Règlement (CE) no 440/2008 de la Commission du 30 mai 2008 établissant des méthodes d'essai conformément au règlement (CE) no 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil concernant l'enregistrement, l'évaluation et l'autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH) (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

En vigueurVersion 2008-05-30depuis le 2008-06-01

Note B

converti depuis le balisage de l’éditeur. Une note indique comment la structure d’un document a été obtenue, pas la fiabilité de la loi.

Interroger Gelex sur ce texte

Adresse https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/fr

Sommaire

Préambule
1. Article premier
2. Article 2
3. Article 3
4. Article 4
ANNEX
ANNEXE PARTIE A: MÉTHODES DE DÉTERMINATION DES PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES A.l.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.4.
1.5. TABLEAU: APPLICABILITÉ DES MÉTHODES A. B. C. D.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
1.6.1.2. Appareil:
1.6.2
1.6.4.
A.2.
1.
1.4.
1.5. Tableau 1 Comparaison des méthodes
1.6.
1.6.4.
1.6.6.
2. Tableau 2 Facteurs de correction de la température (fT)
A.3.
1.
1.4.
1.4.1.
3. Tableau 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Applicabilité des méthodes
3. Tableau 1.4.1.1.1.4.1.2. Applicabilité des méthodes a)
3. Tableau 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Applicabilité des méthodes a)
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
A.4.
1.
1.4.
1.5. Tableau 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Critère de qualité
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.4.
1.6.4.2.
1.6.5.
1.6.6.
1.6.6.1. Gaz inerte:
1.6.6.2. Préparation de la colonne de saturation:
a)
b)
1.6.7.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
A.5.
1.
1.6.
1.6.4.
1.6.4.1.
1.6.4.1.3. Figure Corps de mesure
1.6.4.2.
1.6.4.2.2. Montage:
a)
b)
2. Tableau Correction des valeurs mesurées de la tension superficielle Valable seulement pour les solutions aqueuses, p≈1 g/cm3
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.6.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Mode opératoire:
1.6.3.3. Appareil
1.6.3.4. Appareillage (voir figures 3 et 4)
1.6.4.
2.
3.
A.8.
1.
1.3. Méthode par agitation en flacon
1.4.
1.5.
1.5.1. Méthode par agitation en flacon
1.5.2. Méthode par agitation en flacon
1.5.3. Méthode par agitation en flacon
1.6.
1.6.2.
1.6.2.1.
1.6.2.3.
1.6.3.
1.6.3.1. Appareil
1.6.3.2. Calcul du temps mort t0
2. Méthode par agitation en flacon
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(7) (13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
A.9.
1.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Appareil d'Abel:
A.10.
1.
1.6.
1.6.2.
3.
A.11.
1.
1.6.
A.12.
1.
1.3.
1.4.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
A.13.
1.
1.6.
1.6.2. a)
2.
A.14.
1.
1.1. a)
1.4.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2. a)
1.6.3.
1.6.3.2. a)
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.15.
1.
1.6.
A.16.
1.
1.6.
1.6.1.
4.(1)
Figure 1 Modèle de cube d'essai de 20 mm
Figure 2 Courbe type température/temps
A.17.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
3.
3.2. a)
A.18.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.19.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.20.
1.
1.5.
1.5.4.
2.
3.
3.1.
A.21.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.2.
2.
2.1. Tableau 1 Exemples de résultats
3.
3.2. a)
4.(1)
Figure 1 Bombe
Figure 2 Porte-bombe
Figure 3 Système d'allumage
Annexe Pour plus de détails, on peut consulter par exemple les normes suivantes.
1.
2.
4.
Annexe Pour plus de détails techniques, on peut, par exemple, consulter les normes suivantes:
Annexe Pour plus de détails techniques, on peut consulter, par exemple, les normes suivantes.
1.
1.2. Pour les substances solides
2.
Annexe 1 Méthode d'estimation
INTRODUCTION
MÉTHODE D'ESTIMATION
CALCUL
PROCÈS-VERBAL
RÉFÉRENCES
Annexe 2
Figure 1 Appareil de détermination de la courbe de pression de vapeur, suivant la méthode dynamique
Figure 2a Appareil de détermination de la courbe de pression de vapeur, selon la méthode statique (en utilisant un manomètre à tube en U)
Figure 2b Appareil de détermination de la courbe de pression de vapeur, suivant la méthode statique (en utilisant un indicateur de pression)
Figure 3 Isoténiscope (voir référence 2)
Figure 4 Appareil de détermination de la courbe de pression de vapeur, suivant la méthode de la balance de pression de vapeur
Figure 5 Modèle d'appareil pour l'évaporation à basse pression grâce à la méthode d'effusion, avec une cellule d'effusion d'un volume de 8 cm3
Figure 6a Exemple de système de débit permettant de déterminer la pression de vapeur par la méthode de saturation des gaz
Figure 6b Modèle de système de détermination de la pression de vapeur par la méthode de saturation des gaz avec un capillaire placé après la chambre de saturation
Figure 7 Exemple de dispositif expérimental pour la méthode du rotor
Figure 8 Modèle de tête de mesure à rotor
ANNEXE
Figure 1 Méthode par élution sur colonne avec pompe de recirculation
Figure 2 Microcolonne type
Figure 3 Microcolonne type
Figure 4 Colonne d'élution avec réservoir d'eau
Annexe METHODES DE CALCUL/ESTIMATION INTRODUCTION
Estimation préliminaire du coefficient de partage.
Principe des méthodes de calcul
Critères de qualité
Calcul
Méthode π de Hansch
Observations i)
Procès-verbal
Annexe II Substances de référence recommandées pour la méthode HPLC
Annexe Figure Moule et accessoires nécessaires à la confection des tas
Figure 1 Appareil d'essai de sensibilité thermique
Figure 2 Essai de sensibilité thermique
Figure 3 Étalonnage de la vitesse d'échauffement pour essai de sensibilité thermique TEMPS (s)
Figure 4 Appareil d'essai de sensibilité au choc
Figure 5 Appareil d'essai de sensibilité à la friction
Annexe Exemples d'autres méthodes de détermination de la masse moléculaire moyenne en nombre (Mn) des polymères
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
Annexe Indications permettant de corriger la teneur en polymères de faible masse moléculaire pour tenir compte des polymères insolubles
PARTIE B MÉTHODES DE DÉTERMINATION DE LA TOXICITÉ ET DES AUTRES EFFETS SUR LA SANTÉ
INTRODUCTION GÉNÉRALE A.
i)
ii)
B.1 bis.
1.
1.4.
1.5.
1.5.3.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
B.1 ter.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
B.2.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1. a)
B.3.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. Estimation de la toxicité pour l'autre sexe
3.
B.4.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
Tableau I Formation d'érythème et d'escarres Formation d'œdème COTATION DES RÉACTIONS CUTANÉES
B.5.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.2.3.
1.4.2.7.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
Tableau I Cotation des réactions oculaires
Cornée
Iris
Conjonctives
Chémosis
B.6.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.2.
1.5.1.3.
1.5.2.
1.5.2.2.
1.5.2.3.
3. Procès-verbal d'essai (GMPT et essai de Buehler)
B.7.
1.
1.4.
1.4.2.
1.4.3.
3. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI
B.8.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1.
pt_2 a)
B.9.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
B.10.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. RAPPORT D'ESSAI
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
B.11.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
B.12.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
1.5.2. a)
2.
3. RAPPORT D'ESSAI
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
B.13/14.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
2.
3. RAPPORT D'ESSAI
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
B.15.
1.
1.6. Préparations
Activation métabolique
Souches d'expérience
Milieux
Utilisation de témoins négatifs et positifs
Concentration d'exposition
Conditions d'incubation
Fréquences de mutation spontanée
Nombre de répétitions
3.
B.16.
1.
1.6. Préparations
Activation métabolique
Souches d'expérience
Milieux
Utilisation de témoins négatifs et positifs
Concentration d'exposition
Conditions d'incubation
Fréquences de recombinaisons mitotiques spontanées
Nombre de répétitions
3.
B. 17.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. RAPPORT D'ESSAI
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
B.18.
1.
1.6. Préparations
Nombre de cultures
Utilisation de témoins négatifs et positifs
Concentration d'exposition
Cellules
Activation métabolique
Préparation des cultures
Traitement des cultures avec la substance d'essai Hépatocytes primaires de rat:
Déterminations autoradiographiques
Détermination LSC
2.
3.
B.19.
1.
1.6. Conditions d'essai
Nombre de cultures
Utilisation de témoins positifs et négatifs
Concentration d'exposition
Préparation des cultures
Traitement
Récolte des cellules
Préparation des chromosomes et coloration
Analyse
3.
B.20.
1.
1.6. Préparations
Stocks
Substance d'essai
Nombre d'animaux
Voie d'administration
Utilisation de témoins négatifs et positifs
Niveau d'exposition
3.
B.21.
1.
1.6. Préparations
Cellules
Milieu
Substance d'essai
Activation métabolique
Utilisation de témoins positifs et négatifs
Concentrations d'exposition
3.
B.22.
1.
1.6. Préparations
Voie d'administration
Animaux d'expérience
Nombre et sexe
Utilisation de témoins négatifs et positifs
Doses
Épreuve limite

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté européenne,

vu le règlement (CE) no 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil du 18 décembre 2006 concernant l'enregistrement, l'évaluation et l'autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH), instituant une agence européenne des produits chimiques, modifiant la directive 1999/45/CE et abrogeant le règlement (CEE) no 793/93 du Conseil et le règlement (CE) no 1488/94 de la Commission ainsi que la directive 76/769/CEE du Conseil et les directives 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE et 2000/21/CE de la Commission, et notamment son article 13, paragraphe 3,

considérant ce qui suit:

(1) Conformément au règlement (CE) no 1907/2006, il convient que des méthodes d'essai soient adoptées au niveau communautaire aux fins de la réalisation d'essais sur des substances lorsque de tels essais sont nécessaires pour produire des informations sur les propriétés intrinsèques desdites substances.

(2) La directive 67/548/CEE du Conseil du 27 juin 1967 concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses définissait, à l'annexe V, les méthodes permettant de déterminer les propriétés physico-chimiques, la toxicité et l'écotoxicité des substances et préparations. L'annexe V de la directive 67/548/CEE a été supprimée par la directive 2006/121/CE avec effet au 1er juin 2008.

(3) Il y a lieu que les méthodes d'essai de l'annexe V de la directive 67/548/CEE soient intégrées dans le présent règlement.

(4) Le présent règlement n'exclut pas l'utilisation d'autres méthodes d'essai à condition que ladite utilisation soit conforme aux dispositions de l'article 13, paragraphe 3, du règlement (CE) no 1907/2006.

(5) Il importe que les principes de remplacement, de réduction et d'affinement de l'utilisation des animaux dans les procédures soient pleinement pris en compte lors de l'élaboration des méthodes d'essai, notamment lorsque des méthodes appropriées et validées permettant de remplacer, réduire ou affiner les essais sur les animaux deviennent disponibles.

(6) Les dispositions du présent règlement sont conformes à l'avis du comité institué par l'article 133 du règlement (CE) no 1907/2006,

A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:

Article premier

Les méthodes d'essai à appliquer aux fins du règlement (CE) no 1907/2006 sont définies à l'annexe du présent règlement.

Article 2

La Commission procède, si nécessaire, à une révision des méthodes d'essai établies dans le présent règlement en vue de remplacer, réduire ou affiner les essais menés sur les animaux vertébrés.

Article 3

Toutes les références à l'annexe V de la directive 67/548/CEE s'entendent comme des références au présent règlement.

Article 4

Le présent règlement entre en vigueur le jour suivant celui de sa publication au Journal officiel de l'Union européenne.

Il s'applique à compter du 1er juin 2008. Fait à Bruxelles, le 30 mai 2008. Par la Commission Stavros Dimas Membre de la Commission

ANNEX

ANNEXE PARTIE A: MÉTHODES DE DÉTERMINATION DES PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES A.l.

TEMPÉRATURE DE FUSION/DE CONGÉLATION

1. MÉTHODE La plupart des méthodes décrites se basent sur les lignes directrices de l'OCDE (1). Leurs principes fondamentaux sont décrits dans les références (2) et (3).

1.

1.1. INTRODUCTION Les méthodes et les appareils décrits ci-après permettent de déterminer la température de fusion des produits chimiques, quel que soit leur degré de pureté. La sélection de la méthode dépend de la nature de la substance à tester. Par conséquent, le facteur limitant dépend du fait que la substance peut être facilement ou difficilement pulvérisable ou peut ne pas l'être du tout. Pour certaines substances, il est préférable de déterminer la température de congélation ou de solidification. C'est pourquoi les normes de ces déterminations figurent également dans cette méthode. Lorsqu'il est difficile, du fait de certaines propriétés de la substance, de mesurer les paramètres cités ci-dessus, il peut être approprié de rechercher un point d'écoulement.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La température de fusion est définie comme étant la température à laquelle se produit la transition de phase de l'état solide à l'état liquide, à la pression atmosphérique. Idéalement, cette température correspond à la température de congélation. Étant donné que la transition de phase de nombreuses substances a lieu dans un certain intervalle de température, celle-ci est souvent décrite comme un intervalle de fusion. Conversion des unités (K en oC) t = T – 273,15 t température Celsius en degrés Celsius ( oC) T température thermodynamique en Kelvin (K)

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles devraient servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre les comparaisons avec les résultats obtenus avec d'autres méthodes. Certaines substances d'étalonnage sont énumérées dans la référence (4).

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI La température (intervalle de température) de la phase de transition de l'état solide, à l'état liquide, ou de l'état liquide à l'état solide, est déterminée. En pratique, les températures du début et de la fin de la fusion/congélation sont déterminées au cours du chauffage/refroidissement, à pression atmosphérique, de la substance à étudier. Cinq types de méthodes sont décrites; la méthode en tube capillaire, la méthode par bloc chauffant, la mesure de la température de congélation, les méthodes d'analyse thermique et la détermination du point d'écoulement (mise au point pour les huiles de pétroles). Dans certains cas, il peut être commode de mesurer la température de congélation au lieu de la température de fusion.

1.4.

1.4.1. Méthode du tube capillaire

1.4.1.

1.4.1.1. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bain liquide Une petite quantité de substance finement broyée est placée dans un tube capillaire et tassée avec soin. Le tube est chauffé en même temps qu'un thermomètre dans le bain liquide et l'accroissement de température est ajusté à un peu moins d'1 K/mn pendant la fusion réelle. Les températures correspondant au début et à la fin de la fusion sont relevées.

1.4.1.2. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bloc métallique Le protocole est le même que celui décrit au paragraphe 1.4.1.1, si ce n'est que le tube capillaire et le thermomètre sont placés dans un bloc de métal chauffé et observés à travers des ouvertures aménagées dans ce dernier.

1.4.1.3. Détection photo-électrique L'échantillon contenu dans le tube capillaire est chauffé automatiquement dans un cylindre métallique. Par une ouverture aménagée dans celui-ci, un faisceau de lumière est envoyé à travers la substance à tester vers une cellule photo-électrique soigneusement étalonnée. Au moment de la fusion, les propriétés optiques de la plupart des substances sont modifiées en ce sens que l'opacité fait place à la transparence. De ce fait, l'intensité de la lumière qui atteint la cellule photo-électrique augmente et envoie un signal d'arrêt à l'indicateur digital qui affiche la température d'un thermomètre à résistance de platine placé dans l'enceinte chauffante. Cette méthode n'est pas applicable à certaines substances fortement colorées.

1.4.2. Méthodes avec bloc chauffant

1.4.2.

1.4.2.1. Méthode au banc chauffant de Kofler Le banc chauffant de Kofler est composé de deux pièces de métal de conductivité thermique différente, qui sont chauffées électriquement. Il est construit de façon à ce que le gradient de température soit quasi linéaire sur toute sa longueur. La température de ce banc chauffant peut varier de 283 à 573 K grâce à un dispositif de lecture de la température comprenant un curseur avec un index et une réglette graduée, spécialement conçus pour le banc en question. Pour déterminer une température de fusion, une fine couche de substance est directement déposée sur la surface du banc. En quelques secondes, il se forme une ligne fine de séparation entre la phase fluide et la phase solide. La température à la hauteur de cette ligne est lue en plaçant l'index face à cette dernière.

1.4.2.2. Microscope à fusion Différents microscopes à platine chauffante sont utilisés pour déterminer des températures de fusion avec de très pentes quantités de substance. La température est généralement mesurée à l'aide d'un thermocouple sensible, mais parfois aussi à l'aide d'un thermomètre à mercure. Le dispositif type de mesure de la température de fusion grâce à un microscope à platine chauffante comporte une enceinte chauffante qui contient une platine métallique sur laquelle est posée une lame de verre destinée à recevoir l'échantillon. Le centre de la platine métallique est percé d'un trou permettant le passage de la lumière provenant du miroir éclairant le microscope. Lors de l'utilisation, l'enceinte est fermée à l'aide d'une plaque de verre pour empêcher la circulation d'air dans la région où se trouve l'échantillon. Le chauffage de l'échantillon est réglé au moyen d'un rhéostat. Pour effectuer des mesures très précises sur des substances optiquement anisotropes, il est possible d'utiliser de la lumière polarisée.

1.4.2.3. Méthode du ménisque Cette méthode s'applique spécialement aux polyamides. La température à laquelle se déplace un ménisque d'huile de silicone, emprisonné entre une surface chauffée et une lamelle couvre-objet placée au-dessus de l'échantillon de polyamide à étudier, est déterminée visuellement.

1.4.3. Méthode de détermination de la température de congélation L'échantillon est introduit dans un tube à essai spécial et placé dans un appareil permettant la détermination de la température de congélation. L'échantillon est agité doucement durant tout le refroidissement et la température est relevée à intervalles déterminés. Dès que quelques relevés indiquent une température constante, cette dernière est considérée comme la température de congélation (après correction de l'erreur relative au thermomètre). Il convient d'éviter un refroidissement trop fort en maintenant un équilibre entre la phase liquide et la phase solide.

1.4.4. Analyse thermique

1.4.4.

1.4.4.1. Analyse thermique différentielle (ATD) Cette méthode consiste à enregistrer la différence de température entre la substance et la substance de référence en fonction de la température pendant que la substance et la substance de référence sont soumises à un programme contrôlé de variation de température. Lorsque l'échantillon subit une transition impliquant un changement d'enthalpie, ce changement est indiqué par un mouvement endothermique (fusion) ou exothermique (congélation) sur la ligne de base de l'enregistrement de la température.

1.4.4.2. Analyse calorimétrique différentielle (ACD) Cette technique consiste à soumettre une substance et un produit de référence à un même programme de variation contrôlée de la température et à enregistrer la différence d'énergie absorbée par la substance et par le produit de référence, en fonction de la température. Cette énergie correspond à l'énergie nécessaire pour annuler la différence de température entre la substance et le matériel de référence, Lorsque l'échantillon subit une transition impliquant un changement d'enthalpie, celui-ci est indiqué par un mouvement endothermique (fusion) ou exothermique (congélation) sur la ligne de base de l'enregistrement du flux de chaleur.

1.4.5. Point d'écoulement Cette méthode, mise au point pour les huiles de pétrole, s'applique aux substances huileuses dont la température de fusion est basse. Après un chauffage préliminaire, l'échantillon est refroidi à une vitesse spécifique et son écoulement est observé à des intervalles de 3 K. La température la plus basse à laquelle on observe un mouvement de la substance est considérée comme le point d'écoulement.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ L'applicabilité et la précision des différentes méthodes utilisées pour déterminer la température de fusion/intervalle de fusion sont énumérées dans le tableau suivant.

1.5. TABLEAU: APPLICABILITÉ DES MÉTHODES A. B. C. D.

Méthodes du tube capillaire Méthode de mesure Substances pulvérisables Substances difficilement pulvérisables Gamme de températures Précision approximative Norme existante Dispositifs de mesure de la température de fusion comportant un bain de liquide oui seulement quelques unes de 273 à 573 K ±0,3 K JIS K 0064 Dispositifs de mesure de la température de fusion comportant un bloc métallique oui seulement quelques unes de 293 à 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Détection photoélectrique oui plusieurs avec des dispositifs d'application de 253 à 573 K ±0,5 K Méthodes utilisant une surface chauffée et méthode de mesure de la température de congélation Méthode de mesure Substances pulvérisables Substances difficilement pulvérisables Gamme de températures Précision approximative Norme existante Banc chauffant de Kofler oui non de 283 à > 573 K ±1,0 K ANSI/ASTM D 345176 Microscope a fusion oui quelques-unes seulement de 273 à > 573 K ±0,5 K DIN 53736 Méthode du ménisque non spécifique aux polyamides de 293 à > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Méthodes de mesure de la température de congélation oui oui de 223 à 573 K ±0,5 K par ex. BS 4695 Analyses thermiques Méthode de mesure Substances pulvérisables Substances difficilement pulvérisables Gamme de températures Précision approximative Norme existante Analyse thermique différentielle oui oui de 173 à 1273 K jusqu'à 600 K ±0,5 K jusqu'à 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Analyse calorimétrique différentielle oui oui de 173 à 1273 K jusqu'à 600 K ±0,5 K jusqu'à 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Point d'écoulement Méthode de mesure Substances pulvérisables Substances difficilement pulvérisables Gamme de températures Précision approximative Norme existante Point d'écoulement pour les huiles de pétrole et les substances huileuses pour les huiles de pétrole etles substances huileuses De 223 à 323 K ±3,0 K ASTM D 9766

1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES Les procédures de presque toutes les méthodes d'essai ont été décrites dans des normes internationales et nationales (voir annexe 1).

1.6.

1.6.1. Méthodes en tube capillaire Lorsqu'elles sont soumises à une élévation lente de la température, les substances finement pulvérisées montrent habituellement les stades de fusion représentés à la figure 1.

1.6.1.

Figure 1 Stade A Stade B Stade C Stade D Stade E Stade A (début de la fusion) : de fines gouttes adhèrent uniformément à la paroi intérieure du tube capillaire. Stade B un espace apparaît entre l’échantillon et la paroi intérieure, en raison de la rétraction du produit en fusion. Stade C l’échantillon rétracté commence à s’affaisser et à se liquéfier. Stade D un ménisque complet se forme à la surface, mais une partie importante de l’échantillon reste à l’état solide. Stade E (fin de la fusion) : il n’y a plus aucune particule solide. Durant la détermination de la température de fusion, il y a lieu de relever la température au début et à la fin de la fusion.

1.6.1.1. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bain liquide La figure 2 décrit un type d'appareil de mesure de la température de fusion standardisé (JIS K 0064); l'appareil est en verre et toutes les spécifications sont exprimées en millimètres.

1.6.1.1.

Figure 2 A: Ballon de mesure B: Bouchon C: Tube d’aération D: Thermomètre E: Thermomètre auxiliaire F: Bain liquide G: Tube capillaire en verre (80 à 100 mm de longueur, 1 mm ± 0,2 mm de diamètre intérieur et 0,2 à 0,3 mm d’épaisseur de paroi) H: Tube latéral

Bain liquide:

Il convient de choisir un liquide approprié en fonction de la température de fusion à déterminer; on utilisera, par exemple de la paraffine liquide pour des températures de fusion ne dépassant pas 473 K et de l'huile de silicone pour les températures de fusion ne dépassant pas 573 K. Pour les températures de fusion dépassant 523 K, un mélange composé de trois parties d'acide sulfurique et de deux parties de sulfate de potassium (en rapport de masse) peut être utilisé. Il convient de prendre des précautions appropriées pour utiliser un mélange de ce type.

Thermomètre:

Seuls peuvent être utilisés les thermomètres qui répondent aux exigences des normes suivantes ou de leurs équivalents: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Procédé:

La substance sèche est finement broyée dans un mortier et introduite dans un tube capillaire scellé à une extrémité, la hauteur du remplissage étant fixée à environ 3 mm après tassement. Pour obtenir un échantillon uniformément tassé, il faut laisser tomber le tube capillaire d'une hauteur d'environ 700 mm à l'intérieur d'un tube de verre posé verticalement sur un verre de montre. Le tube capillaire rempli est placé dans le bain de telle sorte que la partie centrale du réservoir à mercure du thermomètre soit en contact avec la partie du tube capillaire où se trouve l'échantillon. En général, le tube capillaire est introduit dans l'appareil au moment où le bain est à environ 10 K en dessous de la température de fusion. Le chauffage du bain est réglé pour que l'accroissement de température soit d'environ 3 K par minute. Le liquide doit être agité. À environ 10 K en dessous de la température de fusion attendue, l'accroissement de température est réglé à un maximum de 1 K par minute.

Calcul:

Le calcul de la température de fusion s'effectue au moyen de la formule suivante: T = TD+0,00016(TD – TE)n où T température de fusion corrigée, exprimée en K TD température lue sur le thermomètre D, exprimée en K TE température lue sur le thermomètre E, exprimée en K n nombre de graduations de la colonne de mercure sur la tige émergente du thermomètre D.

1.6.1.2. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bloc métallique

1.6.1.2. Appareil:

L'appareil comprend:

un bloc métallique cylindrique, dont la partie supérieure est creuse et forme une enceinte (voir figure 3),

un bouchon métallique, percé de deux ou plusieurs trous, permettant l'introduction des tubes dans le bloc métallique,

un système de chauffage du bloc métallique, qui peut être constitué d'une résistance électrique dans le bloc,

un rhéostat pour régler la puissance dans le cas d'un chauffage électrique,

quatre fenêtres en verre résistant à la chaleur, percées dans les parois latérales de l'enceinte, en position diamétralement opposée. Un oculaire permettant d'observer le tube capillaire est installé en face d'une de ces fenêtres. Les trois autres fenêtres permettent d'éclairer l'intérieur de l'enceinte à l'aide de lampes,

un tube capillaire, en verre résistant à la chaleur, scellé à une extrémité (voir point 1.6.1.1).

Thermomètre:

Voir nonnes mentionnées au point 1.6.1.1. Des instruments de mesure thermoélectriques de précision équivalente sont aussi utilisables.

Figure 3 Thermomètre Tube capillaire Bouchon en métal Oculaire Lampe Résistance électrique Bloc en métal chauffant

1.6.1.3. Détection photo-électrique Appareil et procédé: L'appareil consiste en une enceinte métallique pourvue d'un système de chauffage automatisé. Trois tubes capillaires sont remplis comme prévu au point 1.6.1.1 et placés dans le four. Plusieurs programmes d'accroissement linéaire de la température permettant d'étalonner l'appareil. L'accroissement de température approprié est électriquement réglé à un taux constant et linéaire présélectionné. Des enregistreurs indiquent la température réelle du four et la température de la substance dans les tubes capillaires.

1.6.2 Méthode de la surface chauffée

1.6.2

1.6.2.1 Banc chauffant de Kofler Voir annexe.

1.6.2.2 Microscope à fusion Voir annexe.

1.6.2.3 Méthode du ménisque (polyamides) Voir annexe. Aux alentours de la température de fusion, l'accroissement de la température doit être inférieur à 1 K/mn.

1.6.3. Méthodes de détermination de la température de congélation. Voir annexe.

1.6.4. Analyses thermiques

1.6.4.

1.6.4.1. Analyse thermique différentielle Voir annexe

1.6.4.2. Analyse calorimétrique différentielle Voir annexe.

1.6.5. Détermination du point d'écoulement Voir annexe.

2. DONNÉES La correction du thermomètre s'impose dans certains cas.

3. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: La température de fusion indiquée dans le rapport est donnée par la moyenne de deux mesures au moins qui ne dépassent pas les limites de la précision estimée (voir tableau). Si la différence de température entre le début et la fin de la fusion se trouve dans les limites de précision de la méthode, la température relevée au stade final de la fusion est considérée comme la température de fusion; sinon les deux températures sont indiquées. Si la substance se décompose ou se sublime avant que la température de fusion soit atteinte, la température à laquelle cela se produit doit être mentionnée. Toutes les informations et observations pertinentes pour l'interprétation des résultats doivent être mentionnées, en particulier les impuretés et l'état physique de la substance.

la méthode utilisée,

les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) et, éventuellement, l'étape de purification préliminaire,

une estimation de la précision.

4.1)2)3)4) RÉFÉRENCES OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice no 102, décision du Conseil C(81) 30 final. UIPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II, 803-834. R. Weissberger ed., Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. UICPA, Mesures physico-chimiques: Catalogue de substances de référence pour les laboratoires nationaux, Chimie pure et appliquée, 1976, vol. 48, 505-515.

A.2. TEMPÉRATURE D'ÉBULLITION

A.2.

1. MÉTHODES La plupart des méthodes décrites se fondent sur les lignes directrices de l'OCDE (1). Les principes fondamentaux sont décrits dans les références (2) et (3).

1.

1.1. INTRODUCTION Les méthodes et dispositifs décrits ici peuvent être appliqués aux substances liquides et à température de fusion faible, à condition qu'elles ne subissent pas de réaction chimique au-dessous de la température d'ébullition (par exemple, auto-oxydation, réarrangement, dégradation, etc.). Les méthodes s'appliquent aux substances liquides pures et impures. L'importance donnée aux méthodes recourant à la détection photoélectrique et à l'analyse thermique est due au fait que ces méthodes permettent de déterminer non seulement la température de fusion, mais également la température d'ébullition. De surcroît, les mesures peuvent être effectuées de manière automatique. La méthode dynamique a l'avantage de pouvoir être également utilisée pour la détermination de la pression de vapeur et il n'est pas nécessaire de ramener la température d'ébullition aux conditions normales de pression (101,325 kPa), puisque la pression normale peut être maintenue au cours de la mesure à l'aide d'un manostat. Observations: L'influence des impuretés sur la détermination de la température d'ébullition dépend beaucoup de la nature de l'impureté. Si l'échantillon contient des impuretés volatiles, susceptibles d'avoir une incidence sur les résultats, il convient de purifier la substance.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La température d'ébullition normale est définie comme la température à laquelle la pression de vapeur d'un liquide s'élève à 101,325 kPa. Si la température d'ébullition n'est pas mesurée à la pression atmosphérique normale, la dépendance de la pression de vapeur vis-à-vis de la température peut être décrite à l'aide de l'équation de Clausius-Clapeyron: log p = Δ Hv2,3 RT+constante où: p pression de vapeur de la substance exprimée en pascal Δ Hv chaleur de vaporisation en J mol – 1 R constante molaire des gaz parfaits = 8,314 J mol – 1 K – 1 T température thermodynamique exprimée en K La température d'ébullition est établie en tenant compte de la pression ambiante au moment de la mesure. Conversions Pression (unité: kPa) 100 kPa 1 bar = 0,1 MPa (l'utilisation du bar est toujours permise mais non recommandée); 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (l'utilisation des unités mm Hg et Torr n'est pas permise); 1 atm atmosphère standard = 101,325 Pa (l'utilisation de l'unité atm n'est pas permise). Température (unité: K) t = T - 273,15 t température Celsius, exprimée en degré Celsius ( oC) T température thermodynamique, exprimée en kelvin (K)

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE II n'est pas nécessaire d'utiliser des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Ces substances de référence doivent servir en premier lieu à vérifier la fiabilité de la méthode de temps à autre et à permettre la comparaison avec les résultats obtenus à l'aide d'autres méthodes. Certaines substances d'étalonnage figurent dans les méthodes énumérées dans l'annexe.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Cinq méthodes de détermination de la température d'ébullition (intervalle d'ébullition) sont fondées sur la mesure de la température d'ébullition, deux autres sont fondées sur une analyse thermique.

1.4.

1.4.1. Méthode de l'ébulliomètre Bien que les ébulliomètres aient été à l'origine mis au point pour la détermination du poids moléculaire par élévation de la température d'ébullition, ils se prêtent également aux mesures exactes de la température d'ébullition. Un appareil très simple est décrit dans la norme ASTM D 1120-72 (voir annexe). Dans cet appareil, le liquide est chauffé jusqu'à ébullition à la pression atmosphérique (conditions d'équilibre).

1.4.2. Méthode dynamique Cette méthode comporte la mesure de la température de recondensation de la vapeur à l'aide d'un thermomètre approprié placé dans le reflux pendant l'ébullition. La pression peut être modifiée dans cette méthode.

1.4.3. Méthode par distillation à la température d'ébullition Cette méthode comporte la distillation du liquide, la mesure de la température de recondensation de la vapeur et la détermination de la quantité de distillat.

1.4.4. Méthode selon Siwoloboff Un échantillon est chauffé dans un tube à essai, qui est immergé dans le liquide contenu dans un bain chauffant. Un capillaire scellé, contenant une bulle d'air dans sa partie inférieure, est plongé dans le tube à essai.

1.4.5. Détection photoélectrique Suivant le principe de Siwoloboff, l'ascension des bulles permet une mesure photoélectrique automatique.

1.4.6. Analyse thermique différentielle Cette technique permet d'enregistrer la différence de température entre la substance et une substance de référence, en fonction de la température, pendant que la substance et la substance de référence sont soumises au même programme de variation contrôlée de la température. Lorsque l'échantillon subit une transition impliquant un changement d'enthalpie, celui-ci est indiqué par un mouvement endothermique (ébullition) sur la ligne de base de l'enregistrement de la température.

1.4.7. Analyse calorimétrique différentielle Cette technique permet d'enregistrer la différence entre l'énergie absorbée par une substance et par un produit de référence, en fonction de la température, alors qu'ils sont soumis au même programme de variation contrôlée de la température. Cette énergie correspond à l'énergie nécessaire pour annuler la différence de température entre la substance et le matériel de référence. Lorsque l'échantillon subit une transition impliquant un changement d'enthalpie, celui-ci est indiqué par un mouvement endothermique (ébullition) sur la ligne de base de l'enregistrement du flux de chaleur.

1.5. Tableau 1 Comparaison des méthodes

CRITÈRES DE QUALITÉ L'applicabilité et la précision des différentes méthodes utilisées pour déterminer la température d'ébullition/intervalle d'ébullition sont indiquées dans le tableau 1. Méthode de mesure Précision estimée Norme existante Ébulliomètre ±1,4 K (jusqu'à 373 K) ±2,5 K (jusqu'à 600 K) ASTM D 1120-72 Méthode dynamique ±0,5 K (jusqu'à 600 K) Méthode de distillation (intervalle d'ébullition) ±0,5 K (jusqu'à 600 K) ISO/R918, DIN 53171, BS 4591/71 Méthode selon Siwoloboff ± 2 K (jusqu'à 600 K) Détection photoélectrique ±0,3 K (à 373 K) Calorimétrie ±0,5 K (jusqu'à 600 K) ±2,0 K (jusqu'à 1273 K) ASTM E 537-76 Analyse calorimétrique différentielle ±0,5 K (jusqu'à 600 K) ±2,0 K (jusqu'à 1273 K) ASTM E 537-76

1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES Les procédures de certaines méthodes d'essai ont été décrites dans des normes internationales et nationales (voir annexe).

1.6.

1.6.1. Ébulliomètre Voir annexe.

1.6.2. Méthode dynamique Voir méthode d'essai A.4 pour la détermination de la pression de vapeur. La température d'ébullition est enregistrée à une pression de 101,325 kPa.

1.6.3. Méthode de distillation (intervalle d'ébullition) Voir annexe.

1.6.4. Méthode selon Siwoloboff L'échantillon est introduit dans un tube à essai ayant environ 5 mm de diamètre et chauffé dans un appareil servant à la détermination de la température de fusion (figure 1). La figure 1 donne un exemple d'appareil normalisé servant à déterminer la température de fusion et la température d'ébullition (JIS K 0064) (l'appareil est en verre et toutes les spécifications sont données en millimètres). Un tube capillaire (capillaire d'ébullition) scellé à environ 1 cm au-dessus de son extrémité inférieure est plongé dans le tube à essai contenant la substance à étudier. La partie scellée du capillaire doit se trouver au-dessous de la surface du liquide. Le tube à essai contenant le capillaire doit être attaché au thermomètre avec un élastique ou fixé au moyen d'un support latéral (voir figure 2). Figure 2 Méthode selon Siwoloboff Figure 3 Méthode modifiée Le liquide du bain est choisi en fonction de la température d'ébullition. Pour des températures allant jusqu'à 573 K, on peut utiliser de l'huile de silicone. La paraffine liquide ne convient que pour des températures inférieures à 473 K. Au départ, le chauffage du bain doit être réglé de façon à obtenir un accroissement de température de 3 K/min. Le liquide du bain doit être agité. À environ 10 K au-dessous de la température d'ébullition présumée, le chauffage est réduit de telle sorte que l'accroissement de température ne dépasse pas 1 K par minute. À l'approche de la température d'ébullition, des bulles commencent à s'échapper rapidement du capillaire à l'ébullition. La température d'ébullition est déterminée par la température à laquelle, lors d'un refroidissement momentané, le chapelet de bulles s'interrompt et le liquide s'élève soudain dans le capillaire. La température relevée à ce moment précis correspond à la température d'ébullition de la substance. Dans la méthode modifiée (figure 3), la température d'ébullition est déterminée dans un capillaire à température de fusion. L'extrémité de ce dernier est étirée en une fine pointe d'environ 2 centimètres de longueur (a) et une petite quantité de la substance à tester est aspirée à l'intérieur. La pointe est alors scellée en emprisonnant une petite bulle d'air. Lors du chauffage dans l'appareil servant à déterminer la température de fusion (b), la bulle d'air se dilate. La température d'ébullition correspond à la température à laquelle l'échantillon de la substance atteint le niveau de la surface du bain de liquide (c).

1.6.4.

Figure 1 A: Ballon de mesure B: Bouchon C: Tube d’aération D: Thermomètre E: Thermomètre auxiliaire F: Bain de liquide G: Tube à essais (diamètre extérieur de 5 mm au maximum), contenant un tube capillaire, d’environ 100 mm de longueur, 1 mm de diamètre interne et 0,2 à 0,3 mm d’épaisseur de paroi H: Tube latéral

1.6.5. Détection photoélectrique Un échantillon de la substance à tester est chauffé dans un tube capillaire placé à l'intérieur d'un bloc métallique chauffant. Un faisceau de lumière est envoyé, par les ouvertures aménagées dans le bloc, à travers la substance vers une cellule photoélectrique étalonnée de façon précise. Durant l'élévation de la température de l'échantillon, quelques bulles d'air s'échappent du capillaire d'ébullition. Lorsque la température d'ébullition est atteinte, le nombre de bulles augmente très fortement. La modification de l'intensité lumineuse qui s'ensuit est enregistrée par la cellule, qui envoie un signal d'arrêt à l'indicateur de température (thermomètre à résistance de platine placé dans le bloc). Cette méthode est particulièrement utile parce qu'elle permet d'effectuer des déterminations au-dessous de la température ambiante jusqu'à 253,15 K (– 20 oC) sans aucune modification de l'appareil. L'instrument doit simplement être placé dans un bain réfrigérant.

1.6.6. Analyse thermique

1.6.6.

1.6.6.1. Analyse thermique différentielle Voir annexe.

1.6.6.2. Analyse calorimétrique différentielle Voir annexe.

2. Tableau 2 Facteurs de correction de la température (fT)

DONNÉES Pour de faibles écarts par rapport à la pression normale (maximum ±5 kPa), les températures d'ébullition peuvent être ramenées à Tn par l'équation de Sidney Young: Tn = T + (fT × Δ p) où: Δ p (101,325 - p) [attention au signe] p pression barométrique en kPa fT vitesse de variation de la température d'ébullition avec la pression, en K/kPa T valeur mesurée de la température d'ébullition, en K Tn valeur corrigée de la température d'ébullition, en K, à la pression normale. Les facteurs de correction de la température (fT) et les équations de calcul des approximations figurent dans les normes internationales et nationales citées dans le texte (valable pour de nombreuses substances). Par exemple, la méthode DIN 53171 donne les corrections pour les solvants contenus dans les peintures: Température T (K) Facteur de correction fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47

3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essais contiendra, si possible, les renseignements suivants: La température d'ébullition indiquée dans le procès-verbal est la moyenne d'au moins deux mesures qui se situent à l'intérieur des limites de précision estimées (tableau 1). Les valeurs mesurées des températures d'ébullition ainsi que leurs moyennes doivent être indiquées et la (les) pression(s) à laquelle (auxquelles) ont été effectuées les mesures doit (doivent) être notée(s) en kPa. La pression doit de préférence être proche de la pression atmosphérique normale. Toutes les informations et observations pertinentes pour l'interprétation des résultats doivent être fournies, notamment en ce qui concerne les impuretés et l'état physique de la substance.

la méthode utilisée,

les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) et, éventuellement, l'étape de purification préliminaire,

une estimation de la précision.

4.(1)(2)(3) RÉFÉRENCES OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice no 103, décision du Conseil C(81) 30 final. UICPA, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Expérimenta! thermodynamics, Buttenworths, London, 1975, vol. II. R. Weissberger éd.: Technique of organic chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. 1, Part I, Chapter VIII.

A.3. DENSITÉ RELATIVE

A.3.

1. MÉTHODE Les méthodes décrites se fondent sur les lignes directrices de l'OCDE (1). Les principes fondamentaux sont décrits dans la référence (2).

1.

1.1. INTRODUCTION Les méthodes de détermination de la densité relative décrites s'appliquent aux substances solides et liquides, quel que soit leur degré de pureté. Les diverses méthodes à appliquer sont énumérées dans le tableau 1.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La densité relative D204 des solides ou des liquides est le rapport entre la masse d'un volume de substance à tester, déterminée à 20 oC, et la masse du même volume d'eau, déterminée à 4 oC. La densité relative est un nombre sans dimension. La masse volumique, P, d'une substance est le quotient de la masse, m, par son volume, v. En unités SI, la masse volumique, P, est exprimée en kg/m3.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE (1) (3) Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles devraient servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre les comparaisons avec les résultats obtenus avec d'autres méthodes.

1.4. PRINCIPE DES MÉTHODES Quatre types de méthodes sont utilisés.

1.4.

1.4.1. Méthodes de flottabilité

1.4.1.

1.4.1.1 Aréomètre (pour les liquides) On peut obtenir des mesures de densité suffisamment précises et rapides à l'aide d'aréomètres flottants qui permettent de déduire la densité d'un liquide à partir de la profondeur d'immersion repérée sur une échelle graduée.

1.4.1.2 Balance hydrostatique (pour les liquides et les solides) La différence entre le poids d'un échantillon mesuré dans l'air et dans un liquide approprié (par exemple l'eau) peut servir à déterminer sa densité. Dans le cas des solides, la densité mesurée n'est représentative que de l'échantillon utilisé. Pour déterminer la densité d'un liquide, on pèse un corps d'un volume v tout d'abord dans l'air, puis dans le liquide.

1.4.1.3 Méthode du corps immergé (pour les liquides) (4) Dans cette méthode, la densité d'un liquide est déterminée à partir de la différence entre les résultats de la pesée du liquide avant et après immersion d'un corps de volume connu dans le liquide à étudier.

1.4.2. Méthodes pycnométriques Pour les solides ou les liquides, on peut utiliser des pycnomètres de forme variée dont les volumes sont connus. La densité est calculée à partir de la différence de poids entre le pycnomètre plein et le pycnomètre vide, d'une part, et de son volume connu, d'autre part.

1.4.3. Pycnomètre de comparaison à air (pour les solides) La densité d'un solide de forme quelconque peut être mesurée, à la température ambiante, à l'aide d'un pycnomètre de comparaison à gaz. Le volume d'une substance dans l'air ou dans un gaz inerte est mesuré dans une éprouvette graduée de volume variable. Pour le calcul de la densité, une mesure de masse est effectuée après la mesure du volume.

1.4.4. Densimètre oscillant (5) (6) (7) La densité d'un liquide peut être mesurée à l'aide d'un densimètre oscillant. Un oscillateur mécanique, ayant la forme d'un U, vibre à une fréquence de résonance spécifique qui dépend de sa masse. L'introduction d'un échantillon modifie la fréquence de résonance de l'oscillateur. L'appareil doit être étalonné à l'aide de deux substances liquides de densités connues, choisies de préférence de façon à ce que leurs densités couvrent l'intervalle de mesure.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ L'applicabilité des différentes méthodes utilisées pour la détermination de la densité relative est représentée au tableau.

1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES Les références des normes citées en exemple, qui peuvent être consultées pour obtenir des détails techniques supplémentaires, sont jointes à l'annexe. Les mesures doivent être réalisées à 20 oC, et au moins en double.

2. DONNÉES Voir normes.

3. Tableau 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Applicabilité des méthodes

RÉSULTATS Le procès-verbal contiendra, si possible, les renseignements suivants: La densité relative D204 doit être indiquée selon la définition figurant au point 1.2 en même temps que l'état physique de la substance examinée. Toutes les informations et observations pertinentes pour l'interprétation des résultats doivent être mentionnées, en particulier en ce qui concerne les impuretés et l'état physique de la substance. Méthode de mesure Densité Viscosité dynamique maximale possible Normes existantes solide liquide Aréomètre oui 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Balance hydrostatique oui ISO 1183 (A) oui 5 Pa s ISO 901 et 758 Méthode du corps immergé oui 20 Pa s DIN 53217 Pycnomètre ISO 3507 oui ISO 1183 (B), NF T 20-053 oui 500 Pa s ISO 758 Pycnomètre de comparaison à air oui DIN 55990 partie 3, DIN 53243 Densimètre oscillant oui 5 Pa s

la méthode utilisée,

les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) et, éventuellement, l'étape de purification préliminaire.

3. Tableau 1.4.1.1.1.4.1.2. Applicabilité des méthodes a)

solides

liquides

3. Tableau 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Applicabilité des méthodes a)

solides

liquides

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

RÉFÉRENCES OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice no 109, décision du Conseil C(81) 30 final. R. Weissberger éd., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realisation of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 427-430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung — Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.

A.4. PRESSION DE VAPEUR

A.4.

1. MÉTHODES La plupart des méthodes décrites se fondent sur les lignes directrices de l'OCDE (1). Les principes fondamentaux sont énoncés dans les références (2) et (3).

1.

1.1. INTRODUCTION Il est souhaitable de disposer d'informations préliminaires concernant la structure, la température de fusion et la température d'ébullition de la substance avant de procéder à cet essai. Il n'existe aucune méthode de mesure qui soit applicable à toute la gamme des pressions de vapeur. C'est pourquoi plusieurs méthodes sont recommandées pour la mesure des pressions de vapeur allant de < 10 – 4 Pa à 105 Pa. D'une manière générale, les impuretés ont sur la pression de vapeur une incidence dont l'importance dépend en grande partie de la nature de l'impureté. Si l'échantillon contient des impuretés volatiles qui peuvent avoir une influence sur le résultat, il convient de purifier la substance. Il peut également être nécessaire d'indiquer la pression de vapeur pour le produit technique. Certaines méthodes décrites ici utilisent des appareils contenant des parties métalliques; ceci doit être pris en considération pour les essais concernant des substances corrosives.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La pression de vapeur d'une substance est la pression de saturation au-dessus d'une substance solide ou liquide. À l'équilibre thermodynamique, la pression de vapeur d'une substance pure est uniquement fonction de la température. L'unité SI de pression à utiliser est le pascal (Pa). Ci-après les unités couramment employées autrefois et leurs facteurs de conversion: 1 torr (– 1 mm Hg) = 1,333 × l02 Pa 1 atmosphère = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa L'unité SI de température est le kelvin (K). La constante molaire des gaz parfaits R est égale à 8,314 J mol – 1 K – 1 La dépendance de la pression de vapeur vis-à-vis de la température est décrite par l'équation de Clausius-Clapeyron: log p = Δ Hv2,3 RT+constante où: p pression de vapeur de la substance, exprimée en pascal Δ Hv chaleur de vaporisation, exprimée en J mol – 1 R constante molaire des gaz parfaits en J mol – 1K – 1 T température thermodynamique, exprimée en kelvin.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles doivent servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre la comparaison avec les résultats obtenus avec d'autres méthodes.

1.4. PRINCIPE DES MÉTHODES Le présent paragraphe propose sept méthodes de détermination de la pression de vapeur qui sont applicables à différentes gammes de pression de vapeur. Dans le cadre de chaque méthode, la pression de vapeur est déterminée à différentes températures. Dans une gamme de températures limitée, le logarithme de la pression de vapeur d'une substance pure est une fonction linéaire de l'inverse de la température.

1.4.

1.4.1. Méthode dynamique La méthode dynamique est fondée sur la mesure de la température d'ébullition qui correspond à une pression spécifiée. Gamme recommandée: de 103 à 105 Pa. Cette méthode a aussi été recommandée pour la mesure de la température d'ébullition normale lorsque celle-ci ne dépasse pas 600 K.

1.4.2. Méthode statique Dans le présent procédé, la pression de vapeur s'établissant dans un système fermé à l'équilibre thermodynamique est déterminée à une température spécifiée. Cette méthode est applicable aux solides et aux liquides qui contiennent un ou plusieurs composants. Gamme recommandée: de 10 à 105 Pa. Cette méthode peut aussi être utilisée dans une gamme allant de 1 à 10 Pa, à condition de prendre des précautions.

1.4.3. Isoténiscope Il s'agit d'une méthode normalisée qui est aussi un procédé statique. Toutefois, elle n'est pas applicable aux systèmes à plusieurs composants. La norme ASTM D-2879-86 contient des informations supplémentaires. Gamme recommandée: de 100 à 105 Pa.

1.4.4. Méthode d'effusion: balance de pression de vapeur La quantité de substance quittant une cellule par unité de temps, par une ouverture de taille connue, est déterminée dans des conditions de vide telles que le retour de la substance dans la cellule soit négligeable (par exemple, par mesure de l'impulsion imprimée à une balance sensible par un jet de vapeur ou encore par la mesure de la perte de poids de la cellule). Gamme recommandée: 10 – 3 à 1 Pa.

1.4.5. Méthode d'effusion: par perte de poids ou par collecte du vaporisat Cette méthode repose sur l'estimation de la masse de la substance à tester qui s'écoule, par unité de temps, d'une cellule de Knudsen (4) sous forme de vapeur, au travers d'un capillaire et dans des conditions de vide poussé. La masse de la vapeur formée peut être mesurée, soit en déterminant la perte de masse de la cellule, soit par condensation de la vapeur à basse température; la quantité de substance volatilisée peut alors être déterminée à l'aide d'une analyse chromatographique. La pression de vapeur est calculée en appliquant l'équation d'Hertz-Knudsen. Gamme recommandée: de 10 – 3 à 1 Pa.

1.4.6. Méthode de saturation des gaz Un courant de gaz porteur inerte est envoyé à travers la substance de telle façon qu'il en ressorte saturé de vapeur. La quantité de matière transportée par un volume connu de gaz porteur peut être mesurée après avoir été recueillie dans un collecteur approprié ou estimée à l'aide d'une technique analytique directe. Le résultat obtenu permet de calculer la pression de vapeur à une température donnée. Gamme recommandée : de 10 – 4 à 1 Pa. Cette méthode est aussi applicable à une gamme de 1 à 10 Pa, à condition de prendre des précautions.

1.4.7. Méthode du rotor Dans la jauge à rotor, l'élément de mesure réel est une petite bille d'acier en suspension dans un champ magnétique qui est soumise à une rotation à grande vitesse. La pression du gaz est déduite du ralentissement de la bille d'acier dû à la pression. Gamme recommandée: de 10 – 4 à 0,5 Pa.

1.5. Tableau 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Critère de qualité

CRITÈRES DE QUALITÉ Le tableau suivant présente une comparaison de différentes méthodes de détermination de la pression de vapeur, pour ce qui est du domaine d'application, de la répétabilité, de la reproductibilité, de la gamme de mesure et des possibilités de normalisation. Méthode de mesure Substance Estimation de la répétabilité Estimation de la reproductibilité Gamme recommandée Norme existante solide liquide Méthode dynamique fusion basse X jusqu'à 25 % jusqu'à 25 % de 103 Pa à 2 × 103 Pa — de 1 à 5 % de 1 à 5 % de 2 × 103 Pa à 105 Pa — Méthode statique X X de 5 à 10 % de 5 à 10 % de 10 Pa à 105 Pa NFT 20-048 (5) Isoténiscope X X de 5 à 10 % de 5 à 10 % de 102 Pa à 105 Pa ASTM-D 2879-86 Méthode d'effusion, balance de pression X X de 5 à 20 % jusqu'à 50 % de 10 – 3 Pa à 1 Pa NFT 20-047 (6) Méthode d'effusion, perte de poids X X de 10 à 30 % — de 10 – 3 Pa à 1 Pa — Méthode de saturation des gaz X X 10 à 30 % jusqu'à 50 % de 10 – 4 Pa à 1 Pa — Méthode par rotation X X de 10 à 20 % — de 10 – 4 Pa à 0,5 Pa —

1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES

1.6.

1.6.1. Mesure dynamique

1.6.1.

1.6.1.1. Appareil L'appareil de mesure comporte un appareil à reflux avec réfrigérant en verre ou en métal (figure 1), un dispositif de mesure de la température et un système de régulation et de mesure de la pression. L'appareil de mesure type représenté sur le schéma est en verre et se compose de cinq parties: Un tube large partiellement à double paroi, comprenant un joint rodé, un réfrigérant, un récipient de refroidissement et un orifice d'admission. Un cylindre de verre relié à une pompe Cottrel, qui est monté sur la section du tube où s'effectue l'ébullition et qui possède une surface rugueuse pour éviter les soubresauts lors de l'ébullition. La température est mesurée à l'aide d'un détecteur approprié (par exemple, un thermomètre à résistance ou un thermocouple à enveloppe) immergé dans l'appareil au point de mesure (no 5, figure 1) par un orifice d'admission approprié (par exemple un joint mâle rodé). Cet appareil est relié à un dispositif de régulation et de mesure de la pression. L'ampoule, qui sert de volume tampon, est reliée à l'appareil de mesure par l'intermédiaire d'un tube capillaire. L'appareil à reflux est chauffé à l'aide d'un élément chauffant (par exemple, une cartouche chauffante) inséré dans le bas de l'appareil en verre. Le courant nécessaire pour le chauffage est établi et contrôlé au moyen d'un thermocouple. Une pompe à vide permet d'obtenir le vide désiré, entre 102 Pa et 105 Pa environ. Une soupape appropriée est utilisée pour contrôler l'arrivée d'air ou d'azote afin d'établir la pression souhaitée (entre 102 et 105 Pa environ) et d'assurer la ventilation. La pression est mesurée à l'aide d'un manomètre.

1.6.1.2. Mesure On mesure la pression de vapeur en déterminant la température d'ébullition de l'échantillon à plusieurs pressions spécifiées comprises entre 103 et 105 Pa environ. La température d'ébullition est atteinte lorsque la température reste constante à une pression donnée. Cette méthode n'est pas applicable aux substances moussantes. La substance est placée dans une colonne propre et sèche. Quand les solides ne sont pas sous forme de poudre, le remplissage peut poser des problèmes. Toutefois, il est parfois possible d'y remédier en chauffant la gaine de refroidissement. Après remplissage, l'appareil est scellé au collet et la substance est dégazée. La plus basse des pressions désirées est alors établie et le système de chauffage est mis en marche en même temps que le détecteur de température est connecté à un enregistreur. L'équilibre est atteint lorsque la température d'ébullition enregistrée est constante pour une pression donnée. Il faut prendre particulièrement soin d'éviter les soubresauts pendant l'ébullition. En outre, il peut se produire une condensation complète sur le réfrigérant. Lors de la détermination de la pression de vapeur de solides dont la température de fusion est basse, il convient de prendre soin d'éviter le bouchage du condenseur. Après enregistrement de ce point d'équilibre, une pression plus élevée est établie. Le processus se poursuit de la même manière jusqu'à ce qu'une pression de 105 Pa soit atteinte (environ 5 à 10 mesures en tout, qui seront répétées pour vérification à des pressions décroissantes).

1.6.2. Mesure statique

1.6.2.

1.6.2.1. Appareil L'appareil comporte un récipient où placer l'échantillon ainsi qu'un système de chauffage et de refroidissement permettant de contrôler et de mesurer la température de l'échantillon. Il comporte également un dispositif de réglage et de mesure de la pression. Les figures 2a et 2b illustrent les principes fondamentaux de cette méthode. La cellule où est placé l'échantillon (figure 2a) est reliée d'un côté à un robinet à vide poussé et, de l'autre, à un tube en U rempli d'un liquide manométrique approprié. L'autre extrémité du tube en U se termine par une tubulure dont les branches mènent à la pompe à vide, à un récipient à azote ou à la soupape de ventilation et à un manomètre. Le tube en U peut être remplacé par une jauge de pression munie d'un indicateur de pression (figure 2b). Pour amener l'échantillon à la température choisie, le récipient contenant l'échantillon ainsi que le robinet et le tube en U ou la jauge de pression sont plongés dans un bain maintenu à une température constante de ±0,2 K. La température est mesurée au niveau de la paroi extérieure du récipient contenant l'échantillon, ou à l'intérieur de celui-ci. Une pompe à vide munie d'un piège réfrigérant en amont est utilisée pour faire le vide dans l'appareil. Dans la méthode 2a, la pression de vapeur de la substance est mesurée indirectement à l'aide d'un indicateur de zéro. Cette méthode tient compte du fait que la densité du fluide dans le tube en U est modifiée par un changement important de la température. Différents liquides, huiles de silicone et phtalates, peuvent être utilisés comme indicateur de zéro dans le tube en U, selon la gamme de pressions et le comportement chimique de la substance. La substance à tester ne doit pas se dissoudre ou réagir d'une manière notable avec le liquide du tube en U. Pour le manomètre, le mercure peut être utilisé pour une gamme de pression d'air normale jusqu'à 102 Pa, alors que les huiles de silicone et les phtalates conviennent au-dessous de 102 Pa et jusqu'à 10 Pa. Quant aux manomètres à membrane chauffables, ils peuvent même être utilisés pour des pressions inférieures à 10 – 1 Pa. Il existe d'autres jauges de pression qui peuvent aussi être utilisées au-dessous de 102 Pa.

1.6.2.2. Mesure Avant la mesure, toutes les parties de l'appareil schématisé sur la figure 2 sont soigneusement nettoyées et séchées. Pour la méthode 2a, le tube en U est rempli avec le liquide choisi, qui doit être dégazé à une température élevée avant d'effectuer les lectures. La substance à tester est placée dans l'appareil, qui est alors fermé, et la température est suffisamment abaissée pour permettre le dégazage. La température doit être assez basse pour que l'air soit aspiré, mais sans toutefois modifier la composition du produit dans le cas de systèmes constitués de plusieurs composants. L'équilibre peut, si nécessaire, être établi plus rapidement par agitation. L'échantillon peut être refroidi plus efficacement, par exemple à l'aide d'azote liquide (attention à la condensation de l'air et du liquide de la pompe) ou d'un mélange d'éthanol et de glace carbonique. Pour les mesures à basse température, il convient d'utiliser un bain thermostaté relié à un cryostat. Pour faire le vide dans l'appareil, l'air est aspiré pendant plusieurs minutes, le robinet qui se trouve au-dessus du récipient contenant l'échantillon étant ouvert. Le robinet est ensuite fermé et l'échantillon est amené à la plus basse des températures voulues. L'opération de dégazage doit, si nécessaire, être répétée plusieurs fois. Lorsque l'échantillon est chauffé, la pression de vapeur augmente, ce qui modifie l'équilibre du liquide dans le tube en U. Pour compenser ce changement, on fait entrer de l'azote ou de l'air dans l'appareil en ouvrant le robinet jusqu'à ce que le liquide indicateur de pression soit revenu au zéro. La pression nécessaire peut être lue sur un manomètre de précision à température ambiante. Cette pression correspond à la pression de vapeur de la substance à une température donnée. La méthode 2b est similaire, mais la pression de vapeur est lue directement. La dépendance de la pression de vapeur vis-à-vis de la température est déterminée à des intervalles appropriés (environ 5 à 10 mesures en tout à intervalles courts) jusqu'au maximum désiré. Les mesures à basse température doivent être répétées pour vérification. Si les valeurs obtenues en effectuant des mesures répétées ne coïncident pas avec la courbe obtenue pour des températures croissantes, cela peut être dû à l'une des raisons suivantes:

1.6.2.2.

1. L'échantillon contient encore de l'air (par exemple, dans le cas de produits d'une viscosité élevée) ou des substances dont la température d'ébullition est basse, qui ont été libérés pendant le chauffage et peuvent être éliminés par aspiration après une étape de surréfrigération supplémentaire.

2. La température de refroidissement n'est pas assez basse. Il faut alors utiliser de l'azote liquide comme réfrigérant. S'il s'avère que le problème est dû à l'une de ces deux raisons, il convient de répéter les mesures.

3. La substance subit une réaction chimique dans la gamme de température utilisée (par exemple: décomposition, polymérisation).

1.6.3. Isoténiscope Pour une description complète de cette méthode, se référer à la référence 7. Le principe de l'appareil de mesure est décrit dans la figure 3. À l'instar de la méthode statique décrite au point 1.6.2, la méthode à l'isoténiscope est applicable aux solides et aux liquides. Dans le cas des liquides, la substance elle-même sert de liquide de remplissage dans le manomètre auxiliaire. Une quantité de liquide suffisante pour remplir l'ampoule et la partie courte du manomètre est versée dans l'isoténiscope. L'isoténiscope est ensuite relié à une pompe à vide; une fois le vide fait dans l'appareil, celui-ci est rempli d'azote. L'évacuation et la purge de système sont répétées deux fois afin d'éliminer l'oxygène résiduel. L'isoténiscope rempli est placé en position horizontale de telle sorte que l'échantillon forme une couche fine dans l'ampoule et dans le manomètre (partie en U). La pression du système est réduite à 133 Pa et l'échantillon est chauffé doucement jusqu'au début de l'ébullition afin d'éliminer les gaz dissous fixés. L'isoténiscope est ensuite placé de telle manière que l'échantillon revienne remplir entièrement l'ampoule et la branche courte du manomètre. La pression est maintenue comme pour le dégazage; la pointe de l'ampoule est chauffée à l'aide d'une petite flamme jusqu'à ce que la vapeur provenant de l'échantillon soit suffisante pour déplacer une partie de l'échantillon de la partie supérieure de l'ampoule et de la branche du manomètre vers la partie manomètre de l'isoténiscope, créant ainsi un espace dépourvu d'azote et rempli de vapeur. L'isoténiscope est ensuite placé dans un bain thermostaté, et la pression d'azote est réglée de manière à être la même que celle de l'échantillon. La balance de pressions est indiquée par la partie manomètre de l'isoténiscope. À l'équilibre, la pression de vapeur de l'azote est égale à celle de la substance. Dans le cas des solides, le manomètre est rempli avec l'un des liquides énumérés au point 1.6.2.1, choisi en fonction de la gamme de pression et de température. L'ampoule du côté de la partie la plus longue de l'isoténiscope est remplie avec le liquide dégazé du manomètre. Le solide à examiner est ensuite introduit dans l'ampoule et dégazé à haute température. L'isoténiscope est alors incliné de telle sorte que le liquide du manomètre puisse couler dans le tube en U. La pression de vapeur est mesurée en fonction de la température conformément à la description présentée au point 1.6.2.

1.6.4. Méthode d'effusion: balance de pression de vapeur

1.6.4.

1.6.4.1. Appareil Plusieurs modèles d'appareil sont décrits dans la littérature (1). L'appareil représenté à la figure 4 illustre le principe général de la méthode. Il se compose principalement d'une cuve à vide poussé en acier inoxydable ou en verre, d'une pompe avec dispositif de mesure du vide et d'un équipement incorporé permettant de mesurer la pression de vapeur sur une balance. Les équipements suivants sont incorporés à l'appareil:

Un four d'évaporation avec bride et canal d'alimentation rotatif. Il s'agit d'un récipient cylindrique, fabriqué par exemple en cuivre ou en un alliage chimiquement résistant d'une bonne conductivité thermique. Un récipient de verre doublé d'une paroi de cuivre peut également être utilisé. Le four a un diamètre de 3 à 5 cm et une hauteur de 2 à 5 cm, environ; il possède d'un à trois orifices d'évaporation de sections différentes. Le chauffage du four est produit, soit par une plaque chauffante située au-dessous, soit par une spirale chauffante qui l'entoure à l'extérieur. Afin d'éviter une dissipation de la chaleur vers le plateau de base, le système de chauffage est fixé sur ce dernier à l'aide d'un métal de faible conductivité thermique (acier au nickel-argent ou au chrome-nickel); par exemple, si le four utilisé est muni de plusieurs orifices, un tuyau d'acier au nickel-argent est attaché à un canal d'alimentation rotatif. Ce dispositif présente l'avantage de permettre l'introduction d'une barre de cuivre, ce qui permet d'assurer le refroidissement par l'extérieur à l'aide d'un bain réfrigérant.

Le couvercle du four en cuivre possédant trois orifices de sections différentes, situés à 90 degrés l'un de l'autre, permet de couvrir plusieurs gammes de pression de vapeur au sein de la gamme de mesures globales (orifices d'un diamètre de 0,30 à 4,50 mm environ). Des ouvertures larges sont utilisées pour les pressions de vapeur basses et vice versa. L'orifice choisi ou une position intermédiaire dans le flux de vapeur (orifice du four — bouclier — plateau de la balance) est sélectionné par rotation du four, ce qui permet de diriger le flux moléculaire sur le plateau de la balance au travers de l'orifice du four, ou de l'en dévier. La température de la substance est mesurée à l'aide d'un thermocouple ou d'un thermomètre à résistance placé à un endroit approprié.

Le plateau d'une microbalance ultrasensible est placé sous le bouclier (voir ci-après). Le plateau de la balance a un diamètre de 30 mm environ. L'aluminium, revêtu d'une couche d'or, est un matériau approprié.

Le plateau de la balance est entouré par un cylindre en laiton ou une enceinte de réfrigération en cuivre. Certains types de balances disposant d'un orifice pour le fléau de la balance et d'un orifice dans le bouclier permettant le passage du flux moléculaire assurent une condensation complète de la vapeur sur le plateau de la balance. La dissipation de la chaleur vers l'extérieur est assurée par une barre de cuivre connectée à l'enceinte de réfrigération. Cette barre thermiquement isolée au moyen d'un tube d'acier au chrome-nickel, par exemple, traverse le plateau de base. Sous le plateau de base, la barre plonge dans un vase de Dewar contenant de l'azote liquide, ou de l'azote liquide circule au travers de cette barre. L'enceinte de réfrigération est ainsi maintenue à une température d'environ - 120 oC. Le plateau de la balance n'est refroidi que par rayonnement, ce qui suffit pour la gamme de pressions soumises à l'étude (refroidir une heure environ avant le début des mesures).

La balance est placée au-dessus de l'enceinte de réfrigération. On peut citer, parmi les balances qui conviennent pour cette méthode, la microbalance électronique ultrasensible à deux bras (8) ou la balance ultrasensible à bobine mobile (voir la ligne directrice 104 de l'OCDE, édition 12 mai 1981).

Le plateau de base comporte aussi des connexions électriques pour thermocouples (ou pour thermomètres à résistance) et bobines de chauffage.

Le vide est produit dans le récipient à l'aide d'une pompe à vide partiel ou d'une pompe à vide poussé (le vide requis, correspondant à une pression d'environ 1 à 2 × 10 – 3 Pa, est obtenu après deux heures de pompage). La pression est contrôlée à l'aide d'un manomètre à ionisation approprié.

1.6.4.2. Mesure Le récipient est rempli avec la substance à tester et le couvercle est fermé. Le bouclier et l'enceinte de réfrigération sont glissés de l'autre côté du four. L'appareil est fermé et les pompes à vide sont branchées. La pression à obtenir avant le commencement de la mesure est d'environ 10 – 4 Pa. Le refroidissement de l'enceinte de réfrigération commence à 10 – 2 Pa. Une série d'étalonnage à la plus basse des températures choisies commence dès que le vide nécessaire est atteint. L'orifice approprié dans le couvercle est ouvert, et le jet de vapeur qui traverse le bouclier juste au-dessus de l'orifice vient frapper le plateau réfrigéré de la balance. Ce dernier doit être d'une taille suffisante pour garantir que le jet qui traverse le bouclier l'atteint tout entier. L'impulsion du jet de vapeur exerce une force sur le plateau de la balance, et les molécules se condensent au contact de sa surface froide. Cette impulsion et la condensation simultanée produisent un signal sur l'enregistreur. L'évaluation des signaux fournit deux types d'informations: p = G 2 π RT×103M où: G vitesse d'évaporation (kg s – 1 m – 2) M masse molaire (g mol – 1) T température (K) R constante molaire des gaz parfaits (J mol – 1 K – 1) p pression de vapeur (Pa) Lorsque le vide nécessaire est atteint, une série de mesures est entreprise à la plus basse des températures choisies. Pour les mesures suivantes, la température est augmentée par petits intervalles jusqu'au moment où la plus haute valeur choisie est atteinte. L'échantillon est alors refroidi une nouvelle fois, et une deuxième courbe de pression de vapeur peut être enregistrée. Si les résultats du second enregistrement ne confirment pas ceux du premier, il est possible que la substance se décompose aux températures choisies pour la détermination.

1.6.4.2.

1. L'appareil décrit ici permet de déterminer la pression de vapeur directement à partir de la force exercée sur le plateau de la balance [il n'est pas nécessaire pour cela de connaître le poids moléculaire (2)]. Des facteurs géométriques, tels que la section de l'orifice du four et l'angle du flux moléculaire, doivent être pris en considération pour l'évaluation des lectures.

2. La masse du condensat peut être mesurée en même temps et on peut en déduire la vitesse d'évaporation. La pression de vapeur peut également être calculée à partir de la vitesse d'évaporation et du poids moléculaire à l'aide de l'équation de Hertz (2).

1.6.5. Méthode d'effusion — par perte de poids

1.6.5.

1.6.5.1. Appareil L'appareil utilisé dans la présente méthode comporte principalement les éléments suivants: La figure 5 présente un exemple de cuve à vide en aluminium, munie d'un système de chauffage électrique, contenant quatre cellules à effusion en acier inoxydable. La feuille d'acier inoxydable, d'une épaisseur de 0,3 mm et percée d'un orifice à effusion d'un diamètre de 0,2 à 1,0 mm, est fixée à la cellule à effusion à l'aide d'un couvercle fileté.

une cuve dont la température et la pression peuvent être contrôlées, dans lequel sont placées les cellules à effusion,

une pompe à vide poussé (par exemple, une pompe à diffusion ou une pompe turbomoléculaire) accompagnée d'une jauge à vide,

un piège contenant de l'azote liquide ou de la glace carbonique.

1.6.5.2. Mesure La substance de référence et la substance à tester sont versées dans la cellule à effusion. Le diaphragme métallique percé d'un orifice est fixé à l'aide du couvercle fileté, et la cellule est pesée avec une précision de 0,1 mg. La cellule est placée dans l'appareil thermostaté où la pression est alors réglée à une valeur correspondant au dixième de la pression attendue. On laisse entrer de l'air dans l'appareil à des intervalles de temps définis entre 5 et 30 heures, et la perte de masse de la cellule à effusion est déterminée grâce à une nouvelle pesée. Pour s'assurer que les résultats ne sont pas perturbés par la présence d'impuretés volatiles, la cellule est pesée à intervalles réguliers, ce qui permet de vérifier que le taux d'évaporation est constant, au moins pendant deux intervalles de temps. La pression de vapeur p dans la cellule d'effusion est calculée au moyen de l'équation suivante: p = mKAt2 π R TM ou: p pression de vapeur (Pa) m masse de la substance qui quitte la cellule pendant le temps t (kg) t temps (s) A surface de l'orifice (m2) K facteur de correction R constante molaire des gaz parfaits (J mol – 1 K – 1) T température (K) M masse moléculaire (kg mol – 1) Le facteur de correction K dépend du rapport de la longueur sur le rayon de l'orifice cylindrique: rapport 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 On peut écrire l'équation suivante: p = E mtTM où E = 1KA2πR représente la constante de la cellule à effusion. Cette constante E peut être déterminée à l'aide de substances de référence (2,9), en appliquant l'équation suivante: E = p(r)tmM(r)T où p(r) pression de vapeur de la substance de référence (Pa) M(r) masse moléculaire de la substance de référence (kg × mol – 1)

1.6.6. Méthode de saturation des gaz

1.6.6.

1.6.6.1. Appareil L'appareil utilisé dans la présente méthode comporte un certain nombre d'éléments qui sont schématisés sur la figure 6 a et décrits ci-après (1).

1.6.6.1. Gaz inerte:

Le gaz porteur ne doit pas réagir avec la substance à tester. L'azote convient dans la plupart des cas, mais d'autres gaz peuvent parfois être employés (10). Le gaz choisi doit être sec (voir figure 6 a, numéro 4: sonde d'humidité relative).

Contrôle du flux gazeux:

Un système adéquat de contrôle des gaz est indispensable pour assurer un flux constant et suffisant à travers la colonne de saturation.

Collecteurs de vapeur:

Leur choix dépend des caractéristiques de l'échantillon, ainsi que de la méthode d'analyse utilisée. La vapeur doit être recueillie quantitativement et sous une forme qui permette l'analyse ultérieure. Pour certaines substances, on utilisera des collecteurs contenant des liquides tels que l'hexane ou l'éthylène glycol. Pour d'autres, on recourra à des adsorbants solides. Au lieu de recueillir la vapeur pour l'analyser ultérieurement, il est possible d'utiliser des techniques analytiques directes, comme la chromatographie, pour déterminer la quantité de matériel transporté par un volume connu de gaz porteur. De surcroît, la perte de masse de l'échantillon peut être mesurée.

Enceinte calorifugée:

Pour les mesures à différentes températures, il peut être nécessaire de prévoir une enceinte calorifugée.

Colonne de saturation:

La substance à tester en solution est déposée sur un support inerte qui est ensuite tassé dans la colonne de saturation. Les dimensions de celle-ci et la vitesse d'écoulement doivent être choisies de façon à assurer la saturation complète du gaz porteur. La colonne doit être thermostatée. Pour les déterminations s'effectuant à des températures supérieures à la température ambiante, l'espace entre la colonne et les collecteurs doit être chauffé pour empêcher la condensation de la substance. Afin de diminuer la diffusion de la matière, un tube capillaire peut être placé après la colonne de saturation (figure 6 b).

1.6.6.2. Mesure

1.6.6.2. Préparation de la colonne de saturation:

Après mise en solution dans un solvant très volatil, une partie de la substance d'essai est ajoutée à une quantité donnée du matériau de support. La quantité de substance ajoutée à une quantité adaptée du support doit être suffisante pour maintenir la saturation pendant toute la durée de l'essai. Le solvant est complètement évaporé à l'air ou dans un évaporateur rotatif, et le matériau bien homogénéisé est introduit dans la colonne. Une fois l'échantillon thermostaté, un courant d'azote sec est envoyé à travers l'appareil.

Mesure:

Les collecteurs ou le détecteur direct sont reliés aux tubes de sortie de la colonne et le temps est enregistré. Le débit est vérifié au début de l'expérience et à intervalles réguliers en cours d'expérience, grâce à un débitmètre à bulles (ou encore, en continu, à l'aide d'un débitmètre massique). Il faut mesurer la pression à la sortie de la colonne de saturation, soit: Le temps qu'il faut pour recueillir la quantité de substance nécessaire aux différentes méthodes d'analyse est déterminé au cours d'essais préliminaires ou par estimation. Au lieu de recueillir la substance pour l'analyser ultérieurement, il est possible d'avoir recours à des techniques analytiques quantitatives directes (comme la chromatographie). Avant de calculer la pression de vapeur à une température donnée, il y a lieu d'effectuer des essais préliminaires pour déterminer le débit maximal qui saturera complètement le gaz porteur avec la vapeur de la substance. Il faut pour cela que le gaz porteur passe dans le saturateur suffisamment lentement pour qu'aucune vitesse inférieure ne fournisse de pression de vapeur calculée plus importante. Le choix de la méthode d'analyse sera fonction de la nature de la substance à tester (par exemple, chromatographie en phase gazeuse ou gravimétrie). La quantité de substance transportée par un volume connu de gaz porteur est déterminée.

a)

en intercalant une jauge à pression entre le saturateur et les pièges (cette méthode peut se révéler peu satisfaisante en raison de l'accroissement du volume mort et de la surface d'adsorption); soit

b)

en déterminant la perte de charge du système de pièges utilisé, en fonction du débit dans une expérience séparée (cette méthode peut se révéler peu satisfaisante pour les collecteurs à liquide).

1.6.6.3. Calcul de la pression de vapeur La pression de vapeur est calculée à partir de la densité de vapeur (M/V) au moyen de l'équation suivante: p = WV × RTM où: p pression de vapeur (Pa) W masse de la substance évaporée (g) V volume de gaz saturé (m3) R constante molaire des gaz parfaits (J mol – 1 K – 1) T température (K) M masse molaire de la substance à tester (g mol – 1) Les volumes mesurés doivent être corrigés pour tenir compte des différences de pression et de température entre le débitmètre et le saturateur thermostaté. Si le débitmètre est placé en aval du collecteur de vapeur, des corrections peuvent être nécessaires pour tenir compte de l'évaporation éventuelle des produits contenus dans les collecteurs (1).

1.6.7. Méthode du rotor (8, 11, 13)

1.6.7.

1.6.7.1. Appareil La présente méthode peut être réalisée à l'aide d'une jauge à viscosité à rotor représentée à la figure 8. Le montage expérimental est schématisé à la figure 7. L'appareil de mesure type comporte une tête de mesure à rotor placée dans une enceinte thermostatée (réglée avec une précision de 0,1 oC). Le récipient qui contient l'échantillon est placé dans une enceinte thermostatée (réglée avec une précision de 0,01 oC); tous les autres éléments du montage sont maintenus à une température supérieure afin d'éviter la condensation. Un dispositif de pompe à vide poussé est connecté au système au moyen de vannes appropriées. La tête de mesure à rotor est constituée d'une bille d'acier (d'un diamètre de 4 à 5 mm) placée dans un tube. La bille est mise en suspension et stabilisée dans un champ magnétique, généralement au moyen d'aimants permanents et de bobines de contrôle. La bille est mise en mouvement par les champs rotatifs produits par les bobines. La vitesse de rotation de la bille est mesurée grâce aux bobines de lecture qui déterminent sa faible, mais toujours présente, magnétisation latérale.

1.6.7.2. Mesure Lorsque la bille a atteint une vitesse de rotation donnée v(o), (généralement de 400 révolutions par seconde environ), on coupe l'alimentation, et la décélération, due à la friction par le gaz, commence. La chute de la vitesse de rotation est mesurée en fonction du temps. La friction due à la suspension magnétique étant négligeable par rapport à la friction du gaz, la pression du gaz est donnée par l'équation suivante: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) où: c— vitesse moyenne des molécules de gaz r rayon de la bille ρ densité massique de la bille σ coefficient de transfert tangentiel du moment (σ = 1 si la bille a une surface sphérique idéale) t temps v(t) vitesse de rotation après un temps t v(o) vitesse de rotation initiale Cette équation peut également s'écrire de la manière suivante: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 où tn, et tn - 1, sont les temps requis pour effectuer un nombre donné N de révolutions. Ces intervalles de temps tn et tn - 1 se succèdent et tn > tn - 1. La vitesse moyenne de la molécule de gaz c— est donnée par l'équation suivante: c— = 8 RTπ M12 où: T température R constante molaire des gaz parfaits M masse molaire

2. DONNÉES Quelle que soit la méthode choisie, la pression de vapeur doit être déterminée à deux niveaux de température au moins. Trois niveaux ou plus sont préférables, entre 0 oC et 50 oC, pour vérifier la linéarité de la courbe de la pression de vapeur.

3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: En cas de modification (changement d'état, décomposition): Toutes les informations et remarques pertinentes pour l'interprétation des résultats doivent être signalées, en particulier les impuretés et l'état physique de la substance.

la méthode utilisée,

les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) et, s'il y a lieu, l'étape de purification préliminaire,

au moins deux valeurs pour la pression de vapeur et la température, de préférence comprise entre 0 et 50 oC,

toutes les données brutes,

une courbe de log p en fonction de 1/T,

une estimation de la pression de vapeur à 20 oC ou à 25 oC.

nature de la modification,

température à laquelle la modification survient à la pression atmosphérique,

pression de vapeur à 10 oC et à 20 oC au-dessous et au-dessus de la température de transition (sauf en cas de passage de l'état solide à l'état gazeux).

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)

RÉFÉRENCES OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice no 104, décision du Conseil C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre; B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Chapter IX, Interscience Publ. New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593. NF T 20-048 AFNOR (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de la pression de vapeur des solides et des liquides dans le domaine 10 – 1 à 105 Pa. Méthode statique. NF T 20-047 AFNOR (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de la pression de vapeur des solides et des liquides dans le domaine 10 – 3 à 1 Pa. Méthode de la balance de pression de vapeur. ASTM D 2879-86 Standard test method for vapour pressure-temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Röhl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac Sci.Technol.(A), 1987, vol. 5 (4), 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173. B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435. G. Comsa, J.K. Fremerey anb B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148. J.K. Fremerey. J. Vac Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), 1715.

A.5. TENSION SUPERFICIELLE

A.5.

1. MÉTHODE Les méthodes décrites se fondent sur les lignes directrices de l'OCDE (1). Leurs principes fondamentaux sont décrits dans la référence (2).

1.

1.1. INTRODUCTION Les méthodes décrites s'appliquent à la mesure de la tension superficielle des solutions aqueuses. Avant d'effectuer ces essais, il sera bon d'avoir des informations préliminaires sur l'hydrosolubilité, la structure, les propriétés de la substance en matière d'hydrolyse et la concentration critique pour la formation de micelles. Les méthodes suivantes s'appliquent à la plupart des substances chimiques, quel que soit leur degré de pureté. La mesure de la tension superficielle par la méthode du tensiomètre à anneau est limitée aux solutions aqueuses ayant une viscosité dynamique inférieure à 200 mPa s environ.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS L'enthalpie libre de surface par unité de surface constitue la tension superficielle. La tension surperficielle s'exprime en: N/m (en unités SI) ou mN/M (en sous-unités SI) 1 N/m = 103 dynes/cm I mN/m = 1 dyne/cm dans le système cgs qui n'est plus utilisé.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉFENCE Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles doivent servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec différentes méthodes. Des substances de référence couvrant une vaste gamme de tensions superficielles sont données dans les références (1) et (3).

1.4. PRINCIPE DES MÉTHODES Les méthodes sont fondées sur la mesure de la force maximale qu'il faut exercer verticalement sur un étrier ou un anneau en contact avec la surface du liquide étudié, placé dans un récipient approprié, afin de le séparer de cette surface, ou sur une plaque, dont un des bords est en contact avec la surface, afin d'assurer l'arrachement du film formé. Les substances hydrosolubles à une concentration supérieure à 1 mg/ml sont testées en solution aqueuse à une seule concentration.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Ces méthodes fournissent une plus grande précision que ce qui est probablement requis pour le contrôle de la protection de l'environnement.

1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES La substance est dissoute dans de l'eau distillée à une concentration correspondant à 90 % de la saturation de l'hydrosolubilité de cette substance; si cette concentration excède 1 g/l, l'essai est effectué avec une concentration de 1 g/l. Les substances dont l'hydrosolubilité est inférieure à 1 mg/l n'ont pas besoin d'être testées.

1.6.

1.6.1. Méthode de la plaque Voir ISO 304 et NF T 73-060 (substances tensioactives — détermination de la tension superficielle par arrachement de films liquides).

1.6.2. Méthode de l'étrier Voir ISO 304 et NF T 73-060 (substances tensioactives — détermination de la tension superficielle par arrachement de films liquides).

1.6.3. Méthode de l'anneau Voir ISO 304 et NF T 73-060 (substances tensioactives — détermination de la tension superficielle par arrachement de films liquides).

1.6.4. Méthode de l'anneau harmonisée OCDE

1.6.4.

1.6.4.1. Appareil Des tensiomètres commerciaux se prêtent à cette mesure. Ils comportent les éléments suivants:

un porte-échantillon mobile,

un dynamomètre,

un corps de mesure (anneau),

un récipient de mesure.

1.6.4.1.

1.6.4.1.1. Porte-échantillon mobile Le porte-échantillon mobile sert de support au récipient de mesure thermostaté, qui contient le liquide à étudier. Il est monté sur le même socle que le dynamomètre.

1.6.4.1.2. Dynamomètre Le dynamomètre (voir figure) est placé au-dessus du porte-échantillon. L'erreur dans la mesure de la force ne doit pas dépasser ± 10 – 6 N, ce qui équivaut à une erreur limite de ±0,1 mg dans une mesure de masse. Dans la plupart des cas, l'échelle de mesure des tensiomètres vendus dans le commerce est étalonnée en mN/m, si bien que l'on peut lire directement la tension superficielle en mN/m avec une précision de 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3. Corps de mesure (anneau) L'anneau est habituellement constitué par un fil de platine ou de platine-iridium ayant une épaisseur de 0,4 millimètres environ et une circonférence moyenne de 60 millimètres. Cet anneau est suspendu horizontalement à l'étrier de montage qui est relié par une tige métallique au dynamomètre (voir figure).

1.6.4.1.3. Figure Corps de mesure

(toutes les dimensions sont exprimées en millimètres) tige étrier de montage anneau

1.6.4.1.4. Récipient de mesure Le récipient de mesure qui contient la solution à tester doit être un récipient en verre thermostaté. Il doit être conçu de telle sorte que, au cours de la mesure, la température du liquide et de la phase gazeuse au-dessus de la surface reste constante et qu'il n'y ait pas d'évaporation. Des récipients cylindriques en verre d'un diamètre intérieur d'au moins 45 millimètres répondent à ces exigences.

1.6.4.2. Préparation de l'appareil

1.6.4.2.

1.6.4.2.1. Nettoyage La verrerie doit être nettoyée avec soin. Le cas échéant, elle sera lavée au mélange sulfochromique chaud, puis à l'acide phosphorique sirupeux (83 à 98 % en poids de H3PO4), rincée abondamment à l'eau courante et ensuite à l'eau bidistillée jusqu'au moment où l'on obtient une réaction neutre, et, enfin, séchée ou bien rincée avec une partie du liquide à mesurer. L'anneau sera tout d'abord rincé abondamment à l'eau pour éliminer toutes les traces de substances hydrosolubles, plongé quelques secondes dans le mélange sulfochromique, rincé à l'eau bidistillée jusqu'à ce que l'on obtienne une réaction neutre, et, enfin, rapidement séché au-dessus d'une flamme de méthanol. Note: Les traces de substances qui ne sont pas dissoutes ou détruites par l'acide chromosulfurique ou l'acide phosphorique, telles que les silicones, doivent être éliminées à l'aide d'un solvant organique approprié.

1.6.4.2.2. Étalonnage de l'appareil La validation de l'appareil consiste à vérifier le point zéro et à le régler de telle sorte que l'indication donnée par l'appareil permette une détermination fiable en mN/m.

1.6.4.2.2. Montage:

L'appareil sera mis à niveau, par exemple à l'aide d'un niveau à bulle placé sur le socle du tensiomètre, en ajustant des vis de réglage.

Réglage du point zéro:

Après montage de l'anneau sur l'appareil et avant son immersion dans le liquide, l'indicateur du tensiomètre doit être réglé à zéro; on vérifiera le parallélisme de l'anneau en utilisant la surface du liquide comme miroir.

Étalonnage:

L'étalonnage de l'appareil peut être effectué par l'une des deux méthodes suivantes:

a)

à l'aide d'une masse: ce procédé utilise des cavaliers de masse connue (entre 0,1 et 1,0 g), qui sont placés successivement sur l'anneau. Le facteur d'étalonnage Φa, par lequel il y a lieu de multiplier toutes les lectures de l'instrument, sera déterminé au moyen de l'équation (1): Φa=σrσa (1) où σr=mg2b (mN/m) m masse du cavalier (g) g accélération de la pesanteur (981 cm s – 2 au niveau de la mer) b circonférence moyenne de l'anneau (cm) σa lecture du tensiomètre après placement du cavalier sur l'anneau (mN/m);

b)

à l'aide d'eau: ce procédé utilise de l'eau pure dont la tension superficielle, par exemple à 23 oC, est égale à 72,3 mN/m. Il est plus rapide que l'étalonnage à l'aide de cavaliers, mais il comporte toujours le risque que la tension superficielle de l'eau soit modifiée par des traces de substance tensioactive. Le facteur d'étalonnage Φb, par lequel il faut multiplier toutes les lectures de l'appareil, sera déterminé à l'aide de l'équation ci-après (2): Φb=σoσg (2) où: σo valeur donnée dans la littérature pour la tension superficielle de l'eau (mN/m) σg valeur mesurée de la tension superficielle de l'eau (mN/m) à cette même température.

1.6.4.3. Préparation des échantillons Les solutions aqueuses de la substance à tester seront préparées compte tenu des concentrations requises. Il est impératif que la dissolution de la substance soit complète. La solution ainsi préparée doit être maintenue à une température constante (±0,5 oC). Étant donné que la tension superficielle d'une solution placée dans le récipient de mesure se modifie après un certain temps, il faut effectuer plusieurs mesures à des moments différents et tracer une courbe donnant la tension superficielle en fonction du temps. Lorsqu'il n'y a plus de modification, on a atteint un état d'équilibre. La poussière ou les vapeurs d'autres substances faussent la mesure. Le travail doit donc s'effectuer sous une cloche de protection.

1.6.5. Conditions de l'essai Les mesures doivent être effectuées à une température de 20 oC environ, sans variation supérieure à ±0,5 oC.

1.6.6. Déroulement de l'essai Les solutions à mesurer seront transférées dans le récipient de mesure soigneusement nettoyé, en prenant soin d'éviter la formation de mousse; ensuite, le récipient de mesure sera placé sur le porte-échantillon qui sera élevé jusqu'à ce que l'anneau soit immergé au-dessous de la surface de la solution. Le porte-échantillon est alors abaissé graduellement et uniformément (à une vitesse d'environ 0,5 cm/mn) pour retirer l'anneau de la surface du liquide et ce, jusqu'à ce que la force maximale soit atteinte. La couche du liquide accroché à l'anneau ne doit pas s'en détacher. Une fois les mesures achevées, l'anneau sera immergé à nouveau sous la surface, et les mesures répétées jusqu'à ce que l'on parvienne à une tension superficielle constante. À chaque détermination, le temps écoulé depuis le transfert de la solution dans le récipient de mesure sera enregistré. Des lectures seront effectuées à la valeur maximale de la force nécessaire pour retirer l'anneau de la surface du liquide.

2. Tableau Correction des valeurs mesurées de la tension superficielle Valable seulement pour les solutions aqueuses, p≈1 g/cm3

DONNÉES Pour calculer la tension superficielle, on multipliera tout d'abord la valeur lue sur l'appareil en mN/m par le facteur d'étalonnage Φa ou Φb (selon la méthode d'étalonnage utilisée). On obtiendra alors une valeur qui n'est qu'une approximation et doit ensuite être corrigée. Harkins et Jordan (4) ont établi de manière empirique des facteurs de correction pour les valeurs de tension superficielle obtenues par la méthode de l'anneau, facteurs qui dépendent des dimensions de l'anneau, de la densité du liquide et de sa tension superficielle. Étant donné le travail qu'exige la détermination du facteur de correction propre à chaque mesure à partir des tables de Harkins & Jordan, l'utilisation d'une méthode simplifiée de lecture directe de la tension superficielle corrigée à partir du tableau ci-après est autorisée pour les solutions aqueuses (on recourra à l'interpolation pour les lectures qui se situent entre deux valeurs du tableau.) r = 9,55 mm (rayon moyen de l'anneau) r = 0,185 mm (rayon du fil constituant l'anneau) Valeur expérimentale (mN/nr) Valeur corrigée (mN/m) Étalonnage à l'aide de cavaliers (voir 1.6.4.2.2. (a)] Étalonnage à l'aide d'eau [voir 1.6.4.2.2. (b)] 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 19,9 32,1 36 31,3 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Ce tableau a été établi sur la base de la correction de Harkins-Jordan et correspond à celle de la norme DIN (DIN 53914) concernant l'eau et les solutions aqueuses (densité ρ = 1 g/cm3), et pour un anneau vendu dans le commerce dont les dimensions sont R = 9,55 mm (rayon moyen de l'anneau) et r = 0,185 mm (rayon du fil constituant l'anneau). Le tableau donne les valeurs corrigées des mesures de tension superficielle effectuées après un étalonnage au moyen de cavaliers ou d'eau pure. Une autre solution consiste à calculer la tension superficielle, sans étalonnage préalable, selon la formule suivante: σ=fxF4πR où F la force mesurée sur le dynamomètre au point de rupture du film R le rayon de l'anneau f le facteur de correction (1)

3. RÉSULTATS

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

méthode utilisée,

le type d'eau ou de solution utilisé,

les spécifications précises de la substance étudiée (identité et impuretés),

le résultat des mesures: tension superficielle (lue) en indiquant à la fois les différentes lectures et leur moyenne arithmétique, ainsi que la valeur moyenne corrigée (compte-tenu du facteur dû au matériel et du tableau de correction),

la concentration de la solution,

la température de l'essai,

l'âge de la solution utilisée, en particulier le temps écoulé entre la préparation de la solution et sa mesure,

l'évolution de la tension superficielle en fonction du temps à partir du moment où la solution a été transférée dans le récipient de mesure,

toutes les informations et observations pertinentes pour l'interprétation des résultats doivent être signalées, notamment les impuretés et l'état physique de la substance.

3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Étant donné que la tension superficielle de l'eau est de 72,75 mN/m à 20 oC, les substances dont la tension superficielle est inférieure à 60 mN/m, dans les conditions propres à cette méthode, doivent être considérées comme des produits tensioactifs.

4.(1)(2)(3)(4)

RÉFÉFENCES OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice 115, décision du Conseil C(81) 30 Final. R. Weissberger ed., Technique of organic chemistry, Chapter XIV, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Interscience Publ. New York, 1959, Vol. I, Part I. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, vol. 52, 1751.

A.6. HYDROSOLUBILITÉ

A.6.

1. MÉTHODE Les méthodes décrites sont basées sur les lignes directrices de l'OCDE (1).

1.

1.1. INTRODUCTION Il est utile de disposer d'informations sur la formule développée, la pression de vapeur, la constante de dissociation et l'hydrolyse (en fonction du pH) de la substance pour réaliser cet essai. Une seule méthode ne suffit pas à couvrir toute la gamme des solubilités dans l'eau. Les deux méthodes d'essai décrites ci-après permettent de couvrir toute la gamme des solubilités, mais elles ne sont pas applicables aux substances volatiles: L'hydrosolubilité de la substance étudiée peut être considérablement affectée par la présence d'impuretés.

la première, ci-après dénommée méthode par élution sur colonne, s'applique aux substances essentiellement pures à faible solubilité (< 10-2 g/l) et stables dans l'eau,

la deuxième, ci-après dénommée méthode du flacon, s'applique aux substances essentiellement pures à solubilité élevée (> 10-2 g/1) et stables dans l'eau.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS L'hydrosolubilité d'une substance est la concentration massique de saturation de la substance dans l'eau à une température donnée. Elle s'exprime en unités de masse par volume de solution. L'unité SI est le kg/m3 (g/l peut également être utilisé).

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles doivent servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec différentes méthodes.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI La quantité approximative d'échantillon et le temps nécessaire pour obtenir la concentration massique de saturation doivent être déterminés par un essai préliminaire simple.

1.4.

1.4.1. Méthode par élution sur colonne Cette méthode repose sur l'élution d'une substance à étudier avec de l'eau a partir d'une microcolonne remplie avec un support inerte, tel que des billes de verre ou du sable, chargé avec un excès de substance à étudier. L'hydrosolubilité est déterminée lorsque la concentration massique de l'éluant est constante. Elle est indiquée par un plateau de concentration en fonction du temps.

1.4.2. Méthode du flacon La substance (les solides doivent être pulvérisés) est dissoute dans l'eau à une température quelque peu supérieure à la température d'essai. Lorsque la saturation est atteinte, le mélange est refroidi, maintenu à la température d'essai et agité jusqu'à ce que l'équilibre soit atteint. Une autre possibilité consiste à effectuer la mesure directement à la température d'essai, si un échantillonnage approprié assure que l'équilibre de saturation est atteint. Après quoi, la concentration massique de la substance dans la solution aqueuse, qui ne doit contenir aucune particule non dissoute, est déterminée suivant une méthode analytique appropriée.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ

1.5.

1.5.1. Rentabilité La méthode par élution sur colonne permet d'obtenir une répétabilité < 30 %, et la méthode du flacon, une répétabilité < 15 %.

1.5.2. Sensibilité La sensibilité dépend de la méthode d'analyse, mais la concentration massique peut être déterminée jusqu'à 10-6 grammes par litre.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Conditions de l'essai. L'essai doit de préférence être effectué à 20 oC ±0,5 oC. Si l'on suspecte une incidence de la température sur la solubilité (> 3 %/ oC), on utilisera également deux autres températures, supérieure et inférieure d'au moins 10 oC à la température initiale choisie. Dans ce cas, la température doit être ajustée à ±0,1 oC. La température choisie sera maintenue constante dans toutes les parties de l'appareillage où elle peut avoir une influence.

1.6.2. Essai préliminaire Dans une éprouvette graduée et bouchée de 10 ml, ajouter à 0,1 g environ d'échantillon (les substances solides doivent être réduites en poudre) des volumes croissants d'eau distillée à température ambiante, suivant la progression indiquée dans le tableau suivant: 0,1 g soluble dans x ml d'eau 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Solubilité approximative (grammes par litre) > 1000 1000 à 200 200 à 100 100 à 50 50 à 10 10 à 1 < 1 Après chaque addition de la quantité d'eau indiquée, agiter vigoureusement le mélange pendant dix minutes, puis vérifier visuellement s'il contient des parties d'échantillon non dissoutes. Si, après addition de 10 ml d'eau, l'échantillon, ou des parties de celui-ci, n'est pas dissous, répéter l'expérience dans une éprouvette de 100 ml avec de plus grands volumes d'eau. Si la solubilité est faible, le temps nécessaire pour dissoudre la substance peut être considérablement plus long (24 heures au moins sont à prévoir). La solubilité approximative est indiquée dans le tableau sous le volume d'eau ajoutée dans lequel s'effectue la dissolution complète de l'échantillon. Si la substance reste, selon toute apparence, insoluble, il faut augmenter le temps au-delà de 24 heures (96 heures au maximum), ou procéder à une nouvelle dilution afin de déterminer s'il y a lieu d'utiliser la méthode par élution sur colonne ou la méthode par solubilité en flacon.

1.6.3. Méthode par élution sur colonne

1.6.3.

1.6.3.1. Support, solvant et éluant Dans la méthode par élution sur colonne, le matériel support doit être inerte. On peut employer des billes de verre et du sable. Pour appliquer la substance à tester au support, il faut utiliser un solvant volatile approprié de qualité analytique. L'eau bidistillée dans un appareil de verre ou de quartz peut être utilisée comme éluant. Remarque: Ne pas utiliser l'eau provenant directement d'un échangeur d'ions organique.

1.6.3.2. Charge du support Peser et transférer 600 mg environ de matériel support dans un ballon à fond rond de 50 ml. Peser une quantité appropriée de substance à étudier et la dissoudre dans le solvant choisi. Une quantité déterminée de cette solution est ajoutée au support. Le solvant doit être complètement évaporé, par exemple dans un évaporateur rotatif, afin d'assurer la saturation en eau du support qui, sinon, ne se ferait pas en raison de l'effet de répartition à la surface. La charge du support peut poser des problèmes (résultats erronés) si la substance à étudier est déposée sous forme d'huile ou d'une phase cristalline différente. Le problème devrait être examiné expérimentalement et décrit en détail dans le procès-verbal. Laisser tremper le support chargé pendant au moins 2 heures dans environ 5 ml d'eau, puis transférer la solution dans la microcolonne. Une autre possibilité consiste à verser le support chargé sec dans une microcolonne préalablement remplie d'eau et à équilibrer pendant 2 heures environ.

1.6.3.2. Mode opératoire:

L'élution de la substance à partir du support peut s'effectuer selon deux systèmes différents:

pompe de recirculation (voir figure 1),

réservoir d'eau (voir figure 4).

1.6.3.3. Méthode de colonne d'élution avec pompe de recirculation

1.6.3.3. Appareil

Le schéma d'un système couramment utilisé est indiqué sur la figure 1. La figure 2 montre une microcolonne appropriée, bien que toute autre dimension soit acceptable, à condition de satisfaire aux critères de reproductibilité et de sensibilité. La colonne doit avoir un volume tampon correspondant à cinq fois au moins le volume d'eau contenu dans le lit de la colonne et pouvoir contenir au moins cinq échantillons. On peut cependant réduire la dimension si l'on utilise un appoint de solvant pour remplacer les cinq volumes précités, éliminés avec les impuretés. La colonne doit être reliée à une pompe de recirculation, capable de donner un débit approximatif de 25 ml/heure environ, au moyen de raccords en polytétrafluoroéthylène (PTFE) et/ou en verre. La colonne et la pompe, lorsqu'elles sont couplées, doivent pouvoir permettre l'échantillonnage de l'effluent et l'équilibrage à pression atmosphérique du réservoir. Le matériau dans la colonne est soutenu par un petit tampon de laine de verre (5 mm), qui sert également à filtrer les particules. La pompe de recirculation peut être, par exemple, une pompe péristaltique ou une pompe à membrane (veiller à ce que la matière du tube ne cause aucune contamination et/ou adsorption).

Mesure:

La circulation dans la colonne est amorcée. Le débit recommandé est d'environ 25 ml/h (ce qui correspond à dix volumes de lit par heure pour la colonne décrite ici). Les cinq premiers volumes (minimum) sont écartés afin d'éliminer les impuretés solubles dans l'eau. Après quoi, faire fonctionner la pompe de recirculation jusqu'à atteindre l'état d'équilibre défini par cinq échantillons successifs dont les concentrations ne diffèrent pas de façon aléatoire de plus de ± 30 %. Ces échantillons doivent être séparés l'un de l'autre par un intervalle de temps correspondant au passage d'un volume d'éluant équivalent à dix fois au moins le volume du lit de la colonne.

1.6.3.4. Méthode par élution sur colonne avec réservoir tampon

1.6.3.4. Appareillage (voir figures 3 et 4)

Réservoir: le raccordement au réservoir est assuré par un joint de verre rodé, lui-même raccordé à un tube en polytétrafluoroéthylène. Débit recommandé: environ 25 ml/h. Les fractions successives de l'éluant seront recueillies et analysées suivant la méthode choisie.

Mesure:

Les fractions provenant du milieu de l'intervalle d'élution où les concentrations sont constantes (± 30 %) dans au moins cinq fractions consécutives seront utilisées pour déterminer l'hydrosolubilité. Dans les deux cas (pompe de recirculation ou réservoir d'eau) on répétera l'opération en réduisant le débit de moitié. Si les résultats des deux opérations concordent, l'essai est satisfaisant; si l'on constate une solubilité apparemment plus élevée au débit inférieur, on réduira une nouvelle fois celui-ci de moitié jusqu'à ce que deux opérations successives donnent la même solubilité. Dans les deux cas (pompe de recirculation ou réservoir d'eau), rechercher dans les fractions la présence éventuelle de matière colloïdale par détection de l'effet Tyndall (diffusion de la lumière). La présence de telles particules fausse les résultats et l'essai doit être répété en améliorant l'action de filtration de la colonne. Noter le pH de chaque échantillon. Effectuer une deuxième opération à la même température.

1.6.4. Méthode par solubilité en flacon

1.6.4.

1.6.4.1. Appareil Cette méthode requiert le matériel suivant:

verrerie et instrumentation normale de laboratoire,

dispositif approprié pour agiter les solutions à des températures constantes contrôlées,

si nécessaire en présence d'émulsions, centrifugeuse (de préférence thermostatée),

équipement pour la détermination analytique.

1.6.4.2. Mesure Évaluer, à partir de l'essai préliminaire, la quantité de produit nécessaire pour saturer le volume d'eau choisi. Celui-ci dépend de la méthode analytique et de l'intervalle de solubilité. Peser environ cinq fois la quantité de matière déterminée ci-avant et l'introduire dans trois récipients en verre pourvus d'un bouchon, également en verre (par exemple, flacons ou tubes à centrifuge). Ajouter le volume d'eau choisi dans chaque récipient, que l'on bouchera hermétiquement. Agiter ces récipients bouchés à 30 oC (utiliser un dispositif agitateur ou mélangeur susceptible d'opérer à température constante, par exemple, un agitateur magnétique en bain-marie contrôlé par thermostat). Après une journée, retirer l'un des récipients et rééquilibrer pendant 24 heures à température d'essai; agiter de temps à autre. Le contenu du récipient est ensuite centrifugé à température d'essai et la concentration du composé dans la phase aqueuse limpide est déterminée selon une méthode analytique appropriée. Les deux autres ballons sont traités de la même façon après un premier équilibrage à 30 oC pendant deux et trois jours respectivement. Si les concentrations des deux derniers récipients au moins concordent avec la reproductibilité requise, l'essai est satisfaisant. Répéter l'ensemble de l'essai en utilisant des temps d'équilibrage plus longs si les résultats des récipients 1, 2 et 3 accusent une tendance à la progression. La mesure peut également être effectuée sans préincubation à 30 oC. Pour estimer la vitesse à laquelle s'établit l'équilibre de saturation, prélever des échantillons jusqu'à ce que le temps d'agitation n'ait plus d'effet sur la concentration de la solution à étudier. Le pH de chaque échantillon doit être noté.

1.6.5. Analyse Une méthode d'analyse spécifique de la substance est préférable pour ces déterminations, de petites quantités d'impuretés solubles pouvant entraîner des erreurs sensibles dans la solubilité mesurée. Exemples de méthodes: chromatographie en phase gazeuse ou liquide, méthodes titrimétriques, méthodes photométriques, méthodes voltamétriques.

2. DONNÉES

2.

2.1. MÉTHODE PAR ÉLUTION SUR COLONNE La valeur moyenne déterminée sur au moins cinq échantillons consécutifs prélevés durant le plateau de saturation doit être calculée pour chaque opération, de même que la déviation standard. Les résultats doivent être exprimés en unités de masse par volume de solution. La comparaison des moyennes calculées sur deux essais effectués avec des débits différents doit donner une répétabilité inférieure à 30 %.

2.2. MÉTHODE DU FLACON Les résultats individuels doivent être indiqués pour chacun des trois flacons; on fera la moyenne, exprimée en unités de masse par volume de solution, des résultats considérés comme constants (répétabilité inférieure à 15 %). Cette opération peut exiger de convertir des unités de masse en unités de volume, en utilisant la densité lorsque la solubilité est très élevée (> 100 grammes par litre).

3. RÉSULTATS

3.

3.1. MÉTHODE PAR ÉLUTION SUR COLONNE Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

résultats de l'essai préliminaire,

spécification précise de la substance (identité et impuretés),

concentrations individuelles, débits et pH de chaque échantillon,

moyenne et déviation standard d'au moins cinq échantillons provenant du plateau de saturation pour chaque opération,

moyenne de deux opérations acceptables consécutives,

température de l'eau pendant le processus de saturation,

méthode d'analyse utilisée,

nature du matériel employé comme support,

charge du support,

solvant utilisé,

signe d'instabilité chimique éventuelle de la substance pendant l'essai et la méthode utilisée,

toute information pertinente pour l'interprétation des résultats, notamment les impuretés et l'état physique de la substance.

3.2. MÉTHODE DU FLACON Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

résultats de l'essai préliminaire,

spécification précise de la substance (identité et impuretés),

résultats analytiques individuels et moyenne lorsque plus d'une valeur est déterminée pour un même flacon,

pH de chaque échantillon,

moyenne des valeurs pour les différents flacons en concordance,

température d'essai,

méthode analytique utilisée,

signe d'instabilité chimique éventuelle de la substance pendant l'essai et la méthode utilisée,

toute information pertinente pour l'interprétation des résultats, notamment les impuretés et l'état physique de la substance.

4.(1)(2)(3) RÉFÉRENCES OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice no 105, décision du Conseil C(81) 30 Final. NF T 20-045 AFNOR (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de la solubilité dans l'eau des solides et liquides à faible solubilité — Méthode de l'élution sur colonne NF T 20-046 AFNOR (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de la solubilité dans l'eau des solides et liquides à faible solubilité — Méthode du flacon

A.8. COEFFICIENT DE PARTAGE

A.8.

1. MÉTHODE La méthode par agitation en flacon décrite est basée sur les lignes directrices de l'OCDE (1).

1.

1.1. INTRODUCTION Il est utile de disposer d'informations préliminaires sur la formule développée, la constante de dissociation, l'hydrosolubilité, l'hydrolyse, la solubilité dans le n-Octanol et la tension superficielle de la substance pour exécuter cet essai. Les mesures concernant les substances ionisables ne doivent être réalisées qu'avec leur forme non ionisée (acide libre ou base libre) obtenue à l'aide d'un tampon approprié dont le pH est inférieur (acide libre) ou supérieur (base libre) au pK, au moins d'une unité pH. La présente méthode d'essai comporte deux techniques distinctes: la méthode par agitation en flacon et la chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC). La première est applicable lorsque la valeur de log Pow (voir définition ci-après) tombe dans l'intervalle compris entre 2 et 4, et la seconde dans l'intervalle compris entre 0 et 6. Avant d'effectuer l'une de ces techniques expérimentales, il y a lieu de procéder à une estimation préliminaire du coefficient de partage. La méthode par agitation en flacon ne s'applique qu'aux substances essentiellement pures, solubles dans l'eau et dans le n-Octanol. Elle n'est pas applicable aux substances tensioactives (pour lesquelles il convient de fournir une valeur calculée ou une estimation fondée sur les solubilités individuelles dans l'eau et le n-Octanol). La méthode de HPLC ne s'applique pas aux acides et aux bases forts, aux complexes métalliques, aux substances tensioactives et aux substances qui réagissent avec l'éluant. Pour ces produits, il convient de fournir une valeur calculée ou une estimation fondée sur les solubilités individuelles dans l'eau et le n-Octanol. La méthode de HPLC est moins sensible à la présence d'impuretés dans le composé à tester que la méthode par agitation en flacon. Les impuretés peuvent toutefois, dans certains cas, compliquer l'interprétation des résultats en rendant incertaine l'identification des pics. Pour des mélanges qui donnent des pics non résolus, il faut noter la limite inférieure et la limite supérieure de log P.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Le coefficient de partage (P) est défini comme étant le rapport des concentrations à l'équilibre (ci) d'une substance dissoute dans un système biphasique consistant en deux solvants quasiment non miscibles. Dans le cas du n-Octanol et de l'eau: pow=Cn-octanolCeau Le coefficient de partage (P) est donc le quotient de deux concentrations; il est généralement indiqué sous la forme de son logarithme, base 10 (log P).

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE

1.3. Méthode par agitation en flacon

Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles doivent servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec différentes méthodes.

Méthode de HPLC

Pour établir une corrélation entre les données mesurées par HPLC et le coefficient de partage d'un composé, il faut établir une courbe d'étalonnage de log P par rapport aux données chromatographiques, à l'aide de six points de référence au moins. Le choix des substances de référence appropriées est laissé à l'utilisateur. Au moins un des composés de référence doit, si possible, avoir un Pow supérieur, et un autre un Pow inférieur à celui de la substance à étudier. Pour des valeurs de log P inférieures à 4, l'étalonnage peut reposer sur les données obtenues avec la méthode par agitation en flacon. Pour des valeurs de log P supérieures à 4, l'étalonnage peut être effectué à partir de valeurs validées citées dans la littérature, si celles-ci concordent avec des valeurs calculées. 11 est préférable, pour une plus grande précision, de choisir des composés de référence dont la structure est apparentée à celle de la substance à étudier. Des listes de valeurs de log P ont été établies pour un grand nombre de produits chimiques (2) (3). Si l'on ne dispose pas de données relatives au coefficient de partage de composés de structures voisines, il faut utiliser un étalonnage plus général, établi avec d'autres composés de référence. L'annexe II présente une liste de substances de référence recommandées et la valeur de leur Pow.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE

1.4.

1.4.1. Méthode par agitation en flacon Pour déterminer un coefficient de partage, il faut parvenir à un équilibre entre l'ensemble des éléments constitutifs du système s'influençant mutuellement et déterminer les concentrations des substances dissoutes dans les deux phases. Une étude bibliographique sur ce sujet fait apparaître que plusieurs techniques différentes permettent de résoudre ce problème, à savoir le mélange complet de deux phases suivi de leur séparation dans le but de déterminer la concentration à l'équilibre de la substance étudiée.

1.4.2. Méthode de HPLC La HPLC est effectuée sur des colonnes analytiques remplies d'une phase solide contenant de longues chaînes d'hydrocarbures (par exemple C8, C18) liées chimiquement à de la silice, vendue dans le commerce. Les produits chimiques déposés sur une telle colonne se déplacent sur toute sa longueur à des vitesses différentes en raison de leur différence de taux de partage entre la phase mobile et la phase fixe hydrocarbonée. Les mélanges de produits chimiques sont élués par ordre d'hydrophobicité: les produits hydrosolubles sont élués les premiers et les produits liposolubles, les derniers, proportionnellement à leur coefficient de partage entre l'eau et les hydrocarbures. Ainsi peut on établir une relation entre le temps de rétention sur une telle colonne (à phase inversée) et le coefficient de partage n-Octanol/eau. Le coefficient de partage est déduit du facteur de capacité k, défini par l'expression suivante: k=tR-toto où tR = temps de rétention de la substance à étudier et t0 = temps moyen nécessaire à une molécule de solvant pour traverser la colonne (temps mort). Il n'est pas nécessaire de disposer d'une méthode analytique quantitative; il suffit de déterminer les temps d'élution.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ

1.5.

1.5.1. Répétabilité

1.5.1. Méthode par agitation en flacon

Pour garantir la précision du coefficient de partage, on doit procéder à des déterminations en double, dans trois conditions d'essai différentes, la quantité de substance spécifiée ainsi que le rapport des volumes de solvant pouvant être modifiés. Les valeurs déterminées de ce coefficient, exprimées sous la forme de leurs logarithmes communs, doivent se situer dans un intervalle de ±0,3 unité log.

Méthode de HPLC

Afin d'augmenter la fiabilité des mesures, on procédera à des déterminations en double. Les valeurs de log P issues de mesures individuelles doivent se situer dans un intervalle de ±0,1 unité log.

1.5.2. Sensibilité

1.5.2. Méthode par agitation en flacon

L'intervalle de mesure de la méthode est déterminé par la limite de détection du procédé analytique. Celle-ci doit permettre de déterminer les valeurs de log Pow dans l'intervalle de - 2 à 4 (cet intervalle peut occasionnellement, lorsque les conditions le permettent, être étendu à des valeurs de log Pow allant jusqu'à 5) lorsque la concentration du soluté n'excède pas 0,01 mol par litre dans l'une ou l'autre phase.

Méthode de HPLC

La méthode de HPLC permet d'estimer des coefficients de partage dans une gamme de valeurs de log Pow comprises entre 0 et 6. Normalement, le coefficient de partage d'un composé peut être estimé avec une précision de ± 1 unité log de la valeur obtenue avec la méthode par agitation en flacon. On peut trouver des exemples de corrélations dans la littérature (4) (5) (6) (7) (8). Une plus grande précision peut généralement être obtenue lorsque la courbe de corrélation est établie avec des composés de référence de structure voisine (9).

1.5.3. Spécificité

1.5.3. Méthode par agitation en flacon

La loi de partage de Nernst ne s'applique qu'à température, pression et pH constants pour les solutions diluées. Rigoureusement, elle ne s'applique qu'à une substance dispersée entre deux solvants purs. Les résultats peuvent être affectés par l'apparition simultanée, dans l'une ou dans les deux phases, de plusieurs solutés différents. La dissociation ou l'association de molécules dissoutes se traduit par des déviations par rapport à la loi de partage citée. Ces déviations s'expliquent par le fait que le coefficient de partage dépend dès lors de la concentration de la solution. En raison des équilibres multiples en présence, cette méthode d'essai ne doit pas être appliquée sans correction aux composés ionisables. Dans ce cas, il faut envisager de remplacer l'eau par des solutions tampons dont le pH doit être distant d'au moins une unité pH du pKa de la substance; il faut tenir compte de l'importance de ce pH pour l'environnement.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Estimation préliminaire du coefficient de partage La valeur du coefficient de partage est estimée de préférence à l'aide d'une méthode de calcul (voir annexe 1), ou bien, s'il y a lieu, à partir du rapport des valeurs de solubilité de la substance à étudier dans des solvants purs (10).

1.6.2. Méthode par agitation en flacon

1.6.2.

1.6.2.1. Préparation n-Octanol: la détermination du coefficient de partage doit être effectuée en recourant à un réactif de qualité analytique. Eau: utiliser de l'eau distillée ou bidistillée dans un appareil de verre ou de quartz. Pour les composés ionisables, remplacer, si c'est justifié, l'eau par des solutions tampons. Note: Ne pas utiliser l'eau provenant directement d'un échangeur d'ions.

1.6.2.1.

1.6.2.1.1. Présaturation des solvants Avant de déterminer un coefficient de partage, les phases du système de solvants sont saturées réciproquement par agitation à température d'essai. Pour ce faire, il est pratique d'agiter pendant vingt-quatre heures, dans un agitateur mécanique, deux grands flacons contenant du n-Octanol pur de qualité analytique ou de l'eau, avec une quantité suffisante de l'autre solvant, puis de les laisser reposer jusqu'à ce que les phases se séparent et que l'on parvienne à un état de saturation.

1.6.2.1.2. Préparation de l'essai Le volume liquide doit remplir presque complètement le récipient d'essai afin d'éviter toute perte de matière due à la volatilisation. Le rapport de volume et les quantités de substance à utiliser sont fixés comme suit: Trois essais sont effectués. Pour le premier, on utilise le rapport n-Octanol/eau calculé, pour le second, ce rapport est réduit de moitié et pour le troisième, il est doublé (par exemple 1:1, 1:2, 2:1).

estimation préliminaire du coefficient de partage (voir ci-avant),

quantité minimale de substance à tester requise par le procédé analytique utilisé,

limite de concentration maximale dans chaque phase de 0,01 mol par litre.

1.6.2.1.3. Substance à étudier Une solution de réserve est préparée dans du n-Octanol présaturé d'eau. La concentration de cette solution mère doit être déterminée avec précision avant de l'utiliser pour déterminer le coefficient de partage. Cette solution doit être stockée dans des conditions qui garantissent sa stabilité.

1.6.2.2. Conditions de l'essai La température d'essai doit être maintenue constante (± 1 oC) et se situer dans l'intervalle compris entre 20 oC et 25 oC.

1.6.2.3. Mesure

1.6.2.3.

1.6.2.3.1. Établissement de l'équilibre de partage Pour chaque série de conditions d'essai, préparer en double des récipients d'essai contenant les quantités requises, mesurées avec précision, des deux solvants ainsi que la quantité nécessaire de solution de réserve. Mesurer le volume des phases de n-Octanol. Placer les récipients d'essai dans un agitateur approprié ou les agiter à la main. Lorsqu'on utilise un tube à centrifuger, une méthode recommandée consiste à retourner rapidement le tube à 180o autour de son axe transversal de telle sorte que l'air éventuellement retenu traverse les deux phases. L'expérience a montré que cinquante rotations de ce type suffisent généralement pour établir l'équilibre de partage. Pour plus de certitude, il est recommandé d'effectuer cent rotations en cinq minutes.

1.6.2.3.2. Séparation des phases On peut, si nécessaire, centrifuger le mélange pour séparer les phases. Cette opération est effectuée à l'aide d'une centrifugeuse de laboratoire maintenue à température ambiante, ou, si l'on utilise une centrifugeuse sans contrôle de température, les tubes a centrifuger doivent être gardés à température d'essai pendant au moins une heure avant l'essai.

1.6.2.4. Analyse Pour déterminer le coefficient de partage, il est nécessaire de déterminer la concentration de la substance à étudier dans les deux phases. Pour ce faire, prélever une portion de chacune des deux phases de chaque tube pour chaque série de conditions d'essai et les analyser suivant le procédé choisi. La quantité totale de substance présente dans les deux phases doit être calculée et comparée avec la quantité de substance initialement introduite. La phase aqueuse doit être échantillonnée selon un procédé réduisant au minimum le risque d'inclusion de traces de n-Octanol: on peut utiliser à cet effet une seringue en verre à aiguille interchangeable. Tout d'abord remplir partiellement la seringue d'air, lequel est ensuite expulsé doucement, tout en insérant l'aiguille dans la couche de n-Octanol. Prélever un volume adéquat de phase aqueuse. Retirer rapidement la seringue de la solution et enlever l'aiguille. Le contenu de la seringue pourra alors être utilisé comme échantillon aqueux. La concentration doit être déterminée dans les deux phases distinctes de préférence par un procédé spécifique à la substance. Exemples de méthodes analytiques susceptibles de convenir:

méthodes photométriques,

chromatographie en phase gazeuse,

chromatographie en phase liquide haute performance.

1.6.3. Méthode HPLC

1.6.3.

1.6.3.1. Préparation

1.6.3.1. Appareil

Il est nécessaire de disposer d'un chromatographe à phase liquide, muni d'une pompe à débit régulier et d'un dispositif de détection approprié. Il est recommandé d'utiliser une valve à injection portant des boucles à injection. La présence de groupes polaires dans la phase stationnaire peut entraver considérablement le fonctionnement de la colonne d'HPLC. C'est pourquoi les phases stationnaires doivent contenir un minimum de groupes polaires (11). On peut utiliser des phases inverses à microparticules ou des colonnes prêtes à l'emploi vendues dans le commerce. Une colonne de sécurité peut être placée entre le système d'injection et la colonne analytique.

Phase mobile

Le solvant d'élution est préparé avec du méthanol et de l'eau de qualité HPLC et dégazé avant utilisation. Il convient d'employer une élution isocratique et d'utiliser un rapport méthanol/eau contenant un minimum de 25 % d'eau. Normalement, un mélange méthanol-eau 3:1 (v/v) convient pour éluer des composés de log P 6 en moins d'une heure, à un débit de 1 millilitre/minute. Pour les composés dont le log P est élevé, il peut être nécessaire de réduire le temps d'élution et celui des composés de référence en diminuant la polarité de la phase mobile ou la longueur de la colonne. Les substances très peu solubles dans le n-Octanol ont tendance à donner des valeurs de log Pow anormalement basses avec la méthode HPLC; les pics formés par ces composés font parfois partie du front du solvant. Ce phénomène est probablement dû au fait que le processus de partage est trop lent pour atteindre l'équilibre dans un laps de temps normal pour une séparation par HPLC. Pour parvenir à une valeur fiable, il peut être utile de diminuer le débit ou le rapport méthanol/eau. Les substances à tester et les composés de référence doivent être solubles, dans la phase mobile, à des concentrations suffisantes pour permettre leur détection. On ne peut employer d'additifs avec le mélange méthanol-eau que dans des cas exceptionnels, car ils modifient les propriétés de la colonne. Les chromatogrammes avec additifs doivent obligatoirement être effectués avec une autre colonne du même type. Si le mélange méthanol-eau n'est pas approprié, on peut utiliser d'autres mélanges solvant organique-eau, par exemple éthanol-eau ou acétonitrile-eau. Le pH de l'éluant est d'une importance capitale pour les composés ionisables. Il doit se situer dans l'intervalle de pH auquel fonctionne la colonne, qui est habituellement compris entre 2 et 8. Il est recommandé de tamponner. Il faut prendre soin d'éviter la précipitation saline et la détérioration de la colonne qui se produisent avec certains mélanges phase organique/tampon. Il n'est pas recommandé d'effectuer des mesures de HPLC avec des phases stationnaires à base de silice à un pH supérieur à 8 parce qu'une phase mobile alcaline peut altérer rapidement le fonctionnement de la colonne.

Solutés

Les composés de référence doivent être les plus purs possibles. Les composés utilisés à des fins d'essai ou d'étalonnage sont, si possible, dissous dans la phase mobile.

Conditions de l'essai

La température ne doit pas varier de plus de ± 2 K pendant les mesures.

1.6.3.2. Mesure

1.6.3.2. Calcul du temps mort t0

Le temps mort t0 peut être déterminé en utilisant soit une série d'homologues (par exemple n-alkyl-méthyl-cétones) soit des composés organiques non retenus (par exemple thiourée ou formamide). Pour calculer le temps mort (t0) à l'aide d'une série homologue, il faut injecter un jeu d'au moins 7 membres d'une série homologue et déterminer leurs temps de rétention respectifs. Les temps de rétention bruts tr(nc + 1) sont tracés en fonction de tr(nc). L'intersection a et la pente b de l'équation de régression: tr(nc + 1) = a + b tr(nc) sont déterminés (nc = nombre d'atomes de carbone). Le temps mort est défini par l'équation suivante t0 = a/(1 - b)

Courbe d'étalonnage

L'étape suivante consiste à construire une courbe de corrélation entre log k et log P pour des composés de référence appropriés. En pratique, il s'agit d'injecter simultanément un jeu de cinq à dix composés de référence standard dont le log P est proche de la gamme prévue et de déterminer les temps de rétention, de préférence sur un intégrateur enregistreur lié au système de détection. Les logarithmes des facteurs de capacité, log k, correspondants sont calculés et tracés en fonction du log P déterminé avec la méthode par agitation en flacon. L'étalonnage est effectué à intervalles réguliers, au moins une fois par jour, afin de pouvoir tenir compte de changements éventuels du fonctionnement de la colonne.

Détermination du facteur de capacité de la substance à tester

Injecter la substance à tester dans une quantité aussi petite que possible de phase mobile. Déterminer (en double) le temps de rétention qui permet de calculer le facteur de capacité k. Le coefficient de partage de la substance à tester peut être déduit par interpolation à partir de la courbe de corrélation des produits de référence. Une extrapolation s'impose pour les coefficients de partage très faibles ou très élevés. Il faut alors accorder une attention particulière aux limites de confiance de la courbe de régression.

2. DONNÉES

2. Méthode par agitation en flacon

La fiabilité des valeurs de P ainsi déterminées peut être vérifiée en procédant à une comparaison de la moyenne des déterminations effectuées en double avec la moyenne générale.

3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) et, s'il y a lieu, l'étape de purification préliminaire,

si les méthodes ne sont pas applicables (par exemple substance tensioactive), il convient de fournir une valeur calculée ou estimée à partir des solubilités individuelles dans l'eau ou le n-Octanol,

toutes les informations et remarques pertinentes pour l'interprétation des résultats doivent être signalées, en particulier les impuretés et l'état physique de la substance.

les résultats de l'estimation préliminaire, s'il y a lieu,

la température à laquelle est effectuée la détermination,

les données relatives aux procédés analytiques utilisés pour déterminer les concentrations,

le temps et la vitesse de centrifugation, s'il y a lieu,

les concentrations mesurées dans les deux phases pour chaque détermination (cela signifie qu'un total de douze concentrations doit être consigné),

le poids de la substance à étudier, le volume de chaque phase utilisée dans chaque récipient à essai et la quantité totale calculée de substance à étudier présente dans chaque phase une fois l'équilibre atteint,

les valeurs calculées du coefficient de partage (P) et la moyenne doivent être mentionnées pour chaque série de conditions d'essai ainsi que la moyenne de l'ensemble des déterminations. Toute indication de dépendance du coefficient de partage vis-à-vis de la concentration doit être mentionnée,

la déviation standard des valeurs individuelles de P par rapport à leur moyenne,

la moyenne P de l'ensemble des déterminations exprimée par son logarithme (base 10),

la valeur théorique calculée de Pow, si elle a été déterminée, ou si la valeur mesurée est > 104,

le pH de l'eau utilisée et de la phase aqueuse pendant l'expérience,

si l'eau est remplacée par un tampon, justifier son utilisation, et donner sa composition sa concentration et son pH ainsi que le pH de la phase aqueuse avant et après l'expérience.

le résultat de l'estimation préliminaire, s'il y a lieu,

les substances à étudier et les substances de référence ainsi que leur degré de pureté,

la gamme de température à laquelle sont effectuées les déterminations,

le pH auquel sont effectuées les déterminations,

une description détaillée de la colonne analytique et de la colonne de sécurité ainsi que de la phase mobile et des moyens de détection,

des données relatives à la rétention et les valeurs de log P citées dans la littérature pour les composés de référence utilisés pour l'étalonnage,

une description détaillée de la ligne de régression ajustée (log k en fonction de log P),

des données relatives à la rétention moyenne et à la valeur interpolée de log P pour le composé à étudier,

une description du matériel et des conditions expérimentales,

les profils d'élution,

les quantités de produit à étudier et de substances de référence introduites dans la colonne,

le temps mort et la méthode utilisée pour le calculer.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(7) (13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)

RÉFÉRENCES OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice no 107, décision du Conseil C(81) 30 final. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. Log P and Parameter Database, A tool for quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo. dir.) — Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Dundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683. H. Ellgehausen. C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed Mat. Res., 1981, vol. 15, 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (édité par E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses, Chem Rev., 1971, vol. 71, 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmentai Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination du coefficient de partage — Méthode par agitation en flacon. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. A. Leo, C.Hansch and D. Elkins, Chem. Rev, 1971, vol. 71, 525. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitam and E. J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984. Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.

A.9. POINT D'ÉCLAIR

A.9.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Pour réaliser cet essai, il est utile de disposer d'informations préliminaires sur l'inflammabilité de la substance. Le mode opératoire est applicable aux substances liquides dont les vapeurs peuvent être enflammées par des sources d'inflammation. Les méthodes d'essai énumérées dans le présent document ne sont valables que pour les intervalles de point d'éclair spécifiés dans les méthodes individuelles. Il convient de tenir compte dans le choix de la méthode des réactions chimiques éventuelles entre la substance et le support de l'échantillon.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Le point d'éclair est la température la plus basse, corrigée pour une pression de 101,325 kPa, à laquelle le liquide d'essai dégage des vapeurs, dans les conditions définies dans la méthode d'essai, en quantité telle qu'il en résulte dans le récipient d'essai un mélange vapeur/air inflammable. Unités: oC t = T - 273,15 (t est exprimé en oC et T en K)

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles devraient servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec différentes méthodes.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La substance est placée dans un récipient d'essai que l'on chauffe ou que l'on refroidit à la température d'essai, suivant le mode opératoire décrit dans la méthode d'essai individuel. Des essais d'inflammation doivent être effectués afin de s'assurer que la substance dégage ou non des vapeurs inflammables à la température d'essai,

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ

1.5.

1.5.1. Répétabilité La répétabilité dépend de l'intervalle de point d'éclair et de la méthode d'essai utilisée; maximum 2 oC.

1.5.2. Sensibilité La sensibilité dépend de la méthode d'essai utilisée.

1.5.3. Spécificité La spécificité de certaines méthodes d'essai est limitée à certains intervalles de point d'éclair et dépend de données relatives à la substance (par exemple haute viscosité).

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Préparation Un échantillon de la substance à tester est placé dans un appareil d'essai conforme aux points 1.6.3.1 ou 1.6.3.2. Par mesure de sécurité, il est conseillé d'utiliser pour les substances énergétiques ou toxiques, une méthode n'exigeant qu'un échantillon de petite taille (2 cm3 environ).

1.6.2. Conditions d'essai L'appareil doit, dans la limite des règles de sécurité, être placé à l'abri des courants d'air.

1.6.3. Mode opératoire

1.6.3.

1.6.3.1. Méthode de l'équilibre Voir normes ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2. Méthode du non-équilibre

1.6.3.2. Appareil d'Abel:

Voir normes BS 2000 partie 170, NF M07-011, NF T66-009.

Appareil d'Abel-Pensky:

Voir normes EN 57, DIN 51755 partie 1 (pour des températures de 5 à 65 oC), DIN 51755 partie 2 (pour des températures inférieures à 5 oC), NF M07-036.

Appareil Tag:

Voir norme ASTM D 56.

Appareil de Pensky-Martens:

Voir normes ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Observations:

Lorsque le point d'éclair, déterminé par une méthode basée sur le non-équilibre (point 1.6.3.2.), a une valeur de 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC ou 55 ± 2 oC, il importe de confirmer cette valeur par une méthode basée sur l'équilibre en utilisant le même appareil. Seules les méthodes susceptibles de donner la température du point d'éclair peuvent être utilisées pour une notification. Pour déterminer le point d'éclair des liquides visqueux (peintures, gommes et substances similaires) contenant des solvants, il ne faut utiliser que des appareils et des méthodes d'essai permettant de déterminer le point d'éclair des liquides visqueux. Voir normes ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 partie 1.

2. DONNÉES

3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

les spécifications précises de la substance (identité et impuretés),

la méthode utilisée ainsi que toute variante éventuelle,

les résultats et toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation des résultats.

4. RÉFÉRENCES Aucune.

A.10. INFLAMMABILITÉ (SOLIDES)

A.10.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Avant de procéder à cet essai, il est utile de disposer d'informations préliminaires sur les propriétés explosives potentielles de la substance. Cet essai ne doit être appliqué qu'aux substances poudreuses, granuleuses ou pâteuses. De façon à ne pas englober toutes les substances susceptibles d'être enflammées, mais uniquement celles qui brûlent rapidement ou celles dont la combustion est particulièrement dangereuse d'une façon ou d'une autre, ne sont considérées comme très inflammables que les substances dont la vitesse de combustion dépasse une certaine limite. La propagation de l'incandescence dans une poudre métallique peut être particulièrement dangereuse en raison des difficultés que présente l'extinction du feu. Les poudres métalliques sont considérées comme très inflammables si l'incandescence se propage dans tout l'échantillon en un temps déterminé.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Le temps de combustion est exprimé en secondes.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Non spécifiées.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La substance est disposée de manière à former une bande ininterrompue ou une traînée de poudre d'environ 250 mm de longueur. Un essai préliminaire est effectué afin de déterminer si, par allumage à la flamme d'un brûleur à gaz, il se produit une propagation de la combustion avec ou sans flamme. Si la combustion se propage sur une distance de plus de 200 mm en un temps déterminé, un essai complet est effectué pour déterminer la vitesse de combustion.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Non établis.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Essai préliminaire La substance est disposée en bande ininterrompue ou en traînée de poudre d'environ 250 mm de longueur par 20 mm de largeur et 10 mm de hauteur sur une plaque non combustible, non poreuse et peu thermoconductrice. La flamme chaude d'un brûleur à gaz (diamètre minimum 5 mm) est appliquée à l'une des extrémités de la traînée de poudre jusqu'à ce que celle-ci s'enflamme, ou pendant un maximum de 2 minutes (5 minutes pour les poudres métalliques ou d'alliages métalliques). Noter si la combustion se propage le long de la traînée sur une distance de 200 mm pendant une durée d'essai de 4 minutes (40 minutes pour les poudres métalliques). Si la substance ne s'enflamme pas et ne propage pas la combustion, avec ou sans flamme, sur une distance de 200 mm pendant une durée d'essai de 4 minutes (ou 40 minutes), la substance n'est pas considérée comme très inflammable, et il n'est pas nécessaire de poursuivre l'essai. Si la combustion de la substance se propage sur une distance de 200 mm sur la traînée de poudre en moins de 4 minutes (ou de 40 minutes pour les poudres métalliques), le mode opératoire décrit ci-dessous (aux points 1.6.2 et suivants) doit être suivi.

1.6.2. Essai de vitesse de combustion.

1.6.2.

1.6.2.1. Préparation Les substances poudreuses ou granuleuses sont versées en vrac dans un moule de 250 mm de longueur et de section transversale triangulaire dont la hauteur et la largeur intérieure sont respectivement de 10 et 20 millimètres. Disposer de part et d'autre du moule, dans le sens de la longueur, deux plaques métalliques destinées à jouer le rôle de supports latéraux. Ces plaques dépassent de 2 mm le bord supérieur de la section triangulaire transversale (voir figure). Ensuite, laisser tomber trois fois le moule d'une hauteur de 2 cm sur une surface dure. Rajouter de la substance s'il y a lieu. Enlever ensuite les plaques latérales et racler le trop-plein. Placer une plaque non combustible, non poreuse et peu thermoconductrice sur le moule, retourner l'ensemble et démouler. Les substances pâteuses sont étalées sur une plaque non combustible, non poreuse et peu thermoconductrice sous la forme d'un cordon de 250 mm de longueur et d'environ 1 cm2 de section transversale.

1.6.2.2. Conditions d'essai Dans le cas de substances sensibles à l'humidité, effectuer l'essai le plus vite possible après avoir retiré la substance de son récipient.

1.6.2.3. Mode opératoire Disposer le tas dans une hotte, perpendiculairement au sens du courant d'air. La vitesse de l'air doit suffire à empêcher la fumée de se répandre dans le laboratoire et ne doit pas être modifiée au cours de l'essai. Le flux d'air doit former un écran qui entoure l'appareil. L'une des extrémités du tas est enflammée à l'aide de la flamme chaude d'un brûleur à gaz (diamètre minimal 5 mm). Lorsque le tas a brûlé sur une distance de 80 mm, mesurer la vitesse de combustion sur les 100 mm suivants. Répéter l'essai six fois, en utilisant chaque fois une plaque propre et froide, à moins d'observer un résultat positif avant.

2. DONNÉES Le temps de combustion observé lors de l'essai préliminaire (1.6.1) et le temps de combustion le plus court observé au cours de l'essai (1.6.2.3) sont pertinents pour l'évaluation.

3. RÉSULTATS

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

les spécifications précises de la substance (identité et impuretés),

une description de la substance à essayer, son état physique, y compris son taux d'humidité,

les résultats des essais préliminaires et des essais de vitesse de combustion, si ces derniers ont été effectués,

toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation des résultats.

3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Les substances poudreuses, granuleuses ou pâteuses doivent être considérées comme très inflammables lorsque le temps de combustion observé au cours de l'un des essais effectués conformément au mode opératoire décrit au point 1.6.2 est inférieur à 45 secondes. Les poudres métalliques ou d'alliages métalliques doivent être considérées comme très inflammables lorsqu'elles peuvent être enflammées et que la flamme ou la zone de réaction s'étend à tout l'échantillon en 10 minutes ou moins.

4.(1) RÉFÉRENCES NF T 20-042 (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de l'inflammabilité des solides.

A.11. INFLAMMABILITÉ (GAZ)

A.11.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION La présente méthode permet de déterminer si des gaz mélangés à l'air à température ambiante (20 oC environ) et à la pression atmosphérique sont inflammables et, s'ils le sont, dans quel intervalle de concentration. Des mélanges contenant des concentrations croissantes du gaz à tester dans de l'air sont exposés à une étincelle électrique et on observe si l'inflammation se produit.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS L'intervalle d'inflammabilité est l'intervalle de concentration entre les limites d'explosion supérieure et inférieure. Les limites d'explosion supérieure et inférieure sont les concentrations dans l'air du gaz inflammable auxquelles l'inflammation ne se propage pas.

1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE Non spécifiée.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La concentration du gaz dans l'air est augmentée graduellement et le mélange est exposé à une étincelle électrique à chaque étape.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Non fixés.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Appareil Le récipient d'essai est un cylindre en verre d'un diamètre intérieur de 50 mm au moins et d'une hauteur de 300 mm au moins, disposé verticalement. Les électrodes d'inflammation sont distantes l'une de l'autre de 3 à 5 mm et placées à 60 mm du fond du cylindre. Le cylindre est équipé d'une soupape. L'appareil doit être protégé par un blindage pour limiter les dégâts d'une explosion éventuelle. La source d'inflammation est une étincelle inductive entretenue d'une durée de 0,5 seconde, produite par un transformateur à haute tension avec une tension de sortie de 10 à 15 kV (la puissance maximale est de 300 W). Un modèle d'appareil approprié est décrit dans la référence (2).

1.6.2. Conditions d'essai L'essai doit avoir lieu à température ambiante (20 oC environ).

1.6.3. Mode opératoire Remplir le cylindre en verre d'un mélange air-gaz de concentration connue à l'aide de pompes doseuses. Faire jaillir une étincelle au travers de ce mélange et observer si une flamme se détache de la source d'inflammation et se propage de manière indépendante. La concentration du gaz est modifiée par étapes de 1 % en volume jusqu'à ce que l'inflammation décrite ci-dessus se produise. Si la structure chimique du gaz laisse supposer qu'il doit être ininflammable et s'il est possible de calculer la composition du mélange stœchiométrique avec l'air, ne soumettre à essai, par étapes de 1 %, que des mélanges dans une gamme comprise entre 10 % de moins que la composition stœchiométrique et 10 % de plus.

2. DONNÉES La propagation de la flamme constitue la seule donnée d'information valable pour la détermination de cette propriété.

3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

les spécifications précises de la substance (identité et impuretés),

une description, incluant les dimensions, de l'appareil utilisé,

la température à laquelle l'essai a été réalisé,

les concentrations d'essai ainsi que les résultats obtenus,

le résultat de l'essai: gaz ininflammable ou très inflammable,

lorsque l'on conclut à l'ininflammabilité, il convient de préciser l'intervalle de concentration sur lequel a porté l'essai, par étapes de 1 %,

toute information et observation pertinente pour l'interprétation des résultats.

4.(1)(2) RÉFÉRENCES NF T 20-041 (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de l'inflammabilité des gaz. W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse-Wortmann, T.Redeker und H.Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, 126-127.

A.12. INFLAMMABILITÉ (AU CONTACT DE L'EAU)

A.12.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Cette méthode d'essai peut être utilisée pour déterminer si la réaction d'une substance avec l'eau ou l'air humide entraîne le dégagement d'une quantité dangereuse d'un gaz ou de plusieurs gaz, susceptibles d'être très inflammables. Elle peut être appliquée à la fois aux substances solides et liquides mais non aux substances qui s'enflamment spontanément au contact de l'air.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Très inflammables: substances qui, au contact de l'eau ou de l'air humide, dégagent une quantité dangereuse de gaz très inflammables à raison d'un débit minimal de 1 litre/kg par heure.

1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE L'essai de la substance comporte plusieurs phases décrites ci-après; si l'inflammation intervient à une quelconque de ces phases, il n'est pas nécessaire de poursuivre l'essai. Si on sait que la substance ne réagit pas violemment avec l'eau, procéder à la phase 4 (voir 1.3.4).

1.3.

1.3.1. Phase 1 Placer la substance à tester dans un bac contenant de l'eau distillée à 20 oC et noter si le gaz s'enflamme ou non.

1.3.2. Phase 2 Placer la substance à tester sur un papier filtrant flottant sur de l'eau distillée à 20 oC contenue dans une capsule et noter si le gaz qui se dégage s'enflamme ou non. Le papier-filtre ne sert qu'à maintenir la substance en place, ce qui accroît les probabilités d'inflammation.

1.3.3. Phase 3 Mettre la substance à tester en tas sur une hauteur de 2 cm et un diamètre de 3 cm environ. Ajouter quelques gouttes d'eau au tas ainsi constitué et noter si le gaz qui se dégage s'enflamme ou non.

1.3.4. Phase 4 Mélanger la substance d'essai avec de l'eau distillée a 20 oC et mesura le débit du gaz pendant 7 heures, à intervalles d'une heure. Si ce débit est variable ou s'il s'accroît après 7 heures, le temps de mesure doit être prolongé jusqu'à 5 jours au maximum. L'essai peut être arrêté si le débit excède 1 l/kg par heure à un moment donné.

1.4. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE Non spécifiée.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Non indiqués.

1.4. 1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES

1.4.

1.6.1. Phase 1

1.6.1.

1.6.1.1. Conditions de l'essai L'essai est effectué à température ambiante (20 oC, environ).

1.6.1.2. Mode opératoire Placer une petite quantité (approximativement 2 mm de diamètre) de la substance à tester dans un bac contenant de l'eau distillée. Noter si: i) il y a dégagement de gaz, ii) le gaz s'enflamme. Si le gaz s'enflamme, il est inutile de poursuivre l'essai de la substance, celle-ci étant dès lors considérée comme substance dangereuse.

1.6.2. Phase 2

1.6.2.

1.6.2.1. Appareil Papier-filtre flottant sur la surface de l'eau distillée dans un récipient approprié, par exemple une capsule de 100 mm de diamètre.

1.6.2.2. Conditions de l'essai L'essai est effectué à température ambiante (20 oC, environ).

1.6.2.3. Mode opératoire Placer une petite quantité (approximativement 2 mm de diamètre) de la substance à tester au centre du papier-filtre. Noter si: i) il y a dégagement de gaz, ii) le gaz s'enflamme. Si le gaz s'enflamme, il est inutile de poursuivre l'essai de la substance, celle-ci étant dès lors considérée comme substance dangereuse.

1.6.3. Phase 3

1.6.3.

1.6.3.1. Conditions de l'essai L'essai est effectué à température ambiante (20 oC, environ).

1.6.3.2. Mode opératoire Mettre la substance à tester en tas sur une hauteur de 2 cm et un diamètre de 3 cm environ en aménageant au sommet un petit cratère. Ajouter quelques gouttes d'eau dans le creux. Noter si: i) il y a dégagement de gaz, ii) le gaz s'enflamme. Si le gaz s'enflamme, il est inutile de poursuivre l'essai de la substance, celle-ci étant dès lors considérée comme substance dangereuse.

1.6.4. Phase 4

1.6.4.

1.6.4.1. Appareil L'appareil est monté comme indiqué sur la figure.

1.6.4.2. Conditions de l'essai S'assurer que le récipient contenant la substance à tester est exempt de particules pulvérulentes (< 500 5m). Si celles-ci représentent plus de 1 % en poids du total, ou si l'échantillon est friable, réduire la substance en poudre avant de procéder à l'essai, afin de réduire la dimension des particules pendant le stockage et la manutention; sinon, la substance est utilisée telle qu'elle est reçue. L'essai doit être réalisé à température ambiante (20 oC environ) et à pression atmosphérique.

1.6.4.3. Mode opératoire Verser de 10 à 20 ml d'eau dans l'entonnoir à robinet de l'appareillage et placer 10 g de substance dans la fiole conique. Le volume de gaz qui se dégage peut être mesuré par tout moyen approprié. Ouvrir le robinet de l'entonnoir pour laisser pénétrer l'eau dans la fiole conique et déclencher un chronomètre. Le dégagement gazeux est mesuré toutes les heures pendant sept heures. Si, pendant cette période, le dégagement gazeux devient irrégulier, ou si, à la fin de cette période, son débit augmente, il convient de poursuivre les mesures pendant cinq jours. Si, à un moment quelconque des mesures, le débit du dégagement gazeux excède 1 litre/kg par heure, l'essai peut être interrompu. L'essai doit être réalisé en triple. Si l'identité chimique du gaz est inconnue, celui-ci doit être analysé. Si le gaz contient des constituants très inflammables, ou si l'on ignore si l'ensemble du mélange est très inflammable, préparer et essayer un mélange de même composition conformément à la méthode d'essai (A.11).

2. DONNÉES La substance est considérée comme dangereuse si:

une inflammation spontanée intervient lors d'une phase quelconque du déroulement de l'essai,

un gaz inflammable se dégage à un débit supérieur à 1 litre/kg de substance par heure.

3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

les spécifications précises de la substance (identité et impuretés),

une description détaillée de toute préparation préalable de la substance à essayer,

les résultats de l'essai (phases 1, 2, 3 et 4),

l'identité chimique du gaz qui se dégage,

le débit du dégagement gazeux, si la phase 4 (1.6.4) est effectuée,

le résultat de l'essai: gaz ininflammable ou très inflammable,

toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation des résultats.

4.(1)(2) RÉFÉRENCES Recommandations relatives au transport des marchandises dangereuses. Épreuves et critères, 1990, Nations unies, New York. NF T 20-040 (septembre 1985), Produits chimiques à usage industriel. Détermination de l'inflammabilité des gaz engendrés par hydrolyse des produits solides et liquides.

A.13. PROPRIÉTÉS PYROPHORIQUES DES SOLIDES ET DES LIQUIDES

A.13.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Cet essai est applicable aux substances solides et liquides, qui, en petite quantité, s'enflamment spontanément, peu de temps après être entrées en contact avec l'air à température ambiante (20 oC environ). Les substances dont l'inflammation spontanée n'intervient qu'après une exposition de plusieurs heures ou de plusieurs jours à température ambiante, ou à des températures élevées, ne sont pas couvertes par cette méthode d'essai.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Les substances sont considérées comme ayant des propriétés pyrophores si elles s'enflamment ou causent la carbonisation dans les conditions décrites au point 1.6. L'auto-inflammabilité des liquides peut également exiger d'être évaluée selon la méthode A.15 (température d'inflammation spontanée des liquides et des gaz).

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Non spécifiées.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La substance, solide ou liquide, est ajoutée à un porteur inerte et mise en contact avec l'air à température ambiante pendant une période de cinq minutes. Si les substances liquides ne s'enflamment pas, elles sont absorbées sur un papier-filtre qui est exposé à l'air, à température ambiante (20 oC environ), pendant cinq minutes. Si la substance, solide ou liquide, enflamme ou carbonise un papier-filtre, elle est considérée comme pyrophorique.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Répétabilité: en raison de l'importance que revêt l'aspect sécurité, un seul résultat positif est suffisant pour conclure que la substance est très inflammable.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.6.

1.6.1. Appareillage Remplir une capsule de porcelaine de 10 cm de diamètre environ de terre d'infusoires, sur une épaisseur de 5 mm environ, à température ambiante (20 oC environ). Remarque: La terre d'infusoires, ou toute autre substance inerte comparable généralement disponible, sera prise comme représentative du sol sur lequel la substance pourra être accidentellement répandue. Les essais concernant les liquides qui ne s'enflamment pas au contact de l'air lorsqu'ils sont en contact avec un porteur inerte seront effectués avec un papier-filtre sec.

1.6.2. Réalisation de l'essai

1.6.2. a)

Solides pulvérulents Verser 1 ou 2 cm3 de substance pulvérulente à tester, d'une hauteur d'environ 1 m sur une surface non combustible et observer si la substance s'enflamme pendant la chute ou pendant les cinq premières minutes de tassement. L'essai est répété six fois, à moins qu'une inflammation ne survienne.

Liquides Verser environ 5 cm3 de liquide à essayer dans une capsule de porcelaine préparée et observer si la substance s'enflamme dans les cinq minutes. S'il ne survient pas d'inflammation au cours de six essais, effectuer l'essai suivant: Déposer à l'aide d'une seringue 0,5 ml de l'échantillon à essayer sur un papier-filtre à cet usage et observer si le papier-filtre s'enflamme ou se carbonise dans les cinq minutes qui suivent le dépôt du liquide. L'essai est effectué trois fois, à moins qu'une inflammation ou une carbonisation ne survienne.

2. DONNÉES

2.

2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS L'essai peut être interrompu dès que l'un des essais donne un résultat positif.

2.2. ÉVALUATION Si la substance s'enflamme dans les cinq minutes après avoir été ajoutée à un porteur inerte et exposée à l'air, ou si un liquide carbonise ou enflamme un papier-filtre dans les cinq minutes après avoir été déposé sur ce dernier et exposé à l'air, il est considéré comme pyrophore.

3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

les spécifications précises de la substance (identité et impuretés),

les résultats de l'essai,

toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation des résultats.

4.(1)(2) RÉFÉRENCES NF T 20-039 (septembre 1985), Produits chimiques à usage industriel — Détermination de l'inflammabilité spontanée des solides et liquides. Recommandations relatives au transport des marchandises dangereuses — Épreuves et critères, 1990, Nations unies, New York.

A.14. DANGER D'EXPLOSION

A.14.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Cette méthode permet de déterminer si une substance solide ou pâteuse présente un danger d'explosion lorsqu'elle est soumise à l'effet d'une flamme (sensibilité thermique), à un choc ou à une friction (sensibilité aux stimulations mécaniques), et si une substance liquide présente un danger d'explosion lorsqu'il est soumis à l'effet d'une flamme ou d'un choc. La méthode comprend trois parties: La méthode fournit des données permettant d'évaluer la probabilité d'amorcer une explosion par certaines stimulations ordinaires. Elle n'a pas pour objet d'affirmer qu'une substance n'est pas susceptible d'exploser dans certaines conditions. La méthode est apte à déterminer si une substance présentera un danger d'explosion (sensibilité thermique et mécanique) dans les conditions particulières définies par la directive. Elle repose sur un certain nombre de types d'appareils qui sont largement utilisés sur le plan international (1) et qui donnent en règle générale des résultats probants. Il est cependant admis qu'elle n'a pas une valeur définitive. D'autres appareils que ceux qui sont mentionnés peuvent être utilisés, à condition qu'ils soient reconnus à l'échelle internationale et que les résultats puissent être mis en corrélation avec les résultats obtenus avec les appareils spécifiés. Il n'est pas nécessaire d'effectuer les essais lorsque les informations disponibles, d'ordre thermodynamique (par exemple: chaleur de formation, chaleur de décomposition) ou structural (absence de certains groupes réactifs (2) dans la formule développée), montrent que la substance n'est, sans aucun doute, pas susceptible de se décomposer rapidement en libérant des gaz ou de la chaleur (à savoir, que ce matériau ne présente aucun risque d'explosion). Il est inutile de réaliser un essai de sensibilité mécanique à la friction pour les liquides.

1.1. a)

un essai de sensibilité thermique (1),

un essai de sensibilité mécanique (choc) (1),

un essai de sensibilité mécanique (friction) (1).

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Substances explosibles: substances qui sont susceptibles d'exploser sous l'effet d'une flamme, ou qui sont sensibles au choc ou à la friction dans l'appareil spécifié (ou dont la sensibilité mécanique est supérieure à celle du 1,3-dinitrobenzène dans un autre appareil).

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE 1,3-dinitrobenzène, produit technique cristallisé, tamisé (qui passe au travers d'une maille de 0,5 mm) pour la méthode d'essai par friction et par choc. Perhydro-l,3,5,-trinitro-l,3,5-triazine (RDX, hexogène, cyclonite — CAS 121-82-4), recristallisé à partir d'une solution aqueuse de cyclohexanone, tamisé mouillé au travers d'une maille de 250 μm et retenu par une maille de 150 μm) puis séché à 103 ± 2 oC (pendant 4 heures) pour la seconde série d'essais par friction et par choc.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Des essais préliminaires sont nécessaires pour établir les conditions de sécurité devant présider à l'exécution des trois essais de sensibilité.

1.4.

1.4.1. Essais de sécurité de manipulation (3) Pour des raisons de sécurité, avant d'effectuer les essais proprement dits, des échantillons très réduits (10 mg environ) de substance sont soumis à échauffement sans confinement dans la flamme d'un brûleur à gaz, à un choc dans toute forme appropriée d'appareil, et à friction en utilisant un maillet et une enclume ou tout autre type de dispositif à friction. Ces essais ont pour objectif de déterminer si la substance est sensible et explosible au point de devoir s'entourer de précautions particulières pour réaliser les essais de sensibilité prescrits, notamment les essais de sensibilité thermique, afin d'éviter tout dommage corporel pour l'expérimentateur.

1.4.2. Sensibilité thermique Cette méthode consiste à chauffer la substance dans un tube d'acier, fermé par des plaques à orifice dont le trou peut avoir différents diamètres, pour déterminer si la substance ou la préparation est susceptible d'exploser dans des conditions de température très élevée et de confinement défini.

1.4.3. Sensibilité mécanique (choc) Cette méthode consiste à soumettre la substance au choc d'une masse spécifiée tombant d'une hauteur définie.

1.4.4. Sensibilité mécanique (friction) La méthode consiste à soumettre des substances solides ou pâteuses à une friction entre des surfaces standard dans des conditions spécifiées de charge et de mouvement relatif.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Non indiqués.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Sensibilité thermique (effet d'une flamme)

1.6.1.

1.6.1.1. Appareil L'appareil consiste en un tube d'acier non réutilisable et de son système de fermeture réutilisable (figure 1), installé dans un dispositif de chauffage et de protection. Chaque tube, d'un diamètre interne de 24 mm, d'une longueur de 75 mm et d'une épaisseur de paroi de 0,5 mm, est réalisé par un processus d'emboutissage profond à partir d'une tôle (voir appendice). Les tubes sont pourvus d'une bride de fermeture à leur extrémité ouverte afin de pouvoir les fermer par une plaque à orifice. Il s'agit d'une plaque solidement assujettie au tube par un joint fileté en deux parties (écrou et écrou borgne), résistante à la pression et munie d'un orifice central. L'écrou et l'écrou borgne sont en acier au chrome-manganèse (voir annexe) ne produisant aucune étincelle jusqu'à 800 oC. Les plaques ont une épaisseur de 6 mm et sont fabriquées avec un acier résistant à la chaleur (voir annexe). L'expérimentateur dispose d'une série de plaques dont l'orifice présente différents diamètres.

1.6.1.2. Conditions de l'essai L'essai est normalement réalisé avec la substance telle qu'elle est reçue; toutefois, dans certains cas, par exemple si elle est comprimée, coulée ou condensée d'une manière quelconque, il peut être nécessaire de la désagréger avant de procéder à l'essai. Pour les solides, la masse de matériel à utiliser pour chaque essai est déterminée par une opération préliminaire à deux étapes. Placer un volume de substance de 9 cm3 dans un tube taré, puis tasser en appliquant une force de 80 N sur toute la surface de la section du tube. D'autres méthodes de remplissage doivent parfois être utilisées pour des raisons de sécurité ou lorsque l'état physique de l'échantillon peut être modifié par la compression; par exemple, si la substance est très sensible à la friction, il ne faut pas tasser. Si le matériel est compressible, en rajouter et tasser jusqu'à ce que le tube soit rempli jusqu'à 55 mm du bord. Déterminer la masse totale utilisée pour remplir le tube jusqu'à ce niveau, puis ajouter de la substance encore deux fois, en tassant à chaque fois avec une force de 80 N. Ensuite, rajouter du matériel et tasser, ou en enlever, de manière à ce que le tube soit rempli jusqu'à 15 mm du bord. Effectuer une seconde opération préliminaire en commençant avec une quantité tassée correspondant au tiers de la masse totale déterminée lors de l'opération précédente. Ajouter deux fois de la substance en tassant avec une force de 80 N et ajuster le niveau à 15 mm du bord du tube en ajoutant du matériel ou en enlevant. La quantité de produit solide déterminée lors de cette seconde opération est utilisée pour chaque essai; le remplissage est effectué en trois fois avec des quantités égales de substance comprimées afin que leur volume soit de 9 cm3, quelle que soit la force nécessaire pour y parvenir. (Cette opération peut être facilitée par l'emploi d'anneaux d'espacement.) Les liquides et les gels sont versés dans le tube jusqu'à une hauteur de 60 mm, en prenant soin d'éviter la formation de bulles d'air avec les gels. L'écrou borgne est glissé sur le tube par le bas, la plaque à orifice appropriée est insérée et l'écrou est serré après qu'a été appliqué un lubrifiant à base de bisulfite de molybdène. Il est important de vérifier qu'aucune substance n'est emprisonnée entre la bride et la plaque, ni dans les filetages. Le chauffage est assuré par du propane venant d'une bouteille industrielle, équipée d'un régulateur de pression (60 à 70 mbar), grâce à un débitmètre, et distribué régulièrement (ce que l'on vérifie en observant les flammes des brûleurs) par un collecteur à quatre brûleurs. Les brûleurs sont situés autour de la chambre d'essai, comme indiqué à la figure 1. Les quatre brûleurs consomment ensemble 3,2 litres de propane par minute, environ. Il est possible d'utiliser d'autres gaz de chauffage et d'autres brûleurs, mais la vitesse de chauffage doit correspondre à celle qui est spécifiée à la figure 3. Pour tous les appareils, la vitesse de chauffage doit être vérifiée régulièrement en utilisant des tubes remplis de phtalate de dibutyle, comme indiqué à la figure 3.

1.6.1.3. Déroulement des essais Chaque essai est poursuivi jusqu'à ce que le tube se soit fragmenté ou que le tube ait été chauffé pendant cinq minutes. Un essai aboutissant à la fragmentation du tube en trois parties, ou plus, qui peuvent parfois être reliées l'une à l'autre par d'étroites bandes de métal, comme l'illustre la figure 2, est considéré comme produisant une explosion. Un essai aboutissant à un plus petit nombre de fragments ou à une absence de fragmentation, est considéré comme ne produisant pas d'explosion. Une série de trois essais est d'abord effectuée avec une plaque dont l'orifice a un diamètre de 6,0 mm et, si aucune explosion ne se produit, une seconde série de trois essais est réalisée avec une plaque dont l'orifice a un diamètre de 2,0 mm. S'il se produit une explosion au cours de l'une des séries d'essais, aucun essai supplémentaire n'est requis.

1.6.1.4. Évaluation Le résultat de l'essai est considéré comme positif s'il se produit une explosion au cours de l'une des séries d'essais mentionnées ci-avant.

1.6.2. Sensibilité mécanique (choc)

1.6.2.

1.6.2.1. Appareil (figure 4) Le mouton de choc classique comprend essentiellement: un bloc de fonte avec une embase, une enclume, une colonne, des guides, des masses tombantes, un mécanisme de libération et un support pour l'échantillon. L'enclume d'acier (100 mm de diamètre × 70 mm de hauteur) est vissée sur un bloc d'acier (230 mm de longueur × 250 mm de largeur × 200 mm de hauteur) avec une embase coulée (450 mm de longueur × 450 mm de largeur × 60 mm de hauteur). Une colonne, qui consiste en un tube d'acier étiré sans soudure, est fixée dans un support vissé au dos du bloc d'acier. Quatre vis ancrent l'appareil dans un bloc de béton (60 × 60 × 60 cm) de telle sorte que les rails soient absolument verticaux et que la chute de la masse tombante ne soit pas entravée. L'expérimentateur dispose de masses de 5 et 10 kg, en acier trempé et dont la surface d'impact, d'un diamètre minimal de 25 mm, est en acier traité HRC 60 à 63. L'échantillon à essayer est enfermé dans une matrice de choc constituée de deux cylindres coaxiaux en acier trempé, placés l'un au dessus de l'autre dans un cylindre d'acier creux faisant office de bague de guidage. Les cylindres d'acier trempé doivent avoir un diamètre de 10 (-0,003, -0,005) mm et une hauteur de 10 mm, des surfaces polies, des arêtes arrondies (rayon de courbure 0,5 mm) et une dureté de HRC 58 à 65. Le cylindre creux doit avoir un diamètre extérieur de 16 mm, un alésage de 10 (+0,005, +0,010) mm et une hauteur de 13 mm. La matrice de choc est placée sur une enclume intermédiaire (26 mm de diamètre et 26 mm de hauteur) en acier, centrée par une bague munie de perforations permettant aux vapeurs de s'échapper.

1.6.2.2. Conditions de l'essai L'échantillon doit avoir un volume de 40 mm3, ou un volume compatible avec l'appareil utilisé. Les substances solides doivent être essayées à l'état sec et préparées comme suit: Les substances sous forme de pâte doivent être essayées à l'état sec si c'est possible, ou, en tout cas, après avoir enlevé la plus grande quantité possible de diluant. Pour ce qui est des substances liquides, l'essai est réalisé avec un intervalle de 1 mm entre le cylindre d'acier du haut et celui du bas.

1.6.2.2. a)

les substances pulvérulentes sont tamisées (maille de 0,5 mm); la fraction séparée par tamisage est entièrement utilisée pour l'essai;

les substances comprimées, coulées ou condensées sont désagrégées et tamisées; la fraction de 0,5 à 1 mm de diamètre séparée par tamisage est utilisée pour l'essai et doit être représentative de la substance originale.

1.6.2.3. Déroulement des essais On effectue une série de six essais en faisant tomber une masse de 10 kg d'une hauteur de 0,40 m (40 J). S'il se produit une explosion au cours des six essais effectués à 40 J, une autre série de six essais doit être effectuée en faisant tomber une masse de 5 kg d'une hauteur de 0,15 m (7,5 J). Dans d'autres appareils, l'échantillon est comparé avec la substance de référence choisie selon la procédure établie (technique du up-and-down, etc.).

1.6.2.4. Évaluation Le résultat de l'essai est considéré comme positif si une explosion (l'inflammation ou un bruit intense équivaut à une explosion) se produit au moins une fois au cours des six essais réalisés avec l'appareil de choc indiqué ou si l'échantillon est plus sensible que le 1,3-dinitrobenzène ou le RDX lors d'un autre essai par choc.

1.6.3. Sensibilité mécanique (friction)

1.6.3.

1.6.3.1. Appareil (figure 5) L'appareil consiste en une plaque de base en fonte sur laquelle est monté le dispositif de friction proprement dit comprenant un crayon fixe en porcelaine et une plaquette mobile en porcelaine. La plaquette est fixée dans un coulisseau se déplaçant entre deux rails. Le coulisseau est relié par une barre d'entraînement et un engrenage de transmission excentrique à un moteur électrique, de telle sorte que la plaquette se déplace une fois seulement sur une distance de 10 mm, en arrière et en avant sous le crayon. Le crayon peut être chargé, par exemple, à 120 ou 360 newtons. Les plaquettes de porcelaine plates sont en porcelaine blanche technique (rugosité de 9 à 32 μm) et ont les dimensions suivantes: 25 mm de longueur, 25 mm de largeur et 5 mm de hauteur. Le crayon cylindrique qui est également en porcelaine blanche technique (longueur 15 mm, diamètre 10 mm), présente des extrémités sphériques rugueuses dont le rayon de courbure est de 10 mm.

1.6.3.2. Conditions de l'essai L'échantillon doit avoir un volume de 10 mm3, ou un volume compatible avec l'appareil utilisé. Les substances solides sont essayées à l'état sec et préparées comme suit: Les substances sous forme de pâte doivent être essayées à l'état sec si possible. Si la substance ne peut pas être préparée à l'état sec, la pâte (après avoir enlevé la plus grande quantité possible de diluent) est essayée sous la forme d'un film de 0,5 mm d'épaisseur, 2 mm de largeur et 10 mm de longueur préparé à l'aide d'un gabarit.

1.6.3.2. a)

les substances pulvérulentes sont tamisées (maille de 0,5 mm); la fraction séparée par tamisage est entièrement utilisée pour l'essai;

les substances comprimées, coulées ou condensées sont désagrégées et tamisées; la fraction tamisée d'un diamètre inférieur à 0,5 mm est utilisée pour l'essai.

1.6.3.3. Déroulement des essais Placer le crayon de porcelaine sur l'échantillon soumis à essai et accrocher le poids. Lors de la réalisation de l'essai, les marques laissées par l'éponge sur la plaquette de porcelaine doivent être transversales par rapport à la direction du mouvement. Veiller à ce que le crayon repose sur l'échantillon, à ce que la quantité de substance essayée soit suffisante et à ce que la plaquette se déplace correctement sous le crayon. Les substances pâteuses seront appliquées sur le plateau à l'aide d'une gabarit de 0,5 mm d'épaisseur avec une rainure de 2 × 10 mm. La plaquette de porcelaine accomplit sous le crayon un mouvement de va-et-vient sur une distance de 10 mm dans chaque direction en 0,44 secondes. N'utiliser chaque partie de la surface de la plaquette et du crayon que pour un seul essai; les deux extrémités de chaque crayon serviront pour deux essais et les deux surfaces de la plaquette pour trois essais. Une série de six essais est effectuée avec une charge de 360 N. Si un résultat positif survient au cours de ces six essais, il convient d'effectuer une autre série de six essais avec une charge de 120 N. Dans d'autres appareils, l'échantillon est comparé avec la substance de référence choisie en suivant un mode opératoire établi (technique up-and-down, etc.).

1.6.3.4. Évaluation Le résultat de l'essai est considéré comme positif s'il se produit au moins une explosion (un crépitement, un bruit intense ou une inflammation sont équivalents à une explosion) au cours de l'un des essais réalisés avec l'appareil de friction indiqué ou s'il satisfait aux critères équivalents pour un autre essai de friction.

2. DONNÉES En principe, une substance est considérée comme présentant un risque d'explosion dans le sens de la directive dés qu'un résultat est positif lors des essais de sensibilité thermique, au choc ou à la friction.

3. RÉSULTATS

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

l'identité, la composition, la pureté, le contenu en humidité, etc., de la substance soumise à essai,

la forme physique de l'échantillon; préciser s'il a été désagrégé, cassé ou tamisé,

les observations relevées au cours des essais de sensibilité thermique (par exemple masse de l'échantillon, nombre de fragments, etc.),

les observations relevées au cours des essais de sensibilité mécanique (par exemple formation d'une quantité considérable de fumée ou décomposition complète sans bruit intense, flammes, étincelles, crépitation, etc.),

les résultats de chaque type d'essai,

si un autre appareil a été utilisé, fournir une justification scientifique ainsi que la preuve de la corrélation entre les résultats obtenus avec l'appareil spécifié et les résultats obtenus avec l'appareil utilisé,

tout commentaire utile, se référant notamment aux essais pratiqués avec des produits similaires, susceptible d'être pertinent pour une interprétation correcte des résultats,

toutes observations supplémentaires pertinentes pour l'interprétation des résultats.

3.2. INTERPRÉTATION ET ÉVALUATION DES RÉSULTATS Le rapport d'essai doit mentionner tous les résultats considérés comme erronés, anormaux, ou non représentatifs. Lorsqu'un des résultats est rejeté, fournir une explication et indiquer les résultats de tout essai substitutif ou supplémentaire. À moins de pouvoir expliquer un résultat anormal, celui-ci doit être accepté tel quel et utilisé pour classer la substance en conséquence.

4.(1)(2)(3)(4)

RÉFÉRENCES Recommandations relatives au transport des marchandises dangereuses, Épreuves et critères, 1990, Nations unies, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H. und Swart, K.H. Explosive Stoffe, 1961, vol.3, 6-13 and 30-42. NFT 20-038 (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination du danger d'explosion.

A.15. TEMPÉRATURE D'INFLAMMATION SPONTANÉE DES LIQUIDES ET DES GAZ

A.15.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Les substances explosives qui s'enflamment spontanément au contact de l'air à température ambiante ne doivent pas être soumises à cet essai. Le mode opératoire est applicable aux gaz, aux liquides et aux vapeurs qui peuvent être enflammés par une surface chaude, en présence d'air. La température d'inflammation spontanée peut être réduite considérablement par la présence d'impuretés catalytiques, par la matière de la surface ou par une augmentation du volume du récipient d'essai.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Le degré d'inflammabilité spontanée est exprimé en termes de température d'inflammation spontanée. La température d'inflammation spontanée est la température la plus basse à laquelle s'enflamme la substance à essayer mélangée avec de l'air dans les conditions définies dans la méthode d'essai.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Les substances de références sont citées dans les normes (voir 1.6.3). Elles devraient servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec différentes méthodes.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La méthode permet de déterminer la température minimale de la surface interne d'une enceinte qui provoquera l'inflammation d'un gaz, d'une vapeur ou d'un liquide injecté dans l'enceinte.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ La répétabilité varie en fonction de l'intervalle de température d'inflammation spontanée et de la méthode d'essai utilisée. La sensibilité et la spécificité dépendent de la méthode d'essai utilisée.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Appareil L'appareil est décrit dans la méthode évoquée au point 1.6.3.

1.6.2. Conditions de l'essai Un échantillon de la substance à essayer est essayé selon le point 1.6.3.

1.6.3. Mode opératoire Voir normes IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. DONNÉES Noter la température d'essai, la pression atmosphérique, la quantité d'échantillon utilisée et le laps de temps qui s'écoule avant que l'inflammation se produise.

3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

les spécifications précises de la substance (identité et impuretés),

la quantité d'échantillon utilisée, la pression atmosphérique,

l'appareil utilisé,

les résultats des mesures (température d'essai, résultats concernant l'inflammation, laps de temps correspondants),

toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation des résultats.

4. RÉFÉRENCES Aucune.

A.16. TEMPÉRATURE RELATIVE D'INFLAMMATION SPONTANÉE POUR LES SOLIDES

A.16.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Les substances explosibles et les substances qui s'enflamment spontanément au contact de l'air à température ambiante ne doivent pas être soumises à cet essai. L'objectif en est de fournir des données préliminaires sur l'inflammabilité spontanée des substances solides soumises à de hautes températures. Si la chaleur engendrée, soit par une réaction de la substance avec l'oxygène, soit par décomposition exothermique, ne se dissipe pas assez rapidement dans l'environnement, l'auto-échauffement entraîne l'inflammation spontanée. L'inflammation spontanée se produit par conséquent lorsque la vitesse de production de chaleur excède la vitesse de perte de chaleur. Le procédé d'essai est utile en tant que test préliminaire de sélection des substances solides. Compte tenu de la nature complexe de l'inflammation et de la combustion des solides, la température d'inflammation spontanée déterminée selon cette méthode d'essai ne doit servir qu'à des fins de comparaison.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La température d'inflammation spontanée telle qu'elle est déterminée par cette méthode est la température ambiante minimale exprimée en degrés Celsius ( oC), à laquelle un certain volume d'une substance s'enflamme spontanément dans des conditions définies.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Placer un volume défini de la substance soumise à essai dans un four à température ambiante; enregistrer la courbe température/temps au centre de l'échantillon, la température du four étant portée à 400 oC, ou à la température du point de fusion si celle-ci est inférieure, à la vitesse de 0,5 oC/mn. Pour les besoins de cet essai, la température du four à laquelle l'échantillon atteint une température de 400 oC par auto-échauffement est appelée température d'inflammation spontanée.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Aucun.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Appareil

1.6.1.

1.6.1.1. Four Un four de laboratoire à température programmable (d'un volume de 2 litres environ) équipé d'une circulation d'air naturel et d'un clapet d'explosion. Pour éviter tout risque potentiel d'explosion, il convient d'empêcher que les gaz de décomposition puissent entrer en contact avec les éléments de chauffage électrique.

1.6.1.2. Cube en treillis de fil métallique Couper un morceau de treillis en fil d'acier inoxydable d'une maille d'une taille de 0,045 mm, selon le modèle indiqué à la figure 1. Plier le treillis et l'attacher avec du fil métallique en forme de cube ouvert.

1.6.1.3. Thermocouples Thermocouples appropriés.

1.6.1.4. Enregistreur Tout enregistreur à deux canaux, étalonné à l'intervalle 0 — 600 oC ou à une tension correspondante.

1.6.2. Conditions de l'essai Les substances sont testées telles qu'elles sont reçues.

1.6.3. Mode opératoire Remplir le cube de la substance soumise à essai. Tasser doucement en ajoutant de la substance jusqu'à le remplir complètement. Suspendre ensuite le cube au centre du four à température ambiante. Placer un thermocouple au centre du cube et l'autre entre le cube et la paroi du four afin d'enregistrer la température du four. Les températures du four et de l'échantillon sont enregistrées en continu pendant que la température du four est portée à 400 oC, ou au point de fusion si cette valeur est plus basse, à une vitesse de 0,5 oC/min. Lorsque la substance s'enflamme, le thermocouple de l'échantillon indiquera une très forte montée de température par rapport à la température du four.

2. DONNÉES La température du four à laquelle la température de l'échantillon atteint 400 oC par auto-échauffement est pertinente pour l'évaluation (voir figure 2).

3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

une description de la substance à essayer,

les résultats des mesures incluant la courbe température/temps,

toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation des résultats.

4.(1) RÉFÉRENCES NF T 20-036 (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de la température relative d'inflammation spontanée des solides.

4.(1)

Figure 1 Modèle de cube d'essai de 20 mm

Figure 2 Courbe type température/temps

Température de l’échantillon Température du four Température d’inflammation temps

A.17. PROPRIÉTÉS COMBURANTES (SOLIDES)

A.17.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Il est utile de disposer d'informations préliminaires sur les propriétés explosives éventuelles de la substance avant d'effectuer cet essai. Cet essai n'est pas applicable aux liquides, aux gaz, aux substances explosives ou très inflammables ou aux peroxydes organiques. Cet essai est inadapté quand l'examen de la structure chimique montre que la substance ne peut sans aucun doute avoir de réaction de type exothermique avec un combustible. Un essai préliminaire doit être effectué pour s'assurer que cet essai ne nécessite pas de précautions particulières.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Temps de combustion: temps de réaction, exprimé en secondes, pris par la zone de réaction pour se propager à travers un tas, selon la procédure décrite au point 1.6. Vitesse de combustion: exprimée en millimètres par seconde. Vitesse maximale de combustion: valeur la plus élevée parmi les vitesses de combustion obtenues avec des mélanges contenant 10 à 90 % en poids de comburant.

1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE Le nitrate de barium (de pureté analytique) est utilisé comme substance de référence pour l'essai et l'essai préliminaire. Le mélange de référence est composé de nitrate de barium et de cellulose en poudre, préparé conformément au point 1.6 et possédant la vitesse de combustion maximale (il s'agit généralement d'un mélange contenant 60 % de nitrate de barium en poids).

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Il convient, pour des raisons de sécurité, d'effectuer un essai préliminaire. Il est inutile de continuer l'essai si l'essai préliminaire montre clairement que la substance a des propriétés oxydantes. Lorsque ce n'est pas le cas, la substance est soumise à l'essai complet. Dans l'essai complet, la substance à essayer et une substance combustible définie sont mélangées dans des proportions variables. Chacun de ces mélanges est alors disposé en tas, que l'on enflamme à une extrémité. La vitesse maximale de combustion est comparée à la vitesse maximale de combustion du mélange de référence.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Lorsqu'elle est requise, toute méthode de broyage et de mélange est valable pour autant que l'écart entre la vitesse maximale de combustion et la moyenne arithmétique, dans les six essais, ne dépasse pas 10 %.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Préparation

1.6.1.

1.6.1.1. Substance à essayer L'échantillon à essayer est traité comme suit afin d'obtenir une granulométrie inférieure à 0,125 mm: tamiser la substance à essayer et broyer la fraction restante; répéter cette opération jusqu'à ce que tout l'échantillon soit passé au travers du tamis. Toutes méthodes de broyage et de tamisage respectant les critères de qualité requis peuvent être utilisées. Avant de préparer le mélange, sécher la substance à 105 oC jusqu'à obtention d'un poids constant. Si la température de décomposition de la substance est inférieure à 105 oC, la substance doit être séchée à une température moins élevée.

1.6.1.2. Substance combustible On utilise de la cellulose en poudre comme substance combustible. Elle doit être du type utilisé en chromatographie en couche mince ou en colonne. Un type de cellulose dont la longueur de plus de 85 % des fibres est comprise entre 0,020 mm et 0,075 mm s'est avérée adéquate. La poudre de cellulose est tamisée au moyen d'un tamis à mailles de 0,125 mm. Il faut utiliser le même lot de cellulose pour tout l'essai. Avant de préparer le mélange, sécher la poudre de cellulose à 105 oC jusqu'à ce que son poids soit constant. Si de la sciure de bois est utilisée lors de l'essai préliminaire, préparer une sciure de bois tendre qui passe au travers d'un tamis d'une maille de 1,6 mm, mélanger, puis sécher à 105 oC pendant 4 heures en couche de moins de 25 mm d'épaisseur. Refroidir la sciure et la conserver jusqu'à utilisation dans un récipient hermétique aussi rempli que possible. Elle sera de préférence utilisée dans les 24 heures après séchage.

1.6.1.3. Source d'allumage Utiliser la flamme d'un brûleur à gaz (diamètre; 5 mm minimum). Si une autre source d'allumage est utilisée (par exemple lorsque l'essai est effectué dans une atmosphère inerte), fournir la description et la justification.

1.6.2. Mode opératoire Note: Les mélanges de comburants avec de la cellulose ou de la sciure de bois doivent être considérés comme des explosifs potentiels et manipulés avec prudence.

1.6.2.

1.6.2.1. Essai préliminaire La substance séchée est grossièrement mélangée à de la cellulose ou à de la sciure de bois sèche dans des proportions de 2 (substance à essayer) pour 1 (cellulose ou sciure de bois) en poids et le mélange est disposé en petit tas conique de 3,5 cm (diamètre de base) × 2,5 cm (hauteur) par remplissage sans tassement d'une forme conique (par exemple un entonnoir de laboratoire en verre dont le tube est bouché). Le tas est placé sur une plaque froide, non-combustible, non poreuse, et peu thermo-conductrice. L'essai doit être conduit dans une hotte aspirante (voir point 1.6.2.2). La source d'allumage est mise en contact avec le cône. L'intensité et la durée de la réaction sont observées et enregistrées. La substance doit être considérée comme comburante si la réaction est intense. Lorsqu'il y a doute quant au résultat, il est nécessaire de pratiquer l'essai complet décrit ci-après.

1.6.2.2. Essai complet Préparer des mélanges oxydant/cellulose contenant de 10 à 90 % de comburant, en poids, par incréments de 10 %. Pour les cas limites utiliser des mélanges comburant/cellulose intermédiaires pour déterminer la vitesse maximale de combustion avec plus de précision. On réalise un tas au moyen d'un moule métallique d'une longueur de 250 mm et dont la section triangulaire transversale a une hauteur intérieure de 10 mm et une largeur intérieure de 20 mm. Placer comme cadres latéraux des deux côtés du moule, dans le sens de la longueur, deux plaques métalliques dépassant de 2 mm le bord supérieur de la section triangulaire (figure). Remplir ce dispositif avec un excès de mélange, sans tasser. Après avoir laissé tomber le moule une fois d'une hauteur de 2 cm sur une surface dure, racler l'excès avec une raclette tenue obliquement. Enlever alors les cadres latéraux et égaliser la surface de la poudre à l'aide d'un rouleau. Disposer une plaque non-combustible non-poreuse et peu thermo-conductrice sur le moule, retourner et démouler. Disposer le tas dans une hotte perpendiculairement au sens de courant d'air. Le débit d'air doit être suffisant pour empêcher les vapeurs de se répandre dans le laboratoire et il ne doit pas subir de modification au cours de l'essai. Le courant d'air doit former un écran entourant l'appareil. Vu les propriétés hygroscopiques de la cellulose et de certaines substances à essayer, l'essai doit être effectué aussi rapidement que possible. Enflammer une extrémité du tas par contact avec la flamme. Mesurer le temps de réaction sur une distance de 200 mm après que la zone de réaction a parcouru une distance initiale de 30 mm. L'essai est effectué avec la substance de référence et au moins une fois avec chacun des mélanges de substance à essayer et de cellulose. Si l'on trouve une vitesse maximale de combustion significativement plus grande que celle de la substance de référence, l'essai peut être arrêté; autrement, les essais doivent être répétés cinq fois avec chacun des trois mélanges qui donnent les vitesses de combustion les plus élevées. Si l'on soupçonne que le résultat est un faux positif, répéter l'essai en remplaçant la cellulose par une substance inerte dont la taille des particules est la même, comme le kieselguhr. Une autre possibilité consiste à renouveler l'essai avec le mélange substance à essayer/cellulose dont la vitesse de combustion est la plus élevée, dans une atmosphère inerte (contenu d'oxygène < 2 % v/v).

2. DONNÉES Pour des raisons de sécurité, la vitesse maximale de combustion — et non la valeur moyenne — sera retenue pour caractériser les propriétés comburantes de la substance examinée. Pour l'évaluation d'un mélange donné, retenir la vitesse de combustion la plus élevée mesurée au cours des six essais. Porter sur un graphique la vitesse de combustion la plus élevée de chaque mélange en fonction de la concentration de comburant. Déduire de ce graphique la vitesse de combustion maximale. Les six vitesses de combustion mesurées au cours d'une même opération pour le mélange qui a donné la vitesse de combustion maximale ne doit pas s'écarter de plus de 10 % de la moyenne arithmétique; dans le cas contraire, il importe d'améliorer les méthodes de broyage et de mélange. Comparer la vitesse maximale de combustion obtenue avec la vitesse maximale de combustion du mélange de référence (voir point 1.3). Si les essais sont réalisés dans une atmosphère inerte, comparer la vitesse maximale avec la vitesse de réaction du mélange de référence dans une atmosphère inerte.

3. RÉSULTATS

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

l'identité, la composition, la pureté, le contenu en humidité etc., de la substance à essayer,

tout traitement de l'échantillon à essayer (par exemple, broyage, séchage...),

la source d'allumage utilisée dans les essais,

les résultats des mesures,

le type de réaction (par exemple combustion rapide superficielle, combustion à travers toute la masse, toute observation concernant les produits de combustion,...),

toute observation supplémentaire, y compris une description de l'intensité (flamme, étincelle, fumée, lente incandescence, etc.) et la durée approximative de la réaction observée au cours de l'essai préliminaire de sécurité/dépistage pour la substance à essayer comme pour la substance de référence,

les résultats des essais effectués avec un matériel inerte, s'il y a lieu,

les résultats des essais effectués dans une atmosphère inerte, s'il y a lieu.

3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Une substance est à considérer comme comburante si: Pour éviter un faux résultat positif, il faut aussi tenir compte des résultats obtenus en essayant la substance mélangée avec un matériel inerte et/ou dans une atmosphère inerte, lors de l'interprétation des résultats.

3.2. a)

lors de l'essai préliminaire, il y a réaction intense;

lors de l'essai, la vitesse maximale de combustion de la substance soumise à essai est supérieure ou égale à celle du mélange de référence composé de cellulose et de nitrate de barium.

4. RÉFÉRENCES NF T 20-035 (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination des propriétés comburantes des solides.

A.18. DÉTERMINATION DE LA MASSE MOLÉCULAIRE MOYENNE EN NOMBRE ET DE LA DISTRIBUTION DES MASSES MOLÉCULAIRES DES POLYMÈRES

A.18.

1. MÉTHODE Cette méthode de chromatographie sur gel perméable reprend la ligne directrice OCDE TG 118 (1996). Les principes fondamentaux et tous autres renseignements techniques sont donnés en référence (1).

1.

1.1. INTRODUCTION Les propriétés des polymères sont tellement diversifiées qu'il est impossible de décrire une méthode unique indiquant avec précision des conditions de séparation et d'évaluation qui recouvrent toutes les éventualités et particularités rencontrées dans la séparation des polymères. Les systèmes complexes de polymères, notamment, se prêtent rarement à la chromatographie sur gel perméable. Lorsque la chromatographie sur gel perméable n'est pas applicable, on peut déterminer la masse moléculaire moyenne à l'aide d'autres méthodes (voir annexe). Dans de tels cas, il convient de fournir tous les détails de la méthode utilisée et de justifier son choix. La méthode décrite ci-après est basée sur la norme D1N 55672 (1). Celle-ci fournit des indications détaillées sur la manière de réaliser les expériences et d'évaluer les données. S'il est nécessaire de modifier les conditions expérimentales, ces changements doivent être justifiés. D'autres normes peuvent être utilisées, à condition d'en mentionner toutes les références. La méthode décrite fait appel à des échantillons de polystyrène de polydispersité connue pour l'étalonnage et il y aura peut-être lieu de la modifier pour l'adapter aux cas de polymères particuliers, par exemple, les polymères solubles dans l'eau et les polymères ramifiés à longue chaîne.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La masse moléculaire moyenne en nombre Mn et la masse moléculaire moyenne en poids Mw sont déterminées à l'aide des équations suivantes: Mn=Σni=lHiΣni=lHi/Mi Mw=Σni=lHixMiΣni=lHi où Hi est l'amplitude du signal du détecteur, par rapport au niveau de référence, correspondant au volume de rétention Vi; Mi est la masse moléculaire de la fraction de polymère correspondant au volume de rétention Vi et n est le nombre de points expérimentaux. La largeur de la distribution des masses moléculaires, qui représente une mesure de la polydispersité du système, est donnée par le rapport Mw/Mn.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE La méthode par chromatographie sur gel perméable étant une méthode relative, il est nécessaire de procéder à un étalonnage. Celui-ci est généralement effectué au moyen de polystyrènes étalons à chaîne linéaire et à distribution étroite, dont les masses moléculaires moyennes Mn et Mv ainsi que la distribution des masses moléculaires sont connues. La courbe d'étalonnage ne peut être utilisée pour déterminer la masse moléculaire d'un échantillon inconnu que si les conditions de séparation des échantillons et des étalons ont été sélectionnées de manière identique. Une relation déterminée entre la masse moléculaire et le volume d'élution n'est valable que dans les conditions particulières d'une expérience donnée. Parmi ces conditions figurent, avant tout, la température, le solvant (ou le mélange de solvants), les conditions de chromatographie, ainsi que la colonne de séparation ou le système de colonnes. Les masses moléculaires de l'échantillon déterminées de cette manière constituent des valeurs relatives et sont désignées par le terme masses moléculaires en équivalent polystyrène. Cela signifie qu'en fonction des différences chimiques et structurelles entre l'échantillon à tester et les étalons, les masses moléculaires peuvent dévier des valeurs absolues de manière plus ou moins importante. Si d'autres étalons sont utilisés, par exemple le polyéthylène glycol, le poly(éthylène oxyde), le poly(méthacrylate de méthyle) ou l'acide polyacrylique, il importe d'en indiquer la raison.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La chromatographie sur gel perméable permet de déterminer la distribution des masses moléculaires ainsi que les masses moléculaires moyennes (Mn, Mw). La chromatographie sur gel perméable constitue un type particulier de chromatographie liquide dans lequel l'échantillon à tester est séparé en fonction des volumes hydrodynamiques de chaque constituant (2). La séparation s'effectue à mesure que l'échantillon progresse dans une colonne remplie d'un matériau poreux, généralement un gel organique. Les petites molécules peuvent pénétrer dans les pores tandis que les grosses molécules en sont exclues. Le parcours des grosses molécules est, de ce fait, plus court; elles sont éluées en premier lieu. Les molécules de taille moyenne pénètrent dans certains des pores; elles sont éluées plus tard. Les molécules les plus petites, dont le rayon hydrodynamique moyen est plus petit que les pores du gel, peuvent pénétrer dans tous les pores. Elles sont éluées en dernier lieu. Dans la situation idéale, c'est la taille des espèces moléculaires qui régit entièrement la séparation, mais, en pratique, il est difficile d'éviter tout au moins l'interférence de certains effets d'absorption. Un remplissage irrégulier de la colonne, de même que des volumes morts, peuvent aggraver la situation (2). La détection s'effectue, par exemple, par mesure de l'indice de réfraction ou de l'absorption dans l'UV pour donner une courbe de distribution simple. Cependant, pour pouvoir associer à la courbe des valeurs de masses moléculaires réelles, il est nécessaire d'étalonner la colonne par passage de polymères de masse moléculaire connue et, idéalement, d'une structure aussi proche que possible, par exemple divers polystyrènes étalons. Une courbe de Gauss en résulte généralement, parfois avec une dissymétrie marquée du côté des faibles masses moléculaires, l'axe vertical indiquant la quantité, en poids, des espèces de différentes masses moléculaires éluées, tandis que sur l'axe horizontal figure le logarithme de la masse moléculaire.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ La reproductibilité (écart-type relatif) du volume d'élution doit être au plus égale à 0,3 pour cent. Il y a lieu d'assurer la reproductibilité de l'analyse grâce à une correction mettant en jeu un étalon interne, si un chromatogramme est évalué en fonction du temps et ne satisfait pas aux critères mentionnés plus haut (1). Les polydispersités dépendent des masses moléculaires des étalons. Dans le cas des polystyrènes étalons, les valeurs typiques sont: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp est la masse moléculaire de l'étalon correspondant au maximum du pic)

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Préparation des solutions de polystyrène étalon On dissout les polystyrènes étalons en les mélangeant soigneusement à l'éluant choisi. On préparera les solutions en observant les recommandations du fabricant. Les concentrations des étalons choisis dépendent de différents facteurs, comme le volume d'injection, la viscosité de la solution et la sensibilité du détecteur. Le volume d'injection maximum doit être adapté à la longueur de la colonne, en veillant à ne pas surcharger celle-ci. Les volumes d'injection courants pour des séparations analytiques par chromatographie sur gel perméable, au moyen d'une colonne de 30 cm × 7,8 mm, varient normalement entre 40 et 100 ml. Il est possible d'injecter des volumes plus importants, mais ceux-ci ne peuvent dépasser 250 μl. On doit déterminer le rapport optimal entre le volume d'injection et la concentration avant l'étalonnage de la colonne.

1.6.2. Préparation de la solution de l'échantillon En principe, la préparation des solutions de l'échantillon s'effectue dans les mêmes conditions. L'échantillon est dissous dans un solvant approprié, par exemple le tétrahydrofurane (THF), en agitant soigneusement. Il ne doit, en aucun cas, être dissous dans un bain à ultrasons. Si nécessaire, la solution de l'échantillon est purifiée au moyen d'un filtre à membrane d'une dimension de pores comprise entre 0,2 et 2 μm. La présence de particules non dissoutes doit être mentionnée dans le rapport final, dans la mesure où elle peut résulter d'espèces de masse moléculaire élevée. Il faut recourir à une méthode appropriée pour déterminer le pourcentage en poids des particules non dissoutes. Les solutions doivent être analysées dans un délai de 24 heures.

1.6.3. Appareillage On doit vérifier que le système de chromatographie sur gel perméable est inerte vis-à-vis des solvants utilisés (par exemple, utilisation de capillaires en acier lorsque le solvant est le THF).

un réservoir à solvant,

un système de dégazage (si nécessaire),

une pompe,

un amortisseur d'impulsions (si nécessaire),

un système d'injection,

des colonnes de chromatographie,

un détecteur,

un débitmètre (si nécessaire),

un système d'enregistrement et de traitement des données,

un récipient pour recueillir les solutions usées.

1.6.4. Injection et système de distribution du solvant Un volume défini de la solution de l'échantillon est chargé sur la colonne dans une zone étroitement définie, à l'aide d'un échantillonneur automatique ou manuellement. Si on opère manuellement, le fait de retirer ou d'enfoncer le piston de la seringue trop rapidement peut provoquer des modifications dans la distribution des masses moléculaires observées. Le système de distribution du solvant doit, dans la mesure du possible, être exempt de pulsations; il est souhaitable qu'il comporte un amortisseur d'impulsions. Le débit est de l'ordre de 1 ml/min.

1.6.5. Colonne Selon la nature de l'échantillon a tester, le polymère est caractérisé en ayant recours à une seule colonne ou à plusieurs colonnes connectées en série. Un certain nombre de matériaux poreux pour colonne de propriétés définies (par exemple taille des pores, limites d'exclusion) sont disponibles dans le commerce. Le choix du gel de séparation ou celui de la longueur de la colonne dépendent, d'une part, des propriétés de l'échantillon à tester (volumes hydrodynamiques, distribution des masses moléculaires), d'autre part, des conditions particulières de la séparation, telles que la nature du solvant, la température et le débit (1) (2) (3).

1.6.6. Plateaux théoriques La colonne ou la combinaison de colonnes utilisée pour la séparation doit être caractérisée par le nombre de plateaux théoriques. Pour ce faire, dans le cas où le solvant d'élution est le THF, il y a lieu de faire passer une solution d'ethylbenzène ou d'un autre soluté non polaire approprié sur une colonne de longueur connue. Le nombre de plateaux théoriques est donné par l'équation suivante: N=5,54VeW1/22 ou N=16VeW2 où: N est le nombre de plateaux théoriques Ve est le volume d'élution correspondant au maximum du pic W est la largeur du pic au niveau de la ligne de base W1/2 est la largeur du pic à mi-hauteur.

1.6.7. Efficacité de la séparation Outre le nombre de plateaux théoriques, paramètre déterminant la largeur de bande, l'efficacité de séparation est une autre grandeur caractéristique; c'est la pente de la courbe de calibrage qui la détermine. L'efficacité de séparation d'une colonne se détermine au moyen de la relation suivante: Ve,Mx-Ve,(10Mx)section de la colonne≥6,0 cm3cm2 où Ve, Mx est le volume d'élution du polystyrène de masse moléculaire Mx Ve,(10.Mx) est le volume d'élution du polystyrène de masse moléculaire 10 fois supérieure La résolution du système est généralement définie comme suit: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 où, Ve1, Ve2 sont les volumes d'élution des deux polystyrènes étalons au maximum du pic W1, W2 sont les largeurs des pics au niveau de la ligne de base Mp M2 sont les masses moléculaires correspondant au maximum des pics (elles devraient différer d'un facteur 10). La valeur de R pour le système de colonnes doit être supérieure à 1,7 (4).

1.6.8. Solvants Tous les solvants doivent être d'une grande pureté (on emploie du THF à 99,5 % de pureté). Le réservoir de solvant (mis, au besoin, sous atmosphère de gaz inerte) doit être assez grand pour permettre l'étalonnage de la colonne et plusieurs analyses d'échantillons. Le solvant sera dégazé avant d'être pompé vers la colonne.

1.6.9. Régulation de la température La température des composants internes critiques (boucle d'injection, colonne(s), détecteur et tuyaux) doit être constante et compatible avec le choix du solvant.

1.6.10. Détecteur Le détecteur sert à enregistrer de manière quantitative la concentration de l'échantillon qui est élue de la colonne. En vue d'éviter un élargissement indésirable des pics, le volume de la cuvette du détecteur sera choisi aussi petit que possible. Il ne doit pas excéder 10 μl, sauf pour les détecteurs par diffusion de la lumière et les viscosimètres. La détection s'effectue généralement par réfractométrie différentielle. Si les propriétés spécifiques de l'échantillon ou du solvant d'élution l'exigent, on peut toutefois utiliser d'autres types de détecteurs tels que les détecteurs UV/VIS ou IR, les viscosimètres, etc.

2. RÉSULTATS ET PROCÈS-VERBAL D'ESSAI

2.

2.1. RÉSULTATS On se référera à la norme DIN (1) pour ce qui concerne les critères d'évaluation détaillés, de même que pour les spécifications relatives à la collecte et au traitement des données. Pour chaque échantillon analysé, il est nécessaire de réaliser deux expériences indépendantes. Leurs résultats seront analysés séparément. Les paramètres Mn, Mw, Mw/Mn, Mp doivent être déterminés pour chaque mesure. Il est nécessaire d'indiquer de façon explicite que les valeurs mesurées sont des valeurs relatives correspondant a des équivalents de masse moléculaire de l'étalon utilisé. Après avoir déterminé les volumes et les temps de rétention (éventuellement corrigés au moyen d'un étalon interne), on porte en graphique les valeurs de log Mp (Mp représentant les maxima des pics des polymères d'étalonnage) en fonction de l'une de ces quantités. Deux points d'étalonnage au moins sont nécessaires pour chaque facteur 10 de masse moléculaire; cinq points de mesure au moins sont requis pour la courbe dans son ensemble, qui doit couvrir la masse moléculaire estimée de l'échantillon. Le point extrême de la courbe d'étalonnage du côté des faibles masses moléculaires peut être défini grâce au n-hexylbenzène ou à un autre soluté non polaire approprié. Les masses moléculaires moyennes en nombre et en poids sont généralement déterminées par un traitement électronique des données fondé sur les formules décrites dans la section 1.2. Si on a recours à un traitement manuel, il est opportun de consulter l'ASTM D 3536-91 (3). La courbe de distribution doit être présentée sous la forme d'un tableau ou d'un graphique (fréquence différentielle ou pourcentages cumulatifs en fonction du log M). Dans la représentation graphique, une puissance de dix de masse moléculaire doit normalement correspondre à une largeur de 4 cm environ tandis que pour le maximum du pic une hauteur de 8 cm environ est adéquate. Dans le cas de courbes de distribution cumulatives, la différence entre 0 et 100 pour cent sur l'axe des ordonnées doit être d'environ 10 cm.

2.2. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai doit comporter les renseignements suivants:

2.2.

2.2.1. Substance à tester

renseignements disponibles sur la substance à tester (nature, additifs, impuretés),

description du traitement de l'échantillon, observations, problèmes.

2.2.2. Dispositif expérimental

réservoir d'éluant, gaz inerte, dégazage de l'éluant, composition de l'éluant, impuretés,

pompe, amortisseur d'impulsions, système d'injection,

colonnes de séparation (fabricant, toutes précisions sur les caractéristiques des colonnes, telles que taille des pores, nature du matériel de séparation etc., nombre, longueur et ordre des colonnes utilisées),

nombre de plateaux théoriques de la colonne (ou de la combinaison de colonnes), efficacité de la séparation (résolution du système),

informations sur la symétrie des pics,

température de la colonne, mode de régulation de la température,

détecteur (principe de mesure, type, volume de la cuvette),

débitmètre, s'il y en a un (fabricant, principe de mesure),

système utilisé pour rassembler et pour traiter les données (matériel et logiciel).

2.2.3. Étalonnage du système

description détaillée de la méthode utilisée pour établir la courbe d'étalonnage,

précisions sur les critères de qualité propres à cette méthode (par exemple, coefficient de corrélation, erreur quadratique moyenne, etc.),

informations sur toutes les extrapolations, hypothèses et approximations effectuées au cours de la procédure expérimentale, ainsi que sur l'évaluation et le traitement des données,

toutes les mesures effectuées pour établir la courbe d'étalonnage doivent être présentées dans un tableau qui comporte, pour chaque point d'étalonnage, les informations suivantes:

nom de l'échantillon,

fabricant de l'échantillon,

valeurs caractéristiques Mp, Mn, Mw, Mw/Mn des étalons fournis par le fabricant ou déduites de mesures ultérieures, complétées d'indications relatives à la méthode de détermination,

volume d'injection et concentration d'injection,

valeur de Mp utilisée pour l'étalonnage,

volume d'élution ou temps de rétention corrigé mesuré aux maxima des pics,

Mp calculée au maximum du pic,

pourcentage d'erreur sur la Mp calculée et sur la valeur d'étalonnage.

2.2.4. Évaluation

évaluation en fonction du temps: toutes méthodes visant à améliorer la reproductibilité requise (méthode de correction, étalon interne, etc.),

préciser si l'évaluation a été effectuée à partir du volume d'élution ou à partir du temps de rétention,

indiquer les limites de l'évaluation si un pic n'est pas complètement analysé,

décrire les méthodes de lissage lorsqu'on y a recours,

décrire les procédés de préparation et de prétraitement de l'échantillon,

indiquer la présence de particules non dissoutes, s'il y en a,

indiquer le volume d'injection (μl) et la concentration d'injection (mg/ml),

mentionner les observations témoignant d'effets qui engendrent des déviations par rapport au profil idéal de chromatographie sur gel perméable,

décrire en détail toutes les modifications aux procédures d'essais,

préciser les intervalles d'erreur,

consigner toutes autres informations et observations utiles pour interpréter les résultats.

3.(1)(2)(3)(4)

RÉFÉRENCES DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J. and Bly, D.D. (eds) (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley & Sons. ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC), American Society for Testing and Materials, Philadelphie, Pennsylvanie. ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrène by High Performance Size-Exclusion Chromatography, American Society for Testing and Materials, Philadelphie, Pennsylvanie.

A.19. DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN POLYMÈRES DE FAIBLE MASSE MOLÉCULAIRE

A.19.

1. MÉTHODE Cette méthode de chromatographie sur gel perméable reprend la ligne directrice OCDE TG 118 (1996). On trouvera dans les références les principes fondamentaux et autres renseignements techniques.

1.

1.1. INTRODUCTION Les propriétés des polymères sont tellement diversifiées qu’il est impossible de décrire une méthode unique indiquant avec précision des conditions de séparation et d’évaluation qui recouvrent toutes les éventualités et particularités rencontrées dans la séparation des polymères. Les systèmes complexes de polymères, notamment, se prêtent rarement à la chromatographie sur gel perméable. Lorsque la chromatographie sur gel perméable n’est pas applicable, on peut déterminer la teneur en polymères de faible masse moléculaire à l’aide d’autres méthodes. Dans de tels cas, il convient de fournir tous les détails de la méthode utilisée et de justifier son choix. La méthode décrite ci-après est basée sur la norme DIN 55672 (1). Celle-ci fournit des indications détaillées sur la manière de réaliser les expériences et d’évaluer les données. S’il est nécessaire de modifier les conditions expérimentales, ces changements doivent être justifiés. D’autres normes peuvent être utilisées, à condition d’en mentionner toutes les références. La méthode décrite fait appel à des échantillons de polystyrène de polydispersité connue pour l’étalonnage et il y aura peut-être lieu de la modifier pour l’adapter aux cas de polymères particuliers, par exemple, les polymères solubles dans l’eau et les polymères ramifiés à longue chaîne.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS On définit arbitrairement une masse moléculaire faible comme étant une masse moléculaire inférieure à 1000 daltons. La masse moléculaire moyenne en nombre Mn et la masse moléculaire moyenne en poids Mw sont déterminées à l’aide des équations suivantes: Mn=Σni=lHiΣni=lHi/Mi Mw=Σni=lHixMiΣni=lHi où Hi est l’amplitude du signal du détecteur, par rapport au niveau de référence, correspondant au volume de rétention Vi, par rapport au niveau de référence. Mi est la masse moléculaire de la fraction de polymère correspondant au volume de rétention, Vi et n est le nombre de points expérimentaux. La largeur de la distribution des masses moléculaires, qui représente une mesure de la polydispersité du système, est donnée par le rapport MW/Mn.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE La méthode par chromatographie sur gel perméable étant une méthode relative, il est nécessaire de procéder à un étalonnage. Celui-ci est généralement effectué au moyen de polystyrènes étalons à chaîne linéaire et à distribution étroite, dont les masses moléculaires moyennes Mn et Mw, ainsi que la distribution des masses moléculaires sont connues. La courbe d’étalonnage ne peut être utilisée pour déterminer la masse moléculaire d’un échantillon inconnu que si les conditions de séparation des échantillons et des étalons ont été sélectionnées de manière identique. Une relation déterminée entre la masse moléculaire et le volume d'élution n'est valable que dans les conditions particulières d'une expérience donnée. Parmi ces conditions figurent, avant tout, la température, le solvant (ou le mélange de solvants), les conditions de chromatographie, ainsi que la colonne de séparation ou le système de colonnes. Les masses moléculaires de l'échantillon déterminées de cette manière constituent des valeurs relatives; on les désigne par le terme masses moléculaires en équivalent-polystyrène. Cela signifie qu'en fonction des différences chimiques et structurelles entre l'échantillon à tester et les étalons, les masses moléculaires peuvent dévier des valeurs absolues de manière plus ou moins importante. Si d'autres étalons sont utilisés, par exemple le polyéthylèneglycol, le poly(éthylène oxyde), le poly(méthacrylate de méthyle) ou l'acide polyacrylique, il importe d'en indiquer la raison.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La chromatographie sur gel perméable permet de déterminer la distribution des masses moléculaires ainsi que les masses moléculaires moyennes (Mn, Mw). La chromatographie sur gel perméable constitue un type particulier de chromatographie liquide dans lequel l'échantillon à tester est séparé en fonction des volumes hydrodynamiques de chaque constituant (2). La séparation s'effectue à mesure que l'échantillon progresse dans une colonne remplie d'un matériau poreux, généralement un gel organique. Les petites molécules peuvent pénétrer dans les pores tandis que les grosses molécules en sont exclues. Le parcours des grosses molécules est, de ce fait, plus court; elles sont éluées en premier lieu. Les molécules de taille moyenne pénètrent dans certains des pores; elles sont éluées plus tard. Les molécules les plus petites, dont le rayon hydrodynamique moyen est plus petit que les pores du gel, peuvent pénétrer dans tous les pores. Elles sont éluées en dernier lieu. Dans la situation idéale, c'est la taille des espèces moléculaires qui régit entièrement la séparation, mais, en pratique, il est difficile d'éviter l'interférence de certains effets d'absorption au moins. Un remplissage irrégulier de la colonne, de même que des volumes morts, peuvent aggraver la situation (2). La détection s'effectue, par exemple, par mesure de l'indice de réfraction ou de l'absorption dans l'UV pour donner une courbe de distribution simple. Cependant, pour pouvoir associer à la courbe des valeurs de masses moléculaires réelles, il est nécessaire d'étalonner la colonne par passage de polymères de masse moléculaire connue et, idéalement, d'une structure aussi proche que possible. Une courbe de Gauss en résulte généralement; elle présente parfois une dissymétrie marquée du coté des masses moléculaires faibles, l'axe vertical indiquant la quantité, en poids, des espèces de différentes masses moléculaires éluées, tandis que sur l'axe horizontal figure le logarithme de la masse moléculaire. La teneur en polymères de faible masse moléculaire est déduite de cette courbe. Le calcul ne peut être exact que si les espèces à faible masse moléculaire se comportent de la même manière, par unité de masse, que l'ensemble du polymère.

1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ La reproductibilité (écart-type relatif) du volume d'élution doit être au plus égale à 0,3 pour cent. Il y a lieu d'améliorer la reproductibilité de l'analyse grâce à une correction mettant en jeu un étalon interne, si un chromatogramme est évalué en fonction du temps et ne satisfait pas aux critères mentionnés plus haut [voir informations complémentaires en (1)]. Les polydispersités dépendent des masses moléculaires des étalons; dans le cas des polystyrènes étalons: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp est la masse moléculaire de l'étalon correspondant au maximum du pic)

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Préparation des solutions de polystyrène étalon On dissout les polystyrènes étalons en les mélangeant soigneusement à l'éluant choisi. On préparera les solutions en observant les recommandations du fabricant. Les concentrations des étalons choisis dépendent de différents facteurs, comme le volume d'injection, la viscosité de la solution et la sensibilité du détecteur. Le volume d'injection maximum doit être adapté à la longueur de la colonne, en veillant à ne pas surcharger celle-ci. Les volumes d'injection courants pour des séparations analytiques par chromatographie sur gel perméable, au moyen d'une colonne de 30 cm × 7,8 mm, varient normalement entre 40 et 100 μl. Il est possible d'injecter des volumes plus importants, mais ceux-ci ne peuvent dépasser 250 μl. On doit déterminer le rapport optimal entre le volume d'injection et la concentration avant l'étalonnage de la colonne.

1.6.2. Préparation de la solution de l'échantillon En principe, la préparation des solutions de l'échantillon s'effectue selon les mêmes critères. L'échantillon est dissous dans un solvant approprié, par exemple le THF, en agitant soigneusement. Il ne doit, en aucun cas, être dissous dans un bain à ultrasons. Si nécessaire, la solution de l'échantillon est purifiée au moyen d'un filtre à membrane d'une dimension de pores comprise entre 0,2 et 2 μm. La présence de particules non dissoutes doit être mentionnée dans le rapport final, dans la mesure où elle peut résulter d'espèces de masse moléculaire élevée. Il faut recourir à une méthode appropriée pour déterminer le pourcentage en poids des particules non dissoutes. Les solutions doivent être analysées dans un délai de 24 heures.

1.6.3. Correction liée à la présence d'impuretés et d'additifs S'agissant de la teneur en espèces de M < 1000, il est généralement nécessaire d'apporter une correction pour tenir compte de la présence de composés particuliers non polymériques (par exemple des impuretés ou des additifs), sauf si la teneur mesurée n'excède pas un pour cent. Cette correction peut être réalisée par analyse directe de la solution de polymère ou de l'éluat de la chromatographie sur gel perméable. Au cas où l'éluat est trop dilué pour permettre une analyse après passage à travers la colonne, il convient de le concentrer. Il est éventuellement nécessaire d'évaporer l'éluat à sec puis de le redissoudre. La concentration de l'éluat sera effectuée dans des conditions telles qu'aucune modification de sa composition n'intervienne. Le traitement de l'éluat après la phase de chromatographie sur gel perméable est fonction de la méthode d'analyse utilisée pour la détermination quantitative.

1.6.4. Appareillage Un appareil de chromatographie sur gel perméable se compose des éléments suivants: On doit vérifier que le système de chromatographie sur gel perméable est inerte vis-à-vis du solvant utilisé (par exemple, utilisation de capillaires en acier lorsque le solvant est le THF).

un réservoir à solvant,

un système de dégazage (si nécessaire),

une pompe,

un amortisseur d'impulsions (si nécessaire),

un système d'injection,

des colonnes de chromatographie,

un détecteur,

un débimètre (si nécessaire),

un système d'enregistrement et de traitement des données,

un récipient pour recueillir les solutions usées.

1.6.5. Injection et système de pompage du solvant Un volume défini de la solution de l'échantillon est chargé sur la colonne dans une zone étroitement définie, à l'aide d'un échantillonneur automatique ou manuellement. Si on opère manuellement, le fait de retirer ou d'enfoncer le piston de la seringue trop rapidement peut provoquer des modifications dans la distribution des masses moléculaires observées. Le système de pompage du solvant doit, dans toute la mesure du possible, être exempt de pulsations; il est souhaitable qu'il comporte un amortisseur d'impulsions. Le débit est de l'ordre de 1 ml/min.

1.6.6. Colonne Selon la nature de l'échantillon à tester, le polymère est caractérisé en ayant recours à une seule colonne ou à plusieurs colonnes connectées en série. Un certain nombre de matériaux poreux pour colonne de propriétés définies (par exemple taille des pores, limites d'exclusion) sont disponibles dans le commerce. Le choix du gel de séparation ou celui de la longueur de la colonne dépendent, d'une part, des propriétés de l'échantillon à tester (volumes hydrodynamiques, distribution des masses moléculaires), d'autre part, des conditions particulières de la séparation, telles que la nature du solvant, la température et le débit (1) (2) (3).

1.6.7. Plateaux théoriques La colonne ou la combinaison de colonnes utilisée pour la séparation doit être caractérisée par le nombre de plateaux théoriques. Pour ce faire, dans le cas où le solvant d'élution est le THF, il y a lieu de faire passer une solution d'éthylbenzène ou d'un autre soluté non polaire approprié sur une colonne de longueur connue. Le nombre de plateaux théoriques est donné par l'équation suivante: N=5,54VeW1/22 ou N=16VeW2 où N est le nombre de plateaux théoriques Ve est le volume d'élution correspondant au maximum du pic W est la largeur du pic au niveau de la ligne de base W1/2 est la largeur du pic à mi-hauteur.

1.6.8. Efficacité de la séparation Outre le nombre de plateaux théoriques, paramètre déterminant la largeur de bande, l'efficacité de séparation est une autre grandeur caractéristique; c'est la pente de la courbe de calibrage qui la détermine. L'efficacité de séparation d'une colonne se détermine au moyen de la relation suivante: Ve,Mx-Ve,(10Mx)section de la colonne≥6,0cm3cm2 où VeMx est le volume d'élution du polystyrène de masse moléculaire Mx Ve,(10.Mx) est le volume d'élution du polystyrène de masse moléculaire 10 fois supérieure. La résolution du système est généralement définie comme suit: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 où. Ve1, Ve2 sont les volumes d'élution des deux polystyrènes étalons au maximum du pic. W1, W2 sont les largeurs des pics au niveau de la ligne de base. M1, M2 sont les masses moléculaires correspondant au maximum des pics (elles doivent différer d'un facteur 10). La valeur de R pour le système de colonnes doit être supérieure à 1,7 (4).

1.6.9. Solvants Tous les solvants doivent être d'une grande pureté (on emploie du THF à 99,5 pour cent de pureté}. Le réservoir de solvant (mis, au besoin, sous atmosphère de gaz inerte) doit être assez grand pour permettre l'étalonnage de la colonne et plusieurs analyses d'échantillons. Le solvant sera dégazé avant d'être pompe vers la colonne.

1.6.10. Régulation de la température La température des composants internes critiques [boucle d'injection, colonne(s), détecteur et tuyaux] doit être constante et compatible avec le choix du solvant.

1.6.11. Détecteur Le détecteur sert à enregistrer de manière quantitative la concentration de l'échantillon qui est élué de la colonne. En vue d'éviter un élargissement indésirable des pics, le volume de la cuvette du détecteur sera choisi aussi petit que possible. Il ne doit pas excéder 10 μl, sauf pour les détecteurs par diffusion de la lumière et les viscosimètres. La détection s'effectue généralement par réfractométrie différentielle. Toutefois, si les propriétés spécifiques de l'échantillon ou du solvant d'élution l'exigent, d'autres types de détecteurs peuvent être utilisés tels que les détecteurs UV/VIS ou IR, les viscosimètres, etc.

2. RÉSULTATS ET PROCÈS-VERBAL D'ESSAI

2.

2.1. RÉSULTATS On se référera à la norme DIN (1) pour ce qui concerne les critères d'évaluation détaillés, de même que pour les spécifications relatives à la collecte et au traitement des données. Pour chaque échantillon analysé, on réalisera deux expériences indépendantes. Leurs résultats seront analysés séparément. Il est nécessaire d'indiquer explicitement que les valeurs mesurées sont des valeurs relatives correspondant a des équivalents de masse moléculaire de l'étalon utilisé. Dans tous les cas, il est essentiel de déterminer aussi les données relatives aux blancs, ceux-ci étant traités de la même manière que les échantillons. Après avoir déterminé les volumes et les temps de rétention (éventuellement corrigés au moyen d'un étalon interne), on porte en graphique les valeurs de log Mp (Mp représentant les maxima des pics des polymères d'étalonnage) en fonction de l'une de ces quantités. Deux points d'étalonnage au moins sont nécessaires pour chaque facteur 10 de masse moléculaire; cinq points de mesure au moins sont requis, pour la courbe dans son ensemble qui doit couvrir la masse moléculaire estimée de l'échantillon. Le point extrême de la courbe d'étalonnage du côté des faibles masses moléculaires peut être défini grâce au n-hexylbenzène ou à un autre soluté non polaire approprié. On détermine la portion de la courbe correspondant aux masses moléculaires inférieures à 1000 et on la corrige, si nécessaire, pour tenir compte des impuretés et des additifs. Les courbes d'élution sont généralement évaluées au moyen d'un système électronique de traitement des données. Si on a recours à un traitement manuel, il est opportun de consulter l'ASTM D 3536-91 (3). Si un polymère insoluble est retenu sur la colonne, sa masse moléculaire est vraisemblablement supérieure à celle de la fraction soluble et il faut en tenir compte pour éviter de surestimer la teneur en polymères de faible masse moléculaire. On trouvera en annexe des indications permettant de corriger la teneur en polymères de faible masse moléculaire pour tenir compte des polymères insolubles. La courbe de distribution doit être présentée sous la forme d'un tableau ou d'un graphique (fréquence-différentielle ou pourcentages cumulatifs en fonction du log M). Dans la représentation graphique, une puissance de dix de masse moléculaire doit normalement correspondre à une largeur de 4 cm environ, tandis que pour le maximum du pic une hauteur de 8 cm environ est adéquate. Dans le cas de courbes de distribution cumulatives, la différence entre 0 et 100 pour cent sur l'axe des ordonnées doit être d'environ 10 cm.

2.2. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai doit comporter les renseignements suivants:

2.2.

2.2.1. Substance à tester

renseignements disponibles sur la substance à tester (nature, additifs, impuretés),

description du traitement de l'échantillon, observations, problèmes.

2.2.2. Dispositif expérimental

réservoir d'éluant, gaz inerte, dégazage de l'éluant, composition de l'éluant, impuretés,

pompe, amortisseur d'impulsions, système d'injection,

colonnes de séparation (fabricant, toutes précisions sur les caractéristiques de la colonne, telles que taille des pores, nature du matériel de séparation, etc., nombre, longueur et ordre des colonnes utilisées),

nombre de plateaux théoriques de la colonne (ou de la combinaison de colonnes), efficacité de la séparation (résolution du système),

informations sur la symétrie des pics,

température de la colonne, mode de régulation de la température,

détecteur (principe de mesure, type, volume de la cuvette),

débitmètre s'il y en a un (fabricant, principe de mesure),

système utilisé pour rassembler et pour traiter les données (matériel et logiciel).

2.2.3. Étalonnage du système

description détaillée de la méthode utilisée pour établir la courbe d'étalonnage,

précisions sur les critères de qualité propres à cette méthode (par exemple, coefficient de corrélation, erreur quadratique moyenne, etc.),

informations sur toutes les extrapolations, hypothèses et approximations effectuées au cours des processus expérimentaux, ainsi que sur l'évaluation et le traitement des données,

toutes les mesures effectuées pour établir la courbe d'étalonnage doivent être présentées dans un tableau qui comporte, pour chaque point d'étalonnage, les informations suivantes:

nom de l'échantillon,

fabricant de l'échantillon,

valeurs caractéristiques Mp, Mo, Mw, Mw/Mn des étalons fournies par le fabricant déduites de mesures ultérieures, complétées d'indications relatives à la méthode de détermination,

volume d'injection et concentration d'injection,

valeur de Mp utilisée pour l'étalonnage,

volume d'élution ou temps de rétention corrigé mesuré aux maxima des pics,

Mp calculée au maximum du pic,

pourcentage d'erreur sur la Mp calculée et sur la valeur d'étalonnage.

2.2.4. Renseignements sur la teneur en polymères de faible masse moléculaire

description des méthodes d'analyse utilisées et de la manière dont les expériences ont été menées,

informations sur le pourcentage que représente la teneur en espèces de faible masse moléculaire (poids/poids) par rapport à l'ensemble de l'échantillon,

informations sur les impuretés, les additifs et les autres substances non polymériques en pourcentage pondéral de l'ensemble de l'échantillon.

2.2.5. Évaluation

évaluation en fonction du temps: toutes méthodes visant à améliorer la reproductibilité requise (méthode de corrections, étalon interne, etc.),

préciser si l'évaluation a été effectuée à partir du volume d'élution ou à partir du temps de rétention,

indiquer les limites de l'évaluation si un pic n'est pas complètement analyse,

décrire les méthodes de lissage lorsqu'on y a recours.

décrire les procédés de préparation et de prétraitement de l'échantillon,

indiquer la présence de particules non dissoutes, s'il y en a,

indiquer le volume d'injection (μl) et la concentration d'injection (mg/ml),

mentionner les observations témoignant d'effets qui engendrent des déviations par rapport au profil idéal de chromatographie sur gel perméable,

décrire en détail toutes les modifications aux procédures d'essais,

préciser les intervalles d'erreur,

consigner toutes autres informations et observations utiles pour interpréter les résultats.

3.(1)(2)(3)(4)

RÉFÉRENCES DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J. et Bly, D.D. (eds.) (1979). Modem Size Exclusion Liquid Chromatography, J.Wiley & Sons. ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC), American Society for Testing and Materials, Philadelphie, Pennsylvanie. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography, American Society for Testing and Materials, Philadelphie, Pennsylvanie.

A.20. COMPORTEMENT DE DISSOLUTION — EXTRACTION DES POLYMÈRES DANS L'EAU

A.20.

1. MÉTHODE La méthode décrite reprend la version révisée de la ligne directrice OCDE TG 120 (1997). On trouvera davantage de renseignements techniques en référence (1).

1.

1.1. INTRODUCTION Dans le cas de certains polymères, tels que les polymères en émulsion, un travail préparatoire initial peut être nécessaire avant utilisation de la méthode exposée. La méthode n'est pas applicable aux polymères liquides ni aux polymères qui réagissent avec l'eau dans les conditions d'essai. Lorsque la méthode est difficile ou impossible à mettre en pratique, le comportement de dissolution-extraction des polymères peut être étudié par d'autres méthodes. Dans ce cas, la méthode utilisée devra être entièrement détaillée et justifiée.

1.2. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant

1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Le comportement de dissolution — extraction des polymères en milieu aqueux est déterminé par la méthode du flacon (voir A.6, Solubilité dans l'eau, méthode du flacon), en y apportant les modifications décrites ci-après.

1.4. CRITÈRES DE QUALITÉ Néant

1.5. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.5.

1.5.1. Appareillage L'appareillage nécessaire à l'application de la méthode est le suivant:

un dispositif permettant de réduire l'échantillon en poudre, tel qu'un broyeur produisant des particules de taille déterminée

un système d'agitation avec possibilité de régler la température

un système de filtration sur membrane

un dispositif d'analyse

des tamis normalisés.

1.5.2. Préparation de la solution de l'échantillon Il convient de réduire d'abord un échantillon représentatif à l'état de particules d'une taille comprise entre 0,125 et 0,25 mm en utilisant des tamis appropriés. Il peut être nécessaire de refroidir pour garantir la stabilité de l'échantillon ou pour procéder au broyage. Les matériaux du type du caoutchouc peuvent être pulvérisés à la température de l'azote liquide (1). S'il n'est pas possible d'obtenir des particules de la dimension requise, on doit s'efforcer de réduire autant que possible la taille des particules et consigner le résultat. Dans le rapport, il est nécessaire d'indiquer comment l'échantillon pulvérisé a été conservé avant l'analyse.

1.5.3. Procédure On pèse trois échantillons de la substance à tester, de 10 g chacun, dans trois récipients pourvus de bouchons en verre et on ajoute 1000 ml d'eau dans chacun des récipients. Si la manipulation de 10 g de polymère s'avère impossible, il convient d'utiliser la quantité la plus grande qui puisse être manipulée, le volume d'eau étant ajusté en proportion. Les récipients sont soigneusement bouchés, puis agités à 20 oC. On doit employer un dispositif d'agitation qui puisse fonctionner à température constante. Après une période de 24 heures, le contenu de chaque récipient est centrifugé ou filtré et la concentration du polymère dans la phase aqueuse limpide est déterminée à l'aide d'une méthode d'analyse appropriée. S'il n'existe pas de méthode permettant une analyse adéquate de la phase aqueuse, on peut obtenir une estimation de la solubilité-extractibilité totale en pesant, après séchage, le résidu filtré ou le précipité centrifugé. Il est également nécessaire de différencier au plan quantitatif les impuretés et les additifs, d'une part, et les espèces de faible masse moléculaire, d'autre part. Dans le cas d'une détermination par gravimétrie, il est important de réaliser un essai à blanc, c'est-à-dire sans utiliser la substance à tester, de manière à pouvoir tenir compte des résidus générés par la méthode expérimentale. On peut déterminer de la même manière le comportement de dissolution — extraction des polymères dans l'eau à 37 oC à pH 2 et pH 9 tel que décrit pour l'expérience réalisée à 20 oC. Les valeurs de pH peuvent être obtenues par addition de tampons adéquats ou d'acides et de bases appropriés tels que l'acide chlorhydrique, l'acide acétique, les hydroxydes de sodium et de potassium de qualité pour analyse ou l'ammoniac. Il convient de mener un ou deux essais, suivant la méthode d'analyse utilisée. Lorsqu'on dispose de méthodes suffisamment spécifiques pour l'analyse directe du polymère en phase aqueuse, un essai tel que décrit plus haut devrait suffire. Mais quand ces méthodes n'existent pas et que la détermination du comportement de dissolution-extraction du polymère ne peut se faire que par une analyse indirecte, c'est-à-dire uniquement par la détermination de la teneur en carbone organique total (COT) de l'extrait aqueux, il est nécessaire de réaliser un essai supplémentaire. Celui-ci doit aussi être effectué en trois exemplaires, avec des échantillons de polymère dix fois plus petits et les mêmes quantités d'eau que celles qui ont été utilisées dans le premier essai.

1.5.4. Analyse

1.5.4.

1.5.4.1. Essais réalisés sur des échantillons d'une seule taille Il est possible que l'on dispose de méthodes permettant une analyse directe des polymères en phase aqueuse. Sinon, l'analyse indirecte des polymères dissous ou extraits peut aussi être envisagée. Pour ce faire, on détermine la teneur totale en parties solubles et on la corrige pour tenir compte des substances non polymériques. L'analyse de l'extrait aqueux pour déterminer la teneur totale en espèces polymériques peut être réalisée; soit par une méthode suffisamment sensible, par exemple. soit par évaporation à sec, sous vide, de l'extrait aqueux, suivie d'une analyse du résidu par spectroscopie (IR, UV, etc.) ou par SAA-PCI. Si une telle analyse de la phase aqueuse est impossible, l'extrait aqueux sera obtenu au moyen d'un solvant organique non miscible à l'eau (un hydrocarbure chlore, par exemple). Le solvant est alors évaporé et le résidu analysé, par ex. par IR, UV ou SAA-PCI, pour déterminer sa teneur en polymère notifié. Tous les constituants de ce résidu qui s'avèrent être des impuretés ou des additifs doivent être soustraits dans le but de déterminer le degré de dissolution — extraction du polymère lui-même. Lorsque de telles substances sont présentes en quantités relativement importantes, il peut être nécessaire de soumettre le résidu à une analyse par chromatographie en phase liquide à haute performance ou en phase gazeuse, par exemple, afin de différencier ces impuretés des monomères et des dérivés des monomères présents, de telle sorte que la teneur réelle en ces dernières espèces puisse être déterminée. Dans certains cas, une simple évaporation à sec du solvant organique, suivie de la pesée du résidu sec, peut suffire.

la détermination du COT par la digestion au persulfate ou au dichromate pour donner du CO2, suivie d'une estimation par IR ou d'une analyse chimique,

la spectrométrie d'absorption atomique (SAA) ou son équivalent en émission d'un plasma couplé par induction (PCI), dans le cas des polymères contenant du silicium ou un métal,

l'absorption UV ou la spectrofluorimétrie pour les polymères arylés,

la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse pour les échantillons de faible masse moléculaire,

1.5.4.2. Essais réalisés sur des échantillons de deux tailles différentes La teneur en carbone organique total doit être déterminée pour tous les extraits aqueux. Une détermination par gravimétrie est réalisée sur la partie non dissoute ou non extraite de l'échantillon. Si, après la centrifugation ou la filtration du contenu de chaque récipient, des résidus de polymère adhèrent encore à la paroi d'un récipient, il faut rincer ce dernier avec le filtrat jusqu'à ce qu'il ne comporte plus aucune trace visible de résidus. Après quoi, le filtrat est à nouveau filtré ou centrifugé. Les résidus déposés sur le filtre ou dans le tube de centrifugation sont séchés à 40 oC sous vide et pesés. On poursuit le séchage jusqu'à obtention d'une masse constante.

2. RÉSULTATS

2.

2.1. ESSAIS RÉALISÉS SUR DES ÉCHANTILLONS D'UNE SEULE TAILLE Les résultats obtenus pour chacun des trois flacons, ainsi que les valeurs moyennes, doivent être consignés et exprimés en unités de masse par volume de solution (généralement en mg/l) ou en unités de masse par masse d'échantillon de polymère (habituellement en mg/g). En outre, la perte de masse de l'échantillon (calculée en divisant la masse du soluté par la masse de l'échantillon initial) sera également mentionnée. Les écarts-types relatifs doivent être calculés. Les diverses valeurs seront consignées à la fois pour le produit total (polymère + principaux additifs, etc.) et pour le polymère seul (à savoir, après soustraction de la contribution relative à de tels additifs).

2.2. ESSAIS RÉALISÉS SUR DES ÉCHANTILLONS DE DEUX TAILLES DIFFÉRENTES Les différentes concentrations du carbone organique total dans les extraits aqueux provenant des deux séries de trois expériences, ainsi que la valeur moyenne pour chaque série, doivent être consignées et exprimées en unités de masse par volume de solution (généralement en mgC/l), ainsi qu'en unités de masse par masse de l'échantillon initial (généralement en mgC/g). S'il n'y a pas de différence entre les résultats correspondant aux rapports taille de l'échantillon/volume d'eau élevés et bas, cela peut indiquer que tous les constituants susceptibles d'être extraits l'ont effectivement été. Si tel est le cas, une analyse directe n'est, en principe, pas nécessaire. Les différentes masses des résidus doivent être consignées et exprimées en pourcentage des masses initiales des échantillons. On calculera les valeurs moyennes pour chaque expérience. La différence entre 100 et le pourcentage obtenu représente le pourcentage de matières solubles et extractibles dans les échantillons de départ.

3. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai doit comporter les renseignements suivants:

3.1.

3.1.1. Substance à tester

renseignements disponibles sur la substance à tester (nature, additifs, impuretés, proportion d'espèces de faible masse moléculaire).

3.1.2. Conditions expérimentales

description des méthodes utilisées et des conditions expérimentales,

description des méthodes d'analyse et de détection.

3.1.3. Résultats

résultats de solubilité — extractibilité en mg/l: toutes les valeurs et la valeur moyenne obtenues pour les essais d'extraction dans les différentes solutions, ventilées en polymères et impuretés, additifs, etc.,

résultats de solubilité — extractibilité en mg/g de polymère,

concentrations du carbone organique total dans les extraits aqueux, masse du soluté et pourcentages calculés, si on en fait la mesure,

pH de chaque échantillon,

informations sur les valeurs obtenues dans les essais à blanc,

description des méthodes d'analyse et de détection,

si nécessaire, mention de l'instabilité chimique de la substance à tester durant la procédure d'essai et durant la procédure d'analyse,

toutes les informations importantes pour interpréter les résultats.

4.(1) RÉFÉRENCES DIN 53733 (1976). Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen fur Prüfzwecke.

A.21. PROPRIÉTÉS COMBURANTES (LIQUIDES)

A.21.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION La présente méthode vise à déterminer l'aptitude d'un liquide à accroître la vitesse de combustion ou l'intensité de la combustion d'une substance combustible, ou de provoquer l'inflammation spontanée d'une substance combustible avec laquelle il est mélangé de manière homogène. La méthode repose sur l'épreuve des Nations unies pour les liquides comburants (1) et en est l'équivalent. Toutefois, comme cette méthode A.21 est avant tout conçue pour satisfaire aux exigences du règlement 1907/2006, une seule substance de référence est nécessaire pour effectuer la comparaison. Il peut être nécessaire d'effectuer des tests et des comparaisons avec d'autres substances de référence lorsque les résultats du test doivent être utilisés à d'autres fins. Il n'est pas nécessaire d'effectuer ce test lorsque l'examen de la formule structurale établit indubitablement que la substance est incapable de présenter une réaction exothermique avec un combustible. Il est utile de disposer d'informations préliminaires sur les éventuelles propriétés explosives de la substance avant de pratiquer ce test. Ce test ne s'applique pas aux solides, gaz, substances explosives ou hautement inflammables, ni aux peroxydes organiques. Il n'est pas nécessaire d'effectuer ce test lorsque l'on dispose déjà, pour la substance concernée, des résultats de l'épreuve des Nations unies pour les liquides comburants (1).

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Le temps moyen de montée en pression est la moyenne des temps mesurés pour que le mélange testé produise une élévation de pression de 690 kPa à 2070 kPa au-dessus de la pression atmosphérique.

1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE La substance de référence est une solution aqueuse d'acide nitrique (qualité pour analyse) à 65 % (poids/poids). Le cas échéant, si l'expérimentateur prévoit que les résultats de ce test seront peut-être utilisés à d'autres fins, il peut également être indiqué de tester d'autres substances de référence.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Le liquide à tester est mélangé avec de la cellulose fibreuse dans un rapport massique de 1 pour 1 et placé dans une bombe. Si le mélange s'enflamme spontanément lors du mélange ou du remplissage, il n'est pas nécessaire de poursuivre l'essai. Si le mélange ne s'enflamme pas spontanément, il y lieu d'effectuer l'essai complet. Le mélange est chauffé dans la bombe et le temps moyen que met la pression pour s'élever de 690 kPa à 2070 kPa au-dessus de la pression atmosphérique est déterminé. Ce résultat est comparé au temps moyen de montée en pression pour le mélange 1:1 de la (des) substance(s) de référence et de cellulose.

1.5 CRITÈRES DE QUALITÉ Dans une série de cinq essais sur une substance, aucun résultat ne devrait s'écarter de plus de 30 % de la moyenne arithmétique. Les résultats qui diffèrent de plus de 30 % de la moyenne devraient être rejetés, la procédure de mélange et de remplissage améliorée et les essais répétés.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Préparation

1.6.1.

1.6.1.1. Substance combustible Comme matériau combustible on utilise de la cellulose fibreuse séchée ayant une longueur de fibre comprise entre 50 et 250 μm pour un diamètre de 25 μm. On la fait sécher en couche de moins de 25 mm d'épaisseur à 105 oC pendant 4 heures jusqu'à obtention d'un poids constant, puis on la maintient dans un dessiccateur en présence de dessiccant jusqu'à refroidissement et utilisation. La teneur en eau doit être inférieure à 0,5 % en masse (rapportée au poids sec). Si cela est nécessaire pour satisfaire à cette condition, la durée de séchage doit être prolongée. Le même lot de cellulose doit être utilisé tout au long des essais.

1.6.1.2. Appareillage

1.6.1.2.

1.6.1.2.1. Bombe On doit disposer d'une bombe. Le dispositif d'essai est constitué par une bombe cylindrique en acier de 89 mm de longueur et de 60 mm de diamètre extérieur (voir figure 1). La bombe comporte deux plats usinés en des points diamétralement opposés (réduisant sa largeur à cet endroit à 50 mm), ce qui permet de l'immobiliser pour le serrage du bouchon de mise à feu et du bouchon à évent. Elle est alésée intérieurement à 20 mm et comporte aux deux extrémités un chambrage de 19 mm de profondeur taraudé au pas de 1 en tube normalisé BSP (British Standard Pipe) ou son équivalent métrique. Une prise de pression est vissée latéralement dans le corps de la bombe à 35 mm d'une extrémité, et à un angle de 90o par rapport aux plats. Elle se visse dans un chambrage de 12 mm de profondeur taraudé au pas de 1/2 en tube normalisé BSP (ou l'équivalent métrique). Si nécessaire, un joint en un matériau inerte est utilisé pour assurer l'étanchéité au gaz. La prise de pression fait saillie latéralement de 55 mm par rapport au corps de la bombe et elle est percée d'un trou axial de 6 mm. Elle comporte à son extrémité extérieure un chambrage taraudé pour recevoir un capteur de pression du type à diaphragme. Tout autre type de dispositif de mesure de la pression peut être utilisé, à condition qu'il résiste aux gaz chauds et produits de décomposition et qu'il puisse réagir à des accroissements de pression de 690 à 2070 kPa en moins de 5 ms. L'extrémité de la bombe la plus éloignée du raccord est fermée par un bouchon fileté qui porte deux électrodes, dont l'une est isolée du corps du bouchon et l'autre mise à la masse. L'autre extrémité est fermée par un disque de rupture en aluminium de 0,2 mm d'épaisseur (taré à une pression d'environ 2200 kPa), maintenu en place par un bouchon comportant un évent de 20 mm. Si nécessaire, un joint inerte est utilisé pour assurer la bonne étanchéité entre le bouchon et la bombe. Un porte-bombe spécial (figure 2) permet de maintenir la bombe dans la position voulue pendant les essais. Il est généralement constitué par une embase en acier doux de 235 mm × 184 mm × 6 mm, sur laquelle est soudé obliquement un tube de section carrée (de 70 mm × 70 mm × 4 mm) de 185 mm de longueur. À une extrémité du tube carré, on a enlevé une certaine longueur de métal sur deux faces opposées, ce qui laisse une longueur de 86 mm de tube carré prolongée par deux côtés plats. Les extrémités de ces plats sont coupées à 60o par rapport à l'axe du tube et soudées à la plaque d'embase. Une encoche de 22 mm de large et de 46 mm de profondeur est découpée sur un côté en haut du tube carré, de telle manière que lorsque la bombe repose sur le support, bouchon de mise à feu vers la base, le raccord de prise de pression vienne s'y loger. Une entretoise en acier de 30 mm de largeur et 6 mm d'épaisseur est soudée sur la paroi intérieure du tube du côté orienté vers le bas. Deux trous taraudés dans le côté opposé reçoivent des vis à molettes de 7 mm, qui servent à fixer la bombe. Deux rebords en acier de 12 mm de largeur et de 6 mm d'épaisseur, soudés sur les flancs du support à la base de la section carrée soutiennent la cuve par le fond.

1.6.1.2.2. Système d'allumage Le système d'allumage est constitué par un enroulement de fil au Ni/Cr de 25 cm de longueur, de 0,6 mm de section, et d'une résistance électrique de 3,85 ohm/m. Le fil a été enroulé en forme de bobine sur un mandrin de 5 mm de diamètre; ses extrémités sont reliées aux électrodes du bouchon de mise à feu. La bobine doit avoir l'une des configurations présentées à la figure 3. La distance entre la face supérieure du bouchon et le point le plus bas de l'enroulement de chauffage doit être de 20 mm. Si les électrodes ne sont pas réglables en longueur, les deux sections de fil chauffant situées entre la bobine et la face supérieure du bouchon doivent être isolées par une gaine de céramique. Le fil doit être alimenté par une source électrique stable pouvant fournir une intensité d'au moins 10 A.

1.6.2. Réalisation de l'essai La bombe montée, avec son capteur de pression, mais non fermée par son disque de rupture, est posée bouchon d'allumage vers le bas dans son support. On mélange 2,5 g du liquide à essayer avec 2,5 g de cellulose séchée dans un bécher en verre à l'aide d'un agitateur en verre. Pour des raisons de sécurité, lors de cette opération, le manipulateur devrait s'abriter derrière un écran de protection. Si le mélange s'enflamme spontanément au cours du mélange ou du remplissage, il n'est pas nécessaire de poursuivre l'essai. On remplit la bombe en plusieurs fois en tassant par petits chocs contre un objet dur; on s'assure qu'il n'y a pas de vide autour de l'enroulement de chauffage et que le mélange est directement en contact avec celui-ci. On doit cependant veiller à ne pas déformer l'enroulement en tassant le mélange car cela pourrait entraîner des résultats erronés. On met en place le disque de rupture et on visse le bouchon à évent en le bloquant. La bombe chargée est alors posée sur le porte-bombe, disque de rupture vers le haut, l'ensemble étant placé dans une hotte blindée ou dans une chambre de tir. On raccorde les bornes extérieures du bouchon de mise à feu à une source électrique et on applique au dispositif de chauffage un courant de 10 A. Il ne devrait pas s'écouler plus de 10 minutes entre le début de la préparation du mélange et le moment de la mise sous tension. Le signal émis par le capteur de pression est enregistré sur un système permettant d'effectuer un enregistrement permanent de la courbe pression/temps et une analyse de cette courbe (enregistreur de signaux transitoires couplé à un enregistreur à bande de papier par exemple). Le mélange est chauffé jusqu'à rupture du disque ou pendant une durée d'au moins 60 s. S'il n'y a pas rupture, on doit attendre que le mélange ait refroidi avant d'ouvrir la bombe prudemment au cas où celle-ci serait encore sous pression. Cinq essais sont exécutés avec le mélange et avec chacune des substances de référence. On note le temps nécessaire pour monter de 690 kPa à 2070 kPa (pression manométrique). Le temps moyen de montée en pression est calculé. Dans certains cas, des substances peuvent engendrer une augmentation de pression (trop élevée ou trop faible), due à des réactions chimiques non caractéristiques des propriétés comburantes de ces substances. Il peut alors se révéler nécessaire de répéter l'épreuve en remplaçant la cellulose par une substance inerte, par exemple la diatomite (kieselguhr), afin de s'assurer de la nature de la réaction.

2. DONNÉES Temps de montée en pression à la fois pour la substance à essayer et pour la (les) substance(s) de référence. Temps de montée en pression pour les essais avec une substance inerte, le cas échéant.

2. 2.1. Tableau 1 Exemples de résultats

TRAITEMENT DES RÉSULTATS Le temps moyen de montée en pression est calculé à la fois pour la substance à essayer et pour la (les) substances(s) de référence. Le temps moyen de montée en pression est calculé pour les essais réalisés, avec une substance inerte (le cas échéant). Le tableau 1 présente quelques exemples. Substance Temps moyen de montée en pression pour un mélange 1:1 avec de la cellulose (ms) Dichromate d'ammonium, solution aqueuse saturée 20800 Nitrate de calcium, solution aqueuse saturée 6700 Nitrate ferrique, solution aqueuse saturée 4133 Perchlorate de lithium, solution aqueuse saturée 1686 Perchlorate de magnésium, solution aqueuse saturée 777 Nitrate de nickel, solution aqueuse saturée 6250 Acide nitrique, 65 % 4767 Acide perchlorique, 50 % 121 Acide perchlorique, 55 % 59 Nitrate de potassium, 30 % solution aqueuse 26690 Nitrate d'argent, solution aqueuse saturée Chlorate de sodium, 40 % solution aqueuse 2555 Nitrate de sodium, 45 % solution aqueuse 4133 Substance inerte Eau: cellulose

3. COMPTE RENDU

3.

3.1. COMPTE RENDU DE L'ESSAI Le compte rendu de l'essai doit comprendre les informations suivantes:

l'identité, la composition, la pureté, etc. de la substance essayée,

la concentration de la substance,

la méthode de séchage de la cellulose employé,

la teneur en eau de la cellulose utilisé,

le résultat des mesures,

le résultat des essais réalisés avec une substance inerte, le cas échéant,

les temps moyens de montée en pression calculés,

tout écart par rapport à cette méthode et les raisons de celui-ci,

toute information ou remarque complémentaire présentant un intérêt pour l'interprétation des résultats.

3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Pour l'évaluation des résultats, on se fonde: Une substance liquide doit être considérée comme comburante lorsque: Afin d'éviter les faux positifs, il y a lieu, si nécessaire, de tenir également compte, lors de l'interprétation des résultats, des résultats obtenus dans les essais de la substance avec un matériel inerte.

3.2. a)

sur le fait que le mélange substance à essayer/cellulose s'enflamme spontanément ou non;

sur la comparaison du temps moyen de montée de 690 kPa à 2070 kPa (pression manométrique) avec le temps moyen obtenu pour la (les) substance(s) de référence.

un mélange 1:1, en poids, de la substance et de cellulose s'enflamme spontanément; ou

un mélange 1:1, en poids, de la substance et de cellulose présente un temps moyen de montée en pression inférieur ou égal au temps moyen de montée en pression d'un mélange 1:1, en poids, d'une solution aqueuse d'acide nitrique à 65 % (poids/poids) et de cellulose.

4.(1) RÉFÉRENCES Recommandations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.lO/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.

4.(1)

Figure 1 Bombe

(A) Corps de la bombe (B) Bouchon retenant le disque de rupture (C) Bouchon de mise à feu (D) Joint en plomb mou (E) Disque de rupture (F) Raccord de prise de pression (G) Taraudage pour capteur de pression (H) Joint (J) Électrode isolée (K) Électrode mise à la masse (L) Isolation (M) Cône en acier (N) Rainure de matage du joint

Figure 2 Porte-bombe

Figure 3 Système d'allumage

(A) Bobine d’allumage (B) Isolation (C) Électrodes (D) Bouchon de mise à feu

Annexe Pour plus de détails, on peut consulter par exemple les normes suivantes.

1. Méthodes du tube capillaire

1.

1.1. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bain liquide ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung der Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren. JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products.

1.2. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bloc métallique DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determination of melting point

2. Méthodes du bloc chauffant

2.

2.1. Banc chauffant de Kofler ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommanded practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Microscope à fusion DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von reilkristallinen Kunsrstoffen.

2.3. Méthode du ménisque (polyamides) ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resine injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du point de fusion. Méthode du ménisque.

3. Méthodes de détermination de la température de congélation BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax (cooling curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage. DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point.

4. Analyse thermique

4.

4.1. Analyse thermique différentielle ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Analyse calorimétrique différentielle ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Détermination du point d'écoulement NBN 52014 Échantillonnage et analyse des produits du pétrole: point de trouble et point d'écoulement limite — Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroieum oils ISO 3016 Petroleum oils — Determination of pour point.

Annexe Pour plus de détails techniques, on peut, par exemple, consulter les normes suivantes:

1. Ébulliomètre ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Méthode de distillation (intervalle d'ébullition) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Analyse thermique différentielle et analyse calorimétrique différentielle ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

Annexe Pour plus de détails techniques, on peut consulter, par exemple, les normes suivantes.

1. Méthodes de flottabilité

1.

1.1. Aréomètre DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Produits chimiques à usage industriel — détermination de la densité des liquides — méthode aréométrique DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2. Balance hydrostatique

1.2. Pour les substances solides

ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Produits chimiques à usage industriel — détermination de la densité des solides autres que les poudres et les produits alvéolaires — méthode de la balance hydrostatique ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density

Pour les substances liquides

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oil and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 et ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3. Méthode du corps immergé DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2. Méthodes pycnométriques

2.

2.1. Pour les substances liquides ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00,10 – 6 m2 s – 1 at 15 °C DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10 – 6 m2 s – 1 at 20 °C, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approxi-mately 1 bar at 90 oC) DIN 12806 Hubbard pycnoter (for viscous liquids of all types which do not have a too high vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol-water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; détermination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products -chemical analysis ASTM D 2111 (Method C: Halogenated organic compounds) BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method NF T 20-053 Produits chimiques à usage industriel — détermination de la densité des solides en poudre et des liquides — méthode pycnométrique

2.2. Pour les substances solides ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-053 Produits chimiques à usage industriel — détermination de la densité des solides en poudre et des liquides — méthode pycnométrique DIN 19683 Determination of the density of soils

3. Pycnomètre de comparaison à air DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige polymere; Prüfung

Annexe 1 Méthode d'estimation

INTRODUCTION

Des valeurs calculées de la pression de vapeur peuvent être utilisées pour:

choisir la méthode expérimentale,

fournir une estimation ou une valeur limite au cas où la méthode expérimentale ne peut pas être appliquée pour des raisons techniques (notamment lorsque la pression de vapeur est très faible),

contribuer à déceler les cas où il est justifié de ne pas effectuer de mesures expérimentales car la pression de vapeur serait < 10 – 5 Pa à la température ambiante.

MÉTHODE D'ESTIMATION

La pression de vapeur des liquides et des solides peut être estimée à l'aide de la corrélation de Watson modifiée (a). La seule donnée expérimentale requise est le point d'ébullition normal. Cette méthode est applicable à des pressions comprises entre 105 et 10 – 5 Pa. Cette méthode est décrite en détail dans Handbook of Chemical Properry Estimation Methods (b).

CALCUL

D'après la méthode décrite dans la référence (b), la pression de vapeur est calculée de la manière suivante: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb où: T = température choisie Tb = point d'ébullition normal Pvp = pression de vapeur à la température T ΔHvb = température de vaporisation ΔZb = facteur de compressibilité (estimé à 0,97) m = facteur empirique dépendant de l'état physique à la température choisie. De plus: Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb où KF est un facteur empirique qui tient compte de la polarité de la substance. Les facteurs KF pour plusieurs types de composés sont énumérés à la référence (b). Il est fréquent que l'on dispose de données mentionnant un point d'ébullition à une pression réduite. Dans ce cas, la pression de vapeur est calculée comme suit [conformément à (b)]: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 où T1 est le point d'ébullition à la pression réduite P1.

PROCÈS-VERBAL

Lorsque la méthode d'estimation est utilisée, le procès-verbal doit comporter une documentation détaillée concernant le calcul.

RÉFÉRENCES

(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem., 1943, vol. 35, 398.

(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

Annexe 2

Figure 1 Appareil de détermination de la courbe de pression de vapeur, suivant la méthode dynamique

1 = Thermocouple 2 = Volume tampon 3 = Jauge de pression 4 = Vide 5 = Point de mesure 6 = Élément chauffant (environ 150 W)

Figure 2a Appareil de détermination de la courbe de pression de vapeur, selon la méthode statique (en utilisant un manomètre à tube en U)

1 = Substance à tester 2 = Vapeur 3 = Robinet à vide poussé 4 = Tube en U (manomètre) 5 = Manomètre (auxiliaire) 6 = Bain thermostaté 7 = Dispositif de mesure de la température 8 = Vers la pompe à vide 9 = Ventilation

Figure 2b Appareil de détermination de la courbe de pression de vapeur, suivant la méthode statique (en utilisant un indicateur de pression)

1 = Substance à tester 2 = Vapeur 3 = Robinet à vide poussé 4 = Jauge de pression 5 = Indicateur de pression 6 = Bain thermostaté 7 = Dispositif de mesure de la température

Figure 3 Isoténiscope (voir référence 2)

1 = Vers les systèmes de contrôle et de mesure de la pression 2 = Tube de 8 mm de diamètre extérieur 3 = Azote sec 4 = Vapeur de l’échantillon 5 = Petite pointe 6 = Échantillon liquide

Figure 4 Appareil de détermination de la courbe de pression de vapeur, suivant la méthode de la balance de pression de vapeur

1 = Substance à étudier 2 = Vapeur avec jet de vapeur 3 = Four d’évaporation avec canal d’alimentation rotatif 3 a = Couvercle du four avec orifice 4 = Système de chauffage du four (réfrigération) 5 = Système de mesure de la température de l’échantillon 6 = Enceinte de réfrigération 7 = Bouclier 8 = Barre pour l’enceinte de réfrigération 9 = Plateau de balance 10 = Microbalance 11 = Vers l’enregistreur (réfrigération) 12 = Vers la pompe à vide poussé (réfrigération)

Figure 5 Modèle d'appareil pour l'évaporation à basse pression grâce à la méthode d'effusion, avec une cellule d'effusion d'un volume de 8 cm3

1 = Vers la pompe à vide 2 = Puits pour le thermomètre à résistance de platine ou pour les systèmes de mesure et de contrôle de la température (2) 3 = Couvercle du récipient à vide 4 = Anneau 5 = Enceinte à vide en aluminium 6 = Système d’accès aux cellules à effusion 7 = Couvercle fileté 8 = Écrou à ailettes (6) 9 = Boulon (6) 10 = Cellules à effusion en acier inoxydable 11 = Cartouches de chauffage (6)

Figure 6a Exemple de système de débit permettant de déterminer la pression de vapeur par la méthode de saturation des gaz

Mise à l’air Rampe 1 = Régulateur de débit 2 = Échangeur de chaleur 3 = Vannes à pointeau 4 = Sondes d’humidité relative 5 = Colonnes de saturation 6 = Joints PTFE 7 = Débitmètre 8 = Collecteur (absorbant) 9 = Collecteur (huile) 10 = Fritté pour barbotage des gaz

Figure 6b Modèle de système de détermination de la pression de vapeur par la méthode de saturation des gaz avec un capillaire placé après la chambre de saturation

1 = Débitmètre 2 = Manomètre 3 = Enceinte thermostatée 4 = Système de contrôle de la température du gaz porteur 5 = Thermomètre (pt 100) 6 = Chambre de saturation des gaz 7 = Tube capillaire 8 = Récipient de barbotage 9 = Débitmètre 10 = Collecteur froid

Figure 7 Exemple de dispositif expérimental pour la méthode du rotor

Appareil de mesure de la pression de vapeur A. Tête de détection à rotor B. Cellule contenant l’échantillon C. Thermostat D. Ligne vers la pompe à vide (pompe turbo) E. Système de thermostatisation de la température de l’air

Figure 8 Modèle de tête de mesure à rotor

1 = Bille 2 = Extension tubulaire de 6 sous vide 3 = Aimants permanents (2) 4 = Bobines (2) de stabilisation verticale 5 = Bobines conductrices (4) 6 = Bride de connexion

ANNEXE

Figure 1 Méthode par élution sur colonne avec pompe de recirculation

Équilibrage atmosphérique Débitmètre Microcolonne Pompe de circulation thermostatée Pompe de recirculation Robinet à deux voies pour échantillonnage

Figure 2 Microcolonne type

(dimensions en millimètres) Raccordement en verre rodé Volume tampon Diamètre intérieur 5 Diamètre extérieur 19 Tampon en laine de verre Robinet à deux voies

Figure 3 Microcolonne type

(dimensions en millimètres) Raccordement en verre rodé Volume tampon Diamètre intérieur 5 Diamètre intérieur 19 Robinet

Figure 4 Colonne d'élution avec réservoir d'eau

1 = Réservoir d’eau (par exemple un ballon d’une contenance de 2,5 litres) 2 = Colonne (voir figure 3) 3 = Collecteur de fractions 4 = Thermostat 5 = Tuyau en téflon 6 = Bouchon rodé en verre 7 = Conduite d’eau (entre le thermostat et la colonne, diamètre intérieur de 8 millimètres approximativement)

Annexe METHODES DE CALCUL/ESTIMATION INTRODUCTION

Une introduction générale aux méthodes de calcul des données et des exemples figurent dans le Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). Les valeurs calculées du Pow peuvent servir:

à choisir la méthode expérimentale appropriée (gamme pour la méthode par agitation du flacon: log Pow: de - 2 à 4 T; gamme pour l'HPLC: log Pow: de 0 à 6),

à déterminer les conditions d'essai appropriées (par exemple, les substances de référence pour l'HPLC, le rapport de volume n-Octanol/eau pour la méthode par agitation du flacon),

de contrôle propre au laboratoire relatif aux erreurs expérimentales éventuelles,

à fournir une estimation de Pow au cas où les méthodes expérimentales ne peuvent être appliquées pour des raisons techniques.

MÉTHODES D'ESTIMATION

Estimation préliminaire du coefficient de partage.

La valeur du coefficient de partage peut être estimée à l'aide de la solubilité de la substance à tester dans les solvants purs: Pestimé = saturation Cn-Octanolsaturation Ceau

MÉTHODES DE CALCUL

Principe des méthodes de calcul

Toutes les méthodes de calcul reposent sur la fragmentation formelle de la molécule en sous-structures appropriées pour lesquelles on dispose de données précises concernant le log Pow. Le log Pow de la molécule entière est alors calculé en ajoutant la somme des valeurs des fragments correspondantes et la somme des termes de correction pour les interactions moléculaires. Il existe des listes de constantes de fragments et de termes de correction (b) (c) (d) (e) dont certaines sont régulièrement mises à jour (b).

Critères de qualité

En général, la fiabilité de la méthode de calcul est inversement proportionnelle à la complexité du composé étudié. Dans le cas de molécules simples, dont le poids moléculaire est faible et qui contiennent un ou deux groupes fonctionnels, on peut prévoir une déviation de 0,1 à 0,3 unité de log P entre les résultats obtenus à l'aide de différentes méthodes de fragmentation et la valeur mesurée. La marge d'erreur peut être plus importante dans le cas de molécules plus complexes. Cette marge d'erreur dépend de l'existence des constantes de fragments et de leur fiabilité ainsi que de la possibilité d'identifier les interactions intramoléculaires (par exemple les liaisons hydrogènes) et de l'utilisation correcte des termes de correction (ce qui ne pose aucune difficulté avec un logiciel informatique CLOGP-3) (b). Dans le cas des composés ionisables, il est important de prendre en considération la charge ou le degré d'ionisation.

Calcul

Méthode π de Hansch

La constante du substituant hydrophobe d'origine, π, établie par Fujita et al. (f) est définie comme suit: πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH) où Pow (PhX) est le coefficient de partage d'un dérivé aromatique et Pow (PhH), celui du composé parent; (par exemple πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71). Conformément à sa définition la méthode π s'applique surtout à la substitution aromatique. Les valeurs de π d'un grand nombre de substituants ont été rassemblées (b) (c) (d). Elles sont utilisées pour calculer le log P de molécules aromatiques ou de sous-structures.

Méthode de Rekker

Selon Rekker (g), la valeur de log Pow est calculée de la manière suivante: log Pow=Σi ai fi+Σj où fi représente les constantes des divers fragments moléculaires et ai leur fréquence dans la molécule à l'étude. Les termes de corrections peuvent être exprimés sous la forme du multiple entier d'une constante unique Cm (appelée constante magique). Les constantes de fragments fi et Cm ont été déterminées à partir d'une liste de 1054 valeurs de Pow obtenues expérimentalement (825 composés) à l'aide d'une analyse de régression multiple (c) (h). La détermination des termes d'interaction est effectuée conformément aux règles établies décrites dans la littérature (e) (h) (i).

Méthode de Hansch-Leo

Selon Hansch et Léo (c), la valeur de log Pow est calculée à l'aide de l'équation suivante: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj où fi représente les constantes des divers fragments moléculaires, Fj les termes de correction et ai et bj les fréquences correspondantes. Une liste de valeurs de fragments (atomes ou groupes) a été déterminée par essai et erreur à partir de valeurs expérimentales de Pow, ainsi qu'une liste de termes de correction Fj (appelés facteurs). Les termes de correction ont été classés en plusieurs classes (a) (c). Il est relativement long et compliqué de tenir compte de toutes les règles et de tous les termes de correction mais des logiciels ont été mis au point (b).

Méthode mixte

Le calcul de log Pow pour des molécules complexes peut être considérablement amélioré si l'on découpe la molécule en infrastructures de plus grande dimension, pour lesquelles on dispose de valeurs de log Pow fiables, provenant soit de tableaux (b) (c) soit de mesures. De tels fragments (par exemple des hétérocycles, anthraquinone, azobenzène) peuvent être associés avec les valeurs de π définies selon Hansch ou avec les constantes de fragments définies par Rekker ou par Leo.

Observations i)

Les méthodes de calcul ne s'appliquent qu'à des composés partiellement ou totalement ionisés lorsqu'il est possible de tenir compte des facteurs de correction nécessaires.

ii)

Si les liaisons hydrogène intramoléculaires peuvent être déterminées, les termes de correction correspondants (de +0,6 à +1,0 unité log P) doivent être ajoutés (a). Les modèles stériques ou les données spectroscopiques relatives à la molécule peuvent indiquer la présence de telles liaisons.

iii)

Si plusieurs formes tautomériques sont possibles, les calculs doivent être basés sur la forme la plus probable.

iv)

Les révisions des listes de constantes de fragments doivent être soigneusement suivies.

Procès-verbal

Lors de l'utilisation de méthodes de calcul/estimation. Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

description de la substance (mélange, impuretés, etc.),

indication concernant toute liaison hydrogène intramoléculaire possible, charge, ou tout effet inhabituel (par exemple tautomérisme),

description de la méthode de calcul,

identification ou base de données,

particularités du choix des fragments,

documentation détaillée du calcul.

RÉFÉRENCES

(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chim Ther., 1979, vol. 14, 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, 5175

(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977.

(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.

(i) R.A. Scherrer, ACS — American Chemical Society, Washington, D.C. 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Annexe II Substances de référence recommandées pour la méthode HPLC

No Substance de référence Log Pow pKa 1 2-butanone 0,3 2 4-acétylpyridine 0,5 3 aniline 0,9 4 acétaniline 1,0 5 alcool benzylique 1,1 6 p-méthoxyphénol 1,3 pKa = 10,26 7 acide phénoxy-acétique 1,4 pKa = 3,12 8 phénol 1,5 pKa = 9,92 9 dinitrophénol 1,5 pKa = 3,96 10 benzonitrile 1,6 11 phénylacétonitrile 1,6 12 alcool 4-méthylbenzylique 1,6 13 acécophénone 1,7 14 2-nitrophénol 1,8 pKa = 7,17 15 acide 3-nitrobenzoïque 1,8 pKa = 3,47 16 4-chloraniline 1,8 pKa = 4,15 17 nitrobenzène 1,9 18 alcool cinnamique 1,9 19 acide benzoïque 1,9 pKa = 4,19 20 p-crésol 1,9 pKa = 10,17 21 acide cinnamique 2,1 pKa = 3,89 cis pKa = 4,44 trans 22 anisole 2,1 23 méthylbenzoate 2,1 24 benzène 2,1 25 acide méthylbenzoïque 2,4 pKa = 4,27 26 chlorophénol 2,4 pKa = 9,1 27 trichloréthylène 2,4 28 atrazine 2,6 29 éthylbenzoate 2,6 30 2,6-dichlorobenzonitrile 2,6 31 acide chlorobenzoïque 2,7 pKa = 3,82 32 toluène 2,7 33 naphtol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3 dichloroaniiine 2,8 35 chlorobenzène 2,8 36 allyl-phényléther 2,9 37 bromobenzène 3,0 38 éthylbenzène 3,2 39 benzophénone 3,2 40 4-phénylphénone 3,2 pKa = 9,54 41 thymol 3,3 42 1,4-dichlorobenzène 3,4 43 diphénylamine 3,4 pKa = 0,79 44 naphtalène 3,6 45 phénylbenzoate 3,6 46 isopropylbenzène 3,7 47 2,4,6-trichlorophénol 3,7 pKa = 6 48 biphényl 4,0 49 benzylbenzoate 4,0 50 2,4-dinitro-6sec.butylphénol 4,1 51 1,2,4-trichlorobenzène 4,2 52 acide dodécanoïque 4,2 53 diphényléther 4,2 54 n-butylbenzène 4,5 55 phénanthrène 4,5 56 fluoranthène 4,7 57 dibenzyl 4,8 58 2,6-diphénylpyridine 4,9 59 triphénylamine 5,7 60 DDT 6,2 Autre substance de référence dont le log Pow est faible 1 acide nicotinique -0,07

Annexe Figure Moule et accessoires nécessaires à la confection des tas

(toutes les dimensions sont exprimées en millimètres) Longueur du moule: 250 mm Matière: aluminium

Annexe Figure Appareillage

Annexe Exemple de spécification de matériel pour les essais de sensibilité thermique (voir norme DIN 1623) (1)(2)(3)

Tube: Spécification de matériel No 1.0336.505 g Plaque à orifice: Spécification de matériel No 1.4873 Écrou et écrou borgne: Spécification de matériel No 1.3817

Figure 1 Appareil d'essai de sensibilité thermique

(dimensions en mm) Fig. 1a Tube d’acier et accessoires (1) tube (1a) bride extérieure (2) collier fileté; filetage à faible friction (3) plaque à orifice a = 2,0 ou 6,0 mm de diamètre (4) écrou b = 10 mm de diamètre (5) chanfrein (6) 2 pans pour clé de 41 Fig. 1b Dispositifs de chauffage et de protection (7) 2 pans pour clé de 36 (8) enceinte résistante aux éclats (9) 2 barres de support pour le tube (10) tube assemblé (11) position du brûleur arrière ; les autres brûleurs sont visibles (12) veilleuse

Figure 2 Essai de sensibilité thermique

Exemples de fragmentation Pas d’explosion Pas d’explosion Explosion Explosion Explosion Explosion

Figure 3 Étalonnage de la vitesse d'échauffement pour essai de sensibilité thermique TEMPS (s)

Température (°C) Temps (s) Courbe de température en fonction du temps obtenue en chauffant du phtalate de dibutyle (27 cm3) dans un tube fermé (plaque à orifice de 1,5 mm) au moyen d'un débit de propane de 3,2 litres/minute. La température est mesurée à l'aide d'un thermocouple chromel/alumel gainé d'acier inoxydable de 1 mm de diamètre, placé en position centrale, 43 mm sous le bord du tube. Entre 135 oC et 285 oC, la vitesse d'échauffement doit se situer entre 185 et 215 K/minute.

Figure 4 Appareil d'essai de sensibilité au choc

(dimensions en mm) Fig. 4a Appareil à mouton, vue générale de face et latérale Fig. 4b Appareil à mouton partie inférieure (1) embase 450 x 450 x 60 (2) bloc d’acier 230 x 250 x 200 (3) enclume 100 (diamètre) x 70 (4) colonne (5) partie médiane transversale (6) 2 rails (7) crémaillère (8) échelle graduée (9) mouton (masse qui tombe) (10) dispositif de support et de libération (11) plaque de positionnement (12) enclume intermédiaire 26 (diamètre) x 26 (13) bague de positionnement munie d’orifices (14) dispositif d’impact

suite

Fig. 4c Dispositif de choc pour les substances sous forme de poudres ou de pâtes Fig. 4d Dispositif de choc pour les substances liquides (1) cylindres d’acier (2) anneau de guidage pour les cylindres d’acier (3) bague de positionnement munie d’orifices (a) section verticale (b) plan (4) anneau de caoutchouc (5) substance liquide (40 mm3) (6) espace sans liquide Fig. 4e Mouton (masse de 5 kg) (1) ergot de suspension (2) marqueur de hauteur (3) sillon de positionnement (4) tête d’impact cylindrique (5) arrêt de rebond

Figure 5 Appareil d'essai de sensibilité à la friction

Fig. 5a Appareil de friction : vue de dessus et plane (1) Embase d’acier (2) Coulisseau mobile (3) Plaquette de porcelaine 25 × 25 × 5 mm maintenue sur le coulisseau (4) Crayon de porcelaine fixe 10 mm (diamètre) × 15 mm (5) échantillon à essayer (10 mm3 environ) Fig. 5b Position de départ du crayon sur l’échantillon (6) Support de crayon (7) Bras de charge (8) Contrepoids (9) Interrupteur (10) Roue permettant d’amener le coulisseau en position de départ (11) Vers un moteur électrique

Annexe Figure Moule et accessoires nécessaires à la confection de tas

(toutes les dimensions sont en millimètres)

Annexe Exemples d'autres méthodes de détermination de la masse moléculaire moyenne en nombre (Mn) des polymères

La chromatographie sur gel perméable constitue la méthode de choix pour la détermination de Mn, en particulier lorsqu'on dispose d'un ensemble de substances étalons de structure comparable à la structure du polymère. Toutefois, lorsque le recours à la chromatographie sur gel perméable présente des difficultés pratiques ou que l'on peut s'attendre à ce que la substance ne satisfasse pas à un critère réglementaire pour la Mn (ce qui demande confirmation), il existe des méthodes de remplacement, par exemple:

1.1.1.1.2.1.3.1.4.

Utilisation des propriétés colligatives Ébullioscopie et cryoscopie: consistent à mesurer l'élévation du point d'ébullition (ébullioscopie) ou l'abaissement du point de congélation (cryoscopie) d'un solvant lorsque le polymère est ajouté. La méthode est basée sur le fait que la dissolution d'un polymère dans un liquide exerce sur les points d'ébullition et de congélation de celui-ci un effet qui dépend de la masse moléculaire du polymère (1) (2). Le domaine d'application correspond à Mn < 20000. Abaissement de la pression de vapeur: consiste à mesurer la pression de vapeur d'un liquide de référence avant et après addition de quantités connues de polymères (1) (2). Le domaine d'application correspond à Mn < 20000 (théoriquement; en pratique, ne présente toutefois qu'une valeur limitée). Osmométrie à membrane: repose sur le principe de l'osmose, à savoir la tendance naturelle des molécules de solvant à traverser une membrane semi-perméable à partir d'une solution diluée vers une solution concentrée de manière à réaliser l'équilibre. Dans l'essai, la concentration de la solution diluée est nulle tandis que la solution concentrée contient le polymère. Le passage de solvant à travers la membrane induit une différence de pression qui dépend de la concentration et de la masse moléculaire du polymère (1) (3) (4). Le domaine d'application correspond à des valeurs de Mn comprises entre 20000 et 200000. Osmométrie en phase vapeur: consiste à comparer la vitesse d'évaporation d'un aérosol de solvant pur à celle de trois aérosols au moins contenant le polymère à différentes concentrations (1) (5) (6). Le domaine d'application correspond à Mn < 20000.

2. Analyse des groupes terminaux Pour utiliser cette méthode, il est nécessaire de connaître à la fois la structure globale du polymère et la nature des groupes terminaux situés en bout de chaîne (ceux-ci doivent pouvoir être distingués de ta chaîne principale par exemple, par leur spectre RMN ou par titrage et formation de dérivés). La détermination de la concentration moléculaire des groupes terminaux présents sur le polymère peut, ensuite, fournir une valeur de la masse moléculaire (7) (8) (9). Le domaine d'application correspond a des valeurs de Mn pouvant atteindre 50000 (avec une fiabilité décroissante).

3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)

Références de l'annexe Billmeyer, F.W. Jr. (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York. Glover, C.A. (1975). Absolute Colligative Property Methods, Chapter 4, in Polymer Molecular Weights, Part I (ed. P.E. Slade, Jr.), Marcel Dekker, New York. ASTM D 375-79 (1979). Standard Practice for Détermination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane osmometry, American Society for Testing and Materials, Philadelphie, Pennsylvanie. Coll, H. (1989). Membrane osmometry, in: Détermination of Molecular Weight (ed. A.R. Cooper), J. Wiley and Sons, pp. 25-52. ASTM D 3592-77 (1977). Standard recommended practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphie, Pennsylvanie. Morris, C.E.M. (1989). Vapour Pressure Osmometry in Determination of Molecular Weight (ed. A.R. Cooper), J. Wiley and Sons. Schröder, E. Müller, G. & Arndt, K.-F. (1989). Polymer Characterisadon, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G. (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 in Polymer Molecular Weights, Part I, (ed. P.E. Slade, Jr.) Marcel Dekker, New York. Amiya, S. et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

Annexe Indications permettant de corriger la teneur en polymères de faible masse moléculaire pour tenir compte des polymères insolubles

La présence d'un polymère insoluble dans un échantillon entraîne une perte de masse au cours de l'analyse par chromatographie sur gel perméable. Le polymère insoluble est irréversiblement retenu sur la colonne ou sur le filtre à échantillon lorsque la partie soluble de l'échantillon traverse la colonne. Si l'indice de réfraction différentiel (dn/dc) du polymère peut être estimé ou mesuré, il est possible d'estimer la masse que l'échantillon a perdue sur la colonne. Dans ce cas, on effectue une correction à l'aide d'un étalonnage externe du réfractomètre, avec des étalons dont on connaît la concentration et le dn/dc. Dans l'exemple qui suit, on utilise un étalon de poly(méthacrylate de méthyle). L'étalonnage externe pratiqué lors de l'analyse des polymères acryliques consiste à analyser par chromatographie sur gel perméable une solution étalon de concentration connue de poly(méthacrylate de méthyle) dans du tétrahydrofuranne; les résultats servent à calculer la constante du réfractomètre selon l'équation suivante: K = R/(C × V × dn/dc) où K est la constante du réfractomètre (microvolts secondes/ml) R est la réponse de l'étalon de poly(méthacrylate de méthyle) (microvolts secondes) C est la concentration de l'étalon de poly(méthacrylate de méthyle) (mg/ml) V est le volume d'injection (ml) et dn/dc est l'indice de réfraction différentiel d'une solution de poly(méthacrylate de méthyle) dans du tétrahydrofuranne (ml/mg). Les données suivantes caractérisent généralement un étalon de poly(méthacrylate de méthyle): R 2937891; C 1,07 mg/ml; V 0,1 ml; dn/dc 9 x 10 – 5 ml/mg. La valeur de K résultante, 3,05 x 1011, est ensuite utilisée pour calculer la réponse théorique du détecteur, c'est-à-dire celle qu'on obtiendrait si 100 pour cent du polymère injecté était élué à travers le détecteur.

PARTIE B MÉTHODES DE DÉTERMINATION DE LA TOXICITÉ ET DES AUTRES EFFETS SUR LA SANTÉ

INTRODUCTION GÉNÉRALE A.

CARACTÉRISATION DE LA SUBSTANCE À TESTER Avant d'entreprendre toute étude de toxicité, il faut connaître la composition de la substance à tester, y compris les principales impuretés, ainsi que ses propriétés physico-chimiques dont sa stabilité. Les propriétés physico-chimiques de la substance fournissent des informations importantes pour le choix de la voie d'administration, pour la conception des différentes études, ainsi que pour la manipulation et le stockage de la substance. La mise au point d'une méthode d'analyse permettant une évaluation qualitative et quantitative de la substance à tester (y compris, si possible, de ses principales impuretés) dans le véhicule d'administration et dans le matériel biologique doit précéder la mise en œuvre de l'étude. Toutes les informations concernant l'identification, les propriétés physico-chimiques, la pureté et le comportement de la substance à tester doivent être consignées dans le procès-verbal d'essai.

SOIN DES ANIMAUX Lors des essais de toxicité, il est essentiel de procéder à des contrôles stricts des conditions ambiantes et d'utiliser des techniques appropriées de soin des animaux.

i)

Conditions d'hébergement Les conditions ambiantes dans les locaux ou enceintes réservés aux animaux d'expérience doivent être adaptées à l'espèce utilisée pour l'essai. Pour les rats, les souris et les cobayes, la température ambiante doit être de 22 oC ± 3 oC et l'humidité relative de 30 à 70 %; pour les lapins, la température doit être de 20 oC ± 3 oC et l'humidité relative de 30 à 70 %. Certaines techniques expérimentales sont particulièrement sensibles aux effets thermiques et, dans de tels cas, des indications précises concernant les conditions adéquates figurent dans la description de la méthode d'essai. Dans tous les essais de toxicité, la température et l'humidité doivent être contrôlées et consignées, et doivent figurer dans le rapport final d'étude. Un éclairage artificiel doit garantir l'alternance de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Les détails concernant les conditions d'éclairage doivent être consignés dans le rapport final d'étude. Sauf si la méthode prévoit d'autres conditions, les animaux doivent être hébergés individuellement ou mis en cage par petits groupes de même sexe. Les cages collectives ne doivent pas contenir plus de cinq animaux. Il est important que les comptes rendus d'expérimentation animale précisent le type de cage utilisé et le nombre d'animaux par cage lors de l'exposition à la substance chimique et pendant toute période d'observation qui suit.

ii)

Conditions d'alimentation Le régime alimentaire doit répondre à tous les besoins nutritionnels de l'espèce soumise à l'expérience. Lorsque les substances à tester sont administrées dans la nourriture, il se peut que la valeur nutritionnelle de cette dernière soit amoindrie par une interaction entre la substance et un ingrédient de l'alimentation. Cette éventualité doit être prise en compte lors de l'interprétation des résultats de l'essai. Les régimes alimentaires classiquement utilisés en laboratoire sont acceptables, l'eau de boisson étant fournie à satiété. Le choix du régime alimentaire peut être guidé par la nécessité de garantir une proportion appropriée de substance en cas d'administration par cette méthode. Les contaminants alimentaires qui agissent sur la toxicité ne doivent pas être présents à des concentrations susceptibles d'influencer les résultats.

MÉTHODES ALTERNATIVES L'UE attache une grande importance à la mise au point et à la validation de méthodes alternatives qui fournissent autant d'informations que les expérimentations animales actuelles, mais qui nécessitent moins d'animaux, minimisent leurs souffrances et permettent d'éviter leur sacrifice. Dès que de telles méthodes sont disponibles, elles doivent être envisagées, chaque fois que cela est possible, pour la caractérisation des dangers et pour la classification et l'étiquetage des substances en fonction des dangers intrinsèques.

ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION L'extrapolation directe à l'homme des résultats des expériences sur les animaux et des essais in vitro n'est possible que dans certaines limites; il faut en tenir compte lors de l'évaluation et de l'interprétation des essais; aussi, lorsque des effets indésirables ont été mis en évidence chez l'homme, ces données peuvent être utilisées pour confirmer les résultats expérimentaux.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES La plupart des méthodes présentées ici sont élaborées dans le cadre du programme de lignes directrices de l'OCDE en matière d'essais. Ces méthodes doivent être mises en œuvre conformément aux bonnes pratiques de laboratoire, afin de garantir l'acceptation mutuelle des données. De plus amples informations peuvent être obtenues dans les références citées dans les lignes directrices de l'OCDE et dans d'autres publications pertinentes.

B.1 bis. TOXICITÉ ORALE AIGUË — MÉTHODE DE LA DOSE PRÉDÉTERMINÉE

B.1 bis.

1. MÉTHODE Cette méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 420 (2001) de l'OCDE.

1.

1.1. INTRODUCTION Les méthodes traditionnelles pour évaluer la toxicité aiguë utilisent comme effet observé la mort des animaux. En 1984, la British Toxicology Society (BTS) a proposé une nouvelle approche pour les essais de toxicité aiguë, utilisant des doses prédéterminées (1). Cette méthode évitait d'utiliser la mort des animaux comme effet observé et s'appuyait plutôt sur l'observation de signes manifestes de toxicité apparaissant après traitement à une dose prédéterminée. À la suite des études de validation in vivo au Royaume-Uni (2) et au niveau international (3), cette procédure a été adoptée comme ligne directrice en 1992. Après cela, les propriétés statistiques de la méthode de la dose prédéterminée ont été évaluées dans une série d'études utilisant des modèles mathématiques (4) (5) (6). Ensemble, les études in vivo et celles fondées sur des modèles mathématiques ont démontré que la procédure était reproductible et utilisait moins d'animaux auxquels elle occasionnait moins de souffrance que les méthodes traditionnelles. Elle permet de classer les substances par ordre de toxicité, de la même manière que les autres méthodes d'essai de toxicité aiguë. Des indications permettant de choisir la méthode d'essai la plus appropriée pour un but donné sont présentées dans le document d'orientation sur les essais de toxicité orale aiguë (7). Ce document contient également de plus amples informations sur la conduite et l'interprétation de la méthode d'essai B.1 bis. La méthode de la dose prédéterminée a comme principe de n'utiliser, pour l'étude principale, que des doses modérément toxiques et d'éviter d'administrer des doses qui peuvent s'avérer létales. De même, il n'est pas nécessaire d'administrer des doses dont on sait qu'elles provoquent des douleurs et une détresse importante du fait de propriétés corrosives ou sévèrement irritantes. Au cours de l'essai, les animaux moribonds et les animaux souffrant de façon manifeste ou montrant des signes de détresse grave devront être euthanasiés. Ces animaux devront être pris en compte dans l'interprétation des résultats au même titre que les animaux morts au cours de l'essai. Les critères pour décider d'euthanasier les animaux moribonds et ceux qui souffrent de façon manifeste, ainsi que les orientations pour reconnaître une mort prévisible ou imminente, font l'objet d'un autre document d'orientation (8). La méthode fournit des informations qui permettent à la fois l'évaluation des dangers et le classement des substances selon le système général harmonisé de classification (SGH) des substances ayant une toxicité aiguë (9). Le laboratoire doit rassembler toutes les informations disponibles sur la substance d'essai avant de procéder à l'essai. Ces informations comprennent l'identité et la structure chimique de la substance, ses propriétés physico-chimiques, les résultats obtenus dans tous les autres essais de toxicité in vitro et in vivo, les données toxicologiques concernant des substances structurellement apparentées, ainsi que le ou les usages escomptés de la substance. Ces informations sont nécessaires pour rassurer les personnes concernées quant à la pertinence de l'essai pour la protection de la santé humaine et elles seront utiles dans le choix de la dose initiale appropriée.

1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Toxicité orale aiguë: effets défavorables apparaissant après l'administration par voie orale d'une dose unique de substance ou de plusieurs doses données sur une période de 24 heures. Mort différée: l'animal ne meurt ni n'apparaît moribond en l'espace de 48 heures, mais meurt ultérieurement au cours de la période d'observation de 14 jours. Dose: la quantité de substance d'essai administrée. La dose s'exprime en poids de substance d'essai par unité de poids de l'animal d'expérience (par exemple mg/kg). Toxicité manifeste: terme général désignant des signes évidents de toxicité qui surviennent à la suite de l'administration d'une substance d'essai [voir (3)]. Ces signes doivent être tels que l'on puisse s'attendre à ce qu'une augmentation de la dose administrée entraîne l'apparition de douleurs importantes et des signes persistants de détresse profonde, un état moribond [pour les critères, voir (8)] et probablement de la mortalité pour la plupart des animaux. SGH: système général harmonisé de classification et d'étiquetage. Une activité conjointe de l'OCDE (santé humaine et environnement), du comité d'experts sur le transport des matières dangereuses (propriétés physico-chimiques) et du BIT (communication des dangers) et coordonnée par l'IOMC (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals). Mort imminente: il y a mort imminente lorsqu'on s'attend à ce qu'un état moribond ou la mort interviennent avant le prochain moment d'observation prévu. Les signes indicatifs de cet état chez les rongeurs comprennent les convulsions, la position latérale, la position couchée et les tremblements [voir (8) pour plus de détails]. DL50(dose létale 50 %): dose unique d'une substance d'essai, obtenue par calcul statistique, susceptible d'entraîner la mort de 50 % des animaux lorsqu'elle est administrée par voie orale. La valeur de la DL50 est exprimée en poids de la substance par unité de poids corporel de l'animal d'expérience (mg/kg). Dose limite: désigne une dose qui est la limite supérieure pour l'essai (2000 ou 5000 mg/kg). État moribond: désigne l'état précédant la mort ou l'incapacité à survivre, même si un traitement est donné [pour de plus amples détails, voir (8)]. Mort prévisible: présence de signes cliniques indiquant que la mort va intervenir à un moment déterminé dans le futur, avant la fin projetée de l'expérience, par exemple incapacité à atteindre l'eau ou la nourriture [pour plus de détails, voir (8)].

1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Des groupes d'animaux du même sexe reçoivent des doses prédéterminées de 5, 50, 300 et 2000 mg/kg selon une procédure séquentielle. Exceptionnellement, une dose additionnelle de 5000 mg/kg peut être envisagée (voir section 1.6.2). La dose initiale, choisie sur la base d'une étude d'orientation, est celle qui est susceptible de faire apparaître certains signes de toxicité, sans toutefois provoquer des effets toxiques graves ou la mort. Les manifestations cliniques et les effets associés à la douleur, à la souffrance et à une mort imminente sont décrits dans un document d'orientation de l'OCDE (8). D'autres groupes d'animaux reçoivent des doses plus fortes ou moins fortes en fonction de l'absence ou de la présence d'effets toxiques ou de mortalité. On continue la procédure jusqu'à ce que l'on identifie la dose qui occasionne un effet toxique évident ou la mort d'un seul animal. La procédure est également interrompue lorsque la dose la plus forte ne donne lieu à aucun effet observé ou lorsque la mort survient à la dose la plus faible.

1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.4.

1.4.1. Choix de l'espèce animale Le rat est l'espèce préférée, mais d'autres espèces peuvent être utilisées. Normalement, on utilise des femelles (7). L'étude de la littérature sur les essais traditionnels de DL50 permet de conclure qu'il y a peu de différences de sensibilité entre sexes et que, lorsqu'il y a une différence, les femelles sont en général légèrement plus sensibles (10). Si, toutefois, compte tenu des propriétés toxicologiques et toxicocinétiques de composés structurellement voisins, il apparaît que les mâles sont probablement plus sensibles, il convient d'employer des mâles. Dans ce cas, il faut fournir une justification adéquate. On utilise de jeunes animaux adultes sains issus de souches couramment utilisées en laboratoire. Les femelles doivent être nullipares et non gravides. Au début de l'essai, chaque animal doit être âgé de 8 à 12 semaines et son poids doit se situer dans un intervalle de ± 20 % du poids moyen des animaux précédemment exposés.

1.4.2. Conditions d'hébergement et d'alimentation La température du local des animaux d'expérience doit être maintenue à 22 oC (± 3 oC). L'humidité relative doit atteindre au moins 30 % et rester de préférence inférieure à 70 %, mais en dehors des heures de nettoyage du local, on s'efforcera de maintenir le taux d'humidité autour de 50 à 60 %. On appliquera un éclairage artificiel alternant 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Pour l'alimentation des animaux, on peut utiliser la nourriture classique de laboratoire avec de l'eau potable à satiété. Les animaux peuvent être groupés par dose. Toutefois, le nombre d'animaux par cage ne doit pas faire obstacle à une observation précise de chaque animal.

1.4.3. Préparation des animaux Les animaux sont choisis au hasard, marqués pour permettre une identification individuelle et gardés dans leurs cages pour les acclimater aux conditions de laboratoire pendant au moins cinq jours avant l'expérience.

1.4.4. Préparation des doses En général, il convient d'administrer la substance d'essai à volume constant quelle que soit la dose testée, en faisant varier la concentration de la préparation. Lorsqu'un produit liquide ou un mélange font l'objet de l'essai, l'utilisation du produit non dilué, donc à concentration constante, peut être plus appropriée pour l'évaluation du risque de cette substance. Certaines autorités réglementaires l'exigent. Dans tous les cas, il ne faut pas dépasser le volume de dose maximal. Le volume maximal de liquide qui peut être administré en une seule fois dépend de la taille de l'animal d'essai. Chez les rongeurs, ce volume ne doit pas dépasser 1 ml/100 g de poids corporel, sauf dans le cas de solutions aqueuses pour lesquelles on peut utiliser 2 ml/100 g de poids corporel. Il est recommandé d'utiliser une solution aqueuse chaque fois que cela est possible, sinon on peut utiliser une solution dans de l'huile (par exemple de l'huile de maïs) et éventuellement une solution dans d'autres véhicules. En ce qui concerne les véhicules non aqueux, leur toxicité doit être connue. Les doses doivent être préparées juste avant l'administration, sauf si la stabilité de la préparation pendant la durée de la période d'utilisation est connue et jugée acceptable.

1.5. MODE OPÉRATOIRE

1.5.

1.5.1. Administration des doses La substance d'essai est administrée en une seule dose par gavage à l'aide d'une sonde gastrique ou de toute autre canule pour intubation appropriée. Lorsqu'il n'est pas possible d'administrer la dose en une seule fois, celle-ci peut être fractionnée sur une période n'excédant pas 24 heures. Les animaux doivent être à jeun avant l'administration de la substance (on supprimera la nourriture, mais pas l'eau, pendant toute une nuit pour les rats et pendant 3 à 4 heures pour les souris). Après la période de jeûne, les animaux doivent être pesés; la substance d'essai leur est ensuite administrée. Après l'administration de la substance, les animaux peuvent être à nouveau privés de nourriture, pendant 3 à 4 heures pour les rats et pendant 1 à 2 heures pour les souris. Si la dose est administrée par fractions sur un certain laps de temps, il peut s'avérer nécessaire, en fonction de la durée du traitement, d'alimenter et de faire boire les animaux.

1.5.2. Étude d'orientation Le but de l'étude d'orientation est de permettre la sélection d'une dose initiale appropriée pour l'étude principale. L'administration des doses se fait de façon séquentielle aux animaux individuellement selon les schémas de l'annexe 1. L'étude d'orientation prend fin lorsqu'une décision au sujet de la dose initiale de l'étude principale peut être prise (ou lorsqu'une mortalité est observée à la dose prédéterminée la plus faible). Pour la dose initiale de l'étude d'orientation, on choisit un niveau parmi les suivants: 5, 50, 300 et 2000 mg/kg. Le niveau choisi est celui pour lequel on peut s'attendre à observer des signes de toxicité évidente, si possible sur la base d'indications obtenues à partir de données in vivo et in vitro sur la même substance et sur des substances structurellement voisines. En l'absence de telles informations, la dose initiale sera de 300 mg/kg. Les animaux sont traités à 24 heures d'intervalle au moins. Tous les animaux sont observés pendant au moins quatorze jours. Exceptionnellement, et uniquement lorsque cela est nécessaire pour satisfaire à une exigence réglementaire particulière, l'utilisation d'une dose maximale prédéterminée supplémentaire de 5000 mg/kg peut être envisagée (voir annexe 3). Par souci de protection des animaux, l'essai de substances en catégorie 5 du SGH (2000 - 5000 mg/kg) est déconseillé et ne doit être envisagé que lorsqu'il est très probable qu'il donnera des résultats qui présenteront un intérêt direct pour la protection de la santé des hommes et des animaux ou de l'environnement. Dans le cas où un animal ayant reçu la dose prédéterminée la plus faible (5 mg/kg) mourrait au cours de l'étude d'orientation, la procédure normale est de terminer l'étude et de classer la substance en catégorie 1 du SGH (voir l'annexe 1). Cependant, il peut s'avérer nécessaire de confirmer la classification, et la procédure facultative supplémentaire ci-après est alors proposée. Un deuxième animal reçoit une dose de 5 mg/kg. Si ce deuxième animal meurt, la classification en catégorie 1 du SGH est confirmée et l'étude prend fin immédiatement. Si le deuxième animal survit, un maximum de trois animaux supplémentaires reçoivent chacun 5 mg/kg. Étant donné le risque de mortalité élevé, il convient de procéder de manière séquentielle par souci de protection des animaux. L'intervalle de temps entre chaque administration doit être suffisant afin de pouvoir démontrer que l'animal précédent a des chances de survivre. Si un deuxième animal meurt, l'administration séquentielle sera immédiatement arrêtée et aucun autre animal ne recevra de dose. Avec la mort d'un deuxième animal (indépendamment du nombre d'animaux soumis à l'essai au moment où celui-ci est arrêté), le résultat est A (2 morts ou plus), et la règle de classification présentée à l'annexe 2 pour la dose prédéterminée de 5 rng/kg s'applique: catégorie 1 s'il y a 2 morts ou plus, et catégorie 2 s'il y a seulement 1 mort. En outre, l'annexe 4 propose une méthode de classification selon le système communautaire en attendant la mise en place du nouveau SGH.

1.5.3. Étude principale

1.5.3.

1.5.3.1. Nombre d'animaux et niveaux des doses Les schémas de l'annexe 2 indiquent la marche à suivre après administration de la dose initiale. Il y a trois possibilités: arrêter l'essai et attribuer la classification appropriée, administrer la dose prédéterminée supérieure ou administrer la dose inférieure. Cependant, par souci de protection des animaux, les doses ayant entraîné la mort au cours de l'étude d'orientation ne sont pas réappliquées lors de l'étude principale (voir annexe 2). L'expérience démontre que le résultat le plus probable à la dose initiale est que la substance pourra être classée et qu'il sera inutile de prolonger l'essai. En général, on utilise au total cinq animaux du même sexe à chaque niveau de dose étudié. Ce groupe de cinq animaux est constitué de l'animal utilisé dans l'étude d'orientation, auquel est administrée la dose sélectionnée, et de quatre animaux supplémentaires (sauf dans les rares cas où une dose utilisée dans l'étude principale n'a pas été utilisée dans l'étude d'orientation). L'intervalle de temps à respecter entre l'administration de chaque niveau de dose dépend du moment où se manifestent les effets toxiques, de leur durée et de leur gravité. L'administration de la dose suivante doit être retardée jusqu'à ce que l'on ait obtenu la certitude que les animaux précédemment soumis au traitement vont survivre. Un laps de temps de 3 ou 4 jours entre les administrations à chaque niveau de dose est recommandé, si nécessaire, pour permettre l'observation de signes de toxicité différée. Cet intervalle peut être ajusté selon qu'il convient, par exemple, en cas de réponse peu concluante. Lorsque l'on envisage d'utiliser une dose prédéterminée maximale de 5000 mg/kg, il y a lieu de suivre la procédure présentée à l'annexe 3 (voir également section 1.6.2).

1.5.3.2. Essai limite L'essai limite est utilisé principalement lorsque l'expérimentateur dispose d'informations indiquant que la substance d'essai n'est probablement pas toxique, c'est-à-dire que sa toxicité ne se manifeste qu'au-delà des doses limites réglementaires. Des informations concernant la toxicité de la substance d'essai peuvent être déduites des connaissances acquises sur des substances, produits ou mélanges similaires déjà testés, compte tenu de l'identité et du pourcentage des composants importants sur le plan toxicologique. Quand on ne dispose pas d'informations concernant la toxicité de la substance, ou lorsqu'on s'attend à une substance toxique, il faut effectuer l'essai principal. Selon la procédure normale, une étude d'orientation à la dose initiale de 2000 mg/kg (exceptionnellement 5000 mg/kg), suivie du traitement de quatre animaux supplémentaires à cette même dose, sert d'essai limite dans cette ligne directrice.

1.6. OBSERVATIONS Les animaux doivent être observés individuellement au moins une fois pendant les 30 premières minutes suivant l'administration de la substance et régulièrement pendant les premières 24 heures, avec une attention particulière au cours des 4 premières heures; l'observation doit ensuite être quotidienne, pendant 14 jours en tout, sauf dans le cas des animaux qui meurent en cours d'étude ou qui doivent être retirés de l'étude et euthanasiés pour leur épargner des souffrances excessives. Toutefois, la durée d'observation ne doit pas être fixée de manière rigide. Elle doit être fonction des réactions de toxicité, du moment où elles apparaissent et de la durée de la période de récupération. Elle peut donc être prolongée si nécessaire. Les moments où les signes de toxicité apparaissent et disparaissent sont importants, surtout si les effets toxiques ont tendance à être différés (11). Toutes les observations sont enregistrées de façon systématique, une fiche individuelle étant établie pour chaque animal. D'autres observations peuvent s'avérer nécessaires lorsque les animaux continuent à manifester des signes de toxicité. Les observations doivent porter sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, ainsi que de l'appareil respiratoire, du système circulatoire, du système nerveux central et autonome, de l'activité somatomotrice et du comportement. L'attention portera en particulier sur l'observation des diverses manifestations de tremblement, convulsions, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. Les principes et critères résumés dans le document d'orientation sur les effets sur l'homme doivent être pris en considération (8). Les animaux moribonds et les animaux souffrant manifestement ou présentant des signes graves de détresse doivent être euthanasiés. Qu'il s'agisse d'animaux euthanasiés pour raisons éthiques ou d'animaux retrouvés morts, le moment de la mort doit être enregistré de façon aussi précise que possible.

1.6.

1.6.1. Poids corporel Le poids de chaque animal doit être déterminé peu de temps avant l'administration de la substance d'essai et au moins une fois par semaine ensuite. Les variations de poids doivent être calculées et enregistrées. À la fin de l'essai, les animaux survivants sont pesés puis euthanasiés.

1.6.2. Pathologie Tous les animaux d'essai (y compris ceux qui sont morts au cours de l'essai ou ceux qui ont été retirés de l'étude pour des raisons éthiques) doivent être soumis à une autopsie à l'échelle macroscopique. Pour chaque animal, toutes les altérations pathologiques macroscopiques doivent être enregistrées. Chez les animaux qui survivent 24 heures ou plus après administration de la dose initiale, l'examen microscopique des organes présentant des signes évidents de pathologie doit également être envisagé, car il peut fournir des renseignements utiles.

2. RÉSULTATS Les résultats obtenus pour chaque animal doivent être présentés. Toutes les données doivent être résumées dans un tableau indiquant, pour chaque groupe d'essai, le nombre d'animaux utilisés, le nombre d'animaux présentant des signes de toxicité, le nombre d'animaux retrouvés morts pendant l'essai ou sacrifiés pour des raisons éthiques, et pour chaque animal, le moment de la mort, la description des effets toxiques et leur évolution dans le temps ainsi que leur réversibilité éventuelle et les résultats de l'autopsie.

3. RAPPORT

3.

3.1. RAPPORT D'ESSAI Le rapport d'essai doit contenir, s'il y a lieu, les renseignements suivants:

Substance d'essai:

état physique, pureté et, s'il y a lieu, propriétés physico-chimiques (compris isomérisation),

données relatives à l'identification, y compris numéro CAS.

Véhicule (le cas échéant):

justification du choix du véhicule, s'il ne s'agit pas d'eau.

Animaux d'essai:

espèce/souche utilisée,

état microbiologique des animaux, s'il est connu,

nombre, âge et sexe des animaux (le cas échéant, justification du choix de mâles à la place de femelles),

origine, conditions d'hébergement, régime alimentaire, etc.

Conditions de l'essai:

détails sur la formulation de la substance d'essai, notamment état physique du produit administré,

détails sur le mode d'administration, notamment volume des doses et moment de l'administration,

détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau (y compris le type de régime et sa provenance ainsi que celle de l'eau),

justification du choix de la dose initiale.

Résultats:

tableau des réactions aux différentes doses pour chaque animal (c'est-à-dire nombre d'animaux montrant des signes de toxicité, y compris mortalité, nature, gravité et durée des effets),

tableau des poids corporels et des variations du poids,

poids individuel des animaux le jour du traitement, et ensuite à intervalles d'une semaine, et au moment de la mort ou du sacrifice,

date et heure de la mort si celle-ci intervient avant le moment prévu du sacrifice,

pour chaque animal, moment d'apparition et évolution des signes de toxicité et réversibilité éventuelle,

pour chaque animal, résultats de l'autopsie et observations histopathologiques.

Discussion et interprétation des résultats.

Conclusions.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)

BIBLIOGRAPHIE British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, p. 85-92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279-291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469-482. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313-324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183-196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L, Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223-231. Chan, P.K and A.W. Hayes (1994). Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation in: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

B.1 ter. TOXICITÉ ORALE AIGUË — MÉTHODE DE LA CLASSE DE TOXICITÉ AIGUË

B.1 ter.

1. MÉTHODE Cette méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 423 (2001) de l'OCDE.

1.

1.1. INTRODUCTION La méthode de la classe de toxicité aiguë (1) décrite dans cet essai est une procédure séquentielle qui utilise trois animaux de même sexe à chaque étape. Suivant la mortalité et/ou l'état moribond des animaux, deux à quatre étapes sont en moyenne nécessaires pour évaluer la toxicité aiguë de la substance d'essai. Cette procédure est reproductible, utilise très peu d'animaux et permet de classer des substances par ordre de toxicité de la même manière que les autres méthodes de toxicité aiguë. La méthode par classe de toxicité aiguë est fondée sur des évaluations biométriques (2) (3) (4) (5) avec des doses prédéterminées, convenablement espacées de manière à permettre le classement des substances les unes par rapport aux autres aux fins de l'évaluation des dangers. La méthode, telle qu'elle a été adoptée en 1996, a été largement validée in vivo par rapport aux données de DL50 issues de la littérature, tant sur le plan national (6) que sur le plan international (7). Des indications permettant de choisir la méthode d'essai la plus appropriée pour un but donné sont présentées dans le document d'orientation sur les essais de toxicité orale aiguë (8). Ce document contient également de plus amples informations sur la conduite et l'interprétation de la méthode d'essai B.l ter. Il n'est pas nécessaire d'administrer des substances d'essai à des niveaux de dose dont on sait qu'elles provoquent des douleurs et une détresse importante du fait des propriétés corrosives ou sévèrement irritantes. Au cours de l'essai, les animaux moribonds et les animaux souffrant de façon manifeste ou montrant des signes de détresse grave devront être euthanasiés. Ces animaux devront être pris en compte dans l'interprétation des résultats, au même titre que les animaux morts pendant l'essai. Les critères pour décider de tuer les animaux moribonds et ceux qui souffrent de façon manifeste ainsi que des orientations pour reconnaître une mort prévisible ou imminente font l'objet d'un autre document d'orientation (9). La méthode utilise des doses prédéterminées et donne des résultats qui permettent le classement des substances selon le système général harmonisé de classification (SGH) des substances ayant une toxicité aiguë (10). En principe, la méthode ne vise pas à calculer une valeur précise de DL50, mais elle permet de déterminer dans quelle gamme de doses la substance doit être considérée comme létale, puisque la mort d'une partie des animaux reste le principal effet observé dans cet essai. La méthode permet de déterminer une DL50 uniquement dans le cas où au moins deux doses donnent une mortalité supérieure à 0 % et inférieure à 100 %. Grâce à l'utilisation d'un choix de doses prédéterminées, indépendamment de la substance d'essai, et au lien explicite entre classification et nombre d'animaux dans différents états observés, la cohérence entre laboratoires est favorisée. Le laboratoire doit rassembler toutes les informations disponibles sur la substance d'essai avant de procéder à l'essai. Ces informations comprennent l'identité et la structure chimique de la substance, ses propriétés physico-chimiques, le résultat de tout autre essai de toxicité réalisé in vivo ou in vitro sur la substance, les données toxicologiques concernant des substances structurellement apparentées, ainsi que le ou les usages escomptés de la substance. Ces informations sont nécessaires pour rassurer les personnes concernées quant à la pertinence de l'essai pour la protection de la santé humaine et elles seront utiles dans le choix de la dose initiale appropriée.

1.2. DÉFINITIONS Toxicité orale aiguë: effets défavorables apparaissant après l'administration par voie orale d'une dose unique de substance ou de plusieurs doses données sur une période de 24 heures. Mort différée: l'animal ne meurt ni n'apparaît moribond en l'espace de 48 heures, mais meurt ultérieurement au cours de la période d'observation de 14 jours. Dose: la quantité de substance d'essai administrée. La dose s'exprime en poids de substance d'essai par unité de poids de l'animal d'expérience (par exemple mg/kg). SGH: système général harmonisé de classification et d'étiquetage. Une activité conjointe de l'OCDE (santé humaine et environnement), du comité d'experts sur le transport des matières dangereuses (propriétés physico-chimiques) et du BIT (communication des dangers) et coordonnée par l'IOMC (Interorganisation Program for the Sound Management of Chemicals). Mort imminente: il y a mort imminente lorsqu'on s'attend à ce qu'un état moribond ou la mort interviennent avant le prochain moment d'observation prévu. Parmi les signes qui sont indicatifs de cet état chez les rongeurs, il y a les convulsions, la position latérale, la position couchée et les tremblements [pour de plus amples détails, voir (9)]. DL50 (dose orale létale 50 %): dose unique d'une substance d'essai, obtenue par calcul statistique, susceptible d'entraîner la mort de 50 % des animaux lorsqu'elle est administrée par voie orale. La valeur de la DL50 est exprimée en poids de la substance d'essai par unité de poids corporel de l'animal d'expérience (mg/kg). Dose limite: désigne une dose qui est la limite supérieure pour l'essai (2000 ou 5000 mg/kg). État moribond: l'état avant la mort ou l'incapacité à survivre, même si un traitement est donné [pour de plus amples détails, voir (9)]. Mort prévisible: présence de signes cliniques indiquant que la mort va intervenir à un moment déterminé dans le futur, avant la fin projetée de l'expérience, par exemple incapacité à atteindre l'eau ou la nourriture [pour plus de détails, voir (9)].

1.3. PRINCIPE DE L'ESSAI Le principe de cet essai est que, avec un processus séquentiel et un nombre minimal d'animaux par étape, il est possible d'obtenir des informations sur la toxicité aiguë de la substance d'essai qui sont suffisantes aux fins de sa classification. Une dose déterminée de la substance est administrée par voie orale à un groupe d'animaux. La substance est testée selon une procédure séquentielle utilisant trois animaux de même sexe (généralement des femelles) à chaque étape. L'absence ou la manifestation de mortalité liée à la substance dans un groupe ayant reçu une dose à une étape donnée détermine l'étape suivante, c'est-à-dire: Des détails concernant le mode opératoire sont décrits à l'annexe 1. La méthode permet de se prononcer sur la classification de la substance d'essai dans une classe de toxicité délimitée par des valeurs préalablement fixées de DL50.

arrêt de l'essai,

administration de la même dose à trois animaux supplémentaires,

administration de la dose immédiatement supérieure ou immédiatement inférieure à trois animaux supplémentaires.

1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.4.

1.4.1. Choix de l'espèce animale Le rat est l'espèce préférée mais d'autres espèces de rongeurs peuvent être utilisées. Normalement, on utilise des femelles (9). L'étude de la littérature sur les essais traditionnels de DL50 montre en effet qu'il y a peu de différence de sensibilité entre sexes et que, lorsqu'il y a des différences, les femelles sont en général légèrement plus sensibles (11). Si, toutefois, compte tenu des propriétés toxicologiques et toxicocinétiques de composés structurellement voisins, il apparaît que les mâles sont probablement plus sensibles, il convient d'employer des mâles. Dans ce cas, il faut fournir une justification adéquate. On utilise de jeunes animaux adultes sains, issus de souches couramment utilisées en laboratoire. Les femelles doivent être nullipares et non gravides. Au début de l'essai, chaque animal doit être âgé de 8 à 12 semaines et son poids doit se situer dans un intervalle de ± 20 % du poids moyen des animaux précédemment exposés.

1.4.2. Conditions d'hébergement et d'alimentation La température du local des animaux d'expérience doit être de 22 oC (± 3 oC). L'humidité relative doit atteindre au moins 30 % et rester de préférence inférieure à 70 %, mais en dehors des heures de nettoyage du local, on s'efforcera de maintenir le taux d'humidité autour de 50 à 60 %. On appliquera un éclairage artificiel alternant 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Pour l'alimentation des animaux, on peut utiliser la nourriture classique de laboratoire avec de l'eau potable à satiété. Les animaux peuvent être groupés par dose. Toutefois, le nombre d'animaux par cage ne doit pas faire obstacle à une observation précise de chaque animal.

1.4.4. Préparation des doses En général, il convient d'administrer la substance d'essai à volume constant quelle que soit la dose testée, en faisant varier la concentration de la préparation. Lorsqu'un produit liquide ou un mélange font l'objet de l'essai, l'utilisation du produit non dilué, donc à concentration constante, peut être plus appropriée pour l'évaluation du risque de cette substance. Certaines autorités réglementaires l'exigent. Dans tous les cas, il ne faut pas dépasser le volume de dose maximal. Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une seule fois dépend de la taille de l'animal d'essai. Chez les rongeurs, ce volume ne doit pas dépasser 1 ml/100 g de poids corporel, sauf dans le cas de solutions aqueuses pour lesquelles on peut utiliser 2 ml/100 g de poids corporel. Il est recommandé d'utiliser une solution aqueuse chaque fois que cela est possible, sinon on peut utiliser une solution dans de l'huile (par exemple de l'huile de mais) et éventuellement une solution dans d'autres véhicules. En ce qui concerne les véhicules non aqueux, leur toxicité doit être connue. Les doses doivent être préparées juste avant l'administration, sauf si la stabilité de la préparation pendant la durée de la période d'utilisation est connue et jugée acceptable.

1.5. MODE OPÉRATOIRE

1.5.

1.5.1. Administration des doses La substance d'essai est administrée en une seule dose en utilisant une sonde gastrique ou toute autre canule pour intubation appropriée. Lorsqu'il n'est pas possible d'administrer la dose en une seule fois, celle-ci peut être fractionnée sur une période n'excédant pas 24 heures. Les animaux doivent être à jeun avant l'administration de la substance (on supprimera la nourriture, mais pas l'eau, pendant toute une nuit pour les rats et pendant 3 à 4 heures pour les souris). Après la période de jeûne, les animaux doivent être pesés; la substance d'essai leur est ensuite administrée. Après l'administration de la substance, les animaux peuvent être à nouveau privés de nourriture, pendant 3 à 4 heures pour les rats et pendant 1 à 2 heures pour les souris. Si la dose est administrée par fractions sur un certain laps de temps, il peut s'avérer nécessaire, en fonction de la durée du traitement, d'alimenter et de faire boire les animaux.

1.5.2. Nombre d'animaux et niveaux des doses Trois animaux sont utilisés à chaque étape. Pour la dose initiale, on choisit un niveau parmi les quatre suivants: 5, 50, 300 et 2000 mg/kg de poids corporel. Le niveau choisi est celui pour lequel on peut s'attendre à observer une mortalité chez les animaux traités. Les schémas de l'annexe 1 décrivent la marche à suivre pour chacune des doses initiales. En outre, l'annexe 4 propose une méthode de classification selon le système communautaire en attendant la mise en place du nouveau SGH. Lorsque certaines informations donnent à penser qu'il est peu probable que la dose initiale la plus élevée (2000 mg/kg de poids corporel) provoque une mortalité, il convient de procéder à un essai limite. En l'absence de telles informations sur la substance d'essai, la dose initiale qui est recommandée par souci de protection des animaux est 300 mg/kg de poids corporel. L'intervalle de temps à respecter entre l'administration de chaque niveau de dose dépend du moment où se manifestent les effets toxiques, de leur durée et de leur gravité. L'administration de la dose suivante doit être retardée jusqu'à ce que l'on ait obtenu la certitude que les animaux précédemment soumis au traitement vont survivre. Exceptionnellement, et uniquement lorsque cela est nécessaire pour satisfaire une exigence réglementaire particulière, l'utilisation d'une dose maximale prédéterminée supplémentaire de 5000 mg/kg peut être envisagée (voir annexe 2). Par souci de protection des animaux, l'essai de substances en catégorie 5 du SGH (2000 - 5000 mg/kg) est déconseillé et ne doit être envisagé que lorsqu'il est très probable qu'il donnera des résultats qui présenteront un intérêt direct pour la protection de la santé des hommes et des animaux ou de l'environnement.

1.5.3. Essai limite L'essai limite est utilisé principalement lorsque l'expérimentateur dispose d'informations indiquant que la substance d'essai n'est probablement pas toxique, c'est-à-dire que sa toxicité ne se manifeste qu'au-delà des doses limites réglementaires. Des informations concernant la toxicité de la substance d'essai peuvent être déduites des connaissances acquises sur des substances, produits ou mélanges similaires déjà testés, compte tenu de l'identité et du pourcentage des composants importants sur le plan toxicologique. Quand on ne dispose pas d'informations concernant la toxicité de la substance, ou lorsqu'on s'attend à une substance toxique, il faut effectuer l'essai principal. Un essai limite à la dose de 2000 mg/kg peut être effectué sur six animaux (trois animaux par étape). Exceptionnellement, un essai limite à la dose de 5000 mg/kg peut être réalisé sur trois animaux (voir annexe 2). Si une mortalité liée à la substance est observée, il peut s'avérer nécessaire de poursuivre l'essai à la dose immédiatement inférieure.

1.6. OBSERVATIONS Les animaux doivent être observés individuellement au moins une fois pendant les 30 premières minutes suivant l'administration de la substance et régulièrement pendant les premières 24 heures, avec une attention particulière au cours des 4 premières heures; l'observation doit ensuite être quotidienne, pendant 14 jours en tout, sauf dans le cas des animaux qui meurent en cours d'étude ou qui doivent être retirés de l'étude et euthanasiés pour leur épargner des souffrances excessives. Toutefois, la durée d'observation ne doit pas être fixée de manière rigide. Elle doit être fonction des réactions de toxicité, du moment où elles apparaissent et de la durée de la période de récupération. Elle peut donc être prolongée, si nécessaire. Les moments où apparaissent et disparaissent les signes de toxicité sont importants, particulièrement quand on constate un certain retard dans l'apparition de ces signes (12). Toutes les observations sont enregistrées de façon systématique, une fiche individuelle étant établie pour chaque animal. D'autres observations peuvent s'avérer nécessaires lorsque les animaux continuent à manifester des signes de toxicité. Les observations doivent porter sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, ainsi que de l'appareil respiratoire, du système circulatoire, du système nerveux central et autonome, de l'activité somato-motrice et du comportement. L'attention portera en particulier sur l'observation des diverses manifestations de tremblement, convulsion, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. Les principes et critères résumés dans le document d'orientation sur les effets sur l'homme doivent être pris en considération (9). Les animaux moribonds et les animaux souffrant manifestement ou présentant des signes graves de détresse doivent être euthanasiés. Qu'il s'agisse d'animaux euthanasiés pour raisons éthiques ou d'animaux retrouvés morts, le moment de la mort doit être enregistré de façon aussi précise que possible.

1.6.

1.6.1. Poids corporel Le poids de chaque animal doit être déterminé peu de temps avant l'administration de la substance d'essai, et au moins une fois par semaine ensuite. Les variations de poids doivent être calculées et enregistrées. À la fin de l'essai, les animaux survivants sont pesés puis euthanasiés.

1.6.2. Pathologie Tous les animaux (y compris ceux qui sont morts au cours de l'essai ou ceux qui ont été retirés de l'étude pour des raisons éthiques) doivent être soumis à une autopsie à l'échelle macroscopique. Pour chaque animal, toutes les altérations pathologiques macroscopiques doivent être enregistrées. Chez les animaux qui survivent 24 heures ou plus à l'administration de la dose initiale, l'examen microscopique des organes présentant des signes évidents de pathologie doit également être envisagé, car il peut fournir des renseignements utiles.

2. RÉSULTATS Les résultats obtenus pour chaque animal doivent être présentés. Toutes les données doivent être résumées dans un tableau indiquant, pour chaque groupe d'essai, le nombre d'animaux utilisés, le nombre d'animaux présentant des signes de toxicité, le nombre d'animaux retrouvés morts pendant l'essai ou sacrifiés pour des raisons éthiques, et, pour chaque animal, le moment de la mort, la description des effets toxiques et leur évolution dans le temps ainsi que leur réversibilité éventuelle et les résultats de l'autopsie.

3. RAPPORT

3.

3.1. Rapport d'essai Le rapport d'essai doit contenir, s'il y a lieu, les renseignements suivants:

Substance d'essai:

état physique, pureté et, s'il y a lieu, propriétés physico-chimiques (compris isomérisation),

données relatives à l'identification, y compris numéro CAS.

Véhicule (le cas échéant):

justification du choix du véhicule, s'il ne s'agit pas d'eau.

Animaux d'essai:

espèce/souche utilisée,

état microbiologique des animaux, s'il est connu,

nombre, âge et sexe des animaux (le cas échéant, justification du choix de mâles à la place de femelles),

origine, conditions d'hébergement, régime alimentaire, etc.

Conditions de l'essai:

détails sur la formulation de la substance d'essai, notamment état physique du produit administré,

détails sur le mode d'administration, notamment volume des doses et moment de l'administration,

détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau (y compris le type de régime et sa provenance ainsi que celle de l'eau),

justification du choix de la dose initiale.

Résultats:

tableau des réactions aux différentes doses pour chaque animal (c'est-à-dire nombre d'animaux montrant des signes de toxicité, y compris mortalité; nature, gravité et durée des effets),

tableau des poids corporels et des variations de poids,

poids individuels des animaux le jour du traitement, et ensuite à intervalles d'une semaine, ainsi qu'au moment de la mort ou du sacrifice,

date et heure de la mort si celle-ci intervient avant le moment prévu du sacrifice,

pour chaque animal, moment d'apparition et évolution des signes de toxicité et réversibilité éventuelle,

pour chaque animal, résultats de l'autopsie et observations histopathologiques le cas échéant.

Discussion et interprétation des résultats.

Conclusions.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)

BIBLIOGRAPHIE Roll, R., Höfer-Bosse, Th. And Kayser, D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, p. 86 Roll, R., Riebschläger, M., Mischke, U. and Kayser, D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336-341. Diener, W., Sichha, L., Mischke, U., Kayser, D. and Schlede, E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559-610 Diener, W., Mischke, U., Kayser, D. and Schlede, E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729-734. Diener, W., and Schlede, E. (1999). Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, p. 129-134 Schlede, E., Mischke, U., Roll, R. and Kayser, D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method — An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, p. 455-470. Schlede, E., Mischke, U., Diener, W. and Kayser, D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659-670. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, p. 223-231. Chan, P.K. and Hayes, A.W. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd, New York, USA.

B.2. TOXICITÉ AIGUË (INHALATION)

B.2.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Il est utile de disposer d'informations préliminaires sur la distribution de la taille des particules, la pression de vapeur, le point de fusion, le point d'ébullition, le point d'éclair et l'explosivité (le cas échéant) de la substance. Voir également l'introduction générale, partie B (point A).

1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale, partie B (point B).

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Plusieurs lots d'animaux d'expérience sont exposés à des concentrations croissantes de la substance à tester pendant une période déterminée, une seule concentration étant utilisée par lot. On observe ensuite les effets et la mortalité dus à la substance. Les animaux qui meurent pendant l'essai sont autopsiés ainsi que ceux qui survivent à la fin de l'expérience. Si des animaux montrent des signes d'inconfort et de douleur intenses et durables, il peut être nécessaire de les euthanasier; il n'y a pas lieu d'effectuer l'essai lorsque l'on sait que l'administration de la substance à étudier peut entraîner une détresse ou des douleurs intenses du fait des propriétés corrosives ou irritantes.

1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

1.6.

1.6.1. Préparation Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et d'alimentation propres à l'expérience au minimum pendant au moins les 5 jours qui la précèdent. Avant l'expérience, des animaux adultes jeunes et sains sont distribués selon les règles du hasard dans les différents lots d'expérience. Il n'est pas nécessaire de soumettre les animaux témoins à une exposition simulée, à moins que le dispositif d'exposition utilisé ne l'exige. Il peut être nécessaire de microniser les substances solides à tester afin de les réduire en particules d'une taille appropriée. On peut, au besoin, ajouter à la substance à tester un véhicule approprié en vue d'obtenir la concentration adéquate de celle-ci dans l'atmosphère; il faut alors prévoir un groupe témoin pour ce véhicule. Si un véhicule ou d'autres additifs sont utilisés pour faciliter l'administration, ils doivent être non toxiques et il est possible de s'appuyer pour cela sur des données bibliographiques appropriées.

1.6.2. Conditions de l'essai

1.6.2.

1.6.2.1. Animaux d'expérience Sauf contre-indication, le rat est l'espèce préférée. Il faut utiliser des souches courantes d'animaux de laboratoire. Pour chaque sexe, au début de l'essai, l'intervalle de variation du poids des animaux utilisés ne doit pas excéder ± 20 % de la valeur moyenne requise.

1.6.2.2. Nombre et sexe Dix rongeurs au moins (cinq femelles et cinq mâles) sont utilisés pour chaque niveau de concentration. Les femelles doivent être nullipares et non gravides. Note: Il faut essayer d'utiliser un nombre plus restreint d'animaux pour les tests de toxicité aiguë sur des animaux appartenant à un ordre plus élevé que celui des rongeurs. Les concentrations doivent être soigneusement choisies, en multipliant les efforts visant à ne pas dépasser des doses modérément toxiques. Il faut éviter dans ce type d'essais d'administrer des doses létales de la substance à tester.

1.6.2.3. Concentrations d'exposition Les concentrations doivent être en nombre suffisant, au moins trois, et espacées correctement pour produire des lots présentant une gamme d'effets toxiques et de taux de mortalité. Les données doivent être suffisantes pour permettre de tracer une courbe doses/réponses et, si possible, permettre une détermination acceptable de la CL50.

1.6.2.4. Essai de limite Si une exposition de 5 mâles et de 5 femelles à une concentration de 20 milligrammes par litre d'un gaz ou de 5 milligrammes par litre d'un aérosol ou de particules pendant 4 heures (ou lorsque cela n'est pas possible en raison des propriétés chimiques ou physiques, voire explosives, de la substance d'essai, une exposition à la concentration maximale possible) ne cause la mort d'aucun animal en 14 jours, on peut juger inutile de poursuivre l'expérience.

1.6.2.5. Temps d'exposition La durée de l'exposition doit être de quatre heures.

1.6.2.6. Dispositif expérimental Les animaux doivent être exposés à la substance au moyen d'un dispositif d'exposition dynamique capable de maintenir un courant d'air permettant au moins 12 renouvellements de l'atmosphère de l'enceinte d'exposition par heure, et assurant une teneur suffisante en oxygène ainsi qu'une répartition uniforme du produit à tester dans l'atmosphère de l'enceinte d'exposition. Si l'on utilise une chambre d'exposition, celle-ci doit être conçue de manière à éviter autant que possible l'entassement des animaux et à optimiser l'exposition par inhalation à la substance d'essai. En règle générale, pour assurer la stabilité de la composition de l'atmosphère d'une chambre, le volume total des animaux d'expérience ne doit pas dépasser 5 % du volume de la chambre d'essai. On peut aussi avoir recours à un système d'exposition soit oro-nasal, soit de la tête seule, soit du corps entier en chambre individuelle; les deux premiers types d'exposition présentent l'avantage de limiter la pénétration de la substance d'essai par d'autres voies.

1.6.2.7. Période d'observation La période d'observation doit s'étendre au moins sur 14 jours. Cependant, cette durée ne doit pas être limitée de façon rigide. Elle doit être déterminée en fonction des réactions de toxicité, de leur vitesse d'apparition et de la durée de la période de récupération; elle peut donc être prolongée si nécessaire. Le moment d'apparition ou de disparition des symptômes de toxicité ainsi que le moment de la mort sont importants, surtout en cas de mortalité retardée.

1.6.3. Mode opératoire Peu de temps avant l'exposition, les animaux sont pesés, puis exposés à la concentration d'essai dans l'appareillage décrit pendant une durée de quatre heures après stabilisation de la concentration dans la chambre. La stabilisation doit être rapide. La température à laquelle s'effectue l'essai doit être maintenue à 22 oC ± 3 oC. L'idéal est de maintenir l'humidité relative entre 30 et 70 %, mais, dans certains cas (par exemple certains essais d'aérosols), cela peut être impossible. Le maintien d'une pression légèrement négative à l'intérieur de la chambre (≥ 5 mm d'eau) empêchera la substance d'essai de s'échapper dans le laboratoire. La nourriture et l'eau doivent être retirées pendant l'exposition. Il convient d'utiliser un dispositif permettant de produire et de contrôler l'atmosphère d'essai. Le système doit permettre de créer des conditions d'exposition stables aussi rapidement que possible. La chambre doit être conçue et fonctionner de telle façon qu'il y soit maintenue une distribution homogène de la substance dans l'atmosphère. Il convient de mesurer ou de surveiller: Les observations ont lieu pendant et après l'exposition et sont enregistrées systématiquement; une fiche individuelle doit être établie pour chaque animal. Les observations doivent être fréquentes le premier jour. Un examen clinique attentif doit être pratiqué au moins une fois par jour ouvrable, d'autres observations doivent être faites quotidiennement, en agissant de façon à réduire le nombre d'animaux perdus pour l'étude, par exemple grâce à l'autopsie ou à la conservation au froid des animaux trouvés morts ainsi qu'en isolant et en sacrifiant des animaux faibles ou moribonds. Les observations doivent concerner les modifications de la peau et des poils, des yeux, dés muqueuses, de l'appareil respiratoire, du système circulatoire ainsi que des systèmes nerveux autonome et central, de l'activité somato-motrice et du comportement. Une attention particulière sera apportée à la respiration, aux tremblements, convulsions, salivation, diarrhées, léthargie, sommeil et coma. Le moment de la mort doit être noté avec autant de précision que possible. Le poids de chaque animal doit être déterminé chaque semaine après l'exposition ainsi qu'au moment de la mort. Les animaux qui meurent pendant l'expérience et ceux qui survivent à la fin de l'expérience sont autopsiés en recherchant en particulier toutes les modifications des voies respiratoires supérieures et inférieures. Toutes les modifications doivent être consignées. Si nécessaire, des tissus doivent être prélevés pour un examen histopathologique.

1.6.3. a)

le débit d'air (en permanence);

la concentration réelle de la substance d'essai. Elle doit être mesurée dans la zone de respiration au moins trois fois au cours de l'exposition (certaines atmosphères, comme les aérosols à forte concentration, peuvent nécessiter un contrôle plus fréquent). Pendant la période d'exposition, la concentration ne doit pas varier de plus de ± 15 % par rapport à la valeur moyenne. Toutefois, dans le cas de certains aérosols, ce degré de précision peut ne pas être obtenu et un écart plus grand est alors acceptable. En ce qui concerne les aérosols, la taille des particules doit être analysée aussi souvent que nécessaire (au moins une fois par groupe d'exposition);

la température et l'humidité, en permanence si possible.

2. DONNÉES Les données doivent être récapitulées dans un tableau indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux au début de l'essai, le moment de la mort de chaque animal, le nombre d'animaux présentant d'autres symptômes de toxicité, la description des effets toxiques et les résultats de l'autopsie. Le poids de chaque animal doit être déterminé et enregistré lorsque la survie dépasse une journée. Les animaux qui sont euthanasiés à cause de l'inconfort et des souffrances dus à la substance sont enregistrés en tant que morts dues à la substance. La CL50 doit être déterminée selon une méthode reconnue. L'évaluation des données doit inclure la relation, si elle existe, entre l'exposition des animaux à la substance à tester et l'apparition ainsi que la gravité de toutes les anomalies, y compris les anomalies du comportement et les anomalies cliniques, les lésions macroscopiques, les changements de poids corporel, la mortalité et tout autre effet toxique éventuel.

3. RÉSULTATS

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: Données relatives à l'exposition: Elles doivent être présentées sous forme d'un tableau indiquant les valeurs moyennes ainsi qu'une mesure de la variabilité (par exemple écart type); elles devront, si possible, comprendre:

espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc.,

conditions de l'essai: description de l'appareillage d'exposition, y compris conception, type, dimensions, source d'air, système de génération produisant l'aérosol, méthode de conditionnement d'air et, le cas échéant, stabulation des animaux en chambre d'essai. Le dispositif de mesure de la température, de l'humidité, de la concentration des aérosols et de la distribution de la taille des particules doit être décrit.

3.1. a)

débit d'air dans le dispositif d'inhalation;

température et humidité de l'air;

concentrations nominales (quantité totale de substance d'essai introduite dans le dispositif d'inhalation, divisée par le volume d'air);

le cas échéant, nature du véhicule;

concentrations réelles dans la zone de respiration;

diamètre aérodynamique médian en masse (Damm) et écart type géométrique (ETG);

durée de stabilisation;

durée d'exposition;

tableau de données de réponses par sexe et par dose (à savoir nombre d'animaux morts ou sacrifiés au cours de l'essai, nombre d'animaux présentant des symptômes d'intoxication, nombre d'animaux exposés),

moment de la mort pendant ou après exposition, raisons et critères pour lesquels les animaux ont été euthanasiés,

toutes les observations,

valeur de la CL50 pour les animaux de chaque sexe, déterminée à la fin de la période d'observation (en précisant la méthode de calcul),

intervalle de confiance de 95 % pour la CL50 (lorsque le calcul est possible),

courbe dose/mortalité et pente de cette courbe (lorsque la méthode de calcul le permet),

résultats d'autopsie,

tous les résultats d'examens histopathologiques,

discussion des résultats (en tenant compte, en particulier, de l'effet que peuvent avoir sur la valeur calculée de la CL50 les animaux euthanasiés au cours de l'essai),

interprétation des résultats.

3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale, partie B (point D).

4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale, partie B (point E).

B.3. TOXICITÉ AIGUË (CUTANÉE)

B.3.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A).

1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale, partie B (point B).

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Des doses croissantes de la substance à tester sont appliquées sur la peau à plusieurs lots d'animaux d'expérience, une seule dose étant utilisée par lot. On observe ensuite les effets et la mortalité. Les animaux qui meurent pendant l'essai sont autopsiés ainsi que ceux qui survivent à la fin de l'expérience. Si des animaux montrent des signes de détresse et de douleur intenses et durables, il peut être nécessaire de les euthanasier; il n'y a pas lieu d'effectuer l'essai lorsque l'on sait que l'administration de la substance à étudier entraîne une détresse ou des douleurs intenses du fait de ses propriétés corrosives ou irritantes.

1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.6.

1.6.1. Préparation Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et d'alimentation propres à l'expérience au minimum pendant les 5 jours qui la précèdent. Avant l'expérience, des animaux adultes jeunes et sains sont distribués selon les règles du hasard dans les différents lots d'expérience. Vingt-quatre heures environ avant l'épreuve, on tond ou l'on rase les poils de la région dorsale du tronc des animaux en évitant toute lésion de la peau susceptible de modifier sa perméabilité. La surface à préparer pour l'application de la substance ne doit pas être inférieure à 10 % de la surface corporelle. Lorsque le test concerne des substances solides qui, le cas échéant, peuvent être pulvérisées, la substance à tester doit être suffisamment humectée au moyen d'eau ou, au besoin, d'un véhicule approprié, de manière à assurer un bon contact avec la peau. Si l'on utilise un véhicule, son influence sur la pénétration de la substance dans la peau doit être prise en considération. Les substances liquides sont généralement appliquées non diluées.

1.6.2. Conditions de l'essai

1.6.2.

1.6.2.1. Animaux d'expérience On peut utiliser des rats ou des lapins adultes. On peut également utiliser d'autres espèces, mais il faut dans ce cas en justifier l'utilisation. Il faut utiliser des souches courantes d'animaux de laboratoire. Pour chaque sexe, au début de l'essai, l'intervalle de variation du poids des animaux utilisés ne doit pas excéder ± 20 % de la valeur moyenne requise.

1.6.2.2. Nombre et sexe Cinq animaux au moins sont utilisés pour chaque dose. Ils doivent être de même sexe. Si l'on utilise des femelles, elles doivent être nullipares et non gravides. Si l'on dispose d'informations qui montrent qu'un sexe est nettement plus sensible, les essais seront pratiqués sur des animaux de ce sexe. Note: Il faut essayer d'utiliser un nombre plus restreint d'animaux lorsque les tests de toxicité aiguë sont effectués sur des animaux appartenant à un ordre plus élevé que celui des rongeurs. Les doses doivent être soigneusement choisies, en s'efforçant au maximum de ne pas dépasser des doses modérément toxiques. Il faut éviter dans ce type d'essais d'administrer des doses létales de la substance à tester.

1.6.2.3. Doses Les doses doivent être en nombre suffisant, au moins trois, et espacées de manière à produire des lots présentant une gamme d'effets toxiques et de taux de mortalité. Tout effet irritant ou corrosif doit être pris en considération lors du choix des doses. Les données doivent être suffisantes pour permettre de tracer une courbe doses/réponses et, si possible, permettre une détermination acceptable de la DL50.

1.6.2.4. Essai de limite Un essai de limite peut être effectué en administrant une dose au moins égale à 2000 mg/kg de poids corporel à un lot de 5 mâles et 5 femelles, en suivant le mode opératoire décrit ci-après. Si l'on observe une mortalité due à la substance, il peut être nécessaire de réaliser une étude complète.

1.6.2.5. Période d'observation La période d'observation doit s'étendre au moins sur 14 jours. Cependant, sa durée ne doit pas être limitée de façon rigide. Elle doit être déterminée en fonction des réactions de toxicité, de leur vitesse d'apparition et de la durée de la période de récupération; elle peut donc être prolongée en cas de besoin. Le moment où les signes de toxicité apparaissent et disparaissent, leur durée ainsi que le moment de la mort sont importants, surtout en cas de tendance à une mortalité retardée.

1.6.3. Mode opératoire Les animaux doivent être placés dans des cages individuelles. La substance d'essai doit être appliquée uniformément sur une surface à peu près égale à 10 % de la surface totale du corps. Dans le cas de substances hautement toxiques, la surface traitée peut être moindre, mais la substance d'essai doit être appliquée de manière à former un film aussi mince et uniforme que possible. Les substances d'essai doivent être maintenues en contact avec la peau au moyen d'un pansement de gaze poreux et d'un sparadrap non irritant pendant une période de 24 heures. La partie traitée doit, en outre, être convenablement couverte, de manière à maintenir en place le pansement de gaze et la substance d'essai et à éviter que les animaux puissent ingérer cette dernière. On peut utiliser des appareils de contention pour empêcher les animaux d'ingérer la substance d'essai mais une immobilisation complète n'est pas recommandée. À la fin de la période d'application, la substance d'essai résiduelle doit être éliminée, si possible, avec de l'eau, ou au moyen d'un autre procédé de nettoyage de la peau. Les observations doivent être consignées systématiquement au fur et à mesure qu'elles sont effectuées, en établissant une fiche individuelle pour chaque animal. Les animaux doivent être observés fréquemment le premier jour. Un examen clinique attentif doit être pratiqué au moins une fois par jour ouvrable, d'autres observations doivent être faites quotidiennement, en prenant des mesures de façon à réduire le nombre d'animaux perdus pour l'étude, par exemple autopsie ou conservation au froid des animaux trouvés morts, ainsi qu'en isolant et sacrifiant les animaux faibles ou moribonds. Les observations doivent concerner les modifications des poils, de la peau traitée, des yeux, des muqueuses ainsi que de l'appareil respiratoire, du système circulatoire ainsi que des systèmes nerveux autonome et central, et enfin de l'activité somato-motrice et du comportement. Une attention particulière sera apportée aux tremblements, convulsions, salivation, diarrhées, léthargie, sommeil et coma. Le moment de la mort doit être enregistré avec autant de précision que possible. Les animaux qui meurent pendant l'expérience et ceux qui survivent à la fin de l'expérience sont autopsiés. Toutes les modifications pathologiques macroscopiques doivent être enregistrées. Si nécessaire, des tissus doivent être prélevés pour un examen histopathologique.

1.6.3. Estimation de la toxicité pour l'autre sexe

Après avoir mené à terme l'étude portant sur des animaux appartenant à un sexe, la substance est administrée au moins à un lot de 5 animaux de l'autre sexe, afin de déterminer si les animaux de ce sexe ne sont pas nettement plus sensibles à la substance à tester. L'utilisation d'un plus petit nombre d'animaux peut être justifiée dans des circonstances particulières. Si l'on dispose d'informations appropriées qui montrent que les animaux du sexe testé sont considérablement plus sensibles, on peut se dispenser d'effectuer des essais sur les animaux de l'autre sexe.

2. DONNÉES Les données doivent être récapitulées sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux au début de l'essai, le moment de la mort de chaque animal, le nombre d'animaux présentant d'autres signes d'intoxication, la description des effets toxiques et les résultats de l'autopsie. Le poids de chaque animal doit être déterminé et noté peu de temps avant l'application de la substance d'essai, puis une fois par semaine et au moment de la mort; les modifications du poids doivent être calculées et enregistrées lorsque la survie dépasse une journée. Les animaux qui sont euthanasiés à cause des souffrances et de l'inconfort dus à la substance sont enregistrés comme s'ils étaient morts du fait du composé étudié. La DL50 doit être déterminée par application d'une méthode reconnue. L'évaluation des données doit inclure une évaluation de la relation, si elle existe, entre l'exposition des animaux à la substance à tester et l'apparition ainsi que la sévérité de toutes les anomalies, y compris les anomalies de comportement et les anomalies cliniques, les lésions macroscopiques, les modifications de poids corporel, la mortalité et tout autre effet toxique éventuel.

3. RÉSULTATS

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc.,

conditions expérimentales (y compris le procédé de nettoyage de la peau et le type de pansement: occlusif ou non),

doses (avec indication du véhicule le cas échéant, et des concentrations),

sexe des animaux sur lesquels l'essai a été réalisé,

moment de la mort après administration, raisons et critères justifiant l'euthanasie des animaux,

toutes les observations,

valeur de la DL50 pour le sexe soumis à une étude complète, déterminée à 14 jours (en précisant la méthode de calcul),

intervalle de confiance de 95 % pour la DL50, lorsque le calcul est possible,

courbe dose/mortalité et pente de cette courbe (lorsque la méthode de calcul le permet),

résultats d'autopsie,

toutes les constatations histopathologiques,

résultats de tout essai réalisé sur l'autre sexe,

discussion des résultats (en tenant compte, en particulier, de l'effet que peuvent avoir sur la valeur de la DL50 calculée les animaux euthanasiés au cours de l'essai),

interprétation des résultats.

3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale, partie B (point D).

4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale, partie B (point E).

B.4. TOXICITÉ AIGUË: IRRITATION/CORROSION CUTANÉE

B.4.

1. MÉTHODE Cette méthode est équivalente à la ligne directrice TG 404 (2002) de l'OCDE.

1.

1.1. INTRODUCTION La mise à jour de cette méthode a porté plus particulièrement sur les possibilités d'améliorer le traitement des animaux de laboratoire et sur l'évaluation de toutes les informations existantes se rapportant aux substances d'essai en vue d'éviter les tests inutiles sur animaux. La présente méthode recommande d'analyser la valeur probante des résultats pertinents déjà disponibles avant de procéder à l'essai in vivo de corrosion/irritation décrit ci-après. Les données manquantes pourront être comblées par des essais séquentiels (1). La démarche expérimentale, décrite en annexe, inclut la réalisation d'essais in vitro validés et acceptés. Il est également recommandé d'opter, le cas échéant, pour une application successive plutôt que simultanée des trois timbres sur l'animal dans l'essai in vivo initial. Pour assurer à la fois la fiabilité des résultats scientifiques et le bien-être animal, on ne procédera pas aux essais in vivo tant que la valeur probante de toutes les données relatives au caractère éventuellement corrosif ou irritant pour la peau de la substance n'aura pas été analysée. Ces données comprendront les résultats d'études menées sur des humains et/ou des animaux, des données relatives à l'effet corrosif ou irritant d'une ou plusieurs substances structurellement proches de la substance d'essai ou de mélanges de ces substances, des données démontrant la forte acidité ou alcalinité de la substance (2) (3), et des résultats d'essais in vitro ou ex vivo validés et acceptés (4) (5) (5a). Cette analyse devrait réduire la nécessité de tester in vivo l'effet corrosif ou irritant sur la peau des substances pour lesquelles des études antérieures ont déjà livré suffisamment d'informations quant à ces deux aspects. La démarche expérimentale préconisée, de type séquentiel, comporte des essais de corrosion et d'irritation in vitro ou ex vivo validés et acceptés, et est décrite dans l'annexe de la présente méthode. Cette démarche, élaborée au cours d'un atelier de l'OCDE (6) et recommandée à l'unanimité par les participants à cet atelier, a été adoptée à titre de recommandation dans le cadre du Globally Harmonized System for the Classification of Chemical Substances (GHS) (système de classification des substances chimiques harmonisé à l'échelon mondial) (7). Bien que cette stratégie séquentielle ne fasse pas partie intégrante de la méthode d'essai B.4, elle constitue cependant la procédure recommandée avant d'entreprendre les essais in vivo. S'agissant de nouvelles substances, on préconise de suivre une démarche expérimentale par étapes pour obtenir des résultats scientifiques fiables sur l'effet corrosif ou irritant de la substance. En ce qui concerne les substances existantes dont les données sur l'effet corrosif ou irritant sont insuffisantes, on suppléera à ces dernières en appliquant cette stratégie. Le choix d'une autre démarche expérimentale ou la décision de ne pas procéder par étapes doivent être justifiés. Si l'analyse de la valeur probante des résultats ne permet pas de déterminer l'effet corrosif ou irritant, on envisagera un essai in vivo compatible avec la démarche séquentielle (voir annexe).

1.2. DÉFINITIONS L'irritation cutanée désigne l'apparition de lésions cutanées réversibles consécutives à l'application d'une substance d'essai durant une période de quatre heures au maximum. La corrosion cutanée désigne la survenue de lésions cutanées irréversibles, et plus précisément d'une nécrose visible à travers l'épiderme et dans le derme, à la suite de l'application d'une substance d'essai durant une période de quatre heures au maximum. La corrosion cutanée se manifeste par des ulcères, des saignements, des croûtes saignantes et, au terme de la période d'observation de 14 jours, par une décoloration due au pâlissement de la peau, des zones d'alopécie totale et des escarres. Un examen histopathologique sera envisagé en cas de lésions douteuses.

1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Une seule dose de la substance d'essai est appliquée sur la peau de l'animal choisi pour l'expérience, les zones non traitées de la peau de l'animal servant de témoin. L'expérimentateur observe et note selon une échelle de valeurs le degré d'irritation ou de corrosion à intervalles déterminés, et le décrit de façon plus détaillée afin de fournir une évaluation complète des effets. La durée de l'étude doit être suffisante pour permettre d'évaluer la réversibilité des effets observés. Les animaux qui manifestent des signes persistants de détresse et/ou de douleur aiguës à n'importe quel stade de l'essai doivent être euthanasiés, et ces symptômes seront pris en compte dans l'évaluation de la substance. Les critères régissant la décision d'euthanasier les animaux moribonds et souffrant fortement sont définis dans un document cité en référence (8).

1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.4.

1.4.1. Préparation de l'essai in vivo

1.4.1.

1.4.1.1. Sélection de l'espèce animale On choisira de préférence de jeunes adultes sains parmi les lapins albinos. L'utilisation d'une autre espèce sera justifiée, le cas échéant.

1.4.1.2. Préparation des animaux Environ 24 heures avant l'essai, la région dorsale du tronc des animaux sera tondue à ras. On prendra soin de ne pas égratigner leur peau et seuls des animaux présentant une peau saine et intacte seront utilisés. La fourrure de certaines souches de lapins est plus touffue par endroits et ce phénomène est plus marqué à certaines périodes de l'année. Ces plages à forte pilosité ne doivent pas recevoir la substance d'essai.

1.4.1.3. Conditions d'hébergement et d'alimentation Les animaux sont placés dans des cages individuelles. La température du local expérimental est réglée à 20 oC (± 3 oC) pour les lapins. L'humidité relative doit atteindre au moins 30 % et rester de préférence inférieure à 70 %, mais en dehors des heures de nettoyage du local, on s'efforcera de maintenir le taux d'humidité autour de 50 à 60 %. On appliquera un éclairage artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Les lapins seront nourris avec un mélange classique pour animaux de laboratoire et boiront de l'eau potable à volonté.

1.4.2. Mode opératoire

1.4.2.

1.4.2.1. Application de la substance d'essai La substance d'essai est appliquée sur une petite zone (environ 6 cm2) de la peau et recouverte par une compresse de gaze, maintenue en place à l'aide d'un sparadrap non irritant. Si l'application directe est impossible (dans le cas de liquides ou de certaines pâtes, par exemple), la substance d'essai est d'abord appliquée sur la compresse de gaze, laquelle est ensuite placée sur la peau. La compresse doit être maintenue en contact souple avec la peau à l'aide d'un pansement semi-occlusif durant la période d'exposition. Si la substance d'essai est déposée sur la compresse, celle-ci doit être fixée sur la peau de façon que la substance y soit répartie uniformément et entre bien en contact avec celle-ci. On fera en sorte que l'animal n'ait pas accès à la compresse et ne puisse ingérer ou inhaler la substance d'essai. Les substances liquides sont généralement testées à l'état non dilué. Si la substance d'essai est solide (elle peut être pulvérisée si nécessaire), il y a lieu de l'humidifier avec la plus petite quantité d'eau (ou au besoin avec un autre véhicule approprié) nécessaire à assurer un bon contact avec la peau. Lorsqu'on utilise un véhicule autre que l'eau, l'influence éventuelle du véhicule sur l'irritation de la peau par la substance d'essai doit être minimale. À la fin de la période d'exposition, qui dure normalement 4 heures, on enlève ce qui peut l'être de la substance d'essai restante, avec de l'eau ou un solvant approprié sans interférer avec la réaction ni altérer l'intégrité de l'épiderme.

1.4.2.2. Dose Une dose de 0,5 ml de liquide ou de 0,5 g de solide ou de pâte est appliquée sur la plage à tester.

1.4.2.3. Essai initial (essai d'irritation/corrosion cutanée in vivo sur un seul animal) Il est fortement recommandé de commencer par pratiquer l'essai in vivo sur un seul animal, surtout lorsqu'on pense que la substance risque d'être corrosive. Cette précaution obéit à la démarche expérimentale séquentielle (voir annexe 1). Dès lors qu'une substance est jugée corrosive d'après l'analyse de la valeur probante des résultats, tout essai sur animal s'avère superflu. Pour la plupart des substances risquant d'être corrosives, il n'est généralement pas nécessaire de procéder à un essai in vivo. Toutefois, si l'on estime que les données disponibles ne sont pas assez convaincantes, on peut réaliser un essai limité sur un animal en suivant la procédure décrite ci-après. Jusqu'à trois timbres d'essai sont appliqués successivement sur l'animal. Le premier timbre est enlevé après trois minutes. Si aucune réaction cutanée grave n'est constatée, un deuxième timbre est appliqué et retiré après une heure. Si les observations effectuées à ce stade indiquent que l'exposition peut être étendue à quatre heures sans que cela fasse trop souffrir l'animal, l'expérimentateur appliquera un troisième timbre durant quatre heures et attribuera une cote à la réaction. Si un effet corrosif est détecté à l'issue d'une des trois expositions séquentielles, l'essai s'achève immédiatement. Si aucun effet corrosif n'est relevé après l'enlèvement du troisième timbre, l'animal est gardé en observation durant 14 jours, à moins qu'un effet corrosif se déclare avant. Dans les cas où l'on s'attend à ce que la substance d'essai soit peut-être irritante, mais pas corrosive, un seul timbre sera appliqué sur un animal durant quatre heures.

1.4.2.4. Essai confirmatoire (essai d'irritation cutanée in vivo sur des animaux supplémentaires) Si l'essai initial ne révèle aucun effet corrosif, il convient de confirmer la réaction irritante ou négative sur deux animaux supplémentaires, traités chacun avec un timbre maintenu durant quatre heures. Si l'essai initial produit un effet irritant, l'essai confirmatoire peut être conduit en mode séquentiel ou par l'exposition simultanée de deux animaux supplémentaires. Au cas exceptionnel où l'essai initial ne serait pas pratiqué, deux ou trois animaux peuvent être traités au moyen d'un seul timbre appliqué durant quatre heures. Si l'on utilise deux animaux et qu'ils expriment la même réaction, il n'est pas nécessaire de poursuivre l'essai. Dans le cas contraire, le troisième animal est également testé. L'utilisation d'animaux supplémentaires pourra être requise si les réactions sont équivoques.

1.4.2.5. Période d'observation La durée de la période d'observation devrait être suffisante pour permettre d'évaluer complètement la réversibilité des effets observés. Il faudra cependant mettre fin à l'expérience dès que l'animal montre des signes persistants de douleur ou de détresse aiguës. La réversibilité des effets est déterminée par l'observation des animaux sur une période s'étendant jusqu'à 14 jours après l'enlèvement des timbres. Si la réaction s'avère réversible avant le quatorzième jour, l'expérience s'achève à ce moment-là.

1.4.2.6. Observations cliniques et cotation des réactions cutanées L'observation des signes d'érythème et d'œdème chez tous les animaux et la cotation des réactions s'effectuent au bout de 60 minutes et ensuite 24, 48 et 72 heures après l'enlèvement du timbre. S'agissant de l'animal du test initial, la plage soumise à l'épreuve est aussi examinée immédiatement après l'enlèvement du timbre. Les réactions cutanées sont cotées et consignées conformément à l'échelle figurant dans le tableau ci-après. Si la peau présente des lésions qui ne caractérisent pas une irritation ou une corrosion après 72 heures, il pourra être nécessaire d'observer l'animal jusqu'au quatorzième jour afin de déterminer la réversibilité des effets. En plus de l'observation de l'irritation, tous les effets toxiques locaux, tels qu'un dessèchement de la peau, et tout effet systémique nocif (par exemple des effets se manifestant par des signes cliniques de toxicité et sur le poids corporel) doivent être relevés et décrits en détail. L'examen histopathologiques est à envisager en cas de réactions équivoques. La cotation des réactions cutanées est forcément subjective. L'harmonisation de la cotation des réactions cutanées et l'appui aux laboratoires d'essai ainsi qu'au personnel chargé d'effectuer et d'interpréter les observations passent par une formation adéquate des expérimentateurs au système de cotation utilisé (voir tableau ci-après). Un manuel illustré sur la cotation de l'irritation cutanée et d'autres lésions pourrait être utile (9). La cotation des réactions cutanées devrait faire l'objet d'une évaluation à l'aveugle.

2. RÉSULTATS

2.

2.1. PRÉSENTATION DES RÉSULTATS Les résultats de l'étude devraient être récapitulés dans un tableau joint au rapport d'essai final et couvrir tous les aspects énumérés au paragraphe 3.1.

2.2. ÉVALUATION DES RÉSULTATS Le degré d'irritation cutanée devrait être évalué en considération de la gravité des lésions et de leur caractère réversible ou non. Les cotes individuelles ne fournissent pas une valeur absolue des propriétés irritantes d'une substance, celles-ci étant évaluées parallèlement à d'autres effets de la substance. Ces cotes individuelles doivent plutôt être considérées comme des valeurs de référence, à évaluer en association avec toutes les autres observations effectuées au cours de l'étude. L'évaluation des réactions d'irritation doit tenir compte de la réversibilité des lésions cutanées. Si des réactions, telles qu'une alopécie (sur une aire limitée), une hyperkératose, une hyperplasie et une desquamation, persistent jusqu'à la fin de la période d'observation de 14 jours, il y a lieu de considérer la substance d'essai comme irritante.

3. RAPPORT

3.

3.1. RAPPORT D'ESSAI Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:

Justification de l'essai in vivo: analyse de la valeur probante des résultats disponibles avant l'essai, notamment des résultats de la démarche expérimentale séquentielle:

description des données pertinentes livrées par des essais précédents,

données obtenues à chaque étape de la démarche expérimentale,

description des essais in vitro effectués, exposant le détail des procédures et les résultats obtenus avec les substances d'essai et de référence,

justification de l'étude in vivo après analyse de la valeur probante des résultats disponibles.

Substance d'essai:

données d'identification (par exemple, numéro CAS, source, pureté, impuretés connues, numéro de lot),

état physique et propriétés physico-chimiques (par exemple, pH, volatilité, solubilité, stabilité),

s'il s'agit d'un mélange: composition et pourcentages relatifs des constituants.

Véhicule:

identification, concentration (s'il y a lieu), volume utilisé,

justification du choix du véhicule.

Animaux d'expérience:

espèce/souche utilisée, justification de l'utilisation éventuelle d'un animal autre que le lapin albinos,

nombre d'animaux de chaque sexe,

poids de chaque animal au début et à la fin de l'essai,

âge des animaux au début de l'essai,

source des animaux, conditions d'encagement, régime alimentaire, etc.

Conditions expérimentales:

technique de préparation du site d'application,

détails concernant la composition du timbre et la technique d'application de ce dernier,

détails sur la préparation, l'application et l'enlèvement de la substance d'essai.

Résultats:

tableau faisant apparaître, pour chaque animal et à chaque relevé, les cotes attribuées aux réactions d'irritation/corrosion observées,

description de toutes les lésions observées,

description circonstanciée de la nature et du degré d'irritation ou de corrosion observé, et de tout effet histopathologique,

description de tout autre effet local néfaste (par exemple dessèchement de la peau) et des effets systémiques.

Discussion des résultats

4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)

BIBLIOGRAPHIE Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410-429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, p. 19-26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, p. 709-720. ECETOC (1990) Monograph No 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483-524. Méthode d'essai B.40. Corrosion cutanée. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 - 24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [peut être obtenu sur demande auprès du secrétariat de l'OCDE].

Tableau I Formation d'érythème et d'escarres Formation d'œdème COTATION DES RÉACTIONS CUTANÉES

Pas d'érythème … 0 Érythème très léger (à peine perceptible) … 1 Érythème bien défini … 2 Érythème modéré à grave … 3 Érythème grave (rouge violacé) à formation d'escarres empêchant la cotation de l'érythème … 4 Maximum possible: 4 Pas d'œdème … 0 Œdème très léger (à peine perceptible) … 1 Œdème léger (pourtour de la zone œdémateuse bien délimité par une enflure nette)… 2 Œdème modéré (enflure d'environ 1 mm) … 3 Œdème grave (enflure de plus de 1 mm s'étendant au-delà de l'aire exposée) … 4 Maximum possible: 4 Un examen histopathologique pourra être réalisé en cas de réaction équivoque.

B.5. TOXICITÉ AIGUË: IRRITATION/CORROSION OCULAIRE

B.5.

1. MÉTHODE Cette méthode est équivalente à la ligne directrice TG 405 (2002) de l'OCDE.

1.

1.1. INTRODUCTION La révision de la présente méthode a porté plus particulièrement sur l'évaluation préalable de toutes les informations existantes se rapportant aux substances d'essai, afin d'éviter les essais inutiles sur les animaux de laboratoire et contribuer ainsi à préserver le bien-être animal. Cette méthode préconise d'analyser la valeur probante des résultats pertinents déjà disponibles (1) avant de procéder à l'essai in vivo de corrosion/irritation oculaire décrit ci-après. Il est conseillé de combler le manque de données par des essais séquentiels (2) (3). La démarche expérimentale décrite à l'annexe de la présente méthode inclut la réalisation d'essais in vitro validés et acceptés. Il est en outre recommandé d'effectuer un essai d'irritation/corrosion cutanée in vivo, afin de prédire le pouvoir corrosif pour les yeux avant d'envisager un essai oculaire in vivo. Afin de concilier la fiabilité des résultats scientifiques et le bien-être animal, on ne procédera pas aux essais in vivo avant d'avoir analysé la valeur probante de toutes les données relatives au caractère éventuellement corrosif ou irritant de la substance pour les yeux. Ces données comprendront les résultats d'études menées sur des humains et/ou des animaux de laboratoire, des données relatives à l'effet corrosif ou irritant d'une ou plusieurs substances structurellement proches de la substance d'essai ou de mélanges de ces substances, des données démontrant la forte acidité ou alcalinité de la substance (4) (5), et des résultats d'essais in vitro et ex vivo d'irritation et de corrosion cutanées validés et acceptés (6) (6a). Ces études pourront être effectuées avant ou après l'analyse de la valeur probante des résultats. Pour certaines substances, une telle analyse peut faire ressortir la nécessité de mener des études in vivo afin de déterminer le pouvoir corrosif/irritant de la substance pour les yeux. Dans de tels cas, il est préférable, avant d'envisager un essai oculaire in vivo, de commencer par tester in vivo les effets cutanés de la substance et de les évaluer conformément à la méthode d'essai B.4 (7). L'analyse de la valeur probante des résultats, couplée à la stratégie d'essai séquentielle, devrait réduire la nécessité de tester in vivo l'effet corrosif ou irritant sur les yeux des substances pour lesquelles des études antérieures ont déjà livré suffisamment d'informations quant à ces deux aspects. Si le pouvoir corrosif ou irritant pour les yeux est impossible à déterminer par la démarche séquentielle, même après réalisation d'un essai in vivo d'irritation/corrosion cutanée, on peut tester in vivo l'effet corrosif ou irritant sur les yeux. La démarche expérimentale préconisée, de type séquentiel, comporte des essais de corrosion et d'irritation in vitro ou ex vivo validés, et est décrite dans l'annexe de la présente méthode. Cette démarche, élaborée au cours d'un atelier de l'OCDE (8) et recommandée à l'unanimité par les participants à cet atelier, a été adoptée à titre de recommandation dans le cadre du système de classification des substances chimiques harmonisé à l'échelon mondial (Globally Harmonized System for the Classification of Chemical Substances — GHS) (9). Bien que cette stratégie séquentielle ne fasse pas partie intégrante de la méthode d'essai B.4, elle constitue cependant la procédure recommandée avant d'entreprendre les essais in vivo. S'agissant de nouvelles substances, cette démarche expérimentale par étapes est préconisée pour obtenir des résultats scientifiques fiables sur l'effet corrosif ou irritant de la substance. En ce qui concerne les substances existantes dont les données sur l'effet corrosif ou irritant sur la peau et les yeux sont insuffisantes, on suppléera à ces dernières en appliquant cette stratégie. Le choix d'une autre démarche expérimentale ou la décision de ne pas procéder par étapes doivent être justifiés.

1.2. DÉFINITIONS L'irritation oculaire désigne des altérations oculaires qui surviennent à la suite de l'application d'une substance d'essai sur la surface antérieure de l'œil, et qui sont totalement réversibles dans les 21 jours suivant le traitement. La corrosion oculaire désigne la survenue de lésions tissulaires de l'œil ou une grave détérioration de la vision, qui sont provoqués par l'application d'une substance d'essai sur la surface antérieure de l'œil, et qui ne sont pas totalement réversibles dans les 21 jours suivant le traitement.

1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI La substance d'essai est appliquée en une seule dose sur l'un des yeux de l'animal d'expérience, l'œil non traité servant de témoin. On évalue le degré de l'irritation ou de la corrosion oculaires en cotant la gravité des lésions affectant la conjonctive, la cornée et l'iris, à intervalles déterminés. Les autres réactions de l'œil et les troubles systémiques sont également décrits de manière à fournir une évaluation complète des effets. La durée de l'étude doit être suffisante pour permettre d'évaluer la réversibilité des effets. Les animaux qui manifestent des signes persistants de détresse et/ou de douleur aiguës à n'importe quel stade de l'essai doivent être euthanasiés, et ces symptômes seront pris en compte dans l'évaluation de la substance. Les critères régissant la décision d'euthanasier les animaux moribonds et souffrant fortement sont définis dans un document cité en référence (10).

1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.4.

1.4.1. Préparation de l'essai in vivo

1.4.1.

1.4.1.1. Sélection de l'espèce animale On choisira de préférence de jeunes adultes sains parmi les lapins albinos. L'utilisation d'une autre espèce ou souche sera justifiée, le cas échéant.

1.4.1.2. Préparation des animaux Les deux yeux de chaque animal susceptible de participer à l'essai doivent être examinés dans les 24 heures précédant le début de l'essai. Les animaux qui présentent des signes d'irritation oculaire, des défauts oculaires ou une lésion de la cornée seront écartés.

1.4.2. Mode opératoire

1.4.2.

1.4.2.1. Application de la substance d'essai L'expérimentateur introduit la substance d'essai dans le sac conjonctival de l'un des yeux de chaque animal, après avoir délicatement écarté la paupière inférieure du globe oculaire. Il ramène ensuite doucement les deux paupières l'une contre l'autre et les maintient dans cette position pendant environ une seconde afin d'éviter toute perte de substance. L'autre œil, qui ne subit pas de traitement, sert de témoin.

1.4.2.2. Irrigation Il ne faut pas laver les yeux des animaux traités pendant au moins 24 heures après l'instillation de la substance d'essai, à moins que celle-ci soit à l'état solide (voir paragraphe 1.4.2.3.2) ou déclenche immédiatement des effets corrosifs ou irritants. Au besoin, un lavage pourra être effectué à l'issue de ce délai. L'utilisation d'un groupe d'animaux satellite pour étudier l'influence du lavage n'est pas indiquée, à moins qu'elle ne se justifie d'un point de vue scientifique. Le cas échéant, on utilisera deux lapins. Les conditions du lavage doivent être décrites minutieusement en indiquant, par exemple, le moment du lavage, la composition et la température de la solution ophtalmique, la durée, le volume et la vitesse d'application.

1.4.2.3. Dose

1.4.2.3.

1.4.2.3.1. Essai de liquides Pour les liquides, on utilise une dose de 0,1 ml. Il faut éviter d'instiller la substance directement dans l'œil avec un vaporisateur à pression; il est préférable d'en expulser d'abord le contenu, de prélever 0,1 ml de celui-ci dans une fiole et de l'instiller dans l'œil.

1.4.2.3.2. Essai de solides Dans le cas des solides, pâtes ou substances particulaires, la quantité utilisée doit avoir un volume de 0,1 ml ou un poids ne dépassant pas 100 mg. La substance d'essai sera broyée finement. Il convient de mesurer le volume de la substance solide après l'avoir légèrement tassée, par exemple en tapotant le récipient de mesure. Si la substance d'essai solide n'a pas encore été évacuée de l'œil de l'animal par des mécanismes physiologiques au premier moment d'observation, à savoir une heure après le traitement, l'œil peut être rincé à l'aide d'une solution saline ou à l'eau distillée.

1.4.2.3.3. Essai des aérosols Il est recommandé de prélever une dose du contenu de tous les vaporisateurs à pression et aérosols avant de l'instiller dans l'œil. La seule exception concerne les substances conditionnées en bombes aérosol sous pression, qui sont impossibles à recueillir préalablement à l'instillation car elles se vaporisent. Dans ce cas, l'expérimentateur maintient l'œil de l'animal ouvert et administre la substance à tester en un seul jet d'environ une seconde, émis à 10 cm et directement en face de l'œil. Cette distance peut être modulée en fonction de la pression du jet et de sa composition. Il faut veiller à ce que la pression du jet n'endommage pas l'œil. Dans certains cas, il pourra être nécessaire d'évaluer l'ampleur des dégâts mécaniques risquant d'être causés à l'œil par la force du jet. La dose d'aérosol peut être estimée grâce à une simulation de l'application menée comme suit: la substance est projetée à travers une ouverture de la taille d'un œil de lapin placée directement devant un papier. L'augmentation de poids du papier donne une idée approximative de la quantité administrée dans l'œil du lapin. Pour une substance volatile, la dose peut être estimée à partir du poids du récipient (dans lequel elle est recueillie) avant et après utilisation.

1.4.2.4. Essai initial (essai in vivo de l'effet irritant/corrosif sur les yeux mené sur un seul animal) Conformément à la démarche expérimentale séquentielle (voir annexe 1), il est fortement recommandé de commencer par pratiquer l'essai in vivo sur un seul animal. Si les résultats de cet essai, mené selon la procédure décrite, indiquent que la substance est corrosive ou fortement irritante pour l'œil, il n'y a pas lieu de mener d'autres essais d'irritation oculaire.

1.4.2.5. Anesthésie locale L'anesthésie locale se pratique cas par cas. Si l'analyse de la valeur probante des résultats montre que la substance risque de provoquer une douleur, ou si l'essai initial révèle que l'animal souffrira, un anesthésique local peut être administré avant l'instillation de la substance d'essai. Le type, la concentration et la dose d'anesthésique doivent être choisis avec soin pour éviter que son utilisation n'influe sur la réaction à la substance d'essai. L'œil témoin subira une anesthésie identique.

1.4.2.6. Essai confirmatoire (essai d'irritation oculaire in vivo sur des animaux supplémentaires) Si l'essai initial ne fait apparaître aucun effet corrosif, la réaction négative ou d'irritation demande à être confirmée sur un ou deux animaux supplémentaires. Si l'essai initial provoque une forte irritation, indiquant que l'essai confirmatoire pourrait donner lieu à un effet très marqué (irréversible), on recommande de conduire l'essai confirmatoire sur un mode séquentiel en n'utilisant qu'un seul animal à la fois, plutôt que d'exposer les deux animaux simultanément. Si le deuxième animal manifeste des signes de corrosion ou d'irritation grave, l'essai s'arrête là. On pourra utiliser d'autres animaux s'il y a lieu de confirmer des réactions d'irritation faibles à modérées.

1.4.2.7. Période d'observation La durée de la période d'observation doit être suffisante pour permettre d'évaluer à fond l'ampleur et la réversibilité des effets observés. Il faut cependant mettre un terme à l'expérience dès qu'un animal manifeste des signes persistants de détresse ou de douleur aiguës (9). Pour déterminer la réversibilité des effets, les animaux doivent normalement être observés durant 21 jours après l'administration de la substance d'essai. Si la réversibilité est constatée avant ce délai, l'expérience prend fin à ce moment-là.

1.4.2.7.

1.4.2.7.1. Observations cliniques et cotation de la gravité des réactions oculaires On examine les yeux 1, 24, 48 et 72 heures après l'application de la substance d'essai. Les animaux ne seront maintenus à l'épreuve que le temps nécessaire pour obtenir un résultat concluant. Les animaux manifestant des signes persistants de douleur ou de détresse aiguës doivent être euthanasiés rapidement, et ces symptômes sont à prendre en compte dans l'évaluation de la substance d'essai. Il faudra également euthanasier les animaux qui présentent les lésions oculaires suivantes à la suite de l'instillation: perforation de la cornée ou ulcération profonde de la cornée associée à un staphylome; présence de sang dans la chambre antérieure de l'œil; opacité cornéenne de niveau 4 persistant durant 48 heures; absence de réflexe protomoteur (réaction indienne de niveau 2) durant 72 heures; ulcération de la membrane conjonctivale; nécrose des conjonctives ou de la membrane nictitante, ou décollement du tissu nécrosé. L'euthanasie s'impose parce que ces lésions sont généralement irréversibles. Les animaux qui ne présentent pas de lésions oculaires peuvent être écartés, mais seulement à partir du quatrième jour suivant l'instillation. Les animaux affectés de lésions légères à modérées doivent être gardés en observation jusqu'à ce que ces lésions disparaissent, ou durant 21 jours, soit jusqu'au terme de l'étude. L'expérimentateur déterminera la nature et la gravité des lésions ainsi que leur réversibilité en observant les animaux aux septième, quatorzième et vingt et unième jours. L'intensité des réactions oculaires (conjonctives, cornée et iris) doit être consignée à chaque examen (tableau I). Toute autre lésion oculaire (par exemple un pannus, une coloration) et les troubles systémiques doivent également être signalés. Pour examiner les réactions, on peut s'aider d'une loupe binoculaire, d'une lampe à fente portative, d'un biomicroscope ou d'un autre appareil approprié. Après l'enregistrement des observations effectuées à la vingt-quatrième heure, l'examen des yeux peut se poursuivre à la fluorescéine. La cotation des réactions oculaires est forcément subjective. L'harmonisation de la cotation des réactions oculaires et l'appui aux laboratoires d'essai ainsi qu'au personnel chargé d'effectuer et d'interpréter les observations passent par une formation adéquate des expérimentateurs au système de cotation utilisé. La cotation des réactions cutanées devrait faire l'objet d'une évaluation à l'aveugle.

2. RÉSULTATS

2.

2.2. ÉVALUATION DES RÉSULTATS Le degré d'irritation oculaire devrait être évalué en considération de la gravité des lésions et de leur caractère réversible ou non. Les cotes individuelles ne fournissent pas une valeur absolue des propriétés irritantes d'une substance, celles-ci étant évaluées parallèlement à d'autres effets de la substance. En revanche, les cotes individuelles ont une valeur de référence et ne sont significatives que lorsqu'elles sont appuyées par une description et une évaluation complètes de toutes les observations.

3. RAPPORT

3.

3.1. RAPPORT D'ESSAI Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:

Justification de l'essai in vivo: analyse de la valeur probante des résultats d'essais préexistants, notamment ceux qui procèdent de la démarche expérimentale séquentielle:

description des données pertinentes livrées par des essais précédents,

données obtenues à chaque étape de la démarche expérimentale,

description des essais effectués in vitro, détaillant les procédures utilisées et mentionnant les résultats obtenus avec les substances d'essai et avec les substances de référence,

description de l'étude d'irritation/corrosion cutanée menée in vivo, mentionnant les résultats obtenus,

justification de l'étude in vivo après analyse de la valeur probante des résultats disponibles.

Substance d'essai:

données d'identification (par exemple, numéro CAS, source, pureté, impuretés connues, numéro de lot),

état physique et propriétés physico-chimiques (par exemple, pH, volatilité, solubilité, stabilité, réactivité avec l'eau),

s'il s'agit d'un mélange: composition et pourcentages relatifs des constituants,

si on a eu recours à une anesthésie locale: identification, pureté, type, dose et interaction potentielle avec la substance d'essai.

Véhicule:

identification, concentration (s'il y a lieu), volume utilisé,

justification du choix du véhicule.

Animaux, d'expérience:

espèce/souche utilisée, justification de l'utilisation éventuelle d'un animal autre que le lapin albinos,

âge de chaque animal au début de l'essai,

nombre d'animaux de chaque sexe dans les groupes d'essai et témoin (le cas échéant),

poids de chaque animal au début et à la fin de l'essai,

source des animaux, conditions d'encagement, régime alimentaire, etc.

Résultats:

description de la méthode utilisée pour coter l'irritation à chaque moment d'observation (par exemple lampe à fente portative, biomicroscope, fluorescéine),

présentation sous forme de tableaux des réactions d'irritation ou de corrosion relevées chez chaque animal et à chaque moment d'observation jusqu'à la fin de la participation de chaque animal à l'essai,

description circonstanciée du degré et de la nature de l'irritation ou de la corrosion observées,

description de toute autre lésion oculaire observée (par exemple vascularisation, formation d'un pannus, adhérences, coloration),

description des effets non oculaires locaux et des troubles systémiques, ainsi que des observations histopathologiques, le cas échéant.

Discussion des résultats.

3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS L'extrapolation à l'humain des résultats d'études d'irritation oculaire menées sur des animaux de laboratoire n'est valable que dans une certaine mesure. Dans bien des cas, le lapin albinos est plus sensible que l'espèce humaine aux substances irritantes ou corrosives pour l'œil. Lors de l'interprétation des résultats, il faut savoir reconnaître une irritation consécutive à une infection secondaire, laquelle ne doit pas être prise en compte.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)

BIBLIOGRAPHIE Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410- 429. De Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Cerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159-164. Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, p. 161-177. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, p. 19-26. Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483-524. Méthode d'essai B.40. Corrosion cutanée. Méthode d'essai B.4. Toxicité aiguë: irritation/corrosion cutanée. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 - 24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tableau I Cotation des réactions oculaires

Cornée

Opacité: degré de densité (les observations porteront sur les zones les plus denses) Pas d'ulcération ni d'opacité … 0 Zones d'opacité (autres qu'un léger ternissement de l'éclat normal) dispersées ou diffuses; détails de l'iris nettement visibles … 1 Zone translucide aisément discernable; détails de l'iris légèrement masqués … 2 Zone nacrée; détails de l'iris complètement invisibles; dimension de la pupille à peine discernable … 3 Cornée opaque; iris non discernable à travers l'opacité … 4 Maximum possible: 4 NOTES

Iris

Normal … 0 Plis nettement plus profonds, congestion, tuméfaction, hyperhémie péricornéenne modérée ou conjonctives injectées; iris réactif à la lumière (une réaction lente est positive) … 1 Hémorragie, destruction marquée, ou absence de réaction à la lumière … 2 Maximum possible: 2

Conjonctives

Rougeur (s'applique aux conjonctives palpébrale et bulbaire, mais pas à la cornée ni à l'iris) Normal … 0 Hyperhémie de certains vaisseaux sanguins (yeux injectés) … 1 Coloration pourpre diffuse, vaisseaux sanguins difficilement discernables les uns des autres … 2 Coloration rouge soutenu diffuse … 3 Maximum possible: 3

Chémosis

Tuméfaction (s'applique aux paupières et/ou aux membranes nictitantes) Normal … 0 Tuméfaction légèrement supérieure à la normale … 1 Tuméfaction patente avec éversion partielle des paupières … 2 Tuméfaction avec paupières à demi closes … 3 Tuméfaction avec paupières plus qu'à demi closes … 4 Maximum possible: 4

B.6. SENSIBILISATION CUTANÉE

B.6.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Remarques La sensibilité des essais et leur capacité à détecter les substances susceptibles d'entraîner une sensibilisation cutanée chez l'homme sont des critères importants dans un système de classification de la toxicité établi à des fins de santé publique. Il n'existe pas de méthode d'essai unique qui permette d'identifier de manière adéquate toutes les substances ayant un potentiel de sensibilisation cutanée pour l'homme et qui puisse être appliquée à toutes les substances. Divers facteurs tels que les caractéristiques physiques d'une substance, y compris son pouvoir de pénétration cutanée, doivent être pris en considération lors du choix de l'essai. Deux types d'essai utilisant des cobayes ont été développés: d'une part, les essais avec adjuvant dans lesquels l'état est potentialisé par la dissolution ou la mise en suspension dans de l'adjuvant complet de Freund (ACF) de la substance à tester, et d'autre part les essais sans adjuvant. Les essais avec adjuvant ont généralement un meilleur pouvoir prédictif du potentiel sensibilisant cutanée de la substance testée avec plus de précision que les méthodes qui n'utilisent pas l'adjuvant complet de Freund. C'est la raison pour laquelle leur utilisation est préférable. L'essai de maximalisation chez le cobaye (GPMT: Guinea Pig Maximisation Test) est un essai avec adjuvant très répandu. Bien qu'il existe plusieurs autres méthodes pour détecter le potentiel de sensibilisation cutanée, le GPMT est l'essai avec adjuvant de prédilection. Les essais sans adjuvant (l'essai de Buehler étant préférable) sont considérés comme moins sensibles vis-à-vis de nombreuses classes de produits chimiques. Dans certains cas, l'essai de Buehler qui consiste en une application topique, peut s'avérer préférable à l'essai de maximalisation qui nécessite une injection intradermique. L'utilisation de l'essai de Buehler doit être scientifiquement justifiée. L'essai de maximalisation chez le cobaye (GMPT) et l'essai de Buehler sont décrits dans cette méthode. D'autres méthodes peuvent être utilisées, à condition qu'elles soient correctement validées et que leur utilisation soit scientifiquement justifiée. Si un résultat positif est obtenu dans un test de dépistage reconnu, une substance peut être considérée comme un sensibilisant potentiel et il peut ne pas être nécessaire de réaliser un essai complémentaire sur le cobaye. Cependant si un résultat négatif est obtenu dans un tel test de dépistage, un essai sur le cobaye doit être effectué en utilisant la procédure décrite dans la présente méthode d'essai. Voir également introduction générale, partie B.

1.2. DÉFINITIONS La sensibilisation cutanée (dermite allergique de contact) est une réaction immunologique cutanée à une substance. Chez l'homme, la réaction peut se caractériser par un prurit, un érythème, un œdème, des vésicules, des bulles ou une association de ces manifestations. Dans les autres espèces, la réaction peut différer et prendre uniquement la forme d'un érythème ou d'un œdème. Exposition d'induction: exposition expérimentale d'un sujet à une substance dans le but d'induire une hypersensibilité. Période d'induction: période d'au moins une semaine consécutive à l'exposition d'induction, au cours de laquelle une hypersensibilité peut s'installer. Exposition de déclenchement: exposition expérimentale, après période d'induction, d'un sujet préalablement exposé à la substance, dans le but de vérifier si le sujet présente une réaction d'hypersensibilité.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE La sensibilité et la fiabilité de la technique expérimentale utilisée doivent être vérifiées tous les six mois à l'aide de substances ayant des propriétés connues de sensibilisation cutanée faible à modérée. Pour un essai conduit selon les règles, les substances faiblement ou moyennement sensibilisantes provoquent normalement une réaction d'au moins 30 % dans les méthodes avec adjuvant et 15 % dans les méthodes sans adjuvant. Les substances suivantes seront de préférence utilisées: Numéro CAS Numéro EINECS Dénomination EINECS Dénomination usuelle 101-86-0 202-983-3 α-hexylcinnamaldéhyde α-hexylcinnamaldéhyde 149-30-4 205-736-8 benzothiazole-2-thiol (mercaptobenzothiazole) kaptax 94-09-7 202-303-5 benzocaïne nordcaïne Dans certaines circonstances dûment justifiées, il est possible d'utiliser d'autres substances répondant aux critères ci-dessus.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Les animaux d'expérience sont dans un premier temps exposés à la substance à tester par une injection intradermique et/ou une application épidermique (exposition d'induction). Après une période de repos de 10 à 14 jours (période d'induction) au cours de laquelle une réaction immunitaire peut se produire, les animaux sont exposés à une dose de déclenchement. L'étendue et le degré de la réaction cutanée des animaux sont alors comparées à celles de la réaction observée chez les animaux témoins qui ont reçu un placebo lors de 1 induction et qui ont été soumis à l'exposition de déclenchement.

1.5. DESCRIPTION DES MÉTHODES D'ESSAI Si l'élimination de la substance à tester s'avère nécessaire, ceci doit être fait en utilisant de l'eau ou un solvant approprié afin de ne pas modifier la réaction existante ou l'intégrité de l'épiderme.

1.5.

1.5.1. Essai de maximalisation chez le cobaye (GMPT)

1.5.1.

1.5.1.1. Préparation De jeunes cobayes albinos, sains, sont acclimatés aux conditions du laboratoire pendant au moins cinq jours avant le début de l'essai. Avant l'essai, les animaux sont répartis au hasard en lots à traiter et lots témoins. Les poils sont tondus, rasés ou épilés chimiquement selon la méthode utilisée. Il faut veiller à ne pas érafler la peau. Les animaux sont pesés avant le début et à la fin de l'essai.

1.5.1.2. Conditions de l'essai

1.5.1.2.

1.5.1.2.1. Animaux d'expérience Souches de cobayes albinos couramment utilisées en laboratoire.

1.5.1.2.2. Nombre et sexe On peut utiliser des animaux de l'un ou l'autre sexe. Si l'on utilise des femelles, elles doivent être nullipares et non gravides. Le lot traité comprend au minimum 10 animaux et le lot témoin, au moins 5. Si le lot traité comprend moins de 20 animaux et le lot témoin moins de 10, et qu'il n'est pas possible de conclure que la substance à tester est un agent sensibilisant. Dans ce cas, il est fortement recommandé d'utiliser d'autres animaux afin d'arriver à un total d'au moins 20 animaux d'essai et 10 animaux témoins.

1.5.1.2.3. Doses La concentration de substance utilisée pour chaque exposition d'induction doit être bien tolérée par l'organisme des animaux et doit correspondre à la concentration maximale entraînant une irritation cutanée légère à modérée. La concentration utilisée pour l'exposition de déclenchement doit correspondre à la concentration maximale n'entraînant pas d'irritation. Si nécessaire, les concentrations appropriées peuvent être déterminées à partir d'un essai pilote impliquant deux ou trois animaux. À cet effet, il convient d'utiliser des animaux traités par l'adjuvant complet de Freund.

1.5.1.3. Mode opératoire

1.5.1.3.

1.5.1.3.1. Induction Jour 0 — lot traité Trois séries de deux injections intradermiques d'un volume de 0,1 ml chacune sont pratiquées dans la région scapulaire préalablement débarrassée de ses poils, de part et d'autre de la ligne médiane. Injection 1: mélange 1:1 (v/v) adjuvant complet de Freund/eau ou sérum physiologique Injection 2: la substance à tester dans un véhicule adéquat, à la concentration sélectionnée Injection 3: la substance à tester à la concentration voulue, mélangée dans un rapport 1:1 (v/v) à de l'adjuvant complet de Freund ou du sérum physiologique. Pour l'injection 3, les substances hydrosolubles sont dissoutes dans la phase aqueuse avant d'être mélangées avec l'adjuvant complet de Freund. Les substances liposolubles ou insolubles sont d'abord mises en suspension dans 1 adjuvant complet de Freund, puis mises en phase aqueuse. La concentration finale de la substance à tester doit être égale à celle utilisée pour l'injection 2. Les injections 1 et 2 sont pratiquées à proximité l'une de l'autre et le plus près possible de la tête, tandis que l'injection 3 est effectuée vers la partie caudale de la zone d'essai. Jour 0 — lot témoin Trois séries de deux injections intradermiques d'un volume de 0,1 ml chacune sont réalisées aux mêmes endroits que chez les animaux traités. Injection 1: mélange 1:1 (v/v) adjuvant complet de Freund/eau ou sérum physiologique Injection 2: le véhicule non dilué Injection 3: formulation à 50 % du véhicule dans un mélange 1:1 d'adjuvant complet de Freund/eau ou sérum physiologique. 5e — 7e jour — lot traité et lot témoin Environ 24 heures avant l'application topique d'induction et si la substance ne provoque pas d'irritation cutanée, la zone d'essai rasée et/ou tondue est badigeonnée avec 0,5 ml de lauryl sulfate de sodium à 10 % dans de la vaseline, afin de créer une irritation locale. 6e — 8e jour — lot traité La zone d'essai est à nouveau débarrassée de ses poils. Un papier filtre (2 x 4 cm) imprégné de la substance dans le véhicule approprié est appliqué sur la zone d'essai et maintenu en contact avec la peau à l'aide d'un pansement occlusif pendant 48 heures. Le choix du véhicule doit être justifié. Les substances solides sont réduites en poudre fine et incorporées dans un véhicule approprié; les substances liquides peuvent éventuellement être appliquées directement. 6e — 8e jour — lot témoin La zone d'essai est à nouveau débarrassée de ses poils. Le véhicule seul est appliqué comme indiqué précédemment sur la zone d'essai et maintenu en contact avec la peau pendant 48 heures à l'aide d'un pansement occlusif.

1.5.1.3.2. Déclenchement 20e — 22ème jour — lot traité et lot témoin Les flancs des animaux traités et des animaux témoins sont débarrassés de leurs poils. Un patch ou une cupule chargés de la substance à tester est appliquée sur un des flancs des animaux et, s'il y a lieu, un patch ou une cupule imprégnés uniquement du véhicule est appliquée sur l'autre flanc. Les pastilles sont maintenues en contact avec la peau pendant 24 heures à l'aide d'un pansement occlusif.

1.5.1.3.3. Observation et cotation: lot traité et lot témoin Il est recommandé de procéder à une lecture en aveugle chez les animaux traités et les animaux témoins. S'il est nécessaire de préciser les résultats obtenus lors de la première exposition de déclenchement, une seconde exposition de déclenchement (c'est-à-dire redéclenchement), si nécessaire avec un nouveau lot témoin, sera envisagée environ une semaine après la première exposition. La nouvelle exposition de déclenchement peut également être effectuée sur le lot témoin initial. Toutes les réactions cutanées et toutes les observations inhabituelles, y compris les réactions systémiques, résultant d'une exposition d'induction ou de déclenchement, doivent être observées et cotées d'après l'échelle de Magnusson/Kligman (voir annexe). D'autres techniques telles qu'un examen histopathologique ou la mesure de l'épaisseur du pli cutané peuvent être utilisées pour préciser les réactions douteuses.

Environ 21 heures après le retrait de la pastille, la zone étudiée est nettoyée et rasée et/ou tondue et épilée si nécessaire;

3 heures plus tard environ (à peu près 48 heures après le début de l'application de déclenchement), la réaction cutanée est observée et cotée d'après l'échelle indiquée en annexe;

environ 24 heures après cette observation, on procède à une seconde observation (72 heures) et à une nouvelle cotation.

1.5.2. Essai de Buehler

1.5.2.

1.5.2.1. Préparation De jeunes cobayes albinos, sains, sont acclimatés aux conditions du laboratoire pendant au moins cinq jours avant le début de l'essai. Avant l'essai, les animaux sont répartis au hasard en lots à traiter et lots témoins. Les poils sont coupés, rasés ou éventuellement épilés chimiquement selon la méthode utilisée. Il faut veiller à ne pas érafler la peau. Les animaux sont pesés avant le début et à la fin de l'essai.

1.5.2.2. Conditions de l'essai

1.5.2.2.

1.5.2.2.1. Animaux d'expérience Souches de cobayes albinos couramment utilisées en laboratoire.

1.5.2.2.2. Nombre et sexe On peut utiliser des animaux de l'un ou l'autre sexe. Si l'on utilise des femelles, elles doivent être nullipares et non gravides. Le lot traité comprend au minimum 20 animaux et le lot témoin, au moins 10.

1.5.2.2.3. Doses Pour chaque exposition d'induction, la concentration de substance à utiliser est la concentration maximale entraînant une irritation modérée mais non excessive. Pour l'exposition de déclenchement, la concentration à utiliser est la concentration maximale n'entraînant pas d'irritation. Si nécessaire, les concentrations appropriées peuvent être déterminées à partir d'un essai pilote impliquant deux ou trois animaux. Pour les substances hydrosolubles, il convient d'utiliser comme véhicule de l'eau ou une solution diluée non irritante de surfactant. Pour les autres substances, il est préférable d'utiliser un mélange d'éthanol à 80 % dans de l'eau pour l'induction, et de l'acétone pour le déclenchement.

1.5.2.3. Mode opératoire

1.5.2.3.

1.5.2.3.1. Induction Jour 0 — lot traité Un des flancs des animaux est rasé. La compresse servant à réaliser le test est imprégnée de la substance à tester incorporée dans un véhicule approprié (le choix du véhicule doit être justifié; les substances liquides peuvent au besoin être appliquées directement). La compresse est appliquée sur la zone d'essai et maintenue en contact avec la peau pendant 6 heures à l'aide d'un pansement occlusif ou d'une cupule et d'un pansement approprié. Le système doit être occlusif. Un tampon de ouate rond ou carré de 4 à 6 cm2 convient. Il est préférable d'utiliser un dispositif de contention approprié pour garantir l'occlusion. Si l'on utilise des bandages, des expositions supplémentaires peuvent s'avérer nécessaires. Jour 0 — lot témoin Un des flancs des animaux est rasé. Le véhicule seul est appliqué de la façon décrite pour les animaux traités. La compresse servant à réaliser le test est maintenue en contact avec la peau pendant 6 heures à l'aide d'un pansement occlusif ou d'une cupule et d'un pansement approprié. S'il peut être prouvé qu'il n'est pas nécessaire de simuler le traitement sur le lot témoin, cette étape peut être omise, un contrôle ne recevant rien peut être utilisé. 6e — 8e jour et 13e — 15e jour — lot traité et lot témoin La même application que celle décrite au jour 0 est réalisée sur la même zone (débarrassée de ses poils si nécessaire) du même flanc au 6e — 8e jour, puis à nouveau au 13e — 15e jour.

1.5.2.3.2. Déclenchement 27e — 29e jour — lot traité et lot témoin Le flanc non traité des animaux du lot traité et du lot témoin est rasé. Une compresse occlusive ou une cupule contenant la quantité appropriée de la substance à tester, à la concentration maximale n'entraînant pas d'irritation, est appliquée sur la partie postérieure du flanc non traité des animaux du lot traité et du lot témoin. S'il y a lieu, on appliquera également une compresse occlusive ou une cupule ne contenant que le véhicule sur la partie antérieure du flanc non traité des animaux du lot traité et du lot témoin. Les compresses ou cupules sont maintenues en contact avec la peau à l'aide d'un pansement approprié pendant 6 heures.

1.5.2.3.3. Observations et cotation Il est recommandé d'effectuer une lecture en aveugle de la réaction dans le lot traité et le lot témoin. S'il est nécessaire de préciser les résultats obtenus lors de la première exposition de déclenchement, une seconde exposition de déclenchement, si nécessaire avec un nouveau lot témoin, sera envisagée environ une semaine après la première exposition. La nouvelle exposition de déclenchement peut également être effectuée sur le lot témoin initial. Toutes les réactions cutanées et toutes les observations inhabituelles, y compris les réactions systémiques, résultant d'une exposition d'induction ou de déclenchement (c'est-à-dire de redéclenchement), doivent être consignées et cotées d'après l'échelle de Magnusson/Kligman (voir annexe). D'autres techniques telles qu'un examen histopathologique ou la mesure de l'épaisseur du pli cutané peuvent être utilisées pour préciser les réactions douteuses.

Environ 21 heures après le retrait de la compresse, la zone d'essai est débarrassée de ses poils;

environ trois heures plus tard (à peu près 30 heures après le début de l'exposition de déclenchement), la réaction cutanée est observée et cotée d'après l'échelle indiquée en annexe;

environ 24 heures après cette observation (soit environ 54 heures après l'exposition de déclenchement), la réaction cutanée est à nouveau observée et cotée.

2. RÉSULTATS (GMPT ET ESSAI DE BUEHLER) Les résultats sont récapitulés sous forme de tableaux indiquant, pour chaque animal, la réaction cutanée lors de chaque observation.

3. COMPTE RENDU (GMPT ET ESSAI DE BUEHLER) Lorsqu'un test de dépistage [par exemple essai local sur ganglions lymphatiques (LLNA), essai de gonflement de l'oreille de souris (MEST)], est effectué préalablement à l'essai sur le cobaye, il convient d'en fournir la description ou la référence, ainsi que les détails du mode opératoire et les résultats obtenus avec la substance à tester et les substances de référence.

3. Procès-verbal d'essai (GMPT et essai de Buehler)

Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

Animaux d'expérience:

souche de cobayes utilisée,

nombre, âge et sexe des animaux,

origine, conditions d'hébergement, régime alimentaire, etc.,

poids de chaque animal au début de l'essai.

Conditions expérimentales:

technique de préparation du site d'application,

détails sur les matériaux utilisés pour l'application et la technique d'application,

résultats de l'étude pilote et conclusions concernant les concentrations d'induction et de déclenchement à utiliser dans l'essai,

détails concernant la préparation, l'application et l'élimination de la substance à tester,

justification du choix du véhicule,

concentrations du véhicule et de la substance à tester utilisées pour les expositions d'induction et de déclenchement, et quantité totale de substance appliquée pour l'induction et le déclenchement.

Résultats:

résumé des résultats du dernier contrôle de sensibilité et de fiabilité (voir 1.3), y compris informations sur la substance, la concentration et le véhicule utilisés,

toute observation effectuée sur chaque animal, cotations comprises,

description de la nature et de la gravité des effets observés,

toute observation histopathologique.

Discussion des résultats

Conclusions

4. RÉFÉRENCES Cette méthode reprend la ligne directrice 406 de l'OCDE.

B.7. TOXICITÉ (ORALE) PAR ADMINISTRATION RÉPÉTÉE (28 JOURS)

B.7.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B.

1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale, partie B.

1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI La substance à tester est administrée quotidiennement, par voie orale, à doses croissantes, à plusieurs lots d'animaux d'expérience, à raison d'une dose par lot pendant 28 jours. Pendant la période d'administration, les animaux sont observés attentivement chaque jour pour déceler les éventuels signes de toxicité. Les animaux qui meurent ou qui sont sacrifiés en cours d'expérience ainsi que ceux qui survivent jusqu'à! a fin de l'essai sont autopsiés. Cette méthode insiste davantage sur les effets neurologiques; les observations cliniques doivent être effectuées avec grand soin pour obtenir le maximum d'informations possible. La méthode vise à identifier les produits chimiques ayant un potentiel neurotoxique qui pourrait nécessiter des études plus approfondies. En outre, cette méthode peut fournir des indications sur les effets immunologiques et sur la toxicité de la substance pour les organes de la reproduction.

1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.4.

1.4.1. Préparation De jeunes animaux adultes, sains, sont répartis au hasard en lots traités et lots témoins. Les cages seront disposées de façon à minimiser les éventuels effets dus à l'emplacement des cages. Les animaux sont identifiés individuellement et maintenus dans leur cage pendant au moins cinq jours avant le début de l'étude, pour leur permettre de s'acclimater aux conditions régnant dans le laboratoire. La substance à tester est administrée par gavage ou dans l'alimentation ou l'eau de boisson. La méthode d'administration orale dépend du but de l'étude et des propriétés physico-chimiques de la substance. Si nécessaire, la substance à tester est dissoute ou mise en suspension dans un véhicule approprié. Chaque fois que possible, on utilisera plutôt une solution/suspension aqueuse, ou sinon une solution/émulsion huileuse (par exemple huile de maïs) et en dernier lieu d'autres véhicules. Si le véhicule utilisé n'est pas de l'eau, ses caractéristiques toxiques doivent être connues. Il convient de déterminer la stabilité de la substance à tester dans le véhicule.

1.4.2. Conditions de l'essai

1.4.2.

1.4.2.1. Animaux d'expérience Les expériences sont de préférence effectuées sur le rat, mais d'autres espèces de rongeurs peuvent être utilisées. Les animaux adultes jeunes et sains sont issus de souches couramment utilisées en laboratoires. Les femelles doivent être nullipares et non gravides. L'administration de la substance doit débuter le plus tôt possible après le sevrage, et dans tous les cas, avant que les animaux aient atteint l'âge de neuf semaines. Au début de l'étude, l'écart de poids entre les animaux doit être minime et ne doit pas dépasser — 20 % du poids moyen de chaque sexe. Lorsqu'une étude par administration orale répétée est effectuée préalablement à une étude à long terme, il est préférable d'utiliser des animaux de même souche et de même origine pour les deux études.

1.4.2.2. Nombre et sexe Dix animaux au moins (5 femelles et 5 mâles) sont utilisés pour chaque dose. Si le protocole expérimental prévoit des sacrifices en cours d'étude, le nombre d'animaux doit être augmenté du nombre de sacrifices prévus. En outre, un lot satellite de 10 animaux (cinq de chaque sexe) peut être traité à la dose la plus élevée pendant 28 jours et placé en observation pendant 14 jours après l'arrêt du traitement pour étudier la réversibilité, la persistance ou l'apparition tardive des effets toxiques. Un lot satellite de 10 animaux témoins est également utilisé.

1.4.2.3. Niveau des doses On utilise en général au moins trois lots d'essai et un lot témoin. A l'exception de la substance à tester, les animaux du lot témoin reçoivent le même traitement que les animaux des lots traités. Si un véhicule est utilisé pour administrer la substance à tester, le volume maximal de ce véhicule sera administré au lot témoin. S'il ressort de l'évaluation d'autres données que l'administration d'une dose de 1000 mg/kg/j ne devrait pas entraîner d'effets, il est possible d'effectuer un essai de limite. En l'absence de données pertinentes, on peut procéder à une étude exploratoire pour aider à déterminer les doses à utiliser. Les doses doivent être choisies en tenant compte de toutes les données disponibles concernant la toxicité et les aspects toxicocinétiques de la substance à tester ou des substances de structure analogue. La dose la plus élevée doit produire des effets toxiques sans entraîner la mort ni des souffrances intenses. Une série de doses décroissantes est ensuite choisie, dans le but de mettre en évidence une relation entre la réaction et la dose administrée et d'objectiver une absence d'effets adverses à la dose la plus faible (dose sans effet adverse observé). L'écart optimal entre deux doses est souvent un facteur 2 à 4; il est préférable de prévoir une quatrième dose plutôt que d'avoir un écart excessif entre deux doses (plus qu'un facteur 10). Pour les substances qui sont administrées dans l'alimentation ou dans l'eau de boisson, il est important de vérifier que les quantités de substance d'essai administrées n'interfèrent pas sur la nutrition normale et l'équilibre hydrique. Si la substance est administrée dans l'alimentation, on peut utiliser une concentration alimentaire constante (ppm) ou une dose constante par rapport au poids de l'animal; la solution choisie doit être précisée. Si la substance est administrée par gavage, la dose doit être administrée chaque jour à heure fixe et si nécessaire ajustée pour rester constante par rapport au poids de l'animal. Lorsqu'une étude par administration orale répétée est effectuée préalablement à une étude à long terme, le régime alimentaire doit être identique dans les deux études.

1.4.2.4. Essai limite Lorsqu'un essai réalisé selon les méthodes décrites dans la présente étude, à une dose d'au moins 1000 mg/kg poids corporel/jour, ou en cas d'administration dans l'alimentation ou l'eau de boisson, à une concentration équivalente (en fonction du poids corporel), ne produit pas d'effets toxiques observables et que les données relatives à des substances de structure apparentée ne laissent pas présumer une toxicité, il peut s'avérer inutile d'effectuer une étude complète sur trois doses. Dans ce cas, un essai limite se justifie, sauf si l'exposition humaine fait apparaître la nécessité d'utiliser une dose plus élevée.

1.4.2.5. Période d'observation La période d'observation dure 28 jours. Les animaux des lots satellites prévus pour des observations complémentaires seront maintenus en observation, sans aucun traitement, pendant 14 jours supplémentaires au moins, afin de détecter l'apparition retardée, la persistance ou la réversibilité des effets toxiques.

1.4.3. Mode opératoire La substance à tester est administrée aux animaux sept jours sur sept pendant 28 jours. Si la substance n'est administrée qu'à raison de cinq jours par semaine, ce choix doit être justifié. En cas d'administration par gavage, la dose doit être administrée en une fois à l'aide d'une sonde œsophagienne ou d'une canule à intubation appropriée. Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une fois dépend de la taille de l'animal. Ce volume ne doit pas excéder 1 ml/100 g de poids corporel, mais peut atteindre 2 ml/100 g de poids corporel lorsqu'il s'agit de solutions aqueuses. Sauf en ce qui concerne les substances irritantes ou corrosives pour lesquelles une augmentation de la concentration entraînerait des effets exacerbés, la variabilité des volumes d'essai doit être minimisée par un ajustement des concentrations, afin que le volume reste constant quelle que soit la dose.

1.4.3.

1.4.3.1. Observation générale L'observation clinique générale doit être effectuée au moins une fois par jour, de préférence au(x) même(s) moment(s) de la journée, en fonction de la période post-administration où les effets sont les plus marqués. L'état de santé des animaux doit être consigné. Au moins deux fois par jour, tous les animaux sont examinés pour déterminer la morbidité et la mortalité. Les animaux moribonds ou présentant des signes de détresse ou de souffrance intenses sont immédiatement retirés, euthanasiés et autopsiés. Tous les animaux sont soumis à une observation clinique détaillée une fois avant la première exposition (pour permettre des comparaisons sur un même sujet) et au moins une fois par semaine par la suite. Ces observations doivent être effectuées sur les animaux sortis de leur cage et placés dans une enceinte standard, et doivent de préférence avoir lieu toujours au même moment. Les observations doivent être soigneusement consignées, de préférence à l'aide de systèmes de notation explicitement définis par le laboratoire d'essai. Il convient de veiller à ce que les conditions expérimentales varient le moins possible, il est souhaitable que les personnes qui effectuent les observations ne soient pas informées du traitement administré. Les observations doivent porter, entre autres, sur les modifications de la peau, du poil, des yeux, des muqueuses, des sécrétions et excrétions et de l'activité autonome (par exemple larmoiement, hérissement du poil, respiration inhabituelle). Il convient également de noter tout changement de comportement, de posture ou de réaction à la manipulation, ainsi que la présence de mouvements cloniques ou toniques, comportements stéréotypés (par exemple, toilettage excessif, animaux qui tournent en rond de façon répétitive) ainsi que tout comportement bizarre (automutilation, marche à reculons). Au cours de la quatrième semaine d'exposition, la réactivité aux différents stimuli sensoriels (auditifs, visuels et proprioceptifs), ainsi que la force de préhension et l'activité motrice sont évaluées. Les méthodes utilisables à cet effet sont détaillées dans les publications de référence (voir introduction générale, partie B). Les observations fonctionnelles de la quatrième semaine d'exposition peuvent être omises si l'étude est effectuée préalablement à une étude subchronique (sur 90 jours). Dans ce cas, les observations fonctionnelles doivent faire partie de l'étude complémentaire. En revanche, l'existence de données résultant des observations fonctionnelles effectuées lors de l'étude préliminaire par administration réitérée peut faciliter le choix des doses pour l'étude subchronique complémentaire. Exceptionnellement, les observations fonctionnelles peuvent également être omises pour les lots qui montrent des signes de toxicité tels que les examens fonctionnels perdraient de leur valeur.

1.4.3.2. Poids corporel et consommation de nourriture et d'eau Tous les animaux doivent être pesés au moins une fois par semaine. La consommation d'aliments et d'eau doit être mesurée au minimum une fois par semaine. Si la substance est administrée dans l'eau de boisson, la consommation d'eau doit également être mesurée une fois par semaine au minimum.

1.4.3.3. Hématologie Les examens hématologiques suivants doivent être réalisés à la fin de la période d'essai: hématocrite, concentration en hémoglobine, numération des hématies et des leucocytes et formule leucocytaire, numération des plaquettes et mesure du temps/potentiel de coagulation. Les échantillons de sang doivent être prélevés en un point déterminé, juste avant ou pendant le sacrifice des animaux, et conservés dans des conditions appropriées.

1.4.3.4. Biochimie clinique Des analyses biochimiques cliniques visant à étudier les principaux effets toxiques sur les tissus et en particulier sur le foie et les reins doivent être effectuées sur les échantillons de sang prélevés sur tous les animaux juste avant ou pendant le sacrifice (à l'exception des animaux retrouvés moribonds ou sacrifiés en cours d'essai). Il est préférable que les animaux soient à jeun depuis la veille. Ces déterminations effectuées dans le sérum ou le plasma concernent notamment le sodium, le potassium, le glucose, le cholestérol total, l'urée, le créatinine, les protéines totales et l'albumine, et au moins deux enzymes révélatrices des effets hépatocellulaires (telles que l'alanine, aminotransférase, l'aspartate aminotransférase, la phosphatase alcaline, la gamma-glutamyl transpeptidase et la sorbitol-deshydrogénase). La détermination d'autres enzymes (d'origine hépatique ou autre) ainsi que des acides biliaires peut dans certains cas fournir des informations utiles. Éventuellement, des analyses d'urine peuvent être effectuées au cours de la dernière semaine de l'étude, comprenant un recueil du volume urinaire en un temps donné: aspect, volume, osmolalité ou densité, pH, protéines, glucose, de sang ou de cellules sanguines. En outre, des études portant sur les marqueurs sériques des lésions tissulaires doivent être considérées. Les autres déterminations éventuellement nécessaires lorsque les propriétés de la substance à tester sont susceptibles de modifier les profils métaboliques concernant le calcium, le phosphate, les triglycérides à jeun, les hormones spécifiques, le méthémoglobine et la cholinestérase. Ces analyses devront être effectuées systématiquement pour les substances appartenant à certaines classes et au cas par cas pour les autres. Dans l'ensemble, la démarche adoptée doit être souple et pouvoir être adaptée en fonction de l'espèce utilisée et des effets observés et/ou prévisibles de la substance considérée. Si les données historiques de base recueillies antérieurement sont insuffisantes, les paramètres hématologiques et biochimiques devront être déterminés avant le début de l'expérience.

1.4.3.5. Autopsie Tous les animaux de l'étude doivent faire l'objet d'une autopsie détaillée comportant un examen approfondi de la surface externe du corps, de tous les orifices ainsi que des cavités crânienne, thoracique et abdominale et de leur contenu. Le foie, les reins, les glandes surrénales, les testicules, les épididymes, le thymus, la rate, le cerveau et le cœur de tous les animaux seront débarrassés de tous les tissus adhérents et pesés le plus rapidement possible pour éviter le dessèchement. Les tissus ci-après seront conservés dans le milieu de fixation le plus approprié en fonction du type de tissu et des examens histopathologiques prévus: tout tissu présentant des lésions macroscopiques, l'encéphale (régions représentatives: cerveau, cervelet et protubérance annulaire), la moelle épinière, l'estomac, le colon et l'intestin grêle (y compris plaques de Peyer), le foie, les reins, les surrénales, la rate, le cœur, le thymus, la thyroïde, la trachée et les poumons (conservés par insufflation d'un fixateur et immersion), les gonades, les organes génitaux annexes (par exemple: utérus, prostate), la vessie, les ganglions lymphatiques (de préférence un ganglion sur le trajet de la voie d'administration et un autre à distance pour couvrir les effets systématiques), nerfs périphériques (sciatique ou tibial) de préférence très près du muscle, et une coupe de moelle osseuse (ou lame fraîchement montée de moelle recueillie par aspiration). En fonction des observations cliniques et des autres résultats, il peut s'avérer nécessaire d'examiner d'autres tissus. Tous les organes considérés comme organes cibles potentiels du fait des propriétés de la substance doivent également être conservés.

1.4.3.6. Examen histopathologique Pour tous les animaux du lot témoin et du lot traité à la dose la plus élevée, il est pratiqué un examen histopathologique complet des organes et tissus conservés. Cet examen devra être pratiqué pour tous les lots exposés à des doses inférieures si des modifications induites par la substance à tester sont observées chez les animaux du lot traité à la dose la plus élevée. Toutes les lésions macroscopiques doivent être examinées. Lorsqu'un lot satellite est utilisé, un examen histopathologique doit être pratiqué sur les organes et tissus sur lesquels des effets ont été observés dans les lots traités.

2. RÉSULTATS Les résultats doivent être indiqués pour chaque animal, individuellement. En outre, tous les résultats doivent être récapitulés sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux utilisé, le nombre d'animaux retrouvés morts au cours de l'essai ou sacrifiés pour des raisons humanitaires, le moment de la mort ou du sacrifice, le nombre d'animaux présentant des signes de toxicité ainsi qu'une description de ces signes, le moment d'apparition, leur durée et leur gravité, le nombre d'animaux présentant des lésions, le type de lésion et le pourcentage d'animaux présentant chaque type de lésion. Si possible, les résultats numériques seront évalués au moyen d'une méthode statistique appropriée et reconnue. La méthode statistique doit être choisie lors de la conception de l'étude.

3. COMPTE RENDU

3. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI

Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les informations suivantes:

Animaux d'expérience:

espèce/souche utilisée,

nombre d'animaux, âge et sexe,

origine, conditions d'hébergement, régime alimentaire, etc.,

poids de chaque animal au début de l'essai, à intervalles d'une semaine par la suite et à la fin de l'essai.

Conditions expérimentales:

justification du choix du véhicule si autre que de l'eau,

justification du choix de la dose,

détails concernant la formulation/préparation de la substance, la concentration obtenue, la stabilité et l'homogénéité de la préparation,

détails concernant l'administration de la substance,

le cas échéant, conversion de la concentration de la substance dans la ration alimentaire/l'eau de boisson (ppm) en dose effective (mg/kg p.c./jour),

détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau.

Résultats:

poids corporel/modifications du poids corporel,

consommation d'aliments et, le cas échéant, consommation d'eau,

réponse toxique par sexe et par dose, signes de toxicité compris,

nature, gravité et durée des effets cliniques observés (réversibilité éventuelle),

évaluation de l'activité sensorielle, de la force de préhension et de l'activité motrice,

tests hématologiques et valeurs de référence applicables,

tests de biochimie clinique et valeurs de référence applicables,

poids corporel au moment du sacrifice et poids des organes,

résultats de l'autopsie,

description détaillée de tous les résultats de l'examen histopathologique,

données relatives à l'absorption si disponibles,

le cas échéant, traitement statistique des résultats.

Discussion des résultats

Conclusions

4. RÉFÉRENCES Cette méthode reprend la ligne directrice 407 de l'OCDE.

B.8. TOXICITÉ À DOSES RÉPÉTÉES (28 JOURS) (INHALATION)

B.8.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Il est utile de disposer d'informations préliminaires sur la distribution de la taille des particules, la pression de vapeur, le point de fusion, le point d'ébullition, le point d'éclair et l'explosivité (si applicables) de la substance. Voir également l'introduction générale, partie B (point A).

1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point B).

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Plusieurs lots d'animaux d'expérience sont exposés quotidiennement, pendant une période déterminée, à des concentrations croissantes de la substance à tester, une seule concentration étant utilisée par lot et ce, pendant une durée de 28 jours. Lorsqu'on utilise un véhicule en vue d'obtenir une concentration adéquate de la substance d'essai dans l'atmosphère, il y a lieu de prévoir un lot témoin pour le véhicule. Durant la période d'administration, les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler les symptômes de toxicité. Les animaux qui meurent en cours d'expérience sont autopsiés de même que ceux qui sont encore en vie à l'issue de l'expérience.

1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.6.

1.6.1. Préparation Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et d'alimentation propres à l'expérience au moins pendant les 5 jours qui la précèdent. Avant l'expérience, des animaux jeunes et sains sont répartis selon les règles du hasard entre les différents lots requis. Au besoin un véhicule approprié peut être utilisé pour obtenir une concentration adéquate de substance dans l'atmosphère. Si l'on utilise un véhicule ou un autre additif pour faciliter l'administration, celui-ci doit être réputé non toxique et cela peut être étayé par des données publiées, si nécessaire.

1.6.2. Conditions de l'essai

1.6.2.

1.6.2.1. Animaux d'expérience Sauf contre-indication, le rat est l'espèce utilisée de préférence. Il faut utiliser des animaux jeunes et sains d'une souche courante d'animaux de laboratoire. Au début de l'expérience, l'intervalle de variation de poids entre les animaux utilisés ne doit pas excéder ± 20 % de la valeur moyenne requise.

1.6.2.2. Nombre et sexe Dix animaux au moins (cinq femelles et cinq mâles) sont utilisés pour chaque lot. Les femelles doivent être nullipares et non-gravides. S'il est prévu dans le protocole expérimental des sacrifices intermédiaires en cours d'expérience, il y a lieu d'ajouter la quantité d'animaux nécessaire pour ces sacrifices. De plus, un lot satellite de 10 animaux (5 par sexe) peut être traité à la dose la plus élevée pendant 28 jours et faire l'objet d'une observation relative à la réversibilité, la persistance ou l'apparition tardive d'effets toxiques durant les 14 jours qui suivent l'arrêt du traitement. On utilise aussi un lot satellite témoin de 10 animaux (cinq animaux par sexe).

1.6.2.3. Concentration d'exposition On utilise au moins trois concentrations ainsi qu'un témoin ou un lot témoin pour le véhicule (correspondant à la concentration de véhicule présente dans l'atmosphère inhalé par le groupe de traitement le plus élevé). Excepté l'exposition à la substance d'essai, les animaux du lot témoin doivent être traités de la même manière que les sujets des lots d'expérience. La concentration la plus élevée doit être suffisamment forte pour produire des effets toxiques mais sans toutefois entraîner la mort (ou rarement). La concentration la plus faible ne doit faire apparaître aucun effet toxique. Lorsque l'on dispose d'une estimation concernant l'exposition de l'homme, la concentration la plus faible doit être supérieure à cette valeur. Dans les conditions idéales, la concentration intermédiaire doit produire des effets toxiques minimaux observables. Si l'on utilise plusieurs concentrations intermédiaires, celles-ci doivent être espacées de façon à entraîner une gradation des effets toxiques. En cas de mortalité dans les lots à concentrations faibles et intermédiaires, ainsi que dans les lots témoins, celle-ci devra être minime pour que l'évaluation des résultats soit valable.

1.6.2.4. Durée d'exposition L'exposition quotidienne doit être de 6 heures, mais d'autres durées peuvent se révéler nécessaires pour répondre à certaines exigences particulières.

1.6.2.5. Dispositif expérimental Les animaux doivent être exposés à la substance d'essai au moyen d'un dispositif d'exposition dynamique capable de maintenir un flux d'air continu permettant au moins 12 renouvellements de l'atmosphère de l'enceinte d'exposition par heure, et assurant une teneur en oxygène suffisante et une répartition uniforme du produit à tester dans l'air. Si l'on utilise une chambre d'exposition, celle-ci doit être conçue de manière à éviter autant que possible l'entassement des animaux et à optimiser l'exposition par inhalation à la substance d'essai. En règle générale, pour assurer la stabilité de l'atmosphère d'une chambre, le volume total des animaux d'expérience ne doit pas dépasser 5 % du volume de la chambre d'essai. On peut aussi avoir recours à un système d'exposition soit oro-nasal, soit de la tète seule, soit du corps entier en chambre individuelle; les deux premiers types d'exposition présentent l'avantage de limiter la pénétration de la substance d'essai par d'autres voies.

1.6.2.6. Période d'observation Les animaux d'expérience devront être observés quotidiennement, en vue de déceler les symptômes de toxicité, durant toute la période de traitement et de récupération. Le moment de la mort ainsi que celui auquel les symptômes de toxicité apparaissent et disparaissent doivent être notées.

1.6.3. Mode opératoire Les animaux sont quotidiennement exposés a la substance à tester à raison de 5 à 7 jours par semaine pendant une période de 28 jours. Les animaux de tout groupe satellite destiné à des observations de réversibilité d'effet doivent être gardés en vie pendant 14 jours encore, sans traitement, afin de déceler la régression ou la persistance des effets toxiques. La température à laquelle s'effectue l'essai doit être maintenue à 22 oC ± 3 oC. Dans les conditions idéales, l'humidité relative doit être maintenue entre 30 et 70 % mais, dans certains cas, cela peut se révéler impossible (par exemple, essai de certains aérosols). Le maintien d'une pression légèrement négative à l'intérieur de la chambre (≤ 5 mm d'eau) empêchera la fuite de substance d'essai vers l'extérieur. La nourriture et l'eau doivent être retirées pendant l'exposition. Il y a lieu d'utiliser un système d'inhalation qui fonctionne dans des conditions dynamiques comportant un dispositif approprié de contrôle analytique de la concentration. Pour établir les concentrations d'exposition appropriées, il est recommandé de procéder à un essai préliminaire. Le débit devra être réglé ajusté pour assurer des concentrations homogènes dans toute la chambre. Le système doit permettre d'obtenir des conditions d'exposition stables aussi rapidement que possible. II y a lieu de mesurer ou de contrôler: Les observations ont lieu pendant et après l'exposition et sont notées systématiquement; une fiche individuelle doit être établie pour chaque animal. Tous les animaux doivent être observés quotidiennement et les signes de toxicité, y compris leur moment d'apparition, leur intensité et leur durée doivent être enregistrés. Les observations doivent concerner les modifications de la peau et des poils, des yeux, des muqueuses, de l'appareil respiratoire, du système circulatoire ainsi que des systèmes nerveux autonome et central, de l'activité somatomotrice et du comportement. Les animaux sont pesés toutes les semaines. Il est aussi recommandé d'effectuer des mesures hebdomadaires sur la consommation alimentaire. Il est nécessaire d'observer régulièrement les animaux afin de veiller à ce que, dans la mesure du possible, ceux-ci ne soient pas perdus pour l'expérience pour des raisons telles que cannibalisme, autolyse des tissus ou erreur au cours des remises en cage. A l'issue de l'expérience, tous les animaux survivants, appartenant aux lots traités, non satellites, sont autopsiés. Les animaux trouvés moribonds ou dans un état de détresse ou de douleur intenses au cours de l'essai doivent être immédiatement retirés, euthanasiés et autopsiés. Les examens figurant ci-après seront effectués à l'issue de la période d'essai sur tous les animaux (y compris les témoins): Les autres déterminations éventuellement nécessaires à une évaluation toxicologique adéquate concernent le calcium, le phosphore, les chlorures, le sodium, le potassium, la glycémie à jeun, l'analyse des lipides, les hormones, l'équilibre acido-basique, la méthémoglobine et l'activité cholinestérasique. D'autres analyses biochimiques cliniques peuvent, si nécessaire, être effectuées pour approfondir l'étude des effets observés.

1.6.3. a)

le débit d'air (en permanence).

la concentration réelle de la substance d'essai. Elle doit être mesurée dans la zone de respiration; pendant la période d'exposition quotidienne, la concentration ne doit pas varier de plus de ± 15 % par rapport à la valeur moyenne. Toutefois, dans le cas de certains aérosols, ce degré de contrôle peut ne pas être obtenu et un écart plus grand est alors acceptable. Durant toute la durée de l'étude, il faut garder les concentrations aussi constantes que possible d'un jour à l'autre. En ce qui concerne les aérosols, la taille des particules doit être analysée au moins une fois par semaine pour chaque groupe d'exposition.

la température et l'humidité, en permanence si possible.

1. examen hématologique comprenant au moins l'hématocrite, la concentration en hémoglobine, le dénombrement des érythrocytes et des leucocytes, la formule leucocytaire ainsi qu'une étude de la coagulation;

2. examen biochimique clinique du sang comprenant au moins un paramètre des fonctions hépatiques et rénales: alanine aminotransférase sérique (anciennement connue sous le nom de transaminase glutamopyruvique) aspartate aminotransférase sérique (anciennement connue sous le nom de transaminase glutamo-oxalo-acétique), urée, albumine, créatinine, bilirubine totale et protéines sériques totales.

1.6.3.1. Autopsie Tous les animaux soumis à l'essai doivent faire l'objet d'une autopsie macroscopique. Au moins le foie, les reins, les glandes surrénales, les poumons et les testicules doivent être pesés à l'état humide le plus rapidement possible après la dissection afin d'éviter le dessèchement. Organes et tissus (système respiratoire, foie, reins, rate, testicules, glandes surrénales, cœur et tout autre organe présentant des lésions macroscopiques ou des modifications de leur volume) doivent être conservés dans un milieu approprié en vue éventuels d'examens histopathologiques ultérieurs. Les poumons doivent être prélevés entiers, pesés et traités au moyen d'un fixateur approprié permettant de conserver la structure pulmonaire intacte.

1.6.3.2. Examen histopathologique Pour le lot exposé à la dose la plus élevée et le(s) lot(s) témoin(s), il faut pratiquer un examen histologique systématique de tous les organes et des tissus conservés. Les organes et tissus qui auront présenté des lésions induites par la substance à tester au niveau a la dose la plus élevée, devront être examinés dans tous les lots exposés à toutes les doses inférieures. Les animaux de tout lot satellite devront faire l'objet d'un examen histologique particulièrement axé sur les organes et les tissus pour lesquels les lésions ont été constatées dans les autres lots traités.

2. DONNÉES Les données doivent être récapitulées sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux au début de l'essai et le nombre d'animaux présentant chaque type de lésion. Tous les résultats observés doivent être évalués au moyen d'une méthode statistique appropriée. Toute méthode statistique reconnue peut être utilisée.

3. RÉSULTATS

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc.,

conditions de l'essai: Description du dispositif d'inhalation, y compris conception, type, dimensions, source d'air, système de génération d'aérosols, méthode de conditionnement d'air, traitement de l'atmosphère rejetée hors de l'enceinte et, le cas échéant, modalités d'hébergement des animaux en chambre d'essai. L'équipement de mesure de température, d'humidité et, s'il y a lieu, de la stabilité des concentrations des aérosols ou de la distribution de taille des particules doit être décrit. Données relatives à l'exposition: elles doivent être représentées sous la forme de tableaux indiquant des valeurs moyennes ainsi qu'une mesure de la variabilité (par exemple, écart type); elles doivent, si possible, inclure:

3.1. pt_2 a)

les débits d'air dans le dispositif d'inhalation,

la température et l'humidité de l'air,

les concentrations nominales (quantité totale de substance d'essai introduite dans le dispositif d'inhalation, divisée par le volume d'air),

le cas échéant, nature du véhicule,

concentrations réelles dans la zone de respiration,

le diamètre aérodynamique médian en masse (DAMM) et l'écart-type géométrique (ETG),

données concernant la réponse toxique par sexe et par concentration,

moment de la mort en cours d'expérience ou indication que les animaux ont survécu à l'expérience,

description des effets toxiques ou autres; concentration sans effet,

moment de l'observation de tout symptôme anormal et évolution de celui-ci,

données relatives à la prise de nourriture et à l'évolution du poids corporel,

examens hématologiques pratiqués et résultats complets,

examens biochimiques cliniques pratiqués et résultats complets,

résultats d'autopsie,

description détaillée de tous les résultats histopathologiques,

traitement statistique des résultats, si possible,

discussion des résultats,

interprétation des résultats.

3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D).

4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E).

B.9. TOXICITÉ À DOSES RÉPÉTÉES (28 JOURS) (ADMINISTRATION CUTANÉE)

B.9.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A).

1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale, partie B (point B).

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI La substance à tester est appliquée quotidiennement, à doses croissantes, sur la peau de plusieurs lots d'animaux d'expérience pendant une période déterminée, à raison d'une seule dose par lot, pendant une durée de 28 jours. Durant la période d'application, les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler les signes de toxicité. Les animaux qui meurent en cours d'expérience ainsi que ceux qui sont encore en vie à l'issue de l'expérience sont autopsiés.

1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.6.

1.6.1. Préparation Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et d'alimentation propres à l'expérience au minimum pendant les 5 jours qui la précèdent. Avant l'expérience, des animaux jeunes et sains sont répartis selon les règles du hasard entre les différents lots témoins et traités. Peu de temps avant l'essai, on tond la région dorsale du tronc des animaux. On peut avoir recours au rasage mais, dans ce cas, l'opération doit être effectuée 24 heures environ avant l'essai. Il est en général nécessaire de répéter les opérations de tonte ou de rasage à des intervalles d'une semaine environ, en évitant toute lésion de la peau. La surface à préparer pour l'application de la substance ne doit pas être inférieure à 10 % de la surface corporelle. Le poids de l'animal doit être pris en considération pour décider de la taille de la zone à épiler, et de la dimension de la surface à traiter. Lorsque le test concerne des substances solides qui, le cas échéant, peuvent être pulvérisées, la substance à tester doit être humectée au moyen d'eau ou, au besoin, d'un véhicule approprié, de manière à garantir un bon contact avec la peau. Les substances liquides sont généralement appliquées non diluées. On procède à une application quotidienne à raison de 5 à 7 jours par semaine.

1.6.2. Conditions de l'essai

1.6.2.

1.6.2.1. Animaux d'expérience On peut utiliser des rats, des lapins ou des cobayes adultes. On peut également utiliser d'autres espèces, mais il faut dans ce cas en justifier l'utilisation. Au début de l'essai, l'intervalle de variation du poids des animaux utilisés ne doit pas excéder ± 20 % de la valeur moyenne requise.

1.6.2.2. Nombre et sexe Dix animaux au moins (cinq femelles et cinq mâles), à la peau saine, sont utilisés pour chaque dose. Les femelles doivent être nullipares et non-gravides. S'il est prévu dans le protocole expérimental des sacrifices intermédiaires en cours d'expérience, il y a lieu d'ajouter la quantité d'animaux nécessaire pour ces sacrifices. De plus, un lot satellite de 10 animaux (5 par sexe) peut être traité à la dose la plus élevée pendant 28 jours et faire l'objet d'une observation relative à la réversibilité, la persistance ou l'apparition tardive d'effets toxiques durant les 14 jours qui suivent l'arrêt du traitement. On utilise aussi un lot satellite témoin de 10 animaux (cinq animaux par sexe).

1.6.2.3. Doses On utilise au moins trois doses ainsi qu'un lot témoin ou, le cas échéant, un lot témoin traité avec le véhicule. La période d'exposition devra être d'au moins 6 heures par jour. La substance à tester doit être appliquée chaque jour au même moment et les quantités à administrer doivent faire l'objet d'une adaptation régulière (hebdomadaire ou bihebdomadaire) afin de conserver un niveau de dose constant par rapport au poids corporel des animaux. Excepté l'administration de substance d'essai, les animaux du lot témoin doivent être traités de la même manière que les animaux des lots d'expérience. Lorsqu'un véhicule est utilisé pour faciliter l'administration, celui-ci sera administré au lot témoin dans les mêmes conditions qu'aux lots traités et la quantité de véhicule correspondra à celle reçue par le groupe traité avec la dose de substance d'essai la plus élevée. La dose la plus élevée doit être suffisamment forte pour produire des effets toxiques mais sans toutefois entraîner la mort (ou rarement). La dose la plus faible ne doit faire apparaître aucun effet toxique. Lorsque l'on dispose d'une estimation concernant l'exposition de l'homme, la dose la plus faible doit être supérieure à cette valeur. Dans les conditions idéales, la concentration intermédiaire doit produire des effets toxiques minimaux observables. Si l'on utilise plusieurs concentrations intermédiaires, celles-ci doivent être espacées de façon à entraîner une gradation des effets toxiques. En cas de mortalité dans les lots recevant les doses faibles et intermédiaires, ainsi que dans les lots témoins, celle-ci devra être minime pour que l'évaluation des résultats soit valable. Si l'application de la substance d'essai provoque une irritation cutanée grave, les concentrations doivent être réduites, ce qui peut entraîner une diminution, voire une disparition, des autres effets toxiques à la dose la plus élevée. De plus, si les lésions cutanées sont très graves, il peut se révéler nécessaire d'arrêter l'expérience et de la recommencer avec des concentrations plus faibles.

1.6.2.4. Essai limite Si une expérience préliminaire réalisée avec une dose de 1000 mg/kg de poids corporel ou avec une dose plus élevée en fonction de l'exposition possible pour l'homme, n'a provoqué aucun effet toxique, il peut s'avérer inutile de poursuivre l'expérience.

1.6.2.5. Période d'observation Les animaux d'expérience doivent faire l'objet d'une observation quotidienne afin de déceler les symptômes d'intoxication. Le moment où les symptômes d'intoxication apparaissent et disparaissent ainsi que le moment de la mort doivent être consignés.

1.6.3. Mode opératoire Les animaux doivent être placés dans des cages individuelles. Dans les conditions idéales, la substance d'essai est administrée aux animaux 7 jours sur 7, pendant une période de 28 jours. Les animaux de tous les lots satellites destinés à des observations complémentaires doivent être gardés en vie pendant 14 jours encore, sans traitement, afin de constater la régression ou la persistance des effets toxiques. La durée de l'exposition doit être au moins de 6 heures par jour. La substance d'essai doit être appliquée uniformément sur une surface représentant environ 10 % de la surface corporelle totale mais lorsqu'il s'agit de substances hautement toxiques, la surface couverte peut être réduite. La couche de substance doit être aussi mince et uniforme que possible. Durant l'exposition, la substance d'essai est maintenue en contact avec la peau au moyen d'une compresse de gaze poreuse et d'un sparadrap non irritant. La surface traitée doit, en outre, être convenablement couverte de manière à maintenir en place le pansement de gaze et la substance d'essai et de manière à éviter que les animaux puissent ingérer la substance à tester. Des appareils de contention peuvent être utilisés pour empêcher l'ingestion de la substance mais une immobilisation complète n'est pas recommandée. Il est également possible d'utiliser la technique du collier de protection. À l'issue de la période d'exposition, il faut, si possible, éliminer la substance résiduelle avec de l'eau ou par tout autre procédé adéquat de nettoyage de la peau. Tous les animaux doivent être observés quotidiennement et les signes de toxicité ainsi que le moment de leur apparition, leur intensité et leur durée doivent être notés. Les observations doivent concerner les modifications de la peau et des poils, des yeux, des muqueuses, de l'appareil respiratoire, du système circulatoire ainsi que des systèmes nerveux autonome et central, de l'activité somatomotrice et du comportement. Les animaux doivent être pesés chaque semaine. Il est également recommandé d'effectuer des mesures hebdomadaires sur la consommation alimentaire des animaux. Il est nécessaire d'observer régulièrement les animaux afin de veiller à ce que, dans la mesure du possible, ceux-ci ne soient pas perdus pour l'expérience pour des raisons telles que cannibalisme, autolyse des tissus au cours des remises en cages. A l'issue de l'expérience, tous les animaux survivants appartenant aux lots traités, non satellites, sont autopsiés. Les animaux moribonds et les animaux dans un état de détresse ou de douleur intenses doivent être immédiatement retirés, euthanasiés et autopsiés. Les examens figurant ci-après seront effectués à l'issue de la période d'essai sur tous les animaux (y compris les témoins): D'autres déterminations éventuellement nécessaires à une évaluation toxicologique adéquate concernent le calcium, le phosphore, les chlorures, le sodium, le potassium, la glycémie à jeun, l'analyse des lipides, les hormones, l'équilibre acido-basique, la méthémoglobine, l'activité cholinestérasique. D'autres analyses biochimiques cliniques peuvent, si nécessaire, être effectuées pour approfondir l'étude des effets observés.

1.6.3.

1. examen hématologique comprenant au moins l'hématocrite, la concentration en hémoglobine, le dénombre ment des érythrocytes et des leucocytes, la formule leucocytaire ainsi qu'une étude de la coagulation;

2. examen biochimique clinique du sang comprenant au moins un paramètre des fonctions hépatiques et rénales: alanine aminotransférase sérique (anciennement connue sous le nom de transaminase glutamopyru-vique), aspartate aminotransférase sérique (anciennement connue sous le nom de transaminase glutano-oxalo-acétique), urée, albumine, créatinine, bilirubine totale et protéines sériques totales.

1.6.4. Autopsie Tous les animaux soumis à l'essai doivent faire l'objet d'une autopsie macroscopique. Au moins le foie, les reins, les glandes surrénales et les testicules doivent être pesés à l'état humide le plus rapidement possible après la dissection afin d'éviter le dessèchement. Organes et tissus, à savoir, peau normale et traitée, foie, reins, rate, testicules, glandes surrénales, cœur et les organes-cibles (c'est-à-dire ceux qui présentent des lésions importantes ou des modifications de leur volume) doivent être conservés dans un milieu approprié en vue d'éventuels examens histopathologiques ultérieurs.

1.6.5. Examen histopathologique Pour le lot exposé à la dose la plus élevée et le lot témoin, il faut pratiquer un examen histologique systématique de tous les organes et des tissus conservés. Les organes et tissus qui auront présenté des lésions attribuables à la substance à tester à la dose la plus élevée devront être examinés dans tous les lots ayant été exposés à des doses plus faibles. Les animaux de tout lot satellite devront faire l'objet d'un examen histologique particulièrement axé sur les organes et les tissus pour lesquels les lésions ont été constatées dans les lots traités.

2. DONNÉES Les données doivent être récapitulées sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, nombre d'animaux au début de l'essai et le nombre d'animaux présentant chaque type de lésion. Tous les résultats observés doivent être évalués au moyen d'une méthode statistique appropriée. Toute méthode statistique reconnue peut être utilisée.

3. RÉSULTATS

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants:

données concernant les animaux (espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc.),

conditions de l'essai, (y compris le type de pansement: occlusif ou non-occlusif),

doses (avec, le cas échéant, le véhicule) et concentrations,

dose sans effet, lorsque c'est possible,

données relatives à la réponse toxique par sexe et par dose,

indication du moment de la mort en cours d'expérience ou des survies au terme de l'expérience,

effets toxiques ou autres,

moment de l'observation de tout symptôme anormal et évolution de celui-ci,

données relatives à la prise de nourriture et à l'évolution du poids corporel,

examens hématologiques pratiqués et résultats complets,

examens biochimiques cliniques pratiqués et résultats complets,

résultats d'autopsie,

description détaillée de tous les résultats histopathologiques,

traitement statistique des résultats, si possible,

discussion des résultats,

interprétation des résultats.

3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale, partie B (point D).

4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale, partie B (point E).

B.10. MUTAGÉNICITÉ — ESSAI IN VITRO D'ABERRATION CHROMOSOMIQUE SUR CELLULES DE MAMMIFÈRE

B.10.

1. MÉTHODE Cette méthode est une adaptation de la ligne directrice OCDE TG 473, Essai d'aberration chromosomique in vitro chez les mammifères (1997).

1.

1.1. INTRODUCTION L'essai d'aberration chromosomique in vitro est destiné à détecter les agents qui provoquent des aberrations chromosomiques de structure dans des cellules de mammifère en culture (1) (2) (3). Les aberrations de structure peuvent être de deux types: chromosomiques ou chromatidiennes. La majorité des mutagènes chimiques induisent des aberrations de type chromatidien, mais parfois de type chromosomique. Une augmentation de la fréquence de polyploïdie peut indiquer qu'une substance chimique possède la faculté de provoquer des aberrations du nombre des chromosomes. Cet essai n'est cependant pas conçu pour évaluer les aberrations de nombre et il n'est généralement pas utilisé à cette fin. Les mutations chromosomiques et les événements liés sont à l'origine de beaucoup de maladies génétiques humaines et on a de bonnes raisons de penser que les mutations chromosomiques et événements liés, touchant les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs des cellules somatiques, jouent un rôle dans l'induction de cancers chez l'homme et chez les animaux de laboratoire. L'essai d'aberration chromosomique in vitro peut être pratiqué sur des cultures de lignées cellulaires établies, des souches cellulaires ou des cultures de cellules primaires. Les cellules utilisées sont choisies en fonction de leur potentiel de croissance en culture, de la stabilité de leur caryotype, du nombre et de la diversité des chromosomes et de la fréquence des aberrations chromosomiques spontanées. Les essais in vitro requièrent généralement l'utilisation d'une source exogène d'activation métabolique. Ce système d'activation métabolique est incapable de reproduire parfaitement les conditions présentes in vitro chez les mammifères. Il faut éviter absolument d'introduire des conditions qui conduiraient à des résultats positifs ne reflétant pas une mutagénicité intrinsèque et pouvant provenir de modification du pli, de l'osmolalité, ou d'une forte cytotoxicité (4) (5). Cet essai est utilisé pour le dépistage de substances pouvant être mutagènes et cancérigènes pour les mammifères. Bien que de nombreux composés donnant un résultat positif lors de cet essai soient cancérigènes pour les mammifères, il n'y a pas de corrélation parfaite entre cet essai et la cancérogénicité. La corrélation dépend de la classe chimique mais d'autre part, de plus en plus d'arguments laissent penser qu'il existe des agents cancérigènes que cet essai ne permet pas de détecter parce qu'ils agissent par des mécanismes qui n'impliquent pas des lésions directes de l'ADN. Voir aussi l'introduction générale de la partie B.

1.2. DÉFINITIONS Aberration de type chromatidien: lésion chromosomique de structure se traduisant par une cassure d'une seule chromatide ou par une cassure et une réunion entre chromatides. Aberration de type chromosomique: lésion chromosomique de structure se traduisant par une cassure, ou par une cassure et une réunion, des deux chromatides sur le même site. Endoreduplication: processus dans lequel le noyau, après une phase S de implication, n'entre pas en mitose mais commence une autre phase S. Il en résulte des chromosomes avec 4, 8, 16, ... chromatides. Lacune (gap): lésion achromatique plus petite que la largeur d'une chromatide, avec un défaut d'alignement minimal des chromatides. Index mitotique: nombre de cellules en métaphase divisé par le nombre total de cellules dans une population une indication de la vitesse de prolifération de cette population. Aberration de nombre: modification du nombre de chromosomes par rapport au nombre normal caractéristique des cellules employées. Polyploïde: état multiple du nombre de chromosomes haploïdes (n), autre que la diploïdie (c'est-à-dire 3n, 4n, etc.). Aberration de structure: modification de la structure des chromosomes, détectable par un examen au microscope au stade de la métaphase et se présentant sous la forme de délétions, de cassures, de modifications intrachromosomiques ou interchromosomiques.

1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Des cultures de cellules sont exposées à la substance d'essai avec et sans activation métabolique. Après avoir été exposées à la substance d'essai, les cultures de cellules sont, à intervalles préétablis, traitées par une substance qui bloque les cellules en métaphase (par exemple de la clochicine ou du Colcemid®), récoltées et teintées. Les cellules en métaphase sont soumises à un examen microscopique afin de déceler les aberrations chromosomiques.

1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.4.

1.4.1. Préparations

1.4.1.

1.4.1.1. Cellules Diverses lignées cellulaires, souches cellulaires ou cultures de cellules primaires, y compris des cellules humaines, peuvent être utilisées (par exemple les fibroblastes de hamster chinois, les lymphocytes du sang périphérique de l'homme ou d'autres mammifères).

1.4.1.2. Milieu et conditions de culture Il convient d'utiliser un milieu de croissance et des conditions d'incubation (récipients de culture, concentration de CO2, température et degré d'humidité) appropriés pour la croissance cellulaire. La stabilité du nombre modal de chromosomes et l'absence de contamination par des mycoplasmes doivent être vérifiées régulièrement dans les lignées cellulaires établies et les souches cellulaires. En cas de contamination, elles ne doivent pas être utilisées. La durée normale du cycle cellulaire de la lignée cellulaire et les conditions de culture utilisées doivent être connues.

1.4.1.3. Préparation des cultures Lignées et souches cellulaires établies: les cellules sont multipliées à partir de stocks cellulaires, ensemencées dans un milieu de culture à une densité telle que les cultures ne confluent pas avant la récolte, et incubées à 37 oC. Lymphocytes: du sang complet traité avec un anticoagulant (héparine, par exemple) ou des lymphocytes isolés issus de donneurs sains sont ajoutés à un milieu de culture contenant un mitogène (par exemple la phytohémagglutinine) et sont incubés à 37 oC.

1.4.1.4. Activation métabolique Les cellules doivent être exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié. Le système le plus couramment utilisé est une fraction postmitochondriale enrichie en cofacteurs (S9), préparée à partir de foie de rongeur traité avec des inducteurs enzymatiques, tels que de l'Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) ou un mélange de phénobarbitone et de ß-naphthoflavone (10) (11) (12). La fraction postmitochondriale est généralement utilisée à des concentrations allant de 1 a 10 % v/v dans le milieu de culture final. Le choix du système d'activation métabolique peut dépendre de la classe chimique de la substance d'essai. Dans certains cas il peut être préférable d'utiliser plus d'une concentration de la fraction postmitochondriale. Plusieurs procédés nouveaux, comme la création par génie génétique de lignées cellulaires exprimant des enzymes activantes spécifiques, sont susceptibles de fournir une activation endogène. Le choix des lignées cellulaires utilisées doit être justifié scientifiquement (par exemple par l'importance de l'isoenzyme du cytochrome P450 pour le métabolisme de la substance d'essai).

1.4.1.5. Substances d'essai/préparation Les substances d'essai solides sont préparées par dissolution ou suspension dans un véhicule ou un solvant approprié, puis éventuellement diluées avant le traitement des cellules. Les substances d'essai liquides peuvent être ajoutées directement au système d'essai et/ou diluées avant traitement. Il convient d'utiliser des préparations fraîches, sauf si l'on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les conditions du stockage.

1.4.2. Conditions expérimentales

1.4.2.

1.4.2.1. Solvant/véhicule Le solvant/véhicule choisi ne doit pas réagir chimiquement avec la substance d'essai ni altérer la survie des cellules et l'activité du mélange S9. L'emploi d'un solvant/véhicule inhabituel doit être justifié par des données faisant état de sa compatibilité. On préconise d'envisager d'abord l'utilisation d'un véhicule/solvant aqueux, chaque fois que cela est possible. Dans le cas d'essais conduits avec des substances instables dans l'eau, on utilisera des solvants organiques exempts d'eau. L'eau peut être enlevée par addition d'un tamis moléculaire.

1.4.2.2. Concentrations d'exposition La cytotoxicité, la solubilité dans le système d'essai et les modifications de pH et d'osmolalité sont des critères à prendre en considération pour déterminer la dose la plus élevée à utiliser. La cytotoxicité est mesurée, avec et sans système d'activation métabolique, dans l'expérience principale par un indicateur approprié de l'intégrité et de la croissance cellulaires, tel que le degré de confluence des colonies cellulaires, le nombre de cellules viables ou l'index mitotique. Il peut être utile de déterminer la cytotoxicité et la solubilité lors d'un essai préliminaire. Il convient d'utiliser au moins trois concentrations analysables. Dans le cas d'une substance cytotoxique, on utilisera des concentrations qui couvrent un domaine allant d'une toxicité nulle ou légère à la toxicité maximale, ce qui signifie en général des concentrations séparées par un facteur compris entre 2 et √10 au maximum. La concentration la plus élevée doit entraîner au moment de la récolte, une réduction significative (au moins 50 %) du degré de confluence, du nombre de cellules ou de l'index mitotique. Ce dernier varie dans le temps après le traitement et fournit seulement une mesure indirecte des effets cytotoxiques et cytostatiques. Cependant, l'index mitotique est une mesure acceptable pour des cultures en suspension pour lesquelles d'autres mesures de toxicité peuvent être incommodes ou irréalisables. Des données sur la cinétique du cycle cellulaire, par exemple le temps de génération moyen (TGM), peuvent fournir des compléments d'information. Toutefois, le TGM est une moyenne générale qui ne révèle pas toujours l'existence de sous-populations en retard; même de faibles augmentations du temps de génération moyen peuvent conduire à un retard très important du moment où le nombre d'aberrations est optimal. En ce qui concerne les substances relativement non cytotoxiques, la concentration maximale doit être la plus basse des trois concentrations suivantes: 5 μl/ml, 5 mg/ml ou 0,01 M. Pour les substances relativement insolubles qui ne sont pas toxiques aux concentrations solubles, la dose la plus élevée à tester doit être une concentration supérieure à la limite de solubilité dans le milieu de culture à la fin de la période de traitement. Dans certains cas (par exemple si la toxicité n'apparaît qu'à des concentrations supérieures à la plus faible concentration insoluble), il est recommandé de tester plusieurs concentrations auxquelles une précipitation est visible. Il peut être utile d'évaluer la solubilité au début et à la fin du traitement, celle-ci pouvant varier au cours de l'exposition dans le système d'essai en raison de la présence de cellules, de S9, de sérum, etc. On conclut à l'insolubilité lorsqu'une précipitation est observée à l'œil nu. Le précipité ne doit pas interférer avec l'évaluation des résultats.

1.4.2.3. Témoins négatifs et positifs Des témoins positifs et négatifs (solvant ou véhicule), avec et sans activation métabolique, doivent être inclus simultanément dans chaque expérience. En présence d'un système d'activation métabolique, la substance utilisée comme témoin positif doit être celle qui exige l'activation pour donner une réponse mutagène. On utilise comme témoin positif un clastogène connu à des niveaux d'exposition qui conduisent à un accroissement détectable et reproductible par rapport au bruit de fond, démontrant la sensibilité du système d'essai. Les doses des témoins positifs doivent être choisies de manière que les effets soient nets et que l'identité des lames codées ne soit pas évidente. Quelques exemples de témoins positifs figurent dans le tableau ci-dessous. Condition d'activation métabolique Substances Numéro CAS Numéro EINECS En l'absence d'activation métabolique exogène Méthanesulfonate de méthyle 66-27-3 200-625-0 Méthanesulfonate d'éthyle 62-50-0 200-536-7 Éthylnitrosourée 759-73-9 212-072-2 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 N-oxyde de 4-nitroquinoléine 56-57-5 200-281-1 En présence d'activation métabolique exogène Benzo[a]pyrène 50-32-8 200-028-5 Cyclophosphamide Monohydrate de cyclophosphamidée 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 D'autres témoins positifs appropriés peuvent être utilisés. De plus, l'emploi de témoins positifs appartenant à la même classe chimique sera envisagé, s'ils sont disponibles. Le solvant ou le véhicule doit être utilisé seul en tant que témoin négatif dans le même milieu de culture, dans les mêmes conditions que la substance d'essai et pour chaque temps de prélèvement. On utilisera également des témoins non traités, à moins que des essais antérieurs n'aient démontré que le solvant/véhicule choisi n'a pas d'effet délétère ou mutagène.

1.4.3. Mode opératoire

1.4.3.

1.4.3.1. Traitement avec la substance d'essai Les cellules en prolifération sont traitées avec la substance d'essai en présence et en l'absence de système d'activation métabolique. Le traitement des lymphocytes doit débuter environ 48 heures après la simulation mitogénique.

1.4.3.2. On réalise normalement des cultures dupliquées à chaque niveau de dose. Des cultures dupliquées sont aussi vivement recommandées pour les témoins négatifs (solvant). Si des essais antérieurs ont démontré que la variation entre cultures dupliquées est minime (13) (14), l'utilisation d'une seule culture pour chaque concentration peut être envisagée. Les substances gazeuses ou volatiles doivent être testées en utilisant des méthodes appropriées, par exemple dans des récipients de culture hermétiquement fermés (15) (16).

1.4.3.3. Récolte des cultures Pour la première expérience, les cellules sont exposées à la substance d'essai pendant 3 à 6 heures, en présence et en l'absence d'activation métabolique. On prélève ensuite des échantillons après un temps correspondant à environ 1,5 fois la durée du cycle cellulaire normal après le début du traitement (12). Si l'essai s'avère négatif, que ce soit avec ou sans activation métabolique, on effectue un essai supplémentaire sans activation. le traitement se poursuivant jusqu'au prélèvement d'échantillons après une période équivalente à environ 1,5 fois la durée du cycle cellulaire normal. Certaines substances peuvent être détectées plus facilement en prolongeant le temps de traitement et de prélèvement au-delà de 1,5 fois la durée du cycle cellulaire. Les résultats négatifs obtenus avec activation métabolique demandent à être confirmés cas par cas. Si la confirmation des résultats négatifs n'est pas jugée nécessaire, une justification doit être fournie.

1.4.3.4. Préparation des chromosomes Les cultures de cellules sont traitées avec du Colcemid® ou de la colchicine pendant 1 à 3 heures avant la récolte. Chaque culture est récoltée et traitée séparément en vue de la préparation des chromosomes. Celle-ci consiste en un traitement hypotonique, une fixation et une coloration des cellules.

1.4.3.5. Analyse Toutes les lames, y compris celles des témoins positifs et négatifs, doivent être codées individuellement avant l'analyse au microscope. Le procédé de fixation provoque souvent la rupture d'une certaine fraction des cellules en métaphase, ce qui entraîne une perte des chromosomes. Pour cette raison, toutes les cellules examinées doivent contenir un nombre de centromères égal au nombre modal ± 2. Pour chaque dose et chaque témoin, il y a lieu d'examiner au moins 200 cellules en métaphase bien étalées et, le cas échéant, réparties de façon égale entre les cultures en double exemplaire. Ce nombre peut être réduit lorsqu'un grand nombre d'aberrations sont observées. Bien que l'essai soit destiné à détecter les aberrations chromosomiques de structure, il est important de signaler d'éventuels cas de polyploidie et d'endoreduplication.

2. RÉSULTATS

2.

2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS L'unité expérimentale étant la cellule, on détermine le pourcentage de cellules présentant une ou plusieurs aberrations de structure. Une liste des différents types d'aberrations chromosomiques de structure doit être établie avec leur nombre et leur fréquence dans les cultures traitées et les cultures témoins. Les lacunes sont enregistrées séparément et rapportées mais ne sont généralement pas incluses dans la fréquence totale des aberrations. On indiquera aussi les résultats des mesures concomitantes de cytoxicité pour toutes les cultures traitées et les témoins négatifs dans les principaux essais d'aberration chromosomique. Les données seront présentées séparément pour chaque culture. En outre, toutes les données doivent être résumées sous tonne de tableaux. Il n'est pas obligatoire de vérifier une réponse nettement positive. Par contre, les résultats équivoques doivent être clarifiés par un ou des essais supplémentaires, de préférence dans des conditions expérimentales modifiées. La nécessité de confirmer les résultats négatifs est discutée au point 1.4.3.3. Lors des expériences complémentaires, il faut envisager la modification des paramètres de l'étude afin d'élargir l'éventail des conditions évaluées. Les paramètres susceptibles d'être modifiés comprennent l'intervalle entre les niveaux de dose et les conditions d'activation métabolique.

2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, notamment un accroissement lié à la dose ou un accroissement reproductible du nombre de cellules présentant des aberrations. En premier lieu, il s'agir de prendre en considération la pertinence biologique des résultats. L'évaluation des résultats peut s'appuyer sur des méthodes statistiques (3) (13) mais la signification statistique ne doit pas être le seul facteur décisif pour conclure à une réponse positive. Une augmentation du nombre de cellules polyploïdes peut signifier que la substance d'essai est capable d'inhiber les processus mitotiques et d'induire des aberrations de nombre. Une augmentation du nombre de cellules ayant des chromosomes endoredupliqués peut indiquer que la substance d'essai est capable d'inhiber la progression du cycle cellulaire (17) (18). Si les résultats obtenus avec une substance d'essai ne répondent pas aux critères indiqués ci-dessus, on peut conclure que la substance en question n'est pas mutagène dans cet essai. Bien que la plupart des essais donneront des résultats nettement positifs ou négatifs, dans de rares cas l'ensemble des résultats d'un essai n'autorise pas de conclusion catégorique sur l'activité de la substance étudiée. Les résultats peuvent rester équivoques ou discutables indépendamment du nombre de répétitions de l'essai. Des résultats positifs à l'essai d'aberration chromosomique in vitro indiquent que la substance d'essai induit des aberrations chromosomiques de structure dans des cellules somatiques de mammifère en culture. Des résultats négatifs signifient que, dans les conditions expérimentales, la substance d'essai n'induit pas d'aberration chromosomique dans des cellules somatiques de mammifère en culture.

3. RAPPORT

3. RAPPORT D'ESSAI

Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:

Solvant/véhicule:

justification du choix du véhicule,

solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant/véhicule, si elles sont connues.

Cellules:

type et source des cellules,

données sur le caryotype et raisons du choix du type cellulaire utilisé,

absence de mycoplasme, le cas échéant,

données concernant le cycle cellulaire,

sexe des donneurs de sang, sang complet ou lymphocytes isolés, mitogène utilisé,

nombre de repiquages, le cas échéant,

méthodes d'entretien des cultures cellulaires, le cas échéant,

nombre modal de chromosomes.

Conditions de l'essai:

identité de l'inhibiteur de 1a métaphase, sa concentration et la durée d'exposition des cellules,

justification du choix des concentrations et du nombre de cultures, y compris des données relatives à la cytotoxicité et aux limites de solubilité, si elles sont disponibles,

composition du milieu et, le cas échéant, la concentration de CO2,

concentration de la substance d'essai,

volume de véhicule et de substances d'essai ajouté,

température d'incubation,

temps d'incubation,

durée du traitement,

densité cellulaire au moment de l'ensemencement, si nécessaire,

type et composition du système d'activation métabolique, y compris les critères d'acceptabilité,

témoins positifs et négatifs,

méthodes de préparation des lames,

critères de dénombrement des aberrations,

nombre de métaphases analysées,

méthodes de mesure de la toxicité,

critères pour conclure que l'étude est positive, négative ou équivoque.

Résultats:

signes de toxicité (degré de confluence, données sur le cycle cellulaire, comptage des cellules, index mitotique),

signes de précipitation,

données sur le pH et l'osmolalité du milieu de traitement, si elles ont été déterminées,

définition appliquée aux aberrations, y compris les lacunes,

nombre de cellules présentant des aberrations chromosomiques et type d'aberration, séparément pour chaque culture traitée et culture témoin,

changements de la ploïdie, le cas échéant,

relation dose-réponse, si possible.

analyses statistiques, le cas échéant,

données concernant les témoins négatifs (solvant/véhicule) et positifs concomitants,

données historiques concernant les témoins négatifs (solvant/véhicule) et positifs (étendues, moyennes, écarts-types).

Discussion des résultats.

Conclusions.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)

BIBLIOGRAPHIE Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens. Princi-ples and Methods for their Detection. Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London. pp. 1-29. Ishidate. M. jr. and Sofuni, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hams ter Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5. Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432. Galloway, S. M.. Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., Brown, 13., Cannon, C, Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Kimpo, j., iviargolin, c. H., Resnick, M. A., Andersen. G. and Zeiger, E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs. Molec. Mulogen 10 (suppl. 10), pp. 1-175. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from 1CPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204. Monta, T., Nagaki, T., Fukuda. I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268. pp. 297-305 Ames. B. N., McCann. J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron. D. M. and Ames, B. N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113. pp. 17 3-215. Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, J. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, pp. 277-290. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclar 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J., Fonts, J. R., Berid, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. Galloway, S. M., Aardema. M. J., Ishidate, M. Jr., Iven, J. L., Kirkland, D. J., Morita, T., Mosesso. P., Sofuni, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312. pp. 241-261. Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154. Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, pp. 139-149. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L, Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801. Locke-Huhlc, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119. pp. 403-413 Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.

B.11. MUTAGÉNICITÉ — ESSAI IN VIVO D'ABERRATION CHROMOSOMIQUE SUR MOELLE OSSEUSE DE MAMMIFÈRE

B.11.

1. MÉTHODE Cette méthode est une adaptation de la ligne directrice OCDE TG 475, Essai d'aberration chromosomique sur moelle osseuse de mammifères (1997).

1.

1.1. INTRODUCTION L'essai in vivo d'aberration chromosomique est destiné à identifier les agents qui provoquent des aberrations chromosomiques de structure dans des cellules de moelle osseuse d'animaux, généralement des rongeurs (1, 2, 3, 4). Les aberrations de structure peuvent être de deux types: chromosomiques ou chromatidiennes. Une augmentation de la fréquence de polyploïdie peut indiquer qu'une substance chimique possède la faculté de provoquer des aberrations du nombre des chromosomes. La majorité des mutagènes chimiques induisent des aberrations de type chromatidien, mais parfois de type chromosomique. Les mutations chromosomiques et les événements connexes sont à l'origine de beaucoup de maladies génétiques humaines et on a de bonnes raisons de penser que les mutations chromosomiques et événements connexes, touchant les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs des cellules somatiques, jouent un rôle dans l'induction de cancers chez l'homme et chez les animaux de laboratoire. Les rongeurs sont couramment utilisés dans cet essai. Cet essai se pratique sur la moelle osseuse parce que c'est un tissu très vascularisé, formé d'une population de cellules au cycle rapide et faciles à prélever et traiter. D'autres espèces et tissus cibles ne font pas l'objet de cette méthode. Cet essai d'aberration chromosomique se prête particulièrement bien à l'évaluation du risque mutagène, en ce sens qu'il permet de prendre en compte des facteurs de métabolisme in vivo, de pharmacocinétique et de processus de réparation de l'ADN. Ces facteurs peuvent cependant varier d'un animal à un autre et d'un tissu à un autre. Un essai in vivo est aussi utile pour vérifier un effet mutagène détecté par un essai in vitro. On n'aura pas recours à cet essai s'il est manifeste que la substance d'essai ou un métabolite réactif n'atteindra pas le tissu cible. Voir aussi l'introduction générale de la partie B.

1.2. DÉFINITIONS Aberration de type chromatinien: lésion chromosomique de structure se traduisant par une cassure d'une seule chromatide ou par une cassure et une réunion entre chromatides. Aberration de type chromosomique: lésion chromosomique de structure se traduisant par une cassure, ou par une cassure et une réunion, des deux chromatides sur le même site. Endoreduplication: processus dans lequel le noyau, après une phase S de réplication, n'entre pas en mitose mais commence une autre phase S. Il en résulte des chromosomes avec 4, 8, 16, ... chromatides. Lacune: lésion achromatique inférieur à la largeur d'une chromatide avec un défaut d'alignement minimal des chromatides. Aberration de nombre: modification du nombre de chromosomes par rapport au nombre normal caractéristique des cellules employées. Polyploïdie: état multiple du nombre de chromosomes haploïdes (n), autre que la diploïdie (c'est-à-dire 3n, 4n, etc.). Aberration de structure: modification de la structure des chromosomes, détectable par un examen au microscope au stade de la métastase et se présentant sous la forma de délétions, de cassure, de modifications intrachromosomiques ou interchromosomiques.

1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Les animaux sont exposés à la substance d'essai par une voie d'exposition appropriée et sont sacrifiés à des moments appropriés après le traitement. Avant le sacrifice, les animaux sont traités avec une substance qui bloque les cellules en métaphase (par exemple de la colchicine ou du Colcemid®). Ensuite, les préparations chromosomiques réalisées à partir des cellules de moelle osseuse sont colorées, et les cellules en métaphase sont examinées en vue de la mise en évidence d'aberrations chromosomiques.

1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.4.

1.4.1. Préparations

1.4.1.

1.4.1.1. Sélection des espèces, animales Bien que le rat, la souris et le hamster chinois soient habituellement utilisés, n'importe quelle espèce de mammifère appropriée peut être utilisée. Il convient d'utiliser des animaux adultes, jeunes et sains issus de souches couramment utilisées en laboratoire. Au début de l'étude, la différence pondérale entre les animaux doit être minimale et ne pas dépasser ± 20 % du poids moyen de chaque sexe.

1.4.1.2. Conditions d'encagement et régime alimentaire Les conditions générales décrites dans l'introduction générale de la partie B sont appliquées mais le taux d'humidité devrait se situer aux environs de 50-60 %.

1.4.1.3. Préparation des animaux Les animaux sont répartis par randomisation entre les groupes témoins et les groupes traités. Les cages doivent être disposées de telle manière qu'il n'y ait pas d'effet dû à leur emplacement. Les animaux sont identifiés individuellement. Ils sont acclimatés aux conditions du laboratoire pendant au moins cinq jours.

1.4.1.4. Préparation des doses Les substances d'essai solides sont dissoutes ou mises en suspension dans un véhicule ou un solvant approprié, puis si nécessaire diluées avant d'être administrées aux animaux. Les substances d'essai liquides peuvent être administrées directement ou après dilution. Il convient d'utiliser des préparations fraîches, sauf si l'on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les conditions du stockage.

1.4.2. Conditions expérimentales

1.4.2.

1.4.2.1. Solvant/véhicule Le solvant/véhicule choisi ne doit pas avoir d'effet toxique aux doses utilisées ni présenter de réaction chimique avec la substance d'essai. Le recours à des solvants/véhicules inhabituels doit être justifié par des données sur leur compatibilité. On préconise d'envisager d'abord l'utilisation d'un véhicule/solvant aqueux, chaque fois que cela est possible.

1.4.2.2. Témoins Des témoins positifs et négatifs (solvant ou véhicule) doivent être inclus pour chaque sexe et dans chaque essai. Les animaux des groupes témoins doivent être manipulés exactement comme ceux des groupes traités, mise à part l'administration de la substance d'essai. Les témoins positifs doivent produire des aberrations chromosomiques de structure in vivo à des niveaux d'exposition supposés provoquer un accroissement détectable par rapport au bruit de fond. Les doses de témoin positif doivent être choisies afin que les effets soient évidents mais que l'identité des lames codées ne soit pas révélée immédiatement à l'examinateur. Le témoin positif peut être administré par une voie différente de celle utilisée pour la substance d'essai et un seul prélèvement d'échantillon peut suffire. L'emploi de témoins positifs appartenant à la même classe chimique peut être envisagé, s'ils sont disponibles. Les substances indiquées dans le tableau ci-dessous sont des exemples de témoins positifs. Substance Numéro CAS Numéro Einecs Méthanesulfonate d'éthyle 62-50-0 200-536-7 Éthylnitrosourée 759-73-9 212-072-2 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 Cyclophosphamide Monohydrate de cyclophosphamide 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Triéthylènemélamine 51-18-3 200-083-5 Lors de chaque prélèvement, il faut inclure un lot d'animaux témoins négatifs traités seulement avec le solvant ou le véhicule et par ailleurs manipulés de la même façon que les groupes traités. Ceci peut être évité si l'on dispose de données acceptables sur la variabilité interindividuelle et la fréquence spontanée de cellules comportant des aberrations chromosomiques provenant de témoins historiques. Dans le cas où un seul prélèvement est effectué pour les témoins négatifs, le premier temps de prélèvement est le plus approprié. En outre, des témoins non traités doivent aussi être inclus, à moins que des données historiques ne démontrent que le solvant/véhicule choisi n'induit aucun effet délétère ou mutagène.

1.5. MODE OPÉRATOIRE

1.5.

1.5.1. Nombre et sexe des animaux Chaque groupe traité et groupe témoin doit comprendre au moins cinq animaux analysables par sexe. Si, au moment de l'étude, on dispose de données historiques sur la même espèce et avec la même voie d'administration démontrant l'absence de différence notable de toxicité entre les sexes, la réalisation de l'essai sur un seul sexe est acceptable. Si l'exposition humaine est spécifique du sexe, par exemple dans le cas de certains produits pharmaceutiques, des animaux du sexe approprié doivent être utilisés pour l'essai.

1.5.2. Modalité de traitement Il est préférable d'administrer la substance d'essai en une seule fois. Elle peut aussi être administrée en doses fractionnées (deux doses le même jour avec un intervalle de quelques heures au maximum) afin que l'administration d'un grand volume soit plus aisée. D'autres modalités de traitement sont acceptables s'ils sont scientifiquement justifiés. Les échantillons sont prélevés après le traitement à deux moments différents de la même journée. Pour les rongeurs, le premier prélèvement après le traitement est effectué après une période de 1,5 fois la durée normale du cycle cellulaire (généralement de 12 à 18 heures). Étant donné que le temps requis par l'absorption et le métabolisme de la substance d'essai ainsi que l'effet de celle-ci sur la cinétique du cycle cellulaire peuvent influer sur le moment optimal de détection des aberrations, on recommande d'effectuer un autre prélèvement 24 heures après le premier. Si le traitement s'étend sur plus d'une journée, le prélèvement doit avoir lieu après une période de 1,5 fois la durée normale du cycle cellulaire après la dernière administration. Avant d'être sacrifiés, les animaux reçoivent une dose appropriée d'une substance qui bloque les cellules en métaphase (par exemple du Colcemid® ou de la colchicine) par injection intrapéritonéale. Les prélèvements sont effectués après une période appropriée, qui est de 3 à 5 heures pour la souris et de 4 à 5 heures pour le hamster chinois. Les cellules sont prélevées de la moelle osseuse et analysées en vue de la détection d'aberrations chromosomiques.

1.5.3. Niveaux de dose Si une étude préliminaire est réalisée afin d'évaluer les niveaux de dose requis, cette étude doit être effectuée dans le même laboratoire en utilisant la même espèce, la même souche, des animaux du même sexe et la même modalité de traitement que ceux de l'étude principale (5). En cas de toxicité, on utilise trois niveaux de dose pour le premier prélèvement. Ces niveaux de dose doivent couvrir un domaine allant d'une toxicité nulle ou légère à la toxicité maximale. Pour les prélèvements suivants, seule la dose la plus élevée est utilisée. Celle-ci est définie comme la dose qui produit des signes de toxicité tels qu'ils font supposer que des doses plus fortes, administrées selon les mêmes modalités, seraient létales. Les substances possédant une activité biologique spécifique à des doses faibles et non toxiques (comme les hormones et les mitogènes) peuvent faire exception aux critères d'établissement des doses et doivent être évaluées cas par cas. La dose la plus élevée peut aussi être définie comme étant celle qui produit certains indices de toxicité dans la moelle osseuse (par exemple une diminution de plus de 50 % de l'index mitotique).

1.5.4. Test limite Si un essai réalisé avec au moins 2000 mg/kg de poids corporel, en une seule dose ou en deux doses administrées le même jour, n'engendre aucun effet toxique observable et si une génotoxicité est improbable d'après les données relatives à des substances de structure voisine, on peut considérer qu'une étude complète avec trois niveaux de doses n'est pas nécessaire. Pour les études de plus longue durée, la dose limite est de 2000 mg/kg de poids corporel par jour dans le cas d'un traitement d'une durée allant jusqu'à 14 jours et de 1000 mg/kg de poids corporel par jour pour les études plus longues. Suivant l'importance de l'exposition humaine probable, on peut envisager d'utiliser des doses plus fortes dans l'essai de dose limite.

1.5.5. Voies d'administration La substance d'essai est généralement administrée par gavage à l'aide d'une sonde gastrique ou d'une canule d'intubation adaptée, ou par injection intrapéritonéale. D'autres voies d'exposition sont acceptables lorsqu'elles peuvent être justifiées. Le volume maximal de liquide administré en une fois par gavage ou par injection dépend de la taille de l'animal. Ce volume ne devrait pas dépasser 2 ml/100g de poids corporel. Une justification doit être fournie si des volumes plus importants sont administrés. Il convient de réduire au minimum la variation du volume administré en ajustant la concentration à tous les niveaux de doses, sauf pour les produits irritants ou corrosifs dont les effets sont généralement exacerbés lorsqu'on augmente la concentration.

1.5.6. Préparation des chromosomes La moelle osseuse est extraite immédiatement après le sacrifice, exposée à une solution hypotonique et fixée. Les cellules sont alors étalées sur des lames et colorées.

1.5.7. Analyse L'index mitotique sert de mesure de la cytotoxicité et doit être déterminé sur un minimum de 1000 cellules pour chaque animal traité (y compris les témoins positifs) et pour chaque témoin négatif non traité. L'analyse des aberrations chromosomiques doit porter sur au moins 100 cellules de chaque animal. Ce nombre peut être réduit lorsque les aberrations observées sont nombreuses. Toutes les lames, y compris celles des témoins négatifs et positifs, doivent être codées indépendamment avant l'analyse au microscope. Comme le procédé de fixation provoque souvent la rupture d'une certaine fraction des cellules en métaphase, entraînant une perte de chromosomes, toutes les cellules examinées doivent contenir un nombre de centromères égal à 2n ± 2.

2. RÉSULTATS

2.

2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS Les résultats individuels pour chaque animal doivent être présentés sous forme de tableaux. L'unité expérimentale est l'animal. Pour chaque animal, on indiquera le nombre de cellules examinées et on évaluera le nombre d'aberrations par cellule ainsi que le pourcentage de cellules présentant une ou plusieurs aberrations de structure. Les différents types d'aberrations chromosomiques de structure doivent être consignés avec leur nombre et leur fréquence pour les groupes traités et les groupes témoins. Les lacunes sont enregistrées séparément et rapportées mais ne sont généralement pas incluses dans la fréquence totale des aberrations. S'il n'y a pas de différence de réponse entre sexes, les données des deux sexes peuvent être combinées dans l'analyse statistique.

2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, notamment un accroissement dose-dépendant du nombre relatif de cellules présentant des aberrations ou une augmentation nette du nombre de cellules présentant des aberrations dans un seul groupe traité à un seul temps de prélèvement. En premier lieu, il s'agit de déterminer la pertinence biologique des résultats. L'évaluation des résultats peut s'appuyer sur des méthodes statistiques (6) mais la signification statistique ne doit pas être le seul facteur décisif pour conclure à une réponse positive. Les résultats équivoques doivent être clarifiés par des essais supplémentaires réalisés de préférence dans des conditions expérimentales modifiées. Une augmentation du nombre de cellules polyploïdes peut signifier que la substance d'essai est capable d'induire des aberrations de nombre. Une augmentation du nombre de cellules présentant des chromosomes endoredupliqués peut indiquer que la substance d'essai est capable d'inhiber la progression du cycle cellulaire (7) (8). Si les résultats obtenus avec une substance d'essai ne répondent pas aux critères indiqués ci-dessus, on peut conclure que la substance en question n'est pas mutagène dans cet essai. Bien que la plupart des essais donneront des résultats manifestement positifs ou négatifs, dans de rares cas l'ensemble des résultats d'un essai n'autorise pas de conclusion catégorique sur l'activité de la substance étudiée. Les résultats peuvent rester équivoques ou discutables indépendamment du nombre de répétitions de l'essai. Des résultats positifs obtenus dans cet essai in vivo d'aberration chromosomique indiquent qu'une substance induit des aberrations chromosomiques dans la moelle osseuse de l'espèce testée. Des résultats négatifs signifient que, dans les conditions de l'essai, la substance testée n'induit pas d'aberrations chromosomiques dans la moelle osseuse de l'espèce testée. Le fait que la substance d'essai ou ses métabolites atteignent la circulation générale ou spécifiquement le tissu cible (toxicité systémique) doit être discuté.

3. RAPPORT

3.

3.1. RAPPORT D'ESSAI Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:

Solvant/véhicule:

justification du choix du véhicule,

solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant/véhicule, si elles sont connues.

Animaux d'expérience:

espèce/souche utilisée,

nombre, âge et sexe des animaux,

source, conditions d'encagement, régime alimentaire, etc.,

poids individuel des animaux au début de l'essai, y compris l'intervalle des poids, la moyenne et l'écart-type dans chaque groupe.

Conditions expérimentales:

données relatives aux témoins positifs et négatifs (solvant/véhicule),

résultats de l'étude de détermination des doses utiles, si elle a été réalisée,

justification du choix des doses employées,

détails concernant la préparation de la substance d'essai,

détails concernant l'administration de la substance d'essai,

justification du choix de la voie d'administration,

méthodes pour vérifier que la substance a atteint la grande circulation ou le tissu cible, le cas échéant,

conversion de la concentration (ppm) de la substance d'essai dans l'eau de boisson ou la nourriture en dose réelle (mg/kg de poids corporel/jour), s'il y a lieu,

détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau,

description détaillée des modalités de traitement et de prélèvement,

méthodes de mesure de la toxicité,

nature et concentration de l'inhibiteur du fuseau mitotique et durée du traitement,

méthodes de préparation des lames,

critères de dénombrement des aberrations,

nombre de cellules analysées par animal,

critères de décision concernant les résultats positifs, négatifs et équivoques.

Résultats:

signes de toxicité,

index mitotique,

type et nombre d'aberrations, séparément pour chaque animal,

nombre total d'aberrations par groupe, moyennes et écarts-types,

nombre de cellules présentant des aberrations par groupe, moyennes et écarts-types,

changements de la ploïdie, le cas échéant,

relation dose-réponse, si possible,

analyses statistiques, le cas échéant,

données concernant les témoins négatifs concomitants,

données concernant les témoins négatifs antérieurs (étendues, moyennes et écarts-types),

données concernant les témoins positifs concomitants.

Discussion des résultats.

Conclusions.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)

BIBLIOGRAPHIE Adler, J. D. (1984), Cytogenctic Tests in Mammals, in: Mutagenidty Testing: a Practical Approach. S. Vcnitt and J. M. Parry (eds.). IRL Press, Oxford, Washington D. C, pp. 275-306. Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, 157-165. Richold, M.. Chandly, A., Ashby, J., Gatehouse D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland, (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New Cork, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Tice, R. R. Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirch-Volders, M, Oleson Jr., F. B., Paccierotti, F., Preston R. J., Romagna F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312. Fielder, R. J., Alleen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A.. Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson- Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Pap- worth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland, (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1363-1364.

B.12. MUTAGÉNICITÉ — ESSAI IN VIVO DU MICRONOYAU SUR ÉRYTHROCYTES DE MAMMIFÈRE

B.12.

1. MÉTHODE Cette méthode est une adaptation de la ligne directrice OCDE TG 474, Test du micronoyau sur les érythrocytes de mammifère (1997).

1.

1.1. INTRODUCTION L'essai du micronoyau in vivo sur des cellules de mammifère est pratiqué en vue de détecter des lésions des chromosomes ou de l'appareil mitotique d'érythroblastes résultant de l'action d'une substance d'essai. Il repose sur l'analyse d'érythrocytes prélevés dans la moelle osseuse et/ou dans le sang périphérique d'animaux, généralement des rongeurs. L'essai du micronoyau est destiné à identifier les substances qui provoquent les lésions cytogénétiques se traduisant par la formation de micronoyaux contenant des fragments de chromosomes ou des chromosomes entiers. Lorsqu'un érythroblaste de moelle osseuse se transforme en érythrocyte polychromatique, le noyau principal est expulsé et chaque micronoyau qui s'est formé peut subsister dans le cytoplasme anucléé. La visualisation des micronoyaux est facilitée par l'absence du noyau principal. Un accroissement de la fréquence des micronoyaux dans les érythrocytes polychromatiques des animaux traités est le signe d'une lésion chromosomique induite. La moelle osseuse des rongeurs est couramment utilisée dans cet essai, les érythrocytes polychromatiques étant produits dans ce tissu. Le comptage des érythrocytes (polychromatiques) immatures micronucléés dans le sang périphérique est également acceptable chez toute espèce où l'on a démontré l'incapacité de la rate à éliminer les érythrocytes micronucléés ou qui présente une sensibilité suffisante pour permettre la détection des agents provoquant des aberrations chromosomiques de structure ou de nombre. Plusieurs critères permettent de distinguer les micronoyaux. Un de ces critères est la détection de la présence ou de l'absence dans les micronoyaux d'un centromère ou d'ADN centromérique. La fréquence des érythrocytes immatures (polychromatiques) micronucléés est le principal critère. Quand les animaux sont traités en continu pendant quatre semaines ou plus, on peut également rechercher dans le sang périphérique la proportion des érythrocytes matures (normochromatiques) contenant des micronoyaux par rapport à un nombre donné d'érythrocytes matures. Cet essai in vivo du micronoyau pratiqué sur des érythrocytes de mammifère se prête particulièrement bien à l'évaluation des risques mutagènes, en ce sens qu'il permet de prendre en compte des facteurs du métabolisme in vivo, de pharmacocinétique et des processus de réparation de l'ADN, malgré la variabilité de ces facteurs en fonction de l'espèce, du tissu et de l'effet génétique recherché. Un essai in vivo sert aussi à vérifier un effet mutagène détecté dans un système in vitro. On n'aura pas recours à cet essai s'il est manifeste que la substance d'essai ou un métabolite réactif n'atteindra pas le tissu cible. Voir aussi l'introduction générale de la partie B.

1.2. DÉFINITIONS Centromère: portion d'un chromosome qui au cours de la division cellulaire est lié aux fibres du fuseau mitotique permettant un mouvement ordonné des chromosomes filles vers les pôles des cellules filles. Micronoyau: petit noyau, présent en plus du noyau principal des cellules et séparé de celui-ci, produit pendant la télophase de la mitose (méiose) par des chromosomes ou des fragments de chromosomes retardataires. Érythrocyte normochromatique: érythrocyte mature dépourvu de ribosomes et pouvant être distingué des érythrocytes immatures polychromatiques à l'aide de substances colorant sélectivement les ribosomes. Érythrocyte polychromatique: érythrocyte immature se trouvant à un stade de développement intermédiaire, qui renferme encore des ribosomes et peut ainsi être distingué des érythrocytes matures normochromatiques à l'aide de substances colorant sélectivement les ribosomes.

1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Les animaux sont exposés à la substance d'essai par une voie d'exposition appropriée. Si on utilise la moelle osseuse, les animaux sont sacrifiés à des moments appropriés après le traitement, la moelle est extraite, préparée sur des lames et colorée (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Lorsqu'on utilise le sang périphérique, ce dernier est prélevé à des moments appropriés après le traitement, les cellules sanguines sont étalées sur des lames et colorées (4) (8) (9) (10). En cas d'essai sur cellules du sang périphérique, il faut recueillir les cellules aussi rapidement que possible après la dernière exposition. Les lames préparées sont soumises à une analyse en vue de la détection de micronoyaux.

1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.4.

1.4.1. Préparations

1.4.1.

1.4.1.1. Sélection des espèces animales L'utilisation de souris ou de rats est recommandée en cas d'essai sur moelle osseuse, bien que n'importe quelle espèce de mammifère appropriée puisse être employée. Si l'essai porte sur le sang périphérique, on recommande d'utiliser des souris. Il est toutefois possible d'utiliser n'importe quelle espèce de mammifère appropriée, à condition que sa rate n'élimine pas les érythrocytes micronucléés ou que sa sensibilité soit suffisante pour permettre la détection d'agents qui provoquent des aberrations chromosomiques de structure ou de nombre. Il convient d'utiliser des animaux adultes, jeunes et sains issus de souches couramment utilisées en laboratoire. Au début de l'étude, la différence pondérale entre les animaux ne doit pas dépasser ± 20 % du poids moyen de chaque sexe.

1.4.1.3. Préparations des animaux Les animaux sont répartis par randomisation entre les groupes témoins et les groupes traités. Les animaux sont identifiés individuellement. Ils sont gardés dans leur cage pendant au moins cinq jours avant le début de l'étude, de façon à les acclimater aux conditions du laboratoire. Les cages doivent être disposées de telle manière qu'il n'y ait pas d'effet dû à leur emplacement.

1.4.1.4. Préparation des doses Les substances d'essai solides sont dissoutes ou mises en suspension dans un véhicule ou un solvant approprié, puis éventuellement diluées avant d'être administrées aux animaux. Les substances d'essai liquides peuvent être administrées directement ou après dilution. Il convient d'utiliser des préparations fraîches, sauf si l'on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les conditions du stockage.

1.4.2. Conditions expérimentales

1.4.2.

1.4.2.1. Solvant/véhicule Le solvant/véhicule choisi ne doit pas avoir d'effet toxique aux doses utilisées ni présenter de réaction chimique avec la substance d'essai. Le recours à des solvants/véhicules inhabituels doit être justifié par des données faisant état de leur compatibilité. On préconise d'envisager d'abord l'utilisation d'un véhicule/solvant aqueux, chaque fois que cela est possible.

1.4.2.2. Témoins Des témoins positifs et négatifs (solvant ou véhicule) doivent être inclus pour chaque sexe et chaque essai. Les animaux des groupes témoins sont manipulés exactement comme ceux des groupes traités, mise à part l'administration de la substance d'essai. Les témoins positifs doivent produire des micronoyaux in vivo à des niveaux d'exposition supposés conduire à un accroissement détectable par rapport au bruit de fond. Les doses de témoin positif doivent être choisies de façon que les effets soient nets et que l'identité des lames codées ne soit pas révélée immédiatement à l'examinateur. Le témoin positif peut être administré par une voie différente de celle utilisée pour la substance d'essai et un seul prélèvement d'échantillon peut suffire. En outre, l'emploi de témoins positifs appartenant à la même classe chimique peut être envisagé, s'ils sont disponibles. Les substances indiquées dans le tableau ci-dessous sont des exemples de témoins positifs. Substance Numéro CAS Numéro Einecs Méthanesulfonate d'éthyle 62-50-0 200-536-7 N-éthyl N-nitrosourée 759-73-9 212-072-2 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 Cyclophosphamide Monohydrate de cyclophosphamide 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Triéthylènemélamine 51-18-3 200-083-5 Lors de chaque prélèvement, il faut inclure un lot d'animaux témoins négatifs traités seulement avec le solvant ou le véhicule et par ailleurs manipulés de la même façon que les groupes traités. Ceci peut être évité si l'on dispose de données acceptables sur la variabilité interindividuelle et la fréquence spontanée de cellules comportant des micronoyaux provenant de témoins historiques. Dans le cas où un seul prélèvement est effectué pour les témoins négatifs, le premier temps de prélèvement est le plus approprié. En outre, des témoins non traités doivent aussi être inclus, à moins que des données historiques ne démontrent que le solvant/véhicule choisi n'induit aucun effet délétère ou mutagène. Si le sang périphérique est utilisé, un échantillon prélevé avant le traitement peut aussi tenir lieu de témoin négatif, mais uniquement dans les études de courte durée sur sang périphérique (par exemple 1 à 3 traitements) lorsque les résultats se situent dans l'intervalle auquel on peut s'attendre sur la base de données historiques.

1.5. MODE OPÉRATOIRE

1.5.

1.5.1. Nombre et sexe des animaux Chaque groupe traité et groupe témoin doit comprendre au moins cinq animaux analysables par sexe (11). Si, au moment de l'étude, on dispose de données d'études antérieures effectuées avec la même espèce et ayant utilisé la même voie d'administration, qui démontrent l'absence de différence importante de toxicité entre les sexes, il suffit d'effectuer l'essai avec des animaux d'un seul sexe. Si l'exposition humaine est spécifique du sexe, par exemple dans le cas de certains produits pharmaceutiques, des animaux du sexe approprié doivent être utilisés pour l'essai.

1.5.2. Modalité de traitement Aucune modalité particulière de traitement (un, deux ou davantage de traitements à intervalles de 24 heures) ne peut être recommandée. Les prélèvements qui proviennent d'une étude avec des procédures d'administration prolongées sont acceptables si l'essai est positif ou, pour les essais négatifs, si un effet toxique est observé ou que la dose limite a été employée et que la substance a été administrée jusqu'au moment du prélèvement. La substance d'essai peut aussi être administrée en doses fractionnées (deux doses le même jour avec un intervalle de quelques heures au maximum) afin que l'administration d'un grand volume soit plus aisée. L'essai peut être effectué de deux façons: Des temps de prélèvements supplémentaires peuvent être envisagés si nécessaire.

1.5.2. a)

La substance d'essai est administrée en une seule fois aux animaux. Des échantillons de moelle osseuse sont prélevés au moins deux fois, jamais avant 24 heures et pas au-delà de 48 heures après le traitement et à un intervalle approprié. Des prélèvements effectués moins de 24 heures après le traitement doivent avoir une justification. Les échantillons de sang périphérique sont prélevés au moins deux fois jamais avant 36 heures et pas au-delà de 72 heures après le traitement et à un intervalle approprié. Si une réponse positive est observée lors d'un prélèvement, il n'est pas nécessaire de procéder à un autre prélèvement.

Dans le cas où deux doses ou plus sont administrées (par exemple deux doses ou plus à intervalle de 24 heures), les échantillons de moelle osseuse doivent être prélevés une seule fois entre 18 et 24 heures après le dernier traitement, et ceux de sang périphérique une seule fois entre 36 et 48 heures après le dernier traitement (12).

1.3.3. Niveaux de dose Si une étude préliminaire est réalisée afin d'évaluer les niveaux de dose requis, cette étude doit être effectuée dans le même laboratoire en utilisant la même espèce, la même souche, des animaux du même sexe et la même modalité de traitement que ceux de l'étude principale (13). En cas de toxicité, on utilise trois niveaux de dose pour le premier prélèvement. Ces niveaux de doses doivent couvrir un domaine allant d'une toxicité nulle ou légère à la toxicité maximale. Pour les prélèvements suivants, seule la dose la plus élevée est utilisée. Celle-ci est définie comme la dose qui produit des signes de toxicité tels qu'ils font supposer que des doses plus fortes, administrées selon les mêmes modalités, seraient létales. Les substances possédant une activité biologique spécifique à des doses faibles et non toxiques (comme les hormones et les mitogènes) peuvent faire exception aux critères d'établissement des doses et doivent être évaluées cas par cas. La dose la plus élevée peut aussi être définie comme étant celle qui produit certains indices de toxicité dans la moelle osseuse (par exemple une diminution de la proportion d'érythrocytes immatures par rapport au nombre total d'érythrocytes dans la moelle osseuse ou le sang périphérique).

1.5.5. Voie d'administration La substance d'essai est généralement administrée par gavage à l'aide dune sonde gastrique ou d'une canule d'intubation adaptée, ou par injection intrapéritonéale. D'autres voies d'exposition sont acceptables lorsqu'elles peuvent être justifiées. Le volume maximal de liquide administré en une fois par gavage ou par injection dépend de la taille de l'animal. Ce volume ne devrait pas dépasser 2 ml/100 g de poids corporel. Une justification doit être fournie si des volumes plus importants sont administrés. Il convient de réduire au minimum la variation du volume administré en ajustant la concentration à tous les niveaux de doses, sauf pour les produits irritants ou corrosifs dont les effets sont généralement exacerbés lorsqu'on augmente la concentration.

1.5.6. Préparation de la moelle osseuse et du sang Les cellules de moelle osseuse sont généralement prélevées dans le fémur ou le tibia immédiatement après le sacrifice. Les cellules sont extraites, préparées et colorées suivant des méthodes bien établies. Le sang périphérique est prélevé dans la veine caudale ou un autre vaisseau sanguin approprié. On effectue immédiatement une coloration supravitale des cellules sanguines (8) (9) (10) ou des frottis qui sont ensuite colorés. L'emploi d'un colorant spécifique de l'ADN [par exemple, l'organe d'acridine (14) ou Hoechst 33258 plus pyronine-Y (15)] peut éliminer une partie des artefacts dus à l'utilisation d'un colorant non spécifique de l'ADN. Cet avantage n'exclut pas l'emploi de colorants classiques (Giemsa, par exemple). D'autres méthodes, telles que celle basée sur l'emploi de colonnes de cellulose pour enlever les cellules nucléées (16), peuvent être utilisées à condition que leur efficacité pour la préparation de micronoyaux dans le laboratoire ait été prouvée.

1.5.7. Analyse Le pourcentage d'érythrocytes immatures par rapport au nombre total d'érythrocytes (immatures + matures) est déterminé pour chaque animal en comptant au moins 200 érythrocytes dans le cas de la moelle osseuse et 1000 érythrocytes dans le cas du sang périphérique (17). Toutes les lames, y compris celles des témoins positifs et négatifs, doivent êtres codées indépendamment avant l'analyse au microscope. L'incidence des érythrocytes immatures micronucléés est déterminée sur la base de l'examen d'au moins 2000 érythrocytes immatures par animal. On peut obtenir des informations supplémentaires en recherchant la présence de micronoyaux dans les érythrocytes matures. A l'examen des lames, le pourcentage d'érythrocytes immatures par rapport au nombre total d'érythrocytes ne doit pas être inférieur à 20 % de la valeur des témoins. Lorsque les animaux sont traités en continu pendant 4 semaines ou davantage, on peut aussi examiner au moins 2000 érythrocytes matures par animal pour déterminer l'incidence des érythrocytes matures micronucléés. Des systèmes d'analyse automatisée (analyse d'images et cytométrie de flux pour cellules en suspension) peuvent remplacer des techniques manuelles s'ils sont justifiés et validés.

2. RÉSULTATS

2.

2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS Les résultats individuels pour chaque animal doivent être présentés sous forme de tableaux. L'unité expérimentale est l'animal. Le nombre d'érythrocytes immatures examinés, le nombre d'érythrocytes immatures micronucléés et le nombre d'érythrocytes immatures par rapport au nombre total d'érythrocytes doivent être présentés séparément pour chaque animal analysé. Lorsque les animaux sont traités en continu pendant quatre semaines ou davantage, il convient de fournir également les données relatives aux érythrocytes matures, si elles ont été recueillies. Le pourcentage d'érythrocytes immatures par rapport au nombre total d'érythrocytes et, si cela est jugé pertinent, le pourcentage d'érythrocytes micronucléés seront indiqués pour chaque animal. S'il n'y a pas de différence de réponse entre sexes, les données des deux sexes peuvent être combinées dans l'analyse statistique.

2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, notamment une augmentation, dose-dépendante, du nombre de cellules micronucléées ou une augmentation nette du nombre de cellules micronucléées dans un seul groupe traité à un seul temps de prélèvement. En premier lieu, il s'agit de déterminer la pertinence biologique des résultats. L'évaluation des résultats peut s'appuyer sur des méthodes statistiques (18) (19) mais la signification statistique ne doit pas être le seul facteur décisif pour conclure à une réponse positive. Les résultats équivoques doivent être clarifiés par des essais supplémentaires réalisés de préférence dans des conditions expérimentales modifiées. Si les résultats obtenus avec une substance d'essai ne répondent pas aux critères indiqués ci-dessus, on peut conclure que la substance en question n'est pas mutagène dans cet essai. Bien que la plupart des essais donneront des résultats nettement positifs ou négatifs, dans certains cas rares l'ensemble des résultats d'un essai n'autorise pas un jugement catégorique sur l'activité de la substance étudiée. Les résultats peuvent rester équivoques ou discutables indépendamment du nombre de répétitions de l'essai. Des résultats positifs obtenus dans cet essai in vivo du micronoyau indiquent que la substance induit la formation de micronoyaux qui résultent de lésions des chromosomes ou de l'appareil mitotique dans les érythroblastes de l'espèce testée. Des résultats négatifs signifient que, dans les conditions de l'essai la substance testée n'induit pas la formation de micronoyaux dans les érythrocytes immatures de l'espèce testée. Le fait que la substance d'essai ou ses métabolites atteignent la circulation générale ou spécifiquement le tissu cible (toxicité systématique) doit être discute.

3. RAPPORT

3. RAPPORT D'ESSAI

Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:

Solvant/véhicule:

justification du choix du véhicule,

solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant/véhicule, si elles sont connues.

Animaux d'expérience:

espèce/souche utilisée,

nombre, âge et sexe des animaux,

source, conditions d'encagement, régime alimentaire, etc.,

poids individuel des animaux au début de l'essai, y compris l'intervalle des poids, la moyenne et l'écart-type dans chaque groupe.

Conditions expérimentales:

données relatives aux témoins positifs et négatifs (solvant/véhicule),

résultats de l'étude de détermination des doses utiles, si elle a été réalisée,

justification du choix des doses employées,

détails concernant la préparation de la substance d'essai,

détails concernant l'administration de la substance d'essai,

justification du choix de la voie d'administration,

méthodes pour vérifier que la substance a atteint la circulation générale ou le tissu cible, le cas échéant,

conversion de la concentration (ppm) de la substance d'essai dans l'eau de boisson ou la nourriture en dose réelle (mg/kg de poids corporel/jour), s'il y a lieu,

détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau,

description détaillée des modalités de traitement et de prélèvement,

méthodes de préparation des lames,

méthodes de mesure de la toxicité,

critères de dénombrement des érythrocytes immatures micronuclées,

nombre de cellules analysées par animal,

critères de décision concernant les résultats positifs, négatifs et équivoques.

Résultats:

signes de toxicité,

proportion d'érythrocytes immatures par rapport au nombre total d'érythrocytes,

nombre d'érythrocytes immatures micronuclées, donné séparément pour chaque animal,

moyenne ± écart-type des érythrocytes micronuclées immatures par groupe,

relation dose-réponse, si possible,

analyses et méthodes statistiques appliquées,

données concernant les témoins négatifs concomitants et antérieurs,

données concernant les témoins positifs concomitants.

Discussion des résultats.

Conclusions.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)

BIBLIOGRAPHIE Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15. Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin. K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res., 123, pp. 61-118. Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80. MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N., and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytcs: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp. , 555-558. MacGregor, J. T., Heddle, J. A., Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R. and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245-249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 153-159. Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), in vivo, Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293-304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 16 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis. 10, pp. 313-319. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in in vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247. MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 3 3258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, pp. 269-275. Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 211, pp. 91-104. Gollapudi. B. and McFadden. L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, pp. 97-99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests. L/KEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report, Part 1. revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Lovell. D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

B.13/14. MUTAGÉNICITÉ — ESSAI DE MUTATION RÉVERSE SUR BACTÉRIES

B.13/14.

1. MÉTHODE Cette méthode est une adaptation de la ligne directrice OCDE TG 471, Essai de mutation réverse sur des bactéries (1997).

1.

1.1. INTRODUCTION L'essai bactérien de mutation réverse est pratiqué sur des souches de Salmonella typhimurium et d'Escherichia coït auxotrophes à l'égard d'un acide aminé. Il sert à détecter des mutations ponctuelles résultant de la substitution, de l'addition ou de la délétion d'une ou de plusieurs paires de base de l'ADN (1) (2) (3). Le principe de cet essai repose sur la détection de mutations qui inversent des mutations présentes dans la souche d'essai et rétablissent ainsi la capacité fonctionnelle des bactéries de synthétiser un acide aminé essentiel. Les bactéries révertantes sont détectées d'après leur capacité de se développer en l'absence de l'acide aminé requis par la souche d'essai parentale. Les mutations ponctuelles sont à l'origine de beaucoup de maladies génétiques humaines et de nombreuses données tendent à démontrer que des mutations ponctuelles frappant les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs dans des cellules somatiques jouent un rôle dans le développement de tumeurs tant chez l'homme que chez les animaux de laboratoire. L'essai bactérien de mutation réverse est rapide, peu coûteux et relativement facile à effectuer. Beaucoup de souches utilisées possèdent entre autres particularités, celles de les rendre plus sensibles aux mutations: séquences d'ADN plus sensibles aux mutations au niveau des sites de réversion, augmentation de perméabilité cellulaire pour les grosses molécules, élimination des systèmes de réparation de l'ADN ou favorisation (augmentation) des processus induisant des erreurs lors de la réparation de l'ADN. La spécificité des souches d'essai peut fournir des informations utiles sur les types de mutations induites par les agents génotoxiques. On dispose pour les essais bactériens de mutation réverse de très nombreux résultats pour une grande variété de structures et d'une méthodologie d'essai qui est bien au point et qui peut être appliquée à des substances ayant des propriétés physico-chimiques très diverses, y compris les composés volatils. Voir aussi l'introduction générale de la partie B.

1.2. DÉFINITIONS Un essai de mutation réverse chez Salmonella typhimurium ou Escherichia coli détecte, chez une souche dont la croissance requiert la présence d'un acide aminé (respectivement histidine ou trytophane), des mutations qui transforment cette souche en une souche dont la croissance s'effectue indépendamment d'un rapport extérieur de cet acide aminé. Les mutagènes provoquant la substitution de paires de base sont des agents qui entraînent le remplacement d'une base de l'ADN. Lors d'un essai de réversion, cette modification peut avoir lieu sur le site de la mutation initiale ou sur un autre site du génome bactérien. Les mutagènes décalant le cadre de lecture sont des agents qui provoquent l'addition ou la délétion d'une ou de plusieurs paires de base dans l'ADN, modifiant ainsi le cadre de lecture dans l'ARN.

1.3. CONSIDÉRATIONS PRÉLIMINAIRES L'essai bactérien de mutation réverse porte sur des cellules procaryotes qui différent des cellules de mammifère notamment du point de vue de l'absorption, du métabolisme, de la structure des chromosomes et des processus de répartition de l'ADN. Les essais in vitro nécessitent généralement une activation métabolique exogène. Comme les systèmes d'activation métabolique in vitro ne peuvent pas reproduire parfaitement le métabolisme de cellules de mammifère in vivo, les essais ne fournissent pas directement des informations sur le pouvoir mutagène et carcinogène d'une substance chez les mammifères. L'essai de mutation réverse sur bactéries est couramment employé comme première étape pour la détection de l'activité génotoxique en général et des mutations ponctuelles en particulier. De nombreuses données démontrent que beaucoup de substances chimiques qui se révèlent positives dans cet essai présentent aussi une activité mutagène dans d'autres essais. Certains agents mutagènes ne sont pas décelés par ces systèmes d'essai. Ces défaillances peuvent tenir à la nature particulière de l'effet détecté, à des différences sur le plan de l'activation métabolique ou à des différences de biodisponibilité. D'autre part, les facteurs qui amplifient la sensibilité de l'essai de mutation réverse sur bactéries peuvent conduire à une surestimation de l'activité mutagène. L'essai de mutation réverse sur bactéries peut ne pas convenir pour l'évaluation de certaines classes de substances chimiques, par exemple les composés fortement bactéricides (certains antibiotiques, par exemple) et ceux dont on soupçonne (ou on sait) qu'ils interfèrent spécifiquement avec le système de réplication des cellules de mammifère (par exemple les inhibiteurs de la topoisomérase ou certains analogues de nucléosides). Dans de tels cas, des essais de mutation sur des cellules de mammifère peuvent s'avérer plus appropriés. Bien que de nombreux composés qui donnent un résultat positif à cet essai soient cancérogènes pour les mammifères, la corrélation n'est pas parfaite. Celle-ci dépend de la classe chimique et il existe des substances cancérogènes qui ne sont pas détectées par cet essai parce qu'elles agissent par des mécanismes non génotoxiques ou par des mécanismes qui sont absents des cellules bactériennes.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Des bactéries en suspension sont exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique exogène. Dans le cas de la méthode d'incorporation directe (méthode par étalement), ces suspensions sont mélangées avec la gélose de surface et déposées immédiatement sur le milieu minimal. Dans le cas de la méthode avec préincubation, le mélange de bactéries en suspension-substance testée est incubé et ensuite mélangé avec un couche de gélose de surface avant d'être étalé sur le milieu minimal. Dans les deux techniques, après deux ou trois jours d'incubation, les colonies révertantes sont comptées et leur nombre est comparé à celui des revenants spontanés dans les boîtes témoins traitées avec le solvant. Plusieurs méthodes permettant de réaliser l'essai de mutation réverse sur bactéries ont été décrites. Parmi celles qui sont communément utilisées figure la méthode par incorporation directe (1) (2) (3) (4), la méthode de la préincubation (2) (3) (5) (6) (7) (8), la méthode de la fluctuation (9) (10) et la méthode par suspension (11). Des méthodes modifiées pour les essais avec des gaz ou des vapeurs ont été décrites (12). Les modes opératoires décrits se réfèrent principalement aux méthodes d'incorporation directe et de préincubation. Chacune de ces méthodes peut être utilisée avec et sans activation métabolique. L'utilisation de la méthode avec préincubation permet de détecter plus efficacement l'effet mutagène de certaines substances. Ces substances appartiennent à des classes chimiques qui comprennent les nitrosamines aliphatiques à chaînes courtes, les métaux bivalents, les aldéhydes, les colorants azoïques et les composés diazoïques, les alcaloïdes pyrollizidiniques, les composés allyliques et nitrés (3). Il est également admis que certaines classes de mutagènes ne sont pas toujours détectées par les méthodes conventionnelles telles que l'incorporation directe ou la préincubation. Ces substances doivent être considérées comme des cas particuliers et il est fortement recommandé d'utiliser d'autres méthodes de détection. On a pu mettre en évidence les cas particuliers suivants (ainsi que des exemples de méthodes qui pourraient servir à leur détection): colorants azoïques et composés diazoïques (3) (5) (6) (13), gaz et substances chimiques volatiles (12) (14) (15) (16), glycosides (17) (18). Tout écart par rapport au mode opératoire standard demande à être scientifiquement justifié.

1.5. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.5.

1.5.1. Préparations

1.5.1.

1.5.1.1. Bactéries On laisse des cultures fraîches de bactéries se développer jusqu'à la fin de la phase exponentielle ou jusqu'au début de la phase stationnaire de croissance (environ 109 cellules par ml). Des cultures en fin de phase stationnaire ne doivent pas être utilisées. Il est essentiel que les cultures utilisées pour cet essai présentent une concentration élevée de bactéries viables. La concentration peut être déterminée à partir des données historiques sur les courbes de croissance des souches bactériennes utilisées ou, lors de chaque essai, par la détermination du nombre de cellules viables à l'aide de la méthode par étalement. La température d'incubation recommandée est de 37 oC. Au moins cinq souches de bactéries doivent être employées. Celles-ci doivent comprendre quatre souches de S. typhimurium (TA1535, TA1537 ou TA97a ou TA97, TA98 et TA100) pour lesquelles des comparaisons entres laboratoires ont démontré la fiabilité et la reproductibilité de la réponse. Ces souches, qui comportent des paires de bases GC sur les sites primaires de réversion, risquent toutefois de ne pas déceler certains mutagènes oxydants, des agents de réticulation et des hydrazines. Ces substances mutagènes peuvent être détectées à l'aide de souches d'E. coli WP2 ou de S. typhimurium TA102 (19) qui ont une paire de base AT sur le site primaire de réversion. Par conséquent, il est recommandé de mettre en œuvre la combinaison de souches suivante: Pour les mutagènes à pouvoir réticulant, il peut être préférable d'inclure la souche TA102 ou d'ajouter une souche d'E. coli pourvue d'un mécanisme de réparation de l'ADN [E. coli WP2 ou E. coli WP2 (pKM101), par exemple]. La préparation des cultures souches, la vérification des marqueurs et le stockage doivent s'effectuer suivant des méthodes reconnues. Pour chaque culture souche congelée, il faut démontrer que la croissance exige la présence d'un acide aminé (histidine pour S. typhimurium et tryptophane pour E. coli). D'autres caractéristiques phénotypiques demandent également à être vérifiées, à savoir la présence ou l'absence de plasmides de résistance, s'il y a lieu [résistance à l'ampicilline des souches TA98, TA100 et TA97a ou TA97, WP2 uvrA et WP2 uvrA (pKM101), et résistance à l'association ampicilline/tétracycline de la souche TA102], ainsi que la présence de mutations caractéristiques (à savoir la mutation rfa chez S. typhimurium d'après la sensibilité au cristal violet et la mutation uvrA chez E. coli ou uvrB chez S. typhimurium d'après la sensibilité aux UV) (2) (3). D'autre part, les souches doivent produire un nombre de colonies de révertants spontanés par boîte qui se situe dans la gamme de fréquence prévue sur la base des données historiques du laboratoire et de préférence être comparable aux valeurs citées dans la littérature.

S. typhimurium TA1535, et

S. typhimurium TA1537 ou TA97 ou TA97a, et

S. typhimurium TA98, et

S. typhimurium TA100, et

E. coli WP2 uvrA ou E. coli WP2 uvrA (pKM101) ou S. typhimurium TA102.

1.5.1.2. Milieu On utilise une gélose minimale appropriée (composée, par exemple, de milieu minimal E de Vogel-Bonner et de glucose) et une gélose de recouvrement contenant de l'histidine et de la biotine ou du tryptophane pour permettre quelques divisions cellulaires (1) (2) (9).

1.5.1.3. Activation métabolique Les bactéries sont exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié. Le système le plus communément utilisé est une fraction post-mitochondriale enrichie en cofacteur (S9), préparée à partir de foie de rongeur traité avec des indicateurs enzymatiques comme Aroclor 1254 (1) (2) ou une combinaison de phénobarbital et de β-naphthoflavone (18) (20) (21). La fraction post-mitochondriale est généralement utilisée à une concentration comprise entre 5 et 30 % v/v dans le mélange S9. Le choix et la composition du système d'activation métabolique peuvent varier suivant la classe chimique de la substance d'essai. Dans certains cas, il peut être intéressant d'utiliser plusieurs concentrations de la fraction post-mitochondriale. Dans le cas de composés azoïques et diazoïques, un système d'activation métabolique réducteur peut s'avérer plus approprié (6) (13).

1.5.1.4. Substance d'essai/préparation Les substances d'essai solides sont préparées par dissolution ou suspension dans un véhicule ou un solvant approprié, plus éventuellement diluées avant le traitement des bactéries. Les substances d'essai liquides peuvent être ajoutées au système d'essai directement ou après dilution. Il convient d'utiliser des préparations fraîches, sauf si l'on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les conditions du stockage. Le solvant/véhicule choisi ne doit pas réagir chimiquement avec la substance d'essai ni altérer la survie des bactéries et l'activité du mélange S9 (22). L'emploi d'un solvant/véhicule inhabituel doit être justifié par des données faisant état de sa compatibilité. On préconise d'envisager d'abord l'utilisation d'un véhicule/solvant aqueux, chaque fois que cela est possible. Dans les essais de substances qui sont instables dans l'eau, on utilisera des solvants organiques exempts d'eau.

1.5.2. Conditions expérimentales

1.5.2.

1.5.2.1. Souches utilisées (voir point 1.5.1.1)

1.5.2.2. Concentration d'exposition La cytotoxicité et la solubilité dans le mélange d'essai final sont des critères à prendre en considération pour déterminer la dose la plus élevée à mettre en œuvre. Un essai préliminaire destiné à déterminer la toxicité et les caractéristiques de solubilité peut être utile. La cytotoxicité peut être détectée par une réduction du nombre de révertants, un éclaircissement ou une diminution du tapis bactérien ou une diminution du taux de survie des cultures traitées. Les systèmes d'activation métabolique peuvent avoir une influence sur la cytotoxicité d'une substance. On conclut à l'insolubilité lorsqu'une précipitation dans le mélange final est observée à l'œil nu dans les conditions réelles de l'essai. Pour les substances d'essai solubles et non cytotoxiques, on recommande une concentration maximale de 5 mg ou 5 μl par boîte. Pour les substances d'essai non cytotoxiques qui sont insolubles à 5 mg ou 5 μl par boîte, l'essai doit comprendre une ou plusieurs concentrations auxquelles on observe une insolubilité. Pour les substances qui sont déjà cytotoxiques à une concentration inférieure à 5 mg ou 5μl/boîte, l'essai doit être effectué jusqu'à une concentration cytotoxique. Le précipité ne doit pas interférer avec l'évaluation des résultats. Pour un premier essai, il convient de tester au moins cinq concentrations analysables différentes de la substance d'essai, avec des intervalles d'environ une demi-unité logarithmique, c'est-à-dire √10. Pour établir une relation dose-réponse, il peut s'avérer nécessaire de réduire ces intervalles. Dans le cas de substances d'essai contenant des quantités substantielles d'impuretés potentiellement mutagènes, il peut être utile d'effectuer des essais avec des concentrations supérieures à 5 mg ou 5 μl/boîte.

1.5.2.3. Témoins négatifs et positifs Des témoins positifs spécifiques de la souche, et des témoins négatifs (solvant ou véhicule), doivent être inclus dans chaque essai, avec ou sans activation métabolique. Dans le cas des témoins positifs, on utilisera une concentration permettant de démontrer l'efficacité de chaque essai. Pour les essais avec système d'activation métabolique, le ou les témoins positifs de référence doivent être choisis en fonction du type de souche bactérienne utilisé. Les substances suivantes sont des exemples de témoins positifs pour les essais avec activation métabolique: Substance Numéro CAS Numéro Einecs Diméthyl-9,10 anthracène 781-43-1 212-308-4 Diméthyl-7,12 benz[a]anthracène 57-97-6 200-359-5 3enzo[a]pyrène 50-32-8 200-028-5 Amino-2 anthracène 613-13-8 210-330-9 Cyclophosphamide 50-18-0 200-015-4 Monohydrate de cyclophosphamide 6055-19-2 La substance suivante convient comme témoin positif pour la méthode d'activation métabolique réductrice: Substance Numéro CAS Numéro Einecs Rouge Congo 573-58-0 209-358-4 L'amino-2 anthracène ne peut être utilisé comme indicateur unique de l'efficacité du mélange S9. S'il est utilisé, il faut également caractériser chaque lot de S9 avec un mutagène qui requiert une activation métabolique par des enzymes microsomalcs, benzo[a]pyrène et diméthylbenzanthracène par exemple. Les substances suivantes sont des exemples de témoins positifs spécifiques de souches pour les essais sans activation métabolique exogène: Substance Numéro CAS Numéro Ëinecs Souche Azoture de sodium 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 et TA 100 Nitro-2 fluorène 607-57-8 210-138-5 TA 98 Amino-9 acridine 90-45-9 201-995-6 TA 15 37, TA 97 et TA 97a ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 et TA 97a Hydropéroxyde de cumène 80-15-9 201-254-7 TA 102 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA et TA 102 N-éthyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2 uvrA et WP2 uvrA (pKM101) 1-oxyde de 4-nitroquinoléine 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2 uvrA et WP2 uvrA (pKM101) Furylfuramide (AF2) 3688-53-7 Souches contenant des plasmides D'autres témoins positifs appropriés peuvent être utilisés comme référence. L'utilisation de témoins positifs appartenant à la même classe chimique doit être envisagée, s'ils sont disponibles. L'essai doit comprendre des témoins négatifs constitués de solvant ou véhicule sans substances d'essai, auxquels sont appliquées les mêmes conditions expérimentales qu'à la substance d'essai. Il faut également inclure des témoins non traités, à moins que des essais antérieurs n'aient démontré que le solvant choisi n'a pas d'effet délétère ou mutagène.

1.5.3. Mode opératoire Pour la méthode par étalement (1) (2) (3) (4) sans activation métabolique, on ajoute généralement 0,05 ml ou 0,1 ml de la solution à tester, 0,1 ml de culture bactérienne fraîche (contenant environ 108 cellules viables) et 0,5 ml de tampon stérile à 2,0 ml de gélose de recouvrement. Pour l'essai avec activation métabolique, on mélange habituellement 0,5 ml du mélange d'activation métabolique contenant une quantité adéquate de fraction post-mitochondriaie (entre 5 et 30 % v/v), les bactéries et la substance d'essai, ou une solution de celle-ci, avec 2,0 ml de gélose de recouvrement. Le contenu de chaque tube est mélangé et versé sur la surface d'un milieu minimal gélosé. On laisse la gélose de recouvrement se solidifier avant incubation. Dans la méthode de la préincubation (2) (3) (5) (6), la substance d'essai, ou une solution de celle-ci, est préincubée avec la souche d'essai (environ 108 cellules viables) et un tampon stérile ou 0,5 ml du système d'activation métabolique généralement pendant 20 minutes ou plus à 30-37 oC. On ajoute ensuite la gélose de recouvrement et on verse le tout sur la surface d'un milieu minimal gélosé. On mélange généralement 0,05 ou 0,1 ml de la substance d'essai, ou d'une solution de celle-ci, 0,1 ml de bactéries et 0,5 ml de mélange S9 ou de tampon stérile avec 2,0 ml de gélose de recouvrement. Pendant la préincubation, les tubes doivent être aérés par agitation. Pour une bonne estimation de la variation, chaque concentration doit être testée dans trois boîtes de Petri. Le nombre de boîtes peut être limité à deux si cela se justifie scientifiquement. La perte accidentelle d'une boîte n'invalide pas nécessairement l'essai. Les substances gazeuses ou volatiles doivent être testées en utilisant des méthodes appropriées, par exemple dans des récipients hermétiquement fermés (12) (14) (15) (16).

1.5.4. Incubation Toutes les boîtes d'un essai donné doivent être incubées à 37 oC pendant 48-72 heures. À la fin de la période d'incubation, on compte dans chaque boîte le nombre de colonies révertantes.

2. RÉSULTATS

2.

2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS Les données doivent être présentées sous la forme du nombre de colonies révertantes par boîte. Le nombre de colonies révertantes dans les boîtes de témoins négatifs (témoins traités avec le solvant et, le cas échéant, témoins non traités) et positifs doit également être mentionné. Le dénombrement par boîte, le nombre moyen de colonies révertantes par boîte et l'écart-type doivent être indiqués pour la substance d'essai ainsi que pour les témoins positifs et négatifs (non traités et/ou traités au solvant). Il n'est pas nécessaire de vérifier une réponse nettement positive. Les résultats équivoques doivent être clarifiés par des essais supplémentaires réalisés de préférence dans des conditions expérimentales modifiées. Les résultats négatifs demandent à être confirmés cas par cas. Si la confirmation de résultats négatifs n'est pas jugée nécessaire, une justification doit être fournie. Pour les essais de confirmation, il convient d'envisager une modification des conditions expérimentales, afin d'élargir la gamme des conditions évaluées. Les paramètres susceptibles d'être modifiés comprennent l'écart entre les doses, la méthode de traitement (étalement ou préincubation en milieu liquide) et les conditions d'activation métabolique.

2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, notamment un accroissement, dose-dépendant, du nombre de révertants ou une augmentation reproductible du nombre de colonies de revenants par boîte à une ou plusieurs concentrations pour au moins une souche, avec ou sans activation métabolique (23). En premier lieu, il s'agit de prendre en considération la signification biologique des résultats. L'évaluation des résultats peut s'appuyer sur des méthodes statistiques (24) mais la signification statistique ne doit pas être le seul facteur décisif pour conclure à une réponse positive. Si les résultats obtenus avec une substance d'essai ne répondent pas aux critères indiqués ci-dessus, on peut conclure que la substance en question n'est pas mutagène dans cet essai. Bien que la plupart des essais donneront des résultats manifestement positifs ou négatifs, dans certains cas rares l'ensemble des résultats d'un essai n'autorise pas de conclusion catégorique sur l'activité de la substance étudiée. Les résultats peuvent rester équivoques ou discutables indépendamment du nombre de répétitions de l'essai. Des résultats positifs obtenus à l'essai de mutation réverse sur bactéries indiquent que la substance induit des mutations ponctuelles par substitution de bases ou décalage du cadre de lecture dans le génome de Salmonella typhimurium et/ou Escherichia coli. Un résultat négatif signifie que, dans les conditions de l'essai, la substance n'est pas mutagène pour l'espèce utilisée dans l'essai.

3. RAPPORT

3. RAPPORT D'ESSAI

Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:

Solvant/véhicule:

justification du choix du solvant/véhicule,

solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant/véhicule, si elles sont connues.

Souches:

souches utilisées,

nombre de cellules par culture,

caractéristiques des souches.

Conditions expérimentales:

quantité de substance d'essai par boite (mg/boîte ou μl/boîte) et justification du choix des doses et du nombre de boîtes par concentration,

milieux utilisés,

type et composition du système d'activation métabolique, y compris les critères d'acceptabilité,

procédés de traitement.

Résultats:

signes de toxicité,

signes de précipitation,

dénombrement par boîte,

nombre moyen de colonies révertantes par boîte et écart-type,

relation dose-réponse, si possible,

analyses statistiques, le cas échéant,

données concernant les témoins négatifs (solvant/véhicule) et positifs concomitants (étendues, moyennes et écarts-types),

données concernant les témoins négatifs (solvant/véhicule) et positifs antérieurs (étendues, moyennes et écarts-types).

Discussion des résultats.

Conclusions.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)

BIBLIOGRAPHIE Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233. Kier, L. D., Brusick, D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-lox Program, Mutation Res., 168, pp. 69-240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura. T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives. Cancer Letters, 1, pp. 91-96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. ed. Nor- poth K. H. and Garner, R. C, Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285. Gatehouse. D. G.. Rowland, I. R.. Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenecity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61. Aeschacher. H. U.. Wolleb, U. and Porchet. L. (1987). Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, pp. 167-177. Green, M. H. L, Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutations Res., 38, pp. 33-42. Hubbard, S. A., Green, M. H. L, Gatehouse, D. and J. W. Bridges (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicitv Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161. Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453-465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335-344. Privai, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47. Zeiger, E., Anderson B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141. Simmon, V., Kauhanen K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258. Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, 1. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M. and Sugimura T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780-3782. Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Nail. Acad. Sri, USA, 77, pp. 4961-4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285-291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Tatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Maron, D., Katzenellenbogcn, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350. Claxton, L. D., Allen J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomc Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91. Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, pp. 28-65.

B.15. TESTS DE MUTAGENÈSE ET DE DÉPISTAGE DE CANCÉROGENÈSE MUTATION GÉNIQUE — SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.15.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B.

1.2. DÉFINITION Voir introduction générale, partie B.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Diverses souches haploïdes et diploïdes de la levure Saccharomyces cerevisiae peuvent être utilisées pour mesurer la production de mutations géniques induites par des agents chimiques en présence et en l'absence d'activation métabolique. La mesure de mutation en avant dans les souches haploïdes peut être réalisée notamment par la mesure du passage des mutants rouges exigeant l'adénine (ade-1, ade-2) à une forme blanche doublement exigeante pour l'adénine ainsi que des systèmes sélectifs tels que l'induction de la résistance à la canavanine et la cydoheximide. La méthode de mutation reverse la plus largement utilisée implique l'utilisation de la souche haploïde XV 185-14C qui porte les mutations non-sens ochre ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 et trp 5-48, lesquelles sont réversibles par des mutagènes provoquant des substitutions de bases qui induisent des mutations à un site spécifique ou des mutations suppressives ochre. La souche XV 185-14C porte également le marqueur his 1-7, une mutation contresens principalement révertée par des mutations de second site et le marqueur hom 3-10 qui est réverté par des mutagènes conduisant au décalage du cadre de lecture du code génétique (frameshift mutagens). La seule souche diploïde de S. cerevisiae largement validée est la souche D7, homozygote pour ilv 1-92.

1.5. CRITÈRE QUALITATIF Néant.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.6. Préparations

Les solutions des substances d'essai ainsi que celles des substances témoins seront préparées, immédiatement avant l'essai, à l'aide d'un véhicule approprié. Lorsqu'il s'agit de substances organiques non solubles dans l'eau, les solvants organiques tels que l'éthanol, l'acétone ou le diméthylsulfoxyde (DMSO) devraient être utilisés à une concentration ne dépassant pas 2 % v/v. La concentration finale du véhicule ne doit pas affecter de manière significative la viabilité des cellules ni les caractéristiques de croissance.

Activation métabolique

Les cellules devraient être exposées aux substances d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique exogène approprié. La méthode la plus fréquemment utilisée consiste à ajouter la fraction post-mitochondriale préparée à partir de foies de rongeurs prétraités par des inducteurs enzymatiques additionnée de co-facteurs. L'usage d'autres espèces, tissus, fractions post-mitochondriales, ou méthodes peut aussi convenir pour l'activation métabolique.

Conditions d'essai

Souches d'expérience

La souche haploïde XV 185-14C et la souche diploïde D7 sont les plus fréquemment utilisées dans les études de mutation génique. D'autres souches peuvent également convenir.

Milieux

Des milieux de culture appropriés sont utilisés pour déterminer la survie cellulaire et le nombre de mutants.

Utilisation de témoins négatifs et positifs

Des témoins positifs, des témoins non traités et des témoins en présence de solvant devraient être simultanément réalisés. Des substances chimiques témoins positives appropriées devraient être utilisées pour concrétiser chaque effet mutagène spécifique.

Concentration d'exposition

Au moins 55 concentrations convenablement espacées devraient être utilisées. Dans le cas de substances toxiques, la concentration maximale testée ne fera pas descendre le taux de survie en dessous de 5 à 10 %. Les substances relativement insolubles dans l'eau seront testées jusqu'à leur limite de solubilité par des méthodes appropriées. En ce qui concerne les substances non toxiques très solubles dans l'eau, la concentration la plus élevée sera déterminée cas par cas.

Conditions d'incubation

Les boîtes sont incubées dans l'obscurité à une température de 28 à 30 oC pendant 4 à 7 jours.

Fréquences de mutation spontanée

On utilisera des subcultures dont les fréquences de mutations spontanées se situent dans les limites normales admises.

Nombre de répétitions

Trois boîtes au moins seront utilisées par concentration, en vue de déterminer les prototrophes produits par mutation génique et d'observer la viabilité des cellules. Dans le cas d'expériences utilisant des marqueurs tels que hom 3-10 à faible taux de mutation, le nombre des boîtes utilisées peut être augmenté afin de fournir des données statistiquement pertinentes.

Conduite de l'essai

Les souches de S. cerevisiae sont habituellement traitées au cours d'un essai en milieu liquide impliquant l'utilisation de cellules en phase stationnaire ou de croissance. Les expériences initiales devraient être faites sur des cellules en croissance. 1 — 5 × 107 cellules/ml sont exposées à la substance d'essai pendant une période allant jusqu'à 18 heures, à une température de 28 à 37 oC, le mélange étant agité; une quantité adéquate d'un système d'activation métabolique est ajoutée pendant le traitement. Si la première expérience fournit des résultats négatifs, une deuxième expérience devrait être réalisée en utilisant des cellules en phase stationnaire. Si la première expérience fournit des résultats positifs, ceux-ci sont confirmés par une expérience indépendante. À l'issue du traitement, les cellules sont centrifugées, lavées et ensemencées sur un milieu de culture approprié. Après incubation, les boîtes sont examinées afin de déterminer le taux de survie et l'induction de mutations géniques.

2. RÉSULTATS Les résultats devraient être présentés sous forme de tableaux indiquant le nombre de colonies comptées, le nombre de mutants, le taux de survie et la fréquence de mutants. Tous les résultats devraient être confirmés au cours d'une expérience indépendante. Les résultats devraient être évalués par des méthodes statistiques adéquates.

3. RAPPORT

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements suivants:

souche utilisée,

conditions d'essai: cellules en phases stationnaire ou de croissance; composition des milieux; température d'incubation et durée de celle-ci; système d'activation métabolique,

conditions de traitement: concentration d'exposition; méthode et durée de traitement; température de traitement; témoins positifs et négatifs,

nombre de colonies comptées; nombre de mutants; taux de survie et fréquence de mutants; relation dose-réponse, si possible; évaluation statistique des résultats,

discussion des résultats,

interprétation des résultats.

3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale, partie B.

4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale, partie B.

B.16. RECOMBINAISON MITOTIQUE — SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.16.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B.

1.2. DÉFINITION Voir introduction générale, partie B.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Chez Saccharomyces cerevisiae, on peut déceler la recombinaison mitotique intergénique (ou plus généralement, entre un gène et son centromère) et intragénique. Dans le premier cas, on parle de croissing-over mitotique lequel donne naissance à des échanges réciproques, tandis que, dans le second cas, les échanges sont le plus souvent non réciproques et l'on parle de conversion génique. Le crossing-over est généralement déterminé par la production de colonies ou de secteurs récessifs homozygotes à partir d'une souche hétérozygote, tandis que la conversion génique est déterminée par la production de revertants prototrophes dans une souche auxotrophe hétéroallélique portant deux allèles défectueux différents du même gène. Les souches les plus couramment utilisées pour déceler une conversion génique mitotique sont D4 (hétéroallélique pour ade 2 et trp 5), D7 (hétéroallélique pour trp 5), BZ34 (hétéroallélique pour arg 4) et JD1 (hétéroallélique pour his 4 et trp S). croissing-over mitotique produisant des secteurs homozygotes de couleur rouge et rose peut être déterminé dans D5 ou dans D7 (qui mesure aussi la conversion génique mitotique et la mutation reverse pour ilv 1-92), ces deux souches étant hétéroalléliques complémentaires pour les allèles ade 2.

1.5. CRITÈRE QUALITATIF Néant.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.6. Préparations

Les solutions des substances d'essai ainsi que celles des substances témoins ou de référence devraient être préparées, immédiatement avant l'essai, à l'aide d'un véhicule approprié. Dans le cas de substances organiques insolubles dans l'eau, on utilisera des solvants organiques, tels que l'éthanol, l'acétone et le Diméthylsulfoxyde (DMSO), a une concentration ne dépassant pas 2 % v/v. La concentration finale du véhicule ne devrait pas affecter de manière significative la viabilité des cellules ni les caractéristiques de croissance.

Activation métabolique

Les cellules seront exposées aux substances d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique exogène. La méthode la plus fréquemment utilisée consiste à ajouter la fraction post-mitochondriale préparée à partir de foies de rongeurs prétraités par des inducteurs enzymatiques additionnée de co-facteurs. L'usage d'autres espèces, tissus, fractions post-mitochondriales, ou méthodes peut aussi convenir pour l'activation métabolique.

Conditions d'essai

Souches d'expérience

Les souches les plus fréquemment utilisées sont les diploïdes D4, D5, D7 et JD1. D'autres souches peuvent convenir.

Milieux

Des milieux de culture adéquats sont utilisés en vue de déterminer le taux de survie et la fréquence de recombinaisons mitotiques.

Utilisation de témoins négatifs et positifs

Des témoins positifs, des témoins non traités et des témoins en présence de solvant seront simultanément réalisés. Des substances chimiques témoins positives appropriées seront utilisées pour chaque type spécifique de recombinaison.

Concentration d'exposition

Au moins cinq concentrations convenablement espacées de substance d'essai seront utilisées. La cytotoxicité et la solubilité sont au nombre des facteurs à prendre en considération. La concentration la plus faible ne doit avoir aucun effet sur la viabilité des cellules. Dans le cas de produits chimiques toxiques, la concentration maximale testée ne diminuera pas le taux de survie en dessous de 5 à 10 %. Les produits chimiques relativement insolubles dans l'eau seront testés jusqu'à leur limite de solubilité par des méthodes appropriées. Dans le cas de produits chimiques non toxiques franchement solubles dans l'eau, la concentration d'essai maximale sera déterminée cas par cas. Les cellules peuvent être exposées aux substances d'essai en phase stationnaire ou en phase de croissance pendant des périodes allant jusqu'à 18 heures. Toutefois, dans le cas d'un traitement de longue durée, les cultures seront examinées au microscope afin de déceler la formation de spores; la présence de celles-ci rendant l'essai nul.

Conditions d'incubation

Les boîtes sont incubées, dans l'obscurité, à une température de 28 à 30 oC, pendant 4 à 7 jours. Les boîtes utilisées pour la détermination des secteurs homozygotes rouge et rose produits par croissing-over mitotique seront conservées dans un réfrigérateur à ± 4 oC pendant 1 à 2 jours encore avant le dénombrement de manière à ce que la pigmentation des colonies concernées puisse s'intensifier.

Fréquences de recombinaisons mitotiques spontanées

On utilisera des subcultures dont les fréquences de recombinaisons mitotiques spontanées se situeront dans la gamme normalement admise.

Nombre de répétitions

Trois boîtes au moins seront ensemencées par concentration afin de déterminer la viabilité ainsi que le nombre de prototrophes produits par conversion génique mitotique. Dans le cas de la détermination d'homozygotie récessive produite par croissing-over mitotique, le nombre des boîtes sera augmenté pour obtenir un nombre adéquat de colonies.

Conduite de l'essai

Les souches de S. cerevisiae sont habituellement traitées au cours d'un essai en milieu liquide impliquant l'utilisation de cellules en phase stationnaire ou de croissance. Les expériences initiales devraient être faites sur des cellules en croissance. 1 — 5 × 107 cellules/ml sont exposées à la substance d'essai pendant une période allant jusqu'à 18 heures à des températures de 28 à 37 oC, le mélange étant agité; une quantité adéquate d'un système d'activation métabolique est ajoutée pendant le traitement. Si la première expérience fournit des résultats négatifs, une deuxième expérience devrait être réalisée en utilisant des cellules en phase stationnaire. Si la première expérience fournit des résultats positifs, ceux-ci sont confirmés par une expérience indépendante appropriée. À l'issue du traitement, les cellules sont centrifugées, lavées et ensemencées sur un milieu de culture adéquat. Après incubation, les boîtes sont examinées afin de déterminer le taux de survie et l'induction de recombinaison mitotique.

2. RÉSULTATS Les résultats devraient être présentés sous forme de tableaux indiquant le nombre de colonies comptées, le nombre de recombinants, le taux de survie et la fréquence de recombinants. Tous les résultats devraient être confirmés au cours d'une expérience indépendante. Les résultats devraient être évalués par des méthodes statistiques adéquates.

3. RAPPORT

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements suivants:

souche utilisée,

conditions d'essai: cellules en phase stationnaire ou en phase de croissance; composition des milieux; température d'incubation et durée d'incubation; système d'activation métabolique,

conditions de traitement: concentration d'exposition; méthode et durée de traitement; température de traitement; témoins positifs et négatifs,

nombre de colonies comptées; nombre de recombinants; taux de survie et fréquence de recombinaison: relation dose-réponse, si possible; évaluation statistique des résultats,

discussion des résultats,

interprétation des résultats.

3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale, partie B.

4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale, partie B.

B. 17. MUTAGÉNICITÉ — ESSAI IN VITRO DE MUTATION GÉNIQUE SUR CELLULES DE MAMMIFÈRE

B. 17.

1. MÉTHODE Cette méthode est une adaptation de la ligne directrice OCDE TG 476, Essai in vitro de mutation génique sur cellules de mammifères (1997).

1.

1.1. INTRODUCTION L'essai in vitro de mutation génique sur cellules de mammifères permet de détecter des mutations géniques induites par des substances chimiques. Les lignées cellulaires appropriées comprennent des cellules de lymphome de souris L5178Y, les lignées CHO-AS52 et V79 de cellules de hamster chinois et les cellules lymphoblastoïdes humaines TK6 (1). Dans ces lignées cellulaires, les critères génétiques les plus couramment utilisés sont une mutation sur les loci de la thymidine kinase (TK) et de l'hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transférase (HPRT), ainsi qu'un transgène de la xanthine-guanine phosphoribosyl transférasc (XPRT). Les essais de mutation TK, HPRT et XPRT détectent des gammes différentes d'effet génétiques. L'emplacement autosomique de TK et XPRT peut permettre de détecter des effets génétiques (par exemple des délétions importantes) qui ne sont pas détectés sur le locus HPRT de chromosomes X (2, 3, 4, 5, 6). L'essai in vitro de mutation génique sur cellules de mammifère peut être pratiqué sur des cultures de lignées cellulaires établies ou de souches cellulaires. Les cellules employées sont choisies en fonction de leur potentiel de croissance en culture et de la stabilité de la fréquence de mutation spontanée. Les essais in vitro requièrent généralement une source exogène d'activation métabolique qui ne peut pas reproduire parfaitement les conditions présentes in vivo chez les mammifères. Il faut éviter absolument d'introduire des conditions qui conduiraient à des résultats positifs ne reflétant pas une mutagénicité intrinsèque et pouvant provenir de modifications du pH ou de l'osmolalité ou d'une forte cytotoxicité (7). Cet essai est utilisé pour le dépistage de substances pouvant être mutagènes et cancérigènes pour les mammifères. Bien que de nombreux composés donnant un résultat positif à cet essai soient cancérigènes pour les mammifères, il n'y a pas de corrélation parfaite entre cet essai et la cancérogénicité. La corrélation dépend de la classe chimique et de plus en plus d'éléments laissent penser qu'il existe des agents cancérigènes que cet essai ne permet pas de détecter parce qu'ils agissent par des mécanismes non génotoxiques ou par des mécanismes qui sont absents des cellules de mammifères (6). Voir aussi l'introduction générale de la partie B.

1.2. DÉFINITIONS Mutation directe: mutation génique de la forme parentale en une forme mutante, qui engendre une modification ou une perte de l'activité enzymatique de la fonction de la protéine codée. Mutagènes provoquant la substitution de paires de bases: substances qui entraînent le remplacement d'une ou de plusieurs bases de l'ADN. Mutagènes décalant le cadre de lecture: substances qui entraînent l'addition ou la délétion d'une ou de plusieurs paires de bases dans la molécule d'ADN. Temps d'expression du phénotype: période pendant laquelle des produits géniques non modifiés disparaissent des cellules qui viennent de subir une mutation. Fréquence de mutants: rapport cellules mutantes observées/cellules viables. Croissance totale relative: augmentation du nombre de cellules dans le temps par rapport à une population témoin; elle est calculée comme le produit de la croissance en suspension par rapport au témoin négatif et de l'efficacité de clonage par rapport au témoin négatif. Croissance relative en suspension: augmentation du nombre de cellules pendant la période d'expression par rapport au témoin négatif. Viabilité: efficacité de clonage des cellules traitées au moment de l'étalement dans des conditions sélectives après la période d'expression. Taux de survie: efficacité de clonage des cellules traitées au moment de l'étalement à la fin de la période de traitement; le taux de survie est généralement exprimé par rapport au taux de survie de la population cellulaire témoin.

1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Les cellules déficientes en thymidine kinase (TK) par suite de la mutation directe TK-/- —> TK-/- sont résistantes aux effets cytotoxiques de la trifluorothymidinc (TFT), un analogue de la pyrimidine. Les cellules non déficientes en TK sont sensibles à la TFT, ce qui entraîne une inhibition du métabolisme cellulaire et l'arrêt de la division cellulaire. Ainsi, les cellules mutantes peuvent proliférer en présence de TFT, tandis que les cellules normales, qui contiennent de la TK, ne le peuvent pas. De la même façon, des cellules déficientes en HPRT ou XPRT sont sélectionnées par leur résistance à la thio-6 guanine (TG) ou à l'aza-8 guanine (AG). Lorsqu'un analogue d'une base ou une substance apparentée à l'agent sélectif est soumis à un essai de mutation génique sur des cellules de mammifère, il convient d'en étudier soigneusement les propriétés. Il faut, par exemple, examiner toute toxicité sélective soupçonnée de la substance d'essai vis-à-vis de cellules mutantes et non mutantes. Par conséquent, la performance du système ou de l'agent de sélection doit être confirmée lors de l'essai de substances ayant une similitude de structure avec l'agent de sélection (8). Des cellules en suspension ou en culture monocouche sont exposées à la substance d'essai, avec et sans activation métabolique, pendant une période appropriée. Les cellules sont repiquées afin de déterminer la cytotoxicité et de laisser le phénotype s'exprimer avant la sélection des mutants (9, 10, 11, 12, 13). On détermine la cytotoxicitc en mesurant l'efficacité de clonage relative (taux de survie) ou la croissance totale relative des cultures après la période de traitement. Les cultures traitées sont maintenues dans un milieu de croissance pendant une période de temps suffisante, caractéristique de chaque locus et du type de cellule choisi, afin de permettre une expression phénotypique presque optimale des mutations induites. On détermine la proportion de mutants en mettant en culture un nombre connu de cellules dans un milieu contenant l'agent sélectif pour détecter les cellules mutantes et dans un milieu exempt d'agent sélectif pour déterminer l'efficacité de clonage (viabilité). Les colonies sont comptées après une durée d'incubation appropriée. On compare le nombre de colonies mutantes en milieu sélectif au nombre de colonies en milieu non sélectif pour obtenir la proportion de mutants.

1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.4.

1.4.1. Préparations

1.4.1.

1.4.1.1. Cellules Divers types de cellules conviennent pour ce test, entre autres: sous-clones de L5178Y, CHO, AS52, V79 ou TK6. Les cellules utilisées doivent avoir une sensibilité prouvée aux mutagènes chimiques, une efficacité de clonage élevée et une fréquence de mutation spontanée stable. On doit veiller à ce que les cellules ne soient pas contaminées par des mycoplasmes. Des cellules contaminées ne doivent pas être utilisées. L'essai doit être conçu de façon à avoir une sensibilité et une puissance prédéterminées. Le nombre de cellules, de cultures et de concentrations de la substance d'essai utilisées doit refléter ces paramètres définis à l'avance (14). À chaque stade de l'essai, le nombre minimal de cellules viables survivant au traitement doit être basé sur la fréquence de mutation spontanée. Une règle générale consiste à utiliser un nombre de cellules au moins égal à dix fois l'inverse de cette fréquence. Cependant, il est recommandé d'utiliser au moins 106 cellules. Pour s'assurer de la performance constante de l'essai, il faut disposer de données antérieures adéquates relatives au système cellulaire utilisé.

1.4.1.2. Milieux et conditions de culture On doit utiliser des milieux de culture et des conditions d'incubation appropriés (récipients de culture, température, concentration de CO2 et humidité). Les milieux doivent être choisis en fonction des systèmes sélectifs et du type de cellules utilisés dans l'essai. Il est particulièrement important de choisir des conditions de culture qui assurent une croissance optimale des cellules pendant la période d'expression, ainsi que la capacité des cellules, tant mutantes que non mutantes, à former des colonies.

1.4.1.3. Préparation des cultures Les cellules sont multipliées à partir de cultures souches, ensemencées dans le milieu de culture et incubées à 37 oC. Avant l'emploi des cultures pour l'essai, il peut être nécessaire de les débarrasser des cellules mutantes qu'elles contiennent.

1.4.1.4. Activation métabolique Les cellules doivent être exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié. Le système le plus couramment utilisé est une fraction post-mitochondriale enrichie en cofacteur (S9), préparée à partir de foie de rongeur traité avec des inducteurs enzymatiques, par exemple Aroclor 1254 (15, 16, 17, 18) ou un mélange de phénobarbital et de β-naphthoflavone (19, 20). La fraction post-mitochondriale est généralement utilisée à une concentration comprise entre 1 et 10 % v/v dans le milieu final. Le choix du système d'activation métabolique peut dépendre de la classe chimique de la substance d'essai. Dans certains cas il peut y avoir avantage à utiliser plus d'une concentration de la fraction post-mitochondriale. Plusieurs procédés nouveaux, comme la création de lignées cellulaires génétiquement modifiées exprimant des enzymes activantes spécifiques, sont susceptibles de fournir une activation endogène. Le choix des lignées cellulaires utilisées doit être justifié scientifiquement (par exemple par la pertinence de l'isoenzyme du cytochrome P4 50 pour le métabolisme de la substance d'essai).

1.4.1.5. Substance d'essai/préparation Les substances d'essai solides sont dissoutes ou mises en suspension dans un solvant ou un véhicule approprié, puis éventuellement diluées avant le traitement des cellules. Les substances d'essai liquides peuvent être ajoutées directement ou après dilution au système d'essai. Il convient d'utiliser des préparations fraîches, sauf si l'on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les conditions du stockage.

1.4.2. Conditions expérimentales

1.4.2.

1.4.2.1. Solvant/véhicule Le solvant/véhicule choisi ne doit pas réagir chimiquement avec la substance d'essai ni altérer la survie des cellules et l'activité du mélange S9. L'emploi d'un solvant/véhicule inhabituel doit être justifié par des données faisant état de sa compatibilité. On préconise d'envisager d'abord l'utilisation d'un véhicule/solvant aqueux, chaque fois que cela est possible. Dans les essais de substances qui sont instables dans l'eau, on utilisera des solvants organiques exempts d'eau. L'eau peut être enlevée à l'aide d'un tamis moléculaire.

1.4.2.2. Concentration d'exposition La cytotoxicité, la solubilité dans le mélange d'essai final et les modifications de pH et d'osmolalité sont des critères à prendre en considération pour déterminer la dose la plus élevée à mettre en œuvre. La cytotoxicité doit être mesurée, avec et sans système d'activation métabolique, dans l'expérience principale par un indicateur pertinent de l'intégrité et de la croissance cellulaire, tel que l'efficacité de clonage relative (taux de survie) ou la croissance totale relative. Il peut être utile de déterminer la cytotoxicité et la solubilité dans un essai préliminaire. Il convient d'utiliser au moins quatre concentrations analysables. Dans le cas d'une substance cytotoxique, ces concentrations doivent couvrir un domaine allant d'une toxicité nulle ou légère à la toxicité maximale, ce qui signifie généralement des concentrations séparées par un facteur compris entre 2 et √10 au maximum. Si la concentration la plus forte est basée sur la cytotoxicité, elle devrait donner un taux de survie relatif (efficacité de clonage relative) ou une croissance totale relative d'environ 10 à 20 % (mais non inférieure à 10 %). En ce qui concerne les substances relativement non cytotoxiques, la concentration maximale doit être la plus basse des trois concentrations suivantes: 5 μl/ml, 5 mg/ml ou 0,01 M. Les substances relativement insolubles doivent être testées jusqu'à des concentrations égales ou supérieures à la limite de solubilité dans les conditions de culture. L'insolubilité doit être mise en évidence dans le milieu de traitement final auquel les cellules sont exposées. Il peut être utile d'évaluer la solubilité au début et à la fin du traitement, celle-ci pouvant varier au cours de l'exposition dans le système d'essai en raison de la présence de cellules, de S9, de sérum, etc. On conclut à l'insolubilité lorsqu'une précipitation est observée à l'exil nu. Le précipité ne doit pas interférer avec l'évaluation des résultats.

1.4.2.3. Témoins Des témoins positifs et négatifs (solvant ou véhicule) doivent être inclus dans chaque expérience avec et sans activation métabolique. Quand l'essai est effectué avec activation métabolique, la substance utilisée comme témoin doit être celle qui exige l'activation pour donner une réponse mutagène. Des exemples de substances pouvant servir comme témoins positifs figurent dans le tableau ci-dessous. Condition d'activation métabolique Locus Substance No CAS No Einecs Absence d'activation métabolique exogène HPRT Méthanesulfonate d'éthyle 62-50-0 200-536-7 Éthylnitrosourée 759-73-9 212-072-2 TK (petites et grandes colonies) Méthanesulfonate de méthyle 66-27-3 200-625-0 XPRT Méthanesulfonate d'éthyle 62-50-0 200-536-7 Éthylnitrosourée 759-73-9 212-072-2 Présence d'activation métabolique exogène HPRT Méthyl-3 cholanthrène 56-49-5 200-276-4 N-Nitrosodiméthylaminc 62-75-9 200-549-8 Diméthyl-7,12 benzanthracène 57-97-6 200-359-5 TK (petites et grandes colonies) Cvclophosphamide 50-18-0 200-015-4 Monohydrate de cyclophosphamide 6055-19-2 Benzo[a]pyrène 50-32-8 200-028-5 Méthyl-3 cholanthrène 56-49-5 200-276-5 XPRT N-Nitrosodiméthylamine (pour des niveaux élevés de S9) 62-75-9 200-549-8 Benzo[a]pyrène 50-32-8 200-028-5 D'autres substances de référence appropriées peuvent être utilisées comme témoins positifs, par exemple la 5-bromo 2'-désoxyuridine (no CAS 59-14-3, no Einecs 200-415-9) si le laboratoire possède des contrôles historiques relatifs à cette substance. L'emploi de témoins positifs appartenant à la même classe chimique doit être envisagé, s'ils sont disponibles. Des témoins négatifs, constitués uniquement du solvant ou du véhicule dans le milieu de traitement et traités de la même façon que la substance d'essai, doivent être inclus. Il faut également inclure des témoins non traités, à moins que des essais antérieurs n'aient démontré que le solvant choisi n'a pas d'action délétère ou mutagène.

1.4.3. Mode opératoire

1.4.3.

1.4.3.1. Traitement avec la substance d'essai Les cellules en prolifération sont traitées avec la substance d'essai en présence et en l'absence d'activation métabolique. La durée d'exposition doit être suffisante (une durée de trois à six heures est généralement efficace) et peut s'étendre sur un ou plusieurs cycles cellulaires. On peut réaliser les cultures en un seul ou en double exemplaire pour chaque concentration testée. Dans le cas des cultures en un seul exemplaire, il faut augmenter le nombre des concentrations afin d'assurer un nombre adéquat de cultures à analyser (par exemple, au moins huit concentrations analysables). Les cultures servant de témoins négatifs (solvant) sont faites en double. Les substances gazeuses ou volatiles doivent être testées en utilisant des méthodes appropriées, par exemple dans des récipients de culture hermétiquement fermés (21, 22).

1.4.3.2. Détermination du taux de survie, de la viabilité et de la proportion de mutants À la fin de la période d'exposition, les cellules sont lavées et mises en culture en vue de la détermination de leur taux de survie et de l'expression du phénotype mutant. La détermination de la cytotoxicité commence généralement après la période de traitement par la mesure de l'efficacité de clonage relative (taux de survie) ou de la croissance totale relative des cultures. À chaque locus correspond un temps bien défini qui est nécessaire à l'expression presque optimale du phénotype des mutants nouvellement induits (HPRT et XPRT ont besoin d'au moins 6 à 8 jours et TK d'au moins 2 jours). Pour déterminer le nombre de mutants et l'efficacité de clonage, les cellules sont placées dans un milieu en présence et en l'absence d'agent(s) sélectif(s). On commence à mesurer la viabilité, qui permet de calculer la proportion de mutants, à la fin de la période d'expression en déposant les cultures dans un milieu non sélectif. Si la substance d'essai est positive à l'essai sur L5178Y TK-/-, la taille des colonies doit être déterminée dans au moins une des cultures traitées (à la concentration positive la plus élevée) et dans les témoins négatifs et positifs. Si la substance d'essai est négative à l'essai sur L5178Y TK+/-, la taille des colonies doit être déterminée dans les témoins négatifs et positifs. Dans le cas des essais sur TK6TK+/-, on peut également déterminer la taille des colonies.

2. RÉSULTATS

2.

2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS Les données doivent comprendre la détermination de la cytotoxicité et de la viabilité, le nombre de colonies et la proportion de mutants dans les cultures traitées et les cultures témoins. Dans le cas d'une réponse positive à l'essai sur L5178Y TK+/-, on dénombre les colonies en distinguant les petites des grandes colonies pour au moins une concentration de la substance d'essai (concentration positive la plus élevée) et pour les témoins négatifs et positifs. La nature moléculaire et cytogénétique des deux sortes de colonies de mutants (petites et grandes) a été étudiée en détail (23, 24). Dans l'essai TK+/-, les colonies sont recensées sur la base du critère de croissance normale (grandes colonies) et de croissance faible (petites colonies) (25). Les cellules mutantes qui ont subi les altérations génétiques les plus importantes ont un temps de duplication plus long et forment donc de petites colonies. Ces altérations vont de la perte du gène entier à des aberrations chromosomiques se manifestant dans le caryotype. L'induction de petites colonies de mutants a été mise en rapport avec des substances chimiques qui engendrent des aberrations chromosomiques importantes (26). Les cellules mutantes moins affectées croissent à des vitesses semblables à celles des cellules parentales et forment de grandes colonies. Il convient d'indiquer le taux de survie (efficacité de clonage relative) ou la croissance totale relative. La proportion de mutants doit être exprimée comme le nombre de cellules mutantes divisé par le nombre de cellules survivantes. Les données individuelles concernant chaque culture doivent être indiquées. En outre, toutes les données doivent être résumées sous forme de tableaux. Il n'est pas nécessaire de vérifier une réponse manifestement positive. Les résultats équivoques doivent être clarifiés par des essais supplémentaires réalisés de préférence dans des conditions expérimentales modifiées. Les résultats négatifs demandent à être confirmés cas par cas. Si la confirmation de résultats négatifs n'est pas jugée nécessaire, une justification doit être fournie. Pour les essais de confirmation effectués en cas de résultats négatifs ou équivoques, il convient d'envisager une modification des paramètres de l'étude, afin d'élargir la gamme des conditions évaluées. Les paramètres susceptibles d'être modifiés comprennent l'écart entre les doses et les conditions d'activation métabolique.

2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, notamment un accroissement dose-dépendant ou un accroissement reproductible de la proportion de mutants. En premier lieu, il s'agit de prendre en considération la pertinence biologique des résultats. L'évaluation des résultats peut s'appuyer sur des méthodes statistiques mais la signification statistique ne doit pas être le seul facteur décisif pour conclure à une réponse positive. Si les résultats obtenus avec une substance d'essai ne répondent pas aux critères indiqués ci-dessus, on peut conclure que la substance en question n'est pas mutagène dans cet essai. Bien que la plupart des essais donneront des résultats nettement positifs ou négatifs, dans certains cas rares l'ensemble des résultats d'un essai n'autorise pas une conclusion catégorique sur l'activité de la substance étudiée. Les résultats peuvent rester équivoques ou discutables indépendamment du nombre de répétitions de l'essai. Des résultats positifs d'un essai in vitro de mutation génique sur cellules de mammifère indiquent que la substance d'essai induit des mutations géniques dans les cellules de mammifère des cultures utilisées. Une relation dose-réponse positive, si elle est reproductible, est des plus significatives. Des résultats négatifs signifient que, dans les conditions de l'essai, la substance testée n'induit pas de mutation génique dans les cellules de mammifère des cultures utilisées.

3. RAPPORT

3. RAPPORT D'ESSAI

Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:

Solvant/véhicule:

justification du choix du véhicule/solvant,

solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant/véhicule, si elles sont connues.

Cellules:

type et source des cellules,

nombre de cultures,

données concernant le cycle cellulaire,

nombre de repiquages, le cas échéant,

méthodes d'entretien des cultures cellulaires, le cas échéant,

absence de mycoplasme, le cas échéant.

Conditions de l'essai:

justification du choix des concentrations et du nombre de cultures, y compris des données relatives à la cytotoxicité et aux limites de solubilité, si elles sont disponibles,

composition du milieu, concentration de CO2,

concentration de la substance d'essai,

volume de véhicule et de substance d'essai ajouté,

température d'incubation,

temps d'incubation,

durée du traitement,

densité cellulaire pendant le traitement,

type et composition du système d'activation métabolique, y compris les critères d'acceptabilité,

témoins positifs et négatifs,

durée de la période d'expression,

agents sélectifs,

critères pour conclure que les résultats des essais sont positifs, négatifs ou équivoques,

méthodes utilisées pour compter le nombre de cellules viables et de cellules mutantes,

définition de colonies qui sont prises en compte pour le type et pour la taille, y compris les critères pour les petites et grandes colonies.

Résultats:

signes de toxicité,

signes de précipitation,

données sur le pH et l'osmolalité pendant l'exposition à la substance d'essai, si elles ont été déterminées,

taille des colonies si elle a été déterminée pour au moins les témoins négatifs et positifs,

aptitude du laboratoire à déceler des mutants en petites colonies avec le système L5178Y TK+/-, le cas échéant,

relation dose-réponse, si possible,

analyses statistiques, le cas échéant,

données concernant les témoins négatifs (solvant ou véhicule) et positifs concomitants,

données concernant les témoins négatifs (solvant ou véhicule) et positifs antérieurs (étendues, moyennes, écarts-types).

proportion de mutants.

Discussion des résultats.

Conclusions.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)

BIBLIOGRAPHIE Moore, M.M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindall, K. R. (eds.) (1987), Ranbury Report 28: Mammalian Cell Mutaginesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E. H. Y. and Mailing, H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells in Vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 61, pp. 1306-1312. Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymiuine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res., 94, pp. 467-48 5. Moore, M. M., Harington-Brock. K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis. 4, pp. 394-403. Aaron, C. S. and Stankowski, Jr. L. F. (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res, 223, pp. 121-128. Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res, 312, pp. 235-239. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., lshidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Gcnotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res, 257, pp. 147-204. Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res, US, pp. 225-251. Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson. J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hvpoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environment Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res, 196, pp. 17-36. Li, A. P., Carver. J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., O'Neill, J. P., Riddle, J. C, Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Cuanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res, 189, pp. 135-141. Liber, H. L, Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res, 216, pp. 9-17. Stankowski, L. F. Jr., Tindall, K. R. and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191-Induced Mutation in AS 52 Cells, Munition Res, 160, pp. 133-147. Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedures for the L5178Y/TK-/- — TK-/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268. Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L, Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith, J. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland D. J., ed., Cambridge University Press, pp. 66-101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res, 46, pp. 365-373. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res, 31, pp. 347-364. Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson, A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/-/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutation Res, 59, pp. 61-108. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res, 113, pp. 173-215. Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcomc, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-lnduced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis. 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinatcd Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres. F. J.. Fonts, I. R.. Bend, J. R. and Philpot. R. M. (eds.) Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. Krahn, D. F., Barsky. F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds.), Genoloxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis. 5, pp. 795-801. Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burreli, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51- 55. Moore. M. M., Clive, D., Hozier, J. C. Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFT1) and Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res., 151, pp. 161-174. Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res., 229, pp. 89-102. Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small- Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- — 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis 5, pp. 609-614.

B.18. LÉSION ET RÉPARATION D'ADN — SYNTHÈSE NON PROGRAMMÉE DE L'ADN (UDS) — CELLULES DE MAMMIFÈRE — IN VITRO

B.18.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B.

1.2. DÉFINITION Voir introduction générale, partie B.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI L'essai de synthèse non programmée de l'acide désoxyribonucléique (ADN) (UDS) mesure la synthèse de réparation de l'ADN après excision et élimination d'un fragment d'ADN contenant la région lésée par des agents chimiques et physiques. L'essai est basé sur l'incorporation de thymidine tritiée (3H-TdR) dans l'ADN de cellules de mammifère ne se trouvant pas en phase S du cycle cellulaire. On peut déterminer l'incorporation de 3H-TdR en examinant par autoradiographie ou par comptage en scintillation liquide (LSC) l'ADN provenant de cellules traitées. Les cellules de mammifère en culture, à moins que des hépatocytes primaires de rat ne soient utilisés, sont traitées avec la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique exogène. L'UDS peut également être mesurée par des méthodes in vivo.

1.5. CRITÈRE QUALITATIF Néant.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.6. Préparations

Les substances d'essai ainsi que les substances témoins ou de référence seront, soit préparées en milieu de culture, soit dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés, puis diluées en milieu de culture avant d'être utilisées dans l'essai. La concentration finale du véhicule ne devrait pas affecter la viabilité cellulaire. Des cultures primaires d'hépatocytes de rats, de lymphocytes humains ou des lignées cellulaires établies (par exemple fibroblastes humains diploïdes) peuvent être utilisées pour cet essai. Les cellules seront exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié.

Conditions d'essai

Nombre de cultures

Au moins deux cultures cellulaires pour l'autoradiographie et six cultures cellulaires (ou moins si justifié scientifiquement) pour le comptage en scintillation liquide sont nécessaires pour chaque pont expérimental.

Utilisation de témoins négatifs et positifs

Des témoins simultanés positifs et négatifs (non traités et/ou véhicule), avec et sans activation métabolique, devraient être inclus dans chaque expérience. Pour l'essai sur hépatocytes de rat, on peut, par exemple, utiliser le 7,12-DMBA (7,12-diméthylbenzanthracène) ou le 2-AAF (2-acétylaminofluorène). Dans le cas de lignées cellulaires établies, on peut, pour les essais par autoradiographie et LSC réalisés sans activation métabolique, utiliser comme témoin positif par exemple le 4-NQO (4-nitroquinoline-N-oxyde); lorsqu'on a recours à des systèmes d'activation métaboliques, la N-diméthylnitrosamine est un des composés témoins positifs utilisables.

Concentration d'exposition

Une gamme de concentrations de la substance d'essai devrait être utilisée afin de permettre de déterminer au mieux la réponse. La concentration maximale devrait produire certains effets cytotoxiques. Les substances relativement insolubles dans l'eau seront testées jusqu'à leur limite de solubilité. En ce qui concerne les substances non toxiques franchement solubles dans l'eau, la concentration maximale à tester devrait être déterminée cas par cas.

Cellules

Pour l'entretien des cultures on aura recours à des milieux de culture, une concentration en CO2, une température et une humidité appropriées. Les lignées cellulaires établies devraient être périodiquement contrôlées du point de vue de la contamination par Mycoplasme.

Activation métabolique

Aucun système d'activation métabolique n'est utilisé pour des cultures primaires d'hépatocytes. Les lignées cellulaires établies et les lymphocytes sont exposés à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié.

Conduite de l'essai

Préparation des cultures

Des lignées cellulaires établies sont obtenues à partir de cultures souches (par exemple par trypsinisation ou par agitation), ensemencées dans des récipients de culture à une densité adéquate et incubées à 37 oC. Des cultures à court terme d'hépatocytes de rat sont établies en permettant aux hépatocytes récemment dissociés dans un milieu approprié de s'attacher à la surface de croissance. Les cultures de lymphocytes humains sont réalisées par des techniques appropriées.

Traitement des cultures avec la substance d'essai Hépatocytes primaires de rat:

Des hépatocytes primaires de rat récemment isolés sont traités au moyen de la substance d'essai dans un milieu contenant 3H-TdR, pendant un laps de temps adéquat. À l'issue de la période de traitement, le milieu sera éliminé, les cellules seront rincées, fixées et séchées. Les lames sont plongées dans une émulsion autoradiographique [alternativement une pellicule photographique (stripping film) peut être utilisée], exposées, développées, colorées et comptées.

Lignées cellulaires établies et lymphocytes:

Techniques autoradiograpbiques: Les cultures cellulaires sont exposées à la substance d'essai pendant des périodes de temps adéquates, puis traitées à la 3H-TdR. La durée de l'exposition sera fonction de la nature de la substance, de l'activité du système métabolique et du type de cellules. Pour déceler l'acmé de UDS, la 3H-TdR sera ajoutée soit en même temps que la substance d'essai, soit dans les quelques minutes qui suivent l'exposition à la substance d'essai. Le choix de l'une ou l'autre de ces techniques sera déterminé par d'éventuelles interactions entre la substance d'essai et la 3H-TdR. Afin de pouvoir faire la distinction entre l'UDS et la réplication semi-conservatrice de l'ADN, on peut inhiber cette dernière en utilisant, par exemple, un milieu déficient en arginine, une faible teneur en sérum ou en ajoutant de l'hydroxyurée dans le milieu de culture. Mesures l'USC de l'UDS: Avant de procéder au traitement avec la substance d'essai, l'entrée des cellules en phase S sera bloquée de la manière décrite ci-dessus; les cellules sont ensuite exposées à la substance d'essai comme décrit pour l'autoradiographie. À l'issue de la période d'incubation, l'ADN est extrait des cellules et la teneur totale en ADN ainsi que la quantité de 3H-TdR incorporée sont déterminées. Il faut noter que lorsque des lymphocytes humains sont utilisés, il n'est pas nécessaire de supprimer la réplication semi-conservative de l'ADN dans des cultures non stimulées.

Analyse

Déterminations autoradiographiques

Pour déterminer l'UDS dans des cellules en culture, on ne compte pas les noyaux en phase S. Au moins 50 cellules par concentration seront comptées. Les James seront codées avant comptage. Plusieurs champs choisis au hasard suffisamment éloignés les uns des autres seront comptés sur chaque lame. On déterminera la quantité de 3H-TdR incorporée dans le cytoplasme en comptant trois surfaces de la taille du noyau dans le cytoplasme de chaque cellule comptée.

Détermination LSC

On devrait utiliser un nombre adéquat de cultures pour chaque concentration et pour les témoins lors des déterminations LSC-UDS. Tous les résultats sont confirmés au cours d'une expérience indépendante.

2. RÉSULTATS Les résultats sont présentés sous la forme de tableaux.

2.

2.1. DÉTERMINATIONS AUTORADIOGRAPHIQUES La quantité de 3H-TdR incorporée dans le cytoplasme ainsi que le nombre de grains comptés par noyau cellulaire seront enregistrés séparément. La moyenne, la médiane et le mode peuvent être utilisés pour décrire la distribution de la quantité de 3H-TdR incorporée dans le cytoplasme ainsi que le nombre de grains par noyau.

2.2. DÉTERMINATIONS LSC Pour les déterminations LSC, l'incorporation de 3H-TdR sera indiquée sous la forme de dpm/μg d'ADN. La moyenne des dpm/μg d'ADN moyen avec son écart type peut être utilisé pour décrire la distribution de l'incorporation. Les données devraient être évaluées par des méthodes statistiques appropriées.

3. RAPPORT

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements suivants:

cellules utilisées, densité et nombre de passages au moment du traitement, nombre de cultures cellulaires,

méthodes utilisées pour l'entretien des cultures cellulaires, y compris milieu, température et concentration en CO2,

substance d'essai, véhicule, concentration et justification du choix des concentrations utilisées dans l'essai,

détails relatifs aux systèmes d'activation métabolique,

schéma du traitement,

témoins positifs et négatifs,

technique autoradiographique utilisée,

méthodes utilisées pour bloquer l'entrée des cellules en phase S,

techniques utilisées pour extraire l'ADN et déterminer la quantité totale d'ADN dans les déterminations LSC,

relation dose-réponse, si possible,

évaluation statistique,

discussion des résultats,

interprétation des résultats.

3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale, partie B.

4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale, partie B.

B.19. ESSAI IN VITRO D'ÉCHANGE DE CHROMATIDES-SŒURS

B.19.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B.

1.2. DÉFINITION Voir introduction générale, partie B.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI L'essai d'échange des chromatides-sœurs (SCE) constitue un test à court terme destiné à déceler les échanges réciproques d'ADN entre deux chromatides-sœurs d'un chromosome se dédoublant. Les SCE-s représentent l'échange réciproque de produits de réplication de l'ADN à des loci apparemment homologues. Le processus d'échange implique probablement une cassure et une réunion de l'ADN, bien que l'on sache peu de choses de sa base moléculaire. Pour déceler des SCE-s, il est nécessaire de pouvoir marquer différemment les chromatides-sœurs; ceci est rendu possible par l'incorporation de bromodésoxyuridine (BrdU) dans l'ADN chromosomique pendant deux cycles cellulaires. Les cellules de mammifère in vitro sont exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique exogène de mammifère, le cas échéant, et mises en culture pendant deux cycles de réplication dans un milieu contenant de la BrdU. Après traitement avec un inhibiteur du fuseau (par exemple colchicine) afin d'accumuler les cellules en phase de mitose de type métaphasique (c-métaphase), les cellules sont récoltées et des préparations de chromosomes sont réalisées.

1.5. CRITÈRE QUALITATIF Néant.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

Des cultures primaires (lymphocytes humains) ou des lignées cellulaires établies (par exemple cellules ovariennes de hamsters chinois) peuvent être utilisées pour l'essai. Les 'lignées cellulaires seront contrôlées du point de vue de la contamination par des Mycoplasmes.

Des milieux de culture et des conditions d'incubation appropriés (par exemple température, récipients de culture, concentration en CO2 et humidité) seront utilisés.

Les substances d'essai peuvent être soit préparées dans des milieux de culture soit dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés avant le traitement des cellules. La concentration finale d'un véhicule dans le milieu de culture ne devrait pas affecter significativement la viabilité des cellules ou le taux de croissance et les effets sur la fréquence de SCE seront contrôlés à l'aide d'un solvant témoin.

Les cellules seront exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique exogène de mammifère. Lorsqu'on utilise des types de cellules ayant une activité métabolique intrinsèque, le taux et la nature de l'activité devraient être appropriés à la classe chimique testée.

1.6. Conditions d'essai

Nombre de cultures

Deux cultures séparées au moins seront utilisées pour chaque point expérimental.

Utilisation de témoins positifs et négatifs

Des témoins positifs utilisant une substance à action directe et une substance nécessitant une activation métabolique devraient être inclus dans chaque expérience: un témoin devrait être également utilisé pour le véhicule. Les substances ci-après peuvent par exemple, être utilisées comme témoins positifs: Le cas échant, un témoin positif supplémentaire appartenant à la même classe chimique que la substance d'essai peut être inclus.

substance à action directe:

méthanesulfonaté d'éthyle,

substance à action indirecte:

cyclophosphamide.

Concentration d'exposition

Au moins trois concentrations de la substance d'essai, convenablement espacées, devraient être utilisées. La concentration maximale produira un effet toxique significatif mais permettra encore une réplication cellulaire adéquate. Des substances relativement insolubles dans l'eau seront testées jusqu'à leur limite de solubilité par des méthodes appropriées. Dans le cas de substances non toxiques franchement solubles dans l'eau, la concentration maximale de la substance d'essai devrait être déterminée cas par cas.

Conduite de l'essai

Préparation des cultures

Des lignées cellulaires établies sont obtenues à partir de cultures souches (par exemple par trypsinisation ou par agitation), ensemencées dans des récipients de culture à une densité adéquate et incubées à 37 oC. Dans le cas de cultures en couche monocellulaire, le nombre de cellules par récipient de culture devrait être ajusté de manière à ce que les cultures ne soient pas confluentes à plus de 50 % au moment de la récolte. Les cellules peuvent également être utilisées sous une forme de culture en suspension. Les cultures de lymphocytes humains sont préparées à partir de sang hépariné, en utilisant des techniques appropriées, et incubées à 37 oC.

Traitement

Des cellules en phase exponentielle de croissance sont exposées à la substance d'essai pendant un laps de temps adéquat, dans la plupart des cas une à deux heures peuvent suffire, mais, dans certains cas, le traitement peut être prolongé pour couvrir jusqu'à deux cycles cellulaires complets. Les cellules n'ayant pas une activité métabolique intrinsèque suffisante devraient être exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié. À l'issue de la période d'exposition, les cellules sont lavées de manière à éliminer la substance d'essai et mises en culture, en présence de BrdU pendant deux cycles de réplication. Une autre méthode consiste à exposer simultanément les cellules à la substance d'essai et à la BrdU pendant deux cycles cellulaires complets. Les cultures de lymphocytes humains sont traitées pendant qu'elles se trouvent dans un état semi-synchrone. Les cellules sont analysées au cours de leur seconde division après traitement, garantissant ainsi l'exposition des phases les plus sensibles du cycle cellulaire à la substance d'essai. Toutes les cultures additionnées de BrdU seront manipulées dans l'obscurité ou sous un faible éclairage provenant de lampes incandescentes jusqu'au moment de la récolte des cellules, afin de réduire la photolyse de l'ADN contenant de la BrdU.

Récolte des cellules

Les cultures cellulaires sont traitées au moyen d'un inhibiteur du fuseau (par exemple colchicine) une à quatre heures avant leur récolte. Chaque culture est récoltée et traitée séparément pour la préparation des chromosomes.

Préparation des chromosomes et coloration

Les préparations de chromosomes sont effectuées par des méthodes cytogénétiques standard. Plusieurs techniques peuvent être utilisées pour colorer les lames de manière à faire apparaître les SCE (par exemple la méthode par fluorescence plus Giemsa).

Analyse

Le nombre de cellules analysées sera fonction de la fréquence spontanée témoin de SCE. Habituellement, on analyse au moins 25 métaphases bien étalées par culture afin de compter les SCE. Les lames sont codées avant l'analyse. Pour les lymphocytes humains, seules les métaphases contenant 46 centromères sont analysées. Pour les lignées cellulaires établies, seules les métaphases contenant ± 2 centromères du nombre modal sont analysées. Il sera précisé si une inversion de coloration au niveau de centromère est considérée comme un SCE ou non. Les résultats sont confirmés au cours d'une expérience indépendante.

2. RÉSULTATS Les résultats devraient être présentés sous la forme de tableaux. Le nombre de SCE par métaphase et le nombre de SCE par chromosome sont donnés séparément pour toutes les cultures traitées et témoins. Les résultats seront analysés par des méthodes statistiques adéquates.

3. RAPPORT

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements suivants:

cellules utilisées, méthodes d'entretien de la culture cellulaire,

conditions d'essai: composition des milieux, concentration en CO2, concentration de la substance d'essai, véhicule utilisé, température d'incubation, temps de traitement, inhibiteur du fuseau utilisé, concentration et durée du traitement avec celui-ci, type de système d'activation de mammifère utilisé, témoins positifs et négatifs,

nombre de cultures cellulaires par point expérimental,

détails relatifs à la technique utilisée pour la préparation des lames,

nombre de métaphases analysées (données indiquées séparément pour chaque culture),

nombre de SCE par cellule et par chromosome (données indiquées séparément pour chaque culture),

critère de comptage des SCE,

justification du choix des doses,

relation dose-réponse, si possible,

évaluation statistique,

discussion des résultats,

interprétation des résultats.

3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale, partie B.

4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale, partie B.

B.20. TEST DE LÉTALITÉ RÉCESSIVE LIÉE AU SEXE SUR DROSOPHILA MELANOGASTER

B.20.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B.

1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale, partie B.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Le test de létalité récessive liée au sexe (Sex-linked recessive lethal test: SLRL) utilisant Drosophila melanogaster décèle l'apparition de mutations (mutations ponctuelles ainsi que petites délétions), dans la lignée germinale de l'insecte. Cette épreuve constitue un essai de mutation en avant permettant de déceler des mutations à environ 800 loci du chromosome X, soit environ 80 % de tous les loci du chromosome X. Le chromosome X représente approximativement un cinquième du génome haploïde complet. Les mutations du chromosome X de Drosophila melanogaster sont phénotypiquement exprimées chez les mâles porteurs du gène mutant. Lorsque la mutation est létale à l'état hémizygote, sa présence est déduite de l'absence d'un des groupes de descendance mâle sur les deux normalement produits par une femelle hétérozygote. L'épreuve SLRL exploite cette caractéristique en utilisant des chromosomes spécifiquement marqués et possédant des réarrangements de structure.

1.5. CRITÈRE QUALITATIF Néant.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.6. Préparations

Stocks

Des mâles d'une lignée de type sauvage bien définie ainsi que des femelles contenant le chromosome Muller-5 peuvent être utilisés. D'autres lignées de femelles adéquatement marquées et porteuses de chromosomes X inversés de façon multiple peuvent également être utilisées.

Substance d'essai

Les substances d'essai sont dissoutes dans l'eau. Les substances insolubles dans l'eau peuvent être dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés (par exemple un mélange d'éthanol et de Tween-60 ou 80), puis être diluées dans de l'eau ou dans une solution saline avant d'être administrées. L'utilisation de diméthylsulfoxyde comme véhicule devrait être évitée.

Nombre d'animaux

La sensibilité et la signification de l'essai seront prédéterminées. La fréquence de mutants spontanés observée dans le témoin approprié influencera fortement le nombre de chromosomes traités à analyser.

Voie d'administration

L'administration peut être orale, par injection ou par exposition à des gaz ou des vapeurs. L'ingestion de la substance d'essai peut se faire par l'intermédiaire d'une solution sucrée. Si nécessaire, les substances peuvent être dissoutes dans une solution à 0,7 % de NaCl et injectées dans le thorax ou l'abdomen.

Utilisation de témoins négatifs et positifs

Des témoins négatifs (véhicule) et positifs seront inclus. Toutefois, si le laboratoire dispose de données de contrôles historiques adéquats, des témoins simultanés ne sont pas nécessaires.

Niveau d'exposition

Trois niveaux d'exposition seront utilisés. Pour une première évaluation, on peut utiliser un seul niveau d'exposition de la substance d'essai, à savoir, soit la concentration maximale tolérée soit la concentration produisant certains signes de toxicité. Dans le cas de substances non toxiques, on devrait avoir recours à l'exposition à la concentration maximale praticable.

Conduite de l'essai

Des mâles de phénotype sauvage (âgés de 3 à 5 jours) sont traités avec la substance d'essai et individuellement accouplés à plusieurs femelles vierges de la lignée Muller-5 ou d'une autre porteuse d'un marqueur adéquat (à chromosomes X inversés de façon multiple). Tous les deux à trois jours, ces femelles sont remplacées par d'autres femelles vierges afin de couvrir le cycle germinal complet. La descendance de ces femelles est examinée afin de relever les effets létaux correspondant aux effets sur le sperme mature, les spermatides à des stades précoces, moyens ou tardifs, les spermatocytes et les spermatogonies au moment du traitement. Les femelles F1 hétérozygotes provenant des croisements susmentionnés sont accouplées individuellement (c'est-à-dire une femelle par flacon) avec leurs frères. À la génération F2, chaque culture est examinée afin de déceler l'absence de mâles du type sauvage. Si une culture s'avère provenir d'une femelle F1 porteuse d'un gène létal sur le chromosome X parental (c'est-à-dire qu'aucun mâle porteur du chromosome traité n'est observé), les filles de cette femelle présentant le même génotype seront testées afin de vérifier si la létalité se répète dans la génération suivante.

2. RÉSULTATS Les résultats devraient être présentés sous forme de tableaux afin de montrer le nombre de chromosomes testés, le nombre de mâles infertiles et le nombre de chromosomes létaux à chaque concentration d'exposition et à chaque période d'accouplement pour chaque mâle traité. Le nombre de groupes de tailles différentes par mâle est indiqué. Les résultats de l'essai seront confirmés au cours d'une expérience séparée. Des méthodes statistiques appropriées seront utilisées pour évaluer le test de létalité récessive liée au sexe. Le regroupement de gènes létaux récessifs provenant d'un seul mâle sera pris en considération et évalué par une méthode statistique adéquate.

3. RAPPORT

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements suivants:

lignée: lignées ou souches de drosophiles utilisées, âge des insectes, nombre de mâles traités, nombre de mâles stériles, nombre de cultures F2 établies, nombre de cultures F2 sans progéniture, nombre de chromosomes porteurs d'un gène létal décelé à chaque stade de la cellule germinale

critères retenus pour déterminer la taille des groupes traité,

conditions d'essai: description détaillée du programme de traitement et de prélèvement, niveau d'exposition, données relatives à la toxicité, témoins négatifs (solvant) et positifs, si nécessaire,

critères de comptage des mutations létales,

relation exposition/effet, si possible,

évaluation des données,

discussion des résultats,

interprétation des résultats.

3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale, partie B.

4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale, partie B.

B.21. TESTS DE TRANSFORMATION SUR CELLULES DE MAMMIFÈRE IN VITRO

B.21.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B.

1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale, partie B.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Des systèmes de culture de cellules de mammifère peuvent être utilisés pour déceler des modifications phénotypiques in vitro induites par des substances chimiques associées à une transformation maligne in vivo. Parmi les cellules les plus fréquemment utilisées figurent C3H10T'1/2, 3T3, SHE, rat Fisher; les tests sont fondés sur des modifications de la morphologie cellulaire, la formation des foyers ou des modifications liées à la croissance ou non dans un agar semi-solide. Il existe des systèmes moins fréquemment utilisés qui décèlent d'autres modifications physiologiques ou morphologiques dans les cellules a l'issue d'une exposition à des cancérogènes chimiques. Aucun des critères analysés dans ces tests in vitro n'a de relation mécanistique établie avec le cancer. Certains systèmes de tests sont capables de déceler des promoteurs de tumeur. On peut déterminer la cytotoxicité en mesurant l'effet de la substance d'essai sur les aptitudes à former une colonie (efficacité de clonage) ou sur les taux de croissance des cultures. La mesure de la cytotoxicité a pour but de déterminer si l'exposition à la substance d'essai a été toxicologiquement significative mais ne peut servir à calculer la fréquence des transformations dans toutes les épreuves, étant donné que certaines de celles-ci peuvent nécessiter une incubation prolongée et/ou un réensemencement.

1.5. CRITÈRE QUALITATIF Néant.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.6. Préparations

Cellules

Suivant l'épreuve de transformation effectuée, diverses lignées cellulaires ou cellules primaires peuvent être utilisées. L'investigateur veillera à ce que les cellules utilisées pour l'épreuve présentent la modification phénotypique adéquate après exposition à des cancérogènes connus et à ce que la preuve de la validité et de la fiabilité de l'essai effectué dans le laboratoire de l'investigateur soient étayées par des documents.

Milieu

On utilisera des milieux et des conditions d'essai convenant à la méthode de transformation utilisée.

Substance d'essai

Les substances d'essai peuvent être soit préparées dans des milieux de culture, soit dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés avant le traitement des cellules. La concentration finale du véhicule dans le milieu de culture n'affectera ni la viabilité des cellules, ni le taux de croissance, ni l'incidence de transformation.

Activation métabolique

Les cellules sont exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système approprié d'activation métabolique de mammifère. Si l'on utilise des types de cellules ayant une activité métabolique intrinsèque, la nature de l'activité sera reconnue comme appropriée à la classe chimique testée.

Conditions d'essai

Utilisation de témoins positifs et négatifs

Des témoins positifs utilisant une substance à action directe et une substance nécessitant une activation métabolique seront inclus dans chaque expérience: un témoin négatif (véhicule) sera également utilisé. Les substances ci-après peuvent, par exemple, être utilisées comme témoins positifs: Si cela se justifie, un témoin positif supplémentaire appartenant à la même classe chimique que la substance testée devrait être inclus.

substances chimiques à action directe:

méthanesulfonate d'éthyle,

μ-propiolactone,

substances nécessitant une activation métabolique:

2-acétylaminofluorène,

4-diméthylaminoazobenzène,

7,12-diméthylbenzo(a)anthracène.

Concentrations d'exposition

Plusieurs concentrations de la substance d'essai devraient être utilisées. Ces concentrations devraient produire un effet toxique en rapport avec la concentration, la concentration maximale produira un faible taux de survie, la concentration minimale un taux de survie voisin de celui observé pour le témoin négatif. Les substances relativement insolubles dans l'eau seront testées jusqu'à leur limite de solubilité par des méthodes appropriées. Dans le cas de substances non toxiques très solubles dans l'eau, la concentration maximale devrait être déterminée cas par cas.

Conduite de l'essai

Les cellules sont exposées pendant un laps de temps adéquat dépendant du système cellulaire utilisé, et ceci peut impliquer un nouveau traitement assorti d'un changement de milieu (et si nécessaire, un nouveau mélange d'activation métabolique) si l'exposition est prolongée. Les cellules n'ayant pas une activité métabolique intrinsèque suffisante devraient être exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié. À l'issue de la période d'exposition, les cellules sont lavées de manière à éliminer la substance testée et mises en culture dans des conditions permettant l'apparition du phénotype transformé étudié et l'incidence de cette transformation est déterminée. Tous les résultats sont confirmés au cours d'une expérience indépendante.

2. RÉSULTATS Les résultats devraient être présentés sous la forme de tableaux et peuvent être combinés différemment suivant la méthode utilisée, par exemple comptage par boîte, boîtes positives ou nombre de cellules transformées. Le cas échéant, le taux de survie sera exprimé en pourcentage des taux témoins; la fréquence de transformation correspondra au nombre de cellules transformées par nombre de survivantes. Les résultats devraient être évalués par des méthodes statistiques appropriées.

3. RAPPORT

3.

3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements suivants:

type de cellule utilisée, nombre de cultures cellulaires, méthodes d'entretien des cultures cellulaires,

conditions d'essai: concentration de la substance d'essai, véhicule utilisé, temps d'incubation, durée et fréquence du traitement, densité cellulaire durant le traitement, type de système d'activation métabolique exogène utilisé, témoins positifs et négatifs, spécification du phénotype étudié, système sélectif utilisé (le cas échéant), justification du choix des doses,

méthode utilisée pouf compter les cellules viables et transformées,

évaluation statistique,

discussion des résultats,

interprétation des résultats.

3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale, partie B.

4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale, partie B.

B.22.

1. MÉTHODE

1.

1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B.

1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale, partie B.

1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant.

1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI La létalité dominante provoque la mort de l'embryon ou du fœtus. L'induction de létalité dominante par exposition à une substance chimique indique que la substance a altéré le tissu germinal de l'espèce étudiée. Il est généralement admis que la létalité dominante est imputable à une lésion chromosomique (anomalies structurelles et numériques). Si les animaux traités sont des femelles, la mort de l'embryon peut également être due à des effets toxiques. En général, les mâles sont exposés à la substance d'essai et accouplés avec des femelles vierges non traitées. Les différents stades des cellules germinales peuvent être testés séparément grâce à l'utilisation de périodes d'accouplement séquentielles. L'accroissement du nombre d'implants morts par femelle dans le groupe traité par rapport au nombre d'implants morts par femelle dans le groupe témoin reflète les pertes après implantation. Les pertes avant implantation peuvent être estimées par comptage des corps jaunes ou en comparant le nombre total d'implants par femelle dans le groupe traité et dans le groupe témoin. L'effet total de létalité dominante est égal à la somme des pertes avant et après implantation. Le calcul de l'effet total de la létalité dominante est basé sur la comparaison entre le nombre d'implants vivants par femelle dans le groupe testé et celui enregistré pour le groupe témoin. Une réduction du nombre des implants à certaines périodes peut être due à la destruction de cellules (c'est-à-dire de spermatocytes et/ou de spermatogonies).

1.5. CRITÈRE QUALITATIF Néant.

1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI

1.6. Préparations

Lorsque c'est possible, les substances d'essai sont dissoutes ou mises en suspension dans une solution saline isotonique. Les substances chimiques insolubles dans l'eau peuvent être dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés. Le véhicule utilisé ne devrait pas interférer avec la substance d'essai et ne devrait pas produire d'effets toxiques. Des préparations fraîchement réalisées de la substance d'essai sont utilisées.

Conditions d'essai

Voie d'administration

La substance d'essai ne devrait être généralement administrée qu'une seule fois. En fonction des informations toxicologiques disponibles, un programme de traitement répété peut être utilisé. Les voies d'administration habituelles sont l'intubation orale ou l'injection intrapéritonéale. D'autres voies d'administration peuvent être appropriées.

Animaux d'expérience

Il est recommandé d'utiliser des rats ou des souris. De jeunes animaux ayant atteint leur pleine maturité sexuelle sont répartis au hasard entre les groupes traités et témoins.

Nombre et sexe

Un nombre adéquat de mâles traités est utilisé compte tenu de la variabilité spontanée du caractère biologique étudié. Le nombre retenu devrait être fondé sur la sensibilité de détection et le degré de signification qui ont été prédéterminés. Par exemple, dans une expérience type, le nombre de mâles retenus pour chaque groupe de dose devrait être suffisant pour obtenir environ 30 à 50 femelles gravides par période d'accouplement.

Utilisation de témoins négatifs et positifs

Généralement des témoins positifs et négatifs (véhicule) seront inclus simultanément dans chaque expérience. Si des expériences récentes effectuées dans le même laboratoire ont donné des résultats acceptables pour des témoins positifs, ces résultats peuvent être utilisés à la place d'un témoin positif simultané. En ce qui concerne les substances témoins positives, on utilisera une dose faible appropriée (par exemple MMS, i.p., 10 mg/kg), afin de démontrer la sensibilité du test.

Doses

Normalement trois niveaux de dose sont utilisés. La dose élevée produira des signes de toxicité ou réduira la fécondité des animaux traités. Dans certains cas, un seul niveau de dose élevé peut suffire.

Épreuve limite

Les substances non toxiques sont testées à raison de 5 g/kg en cas d'administration unique et de 1 g/kg/jour en cas d'administration multiple.

Conduite de l'essai

Plusieurs schémas de traitement sont possibles. La méthode la plus fréquente est celle de l'administration unique. D'autres schémas de traitement peuvent être utilisés. Chaque mâle est accouplé séquentiellement à 1 ou 2 femelles vierges non traitées à des intervalles de temps appropriés après le traitement. Les femelles devraient être laissées avec les mâles pendant au moins un cycle œstral complet ou jusqu'à ce que l'accouplement soit constaté par la présence de sperme dans le vagin ou la présence d'un bouchon vaginal. Le nombre d'accouplements après traitement est déterminé par le programme de traitement et sera tel que tous les stades des cellules germinates traitées soient impliqués. Les femelles sont sacrifiées durant la seconde moitié de leur gestation et le contenu de leur utérus est examiné, afin de déterminer le nombre d'implants vivants et morts. Les ovaires peuvent être examinés afin de déterminer le nombre de corps jaunes.

2. RÉSULTATS Les résultats devraient être présentés sous la forme de tableaux indiquant le nombre de mâles, le nombre de femelles gravides ainsi que le nombre de femelles non gravides. Les résultats de chaque accouplement, y compris l'identité de chaque mâle et de chaque femelle, sont présentés séparément. Pour chaque femelle, la semaine d'accouplement et la dose reçue par les mâles ainsi que les fréquences d'implants vivants et morts sont rapportés. Le calcul de l'effet total de la létalité dominante est basé sur une comparaison du nombre d'implants vivants par femelle dans le groupe testé avec le nombre d'implants vivants par femelle dans le groupe témoin. Le rapport entre implants vivants et implants morts dans le groupe traité comparé avec le rapport correspondant dans le groupe témoin est analysé en vue d'indiquer la perte après implantation. Si les résultats sont enregistrés sous la forme de mortalité précoce et de mortalité tardive, les tableaux devraient faire clairement ressortir cette différence. Si la perte avant implantation est évaluée, il y a lieu d'en présenter les résultats. Cette perte peut être exprimée par la différence entre le nombre de corps jaunes et le nombre d'implants ou par la réduction du nombre moyen d'implants par femelle par rapport aux accouplements témoins. Les résultats sont évalués par des méthodes statistiques appropriées.

espèces, souche, âge et poids des animaux utilisés, nombre d'animaux de chaque sexe dans les groupes traités et témoins,

substance d'essai, véhicule, niveaux de dose testés et justification du choix des doses, témoins négatifs et positifs, données relatives à la toxicité,

voie et programme de traitement,

programme d'accouplement,

méthode utilisée pour constater l'accouplement,

moment du sacrifice,

3226 autres dispositions ne sont pas affichées ici ; chacune a sa propre adresse.

Versions

2008-05-30