Komisjoni määrus (EÜ) nr 440/2008, 30. mai 2008, millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) (EMPs kohaldatav tekst)

In forceVersion 2008-05-30from 2008-06-01

Grade B

mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.

Ask Gelex about this law

Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/et

Contents

Preamble
1. Artikkel 1
2. Artikkel 2
3. Artikkel 3
4. Artikkel 4
ANNEX
LISA A OSA: FÜÜSIKALIS-KEEMILISTE OMADUSTE MÄÄRAMISE MEETODID
A.1.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.4.
1.5. TABEL: MEETODITE KOHALDATAVUS A. B. C. D.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
1.6.1.2. Seade
1.6.2.
1.6.4.
A.2.
1.
1.4.
1.5. Tabel 1. Meetodite võrdlus
1.6.
1.6.4.
1.6.6.
2. Tabel 2. Temperatuuriparandustegurid fT
A.3.
1.
1.4.
1.4.1.
3. Tabel. 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Meetodite rakendatavus
3. Tabel. 1.4.1.1.1.4.1.2. Meetodite rakendatavus a)
3. Tabel. 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Meetodite rakendatavus a)
4.1.2.3.4.5.6.7.
A.4.
1.
1.4.
1.5.1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.4.
1.6.4.2.
1.6.5.
1.6.6.
1.6.6.1. Inertgaas
1.6.6.2. Küllastuskolonni ttevalmistamine
a)
b)
1.6.7.
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.
A.5.
1.
1.6.
1.6.4.
1.6.4.1.
1.6.4.1.3. Joonis Mõõtekeha
1.6.4.2.
1.6.4.2.2. Kinnitus
a)
b)
2. Tabel: mõõdetud pindpinevuste parandused Ainult vesilahuste jaoks, ρ = 1 g/cm3
3.
A.6.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Katsemenetlus
1.6.3.3. Seade
1.6.3.4. Seade (vt jooniseid 4 ja 3)
1.6.4.
2.
3.
A.8.
1.
1.3. Loksutamismeetod
1.4.
1.5.
1.5.1. Loksutamismeetod
1.5.2. Loksutamismeetod
1.5.3. Loksutamismeetod
1.6.
1.6.2.
1.6.2.1.
1.6.2.3.
1.6.3.
1.6.3.1. Seade
1.6.3.2. Surnud aja t0 arvutamine
2. Loksutamismeetod
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.
A.9.
1.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Abeli seade
A.10.
1.
1.6.
1.6.2.
3.
A.11.
1.
1.6.
A.12.
1.
1.3.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
A.13.
1.
1.6.
1.6.2. a)
2.
A.14.
1.
1.1. a)
1.4.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2. a)
1.6.3.
1.6.3.2. a)
3.
A.15.
1.
1.6.
A.16.
1.
1.6.
1.6.1.
4.
Joonis 1 20 mm katsekuubiku skeem
Joonis 2 Tüüpiline temperatuuri/aja kõver
A.17.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
3.
3.2. a)
A.18.
1.
1.6.
2.
2.2.
2.2.4.
A.19.
1.
1.6.
2.
2.2.
A.20.
1.
1.5.
1.5.4.
2.
3.
3.1.
A.21.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.2.
2.
2.1. Tabel 1 Näiteid tulemustest
3.
3.2. a)
4.1.
Joonis 1 Surveanum
Joonis 2 Tugiraam
Joonis 3 Süütesüsteem
1.
2.
4.
1.2. Tahkete ainete jaoks
1. liide Hindamismeetod SISSEJUHATUS
a)
b)
2. liide
Joonis 1 Seade aururõhukõvera määramiseks dünaamilise meetodi kohaselt
Joonis 2a Seade aururõhukõvera määramiseks staatilise meetodi kohaselt (U-toru-manomeetri abil)
Joonis 2b Seade aururõhukõvera määramiseks staatilise meetodi kohaselt (rõhunäituri abil)
Joonis 3 Isoteniskoop (vt viidet 7)
Joonis 4 Seade aururõhukõvera määramiseks aururõhukaalude meetodi kohaselt
Joonis 5 Näiteseade aurustumise uurimiseks madalal rõhul efusioonmeetodi abil efusiooniraku mahuga 8 cm
Joonis 6a Näitlik läbivoolusüsteem aururõhu määramiseks gaasi küllastamise meetodi kohaselt
Joonis 6b Näitlik küllastuskolonni järgi ühendatud kapillaartoruga süsteem aururõhu määramiseks gaasi küllastamise meetodi kohaselt
Joonis 7 Näitlik katseseade aururõhu uurimiseks pöörleva rootori meetodi kohaselt
Joonis 8 Pöördrootormõõtepea näide
Joonis 1 Kolonn-elueerimismeetod tsirkulatsioonpumbaga
Joonis 2 Tüüpiline mikrokolonn
Joonis 3 Tüüpiline mikrokolonn
Joonis 4 Kolonn-elueerimismeetod ühtlustava anumaga
1. liide Arvutus-/hindamismeetodid SISSEJUHATUS
Jaotusteguri esialgne hindamine Jaotusteguri hinnangulise väärtuse võib leida testaine lahustuvuse põhjal puhastes lahustites.
Arvutusmeetodite põhimõte
Kvaliteedinõuded
Arvutuskäik Hanschi π-meetod
Märkused i)
Aruanne
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
2.liide Soovitatavad võrdlusained HPLC meetodi puhul
Joonis Põlemisriba valmistamise vorm ja abivahendid
Joonis Seade
Näitlik materjalide spetsifikatsioon termilise tundlikkuse katseks (vt DIN 1623) 1)2)3)
Joonis 1 Termilise tundlikkuse katseseade
Joonis 2 Termilise tundlikkuse katse
Joonis 3 Kuumutamiskiiruse kaliibrimine termilise tundlikkuse katseks
Joonis 4 Löögikatse seade
Joonis 5 Hõõrdetundlikkuse katseseade
Joonis Vorm ja abivahendid põlemisriba valmistamiseks
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
3.1.2.3.4.5.6.7.8.9.
ÜLDINE SISSEJUHATUS A.
i)
ii)
B.1a.
1.
1.4.
1.5.
1.5.3.
1.6.
3.
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)
B.1b.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
3.
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)
B.2.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1. a)
B.3.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. Mürgisuse hindamine teisel sool
3.
B.4.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
2.
3.
4.1)2)3)4)5)5a)6)7)8)9)
Tabel 1 Nahapunetuse ja kooriku tekkimine Turse tekkimine NAHA REAKTSIOONIDE MÄÄRAMINE
B.5.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.2.3
1.4.2.7.
2.
3.
4.1)2)3)4)5)6)6a)7)8)9)10)
Tabel 1 SILMAKAHJUSTUSTE HINDAMINE
Sarvkest
Vikerkest
Sidekest
Sidekesta turse
B.6.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.2.
1.5.1.3.
1.5.2.
1.5.2.2.
1.5.2.3.
3. Katsearuanne (GMPT ja Buehleri katse)
B.7.
1.
1.4.
1.4.2.
1.4.3.
3. KATSEARUANNE
B.8.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1.
pt_2 a)
B.9.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
B.10.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. KATSEARUANNE
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)
B.11.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
2.
3.
4.1)2)3)4)5)6)7)8)
B.12.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
1.5.2. a)
2.
3. KATSEARUANNE
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)
B.13/14.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
2.
3. KATSEARUANNE
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)20)21)22)23)24)
B.15.
1.
1.6. Ettevalmistused
Metaboolne aktivatsioon
Test-tüvi
Rakusööde
Positiivsete ja negatiivsete kontrollide kasutamine
Ekspositsiooni kontsentratsioon
Inkubatsiooni tingimused
Spontaansete mutatsioonide sagedus
Replikatsioonide arv
3.
B.16.
1.
1.6. Ettevalmistused
Metaboolne aktivatsioon
Test-tüved
Rakusööde
Positiivsete ja negatiivsete kontrollide kasutamine
Ekspositsiooni kontsentratsioonid
Inkubatsioonitingimused
Spontaanse mitootilise rekombinatsiooni sagedus
Replikatsioonide arv
3.
B.17.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. KATSEARUANNE
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)20)21)22)23)24)25)26)
B.18.
1.
1.6. Ettevalmistused
Rakukultuuride arv
Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine
Kasutatavad kontsentratsioonid
Rakud
Metaboolne aktiveerimine
Rakukultuuride valmistamine
Rakukultuuride töötlemine uuritavate ainetega Primaarsed roti hepatotsüüdid
Autoradiograafilised määramised
VSLi määramised
2.
3.
B.19.
1.
1.6. Katsetingimused
Rakukultuuride arv
Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine
Testimiseks kasutatavad kontsentratsioonid
Rakukultuuride valmistamine
Töötlemine
Rakkude külvamine
Kromosoomide prepareerimine ja värvimine
Analüüs
3.
B.20.
1.
1.6. Ettevalmistused
Kärbseliinid
Uuritav aine
Loomade arv
Manustamisviis
Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine
Ekspositsiooni tasemed
3.
B.21.
1.
1.6. Ettevalmistused
Rakud
Keskkond
Uuritav aine
Metaboolne aktivatsioon
Positiivsete ja negatiivsete kontrollide kasutamine
Kasutatavad kontsentratsioonid
3.
B.22.
1.
1.6. Ettevalmistused
Manustamisviis
Katseloomad
Arv ja sugu
Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine
Annused
Piirtest

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse Euroopa Parlamendi ja nõukogu 18. detsembri 2006. aasta määrust (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ, eriti selle artikli 13 lõiget 3,

ning arvestades järgmist:

(1) Määruse (EÜ) nr 1907/2006 kohaselt tuleb katsemeetodid, mida kasutatakse teabe saamiseks aine omaduste kohta, võtta vastu ühenduse tasandil.

(2) Nõukogu 27. juuni 1967. aasta direktiivi nr 67/548/EMÜ (ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta) V lisas on esitatud meetodid ainete ja valmististe füüsikalis-keemiliste omaduste, toksilisuse ja ökotoksilisuse määramiseks. Direktiivi 67/584/EMÜ V lisa on Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiviga 2006/121/EÜ jäetud välja alates 1. juunist 2008.

(3) Direktiivi 67/548/EMÜ V lisas esitatud katsemeetodid tuleks võtta üle käesolevasse määrusesse.

(4) Käesoleva määrusega ei välistata muude katsemeetodite kasutamist, kui see on kooskõlas määruse (EÜ) nr 1907/2006 artikli 13 lõikega 3.

(5) Katsemeetodite kavandamisel tuleks võtta täielikult arvesse loomkatsete asendamise, vähendamise ja täiustamise põhimõtteid, eriti kui sobivad valideeritud meetodid loomkatsete asendamiseks, vähendamiseks ja täiustamiseks on muutunud kättesaadavaks.

(6) Käesoleva määruse sätted on kooskõlas määruse (EÜ) nr 1907/2006 artikli 133 kohaselt asutatud komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:

Artikkel 1

Määruse (EÜ) nr 1907/2006 rakendamisel kasutatavad katsemeetodid on esitatud käesoleva määruse lisas.

Artikkel 2

Komisjon vaatab käesolevas määruses esitatud katsemeetodeid vajaduse korral läbi, et asendada, vähendada ja täiustada selgroogsetega tehtavaid katseid.

Artikkel 3

Viiteid direktiivi 67/548/EMÜ V lisale tõlgendatakse viidetena käesolevale määrusele.

Artikkel 4

Käesolev määrus jõustub järgmisel päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Käesolevat määrust kohaldatakse alates 1. juunist 2008. Brüssel, 30. mai 2008 Komisjoni nimel komisjoni liige Stavros Dimas

ANNEX

LISA A OSA: FÜÜSIKALIS-KEEMILISTE OMADUSTE MÄÄRAMISE MEETODID

A.1. SULAMIS-/KÜLMUMISTEMPERATUUR

A.1.

1. MEETOD Enamik kirjeldatud meetoditest põhineb OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viidetes 2 ja 3.

1.

1.1. SISSEJUHATUS Kirjeldatud meetodid ja seadmed on ette nähtud ainete sulamistemperatuuri määramiseks olenemata nende puhtusastmest. Meetodi valik sõltub analüüsitava aine iseloomust. Määravaks teguriks on see, kas aine on kergesti või raskesti või üldse mitte peenestatav. Mõnede ainete puhul on kohasem määrata külmumis- või tahkumistemperatuur ning meetod sisaldab ka nende määramise standardeid. Kui aine teatavate omaduste tõttu ei ole otstarbekohane määrata ühtki eespool toodud parameetrit, võib otstarbekas olla määrata hangumistemperatuur.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Sulamistemperatuuri defineeritakse temperatuurina, mille juures aine läheb tahkest olekust vedelasse, ja ideaalis vastab see temperatuur külmumistemperatuurile. Kuna paljude ainete puhul toimub faasisiire mingis temperatuurivahemikus, nimetatakse seda sageli sulamisvahemikuks. Ühikute teisendamine (K oC-ks) t = T – 273,15 t: temperatuur Celsiuse skaalal, Celsiuse kraadides ( oC) T: termodünaamiline temperatuur, kelvinites (K)

1.3. VÕRDLUSAINED Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega. Mõned kaliibrimisained on loetletud viites 4.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Määratakse temperatuur (temperatuurivahemik), mille juures toimub faasisiire tahkest olekust vedelasse või vedelast olekust tahkesse. Praktikas määratakse testaine proovi atmosfäärirõhul kuumutamisel/jahutamisel sulamise/külmumise alg- ja lõppfaasi temperatuurid. Kirjeldatud viit tüüpi meetodeid, nimelt kapillaartorumeetodit, kuumlaua meetodeid, külmumistemperatuuri määramisi, termoanalüüsimeetodeid ja (naftaõlide jaoks välja töötatud) hangumistemperatuuri määramist. Teatud juhtudel võib olla otstarbekas määrata külmumistemperatuuri asemel sulamistemperatuur.

1.4.

1.4.1. Kapillaartorumeetod

1.4.1.

1.4.1.1. Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks Väike kogus peenestatud ainet viiakse kapillaartorusse ja surutakse tihedalt kokku. Kapillaartoru kuumutatakse koos termomeetriga, reguleerides temperatuuri tõusu nii, et tegeliku sulamisprotsessi ajal tõuseb temperatuur kiirusega umbes alla 1 K/min. Määratakse sulamise alg- ja lõpptemperatuur.

1.4.1.2. Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks Põhimõttelt analoogsed punktis 1.4.1.1 kirjeldatuga, kuid kapillaartoru ja termomeeter asuvad kuumutatavas metallplokis ning on vaadeldavad plokis olevate vaatlusavade kaudu.

1.4.1.3. Määramine fotoraku abil Kapillaartorus asuvat proovi kuumutatakse automaatrežiimil metallsilindris. Silindris oleva ava kaudu juhitakse läbi aine täppiskaliibritud fotorakule suunatud valguskiir. Enamiku ainete optilised omadused muutuvad sulades läbipaistmatust läbipaistvaks. Fotorakuni jõudva valguse intensiivsus suureneb ja saadab kuumkambris asuva plaatina-takistustermomeetri temperatuuri digitaalnäidikule stoppsignaali. Mõnede tugeva värvusega ainete jaoks see meetod ei sobi.

1.4.2. Kuumlauad

1.4.2.

1.4.2.1 Kofleri sulavuslaud Kofleri sulavuslaud koosneb kahest erineva soojusjuhtivusega elektriliselt kuumutatavast metallosast, kusjuures laud on valmistatud selliselt, et temperatuurigradient on kogu selle pikkuses peaaegu lineaarne. Sulavuslaua temperatuur võib varieeruda piirides 283–573 K ning sellel on spetsiaalne temperatuurinäidik antud lauale kohandatud skaala, osuti ja jooksikuga. Sulamistemperatuuri määramiseks kantakse aine õhukese kihina otse sulavuslaua pinnale. Mõne sekundi jooksul kujuneb välja terav eraldusjoon vedela ja tahke faasi vahel. Temperatuuri eraldusjoonel loetakse osuti viimisega eraldusjoonele.

1.4.2.2. Sulavusmikroskoop Väga väikeste materjalikoguste sulamistemperatuuri määramisel kasutatakse mitmesuguste kuumlaudadega mikroskoope. Enamiku kuumlaudade puhul mõõdetakse temperatuuri tundliku termopaari abil, vahel kasutatakse aga elavhõbetermomeetrit. Tüüpilises sulavusmikroskoobi kuumlauas on kuumkamber, milles olevale metallalusele asetatakse objektiklaasil olev proov. Metallaluse keskel on ava, mille kaudu siseneb mikroskoobi valguspeeglist lähtuv valgus. Kasutamise ajal suletakse kamber klaasplaadiga, mis takistab õhu juurdepääsu proovile. Proovi kuumutamist reguleeritakse reostaadiga. Väga täpseteks mõõtmisteks optiliselt anisotroopsete ainetega võib kasutada polariseeritud valgust.

1.4.2.3. Meniskimeetod Seda meetodit kasutatakse eelkõige polüamiidide puhul. Temperatuur, mille juures kuumlaua ja polüamiid-katseobjektile toetuva katteklaasi vahele paigutatud silikoonõli menisk nihkub, määratakse visuaalselt.

1.4.3. Külmumistemperatuuri määramise meetod Proov asetatakse spetsiaalsesse katseklaasi ja paigutatakse külmumistemperatuuri määramiseks seadmesse. Jahutamise ajal segatakse proovi pidevalt kergelt ja mõõdetakse sobivate vaheaegade tagant temperatuuri. Niipea, kui temperatuur paari mõõtmise kestel püsima jääb, registreeritakse see temperatuur külmumistemperatuurina (arvestades ka termomeetri viga). Vältida tuleb allajahutamist, säilitades tahke ja vedela faasi vahel tasakaalu.

1.4.4. Termoanalüüs

1.4.4.

1.4.4.1 Diferentsiaaltermoanalüüs (DTA) Registreeritakse ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride erinevuse sõltuvus temperatuurist. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (sulamine) või eksotermilise (külmumine) kõrvalekaldena temperatuurikõvera nulljoonest.

1.4.4.2 Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria (SDK) Registreeritakse neelduva energia koguse sõltuvus temperatuurist ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuritavas aines ja võrdlusmaterjalis. Neelduv energia kulutatakse uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride ühtlustamisele. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (sulamine) või eksotermilise (külmumine) kõrvalekaldena soojusbilansi kõvera nulljoonest.

1.4.5. Hangumistemperatuur Meetod on välja töötatud naftaõlide jaoks ja sobib kasutamiseks madala sulamistemperatuuriga õlitaoliste ainete puhul. Pärast algset kuumutamist jahutatakse proovi kindla kiirusega ja jälgitakse iga 3 K tagant selle voolavust. Madalaim temperatuur, mille juures aine liikumist täheldatakse, registreeritakse hangumistemperatuurina.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Erinevate sulamistemperatuuri/sulamisvahemiku määramise meetodite kohaldatavust ja täpsust kirjeldatakse järgmises tabelis.

1.5. TABEL: MEETODITE KOHALDATAVUS A. B. C. D.

Kapillaartorumeetodid Mõõtmismeetod Peenestatavad ained Raskesti peenestatavad ained Temperatuurivahemik Hinnanguline täpsus Olemasolev standard Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks jah Ainult mõnede puhul 273–573 K ±0,3 K JIS K 0064 Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks jah Ainult mõnede puhul 293 kuni > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Määramine fotoraku abil jah Lisaseadmete abil paljude puhul 253–573 K ±0,5 K Kuumlauad ja külmutamismeetodid Mõõtmismeetod Peenestatavad ained Raskesti peenestatavad ained Temperatuurivahemik Hinnanguline täpsus Olemasolev standard Kofleri sulavuslaud jah ei 283 kuni > 573 K ±1,0 K ANSI/ASTM D 3451-76 Sulavusmikroskoop jah Ainult mõnede puhul 273 kuni > 573 K ±0,5 K DIN 53736 Meniskimeetod ei Eelkõige polüamiidide puhul 293 kuni > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Külmumistemperatuuri meetodid jah jah 223–573 K ±0,5 K nt BS 4695 Termoanalüüs Mõõtmismeetod Peenestatavad ained Raskesti peenestatavad ained Temperatuurivahemik Hinnanguline täpsus Olemasolev standard Diferentsiaaltermoanalüüs jah jah 173 – 1273 K kuni 600 K ±0,5 K kuni 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria jah jah 173 – 1273 K kuni 600 K ±0,5 K kuni 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Hangumistemperatuur Mõõtmismeetod Peenestatavad ained Raskesti peenestatavad ained Temperatuurivahemik Hinnanguline täpsus Olemasolev standard Hangumistemperatuur Naftaõlide ja õlitaoliste ainete jaoks Naftaõlide ja õlitaoliste ainete jaoks 223–323 K ±3,0 K ASTM D 97-66

1.6. MEETODITE KIRJELDUS Peaaegu kõigi katsemeetodite kirjeldus on ära toodud rahvusvahelistes ja siseriiklikes standardites (vt liidet 1).

1.6.

1.6.1. Kapillaartorumeetodid Temperatuuri aeglasel tõstmisel ilmnevad peenestatud ainete puhul tavaliselt joonisel 1 näidatud sulamisetapid.

1.6.1.

Joonis 1 A-etapp B-etapp C-etapp D-etapp E-etapp A-etapp Sulamise algus: peened tilgakesed kinnituvad ühtlaselt kapillaartoru siseseinale. B-etapp Kokkutõmbumine: proov eemaldub sulava massi kokkutõmbumise tõttu siseseinast. C-etapp Kokkutõmbunud proov vajub kokku ja vedeldub. D-etapp Vedeliku pinnal kujuneb välja täielik menisk, kuid arvestatav osa proovist jääb veel tahkeks. E-etapp Sulamise lõppfaas: tahkeid osakesi enam pole. Sulamistemperatuuri määramisel registreeritakse temperatuur nii sulamise alg- kui ka lõppfaasis.

1.6.1.1. Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks Joonisel 2 on näidatud standarditud klaasist sulamistemperatuuri määramise seadet (JIS K 0064); kõik mõõdud on millimeetrites.

1.6.1.1.

Joonis 2 A: Mõõtmisnõu B: Kork C: Õhuava D: Termomeeter E: Lisatermomeeter F: Vannivedelik G: Klaasist kapillaartoru pikkusega 80–100 mm, sisediameetriga 1,0 ± 0,2 mm ja seinapaksusega 0,2–0,3 mm H: Külgtoru

Vedelikuvannis kuumutamisel kasutatav vedelik

Valida tuleks sobiv vedelik. Vedeliku valik sõltub määratavast sulamistemperatuurist, nt sobib parafiinõli sulamistemperatuuridele kuni 473 K, silikoonõli sulamistemperatuuridele kuni 573 K. 523 K ületavate sulamistemperatuuride puhul võib kasutada segu kolmest osast väävelhappest ja kahest osast (massisuhtes) kaaliumsulfaadist. Seesuguste segude kasutamisel tuleb rakendada kohaseid ettevaatusabinõusid.

Termomeeter

Kasutada tuleks ainult järgmiste või nendega võrdväärsete standardite nõuetele vastavaid termomeetreid: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Katse käik

Kuiv aine peenestatakse uhmris ja viiakse ühest otsast kinnisesse kapillaartorusse nii, et pärast kokkusurumist täidab aine kapillaartoru 3 mm ulatuses. Ühtlaselt tihendatud proovi saamiseks tuleks kapillaartorul lasta klaastorus umbes 700 mm kõrguselt vertikaalselt vastu kellaklaasi kukkuda. Täidetud kapillaartoru paigutatakse vanni nii, et termomeetri elavhõbedareservuaari keskosa puutub kapillaartoruga kokku kohas, kus asub proov. Tavaliselt asetatakse kapillaartoru seadmesse temperatuuril umbes 10 K alla sulamistemperatuuri. Vannivedelikku soojendatakse nii, et temperatuur tõuseb umbes 3 K/min. Soovitatav on vedelikku segada. Umbes 10 K enne eeldatava sulamistemperatuurini jõudmist vähendatakse temperatuuri tõusu kiiruseni mitte üle 1 K/min.

Arvutamine

Sulamistemperatuur arvutatakse järgmiselt: T = TD+0,00016(TD – TE) n kus: T parandatud sulamistemperatuur (K) TD termomeetri D temperatuurinäit (K) TE termomeetri E temperatuurinäit (K) n skaalajaotuste arv termomeetri D elavhõbedasamba väljaulatuval osal

1.6.1.2. Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks

1.6.1.2. Seade

Koosneb:

silindrilisest metallplokist, mille ülaosa on õõnes ja moodustab kambri (vt joonist 3);

metallkorgist ühe või kahe avaga, mis võimaldavad metallplokki torusid paigaldada;

metallploki kütteseadmest, mis võib olla lahendatud näiteks elektritakistusena plokis;

reostaadist võimsuse reguleerimiseks juhul, kui kasutatakse elektrilist kütteseadet;

neljast üksteise suhtes täisnurga all paiknevast kuumuskindla klaasiga aknast kambri külgseintel. Ühe sellise akna ette on paigaldatud okulaar kapillaartoru jälgimiseks. Kolme ülejäänud akent kasutatakse sisemuse valgustamiseks lampide abil;

ühest otsast kinnisest kuumuskindlast klaasist kapillaartorust (vt 1.6.1.1).

Vt punktis 1.6.1.1 nimetatud standardeid. Sobivad ka võrreldava täpsusega termoelektrilised mõõteseadmed.

Joonis 3 Termomeeter Kapillaartoru Metallkork Okulaar Lamp Elektritakistus Metallist kuumplokk

1.6.1.3. Määramine fotoraku abil Seade ja katse käik Seade koosneb automaatse küttesüsteemiga metallkambrist. Kolm kapillaartoru täidetakse vastavalt punktile 1.6.1.1 ja paigutatakse ahju. Seadme kaliibrimiseks on võimalik kasutada mitmesuguseid lineaarseid temperatuuritõuse; sobivat temperatuuritõusu reguleeritakse elektriliselt vastavalt seadistatud konstantsele lineaarsele tõusukiirusele. Meerikud näitavad ahju tegelikku temperatuuri ja kapillaartorus oleva aine temperatuuri.

1.6.2. Kuumlauad

1.6.2.

1.6.2.1. Kofleri sulavuslaud Vt liidet.

1.6.2.2. Sulavusmikroskoop Vt liidet.

1.6.2.3. Meniskimeetod (polüamiididele) Vt liidet. Sulamistemperatuuri vahemikus ei tohiks temperatuur tõusta kiiremini kui 1 K/min.

1.6.3. Külmumistemperatuuri määramise meetodid Vt liidet.

1.6.4. Termoanalüüs

1.6.4.

1.6.4.1. Diferentsiaaltermoanalüüs Vt liidet.

1.6.4.2. Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria Vt liidet.

1.6.5. Hangumistemperatuuri määramine Vt liidet.

2. ANDMED Mõningatel juhtudel on termomeetri näitusid vaja korrigeerida.

3. ARUANDLUS Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid: Sulamistemperatuurina registreeritakse vähemalt kahe hinnangulise täpsuse piiridesse (vt tabeleid) jääva mõõtetulemuse keskmine. Kui sulamise alg- ja lõppfaasi temperatuuride vahe jääb meetodi hinnangulise täpsuse piiridesse, registreeritakse sulamistemperatuurina sulamise lõppfaasi temperatuur; vastasel juhul registreeritakse mõlemad väärtused. Kui aine enne sulamistemperatuurini jõudmist laguneb või sublimeerub, registreeritakse temperatuur, mille juures see aset leiab. Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.

kasutatud meetodit;

aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud);

hinnangulist täpsust.

4.1.2.3.4. VIITED OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.

A.2. KEEMISTEMPERATUUR

A.2.

1. MEETOD Enamik kirjeldatud meetoditest põhineb OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viidetes 2 ja 3.

1.

1.1. SISSEJUHATUS Siin kirjeldatud meetodeid ja seadmeid saab kasutada vedelate ja madala sulamistemperatuuriga ainete korral eeldusel, et nendega ei toimu allpool keemistemperatuuri mingeid keemilisi reaktsioone (näiteks autooksüdatsiooni, ümberasetust, lagunemist jne). Meetodid sobivad kohaldamiseks nii puhastele kui ka lisanditega vedelikele. Põhirõhk on pandud fotorakk-detektorit või termoanalüüsi kasutavatele meetoditele, kuna need sobivad nii sulamis- kui ka keemistemperatuuri määramiseks. Lisaks on mõõtmised automatiseeritavad. Dünaamilise meetodi eelis on sobivus ka aururõhu määramiseks ning puudub vajadus parandada keemistemperatuuri normaalrõhule (101,325 kPa), kuna rõhku on mõõtmise käigus võimalik manostaadi abil normaalrõhule reguleerida. Märkused Lisandite mõju keemistemperatuuri määramisele sõltub olulisel määral lisandi iseloomust. Kui proov sisaldab tulemust mõjutada võivaid lenduvaid lisandeid, võib seda puhastada.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Keemistemperatuur normaalrõhul defineeritakse temperatuurina, mille juures vedeliku aururõhk on 101,325 kPa. Kui keemistemperatuuri ei määrata normaalrõhul, kirjeldab aururõhu sõltuvust temperatuurist Clausiuse-Clapeyroni võrrand: log p = Δ Hv2,3 RT+const. kus: P aine aururõhk paskalites ΔHV aine aurustumissoojus (J mol-1) R universaalne gaasikonstant = 8,314 (J mol-1 K-1) T termodünaamiline temperatuur (K) Keemistemperatuur registreeritakse mõõtmisaegse õhurõhu suhtes. Teisendused Rõhk (ühikud: kPa) 100 kPa 1bar = 0,1 MPa (ühik bar on lubatud, kuid ei ole soovitatav) 133 Pa 1mm Hg=1 Torr (ühikud mm Hg ja Torr ei ole lubatud) 1 atm normaalatmosfäär = 101325 Pa (ühik atm ei ole lubatud) Temperatuur (ühikud: K) t = T -273,15 t: temperatuur Celsiuse skaalal, Celsiuse kraadides ( oC) T: termodünaamiline temperatuur, kelvinites (K)

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Viis meetodit keemistemperatuuri (keemistemperatuuri vahemiku) määramiseks põhinevad keemistemperatuuri mõõtmisel, ülejäänud kaks termoanalüüsil.

1.4.

1.4.1. Määramine ebulliomeetri abil Ebulliomeetrid töötati algselt välja molaarmassi määramiseks keemistemperatuuri tõusu järgi, kuid nad sobivad ka keemistemperatuuri täpseks mõõtmiseks. Väga lihtsat seadet kirjeldatakse ASTM D 1120-72 (vt liidet). Selles seadmes kuumutatakse vedelikku atmosfäärirõhul tasakaalutingimustes kuni keemiseni.

1.4.2. Dünaamiline meetod Selle meetodi kohaselt mõõdetakse keemise ajal tagasijooksus sobiva termomeetri abil auru kondensatsioonitemperatuur. Meetod võimaldab rõhku varieerida.

1.4.3. Destillatsioonimeetod keemistemperatuuri määramiseks Selle meetodi kohaselt mõõdetakse vedeliku destillatsioonil auru kondensatsioonitemperatuur ja destillaadi kogus.

1.4.4. Siwoloboffi meetod Proovi kuumutatakse katseklaasis vedelikuvannil. Katseklaasi paigutatakse alt kinni joodetud kapillaartoru, mille alumises osas on õhumull.

1.4.5. Määramine fotoraku abil Mõõtmine tehakse eralduvate mullide põhjal automaatselt ja fotoelektriliselt, järgides Siwoloboffi meetodit.

1.4.6. Diferentsiaaltermoanalüüs Registreeritakse ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride erinevuse sõltuvus temperatuurist. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (keemine) kõrvalekaldena temperatuurikõvera nulljoonest.

1.4.7. Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria Registreeritakse neelduva energia koguse sõltuvus temperatuurist ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuritavas aines ja võrdlusmaterjalis. Neelduv energia kulutatakse uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride ühtlustamisele. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (keemine) kõrvalekaldena soojusbilansi kõvera nulljoonest.

1.5. Tabel 1. Meetodite võrdlus

KVALITEEDINÕUDED Erinevate keemistemperatuuri/keemistemperatuuri vahemiku määramise meetodite kohaldatavust ja täpsust kirjeldatakse tabelis 1. Mõõtmismeetod Hinnanguline täpsus Olemasolev standard Ebulliomeeter ±1,4 K (kuni 373 K), ±2,5 K (kuni 600 K), ASTM D 1120-72 Dünaamiline meetod ±0,5 K (kuni 600 K) Destillatsioonimeetod (keemistemperatuuri vahemik) ±0,5 K (kuni 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Siwoloboffi meetod ± 2 K (kuni 600 K) Määramine fotoraku abil ±0,3 K (373 K juures) Diferentsiaaltermoanalüüs ±0,5 K (kuni 600 K) ±2,0 K (kuni 1273 K) ASTM E 537-76 Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria ±0,5 K (kuni 600 K) ±2,0 K (kuni 1273 K) ASTM E 537-76

1.6. MEETODITE KIRJELDUS Osade katsemeetodite kirjeldus on ära toodud rahvusvahelistes ja siseriiklikes standardites (vt liidet).

1.6.

1.6.1. Ebulliomeeter Vt liidet.

1.6.2. Dünaamiline meetod Vt katsemeetodit A.4 aururõhu määramiseks. Registreeritakse 101325 kPA avaldatavale rõhule vastav keemistemperatuur.

1.6.3. Destillatsioonimeetod (keemistemperatuuri vahemik) Vt liidet.

1.6.4. Siwoloboffi meetod Ligikaudu 5 mm läbimõõduga katseklaasis olevat proovi kuumutatakse sulamistemperatuuri määramise seadmes (joonis 1). Joonisel 1 on näidatud standarditud klaasist sulamis- ja keemistemperatuuri määramise seade (JIS K 0064) (kõik mõõdud on millimeetrites). Katseklaasi paigutatakse alumisest otsast ligikaudu 1 cm kauguselt kinni joodetud kapillaartoru (keedukapillaar). Lisatava testaine kogus valitakse selline, et kapillaartoru kinnijoodetud osa jääb allapoole vedeliku pinda. Keedukapillaariga katseklaas seotakse kas kummipaelaga termomeetri külge või kinnitatakse külgtoega (vt joonist 2). Joonis 2 Siwoloboffi meetod Joonis 3 Muudetud meetod Vedelikuvannis kuumutamisel kasutatav vedelik valitakse keemistemperatuuri järgi. Temperatuuridel kuni 573 K võib kasutada silikoonõli. Parafiinõli võib kasutada maksimaalselt temperatuurini 473 K. Vannivedelikku soojendatakse nii, et temperatuur tõuseb umbes 3 K/min. Vannivedelikku tuleb segada. Umbes 10 K enne eeldatava keemistemperatuurini jõudmist vähendatakse soojendamist nii, et temperatuur tõuseb kiirusega alla 1 K/min. Keemistemperatuuri lähenedes hakkab keedukapillaarist kiiresti mulle eralduma. Keemistemperatuur on selline temperatuur, mille juures mullide voog kiirel jahutamisel katkeb ning vedelikunivoo kapillaartorus hakkab järsult tõusma. Termomeetri vastav näit ongi aine keemistemperatuur. Muudetud meetodi (joonis 3) kohaselt määratakse keemistemperatuur sulamistemperatuuri määramisel kasutatavas kapillaartorus. Selle ots tõmmatakse umbes 2 cm pikkuses peeneks (a) ja kapillaartorusse imetakse väike kogus proovi. Kapillaartoru avatud ots joodetakse kinni, nii et tippu jääb väike õhumull. Kuumutamisel sulamistemperatuuri määramise seadmes (b) õhumull paisub. Keemistemperatuur vastab temperatuurile, mille juures ainekork tõuseb vannivedeliku pinna tasemeni (c).

1.6.4.

Joonis 1 A: Mõõtmisnõu B: Kork C: Õhuava D: Termomeeter E: Lisatermomeeter F: Vannivedelik G: Kuni 5 mm välisdiameetriga katseklaas, mille sees on ligikaudu 100 mm pikkune, ligikaudu 1 mm sisediameetri ja ligikaudu 0,2–0,3 mm seinapaksusega kapillaartoru H: Külgtoru

1.6.5. Määramine fotoraku abil Kapillaartorus olevat proovi kuumutatakse soojendatavas metallplokis. Plokis olevate vastavate avade kaudu juhitakse läbi aine täppiskaliibritud fotorakule suunatud valguskiir. Proovi temperatuuri tõusmisel hakkab keedukapillaarist üksikuid mulle eralduma. Keemistemperatuurile lähenedes kasvab eralduvate mullide arv märgatavalt. Selle tulemusel fotorakus registreeritava valguse intensiivsus suureneb ja saadab plokis asuva plaatinatakistustermomeetri temperatuuri näidikule stoppsignaali. Meetod on väga mugav, kuna võimaldab ilma seadet muutmata mõõta keemistemperatuuri ka allpool toatemperatuuri kuni 253,15 K (–20 oC). Selleks tuleb seade lihtsalt jahutusvanni paigutada.

1.6.6. Termoanalüüs

1.6.6.

1.6.6.1. Diferentsiaaltermoanalüüs Vt liidet.

1.6.6.2. Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria Vt liidet.

2. Tabel 2. Temperatuuriparandustegurid fT

ANDMED Väikestel lahknevustel normaalrõhust (kuni ± 5 kPa) normaliseeritakse keemistemperatuuri väärtused keemistemperatuurile normaalrõhul (Tn) järgmise Sidney Youngi arvväärtus-võrrandi abil: Tn = T + (fT × Δp) kus: Δp (101,325 – p) (vt märki) p mõõdetud rõhk (kPa) fT keemistemperatuuri muutuse sõltuvus rõhust (K/kPa) T mõõdetud keemistemperatuur (K) Tn normaalrõhule parandatud keemistemperatuur (K) Paljude ainete temperatuuriparandustegurid (fT) ning valemid nende ligikaudseks arvutamiseks on ära toodud eespool nimetatud rahvusvahelistes ja siseriiklikes standardites. Näiteks toob DIN 53171 ära järgmised ligikaudsed parandustegurid värvides kasutatavatele lahustitele: Temperatuur T (K) Parandustegur fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,4 548,15 0,45 573,15 0,47

3. ARUANDLUS Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid: Keemistemperatuurina registreeritakse vähemalt kahe hinnangulise täpsuse piiridesse (vt tabel 1) jääva mõõtetulemuse keskmine. Ära tuuakse nii mõõdetud keemistemperatuurid kui ka nende keskmine; rõhud, mille juures mõõtmised tehti, registreeritakse kilopaskalites (kPa). Eelistatavalt peaks rõhk olema lähedane normaalrõhule. Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.

kasutatud meetodit;

aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud);

hinnangulist täpsust.

4.1.2.3. VIITED OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, volume II. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.

A.3. SUHTELINE TIHEDUS

A.3.

1. MEETOD Kirjeldatud meetodid põhinevad OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõte on ära toodud viites (2).

1.

1.1. SISSEJUHATUS Kirjeldatud suhtelise tiheduse määramise meetodid sobivad kohaldamiseks nii tahketele kui vedelatele ainetele, olenemata nende puhtusastmest. Tabelis 1 on ära toodud mitmesugused meetodid.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Tahkete ainete ja vedelike suhteline tihedus D204 on 20 oC juures määratud kindla mahuga aine massi ja 4 oC juures määratud sama mahuga veekoguse massi suhe. Suhtelisel tihedusel puudub ühik. Aine tihedus (p) on tema massi (m) ja mahu (v) suhe. Tihedus (p) esitatakse SI-ühikutes (kg/m3).

1.3. VÕRDLUSAINED (1, 3) Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Kasutatakse nelja tüüpi meetodeid.

1.4.

1.4.1. Ujuvusmeetodid

1.4.1.

1.4.1.1. Hüdromeeter (vedelike jaoks) Küllalt täpselt ja kiiresti saab tihedust määrata ujukhüdromeetrite abil, mille skaalajaotised võimaldavad vedeliku tiheduse määrata sukeldunud osa pikkuse põhjal.

1.4.1.2. Hüdrostaatilised kaalud (vedelike ja tahkete ainete jaoks) Proovi tihedust on võimalik määrata selle õhus ja sobivas vedelikus (nt vees) mõõdetud masside vahe põhjal. Tahkete ainete puhul iseloomustab leitud tihedus ainult konkreetset proovi. Vedelike tiheduse määramiseks kaalutakse teadaoleva ruumalaga (v) keha kõigepealt õhus ja siis vedelikus.

1.4.1.3. Sukeldatud keha meetod (vedelike jaoks) (4) Selle meetodi kohaselt määratakse vedeliku tihedus vedeliku kaalumisel enne ja pärast teadaoleva ruumalaga keha sukeldamist uuritavasse vedelikku saadud masside vahe põhjal.

1.4.2. Püknomeetrit rakendavad meetodid Meetodid sobivad nii tahketele ainetele kui ka vedelikele, võimalik on kasutada erineva kujuga ja kindla ruumalaga püknomeetreid. Tihedus arvutatakse täis ja tühja püknomeetri masside vahe ja püknomeetri teadaoleva ruumala põhjal.

1.4.3. Õhkvõrdluspüknomeeter (tahkete ainete jaoks) Gaasvõrdluspüknomeetri abil on toatemperatuuril võimalik määrata mis tahes kujul oleva tahke aine tihedust. Aine ruumala mõõdetakse õhu või inertgaasiga täidetud muutuva kaliibritud mahuga silindris. Tiheduse arvutamiseks määratakse pärast ruumala mõõtmist aine mass.

1.4.4. Resonantstihedusmõõtur (5, 6, 7) Vedeliku tihedust on võimalik määrata resonantstihedusmõõturi abil. U-toruna konstrueeritud mehaaniline ostsillaator pannakse vibreerima ostsillaatori massist sõltuval resonantssagedusel. Proovi viimine U-torru muudab ostsillaatori resonantssagedust. Seade tuleb kaliibrida kahe vedelikuga, mille tihedus on teada. Vedelike valimisel tuleks eelistada selliseid, mille tihedused hõlmavad mõõdetavat vahemikku.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Erinevate suhtelise tiheduse määramise meetodite kohaldatavust kirjeldatakse allpool olevas tabelis.

1.6. MEETODITE KIRJELDUS Liites on täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks esitatud näidetena standardeid. Katsed tuleb läbi viia 20 oC juures ja teha tuleb vähemalt kaks mõõtmist.

2. ANDMED Vt standardeid.

3. Tabel. 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Meetodite rakendatavus

ARUANDLUS Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid: Suhteline tihedus D204 registreeritakse vastavalt punkti 1.2 definitsioonile koos analüüsitava aine füüsikalise olekuga. Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused. Mõõtmismeetod Tihedus Maksimaalne võimalik dünaamiline viskoossus Olemasolevad standardid tahke aine vedelik Hüdromeeter jah 5 Pa· s ISO 387 ISO 649-2 NF T 20-050 Hüdrostaatilised kaalud jah ISO 1183 (A) jah 5 Pa· s ISO 901 ja 758 Sukeldatud keha meetod jah 20 Pa· s DIN 53217 Püknomeeter ISO 3507 jah ISO1183(B) NF T 20-053 jah 500 Pa· s ISO 758 Õhkvõrdluspüknomeeter jah DIN 55990 Teil 3, DIN 53243 Resonantstihedusmõõtur jah 5 Pa· s

kasutatud meetodit;

aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud).

3. Tabel. 1.4.1.1.1.4.1.2. Meetodite rakendatavus a)

tahked ained

vedelikud

3. Tabel. 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Meetodite rakendatavus a)

tahked ained

vedelikud

4.1.2.3.4.5.6.7.

VIITED OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11,427–430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.

A.4. AURURÕHK

A.4.

1. MEETOD Enamik kirjeldatud meetoditest põhineb OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viidetes 2 ja 3.

1.

1.1. SISSEJUHATUS Katse läbiviimiseks on kasulik teada aine struktuuri, sulamistemperatuuri ja keemistemperatuuri. Ühtki mõõtmismeetodit ei saa kohaldada kõigile võimalikele aururõhkudele. Seetõttu soovitatakse aururõhkude mõõtmiseks vahemikus < 10-4-105 Pa mitmeid meetodeid. Lisandid avaldavad üldjuhul aururõhule mõju, mis sõltub oluliselt lisandi iseloomust. Kui proov sisaldab tulemust mõjutada võivaid lenduvaid lisandeid, võib seda puhastada. Kohane võib olla ka tehniliselt puhta materjali aururõhu registreerimine. Mõnedes siin kirjeldatud meetoditest kasutatakse metallosi sisaldavaid seadmeid, söövitavaid aineid analüüsides tuleks seda arvestada.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Aine aururõhk on defineeritud küllastusrõhuna tahke aine või vedeliku kohal. Termodünaamilise tasakaalu tingimustes sõltub puhta aine aururõhk ainult temperatuurist. Rõhu mõõtühikuna tuleks kasutada SI ühikut paskal (Pa). Allpool on toodud varem kasutatud rõhuühikud koos vastavate teisendusteguritega: 1 Torr (= 1 mm Hg) = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfäär = 1,013 × 105 Pa 1 bar =105 Pa Temperatuuri mõõtühikuks SI süsteemis on kelvin (K). Universaalne gaasikonstant R on 8,314 J mol-1 K-1. Temperatuuri sõltuvust aururõhust kirjeldatakse Clausiuse-Clapeyroni võrrandiga: log p = Δ Hv2,3 RT+const. kus: p aine aururõhk paskalites ΔHV aine aurustumissoojus (J mol-1) R universaalne gaasikonstant (J mol-1 K-1) T termodünaamiline temperatuur (K)

1.4. KATSEMEETODITE PÕHIMÕTE Aururõhu määramiseks on välja pakutud seitse meetodit, mis sobivad erinevate aururõhu vahemike jaoks. Iga meetodi puhul määratakse aururõhk erinevatel temperatuuridel. Piiratud temperatuurivahemikus on puhta aine aururõhu logaritm lineaarses sõltuvuses temperatuuri pöördväärtusest.

1.4.

1.4.1. Dünaamiline meetod Dünaamilise meetodi puhul mõõdetakse konkreetsele rõhule vastav keemistemperatuur. Soovitatav rõhuvahemik: 103-105 Pa. Seda meetodit on soovitatud ka keemistemperatuuri määramiseks normaalrõhul, sel juhul ulatub tema tööpiirkond temperatuurini 600 K.

1.4.2. Staatiline meetod Staatilise meetodi puhul määratakse suletud süsteemis kindlal temperatuuril termodünaamilise tasakaalu tingimustes välja kujunenud aururõhk. Meetod sobib nii ühe- kui ka mitmekomponendiliste tahkete ainete ja vedelike jaoks. Soovitatav rõhuvahemik: 10–105 Pa. Hoolikal käsitlemisel on meetodit võimalik rakendada ka vahemikus 1–10 Pa.

1.4.3. Isoteniskoop See standarditud meetod on küll staatiline, kuid ei ole üldjuhul kohaldatav mitmekomponendilistele süsteemidele. Lisateavet võib leida ASTM meetodist D-2879-86. Soovitatav rõhuvahemik: 100–105 Pa.

1.4.4. Efusioonmeetod: aururõhukaalud Vaakumi tingimustes, kus tagasipöörduva aine voo võib arvestamata jätta, mõõdetakse rakust teadaoleva suurusega ava kaudu ajaühikus väljuva aine hulk (nt aurujoa poolt tundlikele kaaludele antud impulsi või massikao mõõtmise kaudu). Soovitatav rõhuvahemik: 10-3–1 Pa.

1.4.5. Efusioonmeetod: massikao või aurustunud aine kogumise põhjal Meetodi aluseks on ultravaakumi tingimustes Knudseni rakust (4) ajaühikus läbi mikrodüüsi auruna väljuva testaine massi määramine. Välja voolanud auru massi võib leida kas raku massikao määramise kaudu või auru madalal temperatuuril kondenseerimisel ja lendunud aine koguse kromatograafilisel määramisel. Aururõhk arvutatakse Hertzi-Knudseni võrrandi abil. Soovitatav rõhuvahemik: 10-3–1 Pa.

1.4.6. Gaasi küllastamise meetod Üle aine suunatakse inertse kandegaasi voog, nii et gaas aine aurudega küllastub. Teadaoleva koguse kandegaasiga kaasa kandunud aine koguse saab määrata sobivasse püüdurisse kogumise või pideva analüüsitehnika abil. Selle põhjal arvutatakse seejärel aururõhk antud temperatuuril. Soovitatav rõhuvahemik: 10-4–1 Pa. Hoolikal käsitlemisel on meetodit võimalik rakendada ka vahemikus 1–10 Pa.

1.4.7. Pöörlev rootor Pöördrootormõõturi mõõtelemendiks on väike teraskuul, mis hõljub magnetväljas ja pöörleb suurel kiirusel. Gaasirõhk leitakse teraskuuli gaasirõhust tingitud aeglustumise põhjal. Soovitatav rõhuvahemik: 10-4–0,5 Pa.

1.5.1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7.

KVALITEEDINÕUDED Järgmises tabelis võrreldakse omavahel erinevate aururõhu määramise meetodite kohaldatavust, korratavust, reprodutseeritavust, mõõtepiirkonda ja olemasolevat standardit. Määramismeetod Ained Hinnanguline korratavus Hinnanguline reprodutseeritavus Soovitatav rõhuvahemik Olemasolev standard tahke aine vedelik Dünaamiline meetod madala Sulamistemperatuuriga jah kuni 25 % kuni 25 % 103 Pa – 2 × 103 Pa _ 1–5 % 1–5 % 2 × 103 Pa- 105 Pa — Staatiline meetod jah jah 5–10 % 5–10 % 10 Pa – 105 Pa NFT 20-048 (5) Isoteniskoop jah jah 5–10 % 5–10 % 102 Pa – 105 Pa ASTM-D 2879-86 Efusioonmeetod – aururõhukaalud jah jah 5–20 % kuni 50 % 10-3 Pa – 1 Pa NFT 20-047 (6) Efusioonmeetod – massikadu jah jah 10–30 % — 10-3 Pa – 1 Pa — Gaasi küllastamise meetod jah jah 10–30 % kuni 50 % 10-4 Pa – 1 Pa — Pöörleva rootori meetod jah jah 10–20 % 10-4 Pa – 0,5 Pa —

1.6. MEETODITE KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Dünaamiline meetod

1.6.1.

1.6.1.1. Seade Mõõteseade koosneb tavaliselt klaasist või metallist püstjahutiga varustatud keetmiseks mõeldud anumast (joonis 1), temperatuuri mõõtmise ning rõhu reguleerimise ja mõõtmise seadmetest. Joonisel näidatud tüüpiline mõõteseade on valmistatud kuumuskindlast klaasist ja koosneb viiest osast. Suur, osaliselt topeltseintega toru, millel on tasalihviga äärikühendus, jahuti, jahutusnõu ja sisseviik. Cottrelli pumbaga klaassilinder paikneb toru keetmisosas ning tõukelise keemise vältimiseks on silindril kare paagutatud klaasist sisepind. Temperatuur määratakse sobiva temperatuurianduriga (nt takistustermomeeter, kattega termopaar), mis on mõõteseadmesse viidud vastava sisseviigu (nt lihvkerni) kaudu ja ulatub mõõtepunktini (nr 5 joonisel 1). Rõhu reguleerimis- ja mõõteseadmed ühendatakse nii, nagu vaja. Puhvermahutina toimiv kolb ühendatakse seadmega kapillaartoru abil. Keetmisanumat kuumutatakse klaasseadmesse altpoolt sisestatud kütteelemendiga (nt padrunkuumutiga). Kuumutamiseks vajalikku voolutugevust seadistatakse ja reguleeritakse termopaari abil. Vajalik vaakum vahemikus 102 Pa kuni ligikaudu 102 Pa tekitatakse vaakumpumba abil. Õhu või lämmastiku sissepääsu rõhu reguleerimiseks (mõõtepiirkond ligikaudu 102–105 Pa) või ventileerimiseks reguleeritakse sobiva klapi abil. Rõhku mõõdetakse manomeetri abil.

1.6.1.2 . Mõõtmisprotseduur Aururõhk määratakse proovi keemistemperatuuri määramisega kindlatel rõhkudel vahemikus ligikaudu 103–105 Pa. Keemistemperatuurini jõudmist näitab püsiv temperatuur konstantsel rõhul. Meetodit ei saa kasutada vahutavate ainete uurimiseks. Aine pannakse puhtasse, kuiva proovinõusse. Probleeme võib tekkida peenestamata tahkete ainetega, kuid vahel on need jahutussärgi soojendamisega lahendatavad. Pärast täitmist suletakse mõõteseadme äärikühendus ja aine degaseeritakse. Seejärel seadistatakse kõige madalam soovitud temperatuur ja lülitatakse küte tööle. Samal ajal ühendatakse temperatuuriandur meerikuga. Tasakaaluolekuni jõudmist näitab konstantsel rõhul registreeritav konstantne keemistemperatuur. Vältida tuleb tõukelist keemist. Lisaks peab jahutis toimuma täielik kondensatsioon. Madala sulamistemperatuuriga tahkete ainete sulamistemperatuuri määramisel tuleb jälgida, et jahuti ei ummistuks. Pärast tasakaalupunkti registreerimist seadistatakse kõrgem rõhk. Protsessi jätkatakse, kuni jõutakse rõhuni 105 Pa (kokku ligikaudu 5–10 mõõtepunkti). Kontrollimiseks tuleb tasakaalupunkte alanevatel rõhkudel uuesti mõõta.

1.6.2. Staatiline meetod

1.6.2.

1.6.2.1. Seade Seade koosneb proovinõust, kütte- ja jahutussüsteemist proovi temperatuuri reguleerimiseks ja temperatuuri mõõtmise vahenditest. Seade sisaldab ka vahendeid rõhu seadistamiseks ja reguleerimiseks. Meetodi tööpõhimõtteid illustreerivad joonised 2a ja 2b. Proovikambri (joonis 2a) üks avaus on suletud sobiva kõrgvaakumklapiga. Teine avaus on ühendatud sobivat rõhumõõtmisvedelikku sisaldava U-toruga. U-toru üks haru on ühendatud vaakumpumba, lämmastikusilindri või ventilatsiooniklapi ja manomeetriga. U-toru asemel võib kasutada näidikuga rõhumõõturit (joonis 2b). Proovi temperatuuri reguleerimiseks paigutatakse proovinõu koos klapi ja U-toru või rõhumõõturiga konstantsel temperatuuril (täpsusega ±0,2 K) hoitavasse vanni. Temperatuuri mõõdetakse kas proovinõu välisseinal või proovinõu sees. Vaakumi tekitamiseks kasutatakse seadmes ülesvoolu asuva külmpüüduriga vaakumpumpa. Meetodi 2a puhul mõõdetakse aine aururõhk kaudselt, kasutades nullindikaatorit. Siin võetakse arvesse asjaolu, et temperatuuri märgataval muutumisel muutub ka U-torus oleva vedeliku tihedus. Sõltuvalt rõhuvahemikust ja testaine keemilisest iseloomust sobivad U-torus nullindikaatorina kasutamiseks sellised vedelikud nagu silikoonõlid ja ftalaadid. Testaine ei tohi U-toru vedelikus ei arvestataval määral lahustuda ega sellega reageerida. Rõhuvahemikus normaalõhurõhust rõhuni 102 Pa sobib manomeetris kasutamiseks elavhõbe, rõhkudel alla 102 Pa kuni rõhuni 10 Pa aga silikoonõlid ja ftalaadid. Kuumutatavad mahtuvuslikud membraanrõhumõõturid on kasutatavad ka rõhul alla 10-1 Pa. On ka muid rõhumõõtureid, mida saab kasutada rõhkudel alla 10-2 Pa.

1.6.2.2. Mõõtmisprotseduur Enne mõõtmist tuleb kõik joonisel 2 näidatud seadme osad hoolikalt puhastada ja kuivatada. Meetodi 2a kasutamisel täidetakse U-toru valitud vedelikuga, mis tuleb enne mõõtmisi kõrgemal temperatuuril degaseerida. Testaine viiakse seadmesse, mis seejärel suletakse ja temperatuuri alandatakse degaseerimiseks vajaliku tasemeni. Temperatuur peab olema piisavalt madal kindlustamaks, et õhk välja imetaks, kuid mitmekomponendiliste süsteemide koostis ei muutuks. Vajaduse korral võib tasakaalu saavutamist segamisega kiirendada. Proovi võib alla jahutada, nt vedela lämmastikuga (vältides hoolikalt õhu ja pumbavedeliku kondenseerumist) või etanooli ja kuiva jää seguga. Mõõtmistel madalatel temperatuuridel kasutatakse krüostaadiga ühendatud vedelikuvanni. Õhu kõrvaldamiseks avatakse proovi kohal asuv klapp ja hoitakse proovi õhu eemaldamiseks mitu minutit alandatud rõhul. Seejärel klapp suletakse ja proovi temperatuuri langetatakse madalaima soovitud tasemeni. Vajaduse korral tuleb degaseerimist korrata. Proovi soojendamisel selle aururõhk tõuseb. See mõjutab U-torus oleva vedeliku tasakaaluasendit. Selle kompenseerimiseks lastakse klapi kaudu seadmesse lämmastikku või õhku, kuni rõhunäituri vedelik on jälle nullasendis. Selleks vajaliku rõhu näitu saab lugeda toatemperatuuril olevalt täppismanomeetrilt. Leitud rõhk vastab aine aururõhule antud mõõtmistemperatuuril. Meetod 2b on eelmisega analoogne, kuid aururõhku loetakse otse. Aururõhu temperatuurisõltuvus määratakse sobivalt väikeste vahemike tagant (kokku ligikaudu 5–10 mõõtepunkti) kuni kõrgeima soovitud temperatuurini. Madalaid temperatuurinäite tuleb kontrollimiseks korrata. Kui kordamisel saadud väärtused ei lange kokku tõusva temperatuuri kõveraga, võib see olla tingitud ühest järgnevatest asjaoludest.

1.6.2.2.

1. Proov sisaldab veel õhku (nt kõrge viskoossusega materjalid) või madala keemistemperatuuriga aineid, mis kuumutamisel eralduvad ja mida on võimalik edasise allajahutamise käigus vaakumiga eemaldada.

2. Jahutustemperatuur ei ole piisavalt madal. Sellisel juhul tuleb jahutajana kasutada vedelat lämmastikku. Nii juhtumi 1 kui ka 2 puhul tuleb mõõtmisi korrata.

3. Ainega toimub uuritavas temperatuurivahemikus keemiline reaktsioon (nt lagunemine või polümerisatsioon).

1.6.3. Isoteniskoop Meetodi täielik kirjeldus on toodud viites 7. Mõõteseadme tööpõhimõte on näidatud joonisel 3. Analoogselt punktis 1.6.2 kirjeldatud staatilise meetodiga sobib isoteniskoop nii tahkete ainete kui ka vedelike uurimiseks. Vedelike puhul täidab aine ise abimanomeetri rolli. Isoteniskoopi viiakse vedelikukogus, mis on küllaldane nii reservuaari kui ka manomeetri lühikese haru täitmiseks. Isoteniskoop ühendatakse vaakumsüsteemiga ja vakumeeritakse ning täidetakse seejärel lämmastikuga. Süsteemi vakumeerimist ja puhastamist korratakse jääkhapniku eemaldamiseks kahel korral. Täidetud isoteniskoop paigutatakse horisontaalasendisse, nii et proov valgub õhukese kihina üle proovireservuaari ja manomeetri (U-osa). Süsteemi rõhku alandatakse 133 paskalini ja soojendatakse proovi kergelt selle keemahakkamiseni (lahustunud gaaside kõrvaldamiseks). Isoteniskoop paigutatakse seejärel sellisesse asendisse, et proov voolab tagasi reservuaari ja manomeetri lühikesse harru, nii et mõlemad on täielikult vedelikuga täidetud. Hoitakse degaseerimisele vastavat rõhku ja proovireservuaari väljavenitatud tippu kuumutatakse väikesel leegil, kuni proovi aurud küllaldaselt paisuvad ning suruvad osa proovist reservuaari ülaosast ja manomeetri harust isoteniskoobi manomeetri-ossa, nii et tekib auruga täidetud lämmastikuvaba ruum. Isoteniskoop paigutatakse seejärel konstantse temperatuuriga vanni ja lämmastiku rõhk võrdsustatakse proovi rõhuga. Rõhkude tasakaalustumist saab jälgida isoteniskoobi manomeetri-osa põhjal. Tasakaaluolekus on lämmastiku rõhk võrdne aine aururõhuga. Tahkete ainete puhul kasutatakse olenevalt rõhust ja temperatuurivahemikust punktis 1.6.2.1 loetletud rõhunäiturivedelikke. Degaseeritud rõhunäiturivedelik viiakse isoteniskoobi pikema haru kumerasse ossa. Uuritav tahkis viiakse reservuaari ja degaseeritakse kõrgemal temperatuuril. Seejärel kallutatakse isoteniskoopi nii, et rõhunäiturivedelik voolab U-torusse. Aururõhu temperatuurisõltuvus määratakse vastavalt punktile 1.6.2.

1.6.4. Efusioonmeetod: aururõhukaalud

1.6.4.

1.6.4.1. Seade Kirjanduses (1) on kirjeldatud mitmesuguseid seadmeid. Siin kirjeldatud seade illustreerib meetodi üldist tööprintsiipi (joonis 4). Joonisel 4 on näha seadmete peamised osad, sh roostevabast terasest või klaasist kõrgvaakumanum, seadmed vaakumi tekitamiseks ja mõõtmiseks ning katseseadme sees olevad seadmed aururõhu määramiseks kaalude abil. Katseseadmel on järgmised sisemised osad:

aurustusahi ääriku ja pöörleva sisselaskeavaga. Aurustusahi on silindriline anum, mis on valmistatud nt vasest või keemiliselt inertsest, hea soojusjuhtivusega sulamist. Kasutada võib ka vaskseintega klaasanumat. Ahju läbimõõt on ligikaudu 3–5 cm ja kõrgus 2–5 cm. Ahjul on aurujoa tarvis 1–3 erineva suurusega ava. Ahju kütab kas allolev kütteplaat või ümbritsev küttespiraal. Et takistada soojuse kadumist alusplaati, kinnitatakse ahi alusplaadi külge madala soojusjuhtivusega metalli (nikli-hõbedasulami või kroomnikkelterase) abil, mitme avaga ahju kasutamisel nt pöörleva sisselaskeava külge kinnitatud nikli-hõbedasulamist toru abil. Sellise ehituse eeliseks on vaskvarda kasutamise võimalus. Viimane võimaldab kasutada väljastpoolt seadet jahutusvanni abil rakendatavat jahutust;

kui vasest ahjukaanel on kolm erineva läbimõõduga ava, mis paiknevad üksteise suhtes 90o nurga all, võimaldab see hõlmata tööpiirkonna erinevaid aururõhuvahemikke (avad läbimõõtudega ligikaudu 0,30–4,50 mm). Suuri avasid kasutatakse madala aururõhu puhul ja vastupidi. Ahju pöörates on auruvoolu (ahjuava – kaitseekraan – kaalukauss) ette võimalik seada mis tahes soovitud ava või vahepealne asend, nii et molekulide voog lastakse või suunatakse ahjuavast kaalukausi poole. Aine temperatuuri mõõtmiseks paigaldatakse sobivasse punkti termopaar või takistustermomeeter;

kaitseekraani kohal on ülitundlike mikrokaalude kaalukauss (vt allpool). Kaalukausi läbimõõt on ligikaudu 30 mm. Sobivaks materjaliks on näiteks kullatud alumiinium;

kaalukaussi ümbritseb silindriline messingist või vasest külmkamber. Sõltuvalt kaalu tüübist on sel avad kaalukangi jaoks ja kaitseekraanis ava molekulide voo jaoks ning see peaks tagama auru täieliku kondenseerumise kaalukausil. Soojuse hajutamise seadmest väljapoole tagab nt külmkambri külge ühendatud vaskvarras. Varras on viidud läbi alusplaadi ja nende vahel on soojusisolatsioon, nt kroomnikkelterasest toru. Varras on kastetud alusplaadi all olevasse vedelat lämmastikku sisaldavasse Dewari anumasse või juhitakse vedelat lämmastikku läbi varda. Külmkambrit hoitakse nii ligikaudu –120 oC juures. Kaalukauss jahtub ainult kiirguse abil, mis on uuritava rõhuvahemiku jaoks küllaldane (jahutamist alustatakse ligikaudu 1 tund enne mõõtmise algust);

kaalud asuvad külmkambri kohal. Sobivateks kaaludeks on näiteks ülitundlikud 2 õlaga mikrokaalud (8) või ülitundlik liikuvpooliga mõõteriist (vt OECD katsesuunist 104, välja antud 12.5.1981);

alusplaadis on ka elektrilised kontaktid termopaaride (või takistustermomeetrite) ja küttespiraalide jaoks;

vaakum tekitatakse anumas osalise vaakum- või kõrgvaakumpumba abil (vajalik on ligikaudu 1–2 × 10-3 Pa vaakum, mis saavutatakse pärast umbes 2 h pumpamist). Rõhku reguleeritakse sobiva ionisatsioonvaakummeetri abil.

1.6.4.2. Mõõtmisprotseduur Nõu täidetakse testainega ja suletakse kaanega. Kaitseekraan ja külmkamber paigutatakse ahju kohale. Seade suletakse ja käivitatakse vaakumpumbad. Lõplik rõhk peaks enne mõõtmiste alustamist olema ligikaudu 10-4 Pa. Külmkambri jahutamist alustatakse 10-2 Pa juures. Vajaliku vaakumi saavutamisel alustatakse kaliibrimisseeriaga, alustades kõige madalamast vajalikust temperatuurist. Sobiv ava ahjukaanes seatakse paika, auruvoog läbib otse ava kohal oleva kaitseekraani ja põrkub jahutatud kaalukausiga. Kaalukauss peab olema piisavalt suur tagamaks, et sellega põrkub kogu kaitseekraanist läbi juhitud auruvoog. Auruvoo impulss toimib jõuna vastu kaalukaussi ning molekulid kondenseeruvad selle külmal pinnal. Ühel ajal toimivad impulss ja kondenseerumine tekitavad registreeritava signaali. Signaalid annavad kahesugust teavet. p = G 2 π RT×103M kus: G aurustumiskiirus (kg s-1 m-2) M molaarmass (g mol-1) T molaarmass (g mol-1) R universaalne gaasikonstant (J mol-1 K-1) p aururõhk (Pa) Vajaliku vaakumi saavutamisel alustatakse mõõtmisseeriaga, alustades kõige madalamast soovitud mõõtmistemperatuurist. Mõõtmisi jätkatakse, tõstes temperatuuri väikeste vahemike võrra, kuni jõutakse kõige kõrgema soovitud temperatuurini. Seejärel jahutatakse proov uuesti maha ja registreeritakse teine aururõhukõver. Kui teine seeria esimese seeria tulemusi ei kinnita, on võimalik, et aine mõõdetavas temperatuurivahemikus laguneb.

1.6.4.2.

1. Siin kirjeldatud seadme abil määratakse aururõhk otse kaaludele antud impulsi põhjal (molaarmassi ei ole selleks vaja teada (2)). Näitude hindamisel tuleb arvesse võtta geomeetrilisi tegureid, nagu ahju avaja molekulivoo kaldenurka.

2. Ühel ajal on võimalik mõõta kondensaadi mass ja arvutada selle põhjal aurustumiskiirus. Aururõhu võib Hertzi võrrandi (2) abil arvutada ka aurustumiskiiruse ja molaarmassi põhjal.

1.6.5. Efusioonmeetod: massikao järgi

1.6.5.

1.6.5.1. Seade Efusiooniseade koosneb järgmistest põhiosadest: Joonisel 5 on näitena esitatud elektrikütte ja 4 roostevabast terasest efusioonirakuga alumiiniumist vaakummahuti. Umbes 0,3 mm paksuses roostevabas terasfooliumis on 0,2–1,0 mm läbimõõduga efusioonidüüs ja see on keermestatud katte abil efusiooniraku külge kinnitatud.

mahutist, mis on termostateeritav ja vakumeeritav ning milles asuvad efusioonirakud;

vaakummeetriga kõrgvaakumpumbast (nt difusioonpump või turbomolekulaarpump);

vedelat lämmastikku või kuiva jääd kasutavast püüdurist.

1.6.5.2. Mõõtmisprotseduur Uuritav ja võrdlusaine viiakse kumbki oma efusioonirakku, düüsiga metallmembraan kinnitatakse keermestatud katte abil ja kõik rakud kaalutakse 0,1 mg täpsusega. Rakud paigutatakse termostateeritud seadmesse, mille rõhk viiakse seejärel vähem kui kümnendikuni eeldatavast rõhust. Kindlaksmääratud, 5–30tunniste ajavahemike järel lastakse õhk seadmesse ning määratakse kaalumise teel efusiooniraku massikadu. Tagamaks, et lenduvad lisandid tulemusi ei mõjuta, kaalutakse rakk kindlate ajavahemike järel üle, kontrollides, kas aurustumiskiirus jääb vähemalt kahe sellise ajavahemiku kestel konstantseks. Aururõhk p efusioonirakus arvutatakse järgmise võrrandi abil: p = mKAt2 π R TM kus: p aururõhk (Pa) m mass of the substance leaving the cell during time t (kg) t aeg (s) A area of the hole (m2) K parandustegur R universal gas constant (Jmol-l K-1) T temperatuur (K) M molaarmass (kg mol-1) Parandustegur K sõltub silindrilise düüsi pikkuse ja raadiuse suhtest: Suhe 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Eespool esitatud võrrandi võib kirjutada järgmisel kujul: p = E mtTM E = 1KA2πRand is the effusion cell constant. Efusiooniraku konstandi E võib määrata võrdlusainete (2,9) abil, kasutades järgmist võrrandit: E = p(r)tmM(r)T kus: p(r) võrdlusaine aururõhk (Pa) M(r) võrdlusaine molaarmass (kg × mol-1)

1.6.6. Gaasi küllastamise meetod

1.6.6.

1.6.6.1. Seade Tüüpiline katseseade koosneb mitmest joonisel 6a näidatud komponendist ja seda kirjeldatakse allpool (1).

1.6.6.1. Inertgaas

Kandegaas ei tohi testainega keemiliselt reageerida. Üldjuhul sobib kandegaasiks lämmastik, kuid mõningatel juhtudel on vaja kasutada muid gaase (10). Kasutatav gaas peab olema kuiv (vt joonisel 6a tähist 4: suhtelise niiskuse andur).

Gaasivoolu reguleerimine

Konstantse, seadistatud gaasivoolu tagamiseks küllastuskolonnis on vaja sobivat gaasivoolu reguleerimise süsteemi.

Aurupüüdurid

Valitakse olenevalt konkreetse proovi omadustest ja valitud analüüsimeetodist. Püüdurid peavad auru kinni püüdma kvantitatiivselt ja järgnevat analüüsi võimaldaval kujul. Mõnedele katseainetele sobivad vedelikke, nagu heksaani või etüleenglükooli, sisaldavad püüdurid. Teistele katseainetele võivad sobida tahked absorbendid. Aurude kinnipüüdmise ja järgneva analüüsi asemel võib teadaoleva koguse kandegaasiga transporditava materjalikoguse kvantitatiivseks määramiseks kasutada pidevaid analüüsitehnikaid, nt kromatograafiat. Samuti võib mõõta proovi massikadu.

Soojusvaheti

Erinevatel temperatuuridel mõõtmisi tehes võib olla vaja lisada katseseadmele soojusvaheti.

Küllastuskolonn

Testaine kantakse lahusest sobivale inertsele tugiainele. Kaetud tugiainega täidetakse küllastuskolonn, mille mõõtmed ja voolukiirus valitakse sellised, et oleks tagatud kandegaasi täielik küllastatus. Küllastuskolonn peab olema termostateeritud. Toatemperatuurist kõrgemal temperatuuril mõõtmisi tehes tuleks küllastuskolonni ja püüdurite vahelist piirkonda soojendada, et vältida testaine kondenseerumist. Difusioonist tingitud massiülekande vähendamiseks võib küllastuskolonni järgi ühendada kapillaartoru (joonis 6b).

1.6.6.2. Mõõtmisprotseduur

1.6.6.2. Küllastuskolonni ttevalmistamine

Sobivale tugiainekogusele lisatakse hästilenduvas lahustis lahustatud testaine. Lisatava testaine kogus peaks olema piisav, et tagada küllastumine kogu katse ajaks. Lahusti aurustatakse õhus või rootoraurutis ning hoolikalt segatud materjal viiakse küllastuskolonni. Pärast proovi termostateerimist juhitakse läbi katseseadme kuiva lämmastikku.

Mõõtmine

Püüdurid või pideva toimega detektor ühendatakse kolonni väljavooluga ja registreeritakse vastav aeg. Voolukiirus määratakse kindlaks nii katse alguses kui ka kindlate ajavahemike tagant katse käigus mullkulumõõturi abil (või pidevalt massivoolumõõturi abil). Määrata tuleb ka rõhk küllastuskolonni väljavoolus. Selleks on järgmised võimalused: Erinevate analüüsimeetodite jaoks vajaliku ainekoguse kogumiseks vajalik aeg määratakse eelnevalt eelkatsete põhjal või hinnanguliselt. Järgneva analüüsi jaoks testaine kogumise asemel võib kasutada kvantitatiivset pidevat analüüsitehnikat (näiteks kromatograafiat). Enne antud temperatuurile vastava aururõhu arvutamist tuleb teha eelkatsed, et teha kindlaks kõrgeim voolukiirus, mille juures kandegaas aine aurudega täilikult küllastub. Küllastatuses võib kindel olla, kui kandegaas läbib küllastuskolonni nii aeglaselt, et madalama voolukiirusega ei kaasne kõrgemat väljaarvutatud aururõhku. Kasutatav analüütiline meetod (nt gaaskromatograafia või gravimeetria) sõltub uuritava aine iseloomust. Määratakse teadaoleva koguse kandegaasiga kaasa kandunud ainekogus.

a)

küllastuskolonni ja püüdurite vahele lisatakse rõhumõõtur (meetod ei pruugi sobilik olla, kuna suurendab surnud ruumala ja adsorbeerivat pinda) või

b)

eraldi katses määratakse rõhulangus konkreetses püüdursüsteemis sõltuvalt voolukiirusest (ei pruugi sobida vedelikpüüdurite puhul).

1.6.6.3. Aururõhu arvutamine Aururõhk arvutatakse auru tihedusest W/V järgmise võrrandi abil: p = WV × RTM kus: P aururõhk (Pa) W aurustunud testaine mass (g) V küllastatud gaasi ruumala (m3) R universaalne gaasikonstant (J mol-1 K-1) T temperatuur (K) M testaine molaarmass (g mol-1) Mõõdetud mahtusid tuleb voolumõõturi ja termostateeritud küllastuskolonni rõhu- ja temperatuurierinevusi arvestades korrigeerida. Kui voolumõõtur asub aurupüüdurist allavoolu, võib osutuda vajalikuks teha ka püüdurite aurustunud koostisaineid arvestavad parandusi (1).

1.6.7. Pöörlev rootor (8, 11, 13)

1.6.7.

1.6.7.1. Seade Pöörleva rootori meetodi rakendamiseks sobib joonisel 8 näidatud pöörleva rootoriga viskoossusmõõtur. Katseseadmete skeem on esitatud joonisel 7. Mõõteseade koosneb tavaliselt pöörlevast rootormõõtepeast, mis on paigutatud 0,1 oC täpsusega termostateeritud kambrisse. Proovinõu paigutatakse 0,01 oC täpsusega termostateeritud kambrisse ning seadmete kõiki ülejäänud osi hoitakse kondensatsiooni vältimiseks kõrgemal temperatuuril. Kõrgvaakumklappide abil on süsteemiga ühendatud kõrgvaakumpump. Pöördrootormõõtepea koosneb väikesest torus paiknevast teraskuulist (läbimõõduga 4–5 mm). Kuuli hõljutab ja stabiliseerib magnetväli, mida tavaliselt tekitavad püsimagnetid koos juhtmähistega. Kuul pannakse mähiste tekitatud väljade vaheldumisega pöörlema. Kuuli pöörlemiskiirust saab mõõta selle alalist nõrka polaarset magneetumust mõõtvate andurmähistega.

1.6.7.2. Mõõtmisprotseduur Kui kuul on jõudnud ettenähtud pöörlemiskiiruseni v(o) (tavaliselt umbes 400 pööret sekundis), lõpetatakse edasine kiirendamine ja kuul hakkab gaasikeskkonnast tingitud hõõrdumise tõttu aeglustuma. Mõõdetakse pöörlemiskiiruse languse sõltuvust ajast. Kuna magnetilisest hõljutamisest tingitud hõõrdumise võib gaasidest tingitud hõõrdumisega võrreldes arvestamata jätta, leitakse gaasirõhk p järgmisest valemist: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) kus: c— gaasimolekulide keskmine kiirus r kuuli raadius ρ kuuli tihedus σ tangentsiaalse impulsiülekande tegur (ε = 1 kuuli ideaalse kerakujulise pinna korral) t aeg v(t) pöörlemiskiirus pärast aja t möödumist v(o) algne pöörlemiskiirus Võrrandi võib kirjutada ka järgmisel kujul: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 kus tn ja tn-1 on N arvu pöörete tegemiseks kulunud ajavahemikud. Need ajavahemikud järgnevad üksteisele ja tn > tn-1. Gaasimolekuli keskmist kiirust väljendab järgmine valem: c— = 8 RTπ M12 kus: T temperatuur R universaalne gaasikonstant M molaarmass

2. ANDMED Mis tahes eelmise meetodi abil leitud aururõhk tuleks määrata vähemalt kahel temperatuuril. Vahemikus 0–50 oC tuleks aururõhukõvera lineaarsuse kontrollimiseks määrata rõhku kolm või enam korda.

3. ARUANDLUS Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid: Üleminekute (oleku muutus, lagunemine) täheldamisel tuleks üles märkida järgmine teave: Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.

kasutatud meetodit;

aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud);

vähemalt kaht aururõhu ja temperatuuri väärtust, eelistatavalt vahemikus 0–50 oC;

kõiki katseandmeid;

log p vs. 1/T kõverat;

hinnangulist aururõhu väärtust 20 või 25 oC juures.

ülemineku iseloom;

temperatuur, mille juures üleminek atmosfäärirõhul toimub;

aururõhk 10 ja 20 oC allpool üleminekutemperatuuri ning 10 ja 20 oC ülevalpool seda temperatuuri (välja arvatud juhul, kui üleminek toimus tahkest olekust gaasilisse).

4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.

VIITED OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593. NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–1 to 10–5 Pa – Static method. NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure-temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Röhl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, Vol. 5 (4), 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173. B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435. G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, Vol. 17 (2), 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148. J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, Vol. 3 (3), 1715.

A.5. PINDPINEVUS

A.5.

1. MEETOD Kirjeldatud meetodid põhinevad OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viites 2.

1.

1.1. SISSEJUHATUS Kirjeldatud meetodid on ette nähtud vesilahuste pindpinevuse mõõtmiseks. Katse tegemiseks on kasulik teada aine lahustuvust vees, selle struktuuri, hüdrolüüsuvust ja mitsellitekke lävikontsentratsiooni. Järgmised meetodid sobivad kohaldamiseks enamikule keemilistele ainetele, olenemata nende puhtusastmest. Pindpinevust saab mõõta rõnga lahtirebimise meetodi abil ainult vesilahuste puhul, mille dünaamiline viskoossus on alla ca. 200 mPa s.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Pindpinevusena käsitatakse pinna vabaentalpiat pinnaühiku kohta. Pindpinevust väljendatakse järgmistes ühikutes: N/m (SI ühik) või mN/m (SI alamühik) 1N/m = 103 dyn/cm 1 mN/m = 1 dyn/cm (aegunud CGS-süsteemis)

1.4. KATSEMEETODITE PÕHIMÕTE Meetodite kohaselt mõõdetakse maksimaalne jõud, mida on vaja püstsuunas rakendada mõõtenõus oleva uuritava vedeliku pinnaga kokkupuutes olevale loogale või rõngale selle lahtirebimiseks pinnalt või pinnaga kokkupuutes oleva plaadi servale tekkinud kile ülestõmbamiseks. Aineid, mille lahustuvus vees on vähemalt 1 mg/l, analüüsitakse vesilahuses ainult ühel kontsentratsioonil.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Nende meetodite täpsus ületab tõenäolised vajadused keskkonnaohtlikkuse hindamisel.

1.6. MEETODITE KIRJELDUS Valmistatakse aine lahus destilleeritud vees. Lahuse kontsentratsioon peaks olema 90 % aine küllastuskontsentratsioonist vees; kui kontsentratsioon ületab 1 g/l, kasutatakse katses kontsentratsiooni 1 g/l. Aineid, mille lahustuvus vees on alla 1 mg/l, pole vaja testida.

1.6.

1.6.1. Plaadimeetod Vt ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.2. Loogameetod Vt ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.3. Rõngameetod Vt ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.4. OECD ühtlustatud rõngameetod

1.6.4.

1.6.4.1. Seade Mõõtmiseks sobivad müügil olevad tensiomeetrid. Need koosnevad järgmistest osadest:

liikuvast proovialusest;

dünamomeetrist;

mõõtekehast (rõngast);

mõõtmisnõust.

1.6.4.1.

1.6.4.1.1. Liikuv proovialus Liikuvale proovialusele asetatakse uuritavat vedelikku sisaldav termostateeritud mõõtmisnõu. Alus kinnitatakse koos dünamomeetriga statiivile.

1.6.4.1.2. Dünamomeeter Dünamomeeter (vt joonist) paikneb proovialuse kohal. Viga jõu mõõtmisel ei tohi ületada ± 10-6 N, mis vastab veapiirile ±0,1 mg massi mõõtmisel. Enamikul juhtudel on müügil olevate tensiomeetrite mõõteskaala kaliibritud mN/m skaalas, nii et pindpinevuse saab skaalalt lugeda otse millinjuutonites meetri kohta täpsusega 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3. Mõõtekeha (rõngas) Rõngas on tavaliselt valmistatud 0,4 mm jämedusest plaatina-iriidiumtraadist ja selle keskmine ümbermõõt on 60 mm. Rõngas ripub horisontaalselt metallvarda ja looga otsas, mille kaudu ta on ühendatud dünamomeetriga (vt joonist).

1.6.4.1.3. Joonis Mõõtekeha

(Kõik mõõdud on millimeetrites) Varras Look, Rõngas

1.6.4.1.4. Mõõtmisnõu Katselahust sisaldava mõõtmisnõuna kasutatakse termostateeritud klaasnõud. Nõu ehitus peab olema selline, et katselahuse ja selle kohal oleva gaasifaasi temperatuurid jäävad katse kestel konstantseks ning proov ei aurustu. Mõõtmisnõuks sobivad silindrilised klaasnõud sisediameetriga vähemalt 45 mm.

1.6.4.2. Seadme ettevalmistamine

1.6.4.2.

1.6.4.2.1. Puhastamine Klaasnõud puhastatakse hoolikalt. Vajaduse korral pestakse neid kuuma kroomseguga ja seejärel kontsentreeritud fosforhappega (83–98 % H3PO4 (massi järgi)), loputatakse põhjalikult kraaniveega, pestakse lõpuks bidestilleeritud veega neutraalse reaktsiooni saavutamiseni ja seejärel kuivatatakse või loputatakse osaga mõõdetavast vedelikuproovist. Rõngast loputatakse kõigepealt põhjalikult veega, et eemaldada vees lahustuvad ained, kastetakse seejärel lühikeseks ajaks kroomsegusse, pestakse siis bidestilleeritud veega neutraalse reaktsiooni saavutamiseni ja kuumutatakse lõpuks lühikest aega metanoolileegi kohal. Märkus Kroomsegus ja fosforhappes mittelahustuvad saasteained, nt silikoonid, eemaldatakse sobiva orgaanilise lahustiga.

1.6.4.2.2. Seadme kaliibrimine Seadme kontrollimiseks kontrollitakse nullpunkti ja reguleeritakse seda nii, et seade võimaldab täpset mõõtmist mN/m skaalas.

1.6.4.2.2. Kinnitus

Seade looditakse tensiomeetri aluse reguleerimiskruvide abil (näiteks alusel oleva loodinäidiku järgi).

Nullpunkti reguleerimine

Pärast rõnga kinnitamist aparaadile ja enne selle vedelikku kastmist reguleeritakse tensiomeetri näit nulli ja kontrollitakse, kas rõngas on vedeliku pinnaga paralleelne. Selleks võib vedelikupinda kasutada peeglina.

Kaliibrimised

Seadme kaliibrimiseks võib kasutada üht kahest järgmisest meetodist.

a)

Raskuste abil: kasutatakse rõngale asetatavaid kindla massiga (0,1–1,0 g) raskusi. Kaliibrimistegur Φa, millega kõiki seadme näitusid tuleb korrutada, leitakse võrrandi 1 abil: Φa=σrσa (1) kus: σr=mg2b(mN/m) m raskuse mass (g) g raskuskiirendus (merepinnal 981 cm s–2) b rõnga keskmine ümbermõõt (cm) σa tensiomeetri näit pärast raskuse asetamist rõngale (mN/m).

b)

Vee abil: kasutatakse puhast vett, mille pindpinevus on näiteks 23 oC juures 72,3 mN/m. Selle meetodi kohaselt toimub kaliibrimine kiiremini kui massi abil, kuid alati eksisteerib oht, et vee pindpinevust mõjutavad pindaktiivsed lisandid. Kaliibrimistegur Φb, millega kõiki seadme näitusid tuleb korrutada, leitakse võrrandi 2 abil: Φb=σoσg (2) kus: σo vee pindpinevus (mN/m) kirjanduse andmetel σg mõõtmisel leitud vee pindpinevus (mN/m) mõlemad samal temperatuuril.

1.6.4.3. Proovide ettevalmistamine Uuritavatest ainetest valmistatakse vajaliku kontsentratsiooniga vesilahused, kuhu ei tohi jääda lahustumatut jääki. Lahust hoitakse püsival temperatuuril (±0,5 oC). Kuna mõõtmisnõus oleva lahuse pindpinevus muutub aja jooksul, tehakse erinevatel aegadel mitu mõõtmist ja koostatakse kõver pindpinevuse muutumise kohta ajas. Kui pindpinevus enam ei muutu, on saavutatud tasakaal. Mõõtmistulemusi mõjutavad tolm ja gaasilised lisandid. Seetõttu tuleb katsed teha suletud kambris.

1.6.5. Katsetingimused Mõõtmised tehakse ligikaudu 20 oC juures ja temperatuuri reguleeritakse ±0,5 oC täpsusega.

1.6.6. Katse tegemine Mõõdetavad lahused viiakse põhjalikult puhastatud mõõtmisnõusse, vältides hoolikalt vahutamist, ja mõõtmisnõu paigutatakse katseseadmesse proovialusele. Proovialust mõõtmisnõuga tõstetakse, kuni rõngas on allpool mõõdetava lahuse pinda. Seejärel lastakse proovialust järk-järgult ühtlaselt allapoole (kiirusega ligikaudu 0,5 cm/min), eemaldades rõngast pinnast kuni maksimaalse tõmbejõu saavutamiseni. Rõnga külge kinnitunud vedelikukiht ei tohi sellest eralduda. Pärast mõõtmiste lõppu viiakse rõngas jälle allapoole vedeliku pinda ja korratakse mõõtmisi, kuni jõutakse konstantsete pindpinevuse väärtusteni. Iga mõõtmise juures registreeritakse lahuse mõõtmisnõusse viimisest möödunud aeg. Näidud võetakse rõnga vedelikupinnast lahtirebimiseks vajaliku maksimaalse jõu juures.

2. Tabel: mõõdetud pindpinevuste parandused Ainult vesilahuste jaoks, ρ = 1 g/cm3

ANDMED Pindpinevuse arvutamiseks tuleb seadme näit (mN/m) korrutada kaliibrimisteguriga Φa või Φb (sõltuvalt kasutatud kaliibrimismeetodist). Nii saadakse väärtus, mis on ainult ligikaudne ja vajab seega korrigeerimist. Harkins ja Jordan (4) on empiiriliselt kindlaks määranud rõngameetodi abil määratud pindpinevuse väärtuste parandustegurid, mis sõltuvad rõnga mõõtmetest, vedeliku tihedusest ja pindpinevusest. Kuna Harkinsi ja Jordani tabelitest iga mõõtmise jaoks eraldi parandustegurite leidmine vesilahuste pindpinevuse arvutamiseks on väga töömahukas, võib kasutada lihtsustatud meetodit, kus parandatud pindpinevuse väärtused loetakse otse tabelist. (Tabeliväärtuste vahele jäävate näitude puhul kasutatakse interpolatsiooni). R = 9,55 mm (rõnga keskmine raadius) r = 0,185 mm (rõngatraadi raadius) Katseliselt mõõdetud väärtus (mN/m) Parandatud väärtus (mN/m) Kaliibrimine raskustega (vt 1.6.4.2.2a) Kaliibrimine veega (vt 1.6.4.2.2b) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Tabel on koostatud Harkinsi-Jordani paranduste põhjal. Tabel on sarnane DIN standardi (DIN 53914) tabeliga vee ja vesilahuste jaoks (tihedus ρ = 1 g/cm3 ja kehtib müügil olevate rõngaste kohta mõõtmetega R = 9,55 mm (rõnga keskmine raadius) ja r = 0,185 mm (rõngatraadi raadius). Tabelis on esitatud pärast raskuste või veega kaliibrimist mõõdetud pindpinevuse väärtuste ka parandatud väärtused. Pindpinevuse võib arvutada ka ilma eelneva kaliibrimiseta, kasutades järgmist valemit: σ=fxF4πR kus: F dünamomeetriga kile katkemisel mõõdetud jõud R rõnga raadius f parandustegur (1)

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

kasutatud meetodit;

kasutatud vee või lahuse iseloomu;

aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

mõõtmistulemusi: pindpinevuse väärtused, sh kõik üksiktulemused ja nende aritmeetiline keskmine ning parandatud keskmine (mis arvestab nii seadmetest tulenevat parandustegurit kui ka parandustabelit);

lahuse kontsentratsiooni;

katsetemperatuuri;

lahuse vanust, st aega lahuse valmistamise ja mõõtmise vahel;

pindpinevuse sõltuvust lahuse mõõtmisnõusse viimisest möödunud ajast;

registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.

3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE Arvestades, et destilleeritud vee pindpinevus on 20 oC juures 72,75 mN/m, tuleks ained, mille pindpinevus käesoleva meetodi abil mõõtes on alla 60 mN/m, lugeda pindaktiivseteks aineteks.

4.1.2.3.4. VIITED OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.

A.6. LAHUSTUVUS VEES

A.6.

1. MEETOD Kirjeldatud meetodid põhinevad OECD katsesuunisel (1).

1.

1.1. SISSEJUHATUS Katse tegemiseks on kasulik teada aine struktuuri, aururõhku, dissotsiatsioonikonstanti ja hüdrolüüsuvuse pH-sõltuvust. Ükski meetod ei hõlma kogu vees lahustuvuste vahemikku. Kaks allpool kirjeldatud meetodit hõlmavad kogu lahustuvuste vahemiku, kuid ei ole kohaldatavad lenduvatele ainetele: Testaine lahustuvus vees võib lisandite mõjul oluliselt muutuda.

üht neist, mis on kohaldatav madala lahustuvusega (< 10–2 g/l) puhastele, vees stabiilsetele ainetele, nimetatakse kolonn-elueerimismeetodiks;

teist, mis on kohaldatav kõrgema lahustuvusega (> 10–2 g/l) puhastele, vees stabiilsetele ainetele, nimetatakse kolvimeetodiks.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Aine lahustuvus vees on selle küllastuskontsentratsioon vees antud temperatuuril. Lahustuvust vees väljendatakse massiühikutes lahuse ruumala kohta. Lahustuvuse SI-ühik on kg/m3 (kasutada võib ka gramme liitris).

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Küllastuskontsentratsiooni saavutamiseks vajalik ligikaudne proovi kogus ja aeg tuleks varem kindlaks teha lihtsas eelkatses.

1.4.

1.4.1. Kolonn-elueerimismeetod Meetodi aluseks on testaine veega elueerimine mikrokolonnist, mis on täidetud testaine liiaga kaetud inertse tugiaine, nagu klaashelmeste või liivaga. Lahustuvus vees määratakse siis, kui eluaadi massikontsentratsioon on konstantne. Kontsentratsioon vs. aeg kõveral on see nähtav platoona.

1.4.2. Kolvimeetod Selle meetodi kohaselt lahustatakse aine (tahked ained peavad olema peenestatud) vees katsetemperatuurist mõnevõrra kõrgemal temperatuuril. Küllastumise saabumisel segu jahutatakse ja hoitakse katsetemperatuuril, segades seda tasakaalu saavutamiseks piisava aja jooksul. Mõõtmist võib alustada ka kohe katsetemperatuuril, kui sobivate proovide põhjal on teada, et küllastustasakaal on saavutatud. Järgnevalt määratakse sobiva analüüsimeetodi abil aine massikontsentratsioon vesilahuses, mis ei tohi sisaldada lahustumata osakesi.

1.5. KVALITEEDINÕUDED

1.5.

1.5.1. Korratavus Kolonn-elueerimismeetodil võib saavutada korratavuse < 30 %, kolvimeetodil peaks see olema < 15 %.

1.5.2. Tundlikkus Sõltub analüüsimeetodist, kuid määrata saab massikontsentratsioone kuni 10–6 g/l.

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Katsetingimused Eelistatav katsetemperatuur on 20 ±0,5 oC. Kui eeldatakse võimalikku lahustuvuse sõltuvust temperatuurist (> 3 oC kohta), tuleks mõõtmised teha lisaks veel kahel temperatuuril, vähemalt 10 oC algselt valitud temperatuurist kõrgemal ja madalamal. Temperatuuri tuleks sellisel juhul reguleerida täpsusega ±0,1 oC. Valitud temperatuuri tuleks seadme kõigis olulistes osades konstantsena hoida.

1.6.2. Eelkatse Umbes 0,1 g proovile (tahked ained peavad olema peenestatud) 10 ml klaaskorgiga silindris lisatakse toatemperatuuril järjest suuremad kogused destilleeritud vett vastavalt alltoodud tabelile: 0,1 g lahustuv x ml vees 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Ligikaudne lahustuvus (g/l) > 1000 1000 – 200 200 – 1000 100–50 50–10 10–1 < 1 Pärast iga näidatud veekoguse lisamist loksutatakse segu tugevasti kümme minutit ja kontrollitakse visuaalselt lahustumata proovijääkide olemasolu. Kui proov või osa sellest pärast 10 ml vee lisamist ei lahustu, tuleb katset 100 ml mõõtesilindris suuremate veekogustega korrata. Madalamatel lahustuvustel võib aine lahustumiseks vajalik aeg olla oluliselt pikem (aega tuleks anda vähemalt 24 h). Ligikaudne lahustuvus on tabelis esitatud selle lisatud vee mahu all, mille juures proov täielikult lahustub. Kui aine ikka lahustumatu näib, tuleks lahustumiseks jätta rohkem kui 24 h (maksimaalselt 96 h) või segu edasi lahjendada, et veenduda, kas tuleks kasutada kolonn-elueerimis- või kolvimeetodit.

1.6.3. Kolonn-elueerimismeetod

1.6.3.

1.6.3.1. Tugiaine, lahusti ja eluent Kolonn-elueerimismeetodi puhul kasutatav tugiaine peab olema inertne. Materjalidest on võimalik kasutada klaashelmeid ja liiva. Tugiaine katmisel testainega tuleks kasutada sobivat analüüsipuhast lahustit. Eluendina tuleks kasutada vett, mis on bidestilleeritud klaas- või kvartsseadmes. Märkus Otse orgaanilisest ioonvahetist pärit vett kasutada ei tohi.

1.6.3.2. Tugiaine katmine Kaalutakse ligikaudu 600 mg tugiainet ja viiakse see 50 ml ümarkolbi. Sobiv kaalutis testainet lahustatakse valitud lahustis. Sobiv kogus saadud lahust lisatakse tugiainele. Lahusti tuleb täielikult aurustada, nt rootoraurutis, vastasel juhul tugiaine veega küllastumist ei saavutata jaotumisefektide tõttu tugiaine pinnal. Tugiaine katmisest võib tekkida probleeme (vigased tulemused) juhul, kui testaine ladestub tugiaine pinnale õli või eraldi kristalse faasina. Probleemi tuleks katseliselt uurida ja tulemuste üksikasjad registreerida. Kaetud tugiainet lastakse umbes kaks tundi ligikaudu 5 ml vees seista ja viiakse suspensioon seejärel mikrokolonni. Teine võimalus on valada kuiv kaetud tugiaine veega täidetud mikrokolonni ja lasta sellel umbes kaks tundi tasakaalustuda.

1.6.3.2. Katsemenetlus

Ainet võib tugiainelt elueerida kahel erineval moel:

tsirkulatsioonpumbaga (vt joonist 1);

ühtlustava anumaga (vt joonist 4).

1.6.3.3. Kolonn-elueerimismeetod tsirkulatsioonpumbaga

1.6.3.3. Seade

Joonisel 1 on skemaatiliselt kujutatud tüüpiline süsteem. Sobiv mikrokolonn on näidatud joonisel 2, ehkki sobiv on ka mis tahes muude mõõtmetega kolonn eeldusel, et täidetud on reprodutseeritavuse ja tundlikkuse kriteeriumid. Kolonni peas olev vaba ruum peab olema nii suur, et mahutab eeljooksu jaoks kolonni täitmiseks vajaliku vee vähemalt viiekordse ruumala ja sinna saab paigutada vähemalt viis proovi. Seda vaba ruumi võib ka vähendada, kui lisandite kõrvaldamiseks kuluv viis kolonnitäit eluaati kompenseeritakse. Kolonn tuleks ühendada tsirkulatsioonpumbaga, mis tagab voolukiiruse umbes 25 ml/h. Pump ühendatakse polütetrafluoretüleen- (PTFE) ja/või klaasühenduste abil. Kolonnist ja pumbast koosneva seadme korral peab olema ette nähtud võimalus eluaadiproovide võtmiseks ning kolonni peas oleva vaba ruumi rõhu võrdsustamiseks atmosfäärirõhuga. Kolonni täidis toetub väikesele (5 mm) klaasvillast korgile, mis filtreerib ühtlasi välja osakesed. Tsirkulatsioonpumbana võib kasutada näiteks peristaltilist või membraanpumpa (hoolikalt tuleb vältida torustiku materjaliga seotud saastust ja/või absorptsiooni).

Mõõtmisprotseduur

Käivitatakse vool läbi kolonni. Soovitatav on kasutada ligikaudset voolukiirust 25 ml/h (kirjeldatud kolonni puhul vastab see kümnele kolonnitäiele tunnis). Vähemalt esimesed viis kolonnitäit väljavoolu kõrvaldatakse vees lahustuvate lisandite eemaldamiseks. Seejärel lastakse tsirkulatsioonpumbal töötada tasakaalu saavutamiseni, st senikaua, kuni viie järjestikuse proovi kontsentratsioonide juhuslikud erinevused ei ületa ± 30 %. Nende proovide vahelised ajavahemikud peaksid vastama ajale, mis kulub vähemalt kümnel kolonnitäiel eluendil kolonni läbimiseks.

1.6.3.4. Kolonn-elueerimismeetod ühtlustava anumaga

1.6.3.4. Seade (vt jooniseid 4 ja 3)

Ühtlustav anum: ühtlustav anum ühendatakse PTFE torudega ühendatud lihvühenduse abil. Soovitatav on kasutada ligikaudset voolukiirust 25 ml/h. Koguda tuleks järjestikusi eluaadifraktsioone ja neid valitud meetodi abil analüüsida.

Mõõtmisprotseduur

Aine lahustuvus vees määratakse nende fraktsioonide põhjal eluaadi keskjooksust, mille kontsentratsioonid jäävad vähemalt viie järjestikuse proovi kestel konstantseks (± 30 %). Mõlemal juhul (nii tsirkulatsioonpumba kui ka ühtlustava anuma kasutamisel) tehakse ka teine katse esimesest poole madalama voolukiirusega. Kui mõlema katse tulemused kokku langevad, on katse rahuldavalt sooritatud, kui aga madalamal voolukiirusel mõõdetakse kõrgem näiline lahustuvus, tuleb voolukiirust järjest poole võrra vähendada senikaua, kuni kahel järjestikusel katsel leitakse ühesugune lahustuvus. Mõlemal juhul (nii tsirkulatsioonpumba kui ka ühtlustava anuma kasutamisel) tuleb eluaadifraktsioonides kontrollida Tyndalli efekti (valguse hajumise) abil kolloidmaterjali olemasolu. Kolloidosakeste olemasolul tulemusi ei arvestata ja katset korratakse paremate filtreerivate omadustega kolonniga. Kõigi proovide pH registreeritakse. Järjestikused katsed tuleks teha samal temperatuuril.

1.6.4. Kolvimeetod

1.6.4.

1.6.4.1. Seade Kolvimeetodi kasutamisel on vaja järgmisi vahendeid:

tavalisi labori klaastarvikuid ja seadmeid;

seadet lahuste segamiseks konstantsetel termostateeritud temperatuuridel;

tsentrifuugi (eelistatavalt termostateeritud), kui seda on vaja tööks emulsioonidega, ning

analüüsiseadmeid.

1.6.4.2. Mõõtmisprotseduur Soovitud ruumala vee küllastamiseks vajalik ainekogus määratakse eelkatse abil. Vajalik veekogus sõltub analüüsimeetodist ja lahustuvuste vahemikust. Kolme klaaskorgiga klaasnõusse (nt tsentrifuugiklaasidesse või kolbidesse) kaalutakse igaühte umbes viiekordne eespool määratud ainekogus. Igasse nõusse lisatakse valitud veekogus ja suletakse nõu tihedalt. Seejärel segatakse suletud nõusid 30 oC juures. (Kasutada tuleks konstantsel temperatuuril töötavat loksutit või segajat, nt magnetsegajat termostateeritud veevanniga.) Ühe päeva pärast võetakse üks nõu ja tasakaalustatakse seda aeg-ajalt loksutades 24 h katsetemperatuuril. Nõu sisu tsentrifuugitakse seejärel katsetemperatuuril ja määratakse siis selges veefaasis sobiva analüüsimeetodi abil testaine kontsentratsioon. Ülejäänud kaks nõud läbivad vastavalt kahe- ja kolmepäevase 30 oC juures tasakaalustamise järel sama töötluse. Kui vähemalt kahe järjestikuse nõu mõõtmisel saadud kontsentratsioonid nõutava reprodutseeritavuse piires kokku langevad, on katse rahuldavalt sooritatud. Kui esimese, teise ja kolmanda nõu mõõtmisel saadud väärtused kalduvad kasvama, tuleb katset pikemate tasakaalustamisperioodidega korrata. Katse võib teha ka ilma eelinkubeerimiseta 30 oC juures. Küllastustasakaalu saavutamise kiiruse hindamiseks võetakse proove senikaua, kuni segamisaeg enam katselahuse kontsentratsiooni ei mõjuta. Kõigi proovide pH registreeritakse.

1.6.5. Analüüs Määramisel eelistatakse spetsiifilisi määramismeetodeid, kuna juba väikesed lisandikogused võivad mõõdetud lahustuvuse väärtuses anda suure vea. Sellised meetodid on näiteks gaas- ja vedelikkromatograafia, tiitrimismeetodid, fotomeetrilised meetodid ja voltampermeetrilised meetodid.

2. ANDMED

2.

2.1. KOLONN-ELUEERIMISMEETOD Iga katse puhul tuleks välja arvutada vähemalt viie järjestikuse, küllastusplatool võetud proovi keskmine väärtus ning standardhälve. Tulemused tuleks väljendada massiühikutes lahuse ruumala kohta. Võrreldakse kahe erineva voolukiirusega katse tulemusi ja nende korratavus peaks olema alla 30 %.

2.2. KOLVIMEETOD Esitada tuleks kõigi kolme kolvi puhul saadud tulemused; konstantseks loetud tulemused (korratavusega alla 15 %) tuleks keskmistada ja väljendada massiühikutes lahuse ruumala kohta. Selleks võib olla vaja teisendada massiühikud ruumalaühikuteks, kasutades tihedust, kui lahustuvus on väga kõrge (> 100 g/l).

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KOLONN-ELUEERIMISMEETOD Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

eelkatse tulemusi;

aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

kõigi proovide kontsentratsiooni, voolukiirust ja pH-d;

iga katse kohta vähemalt viie küllastusplatool võetud proovi keskväärtusi ja standardhälbeid;

kahe järjestikuse, kriteeriumidele vastava katse keskmist väärtust;

vee temperatuuri küllastamisprotsessis;

kasutatud analüüsimeetodit;

kasutatud tugiaine iseloomu;

tugiaine katmisega seotud andmeid;

kasutatud lahustit;

andmeid aine mis tahes keemilise ebastabiilsuse kohta katse ja kasutatud meetodi tingimustes;

kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevaid andmeid.

3.2. KOLVIMEETOD Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

eelkatse tulemusi;

aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

iga üksiku analüüsi tulemust ja tulemuste keskmist, juhul kui ühe kolvi kohta tehti mitu mõõtmist;

kõigi proovide pH-d;

erinevate, kokkulangevaid tulemusi andnud kolbide puhul mõõdetud tulemuste keskväärtusi;

katsetemperatuuri;

kasutatud analüüsimeetodit;

andmeid aine mis tahes keemilise ebastabiilsuse kohta katse ja kasutatud meetodi tingimustes;

kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevaid andmeid.

4.1.2.3. VIITED OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method. NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.

A.8. JAOTUSTEGUR

A.8.

1. MEETOD Kirjeldatud loksutamismeetod põhineb OECD katsesuunisel (1).

1.

1.1. SISSEJUHATUS Katse tegemiseks on kasulik teada aine struktuuri ja dissotsiatsioonikonstanti, lahustuvust vees, hüdrolüüsuvust, lahustuvust oktanoolis ja pindpinevust. Sooli moodustavate ainete puhul tuleks mõõtmisi teha ainult vabas olekus ainega (vabal happel või vabal alusel), mis saadakse sobiva puhverlahuse kasutamisel pH-ga vähemalt ühe ühiku võrra alla (vaba happe saamiseks) või üle (vaba aluse saamiseks) vastava pK. Katsemeetod sisaldab kaht eraldi protseduuri: loksutamismeetodit ja kõrge eraldusvõimega vedelikkromatograafiat (HPLC). Esimest meetodit kasutatakse ainetel log Pow (mõisteid vt allpool) väärtusega vahemikus –2 kuni 4, viimast ainetel log Pow väärtusega vahemikus 0 kuni 6. Enne kummagi katseprotseduuri rakendamist tuleks varem kindlaks teha jaotusteguri hinnanguline väärtus. Loksutamismeetodit saab kasutada ainult puhaste, vees ja oktanoolis lahustuvate ainete puhul. Seda ei saa kasutada pindaktiivsete ainete korral (viimaste puhul tuleks esitada arvutuslikult leitud väärtus või hinnanguline väärtus, mis on leitud üksikute lahustuvuste põhjal oktanoolis ja vees). HPLC meetodit ei saa kasutada tugevate hapete ega aluste, metallikomplekside, pindaktiivsete ainete ega eluendiga reageerivate ainete puhul. Nende ainete korral tuleks esitada arvutuslikult leitud väärtus või hinnanguline väärtus, mis on leitud üksikute lahustuvuste põhjal oktanoolis ja vees). HPLC meetod on katseühendis olevate lisandite suhtes vähem tundlik kui loksutamismeetod. Sellele vaatamata võivad lisandid tulemuste tõlgendamise keeruliseks muuta, kuna piike ei saa enam kindlalt identifitseerida. Eristamatute piikidega segude puhul tuleks esitada log P ülemine ja alumine piir.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Jaotustegur (P) on määratletud lahustunud aine tasakaalukontsentratsioonide (ci) suhtena kahest praktiliselt segunematust lahustist koosnevas kahefaasilises süsteemis. Oktanooli ja vee puhul: pow=cn-oktanoolcwessi Jaotustegur (P) on seega kahe kontsentratsiooni suhe ja seda väljendatakse harilikult kümnendlogaritmina (log P).

1.3. VÕRDLUSAINED

1.3. Loksutamismeetod

Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.

HPLC meetod

Ühendi HPLC mõõtmistulemuste ja tema P väärtuse vastavuse leidmiseks tuleb koostada vähemalt kuue punktiga kaliibrimiskõver telgedes log P vs. HPLC mõõtmistulemused. Sobivad võrdlusained peab valima analüüsi sooritaja. Võimaluse korral peaks üks võrdlusühend olema testainest kõrgema ja üks madalama POW väärtusega. Log P väärtustel alla 4 piisab kaliibrimiseks loksutamismeetodil saadud andmetest. Log P väärtustel üle 4 võib kaliibrimiseks kasutada kirjanduses esitatud andmeid, kui need on kooskõlas arvutuslikult leitud väärtustega. Suurema täpsuse huvides on eelistatav kasutada testainele struktuuriliselt lähedasi võrdlusühendeid. Kirjandusest on paljude ainerühmade kohta võimalik leida ulatuslikke andmekogumeid log POW väärtustega (2, 3). Kui samalaadse struktuuriga ühendite jaotustegurite kohta andmed puuduvad, võib kasutada vähem spetsiifilist kaliibrimist muude võrdlusühenditega. Liites 2 esitatakse soovitatavate võrdlusainete ja nende POW väärtuste nimekiri.

1.4. KATSEMEETODITE PÕHIMÕTE

1.4.

1.4.1. Loksutamismeetod Jaotusteguri määramiseks tuleb saavutada kõigi süsteemi vastastiktoimes olevate komponentide tasakaal ja määrata siis kummaski faasis lahustunud ainete kontsentratsioonid. Selleteemalise kirjanduse põhjal on selleks võimalik kasutada mitmeid erinevaid meetodeid; nt kaks faasi segatakse põhjalikult ja eraldatakse seejärel uuritava aine tasakaalukontsentratsiooni määramiseks.

1.4.2. HPLC meetod HPLC jaoks kasutatakse müügil olevaid analüütilisi kolonne, mille täidiseks on pikkade (nt C8, C18) silikageeliga seotud süsivesinikahelatega tahke faas. Seesugusesse kolonni süstitud kemikaalid liiguvad selles erinevate kiirustega, kuna jaotuvad liikuva faasi ja statsionaarse süsivesinikfaasi vahel erinevalt. Kemikaalide segud elueeruvad oma hüdrofoobsuse järjekorras – vees lahustuvad kemikaalid elueeruvad esimesena ja rasvlahustuvad viimasena, olenevalt oma süsivesiniku-vee jaotustegurist. Nii on retentsiooniaega sellises (pöördfaasilises) kolonnis võimalik seostada oktanooli/vee jaotusteguriga. Jaotustegur leitakse mahtuvustegurist k, mille valem on järgmine: k=tr-toto kus tr = testaine retentsiooniaeg ja t0 = keskmine aeg, mille jooksul lahustimolekul läbib kolonni (surnud aeg). Kvantitatiivne analüüs pole vajalik, määrata tuleb ainult retentsiooniajad.

1.5. KVALITEEDINÕUDED

1.5.

1.5.1. Korratavus

1.5.1. Loksutamismeetod

Leitava jaotusteguri täpsuse tagamiseks tehakse kordusmõõtmised kolmedel erinevatel katsetingimustel, erineva ainekoguse ja erineva lahustite mahu suhtega. Korduskatsetel määratud jaotusteguri väärtused peaksid logaritmina väljendatuna ±0,3 ühiku täpsusega kokku langema.

HPLC meetod

Mõõtmistulemuste usaldusväärsuse parandamiseks tuleks teha kordusmõõtmised. Üksikutel mõõtmistel määratud log P väärtused peaksid ±0,1 ühiku täpsusega kokku langema.

1.5.2. Tundlikkus

1.5.2. Loksutamismeetod

Meetodi mõõtepiirkonna määrab kasutatava analüüsimeetodi avastamispiir. See peaks võimaldama määrata log POW väärtused vahemikus –2 kuni 4 (mõningatel tingimustel võib ülemist piiri nihutada kuni log POW väärtuseni 5) eeldusel, et lahustunud aine kontsentratsioon kummaski faasis ei ületa 0,01 mooli liitris.

HPLC meetod

HPLC meetod võimaldab määrata jaotusteguri log POW vahemikus 0–6. Üldjuhul langeb selle meetodi abil määratud jaotusteguri logaritmiline väärtus ± 1 ühiku täpsusega kokku loksutamismeetodi abil leitud väärtusega. Tüüpilisi vastavusi võib leida kirjandusest (4, 5, 6, 7, 8). Suurem täpsus on tavaliselt saavutatav samalaadse struktuuriga võrdlusühendite kasutamisel (9).

1.5.3. Spetsiifilisus

1.5.3. Loksutamismeetod

Nernsti jaotusseadus kehtib ainult konstantsel temperatuuril, rõhul ja pH-l ning ainult lahjendatud lahustes. See kehtib ainult puhta, kahe puhta lahusti vahel dispergeeritud aine puhul. Kui ühes või mõlemas faasis on samal ajal mitu lahustunud ainet, võib see tulemusi mõjutada. Lahustunud molekulide dissotsieerumise või assotsieerumisega kaasnevad samuti kõrvalekalded Nernsti jaotusseadusest. Kõrvalekalded väljenduvad sõltuvuse tekkes jaotusteguri ja lahuse kontsentratsiooni vahel. Paljude tulemust mõjutavate tasakaalude tõttu ei tohiks seda katsemeetodit dissotsieeruvatel ühenditel vastava paranduseta kasutada. Selliste ühendite puhul tuleks kaaluda puhverlahuse kasutamist vee asemel; puhvri pH peaks vähemalt ühe ühiku võrra erinema aine pKa väärtusest ja arvesse tuleks võtta selle pH mõju antud keskkonnale.

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Jaotusteguri esialgne hindamine Jaotustegurit on eelistatav hinnata arvutuslikult (vt liidet 1) või testaine lahustuvuse suhte põhjal puhastes lahustites (10).

1.6.2. Loksutamismeetod

1.6.2.

1.6.2.1. Lahustite ettevalmistamine Oktanool: jaotusteguri määramisel tuleks kasutada analüüsipuhast lahustit. Vesi: kasutada tuleks vett, mis on bidestilleeritud klaas- või kvartsseadmes. Dissotsieeruvate ühendite puhul tuleks vee asemel kasutada puhverlahuseid, juhul kui see on õigustatud. Märkus Otse ioonvahetist pärinevat vett kasutada ei tohi.

1.6.2.1.

1.6.2.1.1. Lahustite eelküllastamine Enne jaotustegur määramist tuleks lahustitesüsteemi faasid katsetemperatuuril loksutades üksteise suhtes küllastada. Praktiline lahendus selleks on panna analüüsipuhas oktanool ja vesi kumbki suures pudelis piisava koguse teise lahustiga 24 tunniks mehaanilisele loksutile ja lasta neil seejärel seista faaside eraldumise ja küllastumiseni.

1.6.2.1.2. Katseks valmistumine Kahefaasilise süsteemi kogumaht peaks katseanuma peaaegu täielikult täitma. See aitab vältida kadusid lendumise kaudu. Kasutatavate mahtude suhe ja ainekogused sõltuvad järgmistest asjaoludest: Sooritatakse kolm katset. Esimeses kasutatakse arvutatud oktanooli-vee suhet, teises jagatakse see suhe kahega ja kolmandas korrutatakse see suhe kahega (nt 1:1, 1:2, 2:1).

esialgsest hinnangulisest jaotusteguri väärtusest (vt eespool);

analüüsiks vajalikust minimaalsest testaine kogusest ning

kontsentratsioonipiirangust 0,01 mol/l kummaski faasis.

1.6.2.1.3. Testaine Valmistatakse põhilahus veega eelküllastatud oktanoolis. Põhilahuse kontsentratsioon tuleks enne selle jaotusteguri mõõtmisel kasutamist täpselt kindlaks määrata. Lahust tuleks säilitada tingimustes, mis tagavad selle stabiilsuse.

1.6.2.2. Katsetingimused Katsetemperatuuri tuleks hoida konstantsena (± 1 oC) ja see peaks jääma vahemikku 20–25 oC.

1.6.2.3. Mõõtmisprotseduur

1.6.2.3.

1.6.2.3.1. Jaotustasakaalu saavutamine Kõigi katsetingimuste jaoks tuleks kahes eksemplaris ette valmistada vajalikud mõlema lahusti kaalutised koos vajaliku koguse põhilahusega. Oktanoolifaase tuleks mõõta mahu järgi. Katseanumaid tuleks loksutada kas sobival loksutil või käsitsi. Tsentrifuugiklaasi kasutamisel on seda soovitatav kiiresti 180o ümber oma risttelje pöörata, nii et sissejäänud õhk tõuseb läbi mõlema faasi. Kogemused on näidanud, et tavaliselt piisab jaotustasakaalu saavutamiseks 50 sellisest pöördest. Kindluse mõttes on soovitatav rakendada 100 pööret viie minuti jooksul.

1.6.2.3.2. Faaside eraldamine Vajaduse korral tuleks segu faaside eraldamiseks tsentrifuugida. Seda tuleks teha toatemperatuuril hoitavas laboritsentrifuugis; mittetermostateeritava tsentrifuugi kasutamisel tuleks tsentrifuugiküvette enne analüüsi vähemalt tund aega tasakaalustada.

1.6.2.4. Analüüs Jaotusteguri määramiseks tuleb määrata testaine kontsentratsioonid mõlemas faasis. Selleks võib võtta kindla koguse lahust iga katsenõu mõlemast faasist ja analüüsida neid vastavalt valitud meetodile. Arvutada tuleks mõlemas faasis oleva aine koguhulka ja võrrelda seda alguses süsteemi viidud kogusega. Proovide võtmisel veefaasist tuleks kasutada meetodit, mille puhul oktanoolifaasi jälgede proovi sattumise oht on minimaalne, näiteks klaassüstlalt eemaldatava nõelaga. Süstal peaks algul olema osaliselt õhuga täidetud. Nõela viimisel läbi oktanoolikihi tuleks õhk õrnalt välja suruda. Küllaldane kogus veefaasi tõmmatakse süstlasse. Süstal tõmmatakse kiirelt lahusest välja ja nõel eemaldatakse. Süstla sisu võib seejärel veefaasi proovina kasutada. Kontsentratsioonid eraldatud faasides tuleks eelistatavalt määrata spetsiifiliste määramismeetodite abil. Sobida võivad näiteks järgmised analüüsimeetodid:

fotomeetrilised meetodid;

gaaskromatograafia;

kõrge eraldusvõimega vedelikkromatograafia.

1.6.3. HPLC meetod

1.6.3.

1.6.3.1. Ettevalmistused

1.6.3.1. Seade

Vajalik on pulseerimisvaba pumba ja sobiva detektoriga vedelikkromatograaf. Soovitatav on kasutada silmusega sisestamisklappi. Polaarsete rühmade esinemine statsionaarses faasis võib HPLC kolonni efektiivsust oluliselt vähendada. Seetõttu peaks polaarsete rühmade sisaldus statsionaarses faasis olema minimaalne (11). Kasutada võib müügil olevaid mikrogranulaarseid pöördfaasilisi täidiseid või valmiskolonne. Sisestamissüsteemi ja analüüsikolonni vahel võib olla kaitsekolonn.

Liikuvfaas

Elueerimislahusti valmistatakse HPLC-puhtast metanoolist ja HPLC-puhtast veest ning see degaseeritakse enne kasutamist. Kasutada tuleks isokraatilist elueerimist. Veesisaldus metanooli-vee liikuvfaasides peaks olema vähemalt 25 %. Tavaliselt piisab ühendite, mille log P = 6, elueerimiseks ühe tunni jooksul 1 ml/min voolukiiruse juures metanooli-vee suhtest 3:1 (mahu järgi). Kõrge log P-ga ühendite (ja võrdlusühendite) puhul võib olla vaja retentsiooniaega lühendada, vähendades selleks liikuva faasi polaarsust või kolonni pikkust. Oktanoolis väga madala lahustuvusega ühenditel kaldub HPLC meetodi kohaselt leitud log POW väärtus olema ebaharilikult madal; selliste ühendite piigid elueeruvad vahel koos lahusti frondiga. See on tõenäoliselt tingitud asjaolust, et jaotumisprotsess on liiga aeglane, saavutamaks normaalse kestusega HPLC eraldamise jooksul tasakaalu. Usaldusväärse väärtuse saamiseks võib sellisel juhul abi olla voolukiiruse vähendamisest ja/või metanooli-vee suhte alandamisest. Katse- ja võrdlusühendite lahustuvus liikuvas faasis peab olema küllaldane nende tuvastamiseks. Metanooli-vee segus võib lisandeid kasutada ainult erandjuhtudel, kuna lisandid muudavad kolonni omadusi. Lisanditega kromatogrammide tegemisel tuleb kasutada teist sama tüüpi kolonni. Kui metanooli-vee eluent ei sobi, võib kasutada muid orgaanilise lahusti ja vee segusid, nt etanooli-vee või atsetonitriili-vee segu. Dissotsieeruvate ühendite puhul on eluendi pH kriitilise tähtsusega. See peaks jääma kolonni töövahemikku, mis on tavaliselt 2–8. Soovitatav on kasutada puhverlahust. Hoolikalt tuleks vältida soolade sadestumist ja kolonni omaduste halvenemist, mida tuleb ette mõningate orgaanilise faasi/puhverlahuse segude puhul. HPLC määramisi ei ole silikageelil põhinevate statsionaarsete faasidega pH väärtustel üle 8 soovitatav teha, kuna aluseline liikuv faas võib kolonni omadusi järsult halvendada.

Lahustunud ained

Võrdlusühendid peaksid olema võimalikult kõrge puhtusastmega. Uuritavad ja kaliibrimisel kasutatavad ühendid lahustatakse võimaluse korral liikuvas faasis.

Katsetingimused

Temperatuur ei tohiks mõõtmiste käigus kõikuda rohkem kui ± 2 K.

1.6.3.2. Mõõtmine

1.6.3.2. Surnud aja t0 arvutamine

Surnud aega t0 võib määrata kas homoloogilise rea (nt alküülmetüülketoonid) või kolonnis mittepeetuvate orgaaniliste ühendite (nt tiouurea, formamiid) abil. Surnud aja arvutamiseks homoloogilise rea abil süstitakse kolonni vähemalt seitse homoloogilise rea liiget ja määratakse vastavad retentsiooniajad. Töötlemata retentsiooniaja väärtused tr (n c + 1) esitatakse tr (n c) funktsioonina ja leitakse järgmise regressioonivõrrandi lõikepunkt a ja tõus b: tr(nc + 1) = a + b tr(nc) (nc = süsinikuaatomite arv). Surnud aeg t0 leitakse seejärel järgmisest valemist: t0 = a/(1-b)

Kaliibrimisgraafik

Järgmise etapina koostatakse sobivate võrdlusühendite log k versus log P korrelatsioonikõver. Praktikas süstitakse ühel ajal 5–10 võrdlusühendit, mille log P jääb eeldatavasse log P vahemikku, ja määratakse retentsiooniajad, eelistatavalt detektorsüsteemiga ühendatud meerikuga integraatori abil. Arvutatakse vastavad logaritmilised mahtuvustegurite väärtused log k ja esitatakse graafiliselt nende sõltuvus loksutamismeetodil leitud log P väärtustest. Kaliibrimine tehakse regulaarsete ajavahemike tagant, vähemalt kord päevas, et võtta arvesse võimalikke kolonni efektiivsuse muutusi.

Testaine mahtuvusteguri määramine

Testaine süstitakse võimalikult väikese liikuvfaasi kogusega. Määratakse retentsiooniaeg (soovitatavalt kahe paralleelmääramisena), võimaldades nii arvutada mahtuvustegurit k. Seejärel saab võrdlusühendite korrelatsioonigraafiku põhjal interpoleerida testaine jaotusteguri. Väga kõrgete ja väga madalate jaotustegurite korral tuleb väärtus ekstrapoleerida. Sellisel juhul tuleb hoolikalt silmas pidada regressioonisirge usalduspiiri.

2. ANDMED

2. Loksutamismeetod

Määratud log P väärtuste usaldatavust saab kontrollida topeltmääramiste tulemuste keskmise võrdlemisel üldise keskmisega.

3. ARUANDLUS Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

kui kumbki meetod ei ole kohaldatav (nt pindaktiivsete ainete puhul), tuleks esitada arvutuslikult leitud väärtus või hinnanguline väärtus, mis on leitud üksikute lahustuvuste põhjal oktanoolis ja vees);

kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmeid ja märkusi.

esialgse hinnangulise määramise tulemust, kui see leiti;

määramistemperatuuri;

kontsentratsioonide määramisel kasutatud analüüsiprotseduuride andmeid;

tsentrifuugimise kestust ja kiirust, kui seda kasutati;

mõlemas faasis igal määramisel leitud kontsentratsioone (st kokku 12 kontsentratsiooni väärtust);

testaine massi, mõlema faasi mahtu igas katseanumas ja pärast tasakaalustamist kummaski faasis oleva testaine summaarset arvutuslikku kogust;

iga katsetingimuste kogumi kohta tuleks esitada jaotusteguri (P) arvutuslikult leitud väärtused ning nende keskmine, samuti kõigi määramiste keskmine. Kui on märke jaotusteguri kontsentratsioonisõltuvusest, tuleks see aruandes ära märkida;

esitada tuleks üksikute P väärtuste standardhälve nende keskväärtusest;

kõigi määramiste keskmine P väärtus tuleks esitada ka kümnendlogaritmina;

arvutuslikku teoreetilist POW väärtust, kui selline väärtus määrati või kui mõõdetud väärtus on suurem kui 104;

katses kasutatud vee ja veefaasi pH-d;

puhvrite kasutamisel nende vee asemel kasutamise põhjendust, nende koostist, kontsentratsiooni ja pH väärtust ning veefaasi pH väärtust enne ja pärast katset.

esialgse hinnangulise määramise tulemust, kui see leiti;

test- ja võrdlusaineid ja nende puhtust;

määramiste temperatuurivahemikku;

pH-d, mille juures määramised tehti;

andmeid analüüsi- ja kaitsekolonni, liikuva faasi ja kasutatud detektori kohta;

kaliibrimisel kasutatud võrdlusühendite retentsiooniandmeid ja kirjanduses esitatud log P väärtusi;

sobitatud regressioonisirge (log k versus log P) andmeid;

katseühendi keskmisi retentsiooniandmeid ja interpoleeritud log P väärtust;

seadmete ja töötingimuste kirjeldust;

elueerimisprofiile;

kolonni viidud test- ja võrdlusainete koguseid;

surnud aega ja selle määramise meetodit.

4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.

VIITED OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219 (1981). B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1 459. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16,1 207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1 113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984, Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel 1978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.

A.9. LEEKPUNKT

A.9.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Katse tegemiseks on kasulik teada aine süttivust. Katsemeetod sobib vedelikele, mille aurud võivad süüteallika abil süttida. Siintoodud katsemeetodid annavad usaldusväärseid tulemusi ainult iga meetodi puhul märgitud leekpunkti vahemikus. Kasutatava meetodi valikul tuleks arvestada keemiliste reaktsioonide võimalusega aine ja proovianuma vahel.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Leekpunkt on madalaim, normaalrõhule 101,325 kPa normaliseeritud temperatuur, mille juures eraldub vedelikust katsemeetodis määratletud tingimustel aure sellises koguses, et katseanumas tekib süttiv auru/õhu segu. Ühikud: oC t = T – 273,15 (t ( oC) ja T (K))

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Aine viiakse katseanumasse ja soojendatakse või jahutatakse iga meetodi puhul kirjeldatud protseduuri kohaselt katsetemperatuurini. Veendumaks, kas proov katsetemperatuuril süttib või mitte, tehakse süütamiskatsed.

1.5. KVALITEEDINÕUDED

1.5.

1.5.1. Korratavus Korratavus varieerub vastavalt leekpunkti vahemikule ja kasutatavale katsemeetodile; maksimum on 2 oC.

1.5.2. Tundlikkus Tundlikkus sõltub kasutatavast katsemeetodist.

1.5.3. Spetsiifilisus Osade katsemeetodite spetsiifilisus piirdub kindlate leekpunkti vahemikega ja sõltub ainespetsiifilistest omadustest (nt kõrge viskoossus).

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Ettevalmistused Testaine proov viiakse punktidele 1.6.3.1 ja/või 1.6.3.2 vastavasse katseseadmesse. Ohutuse huvides on kõrge siseenergiaga või mürgiste ainete puhul soovitatav kasutada väikest proovikogust, u 2 cm3, kasutavaid meetodeid.

1.6.2. Katsetingimused Kui see ei ole vastuolus ohutusnõuetega, tuleks katseseade paigaldada tõmbevabasse asukohta.

1.6.3. Katse tegemine

1.6.3.

1.6.3.1. Tasakaaluline meetod Vt ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2. Mittetasakaaluline meetod

1.6.3.2. Abeli seade

Vt BS 2000, 170. osa, NF M07-011, NF T66-009.

Abel-Pensky seade

Vt EN 57, DIN 51755, 1. osa (temperatuuridele 5–65 oC), DIN 51755, 2. osa (temperatuuridele alla 5 oC), NF M07-036.

Tagi seade

Vt ASTM D 56.

Pensky-Martensi seade

Vt ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Märkused

Kui mittetasakaalulise meetodiga (1.6.3.2) määratud leekpunkt on 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC või 55 ± 2 oC, tuleb saadud tulemust kinnitada sama seadmega ja tasakaalulise meetodi abil. Teavitamiseks võib kasutada ainult meetodeid, mille abil saab määrata leekpunkti temperatuuri. Viskoossete, lahusteid sisaldavate vedelike (värvid, kummid jms) leekpunkti määramiseks võib kasutada ainult viskoossete vedelike leekpunkti määramiseks ette nähtud seadmeid ja katsemeetodeid. Vt ISO 3679, ISO 368O, ISO 1523, DIN 53213, 1. osa.

2. ANDMED

3. ARUANDLUS Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

kasutatud meetodit ja võimalikke kõrvalekaldeid sellest;

kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid andmeid ja lisamärkusi.

4. VIITED Puuduvad.

A.10. SÜTTIVUS (TAHKED AINED)

A.10.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Katse tegemiseks on kasulik teada aine võimalikku plahvatusohtlikkust. Käesolevat katset tuleks kasutada ainult pulbriliste, teraliste või pastataoliste ainete puhul. Et mitte hõlmata kõiki süttivaid aineid, vaid ainult kiiresti põlevaid või eriti ohtlike põlemisomadustega aineid, loetakse väga tuleohtlikuks ainult neid aineid, mille põlemiskiirus ületab teatava piirväärtuse. Eriti ohtlik võib olla hõõgumise levik läbi metallipuru, kuna see raskendab tule kustutamist. Metallipulbrid tuleks lugeda väga tuleohtlikuks, kui hõõgumisprotsess levib teatava aja jooksul läbi kogu pulbri massi.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Põlemisaeg sekundites.

1.3. VÕRDLUSAINED Nimetamata.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Ainest moodustatakse umbes 250 mm pikkune katkestusteta pulbririba ja tehakse esialgne sõelkatse kontrollimaks, kas gaasileegiga süütamisel levib põlemisprotsess leegi või hõõgumisena edasi. Kui põlemisprotsess levib kindlaksmääratud aja jooksul läbi 200 mm riba, viiakse põlemiskiiruse määramiseks läbi täiemahuline katseprogramm.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Täpsustamata.

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Esialgne sõelkatse Ainest moodustatakse mittesüttivale, mittepoorsele ja madala soojusjuhtivusega alusplaadile umbes 250 mm pikkune, 20 mm laiune ja 10 mm kõrgune katkestusteta pulbririba. Pulbririba ühele otsale suunatakse pulbri süttimiseni või kuni kaheks minutiks (metallide või metallisulamite pulbrite puhul viieks minutiks) vähemalt 5 mm läbimõõduga gaasipõleti leek. Tehakse kindlaks, kas põlemisprotsess läbib neljaminutilise (metallipulbrite puhul 40minutilise) katseaja jooksul 200 mm ribaosa. Kui pulber ei sütti või põlemisprotsess (leek või hõõgumine) ei läbi neljaminutilise (või 40minutilise) katseaja jooksul 200 mm pulbririba, ei loeta ainet väga tuleohtlikuks ja rohkem katseid sellega ei tehta. Kui põlemisprotsess läbib 200 mm pulbririba vähem kui nelja minutiga või metallipulbrite puhul vähem kui 40 minutiga, viiakse läbi allpool kirjeldatud protseduur (punkt 1.6.2 ja järgmised punktid).

1.6.2. Põlemiskiiruse katse

1.6.2.

1.6.2.1. Ettevalmistused 250 mm pikk, kolmnurkse läbilõikega, 10 mm sisemise kõrguse ja 20 mm sisemise laiusega vorm täidetakse tihendamata pulbrilise või teralise ainega. Vormi kummalegi küljele paigaldatakse pikisuunas külgpiiranguteks kaks metallplaati, mis ulatuvad 2 mm üle kolmnurkse vao ülaääre (vt joonist). Vorm kukutatakse seejärel kolm korda 2 cm kõrguselt kõvale aluspinnale. Vajaduse korral täidetakse vorm seejärel uuesti. Külgmised piirangud eemaldatakse ja liigne aine kaabitakse ära. Vormi peale paigaldatakse seejärel mittesüttiv, mittepoorne ja madala soojusjuhtivusega alusplaat, keeratakse vorm koos plaadiga ümber ja eemaldatakse vorm. Pastataolistest ainetest moodustatakse mittesüttivale, mittepoorsele ja madala soojusjuhtivusega alusplaadile 250 mm pikkune, umbes 1 cm2 läbilõikepindalaga riba.

1.6.2.2. Katsetingimused Niiskustundlike ainete puhul tehakse katse võimalikult kiiresti pärast aine hoiunõust eemaldamist.

1.6.2.3. Katse tegemine Riba paigutatakse tõmbekapi alla õhu liikumise suunaga risti. Õhu liikumise kiirus peab olema piisav, takistamaks suitsu levikut laborisse, ning seda tuleb katse jooksul konstantsena hoida. Seadme ümber tuleks paigaldada tõmbevari. Riba üks ots süüdatakse vähemalt 5 mm läbimõõduga gaasipõleti leegi abil. Kui riba on 80 mm ulatuses põlenud, mõõdetakse järgneva 100 mm kestel põlemiskiirus. Katset korratakse kuus korda, iga kord puhta jaheda alusplaadiga, välja arvatud juhul, kui ühel katsel on juba saadud positiivne tulemus.

2. ANDMED Hindamisel on vajalikud esialgse sõelkatse (1.6.1) põlemisaeg ja kuni kuuel põhikatsel (1.6.2.3) leitud lühim põlemisaeg.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

katseaine kirjeldust, füüsikalist olekut ja niiskusesisaldust;

esialgse sõelkatse ja põlemiskiiruse katse tulemusi (kui see tehti);

kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.

3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE Pulbrilised, teralised või pastataolised ained loetakse väga tuleohtlikuks, kui nende põlemisaeg punktis 1.6.2 kirjeldatud mis tahes katseprotseduuris on alla 45 sekundi. Metallide või metallisulamite pulbrid loetakse väga tuleohtlikuks juhul, kui need süttivad ja leek või reaktsioonivöönd levib kümne minutiga või kiiremini üle kogu proovi.

4. VIITED 1. NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

A.11. SÜTTIVUS (GAASID)

A.11.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS See meetod võimaldab määrata õhuga segunenud gaaside süttivust toatemperatuuril (u 20 oC) ja atmosfäärirõhul ning süttivate gaaside puhul kontsentratsioonivahemikku, milles nad süttivad. Järjest suurenevate kontsentratsioonidega katsegaasi-õhu segudes tekitatakse elektrisäde ja jälgitakse, kas gaas süttib.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Süttimispiirkond on kontsentratsioonivahemik alumise ja ülemise plahvatuspiiri vahel. Alumine ja ülemine plahvatuspiir on piirkontsentratsioonid, mille puhul leek õhuga segatud gaasis ei levi.

1.3. VÕRDLUSAINED Nimetamata.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Gaasi kontsentratsiooni õhus suurendatakse järk-järgult ja igas etapis tekitatakse segus elektrisäde.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Täpsustamata.

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Seade Katseanumaks on kummuli klaassilinder sisediameetriga vähemalt 50 mm ja kõrgusega vähemalt 300 mm. 3–5 mm vahekaugusega süüteelektroodid paigutatakse 60 mm kõrgusele silindri põhjast. Silindril on survepääsuklapiga ava. Plahvatuskahjustuste vältimiseks tuleb seade varjestada. Süüteallikana kasutatakse püsivat 0,5 s kestusega induktsioonsädet, mis tekitatakse 10–15 kV väljundpingega kõrgepingetrafo (maksimaalne sisendvõimsus 300 W) abil. Sobivat seadet on näiteks kirjeldatud viites 2.

1.6.2. Katsetingimused Katse viiakse läbi toatemperatuuril (u 20 oC).

1.6.3. Katse tegemine Doseerpumpade abil viiakse klaassilindrisse kindla kontsentratsiooniga gaasi-õhu segu. Segus tekitatakse säde ja jälgitakse, kas süüteallikast eraldub leek ja levib gaasis iseseisvalt. Gaasikontsentratsiooni muudetakse 1 % kaupa kuni eespool kirjeldatud süttimise toimumiseni. Kui gaasi keemiline struktuur viitab mittesüttivusele ja on võimalik välja arvutada stöhhiomeetrilise gaasiõhu segu koostis, siis kontrollitakse selliste 1 % astmetega ainult segusid kontsentratsioonivahemikus 10 % alla ja 10 % üle stöhhiomeetrilise kontsentratsiooni.

2. ANDMED Ainus selle omaduse määramisel oluline teave on leegi levimine.

3. ARUANDLUS Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

kasutatud seadme kirjeldust koos mõõtmetega;

katsetemperatuuri;

katsekontsentratsioone ja saadud tulemusi;

katse tulemust: mittesüttiv gaas või väga tuleohtlik gaas;

kui järeldatakse, et gaas on mittesüttiv, tuleks ära märkida kontsentratsioonivahemik, milles seda 1 % sammude kaupa testiti;

registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamisega seonduvad andmed ja märkused.

4.1.2. VIITED NF T 20-041 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol 56, 2, 126-127.

A.12. SÜTTIVUS (KOKKUPUUTEL VEEGA)

A.12.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Meetodi abil saab kontrollida, kas aine reaktsioonil vee või niiske õhuga tekib ohtlikus koguses gaasi või gaase, mis võivad olla väga tuleohtlikud. Katsemeetod on kohaldatav nii tahketele kui ka vedelatele ainetele. Meetod ei ole kohaldatav ainetele, mis kokkupuutel õhuga iseeneslikult süttivad.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Väga tuleohtlik: ained, mis kokkupuutel vee või niiske õhuga eraldavad ohtlikus koguses väga tuleohtlikke gaase kiirusega vähemalt 1 liiter/kg kohta tunnis.

1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Ainet kontrollitakse vastavalt allpool esitatud etapiviisilisele eeskirjale; kui mis tahes etapis leiab aset süttimine, pole edasine kontrollimine vajalik. Kui on teada, et aine veega ägedalt ei reageeri, jätkatakse 4. etapiga (1.3.4).

1.3.

1.3.1. 1. etapp Testaine viiakse 20 oC destilleeritud vett sisaldavasse süvendisse ja kontrollitakse, kas tekkiv gaas süttib.

1.3.2. 2. etapp Testaine kantakse 20 oC destilleeritud vett sisaldavas tassis ujuvale filterpaberile ja kontrollitakse, kas tekkiv gaas süttib. Filterpaberi ainus ülesanne on ainet koos hoida ja süttimise tõenäosust suurendada.

1.3.3. 3. etapp Testainest moodustatakse ligikaudu 2 cm kõrgune ja 3 cm läbimõõduga kuhi. Kuhjale lisatakse mõned tilgad vett ja kontrollitakse, kas tekkiv gaas süttib.

1.3.4. 4. etapp Testaine segatakse 20 oC destilleeritud veega ja mõõdetakse seitsme tunni jooksul ühetunniste vahedega gaasi eraldumise kiirust. Kui gaas eraldub ebaühtlase kiirusega või kiirus kasvab veel seitsme tunni pärast, pikendatakse mõõtmisaega kuni viie päevani. Kui kiirus ületab mis tahes ajahetkel 1 liitri/kg kohta tunnis, võib katse peatada.

1.4. VÕRDLUSAINED Nimetamata.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Täpsustamata.

1.6. MEETODITE KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. 1. etapp

1.6.1.

1.6.1.1. Katsetingimused Katse tehakse toatemperatuuril (u 20 oC).

1.6.1.2. Katse tegemine Väike (ligikaudu 2 mm läbimõõduga) kogus testainet viiakse destilleeritud vett sisaldavasse süvendisse. Kontrollitakse, kas i) eraldub gaasi ja ii) kas gaas süttib. Kui gaas süttib, pole edasine uurimine vajalik, kuna aine loetakse ohtlikuks.

1.6.2. 2. etapp

1.6.2.

1.6.2.1. Seade Mis tahes sobivas nõus, näiteks 100 mm läbimõõduga aurustuskausis, asetatakse destilleeritud vee pinnale filterpaber.

1.6.2.2. Katsetingimused Katse tehakse toatemperatuuril (u 20 oC).

1.6.2.3. Katse tegemine Väike (ligikaudu 2 mm läbimõõduga) kogus testainet kantakse filterpaberi keskkohta. Kontrollitakse, kas i) eraldub gaasi ja ii) kas gaas süttib. Kui gaas süttib, pole edasine uurimine vajalik, kuna aine loetakse ohtlikuks.

1.6.3. 3. etapp

1.6.3.

1.6.3.1. Katsetingimused Katse tehakse toatemperatuuril (u 20 oC).

1.6.3.2. Katse tegemine Testainest moodustatakse ligikaudu 2 cm kõrgune ja 3 cm läbimõõduga kuhi süvendiga tipus. Auku lisatakse mõned tilgad vett ja kontrollitakse, kas i) eraldub gaasi ja ii) kas gaas süttib. Kui gaas süttib, pole edasine uurimine vajalik, kuna aine loetakse ohtlikuks.

1.6.4. 4. etapp

1.6.4.

1.6.4.1. Seade Katseseade valmistatakse vastavalt joonisele.

1.6.4.2. Katsetingimused Kontrollida, kas testaine hoiuanumas leidub < 500 μm suuruseid osakesi sisaldavat pulbrit. Kui sellise pulbri sisaldus koguhulgas on üle 1 % mahu järgi või kui materjal on pude, tuleks kogu aine enne katsetusi pulbriks jahvatada, et arvestada osakeste suuruse vähenemisega ladustamisel ja käitlemisel; vastasel juhul uuritakse ainet töötlemata kujul. Katse tuleks teha toatemperatuuril (u 20 oC) ja atmosfäärirõhul.

1.6.4.3. Katse tegemine Seadme tilklehtrisse viiakse 10–20 ml vett ja seadme koonilisse kolbi viiakse 10 g ainet. Eralduva gaasi ruumala mõõdetakse mis tahes sobiva meetodiga. Tilklehtri kraan avatakse, nii et vesi pääseb koonilisse kolbi, ja käivitatakse stopper. Gaasi eraldumise kiirust mõõdetakse seitsme tunni jooksul ühetunniste vahedega. Kui gaasi eraldumise kiirus on selle aja kestel ebaühtlane või kasvab veel selle ajavahemiku lõpus, pikendatakse mõõtmisaega kuni viie päevani. Kui gaasi eraldumise kiirus ületab mis tahes ajahetkel 1 liitri/kg kohta tunnis, võib katse peatada. Tuleks teha kolm paralleelkatset. Kui ei ole teada, mis gaasiga on tegemist, tuleks seda analüüsida. Kui gaas sisaldab väga tuleohtlikke komponente ja ei ole teada, kas summaarne segu on väga tuleohtlik, tuleb valmistada sama koostisega segu ja kontrollida seda vastavalt meetodile A.11.

2. ANDMED Aine loetakse ohtlikuks kui

mis tahes katseetapis leiab aset iseeneslik süttimine või

eraldub tuleohtlikke gaase kiirusega vähemalt 1 liiter/kg aine kohta tunnis.

3. ARUANDLUS Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

testaine ettevalmistamise andmeid;

katsete tulemusi (1., 2., 3. ja 4. etapp);

eralduva gaasi keemilist koostist;

4. etapi (1.6.4) käigus gaasi eraldumise kiirust;

kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.

4.1.2. VIITED Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

A.13. TAHKETE AINETE JA VEDELIKE ISESÜTTIVUS

A.13.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Katsemeetod on kohaldatav tahketele ja vedelatele ainetele, mis väikestes kogustes toatemperatuuril (u 20 oC) õhuga kokku puutudes lühikese aja jooksul iseeneslikult süttivad. Katsemeetod ei hõlma aineid, mis peavad iseeneslikuks süttimiseks toatemperatuuril või kõrgemal temperatuuril õhuga kokku puutuma mitu tundi või päeva.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Ained loetakse isesüttivateks, kui need süttivad või söestuvad punktis 1.6 kirjeldatud tingimustel. Vedelike isesüttivust võib vaja olla kontrollida ka meetodi A.15 Isesüttimistemperatuur (vedelikud ja gaasid) kohaselt.

1.3. VÕRDLUSAINED Nimetamata.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Tahke aine või vedelik kantakse inertsele tugiainele ja viiakse toatemperatuuril viieks minutiks kokkupuutesse õhuga. Kui vedelik sellistes tingimustes ei sütti, imetakse see filterpaberisse ja viiakse toatemperatuuril (u 20 oC) viieks minutiks kokkupuutesse õhuga. Kui tahke aine või vedelik süttib või kui vedelik süütab või söestab filterpaberi, loetakse aine isesüttivaks.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Korratavus: kuna ohutus on oluline, loetakse aine isesüttivaks juba siis, kui üks tulemus on positiivne.

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Seade Umbes 10 cm läbimõõduga portselantass täidetakse toatemperatuuril (u 20 oC) umbes 5 mm kõrguselt diatomiitmullaga. Märkus Diatomiitmulla või mis tahes muu saadaval oleva võrreldava inertse ainega simuleeritakse mulda, millesse testaine õnnetusjuhtumi korral võib voolata. Inertsel kandjal õhuga kokku puutudes mittesüttivate vedelike testimiseks on vaja filterpaberit.

1.6.2. Katse tegemine

1.6.2. a)

Pulbrilised tahked ained 1–2 cm3 uuritavat pulbrit valatakse u 1 m kõrguselt mittesüttivale pinnale ja jälgitakse, kas aine süttib kukkumisel või mahalangemisest viie minuti jooksul. Katset korratakse kuus korda, kui aine enne ei sütti.

Vedelikud U 5 cm3 uuritavat vedelikku valatakse ette valmistatud portselantassi ja jälgitakse, kas aine süttib viie minuti jooksul. Kui aine kuue katse jooksul ei sütti, tuleb teha järgmised katsed: 0,5 ml testaine proov viiakse süstla abil sälgustatud filterpaberile ja jälgitakse, kas filterpaber süttib või söestub viie minuti jooksul vedeliku lisamisest. Katset korratakse kolm korda, kui paber enne ei sütti ega söestu.

2. ANDMED

2.

2.1. TULEMUSTE KÄSITLEMINE Katsed võib peatada kohe pärast positiivse tulemuse saamist mis tahes katses.

2.2. HINDAMINE Kui aine süttib viie minuti jooksul pärast inertsele tugiainele kandmist ja õhu kätte viimist või kui vedelik süütab või söestab filterpaberi viie minuti jooksul pärast lisamist ja õhu kätte viimist, loetakse aine isesüttivaks.

3. ARUANDLUS Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

aine täpset kirjeldust (koostist ja lisandeid);

katsete tulemusi;

kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.

4.1.2. VIITED NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14. PLAHVATUSOHTLIKKUS

A.14.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Meetod näeb ette katseskeemi, mille abil kontrollitakse, kas tahke või pastataoline aine on plahvatusohtlik kokkupuutel leegiga (termiline tundlikkus), löögi või hõõrdumise mõjul (mehaaniline tundlikkus) ja kas vedelik on leegi või löögi mõjul plahvatusohtlik. Meetod koosneb kolmest osast: Meetodi abil saadakse andmeid teatavate tavapäraste mõjuritega seotud plahvatusohu hindamiseks. Meetod ei ole mõeldud aine plahvatusohtlikkuse kontrollimiseks mis tahes tingimustes. Meetod sobib ainega seotud plahvatusohu (termilise ja mehaanilise tundlikkuse) määramiseks konkreetsetel direktiivis täpsustatud tingimustel. Meetodi puhul kasutatakse mitut tüüpi katseseadmeid, mis on laias rahvusvahelises kasutuses (1) ja mis annavad tavaliselt usaldusväärseid tulemusi. On selge, et meetod ei ole ammendav. Kirjeldatud seadmete asemel võib kasutada muid seadmeid eeldusel, et need on rahvusvaheliselt tunnustatud ja tulemused on piisavalt sarnased kirjeldatud seadmetel saadavate tulemustega. Katseid ei ole vaja teha juhul, kui saadaval olevad termodünaamilised andmed (nt tekkesoojus, lagunemissoojus) ja/või teatavate funktsionaalrühmade (2) puudumine struktuurivalemis tõestavad põhjendatud kahtluseta, et toimeaine ei lagune kiirelt gaaside või soojuse eraldumisega (st materjal ei ole plahvatusohtlik). Mehaanilise tundlikkuse katse hõõrdumise suhtes ei ole vedelike puhul nõutav.

1.1. a)

termilise tundlikkuse katse (1);

mehaanilise tundlikkuse katse löögi suhtes (1);

mehaanilise tundlikkuse katse hõõrdumise suhtes (1).

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Lõhkeaine Ained, mis võivad leegi mõjul plahvatada või on kirjeldatud seadmes löögi- või hõõrdetundlikud (või on muus seadmes suurema mehaanilise tundlikkusega kui 1,3-dinitrobenseen).

1.3. VÕRDLUSAINED 1,3-dinitrobenseen, tehniline kristalne saadus, läbib 0,5 mm sõela, hõõrdumis- ja löögimeetoditele. Perhüdro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triasiin (RDX, heksogeen, tsükloniit, CAS-i nr 121-82-4), kristallitud tsükloheksanooni vesilahusest, märgsõelutud läbi 250 μm sõela ja kinni peetud 150 μm sõelal, kuivatatud neli tundi 103 ± 2 oC juures, hõõrdumis- ja löögikatsete teise seeria jaoks.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Eelkatsed on vajalikud kolme tundlikkuskatse tarvis ohutute tingimuste määramiseks.

1.4.

1.4.1. Käsitlemisohutuse katsed (3) Ohutuse huvides rakendatakse väga väikestele proovidele (u 10 mg) enne põhikatsete tegemist kuumutamist gaasileegis vabas õhus, lööke mis tahes tavapärastes seadmetes ja hõõrdumist vasara ja alasi vahel või mis tahes muus hõõrdumisseadmes. Selle eesmärk on kontrollida, kas aine on nii tundlik ja plahvatusohtlik, et ettenähtud tundlikkuskatsetel, eriti termilise tundlikkuse katsetel, tuleb katse tegija vigastamise vältimiseks kasutada erilisi ettevaatusabinõusid.

1.4.2. Termiline tundlikkus Meetodi puhul kuumutatakse ainet erinevas läbimõõdus düüsidega plaatidega suletud terashülsis, et kontrollida, kas aine võib tugeva kuumuse ja piiratud ruumala tingimustes plahvatada.

1.4.3. Mehaaniline tundlikkus (löögitundlikkus) Meetodi puhul antakse ainele kindlalt kõrguselt kukutatud kindla massiga löök.

1.4.4. Mehaaniline tundlikkus (hõõrdetundlikkus) Meetodi puhul mõjutatakse tahkeid ja pastataolisi aineid standardsel pinnal määratud koormuse ja suhtelise liikumise abil tekitatud hõõrdumisega.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Täpsustamata.

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Termiline tundlikkus (leegi mõju)

1.6.1.

1.6.1.1. Seade Seade koosneb ühekordselt kasutatavast terashülsist korduvkasutatava sulguriga (joonis 1), mis on paigutatud kaitsvasse kuumutusseadmesse. Kõik hülsid on valmistatud sügavtõmbamisel lehtterasest (vt liidet) ja on 24 mm sisediameetriga, 75 mm pikad ja 0,5 mm paksuse seinaga. Hülssidel on avatud otsas äärik hülsi sulgemiseks düüsiga plaadiga sulgurseadme abil. Sulgur koosneb keskel asuva düüsiga survekindlast plaadist, mis kaheosalise keermega liitmiku (mutter ja keermega võru) abil kindlalt hülsi külge kinnitatakse. Mutter ja keermega võru on valmistatud kroom-mangaanterasest (vt liidet), mis on sädemevaba kuni temperatuurini 800 oC. Düüsiga plaadid on 6 mm paksud, valmistatud kuumuskindlast terasest (vt liidet) ja neid on mitmesuguse avasuurusega.

1.6.1.2. Katsetingimused Tavaliselt uuritakse ainet töötlemata kujul, kuid mõningatel juhtudel, nt kui see on kokku pressitud, vormi valatud või muul moel tihendatud, võib olla vaja see enne katsetusi purustada. Tahkete ainete puhul määratakse katsetes kasutatav ainekogus kaheetapilisel proovitäitmisel. Kaalutud hülss täidetakse 9 cm3 ainega ja tambitakse kogu hülsi ristlõike ulatuses avaldatava 80 N jõuga kokku. Ohutuse huvides või juhtudel, kus proovi füüsikaline olek võib surve mõjul muutuda, võib kasutada muid täitmismeetodeid; nt väga hõõrdetundliku aine puhul ei saa tampimist kasutada. Kui ainet on võimalik kokku suruda, lisatakse veel ainet ja jätkatakse tampimist, kuni hülss on täidetud 55 mm kauguseni ülaäärest. Määratakse hülsi 55 mm tasemeni täitmiseks vajalik ainekogus ja lisatakse veel kaks lisakogust, mis kumbki 80 N jõuga tampimisel tihendatakse. Seejärel ainet vastavalt vajadusele kas lisatakse ja tambitakse või eemaldatakse, nii et hülss täitub 15 mm kõrguseni ülaäärest. Järgmiseks tehakse teine proovitäitmine, alustades tambitud ainekogusega, mis moodustab kolmandiku esimesel proovitäitmisel leitud kogumassist. Lisatakse veel kaks lisakogust, mis 80 N jõuga tampimisel tihendatakse, ja ainekogus reguleeritakse lisamisel või eemaldamisel 15 mm kõrguseni ülaäärest. Teisel proovitäitmisel leitud ainekogust kasutatakse edasistes katsetes, täites hülsi kolmes võrdses osas, mis surutakse kokku ruumalani 9 cm3 mis tahes selleks vajaliku jõuga. (Selleks võib abivahendina kasutada vaherõngaid). Vedelikud ja geelid viiakse hülssi 60 mm kõrguseni, vältides geelide puhul hoolikalt õhuvahede teket. Keermega võru libistatakse altpoolt hülsi peale, paigaldatakse sobiv düüsiga plaat ja keeratakse mutter pärast molübdeendisulfiidmäärde lisamist kinni. Väga oluline on kontrollida, et ainet ei jääks ääriku ja plaadi või keermete vahele. Kuumutamisel kasutatakse propaani rõhuregulaatori (60–70 mbar) ja voolumõõturiga tööstuslikust balloonist, millest gaas jagatakse jaotustoru kaudu ühtlaselt (kontrollitakse visuaalselt põletite leekide järgi) nelja põleti vahel. Põletid asetsevad ringikujuliselt ümber katsekambri, nagu on näidatud joonisel 1. Kolme põleti kogukulu on umbes 3,2 liitrit propaani minutis. Kasutada võib muid küttegaase ja põleteid, kuid kuumutamise kiirus peab vastama joonisel 3 täpsustatule. Kõigi seadmete puhul tuleb kuumutamise kiirust regulaarselt kontrollida, kasutades selleks dibutüülftalaadiga täidetud hülsse, nagu on näidatud joonisel 3.

1.6.1.3. Katsete tegemine Iga katset sooritatakse hülsi purunemiseni või viie minuti möödumiseni kuumutamise algusest. Plahvatusega lõppenuks loetakse katse, mille tulemusel hülss puruneb kolmeks või enamaks tükiks, mis võivad omavahel olla kitsaste metalliribadega ühendatud, nagu on näha jooniselt 2. Väiksema arvu tükkidega või purunemiseta lõppenud katset plahvatusega lõppenuks ei loeta. Alguses tehakse kolm katset 6,0 mm düüsiga plaadiga ja kui plahvatust ei toimu, tehakse teine kolmene katseseeria 2,0 mm düüsiga plaadiga. Kui kummaski katseseerias plahvatust ei toimu, pole edasised katsed vajalikud.

1.6.1.4. Hindamine Katse loetakse positiivseks, kui kummaski eespool nimetatud katseseerias toimub plahvatus.

1.6.2. Mehaaniline tundlikkus (löögitundlikkus)

1.6.2.

1.6.2.1. Seade (joonis 4) Tüüpilise kukkuva vasaraga seadme põhiosa on valuterasest plokk aluse, alasi, posti, juhtrööbaste, kukkuvate raskuste, päästiku ja proovianumaga. 100 mm (läbimõõt) × 70 mm (kõrgus) terasalasi on kruvitud 230 mm (pikkus) × 250 mm (laius) × 200 mm (kõrgus) terasplokile valatud 450 mm (pikkus) × 450 mm (laius) × 60 mm (kõrgus) alusele. Tõmmatud terastorust liitekohtadeta post on kinnitatud terasploki tagaküljel olevasse fiksaatorisse. Seade on nelja kruviga ankurdatud monoliitsele 60 × 60 × 60 cm betoonplokile nii, et juhtrööpad on täiesti püstsuunalised ja kukkuv raskus langeb vabalt. Kasutada saab nii 5 kg kui ka 10 kg monoliitsest terasest raskusi. Iga raskuse löökpea on valmistatud karastatud terasest, HRC 60–63, ja selle miinimumläbimõõt on 25 mm. Uuritav proov on suletud löögiseadmesse, mis koosneb kahest koaksiaalsest, üksteise kohal paiknevast monoliitsest terassilindrist õõnsas silindrilises terasjuhtvõrus. Monoliitsed terassilindrid peaksid olema läbimõõduga 10 (–0,003, –0,005) mm ja kõrgusega 10 mm ning poleeritud pinna, ümarate nurkadega (kõverusraadius 0,5 mm) ja kõvadusega HRC 58–65. Õõnessilindril peab olema 16 mm välisdiameeter, poleeritud 10 (+0,005, +0,010) mm sisediameeter ja 13 mm kõrgus. Vahealasile (läbimõõt 26 mm ja kõrgus 26 mm) on paigaldatud terasest löögiseade, mille keskosas on tekkivaid gaase läbi laskva perforatsiooniga rõngas.

1.6.2.2. Katsetingimused Proov peaks olema mahuga 40 mm3 või muule seadmele sobiva mahuga. Tahkeid aineid tuleks uurida kuivana ja need ette valmistada järgmiselt: Tavaliselt pastadena tarnitavaid materjale tuleks võimaluse korral uurida kuivana või vähemalt eemaldada eelnevalt võimalikult suur osa lahjendist. Vedelikke testitakse 1 mm vahega alumise ja ülemise terassilindri vahel.

1.6.2.2. a)

pulbrilised ained sõelutakse (sõela ava 0,5 mm) ja katses kasutatakse kogu sõela läbinud osa;

kokku pressitud, vormi valatud või muul moel tihendatud materjalid purustatakse väiksemateks tükkideks ja sõelutakse; katses kasutatakse sõelumisel saadud fraktsiooni osakeste läbimõõduga 0,5–1 mm ja see fraktsioon peab esindama töötlemata algainet.

1.6.2.3. Katsete tegemine Tehakse kuuest katsest koosnev katseseeria, kukutades 10 kg raskust 0,40 m kõrguselt (40 J). Kui kuue katse jooksul 40 J juures toimub plahvatus, tuleb teha järgmine kuue katsega katseseeria, kukutades 5 kg raskust 0,15 m kõrguselt (7,5 J). Muudes seadmetes võrreldakse proovi tunnustatud meetodi (nt üles-alla tehnika jne) abil valitud võrdlusainega.

1.6.2.4. Hindamine Katse tulemus loetakse positiivseks, kui vähemalt ühel korral toimub kirjeldatud katseseadmetega mis tahes katses plahvatus (põlema lahvatamine ja/või paugatused on plahvatusega samaväärsed) või kui proov osutub muus löögikatses tundlikumaks kui 1,3-dinitrobenseen või RDX.

1.6.3. Mehaaniline tundlikkus (hõõrdetundlikkus)

1.6.3.

1.6.3.1. Seade (joonis 5) Hõõrdeseade koosneb valatud terasest alusplaadist, millele on paigaldatud hõõrdeseade. Viimane koosneb fikseeritud portselanpulgast ja liikuvast portselanplaadist. Portselanplaat asub kahel juhtrööpal jooksval kelgul. Kelk on ühendusvarda, ekstsentrilise nuki ja sobiva ülekande abil ühendatud elektrimootoriga nii, et portselanplaati liigutatakse portselanpulga all ainult üks kord 10 mm ulatuses edasi-tagasi. Portselanpulgale rakendatav jõud võib olla 120–360 N. Tasased portselanplaadid on valmistatud valgest tehnilisest portselanist (jämedusega 9–32 μm) ja nende mõõtmed on 25 mm (pikkus) × 25 mm (laius) × 5 mm (kõrgus). Silindriline portselanpulk on samuti valmistatud valgest tehnilisest portselanist ja on 15 mm pikk, 10 mm läbimõõduga ja karestatud ümarate otsapindadega, mille kõverusraadius on 10 mm.

1.6.3.2. Katsetingimused Proov peaks olema mahuga 10 mm3 või muule seadmele sobiva mahuga. Tahkeid aineid uuritakse kuivana ja nad valmistatakse ette järgmiselt: Tavaliselt pastadena tarnitavaid materjale tuleks võimaluse korral uurida kuivana. Kui pastast ei ole kuiva ainet võimalik valmistada, testitakse pastat (eemaldades eelnevalt võimalikult suur osa lahjendist) 0,5 mm paksuse, 2 mm laiuse ja 10 mm pikkuse, šablooni abil tekitatud kihina.

1.6.3.2. a)

pulbrilised ained sõelutakse (sõela ava 0,5 mm) ja katses kasutatakse kogu sõela läbinud osa;

1.6.3.3. Katsete tegemine Portselanpulk viiakse uuritava proovi kohale ja rakendatakse koormus. Katse ajal peavad karedad jooned portselanplaadil olema liikumissuunaga risti. Tuleb jälgida, et pulk toetuks proovile, et pulga all oleks küllaldane kogus testainet ja et plaat pulga all õigesti liiguks. Pastataolised ained kantakse plaadile 0,5 mm paksuse, 2 × 10 mm avaga šablooni abil. Portselanplaat peab portselanpulga all 0,44 sekundi jooksul 10 mm edasi ja tagasi liikuma. Iga plaadi ja pulga pinna osa võib kasutada ainult ühe korra; pulga mõlemat otsa võib kasutada kaheks katseks ja plaadi kumbagi külge kolmeks katseks. 360 N koormusega tehakse kuuest katsest koosnev katseseeria. Kui nende kuue katse käigus saadakse positiivne tulemus, tehakse 120 N koormusega veel üks kuuest katsest koosnev katseseeria. Muudes seadmetes võrreldakse proovi tunnustatud meetodi (nt üles-alla tehnika jne) abil valitud võrdlusainega.

1.6.3.4. Hindamine Katse tulemus loetakse positiivseks, kui vähemalt ühel korral toimub kirjeldatud katseseadmetega mis tahes katses plahvatus (pragin ja/või paugatused või põlema lahvatamine on plahvatusega samaväärsed) või kui proov vastab muus hõõrdekatses võrdväärsetele tingimustele.

2. ANDMED Aine loetakse direktiivi mõistes plahvatusohtlikuks juhul, kui termilise, löögi- või hõõrdetundlikkuse katses saadakse positiivne tulemus.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

testaine tunnusandmeid, koostist, puhtusastet, niiskusesisaldust jne;

proovi füüsikalist olekut ja seda, kas seda on purustatud ja/või sõelutud;

termilise tundlikkuse katsetes tehtud tähelepanekuid (nt proovi massi, kildude arvu jne);

mehaanilise tundlikkuse katsetes tehtud tähelepanekuid (nt suure suitsukoguse teke või täielik lagunemine ilma paugatuste, leekide, sädemete, pragina jne esinemiseta);

igat tüüpi katsete tulemusi;

kui kasutatud on muid seadmeid, tuleb esitada teaduslik põhjendus ning tõendid tulemuste vastavuse kohta kirjeldatud seadmetel saadud tulemustega;

kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid kommentaare, nagu viiteid katsetele analoogsete ainetega;

kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.

3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE JA HINDAMINE Katsearuandes tuleb ära märkida kõik tulemused, mis loeti valeks, anomaalseks või mitterepresentatiivseks. Kui mõnda tulemust ei arvestata, tuleb selle kohta lisada selgitus ja muude või täiendavate katsete tulemused. Kui anomaalsele tulemusele ei leidu seletust, tuleb seda arvestada täisväärtusliku tulemusena ja kasutada aine vastaval liigitamisel.

4.1.2.3.4. VIITED Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750- 60103-5,1990. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol.3, 6-13 and 30-42. NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.

A.15. ISESÜTTIMISTEMPERATUUR (VEDELIKUD JA GAASID)

A.15.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Lõhkeaineid ja tavalisel temperatuuril õhuga kokkupuutel süttivaid aineid ei tohiks selles katses uurida. Katsemeetod on kohaldatav gaasidele, vedelikele ja aurudele, mis õhu juuresolekul kuuma pinnaga kokku puutudes süttivad. Katalüütilised lisandid, pinnamaterjal või katseanuma suurem maht võivad isesüttimistemperatuuri oluliselt alandada.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Isesüttivuse määra väljendatakse isesüttimistemperatuurina. Isesüttimistemperatuur on madalaim temperatuur, mille juures testaine katsemeetodis määratletud tingimustel õhuga segatuna süttib.

1.3. VÕRDLUSAINED Võrdlusained on loetletud standardites (vt 1.6.3). Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Meetodi kohaselt määratakse kambri siseseina minimaalne temperatuur, mis põhjustab kambrisse süstitud gaasi, auru või vedeliku süttimise.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Korratavus varieerub vastavalt isesüttimistemperatuuri vahemikule ja kasutatavale katsemeetodile. Tundlikkus ja spetsiifilisus sõltuvad kasutatavast katsemeetodist.

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Seade Katseseadet kirjeldatakse punktis 1.6.3 viidatud meetodis.

1.6.2. Katsetingimused Testaine proovi uuritakse punktis 1.6.3 viidatud meetodi kohaselt.

1.6.3. Katse tegemine Vt IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. ANDMED Registreerige katsetemperatuur, atmosfäärirõhk, kasutatud proovikogus ja ajavahemik süttimiseni.

3. ARUANDLUS Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);

kasutatud proovikogust ja atmosfäärirõhku;

kasutatud katseseadet;

mõõtmistulemusi (katsetemperatuure, süttimistulemusi ja süttimiseni kulunud ajavahemikke);

kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.

4. VIITED Puuduvad.

A.16. TAHKETE AINETE SUHTELINE ISESÜTTIMISTEMPERATUUR

A.16.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Lõhkeaineid ja tavalisel temperatuuril õhuga kokkupuutel süttivad aineid ei tohiks selles katses uurida. Katse annab eelteavet tahkete ainete isesüttivuse kohta kõrgematel temperatuuridel. Kui aine reaktsioonil hapnikuga või eksotermilisel lagunemisel tekkiv soojus ei haju küllalt kiiresti keskkonda, leiab aset isesüttimiseni viiv isekuumenemine. Seega leiab isesüttimine aset siis, kui soojuse tekkekiirus ületab soojuskao kiiruse. Katse on kasutatav tahkete ainete esialgse sõelkatsena. Arvestades tahkete ainete süttimis- ja põlemisprotsesside keerukust, tuleks selle katsemeetodi abil leitud isesüttimistemperatuuri kasutada ainult võrdlemiseks.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Selle meetodi abil leitud isesüttimistemperatuur on madalaim temperatuur ( oC), mille juures kindel ainekogus määratletud tingimustel süttib.

1.3. VÕRDLUSAINE Puudub.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Uuritava aine kindlaksmääratud kogus viiakse toatemperatuuril ahju ja registreeritakse temperatuuri/aja kõver proovi keskosas ahju temperatuuri tõstmisel kiirusega 0,5 oC/min temperatuurini 400 oC või aine sulamistemperatuurini, kui viimane on madalam. Käesoleva katse kohaselt loetakse isesüttimistemperatuuriks ahju temperatuur, mille juures proovi temperatuur isekuumenemise tulemusel 400 oCni jõuab.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Puuduvad.

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Seade

1.6.1.

1.6.1.1. Ahi Juhitava temperatuuriga laboriahi (mahuga umbes 2 liitrit), millel on loomulik õhuvahetus ja plahvatuskaitseklapp. Vältimaks võimalikku plahvatusohtu, ei tohi eralduvaid lagunemisgaase lasta elektrikütteseadmetega kokku puutuda.

1.6.1.2. Traatvõrgust kuubik Tükk roostevabast terasest traatvõrku 0,045 mm võrgusilmaga lõigatakse välja vastavalt joonisel 1 toodud skeemile. Võrk volditakse kokku ja kinnitatakse traadiga nii, et tekib avatud ülaosaga kuubik.

1.6.1.3. Termopaarid Kasutatakse sobivaid termopaare.

1.6.1.4. Meerik Sobib mis tahes kahe kanaliga meerik, mis on kaliibritud temperatuurivahemikus 0–600 oC või vastavas pingevahemikus.

1.6.2. Katsetingimused Aineid uuritakse töötlemata kujul.

1.6.3. Katse tegemine Kuubik täidetakse uuritava ainega ja koputatakse õrnalt, misjärel lisatakse veel ainet, kuni kuubik on täielikult täidetud. Kuubik riputatakse seejärel toatemperatuuril oleva ahju keskele. Temperatuuri registreerimiseks paigutatakse üks termopaar kuubiku keskele ning teine kuubiku ja ahjuseina vahele. Ahju ja proovi temperatuur registreeritakse pidevalt ahju temperatuuri tõstmisel kiirusega 0,5 oC/min temperatuurini 400 oC või aine sulamistemperatuurini, kui viimane on madalam. Aine süttimisel näitab proovis olev termopaar temperatuuri järsku tõusu üle ahju temperatuuri.

2. ANDMED Hindamisel on oluline ahju temperatuur, mille juures jõuab proovi temperatuur isekuumenemise tulemusena 400 oCni (vt joonist 2).

3. ARUANDLUS Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

uuritava aine kirjeldust;

mõõtmistulemusi, sh temperatuuri/aja kõverat;

kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.

4. VIITED NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

4. Joonis 1 20 mm katsekuubiku skeem

Joonis 2 Tüüpiline temperatuuri/aja kõver

proovi temperatuur ahju temperatuur süttimis- temperatuur aeg

A.17. OKSÜDEERIVAD OMADUSED (TAHKED AINED)

A.17.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Katse tegemiseks on kasulik teada aine võimalikku plahvatusohtlikkust. Katset ei saa kasutada vedelike, gaaside, plahvatusohtlike või väga tuleohtlike ainete ega orgaaniliste peroksiidide puhul. Katset ei ole vaja teha juhul, kui toimeaine struktuurivalemi kontrollimisel ei jää põhjendatud kahtlust, et toimeaine reageerib põleva materjaliga eksotermiliselt. Kontrollimaks, kas katse tegemisel tuleks kasutada erilisi ettevaatusabinõusid, tuleks teha eelkatse.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Põlemisaeg: reaktsiooniaeg (sekundites), mis kulub reaktsioonivööndi levikuks piki kuhilat vastavalt punktis 1.6 kirjeldatud protseduurile. Põlemiskiirus: väljendatakse millimeetrites sekundi kohta. Suurim põlemiskiirus: suurim põlemiskiiruse väärtus, mis on mõõdetud 10–90 % oksüdeerijasisaldusega (massi järgi) segudes.

1.3. VÕRDLUSAINE Võrdlusainena kasutatakse nii katses kui ka eelkatses analüüsipuhast baariumnitraati. Võrdlussegu on selline punkti 1.6 kohaselt valmistatud baariumnitraadi ja pulbertselluloosi segu, millega saavutatakse suurim põlemiskiirus (tavaliselt 60 % baariumnitraadi sisaldusega (massi järgi) segu).

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Ohutuse huvides tehakse eelkatse. Kui eelkatse näitab selgelt, et testainel on oksüdeerivad omadused, pole edasine kontrollimine vajalik. Vastupidisel juhul tehakse aine kohta täiemahuline katseprogramm. Täiemahulises katseprogrammis segatakse uuritavast ainest ja kindlaksmääratud põlevast ainest mitmesugustes vahekordades segusid. Igast segust tehakse seejärel kuhi ja süüdatakse see ühest otsast. Leitud suurimat põlemiskiirust võrreldakse võrdlussegu suurima põlemiskiirusega.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Vajaduse korral võib kasutada mis tahes peenestamis- ja segamismeetodeid eeldusel, et kuues eraldi katses määratud suurimad põlemiskiirused ei erine aritmeetilisest keskmisest rohkem kui 10 %.

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Ettevalmistused

1.6.1.

1.6.1.1. Testaine Uuritava proovi osakeste suurust vähendatakse järgmisel meetodil alla 0,125 mm: testaine sõelutakse, seejärel peenestatakse sõelale jäänud osa ja korratakse protseduuri senikaua, kuni kogu proov on sõela läbinud. Kasutada võib kvaliteedinõuetele vastavaid mis tahes peenestamis- ja sõelumismeetodeid. Enne segu valmistamist kuivatatakse ainet 105 oC juures konstantse massi saavutamiseni. Kui uuritava aine lagunemistemperatuur on alla 105 oC, kuivatatakse aine sobival madalamal temperatuuril.

1.6.1.2. Põlevaine Põlevainena kasutatakse pulbertselluloosi. Tselluloos peaks olema õhukese kihi kromatograafias või kolonnkromatograafias kasutatavat tüüpi. Sobivaks on osutunud tselluloositüüp, mille kiupikkused jäävad 85 % ulatuses vahemikku 0,020–0,075 mm. Tselluloosipulber sõelutakse läbi 0,125 mm avasuurusega sõela. Kogu katse kestel tuleb kasutada samast partiist pärit tselluloosi. Enne segu valmistamist kuivatatakse pulbertselluloosi 105 oC juures konstantse massi saavutamiseni. Kui eelkatses kasutatakse puidutolmu, valmistatakse okaspuu puidutolm ette järgmiselt: kogutakse fraktsioon, mis läbib 1,6 mm avasuurusega sõela, segatakse tolm põhjalikult ja kuivatatakse seda neli tundi 105 oC juures kõige rohkem 25 mm paksuses kihis. Tolm jahutatakse ja suletakse kuni kasutamiseni õhukindlalt võimalikult täis mahutisse; soovitatav on tolmu kasutada 24 tunni jooksul kuivatamisest.

1.6.1.3. Süüteallikas Süüteallikana tuleks kasutada vähemalt 5 mm läbimõõduga gaasipõleti kuuma leeki. Muu süüteallika kasutamisel (nt katse tegemisel inertses atmosfääris) tuleks esitada selle kirjeldus ja kasutamise põhjendus.

1.6.2. Katse tegemine Märkus Oksüdeerijate segusid tselluloosi või puidutolmuga tuleb vaadelda potentsiaalselt plahvatusohtlikuna ja käsitleda nõutava ettevaatusega.

1.6.2.

1.6.2.1. Eelkatse Kuivatatud aine segatakse hoolikalt kuivatatud tselluloosi või puidutolmuga vahekorras kaks osa testainet ühe osa tselluloosi või puidutolmu kohta ja tehakse segust väike koonusekujuline kuhi mõõtudega 3,5 cm (aluse läbimõõt) × 2,5 cm (kõrgus), täites selleks ilma tampimata koonusekujulise vormi (nt suletud põhjaga laborilehtri). Kuhi asetatakse mittesüttivale, mittepoorsele ja madala soojusjuhtivusega alusplaadile. Katse tehakse tõmbekapis vastavalt kirjeldusele punktis 1.6.2.2. Süüteallikas viiakse vastu kuhilat. Jälgitakse järgneva reaktsiooni tugevust ja kestust ning see registreeritakse. Kui reaktsioon on tugev, loetakse aine oksüdeerivaks. Kui tulemused on kaheldavad, tehakse allpool kirjeldatud täiemahuline katseprogramm põlemisribaga.

1.6.2.2. Põlemisribakatse Valmistatakse 10 % kaupa kasvava oksüdeerijasisaldusega oksüdeerija/tselluloosi segud, mis sisaldavad 10–90 % oksüdeerijat (massi järgi). Piiripealsetel juhtudel tuleks suurima põlemiskiiruse täpsemaks mõõtmiseks kasutada vahepealsete kontsentratsioonidega oksüdeerija/tselluloosi segusid. Kuhi tekitatakse vormi abil. Vorm on metallist, 250 mm pikk ja kolmnurkse läbilõikega, 10 mm sisemise kõrguse ja 20 mm sisemise laiusega. Vormi kummalegi küljele paigaldatakse pikisuunas külgpiireteks kaks metallplaati, mis ulatuvad 2 mm üle kolmnurkse vao ülemise ääre (vt joonist). Seade täidetakse mõningases liias seguga, ilma seda tihendamata. Vorm kukutatakse seejärel 2 cm kõrguselt tugevale aluspinnale ja allesjäänud üleliigne aine tõmmatakse viltuse paberilehega pealt ära. Külgmised piirded eemaldatakse ja allesjäänud pulbrit silutakse rulliga. Vormi peale paigaldatakse seejärel mittesüttiv, mittepoorne ja madala soojusjuhtivusega alusplaat, keeratakse vorm koos plaadiga ümber ja vorm eemaldatakse. Riba paigutatakse tõmbekapi alla õhu liikumise suunaga risti. Õhu liikumiskiirus peab olema piisav, et takistada suitsu levikut laborisse, ning seda tuleb katse jooksul konstantsena hoida. Seadme ümber tuleks paigaldada tõmbevari. Tselluloosi ja mõnede uuritavate ainete hügroskoopsuse tõttu tuleb katse teha võimalikult kiiresti. Riba üks ots süüdatakse leegi abil. Pärast seda, kui reaktsioonivöönd on levinud esimesed 30 mm, mõõdetakse järgneva 200 mm ulatuses reaktsiooni leviku aeg. Katse tehakse võrdlusainega ja vähemalt korra kõigi testaine/tselluloosi segudega. Kui leitav suurim põlemiskiirus ületab oluliselt võrdlussegu põlemiskiirust, võib katse peatada; muul juhul korratakse katset viis korda, kasutades kolme suurima põlemiskiirusega segu. Kui arvatakse, et positiivne tulemus on ekslik, korratakse katset sama suurte osakestega inertse ainega, näiteks diatomiidiga tselluloosi asemel. Katset võib korrata ka kõrgeima põlemiskiirusega testaine/tselluloosi seguga inertses atmosfääris (hapnikusisaldus < 2 % mahu järgi).

2. ANDMED Ohutuse huvides loetakse uuritava aine oksüdeerivaid omadusi iseloomustavaks suuruseks suurim põlemiskiirus, mitte selle keskmine väärtus. Hindamise seisukohast on oluline antud seguga kuuest katsest koosnevas seerias saadud suurim põlemiskiiruse väärtus. Koostatakse graafik, mis näitab iga segu põlemiskiiruse suurima väärtuse sõltuvust oksüdeerija kontsentratsioonist. Graafikult loetakse suurim põlemiskiirus. Kuus ühes katses suurima põlemiskiirusega segu mõõtmisel saadud põlemiskiiruse väärtust ei tohi aritmeetilisest keskmisest erineda rohkem kui 10 %, vastasel korral tuleb peenestamis- ja segamismeetodeid täiustada. Leitud suurimat põlemiskiirust võrreldakse võrdlussegu suurima põlemiskiirusega (vt 1.3). Kui katse tehakse inertses atmosfääris, võrreldakse suurimat reaktsioonikiirust võrdlussegu vastava näitajaga inertses atmosfääris.

3. ARUANNE

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

testaine tunnusandmeid, koostist, puhtusastet, niiskusesisaldust jne;

proovi mis tahes käitlemist (nt peenestamist, kuivatamist jne);

katsetes kasutatud süüteallikat;

mõõtmiste tulemusi;

reaktsiooni tüüpi (nt kiire põlemine pinnal, põlemine kogu massis, mis tahes andmeid põlemissaaduste kohta jne);

kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid märkusi, sh eelkatses test- ja võrdlusainega tekkinud reaktsiooni tugevuse kohta (leegiga, sädemetega, suitsuga, hõõgumisega reaktsioon jne) ning nii test- kui ka võrdlusaine puhul eelkatses/sõelkatses kulunud aega;

inertse ainega tehtud katsete tulemusi, kui neid tehti;

inertses atmosfääris tehtud katsete tulemusi, kui neid tehti.

3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE Aine loetakse oksüdeerivaks, kui Ekslike positiivsete tulemuste vältimiseks tuleks tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta ka aine inertse materjaliga segamisel ja/või inertses atmosfääris tehtud katsete tulemusi.

3.2. a)

eelkatses ilmneb tugev reaktsioon;

uuritavate segude suurim täiemahulises katseprogrammis leitud põlemiskiirus on suurem tselluloosist ja baariumnitraadist valmistatud võrdlussegu suurimast põlemiskiirusest või sellega võrdne.

4. VIITED NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

A.18. POLÜMEERIDE ARVKESKMINE MOLEKULMASS JA MOLEKULMASSIDE JAOTUS

A.18.

1. MEETOD Käesolev geelkromatograafia (GPC) meetod on OECD katsejuhendi nr 118 (1996) koopia. Meetodi põhimõte ja tehniline lisateave on toodud kirjandusviites 1.

1.

1.1. SISSEJUHATUS Kuna polümeeride omadused on väga erinevad, siis on võimatu kirjeldada ühtainust meetodit, mis kirjeldaks täpselt eraldamis- ja analüüsitingimusi, mis kataks kõiki polümeeride eraldamisel esinevaid võimalikke juhtumeid ja olukordi. Eelkõige on keeruliste polümeerisegude lahutamine geelkromatograafia abil sageli võimatu. Kui geelkromatograafia ei ole kasutatav, siis võib molekulmassi määramiseks kasutada teisi meetodeid (vt lisa). Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused. Kirjeldatav meetod põhineb standardil DIN 55672 (1). Üksikasjalik teave katsete tegemiseks ja andmete hindamiseks on toodud nimetatud DIN standardis. Kui katse tingimuste muutmine osutub vajalikuks, siis peab vastavaid muudatusi põhjendama. Muude standardite kasutamisel peab nende jaoks andma täielikud viited. Kirjeldatava meetodi kalibreerimiseks kasutatakse teadaoleva polüdisperssusega polüstüreeni proove ja teatud polümeeride (näiteks vesilahustuvad ja pika ahelaga hargnenud polümeerid) analüüsimiseks võib osutuda vajalikuks meetodis muudatuste tegemine.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Arvkeskmise molekulmassi Mn ja masskeskmise molekulmassi Mw arvutamiseks kasutatakse järgmisi valemeid: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1HixMiΣni=1Hi kus Hi on detektori signaali kõrgus mõõdetuna baasjoonelt retentsiooniruumala Vi jaoks, Mi on retentsiooniruumalale Vi vastava polümeerifraktsiooni molekulmass ja n on mõõtepunktide arv. Molekulmassi jaotuse ulatus, mis iseloomustab segu disperssust, leitakse Mw/Mn suhtest.

1.3. VÕRDLUSAINED Kuna geelkromatograafia on suhteline meetod, siis peab seda kalibreerima. Selleks otstarbeks kasutatakse tavaliselt kitsa fraktsioonilise jaotusega lineaarseid polüstüreenistandardeid, mille keskmised molekulmassid Mn ja Mw ning molekulmasside jaotus on teada. Kalibreerimiskõverat võib kasutada tundmatu proovi molekulmassi määramiseks vaid siis, kui proovi ja standardi lahutamiseks kasutatavad tingimused on valitud ühesuguselt. Molekulmassi ja elueerunud ruumala vaheline suhe on õige vaid konkreetsele katsele iseloomulikel tingimustel. Nimetatud tingimused hõlmavad eelkõige temperatuuri, lahustit (või lahustite segu), kromatograafilisi tingimusi ja kasutatavat kolonni või kolonnisüsteemi. Sellisel viisil proovist määratud molekulmassid on suhtelised ja neid nimetatakse polüstüreeniekvivalendi molekulmassideks. See tähendab, et sõltuvalt proovi ja standardi vahelistest struktuurilistest ja keemilistest erinevustest võivad molekulmassid hälbida absoluutsetest väärtustest rohkemal või vähemal määral. Juhul kui kasutatakse teisi standardeid, näiteks polüetüleenglükool, polüetüleenoksiid, polümetüül metakrülaat, polüakrüülhape, siis peab seda põhjendama.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Geelkromatograafia abil võib määrata nii proovi molekulmassi jaotust kui ka keskmisi molekulmasse (Mn, Mw). Geelkromatograafia on spetsiaalne vedelikkromatograafia liik, milles proov lahutatakse üksikute koostisosade hüdrodünaamiliste ruumalade järgi (2). Lahutamiseks juhitakse proov läbi poorse materjaliga, tavaliselt orgaanilise geeliga, täidetud kolonni. Väikesed molekulid suudavad tungida pooridesse, kuhu suurte molekulide juurdepääs on takistatud. Seetõttu on suurte molekulide teepikkus lühem ja nad elueeruvad kiiremini. Keskmise suurusega molekulid tungivad osadesse pooridesse, mistõttu nad elueeruvad mõnevõrra aeglasemalt. Kõige väiksemad molekulid, mille keskmine hüdrodünaamiline raadius on väiksem kui geeli poorid, tungivad kõikidesse pooridesse ja elueeruvad viimastena. Ideaaljuhul mõjutab lahutamist ainult molekulide suurus, kuid praktikas on raske vältida vähemalt mõningaid adsorptsioonist tingitud segavaid mõjusid. Kolonni ebaühtlane täitematerjal ja suurem omaruumala võivad olukorda halvendada (2). Detekteerimiseks kasutatakse näiteks refraktsiooni indeksit või UV-absorptsiooni ja tulemuseks saadakse lihtne jaotuskõver. Selleks, et omistada saadud kõverale tegelikke molekulmassi väärtusi, tuleb kolonni kalibreerida teadaolevate molekulmassidega ja ideaaljuhul üldjoontes sarnase struktuuriga polümeeridega, näiteks erinevad polüstüreenistandardid. Tüüpiliselt saadakse Gaussi kõver, mis on mõnikord madalate molekulmasside osas väljaveninud sabaga, kusjuures vertikaalsel teljel on elueerunud erinevate molekulmassiga ühendite kogus massi järgi ja horisontaalsel teljel on logaritmilises skaalas molekulmass.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Elutsiooniruumala korratavus (suhteline standardhälve, RSD) peaks olema parem kui 0,3 %. Kui kromatogrammi hinnatakse ajalise sõltuvuse põhjal ja see ei vasta ülaltoodud kriteeriumitele, tagatakse nõutav analüüsikorratavus sisestandardi kasutamisega (1). Polüdisperssused sõltuvad standardite molekulmassidest. Polüstüreenistandardite kasutamisel on tüüpilised väärtused järgmised: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp on piigi maksimumile vastav standardi molekulmass)

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Polüstüreeni standardlahuste valmistamine Polüstüreenistandardid lahustatakse ettevaatlikul segamisel valitud eluendiga. Lahuste valmistamisel peab arvestama tootja soovitusi. Valitud standardi kontsentratsioonid sõltuvad mitmetest erinevatest teguritest, näiteks süsteruumala, lahuse viskoossus ja analüütilise detektori tundlikkus. Maksimaalset süsteruumala peab kohandama vastavalt kolonni pikkusele, et vältida kolonni ülelaadimist. Geelkromatograafia analüütiliste meetodite korral jäävad tüüpilised süsteruumalad vahemikku 40 kuni 100 μl, kui kolonni mõõdud on 30 cm × 7,8 mm. Võimalik on kasutada ka suuremaid ruumalasid, kuid need ei tohiks ületada 250 μl. Enne kolonni tegelikku kalibreerimist tuleb kindlaks teha süsteruumala ja kontsentratsiooni vaheline optimaalne suhe.

1.6.2. Proovilahuse valmistamine Põhimõtteliselt kehtivad ülaltoodud nõudsed ka proovilahuste valmistamisel. Proov lahustatakse sobivas lahustis, näiteks tetrahüdrofuraanis (THF), ettevaatlikul loksutamisel. Mitte mingil juhul ei tohi lahustamiseks kasutada ultrahelivanni. Vajaduse korral puhastatakse proovi lahust membraanfiltriga, mille pooride suurus on 0,2 kuni 2 μm. Lahustumatute osakeste olemasolu peab ära märkima ka lõplikus aruandes, kuna see võib olla tingitud kõrge molekulmassiga ühenditest. Lahustunud osakeste massiprotsendi määramiseks peab kasutama sobivat meetodit. Valmistatud lahuseid peab kasutama 24 tunni jooksul.

1.6.3. Seadmed Enne peab kindlaks tegema, et geelkromatograafia süsteem oleks kasutatavate lahustite suhtes inertne (näiteks tetrahüdrofuraani jaoks kasutada teraskapillaare).

mahuti lahustile;

degaseerija (vajaduse korral);

pump;

pulsatsioonisummuti (vajaduse korral);

injektsioonisüsteem;

kromatograafilised kolonnid;

detektor;

kulumõõtja (vajaduse korral);

andmesalvesti ja -töötleja;

nõu jääkide jaoks.

1.6.4. Injektsiooni ja lahusti etteandmise süsteem Proovilahuse etteantud kogus sisestatakse automaatse injektoriga või käsitsi täpselt kindlaks määratud kolonni piirkonda. Käsitsi injektsiooni korral võib süstla kolvi liiga kiire tagasitõmbamine või vabastamine põhjustada muutusi mõõdetava molekulmassi jaotuses. Lahusti etteandmise süsteem peaks olema võimalikult pulseerimisvaba, sisaldades ideaaljuhul pulsatsioonisummutit. Voolukiirus on suurusjärgus 1 ml/min.

1.6.5. Kolonn Sõltuvalt proovist kasutatakse polümeeri analüüsiks kas ühte lihtsat kolonni või mitut järjestikku ühendatud kolonni. Kolonni täitematerjalidena on kaubanduslikult kättesaadavad paljud poorsed kindlate omadustega ained (näiteks poori suurus, eksklusioonipiirid). Lahutamiseks kasutatava geeli või kolonni pikkuse valik sõltub nii proovi omadustest (hüdrodünaamiline ruumala, molekulmasside jaotus) kui ka spetsiifilistest lahutamistingimustest, näiteks lahusti, temperatuur ja voolukiirus (1, 2, 3).

1.6.6. Teoreetilised taldrikud Lahutamiseks kasutatavat kolonni või kolonnide süsteemi iseloomustatakse teoreetiliste taldrikute arvuga. Tetrahüdrofuraani kasutamisel eluendina hinnatakse seda etüülbenseeni või mõne muu sobiva mittepolaarse lahustunud aine (soluudi) laadimisel teadaoleva pikkusega kolonni. Teoreetiliste taldrikute arv saadakse järgmiste valemite põhjal: N=5,54VeW1/22 või N=16VeW2 kus N teoreetiliste taldrikute arv Ve piigi maksimumile vastav elutsiooniruumala W piigi laius baasjoonel W1/2 piigi laius poolel piigi kõrgusel

1.6.7. Lahutamise efektiivsus Lisaks ribalaiust määravale teoreetiliste taldrikute arvule on tähtis ka lahutamise efektiivsus, mis sõltub sellest, kui järsk on kalibreerimiskõvera tõus. Kolonni lahutamisefektiivsus saadakse järgmisest valemist: Ve,Mx-Ve,(10Mx)kolonni ristlõkepindala≥6,0 cm3cm2 kus Ve, Mx polüstüreeni molekulmassiga Mx elutsiooniruumala Ve,(10.Mx) kümme korda suurema molekulmassiga polüstüreeni elutsiooniruumala Süsteemi lahutusvõime defineeritakse tavaliselt järgmiselt: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 kus Ve1, Ve2 kahe polüstüreenistandardi elutsiooniruumalad piigi maksimumil W1, W2 piigi laiused baasjoonel M1, M2 piigi maksimumile vastavad molekulmassid (peaksid erinema kümme korda) Kolonnisüsteemi R-väärtus peaks olema suurem kui 1,7 (4).

1.6.8. Lahustid Kõik lahustid peavad olema kõrge puhtusastmega (kasutatava tetrahüdrofuraani puhtus on 99,5 %). Lahusti mahuti (vajaduse korral paigutatud inertgaasi atmosfääri) peab olema piisavalt suur, et võimaldada kolonni kalibreerimist ja proovide analüüsi. Enne pumpamist kolonni peab lahustit degaseerima.

1.6.9. Temperatuurikontroll Kriitilise tähtsusega komponentide (injektsioonisilmus, kolonnid, detektor ja torustik) temperatuur peab olema konstantne ja sobima kasutatavale lahustile.

1.6.10. Detektor Detektori eesmärk on kolonnist elueeruva proovi kontsentratsiooni kvantitatiivne mõõtmine. Selleks, et vältida piikide tarbetut laienemist, peab detektori mõõteraku küveti ruumala olema võimalikult väike. See ei tohiks olla suurem kui 10 μl, välja arvatud valguse hajuvust ja viskoossust mõõtvate detektorite korral. Detekteerimiseks kasutatakse tavaliselt diferentsiaalrefraktomeetriat. Tingituna proovi või eluendi spetsiifilistest omadustest võib kasutada ka muid detektsioonimeetodeid, näiteks UV/VIS, IR, viskoossusdetektorid jms.

2. ANDMED JA ARUANDLUS

2.

2.1. ANDMED Hindamiskriteeriumitele ning andmete kogumisele ja töötlemisele esitatavate üksikasjaliste nõuete osas peaks järgima DIN standardit (1). Iga proovi jaoks peab tegema kaks teineteisest sõltumatut katset. Neid katseid peab eraldi analüüsima. Iga mõõtmise tulemused peavad hõlmama Mn, Mw, Mw/Mn ja Mp väärtusi. Üheselt mõistetavalt peab näitama, et mõõdetud väärtused on suhtelised väärtused, mis on ekvivalentsed kasutatud standardi molekulmassidega. Pärast retentsiooniruumalade või -aegade kindlaksmääramist (mida võib parandada sisestandardite kasutamisega) esitatakse log Mp väärtused (kus Mp on kalibreerimiseks kasutatava standardi piigi maksimum) ühe eeltoodud suuruse funktsioonina. Molekulmassi dekaadi (kümnekordse vahemiku) kohta on vaja vähemalt kahte kalibreerimiskõvera punkti ja terve kõvera jaoks on vaja vähemalt viit mõõtepunkti, mis peaks hinnanguliselt katma proovi molekulmassi. Kalibreerimiskõvera madala molekulmassiga osa lõpp-punkt määratakse kindlaks n-heksüülbenseeni või muu sobiva mittepolaarse soluudi abil. Arvkeskmised ja masskeskmised molekulmassid arvutatakse tavaliselt elektroonilise andmetöötlusega, mis põhineb punktis 1.2 toodud valemitel. Käsitsi digitaliseerimise kasutamisel võib eeskujuks võtta standardi ASTM D 3536-91 (3). Jaotuskõvera peab esitama tabeli või joonise kujul (diferentsiaalne sagedus või protsentide summa log M funktsioonina). Graafilisel kujutamisel peab üks molekulmassi kümnekordne vahemik olema umbes 4 cm laiune ja piigi maksimum peab olema umbkaudu 8 cm kõrgune. Integraalsete jaotuskõverate korral peab ordinaadi 0 ja 100 % vahemik olema umbes 10 cm laiune.

2.2. ARUANNE Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.

2.2.

2.2.1. Katsetatav aine

Olemasolev teave analüüsitava aine kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused).

Proovi eeltöötluse täpne kirjeldus, tähelepanekud, probleemid.

2.2.2. Seadmed

Eluendi mahuti, inertgaas, eluendi degaseerimine, eluendi koostis, ebapuhtused.

Pump, pulsatsioonisummuti, injektsioonisüsteem.

Lahutuskolonnid (tootja, kõik kolonni näitajad, nagu poori suurus, täitematerjali liik jms, kasutatavate kolonnide arv, pikkus ja järjekord).

Kolonni (või nende kombinatsiooni) teoreetiliste taldrikute arv, lahutamise efektiivsus (süsteemi lahutusvõime).

Andmed piikide sümmeetria kohta.

Kolonni temperatuur, temperatuurikontrolli liik.

Detektor (mõõtmise põhimõte, tüüp, küveti ruumala).

Kulumõõtja, kui kasutati (tootja, mõõtmispõhimõte).

Andmete salvestamise ja töötlemise süsteem (riist- ja tarkvara).

2.2.3. Süsteemi kalibreerimine

Kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutatud meetodi täpne kirjeldus.

Andmed selle meetodi kvaliteedikriteeriumite kohta (näiteks korrelatsioonikoefitsient, ruutsumma viga jms).

Andmed kõikide ekstrapoleerimiste, oletuste ja lähenduste kohta, mis tehti eksperimendi ning andmete hindamise ja töötlemise käigus;

Kõik kalibreerimiskõvera koostamiseks tehtud mõõtmised peavad olema dokumenteeritud tabelis, mis sisaldab kalibreerimiskõvera iga punkti kohta alljärgnevat teavet:

proovi nimetus;

proovi tootja;

tootjapoolsed või mõõtmistel saadud standardit iseloomustavad Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn väärtused koos määramismeetodi üksikasjadega;

süsteruumala ja -kontsentratsioon;

kalibreerimisel kasutatud Mp väärtus;

piigi maksimumile vastav mõõdetud elutsiooniruumala või parandatud retentsiooniaeg;

piigi maksimumile arvutatud Mp;

arvutatud Mp protsentuaalne viga ja kalibreerimistulemus.

2.2.4. Hindamine

2.2.4.

1) Aja põhjal hindamine: nõutava korratavuse tagamiseks kasutatavad meetodid (parandusmeetod, sisestandard jms).

2) Teave selle kohta, kas hindamine viidi läbi elutsiooniruumala või retentsiooniaja põhjal.

3) Teave hindamise piiratuse kohta, kui piik ei ole täielikult analüüsitud.

4) Silumismeetodite kirjeldus, kui neid kasutati.

5) Proovi ettevalmistamise ja eeltöötluse protseduurid.

6) Lahustumatute osakeste olemasolu.

7) Süsteruumala (μl) ja -kontsentratsioon (mg/ml).

8) Tähelepanekud seikade kohta, mis võivad põhjustada kõrvalekaldumist ideaalsest geelkromatograafia profiilist.

9) Kõikide katseprotseduurides tehtud muudatuste üksikasjalik kirjeldus.

Veapiiride üksikasjalikud andmed.

Mis tahes muu teave ja tähelepanekud, mis puudutavad tulemuste tõlgendamist.

3.1.2.3.4. VIITED DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.19. MADALAMOLEKULAARSETE AINETE SISALDUS POLÜMEERIS

A.19.

1. MEETOD Käesolev geelkromatograafia (GPC) meetod on OECD katsejuhendi nr 119 (1996) koopia. Meetodi põhimõte ja tehniline lisateave on toodud kirjandusviidetes.

1.

1.1. SISSEJUHATUS Kuna polümeeride omadused on väga erinevad, siis on võimatu kirjeldada ühtainust meetodit, mille lahutamis- ja analüüsitingimused katavad kõiki polümeeride eraldamisel esinevaid võimalikke juhtumeid ja iseärasusi. Sageli ei ole keeruliste polümeerisegude koostisosadeks lahutamine geelkromatograafiaga võimalik. Kui geelkromatograafia ei ole kasutatav, siis võib molekulmassi määramiseks kasutada teisi meetodeid (vt lisa). Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused. Kirjeldatav meetod põhineb standardil DIN 55672 (1). Üksikasjalik teave katsete tegemiseks ja andmete hindamiseks on toodud nimetatud DIN standardis. Kui katse tingimuste muutmine osutub vajalikuks, siis peab vastavaid muudatusi põhjendama. Kasutada võib ka muid standardeid, kui neile antakse täielikud viited. Kirjeldatava meetodi kalibreerimiseks kasutatakse teadaoleva polüdisperssusega polüstüreenproove ja teatud polümeeride (näiteks vesilahustuvad ja pika ahelaga hargnenud polümeerid) analüüsil võib osutuda vajalikuks meetodi muutmine.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Madal molekulmass on kokkuleppeliselt molekulmass, mis on väiksem kui 1000 daltonit. Arvkeskmise molekulmassi Mn ja masskeskmise molekulmassi Mw arvutamiseks kasutatakse järgmisi valemeid: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1HixMiΣni=1Hi kus Hi on detektori signaali kõrgus mõõdetuna baasjoonelt retentsioonimahu Vi jaoks Mi on retentsioonimahule Vi vastava polümeerifraktsiooni molekulmass ja n on mõõtepunktide arv Molekulmassi jaotuse laius, mis iseloomustab segu disperssust, saadakse Mw/Mn suhtest.

1.3. VÕRDLUSAINED Kuna geelkromatograafia on suhteline meetod, siis peab seda kalibreerima. Selleks otstarbeks kasutatakse tavaliselt kitsa fraktsioonilise jaotusega lineaarseid polüstüreenstandardeid, mille keskmised molekulmassid Mn ja Mw ja molekulmasside jaotus on teada. Kalibreerimiskõverat võib kasutada tundmatu proovi molekulmassi määramiseks vaid siis, kui proovi ja standardi lahutamiseks kasutatavad tingimused on valitud ühtviisi. Molekulmassi ja elueerunud ruumala vaheline suhe on õige vaid konkreetsele katsele iseloomulikel tingimustel. Nimetatud tingimused hõlmavad eelkõige temperatuuri, lahustit (või lahustite segu), kromatograafilisi tingimusi ja kasutatavat kolonni või kolonnisüsteemi. Sellisel viisil proovist määratud molekulmassid on suhtelised ja neid nimetatakse polüstüreeniekvivalendi molekulmassideks. See tähendab, et sõltuvalt proovi ja standardi vahelistest struktuurilistest ja keemilistest erinevustest võivad molekulmassid hälbida absoluutsetest väärtustest rohkemal või vähemal määral. Juhul kui kasutatakse teisi standardeid, näiteks polüetüleenglükool, polüetüleenoksiid, polümetüülmetakrülaat, polüakrüülhape, siis peab seda põhjendama.

1.4. KATSE MEETODI PÕHIMÕTE Geelkromatograafiaga võib määrata nii proovi molekulmassi jaotust kui ka keskmisi molekulmasse (Mn, Mw). Geelkromatograafia on spetsiaalne vedelikkromatograafia liik, milles proov lahutatakse üksikute koostisosade hüdrodünaamiliste ruumalade järgi (2). Lahutamiseks juhitakse proov läbi poorse materjaliga, tavaliselt orgaanilise geeliga, täidetud kolonni. Väikesed molekulid suudavad tungida pooridesse, kuhu suurte molekulide juurdepääs on takistatud. Seetõttu on suurte molekulide teepikkus lühem ja nad elueeruvad kiiremini. Keskmise suurusega molekulid tungivad osadesse pooridesse, mistõttu nad elueeruvad mõnevõrra aeglasemalt. Kõige väiksemad molekulid, mille keskmine hüdrodünaamiline raadius on väiksem kui geeli poorid, tungivad kõikidesse pooridesse ja elueeruvad viimastena. Ideaaljuhul mõjutab lahutamist ainult molekulide suurus, kuid praktikas on raske vältida vähemalt mõningaid adsorptsioonist tingitud segavaid mõjusid. Kolonni ebaühtlane täitematerjal ja suurem omaruumala võivad olukorda halvendada (2). Detekteerimiseks kasutatakse näiteks refraktsiooni indeksit või UV-absorptsiooni ja tulemuseks saadakse lihtne jaotuskõver. Selleks, et omistada saadud kõverale tegelikke molekulmassi väärtusi, tuleb kolonni kalibreerida teadaolevate molekulmassidega ja ideaaljuhul üldjoontes sarnase struktuuriga polümeeridega, näiteks erinevad polüstüreenstandardid. Tüüpiliselt saadakse Gaussi kõver, mis on mõnikord madalate molekulmasside osas väljaveninud sabaga, kusjuures vertikaalsel teljel on elueerunud erinevate molekulmassiga ühendite kogus massi järgi ja horisontaalsel teljel on logaritmilises skaalas molekulmass. Nimetatud kõveralt saadakse madalmolekulaarsete ainete sisaldus. Arvutused saavad olla täpsed vaid siis, kui madala molekulmassiga ühendid annavad massi alusel detektorile samase signaali kui kogu polümeer.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Elutsiooniruumala korratavus (suhteline standardhälve, RSD) peaks olema parem kui 0,3 %. Kui kromatogrammi hinnatakse ajalise sõltuvuse põhjal ja see ei vasta ülaltoodud kriteeriumitele, tagatakse analüüsi nõutav korratavus sisestandardi kasutamisega (1). Polüdisperssused sõltuvad standardite molekulmassidest. Polüstüreenistandardite kasutamisel on tüüpilised väärtused järgmised: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp on piigi maksimumile vastav standardi molekulmass)

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Polüstüreeni standardlahuste valmistamine Polüstüreeni standardid lahustatakse ettevaatlikul segamisel valitud eluendiga. Lahuste valmistamisel peab arvestama tootja soovitusi. Valitud standardi kontsentratsioonid sõltuvad mitmetest erinevatest teguritest, näiteks süsteruumala, lahuse viskoossus ja analüütilise detektori tundlikkus. Maksimaalset süsteruumala peab kohandama vastavalt kolonni pikkusele, et vältida kolonni ülelaadimist. Geelkromatograafia analüütiliste meetodite korral jäävad tüüpilised süsteruumalad vahemikku 40 kuni 100 μl, kui kolonni mõõdud on 30 cm × 7,8 mm. Võimalik on kasutada ka suuremaid ruumalasid, kuid need ei tohiks ületada 250 μl. Enne kolonni tegelikku kalibreerimist tuleb kindlaks teha süsteruumala ja kontsentratsiooni vaheline optimaalne suhe.

1.6.2. Proovilahuse valmistamine Põhimõtteliselt kehtivad ülaltoodud nõuded ka proovilahuste valmistamisel. Proov lahustatakse sobivas lahustis, näiteks tetrahüdrofuraanis (THF), ettevaatlikul loksutamisel. Mitte mingil juhul ei tohi lahustamiseks kasutada ultrahelivanni. Vajaduse korral puhastatakse proovi lahust membraanfiltriga, mille pooride suurus on 0,2 kuni 2 μm. Lahustumatute osakeste olemasolu peab ära märkima ka lõplikus aruandes, kuna see võib olla tingitud kõrge molekulmassiga ühenditest. Lahustunud osakeste massiprotsendi määramiseks peab kasutama sobivat meetodit. Valmistatud lahuseid peab kasutama 24 tunni jooksul.

1.6.3. Parandused ebapuhtuste ja lisandite sisalduse jaoks Tavaliselt on vajalik molekulmassiga M < 1000 ühendite sisalduse korrigeerimine, mis on tingitud mittepolümeersetest komponentidest (näiteks ebapuhtused ja/või lisandid), välja arvatud juhul, kui nende ühendite mõõdetud sisaldus on niigi < 1 %. Selleks analüüsitakse otse polümeerilahust või geelkromatograafi eluaati. Kui eluaat on pärast kolonni läbimist liiga lahja edasiseks analüüsiks, siis peab seda kontsentreerima. Vajalik võib olla eluaadi kuivaks aurutamine ja saadud jäägi uuesti lahustamine. Eluaati peab kontsentreerima tingimustel, mis ei põhjusta eluaadis muutusi. Geelkromatograafi eluaadi töötlemine sõltub kvantitatiivseks määramiseks kasutatavast analüütilisest meetodist.

1.6.4. Seadmed Geelkromatograafia seadmed sisaldavad järgmisi komponente: Enne peab kindlaks tegema, et geelkromatograafia süsteem oleks kasutatavate lahustite suhtes inertne (näiteks tetrahüdrofuraani jaoks kasutada teraskapillaare).

mahuti lahustile;

degaseerija (vajaduse korral);

pump;

pulsatsioonisummuti (vajaduse korral);

injektsioonisüsteem;

kromatograafilised kolonnid;

detektor;

kulumõõtja (vajaduse korral);

andmesalvesti ja-töötleja;

nõu jääkide jaoks.

1.6.5. Injektsiooni ja lahusti etteandmise süsteem Proovilahuse etteantud kogus sisestatakse automaatse injektoriga või käsitsi täpselt kindlaks määratud kolonni piirkonda. Käsitsi injektsiooni korral võib süstla kolvi liiga kiire tagasitõmbamine või vabastamine põhjustada muutusi mõõdetava molekulmassi jaotuses. Lahusti etteandmise süsteem peaks olema võimalikult pulseerimisvaba, sisaldades ideaaljuhul pulsatsioonisummutit. Voolukiirus on suurusjärgus 1 ml/min.

1.6.6. Kolonn Sõltuvalt proovist kasutatakse polümeeri iseloomustamiseks kas ühte kolonni või mitut järjestikku ühendatud kolonni. Kolonni täitematerjalidena on kaubanduslikult kättesaadavad paljud poorsed kindlate omadustega ained (näiteks poori suurus, eksklusioonipiirid). Lahutamiseks kasutatava geeli või kolonni pikkuse valik sõltub nii proovi omadustest (hüdrodünaamiline ruumala, molekulmasside jaotus) kui ka spetsiifilistest lahutamistingimustest, näiteks lahusti, temperatuur ja voolukiirus (1, 2, 3).

1.6.7. Teoreetilised taldrikud Lahutamiseks kasutatavat kolonni või kolonnide süsteemi iseloomustatakse teoreetiliste taldrikute arvuga. Tetrahüdrofuraani kasutamisel eluendina hinnatakse seda etüülbenseeni või mõne muu sobiva mittepolaarse lahustunud aine (soluudi) laadimisel teadaoleva pikkusega kolonni. Teoreetiliste taldrikute arv saadakse järgmiste valemite põhjal: N=5,54VeW1/22 või N=16VeW2 kus N on teoreetiliste taldrikute arv Ve on piigi maksimumile vastav elutsiooniruumala W on piigi laius baasjoonel W1/2 on piigi laius poolel piigi kõrgusel

1.6.8. Lahutamise efektiivsus Lisaks ribalaiust määravale teoreetiliste taldrikute arvule on tähtis ka lahutamise efektiivsus, mis sõltub sellest, kui järsk on kalibreerimiskõvera tõus. Kolonni lahutuse efektiivsus saadakse järgmisest seosest: Ve,Mx-Ve,(10Mx)kolonni ristlõkepindala≥6,0cm3cm2 kus Ve, Mx on polüstüreeni molekulmassiga Mx elutsiooniruumala Ve,(10.Mx on kümme korda suurema molekulmassiga polüstüreeni elutsiooniruumala Süsteemi lahutusvõimet defineeritakse tavaliselt järgmiselt: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 kus Ve1, Ve2 on kahe polüstüreenistandardi elutsiooniruumalad piigi maksimumil W1, W2 on piigi laiused baasjoonel M1, M2 on piigi maksimumile vastavad molekulmassid (peaksid erinema kümme korda) Kolonnisüsteemi R-väärtus peaks olema suurem kui 1,7 (4).

1.6.9. Lahustid Kõik lahustid peavad olema kõrge puhtusastmega (kasutatava tetrahüdrofuraani puhtus on 99,5 %). Lahustimahuti (vajaduse korral paigutatud inertgaasi atmosfääri) peab olema piisavalt suur, et võimaldada kolonni kalibreerimist ja proovide analüüsi. Enne pumpamist kolonni peab lahustit degaseerima.

1.6.10. Temperatuurikontroll Kriitilise tähtsusega komponentide (injektsioonisilmus, kolonnid, detektor ja torustik) temperatuur peab olema konstantne ja sobima kasutatavale lahustile.

1.6.11. Detektor Detektori eesmärk on kolonnist elueeruva proovi kontsentratsiooni kvantitatiivne mõõtmine. Selleks, et vältida piikide tarbetut laienemist, peab detektori mõõteraku küveti ruumala olema võimalikult väike. See ei tohiks olla suurem kui 10 μl, välja arvatud valguse hajuvust ja viskoossust mõõtvate detektorite korral. Detektorina kasutatakse tavaliselt diferentsiaalrefraktomeetriat. Tingituna proovi või eluendi spetsiifilistest omadustest võib kasutada ka muud tüüpi detektsioonimeetodeid, näiteks UV/VIS, IR, viskoossusdetektorid jms.

2. ANDMED JA ARUANDLUS

2.

2.1. ANDMED Hindamiskriteeriumitele ning andmete kogumisele ja töötlemisele esitatavate üksikasjalike nõuete osas peaks järgima DIN standardit (1). Iga proovi jaoks peab tegema kaks teineteisest sõltumatut katset. Neid katseid peab eraldi analüüsima. Kõikidel juhtudel on oluline arvestada ka pimekatse andmeid, mis on tehtud prooviga samadel katsetingimustel. Üheselt mõistetavalt peab näitama, et mõõdetud väärtused on suhtelised väärtused, mis on ekvivalentsed kasutatud standardi molekulmassidega. Pärast retentsiooniruumalade või -aegade kindlaksmääramist (mida võib parandada sisestandardite kasutamisega) esitatakse log Mp väärtused (kus Mp on kalibratsioonistandardi piigi maksimum) ühe järgnevalt toodud suuruse funktsioonina: Mn, Mw või Mw/Mn. Molekulmassi dekaadi (kümnekordse vahemiku) kohta on vaja vähemalt kahte kalibreerimiskõvera punkti ja terve kõvera jaoks on vaja vähemalt viit mõõtepunkti, mis peaks hinnanguliselt katma proovi molekulmassi. Kalibreerimiskõvera madala molekulmassiga osa lõpppunkt määratakse kindlaks n-heksüülbenseeni või muu sobiva mittepolaarse soluudi abil. Kõvera osa, mis vastab molekulmassidele alla 1000, analüüsitakse ja parandatakse ebapuhtuste ja lisandite suhtes. Elutsioonikõveraid analüüsitakse tavaliselt elektrooniliste andmetöötluse vahenditega. Käsitsi digitaliseerimise kasutamisel võib eeskujuks võtta standardi ASTM D 3536-91 (3). Juhul, kui mis tahes lahustumatu polümeer jääb kolonni, siis on selle molekulmass tõenäoliselt suurem kui mis tahes komponendi oma lahustuvas fraktsioonis ja selle arvesse võtmata jätmisel hinnatakse üle madala molekulmassiga komponentide sisaldust. Madala molekulmassiga komponentide sisalduse määramise parandusjuhised lahustumatu polümeeri jaoks on toodud lisas. Jaotuskõvera peab esitama tabeli või joonise kujul (diferentsiaalne sagedus või protsentide summa log M funktsioonina). Graafilisel kujutamisel peab üks molekulmassi kümnekordne vahemik olema umbes 4 cm laiune ja piigi maksimum peab olema umbkaudu 8 cm kõrgune. Integraalsete jaotuskõverate korral peab ordinaadi 0 ja 100 % vahemik olema umbes 10 cm laiune.

2.2. KATSEARUANNE Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.

2.2.

2.2.1. Katsetatav aine

Olemasolev teave analüüsitava aine kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused).

Proovi eeltöötluse täpne kirjeldus, tähelepanekud, probleemid.

2.2.2. Seadmed

Eluendimahuti, inertgaas, eluendi degaseerimine, eluendi koostis, ebapuhtused.

Pump, pulsatsioonisummuti, injektsioonisüsteem.

Lahutuskolonnid (tootja, kõik kolonni näitajad, nagu poori suurus, täitematerjali liik jms, kasutatavate kolonnide arv, pikkus ja järjekord).

Kolonni (või nende kombinatsiooni) teoreetiliste taldrikute arv, lahutamise efektiivsus (süsteemi lahutusvõime).

Andmed piikide sümmeetria kohta.

Kolonni temperatuur, temperatuurikontrolli liik.

Detektor (mõõtmispõhimõte, tüüp, küveti ruumala).

Kulumõõtja, kui kasutati (tootja, mõõtmispõhimõte).

Andmete salvestamise ja töötlemise süsteem (riist- ja tarkvara).

2.2.3. Süsteemi kalibreerimine

Kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutatud meetodi täpne kirjeldus.

Andmed selle meetodi kvaliteedinõuete kohta (näiteks korrelatsioonikoefitsient, ruutsumma viga jms).

Andmed kõikide ekstrapoleerimiste, oletuste ja lähenduste kohta, mis tehti eksperimendi ning andmete hindamise ja töötlemise käigus.

Kõik kalibreerimiskõvera koostamiseks tehtud mõõtmised peavad olema dokumenteeritud tabelis, mis sisaldab kalibreerimiskõvera iga punkti kohta alljärgnevat teavet:

proovi nimetus;

proovi tootja;

tootjapoolsed või mõõtmistel saadud standardit iseloomustavad Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn väärtused, koos määramismeetodi üksikasjadega;

süsteruumala ja -kontsentratsioon;

kalibreerimisel kasutatud Mp väärtus;

piigi maksimumile vastav mõõdetud elutsiooniruumala või parandatud retentsiooniaeg;

piigi maksimumile arvutatud Mp;

arvutatud Mp protsentuaalne viga ja kalibreerimistulemus.

2.2.4. Andmed madalamolekulaarse polümeeri sisalduse kohta

Analüüsimeetodite kirjeldus ja katsete tegemise viis.

Madalamolekulaarsete komponentide protsentuaalne sisaldus (massi järgi) võrreldes kogu prooviga.

Andmed ebapuhtuste, lisandite ja muude mittepolümeersete komponentide kohta massiprotsendina kogu proovist.

2.2.5. Hindamine

Retentsiooniaja järgi hindamine: nõutava korratavuse tagamiseks kasutatavad meetodid (parandusmeetod, sisestandard jms).

Teave selle kohta, kas hinnati elutsiooniruumala või retentsiooniaja põhjal.

Teave hindamise piiratuse kohta, kui piik ei ole täielikult analüüsitud.

Silumismeetodite kirjeldus, kui neid kasutati.

Proovi ettevalmistamise ja eeltöötluse protseduurid.

Lahustumatute osakeste olemasolu.

Süsteruumala (μl) ja -kontsentratsioon (mg/ml).

Tähelepanekud seikade kohta, mis võivad põhjustada kõrvalekaldumist ideaalsest geelkromatograafia profiilist.

Kõikide katseprotseduurides tehtud muudatuste üksikasjalik kirjeldus.

Veapiiride üksikasjalikud andmed.

Mis tahes muu teave ja tähelepanekud, mis puudutavad tulemuste tõlgendamist.

3.1.2.3.4. VIITED DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.20. POLÜMEERIDE LAHUSTUMIS-/EKSTRAHEERUMISKÄITUMINE VEES

A.20.

1. MEETOD Kirjeldatav meetod on OECD katsejuhendi nr 120 (1997) parandatud versiooni koopia. Täpsem tehniline lisateave on toodud kirjandusviites (1).

1.

1.1. SISSEJUHATUS Osade polümeeride, nagu emulsioonipolümeerid, korral on vajalik eeltöötlus enne allkirjeldatud meetodi kasutamist. Meetod ei ole kasutatav vedelate polümeeride ja katsetingimustel veega reageerivate polümeeride jaoks. Kui meetod ei ole otstarbekohane või võimalik, siis võib polümeeri lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist uurida muude meetodite abil. Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused.

1.2. VÕRDLUSAINED Puuduvad.

1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Polümeeride lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist vesilahuses uuritakse muudatustega kolvimeetodil (vt A.6 Vees lahustuvus, Kolvimeetod), mida on alljärgnevalt kirjeldatud.

1.4. KVALITEEDINÕUDED Puuduvad.

1.5. MEETODI KIRJELDUS

1.5.

1.5.1. Seadmed Meetodi jaoks on vajalikud järgmised seadmed:

purustamisseade, näiteks jahvatusmasin, kindla suurusega osakeste valmistamiseks;

seade loksutamiseks, temperatuurikontrolli võimalusega;

membraanfiltratsiooni süsteem;

asjakohased analüütilised seadmed;

standardsed sõelad.

1.5.2. Proovi ettevalmistus Esindusliku proovi peab esmalt vähendama osakeste suuruseni 0,125 kuni 0,25 mm, kasutades vastavaid sõelu. Proovi stabiilsuse tagamiseks või jahvatamiseks võib vajalik olla jahutamine. Kummilaadseid materjale saab purustada vedela lämmastiku temperatuuril (1). Kui osakeste soovitud suurusega fraktsioon ei ole saavutatav, peab vähendama osakeste suurust nii palju kui võimalik ja saadud tulemused protokollima. Protokollis peab täpselt ära näitama, mil viisil säilitati purustatud proovi enne katset.

1.5.3. Protseduur Katsetatava aine kolm proovi (igaüks 10 g) kaalutakse vastavalt kolme klaaskorgiga varustatud nõusse ja igaühte lisatakse 1000 ml vett. Kui polümeeri koguses 10 g ei ole võimalik käsitleda, siis peab kasutama suurimat kogust, mille käsitlemine on veel võimalik, ja muutma vastavalt sellele ka vee kogust. Nõud suletakse tihedalt ja seejärel loksutatakse temperatuuril 20 oC. Kasutada tuleks konstantsel temperatuuril töötavat loksutit või segajat. 24 tunni pärast tsentrifuugitakse või filtritakse iga nõu sisu ja selges veefaasis määratakse polümeeri kontsentratsioon sobiva analüüsimeetodiga. Kui veefaasi jaoks puudub sobiv analüüsimeetod, siis võib summaarset lahustuvust/ekstraktiivsust hinnata filtril oleva jäägi või tsentrifuugimise sademe kuivkaalu põhjal. Tavaliselt on vajalik ebapuhtuste ja lisandite ning madala molekulmassiga komponentide kvantitatiivne eristamine. Gravimeetrilise analüüsi korral on tähtis sooritada ka pimekatse ilma testaineta, et hinnata katseprotseduurist tingitud jääkide kogust. Polümeeride lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist vesilahuses temperatuuril 37 oC ning pH 2 ja pH 9 juures võib määrata samal viisil, nagu kirjeldati katse tegemist temperatuuril 20 oC. Vastava pH väärtuse saavutamiseks võib lisada kas sobivaid puhvreid, happeid või aluseid, nagu vesinikkloriidhape, etaanhape, analüütilise puhtusega naatrium- või kaaliumhüdroksiid või ammoniaak. Sõltuvalt analüüsimeetodist peaks tegema ühe või kaks katset. Kui polümeeri vesilahuse otsese analüüsi jaoks on olemas piisavalt spetsiifilised meetodid, siis piisab ühest eelnevalt kirjeldatud katsest. Kui sellised meetodid ei ole kättesaadavad ja polümeeri lahustumis- või ekstraheerumiskäitumise määramine piirdub vaid kaudse analüüsiga, kus määratakse veefaasi kogu orgaanilise süsiniku sisaldus (TOC), peab tegema lisakatse. Lisakatse hõlmab samuti kolme paralleelkatset, milles kasutatakse kümme korda väiksemat polümeerikogust ja sama veekogust, mida kasutati esimeses katses.

1.5.4. Analüüs

1.5.4.

1.5.4.1. Ühe proovi suurusega tehtud katse Polümeeri komponentide otseseks analüüsiks veefaasis võib olla sobivaid meetodeid. Alternatiivina saab kasutada lahustunud või ekstraheerunud polümeeri komponentide kaudset analüüsi, millega määratakse lahustuvate komponentide üldine sisaldus ning tehakse parandusi polümeerile mittespetsiifiliste komponentide osas. Kõikide polümeeri komponentide analüüs veefaasis on võimalik kas piisavalt tundliku meetodiga, näiteks kogu orgaanilise süsiniku määramine (TOC), kasutades persulfaadi või dikromaadiga lagundamist, tekkiva süsinikdioksiidi koguse määramiseks kasutatakse infrapunaspektroskoopiat või keemilisi analüüsimeetodeid; Kui veefaasi analüüs ei ole teostatav, siis peaks vesiekstrakti ekstraheerima vees segunematu orgaanilise lahustiga, näiteks klorosüsivesinikega. Lahusti aurutatakse ja saadud jäägis analüüsitakse ülalnimetatud polümeeri sisaldust. Selles jäägis sisalduvad ebapuhtusena või lisanditena identifitseeritud komponendid lahutatakse tulemusest, et määrata polümeeri lahustumis- või ekstraheerumisastet. Kui proov sisaldab suhteliselt palju sellist materjali, siis võib jääki analüüsida vedelikkromatograafia (HPLC) või gaaskromatograafia (GC) abil, et eraldada ebapuhtused monomeeridest ja monomeeridest pärinevatest komponentidest nii, et saab määrata monomeeride tegeliku koguse. Osadel juhtudel on piisav orgaanilise lahusti aurutamine kuivjäägini ja saadud jäägi kaalumine.

aatomabsorptsioonspektromeetria (AAS) või induktiivsidestunud plasma (ICP) emissioonspektromeetria, kui polümeer sisaldab räni või metalle;

UV-absorptsioon või spektrofluoromeetria arüülpolümeeride jaoks;

vedelikkromatograafia – mass-spektromeetria (LC-MS) madala molekulmassiga proovide jaoks,

või aurutades vee ekstrakti kuivjäägini ja analüüsides saadud jääki spektroskoopiliselt (IR, UV jms) või AAS/ICP abil.

1.5.4.2. Kahe erineva proovi suurusega tehtud katse Kõikides vesiekstraktides analüüsitakse kogu orgaanilist süsinikku (TOC). Proovi lahustumatut või ekstraheerumatut osa analüüsitakse gravimeetriliselt. Kui pärast iga nõu sisu tsentrifuugimist või filtrimist on nõu seintel polümeeri jääke, siis peab nõud loputama filtraadiga, kuni selle seintel ei ole jääke näha. Seejärel filtritakse või tsentrifuugitakse filtraati uuesti. Filtril või tsentrifuugiklaasis olevat jääki kuivatatakse temperatuuril 40 oC vaakumis ning kaalutakse. Kuivatamist jätkatakse kuni konstantse kaalu saavutamiseni.

2. ANDMED

2.

2.1. ÜHE PROOVI SUURUSEGA TEHTUD KATSE Kõigi kolme kolvikatse tulemused ja keskmised väärtused peab esitama ja tulemused tuleb väljendada massiühikutes lahuse ruumala kohta (tüüpiliselt mg/l) või massiühikutes polümeeri proovi massi kohta (tüüpiliselt mg/g). Lisaks tuleb esitada proovi massikadu (arvutatakse soluudi massi jagamisel esialgse proovi massiga). Katsete puhul tuleks arvutada ka suhteline standardhälve (RSD). Kogu proovi (polümeer + olulised lisandid jms) ja ainult polümeeri (pärast selliste lisandite mõju lahutamist) kohta peab esitama eraldi tulemused.

2.2. KAHE ERINEVA PROOVI SUURUSEGA TEHTUD KATSE Kahest kolme paralleelkatsega eksperimendist saadud TOC väärtused ja iga eksperimendi keskmine tuleb esitada massiühikuna lahuse ruumala kohta (tavaliselt mgC/l) ja massiühikuna proovi massi kohta (tavaliselt mgC/g). Kõrge ja madala proovi/vee suhtega katsetulemuste vahelise erinevuse puudumine viitab sellele, et kõik ekstraheeruvad komponendid on ekstraheerunud. Sellistel juhtudel ei ole tavaliselt otsene analüüs vajalik. Jääkide massid peab esitama ja tulemused tuleb väljendada protsendina proovi esialgsest massist. Iga katse jaoks peab arvutama keskmise. Erinevused 100 % ja leitud protsendi vahel esitavad lahustuva ja ekstraheeruva materjali protsendilist sisaldust esialgses proovis.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. ARUANNE Katsetulemused peavad sisaldama järgmist teavet.

3.1.

3.1.1. Katsetatav aine

Olemasolev teave analüüsitava ühendi kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused, madala molekulmassiga komponentide sisaldus).

3.1.2. Katse tingimused

Kasutatud protseduuride kirjeldus ja katse tingimused.

Analüütiliste ja määramismeetodite kirjeldus.

3.1.3. Tulemused

Lahustuvuse/ekstraktiivsuse tulemused (mg/l); erinevates lahustes tehtud ekstraktsioonikatsete üksikud ja keskmised väärtused, lagunenud polümeeri sisaldus, ebapuhtused, lisandid jms.

Polümeeri lahustuvuse/ekstraktiivsuse tulemused (mg/g).

Kui mõõdeti, siis vee ekstraktide TOC tulemused, soluudi mass ja arvutatud protsendid.

Iga proovi pH väärtus.

Pimekatsete tulemused.

Kus vajalik, peab viitama katsetatava ühendi keemilisele ebastabiilsusele nii katse kui ka analüütilise protsessi käigus.

Kogu teave, mis on oluline tulemuste tõlgendamisel.

4.1. VIITED DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

A.21. OKSÜDEERIMISVÕIME (VEDELIKUD)

A.21.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Käesolev katsemeetod on välja töötatud selleks, et mõõta vedeliku võimet suurendada põleva materjali põlemiskiirust või põlemisintensiivsust või moodustada segu tuleohtliku ainega, mis süttib iseeneslikult juhul, kui need kaks ainet segatakse omavahel põhjalikult. See põhineb oksüdeerivate vedelike (1) ÜRO katsel ja on sellega samaväärne. Kuna käesolev meetod A.21 on algselt ette nähtud vastama määruse (EÜ) nr 1907/2006 nõuetele, on vaja teha võrdlus üksnes ühe võrdlusainega. Katsete tegemine ja võrdlemine täiendava võrdlusainega võib olla vajalik juhul, kui eeldatakse, et katse tulemusi kasutatakse muudel eesmärkidel. Käesolevat katset ei ole vaja teha juhul, kui struktuurivalemi uurimine teeb kahtlusteta kindlaks, et aine ei reageeri tuleohtliku materjaliga eksotermiliselt. On kasulik teada enne katsetamist, kas aine võib plahvatada. Käesolev katse ei ole kasutatav tahkete ainete, gaaside, plahvatusohtlike või kergestisüttivate ainete ega orgaaniliste peroksiidide puhul. Käesolevat katset ei ole vaja teha juhul, kui oksüdeerivaid vedelikke (1) käsitlevas ÜRO katses on tulemused uuritava katseaine kohta juba olemas.

1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Keskmine rõhutõusuaeg on katse käigus manomeeterrõhu suurenemiseks 690 kPa-lt 2070 kPa-le kulunud aegade keskmine.

1.3. VÕRDLUSAINE Võrdlusainena kasutatakse 65 %list (massiprotsent) lämmastikhappe vesilahust (analüütiliselt puhas). Kui katse tegija näeb ette, et katse tulemusi võib lõpuks kasutada muudel eesmärkidel, võib soovi korral samuti osutuda vajalikuks katse tegemine täiendavate võrdlusainetega.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Uuritav vedelik segatakse kiudtselluloosiga massisuhtes 1:1 ja pannakse surveanumasse. Kui segamisel või anuma täitmisel ilmneb isesüttimine, ei ole vaja katsete tegemist jätkata. Kui isesüttimist ei toimu, tehakse kogu katse. Segu kuumutatakse surveanumas ja määratakse kindlaks keskmine aeg, mis kulub manomeeterrõhu suurenemiseks 690 kPa-lt 2070 kPa-le. Seda võrreldakse sellise keskmise ajaga, mis kulub võrdlusaine(te) ja tselluloosi 1:1 segu korral rõhu suurenemiseks.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Ühe ainega tehtud viiest katsest koosnevas seerias ei tohi ükski tulemus erineda aritmeetilisest keskmisest rohkem kui 30 %. Tulemused, mis erinevad keskmisest rohkem kui 30 %, jäetakse kõrvale, täiustatakse segamis- ja täitmismenetlust ning korratakse katset.

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Ettevalmistus

1.6.1.

1.6.1.1. Põlev aine Põleva ainena kasutatakse kuivatatud kiudtselluloosi, mille kiu pikkus on 50–250 μm ja keskmine läbimõõt on 25 μm. Seda kuivatakse konstantse kaaluni kuni 25 mm paksuses kihis 105 oC juures neli tundi ja hoitakse eksikaatoris koos desikandiga kuni jahtumise ja kasutamiseni. Kuivatatud tselluloosi niiskusesisaldus peaks olema alla 0,5 % kuivmassist. Vajaduse korral peaks selle tagamiseks kuivatamisaega pikendama. Tselluloosi sama partiid kasutatakse kogu uuringu vältel.

1.6.1.2. Seadmed

1.6.1.2.

1.6.1.2.1. Surveanum Vaja läheb surveanumat. Anumaks on silindriline terasest anum, mille pikkus on 89 mm ja välisläbimõõt on 60 mm (vt joonist 1). Vastaskülgedel paikneb kaks tasapinnalist süvendit (millega on anuma sisemist vaba ruumi vähendatud 50 mm-ni) süüteküünla ja väljalaskeava korgi paigaldamise hõlbustamiseks. Anumas oleva 20 mm siseläbimõõduga kanali mõlemas otsas on 19 mm astmetaoline laiend, mis on keermestatud vastavalt Briti standardsele 1" torukeermele (British Standard Pipe – BSP) või samaväärsele meeterkeermele. Surveanuma kumerasse külgpinda on ühest otsast 35 mm kaugusele kruvitud külgharu, mis paikneb tasapinnaliste süvenditega 90o nurga all ning mis on ette nähtud ühendamiseks rõhuanduriga. Külgharu pesa moodustab 12 mm sügavune puuritud ava, mis on keermestatud vastavalt külgharu otsas oleva 1/2" BSP keermega (või samaväärse meeterkeermega). Vajaduse korral paigaldatakse inertne tihend, mis tagab hermeetilise ühenduskoha. Külgharu ulatub 55 mm surveanuma korpusest väljapoole ja sellesse on puuritud kanal siseläbimõõduga 6 mm. Külgharu otsas on astmetaoline keermestatud süvend, mis on ette nähtud ühendamiseks membraani tüüpi rõhuanduriga. Kasutada võib mis tahes rõhumõõturit, tingimusel et seda ei mõjuta kuumad gaasid või lagunemissaadused ning et see on võimeline reageerima rõhutõusudele 690 – 2070 kPa vähem kui 5 ms jooksul. Surveanuma külgharust kaugemal asuv ots on suletud süüteküünlaga, milles on kaks elektroodi –üks on isoleeritud küünla korpusest ja teine on sellega ühendatud (maandatud). Surveanuma teine ots on suletud puruneva membraaniga (purunemissurve ligikaudu 2200 kPa), mida hoiab paigal 20 mm läbimõõduga puuritud avaga kork. Vajaduse korral kasutatakse ühenduskoha hermeetilisuse tagamiseks inertset tihendit. Tugiraam (joonis 2) hoiab komplekti kasutamise ajal õiges asendis. Tugiraam koosneb tavaliselt pehmest rauast alusplaadist, mille mõõtmed on 235 mm × 184 mm × 6 mm, ja 185 mm pikkusest õõnsusega ruudukujulisest sektsioonist (S.H.S.) mõõtmetega 70 mm × 70 mm × 4 mm. Õõnsusega ruudukujulise sektsiooni ühe otsa kaks vastaskülge on maha lõigatud selliselt, et moodustub kahest tasapinnalise küljega jalast struktuur, mille otsas paikneb 86 mm pikkune terviklik karbikujuline osa. Nende tasapinnaliste külgedega jalgade otsad on lõigatud horisontaalsuuna suhtes 60o all ning on keevitatud alusplaadi külge. Põhisektsiooni ülaosa ühes küljes paikneb pilu laiusega 22 mm ja sügavusega 46 mm nii, et kui rõhuanuma komplekt lastakse allapoole, süüteküünlaga ots ees, siis satub külgharu pilusse. Karbikujulise osa alumise sisepinna külge keevitatakse terasest 30 mm laiune ja 6 mm paksune detail, mis toimib eraldajana. Kaks vastasküljel olevat 7 mm pitskruvi hoiavad surveanumat kindlalt paigal. Kaks 12 mm laiust ja 6 mm paksust terasriba, mis on keevitatud karbikujulise sektsiooni põhjale toetuvate külgmiste elementide külge, toetavad surveanumat altpoolt.

1.6.1.2.2. Süütesüsteem Süütesüsteem koosneb 25 cm pikkusest Ni/Cr traadist, mille läbimõõt on 0,6 mm ja takistus on 3,85 oom/m. Traat on keritud spiraalina 5 mm läbimõõduga varda abil ja kinnitatud süüteküünla elektroodide külge. Spiraali kuju peaks vastama joonisel 3 toodule. Anuma põhja ja süütespiraali alakülje vaheline kaugus peaks olema 20 mm. Kui elektroode ei saa reguleerida, tuleks süütespiraali ja anuma põhja vahel olevad traadi otsad isoleerida keraamilise kestaga. Traati kuumutatakse püsivoolutoiteallikaga, mis suudab tagada vähemalt 10 A voolutugevuse.

1.6.2. Katse tegemine Seade, mis on komplekteeritud rõhuanduri ja kuumutussüsteemiga, kuid kuhu ei ole paigaldatud purunevat membraani, toetub altpoolt süüteküünlale. 2,5 g uuritavat vedelikku segatakse keeduklaasis 2,5 g kuivatatud tselluloosiga, kasutades klaasist segamispulka. Ohutuse tagamiseks on tegija ja segu vahel segamise ajal kaitseekraan. Kui segu süttib segamise või anuma täitmise ajal, ei ole vaja katsetamist jätkata. Segu lisatakse tilkhaaval väikeste portsjonitena surveanumasse, tagades segu paiknemise ümber süütespiraali ja sellega hea kontakti. On oluline, et spiraal ei deformeeru anuma täitmise ajal, kuna see võib põhjustada väärasid tulemusi. Purunev membraan asetatakse kohale ja lukustav kork keeratakse kõvasti kinni. Täidetud anum asetatakse tugiraamile nii, et purunev membraan jääb ülespoole. Tugiraam asetatakse sobivasse armeeritud tõmbekappi või põlemiskambrisse. Toiteallikas ühendatakse süüteküünla välimiste klemmidega ja lülitatakse sisse 10 A vool. Aeg segamise alustamisest kuni voolu sisselülitamiseni ei tohiks ületada kümmet minutit. Rõhuanduri signaal registreeritakse sobiva süsteemi abil, mis võimaldab nii signaali hindamist kui ka rõhu ajalise sõltuvuse pidevat registreerimist (nt graafilise isekirjutiga ühendatud siirdeprotsesside registraator). Segu kuumutatakse kuni puruneva membraani rebestumiseni või vähemalt 60 s. Kui purunev membraan ei rebestu, tuleks lasta segul jahtuda enne seadme hoolikat lahtimonteerimist, vältides seejuures võimalikku hermeetilisuse kadumist. Uuritava aine ja võrdlusaine(te)ga tehakse viis katset. Fikseeritakse aeg, mis kulub manomeeterrõhu tõusuks 690 kPa-lt 2070 kPa-le. Arvutatakse keskmine rõhutõusuaeg. Mõnedel juhtudel võivad ained tekitada rõhutõusu (liiga suurt või liiga väikest), mille põhjuseks on keemilised reaktsioonid, mis ei ole seotud aine oksüdeerimisvõimega. Neil juhtudel võib osutuda vajalikuks katse kordamine tselluloosi asemel inertse ainega, nt diatomiidiga (kobediatomiit), et selgitada reaktsiooni olemust.

2. ANDMED Rõhutõusuajad nii uuritava aine kui ka võrdlusaine(te) puhul. Rõhutõusuajad inertse ainega katsete puhul (kui need on tehtud).

2. 2.1. Tabel 1 Näiteid tulemustest

TULEMUSTE TÖÖTLEMINE Arvutatakse keskmised rõhutõusuajad nii uuritava aine kui ka võrdlusaine(te) kohta. Arvutatakse keskmine rõhutõusuaeg inertse ainega katsete puhul (kui need on tehtud). Mõned näited tulemuste kohta on toodud tabelis 1. Aine Keskmine rõhutõusu aeg (ms) 1:1 tselluloosisegu puhul Ammooniumdikromaat, küllastunud vesilahus 20800 Kaltsiumnitraat, küllastunud vesilahus 6700 Raud(III)nitraat, küllastunud vesilahus 4133 Liitiumperkloraat, küllastunud vesilahus 1686 Magneesiumperkloraat, küllastunud vesilahus 777 Nikkelnitraat, küllastunud vesilahus 6250 Lämmastikhape, 65 % 4767 Perkloorhape, 50 % 121 Perkloorhape, 55 % 59 Kaaliumnitraat, 30 % vesilahus 26690 Hõbenitraat, küllastunud vesilahus — Naatriumkloraat, 40 % vesilahus 2555 Naatriumkloraat, 45 % vesilahus 4133 Inertne aine Vesi: tselluloos —

3. ARUANDLUS

3.

3.1. ARUANNE Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet:

uuritud aine nimetus, koostis, puhtus jne;

uuritava aine kontsentratsioon;

tselluloosi kuivatusmenetlus;

tselluloosi niiskusesisaldus;

mõõtetulemused;

inertse ainega tehtud katsete tulemused, kui need on olemas;

arvutatud keskmised rõhutõusuajad;

võimalikud kõrvalekalded nimetatud meetodist ja nende põhjused;

kogu täiendav teave või märkused, mis on vajalikud tulemuste tõlgendamiseks.

3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE Katsetulemusi hinnatakse Vedelikku käsitatakse oksüdeerijana juhul, kui Valepositiivse tulemuse vältimiseks tuleks tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta ka tulemusi, mis on saadud aine katsetamisel koos inertse materjaliga.

3.2. a)

selle põhjal, kas uuritava aine ja tselluloosi segu süttib ise, ja

rõhutõusule (690 kPa-lt 2070 kPa-le) kulunud keskmise aja võrdlemisel võrdlusaine(te) korral selleks kulunud ajaga.

uuritava aine ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) süttib iseeneslikult või

uuritava aine ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) korral on keskmine rõhutõusuaeg väiksem 65 massiprotsendilise lämmastikhappe (vesilahus) ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) korral saadud keskmisest rõhutõusuajast või on sellega võrdne.

4.1. VIITED Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3. täiendatud väljaanne. ÜRO väljaanne nr: ST/SG/AC.10/ll/Rev. 3, 1999, lk 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids. Märkus: toodud kujutistest võib kasutada emba-kumba.

4.1. Joonis 1 Surveanum

(A) Surveanuma korpus (B) Purunevat membraani paigalhoidev kork (C) Süüteküünal (D) Pehme tinatihend (E) Purunev membraan (F) Külgharu (G) Rõhuanduri pea (H) Tihend (J) Isoleeritud elektrood (K) Maandatud elektrood (L) Isolatsioon (M) Teraskoonus (N) Tihendit deformeeriv soon

Joonis 2 Tugiraam

Joonis 3 Süütesüsteem

(A) Süütespiraal (B) Isolatsioon (C) Elektroodid (D) Süüteküünal

Liide Täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks võib näidetena tutvuda järgmiste standarditega.

1. Kapillaartoru meetodid

1.

1.1. Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products

1.2. Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point

2. Kuumlauad

2.

2.1. Kofleri sulavuslaud ANSI/ASTM D 3451 76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Sulavusmikroskoop DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

2.3. Meniskimeetod (polüamiididele) ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Résines de polyamides. Determination du point de fusion Methode du ménisque

3. Külmumistemperatuuri määramise meetodid BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Termoanalüüs

4.

4.1. Diferentsiaaltermoanalüüs ASTM E 537-76 Standard method for asseying the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermisches Analyse, Begriffe

4.2. Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria ASTM E 537-76 Standard method for asseying the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermisches Analyse, Begriffe

5. Hangumistemperatuuri määramine NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour point.

Liide Täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks võib näidetena tutvuda järgmiste standarditega.

1.1.1. Ebulliomeeter Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Destillatsioonimeetod (keemistemperatuuri vahemik) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Diferentsiaaltermoanalüüs ja skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

Liide Täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks võib näidetena tutvuda järgmiste standarditega.

1. Ujuvusmeetodid

1.

1.1. Hüdromeeter DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2. Hüdrostaatilised kaalud

1.2. Tahkete ainete jaoks

ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density

Vedelike jaoks

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 ja ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3. Sukeldatud keha meetod DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2. Püknomeetrit rakendavad meetodid

2.

2.1. Vedelike jaoks ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00.10-6 m2 s-1 at 15 oC) DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00 . 10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC) DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary- stoppered pycnometer method NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method

2.2. Tahkete ainete jaoks ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-053 Chemical products for industrial use -Determination of density of solids in powder and liquids -Pyknometric method DIN 19683 Determination of the density of soils

3. Õhkvõrdluspüknomeeter DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung

1. liide Hindamismeetod SISSEJUHATUS

Aururõhu arvutuslikke väärtusi saab kasutada

sobiva katsemeetodi valikul;

hinnangu või piirväärtuse saamiseks juhtudel, kus katsemeetodit tehnilistel põhjustel (sh väga madal aururõhk) rakendada ei saa;

identifitseerimaks juhtumeid, kus on õigustatud eksperimentaalse määramise kõrvalejätmine, kuna aururõhk toatemperatuuril on eeldatavalt alla 10-5 Pa.

HINDAMISMEETOD

Vedelike ja tahkete ainete aururõhku on võimalik hinnata muudetud Watsoni korrelatsiooni (a) abil. Ainus selleks vajalik eksperimentaalselt määratav väärtus on keemistemperatuur normaalrõhul. Meetod on kohaldatav rõhuvahemikus 105 Pa – 10-5 Pa. Meetodi üksikasjalik kirjeldus on toodud väljaandes Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b).

ARVUTUSKÄIK

Viite b kohaselt arvutatakse aururõhk järgmiselt: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb kus: T huvi pakkuv temperatuur Tb keemistemperatuur normaalrõhul Pvp aururõhk temperatuuril T ΔHvb aurustumissoojus ΔZb kokkusurutavusaste (hinnanguliselt 0,97) m empiiriline tegur, mis sõltub füüsikalisest olekust huvi pakkuval temperatuuril Edasi, Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb kus KF on aine polaarsust arvestav empiiriline tegur. Paljude ühendiklasside KF tegurid on loetletud viites b. Sageli on saadaval andmed keemistemperatuuri kohta alandatud rõhul. Sellisel juhul arvutatakse aururõhk viite b kohaselt järgmiselt: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1mT1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 kus T1 on keemistemperatuur alandatud rõhul P1.

ARUANNE

Hindamismeetodi kasutamisel peab aruandes sisalduma põhjalik dokumentatsioon arvutuste kohta.

KIRJANDUS

a)

K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, 398.

b)

W. J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

2. liide

Joonis 1 Seade aururõhukõvera määramiseks dünaamilise meetodi kohaselt

1 = termopaar 2 = vaakumpuhvermahuti 3 = rõhumõõtur 4 = vaakum 5 = mõõtmiskoht 6 = kütteelement, ca 150 W

Joonis 2a Seade aururõhukõvera määramiseks staatilise meetodi kohaselt (U-toru-manomeetri abil)

1. Testaine 2. Aurufaas 3. Kõrgvaakumklapp 4. U-toru (lisamanomeeter) 5. Manomeeter 6. Termostateerimisvann 7. Temperatuurimõõtur 8. Vaakumpump 9. Ventilatsioon

Joonis 2b Seade aururõhukõvera määramiseks staatilise meetodi kohaselt (rõhunäituri abil)

1. Testaine 2. Aurufaas 3. Kõrgvaakumklapp 4. Rõhumõõtur 5. Rõhunäitur 6. Termostateerimisvann 7. Temperatuurimõõtur

Joonis 3 Isoteniskoop (vt viidet 7)

1. Ühendus rõhu reguleerimis- ja mõõtesüsteemiga 2. 8 mm välisdiameetriga toru 3. Kuiv lämmastik survestatud süsteemis 4. Proovi aur 5. Peenike ots 6. Vedelikuproov

Joonis 4 Seade aururõhukõvera määramiseks aururõhukaalude meetodi kohaselt

1. Testaine 2. Aurufaas koos auruvooga 3. Aurustusahi pöörleva sisselaskeava ja külmkambriga 3a. Avaga ahjukaas 4. Ahju kütteseade (jahutusseade) 5. Proovi temperatuuri mõõtmine 6. Külmkamber 7. Kaitseekraan 8. Külmkambri jahutusvarras 9. Kaalukauss 10. Mikrokaalud 11. Meerikusse 12. Kõrgvaakumpump

Joonis 5 Näiteseade aurustumise uurimiseks madalal rõhul efusioonmeetodi abil efusiooniraku mahuga 8 cm

1. Ühendus vaakumiga 2. Pesad plaatina-takistustermomeetri või temperatuuri mõõtmis- ja reguleerimisseadme jaoks (2) 3. Vaakummahuti kaas 4. O-rõngas 5. Alumiiniumist vaakummahuti 6. Efusioonirakkude paigaldamise ja eemaldamise seade 7. Keermega kaas 8. Liblikmutrid (6) 9. Poldid (6) 10. Roostevabast terasest efusioonirakud 11. Padrunkuumutid (6)

Joonis 6a Näitlik läbivoolusüsteem aururõhu määramiseks gaasi küllastamise meetodi kohaselt

1. Vooluregulaator 2. Soojusvaheti 3. Nõelklapid 4. Suhtelise niiskuse andur 5. Küllastuskolonnid 6. PTFE liited 7. Voolumõõtur 8. Püüdur (absorber) 9. Õlipüüdur 10. Paagutatud mullitaja Õhuava Jaotustoru

Joonis 6b Näitlik küllastuskolonni järgi ühendatud kapillaartoruga süsteem aururõhu määramiseks gaasi küllastamise meetodi kohaselt

1. Termiline massivoolumõõtur 2. Manomeeter 3. Termostateeritud kamber 4. Kandegaasi termostateerimisspiraal 5. Termomeeter (Pt 100) 6. Gaasi küllastamise kamber 7. Kapillaartoru 8. Absorptsioonianumad 9. Gaasimõõtur 10. Külmpüüdur

Joonis 7 Näitlik katseseade aururõhu uurimiseks pöörleva rootori meetodi kohaselt

Aururõhu aparaat A. Pöördrootormõõtepea B. Proovirakk C. Termostaat D. Ühendus vaakumseadmega (turbopump) E. Õhu termostaat

Joonis 8 Pöördrootormõõtepea näide

1. Kuul 2. Äärikliite 6 vakumeeritud torupikendus 3. Püsimagnetid (2) 4. Mähised püstsuunaliseks stabiliseerimiseks (2) 5. Ajam-mähised (4) 6. Äärikliide

Liide

Joonis 1 Kolonn-elueerimismeetod tsirkulatsioonpumbaga

Tasakaalustamine atmosfäärirõhuga Voolumõõtur Mikrokolonn Termostateeritud tsirkulatsioonpump Tsirkulatsioonpump Kahe asendiga klapp proovide võtmiseks

Joonis 2 Tüüpiline mikrokolonn

(Kõik mõõdud on millimeetrites) Lihvühendus Vaba ruum kolonni peas Sisediameeter 5 mm Välisdiameeter 19 mm Klaasvatist kork Kahe asendiga korkkraan

Joonis 3 Tüüpiline mikrokolonn

(Kõik mõõdud on millimeetrites) Lihvühendus Vaba ruum kolonni peas Sisediameeter 5 mm Välisdiameeter 19 mm Korkkraan

Joonis 4 Kolonn-elueerimismeetod ühtlustava anumaga

1 = Ühtlustav anum (nt 2,5 l kolb) 2 = Kolonn (vt joonist 3) 3 = Fraktsioonikoguja 4 = Termostaat 5 = Teflontoru 6 = Lihvühendus 7 = Veetoru termostaadi ja kolonni vahel (sisediameeter ligikaudu 8 mm)

1. liide Arvutus-/hindamismeetodid SISSEJUHATUS

Üldise arvutusmeetodite tutvustuse, vastavaid andmeid ja näiteid võib leida raamatust Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). Arvutuslikke POW väärtusi saab kasutada

sobiva katsemeetodi valikul (loksutamismeetod: log POW vahemikus –2 kuni 4, HPLC meetod: log POW vahemikus 0–6);

sobivate katsetingimuste valikul (näiteks võrdlusainete valikul HPLC protseduurideks, oktanooli/vee suhte valikul loksutamismeetodi puhul);

labori sisekontrollimeetodina võimalike katsevigade avastamiseks;

hinnangulise POW väärtuse saamiseks juhtudel, mille puhul katsemeetodeid tehnilistel põhjustel rakendada ei saa.

HINDAMISMEETOD

Jaotusteguri esialgne hindamine Jaotusteguri hinnangulise väärtuse võib leida testaine lahustuvuse põhjal puhastes lahustites.

Selleks: Pestimate = saturation cn-octanolsaturation cwater

ARVUTUSMEETODID

Arvutusmeetodite põhimõte

Kõigi arvutusmeetodite kohaselt jagatakse molekul sobivateks alamstruktuurideks, mille kohta on olemas usaldusväärsed log POW osaväärtused. Seejärel arvutatakse terve molekuli log POW, liites kokku funktsionaalrühmadele vastavad osaväärtused ja sisemolekulaarseid vastasmõjusid arvestavad parandusliikmed. Rühmakonstantide ja parandusliikmete väärtusi võib leida toodud allikatest (b, c, d, e). Mõnda allikat ajakohastatakse regulaarselt (b).

Kvaliteedinõuded

Üldjuhul arvutusmeetodi usaldusväärsus väheneb uuritava ühendi keerukuse kasvades. Madala molaarmassiga lihtsate, ühe või kahe funktsionaalrühmaga molekulide puhul on eeldatav vahe erinevate, funktsionaalrühmade osaväärtusi arvestavate meetodite abil leitud ning mõõdetavate log POW väärtuste vahel 0,1–0,3 ühikut. Keerukamate molekulide puhul võib veapiir olla suurem. See sõltub nii saadaval olevate rühmakonstantide usaldusväärsusest kui ka oskusest hinnata sisemolekulaarseid vastasmõjusid (nt vesiniksidemeid) ja kasutada vastavaid parandusliikmeid (viimane probleem ei ole arvutitarkvara CLOGP-3 kasutamisel eriti oluline) (b). Dissotsieeruvate ühendite puhul on oluline arvestada õigesti dissotsiatsiooniastet ja vastava iooni laengut.

Arvutuskäik Hanschi π-meetod

Algne hüdrofoobse asendaja konstant π, mille võtsid kasutusele Fujita jt (f), määratletakse järgmiselt: πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH) kus POW (PhX) on aromaatse derivaadi jaotustegur ja POW (PhH) lähteaine jaotustegur. (e.g. πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71). Vastavalt määratlusele on π-meetod kohaldatav peamiselt aromaatsetele asendussaadustele. Paljude asendajate π-väärtused on esitatud koondtabelitena (b, c, d). Neid kasutatakse aromaatsete molekulide või alamstruktuuride log POW arvutamisel.

Rekkeri meetod

Rekkeri (g) järgi arvutatakse log POW väärtus järgmiselt: log Pow=Σi ai fi+Σj kus fi tähistab erinevaid rühmakonstante ja ai nende esinemissagedust uuritavas molekulis. Parandusliikmed võib väljendada summaarselt konstandi Cm (nn maagilise konstandi) korrutisena. Rühmakonstandid fi ja Cm leiti mitme muutujaga regressioonianalüüsi abil 825 ühendi 1054 eksperimentaalse POW väärtuse põhjal (c, h). Vastasmõju arvestavad liikmed määratakse vastavalt kirjanduses toodud eeskirjadele (e, h, i).

Hanschi-Leo meetod

Hanschi ja Leo (c) järgi arvutatakse log POW väärtus järgmiselt: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj kus fi tähistab erinevaid rühmakonstante, Fj parandusliikmeid ja ai, bj vastavaid esinemissagedusi. Paljude eksperimentaalsete POW väärtuste põhjal koostati katse-eksituse meetodil aatomite ja funktsionaalrühmade osaväärtuste ning parandusliikmete Fj (nn faktorite) nimekiri. Parandusliikmed on jagatud mitmesse eri klassi (a, c). Kõigi reeglite ja parandusliikmete arvestamine on suhteliselt keerukas ja aeganõudev. Selleks otstarbeks on välja töötatud vastavad tarkvarapaketid (b).

Kombineeritud meetod

Keerukate molekulide log POW arvutamise täpsust on oluliselt võimalik suurendada, kui jagada molekul suuremateks alamstruktuurideks, mille kohta on olemas usaldusväärsed log POW väärtused kas tabelites (b), (c) või on need saadud isiklikel mõõtmistel. Selliseid fragmente (nt heterotsükleid, antrakinooni, asobenseeni) võib seejärel kombineerida Hanschi π-väärtuste või Rekkeri või Leo rühmakonstantidega.

Märkused i)

Osaliselt või täielikult dissotsieerunud ühenditele saab arvutusmeetodeid kohaldada ainult juhul, kui on võimalik arvestada vajalikke parandustegureid.

ii)

Kui võib eeldada sisemolekulaarsete vesiniksidemete olemasolu, tuleb vastavad parandusliikmed liita (ligikaudu +0,6 kuni +1,0 log POW ühikut) (a). Viiteid selliste sidemete olemasolu kohta võib leida molekuli ruumilistest mudelitest või spektroskoopilistest andmetest.

iii)

Kui võimalik on mitu tautomeerset vormi, kasutatakse arvutustes kõige suurema tõenäosusega vormi.

iv)

Hoolikalt tuleks jälgida muudatusi rühmakonstantide tabelites.

Aruanne

Arvutus-/hindamismeetodite kasutamisel peaks katsearuanne võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:

aine kirjeldust (segu, lisandid jne);

märkeid võimalike sisemolekulaarsete vesiniksidemete, dissotsiatsiooni, laengu ja mis tahes muude ebaharilike nähtuste kohta (nt tautomeeria);

arvutusmeetodi kirjeldust;

märget kasutatud andmebaasi kohta või andmebaasi ennast;

lahknevusi tavapärasest fragmentide valikust;

põhjalikku arvutusdokumentatsiooni.

KIRJANDUS

a)

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

b)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

c)

C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

d)

A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

e)

R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 1979, vol. 14,479.

f)

T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.

g)

R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

h)

C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,1459.

i)

R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

2.liide Soovitatavad võrdlusained HPLC meetodi puhul

Nr Võrdlusaine log POW pKa 1 2-butanoon 0,3 2 4-atsetüülpüridiin 0,5 3 Aniliin 0,9 4 Atseetaniliid 1,0 5 Bensüülalkohol 1,1 6 p-metoksüfenool 1,3 pKa = 10,26 7 Fenoksüäädikhape 1,4 pKa = 3,12 8 Fenool 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenool 1,5 pKa = 3,96 10 Bensonitriil 1,6 11 Fenüülatsetonitriil 1,6 12 4-metüülbensüülalkohol 1,6 13 Atsetofenoon 1,7 14 2-nitrofenool 1,8 pKa = 7,17 15 3-nitrobensoehape 1,8 pKa = 3,47 16 4-kloroaniliin 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobenseen 1,9 18 Kaneelalkohol 1,9 19 Bensoehape 1,9 pKa = 4,19 20 p-kresool 1,9 pKa = 10,17 21 Kaneelhape 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Anisool 2,1 23 Metüülbensoaat 2,1 24 Benseen 2,1 25 3-metüülbensoehape 2,4 pKa = 4,27 26 4-klorofenool 2,4 pKa = 9,1 27 Trikloroetüleen 2,4 28 Atrasiin 2,6 29 Etüülbensoaat 2,6 30 2,6-diklorobensonitriil 2,6 31 3-klorobensoehape 2,7 pKa = 3,82 32 Tolueen 2,7 33 1-naftool 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dikloroaniliin 2,8 35 Klorobenseen 2,8 36 Allüülfenüüleeter 2,9 37 Bromobenseen 3,0 38 Etüülbenseen 3,2 39 Bensofenoon 3,2 40 4-fenüülfenool 3,2 pKa = 9,54 41 Tümool 3,3 42 1,4-diklorobenseen 3,4 43 Difenüülamiin 3,4 pKa = 0,79 44 Naftaleen 3,6 45 Fenüülbensoaat 3,6 46 Isopropüülbenseen 3,7 47 2,4,6-triklorofenool 3,7 pKa = 6 48 Bifenüül 4,0 49 Bensüülbensoaat 4,0 50 2,4-dinitro-6-sec-butüülfenool 4,1 51 1,2,4-triklorobenseen 4,2 S2 Dodekaanhape 4,2 53 Difenüüleeter 4,2 54 Butüülbenseen 4,5 55 Fenantreen 4,5 56 Fluoranteen 4,7 57 Dibensüül 4,8 58 2,6-difenüülpüridiin 4,9 59 Trifenüülamiin 5,7 60 DDT 6,2 Muud madala log POW väärtusega võrdlusained 1 Nikotiinhape -0,07

Liide

Joonis Põlemisriba valmistamise vorm ja abivahendid

(Kõik mõõdud on millimeetrites) Vormi pikkus: 250 mm Materjal: alumiinium

Liide

Joonis Seade

Liide

Näitlik materjalide spetsifikatsioon termilise tundlikkuse katseks (vt DIN 1623) 1)2)3)

Hülss: materjalispetsifikatsioon nr 1.0336 505 g Düüsiga plaat: materjalispetsifikatsioon nr 1.4873 Keermega võru ja mutter: materjalispetsifikatsioon nr 1.3817

Joonis 1 Termilise tundlikkuse katseseade

(Kõik mõõdud on millimeetrites) Joonis 1a. Terashülss ja abivahendid (1) hülss (1a) välisäärik (2) keermega võru, madala hõõrduvusega keere (3) düüsiga plaat, läbimõõt a = 2,0 või 6,0 mm (4) mutter, läbimõõt b = 10 mm (5) ümardatud pind (6) 2 lamedat osa mutrivõtmele nr 41 Joonis 1b. Kaitsev kuumutusseade (7) 2 lamedat osa mutrivõtmele nr 36 (8) killunemiskindel kest (9) 2 tugivarrast hülsile (10) komplekteeritud hülss (11) tagumise põleti asukoht; ülejäänud põletid on nähtaval (12) süüteleek

Joonis 2 Termilise tundlikkuse katse

(purunemise näited) Plahvatuseta purunemine Plahvatuseta purunemine Plahvatusega purunemine Plahvatusega purunemine Plahvatusega purunemine Plahvatusega purunemine

Joonis 3 Kuumutamiskiiruse kaliibrimine termilise tundlikkuse katseks

Temperatuur (°C) Aeg (s) Temperatuuri/aja graafik 27 cm3 dibutüülftalaadi kuumutamisel suletud (1,5 mm düüsiga plaadiga) hülsis propaani voolukiirusel 3,2 l/min. Temperatuur määratakse 1 mm läbimõõduga roostevabast terasest kattega kromellist/alumellist termopaariga, mis on paigutatud mõõteseadme keskele 43 mm allapoole hülsi serva. Kuumutamise kiirus temperatuurivahemikus 135-285 oC peats olema 185-215 K/min.

Joonis 4 Löögikatse seade

(Kõik mõõdud on millimeetrites) Joonis 4a. Langev vasar eest ja küljelt, üldvaade (1) alus, 450 × 450 × 60 (2) terasplokk, 230 × 250 × 200 (3) alasi, 100 (diameeter) × 70 (4) post (5) keskmine põiktala (6) 2 juhtrööbast (7) hammaslatt Joonis 4b. Langev vasar, alumine osa (8) jaotistega skaala (9) langev vasar (langev raskus) (10) fiksaator/päästikseade (11) juhtplaat (12) vahetatav vahealasi, 26 (diameeter) × 26 (13) düüsidega juhtrõngas (14) löögiseade

Jätk

Joonis 4c. Löögiseade pulbriliste või pastataoliste ainete jaoks Joonis 4d. Löögiseade vedelike jaoks (1) terassilindrid (2) terassilindrite juhtvõru (3) düüsidega juhtrõngas a) püstsuunaline läbilõige b) pealtvaade (4) kummirõngas (5) vedelik (40 mm3) (6) vedelikuvaba ruum Joonis 4e. Vasar (langev 5 kg raskus) (1) riputusnagapulk (2) kõrgusemärgis (3) fikseeriv soon (4) silindriline löökpea (5) tagasikäigukonks

Joonis 5 Hõõrdetundlikkuse katseseade

Joonis 5a Hõõrdeseade, eestvaade ja pealtvaade (1) terasalus (2) liikuv kelk (3) portselanplaat, 25 × 25 × 5 mm, kelgul (4) fikseeritud portselanpulk, 10 (diameeter) × 15 mm (5) uuritav proov, ligikaudu 10 mm3 Joonis 5b Pulga algpositsioon proovil (6) pulgahoidja (7) koormusõlg (8) vastukaal (9) lüliti (10) ratas kelgu algasendisse viimiseks (11) elektrimootori suund

Liide

Joonis Vorm ja abivahendid põlemisriba valmistamiseks

(Kõik mõõdud on millimeetrites)

Liide Näited muudest meetoditest, mida kasutatakse polümeeride arvkeskmise molekulmassi (Mn) määramisel

Geelkromatograafia (GPC) on eelistatud meetod Mn määramiseks, eriti juhul, kui kättesaadav on standardite kogum, mille struktuur on võrreldav uuritava polümeeri struktuuriga. Kui geelkromatograafia kasutamisel on praktilist laadi raskused või olemasolevate andmete põhjal võib eeldada, et uuritav aine ei vasta esitatavatele Mn kriteeriumitele (vajab eelnevalt kinnitamist), siis on võimalik kasutada alternatiivseid meetodeid, näiteks järgmisi.

1.1.1.1.2.1.3.1.4.

Kolligatiivsete omaduste kasutamine Ebullioskoopia/krüoskoopia Hõlmab lahusti keemistemperatuuri tõusu (ebullioskoopia) või külmumistemperatuuri alanemise (krüoskoopia) mõõtmist pärast polümeeri lisamist. Meetod põhineb sellel, et lahustunud polümeeri mõju keemis- või külmumistemperatuurile sõltub polümeeri molekulmassist (1, 2). Rakendatavus: Mn < 20000. Aururõhu alandamine Hõlmab valitud võrdlusvedeliku aururõhu mõõtmist enne ja pärast teadaoleva koguse polümeeri lisamist (1, 2). Rakendatavus: Mn < 20000 (teoreetiliselt; praktikas siiski piiratud). Membraanosmomeetria Põhineb osmoosi põhimõttel, st tasakaalu saavutamiseks läbivad lahusti molekulid poolläbilaskvat membraani lahjemast lahusest kontsentreeritumasse lahusesse. Katses kasutatav lahja lahus on nullkontsentratsiooniga ja kontsentreeritud lahus sisaldab polümeeri. Läbi membraani tungiv lahusti tekitab rõhkude erinevuse, mis sõltub polümeeri kontsentratsioonist ja molekulmassist (1, 3, 4). Rakendatavus: Mn vahemikus 20000 – 200000. Aurufaasi osmomeetria Hõlmab puhta lahusti aerosooli aurustumiskiiruse võrdlemist vähemalt kolme aerosooliga, mis sisaldavad uuritava polümeeri erinevaid kontsentratsioone (1, 2, 4). Rakendatavus: Mn < 20000.

2. Lõpprühma alüüs Selle meetodi kasutamiseks on vajalik teada nii polümeeri üldist struktuuri kui ka ahela otsmiste rühmade keemilist koostist (mis peab olema eristatav põhiahelast näiteks NMR või tiitrimise/derivatiseerimise abil). Polümeeris esinevate otsmiste rühmade molekulaarse kontsentratsiooni määramise kaudu saab leida molekulmassi (7, 8, 9). Rakendatavus: Mn kuni 50000 (kahaneva usaldusväärsusega).

3.1.2.3.4.5.6.7.8.9.

Viited Billmeyer, F. W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York. Glover, C. A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P. E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determinition of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Menbrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C. E. M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R. G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

Liide Madala molekulmassiga komponentide sisalduse parandamise juhised lahustumatu polümeeri olemasolul

Proovis sisalduv lahustumatu polümeer põhjustab massikadu geelkromatograafilises analüüsis. Lahustumatu polümeer jääb pöördumatult kolonni või proovi ettevalmistamisel kasutatud filtrile, kuid proovi lahustuv osa läbib kolonni. Kui polümeeri refraktsiooniindeksi juurdekasvu (dn/dc) saab hinnata või mõõta, siis on võimalik hinnata proovi massikadu kolonnis. Sellisel juhul kasutatakse paranduse tegemiseks välist kalibreerimist teadaoleva kontsentratsiooniga ja dn/dc väärtusega standardainetega, et kalibreerida refraktomeetri signaali. Järgnevas näites kasutatakse polü(metüülmetakrülaat) (pMMA) standardit. Akrüülpolümeeride analüüsil välise kalibreerimise saamiseks viiakse geelkromatograafi teadaoleva kontsentratsiooniga pMMA standardi lahus tetrahüdrofuraanis ja saadud andmeid kasutatakse refraktomeetri konstandi leidmiseks järgmise valemi põhjal: K = R/(C×V× dn/dc) kus K refraktomeetri konstant (mikrovoltsekund/ml) R pMMA standardi signaal (mikrovolt/sekund) C pMMA standardi kontsentratsioon (mg/ml) V süsteruumala (ml) ja dn/dc pMMA lahuse tetrahüdrofuraanis refraktsiooniindeksi juurdekasv (ml/mg) Järgmised andmed on tüüpilised pMMA standardi jaoks: R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 × 10-5 ml/mg Saadavat K väärtust, 3,05 × 10, kasutatakse teoreetilise detektori signaali arvutamiseks, kui 100 % süstitud polümeerist elueerus läbi detektori.

B OSA: MÜRGISUSE JA MUUDE TERVISEMÕJUDE MÄÄRAMISE MEETODID

ÜLDINE SISSEJUHATUS A.

UURITAVA AINE ISELOOMUSTUS Uuritava aine koostis, sealhulgas peamised lisandid ja selle vastavad füüsikalis-keemilised omadused (sealhulgas stabiilsus), peaksid olema teada enne toksilisuse uuringu alustamist. Uuritava aine füüsikalis-keemilised omadused annavad olulist teavet manustamisviisi valimise, iga konkreetse uuringu kavandamise ning uuritava aine käitlemise ja säilitamise jaoks. Doseeritavas aines ja bioloogilises materjalis oleva uuritava aine (sealhulgas võimaluse korral peamiste lisandite) kindlakstegemiseks kasutatav kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüsimeetod tuleks välja töötada enne uuringu alustamist. Katsearuanne peaks hõlmama kogu teavet uuritava aine identifitseerimise, selle füüsikalis-keemiliste omaduste, selle puhtuse ja käitumise kohta.

LOOMADE HOOLDAMINE Toksilisuse uurimisel on oluline keskkonnatingimuste range kontroll ja õiged loomade hooldamise viisid.

i)

Pidamistingimused Katsealuste loomade ruumide või piirdeaedade keskkonnatingimused peaksid olema katseliikide jaoks sobivad. Rottide, hiirte ja merisigade puhul on sobiv toatemperatuur 22 ± 3 oC ning suhteline õhuniiskus peaks olema 30–70 %; küülikute puhul peaks temperatuur olema 20 ± 3 oC ning suhteline õhuniiskus 30–70 %. Mõned uurimismeetodid on temperatuuri suhtes eriti tundlikud ning sellistel puhkudel on sobivate temperatuuritingimuste üksikasjad lisatud uurimismeetodi kirjeldusse. Kõikide toksilise toime uuringute puhul tuleks jälgida temperatuuri ja niiskust, samuti tuleks need andmed registreerida ning uuringu lõpparuandesse lisada. Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valget ja 12 tundi pimedat aega. Valgustustsükli üksikasjad tuleks registreerida ja märkida uuringu lõpparuandesse. Kui meetodis ei ole teisiti sätestatud, võib loomi pidada üksikult või väikeste rühmadena, kus emas- ja isasloomad on eraldi; kui puuris on mitu looma, ei tohiks koos olla rohkem kui viis looma. Loomkatsete aruannetes on oluline ära märkida, millist tüüpi puure kasutati ning mitu looma igas puuris nii keemilise ainega kokkupuutumise kui ka järgneva vaatlusperioodi jooksul oli.

ii)

Söötmistingimused Toiduvalik peaks vastama kõikidele katses kasutatava liigi toitainevajadustele. Kui uuritavat ainet manustatakse loomadele toidu kaudu, võib toidu toiteväärtust vähendada vastava uuritava aine ja toidukomponendi võrra. Sellise reaktsiooni võimalikkust tuleks katse tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta. Kasutada võib ka tavapärast katseloomadele mõeldud toitu ning joogivee hulk peab olema piiramatu. Toidu valikut võib mõjutada vajadus tagada sobiv segu, mis võimaldab uuritava aine manustamist koos toiduga. Toksilisust mõjutavaid toidu saasteaineid ei tohiks olla sellises kontsentratsioonis, et see segaks katse tegemist.

ALTERNATIIVSED KATSED Euroopa Liit püüab edendada alternatiivmeetodite väljatöötamist ja kinnitamist, mis annaksid loomkatsetest saadud teabega tasemelt samaväärset teavet, kuid kus kasutataks vähem loomi ja mis põhjustaksid vähem kannatusi või milles välditakse üldse loomade kasutamist. Selliste meetodite olemasolu korral tuleb neid kasutada igal võimalusel ohu kirjeldamisel ja seejärel loomuomase ohtlikkuse liigitamisel ja märgistamisel.

HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE Katsete hindamisel ja tõlgendamisel tuleb arvesse võtta seda, millisel määral on loomkatsete ja in vitro uuringute tulemusi võimalik ekstrapoleerida vahetult inimesele, ning seetõttu võib võimaluse korral kasutada katse tulemuste kinnitamiseks tõendeid kahjulikust toimest inimese tervisele.

VIITED KIRJANDUSELE Enamik nendest meetoditest on töötatud välja OECD programmi Testing Guidelines raames ning neid tuleks kasutada kooskõlas heade laboritavadega, et tagada võimalikult laialdane andmete vastastikune heakskiitmine. Lisateavet võib leida OECD suunistes olevatest viidetest ja muust asjakohasest kirjandusest.

B.1a. ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – KINDLA ANNUSE PROTSEDUUR

B.1a.

1. MEETOD Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 420ga (2001).

1.

1.1. SISSEJUHATUS Traditsioonilised ägeda mürgisuse hindamise meetodid kasutavad loomade surma lõpetamiskriteeriumina. 1984. aastal soovitas British Toxicology Society uut lähenemist ägeda mürgisuse katsetamisele, mis põhineb aine manustamisel kindla annusemääraga seeriana (1). See lähenemine vältis loomade surma kasutamist lõpetamiskriteeriumina ja tugines selle asemel selgete mürgisuse nähtude vaatlemisele ühel seeriast valitud kindlal annusemääral. Protseduur kiideti katsemeetodina heaks 1992. aastal Ühendkuningriigi (2) ja rahvusvaheliste (3) in vivo valideerimiste põhjal. Seejärel hinnati kindla annuse protseduuri statistilisi omadusi matemaatiliste mudelite abil mitmetes uuringutes (4, 5, 6). In vivo ja mudeluuringud on tõestanud, et protseduur on korratav, et selles kasutatakse vähe loomi ja et see põhjustab vähem kannatusi kui traditsioonilised meetodid ning et selle abil saab klassifitseerida ained nii nagu muude ägeda mürgisuse katsemeetoditega. Juhised antud eesmärgi saavutamiseks kõige sobivama katsemeetodi valimiseks võib leida ägeda suukaudse mürgisuse katsete juhisdokumendist (Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (7)). Nimetatud juhisdokument sisaldab samuti lisateavet katsemeetodi B.1a kasutamise ja tõlgendamise kohta. Meetodi põhimõte on, et põhiuuringus kasutatakse üksnes mõõdukalt mürgiseid annuseid ja et tõenäoliselt surmavate annuste manustamist tuleks vältida. Samuti ei tohiks manustada annuseid, mis teatavasti põhjustavad märkimisväärset valu või kannatusi sööbivate või tõsiselt ärritavate mõjude tõttu. Suremas loomad või loomad, kes ilmselt on valus või kellel on tugeva ja kestva kannatuse tunnused, surmatakse humaanselt ning need võetakse arvesse katsetulemuste tõlgendamisel samamoodi nagu loomi, kes surid katse käigus. Eraldi juhisdokumendis (8) on esitatud kriteeriumid, mille põhjal tehakse otsus suremas või raskelt kannatavate loomade surmamiseks, ja juhised prognoositava või ähvardava surma kindlakstegemiseks. Meetod annab teavet ohtlike omaduste kohta ning võimaldab reastada ja klassifitseerida ainet ägedat mürgisust põhjustavate kemikaalide klassifitseerimiseks vastavalt globaalselt harmoneeritud süsteemile (Globally Harmonised System – GHS (9)). Katselaboratoorium võtab arvesse kogu katseaine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab aine nimetust ja keemilist struktuuri, selle füüsikalis-keemilisi omadusi, muude ainega in vitro või in vivo tehtud mürgisuskatsete tulemusi, struktuurilt samalaadsete ainete toksikoloogilisi andmeid ja aine eeldatavat otstarvet. Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmiseks, et katse on tähtis inimeste tervise kaitsmiseks, ja aitab valida sobivat lähteannust.

1.2. MÕISTED Äge suukaudne mürgisus – viitab sellistele kahjulikele mõjudele, mis ilmnevad pärast aine suukaudselt manustamist ühekordse annuse või seeriaviisiliste annustena 24 tunni jooksul. Edasilükkunud surm – loom ei sure ega näi olevat suremas 48 tunni jooksul, kuid sureb hiljem, 14päevase jälgimisperioodi jooksul. Annus – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg/kg). Ilmne mürgisus – üldine mõiste, mis kirjeldab katseaine manustamise järel ilmnenud selgeid mürgisuse tunnuseid (vt näiteid viitest 3). Suuruselt järgmine kindel annus võib põhjustada enamikul loomadest tõenäoliselt kas tugevat valu ja kestva tugeva kannatuse tunnuseid, surmaeelset seisundit (kriteeriumid on toodud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)) või tõenäoliselt surma. GHS – Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (keemiliste ainete ja segude globaalselt harmoneeritud klassifitseerimissüsteem). Ühistegevus, milles osalevad OECD (inimeste tervis ja keskkond), ohtlike ainete vedu käsitlev ÜRO eksperdikomitee (füüsikalis-keemilised omadused) ja ILO (ohtudest teavitamine) ning mida koordineerib kemikaalide mõistlikku haldamist käsitlev organisatsioonidevaheline programm (IOMC). Ähvardav surm – loom on suremas või sureb tõenäoliselt enne järgmist kavandatud jälgimisperioodi. Närilistel võiksid sellisele seisundile viitavateks märkideks olla krambid, külili magamine, loidus ja värin (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)). LD50(surmava annuse mediaan) – aine statistiliselt määratletud ühekordne annus, mis tõenäoliselt põhjustab suukaudsel manustamisel surma 50 %-l loomadest. LD50 väärtust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (mg/kg). Piirannus – vastab katses kasutatavale maksimaalsele annusele (2000 või 5000 mg/kg). Surmaeelne seisund – loomad, kes on suremas või kes ei suuda ellu jääda ravist hoolimata (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)). Ennustatav surm – selliste kliiniliste tunnuste olemasolu, mis viitavad sellele, et surm saabub teatud aja möödumisel enne katse kavandatavat lõppu, näiteks suutmatus tarbida vett või toitu (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).

1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Ühesooliste loomade rühmadele annustatakse katseainet järk-järgult 5, 50, 300 ja 2000 mg/kg kindlate annustena (erandkorras võidakse kasutada 5000 mg/kg kindlat lisaannust, vt punkti 1.6.2). Esialgne annusemäär valitakse eelkatse põhjal annusena, mis eeldatavasti põhjustab mõningaid mürgisuse nähte, kuid ei põhjusta tõsiseid toksilisi mõjusid või suremust. Valu, kannatuse ja ähvardava surmaga seotud kliinilisi tunnuseid ja tingimusi kirjeldatakse üksikasjalikult OECD juhisdokumendis (8). Järgnevatele loomarühmadele võib annustada kaitseaine suuremaid või väiksemaid kindlaid annuseid sõltuvalt sellest, kas neil on olemas või puuduvad märgid mürgisuse või suremuse kohta. Käesolevat protseduuri jätkatakse seni, kuni on kindlaks tehtud tõenäoliselt mürgisust põhjustav annus või surmajuhtum, või kui suurim annus ei avalda mõju või kui väikseim annus põhjustab surma.

1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.4.

1.4.1. Loomaliikide valik Eelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib kasutada ka näriliste teisi liike. Tavaliselt kasutatakse emasloomi (7). Selle põhjuseks on, et tavapäraseid LD50 katseid käsitlevad kirjandusülevaated näitavad, et sugupoolte tundlikkuses on vähe erinevusi, kuid neil juhtudel, kui erinevusi on täheldatud, on emasloomad üldiselt veidi tundlikumad (10). Kui struktuurselt samalaadsete kemikaalide toksikoloogilisi või toksikokineetilisi omadusi käsitlevatest andmetest nähtub, et isasloomad on tõenäoliselt tundlikumad, siis kasutatakse neid. Kui katse sooritatakse isasloomadega, tuleks esitada piisav põhjendus. Kasutatakse noorte tervete täiskasvanud loomade enim kasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Iga loom peaks annustamise alustamisel olema 8–12 nädalat vana ning tema mass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % varem annuse saanud loomade keskmisest massist.

1.4.2. Loomade pidamise ja toitmise tingimused Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, peaks eesmärk olema hoida seda vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Loomad võib grupeerida puuridesse annuse põhjal, kuid puuris olevate loomade arv ei tohiks takistada iga looma selget jälgimist.

1.4.3. Loomade ettevalmistamine Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise võimaldamiseks ning hoitakse oma puurides vähemalt 5 päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega.

1.4.4. Annuste valmistamine Üldiselt manustatakse katseaineid kasutatavate annuste vahemikus konstantses mahus nii, et muutub annustatava valmistise kontsentratsioon. Kui uuritakse vedelat lõppsaadust või segu, võib lahjendamata katseaine kasutamine, s.t konstantse kontsentratsiooni juures, olla siiski olulisem nimetatud aine hilisemal riskianalüüsil. See on mõnede reguleerivate asutuste nõue. Kummalgi juhul ei tohi manustamisel ületada annuse suurimat mahtu. Vedeliku suurim ühekordselt manustatav maht sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta: vesilahuste puhul võib siiski manustada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Annuse valmistise koostamiseks on soovitav võimaluse korral kasutada vesilahust/suspensiooni/emulsiooni, tähtsuse järjekorras oleks järjestus lahus/suspensioon/emulsioon õlis (nt maisiõli) ja seejärel muudel kandeainetel põhinev lahus. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused olema teada. Annused tuleb valmistada ette natuke aega enne manustamist, välja arvatud juhul, kui valmistise stabiilsus sellel ajavahemikul, mil seda kasutatakse, on teada ja näib aktsepteeritav.

1.5. PROTSEDUUR

1.5.

1.5.1. Annuste manustamine Katseainet manustatakse ühekordse annusena söögitoru kaudu või sobiva intubeerimiskanüüli abil. Erandkorras, kui ühekordne annus ei ole võimalik, võib annust manustada väiksemates osades kuni 24 tunni jooksul. Loomad peaksid enne doosi manustamist paastuma (nt rotte hoitakse söömata terve öö ja hiiri 3–4 tundi, üksnes vesi on saadaval). Paastumise järel loomi kaalutakse ja manustatakse katseaine. Pärast aine manustamist võib hoida rotte söömata veel 3–4 tundi ja hiiri 1–2 tundi. Kui annust manustatakse osadena teatud ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest osutuda vajalikuks anda loomadele toitu ja vett.

1.5.2. Eelkatse Eelkatse eesmärk on võimaldada valida põhiuuringu tarbeks sobiv lähteannus. Katseainet manustatakse üksikutele loomadele järk-järgult lisas 1 toodud vooskeemide kohaselt. Eelkatse on lõpetatud siis, kui saab langetada otsuse põhikatse lähteannuse kohta (või kui tuvastatakse surm madalaima kindla annuse puhul). Eelkatse lähteannus valitakse kindlate annusmäärade 5, 50, 300 ja 2000 mg/kg hulgast annusena, mis eeldatavasti põhjustab ilmset mürgisust, mis võimaluse korral põhineb sama kemikaali või struktuurselt sarnaste kemikaalidega sooritatud in vivo ja in vitro katsete andmetel. Sellise teabe puudumise korral on lähteannuseks 300 mg/kg. Iga looma korral on manustamiste vahel vähemalt 24tunnine vahemik. Kõiki loomi jälgitakse vähemalt 14 päeva. Maksimaalset kindla annuse määra 5000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras või siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega (vt 3. lisa). Loomade heaolu pärast ei ole soositud loomkatsete tegemisel GHS 5. kategooria (2000–5000 mg/kg) annus ja seda tuleks kasutada üksnes siis, kui on eriti tõenäoline, et sellise katse tulemustel on otsene tähtsus inimeste ja loomade tervise või keskkonna kaitsmiseks. Juhul kui loom, kelle peal katsetati madalaimat kindla annuse määra (5 mg/kg), eelkatse käigus sureb, on tavapäraseks toiminguks uuringu peatamine ja aine klassifitseerimine GHS 1. kategooriasse (nagu on näidatud 1. lisas). Kui on siiski nõutav klassifitseerimise täiendav kinnitamine, võib teha järgmise valikulise lisaprotseduuri. Teisele loomale manustatakse annus 5 mg/kg. Kui teine loom sureb, siis kinnitab see GHS 1. kategooriat ja katse lõpetatakse kohe. Kui teine loom jääb ellu, siis manustatakse maksimaalselt kolmele täiendavale loomale annus 5 mg/kg. Kuna suremuse risk on suur, tuleb ainet manustada kõnealustele loomadele ükshaaval, et tagada nende heaolu. Ajavahemik igale loomale annuse manustamise vahel peab olema piisav selleks, et eelmine loom jääks tõenäoliselt ellu. Kui teine loom sureb, lõpetatakse viivitamata annustamine ja rohkematele loomadele doose ei manustata. Kuna teise surma juhtum (olenemata uuritud loomade arvust katse lõpetamise hetkel) kuulub tulemuse kategooriasse A (kaks või enam surma), järgitakse 5 mg/kg fikseeritud annuse puhul 2. lisas toodud klassifitseerimisreeglit (1. kategooria, kui on kaks või enam surmajuhtumit, või 2. kategooria, kui on vaid üks surmajuhtum). Lisaks sellele antakse 4. lisas juhiseid EL süsteemi kohase klassifitseerimise kohta enne uue GHSi kasutuselevõttu.

1.5.3. Põhiuuring

1.5.3.

1.5.3.1. Loomade arv ja annusemäärad Lähteannuse tasemel katsete tegemise järel võetavad meetmed on esitatud 2. lisas toodud vooskeemides. Üks kolmest meetmest on nõutav; kas katse peatamine või sobiva ohuklassi määramine, katse sooritamine suurema kindla annusega või väiksema kindla annusega. Loomade kaitsmiseks ei kasutata põhiuuringus uuesti eelkatses surma põhjustanud annusemäära (vt 2. lisa). Kogemused on näidanud, et kõige tõenäolisem tulemus läheannuse tasemel on see, et ainet on võimalik klassifitseerida ja täiendavaid katseid ei ole vaja teha. Igal uuritava annusemäära korral kasutatakse tavaliselt kokku viit ühest soost looma. Nende viie looma hulka kuulub üks loom eelkatsest, kellele manustati valitud annusemäärale vastav annus, ja veel neli looma (v.a harvaesineval juhul, kui põhiuuringus kasutatav annusemäär ei sisaldunud eelkatses). Annustamistevaheline ajavahemik iga annusemäära korral määratakse kindlaks mürgisuse tunnuste ilmnemise, kestuse ja ägeduse järgi. Järgmise annuse manustamist tuleb edasi lükata, kuni juba doosi saanud loomade ellujäämine on kindel. Vajaduse korral soovitatakse annustamistevaheliseks ajaks jätta iga annusemäära puhul 3 või 4 päeva, et võimaldada jälgida viivitunud mürgisust. Ajavahemikku võib vajaduse korral korrigeerida, nt ebaselge vastuse puhul. Kui kasutatakse kõrgeimat kindlat annust 5000 mg/kg, tuleks järgida 3. lisas esitatud protseduuri (vt ka punkti 1.6.2).

1.5.3.2. Piirsisalduskatse Piirkatset kasutatakse peamiselt olukordades, kus katse tegijal on teavet selle kohta, et katsematerjal ei ole tõenäoliselt mürgine, s.t selle mürgisus ületab üksnes normatiivseid piirannuseid. Teavet katsematerjali mürgisuse kohta võib saada samalaadseid uuritud ühendeid või segusid või tooteid käsitlevatest teadmistest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisosade olemust ja protsendimäära. Sellistel juhtudel, kui on vähe teavet mürgisuse kohta või see puudub üldse või mil katsematerjal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse. Käesoleva juhise kohase piirkatsena võidakse tavalist protseduuri kasutades kasutada eelkatset, mille lähteannus on 2000 mg/kg (või erandkorras 5000 mg/kg), mille järel manustatakse veel neljale loomale sama annus.

1.6. VAATLUSED Loomi jälgitakse individuaalselt pärast annustamist vähemalt esimese 30 minuti jooksul, perioodiliselt esimese 24 tunni jooksul, erilist tähelepanu pööratakse esimese 4 tunni jooksul ja seejärel iga päev, kokku 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui loomad tuleb kõrvaldada uuringust ja surmata humaanselt nende heaolu pärast või kui loomad leitakse surnuna. Vaatluse kestust ei tuleks siiski jäigalt määratleda. See tuleks kindlaks määrata toksiliste reaktsioonide, nende algushetke ja taastusperioodi pikkuse põhjal ja seda võib seega vajaduse korral pikendada. Mürgisuse nähtude ilmumise ja kadumise aeg on tähtis, eriti siis, kui on tendents, et mürgisusnähud võivad ilmneda hilistumisega (11). Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed. Täiendavad vaatlused on vajalikud siis, kui loomadel on jätkuvalt mürgisuse tunnused. Vaatlused peaksid hõlmama muutusi nahal ja karvkattes, silmades ja limaskestades ning samuti muutusi hingamissüsteemis, vereringes, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses tegevuses ja käitumises. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma jälgimisele. Arvesse tuleks võtta humaansete lõpetamiskriteeriumide juhisdokumendis esitatud põhimõtteid ja kriteeriume (8). Suremas olevad loomad või loomad, kellel on tugev valu või tugeva kannatuse kestvad tunnused, tuleks surmata humaanselt. Kui loomad surmatakse humaansel viisil või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.

1.6.

1.6.1. Kehamass Iga looma mass tuleks määrata kindlaks veidi enne katseaine manustamist ja seejärel vähemalt kord nädalas. Massi muutused tuleks arvutada ja protokollida. Katse lõpus ellujäänud loomad kaalutakse ja siis surmatakse humaanselt.

1.6.2. Patoloogia Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse. Kõik üldpatoloogilised muutused tuleks iga looma puhul protokollida. Esialgse annustamise järel 24 või enam tundi elus püsinud loomade üldpatoloogiliste muutustega organeid võidakse samuti uurida mikroskoopiliselt, kuna see võib anda kasulikku teavet.

2. ANDMED Tulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleb kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates ära iga katserühma puhul osalevate loomade arvu, mürgisusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahangul tehtud leiud.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne peab sisaldama vastavalt vajadusele järgmist teavet.

Katseaine:

füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerumine);

identifitseerimiseks vajalikud andmed, kaasa arvatud CASi number.

Kandeaine (vajaduse korral):

kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.

Katseloomad:

kasutatud liigid/tüved;

loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada;

loomade arv, vanus ja sugu (sh vajaduse korral põhjendus isasloomade kasutamise kohta emasloomade asemel);

päritolu, pidamistingimused, toitumine jne.

Katsetingimused:

katseaine valmistamise üksikasjalikud andmed, sh üksikasjalikud andmed manustatava aine füüsilise oleku kohta;

katseaine manustamise üksikasjad, sh annuste mahud ja annustamise aeg;

üksikasjalikud andmed toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas);

põhjendus lähteannuse valikuks.

Tulemused:

tabelid iga looma (st loomad, kellel on mürgistustunnused, kaasa arvatud suremus, mõjude laad, ägedus ja kestus) reageerimise andmete ja annusemäärade kohta;

tabelid kehamassi ja kehamassi muutuste kohta;

iga looma mass annustamispäeval, seejärel nädalaste intervallidega ja surma- või surmamishetkel;

surma kuupäev ja kellaaeg juhul, kui loom sureb enne kavandatud surmamist;

iga looma korral mürgistusnähtude algusaeg ja nende võimalik taandumine;

iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.

Tulemuste arutelu ja tõlgendamine.

Järeldused.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)

VIITED British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85–92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279–291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Felling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469–482. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313–324. Stallard, N. and Whitehead, A. (199 5). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Pariis OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.Org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P, Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, JA. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231. Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

B.1b. ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – ÄGEDA MÜRGISUSASTME MEETOD

B.1b.

1. MEETOD See katsemeetod on samaväärne OECD TG 423ga (2001).

1.

1.1. SISSEJUHATUS Käesolevas katses sätestatud ägeda mürgisusastme meetod (1) on astmeline meetod, mille igal etapil kasutatakse kolme samast soost looma. Olenevalt loomade suremusest ja/või sellest, kas loomad on suremas, on katseaine ägeda mürgisuse hindamiseks vaja keskmiselt 2–4 etappi. Käesolev protseduur on korratav, selles kasutatakse väga vähe loomi. Selle abil võidakse järjestada ained nii nagu muude ägeda mürgisuse katsemeetodite puhul. Ägeda mürgisusastme meetod põhineb biomeetrilistel hindamistel (2, 3, 4, 5), kus kasutatakse kindlaid annuseid, mis on üksteisest piisavalt eraldatud aine klassifitseerimise eesmärgil ja ohu hindamiseks. 1996. aastal vastuvõetud meetodit valideeriti ulatuslikult in vivo, võrreldes kirjandusest saadud LD50 väärtusi käsitlevaid andmeid nii riiklikul (6) kui ka rahvusvahelisel tasandil (7). Juhised antud eesmärgi saavutamiseks kõige sobivama katsemeetodi valimiseks võib leida ägeda suukaudse mürgisuse katseid käsitlevast (8) juhisdokumendist. Nimetatud juhisdokument sisaldab samuti lisateavet B.1b katsemeetodi rakendamise ja tõlgendamise kohta. Katseaineid ei ole vaja manustada annustes, mis teadaolevalt põhjustavad märkimisväärset valu ja kannatusi sööbiva või tugeva ärritava toime tõttu. Suremas olevad loomad ja loomad, kes kannatavad ilmselgelt valu või kellel ilmnevad tõsiste või kestvate kannatuste tunnused, tuleks surmata humaanselt; need loomad võetakse arvesse katsetulemuste tõlgendamisel samamoodi nagu katse käigus surnud loomi. Eraldi juhisdokumendis (9) on esitatud kriteeriumid, mille alusel tehakse otsus suremas olevate või tõsiselt kannatavate loomade surmamise kohta, ning juhised prognoositava või ähvardava surma äratundmiseks. Meetod kasutab kindlaks määratud annuseid ja tulemused võimaldavad aineid järjestada ja klassifitseerida vastavalt ägedat mürgisust põhjustavate kemikaalide klassifitseerimist käsitlevale globaalselt harmoneeritud süsteemile (10). Põhimõtteliselt ei ole meetod ette nähtud võimaldama arvutada täpset LD50 annust, kuid võimaldab kindlaks määrata määratletud kokkupuutevahemikku, kus suremus on eeldatav, kuna käesoleva katse põhipunkt on endiselt see, et osa loomi sureb. Meetod võimaldab kindlaks määrata LD50 väärtuse üksnes siis, kui vähemalt kaks annust põhjustavad suremuse, mis on 0 %st suurem ja 100 %st väiksem. Tänu kindlaksmääratud annuste valikule sõltumata katseainest, ja klassifitseerimise selgelt väljendatud seosele erinevas seisundis täheldatud loomade arvuga on laborite aruanded järjepidevamad ja korratavamad. Katselaboratoorium võtab arvesse kogu katseaine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab aine nimetust ja keemilist struktuuri, selle füüsikalis-keemilisi omadusi, muude ainetega in vitro või in vivo tehtud mürgisuskatsete tulemusi, struktuurilt sarnaste ainete toksikoloogilisi andmeid ja aine eeldatavat otstarvet. Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmiseks, et katse on tähtis inimeste tervise kaitsmiseks ja aitab valida sobivat lähteannust.

1.2. MÕISTED Äge suukaudne mürgisus – viitab sellistele kahjulikele mõjudele, mis ilmnevad pärast aine suukaudselt manustamist ühekordse annuse või seeriaviisiliste annustena 24 tunni jooksul. Edasilükkunud surm – loom ei sure ega näi olevat suremas 48 tunni jooksul, kuid sureb hiljem, 14päevase jälgimisperioodi jooksul. Annus – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg/kg). GHS – Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (keemiliste ainete ja segude globaalselt harmoneeritud klassifitseerimissüsteem). Ühistegevus, milles osalevad OECD (inimeste tervis ja keskkond), ohtlike ainete vedu käsitlev ÜRO eksperdikomitee (füüsikalis-keemilised omadused) ja ILO (ohtudest teavitamine) ning mida koordineerib kemikaalide mõistlikku haldamist käsitlev organisatsioonidevaheline programm (IOMC). Ähvardav surm – loom on suremas või sureb tõenäoliselt enne järgmist kavandatud jälgimisperioodi. Närilistel võiksid sellisele seisundile viitavateks märkideks olla krambid, külili magamine, loidus ja värin (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)). LD50(surmava suukaudse annuse mediaan) – aine statistiliselt määratletud ühekordne annus, mis tõenäoliselt põhjustab suukaudsel manustamisel surma 50 %l loomadest. LD50 väärtust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (mg/kg). Piirannus – vastab katses kasutatavale maksimaalsele annusele (2000 või 5000 mg/kg). Surmaeelne seisund – loomad, kes on suremas või kes ei suuda ellu jääda ravist hoolimata (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)). Ennustatav surm – selliste kliiniliste tunnuste olemasolu, mis viitavad sellele, et surm saabub teatud aja pärast enne katse kavandatavat lõppu; näiteks suutmatus tarbida vett või toitu (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).

1.3. KATSE PÕHIMÕTE Tuginedes protseduurile, mille kohaselt kasutatakse igal etapil minimaalset arvu loomi, on katse põhimõtteks saada aine klassifitseerimiseks piisavalt teavet katseaine ägeda mürgisuse kohta. Ainet manustatakse katseloomade rühmale suukaudselt ühe kindlaksmääratud doosina. Ainet katsetatakse etapiviisiliselt, igal etapil kasutatakse kolme ühest soost looma (tavaliselt emaslooma). Ühendiga seotud suremuse puudumine või esinemine loomadel, kellele ühel etapil annustati ainet, määrab kindlaks järgmise etapi, s.t: Katseprotseduuri üksikasju on kirjeldatud 1. lisas. Meetod võimaldab langetada otsuse seoses katseaine klassifitseerimisega ühte mürgisuse kategooriasse, mis on määratletud kindlaksmääratud LD50 piirväärtuse põhjal.

lisakatseid ei ole vaja;

aine sama annus manustatakse veel kolmele loomale;

ainet manustatakse vastavalt vahetult järgmisele või eelmisele annusemäärale veel kolmele loomale.

1.4. MEETODI KIRJELDUS

1.4.

1.4.1. Loomaliikide valik Eelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib kasutada ka näriliste teisi liike. Tavaliselt kasutatakse emasloomi (9). Selle põhjuseks on, et tavapäraseid LD50 katseid käsitlevad kirjandusülevaated näitavad, et sugupoolte tundlikkuses on vähe erinevusi, kuid neil juhtudel, kui on erinevusi täheldatud, on emasloomad üldiselt veidi tundlikumad (11). Kui struktuurselt sarnaste kemikaalide toksikoloogilisi või toksikokineetilisi omadusi käsitlevatest andmetest nähtub, et isasloomad on tõenäoliselt tundlikumad, siis kasutatakse neid. Kui katse tehakse isasloomadega, tuleks esitada piisav põhjendus. Kasutatakse noorte tervete täiskasvanud loomade enim kasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Iga loom peaks annustamise alustamisel olema 8–12 nädalat vana ning tema mass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % varem annuse saanud loomade keskmisest massist.

1.4.2. Loomade pidamise ja toitmise tingimused Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise aja, peaks seda hoidma vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Loomad võib grupeerida puuridesse annuse põhjal, kuid puuris olevate loomade arv ei tohiks takistada iga looma selget jälgimist.

1.4.3. Loomade ettevalmistamine Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise jaoks ning hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega.

1.4.4. Annuste valmistamine Üldiselt manustatakse katseaineid kasutatavate annuste vahemikus konstantses mahus nii, et muutub annustatava valmistise kontsentratsioon. Kui uuritakse vedelat lõppsaadust või segu, võib lahjendamata katseaine kasutamine, s.t konstantse kontsentratsiooni juures, olla siiski olulisem nimetatud aine hilisemal riskianalüüsil, ja see on mõnede reguleerivate asutuste nõue. Kummalgi juhul ei tohi ületada manustamisel annuste suurimat mahtu. Vedeliku suurim ühekordselt manustatav maht sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta: vesilahuste puhul võib siiski manustada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Annuse valmistise koostamiseks on soovitav võimaluse korral kasutada vesilahust/suspensiooni/emulsiooni, tähtsuse järjekorras oleks järjestus järgmine: lahus/suspensioon/emulsioon õlis (nt maisiõli) ja seejärel muudel kandeainetel põhinev lahus. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused olema teada. Annused tuleb valmistada ette natuke aega enne manustamist, välja arvatud juhul, kui valmistise stabiilsus sellel ajavahemikul, mil seda kasutatakse, on teada ja näib aktsepteeritav.

1.5. PROTSEDUUR

1.5.

1.5.1. Annuste manustamine Katseainet manustatakse ühekordse annusena söögitoru kaudu või sobiva intubeerimiskanüüli abil. Erandkorras, kui ühekordne annus ei ole võimalik, võib annust manustada väiksemates kogustes kuni 24 tunni jooksul. Loomad peaksid enne doosi manustamist paastuma (nt rotte hoitakse söömata terve öö ja hiiri 3–4 tundi, üksnes vesi on saadaval). Paastumise järel loomi kaalutakse ja manustatakse katseainet. Pärast aine manustamist võib hoida rotte söömata veel 3–4 tundi ja hiiri 1–2 tundi. Kui annust manustatakse osadena teatud ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest osutuda vajalikuks anda loomadele toitu ja vett.

1.5.2. Loomade arv ja annusemäärad Igal etapil kasutatakse kolme looma. Lähteannusena kasutatav annusemäär valitakse üks neljast kindlast suurusest – 5, 50, 300 ja 2000 mg/kehamassi kg. Lähteannuse määr peaks olema sellise väärtusega, mis kutsub suurima tõenäosusega esile suremust mõnede loomade hulgas, kellele ainet manustati. 1. lisas toodud vooskeemid kirjeldavad protseduure, mida tuleks järgida iga lähteannuse puhul. Lisaks sellele antakse 4. lisas juhiseid EL süsteemi kohase klassifitseerimise kohta enne uue GHSi kasutuselevõttu. Kui olemasolev teave kinnitab, et suremus on ebatõenäoline suurima algdoosi taseme juures (2000 mg/kg kehamassi kohta), tuleks teha piirkatse. Kui puudub teave uuritava aine kohta, soovitatakse loomade heaolu tagamiseks kasutada algdoosina 300 mg/kg kehamassi kohta. Katserühmadele annustamiste ajavahemik määratakse kindlaks mürgisustunnuste algushetke, kestuse ja raskuse abil. Järgmise annuse manustamist loomadele tuleb edasi lükata hetkeni, kuni juba annuse saanud loomade ellujäämine on kindel. Maksimaalset kindla annuse määra 5000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras ja ainult siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega (vt 2. lisa). Loomade heaolu pärast ei ole soositud loomkatsete tegemisel GHS 5. kategooria (2000 – 5000 mg/kg) annus ja seda tuleks kasutada üksnes siis, kui on eriti tõenäoline, et sellise katse tulemustel on otsene tähtsus inimeste ja loomade tervise või keskkonna kaitsmisel.

1.5.3. Piirkatse Piirkatset kasutatakse peamiselt olukordades, kus eksperimentaatoril on teavet selle kohta, et katsematerjal ei ole tõenäoliselt mürgine, s.t selle mürgisus ületab üksnes normatiivseid piirannuseid. Teavet katsematerjali mürgisuse kohta võib saada samalaadseid uuritud ühendeid, segusid või tooteid käsitlevatest teadmistest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisosade olemust ja protsendimäära. Sellistel juhtudel, kui on vähe teavet mürgisuse kohta või see puudub üldse või kui katsematerjal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse. Piirkatse võidakse teha ühel annusemääral (2000 mg/kg kehamassi kohta) kuue loomaga (kolm looma igal etapil). Erandkorras võib piirkatse teha ühel annusemääral (5000 mg/kg) kolme loomaga (vt 2. lisa). Kui esineb katseainega seotud suremust, võib sooritada lisakatseid astme võrra madalama annusemääraga.

1.6. VAATLUSED Loomi jälgitakse individuaalselt pärast annustamist vähemalt esimese 30 minuti jooksul, perioodiliselt esimese 24 tunni jooksul, erilist tähelepanu pööratakse esimese nelja tunni jooksul ja seejärel iga päev kokku 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui loomad tuleb kõrvaldada uuringust ja surmata humaanselt loomade heaolu pärast või kui nad leitakse surnuna. Vaatluse kestust ei tuleks siiski jäigalt määratleda. See tuleks kindlaks määrata toksiliste reaktsioonide, nende algushetke ja taastusperioodi pikkuse põhjal ja seda võib seepärast vajaduse korral pikendada. Mürgisuse nähtude ilmumise ja kadumise aeg on tähtis, eriti siis, kui on tendents, et mürgisusnähud võivad ilmneda hilistumisega (12). Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed. Lisavaatlused on vajalikud siis, kui loomadel on jätkuvalt mürgisuse tunnused. Vaatlused peaksid hõlmama muutusi nahal ja karvkattes, silmades ja limaskestades ning samuti muutusi hingamissüsteemis, vereringes, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses tegevuses ja käitumises. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma jälgimisele. Arvesse tuleks võtta humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9) esitatud põhimõtteid ja kriteeriume. Suremas olevad loomad või loomad, kellel on tugev valu või tugeva kannatuse kestvad tunnused, tuleks surmata humaanselt. Kui loomad surmatakse humaansel viisil või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.

1.6.

1.6.1. Kehamass Iga looma mass tuleks määrata kindlaks veidi enne katseaine manustamist ja seejärel vähemalt kord nädalas. Massi muutused tuleks arvutada ja protokollida. Katse lõpus ellu jäänud loomad kaalutakse ja siis surmatakse humaanselt.

2. ANDMED Andmed esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleb kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates ära iga katserühma puhul osalevate loomade arvu, mürgisusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahangul tehtud leiud.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne peab sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.

Katseaine:

füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerumine);

identifitseerimiseks vajalikud andmed, kaasa arvatud CASi number.

Kandeaine (vajaduse korral):

kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.

Katseloomad:

kasutatud liigid/tüved;

loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada;

loomade arv, vanus ja sugu (sh vajaduse korral põhjendus isasloomade kasutamise kohta emasloomade asemel);

päritolu, pidamistingimused, toitumine jne.

Katsetingimused:

katseaine valmistamise üksikasjad, sh üksikasjad manustatava aine füüsilise oleku kohta;

katseaine manustamise üksikasjad, sh annuste mahud ja annustamise aeg;

üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas);

põhjendus lähteannuse valikuks.

Tulemused:

tabelid iga looma (st loomad, kellel on mürgisustunnused, kaasa arvatud suremus, mõjude laad, ägedus ja kestus) reageerimise andmete ja annusemäärade kohta;

tabelid kehamassi ja kehamassi muutuste kohta;

iga looma mass annustamispäeval, seejärel nädalaste intervallidega ja surma- või surmamishetkel;

surma kuupäev ja kellaaeg juhul, kui loom sureb enne kavandatud surmamist;

iga looma korral mürgisusnähtude algusaeg ja nende võimalik taandumine;

iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.

Tulemuste arutlus ja tõlgendamine.

Järeldused.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)

VIITED Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610. Diener W., Mischke U, Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129–134. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R.L., Cotruvo, J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel K.A., Walker A.P., Chu I.; Goddard M., Segal L., Springer J.A. and Myers R.C. (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223–231. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

B.2. ÄGE MÜRGISUS (SISSEHINGAMISEL)

B.2.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Katse tegemiseks on kasulik teada aine osakeste suurusjaotust, aururõhku, sulamistemperatuuri, keemistemperatuuri, leekpunkti ja (vajadusel) plahvatusohtlikkust. Vt ka B osa üldist sissejuhatust (A).

1.2. MÕISTED Vt B osa üldist sissejuhatust (B).

1.3. VÕRDLUSAINED Puuduvad.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Mitu katseloomade rühma viiakse kindlaks ajaks kokkupuutesse testaine astmeliste kontsentratsioonidega nii, et üks rühm puutub kokku ühesuguse kontsentratsiooniga. Seejärel jälgitakse mõju ja surmajuhtumite esinemist. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad. Tõsistele ja kestvatele kannatustele ja valule viitavate märkidega loomad võib vaja olla humaanselt surmata. Testainet pole vaja annustada moel, mis teadaolevalt tekitab märgatavat söövitavatest või ärritavatest omadustest tingitud valu ja kannatusi.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Puuduvad.

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Ettevalmistused Loomi hoitakse enne katset vähemalt viis päeva katsele vastavatel pidamis- ja söötmistingimustel. Noored terved katseloomad randomiseeritakse enne katset ja jagatakse vajalikku arvu katserühmadesse. Kokkupuute simulatsiooni pole vaja kasutada, kui katseseadme iseloom seda ei eelda. Tahked testained võivad vajaliku osakeste suuruse saavutamiseks vajada mikropeenestamist. Sobiva kontsentratsiooni saavutamiseks atmosfääris võib testainele lisada vajaduse korral sobivat kandjat; sellisel juhul tuleb kasutada kandja kontrollrühma. Kui annustamise lihtsustamiseks kasutatakse kandjat või muid lisandeid, peab olema kindel, et need ei põhjusta mürgistusnähte. Vajaduse korral võib kasutada varasemaid andmeid.

1.6.2. Katsetingimused

1.6.2.

1.6.2.1. Katseloomad Vastunäidustuste puudumisel on eelistatavaks liigiks rott. Kasutada tuleks tavapäraseid laboritöös kasutatavaid liine. Kasutatavate katseloomade masside erinevus katse alguses kummagi soo puhul eraldi ei tohiks ületada ± 20 % vastavast keskmisest.

1.6.2.2. Katseloomade arv ja sugu Iga uuritavat kontsentratsiooni katsetakse vähemalt 10 närilisel (viiel emas- ja viiel isasloomal). Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Märkus: ägeda mürgisuse katsetes närilistest kõrgemate loomadega tuleks kaaluda väiksema arvu loomade kasutamist. Annused tuleks valida hoolikalt ja vältida tuleks mõõdukalt mürgiste annuste ületamist. Testaine surmavate annuste manustamist tuleks sellistes katsetes vältida.

1.6.2.3. Kokkupuutekontsentratsioonid Erinevaid annusemäärasid peaks olema küllaldaselt, vähemalt kolm, ja nende vahed peaksid olema sellised, et saadakse erinevate mürgistusnähtude ja suremusega katserühmad. Andmeid peaks olema küllaldaselt kontsentratsiooni/reaktsioonikõvera koostamiseks ja võimalusel LC50 nõuetekohaseks määramiseks.

1.6.2.4. Piirsisalduskatse Kui viiest isas- ja viiest emasloomast koosneval rühmal ei esine neljatunnise kokkupuute järel gaasi või vedeliku või tahke aine aerosooliga kontsentratsioonil 5 mg/l (või kui see ei ole testaine füüsikaliste või keemiliste omaduste, sealhulgas plahvatusohtlikkuse tõttu võimalik, kõrgeimal võimalikul kontsentratsioonil) 14 päeva jooksul ilmnenud ühendiga seotud suremust, võib edasise kontrollimise lugeda tarbetuks.

1.6.2.5. Vaatlusperiood Kokkupuude peaks kestma neli tundi.

1.6.2.6. Seadmed Loomkatsetes tuleks kasutada hingamisseadet, mis suudab tagada dünaamilise õhuvoo vähemalt 12 täieliku õhuvahetusega tunnis ning tagab küllaldase hapnikusisalduse ja homogeense kokkupuutekeskkonna. Kambri kasutamisel peaks selle ehitus piirama katseloomade ühte kohta kogunemist ja tagama võimalikult hea inhalatoorse kokkupuute testainega. Stabiilse kambriatmosfääri tagamiseks ei tohiks katseloomade maht üldjuhul ületada 5 % kambri üldmahust. Kasutada võib väliseid hingamiselundeid, ainult pead või kogu keha haaravat individuaalset kambrit; esimesed kaks piiravad testaine sattumist organismi muid teid pidi.

1.6.2.7. Vaatlusperiood Vaatlusperioodi kestus peaks olema vähemalt 14 päeva. Vaatlemise kestust ei tohiks siiski jäigalt fikseerida. See peaks sõltuma mürgistusnähtudest, nende ilmnemise kiirusest ja paranemisperioodi pikkusest; seega võib seda vajaduse korral pikendada. Mürgistusnähtude ilmnemise ja kadumise ning surma aeg on väga olulised, eriti kui surm saabub sageli hiljem.

1.6.3. Katse käik Kõik loomad kaalutakse vahetult enne kokkupuudet ja viiakse seejärel vastavas seadmes pärast kambrikontsentratsiooni tasakaalustumist neljaks tunniks kokkupuutesse katsekontsentratsiooniga. Tasakaalustumisaeg peaks olema lühike. Katsetemperatuuri tuleks hoida 22 ± 3 oC juures. Ideaaljuhul tuleks suhteline õhuniiskus hoida 30 % ja 70 % vahel, kuid mõningatel juhtudel (nt katsetes mõnede aerosoolidega) ei saa seda rakendada. Väikese alarõhu (< 5 mm H2O) kasutamine kambris välistab testaine lekke ümbritsevasse keskkonda. Süüa ja juua kokkupuute ajal anda ei tohiks. Kasutada tuleks katseatmosfääri tekitamiseks ja jälgimiseks sobivaid seadmeid. Seade peaks võimalikult kiiresti saavutama stabiilsed kokkupuutetingimused. Kambri ehitus ja kasutamine peaksid tagama katseatmosfääri püsiva homogeense jaotuse kambris. Mõõta või kontrollida tuleb: Kokkupuute ajal ja järel loomi jälgitakse ja vaatlustulemused registreeritakse süstemaatiliselt, iga looma kohta tuleb pidada eraldi arvestust. Esimesel päeval tuleks loomi vaadelda tavapärasest sagedamini. Vähemalt kord tööpäevas tuleks teha põhjalik kliiniline uuring; muid vaatlusi tuleks teha iga päev, rakendades sobivaid abinõusid loomade kao piiramiseks uuringus, nt surnuna leitud loomad lahata või külmutada ja nõrgad või surevad loomad eraldada või surmata. Vaadelda tuleks muutusi nii nahas ja karvkattes, silmades ja limaskestades kui ka hingamis- ja vereringeelundkonnas, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses aktiivsuses ja käitumises. Erilist tähelepanu tuleks pöörata hingamise iseloomule, värinatele, krampidele, süljeeritusele, kõhulahtisusele, letargiale, unele ja koomale. Surmahetk tuleks registreerida võimalikult täpselt. Kõik loomad kaalutakse pärast kokkupuudet igal nädalal ja surmahetkel. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad, pöörates erilist tähelepanu muutustele ülemistes ja alumistes hingamisteedes. Registreerida tuleks kõik makropatoloogilised muutused. Vastaval näidustusel tuleks võtta koeproove histopatoloogilisteks uuringuteks.

1.6.3. a)

õhu voolukiirust (pidevalt);

testaine tegelikku kontsentratsiooni hingamistsoonis, seda vähemalt kolm korda kokkupuuteaja jooksul (mõnede keskkondade, nt kõrge kontsentratsiooniga aerosoolkeskkondade puhul võib vajalik olla sagedasem kontroll). Kokkupuute ajal ei tohiks kontsentratsioon keskmise suhtes kõikuda rohkem kui ± 15 %. Mõnede aerosoolide puhul ei ole nii täpne reguleerimine siiski võimalik, sellisel juhul on lubatav suurem kõikumisvahemik. Aerosoolide puhul tuleks piisavalt tihti kontrollida osakeste suurust (igas katserühmas vähemalt üks kord);

temperatuuri ja õhuniiskust, võimalusel pidevalt.

2. ANDMED Andmed tuleks esitada kokkuvõtlikus tabelis, mis iga katserühma puhul näitab katseloomade arvu selle katse algul, iga looma surma aega, muude mürgistusnähtudega loomade arvu, mürgistusnähtude kirjeldust ja lahkamistulemusi. Kõik loomad kaalutakse ja mass registreeritakse vahetult enne testaine manustamist, seejärel igal nädalal ning surmahetkel. Kui looma elulemus katses ületab ühe päeva, tuleks arvutada ja registreerida tema massimuutused. Ühendiga seotud kannatuste ja valu tõttu humaanselt surmatud loomad registreeritakse ühendiga seotud suremusena. Tunnustatud meetodi kohaselt võib määrata LC50. Andmetele hinnangu andmisel tuleks arvesse võtta kõigi kõrvalekallete, sealhulgas käitumuslike ja kliiniliste kõrvalekallete, makropatoloogiliste kahjustuste, kehamassi muutuste, suremuse ja mis tahes muude mürgistusnähtude mis tahes võimalikku sõltuvust kokkupuutest testainega ning nende esinemissagedust ja tõsidust.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid: Andmed kokkupuute kohta Andmed tuleks esitada koondtabelina koos vastavate keskmiste ja hajuvuse näitajatega (nt standardhälve) ning võimaluse korral peaksid andmed sisaldama järgmist:

liiki, liini, päritolu, keskkonnatingimusi, toidusedelit jne;

katsetingimusi: kokkupuuteseadme kirjeldust, sealhulgas selle ehitust, tüüpi, mõõtmeid, õhuallikat, aerosoolide tekitamise seadet, kliima reguleerimise meetodit ja katsekambri kasutamisel loomade katsekambris pidamise meetodit. Kirjeldada tuleks temperatuuri, õhuniiskuse, aerosooli kontsentratsiooni ja osakeste suurusjaotuse määramise vahendeid.

3.1. a)

õhu voolukiirust hingamisseadmes;

õhu temperatuuri ja niiskust;

nimikontsentratsioone (hingamisseadmesse viidud testaine summaarne kogus jagatuna õhu ruumalaga);

kandja kasutamisel viimase iseloomu;

tegelikke kontsentratsioone katse hingamistsoonis;

masskeskmist aerodünaamilist diameetrit (MMAD) ja geomeetrilist standardhälvet (GSD);

tasakaalustumise aega;

kokkupuute kestust:

tabelit reaktsiooni andmetega soo ja kokkupuute ulatuse järgi (st katse käigus surnud või surmatud loomade arvu, mürgistusnähtudega loomade arvu, kokkupuutes olnud loomade arvu);

surma aega, kui loom sureb kokkupuute ajal või pärast seda, loomade humaanse surmamise põhjusi ja seejuures rakendatud kriteeriume;

kõiki vaatlusandmeid;

vaatlusperioodi lõpul kummagi soo puhul määratud LC50 väärtust (koos märkega kasutatud arvutusmeetodi kohta);

leitud LD50 väärtuse 95 % usaldusvahemikku (kui seda on võimalik esitada);

annuse/suremuse kõverat ja selle tõusu (kui määramismeetod seda võimaldab);

lahkamistulemusi;

kõiki histopatoloogilisi leide;

tulemuste arutelu (erilist tähelepanu tuleks pöörata katse ajal tehtud humaanse surmamise võimalikule mõjule arvutatud LC50 väärtusele);

tulemuste tõlgendust.

3.2. HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE Vt B osa üldist sissejuhatust (D).

4. VIITED Vt B osa üldist sissejuhatust (E).

B.3. ÄGE MÜRGISUS (NAHAKAUDNE)

B.3.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Vt B osa üldist sissejuhatust (A).

1.2. MÕISTED Vt B osa üldist sissejuhatust (B).

1.3. VÕRDLUSAINED Puuduvad.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Testaine kantakse astmeliste annustena mitme rühma katseloomade nahale nii, et üks rühm saab ühesuguse annuse. Järgnevalt jälgitakse mõju ja surmajuhtumite esinemist. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad. Tõsistele ja kestvatele kannatustele ja valule viitavate märkidega loomad võib vaja olla humaanselt surmata. Testaineid pole vaja annustada moel, mis teadaolevalt tekitab märgatavat söövitavatest või ärritavatest omadustest tingitud valu ja kannatusi.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Puuduvad.

1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Ettevalmistused Loomi hoitakse enne katset vähemalt viis päeva katsepuurides katsele vastavatel pidamis- ja söötmistingimustel. Täiskasvanud noored terved katseloomad randomiseeritakse enne katset ja jagatakse katserühmadesse. Ligikaudu 24 tundi enne katset eemaldatakse pügamise või raseerimise teel katseloomade keha seljaosalt karvkate. Karvkatte pügamisel või raseerimisel tuleb vältida naha marrastamist, kuna see võib mõjutada naha läbilaskvust. Testaine nahale kandmiseks tuleb vabastada vähemalt 10 % kehapinnast. Tahkete, vajaduse korral peenestatud ainete puhul tuleks testainet nahaga hea kokkupuute saavutamiseks niisutada piisava koguse vee või sobiva kandjaga. Kandja kasutamisel tuleb arvestada selle mõjuga testaine nahaläbimisvõimele. Vedelaid testaineid kasutatakse üldjuhul lahjendamata kujul.

1.6.2. Katsetingimused

1.6.2.

1.6.2.1. Katseloomad Kasutada võib täiskasvanud rotte või küülikuid. Kasutada võib ka muid liike, kuid seda tuleb põhjendada. Kasutada tuleks tavapäraseid laboritöös kasutatavaid liine. Kasutatavate katseloomade masside erinevus katse alguses kummagi soo puhul eraldi ei tohiks ületada ± 20 % vastavast keskmisest.

1.6.2.2. Katseloomade arv ja sugu Iga annuse taseme kohta tuleb kasutada vähemalt viit katselooma. Nad peaksid olema samast soost. Emasloomade kasutamisel ei tohiks nad olla poeginud ega tiined. Kui on andmeid selle kohta, et ühe soo esindajad on märgatavalt tundlikumad, tuleks kasutada sellest soost loomi. Märkus: ägeda mürgisuse katsetes närilistest kõrgemate loomadega tuleks kaaluda väiksema arvu loomade kasutamist. Annused tuleks valida hoolikalt ja vältida tuleks mõõdukalt mürgiste annuste ületamist. Testaine surmavate annuste manustamist tuleks sellistes katsetes vältida.

1.6.2.3. Annused Erinevaid annusemäärasid peaks olema küllaldaselt, vähemalt kolm, ja nende vahed peaksid olema sellised, et saadakse erinevate mürgistusnähtude ja suremusega katserühmad. Annusemäärade valikul tuleks arvesse võtta mis tahes võimalikku ärritavat või söövitavat mõju. Andmeid peaks olema küllaldaselt annuse/reaktsioonikõvera koostamiseks ja võimalusel LD50 nõuetekohaseks määramiseks.

1.6.2.4. Piirsisalduskatse Eespool kirjeldatud meetodi kohaselt võib teha piirsisalduskatse viiest isas- ja viiest emasloomast koosnevas rühmas annusega vähemalt 2000 mg/kg kehakaalu kohta. Kui katses esineb ühendiga seotud suremust, võib kaaluda täiemahulise uuringu tegemist.

1.6.2.5. Vaatlusperiood Vaatlusperioodi kestus peaks olema vähemalt 14 päeva. Vaatlemise kestust ei tohiks siiski jäigalt fikseerida. See peaks sõltuma mürgistusnähtudest, nende ilmnemise kiirusest ja paranemisperioodi pikkusest; seega võib seda vajadusel pikendada. Mürgistusnähtude ilmnemise ja kadumise aeg, nende kestus ja surma aeg on väga olulised, eriti kui surm saabub sageli hiljem.

1.6.3. Katse käik Loomi tuleks puurides pidada ühekaupa. Testaine tuleks kanda ühtlaselt alale, mis moodustab ligikaudu 10 % kogu kehapinnast. Väga mürgiste ainete puhul võib katta väiksema osa kehapinnast, kuid võimalikult suur osa pinnast tuleks katta võimalikult õhukese ja ühtlase kihiga. Testainet tuleks 24tunnise kokkupuuteperioodi jooksul poorse marlisideme ja mitteärritava kleeplindi abil naha vastas hoida. Manustamiskoht tuleks veel lisaks sobival moel kinni katta, et hoida marlisidet ja testainet paigal ja vältida testaine allaneelamist katselooma poolt. Et vältida testaine allaneelamist, võib kasutada looma liikuvust piiravaid vahendeid, kuid looma täielikku fikseerimist ei soovitata. Kokkupuuteperioodi lõpus tuleks testaine jääk nahalt võimaluse korral veega või muu sobiva puhastusmeetodi abil eemaldada. Vaatlustulemused tuleks vaatluse käigus süstemaatiliselt registreerida. Iga looma kohta tuleb pidada eraldi arvestust. Esimesel päeval tuleks loomi vaadelda tavapärasest sagedamini. Vähemalt kord tööpäevas tuleks läbi viia põhjalik kliiniline uuring; muid vaatlusi tuleks teha iga päev, rakendades sobivaid abinõusid loomade kao piiramiseks uuringus, nt surnuna leitud loomad lahata või külmutada ja nõrgad või surevad loomad eraldada või surmata. Vaadelda tuleks muutusi nii karvkattes, testainega töödeldud nahas, silmades ja limaskestades kui ka hingamis- ja vereringeelundkonnas, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses aktiivsuses ja käitumises. Erilist tähelepanu tuleks pöörata värinatele, krampidele, süljeeritusele, kõhulahtisusele, letargiale, unele ja koomale. Surmahetk tuleb registreerida võimalikult täpselt. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad. Registreerida tuleks kõik makropatoloogilised muutused. Vastaval näidustusel tuleks võtta koeproove histopatoloogilisteks uuringuteks.

1.6.3. Mürgisuse hindamine teisel sool

Uuringute lõpetamisel ühest soost katseloomadega annustatakse vähemalt viiest vastassoost loomast koosnevale rühmale, et kontrollida, ega selle soo esindajad testaine suhtes märgatavalt tundlikumad pole. Üksikjuhtudel võib olla õigustatud väiksema arvu loomade kasutamine. Kui on küllalt andmeid selle kohta, et uuritavast soost loomad on märgatavalt tundlikumad, võib katsetest vastassoost loomadega loobuda.

2. ANDMED Andmed tuleks esitada kokkuvõtliku tabelina, mis iga katserühma puhul näitab katseloomade arvu selle katse algul, iga looma surma aega, muude mürgistusnähtudega loomade arvu, mürgistusnähtude kirjeldust ja lahkamistulemusi. Kõik loomad kaalutakse ja mass registreeritakse vahetult enne testaine manustamist, seejärel igal nädalal ning surmahetkel; kui looma elumus katses ületab ühe päeva, tuleks arvutada ja registreerida tema massimuutused. Ühendiga seotud kannatuste ja valu tõttu humaanselt surmatud loomad registreeritakse ühendiga seotud suremusena. Tunnustatud meetodi kohaselt määratakse LD50. Andmetele hinnangu andmisel tuleks arvesse võtta kõigi kõrvalekallete, sealhulgas käitumuslike ja kliiniliste kõrvalekallete, makropatoloogiliste kahjustuste, kehamassi muutuste, suremuse ja mis tahes muude mürgistusnähtude mis tahes võimalikku sõltuvust kokkupuutest testainega ning nende esinemissagedust ja tõsidust.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

liiki, liini, päritolu, keskkonnatingimusi, toidusedelit jne;

katsetingimusi (sealhulgas naha puhastamise meetodit ja sideme tüüpi: oklusiivside või tavaline side);

annuseid (kandja kasutamisel koos kandjaga ja kontsentratsioone);

katseloomade sugu;

tabelit reaktsiooni andmetega soo ja annuse määra järgi (st katse käigus surnud või surmatud loomade arvu, mürgistusnähtudega loomade arvu, kokkupuutes olnud loomade arvu);

surma aega, arvestatuna annuse saamise ajast loomade humaanse surmamise põhjusi ja seejuures rakendatud kriteeriume;

kõiki vaatlusandmeid;

täiemahulises uuringus kasutatud soo 14 päeva kestel määratud LD50 väärtust (märkega määramismeetodi kohta);

leitud LD50 väärtuse 95 % usaldusvahemikku (kui seda on võimalik esitada);

annuse/suremuse kõverat ja selle tõusu (kui määramismeetod seda võimaldab);

lahkamistulemusi;

kõiki histopatoloogilisi leide;

kõiki katsetulemusi teisest soost loomade puhul;

tulemuste analüüsi (erilist tähelepanu tuleks pöörata katse ajal tehtud viidud humaanse surmamise võimalikule mõjule arvutatud LD50 väärtusele);

tulemuste tõlgendust.

3.2. HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE Vt B osa üldist sissejuhatust (D).

4. VIITED Vt B osa üldist sissejuhatust (E).

B.4. ÄGE MÜRGISUS: NAHAÄRRITUS/-SÖÖVITUS

B.4.

1. MEETOD Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 404ga (2002).

1.

1.1. SISSEJUHATUS Käesoleva ajakohastatud meetodi ettevalmistamisel pööratakse erilist tähelepanu võimalikele parandustele seoses loomade heaoluga ja kogu olemasoleva katseainet käsitleva teabe hindamisele, et vältida mittevajalikke katseid laboriloomadega. Käesoleva meetodi hulka kuulub soovitus, et enne kirjeldatud, aine söövitavust ja ärritavust uuriva in vivo katse tegemist analüüsitaks olemasolevate asjaomaste andmete osakaalu. Kui saadaolevad andmed on ebapiisavad, saab neid täiendada järjestikuste katsete tegemise abil (1). Katsete tegemise strateegia, mis on esitatud käesoleva meetodi lisas, hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro katsete sooritamist. Lisaks sellele soovitatakse vastavalt olukorrale, et in vivo algkatses kohaldatakse looma suhtes kolme katselappi järjestikku, mitte korraga. Nii mõistlike teaduslike meetodite kui ka loomade heaolu huvides ei tehta in vivo katseid enne, kui on hinnatud kogu kättesaadava katseaine võimalikku naha söövitamist/ärritamist käsitleva teabe osakaalu. Sellisteks andmeteks on tõendid varasematest inimeste ja/või laboriloomadega tehtud uurimustest, tõendid ühe või mitme struktuuriliselt samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse ja ärrituse kohta, aine tugevale happesusele või leelisusele viitavad andmed (2, 3) ning valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete tulemused (4, 5, 5a). Käesolev analüüs peaks vähendama vajadust teha in vivo katseid selliste ainetega, mille nahasöövitavuse ja -ärritavuse kohta on muudest uurimustest juba piisavalt tõendeid saadud. Eelistatud järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete sooritamist söövitavuse ja ärritavuse kohta, on esitatud käesoleva meetodi lisas. Strateegia töötati välja OECD seminaril (6), millest osavõtjad seda ühehäälselt soovitasid, ja see kiideti heaks soovitusliku katsestrateegiana keemiliste ainete klassifitseerimist käsitlevas globaalselt harmoneeritud süsteemis (GHS) (7). Soovitatakse, et nimetatud katsestrateegiat kasutataks enne in vivo katsete tegemist. Uute ainete katsetamisel on soovitav etapiviisiline katsete tegemine teaduslikult usaldatavate andmete tootmiseks aine söövitavuse ja ärritatavuse kohta. Olemasolevate ainete puhul, mille nahasöövitavuse ja -ärritavuse kohta ei ole piisavalt andmeid, tuleks strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Kui otsustatakse kasutada muud katsetamisstrateegiat või menetlust või mitte kasutada etapiviisilist katsete tegemist, siis tuleks seda otsust põhjendada. Kui söövitavust või ärritavust ei saa kindlaks määrata järjestikuste katsete tegemise strateegia kohaselt osakaalu analüüsimise abil, tuleks kaaluda in vivo katset (vt lisa).

1.2. MÕISTED Nahaärritus – pöörduva nahakahjustuse tekkimine kuni neli tunni jooksul pärast katseaine manustamist. Nahasöövitus – pöördumatu nahakahjustuse, s.t nähtava marrasknahast pärisnahani ulatuva nekroosi tekkimine kuni nelja tunni jooksul pärast katseaine manustamist. Tüüpilised söövitusreaktsioonid on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14päevase jälgimisperioodi lõpus naha heledaks muutumise tõttu värvimuutus, täielik karvakadu ja armid. Küsitavate kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogiat.

1.3 KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Uuritavat ainet manustatakse ühekordse annusena katselooma nahale, katselooma töötlemata kehapinnad toimivad kontrollina. Ärritavuse/söövitavuse astet konstateeritakse ja märgitakse täpsustatud intervallid ning seda astet kirjeldatakse mõjude hindamise täiendamiseks. Uurimus kestab niikaua, et vaadeldud mõjude pöörduvust või pöördumatust saaks hinnata. Loomad, kellel on jätkuvalt tugeva stressi ja/või valu tunnused igal katseetapil, tuleks humaanselt tappa ja seda võetakse aine hindamisel arvesse. Suremas olevate ja tugevalt kannatavate loomade humaanse tapmise kriteeriumid on toodud viites 8.

1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.4.

1.4.1. In vivo katse ettevalmistamine

1.4.1.

1.4.1.1. Loomaliikide valik Eelistatud laboriloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori täiskasvanud küülikuid. Muude liikide kasutamist tuleks põhjendada.

1.4.1.2. Loomade ettevalmistamine Ligikaudu 24 tunni jooksul enne katset lõigatakse loomade seljaosa karvad lühikeseks. Tuleks vältida naha marrastamist ning kasutama peaks üksnes terveid, terve nahaga loomi. Mõnedel küüliku liinidel esineb tihedaid karvalaike, mis on silmatorkavamad teatavatel aastaaegadel. Selliseid tiheda karvastikuga kehapindasid ei tohiks kasutada katsetamise kohana.

1.4.1.3. Loomade pidamise ja toitmise tingimused Loomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur küülikutel peaks olema 20 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, peaks seda hoidma vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.

1.4.2. Katsemenetlus

1.4.2.

1.4.2.1. Katseaine manustamine Katseainet tuleks panna väikesele nahapinnale (ligikaudu 6 cm2) ja see kaetakse marlilapiga, mis kinnitatakse nahka mitteärritava teibiga. Kui ainet ei ole võimalik otse peale kanda (nt vedelikud või mõned pastad), kantakse katseaine esmalt marlilapile, mis seejärel asetatakse nahale. Lappi hoitakse õrnalt vastu nahka sobiva, pooltihke sideme abil kogu mõjuaja. Kui katseaine kantakse lapile, tuleks see lapp kinnitada nahale selliselt, et aine puutuks nahaga hästi kokku ja leviks nahal ühtlaselt. Tuleks tõkestada looma ligipääsu lapile ja katseaine allaneelamist või sissehingamist. Vedalaid katseaineid kasutatakse üldiselt lahjendamata kujul. Tehes katseid tahkete ainetega (mida võib vajaduse korral pulbristada), tuleks katseainet niisutada väikese koguse veega (või vajaduse korral muu sobiva kandeainega), et tagada hea kokkupuude nahaga. Kui kasutatakse muid kandeaineid kui vesi, on kandeaine võimalik mõju katseaine põhjustatud nahaärritusele minimaalne või olematu. Mõjuaja lõpus, mis kestab tavaliselt neli tundi, allesjäänud katseaine eemaldatakse võimaluse korral vee või sobiva lahustiga, muutmata marrasknaha olemasolevat reaktsiooni või puutumatust.

1.4.2.2. Annusmäär Uuritavale pinnale kantakse 0,5 ml vedelat või 0,5 g tahket ainet või pastat.

1.4.2.3. Algkatse (ühe loomaga in vivo nahaärrituvus-/-söövitavuskatse) On eriti soovitav, et algselt tehtaks in vivo katse ühe loomaga, eriti juhul, kui aine võib tõenäoliselt olla söövitav. See on kooskõlas järjestikuste katsete tegemise strateegiaga (vt 1. lisa). Kui osakaalu analüüsi põhjal on tõendatud, et aine on söövitav, ei ole vaja loomadega katseid jätkata. Enamiku võimalike söövitavate ainete puhul ei ole tavaliselt täiendava in vivo katse tegemine vajalik. Juhul, kui lisateavet peetakse vajalikuks puudulike tõendite tõttu, võidakse sooritada piiratud loomkatse, kasutades järgmist lähenemist: Loomale pannakse üksteise järel kuni kolm katselappi. Esimene lapp eemaldatakse kolme minuti pärast. Kui ei täheldata tõsist nahareaktsiooni, asetatakse teine lapp ja eemaldatakse tunni aja pärast. Kui vaatlus antud etapil viitab sellele, et mõjutamist võib humaanselt pikendada nelja tunnini, pannakse peale kolmas lapp ja see eemaldatakse nelja tunni pärast, misjärel reaktsiooni hinnatakse. Kui sööbiv mõju on vaadeldav pärast ükskõik millist kolmest järjestikusest mõjutamisest, lõpetatakse katse kohe. Kui sööbiv mõju ei ole vaadeldav pärast viimase lapi eemaldamist, jälgitakse looma 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui söövitus ei teki varem. Kui katseaine ei tekita söövitust, kuid võib olla ärritav, asetatakse üks lapp ühele loomale neljaks tunniks.

1.4.2.4. Kinnitav katse (in vivo nahaärritust käsitlev katse täiendavate loomadega) Kui söövitavat toimet ei ole algkatses jälgitud, tuleks ärritavat või negatiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil neljatunnisel mõjuperioodil. Kui algkatses on jälgitud ärritavat mõju, tuleks seejärel sooritada kinnitav katse või mõjutada kahte muud looma korraga. Erandkorras, kui algkatset ei ole tehtud, võib kahele või kolmele loomale asetada ühe lapi, mis eemaldatakse nelja tunni pärast. Kui kasutatakse kahte looma, ei ole vaja lisakatset teha, kui mõlematel esineb sama reaktsioon. Muul juhul tehakse katse ka kolmanda loomaga. Ebaselgeid reaktsioone on vaja hinnata, tehes katseid muude loomadega.

1.4.2.5. Jälgimisperiood Jälgitakse seni, kuni on võimalik täielikult hinnata vaadeldud mõjude pöörduvust. Katse tuleks lõpetada igal juhul siis, kui loomal on jätkuvalt tugeva valu või stressi tunnused. Mõjude pöörduvuse kindlaksmääramiseks tuleks jälgida loomi kuni 14 päeva pärast lapi eemaldamist. Kui pöörduvus ilmneb enne 14 päeva möödumist, tuleks katse lõpetada sel ajal.

1.4.2.6. Kliinilised vaatlused ja naha reaktsioonide hindamine Kõikidel loomadel uuritakse nahapunetuse ja turse nähte, reaktsioone hinnatakse 60 minuti pärast, seejärel 24, 48 ja 72 tundi pärast lapi eemaldamist. Ühe loomaga algkatses uuritakse uuritavat pinda samuti vahetult pärast lapi eemaldamist. Nahareaktsioone hinnatakse ja registreeritakse vastavalt allpool tabelis toodud hinnetele. Kui nahal on kahjustus, mida ei suudeta tuvastada ärrituse või söövitusena 72 tunni jooksul, võib olla vajalik jälgida kuni 14. päevani, et kindlaks määrata mõjude pöörduvus. Lisaks ärrituse jälgimisele tuleks täielikult kirjeldada ja registreerida kõik sellised paiksed toksilised mõjud nagu naha rasva lahustumine ja mis tahes organismi kahjulikud mõjud (nt mõjud mürgisuse kliinilistele tunnustele ja kehakaalule). Ebaselgete reaktsioonide selgitamiseks tuleks teha histopatoloogiline uurimine. Naha reaktsioonide hindamine on tingimata subjektiivne. Naha reaktsiooni hindamise ühtlustamiseks ning katselaboratooriumide ning jälgivate või tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatlusi tegevatel isikutel piisavalt tundma õppida kasutatavat hindamissüsteemi (vt tabelit allpool). Illustreeritud juhis nahaärrituse või muude kahjustuste hindamiseks võib olla abiks (9).

2. ANDMED

2.

2.1. TULEMUSTE ESITAMINE Uurimuse tulemused esitatakse tabeli kujul lõplikus katsearuandes ja peaks hõlmama kõiki punktis 3.1 nimetatud asju.

2.2. TULEMUSTE HINDAMINE Nahaärrituse määramisi tuleks hinnata vastavalt kahjustuse laadile ja raskusele ning nende pöörduvusele või pöördumatusele. Üksikud määramised ei esinda aine ärritavate omaduste absoluutset taset, kuna samuti hinnatakse katseaine muid mõjusid. Selle asemel tuleks vaadelda kontrollväärtustena üksikuid määramisi, mis vajavad hindamist koos kõikide muude uurimuses tehtud vaatlustega. Nahakahjustuste pöörduvust tuleb võtta arvesse ärritusreaktsioonide hindamisel. Kui sellised reaktsioonid nagu alopeetsia (piiratud pinnal), liigsarvestus, hüperplaasia ja kestendus jätkuvad 14päevase jälgimisperioodi lõpus, tuleks käsitada katseainet naha ärritajana.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne peab hõlmama järgmist teavet.

Põhjendus in vivo katse tegemiseks: olemasolevate katseandmete, sh järjestikuste katsete tegemise strateegia põhjal saadud tulemuste osakaalu analüüs:

varasematest katsetest saadud asjaomaste andmete kirjeldus;

katsestrateegia igal etapil saadud andmed;

in vitro katsete kirjeldus, sh menetluste üksikasjad, katse-/võrdlusainetest saadud tulemused;

osakaalu analüüs in vivo uurimuse sooritamiseks.

Katseaine:

tunnusandmed (nt CASi number, algupära, puhtus, tuntud lisandid, partii number);

füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, lenduvus, lahustuvus, stabiilsus);

kui tegu on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsendimäärad.

Kandeaine:

nimetus, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus;

kandeaine valiku põhjendamine.

Katseloomad:

kasutatud liigid/liin, põhjendus muude loomade kui albiinoküülikute kasutamiseks;

igast soost loomade arv;

üksikute loomade kaalud katse alguses ja lõpus;

vanus katse alguses;

päritolu, elamistingimused, toitumine jne.

Katsetingimused:

lapi asetuskoha ettevalmistamine;

üksikandmed lapi materjali kohta ning asetustehnika;

katseaine ettevalmistust, pealekandmist ja eemaldamist käsitlevad üksikasjad.

Tulemused:

iga looma ärritus-/söövitusreaktsioonide määramised igal mõõtmiskorral tabeli kujul;

kõikide täheldatud kahjustuste kirjeldused;

täheldatud ärrituse või söövituse laadi ja astme jutustav kirjeldus ja võimalikud histopatoloogilised leiud;

muude kahjulike paiksete (nt naha rasva lahustumine) ning nahaärritusele ja -söövitusele lisaks kogu organismile suunatud mõjude kirjeldus.

Tulemuste arutelu.

4.1)2)3)4)5)5a)6)7)8)9)

VIITED Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L, Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709–720. ECETOC (1990) Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K, Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524. Testing Method B.40 Skin Corrosion. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. (Saadaval taotluse korral OECD sekretariaadist).

Tabel 1 Nahapunetuse ja kooriku tekkimine Turse tekkimine NAHA REAKTSIOONIDE MÄÄRAMINE

Nahapunetust ei esine … 0 Väga kerge nahapunetus (vaevumärgatav) … 1 Selgesti nähtav nahapunetus … 2 Mõõdukas kuni tõsine nahapunetus… 3 Tõsine nahapunetus (tugev punetus) – kooriku tekkimine, mis takistab nahapunetusele punktide andmist… 4 Suurim võimalik punktide arv: 4 Turset ei esine … 0 Väga kerge turse (vaevumärgatav) … 1 Kerge turse (nahapinna servad on kindlalt üleval)… 2 Mõõdukas turse (ligikaudu 1 mm üleval)… 3 Tugev turse (enam kui 1 mm üleval ja levinud ainega mõjutatud alast kaugemale) … 4 Suurim võimalik punktide arv: 4 Ebaselgete reaktsioonide selgitamiseks tuleks teha histopatoloogiline uuring.

B.5. ÄGE MÜRGISUS: SILMADE ÄRRITUS/SÖÖVITUS

B.5.

1. MEETOD Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 405ga (2002).

1.

1.1. SISSEJUHATUS Käesoleva ajakohastatud meetodi ettevalmistamisel pööratakse erilist tähelepanu võimalikele parandustele seoses loomade heaoluga ja kogu olemasoleva katseainet käsitleva teabe hindamisele, et vältida mittevajalikke katseid laboriloomadega. Käesoleva meetodi hulka kuulub soovitus, et enne kirjeldatud, silmade ägedat söövitust ja ärritust uuriva in vivo katse tegemist analüüsitaks olemasolevate asjaomaste andmete osakaalu (1). Kui saadaolevad andmed on puudulikud, saab neid täiendada järjestikuste katsete tegemise abil (2, 3). Katsete tegemise strateegia, mis on esitatud käesoleva meetodi lisas, hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro katsete sooritamist. Lisaks sellele on soovitav enne in vivo silmade katse tegemist teha silmade söövituse ennustamiseks in vivo nahaärrituse ja -söövituse katse. Nii mõistlike teaduslike meetodite kui ka loomade heaolu huvides ei tehta in vivo katseid enne, kui on hinnatud kogu kättesaadava, katseaine võimalikku silmade söövitamist/ärritamist käsitleva teabe osakaalu. Sellisteks andmeteks on tõendid varasematest inimeste ja/või laboriloomadega tehtud uuringutest, tõendid ühe või mitme struktuuriliselt samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse ja ärrituse kohta, aine tugevale happesusele või leelisusele viitavad andmed (4, 5) ning valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo silmade söövitust ja ärritust uurivate katsete tulemused (6, 6a). Katsed võib teha enne osakaalu analüüsi või selle tulemusena. Teatavate ainete puhul võib selline analüüs viidata vajadusele teha in vivo katseid aine võimaliku silmade söövitavuse ja ärrituvuse väljaselgitamiseks. Kõikidel sellistel juhtudel on soovitav esmalt enne in vivo silmade katse tegemist teha katse in vivo aine nahakaudsete mõjude väljaselgitamiseks ja hinnata tulemusi vastavalt katsemeetodile B.4 (7). Osakaalu analüüsi tegemine ja järjestikuste katsete tegemise strateegia vähendaksid vajadust in vivo aine võimalikku silmade söövitavust/ärritavust uuriva katse tegemise järele, mille kohta on muudest katsetest saadud juba piisavalt tõendeid. Kui silmade söövitavust või ärritavust ei suudeta kindlaks määrata järjestikuste katsete tegemise strateegiat kasutades isegi pärast in vivo nahasöövitust ja -ärritust uuriva katse tegemist, võib teha in vivo silmade söövitust/ärritust uuriva katse. Eelistatud järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete sooritamist söövitavuse ja ärritavuse kohta, on esitatud käesoleva meetodi lisas. Strateegia töötati välja OECD seminaril (8), kus osalenud seda ühehäälselt soovitasid, ja see kiideti heaks soovitusliku katsete tegemise strateegiana keemiliste ainete klassifitseerimist käsitlevas globaalselt ühtlustatud süsteemis (GHS) (9). Soovitatakse, et nimetatud katsestrateegiat kasutataks enne in vivo katsete tegemist. Uute ainete katsetamisel on soovitav etapiviisiline katsete tegemine teaduslikult usaldatavate andmete tootmiseks aine söövitavuse ja ärritatavuse kohta. Olemasolevate ainete puhul, mille naha ja silmade söövitavuse ja -ärritavuse kohta ei ole piisavalt andmeid, tuleks strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Kui otsustatakse kasutada muud katsete tegemise strateegiat või menetlust või mitte kasutada etapiviisilist katsete tegemist, siis tuleks seda otsust põhjendada.

1.2. MÕISTED Silmade ärritus – selliste muutuste tekkimine silmas pärast seda, kui katseainet on manustatud silma eespinnale, mis täielikult pöörduvad 21 päeva jooksul pärast manustamist. Silmade söövitus – koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsiline nägemislangus pärast seda, kui katseainet on manustatud silma eespinnale, mis on täielikult pöördumatud 21 päeva jooksul pärast aine manustamist.

1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Uuritavat ainet manustatakse ühekordse annusena katselooma ühte silma, katselooma töötlemata silm toimib kontrollina. Silmade ärrituse/söövituse astet hinnatakse sidekesta, sarvkesta ja vikerkesta kahjustustele punkte andes teatavate intervallide tagant. Muid mõjusid silmas ja kahjulikke süsteemseid mõjusid kirjeldatakse samuti selleks, et hinnata täielikult mõjusid. Katse kestab niikaua, et vaadeldud mõjude pöörduvust või pöördumatust saaks hinnata. Loomad, kellel on jätkuvalt tugeva stressi ja/või valu tunnused igal katseetapil, tuleks humaanselt tappa ja seda võetakse aine hindamisel arvesse. Suremas olevate ja tugevalt kannatavate loomade humaanse tapmise kriteeriumid on toodud viites (10).

1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.4.

1.4.1. In vivo katse ettevalmistamine

1.4.1.

1.4.1.1 Loomaliikide valik Eelistatud laboriloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori täiskasvanud küülikuid. Muude liikide või liinide kasutamist tuleks põhjendada.

1.4.1.2. Loomade ettevalmistamine Kummagi katsesse valitud looma mõlemat silma uuritakse 24 tunni jooksul enne katse algust. Ei tohiks kasutada loomi, kellel esineb silmade ärritust, silmadefekte või varasemaid sarvkestakahjustusi.

1.4.1.3. Loomade pidamise ja toitmise tingimused Loomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur küülikutel peaks olema 20 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, siis eesmärk on hoida see vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust.. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.

1.4.2. Katsemenetlus

1.4.2.

1.4.2.1. Katseaine manustamine Katseainet manustatakse iga looma ühe silma sidekestakotti, tõmmates alumist laugu õrnalt silmamunast eemale. Seejärel pigistatakse laud umbes üheks sekundiks õrnalt kinni, et vältida aine silmast väljavalgumist. Teine silm, mida ei töödelda, toimib kontrollina.

1.4.2.2. Loputamine Katseloomade silmi ei tohiks pesta vähemalt 24 tundi pärast katseaine manustamist, välja arvatud tahkete ainete puhul (vt punkt 1.4.2.3.2) ja koheste sööbivate või ärritavate mõjude korral. 24 tunni pärast võib loputada, kui seda peetakse vajalikuks. Pesemise mõju selgitamiseks ei soovitata kasutada loomade kontrollrühma, välja arvatud juhul, kui see on teaduslikult põhjendatud. Kui on vaja kontrollrühma, kasutatakse kahte küülikut. Pesemise tingimused tuleks hoolikalt dokumenteerida, nt pesemisaeg, pesemislahuse koostis ja temperatuur, pesemise kestus, vedeliku kogus ja voolukiirus.

1.4.2.3 Annusmäär

1.4.2.3

1.4.2.3.1. Vedelike uurimine Vedelike uurimiseks kasutatakse 0,1 ml annust. Pumppihustist ei tohi ainet otse silma manustada. Vedelikujuga tuleks väljutada ja koguda mahutisse enne 0,1 ml silma manustamist.

1.4.2.3.2. Tahkete ainete uurimine Tahkete ainete, pastade ja osakeste uurimisel peaks kasutatav kogus olema 0,1 ml või kaaluga kuni 100 mg. Katseaine tuleks jahvatada peeneks tolmuks. Tahke aine kogust tuleks mõõta pärast selle õrnalt tihendamist, nt raputades mõõtemahutit. Kui tahket katseainet ei ole katselooma silmast eemaldatud füsioloogiliste mehhanismide abil esimese vaatluse ajal üks tund pärast käsitlemist, loputatakse silma füsioloogilise soolalahusega või destilleeritud veega.

1.4.2.3.3. Aerosoolide uurimine Soovitatavalt kogutakse kõik pumbatavad joad ja aerosoolid enne silma manustamist. Üheks erandiks on survestatud aerosoolmahutites ained, mida ei saa koguda aurustumise tõttu. Sellistel juhtudel tuleks silm hoida lahti ja katseaine panna silma ligikaudu üks sekund kestva lihtsa purskega 10 cm kauguselt otse silma ees. Nimetatud vahemaa võib muutuda sõltuvalt pihusti survest ja sisaldusest. Tuleks olla ettevaatlik, et pihusti surve ei teeks silmale liiga. Mõnel juhul võib osutuda vajalikuks hinnata pihusti tugevusest silmale põhjustatud võimalikke mehaanilisi kahjustusi. Aerosooliannuse suurust võib hinnata katset järgmiselt simuleerides: ainet pihustatakse kaalupaberile otse paberi ees oleva küüliku silma suurusest avausest. Paberi kaalu suurenemise abil hinnatakse silma pihustatud kogust. Lenduvate ainete puhul võib hinnata annust kogumismahuti kaalumise teel enne ja pärast katseaine eemaldamist.

1.4.2.4. Algkatse (ühe loomaga in vivo nahaärrituvus/-söövitavuskatse) Järjestikuste katsete tegemise strateegia kohaselt (vt 1. lisa) on väga soovitav, et in vivo katse sooritataks algselt ühe loomaga. Kui nimetatud katse tulemused tõendavad, et aine on kirjeldatud menetlust kasutades silma söövitav või tugevalt ärritav, ei ole silma ärritavuse kindlakstegemiseks vaja teha täiendavaid katseid.

1.4.2.5. Lokaalanesteetikumid Lokaalanesteetikume võib kasutada igal üksikjuhul. Kui osakaalu analüüs viitab sellele, et aine võib põhjustada valu, või kui algkatsega tõendatakse, et võib toimuda valulik reaktsioon, võib lokaalanesteetikume kasutada enne katseaine manustamist. Lokaalanesteetikumi liik, kontsentratsioon ja annus tuleks valida hoolikalt, et erinevused katseainele reageerides ei tuleneks selle kasutamisest. Kontrollsilma tuleb samamoodi tuimestada.

1.4.2.6. Kinnitav katse (in vivo silmade ärritust käsitlev katse täiendavate loomadega) Kui söövitavat toimet ei ole algkatses täheldatud, tuleks ärritavat või negatiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil. Kui algkatses täheldatakse tugevat ärritavat mõju, mis viitab võimalikule tugevale (pöördumatule) mõjule kinnitava katse tegemisel, on soovitav, et kinnitav katse tehtaks järjestikku ühe loomaga korraga, mitte kahte lisalooma korraga mõjutades. Kui teisel loomal esineb söövitavaid või tugevalt ärritavaid mõjusid, siis katset enam ei jätkata. Lisaloomasid võib vaja minna nõrkade või mõõdukate ärritavate reaktsioonide kinnitamiseks.

1.4.2.7. Jälgimisperiood Jälgitakse seni, kuni on võimalik täielikult hinnata vaadeldud mõjude ulatust ja pöörduvust. Katse tuleks lõpetada igal juhul siis, kui loomal on jätkuvalt tugeva valu või stressi tunnused (9). Mõjude pöörduvuse kindlaksmääramiseks tuleks jälgida loomi tavaliselt 21 päeva pärast katseaine manustamist. Kui pöörduvus ilmneb enne 21 päeva möödumist, tuleks katse lõpetada sel ajal.

1.4.2.7.

1.4.2.7.1. Kliinilised vaatlused ja silma reaktsioonide hindamine Silmi tuleks jälgida 1, 24, 48 ja 72 tundi pärast katseaine manustamist. Loomi ei uurita pärast seda, kui on saadud lõplikud andmed. Loomad, kellel jätkuvalt esineb tugevat valu või stressi, tuleks viivitamata humaanselt tappa, ning ainet tuleks hinnata vastavalt sellele. Humaanselt tuleks tappa loomad, kellel aine manustamise järel esineb järgmisi silmakahjustusi: sarvkesta perforatsioon või märgatav sarvkesta haavand, kaasa arvatud silmasopislaiend; veri silma eeskambris; hinde 4 sarvkesta läbipaistmatus, mis püsib 48 tunni jooksul; valgusrefleksi puudumine (vikerkesta reaktsioon – hinne 2), mis püsib 72 tunni jooksul; sidekesta haavand; sidekesta või niktatsioonikesta nekroos või armistumine. Seda seetõttu, et sellised kahjustused üldiselt on pöördumatud. Loomad, kellel ei esine silmakahjustusi, võib tappa mitte varem kui kolm päeva pärast manustamist. Loomi, kellel esinevad kerged või mõõdukad kahjustused, tuleks jälgida seni, kuni kahjustused on selged, või 21 päeva, mil katse lõpetatakse. Jälgitakse 7, 14 ja 21 päeva, et kindlaks määrata kahjustuste seisund ning nende pöörduvus või pöördumatus. Silmade reaktsiooni (sidekest, sarvkest ja vikerkest) hinded tuleks registreerida iga kord, kui looma uuritakse (tabel 1). Kõikidest muudest silmakahjustustest (nt silma sarvkestakiht, värvumine) või kahjulikest süsteemsetest mõjudest tuleks samuti teada anda. Reaktsioonide uurimist võib hõlbustada binokulaarluubi, pilulambi, biomikroskoobi või muu sobiva seadme kasutamine. Pärast vaatluste registreerimist 24 tunni jooksul võib silmi edasi uurida fluorestseiini abil. Silma reaktsioonide hindamine on tingimata subjektiivne. Silma reaktsiooni hindamise ühtlustamiseks ning katselaboratooriumide ning jälgivate või tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatlusi tegevatel isikutel piisavalt tundma õppida kasutatavat hindamissüsteemi (vt tabel allpool).

2. ANDMED

2.

2.2. TULEMUSTE HINDAMINE Silmaärrituse punkte tuleks hinnata vastavalt kahjustuste laadile ja raskusele ning nende pöörduvusele või pöördumatusele. Üksikud määramised ei esinda aine ärritavate omaduste absoluutset taset, kuna samuti hinnatakse katseaine muid mõjusid. Selle asemel tuleks käsitada üksikuid punkte kontrollväärtustena ja need on tähendusrikkad üksnes siis, kui neid on täielikult kirjeldatud ja kõiki vaatlusi on hinnatud.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.

Põhjendus in vivo katse tegemiseks: varasemate katseandmete, sh järjestikuste katsete tegemise strateegia põhjal saadud tulemuste osakaalu analüüs:

varasematest katsetest saadud asjaomaste andmete kirjeldus;

katsestrateegia igal etapil saadud andmed;

in vitro katsete kirjeldus, sh menetluste üksikasjad, katse-/võrdlusainetest saadud tulemused;

in vivo nahaärritust/-söövitust uuriva katse, sh saadud tulemuste kirjeldus;

osakaalu analüüs in vivo uurimuse sooritamiseks.

Katseaine:

tunnusandmed (nt CASi number, algupära, puhtus, tuntud lisandid, partii number);

füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, lenduvus, lahustuvus, stabiilsus, reaktiivsus veega);

kui tegu on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsendimäärad;

kui kasutatakse lokaalanesteetikumi, selle nimetus, puhtus, liik, annus ja võimalik koostoime katseainega.

Kandeaine:

—– nimetus, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus;

kandeaine valiku põhjendamine.

Katseloomad:

kasutatud liigid/liin, põhjendus muude loomade kui albiinoküülikute kasutamiseks;

iga looma vanus katse alguses;

mõlemast soost loomade arv katse- ja kontrollrühmas (vajaduse korral);

üksikute loomade kaalud katse alguses ja lõpus;

päritolu, elamistingimused, toitumine jne.

Tulemused:

igal vaatlusel ärritusele punktide andmisel kasutatava meetodi kirjeldus (nt pilulamp, biomikroskoop, fluorestseiin);

tabeli kujul andmed iga looma ärritavate/söövitavate reaktsioonide kohta igal vaatlusel kuni katselooma kõrvaldamiseni katsest;

jälgitud ärrituse või söövituse astme ja laadi kirjeldus;

muude jälgitud silmakahjustuste kirjeldus (nt vaskularisatsioon, silma sarvkestakihi tekkimine, liited, värvumine);

mujal kui silmas tuvastatud paiksete või süsteemsete kahjulike mõjude ja histopatoloogiliste leidude kirjeldus.

Tulemuste arutelu.

3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE Katseloomadega tehtud silma ärritust uurivate katsete tulemuste ekstrapolatsioon inimestele on kehtiv üksnes piiratud ulatuses. Paljudel juhtudel on albiinoküülikud silma ärritavatele või söövitavatele ainetele tundlikumad kui inimesed. Tuleks olla ettevaatlik andmete tõlgendamisel, et välistada sekundaarsest nakkusest tingitud ärritust.

4.1)2)3)4)5)6)6a)7)8)9)10)

VIITED Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L, Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35., 159–164. Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P, Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26. Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524. Testing Method B.40 Skin Corrosion. Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tabel 1 SILMAKAHJUSTUSTE HINDAMINE

Sarvkest

Hägusus: tihedusaste (mõõtmised tuleks teha kõige tihedamas kohas) Ei esine haavandeid või hägusust… 0 Hajutatud või hajusad hägususalad (välja arvatud tavapärase läike kerge tuhmumine); vikerkesta selgelt nähtavad detailid… 1 Kergesti märgatav poolläbipaistev ala; vikerkesta kergelt varjatud detailid… 2 Pärlmutrine ala; vikerkesta detailid ei ole nähtavad; pupilli suurus on vaevunähtav … 3 Läbipaistmatu sarvkest; vikerkest ei eristu läbi hägususe … 4 Suurim võimalik punktide arv: 4 MÄRKUSED

Vikerkest

Tavaline … 0 Selgesti süvenenud kurrud, verepais, turse, mõõdukas liigveresus sarvkesta ümber; või injektsioon; vikerkest reageerib valgusele (pikaldast reaktsiooni peetakse katseaine mõjuks) … 1 Verejooks, täielikult hävinud vikerkest või ei reageeri valgusele … 2 Suurim võimalik punktide arv: 2

Sidekest

Punasus (viitab laugude ja silmamuna sidekestale, v.a sarv- ja vikerkest) Tavaline … 0 Mõned hüpereemilised veresooned (injekteeritud)… 1 Hajunud sügavpunane värvus; üksikuid veresooni ei ole kerge eristada… 2 Hajunud tumepunane… 3 Suurim võimalik punktide arv: 3

Sidekesta turse

Turse (viitab laugudele ja/või niktatsioonikestale) Tavaline … 0 Mõningane tavapärasest suurem turse … 1 Selge turse, laud osaliselt ümber pöördunud … 2 Turse, laud poolsuletud … 3 Turse, laud rohkem kui poolsuletud… 4 Suurim võimalik punktide arv: 4

B.6. NAHA SENSIBILISEERIMINE

B.6.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Märkused Katsete tundlikkust ja võimet tuvastada inimeste naha võimalikke sensibiliseerijaid loetakse inimese tervisega seotud toksilisuse liigitamise seisukohalt oluliseks. Ei ole olemas uurimismeetodit, mis identifitseeriks adekvaatselt kõik ained, mis võivad inimese nahka sensibiliseerida ja mis sobiks kõikide ainete puhul. Katse valimisel tuleb kaaluda aine füüsikalisi omadusi, sealhulgas aine võimet tungida läbi naha. Välja on töötatud kahte liiki katsed, milles kasutatakse merisigu: abiainega katsed, milles võimendatakse allergiaseisundit sellega, et uuritavat ainet lahustatakse või suspendeeritakse Freundi täielikus abiaines (Freund's Complete Adjuvant – FCA), ja abiaineta katsed. Abiainega katsed on tõenäoliselt konkreetse aine võimaliku nahka sensibiliseeriva toime ennustamisel täpsemad kui need meetodid, mis ei kasuta Freundi täielikku abiainet, ning seega tuleks selliseid meetodeid eelistada. Merisigade maksimeerimise katse (GPMT) on laialdaselt kasutatud abiainega katse. Olgugi, et on olemas mitmeid meetodeid, millega on võimalik tuvastada aine potentsiaali kutsuda esile naha sensibiliseeriv reaktsioon, loetakse GPMT katset eelistatud abiainega katseks. Paljude keemiliste ainete klasside puhul peetakse abiaineta katseid (millest eelistatakse Buehleri katset) vähem tundlikuks. Teatavatel juhtudel võib Buehleri katse valimine olla põhjendatud, kuna selles katses manustatakse aine paikselt, mitte nahasisese süstimise teel nagu GPMT puhul. Buehleri katse kasutamist tuleks teaduslikult põhjendada. Käesolevas meetodis kirjeldatakse GPMTd ja Buehleri katset. Kasutada võib ka teisi meetodeid tingimusel, et need on hästi valideeritud ja teaduslikult põhjendatud. Kui tunnustatud sõelkatsega saadakse positiivne tulemus, võib uuritava aine määrata võimalikuks sensibiliseerijaks ning täiendava meriseakatse tegemine ei pruugi olla vajalik. Kui sellisel katsel on siiski negatiivne tulemus, tuleb meriseakatse teha käesolevas uurimismeetodis kirjeldatud korras. Vt ka üldise sissejuhatuse B osa.

1.2. MÕISTED Naha sensibiliseerimine – (allergiline kontaktne dermatiit) on mingi aine poolt põhjustatud immunoloogiliselt vahendatud nahareaktsioon. Inimestel võib vastureaktsiooniks olla sügelemine, punetus, paistetus, paapulid, vesivillid või nende kombinatsioon. Teiste liikide puhul võivad reaktsioonid erineda ning esineda võib ainult punetust ja paistetust. Induktsioonkokkupuude – katsealuse kokkupuude uuritava ainega, mille eesmärk on kutsuda esile ülitundlik seisund. Induktsiooniperiood – pärast induktsioonkokkupuudet vähemalt nädal aega kestev periood, mille ajal võib kujuneda ülitundlik seisund. Allergilise reaktsiooni esile kutsuv kokkupuude – eelnevalt käsitletud katsealuse kokkupuude uuritava ainega pärast induktsiooniperioodi selleks, et määrata kindlaks, kas katsealune reageerib ülitundlikult.

1.3. VÕRDLUSMATERJAL Kasutatud uurimismeetodi tundlikkust ja usaldusväärsust tuleks hinnata kord kuue kuu jooksul, kasutades selleks aineid, mille puhul on teada, et neil on nõrga või keskmise toimega nahka sensibiliseerivad omadused. Nõuetekohaselt tehtud abiainega katses peaks eeldatavasti reageerima vähemalt 30 % ja abiaineta katses vähemalt 15 % nõrga või keskmise toimega sensibiliseerijat. Eelistatakse järgmisi aineid: CASi number EINECSi number EINECSi nimed Üldnimetused 101-86-0 202-983-3 α-heksüülkaneelaldehüüd α-heksüülkaneelaldehüüd 149-30-4 205-736-8 bensotiasool-2-tiool (merkaptobensotiasool) kaptaks 94-07-7 202-303-5 bensokaiin nordkaiin Teatavas olukorras võib piisavate põhjenduste korral kasutada ka teisi eespool nimetatud kriteeriumidele vastavaid võrdlusaineid.

1.4. UURIMISMEETODI PÕHIMÕTE Katseloomad puutuvad uuritava ainega esimest korda kokku nahasisese süstimise ja/või nahale määrimise kaudu (induktsioonkokkupuude). Pärast 10–14päevast puhkeaega (induktsiooniperioodi), mille jooksul võib välja kujuneda immuunsusreaktsioon, puutuvad loomad kokku nakatumist esile kutsuva doosiga. Katseloomade naha reaktsiooni määra ja ulatust võrreldakse võrdlusloomade omaga, kes saavad induktsiooni ajal platseeboravi ning kellele seejärel manustatakse nakatumist esile kutsuv doos.

1.5. UURIMISMEETODI KIRJELDUS Kui uuritava aine eemaldamist peetakse vajalikuks, tuleks seda teha vee või sobiva lahustiga, ilma et see muudaks olemasolevat reaktsiooni või kahjustaks naha pinda.

1.5.

1.5.1. Merisigade maksimeerimise katse (GPMT)

1.5.1.

1.5.1.1. Valmistised Terveid albiinomerisigu harjutatakse laboritingimustega vähemalt viie päeva jooksul enne katse tegemist. Enne katse tegemist jagatakse loomad juhuslikkuse alusel katserühmadesse. Karvad eemaldatakse sõltuvalt kasutatavast uurimismeetodist lõikamise, raseerimise või vajaduse korral keemilise depilatsiooni teel. Tuleb olla ettevaatlik, et vältida naha hõõrdumist. Loomi kaalutakse enne katse algust ning katse lõpus.

1.5.1.2. Katsetingimused

1.5.1.2.

1.5.1.2.1. Katseloomad Katseloomadena kasutatakse üldkasutatavate albiinomerisigade laboratoorseid aretusliine.

1.5.1.2.2. Arv ja sugu Kasutada võib isas- ja/või emasloomi. Kui kasutatakse emasloomi, peaksid nad olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined. Katserühmas on vähemalt kümme looma ning võrdlusrühmas vähemalt viis looma. Kui katserühmas ja võrdlusrühmas on kasutatud vastavalt vähem kui 20 ja kümmet merisiga ning kui ei ole võimalik järeldada, et uuritav aine on sensibilisaator, soovitatakse tungivalt täiendavate loomad uurimist, et kokku oleks vähemalt 20 katse- ja kümme võrdluslooma.

1.5.1.2.3. Doositasemed Uuritava aine kontsentratsioon peaks iga induktsioonkokkupuute kohta olema süsteemselt hästi talutav ning kasutada tuleks kõrgeimat kerget kuni keskmist nahaärritust tekitavat kontsentratsiooni. Nakatumist esile kutsuva doosi puhul kasutatav kontsentratsioon peaks olema suurim ärritust mitte esile kutsuv doos. Vajaduse korral võib vajalikud kontsentratsioonid määrata kindlaks kahe või kolme loomaga tehtud prooviuuringute põhjal. Sellisel juhul tuleks kaaluda selliste loomade kasutamist, kellele on ainet manustatud FCA abil.

1.5.1.3. Katse käik

1.5.1.3.

1.5.1.3.1. Induktsioon Katserühma 0-päev Abaluude piirkonda, kust on eemaldatud karvad, süstitakse naha alla 3 × 2 korda 0,1 ml selliselt, et kolm süsti tehakse keskjoonest vasakule ja kolm keskjoonest paremale. Injektsioon 1: 1:1 segu (v/v) FCAst ja veest või füsioloogilisest keedusoolalahusest Injektsioon 2: valitud kontsentratsiooniga uuritav aine sobivas vehiikelis Injektsioon 3: valitud kontsentratsiooniga uuritav aine 1:1 segus (v/v) FCAst ja veest või füsioloogilisest keedusoolalahusest Injektsioonis 3 lahustatakse vees lahustuvad ained vesifaasis enne FCAga segamist. Rasvades lahustuvad või lahustumatud ained suspendeeritakse FCAs enne vesifaasiga segamist. Uuritava aine lõppkontsentratsioon peab olema võrdne sellega, mida on kasutatud injektsioonis 2. Injektsioonid 1 ja 2 tehakse lähestikku ning peale kõige lähemale, samal ajal kui injektsioon 3 tehakse piirkonna kõige tagapoolsemasse osasse. Võrdlusrühma 0-päev 3 × 2 korda 0,1 ml süstitakse naha alla samadesse kohtadesse kui katseloomade puhul. Injektsioon 1: 1:1 segu (v/v) FCAst ja veest või füsioloogilisest keedusoolalahusest Injektsioon 2: lahjendamata vehiikel Injektsioon 3: 50 %line w/v segu vehiikelit FCA ja vee või füsioloogilise keedusoolalahuse segus 1:1 (v/v). Katse- ja võrdlusrühma 5.–7. päev Kui aine ei ärrita nahka, manustatakse katsepinda ligikaudu 24 tundi enne paikset induktsioonkokkupuudet ja pärast karvade lõikamist ja/või raseerimist 0,5 ml 10 %list naatriumlaurüülsulfaati vaseliinis kohaliku ärrituse tekitamiseks. Katserühma 6.–8. päev Katsepiirkond puhastatakse uuesti karvadest. Sobivas vehiikelis oleva uuritava ainega täielikult küllastatud filterpaber (2 × 4 cm) asetatakse katsepiirkonnale ning kaetakse 48 tunniks oklusioonmähisega. Vehiikeli valikut tuleb põhjendada. Tahked ained pulbristatakse peeneks ja lisatakse sobivasse vehiikelisse. Vedelikke võib kasutada vajaduse korral lahjendamata kujul. Võrdlusrühma 6.–8. päev Katsepiirkond puhastatakse uuesti karvadest. Vehiikel asetatakse samal viisil uuritava ainega katsepiirkonnale ja kaetakse 48 tunniks oklusioonmähisega.

1.5.1.3.2. Nakatumise esilekutsumine Katse- ja võrdlusrühma 20.–22. päev Katserühma ja võrdlusrühma loomade küljed puhastatakse karvadest. Uuritava ainega immutatud lapp või uuritavat ainet sisaldav nõu pannakse looma ühele küljele ja vajaduse korral võib teisele küljele panna vehiikeliga immutatud lapi või seda sisaldava nõu. Lappe hoitakse oklusioonmähisega 24 tundi naha vastas.

1.5.1.3.3. Vaatlus ja hindamine: katse- ja võrdlusrühm Soovitav on hinnata katse tulemusi pimemeetodiga. Kui esimese nakatumist esile kutsuva katse tulemusi on vaja täpsustada, tuleks kaaluda vajaduse korral uue võrdlusrühmaga teise nakatumist esile kutsuva katse (st taasnakatumise katse) tegemist umbes nädal pärast esimest katset. Taasnakatumise katse võib teha ka esialgse võrdlusrühmaga. Vaadelda tuleks kõiki nahareaktsioone ja ebatavalisi leidusid, sealhulgas induktsioonist ja nakatumise esilekutsumisest tulenevaid süsteemseid reaktsioone, ja need tuleks üles märkida Magnussoni/Klingmani (vt liidet) hindamisskaala alusel. Muude toimingute puhul, nt histopatoloogiline uuring, võib küsitavate mõjude täpsustamiseks mõõta nahavoldi paksust.

Umbes 21 tundi pärast lapi äravõtmist nakatatud ala puhastatakse, pügatakse ja/või raseeritakse ning vajaduse korral depileeritakse.

Umbes 3 tundi hiljem (umbes 48 tundi pärast nakatumise esilekutsumise alustamist) vaadeldakse naha reaktsiooni ning see registreeritakse liites esitatud hindamisskaala põhjal.

Umbes 24 tundi pärast vaatlust tehakse teine vaatlus (72 tunni pärast) ning tulemused märgitakse üles.

1.5.2. Buehleri katse

1.5.2.

1.5.2.1. Valmistised Terveid albiinomerisigu harjutatakse laboritingimustega vähemalt viie päeva jooksul enne katse tegemist. Enne katse tegemist jagatakse loomad juhuslikkuse alusel katserühmadesse. Karvad eemaldatakse sõltuvalt kasutatavast uurimismeetodist lõikamise, raseerimise või vajaduse korral keemilise depilatsiooni teel. Tuleb olla ettevaatlik, et vältida naha hõõrdumist. Loomi kaalutakse enne katse algust ning katse lõpus.

1.5.2.2. Katsetingimused

1.5.2.2.

1.5.2.2.1. Katseloomad Katseloomadena kasutatakse üldkasutatavate albiinomerisigade laboratoorseid aretusliine.

1.5.2.2.2. Arv ja sugu Kasutada võib isaseid ja/või emaseid loomi. Kui kasutatakse emasloomi, peaksid nad olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined. Katserühmas on vähemalt 20 looma ning võrdlusrühmas vähemalt kümme looma.

1.5.2.2.3. Doositasemed Uuritava aine kontsentratsioon iga induktsioonkokkupuute kohta peaks olema kõrgeim kontsentratsioon, mis kutsub esile kerge, kuid mitte ülemäärase ärrituse. Nakatumist esile kutsuva doosi puhul kasutatav kontsentratsioon peaks olema suurim ärritust mitte esile kutsuv doos. Vajaduse korral võib vajalikud kontsentratsioonid määrata kindlaks kahe või kolme loomaga tehtava prooviuuringute põhjal. Vees lahustuvate uuritavate ainete puhul on vehiikelina asjakohane kasutada vett või lahjendatud mitteärritavat pindaktiivse aine lahust. Teiste uuritavate ainete vehiikeliks sobib induktsioonkokkupuute 80 %line etanooli ja vee lahus ning nakatumise esilkutsumise puhul atsetoon.

1.5.2.3. Analüüsi käik

1.5.2.3.

1.5.2.3.1. Induktsioon Katserühma 0-päev Üks külg puhastatakse korralikult karvadest. Katselapp peab olema sobivas vehiikelis uuritava ainega põhjalikult immutatud (vehiikeli valikut tuleks põhjendada; vedelaid uuritavaid aineid võib vajaduse korral kasutada lahjendamata kujul). Katselapid pannakse katsepiirkonda ning hoitakse kuus tundi oklusioonlapi või uuritavat ainet sisaldava nõu ja sobiva mähisega naha peal. Katselapid peavad olema oklusiivsed. Kasutamiseks sobib umbes 4–6 cm2 suurune puuvillalapike ning see võib olla ümmargune või kandiline. Oklusiooni tagamiseks soovitatakse sobivat kinnitusmehhanismi. Mähise kasutamisel võib olla vaja täiendavat kokkupuudet. Võrdlusrühma 0-päev Üks külg puhastatakse korralikult karvadest. Vehiikel asetatakse katsepinnale samal viisil kui katserühma puhul. Katselappe hoitakse kuus tundi oklusioonlapi või uuritavat ainet sisaldava nõuga ja sobiva mähisega naha peal. Kui on võimalik tõestada, et platseeboravi saavat võrdlusrühma ei ole vaja, võib kasutada varem kasutamata võrdlusrühma. Katse- ja võrdlusrühma 6.–8. ja 13.–15. päev Samas katsepiirkonnas, 6.–8. ja siis 13.–15. päevaga samal küljel viiakse läbi samasugune kokkupuude nagu 0-päeval (vajaduse korral puhastatakse nahk karvadest).

1.5.2.3.2. Nakatumise esilekutsumine Katse- ja võrdlusrühma 27.–29. päev Katserühma ja võrdlusrühma loomade külg, mis ei ole seni uuritava ainega kokkupuutes olnud, puhastatakse karvadest. Oklusioonlapp või nõu, milles on piisaval määral kõrgeima mitteärritava kontsentratsiooniga uuritavat ainet, pannakse katse- ja võrdlusrühma loomade selle külje tagaosale, millel ei ole veel katset tehtud. Vajaduse korral pannakse katse- ja võrdlusrühma loomade töötlemata külje tagaosale vehiikelit sisaldav oklusioonlapp või -nõu. Neid lappe või nõusid hoitakse sobiva mähisega kuus tundi naha vastas.

1.5.2.3.3. Vaatlus ja hindamine Katse tulemusi tuleks hinnata soovitatavalt pimemeetodiga. Kui esimese nakatumist esile kutsuva katse tulemusi on vaja täpsustada, tuleks kaaluda vajaduse korral uue võrdlusrühmaga teise nakatumist esile kutsuva katse (st taasnakatumise katse) tegemist umbes nädal pärast esimest katset. Taasnakatumise katse võib teha ka esialgse võrdlusrühmaga. Kõiki nahareaktsioone ja ebatavalisi leidusid, sealhulgas induktsioonist ja nakatumise esilekutsumisest tulenevaid süsteemseid mõjusid, tuleks vaadelda ja need tuleks üles märkida Magnussoni/Klingmani (vt liidet) hindamisskaala alusel. Muude toimingute puhul, nt histopatoloogiline uuring, võib küsitavate mõjude täpsustamiseks mõõta nahavoldi paksust.

Umbes 21 tundi pärast lapi äravõtmist puhastatakse karvadest ala, millel nakatumine esile kutsuti.

Umbes kolm tundi hiljem (umbes 30 tundi pärast nakatumist esile kutsuva lapi katsepiirkonda asetamist) vaadeldakse nahareaktsioone ning need märgitakse üles vastavalt liites esitatud hindamisskaalale.

Umbes 24 tundi pärast 30 tundi kestnud vaatlusperioodi (umbes 54 tundi pärast nakatumist esile kutsuva lapi nahapinnale asetamist) vaadeldakse nahareaktsioone uuesti ning tulemused märgitakse üles.

2. ANDMED (GPMT ja Buehleri katse) Andmed tuleks esitada kokkuvõtvalt tabelis, milles oleks iga looma kohta märgitud kõikidel vaatlustel täheldatud nahareaktsioonid.

3. ARUANDLUS (GPMT ja Buehleri katse) Kui enne merisigade maksimeerimise katset tehakse sõeluuring, tuleb koos katse- ja võrdlusrühmaga saadud tulemustega esitada ka katse (nt paikne lümfisõlmede uuring (LLNA), hiire kõrva turse määratlemise katse (MEST)) kirjeldus või viide sellele, sealhulgas meetodi üksikasjad.

3. Katsearuanne (GMPT ja Buehleri katse)

Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet.

Katseloomad:

kasutatud merisea aretusliin;

loomade arv, vanus ja sugu;

päritolu, pidamistingimused, toit jne;

iga looma kaal katse alguses.

Katsetingimused:

lapi asetuskoha ettevalmistamise meetod;

lapi materjali ja lappide asetamise meetodi üksikasjad;

prooviuuringu tulemused ning järeldused katses kasutatavate induktsiooni- ja nakatumist esile kutsuvate kontsentratsioonide kohta;

uuritava aine ettevalmistamise, kasutamise ja eemaldamise üksikasjad;

vehiikeli valiku põhjendus;

induktsioonkokkupuutes ja nakatumise esilekutsumisel kasutatud vehiikeli ja uuritava aine kontsentratsioonid ning induktsiooni ja nakatumise esilekutsumise ajal kasutatud aine kogumäär.

Tulemused:

kokkuvõte kõige värskemate tundlikkuse ja usaldusväärsuse kontrollide tulemuste kohta (vt 1.3), sealhulgas teave kasutatud aine, kontsentratsiooni ja vehiikeli kohta;

iga looma kohta, sealhulgas hindamissüsteem;

täheldatud toime iseärasuse ja määra kirjeldus;

histopatoloogilised leiud.

Tulemuste üle arutlemine.

Järeldused.

4. VIITED Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 406.

B.7. TOKSILINE TOIME KORDUSDOOSI TÕTTU (28 PÄEVA) (SUUKAUDNE)

B.7.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Vt üldise sissejuhatuse B osa.

1.2. MÕISTED Vt üldise sissejuhatuse B osa.

1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Uuritav aine manustatakse erinevatele katseloomade rühmadele suu kaudu kord päevas astmeliselt suureneva koguse kaupa selliselt, et üks rühm saaks 28 päeva jooksul ainult ühte doosi. Manustamisperioodi jooksul vaadeldakse loomi põhjalikult toksilisuse märkide tuvastamiseks. Katse ajal surnud või tapetud loomad lahatakse ning katse lõppemisel tapetakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad. Selleks et saada võimalikult palju teavet, asetab see meetod lõpp-punktina suuremat rõhku neuroloogilistele mõjudele ning loomade põhjaliku kliinilise vaatlemise vajadusele. Meetod peaks identifitseerima neurotoksilisi kemikaale, mis võivad nõuda neurotoksilisuse osas täiendavat ja põhjalikumat uurimist. Lisaks sellele võib meetod anda teavet immunoloogiliste mõjude ja paljunemisorganeid kahjustava toksilisuse kohta.

1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.4.

1.4.1. Ettevalmistused Terved ja noored täiskasvanud loomad määratakse võrdlus- ja katserühmadesse juhuslikult. Puurid peaksid asetsema selliselt, et nende asukohast tingitud võimalikud mõjud oleksid minimaalsed. Loomad märgistatakse eristamise eesmärgil ning neid hoitakse vähemalt viis päeva enne katse algust puurides, et nad jõuaksid laboritingimustega kohaneda. Uuritav aine manustatakse kunstlikult või koos toidu või joogiveega. Suukaudse manustamise meetod sõltub uuringu eesmärgist ja aine füüsikalis-keemilistest omadustest. Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav aine sobivas vehiikelis. Soovitatakse, et võimaluse korral tuleks kõigepealt kasutada vesilahust/suspensiooni, seejärel õlilahust/emulsiooni (nt maisiõli) ja siis lahustamist teistes vehiikelites. Mittevesilahuseliste vehiikelite puhul peab teadma vehiikeli toksilisi omadusi. Kindlaks tuleks määrata uuritava aine stabiilsus vehiikelis.

1.4.2. Katsetingimused

1.4.2.

1.4.2.1. Katseloomad Närilistest eelistatakse rotte, kuigi kasutada võib ka teisi närilisi. Katseloomadena tuleks kasutada üldkasutatavate tervete täiskasvanud laboratooriumiloomade aretusliine. Emasloomad peaksid olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined. Doseerimisega tuleks alustada võimalikult kohe pärast võõrutamist ja igal juhul enne loomade üheksanädalaseks saamist. Uuringu alguses peaks loomade kaaluerinevus olema minimaalne ega tohiks ületada ± 20 % kummastki soost loomade keskmisest kaalust. Kui korduva suukaudse manustamisega uuringule järgneb pikaajaline uuring, tuleks mõlemas uuringus kasutada samast aretusliinist ja sama päritoluga loomi.

1.4.2.2. Arv ja sugu Igal doositasemel tuleks kasutada vähemalt kümmet looma (viis emas- ja viis isaslooma). Kui osa loomi on kavas katse käigus tappa, tuleks loomade arvu enne katse lõppu tapetavate loomade arvu võrra suurendada. Lisaks sellele võib kümnest loomast (viis emas- ja viis isaslooma) koosnevale satelliitrühmale 28 päeva jooksul manustada suure doositaseme ning jälgida 14 päeva jooksul pärast selle manustamist, kas toksiline toime on pöörduv, püsiv või kas toksilise toime avaldumine hilineb. Kasutatakse ka kümnest võrdlusloomast (viis emas- ja viis isaslooma) koosnevat satelliitrühma.

1.4.2.3. Doositasemed Üldiselt tuleks kasutada kolme katserühma ja ühte võrdlusrühma. Võrdlusrühma loomi tuleks käsitleda samal viisil kui katserühma loomi, välja arvatud uuritava aine manustamisel. Kui uuritava aine manustamisel kasutatakse vehiikelit, tuleb võrdlusrühmale manustada vehiikelit suurimas kasutatud mahus. Kui muude andmete hindamise põhjal võib arvata, et päevadoosil 1000 mg eluskaalu kg kohta ei ole eeldatavasti mõju, võib teha piirsisalduskatse. Kui vajalikke andmeid ei ole, võib kasutatavate dooside kindlaksmääramise hõlbustamiseks teha doosipiirkonna määramise katse. Doosimäärade valimisel tuleks arvesse võtta kõiki uuritava aine või sellega seotud ainete toksilisust käsitlevaid ja (toksikoloogilis)kineetilisi andmeid. Toksilise toime esilekutsumise eesmärgil tuleks valida kõrgeim doositase, kuid vältida tuleks surma või tõsiseid kannatusi esile kutsuvat doositaset. Seejärel tuleks doosist tuleneva reaktsiooni ja madalaimal doositasemel täheldatava kahjuliku toimeta doosi (NOAEL) demonstreerimiseks valida aste-astmelt vähenevad doositasemed. Kahanevate doositasemete puhul on tavaliselt optimaalsed kahe- kuni neljakordsed intervallid ja väga pikkadele intervallidele (nt kui koefitsient on suurem kui 10) eelistatakse tavaliselt neljanda katserühma lisamist. Ainete puhul, mida manustatakse toidu või joogiveega, on oluline tagada, et toiduga kasutatavad uuritava aine kogused ei häiriks tavalist toitumise või joogivee tasakaalu. Kui uuritavat ainet manustatakse toiduga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni toidus (ppm) või püsiva suurusega doosi vastavalt looma kehakaalule; tuleks täpsustada, millist võimalust kasutatakse. Kui ainet manustatakse kunstlikult, tuleks doos anda igal päeval samal ajal ning seda tuleks vajaduse korral kohandada, et looma kehakaalu suhtes säiliks püsiv doositase. Kui pärast kordusdoosi uuringut tehakse pikaajaline uuring, tuleks mõlema uuringu puhul kasutada samasugust toitu.

1.4.2.4. Piirsisalduskatse Kui katses ei tuvastata käesolevas uuringus kirjeldatud menetlusega päevadoosil vähemalt 1000 mg kehakaalu kg kohta, või uuritava aine manustamisel (kehakaalu määramistele tuginedes) protsentuaalselt samal määral söögi või toidu kaudu, märkimisväärset toksilist mõju ja kui toksilisus ei ole samalaadse struktuuriga ainete osas saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta täielikku kolme doositasemega uuringut vajalikuks. Võib teha piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.

1.4.2.5. Vaatlusperiood Vaatlusperiood peaks olema 28 päeva. Satelliitrühma kuuluvatele loomadele, kelle puhul tehakse järelvaatlus, ei tohiks uuritavat ainet toksilise toime hilinenud ilmnemise, selle püsimise või sellest toibumise tuvastamise eesmärgil veel vähemalt 14 päeva jooksul manustada.

1.4.3. Analüüsi käik Loomadele doseeritakse uuritavat ainet seitsmel päeval nädalas ja 28 päeva jooksul; nädalas viiepäevase doseerimismeetodi kasutamist tuleb põhjendada. Kui uuritavat ainet manustatakse kunstlikult, peaks seda tegema loomadele ühe doosi kaupa, kasutades maosondi või sobivat intubatsioonikanüüli. Maksimaalne vedelikumaht, mida võib korraga loomale manustada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 1 ml kehakaalu 100 g kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, mille puhul on lubatud 2 ml kehakaalu 100 g kohta. Välja arvatud ärritavate või söövitavate ainete puhul, millel on suurematel kontsentratsioonidel tavaliselt halvem toime, tuleks katsemahu varieeruvus muuta minimaalseks sellega, et kõikidel doositasemetel kohandatakse ühesuguse mahu tagamiseks kontsentratsiooni.

1.4.3.

1.4.3.1. Üldised märkused Üldisi kliinilisi vaatlusi tuleks teha vähemalt kord päevas, soovitavalt iga kord samal ajal ning võttes arvesse, et oodatud tulemusi esineb kõige rohkem pärast doseerimist. Üles tuleks märkida loomade tervislik seisund. Vähemalt kaks korda päevas tuleks kontrollida, kas loomad on haigestunud või surnud. Haigestunud loomad ja loomad, kellel esineb suurt stressi või valu, eemaldatakse katsest, tapetakse humaanselt ja lahatakse. Kõikide loomade puhul tuleks üksikasjalik kliiniline vaatlus teha enne seda, kui loomale esimest korda uuritavat ainet manustatakse (selleks, et oleks võimalik teha võrdlusi ühe looma põhjal), ning seejärel vähemalt kord nädalas. Need vaatlused tuleks teha väljaspool puuri, selleks ettenähtud kohas ja eelistatavalt iga kord samal ajal. Tulemused tuleks hoolikalt üles märkida, kasutades selleks võimaluse korral katselabori poolt fikseeritud hindamissüsteeme. Tuleks püüda tagada, et katsetingimuste varieeruvus oleks võimalikult minimaalne ja et eelistatult poleks vaatlejad uuritava aine manustamisest teadlikud. Tuvastatud märgid peaksid hõlmama lisaks muule muutusi nahal, karvades, silmades, limaskestas, ekstraktide ja eritiste esinemist ning autonoomseid toiminguid (nt pisaravool, piloerektsioon, pupillide suurus, ebaregulaarne hingamine). Samuti tuleks üles märkida muudatused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas loomad endaga ümberkäimisele reageerivad, samuti kloonilised või toonilised liigutused, stereotüübid (nt ülemäärane karvastiku hooldus, ringiratast keerlemine) või kummaline käitumine (nt enese vigastamine, tagurpidi kõndimine). Neljandal kokkupuutenädalal tuleks hinnata sensoorseid reaktsioone erinevat liiki ärritustele (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptiivsetele ärritajatele), samuti haardetugevust ja motoorset tegevust. Võimalike meetodite täpsemad üksikasjad on esitatud kirjanduse loetelus (vt üldise sissejuhatuse B osa). Neljanda kokkupuutenädala funktsionaalsed vaatlused võib ära jätta juhul, kui uuring tehakse subkroonilise toksilisuse 90päevase uuringu eeluuringuna. Sellisel juhul tuleks funktsionaalsed vaatlused hõlmata käesolevasse järeluuringusse. Teiselt poolt võivad kordusdoosi uuringu käigus saadud funktsionaalsete vaatluste andmed hõlbustada järgneva subkroonilise uuringu jaoks doositasemete valimist. Erandkorras võib funktsionaalsed vaatlused ära jätta rühmade puhul, millel esineb toksilisuse märke niisugusel määral, et see takistaks märkimisväärselt funktsionaalsete katsete tegemist.

1.4.3.2. Kehakaal ja toidu/vee tarbimine Kõiki loomi tuleks kaaluda vähemalt kord nädalas. Toidu ja vee tarbimist tuleks mõõta vähemalt kord nädalas. Kui uuritavat ainet manustatakse joogiveega, tuleks vee tarbimist samuti vähemalt kord nädalas mõõta.

1.4.3.3. Hematoloogia Katseperioodi lõpus tuleks teha järgmised hematoloogilised uuringud: hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide üld- ja diferentseeritud arv, vereliistakute arv ja vere hüübimisaja/hüübimisvõime mõõtmine. Vereproovid tuleks võtta kindlaksmääratud kohast ja vahetult enne loomade tapmist või selle ajal ning neid tuleks säilitada sobivates tingimustes.

1.4.3.4. Kliiniline biokeemia Kliinilised biokeemilised analüüsid peamiste toksiliste mõjude uurimiseks kudedes ja eelkõige nende toime uurimisel neerudele ja maksale tuleks teha vereproovidega, mis on võetud loomadelt vahetult enne tapmist või selle ajal (välja arvatud loomad, kes leiti surevana ja/või tapeti katse ajal). Loomadele soovitatakse vereproovi võtmisele eelneval ööl süüa mitte anda. Plasma- või seerumiuuringud peavad hõlmama naatriumi, kaaliumi, glükoosi, üldkolesterooli, karbamiidi, kreatiniini, üldvalku ja albumiini, vähemalt kahte hepatotsellulaarsele toimele osutavat ensüümi (näiteks alaniinaminotransferaas, aspartaataminotransferaas, aluseline fosfataas, gamma-glutamüültranspeptidaas, ja sorbitooldehüdrogenaas). Muude maksaensüümide või muud päritolu ensüümide ja sapphapete mõõtmised võivad teatavatel tingimustel anda kasulikku teavet. Alternatiivselt on uuringu viimasel nädalal võimalik loomadelt uriiniproovide kogumise teel teha järgmisi uriinianalüüse: välised tunnused, maht, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, valgud, glükoos ja veri/vererakud. Lisaks sellele tuleks uurida, kas seerumis on üldistele koekahjustustele osutavaid markereid. Muud määramised, mis tuleks teha juhul, kui uuritava aine teadaolevad omadused võivad mõjutada või mõjutavad eeldatavasti sellega seotud ainevahetuse profiili, hõlmavad kaltsiumi, fosfaati, triglütseriide, mis on määratud enne sööki, teatavaid hormoone, methemoglobiini ja koliinesteraasi. Need on vaja määrata teatavatesse klassidesse kuuluvate ainete puhul või konkreetsete juhtude põhiselt. Üldiselt on vaja paindlikku lähenemisviisi, mis sõltub vastava aine liigist ja selle täheldatud ja/või oodatud toimest. Kui varasemad lähteandmed ei ole piisavad, tuleks enne doseerimise alustamist määrata hematoloogilised ja kliinilis-biokeemilised muutujad.

1.4.3.5. Täielik lahang Kõik uuringusse kaasatud loomad läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki haavu, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisu. Kõikide loomade maksalt, neerudelt, neerupealsetelt, munanditelt, munandimanustelt, harknäärmelt, põrnalt, ajult ja südamelt tuleb vajaduse korral kõik koed eemaldada ning nende märgkaal määratakse kuivamise vältimiseks võimalikult kiiresti pärast dissekteerimist. Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise uuringu seisukohast kõige sobivamas fiksaatoris: kõik silmaga täheldatavad vigastused, aju (olulised piirkonnad, sealhulgas suuraju, väikeaju, ajusild), seljaaju, magu, jämesool ja peensool (sealhulgas Peyeri naastud), maks, neerud, neerupealsed, põrn, süda, harknääre, kilpnääre, hingetoru ja kopsud (kopsud pumbatakse fiksaatorit täis ja pannakse fiksaatorisse), sugunäärmed, suguelundid (nt emakas, eesnääre), põis, lümfisõlmed (eelistatult üks lümfisõlm, mis hõlmab manustamiskohta, ja teine lümfisõlm, mis on manustamiskohast eemal, et anda teavet süsteemse toime kohta), perifeerne närv (istmiku- või sääreluu närv), mis on eelistatult lihase lähedal, ning osa luuüdi (või alternatiivselt väike kogus toorest luuüdi). Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka teisi kudesid. Säilitada tuleks ka teised organid, mis on uuritava aine teadaolevatest omadustest tulenevalt tõenäoliselt sihtorganid.

1.4.3.6. Histopatoloogiline uuring Kõikide võrdlusrühma ja kõrge doosiga rühmade loomade säilitatud organeid ja kudesid tuleks histopatoloogiliselt põhjalikult uurida. Histopatoloogilised uuringud tuleks teha ka teiste doosirühmade loomade puhul juhul, kui kõrge doosiga rühma osas tuvastatakse manustamisega seotud muudatusi. Uurida tuleks kõiki silmaga täheldatavaid kahjustusi. Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogiline uuring teha nende kudede ja organite puhul, millel esineb samasugune toime kui katserühma puhul.

2. ANDMED Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Lisaks sellele tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel tapetud loomade arv, toksiliste märkidega loomade arv, täheldatud toksiliste märkide kirjeldus, sealhulgas toksilise toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta loomade protsent, kellel neid esines. Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohaste ja üldiselt tunnustatud statistilise meetodiga. Statistilised meetodid tuleks valida uuringu kavandamise etapis.

3. ARUANDLUS

3. KATSEARUANNE

Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet.

Katseloomad:

kasutatud liik/aretusliin;

loomade arv, vanus ja sugu;

päritolu, pidamistingimused, toit jne;

iga looma kaal katse alguses, pärast iga nädalat ning katse lõpus.

Katsetingimused:

vehiikeli valiku põhjendamine, kui vehiikeliks ei ole vesi;

doositaseme valimise põhjendus;

üksikasjad uuritava aine koostise/toiduvalmistise kohta, valmistises saavutatud kontsentratsiooni, stabiilsuse ja homogeensuse kohta;

uuritava aine manustamise üksikasjad;

vajaduse korral toidus/joogivees oleva uuritava aine määra (ppm) muundamine tegelikuks päevadoosiks (mg kehakaalu kg kohta);

toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad.

Tulemused:

eluskaal/muutused eluskaalus;

toidu ja vajaduse korral vee tarbimine;

toksilise reaktsiooni andmed vastavalt looma soole ja doositasemele, sealhulgas toksilisuse märgid;

kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või mitte);

sensoorse aktiivsuse, haardetugevuse ja motoorse tegevuse hindamine;

hematoloogilised katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;

kliinilise biokeemia katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;

kehakaal tapmise ajal ja organite kaal;

lahkamise tulemused;

histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;

võimaluse korral andmed imendumise kohta;

vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.

Tulemuste üle arutlemine.

Järeldused.

4. VIITED Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 407.

B.8. KORDUSDOOSI MÜRGISUS (28 PÄEVA, SISSEHINGAMISEL)

B.8.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Katse tegemiseks on kasulik teada aine osakeste suurusjaotust, aururõhku, sulamistemperatuuri, keemistemperatuuri, leekpunkti ja (vajaduse korral) plahvatusohtlikkust. Vt ka B osa üldist sissejuhatust (A).

1.2. MÕISTE Vt B osa üldist sissejuhatust (B).

1.3. VÕRDLUSAINED Puuduvad.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Mitu katseloomade rühma viiakse 28 päeva jooksul iga päev kindlaks ajaks kokkupuutesse testaine astmeliste kontsentratsioonidega nii, et üks rühm puutub kokku ühesuguse kontsentratsiooniga. Kui testainele lisatakse atmosfääris sobiva kontsentratsiooni saavutamiseks kandjat, tuleks kasutada kandja kontrollrühma. Manustamisperioodil jälgitakse loomi iga päev, et kontrollida mürgistusnähtude ilmnemist. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Puuduvad.

1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Ettevalmistused Loomi hoitakse enne katset vähemalt viis päeva katsele vastavates pidamis- ja söötmistingimustes. Noored terved katseloomad randomiseeritakse enne katset ja jagatakse vajalikku arvu katserühmadesse. Sobiva kontsentratsiooni saavutamiseks atmosfääris võib testainele lisada vajaduse korral sobivat kandjat. Kui annustamise lihtsustamiseks kasutatakse kandjat või muid lisandeid, peab olema kindel, et need ei põhjusta mürgistusnähte. Vajaduse korral võib kasutada varasemaid andmeid.

1.6.2. Katsetingimused

1.6.2.

1.6.2.1. Katseloomad Vastunäidustuste puudumisel on eelistatavaks liigiks rott. Kasutada tuleks tavapäraseid laboritöös kasutatavaid liine ja noori terveid loomi. Kasutatavate katseloomade masside erinevus katse alguses ei tohiks ületada ± 20 % vastavast keskmisest.

1.6.2.2. Katseloomade arv ja sugu Igas katserühmas peaks olema vähemalt kümme looma (viis emas- ja viis isaslooma). Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Kui uuringu jooksul plaanitakse loomi surmata, tuleks loomade arvu enne uuringu lõppu surmamisele määratud loomade arvu võrra suurendada. Lisaks võib testaine kõrgeima kontsentratsiooniga mõjutada 28 päeva jooksul üht kümne loomaga (viis looma kummastki soost) satelliitrühma ja jälgida sellel 14 päeva jooksul pärast kokkupuudet mürgistusnähtude pöörduvust, püsivust või hilist avaldumist. Kasutatakse ka üht kümne kontroll-loomaga (viis looma kummastki soost) satelliitrühma.

1.6.2.3. Kokkupuutekontsentratsioon Kasutatakse vähemalt kolme kontsentratsiooni ja kontrolli või kandja kasutamisel kandja kontrolli (mis vastab kandja kontsentratsioonile testaine kõrgeimal kontsentratsioonitasemel). Kui testainega töötlemine välja arvata, tuleks kontrollrühma loomi kohelda samamoodi nagu katserühma loomi. Kõrgeim kontsentratsioon peaks põhjustama mürgistusnähte, kuid ei tohiks põhjustada suremust või siis peaks suremus olema väike. Väikseima kontsentratsiooni puhul ei tohiks mürgisust ilmneda. Kasutuskõlbuliku hinnangulise inimkokkupuute kontsentratsiooni olemasolul peaks madalaim kontsentratsioon olema sellest kõrgem. Ideaaljuhul peaks keskmine kontsentratsioon põhjustama minimaalseid täheldatavaid mürgistusnähte. Rohkem kui ühe vahepealse kontsentratsiooni kasutamisel peaksid kontsentratsioonitasemed jaotuma nii, et tekkivad mürgistusnähud jaotuvad astmeliselt. Tulemuste usaldusväärse hindamise võimaldamiseks peaks suremus madala ja vahepealsete annusemääradega ning kontrollrühmades, kui seda esineb, olema madal.

1.6.2.4. Kokkupuute kestus Igapäevase kokkupuuteaja kestus peaks olema kuus tundi, kuid spetsiifiliste vajaduste puhul võib vajalik olla teistsugune kestus.

1.6.2.5. Seadmed Loomkatsetes tuleks kasutada hingamisseadet, mis suudab tagada dünaamilise õhuvoo vähemalt 12 täieliku õhuvahetusega tunnis ning tagab küllaldase hapnikusisalduse ja homogeense kokkupuutekeskkonna. Kambri kasutamisel peaks selle ehitus piirama katseloomade ühte kohta kogunemist ja tagama võimalikult hea inhalatoorse kokkupuute testainega. Stabiilse kambriatmosfääri tagamiseks ei tohiks katseloomade maht üldjuhul ületada 5 % kambri üldmahust. Kasutada võib väliseid hingamiselundeid, ainult pead või kogu keha haaravat individuaalset kambrit; esimesed kaks piiravad testaine sattumist organismi muid teid pidi.

1.6.2.6. Vaatlusperiood Kõigil katseloomadel tuleb nii kokkupuute- kui ka taastumisperioodil iga päev jälgida mürgistusnähtude ilmnemist. Mürgistusnähtude ilmnemise ja kadumise ning surma aeg on väga olulised ning tuleks registreerida.

1.6.3. Katse käik Loomad viiakse testainega kokkupuutesse 28päevase perioodi jooksul kord päevas 5–7 päeval nädalas. Mis tahes satelliitrühma loomadele, kellega planeeritakse hilisemaid vaatlusi, ei tohiks järgneva 14 päeva jooksul ainet manustada, et kontrollida mürgistusnähtudest paranemist või nende püsivust. Katsetemperatuuri tuleks hoida 22 ± 3 oC juures. Ideaaljuhul tuleks suhteline õhuniiskus hoida 30 % ja 70 % vahel, kuid mõningatel juhtudel (nt katsetes mõnede aerosoolidega) ei saa seda rakendada. Väikese alarõhu (≤ 5 mm H2O) kasutamine kambris välistab testaine lekke ümbritsevasse keskkonda. Süüa ja juua kokkupuute ajal anda ei tohiks. Kasutada tuleks analüütilise kontsentratsioonijuhtimissüsteemiga dünaamilist hingamisseadet. Sobivate kokkupuutekontsentratsioonide leidmiseks on soovitatav teha eelkatse. Õhu voolukiirust tuleks reguleerida nii, et tingimused on kogu kokkupuutekambri ulatuses homogeensed. Seade peaks võimalikult kiiresti saavutama stabiilsed kokkupuutetingimused. Mõõta või kontrollida tuleb järgmist: Kokkupuute ajal ja järel loomi jälgitakse ja vaatlustulemused registreeritakse süstemaatiliselt, iga looma kohta tuleb pidada eraldi arvestust. Kõiki loomi tuleb iga päev jälgida ja registreerida kõik mürgistusnähud ja nende ilmnemise aeg, raskusaste ja kestus. Vaadelda tuleks muutusi nii nahas ja karvkattes, silmades ja limaskestades kui ka hingamis- ja vereringeelundkonnas, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somato-motoorses aktiivsuses ja käitumises. Loomi tuleks iga nädal kaaluda. Soovitatav on iga nädal mõõta ka toidu tarbimist. Loomi tuleb regulaarselt vaadelda, et võimaluse piirides vältida loomade kadu sellistel põhjustel nagu kannibalism, kudede autolüüs või loomade kaotsiminek nende ümberpaigutamisel. Uuringuperioodi lõpus surmatakse ja lahatakse kõik ellujäänud loomad, v.a satelliitrühma loomad. Surevad ja tõsistes kannatustes või valudes loomad tuleks avastamisel kõrvaldada, humaanselt surmata ja lahata. Kõigile loomadele, sh kontrollrühma loomadele, tehakse katseperioodi lõpus järgmine uuring: Muud analüüsinäidud, mida võib pädeva toksikoloogilise hinnangu andmiseks vaja minna, on järgmised: kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, veresuhkur (tühja kõhuga), lipiidianalüüs, hormoonid, happe/aluse tasakaal, methemoglobiin ja koliini esteraasi aktiivsus. Vajaduse korral võib vaadeldavate mürgistusnähtude põhjalikumaks uurimiseks kasutada täiendavaid kliinilisi biokeemilisi näitajaid.

1.6.3. a)

õhu voolukiirust (pidevalt);

testaine tegelikku kontsentratsiooni hingamistsoonis. Igapäevase kokkupuute ajal ei tohiks kontsentratsioon keskmise suhtes kõikuda rohkem kui ± 15 %. Mõnede aerosoolide puhul ei ole nii täpne reguleerimine siiski võimalik, sellisel juhul on lubatav suurem kõikumisvahemik. Kogu katse kestel tuleks kontsentratsioone päevast päeva võimalikult konstantsena hoida. Aerosoolide puhul tuleks igas katserühmas vähemalt üks kord nädalas kontrollida osakeste suurusi;

temperatuuri ja õhuniiskust, võimaluse korral pidevalt.

hematoloogia, sealhulgas vähemalt hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide üld- ja suhtarv ja hüübimisvõime;

ii)

kliiniline verebiokeemia, sh vähemalt üks maksa ja neerude funktsiooni parameeter: alaniini aminotransferaas (varem tuntud glutamaat-püruvaadi transaminaasina), seerumi aspartaadi aminotransferaas (varem tuntud glutamaat-oksaloatsetaadi transaminaasina), kusiainelämmastik, albumiin, kreatiniin, üldbilirubiin ja seerumi üldvalk.

1.6.3.1. Üldlahang Kõik katseloomad tuleks üleni lahata. Vähemalt maks, neerud, neerupealised, kopsud ja munandid tuleks kohe pärast lahti lõikamist kuivamise vältimiseks märjalt kaaluda. Elundid ja koed (hingamisteed, maks, neerud, põrn, munandid, neerupealised, süda ja mis tahes muud makropatoloogiliste kahjustustega või muutunud suurusega elundid) tuleks säilitada sobivas keskkonnas võimaliku hilisema histopatoloogilise uuringu jaoks. Kopsud tuleks eemaldada tervelt, kaaluda ja töödelda koestruktuuri säilitamiseks sobiva fiksaatoriga.

1.6.3.2. Histopatoloogiline uuring Kõrgeima kontsentratsiooniga rühma ja kontrollrühma(de) loomade säilitatud elundeid ja kudesid tuleks histoloogiliselt uurida. Kõrgeima annusega rühmal testainega seostatavate kahjustustega elundeid ja kudesid tuleks kontrollida ka kõigil madalama annusega rühmadel. Võimaliku satelliitrühma loomi tuleks samuti histoloogiliselt uurida, pöörates eriti tähelepanu nendele elunditele ja kudedele, milles muudes katserühmades esines muutusi.

2. ANDMED Andmed tuleks esitada kokkuvõtliku tabelina, mis iga katserühma puhul näitab katseloomade arvu selle katse algul ja igat tüüpi kahjustustega loomade arvu. Kõiki vaatlustulemusi tuleks hinnata sobiva statistilise meetodi abil. Kasutada võib kõiki tunnustatud statistilisi meetodeid.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

liiki, liini, päritolu, keskkonnatingimusi, toidusedelit jne;

katsetingimusi: katseseadme kirjeldust, sealhulgas selle ehitust, tüüpi, mõõtmeid, õhuallikat, aerosoolide tekitamise seadet, kliima reguleerimise meetodit, väljuva õhu töötlemise meetodit ja katsekambri kasutamisel loomade katsekambris pidamise meetodit. Kirjeldada tuleks temperatuuri, õhuniiskuse ja vajaduse korral aerosooli kontsentratsiooni ja osakeste suurusjaotuse määramise seadmeid. Andmed kokkupuute kohta Andmed tuleks esitada koondtabelina koos vastavate keskmiste ja hajuvuse näitajatega (nt standardhälve) ning võimaluse korral peaksid andmed sisaldama järgmist:

3.1. pt_2 a)

õhu voolukiirusi hingamisseadmes;

temperatuuri ja õhuniiskust;

nimikontsentratsioone (hingamisseadmesse viidud testaine summaarne kogus jagatuna õhu ruumalaga);

kandeaine kasutamisel viimase iseloomu;

tegelikke kontsentratsioone katse hingamistsoonis;

masskeskmist aerodünaamilist diameetrit (MMAD) ja geomeetrilist standardhälvet (GSD):

mürgistusnähtude andmeid soo ja kontsentratsiooni järgi;

surmahetke uuringu aega või seda, kas loomad jäid kuni surmamiseni ellu;

mürgistus- või muid nähte; toimeta annust;

iga kõrvalekalde täheldamise aega ja kõrvalekalde hilisemat kulgu;

sööda ja kehamassi andmeid;

kasutatud hematoloogilisi analüüse ja nende tulemusi;

kasutatud kliinilise biokeemia analüüse ja nende tulemusi;

lahkamistulemusi;

kõigi histopatoloogiliste leidude üksikasjalikku kirjeldust;

võimaluse korral tulemuste statistilist analüüsi;

tulemuste analüüsi;

järeldusi.

3.2. HINDAMINE JA JÄRELDUSED Vt B osa üldist sissejuhatust (D).

4. VIITED Vt B osa üldist sissejuhatust (E).

B.9. KORDUSDOOSI MÜRGISUS (28 PÄEVA, NAHAKAUDNE)

B.9.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Vt B osa üldist sissejuhatust (A).

1.2. MÕISTED Vt B osa üldist sissejuhatust (B).

1.3. VÕRDLUSAINED Puuduvad.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Testainet kantakse 28 päeva jooksul iga päev astmeliste annustena mitme rühma katseloomade nahale nii, et üks rühm saab ühesuguse annuse. Manustamisperioodil jälgitakse loomi iga päev, et kontrollida mürgistusnähtude ilmnemist. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.

1.5. KVALITEEDINÕUDED Puuduvad.

1.6. MEETODI KIRJELDUS

1.6.

1.6.1. Ettevalmistused Loomi hoitakse enne katset vähemalt viis päeva katsele vastavatel pidamis- ja söötmistingimustel. Noored terved katseloomad randomiseeritakse enne katset ja jagatakse katse- ja kontrollrühmadesse. Vahetult enne katset eemaldatakse pügamise teel katselooma keha seljaosalt karvkate. Kasutada võib ka raseerimist, seda tuleks teha 24 tundi enne katset. Korduspügamist või -raseerimist on tavaliselt vaja ligikaudu nädalaste vahedega. Karvkatte pügamisel või raseerimisel tuleb vältida naha marrastamist. Testaine nahale kandmiseks tuleb vabastada vähemalt 10 % kehapinnast. Vabastatava ala ja katte mõõtmete valikul tuleks arvesse võtta looma massi. Tahkete, vajaduse korral peenestatud ainete puhul tuleks testainet nahaga hea kokkupuute saavutamiseks niisutada piisava koguse vee või sobiva kandjaga. Vedelaid testaineid kasutatakse üldjuhul lahjendamata kujul. Testainet kantakse nahale kord päevas, 5–7 päeval nädalas.

1.6.2. Katsetingimused

1.6.2.

1.6.2.1. Katseloomad Kasutada võib täiskasvanud rotti, küülikut või merisiga. Kasutada võib ka muid liike, kuid seda tuleb põhjendada. Kasutatavate katseloomade masside erinevus katse alguses ei tohiks ületada ± 20 % vastavast keskmisest.

1.6.2.2. Katseloomade arv ja sugu Iga uuritavat annusemäära katsetakse vähemalt kümnel terve nahaga loomal (viiel emas- ja viiel isasloomal). Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Kui uuringu jooksul plaanitakse loomi surmata, tuleks loomade arvu enne uuringu lõppu surmamisele määratud loomade arvu võrra suurendada. Lisaks võib testaine kõrgeima annusega mõjutada 28 päeva jooksul üht kümne loomaga (viis looma kummastki soost) satelliitrühma ja jälgida sellel 14 päeva jooksul pärast kokkupuudet mürgistusnähtude pöörduvust, püsivust või hilist avaldumist. Kasutatakse ka üht kümne kontroll-loomaga (viis looma kummastki soost) satelliitrühma.

1.6.2.3. Annused Kasutatakse vähemalt kolme annusemäära ja kontrolli või kandja kasutamisel kandja kontrolli. Kokkupuuteperioodi kestus peaks olema vähemalt kuus tundi päevas. Testainet tuleks peale kanda iga päev sarnastel kellaaegadel ja annuseid järk-järgult (üks või kaks korda nädalas) reguleerida, et annus jääks looma kehamassi suhtes konstantseks. Testainega töötlemine välja arvatud, tuleks kontrollrühma loomi kohelda samamoodi nagu katserühma loomi. Kui annustamise lihtsustamiseks kasutatakse kandjat, tuleks kandja kontrollrühmale manustada kandjat analoogselt katserühmaga ja nad peaksid saama sama koguse kandjat nagu kõrgeima annusemääraga rühm. Kõrgeim annus peaks põhjustama mürgistusnähte, kuid ei tohiks põhjustada suremust või siis peaks suremus olema väike. Väikseima doosi puhul ei tohiks mürgisust ilmneda. Kasutuskõlbliku hinnangulise inimkokkupuute annuse olemasolul peaks madalaim annus olema sellest kõrgem. Ideaaljuhul peaks keskmine annusemäär põhjustama minimaalseid täheldatavaid mürgistusnähte. Rohkem kui ühe vahepealse annuse kasutamisel peaks annusemäärad jaotuma nii, et tekkivad mürgistusnähud jaotuvad astmeliselt. Tulemuste usaldusväärse hindamise võimaldamiseks peaks suremus madala ja vahepealsete annusemääradega ning kontrollrühmades olema madal. Kui testaine nahale kandmine toob kaasa tugeva nahaärrituse, tuleks kontsentratsioone vähendada; selle tulemuseks võib olla muude mürgistusnähtude vähenemine või puudumine kõrgeima annusemäära kasutamisel. Lisaks võib tõsiste nahakahjustuste ilmnemisel olla vaja uuring lõpetada ja teha madalamatel kontsentratsioonidel uus uuring.

1.6.2.4. Piirsisalduskatse Kui eelkatse annusemääraga 1000 mg/kg või kõrgema, võimaliku teadaoleva inimkokkupuute kontsentratsiooniga seotud annusemääraga ei kutsu esile mürgistusnähte, võib edasise kontrollimise lugeda tarbetuks.

1.6.2.5. Vaatlusperiood Kõigil katseloomadel tuleb iga päev jälgida mürgistusnähtude ilmnemist. Mürgistusnähtude ilmnemise ja kadumise ning surma aeg on väga olulised ning tuleks registreerida.

1.6.3. Katse käik Loomi tuleks puurides pidada ühekaupa. Testainet kantakse loomade nahale 28 päeva jooksul, ideaaljuhul 7 päeval nädalas. Mis tahes satelliitrühma loomadele, kellega planeeritakse hilisemaid vaatlusi, ei tohiks järgneva 14 päeva jooksul ainet manustada, et kontrollida mürgistusnähtudest paranemist või nende püsivust. Kokkupuute kestus peaks olema vähemalt kuus tundi päevas. Testaine tuleks kanda ühtlaselt alale, mis moodustab ligikaudu 10 % kogu kehapinnast. Väga mürgiste ainete puhul võib katta väiksema osa kehapinnast, kuid võimalikult suur osa pinnast tuleks katta võimalikult õhukese ja ühtlase kihiga. Testainet tuleks kokkupuuteperioodi jooksul hoida poorse marlisideme ja mitteärritava kleeplindi abil naha vastas. Manustamiskoht tuleks veel lisaks sobival moel kinni katta, et hoida marlisidet ja testainet paigal ja vältida testaine allaneelamist katselooma poolt. Et vältida testaine allaneelamist, võib kasutada looma liikuvust piiravaid vahendeid, kuid looma täielikku fikseerimist ei soovitata. Kasutada võib ka kaitsekraed. Kokkupuuteperioodi lõpus tuleks testaine jääk nahalt võimaluse korral veega või muu sobiva puhastusmeetodi abil eemaldada. Kõiki loomi tuleb iga päev jälgida ja registreerida kõik mürgistusnähud ja nende ilmnemise aeg, raskusaste ja kestus. Vaadelda tuleks muutusi nii nahas ja karvkattes, silmades ja limaskestades kui ka hingamis- ja vereringeelundkonnas, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses aktiivsuses ja käitumises. Loomi tuleks iga nädal kaaluda. Soovitatav on iga nädal mõõta ka toidu tarbimist. Loomi tuleb regulaarselt vaadelda, et võimaluse piirides vältida loomade kadu sellistel põhjustel nagu kannibalism, kudede autolüüs või loomade kaotsiminek nende ümberpaigutamisel. Uuringuperioodi lõpus surmatakse ja lahatakse kõik ellujäänud loomad, v.a satelliitrühma loomad. Surevad ja tõsistes kannatustes või valudes loomad tuleks avastamisel kõrvaldada, humaanselt surmata ja lahata. Kõigile loomadele, sh kontrollrühma loomadele, tehakse katseperioodi lõpus järgmine uuring: Muud analüüsinäidud, mida võib pädeva toksikoloogilise hinnangu andmiseks vaja minna, on järgmised: kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, veresuhkur (tühja kõhuga), lipiidianalüüs, hormoonid, happe/aluse tasakaal, methemoglobiin ja koluni esteraasi aktiivsus. Vajaduse korral võib vaadeldava toime põhjalikumaks uurimiseks kasutada täiendavaid kliinilisi biokeemilisi näitajaid.

1.6.3.

1) hematoloogia, sealhulgas vähemalt hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide üld- ja suhtarv ja hüübimisvõime;

2) kliiniline verebiokeemia, sh vähemalt üks maksa ja neerude funktsiooni parameeter: alaniini aminotransferaas (varem tuntud glutamaatpüruvaadi transaminaasina), seerumi aspartaadi aminotransferaas (varem tuntud glutamaatoksaloatsetaadi transaminaasina, kusiainelämmastik, albumiin, kreatiniin, üldbilirubiin ja seerumi üldvalk.

1.6.4. Üldlahang Kõik katseloomad tuleks üleni lahata. Vähemalt maks, neerud, neerupealised ja munandid tuleks kohe pärast lahti lõikamist kuivamise vältimiseks märjalt kaaluda. Elundid ja koed, st normaalne ja töödeldud nahk, maks, neerud, põrn, munandid, neerupealised, süda ja muud sihtelundid (see tähendab makropatoloogiliste kahjustustega või muutunud suurusega elundid) tuleks säilitada sobivas keskkonnas võimaliku hilisema histopatoloogilise uuringu jaoks.

1.6.5. Histopatoloogiline uuring Kõrgeima annusega rühma ja kontrollrühma loomade säilitatud elundeid ja kudesid tuleks histoloogiliselt uurida. Kõrgeima annusega rühmal testainega seostatavaid kahjustusi sisaldavaid elundeid ja kudesid tuleks kontrollida ka kõigil madalama annusega rühmadel. Võimaliku satelliitrühma loomi tuleks samuti histoloogiliselt uurida, pöörates eriti tähelepanu nendele elunditele ja kudedele, milles muudes katserühmades esines muutusi.

2. ANDMED Andmed tuleks esitada kokkuvõtlikus tabelis, mis iga katserühma puhul näitab katseloomade arvu selle katse algul ja igat tüüpi kahjustustega loomade arvu. Kõiki vaatlustulemusi tuleks hinnata sobiva statistilise meetodi abil. Kasutada võib kõiki tunnustatud statistilisi meetodeid.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:

katseloomade kohta käivaid andmeid (liiki, liini, päritolu, keskkonnatingimusi, toidusedelit jne);

katsetingimusi (sealhulgas sideme tüüpi: oklusiivside või tavaline side);

annuseid (kandja kasutamisel koos kandjaga) ja kontsentratsioone;

võimaluse korral toimeta annust;

mürgistusnähtude andmeid soo ja annuse järgi;

surmahetke katse ajal või seda, kas loomad jäid kuni surmamiseni ellu;

mürgistus- või muid nähte;

iga kõrvalekalde täheldamise aega ja kõrvalekalde hilisemat kulgu;

sööda ja kehakaalu andmeid;

kasutatud hematoloogilisi analüüse ja nende tulemusi;

kasutatud kliinilise biokeemia analüüse ja nende tulemusi;

lahkamistulemusi;

kõigi histopatoloogiliste leidude üksikasjalikku kirjeldust;

võimaluse korral tulemuste statistilist käsitlust;

tulemuste analüüsi;

tulemuste tõlgendust.

3.2. HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE Vt B osa üldist sissejuhatust (D).

4. VIITED Vt B osa üldist sissejuhatust (E).

B.10. MUTAGEENSUS – IMETAJATE KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE IN VITRO

B.10.

1. MEETOD Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 473, In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test (1997).

1.

1.1. SISSEJUHATUS In vitro kromosoomaberratsioonkatse eesmärgiks on kindlaks määrata ained, mis põhjustavad struktuurseid kromosoomaberratsioone kultiveeritud imetajarakkudes (1, 2, 3). Struktuursed aberratsioonid võivad olla kahte tüüpi: kromosoom- või kromatiidaberratsioonid. Keemiliste mutageenide põhjustatud aberratsioonid on enamasti kromatiidaberratsioonid, aga esineb ka kromosoomaberratsioone. Polüploidsuse suurenemine võib viidata sellele, et kemikaal võib esile kutsuda numbrilisi aberratsioone. Käesolev meetod ei võimalda siiski mõõta numbrilisi aberratsioone ja seda ei kasutata sel eesmärgil korrapäraselt. Kromo-soommutatsioonid ja nendega seotud juhud on süüdi paljudes inimeste geneetilistes haigustes ja on olemas olulisi tõendeid, et kromosoommutatsioonid ja nendega seotud juhud, mis põhjustavad muutusi keharakkude onkogeenides ja kasvaja supressorgeenides, osalevad vähktõve tekkes inimestel ja katseloomadel. In vitro kromosoommutatsiooni katsetes võib kasutada loodud rakuliinide kultuure, rakutüvesid või primaarsete rakkude kultuure. Kasutatavad rakud valitakse rakkude kasvuvõime, karüotüüpide püsivuse, kromosoomiarvu, kromosoomide mitmekesisuse ja kromosoomaberratsioonide spontaanse sageduse põhjal. Läbiviidud in vitro katsed üldjuhul nõuavad eksogeenset metaboolset aktiveerimist. Kõnealune metaboolse aktiveerimise süsteem ei saa tervenisti jäljendada in vivo tingimusi imetajatel. Tuleb hoolt kanda selle eest, et välditakse positiivseid tulemusi põhjustavaid tingimusi, mis ei peegelda looduslikku mutageensust ja võivad tuleneda pH muutustest, osmolaalsusest või tsütotoksilisuse kõrgetest tasemetest (4, 5). Kõnealust katset kasutatakse imetajate võimalike mutageenide ja kantserogeenide skriinimiseks. Mitmed ühendid, mis annavad kõnealuses katses positiivseid tulemusi, on imetajate kantserogeenid; siiski ei ole kõnealuse katse ja kantserogeensuse vahel täielikku korrelatsiooni. Korrelatsioon sõltub ühendi keemilisest klassist ja üha enam uurimistulemusi viitab sellele, et on olemas kantserogeenid, mida kõnealuse katse abil ei avastata, kuna need näivad mõjuvat muude mehhanismide kui otsese DNA kahjustuse kaudu. Vt ka üldist sissejuhatust B osas.

1.2. MÕISTED Kromatiidaberratsioon – struktuurne kromosoomikahjustus, mis ilmneb üksikute kromatiidide katkemises või kromatiididevahelises katkemises ja taasühinemises. Kromosoomaberratsioon – struktuurne kromosoomikahjustus, mis ilmneb mõlema kromosoomi katkemises või mõlema kromatiidi samas kohas katkemises ja taasühinemises. Endoreduplikatsioon – protsess, milles pärast DNA replikatsiooni S-faasi tuum ei lähe mitoosi, vaid algab uus S-faas. Selle tulemusena tekivad kromosoomid, milles on 4, 8, 16, ... kromatiidi. Tühik – akromaatiline kahjustus, mis on väiksem kui kromatiidi laius ja millel on kromatiidide orientatsiooni erinevus minimaalne. Mitootiline indeks – metafaasis olevate rakkude arv jagatakse rakupopulatsioonis vaadeldud rakkude koguarvuga; näitab rakkude proliferatsiooni astet kõnealuses populatsioonis. Numbriline aberratsioon – kasutatud rakkude tüüpilisest kromosoomiarvust erinev kromosoomide arv. Polüploidsus – haploidse kromosoomiarvu (n) kordsus, v.a diploidne kromosoomiarv (nt 3n, 4n jne). Struktuurne aberratsioon – kromosoomistruktuuri muutus, mis on avastatav raku jagunemise metafaasi etapi mikroskoopilisel uurimisel ja mida täheldatakse deletsiooni ja fragmentidena, kromosoomisiseste või -väliste muutustena.

1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Rakukultuurid allutatakse uuritava aine toimele nii metaboolse aktiveerimise tingimustes kui ka ilma selleta. Pärast rakukultuuridele uuritava ainega toimimist töödeldakse neid kindlaksmääratud ajavahemike järel metafaasi peatava ainega (nt Colcemid® või kolhitsiin), rakud kogutakse ja värvitakse ning metafaasis olevaid rakke analüüsitakse mikroskoopiliselt kromosoomaberratsioonide suhtes.

1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.4.

1.4.1. Ettevalmistused

1.4.1.

1.4.1.1. Rakud Katses võib kasutada erinevaid rakuliine, rakutüvesid või primaarsete rakkude kultuure, sh inimrakke (nt hiina hamstri fibroplaste, inimeste või muude imetajate perifeerse vere lümfotsüüte).

1.4.1.2. Kasvukeskkonnad ja söötmed Rakukultuuride säilitamiseks tuleks kasutada vastavaid kasvukeskkondi ja inkubeerimistingimusi (kasvunõud, CO2 kontsentratsioon, temperatuur ja niiskus). Püsivaid rakuliine ja -tüvesid tuleb kontrollida regulaarselt modaalse kromosoomiarvu stabiilsuse ning mükoplasma saastumise puudumise suhtes; kui see on saastunud, siis ei tohiks seda kasutada. Rakkude normaalse rakutsükli kestus ja kasutatavad kasvutingimused peaksid teada olema.

1.4.1.3. Rakukultuuride valmistamine Püsivad rakuliinid ja -tüved: rakud paljundatakse tüvikultuuridest, mis on külvatud kasvukeskkonda sellise tihedusega, et rakukultuurid ei saavuta konfluentsust enne kogumisaega, ja inkubeeritakse 37 oC juures. Lümfotsüüdid: antikoagulandiga (nt hepariin) töödeldud täisveri või tervetelt isenditelt saadud eraldatud lümfotsüüdid lisatakse mitogeeni (nt fütohemaglutiniini) sisaldavale kasvukeskkonnale ja inkubeeritakse 37 oC juures.

1.4.1.4. Metaboolne aktiveerimine Rakud allutatakse uuritava aine toimele nii vastava metaboolse aktiveerimissüsteemi olemasolu kui ka puudumise korral. Enim kasutatav süsteem on ensüüme indutseerivate ainete, nt Aroclor 1254ga (6, 7, 8, 9) või fenobarbitooni ja β-naftoflavooni seguga (10, 11, 12) töödeldud näriliste maksast valmistatud postmitokondriaalne osa (S9), millele on lisatud kofaktor. Tavaliselt kasutatakse postmitokondriaalset fraktsiooni kontsentratsioonis 1–10 mahuprotsenti lõplikus katsekeskkonnas. Metaboolse aktiveerimissüsteemi tingimused võivad sõltuda uuritava keemilise aine klassist. Mõnel juhul on vaja kasutada postmitokondriaalse fraktsiooni rohkem kui üht kontsentratsiooni. Rida meetodeid, sh geneetiliselt muudetud rakuliini loomine, mis ekspresseerivad teatavaid aktiveerimisensüüme, võivad omada endogeense aktiveerimise võimet. Kasutatavate rakuliinide valik peab olema teaduslikult põhjendatud (nt tsütokroom P450 isoensüümi tähtsus uuritava aine metabolismi puhul).

1.4.1.5. Uuritav aine/preparaat Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne rakkude töötlemist. Vedelad uuritavad ained võib lisada vahetult katsesüsteemidesse ja/või lahjendada enne töötlemist. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.

1.4.2. Katsetingimused

1.4.2.

1.4.2.1. Lahusti/kandjaaine Lahusti/kandjaaine ei tohiks uuritava ainega keemiliselt reageerida ning see peaks sobima rakkude eluvõimelisuse ja S9 aktiivsusega. Kui kasutatakse tuntud lahustist/kandjaainest erinevat, siis peab nende kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine kasutamist. Vees ebapüsivate ainete uurimisel kasutatavad orgaanilised lahustid peavad olema veevabad. Vett saab eemaldada molekulaarsõelte lisamisega.

1.4.2.2. Toimimiseks kasutatavad kontsentratsioonid Suurima kontsentratsiooni määramisel on arvestatavad kriteeriumid tsütotoksilisus, lahustuvus katsesüsteemis ning pH või osmolaalsuse muutused. Tsütotoksilisus määratakse põhikatses kindlaks nii metaboolse aktiveerimisega kui ka ilma selleta, kasutades sobivaid rakkude puhtuse ja kasvu indikaatoreid, nt konfluentsuse astet, eluvõimeliste rakkude arvu või mitootilist indeksit. Tsütotoksilisust ja lahustuvust võib olla kasulik määrata eelkatses. Tuleks kasutada vähemalt kolme analüüsitavat kontsentratsiooni. Kui esineb tsütotoksilisust, peaksid need kontsentratsioonid katma vahemiku suurimast kontsentratsioonist vähimani või sellise kontsentratsioonini, mille korral mürgisus puudub; mis tavaliselt tähendab seda, et kontsentratsioonide erinevus üksteisest võib olla mitte rohkem kui vahemikus 2 kuni √10 asuv koefitsient. Rakkude kogumise ajal peaks suurima kontsentratsiooni korral ilmnema märkimisväärne konfluentsuse astme, rakkude arvu või mitootilise indeksi (kõigi osas rohkem kui 50 %) vähenemine. Mitootiline indeks on üksnes tsütotoksiliste/tsütostaatiliste mõjude kaudne mõõt ja sõltub töötlemisele järgnevast ajast. Mitootilist indeksit tunnustatakse siiski suspensioonkultuuride puhul, milles muude toksilisust mõõtvate vahendite kasutamine võib olla tülikas ja ebapraktiline. Teavet rakutsükli kineetika kohta, nagu näiteks keskmist generatsiooniaega (AGT), tuleks kasutada lisateabena. AGT on siiski üldine keskmine, mis alati ei too esile hilistunud alampopulatsioonide olemasolu, ning isegi keskmise generatsiooniaja kerge pikenemine võib lükata aberratsioonide optimaalse tõestamisaja palju hilisemaks. Suhteliselt mittetoksiliste ainete puhul peaks suurim testkontsentratsioon olema 5 μl/ml, 5 mg/ml või 0,01 M, sõltuvalt sellest, milline neist on väikseim. Suhteliselt lahustumatute ainete puhul, mis ei ole lahustumispiirile vastavast kontsentratsioonist madalamatel kontsentratsioonidel toksilised, peaks suurim kasutatud annus olema lahustumispiiri ületav kontsentratsioon viimases kasvukeskkonnas manustamisperioodi lõpus. Mõnedel juhtudel (nt siis, kui toksilisus esineb üksnes madalaimast lahustumatuskontsentratsioonist kõrgematel kontsentratsioonidel), on soovitav katseid teha rohkem kui ühe kontsentratsiooniga, millel on nähtav sadestus. On kasulik hinnata lahustuvust töötlemise alguses ja lõpus, kuna lahustuvus katsesüsteemis muutub töötlemise ajal rakkude, S9-seerumi jms mõjul. Lahustumatust saab avastada palja silmaga. Sadestus ei tohiks mõjutada tulemust.

1.4.2.3. Negatiivsed ja positiivsed kontrollkatsed Igas uuringus kasutatakse paralleelseid positiivseid ja negatiivseid (lahusti või kandjaaine) kontrollkatseid koos metaboolse aktiveerimisega või ilma selleta. Kui kasutatakse metaboolset aktiveerimist, käsitatakse positiivse kontrollainena sellist kemikaali, mis eeldab aktiveerimist mutageense reaktsiooni saamiseks. Positiivsed kontrollkatsed peaksid kasutama tuntud elastogeeni toimimistasemetel, mis ootuspäraselt peaks reprodutseeritavust ja avastatavust suurendama fooniga võrreldes, mis näitab katsesüsteemi tundlikkust. Kontsentratsioonid positiivsetes kontrollkatsetes valitakse sellised, et mõjud on selged, kuid neist ei ilmne riideris kohe kodeeritud objektiklaaside identsus. Positiivsete kontrollainete näited: Metaboolse aktiveerimise tingimus Aine CASi nr EINECSi nr Eksogeense metaboolse aktiveerimise puudumine Metüülmetaansulfonaat 66-27-3 200-625-0 Etüülmetaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 N-etüül-N-nitrosokarbamiid 759-73-9 212-072-2 Mitomütsiin-C 50-07-7 200-008-6 4-nitrokinoliin-N-oksiid 56-57-5 200-281-1 Eksogeense metaboolse aktiveerimise olemasolu Benso(α)püreen 50-32-8 200-028-5 Tsüklofosfamiid Tsüklofosfamiidmonohüdraat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Võidakse kasutada muid sobivaid positiivseid kontrollaineid. Samasse keemiliste ainete klassi kuuluvate positiivsete kontrollkemikaalide kasutamist tuleks kaaluda, kui sellised ained on kättesaadavad. Igal kogumisperioodil võetakse ka negatiivsetest kontrollkatsetest proovid, mis koosnevad üksnes kasvukeskkonnas olevast lahustist või kandjaainest ning mida on töödeldud samal viisil kui kasvukultuure. Lisaks sellele kasutatakse ka töötlemata kontrollproove, välja arvatud juhul, kui varasemad kontrollandmed näitavad, et valitud lahustil ei indutseeri kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.

1.4.3. Menetlus

1.4.3.

1.4.3.1. Töötlemine uuritava ainega Paljunevaid rakke töödeldakse uuritava ainega nii metaboolse aktiveerimise süsteemis kui ka ilma selleta. Lümfotsüütide töötlemist alustatakse ligikaudu 48 tundi pärast mitogeenset stimulatsiooni.

1.4.3.2. Tavaliselt tuleks kasutada iga kontsentratsiooni korral paralleelseid kultuure ja see on rangelt soovitatav negatiivsete/lahusti kontrollkultuuride puhul. Kui varasemad andmed näitavad, et paralleelkultuuride vahel on väike erinevus (13, 14), siis võib olla vastuvõetav iga kontsentratsiooni korral ühe kultuuri kasutamine. Gaasilisi või lenduvaid aineid uuritakse sobiva meetodi abil, näiteks suletud kasvuanumates (15, 16).

1.4.3.3. Kultuuride kogumise aeg Esimeses katses alluvad rakud uuritava aine toimele nii metaboolse aktiveerimise teel kui ka ilma selleta 3–6 tunni jooksul ning proovid võetakse pärast töötlemise algust (12) ajal, mis vastab ligikaudu 1,5 normaalse rakutsükli kestusele. Kui kõnealusel meetodil saadakse negatiivsed tulemused nii aktiveerimisega kui ka ilma selleta, tehakse uus katse ilma aktiveerimiseta ja töötlemist jätkatakse kuni proovivõtmise hetkeni, mis vastab ligikaudu 1,5 normaalse rakutsükli kestusele. Teatud keemilisi aineid saab hõlpsamini avastada, kui töötlemis-/proovivõtuaeg on pikem kui 1,5 rakutsüklit. Metaboolse aktiveerimise korral saadud negatiivseid tulemusi tuleb kooskõlastada igal üksikjuhul eraldi. Neil juhtudel, kui negatiivsete tulemuste kooskõlastamist ei peeta vajalikuks, esitatakse põhjendus.

1.4.3.4. Kromosoomipreparaatide valmistamine Rakukultuure töödeldakse ainega Colcemid® või kolhitsiiniga tavaliselt 1–3 tundi enne kogumist. Iga rakukultuuri kogutakse ja töödeldakse eraldi kromosoomipreparaatide jaoks. Kromosoomipreparaatide valmistamise alla kuulub rakkude hüpotooniline töötlemine, fikseerimine ja värvimine.

1.4.3.5. Analüüs Kõik objektiklaasid, sh positiivsete ja negatiivsete kontrollkatsete omad, kodeeritakse sõltumatult enne mikroskoopilist analüüsi. Kui fikseerimismenetlused viivad tihti metafaasis olevate rakkude suhte rikkumiseni ja kromosoomide kaotamiseni, peaksid seega loetud rakud sisaldama tsentromeere koguses, mis vastab modaalarvule ± 2 kõikide rakutüüpide korral. Iga kontsentratsiooni ja kontrollkatse puhul tuleb lugeda vähemalt 200 hästi levinud metafaasi, mis on võrdselt jaotunud paralleelkultuuride vahel, kui neid kasutatakse. Seda arvu saab vähendada, kui täheldatakse palju aberratsioone. Kuigi katse eesmärk on avastada struktuursed kromosoomaberratsioonid, on tähtis registreerida ka polüploidsus ja endoreduplikatsioon, kui need esinevad.

2. ANDMED

2.

2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE Katseühikuks on rakk, mistõttu hinnatakse nende rakkude protsendimäära, milles on struktuurne kromosoomaberratsioon või struktuursed kromosoomaberratsioonid. Eri tüüpi struktuursed kromosoomaberratsioonid loetletakse koos nende arvukuse ja esinemissagedustega katse- ja kontrollkultuurides. Tühikud registreeritakse eraldi ja nende kohta antakse teavet, aga üldiselt ei arvestata neid aberratsioonide üldsageduse hulka. Samuti registreeritakse kõikides töödeldud ja negatiivsetes kontrollkultuurides tehtud samaaegsed tsütotoksilisuse mõõtmised peamistes aberratsioonikatsetes. Tulemused esitatakse iga üksiku kultuuri kohta. Lisaks esitatakse kokkuvõte kõikidest tulemustest tabeli kujul. Selget positiivset vastust ei ole vaja verifitseerida. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval uurimisel muudetud katsetingimustes. Vajadust negatiivsete tulemuste kinnitamise järele on arutatud punktis 1.4.3.3. Katse parameetrite muutmist hinnatud tingimuste vahemiku laiendamiseks tuleb arvesse võtta järelkatsetel. Katse parameetrite, mida võidakse muuta, hulka kuuluvad kontsentratsioonivahemik ja metaboolse aktiveerimise tingimused.

2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE On mitmeid kriteeriume positiivse tulemuse määramiseks, nagu nt kontsentratsioonist sõltuv kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude arvu suurenemine või selle reprodutseeruv kasv. Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel (3, 13). Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse jaoks. Polüploidsete rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et katseainel on võime inhibeerida mitoosiprotsessi ja põhjustada numbrilisi kromosoomaberratsioone. Endoreduplitseeritud kromosoome sisaldavate rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritav aine võib takistada rakutsükli progressi (17, 18). Uuritavat ainet, mille tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumidele, peetakse mittemutageenseks aineks käesolevas süsteemis. Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tulemused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud korduskatsete arvust hoolimata. In vitro kromosoomaberratsiooni katse positiivsed tulemused viitavad sellele, et uuritav aine põhjustab struktuurseid kromosoomaberratsioone imetajate kultiveeritud keharakkudes. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et katsetingimuste põhjal ei põhjusta uuritav aine kromsoomaberratsioone imetajate kultiveeritud keharakkudes.

3. ARUANDLUS

3. KATSEARUANNE

Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.

Lahusti/kandjaaine:

kandjaaine valiku põhjendamine;

uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on teada.

Rakud:

rakkude tüüp ja allikas;

karüotüübi omadused ja kasutatava rakutüübi sobivus;

mükoplasma puudumine, vajaduse korral;

teave rakutsükli pikkuse kohta;

veredoonorite sugu, täisveri või eraldatud lümfotsüüdid, kasutatav mitogeen;

passaažide arv, vajaduse korral;

rakukultuuri säilitamise meetodid, vajaduse korral;

kromosoomide modaalarv

Katsetingimused:

metafaasi peatav aine, selle kontsentratsioon ja rakule toimimise kestus;

kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valimise põhimõtted, sh nt tsütotoksilisuse andmed ja lahustuvuse piirangud, kui need on olemas;

kasvukeskkonna koostis, CO2 kontsentratsioon, vajaduse korral;

uuritava aine kontsentratsioon;

lisatud kandjaaine ja uuritava aine maht;

inkubatsioonitemperatuur;

inkubatsiooniaeg;

töötlemise kestus;

rakutihedus külvamisel, vajaduse korral;

metaboolse aktiveerimise süsteemi tüüp ja koostis, sh selle vastuvõetavuse kriteeriumid;

positiivsed ja negatiivsed kontrollkatsed;

objektiklaaside valmistamise meetodid;

aberratsioonide loendamise kriteeriumid;

analüüsitud metafaaside arv;

toksilisuse mõõtmise meetodid;

kriteeriumid, mille alusel uuringuid liigitatakse positiivseteks, negatiivseteks või ebaselgeteks.

Tulemused:

toksilisuse tunnused, nt konfluentsuse aste, rakutsüklit käsitlev teave, rakkude loendused, mitootiline indeks;

sadestumise tunnused;

teave kasvukeskkonna pH ja osmolaalsuse kohta, kui see on määratud;

aberratsioonide, sh tühikute määratlemine;

kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude arv ja kromosoomaberratsioonide tüüp, mis on toodud eraldi iga katse- ja kontrollkultuuri kohta;

ploidsuse muutused, kui neid esineb;

doosi ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;

võimalikud statistilised analüüsid;

paralleelsete negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollide tulemused;

varasemate negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollkatsete andmed, sh vahemik, keskväärtused ja standardhälbed.

Tulemuste arutelu.

Järeldused.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)

VIITED Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1–29. Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427–432. Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Naka-mura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1–175. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257,pp. 147–204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, pp. 297–305. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347–364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (19 8 3), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173–215. Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dime-thylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83–90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, pp. 277–290. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlori-nated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85–88. Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofu-mi, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241–261. Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141–154. Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139–149. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91–103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795–801. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403–413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362–1364.

B.11. MUTAGEENSUS – KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE IMETAJATE LUUÜDIS IN VIVO

B.11.

1. MEETOD Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 475, Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test (1997).

1.

1.1. SISSEJUHATUS Imetajate in vivo kromosoomaberratsioonkatset kasutatakse uuritava aine põhjustatud strukturaalsete kromosoomaberratsioonide avastamiseks imetajate, tavaliselt näriliste luuüdirakkudes (1, 2, 3, 4). Strukturaalsed kromosoomaberratsioonid võivad olla kahte tüüpi: kromosoom- või kromatiidaberratsioonid. Polüploidsuse suurenemine võib viidata sellele, et kemikaal võib esile kutsuda numbrilisi aberratsioone. Keemiliste mutageenide põhjustatud aberratsioonid on enamasti kromatiidaberratsioonid, aga esineb ka kromosoomaberratsioone. Kromosoommutatsioonid ja nendega seotud juhud põhjustavad paljusid inimeste geneetilisi haigusi ja on olemas olulisi tõendeid selle kohta, et kromosoommutatsioonid ja nendega seotud juhud, mis põhjustavad muutusi keharakkude onkogeenides ja kasvaja supressorgeenides, osalevad vähktõve tekkes inimestel ja katseloomadel. Kõnealuses katses kasutatakse tavaliselt närilisi. Kõnealuses katses on sihtkoeks luuüdi, kuna selle verevarustus on väga rikkalik ja see sisaldab rakupopulatsiooni, mille rakutsükkel on kiire ning mida on kerge isoleerida ja töödelda. Käesoleva meetodi puhul ei kasutata muid liike ega sihtkudesid. Käesolev kromosoomaberratsioonkatse on eriti oluline mutageensuse ohu hindamisel, kuna see võimaldab arvesse võtta in vivo metabolismi, farmakokineetika ja DNA parandamisprotsesside tegureid, kuigi need võivad erineda liigiti ja kudede vahel. In vivo katset võidakse samuti kasutada in vitro katses avastatud mutageense mõju täiendaval uurimisel. Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav aine või reageerimisvõimeline metaboliit ei pääse sihtkoesse, ei ole sobiv kasutada käesolevat katset. Vt ka üldist sissejuhatust B osas.

1.2. MÕISTED Kromatiidaberratsioon – strukturaalne kromosoomikahjustus, mis ilmneb üksikute kromatiidide katkemises või kromatiididevahelises katkemises ja taasühinemises. Kromosoomaberratsioon – strukturaalne kromosoomikahjustus, mis ilmneb mõlema kromosoomi katkemises või mõlema kromatiidi katkemises ja taasühinemises samas kohas. Endoreduplikatsioon – protsess, milles pärast DNA replikatsiooni S-perioodi tuum ei lähe mitoosi, vaid algab uus S-periood. Selle tulemusena tekivad kromosoomid, milles on 4, 8, 16, ... kromatiidi. Tühik – akromaatiline kahjustus, mis on väiksem kui kromatiidi laius ja millel on kromatiidide orientatsiooni erinevus minimaalne. Numbriline aberratsioon – kasutatud rakkude tüüpilisest normaalsest kromosoomiarvust erinev kromosoomide arv. Polüploidsus – haploidse kromosoomiarvu (n) kordsus, v.a diploidne arv (nt 3n, 4n jne). Struktuurne aberratsioon – kromosoomistruktuuri muutus, mida saab avastada raku jagunemise metafaasi etapi mikroskoopilisel uurimisel ja mida täheldatakse deletsiooni ja fragmentidena, kromosoomisiseste või -väliste muutustena.

1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Loomad allutatakse uuritava aine toimele, kasutades sobivat toimimisviisi, ja tapetakse sobiva aja möödudes töötlemisest. Enne tapmist töödeldakse loomi metafaasi peatava ainega (nt kolhitsiiniga või ainega Colcemid®). Seejärel tehakse luuüdirakkudest kromosoomipreparaadid ja need värvitakse ning metafaasi rakkude kromosoomaberratsioone analüüsitakse.

1.4. MEETODI KIRJELDUS

1.4.

1.4.1. Ettevalmistused

1.4.1.

1.4.1.1. Loomaliikide valik Tavaliselt kasutatakse rotte, hiiri ja hiina hamstreid, kuigi võib kasutada mis tahes sobivaid imetajate liike. Rakendatakse noorte tervete loomade tavaliselt kasutatavaid laboritüvesid. Uuringut alustades peaks loomade massi muutus olema minimaalne ja ei tohiks ületada ± 20 % iga soo keskmisest massist.

1.4.1.2. Pidamis- ja söötmistingimused Üldise sissejuhatuse B osas toodud üldtingimusi kohaldatakse, kuigi otstarbekas niiskusesisaldus peaks olema 50–60 %.

1.4.1.3. Loomade ettevalmistamine Terved noored täiskasvanud loomad määratakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühma. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomad identifitseeritakse individuaalselt. Loomi harjutatakse laboritingimustega vähemalt viie päeva jooksul.

1.4.1.4. Annuste ettevalmistamine Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne loomadele andmist. Vedelaid uuritavaid aineid võib doseerida vahetult või lahjendada enne doseerimist. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.

1.4.2. Katsetingimused

1.4.2.

1.4.2.1. Lahusti/kandjaaine Lahusti/kandjaaine ei tohi avaldada toksilist mõju kasutatava annuse korral ega reageerida keemiliselt siooni uuritava ainega. Kui kasutatakse tuntud lahustist/kandjaainest erinevat, siis peab selle kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine kasutamist.

1.4.2.2. Kontrollkatsed Käesolevasse katsesse kaasatakse mõlema sugupoole korral paralleelsed positiivsed ja negatiivsed (lahusti/kandjaaine) kontrollkatsed. Kontrollrühma loomi käsitletakse nii nagu katserühma loomi, kuid neid ei töödelda uuritava ainega. Positiivsed kontrollkatsed ei tohiks põhjustada struktuurseid aberratsioone in vivo kokkupuutetasemel, mis peaksid põhjustama avastatavat suurenemist fooniga võrreldes. Positiivsete kontrollainete annused valitakse sellised, et mõjud on selged, kuid neist ei ilmne riideris kohe kodeeritud objektiklaaside identsus. On aktsepteeritav, et positiivses kontrollkatses võib kasutada uuritava aine manustamisviisist erinevat viisi ja proovid võetakse üksnes korra. Samasse keemiliste ainete klassi kuuluvate positiivsete kontrollkemikaalide kasutamist võib kaaluda, kui selline aine on kättesaadav. Positiivsete kontrollainete näited: Aine CASi nr EINECSi nr Etüül-metaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 N-etüül-N-nitroso-karbamiid 759-73-9 212-072-2 Mitomütsiin-C 50-07-7 200-008-6 Tsüklofosfamiid Tsiklofosfamiidmonohüdraat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietüleen-melamiin 51-18-3 200-083-5 Üksnes lahusti või kandjaainega töödeldud või muul katserühmaga samalaadsel viisil töödeldud negatiivsetest kontrollkatsetest võetakse proovid igal proovivõtukorral, välja arvatud siis, kui varasemad kontrollitulemused näitavad vastuvõetavat loomadevahelist varieerumist ja kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude esinemissagedust. Kui negatiivsetest kontrollkatsetest võetakse üksnes üks proov, on kõige sobivam võtta see esimesel proovivõtukorral. Lisaks sellele kasutatakse ka töötlemata kontrollproove, välja arvatud juhul, kui varasemad või avaldatud kontrollandmed näitavad, et valitud lahusti/kandjaaine ei indutseeri kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.

1.5. MENETLUS

1.5.

1.5.1. Loomade arv ja sugu Nii katse- kui kontrollrühmas on mõlemast soost vähemalt viis analüüsitavat looma. Kui uuringu ajal on kättesaadavad tulemused sama liigi sama vastuvõtlikkuse liini kasutades tehtud uuringute kohta, mille tulemused näitavad, et toksilisuses ei ole sugupoolte vahel olulisi erinevusi, siis piisab vaid ühe sugupoolega katsete tegemisest. Kui inimese vastuvõtlikkus kemikaalidele on soospetsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse sobivast soost loomadega.

1.5.2. Katse kava Uuritavad ained tuleb eelistatavalt manustada ühekordsete annustena. Uuritavaid aineid võib manustada ka jagatud annustena, näiteks kaks annust ühel päeval kuni mõnetunnise vahega, et hõlbustada suurte ainekoguste manustamist. Muud manustamisrežiimid peaksid olema teaduslikult tõestatud. Proovid võetakse kahel korral samal päeval pärast manustamist. Näriliste puhul esimene proovivõtuaeg on 1,5 normaalset rakutsüklit (rakutsükkel kestab tavaliselt 12–18 tundi) pärast manustamist. Kuna aeg uuritava aine sissevõtmise ja metabolismi vahel ja selle mõju rakutsükli kineetikale saavad mõjutada kromosoomaberratsiooni avastamise optimaalset aega, on soovitav 24 tundi pärast esimese proovi võtmist koguda hilisem proov. Kui uuritavat ainet antakse kauem kui üks päev, tuleks võtta üks proov pärast viimast manustamist ajal, mis vastab 1,5 normaalse rakutsükli kestusele. Enne tapmist süstitakse loomade kõhukelmesse sobiv annus metafaasi peatavat ainet (nt ainet Colcemid® või kolhitsiini). Loomadelt võetakse seejärel proovid sobiva intervalli järel. Hiirte puhul on see intervall ligikaudu 3–5 tundi; hiina hamstrite korral ligikaudu 4–5 tundi. Rakud kogutakse luuüdist ja neid analüüsitakse kromosoomaberratsioonide tuvastamiseks.

1.5.3. Annused Kui sobivate andmete puudumisel tehakse annuse vahemiku määramiseks uuring, siis tehakse uuring samas laboris, kasutades samu liike, tüvesid, sugu ja manustamiskava kui põhiuuringus (5). Kui esineb mürgisus, kasutatakse esimeses proovivõtus kolme erinevat annust. Need annused peaksid hõlmama vahemikku suurimast kuni väiksema mürgisuseni või mürgisuse puudumiseni. Hilisemal proovivõtuajal on vaja kasutada üksnes suurimat annust. Suurim annus on määratletud annusena, mis põhjustab selliseid mürgistusnähte, et samale manustamisrežiimile põhinevate suuremate annusetasemete kasutamine võib põhjustada surma. Ained, millel on spetsiifilised bioloogilised mõjud väikeste mittetoksiliste annustena (nt hormoonid ja mitogeenid), võivad olla erandiks annuse määramise kriteeriumidele ja neid tuleks hinnata iga üksikjuhtumi puhul eraldi. Suurimat annust võidakse samuti määratleda annusena, mis põhjustab mõningaid mürgisusele viitavaid muutusi luuüdis (nt mitootiline indeks väheneb üle 50 %).

1.5.4. Piirkatse Kui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 2000 mg/kg kehamassi kohta ja mida manustatakse ühekordse annusena või kahe annusena samal päeval, ei põhjusta täheldatavaid toksilisi mõjusid ja kui genotoksilisus ootuspäraselt põhineb struktuurselt lähedaste ainete andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku uuringut vajalikuks. Kauem kestvate uuringute korral on piirannus 2000 mg/kg kehamassi kohta päevas kuni 14 päeva kestval manustamisel ja 1000 mg/kg kehamassi kohta päevas, kui manustamine kestab kauem kui 14 päeva. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus võib viidata piirkatses kasutatavatest annustest suuremate annuste kasutamise vajadusele.

1.5.5. Manustamine Uuritavat ainet manustatakse tavaliselt söögitoru kaudu või sobiva intubeerimiskanüüli abil või süstides kõhuõõnde. Samuti võib muid manustamisviise aktsepteerida, kui need on põhjendatud. Vedeliku suurim maht, mida saab söögitoru kaudu või süstides ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 2 ml/100 g kehamassi kohta. Suuremate mahtude kasutamine peab olema põhjendatud. Kui välja arvata ärritavad või söövitavad ained, mille mõjud tavaliselt teravnevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katses kasutatavate mahtude varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks samaks.

1.5.6. Kromosoomipreparaat Vahetult pärast tapmist kogutakse luuüdi, seda töödeldakse hüpotoonilise lahusega ja fikseeritakse. Seejärel kantakse rakud objektiklaasidele ja värvitakse.

1.5.7. Analüüs Mitootiline indeks tuleks määrata tsütotoksilisuse määrana vähemalt 1000 rakust looma kohta kõikides katseloomades (sh positiivsed kontrollid) ja töötlemata negatiivsetes kontroll-loomades. Vähemalt 100 rakku tuleks iga looma puhul analüüsida. Seda arvu saab vähendada, kui täheldatakse palju aberratsioone. Kõik objektiklaasid, sh positiivsete ja negatiivsete kontrollkatsete omad, kodeeritakse sõltumatult enne mikroskoopilist analüüsi. Kui objektiklaasi valmistamise menetlused viivad tihti metafaasis olevate rakkude suhte rikkumiseni ja kromosoomide kaotamiseni, peaksid seega loendatud rakud sisaldama tsentromeere koguses, mis vastab modaalarvule 2n ± 2.

2. ANDMED

2.

2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE Andmed üksikute loomade kohta esitatakse tabeli kujul. Katseühikuks on loom. Iga looma puhul tuleks hinnata loendatud rakkude arvu, aberratsioonide arvu raku kohta ja struktuurse(te) kromosoomaberratsiooni(de)ga rakkude protsendimäära. Eri tüüpi struktuursed kromosoomaberratsioonid tuleks loetleda koos nende arvukuse ja esinemissagedustega katse- ja kontrollkultuurides. Tühikud (gaps) registreeritakse eraldi ja nende kohta antakse teavet, aga üldiselt ei võeta neid aberratsioonide üldsageduse hulka. Kui pole tõestust toime erinevuse kohta sugude vahel, võidakse kombineerida mõlema sugupoole andmed statistiliseks analüüsiks.

2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE Positiivse tulemuse saamiseks on mitmeid kriteeriume, nt kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude suhtelise arvu suurenemine annusest tingituna või kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude arvu selge suurenemine ühes annuse rühmas ühel proovivõtuajal. Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel (6). Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse jaoks. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval uurimisel muudetud katsetingimustes. Polüploidsuse suurenemine võib viidata sellele, et uuritav aine võib esile kutsuda numbrilisi aberratsioone. Endoreduplikatsiooni suurenemine võib viidata sellele, et uuritaval ainel on võime inhibeerida rakutsükli kulgemist (7, 8). Uuritavat ainet, mille korral saadud tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumidele, peetakse käesolevas katses mittemutageenseks aineks. Kuigi enamikus katsetes saadakse selged positiivsed või negatiivsed tulemused, välistavad harvadel juhtudel saadud tulemused uuritava aine aktiivsuse kohta kindlate otsuste tegemise. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete arvust sõltumata. In vivo kromosoomaberratsioonkatsel saadud positiivsed tulemused viitavad sellele, et aine põhjustab kromosoomaberratsioone testitud liikide luuüdis. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et antud katsetingimustes ei põhjusta aine kromosoomaberratsioone testitud liikide luuüdis. Tõenäosust, et uuritav aine või selle metaboliidid jõuavad üldisesse vereringesse või eriti sihtkoesse (nt süsteemne toksilisus), tuleks arutada.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.

Kandjaaine:

kandjaaine valiku põhjendamine;

uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui see on teada.

Katseloomad:

kasutatud liigid/tüved;

loomade arv, vanus ja sugu;

päritolu, pidamistingimused, toitumine jne;

loomade individuaalne mass katse alustamisel, sh kehamassi vahemik, keskväärtused ja standardhälve iga rühma kohta.

Katsetingimused:

positiivsed ja negatiivsed (kandjaaine/lahusti) kontrollkatsed;

annuse vahemiku määramise uuringu andmed, kui see on tehtud;

manustamise tasemete valimise põhimõtted;

uuritava aine ettevalmistamise üksikasjad;

uuritava aine manustamise üksikasjad;

manustamistee põhjendus;

meetodid, mis verifitseerivad, et uuritav aine jõuab üldisesse vereringesse või sihtkoesse, vajaduse korral;

toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) teisendamine tegelikuks annuseks (mg/kg kehamassi kohta päevas), vajaduse korral;

üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta;

manustamis- ja proovivõtukavade üksikasjalik kirjeldus;

toksilisuse mõõtmise meetodid;

metafaasi peatav aine, selle kontsentratsioon ja töötlemise kestus;

objektiklaaside ettevalmistamise meetodid;

aberratsioonide loendamise kriteeriumid;

analüüsitud rakkude arv looma kohta;

kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, negatiivseteks või ebaselgeteks.

Tulemused:

toksilisuse tunnused;

mitootiline indeks;

aberratsioonide tüüp ja arv, antud iga looma kohta eraldi;

aberratsioonide üldarv rühma kohta ning keskväärtused ja standardhälbed;

aberratsioone sisaldavate rakkude arv rühma kohta ning keskväärtused ja standardhälbed;

ploidsuse muutused, kui neid esineb;

doosi ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;

võimalikud statistilised analüüsid;

paralleelsed negatiivsed kontrollandmed;

varasemad negatiivsed kontrollandmed ning vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;

paralleelsed positiivsed kontrollandmed.

Tulemuste arutelu.

Järeldused.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)

VIITED Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D. C, pp. 275–306. Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (19 8 7), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157–165. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115–141. Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305–312. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313–319. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Pap-worth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184–232. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403–413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362–1364.

B.12. MUTAGEENSUS – PISITUUMA KATSE IMETAJATE ERÜTROTSÜÜTIDES IN VIVO

B.12.

1. MEETOD Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 474, Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test (1997).

1.

1.1. SISSEJUHATUS Imetajate pisituuma katset in vivo kasutatakse uuritava aine põhjustatud kromosoomikahjustuse või mitoosiaparaadi kahjustuse avastamiseks erütroblastides, analüüsides loomade, tavaliselt näriliste luuüdist ja/või perifeersetest vererakkudest võetud erütrotsüüte. Pisituuma katse eesmärk on identifitseerida ained, mis põhjustavad tsütogeenset kahjustust, mille tulemuseks on kromosoomiloive fragmente või terveid kromosoome sisaldava pisituuma moodustamine. Kui luuüdi erütroblast areneb polükromaatseks erütrotsüüdiks, siis põhituum lükatakse välja; mis tahes moodustatud pisituum võib jääda muul viisil tuumata tsütoplasmasse. Põhituuma puudumine hõlbustab pisituumade avastamist neis rakkudes. Pisituumsete polükromaatsete erütrotsüütide sageduse suurenemine katseloomade puhul on indutseeritud kromosoomikahjustuse indikaatoriks. Tavaliselt kasutatakse näriliste luuüdi käesolevas katses kuni polükromaatsete erütrotsüütide moodustumiseni kõnealuses koes. Ebaküpsete mikrotuumsete (polükromaatsete) erütrotsüütide mõõtmine perifeerses veres on võrdselt vastuvõetav mis tahes liigi puhul, mille põrn ei suuda hävitada pisituumseid erütrotsüüte või mis on piisavalt tundlikud selleks, et avastada struktuurseid või numbrilisi kromosoomaberratsioone põhjustavaid aineid. Pisituuma saab eristada erinevate kriteeriumide alusel. Nende hulka kuulub kinetohoori või tsentromeerse DNA olemasolu või puudumise tõendamine pisituumas. Ebaküpsete (polükromaatsete) pisituumsete erütrotsüütide esinemissagedus on peamine lõpp-punkt. Küpsete (normokromaatsete) erütrotsüütide arvu perifeerses veres, mis sisaldab pisituuma küpsete erütrotsüütide hulgas, saab samuti kasutada katse lõpp-punktina, kui loomadele manustatakse uuritavat ainet nelja või enama nädala jooksul. Käesolev imetajate in vivo pisituuma katse on eriti vajalik mutageensuse ohu hindamiseks, kuna selles võidakse arvesse võtta in vivo metabolismi, farmakokineetika ja DNA parandusprotsesside tegureid, kuigi need võivad liigiti, kudede vahel ja geneetiliste lõpp-punktide osas erineda. In vivo katset võidakse samuti kasutada in vitro katses avastatud mutageense mõju täiendaval uurimisel. Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav aine või reaktsioonivõimeline metaboliit ei pääse sihtkoesse, ei ole sobiv kasutada käesolevat katset. Vt ka üldist sissejuhatust B osas.

1.2. MÕISTED Tsentromeer (kinetohoor) – kromosoomi ala(d), kus kääviniidid kinnituvad raku jagunemise ajal, võimaldades tütarkromosoomide korrapärast liikumist tütarrakkude poolustele. Pisituum – väike tuum, mis on rakkude põhituumast eraldi ja sellega paralleelselt esinev, see on moodustunud mitoosi telofaasi (meioosi) ajal kromosoomiloive fragmentidest või tervetest kromosoomidest. Normokromaatne erütrotsüüt – küps erütrotsüüt, millel puuduvad ribosoomid ja mida saab eristada mitteküpsetest, polükromaatsetest erütrotsüütidest ribosoomide jaoks valikuliste värvainete abil. Polükromaatne erütrotsüüt – ebaküps erütrotsüüt, arengu vahefaasis olev erütrotsüüt, millel on endiselt alles ribosoomid ja seetõttu saab seda eristada küpsetest, normokromaatsetest erütrotsüütidest ribosoomide jaoks valikuliste värvainete abil.

1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Loomadele manustatakse uuritavat ainet sobiva manustamistee kaudu. Kui kasutatakse luuüdi, tapetakse loomad pärast manustamist sobival ajal, luuüdi eemaldatakse ning valmistatakse preparaadid ja need värvitakse (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Kui kasutatakse perifeerset verd, kogutakse veri sobival ajal pärast manustamist ning äigepreparaadid valmistatakse ja värvitakse (4, 8, 9, 10). Perifeerse vere uurimisel peaks jääma võimalikult vähe aega viimase manustamise ja rakkude kogumise vahele. Preparaate analüüsitakse pisituuma avastamiseks.

1.4. MEETODI KIRJELDUS

1.4.

1.4.1. Ettevalmistused

1.4.1.

1.4.1.1. Loomaliikide valik Kui kasutatakse luuüdi, siis on soovitatav kasutada hiiri või rotte, kuigi võib kasutada mis tahes imetajate liike. Perifeerse vere kasutamise korral soovitatakse hiiri. Siiski võib kasutada mis tahes imetajate liike, kelle põrn ei eemalda pisituumseid erütrotsüüte, või liike, kes on näidanud piisavat tundlikkust struktuursete või numbriliste kromosoomaberratsioonide tekitajate avastamiseks. Kasutatakse noorte tervete loomade tavaliselt kasutatavaid laboritüvesid. Uuringut alustades peaks loomade massi muutus olema minimaalne ega tohiks ületada ± 20 % iga soo keskmisest kaalust.

1.4.1.2. Pidamis- ja söötmistingimused Üldise sissejuhatuse B osas toodud üldtingimusi kohaldatakse, kuigi otstarbekas niiskusesisaldus peaks olema 50–60 %.

1.4.1.3. Loomade ettevalmistamine Terved noored täiskasvanud loomad määratakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühma. Loomad identifitseeritakse individuaalselt. Loomi harjutatakse laboritingimustega vähemalt viie päeva jooksul. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed.

1.4.2. Katsetingimused

1.4.2.

1.4.2.1. Lahusti/kandjaaine Lahusti/kandjaaine ei tohi avaldada toksilist mõju kasutatavate annuste korral ega reageerida keemiliselt uuritava ainega. Kui kasutatakse tuntud lahustist/kandjaainest erinevat, peab selle kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele võrdlusandmetele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine kasutamist.

1.4.2.2. Kontrollkatsed Käesolevasse katsesse kaasatakse mõlema sugupoole korral paralleelsed positiivsed ja negatiivsed (lahusti/kandjaaine) kontrollkatsed. Kontrollrühma loomi käsitletakse nii nagu katserühma loomi, kuid neid ei töödelda uuritava ainega. Positiivsed kontrollkatsed peaksid tekitama pisituuma in vivo toime tasemel, millelt oodatakse fooniga võrreldes märgatava suurenemise põhjustamist. Positiivsete kontrollainete annused valitakse sellised, et mõjud on selged, kuid neist ei ilmne riideris kohe kodeeritud objektiklaaside identsus. On aktsepteeritav, et positiivses kontrollkatses võib kasutada uuritava aine manustamisviisist erinevat viisi ja proovid võetakse üksnes korra. Lisaks võib kaalutleda samasse keemiliste ainete klassi kuuluvate positiivsete kontrollkemikaalide kasutamist, kui sellised ained on kättesaadavad. Positiivsete kontrollainete näited: Aine CASi nr EINECSi nr Etüül-metaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 N-etüül-N-nitrosokarbamiid 759-73-9 212-072-2 Mitomütsiin-C 50-07-7 200-008-6 Tsüklofosfamiid Tsüklofosfamiidmonohüdraat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietüleen-melamiin 51-18-3 200-083-5 Üksnes lahustit või kandjaainet saanud või muul katserühmaga samalaadsel viisil töödeldud negatiivsetest kontrollkatsetest võetakse proovid igal proovivõtukorral, välja arvatud siis, kui varasemad kontrollitulemused näitavad vastuvõetavat loomadevahelist varieerumist ja kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude esinemissagedust. Kui negatiivsetest kontrollkatsetest võetakse üksnes üks proov, on kõige sobivam võtta see esimesel proovivõtukorral. Lisaks sellele kasutatakse ka töötlemata kontrollproove, välja arvatud juhul, kui varasemad või avaldatud kontrollandmed näitavad, et valitud lahusti/kandjaaine ei indutseeri kahjulikke ega mutageenseid mõjusid. Kui kasutatakse perifeerset verd, võib enne töötlemist võetud proov olla samuti aktsepteeritav paralleelse negatiivse kontrollina, kuid üksnes perifeerse verega tehtud lühiajalistel katsetel (nt 1–3 töötlemist), kui saadud tulemused on varasemate kontrollide alusel oodatavas vahemikus.

1.5. MENETLUS

1.5.

1.5.1. Loomade arv ja sugu Nii katse- kui kontrollrühmas on mõlemast soost vähemalt viis analüüsitavat looma (11). Kui uuringu ajal on kättesaadavad tulemused sama liigi korral sama manustamisteed kasutades tehtud uuringute kohta, mille tulemused näitavad, et toksilisuse osas ei ole olulisi erinevusi sugupoolte vahel, siis piisab katsete tegemisest vaid ühe sugupoolega. Kui inimese vastuvõtlikkus kemikaalidele on soospetsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse sobivast soost loomadega.

1.5.2. Manustamiskava Ei ole võimalik soovitada ühtegi standardset manustamiskava (nt üks, kaks või enam manustamist 24tunniste intervallidega). Pikemate manustamisrežiimide ajal kogutud proovid on aktsepteeritavad, kui positiivset mõju on näidatud käesolevas katses või negatiivses katses on näidatud toksilisust või on kasutatud piirannust ja manustamist on jätkatud proovivõtmise ajani. Uuritavaid aineid võib manustada ka jagatud annustena, näiteks kaks annust ühel päeval kuni mõnetunnise vahega, et hõlbustada suurte ainemahtude andmist. Katset võib sooritada kahel viisil: Vajaduse korral võib lisaproove võtta muul ajal.

1.5.2. a)

loomadele manustatakse uuritavat ainet ühel korral. Proove luuüdist võetakse vähemalt kahel korral, alustades mitte varem kui 24 tundi pärast manustamist, kuid mitte hiljem kui 48 tundi pärast manustamist, ning proovide võtmise vahel on sobiv intervall. Proovide võtmine varem kui 24 tundi pärast manustamist peaks olema põhjendatud. Perifeerse vere proovid võetakse vähemalt kahel korral, alustades mitte varem kui 36 tundi pärast manustamist, ning esimesele proovile järgneb sobiv intervall, kuid mitte hiljem kui 72 tundi pärast manustamist. Kui positiivne tulemus on tuvastatav ühel proovivõtukorra järel, siis lisaproovide võtmist ei ole vaja;

kui kasutatakse kahte või enamat päevaannust (nt kaks või rohkem manustamist 24tunniste intervallidega), kogutakse proovid üks kord 18–24 tundi pärast viimast manustamist luuüdisse ja korra 36–48 tundi pärast viimast manustamist perifeersesse verre (12).

1.5.3. Annused Kui tehakse annuse vahemiku määramiseks uuring sobivate andmete puudumisel, siis tehakse uuring samas laboris, kasutades samu liike, tüvesid, sugu ja manustamisrežiimi, mida kasutatakse põhiuuringus (13). Kui esineb mürgisus, kasutatakse kolme erinevat annust esimese proovivõtu jaoks. Need annused peaksid hõlmama vahemikku suurimast kuni väiksema mürgisuseni või mürgisuse puudumiseni. Hilisemal proovivõtuajal on vaja kasutada üksnes suurimat annust. Suurim annus on määratletud annusena, mis põhjustab selliseid mürgistusnähte, et samale manustamisrežiimile põhinevate suuremate annuste kasutamine võib põhjustada surma. Ained, millel on spetsiifilised bioloogilised mõjud väikeste mittetoksiliste annustena (nt hormoonid ja mitogeenid), võivad olla erandiks annuse määramise kriteeriumidele ja neid tuleks hinnata iga üksikjuhtumi puhul eraldi. Suurimat annust võidakse samuti määratleda annusena, mis põhjustab mõningaid mürgisusele viitavaid muutusi luuüdis (nt ebaküpsete erütrotsüütide hulga vähenemine erütrotsüütide koguarvus luuüdis või perifeerses veres).

1.5.4. Piirkatse Kui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 2000 mg/kehamassi kg kohta ja mida manustatakse ühekordse annusena või kahe annusena samal päeval, ei põhjusta täheldatavaid toksilisi mõjusid ja kui genotoksilisus ootuspäraselt põhineb struktuurselt lähedaste ainete andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku uuringut vajalikuks. Kauem kestvate uuringute korral on piirannus 2000 mg/kehamassi kg kohta päevas kuni 14 päeva kestval manustamisel ja 1000 mg/kehamassi kg kohta päevas, kui manustamine kestab kauem kui 14 päeva. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus võib viidata piirkatses kasutatavatest annustest suuremate annuste kasutamise vajadusele.

1.5.6. Luuüdi-/verepreparaat Luuüdirakud saadakse tavaliselt reieluudest või sääreluudest vahetult pärast tapmist. Rakud eemaldatakse reieluudest või sääreluudest, neist tehakse preparaadid ja värvitakse kindlakskujunenud meetoditel. Perifeerne veri võetakse sabaveenist või muust sobivast veresoonest. Vererakud värvitakse kohe supravitaalvärvide abil (8, 9, 10) või tehakse äigepreparaadid ja seejärel värvitakse. DNA-spetsiifilise värvaine kasutamine (nt akridiinoranž (14) või Hoechst 33258 + püroniin-Y (15)) võib kõrvaldada mõned mitte-DNA-spetsiifiliste värvainete kasutamisega seotud artefaktid. See eelis ei välista tavaliste värvainete (nt Giemsa) kasutamist. Täiendavaid süsteeme (nt tsellulooskolonne tuumsete rakkude eemaldamiseks (16)) saab samuti kasutada, kui kõnealused süsteemid on piisavalt toimivad laboris pisituumapreparaatide valmistamiseks.

1.5.7. Analüüs Ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikide (ebaküpsete + küpsete) erütrotsüütide hulgas määratakse iga looma puhul eraldi, loendades kokku vähemalt 200 erütrotsüüti luuüdist ja 1000 erütrotsüüti perifeersest verest (17). Kõik objektiklaasid, sh positiivsete ja negatiivsete kontrollkatsete omad, kodeeritakse sõltumatult enne mikroskoopilist analüüsi. Ebaküpsete pisituumsete erütrotsüütide esinemissageduse määramiseks loendatakse looma kohta vähemalt 2000 ebaküpset erütrotsüüti. Lisateavet võidakse saada, loendades pisituumasid küpsetes erütrotsüütides. Objektiklaase analüüsides ei tohiks ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikide erütrotsüütide hulgas olla väiksem kui 20 % kontrollväärtusest. Kui loomadele manustatakse uuritavat ainet pidevalt nelja või enama nädala jooksul, saab loendada vähemalt 2000 küpset erütrotsüüti looma kohta pisituumade esinemissageduse määramiseks. Automaatsed analüüsisüsteemid (kujutise analüüs ja rakususpensioonide voolutsütomeetria) on vastuvõetavad alternatiivid manuaalsele hindamisele, kui see on asjakohaselt põhjendatud ja valideeritud.

2. ANDMED

2.

2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE Andmed üksikute loomade kohta esitatakse tabeli kujul. Katseühikuks on loom. Ebaküpsete erütrotsüütide arv, pisituumsete ebaküpsete erütrotsüütide arv ja ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikidest erütrotsüütidest tuleks iga analüüsitava looma kohta loetleda eraldi. Kui loomadele manustatakse uuritavat ainet pidevalt nelja või enama nädala jooksul, tuleks samuti esitada teave küpsete erütrotsüütide kohta, kui seda on kogutud. Ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikidest erütrotsüütidest ja, vajaduse korral, pisituumsete erütrotsüütide protsendimäär esitatakse iga looma kohta. Kui pole tõestust vastuse sugudevahelise erinevuse kohta, võidakse kombineerida mõlema sugupoole andmed statistiliseks analüüsiks.

2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE Positiivse tulemuse saamiseks on mitmeid kriteeriume, nt pisituumsete rakkude arvu suurenemine annusest tingituna või pisituumsete rakkude arvu selge suurenemine ühes annuse rühmas ühel proovivõtuajal. Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel (18, 19). Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse jaoks. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval uurimisel meelepäraselt muudetud katsetingimustes. Uuritavat ainet, mille korral saadud tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumidele, peetakse käesolevas katses mittemutageenseks aineks. Kuigi enamikus katsetes saadakse selged positiivsed või negatiivsed tulemused, välistavad harvadel juhtudel saadud tulemused uuritava aine aktiivsuse kohta kindlate otsuste tegemise. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete kordamisest sõltumata. Pisituuma katse positiivsed tulemused viitavad sellele, et aine indutseerib pisituumi, mis põhjustavad kromosoomikahjustuse või mitoosiaparaadi kahjustuse katseliikide erütroblastides. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et antud katsetingimustes ei tekita aine katseliikide ebaküpsetes erütrotsüütides pisituumi. Tõenäosust, et uuritav aine või selle metaboliidid jõuavad üldisesse vereringesse või eriti sihtkoesse (nt süsteemne toksilisus), tuleks arutada.

3. ARUANDLUS

3. KATSEARUANNE

Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.

Lahusti/kandjaaine:

kandjaaine valiku põhjendamine;

uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui see on teada.

Katseloomad:

kasutatud liigid/tüved;

loomade arv, vanus ja sugu;

päritolu, pidamistingimused, toitumine jne;

loomade individuaalne mass katse alustamisel, sh kehamassi vahemik, keskväärtus ja standardhälve iga rühma kohta.

Katsetingimused:

positiivseid ja negatiivseid (lahus/kandjaaine) kontrollkatseid käsitlevad andmed;

annuse vahemiku määramise uuringu tulemused, kui see on tehtud;

annuste valimiku põhimõtted;

uuritava aine ettevalmistamise üksikasjad;

uuritava aine manustamise üksikasjad;

manustamistee põhjendus;

meetodid, mis verifitseerivad, et uuritav aine jõuab üldisesse vereringesse või sihtkoesse, vajaduse korral;

toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) teisendamine tegelikuks annuseks (mg/kehamassi kg kohta päevas), vajaduse korral;

üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta;

manustamis- ja proovivõtukavade üksikasjalik kirjeldus;

objektiklaaside ettevalmistamise meetodid;

toksilisuse mõõtmise meetodid;

ebaküpsete pisituumsete erütrotsüütide loendamise kriteeriumid;

analüüsitud rakkude arv looma kohta;

kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, negatiivseteks või ebaselgeteks.

Tulemused:

toksilisuse tunnused;

ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikides erütrotsüütides;

ebaküpsete pisituumsete erütrotsüütide arv, esitatakse iga looma kohta eraldi;

ebaküpsete erütrotsüütide keskväärtus ± standardhälve rühma kohta;

doosi ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;

kasutatud statistilised analüüsid ja meetodid;

paralleelsed ja varasemad negatiivsed kontrollandmed;

paralleelsed positiivsed kontrollandmed.

Tulemuste arutelu.

Järeldused.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)

VIITED Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187–190. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9–15. Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61–118. Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29–80. MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. Elsevier, Amsterdam, pp. 555–558. MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103–112. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513–522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245–249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83–98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 153–159. Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. (1994), in Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293–304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313–319. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313–319. Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241–247. MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, pp. 269–275. Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91–104. Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to nor-mochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97–99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115–141. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Pap-worth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184–232.

B.13/14. MUTAGEENSUS – BAKTERITE PÖÖRDMUTATSIOONKATSE

B.13/14.

1. MEETOD Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 471, Bacterial Reverse Mutation Test (1997).

1.

1.1. SISSEJUHATUS Bakterite pöördmutatsioonkatses kasutatakse aminohappeid vajavaid Salmonella typhimurium’i ja Escherichia coli tüvesid punktmutatsiooni avastamiseks, millega kaasneb ühe või mitme DNA aluspaari asendus, lisamine või deletsioon (1, 2, 3). Käesoleva bakterite pöördmutatsioonkatse põhimõtteks on avastada mutatsioonid, mis parandavad katsetüvedes olevaid mutatsioone ja taastavad bakterite funktsionaalse võime sünteesida põhilisi aminohappeid. Revertantsed bakterid avastatakse seepärast, et nad on võimelised kasvama, kuigi katsebakteritüves vajalik aminohape puudub. Punktmutatsioonid põhjustavad inimestel mitmeid geneetilisi haigusi ja on märkimisväärseid tõendeid selle kohta, et punktmutatsioonid onkogeenides ja keharakkude kasvaja supressorgeenides osalevad inimeste ja katseloomade kasvajate moodustumisel. Bakterite pöördmutatsioonkatse on kiire, odav ja suhteliselt kergesti sooritatav. Paljudel katsetüvedel on mitmeid omadusi, mis muudavad nad tundlikumaks mutatsioonide avastamiseks, sh kergesti reageerivad DNA järjestused pöördmutatsiooni saitides, rakkude suurenenud läbitavus suurte molekulide suhtes ja DNA parandamise süsteemide kõrvaldamine või vigadele vastuvõtlike DNA parandamisprotsesside tõhustamine. Katsetüvede spetsiifilisus võib anda vajalikku teavet genotoksiliste ainete põhjustatud mutatsiooni tüüpide kohta. Väga ulatuslik andmebaas eri struktuuride korral saadud tulemuste kohta on kättesaadav bakterite pöördmutatsioonkatsete põhjal ja kindlakskujunenud meetodid on välja töötatud erinevate füüsikalis-keemiliste omadustega keemiliste ainete, sh lenduvate ühendite testimiseks. Vt ka üldist sissejuhatust B osas.

1.2. MÕISTED Pöördmutatsioonkatse kas Salmonella typhimurium’i või Escherichia coli puhul avastab mutatsiooni aminohapet (vastavalt histidiinis või trüptofaanis) nõudvas tüves, mille tulemusena tekib väljastpoolt saadud aminohappest sõltumatu tüvi. Aluspaari asendusmutageenid on ained, mis põhjustavad aluse vahetust DNAs. Pöördmutatsioonkatses võib kõnealune muutus aset leida algupärase mutatsiooni kohas või muus bakterigenoomi saidis. Raaminihke mutageenid on ained, mis põhjustavad ühe või mitme DNA aluspaari lisamist või deletsiooni, seega muutes RNA lugemisraami.

1.3. ALGSED KAALUTLUSED Bakterite pöördmutatsioonkatse kasutab prokarüootseid rakke, mis erinevad imetajate rakkudest sellise tegurite poolest nagu tagasihaare, metabolism, kromosoomi struktuur ja DNA parandamisprotsessid. Tehtud in vitro katsed üldjuhul nõuavad eksogeenset metaboolset aktiveerimist. In vitro metaboolse aktiveerimise süsteem ei saa tervenisti jäljendada in vivo tingimusi imetajatel. Seetõttu ei anna katse otsest teavet aine mutageensuse või kantserogeensuse kohta imetajatel. Bakterite pöördmutatsioonkatset kasutatakse tavaliselt genotoksilisust ja eriti punktmutatsiooni põhjustava tegevuse algseks skriinimiseks. Ulatuslik andmebaas on näidanud, et mitmetel keemilistel ainetel, mis annavad käesolevas katses positiivseid tulemusi, on mutageenne aktiivsus ka muudes katsetes. On näiteid mutageensetest ainetest, mida ei avastata käesoleva katse abil; nende ebaõnnestumiste põhjusteks on avastatud lõpp-punkti spetsiifiline olemus, metaboolse aktiveerimise erinevused või biosaadavuse erinevused. Teisalt võivad tegurid, mis tõhustavad bakterite pöördmutatsioonikatse tundlikkust, viia mutageense aktiivsuse ülehindamiseni. Bakterite pöördmutatsioonkatse ei sobi teatud klassidesse kuuluvate keemiliste ainete hindamiseks, nt väga bakteritsiidsed ühendid (nt teatud antibiootikumid) ja need, mida peetakse (või tuntakse) imetajate raku replikatsioonisüsteemi (nt mõnede topoisomeraasi inhibiitorite ja mõnede nukleosiidide analoogide) mõjutajatena. Sellistel juhtudel on imetajate mutatsioonikatsed sobivamad. Kuigi paljud ühendid, mis annavad positiivseid tulemusi käesolevas katses, on imetajate kantserogeenid, ei ole korrelatsioon täielik. See sõltub keemilisest aineklassist ning esineb kantserogeene, mida käesoleva katse abil ei avastata, kuna nad tegutsevad muude, mittegenotoksiliste mehhanismide või bakterirakkudes puuduvate mehhanismide abil.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Bakterirakkude suspensioonid allutatakse uuritava aine toimele eksogeense metaboolse aktiveerimise olemasolu ja puudumise korral. Vahetu kokkusegamise meetodil segatakse kõnealused suspensioonid külviagariga ja asetatakse vahetult minimaalsesse kasvukeskkonda. Preinkubatsioonimeetodi puhul inkubeeritakse uuritavat ainet sisaldav segu ja segatakse seejärel külviagariga enne minimaalsesse kasvukeskkonda asetamist. Mõlema metoodika puhul pärast kahte või kolme inkubatsioonipäeva loendatakse revertantkolooniad ja võrreldakse nende arvu spontaansete revertantkolooniate arvuga lahusti kontrollplaatidel. On kirjeldatud mitmeid bakterite pöördmutatsioonkatse sooritamise menetlusi. Nende seas on enimkasutatavad vahetu kokkusegamise meetod (1, 2, 3, 4), preinkubatsioonimeetod (2, 3, 5, 6, 7, 8), fluktuatsioonimeetod (9, 10) ja suspensioonimeetod (11). Gaaside või aurude uurimist käsitlevaid muudatusi on kirjeldatud (12). Kõnealuses meetodis kirjeldatud menetlused puudutavad peamiselt vahetu kokkusegamise ja preinkubatsioonimeetodit. Nende mõlema abil võidakse teha katseid koos metaboolse aktiveerimisega või ilma selleta. Mõned ained võivad olla paremini tuvastatavad preinkubatsioonimeetodi abil. Need ained kuuluvad keemilistesse aineklassidesse, kus on lühiahelalised alifaatsed nitrosoamiinid, metallid oksüdatsiooniastmega + 2, aldehüüdid, asovärvid ja diasoühendid, pürollisidiinalkaloidid, allüülühendid ja nitroühendid (3). Samuti on täheldatud, et teatud mutageenide klasse ei tuvastata alati standardmenetluste abil, nagu nt vahetu kokkusegamise meetodil või preinkubatsioonimeetodil. Neid tuleks vaadelda erijuhtudena ja on rangelt soovitatav, et nende tuvastamiseks kasutataks alternatiivseid menetlusi. Järgmised erijuhud on võimalik ära tunda (koos menetluste näidetega, mida võib nende tuvastamiseks kasutada): asovärvained ja diasoühendid (3, 5, 6, 13), gaasid ja lenduvad kemikaalid (12, 14, 15, 16) ning glükosiidid (17, 18). Kõrvalekaldeid standardmenetlustest on vaja teaduslikult põhjendada.

1.5. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.5.

1.5.1. Ettevalmistused

1.5.1.

1.5.1.1. Bakterid Värsked bakterikultuurid tuleb kasvatada kuni hilise eksponentsiaalse või varase statsionaarse kasvufaasini (ligikaudu 109 rakku ml kohta). Hilises statsionaarses faasis olevaid kultuure ei tohiks kasutada. On oluline, et katses kasutatavad kultuurid sisaldaksid elujõuliste rakkude suuri tiitreid. Tiitrit võib näidata kas varasematest kontrollkatsetest saadud kasvukõverate abil või määrates igas analüüsis elujõuliste rakkude arv külvikatsel. Soovitav inkubatsioonitemperatuur on 37 oC. Tuleks kasutada vähemalt viit bakteritüve. Nende hulka peaks kuuluma neli tüve S. typhimurium’ilt (TA 1535; TA 1537 või TA97a või TA97; TA98; ja TA100), mida peetakse usaldusväärseteks ja mis on andnud reprodutseeritava vaste eri laborites. Nendes neljas S. typhimurium’i tüves on GC aluspaarid algses pöördmutatsioonisaidis ja on teada, et need ei avasta teatud oksüdeerivaid mutageene, ristseoseid moodustavaid aineid ja hüdrasiine. Selliseid aineid võib avastada E. coli WP2-tüvede või S. typhimurium TA1 02 (19) abil, millel on AT aluspaar algses pöördmutatsioonisaidis. Seetõttu on soovitavad tüvede kombinatsioonid järgmised: Ristseostuvate mutageenide avastamiseks on eelistatav kasutada TA1 02 või lisada DNA parandusele spetsiifilist E. coli tüve (nt E. coli WP2 või E. coli WP2 (pKMIOl)). Tüvikultuuri preparaatide valmistamiseks, markeri verifitseerimiseks ja säilitamiseks tuleks kasutada väljakujunenud menetlusi. Kasvuks mõeldud aminohappe vajadust tuleks näidata iga külmutatud tüvikultuuri varupreparaadi puhul (S. typhimurium’i tüvede puhul histidiin ja E. coli tüvede puhul trüptofaan). Muid fenotüüpseid tunnuseid tuleks vastavalt kontrollida: R-faktori plasmiidide esinemist või puudumist, vajaduse korral (nt ampitsilliini resistentsus TA98, TA100 ja TA97a või TA97, WP2 uvrA ja WP2 uvrA (pKM101) tüvede puhul ning ampitsilliini + tetratsükliini resistentsus TA102 tüve puhul); iseloomulike mutatsioonide esinemine (nt tundlikkusest kristallvioleti suhtes põhjustatud rfa-mutatsioon S. typhimurium’is ja tundlikkusest ultraviolettkiirguse suhtes põhjustatud uvrA-mutatsioon E. coli’is või uvrB-mutatsioon S. typhimurium’is) (2, 3). Tüved peaksid samuti andma plaatidel spontaansete revertantsete bakterite kolooniate loendamise tulemusi, mis vastavad laborite esinemissageduste kontrollandmete vahemikele ja kirjanduses eelistatult esitatud vahemikele.

S. typhimurium TA1535;

S. typhimurium TA1537 või TA97 või TA97a;

S. typhimurium TA98;

S. typhimurium TA100;

E. coli WP2 uvrA või E. coli WP2 uvrA (pKM101) või S. typhimurium TA102.

1.5.1.2. Sööde Kasutatakse sobivat minimaalset agarit (sisaldab nt Vogel-Bonneri minimaalset söödet E ja glükoosi) ja külviagarit, mis sisaldab histidiini ja biotiini või trüptofaani, mis võimaldavad raku jagunemist (1, 2, 9).

1.5.1.3. Metaboolne aktiveerimine Bakterid puutuvad kokku uuritava ainega nii vastava metaboolse aktiveerimissüsteemi olemasolu kui ka puudumise korral. Enim kasutatav süsteem on ensüüme indutseerivate ainete, nt Aroclor 1254ga (1, 2) või fenobarbitooni ja β-naftoflavooni seguga (18, 20, 21) töödeldud näriliste maksast valmistatud postmitokondriaalne osa (S9), millele on lisatud kofaktor. Tavaliselt kasutatakse postmitokondriaalset fraktsiooni kontsentratsiooni vahemikus 5–30 mahuprotsenti S9-segus. Metaboolse aktiveerimissüsteemi valik ja tingimused võivad sõltuda uuritava keemilise aine klassist. Mõnel juhul on vaja kasutada postmitokondriaalse fraktsiooni rohkem kui üht kontsentratsiooni. Asovärvainete ja diasoühendite puhul võib olla sobivam kasutada redutseerivat metaboolse aktiveerimise süsteemi (6, 13).

1.5.1.4. Uuritav aine/ettevalmistused Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne bakterite töötlemist. Vedelad uuritavad ained võib lisada vahetult katsesüsteemidesse ja/või lahjendada enne manustamist. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav. Lahusti/kandjaaine ei tohiks uuritava ainega keemiliselt reageerida ning see peaks sobima rakkude eluvõimelisuse ja S9 aktiivsusega (22). Kui kasutatakse muud kui tuntud lahustit/kandjaainet, siis peab selle kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine kasutamist. Vees ebapüsivate ainete uurimisel kasutatavad orgaanilised lahustid peavad olema veevabad.

1.5.2. Katsetingimused

1.5.2.

1.5.2.1. Katsetüved (vt 1.5.1.1)

1.5.2.2. Manustamise kontsentratsioon Kasutatavate katseainete suurima koguse määramisel võetakse arvesse tsütotoksilisust ja lahustuvust lõplikus katsesegus. Tsütotoksilisust ja lahustuvust võib olla kasulik määrata eelkatses. Tsütotoksilisust võib tuvastada töödeldud kultuurides revertantsete kolooniate arvu vähenemise, lausfooni selginemise või vähenemise või rakkude ellujäämisastme abil. Aine tsütotoksilisust võib muuta metaboolsete aktiveerimissüsteemide esinemise korral. Lahustumatust tuleks hinnata lõplikus segus palja silmaga nähtava sadestuse tekke põhjal tegelikes katsetingimustes. Soovitatav suurim katsekontsentratsioon lahustuvate mittetoksiliste ainete kohta on 5 mg plaat või 5 μl plaat. Mittetoksiliste ainete puhul, mis on lahustumatud kontsentratsioonidel 5 mg plaadi kohta või 5 μl plaadi kohta, peaks üks või enam uuritavat kontsentratsiooni vastama lahustumatusele lõplikus katsesegus. Katseaineid, mis on tsütotoksilised juba kontsentratsioonidel alla 5 mg plaadi kohta või 5 μl plaadi kohta, tuleks testida tsütotoksilise kontsentratsiooni suhtes. Sadestus ei tohiks mõjutada tulemust. Tuleks kasutada vähemalt viit erinevat analüüsitava katseaine kontsentratsiooni, mille korral on katsepunktidele vastav vahemik ligikaudu poollogaritmiline (nt √10). Kontsentratsioonsõltuvuse uurimisel võivad olla sobivamad väiksemad intervallid. Hinnates aineid, mis sisaldavad märkimisväärsel hulgal võimalikke mutageenseid lisandeid, võib kõne alla tulla katsete tegemine suuremate kontsentratsioonidega kui 5 mg plaadi kohta või 5 μl plaadi kohta.

1.5.2.3. Negatiivsed ja positiivsed kontrollkatsed Igas katses kasutatakse paralleelseid positiivseid ja negatiivseid (lahusti või kandjaaine) kontrollkatseid nii metaboolse aktiveerimisega kui ka ilma selleta. Positiivsetes kontrollkatsetes kasutatavad kontsentratsioonid tuleb valida selliselt, et need näitaksid iga katse sooritamise tõhusust. Metaboolset aktiveerimissüsteemi kasutavate katsete puhul tuleks välja valida positiivsete kontrollkatsete võrdlusaine(d) kasutatavate bakteritüvede tüübi põhjal. Järgmised ained on näited sobivatest positiivsetest kontrollainetest metaboolse aktiveerimisega katsete jaoks: Aine CASi nr EINECSi nr 781-43-1 212-308-4 9,10-dimetüülantratseen 57-97-6 200-359-5 7,12-dimetüülbens(α)antratseen 50-32-8 200-028-5 Benso(a)püreen 613-13-8 210-330-9 2-aminoantratseen 50-18-0 Tsüklofosfamiid 6055-19-2 200-015-4 Tsüklofosfamiidmonohüdraat Järgmine aine on sobiv positiivseks kontrolliks redutseeriva metaboolse aktiveerimise meetodi jaoks: Aine CASi nr EINECSi nr Kongopunane 573-58-0 209-358-4 2-aminoantratseeni ei tohiks kasutada S9-segu tõhususe ainsa indikaatorina. Kui kasutatakse 2-aminoantratseeni, peaks iga S9-partiid samuti iseloomustama mutageeniga (nt benso[a]püreen, dimetüülbensantratseen), mis eeldab mikrosomaalse ensüümi tekitatud metaboolset aktiveerimist. Järgmised ained on näited positiivsetest tüvele spetsiifilistest sobivatest kontrollainetest eksogeense metaboolse aktiveerimissüsteemiga katsete jaoks: Aine CASi nr EINECSi nr Tüvi Naatriumasiid 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 ja TA 100 2-nitrofluoreen 607-57-8 210-138-5 TA 98 9-aminoakridiin 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 ja TA 97a ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 ja TA 97a Kumeenvesinikperoksiid 80-15-9 201-254-7 TA 102 Mitomütsiin-C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA ja TA 102 l-metüül-3-nitro-l-nitrosoguanidiin 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2uvrA ja WP2uvrA (pKM101) 4-nitrokinoliin-1-oksiid 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2uvrA ja WP2uvrA (pKM101) Furiilfuramiid (AF2) 3688-53-7 Plasmiidi sisaldavad tüved Võidakse kasutada muid sobivaid positiivse kontrolli võrdlusaineid. Lähedasse keemilisse aineteklassi kuuluvate positiivsete keemiliste kontrollainete kasutamist tuleks kaaluda, kui selline aine on kättesaadav. Tuleks kasutada negatiivseid kontrollaineid, mis sisaldavad üksnes lahustit või kandjaainet ilma katseaineta ja mida muidu manustatakse sarnasel viisil nagu katserühmade puhul. Lisaks sellele kasutatakse ka töötlemata kontrollkatseid, välja arvatud juhul, kui varasemad andmed kontrollaine kohta näitavad, et valitud lahusti ei indutseeri kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.

1.5.3. Menetlus Vahetu kokkusegamise meetodil (1, 2, 3, 4), ilma metaboolse aktiveerimiseta, segatakse 2,0 ml külviagariga tavaliselt 0,05 ml või 0,1 ml katselahuseid, 0,1 ml värskeid bakterikultuure (mis sisaldavad ligikaudu 108 elujõulist rakku) ja 0,5 ml steriilset puhvrit. Metaboolse aktiveerimisega katse puhul segatakse tavaliselt 0,5 ml metaboolse aktiveerimise segu, mis sisaldab piisaval hulgal postmitokondriaalset fraktsiooni (vahemikus 5–30 mahuprotsenti metaboolse aktiveerimise segus) külviagari (2,0 ml) ja bakterite ja uuritava aine/katselahusega. Iga katseklaasi sisu segatakse ja külvatakse minimaalse agarinõu pinnale. Külviagarit võib lasta tahkestuda enne inkubatsiooni. Eelinkubatsioonimeetodi puhul (2, 3, 5, 6) eelinkubeeritakse uuritav aine/katselahus uuritava tüvega (mis sisaldab ligikaudu 108 elujõulist rakku) ja steriilse puhvriga või metaboolse aktiveerimise süsteemiga (0,5 ml) enamasti 20 minutit või kauem 30–37 oC juures enne külviagariga segamist ja külvatakse minimaalse agariplaadi pinnale. Tavaliselt segatakse 0,05 või 0,1 ml uuritavat ainet/katselahust, 0,1 ml baktereid ja 0,5 ml S9-segu või steriilset puhvrit 2,0 ml külviagariga. Katseklaase tuleks täita õhuga eelinkubatsiooni ajal, kasutades selleks loksutit. Varieerumise piisavaks hindamiseks tuleks kasutada kolme paralleelset plaati iga annuse korral. Kahe paralleelse plaadi kasutamine on aktsepteeritav siis, kui seda on teaduslikult põhjendatud. Plaadi juhuslikul kaotsiminekul ei tunnistata katset ilmtingimata kehtetuks. Gaasilisi või lenduvaid aineid uuritakse sobiva meetodi abil, näiteks suletud kasvuanumates (12, 14, 15, 16).

1.5.4. Inkubatsioon Kõiki antud katse anumaid tuleks inkubeerida 37 oC juures 48–72 tundi. Pärast inkubatsiooniperioodi loendatakse kokku revertantsete kolooniate arv plaadi kohta.

2. ANDMED

2.

2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE Tulemused tuleks esitada revertantsete kolooniate arvuna plaadi kohta. Revertantsete kolooniate arv nii negatiivsete (lahusti kontrollkatse ja töötlemata kontrollkatse, kui seda kasutatakse) kui ka positiivsete kontrollplaatide korral tuleks esitada. Üksikute plaatide korral loendatud bakterite arvud, revertantsete kolooniate keskmine arv plaadi kohta ja standardhälve tuleks esitada uuritava aine ning positiivsete ja negatiivsete (töötlemata ja/või lahusti) kontrollkatsete kohta. Selget positiivset vastust ei ole vaja verifitseerida. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval uurimisel meelepäraselt muudetud katsetingimustes. Negatiivseid tulemusi kinnitatakse igal üksikjuhul eraldi. Neil juhtudel, kui negatiivsete tulemuste kinnitamist ei peeta vajalikuks, esitatakse põhjendus. Katse parameetrite muutmist hinnatud tingimuste vahemiku suurendamiseks tuleks arvesse võtta järelkatsetel. Katse parameetrid, mida võidakse muuta, hõlmavad kontsentratsioonivahemikku, manustamisviisi (vahetu kokkusegamise või vedeliku eelinkubatsiooni meetod) ja metaboolse aktiveerimise tingimusi.

2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE Positiivse tulemuse määramise kriteeriumid, nagu näiteks kontsentratsiooniga seotud uuritava vahemiku suurenemine ja/või ühes või mitmes kontsentratsioonis revertantsete kolooniate arvu reprodutseeruv suurenemine plaadil vähemalt ühe tüve korral süsteemis koos metaboolse aktiveerimisega või ilma selleta (23). Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel (24). Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse saamiseks. Uuritavat ainet, mille tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumidele, peetakse mittemutageenseks aineks käesolevas katses. Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tulemused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud korduskatsete arvust sõltumata. Bakterite pöördmutatsioonkatse positiivsed tulemused näitavad, et aine põhjustab punktmutatsioone aluste asendamise või Salmonella typhimurium’i ja/või Escherichia coli genoomi raaminihke abil. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et uuritav aine ei ole katsetingimustes mutageenne uuritavate liikide puhul.

3. ARUANDLUS

3. KATSEARUANNE

Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.

Lahusti/kandjaaine:

kandjaaine valiku põhjendus;

uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on teada.

Tüved:

kasutatavad tüved;

rakkude arv rakukultuuri kohta;

tüvede omadused.

Katsetingimused:

uuritava aine hulk plaadi kohta (mg plaadi kohta või μl plaadi kohta) annuse valiku põhjendusega ja plaatide arvuga ühe kontsentratsiooni kohta;

kasutatavad söötmed;

metaboolse aktiveerimise süsteemi tüüp ja koostis, sh selle vastuvõetavuse kriteeriumid;

manustamismenetlused

Tulemused:

toksilisuse tunnused;

sadestuse tunnused;

individuaalsed loendusandmed plaadi kohta;

revertantsete kolooniate keskmine arv plaadi kohta ja standardhälve;

doosi ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;

võimalikud statistilised analüüsid;

paralleelsete negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollkatsete andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;

varasemate negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollkatsete andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed.

Tulemuste arutelu.

Järeldused.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)20)21)22)23)24)

VIITED Arnes, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347–364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (19 8 3), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173–215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217–233. Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69–240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, pp. 91–96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Nor-poth K. H. and Garner, R. C, Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273–285. Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13–61. Aeschacher, H. U, Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods,/. Food Safety, 8, pp. 167–177. Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, pp. 33–42. Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141–161. Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453–465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335–344. Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33–47. Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2–141. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in GeneticToxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249–258. Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421–441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (19 79), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780–3782. Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961–4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285–291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlori-nated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85–88. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175–177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343–350. Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83–91. Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, pp. 28–65.

B.15. MUTAGEENSUSE JA KARTSINOGEENSUSE UURING, GEENMUTATSIOON – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.15.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Vt B osa üldist sissejuhatust.

1.2. MÕISTED Vt B osa üldist sissejuhatust.

1.3. VÕRDLUSAINED Puuduvad.

1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE Pärmseene Saccharomyces cerevisiae erinevaid haploidseid ja diploidseid tüvesid saab kasutada keemiliste ainete poolt põhjustatud geenmutatsioonide uurimiseks koos metabolismi aktiveerimisega või ilma. Haploidsete tüvede puhul on kasutusel otsemutatsiooni süsteemid, näiteks mõõtes mutatsiooni punasest, adeniinsõltuvast mutandist (ade-1, ade-2), topelt adeniinsõltuvaks valgeks mutandiks, ja selektiivsed süsteemid, nagu resistentsuse induktsioon kanavnaiinile ja tsükloheksimiidile. Kõige laialdasemalt tunnustatud pöördmutatsioonisüsteem hõlmab haploidse tüve XV 185-14C kasutamist, mis kannab ooker-nonsenss-mutatsioone ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 ja trp 5-48. Need mutatsioonid on pöörduvad baasasendatavate mutageenide poolt, mis indutseerivad kohaspetsiifilisi mutatsioone või ooker-supressor-mutatsioone. XV 185-14C kannab ka his 1-7 markerit, missense-mutatsiooni, mis on pöörduv peamiselt sekundaarsete mutatsioonikohtade poolt, ja hom 3-10 markerit, mis on pöörduv raaminihke mutageenide poolt. Diploidsete S. cerevisiae tüvede korral on ainukeseks laialdaselt kasutatavaks tüveks D7 mis on homosügootne ilv 1-92 suhtes.

1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID Puuduvad.

1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.6. Ettevalmistused

Testitava aine ja kontrollaine lahused tuleb valmistada vahetult enne testimise alustamist, kasutades sobilikke vehiikleid. Vees mittelahustuvate orgaaniliste koostisosiste puhul ei tohiks kasutada rohkem kui 2 % orgaaniliste ainete lahustamiseks sobivaid lahusteid, näiteks etanool, atsetoon või dimetüülsulfoksiid (DMSO). Abiaine lõplik kontsentratsioon ei tohiks oluliselt mõjutada raku eluvõimet ja kasvu karakteristikuid.

Metaboolne aktivatsioon

Rakud tuleks eksponeerida testitavale kemikaalile nii sobivate eksogeensete metabolismi aktiveerivate süsteemide juuresolekul kui ka ilma. Kõige sagedamini kasutatavaks süsteemiks on kofaktor, mille koostises on eelnevalt ensüümindutseeriva ainega mõjutatud näriliste maksast saadav post-mitokondriaalne fraktsioon. Metaboolseks aktivatsiooniks võib kasutada ka teisi loomaliike, kudesid, post-mitokondriaalseid fraktsioone või protseduure.

Uuringu tingimused

Test-tüvi

Geenmutatsiooni uuringutes on kõige kasutatavamad haploidne tüvi XV 185-14C ja diploidne tüvi D7. Teiste tüvede kasutamine võib olla kohane.

Rakusööde

Elulemuse ja mutantide arvu kindlakstegemiseks kasutatakse sobivaid rakusöötmeid.

Positiivsete ja negatiivsete kontrollide kasutamine

Positiivsed, töötlemata ja lahuse kontrollid tuleb teha korraga. Iga spetsiifilise mutatsioonilise tulemusnäitaja puhul tuleks kasutada sobivaid positiivse kontrolli kemikaale.

Ekspositsiooni kontsentratsioon

Testimisel peaks kasutama vähemalt viit piisavalt erinevat testitava aine kontsentratsiooni. Toksiliste ainete puhul ei tohiks kõrgeim testitav kontsentratsioon vähendada elulemust alla 5–10 %. Vees mittelahustuvad ained tuleks testida lahustuvuspiirini, kasutades selleks sobivaid meetodeid. Vabalt vees lahustuvate mittetoksiliste ainete puhul tuleks maksimaalne kontsentratsioon määrata üksikjuhtumite kaupa.

Inkubatsiooni tingimused

Alusklaase inkubeeritakse seitse päeva 28–30 oC juures pimedas.

Spontaansete mutatsioonide sagedus

Tuleks kasutada subkultuure, mille spontaansete mutatsioonide sagedus on aktsepteeritud normivahemikus.

Replikatsioonide arv

Raku eluvõime ja geenmutatsiooni poolt produtseeritud prototroofide analüüsimiseks tuleks kasutada vähemalt kolme replikatsiooni-alusklaasi iga testitava aine kontsentratsiooniväärtuse kohta. Kui kasutatakse madala mutatsioonitasemega markereid, nagu horn 3-10, tuleb alusklaaside arvu suurendada, et saada statistiliselt olulisi andmeid.

Protseduur

S.cerevisiae tüvede töötlus sooritatakse tavaliselt vedeltesti meetodil latentsete või paljunevate rakkudega. Algsed katsed tuleks teha paljunevate rakkudega: 1-5 x 107 rakku/ml eksponeeritakse testitavale kemikaalile kuni 18 tunni jooksul temperatuuril 28–37 oC, aeg-ajalt loksutades; piisav kogus metabolismi aktiveerivat süsteemi lisatakse töötluse käigus sobilikul ajahetkel. Töötluse lõpus rakud tsentrifuugitakse, pestakse ja külvatakse sobivale rakusöötmele. Pärast inkubatsiooni hinnatakse alusklaase rakkude elulemuse ja mutatsioonide induktsiooni osas. Kui esimene katse on negatiivne, tuleks teha teine katse, kasutades latentse faasi rakke. Kui esimene katse on positiivne, kinnitatakse see sobiva sõltumatu uuringuga.

2. ANDMED Andmed tuleks esitada tabelis, näidates loendatud kolooniate arvu, mutantide arvu, elulemuse ja mutantide sageduse. Kõik tulemused tuleks kinnitada sõltumatu uuringuga. Andmeid tuleks töödelda sobivaid statistilisi meetodeid kasutades.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:

kasutatav tüvi;

katsetingimused: latentses faasis või paljunevad rakud, rakusöötme koostis, inkubatsiooni temperatuur ja kestus, metabolismi aktiveeriv süsteem;

töötluse tingimused: ekspositsiooni tase, töötluse meetod ja kestus, töötluse temperatuur, positiivsed ja negatiivsed kontrollid;

loendatud kolooniate arv, mutantide arv, elulemuse ja mutantide sagedus, doos/vastus suhe (kui oluline), andmete statistiline hinnang;

tulemuste arutelu;

järeldused.

3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED Vt B osa üldist sissejuhatust.

4. VIITED Vt B osa üldist sissejuhatust.

B.16. MITOOTILINE REKOMBINATSIOON – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.16.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Vt B osa üldist sissejuhatust.

1.2. MÕISTED Vt B osa üldist sissejuhatust.

1.3. VÕRDLUSAINED Puuduvad.

1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE Saccharomyces cerevisiae mitootilist rekombinatsiooni saab määrata geenide vahel (üldisemalt geeni ja selle tsentromeeri vahel) või geenide sees. Esimest nimetatakse mitootiliseks ristsiirdeks, mille tulemuseks on retsiprooksed produktid, teist geeni konversiooniks, mis on kõige sagedamini mitteretsiprookne. Ristsiiret analüüsitakse tavaliselt retsessiivsete homosügootsete kolooniate produktsiooni järgi või heterosügootsete tüvede poolt produtseeritud sektorite järgi. Geeni konversiooni analüüsitakse prototroofsete revertantide produktsiooni järgi, mida toodavad kahte erinevat sama geeni defektset alleeli kandvad auksotroofsed heteroalleelsed tüved. Kõige sagedamini kasutatavad tüved mitootilise geeni konversiooni kindlakstegemiseks on D4 (heteroalleelne ade 2-s ja trp 5-s), D7 (heteroalleelne trp 5-s), BZ34 (heteroalleelne arg 4-s) ja JD1 (heteroalleelne his 4-s ja trp 5-s). Mitootilist ristsiiret, mis produtseerib punaseid ja roosasid homosügootseid sektoreid, saab analüüsida D5-s või D7-s (mis mõõdavad ka mitootilist geeni konversiooni ja pöördmutatsiooni ilv 1-92-s), mõlemad tüved on heteroalleelsed ade 2 komplementaarsete alleelide osas.

1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID Puuduvad.

1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.6. Ettevalmistused

Testitava kemikaali ja kontroll- või võrdluslahused tuleks valmistada vahetult enne testimist, kasutades sobivaid vehiikleid. Vees mittelahustuvate orgaaniliste koostisosade puhul ei tohiks kasutada rohkem kui 2 % orgaaniliste ainete lahustamiseks sobivaid lahusteid, näiteks etanool, atsetoon või dimetüülsulfoksiid (DMSO). Vehiikli lõplik kontsentratsioon ei tohiks oluliselt mõjutada raku eluvõimet ja kasvu omadusi.

Metaboolne aktivatsioon

Rakud tuleks eksponeerida testitavale kemikaalile nii sobiva eksogeense metabolismi aktiveeriva süsteemi juuresolekul kui ka ilma. Kõige sagedamini kasutatavaks süsteemiks on kofaktor, mille koostises on eelnevalt ensüümindutseeriva ainega mõjutatud näriliste maksast saadav post-mitokondriaalne fraktsioon. Ka teiste liikide, kudede, post-mitokondriaalsete fraktsioonide või meetodite kasutamine metaboolseks aktivatsiooniks on lubatud.

Katsetingimused

Test-tüved

Kõige sagedamini kasutatavad tüved on diploidsed D4, D5, D7 ja JD1. Teiste tüvede kasutamine võib olla kohane.

Rakusööde

Mitootilise rekombinatsiooni ja elulemuse sageduse hindamiseks kasutatakse sobivaid rakusöötmeid.

Positiivsete ja negatiivsete kontrollide kasutamine

Positiivsed, mittetöödeldud ja lahusti kontrollid peaksid olema tehtud korraga. Iga spetsiifilise rekombinatsiooni tulemusnäitaja puhul tuleks kasutada sobivaid positiivse kontrolli kemikaale.

Ekspositsiooni kontsentratsioonid

Tuleks kasutada vähemalt viit piisavalt erinevat testitava aine kontsentratsiooni. Uuritavate faktorite hulgas peavad muu hulgas olema tsütotoksilisus ja lahustuvus. Kõige madalam kontsentratsioon ei tohi mõju avaldada raku eluvõimele. Toksiliste ainete puhul ei tohiks kõrgeim testitav kontsentratsioon vähendada elulemust alla 5–10 %. Vees mittelahustuvaid kemikaale tuleks testida lahustuvuspiirini, kasutades selleks sobivaid meetodeid. Vabalt vees lahustuvate mittetoksiliste ainete kõrgeim kontsentratsioon tuleb määrata üksikjuhtumite kaupa. Rakke võib eksponeerida testitavale kemikaalile kas latentses või paljunemisfaasis kuni 18 tunni jooksul. Pika töötlemisaja puhul tuleks kultuure uurida mikroskoopiliselt spooride moodustumise aspektist, spooride olemasolu tühistab testi tulemuse.

Inkubatsioonitingimused

Alusklaase inkubeeritakse pimedas neli kuni seitse päeva temperatuuril 28–30 oC. Alusklaase, mida kasutatakse mitootilise ristsiirde poolt produtseeritud punaste ja roosade homosügootsete sektorite analüüsimiseks, tuleks enne loendust hoida üks kuni kaks päeva külmikus (umbes 4 oC juures), mis võimaldab sobivate pigmenteeritud kolooniate tekke.

Spontaanse mitootilise rekombinatsiooni sagedus

Tuleks kasutada subkultuuri, mille spontaanse mitootilise rekombinatsiooni mutatsiooni sagedus on aktsepteeritud normivahemikus.

Replikatsioonide arv

Elulemuse ja mitootilise geenikonversiooni poolt produtseeritud prototroofide analüüsimiseks tuleks kasutada vähemalt kolme replikatsiooni-alusklaasi iga testitava aine kontsentratsiooni kohta. Mitootilise ristsiirde poolt produtseeritud retsessiivse homosügoosi analüüsimiseks tuleks alusklaaside arvu suurendada, et saada piisavat kolooniate arvu.

Protseduur

S. cerevisiae tüvede töötlus sooritatakse tavaliselt vedeltesti meetodil, kasutatakse latentseid või paljunevaid rakke. Algsed katsed tuleks teha paljunevate rakkudega. 1-5 x 107 rakku/ml eksponeeritakse testitavale kemikaalile kuni 18 tunniks temperatuuril 28–37 oC loksutades; piisav kogus metabolismi aktiveerivat süsteemi lisatakse töötluse käigus sobilikul ajahetkel. Töötluse lõpus rakud tsentrifugeeritakse, pestakse ja külvatakse sobivale rakusöötmele. Pärast inkubatsiooni hinnatakse alusklaase rakkude elulemuse ja mitootilise rekombinatsiooni induktsiooni osas. Kui esimene katse on negatiivne, tuleks teha teine katse, kasutades latentse faasi rakke. Kui esimene katse on positiivne, kinnitatakse see sõltumatu uuringuga.

2. ANDMED Andmed tuleks esitada tabelis, näidates ära loendatud kolooniate arvu, rekombinantide arvu, elulemuse ja rekombinantide sagedus. Tulemused tuleks kinnitada sõltumatu uuringuga. Andmeid tuleks töödelda sobivaid statistilisi meetodeid kasutades.

3. ARUANNE

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:

kasutatud tüvi;

katsetingimused: latentse faasi või paljunevad rakud, kultuuri koostis, inkubatsiooni temperatuur ja kestus, metabolismi aktiveeriv süsteem;

töötluse tingimused: ekspositsiooni kontsentratsioon, meetod ja töötluse kestus, töötluse temperatuur, positiivsed ja negatiivsed kontrollid;

loendatud kolooniate arv, rekombinantide arv, elulemus ja rekombinantide sagedus, doosi/vastuse suhe (kui oluline), andmete statistiline hinnang;

tulemuste arutelu;

järeldused.

3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED Vt B osa üldist sissejuhatust.

4. VIITED Vt B osa üldist sissejuhatust.

B.17. MUTAGEENSUS — IN VITRO IMETAJATE RAKKUDE GEENMUTATSIOONKATSE

B.17.

1. MEETOD Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 476, In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997).

1.

1.1. SISSEJUHATUS In vitro imetajate rakkude geenmutatsioonkatset saab kasutada keemiliste ainete põhjustatud geenmutatsioonide avastamiseks. Sobivate rakuliinide hulka kuuluvad hiire lümfoomirakud L5178Y, hiina hamstri rakuliinid CHO, CHO-AS52 ja V79 ning inimeste lümfoblastoidrakud TK6 (1). Kõnealustes rakuliinides enim kasutatavad geneetilised lõpp-punktid mõõdavad mutatsioone tümidiinkinaasi- (TK) ja hüpoksantiin-guaniinfosforibosüültransferaasil (HPRT) ja ksantiin-guaniinfosforibosüültransferaasil (XPRT). TK-, HPRT-ja XPRT-mutatsiooni katsed avastavad erinevaid geneetilisi juhtumeid. TK ja XPRT autosomaalne asukoht võimaldab avastada geneetilisi juhtumeid (nt suuri deletsioone), mida ei avastata X-kromosoomides HPRT-lookuses (2, 3, 4, 5, 6). In vitro imetajate rakkude geenmutatsioonkatses saab kasutada kindlakskujunenud rakuliinide või rakutüvede kultuure. Kasutatavad rakud valitakse kultuuris kasvamisvõime ja nende spontaanse mutatsioonisageduse stabiilsuse põhjal. Tehtud in vitro katsed üldjuhul nõuavad eksogeenset metaboolset aktiveerimist. Kõnealune metaboolse aktiveerimise süsteem ei saa tervenisti jäljendada in vivo tingimusi imetajates. Tuleks hoolikalt vältida tingimusi, mille tulemused ei peegelda neile omaseid mutageensusi. Positiivsed tulemused, mis ei peegelda omast mutageensust, võivad tekkida pH, osmolaalsuse või tsütotoksilisuse kõrgete tasemete muutuste põhjal (7). Kõnealust katset kasutatakse imetajate võimalike mutageenide ja kantserogeenide skriinimiseks. Mitmed ühendid, mis annavad positiivseid tulemusi kõnealuses katses, on imetajate kantserogeenid; siiski ei ole kõnealuse katse ja kantserogeensuse vahel täielikku korrelatsiooni. Korrelatsioon sõltub keemilisest aineklassist ning üha suuremal arvul esineb kantserogeene, mida ei avastata käesoleva katse abil, kuna need toimivad muude, mittegenotoksiliste mehhanismide või bakterirakkudes puuduvate mehhanismide abil (6). Vt ka üldist sissejuhatust B osas.

1.2. MÕISTED Päripidine mutatsioon: geenimutatsioon parentaalset tüüpi mutantvormist, mille tulemusena kodeeritud valk kaotab ensümaatilise aktiivsuse või seda ensümaatilist aktiivsust muudetakse. Aluspaari asendust põhjustavad mutageenid: ained, mis põhjustavad ühe või mitme aluspaari asendust DNAs. Raaminihke mutageenid: ained, mis põhjustavad ühe või mitme aluspaari lisamist või deletsiooni DNA-molekulis. Fenotüübi ekspressiooniaeg: periood, mille jooksul muutmata geeniproduktid lahkuvad äsja muteerunud rakkudest. Mutatsioonsagedus: vaadeldud mutantrakkude arv, mis on jagatud elujõuliste rakkude arvuga. Suhteline kogukasv: rakkude arvu suurenemine ajas võrrelduna rakkude kontrollpopulatsiooniga; arvutatud korrutisena, mille teguriteks on suspensioonikasv negatiivse kontrollkatse suhtes ja kloonimisefektiivsus negatiivse kontrollkatse suhtes. Suhteline suspensioonikasv: rakkude arvu suurenemine ekspressiooniperioodi jooksul võrreldes negatiivse kontrollkatsega. Elujõulisus: töödeldud rakkude kloonimisefektiivsus valiktingimustel plaatidele paigutamisel pärast ekspressiooniperioodi. Ellujäämine: töödeldud rakkude kloonimisefektiivsus plaatidele paigutamisel töötlemisperioodi lõpus; ellujäämist väljendatakse tavaliselt rakkude kontrollpopulatsiooni elujäämise suhtes.

1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Rakud, millel TK+/- —> TK-/--mutatsiooni tulemusel puudub tümidiinkinaas (TK), on resistentsed pürimidiini analoogi trifluorotümidiini (TFT) tsütotoksiliste mõjude suhtes. Tümidiinkinaasi suhtes spetsiifilised rakud on tundlikud TFT-le, mis takistab rakuainevahetust ja peatab edasise raku jagunemise. Seega mutantrakud on võimelised TFT esinemise korral vohama, samal ajal kui normaalsed rakud, milles on tümidiinkinaas, ei voha. Analoogiliselt valitakse HPRT- või XPRT-defitsiidiga rakud 6-tioguaniinile (TG) või 8-asaguaniinile (AG) resistentsuse alusel. Uuritava aine omadusi tuleb hoolikalt arvesse võtta, kui testitakse selektiivainega seotud alusanaloogi või ühendit mis tahes imetajate rakkude geenimutatsiooni katsetes. Näiteks tuleb uurida uuritava aine võimalikku kahtlustatavat selektiivset toksilisust mutantsetes või mittemutantsetes rakkudes. Valikusüsteemi/aine efektiivsust tuleb kinnitada, testides selektiivainega lähedase struktuuriga kemikaale (8). Suspensioonis või monokihilises kultuuris olevad rakud allutatakse uuritava aine toimele, nii koos metaboolse aktiveerimisega kui ka ilma selleta, sobiva aja jooksul ning tsütotoksilisuse määramiseks külvatakse rakud ümber võimaldamaks fenotüübi avaldumist enne mutandi valikut (9, 10, 11, 12, 13). Tavaliselt määratakse tsütotoksilisus suhtelise kloonimisefektiivsuse (ellujäämise) või suhtelise rakkude kogukasvu mõõtmisega pärast töötlemisperioodi. Töödeldud katsekultuure hoitakse kasvukeskkonnas piisava aja jooksul, mis on igale valitud lookusele ja rakutüübile iseloomulik, võimaldamaks saavutatud mutatsioonide fenotüüpide avaldumist võimalikult lähedal optimaalsele tasemele. Mutatsioonisagedus määratakse teadaoleva arvu rakkude külvamisel söötmesse, mis sisaldab selektiivainet, millega avastatakse mutantrakud, ja söötmesse, milles pole selektiivainet kloonimisefektiivsuse (elujõulisuse) määramiseks. Pärast piisavat inkubatsiooniaega loendatakse kolooniad. Mutatsioonisagedus saadakse selektiivses kasvukeskkonnas olevate mutantkolooniate arvu ja mitteselektiivses keskkonnas olevate kolooniate arvu alusel.

1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.4.

1.4.1. Ettevalmistused

1.4.1.

1.4.1.1. Rakud Käesolevas katses kasutatakse erinevaid rakutüüpe, sh L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 või TK6 rakkude subkloone. Käesolevas katses kasutatavad rakutüübid on näidanud tundlikkust keemiliste mutageenide suhtes, suurt kloonimisefektiivsust ja stabiilset spontaanset mutatsioonsagedust. Rakkudes kontrollitakse mükoplasma saastatust ja saastumise korral ei tohiks neid kasutada. Katsed tuleb kavandada etteantud tundlikkusest ja usaldusväärsusest lähtudes. Rakkude, kultuuride ja uuritava aine kontsentratsioonide arv peaks peegeldama neid määratletud parameetreid (14). Töötlemise järel ellu jäänud ja igas katsefaasis kasutatavate elujõuliste rakkude minimaalne arv peaks põhinema spontaansel mutatsioonsagedusel. Üldjuhendiks on see, et rakkude arv on vähemalt kümnekordse spontaanse mutatsioonsageduse pöördväärtus. On soovitatav kasutada vähemalt 106 rakku. Kasutatava rakusüsteemi kohta peab olema piisavalt varasemaid andmeid, mis viitavad katse efektiivsuse vastavusele.

1.4.1.2. Kasvukeskkonnad ja söötmed Tuleks kasutada sobivaid kasvukeskkondasid ja inkubatsioonitingimusi (kasvuanumad, temperatuur, CO2 kontsentratsioon ja niiskus). Kasvukeskkonnad tuleks valida vastavalt katses kasutatavatele valikusüsteemidele ja rakutüüpidele. On eriti tähtis, et kasvutingimused valitakse nii, et tagatakse rakkude optimaalne kasv ekspressiooniperioodi ajal ning nii mutantsete kui mittemutantsete rakkude võime moodustada kolooniaid.

1.4.1.3. Rakukultuuride ettevalmistamine Rakud paljundatakse tüvekultuuridest, mis on külvatud kasvukeskkonda ja inkubeeritud 37 oC juures. Enne käesoleva katse tegemist tuleb kultuurid puhastada varasematest mutantrakkudest.

1.4.1.4. Metaboolne aktiveerimine Rakud allutatakse uuritava aine toimele nii vastava metaboolse aktiveerimissüsteemi olemasolu kui ka puud umise korral. Enim kasutatav süsteem on ensüüme indutseerivate ainetega, nt Aroclor 1254-ga (15, 16, 17, 18) või fenobarbitooni ja β-naftoflavooni seguga (19, 20), töödeldud näriliste maksast valmistatud postmitokondriaalne osa (S9), millele on lisatud kofaktor. Tavaliselt kasutatakse postmitokondriaalset fraktsiooni kontsentratsioonis 1–10 mahuprotsenti lõplikus katsekeskkonnas. Metaboolse aktiveerimissüsteemi valik ja tingimused võivad sõltuda uuritava aine keemilisest aineklassist. Mõnel juhul on vaja kasutada rohkem kui üht postmitokondriaalse fraktsiooni kontsentratsiooni. Osade meetodite korral, sh geneetiliselt muudetud rakuliini saamine, mis ekspresseerib spetsiifilisi aktiveerimisensüüme, võib avalduda endogeense aktiveerimise võime. Kasutatavate rakuliinide valik peab olema teaduslikult põhjendatud (nt tsütokroom P450 isoensüümi tähtsus uuritava aine metabolismil).

1.4.1.5. Uuritav aine/ettevalmistused Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne rakkude töötlemist. Vedelad uuritavad ained võib lisada vahetult katsesüsteemidesse ja/või lahjendada enne töötlemist. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.

1.4.2. Katsetingimused

1.4.2.

1.4.2.1. Lahusti/kandjaaine Lahusti/kandjaaine ei tohiks uuritava ainega keemiliselt reageerida ning see peaks sobima rakkude eluvõimelisuse ja S9 aktiivsusega. Kui kasutatakse tuntud lahustist/kandjaainest erinevat, siis peab selle kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine kasutamist. Vees ebapüsivate ainete uurimisel kasutatavad orgaanilised lahustid peavad olema veevabad. Vett saab eemaldada molekulaarsõelte lisamisega.

1.4.2.3 Kontrollkatsed Igas uuringus kasutatakse paralleelseid positiivseid ja negatiivseid (lahusti või kandjaaine) kontrollkatseid nii koos metaboolse aktiveerimisega kui ka ilma selleta. Kui kasutatakse metaboolset aktiveerimist, käsitatakse positiivse kontrollainena sellist kemikaali, mis eeldab aktiveerimist mutageense reaktsiooni saamiseks. Positiivsete kontrollainete näited: Metaboolse aktiveerimise tingimus Lookus Aine CAS nr EINECSi nr Eksogeense metaboolse aktiveerimise puudumine HPRT Etüül-metaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 N-etüül-N-nitrosokarbamiid 759-73-9 212-072-2 TK (väikesed ja suured kolooniad) Metüül-metaansulfonaat 66-27-3 200-625-0 XPRT Etüül-metaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 N-etüül-N-nitrosokarbamiid 759-73-9 212-072-2 Eksogeense metaboolse aktiveerimise olemasolu HPRT 3-metüülkolantreen 56-49-5 200-276-4 Dimetüülnitrosoamiin 62-75-9 200-549-8 7,12-dimetüülbensantratseen 57-97-6 200-359-5 TK (väikesed ja suured kolooniad) Tsüklofosfamiid 50-18-0 200-015-4 Tsüklofosfamiidmonohüdraat 6055-19-2 Benso(α)püreen 50-32-8 200-028-5 3-metüülkolantreen 56-49-5 200-276-5 XPRT Dimetüülnitrosoamiin (S9 kõrge taseme jaoks) 62-75-9 200-549-8 Benso(α)püreen 50-32-8 200-028-5 Muid sobivaid positiivse kontrolli võrdlusaineid võib kasutada nt siis, kui laboril on andmebaas 5-bromo-2'-desoksüuridiini kohta (CASi nr 59-14-3, EINECSi nr 200-415-9), siis võib samuti kasutada kõnealust võrdlusainet. Lähedasse keemilisse aineklassi kuuluvate positiivsete kontrollkemikaalide kasutamist tuleks kaaluda, kui selline aine on kättesaadav. Negatiivsed kontrollid, mis koosnevad üksnes kasvukeskkonnas olevast lahustist või kandjaainest ning mida on käsitletud samal viisil kui katserühma, peaksid sisalduma. Lisaks sellele käsitletakse ka manustamata kontrollaineid, välja arvatud juhul, kui varasemad andmed kontrollaine kohta näitavad, et valitud lahustil ei ole kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.

1.4.3. Menetlus

1.4.3.

1.4.3.1. Vastuvõtlikkus uuritavale ainele Rakukultuure manustatakse uuritavale ainele koos metaboolse aktiveerimisega ja ilma selleta. Manustamisaeg peab olema sobiv (efektiivne aeg on tavaliselt 3–6 tundi). Manustamist võidakse jätkata ühe või mitme rakutsükli jooksul. Igal uuritaval kontsentratsioonil võib kasutada kas kahte paralleelset või ühte kultuuri. Kui kasutatakse üksikkultuure, peaks kontsentratsioonide arv tõusma, et tagada analüüsitavate kultuuride piisav arv (nt vähemalt 8 analüüsitavat kontsentratsiooni). Tuleks kasutada paralleelseid negatiivseid (lahusti) kontrollkultuure. Gaasilisi või lenduvaid aineid uuritakse sobiva meetodi abil, näiteks suletud kasvuanumates (21, 22).

1.4.3.2. Ellujäämise, elujõulisuse ja mutatsioonisageduse mõõtmine Manustamisperioodi lõpus rakud pestakse ja kultiveeritakse ellujäämise määramiseks ja mutantse fenotüübi avaldumise võimaldamiseks. Tsütotoksilisuse suhtelise kloonimisefektiivsuse (ellujäämise) või suhtelise rakkude kogukasvu mõõtmise määramine algatatakse tavaliselt pärast manustamisperioodi. Iga lookus on kindlaksmääratud minimaalse ajaga, et värskelt põhjustatud mutantide fenotüüpide avaldumine oleks lähedal optimaalsele (HPRT ja XPRT eeldab vähemalt 6–8 päeva ja TK vähemalt kahte päeva). Rakud kasvatakse selektiivse(te) aine(te)ga söötmes mutantide arvu ja ilma selektiivse(te) aine(te)ta söötmes kloonimisefektiivsuse määramiseks. Elujõulisuse mõõtmine (kasutatakse mutatsioonisageduse arvutamiseks) algatatakse avaldumisaja lõpus, asetades rakke mitteselektiivsesse söötmesse. Kui uuritav aine on positiivne L5178Y TK+/- katses, tuleks kolooniate arv määrata vähemalt ühes uuritavas kultuuris (suurim positiivne kontsentratsioon) ning negatiivsetes ja positiivsetes kontrollides. Kui uuritav aine on negatiivne L5178Y TK+/- katses, tuleks kolooniate arv määrata negatiivsetes ja positiivsetes kontrollides. Uurimustes, kus kasutatakse TK6TK+/-, võidakse samuti kolooniate arvu määrata.

2. ANDMED

2.

2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE Tulemuste hulgas peaksid olema tsütotoksilisuse ja elujõulisuse määramine, kolooniate arv ja mutatsioonisagedused katse- ja kontrollkultuuride kohta. L5178Y TK+/- katse positiivse vastuse korral loendatakse kolooniad, kasutades selles väikeste või suurte kolooniate kriteeriume uuritava aine vähemalt ühel kontsentratsioonil (suurim positiivne kontsentratsioon) ning negatiivses ja positiivses kontrollis. Nii suurte kui ka väikeste kolooniate mutantide molekulaarset ja tsütogeenilist olemust on uuritud täpsemalt (23, 24). TK+/- katses loendatakse kolooniad, kasutades normaalse kasvuga (suurte) ja aeglase kasvuga (väikeste) kolooniate kriteeriumeid (25). Mutantsed rakud, millel on kõige ulatuslikum geneetiline kahjustus, on pikendanud kahekordistumise aega ja seetõttu moodustavad väikeseid kolooniaid. Kõnealune kahjustus ulatub tüüpiliselt kogu geeni kaotamisest kuni karüotüüpiliselt nähtavate kromosoomide aberratsioonideni. Väikese koloonia mutantide moodustamine on seotud keemiliste ainetega, mis põhjustavad suuri kromosoomaberratsioone (26). Vähem tõsiselt mõjutatud mutantrakud kasvavad kiirusel, mis on sarnane parentaalsete rakkudega ja moodustavad suuri kolooniaid. Ellujäämine (suhtelised kloonimisefektiivsused) või suhteline kogukasv on ära toodud. Mutatsioonisagedust väljendatakse mutantrakkude arvuga ellujäänud rakkude arvu kohta. Tulemused esitatakse iga üksiku kultuuri kohta. Lisaks esitatakse kokkuvõte kõikidest tulemustest tabeli kujul. Selget positiivset vastust ei ole vaja kontrollida. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval uurimisel meelepäraselt muudetud katsetingimustes. Negatiivseid tulemusi kinnitatakse igal üksikjuhul eraldi. Neil juhtudel, kui negatiivsete tulemuste kinnitamist ei peeta vajalikuks, esitatakse põhjendus. Katse parameetrite muutmist hinnatud tingimuste vahemiku suurendamiseks tuleks arvesse võtta ebaselgete või negatiivsete tulemuste järelkatsetel. Katse selliste parameetrite, mida võidakse muuta, hulka kuuluvad kontsentratsioonivahemik ja metaboolse aktiveerimise tingimused.

2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE On mitmeid kriteeriume positiivse tulemuse määramiseks, nagu nt mutatsioonisageduse kontsentratsiooniga seotud suurenemine või paljundamine. Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel. Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse jaoks. Uuritavat ainet, mille puhul tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumidele, peetakse mittemutageenseks aineks käesolevas katses. Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tulemused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete kordamisest sõltumata. Positiivsed tulemused in vitro imetajate rakkude geenmutatsiooni katses viitavad sellele, et uuritav aine põhjustab geenmutatsioone kasutatud kultiveeritud imetajate rakkudes. Paljundatav positiivne kontsentratsiooni ja toime suhe on kõige tähelepanuväärsem. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et katsetingimuste põhjal ei põhjusta uuritav aine geenmutatsioone kasutatud kultiveeritud imetajate rakkudes.

3. ARUANDLUS

3. KATSEARUANNE

Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.

Lahusti/kandjaaine:

kandjaaine/lahusti valiku põhjendamine;

uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on teada.

Rakud:

rakkude tüüp ja allikas;

rakukultuuride arv;

raku passaažide arv, vajaduse korral;

rakukultuuri säilitamise meetodid, vajaduse korral;

mükoplasma puudumine.

Katsetingimused:

kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valimise põhimõtted, sh nt tsütotoksilisuse andmed ja lahustuvuse piirangud, kui need on olemas;

kasvukeskkonna koostis, CO2 kontsentratsioon;

uuritava aine kontsentratsioon;

lisatud kandjaaine ja uuritava aine hulk;

inkubatsioonitemperatuur;

inkubatsiooniaeg;

manustamise kestus;

rakutihedus manustamise ajal;

metaboolse aktiveerimise süsteemi tüüp ja koostis, sh selle heakskiitmise kriteeriumid;

positiivsed ja negatiivsed kontrollid;

avaldumisperioodi pikkus (sh külvatud rakkude arv, subkultuurid ja söötmiskavad, vajaduse korral);

selektiivsed ained;

kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, negatiivseteks või ebaselgeteks;

meetodid elujõuliste ja mutantrakkude loendamiseks;

kolooniate kindlakstegemine, kus kolooniate arvu ja tüüpi võetakse arvesse (sh väikeste ja suurte kolooniate kriteeriumid, vajaduse korral).

Tulemused:

toksilisuse tunnused;

sadestuse tunnused;

teave pH ja osmolaalsuse kohta uuritavale ainele vastuvõtlikkuse ajal, kui see on määratud;

koloonia suurus, kui see on arvutatud vähemalt negatiivsetest ja positiivsetest kontrollidest;

labori valmisolek väikeste mutantide kolooniate avastamiseks L5178Y TK+/- süsteemi abil, vajaduse korral;

doosi ja toime suhe, võimaluse korral;

võimalikud statistilised analüüsid;

paralleelsete negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollide tulemused;

varasemate negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollide andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;

mutatsioonisagedus.

Tulemuste arutelu.

Järeldused.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)20)21)22)23)24)25)26)

VIITED Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindal, K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E. H. Y. and Mailing H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306–1312. Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, pp. 467–485. Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394–403. Aaron, C. S., and Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res. 223, pp. 121–128. Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, pp. 235–239. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, pp. 147–204. Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225–251. Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17–36. Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C, Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135–141. Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9–17. Stankowski, L. F. Jr., Tindal, K. R., and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191 -Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and lCR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133–147. Turner, N. T, Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for the L5178Y/TK+/— TK+/" Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239–268. Ariett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, pp. 66–101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, pp. 365–373. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, pp. 347–364. Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+' – Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res. 59, pp. 61–108. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173–215. Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, pp. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholri-nated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85–88. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91–103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795–801. Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51–55. Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C, Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluoronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK+'" – Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161–174. Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res. 229, pp. 89–102. Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+'" – 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, pp. 609–614.

B.18. DNA KAHJUSTAMINE JA PARANDAMINE – PLAANIVÄLINE DNA SÜNTEES – IMETAJATE RAKKUDEL IN VITRO

B.18.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Vt B osa üldist sissejuhatust.

1.2. MÕISTED Vt B osa üldist sissejuhatust.

1.3. VÕRDLUSAINED Puuduvad.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Plaanivälise DNA sünteesi (PDS) test mõõdab DNA reparatiivset sünteesi pärast keemiliste ja füüsikaliste tegurite poolt kahjustatud DNA segmendi väljalõikamist. Test põhineb triitiumiga märgistatud tümidiini (3H-TdR) sisestamisel sünteesifaasis (S) mitte oleva imetajaraku DNAsse. Radioaktiivse tümidiini (3H-TdR) seondumist töödeldud rakkude DNAga võib määrata autoradiograafiliselt või vedelik-stsintillatsiooniloenduri (VSL) abil. Imetajarakkude kultuuri, juhul kui ei kasutata primaarseid roti hepatotsüüte, töödeldakse uuritava ainega nii ilma kui ka koos eksogeense metaboolse aktivatsioonisüsteemiga. PDSi võib mõõta ka in vivo süsteemides.

1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID Puuduvad.

1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.6. Ettevalmistused

Analüüsis kasutamiseks tuleb uuritavad kemikaalid ja kontroll- või võrdlusained valmistada söötmes või suspendeerida vastavatesse lahustitesse ja seejärel lahustada söötmes. Lahuse lõppkontsentratsioon ei tohiks mõjutada rakkude eluvõimelisust. Analüüsiks võib kasutada roti hepatotsüütide primaarkultuuri, inimese lümfotsüüte või püsiliini rakke (nt inimese diploidseid fibroblaste). Rakke tuleb eksponeerida uuritavale kemikaalile nii vastava metaboolse aktivatsioonisüsteemi olemasolul kui ka ilma selleta.

Katsetingimused

Rakukultuuride arv

Igas eksperimendi lõigus on vajalikud vähemalt kaks rakukultuuri autoradiograafia jaoks ja kuus kultuuri (või vähem, kui see on teaduslikult põhjendatud) VSLi abil PDSi määramise jaoks.

Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine

Igasse eksperimenti peaks olema kaasatud sobiv positiivne ja negatiivne (töötlemata ja/või lahusti) kontroll nii aktivatsioonisüsteemi olemasolu korral kui ka ilma selleta. Positiivseteks kontrollideks roti hepatotsüütide analüüsil võivad olla näiteks kas 7,12-dimetüülbensatratseen (7,12-DMBA) või 2-atsetüülaminofluoreen (2-AAF). Püsiliini rakkude puhul võib 4-nitrokinoliin-N-oksiid (4-NQO) olla positiivseks kontrolliks nii autoradiograafia kui ka VSLi analüüsi puhul, mis tehakse ilma metaboolse aktivatsioonita; N-dimetüülnitroosamiin on positiivse kontrolli näiteks sel juhul, kui kasutatakse metaboolset aktivatsioonisüsteemi.

Kasutatavad kontsentratsioonid

Kasutada tuleb uuritava aine palju erinevaid kontsentratsioone piirides, mis võimaldaksid välja selgitada selle aine toime. Kõige kõrgem kontsentratsioon peaks esile kutsuma mõningaid tsütotoksilisi toimeid. Vees suhteliselt halvasti lahustuvaid ühendeid tuleks uurida kuni nende veeslahustuvuse piirini. Vabalt vees lahustuvate mittetoksiliste kemikaalide ülemine testitav piirikontsentratsioon tuleb määrata igal üksikjuhul eraldi.

Rakud

Säilituskultuurides tuleb kasutada sobivat söödet, CO2 kontsentratsiooni ja temperatuuri. Püsiliini rakke tuleb perioodiliselt kontrollida mükoplasmaga kontamineerituse suhtes.

Metaboolne aktiveerimine

Metaboolse aktivatsiooni süsteemi ei kasutata hepatotsüütide primaarkultuuris. Püsiliini rakkude ja lümfotsüütide puhul eksponeeritakse neid uuritavale ainele nii vastava metaboolse aktivatsiooni süsteemi olemasolu korral kui ka selle puudumisel.

Protseduur

Rakukultuuride valmistamine

Püsiliini rakud saadakse tüvikultuurist (nt selle trüpsiniseerimisel või lahtiraputamisel), külvatakse kultiveerimisnõusse vastaval tihedusel ja inkubeeritakse + 37 oC juures. Roti hepatotsüütide lühiajalised kultuurid saadakse, kui värskelt üksteisest eraldatud hepatotsüütidel lastakse vastavas söötmes kinnituda kasvupinnasele. Inimese lümfotsüütide kultuurid valmistatakse selleks ette nähtud viisil.

Rakukultuuride töötlemine uuritavate ainetega Primaarsed roti hepatotsüüdid

Värskelt isoleeritud roti hepatotsüüte töödeldakse uuritava ainega ettenähtud aja jooksul radioaktiivset tümiini 3H-TdR sisaldavas söötmes. Töötluse lõpus eemaldatakse rakkudelt sööde, nad loputatakse, fikseeritakse ja kuivatatakse. Alusklaasid kastetakse kiirgustundlikku vedelasse emulsiooni (alternatiivselt võib kasutada kile-emulsiooni), eksponeeritakse, ilmutatakse, värvitakse ja loendatakse.

Püsiliini rakud ja lümfotsüüdid

Autoradiograafilised tehnikad: pärast töötlemist 3H-TdR-ga allutatakse rakukultuurid ettenähtud ajaks uuritava aine toimele. Toimeaja kestus sõltub aine omadustest, metaboolsete süsteemide aktiivsusest ja rakutüübist. Et kindlaks määrata PDSi maksimaaltulemust, tuleks 3H-TdR-i lisada kas samal ajal uuritava ainega või mõne minuti jooksul pärast kokkupuudet uuritava ainega. Protseduuri valikut mõjutab võimalik koosmõju uuritava aine ja 3H-TdR-i vahel. Selleks, et eristada PDSi semikonservatiivsest DNA replikatsioonist, võib viimase inhibeerida näiteks kas arginiin-defitsiitset söödet, madala seerumisisaldusega või hüdroksüuureat sisaldavat rakukultuuri söödet kasutades. PDSi mõõtmine VSLi abil: enne uuritava ainega töötlemist tuleb blokeerida rakkude sisenemine S-faasi, nagu ülalpool kirjeldatud; seejärel tuleb rakke eksponeerida testitavale kemikaalile nagu autoradiograafia puhul. Inkubatsiooniaja lõpus tuleb DNA rakkudest eraldada ja määrata kogu DNA hulk ning 3H-TdR-ga liitumise ulatus. Tuleb märkida, et kui ülalkirjeldatud meetodi puhul kasutatakse inimese lümfotsüüte, siis ei ole stimuleerimata kultuurides semi-konservatiivse DNA replikatsiooni mahasurumine vajalik.

Analüüs

Autoradiograafilised määramised

PDSi määramisel rakukultuuris S-faasis olevaid rakutuumi ei loendata. Iga erineva kontsentratsiooni kohta tuleb loendada vähemalt 50 rakku. Alusklaasid tuleb enne loendamist kodeerida. Igal alusklaasil tuleb loendada mitu eraldi asetsevat juhuslikult valitud välja. Seondunud 3H-TdR-i kogus tsütoplasmas tuleb määrata, loendades igas loendatava raku tsütoplasmas kolm rakutuuma suurust ala.

VSLi määramised

VSLi PDSi määramisel tuleb kasutada iga erineva kontsentratsiooni ja kontrolli puhul adekvaatset kultuuride arvu. Kõiki andmeid tuleb kinnitada sõltumatu katsega.

2. ANDMED Andmed tuleb esitada tabelina.

2.

2.1. AUTORADIOGRAAFILISED MÄÄRAMISED 3H-TdR-i tsütoplasmasse seondumise ulatus ja rakutuumalt leitud hõbedaterade arv tuleb eraldi registreerida. 3H-TdR-i tsütoplasmaga seondumuse ulatuse ja tuuma kohta tuleva hõbedaterade arvu kirjeldamiseks võib kasutada keskmist näitajat, mediaani ja moodväärtust.

2.2. VSLI MÄÄRAMISED VSLi määramisteks tuleb 3H-TdR-i seondumist väljendada kui dpm/μg DNA. Seondumise jaotuse kirjeldamiseks võib kasutada näitajat keskmine dpm/μg DNA koos standardhälbega. Andmeid tuleb hinnata vastavaid statistilisi meetodeid kasutades.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:

kasutatud rakud, tihedus ja külvi number töötluse ajal, rakukultuuride arv;

rakukultuuride säilitamiseks kasutatud meetodid, sealhulgas rakkude sööde, temperatuur ja CO2 kontsentratsioon;

uuritav aine, lahusti, kontsentratsioonid ja analüüsiks kasutatud kontsentratsioonide valiku põhjendus;

metaboolsete aktivatsioonisüsteemide detailid;

töötluste kava;

positiivsed ja negatiivsed kontrollid;

kasutatud autoradiograafilised meetodid;

rakkude S-faasi mineku blokeerimiseks kasutatud meetodid;

DNA eraldamiseks ja DNA koguhulga määramiseks VSLiga kasutatud tehnikad;

kus võimalik, anda doosi/vastuse suhe;

statistiline hinnang;

tulemuste arutelu;

järeldused.

3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED Vt B osa üldist sissejuhatust.

4. VIITED Vt B osa üldist sissejuhatust.

B.19. ÕDEKROMATIIDI VAHETUSE IN VITRO ANALÜÜS

B.19.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Vt B osa üldist sissejuhatust.

1.2. MÕISTED Vt B osa üldist sissejuhatust.

1.3. VÕRDLUSAINED Puuduvad.

1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE Õdekromatiidi vahetuse (ÕKV) analüüs on lühiajaline test retsiprooksete DNA vahetuste kindlakstegemiseks kahe õdekromatiidi vahel duplitseeruvas kromosoomis. ÕKV väljendab DNA replikatsiooniproduktide väljavahetamist ilmselt homoloogsetes lookustes. Eeldatavasti sisaldab see vahetusprotsess DNA ahela lõhkumist ja uuesti ühendamist, ehkki tema molekulaarsest olemusest on vähe teada. ÕKV määramine nõuab õdekromatiidide erinevat märgistamist, mida võib teha bromodeoksüuridiini (BrdU) sisestamisega kromosomaalsesse DNAsse kahes rakutsüklis. Imetajate rakud eksponeeritakse testitavale kemikaalile nii koos imetajate eksogeense metaboolse aktivatsioonisüsteemiga kui ka ilma selleta ja kultiveeritakse kahe replikatsiooni vältel BrdU-d sisaldavas meediumis. Pärast töötlust spindel-inhibiitoriga (nt kolhitsiin), et akumuleerida rakke mitoosi metafaasi staadiumis (c-metafaasis), rakud külvatakse ja kromosoomid prepareeritakse.

1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID Puuduvad.

1.6. UURINGUMEETODI KIRJELDUS

Selles analüüsis võib kasutada primaarkultuure (inimese lümfotsüüte) või püsiliini rakke (nt hiina hamstri munasarja rakke). Püsiliini rakukultuure tuleb kontrollida mükoplasmaga kontamineerumise suhtes.

Kasutada tuleks sobivat söödet ja inkubeerimise tingimusi (nt temperatuur, kultiveerimisnõud, CO2 kontsentratsioon ja niiskus).

Uuritavad ained võib ette valmistada söötmes või suspendeerida nad vastavatesse lahustitesse enne rakkude töötlemist. Lahusti lõppkontsentratsioon rakukultuuris ei tohiks oluliselt mõjutada rakkude eluvõimelisust ega kasvukiirust ja selle mõju ÕKV sagedusele tuleb jälgida lahustiga kontrollis.

Rakke tuleb eksponeerida uuritavale ainele nii eksogeense imetajate metaboolse aktivatsioonisüsteemi olemasolu kui ka selle puudumise korral. Kui kasutatakse sisemist metaboolset aktiivsust omavaid rakutüüpe, peab selle aktiivsuse kiirus ja olemus olema vastavuses testitava kemikaalide klassi omadustega.

1.6. Katsetingimused

Rakukultuuride arv

Igas eksperimendi lõigus tuleb kasutada vähemalt kahte kultuuri.

Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine

Positiivseid kontrolle peab kaasama igasse katsesse, kasutades nii otseselt toimivat ühendit kui metaboolset aktiveerimist vajavat ühendit, ja samuti tuleb kontrollina kasutada lahustit. Järgnevalt on näitena ära toodud ained, mida võiks kasutada positiivsete kontrollidena: Sobivuse korral võib kasutada ka täiendavat positiivset kontrolli samast kemikaalide klassist, kust pärineb uuritav kemikaal.

otseselt toimiv ühend:

etüülmetaansulfonaat;

kaudselt toimiv ühend:

tsüklofosfamiid.

Testimiseks kasutatavad kontsentratsioonid

Tuleks kasutada vähemalt kolme erinevat uuritava aine kontsentratsiooni. Kõige suurem kontsentratsioon peaks esile kutsuma olulise toksilise efekti, võimaldades samal ajal rakkudel siiski normaalselt jaguneda. Vees suhteliselt halvasti lahustuvaid aineid tuleks testida kuni lahustuvuse piirini, kasutades selleks sobivaid protseduure. Vabalt vees lahustuvate mittetoksiliste kemikaalide ülemine testitav piirikontsentratsioon tuleb määrata igal üksikjuhul eraldi.

Protseduur

Rakukultuuride valmistamine

Püsiliini rakud saadakse tüvikultuurist (nt selle trüpsiniseerimisel või lahtiraputamisel), külvatakse kultiveerimisnõusse vastaval tihedusel ja inkubeeritakse 37 oC juures. Ühekihiliste rakukultuuride saamiseks peab olema rakkude arv kultiveerimisnõus viidud vastavusse nii, et kultuuride konfluentsus ei oleks külvamise ajal üle 50 %. Teiseks võimaluseks on rakkude kasvatamine suspensioonis. Inimese lümfotsüütide kultuurid valmistatakse hepariniseeritud verest vastavat tehnikat kasutades ja inkubeeritakse 37 oC juures.

Töötlemine

Eksponentsiaalse kasvu faasis olevaid rakke töödeldakse ettenähtud aja jooksul uuritava ainega. Enamikul juhtudest võib 1–2 tundi olla piisav, kuid teatud juhtudel võib töötluse aeg ulatuda kuni kahe täieliku rakutsüklini. Rakud, millel puudub metaboolne aktiivsus, tuleb allutada testitavate kemikaalide toimele, tehes seda nii vastava metaboolse aktivatsioonisüsteemi olemasolu korral kui ka selle puudumisel. Kokkupuuteaja lõpus pestakse rakud uuritavast ainest puhtaks ja kultiveeritakse BrdU juuresolekul kahe replikatsioonitsükli ajaks. Teiseks võimaluseks on rakkude samaaegne kokkupuude uuritava aine ja BrdU-ga kahe rakutsükli vältel. Inimese lümfotsüütide kultuure töödeldakse semisünkroonse seisundi ajal. Rakke analüüsitakse pärast töötlust aset leidva teise jagunemise ajal, tagades nii kõige tundlikumate rakutsükli staadiumide eksponeerituse kemikaalile. Kõiki kultuure, kuhu on lisatud BrdU, tuleb töödelda pimedas või hämaras hõõglambi valguses kuni rakkude külvamiseni, et viia miinimumini BrdU-d sisaldava DNA fotolüüs.

Rakkude külvamine

Üks kuni neli tundi enne külvamist töödeldakse rakukultuure spindel-inhibiitoriga (nt kolhitsiin). Iga kultuur külvatakse ja töödeldakse kromosoomide prepareerimiseks eraldi.

Kromosoomide prepareerimine ja värvimine

Kromosoomide prepareerimiseks kasutatakse standardseid tsütogeneetilisi meetodeid. Preparaate võib ÕKV näitamiseks värvida mitmel meetodil (nt fluorestsents pluss Giemsa meetod).

Analüüs

Analüüsitavate rakkude arv peab põhinema ÕKV spontaanse kontrolli sagedusel. Tavaliselt analüüsitakse ÕKV kindlakstegemiseks vähemalt 25 hästi väljakujunenud metafaasi kultuuri kohta. Alusklaasid kodeeritakse enne analüüsi. Inimese lümfotsüütide puhul analüüsitakse vaid 46 tsentromeeri sisaldavaid metafaase. Püsiliini rakkude puhul analüüsitakse modaalarvust ainult ± 2 tsentromeeri sisaldavaid metafaase. Tuleb ära näidata, kas tsentromeerse märgistuse lülitumist loetakse ÕKVks või ei. Tulemusi tuleb kinnitada sõltumatu katsega.

2. ANDMED Andmed tuleb esitada tabelis. ÕKVde arv iga metafaasi kohta ja ÕKVde arv kromosoomi kohta igas metafaasis tuleb märkida eraldi kõigi töödeldud ja kontrollkultuuride kohta. Andmeid tuleb hinnata vastavate statistiliste meetoditega.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:

kasutatud rakud, rakukultuuride säilitamise meetodid;

katsetingimused: söötme koostis, CO2 kontsentratsioon, uuritava aine kontsentratsioon, kasutatud lahusti, inkubeerimise temperatuur, töötluse aeg, kasutatud tuumakäävi inhibiitor, selle kontsentratsioon ja sellega töötlemise kestus, kasutatud imetajate aktivatsioonisüsteemi tüüp, positiivsed ja negatiivsed kontrollid;

rakukultuuride arv igas katse lõigus;

mikroskopeeritavate preparaatide valmistamise tehnika üksikasjad;

analüüsitud metafaaside arv (andmed iga kultuuri kohta eraldi);

keskmine ÕKV arv raku ja kromosoomi kohta (andmed iga kultuuri kohta eraldi);

kriteeriumid ÕKV hindamiseks;

annuste valiku põhjendus;

võimaluse korral anda annuse/vastuse reaktsiooni suhe;

statistiline analüüs;

tulemuste arutelu;

järeldused.

3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED Vt B osa üldist sissejuhatust.

4. VIITED Vt B osa üldist sissejuhatust.

B.20. SUGULIITELISE RETSESSIIVSE LETAALSUSE TEST ÄÄDIKAKÄRBSEL DROSOPHILA MELANOGASTER

B.20.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Vt B osa üldist sissejuhatust.

1.2. MÕISTED Vt B osa üldist sissejuhatust.

1.3. VÕRDLUSAINED Puuduvad.

1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE Suguliitelise retsessiivse letaalsuse (SLRL) test äädikakärbsel Drosophila melanogaster teeb kindlaks nii punktmutatsioonide kui ka väikeste deletsioonide esinemise putuka idurakkudes. See test kujutab endast otsemutatsioonide analüüsi, skriinides mutatsioone ligi kaheksasajas X-kromosoomi lookuses, esindades kuni 80 % kõikidest X-kromosoomi lookustest. X-kromosoom esindab ligikaudu ühte viiendikku tervest haploidsest genoomist. X-kromosoomi mutatsioonid väljenduvad fenotüüpselt Drosophila melanogaster’i isasel, kes kannab mutantset geeni. Kui mutatsioon on hemisügootses olekus letaalne, siis tema esinemine järeldub ühe klassi isaste järglaskonna puudumisest kahe asemel, mida tavaliselt produtseerib heterosügootne emane. SLRL test võimaldab neid fakte tuvastada spetsiaalselt markeeritud ja korraldatud kromosoomide abil.

1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID Puuduvad.

1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.6. Ettevalmistused

Kärbseliinid

Võib kasutada isaseid hästi eristatavast metsiktüübist ja Muller-5 liini emaseid. Samuti võib kasutada teiste liinide vastavalt markeeritud emaseid, kellel esinevad mitmekordselt inverteerunud X-kromosoomid.

Uuritav aine

Uuritavad ained tuleb vees lahustada. Vees mittelahustuvaid aineid võib lahustada või suspendeerida vastavates lahustites (nt etanooli ja Tween-60 või 80 segus) ning vahetult enne kasutamist lahustatakse nad vees või soolalahuses. Lahustina ei tohi kasutada dimetüülsulfoksiidi (DMSO).

Loomade arv

Test tuleb planeerida ettemääratud tundlikkuse ja võimsusega. Spontaansete mutatsioonide sagedus vastaval kontrollil mõjutab tugevalt töödeldavate ja analüüsimisele kuuluvate kromosoomide arvu.

Manustamisviis

Aineid võib loomadele manustada kas suukaudselt, süstevedelikuga või eksponeerides neid selle aine gaasidele või aurudele. Testitavat ainel võib kärbestele sisse sööta koos suhkrulahusega. Vajaduse korral võib uuritavad ained lahustada 0,7 % NaCl lahuses ja süstida rindmikku või tagakehasse.

Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine

Kasutada negatiivseid (lahusti) ja positiivseid kontrolle. Kui on aga olemas vastavad eelnevad laboratoorsed andmed kontrollide kohta, ei ole samaaegseid kontrolle vaja.

Ekspositsiooni tasemed

Kasutada kolme ekspositsiooni taset. Uuritava aine esialgseks hindamiseks võib kasutada ühte ekspositsiooni taset, mis oleks kas maksimaalne talutav kontsentratsioon või mis tekitaks juba mõningast toksilisust. Mitte-toksiliste ainete puhul tuleks kasutada praktikas kasutatavat maksimaalset kontsentratsiooni.

Protseduur

Metsiktüüpi isaseid (kolm kuni viis päeva vanad) töödeldakse uuritava ainega ja paaritatakse individuaalselt liias olevate eelnevalt paaritamata Muller-5 liini või mõne muu vastavalt markeeritud (mitmekordselt inverteeritud X-kromosoomidega) liini emastega. Paaritatud emased asendatakse noorte veel paaritamata emastega iga kahe kuni kolme päeva järel, et kogu idurakkude tsükkel saaks kaetud. Nende emaste järglaskonna põhjal hinnatakse letaalseid efekte, mis vastavad küpsete spermatosoidide mõjutamisele, keskmise või lõpustaadiumi spermatiidide mõjutamisele, noorte spermatiidide, spermatotsüütide ja spermatogoonia mõjutamisele uuritava ainega. Ülalkirjeldatud ristamistest saadud heterosügootseid F1 emaseid lastakse individuaalselt paarituda (s.o üks emane viaali kohta) oma vendadega. F2 generatsioonis hinnatakse igat kultuuri metsiktüübi isaste puudumise alusel. Kui kultuur on tekkinud F1 emasest, kellel oli vanematelt saadud letaalsust kandev X-kromosoom (s.o töödeldud kromosoomiga isased isendid puuduvad), tuleb selle emase sama genotüübiga tütreid testida, et teha kindlaks, kas letaalsus kordub järgmises generatsioonis.

2. ANDMED Andmed esitatakse tabelis, et näidata testitud X-kromosoomide arv, mittefertiilsete isaste arv ja letaalsete kromosoomide arv iga testitud aine kontsentratsiooni kohta ja iga töödeldud isase iga paaritusperioodi kohta. Raportis tuleb ära tuua ühe isase kohta esinevate erineva suurusega klastrite arv. Neid andmeid tuleb kinnitada sõltumatu eksperimendiga. Suguliitelise retsessiivse letaalsuse testide hindamiseks tuleb kasutada vastavaid statistilisi meetodeid. Arvesse tuleb võtta ühelt isaselt pärinevate retsessiivsete letaalide klastrite moodustumist ja hinnata seda vastava statistilise meetodiga.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:

liin: Drosophila kasutatud tüved või liinid, putukate vanus, töödeldud isaste arv, steriilsete isaste arv, saadud F2 kultuuride arv, ilma järglaskonnata F2 kultuuride arv, letaalset geeni kandvate kromosoomide arv, mis määratakse igas idurakkude staadiumis;

töödeldud gruppide suuruse kindlaksmääramise kriteeriumid;

katsetingimused: üksikasjalik töötluste ja katseplaani kirjeldus, ekspositsiooni tasemed, toksilisuse andmed, vajaduse korral negatiivne (lahusti) ja positiivne kontroll;

letaalsete mutatsioonide hindamiskriteeriumid;

kus võimalik, esitada ekspositsiooni/toime suhe;

andmete hindamine;

tulemuste arutelu;

järeldused.

3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED Vt B osa üldist sissejuhatust.

4. VIITED Vt B osa üldist sissejuhatust.

B.21. IMETAJARAKU TRANSFORMATSIOONITESTID IN VITRO

B.21.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Vt B osa üldist sissejuhatust.

1.2. MÕISTED Vt B osa üldist sissejuhatust.

1.3. VÕRDLUSAINED Puuduvad.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Imetajarakukultuure on võimalik in vitro kasutada keemiliste mutageenide poolt indutseeritud fenotüübiliste muutuste avastamiseks. Neid mutageene seostatakse maliigse transformatsiooni tekkega in vivo. Laialt kasutatavateks rakkudeks on C3H10T1/2, 3T3, SHE ja Fischeri roti rakuliinid. Testid põhinevad rakumorfoloogia muutuste, fookuse moodustumise või agaroosgeelidel rakkude pesastumise muutuste avastamisel. Harvem tehakse uuringuid, mis avastavad kartsinogeensetele kemikaalidele eksponeeritud rakkudel teisi morfoloogilisi või füsioloogilisi muutuseid. Ükski in vitro testi tulemusnäitaja ei ole kinnitanud ühegi mehhanismi konkreetset süstemaatilist seost kasvajatega. Osad testsüsteemid on võimelised kindlaks tegema kasvajate promootoreid. Uuritavate ainete tsütotoksilisuse astet saab määrata, kui mõõta aine toimet pesasid moodustavatele ühikutele (kloonide produktsiooni efektiivsusele) ja rakukultuuride kasvukiirusele. Tsütotoksilisuse määramine on oluline tõestamaks, et testitav kemikaal avaldab toksilist toimet rakkudele, vaatamata sellele, et rakkude maliigse transformatsiooni sagedust ei ole alati võimalik mõõta. Põhjuseks on osades katsetes kasutatav pikem inkubatsiooniaeg ja/või ümber külvamine teisele alusele.

1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID Puuduvad.

1.6. UURINGUMEETODI KIRJELDUS

1.6. Ettevalmistused

Rakud

Läbiviidavast transformatsioonitestist sõltuvalt on võimalik kasutada erinevaid rakuliine või tüvirakke. Katse tegija peab olema kindel, et testis kasutatavad rakud teevad läbi vajaliku fenotüüpse muutuse pärast kokkupuudet tuntud kartsinogeenidega. Samuti peab katse tegija tagama optimaalsed laboritingimused ning dokumenteeritud tõestuse, et uuring on kehtiv ja usaldusväärne.

Keskkond

Transformatsiooni analüüsi tegemise keskkond ja katsetingimused peavad vastama vajadustele.

Uuritav aine

Uuritavad ained võib valmistada kultiveerimiskeskkonnas või lahustada või suspendeerida vastavates lahustis enne rakkude töötlemist. Lahusti lõppkontsentratsioon kultiveerimiskeskkonnas ei tohi mõjutada rakkude elulemust ega kasvukiirust.

Metaboolne aktivatsioon

Rakud peaksid olema eksponeeritud uuritavale ainele nii imetaja metaboolse aktivatsioonisüsteemi olemasolul kui ka selle puudumisel. Kui kasutatakse sisemist metaboolset aktiivsust omavaid rakutüüpe, peab tegema kindlaks, et rakkude metabolismi kiirus ja aktiivsuse iseloom vastavad tingimustele.

Katsetingimused

Positiivsete ja negatiivsete kontrollide kasutamine

Igas eksperimendis peab rakendama positiivset kontrolli rakkudele otsest mõju avaldava ühendiga ja ka ühendiga, mille toime avaldumiseks on vajalik metaboolse aktiivsuse olemasolu. Samuti on vajalik negatiivne kontroll (lahusti). Positiivsete kontrollidena võib kasutada Kui võimalik, võib kasutada positiivse kontrollina uuritava ühendiga samasse keemilisse klassi kuuluvat ainet.

otsest toimet avaldavaid ühendeid:

etüülmetaansulfonaat;

β-propiolaktoon;

kaudse toimega ühendeid:

2-atsetüülaminofluoreen;

4-dimetüülaminoasobenseen;

7,12-dimetüülbensantratseen.

Kasutatavad kontsentratsioonid

Testis tuleb kasutada erineva uuritava aine kontsentratsiooniga lahuseid. Eesmärk on teha kindlaks kontsentratsioonist sõltuv toksiline efekt. Efekti olemasolul peaks kõrge uuritava aine kontsentratsiooniga lahuse toime järel rakkude elulemus langema ning väikese kontsentratsiooniga lahuse toime järel peaks rakkude elulemus olema ligikaudu sama, mis negatiivses kontroll-lahuses. Vees suhteliselt halvasti lahustuvaid aineid tuleks vastavate meetodite abil uurida lahustuvuse piirini. Täielikult veeslahustuvatele mittetoksilistele ainetele tuleb maksimaalne kontsentratsioonimäär valida vastavalt iga katse vajadusele.

Protseduur

Rakud peavad toksilisele substantsile olema eksponeeritud sobiva aja vältel, mis oleneb kasutatud testisüsteemist. Kui kokkupuuteaega pikendatakse, võib olla vajalik aine uuesti lisamine koos keskkonna vahetamisega (ja vajaduse korral värske, metaboolselt aktiivse lahuse lisamine). Piisava sisemise metaboolse aktiivsuseta rakud peavad uuritava ainega kokku puutuma nii sobiva metaboolset aktivatsiooni esilekutsuva süsteemi olemasolul kui ka puudumisel. Kokkupuuteaja lõppemisel pestakse rakud uuritavast ainest puhtaks ning külvatakse tingimustel, mis sobivad uuritava fenotüübi muutuse ilmnemiseks ja transformatsioonide arvu määramiseks. Kõik tulemused tõestatakse sõltumatu uuringuga.

2. ANDMED Andmed tuleks esitada tabelis, mis võib olla erinev sõltuvalt kasutatud testist (kasutatud alusklaaside arv, positiivse tulemusega alusklaaside arv, mutatsioonidega rakkude arv). Võimaluse korral tuleks esitada mutatsioonisagedus muteerunud rakkude arvu ja eluvõimeliste rakkude arvu suhtena. Eluvõimelisuse määr ja kloonide produtseerimismäär esitatakse protsendina kontrollmäärast. Andmeid peab analüüsima sobivate statistiliste meetodite abil.

3. ARUANDLUS

3.

3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:

kasutatud rakuliin, rakukultuuride arv, rakukultuuride säilitusmeetodid;

katsetingimused: uuritava aine kontsentratsioon, kasutatud lahusti, inkubatsiooni aeg, rakutihedus töötlemise ajal, imetaja metaboolset aktiivsust omava süsteemi tüüp, positiivsed ja negatiivsed kontrollid, jälgitud fenotüüpide kirjeldus, kasutatud selektiivsed ained (kui on asjakohane), annuste valiku põhimõte;

eluvõimeliste ja mutantsete rakkude loendamise meetod;

statistiline hindamine;

tulemuste arutelu;

järeldused.

3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED Vt üldtutvustus, B osa.

4. VIITED Vt üldtutvustus, B osa.

B.22.

1. MEETOD

1.

1.1. SISSEJUHATUS Vt üldtutvustus, B osa.

1.2. MÕISTED Vt üldtutvustus, B osa.

1.3. VÕRDLUSAINED Puuduvad.

1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE Dominantsed letaalsed toimed põhjustavad loote surma. Dominantsete letaalide indutseerimine keemiliste ainetega töötlemisel näitab, et see aine on mõjutanud uuritava liigi lootekudet. Üldiselt aktsepteeritakse, et dominantne letaalsus tekib kromosoomide kahjustumise tõttu (struktuurilised ja arvulised anomaaliad). Loodete suremine ravitud emasloomal võib olla ka toksilise mõju tulemuseks. Üldiselt eksponeeritakse uuritavale ainele isasloomi ning neid paaritatakse ravimata ja seni paaritamata emastega. Erinevaid iduraku staadiume võib testida eraldi, kasutades järjestikuseid paarituste intervalle. Ühe emase kohta tulevate surnud implanteerunud loodete arvu suurenemine töödeldud grupis võrrelduna surnud implantaatide arvuga kontrollgrupi emastel peegeldab implantatsioonijärgset loodete surma. Enne implantatsiooni toimunud loodete hävimist saab hinnata kollaskehade (corpora lutea) arvu järgi või võrreldes ühe emase kohta tulevat implantaatide koguarvu ravi saanute ja kontrollgrupis. Dominantne letaalne üldtoime on implantatsioonieelsete ja -järgsete kadude summa. Dominantse letaalse üldtoime arvutamine põhineb ravi saanute grupis ühe emase kohta tulevate elusate implantaatide arvu võrdlemisel kontrollgrupi sama näitajaga. Implantaatide arvu vähenemine teatud ajavahemikes võib olla rakkude hävimise tulemuseks (s.o kas spermatotsüütide ja/või spermatogoonide).

1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID Puuduvad.

1.6. UURINGUMEETODI KIRJELDUS

1.6. Ettevalmistused

Kui võimalik, tuleb uuritavad ained lahustada või suspendeerida isotoonilises soolalahuses. Vees mittelahustuvad ained võib lahustada või suspendeerida vastavates lahustites. Kasutatav lahusti ei tohi omada koostoimeid uuritava kemikaaliga ega avaldada tokilist mõju. Uuritav kemikaal tuleb ette valmistada vahetult enne kasutamist.

Katsetingimused

Manustamisviis

Testitavat ühendit tuleb üldjuhul manustada ainult üks kord. Vajaduse korral võib rakendada korduvaid manustamisi, olenevalt toksikoloogilisest informatsioonist. Tavalisteks manustamisviisideks on suukaudselt sondi teel või intraperitoneaalne süstimine. Võivad sobida ka teistsugused manustamisviisid.

Katseloomad

Soovitatavateks loomaliikideks on rotid ja hiired. Terved täielikult suguküpsed loomad jagatakse juhuslikkuse alusel töötlemisele kuuluva ja kontrollgrupi vahel ära.

Arv ja sugu

Uuritava aine manustamiseks tuleb kasutada piisavat arvu isaseid loomi, võttes arvesse hinnatava bioloogilise tunnuse iseeneslikku varieerumist. Loomade arvu valik peaks põhinema eelnevalt kindlaks tehtud määramise tundlikkusel ja olulisuse määral. Näiteks ühes tüüpilises testis peaks olema isaste arv igas erineva annusega ravitavas grupis piisav, et saada 30–50 tiinet emaslooma ühe paaritusintervalli kohta.

Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine

Tavaliselt peavad igas eksperimendis olema korraga nii positiivsed kui ka negatiivsed (lahusti) kontrollid. Kui samas laboratooriumis on olemas hiljuti tehtud katse positiivse kontrolli aktsepteeritavad tulemused, siis võib kasutada neid tulemusi positiivse kontrolli katsesse lülitamise asemel. Positiivseid kontrollaineid tuleb kasutada vastavas madalas annuses (nt MMS, intraperitoneaalselt annuses 10 mg/kg), et näidata testi sensitiivsust.

Annused

Tavaliselt tuleb kasutada kolme annust. Kõrge annus peaks avaldama toksilist toimet või vähendama uuritavat ainet saanud loomade viljakust. Teatud juhtudel võib olla piisav ühe suure annuse kasutamine.

Piirtest

Mittetoksilisi aineid tuleb testida annuses 5 g/kg ühekordsel manustamisel või 1 g/kg päevas korduval manustamisel.

Protseduur

Kasutusel on mitmesugused uuritava aine manustamise skeemid. Kõige enam kasutatakse uuritava aine ühekordset manustamist. Võib kasutada ka teisi skeeme. Ühte isaslooma paaritatakse manustamisjärgselt ettenähtud aja möödudes järgemööda ühe või kahe ainet mittesaanud ja paaritamata emasega. Emased tuleb jätta isastega kokku vähemalt ühe östraaltsükli ajaks või seniks, kuni paaritumine on toimunud. Seda hinnatakse sperma leidumise alusel tupes või vaginaalkorgi olemasolu järgi. Aine manustamise järgsete paarituste arvu määrab manustamise ajaline skeem, mis peab võimaldama kõigi idurakustaadiumide mõjutamise uurimist. Emased lahatakse tiinuse teisel poolel ja emaka sisaldist uuritakse surnud ja elusate implanteerunud loodete arvu kindlakstegemiseks. Munasarju võib uurida kollaskehade arvu kindlakstegemiseks.

2. ANDMED Andmed tuleb esitada tabelis, näidates isaste arvu, tiinete ja mittetiinete emaste arvu. Iga paarituse tulemused tuleb esitada individuaalselt iga isase ja emase kohta eraldi. Iga emase kohta tuleb näidata paarituse nädal, isasele manustatud annus, elusate ja surnud loodete esinemine. Dominantse letaalsuse kogutoime arvutatakse välja, võrreldes omavahel elusate implantaatide arvu ühe emase kohta testgrupis elusate implantaatide arvuga ühe emase kohta kontrollgrupis. Saadud andmeid – surnud loodete suhe elusatesse ainet saanute grupis võrrelduna sama suhtega kontrollgrupis – analüüsitakse implantatsioonijärgset loodete hävimise näitamiseks. Kui andmed pannakse kirja varaste ja hiliste surmadena, peab ka see tabelites kajastuma. Kui hinnatakse implantatsioonieelset kadu, peab see olema registreeritud. Implantatsioonieelset kadu võib arvutada kui erinevust kollaskehade arvu ja implantaatide arvu vahel või kui implantaatide keskmise arvu vähenemist emaka kohta võrrelduna kontrollpaaritustega. Andmeid hinnatakse vastavaid statistilisi meetodeid kasutades.

kasutatud loomade liik, aretusliin, vanus, kehakaal, isaste ja emaste arv testitavas ja kontrollgrupis;

testitav aine, lahusti, testitavad annused ja annuste valiku põhjendus, negatiivsed ja positiivsed kontrollid, andmed toksilisuse kohta;

töötlemisviis ja töötluste ajakava;

paarituste ajakava;

paarituse toimumise määramiseks kasutatud meetod;

lahangu aeg;

dominantse letaalsuse hindamise kriteeriumid;

võimaluse korral anda annuse/vastuse reaktsiooni suhe;

statistiline analüüs;

3233 more provisions are not shown here; each has its own address.

Versions

2008-05-30