής.
Β.
ΦΡΟΝΤΙΔΑ ΤΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΩΝ Για τις δοκιμές τοξικότητας ουσιαστικός είναι ο αυστηρός έλεγχος των περιβαλλοντικών συνθηκών και οι κατάλληλες τεχνικές φροντίδας των πειραματόζωων.
i)
Συνθήκες στέγασης Οι περιβαλλοντικές συνθήκες στους θαλάμους ή στα περιφράγματα θα πρέπει να είναι κατάλληλες για το κάθε είδος πειραματόζωου. Για τους επίμυες, τους ποντικούς και τα ινδικά χοιρίδια, κατάλληλες συνθήκες είναι η θερμοκρασία δωματίου 22 ± 3 oC με σχετική υγρασία 30 % έως 70 % 7 για τα κουνέλια η θερμοκρασία πρέπει να είναι 20 ± 3 oC με σχετική υγρασία 30 % έως 70 %. Μερικές πειραματικές τελικές είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες στην επίδραση της θερμοκρασίας και, σ' αυτές τις περιπτώσεις, η περιγραφή της πειραματικής μεθόδου πρέπει να περιλαμβάνει και λεπτομέρειες για τις κατάλληλες συνθήκες. Σε όλες τις έρευνες για τις τοξικές επιδράσεις η θερμοκρασία και η υγρασία πρέπει να παρακολουθούνται, να καταγράφονται και να περιλαμβάνονται στην τελική έκθεση της μελέτης. Ο φωτισμός πρέπει να είναι τεχνητός και η φωτοπερίοδος να αποτελείται από δώδεκα ώρες φωτός και δώδεκα ώρες σκότους. Λεπτομέρειες για τον προγραμματισμό της φωτοπεριόδου πρέπει να καταγράφονται και να περιλαμβάνονται στην τελική έκθεση της μελέτης. Εάν η μέθοδος δεν καθορίζει διαφορετικές συνθήκες, τα ζώα μπορούν να στεγάζονται ατομικά ή σε μικρές ομάδες ζώων του ιδίου φύλου. Σε περίπτωση ομαδικής στέγασης, τα κλουβιά δεν πρέπει να περιέχουν περισσότερα από πέντε ζώα. Στις εκθέσεις πειραμάτων με ζώα, είναι σημαντικό να αναφέρεται ο τύπος των χρησιμοποιουμένων κλουβιών και ο αριθμός των ζώων ανά κλουβί, τόσο κατά την περίοδο έκθεσης στη χημική ουσία όσο και κατά την μετέπειτα περίοδο των παρατηρήσεων.
ii)
Συνθήκες διατροφής Τα σιτηρέσια πρέπει να ανταποκρίνονται σε όλες τις διατροφικές απαιτήσεις του χρησιμοποιουμένου πειραματόζωου. Όταν οι ουσίες χορηγούνται στα ζώα μαζί με την τροφή τους. Η θρεπτική αξία του σιτηρεσίου μπορεί να ελαττωθεί λόγω αλληλεπιδράσεων μεταξύ της ουσίας και των συστατικών της τροφής. Η δυνατότητα μιας τέτοιας αντίδρασης πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά την ερμηνεία των αποτελεσμάτων του πειράματος. Επιτρέπεται η χορήγηση συμβατικών εργαστηριακών σιτηρεσίων με χορήγηση απεριόριστης ποσότητας πόσιμου νερού. Η επιλογή του σιτηρεσίου μπορεί να εξαρτηθεί από την ανάγκη εξασφάλισης κατάλληλου δείγματος ελεγχόμενης ουσίας εφόσον αυτή χορηγείται με την εν λόγω μέθοδο. Τροφικές προσμείξεις που είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την τοξικότητα δεν πρέπει να περιέχονται στο σιτηρέσιο σε συγκεντρώσεις που θα επιτρέψουν παρεμβολή.
Γ.
ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΕΣ Η Ευρωπαϊκή Ένωση δεσμεύεται για την ανάπτυξη και την αξιολόγηση της εγκυρότητας εναλλακτικών τεχνικών που μπορούν να παρέχουν πληροφορίες του ιδίου επιπέδου με εκείνες που λαμβάνονται από τις τρέχουσες δοκιμές ου ζώου. χρησιμοποιώντας όπως μικρότερο αριθμό πειραματόζωων και προκαλώντας λιγότερη ταλαιπωρία ή αποφεύγοντας τη χρήση πειραματόζωων. Τέτοιες μέθοδοι, εφόσον διατίθενται, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη όταν είναι δυνατόν για τον χαρακτηρισμό του κινδύνου και την επακόλουθη ταξινόμηση και επισήμανση σε σχέση με τους εγγενείς κινδύνους.
Δ.
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ Κατά την αξιολόγηση και ερμηνεία των δοκιμών, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι περιορισμοί στο βαθμό απ' ευθείας προέκτασης στον άνθρωπο των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από τις δοκιμές in vitro σε ζώα και, εφόσον διατίθενται στοιχεία για δυσμενείς επιπτώσεις στον άνθρωπο, μπορεί να χρησιμοποιούνται για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων των δοκιμών.
Ε.
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ Οι περισσότερες από τις μεθόδους αυτές έχουν αναπτυχθεί στο πλαίσιο του προγράμματος του ΟΟΣΑ για τις κατευθυντήριες γραμμές δοκιμών και πρέπει να εφαρμόζονται σύμφωνα με τις αρχές ορθής εργαστηριακής πρακτικής ώστε να εξασφαλίζεται η ευρύτερη δυνατή αμοιβαία αποδοχή των δεδομένων. Περαιτέρω πληροφορίες μπορούν να αναζητηθούν στις παραπομπές των κατευθυντήριων γραμμών του ΟΟΣΑ καθώς και στην αλλού δημοσιευμένη σχετική βιβλιογραφία.
Β.1α. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΑΠΟ ΤΟ ΣΤΟΜΑ — ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΡΟΚΑΘΟΡΙΣΜΕΝΩΝ ΔΟΣΕΩΝ
Β.1α.
1. Η ΜΕΘΟΔΟΣ Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντηρία γραμμή δοκιμών TG 420 (2001) του ΟΟΣΑ.
1.
1.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στις κλασικές μεθόδους εκτίμησης της οξείας τοξικότητας, χρησιμοποιείται ως τελικό ο θάνατος των ζώων. Το 1984, η Βρετανική Τοξικολογική Εταιρεία πρότεινε μια νέα προσέγγιση των δοκιμών οξείας τοξικότητας, βασισμένη στη χορήγηση σειράς προκαθορισμένων δόσεων (1). Η προσέγγιση αυτή αποτρέπει τη χρήση του θανάτου των ζώων ως τελικού σημείου και αντί αυτού, στηρίζεται στην παρατήρηση σαφών συμπτωμάτων τοξικότητας σε ένα από μια σειρά προκαθορισμένων επιπέδων δόσης. Μετά τη διεξαγωγή μελετών ελέγχου της αξιοπιστίας, in vivo, συγκεκριμένα μίας στο Ηνωμένο Βασίλειο (2) και μίας δεύτερης σε διεθνή κλίμακα(3), η διαδικασία εγκρίθηκε ως μέθοδος δοκιμών το 1992. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκαν σε σειρά μελετών, με χρήση μαθηματικών μοντέλων, οι στατιστικές ιδιότητες της διαδικασίας σταθερής δόσης (4)(5)(6). Οι μελέτες in vivo σε συνδυασμό με τις μελέτες εκπόνησης μοντέλων έδειξαν ότι η διαδικασία διαθέτει επαναληπτικότητα, απαιτεί μικρότερο αριθμό ζώων και τους προκαλεί λιγότερες ταλαιπωρίες σε σύγκριση με τις κλασικές μεθόδους, Επίσης, παρέχει ανάλογες δυνατότητες ταξινόμησης των ουσιών με τις άλλες μεθόδους δοκιμών οξείας τοξικότητας. Οδηγίες για την επιλογή της καταλληλότερης μεθόδου δοκιμών σε κάθε δεδομένη περίπτωση παρέχονται από το καθοδηγητικό έγγραφο Guidance document on Acute Oral Toxicity Testing (7), το οποίο περιέχει επίσης συμπληρωματικές πληροφορίες σχετικά με την εφαρμογή και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της μεθόδου δοκιμών Β.1δις. Αποτελεί αρχή της μεθόδου η χρήση στην κυρίως μελέτη μόνο μετρίως τοξικών και η αποφυγή της χορήγησης δόσεων που προβλέπεται να είναι θανατηφόρες. Επίσης, δεν χρειάζεται να χορηγούνται δόσεις που είναι γνωστό ότι προκαλούν ισχυρούς πόνους και έντονη δυσφορία, εξαιτίας της διαβρωτικής ή πολύ ερεθιστικής δράσης των ουσιών. Τα ετοιμοθάνατα ζώα, καθώς και εκείνα που εμφανίζουν σαφή σημεία πόνου ή έντονης και διαρκούς δυσφορίας, θανατώνονται με ευθανασία και λαμβάνονται υπόψη της απόφασης να θανατωθούν ετοιμοθάνατα ή βαρέως πάσχοντα ζώα, καθώς και οι οδηγίες για την αναγνώριση των ενδείξεων προβλέψιμου ή επικείμενου θανάτου αποτελούν το αντικείμενο χωριστού καθοδηγητικού εγγράφου (8). Η μέθοδος παρέχει στοιχεία για τις επικίνδυνες ιδιότητες των ουσιών και επιτρέπει την ιεράρχηση και την ταξινόμησή τους σύμφωνα με το Παγκόσμιο Εναρμονισμένο Σύστημα Ταξινόμησης των χημικών ουσιών που προκαλούν οξεία τοξικότητα (GHS από τα αρχικά τον αγγλικού Globally Harmonised System) (9). Πριν από τη διεξαγωγή της μελέτης, το εργαστήριο δοκιμών θα πρέπει να λαμβάνει υπόψη όλα τα διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με την ελεγχόμενη ουσία, μεταξύ των οποίων την ταυτότητα και τη χημική δομή της, τις φυσικές και χημικές ιδιότητές της, τα αποτελέσματα τυχόν άλλων δοκιμών τοξικότητας της ουσίας in vivο, τα τοξικολογικά δεδομένα του αφορούν ουσίες ανάλογης χημικής δομής, καθώς και την ή τις προβλεπόμενες χρήσεις της ουσίας. Οι πληροφορίες αυτές είναι απαραίτητες για να διασφαλίζεται ότι η διεξαγωγή της δοκιμής έχει ουσιαστική σημασία για την προστασία της υγείας του ανθρώπου και βοηθούν στην εκλογή της κατάλληλης αρχικής δόσης.
1.2 ΟΡΙΣΜΟΙ Οξεία τοξικότητα από το στόμα: οι δυσμενείς δράσεις που παρατηρούνται μετά τη χορήγηση από το στόμα μίας δόσης της ουσίας εφάπαξ ή πολλών δόσεων εντός 24ώρου. Όψιμος θάνατος: η περίπτωση όπου ένα ζώο δεν πεθαίνει ούτε φαίνεται ετοιμοθάνατο εντός 48 ωρών, αλλά πεθαίνει αργότερα στη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης που διαρκεί 14 ημέρες. Δόση: η χορηγούμενη ποσότητα ελεγχόμενης ουσίας εκφράζεται σε βάρος ελεγχόμενης ουσίας ανά μονάδα βάρους του πειραματόζωου (π.χ. mg/kg). Έκδηλη τοξικότητα: γενικός όρος που δηλώνει την εμφάνιση σαφών συμπτωμάτων τοξικότητας μετά τη χορήγηση της ελεγχόμενης ουσίας [βλέπε παραδείγματα στη δημοσίευση (3)], ώστε να αναμένεται ότι η αμέσως υψηλότερη προκαθορισμένη δόση θα προκαλέσει είτε ισχυρό πόνο και διαρκή σημεία έντονης δυσφορίας ή κατάσταση ετοιμοθάνατου [τα σχετικά κριτήρια παρατίθενται στο καθοδηγητικό έγγραφο για τα τελικά σημεία ευθανασίας (8)] ή πιθανή θνησιμότητα στα περισσότερα ζώα. GHS: παγκόσμιο εναρμονισμένο σύστημα ταξινόμησης για τις χημικές ουσίες και τα μίγματά τους. Πρόκειται για κοινή πρωτοβουλία του ΟΟΣΑ (υγεία του ανθρώπου και περιβάλλον), της Επιτροπής Εμπειρογνωμόνων για τις Μεταφορές Επικίνδυνων Εμπορευμάτων του ΟΗΕ (φυσικές και χημικές ιδιότητες) και της Διεθνούς Οργάνωσης Εργασίας (ανακοίνωση κινδύνων), με συντονιστή το Πρόγραμμα Διεθνών Οργανισμών για την ορθή Διαχείριση των Χημικών Προϊόντων (ΙΟΜC). Επικείμενος θάνατος: η περίπτωση όπου αναμένεται κατάσταση ετοιμοθάνατου ή θάνατος πριν από τον επόμενο προγραμματισμένο χρόνο παρατήρησης. Μεταξύ των ενδείξεων επικείμενου θανάτου στα τρωκτικά περιλαμβάνονται οι σπασμοί, η πλάγια θέση, η κατάκλιση και ο τρόμος [για περισσότερες λεπτομέρειες, βλέπε καθοδηγητικό έγγραφο για τα τελικά σημεία ευθανασίας (8)]. LD50(διάμεσος θανατηφόρου δόσης): η στατιστικά λαμβανόμενη τιμή εφάπαξ δόσης μιας ουσίας που αναμένεται να προκαλέσει το θάνατο του 50 % των πειραματόζωων, όταν χορηγηθεί από το στόμα. Η τιμή LD50 εκφράζεται σε βάρος ελεγχόμενης ουσίας ανά μονάδα βάρους του πειραματόζωου (mg/kg). Οριακή δόση: μια δόση που αποτελεί το ανώτατο όριο για τη δοκιμή (2000 ή 5000 mg/kg). Κατάσταση ετοιμοθάνατου: η κατάσταση πολύ κοντά στο θάνατο ή η αδυναμία επιβίωσης ακόμη και μετά από θεραπευτική αγωγή [για περισσότερες λεπτομέρειες, βλέπε καθοδηγητικό έγγραφο για τα τελικά σημεία ευθανασίας (8)]. Προβλέψιμος θάνατος: η εμφάνιση κλινικών συμπτωμάτων που αποτελούν ένδειξη μελλοντικού θανάτου σε γνωστό χρόνο πριν από τον προγραμματισμένο τερματισμό του πειράματος, λόγου χάριν η αδυναμία του πειραματόζωου να φθάσει την τροφή ή το νερό [για περισσότερες λεπτομέρειες, βλέπε καθοδηγητικό έγγραφο για τα τελικά σημεία ευθανασίας (8)].
1.3 ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ Σε ομάδες ζώων του ίδιου φύλου χορηγούνται με βαθμιδωτή διαδικασία οι προκαθορισμένες δόσεις 5, 50, 300 και 2000 mg/kg (κατ' εξαίρεση, μπορεί να προστεθεί η προκαθορισμένη δόση 5000 mg/kg, βλέπε σημείο 1.6.2). Η αρχική δόση επιλέγεται με βάση τα αποτελέσματα αναγνωριστικής μελέτης ως η δόση εκείνη που αναμένεται να προκαλέσει κάποια συμπτώματα τοξικότητας, όχι όμως σοβαρές τοξικές επιδράσεις ή θνησιμότητα. Τα κλινικά συμπτώματα και οι παθολογικές καταστάσεις που συνοδεύονται από πόνο, ταλαιπωρίες και επικείμενο θάνατο περιγράφονται λεπτομερώς σε χωριστό καθοδηγητικό έγγραφο του ΟΟΣΑ (8). Ανάλογα με την εκδήλωση ή την απουσία συμπτωμάτων τοξικότητας ή θνησιμότητας, είναι δυνατόν να χορηγηθούν σε πρόσθετες ομάδες ζώων υψηλότερες ή χαμηλότερες προκαθορισμένες δόσεις. Η διαδικασία αυτή συνεχίζεται μέχρι να προσδιοριστεί η δόση που προκαλεί έκδηλη τοξικότητα ή το θάνατο όχι περισσότερων του ενός ζώων ή διακόπτεται όταν δεν παρατηρούνται επιδράσεις στο ανώτατο επίπεδο δόσης ή η κατώτατη δόση προκαλεί θανάτους.
1.4 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ
1.4
1.4.1 Επιλογή είδους ζώων Το προτιμώμενο είδος τρωκτικού είναι ο επίμυς, αλλά μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα είδη τρωκτικών. Κατά κανόνα χρησιμοποιούνται θηλυκά ζώα (7), επειδή από τη βιβλιογραφική έρευνα για τις συμβατικές δοκιμές LD50 προκύπτει ότι, αν και οι διαφορές ευπάθειας μεταξύ των δύο φύλων είναι συνήθως ελάχιστες, όταν παρατηρούνται διαφορές, τα θηλυκά ζώα είναι κατά κανόνα ελαφρώς πιο ευπαθή (10). Εάν ωστόσο οι γνώσεις σχετικά με τις τοξικολογικές ή τοξικοκινητικές ιδιότητες χημικών ουσιών με ανάλογη χημική δομή συνηγορούν υπέρ του ότι τα αρσενικά ζώα είναι πιθανώς πιο ευπαθή, τότε θα πρέπει να προτιμάται αυτό το φύλο. Όταν η δοκιμή διεξάγεται σε αρσενικά ζώα, η επιλογή αυτή θα πρέπει να αιτιολογείται επαρκώς. Πρέπει να χρησιμοποιούνται υγιή νεαρά ενήλικα ζώα που ανήκουν σε φυλές κοινής εργαστηριακής χρήσης. Τα θηλυκά ζώα πρέπει να μην έχουν ποτέ γεννήσει ούτε να εγκυμονούν. Κατά την έναρξη της χορήγησης των δόσεων, η ηλικία κάθε ζώου πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 8 και 12 εβδομάδων και το βάρος του να μην αποκλίνει περισσότερο από ± 20 % από το μέσο βάρος των ζώων στα οποία έχει ενδεχομένως χορηγηθεί η ουσία σε προηγούμενο στάδιο.
1.4.2 Συνθήκες στέγασης και διατροφής Η θερμοκρασία του θαλάμου πειραματόζωων πρέπει να είναι 22 oC (± 3 oC). Αν και η σχετική υγρασία πρέπει να είναι τουλάχιστον 30 % και, κατά προτίμηση, να μην υπερβαίνει το 70 %, εκτός από τις περιόδους καθαρισμού του θαλάμου, εν τούτοις ο στόχος θα πρέπει να είναι μια τιμή 50-60 %. Ο φωτισμός πρέπει να είναι τεχνητός, με εναλλαγή φωτός-σκότους ανά 12ωρο. Για τη διατροφή των ζώων μπορούν να χρησιμοποιούνται τα συνήθη εργαστηριακά σιτηρέσια, με απεριόριστη παροχή πόσιμου νερού. Τα ζώα μπορούν να τοποθετούνται ομαδικά σε κλουβιά κατά δόση, αλλά ο αριθμός ζώων σε κάθε κλουβί δεν πρέπει να παρεμποδίζει την ακριβή παρατήρηση του καθενός ζώου.
1.4.3 Προετοιμασία των ζώων Τα ζώα επιλέγονται τυχαία, σημαίνονται με τρόπο που επιτρέπει την αναγνώριση του καθενός και παραμένουν στα κλουβιά τους τουλάχιστον για πέντε ημέρες πριν από την έναρξη της χορήγησης των δόσεων, ώστε να εγκλιματιστούν στις εργαστηριακές συνθήκες.
1.4.4 Παρασκευή των δόσεων Ο χορηγούμενος όγκος της ελεγχόμενης ουσίας πρέπει κατά κανόνα να διατηρείται σταθερός σε όλη τη σειρά των δόσεων της δοκιμής με αλλαγή της συγκέντρωσης του χορηγούμενου παρασκευάσματος Όταν ωστόσο πρόκειται να ελεγχθεί ένα υγρό τελικό προϊόν ή μίγμα, η χρήση της ελεγχόμενης ουσίας χωρίς αραίωση, δηλαδή σε σταθερή συγκέντρωση, μπορεί να είναι πιο ενδεδειγμένη για τη μετέπειτα εκτίμηση των κινδύνων, ενώ αποτελεί και απαίτηση ορισμένων αρμόδιων για τις νομοθετικές ρυθμίσεις Αρχών. Σε κάθε περίπτωση, δεν επιτρέπεται υπέρβαση του μέγιστου όγκου χορηγούμενης δόσης. Ο μέγιστος όγκος υγρού που μπορεί να χορηγηθεί εφάπαξ εξαρτάται από το μέγεθος του πειραματόζωου. Στα τρωκτικά, ο όγκος δεν πρέπει κατά κανόνα να υπερβαίνει το 1 ml/100 g βάρους σώματος, αλλά στην περίπτωση των υδατικών διαλυμάτων μπορεί να εξετασθεί το ενδεχόμενο χορήγησης 2 ml/100 g βάρους σώματος. Όσον αφορά τη μορφή του χορηγούμενου παρασκευάσματος, συνιστάται να χρησιμοποιούνται, κατά το δυνατόν, υδατικά διαλύματα/εναιωρήματα/γαλακτώματα, με δεύτερα κατά σειρά προτίμησης τα διαλύματα/εναιωρήματα/γαλακτώματα σε έλαιο (π.χ. αραβοσιτέλαιο) και τελευταία τα διαλύματα σε άλλους φορείς. Σε περίπτωση χρήσης άλλου φορέα πλην του νερού, πρέπει να είναι γνωστές οι τοξικολογικές ιδιότητές του. Οι δόσεις πρέπει να παρασκευάζονται λίγο πριν από τη χορήγηση, εκτός εάν η σταθερότητα του παρασκευάσματος στο χρονικό διάστημα εντός του οποίου πρόκειται να χρησιμοποιηθεί είναι γνωστή και έχει κριθεί αποδεκτή.
1.5 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΔΟΚΙΜΗΣ
1.5
1.5.1 Χορήγηση των δόσεων Η ελεγχόμενη ουσία χορηγείται εφάπαξ με τη βοήθεια ρινογαστρικού καθετήρα σίτισης ή κατάλληλου σωλήνα διασωλήνωσης. Στη σπάνια περίπτωση όπου η εφάπαξ χορήγηση δεν είναι εφικτή, η δόση μπορεί να χορηγηθεί τμηματικά εντός περιόδου που δεν υπερβαίνει τις 24 ώρες. Πριν από τη χορήγηση των δόσεων, τα ζώα υποβάλλονται σε νηστεία (π.χ. διακοπή της σίτισης, αλλά όχι της παροχής νερού για όλη την προηγούμενη νύκτα, όταν χρησιμοποιούνται επίμυες, ή για 3-4 ώρες, όταν χρησιμοποιούνται ποντικοί). Μετά την περίοδο νηστείας, τα ζώα ζυγίζονται και τους χορηγείται η ελεγχόμενη ουσία. Η διακοπή της σίτισης μπορεί να συνεχιστεί και μετά τη χορήγηση της ουσίας για 3-4 ώρες, προκειμένου για επίμυες, ή 1-2 ώρες, προκειμένου για ποντικούς. Σε περίπτωση τμηματικής χορήγησης της δόσης εντός ορισμένου χρόνου, μπορεί να χρειαστεί να δοθεί στα ζώα τροφή και νερό, ανάλογα με τη διάρκεια του συγκεκριμένου χρονικού διαστήματος.
1.5.2 Αναγνωριστική μελέτη Σκοπός της αναγνωριστικής μελέτης είναι να επιτρέψει την επιλογή της ενδεδειγμένης αρχικής δόσης για την κυρίως μελέτη. Η ελεγχόμενη ουσία χορηγείται σε μεμονωμένα ζώα σε διαδοχικά στάδια σύμφωνα με τα διαγράμματα ροής του παρατήματος 1. Η αναγνωριστική μελέτη τερματίζεται όταν μπορεί να ληφθεί απόφαση σχετικά με την αρχική δόση της κυρίως μελέτης (ή εάν η κατώτατη προκαθορισμένη δόση προκαλέσει θάνατο). Η αρχική δόση της αναγνωριστικής μελέτης επιλέγεται μεταξύ των προκαθορισμένων επιπέδων 5, 50, 300 και 2000 mg/kg ως η δόση που αναμένεται να προκαλέσει έκδηλη τοξικότητα, κατά το δυνατόν με βάση δεδομένα από μελέτες in vivo και in vitro με την ίδια ουσία ή με ουσίες ανάλογης χημικής δομής. Εάν δεν υπάρχουν τέτοια στοιχεία, η αρχική δόση είναι 300 mg/kg. Τα διαδοχικά στάδια χορήγησης των δόσεων στο εκάστοτε ζώο πρέπει να απέχουν τουλάχιστον 24 ώρες. Όλα τα ζώα πρέπει να παρατηρούνται για 14 ημέρες τουλάχιστον. Κατ’ εξαίρεση, και μόνον εφόσον το επιβάλλουν συγκεκριμένες ανάγκες νομοθετικής ρύθμισης, μπορεί να εξεταστεί η χρήση ενός επιπλέον ανώτατου προκαθορισμένου επιπέδου δόσης 5000 mg/kg (βλέπε παράρτημα 3). Για λόγους προστασίας των ζώων, η διεξαγωγή δοκιμών σε ζώα με δόσεις της κλίμακας που ορίζει την κατηγορία 5 του GHS (2000-5000 mg/kg) δεν συνιστάται και θα πρέπει να εξετάζεται μόνον εφόσον υπάρχουν μεγάλες πιθανότητες τα αποτελέσματα των δοκιμών αυτών να έχουν άμεση, ουσιαστική σημασία για την προστασία της υγείας των ζώων ή του ανθρώπου ή για την προστασία του περιβάλλοντος. Σε περίπτωση θανάτου ενός ζώου στο οποίο έχει χορηγηθεί η κατώτατη προκαθορισμένη δόση για την αναγνωριστική μελέτη (5 mg/kg), ο κανόνας είναι να τερματίζεται η μελέτη και η ουσία να κατατάσσεται στην κατηγορία 1 του GHS (όπως φαίνεται στο παράρτημα 1). Εάν ωστόσο απαιτείται επιβεβαίωση της ταξινόμησης, μπορεί να εφαρμοστεί η προαιρετική συμπληρωματική διαδικασία που ακολουθεί. Χορηγούνται 5 mg/kg σε ένα δεύτερο ζώο. Εάν αυτό πεθάνει, τότε επιβεβαιώνεται η κατάταξη στην κατηγορία 1 του GHS και η μελέτη τερματίζεται αμέσως. Εάν το δεύτερο ζώο επιζήσει, χορηγούνται 5 mg/kg σε τρία επιπλέον ζώα κατ' ανώτατο όριο. Επειδή υπάρχει πλέον μεγάλος κίνδυνος θνησιμότητας, η δόση θα πρέπει να χορηγείται διαδοχικά για να προστατεύονται τα ζώα. Το χρονικό διάστημα μεταξύ των διαδοχικών σταδίων χορήγησης της δόσης πρέπει να είναι επαρκές, ώστε να τεκμαίρεται ότι το προηγούμενο ζώο θα επιζήσει. Σε περίπτωση δεύτερου θανάτου, η ακολουθία χορήγησης της δόσης διακόπτεται αμέσως και δεν υποβάλλονται σε δοκιμή άλλα ζώα. Δεδομένου ότι ο δεύτερος θάνατος (ανεξαρτήτως του αριθμού των ζώων που είχαν υποβληθεί στη δοκιμή κατά το χρόνο τερματισμού) εμπίπτει στην έκβαση Α (2 ή περισσότεροι θάνατοι), εφαρμόζεται ο κανόνας ταξινόμησης του παραρτήματος 2 για την προκαθορισμένη δόση 5 mg/kg (κατάταξη στην κατηγορία 1, όταν διαπιστώνονται 2 ή περισσότεροι θάνατοι, ή στην κατηγορία 2, όταν διαπιστώνεται μόνον 1 θάνατος). Επιπλέον, το παράρτημα 4 παρέχει καθοδήγηση για την ταξινόμηση κατά το σύστημα της ΕΕ μέχρι να εφαρμοστεί το νέο GHS.
1.5.3 Κυρίως μελέτη
1.5.3
1.5.3.1 Αριθμοί ζώων και επίπεδα δόσεων Το επόμενο βήμα μετά τη δοκιμή με την αρχική δόση υποδεικνύεται στα διαγράμματα ροής του παραρτήματος 2. Υπάρχουν οι εξής τρεις πιθανότητες: διακοπή της δοκιμής και κατάταξη στην ενδεδειγμένη κλάση κινδύνου ή δοκιμή με υψηλότερη προκαθορισμένη δόση ή δοκιμή με χαμηλότερη προκαθορισμένη δόση. Παρόλα αυτά, για λόγους προστασίας των ζώων, οι δόσεις που προκαλούν θανάτους κατά την αναγνωριστική μελέτη δεν χορηγούνται εκ νέου κατά την κυρίως μελέτη (βλέπε παράρτημα 2). Η πείρα δείχνει ότι το πιθανότερο αποτέλεσμα της δοκιμής με την αρχική δόση είναι η δυνατότητα ταξινόμησης της ουσίας, χωρίς να χρειάζονται άλλες δοκιμές. Για κάθε επίπεδο δόσης που ελέγχεται, χρησιμοποιούνται κατά κανόνα πέντε ζώα του ίδιου φύλου. Η ομάδα των πέντε ζώων σχηματίζεται από το ζώο στο οποίο χορηγήθηκε το συγκεκριμένο επίπεδο δόσης κατά την αναγνωριστική μελέτη συν τέσσερα άλλα ζώα (εκτός εάν —σπάνια περίπτωση— ένα επίπεδο δόσης της κυρίως μελέτης δεν χορηγήθηκε στο πλαίσιο της αναγνωριστικής). Το χρονικό διάστημα μεταξύ των δόσεων καθορίζεται ανάλογα με το χρόνο εκδήλωσης, τη διάρκεια και τη σοβαρότητα των συμπτωμάτων τοξικότητας. Η χορήγηση της επόμενης δόσης θα πρέπει να καθυστερεί μέχρις ότου είναι βέβαιο ότι τα ζώα που έλαβαν την προηγούμενη θα επιζήσουν. Συνιστάται να μεσολαβούν μεταξύ των δόσεων 3 ή 4 ημέρες, εάν χρειάζεται, ώστε να είναι δυνατόν να διαπιστωθούν οι όψιμες τοξικές επιδράσεις. Το χρονικό διάστημα μεταξύ των δόσεων μπορεί να αναπροσαρμόζεται ανάλογα με τις ανάγκες, λόγου χάριν στις περιπτώσεις αβέβαιης απόκρισης. Όταν εξετάζεται η χρήση των 5000 mg/kg ως ανώτατης προκαθορισμένης δόσης, πρέπει να εφαρμόζεται η διαδικασία που περιγράφεται στο παράρτημα 3 (βλέπε επίσης σημείο 1.6.2).
1.5.3.2 Οριακή δοκιμή Η οριακή δοκιμή χρησιμοποιείται κυρίως στις περιπτώσεις όπου ο ερευνητής έχει στη διάθεσή του στοιχεία, από τα οποία προκύπτει ότι η ελεγχόμενη ουσία μάλλον δεν είναι τοξική, δηλαδή ότι έχει τοξικές επιδράσεις μόνον εάν ληφθεί σε δόσεις μεγαλύτερες από τις οριακές τιμές που προβλέπονται στις νομοθετικές ρυθμίσεις. Στοιχεία σχετικά με την τοξικότητα της ελεγχόμενης ουσίας είναι δυνατόν να συναχθούν από τα αποτελέσματα δοκιμών που έχουν διεξαχθεί με ενώσεις, μίγματα ή προϊόντα ανάλογης χημικής δομής, λαμβάνοντας υπόψη την ταυτότητα και την εκατοστιαία αναλογία των σημαντικών από τοξικολογική άποψη συστατικών. Στις περιπτώσεις όπου δεν υπάρχουν καθόλου ή υπάρχουν ελάχιστα στοιχεία για την τοξικότητα της ελεγχόμενης ουσίας ή εάν η τελευταία αναμένεται να είναι τοξική, πρέπει να διεξάγεται η κυρίως δοκιμή. Μία αναγνωριστική μελέτη με αρχική δόση 2000 mg/kg (ή κατ’ εξαίρεση 5000 mg/kg), ακολουθούμενη από τη χορήγηση της ίδιας δόσης σε τέσσερα επιπλέον ζώα, με εφαρμογή της συνήθους διαδικασίας, συνιστά οριακή δοκιμή για τους σκοπούς της παρούσας κατευθυντήριας γραμμής.
1.6 ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ Τα ζώα εξετάζονται το καθένα χωριστά τουλάχιστον μία φορά εντός των πρώτων 30 λεπτών από τη χορήγηση της ουσίας και τακτικά στη διάρκεια του πρώτου 24ώρου, με ιδιαίτερη προσοχή στις πρώτες 4 ώρες. Στη συνέχεια, εξετάζονται καθημερινά για 14 ημέρες συνολικά, εκτός εάν χρειαστεί να αποσυρθούν από τη μελέτη και να θανατωθούν με ευθανασία για να μην υποφέρουν ή εάν βρεθούν νεκρά. Η διάρκεια της περιόδου παρατήρησης δεν πρέπει πάντως να είναι αυστηρά καθορισμένη, αλλά να συναρτάται με τις τοξικές αντιδράσεις, το χρόνο εκδήλωσής τους και το χρόνο ανάρρωσης· συνεπώς, μπορεί να παρατείνεται, εφόσον κρίνεται απαραίτητο. Ο χρόνος εμφάνισης και εξαφάνισης των συμπτωμάτων τοξικότητας έχει μεγάλη σημασία, ιδίως στις περιπτώσεις όπου αυτά τείνουν να εκδηλώνονται με καθυστέρηση (11). Όλες οι παρατηρήσεις καταγράφονται συστηματικά σε χωριστό αρχείο για κάθε ζώο. Εάν τα ζώα εξακολουθούν να παρουσιάζουν συμπτώματα τοξικότητας, απαιτούνται συμπληρωματικές παρατηρήσεις, μεταξύ των οποίων αλλαγές στο δέρμα και στο τρίχωμα, στους οφθαλμούς και στους βλεννογόνους, επίσης στη λειτουργία του αναπνευστικού και του κυκλοφοριακού συστήματος, του Κ.Ν.Σ και του αυτόνομου, καθώς και στη σωματική κινητικότητα και τη συμπεριφορά. Η προσοχή πρέπει να εστιάζεται στην παρατήρηση των σημείων τρόμου, σπασμών, σιελόρροιας, διάρροιας, υπνηλίας, λήθαργου και κώματος. Πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι γενικές αρχές και τα κριτήρια που συνοψίζονται στο καθοδηγητικό έγγραφο για τα τελικά σημεία ευθανασίας (8). Τα ετοιμοθάνατα ζώα και όσα εμφανίζουν ισχυρούς πόνους ή διαρκή σημεία έντονης δυσφορίας θα πρέπει να θανατώνονται με ευθανασία Ο χρόνος θανάτου των ζώων που θανατώνονται για να μην υποφέρουν ή βρίσκονται νεκρά θα πρέπει να σημειώνεται με τη μεγαλύτερη δυνατή ακρίβεια.
1.6
1.6.1 Βάρος σώματος Το βάρος κάθε ζώου πρέπει να μετριέται λίγο πριν από τη χορήγηση της ελεγχόμενης ουσίας και, μετά, τουλάχιστον ανά εβδομάδα. Πρέπει να υπολογίζονται οι αλλαγές βάρους και να καταγράφονται. Στο τέλος της δοκιμής, τα ζώα που έχουν επιζήσει ζυγίζονται και έπειτα θανατώνονται με ευθανασία·.
1.6.2 Παθολογία Σε όλα τα ζώα της δοκιμής (συμπεριλαμβανομένων εκείνων που πεθαίνουν στη διάρκεια της μελέτης ή αποσύρονται από τη μελέτη για να μην υποφέρουν τα ζώα) πρέπει να διενεργείται νεκροψία-νεκροτομία. Για κάθε ζώο, πρέπει να καταγράφονται όλες οι μακροσκοπικές παθολογικές αλλοιώσεις. Στα ζώα που επιζούν 24 ή περισσότερες ώρες μετά τη χορήγηση της πρώτης δόσης, μπορεί επιπλέον να πραγματοποιείται μικροσκοπική εξέταση των οργάνων που εμφανίζουν μακροσκοπικώς παθολογικές αλλοιώσεις, καθώς από την εξέταση αυτή ενδέχεται να προκύψουν χρήσιμα στοιχεία.
2 ΔΕΔΟΜΕΝΑ Πρέπει να παρέχονται τα δεδομένα για κάθε ζώο χωριστά.. Επιπλέον, το σύνολο των δεδομένων πρέπει να συνοψίζεται σε πίνακα, όπου θα εμφαίνονται, για κάθε ομάδα της δοκιμής, ο αριθμός ζώων που χρησιμοποιήθηκαν, ο αριθμός ζώων που παρουσίασαν συμπτώματα τοξικότητας, ο αριθμός ζώων που βρέθηκαν νεκρά στη διάρκεια της δοκιμής ή θανατώθηκαν για να μην υποφέρουν, ο χρόνος θανάτου κάθε ζώου, περιγραφή και εξέλιξη των τοξικών επιδράσεων και κατά πόσον ήταν ανατάξιμες, καθώς και τα ευρήματα από τη νεκροψία.
3 ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΕΩΝ
3
3.1 ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ Η έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία, κατά περίπτωση:
Ελεγχόμενη ουσία:
φυσική κατάσταση, καθαρότητα και, εφόσον έχει σημασία, φυσικές και χημικές ιδιότητες (συμπεριλαμβανομένης της ισομερείωσης)·
στοιχεία ταυτότητας, μεταξύ των οποίων τον αριθμό CAS.
Φορέας (κατά περίπτωση):
αιτιολόγηση της επιλογής άλλου φορέα εκτός από νερό.
Πειραματόζωα:
είδος/φυλή που χρησιμοποιήθηκε·
μικροβιολογική κατάσταση των ζώων, εφόσον είναι γνωστή·
αριθμό, ηλικία και φύλο των ζώων (όπου συμπεριλαμβάνεται, κατά περίπτωση, αιτιολόγηση της χρήσης αρσενικών αντί θηλυκών ζώων)·
προέλευση των ζώων, συνθήκες στέγασης, σιτηρέσιο κλπ..
Συνθήκες δοκιμής:
λεπτομέρειες για το παρασκεύασμα της ελεγχόμενης ουσίας, συμπεριλαμβανομένης της φυσικής κατάστασης στην οποία χορηγήθηκε·
λεπτομέρειες για τη χορήγηση των δόσεων, συμπεριλαμβανομένων των όγκων τους και του χρόνου χορήγησης·
λεπτομέρειες για την ποιότητα της τροφής και του νερού (μεταξύ άλλων, τύπος/προέλευση του σιτηρεσίου, προέλευση του νερού)·
αιτιολόγηση της επιλογής της αρχικής δόσης.
Αποτελέσματα:
πίνακα με τα δεδομένα απόκρισης και τα επίπεδα δόσης για κάθε ζώο (δηλ. ζώα που παρουσίασαν συμπτώματα τοξικότητας, συμπεριλαμβανομένης της θνησιμότητας, φύση, σοβαρότητα και διάρκεια των επιδράσεων)·
πίνακα με τα βάρη των ζώων και τις μεταβολές τους·
για κάθε ζώο, βάρος την ημέρα χορήγησης της δόσης, κατόπιν ανά εβδομάδα και, τέλος, κατά το χρόνο θανάτου ή θανάτωσης·
ημερομηνία και ώρα θανάτου, εάν επήλθε νωρίτερα από την προγραμματισμένη θανάτωση·
για κάθε ζώο, το χρόνο εκδήλωσης και την εξέλιξη των συμπτωμάτων τοξικότητας, καθώς και το κατά πόσον αυτά ήταν ανατάξιμα·
για κάθε ζώο, ευρήματα από τη νεκροψία και την ιστολογική εξέταση, εφόσον υπάρχουν.
Συζήτηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
Συμπεράσματα.
4(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P.-(1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure.-Hum. . Exp. Toxicol., 21,183-196. ΟΟΣΑ (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris ΟΟΣΑ (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. ΟΟΣΑ (1998) Εναρμονισμένο Ολοκληρωμένο Σύστημα Ταξινόμησης Κινδύνων για τις Επιδράσεις των Χημικών Ουσιών στην Υγεία του ανθρώπου και στο Περιβάλλον, το οποίο εγκρίθηκε από την 28η κοινή συνεδρίαση της επιτροπής χημικών προϊόντων και της ομάδας εργασίας για τα χημικά προϊόντα, το Νοέμβριο του 1998, Μέρος 2, σ. 11 [http://webnetl .oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231. Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.
Β.1β. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΑΠΟ ΤΟ ΣΤΟΜΑ — ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΩΝ ΚΛΑΣΕΩΝ ΟΞΕΙΑΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ
Β.1β.
1. Η ΜΕΘΟΔΟΣ Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη την κατευθυντήρια γραμμή ΤG 423 (2001) του ΟΟΣΑ
1.
1.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η μέθοδος των οξείας τοξικότητας (1) που περιγράφεται στην παρούσα κατευθυντήρια γραμμή συνίσταται σε μια βαθμιδωτή διαδικασία, σε κάθε στάδιο της οποίας χρησιμοποιούνται 3 ζώα του ίδιου φύλου. Για να είναι δυνατόν να κριθεί η οξεία τοξικότητα της ελεγχόμενης ουσίας, χρειάζονται κατά μέσον όρο 2.4 βαθμίδες, ανάλογα με τη θνησιμότητα ή/και την κατάσταση ετοιμοθάνατων των ζώων. Η διαδικασία διαθέτει επαναληπτικότητα, απαιτεί πολύ μικρό αριθμό ζώων και παρέχει ανάλογες δυνατότητες ταξινόμησης των ουσιών με τις άλλος μεθόδους δοκιμών οξείας τοξικότητας. Η μέθοδος των κλάσεων οξείας τοξικότητας βασίζεται σε βιομετρικές αξιολογήσεις (2) (3) (4) (5) με χρήση καθορισμένων δόσεων, οι οποίες διαφέρουν επαρκώς μεταξύ τους, ώστε να επιτρέπουν την ιεράρχηση των ελεγχόμενων ουσιών για τους σκοπούς της ταξινόμησης και της εκτίμησης κινδύνου. Η μέθοδος, του υιοθετήθηκε το 1996, αποτέλεσε αντικείμενο διεξοδικών μελετών ελέγχων της αξιοπιστίας in vivo, τόσο σε εθνική (6) όσο και σε διεθνή κλίμακα (7), έναντι δεδομένων σχετικών με την LD50 που ελήφθησαν από τη βιβλιογραφία. Οδηγίες για την επιλογή της καταλληλότερης μεθόδου δοκιμών σε κάθε δεδομένη περίπτωση παρέχονται από το καθοδηγητικό έγγραφο Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8), το οποίο περιέχει επίσης συμπληρωματικές πληροφορίες σχετικά με την εφαρμογή και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της μεθόδου δοκιμών Β.1β. Δεν απαιτείται να χορηγούνται οι ελεγχόμενες ουσίες σε δόσεις που είναι γνωστό ότι προκαλούν ισχυρούς πόνους και έντονη δυσφορία, εξαιτίας της διαβρωτικής ή πολύ ερεθιστικής δράσης των ουσιών. Τα ετοιμοθάνατα ζώα, καθώς και εκείνα που παρουσιάζουν σαφή σημεία πόνου ή έντονης και διαρκούς δυσφορίας, θανατώνονται με ευθανασία και λαμβάνονται υπόψη στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων με τον ίδιο τρόπο όπως τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη δοκιμή. Τα κριτήρια για τη λήψη της απόφασης να θανατωθούν ετοιμοθάνατα ή βαρέως πάσχοντα ζώα, καθώς και οι οδηγίες για την αναγνώριση των ενδείξεων προβλέψιμου ή επικειμένου θανάτου, αποτελούν το αντικείμενο χωριστού καθοδηγητικού εγγράφου (9). Στη μέθοδο χρησιμοποιούνται προκαθορισμένες δόσεις, ενώ τα αποτελέσματα της επιτρέπουν την ιεράρχηση και την ταξινόμηση των ουσιών σύμφωνα με το Παγκόσμιο Εναρμονισμένο Σύστημα Ταξινόμησης των χημικών ουσιών που προκαλούν οξεία τοξικότητα (10). Η μέθοδος αυτή δεν έχει μελετηθεί, καταρχήν, για να επιτρέπει του ακριβή υπολογισμό της LD50 μόνον στις περιπτώσεις όπου δύο τουλάχιστον δόσεις έχουν ως αποτέλεσμα θνησιμότητα μεγαλύτερη από 0 % και μικρότερη από 100 %. Η χρήση επιλεγμένων προκαθορισμένων δόσεων, ανεξαρτήτως της ελεγχόμενης ουσίας, σε συνδυασμό με τη ρητή σύνδεση της ταξινόμησης με τον αριθμό των ζώων του διαπιστώνεται ότι βρίσκονται σε μια σειρά διαφορετικών καταστάσεων, βελτιώνει τη συνέπεια των εκθέσεων δοκιμής την επαναληπτικότητα της μεθόδου μεταξύ των εργαστηρίων. Πριν από τη διεξαγωγή της μελέτης, το εργαστήριο δοκιμών θα πρέπει να λαμβάνει υπόψη όλα τα διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με την ελεγχόμενη ουσία, μεταξύ των οποίων την ταυτότητα και τη χημική δομή της, τις φυσικές και χημικές ιδιότητές της, τα αποτελέσματα τυχόν άλλων δοκιμών της ουσίας in vitro ή in vivo, τα τοξικολογικά δεδομένα του αφορούν ουσίες ανάλογης χημικής δομής, καθώς και την ή τις προβλεπόμενες χρήσεις, της ουσίας. Οι πληροφορίες αυτές είναι απαραίτητες για να διασφαλίζεται ότι η διεξαγωγή της δοκιμής έχει ουσιαστική σημασία για την προστασία της υγείας του ανθρώπου και βοηθούν στην επιλογή της καταλληλότερης αρχικής δόσης.
1.2 ΟΡΙΣΜΟΙ Οξεία τοξικότητα από το στόμα: οι δυσμενείς επιδράσεις που παρατηρούνται μετά τη χορήγηση από το στόμα μίας δόσης της ουσίας εφάπαξ ή πολλών δόσεων εντός 24ώρου. Όψιμος θάνατος: η περίπτωση όπου ένα ζώο δεν πεθαίνει ούτε είναι ετοιμοθάνατο εντός 48 ωρών, αλλά πεθαίνει αργότερα στη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης, που διαρκεί 14 ημέρες. Δόση: η χορηγούμενη ποσότητα ελεγχόμενης ουσίας· εκφράζεται σε βάρος ελεγχόμενης ουσίας ανά μονάδα βάρους του πειραματόζωου (π.χ. mg/kg). GHS: παγκόσμιο εναρμονισμένο σύστημα ταξινόμησης για τις χημικές ουσίες και τα μίγματά τους. Πρόκειται για κοινή πρωτοβουλία του ΟΟΣΑ (υγεία του ανθρώπου και περιβάλλον), της Επιτροπής Εμπειρογνωμόνων για τις Μεταφορές Επικίνδυνων Εμπορευμάτων του ΟΗΕ (φυσικές και χημικές ιδιότητες) και της Διεθνούς Οργάνωσης Εργασίας (ανακοίνωση κινδύνων), με συντονιστή το Πρόγραμμα Διεθνών Οργανισμών για την ορθή Διαχείριση των Χημικών Προϊόντων (ΙΟΜC). Επικείμενος θάνατος: η περίπτωση όπου αναμένεται κατάσταση ετοιμοθάνατου ή θάνατος πριν από τον επόμενο προγραμματισμένο χρόνο παρατήρησης. Μεταξύ των ενδείξεων επικείμενου θανάτου στα τρωκτικά περιλαμβάνονται οι σπασμοί, η πλάγια θέση, η κατάκλιση και ο τρόμος [για περισσότερες λεπτομέρειες, βλέπε καθοδηγητικό έγγραφο για τα τελικά σημεία ευθανασίας (8)]. LD50(διάμεσος θανατηφόρου δόσης): η στατιστικά λαμβανόμενη τιμή εφάπαξ δόσης μιας ουσίας που αναμένεται να προκαλέσει το θάνατο του 50 % των πειραματόζωων, όταν χορηγηθεί από το στόμα. Η τιμή LD50 εκφράζεται σε βάρος ελεγχόμενης ουσίας ανά μονάδα βάρους του πειραματόζωου (mg/kg). Οριακή δόση: μια δόση που αποτελεί το ανώτατο όριο για τη δοκιμή (2000 ή 5000 mg/kg). Κατάσταση ετοιμοθάνατου: η κατάσταση πολύ κοντά στο θάνατο ή η αδυναμία επιβίωσης ακόμη και μετά από θεραπευτική αγωγή [για περισσότερες λεπτομέρειες, βλέπε καθοδηγητικό έγγραφο για τα τελικά σημεία ευθανασίας (8)]. Προβλέψιμος θάνατος: η εμφάνιση κλινικών συμπτωμάτων που αποτελούν ένδειξη μελλοντικού θανάτου σε γνωστό χρόνο πριν από τον προγραμματισμένο τερματισμό του πειράματος, λόγου χάριν η αδυναμία του πειραματόζωου να φθάσει την τροφή ή το νερό [για περισσότερες λεπτομέρειες, βλέπε καθοδηγητικό έγγραφο για τα τελικά σημεία ευθανασίας (8)].
1.3 ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ Η αρχή της μεθόδου συνίσταται στη συγκέντρωση επαρκών στοιχείων για την οξεία τοξικότητα της ελεγχόμενης ουσίας, ώστε να είναι δυνατή η ταξινόμηση της, με βαθμιδωτή διαδικασία, σε κάθε στάδιο της οποίας χρησιμοποιείται ο ελάχιστος δυνατός αριθμός ζώων. Μία από τις προκαθορισμένες δόσεις ουσίας χορηγείται από το στόμα σε ομάδα πειραματόζωων. Η διαδικασία δοκιμής είναι βαθμιδωτή και σε κάθε στάδιό της χρησιμοποιούνται τρία ζώα του ίδιου φύλου (συνήθως θηλυκά). Η απουσία ή παρουσία θνησιμότητας των ζώων συνδεόμενης με την ουσία σε μια δεδομένη βαθμίδα, καθορίζει ποια θα είναι η επόμενη, δηλαδή: Οι λεπτομέρειες της διαδικασίας δοκιμών παρατίθενται στο παράρτημα 1. Η μέθοδος επιτρέπει τη λήψη απόφασης σχετικά με την κατάταξη της ελεγχόμενης ουσίας σε μία από μια σειρά κλάσεων τοξικότητας, οι οποίες ορίζονται από καθορισμένες κρίσιμες τιμές LD50.
δεν χρειάζονται άλλες δοκιμές,
χορήγηση της ίδιας δόσης σε τρία επιπλέον ζώα,
χορήγηση της αμέσως υψηλότερης ή χαμηλότερης δόσης σε τρία επιπλέον ζώα.
1.4 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ
1.4
1.4.1 Επιλογή είδους ζώων Το προτιμώμενο είδος τρωκτικού είναι ο επίμυς, αλλά μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα είδη τρωκτικών. Κατά κανόνα χρησιμοποιούνται θηλυκά ζώα (7), επειδή από τη βιβλιογραφική έρευνα για τις συμβατικές δοκιμές LD50 προκύπτει ότι, αν και οι διαφορές ευπάθειας μεταξύ των δύο φύλων είναι συνήθως ελάχιστες, όταν παρατηρούνται διαφορές, τα θηλυκά ζώα είναι κατά κανόνα ελαφρώς πιο ευπαθή (10). Εάν ωστόσο οι γνώσεις σχετικά με τις τοξικολογικές ή τοξικοκινητικές ιδιότητες χημικών ουσιών με ανάλογη χημική δομή συνηγορούν υπέρ του ότι τα αρσενικά ζώα είναι πιθανώς πιο ευπαθή, τότε θα πρέπει να προτιμάται αυτό το φύλο. Όταν η δοκιμή διεξάγεται σε αρσενικά ζώα, η επιλογή αυτή θα πρέπει να αιτιολογείται επαρκώς. Πρέπει να χρησιμοποιούνται υγιή νεαρά ενήλικα ζώα που ανήκουν σε φυλές κοινής εργαστηριακής χρήσης. Τα θηλυκά ζώα πρέπει να μην έχουν ποτέ γεννήσει ούτε να εγκυμονούν. Κατά την έναρξη της χορήγησης των δόσεων, η ηλικία κάθε ζώου πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 8 και 12 εβδομάδων και το βάρος του να μην αποκλίνει περισσότερο από ± 20 % από το μέσο βάρος των ζώων στα οποία έχει ενδεχομένως χορηγηθεί η ουσία σε προηγούμενο στάδιο.
1.4.2 Συνθήκες στέγασης και διατροφής Η θερμοκρασία του θαλάμου πειραματόζωων πρέπει να είναι 22 oC (± 3 oC). Αν και η σχετική υγρασία πρέπει να είναι τουλάχιστον 30 % και, κατά προτίμηση, να μην υπερβαίνει το 70 %, εκτός από τις περιόδους καθαρισμού του θαλάμου, εν τούτοις ο στόχος θα πρέπει να είναι μια τιμή 50-60 %. Ο φωτισμός πρέπει να είναι τεχνητός, με εναλλαγή φωτός-σκότους ανά 12ωρο. Για τη διατροφή των ζώων μπορούν να χρησιμοποιούνται τα συνήθη εργαστηριακά σιτηρέσια, με απεριόριστη παροχή πόσιμου νερού. Τα ζώα μπορούν να τοποθετούνται ομαδικά σε κλουβιά κατά δόση, αλλά ο αριθμός ζώων σε κάθε κλουβί δεν πρέπει να παρεμποδίζει την ακριβή παρατήρηση του καθενός ζώου.
1.4.3 Προετοιμασία των ζώων Τα ζώα επιλέγονται τυχαία, σημαίνονται με τρόπο που επιτρέπει την αναγνώριση του καθενός και παραμένουν στα κλουβιά τους τουλάχιστον για πέντε ημέρες πριν από την έναρξη της χορήγησης των δόσεων, ώστε να εγκλιματιστούν στις εργαστηριακές συνθήκες.
1.4.4 Παρασκευή των δόσεων Ο χορηγούμενος όγκος της ελεγχόμενης ουσίας πρέπει κατά κανόνα να διατηρείται σταθερός σε όλη τη σειρά των δόσεων της δοκιμής με αλλαγή της συγκέντρωσης του χορηγούμενου παρασκευάσματος Όταν ωστόσο πρόκειται να ελεγχθεί ένα υγρό τελικό προϊόν ή μίγμα, η χρήση της ελεγχόμενης ουσίας χωρίς αραίωση, δηλαδή σε σταθερή συγκέντρωση, μπορεί να είναι πιο ενδεδειγμένη για τη μετέπειτα εκτίμηση των κινδύνων, ενώ αποτελεί και απαίτηση ορισμένων αρμόδιων για τις νομοθετικές ρυθμίσεις Αρχών. Σε κάθε περίπτωση, δεν επιτρέπεται υπέρβαση του μέγιστου όγκου χορηγούμενης δόσης. Ο μέγιστος όγκος υγρού που μπορεί να χορηγηθεί εφάπαξ εξαρτάται από το μέγεθος του πειραματόζωου. Στα τρωκτικά, ο όγκος δεν πρέπει κατά κανόνα να υπερβαίνει το 1 ml/100g βάρους σώματος, αλλά στην περίπτωση των υδατικών διαλυμάτων μπορεί να εξετασθεί το ενδεχόμενο χορήγησης 2 ml/100g βάρους σώματος. Όσον αφορά τη μορφή του χορηγούμενου παρασκευάσματος, συνιστάται να χρησιμοποιούνται, κατά το δυνατόν, υδατικά διαλύματα/εναιωρήματα/γαλακτώματα, με δεύτερα κατά σειρά προτίμησης τα διαλύματα/εναιωρήματα/γαλακτώματα σε έλαιο (π.χ. αραβοσιτέλαιο) και τελευταία τα διαλύματα σε άλλους φορείς. Σε περίπτωση χρήσης άλλου φορέα πλην του νερού, πρέπει να είναι γνωστές οι τοξικολογικές ιδιότητές του. Οι δόσεις πρέπει να παρασκευάζονται λίγο πριν από τη χορήγηση, εκτός εάν η σταθερότητα του παρασκευάσματος στο χρονικό διάστημα εντός του οποίου πρόκειται να χρησιμοποιηθεί είναι γνωστή και έχει κριθεί αποδεκτή.
1.5 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΔΟΚΙΜΗΣ
1.5
1.5.1 Χορήγηση των δόσεων Η ελεγχόμενη ουσία χορηγείται εφάπαξ με τη βοήθεια ρινογαστρικού καθετήρα σίτισης ή κατάλληλου σωλήνα διασωλήνωσης. Στη σπάνια περίπτωση όπου η εφάπαξ χορήγηση δεν είναι εφικτή, η δόση μπορεί να χορηγηθεί τμηματικά εντός περιόδου που δεν υπερβαίνει τις 24 ώρες. Πριν από τη χορήγηση των δόσεων, τα ζώα υποβάλλονται σε νηστεία (π.χ. διακοπή της σίτισης, αλλά όχι της παροχής νερού για όλη την προηγούμενη νύκτα, όταν χρησιμοποιούνται επίμυες, ή για 34 ώρες, όταν χρησιμοποιούνται ποντικοί). Μετά την περίοδο νηστείας, τα ζώα ζυγίζονται και τους χορηγείται η ελεγχόμενη ουσία. Η διακοπή της σίτισης μπορεί να συνεχιστεί και μετά τη χορήγηση της ουσίας για 3-4 ώρες, προκειμένου για επίμυες, ή 1-2 ώρες, προκειμένου για ποντικούς. Σε περίπτωση τμηματικής χορήγησης της δόσης εντός ορισμένου χρόνου, μπορεί να χρειαστεί να δοθεί στα ζώα τροφή και νερό, ανάλογα με τη διάρκεια του συγκεκριμένου χρονικού διαστήματος.
1.5.2 Αριθμός ζώων και επίπεδα δόσεων Σε κάθε βαθμίδα χρησιμοποιούνται τρία ζώα. Η αρχική δόση επιλέγεται μεταξύ τεσσάρων προκαθορισμένων επιπέδων, που είναι τα 5, 50, 300 και 2000 mg/kg βάρους σώματος. Η αρχική δόση θα πρέπει να είναι το επίπεδο με τις μεγαλύτερες πιθανότητες να προκαλέσει το θάνατο ορισμένων από τα ζώα στα οποία θα χορηγηθεί. Η διαδικασία που θα πρέπει να εφαρμόζεται για κάθε επίπεδο αρχικής δόσης εμφαίνεται στα διαγράμματα ροής του παραρτήματος 1. Επιπλέον, το παράρτημα 4 παρέχει καθοδήγηση για την ταξινόμηση κατά το σύστημα της ΕΕ μέχρι να εφαρμοστεί το νέο GHS. Όταν από τα διαθέσιμα στοιχεία συνάγεται μικρή πιθανότητα θνησιμότητας στο υψηλότερο επίπεδο αρχικής δόσης (2000 mg/kg βάρους σώματος), θα πρέπει να διεξάγεται οριακή δοκιμή. Εάν δεν υπάρχουν στοιχεία για την ουσία που πρόκειται να ελεγχθεί, συνιστάται να χρησιμοποιείται αρχική δόση 300 mg/kg βάρους σώματος για λόγους προστασίας των ζώων. Το χρονικό διάστημα μεταξύ των δόσεων καθορίζεται με την έναρξη, τη διάρκεια και τη σοβαρότητα των συμπτωμάτων τοξικότητας. Η χορήγηση της επόμενης δόσης θα πρέπει να καθυστερεί μέχρις ότου είναι βέβαιο ότι τα ζώα που έλαβαν την προηγούμενη θα επιζήσουν. Κατ’ εξαίρεση, και μόνον εφόσον το επιβάλλουν συγκεκριμένες ανάγκες νομοθετικής ρύθμισης, μπορεί να εξεταστεί η χρήση ενός επιπλέον ανώτατου επιπέδου δόσης 5000 mg/kg (βλέπε παράρτημα 2). Για λόγους προστασίας των ζώων, η διεξαγωγή δοκιμών σε ζώα με δόσεις της κλίμακας που ορίζει την κατηγορία 5 του GHS (2000-5000 mg/kg) δεν συνιστάται και θα πρέπει να εξετάζεται μόνον εφόσον υπάρχουν μεγάλες πιθανότητες τα αποτελέσματα των δοκιμών αυτών να έχουν άμεση, ουσιαστική σημασία για την προστασία της υγείας του ανθρώπου ή των ζώων ή για την προστασία του περιβάλλοντος.
1.5.3 Οριακή δοκιμή Η οριακή δοκιμή χρησιμοποιείται κυρίως στις περιπτώσεις όπου ο ερευνητής έχει στη διάθεσή του στοιχεία, από τα οποία προκύπτει ότι η ελεγχόμενη ουσία μάλλον δεν είναι τοξική, δηλαδή ότι έχει τοξικές επιδράσεις μόνον εάν ληφθεί σε δόσεις μεγαλύτερες από τις οριακές τιμές που προβλέπονται στις νομοθετικές ρυθμίσεις. Στοιχεία σχετικά με την τοξικότητα της ελεγχόμενης ουσίας είναι δυνατόν να συναχθούν από τα αποτελέσματα δοκιμών που έχουν διεξαχθεί με ενώσεις, μίγματα ή προϊόντα ανάλογης χημικής δομής, λαμβάνοντας υπόψη την ταυτότητα και την εκατοστιαία αναλογία των σημαντικών από τοξικολογική άποψη συστατικών. Στις περιπτώσεις όπου δεν υπάρχουν καθόλου ή υπάρχουν ελάχιστα στοιχεία για την τοξικότητα της ελεγχόμενης ουσίας ή εάν η τελευταία αναμένεται να είναι τοξική, πρέπει να διεξάγεται η κυρίως δοκιμή. Μπορεί να διεξαχθεί οριακή δοκιμή με δόση 2000 mg/kg βάρους σώματος σε έξι ζώα (τρία ανά βαθμίδα). Κατ' εξαίρεση, μπορεί να διεξαχθεί οριακή δοκιμή με δόση 5000 mg/kg σε τρία ζώα (βλ. παράρτημα 2). Εάν διαπιστωθεί θνησιμότητα συνδεόμενη με την ελεγχόμενη ουσία, μπορεί να χρειαστεί να διεξαχθεί δοκιμή με το αμέσως χαμηλότερο επίπεδο δόσης.
1.6 ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ Τα ζώα εξετάζονται το καθένα χωριστά τουλάχιστον μία φορά εντός των πρώτων 30 λεπτών από τη χορήγηση της ουσίας και τακτικά στη διάρκεια του πρώτου 24ώρου, με ιδιαίτερη προσοχή στις πρώτες 4 ώρες. Στη συνέχεια, εξετάζονται καθημερινά για 14 ημέρες συνολικά, εκτός εάν χρειαστεί να αποσυρθούν από τη μελέτη και να θανατωθούν με ευθανασία για να μην υποφέρουν ή εάν βρεθούν νεκρά. Η διάρκεια της περιόδου παρατήρησης δεν πρέπει πάντως να είναι αυστηρά καθορισμένη, αλλά να συναρτάται με τις τοξικές αντιδράσεις, το χρόνο έναρξής τους και το χρόνο ανάρρωσης· συνεπώς, μπορεί να παρατείνεται, εφόσον κρίνεται απαραίτητο. Ο χρόνος εμφάνισης και εξαφάνισης των συμπτωμάτων τοξικότητας έχει μεγάλη σημασία, ιδίως στις περιπτώσεις όπου αυτά τείνουν να εκδηλώνονται με καθυστέρηση (11). Όλες οι παρατηρήσεις καταγράφονται συστηματικά σε χωριστό αρχείο για κάθε ζώο. Εάν τα ζώα εξακολουθούν να παρουσιάζουν συμπτώματα τοξικότητας, απαιτούνται συμπληρωματικές παρατηρήσεις, μεταξύ των οποίων αλλαγές στο δέρμα και στο τρίχωμα, στους οφθαλμούς και στους βλεννογόνους, επίσης στη λειτουργία του αναπνευστικού και του κυκλοφοριακού συστήματος, του Κ.Ν.Σ και του (αυτόνομου), καθώς και στη σωματική κινητικότητα και τη συμπεριφορά. Η προσοχή πρέπει να εστιάζεται σε παρατηρήσεις των σημείων τρόμου, σπασμών, σιελόρροιας, διάρροιας, υπνηλίας, λήθαργου και κώματος. Πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι γενικές αρχές και τα κριτήρια που συνοψίζονται στο καθοδηγητικό έγγραφο για τα τελικά σημεία ευθανασίας (9). Τα ετοιμοθάνατα ζώα και όσα παρουσιάζουν ισχυρούς πόνους ή διαρκή σημεία έντονης δυσφορίας θα πρέπει να θανατώνονται με ευθανασία. Ο χρόνος θανάτου των ζώων που θανατώνονται για να μην υποφέρουν ή βρίσκονται νεκρά θα πρέπει να σημειώνεται με τη μεγαλύτερη δυνατή ακρίβεια.
1.6
1.6.1 Βάρος σώματος Το βάρος κάθε ζώου πρέπει να μετριέται λίγο πριν από τη χορήγηση της ελεγχόμενης ουσίας και, κατόπιν, τουλάχιστον ανά εβδομάδα. Πρέπει να υπολογίζονται οι αλλαγές βάρους και να καταγράφονται. Στο τέλος της δοκιμής, τα ζώα που έχουν επιζήσει ζυγίζονται και έπειτα θανατώνονται με ευθανασία.
1.6.2 Παθολογία Σε όλα τα ζώα της δοκιμής (συμπεριλαμβανομένων εκείνων που πεθαίνουν στη διάρκεια της δοκιμής ή αποσύρονται από τη μελέτη για να μην υποφέρουν) πρέπει να διενεργείται μη λεπτομερειακή νεκροψία-νεκροτομία. Για κάθε ζώο, πρέπει να καταγράφονται όλες οι μακροσκοπικές παθολογικές αλλοιώσεις. Στα ζώα που επιζούν 24 ή περισσότερες ώρες μετά τη χορήγηση της πρώτης δόσης, μπορεί επιπλέον να πραγματοποιείται μικροσκοπική εξέταση των οργάνων που εμφανίζουν μακροσκοπικώς παθολογικές αλλοιώσεις, καθώς από την εξέταση αυτή ενδέχεται να προκύψουν χρήσιμα στοιχεία.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Πρέπει να παρέχονται τα δεδομένα για κάθε ζώο χωριστά.. Επιπλέον, το σύνολο των δεδομένων πρέπει να συνοψίζεται σε πίνακα, όπου θα εμφαίνονται, για κάθε ομάδα της δοκιμής, ο αριθμός ζώων που χρησιμοποιήθηκαν, ο αριθμός ζώων που παρουσίασαν συμπτώματα τοξικότητας, ο αριθμός ζώων που βρέθηκαν νεκρά στη διάρκεια της δοκιμής ή θανατώθηκαν για να μην υποφέρουν, ο χρόνος θανάτου κάθε ζώου, περιγραφή και εξέλιξη των τοξικών επιδράσεων και κατά πόσον ήταν ανατάξιμες, καθώς και τα ευρήματα από τη νεκροψία.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΕΩΝ
3.
3.1 Έκθεση δοκιμής Η έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία, κατά περίπτωση:
Ελεγχόμενη ουσία:
φυσική κατάσταση, καθαρότητα και, εφόσον έχει σημασία, φυσικές και χημικές ιδιότητες (συμπεριλαμβανομένης της ισομερείωσης)·
στοιχεία ταυτότητας, μεταξύ των οποίων τον αριθμό CAS.
Φορέας (κατά περίπτωση):
αιτιολόγηση της επιλογής άλλου φορέα εκτός από νερό.
Πειραματόζωα:
είδος/φυλή που χρησιμοποιήθηκε·
μικροβιολογική κατάσταση των ζώων, εφόσον είναι γνωστή·
αριθμό, ηλικία και φύλο των ζώων (όπου συμπεριλαμβάνεται, κατά περίπτωση, αιτιολόγηση της χρήσης αρσενικών αντί θηλυκών ζώων)·
προέλευση των ζώων, συνθήκες στέγασης, σιτηρέσιο κλπ..
Συνθήκες δοκιμής:
λεπτομέρειες για τον τύπο της ελεγχόμενης ουσίας, συμπεριλαμβανομένης της φυσικής κατάστασης στην οποία χορηγήθηκε·
λεπτομέρειες για τη χορήγηση της ελεγχόμενης ουσίας, συμπεριλαμβανομένων των όγκων και του χρόνου χορήγησης των δόσεων·
λεπτομέρειες για την ποιότητα της τροφής και του νερού (μεταξύ άλλων, τύπος/προέλευση του σιτηρεσίου, προέλευση του νερού)·
αιτιολόγηση της επιλογής της αρχικής δόσης.
Αποτελέσματα:
πίνακα με τα δεδομένα απόκρισης και τα επίπεδα δόσης για κάθε ζώο (δηλ. ζώα που παρουσίασαν συμπτώματα τοξικότητας, συμπεριλαμβανομένης της θνησιμότητας, φύση, σοβαρότητα και διάρκεια των επιδράσεων)·
πίνακα με τα βάρη των ζώων και τις μεταβολές τους·
για κάθε ζώο, βάρος την ημέρα χορήγησης της δόσης, κατόπιν ανά εβδομάδα και, τέλος, κατά το χρόνο θανάτου ή θανάτωσης·
ημερομηνία και ώρα θανάτου, εάν επήλθε νωρίτερα από την προγραμματισμένη θανάτωση·
για κάθε ζώο, το χρόνο εκδήλωσης και την εξέλιξη των συμπτωμάτων τοξικότητας, καθώς και το κατά πόσον αυτά ήταν ανατάξιμα·
για κάθε ζώο, ευρήματα από τη νεκροψία και και τα ιστοπαθολογικά ευρήματα, εφόσον υπάρχουν.
Συζήτηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων
Συμπεράσματα.
4(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86 Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610 Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134 Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method — An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment Ν 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl .oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel Κ A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
Β.2. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ (ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ)
Β.2.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1 ΕΙΣΑΓΩΓΉ Είναι χρήσιμο να έχουμε προκαταρκτικές πληροφορίες για την κατανομή του μεγέθους σωματιδίων, την τάση ατμών, το σημείο τήξεως, το σημείο ζέσεως, το σημείο αναφλέξεως και την εκκρηκτικότητα (αν υπάρχει) της ουσίας. Βλέπε επίσης Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).
1.2 ΟΡΙΣΜΟΙ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Β).
1.3 ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Ουδεμία.
1.4 ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Διάφορες ομάδες πειραματόζωων εκτίθενται για ένα ορισμένο χρονικό διάστημα σε διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις της ελεγχόμενης ουσίας, χρησιμοποιούμενης μιας μόνο συγκεντρώσεως ανά ομάδα. Στη συνέχεια γίνονται παρατηρήσεις για τοξικές επιδράσεις και θανάτους. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας νεκροτομούνται, καθώς και εκείνα που επιζούν στο τέλος της δοκιμασίας. Τα ζώα που εμφανίζουν έντονα και διαρκή σημεία δυσφορίας και πόνου μπορεί να χρειάζεται να θανατωθούν ανώδυνα. Δεν χρειάζεται να γίνεται χορήγηση των εξεταζόμενων ουσιών με τρόπο ο οποίος είναι γνωστό ότι προκαλεί έντονο πόνο και δυσφορία λόγω διαβρωτικών ή ιδιαίτερα ερεθιστικών ιδιοτήτων.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Ουδέν.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ
1.6.
1.6.1. Προετοιμασίες Τα ζώα κρατούνται κάτω από τις πειραματικές συνθήκες εγκλωβισμού και διατροφής τουλάχιστον για 5 ημέρες πριν από τη δοκιμασία. Πριν από τη δοκιμασία, ξεχωρίζονται με τυχαία επιλογή υγιή, νεαρά ζώα και κατανέμονται στον απαιτούμενο αριθμό ομάδων. Τα ζώα δεν είναι ανάγκη να υφίστανται παρόμοιες εκθέσεις, εκτός εάν αυτό ενδείκνυται από τον τύπο της χρησιμοποιούμενης συσκευής εκθέσεως. Οι στερεές εξεταζόμενες ουσίες μπορεί να χρειάζονται κονιοποίηση προκειμένου να ληφθούν σωματίδια ενός κατάλληλου μεγέθους. Εφόσον κριθεί αναγκαίο μπορεί να προστεθεί, ένας κατάλληλος φορέας για να βοηθήσει την παραγωγή κατάλληλης συγκεντρώσεως στην ατμόσφαιρα. Σε αυτή την περίπτωση, πρέπει να χρησιμοποιηθεί και μία ομάδα μάρτυρα με το φορέα. Αν φορέας ή άλλες προσθετικές ουσίες χρησιμοποιούνται για να διευκολύνουν τη χορήγηση, πρέπει να είναι γνωστό ότι δεν προκαλούν τοξικές επιδράσεις. Ιστορικά στοιχεία μπορούν να χρησιμοποιηθούν, εάν είναι κατάλληλα.
1.6.2. Συνθήκες δοκιμής
1.6.2.
1.6.2.1. Πειραματόζωα Εφόσον δεν υπάρχουν αντενδείξεις, ο επίμυς είναι το προτιμώμενο είδος. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται οι συνήθως χρησιμοποιούμενες εργαστηριακές φυλές. Για κάθε φύλο, το εύρος της διακύμανσης βαρών των ζώων στην αρχή της δοκιμής δεν πρέπει να υπερβαίνει το ± 20 % της κατάλληλης μέσης τιμής.
1.6.2.2. Αριθμός και φύλο Για κάβε επίπεδο συγκεντρώσεως χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 10 τρωκτικά (πέντε θηλυκά και πέντε αρσενικά). Τα θηλυκά θα πρέπει να είναι άτοκα και να μην ευρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Σημείωση: Σε δοκιμές οξείας τοξικότητας με ζώα υψηλότερης τάξης από την τάξη των τρωκτικών, θα πρέπει να εξετάζεται η ενδεχόμενη χρησιμοποίηση μικρότερου αριθμού ζώων. Οι δόσεις θα πρέπει να επιλέγονται με προσοχή ενώ θα πρέπει να καταβάλλεται κάθε προσπάθεια ώστε να μη γίνεται υπέρβαση μετρίως τοξικών δόσεων. Στις δοκιμές αυτές, θα πρέπει να αποφεύγεται η χορήγηση θανατηφόρων δόσεων της εξεταζόμενης ουσίας.
1.6.2.3. Συγκεντρώσεις εκθέσεως Οι συγκεντρώσεις εκθέσεως θα πρέπει να είναι επαρκείς ως προς τον αριθμό, τουλάχιστον τρεις, και να απέχουν μεταξύ τους αρκετά ώστε να παρέχουν ομάδες πειραματισμού με εύρος τοξικών επιδράσεων και ποσοστών θνησιμότητας. Τα δεδομένα θα πρέπει να είναι αρκετά για τη χάραξη καμπύλης συγκεντρώσεως/θνησιμότητας και, όπου είναι δυνατό, να επιτρέπουν ένα αποδεκτό προσδιορισμό της LC50·
1.6.2.4. Οριακή δοκιμασία Εάν η έκθεση πέντε αρσενικών και πέντε θηλυκών πειραματόζωων σε 20 mg/l αερίου ή 5 mg/l αερολύματος ή σωματιδίων για τέσσερις ώρες (ή, όταν αυτό δεν είναι δυνατό λόγω των φυσικών ή χημικών ιδιοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της εκρηκτικότητας της ελεγχόμενης ουσίας, στη μέγιστη εφικτή συγκέντρωση, δεν προκαλεί θνησιμότητα σχετιζόμενη με την ουσία, μέσα σε 14 ημέρες, τότε η περαιτέρω μελέτη μπορεί να θεωρείται απαραίτητη.
1.6.2.5. Χρόνος εκθέσεως Το χρονικό διάστημα εκθέσεως θα πρέπει να είναι τέσσερις ώρες.
1.6.2.6. Συσκευές Η δοκιμή στα ζώα πρέπει να γίνεται με αναπνευστικές συσκευές, σχεδιασμένες να διατηρούν μια δυναμική ροή του αέρα τουλάχιστον 12 αλλαγών την ώρα, να εξασφαλίζουν επάρκεια οξυγόνου και μία ομοιομορφία κατανομής της ατμόσφαιρας εκθέσεως. Όταν χρησιμοποιείται θάλαμος, το σχήμα του πρέπει να είναι τέτοιο ώστε να μειώνεται στο ελάχιστο ο συνωστισμός των πειραματόζωων και να αυξάνεται όσο το δυνατό περισσότερο η αναπνευστική τους έκθεση στην ελεγχόμενη ουσία. Γενικά, για να εξασφαλίζεται σταθερότητα στην ατμόσφαιρα ενός θαλάμου, ο ολικός όγκος των πειραματόζωων δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5 % του όγκου του πειραματικού θαλάμου. Μπορεί να χρησιμοποιείται στοματορρινικός, κεφαλικός ή ολοκλήρου του σώματος ατομικός θάλαμος εκθέσεως. Οι δύο πρώτοι συντελούν στην ελαχιστοποίηση της λήψεως ελεγχόμενης ουσίας από άλλες οδούς.
1.6.2.7. Περίοδος παρατηρήσεως Η περίοδος παρατηρήσεων πρέπει να είναι τουλάχιστον 14 ημέρες. Εντούτοις, η διάρκεια των παρατηρήσεων δεν θα πρέπει να είναι αυστηρά καθορισμένη. Θα πρέπει να προσδιορίζεται από τις τοξικές αντιδράσεις, την τάξη εμφανίσεώς τους και τη διάρκεια της περιόδου αναρρώσεως. Έτσι, μπορεί να επεκταθεί αν θεωρηθεί αναγκαίο. Ο χρόνος κατά τον οποίο εμφανίζονται και εξαφανίζονται τα συμπτώματα τοξικότητας και ο χρόνος θανάτου είναι σημαντικός, ιδίως αν υπάρχει τάση για αργοπορημένους θανάτους.
1.6.3. Διαδικασία Λίγο πριν από την έκθεση, τα ζώα ζυγίζονται και κατόπιν εκτίθενται στην υπό μελέτη συγκέντρωση στην καθορισμένη συσκευή για χρονικό διάστημα τεσσάρων ωρών, μετά από την εξισορρόπηση της συγκεντρώσεως στο θάλαμο. Ο χρόνος εξισορρόπησης θα πρέπει να είναι βραχύς. Η θερμοκρασία στην οποία πραγματοποιείται η δοκιμή θα πρέπει να διατηρείται στους 22 ± 3 oC. Θεωρητικώς, η σχετική υγρασία θα πρέπει να διατηρείται μεταξύ 30 % και 70 %, σε ορισμένες όμως περιπτώσεις (π.χ. δοκιμές ορισμένων αερολυμάτων) αυτό μπορεί να μην είναι πρακτικώς δυνατό. Η διατήρηση ελαφρά αρνητικής πίεσης μέσα στο θάλαμο (≤ 5 mm νερού) εμποδίζει τη διαφυγή της εξεταζόμενης ουσίας στον περιβάλλοντα χώρο. Κατά τη διάρκεια της έκθεσης δεν θα πρέπει να χορηγείται τροφή και νερό. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλα συστήματα για τη δημιουργία και παρακολούθηση της πειραματικής ατμόσφαιρας. Το σύστημα θα πρέπει να εξασφαλίζει την όσο το δυνατόν ταχύτερη αποκατάσταση σταθερών συνθηκών εκθέσεως. Ο σχεδιασμός και λειτουργία του θαλάμου θα πρέπει να γίνεται με τέτοιο τρόπο ώστε μέσα στο θάλαμο να διατηρείται μία ομοιογενής κατανομή της πειραματικής ατμόσφαιρας. Θα πρέπει να γίνονται μετρήσεις ή παρακολούθηση: Κατά τη διάρκεια και μετά την έκθεση, γίνονται τακτικά παρατηρήσεις και καταχωρούνται συστηματικά πρέπει να γίνονται ξεχωριστές καταχωρήσεις για κάθε ζώο. Κατά την πρώτη ημέρα οι παρατηρήσεις πρέπει να γίνονται συχνά. Μία φορά την ημέρα πρέπει να γίνεται μια προσεκτική κλινική εξέταση. Πρόσθετες παρατηρήσεις πρέπει να γίνονται καθημερινά και να λαμβάνονται τα απαραίτητα μέτρα για να μειώνεται στο ελάχιστο η απώλεια των ζώων από τη μελέτη δηλαδή νεκροψίες ή ψύξη των ζώων που βρέθηκαν νεκρά και απομόνωση ή θανάτωση των ετοιμοθάνατων και αδύνατων ζώων. Οι παρατηρήσεις θα πρέπει να περιλαμβάνουν αλλοιώσεις του δέρματος και του τριχώματος, των οφθαλμών, των βλεννογόνων, του αναπνευστικού και του κυκλοφοριακού συστήματος, του αυτόνομου και κεντρικού νευρικού συστήματος καθώς και του τρόπου συμπεριφοράς και της σωματοκινητικής δραστηριότητας. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται στην αναπνευστική συμπεριφορά, στους τρόμους, στους σπασμούς, στη σιελόρροια, στη διάρροια, στο λήθαργο, στον ύπνο και το κώμα. Ο χρόνος θανάτου πρέπει να καταχωρείται όσο το δυνατό ακριβέστερα. Τα ατομικά βάρη των ζώων πρέπει να προσδιορίζονται ανά εβδομάδα μετά την έκθεση και κατά το θάνατο. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, όπως και αυτά που επιζούν στο τέλος της, υπόκεινται σε νεκροψία και ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στις αλλοιώσεις του αναπνευστικού συστήματος, ανώτερου και κατώτερου. Όλες οι μακροσκοπικά παρατηρούμενες ανωμαλίες πρέπει να καταχωρούνται. Όπου αυτό ενδείκνυται, οι ιστοί πρέπει να λαμβάνονται για ιστοπαθολογική εξέταση.
1.6.3.
(α) της ταχύτητας ροής του αέρα (συνεχώς),
(β) της πραγματικής συγκέντρωσης της εξεταζόμενης ουσίας στη ζώνη αναπνοής τρεις τουλάχιστον φορές κατά τη διάρκεια της έκθεσης (ορισμένες ατμόσφαιρες, π.χ. αερολύματα σε υψηλές συγκεντρώσεις, μπορεί να χρειάζονται συχνότερη παρακολούθηση). Κατά τη διάρκεια της έκθεσης η συγκέντρωση δεν θα πρέπει να διαφέρει περισσότερο από το ± 15 % της μέσης τιμής. Εντούτοις, στην περίπτωση ορισμένων αερολυμάτων, ενδέχεται να μη μπορεί να επιτευχθεί το επίπεδο αυτό ελέγχου οπότε είναι αποδεκτό ένα μεγαλύτερο εύρος αποκλίσεων. Στα αερολύματα, θα πρέπει να διενεργείται με την απαιτούμενη συχνότητα, ανάλυση μεγέθους σωματιδίων (τουλάχιστον μία φορά ανά ομάδα πειραματισμού),
(γ) της θερμοκρασίας και υγρασίας, συνεχώς αν είναι δυνατόν.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα, στον οποίο να φαίνεται, για κάθε πειραματική ομάδα, ο αριθμός των ζώων στην αρχή της δοκιμασίας, ο χρόνος θανάτου χωριστά για κάθε ζώο, ο αριθμός των ζώων που παρουσίασαν άλλα συμπτώματα τοξικότητας και περιγραφή των τοξικών επιδράσεων και των ευρημάτων της νεκροψίας. Αλλαγές στο βάρος πρέπει να υπολογίζονται και να καταχωρούνται όταν τα ζώα επιζούν περισσότερο από μία ημέρα. Τα ζώα που θανατώνονται ανώδυνα λόγω δυσφορίας ή πόνου που έχει σχέση με την ουσία, καταγράφονται ως θάνατοι που σχετίζονται με την ουσία. Η LC50 θα πρέπει να προσδιορίζεται με μια αναγνωρισμένη μέθοδο. Η αξιολόγηση των δεδομένων πρέπει να περιλαμβάνει τη σχέση, αν υπάρχει, μεταξύ της έκθεσης των ζώων στην ελεγχόμενη ουσία και τη συχνότητα και σοβαρότητα όλων των ανωμαλιών, συμπεριλαμβανομένων αυτών της συμπεριφοράς και των κλινικών ανωμαλιών, μακροσκοπικών αλλοιώσεων, αλλαγών του βάρους του σώματος, θνησιμότητας και κάθε άλλης τοξικής επίδρασης.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες: Περιγραφή της συσκευής έκθεσης συμπεριλαμβανομένου του σχεδίου, του τύπου, των διαστάσεων, της πηγής του αέρα, του συστήματος παραγωγής αερολυμάτων, της μεθόδου κλιματισμού του αέρα και της μεθόδου εγκλωβισμού των ζώων στο θάλαμο δοκιμής, όταν χρησιμοποιείται. Θα πρέπει να περιγράφεται ο εξοπλισμός που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της θερμοκρασίας, της υγρασίας, και των συγκεντρώσεων και κατανομής μεγέθους σωματιδίων των αερολυμάτων, Δεδομένα έκθεσης Τα δεδομένα αυτά θα πρέπει να καταγράφονται σε πίνακα και να παρουσιάζονται με μέσες τιμές και ένα μέτρο μεταβλητότητας (π.χ. μέση τυπική απόκλιση) και, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνουν:
είδος, φυλή, πηγή, περιβαλλοντικές συνθήκες, διατροφή, κλπ.
συνθήκες δοκιμής: Περιγραφή της συσκευής έκθεσης συμπεριλαμβανομένου του σχεδίου, του τύπου, των διαστάσεων, της πηγής του αέρα, του συστήματος παραγωγής αερολυμάτων, της μεθόδου κλιματισμού του αέρα και της μεθόδου εγκλωβισμού των ζώων στο θάλαμο δοκιμής, όταν χρησιμοποιείται. Θα πρέπει να περιγράφεται ο εξοπλισμός που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της θερμοκρασίας, της υγρασίας, και των συγκεντρώσεων και κατανομής μεγέθους σωματιδίων των αερολυμάτων.
3.1.
(α) τις τιμές ροής του αέρα διαμέσου της αναπνευστικής συσκευής,
(β) θερμοκρασία και υγρασία του αέρα,
(γ) ονομαστικές συγκεντρώσεις (ολική ποσότητα της εξεταζόμενης ουσίας που προσάγεται στην αναπνευστική συσκευή διηρημένη δια του όγκου του αέρα),
(δ) φύση του φορέα, αν χρησιμοποιήθηκε,
(ε) πραγματικές συγκεντρώσεις στην πειραματική ζώνη αναπνοής,
(ζ) τη μέση αεροδυναμική διάμετρο μάζας (ΜΑΔΜ) και τη γεωμετρική τυπική απόκλιση (ΓΤΑ),
(η) το χρονικό διάστημα εξισορρόπησης,
(θ) το χρονικό διάστημα έκθεσης,
καταγραφή σε πίνακα των δεδομένων αποκρίσεως κατά φύλο και επίπεδο έκθεσης (δηλαδή ο αριθμός ζώων που πέθαναν ή θανατώθηκαν κατά τη διάρκεια της δοκιμής αριθμός ζώων που εμφάνισαν συμπτώματα τοξικότητας αριθμός εκτεθέντων ζώων)·
χρόνο θανάτου κατά τη διάρκεια ή μετά από την έκθεση, λόγους και κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την ανώδυνη θανάτωση ζώων·
όλες τις παρατηρήσεις·
τιμή LC50 για κάθε φύλο προσδιορισμένη στο τέλος της περιόδου παρατήρησης (με καθορισμένη μέθοδο υπολογισμού)·
όριο αξιοπιστίας 95 % για την LC50 (όπου είναι δυνατόν)·
καμπύλη δόσης/θνησιμότητας και κλίση (όπου το επιτρέπει η μέθοδος προσδιορισμού)·
ευρήματα νεκροψίας·
κάθε ιστοπαθολογικό εύρημα·
συζήτηση των αποτελεσμάτων (ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δίνεται στο αποτέλεσμα που μπορεί να έχει στην υπολογιζόμενη τιμή LC50 η ανώδυνη θανάτωση ζώων κατά τη διάρκεια της δοκιμής)·
ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).
4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).
Β.3. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ (ΔΕΡΜΑΤΙΚΗ)
Β.3.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Β).
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Ουδεμία.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ Η εξεταζόμενη ουσία επιτίθεται στο δέρμα σε διαβαθμισμένες δόσεις σε διάφορες ομάδες πειραματόζωων, για κάθε δε ομάδα χρησιμοποιείται και μία δόση. Ακολούθως, γίνονται παρατηρήσεις των επιδράσεων και των θανάτων. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμής υποβάλλονται σε νεκροψία όπως επίσης υποβάλλονται σε νεκροψία και τα ζώα που επιζούν μετά το πέρας της δοκιμής. Τα ζώα που εμφανίζουν έντονα και διαρκή συμπτώματα δυσφορίας και πόνου μπορεί αν χρειασθεί να θανατωθούν ανώδυνα. Δεν χρειάζεται να γίνεται χορήγηση της εξεταζόμενης ουσίας με τρόπο που είναι γνωστό ότι προκαλεί έντονο πόνο και αγωνία λόγω διαβρωτικών ή ερεθιστικών ιδιοτήτων.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Ουδέν.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Προετοιμασίες Τα ζώα κρατούνται μέσα στους πειραματικούς κλωβούς τους, κάτω από τις πειραματικές συνθήκες εγκλωβισμού και διατροφής, για 5 τουλάχιστον ημέρες πριν από τη δοκιμασία. Πριν από τη δοκιμασία υγιή, νεαρά, ενήλικα ζώα ξεχωρίζονται τυχαία και κατανέμονται στις πειραματικές ομάδες. Περίπου 24 ώρες πριν από τη δοκιμασία, το τρίχωμα πρέπει να απομακρύνεται με τη βοήθεια ψαλιδιού ή ξυριστικής μηχανής, από την περιοχή της ράχης του κορμού των ζώων. Κατά το κούρεμα ή ξύρισμα του τριχώματος, προσοχή πρέπει να δίνεται ώστε να αποφεύγεται η απόξεση του δέρματος, πράγμα το οποίο μπορεί να μεταβάλει τη διαπερατότητά του. Η επιφάνεια της εφαρμογής δεν πρέπει να είναι μικρότερη από το 10 % της ολικής επιφάνειας του σώματος. Όταν δοκιμάζονται στερεά, τα οποία μπορούν να κονιοποιηθούν αν χρειάζεται, η ελεγχόμενη ουσία πρέπει να υγραίνεται αρκετά με νερό ή, όπου είναι ανάγκη, με έναν κατάλληλο φορέα για να εξασφαλίζεται καλή επαφή με το δέρμα. Όταν χρησιμοποιείται φορέας, η επίδρασή του στη δίοδο της ελεγχόμενης ουσίας πρέπει να λαμβάνεται υπόψη. Οι υγρές ουσίες χρησιμοποιούνται γενικά αδιάλυτες.
1.6.2. Συνθήκες δοκιμής
1.6.2.
1.6.2.1. Πειραματόζωα Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο ενήλικας επίμυς ή το κουνέλι. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα είδη, για τη χρησιμοποίησή τους όμως απαιτείται αιτιολόγηση. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται οι συνήθεις εργαστηριακές φυλές. Για κάθε φύλο, το εύρος της διαφοράς βαρών των ζώων στην αρχή της δοκιμής δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το ±20 % της συνιστάμενης μέσης τιμής.
1.6.2.2. Αριθμός και φύλο Για κάθε επίπεδο δόσεως χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 5 ζώα. Και τα πέντε πρέπει να είναι του ιδίου φύλου. Αν χρησιμοποιούνται θηλυκά, θα πρέπει να είναι άτοκα και να μην ευρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Όπου υπάρχουν πληροφορίες ότι ένα φύλο είναι πολύ περισσότερο ευαίσθητο, η χορήγηση της ουσίας θα πρέπει να γίνεται στα ζώα αυτού του φύλου. Σημείωση: Σε δοκιμές οξείας τοξικότητας με ζώα υψηλότερης τάξης από την τάξη των τρωκτικών, θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο χρησιμοποίησης μικρότερου αριθμού ζώων. Οι δόσεις θα πρέπει να επιλέγονται με προσοχή ενώ θα πρέπει να καταβάλλεται κάθε προσπάθεια ώστε να μη γίνεται υπέρβαση μετρίως τοξικών δόσεων. Στις δοκιμές αυτές, θα πρέπει να αποφεύγεται να χορηγούνται θανατηφόρες δόσεις της εξεταζόμενης ουσίας.
1.6.2.3. Επίπεδα δόσεων Τα επίπεδα δόσεων θα πρέπει να είναι επαρκή ως προς τον αριθμό, τουλάχιστον τρία, και να απέχουν μεταξύ τους αρκετά ώστε να παρέχουν ομάδες πειραματισμού με εύρος τοξικών επιδράσεων και ποσοστών θνησιμότητας. Κατά τη λήψη αποφάσεων σχετικά με τα επίπεδα δόσεων, θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κάθε ερεθιστική ή διαβρωτική επίδραση. Τα δεδομένα θα πρέπει να είναι αρκετά για τη χάραξη καμπύλης δόσεως/αποκρίσεως και, όπου είναι δυνατόν, να δίνουν τη δυνατότητα αποδεκτού προσδιορισμού της LD50.
1.6.2.4. Οριακή δοκιμή Σε ομάδα 5 αρσενικών και 5 θηλυκών ζώων, μπορεί να πραγματοποιηθεί οριακή δοκιμή σε επίπεδο μιας δόσης τουλάχιστον 2000 mg/kg βάρους σώματος, χρησιμοποιώντας τις διαδικασίες που περιγράφονται ανωτέρω. Αν παρουσιασθεί θνησιμότητα σχετιζόμενη με την ουσία, μπορεί να χρειασθεί η πραγματοποίηση πλήρους μελέτης.
1.6.2.5. Περίοδος παρατήρησης Η περίοδος παρατήρησης θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 14 ημέρες. Εντούτοις, η διάρκεια των παρατηρήσεων δεν πρέπει να είναι αυστηρά καθορισμένη. Μπορεί να καθορίζεται από τις τοξικές επιδράσεις, την τάξη εμφανίσεώς τους και τη διάρκεια της περιόδου αναρρώσεως μπορεί έτσι να επεκτείνεται όταν αυτό θεωρηθεί αναγκαίο. Ο χρόνος εμφανίσεως και εξαφανίσεως των τοξικών συμπτωμάτων, η διάρκειά τους και ο χρόνος θανάτου είναι σημαντικά, ιδιαίτερα αν υπάρχει τάση να αργοπορούν οι θάνατοι.
1.6.3. Διαδικασία Τα ζώα θα πρέπει να εγκλωβίζονται κατ' άτομο. Η εξεταζόμενη ουσία θα πρέπει να επιτίθεται ομοιόμορφα σε μια περιοχή που να αντιστοιχεί στο 10 % περίπου του συνολικού εμβαδού της επιφάνειας του σώματος. Στην περίπτωση λίαν τοξικών ουσιών, το εμβαδόν της καλυπτόμενης επιφάνειας μπορεί να είναι μικρότερο, πάντως όμως θα πρέπει να καλύπτεται η μεγαλύτερη δυνατή επιφάνεια με ένα όσο το δυνατόν λεπτότερο και πιο ομοιόμορφο στρώμα. Η ελεγχόμενη ουσία πρέπει να κρατείται σε επαφή με το δέρμα καθ' όλη τη διάρκεια της εκθέσεως των 24 ωρών, με τη βοήθεια ενός επιδέσμου από πορώδη γάζα και μια μη ερεθιστική ταινία. Η ελεγχόμενη περιοχή πρέπει, επιπλέον, να καλύπτεται με τον κατάλληλο τρόπο για να συγκρατείται ο επίδεσμος και η ελεγχόμενη ουσία και να εξασφαλίζεται έτσι η αδυναμία καταπόσεως της ουσίας από τα ζώα. Επιτρέπεται η χρήση συσκευών περιορισμού για να εμποδίζεται η κατάποση, αλλά δεν συνιστάται η μέθοδος της απόλυτης ακινησίας. Στο τέλος της περιόδου εκθέσεως, πρέπει να απομακρύνεται το υπόλειμμα της ελεγχόμενης ουσίας, όταν αυτό είναι δυνατόν, με τη χρήση νερού ή με μια άλλη κατάλληλη μέθοδο καθαρισμού του δέρματος. Οι παρατηρήσεις πρέπει να καταχωρούνται συστηματικά, όπως γίνονται. Πρέπει να διατηρούνται ατομικά αρχεία για κάθε ζώο. Οι παρατηρήσεις, κατά τη διάρκεια της πρώτης ημέρας, πρέπει να γίνονται συχνά. Τουλάχιστον μια φορά την ημέρα πρέπει να γίνεται μια προσεκτική κλινική εξέταση. Πρόσθετες παρατηρήσεις θα πρέπει να γίνονται καθημερινά και να λαμβάνονται τα απαραίτητα μέτρα ώστε να μειώνεται στο ελάχιστο η απώλεια των ζώων από τη μελέτη. Λ.χ. νεκροψία ή ψύξη εκείνων των ζώων που βρέθηκαν νεκρά και απομόνωση ή θανάτωση των αδύνατων και ετοιμοθάνατων ζώων. Οι παρατηρήσεις θα πρέπει να περιλαμβάνουν αλλοιώσεις του τριχώματος, του εξεταζόμενου δέρματος, των οφθαλμών και των βλεννογόνων, όπως επίσης του αναπνευστικού, κυκλοφοριακού, αυτόνομου και κεντρικού νευρικού συστήματος, καθώς και αλλοιώσεις στη σωματοκινητική δραστηριότητα και του τρόπου συμπεριφοράς. Με ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να γίνονται οι παρατηρήσεις των τρόμων, σπασμών, σιελόρροιας, διάρροιας, λήθαργου, ύπνου και κώματος. Ο χρόνος θανάτου πρέπει να καταχωρείται όσο το δυνατόν ακριβέστερα. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, όπως και αυτά που επιζούν στη λήξη της, υπόκεινται σε νεκροψία. Όλες οι μακροσκοπικά παρατηρούμενες αλλοιώσεις πρέπει να καταχωρούνται. Όπου ενδείκνυται, οι ιστοί πρέπει να λαμβάνονται για ιστοπαθολογική εξέταση.
1.6.3. Εκτίμηση τοξικότητας στο άλλο φύλο
Αφού συμπληρωθεί η μελέτη σε ένα φύλο, η ουσία χορηγείται σε μία τουλάχιστον ομάδα 5 ζώων του άλλου φύλου για να επιβεβαιωθεί ότι τα ζώα αυτού του φύλου δεν είναι σε σημαντικό βαθμό πιο ευαίσθητα στην εξεταζόμενη ουσία. Σε συγκεκριμένες περιπτώσεις μπορεί να δικαιολογείται η χρήση λιγότερων ζώων. Όπου υπάρχουν σαφείς πληροφορίες ότι τα ζώα του εξεταζόμενου φύλου είναι σε σημαντικό βαθμό πιο ευαίσθητα, μπορεί να μη χρειασθεί η υποβολή σε δοκιμή ζώων του άλλου φύλου.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα, στον οποίο να φαίνεται, για κάθε πειραματική ομάδα, ο αριθμός των ζώων στην αρχή της δοκιμασίας, ο χρόνος θανάτου για κάθε ζώο, ο αριθμός των ζώων που εμφανίζουν άλλα συμπτώματα τοξικότητας, περιγραφή των τοξικών επιδράσεων και τα αποτελέσματα της νεκροψίας. Τα ατομικά βάρη των ζώων πρέπει να προσδιορίζονται και να καταχωρούνται, λίγο πριν την εφαρμογή της ελεγχόμενης ουσίας ανά εβδομάδα μετά, και κατά το θάνατο. Αλλαγές στο βάρος θα πρέπει να υπολογίζονται και να καταγράφονται, εφόσον τα ζώα επιζούν περισσότερο από μία ημέρα. Τα ζώα που θανατώνονται ανώδυνα λόγω δυσφορίας και πόνου που οφείλεται στην ουσία, καταγράφονται ως θάνατοι που σχετίζονται με την ουσία. Η LD50 θα πρέπει να προσδιορίζεται με μια αναγνωρισμένη μέθοδο. Η αξιολόγηση των δεδομένων πρέπει να περιλαμβάνει μια αξιολόγηση της σχέσης, αν αυτή υπάρχει, μεταξύ της έκθεσης των ζώων στην ελεγχόμενη ουσία και της συχνότητας και σοβαρότητας όλων των ανωμαλιών, όπου περιλαμβάνονται ανωμαλίες συμπεριφοράς, κλινικές ανωμαλίες, μακροσκοπικές αλλοιώσεις, αλλαγές του βάρους του σώματος, θνησιμότητα, και κάθε άλλη τοξικολογική επίδραση.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
είδος, φυλή, πηγή, περιβαλλοντικές συνθήκες, διατροφή, κλπ.
συνθήκες δοκιμής (συμπεριλαμβανόμενης και της μεθόδου καθαρισμού του δέρματος και του τύπου της επίδεσης: προσροφητικής ή μη προσροφητικής)
επίπεδα δόσεων (με φορέα, εφόσον χρησιμοποιήθηκε, και συγκεντρώσεις)
φύλο των υποβληθέντων σε δοκιμή ζώων
καταγραφή σε πίνακα των δεδομένων απόκρισης κατά φύλο και επίπεδο έκθεσης (δηλ., ο αριθμός ζώων που πέθαναν ή θανατώθηκαν κατά τη διάρκεια της δοκιμής, αριθμός ζώων που εμφάνισαν σημεία τοξικότητας, αριθμός εκτεθέντων ζώων)
χρόνο θανάτου μετά από τη χορήγηση, λόγους και κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την ανώδυνη θανάτωση ζώων
όλες τις παρατηρήσεις
τιμή LD50 για το φύλο που υποβλήθηκε σε πλήρη μελέτη, προσδιορισμένη μετά από 14 ημέρες με την καθορισμένη μέθοδο υπολογισμού
όριο αξιοπιστίας 95 % για την LD50 (όπου είναι δυνατόν)
καμπύλη δόσης/θνησιμότητας και κλίση (όπου το επιτρέπει η μέθοδος προσδιορισμού)
ευρήματα νεκροψίας
κάθε ιστοπαθολογικό εύρημα
αποτελέσματα οποιασδήποτε δοκιμής στο άλλο φύλο
συζήτηση των αποτελεσμάτων (ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δοθεί στην επίδραση που μπορεί να έχει στην υπολογιζόμενη τιμή LD50 η ανώδυνη θανάτωση των ζώων)
ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).
4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).
Β.4. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ: ΕΡΕΘΙΣΜΟΣ/ΔΙΑΒΡΩΣΗ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ
Β.4.
1. Η ΜΕΘΟΔΟΣ Η παρούσα μέθοδος είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών ΤΟ 404 (2002) του ΟΟΣΑ
1.
1.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κατά την ανάπτυξη της παρούσας αναπροσαρμοσμένης μεθόδου, δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή στις δυνατότητες βελτίωσης σε σχέση με τον προβληματισμό για τη μεταχείριση των ζώων, καθώς και στην αξιολόγηση όλων των διαθέσιμων στοιχείων σχετικά με τις ελεγχόμενες ουσίες, ώστε να μην διεξάγονται περιττές δοκιμές σε πειραματόζωα, Η μέθοδος περιλαμβάνει τη σύσταση να υποβάλλονται τα υφιστάμενα δεδομένα σε ανάλυση βάρους της μαρτυρίας, πριν από τη διεξαγωγή της περιγραφόμενης δοκιμής των ουσιών in vivo για διάβρωση/ερεθισμό. Εφόσον τα διαθέσιμο δεδομένα είναι ανεπαρκή, μπορούν να συμπληρώνονται με την εφαρμογή ακολουθιακού ελέγχου (1). Η συνιστώμενη στρατηγική δοκιμών περιλαμβάνει την εκτέλεση έγκυρων και αποδεκτών δοκιμασιών in vitro και παρατίθεται σε παράρτημα της παρούσας μεθόδου. Επιπλέον, όπου ενδείκνυται, συνίσταται η διαδοχική αντί της ταυτόχρονης εφαρμογή των τριών επιθεμάτων στο ζώο κατά την αρχική δοκιμή in vivo. Προς όφελος τόσο της ορθότητας του επιστημονικού έργου, όσο και της πρόνοιας για τα ζώα, δεν θα πρέπει να διεξάγονται δοκιμές in vivo, πριν αξιολογηθούν, με ανάλυση βάρους της μαρτυρίας, όλα τα διαθέσιμα δεδομένα σχετικά με την πιθανή διαβρωτική/ερεθιστική επίδραση των ουσιών στο δέρμα. Τα εν λόγω δεδομένα περιλαμβάνουν στοιχεία από προηγούμενες μελέτες στον άνθρωπο ή/και σε πειραματόζωα, στοιχεία που υποδεικνύουν ότι μία ή περισσότερες ουσίες με ανάλογη χημική δομή ή μίγματα τέτοιων ουσιών προκαλούν διάβρωση/ερεθισμό, δεδομένα υψηλής οξύτητας ή αλκαλικότητας των ουσιών (2)(3) και αποτελέσματα έγκυρων και αποδεκτών δοκιμών in vitro ή ex vivo (4)(5)(5a). Η ανωτέρω ανάλυση αναμένεται να περιορίσει την ανάγκη διεξαγωγής δοκιμών in vivo για διαβρωτική/ερεθιστική επίδραση στο δέρμα, ουσιών για τις οποίες υπάρχουν ήδη επαρκή αποδεικτικά στοιχεία, προερχόμενα από άλλες μελέτες, όσον αφορά τα συγκεκριμένα δύο τελικά σημεία, Σε παράρτημα της παρούσας μεθόδου παρατίθεται η προτιμώμενη στρατηγική διαδοχικών δοκιμών (ακολουθιακός έλεγχος), που περιλαμβάνει τη διεξαγωγή έγκυρων και αποδεκτών δοκιμών διάβρωσης/ερεθισμού in vitro ή ex vivo. Η στρατηγική αυτή διαμορφώθηκε σε ημερίδα του ΟΟΣΑ, προτάθηκε ομόφωνα από τους συνέδρους (6) και εγκρίθηκε ως συνιστώμενη στρατηγική δοκιμών στο Παγκόσμιο Εναρμονισμένο Σύστημα Ταξινόμησης Χημικών Ουσιών (Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Substances/GHS) (7). Συνιστάται η εφαρμογή της εν λόγω στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών πριν από τη διεξαγωγή δοκιμών in vivo. Προκειμένου για νέες ουσίες, αποτελεί τη συνιστώμενη κλιμακωτή προσέγγιση για τη συλλογή επιστημονικώς ορθών στοιχείων σχετικά με τη διαβρωτική/ερεθιστική δράση των ουσιών. Στην περίπτωση των υφισταμένων ουσιών, για τις οποίες δεν υπάρχουν επαρκή στοιχεία όσον αφορά τη δερματική διάβρωση/ερεθισμό, η στρατηγική θα πρέπει να χρησιμοποιείται για να συμπληρωθούν τα κενά στα δεδομένα. Η εφαρμογή διαφορετικής στρατηγικής ή διαδικασίας δοκιμών ή τυχόν απόφαση να μην εφαρμοστεί κλιμακωτή προσέγγιση δοκιμών θα πρέπει να αιτιολογείται. Εάν ο διαβρωτικός ή ερεθιστικός χαρακτήρας δεν είναι δυνατόν να προσδιοριστεί με ανάλυση βάρους της μαρτυρίας σύμφωνα με τη στρατηγική διαδοχικών δοκιμών, τότε θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο διεξαγωγής δοκιμής in vivo (βλ. παράρτημα).
1.2 ΟΡΙΣΜΟΙ Δερματικός ερεθισμός: είναι η πρόκληση αναστρέψιμων βλαβών του δέρματος μετά την εφαρμογή της ελεγχόμενης ουσίας για χρονικά διάστημα έως 4 ωρών. Δερματική διάβρωση: είναι η πρόκληση μη αναστρέψιμης βλάβης του δέρματος, συγκεκριμένα εμφανούς νεκρώσεως που διαπερνά την επιδερμίδα φθάνοντας στο χόριο, μετά την εφαρμογή της ελεγχόμενης ουσίας για χρονικό διάστημα έως 4 ωρών. Τυπικές διαβρωτικές αντιδράσεις είναι τα έλκη. η αιμορραγία, οι εσχάρες αίματος και, στο τέλος της παρατήρησης μετά παρέλευση 14 ημερών, ο αποχρωματισμός λόγω λευκοδερμίας, επιφάνειες με τελεία αλωπεκία και ουλές. Για την αξιολόγηση αμφίβολων βλαβών, θα πρέπει να μελετάται το ενδεχόμενο ιστοπαθολογικής εξέτασης.
1.3 ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ Μία δόση της ελεγχόμενης ουσίας εφαρμόζεται εφάπαξ στο δέρμα ενός πειραματόζωου, ενώ το υπόλοιπο δέρμα του, που δεν έχει υποβληθεί σε αγωγή, χρησιμεύει ως μάρτυρας. Σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα, παρατηρείται η έκταση του ερεθισμού/της διάβρωσης, βαθμολογείται και περιγράφεται λεπτομερώς με σκοπό την πλήρη αξιολόγηση των επιδράσεων. Η διάρκεια της μελέτης θα πρέπει να είναι επαρκής για να εκτιμηθεί αν οι παρατηρούμενες επιδράσεις είναι αναστρέψιμες ή μη. Τα ζώα που εμφανίζουν διαρκή σημεία έντονης δυσφορίας σε οποιοδήποτε στάδιο της δοκιμής ή/και πόνου θα πρέπει να θανατώνονται με ευθανασία, οπότε η ουσία αξιολογείται ανάλογα. Κριτήρια για τη λήψη απόφασης σχετικά με την ευθανασία ετοιμοθάνατων ή βαρέως πασχόντων ζώων παρέχονται στη δημοσίευση (8).
1.4 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ
1.4
1.4.1 Προετοιμασία της δοκιμής in vivo
1.4.1
1.4.1.1 Επιλογή είδους ζώων Το προτιμώμενο πειραματόζωο είναι το αλφικό κουνέλι και χρησιμοποιούνται υγιή νεαρά ενήλικα κουνέλια. Η χρήση άλλων ειδών ζώων θα πρέπει να αιτιολογείται,
1.4.1.2 Προετοιμασία των ζώων Ένα 24ωρο περίπου πριν από τη δοκιμή, πρέπει να αφαιρείται με κουρά το τρίχωμα από τη ραχιαία επιφάνεια του κορμού των ζώων. Η κουρά πρέπει να εκτελείται με προσοχή για να αποφεύγεται η απόξεση του δέρματος. Πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο ζώα με υγιές, ανέπαφο δέρμα. Μερικές φυλές κουνελιών έχουν νησίδες πυκνού τριχώματος, που είναι πιο ανεπτυγμένες ορισμένες εποχές του έτους. Οι ελεγχόμενες ουσίες δεν θα πρέπει να εφαρμόζονται σε αυτές τις επιφάνειες πυκνού τριχώματος.
1.4.1.3 Συνθήκες στέγασης και διατροφής Τα ζώα πρέπει να στεγάζονται χωριστά. Για τα κουνέλια, η θερμοκρασία του θαλάμου πειραματόζωων πρέπει να είναι 20 oC (±3 oC). Αν και η σχετική υγρασία πρέπει να είναι τουλάχιστον 30 % και, κατά προτίμηση, να μην υπερβαίνει το 70 %, εκτός από τις περιόδους καθαρισμού του θαλάμου, εν τούτοις ο στόχος θα πρέπει να είναι μια τιμή 50-60 %. Ο φωτισμός πρέπει να είναι τεχνητός, με εναλλαγή φωτός-σκότους ανά 12ωρο. Για τη διατροφή των ζώων μπορούν να χρησιμοποιούνται τα συνήθη εργαστηριακά σιτηρέσια, με απεριόριστη παροχή πόσιμου νερού.
1.4.2 Διαδικασία δοκιμής
1.4.2
1.4.2.1 Εφαρμογή της ελεγχόμενης ουσίας Η ελεγχόμενη ουσία θα πρέπει να εφαρμόζεται σε μια μικρή επιφάνεια του δέρματος (περίπου 6 cm2) και να καλύπτεται με ένα κομμάτι γάζας, το οποίο συγκρατείται στη θέση του με μη ερεθιστική ταινία. Σε περίπτωση όπου η απευθείας εφαρμογή δεν είναι εφικτή (π.χ. υγρά ή ορισμένες αλοιφές), θα πρέπει να τοποθετείται πρώτα η ελεγχόμενη ουσία στη γάζα και κατόπιν το σύνολο στο δέρμα. Το επίθεμα θα πρέπει να διατηρείται χαλαρά σε επαφή με το δέρμα με τη βοήθεια κατάλληλου ημιπερατού επίδεσμοι) σε όλη τη διάρκεια της περιόδου έκθεσης. Όταν η ελεγχόμενη ουσία τοποθετείται στη γάζα, το επίθεμα θα πρέπει να στερεώνεται στο δέρμα κατά τρόπον ώστε να εξασφαλίζεται καλή επαφή και ομοιόμορφη κατανομή της ουσίας στο δέρμα. Το ζώο θα πρέπει να μην μπορεί να φθάσει το επίθεμα, ώστε να μην υπάρχει κίνδυνος να καταπιεί/εισπνεύσει την ελεγχόμενη ουσία. Οι υγρές ελεγχόμενες ουσίες χρησιμοποιούνται κατά κανόνα χωρίς να αραιωθούν. Όταν ελέγχονται στερεές ουσίες (που μπορούν να λειοτριβούνται, εάν κρίνεται αναγκαίο), θα πρέπει να υγραίνονται με την ελάχιστη ποσότητα νερού (ή, εάν είναι απαραίτητο, άλλου κατάλληλου φορέα) που εξασφαλίζει καλή επαφή με το δέρμα. Εφόσον χρησιμοποιείται άλλος φορέας πλην του νερού, η τυχόν επίδρασή του στο ερεθισμό του δέρματος από την ελεγχόμενη ουσία πρέπει να είναι αμελητέα. Στο τέλος της περιόδου έκθεσης, που συνήθως διαρκεί τέσσερις ώρες, τα υπολείμματα της ελεγχόμενης ουσίας θα πρέπει να απομακρύνονται, εφόσον αυτό είναι πρακτικά εφικτό, με νερό ή κατάλληλο διαλύτη, χωρίς να αλλοιώνεται η υφιστάμενη απόκριση ούτε η ακεραιότητα της επιδερμίδας.
1.4.2.2 Επίπεδα δόσεων Στο σημείο δοκιμής εφαρμόζονται Εφάπαξ 0,5 ml υγρού ή 0,5 g στερεού η αλοιφής.
1.4.2.3 Αρχική δοκιμή (Δοκιμή δερματικού ερεθισμού/διάβρωσης in vivo σε ένα ζώο) Συνιστάται θερμά να διεξάγεται η δοκιμή in vivo πρώτα σε ένα μόνο ζώο, ιδίως όταν υπάρχουν υπόνοιες ότι η ουσία έχει διαβρωτικές ιδιότητες, σύμφωνα και με τη στρατηγική διαδοχικών δοκιμών (Βλ. παράρτημα 1). Οταν κρίνεται, με βάση ανάλυση βάρους της μαρτυρίας, ότι μια ουσία είναι διαβρωτική, δεν χρειάζονται περαιτέρω δοκιμές σε ζώα. Οι περισσότερες από τις ουσίες για τις οποίες υπάρχουν υπόνοιες ότι είναι διαβρωτικές δεν χρειάζεται κατά κανόνα να υποβάλλονται σε περαιτέρω δοκιμές in vitro. Ωστόσο, σε περίπτωση όπου θεωρείται σκόπιμο να συγκεντρωθούν συμπληρωματικά δεδομένα, επειδή τα υπάρχοντα είναι ανεπαρκή, μπορούν να διεξάγονται περιορισμένης έκτασης δοκιμές σε ζώα με την ακόλουθη προσέγγιση: Στο ζώο εφαρμόζονται διαδοχικά τρία επιθέματα κατ' ανώτατο όριο. Το πρώτο αφαιρείται μετά από τρία λεπτά. Εάν δεν παρατηρηθεί καμία σοβαρή δερματική αντίδραση, εφαρμόζεται δεύτερο επίθεμα, το οποίο αφαιρείται μετά από μία ώρα. Εάν οι παρατηρήσείς στο στάδιο αυτό υποδεικνύουν ότι η έκθεση του ζώου μπορεί να παραταθεί ανώδυνα για τέσσερις ώρες, εφαρμόζεται τρίτο επίθεμα, το οποίο αφαιρείται μετά από τέσσερις ώρες, και διαβαθμίζεται η απόκριση. Εάν μετά οποιοδήποτε από τα τρία διαδοχικά στάδια έκθεσης παρατηρηθεί διαβρωτική επίδραση, η δοκιμή τερματίζεται αμέσως. Εάν δεν παρατηρηθεί διαβρωτική επίδραση μετά την αφαίρεση του τελευταίου επιθέματος, το ζώο παραμένει υπό παρατήρηση για 14 ημέρες, εκτός εάν εκδηλωθεί διάβρωση νωρίτερα. Στις περιπτώσεις όπου η ελεγχόμενη ουσία δεν αναμένεται να προκαλέσει διάβρωση, αλλά ενδέχεται να είναι ερεθιστική, θα πρέπει να εφαρμόζεται ένα μόνο επίθεμα σε ένα ζώο για 4 ώρες,
1.4.2.4 Επιβεβαιωτική δοκιμή (δοκιμή δερματικού ερεθισμού in vivo σε επιπλέον ζώα} Εάν δεν έχει παρατηρηθεί διαβρωτική επίδραση κατά την αρχική δοκιμή, η ερεθιστική ή αρνητική απόκριση θα πρέπει να επιβεβαιώνεται με χρήση έως δύο επιπλέον ζώων, στο καθένα από τα οποία εφαρμόζεται ένα επίθεμα για περίοδο έκθεσης 4 ωρών. Εάν κατά την αρχική δοκιμή έχει παρατηρηθεί ερεθιστική επίδραση, η επιβεβαιωτική δοκιμή μπορεί να διεξαχθεί με διαδοχική ή ταυτόχρονη έκθεση των δύο επιπλέον ζώων. Στην εξαιρετική περίπτωση όπου δεν έχει διεξαχθεί η αρχική δοκιμή, είναι δυνατόν να υποβληθούν σε αγωγή δύο ή τρία ζώα με ένα μόνον επίθεμα, το οποίο αφαιρείται μετά από 4 ώρες. Όταν χρησιμοποιούνται δύο ζώα και εμφανίζουν και τα δύο την ίδια απόκριση, δεν χρειάζονται άλλες δοκιμές. Στην αντίθετη περίπτωση, υποβάλλεται στη δοκιμή και το τρίτο ζώο. Για την αξιολόγηση αμφίβολων αποκρίσεων ενδέχεται να απαιτηθούν περισσότερα ζώα.
1.4.2.5 Περίοδος παρατήρησης Η διάρκεια της περιόδου παρατήρησης θα πρέπει να είναι επαρκής για να εκτιμηθεί πλήρως κατά πόσον οι παρατηρούμενες επιδράσεις είναι αναστρέψιμες. Παρόλα αυτά, το πείραμα θα πρέπει να τερματίζεται αμέσως μόλις το ζώο εμφανίσει διαρκή σημεία ισχυρού πόνου ή δυσφορίας. Για να κριθεί αν οι επιδράσεις είναι αναστρέψιμες, τα ζώα θα πρέπει να παρατηρούνται για χρονικό διάστημα έως 14 ημερών μετά την αφαίρεση των επιθεμάτων. Εάν διαπιστωθεί ότι είναι αναστρέψιμες πριν παρέλθουν 14 ημέρες, το πείραμα θα πρέπει να τερματίζεται τη συγκεκριμένη στιγμή.
1.4.2.6 Κλινικές παρατηρήσεις και διαβάθμιση των δερματικών αντιδράσεων Όλα τα ζώα θα πρέπει να εξετάζονται για σημεία ερυθήματος και οιδήματος και η οι αποκρίσεις να διαβαθμίζονται σε 60 λεπτά και, κατόπιν, σε 24, 48 και 72 ώρες από την αφαίρεση του επιθέματος. Κατά την αρχική δοκιμή σε ένα ζώο, εξετάζεται επίσης το σημείο εφαρμογής του επιθέματος αμέσως μετά την αφαίρεση του. Οι δερματικές αντιδράσεις βαθμολογούνται και καταγράφονται σύμφωνα με το σύστημα του παρακάτω πίνακα. Εάν σε 72 ώρες παρατηρηθεί βλάβη του δέρματος που δεν είναι δυνατόν να χαρακτηριστεί ερεθισμός ή διάβρωση, μπορεί να χρειάζεται να συνεχιστεί η παρατήρηση μέχρι τη 14η ημέρα για να κριθεί αν οι επιδράσεις είναι αναστρέψιμες. Εκτός από την παρατήρηση του ερεθισμού, θα πρέπει να περιγράφονται πλήρως και να καταγράφονται όλες οι τοπικές τοξικές επιδράσεις, λόγου χάριν απολίπανση του δέρματος, και οι τυχόν συστημικές δυσμενείς επιδράσεις (π.χ., στα κλινικά συμπτώματα τοξικότητας και στο βάρος του σώματος). Για τη διασαφήνιση αμφίβολων αποκρίσεων, θα πρέπει να μελετάται το ενδεχόμενο ιστοπαθολογικής εξέτασης. Η διαβάθμιση των δερματικών αποκρίσεων είναι κατ' ανάγκην υποκειμενική. Για να διευκολυνθεί η εναρμονισμένη διαβάθμιση των δερματικών αποκρίσεων και να βοηθηθούν, αφενός τα εργαστήρια δοκιμών και, αφετέρου, το προσωπικό που εκτελεί και ερμηνεύει τις παρατηρήσεις, απαιτείται κατάλληλη εκπαίδευση του εν λόγω προσωπικού στο χρησιμοποιούμενο σύστημα βαθμολόγησης (βλ. πίνακα παρακάτω). Χρήσιμος είναι επίσης ένας εικονογραφημένος οδηγός ιεράρχησης του ερεθισμού και άλλων βλαβών του δέρματος (9).
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ
2.
2.1 ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Τα αποτελέσματα της μελέτης θα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα της τελικής έκθεσης δοκιμής και να καλύπτουν όλα τα στοιχεία που απαριθμούνται στην παράγραφο 3.1.
2.2 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η βαθμολογία του δερματικού ερεθισμού θα πρέπει να αξιολογείται σε συνδυασμό με το είδος και τη σοβαρότητα των βλαβών, καθώς και με το κατά πόσον αυτές είναι αναστρέψιμες. Οι επιμέρους βαθμοί δεν αντιπροσωπεύουν ένα απόλυτο πρότυπο για τις ερεθιστικές ιδιότητες ενός υλικού, δεδομένου ότι αξιολογούνται και άλλες επιδράσεις των ελεγχόμενων ουσιών. Αντίθετα, θα πρέπει να θεωρούνται ως τιμές αναφοράς, οι οποίες πρέπει να συνεκτιμώνται με όλες τις υπόλοιπες παρατηρήσεις της μελέτης. Κατά την αξιολόγηση των ερεθιστικών αποκρίσεων, θα πρέπει να εξετάζεται αν οι βλάβες του δέρματος είναι. αναστρέψιμες. Εφόσον αποκρίσεις όπως αλωπεκία (περιορισμένη επιφάνεια), υπερκεράτωση, υπερπλασία και απολέπιση επιμένουν μέχρι το τέλος της 14ήμερης περιόδου παρατήρησης, η ελεγχόμενη ουσία θα πρέπει να θεωρείται ερεθιστική.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΕΩΝ
3.
3.1 ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει χα ακόλουθα στοιχεία:
Αιτιολόγηση της διεξαγωγής δοκιμής in vivo: ανάλυση βάρους της μαρτυρίας των δεδομένων που προϋπήρχαν, συμπεριλαμβανομένων των αποτελεσμάτων της στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών:
περιγραφή των σχετικών δεδομένων που έχουν προκύψει από προηγούμενες δοκιμές
δεδομένα που προέκυψαν σε κάθε στάδιο της στρατηγικής δοκιμών
περιγραφή των δοκιμών in vitro που πραγματοποιήθηκαν, με λεπτομέρειες για τις διαδικασίες και τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με τις ουσίες ελέγχου/αναφοράς-
ανάλυση βάρους της μαρτυρίας προκειμένου να διεξαχθεί μελέτη in vivo.
Ελεγχόμενη ουσία:
στοιχεία ταυτότητας (π.χ. αριθ. CAS, πηγή, καθαρότητα, γνωστές ξένες προσμίξεις, αριθμός παρτίδας)·
σύσταση και φυσικές και χημικές ιδιότητες (π.χ. pH, πτητικότητα, διαλυτότητα, σταθερότηια)·
προκειμένου για μίγματα, σύνθεση και εκατοστιαία αναλογία των συστατικών.
Φορέας:
στοιχεία ταυτότητας, συγκέντρωση (κατά περίπτωση), όγκος που χρησιμοποιήθηκε-
αιτιολόγηση της επιλογής του φορέα.
Πειραματόζωα δοκιμής:
είδος/φυλή που χρησιμοποιήθηκε, αιτιολόγηση της χρήσης άλλων ζώων αντί αλφικών κουνελιών·
αριθμός ζώων κάθε φύλου·
βάρος κάθε ζώου στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής·
ηλικία κατά την έναρξη της μελέτης·
προέλευση των ζώων, συνθήκες στέγασης, σιτηρέσιο κ.λπ.
Συνθήκες δοκιμής:
τεχνική προετοιμασίας του σημείου εφαρμογής των επιθεμάτων·
λεπτομέρειες για τα υλικά των επιθεμάτων και την τεχνική εφαρμογής τους·
λεπτομέρειες για την παρασκευή, την εφαρμογή και την απομάκρυνση της ελεγχόμενης ουσίας.
Αποτελέσματα:
καταχώρηση σε πίνακα των βαθμών ερεθιστικής/διαβρωτικής απόκρισης για κάθε ζώο σε κάθε χρονική στιγμή μέτρησης·
περιγραφή όλων των βλαβών που παρατηρήθηκαν·
αναλυτική περιγραφή του είδους και της έκτασης του ερεθισμού ή της διάβρωσης που παρατηρήθηκε, καθώς και τυχόν παθολογοανατομικών ευρημάτων·
περιγραφή άλλων δυσμενών τοπικών επιδράσεων εκτός από δερματικό ερεθισμό ή διάβρωση (π.χ, απολίπανση του δέρματος) και τυχόν συστημικών επιδράσεων.
Συζήτηση των αποτελεσμάτων
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, Μ., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, Α., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23,410 — 429. Young, J.R., How, Μ J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720. ECETOC (1990) Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524. Μέθοδος Β.40 Διάβρωση του δέρματος;. ΟΟΣΑ (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Solna, Σουηδία, 22-24 Ιανουαρίου 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm) ΟΟΣΑ (1998) Εναρμονισμένο Ολοκληρωμένο Σύστημα Ταξινόμησης Κινδύνων για τις Επιδράσεις των Χημικών Ουσιών στην Υγεία του ανθρώπου και στο Περιβάλλον, το οποίο εγκρίθηκε από την 28η κοινή συνεδρίαση της επιτροπής χημικών προϊόντων και της ομάδας εργασίας για τα χημικά προϊόντα, το Νοέμβριο του 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Διατίθεται κατόπιν αιτήσεως από τη Γραμματεία του ΟΟΣΑ].
ΠΙΝΑΚΑΣ 1 Ερύθημα και σχηματισμός εσχάρας Οίδημα ΔΙΑΒΑΘΜΙΣΗ ΤΩΝ ΔΕΡΜΑΤΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ
Κανένα ερύθημα … 0 Πολύ ελαφρό ερύθημα (μόλις αντιληπτό) … 1 Περιγεγραμμένο ερύθημα … 2 Μέτριο έως σοβαρό ερύθημα … 3 Σοβαρό ερύθημα (ερυθρότητα βοείου κρέατος) έως σχηματισμός εσχάρας που εμποδίζει τη διαβάθμιση του ερυθήματος … 4 Μέγιστος δυνατός βαθμός: 4 Κανένα οίδημα … 0 Πολύ ελαφρό οίδημα (μόλις αντιληπτό) … 1 Ελαφρό οίδημα (περιγεγραμμένα χείλη με σαφή διόγκωση) … 2 Μέτριο οίδημα (διόγκωση 1 mm περίπου) … 3 Σοβαρό οίδημα (διόγκωση άνω του 1 mm εκτεινόμενη πέραν της επιφάνειας έκθεσης) … 4 Μέγιστος δυνατός βαθμός: 4 Για τη διασαφήνιση αμφίβολων αποκρίσεων είναι δυνατόν να γίνει ιστοπαθολογική εξέταση.
Β.5. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ: ΕΡΕΘΙΣΜΟΣ/ΔΙΑΒΡΩΣΗ ΤΩΝ ΟΦΘΑΛΜΩΝ
Β.5.
1. Η ΜΕΘΟΔΟΣ Η παρούσα μέθοδος είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών TG 405 (2002) του ΟΟΣΑ.
1.
1.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κατά την ανάπτυξη της παρούσας αναπροσαρμοσμένης μεθόδου, δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή στις δυνατότητες βελτίωσης με την αξιολόγηση όλων των διαθέσιμων στοιχείων σχετικά με τις ελεγχόμενες ουσίες, ώστε να μην διεξάγονται περιττές δοκιμές πειραματόζωα και, κατ’ επέκταση να υπάρξει ανταπόκριση στον προβληματισμό για τη καλή μεταχείριση των ζώων. Η μέθοδος περιλαμβάνει τη σύσταση να υποβάλλονται τα υφιστάμενα δεδομένα σε ανάλυση βάρους της μαρτυρίας (1), πριν από την διεξαγωγή της περιγραφόμενης δοκιμής in vivo για οξείας μορφής διάβρωση/ερεθισμό των οφθαλμών. Εφόσον τα διαθέσιμα δεδομένα είναι ανεπαρκή, συνιστάται να συμπληρώνονται με την εφαρμογή ακολουθιακού ελέγχου (2) (3). Η συνιστώμενη στρατηγική δοκιμών περιλαμβάνει την εκτέλεση έγκυρων και αποδεκτών δοκιμασιών in vitro και παρατίθεται σε παράρτημα της μεθόδου δοκιμών. Επιπλέον, πριν εξεταστεί το ενδεχόμενο οφθαλμικής δοκιμής in vivo, συνιστάται την διεξαγωγή δοκιμής in vivo για διάβρωση/ερεθισμό του δέρματος με σκοπό την πρόγνωση της διάβρωσης των οφθαλμών. Προς όφελος τόσο της ορθότητας του επιστημονικού έργου, όσο και της πρόνοιας για τα ζώα, δεν θα πρέπει να διεξάγονται δοκιμές in vivo, πριν αξιολογηθούν, με ανάλυση βάρους της μαρτυρίας, όλα τα διαθέσιμα δεδομένα σχετικά με την πιθανή διαβρωτική/ερεθιστική επίδραση των ουσιών στους οφθαλμούς. Τα εν λόγω δεδομένα περιλαμβάνουν στοιχεία από προηγούμενες μελέτες στον άνθρωπο ή/και σε πειραματόζωα, στοιχεία που αποδεικνύουν ότι μια ή περισσότερες ουσίες με ανάλογη χημική δομή ή μείγματα τέτοιων ουσιών προκαλούν διάβρωση/ερεθισμό, δεδομένα υψηλής οξύτητας ή αλκαλικότητας των ουσιών (4) (5) και αποτελέσματα έγκυρων και αποδεκτών δοκιμών in vitro ή ex vivo για διάβρωση και ερεθισμό του δέρματος (6) (6a). Οι μελέτες αυτές είναι δυνατόν να έχουν διεξαχθεί πριν από την ανάλυση βάρους της μαρτυρίας ή ως απόρροιά της. Από την ανωτέρω ανάλυση ενδέχεται να προκύπτει ανάγκη μελετών in vivo της διαβρωτικής/ερεθιστικής για τους οφθαλμούς ικανότητας ορισμένων ουσιών. Στις περιπτώσεις αυτές, πριν εξεταστεί το ενδεχόμενο εφαρμογής της οφθαλμικής δοκιμής in vivo, θα πρέπει πρώτα να μελετώνται και να αξιολογούνται οι δερματικές επιδράσεις των ουσιών in vivo σύμφωνα με την μέθοδο δοκιμών B.4 (7). Η εφαρμογή της ανάλυσης βάρους της μαρτυρίας, καθώς και της στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών αναμένεται να περιορίσει την ανάγκη διεξαγωγής δοκιμών in vivo για διαβρωτική/ερεθιστική επίδραση στους οφθαλμούς, ουσιών για τις οποίες υπάρχουν ήδη επαρκή αποδεικτικά στοιχεία, προερχόμενα από άλλες μελέτες. Εάν η διαβρωτική/ερεθιστική για τους οφθαλμούς ικανότητα δεν είναι δυνατόν προσδιοριστεί με τη στρατηγική διαδοχικών δοκιμών, ακόμη και μετά τη μελέτη της διάβρωσης και του ερεθισμού του δέρματος in vivo, τότε μπορεί διεξάγεται δοκιμή in vivo για διάβρωση/ερεθισμό των οφθαλμών. Σε παράρτημα της παρούσας μεθόδου παρατίθεται προτιμώμενη στρατηγική διαδοχικών δοκιμών (ακολουθιακός έλεγχος), που περιλαμβάνει τη διεξαγωγή έγκυρων και αποδεκτών δοκιμών διάβρωσης/ερεθισμού in vitro ή ex vivo. Η στρατηγική αυτή διαμορφώθηκε σε ημερίδα του ΟΟΣΑ, προτάθηκε ομόφωνα από τους συνέδρους (8) και εγκρίθηκε ως συνιστώμενη στρατηγική δοκιμών στο Παγκόσμιο Εναρμονισμένο Σύστημα Ταξινόμησης Χημικών Ουσιών (Globaly Harmonised System for the Classification oh Chemical Substances/GHS (9). Συνιστάται η εφαρμογή της εν λόγω στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών πριν από τη διεξαγωγή δοκιμών in vivo. Προκειμένου για νέες ουσίες, αποτελεί τη συνιστώμενη κλιμακωτή προσέγγιση για τη συλλογή επιστημονικώς ορθών στοιχείων σχετικά με τη διαβρωτική/ερεθιστική δράση των ουσιών. Στην περίπτωση των υφισταμένων ουσιών, για τις οποίες δεν υπάρχουν επαρκή στοιχεία όσον αφορά τη δερματική και οφθαλμική διάβρωση/ερεθισμό, η στρατηγική θα πρέπει να χρησιμοποιείται για να συμπληρωθούν τα κενά στα δεδομένα. Η εφαρμογή διαφορετικής στρατηγικής ή διαδικασίας δοκιμών η τυχόν απόφαση να μην εφαρμοστεί κλιμακωτή προσέγγιση δοκιμών θα πρέπει να αιτιολογείται.
1.2 ΟΡΙΣΜΟΙ Ερεθισμός των οφθαλμών: είναι η πρόκληση αλλοιώσεων του οφθαλμού, οι οποίες εμφανίζονται μετά την εφαρμογή της ελεγχόμενης ουσίας στην εμπρόσθια επιφάνειά του και είναι πλήρως αναστρέψιμες εντός 21 ημερών από την εφαρμογή της ουσίας. Διάβρωση των οφθαλμών: είναι η βλάβη ιστών του οφθαλμού ή σοβαρή μείωση της όρασης, η οποία εμφανίζεται μετά την εφαρμογή της ελεγχόμενης ουσίας στην εμπρόσθια επιφάνεια του οφθαλμού και δεν είναι πλήρως αναστρέψιμη εντός 21 ημερών από την εφαρμογή της ουσίας.
1.3 ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ Μία δόση της ελεγχόμενης ουσίας εφαρμόζεται εφάπαξ σε έναν από τους οφθαλμούς του πειραματοζώου, ενώ ο οφθαλμός που δεν έχει υποβληθεί σε αγωγή χρησιμεύει ως μάρτυρας. Σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα, αξιολογείται η έκταση του ερεθισμού/της διάβρωσης του οφθαλμού με βαθμολόγηση τω αλλοιώσεων του επιπεφυκότα, του κερατοειδούς και της ίριδας. Περιγράφονται επίσης τυχόν άλλες επιδράσεις στους οφθαλμούς και συστημικές δυσμενείς επιδράσεις με σκοπό την πλήρη αξιολόγηση των επιδράσεων. Η διάρκεια της μελέτης θα πρέπει να είναι επαρκής για να εκτιμηθεί αν οι επιδράσεις είναι αναστρέψιμες ή μη. Τα ζώα που εμφανίζουν διαρκή σημεία έντονης δυσφορίας ή/και πόνου σε οποιοδήποτε στάδιο της δοκιμής θα πρέπει να θανατώνονται με ευθανασία, οπότε η ουσία αξιολογείται ανάλογα. Κριτήρια για τη λήψη απόφασης σχετικά με την ευθανασία ετοιμοθάνατων ή βαρέως πασχόντων ζώων παρέχονται στη δημοσίευση (10).
1.4 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ
1.4
1.4.1 Προετοιμασία της δοκιμής in vivo
1.4.1
1.4.1.1 Επιλογή είδους ζώων Το προτιμώμενο πειραματόζωο είναι το αλφικό κουνέλι και χρησιμοποιούνται υγιή νεαρά ενήλικα ζώα. Η χρήση άλλων φυλών ή ειδών θα πρέπει να αιτιολογείται.
1.4.1.2 Προετοιμασία των ζώων Κάθε πειραματόζωο που επιλέγεται προσωρινά για τη δοκιμή θα πρέπει, εντός των 24 ωρών που προηγούνται της έναρξης της, να υποβάλλεται σε οφθαλμολογική εξέταση και των δύο οφθαλμών. Δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ζώα που εμφανίζουν ερεθισμένους οφθαλμούς, ανωμαλίες της όρασης ή προϋπάρχουσες κακώσεις του κερατοειδούς.
1.4.1.3 Συνθήκες στέγασης και διατροφής Τα ζώα πρέπει να στεγάζονται χωριστά. Για τα κουνέλια, η θερμοκρασία του θαλάμου πειραματόζωων πρέπει να είναι 20 oC (±3 oC). Αν και η σχετική υγρασία πρέπει να είναι τουλάχιστον 30 % και, κατά προτίμηση, να μην υπερβαίνει το 70 %, εκτός από τις περιόδους καθαρισμού του θαλάμου, εν τούτοις ο στόχος θα πρέπει να είναι μια τιμή 50-60 %. Ο φωτισμός πρέπει να είναι τεχνητός, με εναλλαγή φωτός-σκότους ανά 12ωρο. Για τη διατροφή των ζώων μπορούν να χρησιμοποιούνται τα συνήθη εργαστηριακά σιτηρέσια, με απεριόριστη παροχή πόσιμου νερού.
1.4.2 Διαδικασία δοκιμής
1.4.2
1.4.2.1 Εφαρμογή της ελεγχόμενης ουσίας Η ελεγχόμενη ουσία πρέπει να τοποθετείται στο θόλο του επιπεφυκότα του ενός οφθαλμού κάθε ζώου, αφού τραβηχτεί, με απαλές κινήσεις, το κάτω βλέφαρο από το βολβό. Στη συνέχεια, με απαλές κινήσεις, τα βλέφαρα διατηρούνται κλειστά για ένα περίπου δευτερόλεπτο, για να αποφευχθεί η απώλεια υλικού. Ο άλλος οφθαλμός, που δεν υποβάλλεται σε αγωγή, χρησιμεύει ως μάρτυρας.
1.4.2.2 Διαβροχή Οι οφθαλμοί των πειραματόζωων δεν πρέπει να εκπλύνονται για 24 ώρες τουλάχιστον μετά την ενστάλαξη της ελεγχόμενης ουσίας, εκτός εάν αυτή είναι στερεά (βλέπε παράγραφο 1.4.2.3.2), όπως και εάν εκδηλωθούν αμέσως διαβρωτικές ή ερεθιστικές επιδράσεις. Σε 24 ώρες μπορεί να γίνει έκπλυση, εάν θεωρηθεί απαραίτητο. Δεν συνιστάται η χρήση δορυφορικής ομάδας ζώων για τη διερεύνηση της επίδρασης της έκπλυσης, εκτός εάν το επιβάλλουν επιστημονικοί λόγοι. Στις περιπτώσεις όπου απαιτείται δορυφορική ομάδα, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται δύο κουνέλια και να τεκμηριώνονται επιμελώς οι συνθήκες έκπλυσης, π.χ. χρόνος έκπλυσης, σύνθεση και θερμοκρασία του διαλύματος, διάρκεια, όγκος και ταχύτητα εφαρμογής.
1.4.2.3 Επίπεδα δόσεων
1.4.2.3
1.4.2.3.1 Δοκιμή υγρών Για τη δοκιμή υγρών χρησιμοποιείται μία δόση 0,1 ml. Τα εκνεφώματα (σπρέι) δεν θα πρέπει να ενσταλάζονται απευθείας από τον ψεκαστήρα στον οφθαλμό. Το υγρό θα πρέπει να εκβάλλεται από τον περιέκτη, να συλλέγεται σε άλλο δοχείο και κατόπιν να λαμβάνονται 0,1 ml για ενστάλαξη στον οφθαλμό.
1.4.2.3.2 Δοκιμή στερεών Για τη δοκιμή στερεών, αλοιφών και κοκκωδών υλικών, η χρησιμοποιούμενη ποσότητα πρέπει να έχει όγκο 0,1 ml ή βάρος που δεν υπερβαίνει τα 100 mg. Το ελεγχόμενο υλικό πρέπει να λειοτριβείται σε λεπτή σκόνη. Ο όγκος του στερεού υλικού πρέπει να μετράται μετά από ελαφρά συμπίεση, π.χ. με μικρά κτυπήματα στο δοχείο μέτρησης. Εάν η στερεά ελεγχόμενη ουσία δεν έχει απομακρυνθεί από τον οφθαλμό του πειραματόζωου, με τους φυσιολογικούς μηχανισμούς, κατά την πρώτο χρόνο παρατήρησης, που είναι μία ώρα μετά την αγωγή, ο οφθαλμός μπορεί να εκπλύνεται με φυσιολογικό ορό ή απεσταγμένο νερό.
1.4.2.3.3 Δοκιμή αερολυμάτων Όλα τα εκνεφώματα και αερολύματα συνιστάται να συλλέγονται σε άλλο δοχείο πριν από την ενστάλαξή στον οφθαλμό, με μόνη εξαίρεση τις ουσίες που περιέχονται σε δοχεία υπό πίεση, οι οποίες δεν είναι δυνατόν να συλλεχθούν επειδή εξατμίζονται. Στις περιπτώσεις αυτές, ο οφθαλμός θα πρέπει να κρατείται ανοικτός και η ουσία να χορηγείται με ένα μόνο ψεκασμό διάρκειας ενός δευτερολέπτου περίπου από απόσταση 10 cm, ακριβώς απέναντι από τον οφθαλμό. Αυτή η απόσταση μπορεί να κυμαίνεται πράγμα που εξαρτάται από την πίεση του εκνεφώματος και από τα συστατικά του. Θα πρέπει να καταβάλλεται προσοχή ώστε ο οφθαλμός να μην υφίσταται βλάβη από την πίεση ψεκασμού. Σε ειδικές περιπτώσεις, ενδέχεται να είναι αναγκαία η εκτίμηση της πιθανότητας να προκληθεί μηχανική βλάβη στον οφθαλμό από τη δύναμη του αερολύματος. Η δόση του αερολύματος είναι δυνατόν να υπολογιστεί κατά προσέγγιση με την ακόλουθη προσομοίωση της δοκιμής: η ουσία ψεκάζεται μέσω οπής μεγέθους οφθαλμού κουνελιού επάνω σε χαρτί τοποθετημένο ακριβώς πίσω της. Η αύξηση του βάρους του χαρτιού παρέχει μια εκτίμηση της ποσότητας που θα ψεκαστεί στον οφθαλμό. Στην περίπτωση των πτητικών ουσιών, η δόση μπορεί να υπολογιστεί κατά προσέγγιση με ζύγιση του δοχείου που περιέχει το ελεγχόμενο υλικό πριν και μετά την αφαίρεσή του.
1.4.2.4 Αρχική δοκιμή (Δοκιμή ερεθισμού/διάβρωσης των οφθαλμών in vivo σε ένα ζώο) Όπως αναφέρεται στη στρατηγική διαδοχικών δοκιμών (βλέπε παράρτημα 1), συνιστάται έντονα να διεξάγεται η δοκιμή in vivo πρώτα σε ένα μόνο ζώο. Εάν τα αποτελέσματα της δοκιμής αυτής υποδεικνύουν, σύμφωνα με την περιγραφόμενη διαδικασία, ότι η ουσία είναι διαβρωτικό ή ισχυρό ερεθιστικό των οφθαλμών, δεν θα πρέπει να διεξάγονται άλλες δοκιμές ερεθισμού των οφθαλμών.
1.4.2.5 Τοπική αναισθησία Κατά περίπτωση, μπορούν να χρησιμοποιούνται τοπικά αναισθητικά. Εάν η ανάλυση βάρους της μαρτυρίας υποδεικνύει ότι η ουσία μπορεί να προκαλέσει πόνο ή εάν από την αρχική δοκιμή έχει προκύψει επώδυνη αντίδραση, μπορεί να χρησιμοποιηθεί τοπικό αναισθητικό πριν από την ενστάλαξη της ελεγχόμενης ουσίας. Ο τύπος, η συγκέντρωση και η δόση του τοπικού αναισθητικού θα πρέπει να επιλέγονται προσεκτικά, ώστε να εξασφαλίζεται ότι δεν πρόκειται να υπάρξει σημαντική διαφοροποίηση της αντίδρασης στην ελεγχόμενη ουσία λόγω της χρήσης του. Με τον ίδιο τρόπο θα πρέπει να αναισθητοποιείται και ο οφθαλμός μάρτυρας.
1.4.2.6 Επιβεβαιωτική δοκιμή (δοκιμή ερεθισμού των οφθαλμών in vivo σε επιπλέον ζώα) Εάν δεν έχει παρατηρηθεί διαβρωτική επίδραση κατά την αρχική δοκιμή, η ερεθιστική ή αρνητική απόκριση θα πρέπει να επιβεβαιώνεται με χρήση έως δύο επιπλέον ζώων. Εάν κατά την αρχική δοκιμή έχει παρατηρηθεί ισχυρή ερεθιστική επίδραση, που υποδεικνύει πιθανή σοβαρή (μη αναστρέψιμη) επίδραση κατά την επιβεβαιωτική δοκιμή, συνιστάται η διεξαγωγή της επιβεβαιωτικής δοκιμής σε διαδοχικές φάσεις με χρήση ενός ζώου κάθε φορά αντί της ταυτόχρονης έκθεσης των δύο επιπλέον ζώων. Εάν το δεύτερο ζώο εμφανίσει διαβρωτικές ή ισχυρές ερεθιστικές επιδράσεις, η δοκιμή διακόπτεται. Για την αξιολόγηση ασθενών ή μέτριων ερεθιστικών αποκρίσεων ενδέχεται να απαιτηθούν περισσότερα ζώα.
1.4.2.7 Περίοδος παρατήρησης Η διάρκεια της περιόδου παρατήρησης θα πρέπει να είναι επαρκής για να εκτιμηθεί πλήρως η έκταση των παρατηρούμενων επιδράσεων και το κατά πόσον αυτές είναι αναστρέψιμες. Παρόλα αυτά, το πείραμα θα πρέπει να τερματίζεται αμέσως μόλις το ζώο εμφανίσει διαρκή σημεία ισχυρού πόνου ή δυσφορίας (9). Για να κριθεί αν οι επιδράσεις είναι αναστρέψιμες, τα ζώα θα πρέπει κατά κανόνα να παρατηρούνται για χρονικό διάστημα 21 ημερών μετά τη χορήγηση της ελεγχόμενης ουσίας. Εάν διαπιστωθεί ότι είναι αναστρέψιμες πριν παρέλθουν 21 ημέρες, το πείραμα θα πρέπει να τερματίζεται τη συγκεκριμένη αυτή στιγμή.
1.4.2.7
1.4.2.7.1 Κλινικές παρατηρήσεις και διαβάθμιση των οφθαλμικών αντιδράσεων Οι οφθαλμοί θα πρέπει να εξετάζονται 1, 24, 48 και 72 ώρες μετά την εφαρμογή της ελεγχόμενης ουσίας. Τα ζώα θα πρέπει να παραμένουν στη δοκιμή μόνο για όσο χρόνο απαιτείται για να ληφθούν οριστικά στοιχεία. Τα ζώα που εμφανίζουν διαρκή σημεία ισχυρού πόνου ή δυσφορίας θα πρέπει να θανατώνονται αμέσως με ευθανασία, οπότε η ουσία αξιολογείται ανάλογα. Θα πρέπει επίσης να θανατώνονται με ευθανασία τα ζώα που εμφανίζουν τις ακόλουθες αλλοιώσεις μετά την ενστάλαξη, επειδή συνήθως αυτές δεν είναι αναστρέψιμες: διάτρηση ή σοβαρή εξέλκωση του κερατοειδούς, συμπεριλαμβανομένου του σταφυλώματος, αιμορραγία στον οπίσθιο θάλαμο του οφθαλμού, θολερότητα του κερατοειδούς βαθμού 4 για 48 ώρες; απουσία φωτοκινητικού αντανακλαστικού (βαθμός απόκρισης ίριδας 2) για 72 ώρες; εξέλκωση του επιπεφυκότα, νέκρωση του επιπεφυκότα ή της σκαρδαμυκτικής μεμβράνης, εσχάρα. Τα ζώα που δεν εμφανίζουν αλλοιώσεις των οφθαλμών μπορούν να απομακρύνονται από τη δοκιμή, το νωρίτερο 3 ημέρες μετά την ενστάλαξη. Τα ζώα που εμφανίζουν ελαφρές έως μέτριες αλλοιώσεις θα πρέπει να παρατηρούνται μέχρι αυτές να εξαλειφθούν ή για χρονικό διάστημα 21 ημερών, οπότε η μελέτη τερματίζεται. Θα πρέπει να γίνεται παρατήρηση την 7η, 14η και 21η ημέρα για να παρακολουθείται η εξέλιξη των αλλοιώσεων και να κρίνεται αν αυτές είναι αναστρέψιμες ή μη. Σε κάθε εξέταση θα πρέπει να καταγράφεται η βαθμολογία των οφθαλμικών αντιδράσεων (πίνακας Ι). Θα πρέπει επίσης να αναφέρονται τυχόν άλλες αλλοιώσεις του οφθαλμού (π.χ. πόνος, χρώση) ή συστημικές δυσμενείς επιδράσεις. Η εξέταση των αντιδράσεων μπορεί να διευκολυνθεί με τη χρήση διόφθαλμου οφθαλμοσκοπίου, φορητής σχισμοειδούς λυχνίας, βιομικροσκοπίου ή άλλου κατάλληλου οργάνου. Μετά την καταγραφή των παρατηρήσεων του πρώτου 24ώρου, οι οφθαλμοί μπορούν να εξετάζονται περαιτέρω με τη βοήθεια φλουορεσκεΐνης. Η διαβάθμιση των οφθαλμικών αποκρίσεων είναι κατ’ ανάγκη υποκειμενική. Για να διευκολυνθεί η εναρμόνιση της διαβάθμισης των οφθαλμικών αποκρίσεων και να βοηθηθούν, αφενός τα εργαστήρια δοκιμών και, αφετέρου, το προσωπικό που εκτελεί και ερμηνεύει τις παρατηρήσεις, απαιτείται κατάλληλη εκπαίδευση του εν λόγω προσωπικού στο χρησιμοποιούμενο σύστημα βαθμολόγησης.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ
2.
2.2 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η βαθμολογία του οφθαλμικού ερεθισμού θα πρέπει να αξιολογείται σε συνδυασμό με το είδος και τη σοβαρότητα των αλλοιώσεων, καθώς και με το κατά πόσον αυτές είναι αναστρέψιμες. Οι επιμέρους βαθμοί δεν αντιπροσωπεύουν ένα απόλυτο πρότυπο για τις ερεθιστικές ιδιότητες ενός υλικού, δεδομένου ότι αξιολογούνται και άλλες επιδράσεις των ελεγχόμενων ουσιών. Αντίθετα, θα πρέπει να θεωρούνται ως τιμές αναφοράς και έχουν αξία μόνον εφόσον τεκμηριώνονται από πλήρη περιγραφή και αξιολόγηση όλων των παρατηρήσεων.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΕΩΝ
3.
3.1 ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία:
Αιτιολόγηση της διεξαγωγής δοκιμής iη vivo: ανάλυση βάρους της μαρτυρίας των δεδομένων που προϋπήρχαν, συμπεριλαμβανομένων των αποτελεσμάτων της στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών:
περιγραφή των σχετικών δεδομένων που έχουν προκύψει από προηγούμενες δοκιμές·
δεδομένα που προέκυψαν σε κάθε στάδιο της στρατηγικής δοκιμών·
περιγραφή των δοκιμών iη vitro που πραγματοποιήθηκαν, με λεπτομέρειες για τις διαδικασίες και τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με τις ουσίες ελέγχου/αναφοράς·
περιγραφή της μελέτης του δερματικού ερεθισμού/διάβρωσης in vivo που πραγματοποιήθηκε, καθώς και των αποτελεσμάτων της·
ανάλυση βάρους της μαρτυρίας προκειμένου να διεξαχθεί μελέτη in vivo.
Ελεγχόμενη ουσία:
στοιχεία ταυτότητας (π.χ. αριθ. CAS, πηγή, καθαρότητα, γνωστές ξένες προσμίξεις, αριθμός παρτίδας)·
σύσταση και φυσικές και χημικές ιδιότητες (π.χ. pΗ, πτητικότητα, διαλυτότητα, σταθερότητα, αντίδραση με το νερό)·
προκειμένου για μίγματα, σύνθεση και εκατοστιαία αναλογία των συστατικών·
εάν χρησιμοποιήθηκε τοπικό αναισθητικό, στοιχεία ταυτότητας, καθαρότητα, τύπος, δόση και πιθανή αλληλεπίδραση με την ελεγχόμενη ουσία.
Φορέας:
στοιχεία ταυτότητας, συγκέντρωση (κατά περίπτωση), όγκος που χρησιμοποιήθηκε·
αιτιολόγηση της επιλογής του φορέα.
Πειραματόζωα δοκιμής:
είδος/φυλή που χρησιμοποιήθηκε, αιτιολόγηση της χρήσης άλλων ζώων αντί αλφικών κουνελιών·
ηλικία κάθε ζώου κατά την έναρξη της μελέτης·
αριθμός ζώων κάθε φύλου στις ομάδες δοκιμής και μαρτύρων (εφόσον απαιτούνται)·
βάρος κάθε ζώου στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής·
προέλευση των ζώων, συνθήκες στέγασης, σιτηρέσιο κ.λπ..
Αποτελέσματα:
περιγραφή της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε για τη βαθμολόγηση του ερεθισμού σε κάθε χρονική στιγμή παρατήρησης (π.χ. φορητή σχισμοειδής λυχνία, βιομικροσκόπιο, φλουορεσκεΐνη)·
καταχώρηση σε πίνακα των δεδομένων που αφορούν την ερεθιστική/διαβρωτική απόκριση για κάθε ζώο σε κάθε χρονική στιγμή παρατήρησης μέχρι την απομάκρυνσή του από τη δοκιμή·
αναλυτική περιγραφή του είδους και της έκτασης του ερεθισμού ή της διάβρωσης που παρατηρήθηκε·
περιγραφή άλλων αλλοιώσεων που ενδεχομένως παρατηρήθηκαν στον οφθαλμό (π.χ. νεοαγγείωση, σχηματισμός πάννου, συγκολλήσεις, χρώση)·
περιγραφή άλλων δυσμενών τοπικών επιδράσεων εκτός της περιοχής των οφθαλμών και συστημικών επιδράσεων, καθώς και τυχόν παθολογοανατομικών ευρημάτων.
Συζήτηση των αποτελεσμάτων
3.2 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η παρέκταση στον άνθρωπο των αποτελεσμάτων μελετών ερεθισμού των οφθαλμών που έχουν διεξαχθεί σε πειραματόζωα ισχύει μόνον ως ένα σημείο. Σε πολλές περιπτώσεις το αλφικό κουνέλι είναι πιο ευαίσθητο από τον άνθρωπο στα ερεθιστικά ή διαβρωτικά των οφθαλμών. Κατά την ερμηνεία των αποτελεσμάτων θα πρέπει να καταβάλλεται προσοχή για να μην λαμβάνεται υπόψη ο ερεθισμός που οφείλεται σε δευτεροπαθείς μολύνσεις.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, Μ., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, Α., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, Α., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164. Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26. Neun, DJ. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483-524. Μέθοδο! δοκιμών Β.40. Διάβρωση του δέρματος, Μέθοδος δοκιμών Β.4. Οξεία τοξικότητα: ερεθισμός/διάβρωση του δέρματος. ΟΟΣΑ (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OE.CD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Solna, Σουηδία, 22-24 Ιανουαρίου 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). ΟΟΣΑ (1998) Εναρμονισμένο Ολοκληρωμένο Σύστημα Ταξινόμησης Κινδύνων για τις Επιδράσεις των Χημικών Ουσιών στην Υγεία του ανθρώπου και στο Περιβάλλον, το οποίο εγκρίθηκε από την 28η κοινή συνεδρίαση της επιτροπής χημικών προϊόντων και της ομάδας εργασίας για τα χημικά προϊόντα, το Νοέμβριο του 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
Πίνακας Ι ΔΙΑΒΑΘΜΙΣΗ ΤΩΝ ΟΦΘΑΛΜΙΚΩΝ ΚΑΚΩΣΕΩΝ
Κερατοειδής
Αδιαφάνεια: βαθμός θολερότητας (η ανάγνωση θα πρέπει να λαμβάνεται από την πιο θολή περιοχή) Καμία εξέλκωση ούτε αδιαφάνεια … 0 Διάσπαρτες ή διάχυτες αδιαφανείς περιοχές (εκτός από ελαφρό θάμπωμα της φυσιολογικής στιλπνότητας), σαφώς διακρινόμενες λεπτομέρειες της ίριδας … 1 Ευδιάκριτη ημιδιαφανής περιοχή, ελαφρά συγκάλυψη των λεπτομερειών της ίριδας … 2 Γκρίζα περιοχή, πλήρης συγκάλυψη των λεπτομερειών της ίριδας: μόλις διακρινόμενο μέγεθος της κόρης … 3 Αδιαφανής κερατοειδής; μη διακρινόμενη ίριδα … 4 Μέγιστος δυνατός βαθμός: 4 ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ
Ίριδα
Φυσιολογική … 0 Εμφανής βάθυνση των πτυχώσεων, συμφόρηση, οίδημα, μέτρια υπεραιμία από τους περιβάλλοντας τον κερατοειδή ιστούς, ή διαστολή, φωτοευαίσθητη ίριδα (η καθυστέρηση αντίδρασης θεωρείται θετικό εύρημα) … 1 Αιμορραγία, μακροσκοπικώς ορατή καταστροφή ή καμία αντίδραση στο φως … 2 Μέγιστος δυνατός βαθμός: 2
Επιπεφυκός
Φυσιολογική ερυθρότητα (αναφέρεται στο βλεφαρικό και βολβικό επιπεφυκότα, εκτός της ίριδας και του κερατοειδούς) 0 Υπεραιμία ορισμένων αιμοφόρων αγγείων (Διαστολή) … 1 Διάχυτο πορφυρό χρώμα, δυσδιάκριτα τα αιμοφόρα αγγεία … 2 Διάχυτο ερυθρό χρώμα βοείου κρέατος … 3 Μέγιστος δυνατός βαθμός: 3
Χήμωση
Οίδημα (αναφέρεται στα βλέφαρα ή/και στη σκαρδαμυκτική μεμβράνη) Φυσιολογική … 0 Οίδημα ελαφρώς μεγαλύτερο του φυσιολογικού … 1 Εμφανές οίδημα με μερική αναστροφή των βλεφάρων … 2 Οίδημα με τα βλέφαρα σχεδόν ημίκλειστα … 3 Οίδημα με τα βλέφαρα σχεδόν κλειστά … 4 Μέγιστος δυνατός βαθμός: 4
Β. 6 ΕΥΑΙΣΘΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΔΕΡΜΑΤΟΣ
Β. 6
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Παρατηρήσεις Η ευαισθησία των δοκιμών και η ικανότητά τους να ανιχνεύσουν πιθανούς ευαισθητοποιητές του δέρματος του ανθρώπου θεωρούνται σημαντικά στοιχεία για ένα σύστημα ταξινόμησης της τοξικότητας που αφορά τη δημόσια υγεία. Δεν υπάρχει μία ενιαία μέθοδος δοκιμής που να προσδιορίζει επαρκώς όλες τις ουσίες οι οποίες δύνανται να προκαλέσουν ευαισθητοποίηση του δέρματος του ανθρώπου και που να είναι κατάλληλη για όλες τις ουσίες. Στην επιλογή μιας δοκιμής, πρέπει να ληφθούν υπόψη παράγοντες όπως τα φυσικά χαρακτηριστικά μιας ουσίας συμπεριλαμβανομένης και της ικανότητας της να διεισδύει στο δέρμα. Έχουν αναπτυχθεί δύο τύποι δοκιμών που χρησιμοποιούν ινδικά χοιρίδια; οι δοκιμές με βοηθητική ουσία, όπου μια αλλεργική κατάσταση ενεργοποιείται με τη διάλυση ή την παρασκευή εναιωρήματος της εξεταζόμενης ουσίας στο Freunds Complete Adjuvant (FCA) και οι δοκιμές χωρίς βοηθητική ουσία. Οι δοκιμές με βοηθητική ουσία είναι ενδεχομένως πιο ακριβείς στην πρόβλεψη πιθανής ευαισθητοποιητικής αντίδρασης μιας ουσίας στο δέρμα του ανθρώπου, σε σχέση με τις μεθόδους στις οποίες δεν χρησιμοποιείται FCA και κατά συνέπεια προτιμώνται. Η δοκιμή μεγιστοποίησης σε ινδικό χοιρίδιο (ΔΜΙΧ) είναι μία ευρέως χρησιμοποιούμενη δοκιμή με βοηθητική ουσία. Αν και μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες μέθοδοι για την ανίχνευση της δυνατότητας μιας ουσίας να προκαλέσει αντίδραση ευαισθητοποίησης του δέρματος, η ΔΜΙΧ θεωρείται ότι είναι η προτιμότερη τεχνική με βοηθητική ουσία. Για πολλές τάξεις χημικών ουσιών, οι δοκιμές χωρίς βοηθητική ουσία (από αυτές προτιμάται η δοκιμή Buehler) θεωρούνται λιγότερο ευαίσθητες. Σε ορισμένες περιπτώσεις είναι σκόπιμο να επιλεγεί η δοκιμή Buehler η οποία περιλαμβάνει τοπική εφαρμογή αντί της ενδοδερμικής έγχυσης που χρησιμοποιείται στη ΔΜΙΧ. Η χρησιμοποίηση της δοκιμής Buehler πρέπει να αιτιολογείται επιστημονικά. Στη μέθοδο αυτή περιγράφονται η δοκιμή μεγιστοποίησης σε ινδικά χοιρίδια (ΔΜΙΧ) και η δοκιμή Buehler. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες μέθοδοι με την προϋπόθεση ότι είναι έγκυρες και ότι αιτιολογούνται επιστημονικά. Εάν προκύψει θετικό αποτέλεσμα από μία αξιόπιστη προκαταρκτική δοκιμή, η ελεγχόμενη ουσία μπορεί να χαρακτηρισθεί ως εν δυνάμει ευαισθητοποιός και ενδέχεται να μην είναι αναγκαία η διεξαγωγή ΔΜΙΧ. Ωστόσο, εάν προκύψει αρνητικό αποτέλεσμα σε μία τέτοια δοκιμή, θα πρέπει να γίνει η ΔΜΙΧ σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται κατωτέρω. Βλέπε επίσης γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Ευαισθητοποίηση δέρματος: (αλλεργική δερματίτις εξ επαφής) δερματική αντίδραση ανοσολογικής φύσεως σε μια ουσία. Στον άνθρωπο, η αντίδραση αυτή μπορεί να χαρακτηρίζεται από κνησμό, ερύθημα, οίδημα, βλατίδες, φυσαλίδες, πομφόλυγες ή συνδυασμό αυτών. Σε άλλα είδη, οι αντιδράσεις είναι δυνατόν να διαφέρουν και να εμφανίζεται μόνο ερύθημα ή οίδημα Έκθεση διέγερσης: πειραματική έκθεση υποκειμένου στην ελεγχόμενη ουσία με σκοπό την πρόκληση κατάστασης υπερευαισθησίας. Περίοδος διέγερσης: περίοδος μιας τουλάχιστον εβδομάδας μετά την έκθεση διέγερσης κατά τη διάρκεια της οποίας είναι δυνατόν να εκδηλωθεί υπερευαισθησία. Έκθεση πρόκλησης: πειραματική έκθεση, μετά την περίοδο διέγερσης, υποκειμένου εκτεθέντος προηγουμένως σε εξεταζόμενη ουσία, προκειμένου να διαπιστωθεί αν το υποκείμενο αυτό αντιδρά με υπερευαισθησία.
1.3. ΟΥΣΙΑΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Η ευαισθησία και η αξιοπιστία της χρησιμοποιηθείσας πειραματικής τεχνικής πρέπει να αξιολογούνται ανά εξάμηνο με τη χρήση ουσιών οι οποίες είναι γνωστό ότι μπορούν να προκαλέσουν ήπια έως μέτρια ευαισθητοποίηση του δέρματος. Εφόσον η δοκιμή έχει διεξαχθεί ορθά, θα πρέπει να αναμένεται για τους ήπιους έως μέτριους ευαισθητοποιητές ποσοστό απόκρισης τουλάχιστον 30 % στις δοκιμές με βοηθητική ουσία και τουλάχιστον 15 % στις δοκιμές χωρίς βοηθητική ουσία. Προτιμούνται οι ακόλουθες ουσίες Αριθ. CAS Αρθ ΕIΝΕCS Ονομασία EINECS Κοινή Ονομασία 101-86-0 202-983-3 α-εξυλοκινναμαμαλδεύδη α-εξυλοκινναμαλδεύδη 149-30-4 205-736-8 βενζοσειαζολο-2-θειόλη (μερκαπτοβενζοθειαζόλη) kaptax 94-07-7 202-303-5 δενζοκαΐνη νορκαίνη Σε ορισμένες δεόντως αιτιολογημένες περιπτώσεις είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν άλλες ουσίες που πληρούν τα προαναφερθέντα κριτήρια.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ Τα πειραματόζωα εκτίθενται αρχικά στη δοκιμαζόμενη ουσία με ενδοδερμικές ενέσεις και/ή επιδερμική επίθεση (έκθεση διέγερσης). Μετά από μια περίοδο ανάπαυσης 10 έως 14 ημερών (περίοδος διέγερσης), κατά τη διάρκεια της οποίας είναι δυνατόν να εμφανιστεί ανοσολογική αντίδραση, τα ζώα εκτίθενται σε μια δόση πρόκλησης Η έκταση και ο βαθμός της δερματικής αντίδρασης των πειραματοζώων στην έκθεση πρόκλησης συγκρίνεται με την αντίστοιχη αντίδραση των ζώων μαρτύρων τα οποία αφού εκτεθούν σε σκεύασμα placebo (κατά τη διέγερση) υποβάλλονται σε έκθεση πρόκλησης.
1.5. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΔΟΚΙΜΗΣ Σε περίπτωση που απαιτείται απομάκρυνση της ελεγχόμενης ουσίας από το δέρμα, θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί νερό ή κατάλληλος διαλύτης ώστε να μην αλλοιωθεί η εμφανισθείσα αντίδραση και να διατηρηθεί η ακεραιότητα της επιδερμίδας
1.5.
1.5.1. Δοκιμή μεγιστοποίησης σε ινδικό χοιρίδιο (ΔΜΙΧ)
1.5.1.
1.5.1.1. Προετοιμασία Υγιή νεαρά ενήλικα ινδικά χοιρίδια (albino) εγκλιματίζονται στις συνθήκες του εργαστηρίου επί 5 τουλάχιστον ημέρες πριν από την έναρξη της δοκιμής Πριν από τη δοκιμή τα ζώα λαμβάνονται τυχαία και χωρίζονται σε ομάδες αγωγής Το τρίχωμα αφαιρείται με κούρεμα, ξύρισμα ή, εφ όσον είναι δυνατόν, με χημική αποτρίχωση, ανάλογα με τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο δοκιμής Λαμβάνεται μέριμνα ώστε να αποφεύγεται η λύση της συνεχείας του δέρματος. Τα ζώα ζυγίζονται πριν από την έναρξη της δοκιμής και στο τέλος της·
1.5.1.2. Συνθήκες δοκιμής
1.5.1.2.
1.5.1.2.1. Πειραματόζωα Χρησιμοποιούνται συνήθεις φυλές ινδικών χοιριδίων albino εργαστηρίου.
1.5.1.2.2. Αριθμός και φύλο Μπορούν να χρησιμοποιηθούν αρσενικά και/ή θηλυκά ζώα. Αν χρησιμοποιηθούν θηλυκά, αυτά θα πρέπει να είναι άτοκα και να μην ευρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Για την ομάδα αγωγής χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 10 ζώα και για την ομάδα των μαρτύρων τουλάχιστον 5 ζώα. Όταν έχουν χρησιμοποιηθεί λιγότερα από 20 πειραματόζωα και λιγότερα από 10 ζώα-μάρτυρες και δεν είναι δυνατόν να συναχθεί συμπέρασμα για την ευαισθητοποιώ δράση της ουσίας, συνιστάται ιδιαιτέρως η διεξαγωγή δοκιμής και με άλλα ζώα ώστε να συμπληρωθεί ο αριθμός των 20 πειραματόζωων και 10 μαρτύρων τουλάχιστον.
1.5.1.2.3. Επίπεδα δόσεων Η χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση δοκιμαζόμενης ουσίας σε κάθε έκθεση διέγερσης πρέπει να είναι καλώς ανεκτή διασυστημικά και να αντιπροσωπεύει την υψηλότερη συγκέντρωση που προκαλεί ήπιο έως μέτριας εντάσεως ερεθισμό του δέρματος. Η χρησιμοποιούμενη στην έκθεση πρόκλησης συγκέντρωση πρέπει να αντιπροσωπεύει την υψηλότερη δόση που δεν προκαλεί ερεθισμό. Εφ όσον απαιτείται, οι κατάλληλες συγκεντρώσεις προσδιορίζονται από πιλοτική μελέτη με 2 ή 3 πειραματόζωα. Για το σκοπό αυτό, είναι σκόπιμο να χρησιμοποιούνται ζώα που έχουν υποβληθεί σε αγωγή με FCA.
1.5.1.3. Διαδικασία
1.5.1.3.
1.5.1.3.1. Διέγερση Ημέρα 0 — ομάδα αγωγής Στην περιοχή του ώμου από την οποία έχει αφαιρεθεί προηγουμένως το τρίχωμα διενεργούνται τρία ζεύγη ενδοδερμικών ενέσεων των 0,1 ml, το καθένα εκατέρωθεν της σπονδυλικής στήλης. Ένεση 1: μείγμα FCA/νερό ή φυσιολογικό ορό αναλογίας 1:1 (v/v). Ένεση 2: επιλεγμένη συγκέντρωση της ελεγχόμενης ουσίας σε κατάλληλο φορέα. Ένεση 3: παρασκεύασμα της ελεγχόμενης ουσίας στην επιλεγμένη συγκέντρωση σε μείγμα FCA/νερό ή φυσιολογικό ορό αναλογίας 1:1 (v/v). Στην ένεση 3, οι υδατοδιαλυτές ουσίες διαλύονται στην υδατική φάση προτού αναμειχθούν με το FCA. Για τις λιποδιαλυτές ή αδιάλυτες ουσίες, σχηματίζεται εναιώρημα στο FCA προτού αναμειχθούν με την υδατική φάση. Η τελική συγκέντρωση της ελεγχόμενης ουσίας ισούται με εκείνη της ένεσης 2. Οι ενέσεις 1 και 2 διενεργούνται σε μικρή απόσταση μεταξύ τους πολύ κοντά στο κεφάλι ενώ η ένεση 3 διενεργείται προς το ουραίο τμήμα της εξεταζόμενης περιοχής. Ημέρα 0 — ομάδα μάρτυρας Διενεργούνται τρία ζεύγη ενδοδερμικών ενέσεων των 0,1 ml στις ίδιες θέσεις με την ομάδα αγωγής. Ένεση 1: μείγμα FCA/νερό ή φυσιολογικό ορό αναλογίας 1:1 (v/v). Ένεση 2: μη αραιωμένος φορέας Ένεση 3: παρασκεύασμα του φορέα σε συγκέντρωση 50 % w/v σε μείγμα FCA και νερού ή φυσιολογικού ορού αναλογίας 1:1 (v/v). 5η-7η ημέρα — ομάδα αγωγής και ομάδα μάρτυρας Σε περίπτωση που η ουσία δεν είναι ερεθιστική για το δέρμα, είκοσι τέσσερις περίπου ώρες πριν αχό την τοπική εφαρμογή διέγερσης, και αφού προηγηθεί κούρεμα και/ή ξύρισμα του τριχώματος της εξεταζόμενης περιοχής αυτή επιχρίεται με 0,5 ml 10 % δωδεκυλοθειικού νατρίου σε βαζελίνη, προκειμένου να προκληθεί τοπικός ερεθισμός. 6η-8η ημέρα — ομάδα αγωγής Αφαιρείται και πάλι το τρίχωμα από την εξεταζόμενη περιοχή. Διηθητικό χαρτί διαστάσεων 2 cm × 4 cm κορέννυται με την ελεγχόμενη ουσία σε κατάλληλο φορέα, εφαρμόζεται στην εξεταζόμενη περιοχή και διατηρείται σε επαφή με το δέρμα επί 48 ώρες με πιεστικό επίδεσμο. Η επιλογή του φορέα πρέπει να αιτιολογείται. Ουσίες σε στερεή μορφή λεπτοκονιοποιούνται και ενσωματώνονται σε κατάλληλο φορέα. Υγρές ουσίες μπορούν να εφαρμόζονται χωρίς προηγούμενη αραίωση, εφόσον είναι σκόπιμο. 6η-8η ημέρα — ομάδα μάρτυρας Αφαιρείται και πάλι το τρίχωμα από την εξεταζόμενη περιοχή στην οποία εφαρμόζεται στη συνέχεια μόνον ο φορέας με τον τρόπο που περιγράφεται ανωτέρω, και διατηρείται σε επαφή με το δέρμα επί 48 ώρες με αδιαπέραστο επίδεσμο.
1.5.1.3.2. Πρόκληση 20ή-22η ημέρα — ομάδα αγωγής και ομάδα μάρτυρας Αφαιρείται το τρίχωμα από τις πλευρές των ζώων της ομάδας αγωγής και της ομάδας μαρτύρων. Στη μία πλευρά των ζώων εφαρμόζεται επίθεμα ή κάψουλα με την ελεγχόμενη ουσία και εφόσον είναι σκόπιμο, στην άλλη πλευρά εφαρμόζεται επίθεμα ή κάψουλα που περιέχει μόνο φορέα. Τα επιθέματα διατηρούνται σε επαφή με το δέρμα επί 24 ώρες με αδιαπέραστο επίδεσμο.
1.5.1.3.3. Παρατήρηση και βαθμολόγηση: ομάδα αγωγής και ομάδα μάρτυρας Συνιστάται τυφλή ανάγνωση των αποτελεσμάτων από τα ζώα δοκιμής και τους μάρτυρες. Εάν απαιτείται αποσαφήνιση των ληφθέντων αποτελεσμάτων από την πρώτη πρόκληση, θα πρέπει να εξεταστεί το ενδεχόμενο διεξαγωγής δεύτερης πρόκλησης (επαναπρόκλήση), μια εβδομάδα περίπου μετά την πρώτη, με νέα ομάδα μάρτυρα, εφόσον είναι αναγκαίο. Επαναπρόκληση μπορεί να διεξαχθεί και με την αρχική ομάδα μάρτυρα. Όλες οι δερματικές αντιδράσεις και τα ασυνήθη ευρήματα, συμπεριλαμβανομένων των διασυστημικών αντιδράσεων, που προκύπτουν από τις διαδικασίες διέγερσης και πρόκλησης πρέπει να παρατηρούνται και να καταγράφονται σύμφωνα με την κλίμακα Magnusson/Kligman (βλ. προσάρτημα). Για την αποσαφήνιση αμφισβητήσιμων αντιδράσεων μπορούν να χρησιμοποιηθούν άλλες διαδικασίες όπως η ιστοπαθολογική εξέταση ή η μέτρηση του πάχους των πτυχώσεων του δέρματος.
21 περίπου ώρες μετά την απομάκρυνση του επιθέματος η περιοχή πρόκλησης καθαρίζεται, κουρεύεται και/ή ξυρίζεται και αποτριχώνεται εάν είναι αναγκαίο,
3 περίπου ώρες αργότερα (περίπου 48 ώρες από την έναρξη της πρόκλησης) παρατηρείται η αντίδραση του δέρματος και καταγράφεται σύμφωνα με τους βαθμούς του προσαρτήματος,
24 περίπου ώρες μετά την παρατήρηση αυτή, διενεργείται δεύτερη παρατήρηση (72 ώρες) η οποία και καταγράφεται.
1.5.2. Δοκιμή Buehler
1.5.2.
1.5.2.1. Προετοιμασία Υγιή νεαρά ενήλικα ινδικά χοιρίδια albino εγκλιματίζονται στις συνθήκες του εργαστηρίου επί 5 τουλάχιστον ημέρες πριν από την έναρξη της δοκιμής. Πριν από τη δοκιμή, τα ζώα λαμβάνονται τυχαία και χωρίζονται σε ομάδες αγωγής. Το τρίχωμα αφαιρείται με κούρεμα, ξύρισμα ή, εφ' όσον είναι δυνατόν με χημική αποτρίχωση, ανάλογα με τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο δοκιμής, Λαμβάνεται μέριμνα ώστε να αποφεύγεται η λύση της συνεχείας του δέρματος. Τα ζώα ζυγίζονται πριν από την έναρξη της δοκιμής και στο τέλος της.
1.5.2.2. Συνθήκες δοκιμής
1.5.2.2.
1.52.2.1. Πειραματόζωα Χρησιμοποιούνται συνήθεις φυλές ινδικών χοιριδίων albino εργαστηρίου.
1.5.2.2.2. Αριθμός και φύλο Μπορούν να χρησιμοποιηθούν αρσενικά και/ή θηλυκά ζώα. Αν χρησιμοποιηθούν θηλυκά, αυτά πρέπει να είναι άτοκα και να μην ευρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης Για την ομάδα αγωγής χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 20 ζώα και για την ομάδα των μαρτύρων τουλάχιστον 10 ζώα.
1.5.2.2.3. Επίπεδα δόσεων Η χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση δοκιμαζόμενης ουσίας σε κάθε έκθεση διέγερσης πρέπει να αντιπροσωπεύει την υψηλότερη δυνατή συγκέντρωση που προκαλεί ήπιο αλλά όχι υπέρμετρο ερεθισμό. Η χρησιμοποιούμενη στην έκθεση πρόκλησης συγκέντρωση πρέπει να αντιπροσωπεύει την υψηλότερη δόση που δεν προκαλεί ερεθισμό. Εφόσον απαιτείται, οι κατάλληλες συγκεντρώσεις προσδιορίζονται από πιλοτική μελέτη με 2 ή 3 πειραματόζωα. Για τις υδατοδιαλυτές ουσίες ως φορέας συνίσταται το νερό ή αραιό διάλυμα μη ερεθιστικής τασιενεργού ουσίας. Για τις άλλες ελεγχόμενες ουσίες προτιμάται η χρήση μείγματος 80 % αιθανόλης/νερού στην έκθεση διέγερσης και ακετόνης στην έκθεση πρόκλησης
1.5.2.3. Διαδικασία
1.5.2.3.
1.5.2.3.1. Διέγερση Ημέρα 0 — ομάδα αγωγής Αφαιρείται το τρίχωμα από τη μια πλευρά του ζώου {με κούρεμα). Το επίθεμα δοκιμής κορέννυται με ελεγχόμενη ουσία, σε κατάλληλο φορέα (η επιλογή του φορέα πρέπει να αιτιολογείται· υγρές ουσίες μπορούν να χρησιμοποιούνται, αν είναι σκόπιμο, χωρίς προηγούμενη αραίωση). Το επίθεμα δοκιμής εφαρμόζεται επί της εξεταζόμενης περιοχής και διατηρείται σε επαφή με το δέρμα επί 6 ώρες με τη βοήθεια αδιαπέραστου επιδέσμου ή κάψουλας και καταλλήλου επιδέσμου. Το επίθεμα δοκιμής πρέπει να είναι αδιαπέραστο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί στρογγυλό ή τετράγωνο επικάλλυμα από βαμβάκι διαστάσεων 4-6 cm2 περίπου. Θεωρείται σκόπιμη η χρησιμοποίηση διάταξης συγκράτησης για την εξασφάλιση της αδιαπερατότητας. Σε περίπτωση περιτύλιξης της υπό αγωγή περιοχής ενδέχεται να απαιτηθούν επιπλέον εκθέσεις στην ουσία. Ημέρα 0 — ομάδα μάρτυρας Αφαιρείται το τρίχωμα από τη μια πλευρά του ζώου (με κούρεμα). Εφαρμόζεται μόνον ο φορέας με τον τρόπο που περιγράφεται για την ομάδα αγωγής. Το επίθεμα δοκιμής διατηρείται σε επαφή με το δέρμα επί 6 ώρες με τη βοήθεια αδιαπέραστου επιδέσμου ή κάψουλας και κατάλληλου επιδέσμου. Εάν είναι δυνατόν να αποδειχθεί ότι η δοκιμή με σκεύασμα placebo σε ομάδα μάρτυρα δεν είναι αναγκαία, επιτρέπεται να χρησιμοποιηθεί ομάδα μάρτυρας στην οποία δεν χορηγείται καμία ουσία. 6η-8η και Ι3η-!5η ημέρα — ομάδα αγωγής και ομάδα μάρτυρας την 6η-8η ημέρα και επίσης την 13η-15η ημέρα, πραγματοποιείται η ίδια εργασία όπως και την ημέρα 0 στην ίδια εξεταζόμενη περιοχή (μετά από αφαίρεση του τριχώματος αν είναι αναγκαίο) της ίδιας πλευράς.
1.5.2.3.2. Πρόκληση 27η-29η ημέρα — ομάδα αγωγής και ομάδα μάρτυρας Αφαιρείται το τρίχωμα (με κούρεμα) από την άλλη πλευρά των ζώων αγωγής και ζώων μαρτύρων η οποία δεν έχει εκτεθεί στην ελεγχόμενη ουσία. Στο οπίσθιο τμήμα της πλευράς αυτής εφαρμόζεται αδιαπέραστος επίδεσμος ή κάψουλα που περέχει κατάλληλη ποσότητα ελεγχόμενης ουσίας στη μέγιστη συγκέντρωση που δεν προκαλεί ερεθισμό. Όταν είναι σκόπιμο, εφαρμόζεται στο εμπρόσθιο μέρος της ίδιας πλευράς των ζώων αγωγής και των ζώων μαρτύρων αδιαπέραστος επίδεσμος ή κάψουλα που περιέχει μόνο φορέα. Τα επιθέματα ή οι κάψουλες διατηρούνται σε επαφή με το δέρμα επί 6 ώρες με τη βοήθεια κατάλληλου επιδέσμου.
1.5.2.3.3. Παρατήρηση και βαθμολόγηση Συνίσταται τυφλή ανάγνωση των αποτελεσμάτων από τα ζώα δοκιμής και τους μάρτυρες. Εάν απαιτείται αποσαφήνιση των ληφθέντων αποτελεσμάτων από την πρώτη πρόκληση, θα πρέπει να εξεταστεί το ενδεχόμενο διεξαγωγής δεύτερης πρόκλησης (επαναπρόκληση), μια εβδομάδα περίπου μετά την πρώτη, με νέα ομάδα μάρτυρα, εφόσον είναι αναγκαίο. Επαναπρόκληση μπορεί να διεξαχθεί και με την αρχική ομάδα μάρτυρα. Όλες οι δερματικές αντιδράσεις και τα ασυνήθη ευρήματα, συμπεριλαμβανομένων των διασυστημικών αντιδράσεων, που προκύπτουν από τις διαδικασίες διέγερσης και πρόκλησης πρέπει να παρατηρούνται και να καταγράφονται σύμφωνα με την κλίμακα Magnusson/Kligman (βλέπε προσάρτημα). Για την αποσαφήνιση αμφισβητήσιμων αντιδράσεων μπορούν να χρησιμοποιηθούν άλλες διαδικασίες όπως η ιστοπαθολογική εξέταση ή η μέτρηση του πάχους των πτυχώσεων του δέρματος.
περίπου 21 ώρες μετά την απομάκρυνση του επιθέματος αφαιρείται το τρίχωμα από την περιοχή πρόκλησης,
περίπου τρεις ώρες αργότερα (δηλαδή 30 περίπου ώρες μετά την εφαρμογή του επιθέματος πρόκλησης) παρατηρούνται οι αντιδράσεις του δέρματος και καταγράφονται σύμφωνα με τους βαθμούς του προσαρτήματος,
περίπου 24 ώρες μετά την τριαντακοντάωρη παρατήρηση (δηλαδή 54 περίπου ώρες μετά την εφαρμογή του επιθέματος πρόκλησης) παρατηρούνται εκ νέου και καταγράφονται οι αντιδράσεις του δέρματος.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ (ΔΜΙΧ ΚΑΙ ΔΟΚΙΜΗ BUEHLER) Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα στον οποίο παρουσιάζονται για κάθε ζώο οι δερματικές αντιδράσεις που αντιστοιχούν σε κάθε παρατήρηση.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ (ΔΜΙΧ ΚΑΙ ΔΟΚΙΜΗ BUEHLER) Σε περίπτωση που πραγματοποιήθηκε προκαταρκτική δοκιμή πριν από τη δοκιμή με ινδικά χοιρίδια παρέχονται περιγραφή ή τα στοιχεία αναφοράς της δοκιμής (επί παραδείγματι, δοκιμή τοπικού λεμφαδένα — LLΝΑ, δοκιμή οιδήματος αυτιού ποντικού — ΜΕSΤ) συμπεριλαμβανομένων των λεπτομερειών της διαδικασίας καθώς και τα αποτελέσματα που ελήφθησαν τόσο με την ελεγχόμενη ουσία όσο και με τις ουσίες αναφοράς.
3. Έκθεση δοκιμής (ΔΜΙΧ και δοκιμή Buehler)
Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει, εφόσον είναι δυνατόν, τις ακόλουθες πληροφορίες.
Για τα πειραματόζωα:
φυλή των χρησιμοποιηθέντων ινδικών χοιριδίων,
αριθμός ηλικία και φύλο των ζώων,
προέλευση, συνθήκες στέγασης διατροφής κ.λπ.,
βάρος κάθε ζώου κατά την έναρξη της δοκιμής.
Για τις συνθήκες δοκιμής:
τεχνική προετοιμασίας της περιοχής εφαρμογής της ουσίας,
λεπτομέρειες σχετικά με το επιδεσμικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε και την τεχνική της εφαρμογής του,
αποτέλεσμα της πιλοτικής μελέτης και πόρισμα σχετικά με τις συγκεντρώσεις διέγερσης και πρόκλησης που πρέπει να χρησιμοποιηθούν στη δοκιμή,
λεπτομέρειες για την προετοιμασία, εφαρμογή και απομάκρυνση της ουσίας,
αιτιολόγηση της επιλογής του φορέα,
συγκεντρώσεις φορέα και δοκιμαζόμενης ουσίας που χρησιμοποιήθηκαν για τις εκθέσεις διέγερσης και πρόκλησης και συνολική ποσότητα ουσίας που εφαρμόστηκε για διέγερση και πρόκληση.
Για τα αποτελέσματα:
περίληψη των αποτελεσμάτων του τελευταίου ελέγχου ευαισθησίας και αξιοπιστίας (βλέπε 1.3) συμπεριλαμβανομένων πληροφοριών για την ουσία, τη συγκέντρωση και το φορέα που χρησιμοποιήθηκαν,
πληροφορίες για κάθε ζώο συμπεριλαμβανομένου του συστήματος βαθμολόγησης,
αναλυτική περιγραφή της φύσης και του βαθμού των εκδηλώσεων που παρατηρήθηκαν,
τυχόν ιστοπαθολογικά ευρήματα.
Συζήτηση των αποτελεσμάτων.
Συμπεράσματα.
4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Η παρούσα μέθοδος είναι παραπλήσια της ΤΟ 406 του ΟΟΣΑ.
Β.7 ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΗΣ (28 ΗΜΕΡΕΣ) ΔΟΣΗΣ (ΑΠΟ ΤΟ ΣΤΟΜΑ)
Β.7
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βλέπε γενική εισαγωγή μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Βλέπε γενική εισαγωγή μέρος Β.
1.3. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ Η δοκιμασμένη ουσία χορηγείται από το στόμα σε ημερήσιες διαβαθμισμένες δόσεις, σε διάφορες ομάδες πειραματόζωων, μια δόση ανά ομάδα, για μια περίοδο 28 ημερών. Τα ζώα εξετάζονται με προσοχή καθημερινά κατά τη διάρκεια της περιόδου χορήγησης για τη διαπίστωση τοξικών συμπτωμάτων. Τα ζώα που πεθαίνουν ή θανατώνονται κατά τη διάρκεια της δοκιμής νεκροτομούνται, και στο τέλος της δοκιμής, αυτά που έχουν επιζήσει θανατώνονται και νεκροτομούνται επίσης. Η παρούσα μέθοδος δίδει μεγαλύτερη έμφαση στις νευρολογικές επιδράσεις ως ειδικό τελικό σημείο καθώς και στην ανάγκη προσεκτικής κλινικής παρατήρησης των ζώων με σκοπό τη συγκέντρωση των περισσοτέρων δυνατών πληροφοριών. Επιδιώκεται η ταυτοποίηση χημικών ουσιών με νευροτοξικό δυναμικό, πράγμα το οποίο ενδέχεται να απαιτήσει περαιτέρω εις βάθος διερεύνηση του θέματος. Επιπλέον, η μέθοδος αυτή είναι δυνατόν να παρέχει ενδείξεις για ανοσολογικές επιδράσεις και τοξικότητα στα όργανα αναπαραγωγής.
1.4. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ
1.4.
1.4.1. Προετοιμασία Υγιή νεαρά ζώα κατανέμονται τυχαία σε ομάδες μαρτύρων και αγωγής. Τα κλουβιά διευθετούνται με τρόπο ώστε να ελαχιστοποιούνται οι οφειλόμενες στη θέση των κλουβιών επιπτώσεις. Τα ζώα σημαδεύονται και διατηρούνται στα κλουβιά τους επί πέντε τουλάχιστον ημέρες πριν από την έναρξη της μελέτης προκειμένου να εγκλιματιστούν στις συνθήκες του εργαστηρίου. Η ελεγχόμενη ουσία χορηγείται με αναγκαστική θρέψη ή μέσω της τροφής ή του πόσιμου νερού. Ο τρόπος χορήγησης της ουσίας διά του στόματος εξαρτάται από το σκοπό της μελέτης και από τις φυσικές και χημικές ιδιότητες της ουσίας. Εφόσον είναι αναγκαίο, παρασκευάζεται διάλυμα ή εναιώρημα της δοκιμαζόμενης ουσίας σε κατάλληλο φορέα. Συνίσταται, εφόσον είναι δυνατόν, η χρήση υδατικού διαλύματος/εναιωρήματος, ως πρώτη επιλογή, διαλύματος/γαλακτώματος σε έλαιο (π.χ. αραβοσιτέλαιο) κατόπιν, και, ως τελευταία επιλογή, η χρήση διαλύματος σε άλλο φορέα. Σε περίπτωση που ο φορέας δεν είναι το νερό, τα τοξικά χαρακτηριστικά του πρέπει να είναι γνωστά. Επίσης πρέπει να προσδιορίζεται η σταθερότητα της ελεγχόμενης ουσίας στον φορέα.
1.4.2. Συνθήκες δοκιμής
1.4.2.
1.4.2.1. Πειραματόζωα Το προτιμότερο είδος είναι ο επίμυς αν και μπορούν να χρησιμοποιηθούν άλλα είδη τρωκτικών. Πρέπει να χρησιμοποιούνται οι συνήθεις εργαστηριακές φυλές νεαρών, υγιών ενήλικων ζώων. Τα θηλυκά πρέπει να είναι άτοκα και να μη βρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Η χορήγηση της ουσίας πρέπει να αρχίσει το ταχύτερο δυνατόν μετά τον απογαλακτισμό και, οπωσδήποτε σε ηλικία μικρότερη των εννέα εβδομάδων. Στην αρχή της μελέτης, η διαφορά βάρους των χρησιμοποιούμενων ζώων δεν πρέπει να υπερβαίνει το ± 20 % της μέσης τιμής, για κάθε φύλο. Σε περίπτωση που διεξάγεται προκαταρκτική μελέτη με επαναλαμβανόμενη δόση από το στόμα πριν από μία μακροπρόθεσμη μελέτη, είναι προτιμότερο να χρησιμοποιηθούν ζώα της ίδιας φυλής και προέλευσης και για τις δύο μελέτες.
1.4.2.2. Αριθμός και φύλο Για κάθε επίπεδο δόσεων, πρέπει να χρησιμοποιούνται 10, τουλάχιστον, ζώα (5 θηλυκά και 5 αρσενικά). Εάν έχουν σχεδιαστεί ενδιάμεσες θανατώσεις ζώων, ο αριθμός των ζώων ανά ομάδα πρέπει να αυξηθεί κατά τον αριθμό των ζώων που προγραμματίστηκε να θανατωθούν πριν από τη συμπλήρωση της μελέτης. Επιπλέον, μια δορυφορική ομάδα από 10 ζώα (5 ζώα ανά φύλο) πρέπει να υποβληθεί σε αγωγή με την υψηλότερη δόση για 28 ημέρες, ώστε να επιτρέψει παρατηρήσεις για την αναστρεψιμότητα, εμμονή ή καθυστερημένη εμφάνιση των τοξικών συμπτωμάτων επί 14 ημέρες μετά το τέλος των χορηγήσεων. Χρησιμοποιείται επίσης και μία δορυφορική ομάδα από 10 ζώα μάρτυρες (πέντε ζώα ανά φύλο).
1.4.2.3. Επίπεδα δόσεων Γενικά, πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον τρεις ομάδες αγωγής και μία ομάδα μάρτυρας. Εκτός από τη χορήγηση της ελεγχόμενης ουσίας, τα ζώα της ομάδας μάρτυρα πρέπει να υφίστανται την ίδια ακριβώς μεταχείριση με τα ζώα της ομάδας αγωγής. Εάν χρησιμοποιείται φορέας για τη χορήγηση της ελεγχόμενης ουσίας, τα ζώα της ομάδας μάρτυρα πρέπει να λάβουν το φορέα στο μεγαλύτερο όγκο που χρησιμοποιήθηκε. Αν από την εκτίμηση άλλων δεδομένων προκύπτει ότι η χορήγηση ημερήσιας δόσης 1000 mg/kg βάρους σώματος δεν αναμένεται να έχει επίδραση, μπορεί να διενεργηθεί οριακή δοκιμή. Εάν δεν διατίθενται κατάλληλα δεδομένα είναι δυνατόν να διενεργηθεί διερευνητική μελέτη που θα βοηθήσει στον προσδιορισμό των απαιτούμενων δόσεων. Για την επιλογή των επιπέδων δόσεων πρέπει να ληφθούν υπόψη τυχόν διαθέσιμα δεδομένα για την τοξικότητα και την (τοξικο)κινητική της ελεγχόμενης ουσίας ή σχετικών με αυτή προϊόντων. Το υψηλότερο επίπεδο δόσης πρέπει να προκαλέσει τοξικές εκδηλώσεις όχι όμως το θάνατο ή έντονους πόνους. Στη συνέχεια επιλέγεται φθίνουσα σειρά δοσολογικών επιπέδων με σκοπό τον εντοπισμό απόκρισης συνδεόμενης με τη δόση και του χαμηλότερου επιπέδου δόσης στο οποίο δεν παρατηρούνται δυσμενείς επιδράσεις (ΝΟΑΕL). Για τον καθορισμό της φθίνουσας σειράς δοσολογικών επιπέδων τα διπλάσια έως τετραπλάσια μεσοδιαστήματα αποτελούν συνήθως τη βέλτιστη επιλογή. Συχνά προτιμάται η προσθήκη τέταρτης ομάδας αγωγής αντί της χρησιμοποίησης πολύ μεγάλων διαστημάτων (πολλαπλάσια του 10 και άνω) μεταξύ των διαδοχικών δόσεων. Για τις ουσίες που χορηγούνται μέσω της τροφής ή του πόσιμου νερού πρέπει να εξασφαλίζεται ότι οι χορηγούμενες ποσότητες ελεγχόμενης ουσίας δεν επηρεάζουν τη συνήθη ισορροπία του διαιτολογίου ή το ισοζύγιο νερού. Όταν η ελεγχόμενη ουσία χορηγείται με την τροφή, πρέπει να χρησιμοποιείται είτε σταθερή συγκέντρωση στην τροφή (ppm) είτε σταθερό επίπεδο δόσεων εκφρασμένο επί του βάρους του σώματος του ζώου και να διευκρινίζεται ποια από τις δύο δυνατότητες έχει επιλεγεί. Για ουσίες που χορηγούνται με αναγκαστική θρέψη η χορήγηση πρέπει να γίνεται ακριβώς την ίδια ώρα κάθε ημέρα. Οι δόσεις πρέπει να προσαρμόζονται ώστε να διατηρείται ένα σταθερό επίπεδο δόσεων ως προς το βάρος του σώματος. Σε περίπτωση που διενεργείται προκαταρκτική μελέτη με επαναλαμβανόμενη δόση από μία μακροπρόθεσμη μελέτη, η χορηγούμενη τροφή πρέπει να είναι η ίδια και στις δύο μελέτες.
1.4.2.4. Οριακή δοκιμή Εάν μια δοκιμή που έχει πραγματοποιηθεί σύμφωνα με τις περιγραφόμενες για την παρούσα μελέτη διαδικασίες, με επίπεδο δόσης τουλάχιστον 1000 mg/kg βάρους σώματος/ημέρα ή, εφ' όσον πρόκειται για χορήγηση με την τροφή ή το πόσιμο νερό, με αντίστοιχη αναλογία στην τροφή ή στο πόσιμο νερό (σε σχέση με το βάρος του σώματος), δεν οδηγήσει στην παρατήρηση τοξικών εκδηλώσεων και εάν, βάσει των στοιχείων που διατίθενται για ουσίες ανάλογης δομής, δεν αναμένεται εμφάνιση τοξικότητας, είναι δυνατόν να μην απαιτείται διεξαγωγή πλήρους μελέτης με τρία επίπεδα δόσεων. Η οριακή δοκιμή εφαρμόζεται εφόσον από την έκθεση του ανθρώπου δεν προκύψει ανάγκη χρησιμοποίησης υψηλοτέρου επιπέδου δόσης.
1.4.2.5. Περίοδος παρατήρησης Η περίοδος παρατήρησης διαρκεί 28 ημέρες. Τα ζώα μίας δορυφορικής ομάδας που θα χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω παρατηρήσεις πρέπει να αναμείνουν 14 ακόμη ημέρες χωρίς να υποβληθούν σε οιαδήποτε αγωγή, προκειμένου να παρατηρηθεί τυχόν καθυστερημένη εμφάνιση, εμμονή, ή ανάνηψη από τοξικά συμπτώματα.
1.4.3. Διαδικασία Η ελεγχόμενη ουσία χορηγείται στα ζώα καθημερινά επί επτά ημέρες την εβδομάδα για περίοδο 28 ημερών. Εάν η ουσία χορηγείται επί πέντε μόνο ημέρες την εβδομάδα, αυτό πρέπει να αιτιολογείται. Όταν η ελεγχόμενη ουσία χορηγείται με αναγκαστική θρέψη, η χορήγηση πρέπει να γίνεται εφάπαξ με τη βοήθεια καθετήρα στομάχου ή κατάλληλης διασωλήνωσης. Ο μέγιστος όγκος υγρού που μπορεί να χορηγηθεί εφάπαξ εξαρτάται από το μέγεθος του πειραματόζωου. Ο όγκος αυτός δεν πρέπει να υπερβαίνει το 1 ml/100 g βάρους σώματος, ή τα 2 ml/100 g βάρους σώματος εάν πρόκειται για υδατικά διαλύματα. Εκτός από την περίπτωση των ερεθιστικών ή διαβρωτικών ουσιών οι οποίες σε υψηλότερες συγκεντρώσεις θα προκαλούσαν έξαρση των συμπτωμάτων, οι διαφορές των χορηγουμένων όγκων ελεγχόμενης ουσίας πρέπει να ελαχιστοποιούνται ρυθμίζοντας τη συγκέντρωση, ώστε να εξασφαλιστεί σταθερός όγκος σε όλα τα επίπεδα δόσεων.
1.4.3.
1.4.3.1. Γενικές παρατηρήσεις Γενικές κλινικές παρατηρήσεις πρέπει να διεξάγονται τουλάχιστον μια φορά την ημέρα, κατά προτίμηση την (τις) ίδια(-ες) ώρα(-ες) κάθε μέρα και λαμβάνοντας υπόψη το χρόνο κορυφώσεως των αναμενόμενων επιδράσεων μετά τη χορήγηση της δόσης. Η κατάσταση της υγείας των ζώων πρέπει να καταγράφεται. Όλα τα ζώα εξετάζονται τουλάχιστον δύο φορές την ημέρα για τη διαπίστωση νοσηρότητας και θνησιμότητας. Τα ετοιμοθάνατα ζώα και τα ζώα που παρουσιάζουν έντονη δυσφορία ή πόνο πρέπει να απομακρύνονται, μόλις αυτό γίνει αντιληπτό, να θανατώνονται με ανώδυνο τρόπο και να νεκροτομούνται. Όλα τα ζώα πρέπει να υποβληθούν σε λεπτομερή κλινική παρατήρηση μία φορά πριν από την πρώτη έκθεση (προκειμένου να γίνουν συγκρίσεις μεταξύ των διαφόρων ζώων) και στη συνέχεια τουλάχιστον μια φορά την εβδομάδα. Οι παρατηρήσεις αυτές πρέπει να διενεργούνται κατά προτίμηση την ίδια ώρα κάθε φορά, έξω από τα κλουβιά σ' έναν τυποποιημένο χώρο. Καταγράφονται προσεκτικά, χρησιμοποιώντας κατά προτίμηση συστήματα βαθμολόγησης καθορισμένα σαφώς από το εργαστήριο. Καταβάλλεται κάθε προσπάθεια ώστε οι συνθήκες της δοκιμής να παρουσιάζουν τις ελάχιστες δυνατές διακυμάνσεις και οι παρατηρήσεις να διεξάγονται κατά προτίμηση από άτομα που δεν έχουν ενημερωθεί για την αγωγή. Καταγράφονται, μεταξύ άλλων, μεταβολές στο δέρμα, στο τρίχωμα, στα μάτια, στους βλεννογόνους, εκκρίσεις και απεκκρίσεις καθώς και αυτόνομες ενέργειες (όπως δακρύρροια, ανόρθωση τριχών, μεταβολή της διαμέτρου της κόρης του οφθαλμού, του ρυθμού της αναπνοής). Καταγράφονται επίσης μεταβολές στο βάδισμα, στη στάση και στην αντίδραση κατά τη μεταχείριση καθώς και η εμφάνιση κλονικών ή τονικών κινήσεων, στερεότυπων κινήσεων (όπως υπερβολική περιποίηση του εαυτού τους, συνεχείς περιστροφές) ή περίεργη συμπεριφορά (όπως αυτοακρωτηριασμός, βάδισμα προς τα πίσω), Την τέταρτη εβδομάδα έκθεσης αξιολογούνται οι αντιδράσεις των αισθητηρίων οργάνων σε διαφόρων ειδών ερεθίσματα (όπως σε ακουστικά, οπτικά και ιδιοδόχα ερεθίσματα) η δύναμη της λαβής και η κινητικότητα. Λεπτομέρειες σχετικά με τις διαδικασίες που μπορούν να ακολουθηθούν παρέχονται στις σχετικές δημοσιεύσεις (βλέπε γενική εισαγωγή μέρος Β). Οι παρατηρήσεις των λειτουργιών που διεξάγονται κατά την τέταρτη εβδομάδα έκθεσης μπορούν να παραλειφθούν εάν η μελέτη προηγείται μελέτης υποχρόνιας τοξικότητας (90 ημερών). Στην περίπτωση αυτή, οι παρατηρήσεις των λειτουργιών θα πρέπει να περιληφθούν στην επόμενη αυτή μελέτη. Από την άλλη πλευρά όμως, η ύπαρξη δεδομένων για τις λειτουργίες από μια μελέτη με επαναλαμβανόμενη δόση είναι δυνατόν να διευκολύνει την επιλογή επίπεδων δόσεων για μια επακόλουθη υποχρόνια μελέτη. Κατ’ εξαίρεση, οι παρατηρήσεις των λειτουργιών μπορούν επίσης να παραλειφθούν όταν οι ομάδες εμφανίζουν εκδηλώσεις τοξικότητας σε σημείο που να επηρεάζει σημαντικά την αποτελεσματικότητα της σχετικής με την εξέταση των λειτουργιών δοκιμής.
1.4.3.2. Βάρος σώματος και κατανάλωση τροφής και νερού Όλα τα ζώα πρέπει να ζυγίζονται τουλάχιστον μια φορά την εβδομάδα. Επίσης μια φορά τουλάχιστον την εβδομάδα μετράται η κατανάλωση τροφής και νερού. Εάν η ελεγχόμενη ουσία χορηγείται με το πόσιμο νερό, η κατανάλωσή του πρέπει επίσης να υπολογίζεται μια φορά την εβδομάδα τουλάχιστον.
1.4.3.3. Αιματολογικές εξετάσεις Στο τέλος της περιόδου δοκιμής πρέπει να διεξαχθούν οι ακόλουθες αιματολογικές εξετάσεις: προσδιορισμός αιματοκρίτη, συγκέντρωσης αιμοσφαιρίνης, αριθμού ερυθρών αιμοσφαιρίων, αριθμού λευκών αιμοσφαιρίων και λευκοκυτταρικού τύπου, αριθμού αιμοπεταλίων, χρόνου πήξεως και πηκτικότητας του αίματος. Το αίμα πρέπει να λαμβάνεται από καθορισμένο σημείο αμέσως πριν από τη θανάτωση των ζώων ή κατά τη διάρκεια της, και να διατηρείται υπό κατάλληλες συνθήκες.
1.4.3.4. Κλινικές βιοχημικές εξετάσεις Κλινικές βιοχημικές εξετάσεις για τη διερεύνηση σοβαρών τοξικών επιδράσεων στους ιστούς και ειδικότερα στα νεφρά και στο ήπαρ, διεξάγονται με αίμα που έχει ληφθεί από όλα τα ζώα αμέσως πριν από τη θανάτωση των ζώων ή κατά τη διάρκεια της (δεν λαμβάνεται αίμα από ετοιμοθάνατα ζώα και/ή από ζώα που θανατώθηκαν κατά τη διάρκεια της δοκιμής). Συνιστάται τα ζώα να έχουν υποβληθεί σε ολονύκτια νηστεία πριν από την αιμοληψία. Οι εξετάσεις στο πλάσμα ή στον ορό του αίματος περιλαμβάνουν προσδιορισμό νατρίου, καλίου, γλυκόζης, ολικής χοληστερόλης, ουρίας, κρεατινίνης, ολικής πρωτεΐνης και αλβουμίνης, δύο τουλάχιστον ενζύμων ενδεικτικών ηπατοκυτταρικής επίδρασης (όπως της αλανινο-αμινοτρανσφεράσης, της ασπαραγινικής αμινοτρασφεράσης και της δεϋδρογονάσης της σορβιτόλης). Η μέτρηση και άλλων ενζύμων (ηπατικής ή άλλης προέλευσης) καθώς και χολικών οξέων είναι δυνατόν να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες σε ορισμένες περιπτώσεις. Κατά την τελευταία εβδομάδα της μελέτης μπορούν να διεξαχθούν, προαιρετικά, οι ακόλουθες αναλύσεις ούρων χρησιμοποιώντας ούρα συλλεχθέντα σε καθορισμένο χρόνο: προσδιορισμός όψης, όγκου, ωσμωτικής πίεσης ή ειδικού βάρους, pH, πρωτεϊνών, γλυκόζης αίματος και αιμοσφαιρίων. Επιπλέον, πρέπει να διεξάγονται μελέτες για την αναζήτηση στον ορό δεικτών γενικής αλλοίωσης των ιστών. Άλλοι προσδιορισμοί που απαιτούνται όταν οι ιδιότητες της ελεγχόμενης ουσίας ενδέχεται ή αναμένεται να επηρεάσουν τα μεταβολικά χαρακτηριστικά, αφορούν το ασβέστιο, τα φωσφορικά, τα τριγλυκερίδια μετά από νηστεία, ειδικές ορμόνες, τη μεθαιμοσφαιρίνη και τη χολινεστεράση. Οι προσδιορισμοί αυτοί πρέπει να διεξάγονται για ουσίες ορισμένων κατηγοριών ή σε συγκεκριμένες περιπτώσεις. Γενικά πρέπει να ακολουθείται ευέλικτη προσέγγιση, ανάλογα με το είδος και τις παρατηρούμενες και/ή αναμενόμενες επιδράσεις από μια συγκεκριμένη ουσία. Εάν τα διατιθέμενα βασικά δεδομένα του ιστορικού δεν επαρκούν θα πρέπει να προσδιοριστούν μεταβλητές για τις αιματολογικές και κλινικές βιοχημικές εξετάσεις πριν από την έναρξη της δοκιμής.
1.4.3.5. Νεκροψία Όλα τα ζώα της μελέτης πρέπει να υποβάλλονται σε πλήρη, λεπτομερή νεκροψία η οποία περιλαμβάνει προσεκτική εξέταση της εξωτερικής επιφάνειας του σώματος, όλων των στομίων, της κρανιακής, θωρακικής και περιτοναϊκής κοιλότητας και του περιεχομένου τους. Συκώτι, νεφρά, επινεφρίδια, όρχεις, επιδιδυμίδες, θύμος αδένας, σπλήνα, εγκέφαλος και καρδιά όλων των ζώων απαλλάσσονται από τους προσφυόμενους ιστούς και ζυγίζονται νωπά όσο το δυνατόν γρηγορότερα μετά την ανατομή για να αποφευχθεί η ξήρανση τους. Οι ιστοί που ακολουθούν πρέπει να διατηρούνται στο μέσο συντήρησης που θεωρείται καταλληλότερο τόσο για το είδος του ιστού όσο και για την ιστοπαθολογική εξέταση για την οποία προορίζεται: κάθε ιστός που εμφανίζει μακροσκοπικές αλλοιώσεις, εγκέφαλος (αντιπροσωπευτικές περιοχές του κυρίου τμήματος, της παρεγκεφαλίδος και της γέφυρας), νωτιαίος μυελός, στομάχι, λεπτό και παχύ έντερο (συμπεριλαμβανομένων των Παϋέριων πλακών), συκώτι, νεφρά, επινεφρίδια, σπλήνα, καρδιά, θύμος αδένας, θυρεοειδής αδένας, τραχεία και πνεύμονες (διατηρημένοι με εμφύσηση συντηρητικού ακολουθούμενη από εμβάπτιση), γεννητικοί αδένες, άλλα όργανα του γεννητικού συστήματος (όπως η μήτρα, ο προστάτης), ουροδόχος κύστη, λεμφαδένες (κατά προτίμηση ένας λεμφαδένας που να καλύπτει την οδό χορήγησης και ένας άλλος, σε αρκετή απόσταση από αυτή, που να καλύπτει τις διασυστημικές επιδράσεις), περιφερειακό νεύρο (ισχιακό ή κνημιαίο) ευρισκόμενο κατά προτίμηση πολύ κοντά στον μυν, και τμήμα του μυελού των οστών ή, ενδεχομένως, νωπό παρασκεύασμα αναρροφηθέντος μυελού). Τα κλινικά και άλλα ευρήματα είναι δυνατόν να καταδείξουν την ανάγκη εξέτασης και άλλων ιστών. Κάθε όργανο που, λόγω των γνωστών ιδιοτήτων της ελεγχόμενης ουσίας, θεωρείται πιθανό να αποτελεί όργανο-στόχο, πρέπει επίσης να διατηρείται.
1.4.3.6. Ιστοπαθολογική εξέταση Τα διατηρημένα όργανα και οι ιστοί όλων των ζώων των ομάδων υψηλών δόσεων και μάρτυρα πρέπει να υποβάλλονται σε πλήρη ιστοπαθολογική εξέταση. Σε περίπτωση που παρατηρούνται αλλοιώσεις συνδεόμενες με την αγωγή στην ομάδα υψηλής δόσης, η εξέταση επεκτείνεται και στα ζώα των ομάδων που έλαβαν χαμηλότερες δόσεις. Εξετάζονται όλα τα μακροσκοπικά ευρήματα. Σε περίπτωση που έχει χρησιμοποιηθεί δορυφορική ομάδα, υποβάλλονται σε ιστοπαθολογική εξέταση οι ιστοί και τα όργανα που έχουν παρουσιάσει αλλοιώσεις στα ζώα των ομάδων αγωγής.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Πρέπει να παρέχονται δεδομένα για κάθε ζώο. Επιπλέον, όλα τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα ο οποίος περιλαμβάνει, για κάθε ομάδα αγωγής, τον αριθμό των ζώων κατά την έναρξη της αγωγής, τον αριθμό των ζώων που ευρέθησαν νεκρά κατά τη διάρκεια της αγωγής ή θανατώθηκαν για να μην ταλαιπωρηθούν, το χρόνο θανάτου ή θανάτωσης, τον αριθμό των ζώων που εμφάνισαν εκδηλώσεις τοξικότητας, περιγραφή των παρατηρηθέντων τοξικών συμπτωμάτων, συμπεριλαμβανομένου του χρόνου εμφάνισής τους, της διάρκειας και της σοβαρότητάς τους, τον αριθμό των ζώων που παρουσίασαν αλλοιώσεις, το είδος των αλλοιώσεων και το ποσοστό των ζώων που εμφάνισαν καθέναν από τους τύπους αλλοιώσεων. Όταν είναι δυνατόν, τα αριθμητικά αποτελέσματα αξιολογούνται με τη βοήθεια στατιστικής μεθόδου γενικής αποδοχής. Οι στατιστικές μέθοδοι πρέπει να επιλέγονται κατά το σχεδιασμό της μελέτης.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ
Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει, εάν είναι δυνατόν, τις ακόλουθες πληροφορίες:
Για τα πειραματόζωα:
είδος/φυλή χρησιμοποιηθέντων ζώων,
αριθμός ηλικία και φύλο των ζώων,
προέλευση, συνθήκες στέγασης, διατροφή, κ.λπ.,
βάρος κάθε ζώου κατά την έναρξη της δοκιμής, στη συνέχεια κατά εβδομαδιαία διαστήματα και στο τέλος της δοκιμής.
Για τις συνθήκες δοκιμής:
αιτιολόγηση της επιλογής του φορέα, εάν δεν πρόκειται για νερό,
αιτιολόγηση της επιλογής του επιπέδου δόσεων,
λεπτομέρειες σχετικά με το παρασκεύασμα της δοκιμαζόμενης ουσίας/τροφής, την επιτευχθείσα συγκέντρωση, σταθερότητα και ομοιογένεια του παρασκευάσματος,
λεπτομέρειες σχετικά με τη χορήγηση της δοκιμαζόμενης ουσίας,
εφ' όσον είναι σκόπιμο, μετατροπή της συγκέντρωσης της δοκιμαζόμενης ουσίας στην τροφή ή το πόσιμο νερό (ppm) σε πραγματική δόση (mg/kg βάρους σώματος/ημέρα),
λεπτομέρειες σχετικά με την ποιότητα της τροφής και του νερού.
Για τα αποτελέσματα:
βάρος του σώματος/μεταβολές βάρους σώματος,
εφόσον είναι σκόπιμο, κατανάλωσης τροφής και νερού,
δεδομένα τοξικής απόκρισης κατά φύλο και επίπεδο δόσης, συμπεριλαμβανομένων των τοξικών εκδηλώσεων,
φύση, σοβαρότητα και διάρκεια των κλινικών παρατηρήσεων (αναστρέψιμων ή μη),
αξιολόγηση των αισθητηρίων λειτουργιών, της δύναμης της λαβής και της κινητικότητας,
αιματολογικές εξετάσεις με τις αντίστοιχες τιμές αναφοράς,
κλινικές βιοχημικές εξετάσεις με τις αντίστοιχες τιμές αναφοράς,
βάρος σώματος κατά τη θανάτωση και βάρος των οργάνων,
ευρήματα νεκροψίας,
αναλυτική περιγραφή όλων των ιστοπαθολογικών ευρημάτων,
δεδομένα για την απορρόφηση, εφόσον διατίθενται,
στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, εάν είναι σκόπιμη.
Συζήτηση των αποτελεσμάτων
Συμπεράσματα
4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Η παρούσα μέθοδος είναι παραπλήσια της ΤG 407 του ΟΟΣΑ.
Β.8. ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΗΣ (28 ΗΜΕΡΕΣ) ΔΟΣΗΣ (ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ)
Β.8.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Χρήσιμο είναι να υπάρχουν προκαταρκτικές πληροφορίες για την κατανομή μεγέθους σωματιδίων, την τάση ατμών, το σημείο τήξεως, το σημείο ζέσεως, το σημείο ανάφλεξης και την εκρηξιμότητα (αν υπάρχει) της ουσίας. Βλέπε επίσης Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Β).
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Ουδεμία.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Διάφορες ομάδες πειραματόζωων εκτίθενται καθημερινά, για μια ορισμένη περίοδο, σε διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις της εξεταζόμενης ουσίας, μια συγκέντρωση ανά ομάδα, για μια χρονική περίοδο 28 ημερών. Όταν χρησιμοποιείται φορέας για να βοηθήσει στην παραγωγή της κατάλληλης συγκέντρωσης της εξεταζόμενης ουσίας, τότε πρέπει να χρησιμοποιείται και μια ομάδα μάρτυρας για το φορέα. Κατά τη διάρκεια της χορήγησης, πρέπει να γίνονται καθημερινές παρατηρήσεις στα ζώα, για τη διαπίστωση συμπτωμάτων τοξικότητας. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, όπως και αυτά που επιζούν στο τέλος της, πρέπει να νεκροτομούνται.
1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Ουδέν.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Προετοιμασίες Τα ζώα κρατούνται κάτω από τις πειραματικές συνθήκες εγκλωβισμού και διατροφής για 5 τουλάχιστον ημέρες πριν από την έναρξη του πειράματος. Πριν από τη δοκιμή υγιή, νεαρά ζώα ξεχωρίζονται τυχαία και κατανέμονται στις απαιτούμενες πειραματικές ομάδες. Ένας κατάλληλος φορέας μπορεί να προστεθεί στην εξεταζόμενη ουσία, όταν χρειαστεί, για να βοηθήσει την παραγωγή της κατάλληλης συγκέντρωσης της ουσίας στην ατμόσφαιρα. Αν ένας φορέας ή άλλες προσθετικές ουσίες χρησιμοποιούνται για να διευκολυνθεί η χορήγηση των δόσεων, πρέπει να είναι γνωστά ότι δεν προκαλούν τοξικές επιδράσεις. Ιστορικά στοιχεία, αν υπάρχουν, μπορεί να χρησιμοποιηθούν.
1.6.2. Πειραματικές συνθήκες
1.6.2.
1.6.2.1. Πειραματόζωα Ο επίμυς είναι το είδος που προτιμάται, εκτός αν υπάρχουν αντενδείξεις. Πρέπει να χρησιμοποιούνται οι συνηθισμένες εργαστηριακές φυλές και νεαρά, υγιή ζώα. Στην αρχή της μελέτης, το εύρος της διαφοράς βαρών των χρησιμοποιουμένων ζώων δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το ± 20 % της ενδεδειγμένης μέσης τιμής.
1.6.2.2. Αριθμός και φύλο Για κάθε δοκιμαζόμενη ομάδα πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 10 ζώα (5 θυλυκά και 5 αρσενικά). Τα θηλυκά πρέπει να είναι άτοκα και να μη βρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Εάν έχουν προγραμματιστεί ενδιάμεσες θανατώσεις ζώων, τότε ο αριθμός των ζώων, ανά ομάδα, πρέπει να αυξηθεί με τον αριθμό των ζώων που έχουν προγραμματιστεί να θανατωθούν πριν την ολοκλήρωση της μελέτης. Επιπλέον, μία δορυφορική ομάδα από 10 ζώα (πέντε ζώα κατά φύλο) μπορεί να υποβληθεί σε αγωγή με το επίπεδο υψηλής συγκέντρωσης επί 28 ημέρες και να παρατηρηθεί σε σχέση με την αναστρεψιμότητα, εμμονή ή όψιμη εμφάνιση τοπικών επιδράσεων επί 14 ημέρες μετά την αγωγή. Χρησιμοποιείται επίσης μία δορυφορική ομάδα από 10 ζώα μάρτυρες (πέντε ζώα κατά φύλο).
1.6.2.3. Συγκεντρώσεις έκθεσης Απαιτούνται τουλάχιστον τρεις συγκεντρώσεις, με ένα μάρτυρα ή ένα μάρτυρα φορέα (που αντιστοιχεί στη συγκέντρωση του φορέα στην υψηλότερη δόση), αν χρησιμοποιείται φορέας. Τα ζώα στην ομάδα του μάρτυρα πρέπει να υφίστανται την ίδια μεταχείριση, της χορήγησης της εξεταζόμενης ουσίας εξαιρουμένης, με τα ζώα της εξεταζόμενης ομάδας. Η υψηλότερη συγκέντρωση πρέπει να προκαλεί τοξικές επιδράσεις, αλλά καθόλου ή λίγους θανάτους. Η χαμηλότερη συγκέντρωση δεν πρέπει να προκαλεί ενδείξεις τοξικότητας. Όπου υπάρχει μια ευχερής εκτίμηση ανθρώπινης έκθεσης, τότε η χαμηλότερη συγκέντρωση πρέπει να την υπερβαίνει. Στην πιο ιδανική περίπτωση, η ενδιάμεση συγκέντρωση πρέπει να προκαλεί ελάχιστα, αλλά φανερά, τοξικά συμπτώματα. Αν χρησιμοποιούνται περισσότερες από μία ενδιάμεσες συγκεντρώσεις, τότε πρέπει να κατανέμονται έτσι που να παράγεται μια διαβάθμιση των τοξικών επιδράσεων. Στα κατώτερα και ενδιάμεσα επίπεδα συγκεντρώσεων, όπως και στους μάρτυρες, η συχνότητα των θανάτων πρέπει να είναι χαμηλή, ώστε να επιτρέπεται μια σημαντική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων.
1.6.2.4. Χρόνος έκθεσης Η διάρκεια της έκθεσης ανά ημέρα πρέπει να είναι 6 ώρες, αλλά και άλλες χρονικές περίοδοι μπορεί να απαιτηθούν σε ειδικές περιπτώσεις.
1.6.2.5. Συσκευές Τα ζώα πρέπει να δοκιμάζονται μέσα σε μια αναπνευστική συσκευή σχεδιασμένη για να διατηρεί μια δυναμική ροή αέρα, τουλάχιστον 12 αλλαγών του αέρα ανά ώρα, ώστε να εξασφαλίζεται έτσι μια επάρκεια σε οξυγόνο και μια ομαλά κατανεμημένη ατμόσφαιρα έκθεσης. Όπου χρησιμοποιείται θάλαμος, το σχήμα του πρέπει να μειώνει στο ελάχιστο το συνωστισμό των ζώων και να αυξάνει στο μεγαλύτερο βαθμό την αναπνευστική τους έκθεση στην εξεταζόμενη ουσία. Σαν γενικός κανόνας για να εξασφαλιστεί σταθερότητα στην ατμόσφαιρα ενός θαλάμου, ο ολικός όγκος των πειραματόζωων δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5 % του όγκου του δοκιμαστικού θαλάμου. Μπορεί να χρησιμοποιείται στοματορρινικός ή κεφαλικός, ή ολόκληρου του σώματος ατομικός θάλαμος έκθεσης. Οι δύο πρώτοι θα μειώσουν στο ελάχιστο τη λήψη της ουσίας από άλλες οδούς.
1.6.2.6. Περίοδος παρατηρήσεων Τα πειραματόζωα πρέπει να εξετάζονται καθημερινά για συμπτώματα τοξικότητας σ' όλη τη διάρκεια της δοκιμής, όπως και κατά την περίοδο της θεραπείας. Ο χρόνος θανάτου και ο χρόνος εμφάνισης και εξαφάνισης των τοξικών συμπτωμάτων πρέπει να καταχωρούνται.
1.6.3. Διαδικασία Τα ζώα εκτίθενται στην ελεγχόμενη ουσία καθημερινά 5 έως 7 ημέρες την εβδομάδα, για μια περίοδο 28 ημερών. Τα ζώα κάθε δορυφορικής ομάδας, προγραμματισμένα για συνεχείς παρατηρήσεις, θα κρατηθούν για 14 επιπλέον ημέρες χωρίς χορήγηση της ουσίας, για να διαπιστωθεί η θεραπεία ή η εμμονή των τοξικών συμπτωμάτων. Η θερμοκρασία στην οποία πρέπει να πραγματοποιείται η δοκιμασία, πρέπει να διατηρείται στους 22 oC ± 3 oC. Θεωρητικά, η σχετική υγρασία θα πρέπει να διατηρείται μεταξύ 30 % και 70 %, σε ορισμένες όμως περιπτώσεις (π.χ. δοκιμές ορισμένων αεροζόλ) αυτό μπορεί να μην είναι πρακτικά δυνατό. Η διατήρηση ελαφράς αρνητικής πίεσης μέσα στο θάλαμο (≤ 5 mm νερού) εμποδίζει τη διαφυγή της εξεταζόμενης ουσίας στον περιβάλλοντα χώρο. Κατά τη διάρκεια της έκθεσης, δεν θα πρέπει να χορηγούνται τροφή και νερά. Πρέπει να χρησιμοποιείται ένα δυναμικό αναπνευστικό σύστημα εφοδιασμένο με ένα κατάλληλο σύστημα μέτρησης της συγκέντρωσης. Για να διαπιστωθεί η κατάλληλη συγκέντρωση έκθεσης, συνιστάται μια προκαταρκτική δοκιμασία. Η ροή του αέρα πρέπει να προσαρμόζεται για να εξασφαλίζεται η ομοιογένεια των συνθηκών στο θάλαμο έκθεσης. Το σύστημα πρέπει να εξασφαλίζει την όσο το δυνατό γρηγορότερη αποκατάσταση σταθερών συνθηκών έκθεσης. Θα πρέπει να γίνονται μετρήσεις ή παρακολούθηση: Κατά τη διάρκεια, και στη συνέχεια της έκθεσης, γίνονται συστηματικές παρατηρήσεις. Πρέπει να διατηρείται ατομικό αρχείο για κάθε ζώο. Όλα τα ζώα πρέπει να εξετάζονται καθημερινά και τα συμπτώματα τοξικότητας πρέπει να καταγράφονται, περιλαμβανομένου του χρόνου εμφάνισης της σοβαρότητας και της διάρκειάς τους. Οι παρατηρήσεις πρέπει να περιλαμβάνουν αλλοιώσεις στο δέρμα και στο τρίχωμα, αλλοιώσεις στα μάτια, στους βλεννογόνους, αλλοιώσεις στο αναπνευστικό, κυκλοφοριακό, στο αυτόνομο και κεντρικό νευρικό σύστημα, στη σωματοκινητική δραστηριότητα και στον τρόπο συμπεριφοράς. Τα ζώα πρέπει να ζυγίζονται εβδομαδιαία. Επίσης, συνιστάται να γίνονται μετρήσεις της κατανάλωσης της τροφής μια φορά την εβδομάδα. Οι τακτικές παρατηρήσεις των ζώων είναι απαραίτητες για να εξασφαλίζεται ότι τα ζώα δεν χάνονται από τη μελέτη για λόγους όπως ο κανιβαλισμός, η αυτόλυση των ιστών και η κακή τοποθέτηση. Στο τέλος της περιόδου μελέτης, όλα τα επιζώντα στις μη δορυφορικές ομάδες νεκροτομούνται. Τα ετοιμοθάνατα ζώα και τα ζώα που παρουσιάζουν συμπτώματα έντονου πόνου και δυσφορίας θα πρέπει να απομακρύνονται μόλις αυτό γίνεται αντιληπτό, να θανατώνονται ανώδυνα και να νεκροτομούνται. Οι ακόλουθες εξετάσεις πρέπει να γίνονται στο τέλος της δοκιμασίας σε όλα τα ζώα, των μαρτύρων συμπεριλαμβανομένων: Άλλοι προσδιορισμοί, οι οποίοι μπορεί να είναι απαραίτητοι για μια ικανοποιητική τοξικολογική αξιολόγηση, περιλαμβάνουν: ασβέστιο, φωσφόρο, χλωριούχα, νάτριο, κάλιο, δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη, ανάλυση λιπιδίων, ορμόνες, σχέση οξέων/βάσεων, μεθαιμοσφαιρίνη και δραστικότητα χοληνεστεράσης. Πρόσθετες κλινικές βιοχημικές δοκιμές μπορεί να χρησιμοποιηθούν όταν υπάρχει ανάγκη επέκτασης της έρευνας των παρατηρηθεισών επιδράσεων.
1.6.3.
(α) της ταχύτητας ροής του αέρα (συνεχώς).
(β) της πραγματικής συγκέντρωσης της εξεταζόμενης ουσίας στην αναπνευστική ζώνη. Κατά τη διάρκεια της ημερήσιας έκθεσης, η συγκέντρωση δεν θα πρέπει να κυμαίνεται περισσότερο του ± 15 % εκατέρωθεν της μέσης τιμής. Εντούτοις, στην περίπτωση ορισμένων αερολυμάτων, το επίπεδο αυτό ελέγχου μπορεί να μην είναι εφικτό οπότε μπορεί να γίνει αποδεκτή μία ευρύτερη ανοχή. Καθ' όλη τη μελέτη, οι συγκεντρώσεις μέρα προς μέρα θα πρέπει να κρατούνται όσο το δυνατόν πιο σταθερές. Στα αερολύματα, θα πρέπει να εκτελείται ανά ομάδα κάθε εβδομάδα, μία τουλάχιστον ανάλυση μεγέθους σωματιδίων.
(γ) της θερμοκρασίας και της υγρασίας, συνεχώς αν είναι δυνατόν.
(i) αιματολογικές, που να περιλαμβάνουν, τουλάχιστον, το δείκτη αιματοκρίτη, συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης, μέτρηση ερυθροκυττάρων, μέτρηση λευκοκυττάρων και λευκοκυτταρικό τύπο και μια μέτρηση της πηκτικότητας του αίματος,
(ii) κλινικοί βιοχημικοί προσδιορισμοί στο αίμα, περιλαμβανομένης, τουλάχιστον, μιας παραμέτρου της λειτουργίας του ήπατος και των νεφρών: αλανίνο αμινοτρανσφεράση του ορού (αρχικά γνωστή σαν γλουταμίνη-πυροσταφυλική αμινάση του ορού), ασπαρτική αμινοτρανσφεράση του ορού (αρχικά γνωστή σαν γλουταμινική οξαλοοξική τρανσαμινάση του ορού), άζωτο ουρίας, λεύκωμα, κρεατινίνη αίματος, ολική χολερυθρίνη και ολικές πρωτεΐνες ορού.
1.6.3.1 Νεκροψία Όλα τα ζώα της μελέτης θα πρέπει να υποβάλλονται σε πλήρη νεκροψία. Τουλάχιστον το συκώτι, τα νεφρά, τα επινεφρίδια, οι πνεύμονες και οι όρχεις θα πρέπει να ζυγίζονται νωπά όσο το δυνατόν γρηγορότερα μετά από την ανατομή, για να αποφεύγεται η ξήρανση. Τα όργανα και οι ιστοί (το αναπνευστικό σύστημα, το συκώτι, τα νεφρά, η σπλήνα, οι όρχεις, τα επινεφρίδια, η καρδιά και κάθε όργανο που εμφανίζει μακροσκοπικές αλλοιώσεις ή αλλαγές στο μέγεθος) θα πρέπει να διατηρούνται σε κατάλληλο μέσον για πιθανή μελλοντική ιστοπαθολογική εξέταση. Οι πνεύμονες θα πρέπει να απομακρύνονται άθικτοι, να ζυγίζονται και να υποβάλλονται σε κατεργασία με κατάλληλο στερεωτικό για να εξασφαλίζεται η συντήρηση της δομής των πνευμόνων.
1.6.3.2. Ιστοπαθολογική εξέταση Στις ομάδες των υψηλών συγκεντρώσεων και στις ομάδες των μαρτύρων, πρέπει να γίνει ιστολογική εξέταση σε συντηρημένα όργανα και ιστούς. Όργανα και ιστοί που παρουσιάζουν ανωμαλίες στην υψηλότερη δόση και που μπορούν να αποδοθούν στην ελεγχόμενη ουσία, πρέπει να εξετάζονται σε όλες τις ομάδες των χαμηλότερων δόσεων. Τα ζώα κάθε δορυφορικής ομάδας πρέπει να εξετάζονται ιστολογικά, με ιδιαίτερη έμφαση σ’ εκείνα τα όργανα και ιστούς που εμφάνισαν επιδράσεις στα ζώα των άλλων ομάδων.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα, στον οποίο να φαίνεται, για κάθε ομάδα δοκιμής, ο αριθμός των ζώων στην αρχή της δοκιμής και ο αριθμός των ζώων που εμφανίζουν κάθε τύπο αλλοίωσης. Όλα τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν πρέπει να αξιολογηθούν με μια κατάλληλη στατιστική μέθοδο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάθε αναγνωρισμένη στατιστική μέθοδος.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατό, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
είδος, φυλή, πηγή, συνθήκες περιβάλλοντος, διατροφή κλπ.·
πειραματικές συνθήκες: περιγραφή της συσκευής έκθεσης συμπεριλαμβανομένου του σχεδίου, του τύπου, των διαστάσεων, της πηγής του αέρα, του συστήματος παραγωγής αερολυμάτων, της μεθόδου κλιματισμού του αέρα, της κατεργασίας του εξερχόμενου αέρα και της μεθόδου στέγασης των ζώων στο δοκιμαστικό θάλαμο, που χρησιμοποιείται. Θα πρέπει να περιγράφεται η διάταξη μέτρησης της θερμοκρασίας, της υγρασίας και, όπου χρειάζεται, της σταθερότητας των συγκεντρώσεων ή κατανομής μεγέθους σωματιδίων των αερολυμάτων. Δεδομένα έκθεσης: Αυτά θα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα και να παρουσιάζονται με μέσες τιμές και μέτρηση μεταβλητότητας (π.χ. τυπική απόκλιση) και θα περιλαμβάνουν, αν είναι δυνατόν:
3.1.
pt_2 α)
ταχύτητες αέρα από τη συσκευή αναπνευστικής έκθεσης·
β)
θερμοκρασία και υγρασία του αέρα·
γ)
ονομαστικές συγκεντρώσεις (ολικό ποσό της εξεταζόμενης ουσίας που τροφοδοτεί τη συσκευή, διαιρεμένο με τον όγκο του αέρα)·
δ)
φύση φορέα, εάν χρησιμοποιείται·
ε)
πραγματικές συγκεντρώσεις στην πειραματική αναπνευστική ζώνη·
στ)
τη μέση αεροδυναμική διάμετρο μάζας (ΜΑΔΜ) και τη γεωμετρική τυπική απόκλιση (ΓΤΑ)·
δεδομένα τοξικών αντιδράσεων ανά φύλο και συγκέντρωση·
χρόνο θανάτου κατά τη διάρκεια της δοκιμής ή, εάν τα ζώα επέζησαν, στο τέλος της δοκιμής·
περιγραφή τοξικών ή άλλων επιδράσεων, δόσεις χωρίς επίδραση·
το χρόνο παρατήρησης κάθε ανώμαλου συμπτώματος και την επακόλουθη πορεία του·
δεδομένα βάρους τροφής και σώματος·
χρησιμοποιηθείσες αιματολογικές εξετάσεις και αποτελέσματα·
κλινικές βιοχημικές εξετάσεις που χρησιμοποιήθηκαν και αποτελέσματα·
αποτελέσματα νεκροψίας·
μια λεπτομερή περιγραφή όλων των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων που βρέθηκαν·
μια στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, όταν αυτό είναι δυνατό·
συζήτηση των αποτελεσμάτων·
ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).
4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).
Β.9. ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΗΣ (28 ΗΜΕΡΕΣ) ΔΟΣΗΣ (ΔΕΡΜΑΤΙΚΗ)
Β.9.
1 ΜΕΘΟΔΟΣ
1
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Βλέπε Γενική Εισαγωγή, Μέρος Β (Β).
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Ουδεμία.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Η εξεταζόμενη ουσία εφαρμόζεται καθημερινά στο δέρμα σε διαβαθμισμένες δόσεις, σε διάφορες ομάδες πειραματόζωων, μία δόση ανά ομάδα, για μια χρονική περίοδο 28 ημερών. Κατά τη διάρκεια της περιόδου εφαρμογής, τα ζώα εξετάζονται καθημερινά για τη διαπίστωση τοξικών συμπτωμάτων. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμής, όπως και αυτά που επιζούν στη λήξη της, νεκροτομούνται.
1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Ουδέν.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
1.6.
1.6.1. Προετοιμασίες Τα ζώα κρατούνται κάτω από τις πειραματικές συνθήκες εγκλωβισμού και διατροφής για 5 τουλάχιστον ημέρες πριν από τη δοκιμασία. Πριν από τη δοκιμή υγιή, νεαρά ζώα ξεχωρίζονται τυχαία και κατανέμονται στις πειραματικές ομάδες και τις ομάδες μαρτύρων. Λίγο πριν αρχίσει η δοκιμή το τρίχωμα ψαλιδίζεται από την περιοχή της ράχης του κορμού των πειραματόζωων. Μπορεί, επίσης, να χρησιμοποιηθεί το ξύρισμα για την απομάκρυνση του τριχώματος, αλλά αυτό πρέπει να γίνεται 24 ώρες περίπου πριν από τη δοκιμή. Επανάληψη του ψαλιδίσματος ή του ξυρίσματος χρειάζεται συνήθως κάθε εβδομάδα. Το ψαλίδισμα ή ξύρισμα πρέπει να γίνεται με προσοχή, ώστε να αποφεύγεται η απόξεση του δέρματος. Πρέπει να καθαρίζεται μια περιοχή για την εφαρμογή της εξεταζόμενης ουσίας, η οποία δεν πρέπει να είναι μικρότερη από το 10 % της επιφάνειας του σώματος. Όταν αποφασίζονται οι διαστάσεις της περιοχής που πρέπει να καθαριστεί και να καλυφθεί με την εξεταζόμενη ουσία, πρέπει να λαμβάνεται υπόψη το βάρος του ζώου. Όταν ελέγχονται στερεά, τα οποία μπορούν να κονιοποιηθούν, πρέπει να υγραίνονται αρκετά με νερό ή αν χρειαστεί με κατάλληλο φορέα, για να εξασφαλιστεί η καλή επαφή με το δέρμα. Οι υγρές ουσίες χρησιμοποιούνται συνήθως αδιάλυτες. Η εφαρμογή γίνεται καθημερινά 5 έως 7 ημέρες την εβδομάδα.
1.6.2. Πειραματικές συνθήκες
1.6.2.
1.6.2.1. Πειραματόζωα Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ενήλικας επίμυς, κουνέλι ή ινδικό χοιρίδιο. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα είδη, η χρήση τους όμως απαιτεί αιτιολόγηση. Στην αρχή της μελέτης, το εύρος της διαφοράς βαρών των χρησιμοποιούμενων ζώων δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το ± 20 % της ενδεδειγμένης μέσης τιμής.
1.6.2.2. Αριθμός και φύλο Σε κάθε επίπεδο δόσεων πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 10 ζώα (5 θηλυκά και 5 αρσενικά) με υγιές δέρμα. Τα θηλυκά πρέπει να είναι άτοκα και να μη βρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Εάν έχουν προγραμματιστεί ενδιάμεσες θανατώσεις ζώων, τότε ο αριθμός των ζώων ανά ομάδα πρέπει να αυξηθεί με τον αριθμό των ζώων που είναι προγραμματισμένο να θανατωθούν πριν από τη συμπλήρωση της μελέτης. Επιπλέον, μια δορυφορική ομάδα από 10 ζώα (5 ζώα ανά φύλο) μπορεί να εκτεθεί στην υψηλότερη δόση για 28 ημέρες και να εξετασθεί για επαναφορά, εμμονή ή αργοπορημένη εμφάνιση των τοξικών επιδράσεων για ένα χρονικό διάστημα 14 ημερών μετά το πέρας της δηλητηρίασης. Χρησιμοποιείται επίσης και μία δορυφορική ομάδα από 10 ζώα μάρτυρες (πέντε ζώα κατά φύλο).
1.6.2.3. Επίπεδα δόσεων Απαιτούνται τουλάχιστον τρία επίπεδα δόσεων και ένας μάρτυρας ή ένας μάρτυρας του φορέα, αν χρησιμοποιείται φορέας. Η περίοδος έκθεσης πρέπει να είναι τουλάχιστον 6 ώρες την ημέρα. Η εφαρμογή της ελεγχόμενης ουσίας πρέπει να γίνεται την ίδια ώρα κάθε μέρα και να προσαρμόζεται κατά διαστήματα (μια ή δύο φορές την εβδομάδα), έτσι ώστε να διατηρείται ένα σταθερό επίπεδο δόσεων σε σχέση με το βάρος του σώματος των ζώων. Τα ζώα στην ομάδα του μάρτυρα πρέπει να υπόκεινται στην ίδια μεταχείριση με τα πειραματόζωα, εξαιρουμένης της εφαρμογής της εξεταζόμενης ουσίας. Όταν χρησιμοποιείται φορέας για διευκόλυνση της χορήγησης της δόσης, η ομάδα του μάρτυρα πρέπει να παίρνει τη δόση κατά τον ίδιο τρόπο με την ομάδα των πειραματόζωων και η ποσότητα της δόσης να είναι ίδια με την υψηλότερη δόση που παίρνουν τα πειραματόζωα. Η υψηλότερη δόση θα πρέπει να προκαλεί τοξικές επιδράσεις, αλλά λίγους ή καθόλου θανάτους. Η χαμηλότερη δόση δεν θα πρέπει να προκαλεί συμπτώματα τοξικότητας. Όταν υπάρχει μια ευχερής εκτίμηση της ανθρώπινης έκθεσης, η χαμηλότερη δόση θα πρέπει να την υπερβαίνει. Η ενδιάμεση δόση, στην πιο ιδανική περίπτωση, θα πρέπει να προκαλεί ελάχιστα ευδιάκριτα τοξικά συμπτώματα. Εάν χρησιμοποιούνται περισσότερες από μία ενδιάμεσες δόσεις, τότε αυτές πρέπει να απέχουν έτσι μεταξύ τους ώστε να προκαλούν διαβαθμισμένες τοξικές επιδράσεις. Στις χαμηλές και στις ενδιάμεσες ομάδες, όπως και στους μάρτυρες, η συχνότητα των θανάτων θα πρέπει να είναι χαμηλή, ώστε να επιτρέπει μια χρήσιμη αξιολόγηση των αποτελεσμάτων. Εάν η εφαρμογή της εξεταζόμενης ουσίας προκαλεί σοβαρό δερματικό ερεθισμό, οι συγκεντρώσεις θα πρέπει να ελαττωθούν και αυτό μπορεί να ελαττώσει ή να εξαφανίσει τις άλλες τοξικές επιδράσεις στην υψηλότερη δόση. Επιπλέον, αν το δέρμα έχει υποστεί σοβαρή βλάβη, είναι δυνατόν να χρειαστεί, να ακυρωθεί η μελέτη και να επιχειρηθεί ένα νέο πείραμα με χαμηλότερες συγκεντρώσεις.
1.6.2.4. Οριακή δοκιμή Αν μια προκαταρκτική μελέτη με μια δόση 1000 mg/kg ή και μεγαλύτερη, σχετική με το πιθανό όριο έκθεσης του ανθρώπινου πληθυσμού, εάν είναι γνωστό, δεν προκαλεί καμιά τοξική επίδραση, ο περαιτέρω πειραματισμός μπορεί να μη θεωρηθεί αναγκαίος.
1.6.2.5. Περίοδος παρατήρησης Τα πειραματόζωα πρέπει να παρατηρούνται καθημερινά για φαινόμενα τοξικότητας. Ο χρόνος θανάτου και ο χρόνος κατά τον οποίο εμφανίζονται και εξαφανίζονται τα τοξικά συμπτώματα πρέπει να καταγράφονται.
1.6.3. Διαδικασία Τα ζώα πρέπει να εγκλωβίζονται μεμονωμένα. Η επέμβαση στα ζώα με την εξεταζόμενη ουσία γίνεται, στην πιο ιδανική περίπτωση, 7 ημέρες την εβδομάδα, για μια περίοδο 28 ημερών. Τα ζώα κάθε δορυφορικής ομάδας που προγραμματίστηκαν για συνεχείς παρατηρήσεις πρέπει να διατηρηθούν για 14 επιπλέον ημέρες χωρίς επέμβαση, για να εξακριβωθεί η ανάρρωση από τις τοξικές επιδράσεις ή η εμμονή τους. Ο χρόνος έκθεσης πρέπει να είναι τουλάχιστον 6 ώρες την ημέρα. Η εξεταζόμενη ουσία πρέπει να εφαρμόζεται ομοιόμορφα σε μια έκταση, η οποία είναι περίπου το 10 % της όλης επιφάνειας του σώματος. Με πολύ τοξικές ουσίες η καλυπτόμενη επιφάνεια μπορεί να είναι μικρότερη, αλλά όσο γίνεται περισσότερη από την επιφάνεια πρέπει να καλύπτεται με μία λεπτή και ομοιόμορφη στοιβάδα ουσίας. Η εξεταζόμενη ουσία, κρατιέται σ’ επαφή με το δέρμα κατά τη διάρκεια της έκθεσης, με τη βοήθεια επιδέσμου από πορώδη γάζα και μιας μη ερεθιστικής ταινίας. Η δοκιμαζόμενη περιοχή πρέπει, επιπλέον, να καλύπτεται κατάλληλα, ώστε να συγκρατείται ο επίδεσμος και η εξεταζόμενη ουσία και έτσι να εξασφαλίζεται η μη κατάποσή της από τα πειραματόζωα. Για να αποφευχθεί η κατάποση της εξεταζόμενης ουσίας, μπορεί να χρησιμοποιούνται επίσης συσκευές περιορισμού των ζώων, αλλά δεν συνιστάται η μέθοδος της απόλυτης ακινησίας. Ως εναλλακτική λύση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα προστατευτικό κολλάρο. Η ουσία που μένει σαν υπόλειμμα, στο τέλος της περιόδου έκθεσης, θα πρέπει να απομακρύνεται όταν αυτό είναι δυνατό με νερό ή άλλη κατάλληλη μέθοδο καθαρισμού του δέρματος. Όλα τα πειραματόζωα πρέπει να εξετάζονται καθημερινά και να καταγράφονται τα τοξικά συμπτώματα, ο χρόνος έναρξής τους, ο βαθμός και η διάρκειά τους. Οι παρατηρήσεις πρέπει να περιλαμβάνουν αλλοιώσεις στο δέρμα και στο τρίχωμα, στα μάτια και στους βλεννογόνους, όπως επίσης στο αναπνευστικό, κυκλοφοριακό, αυτόνομο και κεντρικό νευρικό σύστημα, στη σωματοκινητική δραστηριότητα και στον τρόπο συμπεριφοράς. Πρέπει, επίσης, να γίνονται μετρήσεις της κατανάλωσης τροφής και του βάρους των ζώων μια φορά την εβδομάδα. Η κανονική παρατήρηση των ζώων είναι απαραίτητη για να εξασφαλίζεται ότι δεν υπάρχει απώλεια πειραματόζωων εξαιτίας κανιβαλισμού, αυτόλυσης των ιστών ή κακής στέγασης. Στο τέλος της πειραματικής περιόδου, όλα τα επιζώντα ζώα στις μη δορυφορικές ομάδες νεκροτομούνται. Τα ετοιμοθάνατα ζώα και τα ζώα που παρουσιάζουν συμπτώματα έντονου πόνου και δυσφορίας θα πρέπει να απομακρύνονται, μόλις αυτό γίνεται αντιληπτό, να θανατώνονται ανώδυνα και να νεκροτομούνται. Οι παρακάτω εξετάσεις θα πρέπει να γίνουν στο τέλος της δοκιμής σε όλα τα ζώα, των μαρτύρων συμπεριλαμβανομένων: Άλλοι προσδιορισμοί, οι οποίοι μπορεί να είναι αναγκαίοι για την τοξικολογική αξιολόγηση, περιλαμβάνουν: ασβέστιο, φωσφόρο, χλώριο, νάτριο, κάλιο, δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη, ανάλυση λιπιδίων, ορμονών, ισορροπία οξέων/βάσεων, μεθαιμοσφαιρίνη και δραστικότητα χολινεστεράσης. Μπορεί, επίσης, να χρησιμοποιηθούν και άλλοι βιοχημικοί προσδιορισμοί για την επέκταση της έρευνας των παρατηρηθεισών επιδράσεων.
1.6.3.
1) αιματολογικές που να περιλαμβάνουν τουλάχιστον μετρήσεις αιματοκρίτη, αιμοσφαιρίνης, μετρήσεις ερυθρών αιμοσφαιρίων, λευκών και λευκοκυτταρικού τύπου, και μια μέτρηση της πηκτικότητας του αίματος·
2) κλινικές βιοχημικές μετρήσεις του αίματος που περιλαμβάνουν τουλάχιστον μια παράμετρο της λειτουργίας του ήπατος και των νεφρών: αλανίνο-αμινοτρανσφεράση του ορού (αρχικά γνωστή σαν γλουταμίνη-πυροσταφυλική τρανσαμινάση του ορού), ασπαρτική αμινοτρανσφεράση του ορού (αρχικά γνωστή σαν γλουταμινι-κή οξαλοοξική τρανσαμινάση του ορού), άζωτο ουρίας, αλβουμίνη, κρεατινίνη αίματος, ολική χολερυθρίνη και ολικές πρωτεΐνες του ορού.
1.6.4. Μακροσκοπική νεκροψία Όλα τα ζώα της μελέτης πρέπει να υποβληθούν σε μία πλήρη μακροσκοπική νεκροψία. Το συκώτι, οι νεφροί, τα επινεφρίδια και οι όρχεις πρέπει να ζυγιστούν νωπά, όσο το δυνατό γρηγορότερα μετά την ανατομή για την αποφυγή αποξήρανσης. Τα όργανα και οι ιστοί, δηλ. φυσιολογικό και εκτεθειμένο δέρμα, συκώτι, νεφρά, σπλήνα, όρχεις, επινεφρίδια, καρδιά και όργανα στόχοι (δηλαδή τα όργανα εκείνα που εμφανίζουν μακροσκοπικές αλλοιώσεις ή μεταβολές μεγέθους) θα πρέπει να διατηρούνται σ' ένα κατάλληλο μέσο για την πιθανή, μελλοντική ιστοπαθολογική εξέταση.
1.6.5. Ιστοπαθολογική εξέταση Η ιστοπαθολογική εξέταση πρέπει να γίνεται στα διατηρηθέντα όργανα των ζώων της ομάδας της υψηλότερης δόσης και των μαρτύρων. Τα όργανα και οι ιστοί που παρουσιάζουν ανωμαλίες, που μπορεί να αποδοθούν στην υψηλότερη δόση της εξεταζόμενης ουσίας, πρέπει να εξετάζονται και σ’ όλες τις ομάδες χαμηλότερων δόσεων. Τα ζώα της δορυφορικής ομάδας πρέπει να εξετάζονται ιστολογικά με ιδιαίτερη έμφαση για κείνα τα όργανα που διαπιστώθηκε ότι δείχνουν ανωμαλίες στις άλλες ομάδες.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα, στον οποίο να φαίνεται, για κάθε πειραματική ομάδα, ο αριθμός των ζώων που εμφανίζουν κάθε τύπο αλλοίωσης. Όλα τα παρατηρούμενα αποτελέσματα πρέπει να αξιολογούνται με μια κατάλληλη στατιστική μέθοδο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάθε αναγνωρισμένη στατιστική μέθοδος.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
δεδομένα ζώων (είδος, φυλή, πηγή, συνθήκες περιβάλλοντος, διατροφή, κ.λπ.)·
πειραματικές συνθήκες (συμπεριλαμβανομένου και του τύπου του επιδέσμου: προσροφητικού ή μη προσροφητικού)·
επίπεδα δόσεων (συμπεριλαμβανομένου του φορέα, αν χρησιμοποιήθηκε) και συγκεντρώσεις·
μη τοξικά επίπεδα, όταν είναι δυνατόν·
δεδομένα τοξικών αποκρίσεων ανά δόση και φύλο·
χρόνο θανάτου των ζώων κατά τη διάρκεια της μελέτης ή αν τα ζώα επιζούν έως το τέλος·
τοξικές ή άλλες επιδράσεις·
το χρόνο που παρατηρήθηκε κάθε ανωμαλία και τη διαδοχική πορεία τους·
δεδομένα βάρους σώματος και κατανάλωσης τροφής·
αιματολογικές εξετάσεις που χρησιμοποιήθηκαν και αποτελέσματα·
κλινικές βιοχημικές εξετάσεις που χρησιμοποιήθηκαν και αποτελέσματα·
ευρήματα νεκροψίας·
λεπτομερή περιγραφή όλων των ιστοπαθολογικών ευρημάτων·
στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, όταν αυτό είναι δυνατό·
συζήτηση των αποτελεσμάτων·
ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).
4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).
Β.10. ΜΕΤΑΛΛΑΞΙΓΕΝΕΣΗ — IN VITRO ΔΟΚΙΜΗ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΩΝ ΕΚΤΡΟΠΩΝ ΣΕ ΘΗΛΑΣΤΙΚΑ
Β.10.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Η παρούσα μέθοδος αποτελεί αντιγραφή της ΟΕCD ΤG 473, In Vitro Mammalian Chromosome Αberration Τest (1997).
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σκοπός της in vitro δοκιμής χρωμοσωμικών εκτροπών είναι ο εντοπισμός παραγόντων που προκαλούν δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές σε καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών (1) (2) (3). Οι δοκιμές εκτροπές μπορεί να είναι δύο τύπων, χρωμοσωμικές ή χρωματιδικές. Τα περισσότερα χημικά μεταλλαξιγόνα προκαλούν εκτροπές χρωματιδικού τύπου, απαντώνται όμως και εκτροπές χρωμοσωμικού τύπου. Τυχόν αύξηση στην πολυπλοειδία μπορεί να σημαίνει ότι μία χημική ουσία έχει τη δυνατότητα να επάγει αριθμητικές εκτροπές. Εντούτοις, η παρούσα μέθοδος δεν έχει σχεδιαστεί για τη μέτρηση αριθμητικών εκτροπών και δεν χρησιμοποιείται συνήθως για το σκοπό αυτό. Οι χρωμοσωμικές μεταλλάξεις και τα συναφή συμβάντα αποτελούν αίτιο πολλών γενετικών ασθενειών του ανθρώπου και υπάρχουν σημαντικές ενδείξεις ότι οι χρωμοσωμικές μεταλλάξεις και τα συναφή συμβάντα που προκαλούν αλλοιώσεις σε ογκογονίδια και ογκογενή αποκαταστατικά γονίδια σωματικών κυττάρων σχετίζονται με την εμφάνιση καρκίνου σε ανθρώπους και σε πειραματόζωα. Στην in vitro δομική χρωμοσωμικών εκτροπών μπορούν να χρησιμοποιηθούν καλλιέργειες καθιερωμένων κυτταρικών σειρών, κυτταρικών στελεχών ή καλλιέργειες αρχέγονων κυττάρων. Τα χρησιμοποιούμενα κύτταρα επιλέγονται με βάση την ικανότητα ανάπτυξης τους στην καλλιέργεια, τη σταθερότητα του καρυοτύπου, τον αριθμό των χρωμοσωμάτων, την ποικιλότητα των χρωμοσωμάτων και την αυθόρμητη συχνότητα χρωμοσωμικών εκτροπών. Οι δοκιμές που διεξάγονται in vitro απαιτούν εν γένει τη χρήση εξωγενούς πηγής μεταβολικής ενεργοποίησης. Το σύστημα αυτό μεταβολικής ενεργοποίησης δεν μπορεί να μιμηθεί εξ ολοκλήρου τις in vivo συνθήκες των θηλαστικών. Πρέπει να λαμβάνεται πρόνοια ώστε να αποφεύγεται η χρήση συνθηκών που μπορεί να οδηγήσουν στη λήψη αποτελεσμάτων τα οποία μπορεί να μην οφείλονται σε εγγενή μεταλλαξιγένεση αλλά να προέχονται από αλλαγές στο pH, την ωσμωμοριακότητα ή υψηλά επίπεδα κυτταροτοξικότητας (4) (5). Η παρούσα δοκιμή χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό πιθανών μεταλλαξιγόνων και καρκινογόνων ουσιών στα θηλαστικά. Πολλές ενώσεις που εμφανίζονται θετικές στην παρούσα δοκιμή είναι καρκινογόνες για τα θηλαστικά. Δεν υπάρχει όμως απόλυτη συσχέτιση μεταξύ αυτής της δοκιμής και του φαινομένου της καρκινογενετικότητας. Η συσχέτιση εξαρτάται από τη χημική τάξη και υπάρχουν αύξουσες ενδείξεις ότι υπάρχουν καρκινογόνα που δεν ανιχνεύονται από τη δοκιμή αυτή γιατί δρουν μέσω μηχανισμών που δεν έχουν σχέση με άμεση βλάβη του DΝΑ. Βλέπε επίσης γενική εισαγωγή μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Εκτροπή χρωματιδικού τύπου: δομική χρωμοσωμική βλάβη που εμφανίζεται ως ρήξη μεμονωμένων χρωματιδών ή ρήξη και επανένωση μεταξύ χρωματιδών. Εκτροπή χρωμοσωμικού τύπου: δομική χρωμοσωμική βλάβη που εμφανίζεται ως ρήξη, ή ρήξη και επανένωση, και των δύο χρωματιδών στην ίδια θέση. Ενδοαναδιπλασιασμός: διεργασία κατά την οποία έπειτα από μία S φάση αντιγραφής DΝΑ. ο πυρήνας δεν υφίσταται μίτωση αλλά ξεκινά μία νέα S φάση. Το αποτέλεσμα είναι χρωμοσώματα με 4, 8, 16, ... χρωματίδες. Χάσμα: αχρωματική βλάβη μικρότερη από το πλάτος μιας χρωματίδης και με ελάχιστη απευθυγράμμιση των χρωματιδών. Μιτωτικός δείκτης: ο λόγος των κυττάρων σε μετάφαση διά του συνολικού αριθμού των κυττάρων που παρατηρούνται σε ένα κυτταρικό πληθυσμό· αποτελεί ένδειξη του βαθμού πολλαπλασιασμού του πληθυσμού. Αριθμητική εκτροπή: μεταβολή του αριθμού των χρωμοσωμάτων από τον κανονικό χαρακτηριστικό αριθμό των χρησιμοποιουμένων κυττάρων. Πολυπλοειδία: πολλαπλάσιο του απλοειδούς χρωμοσωμικού αριθμού (η) πέραν του διπλοειδούς αριθμού (δηλαδή 3η, 4η κ.ο.κ.). Δομική εκτροπή: μεταβολή της δομής των χρωμοσωμάτων που εντοπίζεται με παρατήρηση στο μικροσκόπιο του σταδίου της μεταφάσεως της διαίρεσης των κυττάρων και γίνεται αντιληπτή με τη μορφή απαλείψεων και θραυσμάτων, ενδοανταλλαγών ή ανταλλαγών.
1.3. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ Κυτταρικές καλλιέργειες εκτίθενται στην υπό δοκιμή ουσία με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση. Σε προκαθορισμένα διαστήματα μετά την έκθεση των κυτταρικών καλλιεργειών στην υπό δοκιμή ουσία, αυτές υποβάλλονται σε κατεργασία με μία ουσία αναστολής της μετάφασης (π.χ. Colcemid ή κολχικίνη), συλλέγονται, χρωματίζονται και τα μεταφασικά κύτταρα εξετάζονται με μικροσκόπιο για να διαπιστωθεί αν υπάρχουν χρωμοσωμικές εκτροπές.
1.4. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ
1.4.
1.4.1. Προετοιμασίες
1.4.1.
1.4.1.1. Κύτταρα Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορες κυτταρικές σειρές, στελέχη ή καλλιέργειες αρχέγονων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων και ανθρώπινων κυττάρων (π.χ. ινοβλάστες κινέζικων κρικητών, ανθρώπινα περιφερικά λεμφοκύτταρα αίματος ή λεμφοκύτταρα αίματος άλλων θηλαστικών).
1.4.1.2. Μέσο και συνθήκες καλλιέργειας Για τις καλλιέργειες πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλο μέσο καλλιέργειας και συνθήκες επωάσεως (δοχεία καλλιέργειας, συγκέντρωση CO2 θερμοκρασία και υγρασία). Οι καθιερωμένες κυτταρικές σειρές και στελέχη πρέπει νιa ελέγχονται σε τακτική βάση ως προς τη σταθερότητα του υποθετικού χρωμοσωμικού αριθμού και την απουσία μόλυνσης από μυκόπλασμα και δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται εφόσον έχουν μολυνθεί. Θα πρέπει να είναι γνωστός ο κανονικός χρόνος του κυτταρικού κύκλου για τaι κύτταρα και τις χρησιμοποιούμενες συνθήκες καλλιέργειας.
1.4.1.3. Ετοιμασία των καλλιεργειών Καθιερωμένες κυτταρικές σειρές και στελέχη: κύτταρα πολλαπλασιάζονται από έτοιμες καλλιέργειες, ανακαλλιεργούνται σε μέσο καλλιέργειας με πυκνότητα τέτοια ώστε οι καλλιέργειες να μη φθάνουν σε κατάσταση συρροής πριν από το χρόνο συλλογής και επωάζονται στους 37 oC. Λεμφοκύτταρα: πλήρες αίμα κατεργασμένο με ένα αντιθρομβωτικό (π.χ. ηπαρίνη) ή διαχωρισμένα λεμφοκύτταρα ληφθέντα από υγιή υποκείμενα προστίθενται στο μέσο καλλιέργειας που περιέχει ένα μιτωγόνο (π.χ. φυτοαιμοσυγκολλητίνη) και επωάζονται στους 37 oC.
1.4.1.4. Μεταβολική ενεργοποίηση Tα κύτταρα πρέπει να εκτίθενται στην υπό δομική ουσία παρουσία και απουσία κατάλληλου συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης. Το συνηθέστερα χρησιμοποιούμενο σύστημα είναι ένα μεταμιτοχονδριακό κλάσμα εμπλουτισμένο με συμπαράγοντα (59) που παρασκευάζεται από ήπαρ τρωκτικών που έχει υποβληθεί σε κατεργασία με ενζυμοεπαγωγικούς παράγοντες όπως Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) ή μείγμα φαινοβαρτιτόνης και β-ναφσοφλαβόνης (10) (11) (12). Το μεταμιτοχονδριακό κλάσμα χρησιμοποιείται συνήθως σε συγκεντρώσεις της τάξεως του 1-10 % v/v στο τελικό μέσο δοκιμής. Η κατάσταση ενός συστήματος μεταβολικές ενεργοποίησης μπορεί να εξαρτάται από την τάξη της υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να χρειάζεται να χρησιμοποιηθούν περισσότερες από μία συγκεντρώσεις μεταμιτοχονδριακού κλάσματος. Με ορισμένες αλλαγές, στις οποίες περιλαμβάνεται και η παρασκευή επεξεργασμένων με μεθόδους γενετικής μηχανικής κυτταρικών σειρών που εκφράζουν ειδικά ενεργοποιητικά ένζυμα, ενδέχεται να μπορεί να γίνει και ενδογενής ενεργοποίηση. Η επιλογή των χρησιμοποιουμένων κυτταρικών σειρών πρέπει να αιτιολογείται επιστημονικώς (π.χ. από τη σχέση του κυτοχρωμικού Ρ 450 ισοενζύμου με το μεταβολισμό της υπό δοκιμή ουσίας).
1.4.1.5. Υπό δοκιμή ουσία/προετοιμασία Οι στερεές υπό δοκιμή ουσίες πρέπει να διαλύονται ή να τίθενται υπό μορφή εναιωρήματος σε κατάλληλους διαλύτες ή φορείς και να αραιώνονται, εφόσον απαιτείται, πριν από την κατεργασία των κυττάρων. Οι υγρές ουσίες μπορούν να προστίθενται απευθείας στα συστήματα δοκιμής ή/και να αραιώνονται πριν από την κατεργασία. Πρέπει να χρησιμοποιούνται πρόσφατα παρασκευάσματα της υπό δοκιμή ουσίας εκτός κι αν τα σχετικά με τη σταθερότητα της ουσίας στοιχεία επιτρέπουν τη χρήση έτοιμων παρασκευασμάτων.
1.4.2. Συνθήκες δοκιμής
1.4.2.
1.4.2.1. Διαλύτης/φορέας Λεν πρέπει να υπάρχουν υπόνοιες για πιθανή χημική αντίδραση του διαλύτη/φορέα με την υπό δοκιμή ουσία ενώ αυτός θα πρέπει να είναι συμβατός με την επιβίωση των κυττάρων και τη δραστικότητα 59. Εφόσον ο χρησιμοποιούμενος διαλύτης/φορέας δεν είναι από τους γνωστούς, η χρήση του θα πρέπει να στηρίζεται στην ύπαρξη στοιχείων που αποδεικνύουν τη συμβατότητά του. Συνιστάται, εφόσον είναι δυνατό, να εξετάζεται πρώτα αν μπορεί να χρησιμοποιηθεί υδατικός διαλύτης/φορέας. Όταν εξετάζονται ουσίες που δεν είναι σταθερές στο νερό, οι χρησιμοποιούμενοι οργανικοί διαλύτες θα πρέπει να είναι απαλλαγμένοι ύδατος. Το νερό μπορεί να αφαιρεθεί με την προσθήκη μοριακού κόσκινου.
1.4.2.2. Συγκεντρώσεις εκθέσεως Μεταξύ των κριτηρίων που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη όταν καθορίζεται η μέγιστη προς χρήση συγκέντρωση είναι η κυτταροτοξικότητα, η διαλυτότητα στο σύστημα δοκιμής και οι μεταβολές στο pH ή την οσμωμοριακότητα. Η κυτταροτοξικότητα θα πρέπει να προσδιορίζεται με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση στο κύριο πείραμα χρησιμοποιώντας προς τούτο μία κατάλληλη ένδειξη της ακεραιότητας και ανάπτυξης των κυττάρων όπως ο βαθμός συρροής, ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων ή ο μιτωτικός δείκτης. Χρήσιμο μπορεί να είναι ο προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας και διαλυτότητας να γίνει σε ένα προκαταρκτικό πείραμα. Για την ανάλυση θα πρέπει να χρησιμοποιούνται τρεις τουλάχιστον συγκεντρώσεις. Εφόσον εμφανίζονται φαινόμενα κυτταροτοξικότητας, οι συγκεντρώσεις αυτές θα πρέπει να καλύπτουν μία περιοχή από τη μέγιστη μέχρι μικρή ή και μηδενική τοξικότητα. Λυτό σημαίνει συνήθως ότι οι συγκεντρώσεις δεν θα πρέπει να διαφέρουν περισσότερο από ένα συντελεστή μεταξύ 2 και 10. Κατά το χρόνο της συλλογής, η μέγιστη συγκέντρωση θα πρέπει να εμφανίζει σημαντική μείωση στο βαθμό συρροής, τον αριθμό των κυττάρων ή το μιτωτικό δείκτη (όλα περισσότερο από 50 %). Ο μιτωτικός δείκτης αποτελεί έμμεση μόνο μέτρηση των κυτταροτοξικών/κυτταροστατικών αποτελεσμάτων και εξαρτάται από το χρόνο που μεσολάβησε από την κατεργασία. Εντούτοις, ο μιτωτικός δείκτης είναι αποδεκτός για καλλιέργειες μορφής εναιωρήματος για τις οποίες άλλες μετρήσεις τοξικότητας μπορεί να είναι άβολες και μη πρακτικές. Στοιχεία σχετικά με την κινητική του κυτταρικού κύλου, όπως ο μέσος χρόνος γενεάς (ΜΧΓ), μπορούν να χρησιμοποιούνται ως συμπληρωματικές πληροφορίες. Εντούτοις, ο ΜΧΓ είναι μία γενική μέση τιμή που δεν αποκαλύπτει πάντοτε την ύπαρξη καθυστερημένων υποπληθυσμών, ακόμη δε και πολύ μικρές αυξήσεις στο μέσο χρόνο γενεάς μπορούν να συνδέονται με πολύ σημαντική καθυστέρηση στο χρόνο της άριστης ανάπτυξης των εκτροπών. Για σχετικά μη κυτταροτοξικές ουσίες, η μέγιστη συγκέντρωση δοκιμής θα πρέπει να είναι 5 μl/ml, 5 mg/ml ή 0,01 Μ, όποια από τις τρεις είναι χαμηλότερη. Για σχετικά αδιάλυτες ουσίες που δεν είναι τοξικές σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες από τη συγκέντρωση μέγιστης διαλυτότητας, η μέγιστη χρησιμοποιούμενη δόση θα πρέπει να αντιστοιχεί σε συγκέντρωση μεγαλύτερη από το όριο διαλυτότητας στο τελικό μέσο καλλιέργειας στο τέλος της περιόδου κατεργασίας. Σε ορισμένες περιπτώσεις (π.χ. όταν φαινόμενα τοξικότητας εμφανίζονται μόνο σε υψηλότερες από τη χαμηλότερη συγκέντρωση μέγιστης διαλυτότητας) συνιστάται να διεξάγεται δοκιμή σε περισσότερες από μία συγκεντρώσεις με ορατή πτώση ιζήματος. Μπορεί να είναι χρήσιμο να εκτιμηθεί η διαλυτότητα στην αρχή και το πέρας της κατεργασίας καθώς η διαλυτότητα μπορεί να αλλάζει κατά τη διάρκεια της έκθεσης στο σύστημα δοκιμής λόγω της παρουσίας κυττάρων, S9, ορού, κ.λπ. Η μέγιστη διαλυτότητα μπορεί να ανιχνευθεί με γυμνό οφθαλμό. Το ίζημα δεν πρέπει να παρεμβαίνει στην εκτίμηση αυτή.
1.4.2.3. Αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες Σε κάθε πείραμα θα πρέπει να περιλαμβάνονται παράλληλα θετικοί και αρνητικοί (διαλύτης ή φορέας) μάρτυρες, με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση. Όταν χρησιμοποιείται μεταβολική ενεργοποίηση, ως θετικός μάρτυρας θα πρέπει να χρησιμοποιείται ουσία που απαιτεί ενεργοποίηση για την παροχή μεταλλαξογόνου απόκρισης. Ως θετικοί μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται γνωστά κλαστογόνα σε επίπεδα έκθεσης που αναμένεται να δώσουν αναπαραγώγιμη και ανιχνεύσιμη αύξηση πάνω από το βασικό όριο που αποδεικνύει την ευαισθησία του συστήματος δοκιμής. Οι συγκεντρώσεις των θετικών μαρτύρων θα πρέπει να επιλέγονται έτσι ώστε τα αποτελέσματα να είναι σαφή αλλά να μην αποκαλύπτουν αμέσως την ταυτότητα των κωδικοποιημένων αντικειμενοφόρων στον παρατηρητή. Παραδείγματα ουσιών θετικών μαρτύρων είναι: Κατάσταση μεταβολικής ενεργοποίησης Ουσία Αριθ. CAS Αριθ. ΕΙΝΕCS Απουσία εξωγενούς μεταβολικής ενεργοποίησης Μεθανοσουλφονικός μεθυλεστέρας 66-27-3 200-625-0 Μεθανοσουλφονικός αιθυλεοτέρας 62-50-0 200-536-7 Λιθυλο νιτροςουρία 759-73-9 212-072-2 Μιτομυκίνη C 50-07-7 200-008-6 4-Νιτροκινολιν-Ν-οξείδιο 56-57-5 200-281-1 Παρουσία εξωγενούς μεταβολικής ενεργοποίησης Βενζο[α]πυρένιο 50-32-8 200-028-5 Κυκλοφωσφαμίδιο Μονοένυδρο κυκλοφωσφαμίδιο 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Ως θετικοί μάρτυρες μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες κατάλληλες ουσίες. Εφόσον υπάρχουν, θα πρέπει να εξετάζεται η δυνατότητα χρήσης ως θετικών μαρτύρων ουσιών σχετικής χημικής τάξης. Σε κάθε συλλογή, θα πρέπει να περιλαμβάνονται και αρνητικοί μάρτυρες, αποτελούμενοι από μόνο τον διαλύτη ή φορέα στο μέσο κατεργασίας και κατεργασμένοι με τον ίδιο τρόπο με εκείνο των καλλιεργειών της υπό δοκιμή ουσίας. Επιπλέον, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται και μη υποστάντες κατεργασία μάρτυρες εκτός αν υπάρχουν πρότερα στοιχεία που καταδεικνύουν ότι ο επιλεγείς διαλύτης δεν επιφέρει επιβλαβή ή μεταλλαξιγόνα αποτελέσματα.
1.4.3. Διαδικασία
1.4.3.
1.4.3.1. Κατεργασία με την υπό δοκιμή ουσία Πολλαπλασιασμένα κύτταρα υποβάλλονται σε κατεργασία με την υπό δοκιμή ουσία παρουσία και απουσία συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης. Η κατεργασία των λεμφοκυττάρων πρέπει να αρχίζει 48 ώρες περίπου μετά τη μιγωμόνο διέγερση.
1.4.3.2. Για κάθε συγκέντρωση θα πρέπει να χρησιμοποιούνται καλλιέργειες εις διπλούν, ενώ το ίδιο συνιστάται ένθερμα και για τις αρνητικές/με διαλύτη καλλιέργειες. Όταν από πρότερα υφιστάμενα στοιχεία μπορεί να αποδειχθεί ότι η διαφοροποίηση μεταξύ των διπλών καλλιεργειών είναι ελάχιστη (13) (14), μπορεί να γίνει δεκτή η χρήση μιας μόνης καλλιέργειας για κάθε συγκέντρωση. Οι αέριες ή πτητικές ουσίες πρέπει να υποβάλλονται σε δοκιμή με κατάλληλες μεθόδους όπως π.χ. σε σφραγισμένα δοχεία καλλιεργειών (15) (16).
1.4.3.3. Χρόνος συλλογής καλλιέργειας Στο πρώτο πείραμα, τα κύτταρα θα πρέπει να εκτίθενται στην υπό δοκιμή ουσία, με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση. για 3-6 ώρες και να λαμβάνεται δείγμα έπειτα από χρονικό διάστημα που αντιστοιχεί με το 1,5 περίπου της κανονικής διάρκειας του κυτταρικού κύκλου μετά την έναρξη της κατεργασίας (12). Εάν το πρωτόκολλο αυτό δίνει αρνητικά αποτελέσματα, τόσο με όσο και χωρίς ενεργοποίηση, θα πρέπει να διεξάγεται μία πρόσθετη δοκιμή χωρίς ενεργοποίηση, με συνεχή κατεργασία μέχρι τη δειγματοληψία σε χρόνο που ισοδυναμεί με το 1,5 περίπου της κανονικής διάρκειας του κυτταρικού κύκλου. Ορισμένες ουσίες μπορεί να ανιχνεύονται ευκολότερα όταν ο χρόνος κατεργασίας/δειγματοληψίας είναι μεγαλύτερος από το 1,5 της διάρκειας του κύκλου. Τα αρνητικά αποτελέσματα με μεταβολική ενεργοποίηση πρέπει να επιβεβαιώνεται περίπτωση προς περίπτωση. Στις περιπτώσεις όπου δεν κρίνεται αναγκαία η επιβεβαίωση των αρνητικών αποτελεσμάτων, αυτό θα πρέπει να αιτιολογείται.
1.4.3.4. Προετοιμασία των χρωμοσωμάτων Κυτταρικές καλλιέργειες υποβάλλονται σε κατεργασία με ColcemidR ή κολχικίνη για μία έως τρεις ώρες συνήθως πριν από τη συλλογή. Κάθε κυτταρική καλλιέργεια συλλέγεται και υποβάλλεται σε χωριστή επεξεργασία για την προετοιμασία των χρωμοσωμάτων. Η προετοιμασία των χρωμοσωμάτων περιλαμβάνει κατεργασία των κυττάρων με υπό-τονο διάλυμα, στερέωση και χρώση.
1.4.3.5. Ανάλυση Όλες οι αντικειμενοφόροι, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων των θετικών και αρνητικών μαρτύρων, θα πρέπει να παίρνουν ένα ξεχωριστό κωδικό πριν από την εξέταση στο μικροσκόπιο. Επειδή οι διαδικασίες στερέωσης απολήγουν συχνά στη ρήξη ενός μέρους των μεταφασικών κυττάρων με απώλεια χρωμοσωμάτων, τα καταμετρούμενα κύτταρα θα πρέπει συνεπώς να περιέχουν αριθμό κεντρομεριδίων ίσο με τον υποθετικό αριθμό ± 2 για όλα τα είδη κυττάρων. Θα πρέπει να καταμετρούνται τουλάχιστον 200 καλώς ανεπτυγμένες μεταφάσεις ανά συγκέντρωση και μάρτυρα, μοιρασμένες εξίσου μεταξύ των εις διπλούν καλλιεργειών, εφόσον γίνεται. Ο αριθμός αυτός μπορεί να μειωθεί όταν παρατηρείται υψηλός αριθμός εκτροπών. Αν και σκοπός της δοκιμής είναι να ανιχνευθούν χρωμοσωμικές δομικές εκτροπές, είναι σημαντικό το να καταγραφούν τυχόν φαινόμενα πολυπλοειδίας και ενδοαναδιπλασιασμού, εφόσον παρατηρηθούν.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ
2.
2.1. ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η πειραματική μονάδα είναι το κύτταρο, επομένως θα πρέπει να υπολογίζεται το ποσοστό των κυττάρων με δομική ή δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές. Οι διάφοροι τύποι δομικών χρωμοσωμικών μεταβολών θα πρέπει να καταγράφονται με τον αριθμό και τη συχνότητα που εμφανίζονται στις πειραματικές και στις καλλιέργειες του μάρτυρα. Τα χάσματα καταγράφονται ξεχωριστά και περιλαμβάνονται στην έκθεση, γενικά όμως δεν περιλαμβάνονται στη συνολική συχνότητα εκτροπών. Θα πρέπει επίσης να καταγράφονται και οι παράλληλες μετρήσεις κυτταροτοξικότητας για όλες τις υποβληθείσες σε κατεργασία καθώς και τις αρνητικές καλλιέργειες μάρτυρα στα κύρια πειράματα εκτροπής. Θα πρέπει να δίνονται στοιχεία για κάθε καλλιέργεια χωριστά. Επιπλέον, όλα τα στοιχεία θα πρέπει να συνοψίζονται με τη μορφή πίνακα. Δεν απαιτείται επαλήθευση των σαφών θετικών αποκρίσεων. Τυχόν διφορούμενα αποτελέσματα θα πρέπει να αποσαφηνίζονται με περαιτέρω δοκιμές τροποποιώντας κατά προτίμηση τις πειραματικές συνθήκες. Η ανάγκη επιβεβαίωσης των αρνητικών αποτελεσμάτων έχει συζητηθεί στο σημείο 1.4.3.3. Στα επαναληπτικά πειράματα θα πρέπει να εξετάζεται η τροποποίηση των παραμέτρων της δοκιμής ώστε να καλύπτουν όλη την έκταση των εκτιμώμενων συνθηκών. Στις παραμέτρους που μπορούν να τροποποιηθούν περιλαμβάνεται το εύρος των συγκεντρώσεων και οι συνθήκες μεταβολικής ενεργοποίησης.
2.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Για να θεωρηθεί ένα αποτέλεσμα ως θετικό υπάρχουν διάφορα κριτήρια όπως η σχετιζόμενη με την συγκέντρωση αύξηση ή η αναπαραγώγιμη αύξηση στον αριθμό των κυττάρων με χρωμοσωμικές εκτροπές. Πρώτα θα πρέπει να εξετάζεται η βιολογική σχετικότητα των αποτελεσμάτων. Ως βοήθημα στην αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των δοκιμών μπορούν να χρησιμοποιούνται και στατιστικές μέθοδοι (3) (13). Σε μία θετική απόκριση δεν θα πρέπει ως μοναδικός αποφασιστικός παράγοντας να λαμβάνεται η στατιστική σημαντικότητα. Τυχόν αύξηση στον αριθμό των πολυπλοειδών κυττάρων μπορεί να σημαίνει ότι η υπό δοκιμή ουσία μπορεί να αναστέλλει τις μιτωτικές διεργασίες και να επάγει αριθμητικές χρωμοσωμικές εκτροπές. Τυχόν αύξηση στον αριθμό των κυττάρων με ενδοαναδιπλασιασμένα χρωμοσώματα μπορεί να σημαίνει ότι η υπό δοκιμή ουσία μπορεί να εμποδίζει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (17) (18). Εφόσον τα αποτελέσματα για μία υπό δοκιμή ουσία δεν πληρούν τα ανωτέρω κριτήρια, η ουσία αυτή θεωρείται ως μη μεταλλαξογόνος στο σύστημα αυτό. Αν και τα περισσότερα πειράματα θα δίνουν σαφώς θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα, σε σπάνιες περιπτώσεις τα δεδομένα ενδέχεται να μην επιτρέπουν την εξαγωγή οριστικού συμπεράσματος σχετικά με τη δραστικότητα της υπό δοκιμή ουσίας. Τα αποτελέσματα μπορεί να παραμένουν διφορούμενα ή αμφισβητήσιμα άσχετα με το πόσες φορές θα επαναληφθεί το πείραμα. Θετικά αποτελέσματα από την in vitro δοκιμή χρωμοσωμικών εκτροπών δείχνουν ότι η υπό δοκιμή ουσία επάγει δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές σε καλλιεργημένα σωματικά κύτταρα θηλαστικών. Αρνητικά αποτελέσματα δείχνουν ότι, υπό τις συνθήκες της δοκιμής, η υπό δοκιμή ουσία δεν επάγει χρωμοσωμικές εκτροπές σε καλλιεργημένα σωματικά κύτταρα θηλαστικών.
3. ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
3. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ
Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία:
Διαλύτης/φορέας:
αιτιολόγηση της επιλογής του φορέα,
διαλυτότητα και σταθερότητα της υπό δοκιμή ουσίας στο διαλύτη/φορέα, εφόσον είναι γνωστές.
Κύτταρα:
τύπος και πηγή των κυττάρων,
χαρακτηριστικά καρυοτύπου και καταλληλότητα του χρησιμοποιηθέντος τύπου κυττάρων,
απουσία μυκοπλάσματος, εφόσον συντρέχει περίπτωση,
πληροφορίες για τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου,
φύλο των δωρητών αίματος, πλήρες αίμα ή διαχωρισμένα λεμφοκύτταρα, χρησιμοποιηθέν μιτωγόνο,
αριθμός διελεύσεων, εφόσον συντρέχει περίπτωση,
μεθόδους συντήρησης της κυτταρικής καλλιέργειας, εφόσον συντρέχει περίπτωση,
υποθετικός αριθμός χρωμοσωμάτων.
Συνθήκες δοκιμής:
ταυτότητα της ουσίας αναστολής της μετάφασης, συγκέντρωση αυτής και διάρκεια έκθεσης των κυττάρων,
αιτιολογία για την επιλογή των συγκεντρώσεων και του αριθμού των καλλιεργειών συμπεριλαμβανομένων, π.χ. στοιχείων κυταροτοξικότητας και περιορισμών από πλευράς διαλυτότητας, εφόσον συντρέχει περίπτωση,
σύσταση του μέσου καλλιέργειας και συγκέντρωση (CO2, εφόσον συντρέχει περίπτωση,
συγκέντρωση της υπό δοκιμή ουσίας,
όγκος του φορέα και της προστεθείσας υπό δοκιμή ουσίας,
θερμοκρασία επωάσεως,
χρόνος επωάσεως,
διάρκεια της κατεργασίας,
πυκνότητα των κυττάρων στην ανακαλλιέργεια, εφόσον συντρέχει περίπτωση,
τύπος και σύσταση του συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης, συμπεριλαμβανομένων και κριτηρίων απο-δοχης,
θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες,
μέθοδοι προετοιμασίας των αντικειμενοφόρων,
κριτήρια καταμέτρησης των εκτροπών,
αριθμοί των αναλυθεισών μεταφάσεων,
μέθοδοι για τις μετρήσεις τοξικότητας,
κριτήρια κατάταξης της δοκιμής ως θετικής, αρνητικής ή διφορούμενης.
Αποτελέσματα:
σημάδια τοξικότητας, π.χ. βαθμός συρροής, στοιχεία κυτταρικού κύκλου, αριθμός κυττάρων, μιτωτικός δείκτης,
σημάδια καθίζησης,
στοιχεία για το pΗ και την οσμωμοριακότητα του μέσου κατεργασίας, εφόσον προσδιορίστηκαν,
ορισμός των εκτροπών, συμπεριλαμβανομένων των χασμάτων,
αριθμός κυττάρων με χρωμοσωμικές εκτροπές και τύπο χρωμοσωμικών εκτροπών ξεχωριστά για κάθε κατεργασθείσα καλλιέργεια και καλλιέργεια-μάρτυρα,
αλλαγές στην πλοειδία, εφόσον παρατηρήθηκαν,
σχέση δόσης-απόκρισης, όπου είναι δυνατό,
στατιστικές αναλύσεις, εφόσον υπάρχουν,
παράλληλα στοιχεία για τους αρνητικούς (διαλύτης/φορέας) και θετικούς μάρτυρες,
ιστορικά στοιχεία για τους αρνητικούς (διαλύτης/φορέας) και θετικούς μάρτυρες, με εύρη, μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις.
Εξέταση των αποτελεσμάτων.
Συμπεράσματα.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29. lshidate, M. Jr. and Sofuni, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5. Ashby, J. et al, (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432. Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Naka-mura, F.. Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, C. H., Resnick, Μ. Λ., Andersen, G. and Zeiger, E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl. 10), pp. 1-175. Scott. D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., lshidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257. pp. 147-204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, 1. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res.. 26S, pp. 297-305. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron, D. M. and Ames, Β. Ν. (198 3), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215. Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, J. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitro-samine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90. Matsuoka, Α., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, pp. 277-290. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclar 1254-induced S9 in in Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara. K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J., Pouts, J. R., Berid, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. Galloway. S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Iven, J. L., Kirkland, D. J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241-261. Richardson. C, Williams, D. Α., Allen, J. Α., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154. Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139-149. Krahn, D. P., Barsky, P. C. and McCooey, Κ. Τ. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Gcnotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103. Zamora, P. O., Benson. J. M., Li, A. P. and Brooks, A. [.. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis. 5, pp. 795-801. I.ocke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res.. 119. pp. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. Ε. (Ι983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.
Β.11. ΜΕΤΑΛΛΑΞΙΓΕΝΕΣΗ — IN VIVO ΔΟΚΙΜΗ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΩΝ ΕΚΤΡΟΠΩΝ ΜΥΕΛΟΥ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ ΣΕ ΘΗΛΑΣΤΙΚΑ
Β.11.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Η παρούσα μέθοδος αποτελεί αντιγραφή της OECD ΤG 475, Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberra-tion Test (1997).
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η in vivo δοκιμή χρωμοσωμικών εκτροπών σε θηλαστικά χρησιμοποιείται για την ανίχνευση δομικών χρωμοσωμικών εκτροπών που προκαλούνται από την υπό δοκιμή ουσία στα κύτταρα του μυελού των οστών ζώων, συνήθως τρωκτικών (1) (2) (3) (4). Οι δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές μπορεί να είναι δύο τύπων, χρωμοσωμικές ή χρωματιδικές. Τυχόν αύξηση στην πολυπλοειδία μπορεί να σημαίνει ότι μία χημική ουσία έχει τη δυνατότητα να επάγει αριθμητικές εκτροπές. Τα περισσότερα χημικά μεταλλαξιγόνα προκαλούν εκτροπές χρωματιδικού τύπου, απαντώνται όμως και εκτροπές χρωμοσωμικού τύπου. Οι χρωμοσωμικές μεταλλάξεις και τα συναφή συμβάντα αποτελούν αίτιο πολλών γενετικών ασθενειών του ανθρώπου και υπάρχουν ουσιαστικές ενδείξεις ότι οι χρωμοσωμικές μεταλλάξεις και τα συναφή συμβάντα που προκαλούν αλλοιώσεις σε ογκογονίδια και ογκογενή αποκαταστατικά γονίδια σωματικών κυττάρων συνδέονται με την εμφάνιση καρκίνου σε ανθρώπους και σε πειραματικά συστήματα. Στην παρούσα δοκιμή χρησιμοποιούνται συνήθως τρωκτικά. Στη δοκιμή αυτή, ιστός στόχος είναι ο μυελός των οστιών επειδή παρουσιάζει έντονη αγγείωση και περιλαμβάνει κύτταρα με ταχύ κυτταρικό κύκλο που μπορούν εύκολα να απομονωθούν και να υποβληθούν σε κατεργασία. Τα υπόλοιπα είδη και ιστοί στόχοι δεν εμπίπτουν στο θέμα της παρούσας μεθόδου. Η παρούσα δοκιμή χρωμοσωμικών εκτροπών έχει άμεση σχέση με την εκτίμηση του κινδύνου μεταλλαξιγένεσης δεδομένου ότι επιτρέπει την εξέταση παραγόντων in vivo μεταβολισμού, φαρμακοκινητικής και διεργασιών επιδιόρθωσης DΝA αν και οι παράγοντες αυτοί μπορεί να διαφέρουν μεταξύ ειδών και μεταξύ ιστών. Η in vivo δοκιμή είναι επίσης χρήσιμη για περαιτέρω διερεύνηση τυχόν μεταλλαξιγόνου δράσης που εντοπίζεται σε in vitro δοκιμή. Εάν υπάρχουν ενδείξεις ότι η υπό δοκιμή ουσία, ή οι ενεργοί μεταβολίτες της, δεν φθάνει στον ιστό στόχο, δεν προσφέρεται η χρήση της παρούσας δοκιμής. Βλέπε επίσης γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Εκτροπή χρωματιδικού τύπου: δομική χρωμοσωμική βλάβη που εμφανίζεται ως ρήξη μεμονωμένων χρωματιδών ή ρήξη και επανένωση μεταξύ χρωματιδών. Εκτροπή χρωμοσωμικού τύπου: δομική χρωμοσωμική βλάβη που εμφανίζεται ως ρήξη, ή ρήξη και επανένωση, και των δύο χρωματιδών στην ίδια θέση. Ενδοαναδιπλασιασμός: διεργασία κατά την οποία έπειτα από μία 5 φάση αντιγραφής DΝΛ, ο πυρήνας δεν υφίσταται μίτωση αλλά ξεκινά μία νέα S φάση. Το αποτέλεσμα είναι χρωμοσώματα με 4, 8, 16, ... χρωματίδες. Χάσμα: αχρωματική βλάβη μικρότερη από το πλάτος μιας χρωματίδης και με ελάχιστη απευθυγράμμιση της ή των χρωματιδών. Αριθμητική εκτροπή: μεταβολή του αριθμού των χρωμοσωμάτων από τον κανονικό χαρακτηριστικό αριθμό των χρησιμοποιουμένων κυττάρων. Πολυπλοειδία: πολλαπλάσιο του απλοειδούς χρωμοσωμικού αριθμού (η) πέραν του διπλοειδούς αριθμού (δηλαδή 3η. 4η κ.ο.κ.). Δομική εκτροπή: μεταβολή της δομής των χρωμοσωμάτων που εντοπίζεται με παρατήρηση στο μικροσκόπιο του σταδίου της μεταφάσεως της διαίρεσης των κυττάρων και γίνεται αντιληπτή με τη μορφή απαλείψεων και θραυσμάτων, ενδοανταλλαγών ή ανταλλαγών.
1.3. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ Τα ζώα εκτίθενται στην υπό δοκιμή ουσία από μία κατάλληλη οδό εκθέσεως και θυσιάζονται σε κατάλληλες χρονικές στιγμές μετά την αγωγή. Πριν από τη Ουσία, τα ζώα υποβάλλονται σε αγωγή με ένα παράγοντα αναστολής μεταφάσεως (π.χ. κολχικίνη ή Colcemid®). Στη συνέχεια, από τα κύτταρα του μυελού των οστών, παρασκευάζονται χρωμοσωμικά παρασκευάσματα τα οποία χρωματίζονται και τα μεταφασικά κύτταρα εξετάζονται προς εντοπισμό τυχόν χρωμοσωμικών εκτροπών.
1.4. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ
1.4.
1.4.1. Προετοιμασίες
1.4.1.
1.4.1.1. Επιλογή ζωικών ειδών Συνήθως χρησιμοποιούνται επίμυες, ποντικοί και κινέζικοι κρικητοί, αν και μπορεί να χρησιμοποιηθεί και οποιοδήποτε άλλο κατάλληλο είδος θηλαστικού. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται συνήθως χρησιμοποιούμενες εργαστηριακές φυλές νεαρών υγιών ενήλικων ζώων. Στην αρχή της δοκιμής, οι διαφορές στα βάρη των ζώων θα πρέπει να είναι ελάχιστες και να μην υπερβαίνουν το ± 20 % του μέσου βάρους κάθε φύλου.
1.4.1.2. Συνθήκες στέγασης και διατροφής Εφαρμόζονται οι γενικές συνθήκες που αναφέρονται στην γενική εισαγωγή του μέρους Β, αν και ο στόχος για την υγρασία θα πρέπει να είναι 50-60 %.
1.4.1.3. Προετοιμασία των ζώων Υγιή νεαρά ενήλικα ζώα χωρίζονται τυχαία σε ομάδες μαρτυρίας και αγωγής. Τα κλουβιά θα πρέπει να διατάσσονται με τέτοιο τρόπο ώστε να ελαχιστοποιούνται τυχόν πιθανές επιδράσεις από τη θέση των κλουβιών. Κάθε ζώο παίρνει ξεχωριστή ταυτότητα. Τα ζώα εγκλιματίζονται στις εργαστηριακές συνθήκες για πέντε τουλάχιστον ημέρες.
1.4.1.4. Προετοιμασία των δόσεων Στερεές υπό δοκιμή ουσίες θα πρέπει να διαλύονται ή να τίθενται υπό μορφή εναιωρήματος σε κατάλληλους διαλύτες ή φορείς και να αραιώνονται, εφόσον χρειάζεται, πριν να χορηγηθούν στα ζώα. Οι υγρές υπό δοκιμή ουσίες μπορούν να χορηγούνται απευθείας ως έχουν ή αραιωμένες. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται πρόσφατα παρασκευάσματα της υπό δοκιμή ουσίας εκτός κι αν τα στοιχεία τα σχετικά με τη σταθερότητα της ουσίας επιτρέπουν τη χρήση έτοιμων παρασκευασμάτων.
1.4.2. Συνθήκες δοκιμής
1.4.2.
1.4.2.1. Διαλύτης/φορέας Ο διαλύτης/φορέας δεν θα πρέπει να εμφανίζει τοξική δράση στα χρησιμοποιούμενα επίπεδα δόσεων αλλά ούτε και να υπάρχουν υπόνοιες για πιθανή χημική αντίδρασή του με την υπό δοκιμή ουσία. Εφόσον ο χρησιμοποιούμενος διαλύτης/φορέας δεν είναι από τους γνωστούς, η χρήση του θα πρέπει να στηρίζεται στην ύπαρξη στοιχείων που αποδεικνύουν τη συμβατότητά του. Συνιστάται, εφόσον είναι δυνατό, να εξετάζεται πρώτα αν μπορεί να χρησιμοποιηθεί υδατικός διαλύτης/φορέας.
1.4.2.2. Μάρτυρες Σε κάθε δοκιμή θα πρέπει να περιλαμβάνονται παράλληλα θετικοί και αρνητικοί (διαλύτης ή φορέας) μάρτυρες για κάθε φύλο. Με εξαίρεση την αγωγή με την υπό δοκιμή ουσία, τα ζώα στις ομάδες μαρτυρίας θα πρέπει να αντιμετωπίζονται με τον ίδιο ακριβώς τρόπο με εκείνο των ζώων στις υποβαλλόμενες σε αγωγή ομάδες. Οι θετικοί μάρτυρες θα πρέπει να προκαλούν δομικές εκτροπές in vivo σε επίπεδα έκθεσης που αναμένεται να δώσουν ανιχνεύσιμη αύξηση πάνω από το βασικό όριο. Οι δόσεις των θετικών μαρτύρων θα πρέπει να επιλέγονται έτσι ώστε τα αποτελέσματα να είναι σαφή αλλά να μην αποκαλύπτουν αμέσως την ταυτότητα των κωδικοποιημένων αντικειμενοφόρων στον παρατηρητή. Οι θετικοί μάρτυρες μπορούν να χορηγούνται και από οδό διαφορετική από εκείνη της υπό δοκιμή ουσίας και να δειγματίζονται μόνο μία φορά. Εφόσον υπάρχουν, μπορεί να εξετάζεται η χρήση θετικών μαρτύρων παρόμοιας χημικής τάξης. Παραδείγματα ουσιών θετικών μαρτύρων είναι: Ουσία Αριθ. CΑS Αριθ. ΕΙΝΕCS Μεθανοσουλφονικός αιθυλεστέρας 62-50-0 200-536-7 Αιθυλο νιτροζουρία 759-73-9 212-072-2 Μιτομυκύνη C 50-07-7 200-008-6 Κυκλοφωσφαμίδιο Μονοένυδρο κυκλοφωσφαμίδιο 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Τριαιθυλενομελαμίνη 51-18-3 200-083-5 Σε κάθε δειγματοληψία θα πρέπει να περιλαμβάνονται και αρνητικοί μάρτυρες, υποβληθέντες σε αγωγή μόνο με διαλύτη ή φορέα αλλά με τον ίδιο κατά τα άλλα τρόπο με εκείνο των ομάδων της υπό δομική ουσίας, εκτός κι αν από προϋπάρχοντα στοιχεία για τους μάρτυρες προκύπτουν αποδεκτές διαφοροποιήσεις και συχνότητες κυττάρων με χρωμοσωμικές εκτροπές. Εάν για τους αρνητικούς μάρτυρες γίνεται μία μόνο δειγματοληψία, ο καταλληλότερος χρόνος είναι ο χρόνος της πρώτης δειγματοληψίας. Επιπλέον, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται και μη υποβληθέντες σε αγωγή μάρτυρες εκτός αν υπάρχουν ιστορικά ή δημοσιευμένα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι ο επιλεγείς διαλύτης/φορέας δεν επιφέρει επιβλαβή ή μεταλλαξογόνα αποτελέσματα.
1.5. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1.5.
1.5.1. Αριθμός και φύλο των ζώων Κάθε υποβαλλόμενη σε αγωγή ομάδα και ομάδα-μάρτυρας πρέπει να περιλαμβάνει 5 τουλάχιστον προς εξέταση ζώα ανά φύλο. Εάν κατά το χρόνο της δοκιμής υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα από μελέτες στο ίδιο είδος ζώου με τη ίδια οδό έκθεσης που αποδεικνύουν ότι δεν υπάρχουν ουσιαστικές διαφορές στην τοξικότητα μεταξύ φύλων, αρκεί τότε η διεξαγωγή δοκιμής σε ένα μόνο φύλο. Στις περιπτώσεις όπου η έκθεση των ανθρώπων στις χημικές ουσίες εξαρτάται από το φύλο, όπως π.χ. μπορεί να συμβεί στην περίπτωση ορισμένων φαρμακευτικών παραγόντων, η δοκιμή θα πρέπει να εκτελείται με ζώα του αντίστοιχου φύλου.
1.5.2. Χρονοδιάγραμμα αγωγής Οι υπό δοκιμή ουσίες χορηγούνται κατά προτίμηση με εφάπαξ αγωγή. Οι υπό δοκιμή ουσίες μπορούν επίσης να χορηγηθούν και διακεκομμένα, δηλαδή δύο αγωγές την ίδια ημέρα που να μην απέχουν χρονικά περισσότερο από μερικές ώρες, για να διευκολυνθεί η χορήγηση μεγάλης ποσότητας ουσίας. Άλλοι τυχόν χρησιμοποιούμενοι τρόποι αγωγής 3α πρέπει να αιτιολογούνται επιστημονικώς. Τα δείγματα θα πρέπει να λαμβάνονται σε δύο διαφορετικές χρονικές στιγμές μετά την αγωγή της μίας ημέρας. Για τα τρωκτικά, ι] πρώτη δειγματοληψία γίνεται σε χρόνο που αντιστοιχεί στο 1,5 της κανονικής διάρκειας του κυτταρικού κύκλου (ο τελευταίος είναι κανονικά 12-18 ώρες) μετά την αγωγή. Επειδή ο απαιτούμενος χρόνος για την πρόσληψη και το μεταβολισμό της υπό δοκιμή ουσίας καθώς επίσης και η επίδρασή της στην κινητική του κυτταρικού κύκλου μπορεί να επηρεάσει τον άριστο ενδεικνυόμενο χρόνο για την ανίχνευση χρωμοσωμικής εκτροπής, συνιστάται να γίνεται μία δεύτερη δειγματοληψία 24 ώρες μετά την πρώτη. Εφόσον η χορήγηση της ουσίας γίνεται σε χρονικό διάστημα που υπερβαίνει τη μία ημέρα, η δειγματοληψία θα πρέπει να γίνεται έπειτα από χρονικό διάστημα που να αντιστοιχεί στο 1,5 της κανονικής διάρκειας του κυτταρικού κύκλου μετρούμενο από την τελική αγωγή. Πριν από τη θυσία, στα ζώα εγχύεται ενδοπεριτοναϊκώς κατάλληλη δόση παράγοντα αναστολής μετάφασης (π.χ. ColcemidR ή κολχικίνη). Σε κατάλληλη μεταγενέστερη χρονική στιγμή πραγματοποιείται στα ζώα δειγματοληψία. Για τους ποντικούς, η καταλληλότερη στιγμή περίπου 3-5 ώρες. ενώ για τους κινέζικους κρικητούς το διάστημα αυτό αντιστοιχεί περίπου σε 4-5 ώρες. Συλλέγονται κύτταρα από το μυελό των οστών και εξετάζονται από πλευράς χρω-μοσωμικών εκτροπών.
1.5.3. Επίπεδα δόσεων Εάν Εκτελεστεί δοκιμή ανεύρεσης εύρους επειδή δεν υπάρχουν κατάλληλα διαθέσιμα δεδομένα, αυτή 3α πρέπει να εκτελείται στο ίδιο εργαστήριο, με το ίδιο είδος, φυλή, φύλο κα τρόπο αγωγής που χρησιμοποιείται στην κύρια δοκιμή (5). Εφόσον υπάρχει τοξικότητα, για την πρώτη δειγματοληψία χρησιμοποιούνται τρία επίπεδα δόσεων. Τα επίπεδα αυτά δόσεων θα πρέπει να καλύπτουν μία περιοχή από τη μέγιστη μέχρι τη χαμηλή ή μηδενική τοξικότητα. Για τη μεταγενέστερη δειγματοληψία, χρειάζεται να χρησιμοποιηθεί μόνο η μέγιστη δόση. Η μέγιστη δόση ορίζεται ως η δόση που παρέχει σημεία τοξικότητας τέτοια ώστε τυχόν υψηλότερα επίπεδα δόσης, με βάση τον ίδιο τρόπο χορήγησης, να αναμένεται φυσιολογικά να οδηγήσουν σε φαινόμενα θνησιμότητας. Ουσίες με ειδικές βιολογικές δράσεις σε χαμηλές μη τοξικές δόσεις (όπως ορμόνες και μιτωγόνα) μπορεί να αποτελούν εξαιρέσεις στα κριτήρια ρύθμισης των δόσεων και ΐ)α πρέπει να αξιολογούνται κατά περίπτωση. Η μέγιστη δόση μπορεί επίσης να οριστεί και ως η δόση που παρέχει ορισμένες ενδείξεις τοξικότητας στο μυελό των οστών (π.χ. μεγαλύτερη από 50 % μείωση στο μιτωτικό δείκτη).
1.5.4. Δοκιμή οριακής δόσης Εάν μία δοκιμή με ένα επίπεδο δόσης τουλάχιστον 2000 mg/kg βάρους σώματος στην οποία χρησιμοποιείται μία μόνη αγωγή, ή δύο αγωγές την ίδια μέρα, δεν δώσει ορατά τοξικά αποτελέσματα, και εφόσον δεν αναμένεται η εμφάνιση γονοτοξικότητας με βάση στοιχεία από ουσίες σχετικής δομής, τότε μπορεί να κριθεί ως μη αναγκαία η εκτέλεση πλήρους μελέτης με τρία επίπεδα δόσης. Σε δοκιμές μεγαλύτερης διάρκειας, η οριακή δόση είναι 2000 mg/kg βάρους σώματος/ημέρα για αγωγή μέχρι 14 ημέρες και 1000 mg/kg βάρους σώματος/ημέρα για αγωγή μεγαλύτερη από 14 ημέρες. Η αναμενόμενη ανθρώπινη έκθεση μπορεί να αποτελέσει ένδειξη ότι πρέπει να χρησιμοποιηθεί υψηλότερο επίπεδο δόσης στη δοκιμή οριακής δόσης.
1.5.5. Χορήγηση των δόσεων Η υπό δοκιμή ουσία χορηγείται συνήθως με διασωλήνωση χρησιμοποιώντας στομαχικό σωλήνα ή κατάλληλο σωλήνα διασωλήνωσης ή με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες οδοί έκθεσης εφόσον μπορούν να αιτιολογηθούν. Ο μέγιστος όγκος υγρού που μπορεί να χορηγηθεί με διασωλήνωση ή έγχυση εφάπαξ εξαρτάται από το μέγεθος του πειραματόζωου. Ο όγκος δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα 2 ml/100 g βάρους σώματος. Αν χρησιμοποιηθούν μεγαλύτεροι όγκοι, αυτό πρέπει να αιτιολογείται. Με εξαίρεση τις ερεθιστικές ή διαβρωτικές ουσίες οι οποίες κανονικά εμφανίζουν εντονότερα αποτελέσματα σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, οι διαφοροποιήσεις στον όγκο θα πρέπει να ελαχιστοποιούνται προσαρμόζοντας τη συγκέντρωση ώστε να διασφαλίζεται σταθερός όγκος σε όλα τα επίπεδα δόσεων.
1.5.6. Προετοιμασία των χρωμοσωμάτων Αμέσως μετά τη θυσία λαμβάνεται μυελός των οστών, εκτίθεται σε υπότονο διάλυμα και στερεώνεται. Τα κύτταρα κατόπιν απλώνονται σε αντικειμενοφόρους πλάκες και χρωματίζονται.
1.5.7. Ανάλυση Θα πρέπει να προσδιορίζεται ο μιτωτικός δείκτης ως μέτρο της κυτταροξικότητας σε 1000 τουλάχιστον κύτταρα ανά ζώο για όλα τα υποβληθέντα σε αγωγή ζώα (συμπεριλαμβανομένων και των θετικών μαρτύρων) και τα μη υποβληθέντα σε αγωγή ζώα-αρνητικούς μάρτυρες. Για κάθε ζώο θα πρέπει να εξετάζονται τουλάχιστον 100 κύτταρα. Ο αριθμός αυτός μπορεί να μειωθεί όταν παρατηρείται υψηλός αριθμός εκτροπών. Όλες οι αντικειμενοφόροι, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων των θετικών και αρνητικών μαρτύρων, θα πρέπει να λαμβάνουν έναν ανεξάρτητο κωδικό πριν από την εξέταση στο μικροσκόπιο. Επειδή οι διαδικασίες προετοιμασίας των αντικειμενοφόρων απολήγουν συχνά στη ρήξη ενός ποσοστού μεταφάσεων με απώλεια χρωμοσωμάτων, τα καταμετρούμενα κύτταρα θα πρέπει συνεπώς να περιέχουν έναν αριθμό κεντρομεριδίων ίσο με τον αριθμό 2η ± 2.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ
2.
2.1. ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Θα πρέπει να παρουσιάζονται με μορφή πίνακα επιμέρους στοιχεία για τα ζώα. Η πειραματική μονάδα είναι το ζώο. Για κάθε ζώο θα πρέπει να εκτιμάται ο αριθμός των καταμετρηθέντων κυττάρων, ο αριθμός των εκτροπών ανά κύτταρο και το ποσοστό των κυττάρων με δομική ή δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές. Οι διάφοροι τύποι δομικών χρωμοσωμικών εκτροπών θα πρέπει να καταγράφονται με τον αριθμό και τη συχνότητά τους στις υποβληθείσες σε αγωγή ομάδες και τις ομάδες μάρτυρες. Τα χάσματα καταγράφονται ξεχωριστά και περιλαμβάνονται στην έκθεση, γενικά όμως δεν περιλαμβάνονται στη συνολική συχνότητα εκτροπών. Εφόσον δεν υπάρχουν ενδείξεις διαφοράς αποκρίσεως ανάλογα με το φύλο, τα δεδομένα από τα δύο φύλα μπορούν να συνδυάζονται για στατιστική ανάλυση.
2.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Για να θεωρηθεί ένα αποτέλεσμα ως θετικό υπάρχουν διάφορα κριτήρια όπως η σχετιζόμενη με τη δόση αύξηση στο σχετικό αριθμό κυττάρων με χρωμοσωμικές εκτροπές ή η σαφής αύξηση στον αριθμό των κυττάρων με εκτροπές σε ομάδα μίας μόνης δόσης με μία μόνη δειγματοληψία. Πρώτα θα πρέπει να εξετάζεται η βιολογική σχετικότητα των αποτελεσμάτων. Ως βοήθημα στην αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των δοκιμών μπορούν να χρησιμοποιούνται και στατιστικές μέθοδοι (6). Σε μία θετική απόκριση δεν θα πρέπει ως μοναδικός αποφασιστικός παράγοντας να λαμβάνεται η στατιστική σημαντικότητα. Τυχόν διφορούμενα αποτελέσματα θα πρέπει να διασαφηνίζονται με περαιτέρω δοκιμές, τροποποιώντας, κατά προτίμηση, τις πειραματικές συνθήκες. Τυχόν αύξηση στην πολυπλοειδία μπορεί να σημαίνει ότι η υπό δοκιμή ουσία μπορεί να επάγει αριθμητικές χρωμοσωμικές εκτροπές. Τυχόν αύξηση στον ενδοαναδιπλασιασμό μπορεί να σημαίνει ότι η υπό δοκιμή ουσία μπορεί να παρεμποδίζει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (7) (8). Εφόσον τα αποτελέσματα για μία υπό δοκιμή ουσία δεν πληρούν τα ανωτέρω κριτήρια, η ουσία αυτή θεωρείται ως μη μεταλλαξιγόνος στη δοκιμή αυτή. Αν και τα περισσότερα πειράματα θα δίνουν σαφώς θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα, σε σπάνιες περιπτώσεις τα δεδομένα ενδέχεται να μην επιτρέπουν την εξαγωγή οριστικού συμπεράσματος σχετικά με τη δραστικότητα της υπό δοκιμή ουσίας. Τα αποτελέσματα μπορεί να παραμένουν διφορούμενα ή αμφισβητήσιμα άσχετα με το πόσες φορές θα επαναληφθεί το πείραμα. Θετικά αποτελέσματα από την in vivo δοκιμή χρωμοσωμικών εκτροπών δείχνουν ότι η υπό δοκιμή ουσία επάγει χρωμοσωμικές εκτροπές μυελό των στο οστών των εξετασθέντων ειδών. Αρνητικά αποτελέσματα δείχνουν ότι, υπό τις συνθήκες της δοκιμής, η υπό δοκιμή ουσία δεν επάγει χρωμοσωμικές εκτροπές στο μυελό των οστών των εξετασθέντων ειδών. Θα πρέπει να εξετάζεται η πιθανότητα πρόσβασης της υπό δοκιμή ουσίας ή των μεταβολών της στη γενική κυκλοφορία ή ειδικότερα στον ιστό στόχο (π.χ. συστεμική τοξικότητα).
3. ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
3. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ
Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία:
Διαλύτης/φορέας:
αιτιολόγηση της επιλογής του φορέα,
διαλυτότητα και σταθερότητα της υπό δοκιμή ουσίας στο διαλύτη/φορές, εφόσον είναι γνωστές.
Εξετασθέντα ζώα:
χρησιμοποιηθέν είδος/φυλή,
αριθμός, ηλικία και φύλο των ζώων,
πηγή, συνθήκες στέγασης, δίαιτα, κ.λπ.,
βάρος των μεμονωμένων ζώων στην έναρξη της δοκιμής, συμπεριλαμβανομένου του εύρους των βαρών σώματος, της μέσης τιμής και της τυπικής απόκλισης για κάθε ομάδα.
Συνθήκες δοκιμής:
θετικός και αρνητικός (φορέας/διαλύτης) μάρτυρες,
στοιχεία από τη μελέτη του εύρους, εφόσον έγινε,
αιτιολογία της επιλογής του επιπέδου δύσεως,
λεπτομέρειες για την προετοιμασία της υπό δοκιμή ουσίας.
λεπτομέρειες για τη χορήγηση της υπό δοκιμή ουσίας,
αιτιολογία της χρησιμοποιηθείσας οδού χορήγησης,
μέθοδοι επαλήθευσης του ότι η υπό δοκιμή ουσία έφθασε στη γενική κυκλοφορία ή στον στόχο, εφόσον συ\τρέχει περίπτωση,
μετατροπή της συγκέντρωσης (ppm) της υπό δοκιμή ουσίας στη δίαιτα/πόσιμο νερό στην πραγματική δόση (mg/kg βάρους σώματος/ημέρα), Εφόσον χρειάζεται,
στοιχεία για την ποιότητα της τροφής και του νερού,
λεπτομερής περιγραφή των σχημάτων αγωγής και δειγματοληψίας,
μέθοδοι για τις μετρήσεις της τοξικότητας,
ταυτότητα της ουσίας αναστολής της μετάφασης, συγκέντρωση αυτής και διάρκεια της αγωγής,
μέθοδοι προετοιμασίας αντικειμενοφόρων,
κριτήρια καταμέτρησης των εκτροπών,
αριθμός εξετασqέντων κυττάρων ανά ζώο,
κριτήρια κατάταξης της δοκιμής ως θετικής, αρνητικής ή διφορούμενης.
Αποτελέσματα:
σημάδια τοξικότητας,
μιτωτικός δείκτης.
τύπος και αριθμός εκτροπών ξεχωριστά για κάθε ζώο,
ολικός αριθμός εκτροπών ανά ομάδα με μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις,
αριθμός κυττάρων με εκτροπές ανά ομάδα με μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις,
αλλαγές στην πλοειδία, εφόσον παρατηρήθηκαν,
σχέση δόσης-απόκρισης, όπου είναι δυνατό,
στατιστικές αναλύσεις, εφόσον υπάρχουν,
παράλληλα στοιχεία για τους αρνητικούς (διαλύτης/φορέας) μάρτυρες,
ιστορικά στοιχεία για τους αρνητικούς (οιαλύτης/φορέας) μάρτυρες, με εύρη, μέσες τιμές και τυπικές αποκλί σεις,
τα παράλληλα στοιχεία για τους θετικούς μάρτυρες.
Εξέταση των αποτελεσμάτων.
Συμπεράσματα.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds.). IRL Press, Oxford, Washington D. C, 275-306. Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee. A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res. 189, 157-165. Richold, M., Chandly, Α., Ashby, J., Gatehouse D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland, (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report. Part 1 revised, Cambridge University Press, Cambridge, New Cork, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Tice, R. R. Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Paccierotti, F., Preston R. J., Romagna F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312. Fielder. R. J., Alleen, J. Α., Boobis, A. R., Botham, P. Α., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage,). R. K. (1989), Statistical Analysis of in Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D.). Kirkland, (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232. Locke-Huhle, C. (198 3), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res. 119, pp. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1363-1364.
B.12. ΜΕΤΑΛΛΑΞΙΓΕΝΕΣΗ — IN VIVO ΔΟΚΙΜΗ ΜΙΚΡΟΠΥΡΗΝΩΝ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ
B.12.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Η παρούσα μέθοδος αποτελεί αντιγραφή της OECD TG 474, Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test (1997).
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η in vivo δοκιμή μικροπυρήνων σε θηλαστικά χρησιμοποιείται για την ανίχνευση βλάβης προκαλούμενης από την υπό δοκιμή ουσία στα χρωμοσώματα ή τη μιτωτική συσκευή ερυθροβλαστών με εξέταση ερυθροκυττάρων λαμβανομένων από το μυελό των οστών ή/και περιφερικά αιμοκύτταρα ζώων, συνήθως τρωκτικών. Σκοπός της δοκιμής μικροπυρήνων είναι η αναγνώριση ουσιών που προκαλούν κυτταρογενετική βλάβη που απολήγει στο σχηματισμό μικροπυρήνων που περιέχουν λανθάνοντα χρωμοσωμικά θραύσματα ή ολόκληρα χρωμοσώματα. Όταν ένας ερυθροβλάστης μυελού των οστών αναπτυχθεί σε πολυχρωμικό ερυθροκύτταρο, ο κύριος πυρήνας εκβάλλεται και οι μικροπυρήνες που έχουν σχηματιστεί μπορεί να παραμείνουν πίσω στο άλλως απύρηνο κυτταρόπλασμα. Η παρατήρηση των μικροπυρήνων διευκολύνεται στα κύτταρα αυτά επειδή δεν έχουν κύριο πυρήνα. Τυχόν αύξηση στη συχνότητα των περιεχόντων μικροπυρήνες πολυχρωμικών ερυθροκυττάρων στα ζώα που έχουν υποβληθεί σε αγωγή αποτελεί ένδειξη προκληθείσας χρωμοσωμικής βλάβης. Στη δοκιμή αυτή χρησιμοποιείται συνήθως μυελός των οστών τρωκτικών επειδή στον ιστό αυτό παράγονται πολυχρωμικά ερυθροκύτταρα. Εξίσου αποδεκτή είναι και η μέτρηση φερόντων μικροπυρήνες άωρων (πολυχρωμικών) ερυθροκυττάρων στο περιφερικό αίμα σε οποιοδήποτε είδος στο οποίο έχει καταδειχθεί ότι ο σπλήνας δεν μπορεί να απομακρύνει ερυθροκύτταρα που φέρουν μικροπυρήνες ή το οποίο εμφανίζει ικανή ευαισθησία στην ανίχνευση παραγόντων που προκαλούν δομικές ή αριθμητικές χρωμοσωμικές εκτροπές. Οι μικροπυρήνες μπορούν να διακριθούν με βάση ορισμένα κριτήρια. Στα κριτήρια αυτά περιλαμβάνεται ο εντοπισμός της παρουσίας ή απουσίας DNA κινητοχώρου ή κεντρομεριδίου στους μικροπυρήνες. Βασικό τελικό σημείο είναι η εύρεση της συχνότητας των φερόντων μικροπυρήνες άωρων (πολυχρωμικών) ερυθροκυττάρων. Ως βασικό τελικό σημείο της δοκιμής μπορεί να χρησιμοποιηθεί και η εύρεση του αριθμού των ώριμων (ορθοχρωμικών) ερυθροκυττάρων στο περιφερικό αίμα που περιέχουν μικροπυρήνες μεταξύ ενός δεδομένου αριθμού ώριμων ερυθροκυττάρων όταν τα ζώα υποβάλλονται σε αγωγή συνεχώς επί τέσσερις εβδομάδες ή περισσότερο. Αυτή η in vivo δοκιμή μικροπυρήνων στα θηλαστικά έχει άμεση σχέση με την εκτίμηση του κινδύνου μεταλλαξιγένεσης δεδομένου ότι επιτρέπει την εξέταση παραγόντων του in vivo μεταβολισμού, της φαρμακοκινητικής και των διεργασιών επιδιόρθωσης DNA αν και αυτοί μπορεί να ποικίλλουν ανάλογα με το είδος, ανάλογα με τον ιστό και ανάλογα με τα γενετικά τελικά σημεία. Οι in vivo δοκιμές είναι επίσης χρήσιμες για την περαιτέρω διερεύνηση της μεταλλαξιγενούς δράσης που ανιχνεύεται από ένα in vitro σύστημα. Εάν υπάρχουν ενδείξεις ότι η υπό δοκιμή ουσία, ή ο ενεργός μεταβολίτης της, δεν θα φθάσει στον ιστό στόχο, δεν προσφέρεται η χρήση της παρούσας δοκιμής. Βλέπε επίσης γενική εισαγωγή μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Κεντρομερίδιο (κινητοχώρος): περιοχή ή περιοχές ενός χρωμοσώματος με τις οποίες τα ινίδια της ατράκτου ενώνονται κατά τη διάρκεια της διαίρεσης του κυττάρου δίνοντας τη δυνατότητα μεθοδευμένης κίνησης των θυγατρικών χρωμοσωμάτων προς τους πόλους των θυγατρικών κυττάρων. Μικροπυρήνες: μικροί πυρήνες, διακριτοί και επιπλέον των κύριων πυρήνων των κυττάρων, που παράγονται κατά τη διάρκεια της τελόφασης της μίτωσης (μείωση) από λανθάνο\τα χρωμοσωμικά θραύσματα ή ολόκληρα χρωμοσώματα. Ορθοχρωμικό ερυθροκύτταρο: ώριμο ερυθροκύτταρο χωρίς ριβοσώματα που διακρίνεται από τα άωρα, πολυχρω-μικά ερυθροκύτταρα μέσω επιλεκτικών για τα ριβοσώματα χρώσεων. Πολυχρωμικό ερυθροκύτταρο: Άωρο ερυθροκύτταρο, σε ενδιάμεσο στάδιο ανάπτυξης, που περιέχει ακόμη ριβοσώματα και συνεπώς μπορεί να διακριθεί από τα ώριμα, ορθοχρωμικά ερυθροκύτταρα με χρώσεις ειδικές για τα ριβοσώματα.
1.3. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Τα ζώα εκτίθενται στην υπό δοκιμή ουσία μέσω κατάλληλης οδού χορήγησης. Εφόσον χρησιμοποιείται μυελός των οστών, τα ζώα θυσιάζονται σε κατάλληλες χρονικές στιγμές μετά την αγωγή, εξάγεται ο μυελός των οστών και στη συνέχεια τα λαμβανόμενα παρασκευάσματα χρωματίζονται (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Όταν χρησιμοποιείται περιφερικό αίμα, το αίμα συλλέγεται σε κατάλληλες χρονικές στιγμές μετά την αγωγή και τα λαμβανόμενα παρασκευάσματα επίστρωσης χρωματίζονται (4) (8) (9) (10). Στις δοκιμές με περιφερικό αίμα θα πρέπει να μεσολαβεί όσο το δυνατό λιγότερος χρόνος μεταξύ της τελευταίας έκθεσης και της συλλογής των κυττάρων. Τα παρασκευάσματα εξετάζονται για να διαπιστωθεί η παρουσία ή μη μικροπυρήνων.
1.4. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ
1.4.
1.4.1. Προετοιμασίες
1.4.1.
1.4.1.1. Επιλογή ζωικών ειδών Εφόσον για τη δοκιμή χρησιμοποιείται μυελός των οστών, συνιστάται η χρήση ποντικών ή επίμυων αν και μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιοδήποτε κατάλληλο είδος θηλαστικού. Όταν χρησιμοποιείται περιφερικό αίμα, συνιστάται η χρήση ποντικών. Εντούτοις, μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιοδήποτε κατάλληλο είδος θηλαστικού υπό την προϋπόθεση ότι είναι είδος στο οποίο ο σπλήνας δεν απομακρύνει τα φέροντα μικροπυρήνες ερυθροκύτταρα ή είδος που εμφανίζει ικανή ευαισθησία στην ανίχνευση παραγόντων που προκαλούν δομικές ή αριθμητικές χρωμοσωμικές εκτροπές. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν συνήθως χρησιμοποιούμενες εργαστηριακές φυλές νεαρών υγιών ζώων. Στην αρχή της δοκιμής, η διαφοροποίηση στα βάρη των ζώων θα πρέπει να είναι ελάχιστη και να μην υπερβαίνει το ± 20 % του μέσου βάρους κάθε φύλου.
1.4.1.2. Συνθήκες στέγασης και διατροφής Εφαρμόζονται οι γενικές συνθήκες που αναφέρονται στη γενική εισαγωγή του μέρους Β, αν και ο στόχος για την υγρασία θα πρέπει να είναι 50-60 %.
1.4.1.3. Προετοιμασία των ζώων Υγιή νεαρά ενήλικα ζώα χωρίζονται τυχαία σε ομάδες-μάρτυρες και αγωγής. Σε κάθε ζώο δίνεται μία ξεχωριστή ταυτότητα. Τα ζώα εγκλιματίζονται στις εργαστηριακές συνθήκες για πέντε τουλάχιστον ημέρες. Τα κλουβιά θα πρέπει να διατάσσονται με τέτοιο τρόπο ώστε να ελαχιστοποιούνται τυχόν πιθανές επιδράσεις από τη θέση των κλουβιών.
1.4.1.4. Προετοιμασία των δόσεων Στερεές υπό δοκιμή ουσίες θα πρέπει να διαλύονται ή να τίθενται υπό μορφή εναιωρήματος σε κατάλληλους διαλύτες ή φορείς και να αραιώνονται, εφόσον χρειάζεται, πριν να χορηγηθούν στα ζώα. Οι υγρές υπό δοκιμή ουσίες μπορούν να χορηγούνται απευθείας ως έχουν ή αραιωμένες πριν από τη χορήγηση. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται πρόσφατα παρασκευάσματα της υπό δοκιμή ουσίας εκτός κι αν στοιχεία που υπάρχουν σχετικά με τη σταθερότητα της ουσίας επιτρέπουν τη χρήση έτοιμων παρασκευασμάτων.
1.4.2. Συνθήκες δοκιμής
1.4.2.
1.4.2.1. Διαλύτης/φορέας Ο διαλύτης/φορέας δεν θα πρέπει να εμφανίζει τοξική δράση στα χρησιμοποιούμενα επίπεδα δόσεων αλλά ούτε και να υπάρχουν υπόνοιες για πιθανή χημική αντίδρασή του με την υπό δοκιμή ουσία. Εφόσον ο χρησιμοποιούμενος διαλύτης/φορέας δεν είναι από τους γνωστούς, η χρήση του θα πρέπει να στηρίζεται στην ύπαρξη στοιχείων που αποδεικνύουν τη συμβατότητα του. Συνιστάται, εφόσον είναι δυνατό, να εξετάζεται πρώτα αν μπορεί να χρησιμοποιηθεί υδατικός διαλύτης/φορέας.
1.4.2.2. Μάρτυρες Σε κάθε δοκιμή θα πρέπει να περιλαμβάνονται παράλληλα θετικοί και αρνητικοί (φορέας/διαλύτης) μάρτυρες για κάθε φύλο. Με εξαίρεση την αγωγή με την υπό δοκιμή ουσία, τα ζώα στις ομάδες-μάρτυρες θα πρέπει να αντιμετωπίζονται με τον ίδιο ακριβώς τρόπο με εκείνο των ζώων που ανήκουν στις ομάδες αγωγής. Οι θετικοί μάρτυρες θα πρέπει να παράγουν μικροπυρήνες in vivo σε επίπεδα έκθεσης που αναμένεται να δώσουν ανιχνεύσιμη αύξηση πάνω από το βασικό όριο. Οι δόσεις των θετικών μαρτύρων θα πρέπει να επιλέγονται έτσι ώστε τα αποτελέσματα να είναι σαφή αλλά να μην αποκαλύπτουν αμέσως την ταυτότητα των κωδικοποιημένων αντικειμε-νοφόρων στον παρατηρητή. Οι θετικοί μάρτυρες μπορούν να χορηγούνται και από οδό διαφορετική από εκείνη της υπό δοκιμή ουσίας και να δειγματίζονται μόνο μία φορά. Εφόσον υπάρχουν, μπορεί να εξετασθεί η χρήση θετικών μαρτύρων παρόμοιας χημικής τάξης. Παραδείγματα ουσιών θετικών μαρτύρων είναι: Ουσία Αριθ. CAS Αριθ. EINECS Μεθανοσουλφονικός αιθυλεστέρας 62-50-0 200-536-7 Ν-αιθυλο-Ν-νιτροζουρία 759-73-9 212-072-2 Μιτομυκίνη C 50-07-7 200-008-6 Κυκλοφωσφαμίδιο Μονοένυδρο κυκλοφωσφαμίδιο 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Τριαιθυλενομελαμίνη 51-18-3 200-083-5 Για κάθε δειγματοληψία θα πρέπει να περιλαμβάνονται και αρνητικοί μάρτυρες, μόνο με διαλύτη ή φορέα, αλλά υποβληθέντες στην ίδια κατά τα άλλα αγωγή με εκείνη των ομάδων της υπό δοκιμή ουσίας, εκτός κι αν από προϋπάρχοντα στοιχεία για τους μάρτυρες προκύπτουν αποδεκτές διαφοροποιήσεις και συχνότητες κυττάρων με μικροπυρήνες μεταξύ των ζώων. Εάν για τους αρνητικούς μάρτυρες γίνεται μία μόνο δειγματοληψία, ο καταλληλότερος χρόνος είναι ο χρόνος της πρώτης δειγματοληψίας. Επιπλέον, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται και μη υποβληθέντες σε αγωγή μάρτυρες εκτός αν υπάρχουν ιστορικά ή δημοσιευμένα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι ο επιλεγείς διαλύτης/φορέας δεν επιφέρει επιβλαβή ή μεταλλαξιγόνα αποτελέσματα. Εφόσον χρησιμοποιείται περιφερικό αίμα, μπορεί επίσης να γίνει αποδεκτό ως παράλληλος αρνητικός μάρτυρας και ένα δείγμα προ-αγωγής, αλλά μόνο στις βραχυχρόνιες δοκιμές με περιφερικό αίμα (π.χ. 1-3 αγωγές) όταν τα προκύπτοντα στοιχεία ευρίσκονται στην αναμενόμενη βάσει ιστορικού περιοχή για το μάρτυρα.
1.5. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1.5.
1.5.1. Αριθμός και φύλο των ζώων Κάθε υποβαλλόμενη σε αγωγή ομάδα και ομάδα-μάρτυρας πρέπει να περιλαμβάνει πέντε τουλάχιστον ζώα ανά φύλο (11). Εάν κατά το χρόνο της δοκιμής υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα από μελέτες στο ίδιο είδος ζώου με την ίδια οδό έκθεσης που αποδεικνύουν ότι δεν υπάρχουν ουσιαστικές διαφορές στην τοξικότητα μεταξύ φύλων, αρκεί τότε η διεξαγωγή δοκιμής σε ένα μόνο φύλο. Στις περιπτώσεις όπου η έκθεση των ανθρώπων στις χημικές ουσίες εξαρτάται από το φύλο, όπως π.χ. μπορεί να συμβεί στην περίπτωση ορισμένων φαρμακευτικών παραγόντων, η δοκιμή θα πρέπει να εκτελείται σε ζώα του αντίστοιχου φύλου.
1.5.2. Χρονοδιάγραμμα αγωγής Δεν μπορεί να προταθεί κανένα τυποποιημένο χρονοδιάγραμμα αγωγής (δηλαδή μία, δύο ή περισσότερες αγωγές σε διαστήματα 24 ωρών). Τα δείγματα από παρατεταμένες δοσολογικές αγωγές είναι αποδεκτά εφόσον υπάρχει αποδεδειγμένο θετικό αποτέλεσμα στη δοκιμή αυτή ή, στην περίπτωση αρνητικής δοκιμής, εφόσον έχει αποδειχθεί η ύπαρξη τοξικότητας ή έχει χρησιμοποιηθεί η οριακή δόση και η χορήγηση συνεχίστηκε μέχρι τη στιγμή της δειγματοληψίας. Οι υπό δοκιμή ουσίες μπορούν επίσης να χορηγηθούν και σε διακεκομμένη δοσολογία, δηλαδή δύο αγωγές την ίδια ημέρα που να μην απέχουν χρονικά περισσότερο από λίγες ώρες, για να διευκολυνθεί η χορήγηση μεγάλης ποσότητας ουσίας. Η δοκιμή μπορεί να εκτελεστεί με δύο τρόπους: Μπορούν να χρησιμοποιηθούν επιπροσθέτως και άλλοι χρόνοι δειγματοληψίας, όταν χρειάζεται.
1.5.2. α)
τα ζώα υποβάλλονται σε εφάπαξ αγωγή με την υπό δοκιμή ουσία. Στην περίπτωση του μυελού των οστών λαμβάνονται δείγματα τουλάχιστον δύο φορές, ξεκινώντας το νωρίτερο 24 ώρες μετά την αγωγή, αλλά μην υπερβαίνοντας τις 48 ώρες από την αγωγή με κατάλληλα διαστήματα μεταξύ των δειγμάτων. Τυχόν λήψη δείγματος πριν από την παρέλευση 24 ωρών μετά την αγωγή θα πρέπει να αιτιολογείται. Στην περίπτωση του περιφερικού αίματος λαμβάνονται δήγματα τουλάχιστον δύο φορές, ξεκινώντας το νωρίτερο 36 ώρες μετά την αγωγή και αφήνοντας να περάσει κατάλληλο χρονικό διάστημα από την πρώτη δειγματοληψία για τη λήψη των επομένων αλλά όχι αργότερα από τις 72 ώρες. Εφόσον σε μία δειγματοληψία εντοπιστεί θετική απόκριση, δεν απαιτείται η λήψη άλλου δείγματος·
β)
εφόσον γίνουν δύο ή περισσότερες ημερήσιες αγωγές (π.χ. δύο ή περισσότερες αγωγές σε διάστημα 24 ωρών), θα πρέπει να γίνει μία μόνο δειγματοληψία στο χρονικό διάστημα μεταξύ 18 και 24 ωρών μετά την τελική αγωγή για το μυελό των οστών και μία πάλι δειγματοληψία στο χρονικό διάστημα μεταξύ 36 και 48 ωρών από την τελική αγωγή για το περιφερικό αίμα (12).
1.5.3. Επίπεδα δόσεων Εάν εκτελεστεί δοκιμή ανεύρεσης εύρους επειδή δεν υπάρχουν κατάλληλα διαθέσιμα δεδομένα, αυτή θα πρέπει να εκτελείται στο ίδιο εργαστήριο, με το ίδιο είδος, φυλή, φύλο και τρόπο αγωγής που χρησιμοποιείται στην κύρια δοκιμή (13). Εφόσον υπάρχει τοξικότητα, για την πρώτη δειγματοληψία χρησιμοποιούνται τρία επίπεδα δόσεων. Τα επίπεδα αυτά δόσεων θα πρέπει να καλύπτουν μία περιοχή από τη μέγιστη μέχρι χαμηλή ή μηδενική τοξικότητα. Στη μεταγενέστερη δειγματοληψία, χρειάζεται να χρησιμοποιηθεί μόνο η μέγιστη δόση. Η μέγιστη δόση ορίζεται ως η δόση που παρέχει σημεία τοξικότητας τέτοια ώστε τυχόν υψηλότερα επίπεδα δόσης, με βάση το ίδιο δοσολογικό καθεστώς, να αναμένεται φυσιολογικά να οδηγήσουν σε φαινόμενα θνησιμότητας. Ουσίες με ειδικές βιολογικές δράσεις σε χαμηλές μη τοξικές δόσεις (όπως ορμόνες και μιτωγόνα) μπορεί να αποτελούν εξαιρέσεις στα κριτήρια ρύθμισης των δόσεων και θα πρέπει να αξιολογούνται κατά περίπτωση. Η μέγιστη δόση μπορεί επίσης να οριστεί και ως η δόση που παρέχει ενδείξεις τοξικότητας στο μυελό των οστών (π.χ. μείωση στο ποσοστό άωρων ερυθροκυττάρων μεταξύ πλήρων ερυθροκυττάρων στο μυελό των οστών ή το περιφερικό αίμα).
1.5.4. Δοκιμή οριακής δόσης Εάν μία δοκιμή με ένα επίπεδο δόσης τουλάχιστον 2000 mg/kg βάρους σώματος στην οποία εφαρμόζεται μία μόνη αγωγή, ή δύο αγωγές την ίδια μέρα, δεν δώσει ορατά τοξικά αποτελέσματα, και εφόσον δεν αναμένεται η εμφάνιση γονοτοξικότητας με βάση στοιχεία από ουσίες σχετικής δομής, τότε μπορεί να θεωρηθεί ως μη αναγκαία η εκτέλεση πλήρους μελέτης με τρία επίπεδα δόσης. Σε μελέτες μεγαλύτερης διάρκειας, η οριακή δόση είναι 2000 mg/kg βάρους σώματος/ημέρα για αγωγή μέχρι 14 ημέρες και 1000 mg/kg βάρους σώματος/day για αγωγή μεγαλύτερη από 14 ημέρες. Η αναμενόμενη ανθρώπινη έκθεση μπορεί να αποτελέσει ένδειξη ότι πρέπει να χρησιμοποιηθεί υψηλότερο επίπεδο δόσης στη δοκιμή οριακής δόσης.
1.5.5. Χορήγηση δόσεων Η υπό δοκιμή ουσία χορηγείται συνήθως με διασωλήνωση χρησιμοποιώντας στομαχικό σωλήνα ή κατάλληλο σωλήνα διασωλήνωσης ή με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες οδοί έκθεσης εφόσον μπορούν να αιτιολογηθούν. Ο μέγιστος όγκος υγρού που μπορεί να χορηγηθεί με διασωλήνωση ή με έγχυση εφάπαξ εξαρτάται από το μέγεθος του πειραματόζωου. Ο όγκος δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα 2 ml//100 g βάρους σώματος. Αν χρησιμοποιηθούν μεγαλύτεροι όγκοι, αυτό πρέπει να αιτιολογείται. Με εξαίρεση τις ερεθιστικές ή διαβρωτικές ουσίες οι οποίες κανονικά εμφανίζουν εντονότερα αποτελέσματα με υψηλότερες συγκεντρώσεις, οι διαφοροποιήσεις στον όγκο θα πρέπει να ελαχιστοποιούνται προσαρμόζοντας τη συγκέντρωση ώστε να διασφαλίζεται σταθερός όγκος σε όλα τα επίπεδα δόσης.
1.5.6. Προετοιμασία του μυελού/αίματος Τα κύτταρα του μυελού των οστών λαμβάνονται συνήθως από τα μηριαία οστά ή τα οστά των κνημών αμέσως μετά τη θυσία. Συνή3ως, τα κύτταρα απομακρύνονται από τα εν λόγω οστά, μορφώνονται σε παρασκευάσματα και χρωματίζονται χρησιμοποιώντας καθιερωμένες μεθόδους. Το περιφερικό αίμα λαμβάνεται από την ουραία φλέβα ή άλλο κατάλληλο αιμοφόρο αγγείο. Τα αιμοκύτταρα χρωματίζονται αμέσως υπερζωικώς (8) (9) (10) ή λαμβάνονται επιστρωμένα παρασκευάσματα και κατόπιν χρωματίζονται. Χρησιμοποιώντας μία ειδική για το DNA χρωστική [π.χ. πορτοκαλόχρουν ακριδίνης (14) ή Hoechst 33258 και pyronin-Y (15)] μπορούν να εξαλειφθούν ορισμένα από τα τεχνικά σφάλματα που προκαλούνται από τη χρήση μη ειδικής για το DNA χρωστικής. Το πλεονέκτημα αυτό δεν αποκλείει τη χρήση συμβατικών χρωστικών (π.χ. Giemsa). Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν και πρόσθετα συστήματα [π.χ. στήλες κυτταρίνης για την απομάκρυνση εμπύρηνων κυττάρων (16)] υπό την προϋπόθεση ότι τα συστήματα αυτά έχουν αποδειχθεί κατάλληλα για την παρασκευή μικροπυρήνων στο εργαστήριο.
1.5.7. Ανάλυση Η αναλογία των άωρων στο σύνολο (άωρα + ώριμα) των ερυ3ροκυττάρων προσδιορίζεται για κά3ε ζώο μετρώντας ένα σύνολο τουλάχιστον 200 ερυθροκυττάρων για το μυελό των οστών και 1000 ερυθροκυττάρων για το περιφερικό αίμα (17). Όλες οι αντικειμενοφόροι, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων των θετικών και αρνητικών μαρτύρων, θα πρέπει να λαμβάνουν ένα διαφορετικό κωδικό πριν από την εξέταση στο μικροσκόπιο. Για τον προσδιορισμό της συχνότητας εμφάνισης άωρων ερυθροκυττάρων με μικροπυρήνα καταμετρούνται τουλάχιστον 2000 άωρα ερυθροκύτταρα ανά ζώο. Μπορούν να ληφθούν και άλλες πληροφορίες καταμετρώντας ώριμα ερυθροκύτταρα για μικροπυρήνες. Κατά την εξέταση των αντικειμενοφόρων, η αναλογία των άωρων στο σύνολο των ερυθροκυττάρων δεν θα πρέπει να είναι μικρότερη από το 20 % της τιμής του μάρτυρα. Όταν τα ζώα υποβάλλονται σε αγωγή συνεχώς για τέσσερις ή και περισσότερες εβδομάδες, για τη συχνότητα εμφάνισης μικροπυρήνων μπορούν να καταμετρηθούν επίσης τουλάχιστον 2000 ώριμα ερυθροκύτταρα ανά ζώο. Ως εναλλακτικός τρόπος εκτίμησης αντί εκείνου με τα χέρια, μπορούν να γίνουν δεκτά και συστήματα αυτόματης ανάλυσης (ανάλυση εικόνας και κυτταρομετρία ροής κυτταρικών εναιωρημάτων), εφόσον υπάρχει κατάλληλη αιτιολόγηση και επικύρωση.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ
2.
2.1. ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Θα πρέπει να παρουσιάζονται με μορφή πίνακα επιμέρους στοιχεία για κάθε ζώο. Η πειραματική μονάδα είναι το ζώο. Για κάθε εξεταζόμενο ζώο θα πρέπει να καταγράφεται χωριστά ο αριθμός των καταμετρηθέντων άωρων ερυθροκυττάρων, ο αριθμός των φερόντων μικροπυρήνες άωρων ερυθροκυττάρων και ο αριθμός των άωρων στο σύνολο των ερυθροκυττάρων. Όταν τα ζώα υποβάλλονται σε αγωγή συνεχώς για τέσσερις ή περισσότερες εβδομάδες, θα πρέπει επίσης να δίνονται και τα στοιχεία για τα ώριμα ερυθροκύτταρα, εφόσον ελήφθησαν. Για κάθε ζώο δίνεται η αναλογία των άωρων στο σύνολο των ερυθροκυττάρων και, εφόσον συντρέχει περίπτωση, το ποσοστό των φερόντων μικροπυρήνες ερυθροκυττάρων. Εφόσον δεν υπάρχουν ενδείξεις διαφοράς αποκρίσεως ανάλογα με το φύλο, τα δεδομένα από τα δύο φύλα μπορούν να συνδυάζονται για στατιστική ανάλυση.
2.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Για να θεωρηθεί ως θετικό ένα αποτέλεσμα υπάρχουν διάφορα κριτήρια όπως η σχετιζόμενη με τη δόση αύξηση στον αριθμό των κυττάρων με μικροπυρήνες ή η σαφής αύξηση στον αριθμό των κυττάρων με μικροπυρήνες σε ομάδα μίας μόνης δόσης σε μία μόνη δειγματοληψία. Πρώτα θα πρέπει να εξετάζεται η βιολογική σχετικότητα των αποτελεσμάτων Ως βοήθημα στην αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των δοκιμών μπορούν να χρησιμοποιούνται και στατιστικές μέθοδοι (18) (19). Σε μία θετική απόκριση δεν θα πρέπει ως μοναδικός αποφασιστικός παράγοντας να λαμβάνεται η στατιστική σημαντικότητα. Τυχόν διφορούμενα αποτελέσματα θα πρέπει να διασαφηνίζονται με περαιτέρω δοκιμές και τροποποιώντας, κατά προτίμηση, τις πειραματικές συνθήκες. Εφόσον τα αποτελέσματα για μία υπό δοκιμή ουσία δεν πληρούν τα ανωτέρω κριτήρια, η ουσία αυτή θεωρείται ως μη μεταλλαξιγόνος στη δοκιμή αυτή. Αν και τα περισσότερα πειράματα θα δίνουν σαφώς θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα, σε σπάνιες περιπτώσεις τα δεδομένα ενδέχεται να μην επιτρέπουν τη εξαγωγή οριστικού συμπεράσματος σχετικά με τη δραστικότητα της υπό δοκιμή ουσίας. Τα αποτελέσματα μπορεί να παραμένουν διφορούμενα ή αμφισβητήσιμα άσχετα με το πόσες φορές θα επαναληφθεί το πείραμα. Θετικά αποτελέσματα στη δοκιμή μικροπυρήνων δείχνουν ότι η υπό δοκιμή ουσία προκαλεί την παραγωγή μικροπυρήνων που είναι αποτέλεσμα χρωμοσωμικής βλάβης ή βλάβης στη μιτωτική συσκευή στους ερυθροβλάστες του εξετασθέντος είδους. Αρνητικά αποτελέσματα δείχνουν ότι, υπό τις συνθήκες της δοκιμής, η υπό δοκιμή ουσία δεν παράγει μικροπυρήνες στα άωρα ερυθροκύτταρα του εξετασθέντος είδους. Θα πρέπει να εξετάζεται αν η υπό δοκιμή ουσία ή οι μεταβολίτες της έχουν τη δυνατότητα πρόσβασης στη γενική κυκλοφορία ή ειδικότερα στον ιστό στόχο (π.χ. συστεμική τοξικότητα).
3 ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
3 ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ
Η έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία:
Διαλύτης φορέας:
αιτιολόγηση της επιλογής του φορέα,
διαλυτότητα και σταθερότητα της υπό δοκιμή ουσίας στο διαλύτη/φορέα, εφόσον είναι γνωστές.
Εξετασθέντα ζώα:
χρησιμοποιηθέν είδος/φυλή,
αριθμός, ηλικία και φύλο των ζώων,
πηγή, συνθήκες στέγασης, δίαιτα, κ.λπ.,
βάρος των μεμονωμένων ζώων στην έναρξη της δοκιμής, συμπεριλαμβανομένου του εύρους των βαρών σώματος, της μέσης τιμής και της τυπικής απόκλισης για κάθε ομάδα.
Συνθήκες δοκιμής:
θετικοί και αρνητικοί (φορέας/διαλύτης) μάρτυρες,
στοιχεία από τη μελέτη εύρεσης του εύρους, εφόσον έγινε,
αιτιολογία της επιλογής του επιπέδου δόσεως.
λεπτομέρειες για την προετοιμασία της υπό δοκιμή ουσίας,
λεπτομέρειες για τη χορήγηση της υπό δοκιμή ουσίας,
αιτιολογία της χρησιμοποιηθείσας οδού χορήγησης,
μέθοδοι επαλήθευσης του ότι η υπό δοκιμή ουσία έφθασε στη γενική κυκλοφορία ή στον ιστό στόχο, εφόσον συντρέχει περίπτωση,
μετατροπή της συγκέντρωσης (ppm) της υπό δοκιμή ουσίας στη δίαιτα/πόσιμο νερό στην πραγματική δόση (mg/kg βάρους σώματος/ημέρα), εφόσον χρειάζεται,
στοιχεία για την ποιότητα της τροφής και του νερού,
λεπτομερής περιγραφή των σχημάτων αγωγής και δειγματοληψίας,
μέθοδοι ετοιμασίας αντικείμενοφόρων,
μέθοδοι για τις μετρήσεις της τοξικότητας,
κριτήρια για την καταμέτρηση των φερόντων μικροπυρήνες άωρων ερυθροκυττάρων,
αριθμός εξετασθέντων κυττάρων ανά ζώο,
κριτήρια κατάταξης της δοκιμής ως θετικής, αρνητικής ή διφορούμενης.
Αποτελέσματα:
σημάδια τοξικότητας,
αναλογία άωρων στο σύνολο των ερυθροκυττάρων,
αριθμός φερόντων μικροπυρήνες άωρων ερυθροκυττάρων, χωριστά για κάθε ζώο,
μέση τιμή ± τυπική απόκλιση των φερόντων μικροπυρήνες ερυθροκυττάρων ανά ομάδα,
σχέση δόσης-απόκρισης, όπου είναι δυνατό,
στατιστικές αναλύσεις και εφαρμοσθείσες μέθοδοι,
παράλληλα και προϋπάρχοντα στοιχεία για τους αρνητικούς (διαλύτης/φορέας) μάρτυρες,
παράλληλα στοιχεία για τους θετικούς μάρτυρες.
Εξέταση των αποτελεσμάτων.
Συμπεράσματα.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15. Heddle, J. Α., Salamone, M. F., Hite, M, Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61-118. Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80. MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N., and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp., 555-558. MacGregor, J. T., Heddle, J. Α., Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R. and Wild, D. (1987). Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 1S9, pp. 103-112. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., and Shelby, Μ. Ε. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, bund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245-249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 27S, pp. 83-98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 153-159. Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), In Vivo, Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, pp. 293-304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30±6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313-319. Fielder, R. J., Allen,). Α., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319. Hayashi, M, Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247. MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and I.anglois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, pp. 269-275. Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104. Gollapudi, B. and McFaddcn, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normo-chromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97-99. Richold, M.. Ashby. J., Bootman, J., Chandley, Α., Gatehouse, D. G. and Henderson. L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report, Part I, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Lovell, D. P., Anderson, D.. Albanese, R.. Amphlett, G. E.. Clare. G., Ferguson, R., Richold. M.. Pap-worth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
Β.13/14. ΜΕΤΑΛΛΑΞΙΓΕΝΕΣΗ — ΔΟΚΙΜΗ ΑΝΑΣΤΡΟΦΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ
Β.13/14.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Η παρούσα μέθοδος αποτελεί αντιγραφή της OECD TG 471 Bacterial Reverse Mutation Test (1997).
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στη δοκιμή βακτηριακής ανάστροφης μετάλλαξης χρησιμοποιούνται στελέχη Salmonella typhimurium και Escherichia coli απαιτούντα αμινοξέα για τον εντοπισμό σημειακών μεταλλάξεων, που περιλαμβάνουν υποκατάσταση, προσθήκη ή απάλειψη ενός ή μερικών ζευγών βάσεων DNA (1) (2) (3). Η αρχή της δοκιμής αυτής της βακτηριακής ανάστροφης μετάλλαξης συνίσταται στο ότι ανιχνεύει μεταλλάξεις που αναστρέφουν μεταλλάξεις που υπάρχουν στα υπό δοκιμή στελέχη και αποκαθιστούν τη λειτουργική ικανότητα των βακτηρίων για σύνθεση ενός βασικού αμινοξέος. Τα αναστραφέντα βακτήρια ανιχνεύονται από την ικανότητά τους να αναπτύσσονται απουσία του αμινοξέος που απαιτείται από το γονικό υπό δοκιμή στέλεχος. Οι σημειακές μεταλλάξεις είναι το αίτιο πολλών γενετικών ασθενειών στους ανθρώπους και υπάρχουν ουσιαστικές ενδείξεις ότι οι σημειακές μεταλλάξεις στα ογκογονίδια και στα ογκογενή αποκαταστατικά γονίδια σωματικών κυττάρων εμπλέκονται στη δημιουργία όγκων στους ανθρώπους και σε πειραματόζωα. Η δοκιμή βακτηριακής ανάστροφης μετάλλαξης είναι ταχεία, φθηνή και σχετικά εύκολη να γίνει. Πολλά από τα υπό δοκιμή στελέχη παρουσιάζουν ορισμένα χαρακτηριστικά που τα καθιστούν πιο ευαίσθητα για την ανίχνευση μεταλλάξεων και στα οποία περιλαμβάνονται αποκρινόμενες ακολουθίες DΝΑ στις θέσεις αναστροφής, αυξημένη κυτταρική διαπερατότητα στα μεγάλα μόρια και εξάλειψη των συστημάτων επιδιόρθωσης DNA ή ενίσχυση των επιρρεπών σε σφάλματα διεργασιών επιδιόρθωσης DNA. Η εξειδίκευση των υπό δοκιμή στελεχών μπορεί να παράσχει ορισμένες χρήσιμες πληροφορίες για τους τύπους μεταλλάξεων που προκαλούνται από γονοτοξικούς παράγοντες. Για τις δοκιμές βακτηριακής ανάστροφης μετάλλαξης υπάρχει διαθέσιμη μία πολύ μεγάλη βάση δεδομένων με αποτελέσματα για μία μεγάλη ποικιλία δομών ενώ έχουν αναπτυχθεί αρκετές καθιερωμένες πλέον μεθοδολογίες για τον έλεγχο χημικών ουσιών με διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένων και πτητικών ενώσεων. Βλέπε επίσης γενική εισαγωγή μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Η δοκιμή ανάστροφης μετάλλαξης στη Salmonella typhimurium ή στα Escherichia coli ανιχνεύει μετάλλαξη σε απαιτούν αμινοξύ στέλεχος (ιστιδίνη ή τρυπτοφάνη, αντίστοιχα) για την παραγωγή στελέχους που δεν εξαρτάται από την έξωθεν παροχή αμινοξέος. Μεταλλαξογόνα υποκατάστασης ζευγών βάσεων είναι παράγοντες που προκαλούν αλλαγή βάσεων στο DNA. Στη δοκιμή αναστροφής η αλλαγή αυτή μπορεί να συμβεί στη θέση της αρχικής μετάλλαξης ή σε μία άλλη θέση του βακτηριακού γονιδιώματος. Μεταλλαξογόνα αλλαγής πλαισίου είναι παράγοντες που προκαλούν την προσθήκη ή απάλειψη ενός ή περισσοτέρων ζευγών βάσεων στο DNA, μεταβάλλοντας έτσι το αναγνωστικό πλαίσιο στο RNA.
1.3. ΑΡΧΙΚΕΣ ΘΕΩΡΗΣΕΙΣ Στη δοκιμή βακτηριακής ανάστροφης μετάλλαξης χρησιμοποιούνται προκαρυωτικά κύτταρα τα οποία διαφέρουν από τα κύτταρα των θηλαστικών σε ορισμένα σημεία όπως η πρόσληψη, ο μεταβολισμός, η χρωμοσωμική δομή και οι διεργασίες επιδιόρθωσης DNA. Οι δοκιμές που πραγματοποιούνται in vitro απαιτούν εν γένει τη χρήση εξωγενούς πηγής μεταβολικής ενεργοποίησης. Τα in vitro συστήματα μεταβολικής ενεργοποίησης δεν μπορούν να μιμηθούν πλήρως τις in vivo συνθήκες στα θηλαστικά. Συνεπώς, η δοκιμή δεν παρέχει άμεσες πληροφορίες για τη μεταλλαξιγόνο και καρκινογόνο δυνατότητα μιας ουσίας στα θηλαστικά. Η δοκιμή βακτηριακής ανάστροφης μετάλλαξης χρησιμοποιείται συνήθως ως μία αρχική δοκιμή προσανατολισμού για τη γονοτοξική δραστικότητα και, ιδιαίτερα, την επάγουσα σημειακές μεταλλάξεις. Από πολυάριθμα συλλεγμένα στοιχεία καταδεικνύεται ότι πολλά χημικά που είναι θετικά στη δοκιμή αυτή εμφανίζουν μεταλλαξιγόνο δράση και σε άλλες δοκιμές. Υπάρχουν παραδείγματα μεταλλαξιγόνων παραγόντων που δεν ανιχνεύονται με τη δοκιμή αυτή. Οι ατέλειες αυτές μπορούν να αποδοθούν στην ειδική φύση του ανιχνευόμενου τελικού σημείου, στις διαφορές στη μεταβολική ενεργοποίηση ή στις διαφορές στη βιοδιιιθεσιμότητα. Από την άλλη μεριά, παράγοντες που ενισχύουν την ευαισθησία της δοκιμής βακτηριακής ανάστροφης μετάλλαξης μπορούν να οδηγήσουν σε υπερεκτίμηση της μεταλλαξιγόνου δραστικότητας. Η δοκιμή βακτηριακής ανάστροφης μετάλλαξης μπορεί να μη προσφέρεται για την αξιολόγηση ορισμένων τάξεων χημικών ουσιών όπως, π.χ., για ισχυρά βακτηριοκτόνες ενώσεις (π.χ. ορισμένα αντιβιωτικά) και ενώσεις που θεωρείται (ή είναι γνωστό) ότι παρεμβαίνουν ειδικά στο σύστημα κυτταρικής αντιγραφής των θηλαστικών (π.χ. ορισμένοι αναστολείς της τοποϊσομεράσης και ορισμένα νουκλεοτιδικά ανάλογα). Για τις περιπτώσεις αυτές, μπορεί να προσφέρονται περισσότερο οι δοκιμές μετάλλαξης στα θηλαστικά. Αν και πολλές ενώσεις που είναι θετικές στη δοκιμή αυτή είναι καρκινογόνες στα θηλαστικά, ο συσχετισμός αυτός δεν είναι απόλυτος. Εξαρτάται από την τάξη της χημικής ένωσης και υπάρχουν καρκινογόνα που δεν ανιχνεύονται με τη δοκιμή αυτή επειδή δρουν μέσω άλλων, μη γονοτοξικών, μηχανισμών ή μηχανισμών που δεν υφίστανται στα βακτηριακά κύτταρα.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ Εναιωρήματα βακτηριακών κυττάρων εκτίθενται στην υπό δοκιμή ουσία παρουσία και απουσία εξωγενούς συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης. Στη μέθοδο προσθήκης σε τρυβλίο, τα εναιωρήματα αυτά αναμειγνύονται με άγαρ επικάλυψης και επιστρώνονται αμέσως σε ελάχιστη ποσότητα θρεπτικού μέσου. Στη μέθοδο προεπωάσεως, το μίγμα κατεργασίας επωάζεται και κατόπιν αναμειγνύεται με άγαρ επιστρώσεως πριν επιστρωθεί σε ελάχιστη ποσότητα μέσου. Και στις δύο τεχνικές, έπειτα από δύο ή τρεις ημέρες επωάσεως, μετρώνται οι ανάστροφες αποικίες και ο αριθμός τους συγκρίνεται με τον αριθμό των αυθόρμητων ανάστροφων αποικιών σε τρυβλία-μάρτυρες με διαλύτη. Έχουν περιγραφεί διάφορες διαδικασίες για την εκτέλεση της δοκιμής βακτηριακής ανάστροφης μετάλλαξης. Μεταξύ εκείνων που χρησιμοποιούνται συνήθως είναι η μέθοδος προσθήκης σε τρυβλίο (1) (2) (3) (4), η μέθοδος προεπωάσεως (2) (3) (5) (6) (7) (8), η μέθοδος διακύμανσης (9) (10) και η μέθοδος εναιωρήματος (11). Έχουν περιγραφεί επίσης και τροποποιήσεις για τη δοκιμασία αερίων η ατμών (12). Οι διαδικασίες που περιγράφονται στη μέθοδο σχετίζονται κυρίως με τις μεθόδους προσθήκης σε τρυβλίο και προεπωάσεως. Και οι δύο είναι αποδεκτές για την πραγματοποίηση πειραμάτων και με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση. Ορισμένες ουσίες μπορούν να ανιχνευθούν αποτελεσματικότερα με τη μέθοδο προεπωάσεως. Οι ουσίες αυτές ανήκουν σε μία σειρά χημικών τάξεων στην οποία περιλαμβάνονται οι αλειφατικές νιτροζαμίνες με βραχεία αλυσίδα, τα δισθενή μέταλλα, αλδεΰδες, αζωχρώματα και διαζωενώσεις, πυρολλιζιδινικά αλκαλοειδή, αλλυλοενώσεις και νιτροενώσεις (3). Αναγνωρίζεται επίσης ότι ορισμένες τάξεις μεταλλαξιγόνων δεν ανιχνεύονται πάντοτε με τις τυποποιημένες διαδικασίες όπως με τη μέθοδο προσθήκης σε τρυβλίο ή με τη μέθοδο προεπωάσεως. Aυτές θα πρέπει να θεωρούνται ως ειδικές περιπτώσεις και συνιστάται ιδιαίτερα να χρησιμοποιούνται για την ανίχνευσή τους εναλλακτικές διαδικασίες. Ως ειδικές περιπτώσεις μπορούν να αναφερθούν οι ακόλουθες (μαζί με παραδείγματα διαδικασιών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευσή τους): αζωχρώματα και διαζωενώσεις (3) (5) (6) (13), αέρια και πτητικές ουσίες (12) (14) (15) (16) και γλυκοζίτες (17) (18). Τυχόν παρέκκλιση από την τυποποιημένη διαδικασία πρέπει να αιτιολογείται επιστημονικώς.
1.5. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ
1.5.
1.5.1. Προετοιμασίες
1.5.1.
1.5.1.1. Βακτήρια Πρόσφατες καλλιέργειες βακτηρίων θα πρέπει να αφήνονται να αναπτυχθούν μέχρι το τελευταίο στάδιο της εκθετικής ή το πρώιμο στάδιο της στατικής φάσης αναπτύξεως (περίπου 109 κύτταρα ανά ml). Δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται καλλιέργειες που βρίσκονται στο τελευταίο στάδιο της στατικής φάσης. Παίζει σημαντικό ρόλο οι χρησιμοποιούμενες καλλιέργειες να εμφανίζουν υψηλό τίτλο βιώσιμων βακτηρίων. Ο τίτλος μπορεί να βρεθεί είτε από προϋπάρχοντα στοιχεία για τις καμπύλες αύξησης, είτε σε κάθε δοκιμή με τον προσδιορισμό του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων με δοκιμή σε τρυβλίο. Η συνιστώμενη θερμοκρασία επωάσεως είναι 37 oC. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται πέντε τουλάχιστον στελέχη βακτηρίων. Σε αυτά θα πρέπει να περιλαμβάνονται τέσσερα στελέχη .8. typhimurium (ΤΑ 1535, ΤΑ 1537 ή TA97a ή ΤΑ97, ΤΑ98 και ΤA100) που έχει αποδειχθεί ότι είναι αξιόπιστα και παρέχουν αναπαραγώγιμες αποκρίσεις μεταξύ εργαστηρίων. Τα τέσσερα αυτά στελέχη S. typhimurium έχουν GC ζεύγη βάσεων στην πρωταρχική θέση αναστροφής και είναι γνωστό ότι δεν μπορούν να εντοπίσουν ορισμένα οξειδωτικά μεταλλαξιγόνα, παράγοντες σταυροειδούς σύνδεσης και υδραζίνες. Οι ουσίες αυτές μπορούν να ανιχνευθούν με στελέχη Ε. coli WP2 ή S. typhimurium ΤΑ102 (19) που έχουν ένα ζεύγος βάσεων ΑΤ στην πρωταρχική θέση αναστροφής. Συνεπώς, ο συνιστώμενος συνδυασμός στελεχών είναι: Για να ανιχνευθούν μεταλλαξιγόνα σταυροειδούς σύνδεσης μπορεί να είναι σκόπιμο να περιληφθεί ΤΑ102 ή να προστεθεί ένα ειδικό για την επιδιόρθρωση DNA στέλεχος Ε. coli [π.χ. Ε. coli YVP2 ή Ε. coli WP2 (pKM101)]. Για την παρασκευή έτοιμων καλλιεργειών, την επαλήθευση ιχνηθετών και την αποθήκευση θα πρέπει να χρησιμοποιούνται καθιερωμένες διαδικασίες. Για κάθε κατεψυγμένο παρασκεύασμα έτοιμης καλλιέργειας θα πρέπει να καταδεικνύεται ότι απαιτεί αμινοξύ για να αναπτυχθεί (ιστιδΐνη για στελέχη S. typhimurium και θρυπτοφάνη για στελέχη Ε. coli). Θα πρέπει ομοίως να ελέγχονται προς επιβεβαίωση και άλλα ψαινοτυπικά χαρακτηριστικά, συγκεκριμένα: η παρουσία ή απουσία πλασμιδίων R-παράγοντα όπου χρειάζεται [δηλαδή αντίσταση αμπικιλλίνης σε στελέχη ΤΑ98, ΤΑ 100 και TA97a ή ΤΑ97, VVP2 uvrA και WP2 uvrA (pKM101), και αντίσταση αμπικιλλίνης + τετρακυκλίνης σε στέλεχος ΤΑ 102], η παρουσία χαρακτηριστικών μεταλλάξεων (δηλαδή rfa μετάλλαξη σε S. typhimurium μέσω της ευαισθησίας σε κρυσταλλικό ιώδες και uvrΑμετάλλαξη σε Ε. coli ή uvrB μετάλλαξη σε S. typhimurium μέσω της ευαισθησίας σε υπεριώδες φως} (2} (3}. Τα στελέχη θα πρέπει επίσης να δίνουν έναν αριθμό αυθόρμητων ανάστροφων αποικιών σε τρυβλίο που να πέφτει μέσα στις περιοχές συχνοτήτων που αναμένονται από τα προϋπάρχοντα εργαστηριακά δεδομένα, και κατά προτίμηση, μέσα στην περιοχή που αναφέρεται στη βιβλιογραφία.
S. typhimurium TA153 5 και
S. typhimurium TA1537 ή ΤΑ97 ή TA97a και
S. typhimurium TA98 και
S. typhimurium TA100 και
Ε. coli WP2 uvrA ή Ε. coli WP2 uvrA (pKM 101) ή S. typhimurium ΤA102.
1.5.1.2. Θρεπτικό μέσο Χρησιμοποιείται κατάλληλο ελάχιστο άγαρ (π.χ. άγαρ που περιέχει ελάχιστο μέσο Ε Vogel-Bonner και γλυκόζη) και άγαρ επίστρωσης που περιέχει ιστιδίνη και βιοτίνη ή τρυπτοφάνη για να μπορούν να γίνουν μερικές κυτταρικές διαιρέσεις (1) (2) (9).
1.5.1.3. Μεταβολική ενεργοποίηση Τα βακτήρια θα πρέπει να εκτίθενται στην υπό δοκιμή ουσία παρουσία και απουσία κατάλληλου συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης. Το συνηθέστερα χρησιμοποιούμενο σύστημα είναι ένα μεταμιτοχονδριακό κλάσμα εμπλουτισμένο με συμπαράγοντα (S9) που παρασκευάζεται από το ήπαρ τρωκτικών που έχει υποβληθεί σε κατεργασία με ενζυμοεπαγωγικούς παράγοντες όπως το Aroclor 1254 (1) (2) ή μείγμα φαινοβαρβιτόνης και β-ναφθοφλαβόνης (18) (20) (21). Το μεταμιτοχονδριακό κλάσμα χρησιμοποιείται συνήθως σε συγκεντρώσεις της τάξεως του 5 έως 30 % ν/ν στο S9—μείγμα. Η επιλογή και κατάσταση ενός συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης μπορεί να εξαρτάται από την τάξη της υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να χρειάζεται να χρησιμοποιηθούν περισσότερες από μία συγκεντρώσεις μεταμιτοχονδριακού κλάσματος. Στην περίπτωση των αζωχρωμάτων και των αζωενώσεων, μπορεί να είναι καλύτερα να χρησιμοποιηθεί αναγωγικό σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης (6) (13).
1.5.1.4. Υπό δοκιμή ουσία/προετοιμασία Οι στερεές υπό δοκιμή ουσίες πρέπει να διαλύονται ή να τίθενται υπό μορφή εναιωρήματος σε κατάλληλους διαλύτες ή φορείς και να αραιώνονται εφόσον απαιτείται πριν από την κατεργασία των βακτηρίων. Οι υγρές ουσίες μπορούν να προστίθενται απευθείας στα συστήματα δοκιμής ή/και να αραιώνονται πριν από την κατεργασία. Πρέπει να χρησιμοποιούνται πρόσφατα παρασκευάσματα της υπό δοκιμή ουσίας εκτός κι αν τα σχετικά με τη σταθερότητα της ουσίας στοιχεία επιτρέπουν τη χρήση έτοιμων παρασκευασμάτων. Δεν πρέπει να υπάρχουν υπόνοιες για πιθανή χημική αντίδραση του διαλύτη/φορέα με την υπό δοκιμή ουσία ενώ θα πρέπει να είναι συμβατός με την επιβίωση των βακτηρίων και τη δραστικότητα S9 (22). Εφόσον ο χρησιμοποιούμενος διαλύτης/φορέας δεν ανήκει στους γνωστούς, η χρήση του θα πρέπει να στηρίζεται στην ύπαρξη στοιχείων που αποδεικνύουν τη συμβατότητά του. Συνιστάται, εφόσον είναι δυνατέ), να εξετάζεται πρώτα η χρήση ενός υδατικού διαλύτη/φορέα. Όταν εξετάζονται ουσίες που δεν είναι σταθερές στο νερό, οι χρησιμοποιούμενοι οργανικοί διαλύτες θα πρέπει να είναι απαλλαγμένοι ύδατος.
1.5.2. Συνθήκες δοκιμής
1.5.2.
1.5.2.1. Υπό δοκιμή στελέχη (βλέπε σημείο 1.5.1.1)
1.5.2.2. Συγκέντρωση εκθέσεως Μεταξύ των κριτηρίων που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη για τον καθορισμό της μέγιστης για χρήση ποσότητας υπό δοκιμή ουσίας είναι η κυτταροτοξικότητα και η διαλυτότητα στο τελικό μίγμα κατεργασίας. Μπορεί να είναι σκόπιμο να προσδιοριστεί η τοξικότητα και η δυσδιαλυτότητα με μία προκαταρκτική δοκιμή. Η κυτ-ταροτοξικότητα μπορεί να βρεθεί από τη μείωση του αριθμού των ανάστροφων αποικιών, το μηδενισμό ή την ελάττωση του υποστρώματος ή το βαθμό επιβίωσης των εξεταζομένων καλλιεργειών. Η κυτταροτοξικότητα μιας ουσίας μπορεί να μεταβληθεί παρουσία συστημάτων μεταβολικής ενεργοποίησης. Η δυσδιαλυτότητα θα πρέπει να εκτιμάται με βάση την πτώση ιζήματος στο τελικό μίγμα υπό τις πραγματικές συνθήκες δοκιμής που είναι εμφανής με γυμνό οφθαλμό. Η συνιστώμενη μέγιστη συγκέντρωση δοκιμής για διαλυτές μη κυτταροτοξικές ουσίες είναι 5 mg/τρυβλίο ή 5 ml/τρυβλίο. Για μη κυτταροτοξικές ουσίες που δεν είναι διαλυτές σε επίπεδα συγκεντρώσεως 5 mg/τρυβλίο ή 5 ml/τρυβλίο, μία ή περισσότερες από τις χρησιμοποιούμενες στη δοκιμή συγκεντρώσεις θα πρέπει να καθιστούν την ουσία αδιάλυτη στο τελικό μίγμα κατεργασίας. Οι υπό δοκιμή ουσίες που είναι κυτταροτοξικές ήδη από επίπεδα συγκεντρώσεως κάτω των 5 mg/τρυβλίο ή 5 ml/τρυβλίο θα πρέπει να υποβάλλονται στη δοκιμή μέχρι του επιπέδου της κυτταροτοξικής συγκέντρωσης. Το ίζημα δεν θα πρέπει να παρεμβαίνει στην εκτίμηση. Στα αρχικά πειράματα θα πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον πέντε διαφορετικές αναλώσιμες συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή ουσίας με ημιλογαριθμικά περίπου διαστήματα (δηλαδή 10) μεταξύ των σημείων δοκιμής. Όταν διερευνάται η σχέση συγκέντρωσης/απόκρισης, μπορεί να είναι σκόπιμο να χρησιμοποιηθούν μικρότερα διαστήματα. Όταν αξιολογούνται ουσίες που περιέχουν σημαντικές ποσότητες δυνητικά μεταλλαξιγόνων προσμείξεων, μπορεί να εξεταστεί και η διενέργεια δοκιμής σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από τα 5 mg/τρυβλίο ή 5 ml/τρυβλίο.
1.5.2.3. Αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες Σε κάθε δοκιμή θα πρέπει να περιλαμβάνονται παράλληλα και καλλιέργειες με εξειδικευμένους για το στέλεχος θετικούς και αρνητικούς (διαλύτης ή φορέας) μάρτυρες. Θα πρέπει να επιλέγονται συγκεντρώσεις θετικών μαρτύρων που αποδεικνύουν την αποτελεσματικότητα κάθε δοκιμής. Σε δοκιμές στις οποίες χρησιμοποιείται σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης, ο ή οι θετικοί μάρτυρες αναφοράς θα πρέπει να επιλέγονται με βάση το είδος των χρησιμοποιουμένων βακτηριακών στελεχών. Παραδείγματα κατάλληλων θετικών μαρτύρων για δοκιμές με μεταβολική ενεργοποίηση αποτελούν οι παρακάτω ουσίες: Ουσια Αριθ. CAS Αριθ. EINECS 9,10-διμεθυλανθρακένιο 781-43-1 212-308-4 7,12-διμεθυλοβενζ[α]ανθρακένιο 57-97-6 200-359-5 βενζο[α]πυρένιο 50-32-8 200-028-5 2-αμινοανθρακένιο 613-13-8 210-330-9 Κυκλοφωσφαμίδιο 50-18-0 200-015-4 Μονοένυδρο κυκλοφωσφαμίδιο 6055-19-2 Η ακόλουθη ουσία είναι ένας κατάλληλος Οπτικός μάρτυρας για τη μέθοδο αναγωγικής μεταβολικής ενεργοποίησης: Ουσία Αριθ. CAS Αριθ. EINECS Ερυθρό του Κονγκό 573-58-0 209-358-4 Το 2-αμινοανθρακένιο δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται ως αποκλειστικός δείκτης της αποτελεσματικότητας του S9-Μείγματος. Εάν χρησιμοποιηθεί 2-αμινοανθρακένιο, κάθε παρτίδα S9 θα πρέπει να χαρακτηρίζεται και με ένα μεταλλαξιγόνο που απαιτεί μεταβολική ενεργοποίηση από μικροσωμικά ένζυμα, π.χ. βενζο[α]πυρένιο, διμεθυλοβενζανθρακένιο. Οι ουσίες που ακολουθούν αποτελούν παραδείγματα εξειδικευμένων κατά στέλεχος θετικών μαρτύρων για δοκιμές που εκτελούνται χωρίς εξωγενές σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης: Ουσία Aρiθ. CAS Αριθ. EINECS Στέλεχος Αζίδιο του νατρίου 26628-22-8 247-852-1 ΤΑ 1535 και ΤΑ 100 2-νιτροφθορένιο 607-57-8 210-138-5 ΤΑ 98 9-αμινοακριδίνη 90-45-9 201-995-6 ΤΑ 1537, ΤΑ 97 και ΤΑ 97a ICR 191 17070-45-0 241-129-4 ΤΑ 1537, ΤΑ 97 και ΤΑ 97a Υδροπεροξείδιο του κουμενίου 80-15-9 201-254-7 ΤΑ 102 Μιτομυκίνη C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA και ΤΑ 102 Ν-αιθυλο-Ν-νιτρο-Ν-νιτροζογουανιδίνη 70-25-7 200-730-1 YVP2, \VP2uvrA και WP2uvrA(pKM101) 4-νιτροκινολιν-1 -οξείδιο 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2uvrA και WP2uvrA(pKM101) Φουρυλοφουραμίδιο (AF2) 3688-53-7 Στελέχη περιέχονται πλασμίδιο Ως θετικοί μάρτυρες μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες κατάλληλες ουσίες αναφοράς. Εφόσον υπάρχουν, θα πρέπει να εξετάζεται η δυνατότητα χρήσης ως θετικών μαρτύρων ουσιών σχετικής χημικής τάξης. Θα πρέπει να περιλαμβάνονται και αρνητικοί μάρτυρες, αποτελούμενοι από μόνο τον διαλύτη ή φορέα στο μέσο, χωρίς την υπό δοκιμή ουσία, και υποβαλλόμενοι στην ίδια κατεργασία με εκείνη των υπό δοκιμή καλλιεργειών, Επιπλέον, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται και μη υποβληθέντες σε κατεργασία μάρτυρες εκτός αν υπάρχουν πρότερα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι ο επιλεγείς διαλύτης δεν επιφέρει επιβλαβή ή μεταλλαξιγόνα αποτελέσματα.
1.3.3. Διαδικασία Στη μέθοδο της προσθήκης σε τρυβλίο (1) (2) (3) (4), χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση, αναμειγνύονται συνήθως 0,05 ml ή 0,1 ml των διαλυμάτων δοκιμής, 0,1 ml πρόσφατης βακτηριακής καλλιέργειας (που περιέχει περίπου 108 βιώσιμα κύτταρα) και 0,5 ml στείρου ρυθμιστικού διαλύματος με 2,0 ml άγαρ επιστρώσεως. Στη δοκιμή με μεταβολική ενεργοποίηση, αναμειγνύονται συνήθως 0,5 ml μίγματος μεταβολικής ενεργοποίησης που περιέχει κατάλληλη ποσότητα μεταμιτοχονδριακού κλάσματος (της τάξεως του 5 έως 30 % ν/ν στο μείγμα μεταβολικής ενεργοποίησης) με το άγαρ επιστρώσεως (2,0 ml), μαζί με τα βακτήρια και την ουσία δοκιμής/διάλυμα δοκιμής. Το περιεχόμενο κάθε σωλήνα ανακατεύεται και φέρεται στην επιφάνεια τρυβλίου με ελάχιστο άγαρ. Το άγαρ επιστρώσεως αφήνεται να στερεοποιηθεί πριν από την επώαση. Στη μέθοδο της προεπωάσεως (2) (3) (5) (6), η ουσία δοκιμής/διάλυμα δοκιμής προεπωάζεται με το υπό δοκιμή στέλεχος (που περιέχει περίπου 108 βιώσιμα κύτταρα) και στείρο ρυθμιστικό διάλυμα ή το σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης (0,5 ml) συνήθως για 20 λεπτά ή και περισσότερο στους 30-37 oC πριν να αναμειχθεί με το άγαρ επιστρώσεως και να επιστρωθεί στην επιφάνεια τρυβλίου με ελάχιστο άγαρ. Συνήθως, 0,05 ή 0,1 ml της υπό δοκιμή ουσίας/διαλύματος δοκιμής, 0,1 ml βακτηρίων και 0,5 ml S9-μείγματος ή στείρου ρυθμιστικού αναμειγνύονται με 2,0 ml άγαρ επιστρώσεως. Οι σωλήνες, κατά τη διάρκεια της προεπώασης, θα πρέπει να αερίζονται με τη χρήση αναταρακτη. Για τη σωστή εκτίμηση της διακύμανσης, σε κάθε επίπεδο δύσεως θα πρέπει να χρησιμοποιείται τριπλή επίστρωση. Εφόσον αιτιολογείται επιστημονικώς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και διπλή επίστρωση. Τυχαία απώλεια τρυβλίου δεν καθιστά κατ' ανάγκη άκυρη τη δοκιμή. Αέριες ή πτητικές ουσίες θα πρέπει να υποβάλλονται σε δοκιμή με κατάλληλες μεθόδους, όπως π.χ. σε σφραγισμένα δοχεία (12) (14) (15) (16).
1.5.4. Επώαση Όλα τα τρυβλία σε μία δεδομένη δοκιμή 9α πρέπει να επωάζονται στους 37 oC για 48-72 ώρες. Μετά την περίοδο επώασης, μετράται ο αριθμός των ανάστροφων αποικιών ανά τρυβλίο.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ
2.
2.1. ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜAΤΩΝ Τα δεδομένα θα πρέπει να παρουσιάζονται ως ο αριθμός των ανάστροφων αποικιών ανά τρυβλίο. Θα πρέπει επίσης να δίνεται και ο αριθμός των ανάστροφων αποικιών στα τρυβλία που χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός (διαλύτης-μάρτυρας και μη υποβληθείς σε κατεργασία μάρτυρας, εφόσον χρησιμοποιείται) και θετικός μάρτυρας. Για την υπό δοκιμή ουσία καθώς και για το θετικό και αρνητικό (μη κατεργασθείς ή/και διαλύτης) μάρτυρα θα πρέπει να δίνονται στοιχεία με τους επιμέρους κατά τρυβλίο αριθμούς, το μέσο αριθμό των ανάστροφων αποικιών ανά τρυβλίο και την τυπική απόκλιση. Δεν απαιτείται επαλήθευση των σαφών θετικών αποκρίσεων. Τυχόν διφορούμενα αποτελέσματα θα πρέπει να αποσαφηνίζονται με περαιτέρω δοκιμές τροποποιώντας κατά προτίμηση τις πειραματικές συνθήκες. Τα αρνητικά αποτελέσματα πρέπει να επιβεβαιώνονται κατά περίπτωση. Στις περιπτώσεις όπου δεν θεωρείται αναγκαία η επιβεβαίωση των αρνητικών αποτελεσμάτων, θα πρέπει να παρέχεται σχετική αιτιολόγηση. Στα επαναληπτικά πειράματα θα πρέπει να εξετάζεται η τροποποίηση των παραμέτρων της δοκιμής ώστε να καλύπτουν όλη την έκταση των εκτιμώμενων συνθηκών. Στις παραμέτρους που μπορούν να τροποποιηθούν περιλαμβάνεται το εύρος της συγκέντρωσης, η μέθοδος κατεργασίας (προσθήκη σε τρυβλίο ή προεπώαση σε υγρό περιβάλλον) και οι συνθήκες μεταβολικής ενεργοποίησης.
2.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Για να θεωρηθεί ένα αποτέλεσμα ως θετικό εφαρμόζονται διάφορα κριτήρια όπως η σχετιζόμενη με την συγκέντρωση αύξηση στην περιοχή δοκιμής ή/και μία αναπαραγώγιμη αύξηση υπό μία ή περισσότερες συγκεντρώσεις στον αριθμό των ανάστροφων αποικιών ανά τρυβλίο σε ένα τουλάχιστον στέλεχος με ή χωρίς σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης (23). Θα πρέπει να εξετάζεται πρώτα η βιολογική σχετικότητα των αποτελεσμάτων. Ως βοήθημα στην αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των δοκιμών μπορούν να χρησιμοποιούνται και στατιστικές μέθοδοι (24). Εντούτοις, σε μία θετική απόκριση δεν θα πρέπει ως μοναδικός αποφασιστικός παράγοντας να λαμβάνεται η στατιστική σημαντικότητα. Εφόσον τα αποτελέσματα για μία υπό δοκιμή ουσία δεν πληρούν τα ανωτέρω κριτήρια, η ουσία αυτή θεωρείται ως μη μεταλλαξιγόνος στο σύστημα αυτό. Αν και τα περισσότερα πειράματα θα δίνουν σαφώς θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα, σε σπάνιες περιπτώσεις τα δεδομένα ενδέχεται να μην επιτρέπουν την εξαγωγή οριστικού συμπεράσματος σχετικά με τη δραστικότητα της υπό δοκιμή ουσίας. Τα αποτελέσματα μπορεί να παραμένουν διφορούμενα ή αμφισβητήσιμα άσχετα με το πόσες φορές θα επαναληφθεί το πείραμα. Θετικά αποτελέσματα από τη δοκιμή βακτηριακής ανάστροφης μετάλλαξης δείχνουν ότι η υπό δοκιμή ουσία επάγει σημειακές μεταλλάξεις με υποκαταστάσεις βάσεων ή αλλαγές πλαισίου στο γονιδίωμα της Salmonella typhimurium ή/και Escherichia coli. Αρνητικά αποτελέσματα δείχνουν ότι, υπό τις συνθήκες της δοκιμής, η υπό δοκιμή ουσία δεν είναι μεταλλαξιγόνος στο εξεταζόμενο είδος.
3. ΕΚΘΕΣΗ ΑΝΑΦΟΡΑΣ
3. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ
Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία:
Διαλύτης/φορέας:
αιτιολόγηση της επιλογής του διαλύτη/φορέα,
διαλυτότητα και σταθερότητα της υπό δοκιμή ουσίας στο διαλύτη/φορέα, εφόσον είναι γνωστές.
Στελέχη:
χρησιμοποιηθέντα στελέχη,
αριθμός κυττάρων ανά καλλιέργεια,
χαρακτηριστικά των στελεχών.
Συνθήκες δοκιμής:
ποσότητα της υπό δοκιμή ουσίας ανά τρυβλίο (mg/τρυβλίο ή μl/τρυβλίο) με αιτιολόγηση της επιλογής της δόσεως και του αριθμού των τρυβλίων ανά συγκέντρωση,
χρησιμοποιηθέν θρεπτικό μέσο,
τύπος και σύσταση του συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης, συμπεριλαμβανομένων και των κριτηρίων αποδοχής,
διαδικασίες κατεργασίας.
Αποτελέσματα:
σημάδια τοξικότητας.
σημάδια καθίζησης,
επιμέρους κατά τρυβλίο αποτελέσματα μετρήσεων,
μέσος αριθμός των ανάστροφων άποικων ανά τρυβλίο και τυπική απόκλιση,
σχέση δόσης-απόκρισης, όπου είναι δυνατό,
στατιστικές αναλύσεις, εφόσον υπάρχουν,
παράλληλα στοιχεία για τους αρνητικούς (διαλύτης/φορέας) και θετικούς μάρτυρες, με ευρη, μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις,
Προϋπάρχοντα στοιχεία για τους αρνητικούς (διαλύτης/φορέας) και θετικούς μάρτυρες, με εύρη, μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις.
Εξέταση των αποτελεσμάτων.
Συμπεράσματα.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Ames, Β. Ν., McCann,]. and Yamasaki E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsomc Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L, Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233. Kier, L. D., Brusick, D.)., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann,]., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mam-malian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res.. 168, pp. 69-240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters. 1. pp. 91-96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Nor-poth K. H. and Garner, R. C., Springer. Bertin-Heidclberg-Ncw York, pp. 273-285. Gatehouse. D. G., Rowland, 1. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutageniciry Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D.). Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61. Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8. pp. 167-1 7 7. Green, Μ. Η. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutations Res., 38, pp. 33-42. Hubbard, S. Α., Green, M. H. L, Gatehouse, D. and J. W. Bridges (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures , 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161. Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453-465. Araki, Α., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335-344. Prival, M.)., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47. Zeiger, E., Anderson B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141. Simmon, V., Kauhanen K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258. Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, 1. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis. 9, pp. 421-441. Matsushima, T., Matsumoto, Α., Shirai, M., Sawamura, M. and Sugimura T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salomonella typhimurium. Cancer Res., 39, pp. 3780-3782. Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, Β. Ν. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965. Wilcox, P., Naidoo, Α., Wedd, D.). and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285-291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88. Elliot. B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Tatehouse, D, G., Gibson, G. G., Mackay,). M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, Β. Ν. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350. Claxton. L. D., Allen J., Auletta, Α., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91. Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part Π. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D.)., Cambridge University Press, pp. 28-65.
Β.15. ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ — SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Β.15.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Καμία.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Μια ποικιλία απλοειδών και διπλοειδών στελεχών του μύκη Saccharomyccs cercvisiac μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση της παραγωγής των μεταλλάξεων γονιδίων που προκαλούνται με χημικά μέσα, με μεταβολική ενεργοποίηση και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση. Έχουν χρησιμοποιηθεί συστήματα πρόσω μετάλλαξης σε απλοειδή στελέχη, όπως είναι η μέτρηση της μετάλλαξης από ερυθρά μεταλλαχθέντα στελέχη που απαιτούν αδενίνη (ade-l, ade-2), σε λευκά μεταλλαχθέντα στελέχη που απαιτούν διπλή αδενίνη καθώς και επιλεκτικά συστήματα, όπως είναι η επαγωγή αντίστασης σε καναβανίνη και κυκλοεξιμίδιο. Το ευρύτερα επιβεβαιωμένο σύστημα αντίστροφης μετάλλαξης περιλαμβάνει χρήση του απλοειδούς στελέχους XV 185-14 C, το οποίο μεταφέρει τις ασυνθετικές μεταλλάξεις ochre-ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 και lrp 5-48, που είναι αντιστρέψιμες από μεταλλαξιογόνα υποκατάστασης βάσης, τα οποία προκαλούν ειδικές μεταλλάξεις θέσεων ή μεταλλάξεις αναστολέα ώχρας. Το XV 185-14 C φέρει επίσης τον δείκτη his 1-7, μία δυσυνθετική μετάλλαξη που ανιστρέφεται κυρίως από μεταλλάξεις δεύτερης θέσης, και τον δείκτη horn 3-10, ο οποίος αντιστρέφεται από μεταλλαξιογόνα μετατόπισης πλαισίου. Στα διπλοειδή στελέχη του Saccharomyces cεrevisiac, το μόνο ευρέως χρησιμοποιούμενο στέλεχος είναι το D7, το οποίο είναι ομόζυγο ως προς το ilv 1-92.
1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Κανένα.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ
1.6. Προετοιμασία
Πρέπει να παρασκευαστούν διαλύματα των δοκιμαζόμενων χημικών ουσιών και των ουσιών ελέγχου ή αναφοράς λίγο πριν από τη δοκιμασία, με τη χρήση κατάλληλου φορέα. Για υδρόφωβες οργανικές ενώσεις πρέπει να χρησιμοποιηθεί διάλυμα μέχρι 2 % κατ' όγκο σε οργανικούς διαλύτες όπως η αιθανόλη, η ακετόνη και το διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO).
Μεταβολική ενεργοποίηση
Τα κύτταρα πρέπει να εκτεθούν στις δοκιμαζόμενες χημικές ουσίες, τόσα με όσο και χωρίς κατάλληλο σύστημα εξωγενούς μεταβολικής ενεργοποίησης. Το περισσότερο χρησιμοποιούμενο σύστημα είναι ένα συνεργό μεταμιτοχονδριακό κλάσμα από το ήπαρ τρωκτικών που έχουν υποστεί προηγούμενα αγωγή με παράγοντες που επάγουν ένζυμα. Η χρήση άλλων ειδών, οργανισμών, ιστών, μεταμιτοχονδριακών κλασμάτων ή διαδικασιών μπορεί επίσης να είναι κατάλληλη για μεταβολική ενεργοποίηση.
Συνθήκες δοκιμασίας
Στελέχη δοκιμασιών
Το απλοειδές στέλεχος XV 185-14 C και το διπλοειδές στέλεχος D7 είναι τα στελέχη που χρησιμοποιούνται περισσότερο σε μελέτες σημειακής μετάλλαξης. Άλλα στελέχη μπορούν επίσης να είναι κατάλληλα.
Μέσον καλλιέργειας
Προσφυές μέσον καλλιέργειας χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της επιβίωσης κυττάρων και του αριθμού των μεταλλαχθέντων στελεχών.
Χρήση αρνητικών και θετικών ελέγχων
Εκτελούνται συγχρόνως με τη δοκιμασία θετικοί έλεγχοι, έλεγχοι χωρίς προηγούμενη αγωγή και έλεγχοι διαλυτών, Χρησιμοποιούνται κατάλληλες χημικές ουσίες θετικού ελέγχου για κάθε ειδικό τελικό σημείο μετάλλαξης.
Συγκέντρωση έκθεσης
Χρησιμοποιούνται πέντε τουλάχιστον κατάλληλα κατανεμημένες συγκεντρώσεις της δοκιμαζόμενης ουσίας. Για τοξικές ουσίες, η υψηλότερη δοκιμαζόμενη συγκέντρωση δεν πρέπει να μειώνει την επιβίωση κάτω από 5 έως 10 %. Οι σχετικά μη υδατοδιαλυτές ουσίες δοκιμάζονται μέχρι το όριο διαλυτότητάς τους, με τη χρήση κατάλληλων διαδικασιών. Για τις πολύ υδατοδιαλυτές μη τοξικές ουσίες, η ανώτερη συγκέντρωση καθορίζεται κατά περίπτωση.
Συνθήκες επώασης
Οι καλλιέργειες μέσα σε αγάρ αγάρ σε τριβλίο επωάζονται τέσσερις έως επτά ημέρες σε θερμοκρασία 28 έως 30 oC σε συνθήκες σκότους.
Συχνότητες αυθόρμητης μετάλλαξης
Πρέπει να χρησιμοποιούνται υποκαλλιέργειες με συχνότητες αυθόρμητης μετάλλαξης μέσα στα αποδεκτά κανονικά πλαίσια.
Αριθμός επαναλήψεων
Τρεις τουλάχιστον διπλές καλλιέργειες πρέπει να χρησιμοποιούνται για κάθε συγκέντρωση για τη δοκιμασία των πρωτοτροφικών στελεχών που παράγονται από τη μετάλλαξη γονιδίων και για τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Στην περίπτωση πειραμάτων με τη χρήση δεικτών, όπως είναι ο horn 3-10 με χαμηλό ρυθμό μετάλλαξης, ο αριθμός των χρησιμοποιούμενων καλλιεργειών μέσα σε αγάρ αγάρ σε τριβλίο πρέπει να αυξηθεί για να δώσει αποτελέσματα σημαντικά από στατιστική άποψη.
Διαδικασία
Η κατεργασία των στελεχών του Saccharomyces cerevisiae γίνεται συνήθως με διαδικασία υγρού θρεπτικού υλικού που περιλαμβάνει στάσιμα ή βλαστάνοντα κύτταρα. Προκαταρκτικά πειράματα πρέπει να γίνονται σε βλαστάνοντα κύτταρα: 1 - 5 × 107 κύτταρα/ml εκτίθενται στη δοκιμαζόμενη χημική ουσία μέχρι 18 ώρες σε θερμοκρασία 28 έως 37 oC, με ανάδευση. Προστίθεται επαρκής ποσότητα μικροσωμικού κλάσματος κατά τη διάρκεια της κατεργασίας, όταν επιβάλλεται. Στο τέλος της κατεργασίας, τα κύτταρα φυγοκεντρούνται, πλένονται και εμφυτεύονται σε κατάλληλο υλικό καλλιέργειας. Μετά την επώαση, οι καλλιέργειες μέσα σε αγάρ αγάρ σε τριβλίο καταμετρούνται για τον προσδιορισμό της επιβίωση και της προκληθείσης μετάλλαξη γονιδίων. Εάν το πρώτο πείραμα είναι αρνητικό, ένα δεύτερο πείραμα πρέπει να γίνει με κύτταρα στάσιμα. Εάν το πρώτο πείραμα είναι θετικό αυτό πρέπει να επιβεβαιωθεί σ ένα κατάλληλο ανεξάρτητο πείραμα.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Τα δεδομένα πρέπει να παρουσιάζονται με μορφή πίνακα που δίνει τον αριθμό των αποικιών που καταμετρήθηκαν, τον αριθμό των μεταλλαχθέντων στελεχών, την επιβίωση και τη συχνότητα των μεταλλαχθέντων στελεχών. Όλα τα αποτελέσματα πρέπει να επιβεβαιωνονται με ένα ανεξάρτητο πείραμα. Τα δεδομένα πρέπει να εκτιμούνται με τη χρήση κατάλληλων στατιστικών μεθόδων.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Η έκθεση της δοκιμασίας πρέπει να περιλαμβάνει τις παρακάτω πληροφορίες:
στέλεχος που χρησιμοποιήθηκε,
συνθήκες δοκιμασίας: κύτταρα σε στάσιμη φάση ή σε βλάστηση, σύνθεση του μέσου καλλιέργειας, θερμοκρασία και διάρκεια επώασης, συστήματα μεταβολικής ενεργοποίησης,
συνθήκες αγωγής: επίπεδα έκθεσης, διαδικασία και διάρκεια αγωγής, θερμοκρασία αγωγής, θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι,
αριθμός των αποικιών που καταμετρήθηκαν, αριθμός μεταλλαχθέντων στελεχών, επιβίωση και συχνότητα μεταλλαχθέντων στελεχών, σχέση δόσης/αποτελέσματος, αν μπορεί να εφαρμοστεί, στατιστική εκτίμηση των δεδομένων,
συζήτηση των αποτελεσμάτων,
ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
4. ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
Β.16. ΜΙΤΩΤΙΚΟΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ — SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Β.16.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β,
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Καμία.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Ο μιτωτικός ανασυνδυασμάς στον Saccharomyces cerevisiae μπορεί να ανιχνευθεί ανάμεσα στα γονίδια (ή συνηθέστερα ανάμεσα σε ένα γονίδιο κατ το κεντρομερίδιό του) καθώς Επίσης και μέσα στα γονίδια. Το πρώτο φαινόμενο καλείται μιτωτικός επιχιασμός και παράγει αντίστοιχα προϊόντα, ενώ το τελευταίο είναι συχνότερα μη αντίστοιχο και καλείται μεταστροφή γονιδίων. Ο επιχιασμός δοκιμάζεται συνήθως με την παραγωγή υπολειπομένων ομοζυγων αποικιών ή τομέων που παράγονται σε ένα ετερόζυγο στέλεχος, ενώ η μεταστροφή γονιδίων δοκιμάζεται με την παραγωγή πρωτοτροφικών αναστροφέων που παράγονται σε ένα αυζατροπικό ετεροαλληλο-μορφικό στέλεχος που φέρει δύο διαφορετικά ελαττωματικά αλληλόμορφα του ίδιου γονιδίου. Τα περισσότερο χρησιμοποιούμενα στελέχη για την ανίχνευση της μιτωτικής μεταστροφής γονιδίων είναιτα D4 (ετεροαλληλόμορφα σε ade 2 και trp 5), το D7 (ετεροαλληλόμορφα σε trp 5) και το JD 1 (ετεροαλληλόμορφα σε his 4 και trp 5) και το ΒΖ3 4 (ετεροαλληλόμορφα, σε arg 4). Ο μιτωτικός επιχιασμός που παράγει ερυθρούς και ροδόχρους ομόζυγους τομείς μπορεί να δοκιμαστεί στο D1 ή στο D7 (το οποίο επίσης μετρά την μιτωτική μετατροπή γονιδίων και την αντίστροφη μετάλλαξη σε ilv 1-92), Και τα δύο στελέχη στην περίπτωση αυτή είναι ετεροαλληλόμορφα ως προς συμπληρωματικά αλληλόμορφα του ade 2.
1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Κανένα.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ
1.6. Προετοιμασία
Τα διαλύματα των δοκιμαζόμενων χημικών ουσιών και των μαρτύρων ή ουσιών ελέγχου και αναφοράς πρέπει να παρασκευάζονται λίγο πριν από τη δοκιμασία, με τη χρήση κατάλληλου φορέα. Για υδρόφοβες οργανικές ενώσεις πρέπει να χρησιμοποιείται διάλυμα μέχρι 2 % κατ' όγκο σε οργανικούς διαλύτες, όπως η αιθανόλη, η ακετόνη και το δίμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO).
Μεταβολική ενεργοποίηση
Τα κύτταρα εκτίθενται στις δοκιμαζόμενες χημικές ουσίες, τόσο με όσο και χωρίς κατάλληλο σύστημα εξωγενούς μεταβολικής ενεργοποίησης. Το περισσότερο χρησιμοποιούμενο σύστημα είναι ένα συνεργό μεταμιτοχονδριακό κλάσμα από το ήπαρ τρωκτικών που έχουν υποστεί προηγούμενη αγωγή με παράγοντες που επάγουν ένζυμα, Η χρήση άλλων ειδών οργανισμών, ιστών, μεταμιτοχονδριακών κλασμάτων ή διαδικασιών μπορεί επίσης να είναι κατάλληλη για μεταβολική ενεργοποίηση.
Συνθήκες δοκιμασίας
Στελέχη δοκιμασιών
Τα συχνότερα χρησιμοποιούμενα στελέχη είναι τα διπλοειδή D4, D5, D7 και JD 1. Η χρήση και άλλων στελεχών μπορεί να είναι κατάλληλη.
Μέσον καλλιέργειας
Προσφυές μέσον καλλιέργειας χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της επιβίωσης και της συχνότητας του μιτωτικού ανασυνδυασμού.
Χρήση αρνητικών και θετικών μαρτύρων
Πρέπει να εκτελούνται συγχρόνως με τη δοκιμασία θετικοί έλεγχοι, έλεγχοι χωρίς προηγούμενη αγωγή και έλεγχοι διαλυτών με μάρτυρες. Για κάθε τελικό σημείο ανασυνδυασμού πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλες χημικές ουσίες σαν θετικοί μάρτυρες.
Συγκέντρωση έκθεσης
Πρέπει να χρησιμοποιηθούν πέντε τουλάχιστον κατάλληλα κατανεμημένες συγκεντρώσεις της δοκιμαζόμενης ουσίας. Μεταξύ των παραγόντων που πρέπει να ληφθούν υπόψη είναι η κυτταροτοξικότητα και ή διαλυτότητα. Οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις δεν πρέπει να έχουν καμία επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Για τις τοξικές χημικές ουσίες, η υψηλότερη χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση δεν πρέπει να μειώνει την επιβίωση κάτω από 5 έως 10 %. Οι σχετικά μη υδατοδιαλυτές χημικές ουσίες πρέπει να δοκιμάζονται μέχρι τα όρια διαλυτότητας, με τη χρήση κατάλληλων διαδικασιών. Για τις πολύ υδατοδιαλύτές μη τοξικές χημικές ουσίες, η ανώτερη συγκέντρωση του πειράματος πρέπει να καθορίζεται κατά περίπτωση. Τα κύτταρα μπορούν να εκτίθενται σε δοκιμαζόμενες χημικές ουσίες είτε σε στάσιμη φάση είτε κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, για περιόδους μέχρι 18 ωρών. Ωστόσο, για μακρές περιόδους αγωγής, οι καλλιέργειες πρέπει να επιθεωρούνται μικροσκοπικά για τον σχηματισμό σπορίων, η παρουσία των οποίων αχρηστεύει το πείραμα.
Συνθήκες επώασης
Οι καλλιέργειες επωάζονται στο σκοτάδι επί τέσσερις έως επτά ημέρες, σε 28 έως 30 oC. Οι καλλιέργειες αυτές που χρησιμοποιούνται για τη δοκιμή των ερυθρών και ροδόχρων ομόζυγων τομέων που παράγονται από μιτωτικό επιχιασμό, πρέπει να διατηρούνται σε ψυγείο (4 oC) για μία έως δύο ημέρες πριν από την καταμέτρηση, έτσι ώστε να αναπτυχθούν οι κατάλληλες χρωματισμένες αποικίες.
Συχνότητες αυθόρμητου μιτωτικού ανασυνδυασμού
Πρέπει να χρησιμοποιούνται υποκαλλιέργειες με συχνότητες αυθόρμητου μιτωτικού ανασυνδυασμού μέσα σε αποδεκτά κανονικά πλαίσια.
Αριθμός επαναλήψεων
Ένα ελάχιστο όριο τριών επαναλήψεων μέσα σε αγάρ αγάρ σε τριβλίο πρέπει να χρησιμοποιείται ανά συγκέντρωση για το πείραμα των πρωτοτροφικών που παράγονται από μιτωτική μεταστροφή γονιδίων καθώς και για τη βιωσιμότητα. Στην περίπτωση της δοκιμασίας των υπολειπόμενων ομοζυγωτών που παράγονται από μιτωτικό επιχιασμό, ο αριθμός καλλιεργειών μέσα σε αγάρ αγάρ σε τρυβλίο πρέπει να αυξηθεί ώστε να υπάρξει ικανός αριθμός αποικιών.
Διαόικασία
Η αγωγή των στελεχών του Saccharomyces cerevisiae εκτελείται συνήθως μέσα σε υγρά με στάσιμα ή αναπτυσσόμενα κύτταρα. Προκαταρκτικά πειράματα πρέπει να γίνονται με αναπτυσσόμενα κύτταρα. 1 - 5 × 107 κύτταρα/ml εκτίθενται στη δοκιμαζόμενη χημική ουσία μέχρι 18 ώρες, σε 28 o έως 37 oC, με ανάδευση. Κατά τη διάρκεια της αγωγής προστίθεται επαρκής ποσότητα μικροσωμικού κλάσματος όταν επιβάλλεται. Κατά το τέλος της αγωγής, τα κύτταρα φυγοκεντρούνται, πλένονται και εμφυτεύονται σε κατάλληλο υλικό καλλιέργειας. Μετά την επώαση, οι καλλιέργειες μέσα σε αγάρ αγάρ καταμετρούνται για προσδιορισμό επιβίωσης και επαγωγής μιτωτικού ανασυνδυασμού. Εάν το πρώτο πείραμα είναι αρνητικό, τότε ένα δεύτερο πείραμα δρέπει να γίνει με στάσιμα κύτταρα. Εάν το πρώτο πείραμα είναι θετικό, αυτό πρέπει να επιβεβαιώνεται σε κατάλληλο ανεξάρτητο πείραμα.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Τα δεδομένα πρέπει να παρουσιάζονται με μορφή πίνακος, ο οποίος δίνει τον αριθμό των αποικιών που καταμετρήθηκαν, τον αριθμό των στελεχών ανασυνδυασμού, την επιβίωση και τη συχνότητα των στελεχών ανασυνδυασμού. Όλα τα αποτελέσματα πρέπει να επιβεβαιώνονται αν είναι δυνατό με ανεξάρτητο πείραμα. Η εκτίμηση των δεδομένων γίνεται με τη χρήση κατάλληλων στατιστικών μεθόδων.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Η έκθεση του πειράματος πρέπει να περιλαμβάνει τις παρακάτω πληροφορίες:
στέλεχος που χρησιμοποιήθηκε,
συνθήκες δοκιμασίας; κύτταρα σε στάσιμη φάση ή σε φάση ανάπτυξης, σύνθεση του μέσου καλλιέργειας, θερμοκρασία και διάρκεια επώασης, σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης,
συνθήκες αγωγής; συγκέντρωση ουσίας έκθεσης, διαδικασία και διάρκεια αγωγής, θερμοκρασία αγωγής, θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι,
Αριθμός των αποικιών που καταμετρήθηκαν, αριθμός των στελεχών ανασυνδυασμού, επιβίωση και συχνότητα ανασυνδυασμού, σχέση δράσης/αποτελέσματος, εάν μπορεί να εφαρμοστεί, στατιστική αξιολόγηση των δεδομένων,
συζήτηση των αποτελεσμάτων,
ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
4. ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
B.17. ΜΕΤΑΛΛΑΞΙΓΕΝΕΣΗ — IN VITRO ΔΟΚΙΜΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ ΣΕ ΘΗΛΑΣΤΙΚΑ
B.17.
1. ΜΕΘΟΔΟΣ Η παρούσα μέθοδος αποτελεί αντιγραφή της OECD TG 476, In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997).
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η in vitro δοκιμή κυτταρικής γονιδιακής μετάλλαξης στα θηλαστικά μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση γονιδιακών μεταλλάξεων που προκαλούνται από χημικές ουσίες. Στις κατάλληλες κυτταρικές σειρές περιλαμβάνονται L5178Υ λεμφωματικά κύτταρα ποντικού, οι CHO, CHO-AS52 και V79 σειρές κυττάρων κινέζικου κρικητού και ΤΚ6 ανθρώπινα λεμφοβλαστοειδή κύτταρα (1). Στις κυτταρικές αυτές σειρές τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα γενετικά τελικά σημεία μετρούν μετάλλαξη σε θυμιδινοκινάση (ΤΚ) και φωσφοριβοζυλοτρανσφεράση υποξανθίνης-γουα-νίνης (HPRT) καθώς και ένα διαγονίδιο φωσφοριβοζυλοτρανσφεράσης ξανθίνης-γουανίνης (XPRT). Οι δοκιμές μετάλλαξης ΤΚ, HPRT και XPRT ανιχνεύουν διάφορα φάσματα γενετικών συμβάντων. Το γεγονός ότι οι ΤΚ και XPRT βρίσκονται σε αυτοσώματα μπορεί να επιτρέψει την ανίχνευση γενετικών συμβάντων (π.χ. μεγάλες απαλείψεις) που δεν ανιχνεύονται στο γενετικό τόπο HPRT σε Χ-χρωμυσώματα (2) (3) (4) (5) (6). Στην in vitro δοκιμή κυτταρικής γονιδιακής μετάλλαξης σε θηλαστικά, μπορούν να χρησιμοποιηθούν καλλιέργειες καθιερωμένων κυτταρικών σειρών ή κυτταρικών στελεχών. Τα χρησιμοποιούμενα κύτταρα επιλέγονται με βάση την ικανότητα ανάπτυξης τους σε καλλιέργεια και τη σταθερότητα της συχνότητας αυθόρμητης μετάλλαξης. Στις δοκιμές που διεξάγονται in vitro απαιτείται εν γίνει η χρήση εξωγενούς πηγής μεταβολικής ενεργοποίησης. Το σύστημα αυτό μεταβολικής ενεργοποίησης δεν μπορεί να μιμηθεί εξ ολοκλήρου τις in vivo συνθήκες των θηλαστικών. Πρέπει να λαμβάνεται πρόνοια ώστε vu αποφεύγονται συνθήκες που μπορεί να οδηγήσουν στη λήψη αποτελεσμάτων τα οποία δεν αντιπροσωπεύουν εγγενή μεταλλαξιγένεση. Θετικά αποτελέσματα που δεν αντικατοπτρίζουν εγγενή μεταλλαξιγένεση μπορεί να προέρχονται από αλλαγές στο pH, την οσμωμοριακότητα ή υψηλά επίπεδα κυτταροτοξικότητας (7). Η παρούσα δοκιμή χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό πιθανών μεταλλαξιγόνων και καρκινογόνων στα θηλαστικά. Πολλές ενώσεις που εμφανίζονται θετικές στην παρούσα δοκιμή είναι καρκινογόνες για τα θηλαστικά. Εντούτοις, δεν υπάρχει απόλυτη συσχέτιση μεταξύ αυτής της δοκιμής και του φαινομένου της καρκινογένεσης. Η συσχέτιση εξαρτάται από τη χημική τάξη και υπάρχουν αύξουσες ενδείξεις ότι υπάρχουν καρκινογόνα που δεν ανιχνεύονται από τη δοκιμή αυτή γιατί δρουν μέσω άλλων, μη γονοτοξικών μηχανισμών ή μηχανισμών που απουσιάζουν στα βακτηριακά κύτταρα (6). Βλέπε επίσης γενική εισαγωγή μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Εξελικτική μετάλλαξη: γονιδιακή μετάλλαξη από το γονικό τύπο προς το προϊόν μετάλλαξης που προκαλεί αλλοίωση ή απώλεια της ενζυματικής δραστικότητας της λειτουργίας της κωδικοποιημένης πρωτείνης. Μεταλλαξιγόνα υποκατάστασης ζευγών βάσεων: ουσίες που προκαλούν υποκατάσταση ενός ή περισσοτέρων ζευγών βάσεων στο DNA. Μεταλλαξιγόνα αλλαγής πλαισίου: Ουσίες που προκαλούν προσθήκη ή απάλειψη ενός ή πολλών ζευγών βάσεων στο μόριο DNA. Χρόνος φαινοτυπικής έκφρασης: περίοδος κατά την οποία μη αλλοιωμένα γονιδιακά προϊόντα υφίστανται μείωση από νεωστί μεταλλαγμένα κύτταρα. Συχνότητα προϊόντων μετάλλαξης: ο αριθμός των παρατηρουμένων μεταλλαγμένων κυττάρων διά του αριθμού βιώσιμων κυττάρων. Σχετική συνολική ανάπτυξη: αύξηση του αριθμού των κυττάρων με το χρόνο σε σύγκριση με ένα κυτταρικό πληθυσμό μάρτυρα. Υπολογίζεται ως το γινόμενο της ανάπτυξης εναιωρήματος σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα επί την αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα. Σχετική ανάπτυξη εναιωρήματος: αύξηση του αριθμού των κυττάρων κατά την περίοδο έκφρασης σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα. Βιωσιμότητα: η αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης των κατεργασμένων κυττάρων στο χρόνο της επίστρωσης σε τρυβλίο υπό επιλεκτικές συνθήκες μετά την περίοδο έκφρασης. Επιβίωση: η αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης των κατεργασμένων κυττάρων όταν επιστρώνονται σε τρυβλίο στο τέλος της περιόδου κατεργασίας. Η επιβίωση εκφράζεται συνήθως σε σχέση με την επιβίωση του κυτταρικού πληθυσμού μάρτυρα.
1.3. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ Τα κύτταρα που παρουσιάζουν έλλειψη θυμιδινοκινάσης (ΤΚ) λόγω της μετάλλαξης ΤΚ+/- —> TK+/- παρουσιάζουν αντίσταση στην κυτταροτοξική επίδραση του πυριμιδινικού αναλόγου τριψθοροθυμιδίνη (TFT). Τα κύτταρα με θυμιδινοκινάση είναι ευαίσθητα στην TFT, πράγμα το οποίο εμποδίζει τον κυτταρικό μεταβολισμό και σταματάει την περαιτέρω κυτταρική διαίρεση. Έτσι, τα μεταλλαγμένα κύτταρα μπορούν να πολλαπλασιάζονται παρουσία TFT, ενώ τα κανονικά κύτταρα, τα οποία περιέχουν θυμιδινοκινάση, δεν μπορούν. Ομοίως, κύτταρα τα οποία παρουσιάζουν έλλειφη σε HPRT ή XPRT επιλέγονται επειδή παρουσιάζουν αντίσταση στην 6-θειογνουανίνη (TG) ή 8-αζαγουανίνη (AG). Εάν σε κάποια από τις δοκιμές κυτταρικής γονιδιακής μετάλλαξης σε θηλαστικά υποβάλλεται σε δοκιμή ανάλογη βάση ή ένωση σχετική με τον παράγοντα επιλογής, θα πρέπει να εξετάζονται προσεκτικά οι ιδιότητες της υπό δοκιμή ουσίας. Για παράδειγμα, θα πρέπει να διερευνάται οποιαδήποτε τυχόν υπόνοια επιλεκτικής τοξικότητας της υπό δοκιμή ουσίας έναντι των μεταλλαγμένων και μη κυττάρων. Κατά την υποβολή λοιπόν σε δοκιμή χημικών ουσιών που έχουν σχέση από πλευράς δομής με τον παράγοντα επιλογής, θα πρέπει να επιβεβαιώνεται η απόδοση του συστήματος επιλογής/παράγοντα (8). Τα υπό μορφή εναιωρήματος ή μονοστρωματικής καλλιέργειας κύτταρα εκτίθενται στην υπό δοκιμή ουσία, με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση, για κατάλληλο χρονικό διάστημα και κατόπιν φέρονται σε υποκαλλιέργειες για τον προσδιορισμό της κυτταροτοξικότητας και για να επιτραπεί η φαινοτυπική έκφραση πριν από την επιλογή των προϊόντων μετάλλαξης (9) (10) (11) (12) (13). Η κυτταροτοξικότητα προσδιορίζεται συνήθως μετρώντας τη σχετική αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης (επιβίωση) ή τη σχετική συνολική ανάπτυξη των καλλιεργειών μετά την περίοδο κατεργασίας. Οι κατεργαζόμενες καλλιέργειες διατηρούνται σε θρεπτικό μέσο για ικανό χρονικό διάστημα που είναι χαρακτηριστικό για κάθε επιλεγόμενο γενετικό τόπο και κυτταρικό τύπο, ώστε να μπορέσει να επιτευχθεί η άριστη δυνατή φαινοτυπική έκφραση των προκληθεισών μεταλλάξεων. Η συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης προσδιορίζεται ανακαλλιεργώντας γνωστούς αριθμούς κυττάρων σε θρεπτικό μέσο που περιέχει τον παράγοντα επιλογής για την ανίχνευση μεταλλαγμένων κυττάρων και σε θρεπτικό μέσο χωρίς παράγοντα επιλογής για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας κλωνοποίησης (βιωσιμότητα). Έπειτα από κατάλληλο χρόνο επωάσεως, μετρώνται οι αποικίες. Η συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης εξάγεται από τον αριθμό των μεταλλαγμένων αποικιών στο μέσο επιλογής και τον αριθμό των αποικιών σε μη επιλεκτικό μέσο.
1.4. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ
1.4.
1.4.1. Προετοιμασίες
1.4.1.
1.4.1.1. Κύτταρα Υπάρχουν διάφοροι κυτταρικοί τύποι που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη δοκιμή αυτή, στους οποίους περιλαμβάνονται υποκλώνοι των L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 ή ΤΚ6 κυττάρων. Οι κυτταρικοί τύποι που χρησιμοποιούνται στη δοκιμή αυτή θα πρέπει να έχουν αποδεδειγμένη ευαισθησία σε χημικά μεταλλαξιγόνα, υψηλή αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης και σταθερή αυθόρμητη συχνότητα προϊόντων μετάλλαξης. Τα κύτταρα θα πρέπει να ελέγχονται για τυχόν παρουσία μυκοπλάσματος και εφόσον είναι μολυσμένα να μη χρησιμοποιούνται. Η δοκιμή θα πρέπει να σχεδιάζεται έτσι ώστε να έχει προκαθορισμένη ευαισθησία και ισχύ. Ο αριθμός των κυττάρων, οι καλλιέργειες και οι συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή ουσίας 9α πρέπει να αντικατοπτρίζουν αυτές τις καθορισμένες παραμέτρους (14). Ο ελάχιστος αριθμός βιώσιμων κυττάρων που επιζούν της κατεργασίας και χρησιμοποιούνται σε κάθε στάδιο της δοκιμής θα πρέπει να βασίζεται στη συχνότητα αυθόρμητης μετάλλαξης. Ένας γενικός κανόνας είναι να χρησιμοποιείται αριθμός κυττάρων που να είναι τουλάχιστον δεκαπλάσιος του αντιστρόφου της συχνότητας αυθόρμητης μετάλλαξης. Συνιστάται πάντως να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 106 κύτταρα. Θα πρέπει να υπάρχει ιστορικό κατάλληλων στοιχείων για το χρησιμοποιούμενο κυτταρικό σύστημα που να αποδεικνύει τη συνεπή αποδοτικότητα της δοκιμής.
1.4.1.2. Θρεπτικά μέσα και συνθήκες καλλιέργειας Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλα μέσα καλλιέργειας και συνθήκες επωάσεως (δοχεία καλλιέργειας, θερμοκρασία, συγκέντρωση CO2 και υγρασία). Τα θρεπτικά μέσα θα πρέπει να επιλέγονται ανάλογα με τα συστήμιιτα επιλογής και τον κυτταρικό τύπο που χρησιμοποιούνται στη δοκιμή. Παίζει σημαντικό ρόλο οι συνθήκες καλλιέργειας να επιλέγονται έτσι ώστε να διασφαλίζεται η άριστη ανάπτυξη των κυττάρων κατά τη διάρκεια της περιόδου εκφράσεως και η ικανότητα σχηματισμού αποικιών μεταλλαγμένων και μη κυττάρων.
1.4.1.3. Προετοιμασία των καλλιεργειών Τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται από έτοιμες καλλιέργειες, ανακαλλιεργούνται σε θρεπτικό μέσο και επωάζονται στους 37 oC Πριν να χρησιμοποιηθούν στη δοκιμή αυτή, οι καλλιέργειες ενδέχεται να χρειάζεται να καθαριστούν από προϋπάρχοντα μεταλλαγμένα κύτταρα.
1.4.1.4. Μεταβολική ενεργοποίηση Τα κύτταρα θα πρέπει να εκτίθενται στην υπό δοκιμή ουσία παρουσία και απουσία κατάλληλου συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης. Το συνηθέστερα χρησιμοποιούμενο σύστημα είναι ένα μεταμιτοχονδριακό κλάσμα εμπλουτισμένο με συμπαράγοντα (S9) που παρασκευάζεται από ήπαρ τρωκτικών που έχει υποβληθεί σε κατεργασία με ενζυμοεπαγωγικούς παράγοντες όπως Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) ή μείγμα φαινοβαρβιτόνης και β-ναφθοφλαβόνης (19) (20). Το μεταμιτοχονδριακό κλάσμα χρησιμοποιείται συνήθως σε συγκεντρώσεις της τάξεως του 1-10 % ν/ν στο τελικό μέσο δοκιμής. Η επιλογή και κατάσταση ενός συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης μπορεί να εξαρτάται από την τάξη της υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να χρειάζεται να χρησιμοποιηθούν περισσότερες από μία συγκεντρώσεις μεταμιτοχονδριακού κλάσματος. Με ορισμένες αλλαγές, στις οποίες περιλαμβάνεται και η παρασκευή επεξεργασμένων με μεθόδους γενετικής μηχανικής κυτταρικών σειρών που εκφράζουν ειδικά ενεργοποιητικά ένζυμα, ενδέχεται να μπορεί να γίνει και ενδογενής ενεργοποίηση. Η επιλογή των χρησιμοποιουμένων κυτταρικών σειρών πρέπει να αιτιολογείται επιστημονικώς (π.χ. από τη σχέση του κυτοχρωμικού Ρ4 50 ισοενζύμου στο μεταβολισμό της υπό δοκιμή ουσίας).
1.4.1.5. Υπό δοκιμή ουσία/προετοιμασία Οι στερεές υπό δοκιμή ουσίες πρέπει να διαλύονται ή να τίθενται υπό μορφή εναιωρήματος σε κατάλληλους διαλύτες ή φορείς και να αραιώνονται εφόσον απαιτείται πριν από την κατεργασία των κυττάρων. Οι υγρές ουσίες μπορούν να προστίθενται απευθείας στα συστήματα δοκιμής ή/και να αραιώνονται πριν από την κατεργασία. Πρέπει να χρησιμοποιούνται πρόσφατα παρασκευάσματα της υπό δοκιμή ουσίας εκτός κι αν τα σχετικά με τη σταθερότητα της ουσίας στοιχεία επιτρέπουν τη χρήση έτοιμων παρασκευασμάτων.
1.4.2. Συνθήκες δοκιμής
1.4.2.
1.4.2.1. Διαλύτης/φορέας Δεν πρέπει να υπάρχουν υπόνοιες για πιθανή χημική αντίδραση του διαλύτη/φορέα με την υπό δοκιμή ουσία ενώ θα πρέπει να είναι συμβατός με την επιβίωση των κυττάρων και τη δραστικότητα S9. Εφόσον ο χρησιμοποιούμενος διαλύτης/φορέας δεν ανήκει στους γνωστούς, η χρήση του θα πρέπει να στηρίζεται στην ύπαρξη στοιχείων που αποδεικνύουν τη συμβατότητά του. Συνιστάται, εφόσον είναι δυνατό, να εξετάζεται πρώτα η χρήση ενός υδατικού διαλύτη/φορέα. Όταν εξετάζονται ουσίες που δεν είναι σταθερές στο νερό, οι χρησιμοποιούμενοι οργανικοί διαλύτες θα πρέπει να είναι απαλλαγμένοι ύδατος. Το νερό μπορεί να αφαιρεθεί με την προσθήκη μοριακού κοσκινού.
1.4.2.2. Συγκεντρώσεις εκθέσεως Μεταξύ των κριτηρίων που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη όταν καθορίζεται η μέγιστη προς χρήση συγκέντρωση είναι η κυτταροτοξικότητα, η διαλυτότητα στο σύστημα δοκιμής και οι μεταβολές στο pH ή την οσμωμοριακότητα. Η κυτταροτοξικότητα θα πρέπει να προσδιορίζεται με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση στο κύριο πείραμα χρησιμοποιώντας μία κατάλληλη ένδειξη της ακεραιότητας και ανάπτυξης των κυττάρων όπως η σχετική αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης (επιβίωση) ή η σχετική συνολική ανάπτυξη. Χρήσιμο μπορεί να είναι ο προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας και διαλυτότητας να γίνει σε ένα προκαταρκτικό πείραμα. Για την ανάλυση θα πρέπει να χρησιμοποιούνται τέσσερις τουλάχιστον συγκεντρώσεις. Εφόσον εμφανίζονται φαινόμενα κυτταροτοξικότητας, οι συγκεντρώσεις αυτές θα πρέπει να καλύπτουν μία περιοχή από τη μέγιστη μέχρι μικρή ή και μηδενική τοξικότητα. Λυτό σημαίνει συνήθως ότι οι συγκεντρώσεις δεν θα πρέπει να διαφέρουν περισσότερο από ένα συντελεστή μεταξύ 2 και 10. Εφόσον η μέγιστη συγκέντρωση βασίζεται στην κυτταροτοξικότητα, θα πρέπει να έχει ως αποτέλεσμα ένα ποσοστό 10-20 % (όχι όμως λιγότερο από 10 %) σχετικής επιβίωσης (σχετικής αποτελεσματικότητας κλωνοποίησης) ή σχετικής συνολικής ανάπτυξης. Για σχετικώς μη κυτταροτοξικές ουσίες, η μέγιστη συγκέντρωση δοκιμής θα πρέπει να είναι 5 μl/ml, 5 mg/ml ή 0,01 Μ, όποια από τις τρεις είναι χαμηλότερη. Σχετικά αδιάλυτες ουσίες θα πρέπει να υποβάλλονται σε δοκιμή μέχρι ή και πέραν που ορίου διαλυτότητάς τους υπό τις συνθήκες καλλιέργειας. Τα σχετικά με τη δυσδιαλυτότητα στοιχεία θα πρέπει να προσδιορίζονται στο τελικό μέσο κατεργασίας στο οποίο εκτίθενται τα κύτταρα. Μπορεί να είναι χρήσιμο να υπολογιστεί η διαλυτότητα στην αρχή και το πέρας της κατεργασίας καθώς η διαλυτότητα μπορεί να αλλάζει κατά τη διάρκεια της έκθεσης στο σύστημα δοκιμής λόγω της παρουσίας κυττάρων, S9, ορού, κ.λπ. Η μέγιστη διαλυτότητα μπορεί να ανιχνευθεί με γυμνό οφθαλμό. Το ίζημα δεν πρέπει να παρεμβαίνει στα αποτελέσματα της εκτίμησης.
1.4.2.3. Μάρτυρες Σε κάθε πείραμα θα πρέπει να περιλαμβάνονται και καλλιέργειες με θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες (διαλύτης ή φορέας), με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση. Όταν χρησιμοποιείται μεταβολική ενεργοποίηση, ως θετικός μάρτυρας θα πρέπει να χρησιμοποιείται ουσία που απαιτεί ενεργοποίηση για την παροχή μεταλλαξιγόνου απόκρισης. Παραδείγματα ουσιών-θετικών μαρτύρων είναι: Μεταβολική ενεργοποίηση Γενετικός τόπος Ουσία Αριθ. CAS Αριθ. EINECS Απουσία εξωγενούς μεταβολικής ενεργοποίησης HPRT Μεθανοσουλφονικός αιθυλεστέρας 62-50-0 200-536-7 Λιθυλονιτροζουρία 759-73-9 212-072-2 ΤΚ (μικρές και μεγάλες αποικίες) Μεθανοσουλφονικός μεθυλεστέρας 66-27-3 200-625-0 XPRT Μεθανοσουλφονικός αιθυλεστέρας 62-50-0 200-536-7 Αιθυλο νιτροζουρία 759-73-9 212-072-2 Παρουσία εξωγενούς μεταβολικής ενεργοποίησης HPRT 3-μεϋυλοχολανθρένιο 56-49-5 200-276-4 Ν-ΝΊτροζωδιμεθυλαμίνη 62-75-9 200-549-8 7,12-διμεθυλοβενζανθρακένιο 57-97-6 200-359-5 ΤΚ (μικρές και μεγάλες αποικίες) Κυκλοφωσφαμίοιο 50-18-0 200-015-4 Μονοένυδρο κυκλοφωσφαμίδιο 6055-19-2 Βενζο[α]πυρένιο 50-32-8 200-028-5 3-μεθυλοχολανϊ)ρένιο 56-49-5 200-276-5 XPRT Ν-νιτροζωδιμεθυλαμίνη (για υψηλά επίπεδα S9) 62-75-9 200-549-8 Βενζο[α]πυρένιο 50-32-8 200-028-5 Ως θετικοί μάρτυρες αναφοράς μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες ουσίες, π.χ. εάν ένα εργαστήριο έχει ένα ιστορικό με στοιχεία για την 5-βρωμο-2'-δεοξυουριδίνη (αριθ. CAS 59-14-3, αριθ. EINECS αριθ. 200-415-9), μπορεί να χρησιμοποιηθεί και αυτή η ουσία αναφοράς, Εφόσον υπάρχουν, θα πρέπει να εξετάζεται η χρήση ως θετικών μαρτύρων ουσιών σχετικής χημικής τάξης. Θα πρέπει να περιλαμβάνονται και αρνητικοί μάρτυρες, αποτελούμενοι από μόνο τον διαλύτη ή το φορέα στο μέσο κατεργασίας, και κατεργασμένοι με τον ίδιο τρόπο με εκείνο των καλλιεργειών της υπό δοκιμή ουσίας. Επιπλέον, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται και μη υποστάντες επεξεργασίας μάρτυρες εκτός αν υπάρχουν πρότερα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι ο επιλεγείς διαλύτης δεν επιφέρει επιβλαβή ή μεταλλαξιγόνα αποτελέσματα.
1.4.3. Διαδικασία
1.4.3.
1.4.3.1. Κατεργασία με την υπό δοκιμή ουσία Πολλαπλασιασθέντα κύτταρα θα πρέπει να εκτίθενται στην υπό δοκιμή ουσία με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση. Η έκθεση θα πρέπει να διαρκεί για κατάλληλο χρονικό διάστημα (συνήθως 3-6 ώρες είναι αρκετό). Ο χρόνος έκθεσης μπορεί να αντιστοιχεί σε ένα ή περισσότερους κυτταρικούς κύκλους. Για κάθε συγκέντρωση, μπορούν να χρησιμοποιηθούν απλές ή διπλές καλλιέργειες της υπό δοκιμή ουσίας. Όταν χρησιμοποιούνται απλές καλλιέργειες, ο αριθμός των συγκεντρώσεων θα πρέπει να αυξάνεται ώστε να εξασφαλίζεται ο κατάλληλος αριθμός καλλιεργειών για ανάλυση (π.χ. τουλάχιστον οκτώ προς ανάλυση συγκεντρώσεις). Οι καλλιέργειες που χρησιμοποιούνται για αρνητικοί μάρτυρες (διαλύτης), θα πρέπει να είναι εις διπλούν. Οι αέριες ή πτητικές ουσίες θα πρέπει να εξετάζονται με κατάλληλες μεθόδους, όπως π.χ. σε σφραγισμένα δοχεία καλλιέργειας (21) (22).
1.4.3.2. Μέτρηση επιβίωσης, βιωσιμότητας και συχνότητας προϊόντων μετάλλαξηζ Στο τέλος της περιόδου έκθεσης, τα κύτταρα πλένονται και καλλιεργούνται για τον προσδιορισμό της επιβίωσης και για να μπορέσει να επιτευχθεί η έκφραση του φαινοτύπου των προϊόντων μετάλλαξης. Η μέτρηση της κυτταροτοξικότητας με τον προσδιορισμό της σχετικής αποτελεσματικότητας κλωνοποίησης (επιβίωσης) ή της σχετικής συνολικής ανάπτυξης των καλλιεργειών γίνεται συνήθως μετά την περίοδο κατεργασίας. Κάθε γενετικός τόπος έχει καθορισμένες χρονικές απαιτήσεις για να πραγματοποιηθεί η κατ' ουσία άριστη φαινοτυπική έκφραση προσφάτως παραχθέντων προϊόντων μετάλλαξης (οι HPRT και XPRT απαιτούν τουλάχιστον 6-8 ημέρες και η ΤΚ τουλάχιστον 2 ημέρες). Τα κύτταρα αυξάνονται σε θρεπτικό μέσο με και χωρίς παράγοντα ή παράγοντες επιλογής για τον προσδιορισμό του αριθμού των προϊόντων μετάλλαξης και της αποτελεσματικότητας κλωνοποίησης, αντίστοιχα. Η μέτρηση της βιωσιμότητας (που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της συχνότητας προϊόντων μετάλλαξης) ξεκινά στο τέλος του χρόνου έκφρασης με επίστρωση σε μη επιλεκτικό μέσο. Εάν η υπό δοκιμή ουσία είναι θετική στη δοκιμή L5178Y ΤΚ+/- , θα πρέπει να πραγματοποιείται μέτρηση μεγέθους των αποικιών σε μία τουλάχιστον από τις καλλιέργειες της δοκιμής (με την υψηλότερη θετική συγκέντρωση) καθώς και στον αρνητικό και θετικό μάρτυρα. Εάν η υπό δοκιμή ουσία είναι αρνητική στη δοκιμή L5178Y ΤΚ+/-, θα πρέπει να πραγματοποιείται μέτρηση μεγέθους αποικιών στον αρνητικό και θετικό μάρτυρα. Σε δοκιμές στις οποίες χρησιμοποιείται ΤΚ6ΤΚ+/- , μπορεί επίσης να γίνει μέτρηση μεγέθους αποικιών.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ
2.
2.1. ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Στα λαμβανόμενα στοιχεία θα πρέπει να περιλαμβάνεται προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας και βιωσιμότητας, ο αριθμός των αποικιών και η συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης και για τις υπό δοκιμή καλλιέργειες και για τους μάρτυρες. Σε περίπτωση θετικής αποκρίσεως στη δοκιμή L5178Y ΤΚ+/-, οι αποικίες καταμετρούνται με βάση τα κριτήρια για τις μικρές και μεγάλες αποικίες για μία τουλάχιστον συγκέντρωση της υπό δοκιμή ουσίας (μέγιστη θετική συγκέντρωση) και στον αρνητικό και τον θετικό μάρτυρα. Η μοριακή και κυτταρογενετική φύση και των μικρών και των μεγάλων αποικιών προϊόντων μετάλλαξης έχει μελετηθεί λεπτομερώς (23) (24). Στην δοκιμή ΤΚ+/- , οι αποικίες καταμετρούνται με βάση τα κριτήρια για τις αποικίες κανονικής ανάπτυξης (μεγάλες) και βραδείας ανάπτυξης (μικρές) (25). Τα μεταλλαγμένα κύτταρα που έχουν υποστεί τις πλέον εκτεταμένες γενετικές βλάβες έχουν παρατεταμένο χρόνο διπλασιασμού και έτσι σχηματίζουν μικρές αποικίες. Οι βλάβες αυτές μπορούν να κυμαίνονται από απώλεια ολόκληρου του γονιδίου μέχρι καρυοτυπικώς ορατές χρωμοσωμικές εκτροπές. Η εμφάνιση προϊόντων μετάλλαξης σε μικρές αποικίες συνδέεται με χημικές ουσίες που προκαλούν σοβαρές χρωμοσωμικές εκτροπές (26). Τα μεταλλαγμένα κύτταρα που έχουν πληγεί λιγότερο σοβαρά, αναπτύσσονται με ρυθμούς παρόμοιους με εκείνους των γονικών κυττάρων και σχηματίζουν μεγάλες αποικίες. Θα πρέπει να δίνεται η επιβίωση (σχετική αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης) ή η σχετική συνολική ανάπτυξη. Η συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης θα πρέπει να εκφράζεται ως ο αριθμός των μεταλλαγμένων κυττάρων προς τον αριθμό των επιβιωσάντων κυττάρων. Θα πρέπει να δίνονται στοιχεία για κάθε μεμονωμένη καλλιέργεια. Επιπλέον, όλα τα δεδομένα θα πρέπει να δίνονται με τη μορφή πίνακα. Δεν απαιτείται επαλήθευση των σαφών θετικών αποκρίσεων. Τυχόν διφορούμενα αποτελέσματα θα πρέπει να αποσαφηνίζονται με δοκιμές τροποποιώντας κατά προτίμηση τις πειραματικές συνθήκες. Τα αρνητικά αποτελέσματα πρέπει να επιβεβαιώνονται κατά περίπτωση. Στις περιπτώσεις όπου δεν κρίνεται αναγκαία η επιβεβαίωση των αρνητικών αποτελεσμάτων. θα πρέπει να παρέχεται σχετική αιτιολόγηση. Στα επιβεβαιωτικά πειράματα, τόσο για τα διφορούμενα όσο και για τα αρνητικά αποτελέσματα, θα πρέπει να εξετάζεται η τροποποίηση των παραμέτρων της μελέτης ώστε να καλύπτουν όλη την έκταση των εκτιμούμενων συνθηκών. Στις παραμέτρους που μπορούν να τροποποιηθούν περι-λαμβάνεται το εύρος των συγκεντρώσεων και οι συνθήκες μεταβολικής ενεργοποίησης.
2.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Για να θεωρηθεί ένα αποτέλεσμα ως θετικό εφαρμόζονται διάφορα κριτήρια όπως η σχετιζόμενη με την συγκέντρωση αύξηση ή η αναπαραγώγιμη αύξηση στη συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης. Πρώτα θα πρέπει να εξετάζεται η βιολογική σχετικότητα των αποτελεσμάτων. Ως βοήθημα στην αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των δοκιμών μπορούν να χρησιμοποιούνται και στατιστικές μέθοδοι. Σε μία θετική απόκριση δεν θα πρέπει ως μοναδικός αποφασιστικός παράγοντας να λαμβάνεται η στατιστική σημαντικότητα. Εφόσον τα αποτελέσματα για μία υπό δοκιμή ουσία δεν πληρούν τα ανωτέρω κριτήρια, η ουσία αυτή θεωρείται ως μη μεταλλαξιγόνος στο σύστημα αυτό. Αν και τα περισσότερα πειράματα θα δίνουν σαφώς θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα, σε σπάνιες περιπτώσεις τα δεδομένα ενδέχεται να μην επιτρέπουν τη εξαγωγή οριστικού συμπεράσματος σχετικά με τη δραστικότητα της υπό δοκιμή ουσίας. Τα αποτελέσματα μπορεί να παραμένουν διφορούμενα ή αμφισβητήσιμα άσχετα με το πόσες φορές θα επαναληφθεί το πείραμα. Θετικά αποτελέσματα από την in vitro δοκιμή κυτταρικής γονιδιακής μετάλλαξης σε θηλαστικά δείχνουν ότι η υπό δοκιμή ουσία επάγει γονιδιακές μεταλλάξεις στα χρησιμοποιηθέντα καλλιεργηθέντα κύτταρα θηλαστικού. Η περίπτωση με τη μεγαλύτερη σημαντικότητα είναι εκείνη όπου υπάρχει θετική και αναπαραγώγιμη συνάρτηση απόκρισης με συγκέντρωση. Αρνητικά αποτελέσματα δείχνουν ότι, υπό τις συνθήκες της δοκιμής, η υπό δοκιμή ουσία δεν επάγει γονιδιακές μεταλλάξεις στα χρησιμοποιηθέντα καλλιεργηθέντα κύτταρα θηλαστικού.
3. ΕΚΘΕΣΗ ΑΝΑΦΟΡΑΣ
3. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ
Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία:
Διαλύτης φορέας:
αιτιολόγηση της επιλογής του φορέα/διαλύτη,
διαλυτότητα και σταθερότητα της υπό δοκιμή ουσίας στο διαλύτη/φορέα εφόσον είναι γνωστές.
Κύτταρα:
τύπος και πηγή των κυττάρων,
αριθμός των κυτταρικών καλλιεργειών,
αριθμός κυτταρικών διελεύσεων, εφόσον συντρέχει περίπτωση,
μέθοδοι συντήρησης της κυτταρικής καλλιέργειας, εφόσον συντρέχει περίπτωση,
απουσία μυκοπλάσματος.
Συνθήκες δοκιμής:
αιτιολογία για την επιλογή των συγκεντρώσεων και του αριθμού των καλλιεργειών συμπεριλαμβανομένων, π.χ. στοιχείων κυτταροτοξικότητας και περιορισμών από πλευράς διαλυτότητας, εφόσον συντρέχει περίπτωση,
σύσταση του μέσου καλλιέργειας, συγκέντρωση CO2,
συγκέντρωση της υπό δοκιμή ουσίας,
όγκος του φορέα και της προστιθέμενης υπό δοκιμή ουσίας,
θερμοκρασία επωάσεως,
χρόνος επωάσεως,
διάρκεια της κατεργασίας,
πυκνότητα των κυττάρων κατά την κατεργασία,
τύπος και σύσταση του συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης, συμπεριλαμβανομένων και κριτηρίων αποδοχής,
θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες,
διάρκεια της περιόδου έκφρασης (συμπεριλαμβανομένου του αριθμού των ανακαλλιεργηθέντων κυττάρων και των υποκαλλιεργειών και διαγραμμάτων διατροφής, εφόσον συντρέχει περίπτωση),
παράγοντες επιλογής,
κριτήρια για την κατάταξης μιας δοκιμής ως θετικής, αρνητικής ή διφορούμενης.
μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την καταγραφή του αριθμού των βιώσιμων και των μεταλλαγμένων κυττάρων,
ορισμός των αποικιών σχετικά με το μέγεθος και τον τύπο τους (συμπεριλαμβανομένων των κριτηρίων κατάταξης σε μικρές και μεγάλες αποικίες, εφόσον συντρέχει περίπτωση).
Αποτελέσματα:
σημάδια τοξικότητας,
σημάδια καθίζησης,
στοιχεία για το pH και την οσμωμοριακότητα κατά τη διάρκεια της έκθεσης στην υπό δοκιμή ουσία, εφόσον προσδιορίστηκαν,
μέγεθος των αποικιών, εφόσον καταγράφηκε, τουλάχιστον για τους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες.
επάρκεια του εργαστηρίου στην ανίχνευση μικροαποικιακών προϊόντων μετάλλαξης με το σύστημα L5178Y ΤΚ+/-, όπου συντρέχει περίπτωση,
σχέση δόσης-απόκρισης, όπου είναι δυνατό,
στατιστικές αναλύσεις, εφόσον υπάρχουν,
παράλληλα στοιχεία για τους αρνητικούς (διαλύτης/φορέας) και θετικούς μάρτυρες,
προϋπάρχοντα στοιχεία για τους αρνητικούς (διαλύτης/φορέας) και θετικούς μάρτυρες, με εύρη, μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις,
συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης.
Εξέταση των αποτελεσμάτων.
Συμπεράσματα.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Moore, Μ.Μ., DeMarini, D. Μ, DeSerres, Κ). and Tindall, Κ. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E. H. Y. and Mailing, H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306-1312. Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res.. 94, pp. 467-485. Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394-403. Aaron, C. S. and Stankovvski. Jr. L. F. (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.. 223. pp. 121-128 Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankovvski, Jr. L. F, Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, pp. 235-239. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M, Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204. Clive, D., McCuen. R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, Κ. Η. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res.. 115, pp. 225-251. Li, A. P.. Gupta, R. S., Heflich. R. H. and Wasson. J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxaiithine Guanine Phosphonbosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environment Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res.. 196. pp. 17-36. Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., O'Neill, J. P., Riddle, J. C, Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Cuanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135-141. Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human l.ymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9-17. Stankowski, L. F. Jr., Tindall, K. R. and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191-lnduced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191-lnduced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res,. 160, pp. 133-147. Turner, N. T., Batson, A. G. and Give, D. (1984), Procedures for the L5178Y/TK+/- — TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268. Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. 1.., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith, J. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland D. J., ed., Cambridge University Press, pp. 66-101. Abbondandolo, Α., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, pp. 365-373. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364. Clive, D., Johnson, K. 0., Spector, J. F. S., Batson, A. G. and Brown Μ. Μ. Μ. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat Res., 59, pp. 61-108. Maron, D. M. and Ames, Β. Ν. (198 3), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215. Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcomc. C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-lnduced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot. R. M. (eds.) Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, Κ. Τ. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, Κ. Μ. (eds.), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801. Applegate, M. L, Moore, M. M.. Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, pp. 51-55. Moore, M. M., Clive, D., Hozier, J. C. Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, Ν. Τ. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluorothymidinc-Resistant (TFT1) and Mutants of L51 78Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res, 151, pp. 161-174. Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res.. 229, pp. 89-102. Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficicnt Mutant Frequency in I.5178Y/TK+/- — 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis 5, pp. 609-614.
Β.18 ΒΛΑΒΗ ΚΑΙ ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ DNA — ΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΤΗ ΣΥΝΘΕΣΗ DNA — ΚΥΤΤΑΡΑ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ — IN VITRO
Β.18
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Καμία.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Η δοκιμασία απρογραμμάτιστης σύνθεσης DNA (UDS) μετρά την επανόρθωση της σύνθεσης του DNA μετά την εκτομή και αφαίρεση τμήματος του DNA που περιέχουν την περιοχή της βλάβης, η οποία προκαλείται από χημικούς και φυσικούς παράγοντες. Η δοκιμασία βασίζεται στην εισαγωγή τριτιωμένης θυμιδίνης (3H-TdR) στο DNA κυττάρων θηλαστικών, τα οποία δεν βρίσκονται στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Η λήψη της 3H-TdR μπορεί να προσδιοριστεί με αυτοραδιογραφία ή με μέτρηση υγρού σπινθηρισμού (LSC) σε DNA από κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή. Εφόσον δεν χρησιμοποιούνται αρχέτυπα ηπατοκύτταρα ποντικών, τα κύτταρα θηλαστικών μέσα στην καλλιέργεια υφίστανται αγωγή με την δοκιμαζόμενη ουσία με ή χωρίς εξωγενή μεταβολική ενεργοποίηση. Η UDS μπορεί επίσης να μετρηθεί σε συστήματα in vivo.
1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Κανένα.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ
1.6. Προετοιμασία
Οι δοκιμαζόμενες χημικές ουσίες και οι μάρτυρες ελέγχου ή οι ουσίες αναφοράς πρέπει να προστεθούν σε θρεπτικό μέσον ανάπτυξης ή να εναιωρηθούν σε κατάλληλο φορέα και έπειτα να διαλυθούν σε θρεπτικό μέσον ανάπτυξης για να χρησιμοποιηθούν στη δοκιμασία. Η τελική συγκέντρωση του φορέα δεν πρέπει να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Καλλιέργειες αρχέτυπων ηπατοκυττάρων ποντικών, ανθρώπινων λεμφοκυττάρων ή καθορισμένες σειρές κυττάρων (π.χ. ανθρώπινοι διπλοειδείς ινοβλάστες) μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη δοκιμασία. Τα κύτταρα πρέπει να εκτεθούν στην πειραματική ουσία τόσο με όσο και χωρίς κατάλληλο σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης.
Συνθήκες δοκιμασίας
Αριθμός καλλιεργειών
Δύο τουλάχιστον καλλιέργειες κυττάρων για την αυτό ραδιογραφία και έξι καλλιέργειες κυττάρων με LSC προσδιορισμούς UDS (ή λιγότερες, εάν επιστημονικά κρίνεται σκόπιμο) είναι απαραίτητες για κάθε πείραμα.
Χρήση αρνητικών και θετικών ελέγχων με μάρτυρες
Πρέπει να γίνονται συγχρόνως με κάθε πείραμα θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι (χωρίς αγωγή ή/και φορέα) με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση. Παραδείγματα θετικών ελέγχων με μάρτυρες για τη δοκιμασία ηπατοκυττάρων αρουραίου είναι το 7,12-DMBA (7,12-όιμε6υλοβενζανθρακένιο) ή το 2-AAF (2-ακετυλαμινοφλουορένιο), Στην περίπτωση καθορισμένων σειρών κυττάρων το 4-NQO (οξείδιο-Ν της 4-νιτροκινολίνης) είναι ένα παράδειγμα θετικού ελέγχου τόσο για αυτοραδιογραφικά πειράματα όσο και για πειράματα με LSC, που εκτελούνται χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση. Η Ν-νατροζοδιμεθυλαμίνη αποτελεί παράδειγμα ουσίας θετικού ελέγχου, όταν χρησιμοποιούνται συστήματα μεταβολικής ενεργοποίησης.
Συγκέντρωση έκθεσης
Πρέπει να χρησιμοποιούνται πολλές συγκεντρώσεις της πειραματικής ουσίας επαρκείς για τον προσδιορισμό της ανταπόκρισης. Η υψηλότερη συγκέντρωση πρέπει να προκαλεί μερικές κυτταροτοςικές επιδράσεις. Οι σχετικά μη υδατοδιαλυτές ενώσεις πρέπει να δοκιμάζονται μέχρι το όριο διαλυτότητάς τους. Για πολύ υδατοδιαλυτές μη τοξικές χημικές ουσίες, η ανώτερη συγκέντρωση της πειραματικής χημικής ουσίας πρέπει να καθορίζεται κατά περίπτωση.
Κύτταρα
Πρέπει να χρησιμοποιείται προσφυές μέσον ανάπτυξης, κατάλληλη συγκέντρωση σε CO2 καθώς και κατάλληλη θερμοκρασία και υγρασία για τη συντήρηση των καλλιεργειών. Οι καθορισμένες σειρές κυττάρων πρέπει να ελέγχονται περιοδικά για πρόσμειξη μυκοπλάσματος. Επίσης είναι επιθυμητός ο περιοδικός έλεγχος των κυττάρων για σταθερότητα καρυοτύπου.
Μεταβολική ενεργοποίηση
Δεν χρησιμοποιείται σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης σε καλλιέργειες αρχετύπων ηπατοκυττάρων. Οι καθορισμένες σειρές κυττάρων και τα λεμφοκύτταρα εκτίθενται στη δοκιμαζόμενη ουσία τόσο με όσο και χωρίς κατάλληλο σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης.
Διαδικασία
Παρασκευή καλλιεργειών
Οι καθορισμένες σειρές κυττάρων παράγονται από μόνιμες καλλιέργειες (π.χ. με θρυψινοποίηοη ή με αποτίναξη), εμφυτεύονται σε δοχεία καλλιέργειας με κατάλληλη πυκνότητα και επωάζονται σε 37 oC. Δημιουργούνται βραχυπρόθεσμες καλλιέργειες ηπατοκυττάρων αρουραίων, επιτρέποντας στα πρόσφατα αποσυνδεμένα ηπατοκύτταρα σε προσφυές μέσον να προσκολληθούν στην αναπτυσσόμενη επιφάνεια. Οι καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων γίνονται με τη χρησιμοποίηση κατάλληλων τεχνικών μεθόδων.
grp_2 Κατεργασία των καλλιεργειών με τη δοκιμαζόμενη ουσία
Αρχέτυπα ηπατοκύτταρα αρουραίου: Πρόσφατα απομονωμένα ηπατοκύτταρα αρουραίου υφίστανται κατεργασία με την δοκιμαζόμενη ουσία σε μέσον που περιέχει 3H-TdR, για κατάλληλη χρονική περίοδο. Στο τέλος της περιόδου αγωγής τα κύτταρα πρέπει να αποσυρθούν από το μέσον, να εκπλυθούν, να μονιμοποιηθούν, και να στεγνώσουν. Οι αντικειμενοφόροι πρέπει να εμβαπτισθούν σε αυτοραδιογραφικό γαλάκτωμα, να μείνουν σε 4 oC για κατάλληλο χρονικό διάστημα, να εμφανιστούν, να χρωσθούν και να γίνουν οι μετρήσεις.
Καθορισμένες σειρές κυττάρων και λεμφοκύτταρα
Τεχνικές αυτοραδιογραφίας: Οι καλλιέργειες κυττάρων εκτίθενται στη δοκιμαζόμενη ουσία για κατάλληλο χρονικό διάστημα και έπειτα υφίστανται αγωγή με 3H-TdR. Ο χρόνος καθορίζεται από τη φύση της ουσίας, τη δραστικότητα του συστήματος μεταβολισμού και τον τύπο των κυττάρων. Για την ανίχνευση της μέγιστης UDS, πρέπει να προστεθεί 3H-TdR είτε ταυτόχρονα με την δοκιμαζόμενη ουσία είτε λίγα λεπτά μετά την έκθεση στην δοκιμαζόμενη ουσία. Η επιλογή μεταξύ των δύο αυτών διαδικασιών επηρεάζεται από πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της δοκιμαζόμενης ουσίας και του 3H-TdR. Για να γίνει η διάκριση μεταξύ της UDS και του ημισυντηρητικού αναδιπλασιασμού του DNA, ο τελευταίος μπορεί να ανασταλεί, π.χ., με τη χρήση υλικού από το οποίο λείπει η αργινίνη, με χαμηλή περιεκτικότητα ορού ή με παρουσία υδροξυουρίας στο υλικό της καλλιέργειας. Μετρήσεις της UDS με LSC: Πριν από την αγωγή με τη δοκιμαζόμενη ουσία, η είσοδος των κυττάρων στη φάση S πρέπει να εμποδιστεί, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα πρέπει να εκτεθούν στην πειραματική χημική ουσία όπως περιγράφεται για την αυτοραδιογραφία. Στο τέλος της περιόδου επώασης, το DNA πρέπει να αποσπαστεί από τα κύτταρα και να καθορισθεί το συνολικό περιεχόμενο DNA και η έκταση της ενσωμάτωσης του 3H-TdR. Πρέπει να σημειωθεί ότι όπου, στις παραπάνω τεχνικές, χρησιμοποιούνται ανθρώπινα λεμφοκύτταρα η αναστολή του ημισυντηρητικού αναδιπλασιασμού του DNA δεν είναι αναγκαία σε μη διεγερμένες καλλιέργειες.
Ανάλυση
Αυτοραδιογραφικοί προσδιορισμοί
Για τον προσδιορισμό της UDS σε κύτταρα που βρίσκονται μέσα σε καλλιέργεια, οι πυρήνες της φάσης S, δεν καταμετρώνται. 50 τουλάχιστον κύτταρα ανά συγκέντρωση πρέπει να μετρηθούν. Οι πλάκες πρέπει να κωδικοποιηθούν πριν καταμετρηθούν. Σε κάθε πλάκα πρέπει να καταμετρηθούν διάφορα ευρέως διαχωρισμένα τυχαία πεδία. Η ποσότητα της ενσωμάτωσης 3H-TdR στο κυτταρόπλασμα πρέπει να προσδιοριστεί με την καταμέτρηση τριών περιοχών μεγέθους πυρήνα μέσα στο κυτταρόπλασμα κάθε καταμετρηθέντος κυττάρου.
Προσδιορισμοί με LSC
Πρέπει να χρησιμοποιηθεί επαρκής αριθμός καλλιεργειών για κάθε συγκέντρωση και για κάθε μάρτυρα για τον προσδιορισμό της UDS με LSC. Όλα τα αποτελέσματα πρέπει να επιβεβαιώνονται με ανεξάρτητο πείραμα.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Τα δεδομένα παρουσιάζονται με τη μορφή πίνακα.
2.
2.1. ΑΥΤΟΡΑΔΙΟΓΡΑΦΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ Η έκταση της ενσωμάτωσης του 3H-TdR στο κυτταρόπλασμα και ο αριθμός των κόκκων που βρέθηκαν πάνω στον πυρήνα του κυττάρου πρέπει να καταγραφούν χωριστά. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν μέσες και επικρατούσες (mode) τιμές για την περιγραφή της κατανομής της έκτασης της ενσωμάτωσης του 3H-TdR στο κυτταρόπλασμα και του αριθμού των κόκκων ανά πυρήνα.
2.2. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΜΕ LSC Στους προσδιορισμούς με LSC, η ενσωμάτωση της 3Ή-TdR θα πρέπει να αναφέρεται σαν dpm/μg DNA. Η μέση τιμή dpm/μg DNA με την μέση σταθερή απόκλιση μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να περιγραφεί η κατανομή της ενσωμάτωσης. Τα δεδομένα πρέπει να εκτιμώνται με τη χρήση κατάλληλων στατιστικών μεθόδων.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Η έκθεση της δοκιμασίας πρέπει να περιλαμβάνει τις παρακάτω πληροφορίες:
κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν, πυκνότητα και αριθμός διελεύσεων κατά το χρόνο αγωγής, αριθμός καλλιεργειών κυττάρων,
μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για τη συντήρηση των καλλιεργειών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου του θρεπτικού μέσου, της θερμοκρασίας και της συγκέντρωσης σε CO2,
δοκιμαζόμενη ουσία, φορέας, συγκεντρώσεις και αιτιολόγηση για την επιλογή των συγκεντρώσεων που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη δοκιμασία,
στοιχεία για τα συστήματα μεταβολικής ενεργοποίησης,
πρόγραμμα αγωγής,
θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι,
αυτοραδιογραφική τεχνική που χρησιμοποιήθηκε,
διαδικασίες που χρησιμοποιήθηκαν για την παρεμπόδιση της εισόδου των κυττάρων στη φάση S,
διαδικασίες που χρησιμοποιήθηκαν για την απόσπαση του DNA και για τον προσδιορισμό του συνολικού περιεχομένου DNA σε μετρήσεις LSC,
σχέση δόσης/αποτελέσματος, όπου είναι δυνατόν,
στατιστική εκτίμηση,
συζήτηση των αποτελεσμάτων,
ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
4. ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
Β.19 ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ ΑΔΕΛΦΩΝ ΧΡΩΜΑΤΙΔΩΝ IN VITRO
Β.19
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Καμία.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Η μέθοδος ανταλλαγής αδελφών χρωματίδων (SCE) αποτελεί μια γρήγορη δοκιμασία για την ανίχνευση των ανταλλαγών του DNA μεταξύ δύο αδελφών χρωματίδων ενός διπλοποιημένου χρωμοσώματος. Η μέθοδος αυτή αντιπροσωπεύει την ανταλλαγή προϊόντων αναδιπλασιασμού του DNA σε φαινομενκά ομόλογες θέσεις. Η διαδικασία ανταλλαγής αφορά προφανώς θραύση του DNA και επανένωση, παρόλο ότι λίγα είναι γνωστά για τη μοριακή βάση. Η ανίχνευση των SCE απαιτεί τη δυνατότητα διαφορετικής σήμανσης αδελφών χρωματίδων, η οποία μπορεί να επιτευχθεί με ενσωμάτωση βρωμοδεσοξυουοριδίνης (BrdU) μέσα σε χρωμοσωμικό DNA για ένα ή δύο κυτταρικούς κύκλους. Τα κύτταρα θηλαστικών in vitro εκτίθενται στη δοκιμαζόμενη χημική ουσία, με ή χωρίς σύστημα εξωγενούς μεταβολικής ενεργοποίησης θηλαστικού, εάν χρειάζεται, και καλλιεργούνται για δύο κύκλους αναδιπλασμού σε υλικό το οποίο περιέχει BrdU. Μετά από αγωγή με αναστολέα ατράκτου (π.χ. κολχικίνη) ώστε να μαζευτούν κύτταρα σε μία μεταφασική φάση μίτωσης (μετάφαση C), τα κύτταρα συλλέγονται και γίνονται παρασκευάσματα χρωμοσωμάτων.
1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Κανένα.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ
Στη δοκιμασία μπορούν να χρησιμοποιηθούν αρχέτυπες καλλιέργειες (ανθρώπινα λεμφοκύτταρα), ή καθορισμένες σειρές κυττάρων [κ.χ. κύτταρα ωοθηκών κινέζικου κρικητού (Chinese hamster)]. Οι σειρές κυττάρων πρέπει να ελέγχονται για πρόσμειξη μυκοπλάσματος.
Πρέπει να χρησιμοποιηθούν προσφυές μέσον καλλιέργειας και κατάλληλες συνθήκες επώασης (π.χ. θερμοκρασία, δοχεία καλλιέργειας, συγκέντρωση σε C02 και υγρασία).
Οι δοκιμαζόμενες ουσίες μπορούν να προστεθούν σε μέσον καλλιέργειας ή να εναιωρηθούν σε κατάλληλους φορείς πριν από την αγωγή των κυττάρων. Η τελική συγκέντρωση ενός φορέα στο σύστημα καλλιέργειας δεν πρέπει να επηρεάζει σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων ή το ρυθμό ανάπτυξης και οι επιδράσεις στη συχνότητα των SCE πρέπει να παρακολουθούνται με έλεγχο διαλύτου.
Τα κύτταρα πρέπει να εκτίθενται στη δοκιμαζόμενη ουσία τόσο με όσο και χωρίς σύστημα εξωγενούς μεταβολικής ενεργοποίησης θηλαστικού. Εναλλακτικά, όπου χρησιμοποιούνται κυτταρικοί τύποι με εγγενή μεταβολική δραστηριότητα, ο ρυθμός και η φύση της δραστηριότητας πρέπει να είναι κατάλληλα για τη χημική κατηγορία που δοκιμάζεται.
1.6. Συνθήκες δοκιμασίας
Αριθμός καλλιεργειών
Διπλές τουλάχιστον καλλιέργειες χρησιμοποιούνται για κάθε πειραματική μέτρηση.
Χρήση θετικών και αρνητικών ελέγχων με μάρτυρες
Πρέπει να περιλαμβάνονται σε κάθε πείραμα θετικοί έλεγχοι με τη χρήση τόσο μιας ουσίας άμεσης ενέργειας όσο και μιας ουσίας που απαιτεί μεταβολική ενεργοποίηση. Πρέπει επίσης να γίνεται έλεγχος του φορέα. Τα παρακάτω είναι παραδείγματα ουσιών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν θετικοί έλεγχοι: Όπου είναι δυνατόν μπορεί να γίνεται και πρόσθετος θετικός έλεγχος με ουσία της ίδιας χημικής κατηγορίας όπως η χημική ουσία της δοκιμασίας.
ουσία άμεσης ενέργειας:
αιθυλοσουλφονικό μεθύλιο
ουσία έμμεσης ενέργειας:
κυκλοφωσφαμίδιο.
Συγκέντρωση έκθεσης
Πρέπει να χρησιμοποιούνται τρεις τουλάχιστον κατάλληλα κατανεμημένες συγκεντρώσεις της δοκιμαζόμενης ουσίας. Η υψηλότερη συγκέντρωση μπορεί να προκαλεί σημαντικές τοξικές επιδράσεις, αλλά πρέπει παρ' όλα αυτά να επιτρέπει επαρκή κυτταρικό αναδιπλασιασμό. Οι σχετικά μη υδατοδιαλυτές ουσίες πρέπει να δοκιμάζονται μέχρι το όριο διαλυτότητάς τους με τη χρήση κατάλληλων διαδικασιών. Για πολύ υδατοδιαλυτές μη τοξικές ουσίες, η ανώτερη συγκέντρωση της δοκιμαζόμενης ουσίας πρέπει να καθορίζεται κατά περίπτωση.
Διαδικασία
Παρασκευή καλλιεργειών
Καθορισμένες σειρές κυττάρων δημιουργούνται από βασικές καλλιέργειες (π.χ. με θρυψινοποίηση ή με αποτίναξη), εμφυτεύονται σε δοχεία καλλιέργειας με κατάλληλη πυκνότητα και επωάζονται σε 37 oC. Για μονοστρωματικές καλλιέργειες, ο αριθμός κυττάρων ανά δοχείο καλλιέργειας πρέπει να ρυθμίζεται έτσι ώστε οι καλλιέργειες να μην είναι συνενωμένες περισσότερο από 50 % κατά το χρόνο της συλλογής. Εναλλακτικά, τα κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε καλλιέργεια εναιωρήματος. Οι καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων γίνονται από ηπαρινισμένο αίμα με τη χρήση κατάλληλων τεχνικών μεθόδων και επωάζονται σε 37 oC,
Αγωγή
Τα κύτταρα σε εκθετική φάση ανάπτυξης εκτίθενται στη δοκιμαζόμενη ουσία για κατάλληλη χρονική περίοδο (στις περισσότερες μία έως δύο ώρες είναι αρκετές), αλλά ο χρόνος αγωγής μπορεί να επεκταθεί μέχρι δύο πλήρεις κυτταρικούς κύκλους, σε ορισμένες περιπτώσεις. Κύτταρα χωρίς επαρκή εγγενή μ εταβολική δραστηριότητα πρέπει να εκτίθενται στην δοκιμαζόμενη χημική ουσία τόσο με όσο και χωρίς κατάλληλο σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης. Κατά το τέλος της περιόδου της έκθεσης, τα κύτταρα πλένονται για να απομακρυνθεί η δοκιμαζόμενη ουσία και καλλιεργούνται για δύο κύκλους αναδιπλασιασμού με παρουσία BrdU, Σαν εναλλακτική διαδικασία, τα κύτταρα μπορούν να εκτεθούν ταυτόχρονα στην δοκιμαζόμενη χημική ουσία και στο BrdU για ολόκληρο το χρόνο καλλιέργειας δύο κυτταρικών κύκλων. Οι καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων υφίστανται αγωγή ενώ βρίσκονται σε ημισύγχρονη κατάσταση. Τα κύτταρα αναλύονται κατά τη δεύτερη διαίρεσή τους μετά την αγωγή, εξασφαλίζοντας ότι οι πιο ευαίσθητες φάσεις του κυτταρικού κύκλου έχουν εκτεθεί στη δοκιμαζόμενη ουσία. Όλες οι καλλιέργειες στις οποίες προστίθεται το BrdU πρέπει να βρίσκονται σε σκότος ή σε ημίφως, που παράγεται με λάμπες πυράκτωσης, μέχρι το χρόνο συλλογής των κυττάρων, έτσι ώστε να ελαχιστοποιηθεί η φωτόλυση του DNA που περ ιέχει BrdU.
Συλλογή των κυττάρων
Οι καλλιέργειες κυττάρων υφίστανται αγωγή με αναστολέα ατράκτου (π.χ. κολχικίνη) μία έως τέσσερις ώρες πριν από τη συλλογή. Κάθε καλλιέργεια συλλέγεται και υφίσταται επεξεργασία χωριστά για την παρασκευή χρωμοσωμάτων.
Ετοιμασία χρωμοσωμάτων και χρώση
Η ετοιμασία χρωμοσωμάτων γίνεται με πρότυπες κυτταρογενετικές τεχνικές. Η χρώση των πλακών για να φανούν οι SCE μπορεί να εκτελεστεί με διάφορες τεχνικές (π.χ. μέθοδος φθορισμού και Giemsa).
Ανάλυση
Ο αριθμός των αναλυόμενων κυττάρων πρέπει να βασίζεται στη συχνότητα αυτογενούς ελέγχου των SCE. Συνήθως, 25 τουλάχιστον καλά διεσπαρμένες μεταφάσεις ανά καλλιέργεια αναλύονται για τις SCE. Οι πλάκες κωδικοποιούνται πριν από την ανάλυση. Στα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα αναλύονται μόνο μεταφάσεις που περιέχουν 46 κεντρομερίδια. Σε καθορισμένες σειρές κυττάρων αναλύονται μόνο μεταφάσεις που περιέχουν κεντρομερίδυα ± 2 του κανονικού αριθμού. Πρέπει να αναφέρεται εάν η κεντρομερική μεταβολή της σήμανσης καταγράφεται σαν SCE. Τα αποτελέσματα πρέπει να επιβεβαιώνονται με ανεξάρτητο πείραμα.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Τα δεδομένα πρέπει να παρίστανται με μορφή πίνακα. Ο αριθμός των SCE για κάθε μετάφαση και ο αριθμός των SCE ανά χρωμόσωμα για κάθε μετάφαση πρέπει να καταγράφονται χωριστά για όλες τις καλλιέργειες που υφίστανται την αγωγή και για της καλλιέργειες του μάρτυρα. Τα δεδομένα πρέπει να εκτιμώνται με τη χρήση κατάλληλων στατιστικών μεθόδων.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Στην έκθεση της δοκιμασίας πρέπει να περιλαμβάνονται οι παρακάτω πληροφορίες:
κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν, μέθοδοι συντήρησης της καλλιέργειας κυττάρων,
συνθήκες του πειράματος: σύνθεση των υλικών, συγκέντρωση σε CO2, συγκέντρωση της δοκιμαζόμενης ουσίας, έκδοχο που χρησιμοποιήθηκε, θερμοκρασία επώασης, χρόνος αγωγής, αναστολέας ατράκτου που χρησιμοποιήθηκε, συγκέντρωση του και διάρκεια αγωγής με αυτόν, τύπος συστήματος ενεργοποίησης θηλαστικού που χρησιμοποιήθηκε, θετικές και αρνητικές δοκιμασίες (μάρτυρες),
αριθμός καλλιεργειών κυττάρων ανά δοκιμασία,
λεπτομέρειες της τεχνικής που χρησιμοποιήθηκε για την προετοιμασία των τριβλίων,
αριθμός των μεταφάσεων που αναλύθηκαν (στοιχεία χωριστά για κάθε καλλιέργεια),
μέσος αριθμός SCE ανά μετάφαση και ανά χρωμόσωμα,
κριτήρια για την καταγραφή των SCE,
αιτιολόγηση της επιλογής της δόσης,
σχέση δόσης/αποτελέσματος, εάν είναι δυνατόν,
στατιστική αξιολόγηση,
συζήτηση των αποτελεσμάτων,
ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
4. ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
B.20 ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΘΑΝΑΤΗΦΟΡΟΥ ΦΥΛΟΣΥΝΔΕΤΟΥ ΥΠΟΛΕΙΠΟΜΕΝΟΥ ΧΑΡΑΚΤΗΡΟΣ ΣΕ DROSOPHILA MELANOGASTER
B.20
1. ΜΕΘΟΔΟΙ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.3. ΟΥΣΙΑΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Καμία.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Η δοκιμασία αυτή (SLRL) με τη χρήση της Drosophila melanogaster ανιχνεύει την εμφάνιση μεταλλάξεων σημείου καθώς και μικρών αφαιρέσεων στη σειρά γεννητικών κυττάρων του εντόμου. Η δοκιμασία αυτή αποτελεί δοκιμή πρόσω μετάλλαξης για την εξέταση μεταλλάξεων 800 περίπου θέσεων επί του χρωμοσώματος Χ, που αντιπροσωπεύει το 80 % περίπου όλων των Χ-χρωμοσωμικών θέσεων. Το χρωμόσωμα Χ αντιπροσωπεύει περίπου το ένα πέμπτο ολόκληρου ταυ απλοειδούς γονοτύπου. Οι μεταλλάξεις στο Χ-χρωμάσωμα της Drosophila melanogaster εκφράζονται φαινοτυπικά σε αρσενικά που φέρουν το μεταλλαγμένο γονίδιο. Όταν η μετάλλαξη είναι θανατηφόρα στην ημίζυγη κατάσταση, η παρουσία της συμπεραίνεται από την απουσία μιας συνομοταξίας αρσενικών απογόνων από τις δύο που παράγονται κανονικά από μια ετεράζυγη θηλυκή. Η δοκιμασία SLRL επωφελείται των γεγονότων αυτών με τη χρήση ειδικά σημασμένων και Τακτοποιημένων χρωμοσωμάτων.
1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Κανένα.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ
1.6. Προετοιμασία
Βασικές καλλιέργειες
Μπορούν να χρησιμοποιηθούν τα αρσενικά μιας καλά καθορισμένης καλλιέργειας φυσικού τύπου και τα θηλυκά της βασικής καλλιέργειας Muller-5. Άλλες κατάλληλα σημασμένες θηλυκές βασικές καλλιέργειες με πολλαπλά ανεστραμένα Χ-χρωμοσώματα μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν.
Δοκιμαζόμενη ουσία
Οι δοκιμαζόμενες ουσίες πρέπει να διαλύονται οτο νερό. Οι ουσίες που είναι αδιάλυτες στο νερό μπορούν να διαλυθούν ή να εναιωρηθούν σε κατάλληλα έκδοχα (π.χ. μείγμα αιθανόλης και Tween-60 ή 80), έπειτα να αραιωθούν με νερό η διάλυμα χλωριούχου νατρίου πριν τη χορήγηση. Το διμεθυλσουλφοξείδιο (DMSO) πρέπει να αποφεύγεται σαν έκδοχο.
Αριθμός ζώων
Η δοκιμασία πρέπει να σχεδιαστεί με προκαθορισμένη ευαισθησία και ισχύ. Η παρατηρούμενη συχνότητα αυτόματης μετάλλαξης στον κατάλληλο μάρτυρα θα επηρεάσει σοβαρά τον αριθμό των χρωμοσωμάτων που πρέπει να αναλυθούν.
Οδός χορήγησης
Η έκθεση μπορεί να είναι από το στόμα, με ένεση ή με έκθεση σε αέρια ή ατμούς. Η χορήγηση της δοκιμαζόμενης ουσίας μπορεί να διενεργηθεί σε σακχαροδιάλυμα. Όπου είναι αναγκαίο, οι ουσίες μπορεί να διαλυθούν σε διάλυμα NaCl 0,7 % και να εισαχθούν με ένεση στο θώρακα ή στην κοιλιά.
Χρήση αρνητικών και θετικών δοκιμασιών με μάρτυρες
Θα πρέπει να συμπεριλαμβάνονται αρνητικές δοκιμασίες (με έκδοχα) καθώς και θετικές. Ωστόσο, εάν υπάρχουν ιστορικά εργαστηριακά δεδομένα ελέγχου, δεν χρειάζονται σύγχρονες δοκιμασίες με μάρτυρες.
Επίπεδο έκθεσης
Τρία επίπεδα έκθεσης θεωρούνται απαραίτητα. Για μια αρχική εκτίμηση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα επίπεδο έκθεσης της δοκιμαζόμενης ουσίας, το οποίο μπορεί να είναι είτε η ανώτατη ανεκτή συγκέντρωση είτε εκείνη που παράγει κάποια ένδειξη τοξικότητας. Για τις μη τοξικές ουσίες πρέπει να χρησιμοποιηθεί η έκθεση στην ανώτατη δυνατή συγκέντρωση.
Διαδικασία
Τα αρσενικά φυσικού (wild) τύπου (ηλικίας τριών έως πέντε ημερών) υφίστανται αγωγή με τη δοκιμαζόμενη ουσία και ζευγαρώνονται χωριστά με πλεόνασμα παρθένων θηλυκών της βασικής καλλιέργειας Muller-5 ή από άλλη κατάλληλη σημασμένη βασική καλλιέργεια (με πολλαπλά ανεστραμμένα Χ-χρωμοσώματα). Τα θηλυκά αντικαθίστανται με καινούργια παρθένα θηλυκά κάθε δύο ως τρεις ημέρες για την κάλυψη ολοκλήρου του κύκλου του γεννητικού κυττάρου. Οι απόγονοι των θηλυκών αυτών καταγράφονται για θανατηφόρες επιδράσεις σε σχέση με τις επιδράσεις στο ώριμο σπέρμα, στα σπερματίδια μέσης ή τελευταίας φάσης, στα πρώιμα σπερματίδια, στα σπερματοκύτταρά και στα σπερματογόνια, κατά τη διάρκεια αγωγής. Τα ετερόζυγα θηλυκά F1 των παραπάνω διασταυρώσεων επιτρέπεται να ζευγαρώσουν χωριστά (π.χ. ένα θηλυκό ανά φιαλίδιο) με τους αδελφούς τους. Στη γενεά F2 σε κάθε καλλιέργεια καταγράφεται η απουσία αρσενικών φυσικού (wild) τύπου, Εάν μια καλλιέργεια εμφανίζεται να έχει προκύψει από ένα θηλυκό F1 που έχει ένα θανατογόνο γονίδιο στο μητρικό Χ-χρωμόσωμα (π.χ. δεν παρατηρούνται καθόλου αρσενικά με το υφιστάμενο αγωγή χρωμόσωμα), οι θυγατέρες του θηλυκΌύ αυτού με τον ίδιο γονότντιο θα πρέπει να εξετασθούν για να διαπιστωθεί εάν η θνησιμότητα επαναλαμβάνεται στην επόμενη γενεά.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Τα δεδομένα πρέπει να παρίστανται με μορφή πίνακα που να δείχνει τον αριθμό των Χ-χρωμοσωμάτων που εξετάσθηκαν, τον αριθμό των μη γόνιμων αρσενικών και τον αριθμό των θανατογόνων χρωμοσωμάτων σε κάθε συγκέντρωση έκθεσης και για κάθε περίοδο ζευγαρώματος, για κάθε αρσενικό που υπέστη αγωγή. Οι αριθμοί συσσωματωμάτων διαφορετικών μεγεθών ανά αρσενικό πρέπει να αναφέρονται. Τα αποτελέσματα πρέπει να επιβεβαιώνονται με χωριστό πείραμα. Για την αξιολόγηση των δοκιμασιών του τύπου αυτού πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλες στατιστικές μέθοδοι. Η συσσωμάτωση (clustering) των θανατογόνων γονιδίων που προέρχονται από ένα αρσενικό πρέπει να εξετάζεται και να αξιολογείται με κατάλληλο στατιστικό τρόπο.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Στην έκθεση της δοκιμασίας πρέπει να περιλαμβάνονται οι παρακάτω πληροφορίες:
βασική καλλιέργεια: βασικές καλλιέργειες Drosophila ή στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν, ηλικία των εντόμων, αριθμός των αρσενικών που δέχθηκαν αγωγή, αριθμός στείρων αρσενικών, αριθμός καθορισμένων καλλιεργειών F1, αριθμός καλλιεργειών F2 χωρίς απογόνους, αριθμός χρωμοσωμάτων που φέρουν θανατογόνο γονίδιο που διαπιστώθηκε σε κάθε φάση του γαμετογόνου κυττάρου,
κριτήρια για τον καθορισμό του μεγέθους των ομάδων που υπέστησαν αγωγή,
συνθήκες της δοκιμασίας: λεπτομερής περιγραφή του προγράμματος αγωγής και δειγματοληψίας, επίπεδα έκθεσης, δεδομένα τοξικότητας, αρνητικοί έλεγχοι (διαλύτες) με μάρτυρες και θετικοί έλεγχοι, εάν υπάρχουν,
κριτήρια για την καταγραφή των θανατηφόρων μεταλλάξεων,
σχέση έκθεσης/αποτελέσματος, όπου είναι δυνατόν,
αξιολόγηση των δεδομένων,
συζήτηση των αποτελεσμάτων,
ερμηνεία των αποτελεσμάτων.
3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
4. ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
Β.21 ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ IN VITRO
Β.21
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Καμία.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Συστήματα καλλιέργειας κυττάρων θηλαστικών μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση φαινοτυπικών μεταβολών in vitro που προκαλούνται από χημικές ουσίες που σχετίζονται με κακοήθη μετασχηματισμό in vivo. Ευρύτερα χρησιμοποιούμενα κύτταρα είναι τα C3H10Τ 1/2, 3Τ3, SHE, αρουραίου Fisher και τα πειράματα βασίζονται στις μεταβολές της μορφολογίας των κυττάρων, στο σχηματισμό εστιών ή στις μεταβολές στην εξάρτηση στήριξης σε ημιστέρεη αγάρ αγάρ. Υπάρχουν και λιγότερο χρησιμοποιούμενα συστήματα, τα οποία ανιχνεύουν άλλες φυσιολογικές ή μορφολογικές μεταβολές στα κύτταρα μετά από έκθεση σε καρκινογόνες χημικές ουσίες. Κανένα από τα τελικά σημεία του πειράματος in vitro δεν έχει αποδεδειγμένη μηχανιστική σχέση με τον καρκίνο. Μερικά από τα πειραματικά συστήματα μπορούν να ανιχνεύουν προαγωγείς όγκων. Η κυτταροτοξικότητα μπορεί να καθοριστεί με τη μέτρηση της επίδρασης του υλικού της δοκιμασίας σε αποικία η οποία διαμορφώνει ικανότητες (κλωνική επάρκεια) ή ρυθμούς ανάπτυξης των καλλιεργειών. Η μέτρηση της κυτταροτοξικότητας γίνεται για να αποδειχθεί ότι η έκθεση στη δοκιμαζόμενη χημική ουσία ήταν τοξικολογικά σχετική αλλά ότι δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον υπολογισμό της συχνότητας μετασχηματισμού σε όλες τις δοκιμασίες λόγω του ότι μερικές μπορούν να αφορούν μακρόχρονη επώαση ή/και ανακαλλιέργεια σε τριβλίο.
1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Κανένα.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ
1.6. Προετοιμασία
Κύτταρα
Υπάρχει μια ποικιλία σειρών κυττάρων ή αρχέτυπων κυττάρων, ανάλογα με την εκτελούμενη δοκιμασία μετασχηματισμού. Ο ερευνητής πρέπει να βεβαιωθεί ότι τα κύτταρα στην εκτελούμενη δοκιμασία παρουσιάζουν την κατάλληλη φαινοτυπική μεταβολή μετά από έκθεση σε γνωστά καρκινογόνα και ότι η δοκιμασία, στο εργαστήριό του, είναι αποδεδειγμένης και τεκμηριωμένης αξίας και αξιοπιστίας.
Μέσον καλλιέργειας
Πρέπει να χρησιμοποιούνται προσφυές μέσον και κατάλληλες πειραματικές συνθήκες για την εκτέλεση της δοκιμασίας μετασχηματισμού.
Δοκιμαζόμενη ουσία
Οι δοκιμαζόμενες ουσίες μπορούν να προστεθούν σε υλικά καλλιέργειας ή να διαλυθούν ή να εναιωρηθούν σε κατάλληλα έκδοχα πριν από την αγωγή των κυττάρων. Η τελική συγκέντρωση του εκδόχου στο σύστημα καλλιέργειας δεν πρέπει να επηρεάζει τη βιωσιμότητα του κυττάρου ή το ρυθμό ανάπτυξης ή τη συχνότητα εμφάνισης μετασχηματισμών.
Μεταβολική ενεργοποίηση
Τα κύτταρα πρέπει να εκτίθενται στη δοκιμαζόμενη ουσία τόσο με όσο και χωρίς κατάλληλο σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης. Εναλλακτικά, όταν χρησιμοποιούνται κυτταρικοί τύποι, οι οποίοι διαθέτουν εγγενή μεταβολική δραστηριότητα, η φύση της δραστηριότητας πρέπει να είναι γνωστό ότι είναι κατάλληλη στη δοκιμαζόμενη χημική κατηγορία.
Συνθήκες δοκιμασίας
Χρήση θετικών και αρνητικών ελέγχων (μάρτυρες)
Σε κάθε πείραμα πρέπει να συμπεριλαμβάνονται και θετικοί έλεγχοι, με τη χρήση μιας ένωσης άμεσης ενέργειας και μιας ένωσης που απαιτεί μεταβολική ενεργοποίηση. Πρέπει επίσης να χρησιμοποιείται ένας αρνητικός έλεγχος (με έκδοχο). Τα παρακάτω είναι παραδείγματα ουσιών που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σαν θετικοί μάρτυρες: Όπου χρειάζεται, πρέπει να συμπεριλαμβάνεται ένας πρόσθετος θετικός έλεγχος με ουσία της ίδιας χημικής κατηγορίας όπου ανήκει η δοκιμαζόμενη ένωση.
χημικές ουσίες άμεσης ενέργειας:
αιθυλοσουλφονικό μεθύλιο,
β-προπιολακτόνη·
ενώσεις που απαιτούν μεταβολική ενεργοποίηση;
2-ακετυλαμινοφλουορένιο,
4-διμεθυλαμινοβενζόλιο,
7,12-διμεθυλοβενζανθρακένιο.
Συγκεντρώσεις έκθεσης
Χρησιμοποιούνται διάφορες συγκεντρώσεις της δοκιμαζόμενης ουσίας. Οι συγκεντρώσεις αυτές πρέπει να δημιουργούν μια τοξική επίδραση ανάλογη με τη συγκέντρωση, και η υψηλότερη συγκέντρωση πρέπει να παράγει χαμηλό επίπεδο επιβίωσης, ενώ η επιβίωση στη χαμηλότερη συγκέντρωση πρέπει να είναι κατά προσέγγιση η ίδια όπως και η επιβίωση στον αρνητικά μάρτυρα. Οι σχετικά μη υδατοδιαλυτές ουσίες πρέπει να δοκιμάζονται μέχρι το όριο διαλυτότητάς τους με τη χρήση κατάλληλων διαδικασιών. Για εξαιρετικά υδατοδιαλυτές μη τοξικές ουσίες, η ανώτερη συγκέντρωση της ουσίας πρέπει να καθορίζεται κατά περίπτωση.
Διαδικασία
Τα κύτταρα πρέπει να εκτίθενται για κατάλληλη χρονική περίοδο, ανάλογα με το πειραματικό σύστημα που χρησιμοποιείται, το οποίο μπορεί να περιλαμβάνει ανανέωση των δόσεων με αλλαγή και του μέσου (και αν είναι αναγκαίο, νέο μείγμα μεταβολικής ενεργοποίησης) στην περίπτωση παράτασης της έκθεσης. Τα κύτταρα που δεν διαθέτουν επαρκή εγγενή μεταβολική δραστηριότητα πρέπει να εκτίθενται στη δοκιμαζόμενη ουσία με και χωρίς κατάλληλο σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης. Κατά το τέλος της περιόδου έκθεσης τα κύτταρα πλένονται για να απομακρυνθεί η δοκιμαζόμενη ουσία και καλλιεργούνται υπό συνθήκες κατάλληλες για την εμφάνιση του παρακολουθούμενου μετασχηματισμένου φαινοτύπου και για τον καθορισμό της συχνότητας εμφάνισης μετασχηματισμών. Όλα τα αποτελέσματα επιβεβαιώνονται με ανεξάρτητο πείραμα.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Τα δεδομένα πρέπει να παρίστανται με μορφή πίνακα και να μπορούν να παίρνουν μια ποικιλία μορφών ανάλογα με το εκτελούμενο πείραμα (π.χ. μέτρηση καλλιεργειών μέσα σε αγάρ αγάρ, θετικές καλλιέργειες ή αριθμός μετασχηματισμένων κυττάρων).Όπου χρειάζεται, η επιβίωση πρέπει να εκφράζεται σαν ποσοστό των επιπέδων ουσίας ελέγχου και η συχνότητα μετασχηματισμού να εκφράζεται σαν αριθμός των μετασχηματισμένων ανά αριθμό επιβιωσάντων. Τα δεδομένα πρέπει να αξιολογούνται με τη χρήση κατάλληλης στατιστικής μεθόδου.
3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
3.
3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Στην έκθεση της δοκιμασίας πρέπει να περιλαμβάνονται οι παρακάτω πληροφορίες:
κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν, αριθμός καλλιεργειών κυττάρων, μέθοδοι συντήρησης της καλλιέργειας κυττάρων,
συνθήκες διαδικασίας: συγκέντρωση της δοκιμαζόμενης ουσίας, έκδοχο που χρησιμοποιήθηκε, χρόνος επώασης, διάρκεια και συχνότητα αγωγής, πυκνότητα κυττάρων κατά τη διάρκεια της αγωγής, τύπος χρησιμοποιούμενου συστήματος εξωγενούς μεταβολικής ενεργοποίησης, θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι, προδιαγραφές του παρακολουθούμενου φαινοτύπου, επιλεγμένο σύστημα που χρησιμοποιείται (εάν χρειάζεται), αιτιολόγηση της επιλογής δόσεων.
method used to enumerate viable and transformed cells,
statistical evaluation,
discussion of results,
interpretation of results.
3.2. EVALUATION AND INTERPRETATION See General introduction Part B.
4. REFERENCES See General introduction Part B.
Β.22
1. ΜΕΘΟΔΟΣ
1.
1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.
1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Καμία.
1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Οι επιδράσεις του θανατηφόρου επικρατούντος χαρακτήρας προκαλούν εμβρυϊκούς θανάτους. Η επαγωγή θανατηφόρων επικρατούντων χαρακτήρων με έκθεση σε χημική ουσία δείχνει ότι η ουσία επηρέασε τον σπερμικό ιστό των πειραματόζωων. Είναι γενικά αποδεκτό ότι οι θανατηφόροι επικρατούντες χαρακτήρες οφείλονται σε χρωμοσωμική βλάβη (δομικές και αριθμητικές ανωμαλίες). Εάν η αγωγή παρέχεται στα θηλυκό, ο εμβρυϊκός θάνατος μπορεί επίσης να είναι αποτέλεσμα τοξικών επιδράσεων. Γενικά, τα αρσενικά ζώα εκτίθενται στη δοκιμαζόμενη ουσία και ζευγαρώνονται με παρθένα θηλυκά που δεν έχουν υποστεί αγωγή. Οι διάφορες φάσεις των γαμετογόνων κυττάρων μπορούν να ελεγχθούν με αλληλοδιάδοχα διαστήματα ζευγαρώματος. Η αύξηση των νεκρών εμφυτευμάτων ανά θηλυκό στην ομάδα αγωγής σε σύγκριση με τα νεκρά εμφυτεύματα ανά θηλυκό στην ομάδα μάρτυρα αντανακλά την μετα-εμφυτευματική απώλεια. Η προ-εμφυτευματική απώλεια μπορεί να εκτιμηθεί με βάση τους αριθμούς των ωχρών σωματίων ή με σύγκριση των συνολικών εμφυτευμάτων ανά θηλυκό ζώο στην ομάδα που έχει υποστεί αγωγή και στην ομάδα ελέγχου. Η συνολική επίδραση του θανατηφόρου επικρατούντος χαρακτήρος είναι το άθροισμα της προ- και μεταεμφυτευματικής απώλειας. Ο υπολογισμός της συνολικής επίδρασης του θανατηφόρου επικρατούντος χαρακτήρος βασίζεται στη σύγκριση των ζωντανών εμφυτευμάτων ανά θηλυκό ζώο στην ομάδα δοκιμασίας προς τα ζωντανά εμφυτεύματα ανά θηλυκό ζώο στην ομάδα μαρτύρων. Η μείωση του αριθμού των εμφυτευμάτων σε ορισμένα διαστήματα μπορεί να είναι αποτέλεσμα θανάτωσης κυττάρων (π.χ. σπερματοκυττάρων ή/και σπερματογονίων).
1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Κανένα.
1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ
1.6. Προετοιμασία
Οι δοκιμαζόμενες ουσίες πρέπει όπου είναι δυνατό να διαλύονται ή να εναιωρούνται σε ισότονο διάλυμα χλωριούχου νατρίου. Χημικές ουσίες με υδατοδιαλυτές μπορούν να διαλυθούν ή να εναιωρηθούν σε κατάλληλα έκδοχα. Το χρησιμοποιούμενο έκδοχο πρέπει να μην αντιδρά με την πειραματική χημική ουσία ούτε να παράγει τοξικές επιδράσεις. Πρέπει να χρησιμοποιούνται πρόσφατα παρασκευάσματα της δοκιμαζόμενης χημικής ουσίας.
Συνθήκες δοκιμασίας
Οδός χορήγησης
Η δοκιμαζόμενη ουσία πρέπει γενικά να χορηγείται εφάπαξ. Με βάση τις τοξικολογικές πληροφορίες, μπορεί να χρησιμοποιηθεί πρόγραμμα επαναλαμβανόμενης αγωγής. Οι συνηθισμένες οδοί χορήγησης είναι η εισαγωγή από το στόμα ή η ενδοπεριτονική ένεση. Κατάλληλες μπορεί να είναι και άλλες οδοί χορήγησης.
Πειραματόζωα
Οι αρουραίοι ή οι ποντικοί συνιστώνται σαν πειραματικό είδος. Γίνεται τυχαία επιλογή σε υγιή ζώα πλήρους σεξουαλικής ωριμότητας, τα οποία τοποθετούνται σε ομάδες αγωγής και ομάδες μαρτύρων.
Αριθμός και φύλο
Πρέπει να χρησιμοποιείται επαρκής αριθμός ζώων Αριθμός και φύλο Πρέπει να χρησιμοποιείται επαρκής αριθμός ζώων για αγωγή, λαμβανομένης υπόψη της αυτογενούς μεταβολής του εκτιμώμενου βιολογικού χαρακτήρα. Ο αριθμός των επιλεγέντων ζώων πρέπει να βασίζεται στην προκαθορισμένη ευαισθησία ανίχνευσης και στο βαθμό σημαντικότητας. Για παράδειγμα, σε ένα τυπικό πείραμα, ο αριθμός των αρσενικών σε κάθε ομάδα δόσης πρέπει να είναι επαρκής για να δημιουργεί 30 έως 50 έγκυα θηλυκά ανά διάστημα ζευγαρώματος.
Χρήση αρνητικών και θετικών ελέγχων (μάρτυρες)
Σε κάθε πείραμα πρέπει συγχρόνως να γίνονται θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι (μάρτυρες). Όταν υπάρχουν αποδεκτά αποτελέσματα θετικών ελέγχων από πρόσφατα πειράματα στο ίδιο εργαστήριο, τα αποτελέσματα αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν αντί ενός σύγχρονου θετικού ελέγχου. Οι ουσίες θετικού ελέγχου πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κατάλληλη χαμηλή δόση (π.χ. MMS, ενδοπεριτονιακά, σε 10 mg/kg) για την απόδειξη της ευαισθησίας της δοκιμασίας.
Επίπεδα δόσεων
Κανονικά πρέπει να χρησιμοποιούνται τρία επίπεδα δόσεων. Η υψηλή δόση πρέπει να παράγει σημεία τοξικότητας ή μειωμένη γονιμότητα στα ζώα που υφίστανται την αγωγή. Σε ορισμένες περιπτώσεις, ένα μόνο επίπεδο υψηλής δόσης μπορεί να είναι επαρκές.
Οριακή δοκιμασία
Οι μη τοξικές ουσίες πρέπει να δοκιμάζονται σε 5 g/kg με εφάπαξ χορήγηση, ή σε 1 g/kg ανά ημέρα με επαναλαμβανόμενη χορήγηση.
Διαδικασία
Διατίθενται διάφορα προγράμματα αγωγής. Η εφάπαξ χορήγηση της δοκιμαζόμενης ουσίας χρησιμοποιείται ευρύτατα. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα προγράμματα αγωγής. Κάθε ένα από τα αρσενικά ζευγαρώνεται αλληλοδιάδοχα με ένα ή δύο παρθένα θηλυκά που δεν έχουν υποστεί αγωγή, σε κατάλληλα διαστήματα μετά την αγωγή. Τα θηλυκά πρέπει να αφεθούν με τα αρσενικά κατά τη διάρκεια ενός τουλάχιστον οιστρικού κύκλου ή μέχρι να επιτευχθεί το ζευγάρωμα που διαπιστώνεται από την παρουσία του σπέρματος στον κόλπο ή από την παρουσία βύσματος από πηγμένο σπέρμα στον κόλπο. Ο αριθμός των ζευγαρωμάτων μετά την αγωγή διέπεται από το πρόγραμμα αγωγής και θα πρέπει να εξασφαλίζει τη λήψη δειγμάτων από όλες τις φάσεις του γαμετογόνου κυττάρου μετά την αγωγή. Τα θηλυκά θανατώνονται κατά το δεύτερο ήμισυ της εγκυμοσύνης και το περιεχόμενο της μήτρας εξετάζεται για τον προσδιορισμό του αριθμού των νεκρών και ζωντανών εμφυτευμάτων. Οι ωοθήκες μπορούν να εξετασθούν για τον προσδιορισμό του αριθμού των ωχρών σωματίων.
2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ Τα δεδομένα πρέπει να παρίστανται με μορφή πίνακα για να δείχνουν τον αριθμό των αρσενικών, τον αριθμό των εγκύων θηλυκών και τον αριθμό των μη εγκύων θηλυκών ζώων. Τα αποτελέσματα κάθε ζευγαρώματος, συμπεριλαμβανομένης της ταυτότητας κάθε αρσενικού και θηλυκού, πρέπει να εκτίθενται χωριστά. Για κάθε θηλυκό πρέπει να αναφέρεται η εβδομάδα ζευγαρώματος και για τα αρσενικά το επίπεδο δόσης, και να καταγράφονται οι συχνότητες των ζωντανών εμφυτευμάτων. Ο υπολογισμός της συνολικής επίδρασης του θανατηφόρου επικρατούντος χαρακτήρος βασίζεται στη σύγκριση των ζωντανών εμφυτευμάτων ανά θηλυκό ζώο στην ομάδα δοκιμασίας προς τα ζωντανά εμφυτεύματα ανά θηλυκό στην ομάδα μάρτυρα. Η σχέση των νεκρών προς τα ζωντανά εμφυτεύματα από την ομάδα που υφίσταται αγωγή συγκρινόμενη προς την ίδια σχέση της ομάδας μάρτυρα αναλύεται για να προκύψει η μετεμφυτευματική απώλεια. Εάν τα δεδομένα καταγράφονται σαν πρώιμοι και καθυστερημένοι θάνατοι, αυτό θα πρέπει να διευκρινιστεί στους πίνακες. Πρέπει να αναφερθεί, εάν έχει εκτιμηθεί, η προ-εμφυτευματική απώλεια. Η προ-εμφυτευματική απώλεια μπορεί να υπολογιστεί σαν διαφορά μεταξύ του αριθμού των ωχρών σωματίων και του αριθμού των εμφυτευμάτων ή σαν μείωση του μέσου αριθμού των εμφυτευμάτων ανά μήτρα σε σύγκριση με τα ζευγαρώματα μαρτύρων. Τα δεδομένα αξιολογούνται με κατάλληλες στατιστικές μεθόδους.
είδος, στέλεχος, ηλικία και βάρος των χρησιμοποιούμενων ζώων, αριθμός των ζώων ανά φύλο· οτην ομάδα δοκιμασίας και στην ομάδα ελέγχου,
δοκιμαζόμενη ουσία, έκδοχο, δοκιμαζόμενο επίπεδο δόσης και αιτιολόγηση της επιλογής δόσεων, αρνητικοί και θετικοί έλεγχοι, δεδομένα τοξικότητας,
οδός και διάρκεια έκθεσης,
πρόγραμμα ζευγαρώματος,
μέθοδος για την διαπίστωση του ζευγαρώματος,
χρόνος θανάτωσης,
κριτήρια για την καταγραφή του θανατηφόρου επικρατούντος χαρακτήρος,
σχέση δόσης/αποτελέσματος, εάν είναι δυνατόν,
στατιστική αξιολόγηση,
3221 more provisions are not shown here; each has its own address.