Komission asetus (EY) N:o 440/2008, annettu 30 päivänä toukokuuta 2008, testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun asetuksen (EY) N:o 1907/2006 nojalla (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)
Grade B
mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.
Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/fi
Contents
- Preamble
- ANNEX
- A.1
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.4.4
- 1.5 TAULUKKO: MENETELMIEN SOVELTUVUUS A. B. C. D.
- 1.6
- 1.6.1
- 1.6.1.1
- 1.6.1.2 Laitteisto:
- 1.6.2
- 1.6.4
- 4.(1)(2)(3)(4)
- A.2
- 1.
- 1.4
- 1.5 Taulukko 1 Menetelmien vertailu
- 1.6
- 1.6.4
- 1.6.6
- 2. Taulukko 2 Lämpötilat ja vastaavat korjauskertoimet fT
- A.3
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 3. Taulukko 1.4.1.11.4.1.21.4.1.31.4.21.4.31.4.4 menetelmien soveltuvuus
- 3. Taulukko 1.4.1.11.4.1.2 menetelmien soveltuvuus
- 3. Taulukko 1.4.1.11.4.1.21.4.1.31.4.2 menetelmien soveltuvuus
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
- A.4
- 1.
- 1.4
- 1.5 Laatukriteerit 1.4.11.4.21.4.31.4.41.4.51.4.61.4.7
- 1.6
- 1.6.1
- 1.6.2
- 1.6.2.2
- 1.6.4
- 1.6.4.2
- 1.6.5
- 1.6.6
- 1.6.6.1 Inertti kaasu
- 1.6.6.2 Kyllästymiskolonnin valmistelu:
- 1.6.7
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
- A.5
- 1.
- 1.6
- 1.6.4
- 1.6.4.1
- 1.6.4.1.3 Kuva Mittauskappale
- 1.6.4.2
- 1.6.4.2.2 Asennus:
- a)
- b)
- 2. Taulukko Mitatun pintajännityksen korjaaminen Vain vesiliuoksille, joiden tiheys on noin 1 g/cm3
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)
- A.6
- 1.
- 1.4
- 1.5
- 1.6
- 1.6.3
- 1.6.3.2 Testi:
- 1.6.3.3 Laite
- 1.6.3.4 Laite (katso kuvia 4 ja 3)
- 1.6.4
- 2.
- 3.
- A.8
- 1.
- 1.3 Ravistuspullomenetelmä
- 1.4
- 1.5
- 1.5.1 Ravistuspullomenetelmä
- 1.5.2 Ravistuspullomenetelmä
- 1.5.3 Ravistuspullomenetelmä
- 1.6
- 1.6.2
- 1.6.2.1
- 1.6.2.3
- 1.6.3
- 1.6.3.1 Laite
- 1.6.3.2 Viiveen to laskeminen
- 2. Ravistuspullomenetelmä
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
- A.9
- 1.
- 1.5
- 1.6
- 1.6.3
- 1.6.3.2 Abelin laite:
- A.10
- 1.
- 1.6
- 1.6.2
- 3.
- A.11
- 1.
- 1.6
- A.12
- 1.
- 1.3
- 1.6
- 1.6.1
- 1.6.2
- 1.6.3
- 1.6.4
- A.13
- 1.
- 1.6
- 1.6.2 a)
- 2.
- A.14
- 1.
- 1.1 a)
- 1.4
- 1.6
- 1.6.1
- 1.6.2
- 1.6.2.2 a)
- 1.6.3
- 1.6.3.2 a)
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)
- A.15
- 1.
- 1.6
- A.16
- 1.
- 1.6
- 1.6.1
- 4.(1)
- Kuva 1 20 mm:n näytekuution kaava
- Kuva 2 Tyypillinen lämpötila-aikakäyrä
- A.17
- 1.
- 1.6
- 1.6.1
- 1.6.2
- 3.
- 3.2 a)
- A.18.
- 1.
- 1.6
- 2.
- 2.2
- 3.(1)(2)(3)(4)
- A.19.
- 1.
- 1.6
- 2.
- 2.2
- 3.(1)(2)(3)(4)
- A.20.
- 1.
- 1.5
- 1.5.4
- 2.
- 3.
- 3.1
- A.21.
- 1.
- 1.6
- 1.6.1
- 1.6.1.2
- 2.
- 2.1 Taulukko 1 Esimerkkejä tuloksista
- 3.
- 3.2 a)
- 4.(1)
- Kuva1 Paineastia
- Kuva 2 Tukiteline
- Kuva 3 Sytytysjärjestelmä
- 1.
- 2.
- 4.
- 1.2 Kiinteät aineet
- Liite 1 Arviointimenetelmä
- JOHDANTO
- ARVIOINTIMENETELMÄ
- LASKENTA
- RAPORTTI
- KIRJALLISUUS
- Liite 2
- Kuva 1 Laite dynaamisen menetelmän mukaan tehtävää höyrynpainekäyrän määritystä varten.
- Kuva 2a Laite staattisen menetelmän mukaan U-putkimanometrin avulla tehtävää höyrynpainekäyrän määritystä varten.
- Kuva 2b Laite staattisen menetelmän mukaan paineenosoittimen avulla tehtävää höyrynpainekäyrän määritystä varten
- Kuva 3 Isoteniskooppi (katso viitettä 7)
- Kuva 4 Laite höyrynpainevaakaan perustuvan menetelmän mukaan tehtävää höyrynpainekäyrän määritystä varten
- Kuva 5 Esimerkki alhaisen paineen effuusiomenetelmän mukaan toimivasta haihdutuslaitteesta, jonka effuusiokennon tilavuus on 8 cm3
- Kuva 6a Esimerkki virtausjärjestelmästä, jolla määritetään höyrynpaine kaasunkyllästysmenetelmän mukaan
- Kuva 6b Esimerkki järjestelmästä, jolla määritetään höyrynpaine kaasunkyllästymismenetelmällä ja jossa on kapillaariputki kyllästyskammion jälkeen
- Kuva7 Esimerkki kokeellisesta järjestelystä pyörivän roottorin menetelmää varten
- Kuva 8 Esimerkki pyörivällä roottorilla varustetusta mittapäästä
- Kuva 1 Kolonnieluutiomenetelmä ja kiertopumppu
- Kuva 2 Tyypillinen mikrokolonni
- Kuva 3 Tyypillinen mikrokolonni
- Kuva 4 Kolonnieluutiomenetelmä ja tasausastia
- LASKENTAMENETELMÄT Laskentamenetelmien periaate
- Hanschin π-menetelmä
- Rekker-menetelmä
- Hansch-Leon menetelmä
- Yhdistetty menetelmä
- i)
- ii)
- iii)
- iv)
- LÄHDEKIRJALLISUUS
- Kuva Muotti ja tarvikkeet näytteen valmistelua varten
- Kuva Laite
- Esimerkki ainespesifikaatiosta lämpöherkkyystestiä varten (katso standardia DIN 1623) (1)(2)(3)
- Kuva 1 Lämpöherkkyyden mittauslaite
- Kuva 1a Teräsputki varusteineen Kuva 2
- Kuva 3 Kuumennusnopeuden kalibrointi lämpöherkkyystestiä varten
- Kuva 4 Iskutestilaite
- Kuva 5 Kitkaherkkyyslaite
- 1.1.11.21.31.4
- (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
- OSA B TOKSISUUDEN JA MUIDEN TERVEYSVAIKUTUSTENMÄÄRITYS
- YLEISJOHDANTO A.
- i)
- ii)
- B.1 a.
- 1.
- 1.4
- 1.5
- 1.5.3
- 1.6
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
- B.1 b.
- 1.
- 1.4
- 1.5
- 1.6
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
- B.2.
- 1.
- 1.6
- 1.6.2
- 1.6.3 a)
- 3.
- 3.1 a)
- B.3.
- 1.
- 1.6
- 1.6.2
- 1.6.3 Arviointi myrkyllisyydestä toisen sukupuolen kohdalla
- 3.
- B.4.
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 2.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
- Taulukko I Eryteeman ja karstan muodostus Ödeeman (turvotuksen) muodostus IHOREAKTIOIDEN PISTEYTYS
- B.5.
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.4.2.3
- 1.4.2.7
- 2.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
- Taulukko I SILMÄVAURIOIDEN PISTEYTYS
- Sarveiskalvo
- Värikalvo
- Sidekalvo
- Sidekalvopöhö
- B.6.
- 1.
- 1.5
- 1.5.1
- 1.5.1.2
- 1.5.1.3
- 1.5.2
- 1.5.2.2
- 1.5.2.3
- 3. Testiraportti (GPMT ja Buehlerin testi)
- B.7.
- 1.
- 1.4
- 1.4.2
- 1.4.3
- 3. KOERAPORTTI
- B.8.
- 1.
- 1.6
- 1.6.2
- 1.6.3 a)
- 3.
- 3.1
- pt_2 a)
- B.9.
- 1.
- 1.6
- 1.6.2
- 1.6.3
- 3.
- B.10.
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.4.3
- 2.
- 3. TUTKIMUSSELOSTUS
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
- B.11.
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.5
- 2.
- 3.
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
- B.12.
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.5
- 1.5.2 a)
- 2.
- 3. TUTKIMUSSELOSTUS
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
- B.13/14.
- 1.
- 1.5
- 1.5.1
- 1.5.2
- 2.
- 3. TUTKIMUSSELOSTUS
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
- B.15.
- 1.
- 1.6 Testin valmistelu
- Metabo1inen aktivaatio
- Testikannat
- Kasvatusalustat
- Negatiiviset ja positiiviset kontrollit
- Altistuspitoisuudet
- Inkubaatio-olosuhteet
- Spontaanimutaatioiden frekvenssi
- Toistojen lukumäärä
- 3.
- B.16.
- 1.
- 1.6 Testin valmistelu
- Metabolinen aktivaatio
- Testikannat
- Kasvatusalustat
- Negatiiviset ja positiiviset kontrollit
- Altistuspitoisuudet
- Inkubaatio-olosuhteet
- Spontaaninen mitoottinen rekombinaatiofrekvenssi
- Toistojen lukumäärä
- 3.
- B.17.
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.4.3
- 2.
- 3. TUTKIMUSSELOSTUS
- 4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
- B.18.
- 1.
- 1.6 Testin valmistelu
- Soluviljelmien lukumäärä
- Negatiiviset ja positiiviset kontrollit
- Altistuspitoisuudet
- Solut
- Metabolinen aktivaatio
- Soluviljelmien perustaminen
- Soluviljelmien altistaminen tutkittavalle aineelle Primaariset rotan maksasolut:
- Autoradiografinen määritys
- Nestetuikelaskentaan perustuva määritys
- 2.
- 3.
- B.19.
- 1.
- 1.6 Koeolosuhteet
- Soluviljelmien lukumäärä
- Negatiiviset ja positiiviset kontrollit
- Altistuspitoisuudet
- Soluviljelmien perustaminen
- Altistus
- Solujen kerääminen
- Kromosomipreparaattien valmistus ja värjäys
- Analyysi
- 3.
- B.20.
- 1.
- 1.6 Testin valmistelu
- Kannat
- Tutkittava aine
- Kärpästen lukumäärä
- Antotapa
- Negatiiviset ja positiiviset kontrollit
- Altistustasot
- 3.
- B.21.
- 1.
- 1.6 Testin valmistelu
- Solut
- Kasvatusalusta
- Tutkittava aine
- Metabolinen aktivaatio
- Negatiiviset ja positiiviset kontrollit
- Altistuspitoisuudet
- 3.
- B.22.
- 1.
- 1.6 Testin valmistelu
- Antotapa
- Koe-eläimet
- Lukumäärä ja sukupuoli
- Negatiivisten ja positiivisten kontrollien käyttö
- Annostasot
- Raja-annostesti
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka
ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,
ottaa huomioon kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan kemikaaliviraston perustamisesta, direktiivin 1999/45/EY muuttamisesta sekä neuvoston asetuksen (ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N:o 1488/94, neuvoston direktiivin 76/769/ETY ja komission direktiivien 91/155/ETY, 93/67/ETY, 93/105/EY ja 2000/21/EY kumoamisesta 18 päivänä joulukuuta 2006 annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 ja erityisesti sen 13 artiklan 3 kohdan,
sekä katsoo seuraavaa:
(1) Aineiden sisäisten ominaisuuksien selvittämiseksi käytettävät testimenetelmät on asetuksen (EY) N:o 1907/2006 mukaisesti hyväksyttävä yhteisön tasolla.
(2) Vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä 27 päivänä kesäkuuta 1967 annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY liitteessä V säädetään aineiden ja valmisteiden fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien, myrkyllisyyden ja ekomyrkyllisyyden määritysmenetelmistä. Direktiivin 67/548/ETY liite V on kumottu Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivillä 2006/121/EY 1 päivästä kesäkuuta 2008 alkaen.
(3) Direktiivin 67/548/ETY liitteessä V olevat testimenetelmät olisi sisällytettävä tähän asetukseen.
(4) Tämä asetus ei rajoita muiden testimenetelmien käyttämistä, jos niitä käytetään asetuksen (EY) N:o 1907/2006 13 artiklan 3 kohdan mukaisesti.
(5) Testimenetelmien suunnittelussa olisi otettava täysimääräisesti huomioon eläinkokeiden korvaamista, vähentämistä sekä niihin liittyvien menetelmien parantamista koskevat periaatteet, erityisesti jos saataville tulee asianmukaisia validoituja menetelmiä, joilla voidaan korvata eläinkokeita, vähentää niiden käyttöä tai parantaa menetelmiä.
(6) Tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat asetuksen (EY) N:o 1907/2006 133 artiklalla perustetun komitean lausunnon mukaiset,
ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN:
1 artikla Asetuksen (EY) N:o 1907/2006/EY soveltamiseksi käytettävät testimenetelmät vahvistetaan tämän asetuksen liitteessä.
2 artikla Komissio tarkastelee tarvittaessa uudelleen tässä asetuksessa mainittuja testimenetelmiä, jos niitä on tarpeen muuttaa selkärankaisilla eläimillä tehtävien kokeiden korvaamiseksi, vähentämiseksi ja menetelmien parantamiseksi.
3 artikla Viittauksia direktiivin 67/548/ETY liitteeseen V pidetään viittauksina tähän asetukseen.
4 artikla Tämä asetus tulee voimaan seuraavana päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.
Sitä sovelletaan 1 päivästä kesäkuuta 2008. Tehty Brysselissä 30 päivänä toukokuuta 2008. Komission puolesta Stavros Dimas Komission jäsen
ANNEX
LIITE OSA A: FYSIKAALIS-KEMIALLISTEN OMINAISUUKSIEN MÄÄRITYSMENETELMÄT
A.1 SULAMIS-/JÄÄTYMISLÄMPÖTILA
A.1
1. MENETELMÄ Tässä kuvattavat menetelmät perustuvat pääosin OECD:n testiohjeisiin (1). Perusperiaatteet kuvataan viitteissä (2) ja (3).
1.
1.1 JOHDANTO Kuvattuja menetelmiä ja laitteita voidaan soveltaa aineiden sulamislämpötilan määritykseen ilman rajoituksia aineiden puhtausasteen suhteen. Sopiva menetelmä valitaan testattavan aineen luonteen mukaan. Aineet voivat olla helposti, vaikeasti tai ei lainkaan jauhettavissa. Joidenkin aineiden kohdalla on käytännöllisempää määrittää jäätymis- tai jähmettymislämpötila, ja tästä syystä menetelmään on myös otettu mukaan tällaisten määritysten standardit. Jos aineen ominaisuudet ovat sellaiset, että mikään edellä mainituista parametreista ei ole mitattavissa, voidaan joissakin tapauksissa käyttää jähmettymispistettä.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Määritelmän mukaan sulamislämpötila on se lämpötila, jossa tapahtuu faasimuutos kiinteästä olomuodosta nestemäiseen olomuotoon ilmakehän paineessa. Ihannetapauksissa sulamislämpötila on sama kuin jäätymislämpötila. Koska faasimuutos kattaa usein määrätyn lämpötila-alueen, voidaan käyttää myös käsitettä sulamisalue. Yksiköiden muuntaminen (K > oC) t = T - 273,15 t Celsius-lämpötila, Celsius-astetta ( oC) T termodynaaminen lämpötila, kelviniä (K)
1.3 VERTAILUAINEET Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Vertailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla saatuihin tuloksiin. Viitteessä (4) kuvataan joitakin kalibrointiaineita.
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATTEET Määritetään lämpötila (lämpötila-alue), jossa tapahtuu faasimuutos kiinteästä olomuodosta nestemäiseen olomuotoon tai päinvastoin. Käytännössä määritetään sulamisen tai jäätymisen alku- ja loppulämpötila kuumennettaessa tai jäähdytettäessä näytettä ilmakehän paineessa. Jäljempänä kuvataan viisi menetelmätyyppiä: kapillaarimenetelmä, kuuma-alustamenetelmät, jäätymislämpötilan määritykset, terminen analyysi ja jähmettymispisteen määritys (kehitetty paloöljyjä varten). Joissakin tapauksissa voi olla käytännöllisempää määrittää sulamislämpötilan sijasta jäätymislämpötila.
1.4
1.4.1 Kapillaarimenetelmä
1.4.1
1.4.1.1 Nestehauteella varustetut sulamislämpötilalaitteet Pieni määrä hienoksi jauhettua näytettä pakataan tiiviisti kapillaariputkeen. Putkea kuumennetaan yhdessä lämpömittarin kanssa siten, että lämpötilan nousu on alle 1 K minuutissa varsinaisen sulamisen aikana. Määritetään sulamisen alku- ja loppulämpötila.
1.4.1.2 Metallikappaleeseen perustuvat sulamislämpötilalaitteet Periaate on muutoin sama kuin kohdassa 1.4.1.1, mutta kapillaariputki ja lämpömittari asetetaan kuumennettavaan metallikappaleeseen, jossa on reiät niiden tarkastelua varten.
1.4.1.3 Valokennoilmaisin Kapillaariputkessa olevaa näytettä kuumennetaan metallisylinterissä automaattisesti. Aineen läpi johdetaan valonsäde sylinterin reiän kautta tarkasti kalibroituun valokennoon. Digitaalisesta osoittimesta nähdään kuumennuskammiossa sijaitsevan platinavastuslämpömittarin mittaama lämpötila. Useimpien aineiden optiset ominaisuudet muuttuvat sulamisen myötä valoaläpäisemättömäksi läpinäkyvään, jolloin valokennoon tulevan valonsäteen intensiteetti kasvaa ja digitaalinen osoitin saa pysäytyssignaalin. Menetelmä ei sovellu voimakkaanväristen aineiden mittauksiin.
1.4.2 Kuuma-alustamenetelmät
1.4.2
1.4.2.1 Koflerin kuumasauva Koflerin kuumasauvassa on kaksi metalliosaa, joilla on eri lämmönjohtavuus. Sähkölämmitteinen sauva on suunniteltu siten, että lämpötilagradientti on lähes lineaarinen sauvan pituussuunnassa. Sauvan mitattava lämpötila-alue on 283–573 K, ja mittaus tehdään sauvatyyppikohtaisella erikoislaitteella, jossa on osoitinkisko. Aineen sulamislämpötilan määritystä varten näytettä levitetään ohuelti suoraan kuuman sauvan pinnalle. Muutamassa sekunnissa muodostuu selvä raja nestemäisen ja kiinteän faasin välille. Rajan lämpötila luetaan siirtämällä osoitin rajan kohdalle.
1.4.2.2 Sulamismikroskooppi Sulamismikroskoopin avulla sulamislämpötila voidaan määrittää hyvin pienestä näytemäärästä. Sulamismikroskooppcja on monia eri tyyppejä. Useimmissa malleissa lämpötila mitataan herkän termoparin avulla, mutta myös elohopeamittaria käytetään. Tyypillisessä sulamismikroskoopissa on kuumennuskammio ja tämän sisällä metallilevy, jolle näytettä sisältävä objektilasi asetetaan. Tarvittava valo saadaan kammioon mikroskoopin valaisupeilistä metallilevyn keskiön reiän kautta. Kammion sulkeva lasilevy estää ilman pääsyn näytealueelle mittauksen aikana. Näytteen kuumentamista säätää reostaatti. Hyvin tarkoissa optisesti anisotrooppisten aineiden mittauksissa voidaan käyttää polarisoitua valoa.
1.4.2.3 Meniskimenetelmä Tätä menetelmää käytetään erityisesti polyamidien ominaisuuksien mittauksissa. Määritetään visuaalisesti lämpötila, jossa polyamidinäytteellä lepäävä kuumennusalustan ja lasilevyn välinen silikoniöljymeniski liikkuu.
1.4.3 Jäätymislämpötilan määritysmenetelmä Näyte pannaan erityiseen koeputkeen, joka asetetaan jäätymislämpötilan määrityslaitteeseen. Näytettä hämmennetään kevyesti koko jäähdyttämisen ajan. Mitataan lämpötila sopivin välein. Kun lämpötila on pysynyt samana muutaman mittauksen ajan, tämä lämpötila (lämpömittarin virheellä korjattuna) katsotaan jäätymislämpötilaksi. Alijäähtymistä on vältettävä pitämällä yllä kiinteän ja nestemäisen faasin välistä tasapainoa.
1.4.4 Terminen analyysi
1.4.4
1.4.4.1 Differentiaaliterminen analyysi (DTA) Tämän tekniikan avulla voidaan rekisteröidä näytteen ja vertailuaineen lämpötilaero lämpötilan funktiona, kun näytettä ja vertailuainetta käsitellään saman valvotun lämpötilaohjelman mukaan. Kun näytteessä tapahtuu entalpiamuutoksen sisältävä olomuodon muutos, muutos näkyy endotermisenä (sulaminen) tai eksotermisenä (jäätyminen) poikkeamana lämpötilakäyrän perusviivasta.
1.4.4.2 Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria (DSC) Tämän tekniikan avulla voidaan rekisteröidä näytteen ja vertailuaineen energianottoero lämpötilan funktiona, kun näytettä ja vertailuainetta käsitellään saman valvotun lämpötilaohjelman mukaan. Tämä energiaero on energiamäärä, joka tarvitaan pienentämään näytteen ja vertailuaineen lämpötilaero nollaan. Kun näytteessä tapahtuu entalpiamuutoksen sisältävä muodonmuutos, muutos näkyy endotermisenä (sulaminen) tai eksotermisena (jäätyminen) poikkeamana lämpövirran perusviivasta.
1.4.5 Jähmettymispiste Tätä paloöljyjä varten kehitettyä menetelmää voidaan käyttää alhaisen sulamispisteen omaavien öljymäisten aineiden tutkimiseen. Alustavan kuumennuksen jälkeen näytettä jäähdytetään määrätyllä nopeudella. Jäähtymisen aikana näytteen virtausominaisuuksia tarkastellaan 3 K:n välein. Alin lämpötila, jossa vielä esiinny liikettä, on aineen jähmettymispiste.
1.5 LAATUKRITEERIT Sulamislämpötilan tai sulamisalueen määritykseen tarkoitettujen menetelmien soveltuvuus ja tarkkuus kuvataan seuraavassa taulukossa:
1.5 TAULUKKO: MENETELMIEN SOVELTUVUUS A. B. C. D.
Kapillaarimenetelmät Mittausmenetelmä Jauhettavat aineet Vaikeasti jauhettavat aineet Lämpötila-alue Arvioitu tarkkuus Nykyinen standardi Nestehauteella varustetut sulamislämpötilalaitteet kyllä vain harvat 273–573 K ±0,3K JIS K 0064 Metallikappaleeseen perustuvat sulamislämpötilalaitteet kyllä vain harvat 293... > 573 K ±0,5K ISO 1218(E) Valokennoilmaisin kyllä useat (erikoislaitteiden avulla) 253–573 K ±0,5 K Kuuma-alusta- ja jäätymismenetelmät Mittausmenetelmä Jauhettavat aineet Vaikeasti jauhettavat aineet Lämpötila-alue Arvioitu tarkkuus Nykyinen standardi Koflerin kuumasauva kyllä ei 283... > 573 K ±1,0 K ANSI/ASTM D 3451-76 Sulamismikroskooppi kyllä vain harvat 273... > 573 K ±0,5K DIN 53736 Meniskimenetelmä ei erityisesti polyamidit 293... > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Jäätymislämpötilamenetelmät kyllä kyllä 223–573 K ±0,5 K esim. BS 4695 Terminen analyysi Mittausmenetelma Jauhettavat aineet Vaikeasti jauhettavat aineet Lämpötila-alue Arvioitu tarkkuus Nykyinen standardi Differentiaaliterminen analyysi kyllä kyllä 173–1273 K enintään 600 K ±0,5 K enintään 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria kyllä kyllä 173–1273 K enintään 600 K ±0,5 K enintään 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Jähmettymispiste Mittausmenetelmä Jauhettavat aineet Vaikeasti jauhettavat aineet Lämpötila-alue Arvioitu tarkkuus Nykyinen standardi Jähmettymispiste paloöljyt ja öljymäiset aineet paloöljyt ja öljymäiset aineet 223–323 K ±3,0 K ASTM D 97-66
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET Testimenetelmien työjärjestys on pääosin kuvattu kansainvälisissä ja kansallisissa standardeissa (katso liitettä 1)
1.6
1.6.1 Kapillaariputkimenetelmät Kun hienoksi jauhettua ainetta kuumennetaan hitaasti, siinä on yleensä havaittavissa kuvassa 1 esitettävät sulamisvaiheet.
1.6.1
Kuva 1 Vaihe A Vaihe B Vaihe C Vaihe D Vaihe E Vaihe A Sulaminen alkaa: Kapillaariputken sisäseinälle muodostuu yhtenäinen kerros pieniä pisaroita. Vaihe B Kutistuminen: Näytteen ja putken sisäseinän väliin muodostuu tyhjä tila. Vaihe C Kutistunut näyte vajoaa kasaan ja muuttuu nestemäiseksi. Vaihe D Yhtenäinen meniski muodostuu koeputken sisällön pinnalle, mutta huomattava osa näytettä on vielä kiinteässä muodossa. Vaihe E Sulamisen loppuvaihe: Nesteen seassa ei enää ole kiinteitä hiukkasia. Sulamislämpötila määritetään rekisteröimällä sulamisen alku- ja loppulämpötila.
1.6.1.1 Nestehauteella varustetut sulamislämpötilalaitteet Kuvassa 2 on lasista valmistettu standardoitu sulamislämpötilalaite (JIS K 0064). Kaikki mitat ovat millimetreinä.
1.6.1.1
Kuva 2 A: Mitta-astia B: Tulppa C: Ilmaputki D: Lämpömittari E: Apulämpömittari F: Haudeneste G: Lasinen kapillaariputki, pituus 80–100 mm, sisähalkaisija 1,0 ± 0,2 mm, lasiseinän paksuus 0,2–0,3 mm H: Sivuputki
Haudeneste:
Haudeneste valitaan määritettävän sulamislämpötilan mukaan. Jos esimerkiksi sulamislämpötila on enintään 473 K, käytetään paloöljyä, ja jos sulamislämpötila on enintään 573 K, käytetään silikoniöljyä. Jos sulamislämpötila on suurempi kuin 523 K, voidaan käyttää seosta, jossa on kolme paino-osaa rikkihappoa ja kaksi paino-osaa kaliumsulfaattia. Tätä seosta käytettäessä on noudatettava tarpeellisia varotoimenpiteitä.
Lämpömittari
Käytettävän lämpömittarin tulee täyttää seuraavat tai niitä vastaavat standardit: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.
Työjärjestys:
Kuiva näyte hienonnetaan huhmareessa ja siirretään kapillaariputkeen, jonka toinen pää on suljettu. Näytettä pannaan putkeen sellainen määrä, että sen korkeus tiiviiksi pakattuna on noin 3 mm. Yhtenäisen pakkaustiiviyden saavuttamiseksi kapillaariputki pudotetaan noin 700 mm:n korkeudelta kohtisuoraan lasiputken läpi kellonlasille. Täytetty kapillaariputki asetetaan hauteeseen siten, että lämpömittarin elohopeanuppi koskettaa kapillaariputkea näytteen kohdalta. Kun kapillaariputki asetetaan hauteeseen, sen lämpötila on yleensä noin 10 K alle sulamislämpötilan. Hauteen nestettä kuumennetaan siten, että lämpötilan nousu on noin 3 K/min. Nestettä on hämmennettävä. Kun lämpötila on noin 10 K alle sulamislämpötilan, kuumenemista säädetään, niin että lämpötilan nousu on enintään 1 K/min.
Tuloksen laskenta:
Sulamislämpötila lasketaan seuraavan suureyhtälön mukaan: T = TD + 0,00016(TD - TE)n jossa: T korjattu sulamislämpötila kelvineinä TD D-lämpömittarin lukema kelvineinä TE E-lämpömittarin lukema kelvineinä n D-lämpömittarin nesteen yläpuolella olevan varren elohopeapylvään astejakojen määrä
1.6.1.2 Metallikappaleeseen perustuvat sulamislämpötilalaitteet
1.6.1.2 Laitteisto:
Laitteiston osat ovat seuraavat:
sylinterinmuotoinen metallikappale, jonka yläosa on ontto ja muodostaa kammion (katso kuvaa 3),
metallitulppa, jossa on vähintään kaksi reikää, joiden kautta metallikappaleeseen voidaan työntää putkia,
metallikappaleen kuumennusjärjestelmä, esimerkiksi kappaleen sisällä oleva sähkövastus,
reostaatti tehonsäätöä varten (jos käytössä on sähkölämmitys),
kammion sivuseinissä neljä lämmönkestävää lasi-ikkunaa, jotka ovat vastakkain ja toisiinsa nähden suorassa kulmassa; yhden ikkunan edessä on okulaari kapillaariputken tarkastelua varten, muiden ikkunoiden läpi johdetaan lampuista valoa kammion sisäosaan,
lämmönkestävästä lasista valmistettu kapillaariputki, jonka toinen pää on suljettu (katso kohtaa 1.6.1.1).
Lämpömittari:
Katso kohdassa 1.6.1.1 mainittavia standardeja. Myös riittävän tarkkoja lämpösähköisiä mittauslaitteita voidaan käyttää.
Kuva 3 Metallitulppa Lamppu Metallinen lämpökappale Lämpömittari Kapillaariputki Okulaari Sähkövastus
1.6.1.3 Valokennoilmaisin Laitteisto ja työjärjestys: Laitteisto on automaattisella kuumennusjärjestelmällä varustettu metallikammio. Kolme kapillaariputkea täytetään kohdan 1.6.1.1 ohjeiden mukaan ja asetetaan uuniin. Laitteiston kalibroinnin avulla saadaan useita lineaarisia lämpötilan nousukäyriä. Kuumennus säädetään sähköisesti valitun vakion ja lineaarisen nousukäyrän mukaan. Uunin lämpötila ja kapillaariputkessa olevien näytteiden lämpötila ilmenevät rekisteröintilaitteesta.
1.6.2 Kuuma-alustat
1.6.2
1.6.2.1 Koflerin kuumasauva Katso liitettä.
1.6.2.2 Sulamismikroskooppi Katso liitettä.
1.6.2.3 Meniskimenetelmä (polyamidit) Katso liitettä. Sulamislämpötilan alueella lämpötilan nousun on oltava alle 1 K/min.
1.6.3 Jäätymislämpötilan määritysmenetelmät Katso liitettä.
1.6.4 Terminen analyysi
1.6.4
1.6.4.1 Differentiaaliterminen analyysi Katso liitettä.
1.6.4.2 Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria Katso liitettä.
1.6.5 Jähmettymispisteen määritys Katso liitettä.
2. TIEDOT Joissakin tapauksissa lämpömittarin korjaus on tarpeen.
3. RAPORTOINTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot: Sulamislämpötilana raportoidaan vähintään kahden arvioidulla tarkkuusalueella (katso taulukoita) olevan mittauksen keskiarvo. Jos sulamisen alku- ja loppulämpötilan ero on menetelmän tarkkuusrajojen sisällä, sulamislämpötilana raportoidaan sulamisen loppuvaiheen lämpötila. Muussa tapauksessa molemmat lämpötilat raportoidaan. Jos aine hajoaa tai höyrystyy ennen sulamislämpötilaa, raportoidaan lämpötila, jossa hajoaminen tai höyrystyminen on tapahtunut. Raporttiin tulee sisällyttää myös kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulosten tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta.
käytetty menetelmä,
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet) ja mahdolliset esipuhdistukset,
arvio tarkkuudesta.
4.(1)(2)(3)(4)
VIITTEET OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 Final. UIPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II, 803-834. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. UICPA, Physiochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505–515.
A.2 KIEHUMISLÄMPÖTILA
A.2
1. MENETELMÄ Tässä kuvattavat menetelmät perustuvat pääosin OECD:n testiohjeisiin (1). Perusperiaatteet kuvataan viitteissä (2) ja (3).
1.
1.1 JOHDANTO Tässä kuvattuja menetelmiä ja laitteita voidaan soveltaa nesteiden ja matalissa lämpötiloissa sulavien aineiden kiehumispisteen määritykseen, edellyttäen että aineissa ei tapahdu kemiallisia reaktioita ennen kiehumista (esimerkiksi itsehapettumista, rakennemuutoksia, hajoamista tms.). Menetelmät soveltuvat sekä puhtaisiin että epäpuhtaisiin nestemäisiin aineisiin. Päähuomion kohteena ovat valokennoilmaisimiin ja termiseen analyysiin perustuvat menetelmät, koska näiden menetelmien avulla voidaan määrittää sekä sulamis- että kiehumislämpötila. Lisäksi mittaukset voidaan suorittaa automaattisesti. Ns. dynaamisen menetelmän etu on se, että menetelmää voidaan käyttää höyrynpaineen määritykseen. Tällöin kiehumislämpötilaa ei tarvitse korjata normaaliin paineeseen (101,325 kPa), koska normaalipainetta voidaan mittauksen aikana säätää painekytkimen avulla. Huomautuksia: Epäpuhtauksien vaikutus kiehumislämpötilan määritykseen vaihtelee huomattavasti niiden luonteen mukaan. Jos näyte sisältää haihtuvia epäpuhtauksia, jotka voivat vaikuttaa tulokseen, aine voidaan puhdistaa.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Määritelmän mukaan normaali kiehumislämpötila on lämpötila, jossa nesteen höyrynpaine on 101,325 kPa. Jos kiehumislämpötilaa ei mitata normaalissa ilmakehän paineessa, lämpötilan riippuvuus höyrynpaineesta voidaan esittää Clausius-Clapeyronin yhtälön avulla: log p = Δ Hv2,3 RT+const. jossa: p aineen höyrynpaine (Pa) Δ Hv höyrystymislämpö (J mol-1) R yleinen molaarinen kaasuvakio (8,314 J mol-1 K-1) T termodynaaminen lämpötila (K) Kiehumislämpötilan rekisteröinnissä otetaan huomioon mittauksen aikana vallitseva ympäristön paine. Muunnokset: Paine (yksikkö: kPa) 100 kPa 0,1 bar = 0,1 MPa (yksikköä bar (baari) saa edelleen käyttää, mutta sitä ei suositella) 133 Pa 1 mmHg = 1 Torr (yksiköitä mmHg ja Torr ei saa käyttää) 1 atm normaali-ilmakehä = 101325 Pa (yksikköä atm ei saa käyttää) Lämpötila (yksikkö: K) t = T - 273,15 t Celsius-lämpötila, Celsius-asteina ( oC) T termodynaaminen lämpötila, kelvineinä (K)
1.3 VERTAILUAINEET Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Vertailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla saatuihin tuloksiin. Liitteessä kuvattavissa menetelmissä mainitaan joitakin kalibrointiaineita.
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATTEET Kiehumislämpötilan (kiehumisalueen) määritysmenetelmistä viisi perustuu kiehumislämpötilan mittaamiseen ja kaksi termiseen analyysiin.
1.4
1.4.1 Ebulliometrimenetelmä Ebulliometrit kehitettiin alun perin molekyylipainon määritykseen kiehumispisteen kohoamisen avulla, mutta niitä voidaan myös käyttää tarkan kiehumislämpötilan määritykseen. Standardissa ASTM D 1120-72 (katso liitettä) kuvataan yksinkertainen laitteisto, jolla neste kuumennetaan tasapaino-olosuhteissa kiehumispisteeseen.
1.4.2 Dynaaminen menetelmä Mitataan höyryn jälleenlauhtumislämpötila pitämällä tarkoitukseen soveltuvaa lämpömittaria höyryn palautusvirrassa nesteen kiehuessa. Tämä menetelmä sallii paineen vaihtelun.
1.4.3 Tislausmenetelmä Neste tislataan ja höyryn jälleenlauhtumislämpötila sekä tisleen määrä mitataan.
1.4.4 Siwoloboffin menetelmä Näyte kuumennetaan putkiottimessa, joka upotetaan kuumahauteen nesteeseen. Putkiottimeen pannaan suljettu kapillaari, jonka alaosassa on ilmakupla.
1.4.5 Valokennomenetelmä Tehdään automaattisia valosähköisiä mittauksia nousevien ilmakuplien avulla Siwoloboffin menetelmän mukaan.
1.4.6 Differentiaaliterminen analyysi Tämän tekniikan avulla voidaan rekisteröidä näytteen ja vertailuaineen lämpötilaero lämpötilan funktiona, kun näytettä ja vertailuainetta käsitellään saman valvotun lämpötilaohjelman mukaan. Kun näytteessä tapahtuu entalpiamuutoksen sisältävä olomuodon muutos, muutos näkyy endotermisenä (kiehuminen) poikkeamana lämpötilakäyrän perusviivasta.
1.4.7 Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria Tämän tekniikan avulla voidaan rekisteröidä näytteen ja vertailuaineen energianottoero lämpötilan funktiona, kun näytettä ja vertailuainetta käsitellään saman valvotun lämpötilaohjelman mukaan. Tämä energiaero on energiamäärä, joka tarvitaan pienentämään näytteen ja vertailuaineen lämpötilaero nollaan. Kun näytteessä tapahtuu entalpiamuutoksen sisältävä olomuodon muutos, muutos näkyy endotermisenä (sulaminen) poikkeamana lämpövirran perusviivasta.
1.5 Taulukko 1 Menetelmien vertailu
LAATUKRITEERIT Kiehumislämpötilan ja kiehumisalueen määritykseen tarkoitettujen menetelmien soveltuvuus ja tarkkuus kuvataan taulukossa 1. Mittausmenetelmä Arvioitu tarkkuus Nykyinen standardi Ebullioometri ±1,4 K (enintään 373 K) ±2,5 K (enintään 600 K) ASTMD 1120-720 Dynaaminen menetelmä ±0,5 K (enintään 600 K) Tislausprosessi (kiehumisalue) ±0,5 K (enintään 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Siwoloboffin menetelmä ± 2 K (enintään 600 K) Valokennomenetelmä ±0,3 K (enintään 373 K) Differentiaaliterminen analyysi ±0,5 K (enintään 600 K) ±2,0 K (enintään 1273 K) ASTM E 537-76 Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria ±0,5 K (enintään 600 K) ±2,0 K (enintään 1273 K) ASTM E 537-76
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET Joidenkin testimenetelmien työjärjestys on kuvattu kansainvälisissä ja kansallisissa standardeissa (katso liitettä).
1.6
1.6.1 Ebulliometrimenetelmä Katso liitettä.
1.6.2 Dynaaminen menetelmä Katso testimenetelmää A4, höyrynpaineen määritys. Rekisteröidään havaittu kiehumislämpötila 101,325 kPa:n paineessa.
1.6.3 Tislausmenetelmä Katso liitettä.
1.6.4 Siwoloboffin menetelmä Näyte pannaan putkiottimeen, jonka halkaisija on noin 5 mm (kuva 1). Putkiotinta kuumennetaan sulamislaitteella. Kuvassa 1 on lasista valmistettu standardisoitu sulamis- ja kiehumislämpötilalaite (JIS K 0064). Kaikki mitat ovat millimetreinä. Kapillaariputki (kiehumiskapillaari), joka on suljettu noin 1 cm alareunan yläpuolelta, asetetaan putkiottimeen. Näytettä lisätään niin paljon, että kapillaariputken suljettu osa on nestepinnan alapuolella. Kiehumiskapillaarin sisältävä putkiotin kiinnitetään lämpömittariin kuminauhan avulla tai tuetaan sivulta muulla tavoin (katso kuva 2). Kuva 2 Siwoloboffin periaate Kuva 3 Muunneltu periaate Haudeneste valitaan mitattavan kiehumislämpötilan mukaan. Mitattaessa alle 573 K:n lämpötiloja voidaan käyttää silikoniöljyä. Parafiiniöljyä voidaan käyttää vain 473 K:iin asti. Alussa haudenestettä kuumennetaan siten, että lämpötila nousee 3 K/min. Kuumentamisen aikana nestettä on hämmennettävä. Kun lämpötila on noin 10 K odotetun kiehumispisteen alapuolella, kuumennusta hidastetaan, niin että lämpötila nousee alle 1 K/min. Kun lämpötila on saavuttanut kiehumispisteen, kiehumiskapillaarista alkaa nopeasti nousta kuplia. Kiehumislämpötila on lämpötila, jossa kuplien nousu lakkaa ja neste alkaa nousta nopeasti kapillaariputkessa hetkellisen jäähdyttämisen seurauksena. Lämpömittarin lukema osoittaa tällöin näytteen kiehumislämpötilaa. Muunnetun periaatteen mukaan (kuva 3) kiehumispiste määritetään sulamislämpötilakapillaarin avulla. Kapillaariputkeen imetään näytettä, kunnes näytepatsaan korkeus kapillaarissa on noin 2 cm (a). Kapillaariputken kapea pää suljetaan sulattamalla ja pieni ilmakupla jätetään ääripäähän. Kun putkea kuumennetaan sulamislämpötilalaitteessa (b), ilmakupla laajenee. Kiehumislämpötila on se lämpötila, jossa näytteen muodostama tulppa saavuttaa haudenesteen pinnan (c).
1.6.4
Kuva 1 A: Mitta-astia B: Korkki C: Ilmanvaihtoputki D: Lämpömittari E: Apulämpömittari F: Haudeneste G: Putkiotin, jonka ulkohalkaisija on enintään 5 mm, ja sen sisällä kapillaariputki, jonka pituus on noin 100 mm, sisähalkaisija noin 1 mm ja lasiseinän paksuus 0,2–0,3 mm H: Sivuputki
1.6.5 Valokennomenetelmä Tässä menetelmässä kuumennettava näyte on metallikappaleeseen asetetussa kapillaariputkessa. Metallikappaleen reikien kautta johdetaan valonsäde näytteen läpi tarkasti kalibroituun valokennoon. Kun näytteen lämpötila nousee, kiehumiskapillaarista nousee yksittäisiä kuplia. Kun kiehumislämpötila saavutetaan, kuplien määrä lisääntyy huomattavasti. Tämä aiheuttaa muutoksen valokennon rekisteröimässä valon intensiteetissä. Valokennosta lähtee pysäytyssignaali osoitinlaitteeseen, joka lukee metallikappaleessa sijaitsevan platinavastuslämpömittarin lukeman. Tämä menetelmä on erityisen käytännöllinen, koska sillä voidaan tehdä määrityksiä kylmissä lämpötiloissa — jopa 253,15 K:ssa (–20 oC:ssa) asti — ilman laitteeseen tehtäviä muutoksia. Riittää, kun laite asetetaan jäähdytyshauteeseen.
1.6.6 Terminen analyysi
1.6.6
1.6.6.1 Differentiaaliterminen analyysi Katso liitettä.
1.6.6.2 Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria Katso liitettä.
2. Taulukko 2 Lämpötilat ja vastaavat korjauskertoimet fT
TIEDOT Kun poikkeamat normaalipaineesta ovat pieniä (enintään ± 5 kPa), kiehumislämpötilat normalisoidaan Tn:ään Sidney Youngin yhtälön avulla: Tn = T + (fTxΔp) jossa: Δp (101,325 - p) [huomaa etumerkki] p paine (kPa) fT kiehumislämpötilan muutos paineen funktiona (K/kPa) T mitattu kiehumislämpötila (K) Tn normaalipaineeseen korjattu kiehumislämpötila (K). Lämpötilan korjausvakiot (fT) ja yhtälöt näiden vakioiden likiarvojen laskemista varten sisältyvät monien aineiden kohdalla edellä mainittuihin kansainvälisiin ja kansallisiin standardeihin. Esimerkiksi DIN 53171 -menetelmä mainitsee seuraavat karkeat korjaukset maaleissa käytettävien liuottimien osalta: Lämpötila T (K) Korjauskerroin fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
3. RAPORTOINTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot: Kiehumislämpötilana raportoidaan vähintään kahden, arvioidun tarkkuusalueen (katso taulukoita) sisällä olevan mittauksen keskiarvo. Ilmoitetaan mitatut kiehumislämpötilat ja näiden keskiarvo. Mittaushetkellä vallinnut paine ilmoitetaan kilopascaleina (kPa). Paineen tulisi olla lähellä normaalia ilmakehän painetta. Raporttiin tulee sisällyttää myös kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulosten tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta.
käytetty menetelmä,
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet) ja mahdolliset esipuhdistukset,
arvio tarkkuudesta.
4.(1)(2)(3) VIITTEET OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C(81) 30 Final. UICPA, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.
A.3 SUHTEELLINEN TIHEYS
A.3
1. MENETELMÄ Tässä kuvattavat menetelmät perustuvat pääosin OECD:n testiohjeisiin (1). Perusperiaatteet kuvataan viitteessä (2).
1.
1.1 JOHDANTO Tässä kuvattavia suhteellisen tiheyden määritysmenetelmiä voidaan soveltaa kiinteisiin ja nestemäisiin aineisiin, ilman rajoituksia aineiden puhtauden suhteen. Luettelo menetelmistä on taulukossa 1.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Kiinteiden ja nestemäisten aineiden suhteellinen tiheys (D420) ilmaisee tutkittavan aineen (t = 20 oC) tilavuuden massan ja saman vesimäärän (t = 4 oC) massan suhteen. Suhteellisella tiheydellä ei ole yksikköä. Aineen tiheys ρ on sen massan (m) ja tilavuuden (v) suhde. Tiheys ρ ilmaistaan SI-yksikköinä kg/m3.
1.3 VERTAILUAINEET Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Vertailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla saatuihin tuloksiin.
1.4 TESTIMENETELMIEN PERIAATTEET Käytössä on neljä menetelmäluokkaa.
1.4
1.4.1 Nesteeseen perustuvat menetelmät
1.4.1
1.4.1.1 Hydrometri (nestemäiset aineet) Nesteen tiheys voidaan määrittää nopeasti ja tyydyttävän tarkasti kelluvan hydrometrin avulla, jonka asteikosta voidaan lukea uppoamissyvyyteen perustuva tiheyslukema.
1.4.1.2 Hydrostaattinen vaaka (nestemäiset ja kiinteät aineet) Aineen tiheys voidaan määrittää punnitsemalla näyte ensin ilmassa ja sen jälkeen sopivassa nesteessä (esimerkiksi vedessä). Kiinteiden aineiden kohdalla mitattu tiheys on edustava vain kyseisen näytteen osalta. Nesteiden tiheys määritetään siten, että tunnettu tilavuus (v) punnitaan ensin ilmassa ja sen jälkeen nesteessä.
1.4.1.3 Uppokappalemenetelmä (nestemäiset aineet) (4) Tässä menetelmässä nesteen tiheys määritetään kahden punnitustuloksen eron perusteella. Kun näyte on ensin punnittu, siihen upotetaan kappale, jonka tilavuus on tunnettu, ja punnitus toistetaan.
1.4.2 Pyknometrimenetelmät Erimuotoisia pyknometrejä, joiden tilavuus on tunnettu, voidaan käyttää kiinteiden ja nestemäisten aineiden tiheyksien määritykseen. Tiheys lasketaan täyden ja tyhjän pyknometrin painoeron ja sen tunnetun tilavuuden perusteella.
1.4.3 Kaasuvertailupyknometri (kiinteät aineet) Kaasuvertailupyknometrin avulla voidaan mitata minkä tahansa aineen tiheys huoneenlämpötilassa, olipa aineen muoto mikä tahansa. Aineen tilavuus mitataan ilmassa tai inerttikaasussa sylinterissä, jonka tilavuus on muutettavissa ja kalibroitu. Tiheyden laskemista varten mitataan tilavuusmittauksen jälkeen aineen massa.
1.4.4 Oskilloiva densitometri (5) (6) (7) Tämän laitteen avulla voidaan mitata nesteen tiheys. U-putken muotoinen mekaaninen oskillaattori asetetaan värähtelemään oskillaattorin resonanssitaajuudella, joka määräytyy oskillaattorin massan mukaan. Kun oskillaattoriin pannaan näyte, resonanssitaajuus muuttuu. Laitteen kalibroinnissa käytetään kahta nestemäistä ainetta, joiden tiheys tunnetaan. Kalibrointiaineet valitaan siten, että niiden tiheydet kattavat mitattavan alueen.
1.5 LAATUKRITEERIT Jäljempänä olevassa taulukossa esitetään suhteellisen tiheyden määritysmenetelmien soveltuvuus eri tarkoituksiin.
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET Lisätietoja teknisistä yksityiskohdista on mm. liitteessä mainituissa standardeissa. Testit tulee suorittaa lämpötilassa 20 oC. Vähintään kaksi mittausta vaaditaan.
2. TIEDOT Katso standardeja.
3. Taulukko 1.4.1.11.4.1.21.4.1.31.4.21.4.31.4.4 menetelmien soveltuvuus
RAPORTOINTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot: Suhteellinen tiheys (D204) raportoidaan kohdan 1.2 määrityksen mukaan. Lisäksi on mainittava mitattavan aineen fysikaalinen olomuoto. Raporttiin tulee sisällyttää myös kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulosten tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta. Mittausmenetelmä Tiheys Suurin mahdollinen dynaaminen viskositeetti Nykyiset standardit kiinteä aine neste Hydrometri kyllä 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Hydrostaattinen vaaka kyllä ISO 1183 (A) kyllä 5 Pa s ISO 901 ja 758 Uppokappalemenetelmä kyllä 20 Pa s DIN 53217 Pyknometri ISO 3507 kyllä ISO 1183 (B), NF T 20-053 kyllä 500 Pa s ISO 758 Kaasuvertailupyknometri kyllä DIN 55990 Teil 3, DIN 53243 Oskilloiva densitometri kyllä 5 Pa s
käytetty menetelmä,
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet) ja mahdolliset esipuhdistukset.
3. Taulukko 1.4.1.11.4.1.2 menetelmien soveltuvuus
(a) kiinteät aineet
(b) nesteet
3. Taulukko 1.4.1.11.4.1.21.4.1.31.4.2 menetelmien soveltuvuus
(a) kiinteät aineet
(b) nesteet
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
VIITTEET OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 Final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realisation of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Fliissigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 427–430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297–302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen — Verfahren zur Dichteb estimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung — Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717–726. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253–255.
A.4 HÖYRYNPAINE
A.4
1. MENETELMÄ Tässä kuvatut menetelmät perustuvat pääosin OECD:n testiohjeisiin (1). Perusperiaatteet kuvataan viitteissä (2) ja (3).
1.
1.1 JOHDANTO On suositeltavaa ensin selvittää tutkittavan aineen rakenne, sulamislämpötila ja kiehumislämpötila. Koska koko höyrynpainealuetta kattavaa yksittäistä mittausmenetelmää ei ole, seuraavassa suositellaan useita eri menetelmiä, joita voidaan käyttää höyrynpainealueella < 10-4 – 105 Pa. Epäpuhtaudet vaikuttavat yleensä höyrynpaineeseen, Vaikutuksen voimakkuus vaihtelee epäpuhtauden laadun mukaan. Jos näyte sisältää haihtuvia epäpuhtauksia, jotka voivat vaikuttaa tulokseen, aine voidaan puhdistaa. Joissakin tapauksissa on suositeltavaa ilmoittaa teknisen aineen höyrynpaine. Joissakin kuvatuissa menetelmissä käytetään metalliosia sisältäviä laitteita, mikä on otettava huomioon syövyttävien aineiden testauksissa.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Määritelmän mukaan aineen höyrynpaine on kiinteään tai nestemäiseen aineeseen ylhäältä kohdistuva kyllästyspaine. Termodynaamisen tasapainon vallitessa puhtaan aineen höyrynpaine vaihtelee ainoastaan lämpötilan funktiona. Höyrynpaineen SI-yksikkö, jota tulee käyttää, on pascal (Pa). Aiemmin käytetyt yksiköt ja niiden muunnostekijät ovat seuraavat: 1 Torr = 1,333 x 102 Pa 1 ilmakehä = 1,013 x 105 Pa 1 baari (bar) = 105 Pa Lämpötilan SI-yksikkö on kelvin (K). Yleinen molaarinen kaasuvakio R on 8,314 J mol-1 K-1. Lämpötilan ja höyrynpaineen välinen riippuvuus voidaan laskea Clausiuksen ja Clapeyronin yhtälön avulla: log p = Δ Hv2,3 RT+const. jossa: p aineen höyrynpaine (Pa) ΔHv aineen höyrystymislämpö (J mol-1) R yleinen molaarinen kaasuvakio (J mol-1 K-1) T termodynaaminen lämpötila (K)
1.3 VERTAILUAINEET Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Vertailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla saatuihin tuloksiin.
1.4 TESTIMENETELMIEN PERIAATTEET Seuraavassa ehdotetaan höyrynpaineen määritystä varten seitsemää menetelmää, joita voidaan soveltaa höyrynpaineen eri alueilla. Jokainen menetelmä sisältää höyrynpaineen mittaamisen eri lämpötiloissa. Rajoitetulla lämpötila-alueella puhtaan aineen höyrynpaineen logaritmi on suoraan verrannollinen lämpötilan käänteisarvoon.
1.4
1.4.1 Dynaaminen menetelmä Dynaamisessa menetelmässä mitataan tiettyä painetta vastaava kiehumislämpötila. Suositeltava alue: 103–105 Pa. Menetelmää on myös suositeltu normaalin kiehumislämpötilan määritykseen. Tällöin yläraja on 600 K.
1.4.2 Staattinen menetelmä Staattisessa menetelmässä mitataan tiettyä lämpötilaa vastaavaa höyrynpaine suljetussa järjestelmässä, jossa vallitsee termodynaaminen tasapaino. Menetelmä soveltuu kiinteiden ja nestemäisten yksi- tai monikomponenttiaineiden tutkimiseen. Suositeltava alue: 10–105 Pa. Menetelmää voidaan huolellisuutta noudattaen käyttää myös alueella 1–10 Pa.
1.4.3 Isoteniskooppi Tämä standardoitu menetelmä on myös staattinen menetelmä, mutta se ei yleensä sovellu monikomponent-tijärjestelmien tutkimiseen. Lisätietoja on menetelmäkuvauksessa ASTM D-2879-86. Suositeltava alue: 100–105 Pa.
1.4.4 Effuusiomenetelmä: Höyrynpainevaaka Ainemäärä, joka aikayksikköä kohti virtaa kennosta tunnetun aukon läpi, määritetään tyhjössä olosuhteissa, joissa aineen paluuvirta on häviävän pieni (esimerkiksi mittaamalla höyrysuihkeen aiheuttaman pulssin vaikutus herkkään vaakaan tai mittaamalla painohäviö). Suositeltava alue: 10-3–1 Pa.
1.4.5 Effuusiomenetelmä: Painohäviön laskenta tai höyryn talteenkeräys Menetelmässä mitataan Knudsen-kennosta (4) aikayksikköä kohti virtaavan, höyrymäisen näytteen massa. Virtaus tapahtuu mikroaukon läpi äärityhjössä. Ulos virtaavan höyryn massa saadaan joko määrittämällä kennon painohäviö tai tiivistämällä höyry alhaisessa lämpötilassa, minkä jälkeen höyrystyneen aineen määrä voidaan määrittää kromatografia-analyysilla. Höyrynpaine lasketaan Hertz-Knudsenin yhtälön avulla. Suositeltava alue: 10-3–1 Pa.
1.4.6 Kaasunkyllästysmenetelmä Näytteen yli johdetaan inerttiä kantokaasua siten, että näytteen höyry kyllästää kantokaasun. Tunnetun kantokaasun kuljettama ainemäärä voidaan mitata talteenkeräämällä tai suora-analyysitekniikalla. Mittaustuloksen avulla voidaan laskea aineen höyrynpaine määrätyssä lämpötilassa. Suositeltava alue: 10-4–1 Pa. Menetelmää voidaan huolellisuutta noudattaen käyttää myös alueella 1–10 Pa.
1.4.7 Pyörivä roottori -menetelmä Tässä mittarissa varsinainen mittauselementti on pieni teräspallo, joka magneettikentän vaikutuksesta pyörii suurella nopeudella. Kaasun paine voidaan päätellä määrittämällä teräspallon nopeuden pieneneminen paineen vaikutuksesta. Suositeltava alue: 10-4–0,5 Pa.
1.5 Laatukriteerit 1.4.11.4.21.4.31.4.41.4.51.4.61.4.7
LAATUKRITEERIT Seuraavassa taulukossa on höyrynpaineen eri määritysmenetelmien vertailu soveltuvuuden, toistettavuuden, uusittavuuden, mittausalueen ja nykyisen standardin suhteen. Mittausmenetelmä Aineet Arvioitu toistettavuus Arvioitu uusittavuus Suositettu alue Nykyinen standardi kiinteät aineet nestemäiset aineet Dynaaminen menetelmä Alhainen sulamispiste kyllä enintään 25 % enintään 25 % 103 Pa – 2 × 103 Pa — 1–5 % 1–5 % 2 × 103 Pa – 105 Pa — Staattinen menetelmä kyllä kyllä 5–10 % 5–10 % 10Pa – 105 Pa NFT 20-048 (5) Isoteniskooppi kyllä kyllä 5–10 % 5–10 % 102 Pa – 105 Pa ASTM-D 2879-86 Effuusiomenetelmä, höyrynpainevaaka kyllä kyllä 5–20 % enintään 50 % 10-3 Pa – 1 Pa NFT 20-047 (6) Effuusiomenetelmä, painohäviön laskenta kyliä kyllä 10–30 % — 10-3 Pa – 1 Pa — Kaasunkyllästys-menetelmä kyllä kyllä 10–30 % enintään 50 % 10-4 Pa – 1 Pa — Pyörivä roottori -menetelmä kyllä kyllä 10– 20 % — 10-4 Pa – 0,5 Pa —
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET
1.6
1.6.1 Dynaaminen mittaus
1.6.1
1.6.1.1 Laite Tyypillisessä mittauslaitteessa on keittokattila, johon on liitetty lasinen tai metallinen jäähdytin (kuva 1), lämpötilan mittausosa sekä paineensäädin ja painemittari. Piirroksen mukainen tyypillinen mittauslaitteisto on valmistettu lämmönkestävästä lasista, ja siinä on seuraavat osat: Suuri, osittain kaksoisseinällä varustettu putki, jossa on lasihios, jäähdytin, jäähdytysastia ja sisääntulo. Putken kiehuntaosassa sijaitsevan, Cottrell-pumpulla varustetun lasisylinterin pinta on murskattua lasia, mikä ehkäisee nesteen poukkoilua kiehunnan aikana. Lämpötilan mittaukseen käytetään sopivaa lämpötilanilmaisinta (esimerkiksi vastuslämpömittaria, vaippatermoparia), joka upotetaan mittauspisteeseen (kuva 1, osa 5) sopivan sisääntulon (esimerkiksi urospuolisen maadoitusliitoksen) kautta. Paineensäätimeen ja painemittariin tehdään tarvittavat liitännät. Pallomainen laajennus, joka toimii tilavuuspuskurina, on liitetty mittalaitteeseen kapillaariputkella. Keittoastian kuumentamiseen käytetään kuumennuselementtiä (esimerkiksi kasettilämmitintä), joka asetetaan lasilaitteistoon alakautta. Kuumennustehoa säädetään termoparin avulla. Tarvittava tyhjö (102–105 Pa) saadaan aikaan tyhjöpumpulla. Paineensäätöä varten tarvittava ilman tai typen mittaus (painealue noin 102–105) ja ilmanvaihto tapahtuvat venttiilin kautta. Paine mitataan manometrilla.
1.6.1.2 Työjärjestys Höyrynpaine määritetään mittaamalla näytteen kiehumislämpötila useassa eri paineessa alueella 102–105 Pa. Kun lämpötila pysyy vakiona määrätyssä vakiopaineessa, näytteen katsotaan saavuttaneen kiehumispisteen. Menetelmä ei sovellu vaahtoavien aineiden mittaukseen. Näyte pannaan puhtaaseen, kuivaan näyteastiaan. Jos näyte ei ole jauheena, mahdolliset ongelmat voidaan yrittää ratkaista kuumentamalla jäähdytysvaippaa. Näyteastian täytön jälkeen laite suljetaan laipan kohdalta ja tehdään kaasunpoisto. Sitten asetetaan alin haluttu paine ja aloitetaan kuumennus. Lämpötilanilmaisin kytketään rekisteröintilaitteeseen. Järjestelmässä vallitsee tasapaino, kun vakiopaineessa mitattu kiehumislämpötila pysyy vakiona. Kiehumisen aikana on erityisesti vältettävä näytteen poukkoilua. Lisäksi jäähdyttimellä tulee tapahtua täydellinen tiivistyminen. Jos näytteen sulamispiste on alhainen, on varottava lauhduttimen tukkeutumista. Tasapainopisteen kirjaamisen jälkeen asetetaan uusi, suurempi paine. Mittauksia jatketaan 105 Pa:n paineeseen asti (yhteensä 5–10 mittausta). Tulokset tarkistetaan toistamalla mittaukset laskevassa painejärjestyksessä.
1.6.2 Staattinen mittaus
1.6.2
1.6.2.1 Laite Laitteessa on näyteastia, näytteen lämpötilaa säätävä kuumennus- ja jäähdytysjärjestelmä sekä paineen asetin ja painemittari. Laitteen periaatepiirrokset ovat kuvissa 2a ja 2b. Näytekammion (kuva 2a) toiselle puolelle on liitetty tyhjöventtiili ja toiselle puolelle on liitetty painemittarinestettä sisältävä U-putki. U-putken toinen pää on liitetty linjaan, jossa on tyhjöpumppu, typpisylinteri tai ilmaventtiili ja manometri. U-putken sijasta voidaan käyttää osoitinlaitteella varustettua painemittaria (kuva 2b). Näytteen lämpötilaa säädetään pitämällä näyteastiaa venttiileineen ja U-putkineen tai painemittareineen hauteessa, jonka lämpötila pidetään vakiona (±0,2 K). Lämpötila mitataan näyteastian ulkopuolelta tai astian sisältä. Laite evakuoidaan tyhjöpumpulla, jonka tulopuolella on kylmäloukku. Menetelmässä 2a näytteen höyrynpaine mitataan epäsuorasti nollaosoitinlaitteella. Menetelmä perustuu siihen, että U-putkessa olevan nesteen tiheys muuttuu, jos lämpötilassa tapahtuu suuria muutoksia. U-putken nollaosoittimia varten voidaan painealueen ja näytteen kemiallisen käyttäytymisen mukaan käyttää silikoninesteitä tai ftalaatteja. Näyte ei saa mainittavassa määrin liueta U-putken nesteeseen tai reagoida sen kanssa. Manometrissa voidaan käyttää elohopeaa normaalista ilmanpaineesta 102 Pa:iin asti ja silikoninesteitä sekä ftalaatteja painealueella 102–10 Pa. Kuumakalvomanometreja voidaan käyttää jopa alle 10-1 Pa:n paineessa. Käytössä on myös muuntyyppisiä painemittareita alle 102 Pa:n mittauksia varten.
1.6.2.2 Työjärjestys Ennen mittauksia laitteen kaikki osat (katso kuvaa 2) on puhdistettava ja kuivattava huolella. Menetelmässä 2a U-putki täytetään valitulla nesteellä, jolle on tehtävä kaasunpoisto korkeassa lämpötilassa ennen mittauksia. Näytettä pannaan laitteeseen, joka suljetaan. Lämpötilaa lasketaan kaasunpoistoa varten niin paljon, että ilma saadaan ulos. Lämpötilaa ei saa laskea niin paljon, että näytteen koostumus muuttuu (monikomponenttijärjestelmät). Tarvittaessa näytettä voidaan hämmentää, jotta tasapaino saavutettaisiin nopeammin. Näyte alijäähdytetään käyttäen nestemäistä typpeä (jolloin on varottava ilmankosteuden tai pumppunesteen lauhtumista) tai etanolin ja hiilihappojään seosta. Alhaisen lämpötilan mittauksissa käytetään lämpötilasäädettyä haudetta, johon on kytketty ultrakryometri. Näyteastian venttiili avataan ja ilma poistetaan ylläpitämällä imua usean minuutin ajan. Venttiili suljetaan ja näytteen lämpötila säädetään alimmalle mitattavalle tasolle. Tarvittaessa ilmanpoisto toistetaan useita kertoja. Kun näytettä kuumennetaan, höyrynpaine suurenee, mikä vaikuttaa U-putken nestepatsaan tasapainoon. Tämä kompensoidaan päästämällä typpeä tai ilmaa venttiilin kautta laitteeseen, kunnes paineosoittimen nestepatsas palaa nollaan. Tähän vaadittavan paineen lukema voidaan katsoa tarkkuuspainemittarista huoneenlämmössä. Paine vastaa näytteen höyrynpainetta kyseisessä mittauslämpötilassa. Menetelmä 2b on muuten samanlainen, mutta höyrynpaineen lukema saadaan suoraan, Höyrynpaineen lämpötilariippuvuus määritetään sopivin välein (yhteensä 5-10 mittauspistettä) haluttuun maksimilämpötilaan asti. Alhaisen lämpötilan mittaukset on toistettava tarkistuksen vuoksi. Jos toistomittauksista saadut tulokset eivät ole yhteneviä lämpötilan noston aikana saatujen tulosten kanssa, syy voi olla jokin seuraavista:
1.6.2.2
1. Näyte sisältää edelleen ilmaa (esimerkiksi aineet, joiden viskositeetti on suuri) tai alhaisessa lämpötilassa kiehuvaa ainetta, joka vapautuu kuumentamisen aikana ja joka voidaan poistaa imemällä alijäähtymisen yhteydessä.
2. Jäähdytyslämpötila ei ole tarpeeksi alhainen. Tällöin jäähdytysaineena käytetään nestemäistä typpeä. Jos syy on jokin edellisistä, mittaukset on toistettava.
3. Näytteessä tapahtuu kemiallinen reaktio (esimerkiksi hajoaminen tai polymerisoituminen) mitattavalla lämpötila-alueella.
1.6.3 Isoteniskooppi Menetelmän kattava kuvaus on viitteessä 7. Mittauslaitteen periaatepiirros on kuvassa 3. Isoteniskooppi soveltuu kohdassa 1.6.2 kuvatun staattisen menetelmän tavoin kiinteiden ja nestemäisten aineiden tutkimiseen. Nestemäiset näytteet toimivat samalla apumanometrin nesteenä. Isoteniskooppiin lisätään nestettä niin paljon, että manometrin laajennus ja manometrin lyhyempi jalka täyttyvät. Isoteniskooppi liitetään tyhjöjärjestelmään ja siitä poistetaan ilma, minkä jälkeen se täytetään typellä. Tämä toistetaan kaksi kertaa hapenjäännösten poistamiseksi. Täytetty isoteniskooppi asetetaan vaaka-asentoon siten, että näyte leviää ohueksi kerrokseksi laajennuksessa ja manometriosassa (U-osassa). Järjestelmän paine lasketaan arvoon 133 Pa ja näytettä kuumennetaan varovasti, kunnes se alkaa kiehua (näytteeseen liuenneiden kaasujen poisto). Isoteniskoopin asentoa muutetaan niin, että näyte palaa manometrin laajennukseen ja lyhyeen jalkaan täyttäen molemmat. Painetta pidetään yllä kuten kaasunpoistossa: laajennuksen nokkaa kuumennetaan pienen liekin avulla, kunnes näytteestä vapautuu niin paljon höyryä, että näytettä työntyy laajennuksen yläosasta ja manometrin varresta isoteniskoopin manometriosaan, jolloin muodostuu höyrytäytteinen tila, jossa ei ole typpeä. Tämän jälkeen isoteniskooppi asetetaan hauteeseen, jonka lämpötila on vakio, ja typen painetta säädetään, kunnes se on sama kuin näytteen paine. Paineiden tasapaino voidaan nähdä isoteniskoopin manometriosasta. Tässä tilanteessa typen ja näytteen höyrynpaine on sama. Kiinteiden aineiden tutkimiseen käytetään jotakin kohdassa 1.6.2.1 mainituista manometrinesteistä mitattavan paine- ja lämpötila-alueen mukaan. Manometrineste, josta on poistettu kaasut, pannaan isoteniskoopin pidemmän varren pullistumaan. Näyte pannaan laajennukseen, ja sille tehdään kaasunpoisto korkeassa lämpötilassa, minkä jälkeen isoteniskooppia kallistetaan, kunnes manometrineste virtaa U-putkeen. Höyrynpaine mitataan lämpötilan funktiona kohdan 1.6.2 mukaan.
1.6.4 Effuusiomenetelmä: Höyrynpainevaaka
1.6.4
1.6.4.1 Laite Kirjallisuudessa on usean laiteversion kuvaukset (1). Tässä käsiteltävä laite kuvaa menetelmän yleisperiaatetta (kuva 4). Kuvassa 4 ovat laitteen pääosat: ruostumattomasta teräksestä tai lasista valmistettu tyhjöastia, tyhjön tuottamiseen ja mittaamiseen tarkoitetut laitteet sekä sisäänrakennetut osat höyrynpaineen mittaamiseksi vaa'alla. Laite sisältää seuraavat osat:
Laipalla ja pyörivällä sisääntulolla varustettu haihdutinuuni, joka on valmistettu sylinterin muotoon esimerkiksi kuparista tai kemikaaleja kestävästä seoksesta, jonka lämmönjohtavuus on hyvä. Kupariseinällä varustettua lasiastiaa voidaan myös käyttää. Uunin läpimitta on 3–5 cm ja korkeus 2–5 cm. Höyryvirtaa varten on 1-3 erikokoista aukkoa. Kuumennus tehdään uunin alla sijaitsevalla kuumennuslevyllä tai uunia ympäröivällä kuumennuskierukalla. Lämmön johtuminen aluslevyyn on estetty liittämällä kuumennin aluslevyyn metallilla, jonka lämmönjohtavuus on heikko (nikkelihopealla tai krominikkeliteräksellä), esimerkiksi nikkelihopeaputkella, joka on liitetty pyörivään tuloliitäntään (tämä edellyttää sitä, että käytetään moniaukkoista uunia. Tällaisen järjestelyn etuna on mahdollisuus panna uuniin kuparitanko, jolla voidaan hoitaa jäähdytys ulkopuolelta jäähdytyshauteiden avulla.
Sijoittamalla kupariuunin kanteen kolme erikokoista aukkoa 90 asteen kulmaan toisiinsa nähden saadaan mahdollisuus mitata erilaisia höyrynpaineita mitta-alueen sisällä (aukkojen halkaisija noin 0,30-4,50 mm). Suuret aukot ovat alhaisia höyrynpaineita ja pienet aukot suuria höyrynpaineita varten. Uunia pyörittämällä höyryvirtaan voidaan asettaa haluttu aukko tai väliasento (uunin aukko — suoja — vaakakuppi), ja näin molekyylivirta joko pääsee uunin aukon läpi vaakakupille tai molekyylivirran pääsy vaakakupille on estetty. Näytteen lämpötila mitataan sopivaan pisteeseen asetetulla termoparilla tai vastuslämpömittarilla.
Suojan yläpuolella on erittäin herkkään mikrovaakaan kuuluva vaakakuppi (lisätietoja on jäljempänä), jonka läpimitta on noin 30 mm. Vaakakupin aineeksi suositellaan kultapäällysteistä alumiinia.
Vaakakuppia ympäröi sylinterinmuotoinen messingistä tai kuparista tehty jäähdytyslaatikko. Vaakatyypin mukaan siinä on aukot vaa'an palkkia varten ja suojan aukko molekyylivirtaa varten. Jäähdytyslaatikon tulisi taata höyryn täydellinen tiivistyminen vaakakupille. Lämmön johtuminen ulkopuolelle tapahtuu esimerkiksi jäähdytyslaatikkoon liitetyn kuparitangon kautta. Tanko kulkee aluslevyn kautta, ja se on eristetty siitä termisesti esimerkiksi krominikkeliteräsputken avulla. Tanko pannaan Dewar-astiaan, jonka aluslevyn alla on nestemäistä typpeä (vaihtoehtoisesti nestemäistä typpeä kierrätetään tangon läpi). Täten jäähdytyslaatikon lämpötila pysyy - 120 oC:een tuntumassa. Vaakakupin jäähdytys tapahtuu vain säteilyn avulla, ja vaakakuppi on sopiva paineiden mittaukseen tutkittavalla alueella (jäähdytys aloitetaan noin tunti ennen mittauksia).
Vaaka sijaitsee jäähdytyslaatikon yläpuolella. Sopivia vaakoja ovat esimerkiksi kaksivartinen elektroninen mikrovaaka (8) tai erittäin herkkä kiertokäämimittauslaite (katso OECD:n testiohjetta 104, 12.5.81).
Aluslevyssä on myös sähköiset liitännät termopareja tai vastuslämpömittareita ja kuumennuskäämiä varten.
Astiaan imetään tyhjö alipaine- tai tyhjöpumpulla (tarvittava tyhjö on noin 1-2 × 10-3 Pa, mikä vaatii kahden tunnin pumppauksen). Painetta säädetään sopivan ionisaatiomanometrin avulla.
1.6.4.2 Työjärjestys Astia täytetään näytteellä ja kansi suljetaan. Suoja ja jäähdytyslaatikko työnnetään uunin läpi. Laite suljetaan ja tyhjöpumput käynnistetään. Mittaukset voidaan aloittaa, kun paine on laskenut noin 10-4 Pa:n tasolle. Jäähdytyslaatikon jäähdytysmekanismi käynnistyy, kun paine on 10-2 Pa. Kun laitteessa on vaadittava tyhjö, käynnistetään kalibrointisarjat alimmassa vaaditussa lämpötilassa. Kun kannen vastaava aukko avataan, höyryvirta kulkee suojan läpi suoraan aukon yläpuolella ja osuu jäähdytettyyn vaakakuppiin. Vaakakupin on oltava niin suuri, että suojan kautta ohjattu virta osuu siihen kokonaisuudessaan. Höyryvirran momentti toimii voimana vaakakuppia kohti, ja molekyylit tiivistyvät kupin kylmälle pinnalle. Momentista ja samanaikaisesti tapahtuvasta tiivistymisestä syntyy rekisteröintilaitteeseen signaali. Signaaleja analysoimalla saadaan kahdenlaista tietoa: p = G 2 π RT×103M jossa G haihtumisnopeus (kg s-1 m-2) M moolimassa (g mol-1) T lämpötila (K) R yleinen molaarinen kaasuvakio (J mol-1 K-1) p höyrynpaine (Pa) Kun tyhjö on saavuttanut halutun arvon, mittaukset aloitetaan alimmasta mittauslämpötilasta. Mittauksia jatketaan nostamalla lämpötilaa vähitellen korkeimpaan haluttuun mittauslämpötilaan asti. Tämän jälkeen näyte jäähdytetään ja mittaukset toistetaan. Jos toinen sarja ei vahvista ensimmäisen sarjan mittaustuloksia, syynä saattaa olla näytteen hajoaminen mitattavalla lämpötila-alueella.
1.6.4.2
1 Tässä kuvatussa laitteessa höyrynpaine määritetään suoraan vaakakuppiin kohdistuvasta momentista (tätä varten ei tarvita tietoja molekyylipainosta (2)). Geometriset tekijät, kuten uunin aukko ja molekyylivirran kulma, on otettava huomioon lukemien arvioinnissa.
2 Samalla voidaan mitata tiivistyneen höyryn massa ja sen perusteella voidaan edelleen laskea haihtumisnopeus. Höyrynpaine voidaan laskea myös haihtumisnopeudesta ja molekyylipainosta Hertzin yhtälön (2) avulla.
1.6.5 Effuusiomenetelmä: Painohäviön laskenta
1.6.5
1.6.5.1 Laite Effuusiolaitteen perusosat ovat seuraavat: Kuvassa 5 on esimerkkinä sähkölämmitteinen, alumiinirakenteinen tyhjösäiliö, jossa on neljä ruostumattomasta teräksestä valmistettua effuusiokennoa. Teräskalvon paksuus on noin 0,3 mm ja sen effuusioaukon läpimitta on 0,2–1,0 mm. Teräskalvo on kiinnitetty effuusiokennoon kierrekannella.
effuusiokennoja sisältävä säiliö, jonka lämpötila on säädettävissä ja johon saadaan tyhjö,
tyhjömittarilla varustettu tyhjöpumppu (esimerkiksi diffuusiopumppu tai molekyyliahtopumppu),
nestemäiseen typpeen tai hiilihappojäähän perustuva loukku.
1.6.5.2 Työjärjestys Toinen kenno täytetään vertailuaineella ja toinen näytteellä. Aukolla varustettu metallikalvo kiinnitetään kierrekannella ja kumpikin kenno punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella. Kenno pannaan termostaatilla varustettuun säiliöön, joka evakuoidaan yhden kymmenyksen alle odotetun paineen. Määrätyin (5-30 tunnin) välein laitteeseen päästetään ilmaa ja effuusiokennon painohäviö määritetään punnitsemalla. Kenno on punnittava uudelleen määrätyin välein, jotta voitaisiin todeta, että haihtumisnopeus pysyy vakiona vähintäin kahden aikajakson ajan. Näin varmistetaan, että näytteeseen mahdollisesti sisältyvät haihtuvat epäpuhtaudet eivät vaikuta tulokseen. Effuusiokennon höyrynpaine lasketaan seuraavan suureyhtälön avulla: p = mKAt2 π R TM jossa p höyrynpaine (Pa) m massa, joka aikajakson t kuluessa poistuu kennosta (kg) t aika (s) A aukon pinta-ala (m2) K korjauskerroin R yleinen molaarinen kaasuvakio (J mol-1 K-1) T lämpötila (K) M molekyylimassa (kg mol-1) Korjauskerroin vaihtelee sylinterinmuotoisen aukon pituuden ja säteen keskinäisen suhteen mukaan seuraavasti: Suhde 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Yhtälö voidaan kirjoittaa seuraavaan muotoon: p = E mtTM jossa E = 1KA2πR muodostaen effuusiokennovakion. Effuusiokennovakio E voidaan määrittää käyttämällä vertailuaineita (2,9) ja seuraavaa yhtälöä: E = p(r)tmM(r)T jossa p(r) vertailuaineen höyrynpaine (Pa) M(r) vertailuaineen molekyylimassa (kg x mol-1)
1.6.6 Kaasunkyllästysmenetelmä
1.6.6
1.6.6.1 Laite Kuvassa 6a on tyypillisen laitteen osat (1):
1.6.6.1 Inertti kaasu
Kantokaasu ei saa reagoida kemiallisesti näytteen kanssa. Yleensä voidaan käyttää typpeä, mutta eräissä tapauksissa on käytettävä muuta kaasua (19). Kaasun on oltava kuivaa (kuva 6a, 4: suhteellisen kosteuden ilmaisin).
Virtausohjaus
Kaasunohjausjärjestelmä valvoo, että virtaus kyllästymiskolonnin läpi pysyy vakiona ja halutussa arvossa.
Höyryloukut
Loukut vaihtelevat näytteen ominaisuuksien ja valitun analyysimenetelmän mukaan. Kaikki höyry on kerättävä talteen myöhemmin tehtävää analyysiä varten. Joillekin näytteille sopii nestettä (esimerkiksi heksaania tai etyleeniglykoolia) sisältävä loukku, toisten kohdalla voi olla parempi käyttää kiinteitä absorbentteja. Höyryn keräämisen ja tätä seuraavan analyysin vaihtoehtona tunnetun kaasumäärän kuljettama ainemäärä voidaan määrittää myös suora-analyysin (esimerkiksi kromatografian) avulla.
Lämmönvaihdin
Kun mittauksia tehdään eri lämpötiloissa, laitteeseen voidaan lisätä lämmönvaihdin.
Kyllästymiskolonni
Näytettä kaadetaan nesteestä sopivalle inertille alustalle. Päällystetty alusta pakataan kyllästymiskolonniin, jonka mitat ja virtausnopeus valitaan siten, että kantokaasu kyllästyy) täysin. Kyllästymiskolonnissa on oltava lämpötilan säätömekanismi. Kun tehdään mittauksia huoneenlämpötilaa korkeammassa lämpötilassa, näytteen lauhtuminen on estettävä lämmittämällä kyllästymiskolonnin ja loukkujen välistä aluetta. Diffuusion kautta tapahtuvaa massankuljetusta voidaan vähentää asentamalla kyllästymiskolonnin perään kapillaariputki (kuva 6b).
1.6.6.2 Työjärjestys
1.6.6.2 Kyllästymiskolonnin valmistelu:
Näytettä ja voimakkaasti haihtuvaa liuotinta sisältävä liuos kaadetaan sopivalle alustalle. Näytettä lisätään sellainen määrä, että sillä varmistetaan kyllästyminen koko testin ajaksi. Liuotin haihdutetaan täysin ilmassa tai pyörivässä haihduttimessa, ja huolella sekoitettu aine lisätään kyllästinkolonniin. Näytteen lämpötila säädetään toivotulle tasolle ja kuivaa typpeä johdetaan laitteen läpi.
Mittaus
Kytketään loukut tai suora-analyysi-ilmaisin kolonnin poistolinjaan ja mitataan aika. Virtausnopeus tarkistetaan testin alussa ja sen jälkeen säännöllisin välein testin aikana kuplavirtausmittarilla (tai jatkuvasti massavirtausmittarilla). Kyllästimen ulostulon paine mitataan jollakin seuraavista menetelmistä: Näytteen kvantitatiiviseen keräämiseen tarvittava aika eri analyysimenetelmissä määritetään alustavien ajojen tai arvioiden perusteella. Vaihtoehtona näytteen keräämiselle myöhemmin tehtävää analyysiä varten ainemäärä voidaan määrittää myös suora-analyysin (esimerkiksi kromatografian) avulla. Ennen höyrynpaineen määritystä annetussa lämpötilassa on alustavien ajojen avulla löydettävä suurin virtausnopeus, jolla näytehöyry vielä kyllästää kantokaasun täysin. Virtausnopeus on tarpeeksi pieni, kun sen pienentäminen ei enää suurenna höyrynpaineen laskettua arvoa. Jos käytetään analyyttisiä menetelmiä, menetelmä (esimerkiksi kaasukromatografia tai painoanalyysi) valitaan testattavan aineen luonteen mukaan. Määritetään tunnetun kantokaasumäärän kuljettama ainemäärä.
(a) Kyllästimen ja loukkujen väliin lisätään painemittari. (Tämä menetelmä voi olla epätyydyttävä, koska se lisää kuollutta tilaa ja suurentaa adsorptiopintaa.)
(b) Tehdään erillinen mittaus, jossa määritetään käytettävän loukkujärjestelmän aiheuttamat paineen laskut virtausnopeuden funktiona. (Tämä menetelmä voi olla nesteloukkujen osalta epätyydyttävä.)
1.6.6.3 Höyrynpaineen laskeminen Höyrynpaine lasketaan höyryn tiheyden (W/V) perusteella seuraavan suureyhtälön mukaan: p = WV × RTM jossa: p höyrynpaine (Pa) W haihdutetun näytteen massa (g) V kyllästetyn kaasun tilavuus (m3) R yleinen molaarinen kaasuvakio J mol-1 K-1) T lämpötila (K) M näytteen moolimassa (g mol-1) Mitatut tilavuudet on korjattava virtausmittarin ja lämpötilasäädetyn kyllästimen välisten paine- ja lämpötilaerojen suhteen. Jos virtausmittari sijaitsee höyryloukusta alavirtaan, voi olla tarpeen ottaa huomioon myös loukun sisältämät höyrystyneet aineet (1).
1.6.7 Pyörivä roottori (8, 11, 13)
1.6.7
1.6.7.1 Laite Pyörivän roottorin tekniikkaa voidaan soveltaa käyttämällä pyörivään roottoriin perustuvaa viskositeettimittaria (kuva 8). Laitteen periaatepiirros on kuvassa 7. Tyypillisessä laitteessa on pyörivään roottoriin perustuva mittapää, joka on suljettu lämpötilasäädettyyn tilaan (säätötarkkuus 0,1 oC). Näytesäiliö asetetaan lämpötilasäädettyyn koteloon (säätötarkkuus 0,01 oC), ja järjestelmän kaikkia muita osia pidetään lämmitettyinä tiivistymisen estämiseksi. Järjestelmään on liitetty tyhjöpumppu tyhjöventtiilien avulla. Mittapäässä on putkeen asetettu teräspallo (halkaisija 4–5 mm). Pallo leijuu stabiloituna magneettikentässä, joka luodaan kestomagneettien ja ohjauskäämien yhdistelmällä. Pallo pyörii käämien tuottamien pyörivien kenttien vaikutuksesta. Pallon pyörimisnopeus saadaan pallon jatkuvaa heikkoa sivuttaista magnetisointia mittaavien vastaanottokäämien avulla.
1.6.7.2 Työjärjestys Kun pallo on saavuttanut annetun pyörimisnopeuden v(o) (yleensä noin 400 kierrosta sekunnissa), magnetointi lopetetaan, jolloin pyöriminen hidastuu kaasukitkan vaikutuksesta. Pyörimisnopeuden pienenemiset mitataan ajan funktiona. Koska magneettisen leijunnan aiheuttama kitka on häviävän pieni kaasukitkaan verrattuna, kaasun paine saadaan seuraavasti: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) jossa c— kaasumolekyylien keskinopeus r pallon säde p pallon massatiheys σ tangentiaalisen momentinsiirron vakio (e = 1, kun pallon pinnan pyöreys on ihanteellinen) t aika v(t) pyörimisnopeus ajan t jälkeen v(o) pyörimisnopeuden alkuarvo Yhtälö voidaan myös kirjoittaa seuraavaan muotoon: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 jossa tn, tn-1 ilmaisevat annettuun kierrosmäärään N kuluvan ajan. Aikavälit tn ja tn-1 seuraavat toisiaan, ja tn > tn-1. Kaasumolekyylin keskinopeus c saadaan seuraavan c— suureyhtälön mukaan: c— = 8 RTπ M12 jossa T lämpötila R yleinen molaarinen kaasuvakio M moolimassa
2. TIEDOT Kaikissa edellä kuvatuissa menetelmissä höyrynpaine määritetään vähintään kahdessa lämpötilassa. Lämpötila-alueella 0–50 oC suositellaan vähintään kolmea mittausta, jotta höyrynpainekäyrän lineaarisuus voitaisiin tarkistaa.
3. RAPORTOINTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot: Jos aineessa tapahtuu muutoksia (olomuodon muutos, hajoaminen), on lisäksi ilmoitettava: Raporttiin tulee sisällyttää myös kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulosten tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta.
käytetty rnenetelmä,
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet) ja mahdolliset esipuhdistukset,
vähintään kaksi höyrynpaine- ja lämpötila-arvoa, mieluiten alueelta 0–50 oC,
kaikki lähtöarvot,
käyrä, joka kuvaa log p:n muuttumista 1/T:n funktiona,
arvio höyrynpaineesta 20 tai 25 oC:n lämpötilassa.
muutoksen luonne,
lämpötila, jossa muutos tapahtui ilmakehän paineessa,
höyrynpaine 10 oC ja 20 oC muutoslämpötilan alapuolella sekä 10 oC ja 20 oC tämän lämpötilan yläpuolella (ellei kyseessä ole muutos kiinteästä olomuodosta kaasuksi).
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
VIITTEET OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre; B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Buttenvorths, London, 1975, Vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Chapter IX, Interscience Publ. New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593. NF T 20-048 AFNOR (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de la pression de vapeur des solides et des liquides dans le domaine 10-1 à 105 Pa. Méthode statique. NF T 20-047 AFNOR (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de la pression de vapeur des solides et des liquides dans le domaine 10-3 à 1 Pa. Méthode de la balance de pression de vapeur. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure-temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Röhl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, vol. 5 (4), 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I. J.; Sprake, C. H. S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173. B. F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435. G. Comsa, J. K. Fremerey anb B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148. J. K. Fremerey. J. Vac Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), 1715.
A.5 PINTAJÄNNITYS
A.5
1. MENETELMÄ Tässä kuvatut menetelmät perustuvat OECD:n testiohjeisiin (1). Perusperiaatteet kuvataan viitteessä (2).
1.
1.1 JOHDANTO Kuvattuja menetelmiä voidaan soveltaa vesiliuosten pintajännityksen mittaamiseen. On suositeltavaa selvittää ensin tutkittavan aineen vesiliukoisuus, rakenne, hydrolysoitumisominaisuudet ja misellimuodostuksen kriittinen pitoisuus. Kuvattuja menetelmiä voidaan käyttää lähes kaikkiin kemiallisiin aineisiin ilman rajoituksia aineiden puhtausasteen suhteen. Pintajännityksen mittaaminen rengastensiometrillä on rajoitettu vesiliuoksiin, joiden dynaaminen viskositeetti on alle 200 mPa s.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Vapaan pinnan entalpiaa pintayksikköä kohti kutsutaan pintajännitykseksi. Pintajännityksen yksiköt ovat seuraavat: N/m (SI-yksikkö) tai mN/m (SI-alayksikkö) 1 N/m = 103 dyniä/cm 1 mN/m = 1 dyni käytöstä poistuneessa cgs-järjestelmässä
1.3 VERTAILUAINEET Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Vertailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla saatuihin tuloksiin. Viitteissä (1) ja (3) esitetään vertailuaineita, jotka kattavat laajan pintajännitysalueen.
1.4 TESTIMENETELMIEN PERIAATTEET Menetelmä perustuu sen pystysuoran vetovoiman mittaamiseen, joka tarvitaan erottamaan sanka tai rengas mitta-astiassa olevan tutkittavan nesteen pinnasta vetämällä kohtisuoraan ylöspäin. Voidaan myös panna neste lautaselle ja mitata voima, joka tarvitaan kappaleen reunan ja nestepinnan välisen kalvon irrottamiseen. Aineet, joiden vesiliukoisuus on vähintään 1 mg/l, tutkitaan vesiliuoksessa yhtenä ainoana pitoisuutena.
1.5 LAATUKRITEERIT Menetelmillä on mahdollista saavuttaa tarkkuus, joka on todennäköisesti suurempi kuin mitä ympäristöllisiä arviointeja varten tarvitaan.
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET Ainetta liuotetaan tislattuun veteen. Liuoksen pitoisuuden tulee olla 90 % aineen kyllästymispitoisuudesta veteen liuotettaessa. Jos kyllästymispitoisuus ylittää arvon 1 g/l, testiin käytetään pitoisuutta 1 g/l. Aineita, joiden vesiliukoisuus on alle 1 mg/l, ei tarvitse testata.
1.6
1.6.1 Lautasmenetelmä Katso standardeja ISO 304 ia NF T 73-060 (Surface active agents — determination of surface tension by drawing up liquid films)
1.6.2 Sinkilämenetelmä Katso standardeja ISO 304 ja NF T 73-060 {Surface active agents — determination of surface tension by drawing up liquid films)
1.6.3 Rengasmenetelmä Katso standardeja ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents — determination of surface tension by drawing up liquid films)
1.6.4 OECD-maiden yhtenäistetty rengasmenetelmä
1.6.4
1.6.4.1 Laite Tähän mittaukseen voidaan käyttää kaupallisesti saatavia tensiometrejä. Tensiometrin osat ovat seuraavat:
liikkuva näytepöytä,
mittauskappale (rengas),
voimanmittausjärjestelmä,
mittausastia.
1.6.4.1
1.6.4.1.1 Liikkuva näytepöytä Liikkuva näytepöytä toimii näytettä paikallaanpitävän, termostaatilla varustetun mittausastian tukena. Näytepöytä ja voimanmittausjärjestelmä on kiinnitetty telineeseen.
1.6.4.1.2 Voimanmittausjärjestelmä Voimanmittausjärjestelmä (katso kuvaa) sijaitsee näytepöydän yläpuolella. Voimanmittauksen virhe ei saa ylittää arvoa ± 10-6 N, mikä vastaa virherajaa ±0,1 mg massamittauksissa. Useimmissa tapauksissa kaupallisten tensiometrien mitta-asteikko on mN/m-yksikköinä, jolloin pintajännityslukema saadaan suoraan mN/m-yksikköinä 0,1 mN/m:n tarkkuudella.
1.6.4.1.3 Mittauskappale (rengas) Rengas on yleensä tehty noin 0,4 mm:n paksuisesta platina-iridiumlangasta. Keskiympärysmitta on 60 mm. Rengas riippuu vaakasuorassa metallitapista ja lankatelineestä ja on tätä kautta yhteydessä voimanmittausjärjestelmään (katso kuvaa).
1.6.4.1.3 Kuva Mittauskappale
(Kaikki mitat ovat millimetreinä.) Tappi Teline Rengas
1.6.4.1.4 Mittausastia Näyteliuosta sisältävän mittausastian on oltava termostaatilla varustettu ja lasista valmistettu. Astian tulee olla siten muotoiltu, että näyteliuoksen ja sen yläpuolella olevan kaasufaasin lämpötila pysyy mittauksen aikana vakiona eikä näytettä pääse haihtumaan. Hyväksyttävän sylinterinmuotoisen mittausastian sisähalkaisijan on oltava vähintään 45 mm.
1.6.4.2 Valmistelutoimet
1.6.4.2
1.6.4.2.1 Puhdistus Lasiastiat on puhdistettava huolella. Tarvittaessa ne on pestävä kuumalla kromi-rikkihapolla ja sen jälkeen väkevällä fosforihapolla (83–98 painoprosenttia H3PO4:ää), ja sen jälkeen huuhdeltava huolellisesti vesijohtovedellä. Lopuksi astiat on pestävä kaksoistislatulla vedellä, niin että saadaan neutraali reaktio, ja kuivattava, tai huuhdeltava pienellä määrällä näyteliuosta. Rengas huuhdellaan ensin huolellisesti vedellä kaikkien vesiliukoisten aineiden poistamiseksi. Tämän jälkeen se upotetaan hetkeksi kromi-rikkihappoon, ja sitten se pestään kaksoistislatulla vedellä, niin että saadaan neutraali reaktio. Lopuksi rengasta kuumennetaan vähän aikaa metanoliliekin yllä. Huomautus: Epäpuhtaudet, jotka eivät liukene tai tuhoudu kromi-rikkihapon tai fosforihapon vaikutuksesta, poistetaan sopivalla orgaanisella liuottimella.
1.6.4.2.2 Laitteen kalibrointi Laite kalibroidaan vahvistamalla nollapiste ja säätämällä se siten, että instrumentin lukema sallii luotettavan mN/m-lukeman määrityksen.
1.6.4.2.2 Asennus:
Laite tasapainotetaan esimerkiksi tensiometrin jalustalla olevan vesiva'an avulla. Jalustan tasapainotusruuveja säädetään tarpeen mukaan.
Nollapisteen säätö:
Kun rengas on kiinnitetty laitteeseen, tensiometrin lukema on ennen mittauksia säädettävä nollaan ja renkaan yhdensuuntaisuus nesteen pinnan suhteen on tarkistettava. Nesteen pintaa voidaan käyttää peilinä.
Kalibrointi:
Varsinainen kalibrointi voidaan tehdä jollakin seuraavista menetelmistä:
a)
Massamenetelmä: Renkaalle asetetaan kappaleita, joiden massa on tunnettu (0,1–1,0 g). Kalibrointikerroin (Фa), jolla instrumentin kaikki lukemat on kerrottava, määritetään yhtälön (1) mukaisesti: Φa=σrσa (1) jossa σr=mg2b (mN/m) m kappaleen massa (g) g putoamiskiihtyvyys (981 cm s-2 merenpinnan tasolla) b renkaan keskiympärysmitta (cm) σa tensiometrin lukema, kun renkaalle on asetettu kappaleita (mN/m).
b)
Vesimenetelmä: Käytetään vettä, jonka pintajännitys esimerkiksi 23 oC:ssa on 72,3 mN/m. Menetelmä on nopeampi kuin painokalibrointi, mutta siihen liittyy vaara veden pintajännitysarvon vääristymisestä pinta-aktiivisten epäpuhtauksien vaikutuksesta. Kalibrointikerroin (Фb), jolla instrumentin kaikki lukemat on kerrottava, määritetään yhtälön (2) mukaisesti: Φb=σoσg (2) jossa σo lähdekirjallisuudesta saatu veden pintajännityksen arvo (mN/m) og veden pintajännityksen mitattu arvo (mN/m) molemmat samassa lämpötilassa.
1.6.4.3 Näytteiden valmistelu Näytteistä valmistetaan vaadittavan pitoiset vesiliuokset, jotka eivät saa sisältää liukenemattomia aineita. Liuosten lämpötila on pidettävä vakiona (±0,5 oC). Koska mittausastiassa olevan liuoksen pintajännitys muuttuu ajan kuluessa, on tehtävä useita mittauksia eri ajankohtina ja tuloksista on piirrettävä käyrä, joka ilmaisee pintajännityksen muuttumisen ajan funktiona. Kun muutoksia ei enää tapahdu, järjestelmä on saavuttanut tasapainon. Pölyt ja muiden aineiden kaasumaiset epäpuhtaudet häiritsevät mittauksia. Siksi mittaukset on suoritettava suojan alla.
1.6.5 Testiolosuhteet Mittaukset tehdään noin 20 oC:ssa. Lämpötila on säädettävä ±0,5 oC:n tarkkuudella.
1.6.6 Työjärjestys Näyteliuokset kaadetaan huolella puhdistettuun mittausastiaan välttäen tarkoin vaahdon muodostumista. Mittausastia asetetaan laitteen pöydälle. Pöytää mittausastioineen nostetaan, kunnes rengas on kokonaan näyteliuoksen pinnan alla. Tämän jälkeen pöytää lasketaan hitaasti ja tasaisesti (noin 0,5 cm minuutissa), niin että saavutetaan maksimivoima renkaan noustessa pintaan irtoamatta siitä ja pintaa yhdistävästä vesikerroksesta. Mittauksen jälkeen rengas lasketaan uudelleen pinnan alle ja mittauksia toistetaan, kunnes pintajännitysarvo ei enää muutu. Jokaisen mittauksen yhteydessä rekisteröidään aika, joka on kulunut näyteliuoksen kaatamisesta mittausastiaan. Mittaustulokseksi valitaan maksimivoima, joka tarvitaan nostamaan rengas nesteen pinnan yläpuolelle.
2. Taulukko Mitatun pintajännityksen korjaaminen Vain vesiliuoksille, joiden tiheys on noin 1 g/cm3
TIEDOT Yksikkönä mN/m saadut mittaustulokset kerrotaan ensin kalibrointikertoimella Φa tai Φb (käytetyn kalibrointimenetelmän mukaan). Näin saadaan kuitenkin vain likiarvo, jota on vielä korjattava. Harkins ja Jordan (4) ovat määritelleet empiirisesti korjauskertoimia rengasmenetelmällä mitatuille arvoille renkaan mittojen, nesteen tiheyden ja pintajännityksen mukaan. Koska korjauskertoimen määritys Harkinsin ja Jordanin taulukosta jokaista yksittäistä mittausta varten on työlästä, voidaan vesiliuosten pintajännityksen laskemista varten käyttää yksinkertaistettua menetelmää, jossa korjatut pintajännitysarvot luetaan suoraan taulukosta. (Väliarvoja varten käytetään interpolointia.) R = 9,55 mm (renkaan säteen keskiarvo) r = 0,185 mm (renkaan langan säde) Kokeellinen arvo (mN/m) Korjattu arvo (mN/m) Painokalibroint (katso 1.6.4.2.2 i (a)) Vesikalibrointi (katso 1.6.4.2.2 (b)) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Taulukko perustuu Harkinsin-Jordanin korjaukseen. Taulukko vastaa vettä ja vesiliuoksia käsittelevän DIN-standardin (DIN 53914) taulukkoa (tiheys = 1 g/cm3). Se on tarkoitettu mittauksiin, joissa käytetään kaupallista rengasta, jonka mitat ovat R = 9,55 mm (renkaan säteen keskiarvo) ja r = 0,185 mm (renkaan langan säde). Taulukossa on pintajännitysmittauksien korjatut arvot, jotka tehdään paino- tai vesikalibroinnin jälkeen. Vaihtoehtoisesti pintajännitys, joka on mitattu ilman ensin tehtyä kalibrointia, voidaan laskea seuraavan suureyhtälön mukaan: σ=fxF4πR jossa F dynamometrin mittaama voima kalvon murtuessa R renkaan säde f korjauskerroin (1)
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TESTIRAPORTTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
käytetty menetelmä,
käytetyn veden tai liuoksen tyyppi,
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet),
mittaustulokset: pintajännitys (lukema); ilmoitetaan sekä yksilölliset lukemat aritmeettisine keskiarvoineen että korjattu keskiarvo (laitekerroin ja korjaustaulukko huomioon ottaen),
liuoksen pitoisuus,
testilämpötila,
liuoksen ikä; erityisesti aika liuoksen valmistelusta mittaushetkeen,
selvitys liuoksen pintajännityksen verrannollisuudesta aikaan siitä hetkestä lähtien, jolloin liuos on siirretty mittausastiaan,
kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta.
3.2 TULOSTEN TULKINTA Koska tislatun veden pintajännitys on 20 oC:ssa 72,75 mN/m, aineet, joiden pintajännitys on alle 60 mN/m kuvatun menetelmän kaltaisissa olosuhteissa, on katsottava pinta-aktiivisiksi aineiksi.
4.(1)(2)(3)(4)
VIITTEET OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of organic chemistry, Chapter XIV, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Interscience Publ. New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. Harkins, W. D., Jordan, H. E, J. Amer. Chem. Soe, 1930, vol. 52, 1751.
A.6 VESILIUKOISUUS
A.6
1. MENETELMÄ Tässä kuvatut menetelmät perustuvat OECD:n testiohjeeseen (1).
1.
1.1 JOHDANTO On suositeltavaa selvittää ensin tutkittavan aineen rakennekaava, dissosiaatiovakio ja hydrolysoituminen (pH:n funktiona). Yksittäistä, koko vesiliukoisuusalueen kattavaa menetelmää ei ole. Seuraavat kaksi testimenetelmää kattavat yhdessä koko liukoisuusalueen, mutta niitä ei voi soveltaa haihtuviin aineisiin:
Ensimmäistä menetelmää voidaan soveltaa huomattavan puhtaisiin aineisiin, joiden liukoisuus on alhainen (< 10-2 grammaa litraa kohti) ja jotka ovat stabiileja vedessä. Menetelmää kutsutaan jäljempänä kolonnieluutiomenetelmäksi.
Toista menetelmää voidaan soveltaa huomattavan puhtaisiin aineisiin, joiden liukoisuus on suuri (> 10-2 grammaa litraa kohti) ja jotka ovat stabiileja vedessä. Menetelmää kutsutaan jäljempänä pullomenetelmäksi.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Määritelmän mukaan aineen vesiliukoisuus on sen kyllästyspitoisuus vedessä määrätyssä lämpötilassa. Vesiliukoisuus ilmoitetaan massayksikkönä liuostilavuutta kohti. SI-yksikkö on kg/m3 (myös yksikköä g/l voidaan käyttää).
1.3 VERTAILUAINEET Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Vertailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla saatuihin tuloksiin.
1.4 TESTIMENETELMIEN PERIAATTEET Yksinkertaisen alustavan testin avulla selvitetään näytteen likimääräinen määrä ja kyllästyspitoisuuden saavuttamiseksi tarvittava aika.
1.4
1.4.1 Kolonnieluutiomenetelmä Menetelmä perustuu veden avulla suoritettavaan näytteen eluutioon mikrokolonnista, jossa on inerttiä, runsaalla määrällä näytettä päällystettyä kantaja-ainetta, esimerkiksi lasihelmiä tai hiekkaa. Vesiliukoisuus voidaan määrittää, kun eluaatin massapitoisuus on vakio (vakiotila näkyy pitoisuus-aika-käyrässä tasanteena).
1.4.2 Pullomenetelmä Näyte (kiinteät aineet on jauhettava) liuotetaan veteen lämpötilassa, joka on hieman testilämpötilan yläpuolella. Kun kyllästyminen saavutetaan, seos jäähdytetään, ja sitä pidetään sen jälkeen testilämpötilassa. Seosta ravistellaan tässä lämpötilassa, kunnes nestejärjestelmä saavuttaa tasapainon. Vaihtoehtoisesti mittaus voidaan suorittaa suoraan testilämpötilassa, edellyttäen, että kyllästymistasapaino varmistetaan soveltuvalla näytteenotolla. Tämän jälkeen määritetään aineen massapitoisuus sopivalla analyyttisellä menetelmällä. Määritys tehdään vesiliuoksessa, joka ei saa sisältää liukenemattomia hiukkasia.
1.5 LAATUKRITEERIT
1.5
1.5.1 Toistettavuus Kolonnieluutiomenetelmällä voidaan saavuttaa arvo < 30 %. Pullomenetelmällä tulisi saavuttaa arvo < 15 %.
1.5.2 Herkkyys Herkkyys vaihtelee analyysimenetelmän mukaan, mutta massapitoisuuksia voidaan määrittää arvoon 10-6 g/l asti.
1.6 MENETELMIEN KUVAUKSET
1.6
1.6.1 Testiolosuhteet Testi on mieluiten tehtävä lämpötilassa 20 ±0,5 oC. Jos epäillään, että vesiliukoisuus vaihtelee lämpötilan mukaan, (> 3 % astetta kohti), on käytettävä kahta ylimääräistä lämpötilaa vähintään 10 oC ensin valitun lämpötilan ylä- ja alapuolella. Tässä tapauksessa lämpötilansäädön on toimittava ±0,1 oC:n tarkkuudella. Valittua lämpötilaa on pidettävä yllä laitteen kaikissa tärkeissä osissa.
1.6.2 Alustava testi Noin 0,1 g näytettä (kiinteät aineet on ensin jauhettava) pannaan lasilla suljettuun, 10 ml:n asteikolla varustettuun sylinteriin. Sylinteriin lisätään huoneenlämpöistä tislattua vettä seuraavan taulukon mukaan: 0,1 g liukenee x ml:aan vettä 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Likimääräinen liukoisuus (g/l) > 1000 1000–2000 200–100 100–50 50–10 10–1 < 1 Jokaisen taulukon mukaisen vedenlisäyksen jälkeen seosta ravistetaan voimakkaasti 10 minuuttia ja tarkistetaan silmämääräisesti, ettei liuokseen ole jäänyt liukenemattomia hiukkasia. Jos näyte tai sen osa jää liukenematta 10 ml:n vedenlisäyksen jälkeen, koe on toistettava 100 ml:n sylinterissä aiempaa suuremmalla vesimäärällä. Huonosti liukenevien aineiden kohdalla liukenemisaika voi olla huomattavasti pitempi (on käytettävä vähintään 24 tuntia). Likimääräinen liukoisuus ilmenee taulukosta sen vesimäärän alta, jonka lisäyksen jälkeen näyte on täysin liuennut. Jos näyte edelleen vaikuttaa liukenemattomalta, odotetaan enemmän kuin 24 tuntia (enintään 96 tuntia), tai liuosta laimennetaan edelleen, jotta voitaisiin päättää, käytetäänkö kolonnieluutio- vai pullomenetelmää.
1.6.3 Kolonnieluutiomenetelmä
1.6.3
1.6.3.1 Kantaja-aine, liuotin ja eluentti Kolonnieluutiota varten on valittava inertti kantaja-aine, esimerkiksi lasihelmet tai hiekka. Näyte kaadetaan kantaja-aineelle sopivaan, analyyttisen puhtaaseen haihtuvaan liuottimeen liuotettuna. Eluenttina käytetään lasi- tai kvartsilaitteessa kahdesti tislattua vettä. Huomautus: Suoraan orgaanisesta ioninvaihtimesta otettua vettä ei pidä käyttää.
1.6.3.2 Kantaja-aineen lisääminen Noin 600 mg kantaja-ainetta punnitaan ja siirretään 50 ml:n pyörökolviin. Sopiva, punnittu määrä näytettä liuotetaan valittuun liuottimeen. Kantaja-aine täytetään sopivalla määrällä tätä liuosta. Liuottimen on haihduttava täysin, esimerkiksi pyörivässä haihduttimessa, muutoin kantaja-aine ei kyllästy vedellä kantaja-aineen pinnalla tapahtuvien jakaantumisilmiöiden takia. Kantaja-aineen täyttö saattaa aiheuttaa ongelmia (vääriä tuloksia), jos näyte lisätään öljynä tai erilaisena kristallifaasina. Ongelmaa on tutkittava kokeellisesti ja yksityiskohdat on raportoitava. Täytön jälkeen kantaja-ainetta pidetään noin 5 ml:ssa vettä kahden tunnin ajan, minkä jälkeen suspensio kaadetaan mikrokolonniin. Vaihtoehtoisesti voidaan kaataa kuivaa, täytettyä kantaja-ainetta vedellä täytettyyn mikrokolonniin ja jättää se tasapainottumaan kahden tunnin ajaksi.
1.6.3.2 Testi:
Näytteen eluointi kantaja-aineesta voidaan tehdä kahdella eri tavalla:
kiertopumpun avulla (kuva 1),
tasausastian avulla (kuva 4).
1.6.3.3 Kolonnieluutiomenetelmä ja kiertopumppu
1.6.3.3 Laite
Kuvassa 1 esitetään tyypillisen järjestelmän periaatteellinen järjestely. Kuvassa 2 on sopiva mikrokolonni, mutta koko voidaan valita vapaasti, edellyttäen, että laite täyttää toistettavuus- ja herkkyysvaatimukset. Kolonnin ylätilaan on mahduttava vähintään viisi tilavuutta vettä, ja kolonniin on mahduttava vähintään viisi näytettä. Vaihtoehtoisesti kokoa voidaan pienentää, jos liuotinta lisäämällä voidaan korvata ensimmäiset viisi epäpuhtauksien poistoon tarkoitettua tilavuutta. Kolonni kytketään kiertopumppuun, joka pystyy säätämään virtauksia, joiden nopeus on noin 25 ml tunnissa. Pumppuliitännät ovat polytetrafluorietyleeniä (PTFE:tä) tai lasia. Asennetussa kolonni-pumppujärjestelmässä pitää olla mahdollisuus näytteenottoon ulos virtaavasta nesteestä ja mahdollisuus ylätilan paineen tasaamiseen ilmanpaineen suhteen. Kolonniainetta tukee pieni (5 mm:n) lasivillatulppa, joka samalla suodattaa pois hiukkasia. Kiertopumppu voi olla esimerkiksi peristaltiikkapumppu tai kalvopumppu (on huolehdittava siitä, ettei putken materiaali aiheuta saastumista tai adsorptiota).
Mittauksen tekeminen
Käynnistetään virtaus kolonnin läpi. Suositeltava virtausnopeus on noin 25 ml tunnissa (vastaa 10 tilavuutta tunnissa kuvatun kolonnin kohdalla). Vesiliukoiset epäpuhtaudet poistetaan hylkäämällä vähintään ensimmäiset viisi tilavuutta. Tämän jälkeen kiertopumppu saa käydä, kunnes tasapaino on saavutettu. Tasapainotila voidaan todeta saavutetuksi, kun viiden peräkkäin otetun näytteen pitoisuudet vaihtelevat enintään ± 30 % satunnaisella tavalla. Näytteenottovälin on vastattava vähintään eluentin kymmenen tilavuuden läpivirtausta.
1.6.3.4 Kolonnieluutiomenetelmä ja tasausastia
1.6.3.4 Laite (katso kuvia 4 ja 3)
Tasausastia: Liitokset tasausastiaan toteutetaan lasihioksella, joka on yhdistetty PTFE-putkeen. Suositeltava virtausnopeus on 25 ml tunnissa. Peräkkäiset eluaattifraktiot kerätään ja analysoidaan valitun menetelmän mukaan.
Mittauksen tekeminen
Vesiliukoisuuden määritykseen käytetään vähintään viisi peräkkäin otettua fraktiota eluaatin keskialueelta, jossa pitoisuudet pysyvät vakiona (± 30 %). Molemmissa tapauksissa (kiertopumppu- tai tasausastiajärjestelmä) on tehtävä toinen ajo, jossa virtausnopeus on puolet ensimmäisen ajon virtausnopeudesta. Jos molempien ajojen tulokset ovat yhtenevät, testin katsotaan olevan tyydyttävä. Jos alempi virtausnopeus antaa suuremman liukoisuuden, virtausnopeuden puolittamista on jatkettava, kunnes saadaan kaksi peräkkäistä, saman liukoisuuden antavaa ajoa. Molemmissa tapauksissa (kiertopumppu- tai tasausastiajärjestelmä) fraktioista on etsittävä kolloideja Tyndall-ilmiön (valon sironta) avulla. Kolloidien esiintyminen mitätöi tulokset, ja tällöin testi on toistettava kolonnin suodatustehon parantumisen jälkeen. Jokaisen näytteen pH on kirjattava, Toinen ajo on tehtävä samassa lämpötilassa.
1.6.4 Pullomenetelmä
1.6.4
1.6.4.1 Laite Pullomenetelmää varten tarvitaan seuraavat osat:
laboratoriolaseja ja –instrumentteja,
laite, jolla liuoksia voidaan ravistaa säädetyissä vakiolämpötiloissa,
sentrifugi (mieluiten termostaatilla varustettu), jos sellainen tarvitaan emulsion käsittelyyn,
laitteet analyyttisia määrityksiä varten.
1.6.4.2 Mittausten tekeminen Alustavan testin avulla saadaan tieto halutun vesimäärän kyllästämiseen tarvittavasta ainemäärästä. Tarvittava vesimäärä vaihtelee analyyttisen menetelmän ja liukoisuusalueen mukaan. Noin viisinkertainen määrä ainetta punnitaan kolmeen eri lasitulpalla varustettuun lasiastiaan (esimerkiksi sentrifugiputkiin tai pulloihin). Valittu vesimäärä lisätään astioihin, jotka suljetaan tiiviisti. Suljettuja astioita ravistetaan 30 oC:ssa. (Tarkoitukseen käytetään ravistus- tai sekoitustapaa, jossa voidaan pitää yllä vakiolämpötilaa, esimerkiksi magneettisekoitusta termostaatilla varustetussa vesihauteessa.) Vuorokauden kuluttua yksi astioista poistetaan, ja astian sisältö tasapainotetaan uudelleen 24 tunnin aikana testilämpötilassa astiaa ajoittain ravistamalla. Astian sisältö lingotaan testilämpötilassa ja näytteen pitoisuus määritetään kirkkaasta vesifaasista sopivan analyyttisen menetelmän mukaisesti. Toista jäljellä olevaa astiaa käsitellään ensimmäisen 30 oC:ssä tapahtuneen tasapainotuksen jälkeen samalla tavoin kaksi vuorokautta ja toista astiaa kolme vuorokautta. Jos pitoisuustulokset vähintään kahdesta viimeisestä astiasta täyttävät toistettavuusvaatimukset, testi hyväksytään. Jos astioista 1, 2 ja 3 saadut tulokset osoittavat nousevaa suuntausta, koko testi on toistettava pidempiä tasapainotusaikoja käyttäen. Mittaus voidaan myös toteuttaa ilman 30 oC:ssa tapahtuvaa esi-inkubaatiota. Kyllästystasapainon saavuttamisnopeutta voidaan arvioida jatkamalla näytteidenottoa, kunnes sekoitusaika ei enää vaikuta liuoksen pitoisuuteen. Jokaisen näytteen pH on kirjattava.
1.6.5 Analyysi Näitä määrityksiä varten suositellaan ainekohtaista analyyttista menetelmää, koska pienet määrät liukoisia epäpuhtauksia voivat aiheuttaa suuria virheitä mitatussa liukoisuudessa. Esimerkkejä tällaisista menetelmistä ovat kaasu- tai nestekromatografia, titrausmenetelmät, fotometriset menetelmät ja kulometriset menetelmät.
2. TIEDOT
2.
2.1 KOLONNIELUUTIOMENETELMÄ Jokaista ajoa kohti on laskettava vähintään viiden peräkkäisen kyllästysalueelta otetun näytteen keskiarvo ja näytteiden keskihajonta. Tulokset ilmoitetaan massayksikköinä liuostilavuutta kohti. Verrataan keskenään kahden eri virtauksilla tehdyn testin keskiarvoja. Toistettavuuden on oltava pienempi kuin 30 %.
2.2 PULLOMENETELMÄ Jokaisen yksittäisen pullon yksittäinen tulos ilmoitetaan, ja vakiona pidettävistä tuloksista (toistettavuus alle 15 %) lasketaan keskiarvo. Näin saatu tulos ilmoitetaan massayksikköinä liuostilavuutta kohti. Tämä saattaa edellyttää massayksiköiden muuntamista tilavuusyksiköiksi. Tällöin käytetään tiheyttä, jossa liukoisuus on hyvin suuri (> 100 g/l).
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 KOLONNIELUUTIOMENETELMÄ Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
alustavan testin tulokset,
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet),
jokaisen näytteen pitoisuus, virtausnopeus ja pH,
jokaisen ajon vähintään viiden kyllästysalueelta otetun näytteen keskiarvot ja keskihajonnat,
kahden peräkkäisen hyväksyttävän ajon keskiarvo,
veden lämpötila kyllästysprosessin aikana,
käytetty analyysimenetelmä,
käytetyn kantaja-aineen luonne,
kantaja-aineen täyttö,
käytetty liuotin,
näytteet aineen mahdollisesta kemiallisesta epästabiliteetista testin ja menetelmän suorittamisen aikana,
kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulosten tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta.
3.2 PULLOMENETELMÄ Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
alustavan testin tulokset,
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet),
yksittäiset analyyttiset määritykset sekä keskiarvo, jos jokaista pulloa kohti on määritetty useampia arvoja,
jokaisen näytteen pH,
keskiarvo niistä eri astioista, joiden tulokset olivat yhteneviä,
testilämpötila,
käytetty analyyttinen menetelmä,
todisteet aineen mahdollisesta kemiallisesta epästabiliteetista testin ja menetelmän suorittamisen aikana,
kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta.
4.(1)(2)(3) VIITTEET OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NFT 20-045 (AFNOR) (Sept. 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method
A.8 JAKAANTUMISKERROIN
A.8
1. MENETELMÄ Tässä kuvattu ravistuspullomenetelmä perustuu OECD:n testiohjeeseen (1).
1.
1.1 JOHDANTO On suositeltavaa selvittää ensin tutkittavan aineen rakennekaava, dissosiaatiovakio, vesiliukoisuus, hydrolysoituminen, n-oktanoliliukoisuus ja pintajännitys. Mitattaessa ionisoituvia aineita on aina käytettävä aineiden ionisoitumatonta muotoa (vapaata happoa tai vapaata emästä), joka on saatu sellaisen sopivan puskurin avulla, jonka pH on vähintään yhden pH-yksikön pK-arvoa pienempi (vapaa happo) tai suurempi (vapaa emäs). Testi voidaan tehdä kahdella eri menetelmällä: ravistuspullomenetelmällä tai HPLC-nestekromatografialla. Ensimmäistä menetelmää voidaan soveltaa, kun Pow-arvo (katso jäljempänä olevaa määritelmää) on - 2...4, ja toista menetelmää arvon ollessa 0...6. Alustavan kokeen avulla saadaan arvio näytteen jakaantumiskertoimesta, minkä jälkeen valitaan sopiva menetelmä. Ravistuspullomenetelmää voidaan soveltaa vain huomattavan puhtaiden, vesi- ja n-oktanoliliukoisten aineiden testaukseen. Menetelmää ei voida soveltaa pinta-aktiivisten aineiden testaukseen (näiden kohdalla on esitettävä laskettu arvo tai arvio, joka perustuu yksittäisiin vesi- ja n-oktanoliliukoisuuksiin). HPLC-menetelmää ei voida soveltaa vahvojen happojen ja emästen, metallikompleksien, pinta-aktiivisten aineiden tai eluentin kanssa reagoivien aineiden testaukseen. Näiden aineiden kohdalla on esitettävä laskettu arvo tai arvio, joka perustuu yksittäisiin vesi- ja n-oktanoliliukoisuuksiin. HPLC-menetelmä ei ole yhtä herkkä näytteessä oleville epäpuhtauksille kuin ravistuspullomenetelmä. Kuitenkin epäpuhtaudet voivat joissakin tapauksissa vaikeuttaa tulosten tulkintaa, koska kärkien kohdentaminen on tällöin epävarmaa. Jos seoksen testauksessa saadaan määrittämätön kaista, on ilmoitettava log P:n ylä- ja alaraja.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Määritelmän mukaan jakaantumiskerroin (P) on liuotetun aineen tasapainopitoisuuksien (ci) välinen suhde kaksifaasijärjestelmässä, jossa on kaksi toisiinsa heikosti sekoittuvaa liuotinta: pow=Cn-oktanoliCvesi Jakaantumiskerroin (P) on siis kahden pitoisuuden välinen suhde, ja se ilmoitetaan normaalisti kymmenkantaisena logaritmina (log P).
1.3 VERTAILUAINEET
1.3 Ravistuspullomenetelmä
Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Vertailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla saatuihin tuloksiin.
HPLC-menetelmä
Aineen HPLC-mittaustulosten ja yhdisteen P-arvon välinen vastaavuus saadaan kalibrointikäyrästä, jossa log P esitetään kromatografisten tietojen funktiona. Kalibrointikäyrän kromatografisten tietojen on katettava vähintään 6 vertailupistettä. Käyttäjä valitsee sopivat vertailuaineet. Mahdollisuuksien mukaan on valittava vähintään yksi vertailuaine, jonka Pow-arvo on pienempi kuin näytteen Pow-arvo, ja yksi vertailuaine, jonka Pow-arvo on suurempi. Kun log P -arvo on pienempi kuin 4, kalibrointi voi perustua ravistuspullomenetelmällä saatuihin tuloksiin. Kun log P -arvo on suurempi kuin 4, kalibrointi voi perustua validoituihin, lähdekirjallisuudesta saatuihin arvoihin, jotka ovat yhteneviä laskettujen arvojen kanssa. Tarkkuutta voidaan parantaa käyttämällä vertailuaineita, joiden rakenne muistuttaa näytteen rakennetta. Lähdekirjallisuudessa on laajat luettelot monen kemikaaliryhmän log Pow -arvoista (2), (3). Jos näytteen kanssa samankaltaisen rakenteen omaavien yhdisteiden tietoja ei ole käytettävissä, voidaan käyttää yleisempää kalibrointia, joka perustuu muihin vertailuaineisiin. Liitteessä 2 on luettelo suositeltavista vertailuaineista ja niiden Pow-arvoista.
1.4 MENETELMIEN PERIAATTEET
1.4
1.4.1 Ravistuspullomenetelmä Jakaantumiskertoimen määritystä varten järjestelmän kaikkien keskinäisessä vuorovaikutuksessa olevien osien on saavutettava tasapaino, minkä jälkeen määritetään järjestelmän kahteen faasiin liuotetun aineen pitoisuudet. Lähdekirjallisuudessa esitetään useita tekniikoita, joiden avulla molemmat faasit voidaan sekoittaa huolella ja joiden avulla niistä voidaan määrittää näytteen tasapainopitoisuudet kummassakin faasissa faasien erotuksen jälkeen.
1.4.2 HPLC-menetelmä HPLC tapahtuu analyyttisessa kolonnissa, joka on täytetty kaupallisesti saatavana olevalla, pitkiä hiilivetyketjuja (esimerkiksi C8, C18) sisältävällä kiinteällä faasilla, joka on kemiallisesti sidottu piidioksidiin. Kolonniin ruiskutetut kemikaalit liikkuvat eri nopeuksilla sen mukaan, mikä on niiden jakaantumiskerroin liikkuvan faasin ja kiinteän hiilivetyfaasin välillä. Kemikaaliseokset eluoituvat hydrofobisuuden perusteella siten, että vesiliukoiset kemikaalit eluoituvat ensin ja öljyliukoiset viimeisenä suhteessa niiden hiilivety-vesi-jakaantumiskertoimeen. Näin voidaan määrittää vastafaasikolonnin retention ja n-oktanoli-vesi-jakaantumiskertoimen välinen suhde. Jakaantumiskerroin voidaan laskea käyttökertoimen k perusteella seuraavasti: k=tR-toto jossa tR = näytteen retentio ja t0 = liuotinmolekyylin keskimääräinen läpäisyaika (viive). Kvantitatiivisia analyyttisia menetelmiä ei tarvita. Eluointiaikojen määritys riittää.
1.5 LAATUKRITEERIT
1.5
1.5.1 Toistettavuus
1.5.1 Ravistuspullomenetelmä
Jakaantumiskertoimen tarkkuus varmistetaan tekemällä kolme määritystä eri testiolosuhteissa, joissa näytteen määrä ja liuotintilavuuksien suhde voivat vaihdella. Saadut jakaantumiskertoimen arvot saavat vaihdella enintään ±0,3 logaritmiyksikköä kymmenkantaisina logaritmeina ilmaistuna.
HPLC-menetelmä
Mittaustulokset varmistetaan tekemällä kaksi määritystä. Yksittäisten mittausten perusteella saadut log P -arvot saavat vaihdella enintään ±0,1 logaritmiyksikköä.
1.5.2 Herkkyys
1.5.2 Ravistuspullomenetelmä
Menetelmän mittausalue määräytyy analyyttisen menetelmän havaintorajojen mukaan. Yleensä log Pow -arvoja voidaan määrittää alueella - 2...4 (määrätyissä olosuhteissa jopa arvoon log Pow = 5 asti), kun liuenneen aineen pitoisuus kummassakin faasissa on enintään 0,01 moolia litrassa.
HPLC-menetelmä
HPCL-menetelmällä voidaan laskea jakaantumiskerroin Pow-alueella 0–6. Yleensä yhdisteen jakaantumiskertoimeksi voidaan arvioida ± 1 logaritmista yksikköä ravistuspullomenetelmän arvosta. Tyypillisiä korrelaatioita löytyy lähdekirjallisuudesta (4), (5), (6), (7), (8). Yleensä on mahdollista saada tarkempia tuloksia, kun korrelaatiopisteet on saatu rakenteellisesti samankaltaisten vertailuyhdisteiden tiedoista (9).
1.5.3 Spesifisyys
1.5.3 Ravistuspullomenetelmä
Nernstin jakaantumislakia voidaan laimennettujen liuosten kohdalla soveltaa vain vakiolämpötilassa, vakiopaineessa ja vakio-pH:ssa. Suoraan sovellettuna laki koskee vain puhtaita aineita, jotka jakautuvat kahden puhtaan liuottimen välillä. Jos toisessa tai molemmissa faaseissa on samanaikaisesti useita erilaisia liuoksia, tämä saattaa vaikuttaa tuloksiin. Liuotettujen molekyylien assosiaatiosta tai dissosiaatiosta seuraa poikkeamia Nernstin jakaantumislaista. Tällaiset poikkeamat voidaan osoittaa sillä, että jakaantumiskerroin vaihtelee liuoksen pitoisuuden mukaan. Koska tasapainoja on useita, testimenetelmää ei pidä soveltaa ionisoituviin yhdisteisiin ilman korjausta. Tällaisten yhdisteiden kohdalla on harkittava veden korvaamista puskuriliuoksilla, ja puskurin pH:n tulisi poiketa vähintään yhden pH-yksikön verran aineen pKa-arvosta. Lisäksi on otettava huomioon valitun pH:n sovellettavuus kyseiseen ympäristöön.
1.6 MENETELMÄKUVAUS
1.6
1.6.1 Jakaantumiskertoimen alustava arviointi Alustavaan arviointiin tulisi mieluiten käyttää laskentamenetelmää (katso liitettä 1). Määrätyissä tapauksissa arviointiin voidaan käyttää myös näytteen liukoisuutta puhtaisiin liuottimiin (10).
1.6.2 Ravistuspullomenetelmä
1.6.2
1.6.2.1 Valmistelutoimet n-oktanoli: Jakaantumiskertoimen määritykseen käytetään analyyttisen puhdasta reagenssia. Vesi: Tarkoitukseen käytetään lasi- tai kvartsilaitteessa tislattua tai kaksoistislattua vettä. Ionisoituvien aineiden kohdalla on tarpeen mukaan käytettävä puskuriliuoksia veden sijasta. Huomautus: Suoraan ioninvaihtimesta otettua vettä ei pidä käyttää.
1.6.2.1
1.6.2.1.1 Liuottimien esikyllästys Ennen jakaantumiskertoimen määritystä molemmat liuotinjärjestelmän faasit kyllästetään ravistamalla testilämpötilassa. Käytännöllinen toteutustapa on käyttää kahta suurta, analyyttisen puhtaalla n-oktanolilla tai vedellä täytettyä varastopulloa, joissa on tarpeellinen määrä toista liuotinta, pitää pulloja vuorokauden ajan mekaanisessa ravistimessa ja antaa tämän jälkeen pullojen levätä, kunnes faasit erottuvat ja kyllästyspiste saavutetaan.
1.6.2.1.2 Testin valmistelutoimet Kaksifaasijärjestelmän on täytettävä testausastia lähes kokonaan. Näin voidaan pienentää haihtumisesta aiheutuvaa ainehukkaa. Aineen tilavuussuhde ja määrät määräytyvät seuraavien tekijöiden mukaan: Tehdään kolme testiä. Ensimmäisessä käytetään laskettua n-oktanolin ja veden tilavuussuhdetta, toisessa suhde puolitetaan ja kolmannessa se kerrotaan kahdella (esimerkiksi 1:1, 1:2, 2:1).
jakaantumiskertoimen alustava määritys (katso edellä),
pienin määrä näytettä, joka tarvitaan analyyttistä menetelmää varten,
rajoitus, jonka mukaan pitoisuus ei saa ylittää 0,01 moolia litrassa kummassakaan faasissa.
1.6.2.1.3 Näyte Valmistetaan varastoliuos esikyllästämällä n-oktanolia vedellä. Varastoliuoksen pitoisuus määritetään tarkasti juuri ennen liuoksen käyttöä jakaantumiskertoimen määritykseen. Liuosta on pidettävä olosuhteissa, joissa sen stabiliteetti voidaan taata.
1.6.2.2 Testiolosuhteet Lämpötila on pidettävä vakiona (± 1 oC) alueella 20–25 oC.
1.6.2.3 Mittauksen suorittaminen
1.6.2.3
1.6.2.3.1 Jakaantumistasapainon luominen Jokaista testiolosuhdetta varten valmistetaan kaksi testausastiaa, joissa on tarkasti mitatut määrät kumpaakin liuotinta ja tarpeellinen määrä varastoliuosta. Mitataan n-oktanolifaasit tilavuuden mukaan. Testausastiat pannaan sopivaan ravistuslaitteeseen tai niitä ravistetaan käsin. Jos käytössä on sentrifugiputki, suositellaan sen kääntämistä nopeasti poikittaisakselillaan 180 astetta, jolloin mahdollisesti loukkuun jäänyt ilma nousee molempien faasien läpi. Käytäntö on osoittanut, että 50 tällaisella käännöllä voidaan saavuttaa jakaantumistasapaino. Varmuuden vuoksi suositellaan kuitenkin 100:aa kääntöä viidessä minuutissa.
1.6.2.3.2 Faasierotus Tarvittaessa faasien erotukseen on käytettävä sentrifugointia. Tämä tehdään laboratoriosentrifugissa huoneenlämmössä. Jos sentrifugissa ei ole termostaattia, sentrifugiputket on pidettävä testilämpötilassa vähintään yhden tunnin ajan ennen analyysia.
1.6.2.4 Analyysi Jakaantumiskertoimen määritystä varten on määritettävä näytteen pitoisuus kummassakin faasissa. Tämä voidaan toteuttaa ottamalla alikvootti kumpaakin faasia kummastakin putkesta testiolosuhdetta kohti ja analysoimalla otokset valitulla menetelmällä. Aineen kokonaismäärä kummassakin faasissa lasketaan ja arvoja verrataan alun perin lisättyyn määrään. Näytteenotto vesifaasista on tehtävä menetelmällä, joka minimoi n-oktanolin mukaanpääsyn riskin. Poistettavalla neulalla varustettu lasiruisku on hyvä vaihtoehto. Näytteenottoa varten ruisku täytetään osittain ilmalla, joka työnnetään varovasti ulos vietäessä ruisku n-oktanolikerroksen läpi. Tämän jälkeen ruiskuun vedetään sopiva määrä vesifaasia. Ruisku poistetaan nopeasti liuoksesta ja neula irrotetaan. Ruiskun sisältöä voidaan tämän jälkeen käyttää vesinäytteenä. Aineen pitoisuus kummassakin erotetussa faasissa määritetään mieluiten ainekohtaisella menetelmällä. Sopivia analyyttisiä menetelmiä ovat esimerkiksi
fotometriset menetelmät,
kaasukromatografia,
nestekromatografia (HPLC).
1.6.3 HPLC-menetelmä
1.6.3
1.6.3.1 Valmistelutoimet
1.6.3.1 Laite
Menetelmää varten tarvitaan sykkimättömällä pumpulla ja sopivalla ilmaisulaitteella varustettu nestekromatografi, jossa tulisi olla suihkusilmukoilla varustettu suihkuventtiili. Kiinteässä faasissa olevat polaariset ryhmät saattavat vakavasti häiritä HPCL-kolonnin tehokkuutta, minkä vuoksi polaaristen ryhmien määrä kiinteissä faaseissa (1) on minimoitava. Menetelmässä voidaan käyttää kaupallisesti saatavana olevia mikrohiukkas-vastafaasipakkauksia tai valmiiksi pakattuja kolonneja. Ruiskutusjärjestelmän ja analyyttisen kolonnin välissä voidaan pitää suojakolonnia.
Liikkuva faasi
Eluutioliuotin valmistetaan HPLC-laatuisesta metanolista ja HPLC-laatuisesta vedestä. Liuottimelle tehdään kaasunpoisto ennen käyttöä. On käytettävä isokraattista eluutiota. Metanoli-vesiseoksessa on oltava vähintään 25 % vettä. Yleensä seos, jossa on metanolia ja vettä tilavuussuhteessa 3:1, on tyydyttävä log P 6 -yhdisteiden eluoimiseksi yhdessä tunnissa, kun virtausnopeus on 1 ml/min. Jos yhdisteiden log P -arvo on suuri, saattaa olla tarpeen lyhentää eluointiaikaa (myös vertailuaineiden kohdalla) vähentämällä liikkuvan faasin polaarisuutta tai kolonnin pituutta. Aineilla, jotka liukenevat n-oktanoliin hyvin heikosti, on yleensä poikkeavan alhainen HPLC-menetelmällä saatu log Pow -arvo. Joskus tällaisten yhdisteiden tuottamat kärjet eivät ylitä liuottimen tasoa. Syynä on todennäköisesti se, että jakaantumisprosessi on liian hidas, eikä tasapaino ehdi asettua HPLC-erotteluun normaalisti käytetyssä ajassa. Tulosten luotettavuutta voidaan yleensä parantaa pienentämällä virtausnopeutta tai metanolin ja veden välistä suhdetta. Näytteiden ja vertailuaineiden liukoisuuden liikkuvaan faasiin on oltava tarpeeksi suuri niiden havaitsemista varten. Vain poikkeustapauksissa voidaan käyttää lisäaineita metanoli-vesiseoksen yhteydessä, koska lisäaineet muuttavat kolonnin ominaisuuksia. Jos käytetään lisäaineita kromatogrammin tuottamiseen, on ehdottomasti käytettävä erillistä, samantyyppistä kolonnia. Jos metanoli-vesiseos ei sovellu tarkoitukseen, voidaan käyttää muita orgaanisen liuottimen ja veden seoksia, esimerkiksi etanoli-vesi- tai asetonitriili-vesiseosta. Ionisoivien yhdisteiden osalta eluentin pH on kriittinen. Sen on oltava kolonnin pH-alueella, yleensä 2-8. Puskurointia suositellaan. On varottava suolan saostumista ja kolonnin huononemista, mitä voi tapahtua eräiden orgaanisten faasi-puskuriseosten yhteydessä. HPLC-mittauksia, joissa piidioksidipohjaisen kiinteän faasin pH on yli 8, ei suositella, koska emäksinen liikkuva faasi voi aiheuttaa kolonnin suorituskyvyn nopeaa huononemista.
Liuokset
Vertailuaineiden on oltava mahdollisimman puhtaita. Testi- ja kalibrointitarkoituksiin käytettävät yhdisteet liuotetaan liikkuvaan faasiin mahdollisuuksien mukaan.
Testiolosuhteet
Mittausten aikana lämpötila saa vaihdella enintään ± 2 K.
1.6.3.2 Mittaukset
1.6.3.2 Viiveen to laskeminen
Viive to voidaan määrittää käyttämällä homologista sarjaa (esimerkiksi n-alkyylimetyyliketoneja) tai kolonnin läpi pidättymättä kulkevia orgaanisia yhdisteitä (esimerkiksi tiokarbamidia tai formamidia). Ensimmäistä vaihtoehtoa käytettäessä kolonniin ruiskutetaan vähintään seitsenosainen homologinen sarja ja vastaavat retentiot määritetään. Suoraan saadut retentiot tr(nc+1) piirretään ajan tr(nc) funktiona, ja regressioyhtälön tr(nc+1)= a + b t r(nc) poikkeama ja kaltevuus b määritetään (nc = hiiliatomien määrä). Viive to saadaan tämän jälkeen seuraavasta yhtälöstä: to=a/(l - b)
Kalibrointikäyrä
Seuraavaksi laaditaan korrelaatiokäyrä, joka esittää soveltuvien vertailuaineiden log k -arvot log P -arvojen funktiona. Tätä varten ruiskutetaan samanaikaisesti sarja, jossa on 5–10 vakiovertailuainetta, joiden log P kattaa odotetun alueen. Retentiot on suositeltavaa määrittää ilmaisinjärjestelmään kytketyllä tallentavalla integraattorilla. Käyttökertoimen k vastaavat logaritmit lasketaan ja merkitään käyrään ravistuspullomenetelmällä saatujen log P -arvojen funktiona. Kalibrointi tehdään määrätyin välein, vähintään kerran päivässä, jotta kolonnin suorituskyvyn mahdolliset muutokset voidaan havaita.
Näytteen käyttökertoimen määritys
Näytettä ruiskutetaan mahdollisimman pieneen määrään liikkuvaa faasia. Retentio määritetään kaksi kertaa. Tuloksen perusteella voidaan laskea käyttökerroin k. Näytteen jakaantumiskerroin voidaan interpoloida vertailuaineiden korrelaatiokäyrästä. Jos jakaantumiskerroin on hyvin pieni tai hyvin suuri, on käytettävä ekstrapolointia. Tällöin on erityisesti otettava huomioon regressiosuoran luottamusrajat.
2. TIEDOT
2. Ravistuspullomenetelmä
Määritettyjen log P -arvojen luotettavuus voidaan tarkistaa vertaamalla kaksoismääritysten keskiarvoa kokonaiskeskiarvoon.
3. RAPORTOINTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet),
jos menetelmiä ei voida soveltaa (esimerkiksi aineen pinta-aktiivisuuden vuoksi), laskettu arvo tai arvio, joka perustuu yksittäisiin n-oktanoli- tai vesiliukoisuuksiin,
kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta.
alustavan arvioinnin tulos (jos sellainen on tehty),
määrityslämpötila,
tiedot pitoisuuden määritykseen käytetyistä analyyttisista menetelmistä,
sentrifugointiaika ja -nopeus (jos sentrifugointia on käytetty),
kummastakin faasista mitatut pitoisuudet (eli raportoidaan yhteensä 12 pitoisuutta) jokaista määritystä kohti,
näytteen paino, yksittäisten testausastioiden faasien tilavuudet ja näytteen laskettu kokonaismäärä jokaisessa faasissa tasapainon saavuttamisen jälkeen,
jakaantumiskertoimen (P) lasketut arvot, keskiarvo ja kaikkien määritysten keskiarvo jokaista testiolosuhdetta kohti. Jos on havaittu merkkejä jakaantumiskertoimen vaihtelusta pitoisuuden mukaan, tästä on oltava maininta raportissa,
yksittäisten P-arvojen keskihajonta keskiarvon suhteen,
kaikkien määritysten P-keskiarvo ilmoitetaan kymmenkantaisena logaritmilukuna,
laskettu teoreettinen Pow kun tällainen on määritetty tai kun mittausten perusteella saatu arvo on > 104,
käytetyn veden ja vesifaasin pH,
jos on käytetty puskureita veden sijasta, on ilmoitettava syy, puskureiden kokoonpano, pitoisuus ja pH sekä vesifaasin pH ennen testiä ja sen jälkeen.
alustavan arvioinnin tulos (jos sellainen on tehty),
näytteet ja vertailuaineet sekä niiden puhtausaste,
määritysten lämpötila-alue,
pH, jossa määritykset on tehty,
analyyttisen kolonnin, suojakolonnin, liikkuvan faasin ja ilmaisumenetelmän tiedot,
retentiotiedot ja lähdekirjallisuudesta saadut, kalibroinnissa käytettyjen vertailuaineiden log P -arvot,
regressiosuoran tiedot (log k:n riippuvuus log P:stä),
retentiotietojen keskiarvo ja näytteen interpoloitu log P -arvo,
laitteen ja käyttöolosuhteiden kuvaus,
eluointiprofillit,
kolonniin pantujen näytteiden ja vertailuaineiden määrät,
viiveet ja niiden mittaustavat.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
VIITTEET OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A. J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Dundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sei., 1981, vol. 12, 219 (1981). B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. W. E. Hammers et al, J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. J. E. Haky and A. M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed Mat. Res., 1981, vol. 15, 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339. R. F. Rekker and H. M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for Industrial use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method. C. V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev, 1971, vol. 71, 525. C. Hansch, A. Leo, S. H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani and E. J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207. W. B. Neely, D. R. Branson and G. E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113. D. S. Brown and E. W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. J. K. Seydel and K. J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984. Y. C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978. N. S. Nirrlees, S. J. Noulton, C. T. Murphy, P. J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.
A.9 LEIMAHDUSPISTE
A.9
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO On suositeltavaa selvittää tutkittavan aineen syttyvyys ennen testauksen aloittamista. Testimenetelmää voidaan soveltaa nestemäisiin aineisiin, joiden höyryt ovat sytytettävissä sytytyslähteen avulla. Tässä luetellut testimenetelmät ovat luotettavia vain menetelmien yhteydessä mainituilla leimahduspistealueilla. Menetelmän valinnassa on otettava huomioon mahdolliset kemialliset reaktiot tutkittavan aineen ja näytteenpitimen välillä.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Leimahduspiste on alin lämpötila, korjattuna 101,325 kPa:n paineeseen, jossa neste testimenetelmässä kuvatuissa olosuhteissa muodostaa niin paljon höyryä, että testausastiassa muodostuu syttyvä höyryn ja ilman seos. Yksiköt: oC t = T - 273,15 (t annetaan Celsius-asteina ja T kelvineinä)
1.3 VERTAILUAINEET Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Vertailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla saatuihin tuloksiin.
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE Näyte pannaan testausastiaan ja se kuumennetaan tai jäähdytetään testilämpötilaan testimenetelmän ohjeiden mukaan. Tämän jälkeen selvitetään syttymiskokeiden avulla, leimahtaako näyte testilämpötilassa vai ei.
1.5 LAATUKRITEERIT
1.5
1.5.1 Toistettavuus Toistettavuus vaihtelee leimahduspistealueen ja testimenetelmän mukaan. Maksimiarvo on 2 oC.
1.5.2 Herkkyys Herkkyys vaihtelee testimenetelmän mukaan.
1.5.3 Spesifisyys Joidenkin testimenetelmien spesifisyys rajoittuu määrättyyn leimahduspistealueeseen ja vaihtelee aineen ominaisuuksien (esimerkiksi viskositeetin) mukaan.
1.6 MENETELMÄKUVAUS
1.6
1.6.1 Valmistelutoimet Näyte asetetaan laitteeseen kohdan 1.6.3.1 tai 1.6.3.2. mukaan. Turvallisuussyistä suositellaan, että voimakkaasti reagoivien tai myrkyllisten aineiden kohdalla valitaan menetelmä, jossa näyte on pieni, noin 2 cm3.
1.6.2 Testiolosuhteet Turvallisuusmääräysten mukaan laite on pidettävä paikassa, jossa ei ole vetoa.
1.6.3 Työjärjestys
1.6.3
1.6.3.1 Tasapainomenetelmä Katso seuraavia standardeja: ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.
1.6.3.2 Tasapainottomuusmenetelmä
1.6.3.2 Abelin laite:
Katso seuraavia standardeja: BS 2000 osa 170, NF M07.011, NF T66-009.
Abel-Penskyn laite:
Katso seuraavia standardeja: EN 57, DIN 51755 osa 1 (lämpötila-alue 5-65 oC), DIN 51755 osa 2 (lämpötilat alle 5 oC), NF M07-036.
Tagin laite:
Katso standardia ASTM D 56.
Pensky- Martensin laite:
Katso seuraavia standardeja: ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.
Huomautuksia:
Jos kohdan 1.6.3.2 mukaisen tasapainottomuusmenetelmän tuloksena saadaan leimahduspiste, joka on 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC tai 55 ± 2 oC, tulos on vahvistettava tasapainomenetelmän avulla samaa laitetta käyttäen. Ilmoituskelpoisia ovat vain sellaiset menetelmät, joilla saadaan leimahduspisteen lämpötila. Nesteiden, jotka sisältävät liuotinta ja joiden viskositeetti on suuri (esimerkiksi maalien ja kumien) leimahduspisteen määritykseen saa käyttää ainoastaan laitteita ja testimenetelmiä, jotka soveltuvat suuren viskositeetin omaavien nesteiden leimahduspisteen määritykseen. Katso seuraavia standardeja: ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 osa 1.
2. TIEDOT
3. RAPORTOINTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot ja epäpuhtaudet),
käytetty menetelmä ja mahdolliset poikkeamat,
kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kannalta.
4. VIITTEET Viitteitä ei ole.
A.10 SYTITVYYS (KIINTEÄT AINEET)
A.10
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO On suositeltavaa selvittää tutkittavan aineen mahdolliset räjähtävät ominaisuudet ennen testiä. Testimenetelmää tulee soveltaa vain jauhemaisiin, rakeisiin tai pastamaisiin aineisiin. Koska ei ole käytännöllistä testata kaikkia syttyviä aineita, vaan vain sellaisia, jotka palavat nopeasti tai joiden palamisominaisuudet ovat joltakin osalta erityisen vaaralliset, herkästi syttyväksi aineeksi luokitellaan vain sellaiset, joiden palamisnopeus ylittää määrätyn raja-arvon. Hehku, joka etenee metallijauheessa, voi olla erityisen vaarallinen palon sammutusvaikeuksien vuoksi. Metallijauheita on pidettävä herkästi syttyvinä, jos hehku etenee niissä massan läpi määrätyssä ajassa.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Palamisaika sekunteina.
1.3 VERTAILUAINEET Vertailuaineita ei ole määritetty.
1.4 MENETELMÄN PERIAATE Aine muotoillaan yhteneväksi nauhaksi tai jauhelinjaksi, jonka pituus on noin 250 mm. Alustavan seulontatestin avulla määritetään, eteneekö kyteminen tai liekki, kun aine sytytetään kaasuliekillä. Jos liekki tai kyteminen etenee yli 200 mm annetun ajan kuluessa, aineen palamisnopeus määritetään kattavan testiohjelman avulla.
1.5 LAATUKRITEERIT Laatukriteerejä ei ole määritetty.
1.6 MENETELMÄKUVAUS
1.6
1.6.1 Alustava seulontatesti Aine muotoillaan yhteneväksi nauhaksi tai jauhelinjaksi, jonka pituus on noin 250 mm, leveys 20 mm ja korkeus 10 mm, palamattomalle, ei-huokoiselle ja heikosti lämpöä johtavalle alustalle. Kaasupolttimen kuumaa liekkiä (vähimmäishalkaisija 5 mm) pidetään jauhelinjan toisessa päässä, kunnes jauhe syttyy tai enintään 2 minuuttia (5 minuuttia metallien ja metalliseosten kohdalla). Seurataan, eteneekö palaminen 200 mm linjaa pitkin 4 minuutin testijakson aikana (40 minuuttia metallijauheiden kohdalla). Jos aine ei syty eikä liekki tai kyteminen etene 200 mm:ä 4 minuutin testijakson aikana (40 minuuttia metallijauheiden kohdalla), ainetta ei pidetä herkästi syttyvänä, eikä lisätestausta tarvita. Jos aineen palaminen etenee jauhelinjaa pitkin 200 mm alle 4 minuutissa (tai alle 40 minuutissa metallijauheiden kohdalla), testausta on jatkettava jäljempänä kuvatun menetelmän mukaan (jatka kohdasta 1.6.2).
1.6.2 Palamisnopeuden testaus
1.6.2
1.6.2.1 Valmistelutoimet Jauhemaista tai rakeista ainetta pannaan kevyelti 250 mm pitkään muottiin, jonka kolmionmuotoisen läpileikkauksen sisäkorkeus on 10 mm ja leveys 20 mm. Muotin pituussuunnassa on molemmille sivuille kiinnitetty kaksi metallilevyä siten, että levyjen yläreuna on 2 mm muotin reunan yläpuolella (katso kuvaa). Muotti pudotetaan kolme kertaa 2 cm:n korkeudelta kiinteälle pinnalle. Tarvittaessa ainetta lisätään muottiin. Tämän jälkeen sivulevyt poistetaan ja ylimääräinen aines kaavitaan pois. Muotille asetetaan palamaton, ei-huokoisesta ja heikosti lämpöä johtavasta aineesta valmistettu aluslevy, laite käännetään ja muotti poistetaan. Pastamaiset aineet levitetään nauhana, jonka pituus on 250 mm ja läpileikkaus noin 1 cm2, palamattomalle, ei-huokoiselle ja lämpöä heikosti johtavalle alustalle.
1.6.2.2 Testiolosuhteet Jos aine on herkkä kosteudelle, testi on tehtävä mahdollisimman pian aineen säilöstä ottamisen jälkeen.
1.6.2.3 Työjärjestys Aseta näyte vetokaappiin. Veto on säädettävä sellaiseksi, ettei laboratoriotiloihin pääse savua. Vedon voimakkuus ei saa vaihdella testin aikana. Laitteen ympärille pystytetään suojaseinä vetoa vastaan. Näytenauha sytytetään toisesta päästä kaasupolttimen kuumalla liekillä, jonka halkaisija on vähintään 5 mm. Kun palaminen on edennyt 80 mm:n verran, mitataan palamisnopeus seuraavalla 100 mm:n osuudella. Testi tehdään kuusi kertaa käyttäen aina puhdasta ja kylmää alustaa, ellei positiivista tulosta saavuteta aiemmin.
2. TIEDOT Arvioinnissa käytetään alustavasta seulontatestistä saatua palamisaikaa (1.6.1) ja enintään kuudesta testistä saatua lyhyintä palamisaikaa (1.6.2.3).
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TESTIRAPORTTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet),
testattavan aineen kuvaus, sen fysikaalinen olomuoto ja kosteuspitoisuus,
tulokset alustavasta seulonta- ja palamisnopeustestistä, jos tällaiset on tehty,
kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kannalta.
3.2 TULOSTEN TULKINTA Jauhemaisia, rakeisia tai pastamaisia aineita pidetään herkästi syttyvinä, jos niiden palamisaika minkä tahansa kohdassa 1.6.2 kuvatun testin tuloksena on lyhyempi kuin 45 sekuntia. Metalli- tai metalliseosjauheita pidetään herkästi syttyvinä, jos ne voidaan sytyttää ja liekin tai reaktioalueen leviäminen koko näytteeseen kestää enintään kymmenen minuuttia.
4.(1) VIITTEET NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.
A.11 SYTTYVYYS (KAASUT)
A.11
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Tällä menetelmällä voidaan määrittää pitoisuusalueet, joilla ilma-kaasuseos syttyy huoneenlämpötilassa (noin 20 oC:ssa) ja normaalissa ilmanpaineessa. Tutkittavan kaasun ja ilman seoksia altistetaan kaasupitoisuuksia suurentaen sähkökipinälle ja tarkkaillaan, syttyykö seos vai ei.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Syttyvyysalue on alimman ja ylimmän räjähdysrajan välinen pitoisuusalue. Alin ja ylin räjähdysraja ovat ne syttyvän kaasun ja ilman seoksen pitoisuudet, joissa ei synny leimahdusta.
1.3 VERTAILUAINEET Vertailuaineita ei ole määritetty.
1.4 MENETELMÄN PERIAATE Ilman kaasupitoisuutta suurennetaan asteittain ja jokaisen vaiheen pitoisuuden seos altistetaan sähkökipinälle.
1.5 LAATUKRITEERIT Laatukriteerejä ei ole määritetty.
1.6 MENETELMÄKUVAUS
1.6
1.6.1 Laite Testausastia on pystysuora lasisylinteri, jonka sisähalkaisija on vähintään 50 mm ja korkeus vähintään 300 mm. Sytytyselektrodit sijaitsevat 3–5 mm:n etäisyydellä toisistaan ja 60 mm:n korkeudella sylinterin pohjasta. Sylinterissä on paineentasausaukko. Laitteen ympärillä on oltava suoja mahdollisten räjähdysvahinkojen estämiseksi. Kipinälähteenä käytetään 0,5 sekunnin induktiokipinää, joka saadaan korkeajännitemuuntajasta, jonka lähtöjännite on 10-15 kV (tehontarve enintään 300 W). Esimerkki soveltuvasta laitteesta on viitteessä (2).
1.6.2 Testiolosuhteet Testi tehdään huoneenlämpötilassa (noin 20 oC:ssa).
1.6.3 Työjärjestys Lasisylinteriin pumpataan annostuspumpulla kaasu-ilmaseosta, jonka pitoisuus tunnetaan. Seoksen läpi johdetaan kipinä ja liekin mahdollista irtaantumista kipinälähteestä sekä sen itsenäistä etenemistä tarkkaillaan. Kaasupitoisuutta muutetaan yhden tilavuusprosentin askelin, kunnes syttyminen tapahtuu edellä kuvatulla tavalla. Jos kaasun kemiallisen rakenteen perusteella voidaan olettaa, että kaasu ei ole syttyvää, ja kaasun ja ilman seoksen stökiometrimen koostumus voidaan testata 1 %:n askelin, tarvitsee testata vain seokset, joiden pitoisuus on enintään 10 % suurempi tai pienempi kuin tämä koostumus.
2. TIEDOT Määrityksen ainoa merkitsevä tieto on liekin eteneminen.
3. RAPORTOINTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot ja epäpuhtaudet),
käytetyn laitteen kuvaus mittatietoineen,
testilämpötila,
testatut pitoisuudet ja saadut tulokset,
testin tulos: syttyvä kaasu tai herkästi syttyvä kaasu,
jos kaasu todetaan syttymättömäksi, on ilmoitettava, millä pitoisuusalueella kaasua on testattu 1 %:n askelin,
kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kannalta.
4.(1)(2) VIITTEET NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W. Berthold, D. Conrad, T, Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, 126–127.
A.12 SYTTYVYYS (KOSKETUS VEDEN KANSSA)
A.12
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Tällä testimenetelmällä voidaan määrittää, kehittääkö testattava aine veden tai kostean ilman kanssa kosketuksiin joutuessaan vaarallisia määriä kaasua tai kaasuja, jotka voivat olla herkästi syttyviä. Testimenetelmää voidaan soveltaa sekä kiinteisiin että nestemäisiin aineisiin. Menetelmää ei voi soveltaa aineisiin, jotka syttyvät itsestään joutuessaan kosketuksiin ilman kanssa.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Herkästi syttyviä ovat aineet, jotka veden tai kostean ilman kanssa kosketuksiin joutuessaan muodostavat vaarallisia määriä herkästi syttyviä kaasuja miniminopeudella 1 l/kg/h.
1.3 MENETELMÄN PERIAATE Ainetta testataan jäljempänä kuvatun vaiheittaisen sarjan mukaan. Jos syttymistä esiintyy, sarjaa ei tarvitse jatkaa. Jos tiedetään, että aine ei reagoi voimakkaasti veden kanssa, voidaan edetä vaiheeseen 4 (1.3.4).
1.3
1.3.1 Vaihe 1 Näyte pannaan kaukaloon, jossa on 20-celsiusasteista tislattua vettä. Todetaan, syttyykö muodostunut kaasu vai ei.
1.3.2 Vaihe 2 Näyte pannaan suodatinpaperille, joka kelluu 20-celsiusasteisen tislatun veden pinnalla sopivassa astiassa. Todetaan, syttyykö muodostunut kaasu vai ei. Suodatinpaperia tarvitaan vain pitämään näyte koossa mahdollisen syttymisen helpottamiseksi.
1.3.3 Vaihe 3 Näyte muotoillaan keoksi, jonka korkeus on noin 2 cm ja läpimitta noin 3 cm. Keolle kaadetaan muutama tippa vettä, ja todetaan, syttyykö muodostunut kaasu vai ei.
1.3.4 Vaihe 4 Näytettä sekoitetaan 20-celsiusasteiseen tislattuun veteen ja kaasun muodostumisnopeus mitataan tunnin välein seitsemän tunnin ajan. Jos muodostumisnopeus on epäsäännöllinen tai kasvava seitsemän tunnin jälkeen, mittausaika voidaan pidentää enintään viideksi päiväksi. Testi voidaan keskeyttää, jos nopeus missä tahansa vaiheessa ylittää arvon 1 l/kg/h.
1.4 VERTAILUAINEET Vertailuaineita ei ole määritetty.
1.5 LAATUKRITEERIT Laatukriteerejä ei ole määritetty.
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET
1.6
1.6.1 Vaihe 1
1.6.1
1.6.1.1 Testiolosuhteet Testi tehdään huoneenlämmössä (noin 20 oC:ssa).
1.6.1.2 Työjärjestys Pieni määrä näytettä, jonka läpimitta on noin 2 mm, pannaan tislattua vettä sisältävään kaukaloon. Todetaan, (i) muodostuuko kaasua ja (ii) syttyykö kaasu. Jos kaasu syttyy, testiä ei tarvitse jatkaa, koska aine luokitellaan tällöin vaaralliseksi.
1.6.2 Vaihe 2
1.6.2
1.6.2.1 Laite Sopivassa astiassa, esimerkiksi 100 ml:n haihdutusastiassa, pidetään 20-celsiusasteista tislattua vettä. Veden pinnalla kelluu suodatinpaperi.
1.6.2.2 Testiolosuhteet Testi tehdään huoneenlämmössä (noin 20 oC:ssa).
1.6.2.3 Työjärjestys Pieni määrä näytettä (läpimitta noin 2 mm) asetetaan suodatinpaperin keskelle. Todetaan, (i) muodostuuko kaasua ja (ii) syttyykö kaasu. Jos kaasu syttyy, testausta ei tarvitse jatkaa, koska aine luokitellaan tällöin vaaralliseksi.
1.6.3 Vaihe 3
1.6.3
1.6.3.1 Testiolosuhteet Testi tehdään huoneenlämmössä (noin 20 oC:ssa).
1.6.3.2 Työjärjestys Näyte muotoillaan keoksi, jonka korkeus on noin 2 cm ja läpimitta noin 3 cm. Keon huipulle tehdään kuoppa, johon kaadetaan muutama tippa vettä. Todetaan, (i) muodostuuko kaasua ja (ii) syttyykö kaasu. Jos kaasu syttyy, testausta ei tarvitse jatkaa, koska aine luokitellaan tällöin vaaralliseksi.
1.6.4 Vaihe 4
1.6.4
1.6.4.1 Laite Laite rakennetaan kuvan mukaisesti.
1.6.4.2 Testiolosuhteet Katsotaan, onko näytesäiliössä jauhetta (hiukkaskoko < 500 μm). Jos tällaisen jauheen paino-osuus ylittää 1 % tai jos näyte on murenevaa, koko näyte on jauhettava ennen testausta, jotta hiukkaskoko olisi pienempi varastoinnin ja käsittelyn aikana. Muuten näytettä testataan vastaanotetussa muodossa. Testi tehdään huoneenlämmössä (noin 20 °C:ssa) ja yhden ilmakehän paineessa.
1.6.4.3 Työjärjestys Laitteen tiputussuppiloon kaadetaan 10–20 ml vettä ja erlenmeyerpulloon pannaan 10 g näytettä. Muodostuneen kaasun tilavuus voidaan mitata millä tahansa sopivalla menetelmällä. Tiputussuppilon hana avataan ja samalla käynnistetään sekuntikello. Kaasunmuodostus mitataan kerran tunnissa seitsemän tunnin ajan. Jos muodostumisnopeus on epäsäännöllinen tai kasvava seitsemän tunnin jälkeen, mittausaikaa voidaan pidentää enintään viideksi päiväksi. Testi voidaan keskeyttää, jos nopeus ylittää arvon 1 l/kg/h missä tahansa vaiheessa. Testi tehdään kolme kertaa. Jos kaasun kemiallista koostumusta ei tunneta, kaasu on analysoitava. Jos kaasu sisältää herkästi syttyviä osia eikä tiedetä, onko koko seos herkästi syttyvä, on valmistettava koostumukseltaan samanlainen seos, joka testataan menetelmän A. 11 mukaisesti.
2. TIEDOT Aine katsotaan vaaralliseksi, jos:
se syttyy itsestään testin jossakin vaiheessa, tai
jos syttyvää kaasua muodostuu nopeudella, joka ylittää arvon 1 l/kg/h.
3. RAPORTOINTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet),
selvitys mahdollisista aineen valmistelutoimista,
testitulokset (vaiheet 1, 2, 3 ja 4),
muodostuneen kaasun kemiallinen koostumus,
kaasun muodostumisnopeus, jos vaihe 4 suoritetaan (1.6.4),
kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kannalta.
4.(1)(2) VIITTEET Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
A.13 KIINTEIDEN AINEIDEN JA NESTEIDEN ITSESYTTYVYYS
A.13
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Testimenetelmää voidaan soveltaa kiinteisiin ja nestemäisiin aineisiin, jotka pieninä määrinä syttyvät itsestään nopeasti jouduttuaan kosketuksiin huoneenlämpöisen (20 oC) ilman kanssa. Testimenetelmä ei kata aineita, jotka syttyvät vain siinä tapauksessa, että niitä pidetään huoneenlämpöisessä ilmassa useita tunteja tai päiviä tai jos lämpötilaa korotetaan.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Aine luokitellaan itsestään syttyväksi, jos se syttyy tai aiheuttaa hiiltymistä kohdassa 1.6 kuvatuissa olosuhteissa. Nesteiden itsesyttyvyyden testauksessa voidaan myös tarvita menetelmää A.15 Itsesyttymislämpötila (nesteet ja kaasut).
1.3 VERTAILUAINEET Vertailuaineita ei ole määritetty.
1.4 MENETELMÄN PERIAATE Näyte (kiinteä tai nestemäinen) pannaan inertille alustalle ja saatetaan kosketuksiin huoneenlämpöisen ilman kanssa viideksi minuutiksi. Jos neste ei syty tässä ajassa, se imeytetään suodatinpaperiin ja pannaan huoneenlämpöiseen (20 oC) ilmaan viideksi minuutiksi. Jos kiinteä aine tai neste syttyy tai jos neste sytyttää suodatinpaperin tai aiheuttaa sen hiiltymisen, aine luokitellaan itsestään syttyväksi.
1.5 LAATUKRITEERIT Toistettavuus: koska itsesyttyvyysominaisuus on tärkeä turvallisuustekijä, yksi positiivinen tulos riittää aineen luokittelemiseksi itsestään syttyväksi.
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET
1.6
1.6.1 Laite Posliinikuppiin, jonka läpimitta on noin 10 cm, pannaan noin 5 mm:n kerros huoneenlämpöistä (noin 20 oC) piimaata. Huomautus: Piimaa tai muu vastaava inertti, yleisesti saatavilla oleva aine katsotaan esimerkiksi aineesta, johon testattavaa ainetta voi kaataa vahingon sattuessa. Kuivaa suodatinpaperia tarvitaan sellaisten nesteiden testaukseen, jotka inertillä alustalla pidettyinä eivät syty joutuessaan ilman kanssa kosketuksiin.
1.6.2 Testin suorittaminen
1.6.2 a)
Jauhemaiset kiinteät aineet 1–2 cm3 testattavaa jauhetta kaadetaan noin 1 m:n korkeudelta palamattomalle alustalle. Samalla tarkkaillaan, syttyykö aine palamaan pudotessaan tai viiden minuutin kuluessa alustalle asettumisesta. Ellei syttymistä tapahdu, koe tehdään kuusi kertaa.
b)
Nesteet Noin 5 cm3 testattavaa nestettä kaadetaan preparoituun posliinikuppiin. Samalla tarkkaillaan, syttyykö neste viiden minuutin kuluessa. Ellei neste syty kuuden kokeen aikana, jatketaan seuraavilla kokeilla: 0,5 ml näytenestettä annostellaan ruiskusta suodatinpaperille. Samalla tarkkaillaan, syttyykö suodatinpaperi palamaan tai hiiltyykö se viiden minuutin kuluessa nesteen lisäyksen jälkeen. Ellei syttymistä tai hiiltymistä tapahdu, testi tehdään kolme kertaa.
2. TIEDOT
2.
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY Testi voidaan keskeyttää heti kun mistä tahansa testin osasta saadaan myönteinen tulos.
2.2 ARVIOINTI Jos aine syttyy viiden minuutin kuluessa siitä, kun sitä on pantu inertille alustalle ja saatettu kosketuksiin ilman kanssa, tai jos neste sytyttää suodatinpaperin tai aiheuttaa sen hiiltymisen viiden minuutin kuluessa, aine luokitellaan itsestään syttyväksi.
3. RAPORTOINTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot ja epäpuhtaudet),
testitulokset,
kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kannalta.
4.(1)(2) VIITTEET NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangereous Goods, Test and Criteria, 1990, United Nations, New York.
A.14 RÄJÄHTÄVYYS
A.14
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Menetelmä koostuu testiohjelmasta, jonka avulla voidaan määrittää, onko kiinteä tai pastamainen aine räjähdysaltis, kun se altistetaan liekille (lämpöherkkyys) tai iskulle tai kitkalle (mekaaninen herkkyys) ja onko neste räjähdysaltis, kun se altistetaan liekille tai iskulle. Menetelmä on kolmiosainen: Menetelmän avulla voidaan selvittää todennäköisyys sille, että aine räjähtää, kun se altistetaan määrätyille tavallisille ärsykkeille. Menetelmää ei ole tarkoitettu käytettäväksi sen selvittämiseen, voiko aine yleensä räjähtää. Menetelmällä voidaan määrittää, liittyykö aineeseen lämpöherkkyydestä ja mekaanisesta herkkyydestä aiheutuvaa räjähdysvaaraa direktiivin kuvaamissa erikoisolosuhteissa. Menetelmä perustuu joukkoon laitetyyppejä, joita käytetään yleisesti monissa maissa (1) ja joilla yleensä saadaan selkeitä tuloksia. Todettakoon, että menetelmä ei ole lopullinen. Myös muita laitteita voidaan käyttää, edellyttäen, että ne ovat kansainvälisesti tunnustettuja ja että tulokset ovat riittävän hyvin korreloitavissa. Testiä ei tarvitse suorittaa, jos käytettävissä olevien termodynaamisten tietojen (esimerkiksi muodostumis- tai hajoamislämmön) tai määrättyjen reaktiivisten ryhmien (2) rakennekaavasta puuttumisen perusteella avulla voidaan täysin varmasti osoittaa, että aine ei voi hajota nopeasti muodostaen kaasuja tai lämpöä, eikä siihen näin ollen liity minkäänlaista räjähdysvaaraa. Nesteiden kohdalla ei vaadita kitkaherkkyyden testausta.
1.1 a)
lämpöherkkyyden testaus (1);
b)
iskuherkkyyden testaus (1);
c)
kitkaherkkyyden testaus (1).
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Räjähtävä: Aineet, jotka voivat räjähtää liekin vaikutuksesta tai jotka ovat herkkiä iskulle tai kitkalle spesifioidussa laitteessa (tai ovat mekaanisesti herkempiä kuin 1,3-dinitrobentseeni vaihtoehtoisessa laitteessa).
1.3 VERTAILUAINEET 1,3-dinitrobentseeni, tekninen kiteinen tuote, joka on läpäissyt 0,5 mm:n seulan, käytetään kitka- ja iskumenetelmissä. Perhydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triatsiini (RDX, heksogeeni, sykloniini — CAS 121-82-4); uudelleenkiteytetty vesipitoisesta sykloheksanonista, märkäseulottu 250 mm:n tarkkuudella ja pidätetty 150 μm:n seulaan sekä kuivattu 130 ± 2 °C:ssa (4 tuntia) toista kitka- ja iskutestisarjaa varten.
1.4 MENETELMÄN PERIAATE On tarpeen tehdä alustavat testit, joiden avulla voidaan määrittää turvalliset olosuhteet kolmelle herkkyystestille.
1.4
1.4.1 Käsittelyturvallisuustestit (3) Ennen varsinaisen testin aloittamista on turvallisuussyistä altistettava hyvin pieniä näytemääriä (noin 10 mg) kuumentamiselle avoimessa kaasuliekissä tai vasaran ja alasimen tai sopivan kitkakoneen avulla aikaansaatavalle kitkalle. Tarkoituksena on selvittää, onko aineen herkkyys ja räjähtävyys sellaista luokkaa, että kuvatut herkkyystestit, etenkin lämpöherkkyyden kohdalla, on henkilövahinkojen välttämiseksi suoritettava erityistä varovaisuutta noudattaen.
1.4.2 Lämpöherkkyys Näytettä kuumennetaan teräsputkessa, joka on suljettu sopivalla reiällä varustetulla mittauslaipalla. Testin avulla selvitetään, onko aine räjähdysherkkä hyvin kuumissa olosuhteissa ja ahtaassa tilassa.
1.4.3 Mekaaninen herkkyys (isku) Näyte altistetaan iskulle pudottamalla sen päälle määrätty massa määrätyltä korkeudelta.
1.4.4 Mekaaninen herkkyys (kitka) Kiinteä tai pastamainen näyte altistetaan kitkalle vakiopintojen välillä käyttäen annettua kuormaa ja suhteellista liikettä.
1.5 LAATUKRITEERIT Laatukriteerejä ei ole määritelty.
1.6 MENETELMÄKUVAUS
1.6
1.6.1 Lämpöherkkyys (liekin vaikutus)
1.6.1
1.6.1.1 Laite Laitteessa on kuumennus- ja suojaosaan asennettu kertakäyttöinen teräsputki, jossa on uudelleen käytettävä suljinosa (kuva 1). Syvävedetystä teräslevystä (katso liitettä) valmistettujen putkien sisähalkaisija on 24 mm, pituus on 75 mm ja seinän paksuus 0,5 mm. Putken avoimessa päässä on laippaliitos mittauslaippaa varten. Paineenkestävä mittauslaippa kiinnitetään putkeen kaksiosaisella ruuviliitännällä (mutterilla ja kierrelaipalla). Mutteri ja kierrelaippa on valmistettu kromi-mangaaniteräksestä (katso liitettä), joka on kipinöimätöntä 800 oC:een asti. Lämmönkestävästä teräksestä valmistettujen, useilla eri reiänhalkaisijoilla varustettujen mittauslaippojen paksuus on 6 mm.
1.6.1.2 Testiolosuhteet Yleensä aine testataan sellaisenaan. Joissakin tapauksissa (esimerkiksi jos aine on puristetussa, valetussa tai muulla tavoin tiivistetyssä muodossa) aine on murskattava ennen testiä. Kiinteiden aineiden kussakin testauksessa käytettävä massa määritetään kaksivaiheisen kuiva-ajon avulla. Taarattuun putkeen pannaan 9 cm3 ainetta, joka sullotaan putkeen tämän koko poikkileikkauspinta-alaan kohdistuvalla 80 N:n voimalla. Turvallisuussyistä ja tapauksissa, joissa näytteen fyysinen muoto voi muuttua puristuksen vaikutuksesta, voidaan käyttää muuntyyppistä täyttömenetelmää (sullomista ei voi käyttää esimerkiksi hyvin kitkaherkkien aineiden kohdalla). Jos aine kestää puristamista, täyttöä ja sullomista jatketaan, kunnes aineen yläpinnan etäisyys putken reunasta on 55 mm. Määritetään kokonaismassa, joka on käytetty putken täyttämiseen 55 mm:iin asti, minkä jälkeen tehdään vielä kaksi lisäystä, kumpikin 80 N:n voimalla sulloen. Tämän jälkeen ainetta joko lisätään sulloen tai poistetaan niin paljon, että aineen yläpinta on 15 mm:n etäisyydellä putken reunasta. Tehdään toinen kuiva-ajo, joka aloitetaan sullotulla massalla, joka on kolmasosa ensimmäisen ajon kokonaismassasta. Kaksi tällaista määrää lisätään sulloen 80 N:n voimalla, ja aineen yläpinta säädetään ainetta lisäämällä tai poistamalla 15 mm:n tasolle putken yläpinnasta. Kussakin kokeessa käytetään toisessa ajossa määritettyä massaa; täyttö tehdään kolmella yhtä suurella määrällä, joista jokainen puristetaan 9 cm3:iin tarpeellista voimaa käyttäen (apuna voidaan käyttää välirenkaita). Nesteet ja geelit täytetään putkeen 60 mm:n korkeuteen. Täytössä on erityisesti varottava tyhjien kohtien muodostumista. Kierrelaippa ohjataan putkeen yläkautta, valittu mittauslaippa asetetaan paikoilleen, hieman molybdeeni-disulfidipohjaista voiteluainetta lisätään ja mutteri kiristetään. On tärkeää tarkistaa, että mitään aineista ei ole jäänyt laipan ja levyn väliin tai kierteisiin. Kuumennus tehdään propaanilla, joka otetaan kaasupullosta. Sylinterissä on oltava paineensäädin (60–70 mbar). Kaasun on kuljettava mittarin ja jakotukin kautta tasaisesti (virtauksen tasaisuus voidaan todeta pohtimien liekeistä) neljään polttimeen, Pohtimien sijoitus testauskammion ympärille ilmenee kuvasta 1. Polttimet kuluttavat yhteensä noin 3,2 litraa propaania minuutissa. Myös muita polttokaasuja tai muita polttimia voidaan käyttää, mutta kuumennusnopeuden on tällöin oltava sama kuin kuvassa 3. Kaikkien laitteiden kuumennusnopeus on tarkistettava säännöllisesti kuvasta 3 ilmenevällä tavalla dibutyyliftalaatilla täytettyjen putkien avulla.
1.6.1.3 Testin suorittaminen Jokaista testiä jatketaan, kunnes putki hajoaa tai kunnes sitä on kuumennettu viiden minuutin ajan. Jos testin tuloksena on putken hajoaminen vähintään kolmeen osaan, jotka joissakin tapauksissa voivat olla vielä kiinni toisissaan kapeilla metallikaistaleilla (katso kuvaa 2), aineen katsotaan räjähtäneen. Jos hajoamisosien määrä on pienempi tai jos hajoamista ei tapahdu, katsotaan, että räjähdystä ei ole tapahtunut. Ensin tehdään kolmen testin sarja, jossa mittauslaipan aukon halkaisija on 6,0 mm. Ellei räjähdystä tapahdu, tehdään toinen kolmen testin sarja, jossa mittauslaipan aukon halkaisija on 2,0 mm. Jos jommankumman sarjan tuloksena on räjähdys, testejä ei tarvitse jatkaa.
1.6.1.4 Arviointi Testitulos katsotaan positiiviseksi, jos jommankumman edellä kuvatun testisarjan aikana tapahtuu räjähdys.
1.6.2 Mekaaninen herkkyys (isku)
1.6.2
1.6.2.1 Laite (kuva 4) Tyypillisen vasaralaitteen tärkeimmät osat ovat teräsvalukappale alustoineen, alasin, pylväs, ohjaimet, pudotuspainot, irrotuslaite ja näytteenpidin. Teräsalasin (halkaisija 100 mm ja korkeus 70 mm) on kiinnitetty ruuveilla teräskappaleeseen (pituus 230 mm, leveys 250 mm ja korkeus 200 mm). Teräskappale on teräsvalualustalla (pituus 450 mm, leveys 450 mm ja korkeus 60 mm). Pylväs on tehty saumattomasta teräksestä vedetystä putkesta, ja se sijaitsee pitimessä, joka on kiinnitetty ruuveilla teräskappaleen taakse. Laite on ankkuroitu massiiviseen sementtikappaleeseen (60 x 60 x 60 cm) ruuveilla siten, että ohjainkiskot ovat ehdottomasti pystysuorassa ja pudotuspaino pääsee putoamaan vapaasti. Painot (5 kg ja 10 kg) on valmistettu umpiteräksestä. Kummankin painon pää on karkaistua terästä (HRC 60-63), iskuhalkaisijaltaan vähintään 25 mm. Näyte suljetaan iskulaitteeseen, jossa on kaksi päällekkäistä, konsentrista, umpiteräksistä sylinteriä, jotka sijaitsevat ontossa, sylinterinmuotoisessa teräsrenkaassa. Umpiterässylintereiden on oltava halkaisijaltaan 10 (-0,003, -0,005) mm ja korkeudeltaan 10 mm ja niissä on oltava kiillotettu pinta sekä pyöristetyt reunat (kaarevuussäde 0,5 mm). Sylintereiden kovuusarvon on oltava HRC 58-65. Onton sylinterin ulkohalkaisijan on oltava 16 mm, sisähalkaisijan 10 (+0,005, +0,10) mm (kiillotettu sisäpinta) ja korkeuden 13 mm. Iskulaite on asennettu teräksiseen välialasimeen (halkaisija 26 mm ja korkeus 26 mm), joka on keskitetty renkaan avulla. Renkaassa on reiät savunpoistoa varten.
1.6.2.2 Testiolosuhteet Näytettä käytetään 40 mm3 tai muu, vaihtoehtoiselle laitteelle sopiva määrä. Kiinteät aineet testataan kuivina ja valmistellaan seuraavasti; Aineet, jotka toimitetaan yleensä pastamuodossa, on mahdollisuuksien mukaan testattava kuivina tai vasta mahdollisimman täydellisen laimennusaineen poiston jälkeen. Nestemäisten aineiden testauksessa ylemmän ja alemman teräs sylinterin väliin on jätettävä 1 mm:n aukko.
1.6.2.2 a)
Jauhetut aineet seulotaan (seulakoko 0,5 mm). Kaikki seulan läpäissyt aines käytetään.
b)
Puristetut tai muulla tavoin tiivistetyt aineet murskataan ja seulotaan. Testissä käytetään seulontafraktiota 0,5–1 mm, jonka on edustettava alkuperäistä ainetta.
1.6.2.3 Testin suorittaminen Tehdään kuuden testin sarja pudottamalla 10 kg:n massa 0,40 m:n korkeudelta (40 J). Jos näiden testien aikana syntyy räjähdys, tehdään toinen kuuden testin sarja pudottamalla 5 kg:n massa 0,15 m:n korkeudelta (7,5 J). Jos käytetään muuntyyppistä laitetta, näytettä verrataan valittuun vertailuaineeseen käyttämällä hyväksyttyä menetelmää (esimerkiksi ylös-alas-tekniikkaa).
1.6.2.4 Arviointi Testitulos katsotaan positiiviseksi, jos räjähdys (liekkeihin leimahtaminen tai muu raportti katsotaan räjähdykseksi) tapahtuu vähintään kerran määritetyllä iskulaitteella suoritetussa testissä tai jos näyte on vaihtoehtoisessa iskutestissä herkempi kuin 1,3-dinitrobentseeni tai RDX.
1.6.3 Mekaaninen herkkyys (kitka)
1.6.3
1.6.3.1 Laite (kuva 5) Kitkalaitteen muodostavat valettu teräslaatta ja sille asennettu kitkayksikkö. Kitkayksikkö koostuu kiinteästä posliinitapista ja liikkuvasta posliinilaatasta, joka on kiinnitetty kahdessa ohjaimessa liikkuvaan vaunuun. Vaunu on kytketty sähkömoottoriin kytkentäsauvan, epäkeskoakselin ja sopivan vaihteiston kautta siten, että posliinilaatta liikkuu kerran edestakaisin 10 mm:n matkan posliinitapin alla. Posliinitappia voidaan kuormittaa esimerkiksi 120 tai 360 Newtonin voimalla. Litteät posliinilaatat on valmistettu valkoisesta teknisestä posliinista (karheus 9–32 μm). Laattojen mitat ovat 25 mm (pituus) x 25 mm (leveys) x 5 mm (korkeus). Myös sylinterinmuotoinen posliinitappi on valkoista teknistä posliinia, pituudeltaan 15 mm ja halkaisijaltaan 10 mm. Tapin pää on pyöreä ja karhennettu (kaarevuussäde 10 mm).
1.6.3.2 Testiolosuhteet Näytettä käytetään 10 mm3 tai jokin muu vaihtoehtoiseen laitteeseen sopiva määrä. Kiinteät aineet testataan kuivina ja valmistellaan seuraavasti: Aineet, jotka yleensä toimitetaan pastamuodossa, on mahdollisuuksien mukaan testattava kuivina. Jos ainetta ei voi valmistella kuivassa muodossaan, pasta (jolle tehdään ensin mahdollisimman täydellinen laimennusaineen poisto) muotoillaan kalvoksi, jonka paksuus on 0,5 mm, leveys 2 mm ja pituus 10 mm.
1.6.3.2 a)
Jauhetut aineet seulotaan (seulakoko 0,5 mm). Kaikki seulan läpäissyt aines käytetään.
b)
Puristetut tai muulla tavalla tiivistetyt aineet murskataan ja seulotaan, Testissä käytetään alle 0,5 mm:n seulontafraktiota.
1.6.3.3 Testin suorittaminen Posliinitappi asetetaan testattavan näytteen päälle ja kuormitus aktivoidaan. Testin aikana posiinilaatan karhennuksien on oltava poikittain liikkeen suuntaan nähden. On varmistettava, että tappi lepää näytteellä, että tarpeellinen määrä näyteainetta on tapin alla ja että laatta liikkuu oikealla tavoin tapin alla. Pastamaista ainetta pannaan laatalle käyttäen 2 × 10 mm:n uralla varustettua mittalevyä, jonka paksuus on 0,5 mm. Posliinilaatan on liikuttava posliinitapin alla 10 mm:n matka eteen ja taakse 0,44 sekunnissa. Laatan ja tapin pinnan osia saa käyttää vain kerran; kummankin tapin molempia päitä voidaan käyttää kahdessa testissä ja laatan kummankin pinnan pitää kestää kolme testiä. Tehdään kuuden testin sarja 360 N:n kuormalla. Jos näiden testien aikana saadaan positiivinen tulos, tehdään toinen kuuden testin sarja 120 N:n kuormalla. Jos käytetään muuntyyppistä laitetta, näytettä verrataan valittuun vertailuaineeseen hyväksyttyä menetelmää (esimerkiksi ylös-alas-tekniikkaa) käyttäen.
1.6.3.4 Arviointi Testin tulos katsotaan positiiviseksi, jos räjähdys (kuuluva rätinä, muu raportti tai leimahdus katsotaan räjähdykseksi) tapahtuu vähintään kerran määritetyllä kitkalaitteella suoritetuissa testeissä tai täyttää tätä vastaavan kriteerin vaihtoehtoisessa kitkatestissä.
2. TIEDOT Periaatteessa aine katsotaan räjähdysvaaralliseksi direktiivin tarkoittamassa mielessä, jos lämpöherkkyys-, iskuherkkyys- tai kitkaherkkyystestistä saadaan positiivinen tulos.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TESTIRAPORTTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot;
näyteaineen tunnistustiedot, koostumus, puhtaus, kosteuspitoisuus jne.,
aineen fyysinen muoto ja tiedot siitä, onko ainetta murskattu, rikottu tai seulottu,
havainnot lämpöherkkyystesteistä (esimerkiksi näytteen massa ja sirpaleiden määrä),
havainnot mekaanisista herkkyystesteistä (esimerkiksi huomattavan savumäärän muodostuminen tai raportoimaton täydellinen hajoaminen, liekit, kipinät, muu raportti ja rätinä),
jokaisen testityypin tulokset,
jos vaihtoehtoisia laitteita on käytetty, on esitettävä tieteellinen perustelu ja todisteet korrelaatiosta määritetyllä laitteella saatujen ja tätä vastaavalla laitteella saatujen tulosten välillä,
kaikki käyttökelpoiset kommentit, kuten tulosten tulkinnan kannalta varten tärkeät viitteet vastaavien tuotteiden testauksiin,
kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kannalta.
3.2 TULOSTEN TULKINTA JA ARVIOINTI Testiraportissa on mainittava kaikki tulokset, joita pidetään virheellisinä, epänormaaleina tai ei-edustavina. Jos jokin tulos hylätään, on annettava selitys ja esitettävä tulos vaihtoehtoisesta tai täydentävästä testistä. Ellei epänormaalia tulosta voida selittää, se on hyväksyttävä sellaisenaan ja sitä on käytettävä aineen luokitukseen tuloksen mukaan.
4.(1)(2)(3)(4)
VIITTEET Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and Criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L,. Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Buttervorths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K. H. and Swart, K. H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 and 30-42. NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of explosion risk.
A.15 ITSESYTTYMISLÄMPÖTILA (NESTEET JA KAASUT)
A.15
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Tätä testiä ei pidä käyttää räjähdysaineiden ja itsestään ilmassa tai huoneenlämmössä syttyvien aineiden kohdalla. Testiä voidaan soveltaa kaasuihin, nesteisiin tai höyryihin, jotka kosketuksissa ilmaan voivat syttyä kuuman pinnan vaikutuksesta. Itsesyttymislämpötila laskee huomattavasti katalyyttisten epäpuhtauksien, pinta-aineen tai testausastian suuremman tilavuuden vaikutuksesta.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Itsesyttyvyysaste ilmaistaan itsesyttymislämpötilana. Itsesyttymislämpötila on alhaisin lämpötila, jossa näyte syttyy, kun se sekoitetaan ilmaan testimenetelmän määrittelemissä olosuhteissa.
1.3 VERTAILUAINEET Vertailuaineet mainitaan standardeissa (katso kohtaa 1.6.3). Vertailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla saatuihin tuloksiin.
1.4 MENETELMÄN PERIAATE Menetelmällä määritetään suljetun astian sisäseinän alhaisin lämpötila, jossa astiaan ruiskutettu kaasu, höyry tai neste syttyy palamaan.
1.5 LAATUKRITEERIT Toistettavuus vaihtelee itsesyttymislämpötila-alueiden ja käytetyn testimenetelmän mukaan. Herkkyys ja spesifisyys vaihtelevat käytetyn testimenetelmän mukaan.
1.6 MENETELMÄKUVAUS
1.6
1.6.1 Laite Laite kuvataan kohdassa 1.6.3 mainituissa menetelmäkuvauksissa.
1.6.2 Testiolosuhteet Näyte aineesta testataan kohdassa 1.6.3 mainitun menetelmäkuvauksen mukaan.
1.6.3 Testin suorittaminen Katso standardeja IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.
2. TIEDOT Pidetään kirjaa testilämpötilasta, ilmanpaineesta, käytetystä näytemäärästä ja syttymiseen kuluvasta ajasta.
3. RAPORTOINTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
näyteaineen tarkat tiedot (tunnistustiedot ja epäpuhtaudet),
käytetty näytemäärä,
ilmanpaine,
käytetty laite,
testitulokset (testilämpötilat, syttymistulokset ja viiveet),
kaikki lisätiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kannalta.
4. VIITTEET Viitteitä ei ole.
A.16 KIINTEIDEN AINEIDEN SUHTEELLINEN ITSESYTTYMISLÄMPÖTILA
A.16
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Tätä testiä ei pidä käyttää räjähtävien aineiden ja itsestään ilmassa tai huoneenlämmössä syttyvien aineiden kohdalla. Testin avulla saadaan alustavaa tietoa kiinteiden aineiden itsesyttyvyydestä korkeissa lämpötiloissa. Jos lämmön vapautuminen ympäristöön aineen reagoidessa hapen kanssa tai sen hajotessa eksotermisesti ei tapahdu tarpeeksi nopeasti, aineen kuumentaminen johtaa itsesyttymiseen. Näin ollen itsesyttyminen tapahtuu, kun lämmöntuotanto on nopeampaa kuin lämpöhäviö. Testimenetelmä on käytännöllinen tapa saada alustavaa tietoa kiinteistä aineista. Koska kiinteiden aineiden syttyminen ja palaminen on monimutkainen tapahtuma, tällä menetelmällä määritettyjä itsesyttymislämpötiloja tulee käyttää vain vertailutarkoituksiin.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Tällä menetelmällä saatu itsesyttymislämpötila on alhaisin ympäristön lämpötila ( oC), jossa tunnettu tilavuus näyteainetta syttyy tunnetuissa olosuhteissa.
1.3 VERTAILUAINEET Vertailuaineita ei ole.
1.4 MENETELMÄN PERIAATE Tunnettu määrä näyteainetta pannaan huoneenlämpöiseen uuniin. Uunin lämpötila nostetaan 0,5 oC:n minuuttinopeudella arvoon 400 oC (tai sulamispisteeseen, jos tämä on alhaisempi), ja näytteen keskustan lämpötila kirjataan ajan funktiona. Tämän testin itsesyttymislämpötilaksi katsotaan se uunin lämpötila, jossa näytteen lämpötila on itsestään kuumenemisen seurauksena saavuttanut arvon 400 oC.
1.5 LAATUKRITEERIT Laatukriteerejä ei ole.
1.6 MENETELMÄKUVAUS
1.6
1.6.1 Laite
1.6.1
1.6.1.1 Uuni Uuni on termostaatilla varustettu laboratoriouuni (tilavuus noin 2 litraa), jossa on luonnollinen ilmanvaihto ja räjähdysventtiili. Räjähdysvaaran välttämiseksi hajoamiskaasuja ei saa päästää kosketuksiin sähkölämmityselementtien kanssa.
1.6.1.2 Lankaverkkokuutio Ruostumattomasta teräslangasta valmistetusta verkosta (0,045 mm aukko) leikataan kuvan 1 mukainen kuvio. Verkko taivutetaan ylhäältä avoimeksi kuutioksi ja kiinnitetään teräslangalla.
1.6.1.3 Termoparit Käytetään sopivia termopareja.
1.6.1.4 Rekisteröintilaite Mikä tahansa kaksikanavainen rekisteröintilaite, joka on kalibroitu 0–600 oC:lle tai vastaavalle jännitteelle.
1.6.2 Testiolosuhteet Aineet testataan vastaanotetussa muodossa.
1.6.3 Testin suorittaminen Verkkokuutioon pannaan näyteainetta, naputetaan kevyesti, ja lisätään ainetta, kunnes kuutio täyttyy. Tämän jälkeen kuutio ripustetaan huoneenlämpöisen uunin keskelle. Toinen termopari pannaan kuution keskustaan ja toinen kuution ja uunin seinän väliin mittaamaan uunin lämpötilaa. Uunin lämpötila nostetaan 400 oC:seen (tai sulamispisteeseen, jos tämä on alhaisempi) 0,5 oC:n minuuttinopeudella. Uunin ja näytteen lämpötilaa rekisteröidään koko kuumennuksen ajan. Kun aine syttyy, näytteessä olevan termoparin lämpötila nousee erittäin jyrkästi yli uunin lämpötilan.
2. TIEDOT Arviointia varten käytetään sitä uunin lämpötilaa, jossa näytteen lämpötila on noussut 400 oC:seen itsesyttymisen vaikutuksesta (katso kuvaa 2).
3. RAPORTOINTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
näyteaineen tiedot,
mittaustulokset lämpötila-aikakäyrineen,
kaikki lisätiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kannalta.
4.(1) VIITTEET NF T 20-036 (September 85), Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.
4.(1)
Kuva 1 20 mm:n näytekuution kaava
Kuva 2 Tyypillinen lämpötila-aikakäyrä
näytteen lämpötila uunin lämpötila syttymis- lämpötila aika
A.17 HAPETTAVAT OMINAISUUDET (KIINTEÄT AINEET)
A.17
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Ennen testiä on suositeltavaa hankkia alustavia tietoja aineen mahdollisista räjähdysominaisuuksista. Menetelmää ei voi käyttää nesteiden, kaasujen, räjähdysalttiiden tai herkästi syttyvien aineiden tai orgaanisten peroksidien testaukseen. Testiä ei tarvitse suorittaa, jos aineen rakennekaavasta voidaan täysin varmasti päätellä, että aine ei voi reagoida eksotermisesti syttyvien aineiden kanssa. Alustavan testin avulla selvitetään, onko varsinaisessa testissä noudatettava erityistä varovaisuutta.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Palamisaika sekunteina on se aika, jossa reaktiovyöhyke kulkee keon läpi, kun käytetään kohdassa 1.6 kuvattua menetelmää. Palamisnopeus ilmaistaan millimetreinä sekunnissa. Suurin palamisnopeus on se palamisnopeuden suurin arvo, joka saadaan kun ainetta sekoitetaan hapettimeen eri pitoisuuksina (10–90 painoprosenttia hapetinta).
1.3 VERTAILUAINEET Analyyttisen puhdasta bariumnitraattia voidaan käyttää testin ja alustavan testin vertailuaineena. Vertailuseoksena käytetään sitä kohdan 1.6 mukaan valmistettua bariumnitraatin ja jauhetun selluloosan seosta, jolla on suurin palamisnopeus (yleensä seos. jossa on 60 painoprosettia bariumnitraattia).
1.4 MENETELMÄN PERIAATE Turvallisuussyistä tehdään alustava testi. Jos alustavasta testistä selvästi ilmenee, että aineella on hapettavia ominaisuuksia, testiä ei tarvitse jatkaa. Muussa tapauksessa aine testataan kattavan testiohjelman mukaan. Kattavassa testissä testattavaa ainetta ja määritettyä syttyvää ainetta sekoitetaan eri suhteissa. Jokaisesta seoksesta valmistetaan pitkänomainen keko, joka sytytetään toisesta päästä. Suurinta palamisnopeutta verrataan vertailuseoksen suurimpaan palamisnopeuteen.
1.5 LAATUKRITEERIT Tarvittaessa voidaan käyttää mitä tahansa jauhamis- ja sekoitusmenetelmää, edellyttäen, että kuudesta erillisestä testistä saadut suurimmat palamisnopeudet poikkeavat aritmeettisesta keskiarvosta enintään 10 %.
1.6 MENETELMÄKUVAUS
1.6
1.6.1 Valmistelutoimet
1.6.1
1.6.1.1 Näyte Näytteen hiukkaskoko pienennetään alle 0,125 mm:iin seuraavasti: näyte seulotaan, jäännös jauhetaan ja seulonta toistetaan. Tätä jatketaan, kunnes koko näytemäärä on läpäissyt seulan. Jauhamiseen ja seulontaan voidaan käyttää mitä tahansa laatukriteerit täyttävää menetelmää. Ennen seoksen valmistelua näytettä kuivataan 105 oC:ssa, kunnes paino vakiintuu. Jos testattavan aineen hajoamislämpötila on alle 105 oC, kuivaus on tehtävä sopivassa, alhaisemmassa lämpötilassa.
1.6.1.2 Syttyvä aine Syttyvänä aineena käytetään jauhettua selluloosaa. Selluloosan on oltava ohutkerroskromatografiaan tai pylväskromatografiaan tarkoitettua tyyppiä. Selluloosatyyppi, jossa yli 85 % kuiduista on pituudeltaan 0,020–0,075 mm, on osoittautunut sopivaksi. Selluloosajauhe seulotaan 0,125 mm:n silmäkoon läpi. Testiin on käytettävä saman erän selluloosaa. Jauhettua selluloosaa kuivataan ennen seoksen valmistelua 105 oC:ssa, kunnes paino vakiintuu. Jos alustavaan testiin käytetään puujauhoa, vaimistetaan havupuujauhe keräämällä talteen 1,6 mm:n seulan läpäissyt osa. Jauhe sekoitetaan huolellisesti ja sitä kuivataan 105 oC:ssa neljä tuntia enintään 25 mm:n paksuisena kerroksena. Kuivauksen jälkeen puujauhe jäähdytetään ja pannaan ilmatiiviiseen säiliöön, joka pakataan mahdollisimman täyteen. Jauhe tulisi käyttää 24 tunnin kuluessa kuivauksesta.
1.6.1.3 Sytytyslähde Sytytyslähteenä käytetään kaasupolttimen kuumaa liekkiä (minimihalkaisija 5 mm). Jos käytetään toista sytytyslähdettä (esimerkiksi kun testi tapahtuu inertissä ilmakehässä), on annettava tilanteen kuvaus ja perustelu.
1.6.2 Testin suorittaminen Huomaulus: Hapettimien ja selluloosan tai puujauheen seoksia on pidettävä räjähdysvaarallisina ja niitä on käsiteltävä varoen.
1.6.2
1.6.2.1 Alustava testi Kuivattua näytettä ja kuivattua selluloosaa tai puujauhetta sekoitetaan huolella suhteessa 2 paino-osaa näytettä ja 1 paino-osa selluloosaa tai puujauhetta. Seos muotoillaan pieneksi kartionmuotoiseksi keoksi, jonka pohjan halkaisija on 3,5 cm ja korkeus 2,5 cm. Keko tehdään täyttämällä (ilman tiivistämistä) kartionmuotoinen muotti (esimerkiksi lasisuppilo, jonka varsi on suljettu). Keko asetetaan kylmälle, palamattomalle ja ei-huokoiselle aluslevylle, jonka lämmönjohtavuus on heikko. Testi on suoritettava vetokaapissa (katso 1.6.2.2). Kartiota kosketetaan sytytystähteellä. Sytytystä seuraavan reaktion voimakkuutta ja kestoa tarkkaillaan ja tulos kirjataan. Jos reaktio on voimakas, ainetta pidetään hapettavana. Jos tuloksen suhteen on epäilyjä, on tarpeen tehdä jäljempänä kuvattu kattava testi.
1.6.2.2 Sarjatesti Valmistetaan hapettimen ja selluloosan seoksia, joissa hapettimen painoprosentti on 10–90 ja vaihteluväli 10 %. Rajatapauksissa on valmistettava seoksia, joilla on pienemmät vaihteluvälit, jotta suurin palamisnopeus voitaisiin määrittää mahdollisimman tarkasti. Keko muotoillaan muotin avulla. Metallista valmistetun muotin pituus on 250 mm. Muotin kolmionmuotoisen läpileikkauksen sisäkorkeus on 10 mm ja leveys 20 mm. Muotin pituussuunnassa on molemmille sivuille kiinnitetty kaksi metallilevyä siten, että levyjen yläreuna on 2 mm muotin reunan yläpuolella (katso kuvaa). Lisätään seosta kevyelti hiukan muotin reunojen yli. Muotti pudotetaan kerran 2 cm korkeudelta kiinteälle pinnalle. Ylimääräinen aines kaavitaan pois, sivulevyt poistetaan ja muottiin jäävä aines tasoitetaan rullalla. Muotille asetetaan palamaton, ei-huokoisesta ja lämpöä heikosti johtavasta aineesta valmistettu aluslevy, laite käännetään ja muotti poistetaan. Aseta näyte vetokaappiin. Veto on säädettävä sellaiseksi, ettei savua pääse laboratoriotiloihin. Vedon voimakkuus ei saa vaihdella testin aikana. Laitteen ympärille pystytetään suojaseinä vetoa vastaan. Koska selluloosa ja eräät testattavat aineet ovat hygroskooppisia, testi on suoritettava mahdollisimman nopeasti. Keon toinen pää sytytetään koskettamalla sitä liekillä. Kun reaktiovyöhyke on edennyt 30 mm, mitataan aika, joka kuluu seuraavan 200 mm:n etenemiseen. Testi tehdään vertailuaineella ja vähintään kerran näyte-selluloosaseossarjan jokaisella osalla. Jos todetaan, että näyteseoksen palamisnopeus on huomattavasti suurempi kuin vertailuseoksen palamisnopeus, testi voidaan keskeyttää. Muussa tapauksessa testi toistetaan viisi kertaa kolmelle nopeimmin palavalle seokselle. Jos epäillään, että positiivinen tulos on virheellinen, testi toistetaan käyttäen selluloosan sijasta inerttiä ainetta, jolla on sama hiukkaskoko (esimerkiksi piimaata). Vaihtoehtoisesti nopeimmin palava näyte-selluloosaseos voidaan testata uudelleen inertissä ilmakehässä (< 2 tilavuusprosenttia happea).
2. TIEDOT Turvallisuussyistä suurinta palamisnopeutta — ei keskiarvoa — pidetään näyteaineen tunnusomaisena hapettavana ominaisuutena. Arviointia varten käytetään kuuden kokeen sarjan suurinta palamisnopeutta. Laaditaan käyrä, johon jokaista seosta kohden merkitään suurin palamisnopeus hapettimen pitoisuuden funktiona. Tältä käyrältä luetaan suurin palamisnopeus. Testattaessa suurimman palamisnopeuden omaava seos, testisarjan kuusi palamisnopeuden arvoa saavat poiketa aritmeettisesta keskiarvosta enintään 10 %. Muussa tapauksessa jauhamis- ja sekoitusmenetelmiä on parannettava. Suurinta saatua palamisnopeutta verrataan vertailuseoksen palamisnopeuteen (katso 1.3). Jos testit tehdään inertissä ilmakehässä, suurinta saatua reaktionopeutta verrataan inertissä ilmakehässä testatun vertailuaineen tulokseen.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TESTIRAPORTTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
näyteaineen tunnistetiedot, koostumus, puhtausaste, kosteuspitoisuus jne.,
näyteaineen mahdolliset käsittelyt (esimerkiksi jauhaminen ja kuivaus),
testeissä käytetty sytytyslähde,
mittaustulokset,
havaitun reaktion luonne (esimerkiksi liekki näytteen pinnalla, palaminen koko massan läpi, tiedot palamistuotteista,...),
kaikki lisätiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kannalta mukaan lukien kuvaus reaktion voimakkuudesta (liekit, kipinät, savunmuodostus, kyteminen, jne.) ja likimääräinen kesto alustavan testin yhteydessä sekä näytteen että vertailuaineen osalta,
tulokset inertin aineen testauksesta, jos tuloksia on käytettävissä,
inertissä ilmakehässä tehtyjen testien tulokset, jos tuloksia on käytettävissä.
3.2 TULOSTEN TULKINTA Aineen katsotaan olevan hapettava seuraavissa tapauksissa: Väärän positiivisen tuloksen välttämiseksi tulosten tulkinnassa on otettava huomioon myös tulokset, jotka on saatu testattaessa näytteen ja inertin aineen seosta tai suoritettaessa testiä inertissä ilmakehässä.
3.2 a)
jos alustavassa testissä tapahtuu voimakas reaktio;
b)
jos seosten palamisnopeus kattavassa testissä on vähintään yhtä suuri kuin selluloosasta ja bariumnitraatista valmistetun vertailuseoksen suurin palamisnopeus.
4.(1) VIITTEET NF T 20-035 (SEPT 85), Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.
A.18. POLYMEERIEN LUKUKESKIMÄÄRÄINEN MOLEKYYLIPAINO JA MOLEKYYLIPAINOJAKAUMA
A.18.
1. MENETELMÄ Tämä geelipermeaatiokromatografiamenetelmä (GPC) on toisinto OECD:n testausohjeesta N:o 118 (1996). Menetelmän periaatteet ja teknisiä lisätietoja on viitteessä 1.
1.
1.1 JOHDANTO Koska polymeerien ominaisuudet ovat hyvin vaihtelevia, on mahdotonta antaa yhtä ainoaa menetelmää ja täsmällisiä erotus- ja arviointiohjeita, jotka sopisivat kaikkiin polymeerien erotuksessa mahdollisesti esiintyviin tapauksiin. Erityisesti monimutkaisia polymeeriseoksia voi olla mahdoton erottaa geelipermeaatiomenetelmällä. Jos GPO:tä ei voi käyttää, voidaan molekyylipaino määrittää muilla tavoilla (katso liite). Tällaisissa tapauksissa on käytetystä menetelmästä annettava yksityiskohtaiset tiedot ja perustelut on esitettävä. Jäljempänä esitettävä menetelmä perustuu DIN-standardiin 55672 (1). Yksityiskohtaiset ohjeet kokeiden suorittamiseksi ja tulosten arvioimiseksi annetaan kyseisessä DIN-standardissa. Jos koeolosuhteita täytyy muuttaa, on muutokset perusteltava. Muita standardeja saa käyttää, jos niistä annetaan täydelliset viitteet. Tässä menetelmässä käytetään kalibrointiin polystyreeninäytteitä, johon sisältyvien polymeerien koot tunnetaan, ja menetelmää voi joutua muuttamaan, jotta sitä voitaisiin käyttää tietyille polymeereille, esim. vesiliukoisille ja pitkäketjuisille haaraantuville polymeereille.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Lukukeskimääräinen molekyylipaino M ja painokeskimääräinen molekyylipaino Mw määritetään seuraavilla yhtälöillä: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1HixMiΣni=1Hi joissa Hi on detektorisignaalin korkeus perustasosta retentiotilavuudelle Vi, Mi on retentiotilavuutta Vi vastaava polymeerifraktion molekyylipaino ja n on mittauspisteiden lukumäärä. Molekyylipainojakauman leveys, joka kuvastaa seoksen dispersiivisyyttä, saadaan suhteesta Mw/Mn.
1.3 VERTAILUAINEET Koska GPC on suhteellinen menetelmä, on tehtävä kalibrointi. Tähän käytetään tavallisesti kokojakaumaltaan kapeita lineaarisia polystyreenistandardeja, joiden keskimääräiset molekyylipainot Mn ja Mw sekä molekyylipainojakauma tunnetaan. Kalibrointikäyrää voidaan käyttää tuntemattoman näytteen molekyylipainon määritykseen vain, jos näytteen ja standardin erotusolosuhteet on valittu samalla tavalla. Molekyylipainon ja eluutiotilavuuden suhde on validi ainoastaan tietyn kokeen tietyissä koeolosuhteissa. Tärkeitä tekijöitä ovat ennen kaikkea lämpötila, liuotin (tai liuotinseos), kromatografiajärjestely sekä erotuspylväs tai pylväsjärjestelmä. Tällä tavoin määritetyt näytteen molekyylipainot ovat suhteellisia arvoja ja niistä käytetään nimitystä polystyreeniekvivalenttimolekyylipaino. Tämä tarkoittaa sitä, että riippuen näytteen ja standardien rakenne-eroista ja kemiallisista eroista molekyylipainot voivat poiketa absoluuttisista arvoista enemmän tai vähemmän. Jos käytetään muita standardeja, esim. polyetyleeniglykolia, polyetyleemoksidia, polymetyylimetakrylaattia tai polyakryylihappoa, on syy ilmoitettava.
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE Sekä näytteen molekyylipainojakauma että keskimääräiset molekyylipainot Mn ja Mw voidaan määrittää GPC:llä. GPC on erityinen nestekromatografian laji, jossa näytteen erottaminen perustuu seoksen yksittäisten aineiden hydrodynaamisiin tilavuuksiin (2). Erottuminen tapahtuu, kun näyte kulkee huokoisella aineella, tyypillisesti orgaanisella geelillä täytetyn pylvään läpi. Pienet molekyylit tunkeutuvat huokosiin, kun taas suuret molekyylit jäävät huokosten ulkopuolelle. Isojen molekyylien kulkema tie on siten lyhyempi, ja ne tulevat ensimmäisenä ulos pylväästä. Keskikokoiset molekyylit tunkeutuvat joihinkin huokosiin ja eluoituvat myöhemmin. Pienimmät molekyylit, joiden keskimääräinen hydrodynaaminen säde on pienempi kuin geelin huokoset, voivat tunkeutua kaikkiin huokosiin. Ne eluoituvat viimeisinä. Ihanteellisessa tilanteessa erottumiseen vaikuttaa ainoastaan molekyylilajin koko, mutta käytännössä on vaikea välttää ainakin jonkin verran adsorptiosta aiheutuvaa haittaa. Epätasaisesti pakattu pylväs ja kuolleet tilavuudet voivat pahentaa tilannetta (2). Detektorina käytetään esim. taitekerroin- tai UV-detektoria, ja tuloksena saadaan yksinkertainen jakaumakäyrä. Jotta käyrästä voidaan lukea oikeita molekyylipainoja, on pylväs kalibroitava molekyylipainoltaan tunnetuilla polymeereillä, joilla on mieluiten suunnilleen samanlainen rakenne, esim. erilaiset polystyreenistandardit. Tuloksena on tyypillisesti Gaussin käyrä, joka on joskus vääristynyt siten, että pienen molekyylipainon puolella on häntä; pystysuoralla akselilla on eluoitujen molekyylilajien määrät painomitoissa ja vaaka-akselilla molekyylipainon logaritmi.
1.5 LAATUKRITEERIT Eluutiotilavuuden toistettavuuden (keskihajonnan keskivirhe: RSD) olisi oltava parempi kuin 0,3 %. Määrityksen vaadittu toistettavuus on varmistettava sisäistä standardia käyttämällä, jos kromatogrammin arviointi on aikariippuvainen eikä täytä edellä mainittuja kriteerejä (1). Polydispersiivisyys riippuu standardien molekyylipainoista. Polystyreenistandardien osalta tyypillisiä arvoja ovat: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 < Mp < 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp on standardin molekyylipaino piikin maksimissa)
1.6 TESTIMENETELMÄN KUVAUS
1.6
1.6.1 Polystyreenistandardiliuosten valmistus Polystyreenistandardit liuotetaan sekoittamalla huolellisesti haluttuun eluointiliuokseen. Valmistajan ohjeet on otettava huomioon liuosten valmistuksessa. Valittujen standardien pitoisuudet riippuvat eri tekijöistä, esim. injektiotilavuudesta, liuoksen viskositeetistä ja detektorin herkkyydestä. Suurin injektiotilavuus on sovitettava pylvään pituuden mukaan, ettei pylvästä kuormiteta liikaa. Tyypilliset injektiotilavuudet käytettäessä GPC:tä analyyttisiin erotuksiin pylväässä, jonka koko on 30 cm x 7,8 mm, ovat tavallisesti 40–100 μl. Suuremmat tilavuudet ovat mahdollisia, mutta eivät saisi olla enemmän kuin 250 μl. Injektiotilavuuden ja aineen pitoisuuden paras suhde on määritettävä ennen pylvään varsinaista kalibrointia.
1.6.2 Näyteliuoksen valmistus Periaatteessa samat vaatimukset koskevat näyteliuosten valmistamista. Näyte liuotetaan sopivaan liuottimeen (esim tetrahydrofuraaniin (THF)) ravistamalla huolellisesti. Sitä ei saa missään tapauksessa liuottaa ultraäänihauteessa. Tarpeen vaatiessa näyte puhdistetaan suodattamalla kalvolla, jonka huokoskoko on 0,2–2 μm. Jos näytteessä on liukenemattomia hiukkasia, on tämä kirjattava loppuraporttiin, koska se saattaa johtua suurikokoisista molekyyleistä. Liukenemattomien hiukkasten painoprosenttiosuus on määritettävä jollakin sopivalla menetelmällä. Liuokset on käytettävä vuorokauden sisällä.
1.6.3 Laitteisto On varmistettava, että GPC-laitteisto ei reagoi käytettävien liuottimien kanssa (esim. THF:n kanssa on käytettävä teräskapillaareja).
liuotinsäiliö
kaasunpoistolaite (tarvittaessa)
pumppu
pulssinvaimennin (tarvittaessa)
injektiojärjestelmä
kromatografiapylväät
ilmaisin (detektori)
virtausmittari (tarvittaessa)
tulosten tallennus/prosessointilaite
jäteastia
1.6.4 Injektiojärjestelmä ja liuottimen annostelujärjestelmä Määrätty näytetilavuus syötetään pylvääseen joko automaattisella näytteensyöttölaitteella tai käsin tarkasti määriteltyyn vyöhykkeeseen, jos ruiskun mäntää vedetään tai työnnetään liian nopeasti, se voi aiheuttaa muutoksia havaitussa molekyylipainojakaumassa. Liuotinta pumppaavien pumppujen olisi oltava mahdollisimman tasaisia ja niissä saisi mieluiten olla pulssinvaimennin. Virtausnopeuden pitäisi olla noin 1 ml/min.
1.6.5 Pylväs Näytteestä riippuen polymeerin ominaisuudet määritetään käyttäen joko yhtä pylvästä tai useita peräkkäin kytkettyjä pylväitä. Kaupallisesti on saatavilla lukuisia pylväsmateriaaleja, joiden ominaisuudet on määritelty (esim. huokoskoko, ekskluusiorajat). Erotusgeelin ja pylvään pituuden valinta riippuu sekä näytteen ominaisuuksista (hydrodynaamiset tilavuudet, molekyylipainojakauma) että erotuksen erityisvaatimuksista kuten liuottimesta, lämpötilasta ja virtausnopeudesta (1) (2) (3).
1.6.6 Teoreettiset levyt Käytettävästä pylväästä tai pylväsyhdistelmästä on tiedettävä teoreettisten levyjen lukumäärä. Tätä varten syötetään pituudeltaan tunnettuun pylvääsen — jos THF on eluutioliuotin — etyylibentseeniIiuosta tai muuta sopivaa ei-polaarista liuotinta. Teoreettisten levyjen lukumäärä saadaan seuraavasta yhtälöstä: N=5,54VeW1/22 tai N=16VeW2 jossa N on teoreettisten levyjen lukumäärä Ve on eluutiotilavuus piikin maksimin kohdalla W on piikin leveys perusviivalla W1/2 on piikin leveys piikin korkeuden puolivälissä.
1.6.7 Erotusteho Teoreettisten levyjen lukumäärän lisäksi, joka on vyöhykkeen leveyden määräävä suure, myös erotusteholla on osansa. Erotustehon määrää kalibraatiokäyrän jyrkkyys. Pylvään erotusteho saadaan seuraavasta yhtälöstä: Ve,Mx-Ve,(10Mx)pylvään leikkausen pinta-ala≥6,0 cm3cm2 jossa Ve, Mx on sellaisen polystyreenin, jonka molekyylipaino on Mx, eluutiotilavuus Ve,(10Mx) on molekyylipainoltaan kymmenen kertaa suuremman polystyreenin eluutiotilavuus. Järjestelmän erotuskyky määritellään yleensä seuraavasti: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 jossa Vel, Ve2 ovat kahden polystyreenistandardin eluutiotilavuudet piikin maksimissa W1, W2 ovat piikin leveydet perusviivalla Ml, M2 ovat molekyylipainot piikin maksimissa (niiden ero pitäisi olla vähintään 10-kertainen). Pylvään R-arvon olisi oltava suurempi kuin 1,7 (4).
1.6.8 Liuottimet Kaikkien liuottimien on oltava korkeaa puhtauslaatua (THF:n puhtaus 99,5 %). Liuotinastian (tarvittaessa inertissä kaasussa) on oltava riittävän iso pylvään kalibroimiseen ja useiden näytteiden määrittämiseen. Liuottimesta on poistettava kaasut ennen kuin sitä pumpataan pylvääseen.
1.6.9 Lämpötilansäätö Tärkeiden laitteiston sisäisten osien (injektiosilmukka, pylväät, detektori ja letkut/putket) lämpötilan olisi oltava vakaa ja valitulle liuottimelle sopiva.
1.6.10 Detektori Detektorin tarkoitus on mitata pylväästä tulevan näytteen pitoisuus. Jotta piikit eivät leviäisi tarpeettomasti, on detektorin mittauskyvetin tilavuuden oltava mahdollisimman pieni. Se ei saisi olla suurempi kuin 10 μl paitsi valon sirontaa tai viskositeettia mittaavilla detektoreilla. Detektorina käytetään tavallisesti differentiaalirefraktometriä. Muitakin detektoreja, esim. UV/VIS-, IR- ja viskositeettidetektoreja voidaan käyttää, mikäli näytteen tai eluutioliuottimen erityiset ominaisuudet edellyttävät sitä.
2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN
2.
2.1 MÄÄRITYSTULOKSET Yksityiskohtaisten arviointiperusteiden samoin kuin määritystulosten keräämisen ja käsittelyn osalta on noudatettava DIN-standardin (1) määrityksiä. Kustakin näytteestä tehdään kaksi erillistä koetta, jotka on analysoitava erikseen. Mn, Mw, Mw/Mn ja Mp on ilmoitettava jokaisesta mittauksesta. On ilmoitettava selvästi, että mitatut arvot ovat suhteellisia arvoja, jotka ovat suhteessa käytettyjen standardien molekyylipainoihin. Kun retentiotilavuudet tai retentioajat (mahdollisesti korjattuina sisäisten standardien suhteen) on määritetty, esitetään log M -arvot (M on kalibrointistandardin piikin korkein kohta) jonkin edellä mainitun suureen funktiona. Kutakin molekyylipainon kymmentä potenssia kohti tarvitaan vähintään kaksi kalibrointipistettä ja koko käyrällä on oltava vähintään viisi mittauspistettä, joiden pitäisi kattaa näytteen arvioitu molekyylipainoalue. Kalibrointikäyrän loppupiste pienen molekyylipainon päässä määritetään n-heksyylibentseenin tai jonkin muun sopivan ei-polaarisen liuottimen avulla Mn ja Mw määritetään tavallisesti tietokoneella osastossa 1.2 esitettyjen kaavojen perusteella. Jos käytetään manuaalista digitointia, voidaan ohjeeksi katsoa menetelmää ASTM D 3536-91 (3). Jakaumakäyrä on esitettävä taulukon tai kuvan muodossa (differentiaalinen taajuus tai summaprosenttiosuudet log M:n funktiona). Graafisessa esityksessä yksi molekyylipainon kymmenen potenssi pitäisi olla tavallisesti noin 4 cm leveä ja piikin maksimin pitäisi olla noin 8 cm korkea. Koko jakaumakäyrän osalta y-akselin korkeuden 0 ja 100 %:n välillä olisi oltava noin 10 cm.
2.2 TESTIRAPORTTI Testiraportissa on esitettävä seuraavat asiat:
2.2
2.2.1 Testattava aine
saatavissa olevat tiedot testattavasta aineesta (tunnistetiedot, lisäaineet, epäpuhtaudet);
näytteen käsittelyn kuvaus, mahdolliset huomiot ja ongelmat.
2.2.2 Laitteisto
eluenttisäiliö, inertti kaasu, kaasun poisto eluentista, eluentin koostumus, epäpuhtaudet,
pumppu, pulssinvaimennin, injektiojärjestelmä,
erotuspylväät (valmistaja, kaikki tiedot pylväiden ominaisuuksista kuten huokoskoko, erotusmateriaalin tyyppi jne., käytettävien pylväiden lukumäärä, pituus ja järjestys),
pylvään (tai pylväsyhdistelmän) teoreettisten levyjen lukumäärä, erotusteho (järjestelmän erotuskyky),
piikkien symmetriaa koskevat tiedot,
pylvään lämpötila, lämpötilan säätötapa,
detektori (mittausperiaate, tyyppi, kyvetin tilavuus),
mahdollinen virtausmittari (valmistaja, mittausperiaate),
mittaustulosten tallennus- ja käsittelyjärjestelmä (laitteet ja ohjelmat).
2.2.3 Järjestelmän kalibrointi
kalibrointikäyrän määrittämiseksi käytetyn menetelmän tarkka kuvaus
tiedot menetelmän laatukriteereistä (esim. korrelaatiokerroin, jäännösneliösumma jne.)
tiedot kaikista kokeen aikana sekä tulosten arvioinnissa ja käsittelyssä suoritetuista ekstrapolaatioista, oletuksista ja aproksimaatioista,
kaikki kalibrointikäyrän määrittämiseksi käytetyt mittaukset on esitettävä taulukossa, jossa esitetään myös seuraavat tiedot kustakin kalibrointipisteestä:
näytteen nimi,
aineen valmistaja,
valmistajan ilmoittamat tai mittauksista johdetut standardien Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn ominaisarvot sekä tarkat tiedot niiden määritysmenetelmästä,
injektiotilavuus ja injektoitavan liuoksen pitoisuus,
kalibrointiin käytetty Mp-arvo
eluutiotilavuus tai piikin maksimissa mitattu korjattu retentioaika,
piikin maksimissa laskettu Mp
laskemalla saadun Mp:n ja kalibrointiarvon prosenttivaihe.
2.2.4 Arviointi
aikaperusteinen arviointi: toistettavuuden varmistamiseen käytetyt menetelmät (korjausmenetelmä, sisäinen standardi jne.),
suoritetaanko arviointi eluutiotilavuuden vai retentioajan perusteella,
tiedot arvion rajoituksista, jos piikkiä ei analysoida täydellisesti,
mahdollisten tasoitusmenetelmien kuvaus,
näytteen valmistus ja esikäsittely,
mahdolliset liukenemattomat hiukkaset,
injektiotilavuus (μl) ja injektoitavan näytteen pitoisuus (mg/ml),
huomiot seikoista, joista aiheutuu poikkeamista ihanteellisesta GPC-käyttäytymisestä,
tarkka kuvaus kaikista testausmeneteimien muutoksista,
virherajoja koskevat yksityiskohtaiset tiedot,
kaikki tulosten tulkintaan vaikuttavat tiedot ja huomiot.
3.(1)(2)(3)(4)
KIRJALLISUUSVIITTEET DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
A.19. PIENIMOLEKYYLISTEN AINEIDEN PITOISUUS POLYMEERISSÄ
A.19.
1. MENETELMÄ Tämä geelipermeaatiokromatografiamenetelmä on toisinto OECD:n testausohjeesta N:o 119 (1996). Perusperiaatteet ja teknisiä lisätietoja saa kirjallisuusviitteistä.
1.
1.1 JOHDANTO Koska polymeerien ominaisuudet vaihtelevat suuresti, on mahdotonta kuvata yhtä ainoaa menetelmää, jossa selitettäisiin täsmällisesti kaikki polymeerien erotuksessa mahdollisesti esiintyvät erityiset seikat kattavat erotus- ja analysointiedellytykset. Erityisesti kompleksiset polymeerijärjestelmät eivät useinkaan sovi geelipermeaatiokromatografiaan. Kun GPC:tä ei voida käyttää, molekyylipaino voidaan määrittää muilla menetelmillä (katso Liite). Tällöin on esitettävä käytettyä menetelmää koskevat yksityiskohdat ja perustelut. Seuraavassa kuvattava menetelmä perustuu DIN-standardiin 55672 (1). Tässä standardissa esitetään yksityiskohtaisesti, miten kokeet suoritetaan ja tulokset arvioidaan. Jos koeolosuhteita täytyy muuttaa, on muutokset perusteltava. Muita standardeja voi käyttää, jos niistä annetaan täydelliset viitteet. Tässä kuvattavassa menetelmässä käytetään tunnetun polydispersiivisyyden omaavia polystyreeninäytteitä kalibrointiin, ja menetelmää on mahdollisesti muutettava tiettyjä polymeerejä varten, esim. vesiliukoisia ja pitkäketjuisia haaraisia polymeerejä varten.
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Matalaksi molekyylipainoksi määritellään pienempi kuin 1000 (daltonia). Mn (lukukeskimääräinen molekyylipaino) ja Mw (painokeskimääräinen molekyylipaino) määritellään seuraavilla yhtälöillä: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1HixMiΣni=1Hi joissa H1 on detektorisignaalin korkeus perustasosta retentiotilavuudelle Vi, Mj on polymeerifraktion molekyylipaino retentiotilavuudessa Vi, ja n on mittauspisteiden lukumäärä. Molekyylipainojakauman leveys, joka on suhteessa järjestelmän dispersiivisyyteen, saadaan suhteesta Mw/Mn
1.3 VERTAILUAINEET Koska GPC on suhteellinen menetelmä, on tehtävä kalibrointi. Tähän käytetään tavallisesti kokojakaumaltaan kapeita lineaarisia polystyreenistandardeja, joiden keskimääräiset molekyylipainot Mn ja Mw sekä molekyylipainojakauma tunnetaan. Kalibrointikäyrää voidaan käyttää tuntemattoman näytteen molekyylipainon määritykseen vain, jos näytteen ja standardin erotusolosuhteet on valittu samalla tavalla. Molekyylipainon ja eluutiotilavuuden suhde on validi ainoastaan tietyn kokeen tietyissä koeolosuhteissa. Tärkeitä tekijöitä ovat ennen kaikkea lämpötila, liuotin (tai liuotinseos), kromatografiajärjestely sekä erotus pylväs tai pylväsjärjestelmä. Tällä tavoin määritetyt näytteen molekyylipainot ovat suhteellisia arvoja ja niistä käytetään nimitystä polystyreeniekvivalenttimolekyylipaino. Tämä tarkoittaa sitä, että riippuen näytteen ja standardien rakenne-eroista ja kemiallisista eroista molekyylipainot voivat poiketa absoluuttisista arvoista enemmän tai vähemmän. Jos käytetään muita standardeja, esim. polyetyleeniglykolia, polyetyleenioksidia, poly-metyylimetakrylaattia tai polyakryylihappoa, on syy ilmoitettava.
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE Sekä näytteen molekyylipainojakauma että keskimääräiset molekyylipainot Mn ja Mw voidaan määrittää GPC:llä. GPC on erityinen nestekromatografian laji, jossa näytteen erottaminen perustuu seoksen yksittäisten aineiden hydrodynaamisiin tilavuuksiin (2). Erottuminen tapahtuu, kun näyte kulkee huokoisella aineella, tyypillisesti orgaanisella geelillä täytetyn pylvään läpi. Pienet molekyylit tunkeutuvat huokosiin, kun taas suuret molekyylit jäävät huokosten ulkopuolelle. Isojen molekyylien kulkema tie on siten lyhyempi, ja ne tulevat ensimmäisenä ulos pylväästä. Keskikokoiset molekyylit tunkeutuvat joihinkin huokosiin ja eluoituvat myöhemmin. Pienimmät molekyylit, joiden keskimääräinen hydrodynaaminen säde on pienempi kuin geelin huokoset, voivat tunkeutua kaikkiin huokosiin. Ne eluoituvat viimeisinä. Ihanteellisessa tilanteessa erottumiseen vaikuttaa ainoastaan molekyylilajin koko, mutta käytännössä on vaikea välttää ainakin jonkin verran adsorptiosta aiheutuvaa haittaa. Epätasaisesti pakattu pylväs ja kuolleet tilavuudet voivat pahentaa tilannetta (2). Detektorina käytetään esim. taitekerroin- tai UV-detektoria, ja tuloksena saadaan yksinkertainen jakaumakäyrä. Jotta käyrästä voidaan lukea oikeita molekyylipainoja, on pylväs kalibroitava molekyylipainoltaan tunnetuilla polymeereillä, joilla on mieluiten suunnilleen samanlainen rakenne, esim. erilaiset polystyreenistandardit. Tuloksena on tyypillisesti Gaussin käyrä, joka on joskus vääristynyt siten, että pienen molekyylipainon puolella on häntä; pystysuoralla akselilla on eluoitujen molekyylilajien määrät painomitoissa ja vaaka-akselilla molekyylipainon logaritmi.
1.5 LAATUKRITEERIT Eluutiotilavuuden toistettavuuden (keskihajonnan keskivirhe: RSD) olisi oltava parempi kuin 0,3 %, Määritvksen vaadittu toistettavuus on varmistettava sisäistä standardia käyttämällä, jos kromato-grammin arviointi on aikariippuvainen eikä täytä edellä mainittuja kriteerejä (1). Polydispersiivisyys riippuu standardien molekyylipainoista. Polystyreenistandardien osalta tyypillisiä arvoja ovat: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw /Mn < 1,20 (Mp on standardin molekyylipaino piikin maksimissa).
1.6 TESTIMENETELMÄN KUVAUS
1.6
1.6.1 Polystyreenistandardiliuosten valmistus Polystyreenistandardit liuotetaan sekoittamalla huolellisesti haluttuun eluointiliuokseen. Valmistajan ohjeet on otettava huomioon liuosten valmistuksessa. Valittujen standardien pitoisuudet riippuvat eri tekijöistä, esim. injektiotilavuudesta, liuoksen viskositeetistä ja detektorin herkkyydestä, Suurin injektiotilavuus on sovitettava pylvään pituuden mukaan, ettei pylvästä kuormiteta liikaa. Tyypilliset injektiotilavuudet käytettäessä GPC:tä analyyttisiin erotuksiin pylväässä, jonka koko on 30 cm x 7,8 mm, ovat tavallisesti 40–100 μl. Suuremmat tilavuudet ovat mahdollisia, mutta eivät saisi olla enemmän kuin 250 μl. Injektiotilavuuden ja aineen pitoisuuden paras suhde on määritettävä ennen pylvään varsinaista kalibrointia.
1.6.2 Näyteliuoksen valmistus Periaatteessa samat vaatimukset koskevat näyteliuosten valmistamista. Näyte liuotetaan sopivaan liuottimeen (esim. tetrahydrofuraaniin (THF) ravistamalla huolellisesti. Sitä ei saa missään tapauksessa liuottaa ultraäänihauteessa. Tarpeen vaatiessa näyte puhdistetaan suodattamalla kalvolla, jonka huokoskoko on 0,2–2 μm. Jos näytteessä on liukenemattomia hiukkasia, on tämä kirjattava loppuraporttiin, koska se saattaa johtua suurikokoisista molekyyleistä. Liukenemattomien hiukkasten painoprosenttiosuus on määritettävä jollakin sopivalla menetelmällä. Liuokset on käytettävä vuorokauden sisällä.
1.6.3 Epäpuhtauksista ja lisäaineista johtuvat korjaukset Molekyylipainoltaan alle 1000 olevien molekyylien suhteen on yleensä tehtävä korjaus, joka aiheutuu ei-polymeerisistä komponenteista (esim. epäpuhtaudet ja/tai lisäaineet), ellei pitoisuus jo ole pienempi kuin 1 %. Tämä tehdään analysoimalla suoraan polymeeriliuos tai GPC-eluaatti. Jos eluaatti on pylväästä tultuaan liian laimea analysoitavaksi edelleen, se on konsentroitava. Voi olla tarpeen haihduttaa se kuiviin ja liuottaa uudelleen. Konsentroiminen on tehtävä siten, ettei eluaatissa tapahdu muutoksia. Eluaatin käsittely GPC-vaiheen jälkeen riippuu kvantitatiiviseen määritykseen käytettävästä analyyttisestä menetelmästä.
1.6.4 Laitteisto GPC-laitteistoon kuuluu seuraavat osat: On varmistettava, että GPC-laitteisto ei reagoi käytettävien liuottimien kanssa (esim. THF:n kanssa on käytettävä teräskapillaareja).
liuotinsäiliö
kaasunpoistolaite (tarvittaessa)
pumppu
pulssinvaimennin (tarvittaessa)
injektiojärjestelmä
kromatografiapylväät
ilmaisin (detektori)
virtausmittari (tarvittaessa)
tulosten tallennus/prosessointilaite
jäteastia.
1.6.5 Injektiojärjestelmä ja liuottimen annostelujärjestelmä Määrätty näytetilavuus syötetään pylvääseen joko automaattisella näytteensyöttölaitteella tai käsin tarkasti määriteltyyn vyöhykkeeseen. Jos ruiskun mäntää vedetään tai työnnetään liian nopeasti, se voi aiheuttaa muutoksia havaitussa molekyylipainojakaumassa. Liuotinta pumppaavien pumppujen olisi oltava mahdollisimman tasaisia ja niissä saisi mieluiten olla pulssinvaimennin. Virtausnopeuden pitäisi olla noin 1 ml/min.
1.6.6 Pylväs Näytteestä riippuen polymeerin ominaisuudet määritetään käyttäen joko yhtä pylvästä tai useita peräkkäin kytkettyjä pylväitä. Kaupallisesti on saatavilla lukuisia pylväsmateriaaleja, joiden ominaisuudet on määritelty (esim. huokoskoko, ekskluusiorajat). Erotusgeelin ja pylvään pituuden valinta riippuu sekä näytteen ominaisuuksista (hydrodynaamiset tilavuudet, molekyylipainojakauma) että erotuksen erityisvaatimuksista kuten liuottimesta, lämpötilasta ja virtausnopeudesta (1) (2) (3).
1.6.7 Teoreettiset levyt Käytettävästä pylväästä tai pylväsyhdistelmästä on tiedettävä teoreettisten levyjen lukumäärä. Tätä varten syötetään pituudeltaan tunnettuun pylvääseen — jos THF on eluutioliuotin — etyylibentseeniliuosta tai muuta sopivaa ei-polaarista liuotinta. Teoreettisten levyjen lukumäärä saadaan seuraavasta yhtälöstä: N=5,54VeW1/22 tai N=16VeW2 jossa N on teoreettisten levyjen lukumäärä Ve on eluutiotilavuus piikin maksimin kohdalla W on piikin leveys perusviivalla W172 on piikin leveys piikin korkeuden puolivälissä.
1.6.8 Erotusteho Teoreettisten levyjen lukumäärän lisäksi, joka on vyöhykkeen leveyden määräävä suure, myös erotusteholla on osansa. Erotustehon määrää kalibraatiokäyrän jyrkkyys. Pylvään erotusteho saadaan seuraavasta yhtälöstä: Ve,Mx-Ve,(10Mx)pylvään leikkausen pinta-ala≥6,0cm3cm2 jossa Ve, Mx on sellaisen polystyreenin, jonka molekyylipaino on Mx, eluutiotilavuus Ve,(10Mx) on molekyylipainoltaan kymmenen kertaa suuremman polystyreenin eluutiotilavuus. Järjestelmän erotuskyky määritellään yleensä seuraavasti: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 jossa Ve1, Ve2 ovat kahden polystyreenistandardin eluutiotilavuudet piikin maksimissa W1, W2 ovat piikin leveydet perusviivalla M1, M2, ovat molekyylipainot piikin maksimissa (niiden ero pitäisi olla vähintään 10-kertainen) Pylvään R-arvon olisi oltava suurempi kuin 1,7 (4).
1.6.9 Liuottimet Kaikkien liuottimien on oltava korkeaa puhtauslaatua (THF:n puhtaus 99,5 %). Liuotinastian (tarvittaessa inertissä kaasussa) on oltava riittävän iso pylvään kalibroimiseen ja useiden näytteiden määrittämiseen. Liuottimesta on poistettava kaasut ennen kuin sitä pumpataan pylvääseen.
1.6.10 Lämpötilansäätö Tärkeiden laitteiston sisäisten osien (injektiosilmukka, pylväät, detektori ja letkut/putket) lämpötilan olisi oltava vakaa ja valitulle liuottimelle sopiva.
1.6.11 Detektori Detektorin tarkoitus on mitata pylväästä tulevan näytteen pitoisuus. Jotta piikit eivät leviäisi tarpeettomasti, on detektorin mittauskyvetin tilavuuden oltava mahdollisimman pieni. Se ei saisi olla suurempi kuin 10 μl paitsi valon sirontaa tai viskositeettia mittaavilla detektoreilla. Detektorina käytetään tavallisesti differentiaalirefraktometriä. Muitakin detektoreja, esim. UV/VIS-, IR- ja viskositeettidetekto-reja voidaan käyttää, mikäli näytteen tai eluutioliuottimen erityiset ominaisuudet edellyttävät sitä.
2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN
2.
2.1 MÄÄRITYSTULOKSET Yksityiskohtaisten arviointiperusteiden samoin kuin määritystulosten keräämisen ja käsittelyn osalta on noudatettava DIN-standardin (1) määrävksiä. Kustakin näytteestä tehdään kaksi erillistä koetta, jotka on analysoitava erikseen. Mn, Mw, Mw /Mn ja M on ilmoitettava jokaisesta mittauksesta. On ilmoitettava selvästi, että mitatut arvot ovat suhteellisia arvoja, jotka ovat suhteessa käytettyjen standardien molekyylipainoihin. Kun retentiotilavuudet tai retentioajat (mahdollisesti korjattuina sisäisten standardien suhteen} on määritetty, esitetään log M -arvot (Mp on kalibrointistandardin piikin korkein kohta) jonkin edellä mainitun suureen funktiona. Kutakin molekyylipainon kymmenen potenssia kohti tarvitaan vähintään kaksi kalibrointipistettä ja koko käyrällä on oltava vähintään viisi mittauspistettä, joiden pitäisi kattaa näytteen arvioitu molekyylipainoalue. Kalibrointikäyrän loppupiste pienen molekyylipainon päässä määritetään n-heksyylibentseenin tai jonkin muun sopivan ei-polaarisen liuottimen avulla. Mn ja Mw määritetään tavallisesti tietokoneella osastossa 1.2 esitettyjen kaavojen perusteella. Jos käytetään manuaalista digitointia, voidaan ohjeeksi katsoa menetelmää ASTM D 3536-91 (3). Jakaumakäyrä on esitettävä taulukon tai kuvan muodossa (differentiaalinen taajuus tai summaprosenttiosuudet log M:n funktiona). Graafisessa esityksessä yksi molekyylipainon kymmenen potenssi pitäisi olla tavallisesti noin 4 cm leveä ja piikin maksimin pitäisi olla noin 8 cm korkea. Koko jakaumakäyrän osalta y-akselin korkeuden 0 ja 100 %:n välillä olisi oltava noin 10 cm.
2.2 TESTIRAPORTTI Testiraportissa on esitettävä seuraavat asiat:
2.2
2.2.1 Testattava aine
saatavissa olevat tiedot testattavasta aineesta (tunnistetiedot, lisäaineet, epäpuhtaudet),
näytteen käsittelyn kuvaus, mahdolliset huomiot ja ongelmat.
2.2.2 Laitteisto
eluenttisailiö, inertti kaasu, kaasun poisto eluentista, eluentin koostumus, epäpuhtaudet
pumppu, pulssinvaimennin, injektiojärjestelmä
erotuspylväät (valmistaja, kaikki tiedot pylväiden ominaisuuksista kuten huokoskoko, erotusmateriaalin tyyppi jne, käytettävien pylväiden lukumäärä, pituus ja järjestys),
pylvään (tai pylväsyhdistelmän) teoreettisten levyjen lukumäärä, erotusteho (järjestelmän erotuskyky),
piikkien symmetriaa koskevat tiedot,
pylvään lämpötila, lämpötilan säätötapa,
detektori (mittausperiaate, tyyppi, kyvetin tilavuus),
mahdollinen virtausmittari (valmistaja, mittausperiaate),
mittaustulosten tallennus- ja käsittelyjärjestelmä (laitteet ja ohjelmat).
2.2.3 Järjestelmän kalibrointi
kalibrointikäyrän määrittämiseksi käytetyn menetelmän tarkka kuvaus,
tiedot menetelmän laatukriteereistä (esim. korrelaatiokerroin, jäännösneliösumma jne.),
tiedot kaikista kokeen aikana sekä tulosten arvioinnissa ja käsittelyssä suoritetuista ekstrapolaatioista, oletuksista ja aproksimaatioista,
kaikki kalibrointikäyrän määrittämiseksi käytetyt mittaukset on esitettävä taulukossa, jossa esitetään myös seuraavat tiedot kustakin kalibrointipisteestä:
näytteen nimi,
aineen valmistaja,
valmistajan ilmoittamat tai mittauksista johdetut standardien Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn ominaisarvot sekä tarkat tiedot niiden määritysmenetelmästä,
injektiotilavuus ja injektoitavan liuoksen pitoisuus,
kalibrointiin käytetty Mp-arvo,
eluutiotilavuus tai piikin maksimissa mitattu korjattu retentioaika,
piikin maksimissa laskettu Mp,
laskemalla saadun Mp:n ja kalibrointiarvon prosenttivaihe.
2.2.4 Tiedot pienimolekyylipainoisen polymeerin pitoisuudesta
käytettyjen analyysimenetelmien kuvaus ja kokeiden suoritustapa,
tiedot pienimolekyylipainoisen aineen pitoisuusprosentista (w/w) suhteessa koko näytteeseen,
tiedot epäpuhtauksista, lisäaineista ja muista ei-polymeerisistä aineista painoprosentteina kokonäytteestä.
2.2.5 Arviointi
aikaperusteinen arviointi: toistettavuuden varmistamiseen käytetyt menetelmät (korjausmenetelmä, sisäinen standardi jne.),
suoritetaanko arviointi eluutiotilavuuden vai retentioajan perusteella,
tiedot arvion rajoituksista, jos piikkiä ei analysoida täydellisesti,
mahdollisten tasoitusmenetelmien kuvaus,
näytteen valmistus ja esikäsittely,
mahdolliset liukenemattomat hiukkaset,
injektiotilavuus (μl) ja injektoitavan näytteen pitoisuus (mg/ml),
huomiot seikoista, joista aiheutuu poikkeamista ihanteellisesta GPC-käyttäytymisestä,
tarkka kuvaus kaikista testausmenetelmien muutoksista,
virherajoja koskevat yksityiskohtaiset tiedot,
kaikki tulosten tulkintaan vaikuttavat tiedot ja huomiot.
3.(1)(2)(3)(4)
KIRJALLISUUSVIITTEET DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J, and Bly, D.D. eds (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J.Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
A.20. VESILIUOKSESSA OLEVIEN POLYMEERIEN LIUKENEMIS/UUTTUMISOMINAISUUDET
A.20.
1. MENETELMÄ Seuraava menetelmä on toisinto OECD:n ohjeen N:o 120 (1997) muutetusta versiosta. Teknisiä lisätietoja on viitteessä (1).
1.
1.1 JOHDANTO Tietyille polymeereille, kuten emulsiopolymeerit, on tehtävä esikäsittelyjä ennen kuin seuraavassa selostettua menetelmää voi käyttää. Menetelmä ei sovellu nestemäisiin polymeereihin eikä veden kanssa testausolosuhteissa reagoiviin polymeereihin. Jos menetelmä ei ole kohtuullisesti tai lainkaan mahdollinen, liukenemis/uuttumisominaisuuksia voi tutkia muilla menetelmillä. Tällöin on esitettävä käytetyn menetelmän yksityiskohdat ja perustelut.
1.2. VERTAILUAINEET Ei vertailuaineita.
1.3. TESTAUSMENETELMÄN PERIAATE Vesiliuoksessa olevien polymeerien liukenemis/uuttumisominaisuudet määritetään pullomenetelmällä (katso A.6. Vesiliukoisuus, pullomenetelmä) seuraavin muutoksin.
1.4 LAATUKRITEERIT Ei laatukriteerejä.
1.5 TESTAUSMENETELMÄN KUVAUS
1.5
1.5.1 Laitteisto Menetelmässä tarvitaan seuraavat laitteet:
murskauslaite, esim. jauhin, tietyn koon omaavien hiukkasten valmistamiseksi,
ravistelulaite, jossa on lämpötilansäätö,
kalvosuodatusjärjestelmä
sopiva analyysilaitteisto
standardisoidut seulat.
1.5.2 Näytteen valmistus Edustava näyte on ensin saatettava hiukkaskokoon 0,125–0,25 mm sopivilla seuloilla. Näytteen stabiilisuuden varmistamiseksi tai jauhamisen aikana voidaan tarvita jäähdytystä. Kumimaisia aineita voi murskata neste typpilämpötilassa (1). Jos vaadittua hiukkaskokoa ei voida saavuttaa, olisi pyrittävä saamaan hiukkaskoko mahdollisimman pieneksi, ja ilmoitettava tulos. Raportissa on selostettava, miten murskattua näytettä säilytettiin ennen testausta.
1.5.3 Menetelmä Kolme 10 gramman näytettä testattavaa ainetta punnitaan kolmeen pulloon, joissa on lasitulpat, ja 1000 ml vettä lisätään kuhunkin pulloon. Jos on hankala käsitellä 10:tä grammaa polymeeriä, käytetään suurempaa määrää ja lisätyn veden tilavuutta muutetaan vastaavasti. Pullot suljetaan tiiviisti ja niitä ravistetaan 20 oC:ssa. Olisi käytettävä ravistelu- tai sekoituslaitetta, jonka lämpötila pysyy käytettäessä vakiona. Kunkin pullon sisältö sentrifugoidaan tai suodatetaan 24 tunnin kuluttua ja polymeerin pitoisuus kirkkaassa vesifaasissa määritetään sopivalla määritysmenetelmällä. Jos vesifaasille ei ole olemassa sopivaa määritysmenetelmää, kokonaisliukoisuus/uuttuvuus voidaan arvioida suodatusjäännöksen tai sentrifugoidun sakan kuivapainosta. Tavallisesti on tehtävä kvantitatiivinen ero epäpuhtauksien ja lisäaineiden ja toisaalta pienimolekyylipainoisten aineiden välillä. Gravimetrisiä määrityksiä tehtäessä on tärkeää tehdä myös nollakoe ilman testattavaa ainetta, jotta voidaan määrittää koemenetelmästä johtuvat jäämät. Polymeerien liukenemis/uuttumisominaisuuksia vedessä 37 oC:ssa pH:ssa 2 ja 9 voidaan määrittää samalla tavalla kuin 20 oC:n kokeessa. pH-arvot voidaan säätää lisäämällä joko sopivia puskureita tai sopivia happoja tai emäksiä kuten suolahappoa, etikkahappoa, pro analyysi -laatuista natrium- tai kaliumhydroksidia tai NH3:a. Määritysmenetelmästä riippuen on tehtävä yksi tai kaksi testiä. Jos on olemassa riittävän spesifinen menetelmä polymeerikomponentin määrittämiseksi suoraan vesiliuoksesta, pitäisi yhden edellä kuvatun kaltaisen testin riittää. Jos tällaista menetelmää ei kuitenkaan ole käytettävissä ja jos polymeerin liukenemis/uuttumisominaisuuksien määritys rajoittuu epäsuoraan analyysiin eli ainoastaan orgaanisen hiilen kokonaismäärän (TOC) määrittämiseen vesiuutteesta, pitäisi tehdä lisätesti. Tämä lisätesti pitäisi myös tehdä kolmoismäärityksenä käyttäen kymmenen kertaa pienempiä polymeerinäytteitä ja samaa määrää vettä kuin ensimmäisessä testissä.
1.5.4 Määritys
1.5.4
1.5.4.1 Testi, jossa on yksi näytekoko Menetelmiä vesifaasissa olevan polymeerikomponentin suoraa määrittämistä varten voi olla olemassa. Vaihtoehtoisesti voidaan harkita myös liuenneiden/uuttuneiden polymeerikomponenttien epäsuoraa analyysiä, jolloin määritetään liukoisten osien kokonaispitoisuus ja korjataan ei-polymeerispesifisten komponenttien suhteen. Kokonaispolymeeri voidaan määrittää vesiliuoksesta: joko riittävän herkällä menetelmällä, esim. tai haihduttamalla vesiuute tyhjiössä kuiviin ja tekemällä jäännöksestä spektroskooppinen (IR, UV jne.) tai AAS/ICP-analyysi. Jos vesifaasia ei voida sellaisenaan analysoida, pitäisi vesiuute uuttaa veteen sekoittuvalla orgaanisella liuottimella, esim. klooratulla hiilivedyllä. Liuotin haihdutetaan ja jäännöksestä määritetään ilmoitetun polymeerin pitoisuus kuten edellä on selostettu. Jos tässä jäännöksessä tunnistetaan epäpuhtauksia tai lisäaineita, on niiden osuus vähennettävä itse polymeerin liukenemis/uuttumisasteen määrittämiseksi. Jos näytteessä on suhteellisen paljon tällaisia aineita, voi olla tarpeen tehdä jäännökselle esim. HPLC-tai GC-analyysi epäpuhtauksien erottamiseksi monomeeristä ja monomeeristä peräisin olevasta aineesta, jotta monomeerin todellinen pitoisuus voidaan määrittää. Joskus voi riittää, että orgaaninen liuotin haihdutetaan kuiviin ja kuiva jäännös punnitaan.
TOC käyttämällä persulfaatti- tai dikromaattidigestiota, jolloin muodostuva CO2 määritetään IR:llä tai kemiallisesti;
atomiabsorptiospektrometrialla (AAS) tai ICP (inductively coupled plasma) -emissiomenetelmällä, jos polymeeri sisältää piitä tai metallia;
UV-absorptio- tai spektrofluorometrialla, jos on kyseessä aryylipolymeeri;
LC-MS:llä, jos on kyseessä pienimolekyylipainoiset näytteet;
1.5.4.2 Testi, jossa on kaksi eri näytekokoa Kaikista vesiuutteista määritetään TOC. Näytteen liukenemattomalle osalle (joka ei uuttunut) tehdään gravimetrinen analyysi. Jos kunkin pullon sisällön sentrifugoinnin tai suodattamisen jälkeen polymeerijäännöksiä on tarttunut pullon seinämiin, pitäisi pullo huuhtoa suodoksella, kunnes siinä ei enää näy mitään jäännöstä. Sen jälkeen suodos sentrifugoidaan tai suodatetaan uudelleen. Suodattimeen tai sentrifuugiputkeen jäänyt jäännös kuivataan 40 oC:ssa tyhjiössä ja punnitaan. Kuivaamista jatketaan, kunnes saavutetaan vakiopaino.
2. MÄÄRITYSTULOKSET
2.
2.1 TESTI, JOSSA ON YKSI NÄYTEKOKO Ilmoitetaan erilliset tulokset kutakin kolmea pulloa kohti ja keskiarvot ilmaistuna massayksiköllä liuostilavuutta kohti (tyypillisesti mg/l) tai massayksiköllä polymeerinäytteen massaa kohti (tyypillisesti mg/g). Lisäksi pitäisi ilmoittaa näytteen painohävikki (liuenneen aineen paino jaettuna alkuperäisen näytteen painolla) Suhteelliset keskihajonnat (RSD) pitäisi laskea. Tulokset pitää antaa koko ainemäärää kohti (polymeeri + olennaiset lisäaineet jne.) ja pelkkää polymeeriä kohti (ts. sen jälkeen, kun on vähennetty tällaisten lisäaineiden vaikutus).
2.2 TESTI, JOSSA ON KAKSI NÄYTEKOKOA Ilmoitetaan erilliset TOC-arvot kahden kolmenkertaisilla näytteillä tehdyn kokeen vesiliuosuutteille ja kunkin kokeen keskiarvo ilmaistuna massayksiköllä liuostilavuutta kohti (tyypillisesti mgC/l) sekä massayksikköinä alkuperäisen näytteen painoa kohti (tyypillisesti mgC/g). Jos tuloksissa ei ole eroa, kun näytteen suhde vesimäärään on suuri tai pieni, tämä voi merkitä sitä, että kaikki uuttuvat komponentit ovat todella uuttuneet. Tällöin ei suora määritys ole yleensä tarpeen. Kunkin jäännöksen painot olisi ilmoitettava erikseen ja ilmaistava prosentteina näytteiden alkuperäispainoista. Keskiarvot lasketaan koetta kohti. Erotus sadan prosentin ja havaittujen prosenttimäärien välillä on alkuperäisen näytteen liukoisen ja uuttuvan aineksen prosenttimäärä.
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN
3.
3.1 TESTIRAPORTTI Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:
3.1
3.1.1 Testattava aine:
saatavissa olevat tiedot testattavasta aineesta (tunnistetiedot, lisäaineet, epäpuhtaudet, pienimolekyylipainoisen aineen pitoisuus)
3.1.2 Koeolosuhteet
kuvaus käytetyistä menetelmistä ja koeolosuhteista;
kuvaus analyyttisistä ja detektiomenetelmistä.
3.1.3 Tulokset:
liukoisuus/uuttuvuustulokset mg/l; yksittäiset arvot ja keskiarvot uuttumiskokeista eri liuoksissa, eritellen polymeeripitoisuus ja epäpuhtaudet, lisäaineet ym.,
liukoisuus/uuttuvuustulokset mg/g polymeeriä,
vesiliuosuutteiden TOC-arvot, liuenneen aineen paino ja lasketut prosenttiosuudet, jos ne on mitattu,
kunkin näytteen pH,
tiedot nollanäytteistä,
tarvittaessa kirjallisuudesta saatavat tiedot testattavan aineen kemiallisesta epästabiilisuudesta sekä testausprosessin aikana että analyysin aikana,
muut tiedot, jotka ovat tärkeitä tulosten tulkitsemisen kannalta.
4.(1) KIRJALLISUUSVIITTEET DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.
A.21. HAPETTAVAT OMINAISUUDET (NESTEET)
A.21.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Tämän testimenetelmän tarkoituksena on mitata nestemäisen aineen kyky suurentaa palavan aineen palamisnopeutta tai -intensiteettiä tai sen kykyä muodostaa palavan aineen kanssa sellainen seos, joka voi syttyä itsestään, kun aineet sekoitetaan täydellisesti. Menetelmä perustuu YK:n testiin hapettaville nesteille (1) ja vastaa sitä täysin. Koska menetelmä A.21 on kuitenkin tarkoitettu pääasiassa täyttämään asetuksen 1907/2006 vaatimukset, testattavaa ainetta on tarpeen verrata vain yhteen vertailuaineeseen. Testaaminen ja aineen vertaaminen muihin vertailuaineisiin voi olla tarpeen, jos on odotettavissa, että testien tuloksia käytetään muihin tarkoituksiin. Tätä testiä ei tarvitse tehdä, jos rakennekaavaa tarkastelemalla voidaan päätellä kohtuullisella varmuudella, että aine ei voi reagoida eksotermisesti palavan aineen kanssa. On hyvä, jos aineen mahdollisista räjähdysominaisuuksista on saatavilla alustavaa tietoa ennen testin tekemistä. Tätä testi ei sovellu kiinteille aineille, kaasuille, räjähtäville tai erittäin helposti syttyville aineille eikä orgaanisille peroksideille. Tätä testiä ei mahdollisesti tarvitse tehdä, jos ainetta koskevia tuloksia on jo olemassa YK:n hapettavia nesteitä koskevasta testistä (1).
1.2 MÄÄRITELMÄT JA MITTAYKSIKÖT Keskimääräinen paineennousuaika on niiden aikojen keskiarvo, jotka on mitattu, kun testattavan seoksen paine on nostettu 690 kPa:sta 2070 kPa:an ilmanpaineen yläpuolella.
1.3 VERTAILUAINE Vertailuaineeksi tarvitaan 65-painoprosenttista typpihappoa (vesiliuos; analyyttinen laatu). Jos kokeen tekijä kuitenkin arvelee, että testin tuloksia saatetaan käyttää muihin tarkoituksiin, muidenkin vertailuaineiden testaaminen voi olla aiheellista.
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE Testattava neste sekoitetaan massasuhteessa 1:1 kuituselluloosan kanssa ja siirretään paineastiaan. Jos aineet syttyvät itsestään sekoitettaessa tai astiaa täytettäessä, ei testiä tarvitse jatkaa. Jos testattava seos ei syty itsestään, tehdään koko testi. Seosta kuumennetaan paineastiassa ja määritetään keskimääräinen aika, joka tarvitaan, että paine nousee 690 kPa:sta 2070 kPa:an ilmanpaineen yläpuolella. Tätä verrataan siihen keskimääräiseen aikaan, joka tarvitaan, että vertailuaine(id)en ja selluloosan 1:1-seos paine nousee saman verran.
1.5 LAATUKRITEERIT Viiden kokeen sarjassa yhdellä aineella mikään tulos ei saa erota enempää kuin 30 % aritmeettisesta keskiarvosta. Tulokset, jotka eroavat yli 30 % keskiarvosta, on hylättävä, sekoitus- ja täyttömenetelmää on parannettava ja testi uusittava.
1.6 MENETELMÄN KUVAUS
1.6
1.6.1 Valmistelu
1.6.1
1.6.1.1 Palava aine Palavana aineena käytetään kuivattua kuituselluloosaa, jonka kuidun pituus 50–250 μm ja keskihalkaisuja 25 μm. Selluloosa kuivataan vakiopainoon kerroksena, joka on enintään 25 mm paksu, 105 oC:ssa 4 tuntia, ja sitä pidetään eksikkaattorissa kuivatusaineen kanssa, kunnes se on jäähtynyt ja kunnes sitä tarvitaan. Kuivatun selluloosan vesipitoisuuden pitäisi olla alle 0,5 % kuivasta massasta. Tarvittaessa kuivatusaikaa on pidennettävä, jotta tähän päästään. Koko testin aikana on käytettävä samaa selluloosaerää.
1.6.1.2 Laitteet
1.6.1.2
1.6.1.2.1 Paineastia Testiin tarvitaan lieriönmuotoinen teräksinen paineastia, jonka pituus on 89 mm ja ulkohalkaisija 60 mm (ks. kuva 1). Vastakkaisille sivuille työstetään kaksi tasaista pintaa (jolloin astian poikkileikkaus pienenee 50 mm:iin) kiinnipitämisen helpottamiseksi, kun sytytystulppaa ja ilmaustulppaa pannaan paikoilleen. Astian sisäläpimitta on 20 mm ja kummankin pään sisäpuoli on kyntetty 19 mm:n syvyydeltä ja siinä on kierteet, joihin sopii 1" British Standard Pipe (BSP) tai vastaava metrijärjestelmän mukainen osa. Paineastian pyöreään pintaan 35 mm:n päähän astian toisesta päästä ja 90 asteen kulmassa työstettyihin pintoihin on ruuvattu sivuhaara, jonka kautta paine voidaan päästää ulos. Sivuhaaraputken istukka porataan 12 mm:n syvyyteen siten, että siihen sopii 1/2":n BSP (tai metrijärjestelmän vastaava) kierre sivuhaaran päässä. Tarvittaessa lisätään inertti tiiviste, jotta liitos on kaasutiivis. Sivuhaara ulottuu 55 mm:n päähän paineastian ulkopuolelle, ja sen sisäläpimitta on 6 mm. Sivuhaaran pää on kyntetty ja sen kierteet ovat sellaiset, että niihin sopii kalvotyyppinen paineenmuunnin. Mitä tahansa paineenmittauslaitetta voidaan käyttää edellyttäen, etteivät kuumat kaasut tai hajoamisessa syntyvät yhdisteet vaikuta siihen ja että se pystyy mittaamaan paineennousunopeuksia 690–2070 kPa:n välillä alle 5 ms:ssa. Kauempana sivuhaarasta oleva paineastian pää suljetaan sytytystulpalla, jossa on kaksi elektrodia. Toinen niistä on eristetty tulpan pääosasta ja toinen on maadoitettu siihen. Paineastian toisessa päässä on varokalvo (murtumispaine noin 2200 kPa), jota pitää paikallaan sisäläpimitaltaan 20 mm:n tulppa. Tarvittaessa sytytystulpan kanssa käytetään inerttiä tiivistettä, jotta liitos on kaasutiivis. Tukiteline (kuva 2) pitää kokoonpanon oikeassa asennossa käytön aikana. Siihen kuuluu tavallisesti pehmeää terästä oleva pohjalaatta, jonka mitat ovat 235 mm x 184 mm x 6 mm, ja 185 mm:n pituinen poikkileikkaukseltaan neliönmuotoinen onttotanko, jonka mitat ovat 70 mm x 70 mm x 4 mm. Neliöonttotangon toisessa päässä siitä leikataan pala vastakkaisilta puolilta siten, että saadaan rakenne, jossa on kaksi litteäreunaista jalkaa, joiden yläpuolella on 86 mm koskematonta neliöonttotankoa. Jalat leikataan siten, että ne muodostavat 60o:n kulman vaakatason kanssa, kun tanko on hitsattu pohjalaattaan. Pohjarakenteen yläosan yhdelle laidalle työstetään lovi, jonka leveys on 22 mm ja syvyys 46 mm, siten, että kun paineastiakokoonpano lasketaan onttotankotelineeseen sytytystulppa edellä, sivuhaara sopii loveen. Onttotangon alempaan sisäpintaan hitsataan 30 mm leveä ja 6 mm paksu teräspala, joka toimii välikkeenä. Kaksi vastakkaisilla pinnoilla olevaa 7 mm:n siipiruuvia pitää paineastian tukevasti paikallaan. Kaksi 12 mm leveää 6 mm:n paksuisesta teräksestä tehtyä nauhaa, jotka on hitsattu onttotangon pohjaosaan kiinnittyviin sivuosiin, tukee paineastiaa alhaalta päin.
1.6.1.2.2 Sytytysjärjestelmä Sytytysjärjestelmä koostuu 25 cm pitkästä Ni/Cr-langasta, jonka halkaisija on 0,6 mm ja vastus 3,85 ohm/m. Lanka on kierretty halkaisijaltaan 5 mm:n tangon avulla kelaksi ja kiinnitetty sytytystulpan elektrodeihin. Kelan muodon pitäisi olla sellainen kuin kuvassa 3 esitetään. Astian pohjan ja sytytyskelan alapään välisen etäisyyden pitäisi olla 20 mm. Ellei elektrodeja voi säätää, pitäisi kelan ja astian pohjan välillä olevan sytytyslangan päät eristää keraamivaipalla. Lankaa kuumennetaan tasavirtatehonlähteellä, joka pystyy tuottamaan vähintään 10 A:n voimakkuista virtaa.
1.6.2 Testin suoritusarvot Laitetta, joka on koottu täydellisesti ja jossa on paineenmuunnin ja kuumennusjärjestelmä, mutta johon ei ole asennettu varokalvoa, tuetaan sytytystulppapuoli alaspäin. 2,5 g testattavaa nestettä ja 2,5 g kuivattua selluloosaa sekoitetaan lasidekanterissa käyttäen lasista sekoitussauvaa. Turvallisuussyistä työntekijän ja seoksen välillä on oltava suojalevy sekoituksen aikana. Jos seos syttyy sekoituksen tai täytön aikana, ei testiä tarvitse jatkaa. Seos siirretään paineastiaan pieni määrä kerrallaan taputtaen, jotta seos pakkautuisi sytytyskelan ympärille ja olisi hyvin kosketuksissa sen kanssa. On tärkeää, ettei kela vääristy seoksen pakkaamisen aikana, koska se voisi aiheuttaa vääriä tuloksia. Varokalvo asetetaan paikalleen ja kiinnitystulppa kierretään tiukasti paikalleen. Täytetty astia asetetaan tukitelineeseen siten, että varokalvo on ylöspäin. Teline olisi sijoitettava sopivaan vahvistettuun vetokaappiin tai sytytyskammioon. Tehonlähde yhdistetään sytytystulpan ulompiin päihin ja annetaan 10 A:n virtaa. Aika, joka kuluu sekoituksen aloittamisesta tehon kytkemiseen, ei saisi olla pitempi kuin 10 min. Paineenmuuntimen aikaansaama signaali rekisteröidään sopivalla järjestelmällä, joka mahdollistaa sekä arvioinnin että saadun aika-painekäyrän pysyvän rekisteröinnin (esim. transienttitallennin, joka on kytketty piirturiin). Seosta kuumennetaan, kunnes varokalvo murtuu tai ainakin 60 s. Jos varokalvo ei murru, seoksen on annettava jäähtyä ennen kuin laite puretaan varovasti ja varoen erityisesti mahdollista paineen vapautumista. Testattavalla aineella ja vertailuaineella (-aineilla) tehdään viisi koetta. Kirjataan aika, joka kuluu siihen, että paine nousee 690 kPa:sta 2070 kPa:iin ilmanpaineen yläpuolella. Lasketaan paineennousuun kuluvien aikojen keskiarvo. Joissakin tapauksissa aineet saattavat aiheuttaa paineen nousun (liian suuren tai liian pienen), joka aiheutuu sellaisista kemiallisista reaktioista, jotka eivät liity aineen hapettaviin ominaisuuksiin. Tällöin voi olla tarpeen toistaa testi inertillä aineella, esim. piimaalla (kieselguhr), selluloosan sijasta reaktion laadun selvittämiseksi.
2. MITTAUSTULOKSET Paineen nousuun kuluneet ajat sekä testiaineelle että vertailuaineelle (-aineille). Paineen nousuun kuluneet ajat mahdollisille inertin aineen kanssa tehdyille testeille.
2.
2.1 Taulukko 1 Esimerkkejä tuloksista
TULOSTEN KÄSITTEY Lasketaan paineen nousuun kuluneiden aikojen keskiarvot sekä testiaineelle että vertailuaineelle (-aineille). Lasketaan paineen nousuun kuluneiden aikojen keskiarvot mahdollisille inertin aineen kanssa tehdyille testeille. Taulukossa 1 esitetään joitakin esimerkkejä tuloksista. Aine Keskimääräinen paineen nousuun kulunut aika 1:1 -selluloosaseokselle (ms) Ammoniumdikromaatti, kyllästetty vesiliuos 20800 Kalsiumnitraatti, kyllästetty vesiliuos 6700 Ferrinitraatti, kyllästetty vesiliuos 4133 Litiumperkloraatti, kyllästetty vesiliuos 1686 Magnesiumperkloraatti, kyllästetty vesiliuos 777 Nikkelinitraatti, kyllästetty vesiliuos 6250 Typpihappo, 65 % 4767 Perkloorihappo, 50 % 121 Perkloorihappo, 55 % 59 Kaliumnitraatti, 30 % vesiliuos 26690 Hopeanitraatti, kyllästetty vesiliuos — Natriumkloraatti, 40 % vesiliuos 2555 Natriumnitraatti, 45 % vesiliuos 4133 Inertti aine Vesi: selluloosa —
3. TESTISELOSTE
3.
3.1 TESTISELOSTE Testiselosteessa on ilmoitettava seuraavat tiedot:
testattavan aineen tunnistetiedot, koostumus, puhtausaste jne.
testiaineen pitoisuus,
selluloosan kuivausmenetelmä,
käytetyn selluloosan vesipitoisuus,
mittaustulokset,
inertin aineen kanssa mahdollisesti tehtyjen testien tulokset,
paineen nousuun kuluvista ajoista lasketut keskiarvot,
mahdolliset poikkeamat tästä menetelmästä ja syyt niihin,
kaikki lisätiedot ja huomautukset, jotka voivat vaikuttaa tulosten tulkintaan.
3.2 TULOSTEN TULKINTA Testitulosten arvioinnissa Nestemäisen aineen katsotaan olevan hapettava, kun Väärien positiivisten tulosten välttämiseksi on tuloksia tulkittaessa tarkasteltava tarvittaessa myös tuloksia, jotka on saatu testattaessa ainetta inertin materiaalin kanssa.
3.2 a)
todetaan, syttyykö testiaineen ja selluloosan seos itsestään ja
b)
verrataan paineen nousuun (690 kPa – 2070 kPa) kuluneiden aikojen keskiarvoja vertailuaine(id)en vastaaviin arvioihin.
a)
testattavan aineen ja selluloosan 1:1-seos (massana) syttyy itsestään tai
b)
testattavan aineen ja selluloosan 1:1-seoksella (massana) on pienempi tai yhtä suuri keskimääräinen paineen nousuun kuuluva aika kuin 65-painoprosenttisen typpihapon ja selluloosan 1:1-seoksella (massana).
4.(1) KIRJALLISUUS Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3. tarkistettu painos. YK:n julkaisu nro ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, sivu 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids. Huom: kokoonpanosta voidaan käyttää kumpaa hyvänsä.
4.(1)
Kuva1 Paineastia
(A) Paineastian runko-osa (B) Varokalvoa paikallaan pitävä tulppa (C) Sytytystulppa (D) Pehmeä lyijytiiviste (E) Varokalvo (F) Sivuhaara (G) Paineenmuuntimen pää (H) Tiivistysrengas (J) Eristetty elektrodi (K) Maadoitettu elektrodi (L) Eristys (M) Teräskartio (N) Eristysrenkaan ura
Kuva 2 Tukiteline
Kuva 3 Sytytysjärjestelmä
(A) Sytytyskela (B) Eristys (C) Elektrodit (D) Sytytystulppa
Liite Lisää teknisiä tietoja on seuraavissa standardeissa.
1. Kapillaarimenetelmät
1.
1.1 Nestehauteella varustetut sulamislämpötilalaitteet ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products.
1.2 Metallikappaleeseen perustuvat sulamislämpötilalaitteet DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determination of melting point
2. Kuuma-alustat
2.
2.1 Koflerin kuumasauva ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings
2.2 Sulamismikroskooppi DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
2.3 Meniskimenetelmä (polyamidit) ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du point de fusion. méthode du ménisque.
3. Jäätymislämpötilan määritysmenetelmät BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallsation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point
4. Terminen analyysi
4.
4.1 Terminen differentiaalianalyysi ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
4.2 Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
5. Jähmettymispisteen määritys NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: point de trouble et point d'ecoulement limite — Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils — Determination of pour point.
Liite Lisää teknisiä tietoja on seuraavissa standardeissa.
1. Ebulliometri ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes
2. Tislausprosessi (kiehumisalue) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation
3. Differentiaaliterminen analyysi ja differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria ASTM F 537 76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definition of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe
Liite Lisää teknisiä tietoja on seuraavissa standardeissa:
1. Nesteeseen perustuvat menetelmät
1.
1.1 Hydrometri DIN 12790, IS0 387 Hydrormeter; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Chemical products for industrial use — Determination of density of liquids — Areometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers
1.2 Hydrostaattinen vaaka
1.2 Kiinteät aineet
ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Chemical products for industrial use — Determination of density and relative density of solids other than powders and cellular products — Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density
Nestemäiset aineet
ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 ja ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
1.3 Uppokappalemenetelmät DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method
2. Pyknometriset menetelmät
2.
2.1 Nestemäiset aineet ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100 × 10-6 m2 s-1 at 15 oC) DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100 × 10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC) DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have a too high vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol-water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side rube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products — chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary — stoppered pycnometer method NF T 20-053 Chemical products for industrial use — Determination of density of solids in powder and liquids — Pycnometric method
2.2 Kiinteät aineet ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-053 Chemical products for industrial use — Determination of density of solids in powder and liquids — Pycnometric method DIN 19683 Determination of the density of soils
3. Kaasuvertailupyknometri DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung
Liite 1 Arviointimenetelmä
JOHDANTO
Höyrynpaineen laskettuja arvoja voidaan käyttää, kun halutaan
päättää, mikä kokeellisista menetelmistä on sopiva,
saada arvio tai raja-arvo tapauksissa, joissa kokeellista menetelmää ei voida käyttää teknisistä syistä (esimerkiksi jos höyrynpaine on hyvin alhainen),
apua sellaisten tapausten tunnistamisessa, joissa kokeellisia mittauksia ei tarvita, koska höyrynpaine huoneenlämmössä on todennäköisesti pienempi kuin 10-5.
ARVIOINTIMENETELMÄ
Nesteiden ja kiinteiden aineiden höyrynpaine voidaan arvioida muunnetun Watson-korrelaation (a) avulla. Ainoa tarvittava kokeellinen tieto on normaali kiehumispiste. Menetelmää voidaan käyttää painealueella 105–10-5 Pa. Tarkemmat tiedot menetelmästä on kirjassa Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b).
LASKENTA
Höyrynpaine voidaan kirjallisuusviitteen (b) mukaan laskea seuraavan suureyhtälön mukaan: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb jossa T = lämpötila Tb = normaali kiehumispiste Pvp = höyrynpaine lämpötilassa T ΔHvb = höyrystymislämpö ΔZb = puristuvuustekijä (arvioitu arvo = 0,97) m = empiirinen kerroin, joka vaihtelee fysikaalisen olomuodon mukaan kyseisessä lämpötilassa. Lisäksi Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb jossa KF on empiirinen vakio, jolla otetaan huomioon aineen polaarisuus. Viitteessä (b) on lueteltu KF-vakiot useille sekoitetyypeille. Usein on saatavana tietoja kiehumispisteestä alennetussa paineessa. Tällöin höyrynpaine voidaan viitteen (b) mukaan laskea seuraavasti: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 jossa T1 on kiehumispiste alennetussa paineessa P1.
RAPORTTI
Kun käytetään laskentamenetelmää, raporttiin tulee sisällyttää yksityiskohtaiset selvitykset laskennasta.
KIRJALLISUUS
(a) K. M. Watson, Ind. Eng. Chem., 1943, vol. 35, 398.
(b) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.
Liite 2
Kuva 1 Laite dynaamisen menetelmän mukaan tehtävää höyrynpainekäyrän määritystä varten.
1. = Termopari 2. = Tyhjön puskuntilavuus 3. = Painemittari 4. = Tyhjö 5. = Mittapiste 6. = Kuumennusvastus, noin 150 W
Kuva 2a Laite staattisen menetelmän mukaan U-putkimanometrin avulla tehtävää höyrynpainekäyrän määritystä varten.
1. Näyte 2. Höyryfaasi 3. Tyhjöventtiili 4. U-putki (apumanometri) 5. Manometri 6. Lämpötilahaude 7. Lämpötilamittari 8. Tyhjöpumppuun johtava linja 9. Ilmaus
Kuva 2b Laite staattisen menetelmän mukaan paineenosoittimen avulla tehtävää höyrynpainekäyrän määritystä varten
1. Näyte 2. Höyryfaasi 3. Tyhjöventtiili 4. Painemittari 5. Paineenosoitin 6. Lämpötilahaude 7. Lämpötilamittari
Kuva 3 Isoteniskooppi (katso viitettä 7)
1. Paineensäätöön ja mittausjärjestelmään johtava linja 2. Halk. 8 mm putki 3. Painejärjestelmän kuiva typpi 4. Näytteen höyry 5. Pieni nokka 6. Nestemäinen näyte
Kuva 4 Laite höyrynpainevaakaan perustuvan menetelmän mukaan tehtävää höyrynpainekäyrän määritystä varten
1. Näyte 2. Höyryfaasi ja höyryvirtaus 3. Pyörivällä sisääntulolla varustettu haihdutinuuni 3a. Aukolla varustettu uunin kansi 4. Uunin kuumennus (jäähdytys) 5. Näytteen lämpötilan mittaus 6. Jäähdytyslaatikko 7. Suoja 8. Jäähdytyslaatikon kylmätanko 9. Vaakakuppi 10. Mikrovaaka 11. Rekisteröintilaitteeseen 12. Tyhjöpumppuun
Kuva 5 Esimerkki alhaisen paineen effuusiomenetelmän mukaan toimivasta haihdutuslaitteesta, jonka effuusiokennon tilavuus on 8 cm3
1. Tyhjöliitäntä 2. Suojatasku platinavastuslämpömittaria tai lämpötilan mittausta ja säätöä (2) varten 3. Tyhjösäiliön kansi 4. O-rengas 5. Tyhjösäiliö (alumiinia) 6. Effuusiokennojen asetus- ja poistolaite 7. Kierrekansi 8. Siipimutterit (6) 9. Pultit (6) 10. Effuusiokennot (ruostumatonta terästä) 11. Kuumennuskasetit (6)
Kuva 6a Esimerkki virtausjärjestelmästä, jolla määritetään höyrynpaine kaasunkyllästysmenetelmän mukaan
1. Virtaussäädin 2. Lämmönvaihdin 3. Neulaventtiilit 4. Suhteellisen kosteuden ilmaisin 5. Kyllästyskolonnit 6. PTFE-liitännät 7. Virtausmittari 8. Loukku (imeytin) 9. Öljyloukku 10. Kuplavirtausmittari Poistoaukko Jakotukki
Kuva 6b Esimerkki järjestelmästä, jolla määritetään höyrynpaine kaasunkyllästymismenetelmällä ja jossa on kapillaariputki kyllästyskammion jälkeen
1. Termisen massan virtausmittari 2. Manometri 3. Lämpötilasäädetty kammio 4. Kantokaasun lämpötilan säätökäämi 5. Lämpömittari (Pt 100) 6. Kaasunkyllästyskammio 7. Kapillaariputki 8. Absorptioastiat 9. Kaasumittari 10. Kylmäloukku
Kuva7 Esimerkki kokeellisesta järjestelystä pyörivän roottorin menetelmää varten
Höyrynpainelaite A. Pyörivällä roottorilla varustettu mittapää B. Näytekenno C. Termostaatti D. Tyhjölinja (turbopumppu) E. Ilmatermostaatti
Kuva 8 Esimerkki pyörivällä roottorilla varustetusta mittapäästä
1. Pallo 2. Liitäntälaipan evakuoitu jatkokappale 3. Kestomagneetit (2) 4. Käämit (2) pystysuoraa stabilointia varten 5. Käyttökäämit (4) 6. Liitäntälaippa
Liite
Kuva 1 Kolonnieluutiomenetelmä ja kiertopumppu
Paineen tasaus Virtausmittari Mikrokolonni Termostaatilla varustettu kiertopumppu Kiertopumppu Kaksitieventtiili näytteenottoa varten
Kuva 2 Tyypillinen mikrokolonni
(Kaikki mitat ovat millimetreinä.) Lasihios Ylätila Sisätila 5 Ulkotila 19 Lasivillatulppa Kaksitiesulkuventtiili
Kuva 3 Tyypillinen mikrokolonni
(Kaikki mitat ovat millimetreinä.) Lasihios Ylätila Sisätila 5 Ulkotila 19 Sulkuventtiili
Kuva 4 Kolonnieluutiomenetelmä ja tasausastia
1. Tasausastia (esimerkiksi 2,5 litran pullo) 2. Kolonni (katso kuvaa 3) 3. Fraktionkeräin 4. Termostaatti 5. Teflonputki 6. Lasihios 7. Vesilinja (termostaatin ja kolonnin välillä, sisähalkaisija noin 8 mm)
Liite 1 Laskenta- ja arviointimenetelmät
JOHDANTO
Julkaisussa Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) on yleinen johdatus aiheeseen (laskentamenetelmiä, tietoja ja esimerkkejä). Laskettuja Pow-arvoja voidaan käyttää seuraviin tarkoituksiin:
päättäminen soveltuvasta kokeellisesta menetelmästä (ravistuspullomenetelmän alue: log Pow: - 2...4, HPLC-menetelmän alue: log Pow: 0...6),
sopivien testiolosuhteiden (esimerkiksi HPLC-menetelmän vertailuaineiden ja ravistuspullomenetelmän n-oktanoli-vesisuhteen) valinta,
laboratorion sisäiset tarkistukset menetelmävirheiden löytämiseksi,
Pow-arvion antaminen tapauksissa, joissa kokeellisia menetelmiä ei voida soveltaa teknisistä syistä.
ARVIOINTIMENETELMÄ Jakaantumiskertoimen alustava arviointi
Jakaantumiskertoimen arvo voidaan arvioida näytteen liukoisuudesta puhtaisiin liuottimiin, joka voidaan laskea seuraavan suureyhtälön avulla: Parvio = kyllästys cn-oktanolikyllästys cvesi
LASKENTAMENETELMÄT Laskentamenetelmien periaate
Kaikki laskentamenetelmät perustuvat molekyylin muodolliseen fragmentointiin sopiviin alarakenteisiin, joille on tiedossa luotettavat log Pow -differentiaalit. Koko molekyylin log Pow -arvo voidaan tämän jälkeen laskea fragmenttiarvojensa summana lisättynä korjaustermeillä, jotka perustuvat molekyylin sisäisiin vuorovaikutuksiin. Luettelot fragmenttivakioista ja korjaustermeistä ovat saatavana lähteistä (b), (c), (d) ja (e). Joitakin niistä päivitetään säännöllisesti.
Laatukriteerit
Yleisesti ottaen laskentamenetelmien luotettavuus heikkenee tutkittavan yhdisteen monimutkaisuuden kasvaessa. Kun tutkitaan yksinkertaisia molekyyleja, joilla on alhainen molekyylipaino ja yksi tai kaksi funktionaalista ryhmää, voidaan odottaa, että poikkeama fragmentaatiomenetelmien ja mitatun arvon välillä on 0,1-0,3 log Pow -yksikköä. Kun käsitellään monimutkaisempia molekyyleja, virhemarginaali voi olla tätä suurempi. Tämä vaihtelee fragmenttivakioiden luotettavuuden ja saatavuuden mukaan sekä sen mukaan, miten hyvin molekyylin sisäiset vuorovaikutukset (esimerkiksi vetysidokset) ovat tunnistettavissa ja miten hyvin korjaustermejä osataan käyttää (ongelma pienenee käytettäessä tietokoneohjelmaa CLOGP-3) (b). Kun käsitellään ionisoivia yhdisteitä, on tärkeää, että lataus tai ionisointiaste otetaan huomioon oikealla tavalla.
Laskentamenetelmät
Hanschin π-menetelmä
Alkuperäinen hydrofobinen substituenttivakio, π, jonka ovat esittäneet Fujita et al. (f), määritetään seuraavasti: πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH) jossa Pow (PhX) on aromaattisen johdannaisen jakaantumiskerroin ja Pow (PhH) on emoyhdisteen jakaantumiskerroin. Esimerkki: (πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84-2,13 = 0,71. Tämän määritelmän mukaan p-menetelmä soveltuu lähinnä aromaattiseen substituutioon, p-arvot suurelle määrälle substituentteja on yhdistetty taulukkomuotoon (b), (c), (d). Arvoja käytetään aromaattisten molekyylien tai alarakenteiden log Pow -arvojen laskentaan.
Rekker-menetelmä
Rekkerin mukaan (g) log Pow -arvo lasketaan seuraavasti: log Pow=Σi ai fi+Σj (vuorovaikutustermit) jossa f1 edustaa eri molekyylifragmenttivakioita ja a1 niiden esiintymistaajuutta tutkittavassa molekyylissa. Korjaustermit voidaan esittää yhden ainoan vakion Cm integraalikerrannaisina (niin sanottuna maagisena vakiona). Fragmenttivakiot f1 ja Cm on määritetty 1054 kokeellista Pow-arvoa (825 yhdistettä) sisältävän luettelon perusteella moninkertaista regressioanalyysiä (c), (h) käyttäen. Vuorovaikutustermin määritys tehdään lähdekirjallisuudessa kuvatun säännöstön mukaan (e), (h), (i).
Hansch-Leon menetelmä
Hanschin ja Leon mukaan (c) log Pow lasketaan seuraavan suureyhtälön mukaan: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj jossa f1 edustaa eri molekyylifragmenttivakioita, Fj korjaustermejä ja ai, bj vastaavia esiintymistaajuuksia. Yrityksen ja erehdyksen kautta on koottu kokeellisista Pow-arvoista johdettujen atomien ja ryhmien fragmenttiarvojen luettelo sekä korjaustermien Fj (niin sanottujen kertoimien) luettelo. Korjaustermit on jaettu useaan eri luokkaan (a), (c). Kaikkien näiden sääntöjen ja korjaustermien huomioonottaminen on melko monimutkaista ja hidasta. Tehtävää helpottavat markkinoilla myytävät erikoisohjelmat (b).
Yhdistetty menetelmä
Monimutkaisten molekyylien Pow-laskentaa voidaan helpottaa huomattavasti jakamalla molekyylit suurehkoihin alarakenteisiin, joille on saatavana luotettavia Pow-arvoja joko taulukoista (b), (c) tai omista mittauksista. Tällaiset fragmentit (esimerkiksi heterosykliset renkaat, antrakinoni ja atsobentseeni) voidaan sen jälkeen yhdistää Hanschin π-arvoihin tai Rekkerin tai Leon fragmenttivakioihin.
Huomautuksia
i)
Laskentamenetelmiä voidaan soveltaa vain osittain tai kokonaan ionisoituihin yhdistelmiin, edellyttäen, että tarpeelliset korjauskertoimet voidaan ottaa huomioon.
ii)
Jos voidaan olettaa, että molekyylin sisällä on vetysidoksia, on lisättävä vastaavat korjaustermit (noin +0,6...+ 0,1 log Pow -yksikköä). Indikaatiot vetysidosten olemassaolosta saadaan stereomalleista tai molekyylin spektroskooppisista tiedoista.
iii)
Jos useat tautomeeriset muodot ovat mahdollisia, todennäköisintä muotoa käytetään laskennan perustana.
iv)
Fragmenttivakioluetteloiden päivityksiä on seurattava huolella.
Raportti
Kun käytetään laskenta- tai arviointimenetelmiä, testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
aineen kuvaus (seos, epäpuhtaudet jne.),
indikaatiot mahdollisten vetysidosten olemassaolosta, dissosiaatiosta, latauksesta tai muista epätavallisista ilmiöistä (esimerkiksi tautomeria),
laskentamenetelmän kuvaus,
tietokannan nimi tai lähde,
fragmenttivalinnan erikoispiirteitä,
yksityiskohtainen selvitys laskennasta.
LÄHDEKIRJALLISUUS
(a) W. J. Lyman, W. F. Reehl and D. H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).
(c) C. Hansch, A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.
(e) R. F. Rekker, H. M. de Kort, Eur. J. Med. Chem.- Chim Ther, 1979, vol. 14, 479.
(f) T. Fujita, J. lwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.
(g) R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.
(h) C. V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.
(i) R. A. Scherrer, ACS — American Chemical Society, Washington, D. C. 1984, Symposium Series 255, p. 225.
Liite 2 Suositeltavia vertailuaineita HPLC-menetelmää varten
Nro Vertailuaine log Pow pKa 1 2-butanoni 0,3 2 4-asetyylipyridini 0,5 3 Aniliini 0,9 4 Asetanilidi 1,0 5 Bentsyylialkoholi 1,1 6 p-metoksifenoli 1,3 pKa = 10,26 7 Fenoksietikkahappo 1,4 pKa = 3,12 8 Fenoli 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenoli 1,5 pKa = 3,96 10 Bentsonitriili 1,6 11 Fenyyliasetonitriili 1,6 12 4-metyylibentsyylialkoholi 1,6 13 Asetofenoni 1,7 14 2-nitrofenoli 1,8 pKa = 7,17 15 3-nitrobentsoehappo 1,8 pKa = 3,47 16 4-kloorianiliini 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobentseeni 1,9 18 Kanelihappo 1,9 19 Bentsoehappo 1,9 pKa = 4,19 20 p-kresoli 1,9 pKa = 10,17 21 Kanelihappo 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Anisoli 2,1 23 Metyylibentsoaatti 2,1 24 Bentseeni 2,1 25 3-metyylibentsoehappo 2,4 pKa = 4,27 26 4-klorofenoli 2,4 pKa = 9,1 27 Trikloroetyleeni 2,4 28 Atrasiini 2,6 29 Etyylibentsoaatti 2,6 30 2,6-diklorobentsonitriili 2,6 31 3-klorobentsoehappo 2,7 pKa = 3,82 32 Tolueeni 2,7 33 1-naftoli 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dikloroanilini 2,8 35 Klorobentseeni 2,8 36 Allyylifenyylieetteri 2,9 37 Bromobentseeni 3,0 38 Etyylibentseeni 3,2 39 Bentsofenoni 3,2 40 4-fenyylifenoli 3,2 pKa = 9,54 41 Tymoli 3,3 42 1,4-diklorobentseeni 3,4 43 Difenyyliamiini 3,4 pKa = 0,79 44 Naftaleeni 3,6 45 Fenyylibentsoaatti 3,6 46 Isopropyylibentseeni 3,7 47 2,4,6-trikloorifenoli 3,7 pKa = 6 48 Bifenyyli 4,0 49 Bentsyylibentsoaatti 4,0 50 2,4-dinitro-6 sek. butyylifenoli 4,1 51 1,2,4-triklooribentseeni 4,2 52 Dodekaanihappo 4,2 53 Difenyylieetteri 4,2 54 n-butyylibentseeni 4,5 55 Fenantreeni 4,5 56 Fluoranteeni 4,7 57 Dibentsyyli 4,8 58 2,6-difenyylipyridiini 4,9 59 Trifenyyliamiini 5,7 60 DDT 6,2 Muita vertailuaineita, joilla on pieni log Pow -arvo 1 Nikotiinihappo -0,07
Liite
Kuva Muotti ja tarvikkeet näytteen valmistelua varten
(Kaikki mitat ovat millimetreinä) Muotin pituus: 250 mm Aine: alumiini
Liite
Kuva Laite
Liite
Esimerkki ainespesifikaatiosta lämpöherkkyystestiä varten (katso standardia DIN 1623) (1)(2)(3)
Putki: ainespesifikaatio nro 1.0336.505 g Mittauslaippa: ainespesifikaatio nro 1.4873 Kierrelaippa ja mutteri: ainespesifikaatio nro 1.3817
Kuva 1 Lämpöherkkyyden mittauslaite
(kaikki mitat ovat millimetreinä) Kuva 1a Teräsputki varusteineen 1. putki 1a. ulkolaippa 2. kierrelaippa; matalakitkakierre 3. mittauslaippa = halkaisija 2,0 tai 6,0 mm 4. mutteri b = halkaisija 10 mm 5. viistetty pinta 6. 2 upporuuvia, avainkoko 41 Kuva 1b Kuumennus- ja suojalaite 7. 2 upporuuvia, avainkoko 36 8. sirpaleenkestävä laatikko 9. putken 2 tukitankoa 10. asennettu putki 11. takapolttimen paikka; muut polttimet ovat näkyvissä 12. joutokäyntisuutin
Kuva 1a Teräsputki varusteineen Kuva 2
Lämpöherkkyystesti Esimerkkejä sirpaleenmuodostuksesta Ei räjähdystä Ei räjähdystä Räjähdys Räjähdys Räjähdys Räjähdys
Kuva 3 Kuumennusnopeuden kalibrointi lämpöherkkyystestiä varten
Lämpötila (°C) Aika (s) Lämpötila-aikakäyrä, joka on saatu kuumentamalla dibutyyliftalaattia (27 cm3) suljetussa (1,5 mm:n mittauslaipalla varustetussa) putkessa käyttäen propaania ja virtausnopeutta 3,2 litraa minuutissa. Lämpötilan mittaukseen käytetään taipuisaa, ruostumattomasta teräksestä valmistettua kromi/alumiini-termoparia, jonka halkaisija on 1 mm ja joka on asetettu keskelle putkea 43 mmm etäisyydelle sen suusta. Alueella 135–285 oC kuumennusnopeuden on oltava välillä 185–215 K/min.
Kuva 4 Iskutestilaite
(kaikki mitat ovat millimetreinä) (1) alusta 450 × 450 × 60 (2) teräskappale, 230 × 250 × 200 (3) alasin, 100 (halkaisija) × 70 (4) pylväs (5) poikkikannatin (6) 2 ohjainta (7) hammastettu tanko (8) mitta-asteikko (9) pudotusvasara (pudotusmassa) (10) pito- ja irrotusosa (11) kohdistuslaatta (12) välialasin (vaihdettava), 26 halkaisija × 26 (13) aukoilla varustettu kohdistusrengas (14) iskulaite Kuva 4a Pudotusvasara sivulta ja edestä, yleisnäkymä Kuva 4b Pudotusvasara, alaosa
(Jatkuu)
Kuva 4d Iskulaite nestemäisiä aineita varten Kuva 4c Iskulaite jauhettuja tai pastamaisia aineita varten 1. terässylinterit 2. terässylintereiden ohjausrengas 3. aukoilla varustettu ohjausrengas (a) pystyleikkaus (b) pohjapiirros 4. kumirengas 5. nestemäinen aine (40 mm3) 6. nesteetön tila Kuva 4e Vasara (pudotusmassa: 5 kg) 1. jännitystappi 2. korkeusindikaattori 3. ohjausura 4. sylinterinmuotoinen iskupää 5. palautushaka
Kuva 5 Kitkaherkkyyslaite
Kuva 5a Kitkaherkkyyslaite, sivukuva ja pohjapiirros 1. teräsalusta 2. liikkuva vaunu 3. vaunulla oleva posliinilevy, 25 x 25 x 5 mm 4. kiinteä posliinitappi, 10 (halkaisija) x 15 mm 5. näyte, noin 10 mm3 6. tapinpidin 7. kuormitusvarsi 8. vastapaino 9. kytkin 10. pyörä, jolla vaunu asetetaan alkuasentoon 11. sähkömoottorin suunta Kuva 5b Tapin alkuasento
Liite
Kuva Muotti ja tarvikkeet näytteen valmistelua varten
(Kaikki mitat ovat millimetreinä)
Liite Esimerkkejä muista menetelmistä polymeerien lukukeskimääräisen molekyylipainon (Mn) määrittämiseksi
Geelipermeaatiokromatografia (GPC) on paras menetelmä Mn:n määrittämiseksi, erityisesti, jos on käytettävissä sarja standardeja, joiden rakenne vastaa polymeerin rakennetta. Jos kuitenkin GPC:n käytössä on käytännön hankaluuksia tai on odotettavissa, että aine ei täytä säädettyä M-kriteeriä (joka on varmistettava), voidaan käyttää muita menetelmiä, kuten
1.1.11.21.31.4
Kolligatiivisten ominaisuuksien käyttö Ebullioskopia/kryoskopia Tässä mitataan kiehumispisteen ylenemä (ebullioskopia) tai jäätymispisteen alenema (kryoskopia), kun liuokseen lisätään tutkittavaa polymeeriä. Menetelmä perustuu siihen, että liuenneen polymeerin vaikutus nesteen kiehumis/jäätymispisteeseen riippuu polymeerin molekyylipainosta (1) (2). Soveltamisala: Mn < 20000. Höyrynpaineen aleneminen Tässä mitataan valitun vertailuaineen höyrynpaine ennen ja jälkeen, kun on lisätty tunnettu määrä polymeeriä (1) (2). Soveltamisala: Mri < 20000 (teoreettisesti; käytännössä tästä menetelmästä on vähän hyötyä). Kalvo-osmometria Tämä menetelmä perustuu osmoosiin, ts. liuotinmolekyylien luonnolliseen taipumukseen diffundoitua puoliläpäisevän kalvon läpi laimeasta väkevään liuokseen päin tasapainon saavuttamiseksi. Testin laimeassa liuoksessa ei ole lainkaan polymeeriä, ja väkevä liuos sisältää polymeeriä. Kun liuos menee kalvon läpi, muodostuu paine-ero, joka riippuu polymeerin konsentraatiosta ja molekyylipainosta (1) (3) (4). Solveltamisala: Mn < 20000–200000. Höyryfaasiosmometria Tässä menetelmässä verrataan puhtaan liuotinaerosolin haihtumisnopeutta vähintään kolmeen aerosoliin, joissa polymeerin pitoisuus vaihtelee (1) (5) (6). Soveltamisala: Mn < 20000.
2. Pääteryhmäanalyysi Jotta tätä menetelmää voitaisiin käyttää, on tunnettava sekä polymeerin koko rakenne että ketjujen päissä olevien ryhmien laatu (joka pitää voida olla erotettavissa päärakenteesta esim. NMR:llä tai titraamalla/derivatisoimalla). Kun määritetään polymeerissä olevien pääteryhmien molekulaarinen konsentraatio, voidaan johtaa arvo molekyylipainolle (7) (8) (9). Soveltamisala: Mn korkeintaan 50000 (luotettavuus vähenee molekyylipainon noustessa).
(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
Kirjallisuusviitteet Billmeyer, F.W. Jr, (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn, John Wiley, New York. Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed, Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25–52. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E, Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139–2146.
Liite Ohjeet pienimolekyylipainoisten aineiden pitoisuuden korjaamiseksi, jos näytteessä on liukenematonta polymeeriä
Jos näytteessä on liukenematonta polymeeriä, aiheuttaa se massakatoa GPC-analyysissä. Liukenematon polymeeri tarttuu pylvääseen tai näytesuodattimeen, kun taas näytteen liukoinen osa menee pylvään läpi. Jos polymeerin taitekerroindifferentiaali (inkrementti) (dn/dc) voidaan arvioida tai mitata, voidaan arvioida pylvääseen hävinnyt näytemassa. Tällöin tehdään korjaus ulkoisella kalibroinnilla käyttäen standardiaineita, joiden konsentraatio ja dn/dc tunnetaan, refraktometrin vasteen kalibroimiseksi. Seuraavassa esimerkissä käytetään poly(metyylimetakrylaatti) (pMMA) -stardardia. Akryylipolymeerianalyysin ulkoisessa kalibroinnissa analysoidaan tetrahydrofuraanissa oleva, tietyn konsentraatin omaava pMMA-standardi GPC:llä, ja tuloksien avulla määritetään refraktometrivakio seuraavalla yhtälöllä: K = R/ (C x V x dn/dc), jossa K on refraktometrivakio (mikrovolttiasekunti/ml), R on pMMA-standardin vaste (mikrovolttiasekunti), C on pMMA-standardin konsentraatio (mg/ml), V on injektiovolyymi (ml) ja dn/dc on tetrahydrofuraanissa olevan pMMA-standardin taitekerroindifferentiaali (ml/mg). Seuraavat tiedot ovat tyypillisiä pMMA-standardille: R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 × 10-5 ml/mg. Tulokseksi saatua K-arvoa (3,05 × 1011) käytetään sitten teoreettisen detektorivasteen laskemiseksi, kun oletetaan, että injisoitu polymeeri eluoituu detektorist 100-prosenttisesti.
OSA B TOKSISUUDEN JA MUIDEN TERVEYSVAIKUTUSTENMÄÄRITYS
YLEISJOHDANTO A.
TESTIAINEEN KARAKTERISAATIO Testiaineen koostumus, mukaan lukien tärkeimmät epäpuhtaudet, ja sen olennaiset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, mukaan lukien stabiliteetti, on oltava tiedossa ennen toksisuustutkimusten aloittamista. Testiaineen fysikaalis-kemialliset ominaisuudet antavat tärkeää tietoa antotavan, tutkimusasetelman ja testiaineen käsittely- ja säilyttämistavan valintaa varten. Annosteluaineessa ja biologisessa materiaalissa olevan testiaineen (ja mahdollisuuksien mukaan myös tärkeimpien epäpuhtauksien) määrittämiseen käytettävä määrällinen ja laadullinen analyysimenetelmä tulee kehittää ennen tutkimuksen aloittamista. Kaikki testiaineen tunnistamiseen, fysikaalis-kemiallisiin ominaisuuksiin, puhtauteen ja käyttäytymiseen liittyvät tiedot tulee sisällyttää tutkimusraporttiin.
B.
ELÄINTEN HOITO Ympäristöolosuhteiden ja eläinten oikeiden hoitomenetelmien tiukka seuranta on oleellista toksisuustutkimuksissa.
i)
Elinolosuhteet Koe-eläintilojen ja häkkien ympäristöolosuhteiden on oltava testattavalle lajille tarkoituksenmukaiset. Rotalle, hiirelle ja marsulle sopiva huoneenlämpötila on 22 ± 3 oC ja suhteellinen ilmankosteus 30-70 %. Kaniineille sopiva huoneenlämpötila on 20 ± 3 oC ja suhteellinen ilmankosteus 30–70 %. Jotkut tutkimusmenetelmät ovat erityisen herkkiä lämpötilavaikutuksille. Näissä tapauksissa asianmukaiset olosuhteet on selostettu yksityiskohtaisesti tutkimusmenetelmän kuvauksen yhteydessä. Kaikissa toksisuustutkimuksissa on valvottava huoneenlämpötilaa ja ilmankosteutta, rekisteröitävä tiedot ja kirjattava ne tutkimuksen loppuraporttiin. Valaistuksen tulee olla keinovaloa. Eläimen tulee saada olla 12 tuntia valossa ja 12 tuntia pimeässä. Valaistusmallin yksityiskohdat on rekisteröitävä ja kirjattava tutkimuksen loppuraporttiin. Jollei menetelmässä erikseen muuta mainita, eläimiä voidaan säilyttää yksin tai pienryhmänä häkeissä, joissa on samaa sukupuolta. Yhdessä ryhmähäkissä saa olla enintään viisi eläintä. Koe-eläintutkimusraporteissa on tärkeää ilmoittaa käytetty häkkityyppi ja eläinten määrä häkkiä kohti sekä kemiallisen altistuksen että sitä seuranneiden havainnointijaksojen aikana.
ii)
Ruokintaolosuhteet Ravinnon tulee tyydyttää testattavan eläinlajin kaikki ravitsemukselliset tarpeet. Jos testiainetta annetaan eläimille ravinnossa, ravinnon ravintoarvo voi heiketä testiaineen ja ruoka-aineen interaktion vuoksi. Tällaisen reaktion mahdollisuus on otettava huomioon tutkimustuloksia tulkittaessa. Eläimille voidaan antaa tavanomaista koe-eläinravintoa ja juomavettä on oltava kaiken aikaa tarjolla. Ravinnon valintaan voi vaikuttaa tarve varmistaa testiaineelle sopiva sekoitus, kun se annostellaan ravinnon mukana. Ravintoa saastuttavia aineita, joiden tiedetään vaikuttavan toksisuuteen, ei saa olla läsnä häiritsevinä pitoisuuksina.
C.
VAIHTOEHTOISET TUTKIMUKSET Euroopan unioni on sitoutunut edistämään sellaisten vaihtoehtomenetelmien kehittämistä ja validointia, joista saadaan samantasoista tietoa kuin nykyisistä eläinkokeista, mutta joihin tarvitaan vähemmän eläimiä ja jotka aiheuttavat vähemmän kärsimystä tai joissa eläimiä ei tarvita lainkaan. Sitä mukaa kuin tällaisia menetelmiä tulee saataville, on niitä mahdollisuuksien mukaan käytettävä vaaran luonnehdinnassa ja siihen perustuvassa ominaisvaarojen luokittelussa ja merkitsemisessä.
D.
ARVIONTI JA TULKINTA Testien arvioinnissa ja tulkinnassa on otettava huomioon ekstrapolaatiorajoitukset eläinkokeiden ja in vitro -tutkimusten tulosten soveltamisessa suoraan ihmiseen, ja siksi mahdollisesti saatavia todisteita haittavaikutuksista ihmisellä voidaan käyttää tutkimustulosten vahvistamiseen.
E.
LÄHDELUETTELO Useimmat näistä menetelmistä on kehitetty OECD:n Testing Guidelines -ohjelman puitteissa ja niitä tulisi käyttää yhtenevästi GLP (Good Laboratory Practice) -periaatteiden kanssa mahdollisimman laajan keskinäisen tietojen hyväksymisen varmistamiseksi. Lisätietoa löytyy OECD-ohjeiston kirjallisuusluettelossa mainituista lähteistä ja muusta asiaankuuluvasta kirjallisuudesta.
B.1 a. AKUUTTI ORAALINEN TOKSISUUS — VAKIOANNOSMENETELMÄ
B.1 a.
1. MENETELMÄ Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro TG 420 (2001)
1.
1.1 JOHDANTO Perinteisissä menetelmissä akuutin toksisuuden arvioimiseksi käytetään päätepisteenä eläinten kuolemaa. Vuonna 1984 British Toxicology Society ehdotti akuutin toksisuuden testaamiseksi uutta käytäntöä, joka perustuu aineen annosteluun vakioannostasojen sarjana (1). Menetelmässä vältettiin käyttämästä eläinten kuolemaa päätepisteenä ja tarkkailtiin sen sijaan selviä toksisuusoireita yhdellä annossarjasta valitulla vakioannostasolla. Menetelmä on hyväksytty tutkimusmenetelmäksi vuonna 1992 Yhdistyneen kuningaskunnan (2) ja kansainvälisten (3) in vivo -validointitutkimusten perusteella. Tämän jälkeen vakioannosmenetelmän tilastollisia ominaisuuksia on arvioitu matemaattisten mallien avulla useissa tutkimuksissa (4) (5) (6). In vivo- ja mallintamistutkimukset ovat osoittaneet, että menetelmä on toistettava, että siinä käytetään vähemmän eläimiä ja että se aiheuttaa vähemmän kärsimystä kuin perinteiset menetelmät. Menetelmällä voidaan luokitella aineita vaarallisuuden mukaan samalla tavoin kuin muilla akuutin toksisuuden tutkimusmenetelmillä. Ohjeita tiettyyn tarkoitukseen sopivimman tutkimusmenetelmän valinnasta on annettu akuutin oraalisen toksisuuden testausta koskevassa ohjeasiakirjassa (Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (7)). Ohjeasiakirjassa on myös lisätietoa tutkimusmenetelmä B.l a:n käyttämisestä ja tulkinnasta. Menetelmän periaatteena on, että päätutkimuksessa käytetään ainoastaan lievästi toksisia annoksia ja että todennäköisesti tappavien annosten antamista vältetään. Annoksia, joiden tiedetään aiheuttavan voimakasta kipua ja kärsimystä syövyttävien tai vaikea-asteisten ärsytysvaikutusten vuoksi, ei myöskään tarvitse annostella. Kuolemaisillaan olevat, selvästi kärsivät tai voimakkaasta ja jatkuvasta kivusta merkkejä osoittavat eläimet on lopetettava humaanilla tavalla, ja koetulosten tulkinnassa ne on otettava huomioon samalla tavalla kuin kokeessa kuolleet eläimet. Erillisessä ohjeasiakirjassa (8) on esitetty kriteerit, joiden perusteella tehdään päätös kuolemaisillaan olevan tai voimakkaasti kärsivän eläimen lopettamisesta. Lisäksi siinä on annettu ohjeita ennustettavan tai uhkaavan kuoleman tunnistamiseksi. Menetelmällä saadaan tietoa vaarallisista ominaisuuksista ja aineet voidaan sen perusteella sijoittaa ja luokitella akuuttia toksisuutta aiheuttavien kemikaalien kansainvälisesti yhdenmukaistetun luokitusjärjestelmän mukaisesti (Globally Harmonised System (GHS) for the classification of chemicals which cause acute toxicity (9)). Koelaboratorion on otettava huomioon kaikki testiaineesta saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen suorittamista. Näissä tiedoissa on esitettävä aineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, sen fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, kaikkien muiden aineella in vivo tai in vitro suoritettujen toksisuuskokeiden tulokset, rakenteellisesti samanlaisten aineiden toksikologiset tiedot ja aineen odotettu käyttö. Nämä tiedot ovat välttämättömiä kaikkien asianosaisten vakuuttamiseksi siitä, että kokeella on merkitystä ihmisten terveyden suojelun kannattaja että sen avulla voidaan valita sopiva alkuannos.
1.2 MÄÄRITELMÄT Akuutti oraalinen toksisuus: haittavaikutukset, joita esiintyy, kun ainetta on annosteltu suun kautta kerta-annoksena tai useampana annoksena 24 tunnin aikana. Viivästynyt kuolema: eläin ei kuole tai vaikuta kuolevalta 48 tunnin kuluessa, mutta kuolee myöhemmin 14 päivän havainnointijakson aikana. Annos: annostellun testiaineen määrä. Annos ilmaistaan testiaineen painona koe-eläimen painoyksikköä kohti (esimerkiksi mg/kg). Ilmeinen toksisuus: yleistermi, jolla tarkoitetaan testiaineen antamisen jälkeen ilmeneviä selviä toksisuuden oireita (katso esimerkiksi (3)). Näiden oireiden perusteella vakioannoksen suurentaminen seuraavaan annokseen aiheuttaisi todennäköisesti voimakasta kipua ja jatkuvia merkkejä kovasta kärsimyksestä tai sen, että eläin on kuolemaisillaan (perusteet on esitetty eläinkokeen humaaneja lopettamiskriteereitä koskevassa ohjeasiakirjassa Humane Endpoints Guidance Document (8)) tai todennäköisesti useimpien eläinten kuoleman. GHS: Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (Kemiallisten aineiden ja seosten kansainvälisesti yhdenmukaistettu luokitusjärjestelmä). Yhteinen toimi, johon osallistuvat OECD (ihmisten terveys ja ympäristö), YK:n vaarallisten aineiden kuljettamista käsittelevä asiantuntijakomitea (fysikaalis-kemialliset ominaisuudet) ja ILO (vaarojen ilmoittaminen) ja jota koordinoidaan kemikaalien järkevää hallinnointia koskevalla organisaatioiden välisellä ohjelmalla (IOMC). Uhkaava kuolema: eläin on vakavasti sairas tai kuolee todennäköisesti ennen seuraavaa suunniteltua havainnointiajankohtaa. Jyrsijöillä tällaista tilaa osoittavia merkkejä voivat olla kouristukset, kyljellään makaaminen, velttous ja vapina. (Katso tarkempia tietoja eläinkokeen humaaneja lopettamiskriteereitä koskevasta ohjeasiakirjasta (8)). LD50(median lethal dose, keskimääräinen tappava annos): on tilastollinen kerta-annos, jonka voidaan suun kautta annosteltuna odottaa tappavan puolet annoksen saaneista eläimistä. LD50-arvo ilmoitetaan testiaineen painona koe-eläimen painoyksikköä kohti (mg/kg). Raja-annos: kokeen yläraja-annos (2000 tai 5000 mg/kg). Kuolemaisillaan oleva: eläin, joka on kuolemaisillaan tai ei kykene säilymään hengissä hoidosta huolimatta. (Katso tarkempia lisätietoja eläinkokeen humaaneja lopettamiskriteereitä koskevasta ohjeasiakirjasta (8)). Ennustettava kuolema: sellaisten kliinisten oireiden esiintyminen, jotka viittaavat siihen, että eläin tulee kuolemaan tietyn ajan kuluttua ennen kokeen suunniteltua päättymistä. Näitä oireita ovat esimerkiksi kykenemättömyys käyttää vettä tai ruokaa. (Katso tarkempia lisätietoja eläinkokeen humaaneja lopettamiskriteereitä koskevasta ohjeasiakirjasta (8)).
1.3 KOEMENETELMÄN PERIAATE Samaa sukupuolta olevien eläinten ryhmille annostellaan testiainetta vaiheittain käyttämällä 5, 50, 300 ja 2000 mg:n/kg vakioannoksia (poikkeuksellisesti voidaan käyttää 5000 mg:n/kg lisävakioannosta, katso kappale 1.6.2). Alkuannostaso valitaan esikokeen perusteella annokseksi, jonka odotetaan aiheuttavan joitakin toksisuusoireita, mutta ei kuitenkaan vakavia toksisia vaikutuksia tai kuolleisuutta. Kipuun, kärsimykseen ja uhkaavaan kuolemaan liittyviä kliinisiä oireita ja tiloja on kuvailtu yksityiskohtaisesti OECD:n ohjeasiakirjassa (8). Muille eläinryhmille voidaan antaa korkeampia tai matalampia vakioannoksia sen mukaan, esiintyykö merkkejä toksisuudesta tai kuolleisuudesta. Menettelyä jatketaan, kunnes ilmeistä toksisuutta tai korkeintaan yhden kuoleman aiheuttava annos pystytään määrittämään, tai kun korkeimmasta annoksesta ei ole havaittavissa vaikutuksia tai alhaisin annos aiheuttaa kuolemia.
1.4 KOEMENETELMÄN KUVAUS
1.4
1.4.1 Eläinlajin valinta Suositeltavin jyrsijälaji on rotta, tosin muitakin jyrsijöitä voidaan käyttää. Yleensä käytetään naaraita (7). Syynä tähän on, että tavanomaisia LD50-kokeita koskevien kirjallisuustutkimusten perusteella sukupuolten herkkyydessä on yleensä vähän eroja, mutta silloin kun eroja on havaittu, naaraat ovat yleensä hieman herkempiä (10). Mikäli rakenteellisesti samanlaisten kemikaalien toksikologisia ja toksikokineettisiä ominaisuuksia koskevat tiedot osoittavat urosten olevan herkempiä, on käytettävä uroksia. Kokeen tekeminen uroksilla edellyttää riittäviä perusteita. Kokeeseen on käytettävä terveitä, nuoria ja täysikasvuisia yleisesti käytettyjä koe-eläinkantoja. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä kantavia. Kunkin eläimen on annostuksensa alussa oltava 8-12 viikon ikäinen, ja sen paino saa poiketa korkeintaan ± 20 % aikaisemmin annoksen saaneiden eläinten keskipainosta.
1.4.2 Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 oC (± 3 oC). Vaikka riittävät vaatimukset suhteellisen kosteuden suhteen ovat vähintään 30 % eikä mielellään yli 70 % muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Eläimet voidaan erotella eri häkkeihin annoksen mukaan, mutta eläinten lukumäärä häkkiä kohti ei saa häiritä kunkin eläimen selkeää havainnointia.
1.4.3 Eläinten valmistelu Eläimet valitaan satunnaisesti ja merkitään yksilötunnistusta varten. Eläimiä pidetään häkeissään vähintään viiden päivän ajan ennen annostelun aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-oloihin.
1.4.4 Annosten valmistelu Yleensä testiaineen testattavat annokset annostellaan vakiotilavuudessa niin, että annosteltavan valmisteen pitoisuus vaihtelee. Testattaessa nestemäistä lopputuotetta tai sekoitusta testiaineen käyttö laimentamattomana eli vakiopitoisena saattaa kuitenkin olla oleellista kyseisen aineen myöhemmän riskinarvioinnin kannalta, ja jotkut sääntelyviranomaiset edellyttävätkin tällaista menettelyä. Kummassakaan tapauksessa annoksen enimmäistilavuutta ei saa ylittää. Kerralla annettavan nesteen enimmäismäärä riippuu koe-eläimen koosta. Jyrsijöillä määrä ei yleensä saa olla yli 1 ml sataa painogrammaa kohti. Vesiliuoksia voidaan kuitenkin antaa 2 ml sataa painogrammaa kohti. Annostellun valmisteen koostumukseksi suositellaan vesipitoista liuosta/suspensiota/emulsiota aina, kun se on mahdollista. Muussa tapauksessa on mieluiten käytettävä öljypohjaista (esimerkiksi maissiöljy) liuosta/suspensiota/emulsiota tässä järjestyksessä ja sen jälkeen muihin kantaja-aineisiin pohjautuvia liuoksia. Jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen toksiset ominaisuudet on tunnettava. Annokset on valmistettava vähän ennen annostelua paitsi, jos valmisteen tiedetään säilyttävän stabiliteettinsa käytön ajan ja sen on osoitettu olevan hyväksyttävä.
1.5 TESTIN SUORITUS
1.5
1.5.1 Annostelu Testiaine annetaan kerta-annoksena mahaletkun tai sopivan intubaatiokanyylin kautta. Mikäli kerta-annostelu ei poikkeuksellisesti ole mahdollinen, annos voidaan antaa pienempinä osina enintään 24 tunnin kuluessa. Eläimiä ei saa ruokkia ennen annostelua (esimerkiksi rottaa on pidettävä ruoatta yli yön ja hiirtä 3–4 tuntia, mutta vettä tulee olla tarjolla). Paaston jälkeen eläimet punnitaan ja niille annetaan testiaine. Aineen annostelun jälkeen ruokintaa voidaan siirtää rotilla vielä 3–4 tuntia ja hiirillä 1–2 tuntia. Mikäli annos annetaan osina tietyn ajan kuluessa, eläimille saatetaan joutua antamaan ruokaa ja vettä jakson pituudesta riippuen.
1.5.2 Esikoe Esikokeen tarkoituksena on sopivan alkuannoksen valinta päätutkimusta varten. Testiaine annostellaan yksittäisille eläimille vaiheittain liitteessä 1 esitetyn toimenpidekaavion mukaisesti. Esikoe on valmis, kun päätös päätutkimuksessa käytettävästä alkuannoksesta voidaan tehdä (tai jos kuolleisuutta ilmenee alhaisimman vakioannoksen yhteydessä). Esikokeen alkuannos valitaan vakioannostasoista 5, 50, 300 ja 2000 mg/kg. Valitun alkuannoksen odotetaan aiheuttavan ilmeistä toksisuutta ja sen on mahdollisuuksien mukaan perustuttava samalla kemikaalilla tai rakenteellisesti samanlaisilla kemikaaleilla suoritettujen in vivo- tai in vitro -testien tietoihin. Jos tällaisia tietoja ei ole käytettävissä, alkuannos on 300 mg/kg. Annokset annetaan eläimille vähintään 24 tunnin välein. Kaikkia eläimiä on havainnoitava vähintään 14 päivää. Korkeinta 5000 mg:n/kg vakioannostasoa voidaan käyttää poikkeuksellisesti ja vain silloin, kun se on perusteltua erityisten sääntelyyn liittyvien vaatimusten vuoksi (katso liite 3). Eläinten hyvinvoinnin takia eläinkokeiden tekeminen GHS-luokassa 5 annoksella 2000–5000 mg/kg ei ole suositeltavaa, ja sitä tulee käyttää vain, kun on erittäin todennäköistä, että tällaisen kokeen tuloksilla on välitöntä merkitystä eläinten tai ihmisten terveyden tai ympäristön suojelemiselle. Kun esikokeessa alhaisimmalla vakioannostasolla (5mg/kg) testattu eläin kuolee, tavanomainen menettely on päättää tutkimus ja luokitella aine GHS-luokkaan 1 (kuten liitteessä 1 on esitetty). Mikäli luokitus on kuitenkin vielä varmennettava, voidaan suorittaa seuraavanlainen vaihtoehtoinen lisätoimenpide: Toiselle eläimelle annetaan 5 mg:n/kg annos. Mikäli eläin kuolee, vahvistetaan luokitukseksi GHS-luokka 1 ja tutkimus päätetään välittömästi. Mikäli eläin jää henkiin, annetaan korkeintaan kolmelle muulle eläimelle 5 mg:n/kg annos. Koska kuolleisuusriski on suuri, annostelun tulee tapahtua vaiheittain eläinten hyvinvoinnin turvaamiseksi. Annokset on annettava eläimille riittävin aikavälein, jotta voidaan osoittaa edellisen eläimen todennäköisesti jäävän henkiin. Mikäli toinen eläin kuolee, annostelu keskeytetään välittömästi eikä enempää eläimiä testata. Koska toisen eläimen kuolema (riippumatta testattujen eläinten määrästä päättymishetkellä) kuuluu tulosluokkaan A (kaksi tai useampia eläimiä kuolee), noudatetaan 5 mg:n/kg vakioannokselle liitteessä 2 esitettyä luokitussääntöä (luokka 1 mikäli kaksi tai useampia eläimiä kuolee tai luokka 2 mikäli vain yksi eläin kuolee). Lisäksi liitteessä 4 annetaan ohjeita EU:n järjestelmän mukaisesta luokituksesta ennen uuden GHS-järjestelmän käyttöönottoa.
1.5.3 Päätutkimus
1.5.3
1.5.3.1 Eläinten määrä ja annostasot Alkuannostasolla tapahtuneen testauksen jälkeen suoritettavat toimet on esitetty toimenpidekaavioissa liitteessä 2. Valittavana on kolme toimintavaihtoehtoa: testauksen keskeyttäminen ja sopivan vaarallisuusluokan määrittäminen, korkeamman vakioannoksen testaaminen tai matalamman vakioannoksen testaaminen. Eläinten suojelemiseksi päätutkimuksessa ei kuitenkaan käytetä uudestaan esikokeessa kuolemaan johtanutta annostasoa (katso liite 2). Kokemusten mukaan todennäköisin tulos alkuannostasolla on, että aine voidaan luokitella eikä uutta testausta tarvita. Yleensä kullakin tutkitulla annostasolla käytetään yhteensä viittä samaa sukupuolta olevaa eläintä. Näihin viiteen eläimeen kuuluu yksi esikokeessa valitulla annostasolla testattu eläin sekä neljä muuta eläintä (paitsi jos päätutkimuksessa käytetty annostaso ei poikkeuksellisesti sisältynyt katsaustutkimukseen). Annostelun aikaväli kullakin tasolla määritellään toksisten oireiden alkamishetken, keston ja vaikeusasteen mukaan. Seuraavan annoksen antamista tulee siirtää, kunnes jo annosteltujen eläinten eloonjäämisestä on saatu varmuus. Tarvittaessa annosteluväliksi suositellaan jokaisella annostasolla 3–4 päivää viivästyneen toksisuuden havainnoimiseksi. Aikaväliä voidaan muuttaa sopivaksi esimerkiksi, jos vasteesta ei vielä ole täyttä varmuutta. Käytettäessä korkeinta 5000 mg:n/kg vakioannosta on noudatettava liitteessä 3 esitettyä menettelytapaa (katso myös kappale 1.6.2).
1.5.3.2 Raja-annostesti Raja-annostestiä käytetään pääasiassa silloin, kun tutkimuksen tekijällä on tietoa, jonka mukaan testiaine on todennäköisesti ei-toksinen, toisin sanoen se on toksista ainoastaan ylittäessään säädösten mukaiset raja-annokset. Tietoa testiaineen toksisuudesta saadaan samanlaisia testattuja yhdisteitä tai seoksia koskevista tiedoista, kun otetaan huomioon toksikologisesti merkittävien ainesosien tunnistetiedot ja prosenttiosuus. Päätutkimus on suoritettava, kun testiaineen toksisuudesta on vain vähän tai ei lainkaan tietoa tai kun se todennäköisesti on toksinen. Näiden ohjeiden mukaisena raja-annostestinä voidaan tavanomaista menettelytapaa käytettäessä käyttää katsaustutkimusta, jossa alkuannos on 2000 mg/kg (tai poikkeuksellisesti 5000 mg/kg), ja jossa sen jälkeen annetaan neljälle muulle eläimelle sama annos.
1.6 HAVAINNOINTI Eläimiä havainnoidaan yksittäin annostelun jälkeen vähintään yhden kerran ensimmäisten 30 minuutin aikana ja säännöllisin väliajoin ensimmäisten 24 tunnin aikana. Havainnoinnin on oltava erityisen tarkkaa ensimmäisten neljän tunnin aikana. Sen jälkeen havainnointi tapahtuu päivittäin 14 päivän ajan paitsi, jos eläin on poistettava tutkimuksesta ja lopetettava humaanilla tavalla eläinten hyvinvointia koskevien periaatteiden vuoksi tai se löydetään kuolleena. Havainnoinnin kestoa ei pitäisi kuitenkaan määritellä tiukasti. Se tulee määrittää toksisten reaktioiden, niiden alkamishetken ja toipumisen keston perusteella ja sitä tulisi voida pidentää tarvittaessa. Toksisuusoireiden ilmaantumis- ja häviämisajankohdat ovat tärkeitä etenkin, jos toksisilla oireilla on taipumus viivästyä (11). Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti eläinkohtaisesti. Lisähavainnointi on tarpeen jos eläinten toksisuusoireet jatkuvat. Havaintoihin tulee sisältyä ihon, karvapeitteen, silmien, limakalvojen, hengitys- ja verenkiertojärjestelmän, autonomisen hermoston ja keskushermoston, somatomotorisen toiminnan ja käyttäytymisen muutokset. Huomiota tulee kiinnittää vapinaan, kouristuksiin, syljeneritykseen, ripuliin, letargiaan, uneen ja koomaan. Eläinkokeiden humaaneja lopettamiskriteereitä koskevassa ohjeasiakirjassa esitetyt periaatteet ja perustelut on otettava huomioon (8). Kuolevat eläimet ja eläimet, jotka osoittavat merkkejä voimakkaasta kivusta ja jatkuvasta kovasta kärsimyksestä, tulee lopettaa humaanilla tavalla. Humaaneista syistä lopetettujen tai kuolleena löydettyjen eläinten kuolinajankohta tulee kirjata muistiin mahdollisimman tarkasti.
1.6
1.6.1 Ruumiinpaino Kunkin eläimen paino on määritettävä hieman ennen testiaineen annostelua ja vähintään viikoittain sen jälkeen. Painon muutokset on laskettava ja kirjattava. Kokeen päätyttyä henkiin jääneet eläimet punnitaan ja lopetetaan sen jälkeen humaanilla tavalla.
1.6.2 Patologia Kaikki koe-eläimet (myös kokeen aikana kuolleet tai eläinten hyvinvointia koskevien periaatteiden vuoksi tutkimuksesta poistetut) avataan. Kunkin eläimen kaikki makroskooppiset muutokset tulee kirjata. Ensimmäisen annostelun jälkeen vähintään 24 tuntia hengissä säilyneiden eläinten makroskooppisia muutoksia sisältävät elimet voidaan myös tutkia mikroskooppisesti siitä mahdollisesti saatavan hyödyllisen tiedon vuoksi.
2. TULOKSET Tuloksina on esitettävä yksittäisiä eläimiä koskevat tulokset. Kaikki tulokset tulee esittää myös yhteenvetona taulukossa, josta käy ilmi kussakin koeryhmässä käytettyjen eläinten lukumäärä, toksisuusoireita osoittaneiden eläinten lukumäärä, kokeen aikana kuolleena löydettyjen tai humaaneista syistä lopetettujen eläinten lukumäärä, yksittäisten eläinten kuolinajankohta, toksisten vaikutusten ja palautuvuuden kuvaus ja niiden ajallinen esiintyminen sekä ruumiinavauslöydökset.
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN
3.
3.1 LOPPURAPORTTI Loppuraportin tulee tarpeen mukaan sisältää seuraavat tiedot:
Testiaine:
fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja tarvittaessa fysikaalis-kemialliset ominaisuudet (myös isomeroituminen),
tunnistetiedot CAS-numero mukaan lukien.
Kantaja-aine (tarvittaessa):
perustelut kantaja-aineen valinnalle, mikäli se on muu kuin vesi.
Koe-eläimet:
käytetty eläinlaji ja -kanta,
eläinten mikrobiologinen status, mikäli se on tiedossa,
eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli (tarvittaessa myös perusteet urosten käytölle naaraiden sijasta),
lähde, ylläpito-olosuhteet, ravinto jne.
Koeolosuhteet:
yksityiskohtaiset tiedot testiainevalmisteesta, mukaan luettuna annostellun aineen fysikaalinen muoto,
yksityiskohtaiset tiedot testiaineen annostelusta, mukaan luettuina annostelutilavuudet ja -ajankohta,
yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan lukien eläinrehun tyyppi/lähde, veden lähde),
alkuannoksen valintaperusteet.
Tulokset:
kunkin eläimen vastetulosten ja annostason taulukot (toksisuusoireet, mukaan lukien kuolleisuus, vaikutusten luonne, vaikeusaste ja kesto),
ruumiinpainon ja siinä tapahtuneiden muutosten taulukot,
kunkin eläimen paino annostelupäivänä, sen jälkeen viikon välein sekä kuolin- tai lopettamishetkellä,
kuolinpäivä ja -ajankohta, mikäli eläin kuolee ennen suunniteltua lopettamista,
kunkin eläimen toksisuusoireiden alkamisajankohta ja niiden mahdollinen palautuminen,
kunkin eläimen ruumiinavauslöydökset ja histopatologiset löydökset, mikäli saatavilla.
Tulosten tarkastelu ja tulkinta.
Johtopäätökset
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
VIITTEET British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85–92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482. Whitehead, A. and Cumow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure.-Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231. Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology . 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.
B.1 b. AKUUTTI ORAALINEN TOKSISUUS — AKUUTIN TOKSISUUSLUOKAN MENETELMÄ
B.1 b.
1. MENETELMÄ Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro TG 423 (2001)
1.
1.1 JOHDANTO Tässä esitetään vaiheittainen akuutin toksisuusluokan menetelmä (1), jonka kussakin vaiheessa käytetään kolmea samaa sukupuolta olevaa eläintä. Testiaineen akuutin toksisuuden arvioimiseksi saatetaan tarvita keskimäärin kahdesta neljään vaihetta riippuen eläinten kuolleisuudesta ja/tai siitä, ovatko ne kuolemaisillaan. Menetelmä on toistettava ja siinä käytetään erittäin vähän eläimiä. Sillä voidaan luokitella aineita vaarallisuuden mukaan samalla tavoin kuin muilla akuutin toksisuuden tutkimusmenetelmillä. Akuutin toksisuusluokan menetelmä perustuu biometrisiin arviointeihin (2) (3) (4) (5) vakioannoksilla, jotka eroavat toisistaan riittävästi aineen luokittelemiseksi vaarallisuuden mukaan ja riskin arvioimiseksi. Menetelmä hyväksyttiin vuonna 1996, ja se on validoitu laajasti sekä kansallisella tasolla (6) että kansainvälisellä tasolla (7) in vivo vertaamalla tuloksia kirjallisuudesta saatuihin LD50-arvoja koskeviin tietoihin. Ohjeita tiettyyn tarkoitukseen sopivimman tutkimusmenetelmän valinnasta on annettu akuutin oraalisen toksisuuden testausta käsittelevässä ohjeasiakirjassa (Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (S)). Ohjeasiakirjassa on myös lisätietoa tutkimusmenetelmä B.1 b:n käyttämisestä ja tulkinnasta. Testiaineita ei tarvitse annostella annoksina, joiden tiedetään aiheuttavan voimakasta kipua ja kärsimystä syövyttävien tai vaikea-asteisten ärsytysvaikutusten vuoksi. Kuolemaisillaan olevat, selvästi kärsivät tai voimakkaasta ja jatkuvasta kivusta merkkejä osoittavat eläimet on lopetettava humaanilla tavalla, ja koetulosten tulkinnassa ne on otettava huomioon samalla tavalla kuin kokeessa kuolleet eläimet. Erillisessä ohjeasiakirjassa (9) on esitetty kriteerit, joiden perusteella tehdään päätös kuolemaisillaan olevan tai voimakkaasti kärsivän eläimen lopettamisesta. Lisäksi siinä on annettu ohjeita ennustettavan tai uhkaavan kuoleman tunnistamiseksi. Menetelmässä käytetään etukäteen määriteltyjä annoksia, ja tulosten avulla voidaan määritellä aineen vaarallisuusaste ja luokitella se akuuttia toksisuutta aiheuttavien kemikaalien kansainvälisesti yhdenmukaistetun luokitusjärjestelmän mukaisesti (Globally Harmonised System for the classification of chemicals which cause acute toxicity (10)). Periaatteessa menetelmän avulla ei ole tarkoitus laskea tarkkaa LD50-annosta, vaan sillä voidaan määrittää tietty altistusalue, jolla kuolleisuutta on odotettavissa, sillä kokeen tärkein päätepiste on edelleenkin se, että osa eläimistä kuolee. Menetelmän avulla voidaan määrittää LD50-arvo vain silloin, kun vähintään kaksi annosta aiheuttaa kuolleisuuden, joka on korkeampi kuin 0 % ja alhaisempi kuin 100 %. Menetelmässä käytetään testiaineesta riippumatta tiettyjä etukäteen määriteltyjä annoksia, ja luokitus tehdään selkeästi eri tilassa olevien eläinten määrästä tehtyjen havaintojen perusteella. Tämän ansiosta eri laboratorioiden raportit ovat yhdenmukaisempia ja toistettavampia. Koelaboratorion on otettava huomioon kaikki testiaineesta saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen suorittamista. Näitä tietoja ovat mm. aineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, sen fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, kaikkien muiden aineella in vitro tai in vivo suoritettujen toksisuuskokeiden tulokset, rakenteellisesti samanlaisten aineiden toksikologiset tiedot ja aineen odotettu käyttö. Nämä tiedot ovat välttämättömiä kaikkien asianosaisten vakuuttamiseksi siitä, että kokeella on merkitystä ihmisten terveyden suojelun kannalta ja että sen avulla voidaan valita sopiva alkuannos.
1.2 MÄÄRITELMÄT Akuutti oraalinen toksisuus: haittavaikutukset, joita esiintyy, kun ainetta on annosteltu suun kautta kerta-annoksena tai useina annoksina 24 tunnin aikana. Viivästynyt kuolema: eläin ei kuole tai vaikuta kuolevalta 48 tunnin kuluessa, mutta kuolee myöhemmin 14 päivän havainnointijakson aikana. Annos: annostellun testiaineen määrä. Annos ilmaistaan testiaineen painona koe-eläimen painoyksikköä kohti (esimerkiksi mg/kg). GHS: Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (Kemiallisten aineiden ja seosten kansainvälisesti yhdenmukaistettu luokitusjärjestelmä). Yhteinen toimi, johon osallistuvat OECD (ihmisten terveys ja ympäristö), YK:n vaarallisten aineiden kuljettamista käsittelevä asiantuntijakomitea (fysikaalis-kemialliset ominaisuudet) ja ILO (vaarojen ilmoittaminen) ja jota koordinoi kemikaalien järkevää hallinnointia koskeva organisaatioiden välinen ohjelma (IOMC). Uhkaava kuolema: eläin on vakavasti sairas tai kuolee todennäköisesti ennen seuraavaa suunniteltua havainnointiajankohtaa. Jyrsijöillä tällaista tilaa osoittavia merkkejä voivat olla kouristukset, kyljellään makaaminen, velttous ja vapina. (Katso tarkempia tietoja eläinkokeen humaaneja lopettamiskriteereitä koskevasta ohjeasiakirjasta (9)). LD50(median lethal oral dose, keskimääräinen tappava annos suun kautta annettuna): on tilastollinen kerta-annos, jonka voidaan suun kautta annosteltuna odottaa tappavan puolet annoksen saaneista eläimistä. LD50-arvo ilmoitetaan testiaineen painona koe-eläimen painoyksikköä kohti (mg/kg). Raja-annos: kokeen yläraja-annos (2000 tai 5000 mg/kg). Kuolemaisillaan oleva: eläin, joka on kuolemaisillaan tai ei kykene säilymään hengissä hoidosta huolimatta. (Katso tarkempia lisätietoja eläinkokeen humaaneja lopettamiskriteereitä koskevasta ohjeasiakirjasta (9)). Ennustettava kuolema: sellaisten kliinisten oireiden esiintyminen, jotka viittaavat siihen, että eläin tulee kuolemaan tietyn ajan kuluttua ennen kokeen suunniteltua päättymistä. Näitä oireita ovat esimerkiksi kykenemättömyys käyttää vettä tai ruokaa. (Katso tarkempia lisätietoja eläinkokeen humaaneja lopettamiskriteereitä koskevasta ohjeasiakirjasta (9)).
1.3 TESTIN PERIAATE Testin periaate on, että vaiheittaisella menetelmällä ja käyttämällä mahdollisimman vähän eläimiä kussakin vaiheessa saadaan riittävästi tietoa testiaineen akuutista toksisuudesta sen luokittelemiseksi. Ainetta annetaan koe-eläinryhmälle suun kautta yhdellä määritellyistä annostasoista. Ainetta testataan vaiheittain siten, että kussakin vaiheessa käytetään kolmea samaa sukupuolta olevaa eläintä (yleensä naaraita). Kyseisestä yhdisteestä johtuva kuolleisuus kussakin testin vaiheessa määrää kokeen seuraavan vaiheen, eli Testin suoritus on kuvattu yksityiskohtaisesti liitteessä 1. Menetelmän avulla testiaine voidaan luokitella johonkin niistä toksisuusluokista, jotka on määritelty kiinteiden LD50-raja-arvojen perusteella.
lisäkokeita ei tarvita,
ainetta annetaan kolmelle muulle eläimelle samalla annostasolla,
ainetta annetaan kolmelle muulle eläimelle astetta korkeammalla tai astetta matalammalla annostasolla.
1.4 MENETELMÄN KUVAUS
1.4
1.4.1 Eläinlajin valinta Suositeltavin jyrsijälaji on rotta, tosin muitakin jyrsijöitä voidaan käyttää. Yleensä käytetään naaraita (9). Syynä tähän on, että tavanomaisia LD50-kokeita koskevien kirjallisuustutkimusten perusteella sukupuolten herkkyydessä on vähäisiä eroja, mutta silloin kun eroja on havaittu, naaraat ovat yleensä hieman herkempiä (11). Mikäli rakenteellisesti samanlaisten kemikaalien toksikologisia ja toksikokineettisiä ominaisuuksia koskevat tiedot osoittavat urosten olevan herkempiä, on käytettävä uroksia. Kokeen tekeminen uroksilla edellyttää riittäviä perusteita. Kokeeseen on käytettävä terveitä, nuoria ja täysikasvuisia yleisesti käytettyjä koe-eläinkantoja. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä kantavia. Kunkin eläimen on annostuksensa alussa oltava 8–12 viikon ikäinen, ja sen paino saa poiketa korkeintaan ± 20 % aikaisemmin annoksen saaneiden eläinten keskipainosta.
1.4.2 Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 oC (± 3 oC). Vaikka riittävät vaatimukset suhteellisen kosteuden suhteen ovat vähintään 30 % eikä mielellään yli 70 % muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Eläimet voidaan sijoittaa eri häkkeihin ryhmissä annoksen mukaan, mutta eläinten lukumäärä häkkiä kohti ei saa häiritä kunkin eläimen selkeää havainnointia.
1.4.3 Eläinten valmistelu Eläimet valitaan satunnaisesti ja merkitään yksilötunnistusta varten. Eläimiä pidetään häkeissään vähintään viiden päivän ajan ennen annostelun aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-oloihin.
1.4.4 Annosten valmistelu Yleensä testiaineen testattavat annokset annostellaan vakiotilavuudessa niin, että annosteltavan valmisteen pitoisuus vaihtelee. Testattaessa nestemäistä lopputuotetta tai seosta testiaineen käyttö laimentamattomana eli vakiopitoisena saattaa kuitenkin olla oleellista kyseisen aineen myöhemmän riskinarvioinnin kannalta, ja jotkut sääntelyviranomaiset edellyttävätkin tällaista menettelyä. Kummassakaan tapauksessa annoksen enimmäistilavuutta ei saa ylittää. Kerralla annettava nesteen enimmäismäärä riippuu koe-eläimen koosta. Jyrsijöillä määrä ei yleensä saa olla yli 1 ml sataa painogrammaa kohti. Vesiliuoksia voidaan kuitenkin antaa 2 ml sataa painogrammaa kohti. Annostellun valmisteen koostumukseksi suositellaan vesipohjaista liuosta/suspensiota/emulsiota aina kun se on mahdollista. Muussa tapauksessa on mieluiten käytettävä öljypohjaista (esimerkiksi maissiöljy) liuosta/suspensiota/emulsiota tässä järjestyksessä ja sen jälkeen muihin kantaja-aineisiin pohjautuvia liuoksia. Jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen toksiset ominaisuudet on tunnettava. Annokset on valmistettava vähän ennen annostelua paitsi, jos valmisteen tiedetään säilyttävän stabiliteettinsa käytön ajan ja sen on osoitettu olevan hyväksyttävä.
1.5 TESTIN SUORITUS
1.5
1.5.1 Annostelu Testiaine annetaan kerta-annoksena mahaletkun tai sopivan intubaatiokanyylin kautta. Mikäli kerta-annostelu ei poikkeuksellisesti ole mahdollinen, annos voidaan antaa pienempinä osina enintään 24 tunnin kuluessa. Eläimiä ei saa ruokkia ennen annostelua (esimerkiksi rottaa on pidettävä ruoatta yli yön ja hiirtä 3–4 tuntia, mutta vettä tulee olla tarjolla). Paaston jälkeen eläimet punnitaan ja niille annetaan testiaine. Aineen annostelun jälkeen ruokintaa voidaan siirtää rotilla vielä 3–4 tuntia ja hiirillä 1–2 tuntia. Mikäli annos annetaan osina tietyn ajan kuluessa, eläimille saatetaan joutua antamaan ruokaa ja vettä jakson pituudesta riippuen.
1.5.2 Eläinten määrä ja annostasot Kussakin vaiheessa käytetään kolmea eläintä. Alkuannostasoksi valitaan yksi neljästä vakiotasosta, jotka ovat 5, 50, 300 ja 2000 mg/kg. Alkuannostason tulee olla sellainen, että se todennäköisesti tappaa muutaman annoksen saaneista eläimistä. Liitteessä 1 esitetyissä toimenpidekaavioissa kuvataan kunkin alkuannoksen yhteydessä noudatettava menettely. Lisäksi liitteessä 4 annetaan ohjeita EU:n järjestelmän mukaisesta luokituksesta ennen uuden GHS-järjestelmän käyttöönottoa. Kun saatavissa olevat tiedot viittaavat siihen, ettei korkein alkuannostaso (2000 mg/kg) todennäköisesti aiheuta eläinten kuolemaa, on tehtävä raja-annostesti. Kun testiaineesta ei ole tietoja, alkuannokseksi suositellaan eläinten hyvinvointia koskevien periaatteiden vuoksi 300 mg/kg. Testiryhmien testaamisen aikavälit määritellään toksisten oireiden alkamishetken, keston ja vaikeusasteen mukaan. Seuraavan annoksen antamista tulee siirtää, kunnes jo annosteltujen eläinten eloonjäämisestä on saatu varmuus. Korkeinta 5000 mg:n/kg annostasoa voidaan käyttää poikkeuksellisesti ja vain silloin, kun se on perusteltua erityisten sääntelyyn liittyvien vaatimusten vuoksi (katso liite 2). Eläinten hyvinvointia koskevien periaatteiden vuoksi eläinkokeiden tekeminen GHS-luokan 5 annoksilla (2000–5000 mg/kg) ei ole suositeltavaa, ja niitä tulee käyttää vain, kun on erittäin todennäköistä, että tällaisen kokeen tuloksilla on välitöntä merkitystä ihmisten tai eläinten terveyden tai ympäristön suojelemiselle.
1.5.3 Raja-annostesti Raja-annostestiä käytetään pääasiassa silloin, kun tutkimuksen tekijällä on tietoa, jonka mukaan testiaine on todennäköisesti ei-toksinen, toisin sanoen se on toksista ainoastaan ylittäessään säädösten mukaiset raja-annokset. Tietoa testiaineen toksisuudesta saadaan samanlaisia testattuja yhdisteitä tai seoksia koskevista tiedoista, kun otetaan huomioon, mitä toksikologisesti merkittävät ainesosat ovat ja mikä on niiden prosenttiosuus. Päätutkimus on suoritettava, kun testiaineen toksisuudesta on vain vähän tai ei lainkaan tietoa tai kun se todennäköisesti on toksinen. Raja-annostesti voidaan tehdä yhdellä annostasolla 2000 mg/kg käyttäen kuutta eläintä (kolme eläintä vaihetta kohden). Poikkeuksellisesti voidaan tehdä raja-annostesti yhdellä annostasolla 5000 mg/kg käyttäen kolmea eläintä (katso liite 2). Mikäli testiaineeseen liittyvää kuolleisuutta esiintyy, voidaan tarvita lisäkokeita seuraavaksi alemmalla annostasolla.
1.6 HAVAINNOINTI Eläimiä havainnoidaan yksittäin annostelun jälkeen vähintään yhden kerran ensimmäisten 30 minuutin aikana ja säännöllisin väliajoin ensimmäisten 24 tunnin aikana. Havainnoinnin on oltava erityisen tarkkaa ensimmäisten neljän tunnin aikana. Sen jälkeen havainnointi tapahtuu päivittäin 14 päivän ajan paitsi, jos eläin on poistettava tutkimuksesta ja lopetettava humaanilla tavalla eläinten hyvinvointia koskevien periaatteiden vuoksi tai se löydetään kuolleena. Havainnoinnin kestoa ei pitäisi kuitenkaan määritellä tiukasti. Se tulee määrittää toksisten reaktioiden, niiden alkamishetken ja toipumisen keston perusteella ja sitä tulisi voida pidentää tarvittaessa. Toksisuusoireiden ilmaantumis- ja häviämisajankohdat ovat tärkeitä etenkin, jos toksisilla oireilla on taipumus viivästyä (12). Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti eläinkohtaisesti. Lisähavainnointi on tarpeen jos eläinten toksisuusoireet jatkuvat. Havaintoihin tulee sisältyä ihon, karvapeitteen, silmien, limakalvojen, hengitys- ja verenkiertojärjestelmän, autonomisen hermoston ja keskushermoston, somatomotorisen toiminnan ja käyttäytymisen muutokset. Huomiota tulee kiinnittää vapinaan, kouristuksiin, syljeneritykseen, ripuliin, letargiaan, uneen ja koomaan. Eläinkokeiden humaaneja lopettamiskriteereitä koskevassa ohjeasiakirjassa (9) esitetyt periaatteet ja perustelut on otettava huomioon. Kuolevat eläimet ja eläimet, jotka osoittavat merkkejä voimakkaasta kivusta ja jatkuvasta kovasta kärsimyksestä, tulee lopettaa humaanilla tavalla. Humaaneista syistä lopetettujen tai kuolleena löydettyjen eläinten kuolinajankohta tulee kirjata mahdollisimman tarkasti.
1.6
1.6.1 Ruumiinpaino Kunkin eläimen paino on määritettävä hieman ennen testiaineen annostelua ja vähintään viikoittain sen jälkeen. Painon muutokset on laskettava ja kirjattava. Kokeen päätyttyä henkiin jääneet eläimet punnitaan ja lopetetaan humaanilla tavalla.
1.6.2 Patologia Kaikki koe-eläimet (myös kokeen aikana kuolleet tai eläinten hyvinvointia koskevien periaatteiden vuoksi tutkimuksesta poistetut) on avattava. Kunkin eläimen kaikki makroskooppiset muutokset tulee kirjata. Vähintään 24 tuntia hengissä säilyneiden eläinten makroskooppisia muutoksia sisältävät elimet voidaan myös tutkia mikroskooppisesti siitä mahdollisesti saatavan hyödyllisen tiedon vuoksi.
2. TULOKSET Tuloksina on esitettävä yksittäisiä eläimiä koskevat tulokset. Kaikki tulokset tulee esittää myös yhteenvetona taulukossa, josta käy ilmi kussakin koeryhmässä käytettyjen eläinten lukumäärä, toksisuusoireita osoittaneiden eläinten lukumäärä, kokeen aikana kuolleena löydettyjen tai humaaneista syistä lopetettujen eläinten lukumäärä, yksittäisten eläinten kuolinajankohta, toksisten vaikutusten ja palautuvuuden kuvaus ja niiden ajallinen esiintyminen sekä ruumiinavauslöydökset.
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN
3.
3.1 Loppuraportti Loppuraportin tulee tarpeen mukaan sisältää seuraavat tiedot:
Testiaine:
fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja tarvittaessa fysikaalis-kemialliset ominaisuudet (myös isomeroituminen),
tunnistetiedot, CAS-numero mukaan lukien.
Kantaja-aine (tarvittaessa):
perustelut kantaja-aineen valinnalle, mikäli se on muu kuin vesi.
Koe-eläimet:
käytetty eläinlaji ja -kanta,
eläinten mikrobiologinen status, mikäli se on tiedossa,
eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli (tarvittaessa myös perusteet urosten käytölle naaraiden sijasta),
lähde, ylläpito-olosuhteet, ravinto jne.
Koeolosuhteet:
yksityiskohtaiset tiedot testiainevalmisteesta, mukaan luettuna annostellun aineen fysikaalinen muoto,
yksityiskohtaiset tiedot testiaineen annostelusta, mukaan luettuina annostelutilavuudet ja -ajankohta,
yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan lukien eläinrehun tyyppi/lähde, veden lähde),
alkuannoksen valintaperusteet.
Tulokset:
kunkin eläimen vastetulosten ja annostason taulukot (toksisuusoireet, mukaan lukien kuolleisuus, vaikutusten luonne, vaikeusaste ja kesto),
ruumiinpainon ja siinä tapahtuneiden muutosten taulukot,
kunkin eläimen paino annostelupäivänä, sen jälkeen viikon välein sekä kuolin- tai lopettamishetkellä,
kuolinpäivä ja -ajankohta, mikäli eläin kuolee ennen suunniteltua lopettamista,
kunkin eläimen toksisuusoireiden alkamisajankohta ja niiden mahdollinen palautuminen,
kunkin eläimen ruumiinavauslöydökset ja histopatologiset löydökset, mikäli saatavilla.
Tulosten tarkastelu ja tulkinta.
Johtopäätökset.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
VIITTEET Roll R., Höfer-Bosse Th. and Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute- Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129–134. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method — An Altemative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute- Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R. L, Cotruvo, J. A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel K. A., Walker A. P., Chu I.; Goddard M., Segal L., Springer J. A. and Myers R. C. (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223–231. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
B.2. AKUUTTI MYRKYLLISYYS (HENGITETTYNÄ)
B.2.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO On suositeltavaa selvittää aineen hiukkaskokojakauma, höyrynpaine, sulamispiste, kiehumispiste, leimahduspiste ja mahdollinen räjähtävyys ennalta. Katso myös yleistä johdantoa, osa B (A).
1.2 MÄÄRITELMÄT Katso yleistä johdantoa, osa B (B).
1.3 VERTAILUAINEET Vertailuaineita ei ole.
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE Koe-eläimet jaetaan useaan ryhmään, jotka altistetaan testattavalle aineelle määrätyn ajan porrastettuja pitoisuuksia käyttäen (yksi pitoisuus ryhmää kohti). Tämän jälkeen eläimiä tarkkaillaan oireiden ja kuolemien suhteen. Ruumiinavaus tehdään kokeen aikana kuolleille eläimille ja kokeen päätyttyä myös henkiin jääneille eläimille, kun ne on ensin lopetettu. Eläimet, joilla on vakavia ja pitkittyneitä ahdistuneisuuden ja kivun oireita, voidaan tarvittaessa lopettaa. Testattavia aineita ei tarvitse antaa tavalla, jonka tiedetään aiheuttavan selvää kipua ja ahdistusta syövyttävien tai ärsyttävien ominaisuuksien vuoksi.
1.5 LAATUKRITEERIT Laatukriteerejä ei ole.
1.6 MENETELMÄKUVAUS
1.6
1.6.1 Valmistelut Ennen testiä eläinten elinolosuhteet pidetään tietyntyyppisinä vähintään viiden päivän ajan testin suorittamista silmälläpitäen. Terveiden aikuisten eläinten joukosta otetaan satunnaisotos, joka jaetaan haluttuun määrään ryhmiä. Eläimille ei tarvitse antaa simuloitua altistusta, ellei käytettävän altistuslaitteen tyyppi tätä vaadi. Jos testattava aine on kiinteässä muodossa, se on tarpeen mukaan mikronoitava sopivan hiukkaskoon saavuttamiseksi. Tarvittaessa voidaan käyttää sopivaa liuotinta, jonka avulla saadaan helpommin ilmakehään sopiva pitoisuus ainetta. Tällöin on käytettävä liuotinkontrolliryhmää. Jos annostelua varten käytetään liuotinta tai muita lisäaineita, on varmistettava, että ne eivät aiheuta myrkytysoireita. Soveltuvissa tapauksissa voidaan käyttää aikaisempia tietoja.
1.6.2 Testiolosuhteet
1.6.2
1.6.2.1 Koe-eläimet Ellei kontraindikaatioita ole, rotan käyttöä suositellaan. Testiin käytetään yleisiä laboratoriokantoja. Testin alussa kumpaakaan sukupuolta edustavien eläinten painonvaihtelut eivät saa olla enempää kuin ± 20 % sukupuolen keskiarvosta.
1.6.2.2 Lukumäärä ja sukupuoli Jokaista annostasoa kohti tarvitaan vähintään kymmenen jyrsijää (viisi naarasta ja viisi urosta). Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineitä. Huomautus: Käytettäessä rottaa kehittyneempiä eläimiä akuutin myrkyllisyyden testaukseen on harkittava pienempää eläinmäärää kuin rottien kohdalla. Annokset valitaan huolella, ja kohtuullisen myrkyllisten annosten ylittämistä on vältettävä kaikin keinoin. Tällaisissa kokeissa on vältettävä tappavien annosten antamista.
1.6.2.3 Altistuspitoisuudet Pitoisuuksia on oltava tarpeellinen määrä, kuitenkin vähintään kolme. Ne jaetaan siten, että saadaan jakauma myrkytysoireiden ja kuolleisuuden suhteen. Tietojen perusteella tulisi voida piirtää pitoisuus/kuolleisuus-käyrä, ja LC50-arvo tulisi määrittää aina kun se vain on mahdollista.
1.6.2.4 Raja-annostesti Jos viiden uroksen ja viiden naaraan altistuminen pitoisuudelle 20 milligrammaa litrassa kaasua tai 5 milligrammaa litrassa aerosolia tai hiukkasille neljän tunnin ajan tai, jos tämä ei kemiallisten tai fysikaalisten tai räjähtävien ominaisuuksien vuoksi ole mahdollista, koeaineelle, altistuminen suurimmalle mahdolliselle pitoisuudelle ei aiheuta yhdenkään eläimen kuolemaa 14 vuorokaudessa, kokeilun jatkamista voidaan pitää hyödyttömänä.
1.6.2.5 Altistusaika Altistusaika on neljä tuntia.
1.6.2.6 Laitteet Eläimiä testataan hengityslaitteella, jonka dynaaminen ilmanvirtaus takaa, että koko ilmamäärä vaihtuu vähintään 12 kertaa tunnissa. Näin varmistetaan riittävä happipitoisuus ja altistusilmakehän tasainen jakaantuminen. Jos käytetään kammiota, sen rakenteen on oltava sellainen, että eläinten elintilan ja altistumistehokkuuden suhde on optimaalinen. Yleinen sääntö kammion ilmakehän stabiiliuden varmistamiseksi on, että eläinten kokonaistilavuus saa olla enintään 5 % kammion tilavuudesta. Eläinkohtaisissa kammioissa voidaan käyttää oronasaalista, vain päähän kohdistuvaa tai koko kehoon kohdistuvaa altistamista. Kahden ensimmäisen tavan avulla aineen imeytyminen muuta kautta voidaan minimoida.
1.6.2.7 Tarkkailujakso Tarkkailujakson minimipituus on 14 päivää. Jakson pituus ei ole ehdottoman kiinteä, vaan sitä voidaan tarvittaessa säätää myrkytysoireiden, oireiden alkamisnopeuden ja toipumisjakson mukaan. Myrkytysoireiden ilmestymis- ja häviämisajankohta sekä kuoleman ajankohta ovat tärkeät, etenkin jos kuolemilla on taipumus viivästyä.
1.6.3 Testin suorittaminen Eläimet punnitaan ja pannaan valittuun laitteeseen, jossa niitä altistetaan halutulle pitoisuudelle neljän tunnin ajan pitoisuustasapainon saavuttamisen jälkeen. Tasapainon saavuttamiseen kuluvan ajan tulee olla lyhyt. Testilämpötilana käytetään arvoa 22 ± 3 oC. Suhteellisen kosteuden tulisi olla 30–70 %, mutta joissakin tapauksissa (eräiden aerosolien testauksissa) tämä ei ehkä ole mahdollista. Pitämällä kammiossa alipainetta (≤ 5 mm H2O) voidaan estää aineen vuotaminen ympäristöön. Altistuksen aikana eläimille ei anneta ruokaa eikä vettä. Testi-ilmakehän tuottamiseen ja ylläpitämiseen on käytettävä soveltuvia järjestelmiä, joiden avulla voidaan varmistaa se, että stabiilit altistusolosuhteet saavutetaan mahdollisimman nopeasti. Kammion suunnittelussa ja sen käytössä on pyrittävä siihen, että testi-ilmakehä jakautuu kammioon mahdollisimman tasaisesti. Seuraavia suureita on mitattava tai valvottava: Altistuksen aikana ja sen jälkeen eläimiä tarkkaillaan systemaattisesti ja tulokset kirjataan. Jokaisesta yksittäisestä eläimestä tulee olla oma kirjanpitonsa. Ensimmäisen päivän aikana havaintoja on tehtävä usein. Vähintään kerran työpäivässä on tehtävä huolellinen kliininen tutkimus. Muut havainnot tehdään päivittäin ja eläinhukka minimoidaan soveltuvin toimenpitein (kuolleet eläimet jäädytetään tai niille tehdään ruumiinavaus ja heikot tai kuolevat eläimet eristetään tai lopetetaan). Tarkkaillaan ihon, turkin, silmien, limakalvojen, hengitysteiden, verenkierron, autonomisen hermoston, keskushermoston, somatomotorisen aktiviteetin ja käyttäytymismallin muutoksia. Erityisesti on tarkkailtava vapinaa, kouristuksia, syljeneritystä, ripulia, letargiaa, unta ja koomaa. Kuoleman ajankohta on kirjattava niin tarkoin kuin mahdollista. Eläimet on punnittava yksitellen viikoittain altistuksen jälkeen sekä kuoleman jälkeen. Ruumiinavaus tehdään kokeen aikana kuolleille eläimille ja kokeen päätyttyä myös henkiin jääneille eläimille, kun ne on ensin lopetettu. Ruumiinavauksessa kiinnitetään erityistä huomiota ylä- ja alahengitysteiden muutoksiin. Kaikki huomattavan suuret patologiset muutokset on kirjattava. Histopatologista tutkimusta varten otetaan kudosnäytteet voimassa olevan ohjeen mukaan.
1.6.3 a)
ilmanvirtaus (jatkuvasti).
b)
testattavan aineen todellinen pitoisuus hengitysilmassa, vähintään kolme kertaa altistuksen aikana (eräät ilmakehät, esimerkiksi aerosolit, voivat suurina pitoisuuksina vaatia edellyttää tiheämpää valvontaa). Päivittäisen altistuksen aikana pitoisuusvaihtelut eivät saa olla enempää kuin ± 15 % keskiarvosta. Eräiden aerosolien kohdalla tällaista säätötasoa ei ehkä voida saavuttaa, jolloin on hyväksyttävä laajempi alue. Aerosoleille on tehtävä hiukkaskokoanalyysi riittävän usein (vähintään kerran koeryhmää kohti).
c)
lämpötila ja kosteus (jatkuvasti, jos mahdollista).
2. TIEDOT Yhteenveto tiedoista esitetään taulukkona, jossa jokaisen ryhmän kohdalla on eläinten määrä kokeen alussa, yksittäisten eläinten kuolinajankohdat, niiden eläinten määrä, joilla on muita myrkyllisyydestä johtuvia oireita, myrkytysoireiden kuvaus ja ruumiinavauslöydökset. Yksittäisten eläinten painot on kirjattava välittömästi ennen aineen annostelua, sen jälkeen viikoittain ja kuoleman jälkeen. Painonmuutokset on laskettava ja kirjattava, kun eläin pysyy hengissä kauemmin kuin yhden vuorokauden. Eläimet, jotka on lopetettu aineen aiheuttaman ahdistuksen ja kipujen takia, luokitellaan aineen vaikutuksesta kuolleiksi. LD50 voidaan määrittää yleisesti tunnetun menetelmän mukaan. Tietojen arviointiin tulee sisältyä mahdolliset yhteydet eläimen aineelle altistamisen ja kaikkien poikkeavuuksien esiintymisen ja vakavuuden välillä. Tällaisia poikkeavuuksia ovat esimerkiksi käyttäytymismuutokset, kliiniset muutokset, painonmuutokset, kuolleisuus ja muut myrkytysoireet.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TESTIRAPORTTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot: Altistustiedot Altistustiedot kootaan taulukkoon, josta ilmenevät myös keskiarvot ja vaihtelut (esimerkiksi keskihajonta). Mahdollisuuksien mukaan esitetään seuraavat tiedot:
laji, kanta, toimittaja, ympäristöolosuhteet, ruokavalio jne.,
testiolosuhteet, altistuslaitteen kuvaus (rakenne, tyyppi, mitat, ilmalähde, aerosolin tuottamiseen käytetty järjestelmä, ilmastointijärjestelmä, mahdollisen testauskammion olosuhteet ja lämpötilan, kosteuden, aerosolin pitoisuuden sekä aerosolin hiukkaskokojakauman mittauslaitteiden tiedot).
3.1 a)
ilmanvirtaus hengityslaitteen kautta;
b)
ilman lämpötila ja kosteus;
c)
nimelliset pitoisuudet (hengityslaitteeseen syötetty kokonaismäärä ainetta jaettuna ilman tilavuudella);
d)
liuottimen laatu, jos liuotinta on käytetty;
e)
todelliset pitoisuudet hengitysilmassa;
f)
massan aerodynaamisen halkaisijan mediaani (MMAD) ja geometrinen keskihajonta (GDS);
g)
aika, joka kului tasapainon saavuttamiseen;
h)
altistusaika.
vastetietojen luokittelu sukupuolen ja annostason mukaan (kokeen aikana kuolleiden tai lopetettujen eläinten määrä, niiden eläinten määrä, joilla on myrkyllisyydestä johtuvia oireita, altistettujen eläinten määrä),
annostelun jälkeisten kuolemien ajankohta, syyt ja kriteerit eläinten lopettamiseen,
kaikki havainnot,
kummankin sukupuolen LD50-arvo tarkkailujakson lopussa (määritysmenetelmä on ilmoitettava),
LD50-arvon 95 prosentin luottamusväli (mahdollisuuksien mukaan),
annos-kuolleisuuskäyrä ja sen kaltevuus (määritysmenetelmän sallimissa rajoissa),
ruumiinavauslöydökset,
muut histopatologiset löydökset,
tulosten pohdinta (erityistä huomiota on kiinnitettävä kokeen aikana tehtyjen koe-eläinten lopettamisien LD50-arvoon kohdistamaan vaikutukseen),
tulosten tulkinta.
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA Katso yleistä johdantoa, osa B (D).
4. VIITTEET Katso yleistä johdantoa, osa B (E).
B.3. AKUUTTI MYRKYLLISYYS (IHON KAUTTA)
B.3.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Katso yleistä johdantoa, osa B (A).
1.2 MÄÄRITELMÄT Katso yleistä johdantoa, osa B (B).
1.3 VERTAILUAINEET Vertailuaineita ei ole.
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE Ainetta levitetään useaan ryhmään jaettujen eläinten iholle porrastettuina annoksina (yksi annos ryhmää kohti). Tämän jälkeen eläimiä tarkkaillaan oireiden ja kuolemien suhteen. Ruumiinavaus tehdään kokeen aikana kuolleille eläimille ja kokeen päätyttyä myös henkiin jääneille eläimille, kun ne on ensin lopetettu. Eläimet, joilla on vakavia ja pitkittyneitä ahdistuneisuuden ja kivun oireita, voidaan tarvittaessa lopettaa. Testattavia aineita ei tarvitse antaa tavalla, jonka tiedetään aiheuttavan selvää kipua ja ahdistusta syövyttävien tai ärsyttävien ominaisuuksien vuoksi.
1.5 LAATUKRITEERIT Laatukriteerejä ei ole.
1.6 MENETELMÄKUVAUS
1.6
1.6.1 Valmistelut Ennen testiä eläinten elinolosuhteet pidetään tietyntyyppisinä vähintään viiden päivän ajan testin suorittamista silmälläpitäen. Terveiden aikuisten eläinten joukosta otetaan satunnaisotos, joka jaetaan käsittelyryhmiin. Noin 24 tuntia ennen testiä turkki leikataan tai ajetaan eläinten selkäalueelta varoen naarmuttamasta ihoa, koska naarmut saattaisivat muuttaa ihon läpäisevyyttä. Vähintään 10 % ihoa peittävästä karvasta on ajeltava tai leikattava. Kiinteät aineet voidaan tarvittaessa jauhaa, ja ne on kosteutettava riittävällä vesimäärällä tai tarvittaessa muulla liuottimella hyvän ihokontaktin varmistamiseksi. Jos käytetään liuotinta, on otettava huomioon liuottimen vaikutus aineen imeytymiseen iholta. Nestemäisiä aineita käytetään yleensä laimentamattomina.
1.6.2 Testiolosuhteet
1.6.2
1.6.2.1 Koe-eläimet Koe-eläiminä voidaan käyttää aikuisia rottia tai kaneja. Muiden lajien käyttö on perusteltava. Testiin käytetään yleisiä laboratoriokantoja. Testin alussa kumpaakaan sukupuolta edustavien eläinten painonvaihtelut eivät saa olla enempää kuin ± 20 % sukupuolen keskiarvosta.
1.6.2.2 Lukumäärä ja sukupuoli Jokaista annostasoa kohti tarvitaan vähintään viisi eläintä, joiden on oltava samaa sukupuolta. Jos käytetään naaraita, ne eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineitä. Jos on käytettävissä tietoja, joiden mukaan jompikumpi sukupuoli on selvästi toista herkempi, kokeessa on käytettävä tätä sukupuolta. Huomautus: Käytettäessä rottaa kehittyneempiä eläimiä akuutin myrkyllisyyden testauksia varten on harkittava pienempää eläinmäärää kuin rottien kohdalla. Annokset valitaan huolella, ja kohtuullisen myrkyllisten annosten ylittämistä on vältettävä kaikin keinoin. Tällaisissa kokeissa on vältettävä tappavien annosten antamista.
1.6.2.3 Annostasot Annostasoja on oltava tarpeellinen määrä, kuitenkin vähintään kolme. Annostasot jaetaan siten, että saadaan jakauma myrkytysoireiden ja kuolleisuuden suhteen. Annostasojen valinnassa on otettava huomioon mahdolliset ärsyttävät tai syövyttävät ominaisuudet. Tietojen perusteella tulisi voida piirtää pitoisuus/kuolleisuus-käyrä, ja LC50-arvo tulisi määrittää aina kun se vain on mahdollista.
1.6.2.4 Rajatesti Voidaan tehdä yhden annostason rajatesti (vähintään 2000 mg/kg) viiden koiraan ja viiden naaraan ryhmälle edellä kuvattujen menetelmien mukaisesti. Jos aineeseen liittyvää kuolleisuutta esiintyy, on harkittava kattavaa testiä.
1.6.2.5 Tarkkailujakso Tarkkailujakson minimipituus on 14 päivää. Jakson pituus ei ole ehdottoman kiinteä, vaan sitä voidaan tarvittaessa säätää myrkytysoireiden, oireiden alkamisnopeuden ja toipumisjakson mukaan. Myrkytysoireiden ilmestymis- ja häviämisajankohta sekä kuoleman ajankohta ovat tärkeät, etenkin jos kuolemilla on taipumus viivästyä.
1.6.3 Testin suorittaminen Eläimiä pidetään yksin häkeissä. Testattavaa ainetta levitetään tasaisesti alueelle, joka on noin 10 % kehon kokonaispinta-alasta. Erittäin myrkyllisten aineiden kohdalla voidaan käyttää pienempää pinta-alaa, mutta ainetta on levitettävä mahdollisimman ohuelti ja tasaisesti niin suurelle alueelle kuin mahdollista. Testattava ihoalue peitetään harsositeellä ja ärsyttämättömällä laastarilla koko 24 tunnin altistusjakson ajaksi. Tämän lisäksi alue on peitettävä siten, että harsoside ja aine pysyvät paikallaan eikä eläin pääse syömään ainetta. Eläin voidaan sitoa osittain siten, että se ei pysty syömään ainetta. Täyttä liikkumattomuutta ei kuitenkaan suositella. Altistusjakson jälkeen aineen jäännökset poistetaan vedellä tai muulla sopivalla ihonpuhdistusmenetelmällä. Havainnot tehdään ja kirjataan systemaattisesti. Jokaisesta eläimestä tulee olla oma kirjanpitonsa. Ensimmäisen päivän aikana havaintoja on tehtävä usein. Vähintään kerran työpäivässä on tehtävä huolellinen kliininen tutkimus. Muut havainnot tehdään päivittäin ja eläinhukka minimoidaan soveltuvin toimenpitein (kuolleet eläimet jäädytetään tai niille tehdään ruumiinavaus ja heikot tai kuolevat eläimet eristetään tai lopetetaan). Tarkkaillaan turkin, käsitellyn ihon, silmien, limakalvojen, hengitysteiden, verenkierron, autonomisen hermoston, keskushermoston, somatomotorisen aktiviteetin ja käyttäytymismallin muutoksia. Erityisesti on tarkkailtava vapinaa, kouristuksia, syljeneritystä, ripulia, letargiaa, unta ja koomaa. Kuoleman ajankohta on kirjattava niin tarkoin kuin mahdollista. Ruumiinavaus tehdään kokeen aikana kuolleille eläimille ja kokeen päätyttyä myös henkiin jääneille eläimille, kun ne on ensin lopetettu. Kaikki huomattavan suuret patologiset muutokset on kirjattava. Histopatologista tutkimusta varten otetaan kudosnäytteet voimassa olevan ohjeen mukaan.
1.6.3 Arviointi myrkyllisyydestä toisen sukupuolen kohdalla
Kun toiselle sukupuolelle tehty koe on saatu päätökseen, ainetta annostellaan vähintään viiden toista sukupuolta olevan eläimen ryhmälle, jotta voitaisiin todeta, ovatko tämän sukupuolen eläimet aineelle huomattavasti herkempiä. Pienemmänkin eläinmäärän käyttöä voidaan perustella yksittäisissä tapauksissa. Jos on käytettävissä tietoja, joiden mukaan testatun sukupuolen eläimet ovat huomattavasti herkempiä, toista sukupuolta ei tarvitse testata.
2. TIEDOT Yhteenveto tiedoista esitetään taulukkona, jossa jokaisen ryhmän kohdalla on eläinten määrä kokeen alussa, yksittäisten eläinten kuolinajankohdat, niiden eläinten määrä, joilla on muita myrkyllisyydestä johtuvia oireita, myrkytysoireiden kuvaus ja ruumiinavauslöydökset. Yksittäisten eläinten painot on kirjattava välittömästi ennen aineen annostelua, sen jälkeen viikoittain ja lopuksi kuoleman jälkeen. Painonmuutokset on laskettava ja kirjattava, kun eläin pysyy hengissä kauemmin kuin yhden vuorokauden. Eläimet, jotka on lopetettu aineen aiheuttaman ahdistuksen ja kipujen takia, luokitellaan aineen vaikutuksesta kuolleiksi. LD50 voidaan määrittää yleisesti tunnetun menetelmän mukaan. Tietojen arviointiin tulee sisältyä mahdolliset yhteydet eläimen aineelle altistamisen ja kaikkien poikkeavuuksien esiintymisen ja vakavuuden välillä. Tällaisia poikkeavuuksia ovat esimerkiksi käyttäytymismuutokset, kliiniset muutokset, painonmuutokset, kuolleisuus ja muut toksikologiset vaikutukset.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TESTIRAPORTTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
laji, kanta, toimittaja, ympäristöolosuhteet, ruokavalio jne.,
testiolosuhteet (mukaan lukien ihonpuhdistusmenetelmä ja siteen tyyppi: okklusiivinen tai ei-okklusiivinen),
annostasot (annoksen suuruus apuaine mukaan lukien sekä mahdollinen testattavan aineen pitoisuus),
altistettujen eläinten sukupuoli,
vastetietojen luokittelu sukupuolen ja annostason mukaan (kokeen aikana kuolleiden tai lopetettujen eläinten määrä, niiden eläinten määrä, joilla on myrkyllisyydestä johtuvia oireita, altistettujen eläinten määrä),
annostelun jälkeisten kuolemien ajankohta, syyt ja kriteerit eläinten lopettamiseen,
kaikki havainnot,
LD50-arvo sukupuolelle, jolle on tehty 14 päivän pituinen kattava koe (määritysmenetelmä on ilmoitettava),
LD50-arvon 95 prosentin luottamusväli (mahdollisuuksien mukaan),
annos-kuolleisuuskäyrä ja sen kaltevuus (määritysmenetelmän sallimissa rajoissa),
ruumiinavauslöydökset,
muut histopatologiset löydökset,
toisen sukupuolen testauksen tulokset (jos on tehty),
tulosten pohdinta (erityistä huomiota on kiinnitettävä kokeen aikana tehtyjen koe-eläinten lopettamisien LD50-arvoon kohdistamaan vaikutukseen),
tulosten tulkinta.
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA Katso yleistä johdantoa, osa B (D).
4. VIITTEET Katso yleistä johdantoa, osa B (E).
B.4. AKUUTTI TOKSISUUS: IHOÄRSYTTÄVYYS/-SYÖVYTTÄVYYS
B.4.
1. TESTIMENETELMÄ Tämä menetelmä on toisinto OECD:n testiohjeesta nro 404 (2002).
1.
1.1 JOHDANTO Tämän päivitetyn testimenetelmän valmistelun yhteydessä on erityisesti pyritty ottamaan huomioon eläinten hyvinvointiin liittyvät näkökohdat sekä kaikkien testiaineesta aiemmin saatujen tietojen arviointi, jotta voidaan välttää tarpeettomia eläinkokeita. Tässä menetelmässä esitetään suositus, että ennen tässä kuvatun, aineen ärsyttävyyttä/syövyttävyyttä tutkivan in vivo -testin toteuttamista on arvioitava aiempien relevanttien tutkimustulosten painoarvo. Jos saatavissa olevat tiedot ovat puutteellisia, niitä voidaan täydentää vaiheittaisen menettelyn avulla (1). Suositeltava testausstrategia, joka on selostettu tämän menetelmän liitteessä, sisältää validoitujen ja hyväksyttyjen in vitro -testien suorittamisen. Lisäksi suositellaan tilanteen mukaan, että in vivo -alkutestissä eläimelle asetetaan kolme testilappua peräkkäin eikä samanaikaisesti. Sekä järkevien tieteellisten menettelytapojen että eläinten hyvinvoinnin vuoksi in viro -testiä ei pidä suorittaa ennen kuin kaikkien saatavissa olevien testiaineen mahdolliseen ihoärsyttävyyteen/-syövyttävyyteen liittyvien tietojen painoarvo on arvioitu. Tällaisia tietoja ovat todisteet aiemmista ihmisille ja/tai koe-eläimille tehdyistä tutkimuksista, todisteet yhden tai usean rakenteellisesti samankaltaisen aineen tai ainetta sisältävän seoksen ärsyttävyydestä/syövyttävyydestä, aineen voimakasta happamuutta tai emäksisyyttä osoittavat tulokset (2) (3) sekä validoidut ja hyväksytyt in vitro- tai ex vivo -testit (4) (5) (5a). Tällainen analyysi vähentää in vivo -testien tarvetta sellaisten aineiden kohdalla, joiden ihoärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä aiempi tutkimus on jo tuottanut riittävästi todisteita. Suositeltava tapa toteuttaa vaiheittainen menettely, johon sisältyy validoituja ja hyväksyttyjä in vitro- tai ex vivo -testejä ärsyttävyyden/syövyttävyyden selvittämiseksi, selostetaan tämän menetelmän liitteessä. Tämä menettelytapa kehitettiin OECD:n seminaarissa (6), jonka osanottajat suosittelevat sitä yksimielisesti, ja se hyväksyttiin suositeltavaksi testimenettelyksi Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Substances (GHS) -kokouksessa (7). Vaikka tämä menettely ei olekaan olennainen osa testimenetelmää B.4, sen käyttöä suositellaan ennen in vivo -testin suorittamista. Uusia aineita testattaessa se on suositeltava vaiheittainen menettelytapa tieteellisesti pätevien tulosten tuottamiseksi aineen ärsyttävyydestä/syövyttävyydestä. Sellaisten aineiden kohdalla, joiden ihoärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä ei ole riittävästi tietoja, menettelytapaa voidaan käyttää puuttuvien tietojen hankkimiseen. Jos päätetään käyttää jotain muuta menettelytapaa tai olla käyttämättä vaiheittaista menettelytapaa, päätös on perusteltava. Jos aineen ärsyttävyyttä tai syövyttävyyttä ei voida määrittää vaiheittaisen menettelyn mukaisesti aiempien tulosten painoarvoanalyysin avulla, on syytä harkita in vivo -testiä (katso liite).
1.2 MÄÄRITELMÄT Ihoärsytys: korjautuvan ihovaurion syntyminen enintään neljä tuntia kestäneen testiaineen annostelun jälkeen. Ihon syöpyminen: korjautumattoman ihovaurion eli näkyvän orvasketeen ja verinahkaan ulottuvan kuolion ilmaantuminen enintään neljä tuntia kestäneen aineen annostelun jälkeen. Tyypillisiä syöpymisreaktioita ovat haavaumat, verenvuoto, veriset ruvet, 14 päivän tarkkailujakson lopussa ihon vaalenemisen aiheuttama värinmuutos, kokonaan kaljuuntuneet alueet ja arvet. Epäselvien vaurioiden tapauksessa olisi harkittava histopatologista tutkimusta.
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE Testiaine annostellaan yhtenä annoksena koe-eläimen iholle; eläimen ihon käsittelemättömät alueet toimivat kontrollina. Ärsytyksen/syöpymisen aste todetaan ja pisteytetään määrävälein, ja vauriota kuvaillaan vaikutusten arvioinnin täydentämiseksi. Testin on kestettävä niin pitkään, että havaittujen vaikutusten korjautuvuus tai korjautumattomuus voidaan arvioida. Eläimet, joissa havaitaan merkkejä jatkuvasta vakavasta stressistä ja/tai tuskista missä tahansa testin vaiheessa, on lopetettava inhimillisellä tavalla, ja tämä on otettava huomioon testiaineen arvioinnissa. Kuolevien ja kärsivien eläinten lopettamiskriteerit ovat lähteessä (8).
1.4 TESTIMENETELMÄN KUVAUS
1.4
1.4.1 In vivo -testin valmistelu
1.4.1
1.4.1.1 Eläinlajin valinta Suositeltava koe-eläinlaji on albiinokaniini. Kokeessa käytetään nuoria ja terveitä täysikasvuisia yksilöitä. Muiden lajien käyttö on perusteltava.
1.4.1.2 Eläinten valmistelu Noin 24 tuntia ennen testiä eläinten selkäpuolen karva ajetaan lyhyeksi. Ihoa on varottava hankaamasta. Testissä voidaan käyttää vain eläimiä, joiden iho on terve ja vahingoittumaton. Joillakin kaniinikannoilla esiintyy tiheitä karvalaikkuja, jotka ovat tavallista voimakkaampia tiettyinä vuodenaikoina. Tällaisia tiheäkarvaisia alueita ei pidä käyttää testikohtina.
1.4.1.3 Eläinten häkit ja ruokinta Jokaisella eläimellä on oltava oma häkki. Koe-eläinhuoneen lämpötilan on oltava kaniineilla 20 oC (± 3 oC). Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 % eikä mielellään ylitä 70 %:a muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa täytyy käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa.
1.4.2 Testin suoritus
1.4.2
1.4.2.1 Testiaineen annostelu Testiaine annostellaan pienelle ihoalueelle (noin 6 cm2) ja peitetään sideharsolapulla, joka kiinnitetään ihoa ärsyttämättömällä teipillä. Jos suora annostelu ei ole mahdollinen (esimerkiksi nesteiden tai joidenkin tahnojen tapauksessa), testiaine annostellaan ensin sideharsolapulle, joka sitten asetetaan iholle. Lappu on pidettävä kevyessä kosketuksessa ihoon sopivan, puolitiiviin siteen avulla koko altistusjakson ajan. Jos testiaine annostellaan lappuun, se on kiinnitettävä ihoon siten, että aine on hyvässä kosketuksessa ihoon ja leviää tasaisesti. Eläimen yltäminen lappuun ja testiaineen nieleminen tai sisäänhengittäminen on estettävä. Nestemäisiä testiaineita käytetään yleensä laimentamattomina. Testattaessa kiinteitä aineita (jotka voidaan tarvittaessa jauhaa) testiaine on kostutettava mahdollisimman pienellä määrällä vettä (tai tarvittaessa jollain muulla sopivalla kantaja-aineella), jotta saadaan hyvä ihokosketus. Jos käytetään muuta kantaja-ainetta kuin vettä, kantaja-aineen mahdollisen vaikutuksen testiaineen aiheuttamaan ihoärsytykseen pitäisi olla olematon tai mahdollisimman vähäinen. Tavallisesti neljän tunnin mittaisen altistusjakson lopussa ylimääräinen testiaine on poistettava, jos se on käytännössä mahdollista, vedellä tai sopivalla liuottimella muuttamatta orvaskeden senhetkistä vastetta tai eheyttä.
1.4.2.2 Annostaso Testikohtaan annostellaan 0,5 ml nestettä tai 0,5 g kiinteää ainetta tai tahnaa.
1.4.2.3 Alkutesti (ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden in vivo -testi yhdelle eläimelle) On erittäin suositeltavaa suorittaa in vivo -testi aluksi yhdelle eläimelle, erityisesti jos testiaineella arvellaan mahdollisesti olevan syövyttävä vaikutus. Tämä on vaiheittaisen menettelyn mukaista (katso liite 1). Kun aine on todettu syövyttäväksi aiempien tietojen painoarvoanalyysin perusteella, eläinkokeita ei enää tarvita. Useimmille syövyttäviksi epäillyille aineille in vivo -jatkotesti ei yleensä ole tarpeen. Tapauksissa, joissa lisätietoja katsotaan tarvittavan puutteellisten todisteiden takia, rajoitettuja eläinkokeita voidaan kuitenkin tehdä seuraavasti: Enintään kolme testilappua asetetaan yksi toisensa jälkeen eläimen iholle. Ensimmäinen niistä poistetaan kolmen minuutin kuluttua. Jos vakavaa ihoreaktiota ei havaita, toinen lappu asetetaan iholle ja poistetaan tunnin kuluttua. Jos havainnot tässä vaiheessa osoittavat, että altistusta voidaan inhimillisesti jatkaa neljään tuntiin asti, kolmas lappu asetetaan paikoilleen ja poistetaan neljän tunnin kuluttua. Vaste pisteytetään. Jos syövyttävä vaikutus havaitaan minkä tahansa kolmen peräkkäisen altistuksen aikana, testi lopetetaan heti. Jos syövyttävää vaikutusta ei havaita viimeisen lapun poistamisen jälkeen, eläintä tarkkaillaan 14 päivän ajan, mikäli syöpymistä ei kehity sitä ennen. Jos testiaineen ei odoteta aiheuttavan syöpymistä vaan ärsytystä, eläimelle asetetaan yksi lappu neljän tunnin ajaksi.
1.4.2.4 Vahvistustesti (ihoärsyttävyyden in vivo -testi useille eläimille) Jos alkutestissä ei havaita syövyttävää vaikutusta, ärsyttävyys tai negatiivinen vaste on vahvistettava testaamalla vielä kaksi eläintä. Kummallekin asetetaan lappu neljän tunnin altistusjakson ajaksi. Jos ärsyttävä vaikutus havaitaan alkutestissä, vahvistustesti voidaan tehdä peräkkäistestinä tai altistamalla kaksi lisäeläintä yhtäaikaisesti. Siinä poikkeustapauksessa, että alkutestiä ei tehdä, kahdelle tai kolmelle eläimelle voidaan asettaa yksi lappu, joka poistetaan neljän tunnin kuluttua. Kun käytetään kahta eläintä, lisätestiä ei tarvita, jos molemmilla esiintyy sama vaste. Muussa tapauksessa testataan myös kolmas eläin. Epäselvät vasteet täytyy mahdollisesti arvioida testaamalla lisää eläimiä.
1.4.2.5 Tarkkailujakso Tarkkailujakson on oltava riittävän pitkä havaittujen vaikutusten korjautuvuuden arvioimiseksi täydellisesti. Testi on kuitenkin lopetettava heti, jos eläin osoittaa jatkuvia kovien tuskien tai stressin merkkejä. Vaikutusten korjautuvuuden määrittämiseksi eläimiä on tarkkailtava enintään 14 päivän ajan lappujen poistamisen jälkeen. Jos korjautuvuus todetaan ennen kuin 14 päivää on kulunut, testi on lopetettava silloin.
1.4.2.6 Kliiniset havainnot ja ihoreaktioiden pisteytys Kaikista eläimistä tutkitaan eryteeman ja ödeeman merkit ja vasteet pisteytetään ensiksi 60 minuutin jälkeen ja sitten 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua lapun poistamisesta. Yhdelle eläimelle tehtävän alkutestin jälkeen testikohta tutkitaan myös heti lapun poistamisen jälkeen. Ihoreaktiot pisteytetään ja kirjataan jäljempänä esitetyn taulukon asteikon mukaan. Jos iholla esiintyy vaurioita, joita ei voida tunnistaa ärsytykseksi tai syöpymiseksi 72 tunnin kuluttua, voi olla tarpeen jatkaa havainnointia päivään 14 asti, jotta vaikutusten korjautuvuus voidaan todeta. Ärsytyksen lisäksi kaikki paikalliset toksiset vaikutukset, kuten ihon rasvan liukeneminen ja mitkä tahansa koko elimistöön kohdistuvat vaikutukset (esimerkiksi vaikutukset kliinisiin toksisuuden merkkeihin ja ruumiinpainoon), on kuvattava ja kirjattava täydellisesti. Epäselvien vaurioiden tapauksessa olisi harkittava histopatologista tutkimusta. Ihovasteiden pisteytys on väistämättä subjektiivista. Ihovasteiden pisteytyksen yhdenmukaistamiseksi sekä testilaboratorion ja havaintoja tekevien ja tulkitsevien henkilöiden työn helpottamiseksi havaintoja tekevän henkilöstön on oltava riittävän perehtynyttä pisteytysjärjestelmään (katso jäljempänä olevaa taulukkoa). Kuvitettu opas ihoärsytyksen ja muiden vaurioiden asteista voi olla hyödyllinen (9). Ihovasteiden pisteytys on arvioitava sokkona.
2. MÄÄRITYSTULOKSET
2.
2.1 TULOSTEN ESITYSTAPA Tutkimuksen tulokset on esitettävä taulukkomuodossa lopullisessa testiselosteessa, ja niiden on sisällettävä kaikki kohdassa 3.1 luetellut asiat.
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI Ihoärsytyspisteet on arvioitava yhdessä vaurioiden luonteen ja vakavuuden sekä niiden korjautuvuuden tai korjautumattomuuden kanssa. Yksittäiset pisteet eivät edusta aineen ärsyttävyysominaisuuksien absoluuttista tasoa, koska testiaineen muutkin vaikutukset ovat arvioinnissa mukana. Sen sijaan yksittäisiä pisteitä voidaan tarkastella viitearvoina, jotka on arvioitava kaikkien muiden tutkimuksessa tehtyjen havaintojen yhteydessä. Ihovaurioiden korjautuvuus on otettava huomioon ärsytysvastetta arvioitaessa. Jos vasteet kuten kaljuuntuminen (suppealla alueella), liikasarveistuminen, liikakasvu ja hilseily jatkuvat 14 päivän tarkkailujakson loppuun asti, testiainetta voidaan pitää ihoa ärsyttävänä.
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN
3.
3.1 LOPPURAPORTTI Loppuraportissa on oltava seuraavat tiedot:
Perustelut in vivo -testin tekemiselle: aiemmista tutkimuksista saatujen testitulosten painoarvoanalyysi, mukaan luettuina vaiheittaisen menettelyn tulokset:
aiemmista testeistä saatujen relevanttien tulosten kuvaus,
testissä käytetyn menettelytavan kustakin vaiheesta saadut tulokset,
kuvaus tehdyistä in vitro -testeistä, mukaan luettuina suoritusta koskevat yksityiskohtaiset tiedot ja testi-/vertailuaineesta saadut tulokset,
painoarvoanalyysi in vivo -testiä varten.
Testiaine:
tunnistetiedot (esimerkiksi CAS-numero, alkuperä, puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, eränumero)
fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet (esimerkiksi pH, haihtuvuus, liukoisuus, stabiilius),
jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteellinen osuus.
Kantaja-aine:
tunnistetiedot, konsentraatio (tilanteen mukaan), käytetty tilavuus,
perustelut kantaja-aineen valinnalle.
Koe-eläin:
käytetty laji ja kanta, perustelut muiden eläinten kuin albiinokaniinien käytölle,
uros- ja naaraseläinten määrä,
eläinyksilöiden paino testin alussa ja lopussa,
eläinten ikä testin alussa,
eläinten alkuperä, häkkijärjestelyt, ruokavalio ja niin edelleen.
Testiolosuhteet:
lapun asetuskohdan valmistelu,
tiedot lapun materiaalista ja asetustekniikasta,
tiedot testiaineen valmistelusta, annostelusta ja iholta poistamisesta.
Tulokset:
kunkin eläimen ärsytys-/syöpymisvasteen pisteytys jokaiselta mittauskerralta taulukkomuodossa,
havaittujen vaurioiden kuvaus,
sanallinen kuvaus havaitun ärsytyksen/syöpymisen luonteesta ja asteesta sekä mahdolliset histopatologiset löydökset,
kuvaus muista paikallisista haittavaikutuksista (esimerkiksi ihon rasvan liukeneminen) ja ihoärsytyksen/-syöpymisen lisäksi koko elimistöön kohdistuvat vaikutukset,
tulosten pohdinta.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
LÄHDELUETTELO Barratt, M. D., Castell, J. V., Chamberlain, M., Combes, R. D., Dearden, J. C, Fentem, J. H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995). The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26. Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Liebsch, M. (1998). Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709–720. ECETOC (1990) Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Bryssel. Fentem, J.H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 483–524. Testimenetelmä B.40 Skin Corrosion. OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Pidetty Solnassa, Ruotsissa 22.–.24. tammikuuta 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, marraskuu 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, elokuu 1990. (Saatavana OECD:n sihteeristöltä pyydettäessä.)
Taulukko I Eryteeman ja karstan muodostus Ödeeman (turvotuksen) muodostus IHOREAKTIOIDEN PISTEYTYS
Ei eryteemaa … 0 Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava) … 1 Selkeästi erottuva eryteema … 2 Keskivakava — vakava eryteema … 3 Vakava eryteema (voimakas punoitus) — karsta, joka estää eryteeman pisteytyksen … 4 Suurin mahdollinen pistemäärä: 4 Ei ödeemaa … 0 Hyvin lievä ödeema (tuskin havaittava) … 1 Lievä ödeema (selvärajainen alue, jonka reunat ovat koholla) … 2 Keskivakava ödeema (noin 1 mm koholla) … 3 Vakava ödeema (enemmän kuin 1 mm koholla ja levinnyt altistuskohtaa laajemmalle) … 4 Suurin mahdollinen pistemäärä: 4 Epäselvien vaurioiden tapauksessa voidaan tehdä histopatologinen tutkimus.
B.5. AKUUTTI TOKSISUUS: SILMÄN ÄRSYTTÄVYYS/SYÖVYTTÄVYYS
B.5.
1. MENETELMÄ Tämä menetelmä on toisinto OECD:n testiohjeesta nro 405 (2002).
1.
1.1 JOHDANTO Tämän päivitetyn testimenetelmän valmistelun yhteydessä on erityisesti pyritty ottamaan huomioon kaikkien testiaineesta aiemmin saatujen tietojen arviointi ja eläinten hyvinvointiin liittyvät näkökohdat, jotta voidaan välttää tarpeettomia eläinkokeita. Tässä menetelmässä esitetään suositus, että ennen tässä kuvatun, akuuttia silmä-ärsyttävyyttä/syövyttävyyttä tutkivan in vivo -testin toteuttamista on arvioitava aiempien relevanttien tutkimustulosten painoarvo (1). Jos saatavissa olevat tiedot ovat puutteellisia, niitä voidaan täydentää vaiheittaisen menettelyn avulla (2) (3). Suositeltava testausstrategia, joka on selostettu tämän menetelmän liitteessä, sisältää validoitujen ja hyväksyttyjen in vitro -testien suorittamisen. Lisäksi suositellaan, että ennen in vivo -silmätestin tekemistä tehdään in vivo -ihoärsyttävyys-/-syövyttävyystesti silmäsyövytyksen ennustamiseksi. Sekä järkevien tieteellisten menettelytapojen että eläinten hyvinvoinnin vuoksi in vivo -testiä ei pidä suorittaa ennen kuin kaikkien saatavissa olevien testiaineen mahdolliseen silmä-ärsyttävyyteen/syövyttävyyteen liittyvien tietojen painoarvo on arvioitu. Tällaisia tietoja ovat todisteet aiemmista ihmisille ja/tai koe-eläimille tehdyistä tutkimuksista, todisteet yhden tai usean rakenteellisesti samankaltaisen aineen tai ainetta sisältävän seoksen ärsyttävyydestä/syövyttävyydestä, aineen voimakasta happamuutta tai emäksisyyttä osoittavat tulokset (4) (5) sekä validoidut ja hyväksytyt in vitro- tai ex vivo -ihoärsyttävyys-/-syövyttävyystestit (6) (6a). Tutkimukset voivat olla painoarvoanalyysia aiemmin tehtyjä tai sen tuloksena syntyneitä. Joidenkin aineiden kohdalla painoarvoanalyysi voi osoittaa, että in vivo -testi on tarpeen aineen mahdollisen silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden selvittämiseksi. Kaikissa sellaisissa tapauksissa on ennen in vivo -silmätestin harkitsemista suositeltavaa tehdä ensin in vivo -ihotesti ihovaikutusten selvittämiseksi ja arvioida se testimenetelmän B.4 mukaan (7). Painoarvoanalyysi ja vaiheittainen menettely vähentävät tarvetta in vivo -testeihin silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden selvittämiseksi aineilla, joiden ominaisuuksista muut tutkimukset ovat jo tuottaneet riittävästi todisteita. Jos aineen silmä-ärsyttävyyttä/-syövyttävyyttä ei voida määrittää vaiheittaisen menettelyn avulla eikä edes in vivo -ihotestin jälkeen, in vivo -silmätesti voidaan tehdä. Suositeltava tapa toteuttaa vaiheittainen menettely, johon sisältyy validoituja ja hyväksyttyjä in vitro- tai ex vivo -testejä ärsyttävyyden/syövyttävyyden selvittämiseksi, selostetaan tämän menetelmän liitteessä. Tämä menettelytapa kehitettiin OECD:n seminaarissa (8), jonka osanottajat suosittelevat sitä yksimielisesti, ja hyväksyttiin suositeltavaksi testimenettelyksi Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Substances (GHS) -kokouksessa (9). Vaikka tämä menettely ei olekaan olennainen osa testimenetelmää B.4, sen käyttöä suositellaan ennen in vivo -testin suorittamista. Uusia aineita testattaessa se on suositeltava vaiheittainen menettelytapa, jonka avulla voidaan kehittää tieteellisesti päteviä tuloksia aineen ärsyttävyydestä/syövyttävyydestä. Sellaisten aineiden kohdalla, joiden iho- ja silmä-ärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä ei ole riittävästi tietoja, menettelytapaa voidaan käyttää puuttuvien tietojen hankkimiseen. Jos päätetään käyttää jotain muuta menettelytapaa tai olla käyttämättä vaiheittaista menettelytapaa, päätös on perusteltava.
1.2 MÄÄRITELMÄT Silmä-ärsytys: silmän muutokset, jotka syntyvät, kun testiainetta on annosteltu silmän etupinnalle, ja korjautuvat täysin 21 päivän kuluessa annostelusta. Silmän syöpyminen: silmän kudosvauriot tai vakava fyysinen näön rappeutuminen, joka syntyy, kun testiainetta on annosteltu silmän etupinnalle, eikä se korjaudu täysin 21 päivän kuluessa annostelusta.
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE Testiaine annostellaan yhtenä annoksena koe-eläimen toiseen silmään. Käsittelemätön silmä toimii kontrollina. Silmän ärtymisen/syöpymisen aste arvioidaan pisteyttämällä sidekalvon, sarveiskalvon ja värikalvon vammat tietyin väliajoin. Muut silmään kohdistuvat vaikutukset ja koko elimistöön kohdistuvat haittavaikutukset kuvataan myös, jotta vaikutuksia voidaan arvioida kokonaisuudessaan. Testin on kestettävä niin pitkään, että havaittujen vaikutusten korjautuvuus tai korjautumattomuus voidaan arvioida. Eläimet, joissa havaitaan merkkejä jatkuvasta vakavasta stressistä ja/tai tuskista missä tahansa testin vaiheessa, on lopetettava inhimillisellä tavalla, ja tämä on otettava huomioon testiaineen arvioinnissa. Kuolevien ja kärsivien eläinten lopettamiskriteerit ovat lähteessä (10).
1.4 TESTIMENETELMÄN KUVAUS
1.4
1.4.1 In vivo -testin valmistelu
1.4.1
1.4.1.1 Eläinlajin valinta Suositeltava koe-eläinlaji on albiinokaniini. Kokeessa käytetään nuoria ja terveitä täysikasvuisia yksilöitä. Muiden lajien käyttö on perusteltava.
1.4.1.2 Koe-eläinten valmistelu Kunkin alustavasti testiin valitun koe-eläimen molemmat silmät tutkitaan testin alkua edeltävän 24 tunnin aikana. Eläimiä, joilla esiintyy silmien ärtyneisyyttä, silmävikoja tai aiempia sarveiskalvon vaurioita, ei voi käyttää testissä.
1.4.1.3 Eläinten häkit ja ruokinta Jokaisella eläimellä on oltava oma häkki. Koe-eläinhuoneen lämpötilan on oltava kaniineilla 20 oC (± 3 oC). Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 % eikä mielellään ylitä 70 %:a muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa.
1.4.2 Testimenettely
1.4.2
1.4.2.1 Testiaineen annostelu Eläimen alaluomea vedetään varovasti silmämunasta poispäin ja testiaine annostellaan eläimen toisen silmän sidekalvopussiin. Sen jälkeen luomia pidetään varovasti yhdessä sekunnin ajan, jotta aine ei valuisi ulos silmästä. Toinen silmä, jota ei käsitellä, toimii kontrollina.
1.4.2.2 Huuhtelu Koe-eläinten silmiä ei saa pestä vähintään 24 tuntiin testiaineen annostelun jälkeen, paitsi jos kyseessä on kiinteä aine (katso kohta 1.4.2.3.2) tai välitön ärsyttävä tai syövyttävä vaikutus. Silmät voidaan pestä 24 tunnin kuluttua, jos se katsotaan tarpeelliseksi. Pesemisen vaikutuksen selvittämiseksi ei suositella kontrolliryhmää, paitsi jos sille on tieteellisiä perusteita. Jos kontrolliryhmä tarvitaan, käytetään kahta kaniinia. Pesuolosuhteet on dokumentoitava tarkasti, esimerkiksi pesuaika, pesuliuoksen koostumus ja lämpötila, pesun kesto, nesteen tilavuus ja virtausnopeus.
1.4.2.3 Annostaso
1.4.2.3
1.4.2.3.1 Nesteiden testaus Testattaessa nesteitä testiannos on 0,1 ml. Ainetta ei saa annostella suoraan suihkepumpusta silmään. Nestesuihke on ensin kerättävä astiaan ennen 0,1 ml:n annostelua silmään.
1.4.2.3.2 Kiinteiden aineiden testaus Testattaessa kiinteitä aineita, tahnoja ja hiukkasmaisia aineita annoksen tilavuuden on oltava 0,1 ml tai painon enintään 100 mg. Testiaine jauhetaan hienoksi pölyksi. Kiinteän aineen tilavuus mitataan, kun aine on ensin kevyesti tiivistetty esimerkiksi naputtamalla mitta-astiaa. Jos kiinteä aine ei ole poistunut koe-eläimen silmästä fysiologisten mekanismien seurauksena ensimmäiseen havainnointiaikaan mennessä eli tunnin kuluttua käsittelystä, silmä voidaan huuhdella fysiologisella suolaliuoksella tai tislatulla vedellä.
1.4.2.3.3 Aerosolien testaus On suositeltavaa kerätä kaikki pumpattavat suihkeet ja aerosolit ennen niiden annostelua silmään. Ainoa poikkeus ovat paineistetuissa aerosolisäiliöissä olevat aineet, joita ei voida kerätä höyrystymisen takia. Sellaisessa tapauksessa silmää pidellään auki ja testiaine annostellaan silmään yhtenä sekunnin kestävänä purskauksena 10 cm:n etäisyydeltä suoraan silmän edestä. Välimatka voi vaihdella suihkesäiliön paineen ja sisällön mukaan. On varottava, ettei suihkesäiliön paine vahingoita silmää. Joissakin tapauksissa voi olla syytä arvioida suihkeen voimakkuuden silmälle mahdollisesti aiheuttamat mekaaniset vauriot. Aerosoliannoksen suuruus voidaan arvioida simuloimalla testiä seuraavalla tavalla. Testiaine suihkutetaan punnituspaperille suoraan paperin edessä olevasta kaniinin silmän kokoisesta aukosta. Paperin painon lisäyksen avulla arvioidaan silmään suihkutettu määrä. Haihtuvien aineiden tapauksessa annoksen suuruus voidaan arvioida punnitsemalla keräysastia ennen ja jälkeen testiaineen poistamisen.
1.4.2.4 Alkutesti (in vivo -silmä-ärsyttävyys/syövyttävyystesti yhdelle eläimelle) Vaiheittaisen menettelyn mukaan (katso liite 1) on erittäin suositeltavaa suorittaa in vivo -testi aluksi vain yhdelle eläimelle. Jos testitulos osoittaa, että aine on silmää syövyttävä tai vakavasti ärsyttävä kuvattua menettelyä käytettäessä, silmän ärtymistä ei pidä enää testata.
1.4.2.5 Paikallispuudutusaineet Paikallispuudutusainetta voidaan käyttää tapauskohtaisesti. Jos painoarvoanalyysi tai vaiheittainen menettely osoittaa, että aine saattaa aiheuttaa tuskia, tai jos alkutestissä on todettu kipureaktio, paikallispuudutusainetta voidaan antaa ennen testiaineen annostelua. Paikallispuudutusaineen laji, konsentraatio ja annos on valittava huolellisesti, jotta varmistetaan, että erot testiaineen aiheuttamissa reaktioissa eivät johdu puudutusaineesta. Testiaineella käsittelemätön silmä on puudutettava samalla tavoin.
1.4.2.6 Vahvistustesti (in vivo -silmä-ärsyttävyystesti useille eläimille) Jos alkutestissä ei havaita syövyttävää vaikutusta, ärsyttävyys tai negatiivinen vaste on vahvistettava testaamalla vielä enintään kaksi eläintä. Jos alkutestissä todetaan voimakas ärsyttävä vaikutus, joka viittaa mahdolliseen voimakkaaseen (korjautumattomaan) vaikutukseen vahvistustestissä, on suositeltavampaa tehdä vahvistustesti vaiheittaisen menettelyn mukaan yhdelle eläimelle kerrallaan kuin altistaa uudet kaksi eläintä samalla kertaa. Jos toisella eläimellä esiintyy syöpymisoireita tai vakavia ärsytysoireita, testiä ei jatketa. Heikon tai keskinkertaisen ärsyttävän vaikutuksen vahvistamiseksi saattaa olla tarpeen testata useampia eläimiä.
1.4.2.7 Tarkkailujakso Tarkkailujakson on oltava riittävän pitkä havaittujen vaikutusten voimakkuuden ja korjautuvuuden arvioimiseksi täydellisesti. Testi on kuitenkin lopetettava heti, jos eläin osoittaa jatkuvia kovien tuskien tai stressin merkkejä (9). Vaikutusten korjautuvuuden määrittämiseksi eläimiä on tarkkailtava tavallisesti 21 päivän ajan testiaineen antamisen jälkeen. Jos korjautuvuus todetaan ennen kuin 21 päivää on kulunut, testi on lopetettava silloin.
1.4.2.7
1.4.2.7.1 Kliiniset havainnot ja silmäreaktioiden pisteytys Silmät tutkitaan 1, 24, 48 ja 72 tuntia testiaineen annostelun jälkeen. Eläintä ei saa pitää testattavana sen jälkeen kun lopulliset tiedot on saatu. Eläimet, jotka osoittavat jatkuvia stressin tai vakavien tuskien merkkejä, on viipymättä lopetettava inhimillisellä tavalla, ja tämä on otettava huomioon testiaineen vaikutusten arvioinnissa. Inhimillisellä tavalla on lopetettava eläimet, joilla esiintyy testiaineen annostelun jälkeen seuraavia silmävammoja: sarveiskalvon puhkeaminen tai huomattava sarveiskalvon haavauma mukaan luettuna pullistuma, verta silmän etukammiossa, asteen 4 sarveiskalvosamentuma, joka jatkuu 48 tuntia, valorefleksin puuttuminen (värikalvon vaste 2), joka jatkuu 72 tuntia, sidekalvon haavauma, sidekalvon tai vilkkukalvon kuolio tai arpeutuminen. Näin menetellään siksi, että kyseiset vauriot ovat yleensä korjautumattomia. Eläimet, joille ei kehity silmävammoja, voidaan lopettaa aikaisintaan kolme päivää testiaineen annostelun jälkeen. Eläimiä, joilla esiintyy lieviä tai keskinkertaisia vaurioita, on tarkkailtava, kunnes vauriot häviävät, tai 21 päivää, jolloin testi lopetetaan. Havainnot on tehtävä päivinä 7, 14 ja 21, jotta voidaan määrittää vaurioiden tila ja niiden korjautuvuus tai korjautumattomuus. Silmäreaktioiden (sidekalvon, sarveiskalvon ja värikalvon) asteet on kirjattava joka kerta, kun eläintä tutkitaan (taulukko I). Kaikki muut silmävauriot (esimerkiksi sarveiskalvoverho, värjäytyminen) tai koko elimistöön kohdistuvat haittavaikutukset on myös raportoitava. Reaktioiden tutkimista helpottaa luuppilasien, lampun, biomikroskoopin tai muiden sopivien laitteiden käyttö. Kun havainnot on kirjattu 24 tunnin jälkeen, silmiä voidaan edelleen tutkia fluoreskeiinin avulla. Silmävasteiden pisteytys on väistämättä subjektiivista. Silmävasteiden pisteytyksen yhdenmukaistamiseksi sekä testilaboratorion ja havaintoja tekevien ja tulkitsevien henkilöiden työn helpottamiseksi havaintoja tekevän henkilöstön on oltava riittävän perehtynyttä pisteytysjärjestelmään. Silmävasteiden pisteytys on arvioitava sokkona.
2. MÄÄRITYSTULOKSET
2.
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI Silmä-ärsytyspisteet on arvioitava yhdessä vammojen luonteen ja vakavuuden sekä niiden korjautuvuuden tai korjautumattomuuden kanssa. Yksittäiset pisteet eivät edusta aineen ärsyttävyysominaisuuksien absoluuttista tasoa, koska testiaineen muutkin vaikutukset ovat arvioinnissa mukana. Sen sijaan yksittäisiä pisteitä pitäisi tarkastella viitearvoina, jotka ovat merkitseviä vain, kun kaikki muut havainnot ja niiden arviointi tukevat pisteiden antamaa tietoa.
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN
3.
3.1 LOPPURAPORTTI Loppuraportissa on annettava seuraavat tiedot:
Perustelut in vivo -testin tekemiselle: aiemmista tutkimuksista saatujen testitulosten painoarvon analyysi, mukaan luettuna vaiheittaisen menettelyn tulokset:
aiemmista testeistä saatujen relevanttien tulosten kuvaus,
testimenettelyn kustakin vaiheesta saadut tulokset,
kuvaus tehdyistä in vitro -testeistä, mukaan luettuna niiden suorittamistapa ja testi-/viiteaineesta saadut tulokset,
kuvaus tehdyistä in vivo -ihoärsyttävyys/-syövyttävyystesteistä sekä niiden tulokset,
painoarvoanalyysi in vivo -testiä varten.
Testiaine:
tunnistetiedot (esimerkiksi CAS-numero, alkuperä, puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, eränumero),
fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet (esimerkiksi pH, haihtuvuus, liukoisuus, stabiilius, reaktiivisuus veden kanssa),
jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteellinen osuus,
jos on käytetty paikallispuudutusainetta, sen tunnistetiedot, puhtaus, laji, annos ja mahdollinen vuorovaikutus testiaineen kanssa.
Kantaja-aine:
tunnistetiedot, konsentraatio (tilanteen mukaan), käytetty tilavuus,
perustelut kantaja-aineen valinnalle.
Koe-eläimet:
käytetty laji ja kanta, perustelut muiden eläinten kuin albiinokaniinien käytölle,
eläinten ikä testin alussa,
uros- ja naaraseläinten määrä testi- ja kontrolliryhmissä (jos tarpeen),
eläinyksilöiden paino testin alussa ja lopussa,
eläinten alkuperä, häkkijärjestelyt, ruokavalio ja niin edelleen.
Tulokset:
kuvaus ärsytyksen pisteytyksessä käytetystä välineestä kullakin havaintokerralla (esimerkiksi lamppu, biomikroskooppi, fluoreskeiini),
taulukkomuotoiset tiedot kunkin eläimen ärsytys-/syöpymisvasteesta kullakin havaintokerralla siihen asti, kun eläin on poistettu testistä,
sanallinen kuvaus havaitun ärsytyksen/syöpymisen luonteesta ja asteesta,
kuvaus kaikista silmässä havaituista vaurioista (esimerkiksi verisuonittuminen, sarveiskalvoverhon muodostus, umpeen muurautuminen, värjäytyminen),
kuvaus muualle kuin silmään kohdistuvista vaurioista sekä koko elimistöön kohdistuvista haittavaikutuksista ja mahdolliset histopatologiset löydökset.
Tulosten pohdinta.
3.2 TULOSTEN TULKINTA Koe-eläimille tehtyjen silmä-ärsytystestien tulosten ekstrapolointi ihmisiä koskeviksi on vain rajoitetusti pätevää. Monissa tapauksissa albiinokaniini on ihmistä herkempi silmää ärsyttäville tai syövyttäville aineille. Tulosten tulkinnassa on huolellisesti erotettava sekundäärisestä tulehduksesta johtuva ärsytys.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
LÄHDELUETTELO Barratt, M. D., Castell, J. V., Chamberlain, M., Combes, R. D., Dearden, J. C, Fentem, J. H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995). The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K. G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K. C, Hill, R. N. (1997). Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159–164. Worth A. P. and Fentem J. H. (1999). A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177. Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26. Neun, D. J. (1993). Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Edsaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483–524. Testimenetelmä B.40. Ihosyövyttävyys. Testimenetelmä B.4. Akuutti toksisuus: ihoärsyttävyys/-syövyttävyys. OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Pidetty Solnassa, Ruotsissa, 22.–24. tammikuuta 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, marraskuu 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
Taulukko I SILMÄVAURIOIDEN PISTEYTYS
Sarveiskalvo
Samentuma: tiheysaste (mittausarvot otettava tiheimmästä kohdasta) Ei haavaumia tai samentumaa … 0 Yksittäisiä tai hajanaisia samentuma-alueita (muu kuin lievä normaalin kiillon himmentyminen); värikalvon yksityiskohdat selvästi nähtävissä … 1 Selvästi erottuva läpinäkyvä alue; värikalvon yksityiskohdat hiukan peittyneet … 2 Helmiäishohtoinen alue; värikalvon yksityiskohtia ei erotu lainkaan; pupilli tuskin erottuva … 3 Samea sarveiskalvo; värikalvo ei erotu samentuman läpi … 4 Suurin mahdollinen pistemäärä: 4 HUOMAUTUKSET
Värikalvo
Normaali … 0 Selvästi syventyneet poimut, verentungosta, turvotusta, keskinkertaista verekkyyttä sarveiskalvon ympärillä; värikalvon reagoiminen valoon (viivästynyt reaktio katsotaan testiaineen vaikutukseksi) … 1 Verenvuotoa, vakavasti tuhoutunut värikalvo tai ei reaktiota valoon … 2 Suurin mahdollinen pistemäärä: 2
Sidekalvo
Normaali punaisuus (viittaa luomen ja silmämunan sidekalvoon; pois lukien sarveiskalvo ja värikalvo) … 0 Joitakin hypereemisiä verisuonia … 1 Laajalle levinnyt helakka punaisuus; yksittäiset suonet eivät erotu selvästi … 2 Laajalle levinnyt voimakas punaisuus … 3 Suurin mahdollinen pistemäärä: 3
Sidekalvopöhö
Turvotus (viittaa luomiin ja/tai vilkkukalvoon) Normaali … 0 Hiukan normaalia enemmän turvotusta … 1 Selvää turvotusta, luomet osittain kääntyneet ympäri … 2 Turvotusta, luomet puoliksi muurautuneet umpeen … 3 Turvotusta, luomet enemmän kuin puoliksi muurautuneet umpeen … 4 Suurin mahdollinen pistemäärä: 4
B.6. IHON HERKISTYMINEN
B.6.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Huomautukset: Testien herkkyys ja kyky havaita ihmisen ihoa mahdollisesti herkistäviä aineita on tärkeä kansanterveyteen liittyvän toksisuuden luokitusjärjestelmän kannalta. Kaikkia ihmisen ihoa mahdollisesti herkistäviä aineita ei voida adekvaatisti tunnistaa millään yksittäisellä testimenetelmällä, joka myös sopisi kaikille aineille. Sellaiset tekijät kuten aineen fysikaaliset ominaisuudet, mukaan lukien sen ihon läpäisykyky, on otettava huomioon testin valinnassa. On kehitetty kahdentyyppisiä marsutestejä: adjuvanttityyppiset testit, joissa allergista tilaa voimistetaan liuottamalla tai suspensoimalla testiaine Freundin täydelliseen adjuvanttiin (FCA, Freunds Complete Adjuvant), ja muut kuin adjuvanttitestit. Adjuvanttityyppiset testit todennäköisesti ennustavat aineen ihmisen ihoa mahdollisesti herkistävää vaikutusta tarkemmin kuin menetelmät, joissa ei käytetä FCA:ta, minkä vuoksi adjuvantti-tyyppisiä testejä suositaan. Marsun maksimaatiotesti (Guinea-Pig Maximisation test, GPMT) on laajalti käytetty adjuvantti-tyyppinen testi. Vaikka aineen ihon herkistämisriski voidaan todeta useilla muillakin menetelmillä, marsun maksimaatiotesti on suositeltavin adjuvanttimenetelmistä. Monien kemikaalien kohdalla muita kuin adjuvanttitestejä (joista suositeltavin on Buehlerin testi) pidetään vähemmän herkkinä. Tietyissä tapauksissa voi olla perusteltua valita Buehlerin testi, jossa aine annostellaan paikallisesti eikä ihonsisäisesti kuten marsun maksimaatiotestissä. Buehlerin testin käytölle on esitettävä tieteelliset perusteet. Marsun maksimaatiotesti ja Buehlerin testi kuvataan tässä menetelmässä. Myös muita menetelmiä voidaan käyttää edellyttäen, että ne on validoitu hyvin ja niiden käyttö on tieteellisesti perusteltua. Jos tunnustetussa seulontatutkimuksessa saadaan positiivinen tulos, testiaine voidaan määrittää mahdollisesti herkistäväksi aineeksi eikä ole tarpeen enää tehdä marsutestiä. Jos tunnustetussa seulontatutkimuksessa saadaan negatiivinen tulos, marsutesti on tehtävä tämän testimenetelmän yhteydessä kuvattua menetelmää käyttäen. Ks. myös yleisjohdanto, osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄT Ihon herkistyminen: (allerginen kosketusihottuma) Aineen aiheuttama immunologisesti välittyvä ihoreaktio. Ihmisellä vastereaktio voi olla kutina, punoitus, turvotus, näppylät, vesirakkulat, vesikellot tai jokin näiden yhdistelmä. Muilla eläinlajeilla reaktiot voivat olla erilaisia ja vain punoitusta ja turvotusta voi esiintyä. lnduktioaltistus: Koehenkilön kokeellinen altistaminen testiaineelle tarkoituksena aikaansaada yliherkistymistila. Induktiojakso: Induktioaltistusta seuraava vähintään viikon kestävä jakso, jonka aikana yliherkistymistila voi kehittyä. Haastealtistus: Aiemmin käsitellyn koehenkilön kokeellinen altistaminen testiaineelle induktiojakson jälkeen koehenkilön mahdollisen yliherkistymisreaktion määrittämiseksi.
1.3. VERTAILUAINEET Käytetyn koemenetelmän herkkyys ja luotettavuus tulee tutkia puolen vuoden välein aineilla, joiden tiedetään herkistävän ihoa lievästi tai kohtalaisesti. Oikein suoritetussa adjuvanttitestissä vasteen voidaan odottaa olevan vähintään 30 % ja muussa kuin adjuvanttitestissä vähintään 15 % lievillä/kohtalaisilla herkistäjillä. Seuraavia aineita suositellaan: CAS-numerot EINECS-numerot EINECS-nimet Geneeriset nimet 101-86-0 202-983-3 α-heksyylisinnaamialdehydi α-heksyylisinnaamialdehydi 149-30-4 205-736-8 bentsotiatsoli-2-tioli (merkaptobentsotiatsoli) kaptaksi 94-09-7 202-303-5 bentsokaiini norkaiini Joissakin olosuhteissa voidaan riittävin perustein käyttää muita vertailuaineita, jotka täyttävät edellä mainitut perusteet.
1.4 KOEMENETELMÄN PERIAATE Koe-eläimet altistetaan testiaineelle aluksi ruiskuttamalla ainetta ihonsisäisesti ja/tai levittämällä sitä iholle (induktioaltistus). Lepojakson (10–14 vrk:n induktiojakso) aikana voi kehittyä immuunivaste. Lepojakson jälkeen eläimet altistetaan haasteannokselle. Haastealtistuksen testiryhmässä aiheuttamaa ihoreaktion laajuutta ja voimakkuutta verrataan verrokkieläimiin, joille annetaan induktion aikana lumekäsittely, mutta jotka saavat kuitenkin haastealtistuksen.
1.5 KOEMENETELMIEN KUVAUS Jos testiaine on välttämättä poistettava, se tulee tehdä vedellä ja sopivalla liuottimella niin ettei saavutettu vaste muutu eikä ihon pinta rikkoonnu.
1.5
1.5.1 Marsun maksimaatiotesti
1.5.1
1.5.1.1 Valmistelut Terveet nuoret täysikasvuiset albiinomarsut totutetaan laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan ennen testiä. Ennen testiä eläimet jaetaan satunnaisotannalla testi- ja verrokkiryhmiin. Karvat poistetaan leikkaamalla, ajelemalla tai mahdollisesti kemiallisella depilaatiolla käytetystä testimenetelmästä riippuen. Varovaisuutta on noudatettava, ettei iho naarmuunnu rikki. Eläimet punnitaan ennen testiä ja sen jälkeen.
1.5.1.2 Koeolosuhteet
1.5.1.2
1.5.1.2.1 Koe-eläimet Koe-eläiminä käytetään yleisesti käytettyjä albiinomarsun laboratoriokantoja.
1.5.1.2.2 Lukumäärä ja sukupuoli Testissä voidaan käyttää sekä uroksia että naaraita. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä. Testiryhmässä on oltava vähintään kymmenen eläintä ja verrokkiryhmässä vähintään viisi. Testeissä, joissa on käytetty alle 20 testimarsua ja alle 10 verrokkimarsua, eikä testiaineen herkistävyydestä voida tehdä johtopäätöksiä, suositellaan voimakkaasti lisätestejä siten, että testieläimiä on yhteensä vähintään 20 ja verrokkieläimiä kymmenen.
1.5.1.2.3 Annostasot Testiaineen pitoisuus kutakin induktioaltistusta kohti tulee olla hyvin siedetty systeemisesti ja korkein mahdollinen lievän tai kohtalaisen ihoärsytyksen aiheuttamiseksi. Haastealtistuspitoisuuden tulee olla suurin ärsyttämätön annos. Mikäli on tarpeen, sopivat pitoisuudet voidaan määrittää esitutkimuksessa kahdella tai kolmella eläimellä. Tähän tarkoitukseen tulisi käyttää FCA:lla käsiteltyjä eläimiä.
1.5.1.3 Kokeen suorittaminen
1.5.1.3
1.5.1.3.1 Induktio Päivä 0 — testiryhmä Lapojen alueelle, jolta on poistettu karvat, pistetään kuusi ihonsisäistä 0,1 ml:n ruisketta pareittain siten, että puolet (3) on keskiviivan vasemmalla ja puolet (3) oikealla puolella. 1. ruiske: 1:1 sekoitus (v/v) FCA:ta ja vettä tai fysiologista keittosuolaliuosta 2. ruiske: testiaine sopivassa vehikkelissä valitulla pitoisuudella 3. ruiske: testiaine valitulla pitoisuudella 1:1 seoksessa (v/v) FCA:ta ja vettä tai fysiologista keittosuolaliuosta. Kolmannen ruiskeen vesiliukoiset aineet liuotetaan vesifaasiin ennen FCA:han sekoittamista. Rasvaliukoiset tai liukenemattomat aineet suspensoidaan FCA:han ennen vesifaasiin yhdistämistä. Testiaineen lopullisen pitoisuuden on oltava sama kuin toisessa ruiskeessa. Ensimmäinen ja toinen ruiske pistetään lähekkäin lähimmäksi päätä. Kolmas ruiske pistetään testialueen hännänpuoleiseen osaan. Päivä 0 — verrokkiryhmä Kuusi ihonsisäistä 0,1 ml:n ruisketta pistetään samoihin kohtiin kuin testiryhmään kuuluville eläimille. 1. ruiske: 1:1 seos (v/v) FCA:ta ja vettä tai fysiologista keittosuolaliuosta 2. ruiske: laimentamatonta vehikkeliä 3. ruiske: 50-prosenttinen v/v -sekoitus vehikkeliä FCA:n ja veden tai fysiologisen keittosuolaliuoksen seoksessa suhteessa 1:1 (v/v). Päivät 5. – 7. — testi- ja verrokkiryhmät Jos aine on ihoa ärsyttämätön, testialuetta käsitellään noin 24 tuntia ennen paikallista induktiota karvojen huolellisen poisleikkaamisen ja/tai ajelemisen jälkeen 0,5 ml:lla 10-prosenttista natrium-lauryylisulfaatti-vaseliinia paikallisärsytyksen aiheuttamiseksi. Päivät 6. – 8. — testiryhmä Testialueelta poistetaan jälleen karvat. Sopivassa vehikkelissä olevalla testiaineella läpikotaisin kyllästetty suodatinpaperi (2 x 4 cm) asetetaan testialueelle ihoa vasten ja peitetään okkluusiositeellä 48 tunniksi. Vehikkelin valinta tulee perustella. Kiinteät aineet hienonnetaan ja yhdistetään sopivaan vehikkeliin. Nesteitä voidaan käyttää laimentamattomina, jos se on tarkoituksenmukaista. Päivät 6. – 8. — verrokkiryhmä Testialueelta poistetaan jälleen karvat. Pelkkä vehikkeli asetetaan testiaineen tavoin testialueelle ja peitetään okkluusiositeellä 48 tunniksi.
1.5.1.3.2 Haastealtistus Päivät 20. – 22. — testi- ja verrokkiryhmät Testi- ja verrokkieläinten kyljistä poistetaan karvapeite. Testiaineella kyllästetty lappu tai kupu asetetaan eläinten toiseen kylkeen ja tarvittaessa pelkällä vehikkelillä kyllästetty lappu tai kupu toiseen kylkeen. Lappujen annetaan olla ihoa vasten okkluusiositeen alla 24 tuntia.
1.5.1.3.3 Havainnointi ja pisteytys: testi- ja verrokkiryhmät Testi- ja verrokkieläinten sokkoarviointia suositellaan. Jos ensimmäisen haastealtistuksen tulokset vaativat selventämistä, on harkittava haastealtistuksen uusimista mahdollisesti uudella verrokkiryhmällä, jos se on tarkoituksenmukaista, noin viikon kuluttua ensimmäisestä haastealtistuksesta. Haastealtistus voidaan uusia myös alkuperäisellä verrokkiryhmällä. Kaikki induktiosta ja haastetoimenpiteistä johtuvat ihoreaktiot ja epätavalliset löydökset, mukaan lukien systeemiset reaktiot, tulee havainnoida ja kirjata Magnusson/Kligman -pisteytysasteikon mukaan (ks. liite). Muita toimenpiteitä, esimerkiksi histopatologinen tutkimus ja ihopoimumittaus, voidaan suorittaa epäilyttävien reaktioiden selventämiseksi.
noin 21 tuntia lapun poistamisen jälkeen haastealue puhdistetaan ja tarvittaessa karvat leikataan huolellisesti pois ja/tai ajellaan tai poistetaan depilaatiolla,
noin kolme tuntia myöhemmin (noin 48 tunnin kuluttua haastealtistuksen aloittamisesta) havainnoidaan ihoreaktiota ja kirjataan se liitteen pisteytysasteikon mukaisesti,
noin 24 tunnin kuluttua ensimmäisestä havainnoinnista ihoreaktiota havainnoidaan uudestaan (72 h) ja tulokset kirjataan jälleen.
1.5.2 Buehlerin testi
1.5.2
1.5.2.1 Valmistelut Terveet nuoret täysikasvuiset albiinomarsut totutetaan laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan ennen testiä. Ennen testiä eläimet jaetaan satunnaisotannalla testi- ja verrokkiryhmiin. Karvat poistetaan leikkaamalla, ajelemalla tai mahdollisesti kemiallisella depilaatiolla käytetystä testimenetelmästä riippuen. Varovaisuutta on noudatettava, ettei ihon pinta naarmuunnu rikki. Eläimet punnitaan ennen testiä ja sen jälkeen.
1.5.2.2 Koeolosuhteet
1.5.2.2
1.5.2.2.1 Koe-eläimet Koe-eläiminä käytetään yleisesti käytettyjä albiinomarsun laboratoriokantoja.
1.5.2.2.2 Lukumäärä ja sukupuoli Testissä voidaan käyttää sekä uroksia että naaraita. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä. Testiryhmässä on oltava vähintään 20 eläintä ja verrokkiryhmässä vähintään kymmenen.
1.5.2.2.3 Annostasot Testiaineen pitoisuuden kutakin induktioaltistusta kohti tulee olla korkein mahdollinen lievän, mutta ei liiallisen ärsytyksen tuottamiseksi. Haastealtistuspitoisuuden tulee olla suurin ärsyttämätön annos. Mikäli on tarpeen, sopivat pitoisuudet voidaan määrittää esitutkimuksessa kahdella tai kolmella eläimellä. Vesiliukoisten testiaineiden vehikkeliksi sopii vesi tai laimennettu ärsyttämätön pinta-aktiivinen liuos. Muiden testiaineiden vehikkeliksi suositellaan 80-prosenttista etanoli-vesiliuosta induktioon ja asetonia haastealtistukseen.
1.5.2.3 Kokeen suorittaminen
1.5.2.3
1.5.2.3.1 Induktio Päivä 0 — testiryhmä Eläimen toisesta kyljestä leikataan huolellisesti karvat pois. Testilapun tulee olla läpikotaisin kyllästetty sopivaan vehikkeliin (vehikkelin valinta tulee perustella; nestemäisiä testiaineita voidaan käyttää laimentamattomina, jos se on tarkoituksenmukaista) sekoitetulla testiaineella. Testilappu asetetaan testialueelle ihoa vasten ja peitetään tiiviillä lapulla tai kuvulla ja sopivalla siteellä kuudeksi tunniksi. Testilappujärjestelmän on oltava okklusiivinen. Tarkoitukseen sopii pyöreä tai neliskulmainen vanulappu, jonka pinta-ala on 4–6 cm2. Tiiviyden varmistamiseen suositellaan sopivaa kiinnitysmekanismia. Kääreitä käytettäessä voidaan tarvita lisäaltistuskertoja. Päivä 0 — verrokkiryhmä Eläimen toisesta kyljestä leikataan huolellisesti karvat pois. Pelkkä vehikkeli asetetaan samoin kuin testiryhmässä. Testilapun annetaan olla ihoa vasten tiiviin lapun tai kuvun ja sopivan siteen alla kuusi tuntia. Jos voidaan osoittaa, ettei lumeverrokkiryhmää tarvita, voidaan käyttää käsittelemätöntä verrokkiryhmää. Päivät 6.–8. ja 13.–15. — testi- ja verrokkiryhmät Päivän 0 toimenpiteet tehdään samalle testialueelle (jolta poistetaan tarvittaessa karvat) eläimen samaan kylkeen päivinä 6.–8. ja uudelleen päivinä 13.–15.
1.5.2.3.2 Haastealtistus Päivä 27.–29. — testi- ja verrokkiryhmät Testi- ja verrokkiryhmien eläinten käsittelemättömästä kyljestä poistetaan karvat (huolellisesti leikkaamalla). Tiivis lappu tai kupu, joka sisältää sopivan määrän testiainetta korkeimpana mahdollisena ärsyttämättömänä pitoisuutena, asetetaan molempien ryhmien eläinten käsittelemättömän kyljen takaosaan. Tarvittaessa asetetaan myös pelkkää vehikkeliä sisältävä tiivis lappu tai kupu molempien ryhmien eläinten käsittelemättömän kyljen etuosaan. Lappujen tai kupujen annetaan olla ihoa vasten sopivalla siteellä peitettyinä kuusi tuntia.
1.5.2.3.3 Havainnointi ja pisteytys Testi- ja verrokkieläinten sokkoarviointia suositellaan. Jos ensimmäisen haastealtistuksen tulokset vaativat selventämistä, on harkittava haastealtistuksen uusimista mahdollisesti uudella verrokkiryhmällä, jos se on tarkoituksenmukaista, noin viikon kuluttua ensimmäisestä haastealtistuksesta. Haastealtistus voidaan uusia myös alkuperäisellä verrokkiryhmällä. Kaikki induktiosta ja haastetoimenpiteistä johtuvat ihoreaktiot ja epätavalliset löydökset, mukaan lukien systeemiset reaktiot, tulee havainnoida ja kirjata Magnusson/Kligman -pisteytysasteikon mukaan (ks. liite). Muita toimenpiteitä, esimerkiksi histopatologinen tutkimus ja ihopoimumittaus, voidaan suorittaa epäilyttävien reaktioiden selventämiseksi.
noin 21 tuntia lapun poistamisen jälkeen haastealueelta poistetaan karvat,
noin kolme tuntia myöhemmin (noin 30 tunnin kuluttua haastelapun asettamisesta) havainnoidaan ihoreaktioita ja kirjataan ne liitteen pisteytysasteikon mukaisesti,
noin 24 tunnin kuluttua 30 ensimmäisen tunnin jälkeen suoritetusta havainnointikerrasta (noin 54 tuntia haastelapun asettamisesta) havainnoidaan ihoreaktioita uudelleen ja tulokset kirjataan.
2. TULOKSET (GPMT JA BUEHLERIN TESTI) Yhteenveto tuloksista tulee esittää taulukossa, josta ilmenee kunkin eläimen ihoreaktiot kullakin havainnointikerralla.
3. RAPORTOINTI (GPMT JA BUEHLERIN TESTI) Jos seulontatesti tehdään ennen marsutestiä, testin (esim. paikallinen imusolmuketesti, LLNA; hiiren korvan turpoamistesti, MEST) kuvaus tai viite, mukaan lukien toimenpiteen yksityiskohdat, on ilmoitettava testi- ja vertailuaineella saatujen tulosten yhteydessä.
3. Testiraportti (GPMT ja Buehlerin testi)
Testiraportin tulee mahdollisuuksien mukaan sisältää seuraavat tiedot:
Koe-eläimet:
käytetty marsukanta,
eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,
lähde, elinolosuhteet, ravinto jne., ja
kunkin eläimen paino testin alussa.
Koeolosuhteet:
lapun asettamiskohdan valmistelumenetelmä,
käytettyjen lappumateriaalien ja lappujen asettamismenetelmän yksityiskohdat,
esitutkimustulokset ja niiden pohjalta tehty johtopäätös testissä käytettävistä induktio- ja haastepitoisuuksista,
testiaineen valmistamisen, asettamisen ja poistamisen yksityiskohdat,
vehikkelin valintaperusteet, ja
induktio- ja haastealtistuksissa käytetyt vehikkeli- ja testiainepitoisuudet sekä induktiossa ja haastealtistuksessa käytetyn aineen kokonaismäärä.
Tulokset:
yhteenveto tuoreimman herkkyys- ja luotettavuustarkistuksen tuloksista (ks. 1.3) mukaan lukien tiedot käytetystä aineesta, pitoisuudesta ja vehikkelistä,
kunkin eläimen kohdalta mukaan lukien pisteytysjärjestelmä,
selostuskuvaus havaittujen vaikutusten luonteesta ja voimakkuudesta, ja
mahdolliset histopatologiset löydökset.
Tulosten pohdinta
Johtopäätökset
4. LÄHDELUETTELO Tämä menetelmä on analoginen OECD TG 406:n kanssa.
B.7. ORAALINEN TOISTUVAN ANNOSTELUN TOKSISUUSTUTKIMUS (28 VRK)
B.7.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Ks. yleisjohdanto, osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄT Ks. yleisjohdanto, osa B.
1.3 KOEMENETELMÄN PERIAATE Testiaine annostellaan useille koe-eläinryhmille suun kautta päivittäin asteittain suurenevina annoksina siten, että yksi ryhmä saa aina yhtä annostasoa 28 päivän ajan. Annostelujakson aikana eläimiä havainnoidaan tarkoin päivittäin toksisuusoireiden varalta. Kokeen aikana kuolleille tai lopetetuille eläimille tehdään ruumiinavaus. Kokeen lopussa vielä elossa olevat eläimet lopetetaan ja niille tehdään ruumiinavaus. Tämä menetelmä painottaa neurologisia vaikutuksia spesifisenä kohdevaikutuksena ja eläinten tarkan kliinisen havainnoinnin tarvetta, jotta tietoa saataisiin mahdollisimman paljon. Menetelmällä tunnistetaan mahdollisesti neurotoksisia kemikaaleja, jotka voivat vaatia tarkempia tutkimuksia tässä suhteessa. Menetelmällä voidaan saada viitteitä myös aineen immunologisista vaikutuksista ja toksisuudesta lisääntymiselimille.
1.4 KOEMENETELMÄN KUVAUS
1.4
1.4.1 Valmistelut Terveet nuoret täysikasvuiset eläimet jaetaan satunnaisotannalla testi- ja verrokkiryhmiin. Häkit tulee järjestää siten, että niiden sijoittamisesta mahdollisesti aiheutuvat vaikutukset minimoituvat. Jokainen eläinyksilö tunnistetaan, ja eläinten annetaan olla häkeissään vähintään viiden päivän ajan ennen kokeen aloittamista niiden totuttamiseksi laboratorio-oloihin. Testiaine annetaan mahaletkun kautta tai ravinnon tai juomaveden mukana. Oraalinen annostelutapa riippuu tutkimuksen tarkoituksesta ja aineen fysikaalis-kemiallisista ominaisuuksista. Testiaine liuotetaan tai suspensoidaan tarvittaessa sopivaan vehikkeliin. Suositusten mukaan ensin tulee mahdollisuuksien mukaan käyttää vesipohjaista nestettä/suspensiota, sitten öljypohjaista nestettä/emulsiota (esim. maissiöljyä) ja viimeiseksi muihin vehikkeleihin sekoitettua nestettä. Jos vehikkeli on muu kuin vesi, toksiset ominaisuudet on oltava tiedossa. Testiaineen stabiliteetti vehikkelissä on määritettävä.
1.4.2 Koeolosuhteet
1.4.2
1.4.2.1 Koe-eläimet Suositeltavin jyrsijälaji on rotta, tosin muitakin jyrsijöitä voidaan käyttää. Kokeessa tulee käyttää yleisesti käytettyjä nuoria ja terveitä täysikasvuisia koe-eläinkantoja. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä. Annostelun tulee alkaa mahdollisimman pian vieroituksen jälkeen ja ainakin ennen yhdeksättä elinviikkoa. Käytettävien eläinten paino ei saisi juurikaan vaihdella eikä ylittää ± 20:tä prosenttia kummankaan sukupuolen keskipainosta kokeen alussa. Silloin kun toistuvan oraalisen annostelun koetta seuraa pitkäaikaistutkimus, molemmissa tutkimuksissa tulee mieluiten käyttää samasta kannasta ja lähteestä olevia eläimiä.
1.4.2.2 Lukumäärä ja sukupuoli Kutakin annostasoa tulee testata vähintään kymmenellä eläimellä (viisi naarasta ja viisi urosta). Jos osa eläimistä aiotaan lopettaa kesken kokeen, eläinten määrää tulee lisätä saman verran kuin niitä aiotaan lopettaa ennen kokeen päättymistä. Lisäksi kymmenen eläimen satelliittiryhmää (viisi kumpaakin sukupuolta) voidaan käsitellä suurella annoksella 28 päivän ajan ja havainnoida toksisten vaikutusten korjaantuvuutta, jatkuvuutta ja ilmenemisen viivästymistä 14 päivän ajan käsittelyn jälkeen. Myös kymmenen verrokkieläimen satelliittiryhmää käytetään.
1.4.2.3 Annostasot Yleensä tulee käyttää vähintään kolmea testiryhmää ja yhtä verrokkiryhmää. Testiaineen annostelua lukuun ottamatta verrokkieläimiä on käsiteltävä täsmälleen samoin kuin testiryhmän eläimiä. Jos testiaineen annostelussa käytetään vehikkeliä, sitä tulee antaa verrokkiryhmälle suurin käytetty määrä. Jos muiden tietojen arvioinnin pohjalta vaikutuksia ei ole odotettavissa 1000 mg/kg:n vuorokausiannoksella, voidaan tehdä raja-annoskoe. Jos saatavilla ei ole sopivia tietoja, voidaan tehdä annosalueen haarukointikoe käytettävien annosten määrittämisen helpottamiseksi. Annostasot tulee valita ottaen huomioon testiaineesta tai samanlaisista aineista jo olemassa olevat toksisuus- ja (toksiko)kineettiset tiedot. Korkein toksisia vaikutuksia, mutta ei kuolemaa eikä voimakasta kärsimystä aiheuttava annostaso olisi valittava. Sitten valitaan asteittain alenevat annostasot annostukseen liittyvän vasteen ja NOAEL-arvon (no observed adverse effect) osoittamiseksi alhaisimmalla annostasolla. Kaksin-nelinkertaiset välit ovat yleensä ihanteellisia alenevissa annostasoissa ja neljännen testiryhmän käyttöä suositellaan usein erittäin pitkien annosvälien sijasta (esim. kerroin yli 10). On tärkeää varmistautua, etteivät ravinnon tai juomaveden mukana annosteltavat testiainemäärät häiritse eläimen normaalia ravitsemustilaa tai nestetasapainoa. Ravinnon mukana annosteltava testiaine voidaan vakioida joko sen pitoisuutena ravinnossa (ppm) tai vakioannostasona eläinten ruumiinpainon suhteen. Käytetty vaihtoehto on ilmoitettava erikseen. Mahaletkun kautta annosteltava aine on annettava suurin piirtein samaan aikaan joka päivä ja annosta tulee tarvittaessa muuttaa vakioannostason säilyttämiseksi suhteessa eläimen ruumiinpainoon. Siiloin kun toistuvan annostelun koetta seuraa pitkäaikaistutkimus, eläimille tulee antaa samanlaista ravintoa molemmissa tutkimuksissa.
1.4.2.4 Raja-annoskoe Jos koe yhdellä vähintään 1000 mg/kg/vrk:n annostasolla tai annosteltaessa ravinnon tai juomaveden mukana testiainetta prosentuaalisesti saman verran (ruumiinpainomääritysten perusteella) ei tässä menetelmässä kuvatuilla toimenpiteillä aiheuta havaittavia toksisia vaikutuksia ja jos toksisuutta ei odoteta rakenteellisesti samanlaisista aineista käytössä olevien tietojen perusteella, täydellinen tutkimus kolmella annostasolla ei ehkä ole tarpeen. Raja-annoskoe tehdään paitsi silloin kun ihmisen altistus edellyttää korkeampaa annostasoa.
1.4.2.5 Havainnointijakso Havainnointijakson on kestettävä 28 päivää. Seurantahavainnointiin tarkoitettuja satelliittiryhmän eläimiä tulisi pitää vähintään 14 päivää ilman annostelua, jotta viivästyneet toksiset vaikutukset, niiden jatkuminen tai niistä toipuminen voidaan todeta.
1.4.3 Kokeen suorittaminen Testiainetta annetaan eläimille päivittäin seitsemänä päivänä viikossa 28 päivän ajan. Viiden päivän viikkoannostusohjelman käyttö on perusteltava. Pakkoruokinta-annostelussa testiaine annetaan kerta-annoksena mahaletkun tai sopivan intubaatiokanyylin kautta. Kerralla annettavan nesteen enimmäismäärä riippuu koe-eläimen koosta. Määrän on oltava alle 1 ml sataa painogrammaa kohti, lukuun ottamatta vesiliuoksia, joita voidaan antaa 2 ml sataa painogrammaa kohti. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyttäviä aineita, joiden haittavaikutukset yleensä pahenevat korkeammilla pitoisuuksilla, testiainemäärän vaihtelevuus on minimoitava pitoisuutta säätämällä vakiomäärän takaamiseksi kaikilla annostasoilla.
1.4.3
1.4.3.1 Yleishavainnot Eläimistä on tehtävä kliinisiä yleishavaintoja vähintään kerran päivässä mieluiten suurin piirtein samaan aikaan / samoihin aikoihin joka päivä ja ottaen huomioon, että odotettuja vaikutuksia esiintyy eniten annostelun jälkeen. Eläinten sairastavuus ja kuolleisuus tarkistetaan vähintään kahdesti päivässä. Kuolemaisillaan olevat ja suuresti kärsivät tai kivuliaat eläimet on poistettava tutkimuksesta ja lopetettava humaanilla tavalla ja niille on tehtävä ruumiinavaus. Kutakin eläintä on havainnoitava kliinisesti seikkaperäisesti kerran ennen ensimmäistä altistuskertaa (samaa koe-eläintä koskevia vertailuja varten) ja sen jälkeen vähintään kerran viikossa. Havainnot tulee tehdä eläimen oman häkin ulkopuolella vakioalueella mieluiten samaan kellonaikaan joka kerta. Havainnot on kirjattava muistiin tarkoin, mieluiten koelaboratorion erikseen määrittelemiä pisteytysjärjestelmiä käyttäen. Vaihtelut koeolosuhteissa on pyrittävä minimoimaan ja havainnoijien on mieluiten oltava annostelusta tietämättömiä henkilöitä. Huomiota tulee kiinnittää mm. ihon, karvapeitteen, silmien, limakalvojen, mahdollisten sisäeritteiden ja kuona-aineiden ja autonomisen toiminnan (esim. kyynelvuoto, piloerektio, mustuaisen koko, hengitys) muutoksiin. Käynnin, asennon ja käsittelyvasteen muutokset, mahdolliset klooniset tai tooniset liikkeet, stereotypiat (esim. ylenmääräinen turkin hoito, jatkuva kehän kiertäminen) tai omituinen käytös (esim. itsensä silpominen, takaperin käveleminen) tulee myös kirjata muistiin. Neljännellä altistusviikolla arvioidaan aistien reaktiivisuutta erityyppisille ärsykkeille (esim. kuulo, näkö ja asentotunto), tarttumaotteen voimakkuutta ja motorista toimintaa. Mahdollisten toimenpiteiden tarkemmat yksityiskohdat löytyvät kirjallisuudesta (ks. yleisjohdanto, osa B). Toiminnallisia havaintoja ei tarvitse tehdä neljännellä altistusviikolla, jos kyseessä on subkroonisen (90 päivän) tutkimuksen esitutkimus. Tällöin toiminnalliset havainnot tehdään seurantatutkimuksessa. Toisaalta toistuvan annostelun tutkimuksesta saatavat toiminnallisia havaintoja koskevat tiedot voivat helpottaa annostasojen valintaa subkroonista tutkimusta varten. Poikkeuksellisesti toiminnallisia havaintoja ei myöskään tarvitse tehdä ryhmillä, joissa muutoin ilmenee merkkejä toksisuudesta laajuudessa, joka häiritsisi merkitsevästi toiminnallisten kokeiden suorittamista.
1.4.3.2 Ruumiinpaino ja ravinnon/veden kulutus Kukin eläin on punnittava vähintään kerran viikossa. Ravinnon ja veden kulutus on mitattava vähintään viikoittain. Jos testiaine annostellaan juomavedessä, myös veden kulutus on mitattava vähintään viikoittain.
1.4.3.3 Hematologia Seuraavat verikokeet on tehtävä koejakson päätyttyä: hematokriitti, hemoglobiini, erytrosyyttien määrä, leukosyyttien kokonaismäärä ja erittelylaskenta, trombosyyttien määrä ja veren hyytymisajan/-potentiaalin mittaus. Verinäytteet tulee ottaa nimetystä kohdasta juuri ennen eläinten lopettamista tai sen yhteydessä. Näytteet tulee säilyttää asianmukaisissa olosuhteissa.
1.4.3.4 Kliininen biokemia Kliiniset biokemialliset määritykset tärkeimpien toksisten kudosvaikutusten ja erityisesti munuais- ja maksavaikutusten tutkimiseksi tulee tehdä verinäytteistä, jotka otetaan kustakin eläimestä juuri ennen lopettamista tai sen yhteydessä (lukuun ottamatta eläimiä, jotka on löydetty kuolemaisillaan ja/tai lopetettu kesken kokeen). Eläinten ruokinnan siirtämistä yön yli ennen verinäytteen ottoa suositellaan. Plasma- ja seerumikokeiden tulee kattaa natrium, kalium, glukoosi, kokonaiskolesteroli, urea, kreatiniini, kokonaisproteiini ja albumiini, vähintään kaksi hepatosellulaarisia vaikutuksia osoittavaa entsyymiä (kuten alaniiniaminotransferaasi, aspartaattiaminotransferaasi, alkalinen fosfataasi, gammaglutamyylitranspeptidaasi ja sorbitolidehydrogenaasi). Muiden entsyymien (maksasta tai muualta peräisin olevien) ja sappihappojen mittauksista voidaan saada hyödyllistä tietoa tietyissä olosuhteissa. Vaihtoehtoisesti voidaan tehdä seuraavat virtsa-analyysit viimeisellä tutkimusviikolla ajastetun virtsankeräyksen avulla: ulkonäkö, määrä, osmolaliteetti tai suhteellinen tiheys, pH-arvo, proteiini, glukoosi ja veri/verisolut. Lisäksi tulee tutkia, esiintyykö seerumissa yleisiä kudosvaurioita osoittavia merkkiaineita. Muita määrityksiä, jotka on tehtävä, jos testiaineen tunnetut ominaisuudet voivat vaikuttaa tai niiden epäillään vaikuttavan siihen liittyviin metaboliaprofiileihin, ovat kalsium, fostaatti, triglyseridien paastoarvot, tietyt hormonit, methemoglobiini ja koliiniesteraasi. Nämä on selvitettävä tiettyjen luokkien aineille tai tapauskohtaisesti. Kaiken kaikkiaan käytännön tulee olla joustava lajin ja annetun aineen havaitun ja/tai odotetun vaikutuksen mukaan. Jos aiemmat lähtötason tiedot ovat riittämättömiä, hematologiset ja kliiniset biokemialliset muuttujat on määritettävä ennen annostelun aloittamista.
1.4.3.5 Silmämääräinen ruumiinavaus Jokaiselle koe-eläimelle tehdään täydellinen ja seikkaperäinen silmämääräinen ruumiinavaus, johon kuuluu ruumiin ulkopinnan, kaikkien aukkojen ja kallon-, rinta- ja vatsaontelon ja niiden sisällön huolellinen tutkimus. Jokaisen eläimen maksa, munuaiset, lisämunuaiset, kivekset, lisäkivekset, kateenkorva, perna, aivot ja sydän puhdistetaan kaikista niihin kiinnittyvistä kudoksista tarkoituksenmukaisella tavalla ja elinten märkäpaino punnitaan mahdollisimman pian dissektion jälkeen kuivumisen estämiseksi. Seuraavat kudokset säilytetään sekä kudostyypin että aiotun histopatologisen tutkimuksen kannalta sopivimmassa kiinnitysaineessa: kaikki silmin havaittavat vauriot, aivot (edustavat alueet, mukaan lukien iso- ja pikkuaivot ja aivosilta), selkäydin, mahalaukku, ohutsuoli, paksusuoli (mukaan lukien Peyerin levy), maksa, munuaiset, lisämunuaiset, perna, sydän, kateenkorva, kilpirauhanen, henkitorvi ja keuhkot (säilytetään puhaltamalla keuhkot täyteen kiinnitysainetta ja upottamalla sitten kiinnitysaiheeseen), sukurauhaset, avustavat sukuelimet (esim. kohtu, eturauhanen), virtsarakko, imusolmukkeet (mieluiten yksi annostelureitin kattava imusolmuke ja yksi annostelureitistä distaalinen imusolmuke systeemisten vaikutusten kattamiseksi), ääreishermo (lonkka- tai säärihermo) mieluiten läheltä lihasta ja osa luuydintä (tai vaihtoehtoisesti tuore luuydinaspiraatti). Kliinisten ja muiden löydösten perusteella on vielä ehkä tutkittava muita kudoksia. Myös testiaineen tunnettujen ominaisuuksien perusteella olevat todennäköiset kohde-elimet on säilytettävä.
1.4.3.6 Histopatologiset tutkimukset Kaikkien verrokkien ja suuriannoksiseen ryhmään kuuluneiden eläinten säilytetyt elimet ja kudokset tutkitaan perusteellisesti histopatologisesti. Histopatologiset tutkimukset tulee tehdä myös kaikille muiden annostusryhmien eläimille, jos käsittelyyn liittyviä muutoksia havaitaan suuriannoksisessa ryhmässä. Kaikki silmin havaittavat vauriot on tutkittava. Mahdolliseen satelliittiryhmään kuuluvilta eläimiltä tulee tutkia histopatologisesti sellaiset kudokset ja elimet, joissa ilmenee samoja vaikutuksia kuin käsitellyillä ryhmillä.
2. TULOKSET Koetulokset tulee esittää yksilöidysti. Yhteenveto tuloksista on esitettävä myös taulukossa, josta ilmenee kussakin koeryhmässä tutkimuksen alussa käytettyjen eläinten lukumäärä, kokeen aikana kuolleena löydettyjen tai humaaneista syistä lopetettujen eläinten lukumäärä ja niiden kuolinaika, toksisuusmerkkejä osoittaneiden eläinten lukumäärä, havaittujen toksisten vaikutusten kuvaus, mukaan lukien niiden alkamisajankohta, kesto ja vaikeusaste, vaurioita saaneiden eläinten lukumäärä, vauriotyypit ja eläinten prosentuaaliset osuudet vauriotyypeittäin. Numeeriset tulokset on mahdollisuuksien mukaan arvioitava asianmukaisella ja yleisesti hyväksytyllä tilastollisella menetelmällä. Tilastolliset menetelmät tulee valita tutkimusasetelman suunnitteluvaiheessa.
3. RAPORTOINTI
3. KOERAPORTTI
Koeraportin tulee mahdollisuuksien mukaan sisältää seuraavat tiedot:
Koe-eläimet:
käytetty laji/kanta,
eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,
lähde, elinolosuhteet, ravinto jne.,
kunkin eläimen paino kokeen alkaessa ja sen jälkeen viikon välein ja kokeen loputtua.
Koeolosuhteet:
vehikkelin valinnan perustelut, jos se on muu kuin vesi,
annostason valintaperustelut,
yksityiskohdat testiaineen koostumuksesta/ravintovalmisteesta, valmisteessa saavutetusta pitoisuudesta, sen stabiliteetista ja homogeenisuudesta,
testiaineen annostelun yksityiskohdat,
ravinnossa/juomavedessä olevan testiaineen määrän (ppm) muuntaminen varsinaiseksi annokseksi (mg/kg/vrk) tarvittaessa,
yksityiskohdat ravinnon ja veden laadusta.
Tulokset:
ruumiinpaino/ruumiinpainon muutokset,
ravinnon ja tarvittaessa veden kulutus,
toksiset vastetiedot sukupuolen ja annostason mukaan, mukaan lukien toksisuusoireet,
kliinisten havaintojen luonne, vaikeusaste ja kesto (korjaantuvuudesta riippumatta),
arvioinnit aistitoiminnoista, tarttumaotteen voimakkuudesta ja motorisesta toiminnasta,
verikokeet ja niihin liittyvät lähtötasoarvot,
kliiniset biokemialliset kokeet ja niihin liittyvät lähtötasoarvot,
ruumiinpaino eläimen lopettamisen yhteydessä ja eri elinten painotiedot,
ruumiinavauslöydökset,
kaikkien histopatologisten löydösten seikkaperäinen kuvaus,
mahdollisesti saatavilla olevat tiedot imeytymisestä,
tulosten tilastollinen käsittely tarvittaessa.
Tulosten pohdinta
Johtopäätökset
4. LÄHDELUETTELO Tämä menetelmä on analoginen OECD TG 407:n kanssa.
B.8. TOISTETUN ANNOKSEN (28 PÄIVÄÄ) MYRKYLLISYYS (HENGITETTYNÄ)
B.8.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO On suositeltavaa selvittää aineen hiukkaskokojakauma, höyrynpaine, sulamispiste, kiehumispiste, leimahduspiste ja mahdollinen räjähtävyys ennalta. Katso myös yleistä johdantoa, osa B (A).
1.2 MÄÄRITELMÄT Katso yleistä johdantoa, osa B (B).
1.3 VERTAILUAINEET Vertailuaineita ei ole.
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE Useita koe-eläinryhmiä altistetaan aineelle päivittäin määrätyn ajan käyttäen porrastettuja pitoisuuksia siten, että kukin ryhmä altistuu eri pitoisuudelle. Testijakson pituus on 28 päivää. Jos aineen sopivan pitoisuuden saamiseksi ilmakehään on tarvittu liuotinta, on käytettävä liuotinkontrolliryhmää. Altistusjakson aikana eläimiä tarkkaillaan myrkytysoireiden suhteen. Ruumiinavaus tehdään kokeen aikana kuolleille eläimille ja kokeen päätyttyä myös henkiin jääneille eläimille, kun ne on ensin lopetettu.
1.5 LAATUKRITEERIT Laatukriteerejä ei ole.
1.6 MENETELMÄKUVAUS
1.6
1.6.1 Valmistelut Ennen testiä eläinten elinolosuhteet pidetään tietyntyyppisinä vähintään viiden päivän ajan testin suorittamista silmälläpitäen. Terveiden aikuisten eläinten joukosta otetaan satunnaisotos, joka jaetaan käsittelyryhmiin. Tarvittaessa käytetään liuotinta, jotta ilmakehään saadaan sopiva pitoisuus ainetta. Jos annostelun apuna käytetään liuotinta tai muita lisäaineita, on varmistettava, että ne eivät aiheuta myrkytysoireita. Aiempia tietoja voidaan käyttää soveltuvin osin.
1.6.2 Testiolosuhteet
1.6.2
1.6.2.1 Koe-eläimet Ellei kontraindikaatioita ole, rotan käyttöä suositellaan. Testiin käytetään yleisiä laboratoriokantoja. Eläinten on oltava nuoria ja terveitä. Testin alussa kumpaakaan sukupuolta edustavien eläinten painonvaihtelut eivät saa olla enempää kuin ± 20 % sukupuolen keskiarvosta.
1.6.2.2 Lukumäärä ja sukupuoli Jokaista annostasoa kohti tarvitaan vähintään kymmenen eläintä (viisi naarasta ja viisi urosta). Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineitä. Jos suunnitellaan testin kuluessa tapahtuvia lopettamisia, eläinten määrää on lisättävä vastaavasti. Tarvittaessa testiin voidaan ottaa kymmenen eläimen apuryhmä (viisi naarasta ja viisi urosta), jota altistetaan suurille annoksille 28 päivän ajan tarkkaillen myrkytysoireiden palautumista ja pysyvyyttä sekä sitä, esiintyykö käsittelyä seuraavan 14 päivän jakson aikana viivästyneitä myrkytysoireita. Tarvitaan myös kymmenen vertailueläimen (viiden naaran ja viiden uroksen) apuryhmä.
1.6.2.3 Altistuspitoisuudet On käytettävä vähintään kolmea pitoisuutta ja yhtä kontrolliryhmää. Testattavalla aineella käsittelyä lukuun ottamatta kontrolliryhmän ja käsittelyryhmien eläimiä on käsiteltävä samalla tavalla. Jos annostelun yhteydessä käytetään liuotinta apuaineena, liuotinta annostellaan kontrolliryhmän eläimille samalla menetelmällä kuin käsittelyryhmän eläimille määränä, joka vastaa suurinta käsittelyannosta. Suurimman annostason on aiheutettava myrkytysoireita, mutta vain vähän tai ei lainkaan kuolleisuutta. Pienimmän annostason ei pidä aiheuttaa lainkaan myrkytysoireita. Jos käytettävissä on soveltuva arvio ihmisaltistumisesta, pienimmän annostason on ylitettävä tämä taso. Keskimmäisen annostason tulee aiheuttaa mahdollisimman vähän myrkytysoireita. Jos käytetään useita välitasoja, ne on valittava siten, että myrkytysoireet porrastuvat. Alimman annostason ja välitason ryhmissä sekä kontrolliryhmissä kuolleisuuden on oltava pieni, jotta tuloksia voidaan arvioida merkityksellisellä tavalla.
1.6.2.4 Altistusaika Päivittäisen altistusajan on oltava kuusi tuntia. Erikoistapauksissa voidaan käyttää myös muunpituisia altistusaikoja.
1.6.2.5 Laite Eläimiä testataan hengityslaitteella, jonka dynaaminen ilmanvirtaus on vähintään 12 ilmanvaihtoa tunnissa. Näin varmistetaan riittävä happipitoisuus ja altistusilmakehän tasainen jakaantuminen. Jos käytetään kammiota, sen rakenteen on oltava sellainen, että koe-eläimet eivät pääse muodostamaan tungosta, mutta altistuvat kuitenkin hengityksen kautta tehokkaasti. Yleinen sääntö kammion ilmakehän stabiiliuden varmistamiseksi on, että eläinten kokonaistilavuus saa olla enintään 5 % kammion tilavuudesta. Eläinkohtaisissa kammioissa voidaan käyttää oronasaalista, vain päähän kohdistuvaa tai koko kehoon kohdistuvaa altistamista. Kahden ensimmäisen tavan avulla aineen imeytyminen muuta kautta voidaan minimoida.
1.6.2.6 Tarkkailujakso Kaikkia eläimiä on tarkkailtava päivittäin myrkytysoireiden suhteen koko altistusjakson ja toipumisjakson ajan. Myös kuolinajankohta ja myrkytysoireiden ilmestymis- sekä häviämisajankohta kirjataan.
1.6.3 Testin suorittaminen Eläimiä altistetaan aineelle päivittäin 5–7 päivänä viikossa 28 päivän ajan. Seurantaa varten koottua apuryhmää tarkkaillaan altistusjakson jälkeen vielä 14 päivän ajan ilman käsittelyä, jotta voitaisiin todeta, ovatko myrkytysoireet häviäviä vai pysyviä. Testilämpötilana käytetään arvoa 22 ± 3 oC. Suhteellisen kosteuden tulisi olla 30-70 %, mutta joissakin tapauksissa (eräiden aerosolien testauksissa) tämä ei ole ehkä mahdollista. Pitämällä kammiossa alipainetta (≤ 5 mm H2O) voidaan estää aineen vuotaminen ympäristöön. Altistuksen aikana eläimille ei anneta ruokaa eikä vettä. On käytettävä soveltuvalla analyyttisella pitoisuuden valvontajärjestelmällä varustettua dynaamista inhalaatiojärjestelmää. Sopivien altistuspitoisuuksien löytämiseksi on suositeltavaa tehdä koetesti. Ilmanvirtausta on säädettävä siten, että altistuskammion olosuhteet ovat kauttaaltaan homogeeniset. Järjestelmän avulla on voitava saavuttaa stabiilit altistusolosuhteet niin pian kuin mahdollista. Seuraavat suureet edellyttävät mittausta ja valvontaa: Altistuksen aikana ja sen jälkeen eläimiä tarkkaillaan systemaattisesti ja tulokset kirjataan. Jokaiselle yksittäiselle eläimelle tulee olla oma kirjanpitonsa. Kaikkia eläimiä on tarkkailtava päivittäin ja myrkytysoireet (alkamisajankohta, voimakkuus ja kesto) on kirjattava. Tarkkaillaan ihon, turkin, silmien, limakalvojen, hengitysteiden, verenkierron, autonomisen hermoston, keskushermoston, somatomotorisen aktiviteetin ja käyttäytymismallin muutoksia. Eläimet punnitaan kerran viikossa. Ravinnonkulutuksen mittaaminen viikoittain on suositeltavaa. Eläimiä on tarkkailtava säännöllisesti, jotta voidaan varmistaa, että mahdollisimman vähän eläimiä menetetään kannibalismin, kudosten autolyysin tai sijoitusvirheiden takia. Testijakson jälkeen kaikki aineelle altistuneet eläimet lopetetaan. Kuolemaisillaan olevat eläimet tai eläimet, joilla on vakavia ahdistuneisuuden tai kivun oireita, on poistettava ryhmästä ja lopetettava, minkä jälkeen niille tehdään ruumiinavaus. Testijakson päätyttyä kaikki eläimet, kontrolliryhmien eläimet mukaan lukien, tutkitaan seuraavilta osin: Muita, riittävän toksikologisen arvion kannalta tärkeitä määrityksiä ovat kalsium, fosfori, kloridi, natrium, kalium, paastoverensokeri, lipidit, hormonit, happo-emästasapaino, methemoglobiini ja kolinesteraasiaktiivisuus. Havaittujen oireiden tutkimista voidaan tarvittaessa laajentaa muita kliinisiä biokemianmäärityksiä käyttämällä.
1.6.3 a)
Ilmanvirtaus (jatkuvasti).
b)
Testattavan aineen todellinen pitoisuus hengitysilmassa. Päivittäisen altistuksen aikana pitoisuusvaihtelut eivät saa ylittää ± 15 %:a keskiarvosta. Eräiden aerosolien kohdalla tällaista säätötasoa ei ehkä voida saavuttaa, jolloin on hyväksyttävä laajempi alue. Testijakson aikana pitoisuudet on pidettävä mahdollisimman muuttumattomina päivästä toiseen. Kerran viikossa aerosoleille on tehtävä hiukkaskokoanalyysi koeryhmittäin.
c)
Lämpötila ja kosteus (jatkuvasti, jos mahdollista).
i)
hematologia — vähintään hematokriitti, hemoglobiinipitoisuus, punasolujen lukumäärä, valkosolujen kokonaismäärä ja erittelylaskenta sekä hyytymistekijät;
ii)
kliininen veribiokemia — vähintään yksi parametri seuraavista maksan ja munuaisten toimintakokeista, alaniiniaminotransferaasi (ALAT), seeruminaspartaattiaminotransferaasi (ASAT), virtsa-aineen typpi, albumiini, veren kreatiniini, kokonaisbilirubiini ja seerumin kokonaisproteiini.
1.6.3.1 Kattava ruumiinavaus Kaikille kokeeseen osallistuneille eläimille on tehtävä kattava ruumiinavaus. Vähintään maksa, munuaiset, lisämunuaiset, keuhkot ja kivekset on punnittava märkinä mahdollisimman pian dissektion jälkeen. Elimet ja kudokset (hengityselimet, maksa, munuaiset, perna, kivekset, lisämunuaiset, sydän ja muut elimet, joissa on oleellisia vaurioita tai kokomuutoksia) on säilytettävä sopivassa aineessa mahdollisia myöhemmin tehtäviä histopatologisia tutkimuksia varten. Keuhkot on poistettava vahingoittumattomina, minkä jälkeen ne punnitaan ja käsitellään sopivalla kiinnitteellä keuhkojen rakenteen säilymisen varmistamiseksi.
1.6.3.2 Histopatologinen tutkimus Suurannosryhmän ja kontrolliryhmän eläinten säilötyille elimille ja kudoksille on tehtävä histologinen tutkimus. Jos suurimman annoksen saaneen ryhmän eläinten elimissä ja kudoksissa on testattavasta aineesta johtuvia vaurioita, myös pienempien annoskokojen ryhmien eläinten vastaavat elimet on tutkittava. Kaikkien apuryhmien eläimet on tutkittava histologisesti kiinnittäen erityistä huomiota niihin elimiin ja kudoksiin, joissa on havaittu muutoksia käsiteltyjen ryhmien kohdalla.
2. TIEDOT Yhteenveto tiedoista esitetään taulukkona, jossa esitetään eläinten määrä kokeen alussa ja eläinten määrä kutakin vauriota kohti ryhmittäin. Kaikki havaintotulokset on arvioitava soveltuvan tilastollisen menetelmän avulla. Tarkoitukseen voidaan käyttää kaikkia yleisiä menetelmiä.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TESTIRAPORTTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
laji, kanta, toimittaja, ympäristöolosuhteet, ruokavalio, jne.,
testiolosuhteet: altistuslaitteen kuvaus (rakenne, tyyppi, mitat, ilmalähde, aerosolin tuottamiseen käytetty järjestelmä, ilmastointijärjestelmä, poistoilman käsittely, mahdollisen testauskammion olosuhteet ja lämpötilan, kosteuden, aerosolin pitoisuuden stabiiliuden sekä aerosolin hiukkaskokojakauman mittauslaitteiden tiedot). Altistustiedot Altistustiedot kootaan taulukkoon, josta ilmenevät myös keskiarvot ja vaihtelut (esimerkiksi keskihajonta). Mahdollisuuksien mukaan esitetään seuraavat tiedot:
3.1
pt_2 a)
ilmanvirtaus hengityslaitteen kautta;
b)
ilman lämpötila ja kosteus;
c)
nimelliset pitoisuudet (hengityslaitteeseen syötetty kokonaismäärä ainetta jaettuna ilman tilavuudella);
d)
liuottimen laatu;
e)
todelliset pitoisuudet hengitysilmassa testivyöhykkeellä;
f)
massan aerodynaamisen halkaisijan mediaani (MMAD) ja geometrinen keskihajonta (GDS);
vastetietojen luokittelu sukupuolen ja pitoisuuden mukaan,
kuolinajankohdat kokeen aikana tai eläinten hengissäpysyminen kokeen loppuun,
myrkytysoireet ja muut vaikutukset sekä oireita aiheuttamaton pitoisuustaso,
ajankohdat, jolloin on havaittu poikkeavuuksia, ja poikkeavuuksien kehittyminen jatkossa,
tiedot ruoasta ja kehonpainosta,
käytetyt hematologiset testit tuloksineen,
käytetyt kliinis-biokemialliset testit tuloksineen,
ruumiinavauslöydökset,
histopatologisten löydösten yksityiskohtaiset kuvaukset,
tulosten tilastollinen käsittely soveltuvin osin,
tulosten pohdinta,
tulosten tulkinta.
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA Katso yleistä johdantoa, osa B (D).
4. VIITTEET Katso yleistä johdantoa, osa B (E).
B.9. TOISTETUN ANNOKSEN (28 PÄIVÄÄ) MYRKYLLISYYS (IHON KAUTTA NAUTITTAVAT AINEET)
B.9.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Katso yleistä johdantoa, osa B (A).
1.2 MÄÄRITELMÄT Katso yleistä johdantoa, osa B (B).
1.3 VERTAILUAINEET Vertailuaineita ei ole.
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE Testattavaa ainetta levitetään useisiin ryhmiin jaettujen eläinten iholle porrastettuina annoksina (yksi annos ryhmää kohti) säännöllisesti 28 päivän koejakson aikana. Jakson aikana eläimiä tarkkaillaan myrkytysoireiden suhteen. Ruumiinavaus tehdään kokeen aikana kuolleille eläimille ja kokeen päätyttyä myös henkiin jääneille eläimille, kun ne on ensin lopetettu.
1.5 LAATUKRITEERIT Laatukriteerejä ei ole.
1.6 MENETELMÄKUVAUS
1.6
1.6.1 Valmistelut Ennen testiä eläinten elinolosuhteet pidetään tietyntyyppisinä vähintään viiden päivän ajan testin suorittamista silmälläpitäen. Terveiden aikuisten eläinten joukosta otetaan satunnaisotos, joka jaetaan käsittely- ja vertailuyryhmiin. Noin 24 tuntia ennen testiä turkki leikataan tai ajetaan eläinten selkäalueelta varoen naarmuttamasta ihoa, koska naarmut saattavat muuttaa ihon läpäisevyyttä. Turkinpoisto on yleensä uusittava noin viikon välein. Vähintään 10 % kehon pinta-alaa peittävästä karvasta on ajeltava tai leikattava. Koe-eläimen paino on otettava huomioon suunniteltaessa paljastettavan alueen ja siteen suuruutta. Kiinteät aineet voidaan tarvittaessa jauhaa, ja ne on kosteutettava riittävällä vesimäärällä tai tarvittaessa muulla liuottimella hyvän ihokontaktin varmistamiseksi. Nestemäisiä aineita käytetään yleensä laimentamattomina. Käsittely toistetaan päivittäin 5–7 päivänä viikossa.
1.6.2 Testiolosuhteet
1.6.2
1.6.2.1 Koe-eläimet Koe-eläiminä voidaan käyttää aikuisia rottia, kaneja tai marsuja. Muiden lajien käyttö on perusteltava. Testin alussa kumpaakaan sukupuolta edustavien eläinten painonvaihtelut eivät saa olla enempää kuin ± 20 % sukupuolen keskiarvosta.
1.6.2.2 Lukumäärä ja sukupuoli Jokaista annostasoa kohti tarvitaan vähintään kymmenen eläintä (viisi naarasta ja viisi urosta). Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineitä. Jos suunnitellaan testin kuluessa tapahtuvia lopettamisia, eläinten määrää on lisättävä vastaavasti. Tarvittaessa testiin voidaan ottaa kymmenen eläimen apuryhmä (viisi naarasta ja viisi urosta), jota altistetaan suurille annoksille 28 päivän ajan tarkkaillen myrkytysoireiden palautumista ja pysyvyyttä sekä sitä, esiintyykö käsittelyä seuraavan 14 päivän jakson aikana viivästyneitä myrkytysoireita. Tarvitaan myös kymmenen vertailueläimen (viiden naaran ja viiden uroksen) apuryhmä.
1.6.2.3 Altistuspitoisuudet Tarvitaan vähintään kolme pitoisuustasoa ja yksi kontrolliryhmä. Jos testattava aine liuotetaan apuaineeseen, tätä varten tarvitaan erillinen kontrolliryhmä. Päivittäisen altistuksen on kestettävä vähintään kuusi tuntia. Ainetta levitetään samaan aikaan joka päivä, ja annosta säädetään 1-2 viikon välein siten, että pitoisuustasot pysyvät vakiona eläimen painoon nähden. Aineella käsittelyä lukuun ottamatta kontrolliryhmän ja käsittelyryhmien eläimiä on käsiteltävä samalla tavalla. Jos annostelun yhteydessä käytetään liuotinta apuaineena, liuotinta annostellaan kontrolliryhmän eläimille samalla menetelmällä kuin käsittelyryhmän eläimille määränä, joka vastaa suurinta käsittelyannosta. Suurimman annostason on aiheutettava myrkytysoireita, mutta vain vähän tai ei lainkaan kuolleisuutta. Pienimmän annostason ei pidä aiheuttaa lainkaan myrkytysoireita. Jos käytettävissä on soveltuva arvio ihmisaltistumisesta, pienimmän annostason on ylitettävä tämä taso. Keskimmäisen annostason tulee aiheuttaa mahdollisimman vähän myrkytysoireita. Jos käytetään useita välitasoja, ne on valittava siten, että myrkytysoireet porrastuvat. Alimman annostason ja välitason ryhmissä sekä kontrolliryhmissä kuolleisuuden on oltava pieni, jotta tuloksia voidaan arvioida merkityksellisellä tavalla. Jos aine aiheuttaa vakavaa ihoärsytystä iholle levitettynä, pitoisuuksia on pienennettävä, mikä voi aiheuttaa suurannosryhmän eläimille muiden myrkytysoireiden vähenemistä tai oireiden häviämisen. Jos eläimen iho on pahoin vaurioitunut, voi olla tarpeen keskeyttää koe ja uusia se pienempiä pitoisuuksia käyttäen.
1.6.2.4 Rajatesti Jos suoritetaan alustava koe käyttäen annostasoa 1000 mg/kg tai tätä korkeampaa tasoa, joka perustuu tunnettuun ihmisaltistukseen, eikä tällainen testi aiheuta myrkytysoireita, lisätestit voidaan katsoa tarpeettomiksi.
1.6.2.5 Tarkkailujakso Kaikkia eläimiä on tarkkailtava päivittäin myrkytysoireiden suhteen. Kuolinajankohta ja myrkytysoireiden llmestymis- sekä häviämisajankohta kirjataan.
1.6.3 Testin suorittaminen Eläimiä pidetään yksin häkeissä. Eläimiä käsitellään testattavalla aineella mieluiten seitsemänä päivänä viikossa 28 päivän ajan. Seurantaa varten koottuja apuryhmiä tarkkaillaan altistusjakson jälkeen vielä 14 päivän ajan ilman käsittelyä, jotta voidaan todeta, ovatko myrkytysoireet häviäviä vai pysyviä. Päivittäisen altistuksen on kestettävä vähintään kuusi tuntia. Testattavaa ainetta levitetään tasaisesti alueelle, joka vastaa noin 10 %:a kehon kokonaispinta-alasta. Erittäin myrkyllisten aineiden kohdalla voidaan käyttää pienempää pinta-alaa, mutta ainetta on levitettävä mahdollisimman ohuelti ja tasaisesti niin suurelle alueelle kuin mahdollista. Altistuksen aikana ihoalue peitetään harsositeellä ja ärsyttämättömällä laastarilla. Tämän lisäksi alue on peitettävä, niin että harsoside ja aine pysyvät paikallaan eikä eläin pääse syömään ainetta. Eläin voidaan sitoa osittain siten, ettei se pysty syömään ainetta. Täydellistä liikkumattomuutta ei kuitenkaan suositella. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää suojakaulusta. Altistusjakson jälkeen aineen jäännökset poistetaan vedellä tai muulla sopivalla ihonpuhdistusmenetelmällä. Eläimiä on tarkkailtava säännöllisesti, jotta voidaan varmistaa, että mahdollisimman vähän eläimiä menetetään kannibalismin, kudosten autolyysin tai sijoitusvirheiden takia. Testijakson jälkeen kaikki aineelle altistuneet eläimet lopetetaan. Kuolemaisillaan olevat eläimet tai eläimet, joilla on vakavia ahdistuneisuuden tai kivun oireita, on poistettava ryhmästä ja lopetettava, minkä jälkeen niille tehdään ruumiinavaus. Testijakson päätyttyä kaikki eläimet, kontrolliryhmien eläimet mukaan lukien, tutkitaan seuraavilta osin: Muita, riittävän toksikologisen arvion kannalta tärkeitä määrityksiä ovat kalsium, fosfori, kloridi, natrium, kalium, paastoverensokeri, lipidit, hormonit, happo-emästasapaino, methemoglobiini ja kolinesteraasiaktiivisuus. Havaittujen oireiden tutkimista voidaan tarvittaessa laajentaa muita kliinisiä biokemianmäärityksiä käyttämällä.
1.6.3
1) hematologia — vähintään hematokriitti, hemoglobiinipitoisuus, punasolujen lukumäärä, valkosolujen kokonaismäärä ja erittelylaskenta sekä hyytymistekijät;
2) kliininen veribiokemia — vähintään yksi parametri seuraavista maksan ja munuaisten toimintakokeista, alaniiniaminotransferaasi (ALAT), seeruminaspartaattiaminotransferaasi (ASAT), virtsa-aineen typpi, albumiini, veren kreatiniini, kokonaisbilirubiini ja seerumin kokonaisproteiini.
1.6.4 Kattava ruumiinavaus Kaikille kokeeseen osallistuneille eläimille on tehtävä kattava ruumiinavaus. Vähintään maksa, munuaiset, lisämunuaiset ja kivekset on punnittava märkinä mahdollisimman pian dissektion jälkeen. Elimet ja kudokset (maksa, munuaiset, perna, kivekset, lisämunuaiset, sydän ja muut elimet, joissa on oleellisia vaurioita tai kokomuutoksia) on säilytettävä sopivassa aineessa mahdollisia myöhemmin tehtäviä histopatologisia tutkimuksia varten.
1.6.5 Histopatologinen tutkimus Suurannosryhmän ja kontrolliryhmän eläinten säilötyille elimille ja kudoksille on tehtävä histologinen tutkimus. Jos suurimman annoksen saaneen ryhmän eläinten elimissä ja kudoksissa on testattavasta aineesta johtuvia vaurioita, myös pienempien annoskokojen ryhmien eläinten vastaavat elimet on tutkittava. Kaikkien apuryhmien eläimet on tutkittava histologisesti kiinnittäen erityistä huomiota niihin elimiin ja kudoksiin, joissa on havaittu muutoksia käsiteltyjen ryhmien kohdalla.
2. TIEDOT Yhteenveto tiedoista esitetään taulukkona, jossa esitetään eläinten määrä kokeen alussa ja eläinten määrä kutakin vauriota kohti ryhmittäin. Kaikki havaintotulokset on arvioitava soveltuvan tilastollisen menetelmän avulla. Tarkoitukseen voidaan käyttää kaikkia yleisiä menetelmiä.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TESTIRAPORTTI Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:
laji, kanta, toimittaja, ympäristöolosuhteet, ruokavalio jne.,
testiolosuhteet (mukaan lukien siteen tyyppi, okklusiivinen tai ei-okklusiivinen),
annostasot (annoksen suuruus apuaine mukaan lukien ja mahdollinen testattavan aineen pitoisuus),
oireita tuottamaton annostaso, mikäli mahdollista,
vastetietojen luokittelu sukupuolen ja annostason mukaan,
kuolinajankohdat kokeen aikana tai eläinten hengissäpysyminen kokeen loppuun,
myrkytysoireet ja muut vaikutukset,
ajankohdat, jolloin on havaittu poikkeavuuksia, ja poikkeavuuksien kehittyminen jatkossa,
tiedot ruoasta ja kehonpainosta,
käytetyt hematologiset testit tuloksineen,
käytetyt kliinis-biokemialliset testit tuloksineen,
ruumiinavauslöydökset,
histopatologisten löydösten yksityiskohtaiset kuvaukset,
tulosten tilastollinen käsittely soveltuvin osin,
tulosten pohdinta,
tulosten tulkinta.
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA Katso yleistä johdantoa, osa B (D).
4. VIITTEET Katso yleistä johdantoa, osa B (E).
B.10. MUTAGEENISUUS — KROMOSOMIPOIKKEAVUUSTESTI NISÄKÄSSOLUILLA IN VITRO
B.10.
1. MENETELMÄ Tämä menetelmä on sama kuin OECD TG 473, In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test (1997).
1.
1.1 JOHDANTO In vitro -kromosomipoikkeavuustestin tarkoituksena on tunnistaa aineet, jotka aiheuttavat rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia viljellyissä nisäkässoluissa (1) (2) (3). Rakenteelliset poikkeavuudet jakautuvat kahteen tyyppiin, kromosomi- ja kromatidipoikkeavuuksiin. Kemiallisten mutageenien aiheuttamat poikkeavuudet ovat useimmiten kromatidityyppisiä, mutta myös kromosomityyppisiä poikkeavuuksia esiintyy. Polyploidian lisääntyminen saattaa osoittaa, että kemiallinen aine voi aiheuttaa numeerisia poikkeavuuksia. Tätä menetelmää ei ole kuitenkaan suunniteltu numeeristen poikkeavuuksien mittaamiseen, eikä sitä käytetä rutiininomaisesti tähän tarkoitukseen. Kromosomimutaatiot ja niihin liittyvät tapahtumat ovat syynä moniin ihmisen geneettisiin sairauksiin, ja on saatu vakuuttavia todisteita siitä, että kromosomimutaatiot ja niihin liittyvät tapahtumat, jotka aiheuttavat muutoksia somaattisten solujen onkogeeneissä ja kasvunrajoitegeeneissä, ovat osallisina syövän synnyssä ihmisillä ja koe-eläimillä. In vitro -kromosomipoikkeavuustestissä voidaan käyttää pysyvien solulinjojen viljelmiä, solukantoja tai primaarisia soluviljelmiä. Käytettävien solujen valintakriteerejä ovat solujen kasvukyky viljelmässä, karyotyypin pysyvyys, kromosomiluku, kromosomien diversiteetti ja kromosomipoikkeavuuksien spontaanifrekvenssi. In vitro -testit vaativat yleensä eksogeenista metabolista aktivaatiota. Tällainen metabolinen aktivaatiojärjestelmä ei pysty täysin jäljittelemään in vivo -olosuhteita nisäkkäissä. On pyrittävä välttämään erityisesti sellaisia olosuhteita, joissa saatavat positiiviset tulokset eivät heijasta aineen luontaista mutageenisuutta ja saattavat johtua pH:n muutoksista, osmolaliteetista tai voimakkaasta sytotoksisuudesta (4) (5). Tätä testiä käytetään nisäkkäiden mahdollisten mutageenien ja karsinogeenien seulontaan. Monet yhdisteet, joilla saadaan positiivinen tulos tässä testissä, ovat nisäkkäiden karsinogeeneja. Tämän testin ja karsinogeenisuuden välillä ei ole kuitenkaan täydellistä korrelaatiota. Korrelaatio riippuu kemiallisista ominaisuuksista, ja yhä useammat tutkimustulokset viittaavat siihen, että on olemassa karsinogeeneja, joita ei voida havaita tällä testillä, koska ne näyttävät vaikuttavan muiden mekanismien kuin suoran DNA-vaurion välityksellä. Ks. myös Yleisjohdanto, osa B.
1.2. MÄÄRITELMÄT Kromatidipoikkeavuus: rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilmenee yksittäisten kromatidien katkeamisena tai kromatidien katkeamisena ja uudelleen yhtymisenä. Kromosomipoikkeavuus: rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilmenee molempien kromatidien katkeamisena tai katkeamisena ja uudelleen yhtymisenä samassa kohdassa. Endoreduplikaatio: tapahtumasarja, jossa DNA:n kahdentumisen S-vaiheen tuma ei etene mitoosiin vaan aloittaa uuden S-vaiheen. Tämän seurauksena syntyy kromosomeja, joissa on 4, 8, 16, ... kromatidia. Aukko: gap, akromaattinen leesio, joka on pienempi kuin yhden kromatidin leveys ja johon liittyy minimaalinen kromatidin (kromatidien) siirtymä. Mitoosi-indeksi: suhdeluku, joka saadaan jakamalla metafaasissa olevien solujen määrä solupopulaatiossa todettujen solujen kokonaismäärällä; ilmoittaa solujen proliferaatioasteen kyseisessä solupopulaatiossa. Numeerinen poikkeavuus: käytetyille soluille tyypillisestä normaalista kromosomimäärästä poikkeava kromosomien lukumäärä. Polyploidia: haploidisen kromosomimäärän (n) esiintyminen moninkertaisena, muu kuin diploidinen kromosomimäärä (3n, 4n jne.). Rakenteellinen poikkeavuus: kromosomirakenteen muutos, joka voidaan havaita solunjakautumisen meta-faasivaiheen mikroskooppitutkimuksella ja joka ilmenee deleetioina ja fragmentteina, kromosomien sisäisinä tai kromosomien välisinä tekijänvaihdoksina.
1.3 TESTIN PERIAATE Soluviljelmät altistetaan tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista aktivaatiota että metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Kun soluviljelmät on altistettu tutkittavalle aineelle, ne käsitellään etukäteen määrätyin välein metafaasin pysäyttävällä aineella (esim. Colcemid® tai kolkisiini), solut kerätään ja värjätään, ja metafaasissa olevat solut analysoidaan mikroskooppisesti kromosomipoikkeavuuksien havaitsemiseksi.
1.4 TESTIN KUVAUS
1.4
1.4.1 Testin valmistelu
1.4.1
1.4.1.1 Solut Testissä voidaan käyttää eri solulinjoja, solukantoja tai primaarisia soluviljelmiä, myös ihmisen soluja (esim. kiinanhamsterin fibroblasteja, ihmisen tai muun nisäkkään perifeerisen veren lymfosyyttejä).
1.4.1.2 Kasvatusväliaineet ja viljelyolosuhteet Soluviljelmien ylläpidossa on käytettävä soveltuvia kasvatusalustoja ja inkubaatio-olosuhteita (kasvatusastiat, CO2-pitoisuus, lämpötila ja kosteus). Pysyvistä solulinjoista ja kannoista on tarkistettava ajoittain modaalisen kromosomimäärän pysyvyys ja mahdollinen mykoplasmakontaminaatio. Kontaminoituneita viljelmiä ei pidä käyttää. Solujen normaali solusyklin kesto ja käytetyt viljelyolosuhteet on tunnettava.
1.4.1.3 Soluviljelmien valmistelu Pysyvät solulinjat ja solukannat: solut kasvatetaan kantaviljelmistä, kylvetään kasvatusvälineeseen sellaiseen tiheyteen, että soluviljelmät eivät saavuta konfluenttisuutta ennen solujen keräämisajankohtaa, ja inkuboidaan 37 oC:ssa. Lymfosyytit: antikoagulanteilla (esim. hepariinilla) käsiteltyä kokoverta tai terveiltä luovuttajilta saatuja erotettuja lymfosyyttejä lisätään mitogeenia (esim. fytohemagglutiniinia) sisältävään kasvatusväliaineeseen ja inkuboidaan 37 oC:ssa.
1.4.1.4 Metabolinen aktivaatio Solut on altistettava tutkittavalle aineelle sekä sopivan metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman sitä. Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjestelmä on entsyymejä indusoivilla aineilla, kuten Aroclor 1254:11ä (6) (7) (8) (9) tai fenobarbitonin ja ß-naftoflavonin (10) (11) (12) yhdistelmällä käsiteltyjen jyrsijöiden maksasta eristetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon on lisätty kofaktoria. Postmitokondriaalisen jakeen yleisesti käytetty pitoisuusalue lopullisessa testiväliaineessa on 1-10 % v/v. Metabolinen aktivaatiojärjestelmä voi vaihdella sen mukaan, mihin kemiallisten aineiden ryhmään tutkittava aine kuuluu. Joissakin tapauksissa saattaa olla perusteltua käyttää useampaa kuin yhtä postmitokondriaalisen jakeen pitoisuutta. Monilla kehitetyillä menetelmillä, kuten yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotetuilla solulinjoilla, joissa ilmentyy spesifisiä aktivaatioentysyymejä, saattaa olla endogeenista aktivaatiovaikutusta. Käytettyjen solulinjojen valinnan on oltava tieteellisesti perusteltua (esim. sytokromi P450 -isoentsyymin merkitys tutkittavan aineen metabolialle).
1.4.1.5 Tutkittava aine / valmistelu Kiinteät tutkittavat aineet liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja laimennetaan tarvittaessa ennen solujen käsittelyä. Nestemäiset tutkittavat aineet voidaan lisätä suoraan koejärjestelmiin ja/tai laimentaa ennen solujen käsittelyä. Tutkittava aine on valmisteltava juuri ennen altistusta, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla.
1.4.2 Koeolosuhteet
1.4.2
1.4.2.1 Liuotin/kantaja-aine Liuotin/kantaja-aine ei saa olla sellainen, että sen voidaan epäillä reagoivan kemiallisesti tutkittavan aineen kanssa, eikä se saa vaikuttaa solujen elinkykyyn eikä S9-aktiivisuuteen. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. Testattaessa aineita, jotka ovat epästabiileja vedessä, orgaanisten liuottimien tulisi olla vedettömiä. Vesi voidaan poistaa lisäämällä molekyylisiivilä.
1.4.2.2 Altistuspitoisuudet Huomioonotettavia kriteerejä suurinta pitoisuutta määritettäessä ovat sytotoksisuus, liukoisuus testijärjestelmään ja pH:n tai osmolaliteetin muutokset. Sytotoksisuus on määritettävä pääasiallisessa kokeessa sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman sitä käyttäen asianmukaisia solujen eheyden ja solukasvun indikaattoreita, kuten konfluenttisuuden astetta, elinkykyisten solujen määrää tai mitoosi-indeksiä. Sytotoksisuus ja liukoisuus saattaa olla hyödyllistä määrittää alustavassa kokeessa. Vähintään kolmea analysoitavissa olevaa pitoisuutta on käytettävä. Mikäli sytotoksisuutta esiintyy, näiden pitoisuuksien on katettava alue, jossa suurimmalla pitoisuudella on maksimaalinen myrkkyvaikutus ja pienimmällä vähäinen tai ei lainkaan myrkkyvaikutusta, mikä tarkoittaa yleensä sitä, että pitoisuudet voivat poiketa toisistaan enintään kertoimella 2–10. Solujen keräämisajankohtana suurimpaan pitoisuuteen tulisi liittyä merkittävä konfluenttisuuden asteen, solumäärän tai mitoosi-indeksin pieneneminen (kaikkien osalta yli 50 %). Mitoosi-indeksi on vain epäsuora sytotoksisten/sytostaattisten vaikutusten mitta, ja se riippuu altistuksesta kuluneesta ajasta. Mitoosi-indeksi hyväksytään kuitenkin suspensioviljelmissä, joissa muiden myrkkyvaikutusta mittaavien menetelmien käyttö saattaa olla hankalaa ja epäkäytännöllistä. Tietoja solusyklin kinetiikasta, kuten keskimääräistä generaatioaikaa (average generation time, AGT), voidaan käyttää täydentävinä tietoina. AGT on kuitenkin yleinen keskiarvo, joka ei aina paljasta hidastuneiden alapopulaatioiden olemassaoloa, ja vähäinenkin generaatioajan piteneminen voi siirtää poikkeavuuksien optimaalista toteamisaikaa hyvinkin paljon myöhemmäksi. Soluille suhteellisen myrkyttömiä aineita tutkittaessa suurimman testattavan pitoisuuden on oltava 5 μl/ml, 5 mg/ml tai 0,01 M, sen mukaan, mikä näistä pitoisuuksista on pienin. Testattaessa huonosti veteen liukenevia aineita, jotka ovat myrkyttömiä liukenemattoman pitoisuuden alittavina pitoisuuksina, suurimman käytetyn annoksen aikaansaaman pitoisuuden on ylitettävä liukoisuusraja lopullisessa kasvatusväliaineessa altistusjakson lopussa. Joissakin tapauksissa (esim. kun myrkkyvaikutus todetaan ainoastaan pienimmän liukenemattoman pitoisuuden ylittävillä pitoisuuksilla) on suositeltavaa testata useampia kuin yksi pitoisuus, jossa havaitaan näkyvää saostumista. Liukoisuus kannattaa arvioida sekä käsittelyn alussa että lopussa, sillä se voi muuttua koejärjestelmässä altistuksen aikana esimerkiksi solujen, S9:n, seerumin ym. vaikutuksesta. Liukenemattomuus voidaan havaita paljaalla silmällä. Sakan ei pitäisi vaikuttaa laskentaan.
1.4.2.3 Negatiiviset ja positiiviset kontrollit Jokaisessa kokeessa on käytettävä rinnakkaisia positiivisia ja negatiivisia (liuotin tai kantaja-aine} kontrolleja, sekä metabolisen aktivaation läsnäollessa että ilman sitä. Metabolista aktivaatiota käytettäessä positiivisena kontrollina on käytettävä sellaista kemiallista ainetta, joka vaatii aktivaatiota mutageenisen vasteen aikaansaamiseksi. Positiivisina kontrollialueina on käytettävä tunnettua klastogeenia altistustasoina, joiden voidaan odottaa aiheuttavan toistettavissa ja havaittavissa olevan lisääntymisen taustaan verrattuna, mikä osoittaa koejärjestelmän herkkyyden. Positiivisen kontrollialueen pitoisuudet on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti lukijalle koodattujen objektilasien identiteettiä. Esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista: Metabolinen aktivaatio Aine CAS nro EINECS nro Ei eksogeenista metabolista aktivaatiota metyylimetaanisulfonaatti 66-27-3 200-625-0 etyylimetaanisulfonaatti 62-50-0 200-536-7 etyylinitrosourea 759-73-9 212-072-2 mitomysiini C 50-07-7 212-072-2 4-nitrokinoliini-N-oksidi 56-57-5 200-281-1 Eksogeeninen metabolinen aktivaatio Bentso[a]pyreeni 50-32-8 200-028-5 syklofosfamidi syklofosfamidimonohydraatti 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Muita sopivia positiivisia kontrolliaineita voidaan käyttää. Samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvan positiivisen kemiallisen kontrolliaineen käyttöä on harkittava, mikäli tällainen aine on käytettävissä. Jokaisena solujen keräämisajankohtana on otettava näytteet myös negatiivisista kontrolleista, jotka koostuvat tutkittavaa ainetta sisältävässä kasvatusväliaineessa olevasta liuottimesta tai pelkästä kantaja-aineesta ja joita on käsitelty samalla tavoin kuin altistettuja viljelmiä. Lisäksi on käytettävä myös käsittelemättömiä kontrolleja, paitsi jos aikaisemmat tiedot kontrollista osoittavat, ettei valitulla liuottimella ole haitallisia eikä mutageenisia vaikutuksia.
1.4.3 Testin suorittaminen
1.4.3
1.4.3.1 Altistaminen tutkittavalle aineelle Lisääntyvät solut altistetaan tutkittavalle aineelle metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa ja ilman sitä. Lymfosyyttien altistus on aloitettava noin 48 tunnin kuluttua mitogeenisesta stimulaatiosta.
1.4.3.2 Normaalisti jokaisesta pitoisuudesta tulisi tehdä kaksi rinnakkaista viljelmää, ja niiden käyttöä suositellaan erityisesti negatiivisissa/liuotinkontrolliviljelmissä. Mikäli aikaisemmat tutkimustulokset osoittavat, että rinnakkaisviljelmien välillä on vain hyvin vähäisiä eroja (13) (14), yhden viljelyn käyttö kustakin pitoisuudesta saattaa olla hyväksyttävää. Kaasumaisia tai haihtuvia aineita on testattava asianmukaisilla menetelmillä, kuten suljetuissa kasvatusastioissa (15) (16).
1.4.3.3 Näytteiden keräämisajankohdat Ensimmäisessä kokeessa soluja on altistettava tutkittavalle aineelle sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman sitä 3–6 tunnin ajan, ja näytteet kerätään suunnilleen 1,5 normaalin solusyklin kuluttua altistuksesta (12). Jos tässä menettelyssä saadaan negatiiviset tulokset sekä metabolisen aktivaation läsnäollessa että ilman sitä, on tehtävä uusi testi ilman aktivaatiota, ja altistusta on jatkettava yhtäjaksoisesti siihen asti, kun näytteet kerätään suunnilleen 1,5 normaalia solusykliä vastaavan ajan kuluttua. Tietyt kemialliset aineet saatetaan havaita helpommin, kun altistus/näytteenottoaika on pitempi kuin 1,5 solusykliä. Metabolisen aktivaation läsnäollessa saadut negatiiviset tulokset on vahvistettava tapauskohtaisesti. Ellei negatiivisten tulosten vahvistamista pidetä tarpeellisena, perustelut on esitettävä.
1.4.3.4 Kromosomipreparaatti Soluviljelmiä käsitellään Colcemid®illa tai kolkisiinilla yleensä 1–3 tunnin ajan ennen näytteiden keräämistä. Jokaisen viljelmän näytteet kerätään ja käsitellään erikseen kromosomipreparaattien valmistusta varten. Kromosomipreparaattien valmistukseen kuuluu solujen hypotoninen käsittely, fiksointi ja värjäys.
1.4.3.5 Analyysi Kaikki objektilasit, myös positiiviset ja negatiiviset kontrollit, on koodattava toisistaan riippumattomasti ennen mikroskooppitutkimusta. Koska fiksaatio johtaa usein joidenkin metafaasissa olevien solujen rikkoutumiseen ja kromosomien menettämiseen, lasketuissa soluissa tulisi olla sentromeerejä modaalista lukumäärää vastaava määrä ± 2 kaikissa solutyypeissä. Kustakin pitoisuudesta ja kontrollista olisi laskettava vähintään 200 hyvin levinnyttä metafaasia, jotka jakautuvat tasaisesti rinnakkaisviljelmien kesken, mikäli niitä käytetään. Lukumäärää voidaan pienentää, mikäli aberraatioita todetaan runsaasti. Vaikka testillä pyritään ensisijaisesti toteamaan rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet, on tärkeää rekisteröidä myös polyploidia ja endoreduplikaatio, mikäli näitä esiintyy.
2. TULOKSET
2.
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY Kokeellinen yksikkö on solu, joten on arvioitava niiden solujen prosentuaalinen määrä, joissa on rakenteellinen kromosomipoikkeavuus (poikkeavuuksia). Erityyppiset rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet on lueteltava ja niiden lukumäärät ja esiintymistaajuudet altistetuissa viljelmissä ja kontrolliviljelmissä on mainittava. Aukot (gaps) rekisteröidään erikseen ja raportoidaan mutta niitä ei yleensä lasketa mukaan poikkeavuuksien kokonaistaajuuteen. Lisäksi on rekisteröitävä kaikissa testiviljelmissä ja negatiivisissa kontrolliviljelmissä tehdyt samanaikaiset sytotoksisuusmittaukset pääasiallisissa kromosomipoikkeavuustesteissä. Tulokset on ilmoitettava kutakin viljelmää kohti. Lisäksi on esitettävä yhteenveto kaikista tiedoista taulukkomuodossa. Selvää positiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa. Epäselvät tulokset on selvitettävä jatkotestauksella mieluiten muunnetuissa koeolosuhteissa. Negatiivisten tulosten vahvistamisen tarvetta on käsitelty kohdassa 1.4.3.3. Jatkokokeissa on harkittava tutkimusparametrien modifiointia arvioitavien olosuhteiden laajentamiseksi. Mahdollisia modifioitavia tutkimusparametreja ovat pitoisuusvälit ja metaboliset aktivaatiojärjestelmät.
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA Positiivisten tulosten määrittämiseen on useita kriteerejä, kuten kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen lukumäärän lisääntyminen, joka on riippuvainen tutkittavan aineen pitoisuudesta tai on toistettavissa. Tulosten biologinen merkitys on otettava ensisijaisesti huomioon. Tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testitulosten arvioinnissa (3) (13). Tilastollinen merkitsevyys ei saa olla ainoa määräävä tekijä positiivisen vasteen arvioinnissa. Polyploidisten solujen määrän suureneminen saattaa osoittaa, että tutkittava aine pystyy estämään mitoottisia prosesseja ja aiheuttamaan numeerisia kromosomipoikkeavuuksia. Endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävien solujen määrän suureneminen saattaa osoittaa, että tutkittava aine kykenee pysäyttämään solusyklin etenemisen (17) (18). Tutkittava aine, jolla saadut tulokset eivät täytä edellä kuvattuja kriteerejä, katsotaan ei-mutageeniseksi tässä koejärjestelmässä. Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tuloksia, mutta joissakin harvinaisissa tapauksissa saatujen tietojen pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä tutkittavan aineen vaikutuksesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi kokeen toistokertojen määrästä riippumatta. In vitro -kromosomipoikkeavuustestissä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että tutkittava aine aiheuttaa rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia viljellyissä nisäkkäiden somaattisissa soluissa. Negatiiviset tulokset osoittavat, ettei tutkittava aine aiheuta koeolosuhteissa kromosomipoikkeavuuksia viljellyissä nisäkkäiden somaattisissa soluissa.
3. RAPORTOINTI
3. TUTKIMUSSELOSTUS
Tutkimusselostuksen on sisällettävä seuraavat tiedot:
Liuotin/kantaja-aine:
kantaja-aineen valintaperusteet,
tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa, jos tiedossa.
Solut:
solutyyppi ja solujen lähde,
karyotyypin ominaisuudet ja käytetyn solutyypin soveltuvuus,
mykoplasman puuttuminen, tarvittaessa,
tiedot solusyklin pituudesta,
verenluovuttajien sukupuoli, kokoveri vai eristetyt lymfosyytit, käytetty mitogeeni,
siirtojen lukumäärä, tarvittaessa,
soluviljelmän ylläpitomenetelmät, tarvittaessa,
kromosomien modaalinen lukumäärä.
Koeolosuhteet:
metafaasin estämiseen käytetty aine, sen pitoisuus ja solujen altistuksen kesto,
pitoisuuksien ja soluviljelmien lukumäärän valintaperusteet, joihin sisältyvät esim. sytotoksisuustiedot ja liukoisuusrajoitukset, mikäli tiedot ovat käytettävissä,
kasvatusväliaineen koostumus, CO2-pitoisuus, tarvittaessa,
tutkittavan aineen pitoisuus,
lisätyn kantaja-aineen ja tutkittavan aineen määrä,
inkubaatiolämpötila,
inkubaatioaika,
altistuksen kesto,
solutiheys kylvämisen aikana, tarvittaessa,
metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus, myös sen hyväksyttävyyskriteerit,
positiiviset ja negatiiviset kontrollit,
objektilasien valmistelumenetelmät,
kromosomipoikkeavuuksien laskentakriteerit,
analysoitujen metafaasien lukumäärä,
myrkkyvaikutuksen mittausmenetelmät,
positiivisten, negatiivisten tai epäselvien tulosten kriteerit.
Tulokset:
myrkkyvaikutuksen merkit, esim. konfluenttisuuden aste, solusykliä koskevat tiedot, solumäärät, mitoosi-indeksi,
saostumisen merkit,
tiedot tutkittavaa ainetta sisältävän kasvatusväliaineen pH:sta ja osmolaliteetista, jos määritetty,
kromosomipoikkeavuuksien, myös aukkojen, määrittely (gaps),
kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen lukumäärä ja kromosomipoikkeavuuksien tyyppi ilmoitetaan kunkin altistetun viljelmän ja kontrolliviljelmän osalta erikseen,
ploidian muutokset, jos niitä esiintyy,
annos-vastesuhde, mikäli mahdollista,
mahdolliset tilastolliset analyysit,
rinnakkaisten negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisten kontrollien tulokset,
aikaisemmat tutkimustulokset negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista kontrolleista, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat.
Tulosten pohdinta.
Johtopäätökset.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
KIRJALLISUUTTA Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A., (ed) Plenum Press, New York and London, s. 1–29. Ishidate, M.Jr. and Sofumi, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, s. 427–432. Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C. Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), s. 1–175. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991).Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, s. 147–204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, s. 297–305. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, s. 347–364. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, s. 173–215. Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, s. 83–90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, s. 277–290. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, s. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F.J. Fouts, J.R. Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, s. 85–88. Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr.. Ivett, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, s. 241–261. Richardson, C, Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, s. 141–154. Soper, K.A. and Galloway, S.M. (1994), replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res,, 312, s. 139–149. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, s. 91–103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, s. 795–801. Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, s. 403–413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983), Aphidicolin — induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, s. 1362–1364.
B.11. MUTAGEENISUUS — KROMOSOMIPOIKKEAVUUSTESTI NISÄKKÄIDEN LUUYTIMESSÄ IN VIVO
B.11.
1. MENETELMÄ Tämä menetelmä on sama kuin OECD TG 475, Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test (1997).
1.
1.1 JOHDANTO Nisäkkäillä in vivo tehtävää kromosomipoikkeavuustestiä käytetään tutkittavan aineen aiheuttamien rakenteellisten kromosomipoikkeavuuksien osoittamiseen nisäkkäiden, yleensä jyrsijöiden, luuydinsoluissa (1) (2) (3) (4). Rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet jakautuvat kahteen tyyppiin, kromosomi- ja kromatidipoikkeavuuksiin. Polyploidian lisääntyminen saattaa osoittaa, että kemiallinen aine voi aiheuttaa numeerisia poikkeavuuksia. Kemiallisten mutageenien aiheuttamat poikkeavuudet ovat useimmiten kromatidityyppisiä, mutta myös kromosomityyppisiä mutaatioita esiintyy. Kromosomimutaatiot ja niihin liittyvät tapahtumat ovat syynä moniin ihmisen geneettisiin sairauksiin, ja on saatu vakuuttavia todisteita siitä, että kromosomimutaatiot ja niihin liittyvä tapahtumat, jotka aiheuttavat muutoksia somaattisten solujen onkogeeneissä ja kasvunrajoitegeeneissä, ovat osallisina syövän synnyssä ihmisillä ja kokeellisissa järjestelmissä. Tässä testissä käytetään rutiinimaisesti jyrsijöitä. Luuydin on tämän testin kohdekudos, sillä sen verisuonitus on hyvin runsasta ja se sisältää solupopulaation, jonka solusykli on nopea ja joka on helppo eristää ja prosessoida. Tätä menetelmää ei käytetä muilla lajeilla eikä muissa kohdekudoksissa. Tämä kromosomipoikkeavuustesti soveltuu erityisesti mutageenisuuden vaaran arvioimiseen, sillä siinä voidaan ottaa huomioon tekijöitä, jotka liittyvät in vivo -metaboliaan, farmakokinetiikkaan ja DNA:n korjautumisprosesseihin, joskin näissä saattaa esiintyä eroja lajien ja kudosten välillä. In vivo -testiä voidaan käyttää myös in vitro -testissä havaitun mutageenisen vaikutuksen jatkotutkimuksena. Jos on saatu viitteitä siitä, ettei tutkittava aine tai sen reaktiivinen metaboliitti pääse kohdekudokseen, tätä testiä ei pidä käyttää. Ks. myös Yleisjohdanto, osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄT Kromatidipoikkeavuus: rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilmenee yksittäisten kromatidien katkeamisena tai kromatidien katkeamisena ja uudelleenyhtymisenä. Kromosomipoikkeavuus: rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilmenee molempien kromatidien katkeamisena tai katkeamisena ja uudelleenyhtymisenä samassa kohdassa. Endoreduplikaatio: tapahtumasarja, jossa DNA:n kahdentumisen S-vaiheen jälkeen tuma ei etene mitoosiin vaan aloittaa uuden S-vaiheen. Tämän seurauksena syntyy kromosomeja, joissa on 4, 8, 16, ... kromatidia. Aukko: gap, akromaattinen leesio, joka on pienempi kuin yhden kromatidin leveys, ja johon liittyy minimaalinen kromatidin (kromatidien) siirtymä. Numeerinen poikkeavuus: käytetyille soluille tyypillisestä normaalista kromosomimäärästä poikkeava kromosomien lukumäärä. Polyploidia: haploidisen kromosomimäärän (n) esiintyminen moninkertaisena, muu kuin diploidinen kromosomimäärä (3n, 4n jne.). Rakenteellinen poikkeavuus: kromosomirakenteen muutos, joka voidaan havaita solunjakautumisen metafaasivaiheen mikroskooppitutkimuksella ja joka ilmenee deleetioina ja fragmentteina, kromosomien sisäisinä tai kromosomien välisinä tekijänvaihdoksina.
1.3 TESTIN PERIAATE Eläimet altistetaan tutkittavalle aineelle soveltuvaa altistusreittiä käyttäen ja lopetetaan sopivan ajan kuluttua altistuksesta. Ennen lopettamista eläimille annetaan ainetta, joka pysäyttää solunjakautumisen metafaasiin (esim. kolkisiinia tai Colcemid®ia). Tämän jälkeen luuydinsoluista tehdään kromosomipreparaatit ja ne värjätään, ja metafaasissa olevien solujen kromosomipoikkeavuudet analysoidaan.
1.4 TESTIN KUVAUS
1.4
1.4.1 Testin valmistelu
1.4.1
1.4.1.1 Eläinlajien valinta Yleisesti käytettyjä eläinlajeja ovat rotta, hiiri ja kiinanhamsteri, mutta myös muita soveltuvia nisäkäslajeja voidaan käyttää. Koe-eläinten on oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä aikuisia eläimiä. Testin alkaessa eläinten painon vaihtelun on oltava minimaalista, enintään ± 20 % kummankin sukupuolen keskipainosta.
1.4.1.2 Asuinolot ja ruokinta Yleiset olosuhteet ovat samat kuin osan B Yleisjohdannossa, mutta kosteustavoitteen on oltava 50–60 %.
1.4.1.3 Eläinten valmistelu Terveet nuoret aikuiset eläimet jaetaan satunnaistetusti koe- ja kontrolliryhmiin. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Eläimet tunnistetaan yksilöllisesti. Eläimiä sopeutetaan laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan.
1.4.1.4 Annosten valmistelu Kiinteät tutkittavat aineet liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja laimennetaan tarvittaessa ennen kuin niitä annetaan koe-eläimille. Nestemäiset tutkittavat aineet voidaan antaa suoraan tai laimentaa ennen antamista. Tutkittava aine on valmistettava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä.
1.4.2 Koeolosuhteet
1.4.2
1.4.2.1 Liuotin/kantaja-aine Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käytetyillä annostasoilla, eikä sen käyttöön saa liittyä epäilyjä mahdollisista kemiallisista reaktioista tutkittavan aineen kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava niiden yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Ensisijaisesti on harkittava vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä, mikäli mahdollista.
1.4.2.2 Kontrollit Jokaiseen testiin on otettava mukaan kumpaakin sukupuolta olevat rinnakkaiset positiiviset ja negatiiviset (liuotin/kantaja-aine) kontrollit. Kontrolliryhmän eläimiä on käsiteltävä samalla tavoin kuin koeryhmän eläimiä, mutta niille ei anneta tutkittavaa ainetta. Positiivisten kontrollien tulisi aiheuttaa rakenteellisia poikkeavuuksia in vivo -altistustasoilla, joiden odotetaan aiheuttavan poikkeavuuksien havaittavaa lisääntymistä taustaan verrattuna. Positiivisten kontrollien annokset on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti lukijalle koodattujen objektilasien identiteettiä. Positiivinen kontrolli voidaan antaa eri reittiä kuin tutkittava aine ja näytteet voidaan ottaa vain kerran. Positiivisina kontrolleina tulisi käyttää samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvia aineita, mikäli mahdollista. Esimerkkejä positiivisista kontrolleista: Aine CAS-nro EINECS-nro Etyylimetaanisulfonaatti 62-50-0 200-536-7 Etyylinitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomysiini C 50-07-7 200-008-6 Syklofosfamidi Syklofosfamidimonohydraatti 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietyleenimelamiini 51-18-3 200-083-5 Pelkkää liuotinta tai kantaja-ainetta saaneista negatiivisista kontrolleista, joita muuten on käsitelty samalla tavoin kuin koeryhmiä, on otettava näytteet jokaisella näytteenottokerralla, paitsi jos aikaisemmat tutkimustulokset osoittavat, että eläinten väliset erot ja vaihtelut kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen esiintymistaajuudessa ovat hyväksyttävällä tasolla. Jos negatiivisista kontrolleista otetaan vain yksi näyte, se tulisi ottaa ensimmäisellä näytteenottokerralla. Lisäksi on käytettävä myös käsittelemättömiä kontrolleja, paitsi jos kontrolleilla aikaisemmin tehdyt tutkimukset tai julkaistut tulokset osoittavat, että valittu liuotin/kantaja-aine ei aiheuta haitallisia eikä mutageenisia vaikutuksia.
1.5 TESTIN SUORITTAMINEN
1.5
1.5.1 Eläinten lukumäärä ja sukupuoli Jokaisessa koe- ja kontrolliryhmässä on oltava vähintään 5 analysoitavissa olevaa eläintä kumpaakin sukupuolta. Vain toista sukupuolta voidaan käyttää, mikäli tutkimusajankohtana on käytettävissä samalla eläinlajilla samaa altistusreittiä käyttäen tehtyjä tutkimuksia, joiden tulokset osoittavat, ettei myrkkyvaikutuksessa ole huomattavia eroja sukupuolten välillä. Jos ihmisen altistuminen tutkittavalle kemialliselle aineelle voi olla sukupuolesta riippuvaa, kuten joidenkin lääkeaineiden kohdalla, testi on tehtävä asianomaista sukupuolta olevilla eläimillä.
1.5.2 Altistusohjelma Tutkittavat aineet tulisi antaa mieluiten kerta-annoksena. Ne voidaan kuitenkin antaa myös jaettuina annoksina, eli kahtena altistuksena saman päivän aikana vain muutaman tunnin välein, mikä helpottaa suurten ainemäärien antamista. Muut annosteluohjelmat on perusteltava tieteellisesti. Näytteet on otettava kahtena ajankohtana saman päivän aikana altistuksen jälkeen. Jyrsijöillä ensimmäisen näytteenottovälin pituus on 1,5 normaalia solusykliä (solusyklin pituus on normaalisti 12–18 tuntia) altistuksen jälkeen. Koska tutkittavan aineen soluunottoon ja metaboloitumiseen kuluva aika ja sen vaikutus solusyklin kinetiikkaan voi muuttaa kromosomipoikkeavuuksien optimaalista havaitsemisajankohtaa, myöhempi näyte tulisi kerätä 24 tunnin kuluttua ensimmäisestä näytteestä. Jos tutkittavaa ainetta annetaan pitempään kuin yhden päivän ajan. yksi näyte on otettava 1,5 normaalin solusyklin kuluttua viimeisestä altistusajankohdasta. Ennen lopettamista eläimille annetaan injektiona vatsaonteloon sopiva annos ainetta, joka pysäyttää solut metafaasivaiheeseen (esim. Colcemid®ia tai kolkisiinia). Eläimistä otetaan näytteet sopivan ajan kuluttua tämän jälkeen. Hiirillä tämä väli on noin 3–5 tuntia; kiinanhamstereilla se on noin 4–5 tuntia. Solut kerätään luuytimestä ja analysoidaan kromosomipoikkeavuuksien toteamiseksi.
1.5.3 Annostasot Jos tehdään annoksenmääritystutkimus, koska soveltuvia tietoja ei ole käytettävissä, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen samaa lajia, samaa kantaa, samaa sukupuolta olevia eläimiä ja samaa altistusohjelmaa kuin päätutkimuksessa on tarkoitus käyttää (5). Mikäli myrkkyvaikutuksia esiintyy, ensimmäiseen näytteenottoajankohtaan asti käytetään kolmea annostasoa. Näistä suurimmalla annoksella on oltava maksimaalinen myrkkyvaikutus ja pienimmällä vähäinen tai ei lainkaan myrkkyvaikutusta. Myöhemmän näytteenottoajankohdan edellä voidaan käyttää vain suurinta annosta. Suurin annos määritellään annokseksi, joka aiheuttaa sen kaltaisia myrkyllisyysoireita, että samaa annosteluohjelmaa käytettäessä suurempien annosten voitaisiin odottaa johtavan kuolemaan. Aineet, joilla on spesifisiä biologisia vaikutuksia pieninä, myrkyttöminä annoksina (kuten hormonit ja mitogeenit), saattavat edellyttää toisenlaisia annoksenmäärityskriteerejä, ja niitä pitäisi arvioida tapauskohtaisesti. Suurin annos voidaan määritellä myös annokseksi, joka aiheuttaa joitakin myrkyllisyyteen viittaavia muutoksia luuytimessä (esim. mitoosi-indeksi pienenee yli 50 %).
1.5.4 Raja-annostesti Ellei havaittavia myrkkyvaikutuksia esiinny testattaessa yhtä annostasoa, joka on vähintään 2000 mg/kg (eläimen painokiloa kohti) ja joka annetaan kerta-annoksena tai kahtena annoksena saman päivän aikana, ja ellei genotoksisuutta ole odotettavissa kemialliselta rakenteeltaan samanlaisilla aineilla saatujen tutkimustulosten perusteella, täydellinen tutkimus kolmella eri annostasolla ei ehkä ole välttämätön. Pitempään kestävissä tutkimuksissa raja-annos on 2000 mg painokiloa kohti vuorokaudessa, jos altistusta jatketaan enintään 14 vuorokautta, ja 1000 mg/kg/vrk, jos altistus kestää yli 14 vuorokautta. Ihmisten odotettu altistus saattaa edellyttää suurempien annostasojen käyttöä raja-annostestissä.
1.5.5 Antotapa Tutkittava aine annetaan yleensä ruokintaletkulla tai sopivalla intubaatiokanyylillä tai injektiona vatsaonteloon. Myös muut antotavat ovat mahdollisia, mikäli ne voidaan perustella. Koe-eläimen koosta riippuu, kuinka paljon nestettä voidaan antaa kerralla ruokintaletkun kautta tai injektiona. Määrä ei kuitenkaan saa olla yli 2 ml/100 g eläimen painon mukaan mitattuna. Mikäli käytetään suurempia nestemääriä, ne on perusteltava. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyttäviä aineita, joiden vaikutukset yleensä pahenevat suurempia pitoisuuksia käytettäessä, nestemäärien vaihtelu olisi pidettävä mahdollisimman pienenä säätämällä tutkittavan aineen pitoisuuksia siten, että kokonaisnestemäärä pysyy samana kaikilla annostasoilla.
1.5.6 Kromosomipreparaatin valmistus Luuydintä kerätään heti eläinten lopettamisen jälkeen, käsitellään hypotonisella liuoksella ja fiksoidaan. Tämän jälkeen solut levitetään objektilaseille ja värjätään.
1.5.7 Analyysi Mitoosi-indeksi on määritettävä sytotoksisuuden mittana vähintään 1000 solusta eläintä kohti kaikista tutkittavalle aineelle altistetuista eläimistä (myös positiivisista kontrolleista) ja altistamattomista negatiivisista kontrollieläimistä. Jokaisesta eläimestä on analysoitava vähintään 100 solua. Määrä voi olla pienempi, mikäli havaitaan runsaasti poikkeavuuksia. Kaikki objektilasit, myös ne, joilla on positiiviset ja negatiiviset kontrollit, on koodattava toisistaan riippumattomasti ennen mikroskooppitutkimusta. Koska objektilasien valmistelu johtaa usein joidenkin metafaasissa olevien solujen rikkoutumiseen ja kromosomien menettämiseen, sentromeerien lukumäärän lasketuissa soluissa on vastattava lukua 2n ± 2.
2. TULOKSET
2.
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY Yksittäisten eläinten tulokset on esitettävä taulukkomuodossa. Kokeellinen yksikkö on eläin. Jokaisesta eläimestä on arvioitava laskettujen solujen lukumäärä, poikkeavuuksien lukumäärä solua kohti ja niiden solujen prosentuaalinen osuus, joissa on yksi tai useampia rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia. Erityyppiset rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet on lueteltava ja niiden lukumäärä ja esiintymistaajuus on ilmoitettava koe- ja kontrolliryhmien osalta. Aukot (gaps) rekisteröidään erikseen ja raportoidaan, mutta niitä ei yleensä lasketa mukaan kromosomipoikkeavuuksien kokonaistaajuuteen. Ellei viitteitä sukupuolten välisistä vaste-eroista ole havaittavissa, molempien sukupuolten tiedot voidaan yhdistää tilastollista analyysiä tehtäessä.
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA Positiivisille tuloksille on useita kriteerejä, kuten kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen suhteellisen lukumäärän annoksesta riippuva suureneminen tai kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen lukumäärän selvä suureneminen yksittäisessä annosryhmässä yhdellä näytteenottokerralla. Tulosten biologinen merkitys on otettava ensisijaisesti huomioon. Tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testitulosten arvioinnissa (6). Tilastollinen merkitsevyys ei saa olla ainoa määräävä tekijä positiivisen vasteen arvioinnissa. Epäselviä tuloksia on selkeytettävä jatkotestauksella mieluiten muunnetuissa koeolosuhteissa. Polyploidian lisääntyminen saattaa osoittaa, että tutkittava aine pystyy aiheuttamaan numeerisia kromosomipoikkeavuuksia. Endoreduplikaation lisääntyminen saattaa osoittaa, että tutkittava aine kykenee pysäyttämään solusyklin etenemisen (7) (8). Tutkittava aine, jolla saadut tulokset eivät täytä edellä kuvattuja kriteerejä, katsotaan ei-mutageeniseksi tässä testissä. Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tuloksia, mutta joissakin harvinaisissa tapauksissa saatujen tulosten pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä tutkittavan aineen vaikutuksesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi tehtyjen kokeiden lukumäärästä riippumatta. In vivo -kromosomipoikkeavuustestissä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että tutkittava aine aiheuttaa kromosomipoikkeavuuksia testatun lajin luuytimessä. Negatiiviset tulokset osoittavat, ettei tutkittava aine aiheuta koeolosuhteissa kromosomipoikkeavuuksia testatun lajin luuytimessä. Tutkittavan aineen tai sen metaboliittien todennäköistä pääsyä yleiseen verenkiertoon tai erityisesti kohdekudokseen (esim. systeeminen toksisuus) on pohdittava.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS Tutkimusselostuksen on sisällettävä seuraavat tiedot:
Liuotin/kantaja-aine:
kantaja-aineen valintaperusteet,
tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa, jos tiedossa.
Koe-eläimet:
käytetty eläinlaji/kanta,
eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,
hankintapaikka, asuinolosuhteet, ruokavalio jne.,
eläinten yksilöllinen paino testiä aloitettaessa, myös painon vaihteluväli, keskiarvo ja keskihajonta kussakin ryhmässä.
Koeolosuhteet:
positiiviset ja negatiiviset (kantaja-aine/liuotin) kontrollit,
mahdolliset raja-annostutkimuksen tulokset,
annostasojen valintaperusteet,
tutkittavan aineen valmistelun yksityiskohdat,
tutkittavan aineen antotavan yksityiskohdat,
antotavan valintaperusteet,
menetelmät, joilla on vahvistettu tutkittavan aineen pääsy yleiseen verenkiertoon tai kohdekudokseen, tarvittaessa,
ravintoon/juomaveteen sekoitetun tutkittavan aineen pitoisuuden (ppm) muuntaminen todelliseksi annokseksi (mg painokiloa kohti vuorokaudessa, mg/kg/vrk), tarvittaessa,
yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta,
yksityiskohtainen kuvaus altistus- ja näytteidenkeräysohjelmasta,
myrkkyvaikutuksen mittausmenetelmät,
metafaasin pysäyttämisessä käytetty aine, sen pitoisuus ja käsittelyn kesto,
objektilasien valmistusmenetelmät,
kromosomipoikkeavuuksien laskentakriteerit,
analysoitujen solujen lukumäärä eläintä kohti,
kriteerit, joiden perustella tutkimukset luokiteltiin positiivisiksi, negatiivisiksi tai epäselviksi.
Tulokset:
myrkkyvaikutuksen merkit,
mitoosi-indeksi,
kromosomipoikkeavuuksien tyyppi ja lukumäärä, ilmoitettava jokaisen eläimen osalta erikseen,
kromosomipoikkeavuuksien kokonaismäärä ryhmää kohti sekä keskiarvot ja keskihajonnat,
kromosomipoikkeavuuksia sisältäneiden solujen lukumäärä ryhmää kohti sekä keskiarvot ja keskihajonnat,
ploidian muutokset, jos niitä esiintyy,
annos-vastesuhde, mikäli mahdollista.
mahdolliset tilastolliset analyysit,
rinnakkaisen negatiivisen kontrollin tulokset,
aikaisemmat negatiivisesta kontrollista saadut tutkimustulokset sekä vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat,
rinnakkaisen positiivisen kontrollin tulokset.
Tulosten pohdinta.
Johtopäätökset.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
KIRJALLISUUTTA Adler, I.D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J.M. Party (eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., s. 275–306. Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, s. 57–165. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetic Assays, in: D.J. Kirkland (Ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115–141. Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, K, Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., s. 312, 305–312. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, s. 313–319. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge, s. 184–232. Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest. Mutation Res., 11 9, s. 403–413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin — induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, s. 1362–1364.
B.12. MUTAGEENISUUS — MIKROTUMATESTI NISÄKKÄÄN PUNASOLUISSA IN VIVO
B.12.
1. MENETELMÄ Tämä menetelmä on sama kuin OECD TG 474, Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test (1997).
1.
1.1 JOHDANTO Nisäkkäiden in vivo -mikrotumatestiä käytetään tutkittavan aineen aiheuttamien kromosomivaurioiden tai mitoosilaitteen vaurioiden toteamiseen erytroblasteissa analysoimalla eläinten, yleensä jyrsijöiden, luuytimestä kerättyjä punasoluja ja/tai perifeerisiä verisoluja. Mikrotumatestin tarkoituksena on tunnistaa sellaisia sytogeneettisiä vaurioita aiheuttavat aineet, jotka johtavat hitaasti liikkuvia (lagging) kromosomifragmentteja tai kokonaisia kromosomeja sisältävien mikrotumien muodostumiseen. Kun luuytimen erytroblasti kehittyy polykromaattiseksi punasoluksi, päätuma irtoaa solusta, ja mahdollinen muodostunut mikrotuma saattaa jäädä muutoin tumattomaan solulimaan. Päätuman puuttuminen helpottaa mikrotumien havaitsemista näissä soluissa. Mikrotumaisten polykromaattisten punasolujen suurentunut esiintymistaajuus altistetuilla eläimillä on osoitus tutkittavan aineen aiheuttamasta kromosomivauriosta. Tässä testissä käytetään rutiinimaisesti jyrsijöiden luuydintä, sillä polykromaattiset punasolut muodostuvat luuytimessä. Mikrotumaiset epäkypsät (polykromaattiset) punasolut voidaan mitata yhtä hyvin perifeerisestä verestä miltä tahansa eläinlajilta, jonka perna ei kykene poistamaan mikrotumaisia punasoluja tai jonka on todettu olevan riittävän herkkä rakenteellisia tai numeerisia kromosomipoikkeavuuksia aiheuttavien aineiden osoittamiseen. Mikrotumien erottamisessa voidaan käyttää useita kriteerejä. Näitä ovat kinetokorin tai sentromeerisen DNA:n osoittaminen mikrotumissa tai puuttuminen niistä. Mikrotumaisten epäkypsien (polykromaattisten) punasolujen esiintymistaajuus on pääasiallinen tulos. Perifeerisen veren kypsien (normokromaattisten) punasolujen lukumäärää, jossa esiintyy mikrotumia tietyssä määrässä kypsiä punasoluja, voidaan myös käyttää analyysin tuloksena, kun eläimet saavat tutkittavaa ainetta jatkuvasti vähintään 4 viikon ajan. Tämä nisäkkäiden in vivo -mikrotumatesti soveltuu erityisesti mutageenisuuden vaaran arvioimiseen, sillä siinä voidaan ottaa huomioon tekijöitä, jotka liittyvät in vivo -metaboliaan, farmakokinetiikkaan ja DNA:n korjautumisprosesseihin, joskin näissä saattaa esiintyä eroja eri lajeilla, eri kudoksissa ja geneettisissä tuloksissa. In vivo -analyysi on hyödyllinen myös in vitro -koejärjestelmässä havaitun mutageenisen vaikutuksen jatkotutkimuksena. Jos on saatu viitteitä siitä, että testattava aine, tai sen reaktiivinen metaboliitti, ei pääse kohdekudokseen, tätä testiä ei pidä käyttää. Ks. myös Yleisjohdanto, osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄT Sentromeeri (kinetokori): Kromosomin alue (alueita), joihin sukkularihmat ovat kiinnittyneet solunjakautumisen aikana. Tähän perustuu tytärkromosomien järjestäytynyt siirtyminen tytärsolujen napoihin. Mikrotumat: Pieniä solun päätumasta erillisiä ja niiden rinnalla esiintyviä tumia, jotka muodostuvat mitoosin (meioosin) telofaasin aikana hitaasti liikkuvista (lagging) kromosomikappaleista tai kokonaisista kromosomeista. Normokromaattinen punasolu: Kypsä punasolu, josta puuttuvat ribosomit ja joka voidaan erottaa polykromaattisista punasolujen esiasteista ribosomiselektiivisillä väriaineilla. Polykromaattinen punasolu: Punasolun esiaste, kehityksen välivaiheessa oleva (epäkypsä) punasolu, jossa on edelleen ribosomeja ja joka voidaan tämän perusteella erottaa kypsistä, normokromaattisista punasoluista ribosomiselektiivisillä väriaineilla.
1.3 TESTIN PERIAATE Eläimet altistetaan tutkittavalle aineelle sopivaa antotapaa käyttäen. Jos käytetään luuydintä, eläimet lopetetaan sopivan ajan kuluttua altistuksesta, luuydin poistetaan ja preparaatit valmistetaan ja värjätään (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Käytettäessä perifeeristä verta verinäytteet otetaan sopivina ajankohtina altistuksen jälkeen, tehdään sivelyvalmisteet ja värjätään (4) (8) (9) (10). Perifeeristä verta käyttävissä tutkimuksissa viimeisen altistuksen ja solujen keräämisen välisen ajan tulisi olla mahdollisimman lyhyt. Preparaatit analysoidaan mikrotumien toteamiseksi.
1.4 TESTIN KUVAUS
1.4
1.4.1 Testin valmistelu
1.4.1
1.4.1.1 Eläinlajin valinta Luuydintä käytettäessä hiiret tai rotat ovat suositeltavia koe-eläimiä, mutta myös muita soveltuvia nisäkäslajeja voidaan käyttää. Perifeerisestä verestä tehtävissä tutkimuksissa koe-eläimiksi suositellaan hiiriä. Koe-eläimenä voidaan kuitenkin käyttää mitä tahansa sopivaa nisäkäslajia, jonka perna ei poista mikrotumaisia punasoluja tai jonka on osoitettu olevan riittävän herkkä rakenteellisia tai numeerisia poikkeavuuksia aiheuttavien aineiden toteamiseen. Koe-eläinten on oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä eläimiä. Tutkimuksen alkaessa eläinten painon vaihtelun on oltava minimaalista, enintään ± 20 % kummankin sukupuolen keskipainosta.
1.4.1.2 Asuinolot ja ruokinta Yleiset olosuhteet ovat samat kuin osan B Yleisjohdannossa mainitut, mutta kosteustavoitteen on oltava 50–60 %.
1.4.1.3 Eläimen valmistelu Terveet nuoret aikuiset eläimet jaetaan satunnaistetusti koe- ja kontrolliryhmiin. Eläimet tunnistetaan yksilöllisesti. Eläimiä sopeutetaan laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä.
1.4.1.4 Annosten valmistelu Kiinteät tutkittavat aineet liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja laimennetaan tarvittaessa ennen kuin niitä annetaan koe-eläimille. Nestemäiset tutkittavat aineet voidaan antaa suoraan tai laimentaa ennen antamista. Tutkittava aine on valmisteltava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä.
1.4.2 Koeolosuhteet
1.4.2
1.4.2.1 Liuotin/kantaja-aine Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käytetyillä annostasoilla, eikä sen käyttöön saa liittyä epäilyjä mahdollisista kemiallisista reaktioista tutkittavan aineen kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava niiden yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Ensisijaisesti on harkittava vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä, mikäli mahdollista.
1.4.2.2 Kontrollit Jokaiseen testiin on otettava mukaan kumpaakin sukupuolta olevat rinnakkaiset positiiviset ja negatiiviset (liuotin/kantaja-aine) kontrollit. Kontrolliryhmän eläimiä on käsiteltävä samalla tavoin kuin koeryhmän eläimiä, mutta niille ei anneta tutkittavaa ainetta. Positiivisten kontrollien tulisi aiheuttaa mikrotumia in vivo -altistustasoilla, joiden odotetaan aiheuttavan havaittavaa lisääntymistä taustaan verrattuna. Positiivisten kontrolliaineiden annokset on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti lukijalle koodattujen objektilasien identiteettiä. Positiivinen kontrolliaine voidaan antaa eri reittiä pitkin kuin tutkittava aine ja näytteet voidaan ottaa vain kerran. Lisäksi positiivisina kontrolleina tulisi käyttää samaan kemiallisten aineiden ryhmän kuuluvia aineita, mikäli mahdollista. Esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista: Aine CAS-nro EINECS-nro Etyylimetaanisulfonaatti 62-50-0 200-536-7 N-etyyli-N-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomysiini C 50-07-7 200-008-6 Syklofosfamidi Syklofosfamidimonohydraatti 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietyleenimelamiini 51-18-3 200-083-5 Negatiivisista kontrolleista, jotka ovat saaneet pelkkää liuotinta tai kantaja-ainetta ja joita muuten on käsitelty samalla tavoin kuin koeryhmiä, on otettava näytteet jokaisella näytteenottokerralla, paitsi jos aikaisemmat tutkimustulokset osoittavat, että eläinten väliset erot ja vaihtelut mikrotumia sisältävien solujen esiintymistaajuudessa ovat hyväksyttävällä tasolla. Jos negatiivisista kontrolleista otetaan vain yksi näyte, se tulisi ottaa ensimmäisellä näytteenottokerralla. Lisäksi on käytettävä käsittelemättömiä kontrolleja, paitsi jos aikaisemmat kontrolleista tehdyt tutkimukset ja julkaistut tulokset osoittavat, ettei valittu liuotin/kantaja-aine aiheuta haitallisia eikä mutageenisia vaikutuksia. Jos käytetään perifeeristä verta, rinnakkaiseksi negatiiviseksi kontrolliksi voidaan hyväksyä myös ennen altistusta otettu näyte, mutta vain lyhytaikaisissa perifeerisestä verestä tehtävissä testeissä (esim. 1-3 altistusta), mikäli saadut tulokset ovat aikaisempiin kontrollista saatuihin tutkimustuloksiin perustuvalla odotetulla alueella.
1.5 TESTIN SUORITTAMINEN
1.5
1.5.1 Eläinten lukumäärä ja sukupuoli Jokaisessa koe- ja kontrolliryhmässä on oltava vähintään 5 analysoitavissa olevaa eläintä kumpaakin sukupuolta (11). Vain toista sukupuolta voidaan käyttää, mikäli tutkimusajankohtana on käytettävissä samalla eläinlajilla ja samaa antoreittiä käyttämällä tehtyjä tutkimuksia, joiden tulokset osoittavat, ettei myrkkyvaikutuksessa ole huomattavia eroja sukupuolten välillä. Jos ihmisen altistuminen tutkittavalle kemialliselle aineelle voi olla sukupuolesta riippuvaa, kuten joidenkin lääkeaineiden kohdalla, testi on tehtävä asianomaista sukupuolta olevilla eläimillä.
1.5.2 Altistusohjelma Mitään standardia altistusohjelmaa (kuten 1, 2 tai useampia altistuksia 24 tunnin välein) ei voida suositella. Pitempien altistusohjelmien aikana kerätyt näytteet ovat hyväksyttäviä, mikäli positiivinen vaikutus on osoitettu tässä tutkimuksessa tai negatiivisessa tutkimuksessa on osoitettu myrkkyvaikutusta tai raja-annosta on käytetty ja annostelua on jatkettu näytteenoton ajankohtaan asti. Tutkittavat aineet voidaan antaa myös jaettuina annoksina, eli kaksi altistuskertaa samana päivänä muutaman tunnin välein, mikä helpottaa suurten ainemäärien antamista. Testi voidaan tehdä kahdella tavalla: Tarvittaessa voidaan näytteitä ottaa muinakin ajankohtina.
1.5.2 a)
Eläimet altistetaan tutkittavalle aineelle yhden kerran. Luuydinnäytteitä otetaan vähintään kaksi kertaa siten, että ensimmäinen näyte otetaan aikaisintaan 24 tunnin kuluttua altistuksesta ja viimeinen viimeistään 48 tunnin kuluttua altistuksesta ja näytteenottokertojen välillä on sopiva väli. Mikäli näytteitä otetaan aikaisemmin kuin 24 tunnin kuluttua, perustelut on esitettävä. Perifeerisestä verestä otetaan näytteitä vähintään kaksi kertaa siten, että ensimmäinen näyte otetaan aikaisintaan 36 tunnin kuluttua altistuksesta ja seuraavat sopivan ajan kuluttua siitä, kuitenkin viimeistään 72 tunnin kuluttua altistuksesta. Mikäli positiivinen vaste havaitaan yhden näytteenottokerran jälkeen, lisänäytteitä ei tarvita.
b)
Jos päivittäisiä altistuskertoja on 2 tai enemmän (esim. kaksi tai useampia altistuksia 24 tunnin välein), näytteet on kerättävä luuytimestä kerran 18-24 tunnin kuluttua viimeisestä altistuksesta ja perifeerisestä verestä kerran 36–48 tunnin kuluttua viimeisestä altistuksesta (12).
1.5.3 Annostasot Jos tehdään annoksenmääritystutkimus, koska soveltuvia tietoja ci ole käytettävissä, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen samaa lajia, samaa kantaa, samaa sukupuolta olevia eläimiä ja samaa altistusohjelmaa kuin päätutkimuksessa on tarkoitus käyttää (13). Mikäli myrkkyvaikutuksia esiintyy, ensimmäiseen näytteenottoajankohtaan asti käytetään kolmea annostasoa. Näistä suurimmalla annoksella on oltava maksimaalinen myrkkyvaikutus ja pienimmällä vähäinen tai ei lainkaan myrkkyvaikutusta. Myöhemmän näytteenottoajankohdan edellä voidaan käyttää vain suurinta annosta. Suurin annos määritellään annokseksi, joka aiheuttaa sen kaltaisia myrkyllisyysoireita, että samaa annosteluohjelmaa käytettäessä suurempien annosten voitaisiin odottaa johtavan kuolemaan. Aineet, joilla on spesifisiä biologisia vaikutuksia pieninä, myrkyttöminä annoksina (kuten hormonit ja mitogeenit) saattavat edellyttää toisenlaisia annoksenmäärityskriteerejä, ja niitä pitäisi arvioida tapauskohtaisesti. Suurin annos voidaan määritellä myös annokseksi, joka aiheuttaa joitakin myrkyllisyyteen viittaavia muutoksia luuytimessä (esim. punasolujen esiasteiden osuuden pieneneminen punasolujen kokonaismäärästä luuytimessä tai perifeerisessä veressä).
1.5.4 Raja-annostesti Ellei havaittavia myrkkyvaikutuksia esiinny testattaessa yhtä annostasoa, joka on vähintään 2000 mg/kg (eläimen painokiloa kohti) ja joka annetaan kerta-annoksena tai kahtena annoksena saman päivän aikana, ja ellei genotoksisuutta ole odotettavissa kemialliselta rakenteeltaan samanlaisilla aineilla saatujen tutkimustulosten perusteella, täydellinen tutkimus kolmella eri annostasolla ei ehkä ole välttämätön. Pitempään kestävissä tutkimuksissa raja-annos on 2000 mg painokiloa kohti vuorokaudessa, jos altistusta jatketaan enintään 14 vuorokautta, ja 1000 mg/kg/vrk, jos altistus kestää yli 14 vuorokautta. Ihmisten odotettu altistus saattaa edellyttää suurempien annostasojen käyttöä raja-annostestissä.
1.5.5 Antotapa Tutkittava aine annetaan yleensä ruokintaletkulla tai sopivalla intubaatiokanyylillä tai injektiona vatsaonteloon. Myös muut antotavat ovat mahdollisia, mikäli ne voidaan perustella. Koe-eläimen koosta riippuu, kuinka paljon nestettä voidaan antaa kerralla ruokintaletkun kautta tai injektiona. Määrä ei kuitenkaan saa olla yli 2 ml/100 g eläimen painon mukaan mitattuna. Mikäli käytetään suurempia nestemääriä, ne on perusteltava. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyttäviä aineita, joiden vaikutukset yleensä pahenevat suurempia pitoisuuksia käytettäessä, nestemäärien vaihtelu olisi pidettävä mahdollisimman pienenä säätämällä tutkittavan aineen pitoisuuksia siten, että kokonaisnestemäärä pysyy samana kaikilla annostasoilla.
1.5.6 Luuydin-/veripreparaatit Luuydinsolut kerätään yleensä reisiluista tai sääriluista heti koe-eläinten lopettamisen jälkeen. Solut otetaan reisi- tai sääriluista, niistä tehdään preparaatit ja ne värjätään vakiintuneilla värjäysmenetelmillä. Perifeerinen veri kerätään häntälaskimosta tai muusta sopivasta verisuonesta. Verisolut värjätään heti supravitaaliväreillä (8) (9) (10) tai niistä tehdään ensin sivelyvalmisteet ja värjätään sen jälkeen. DNA-spesifisten väriaineiden käyttö [esim. akridiinioranssi (14) tai Hoechst 33258 plus pyroniini-Y (15)] voi eliminoida joitakin ei-DNA-spesifisen väriaineen käyttöön liittyviä artefakteja. Tämä etu ei sulje pois tavanomaisten väriaineiden (esim. Giemsa) käyttöä. Myös muita järjestelmiä [esim. selluloosapylväitä tumallisten solujen poistamiseksi (16)] voidaan käyttää, mikäli nämä menetelmät on laboratoriossa osoitettu riittävän toimiviksi mikrotumapreparaattien valmistamisessa.
1.5.7 Analyysi Punasolujen esiasteiden osuus koko punasolumäärästä (esiasteet + kypsät punasolut) määritetään jokaisen eläimen osalta erikseen laskemalla yhteensä vähintään 200 punasolua luuytimestä ja 1000 punasolua perifeerisestä verestä (17). Kaikki objektilasit, myös ne, joilla on positiiviset ja negatiiviset kontrollit, on koodattava toisistaan riippumattomasti ennen mikroskooppitutkimusta. Vähintään 2000 punasolun esiastetta lasketaan eläintä kohti mikrotumaisten punasolujen esiasteiden esiintymistiheyden määrittämistä varten. Lisätietoja voidaan saada laskemalla mikrotumat kypsistä punasoluista. Objektilaseja analysoitaessa punasolujen esiasteiden osuuden punasolujen kokonaismäärästä tulisi olla vähintään 20 % kontrolliarvosta. Kun koe-eläimille annetaan tutkittavaa ainetta jatkuvasti 4 viikon ajan tai pitempään, voidaan laskea myös vähintään 2000 kypsää punasolua eläintä kohti mikrotumien esiintymistiheyden toteamiseksi. Automaattiset analyysijärjestelmät (kuva-analyysi ja solususpensioiden virtaussytometria) ovat hyväksyttäviä vaihtoehtoja manuaaliselle arvioinnille, mikäli ne perustellaan ja validoidaan asianmukaisesti.
2. TULOKSET
2.
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY Yksittäisten eläinten tulokset on esitettävä taulukkomuodossa. Kokeellinen yksikkö on eläin. Punasolujen esiasteiden laskettu määrä, mikrotumaisten punasolujen esiasteiden lukumäärä ja punasolujen esiasteiden osuus koko punasolumäärästä on lueteltava kunkin analysoidun eläimen osalta erikseen. Mikäli eläimille annetaan tutkittavaa ainetta jatkuvasti 4 viikon ajan tai pitempään, myös kypsien punasolujen tiedot on ilmoitettava, mikäli niitä on kerätty. Punasolujen esiasteiden osuus koko punasolumäärästä ja, jos katsotaan aiheelliseksi, mikrotumaisten punasolujen prosentuaalinen määrä ilmoitetaan jokaisen eläimen osalta. Ellei viitteitä sukupuolten välisistä vaste-eroista ole havaittavissa, molempien sukupuolten tiedot voidaan yhdistää tilastollista analyysiä tehtäessä.
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA Positiivisille tuloksille on useita kriteerejä, kuten mikrotumaisten solujen lukumäärän annoksesta riippuva suureneminen tai mikrotumaisten solujen lukumäärän selvä suureneminen yksittäisessä annosryhmässä yhdellä näytteenottokerralla. Tulosten biologinen merkitys on otettava ensisijaisesti huomioon. Tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testitulosten arvioinnissa (18) (19). Tilastollinen merkitsevyys ei saa olla ainoa määräävä tekijä positiivisen vasteen arvioinnissa. Epäselviä tuloksia on selkeytettävä jatkotestauksella, mieluiten muunnetuissa koeolosuhteissa. Testattava aine, jolla saadut tulokset eivät täytä edellä kuvattuja kriteerejä, katsotaan ei-mutageeniseksi tässä testissä. Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tuloksia, mutta joissakin harvinaisissa tapauksissa saatujen tietojen pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä tutkittavan aineen vaikutuksesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi kokeen toistokertojen määrästä riippumatta. Mikrotumatestissä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että tutkittava aine aiheuttaa mikrotumia, jotka ovat seurausta kromosomivauriosta tai mitoosilaitteen vauriosta testatun lajin punasoluissa. Negatiiviset tulokset osoittavat, ettei tutkittava aine aiheuta koeolosuhteissa mikrotumia testattujen lajien punasolujen esiasteissa. Tutkittavan aineen tai sen metaboliittien todennäköistä pääsyä yleiseen verenkiertoon tai erityisesti kohdekudokseen (esim. systeeminen toksisuus) on pohdittava.
3. RAPORTOINTI
3. TUTKIMUSSELOSTUS
Tutkimusselostuksen on sisällettävä seuraavat tiedot:
Liuotin/kantaja-aine:
kantaja-aineen valintaperusteet,
tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa, jos tiedossa.
Koe-eläimet:
käytetty eläinlaji/kanta,
eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,
hankintapaikka, asuinolosuhteet, ruokavalio jne.,
eläinten yksilöllinen paino testiä aloitettaessa, myös painon vaihteluväli, keskiarvo ja keskihajonta kussakin ryhmässä.
Koeolosuhteet:
positiivisia ja negatiivisia (kantaja-aine/liuotin) kontrolleja koskevat tiedot,
raja-annostutkimuksen tulokset, jos tehty,
annostasojen valintaperusteet,
tutkittavan aineen valmistelujen yksityiskohdat,
tutkittavan aineen antotavan yksityiskohdat,
antotavan valintaperusteet,
menetelmät, joilla on vahvistettu tutkittavan aineen pääsy yleiseen verenkiertoon tai kohdekudokseen, tarvittaessa,
ravintoon/juomaveteen sekoitetun tutkittavan aineen pitoisuuden (ppm) muuntaminen todelliseksi annokseksi (mg painokiloa kohti vuorokaudessa, mg/kg/vrk), tarvittaessa,
yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta,
yksityiskohtainen kuvaus altistus- ja näytteenotto-ohjelmasta,
objektilasien valmistusmenetelmät,
myrkkyvaikutuksen mittausmenetelmät,
mikrotumaisten punasolujen esiasteiden laskentakriteerit,
analysoitujen solujen lukumäärä eläintä kohti,
kriteerit, joiden perustella tutkimukset luokiteltiin positiivisiksi, negatiivisiksi tai epäselviksi.
Tulokset:
myrkkyvaikutuksen merkit,
punasolujen esiasteiden osuus punasolujen kokonaismäärästä,
mikrotumaisten punasolujen esiasteiden lukumäärä, ilmoitetaan erikseen jokaisesta eläimestä,
mikrotumaisten punasolujen esiasteiden keskiarvo ± keskihajonta ryhmää kohti,
annos-vastesuhde, mikäli mahdollista,
käytetyt tilastolliset analyysit ja menetelmät,
samanaikaiset ja aikaisemmat negatiivisilla kontrolleilla saadut tulokset,
rinnakkaisen positiivisen kontrollin tiedot.
Tulosten pohdinta.
Johtopäätökset.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
KIRJALLISUUTTA Heddle, J.A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, s. 187–190. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, s. 9–15. Heddle, J.A., Salamonc, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, s. 61–118. Mavournin, K. H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, s. 29–80. MacGregor, J.T., Schlegel, R., Choy, W.N. and Wehr, C.M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, s. 555–558. MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, s. 103–112. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R. and Shelby, M.E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, s. 513–522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, s. 245–249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS, Mutation Res., 278, s. 83–98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, s. 53–159. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. (1994), In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, s. 293–304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalized sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, s. 313–319. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, s. 313–319. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, s. 241–247. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, s. 269–275. Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, s. 91–104. Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, s. 97–99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, in: D.J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115–141. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D.J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 184–232.
B.13/14. MUTAGEENISUUS — TAKAISINMUTAATIOTESTI BAKTEEREILLA
B.13/14.
1. MENETELMÄ Tämä menetelmä on sama kuin OECD TG 471 Bacterial Reverse Mutation Test (1997).
1.
1.1 JOHDANTO Bakteereilla tehtävässä takaisinmutaatiotestissä käytetään Salmonella typhimurium- ja Escherichia coli -bakteereiden aminohappoja vaativia kantoja sellaisten pistemutaatioiden havaitsemiseksi, joihin liittyy DNA:n yhden tai useamman emäsparin korvautuminen, ylimäärä tai deleetio (1) (2) (3). Tämän bakteereilla tehtävän takaisinmutaatiotestin periaate on, että se paljastaa mutaatiot, jotka korjaavat testikannassa olevat mutaatiot ja palauttavat bakteerien toiminnallisen kyvyn syntetisoida essentiaalista aminohappoa. Revertantit bakteerit tunnistetaan siitä, että ne pystyvät kasvamaan, vaikka testibakteerikannan ennen takaisinmutaatiota tarvitsema aminohappo puuttuu. Pistemutaatiot aiheuttavat monia ihmisen geneettisiä sairauksia, ja on saatu vakuuttavia todisteita siitä, että somaattisten solujen onkogeeneissä ja kasvunrajoitegeeneissä olevat pistemutaatiot ovat osallisina ihmisten ja koe-eläinten kasvainten muodostumisessa. Bakteereilla tehtävä takaisinmutaatiotesti on nopea, edullinen ja suhteellisen helposti toteutettava testi. Monilla testikannoilla on useita ominaisuuksia, joiden ansiosta ne osoittavat herkästi mutaatiot. Näitä ovat esimerkiksi herkästi reagoivat DNA-jaksot takaisinmutaatiokohdissa, solujen lisääntynyt läpäisevyys suurille molekyyleille ja DNA:n korjausjärjestelmien eliminoituminen tai virheille alttiiden DNA:n korjausprosessien lisääntyminen. Testikantojen spesifisyys voi tuottaa hyödyllistä tietoa genotoksisten aineiden aiheuttamien mutaatioiden tyypistä. Käytettävissä on hyvin laaja tietokanta bakteerien takaisinmutaatiotestien tuloksista erittäin monissa rakenteissa, ja vakiintuneita menetelmiä on kehitetty fysikaalis-kemiallisilta ominaisuuksiltaan erilaisten kemiallisten aineiden, myös haihtuvien yhdisteiden, testaamista varten. Ks. myös yleisjohdanto, osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄT Takaisinmutaatiotesti joko Salmonella typhimurium- tai Escherichia coli -bakteereilla osoittaa aminohappoa vaativassa kannassa (edellisessä histidiini ja jälkimmäisessä tryptofaani) mutaation, jonka seurauksena syntyy ulkopuolisesta aminohapon saannista riippumaton kanta. Emäsparin korvautumista aiheuttavat mutageenit ovat aineita, jotka aiheuttavat emäksen vaihtumisen DNA:ssa. Takaisinmutaatiotestissä tämä vaihtuminen saattaa tapahtua alkuperäisen mutaation kohdassa tai jossakin muussa bakteerigenomin kohdassa. Lukukehyksensiirtomutageenit ovat aineita, jotka aiheuttavat yhden tai useamman emäsparin ylimäärän tai vajauksen DNA:ssa, mikä muuttaa lukukehystä (reading frame) RNA:ssa.
1.3 ALUSTAVAT VALMISTELUT Bakteereilla tehtävässä takaisinmutaatiotestissä käytetään prokaryoottisoluja, jotka poikkeavat nisäkässoluista soluunoton, metabolian, kromosomirakenteen ja DNA:n korjautumisprosessien suhteen. In vitro -testit vaativat yleensä eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää. In vitro -metaboliset aktivaatiojärjestelmät eivät pysty täysin jäljittelemään nisäkässolujen in vivo -olosuhteita. Testistä ei sen vuoksi voida suoraan päätellä aineen mutageenisuutta ja karsinogeenisuutta nisäkkäillä. Bakteereilla tehtävää takaisinmutaatiotestiä käytetään yleisesti genotoksisuuden, ja varsinkin pistemutaatioita aiheuttavan vaikutuksen, alustavana seulontamenetelmänä. Laaja tietokanta on osoittanut, että monilla kemiallisilla aineilla, joilla saadaan positiivinen tulos tässä tutkimuksessa, todetaan mutageenista vaikutusta myös muissa tutkimuksissa. On myös esimerkkejä mutageenisista aineista, joita ei voida todeta tällä testillä. Nämä epäonnistumiset voivat johtua todetun tulostapahtuman spesifisestä luonteesta, metabolisen aktivaation eroista tai aineen erilaisesta biologisesta hyödynnettävyydestä. Toisaalta takaisinmutaatiotestin herkkyyttä lisäävät tekijät voivat johtaa mutageenisen aktiivisuuden liialliseen stimulaatioon. Bakteereilla tehtävä takaisinmutaatiotesti ei välttämättä sovellu tiettyjen kemiallisten aineryhmien testaamiseen. Tällaisia ovat esimerkiksi voimakkaasti bakterisidiset yhdisteet (esim. tietyt antibiootit) ja aineet, joiden arvellaan (tai tiedetään) vaikuttavan erityisesti nisäkässolun kahdentumisjärjestelmään (esim. jotkut topoisomeraasin estäjät ja jotkut nukleosidianalogit). Nisäkkäillä tehtävät mutaatiotestit saattavat soveltua paremmin näihin tapauksiin. Vaikka monet tässä testissä positiivisen tuloksen antavat kemialliset aineet ovat karsinogeenisia nisäkkäillä, korrelaatio ei ole ehdoton. Se riippuu aineryhmän kemiallisista ominaisuuksista, eikä kaikkia karsinogeeneja voida todeta tällä testillä, koska ne vaikuttavat muiden, ei-genotoksisten mekanismien tai bakteerisoluista puuttuvien mekanismien välityksellä.
1.4 TESTIN PERIAATE Bakteerisolususpensiot altistetaan tutkittavalle aineelle eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa tai ilman sitä. Maljainkorporoitumismenetelmässä nämä suspensiot sekoitetaan overlay-agariin ja levitetään heti minimaalisen kasvualustan pinnalle. Preinkubaatiomenetelmässä tutkittavaa ainetta sisältävää seosta inkuboidaan, minkä jälkeen se sekoitetaan overlay-agariin ennen kuin se levitetään minimaalisen kasvualustan pinnalle. Molemmissa menetelmissä revertantit pesäkkeet lasketaan 2–3 päivän inkubaatioajan jälkeen ja niiden määrää verrataan spontaanien revertanttien pesäkkeiden määrään pelkkää liuotinta sisältävissä kontrollimaljoissa. Takaisinmutaatiotesti bakteereilla voidaan tehdä useilla eri menetelmillä. Yleisesti käytettyjä ovat maljainkorpo-roitumismenetelmä (1) (2) (3) (4), preinkubaatiomenetelmä (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluktuaatiomenetelmä (9) (10) ja suspensiomenetelmä (11). Kaasujen ja höyryjen testaamiseen käytettäviä muunnelmia on myös kuvattu (12). Tässä menetelmässä kuvataan pääasiassa maljainkorporoitumis- ja preinkubaatiomenetelmiä. Niillä molemmilla voidaan tehdä kokeita sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman sitä. Jotkut aineet voidaan havaita tehokkaammin preinkubaatiomenetelmällä. Nämä kuuluvat sellaisiin kemiallisten aineiden ryhmiin, joihin kuuluu lyhytketjuisia alifaattisia nitrosoamiineja, kaksiarvoisia metalleja, aldehydejä, atsovärejä ja diatsoyhdisteitä, pyrollitsidiinialkaloideja, allyyliyhdisteitä ja nitroyhdisteitä (3). On todettu myös, että tiettyjä mutageeniryhmiä ei pystytä aina toteamaan standardeilla menetelmillä, kuten maljainkorporoitumis- tai preinkubaatiomenetelmällä. Näitä on pidettävä erikoistapauksina, ja niiden toteamiseen tulisi ehdottomasti käyttää vaihtoehtoisia menetelmiä. Seuraavat erikoistapaukset on voitu tunnistaa (sekä esimerkkejä toimenpiteistä, joita voidaan käyttää niiden toteamisessa): atsovärit ja diatsoyhdisteet (3) (5) (6) (13), kaasut ja haihtuvat kemialliset aineet (12) (14) (15) (16) ja glykosidit (17) (18). Poikkeaminen standardista menetelmästä on perusteltava tieteellisesti.
1.5 TESTIN KUVAUS
1.5
1.5.1 Testin valmistelu
1.5.1
1.5.1.1 Bakteerit Tuoreita bakteeriviljelmiä on kasvatettava myöhäiseen eksponentiaaliseen tai varhaiseen stationääriseen kasvuaiheeseen (noin 109 solua/ml). Myöhäisessä stationäärivaiheessa olevia viljelmiä ei pidä käyttää. Oleellista on, että kokeessa käytettävät viljelmät sisältävät elinkykyisiä soluja suurina tittereinä. Titteri voidaan osoittaa joko aikaisemmissa kontrollitutkimuksissa saatujen kasvukäyrien perusteella tai määrittämällä jokaisessa analyysissä elinkykyisten solujen lukumäärät maljakokeella. Suositeltu inkubaatiolämpötila on 37 oC. On käytettävä vähintään viittä bakteerikantaa. Näihin tulee sisältyä neljä S. typhimurium -kantaa (TA 1535; TA 1537 tai TA97a tai TA97; TA98; ja TA100), joiden on osoitettu olevan luotettavia ja joilla on saatu toistettavissa oleva vaste eri laboratorioissa. Näissä neljässä S. typhimurium -kannassa on GC-emäsparit primaarisessa takaisinmutaatiokohdassa, ja tiedetään, että ne eivät ehkä paljasta tiettyjä hapettavia mutageeneja, ristisidoksia muodostavia aineita eivätkä hydratsiineja. Tällaiset aineet voidaan todeta E. coli WP2 -kannoilla tai S. typhimurium TA 102 -kannalla (19), joissa on AT-emäspari primaarisessa takaisinmutaatiokohdassa. Suositeltava kantojen yhdistelmä on tämän vuoksi: Ristisidoksia muodostavien mutageenien toteamiseksi mukaan tulisi ehkä käyttää TA102-kantaa tai käyttää lisäksi DNA:n korjautumiseen kykenevää E. coli -kantaa (esim. E. coli WP2 tai E. coli WP2 (pKM101)). Varastoviljelmien valmistuksessa, markkerien vahvistamisessa ja säilytyksessä on käytettävä vakiintuneita menetelmiä. Kasvuun vaadittavien aminohappojen tarve on osoitettava kunkin jäädytetyn varastoviljelmäpreparaatin osalta erikseen (S. typhimurium -kannoilla histidiini ja E. coli -kannoilla tryptofaani). Muut fenotyyppiset ominaisuudet on tarkistettava vastaavasti. Niitä ovat: R-tekijäplasmidien esiintyminen tai puuttuminen, mikäli sillä on merkitystä (ampisilliiniresistenssi kannoissa TA98, TA100 ja TA97a tai TA97, WP2 uvrA ja WP2 uvrA (pKM101) ja ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssi kannassa TA102); tyypillisten mutaatioiden esiintyminen (kristalliviolettiherkkyyden aiheuttama rfa-mutaatio S. typhimurium -bakteerissa ja ultraviolettivaloherkkyyden aiheuttama uvrA-mutaatio E. coli -bakteerissa tai uvrB-mutaatio S. typhimurium -bakteerissa) (2) (3). Kantojen tuottamien spontaanien revertanttien pesäkkeiden määrän tulisi myös olla laboratoriokohtaisten vertailuarvojen esiintymistiheysalueella ja mieluiten kirjallisuudessa raportoidulla alueella.
S. typhimurium TA 1535, ja
S. typhimurium TA 1537 tai TA97 tai TA97a, ja
S. typhimurium TA98, ja
S. typhimurium TA100, ja
E. coli WP2 uvrA tai E. coli WP2 uvrA (pKM101) tai S. typhimurium TA102.
1.5.1.2 Kasvatusväliaine Käytetään sopivaa minimaalista agaria (sisältää esim. Vogel-Bonner minimal medium E:tä ja glukoosia) ja overlay-agaria. joka sisältää histidiiniä ja biotiinia tai tryptofaania, jotta muutama solunjakautuminen voi tapahtua (1) (2) (9).
1.5.1.3 Metabolinen aktivaatio Bakteerit on altistettava tutkittavalle aineelle sekä sopivan metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman sitä. Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjestelmä on entsyymejä indusoivilla aineilla, kuten Aroclor 1254:11ä (1) (2) tai fenobarbitonin ja ß-naftoflavonin (18) (20) (21) yhdistelmällä, käsiteltyjen jyrsijöiden maksasta eristetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon on lisätty kofaktoria. Käytetty postmitokondriaalisen jakeen pitoisuus S9-seoksessa on yleensä 5–30 % v/v. Metabolisen aktivaatiojärjestelmän valinta tai sen pois jättäminen saattaa riippua siitä, millaiseen kemiallisten aineiden ryhmään tutkittava aine kuuluu. joissakin tapauksissa saattaa olla perusteltua käyttää useampia kuin yhtä postmitokondriaalisen jakeen pitoisuutta. Pelkistävä metabolinen aktivaatiojärjestelmä saattaa soveltua paremmin atsovärien ja diatsoyhdisteiden tutkimiseen (6) (13).
1.5.1.4 Tutkittava aine/valmistelu Kiinteät tutkittavat aineet liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja laimennetaan tarvittaessa ennen bakteerien altistamista. Nestemäiset tutkittavat aineet voidaan lisätä suoraan koejärjestelmään ja/tai laimentaa ennen käsittelyä. Tutkittava aine on valmisteltava juuri ennen altistusta, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla. Liuotin/kantaja-aine ei saa olla sellainen, että sen voidaan epäillä reagoivan kemiallisesti tutkittavan aineen kanssa, eikä se saa vaikutta solujen elinkykyyn eikä S9-aktiivisuuteen (22). Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden yhteensopivuuden osoittavat tutkimustulokset on esitettävä. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä tulisi harkita ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. Testattaessa aineita, jotka ovat epästabiileja vedessä, orgaanisten liuottimien tulisi olla vedettömiä.
1.5.2 Koeolosuhteet
1.5.2
1.5.2.1 Testikannat (ks. 1.5.1.1)
1.5.2.2 Altistuspitoisuus Tutkittavan aineen suurinta testattavaa pitoisuutta määritettäessä on otettava huomioon aineen sytotoksisuus ja liukoisuus altistuksessa käytettävään lopulliseen seokseen. Myrkkyvaikutus ja liukenemattomuus saattaa olla hyödyllistä määrittää alustavalla kokeella. Sytotoksisuus voidaan havaita revertanttien pesäkkeiden lukumäärän pienenemisestä, taustakasvuston kirkastumisesta tai vähenemisestä tai solujen eloonjäämisasteesta käsitellyissä viljelmissä. Aineen sytotoksisuus saattaa muuttua metabolisten aktivaatiojärjestelmien läsnäollessa. Liukenemattomuus on arvioitava lopullisen seoksen paljaalla silmällä havaittavan sakkautumisen perusteella todellisissa koeolosuhteissa. Liukoisten, ei-sytotoksisten aineiden suositeltu testattava maksimipitoisuus on 5 mg/malja tai 5 ul/malia. Testattaessa ei-sytotoksisia aineita, jotka eivät ole liukoisia pitoisuuksissa 5 mg/malja tai 5 μl/malja. yhden tai useamman testattavan pitoisuuden on oltava liukenemattomia lopullisessa altistusseoksessa. Jos tutkittava aine on sytotoksinen jo pienempinä pitoisuuksina kuin 5 mg/malja tai 5 μl/malja, se olisi testattava sytotoksiseen pitoisuuteen asti. Sakka ei saisi vaikuttaa laskentaan. Alustavassa kokeessa on käytettävä ainakin viittä erisuuruista tutkittavan aineen analysoitavissa olevaa pitoisuutta siten, että testauspisteiden välillä on noin puolen log:n (√10) väli. Pitoisuus-vastesuhdetta tutkittaessa voi olla syytä käyttää pienempiä välejä. Arvioitaessa aineita, jotka sisältävät huomattavia määriä mahdollisia mutageenisia epäpuhtauksia, voidaan harkita testaamista myös suuremmilla pitoisuuksilla kuin 5 mg/malja tai 5 μl/malja.
1.5.2.3 Negatiiviset ja positiiviset kontrollit Jokaisessa testissä on käytettävä myös kannan suhteen spesifisiä rinnakkaisia positiivisia ja negatiivisia (liuotin tai kantaja-aine) kontrolleja sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman sitä. Positiivisen kontrolliaineen pitoisuudet on valittava siten, että ne tuovat esiin kunkin testin tehokkuuden. Testeissä, joissa käytetään metabolista aktivaatiojärjestelmää, positiivinen (positiiviset) kontrolliaine(et) on valittava käytettävien bakteerikantojen tyypin perusteella. Seuraavassa on esimerkkejä sopivista positiivisista kontrolliaineista testeissä, joissa käytetään metabolista aktivaatiota: Aine CAS-nro EINECS-nro 9,10-dimetyyliantraseeni 781-43-1 212-308-4 7,12-dimetyylibents[a]antraseeni 57-97-6 200-359-5 bentso[a]pyreeni 50-32-8 200-028-5 2-aminoantraseeni 613-13-8 210-330-9 syklofosfamidi 50-18-0 syklofosfamidimonohydraatti 6055-19-2 200-015-4 Seuraava aine sopii positiiviseksi kontrollialueeksi pelkistävää metabolista aktivaatiota käytettäessä: Aine CAS-nro EINECS-nro Congo Red 573-58-0 209-358-4 2-aminoantraseenia ei pidä käyttää ainoana S9-seoksen tehon indikaattorina. Jos 2-aminoantraseenia käytetään, jokainen S9-erä on karakterisoitava myös mutageenilla, joka vaatii mikrosomaalisiin entsyymeihin perustuvaa metabolista aktivaatiota, esim. bentso[a]pyreenilla, dimetyylibentsantraseenilla. Seuraavat aineet ovat esimerkkejä kannan suhteen spesifisistä positiivisista kontrolleista, joita voidaan käyttää ilman eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää tehtävissä testeissä: Aine CAS-nro EINECS-nro Kanta natriumatsidi 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 ja TA 100 2-nitrofluoreeni 607-57-8 210-138-5 TA 98 9-aminoakridiini 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 ja TA 97a ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 ja TA 97a kumeenihydroperoksidi 80-15-9 201-254-7 TA 102 mitomysiini C 50-07-7 200-008-6 WP2uvrA ja TA 102 N-etyyli-N-nitro-N-nitrosoguanidiini 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2uvrA ja WP2uvrA(pKM101) 4-nitrokinoliini-l-oksidi 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2uvrA ja WP2uvrA(pKM101) furyylifuramidi (AF2) 3688-53-7 plasmidin sisältävät kannat Myös muita soveltuvia positiivisia kontrolleja voidaan käyttää. Samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvien positiivisten kontrollien käyttöä on harkittava, mikäli niitä on käytettävissä. Lisäksi on käytettävä pelkkää liuotinta tai kantaja-ainetta negatiivisina kontrolleina, jotka eivät sisällä tutkittavaa ainetta mutta joita muutoin käsitellään samalla tavoin. Lisäksi on käytettävä käsittelemättömiä kontrolleja, paitsi jos kontrolleista saadut aikaisemmat tutkimustulokset osoittavat, ettei valittu liuotin aiheuta haitallisia eikä mutageenisia vaikutuksia.
1.5.3 Testin suorittaminen Maljainkorporoitumismenetelmässä (1) (2) (3) (4), jossa ei käytetä metabolista aktivaatiota, 0,05 ml tai 0,1 ml tutkittavia liuoksia, 0,1 ml tuoretta bakteeriviljelmää (noin 108 elinkykyistä solua) ja 0,5 ml steriiliä puskuria sekoitetaan 2 ml:aan overlay-agaria. Metabolista aktivaatiojärjestelmää käytettäessä 0,5 ml metabolista aktivaatioseosta. jossa on riittävä määrä postmitokondriaalista jaetta (pitoisuus 5–30 % v/v metabolisessa aktivaatioseoksessa), sekoitetaan overlay-agariin (2,0 ml) yhdessä bakteerien ja tutkittavan aineen/tutkittavan liuoksen kanssa. Jokaisen koeputken sisältö sekoitetaan ja kaadetaan minimaalisen agarmaljan pinnalle. Overlay-agarin annetaan jähmettyä ennen inkubaatiota. Preinkubaatiomenetelmässä (2) (3) (5) (6) tutkittavaa ainetta/tutkittavaa liuosta esi-inkuboidaan testikannan (noin 108 elinkykyistä solua) ja steriilin puskurin tai metabolisen aktivaatiojärjestelmän (0,5 ml) kanssa yleensä vähintään 20 minuuttia 30–37 oC:ssa, ennen kuin se sekoitetaan overlay-agariin ja kaadetaan minimaalisen agarmaljan pinnalle. Yleensä 0,05 tai 0,1 ml tutkittavaa ainetta/tutkittavaa liuosta, 0,1 ml bakteereja ja 0,5 ml S9-seosta tai steriiliä puskuria sekoitetaan 2,0 ml:aan overlay-agaria. Koeputket tulisi ilmata preinkubaation aikana sekoittajaa käyttäen. Riittävän arvion tekemiseksi hajonnasta on käytettävä kolmea rinnakkaista maljaa kullakin annostasolla. Kaksoismaljauksen käyttö on mahdollista, mikäli se voidaan perustella tieteellisesti. Satunnainen maljan menetys ei välttämättä mitätöi analyysiä. Kaasumaisia tai haihtuvia aineita tulisi testata asianmukaisin menetelmin, esimerkiksi suljetuissa astioissa (12) (14) (15) (16).
1.5.4 Inkubaatio Kaikkia tiettyyn testiin kuuluvia maljoja on inkuboitava 37 oC:ssa 48–72 tunnin ajan. Inkubaatioajan jälkeen lasketaan revertanttien pesäkkeiden lukumäärä maljaa kohti.
2. TULOKSET
2.
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY Tulokset on ilmoitettava revertanttien pesäkkeiden lukumääränä maljaa kohti. Revertanttien pesäkkeiden määrä sekä negatiivisissa (liuotinainekontrolli ja käsittelemätön kontrolli, jos käytetty) että positiivisissa kontrollimaljoissa on myös ilmoitettava. Maljakohtaiset lukumäärät, revertanttien pesäkkeiden maljakohtaisten määrien keskiarvo ja keskihajonta on ilmoitettava tutkittavan aineen ja positiivisten ja negatiivisten (käsittelemättömät ja/tai liuotinaine) kontrollien osalta. Selvää positiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa. Epäselvät tulokset on selvitettävä jatkotestauksella mieluiten muunnelluissa koeolosuhteissa. Negatiiviset tulokset on vahvistettava tapauskohtaisesti. Ellei negatiivisten tulosten vahvistamista jossakin tapauksessa pidetä tarpeellisena, tämä päätös on perusteltava. Tutkimusparametrien muuttamista koeolosuhteiden monipuolistamiseksi on harkittava seurantatutkimuksia tehtäessä. Mahdollisia muutettavia tutkimusparametreja ovat pitoisuusvälit, altistusmenetelmä (maljainkorporoitumiskoe tai nesteen preinkubointi) ja metaboliset aktivaatiojärjestelmät.
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA Positiivisille tuloksille on useita kriteerejä, kuten pitoisuudesta riippuva revertanttien pesäkkeiden maljakohtaisen lukumäärän suureneminen koko testatulla annosalueella ja/tai toistettavissa oleva lisääntyminen yhdellä tai useammalla pitoisuustasolla vähintään yhdessä kannassa joko metabolista aktivaatiojärjestelmää käytettäessä tai ilman sitä (23). Tulosten biologinen merkitys on otettava ensisijaisesti huomioon. Tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testitulosten arvioinnissa (24). Tilastollinen merkitsevyys ei saa kuitenkaan olla ainoa määräävä tekijä positiivisen vasteen arvioinnissa. Tutkittava aine, jolla saadut tulokset eivät täytä edellä kuvattuja kriteerejä, katsotaan ei-mutageeniseksi tässä testissä. Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tuloksia, mutta joissakin harvinaisissa tapauksissa saatujen tietojen pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä tutkittavan aineen vaikutuksesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi kokeen toistokertojen määrästä riippumatta. Bakteereilla tehtävässä takaisinmutaatiotestissä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että tutkittava aine aiheuttaa pistemutaatioita emässubstituutioiden tai lukukehyksensiirtojen kautta joko Salmonella typhimurium- ja/tai Escherichia coli -bakteerien genomissa. Negatiiviset tulokset osoittavat, ettei testattava aine ole koeolosuhteissa mutageeninen testatulla lajilla.
3. RAPORTOINTI
3. TUTKIMUSSELOSTUS
Tutkimusselostuksen on sisällettävä seuraavat tiedot:
Liuotin/kantaja-aine:
kantaja-aineen valintaperusteet,
tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa, jos tiedossa.
Kannat:
käytetyt kannat,
solujen määrä viljelmää kohti,
kannan ominaisuudet.
Koeolosuhteet:
tutkittavan aineen määrä maljaa kohti (mg/malja tai μl/malja) sekä annoksen valinnan ja kutakin pitoisuutta kohti valittujen maljojen lukumäärän perustelut,
käytetty kasvatusväliaine,
metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus sekä hyväksymiskriteerit,
altistusmenettely.
Tulokset:
myrkkyvaikutuksen merkit,
sakkautumisen merkit,
maljakohtaiset määrät,
revertanttien pesäkkeiden määrä maljaa kohti ja keskihajonta,
annos-vastesuhde, mikäli mahdollista,
mahdolliset tilastolliset analyysit,
rinnakkaisista negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista kontrolleista saadut tulokset, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat,
aikaisemmat negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista kontrolleista saadut tutkimustulokset, myös vaihteluväli, keskiarvot ja keskihajonnat,
Tulosten pohdinta.
Johtopäätökset.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
KIRJALLISUUTTA Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, s. 347–364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, s. 173–215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, s. 217–233. Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, s. 69–240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, s. 91-96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Delecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C, Springer, Berlin-Heidelberg-New York, s. 273–285. Gatehouse, D. G., Rowland. I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part I Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, s. 13–61. Aeschacher, H. U., Wolleb. U. and Porchet, E. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, s. 167–77. Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, s. 33–42. Hubbard, S. A., Green, M. H. L, Gatehouse, D. and Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, s. 141–161. Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis With Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, s. 45–465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, s. 335–344. Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidinc-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, s. 33–47. Zeiger, E., Anderson. B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, s. 2–141. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, s. 249–258. Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames /Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, s. 421–441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, s. 3780–3782. Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, s. 4961–4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of .Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, s. 285–291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, s. 85–88. Elliot. B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternativcs to Aroclor 1254-induccd 89 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, s. 175–177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, s. 343–350. Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, s. 83–91. Mahon, G. A. T., Green, M. H. L, Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, s. 28–65.
B.15. MUTAGEENISUUSTESTAUS JA KARSINOGEENISTEN AINEIDEN SEULONTA GEENIMUTAATIOT — SACCHAROMYCES CEREVISIAE
B.15.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄT Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.3 VERTAILUAINEET Ei ole.
1.4 TESTIN PERIAATE Saccharomyces cerevisiae -hiivalla on joukko haploidisia ja diploidisia kantoja, joiden avulla voidaan mitata kemiallisten aineitten kykyä aiheuttaa geenimutaatioita ilman metabolista aktivaatiota tai metabolisen aktivaation jälkeen. Testeissä on käytetty haploidisten kantojen mutaatioita, esim. punaisen, adeniinia vaativan kannan (ade-1 ade-2) mutaatiota kaksinkertaisen määrän adeniinia vaativaksi valkoiseksi kannaksi, ja selektiivisiä koejärjestelyitä, kuten kanavnaiini- ja sykloheksimidiresistenssin induktiota. Laajimmin tutkitussa takaisinmutaatiojärjestelmässä käytetään haploidista XV 185-14C -kantaa, jolla on ochre-nonsense- mutaatiot ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 ja trp 5-48, joiden takaisinmutaatiota saavat aikaan sellaiset emäsvaihdoksia aiheuttavat mutageenit, jotka aiheuttavat paikkaspesifisiä mutaatioita tai ochre-suppressorimutaatioita. XV 185-14C -kannalla on myös his 1-7 -markkeri, missensemutaatio, jonka takaisinmutaatiota saavat aikaan lähinnä muissa kohdissa tapahtuvat mutaatiot, ja hom 3-10 -markkeri, jonka takaisinmutaatiota saavat aikaan lukuraamiinsiirtomutageenit. Diploidisista S. cerevisiae -kannoista ainoa laajassa käytössä oleva on D7, joka on homotsygoottinen geenin ilv 1-92 suhteen.
1.5 LAATUKRITEERIT Ei ole.
1.6 TESTIN KUVAUS
1.6 Testin valmistelu
Tutkittavat aineet ja kontrolliaineet tulee sekoittaa soveltuvaan kantaja-aineeseen juuri ennen testiä. Veteen liukenemattomia orgaanisia yhdisteitä tutkittaessa saa orgaanisen liuottimen, kuten etanolin, asetonin tai dimetyylisulfoksidin (UMSO) loppupitoisuus olla korkeintaan 2 tilavuus- %. Kantaja-aineen loppupitoisuus ei saa merkitsevästi vaikuttaa solujen elinkykyyn ja kasvuominaisuuksiin.
Metabo1inen aktivaatio
Solut on altistettava tutkittaville aineille sekä ilman eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää että soveltuvan eksogeenisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjestelmä on entsyymejä indusoivilla aineilla käsiteltyjen jyrsijöiden maksoista eristetty postmitokondriaalinen jae, johon on lisätty kofaktoreita. Myös muista lajeista, muista kudoksista tai muista postmitokondriaalisista jakeista peräisin olevat valmisteet tai muut menetelmät saattavat soveltua metaboliseen aktivaatioon.
Koeolosuhteet
Testikannat
Geenimutaatiotutkimuksissa yleisimmin käytetyt kannat ovat haploidinen XV 185-14C -kanta ja diploidinen D7-kanta. Myös muut kannat saattavat soveltua tarkoitukseen.
Kasvatusalustat
Hiivojen kuolleisuuden määrittämiseen ja mutanttien määrien laskemiseen käytetään soveltuvia kasvatusalustoja.
Negatiiviset ja positiiviset kontrollit
Testissä on käytettävä rinnakkaisia altistamattomia, testattavan aineen liuottimelle altistettuja ja positiivisia kontrolliviljelmiä. Kunkin tutkittavan mutaation kohdalla on käytettävä soveltuvia positiivisia kontrolliaineita.
Altistuspitoisuudet
Tutkittava aine on testattava vähintään viitenä eri pitoisuutena, joiden keskinäiset erot ovat sopivat. Myrkyllisillä aineilla korkein testattu pitoisuus ei saa aiheuttaa yli 5-10 %.m kuolleisuutta. Huonosti veteen liukenevilla aineilla liukoisuus määrää korkeimman tutkittavan pitoisuuden. Vesiliukoisten myrkyttömien aineiden korkein tutkittava pitoisuus on päätettävä tapauskohtaisesti.
Inkubaatio-olosuhteet
Maljoja inkuboidaan pimeässä 28–30 oC:n lämpötilassa 4–7 vrk:n ajan.
Spontaanimutaatioiden frekvenssi
Testissä on käytettävä jatkoviljelmiä, joiden spontaanimutaatioiden frekvenssi on normaalina pidettävällä tasolla.
Toistojen lukumäärä
Kussakin pitoisuudessa maljat tehdään ainakin kolmena kappaleena geenimutaation tuottamien prototrofien määrän laskemista ja solujen kuolleisuuden määrittämistä varten. Kokeissa, joissa käytetään alhaisen mutaatiofrekvenssin omaavia markkereita, kuten hom 3–10, rinnakkaisten maljojen määrää on lisättävä tilastollisesti käyttökelpoisten tulosten saamiseksi.
Testin suorittaminen
S.cerevisiae -solujen altistus suoritetaan tavallisesti nesteessä stationäärivaiheessa olevilla tai kasvavilla soluilla. Ensimmäinen koe on tehtävä kasvavilla soluilla, siten että 1-5 x 107 solua/ml altistetaan tutkittavalle aineelle ja seosta ravistellaan 18 tunnin ajan 28–37 oC:ssa; altistuksen aikana seokseen lisätään sopiva määrä metabolista aktivaatioseosta, tarpeen mukaan. Altistuksen jälkeen solut sentrifugoidaan, huuhdotaan ja kylvetään sopivalle kasvatusalustalle. Inkubaation jälkeen maljoilta lasketaan solujen kuolleisuus ja tapahtuneet geenimutaatiot. Jos ensimmäisen kokeen tulos on negatiivinen, tehdään toinen koe stationäärivaiheessa olevilla soluilla. Jos ensimmäisen kokeen tulos on positiivinen, tulos varmistetaan soveltuvalla erillisellä kokeella.
2. TULOKSET Tulokset on esitettävä taulukkoina siten, että niistä käyvät ilmi pesäkkeiden lukumäärä, mutanttien lukumäärä, kuolleisuus ja mutaatiofrekvenssi. Kaikki tulokset on varmistettava erillisellä kokeella. Tulosten merkitsevyys on arvioitava soveltuvin tilastollisin menetelmin.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot:
käytetty kanta,
koeolosuhteet: stationäärivaiheessa olevien tai kasvavien solujen käyttö, kasvatusalustojen koostumus, inkubaatiolämpötila ja inkubaatioaika, metabolinen aktivaatiojärjestelmä,
altistusolosuhteet: altistuspitoisuudet, altistusmenetelmä ja altistuksen kesto, altistuslämpötila, positiiviset ja negatiiviset kontrollit,
pesäkkeiden lukumäärä, mutanttien lukumäärä, kuolleisuus, mutaatiofrekvenssi, annos/vastesuhde mikäli mahdollista, tulosten tilastollinen käsittely,
tulosten pohdinta,
tulosten tulkinta.
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA Ks. Yleisjohdanto, osa B.
4. LÄHDELUETTELO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
B.16. MITOOTTINEN REKOMBINAATIO — SACCHAROMYCES CEREVISIAE
B.16.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄT Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.3 VERTAILUAINEET Ei ole.
1.4 TESTIN PERIAATE Saccharomyces cerevisiae -hiivalla esiintyy mitoottista rekombinaatiota sekä geenien välillä (tai yleisemmin ottaen geenin ja sentromeerin välillä) että geenien sisällä. Ensin mainittu ilmiö on nimeltään mitoottinen tekijäinvaihto ja siinä kaksi sisarkromatidia vaihtaa keskenään osia. Jälkimmäinen ilmiö on yleensä yksisuuntainen ja nimeltään geenikonversio. Tekijäinvaihtotutkimukset perustuvat yleensä heterotsygoottiseen kantaan ilmaantuvien resessiivisten homotsygoottisten pesäkkeiden tai maljasektoreiden laskentaan, kun taas geenikonversioiden tutkiminen perustuu prototrofisten revertanttien laskentaan auksotrofisilla heteroalleelisilla kannoilla, joilla on kaksi erilaista viallista alleelia samasta geenistä. Yleisimmin mitoottisen geenikonversion tutkimiseen käytettyjä kantoja ovat D4 (heteroalleelinen ade 2 ja trp 5 -lokusten suhteen), D7 (heteroalleelinen trp 5 -lokuksen suhteen), BZ34 (heteroalleelinen arg 4 -lokuksen suhteen) ja JD1 (heteroalleelinen his 4 ja trp 5 -lokusten suhteen). Mitoottista tekijäinvaihtoa voidaan testata kannoilla D5 ja D7 (jälkimmäisellä voidaan havainnoida myös mitoottista geenikonversiota ja takaisinmutaatiota ilv 1-92 -lokuksessa), jotka kummatkin ovat heteroalleelisia ade 2 -lokuksen komplementtigeenien suhteen ja joissa mitoottinen tekijäinvaihdos ilmenee maljoilla punaisina tai vaaleanpunaisina homotsygoottisina sektoreina.
1.5 LAATUKRITEERIT Ei ole.
1.6 TESTIN KUVAUS
1.6 Testin valmistelu
Tutkittavat aineet sekä kontrolli- tai vertailuyhdisteet on sekoitettava soveltuvaan kantaja-aineeseen juuri ennen testiä. Veteen liukenemattomia orgaanisia yhdisteitä tutkittaessa saa orgaanisen liuottimen, kuten etanolin, asetonin tai dimetyylisulfoksidin (DMSO) loppupitoisuus olla korkeintaan 2 tilavuus- %. Kantaja-aineen loppupitoisuus ei saa merkitsevästi vaikuttaa solujen elinkykyyn ja kasvuominaisuuksiin.
Metabolinen aktivaatio
Solut on altistettava tutkittaville aineille sekä ilman eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää että soveltuvan eksogeenisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjestelmä on entsyymejä indusoivilla aineilla käsiteltyjen jyrsijöiden maksoista eristetty postmitokondriaalinen jae, johon on lisätty kofaktoreita. Myös muista lajeista, muista kudoksista tai muista postmitokondriallisista jakeista peräisin olevat valmisteet tai muut menetelmät saattavat soveltua metaboliseen aktivaatioon.
Koeolosuhteet
Testikannat
Yleisimmin käytettyjä ovat diploidiset kannat D4, D5, D7 ja JD1. Myös muut kannat saattavat soveltua tarkoitukseen.
Kasvatusalustat
Hiivojen kuolleisuuden ja mitoottisen rekombinaatiofrekvenssin määrittämiseen käytetään soveltuvia kasvatusalustoja.
Negatiiviset ja positiiviset kontrollit
Testissä on käytettävä rinnakkaisia altistamattomia, testattavan aineen liuottimelle altistettuja ja positiivisia kontrolliviljelmiä. Kunkin tutkittavan rekombinaation kohdalla on käytettävä soveltuvia positiivisia kontrolliaineita.
Altistuspitoisuudet
Tutkittava aine on testattava vähintään viitenä eri pitoisuutena, joiden keskinäiset erot ovat sopivat. Huomioon otettavia seikkoja ovat mm. aineen sytomyrkyllisyys ja liukoisuus. Alin pitoisuus ei saa lainkaan lisätä solujen kuolleisuutta. Myrkyllisillä aineilla korkein testattu pitoisuus ei saa aiheuttaa yli 5–10 %:n kuolleisuutta. Huonosti veteen liukenevilla aineilla liukoisuus määrää korkeimman tutkittavan pitoisuuden. Vesiliukoisten myrkyttömien aineiden korkein tutkittava pitoisuus on päätettävä tapauskohtaisesti. Solut voidaan altistaa tutkittavalle aineelle joko stationäärivaiheessa tai kasvuvaiheessa, ja pisin altistusaika voi olla 18 tuntia. Pitkässä altistuksessa viljelmiä on kuitenkin seurattava mikroskoopilla mahdollisen itiönmuodostuksen varalta, sillä itiönmuodostus pilaa testin.
Inkubaatio-olosuhteet
Maljoja inkuboidaan pimeässä 28–30 oC:n lämpötilassa 4–7 vrk:n ajan. Maljoja, joilta tutkitaan mitoottisen tekijäinvaihdoksen aikaansaamat punaiset ja vaaleanpunaiset homotsygoottiset sektorit, on inkuboinnin jälkeen säilytettävä jääkaapissa (noin 4 oC:ssa) yhdestä kahteen vuorokautta ennen laskemista, jotta pesäkkeiden väri ehtii kehittyä.
Spontaaninen mitoottinen rekombinaatiofrekvenssi
Testissä on käytettävä jatkoviljelmiä, joiden spontaaninen mitoottinen rekombinaatiofrekvenssi on normaalina pidettävällä tasolla.
Toistojen lukumäärä
Kussakin pitoisuudessa maljat tehdään ainakin kolmena kappaleena mitoottisen geenikonversion tuottamien prototrofien määrän laskemista ja solujen kuolleisuuden määrittämistä varten. Kokeissa, joissa lasketaan mitoottisen tekijäinvaihdon aikaansaamia resessiivisiä homotsygootteja, rinnakkaisten maljojen määrää on lisättävä riittävän pesäkemäärän saamiseksi.
Testin suorittaminen
S.cerevisiae -solujen altistus suoritetaan tavallisesti nesteessä stationäärivaiheessa olevilla tai kasvavilla soluilla. Ensimmäinen koe on tehtävä kasvavilla soluilla, siten että 1-5 x 107 solua/ml altistetaan tutkittavalle aineelle ja seosta ravistellaan 18 tunnin ajan 28–37 oC:ssa; altistuksen aikana seokseen lisätään sopiva määrä metabolista aktivaatioseosta, mikäli tarpeellista. Altistuksen jälkeen solut sentrifugoidaan, huuhdotaan ja kylvetään sopivalle kasvatusalustalle. Inkubaation jälkeen maljoilta lasketaan solujen kuolleisuus ja tapahtuneet mitoottiset rekombinaatiot. Jos ensimmäisen kokeen tulos on negatiivinen, tehdään toinen koe stationäärivaiheessa olevilla soluilla. Jos ensimmäisen kokeen tulos on positiivinen, tulos varmistetaan erillisellä kokeella.
2. TULOKSET Tulokset on esitettävä taulukkoina siten, että niistä käyvät ilmi pesäkkeiden lukumäärä, rekombinanttien lukumäärä, kuolleisuus ja rekombinaatiofrekvenssi. Tulokset on varmistettava erillisellä kokeella. Tulosten merkitsevyys on arvioitava soveltuvin tilastollisin menetelmin.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot:
käytetty kanta,
koeolosuhteet: stationäärivaiheessa olevien tai kasvavien solujen käyttö, kasvatusalustojen koostumus, inkubaatiolämpötila ja inkubaatioaika, aineenvaihdunnallinen aktivaatiojärjestelmä,
altistusolosuhteet: altistuspitoisuudet, altistusmenetelmä ja altistuksen kesto, altistuslämpötila, positiiviset ja negatiiviset kontrollit,
pesäkkeiden lukumäärä, rekombinanttien lukumäärä, kuolleisuus, rekombinaatiofrekvenssi, annos/vastesuhde mikäli mahdollista, tulosten tilastollinen käsittely,
tulosten pohdinta,
tulosten tulkinta,
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA Ks. Yleisjohdanto, osa B.
4. LÄHDELUETTELO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
B.17. MUTAGEENISUUS — GEENIMUTAATIOTESTI NISÄKÄSSOLUILLA IN VITRO
B.17.
1. MENETELMÄ Tämä menetelmä on sama kuin OECD TG 476, In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997).
1.
1.1 JOHDANTO Nisäkässoluviljelmissä tehtävää in vitro -geenimutaatiotestiä voidaan käyttää kemiallisten aineiden aiheuttamien geenimutaatioiden toteamiseen. Sopivia solulinjoja ovat hiiren lymfoomasolulinja L5178Y, kiinanhamsterin solulinjat CHO, CHO-AS52 ja V79 ja ihmisen lymfoblastoidisolulinja TK6 (1). Näissä solulinjoissa yleisimmin käytetyt geneettiset tulostapahtumat mittaavat tymidiinikinaasi- (TK) ja hypoksantiini-guaniinifosforibosyyli-transferaasilokusten (HPRT) mutaatioita ja ksantiiniguaniinifosforibosyylitransferaasin (XPRT) transgeeniä. TK-, HPRT- ja XPRT-mutaatiotesteillä voidaan havaita erilaisia geneettisiä tapahtumia. Koska TK ja XPRT sijaitsevat autosomissa, niiden avulla voidaan ehkä havaita sellaisia geneettisiä tapahtumia (esim. suuria deleetioita), joita ei voida havaita X-kromosomicn HPRT-lokuksessa (2) (3) (4) (5) (6). Nisäkässoluilla tehtävissä in vitro -geenimutaatiotesteissä voidaan käyttää pysyvien solulinjojen tai solukantojen viljelmiä. Solujen valintakriteereinä käytetään niiden kykyä kasvaa viljelmässä ja niiden spontaanimutaatiotaajuuden stabiliteettia. In vitro tehtävät testit vaativat yleensä eksogeenista metabolista aktivaatiota. Tällainen metabolinen aktivaatiojärjestelmä ei pysty täysin jäljittelemään in vivo -olosuhteita nisäkkäissä. On pyrittävä välttämään erityisesti sellaisia olosuhteita, joissa saatavat positiiviset tulokset eivät heijasta aineen luontaista mutageenisuutta ja saattavat johtua pH:n muutoksista, osmolaliteetista tai voimakkaasta sytotoksisuudesta (7). Tätä testiä käytetään nisäkkäiden mahdollisten mutageenien ja karsinogeenien seulontaan. Monet yhdisteet, joilla saadaan positiivinen tulos tässä testissä, ovat nisäkkäiden karsinogeeneja. Tämän testin ja karsinogeenisuuden välillä ei kuitenkaan ole täydellistä korrelaatiota. Korrelaatio riippuu aineryhmän kemiallisista ominaisuuksista, ja yhä useammat tutkimustulokset viittaavat siihen, että on olemassa karsinogeeneja, joita ei voida havaita tällä testillä, koska ne näyttävät vaikuttavan muiden, ei-genotoksisten mekanismien tai bakteerisoluista puuttuvien mekanismien välityksellä (6). Ks. myös Yleinen johdanto Osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄT Forward-mutaatio: geenin mutaatio parentaalisesta tyypistä mutanttimuotoon, minkä seurauksena geenin koodittama valkuaisaine menettää entsymaattisen aktiivisuutensa tai sen entsyymiaktiivisuus muuttuu. Emäsparien korvautumista aiheuttavat mutageenit: aineita, jotka aiheuttavat yhden tai useamman emäsparin substituution DNA:ssa. Lukukehyksensiirtomutageenit: aineita, jotka aiheuttavat yhden tai useamman emäsparin ylimäärän tai vajauksen DNA-molekyylissä. Fenotyypin ilmentymisaika: ajanjakso, jonka aikana muuttumattomat geenituotteet poistuvat hiljattain mutatoituneista soluista. Mutaatiotaajuus: todettu mutanttien solujen lukumäärä jaettuna elinkykyisten solujen määrällä. Suhteellinen kokonaiskasvu: solumäärän suureneminen tietyssä ajassa verrattuna kontrollina käytettävään solupopulaatioon; lasketaan tulona, joka saadaan kertomalla keskenään suspensiokasvu suhteessa negatiiviseen kontrolliin ja kloonaustehokkuus suhteessa negatiiviseen kontrolliin. Suhteellinen suspensiokasvu: solujen lukumäärän suureneminen ilmentymisajan kuluessa verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Elinkykyisyys: tutkittavalle aineelle altistettujen solujen kloonaustehokkuus maljausajankohtana selektiivisissä olosuhteissa ilmentymisajan jälkeen. Eloonjääneisyys: tutkittavalle aineelle altistettujen solujen kloonaustehokkuus maljattaessa altistusjakson lopussa; eloonjääneisyys ilmoitetaan yleensä suhteessa kontrollina käytetyn solupopulaation eloonjääneisyyteen.
1.3 TESTIN PERIAATE Solut, joista TK+/- → TK-/- -mutaation seurauksena puuttuu tymidiinikinaasi (TK), ovat resistenttejä pyrimidiinianalogitrifluorotymidiinin (TFT) sytotoksisille vaikutuksille. Tymidiinikinaasin läsnä ollessa solut ovat herkkiä TFT:lle, joka estää solun aineenvaihduntaa ja pysäyttää solunjakautumisen. Mutantit solut kykenevät siis lisääntymään TFT:n läsnä ollessa, kun taas normaalit, tymidiinikinaasia sisältävät, solut eivät kykene. Vastaavasti solut, joista puuttuu HPRT- tai XPRT-entsyymi, ovat resistenttejä 6-tioguaniinille (TG) tai 8-atsaguaniinille (AG). Tutkittavan aineen ominaisuuksiin on kiinnitettävä erityistä huomiota, jos selektiivisen aineen emäsanalogia tai sille kemiallisesti sukua olevaa ainetta testataan millä tahansa nisäkässoluissa tehtävällä geenimutaatiotestillä. Esimerkiksi tutkittavan aineen mahdollinen epäilty selektiivinen myrkkyvaikutus mutantteihin ja ei-mutantteihin soluihin on selvitettävä. Selektiivisen järjestelmän/aineen toimintakyky on sen vuoksi vahvistettava testattaessa kemiallisia aineita, jotka ovat rakenteeltaan selektiivisen aineen kaltaisia (8). Suspensiossa tai yksikerrosviljelmässä olevat solut altistetaan sopivaksi ajaksi testattavalle aineelle sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä ja jatkoviljellään sytotoksisuuden toteamiseksi ja fenotyypin ilmentymisen aikaansaamiseksi ennen mutanttien selektiota (9) (10) (11) (12) (13). Sytotoksisuus määritetään yleensä mittaamalla viljelmien suhteellinen kloonaustehokkuus (eloonjääneisyys) tai suhteellinen kokonaiskasvu altistusjakson jälkeen. Altistettuja viljelmiä pidetään kasvatusväliaineessa riittävän pitkä aika, joka on jokaiselle valitulle lokukselle ja solutyypille ominainen, jotta aikaansaatujen mutanttien fenotyypin ilmentyminen olisi lähellä optimaalista. Mutaatiotaajuus lasketaan siten, että tunnettu lukumäärä soluja kylvetään toisaalta mutanttien toteamiseksi selektiivistä ainetta sisältävälle alustalle, toisaalta kloonaustehokkuuden (elinkykyisyyden) määrittämiseksi alustalle, joka ei sisällä selektiivistä ainetta. Sopivan inkubaatioajan kuluttua lasketaan pesäkkeet. Mutaatiotaajuus lasketaan selektiivisellä alustalla todettujen mutanttipesäkkeiden lukumäärän ja ei-selektiivisellä alustalla todettujen pesäkkeiden lukumäärän perusteella.
1.4 MENETELMÄN KUVAUS
1.4
1.4.1 Testin valmistelu
1.4.1
1.4.1.1 Solut Tässä testissä voidaan käyttää useita eri solutyyppejä, kuten L5178Y-, CHO-, CHO-AS52-, V79- tai TK6-solulinjojen subklooneja. Tässä testissä on käytettävä solutyyppejä, joiden on osoitettu olevan herkkiä kemiallisille mutageeneille ja joilla on hyvä kloonaustehokkuus ja stabiili spontaanimutaatiotaajuus. Solujen mahdollinen mykoplasmakontaminaatio on tutkittava. Kontaminoituneita soluja ei saa käyttää. Testi on suunniteltava siten, että sillä on tietty herkkyys ja teho. Solujen lukumäärän, viljelmien ja käytettyjen tutkittavan aineen pitoisuuksien tulee olla näiden määriteltyjen parametrien mukaisia (14). Altistuksen jälkeen elossa olevien ja kussakin testivaiheessa käytettävien elinkykyisten solujen vähimmäismäärän tulee perustua spontaanimutaatiotaajuuteen. Yleisohje on. että solujen lukumäärän on oltava vähintään kymmenen kertaa spontaanimutaatiotaajuuden käänteisluvun suuruinen, vähimmäismääräksi suositellaan kuitenkin 106 solua. Käytetystä solujärjestelmästä on oltava riittävästi aikaisempaa tutkimustietoa, joka osoittaa, että testillä saadaan pysyvästi päteviä tuloksia.
1.4.1.2 Kasvatusväliaineet ja viljelyolosuhteet Testissä on käytettävä soveltuvia kasvatusväliaineita ja inkubaatio-olosuhteita (kasvatusastiat, lämpötila, CO2-pitoisuus ja kosteus). Kasvatusväliaineet on valittava käytettävän selektiojärjestelmän ja solutyypin mukaan. On erityisen tärkeää valita viljelyolosuhteet, jotka takaavat optimaalisen solukasvun ilmentymisaikana ja sekä mutanttien että ei-mutanttien solujen optimaalisen pesäkkeenmuodostuskyvyn.
1.4.1.3 Viljelmien valmistelu Solut kasvatetaan varastoviljelmistä, kylvetään kasvatusväliaineeseen ja inkuboidaan 37 oC:ssa. Viljelmät on ehkä puhdistettava aikaisemmista mutanteista soluista, ennen kuin niitä käytetään tässä testissä.
1.4.1.4 Metabolinen aktivaatio Solut on altistettava tutkittavalle aineelle sekä sopivan metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä. Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjestelmä on entsyymejä indusoivilla aineilla, kuten Aroclor 1254:llä (15) (16) (17) (18) tai fenobarbitonin ja ß-naftoflavonin (19) (20) yhdistelmällä, käsiteltyjen jyrsijöiden maksasta eristetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon on lisätty kofaktoria. Postmitokondriaalisen jakeen yleisesti käytetty pitoisuusalue lopullisessa kasvatusväliaineessa on 1–10 % v/v. Metabolisen aktivaatiojärjestelmän valinta tai sen pois jättäminen saattaa riippua siitä, mihin kemiallisten aineiden ryhmään tutkittava aine kuuluu. Joissakin tapauksissa saattaa olla perusteltua käyttää useampaa kuin yhtä postmitokondriaalisen jakeen pitoisuutta. Monilla uusilla menetelmillä, kuten yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotetuilla solulinjoilla, jotka ilmentävät spesifisiä aktivaatioentsyymejä, saattaa olla endogeenista aktivaatiovaikutusta. Käytettyjen solulinjojen valinnan on oltava tieteellisesti perusteltua (esim. sytokromi P450 -isoentsyymin merkitys tutkittavan aineen metabolialle).
1.4.1.5 Tulkittava aine/valmistelu Kiinteät tutkittavat aineet liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja laimennetaan tarvittaessa ennen solujen käsittelyä. Nestemäiset tutkittavat aineet voidaan lisätä suoraan koejärjestelmiin ja/tai laimentaa ennen solujen käsittelyä. Tutkittava aine on valmisteltava juuri ennen altistusta, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla.
1.4.2 Koeolosuhteet
1.4.2
1.4.2.1 Liuotin/kantaja-aine Liuotin/kantaja-aine ei saa olla sellainen, että sen voidaan epäillä reagoivan kemiallisesti tutkittavan aineen kanssa, eikä se saa vaikuttaa solujen elinkykyyn eikä S9-aktiivisuuteen. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. Testattaessa aineita, jotka ovat epästabiileja vedessä, orgaanisten liuottimien tulisi olla vedettömiä. Vesi voidaan poistaa lisäämällä molekyylisiivilä.
1.4.2.2 Altistuspitoisuudet Huomioon otettavia kriteerejä suurinta pitoisuutta määritettäessä ovat sytotoksisuus, liukoisuus testijärjestelmään ja pH:n tai osmolaliteetin muutokset. Sytotoksisuus on määritettävä pääasiallisessa kokeessa sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä käyttäen asianmukaisia solujen eheyden ja solukasvun indikaattoreita, kuten suhteellista kloonaustehokkuutta (eloonjääneisyyttä) tai suhteellista kokonaiskasvua. Sytotoksisuus ja liukoisuus saattaa olla hyödyllistä määrittää alustavassa kokeessa. Vähintään neljää analysoitavissa olevaa pitoisuutta on käytettävä. Mikäli sytotoksisuutta esiintyy, näiden pitoisuuksien on katettava alue, jossa suurimmalla pitoisuudella on maksimaalinen myrkkyvaikutus ja pienimmällä vähäinen tai ei lainkaan myrkkyvaikutusta, mikä tarkoittaa yleensä sitä, että pitoisuudet voivat poiketa toisistaan enintään kertoimella 2–√10. Mikäli suurin pitoisuus perustuu sytotoksisuuteen, siihen liittyvän suhteellisen eloonjääneisyyden (suhteellisen kloonaustehokkuuden) tai suhteellisen kokonaiskasvun tulisi olla noin 10–20 % (mutta ei alle 10 %). Suhteellisen ei-sytotoksisia aineita testattaessa suurimman testattavan pitoisuuden tulisi olla 5 mg/ml, 5 μl/ml tai 0,01 M sen mukaan, mikä näistä on pienin. Huonosti liukenevia aineita on testattava viljelyolosuhteissa liukoisuusrajaan asti tai sen yli. Liukenemattomuuteen viittaavat muutokset on määritettävä lopullisessa kasvatusväliaineessa, jolle solut altistetaan. Liukoisuus kannattaa arvioida sekä käsittelyn alussa että lopussa, sillä se voi muuttua koejärjestelmässä altistuksen aikana esimerkiksi solujen, S9:n, seerumin ym. vaikutuksesta. Liukenemattomuus voidaan havaita paljaalla silmällä. Sakan ei pitäisi vaikuttaa laskentaan.
1.4.2.3 Kontrollit Jokaisessa kokeessa on käytettävä rinnakkaisia positiivisia ja negatiivisia (liuotin tai kantaja-aine) kontrolleja, sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä. Metabolista aktivaatiota käytettäessä positiivisena kontrollina on käytettävä sellaista kemiallista ainetta, joka vaatii aktivaatiota mutageenisen vasteen aikaansaamiseksi. Esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista: Metabolinen aktivaatio Lokus Aine CAS-nro EINECS-nro Ei eksogeenista metabolista aktivaatiota HPRT etyylimetaanisulfonaatti 62-50-0 200-536-7 etyylinitrosourea 759-73-9 212-072-2 TK (pienet ja suuret pesäkkeet) metyylimetaanisulfonaatti 66-27-3 200-625-0 XPRT etyylimetaanisulfonaatti 62-50-0 200-536-7 etyylinitrosourea 759-73-9 212-072-2 Eksogeeninen metabolinen aktivaatio HPRT 3-metyylikolantreeni 56-49-5 200-276-4 N-nitrosodimetyyliamiini 62-75-9 200-549-8 7,12-dimetyylibentsantraseeni 57-97-6 200-359-5 TK (pienet ja suuret pesäkkeet) syklofosfamidi 50-18-0 200-015-4 syklofosfamidimonohydraatti 6055-19-2 bentso[a]pyreeni 50-32-8 200-028-5 3-metyylikolantreeni 56-49-5 200-276-5 XPRT N-nitrosodimetvyliamiini (suurilla S-9-pitoisuuksilla) 62-75-9 200-549-S bentso[a]pyreeni 50-32-8 200-028-5 Muita sopivia positiivisia kontrolliaineita voidaan käyttää, esim. jos käytettävissä on laboratoriokohtainen tietokanta 5-bromo-2'-deoksiuridiinista (CAS-nro 59-14-3, Einecs-nro 200-415-9), myös tätä vertailuainetta voidaan käyttää. Samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvien positiivisten kontrolliaineiden käyttöä tulisi harkita, mikäli niitä on käytettävissä. Mukana on oltava myös negatiivisia kontrolleja, jotka koostuvat liuottimesta tai pelkästä kantaja-aineesta kasvatusväliaineessa ja joita on käsitelty samalla tavoin kuin altistettuja ryhmiä. Lisäksi on käytettävä käsittelemättömiä kontrolleja, paitsi jos aikaisemmat tiedot kontrollista osoittavat, ettei valitulla liuottimella ole haitallisia eikä mutageenisia vaikutuksia.
1.4.3 Testin suorittaminen
1.4.3
1.4.3.1 Altistuminen tutkittavalle aineelle Lisääntyvät solut on altistettava testattavalle aineelle sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä. Altistusajan on oltava sopiva (tehokas aika on yleensä 3–6 tuntia). Altistusta voidaan jatkaa yhden tai useamman solusyklin ajan. Kullekin testattavalle pitoisuudelle voidaan altistaa kaksi rinnakkaista viljelmää tai vain yksi viljelmä. Yksittäisiä viljelmiä käytettäessä pitoisuuksien määrää on suurennettava, jotta saadaan riittävä määrä viljelmiä analyysiä varten (esim. vähintään 8 analysoitavissa olevaa pitoisuutta). Rinnakkaisia negatiivisia (liuotin) kontrolliviljelmiä on käytettävä. Kaasumaisia tai haihtuvia aineita on testattava asianmukaisin menetelmin, esimerkiksi suljetuissa kasvatusastioissa (21) (22).
1.4.3.2 Eloonjääneisyyden, elinkykyisyyden ja mutaatiotaajuuden mittaaminen Altistusajan päätyttyä solut pestään ja viljellään eloonjääneisyyden määrittämiseksi ja mutanttifenotyypin ilmentymisen aikaansaamiseksi. Sytotoksisuuden mittaus aloitetaan yleensä altistusajan jälkeen määrittämällä viljelmien suhteellinen kloonaustehokkuus (eloonjääneisyys) tai suhteellinen kokonaiskasvu. Jokainen lokus vaatii määrätyn minimiajan, jotta hiljattain aiheutettujen mutanttien fenotyypin ilmentyminen olisi lähellä optimaalista (HPRT ja XPRT vaativat vähintään 6–8 vuorokautta ja TK vähintään 2 vuorokautta). Soluja kasvatetaan selektiivistä ainetta (aineita) sisältävillä alustoilla mutanttien lukumäärän määrittämiseksi ja ilman selektiivisiä aineita kloonaustehokkuuden määrittämiseksi. Elinkykyisyyden mittaaminen (käytetään mutaatiotaajuuden laskemiseen) aloitetaan altistusajan päätyttyä maljaamalla soluja ei-selektiivisessä kasvatusväliaineessa. Jos tutkittavalla aineella saadaan positiivinen tulos L5178Y TK+/- -testissä, pesäkkeiden koko on määritettävä ainakin yhdessä koeviljelmässä (suurin positiivinen pitoisuus) ja negatiivisissa ja positiivisissa kontrolleissa. Jos tutkittavalla aineella saadaan negatiivinen tulos L5178Y TK+/- -testissä, pesäkkeiden koko on määritettävä negatiivisissa ja positiivisissa kontrolleissa. Pesäkkeiden koon määritys voidaan tehdä myös tutkimuksissa, joissa käytetään TK6TK+/- -testiä.
2. TULOKSET
2.
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY Tulosten tulee sisältää tiedot sytotoksisuuden ja elinkykyisyyden määrityksistä, pesäkkeiden lukumäärästä ja mutaatiotaajuudesta altistetuissa viljelmissä ja kontrolliviljelmissä. Mikäli vaste on positiivinen L5178Y TK+/- -testissä, pesäkkeet lasketaan pienten ja suurten pesäkkeiden kriteeriä käyttäen vähintään yhdestä testattavan aineen pitoisuudesta (suurin positiivinen pitoisuus) ja negatiivisista ja positiivisista kontrolleista. Sekä suurten että pienten mutaatiopesäkkeiden molekulaarinen ja sytogeneettinen luonne on selvitetty yksityiskohtaisesti (23) (24). TK+/- -testissä pesäkkeet lasketaan käyttäen kriteereinä normaalin kasvun (suuri) ja hitaan kasvun (pieni) pesäkkeitä (25). Mutanteilla soluilla, joissa geneettinen vaurio on kaikkein suurin, on pitkittynyt kahdentumisaika, joten ne muodostavat pieniä pesäkkeitä. Tällaiset vauriot ulottuvat tyypillisesti kokonaisen geenin puuttumisesta karyotyypissä näkyviin kromosomipoikkeavuuksiin. Pienten mutaatiopesäkkeiden muodostuminen on yhdistetty suuria kromosomipoikkeavuuksia aiheuttaviin kemiallisiin aineisiin (26). Lievemmin vaurioituneet mutantit solut kasvavat yhtä nopeasti kuin parentaalisetkin solut ja muodostavat suuria pesäkkeitä. Eloonjääneisyys (suhteelliset kloonaustehokkuudet) tai suhteellinen kokonaiskasvu on ilmoitettava. Mutaatiotaajuus on ilmoitettava mutanttien solujen lukumäärän suhteena eloonjääneiden solujen lukumäärään. Viljelmäkohtaiset tulokset on ilmoitettava. Lisäksi yhteenveto kaikista tiedoista on ilmoitettava taulukkomuodossa. Selvää positiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa. Epäselvät tulokset on selvitettävä jatkotestauksella mieluiten muunnetuissa koeolosuhteissa. Negatiiviset tulokset on vahvistettava tapauskohtaisesti. Ellei negatiivisten tulosten vahvistamista jossakin tapauksessa pidetä tarpeellisena, tämä päätös on perusteltava. Tutkimusparametrien muuttamista on harkittava epäselvien tai negatiivisten tulosten seurantakokeissa arvioitavien koeolosuhteiden monipuolistamiseksi. Mahdollisia muutettavia tutkimusparametreja ovat pitoisuusvälit ja metaboliset aktivaatiojärjestelmät.
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA Positiivisille tuloksille on useita kriteerejä, kuten pitoisuuteen liittyvä tai toistettavissa oleva mutaatiotaajuuden suureneminen. Tulosten biologinen merkitys on otettava ensisijaisesti huomioon. Tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testitulosten arvioinnissa. Tilastollinen merkitsevyys ei saa olla ainoa määräävä tekijä positiivisen vasteen arvioinnissa. Tutkittava aine. jolla saadut tulokset eivät täytä edellä kuvattuja kriteerejä, katsotaan ei-mutageeniseksi tässä koejärjestelmässä. Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tuloksia, mutta joissakin harvinaisissa tapauksissa saatujen tietojen pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä tutkittavan aineen vaikutuksesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi kokeen toistokertojen määrästä riippumatta. Nisäkässoluilla tehtävässä in vitro -geenimutaatiotestissä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että tutkittava aine aiheuttaa geenimutaatioita käytetyissä viljellyissä nisäkässoluissa. Toistettavissa oleva positiivinen pitoisuus-vastesuhde on kaikkein merkityksellisin. Negatiiviset tulokset osoittavat, ettei tutkittava aine aiheuta koeolosuhteissa geenimutaatioita testatuissa viljellyissä nisäkässoluissa.
3. RAPORTOINTI
3. TUTKIMUSSELOSTUS
Tutkimusselostuksen on sisällettävä seuraavat tiedot:
Liuotin/kantaja-aine:
kantaja-aineen valintaperusteet,
tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa, jos tiedossa.
Solut:
tyyppi ja solujen lähde,
soluviljelmien lukumäärä,
siirrostusten lukumäärä tarvittaessa,
soluviljelmien ylläpitomenetelmät tarvittaessa,
mykoplasman puuttuminen.
Koeolosuhteet:
pitoisuuksien ja viljelmien lukumäärän valintaperusteet, joihin sisältyvät esim. sytotoksisuustiedot ja liukoisuusrajoitukset, mikäli tiedot ovat käytettävissä,
kasvatusväliaineen koostumus, CO2-pitoisuus,
tutkittavan aineen pitoisuus,
lisätyn kantaja-aineen ja tutkittavan aineen määrä,
inkubaatiolämpötila,
inkubaatioaika,
altistuksen kesto.
solutiheys altistuksen aikana,
metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus, myös hyväksymiskriteerit,
positiiviset ja negatiiviset kontrollit,
ilmentymisajan pituus (myös kylvettyjen solujen lukumäärä ja jatkoviljelmät ja kasvatusväliaineen vaihtoajat tarvittaessa),
selektiiviset aineet,
kriteerit, joiden perusteella testit määritellään positiivisiksi, negatiivisiksi tai epäselviksi,
elinkykyisten ja mutanttien solujen laskentamenetelmät,
pesäkkeiden määritelmät, kun pesäkkeen koko ja tyyppi on otettu huomioon (myös pienten ja suurten pesäkkeiden kriteerit tarvittaessa).
Tulokset:
myrkkyvaikutuksen merkit,
sakkautumisen merkit,
tutkittavalle aineelle altistetun viljelmän pH ja osmolaliteetti, jos määritetty,
pesäkkeen koko, jos määritetty, ainakin negatiivisista ja positiivisista kontrolleista,
laboratorion valmiudet todeta pienet mutanttipesäkkeet L5178Y TK+/- -järjestelmässä, mikäli merkitystä,
annos-vastesuhde, mikäli mahdollista,
mahdolliset tilastolliset analyysit,
rinnakkaisista negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista kontrolleista saadut tulokset,
aikaisemmat negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista kontrolleista saadut tutkimustulokset, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat,
mutaatiofrekvenssi.
Tulosten pohdinta.
Johtopäätökset.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
KIRJALLISUUTTA Moore, M. M, DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindall, K. R. (Eds.) (1987), Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E. H. Y. and Mailing, H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl Acad. Sci., USA, 61, s. 1306–1312. Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res., 94, s. 467–485. Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Lori, Mutagenesis, 4, s. 394–403. Aaron, C. S. and Stankowski. Jr. L. F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res., 223, s. 121–128. Aaron, G S., Bolcsfoldi, G.. Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicitv Test Procedures, Mutation Res., 312, s. 235–239. Scott, D, Galloway, S. M., Marshall, R. K., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicitv Under Extremc Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, s. 147–204. Clive. D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, s. 225–251. Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agcncy Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, s. 17–36. Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., O'Neill, J. P., Riddle, J. C., Standkowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, s. 135–141. Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, s. 9–17. Stankowski, L. F. Jr., Tindall, K. R. and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Anaylses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, s. 133–147. Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedures for the L5178Y/TK+/- — TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al. (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, s. 239–268. Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith, J. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., Ed., Cambridge University Press, s. 66–101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Rcsistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res., 46, s. 365–373. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, s. 347–364. Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. E. S., Batson, A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res., 59, s. 61–108. Maron, D. M. and Ames, B. N. (198 3), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, s. 173–215. Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Catehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, s. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation System, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing,, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, s. 85–88. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooney, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, s. 91–103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Crown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, s. 795–801. Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, s. 51–55. Moore, M. M., Clive, D., Hozier, J. C, Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluorothymidine-Resistant TFTr Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res., 151, s. 161–174. Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res., 229, s. 89–102. Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- — 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, s. 609–614.
B.18. DNA-VAURIO JA SEN KORJAANTUMINEN — UDS-TESTI NISÄKÄSSOLUVILJELMÄLLÄ
B.18.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄ Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.3 VERTAILUAINEET Ei ole.
1.4 TESTIN PERIAATE UDS-testissä (Unscheduled DNA Synthesis test) nisäkässolu altistetaan kemiallisille tai fysikaalisille tekijöille, minkä jälkeen näiden mahdollisesti vaurioittama DNA-segmentti leikkautuu irti ja poistuu kromosomista. Testi perustuu tritiumilla leimatun tymidiinin (3H-TdR) sitoutumiseen nisäkässolun DNA:han solunjakautumissyklin S-vaiheen ulkopuolella. 3H-TdR:n sitoutuminen voidaan todeta altistettujen solujen DNA:sta autoradiografisesti tai nestetuikelaskennalla. Testissä altistetaan primaarisia rotan maksasoluja tai nisäkässoluviljelmä tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista aktivaatiota että eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. UDS-testi voidaan myös suorittaa in vivo.
1.5 LAATUKRITEERIT Ei ole.
1.6 TESTIN KUVAUS
1.6 Testin valmistelu
Tutkittava aine ja kontrolli- tai vertailuaineet on sekoitettava kasvatusalustaan tai liuotettava tai sekoitettava soveltuvaan kantaja-aineeseen ja sen jälkeen edelleen kasvatusalustaan testiä varten. Kantaja-aineen loppupitoisuus ei saa vaikuttaa solujen elinkykyyn. Testissä voidaan käyttää primaarisia rotan maksasoluviljelmiä, primaarisia ihmisen lymfosyyttiviljelmiä tai pysyviä solulinjoja (esim. ihmisen diploidisia fibroblasteja). Solut on altistettava tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista aktivaatiota että soveltuvan metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa.
Koeolosuhteet
Soluviljelmien lukumäärä
Autoradiografiaa käytettäessä tarvitaan ainakin kaksi ja nestetuikelaskentaa käytettäessä kuusi (tai vähemmän, mikäli tämä on tieteellisesti perusteltua) soluviljelmää kutakin parametriyhdistelmää kohti.
Negatiiviset ja positiiviset kontrollit
Kuhunkin kokeeseen on sisällyttävä samanaikaisia positiivisia ja negatiivisia (altistamattomia ja/tai kantaja-aineelle altistettuja) kontrolleja sekä ilman metabolista aktivaatiota että metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Rotan maksasoluilla suoritettavan testin positiivisia kontrolleja voivat olla esimerkiksi 7,12-dimetyylibentsantraseeni (7,12-DMBA) tai 2-asetyyliaminofluoreeni (2-AAF). Pysyvien solulinjojen osalta 4-nitrokinoliini-N-oksidi (4-NQO) on esimerkki positiivisesta kontrollista, jota voidaan käyttää ilman metabolista aktivaatiota autoradiografisesti tai nestetuikelaskennalla suoritettavissa testeissä; N-dimentyylinitrosamiini puolestaan on esimerkki positiivisesta kontrolliyhdisteestä, jota käytetään metabolisten aktivaatiojärjestelmien läsnäollessa.
Altistuspitoisuudet
Tutkittava aine on testattava useana eri pitoisuutena, siten että käytetty pitoisuusalue mahdollistaa annos/vastesuhteen selvittämisen. Korkeimmalla pitoisuudella on oltava jonkinasteinen sytomyrkkyvaikutus. Huonosti veteen liukenevilla aineilla pitoisuus määräytyy liukoisuuden mukaan. Vesiliukoisten myrkyttömien aineiden korkein tutkittava pitoisuus on päätettävä tapauskohtaisesti.
Solut
Soluviljelmien kasvatuksessa on käytettävä soveltuvia kasvatusalustoja, CO2-pitoisuuksia, lämpötiloja ja kosteusarvoja. Pysyvät solulinjat on tarkastettava ajoittain Mycoplasma-kontaminaation varalta.
Metabolinen aktivaatio
Primaarisissa maksasoluviljelmissä ei käytetä metabolista aktivaatiojärjestelmää. Pysyvät solulinjat ja lymfosyytit altistetaan tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista aktivaatiota että soveltuvan metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa.
Testin suorittaminen
Soluviljelmien perustaminen
Testissä käytettävät pysyvät solulinjat erotetaan kantaviljelmistä esim. trypsiinin avulla tai ravistelemalla, kylvetään kasvatusastioihin sopivaan tiheyteen ja inkuboidaan 37 oC:ssa. Rotan maksasoluista tehdään lyhytaikaisviljelmät antamalla vastaeroteltujen maksasolujen kiinnittyä kasvupinnalle soveltuvassa kasvualustassa. Ihmisen lymfosyyttiviljelmät perustetaan soveltuvin menetelmin.
Soluviljelmien altistaminen tutkittavalle aineelle Primaariset rotan maksasolut:
Vastaeristettyjä rotan maksasoluja altistetaan sopivan pituiseksi ajaksi tutkittavalle aineelle alustassa, joka sisältää 3H-TdR:ä. Altistuksen jälkeen kasvatusalusta poistetaan kasvatusastiasta, ja solut huuhdellaan, fiksoidaan ja kuivataan. Objektilasit kastetaan autoradiografiaemulsioon (vaihtoehtoisesti voidaan käyttää valmista stripping-filmiä) ja valottumisajan jälkeen lasit kehitetään, värjätään ja lasketaan.
Pysyvät solulinjat ja lymfosyytit:
Autoradiografiset menetelmät: Soluviljelmiä altistetaan sopivaksi ajaksi tutkittavalle aineelle, minkä jälkeen ne käsitellään 3H-TdR:llä. Altistus- ja käsittelyajat määräytyvät tutkittavan aineen luonteen, metaboliajärjestelmien aktiivisuuden ja solutyypin mukaan. Maksimaalisen S-vaiheen ulkopuolisen DNA-synteesin (unscheduled DNA-synthesis) havaitsemiseksi tulee 3H-TdR lisätä kasvatusalustaan yhtä aikaa kuin tutkittava aine tai muutama minuutti tutkittavalle aineelle altistuksen jälkeen. Tutkittavan aineen ja 3H-TdR:n väliset mahdolliset vuorovaikutukset vaikuttavat valintaan näiden kahden menetelmän välillä. S-vaiheen ulkopuolisen DNA-synteesin ja semikonservatiivisen DNA-replikaation erottamiseksi toisistaan jälkimmäinen voidaan estää esimerkiksi käyttämällä kasvatusalustaa, josta puuttuu arginiini tai jonka seerumipitoisuus on alhainen tai joka sisältää hydroksiureaa. S-vaiheen ulkopuolisen DNA-synteesin mittaaminen nestetuikelaskennan avulla: Ennen solujen altistamista tutkittavalle aineelle solunjakautumisen S-vaiheen alkaminen estetään edellä kuvatulla tavalla, minkä jälkeen altistaminen suoritetaan samoin kuin autoradiografiaa käytettäessä. Inkubaation jälkeen DNA eristetään soluista, ja DNA:n kokonaismäärä sekä sitoutuneen 3H-TdR:n määrä mitataan. On huomattava, että semikonservatiivisen DNA-replikaation estäminen ei ole tarpeen stimuloimattomissa ihmisen lymfosyyttiviljelmissä.
Analyysi
Autoradiografinen määritys
S-vaiheessa olevat tumat jätetään laskennan ulkopuolelle määritettäessä viljeltyjen solujen S-vaiheen ulkopuolista DNA-synteesiä. Kutakin tutkittavan aineen pitoisuutta kohti on laskettava vähintään 50 solua. Objektilasit on kooditettava ennen laskemista. Kultakin lasilta lasketaan useita sattumanvaraisesti valittuja, selvästi toisistaan erillään olevia näkökenttiä. Sytoplasmaan sitoutunut 3H-TdR määritetään laskemalla kolme tuman suuruista sytoplasma-aluetta kustakin laskettavasta solusta.
Nestetuikelaskentaan perustuva määritys
Nestetuikelaskentaa käytettäessä on kutakin pitoisuutta ja kontrollia kohti oltava riittävä määrä rinnakkaisia soluviljelmiä. Kaikki tulokset on varmistettava erillisellä kokeella.
2. TULOKSET Tulokset on esitettävä taulukkomuodossa.
2.
2.1 AUTORADIOGRAFINEN MÄÄRITYS 3H-TdR:n sitoutuminen sytoplasmaan ja tuman kohdalla olevien valottuneiden pisteiden lukumäärä on esitettävä erikseen. 3H-TdR:n sytoplasmaattisen sitoutumisen ja tumassa olevien valottuneiden pisteiden lukumäärän jakautumia voidaan kuvata keskiarvolla, mediaanilla ja moodilla.
2.2 NESTETUIKELASKENTAAN PERUSTUVA MÄÄRITYS Ilmoitettaessa sitoutuneen 3H-TdR:n määrää nestetuikelaskentaan perustuvassa määrityksessä tulee yksikkönä olla dpm/μg DNA. Sitoutuneen 3H-TdR:n määrän jakautumaa kuvaamaan voidaan käyttää saatujen dpm/|μg DNA -lukemien keskiarvoa ja keskihajontaa. Tulosten merkitsevyys on arvioitava soveltuvin tilastollisin menetelmin.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot:
käytetyt solut, solutiheys ja altistettujen jatkoviljelmien järjestysluku, soluviljelmien lukumäärä,
soluviljelmien ylläpitomenetelmät, kuten kasvatusalusta, lämpötila ja CO2-pitoisuus,
tutkittu aine, kantaja-aine, testissä käytetyt pitoisuudet ja pitoisuuksien valinnassa käytetyt perusteet,
metabolisten aktivaatiojärjestelmien yksityiskohtainen kuvaus,
altistusohjelma,
positiiviset ja negatiiviset kontrollit,
käytetty autoradiografiamenetelmä,
solunjakautumisen S-vaiheen estämisessä käytetyt menetelmät,
DNA:n eristämisessä ja kokonais-DNA:n määrittämisessä käytetyt menetelmät nestetuikelaskentaan perustuvassa testissä,
annos/vastesuhde mikäli mahdollista,
tulosten tilastollinen käsittely,
tulosten pohdinta,
tulosten tulkinta.
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA Ks. Yleisjohdanto, osa B.
4. LÄHDELUETTELO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
B.19. SISARKROMATIDIVAIHDOSTESTI
B.19.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄT Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.3 VERTAILUAINEET Ei ole.
1.4 TESTIN PERIAATE Sisarkromatidivaihdostesti (Sister Chromatid Exchange, SCE) on lyhytaikainen testi kahdentuvan kromosomin sisarkromatidien kesken tapahtuvan DNA:n vaihtumisen toteamiseksi. Sisarkromatidivaihdoksessa tapahtuu DNA:n replikaatiotuotteiden vaihtumista kahden, ilmeisesti homologisen lokuksen välillä. Vaihtumistapahtumassa oletetaan DNA-ketjun katkeavan ja liittyvän uudelleen yhteen, vaikka ilmiön molekyylitason tapahtumia ei juuri tunneta. Sisarkromatidivaihdosten toteaminen edellyttää sisarkromatidien differentiaalileimausta, joka suoritetaan antamalla bromodeoksiuridiinin sitoutua kromosomaaliseen DNA:han kahden solusyklin ajan. Nisäkässoluviljelmä altistetaan tutkittavalle aineelle tarpeen mukaan sekä ilman metabolista aktivaatiota että nisäkäsperäisen eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Soluviljelmää kasvatetaan kahden DNA:n replikaatiosyklin ajan alustassa, joka sisältää bromodeoksiuridiinia. Soluja käsitellään tämän jälkeen tumasukkulan muodostumisen inhibiittorilla (esim. kolkisiinilla) solujen pysäyttämiseksi mitoosin metafaasivaiheeseen (c-metafaasiin), minkä jälkeen solut kerätään ja niistä tehdään kromosomipreparaatit.
1.5 LAATUKRITEERIT Ei ole.
1.6 TESTIN KUVAUS
Testissä voidaan käyttää primaarisia soluviljelmiä, (ihmisen lymfosyyttejä) tai pysyviä solulinjoja (esim. kiinanhamsterin ovariosoluja). Solulinjat on tarkastettava Mycoplasma-kontaminaation varalta.
Testissä on käytettävä soveltuvia kasvatusalustoja ja inkubaatio-olosuhteita (esim. lämpötila, kasvatusastiat, CO2- pitoisuus ja kosteus).
Tutkittavat aineet voidaan sekoittaa kasvatusalustaan tai liuotettava tai sekoitettava soveltuviin kantaja-aineisiin ennen solujen altistamista. Kantaja-aineen loppupitoisuus kasvatusastiassa ei saa merkitsevästi vaikuttaa solujen elinkykyyn tai kasvunopeuteen, ja sen vaikutusta sisarkromatidivaihdosfrekvenssiin on seurattava kontrollikokeella, jossa altisteena on tutkittavan aineen kantaja-aine.
Solut on altistettava tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista aktivaatiota että nisäkäsperäisen eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Jos käytetään solutyyppejä, joilla on itsessään kyky metaboloida vierasaineita, tämän metabolisen aktiivisuuden on oltava nopeudeltaan ja luonteeltaan tutkittavalle aineryhmälle soveltuva.
1.6 Koeolosuhteet
Soluviljelmien lukumäärä
Kutakin parametriyhdistelmää kohti on oltava ainakin kaksi rinnakkaista soluviljelmää.
Negatiiviset ja positiiviset kontrollit
Kuhunkin kokeeseen on sisällyttävä sekä suoraan vaikuttavia että metabolista aktivaatiota vaativia positiivisia kontrolleja; myös kantaja-ainekontrollia on käytettävä. Seuraavat ovat esimerkkejä aineista, joita voidaan käyttää positiivisina kontrolleina: Tarvittaessa kokeessa voidaan lisäksi käyttää ylimääräistä positiivista kontrollia, joka kuuluu samaan kemiallisten aineitten ryhmään kuin tutkittava aine.
suoraan vaikuttava aine:
etyylimetaanisulfonaatti,
epäsuorasti vaikuttava aine:
syklofosfamidi
Altistuspitoisuudet
Tutkittava aine on testattava vähintään kolmena eri pitoisuutena, joiden keskinäiset erot ovat sopivat. Korkeimmalla pitoisuudella on oltava merkitsevä myrkkyvaikutus, mutta se ei saa silti estää riittävää solunjakautumista. Huonosti veteen liukenevilla aineilla pitoisuus määräytyy liukoisuuden mukaan. Vesiliukoisten myrkyttömien aineiden korkein tutkittava pitoisuus on päätettävä tapauskohtaisesti.
Testin suorittaminen
Soluviljelmien perustaminen
Testissä käytettävät pysyvät solulinjat erotetaan kantaviljelmistä esim. trypsiinin avulla tai ravistelemalla, kylvetään kasvatusastioihin sopivaan tiheyteen ja inkuboidaan 37 oC:ssa. Yksikerrosviljelmissä solujen lukumäärä kasvatusastiaa kohti on säädettävä siten, että viljelmien konfluenttisuus ei juuri ylitä 50 prosenttia solujen keräyshetkellä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää suspensioviljelmiä. Ihmisen lymfosyyttiviljelmät perustetaan heparinisoidusta verestä soveltuvin menetelmin, ja viljelmiä inkuboidaan 37 oC:ssa.
Altistus
Eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa olevat solut altistetaan sopivaksi ajaksi tutkittavalle aineelle; useimmissa tapauksissa 1–2 tuntia voi olla riittävä, mutta tietyissä tapauksissa altistusaikaa voidaan pidentää aina kahteen täyteen solunjakautumissykliin saakka. Solut, joilla ei itsessään ole riittävää kykyä metaboloida vierasaineita, on altistettava tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista aktivaatiota että soveltuvan metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Altistuksen jälkeen solut huuhdellaan puhtaiksi tutkittavasta aineesta ja niitä viljellään kahden solunjakautumissyklin ajan bromodeoksiuridiinin läsnäollessa. Vaihtoehtoisesti solut voidaan altistaa samanaikaisesti tutkittavalle aineelle ja bromodeoksiuridiinille siten, että kokonaisviljelyaika on kaksi solunjakautumissykliä. Ihmisen lymfosyytit altistetaan niiden ollessa semisynkronisessa kasvuvaiheessa. Solut analysoidaan niiden ollessa toisessa altistuksen alkamisen jälkeisessä jakautumisvaiheessa, kun on varmistettu, että solunjakautumissyklin herkimmät vaiheet ovat altistuneet tutkittavalle aineelle. Bromodeoksiuridiinia sisältävän DNA:n fotolysoitumisen minimoimiseksi kaikkia bromodeoksiuridiinia sisältäviä soluviljelmiä on käsiteltävä pimeässä tai heikossa hehkulampun valossa solujen keräämiseen saakka.
Solujen kerääminen
Soluja käsitellään tumasukkulan muodostumisen inhibiittorilla (esim. kolkisiinilla) 1–4 tuntia ennen solujen keräämistä. Jokaisen viljelmän solut kerätään ja käsitellään erikseen kromosomipreparaattien valmistamiseksi.
Kromosomipreparaattien valmistus ja värjäys
Kromosomipreparaatit valmistetaan normaalein sytogeneettisin menetelmin. Objektilasien värjäys sisarkromatidivaihdosten osoittamiseksi voidaan tehdä useilla eri menetelmillä (esim. fluoresenssi + Giemsa-värjäys).
Analyysi
Analysoitavien solujen lukumäärä perustuu kontrolliviljelmien spontaaniin sisarkromatidivaihdosfrekvenssiin. Yleensä kustakin viljelmästä lasketaan ainakin 25 hyvin levinneen metafaasin sisarkromatidivaihdokset. Objektilasit koodataan ennen analyysiä. Ihmisen lymfosyyteistä analysoidaan ainoastaan 46 sentromeeriä sisältävät metafaasit. Pysyvistä solulinjoista analysoidaan ainoastaan metafaasit, joiden sentromeerien lukumäärä on moodi ± 2. Tuloksissa on ilmaistava, onko sentromeerin kohdalla havaittu leiman vaihtuminen tulkittu sisarkromatidivaihdokseksi vai ei. Tulokset on varmistettava erillisellä kokeella.
2. TULOKSET Tulokset on esitettävä taulukkomuodossa. Sisarkromatidivaihdosten lukumäärä kussakin metafaasissa ja sisarkromatidivaihdosten keskimääräinen lukumäärä kromosomia kohti kussakin metafaasissa on kirjattava erikseen kunkin altistetun viljelmän ja kontrolliviljelmän osalta. Tulosten merkitsevyys on arvioitava soveltuvin tilastollisin menetelmin.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot:
käytetyt solut, soluviljelmien ylläpitomenetelmät,
koeolosuhteet: kasvatusalustojen koostumus, CO2-pitoisuus, tutkitun aineen pitoisuus, käytetty kantaja-aine, inkubaatiolämpötila, altistusaika, käytetty tumasukkulan muodostumisen inhibiittori ja sen pitoisuus sekä käsittelyaika, käytetty nisäkäsperäinen aktivaatiojärjestelmä, positiiviset ja negatiiviset kontrollit,
viljelmien lukumäärä parametriyhdistelmää kohti,
kromosomipreparaattien valmistusmenetelmän yksityiskohtainen kuvaus,
analysoitujen metafaasien lukumäärä (erikseen kustakin soluviljelmästä),
sisarkromatidivaihdosten keskimääräinen lukumäärä solua kohti ja kromosomia kohti (erikseen kustakin soluviljelmästä),
sisarkromatidivaihdosten laskentaperusteet,
annostusten valintaperusteet,
annos/vastesuhde mikäli mahdollista,
tulosten tilastollinen käsittely,
tulosten pohdinta,
tulosten tulkinta.
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA Ks. Yleisjohdanto, osa B.
4. LÄHDELUETTELO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
B.20. RESESSIIVI LETAALI -TESTI BANAANIKARPÄSELLÄ (DROSOPHILA MELANOGASTER)
B.20.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄ Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.3 VERTAILUAINEET Ei ole.
1.4 TESTIN PERIAATE Resessiivi letaali -testillä voidaan todeta pistemutaatiot ja pienet deleetiot banaanikärpäsen ituradan soluissa. Testillä havaitaan mutaatiot noin 800:ssa X-kromosomin lokuksessa, jotka muodostavat noin 80 % kaikista X-kromosomin lokuksista. X-kromosomi puolestaan edustaa noin yhtä viidesosaa banaanikärpäsen koko haploidisesta perintöaineksesta. Banaanikärpäsen X-kromosomissa tapahtuvat mutaatiot ilmenevät mutanttigeeniä kantavien koiraiden fenotyypissä. Jos mutaatio on hemitsygoottisena letaali, mutaation tapahtuminen voidaan päätellä siitä, että jälkeläissukupolvesta puuttuu toinen niistä kahdesta koirastyypistä, jotka normaalisti esiintyvät heterotsygoottisen naaraan jälkeläisten joukossa. Resessiivi letaali -testissä näitä ilmiöitä hyödynnetään spesifisiä markkereita ja uudelleen järjestynyttä geenimateriaalia sisältävien kromosomien avulla.
1.5 LAATUKRITEERIT Ei ole.
1.6 TESTIN KUVAUS
1.6 Testin valmistelu
Kannat
Testissä voidaan käyttää hyvin kuvaillun villikannan koiraita ja Muller-5-kannan naaraita. Myös muita sopivalla tavalla merkittyjä naaraskantoja, joilla on multippeleita inversioita X-kromosomeissa, voidaan käyttää.
Tutkittava aine
Tutkittava aine on liuotettava veteen. Veteen liukenemattomat aineet voidaan liuottaa tai sekoittaa soveltuviin kantaja-aineisiin (esim. etanolin ja Tween-60:n tai Tween-80:n seokseen) ja sen jälkeen laimentaa vedellä tai suolaliuoksella ennen kärpäsille antamista. Dimetyylisulfoksidin (DMSO:n) käyttöä kantaja-aineena tulee välttää.
Kärpästen lukumäärä
Testi on suunniteltava etukäteen määriteltyjen tilastollisten herkkyys- ja tehokkuusvaatimusten mukaisesti. Sopivalla kontrollikokeella todettu spontaanimutaatiofrekvenssi vaikuttaa suuresti analysoitavien altistettujen kromosomien lukumäärään.
Antotapa
Altistus voidaan toteuttaa antamalla altiste suun kautta, ruiskeena tai kaasu- tai höyryaltistuksena. Tutkittava aine voidaan syöttää sokeriliuoksessa. Tarpeen mukaan aineet voidaan liuottaa 0,7 % NaCl-liuokseen ja injektoida rintakehään tai vatsaan.
Negatiiviset ja positiiviset kontrollit
Testiin on sisällytettävä negatiivisia (kantaja-ainekontrolleja) ja positiivisia kontrolleja. Jos kuitenkin on käytettävissä laboratoriokohtaiset oletusarvot (laboratory historical Control data), samanaikaisia negatiivisia kontrolleja ei tarvita.
Altistustasot
Testissä on käytettävä kolmea eri altistustasoa. Alustavassa tutkimuksessa voidaan tutkittavasta aineesta käyttää yhtä altistustasoa, jonka on oltava suurin siedetty pitoisuus tai pitoisuus, jolla on joitakin myrkkyvaikutuksia. Myrkyttömien aineitten kohdalla on käytettävä suurinta pitoisuutta, joka on käytännössä mahdollinen.
Testin suorittaminen
Villikoiraat (ikä 3–5 vrk) altistetaan tutkittavalle aineelle, minkä jälkeen niiden kunkin annetaan pariutua useiden Muller-5-kannan tai jonkin muun asianmukaisesti (multippeleilla X-kromosomi-inversioilla) merkityn kannan nuorten naaraiden kanssa. Naaraat vaihdetaan uusiin joka toinen tai kolmas vuorokausi koko sukusolusyklin kattamiseksi. Naaraiden jälkeläisten laskennalla havaittavat letaalivaikutukset voidaan luokitella valmiisiin siittiöihin, keski- tai myöhäisasteen spermatideihin, varhaisasteen spermatideihin, spermatosyytteihin ja spermatogonioihin kohdistuneista altistusvaikutuksista johtuviksi. Edellä kuvatusta risteytyksestä saatujen heterotsygoottisten F1-polven naaraiden annetaan kunkin pariutua (so. yksi naaras kussakin kasvatuspullossa) saman jälkeläisparven koiraiden kanssa. F2-polvessa kukin kärpäsviljelmä tarkastetaan villikoiraiden puuttumisen toteamiseksi. Jos jokin viljelmä näyttää saaneen alkunsa sellaisesta F1-naaraasta, joka on edellisestä polvesta saanut letaalimutaation sisältävän X-kromosomin (eli viljelmässä ei havaita lainkaan koiraita, joilla olisi altistettu X-kromosomi), tällaisen naaraan naaraspuoliset, saman genotyypin omaavat jälkeläiset on testattava, jotta nähdään, toistuuko letaalivaikutus seuraavassa sukupolvessa.
2. TULOKSET Tulokset on taulukoitava siten, että niistä ilmenee testattujen X-kromosomien lukumäärä, steriilien koiraiden lukumäärä sekä kullakin altistuspitoisuudella ja pariutumisjaksolla havaittujen letaalikromosomien lukumäärä kullakin altistetulla koiraalla. Tuloksissa on ilmaistava myös letaalimutaatioiden lukumäärien jakautuma koirasta kohti. Nämä tulokset on varmistettava erillisellä kokeella. Resessiivinen letaali -testien tulosten merkitsevyys on arvioitava soveltuvin tilastollisin menetelmin. Resessiivisten letaalimutaatioiden kasaantuminen yhden koiraan kohdalle on otettava huomioon ja käsiteltävä soveltuvin tilastollisin menetelmin.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot:
kanta: käytetyt banaanikärpäskannat, hyönteisten ikä, altistettujen koiraiden lukumäärä, steriilien koiraiden lukumäärä, perustettujen F2-viljelmien lukumäärä, jälkeläisiä tuottamattomien F2-viljelmien lukumäärä, kussakin sukusolusyklin vaiheessa letaalimutaation saaneiden kromosomien lukumäärä,
altistettavien ryhmien koon määrittelyssä käytetyt perusteet,
koeolosuhteet: altistus- ja näytteenotto-ohjelman yksityiskohtainen kuvaus, altistustasot, tiedot myrkyllisyydestä, negatiiviset (liuotinkontrollit) ja mahdolliset positiiviset kontrollit,
käytetyt letaalimutaation kriteerit,
altistus/vastesuhde, jos mahdollista,
tulosten tilastollinen käsittely,
tulosten pohdinta,
tulosten tulkinta.
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA Ks. Yleisjohdanto, osa B.
4. LÄHDELUETTELO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
B.21. SOLUTRANSFORMAATIOTESTIT NISÄKÄSSOLUVILJELMILLÄ
B.21.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄ Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.3 VERTAILUAINEET Ei ole.
1.4 TESTIN PERIAATE Nisäkässoluviljelmillä voidaan tutkia in vitro sellaisten aineitten aikaansaamia fenotyyppisiä muutoksia, jotka in vivo aiheuttavat pahanlaatuista transformaatiota. Laajassa käytössä olevia soluja ovat mm. C3H10T1/2, 3T3, SHE ja Fischer rotan solut. Testit perustuvat solujen morfologian muutoksiin, fokusten muodostukseen tai muutoksiin kasvukyvyn pehmytagarissa. On olemassa myös vähäisemmässä käytössä olevia testejä, joilla voidaan tutkia muita, karsinogeenisille aineille altistumisen aiheuttamia fysiologisia tai morfologisia muutoksia soluissa. Millään in vitro -testeissä havainnoidulla tulostapahtumalla ei ole osoitettu olevan suoraa mekaanista yhteyttä syövän syntyyn. Joillakin testeillä voidaan havaita tuumoripromoottoreiden muodostuminen. Sytomyrkyllisyys voidaan todeta havainnoimalla tutkittavan aineen vaikutusta soluviljelmien pesäkkeenmuodostuskykyyn (kloonaustehokkuuteen) tai kasvunopeuteen. Sytotoksisuuden mittauksen tarkoituksena on varmistaa, että altistustaso on toksikologisesti mielekäs, mutta kaikissa testeissä tätä mittausta ei voida käyttää transformaatiofrekvenssin laskemiseen, sillä eräät testit edellyttävät pitkää inkubaatiota ja/tai jatkomaljausta.
1.5 LAATUKRITEERIT Ei ole.
1.6 TESTIN KUVAUS
1.6 Testin valmistelu
Solut
Testeissä voidaan käyttää useita erilaisia solulinjoja tai primaarisoluja transformaatiotestistä riippuen. Tutkijan on varmistettava, että testissä käytettävissä soluissa ilmenee haluttu fenotyyppinen muutos tunnetuille karsinogeeneille altistamisen jälkeen ja että testin kelpoisuus ja luotettavuus on osoitettu ja kirjattu tutkijan omassa laboratoriossa.
Kasvatusalusta
Kasvatusalustojen ja koeolosuhteiden on sovelluttava käytettävälle transformaatiotestille.
Tutkittava aine
Tutkittavat aineet voidaan sekoittaa kasvatusalustaan tai liuottaa tai sekoittaa soveltuvaan kantaja-aineeseen ennen solujen altistamista. Kantaja-aineen loppupitoisuus kasvatusalustassa ei saa vaikuttaa solujen elinkykyyn, kasvunopeuteen tai transformaatiofrekvenssiin.
Metabolinen aktivaatio
Solut on altistettava tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista aktivaatiota että soveltuvan metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Jos käytetään solutyyppejä, joilla on itsessään kyky metaboloida vierasaineita, tämän metabolisen aktiivisuuden on oltava luonteeltaan tunnetusti soveltuva tutkittavalle aineryhmälle.
Koeolosuhteet
Negatiiviset ja positiiviset kontrollit
Kuhunkin kokeeseen on sisällyttävä sekä suoraan vaikuttavia että metabolista aktivaatiota vaativia positiivisia kontrolleja; myös negatiivista kontrollia (kantaja-ainekontrollia) on käytettävä. Seuraavassa esimerkkejä aineista, joita voidaan käyttää positiivisina kontrolleina: Tarvittaessa kokeessa voidaan lisäksi käyttää ylimääräistä positiivista kontrollia, joka kuuluu samaan kemiallisten aineitten ryhmään kuin tutkittava yhdiste.
suoraan vaikuttavat aineet:
etyylimetaanisulfonaatti,
μ-propiolaktoni,
metabolista aktivaatiota vaativat aineet:
2-asetyyliaminofluoreeni,
4-dimetyyliaminoatsobentseeni,
7,12-dimetyylibentsantraseeni.
Altistuspitoisuudet
Tutkittava aine on testattava useana eri pitoisuutena, joiden on saatava aikaan pitoisuudesta riippuva myrkkyvaikutus siten, että korkein pitoisuus aiheuttaa suuren solujen kuolleisuuden ja että alhaisimman pitoisuuden aiheuttama kuolleisuus on likimäärin sama kuin negatiivisen kontrollin aikaansaama. Huonosti veteen liukenevilla aineilla pitoisuus määräytyy liukoisuuden mukaan. Vesiliukoisten myrkyttömien aineiden korkein tutkittava pitoisuus on päätettävä tapauskohtaisesti.
Testin suorittaminen
Solujen altistusajan on oltava käytettävään testiin sopiva; jos altistusaika on pitkä, saattaa olla välttämätöntä sen kuluessa vaihtaa soluille tuore kasvatusalusta (ja mahdollisesti tuore metabolinen aktivaatioseos) sekä annostella tutkittava aine uudelleen. Solut, joilla ei itsessään ole riittävää kykyä metaboloida vierasaineita, on altistettava tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista aktivaatiota että soveltuvan metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Altistuksen jälkeen solut huuhdellaan puhtaiksi tutkittavasta aineesta ja niitä viljellään olosuhteissa, jotka mahdollistavat tarkasteltavana olevan transformoituneen fenotyypin ilmaantumisen ja transformaatiofrekvenssin määrittämisen. Kaikki tulokset varmistetaan erillisellä kokeella.
2. TULOKSET Tulokset on esitettävä taulukkomuodossa. Tarkka esitysmuoto riippuu käytetystä testistä, ja se voi sisältää esim. maljakohtaiset tulokset, positiivisten maljojen lukumäärät tai transformoituneiden solujen lukumäärät. Kuolleisuus mahdollisuuksien mukaan on ilmaistava prosenttiosuutena kontrolliviljelmien solujen lukumäärästä ja transformaatiofrekvenssi transformoituneiden solujen osuutena eloonjääneistä soluista. Tulosten merkitsevyys on arvioitava soveltuvin tilastollisin menetelmin.
3. RAPORTOINTI
3.
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot:
käytetty solutyyppi, soluviljelmien lukumäärä, soluviljelmien edelläpitomenetelmät,
koeolosuhteet: tutkittavan aineen pitoisuus, käytetty kantaja-aine, inkubaatioaika, altistuksen kesto ja toistokerrat, solutiheys altistuksen aikana, käytetty eksogeeninen metabolinen aktivaatiojärjestelmä, positiiviset ja negatiiviset kontrollit, tarkasteltavana olleen fenotyypin kuvaus, mahdollisesti käytetty valikointimenetelmä, annostuksen valinnassa käytetyt perusteet,
eloonjääneiden ja transformoituneiden solujen laskentamenetelmä,
tulosten tilastollinen käsittely,
tulosten pohdinta,
tulosten tulkinta.
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA Ks. Yleisjohdanto, osa B.
4. LÄHDELUETTELO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
B.22.
1. MENETELMÄ
1.
1.1 JOHDANTO Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.2 MÄÄRITELMÄT Ks. Yleisjohdanto, osa B.
1.3 VERTAILUAINEET Ei ole.
1.4 TESTIN PERIAATE Dominoivat letaalivaikutukset aiheuttavat alkio- tai sikiökuolemia. Kun kemialliselle aineelle altistus aiheuttaa dominoivia letaalivaikutuksia, on syytä olettaa, että aineella on testattavan lajin sukusoluihin kohdistuvia vaikutuksia. Dominoivia letaalivaikutuksia pidetään yleisesti kromosomivaurioista (rakenteellisista ja numeerisista poikkeamista) johtuvina. Sikiökuolemat voivat myös johtua toksisista vaikutuksista, mikäli naaraat on altistettu. Tässä testissä altistetaan tavallisesti urokset testattavalle yhdisteelle ja pariutetaan altistamattomien ennen pariutumattomien naaraiden kanssa. Sukusolujen eri asteita voidaan tutkia erikseen jaksottamalla pariuttamisvälit. Kuolleiden munasolujen lisääntyminen testiryhmän naarasta kohden verrattuna kontrolliryhmän naaraisiin osoittaa munasolun kohdun seinämään kiinnittymisen jälkeen tapahtuneet menetykset. Ennen sitä tapahtuneet menetykset voidaan arvioida laskemalla munasarjojen keltarauhaset tai vertaamalla kiinnittyneiden munasolujen kokonaismäärää naarasta kohden testiryhmässä ja kontrolliryhmässä. Dominoiva kokonaisletaalivaikutus on ennen ja jälkeen kiinnittymisen kuolleitten munasolujen yhteismäärä. Se lasketaan vertaamalla elävien kohdun seinämään kiinnittyneiden munasolujen määrää testiryhmän naarasta kohden vastaavasti kontrolliryhmän naarasta kohden. Tietyin väliajoin tapahtuva määrän väheneminen voi johtua solujen (spermatosyyttien ja spermatogonioiden) kuolemasta.
1.5 LAATUKRITEERIT Ei ole.
1.6 TESTIN KUVAUS
1.6 Testin valmistelu
Jos mahdollista, testattavat aineet olisi liuotettava tai seostettava isotoniseen suolaliuokseen. Veteen liukenemattomat kemikaalit liuotetaan sopivia liuottimia käyttäen. Liuottimella ei saa olla testattavaan kemikaaliin kohdistuvia vaikutuksia eikä myrkkyvaikutuksia. Käyttöliuoksen on oltava vastavalmistettua.
Koe-olosuhteet
Antotapa
Testattava yhdiste annetaan tavallisesti yhtenä annoksena. Toistuvaa annostelua voidaan käyttää, jos aineen tiedossa olevat myrkkyvaikutukset edellyttävät sitä. Tavanomaiset antotavat ovat suun kautta ruokintaletkulla ja vatsaontelonsisäinen ruiske. Muitakin antotapoja voidaan käyttää.
Koe-eläimet
Rotta tai hiiri on suositeltavin eläinlaji. Terveet, täysin sukukypsät eläimet jaetaan satunnaisesti tutkimus- ja kontrolliryhmiin.
Lukumäärä ja sukupuoli
Altistettujen urosten lukumäärästä päätettäessä on otettava huomioon määritettävänä olevan biologisen ominaisuuden spontaani vaihtelu. Lukumäärän on perustuttava ennalta määritettyyn toteamisherkkyyteen ja merkitsevyyteen. Tyypillisessä testissä on uroksia kussakin annosryhmässä oltava niin monta, että 30-50 naarasta tulee kantavaksi kunkin pariutumisajan kuluessa.
Negatiivisten ja positiivisten kontrollien käyttö
Kuhunkin testiin on yleensä liitettävä positiivinen ja negatiivinen (liuotin) kontrolli. Jos kokeen suorittavassa laboratoriossa on käytettävissä äskettäin tehtyjen kokeiden positiivisia kontrollituloksia, näitä voidaan käyttää meneillään olevan testin positiivisen kontrollin asemesta. Positiivia kontrolliaineita on käytettävä alhaisina annoksina (esimerkiksi MMS:ää vatsaontelon sisäisesti 10 mg/kg) osoittamaan testiherkkyyttä.
Annostasot
Tavallisesti käytetään kolmea annostasoa. Korkeimman annoksen olisi aiheutettava altistetuissa koe-eläimissä myrkkyoireita tai lisääntymiskyvyn alenemista. Eräissä tapauksissa pelkästään korkein kerta-annos saattaa olla riittävä.
Raja-annostesti
Myrkyttömiä aineita käytetään 5 g/kg, kun annoskertoja on yksi, tai 1 g/kg/päivä, kun annostelu on toistuvaa.
Testin suorittaminen
Altistustapoja on useita. Testattavan aineen antaminen kerta-annoksena on yleisimmin käytetty tapa. Muitakin tapoja voidaan käyttää. Yksittäiset urokset pariutetaan peräkkäin yhden tai kahden altistamattoman ja astuttamattoman naaraan kanssa määräajoin altistuksen jälkeen. Naaraita on pidettävä uroksen luona vähintään yhden estrussyklin ajan tai kunnes pariutumisen on todettu tapahtuneen emättimessä esiintyvän sperman tai emätintulpan perusteella. Altistustapa määrää altistamisen jälkeen tapahtuvien pariutumisten määrän. Pariutumisia olisi oltava niin monta, että kaikista sukusoluasteista saadaan näytteet altistuksen jälkeen. Naaraat lopetetaan tiineyden puolenvälin jälkeen ja kohdusta lasketaan kuolleet ja elävät sikiöt. Munasarjoista voidaan laskea keltarauhasten määrä.
2. TULOKSET Tulokset esitetään taulukkomuodossa, josta ilmenee urosten ja kantavien naaraiden sekä hedelmöittymättömien naaraiden lukumäärä. Jokaisen pariutumisen tulos esitetään kunkin yksittäisen uroksen ja naaraan osalta. Naaraiden osalta kirjataan pariutumisviikko, uroksen saama annostaso, elävien ja kuolleiden alkioiden luku. Dominoivaa kokonaisletaalivaikutusta määritettäessä testiryhmän ja kontrolliryhmän kunkin naaraan elävien alkioiden määrää vertaillaan keskenään. Testiryhmän kuolleiden alkioiden suhde eläviin verrattuna kontrolliryhmän vastaavaan suhteeseen analysoidaan munasolun kohdun seinämään kiinnittymisen jälkeen tapahtuneiden menetysten määrittämiseksi. Jos aineisto on käsitelty siten, että tuloksina ilmoitetaan varhaiset ja myöhäiset kuolemat, tämä on ilmoitettava taulukoissa selvästi. Jos menetykset ennen kohdun seinämään kiinnittymistä on arvioitu, tämä on ilmoitettava. Ennen kiinnittymistä tapahtuneet menetykset voidaan määrittää keltarauhasten ja munasolujen määrän välisenä erona tai kiinnittymisten määränä kohtua kohden kontrolliryhmän pariutumistuloksiin verrattuna. Tulosten merkitsevyys arvioidaan soveltuvin tilastollisin menetelmin.
koe-eläinten laji, kanta, ikä ja paino, eläinten lukumäärä sukupuolta kohden koe- ja kontrolliryhmissä,
testattava aine, liuotin, käytetyt annostasot ja annostasojen valintaperusteet, negatiiviset ja positiiviset kontrollit, tiedot myrkyllisyydestä,
altistustie ja annostelutapa,
pariutumisaikataulu,
pariutumisen toteamistapa,
eläinten lopettamisaika,
dominoivien letaalitekijöiden määritysperusteet,
annos/vastesuhde, jos sovellettavissa,
3220 more provisions are not shown here; each has its own address.