Uredba Komisije (EZ) br. 440/2008 od 30. svibnja 2008. o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) (Tekst značajan za EGP)

In forceVersion 2008-05-30from 2008-06-01

Grade B

mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.

Ask Gelex about this law

Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/hr

Contents

Preamble
ANNEX
A.1.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.4.
1.5. TABLICA: PRIMJENLJIVOST METODA A. B. C. D.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
Tekućina u kupki:
1.6.1.2. Uređaj:
1.6.2.
1.6.4.
4.(1)(2)(3)(4)
A.2.
1.
1.4.
1.5. Tablica 1.: Usporedba metoda
1.6.
1.6.4.
1.6.6.
2. Tablica 2. Faktori korekcije temperature fT
A.3.
1.
1.4.
1.4.1.
3. Tablica: 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Primjenljivost metoda
3. Tablica: 1.4.1.1.1.4.1.2. Primjenljivost metoda
3. Tablica: 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Primjenljivost metoda
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
A.4.
1.
1.4.
1.5. Tablica: 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Kriteriji kvalitete
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.4.
1.6.4.2.
1.6.5.
1.6.6.
1.6.6.1. Inertni plin:
1.6.6.2. Priprema kolone saturatora:
1.6.7.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
A.5.
1.
1.6.
1.6.4.
1.6.4.1.
1.6.4.1.3. Slika Mjerno tijelo
1.6.4.2.
1.6.4.2.2. Montaža:
2. Tablica: Korekcija izmjerene površinske napetosti Samo za vodene otopine, ρ = 1 g/cm3
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.6.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Ispitni postupak:
1.6.3.3. Uređaj
1.6.3.4. Uređaj (vidjeti slike 4. i 3.)
1.6.4.
2.
3.
A.8.
1.
1.3. Metoda protresanjem u tikvici
1.4.
1.5.
1.5.1. Metoda protresanjem u tikvici
1.5.2. Metoda protresanjem u tikvici
1.5.3. Metoda protresanjem u tikvici
1.6.
1.6.2.
1.6.2.1.
1.6.2.3.
1.6.3.
1.6.3.1. Uređaj
1.6.3.2. Izračun mrtvog vremena to
2. Metoda protresanja tikvice
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
A.9.
1.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Uređaj Abel:
A.10.
1.
1.6.
1.6.2.
3.
A.11.
1.
1.6.
A.12.
1.
1.3.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
A.13.
1.
1.6.
1.6.2.
2.
A.14.
1.
1.1.
1.4.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.3.
1.6.3.2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.15.
1.
1.6.
A.16.
1.
1.6.
1.6.1.
4.
Slika 1. Model 20 milimetarske ispitne kocke
Slika 2. Tipična krivulja temperatura/vrijeme
A.17.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
3.
3.2.
A.18.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.19.
1.
1.6.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.20.
1.
1.5.
1.5.4.
2.
3.
3.1.
A.21.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.2.
2.
2.1. Tablica 1. Primjeri rezultata
3.
3.2.
4.(1)
Slika 1 Tlačna posuda
Slika 2. Nosivi stalak
Slika 3. Sustav paljenja
1.
2.
4.
1.2. Za krute tvari
Dodatak 1. Metoda procjene
UVOD
METODA PROCJENE
POSTUPAK IZRAČUNA
IZVJEŠĆE
LITERATURA
Dodatak 2.
Slika 1. Uređaj za određivanje krivulje tlaka pare prema dinamičkoj metodi
Slika 2.a Uređaj za određivanje krivulje tlaka pare prema statističkoj metodi (pomoću manometarske U-cijevi)
Slika 2.b Uređaj za određivanje krivulje tlaka pare prema statičkoj metodi (pomoću pokazivača tlaka)
Slika 3. Izoteniskop (vidjeti referencu 7.)
Slika 4. Uređaj za određivanje krivulje tlaka pare prema metodi vaganja tlaka pare
Slika 5. Primjer uređaja za isparivanje kod niskog tlaka metodom efuzije, s ćelijom za istjecanje zapremnine 8 cm3
Slika 6.a Primjer sustava protoka za određivanje tlaka pare metodom zasićenja plina
Slika 6.b. Primjer sustava za određivanje tlaka pare metodom zasićenja plina, s kapilarom postavljenom iza komore za zasićenje
Slika 7. Primjer eksperimentalne postave za metodu s rotorom koji se vrti
Slika 8. Primjer mjerne glave na rotoru koji se vrti
Slika 1. Metoda eluiranja kolone pomoću crpke za recirkulaciju
Slika 2. Tipična mikro-kolona (Sve dimenzije izražene su u milimetrima)
Slika 3. Tipična mikro-kolona (Sve dimenzije izražene su u milimetrima)
Slika 4. Metoda eluiranja kolone pomoću nivelacijske posude
METODE IZRAČUNA Načelo metoda izračuna
Hanschova π-metoda
Rekkerova metoda
Hansch-Leova metoda
Kombinirana metoda
i.
ii.
iii.
iv.
Slika Kalup i pribor za pripremu hrpice
Slika Uređaj
Primjer specifikacije materijala za ispitivanje termičke osjetljivosti (vidjeti normu DIN 1623) (1)(2)(3)
Slika 1. Uređaj za ispitivanje termičke osjetljivosti
Slika 2. Ispitivanje termičke osjetljivosti
Slika 3. Kalibracija brzine zagrijavanja za ispitivanje termičke osjetljivosti
Slika 4. Uređaj za ispitivanje osjetljivosti na udarac
Slika 5. Uređaj za ispitivanje osjetljivosti na trenje
Slika Kalup i pribor za pripravu hrpice
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
DIO B METODE UTVRĐIVANJA TOKSIČNOSTI I DRUGIH UČINAKA NA ZDRAVLJE
OPĆI UVOD A.
i.
ii.
B.1 bis.
1.
1.4.
1.5.
1.5.3.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
B.1 tris.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
B.2.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
3.1.
B.3.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. Ocjenjivanje toksičnosti kod drugog spola
3.
B.4.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
Tablica 1. Nastanak eritema i eshara (crvenila kože i krasta) Nastanak edema UTVRĐIVANJE STUPNJA KOŽNE REAKCIJE
B.5.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.2.3.
1.4.2.7.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
Tablica 1. STUPNJEVANJE OČNIH LEZIJA
Rožnica
NAPOMENE Šarenica
Očna spojnica (konjunktiva) Crvenilo (odnosi se na palpebralnu i bulbarnu konjunktivu; isključujući rožnicu i šarenicu)
Kemoza
B.6.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.2.
1.5.1.3.
1.5.2.
1.5.2.2.
1.5.2.3.
3.
Izvješće o ispitivanju (GPMT i Buehlerov test)
B.7.
1.
1.4.
1.4.2.
1.4.3.
3.
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU
B.8.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
3.1.
pt_2
B.9.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
B.10.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3.
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
B.11.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
B.12.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
1.5.2.
2.
3.
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
B.13./14.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
2.
3.
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
B.15.
1.
1.6. Priprema
Metabolička aktivacija
Pokusni sojevi
Hranjive podloge
Upotreba negativnih i pozitivnih kontrola
Koncentracije izlaganja
Uvjeti inkubacije
Učestalost spontanih mutacija
Broj replikata
3.
B.16.
1.
1.6. Priprema
Metabolička aktivacija
Pokusni sojevi
Hranjive podloge
Upotreba negativnih i pozitivnih kontrola
Koncentracije izlaganja
Uvjeti inkubacije
Učestalost spontanih mitotskih rekombinacija
Broj jednakih agarnih ploča
3.
B.17.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3.
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
B.18.
1.
1.6. Priprema
Broj kultura
Upotreba negativnih i pozitivnih kontrola
Koncentracije izlaganja
Stanice
Metabolička aktivacija
Priprema kultura
Tretiranje kultura ispitivanom tvari Primarni hepatociti štakora
Autoradiografska mjerenja
Mjerenje pomoću tekućinskog scintilacijskog brojača (LSC)
2.
3.
B.19.
1.
1.6.
1.6.2. Broj kultura
1.6.3. Priprema kultura
3.
B.20.
1.
1.6. Priprema
Matične skupine
Ispitivana tvar
Broj životinja
Put primjene
Upotreba negativnih i pozitivnih kontrola
Razine izloženosti
3.
B.21.
1.
1.6. Priprema
Stanice
Hranjiva podloga
Ispitivana tvar
Metabolička aktivacija
Primjena negativnih i pozitivnih kontrola
Koncentracije izlaganja
3.
B.22.
1.
1.6. Priprema
Put primjene
Pokusne životinje
Broj i spol
Primjena negativnih i pozitivnih kontrola
Visine doza
Granični test

KOMISIJA EUROPSKIH ZAJEDNICA,

uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske zajednice,

uzimajući u obzir Uredbu (EZ) br. 1907/2006 od 18. prosinca 2006. Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) i osnivanju Europske agencije za kemikalije te o izmjeni Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage Uredbe Vijeća (EEZ) br. 793/93 i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94 kao i Direktive Vijeća 76/769/EEZ i direktiva Komisije 91/155/EEZ, 93/67/EEZ, 93/105/EZ i 2000/21/EZ, a posebno njezin članak 13. stavak 3.,

budući da:

(1) U skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006, na razini Zajednice treba usvojiti ispitne metode u svrhu ispitivanja tvari kad su ta ispitivanja potrebna za dobivanje podataka o unutarnjim svojstvima tvari.

(2) U Prilogu V. Direktivi Vijeća 67/548/EEZ od 27. lipnja 1967. o usklađivanju zakona i ostalih propisa o razvrstavanju, pakiranju i označivanju opasnih tvari utvrđene su metode za određivanje fizikalno-kemijskih svojstava, toksičnosti i ekotoksičnosti tvari i pripravaka. Prilog V. Direktivi 67/548/EEZ brisao se Direktivom 2006/121/EZ Europskog parlamenta i Vijeća s učinkom od 1. lipnja 2008.

(3) Ispitne metode sadržane u Prilogu V. Direktivi 67/548/EEZ treba ugraditi u ovu Uredbu.

(4) Ovom se Uredbom ne isključuje primjena drugih ispitnih metoda pod uvjetom da se primjenjuju u skladu s člankom 13. stavkom 3. Uredbe 1907/2006.

(5) U oblikovanju ispitnih metoda u potpunosti treba uzeti u obzir načela zamjene, smanjenja broja i usavršavanja postupaka u kojima se rabe životinje, posebno kad postanu dostupne valjane metode za zamjenu, smanjenje broja ili usavršavanje pokusa na životinjama.

(6) Odredbe ove Uredbe u skladu su s mišljenjem Odbora osnovanog na temelju članka 133. Uredbe (EZ) br. 1907/2006,

DONIJELA JE OVU UREDBU:

Članak 1. Ispitne metode koje se trebaju primjenjivati u svrhe Uredbe 1907/2006/EZ utvrđuju se u Prilogu ovoj Uredbi.

Članak 2. Komisija prema potrebi preispituje ispitne metode obuhvaćene ovom Uredbom s ciljem zamjene, smanjenja broja ili usavršavanja pokusa na kralježnjacima.

Članak 3. Sva upućivanja na Prilog V. Direktivi 67/548/EEZ smatraju se upućivanjima na ovu Uredbu.

Članak 4. Ova Uredba stupa na snagu sljedećeg dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.

Ona se primjenjuje od 1. lipnja 2008. Sastavljeno u Bruxellesu 30. svibnja 2008. Za Komisiju Stavros Dimas Član Komisije

ANNEX

PRILOG DIO A: METODE ZA ODREĐIVANJE FIZIKALNO-KEMIJSKIH SVOJSTAVA

A.1. TEMPERATURA TALJENJA/SKRUĆIVANJA

A.1.

1. METODA Većina opisanih metoda zasniva se na Smjernici za ispitivanje OECD-a (1). Temeljna načela navedena su u referencama (2) i (3).

1.

1.1. UVOD Opisane metode i uređaji koristit će se za određivanje temperature taljenja tvari, bez ikakvih ograničenja s obzirom na stupanj njihove čistoće. Izbor metode ovisi o naravi tvari koja se ispituje. Stoga će ograničavajući čimbenik biti činjenica može li se tvar fino usitniti lako, teško ili nikako. Za neke je tvari primjerenije određivati temperature skrućivanja ili očvršćivanja te su u ovu metodu uključene i norme za njihovo određivanje. Ako, zbog posebnih svojstava tvari, niti jedan od navedenih parametara nije prikladan za mjerenje, može biti prikladno izmjeriti točku stinjavanja.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Temperatura taljenja definira se kao temperatura kod koje dolazi do faznog prijelaza iz krutog u tekuće stanje pod atmosferskim tlakom, a ta temperatura idealno odgovara temperaturi skrućivanja. Kako do faznog prijelaza mnogih tvari dolazi unutar temperaturnog područja, često se definira kao područje taljenja. Pretvaranje jedinica (K u °C) t = T – 273,15 t temperatura u Celzijusima, stupanj Celzijusa (°C) T Termodinamička temperatura, kelvin (K)

1.3. REFERENTNE TVARI Referentne tvari nije potrebno upotrebljavati kod svakog istraživanja nove tvari. One bi trebale služiti prvenstveno za povremenu provjeru primijenjene metode i omogućiti usporedbu s rezultatima dobivenim drugim metodama. Neke tvari za kalibraciju navedene su u referencama (4).

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Određuje se temperatura (temperaturno područje) faznog prijelaza iz krutog u tekuće stanje ili iz tekućeg u kruto stanje. U praksi, kad se uzorak ispitivane tvari zagrijava/hladi pod atmosferskim tlakom, određuju se temperature početne faze taljenja/skrućivanja i konačne faze taljenja/skrućivanja. Opisano je pet vrsta metoda, poimence: metoda kapilare, metode vrućih faza, određivanja temperature skrućivanja, metode termičke analize i određivanje točke stinjavanja (metoda razvijena za naftne derivate). U određenim slučajevima možda je prikladnije mjeriti temperaturu skrućivanja nego temperaturu taljenja.

1.4.

1.4.1. Metoda kapilare

1.4.1.

1.4.1.1. Uređaji za mjerenje temperature taljenja u kupki Mala količina fino usitnjene tvari stavlja se u kapilarnu cjevčicu i čvrsto sabije. Cjevčica se zagrijava zajedno s termometrom, a kad taljenje zaista započne, porast temperature podešava se na manje od oko 1 K/min. Utvrđuju se početna i konačna temperatura taljenja.

1.4.1.2. Uređaji za mjerenje temperature taljenja u metalnom bloku Kao što je opisano u 1.4.1.1., osim što se kapilarna cjevčica i termometar stavljaju u zagrijani metalni blok i mogu se promatrati kroz otvore u bloku.

1.4.1.3. Detekcija pomoću fotoćelija Uzorak u kapilarnoj cjevčici automatski se zagrijava u metalnom cilindru. Zraka svjetlosti usmjerava se kroz tvar, putem otvora u cilindru, na precizno kalibriranu fotoćeliju. Optička svojstva većine tvari taljenjem se mijenjaju iz mutnih u prozirne. Jakost svjetlosti koja dolazi na fotoćeliju povećava se i šalje signal za zaustavljanje digitalnom pokazivaču na kojem se temperatura očitava na otporničkom termometru izvedenom od platine koji se nalazi u komori za zagrijavanje. Ova metoda nije prikladna za neke jako obojene tvari.

1.4.2. Vruće faze

1.4.2.

1.4.2.1. Koflerov vrući štap Koflerov vrući štap ima dva komada metala različite termičke provodljivosti, koji se zagrijavaju električki, s tim da je štap izveden na način da je temperaturni gradijent cijelom svojom dužinom gotovo linearan. Temperatura vrućeg štapa može se kretati u području od 283 do 573 K zahvaljujući spravi za očitavanje temperature koja je posebno konstruirana za takav štap, a koja sadrži klizni pokazivač sa strelicom na skali. Kako bi se odredila temperatura taljenja, tvar se postavlja u tankom sloju izravno na površinu vrućega štapa. Za nekoliko sekundi razvija se oštra crta koja razdvaja tekuću od krute faze. Temperatura u visini razdjelne crte očitava se podešavanjem pokazivača na tu crtu.

1.4.2.2. Mikroskop za taljenje Za određivanje temperatura taljenja vrlo malih količina materijala u uporabi je nekoliko mikroskopskih vrućih faza. U većini se vrućih faza temperatura mjeri osjetljivim termoparom, iako se ponekad koriste živini termometri. Tipični uređaj za mjerenje temperature taljenja mikroskopskom vrućom fazom ima komoru za zagrijavanje koja sadrži metalnu pločicu na koju se postavlja uzorak na stakalcu. Na sredini metalne pločice nalazi se otvor koji omogućava prolaz svjetla sa zrcala za osvjetljavanje na mikroskopu. Kad je u upotrebi, komora se zatvara staklenom pločom kako zrak ne bi ulazio u područje na kojem se nalazi uzorak. Zagrijavanje uzorka regulirano je reostatom. Za vrlo precizna mjerenja optički anizotropnih tvari može se koristiti polarizirano svjetlo.

1.4.2.3. Metoda meniska Ova se metoda koristi posebno za poliamide. Temperatura na kojoj dolazi do pomaka meniska silikonskog ulja, zatvorenog između vruće faze i staklenog poklopca postavljenog iznad uzorka poliamida koji se ispituje, određuje se vizualno.

1.4.3. Metoda određivanja temperature skrućivanja Uzorak se stavlja u posebnu epruvetu i zatim u uređaj za određivanje temperature skrućivanja. Uzorak se lagano miješa tijekom cijelog postupka hlađenja, a temperatura se mjeri u odgovarajućim intervalima. Čim temperatura postane stalna u nekoliko očitavanja, ta se temperatura (uz ispravak greške termometra) bilježi kao temperatura skrućivanja. Obvezno treba izbjegavati pretjerano hlađenje kako bi se održala ravnoteža između krute i tekuće faze.

1.4.4. Termička analiza

1.4.4.

1.4.4.1. Diferencijalna termička analiza (DTA) Ovom se tehnikom bilježi razlika između temperature tvari i temperature referentnog materijala kao funkcije temperature, dok su tvar i referentni materijal podvrgnuti istom kontroliranom temperaturnom programu. Kad na uzorku dođe do prijelaza koji obuhvaća promjenu entalpije, ta se promjena pokazuje endotermnim (taljenje) ili egzotermnim (skrućivanje) odstupanjem od osnovne crte zabilježene temperature.

1.4.4.2. Diferencijalna pretražna kalorimetrija (DSC) Ovom se tehnikom bilježi razlika između ulaza energije u tvar i u referentni materijal, kao funkcije temperature, dok su tvar i referentni materijal podvrgnuti istom kontroliranom temperaturnom programu. Ta energija predstavlja energiju koja je potrebna kako bi se između tvari i referentnog materijala postigla nulta temperaturna razlika. Kad na uzorku dođe do prijelaza koji obuhvaća promjenu entalpije, ta se promjena pokazuje endotermnim (taljenje) ili egzotermnim (skrućivanje) odstupanjem od osnovne crte zabilježenog protoka topline.

1.4.5. Točka stinjavanja Ova je metoda razvijena za primjenu kod naftnih derivata i pogodna je za primjenu kod naftnih tvari niskih temperatura taljenja. Nakon predgrijavanja, uzorak se hladi određenom brzinom i karakteristike protoka ispituju se u intervalima od 3 K. Najniža temperatura na kojoj se uočava gibanje tvari bilježi se kao točka stinjavanja.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Primjenljivost i točnost različitih metoda koje se rabe za određivanje temperature taljenja/područja taljenja navedene su u sljedećoj tablici:

1.5. TABLICA: PRIMJENLJIVOST METODA A. B. C. D.

Metode kapilare Metoda mjerenja Tvari koje je moguće fino usitniti Tvari koje je teško fino usitniti Temperaturno područje Procijenjena točnost Postojeće norme Uređaji za mjerenje temperature taljenja u kupki da samo na neke 273 do 573 K ± 0,3 K JIS K 0064 Mjerenje temperature taljenja metalnim blokom da samo na neke 293 do > 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) Detekcija pomoću fotoćelija da nekoliko uz primjenu uređaja 253 do 573 K ± 0,5 K Metode vrućih faza i metode skrućivanja Metoda mjerenja Tvari koje je moguće fino usitniti Tvari koje je teško fino usitniti Temperaturno područje Procijenjena točnost Postojeće norme Koflerov vrući štap da ne 283 do > 573 K ± 1 K ANSI/ASTM D 3451-76 Mikroskop za taljenje da samo na neke 273 do > 573 K ± 0,5 K DIN 53736 Metoda meniska ne posebno za poliamide 293 do > 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) Temperatura skrućivanja da da 223 do 573 K ± 0,5 K Npr. BS 4695 Termička analiza Metoda mjerenja Tvari koje je moguće fino usitniti Tvari koje je teško fino usitniti Temperaturno područje Procijenjena točnost Postojeće norme Diferencijalna termička analiza da da 173 do 1273 K do 600 K ± 0,5 K do 1273 K ± 2,0 K ASTM E 537-76 Diferencijalna pretražna kalorimetrija da da 173 do 1273 K do 600 K ± 0,5 K do 1273 K ± 2,0 K ASTM E 537-76 Točka stinjavanja Metoda mjerenja Tvari koje je moguće usitniti Tvari koje je teško fino usitniti Temperaturno područje Procijenjena točnost Postojeće norme Točka stinjavanja Za naftne derivate i naftne tvari Za naftne derivate i naftne tvari 223 do 323 K ± 0,3 K ASTM D 97-66

1.6. OPIS METODA Postupci gotovo svih ispitnih metoda opisani su međunarodnim i nacionalnim normama (vidjeti Dodatak 1.).

1.6.

1.6.1. Metode s kapilarnom cjevčicom Kad su izložene polaganom rastu temperature, za fino usitnjene tvari obično vrijede faze taljenja prikazane na slici 1.

1.6.1.

Slika 1. Faza A Faza B Faza C Faza D Faza E Faza A (početak taljenja): fine kapljice jednoliko prianjaju na unutrašnju stijenku kapilarne cjevčice Faza B pojavljuje se zračnost između uzorka i unutrašnje stijenke uslijed stezanja taline Faza C stegnuti uzorak počinje padati i ukapljuje se Faza D na površini nastaje potpun menisk dok znatna količina uzorka ostaje kruta Faza E (konačna faza taljenja): nema krutih čestica Tijekom određivanja temperature taljenja, temperature se bilježe na početku taljenja i u konačnoj fazi.

1.6.1.1. Uređaji za mjerenje temperature taljenja u kupki Slika 2. prikazuje standardizirani uređaj za mjerenje temperature taljenja izrađen od stakla (JIS K 0064); sve dimenzije izražene su u milimetrima.

1.6.1.1.

Slika 2. A:Mjerna posuda B:Zatvarač C:Odzračnik D:Termometar E:Pomoćni termometar F:Tekućina u kupki G: Staklena kapilarna cjevčica, duljine od 80 do 100 mm, unutrašnjeg promjera 1,0 ± 0,2 mm, debljine stijenke od 0,2 do 0,3 mm H:Bočna cijev

Tekućina u kupki:

Treba odabrati odgovarajuću tekućinu. Izbor tekućine ovisi o temperaturi taljenja koja se određuje, npr. tekući parafin za temperature taljenja do 473 K, silikonsko ulje za temperature taljenja do 573 K. Za temperature taljenja iznad 523 K može se upotrijebiti mješavina koja se sastoji od tri dijela sumporne kiseline i dva dijela kalijevog sulfata (u masenom omjeru). Ako se upotrebljava takva mješavina, treba poduzeti odgovarajuće mjere opreza.

Termometar:

Treba koristiti samo termometre koji zadovoljavaju uvjete sljedećih ili ekvivalentnih normi: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Postupak:

Suha tvar fino se usitni u tarioniku, stavlja se u kapilarnu cjevčicu koja je stopljena na jednom kraju, na način da je nakon čvrstog sabijanja razina punjenja otprilike 3 mm. Kako bi se dobio jednolično sabijen uzorak, kapilarnu cjevčicu treba spustiti s visine od otprilike 700 mm kroz staklenu cijev vertikalno na pokazno staklo. Napunjena kapilarna cjevčica postavlja se u posudu na način da srednji dio kuglice termometra ispunjene živom dodiruje kapilarnu cjevčicu u dijelu u kojem je smješten uzorak. Kapilarna cjevčica obično se uvodi u uređaj oko 10 K ispod temperature taljenja. Tekućina u posudi zagrijava se na način da temperatura raste otprilike 3 K/min. Tekućinu treba miješati. Na oko 10 K ispod očekivane temperature taljenja, brzina porasta temperature podešava se do maksimalno 1 K/min.

Izračun:

Izračun temperature taljenja je sljedeći: T = TD + 0,00016 (TD - TE) n gdje je: T ispravljena temperatura tališta u K TD očitanje temperature na termometru D u K TE očitanje temperature na termometru E u K n broj stupnjeva žive na termometru D u pari koja se pojavljuje na površini

1.6.1.2. Uređaj za određivanje temperature taljenja u metalnom bloku

1.6.1.2. Uređaj:

Dijelovi uređaja:

cilindrični metalni blok čiji je gornji dio šupalj i oblikuje komoru (vidjeti sliku 3.),

metalni čep, s dva ili više otvora, za umetanje cjevčica u metalni blok,

sustav za zagrijavanje metalnog bloka, koji se uspostavlja primjerice električnim otpornikom ugrađenim u kućištu bloka,

reostat za regulaciju ulaza energije, ako se rabi električno grijanje,

četiri prozora od termootpornog stakla na bočnim stijenkama komore, međusobno dijametralno raspoređena pod pravim kutem. Ispred jednog od tih prozora ugrađen je okular za promatranje kapilarne cjevčice. Druga tri prozora služe za osvjetljavanje unutrašnjosti kućišta pomoću svjetiljki.

kapilarna cjevčica od termootpornog stakla zatvorena na jednom kraju (vidjeti 1.6.1.1.).

Termometar: Vidjeti norme spomenute u 1.6.1.1. Mogu se primijeniti i termoelektrični mjerni uređaji usporedive točnosti.

Slika 3. Termometar Kapilarna cjevčica Metalni čep Okular Svjetiljka Električni otpornik Metalni blok za zagrijavanje

1.6.1.3. Detekcija pomoću fotoćelije Uređaj i postupak: Uređaj se sastoji od metalne komore s automatiziranim sustavom zagrijavanja. Tri kapilare pune se kako je opisano u 1.6.1.1. i postavljaju u peć. Kalibracija uređaja postiže se u nekoliko lineranih povećanja temperature, a odgovarajući porast temperature ugađa se na prethodno odabranu stalnu linearnu brzinu, zapisivači pokazuju stvarnu temperaturu peći i temperaturu tvari u kapilarnim cjevčicama.

1.6.2. Vruće faze

1.6.2.

1.6.2.1. Koflerov vrući štap Vidjeti Dodatak.

1.6.2.2. Mikroskop za taljenje Vidjeti Dodatak.

1.6.2.3. Metoda meniska (poliamidi) Vidjeti Dodatak. Brzina zagrijavanja u postupku određivanja temperature tališta trebala bi biti manja od 1 K/min.

1.6.3. Metode za određivanje temperature skrućivanja Vidjeti Dodatak.

1.6.4. Termička analiza

1.6.4.

1.6.4.1. Diferencijalna termička analiza Vidjeti Dodatak.

1.6.4.2. Diferencijalna pretražna kalorimetrija Vidjeti Dodatak.

1.6.5. Određivanje točke stinjavanja Vidjeti Dodatak.

2. PODACI U nekim slučajevima potrebna je korekcija termometra.

3. IZVJEŠĆIVANJE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije: Kao temperatura taljenja u izvješću se navodi srednja vrijednost najmanje dvije izmjere koje se nalaze u području procijenjene točnosti. Ako je razlika između temperatura u početnoj i konačnoj fazi taljenja unutar granica točnosti metode, temperatura u konačnoj fazi uzima se kao temperatura taljenja; u protivnom u izvješću se navode obje temperature. Ako se tvar razloži ili sublimira prije nego je postignuta temperatura taljenja, u izvješće se unosi temperatura na kojoj je taj učinak opažen. U izvješće treba unijeti sve podatke i napomene relevantne za tumačenje rezultata, posebno s obzirom na nečistoće i fizikalno stanje tvari.

primijenjena metoda,

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće) i prethodne mjere pročišćivanja ako su poduzete,

procjena točnosti.

4.(1)(2)(3)(4)

REFERENCE OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, str. 803-834. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, str. 505-515.

A.2. TEMPERATURA VRENJA

A.2.

1. METODA Većina opisanih metoda zasniva se na Smjernici za ispitivanje OECD-a (1). Temeljna načela navedena su u referencama (2) i (3).

1.

1.1. UVOD Ovdje opisane metode i uređaji mogu se primijeniti na tekućine i tvari s niskim talištem, pod uvjetom da kod njih ne dolazi do kemijske reakcije ispod temperature vrenja (na primjer: auto-oksidacija, premještanje grupa, degradacija itd.). Metode se mogu primijeniti na čiste i nečiste tekuće tvari. Naglasak se stavlja na metode kod kojih se primjenjuje detekcija pomoću fotoćelije i termičke analize jer te metode omogućuju određivanje ne samo temperatura taljenja nego i temperatura vrenja. Osim toga, mjerenja se mogu obavljati automatski. Prednost dinamičke metode je i u tome što pruža mogućnost određivanja tlaka pare bez nužne korekcije temperature vrenja prema standardnom tlaku (101,325 kPa) jer se standardan tlak tijekom mjerenja može održavati pomoću manostata. Napomene: Utjecaj nečistoća na određivanje temperature vrenja uvelike ovisi o naravi nečistoće. Ako u uzorku postoje hlapljive nečistoće, što bi moglo utjecati na rezultat, tvar se može pročistiti.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Standardna temperatura vrenja definira se kao temperatura kod koje je tlak pare tekućine 101,325 kPa. Ako se temperatura vrenja ne mjeri kod standardnog atmosferskog tlaka, zavisnost tlaka pare o temperaturi može se opisati Clausius-Clapeyronovom jednadžbom: log p = ΔHv2,3RT+ konst. gdje je: p tlak pare tvari u paskalima Δ Hv njezina toplina isparavanja u J mol-1 R univerzalna molarna plinska konstanta = 8,314 J mol-1 K-1 T termodinamička temperatura u K Temperatura vrenja iskazuje se s obzirom na tlak okoline tijekom mjerenja. Pretvaranje jedinica Tlak (jedinice: kPa) 100 kPa 1 bar = 0,1 Mpa (bar je još dozvoljen, ali se ne preporuča) 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (jedinice mm Hg i Torr nisu dozvoljene) 1 atm standardna atmosfera = 101325 Pa (jedinica atm nije dozvoljena) Temperatura (jedinice: K) t = T – 273,15 t temperatura u Celzijusima, stupanj Celzijusa (°C) T Termodinamička temperatura, kelvin (K)

1.3. REFERENTNE TVARI Referentne tvari nije potrebno rabiti kod svakog istraživanja nove tvari. One bi trebale služiti prvenstveno za povremenu provjeru primijenjene metode i omogućiti usporedbu s rezultatima dobivenim drugim metodama. Neke tvari za kalibraciju mogu se pronaći u metodama navedenim u Dodatku.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Pet metoda za određivanje temperature vrenja (područja vrenja) temelji se na mjerenju temperature vrenja, preostale dvije temelje se na termičkoj analizi.

1.4.

1.4.1. Određivanje pomoću ebuliometra Ebuliometri su prvobitno konstruirani za određivanje molekulske težine podizanjem temperature vrenja, ali su prikladni i za točna mjerenja temperature vrenja. Vrlo jednostavan uređaj opisan je u normi ASTM D 1120-72 (vidjeti Dodatak). U tom uređaju tekućina se zagrijava u uvjetima ravnoteže kod atmosferskog tlaka dok ne zavri.

1.4.2. Dinamička metoda Ova se metoda zasniva na mjerenju temperature na kojoj dolazi do ponovne kondenzacije pare, pomoću odgovarajućeg termometra u refluksu za vrijeme vrenja. U ovoj metodi tlak se može mijenjati.

1.4.3. Određivanje temperature vrenja metodom destilacije Ova se metoda zasniva na destilaciji tekućine i mjerenju temperature na kojoj dolazi do ponovne kondenzacije pare, te određivanju količine destilata.

1.4.4. Metoda prema Siwoloboffu Uzorak se zagrijava u epruveti koja je uronjena u tekućinu toplinske kupke. Zataljena kapilarna cjevčica, koja ima zračni mjehurić u donjem dijelu, uroni se u epruvetu s uzorkom.

1.4.5. Detekcija fotoćelijom Primjenjujući načelo prema Siwoloboffu, automatsko foto-električno mjerenje vrši se pomoću mjehurića koji se dižu.

1.4.6. Diferencijalna termička analiza Ovom se tehnikom bilježi razlika između temperature tvari i temperature referentnog materijala kao funkcije temperature, dok su tvar i referentni materijal podvrgnuti istom kontroliranom temperaturnom programu. Kad na uzorku dođe do prijelaza koji obuhvaća promjenu entalpije, ta se promjena pokazuje endotermnim odstupanjem (vrenje) od osnovne crte zabilježene temperature.

1.4.7. Diferencijalna pretražna kalorimetrija Ovom se tehnikom bilježi razlika između ulaza energije u tvar i u referentni materijal, kao funkcije temperature, dok su tvar i referentni materijal podvrgnuti istom kontroliranom temperaturnom programu. Ta energija predstavlja energiju koja je potrebna kako bi se između tvari i referentnog materijala postigla nulta temperaturna razlika. Kad na uzorku dođe do prijelaza koji obuhvaća promjenu entalpije, ta se promjena pokazuje endotermnim odstupanjem (vrenje) od osnovne crte zabilježenog protoka topline.

1.5. Tablica 1.: Usporedba metoda

KRITERIJI KVALITETE Primjenljivost i točnost različitih metoda koje se rabe za određivanje temperature vrenja/područja vrenja navedene su u tablici 1. Metoda mjerenja Procijenjena točnost Postojeća norma Ebuliometar ± 1,4 K (do 373 K) ± 2,5 K (do 600 K) ASTM D 1120-72 Dinamička metoda ± 0,5 K (do 600 K) Postupak destilacije (područje vrenja) ± 0,5 K (do 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Prema Siwoloboffu ± 2 K (do 600 K) Detekcija pomoću fotoćelije ± 0,3 K (do 373 K) Diferencijalna termička kalorimetrija ± 0,5 K (do 600 K) ± 2,0 K (do 1273 K) ASTM E 537-76 Diferencijalna pretražna kalorimetrija ± 0,5 K (do 600 K) ± 2,0 K (do 1273 K) ASTM E 537-76

1.6. OPIS METODA Postupci nekih ispitnih metoda opisani su u međunarodnim i nacionalnim normama (vidjeti Dodatak).

1.6.

1.6.1. Ebuliometar Vidjeti Dodatak.

1.6.2. Dinamička metoda Vidjeti ispitnu metodu A.4. za određivanje tlaka pare. Bilježi se temperatura vrenja koja se opaža kod primijenjenog tlaka od 101,325 kPa.

1.6.3. Postupak destilacije (područje vrenja) Vidjeti Dodatak.

1.6.4. Metoda prema Siwoloboffu Uzorak se zagrijava u uređaju za mjerenje temperature taljenja u epruveti promjera približno 5 mm (Slika 1.). Slika 1. prikazuje tip standardiziranog uređaja za određivanje temperature taljenja i vrenja (izrađenog od stakla, sve dimenzije izražene su u milimetrima). Kapilarna cjevčica (kapilara za određivanje vrelišta), zataljena oko 1 cm iznad donjeg kraja, stavlja se u epruvetu s uzorkom. Ispitivana tvar dodaje se do razine na kojoj je zataljeni dio kapilare ispod površine tekućine. Epruveta s uzorkom koja sadrži kapilaru za određivanje vrelišta pričvršćena je za termometar gumenom trakom ili je učvršćena pomoću bočnog nosača (vidjeti sliku 2). Slika 2. Načelo prema Siwoloboffu Slika 3. Izmijenjeno načelo Tekućina kupke odabire se prema temperaturi vrenja. Na temperaturama do 573 K, može se koristiti silikonsko ulje. Tekući parafin može se koristiti do 473 K. Tekućina u posudi zagrijava se na način da temperatura najprije raste otprilike 3 K/min. Tekućinu treba miješati. Na oko 10 K ispod očekivane temperature vrenja zagrijavanje se smanjuje na način da temperatura raste brzinom manjom od 1 K/min. Približavanjem temperaturi vrenja, iz kapilare za određivanje vrelišta brzo počinju izlaziti mjehurići. Temperatura vrenja je temperatura na kojoj se, kod momentalnog hlađenja, niz mjehurića zaustavlja, a tekućina u kapilari naglo počinje rasti. Odgovarajuće očitanje na termometru temperatura je vrelišta dotične tvari. Kod izmijenjenog načela (Slika 3.), temperatura vrenja određuje se u kapilari za određivanje temperature taljenja. Kapilara je izdužena u tanki vrh duljine oko 2 cm (a) i u nju se usisa mala količina uzorka. Otvoreni kraj te kapilare zatvara se kad dođe do taljenja na način da se na kraju stvara mali zračni mjehurić. Tijekom zagrijavanja u uređaju za mjerenje temperature taljenja (b), zračni se mjehurić širi. Temperatura vrenja odgovara temperaturi kod koje uzorak tvari dostiže razinu površine tekućine kupke (c).

1.6.4.

Slika 1. A:Mjerna posuda B:Zatvarač C:Odzračnik D:Termometar E:Pomoćni termometar F:Tekućina kupke G: Epruveta s uzorkom, promjera najviše 5 mm; sadrži kapilarnu cjevčicu, približne duljine 100 mm, unutrašnjeg promjera približno 1 mm i debljine stijenke približno od 0,2 do 0,3 mm H:Bočna cijev

1.6.5. Detekcija pomoću fotoćelije Uzorak se zagrijava u kapilarnoj cjevčici unutar zagrijavanog metalnog bloka. Zraka svjetlosti usmjerava se odgovarajućim otvorima u bloku kroz tvar na precizno kalibriranu fotoćeliju. Tijekom porasta temperature uzorka pojedinačni mjehurići zraka izlaze iz kapilare za određivanje vrelišta. Kad je dostignuta temperatura vrenja, broj mjehurića jako se poveća. To uzrokuje promjenu jakosti svjetla koju bilježi fotoćelija i šalje signal za zaustavljanje pokazivaču na kojem se očitava temperatura na otporničkom termometru s platinom koji se nalazi u bloku. Ova je metoda posebno korisna jer omogućuje određivanje temperatura od sobne temperature prema dolje sve do 253,15 K (- 20 °C) bez ikakvih izmjena na uređaju. Uređaj samo treba uroniti u posudu za hlađenje.

1.6.6. Termička analiza

1.6.6.

1.6.6.1. Diferencijalna termička analiza Vidjeti Dodatak.

1.6.6.2. Diferencijalna pretražna kalorimetrija Vidjeti Dodatak.

2. Tablica 2. Faktori korekcije temperature fT

PODACI Kod malih odstupanja od standardnog tlaka (maksimalno ± 5 kPa), temperature vrenja normaliziraju se na Tn pomoću sljedeće jednadžbe Sidneya Younga: Tn = T + (fT × Δp) gdje je: Δp (101,325 – p) (obratiti pozornost na znak) P izmjereni tlak u kPa fT brzina promjene temperature vrenja u zavisnosti od tlaka u K/kPa T izmjerena temperatura vrenja u K Tn temperatura vrenja ispravljena na standardni tlak u K Za mnoge tvari, faktori korekcije temperature, fT, i jednadžbe za njihovo usklađivanje obuhvaćene su gore navedenim međunarodnim i nacionalnim normama. Na primjer, u metodi prema normi DIN 53171 spominju se sljedeće grube korekcije za otapala koja su sadržana u bojama: Temperatura T (K) Korektivni faktor fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,4 548,15 0,45 573,15 0,47

3. IZVJEŠĆIVANJE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije: Kao temperatura vrenja u izvješću se navodi srednja vrijednost najmanje dvije izmjere koje se nalaze u području procijenjene točnosti (vidjeti tablicu 1.). Treba navesti izmjerene temperature vrenja i njihovu srednju vrijednost, a podatke o tlaku ili tlakovima kod kojih su mjerenja izvršena navesti u kPa. Tlak bi trebao biti blizak standardnom atmosferskom tlaku. U izvješće treba unijeti sve podatke i napomene relevantne za tumačenje rezultata, posebno s obzirom na nečistoće i fizikalno stanje tvari.

primijenjena metoda,

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće) i prethodne mjere pročišćavanja ako su poduzete,

procjena točnosti.

4.(1)(2)(3) REFERENCE OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.

A.3. RELATIVNA GUSTOĆA

A.3.

1. METODA Opisane metode zasnivaju se na Smjernici za ispitivanje OECD-a (1). Temeljna načela navedena su u referenci (2).

1.

1.1. UVOD Opisane metode za određivanje relativne gustoće mogu se koristiti za krute i za tekuće tvari, bez ikakvih ograničenja s obzirom na stupanj njihove čistoće. Rabe se različite metode navedene u tablici 1.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Relativna gustoća D204 krutina ili tekućina omjer je mase volumena tvari koja se ispituje, određene na 20 °C, i mase istog volumena vode, određene na 4 °C. Relativna gustoća nema jedinice. Gustoća, ρ, neke tvari kvocijent je mase, m, i njezinog volumena, v. Gustoća, ρ, u SI mjernom sustavu iskazuje se u kg/m3.

1.3. REFERENTNE TVARI (1)(3) Referentne tvari nije potrebno rabiti kod svakog istraživanja nove tvari. One bi trebale služiti prvenstveno za povremenu provjeru primijenjene metode i omogućiti usporedbu s rezultatima dobivenim drugim metodama.

1.4. NAČELO METODA Koriste se četiri kategorije metoda.

1.4.

1.4.1. Metode uzgona

1.4.1.

1.4.1.1. Hidrometar (za tekuće tvari) Zadovoljavajuće točno i brzo određivanje gustoće može se postići plutajućim hidrometrima, pomoću kojih se gustoća neke tekućine može utvrditi prema dubini uranjanja očitanjem na stupnjevanoj ljestvici.

1.4.1.2. Hidrostatska vaga (za tekuće i krute tvari) Za određivanje gustoće uzorka može se iskoristiti razlika između težine ispitivanog uzorka mjerene na zraku i u odgovarajućoj tekućini (npr. vodi). Za krutine, izmjerena gustoća reprezentativna je samo za određeni uzorak koji je korišten. Za određivanje gustoće tekućina, tijelo poznatog volumena, v, važe se prvo na zraku, a zatim u tekućini.

1.4.1.3. Metoda uranjanja tijela (za tekuće tvari) (4) U ovoj metodi, gustoća tekućine određuje se iz razlike između rezultata vaganja tekućine prije i nakon uranjanja tijela poznatog volumena u tekućinu koja se ispituje.

1.4.2. Metode pomoću piknometra Za krutine ili tekućine mogu se koristiti piknometri raznih oblika i poznatih volumena. Gustoća se izračunava iz razlike u težini punog i praznog piknometra i njegovog poznatog volumena.

1.4.3. Usporedba sa zrakom pomoću piknometra (za krutine) Gustoća krutine u bilo kojem obliku može se mjeriti na sobnoj temperaturi usporedbom plinova piknometrom. Volumen tvari mjeri se na zraku ili u inertnom plinu u cilindru varijabilnog kalibriranog volumena. Za izračun gustoće uzima se jedno mjerenje mase nakon završetka mjerenja volumena.

1.4.4. Oscilirajući denzitometar (5)(6)(7) Gustoća tekućine može se izmjeriti oscilirajućim denzitometrom. Mehanički oscilator konstruiran u obliku U-cijevi vibrira rezonantnom frekvencijom oscilatora koja ovisi o njegovoj masi. Uvođenjem uzorka mijenja se rezonantna frekvencija oscilatora. Uređaj mora biti kalibriran pomoću dvije tekućine poznatih gustoća. Poželjno je odabrati tvari čije su gustoće u rasponu područja koje se mjeri.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Primjenljivost različitih metoda koje se rabe za određivanje relativne gustoće navedene su u tablici.

1.6. OPIS METODA Norme koje se navode kao primjeri, u kojima se mogu pronaći dodatne tehničke pojedinosti, navedene su u Dodatku. Ispitivanja treba provoditi na 20 °C, uz najmanje dva mjerenja.

2. PODACI Vidjeti norme.

3. Tablica: 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Primjenljivost metoda

IZVJEŠĆIVANJE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije: Relativna gustoća D204 u izvješću se bilježi kako je utvrđeno u 1.2., zajedno s fizikalnim stanjem mjerene tvari. U izvješće treba unijeti sve informacije i napomene relevantne za tumačenje rezultata, posebno s obzirom na nečistoće i fizikalno stanje tvari. Metoda mjerenja Gustoća Najveći mogući dinamički viskozitet Postojeće norme krutina tekućina Hidrometar da 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Hidrostatska vaga da ISO 1183 (A) da 5 Pa s ISO 901 i 758 Metoda uranjanja tijela da 20 Pa s DIN 53217 Piknometar ISO 3507 da ISO 1183 (B), NF T 20-053 da 500 Pa s ISO 758 Usporedba sa zrakom - piknometar da DIN 55990 dio 3. DIN 53243 Oscilirajući denzitometar da 5 Pa s

primijenjena metoda,

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće) i prethodne mjere pročišćivanja ako su poduzete.

3. Tablica: 1.4.1.1.1.4.1.2. Primjenljivost metoda

(a) krutine

(b) tekućine

3. Tablica: 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Primjenljivost metoda

(a) krutine

(b) tekućine

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

REFERENCE OECD, Paris, 1981, Testing Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, str. 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.ll, str. 427-430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, str. 297-302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen -Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, str. 717 -726. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, str. 253-255.

A.4. TLAK PARE

A.4.

1. METODA Većina opisanih metoda zasniva se na Smjernici za ispitivanje OECD-a (1). Temeljna načela navedena su u referencama (2) i (3).

1.

1.1. UVOD Prije provođenja ovog ispitivanja korisno je za tvar koja se ispituje raspolagati preliminarnim podacima o strukturi, temperaturi taljenja i temperaturi vrenja. Ne postoji jedinstveni postupak mjerenja koji bi bio primjenljiv na cijelo područje tlakova pare. Stoga se preporuča nekoliko metoda za mjerenje tlaka pare od < 10-4 do 105 Pa. Nečistoće obično imaju utjecaja na tlak pare, i to do mjere koja uvelike ovisi o vrsti nečistoće. Ako u uzorku postoje hlapljive nečistoće, što bi moglo utjecati na rezultat, tvar se može pročistiti. Isto tako može biti prikladno navesti tlak pare za tehničke materijale. Kod nekih metoda koje su ovdje opisane koriste se uređaji s metalnim dijelovima; to treba uzeti u obzir kad se ispituju korozivne tvari.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Tlak pare neke tvari definira se kao tlak zasićenja iznad krute ili tekuće tvari. U termodinamičkoj ravnoteži, tlak pare čiste tvari isključivo je funkcija temperature. Treba koristiti jedinicu pascal (Pa) koja se za tlak koristi u SI mjernom sustavu. U prošlosti su se koristile sljedeće jedinice s pripadajućim faktorima pretvorbe: 1 Torr (= 1 mm Hg) = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfera = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa Jedinica za temperaturu u SI sustavu je kelvin (K). Univerzalna molarna plinska konstanta R je 8,314 J mol-1 K-1. Zavisnost tlaka pare o temperaturi opisana je Clausius-Clapeyronovom jednadžbom: log p = ΔHv2,3RT+ konst. gdje je: p tlak pare tvari u paskalima ΔΗν njezina toplina isparavanja u Jmol-1 R univerzalna molarna plinska konstanta u Jmol-1 K-1 T termodinamička temperatura u K

1.4. NAČELO ISPITNIH METODA Za određivanje tlaka pare predlaže se sedam metoda koje se primjenjuju u različitim područjima tlaka pare. Kod svake metode tlak pare određuje se na raznim temperaturama. U ograničenom temperaturnom području, logaritam tlaka pare čiste tvari linearna je funkcija recipročne temperature.

1.4.

1.4.1. Dinamička metoda Dinamičkom metodom mjeri se temperatura vrenja koja pripada određenom tlaku. Preporučeno područje: 103 do 105 Pa. Ova se metoda preporuča i za određivanje standardne temperature vrenja i korisna je za tu svrhu do temperature od 600 K.

1.4.2. Statička metoda Kod statičkog postupka, u termodinamičkoj ravnoteži, tlak pare uspostavljen u zatvorenom sustavu određuje se kod određene temperature. Ta je metoda prikladna za jednokomponentne i višekomponentne krutine i tekućine. Preporučeno područje: 10 do 105 Pa. Ova se metoda može koristiti i u području 1 do 10 Pa, uz potreban oprez.

1.4.3. Izoteniskop Ova standardizirana metoda također je statička metoda, ali obično nije prikladna za višekomponentne sustave. Dodatne informacije dostupne su u metodi D-2879-86 norme ASTM. Preporučeno područje: 100 do 105 Pa.

1.4.4. Metoda efuzije: vaganje tlaka pare Količina tvari koja u jedinici vremena napusti ćeliju kroz otvor poznate veličine određuje se u takvim uvjetima vakuuma da je povrat tvari u ćeliju zanemariv (npr. mjerenjem pulsa koji nastaje na osjetljivoj vagi vaganjem mlaza pare ili mjerenjem gubitka težine). Preporučeno područje: 10-3 do 1 Pa.

1.4.5. Metoda efuzije: gubitkom težine ili skupljanjem isparenog dijela Ova se metoda temelji na procjeni mase ispitivane tvari koja u jedinici vremena istječe iz Knudsenove ćelije (4) u obliku pare, kroz mikrootvor u uvjetima ultra-vakuuma. Masa pare može se dobiti određivanjem gubitka mase ćelije ili kondenziranjem pare na niskoj temperaturi i određivanjem količine hlapljive tvari primjenom kromatografske analize. Tlak pare izračunava se primjenom Hertz-Knudsenove jednadžbe. Preporučeno područje: 10-3 do 1 Pa.

1.4.6. Metoda zasićenjem plina Mlaz inertnog nosivog plina usmjeri se preko tvari na način da postane zasićen parom te tvari. Količina materijala koju nosi poznata količina nosivog plina može se izmjeriti skupljanjem u odgovarajuću posudu ili procijeniti izravnom analitičkom tehnikom. Dobiveni se rezultat zatim koristi za izračun tlaka pare kod zadane temperature. Preporučeno područje: 10-4 do 1 Pa. Ova se metoda može koristiti i u području od 1 do 10 Pa, uz potreban oprez.

1.4.7. Vrtnja rotora U uređaju s rotorom koji se vrti, mjerni element ustvari je mala čelična kuglica koja lebdi u magnetskom polju i vrti se velikom brzinom. Tlak plina utvrđuje se prema tlakom uvjetovanom usporavanju čelične kuglice. Preporučeno područje: 10-4 do 0,5 Pa.

1.5. Tablica: 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Kriteriji kvalitete

KRITERIJI KVALITETE Različite metode određivanja tlaka pare uspoređuju se s obzirom na primjenljivost, ponovljivost, mjernu obnovljivost, područje mjerenja, postojeću normu. To je prikazano u sljedećoj tablici: Metoda mjerenja Tvari Procijenjena ponovljivost Procijenjena mjerna obnovljivost Preporučeno područje Postojeća norma krutina tekućina Dinamička metoda s niskim talištem da do 25 % do 25 % 103 Pa do 2 × 103 Pa – 1 do 5 % 1 do 5 % 2 × 103 Pa do 105 Pa – Statička metoda da da 5 do 10 % 5 do 10 % 10 Pa do 105 Pa NFT 20-048 (5) Izoteniskop da da 5 do 10 % 5 do 10 % 102 Pa do 105 Pa ASTM-D 2879-86 Metoda efuzije: vaganje tlaka pare da da 5 do 20 % 5 do 50 % 10-3 Pa do 1 Pa NFT 20-047 (6) Metoda efuzije: gubitak težine da da 10 do 30 % – 10-3 Pa do 1 Pa – Metoda zasićenja plina da da 10 do 30 % do 50 % 10-4 Pa do 1 Pa – Metoda vrtnje rotora da da 10 do 20 % – 10-4 Pa do 0,5 Pa –

1.6. OPIS METODA

1.6.

1.6.1. Dinamičko mjerenje

1.6.1.

1.6.1.1. Uređaj Tipični mjerni uređaj sastoji se od staklene ili metalne posude za vrenje s prigrađenim hladnjakom (Slika 1.), opreme za mjerenje temperature i opreme za regulaciju i mjerenje tlaka. Tipični mjerni uređaj prikazan na slici izrađen je od vatrostalnog stakla i sastoji se od pet dijelova: Velika cijev djelomično dvostrukih stijenki sastoji se od brušene ovojne spojke, hladnjaka, rashladne posude i ulaznog otvora. Stakleni cilindar s crpkom Cottrell ugrađen je na dio cijevi u kojem dolazi do vrenja i ima grubu površinu od lomljenog stakla kako bi se izbjeglo poskakivanje u postupku vrenja. Temperatura se mjeri odgovarajućim temperaturnim osjetnikom (npr. otpornički termometar, termopar s plaštom) uronjenim u uređaj do točke mjerenja (br. 5 na slici 1.) kroz odgovarajući ulazni otvor (npr. muški ubrušeni spoj). Izvedeni su potrebni priključci na opremu za regulaciju i mjerenje tlaka. Balon, koji ima ulogu puferskog spremnika, spojen je na mjerni uređaj pomoću kapilarne cijevi. Posuda za vrenje zagrijava se grijaćim elementom (npr. uložnim grijačem) koji se umeće u stakleni uređaj s donje strane. Potrebna jačina zagrijavanja postavlja se i regulira preko termopara. Potrebni vakuum između 102 Pa i približno 105 Pa osigurava se vakuum crpkom. Odgovarajući ventil koristi se za mjerenje zraka ili dušika za regulaciju tlaka (područje mjerenja približno 102 do 105 Pa) i ventilaciju. Tlak se mjeri manometrom.

1.6.1.2. Postupak mjerenja Tlak pare mjeri se određivanjem temperature vrenja uzorka na raznim specificiranim tlakovima između približno 103 i 105Pa. Stabilna temperatura pod stalnim tlakom pokazuje da je dostignuta temperatura vrenja. Ovom metodom ne mogu se mjeriti tvari koje se pjene. Tvar se stavlja u čistu suhu ispitnu posudu. Krutine koje se ne mogu fino usitniti mogu predstavljati problem, što je ponekad moguće riješiti zagrijavanjem plašta za hlađenje. Kad je posuda napunjena, uređaj se nepropusno zatvori na prirubnici i tvar se otplinjuje. Zatim se postavlja najniži željeni tlak i uključuje zagrijavanje. Istodobno, temperaturni osjetnik priključuje se na pisač. Ravnoteža je postignuta kad se kod stalnog tlaka bilježi stalna temperatura. Posebnu pozornost treba obratiti na sprečavanje poskakivanja tijekom vrenja. Osim toga, na hladnjaku mora doći do potpune kondenzacije. Kod određivanja tlaka pare krutina s niskim talištem treba voditi računa da se izbjegne začepljenje kondenzatora. Nakon što je zabilježena točka ravnoteže, namješta se veći tlak. Postupak se nastavlja na taj način dok se ne postigne 105 Pa (sveukupno približno 5 do 10 mjernih točaka). Za provjeru, točke ravnoteže treba ponoviti i kod smanjivanja tlaka.

1.6.2. Statičko mjerenje

1.6.2.

1.6.2.1. Uređaj Uređaj se sastoji od posude za uzorak, sustava za hlađenje i grijanje koji služi za regulaciju temperature uzorka i mjerenje temperature. Uređaj također obuhvaća instrumente za namještanje i mjerenje tlaka. Osnovna načela rada prikazana su na slikama 2.a i 2.b. Komora s uzorkom (Slika 2.a) omeđena je s jedne strane odgovarajućim vakuum ventilom. S druge strane prigrađena je U-cijev koja sadrži odgovarajući fluid za mjerenje tlaka. Jedan kraj U-cijevi grana se na vakuum crpku, bocu s dušikom ili ventil za ventilaciju, i manometar. Umjesto U-cijevi može se upotrijebiti mjerač tlaka s pokazivačem tlaka (Slika 2.b). Za regulaciju temperature uzorka, posuda s uzorkom zajedno s ventilom i U-cijevi ili mjeračem tlaka postavlja se u kupku koja se drži na stalnoj temperaturi od ± 0,2 K. Temperatura se mjeri na vanjskoj stijenci posude s uzorkom ili u samoj posudi. Uzvodno od vakuumske crpke predviđen je prihvat i hlađenje pare koja se odvodi iz uređaja. U metodi 2.a tlak pare tvari mjeri se posredno pomoću nultog pokazivača. Pri tomu se uzima u obzir činjenica da se kod velikih promjena temperatura gustoća fluida u U-cijevi mijenja. Za upotrebu kao nulti pokazivači za U-cijevi, u zavisnosti od područja tlaka i kemijskog ponašanja ispitivane tvari, pogodni su sljedeći fluidi: silikonski fluidi, ftalati. Ispitivana tvar ne smije se primjetno otapati u fluidu U-cijevi niti s njom reagirati. Za manometre, živa se može koristiti u području standardnog tlaka zraka do 102 Pa, dok su silikonski fluidi i ftalati prikladni za upotrebu ispod 102 Pa na niže do 10 Pa. Manometri s membranom koja se može grijati mogu se koristiti čak i ispod 10-1 Pa. Postoje i drugi mjerači tlaka koji se mogu koristiti ispod 102 Pa.

1.6.2.2. Postupak mjerenja Prije mjerenja, svi dijelovi uređaja prikazanog na slici 2. moraju biti potpuno čisti i suhi. Za metodu 2., U-cijev treba napuniti odabranom tekućinom koju je prije očitavanja potrebno otpliniti kod povišene temperature Ispitivana tvar stavi se u uređaj, uređaj se zatvori, a temperatura se smanjuje koliko je potrebno za otplinjavanje. Temperatura mora biti dovoljno niska kako bi se osiguralo isisavanje zraka, ali – kod višekomponentnog sustava – ne smije mijenjati sastav materijala. Ako je potrebno, ravnotežu je moguće brže uspostaviti miješanjem. Uzorak se može jače ohladiti npr. tekućim dušikom (paziti da se izbjegne kondenzacija zraka ili fluida crpke) ili mješavinom etanola i suhog leda. Za mjerenja kod niskih temperatura primijeniti kupku s reguliranom temperaturom koja je spojena na ultra-kriomat. Kod otvorenog ventila iznad posude s uzorkom, nekoliko minuta provodi se usisavanje kako bi se uklonio zrak. Zatim se ventil zatvara, a temperatura uzorka smanjuje na najnižu potrebnu razinu. Ako je potrebno, postupak otplinjavanja treba ponoviti nekoliko puta. Kad se uzorak zagrijava, tlak pare se povećava. To mijenja ravnotežu fluida u U-cijevi. Da bi se utjecaj tog umanjio, u uređaj se kroz ventil uvodi dušik ili zrak sve dok se fluid pokazivača tlaka ne vrati na nulu. Tlak koji je za to potreban može se očitati s preciznog manometra na sobnoj temperaturi. Taj tlak odgovara tlaku pare tvari na toj određenoj temperaturi mjerenja. Metoda 2.b slična je, samo se tlak pare očitava izravno. Zavisnost tlaka pare o temperaturi određuje se u odgovarajuće malim intervalima (sveukupno približno 5 do 10 mjernih točaka) do željene maksimalne vrijednosti. Očitanja na niskim temperaturama treba ponoviti u svrhu provjere. Ako se vrijednosti dobivene ponovljenim očitanjem ne podudaraju s krivuljom dobivenom porastom temperature, razlog može biti jedno od sljedećeg:

1.6.2.2.

1. uzorak još uvijek sadrži zrak (npr. jako viskozni materijali) ili jedna ili više tvari s niskim talištem koje se oslobađaju tijekom zagrijavanja, a moguće ih je ukloniti usisavanjem nakon dodatnog pothlađivanja;

2. temperatura hlađenja nije dovoljno niska. U tom slučaju kao rashladno sredstvo koristi se tekući dušik. U bilo kojem od navedena dva slučaja, mjerenje se mora ponoviti;

3. tvar kemijski reagira u temperaturom području koje se istražuje (npr. razlaganje, polimerizacija).

1.6.3. Izoteniskop Cjelovit opis ove metode može se naći u referenci 7. Načelo mjernog uređaja prikazuje slika 3. Slično statičkoj metodi opisanoj u 1.6.2., izoteniskop je prikladan za istraživanje krutina i tekućina. Kad se radi o tekućinama, sama tvar služi kao fluid u pomoćnom manometru. Količina tekućine, dostatna da se napuni balon, i kraći krak manometarskog dijela stavlja se u izoteniskop. Izoteniskop se spaja na vakuumski sustav i evakuira, zatim puni dušikom. Evakuacija i čišćenje sustava ponavlja se dvaput kako bi se odstranio preostali kisik. Puni izoteniskop postavlja se u horizontalni položaj kako bi se uzorak raširio u tankom sloju u balonu s uzorkom i odjeljku manometra (U-dio). Tlak sustava smanjuje se na 133 Pa, a uzorak se polagano zagrijava dok ne zavri (uklanjanje otopljenih nekondenzirajućih plinova). Izoteniskop se zatim postavlja u takav položaj da se uzorak vraća u balon i kraći krak manometra, koji se u potpunosti pune tekućinom. Tlak se održava kao za otplinjavanje; izvučen dio balona s uzorkom zagrijava se malim plamenom dok se uzorak pare koja se oslobađa ne raširi dovoljno kako bi istisnuo s mjesta dio uzorka s gornjeg dijela balona i kraka manometra u manometarski dio izoteniskopa, stvarajući tako prostor ispunjen parom bez prisutnosti dušika. Izoteniskop se zatim postavlja u kupku stalne temperature, a tlak dušika podešava se sve dok se ne izjednači s tlakom uzorka. Manometarski dio izoteniskopa pokazuje ujednačenost tlakova. U ravnoteži, tlak pare dušika jednak je tlaku pare tvari. Kad se radi o krutinama, u zavisnosti o području temperature i tlaka, koriste se manometarske tekućine nabrojane u 1.6.2.1. Otplinjena manometarska tekućina puni se u proširenje na dugom kraku izoteniskopa. Zatim se krutina koju treba ispitati stavlja u balon i otplinjuje na povišenoj temperaturi. Nakon tog izotensikop se naginje kako bi manometarska tekućina mogla teći u U-cijev. Mjerenje tlaka pare kao funkcije temperature provodi se prema 1.6.2.

1.6.4. Metoda efuzije: vaganje tlaka pare

1.6.4.

1.6.4.1. Uređaj Različite verzije uređaja opisane su u literaturi (1). Uređaj koji je ovdje opisan primjer je primjene općeg načela (Slika 4.). Slika 4. prikazuje glavne dijelove uređaja koji se sastoji od čelične ili staklene posude za jaki vakuum, opreme za stvaranje i mjerenje vakuuma i ugrađenih dijelova za mjerenje tlaka pare na vagi. U uređaj su ugrađeni sljedeći dijelovi:

peć za isparavanje s prirubnicom i okretnim ulaznim otvorom. Peć za isparavanje je cilindrična posuda, izrađena od npr. bakra ili kemijski otporne legure dobre termičke provodljivosti. Može se koristiti i staklena posuda s bakrenom stijenkom. Peć je promjera približno od 3 do 5 cm, visine od 2 do 5 cm. Ima od jedan do tri otvora različitih veličina za protok pare. Peć se zagrijava grijaćom spiralom s vanjske strane. Radi sprečavanja rasapa topline na postolje, grijač je postavljen na postolje preko metala niske termičke provodljivosti (nikal-srebrov čelik ili krom-niklov čelik), npr. cijevi od nikal-srebrovog čelika ugrađene na okretni ulazni otvor ako se koristi peć s nekoliko otvora. Prednost ovakvog sklopa je u tome što omogućuje uvođenje bakrene šipke. Time se omogućuje hlađenje s vanjske strane primjenom hladne kupke,

ako bakreni poklopac peći ima tri otvora različitih promjera međusobno postavljenih na 90°, sveukupnim područjem mjerenja moguće je obuhvatiti različita područja tlaka pare (otvori između približno 0,30 i 4,50 mm u promjeru). Veliki otvori koriste se za niski tlak pare i obrnuto. Okretanjem peći namješta se željeni otvor ili međupoložaj u strujanju pare (otvor na peći – štitnik – posuda vage), pa se strujanje molekula oslobađa ili skreće kroz otvor na peći na posudu vage. Za mjerenje temperature tvari na odgovarajućoj točki postavlja se termopar ili otpornički termometar,

iznad štitnika nalazi se posuda vrlo osjetljive mikrovage (vidjeti dolje). Posuda vage promjera je približno 30 mm. Pogodan materijal je pozlaćeni aluminij,

oko posude vage nalazi se cilindrično kućište za hlađenje od mjedi ili bakra. U zavisnosti od tipa vage, ima otvore za ozib vage i otvor na štitniku za strujanje molekula, te bi trebalo jamčiti potpunu kondenzaciju pare na posudi vage. Širenje topline prema van osigurano je npr. bakrenom šipkom spojenom na kućište za hlađenje. Šipka prolazi kroz postolje i termički je izolirana od njega, npr. pomoću cijevi od krom-niklovog čelika. Šipka je uronjena u Dewarovu posudu s tekućim dušikom ispod postolja ili tekući dušik cirkulira kroz šipku. Kućište za hlađenje time se drži na približno - 120 °C. Posuda vage hladi se isključivo isijavanjem, što je zadovoljavajuće s obzirom na područje tlaka koje se istražuje (hlađenje približno 1 sat prije početka mjerenja),

vaga je smještena iznad kućišta za hlađenje. Prikladne su, npr. vrlo osjetljive elektronske mikrovage s 2 kraka (8) ili vrlo osjetljivi instrument s pomičnim svitkom (vidjeti Smjernicu za ispitivanje OECD-a 104, Izdanje 12.05.81.),

u postolje su ugrađeni i električni priključci za termoparove (ili otpornički termometri) i grijaće spirale,

vakuum se postiže u posudi pomoću crpke za djelomičan ili visoki vakuum (potreban vakuum od približno 1 do 2 × 10-3 Pa postiže se nakon 2 sata rada crpke). Tlak se regulira odgovarajućim ionizacijskim manometrom.

1.6.4.2. Postupak mjerenja Posuda se napuni ispitivanom tvari i poklopac se zatvori. Štitnik i kućište za hlađenje povuku se kroz peć. Uređaj se zatvara i vakuum crpke se uključuju. Konačni tlak prije početka mjerenja trebao bi biti približno 10-4 Pa. Hlađenje kućišta za hlađenje počinje na 10-2 Pa. Čim je postignut potreban vakuum, započinje kalibracijski niz na najnižoj potrebnoj temperaturi. Namješta se odgovarajući otvor na poklopcu, struja pare prolazi kroz štitnik izravno iznad otvora i udara na hlađenu posudu vage. Posuda vage mora biti dovoljno velika kako bi mogla primiti cijelu struju koji na nju upućuje štitnik. Moment strujanja pare djeluje kao sila na posudu vage, a molekule se kondenziraju na njezinoj hladnoj površini. Moment i istovremena kondenzacija proizvode signal na zapisivaču. Procjenom signala dolazi se do dva podatka: p = G 2πRT × 103M gdje je: G brzina isparavanja (kg s-1 m-2) M molekulska masa (g mol-1) T temperatura (K) R univerzalna molarna plinska konstanta (J mol-1 K-1) p tlak pare (Pa) Nakon što je postignut potreban vakuum, započinje niz mjerenja na najnižoj željenoj temperaturi mjerenja. Za daljnja mjerenja temperatura se povećava u malim intervalima sve dok se ne postigne najviša željena vrijednost temperature. Uzorak se zatim ponovno hladi i može se bilježiti druga krivulja tlaka pare. Ako se u drugom pokušaju ne uspiju potvrditi rezultati prvog mjerenja, moguće je da se u području temperature koje se mjeri tvar razlaže.

1.6.4.2.

1. u gore opisanom uređaju tlak pare određuje se iz momenta na posudi vage (za to nije nužno znati molekulsku težinu (2)). Kod očitanja treba uzeti u obzir geometrijske faktore kao što su otvor peći i kut strujanja molekula;

2. istodobno se može mjeriti masa kondenzata, a iz tog se može izračunati brzina isparavanja. Tlak pare može se izračunati iz brzine isparavanja i molekulske težine primjenom Hertzove jednadžbe (2).

1.6.5. Metoda efuzije: gubitkom težine

1.6.5.

1.6.5.1. Uređaj Uređaj za efuziju sastoji se od sljedećih osnovnih dijelova: Na slici 5. kao primjer prikazan je jedan električno zagrijavan aluminijski vakuumski spremnik s četiri ćelije za istjecanje od nehrđajućeg čelika. Folija od nehrđajućeg čelika debljine 0,3 mm ima otvor za istjecanje promjera od 0,2 do 1,0 mm i postavljena je na ćeliju za istjecanje pomoću navojnog poklopca.

spremnik koji može biti reguliran termostatom i koji je moguće evakuirati, u kojem su smještene ćelije za istjecanje plina,

jaka vakuumska crpka (npr. difuzna pumpa ili turbomolekulska pumpa) s instrumentom za mjerenje vakuuma,

posuda za skupljanje, pomoću ukapljenog dušika ili suhog leda.

1.6.5.2. Postupak mjerenja Svaka ćelija za istjecanje puni se referentnom tvari i ispitivanom tvari. Metalna ploča s otvorom pričvršćuje se navojnim poklopcem, i svaka ćelija se važe u okviru točnosti od 0,1 mg. Ćelija se postavlja u uređaj opremljen termostatom iz kojeg se zatim odvodi tlak do razine ispod jedne desetine očekivanog tlaka. U određenim vremenskim razmacima u rasponu od 5 do 30 sati, u uređaj se upušta zrak, a gubitak mase ćelije određuje se ponovnim vaganjem. Kako na rezultat ne bi utjecale hlapljive nečistoće, ćelija se ponovno važe u određenim vremenskim razmacima radi provjere da je u najmanje dva takva vremenska razmaka brzina isparavanja stalna. Tlak pare p u ćeliji za istjecanje izražen je kao: p = mKAt2πRTM gdje je: p tlak pare (Pa) m masa tvari koja napusti ćeliju u vremenu t (kg) t vrijeme (s) A površina otvora (m2) K korektivni faktor R univerzalna molarna plinska konstanta (J mol-1 K-1) T temperatura (K) M molekulska masa (kg mol-1) Korektivni faktor K ovisi o omjeru duljine i promjera cilindričnog otvora. omjer 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Gornja se jednadžba može napisati ovako: p = E mtTM gdje je konstanta ćelije za istjecanje: E = 1KA2πR. Konstanta ćelije za istjecanje E može se odrediti kod referentne tvari (2, 9), primjenom sljedeće jednadžbe: E = p(r)tmM(r)T gdje je: p(r) tlak pare referentne tvari (Pa) M(r) molekulska masa referentne tvari (kg × mol–1)

1.6.6. Metoda zasićenja plina

1.6.6.

1.6.6.1. Uređaj Tipični uređaj koji se koristi za obavljanje ovog ispitivanja sastoji se od dijelova prikazanih na slici 6.a i opisanih u daljnjem tekstu (1).

1.6.6.1. Inertni plin:

Nosivi plin ne smije kemijski reagirati s ispitivanom tvari. Obično je za tu svrhu dovoljan dušik, ali povremeno se može javiti potreba za drugim plinovima. Plin koji se koristi mora biti suh (vidjeti sliku 6., legenda br. 4: osjetnik relativne vlage).

Regulacija protoka:

Potreban je odgovarajući sustav za regulaciju plina kojim se osigurava stalan i odabrani protok kroz kolonu saturatora.

Skupljanje pare:

Skupljanje pare ovisi o karakteristikama pojedinog uzorka i odabrane analitičke metode. Para se skuplja količinski i u obliku koji omogućuje naknadnu analizu. Za neke ispitivane tvari, pogodne tekućine za skupljanje su heksan ili etilen glikol. Za druge, mogu se koristiti kruti apsorbenti. Alternativa skupljanju pare i naknadnoj analizi izravne su analitičke tehnike poput kromatografije, u kojima se kvantitativno određuje količina materijala koju prenosi poznata količina nosivog plina. Nadalje, može se mjeriti gubitak mase tvari.

Izmjenjivač topline:

Za mjerenja kod različitih temperatura možda će trebati u sklop uključiti izmjenjivač topline.

Kolona saturatora:

Ispitivana tvar taloži se iz otopine na odgovarajući inertni nosač. Tako obloženim nosačem puni se kolona saturatora koja svojim dimenzijama i brzinom protoka mora osigurati potpunu saturaciju nosivog plina. Kolona saturatora mora biti opremljena termostatom. Za mjerenja iznad sobne temperature, područje između kolone saturatora i skupljanja pare trebalo bi zagrijavati kako bi se spriječila kondenzacija ispitivane tvari. Radi smanjena prijenosa mase do kojega dolazi uslijed difuzije, iza kolone saturatora može se postaviti kapilara (Slika 6.b).

1.6.6.2. Postupak mjerenja

1.6.6.2. Priprema kolone saturatora:

Otopina ispitivane tvari u jako hlapljivom otapalu dodaje se odgovarajućem nosaču. Treba dodati dovoljno ispitivane tvari kako bi se zasićenost održala tijekom cijelog ispitivanja. Otapalo u potpunosti ispari na zraku ili u okretnom isparivaču, a potpuno izmiješani materijal stavlja se u kolonu saturatora. Nakon mjerenja uzorka termostatom, kroz uređaj se pušta suhi dušik.

Mjerenje:

Skupljači ili izravni detektori spajaju se na izlazni vod kolone, a vrijeme se bilježi. Brzina protoka provjerava se na početku i u redovnim intervalima tijekom pokusa, pomoću uređaja za ispitivanje nepropusnosti na plin ili kontinuirano mjeračem protoka mase. Tlak na izlazu iz saturatora mora se mjeriti. To se može učiniti: Vrijeme potrebno za skupljanje količine ispitivane tvari koja je potrebna za različite analitičke metode određuje se u prethodnim pokusima ili procjenom. Alternativa skupljanju pare i naknadnim analizama izravne su analitičke tehnike (npr. kromatografija). Prije izračunavanja tlaka pare kod dane temperature, potrebno je provesti prethodna ispitivanja za određivanje maksimalne brzina protoka kod koje će nosivi plin biti u potpunosti zasićen parom tvari. To je zajamčeno ako nosivi plin kroz saturator prolazi dovoljno polako kako se izračunom kod manje brzine ne bi dobio veći tlak pare. Konkretna analitička metoda odredit će se prema naravi tvari koja se ispituje (npr. plinska kromatografija ili gravimetrija). Određuje se količina tvari koju prenosi poznati volumen nosivog tlaka.

(a) stavljanjem mjerača tlaka između saturatora i skupljača (to može biti nezadovoljavajuće jer se time povećava mrtvi prostor i površina adsorpcije); ili

(b) određivanjem padova tlaka u konkretnom sustavu skupljača koji se koristi, kao funkcije brzine protoka u posebnom pokusu (to možda nije dovoljno zadovoljavajuće kod tekućih skupljača).

1.6.6.3. Izračun tlaka pare Tlak pare izračunava se iz gustoće pare, W/V, jednadžbom: p = WV × RTM gdje je: p tlak pare (Pa) W masa isparene ispitivane tvari (g) V volumen zasićenog plina (m3) T temperatura (K) M molarna masa ispitivane tvari (g mol–1) Izmjerene volumene treba ispraviti za razlike u tlaku i temperaturi između mjerača protoka i saturatora s termostatom. Ako je mjerač protoka smješten nizvodno od skupljača pare, korekcije mogu biti nužne kako bi se uzeli u obzir sastojci eventualno ispareni na skupljaču (1).

1.6.7. Vrtnja rotora (8, 11, 13)

1.6.7.

1.6.7.1. Uređaj Tehnika vrtnje rotora može se primijeniti upotrebom viskozimetra na rotoru koji se vrti kako prikazuje slika 8. Shematski prikaz pokusa prikazan je na slici 7. Tipični mjerni uređaj sastoji se od rotora s mjernom glavom koji se vrti u termostatski reguliranom kućištu (regulacija unutar 0,1 °C). Posuda s uzorkom nalazi se u termostatski reguliranom kućištu (regulacija unutar 0,01 °C), a svi drugi dijelovi sklopa drže se na višoj temperaturi kako bi se spriječila kondenzacija. Jaka vakuumska crpka priključena je na sustav pomoću vakuumskih ventila. Mjerna glava rotora koji se vrti sastoji se od čelične kuglice (promjera od 4 do 5 mm) u cijevi. Kuglica je stablizirana i lebdi u magnetskom polju koje proizvode stalni magneti i regulacijski svici. Kuglica se vrti pod utjecajem okretnog magnetskog polja koje stvaraju svici. Svici s davačima, koji mjere uvijek prisutnu malu bočnu magnetiziranost kuglice, omogućuju mjerenje njezine brzine vrtnje.

1.6.7.2. Postupak mjerenja Kad kuglica dostigne danu brzinu vrtnje v(o) (obično oko 400 okretaja u sekundi), zaustavlja se daljnje dovođenje energije pa, uslijed trenja plinova, dolazi do usporavanja. Pad brzine vrtnje mjeri se kao funkcija vremena. Kako je trenje koje uzrokuje magnetska suspenzija zanemarivo u usporedbi s trenjem plinova, tlak plina p određen je jednadžbom: p = πc–rρσ10t × ln v(t)v(o) gdje je: c– prosječna brzina molekula plina r promjer kuglice ρ masena gustoća kuglice σ koeficijent prijenosa tangencijalnog momenta (ε = 1 za idealno sfernu površinu kuglice) t vrijeme v(t) brzina vrtnje nakon vremena t v(o) početna brzina vrtnje Tu jednadžbu možemo napisati i ovako: p = πc–rρ10σ × tn – tn–1tn × tn–1 gdje su tn, tn–1 vremena potrebna za određeni broj, N, okretaja. Ti vremenski razmaci tn i tn–1 slijede jedan iza drugoga, i tn > tn–1. Prosječna brzina molekule plina c– određena je jednadžbom: c– = 8RTπM12 gdje je: T temperatura R univerzalna molarna plinska konstanta M molarna masa

2. PODACI Tlak pare iz bilo koje od prethodnih metoda treba odrediti za najmanje dvije temperature. Za provjeru linearnosti krivulje tlaka pare poželjno je tri ili više u području od 0 do 50 °C.

3. IZVJEŠĆIVANJE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije: Ako se zamijeti prijelazno stanje (promjena stanja, razlaganje), treba zabilježiti sljedeće informacije: U izvješće treba unijeti sve podatke i napomene relevantne za tumačenje rezultata, posebno s obzirom na nečistoće i fizikalno stanje tvari.

primijenjena metoda,

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće) i prethodne mjere pročišćivanja ako su poduzete,

najmanje dvije vrijednosti za tlak pare i temperaturu, po mogućnosti u području od 0 do 50 °C,

svi neobrađeni podaci,

krivulja log ρ u odnosu na krivulju l/T,

procjena tlaka pare na 20 ili 25 °C.

vrsta promjene,

temperatura na kojoj je došlo do promjene atmosferskog tlaka,

tlak pare na 10 i 20 °C ispod temperature prijelaza te na 10 i 20 °C iznad te temperature (ako se ne radi o prijelazu iz krutine u plin).

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)

REFERENCE OECD, Paris, 1981, Testing Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, str. 593. NF T 20-048 AFNOR (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa – Static method. NF T 20-047 AFNOR (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. ASTM D 2879 -86, Standard test method for vapour pressure-temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, ‚Vol. 5 (4), str. 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, str. 1173. B. F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, str. 435. G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), str. 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), str. 1148. J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), str. 1715.

A.5. POVRŠINSKA NAPETOST

A.5.

1. METODA Opisane metode zasnivaju se na Smjernici za ispitivanje OECD-a (1). Temeljna načela navedena su u referenci (2).

1.

1.1. UVOD Opisane metode koristit će se za mjerenje površinske napetosti vodenih otopina. Prije provođenja ovih ispitivanja korisno je raspolagati preliminarnim informacijama o topljivosti tvari u vodi, njezinoj strukturi, hidrolitičkim svojstvima i kritičnim koncentracijama za formiranje micela. Sljedeće metode primjenljive su na većinu kemijskih tvari, bez ikakvog ograničenja u pogledu stupnja njihove čistoće. Mjerenje površinske napetosti metodom prstenastog tenzometra ograničeno je na vodene otopine čiji je dinamički viskozitet manji od približno 200 mPa s.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Površinskom napetošću smatra se slobodna površinska entalpija po jedinici površine. Površinska napetost izražava se kao: N/m (SI jedinica) ili mN/m (SI pod-jedinica) 1 N/m = 103 din/cm 1 mN/m = 1 din/cm u zastarjelom CGS sustavu

1.3. REFERENTNE TVARI Referentne tvari nije potrebno upotrebljavati kod svakog istraživanja nove tvari. One bi trebale služiti prvenstveno za povremenu provjeru primijenjene metode i omogućiti usporedbu s rezultatima dobivenim drugim metodama. Referentne tvari koje obuhvaćaju široko područje površinskih napetosti navedene su u referencama 1. i 3.

1.4. NAČELO METODA Metode se temelje na mjerenju maksimalne sile kojom je potrebno vertikalno djelovati na stremen ili na prsten u dodiru s površinom ispitivane tekućine koja se nalazi u mjernoj posudi kako bi ga se odvojilo od te površine, ili na pločicu čiji rub dodiruje površinu, kako bi se nastali film izvukao. Tvari koje su topljive u vodi kod koncentracija od minimalno 1 mg/l ispituju se u vodenoj otopini kod samo jedne koncentracije.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Ovim se metodama može postići veća preciznost nego što se obično zahtijeva za procjenu utjecaja na okoliš.

1.6. OPIS METODA Pripremi se otopina tvari u destiliranoj vodi. Otopina bi trebala biti koncentracije 90 % zasićene otopine tvari u vodi; ako je ta koncentracija veća od 1 g/l, za ispitivanje se upotrebljava koncentracija od 1 g/l. Tvari čija je topljivost u vodi manja od 1 mg/l nije potrebno ispitivati.

1.6.

1.6.1. Metoda pločice Vidjeti norme ISO 304 i NF T 73-060 (Površinski aktivni agensi – određivanje površinske napetosti izvlačenjem tekućeg filma).

1.6.2. Metoda stremena Vidjeti norme ISO 304 i NF T 73-060 (Površinski aktivni agensi – određivanje površinske napetosti izvlačenjem tekućeg filma).

1.6.3. Metoda prstena Vidjeti norme ISO 304 i NF T 73-060 (Površinski aktivni agensi – određivanje površinske napetosti izvlačenjem tekućeg filma).

1.6.4. Harmonizirana OECD-ova metoda prstena

1.6.4.

1.6.4.1. Uređaj Za ovo mjerenje prikladni su komercijalno dostupni tenzometri. Tenzometar se sastoji od sljedećih elemenata:

pokretni stolić za uzorak,

sustav za mjerenje sile,

mjerno tijelo (prsten),

mjerna posuda.

1.6.4.1.

1.6.4.1.1. Pokretni stolić za uzorak Pokretni stolić za uzorak koristi se kao nosač mjerne posude s regulacijom temperature koja sadrži tekućinu koju treba ispitati. Montiran je na stalak, zajedno sa sustavom za mjerenje sile.

1.6.4.1.2. Sustav za mjerenje sile Sustav za mjerenje sile (vidjeti sliku) smješten je iznad stolića za uzorak. Pogreška sustava za mjerenje sile ne smije biti veća od ± 10-6 N, što kod mjerenja mase odgovara ograničenju greške od ± 0,1 mg. U većini slučajeva mjerna ljestvica komercijalno dostupnih tenzometara kalibrirana je u mN/m pa je površinsku napetost moguće očitati izravno u mN/m s točnošću od 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3. Mjerno tijelo (prsten) Prsten je obično izrađen od platina-iridijeve žice debljine oko 0,4 mm i srednjeg opsega 60 mm. Žičani prsten horizontalno je obješen na metalni zatik i konzolu za montažu preko kojih se povezuje sa sustavom za mjerenje sile (vidjeti sliku).

1.6.4.1.3. Slika Mjerno tijelo

(Sve su dimenzije izražene u milimetrima) Zatik Konzola za montažu Prsten

1.6.4.1.4. Mjerna posuda Mjerna posuda s ispitnom otopinom koju treba izmjeriti staklena je posuda s regulacijom temperature. Mora biti konstruirana na način da tijekom mjerenja temperatura ispitne otopine i plinske faze iznad njezine površine ostane stalna i da uzorak ne može isparavati. Prihvatljive su cilindrične staklene posude unutarnjeg promjera najmanje 45 mm.

1.6.4.2. Priprema uređaja

1.6.4.2.

1.6.4.2.1. Čišćenje Staklene posude treba pažljivo očistiti. Po potrebi treba ih oprati vrućom krom-sumpornom kiselinom i zatim gustom tekućom fosfornom kiselinom (od 83 do 98 % težinskog udjela H3PO4), u potpunosti isprati tekućom vodom i na kraju prati dvostruko destiliranom vodom sve dok se ne postigne neutralna reakcija, te zatim osušiti i isprati s dijelom tekućeg uzorka koji će se mjeriti. Prsten prvo treba potpuno namočiti u vodu kako bi se s njega uklonile sve tvari topljive u vodi, nakratko uroniti u krom-sumpornu kiselinu, prati dvostruko destiliranom vodom sve dok se ne postigne neutralna reakcija, i na kraju kratkotrajno zagrijati iznad plamena metanola. Napomena: Kontaminacija tvarima koje se ne tope u krom-sumpornoj ili fosfornoj kiselini niti ih ona uništava, npr silikonima, otklanja se pomoću odgovarajućeg organskog otapala.

1.6.4.2.2. Kalibracija uređaja Validacija uređaja sastoji se od verifikacije nulte točke i njezinog podešavanja na način da indikacija na instrumentu omogućuje pouzdano određivanje vrijednosti u mN/m.

1.6.4.2.2. Montaža:

Uređaj mora biti postavljen na postolje tenzometra u ravnini, primjerice pomoću libele i podešavanjem nivelacijskih vijaka na postolju.

Podešavanje nulte točke:

Nakon montaže prstena na uređaj, a prije uranjanja u tekućinu, treba provjeriti da je indikacija tenzometra podešena na nulu, a prsten postavljen paralelno s površinom tekućine. U tu svrhu, površina tekućine može se upotrijebiti kao zrcalo.

Kalibracija:

Kalibracija za određeni pokus može se izvršiti bilo kojim od sljedeća dva postupka:

(a) Korištenjem mase: postupak pomoću jahača poznate mase između 0,1 i 1,0 g koji se postavljaju na prsten. Faktor kalibracije, Φa, kojim se množe sve očitanja na instrumentu određuje se prema jednadžbi (1). Φa = σrσa gdje je: σr = mg2b (mN/m) m masa jahača (g) g ubrzanje sile teže (981 cm s-2 na morskoj razini) b srednji opseg prstena (cm) σa očitanje tenzometra nakon stavljanja jahača na prsten (mN/m)

(b) Korištenjem vode: postupak pomoću čiste vode čija je površinska napetost, primjerice, na 23 °C jednaka 72,3 mN/m. Taj se postupak može provesti brže nego kalibracija utegom, ali uvijek postoji opasnost da površinska napetost vode bude lažno predstavljena zbog tragova kontaminacije surfaktantima. Faktor kalibracije, Φa, kojim se množe sve očitanja na instrumentu, određuje se prema jednadžbi (2): Φb = σoσg gdje je: σο vrijednost koja se za površinsku napetost vode navodi u literaturi (mN/m) σg izmjerena vrijednost površinske napetosti vode (mN/m), obje kod iste temperature

1.6.4.3. Priprema uzoraka Vodene otopine priređuju se od tvari koje će se ispitivati, u potrebnim koncentracijama u vodi, i ne smiju sadržavati neotopljene tvari. Otopina se mora održavati na stalnoj temperaturi (± 0,5 °C). Kako se površinska napetost otopine u mjernoj posudi tijekom vremena mijenja, treba provesti nekoliko mjerenja u raznim vremenima, a krivulju koja pokazuje površinsku napetost iscrtati kao funkciju vremena. Kad više nema promjena, postignuto je stanje ravnoteže. Kontaminacija prašinom i plinovima drugih tvari ometa mjerenje. Posao stoga treba obaviti ispod zaštitnog pokrivača.

1.6.5. Ispitni uvjeti Mjerenje se provodi na približno 20 °C i kontrolira se unutar ± 0,5 °C.

1.6.6. Provođenje ispitivanja Otopine na kojima se obavljaju mjerenja prenose se u pažljivo očišćenu mjernu posudu, vodeći računa da se ne zapjene, pa se zatim mjerna posuda stavlja na stolić ispitnog uređaja. Gornji dio stola s mjernom posudom podiže se sve dok se prsten ne uroni ispod površine otopine koja se mjeri. Nakon toga, sve dok se ne postigne maksimalna sila, gornji dio stola se postupno i jednolično spušta (brzinom od oko 0,5 cm/min) kako bi se prsten odvojio od površine. Sloj tekućine koji se drži za prsten ne smije se odvojiti od njega. Kad su mjerenja završena, prsten se ponovno uranja ispod površine i mjerenje se ponavlja sve dok se ne postigne stalna napetost površine. Vrijeme od prenošenja otopine u mjernu posudu bilježi se za svako određivanje. Vrijednosti se očitavaju kod maksimalne sile koja je potrebna da se prsten odvoji od površine tekućine.

2. Tablica: Korekcija izmjerene površinske napetosti Samo za vodene otopine, ρ = 1 g/cm3

PODACI Za izračun površinske napetosti, vrijednost očitanja u mN/m na uređaju prvo se množi s faktorom kalibracije Φa ili Φb (u zavisnosti o tome koji je postupak kalibracije primijenjen). Time se dolazi samo do približne vrijednosti koju stoga treba ispraviti. Harkins i Jordan (4) empirijski su odredili korektivne faktore za vrijednosti površinske napetosti izmjerene metodom prstena koji ovise o promjerima prstena, gustoći tekućine i njezinoj površinskoj napetosti. Kako je utvrđivanje korektivnog faktora za svako pojedino mjerenje iz Harkinsovih i Jordanovih tablica mukotrpan posao, za izračun površinske napetosti vodenih otopina može se primijeniti pojednostavnjeni postupak očitavanja ispravljenih vrijednosti površinske napetosti izravno iz tablice. (Za očitanja u područjima između vrijednosti navedenih u tablici primjenjuje se interpolacija.) r = 9,55 mm (promjer prosječnog prstena) r = 0,185 mm (promjer žice od koje je prsten izrađen) Eksperimentalna vrijednost (mN/m) Korigirana vrijednost (mN/m) Kalibracija utegom (vidjeti 1.6.4.2.2.(a)) Kalibracija vodom (vidjeti 1.6.4.2.2.(b)) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Podaci u ovoj tablici prikupljeni su na temelju Harkins-Jordanove korekcije. Slična je tablici u normi DIN (DIN 53914) za vodu i vodene otopine (gustoća ρ = 1 g/cm3 i za komercijalno dostupan prsten dimenzije R = 9,55 mm (srednji promjer prstena) i r = 0,185 mm (promjer žice od koje je izrađen prsten). U tablici su navedene korigirane vrijednosti za vrijednosti mjerenja površinske napetosti nakon kalibracije s utezima ili kalibracije vodom. Alternativno, bez prethodne kalibracije, površinska napetost može se izračunati prema sljedećoj formuli: σ = f × F4πR gdje je: F sila izmjerena na dinamometru u točki pucanja filma R promjer prstena f korektivni faktor (1)

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1 IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

primijenjena metoda,

tip vode ili otopine koja je upotrijebljena.

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće),

rezultati mjerenja: (očitanje) površinske napetosti s tim da se navedu i pojedinačna očitanja i njihove aritmetičke sredine kao i korigirana srednja vrijednost (uzimajući u obzir faktor opreme i tablicu s korekcijama),

koncentracija otopine,

ispitna temperatura,

starost otopine koja je upotrijebljena; posebno vrijeme između pripreme i mjerenja otopine,

opis kako površinska napetost zavisi o vremenu nakon prijenosa otopine u mjernu posudu,

sve informacije i opaske relevantne za tumačenje rezultata, posebno s obzirom na nečistoće i fizikalno stanje tvari.

3.2. TUMAČENJE REZULTATA Uzimajući u obzir da destilirana voda ima površinsku napetost od 72,75 mN/m na 20 °C, tvari kod kojih je u uvjetima ove metode uočena površinska napetost niža od 60 mN/m treba smatrati površinski aktivnim materijalima.

4.(1)(2)(3)(4)

REFERENCE OECD, Paris, 1981, Testing Guideline 1152, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, str. 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, str. 1751.

A.6. TOPLJIVOST U VODI

A.6.

1. METODA Opisane metode temelje se na Smjernici za ispitivanje OECD-a (1).

1.

1.1. UVOD Prije provođenja ovog ispitivanja korisno je za tvar koja se ispituje posjedovati preliminarne informacije o strukturnoj formuli, tlaku pare, konstanti disasocijacije i hidrolizi (kao funkcije pH vrijednosti). Nema dostupne pojedinačne metode koja bi obuhvatila cijelo područje topljivosti u vodi. Dvije metode opisane dalje u tekstu obuhvaćaju cijelo područje topljivosti, ali nisu primjenljive na hlapljive tvari: Na topljivost ispitivane tvari u vodi prisutnost nečistoća može značajno utjecati.

jedna, nazvana metoda eluiranja kolone, koja se primjenjuje prvenstveno na čiste tvari niske topljivosti (< 10-2 grama po litri), a koje su stabilne u vodi,

druga, nazvana metoda tikvice koja se primjenjuje prvenstveno na čiste tvari visoke topljivosti (> 10-2 grama po litri), a koje su stabilne u vodi.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Topljivost neke tvari u vodi određena je masenom koncentracijom zasićene vodene otopine te tvari na određenoj temperaturi. Topljivost u vodi izražava se u jedinicama mase po volumenu otopine. Jedinica u SI sustavu je kg/m3 (može se koristiti i gram po litri).

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Približnu količinu uzorka i vrijeme koje je potrebno za postizanje koncentracije zasićenja mase treba odrediti prethodnim ispitivanjem.

1.4.

1.4.1. Metoda eluiranja kolone Ova se metoda zasniva na eluiranju vodom ispitivane tvari iz mikro-kolone koja je napunjena inertnim nosivim materijalom, kao što su staklena zrnca ili pijesak, obloženim prekomjernom količinom ispitivane tvari. Topljivost u vodi određuje se kad koncentracija mase eluata postane stalna. To se očituje koncentracijom koja doseže plato u zavisnosti od vremena.

1.4.2. Metoda tikvice U ovoj se metodi tvar (krutine treba fino usitniti) otapa u vodi na temperaturi nešto iznad temperature ispitivanja. Kad se postigne zasićenje, mješavina se hladi i drži na temperaturi ispitivanja te se miješa koliko je potrebno za postizanje ravnoteže. Alternativno, mjerenje se može provesti izravno na temperaturi ispitivanja ako je odgovarajućim uzorkovanjem zajamčeno postizanje ravnoteže zasićenja. Nakon toga, koncentracija mase tvari u vodenoj otopini, koja ne smije sadržavati neotopljene čestice, određuje se odgovarajućom analitičkom metodom.

1.5. KRITERIJI KVALITETE

1.5.

1.5.1. Ponovljivost Kod metode eluiranja kolone može se postići < 30 %; kod metode tikvice trebalo bi se pridržavati ponovljivosti < 15 %.

1.5.2. Osjetljivost Iako osjetljivost zavisi o metodi analize, moguće je odrediti koncentracije mase ispod 10-6 grama po litri.

1.6. OPIS METODE

1.6.

1.6.1. Ispitni uvjeti Poželjno je ispitivanje provoditi na 20 ± 0,5 °C. Ako postoji sumnja da topljivost može ovisiti o temperaturi (> 3 % po °C), ispitivanje treba provesti i kod druge dvije temperature koje će biti najmanje 10 °C iznad i ispod početno izabrane temperature. U takvom slučaju, regulacija temperature treba biti ± 0,1 °C. Izabranu temperaturu treba držati stalnom u svim relevantnim dijelovima opreme.

1.6.2. Preliminarno ispitivanje Uzorku od približno 0,1 g (krutine treba fino usitniti) u cilindru sa staklenim čepom i gradacijom od 10 ml dodaju se sve veći i veći volumeni destilirane vode sobne temperature prema dinamici kako je navedeno u sljedećoj tablici: 0,1 g topljiv u x ml vode 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Približna topljivost (grami po litri) > 1000 1000 do 200 200 do 100 100 do 50 50 do 10 10 do 1 < 1 Nakon svakog dodavanja navedene količine vode, mješavinu treba snažno protresati 10 minuta i zatim vizualno provjeriti ima li u uzorku još neotopljenih dijelova. Ako, nakon dodavanja 10 ml vode, uzorak ili dijelovi uzorka ostanu neotopljeni, pokus treba ponoviti u cilindru od 100 ml s većim volumenima vode. Kod nižih topljivosti, vrijeme koje je potrebno da bi se tvar otopila može biti znatno duže (treba omogućiti najmanje 24 sata). Približna topljivost navedena je u tablici pod onim volumenom dodane vode u kojem dolazi do potpunog otapanja uzorka. Ako je očito da je tvar i dalje neotopljena, treba omogućiti vrijeme duže od 24 sata (najviše 96 sati), ili je treba još razrijediti kako bi se utvrdilo treba li primijeniti metodu eluiranja ili metodu tikvice.

1.6.3. Metoda eluiranja kolone

1.6.3.

1.6.3.1. Nosivi materijal, otapalo i eluens Nosivi materijal u metodi eluiranja kolone treba biti inertan. Kao nosivi materijali mogu se upotrijebiti zrnca stakla i pijesak. Za nanošenje ispitivane tvari na nosivi materijal treba upotrijebiti odgovarajuće hlapljivo otapalo kvalitete pogodne za analitičku reakciju. Kao eluens treba upotrijebiti vodu dvostruko destiliranu u uređaju sa staklom ili kvarcom. Napomena: Ne smije se koristiti voda izravno s organskog ionskog izmjenjivača.

1.6.3.2. Punjenje nosača Odmjeri se približno 600 mg nosivog materijala i prenese u tikvicu zaobljenog dna od 50 ml. Odgovarajuća, izmjerena količina ispitivane tvari otopi se u izabranom otapalu. Prikladna količina te otopine dodaje se nosivom materijalu. Otapalo mora u potpunosti ispariti, primjerice u okretnom isparivaču; u suprotnom zasićenje nosača vodom ne postiže se zbog učinka razdjeljivanja na površini nosivog materijala. Punjenje nosivog materijala može uzrokovati probleme (pogrešne rezultate) ako se ispitna tvar taloži kao ulje ili neka drugačija kristalna faza. Takav problem treba eksperimentalno ispitati i pojedinosti unijeti u izviješće. Napunjen nosivi materijal ostavi se namakati otprilike dva sata u približno 5 ml vode, a zatim se otopina dodaje u mikro-kolonu. Alternativno, suhi napunjeni nosivi materijal može se istresti u mikro-kolonu ranije ispunjenu vodom, a zatim se uravnotežuje približno dva sata.

1.6.3.2. Ispitni postupak:

Eluiranje tvari s nosivog materijala može se odvijati na jedan od sljedeća dva različita načina:

recirkulacijskom crpkom (vidjeti sliku 1.),

nivelacijskom posudom (vidjeti sliku 4.)

1.6.3.3. Metoda eluiranja kolone pomoću recirkulacijske crpke

1.6.3.3. Uređaj

Tipični sustav shematski je prikazan na slici 1. Odgovarajuća mikro-kolona prikazana je na slici 2., iako je svaka veličina prihvatljiva pod uvjetom da zadovoljava kriterije mjerne obnovljivosti i osjetljivosti. U koloni iznad uzorka mora biti mjesta za najmanje pet volumena vode i kolona mora biti u stanju prihvatiti najmanje pet uzoraka. Alternativno, dimenzija može biti manja ako se koristi svježe otapalo koje zamjenjuje pet početnih volumena vode koji su uklonjeni s nečistoćama. Kolonu treba spojiti na recirkulacijsku crpku koja je u stanju regulirati protoke od približno 25 ml/h. Crpka je spojena politetrafluoroetilenskim (PTFE) ili staklenim priključcima. Kolona i crpka nakon montaže moraju biti opremljene za uzorkovanje efluensa i uravnoteženje prostora u koloni kod atmosferskog tlaka. Nosač materijala u koloni je mali (5 mm) čep od staklene vune, koji služi i za filtriranje čestica. Recirkulacijska crpka može biti, primjerice peristaltička crpka ili membranska crpka (treba voditi računa da ne dođe do kontaminacije materijalom same cijevi i/ili apsorpcije tog materijala).

Postupak mjerenja

Započinje protok kroz kolonu. Preporuča se primjena brzine protoka od približno 25 ml/sat (što kod opisane kolone odgovara veličini od 10 volumena punjenja/sat). Prvih pet volumena (minimalno) potroše se na uklanjanje nečistoća topljivih u vodi. Nakon toga, recirkulacijska crpka ostavi se u radu dok se ne postigne ravnoteža, nasumice utvrđena s pet uzastopnih uzoraka čije se koncentracije ne razlikuju za više od ± 30 %. Te uzorke treba međusobno odvojiti vremenskim intervalima koji odgovaraju prolazu najmanje 10 volumena punjenja eluensa.

1.6.3.4. Metoda eluiranja kolone s nivelacijskom posudom

1.6.3.4. Uređaj (vidjeti slike 4. i 3.)

Nivelacijska posuda: priključak na nivelacijsku posudu ostvaren je pomoću ubrušenog staklenog spoja s teflonskim (PTFE) cjevovodom. Preporuča se brzina protoka od približno 25 ml/sat. Uzastopne frakcije eluata treba skupljati i analizirati odabranom metodom.

Postupak mjerenja

Za određivanje topljivosti u vodi koriste se frakcije iz središnjeg područja eluata u kojem su koncentracije stalne (± 30 %) u najmanje pet uzastopnih frakcija. U oba slučaja (upotrebe recirkulacijske crpke ili nivelacijske posude), drugi krug pokusa treba provesti s pola brzine protoka prvog kruga. Ako se rezultati oba kruga slažu, ispitivanje se smatra zadovoljavajućim; ako je topljivost očito niža kod niže brzine protoka, tada se prepolavljanje brzine protoka mora nastaviti sve dok dva uzastopna kruga ne daju istu topljivost. U oba slučaja (upotrebe recirkulacijske crpke ili nivelacijske posude), kod frakcija treba provjeriti prisutnost koloidne tvari na način da se provjeri javlja li se Tyndallov efekt (raspršivanje svjetlosti). Prisutnost takvih čestica rezultate čini nevaljanim te ispitivanje treba ponoviti uz bolje filtriranje kolone.

1.6.4. Metoda tikvice

1.6.4.

1.6.4.1. Uređaj Za metodu tikvice potreban je sljedeći materijal:

obične laboratorijske staklene posude i instrumenti,

uređaj pogodan za miješanje otopina na kontroliranim stalnim temperaturama,

centrifuga (poželjno termostatski regulirana), po potrebi s emulzijama, i

oprema za analitičko određivanje.

1.6.4.2. Postupak mjerenja Količina materijala koja je potrebna za zasićenje željenog volumena vode procjenjuje se iz preliminarnog ispitivanja. Potreban volumen vode ovisit će o analitičkoj metodi i području topljivosti. U svaku od tri staklene posude opremljene staklenim zatvaračima (npr. cijevi centrifuge, tikvice) odmjerava se peterostruka gore određena količina materijala. Odabrani volumen vode dodaje se u svaku posudu te se posude čvrsto začepe. Zatvorene posude se tada protresaju na 30 °C. (Treba koristiti uređaj za protresanje ili miješanje koji može raditi na stalnoj temperaturi, npr. magnetna miješalica u termostatski reguliranoj vodenoj kupki). Nakon jednog dana jedna od posuda skida se i uravnotežuje 24 sata na temperaturi ispitivanja uz povremeno protresanje. Sadržaj posude se zatim centrifugira na temperaturi ispitivanja, a koncentracija ispitivane tvari u jasnoj vodenoj fazi određuje se odgovarajućom analitičkom metodom. S druge dvije tikvice postupa se na sličan način nakon početnog uravnoteženja na 30 °C tijekom dva odnosno tri dana. Ako rezultati koncentracija iz najmanje posljednje dvije posude odgovaraju zahtijevanoj ponovljivosti mjerenja, ispitivanje se smatra uspješnim. Ispitivanje treba u potpunosti ponoviti s dužim vremenom uravnoteženja ako rezultati iz posuda 1., 2. i 3. imaju tendenciju sve većih vrijednosti. Postupak mjerenja može se provoditi i bez prethodne inkubacije na 30 °C. Kako bi se procijenila brzina postizanja uravnoteženja zasićenja, uzorci se uzimaju sve do trenutka kada vrijeme miješanja više nema utjecaja na koncentraciju otopine koja se ispituje. pH vrijednost svakog uzorka treba zabilježiti.

1.6.5. Analiza Za ova određivanja poželjno je analitičku metodu odrediti točno prema ispitivanoj tvari, jer male količine topljivih nečistoća mogu uzrokovati velike pogreške u izmjerenoj topljivosti. Te metode mogu biti primjerice plinska ili tekuća kromatografija, metode titranja, fotometrijske metode, voltametrijske metode.

2. PODACI

2.

2.1. METODA ELUIRANJA KOLONE Za svaki krug treba izračunati srednju vrijednost najmanje pet uzastopnih uzoraka izmjerenih kod platoa zasićenja, kao i standardno odstupanje. Rezultate treba izraziti u jedinicama mase po volumenu otopine. Srednje vrijednosti izračunane u dva ispitivanja u kojima su primijenjena dva različita protoka uspoređuju se, a ponovljivost bi trebala biti manja od 30 %.

2.2. METODA TIKVICE Za svaku od tri tikvice treba dati pojedinačne rezultate koji će se smatrati stalnim (ponovljivost manja od 15 %), izračunati njihov prosjek i izraziti u jedinicama mase po volumenu otopine. Kad je topljivost visoka (> 100 grama po litri), za to će možda trebati potrebno ponovno pretvoriti jedinice mase u jedinice volumena, primjenom gustoće.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. METODA ELUIRANJA KOLONE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

rezultati preliminarnog testa,

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće),

pojedinačne koncentracije, brzine protoka i pH vrijednosti svakog uzorka,

srednje vrijednosti i standardna odstupanja od najmanje pet uzoraka na platou zasićenja,

prosječna vrijednost dva uzastopna prihvatljiva kruga,

temperatura vode tijekom postupka zasićenja,

primijenjena metoda analize,

narav primijenjenog nosivog materijala,

punjenje nosivog materijala,

primijenjeno otapalo,

dokaz o eventualnoj kemijskoj nestabilnosti tvari tijekom ispitivanja i kod primijenjene metode,

sve podatke i napomene relevantne za tumačenje rezultata, posebno s obzirom na nečistoće i fizikalno stanje tvari.

3.2. METODA TIKVICE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

rezultati preliminarnog testa,

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće),

pojedinačna analitička određivanja i prosjek ako je za svaku tikvicu određeno više od jedne vrijednosti,

pH vrijednost svakog uzorka,

prosječna vrijednost za različite tikvice koje su međusobno usklađene

temperatura ispitivanja,

primijenjena analitička metoda,

dokaz o eventualnoj kemijskoj nestabilnosti tvari tijekom ispitivanja i kod primijenjene metode,

sve podatke i napomene relevantne za tumačenje rezultata, posebno s obzirom na nečistoće i fizikalno stanje tvari.

4.(1)(2)(3) REFERENCE OECD, Paris, 1981, Testing Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF T 20-045 (AFNOR) (September 85) Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method. NF T 20-046 (AFNOR) (September 85) Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.

A.8. KOEFICIJENT RAZDJELJENJA

A.8.

1. METODA Opisana metoda protresanjem u tikvici temelji se na Smjernici za ispitivanje OECD-a (1).

1.

1.1. UVOD Prije provođenja ovog ispitivanja korisno je za tvar koja se ispituje posjedovati preliminarne informacije o strukturnoj formuli, konstanti disasocijacije, topljivosti u vodi, hidrolizi, topljivosti u n-oktanolu i površinskoj napetosti. Mjerenja treba provoditi na ionizirajućim tvarima samo kad su u neioniziranom obliku (slobodne kiseline ili slobodne lužine) dobivene primjenom odgovarajuće pufer otopine pH vrijednosti najmanje jednu pH jedinicu ispod (za slobodne kiseline) ili iznad (za slobodne lužine) vrijednosti pK. Ovom ispitnom metodom obuhvaćena su dva odvojena postupka: metoda protresanjem u tikvici i visokoučinkovita tekućinska kromatografija (HPLC). Prvi je primjenljiv kad log Pow (vidjeti definiciju dalje u tekstu) pripada području – 2 do 4, a drugi u području 0 do 6. Prije izvršenja bilo kojega od tih eksperimentalnih postupaka prvo treba dobiti preliminarnu procjenu koeficijenta razdjeljenja. Metoda protresanjem u tikvici primjenljiva je samo na bitno čiste tvari topljive u vodi i n-oktanolu. Nije primjenljiva na površinski aktivne materijale (za koje treba osigurati izračunanu ili procijenjenu vrijednost na temelju pojedinačnih vrijednosti topljivosti u n-oktanolu i vodi). Metoda visokoučinkovite tekućinske kromatografije (HPLC) nije primjenljiva na jake kiseline ili lužine, metalne komplekse, površinski aktivne materijale ili tvari koje reagiraju s eluensom. Za te materijale treba osigurati izračunanu ili procijenjenu vrijednost na temelju pojedinačnih vrijednosti topljivosti u n-oktanolu i vodi. Metoda HPLC manje je osjetljiva na prisutnost nečistoća u ispitivanim spojevima nego metoda protresanjem u tikvici. Bez obzira na to u nekim slučajevima nečistoće mogu otežati tumačenje rezultata jer vršne vrijednosti nije moguće odrediti sa sigurnošću. Za mješavine koje daju nerazlučeni pojas, treba navesti gornju i donju granicu vrijednosti log P.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Koeficijent razdjeljenja (P) definira se kao omjer uravnoteženih koncentracija (ci) otopljene tvari u dvofaznom sustavu koji obuhvaća dva otapala koja uglavnom nije moguće miješati. Kad se radi o n-oktanolu i vodi: pow = cn–octanolcwater Dakle, koeficijent razdjeljenja (P) količnik je dviju koncentracija, a obično se izražava u obliku svojega logaritma na bazu 10 (log P).

1.3. REFERENTNE TVARI

1.3. Metoda protresanjem u tikvici

Referentne tvari nije potrebno upotrebljavati kod svakog istraživanja nove tvari. One bi trebale služiti prvenstveno za povremenu provjeru primijenjene metode i omogućiti usporedbu s rezultatima dobivenim drugim metodama.

Metoda HPLC

Radi postavljanja korelacije između podataka koji su metodom HPLC izmjereni o nekom spoju s njegovom vrijednošću koeficijenta razdjeljenja P, treba uspostaviti kalibracijsku krivulju log P u odnosu na podatke dobivene kromatografijom pomoću najmanje šest referentnih točaka. Odgovarajuće referentne tvari odabire sam korisnik. Kad god je to moguće, najmanje jedan referentni spoj treba imati Pow iznad Pow vrijednosti ispitivane tvari, a Pow vrijednost drugog spoja treba biti ispod Pow vrijednosti ispitivane tvari. Za vrijednosti log P ispod 4, kalibracija se može temeljiti na podacima dobivenim metodom protresanjem u tikvici. Za vrijednosti log P veće od 4, kalibracija se može temeljiti na validiranim vrijednostima iz literature ako se te vrijednosti podudaraju s izračunanim vrijednostima. Radi veće točnosti, poželjno je odabrati referentne spojeve koji su strukturno srodni ispitivanoj tvari. Dostupan je dugi popis vrijednosti log Pow za mnogo skupina kemikalija (2)(3). Ako podaci o koeficijentima razdjeljenja strukturno srodnih spojeva nisu dostupni, može se primijeniti općenitija kalibracija, utvrđena s drugim referentnim spojevima. Popis preporučenih referentnih tvari i njihovih vrijednosti Pow naveden je u Dodatku 2.

1.4. NAČELO METODE

1.4.

1.4.1. Metoda protresanjem u tikvici Kako bi se odredio koeficijent razdjeljenja, između svih sastavnih dijelova sustava treba postići ravnotežu i odrediti koncentracije tvari otopljenih u dvije faze. Proučavanje te teme u literaturi pokazuje da za rješenje tog problema postoji nekoliko raznih tehnika, tj. potpunog miješanja dvije faze nakon kojega slijedi njihovo odvajanje kako bi se odredila koncentracija ravnoteže za tvari koje se ispituju.

1.4.2. Metoda HPLC HPLC se provodi na analitičkim kolonama punjenim komercijalno dostupnom krutom fazom koja sadrži duge lance ugljikovodika (npr.C8, C18) kemijski vezane na silicijev dioksid. Kemikalije koje se ubrizgavaju u takvu kolonu kreću se duž nje različitim brzinama zbog različitih stupnjeva razdjeljenja između mobilne faze i stacionarne faze ugljikovodika. Mješavine kemikalija eluiraju redom svoje hidrofobičnosti, s tim da kemikalije topljive u vodi eluiraju prve, a kemikalije topljive u ulju posljednje, proporcionalno svojem koeficijentu razdjeljenja ugljikovodik/voda. To omogućuje uspostavljanje veze između vremena zadržavanja na toj koloni (obrnuta faza) i koeficijenta razdjeljenja n-oktanol/voda. Koeficijent razdjeljenja dobiva se iz faktora kapaciteta k izraženog kao: k = tr – toto gdje je tr = vrijeme zadržavanja ispitivane tvari, a to = prosječno vrijeme koje molekuli otapala treba za prolaz kroz kolonu (mrtvo vrijeme). Kvantitativne analitičke metode nisu potrebne, već treba samo odrediti vremena eluiranja.

1.5. KRITERIJI KVALITETE

1.5.

1.5.1. Ponovljivost

1.5.1. Metoda protresanjem u tikvici

Kako bi se osigurala točnost koeficijenta razdjeljenja, u tri različita ispitna uvjeta treba provesti dvostruko određivanje, pri čemu količina konkretne tvari kao i omjer volumena otapala mogu biti različiti. Određene vrijednosti koeficijenta razdjeljenja izražene kao njihovi zajednički logaritmi trebaju se kretati u području ± 0,3 log jedinica.

Metoda HPLC

Kako bi se povećala pouzdanost mjerenja, treba provoditi dvostruka određivanja. Vrijednosti log P derivirane iz pojedinačnih mjerenja trebaju se kretati u području ± 0,1 log jedinica.

1.5.2. Osjetljivost

1.5.2. Metoda protresanjem u tikvici

Mjerno područje ove metode određeno je granicom detekcije analitičkog postupka. Taj bi postupak trebao omogućiti procjenu vrijednosti log Pow u području od – 2 do 4 (povremeno, kad to uvjeti dopuštaju, to se područje može proširiti na vrijednosti log Pow do 5) kad koncentracija topljive tvari u jednoj ili drugoj fazi nije veća od 0,01 mol po litri.

Metoda HPLC

Metoda HPLC omogućuje procjenu koeficijenata razdjeljenja vrijednosti log Pow u području od 0 do 6. Koeficijent razdjeljenja spoja obično se može procijeniti unutar ± 1 log jedinice vrijednosti dobivene metodom protresanjem u tikvici. Tipična korelacija može se naći u literaturi (4)(5)(6)(7)(8). Velika točnost obično se može postići kad se korelacijske krivulje temelje na strukturno srodnim referentnim spojevima (9).

1.5.3. Specifičnost

1.5.3. Metoda protresanjem u tikvici

Nernstov zakon razdjeljenja važi samo kod stalne temperature, tlaka i pH vrijednosti za razrijeđene otopine. Strogo važi za čistu tvar raspršenu između dva čista otapala. Ako se nekoliko različitih topljivih tvari istodobno nađe u jednoj ili obje faze, to može imati utjecaja na rezultate. Disocijacija ili asocijacija otopljenih molekula vode do odstupanja od Nernstovog zakona razdjeljenja. Na ta odstupanja ukazuje činjenica da koeficijent razdjeljenja postaje ovisan o koncentraciji otopine. S obzirom da se radi o višestrukim ravnotežama, ovu ispitnu metodu na ionizirajuće spojeve trebalo bi primjenjivati samo uz primjenu korekcije. Za takve spojeve treba razmotriti upotrebu pufer otopina umjesto vode; s tim da se pH vrijednost pufer otopine treba za najmanje 1 pH jedinicu razlikovati od vrijednosti pKa tvari, vodeći računa o relevantnosti te pH vrijednosti za okoliš.

1.6. OPIS METODE

1.6.

1.6.1. Preliminarna procjena koeficijenta razdjeljenja Koeficijent razdjeljenja poželjno je procijeniti metodom izračuna (vidjeti Dodatak 1.), ili kad je to primjereno, iz omjera topljivosti ispitivane tvari u čistim otapalima (10).

1.6.2. Metoda protresanjem u tikvici

1.6.2.

1.6.2.1. Priprema n-oktanol: određivanje koeficijenta razdjeljenja treba provesti pomoću reagensa analitičke kvalitete visoke čistoće. Voda: treba upotrebljavati vodu destiliranu ili dvostruko destiliranu u uređaju sa staklom ili kvarcnim pijeskom. Za ionizirajuće spojeve, kad je to opravdano, treba koristiti pufer otopinu umjesto vode. Napomena: Ne bi trebalo koristiti vodu uzetu izravno iz ionskog izmjenjivača.

1.6.2.1.

1.6.2.1.1. Prethodno zasićenje otapala Prije određivanja koeficijenta razdjeljenja, faze sustava otapala obostrano se zasićuju protresanjem na temperaturi pokusa. Za to je praktično tresti dvije velike stock boce n-oktanola analitičke kvalitete visoke čistoće ili vode, i jednog i drugog s dovoljnim količinama drugog otapala, tijekom 24 sata na mehaničkoj miješalici pa ih zatim ostaviti da stoje dovoljno dugo kako bi se faze odvojile i postiglo stanje zasićenja.

1.6.2.1.2. Priprema ispitivanja Čitav volumen dvofaznog sustava treba gotovo ispuniti ispitnu posudu. Time će se spriječiti gubitak materijala uslijed hlapljenja. Omjer volumena i količine tvari koje treba upotrijebiti utvrđuju se na sljedeći način: Provode se tri ispitivanja. U prvom se primjenjuje izračunani omjer volumena n-oktanola i vode; u drugom se taj omjer dijeli s dva; i u trećem, taj se omjer množi s dva (npr. 1:1, 1:2, 2:1).

prethodnom procjenom koeficijenta razdjeljenja (vidjeti gore),

minimalnom količinom ispitivane tvari koja je potrebna za analitički postupak, i

ograničenjem maksimalne koncentracije u svakoj od faza na 0,01 mol po litri.

1.6.2.1.3. Ispitivana tvar Matična otopina pripravlja se u n-oktanolu prethodno zasićenom vodom. Koncentraciju matične otopine treba točno utvrditi prije određivanja koeficijenta razdjeljenja. Tu otopinu treba skladištiti u uvjetima koji će osigurati njezinu stabilnost.

1.6.2.2. Ispitni uvjeti Temperaturu ispitivanja treba držati stalnom (± 1 °C) i u području od 20 do 25 °C.

1.6.2.3. Postupak mjerenja

1.6.2.3.

1.6.2.3.1. Uspostavljanje ravnoteže razdjeljenja Za svaki od uvjeta ispitivanja treba pripraviti dvostruke ispitne posude koje sadrže potrebnu točno odmjerenu količinu dva otapala zajedno s potrebnom količinom matične otopine. N-oktanol faze treba odmjeriti volumenski. Ispitne posude treba postaviti u odgovarajući uređaj za protresanje ili tresti rukom. Ako se koristi centrifugalna cijev, preporuča se metoda brze vrtnje cijevi kroz 180° oko njezine transverzalne osi kako bi se eventualno zaostali zrak mogao izdići kroz faze. Iskustvo je pokazalo da je 50 takvih rotacija obično dostatno za uspostavljanje ravnoteže razdjeljenja. Radi sigurnosti, preporuča se 100 rotacija u pet minuta.

1.6.2.3.2. Faza separacije Ako je potrebno, za odvajanje faza potrebno je provesti centrifugiranje mješavine. To se radi u laboratorijskoj centrifugi koja se drži na sobnoj temperaturi ili, ako se rabi centrifuga bez regulacije temperature, radi uravnoteženja, centrifugalne cijevi treba držati na temperaturi ispitivanja najmanje jedan sat prije analize.

1.6.2.4. Analiza Za određivanje koeficijenta razdjeljenja, potrebno je odrediti koncentracije ispitivanih tvari u obje faze. To se može učiniti na način da se uzme alikvot od svake od dviju faza iz svake cijevi za svaki ispitni uvjet i analizira odabranim postupkom. Ukupna količina tvari prisutna u obje faze izračunava se i uspoređuje s količinom tvari koja je prvobitna uvedena. Vodenu fazu treba uzorkovati postupkom kojim se minimalizira rizik uključivanja tragova n-oktanola: za uzimanje uzorka vodene faze može se koristiti staklena šprica s izmjenljivom iglom. Šprica mora najprije biti djelomično napunjena zrakom. Zrak treba nježno istiskivati dok se igla uvodi kroz sloj n-oktanola. Odgovarajući volumen vodene faze uvuče se u špricu. Šprica se brzo izvadi iz otopine i igla odvoji. Sadržaj šprice sada se može koristiti kao uzorak vode. Koncentraciju u dvije odvojene faze poželjno je utvrditi metodom koja posebno odgovara za dotičnu tvar. Analitičke metode koje bi mogle biti primjerene su, primjerice:

fotometričke metode,

plinska kromatografija,

visokoučinkovita tekućinska kromatografija.

1.6.3. Metoda HPLC

1.6.3.

1.6.3.1. Priprema

1.6.3.1. Uređaj

Potreban je tekućinski kromatograf opremljen crpkom sa stalnim protokom i odgovarajućim uređajem za detekciju. Preporuča se upotreba ventila za ubrizgavanje s petljama za ubrizgavanje. Prisutnost polarnih grupa u stacionarnoj fazi može ozbiljno ugroziti rad kolone kromotografa. Stoga bi stacionarna faza trebala sadržavati minimalni postotak polarnih grupa (11). Mogu se upotrebljavati trgovačka pakiranja mikro-čestica inverzne faze ili gotove kolone. Između sustava ubrizgavanja i analitičke kolone može se postaviti sigurnosna kolona.

Mobilna faza

Za pripremanje otapala za eluiranje upotrebljavaju se metanol kvalitete predviđene za HPLC i voda kvalitete previđene za HPLC, a otapalo se prije upotrebe otplinjava. Treba primijeniti izokratičnu eluaciju. Treba upotrijebiti omjere metanol/voda s minimalnim sadržajem vode od 25 %. Obično je omjer mješavine metanola i vode 3:1 (v/v) zadovoljavajući za eluiranje spojeva s vrijednošću log P 6 unutar jednog sata kod brzine protoka od 1 ml/min. Za spojeve koji imaju viši log P možda će trebati skratiti vrijeme eluiranja (i vrijeme eluiranja referentnih spojeva) smanjivanjem polariteta mobilne faze ili duljine kolone. Kod metode HPLC, tvari jako niske topljivosti u n-oktanolu imaju tendenciju dati neuobičajeno male vrijednosti log Pow; vršne vrijednosti takvih spojeva ponekad prate frontu otapala. To je vjerojatno zato što je postupak razdjeljivanja prespor da bi se ravnoteža postigla u vremenu koje obično treba za odvajanje kromatografijom HPLC. Stoga bi se do pouzdane vrijednosti učinkovito moglo doći snižavanjem brzine protoka i/ili smanjivanjem omjera metanol/voda. Ispitivani i referentni spojevi trebali bi biti topljivi u mobilnoj fazi u koncentracijama koje su dovoljne za njihovu detekciju. Samo u izuzetnim slučajevima s mješavinom metanola i vode smiju se koristiti aditivi, jer aditivi mijenjaju svojstva kolone. Za kromatograme s aditivima obvezno je rabiti posebnu kolonu istog tipa. Ako mješavina metanol-voda nije prikladna, mogu se koristiti mješavine drugih otapala i vode, npr. etanol-voda ili acetonitril-voda. pH eluensa od kritične je važnosti za ionizirajuće spojeve. pH vrijednost mora biti u radnom području pH vrijednosti kolone, što je obično između 2 i 8. Preporuča se puferiranje. Treba paziti da se izbjegne taloženje soli i propadanje kolone, do čega dolazi kod nekih organskih faza/pufer mješavina. Kod stacionarnih faza koje se temelje na silicijevom dioksidu s pH vrijednošću iznad 8, ne preporuča se mjerenje kromatografijom HPLC jer upotreba alkalne mobilne faze može brzo uzrokovati slabije funkcioniranje kolone.

Rastvori

Referentni spojevi trebali bi biti što je moguće čišći. Spojevi koji se koriste za ispitivanje ili u svrhu kalibracije otapaju se, po mogućnosti, u mobilnoj fazi.

Ispitni uvjeti

Za vrijeme mjerenja, temperatura ne bi smjela varirati za više od ± 2 K.

1.6.3.2. Mjerenje

1.6.3.2. Izračun mrtvog vremena to

Mrtvo vrijeme to može se odrediti upotrebom homolognog niza (npr. n-alkil metil ketoni) ili nezadržanih organskih spojeva (npr. tiourea ili formamid). Za izračun mrtvog vremena to primjenom homolognog niza, ubrizgava se set od najmanje sedam članova homolognog niza i utvrđuju se njihova vremena zadržavanja. Sirovi podaci o vremenima zadržavanja tr(nc + 1) ucrtavaju se kao funkcija vremena tr(nc), i određuju se sjecište a i kosina b regresijske jednadžbe: tr(nc + 1) = a + b tr(nc) (nc = broj atoma ugljika). Dakle, mrtvo vrijeme to određeno je jednadžbom: to = a/(1 – b)

Kalibracijska krivulja

Sljedeći je korak konstruiranje korelacijske krivulje vrijednosti log k u odnosu na log p za odgovarajuće referentne spojeve. U praksi, set od 5 do 10 standardnih referentnih spojeva čija je vrijednost log p oko očekivanog područja istodobno se ubrizgava te se određuju vremena zadržavanja, poželjno na integratoru za bilježenje rezultata spojenom na sustav za detekciju. Odgovarajući logaritmi faktora kapaciteta, log k, izračunavaju se i ucrtavaju kao funkcija vrijednosti log p određena metodom protresanja tikvice. Kalibracija se obavlja u redovitim intervalima, najmanje jednom dnevno, kako bi se mogle uzeti u obzir eventualne promjene u funkcioniranju kolone.

Utvrđivanje faktora kapaciteta ispitivane tvari

Ispitivana tvar ubrizga se u najmanju moguću količinu mobilne faze. Odredi se vrijeme zadržavanja (dva puta), čime se omogućuje izračun faktora kapaciteta k. Iz korelacijske krivulje referentnih spojeva može se interpolirati koeficijent razdjeljenja ispitivane tvari. Za jako male i jako velike koeficijente razdjeljenja, ekstrapolacija je neophodna. U tim slučajevima treba voditi računa o granicama pouzdanosti linije regresije.

2. PODACI

2. Metoda protresanja tikvice

Pouzdanost utvrđenih vrijednosti P može se ispitati uspoređivanjem srednjih vrijednosti dvostrukih određivanja i sveukupne srednje vrijednosti.

3. IZVJEŠĆIVANJE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće),

kad metode nisu primjenljive (npr. površinski aktivni materijali), treba osigurati izračunanu ili procijenjenu vrijednost koja se temelji na pojedinačnim topljivostima n-oktanola i vode

svi podaci i napomene relevantne za tumačenje rezultata, posebno s obzirom na nečistoće i fizikalno stanje tvari.

rezultat prethodne procjene, ako je provedena,

temperatura određivanja,

podaci o analitičkim postupcima koji su primijenjeni u određivanju koncentracija,

vrijeme i brzina centrifugiranja, ako je primijenjeno,

izmjerene koncentracije u obje faze za svako određivanje (to znači da u izvješće treba unijeti ukupno 12 koncentracija),

težina ispitivane tvari, volumen svake faze koja je upotrijebljena u svakoj ispitnoj posudi i ukupna izračunana količina ispitivane tvari prisutna u svakoj fazi nakon uravnoteženja,

izračunane vrijednosti koeficijenta razdjeljenja (P) i srednja vrijednost za svaki set ispitnih uvjeta kao i srednja vrijednost za sva određivanja. U izvješću treba navesti svaku indikaciju zavisnosti koncentracije o koeficijentu razdjeljenja,

treba navesti standardno odstupanje pojedinačnih vrijednosti P od njihove srednje vrijednosti,

srednja vrijednost P iz svih određivanja mora biti izražena i njezinim logaritmom (baza 10),

izračunati teoretski Pow ako je ta vrijednost utvrđena ili ako je izmjerena vrijednost > 104,

pH vrijednost vode koja je upotrijebljena i pH vodene faze tijekom pokusa,

ako su korišteni puferi, obrazloženje za upotrebu pufera umjesto vode, sastav, koncentracija i pH vrijednost pufera, pH vrijednost vodene faze prije i poslije pokusa.

rezultat prethodne procjene, ako je provedena,

ispitivanja i referentne tvari, i njihova čistoća,

temperaturno područje određivanja,

pH vrijednost na kojoj su određivanja provedena,

podaci o analitičkoj i sigurnosnoj koloni, mobilnoj fazi i srednjim vrijednostima detekcije,

podaci o zadržavanju i vrijednosti log P koje se za referentne spojeve upotrijebljene u kalibraciji spominju u literaturi,

pojedinosti o prilagođenoj liniji regresije (log k u odnosu na log P),

podaci o prosječnom zadržavanju i interpolirana vrijednost log P za ispitivani spoj,

opis opreme i radnih uvjeta,

profili eluiranja,

količine ispitivane i referentne tvari uvedene u kolonu,

mrtvo vrijeme i način na koji je mjereno.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)

REFERENCE OECD, Paris, 1981, Testing Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, str. 683. H. Ellgehausen, C. D’Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, str. 219. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, str. 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, str. 1. J.E. Haky and A. M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, str. 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, str. 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, str. 223-339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, str. 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, str. 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use – Determination of Partition Coefficients – Flask shaking method. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, str. 1459. A.Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, str. 525. C.Hansch, A.Leo, S. H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani and E. J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, str. 1207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, str. 1113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, str. 382. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984. Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Base1, 1978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, str. 615.

A.9. PLAMIŠTE

A.9.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Prije provođenja ovog ispitivanja korisno je raspolagati preliminarnim informacijama o zapaljivosti tvari koja se ispituje. Ispitni postupak primjenjuje se na tekuće tvari čije je pare moguće zapaliti izvorom zapaljenja. Ispitne metode navedene u ovom tekstu pouzdane su samo za područja plamišta koja su pojedinačno navedena za svaku metodu. Kod odabira metode koja će se primijeniti treba uzeti u obzir mogućnost kemijske reakcije između tvari i posude za uzorak.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Plamište je najniža temperatura, ispravljena na tlak od 101,325 kPa, kod koje, u uvjetima utvrđenim u ispitnoj metodi, tekućina evolvira toliku količinu para da u ispitnoj posudi nastane zapaljiva mješavina pare i zraka. Jedinice: °C t = T – 273,15 (t u °C, a T u K)

1.4. NAČELO METODE Tvar se stavi u ispitnu posudu i zagrijava ili hladi do temperature ispitivanja u skladu s postupkom opisanim u pojedinoj ispitnoj metodi. Probe zapaljenja provode se kako bi se utvrdilo hoće li se uzorak zapaliti na temperaturi ispitivanja ili neće.

1.5. KRITERIJI KVALITETE

1.5.

1.5.1. Ponovljivost Ponovljivost varira u skladu s područjem plamišta i primijenjenoj ispitnoj metodi; maksimalno 2 °C.

1.5.2. Osjetljivost Osjetljivost ovisi o primijenjenoj ispitnoj metodi.

1.5.3. Specifičnost Posebnost nekih ispitnih metoda ograničena je na određena područja plamišta i ovisi o podacima specifičnim za pojedinu tvar (npr. velika viskoznost).

1.6. OPIS METODE

1.6.

1.6.1. Pripravci Uzorak ispitivane tvari stavi se u ispitni uređaj prema 1.6.3.1. i/ili 1.6.3.2. Radi sigurnosnih razloga, za energetske i toksične tvari preporuča se primjena metode kod koje se koristi mala količina uzorka, približno 2 cm3.

1.6.2. Ispitni uvjeti Do mjere u kojoj je to moguće iz sigurnosnih razloga, uređaj treba postaviti u položaj zaštićen od strujanja zraka.

1.6.3. Provođenje ispitivanja

1.6.3.

1.6.3.1. Metoda ravnoteže Vidjeti norme: ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2. Metoda neravnoteže

1.6.3.2. Uređaj Abel:

Vidjeti norme: BS 2000 dio 170., NF M07-011, NF T66-009.

Uređaj Abel-Pensky:

Vidjeti norme: EN 57, DIN 51755 dio 1. (za temperature od 5 do 65 °C), DIN 51755 dio 2. (za temperature ispod 5 °C), NF M07-036.

Uređaj Tag:

Vidjeti normu ASTM D 56.

Uređaj Pensky-Martens:

Vidjeti norme: ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Napomene:

Ako se metodom neravnoteže iz 1.6.3.2. utvrdi da je plamište na temperaturi 0 ± 2 °C, 21 ± 2 °C ili 55 ± 2 °C, to treba potvrditi metodom ravnoteže koristeći isti uređaj. U svrhu prijavljivanja smiju se koristiti samo one metode koje daju temperaturu plamišta. Za određivanje plamišta viskoznih tekućina (boje, gume i slično) koje sadrže otapala dozvoljeno je koristiti samo uređaj i ispitne metode prikladne za određivanje plamišta viskoznih tekućina. Vidjeti norme: ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 dio 1.

2. PODACI

3. IZVJEŠĆIVANJE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće),

treba navesti primijenjenu metodu kao i eventualna odstupanja,

rezultate i sve dodatne napomene relevantne za tumačenje rezultata.

4. REFERENCE Nema ih.

A.10. ZAPALJIVOST (KRUTINE)

A.10.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Prije provođenja ovog ispitivanja korisno je raspolagati preliminarnim informacijama o potencijalno eksplozivnim svojstvima tvari. Ovo ispitivanje treba primjenjivati samo na tvari u obliku praha, granula ili paste. Kako se ne bi obuhvatile sve tvari koje gore već samo one koje gore brzo ili one čije ponašanje kod zapaljenja je na bilo koji način izrazito opasno, lako zapaljivim tvarima smatraju se samo one tvari čija brzina gorenja premašuje određenu graničnu vrijednost. Usijanost koja se proširi kroz metalnu prašinu može biti izrazito opasna jer se takav požar teško gasi. Metalnu prašinu treba smatrati lako zapaljivom ako podržava širenje usijanja cijelom masom u određenom vremenu.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Vrijeme gorenja izraženo u sekundama

1.3. REFERENTNE TVARI Nisu navedene.

1.4. NAČELO METODE Tvar se oblikuje kao neprekinuta traka ili pruga od praha dugačka oko 250 mm, te se provodi preliminarni test probira kako bi se odredilo dolazi li kod zapaljenja na plinskom plamenu do širenja plamena ili do tinjanja. Ako se plamen u određenom vremenu proširi na preko 200 mm u dužinu, treba provesti potpuni program ispitivanja kako bi se odredila brzina gorenja.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nisu navedeni.

1.6. OPIS METODE

1.6.

1.6.1. Preliminarni test probira Tvar se oblikuje na nezapaljivoj, neporoznoj ploči slabe termičke provodljivosti kao neprekinuta traka ili pruga od praha dugačka oko 250 mm, široka 20 mm i visoka 10 mm. Plamen iz plinskoga gorača (minimalnog promjera 5 mm) drži se na jednom kraju pruge od praha sve dok se prah ne zapali ili najduže dvije minute (pet minuta za prah metala ili metalnih legura). Treba pratiti širi li se gorenje uzduž 200 mm dugačke pruge u ispitnom razdoblju od 4 minute (ili 40 minuta za metalnu prašinu). Ako se u ispitnom razdoblju od 4 minute (ili 40 minuta) tvar nije zapalila niti se gorenje nastavilo bilo kao plamen ili kao tinjanje uzduž 200 mm dugačke pruge, tvar ne treba smatrati lako zapaljivom i daljnje ispitivanje nije potrebno. Ako se širenje gorenja tvari nastavi na način da 200 mm dugačka pruga izgori za manje od četiri minute, ili manje od 40 minuta za metalni prah, treba provesti postupak opisan dalje u tekstu (točka 1.6.2. i dalje).

1.6.2. Ispitivanje brzine gorenja

1.6.2.

1.6.2.1. Priprema Praškaste ili zrnate tvari rahlo se napune u kalup dugačak 250 mm, trokutastog presjeka unutarnje visine 10 mm i širine 20 mm. S obje strane kalupa uzdužno su montirana dva metalna lima kao bočni graničnici koji su za 2 mm viši od gornjeg ruba trokutastog presjeka (slika). Kalup se tri puta spusti s visine od 2 cm na čvrstu podlogu. Po potrebi kalup treba nadopuniti. Bočni graničnici se zatim skinu, a višak tvari sastruže. Na vrh kalupa postavi se nezapaljiva, neporozna ploča slabe toplinske provodljivosti, uređaj se preokrene naopako i kalup se odstrani. Tvari u obliku paste nanesu se na nezapaljivu, neporoznu ploču slabe toplinske provodljivosti u obliku užeta dugačkog 250 mm, poprečnog presjeka oko 1 cm2.

1.6.2.2. Ispitni uvjeti Kad se radi o tvari koja je osjetljiva na vlagu, ispitivanje treba provesti što je moguće brže nakon što je tvar izvađena iz spremnika.

1.6.2.3. Provođenje ispitivanja Složite u digestor hrpicu uzorka na način da kroz njega struji zrak. Brzina strujanja zraka trebala bi biti dovoljna da se spriječi istjecanje para u laboratorij i ne bi je se smjelo mijenjati tijekom ispitivanja. Strujanjem zraka oko uređaja mora se formirati zračna zavjesa. Plamen iz plinskoga gorača (najmanje 5 mm u promjeru) koristi se za paljenje hrpice s jednog kraja. Kad tvar izgori u duljini od 80 mm, mjeri se brzina gorenja na sljedećih 100 mm. Ako se pozitivan rezultat ne zamijeti ranije, ispitivanje se provodi šest puta, svaki put na čistom limu za hlađenje.

2. PODACI Za procjenu relevantno je vrijeme gorenja iz preliminarnog testa probira (1.6.1.) i najkraće vrijeme gorenja u najviše šest ispitivanja (1.6.2.3.)

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće),

opis tvari koja se ispituje, njezino fizikalno stanje uključujući sadržaj vlage

rezultati iz preliminarnog testa probira i ispitivanja brzine gorenja, ako je to ispitivanje provedeno,

sve dodatne napomene relevantne za tumačenje rezultata.

3.2. TUMAČENJE REZULTATA Tvari u obliku praha, granula ili paste smatraju se lako zapaljivima ako je vrijeme gorenja prilikom bilo kojih testiranja provedenih sukladno postupku ispitivanja iz 1.6.2. kraće od 45 sekundi. Prah metala ili metalnih legura smatra se lako zapaljivim ako se može zapaliti a plamen ili zona reakcije se proširi po cijelom uzorku u roku od 10 minuta ili manje.

4. REFERENCE NF T 20-042 (September 85) Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

A.11. ZAPALJIVOST (PLINOVI)

A.11.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Ovom metodom moguće je odrediti jesu li plinovi pomiješani sa zrakom na sobnoj temperaturi (oko 20 °C) i atmosferskom tlaku zapaljivi i, ako jesu, u kojem području koncentracija. Mješavine sve većih koncentracija ispitivanog plina i zraka izlažu se električnoj iskri te se prati dolazi li do zapaljenja.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Područje zapaljivosti je područje koncentracija između donje i gornje granice eksplozije. Donja i gornja granica eksplozivnosti su granične koncentracije zapaljivog plina u smjesama sa zrakom na kojima ne dolazi do širenja plamena.

1.3. REFERENTNE TVARI Nisu navedene.

1.4. NAČELO METODE Koncentracija plina u zraku postupno se povećava, te se kod svakog povećanja izlaže električnoj iskri.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nisu navedeni.

1.6. OPIS METODE

1.6.

1.6.1. Uređaj Ispitna posuda je uspravni stakleni cilindar unutarnjeg promjera najmanje 50 mm i minimalne visine 300 mm. Elektrode za paljenje međusobno su odvojene od 3 do 5 mm, a postavljene su 60 mm iznad dna cilindra. Cilindar ima otvor za oslobađanje tlaka. Uređaj mora imati zaštitni plašt kako bi se ograničila eventualna šteta od eksplozije. Kao izvor zapaljenja koristi se indukcijska iskra koja traje 0,5 sek., a nastaje visokonaponskim transformatorom izlaznog napona 10 do 15 kV (maksimalne ulazne snage 300 W). Primjer odgovarajućeg uređaja opisan je u referenci (2).

1.6.2. Ispitni uvjeti Ispitivanje treba provoditi na sobnoj temperaturi (oko 20 °C).

1.6.3. Provođenje ispitivanja Dozirnim crpkama u stakleni cilindar uvodi se poznata koncentracija plina u zraku. Kroz mješavinu se pušta iskra i promatra se hoće li se plamen odvojiti od izvora zapaljenja i neovisno širiti ili ne. Koncentracija plina mijenja se po 1 % vol. dok ne dođe do zapaljenja kako je gore opisano. Ako kemijska struktura plina ukazuje da bi mogao biti nezapaljiv, a sastav stehiometrijske mješavine sa zrakom može se izračunati, tada postupno u rasponu od 1 % treba ispitivati samo mješavine u području od 10 % ispod do 10 % iznad stehiometrijskog sastava.

2. PODACI Pojava širenja plamena jedini je relevantan podatak za određivanje ovog svojstva.

3. IZVJEŠĆIVANJE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće),

opis i dimenzije uređaja koji se koristi,

temperatura na kojoj je ispitivanje provedeno,

ispitane koncentracije i dobiveni rezultati,

rezultat ispitivanja: nezapaljivi plin ili lako zapaljivi plin,

ako je zaključeno da je plin nezapaljiv, tada treba navesti područje koncentracija u kojem je plin postupno ispitivan po 1 %,

sve informacije i napomene relevantne za tumačenje rezultata.

4.(1)(2) REFERENCE NF T 20-041 (September 85) Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.- Tech., 1984, vol. 56, 2, 126-127., T. Redeker und H.Schacke, str. 126-127.

A.12. ZAPALJIVOST (U DODIRU S VODOM)

A.12.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Ovom metodom moguće je odrediti razvijaju li se kod reakcije tvari s vodom ili vlažnim zrakom opasne količine plina ili plinova koji mogu biti lako zapaljivi. Ova se ispitna metoda može primijeniti i na krute i na tekuće tvari. Ova metoda nije primjenljiva na tvari koje se spontano pale u dodiru sa zrakom.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Lako zapaljive: tvari koje u dodiru s vodom ili vlažnim zrakom razvijaju lako zapaljive plinove u opasnim količinama brzinom od najmanje 1 litra/kg na sat.

1.3. NAČELO METODE Tvar se ispituje postupno kako je opisano dalje u tekstu; ako u bilo kojoj fazi dođe do zapaljenja, daljnje ispitivanje nije potrebno. Ako je poznato da tvar ne reagira burno s vodom, treba odmah prijeći na fazu 4. (1.3.4.)

1.3.

1.3.1. Faza 1. Ispitivana tvar postavlja se u korito koje sadrži destiliranu vodu na 20 °C i bilježi se hoće li se razvijeni plin zapaliti ili ne.

1.3.2. Faza 2. Ispitivana tvar postavlja se na filtar papir koji pluta na površini posude koja sadrži destiliranu vodu na 20 °C i bilježi se hoće li se razvijeni plin zapaliti ili ne. Filtar papir služi samo da bi se tvar održala na mjestu, čime se povećava vjerojatnost zapaljenja.

1.3.3. Faza 3. Ispitivana tvar složi se u hrpicu otprilike 2 cm visoku i 3 cm u promjeru. Na hrpicu se doda nekoliko kapi vode i bilježi se hoće li se razvijeni plin zapaliti ili ne.

1.3.4. Faza 4. Ispitivana tvar miješa se s destiliranom vodom na 20 °C, brzina razvijanja plina mjeri se u razdoblju od sedam sati, u polusatnim intervalima. Ako se plin razvija nepravilnom brzinom, ili brzinom koja se povećava, trajanje mjerenja nakon sedam sati treba produžiti na maksimalno pet dana. Ako brzina u bilo koje vrijeme premaši 1 litru/kg na sat, ispitivanje treba zaustaviti.

1.4. REFERENTNE TVARI Nije navedeno.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nije navedeno.

1.6. OPIS METODA

1.6.

1.6.1. Faza 1.

1.6.1.

1.6.1.1. Ispitni uvjeti Ispitivanje se provodi na sobnoj temperaturi (oko 20 °C).

1.6.1.2. Provođenje ispitivanja Malu količinu (približno 2 mm u promjeru) ispitivane tvari treba staviti u korito koje sadrži destiliranu vodu. Treba zabilježiti i. razvija li se plin i ii. dolazi li do zapaljenja. Ako dođe do zapaljenja plina, daljnje ispitivanje tvari nije potrebno jer se tvar smatra opasnom.

1.6.2. Faza 2.

1.6.2.

1.6.2.1. Uređaj Filtar papir pluta na površini destilirane vode u bilo kojoj prikladnoj posudi, npr. posudi za isparavanje promjera 100 mm.

1.6.2.2. Ispitni uvjeti Ispitivanje se provodi na sobnoj temperaturi (oko 20 °C).

1.6.2.3. Provođenje ispitivanja Mala količina ispitivane tvari (približno 2 mm u promjeru) stavi se na sredinu filtar papira. Treba zabilježiti i. razvija li se plin i ii. dolazi li do zapaljenja. Ako dođe do zapaljenja plina, daljnje ispitivanje tvari nije potrebno jer se tvar smatra opasnom.

1.6.3. Faza 3.

1.6.3.

1.6.3.1. Ispitni uvjeti Ispitivanje se provodi na sobnoj temperaturi (oko 20 °C).

1.6.3.2. Provođenje ispitivanja Ispitivana tvar složi se u hrpicu približno 2 cm visoku i 3 cm u promjeru s udubljenjem na vrhu. U udubljenje se doda nekoliko kapi vode i bilježi se i. razvija li se plin i ii. dolazi li do zapaljenja. Ako dođe do zapaljenja plina, daljnje ispitivanje tvari nije potrebno jer se tvar smatra opasnom.

1.6.4. Faza 4.

1.6.4.

1.6.4.1. Uređaj Uređaj se postavlja kako prikazuje slika.

1.6.4.2. Ispitni uvjeti Pregledati ima li u spremniku za ispitivanu tvar praha < 500 μm (veličina čestice). Ako prah čini više od 1 % (m/m) ukupne količine, ili ako se uzorak mrvi, tada prije ispitivanja cijelu količinu tvari treba samljeti u prah kako bi se uzelo u obzir smanjenje veličine čestica tijekom skladištenja i rukovanja; u protivnom tvar treba ispitati kako je primljena. Ispitivanje treba provesti na sobnoj temperaturi (oko 20 °C) i pod atmosferskim tlakom.

1.6.4.3. Provođenje ispitivanja 10 do 20 ml vode stavi se u lijevak za dokapavanje u uređaju, a 10 g tvari u konusnu tikvicu. Volumen plina koji se razvija može se mjeriti svim prikladnim sredstvima. Slavina lijevka otvori se kako bi voda ušla u konusnu tikvicu i započinje mjerenje vremena štopericom. Nastajanje plina mjeri se svakog sata tijekom sedmosatnog razdoblja. Ako je u tom razdoblju nastajanje plina nepravilno ili ako se brzina nastajanja plina povećava, mjerenja treba nastaviti do najviše pet dana. Ako, u bilo koje vrijeme mjerenja, brzina nastajanja plina prijeđe 1 litru/kg po satu, pokus treba prekinuti. Ovaj se pokus izvodi tri puta. Ako kemijski identitet plina nije poznat, plin treba analizirati. Ako plin sadrži lako zapaljive komponente, a nije poznato je li cijela mješavina lako zapaljiva, treba pripraviti mješavinu istog sastava i ispitati je ispitnom metodom A.11.

2. PODACI Smatra se da je tvar opasna ako:

u bilo kojoj fazi ispitnog postupka dođe do spontanog zapaljenja, ili

do nastajanja zapaljivog plina dođe brzinom većom od 1 litre/kg tvari na sat.

3. IZVJEŠĆIVANJE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće),

podatke o eventualnoj početnoj pripremi ispitivane tvari,

rezultati pokusa (faze 1., 2., 3. i 4.),

kemijski sastav nastalog plina,

brzina nastajanja plina ako se provodi faza 4. (1.6.4.),

svi dodatni podaci relevantni za tumačenje rezultata.

4.(1)(2) REFERENCE Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (September 85) Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

A.13. PIROFORNA SVOJSTVA KRUTINA I TEKUĆINA

A.13.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Ovaj ispitni postupak primjenljiv je na krute i tekuće tvari koje će se u malim količinama spontano zapaliti ubrzo nakon dodira sa zrakom na sobnoj temperaturi (oko 20 °C). Tvari koje prije nego se zapale trebaju biti izložene zraku satima ili danima na sobnoj temperaturi ili na povišenim temperaturama nisu obuhvaćene ovom ispitnom metodom.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Smatra se da tvari imaju piroforna svojstva ako su zapaljive ili uzrokuju pougljenjivanje u uvjetima opisanim u 1.6. Možda treba ispitati i samozapaljivost tekućina primjenom metode A.15. Temperatura samozapaljenja (tekućine i plinovi).

1.3. REFERENTNE TVARI Nije navedeno.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Tvar, bilo krutina ili tekućina, dodaje se inertnom nosaču i drži u dodiru sa zrakom na sobnoj temperaturi tijekom pet minuta. Tekuće tvari koje se ne zapale upiju se na filtar papir i pet minuta izlažu zraku na temperaturi okoline (oko 20 °C). Ako se krutina ili tekućina zapali, ili ako tekućina zapali ili pougljeni filtar papir, tvar se smatra pirofornom.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Ponovljivost: zbog sigurnosnih razloga, dovoljan je samo jedan rezultat da bi se tvar smatrala pirofornom.

1.6. OPIS METODE

1.6.

1.6.1. Uređaj Porculanska šalica od oko 10 cm u promjeru napuni se dijatomejskom zemljom do visine od oko 5 mm na sobnoj temperaturi (oko 20 °C). Napomena: Dijatomejska zemlja ili bilo koja druga usporediva inertna tvar koju je jednostavno nabaviti uzima se kao reprezentativni uzorak tla po kojem se u slučaju nezgode može izliti ispitivana tvar. Za ispitivanje tekućina koje nisu zapaljive u dodiru sa zrakom kada su u dodiru s inertnim nosačem potreban je suhi filtar papir.

1.6.2. Provođenje ispitivanja

1.6.2.

(a) Praškaste krutine 1 do 2 cm3 tvari koja se ispituje isipa se s visine od oko 1 m na nezapaljivu površinu, te se promatra hoće li se tvar zapaliti tijekom sipanja ili u roku od pet minuta nakon toga. Pokus se provodi šest puta ako prije ne dođe do zapaljenja;

(b) tekućine Oko 5 cm3 tekućine koja se ispituje ulije se u pripremljenu porculansku šalicu, te se promatra hoće li se tvar zapaliti u roku od pet minuta. Ako u šest pokusa ne dođe do zapaljenja, provode se sljedeći pokusi: Ispitni uzorak od 0,5 ml štrcaljkom se uvodi na pripremljeni filtar papir, te se promatra hoće li se filtar papir zapaliti ili pougljeniti u roku pet minuta nakon dodavanja tekućine. Pokus se provodi tri puta ako prije ne dođe do zapaljenja ili pougljenjivanja.

2. PODACI

2.

2.1. OBRADA PODATAKA Ispitivanje se može prekinuti čim se u bilo kojem pokusu dođe do pozitivnog rezultata.

2.2. PROCJENA Ako se tvar zapali u roku pet minuta nakon što je dodana inertnom nosaču i izložena zraku, ili tekuća tvar zapali ili pougljeni filtar papir u roku pet minuta nakon što je dodana i izložena zraku, smatra se pirofornom.

3. IZVJEŠĆIVANJE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće),

rezultati pokusa,

svi dodatni podaci relevantni za tumačenje rezultata.

4.(1)(2) REFERENCE NF T 20-039 (September 85) Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, NewYork.

A.14. EKSPLOZIVNA SVOJSTVA

A.14.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Pomoću ove metode može se odrediti predstavlja li kruta tvar ili tvar u obliku paste opasnost od eksplozije ako se izloži djelovanju plamena (termička osjetljivost), ili udarcu ili trenju (osjetljivost na mehaničke podražaje), te predstavlja li tekuća tvar opasnost ako se izloži djelovanju plamena ili udarca. Metoda obuhvaća tri elementa: Ovom se metodom dolazi do podataka na temelju kojih je moguće procijeniti vjerojatnost izazivanja eksplozije pomoću određenih općenitih podražaja. Metoda nije namijenjena za utvrđivanje može li tvar eksplodirati u bilo kojim uvjetima. Ova je metoda prikladna da se njome odredi hoće li tvar predstavljati opasnost od eksplozije (termička i mehanička osjetljivost) u uvjetima koji su posebno navedeni u Direktivi. Temelji se na velikom broju uređaja koji su u širokoj upotrebi u mnogim zemljama (1) i koji obično daju smislene rezultate. Priznato je da metoda nije definitivna. Osim navedenih uređaja, dozvoljena je upotreba i alternativnih uređaja pod uvjetom da su međunarodno priznati i da se rezultati mogu dovesti u korelaciju s rezultatima dobivenim navedenim uređajima. Ispitivanja ne treba provoditi ako se na temelju dostupnih termodinamičkih podataka (npr. toplina nastajanja, toplina raspadanja) i/ili nepostojanja određenih reaktivnih skupina (2) u strukturnoj formuli sa sigurnošću može utvrditi da s nastankom plinova ili oslobađanjem topline tvar nije sposobna za brzo razlaganje (npr. materijal ne predstavlja rizik od eksplozije). Ispitivanje mehaničke osjetljivosti s obzirom na trenje nije potrebno za tekućine.

1.1.

(a) ispitivanje termičke osjetljivosti (1);

(b) ispitivanje mehaničke osjetljivosti s obzirom na udarac (1);

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Eksplozivne tvari: Tvari koje mogu eksplodirati pod djelovanjem plamena ili koje su osjetljive na udarac ili trenje u navedenom uređaju (ili su mehanički osjetljivije od 1,3-dinitrobenzena u alternativnom uređaju).

1.3. REFERENTNE TVARI 1,3-dinitrobenzen, tehnički kristalizirani proizvod prosijan kroz sito 0,5 mm, za metode ispitivanja osjetljivosti na trenje i na udarac. Perhidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX, heksogen, ciklonit – CAS 121-82-4), rekristaliziran iz vodenog cikloheksanona, prosijan na mokro kroz sito od 250 μm i zadržan na situ od 150 μm te sušen na 103 ± 2 °C (u trajanju od četiri sata) za drugi niz ispitivanja osjetljivosti na trenje i na udarac.

1.4. NAČELO METODE Preliminarni pokusi potrebni su kako bi se uspostavili sigurni uvjeti za provođenje tri pokusa osjetljivosti.

1.4.

1.4.1. Pokusi sigurnosnog rukovanja (3) Iz sigurnosnih razloga, prije provođenja glavnog pokusa, vrlo mali uzorci (oko 10 mg) tvari izlažu se zagrijavanju bez zatvaranja u plinskom plamenu, udarcima u bilo kojem uređaju prikladnog oblika i trenju pomoću čekića i nakovnja ili kojeg drugog uređaja za trenje. Cilj je utvrditi je li tvar toliko osjetljiva i eksplozivna da propisana ispitivanja osjetljivosti, posebno termičke osjetljivosti, treba provesti uz posebne mjere opreza kako bi se spriječile ozljede.

1.4.2. Termička osjetljivost Metoda obuhvaća zagrijavanje tvari u čeličnoj cijevi koju zatvaraju ploče različitih promjera otvora, kako bi se odredilo ima li tvar tendenciju eksplodiranja pod uvjetima intenzivne topline i definiranog zatvaranja.

1.4.3. Mehanička osjetljivost (udarac) Metoda obuhvaća izlaganje tvari udarcu određene mase koja se baca s određene visine.

1.4.4. Mehanička osjetljivost (trenje) Metoda obuhvaća izlaganje krute tvari ili paste između uobičajenih površina pod određenim uvjetima opterećenja i relativnoga gibanja.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nije navedeno.

1.6. OPIS METODE

1.6.

1.6.1. Termička osjetljivost (djelovanje plamena)

1.6.1.

1.6.1.1. Uređaj Uređaj se sastoji od čelične cijevi za jednokratnu upotrebu s napravom za zatvaranje za višekratnu upotrebu (Slika 1.), koja je montirana u sigurnosnom uređaju za zagrijavanje. Sve su cijevi od vučenog čeličnog lima (vidjeti Dodatak), imaju unutarnji promjer 24 mm, duljinu 75 mm i debljinu stijenke 0,5 mm. Cijevi su spojene prirubnicama na otvorenom kraju kako bi ih se moglo zatvoriti sklopom mjerne prigušnice. Taj se sklop sastoji od mjerne prigušnice otporne na tlak s otvorom u sredini, učvršćene na cijev pomoću dvodijelnog navojnog spoja (matica i navojna obujmica). Vijak i navojna obujmica izrađeni su od krom-manganovog čelika (vidjeti Dodatak) koji do 800 °C ne iskri. Mjerne prigušnice su ploče debljine 6 mm izrađene od čelika otpornog na toplinu (vidjeti Dodatak), i dostupne su s različitim promjerima otvora.

1.6.1.2. Ispitni uvjeti Obično se tvar ispituje u obliku u kojem je primljena, ali u nekim slučajevima, npr. ako je prešana, lijevana ili na drugi način sažeta, tvar će prije pokusa možda trebati zdrobiti. Za krutine, masa materijala koji se koristi u svakom pokusu određuje se suhim postupkom u dvije faze. Tarirana cijev puni se s 9 cm3 tvari i sabije silom od 80 N kojom se djeluje na ukupni poprečni presjek cijevi. Iz sigurnosnih razloga ili ako bi se fizikalni oblik uzorka sabijanjem mogao promijeniti, mogu se primijeniti druge metode punjenja; npr. ako je tvar jako osjetljiva na trenje, sabijanje nije primjereno. Ako je materijal moguće sažeti, dodaje se još i sabija sve dok se cijev ne napuni do 55 mm od vrha. Odredi se ukupna masa koja se koristi za punjenje cijevi do razine 55 mm, i dodaju se dva dodatna prirasta te se svaki sabije silom od 80 N. Zatim se kod sabijanja, prema potrebi, materijal dodaje, odnosno izuzima kako bi se cijev napunila do razine od 15 mm od vrha. Provodi se drugi po redu suhi postupak, na način da se počne sa sabijenom količinom trećine ukupne mase utvrđene u prvom suhom postupku. Dodaju se još dva dodatna inkremeta uz sabijanje silom od 80 N, a razina u cijevi podešava se na 15 mm od vrha dodavanjem ili oduzimanjem materijala, prema potrebi. Količina krutine utvrđena u drugom suhom postupku koristi se za svaki pokus, s tim da se punjenje obavlja s tri jednake količine, pojedinačno sabijene na 9 cm3 primjenom za to odgovarajuće sile. (To se može lakše provesti pomoću razdjelnih prstenova). Cijev se puni tekućinama i gelovima do visine 60 mm s tim da kod gelova treba posebno paziti da se izbjegne stvaranje praznina. Navojna obujmica navuče se na cijev odozdo, umetne se odgovarajuća mjerna prigušnica i nakon što se stavi malo sredstva za podmazivanje na osnovu molibdenovog disulfida, zategne matica. Ključno je provjeriti da se čestice tvari nisu zaglavile između prirubnice i ploče, ili u navojima. Za zagrijavanje se koristi propan iz boce za industrijsku primjenu koja je opremljena regulatorom tlaka (od 60 do 70 mbara), te se plin preko mjerača jednakomjerno distribuira (što se vizualno opaža promatranjem plamena iz gorača) cjevovodom do četiri gorača. Gorači se nalaze oko ispitne komore kako prikazuje slika 1. Četiri gorača zajedno troše oko 3,2 litre propana u minuti. Mogu se upotrijebiti alternativna plinska goriva i grijači, ali brzina zagrijavanja mora biti kako je navedeno na slici 3. Kod svih uređaja neophodno je provoditi periodičke provjere pomoću cijevi napunjenih dibutil ftalatom kako je prikazano na slici 3.

1.6.1.3. Provođenje ispitivanja Svako se ispitivanje provodi dok cijev ne fragmentira odnosno cijev se zagrijava pet minuta. U pokusu koji rezultira pucanjem cijevi na tri ili više komada koji u nekim slučajevima mogu biti međusobno povezani uskim trakama metala kako je prikazano na slici 2., smatra se da je došlo do eksplozije. Kod pokusa koji rezultiraju pucanjem na manji broj komada ili bez ijednog komada, smatra se da nije bilo eksplozije. Prvo se provodi niz od tri testa s mjernom prigušnicom promjera 6,0 mm, pa ako se ne postigne eksplozija, provodi se drugi niz od tri testa s pločom prigušnice promjera 2,0 mm. Ako u bilo kojem od ta dva pokusa dođe do eksplozije, daljnji pokusi nisu potrebni.

1.6.1.4. Procjena Rezultat pokusa smatra se pozitivnim ako do eksplozije dođe u bilo kojem od gornjih nizova pokusa.

1.6.2. Mehanička osjetljivost (udarac)

1.6.2.

1.6.2.1. Uređaj (Slika 4.) Osnovni dijelovi tipičnog uređaja s padajućim maljem su blok od lijevanog čelika s postoljem, nakovanj, stupac, vodilice, utezi, uređaj za oslobađanje i držač uzorka. Čelični nakovanj 100 mm (promjer) × 70 mm (visina) vijkom je pričvršćen na čelični blok 230 mm (dužina) × 250 mm (širina) × 200 mm (visina) s lijevanim postoljem 450 mm (dužina) × 450 mm (širina) × 60 mm (visina). Stupac, izrađen od bešavne cijevi od vučenog čelika učvršćen je u držaču koji je vijkom pričvršćen na stražnji dio čeličnog bloka. Četiri vijka sidre uređaj na čvrsti betonski blok 60 × 60 × 60 cm na način da su vodilice postavljene potpuno okomito i da uteg pada slobodno. Koriste se utezi od 5 i 10 kg izrađeni od punog čelika. Udarna glava svakog utega izrađena je od otvrdnutog čelika, HRC 60 do 63, i ima minimalno 25 mm u promjeru. Uzorak koji se ispituje stavi se u uređaj za pokus udarcem, koji se sastoji od dva koaksijalna čvrsta čelična cilindra, jedan iznad drugog, u šupljoj cilindričnoj čeličnoj prstenastoj vodilici. Čvrsti čelični cilindri trebaju biti promjera 10 (– 0,003, – 0,005) mm i visine 10 mm i imati polirane površine, zaobljene rubove (radijus zakrivljenosti 0,5 mm) i tvrdoću od HRC 58 do 65. Šuplji cilindar mora imati vanjski promjer 16 mm, ispolirani provrt 10 (+ 0,005, + 0,010) mm i visinu 13 mm. Uređaj za ispitivanje osjetljivosti na udarac postavlja se na nakovanj (26 mm u promjeru i 26 mm visine) izrađen od čelika i centriran pomoću prstena s perforacijama za istjecanje para.

1.6.2.2. Ispitni uvjeti Volumen uzorka treba biti 40 mm3, ili volumen koji odgovara alternativnom uređaju. Krute tvari treba ispitati u suhom stanju i pripravljene kako slijedi: Tvari koje se obično isporučuju kao kreme treba ispitati u suhom stanju ako je to moguće ili svakako nakon što se odstrani što je moguće veća količina razrjeđivača. Tekuće tvari ispituju se s razmakom od 1 mm između gornjeg i donjeg čeličnog cilindra.

1.6.2.2.

(a) praškaste tvari se prosiju (veličina sita 0,5 mm); za ispitivanje se koristi sve što prolazi kroz sito;

(b) tvari koje su prešane, lijevane ili na drugačiji način sažete, lome se na komadiće i siju; za ispitivanje se koriste prosijani komadići od 0,5 do 1,0 mm u promjeru koji se smatraju reprezentativnim uzorkom izvorne tvari.

1.6.2.3. Provođenje ispitivanja Provodi se niz od šest pokusa bacanjem mase od 10 kg s visine od 0,40 m (40 J). Ako se tijekom tih šest pokusa postigne eksplozija, provodi se drugi niz od šest pokusa, na način da se baca masa od 5 kg s visine od 0,15 m (7,5 J). U drugom uređaju, uzorak se uspoređuje s izabranom referentnom tvari primjenom utvrđenog postupka (npr. tehnikom gore-dolje itd.).

1.6.2.4. Procjena Rezultat pokusa smatra se pozitivnim ako do eksplozije (pojava plamena i/ili praska ekvivalentna je eksploziji) dođe najmanje jednom u bilo kojem od pokusa kod navedenog uređaja za ispitivanje osjetljivosti na udarac ili ako je uzorak osjetljiviji od 1,3-dinitrobenzen ili RDX u alternativnom ispitivanju osjetljivosti na udarac.

1.6.3. Mehanička osjetljivost (trenje)

1.6.3.

1.6.3.1. Uređaj (Slika 5.) Uređaj za ispitivanje osjetljivosti na trenje sastoji se od temeljne ploče od lijevanog čelika na koju je postavljena naprava za trenje. Ona se sastoji od fiksnog porculanskog klina/štipaljke i pokretne porculanske ploče. Porculanska ploča nalazi se u klizaču koji se kreće unutar dvije vodilice. Klizač je spojen na elektromotor preko ojnice, ekscentra i odgovarajućeg zupčastog prijenosa na način da se porculanska ploča pomakne natrag i naprijed ispod porculanskog klina samo jednom na udaljenosti od 10 mm. Porculanski klin može se opteretiti silom od, primjerice, 120 ili 360 N. Ravne porculanske ploče izrađene su od bijelog tehničkog porculana (hrapavost 9 do 32 μm), veličine 25 mm (dužina) × 25 mm (širina) × 5 mm (visina). Cilindrični porculanski klin također je izrađen od bijelog tehničkog porculana, dugačak je 15 mm, ima promjer 10 mm i grube površine sfernih rubova promjera zaobljenosti 10 mm.

1.6.3.2. Ispitni uvjeti Volumen uzorka treba biti 10 mm3 ili volumen koji odgovara alternativnom uređaju. Krute tvari ispituju se u suhom stanju i pripravljene kako slijedi: Tvari koje se obično isporučuju kao paste treba ispitati u suhom stanju ako je to moguće. Ako tvar nije moguće pripraviti u suhom stanju, pasta (nakon što se odstrani što je moguće veća količina razrjeđivača) se ispituje kao 0,5 mm debeli, 2 mm širok, 10 mm dugačak film koji se pripravlja pomoću šablone.

1.6.3.2.

(a) praškaste tvari prosiju se (veličina sita 0,5 mm); za ispitivanje se koristi sve što prođe kroz sito;

(b) tvari koje su prešane, lijevane ili na drugačiji način sažete, lome se na komadiće i siju; za ispitivanje se koriste prosijani komadići < 0,5 mm u promjeru.

1.6.3.3. Provođenje ispitivanja Porculanski klin postavlja se na uzorak koji se ispituje, i optereti se. Kod provođenja pokusa, oznake nanesene spužvom na porculansku ploču moraju ležati transverzalno u odnosu na smjer kretanja. Treba paziti da se klin nalazi na uzorku, da ispod klina ima dovoljno materijala koji se ispituje kao i da se ploča ispod klina pomiče propisno. Paste se nanašaju na ploču pomoću 0,5 mm debele šablone s urezom veličine 2 × 10 mm. Porculanska ploča mora se pomaknuti 10 mm naprijed i natrag ispod porculanskog klina u vremenu od 0,44 sekunde. Svaki dio površine ploče i klina smije se koristiti samo jednom; dva kraja svakog klina služe za dva pokusa, a svaka od dvije površine ploče služi za tri pokusa. Niz od šest pokusa provodi se pod opterećenjem od 360 N. Ako tijekom tih šest pokusa dođe do pozitivnog događaja, provodi se još jedan niz od šest pokusa s opterećenjem od 120 N. U drugom uređaju, uzorak se uspoređuje s odabranom referentnom tvari primjenom utvrđenog postupka (npr. tehnika gore-dolje itd.).

1.6.3.4. Procjena Rezultat pokusa smatra se pozitivnim ako do eksplozije (pucketanje i/ili prasak ili pojava plamena ekvivalentni su eksploziji) dođe najmanje jednom u bilo kojem pokusu kod navedenog uređaja za ispitivanje trenja ili ako su zadovoljeni ekvivalentni kriteriji u alternativnom ispitivanju osjetljivosti na trenje.

2. PODACI U načelu smatra se da tvar predstavlja opasnost od eksplozije u smislu Direktive ako je ispitivanje termičke osjetljivosti, osjetljivosti na udarac ili trenje dalo pozitivan rezultat.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE OISPITIVANJU U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

identitet, sastav, čistoća, sadržaj vlage itd. ispitivane tvari,

fizikalni oblik uzorka i je li uzorak bio drobljen, lomljen i/ili prosijavan ili ne,

zapažanja tijekom ispitivanja termičke osjetljivosti (npr. masa uzorka, broj komadića itd.),

zapažanja tijekom ispitivanja mehaničke osjetljivosti (npr. nastajanje znatnih količina dima ili potpuna razgradnja bez praska, plamena, iskri, praska, pucketanja itd.),

rezultate svakog tipa ispitivanja,

ako je korišten alternativni uređaj, treba pružiti znanstveno opravdanje za to kao i dokaz o korelaciji između rezultata dobivenih navedenim uređajem i rezultata dobivenih ekvivalentnim uređajem,

sve korisne napomene kao što su upute na pokuse sa sličnim proizvodima koje bi mogle biti relevantne za pravilno tumačenje rezultata,

sve dodatne napomene relevantne za tumačenje rezultata.

3.2. TUMAČENJE I PROCJENA REZULTATA U izvješću o ispitivanju treba navesti sve rezultate koji se smatraju lažnim, neuobičajenim, ili nereprezentativnim. Ako bilo koji od rezultata ne bi trebalo uzeti u obzir, za to treba dati objašnjenje i navesti rezultate eventualnog alternativnog ili dodatnog ispitivanja. Ako se neuobičajeni rezultat ne može objasniti, mora se prihvatiti takav kakav jest i primijeniti za klasifikaciju tvari s tim u skladu.

4.(1)(2)(3)(4)

REFERENCE Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750 -60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol.3, 6-13 and 30-42. NF T 20-038 (September 85) Chemical products for industrial use — Determination of explosion risk.

A.15. TEMPERATURA SAMOZAPALJENJA (TEKUĆINE I PLINOVI)

A.15.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Eksplozivne tvari i tvari koje se spontano zapale u dodiru sa zrakom na sobnoj temperaturi ne treba podvrgavati ovom ispitivanju. Ispitni postupak primjenljiv je na plinove, tekućine i pare koje je u prisutnosti zraka moguće upaliti vrućom površinom. Temperatura samozapaljenja može se znatno smanjiti prisustvom katalitičkih nečistoća, površinskim materijalom ili većim volumenom ispitne posude.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Stupanj samozapaljenja izražava se temperaturom samozapaljenja. Temperatura samozapaljenja je najniža temperatura na kojoj će se ispitivana tvar zapaliti ako se pomiješa sa zrakom u uvjetima utvrđenim u ovoj ispitnoj metodi.

1.3. REFERENTNE TVARI Referentne tvari navedene su u normama (vidjeti 1.6.3.) One prvenstveno služe za povremenu provjeru primijenjene metode te radi usporedbe s rezultatima dobivenim drugim metodama.

1.4. NAČELO METODE Ovom se metodom određuje minimalna temperatura unutarnje površine kućišta koja će rezultirati zapaljenjem plina, pare ili tekućine ubrizgane u to kućište.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Ponovljivost varira u skladu s područjem temperatura samozapaljenja i primijenjene ispitne metode. Osjetljivost i specifičnost ovise o primijenjenoj ispitnoj metodi.

1.6. OPIS METODE

1.6.

1.6.1. Uređaj Uređaj je opisan u metodi koja se spominje u 1.6.3.

1.6.2. Ispitni uvjeti Uzorak ispitivane tvari ispituje se u skladu s metodom navedenom u 1.6.3.

1.6.3. Provođenje ispitivanja Vidjeti norme IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. PODACI Bilježi se temperatura ispitivanja, atmosferski tlak, količina uzorka koja se koristi i vremenski pomak do pojave zapaljenja.

3. IZVJEŠĆIVANJE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće podatke:

precizna specifikacija tvari (identitet i nečistoće),

količina uzorka koja se koristi, atmosferski tlak,

uređaj koji se koristi,

rezultati mjerenja (temperature ispitivanja, rezultati u vezi zapaljenja, odgovarajući vremenski razmaci),

svi dodatni podaci relevantni za tumačenje rezultata.

4. REFERENCE Nema ih.

A.16. RELATIVNA TEMPERATURA SAMOZAPALJENJA ZA KRUTINE

A.16.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Eksplozivne tvari i tvari koje se spontano zapale u dodiru sa zrakom na temperaturi okoline ne treba podvrgavati ovom ispitivanju. Ovo se ispitivanje provodi sa svrhom dobivanja preliminarnih podataka o samozapaljivosti krutih tvari na povišenim temperaturama. Ako se toplina koja se razvija bilo reakcijom tvari s kisikom ili egzotermičnim raspadanjem ne gubi dovoljno brzo u okolini, dolazi do samozagrijavanja koje vodi do samozapaljenja. Dakle, do samozapaljenja dolazi kad brzina kojom se toplina razvija premaši brzinu gubitka topline. Ovaj je ispitni postupak koristan kao preliminarni test probira za krute tvari. Radi složene naravi zapaljenja i izgaranja krutina, temperaturu samozapaljenja koja se odredi prema ovoj ispitnoj metodi treba koristiti samo u svrhe uspoređivanja.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Temperatura samozapaljenja koja se dobije ovom metodom minimalna je temperatura okoline izražena u °C na kojoj će se u određenim uvjetima zapaliti određeni volumen tvari.

1.3. REFERENTNA TVAR Nema je.

1.4. NAČELO METODE Izvjestan volumen tvari koja se ispituje stavi se u peć na temperaturu okoline; bilježi se krivulja temperature u funkciji vremena s obzirom na uvjete u središtu uzorka dok se temperatura peći povećava brzinom od 0,5 °C/min do 400 °C, ili do tališta ako je ono na nižoj temperaturi. U svrhu ovog ispitivanja, temperatura peći u kojoj temperatura uzorka koji se samozagrijava dostiže 400 °C naziva se temperaturom samozapaljenja.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.6. OPIS METODE

1.6.

1.6.1. Uređaj

1.6.1.

1.6.1.1. Peć Laboratorijska peć (zapremnine oko 2 litre) s ugrađenom regulacijom temperature, prirodnom cirkulacijom zraka i sustavom za rasterećenje. Kako bi se izbjegao eventualan rizik od eksplozije, plinovi koji nastaju razlaganjem ne smiju doći u dodir s električnim grijaćim elementima.

1.6.1.2. Kocka od žičane mrežice Komad mrežice otvora 0,045 mm izrađene od nehrđajuće čelične žice treba izrezati prema modelu u slici 1. Mrežicu treba složiti savijanjem i pričvrstiti žicom da se dobije kocka s otvorenim gornjim dijelom.

1.6.1.3. Termoparovi Odgovarajući termoparovi.

1.6.1.4. Zapisivač Bilo koji dvokanalni zapisivač kalibriran za temperaturu od 0 do 600 °C ili za odgovarajući napon.

1.6.2. Ispitni uvjeti Tvari se ispituju kako su primljene.

1.6.3. Provođenje ispitivanja U kocku se stavi tvar koja će se ispitivati, lagano se potapka i dodaje još tvari sve dok kocka nije potpuno puna. Kocka se tada objesi u središtu peći na sobnoj temperaturi. Jedan termopar se postavi u središte kocke, a drugi između kocke i stijenke peći na kojoj se mjeri temperatura peći. Temperature peći i uzorka mjere se cijelo vrijeme dok se temperatura peći povećava brzinom od 0,5 °C/min do 400 °C ili do tališta ako je ono na nižoj temperaturi. Kad tvar zapali uzorak, termopar će pokazati nagli porast temperature iznad temperature peći.

2. PODACI Za procjenu je relevantna temperatura peći na kojoj uzorak samozagrijavanjem dostiže temperaturu od 400 °C (vidjeti sliku 2.).

3. IZVJEŠĆIVANJE U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

opis tvari koja se ispituje,

rezultati mjerenja uključujući krivulju temperatura/vrijeme,

svi podaci relevantni za tumačenje rezultata.

4. REFERENCE NF T 20-036 (September 85) Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

4.

Slika 1. Model 20 milimetarske ispitne kocke

Slika 2. Tipična krivulja temperatura/vrijeme

temperatura uzorka temperatura peći temperatura zapaljenja Vrijeme

A.17. SVOJSTVA OKSIDACIJE (KRUTINE)

A.17.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Prije provođenja ovog ispitivanja korisno je raspolagati preliminarnim informacijama o eventualno eksplozivnim svojstvima tvari. Ovo ispitivanje nije primjenljivo na tekućine, plinove, eksplozivne ili lako zapaljive tvari, ili perokside. Ovo ispitivanje ne treba provoditi ako je provjerom strukturne formule sa sigurnošću utvrđeno da tvar nije u stanju egzotermički reagirati sa zapaljivim materijalom. Kako bi se utvrdilo treba li ispitivanje provesti uz posebne mjere opreza, provodi se preliminarni pokus.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Vrijeme gorenja: vrijeme reakcije, u sekundama, uzeto iz zone reakcije potrebno za prolaz kroz hrpicu materijala, prema postupku opisanom u 1.6. Brzina gorenja: izražena u milimetrima po sekundi. Maksimalna brzina gorenja: najveća vrijednost brzine gorenja dobivena s mješavinama koje sadrže 10 do 90 % težinskog udjela oksidansa.

1.3. REFERENTNA TVAR Barijev nitrat (analitičke kvalitete) koristi se kao referentna tvar za ispitivanje i za preliminarni test. Referentna mješavina je mješavina barijevog nitrata s celulozom u prahu, pripravljena u skladu s 1.6., koja ima maksimalnu brzinu gorenja (obično mješavina koja sadrži 60 % težinskog udjela barijevog nitrata).

1.4. NAČELO METODE Preliminarni test provodi se radi sigurnosti. Ako je preliminarnim testom jasno pokazano da ispitivana tvar ima svojstva oksidacije, daljnja ispitivanja nisu potrebna. Ako to nije slučaj, tvar zatim treba u potpunosti ispitati. Kod punog ispitivanja, tvar koja se ispituje miješa se u raznim omjerima s određenom zapaljivom tvari. Od svake se mješavine napravi hrpica koja se s jednog kraja zapali. Maksimalna brzina gorenja koja se odredi uspoređuje se s maksimalnom brzinom gorenja referentne mješavine.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Prema potrebi, svaka metoda mljevenja i miješanja je valjana pod uvjetom da se najveća brzina gorenja u šest odvojenih testova ne razlikuje od aritmetičke srednje vrijednosti za više od 10 %.

1.6. OPIS METODE

1.6.

1.6.1. Priprema

1.6.1.

1.6.1.1. Ispitivana tvar Smanjiti ispitni uzorak na veličinu čestica < 0,125 mm primjenjujući sljedeći postupak: prosijati ispitnu tvar, samljeti preostali dio, ponoviti postupak sve dok cijela količina ispitnog uzorka ne prođe kroz sito. Smije se koristiti bilo koja tehnika mljevenja i prosijavanja koja zadovoljava kriterije kvalitete. Prije pripreme mješavine, tvar se suši na 105 °C sve dok se ne postigne stalna težina. Ako je temperatura razlaganja tvari koja se ispituje ispod 105 °C, tvar treba sušiti na odgovarajućoj nižoj temperaturi.

1.6.1.2. Zapaljiva tvar Kao zapaljiva tvar koristi se celuloza u prahu. Celuloza mora biti one vrste koja se koristi za kromatografiju u tankom sloju ili kromatografiju u koloni. Za vrstu koja sadrži više od 85 % vlakana u dužinama između 0,020 i 0,075 mm dokazano je da je odgovarajuća. Celuloza u prahu propušta se kroz sito veličine mrežice 0,125 mm. Istu partiju celuloze treba koristiti cijelo vrijeme ispitivanja. Prije pripreme mješavine, celuloza u prahu suši se na 105 °C sve dok se ne postigne stalna težina. Ako se u preliminarnom testu koristi piljevina, treba je pripraviti od drveta četinjača skupljanjem dijela koji je prošao kroz sito mrežice 1,6 mm, dobro promiješati, te zatim sušiti na 105 °C tijekom četiri sata u sloju debljine do 25 mm. Ohladiti i do upotrebe, po mogućnosti unutar 24 sata od sušenja, skladištiti u hermetički zatvorenom spremniku koji se puni do mjere koliko je to praktično.

1.6.1.3. Izvor paljenja Kao izvor paljenja treba koristiti vrući plamen iz plinskoga gorača (minimalnog promjera 5 mm). Ako se koristi neki drugi izvor paljenja (npr. kod ispitivanja u inertnoj atmosferi), taj izvor u izvješću treba opisati i dati obrazloženje upotrebe takvog izvora.

1.6.2. Provođenje ispitivanja Napomena: Mješavine oksidansa s celulozom ili piljevinom smatraju se potencijalno eksplozivnim te njima treba oprezno rukovati.

1.6.2.

1.6.2.1. Preliminarni test Osušena tvar dobro se izmiješa s osušenom celulozom ili piljevinom u omjerima 2 težinska udjela ispitivane tvari u odnosu na 1 težinski dio celuloze ili piljevine, te se oblikuje u malu konusnu hrpicu dimenzija 3,5 cm (promjer osnovice) × 2,5 cm (visina) rahlim punjenjem šablone konusnog oblika (npr. laboratorijski stakleni lijevak sa začepljenim otvorom). Hrpica se postavi na hladnu, nezapaljivu, neporoznu podlogu slabe toplinske provodljivosti. Pokus treba provoditi u digestoru kako je opisano u 1.6.2.2. Izvor zapaljenja dovede se u dodir s konusnom hrpicom. Promatraju se i bilježe jačina i trajanje rezultirajuće reakcije. Ako je reakcija snažna, tvar treba smatrati oksidirajućom. U svakom slučaju u kojem postoji sumnja potrebno je provesti cijeli postupak ispitivanja kako se opisuje dalje u tekstu.

1.6.2.2. Potpuno ispitivanje Pripraviti mješavine oksidansa i celuloze s težinskim udjelima od 10 do 90 % oksidansa u 10 %-tnim prirastima. Kod graničnih slučajeva treba upotrijebiti gotove mješavine oksidansa i celuloze kako bi se maksimalna brzina gorenja dobila točnije. Hrpica se oblikuje pomoću kalupa. Kalup je izrađen od metala, duljine je 250 mm i trokutastog poprečnog presjeka unutarnje visine 10 mm i unutarnje širine 20 mm. S obje strane kalupa, u uzdužnom smjeru, postavljene su dvije metalne ploče kao bočni graničnici koji se protežu 2 mm preko gornjega ruba trokutastog poprečnog presjeka (slika). Taj se sklop bez sabijanja puni mješavinom u nešto prekomjernoj količini. Nakon što se kalup spusti s visine od 2 cm na krutu površinu, preostala prekomjerna količina tvari poravna se tupim limom. Bočni graničnici se skinu, a preostali se prah zagladi valjkom. Na vrh kalupa stavi se nezapaljiva, neporozna podloga slabe toplinske provodljivosti, uređaj se preokrene i kalup ukloni. Hrpicu treba postaviti u smjeru strujanja zraka u digestoru. Brzina zraka treba biti dostatna da spriječi istjecanje para u laboratorij i ne smije varirati tijekom testa. Strujanjem zraka oko uređaja mora se formirati zračna zavjesa. Uslijed higroskopičnosti celuloze i nekih tvari koje se ispituju, ispitivanje treba provesti što je moguće brže. Zapaliti jedan kraj hrpice na način da ga se dotakne plamenom. Mjeriti vrijeme reakcije u duljini od 200 mm nakon što se područje reakcije proširilo preko početne udaljenosti od 30 mm. Ispitivanje se provodi s referentnom tvari i najmanje jednom sa svakom mješavinom iz područja mješavina ispitivane tvari s celulozom. Ako se utvrdi da je maksimalna brzina gorenja znatno veća od brzine referentne mješavine, ispitivanje treba zaustaviti; u suprotnom, pokus treba ponavljati pet puta za svaku od tri mješavine koje daju najveću brzinu gorenja. Ako se sumnja da bi rezultat mogao biti lažno pozitivan, pokus treba ponoviti s tim da se umjesto celuloze upotrijebi inertna tvar slične dimenzije čestica, kao što je dijatomejska zemlja. Alternativno, celuloznu mješavinu ispitivane tvari koja ima najveću brzinu gorenja treba ponovno ispitati u inertnoj atmosferi (< 2 % v/v udjela sadržaja kisika).

2. PODACI Iz sigurnosnih razloga, karakterističnim oksidativnim svojstvom tvari koja se ispituje smatra se maksimalna brzina gorenja – a ne srednja vrijednost. Za procjenu relevantna je najviša vrijednost brzine gorenja određene mješavine u nizu u šest pokusa. Iscrtati krivulju najviše vrijednosti brzine gorenja za svaku mješavinu u odnosu na koncentraciju oksidansa. S krivulje očitati maksimalnu brzinu gorenja. Šest izmjerenih vrijednosti u jednom nizu dobivenih od mješavine kod maksimalne brzine gorenja ne smiju se razlikovati od aritmetičke srednje vrijednosti za više od 10 %; u protivnom, treba primijeniti bolje metode mljevenja i miješanja. Usporediti maksimalnu brzinu gorenja koja je postignuta s maksimalnom brzinom gorenja referentne mješavine (vidjeti 1.3.). Ako se ispitivanja provode u inertnoj atmosferi, maksimalna brzina reakcije uspoređuje se s maksimalnom brzinom reakcije referentne mješavine u inertnoj atmosferi.

3. IZVJEŠĆE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

identitet, sastav, čistoća, sadržaj vlage itd. ispitivane tvari,

eventualna obrada ispitivanog uzorka (npr. mljevenje, sušenje),

izvor zapaljenja koji je upotrebljen u ispitivanju,

način reakcije (npr. gorenje uz bljesak na površini, gorenje kroz cijelu masu, sve informacije o zapaljivim proizvodima itd.),

sve dodatne napomene relevantne za tumačenje rezultata, uključujući opis jačine (plamen, iskre, dimne pare, polagano tinjanje itd.) i približno trajanje tijekom preliminarnog sigurnosnog testa/testa probira i za ispitivanu tvar i za referentnu tvar,

rezultati pokusa s inertnom tvari, ako su provedeni,

rezultati pokusa u inertnoj atmosferi, ako su provedeni.

3.2. TUMAČENJE REZULTATA. Tvar treba smatrati oksidirajućom tvari ako: Kako bi se izbjegao lažni pozitivni rezultat, kod tumačenja rezultata treba uzeti u obzir i rezultate ispitivanja tvari pomiješane s inertnim materijalom i/ili ispitivanja u inertnoj atmosferi.

3.2.

(a) u preliminarnom pokusu dođe do snažne reakcije;

(b) je u punom ispitivanju maksimalna brzina gorenja mješavina veća ili jednaka maksimalnoj brzini gorenja referentne mješavine celuloze i barijevog nitrata.

4. REFERENCE NF T 20-035 (September 85) Chemical products for industrial use. Determination of the oxidising properties of solids.

A.18. OPĆI PROSJEK MOLEKULSKE TEŽINE I RASPODJELA MOLEKULSKE TEŽINE POLIMERA

A.18.

1. METODA Metoda kromatografije na permeabilnom gelu preslika je OECD-ove Smjernice za ispitivanje TG 118 (1996.). Temeljna načela i daljnje tehničke informacije navedene su u referenci (1).

1.

1.1. UVOD Kako su svojstva polimera vrlo raznolika, nemoguće je opisati jednu metodu kojom se precizno utvrđuju uvjeti separacije i procjene koji obuhvaćaju sve slučajnosti i posebnosti do kojih dolazi kod separacije polimera. Posebno, složeni sustavi polimera često nisu pogodni za kromatografiju na permeabilnom gelu (GPC). Kad kromatografija GPC nije u praksi provediva, molekulske mase moguće je određivati drugim metodama (vidjeti Dodatak). U takvim slučajevima treba potanko obrazložiti zašto se koristi baš određena metoda. Opisana metoda temelji se na normi DIN 55672 (1). Ta DIN norma sadrži iscrpne informacije o načinu na koji treba provoditi pokuse i procjenjivati podatke. Ako su izmjene uvjeta pokusa nužne, takve je promjene potrebno opravdati. Dozvoljeno je koristiti druge norme ako se za njih u potpunosti navedu reference. U opisanoj metodi, za kalibraciju se koriste uzorci polistirena poznate polidisperzivnosti, i možda će je za određene polimere, npr. polimere dugih razgranatih lanaca i topljive u vodi, biti potrebno prilagoditi.

1.2. DEFINICIJE I MJERNE JEDINICE Opći prosjek molekulske težine Mn i prosječna molekulska težina Mw određuju se sljedećim jednadžbama: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi gdje je: Hi razina detektorskog signala od osnovice za volumen retencije Vi Mi molekulska težina frakcije polimera kod volumena retencije Vi i n broj točaka s podacima Širina raspodjele molekulske težine, kojom se mjeri disperzivnost sustava, određena je omjerom Mw/Mn.

1.3. REFERENTNE TVARI Kako je kromatografija GPC relativna metoda, neophodno je provesti kalibraciju. Za to se obično koriste etaloni za usko raspodijeljene, linearno strukturirane polistirene poznatih prosječnih molekulskih težina Mn i Mw, te poznate raspodjele molekulske težine. Kalibracijska krivulja može se koristiti za određivanje molekulske težine nepoznatog uzorka samo ako su uvjeti za separaciju uzorka i etaloni odabrani na istovjetan način. Utvrđena veza između molekulske težine i volumena eluiranja vrijedi jedino pod konkretnim uvjetima svakog pojedinog pokusa. Ti uvjeti uključuju prije svega temperaturu, otapalo (ili mješavinu otapala), uvjete kromatografije i separacijsku kolonu ili sustav kolona. Na taj način određene molekulske težine uzorka relativne su vrijednosti i opisujemo ih kao ekvivalentne molekulske težine polistirena. To znači da u zavisnosti o strukturnim i kemijskim razlikama između uzorka i etalona, molekulska težina može više ili manje odstupati od apsolutnih vrijednosti. Ako se koriste drugi etaloni, npr. polietilen glikol, polietilen oksid, polimetil metakrilat, poliakrilna kiselina, razlog za to treba navesti.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE GPC kromatografijom moguće je odrediti kako raspodjelu molekulske težine uzorka tako i prosječne molekulske težine (Mn, Mw). GPC metoda je poseban tip tekućinske kromatografije kod kojeg se uzorak separira prema hidrodinamičkim volumenima pojedinih komponenata (2). Do separacije dolazi prolazom uzorka kroz kolonu koja je ispunjena propusnim materijalom, obično organskim gelom. Male molekule mogu penetrirati kroz pore dok se velike molekule isključuju. Dakle, put velikih molekula je kraći i one prve eluiraju. Molekule srednje veličine prolaze kroz neke od pora i eluiraju kasnije. Najmanje molekule, čiji je srednji hidrodinamički promjer manji od pora gela, mogu ući u sve pore. One eluiraju posljednje. U idealnom slučaju, separaciju u potpunosti regulira veličina molekulskih vrsta, ali u praksi je teško izbjeći međudjelovanje barem nekih učinaka apsorpcije. Nejednoliko punjenje kolone i mrtvi volumeni mogu pogoršati stanje (2). Detekcija se vrši, npr. refrakcijskim indeksom ili UV apsorpcijom, čime se dobije jednostavna krivulja raspodjele. Međutim, kako bi se krivulji dodale stvarne vrijednosti molekulskih težina, potrebno je kalibrirati kolonu prolaskom polimera poznate molekulske težine i, u idealnom slučaju, u širem smislu slične strukture, npr. raznih etalona polistirena. Tipični rezultati iz Gaussove krivulje ponekad iskrivljene manjim repom prema strani manje molekulske težine, kod koje okomita os pokazuje količinu, izraženu težinom, raznih molekulskih težina koje su eluirane, a vodoravna os logaritamsku molekulsku težinu.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Ponovljivost (relativno odstupanje etalona: RSD) volumena eluiranja treba biti bolja od 0,3 %. Propisana ponovljivost analize mora se osigurati korekcijom putem internog etalona ako se kromatogram procjenjuje u zavisnosti od vremena i ne odgovara gore navedenom kriteriju (1). Polidisperzivnosti ovise o molekulskim težinama etalona. Kod etalona polistirena tipične vrijednosti su: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp je molekulska težina etalona na tjemenu krivulje eluacije)

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6.

1.6.1. Priprema otopina polistirena za etalone Etaloni polistirena otapaju se opreznim miješanjem u odabranom eluentu. Kod pripreme otopina obvezno treba uzeti u obzir upute proizvođača. Koncentracije odabranih etalona ovise o raznim čimbenicima, npr. volumenu ubrizgavanja, viskozitetu otopine i osjetljivosti analitičkog detektora. Maksimalni volumen ubrizgavanja mora se prilagoditi duljini kolone, kako bi se spriječilo prekomjerno punjenje. Za analitičke separacije metodom GPC s kolonom dimenzija 30 cm × 7,8 mm, tipični volumeni ubrizgavanja su obično između 40 i 100 μl. Veći volumeni su mogući, ali ne bi trebali prijeći 250 μl. Optimalni omjer između volumena ubrizgavanja i koncentracije mora se utvrditi prije stvarne kalibracije kolone.

1.6.2. Priprema otopine uzorka U načelu, isti zahtjevi vrijede za pripremu otopina uzorka. Uzorak se otapa u odgovarajućem otapalu, npr. tetrahidrofuranu (THF), na način da se oprezno protrese. Ni u kom slučaju ne treba ga otapati pomoću ultrazvučne kupke. Po potrebi otopinu uzorka treba pročistiti preko membranskog filtra veličine pora između 0,2 i 2 μm. Prisutnost neotopljenih čestica mora se zabilježiti u konačnom izvješću jer se kod vrsta velike molekulske težine one mogu javiti kao posljedica. Težinski postotak otopljenih čestica određuje se primjenom odgovarajuće metode. Otopine treba upotrijebiti u roku od 24 sata.

1.6.3. Uređaj Mora se osigurati inertnost sustava za kromatografiju GPC s obzirom na otapala koja se koriste (što se postiže npr. uporabom čeličnih kapilara za otapalo THF).

spremnik za otapalo,

otplinjač (ako je potrebno),

crpka,

ublaživač trzaja (ako je potrebno),

sustav za ubrizgavanje,

kromatografske kolone,

detektor,

mjerač protoka (ako je potrebno),

uređaj za bilježenje i obradu podataka,

posuda za otpad.

1.6.4. Ubrizgavanje i sustav dobave otapala Utvrđeni volumen otopine uzorka puni se u kolonu bilo uređajem za automatsko uzimanje uzorka ili ručno u točno određeno područje. Prebrzo povlačenje ili otpuštanje klipa brizgaljke, ako se radi ručno, može uzrokovati promjene u raspodjeli molekulske težine koja se promatra. Sustav dobave otapala trebao bi, koliko je to moguće, raditi bez trzaja, što se u idealnim uvjetima osigurava ublaživačem trzaja. Brzina protoka je 1 ml/min.

1.6.5. Kolona U zavisnosti od uzorka, za karakterizaciju polimera koristi se ili jednostruka kolona ili nekoliko kolona povezanih u niz. Na tržištu postoji cijeli niz poroznih materijala za kolone, koji imaju određena svojstva (npr. veličinu pore, granice isključenja po veličini). Odabir separacijskoga gela ili duljine kolone ovisi kako o svojstvima uzorka (hidrodinamičkim volumenima, raspodjeli molekulske težine) tako i o konkretnim uvjetima separacije, kao što su otapalo, temperatura i brzina protoka (1)(2)(3).

1.6.6. Teoretski stupnjevi Kolona ili kombinacija kolona koja se koristi za separaciju mora biti karakterizirana brojem teoretskih stupnjeva. To obuhvaća, u slučaju kad se kao otapalo za eluaciju koristi THF, punjenje otopine etil benzena ili neke druge pogodne nepolarne topljive tvari na kolonu poznate duljine. Broj teoretskih stupnjeva određen je sljedećom jednadžbom: N=5,54VeW1/22 ili N=16VeW2 gdje je: N broj teoretskih stupnjeva Ve volumen eluiranja na tjemenu krivulje eluiranja W širina osnovice krivulje W1/2 širina krivulje na pola visine

1.6.7. Učinkovitost separacije Osim broja teoretskih stupnjeva, što je količina koja određuje širinu pojasa, važna je učinkovitost separacije, a nju određuje kosina kalibracijske krivulje. Učinkovitost separacije kolone dobiva se iz sljedećeg odnosa: Ve,Mx–Ve,(10Mx)poprečni presjek kolone ≥ 6,0 cm3cm2 gdje je: Ve,Mx volumen eluiranja za polistiren molekulske težine Mx Ve,(10.Mx) volumen eluiranja za polistiren 10 puta veće molekulske težine Rezolucija sustava obično se definira kako slijedi: R1,2 = 2 × Ve1 – Ve2W1 + W2 × 1log10M2/M1 gdje je: Ve1, Ve2 volumeni eluiranja dva etalona polistirena na tjemenu krivulje eluiranja W1, W2 širine osnovice krivulje M1, M2 molekulske težine na tjemenu krivulje (trebale bi se razlikovati faktorom 10) R-vrijednost sustava kolona treba biti veća od 1,7 (4).

1.6.8. Otapala Sva otapala moraju biti velike čistoće (za THF, uzima se čistoća od 99,5 %). Spremnik za otapalo (ako je potreban u atmosferi inertnog plina) mora biti dovoljno velik za kalibraciju kolona i nekoliko analiza uzorka. Prije nego se crpkom prenosi do kolone, otapalo se mora otpliniti.

1.6.9. Regulacija temperature Temperatura kritičnih unutarnjih komponenata (petlje ubrizgavanja, kolona, detektora i cjevovoda) mora biti stalna i u skladu s izborom otapala.

1.6.10. Detektor Svrha detektora količinski je bilježiti koncentraciju uzorka eluiranog iz kolone. Kako bi se izbjeglo nepotrebno širenje krivulje, volumen kivete ćelije detektora mora se držati što je moguće manjim. Ne bi trebao biti veći od 10 μl, osim za detektore koji rade po metodama rasapa svjetlosti i viskozimetrije. Za detekciju se obično koristi diferencijalna refraktometrija. Međutim, ako je to potrebno zbog posebnih svojstava uzorka ili otapala za eluaciju, moguće je koristiti i druge tipove detektora, npr. UV/VIS, IR, viskozimetriju itd.

2. PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

2.

2.1. PODACI Za pojedinosti u vezi s kriterijima procjene kao i za zahtjeve koji se odnose na prikupljanje i obradu podataka treba konzultirati normu DIN (1). Za svaki je uzorak nužno provesti dva neovisna pokusa. Njih treba analizirati odvojeno. Za svako mjerenje treba imati vrijednosti Mn, Mw, Mw/Mn i Mp. Potrebno je izričito navesti da su izmjerene vrijednosti relativne vrijednosti ekvivalentne molekulskim težinama etalona koji je upotrijebljen. Nakon određivanja volumena retencije ili vremena retencije (koje je moguće korigirati upotrebom internog etalona), logaritamske se vrijednosti Mp (s tim da Mp predstavlja najviše točke krivulje kalibracijskog etalona) ucrtavaju u odnosu na jednu od tih količina. Najmanje dvije kalibracijske točke nužne su po dekadi molekulske težine, a najmanje pet mjernih točaka potrebno je za ukupnu krivulju, koja bi trebala obuhvatiti procijenjenu molekulsku težinu uzorka. Krajnja točka kalibracijske krivulje za malu molekulsku težinu definira se n-heksil benzenom ili drugom pogodnom nepolarnom topljivom tvari. Vrijednosti molekulskih težina Mn i Mw obično se utvrđuju elektronskom obradom podataka, koja se temelji na formulama iz odjeljka 1.2. Ako se koristi ručna obrada, upute se mogu naći u normi ASTM D 3536-91 (3). Krivulja raspodjele mora biti u obliku tablice ili kao slika (diferencijalna frekvencija ili zbroj postotaka u odnosu na logaritamsku vrijednost M). U grafičkom prikazu, jedna dekada molekulske težine obično treba biti oko 4 cm u širinu, a najviša točka krivulje oko 8 cm u visinu. Kod integralnih krivulja raspodjele, razlika na ordinati između 0 i 100 % treba biti oko 10 cm.

2.2. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljedeće podatke:

2.2.

2.2.1. Ispitna tvar:

dostupne informacije o ispitivanoj tvari (identitet, aditivi, nečistoće),

opis obrade uzorka, opažanja, problemi.

2.2.2. Instrumentacija:

spremnik za eluent, inertni plin, otplinjavanje eluenta, sastav eluenta, nečistoće,

crpka, ublaživač trzaja, sustav ubrizgavanja,

kolone za separaciju (proizvođač, sve informacije o karakteristikama kolona, kao što su veličina pora, vrsta materijala za separaciju itd., broj, duljina i red kolona koje se koriste),

broj teoretskih stupnjeva kolone (ili kombinacije), učinkovitost separacije (rezolucija sustava),

informacije o simetriji tjemena krivulja,

temperatura kolone, vrsta regulacije temperature,

detektor (mjerno načelo, tip, volumen kivete),

mjerač protoka, ako se koristi (proizvođač, mjerno načelo),

sustav za bilježenje i obradu podataka (uređaji i računalni programi).

2.2.3. Kalibracija sustava:

iscrpan opis metode koja se koristi za konstruiranje kalibracijske krivulje,

informacije o kriterijima kvalitete za ovu metodu (npr. koeficijent korelacije, zbroj kvadrata odstupanja itd.),

informacije o svim ekstrapolacijama, pretpostavkama i približavanjima učinjenim tijekom postupka pokusa, kao i o procjeni i obradi podataka,

sva mjerenja poduzeta radi konstruiranja kalibracijske krivulje moraju biti dokumentirana u tablici koja obuhvaća sljedeće informacije o svakoj točki kalibracije:

naziv uzorka,

proizvođač uzorka,

karakteristične vrijednosti etalona Mp, Mn, Mw i Mw/Mn koje je dao proizvođač ili koje proizlaze iz naknadnih mjerenja, zajedno s pojedinostima o metodi određivanja,

volumen ubrizgavanja i koncentracija ubrizgavanja,

vrijednost Mp koja je upotrijebljena za kalibraciju,

volumen eluiranja ili korigirano vrijeme retencije mjereno na tjemenu krivulje eluiranja,

vrijednost Mp izračunana na tjemenu krivulje,

postotak greške izračunane vrijednosti Mp i kalibracijska vrijednost.

2.2.4. Procjena:

procjena na osnovi vremena: sve metode kojima se osigurava propisana mjerna obnovljivost (metoda korekcije, interni etalon itd.),

informacija o tome je li procjena izvršena na temelju volumena eluiranja ili vremena retencije,

informacije o ograničenjima procjene ako tjeme krivulje nije u potpunosti analizirano,

opis metoda poravnavanja (rezultata), ako su korištene,

priprema i postupci prethodne obrade uzorka,

eventualna prisutnost neotopljenih čestica,

volumen ubrizgavanja (μl) i koncentracija ubrizgavanja (mg/ml)

opažanja o učincima koji vode do odstupanja od idealnog profila GPC,

iscrpan opis svih izmjena postupaka ispitivanja,

pojedinosti o područjima greške,

sve ostale informacije i opažanja koja su bitna za tumačenje rezultata.

3.(1)(2)(3)(4)

REFERENCE DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992) Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.19. SADRŽAJ MALE MOLEKULSKE TEŽINE U POLIMERIMA

A.19.

1. METODA Metoda kromatografije na permeabilnom gelu preslika je Smjernice OECD-a za ispitivanje TG 119 (1996.) Temeljna načela i daljnje tehničke informacije navedeni su u referencama.

1.

1.1. UVOD Kako su svojstva polimera veoma raznolika, nemoguće je opisati jednu metodu kojom se precizno utvrđuju uvjeti separacije i procjene koji obuhvaćaju sve slučajnosti i posebnosti do kojih dolazi kod separacije polimera. Posebno, složeni sustavi polimera često nisu pogodni za kromatografiju na permeabilnom gelu (GPC). Kad metoda GPC nije u praksi provediva, molekulske mase moguće je određivati drugim metodama (vidjeti Dodatak). U takvim slučajevima treba potanko obrazložiti zašto se određena metoda koristi. Opisana metoda temelji se na normi DIN 55672 (1). Ta DIN norma sadrži iscrpne informacije o načinu na koji treba provoditi pokuse i procjenjivati podatke. Ako su izmjene uvjeta pokusa nužne, takve promjene treba opravdati. Dozvoljeno je koristiti druge norme ako se za njih u potpunosti navedu reference. U opisanoj metodi, za kalibraciju se koriste uzorci polistirena poznate polidisperzivnosti, i možda će je za određene polimere, npr. polimere dugih razgranatih lanaca i topljive u vodi, trebati prilagoditi.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Mala molekulska težina proizvoljno je definirana kao molekulska težina ispod 1000 daltona. Opći prosjek molekulske težine Mn i prosječna molekulska težina Mw određuju se sljedećim jednadžbama: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi gdje je: Hi razina detektorskog signala od osnovice za volumen retencije Vi Mi molekulska težina frakcije polimera kod volumena retencije Vi, a n je broj točaka s podacima Širina raspodjele molekulske težine, kojom se mjeri disperzivnost sustava, određena je omjerom Mw/Mn.

1.3. REFERENTNE TVARI Kako je kromatografija GPC relativna metoda, neophodno je provesti kalibraciju. Za to se obično koriste etaloni za usko raspodijeljene, linearno strukturirane polistirene poznatih prosječnih molekulskih težina Mn i Mw i poznate raspodjele molekulske težine. Kalibracijska krivulja može se koristiti za određivanje molekulske težine nepoznatog uzorka samo ako su uvjeti za separaciju uzorka i etaloni odabrani na istovjetan način. Utvrđena veza između molekulske težine i volumena eluiranja vrijedi jedino pod konkretnim uvjetima svakog pojedinog pokusa. Ti uvjeti uključuju prije svega temperaturu, otapalo (ili mješavinu otapala), uvjete kromatografije i separacijsku kolonu ili sustav kolona. Na taj način određene molekulske težine uzorka relativne su vrijednosti i opisujemo ih kao ekvivalentne molekulske težine polistirena. To znači da u ovisnosti o strukturnim i kemijskim razlikama između uzorka i etalona, molekulska težina može više ili manje odstupati od apsolutnih vrijednosti. Ako se koriste drugi etaloni, npr. polietilen glikol, polietilen oksid, polimetil metakrilat, poliakrilna kiselina, razlog za to treba navesti.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE GPC metodom moguće je odrediti kako raspodjelu molekulske težine uzorka tako i prosječne molekulske težine (Mn, Mw). GPC je poseban tip tekućinske kromatografije kod kojeg se uzorak separira prema hidrodinamičkim volumenima pojedinih komponenata (2). Do separacije dolazi prolazom uzorka kroz kolonu koja je ispunjena poroznim materijalom, obično organskim gelom. Male molekule mogu penetrirati kroz pore dok se velike molekule isključuju. Dakle, put velikih molekula je kraći i one prve eluiraju. Molekule srednje veličine prolaze kroz neke od pora i eluiraju kasnije. Najmanje molekule, čiji je srednji hidrodinamički promjer manji od pora gela, mogu ući u sve pore. One eluiraju posljednje. U idealnom slučaju, separaciju u potpunosti regulira veličina molekulskih vrsta, ali u praksi je teško izbjeći međudjelovanje barem nekih učinaka apsorpcije. Nejednoliko punjenje kolone i prazni volumeni mogu pogoršati stanje (2). Detekcija se vrši npr. refrakcijskim indeksom ili UV apsorpcijom, čime se dobije jednostavna krivulja raspodjele. Međutim, kako bi se krivulji dodale stvarne vrijednosti molekulskih težina, potrebno je kalibrirati kolonu prolaskom polimera poznate molekulske težine, i u idealnom slučaju, u širem smislu slične strukture, npr. raznih etalona polistirena. Tipični rezultati iz Gaussove krivulje, ponekad iskrivljene manjim repom prema strani manje molekulske težine, kod koje okomita os pokazuje količinu, izraženu težinom, raznih molekulskih težina koje su eluirane, a vodoravna os logaritamsku molekulsku težinu. Iz te krivulje izvodi se sadržaj male molekulske težine. Izračun može biti točan samo ako se vrste polimera malih molekulskih težina na isti način odnose prema jedinici mase, kao prema polimeru u cjelini.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Ponovljivost (relativno odstupanje etalona: RSD) volumena eluiranja treba biti bolja od 0,3 %. Propisana ponovljivost analize mora se osigurati korekcijom putem internog etalona ako se kromatogram procjenjuje u zavisnosti od vremena, i ne odgovara gore navedenom kriteriju (1). Polidisperzivnosti ovise o molekulskim težinama etalona. Kod etalona polistirena tipične vrijednosti su: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp je molekulska težina etalona na tjemenu krivulje eluiranja)

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6.

1.6.1. Priprema otopina polistirena za etalone Etaloni polistirena otapaju se opreznim miješanjem u odabranom eluentu. U pripremi otopina obvezno treba uzeti u obzir upute proizvođača. Koncentracije odabranih etalona ovise o raznim čimbenicima, npr. volumenu ubrizgavanja, viskoznosti otopine i osjetljivosti analitičkog detektora. Maksimalni volumen ubrizgavanja mora se prilagoditi duljini kolone, radi sprečavanja prekomjernog punjenja. Za analitičke separacije metodom GPC s kolonom dimenzija 30 cm × 7,8 mm, tipični volumeni ubrizgavanja su obično između 40 i 100 μl. Veći volumeni su mogući, ali ne bi trebali prijeći 250 μl. Optimalni omjer između volumena ubrizgavanja i koncentracije mora se utvrditi prije stvarne kalibracije kolone.

1.6.2. Priprema otopine uzorka U načelu, isti zahtjevi vrijede za pripremu otopina uzorka. Uzorak se otapa u odgovarajućem otapalu, npr. tetrahidrofuranu (THF), na način da se oprezno protrese. Ni u kom slučaju ne treba ga otapati pomoću ultrazvučne kupke. Po potrebi, otopinu uzorka treba pročistiti preko membranskog filtra veličine pora između 0,2 i 2 μm. Prisutnost neotopljenih čestica mora se zabilježiti u konačnom izvješću jer one mogu biti posljedica vrsta velike molekulske težine. Težinski postotak neotopljenih čestica određuje se primjenom odgovarajuće metode. Otopine treba upotrijebiti u roku od 24 sata.

1.6.3. Korekcija radi sadržaja nečistoća i aditiva Korekcija sadržaja vrsta koje imaju M < 1000 za prinos iz prisutnih konkretnih nepolimernih komponenata (npr. nečistoća i/ili aditiva) obično je potrebna, ako izmjereni sadržaj već nije < 1 %. To se postiže neposrednom analizom otopine polimera ili eluata koji se koristi u metodi GPC. Ako je eluat nakon prolaza kroz kolonu prerazrijeđen za daljnju analizu, potrebno ga je koncentrirati. Možda će eluat trebati prvo u potpunosti ispariti, a zatim ga ponovno otopiti. Koncentriranje eluata mora se vršiti pod uvjetima koji osiguravaju da na eluatu neće doći ni do kakvih promjena. Postupak s eluatom nakon uporabe u GPC-u ovisi o analitičkoj metodi koja je primijenjena za količinsko određivanje.

1.6.4. Uređaj Uređaj GPC obuhvaća sljedeće komponente: Mora se osigurati inertnost sustava za kromatografiju GPC s obzirom na otapala koja se koriste (što se postiže npr. uporabom čeličnih kapilara za otapalo THF).

spremnik za otapalo,

otplinjač (ako je potrebno),

crpku,

ublaživač trzaja (ako je potrebno)

sustav za ubrizgavanje,

kromatografske kolone,

detektor,

mjerač protoka (ako je potrebno),

uređaj za bilježenje i obradu podataka – procesor,

posudu za otpad.

1.6.5. Ubrizgavanje i sustav dobave otapala Utvrđeni volumen otopine uzorka puni se u kolonu bilo uređajem za automatsko uzimanje uzorka ili ručno u točno određeno područje. Prebrzo povlačenje ili otpuštanje klipa brizgaljke, ako se radi ručno, može uzrokovati promjene u raspodjeli molekulske težine koja se promatra. Sustav dobave otapala trebao bi, koliko je to moguće, raditi bez trzaja, što se u idealnim uvjetima osigurava ublaživačem trzaja. Brzina protoka je reda veličine 1 ml/min.

1.6.6. Kolona U zavisnosti od uzorka, za karakterizaciju polimera koristi se ili jednostruka kolona ili nekoliko kolona povezanih u niz. Na tržištu postoji cijeli niz poroznih materijala za kolone, koji imaju određena svojstva (npr. veličinu pore, granice isključenja po veličini). Odabir separacijskoga gela ili duljine kolone ovisi kako o svojstvima uzorka (hidrodinamičkim volumenima, raspodjeli molekulske težine) tako i o konkretnim uvjetima separacije, kao što su otapalo, temperatura i brzina protoka (1)(2)(3).

1.6.7. Teoretski stupnjevi Kolona ili kombinacija kolona koja se koristi za separaciju mora biti karakterizirana brojem teoretskih stupnjeva. To obuhvaća, u slučaju kad se kao otapalo za eluaciju koristi THF, punjenje otopine etil benzena ili neke druge pogodne nepolarne topljive tvari na kolonu poznate duljine. Broj teoretskih stupnjeva određen je sljedećom jednadžbom: N=5,54VeW1/22 ili N=16VeW2 gdje je: N broj teoretskih stupnjeva Ve volumen eluiranja na tjemenu krivulje eluiranja W širina osnovice krivulje W1/2 širina krivulje na pola visine

1.6.8. Učinkovitost separacije Osim broja teoretskih stupnjeva, što je količina koja određuje širinu pojasa, važna je učinkovitost separacije, a nju određuje kosina kalibracijske krivulje. Učinkovitost separacije kolone dobiva se iz sljedećeg odnosa: Ve,Mx–Ve,(10Mx)poprečni presjek kolone≥ 6,0cm3cm2 gdje je: Ve,Mx volumen eluiranja za polistiren molekulske težine Mx Ve,(10.Mx) volumen eluiranja za polistiren 10 puta veće molekulske težine Rezolucija sustava obično se definira kako slijedi: R1,2 = 2 × Ve1 – Ve2W1 + W2 × 1log10M2/M1 gdje je: Ve1, Ve2 volumeni dva etalona polistirena na tjemenu krivulje eluiranja W1, W2 širine osnovice krivulje M1, M2 molekulske težine na tjemenu krivulje (trebali bi se razlikovati faktorom 10) R-vrijednost sustava kolona treba biti veća od 1,7 (4).

1.6.9. Otapala Sva otapala moraju biti velike čistoće (za THF, uzima se čistoća od 99,5 %). Spremnik za otapalo (ako je potreban u atmosferi inertnog plina) mora biti dovoljno velik za kalibraciju kolona i nekoliko analiza uzorka. Prije nego se crpkom prenosi do kolone, otapalo se mora otpliniti.

1.6.10. Regulacija temperature Temperatura kritičnih unutarnjih komponenata (petlje ubrizgavanja, kolona, detektora i cjevovoda) mora biti stalna, i u skladu s izborom otapala.

1.6.11. Detektor Svrha detektora je količinski bilježiti koncentraciju uzorka eluiranog iz kolone. Kako bi se izbjeglo nepotrebno širenje krivulje, volumen kivete ćelije detektora mora se držati što je moguće manjim. Ne bi trebao biti veći od 10 μl, osim za detektore koji rade po metodama rasapa svjetlosti i viskozimetrije. Za detekciju se obično koristi diferencijalna refraktometrija. Međutim, ako je to potrebno zbog posebnih svojstava uzorka ili otapala za eluaciju, moguće je koristiti i druge tipove detektora, npr. UV/VIS, IR, viskozimetriju itd.

1. PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

1.

2.1. PODACI Za pojedinosti u vezi s kriterijima procjene kao i za zahtjeve koji se odnose na prikupljanje i obradu podataka treba konzultirati DIN normu (1). Za svaki je uzorak nužno provesti dva neovisna pokusa. Te pokuse treba analizirati odvojeno. Uvijek je bitno odrediti i podatke iz slijepih proba koje su napravljene pod istim uvjetima kao s uzorkom. Treba izričito navesti da su izmjerene vrijednosti relativne vrijednosti ekvivalentne molekulskim težinama etalona koji je upotrijebljen. Nakon određivanja volumena retencije ili vremena retencije (koje je moguće korigirati upotrebom internog etalona), logaritamske se vrijednosti Mp (s tim da Mp predstavlja najviše točke krivulje kalibracijskog etalona) ucrtavaju u odnosu na jednu od tih količina. Barem dvije kalibracijske točke nužne su po dekadi molekulske težine, a barem pet mjernih točaka potrebno je za ukupnu krivulju, koja bi trebala obuhvatiti procijenjenu molekulsku težinu uzorka. Krajnja točka kalibracijske krivulje za malu molekulsku težinu definira se n-heksil benzenom ili drugom pogodnom nepolarnom topljivom tvari. Dio krivulje koji odgovara molekulskim težinama ispod 1000 određuje se i po potrebi ispravlja za nečistoće i aditive. Krivulje eluacije obično se procjenjuju elektronskom obradom podataka. Ako se koristi ručna obrada, upute se mogu naći u normi ASTM D 3536-91 (3). Ako se na koloni zadržao koji netopljivi polimer, njegova molekulska težina vjerojatno je veća od težine topljive frakcije, i ako se ne uzme u obzir, sadržaj malih molekulskih težina će biti precijenjen. Smjernice za korekcije sadržaja male molekulske težine za netopljive polimere navedene su u Dodatku. Krivulja raspodjele mora biti u obliku tablice ili kao slika (diferencijalna frekvencija ili zbroj postotaka naprema logaritamskoj vrijednosti M). U grafičkom prikazu, jedna dekada molekulske težine treba obično biti oko 4 cm u širinu, a najviša točka krivulje oko 8 cm u visinu. Kod integralnih krivulja raspodjele, razlika na ordinati između 0 i 100 % treba biti oko 10 cm.

2.2. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljedeće informacije:

2.2.

2.2.1. Ispitivana tvar:

dostupne informacije o tvari koja se ispituje (identitet, aditivi, nečistoće),

opis obrade uzorka, opažanja, problemi.

2.2.2. Instrumentacija:

spremnik za eluent, inertni plin, otplinjavanje eluenta, sastav eluenta, nečistoće,

crpka, ublaživač trzaja, sustav ubrizgavanja,

kolone za separaciju (proizvođač, sve informacije o karakteristikama kolona, kao što su veličina pora, vrsta materijala za separaciju itd., broj, duljina i red kolona koje se koriste),

broj teoretskih stupnjeva kolone (ili kombinacije), učinkovitost separacije (rezolucija sustava),

informacije o simetriji krivulja eluiranja,

temperatura kolone, vrsta regulacije temperature,

detektor (mjerno načelo, tip, volumen kivete),

mjerač protoka, ako se koristi (proizvođač, mjerno načelo),

sustav za bilježenje i obradu podataka (uređaji i računalni programi).

2.2.3. Kalibracija sustava:

iscrpan opis metode koja se koristi za konstruiranje kalibracijske krivulje,

informacije o kriterijima kvalitete za ovu metodu (npr. koeficijent korelacije, zbroj kvadrata odstupanja itd.),

informacije o svim ekstrapolacijama, pretpostavkama i približavanjima učinjenim tijekom postupka pokusa, kao i o procjeni i obradi podataka,

sva mjerenja poduzeta radi konstruiranja kalibracijske krivulje moraju biti dokumentirana u tablici koja obuhvaća sljedeće informacije o svakoj točki kalibracije:

naziv uzorka,

proizvođač uzorka,

karakteristične vrijednosti etalona Mp, Mn, Mw, Mw/Mn, koje je dao proizvođač ili koje proizlaze iz naknadnih mjerenja, zajedno s pojedinostima o metodi određivanja,

volumen ubrizgavanja i koncentracija ubrizgavanja,

vrijednost Mp koja je upotrijebljena za kalibraciju,

volumen eluiranja ili korigirano vrijeme retencije mjereno na tjemenu krivulje,

vrijednost Mp izračunana na tjemenu krivulje,

postotak greške izračunane vrijednosti Mp i kalibracijska vrijednost.

2.2.4. Informacije o sadržaju male molekulske težine u polimerima:

opis metoda koje su primijenjene u analizi i način na koji su pokusi rađeni,

informacije o postotku sadržaja vrsta male molekulske težine,

informacije o nečistoćama, aditivima i ostalim nepolimerskim vrstama u težinskom postotku u odnosu na ukupan uzorak.

2.2.5. Procjena:

procjena na osnovi vremena; sve metode kojima se osigurava propisana mjerna obnovljivost (metoda korekcije, interni etalon itd.),

informacija o tome je li procjena izvršena na temelju volumena eluiranja ili vremena retencije,

informacije o ograničenjima procjene ako krivulja nije u potpunosti analizirana,

opis metoda poravnavanja (rezultata), ako su korištene,

priprema i postupci prethodne obrade uzorka,

eventualna prisutnost neotopljenih čestica,

volumen ubrizgavanja (μl) i koncentracija ubrizgavanja (mg/ml),

opažanja o učincima koji vode do odstupanja od idealnog profila GPC,

iscrpan opis svih izmjena u postupcima ispitivanja,

pojedinosti o područjima greške,

sve ostale informacije i opažanja koja su bitna za tumačenje rezultata.

3.(1)(2)(3)(4)

REFERENCE DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979) Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991) Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992) Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.20. PONAŠANJE POLIMERA U VODI - OTAPANJE/EKSTRAKCIJA

A.20.

1. METODA Opisana metoda preslika je Smjernice OECD-a za ispitivanje TG 120 (1997.). Daljnje tehničke informacije navedene su u referenci (1).

1.

1.1. UVOD Za određene polimere, kao što su emulzijski polimeri, prije primjene metode opisane dalje u tekstu možda će trebati izvršiti određene pripremne radnje. Metoda nije primjenljiva na tekuće polimere niti na polimere koji u ispitnim uvjetima reagiraju s vodom. Kad metoda nije praktična ili nije moguća, ponašanje kod otapanja/ekstrakcije moguće je istražiti drugim metodama. U takvim slučajevima, odabranu metodu treba iscrpno opisati i opravdati.

1.2. REFERENTNE TVARI Nema ih.

1.3. NAČELO ISPITNE METODE Ponašanje polimera kod otapanja/ekstrakcije u vodenom mediju utvrđuje se primjenom metode tikvice (vidjeti A.6. Topljivost u vodi, metoda tikvice) uz izmjene opisane u daljnjem tekstu.

1.4. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.5. OPIS ISPITNE METODE

1.5.

1.5.1. Oprema Za ovu metodu potrebna je sljedeća oprema:

uređaj za drobljenje, npr. mlin za dobivanje čestica poznate veličine,

uređaj za protresanje s mogućnošću regulacije temperature,

membranski sustav za filtriranje,

odgovarajuća analitička oprema,

standardizirana sita.

1.5.2. Priprema uzorka Reprezentativni uzorak prvo treba smanjiti na čestice veličine između 0,125 i 0,25 mm upotrebom odgovarajućih sita. Radi održavanja stabilnosti uzorka ili radi postupka mljevenja možda će biti potrebno hlađenje. Gumaste materijale moguće je smrviti na temperaturi tekućeg dušika (1). Ako nije moguće postići potrebnu veličinu čestica, treba poduzeti radnje da se čestice što je moguće više smanje, te o tome treba izraditi izvješće. U tom izvješću treba navesti na koji je način smrvljeni uzorak bio skladišten prije ispitivanja.

1.5.3. Postupak Tri uzorka po 10 g ispitne tvari odvagnu se u tri zasebne posude opremljene staklenim čepovima i u svaku se posudu doda 1000 ml vode. Ako se rukovanje količinom od 10 g polimera pokaže nepraktičnim, treba uzeti prvu sljedeću količinu kojom se može rukovati i njoj prilagođen volumen vode. Posude se čvrsto začepe i zatim tresu na 20 °C. Treba upotrijebiti uređaj za protresanje ili miješanje koji radi na stalnoj temperaturi. Nakon razdoblja od 24 sata, sadržaj svake posude se centrifugira ili filtrira, a koncentracija polimera u čistoj vodenoj fazi utvrđuje se odgovarajućom analitičkom metodom. Ako odgovarajuće analitičke metode za vodenu fazu nisu dostupne, ukupnu je topljivost/sposobnost ekstrakcije moguće procijeniti iz suhe težine taloga na filtru ili centrifugiranog precipitata. Obično je potrebno količinski razlikovati nečistoće i aditive s jedne strane i vrste male molekulske težine s druge strane. U slučaju određivanja gravimetrijom, isto tako je važno napraviti slijepu probu bez ispitne tvari radi uzimanja u obzir taloga koji nastaju u postupku pokusa. Ponašanje polimera kod otapanja/ekstrakcije u vodi na 37 °C kod pH 2 i pH 9 može se utvrditi na isti način kao što je opisano za provođenje pokusa na 20 °C. pH vrijednosti moguće je postići dodavanjem bilo odgovarajućih pufera ili odgovarajućih kiselina ili lužina, kao što su klorovodična kiselina, octena kiselina, natrij analitičke kvalitete, ili kalijev hidroksid, ili NH3. Ovisno o metodi analize koja se primjenjuje treba provesti jedno ili dva ispitivanja. Ako su dostupne dovoljno konkretne metode za izravnu analizu vodene faze za polimernu komponentu, dovoljno je jedno ispitivanje kao što je opisano u gornjem tekstu. Međutim, ako takve metode nisu dostupne pa se utvrđivanje ponašanja polimera kod otapanja/ekstrakcije ograničava na posredne analize utvrđivanjem samo ukupnog sadržaja organskog ugljika (TOC) vodenog ekstrakta, treba provesti i dodatno ispitivanje. To dodatno ispitivanje treba također provesti tri puta, uporabom 10 puta manjih uzoraka polimera i istih količina vode od onih koje su bile upotrijebljene u prvom ispitivanju.

1.5.4. Analiza

1.5.4.

1.5.4.1. Ispitivanje koje se provodi na uzorku jedne veličine Možda su dostupne metode za neposrednu analizu polimerne komponente u vodenoj fazi. Alternativno, moguće je razmotriti primjenu posredne analize otopljenih/izdvojenih polimernih komponenata utvrđivanjem ukupnog sadržaja topljivih dijelova i korekcijom za komponente koje nisu konkretno polimerne. Analiza vodene faze ukupnih polimerskih vrsta moguća je: nekom dovoljno osjetljivom metodom, npr. ili evaporacijom u vakuumu do isušivanja vodenog ekstrakta, i spektroskopijom (IR, UV itd.) ili AAS/ICP analizom taloga. Ako takva analiza vodene faze nije praktična, vodeni ekstrakt treba izdvojiti organskim otapalom koje se ne miješa s vodom, npr. kloriranim ugljikohidratom. Otapalo tada ishlapi, a talog se analizira s obzirom na prijavljeni sadržaj polimera, na način opisan u gornjem tekstu. Komponente koje se u tomu talogu utvrde kao nečistoće ili aditivi treba suptrahirati radi utvrđivanja stupnja otapanja/ekstrakcije samog polimera. Kad su prisutne relativno velike količine takvih materijala, talog će možda trebati podvrći analizi, npr. HPLC (visokodjelotvornoj tekućinskoj kromatografiji) ili GC (plinskoj kromatografiji), radi razlikovanja nečistoća od monomera i vrsta koje potječu od monomera, kako bi se mogao odrediti sadržaj ovih potonjih. U nekim slučajevima, obično ishlapljivanje organskog otapala do potpune suhoće i vaganje suhog taloga može biti dovoljno.

određivanjem ukupnog sadržaja organskog ugljika digestijom persulfata ili dikromata kojom nastaje CO2, nakon čega se vrši procjena metodom IR ili kemijskom analizom,

spektrometrijom atomske apsorpcije (AAS) ili njenim induktivno spregnutim plazma (ICP) emisijskim ekvivalentom za polimere koji sadrže silicij ili metale,

UV apsorpcijom ili spektrofluorometrijom za aril polimere,

LC-MS (tekućinskom kromatografijom - masenom spektrometrijom) za uzorke male molekulske težine,

1.5.4.2. Ispitivanje koje se provodi na dvije različite veličine uzorka Svi vodeni ekstrakati analiziraju se s obzirom na ukupni sadržaj organskog ugljika. Gravimetrijsko određivanje provodi se na neotopljenom/neizdvojenom dijelu uzorka. Ako, nakon centrifugiranja ili filtriranja sadržaja svake posude, talog polimera ostane na stjenkama posude, posudu treba ispirati filtratom sve dok se sav vidljiv talog ne ukloni. Nakon toga, filtrat se ponovno centrifugira ili filtrira. Talog koji preostaje na filtru ili na cijevi centrifuge suši se na 40 °C u vakuumu i važe. Sušenje se nastavlja dok se ne postigne stalna težina.

2. PODACI

2.

2.1. ISPITIVANJE PROVEDENO NA UZORKU JEDNE VELIČINE Pojedinačne rezultate za svaku od tri tikvice i prosječne vrijednosti treba izraziti u jedinicama mase po volumenu otopine (obično mg/l) ili mase po masi uzorka polimera (obično mg/g). Osim toga, treba navesti i gubitak težine uzorka (koji se izračunava kao težina topljive tvari podijeljena početnom težinom uzorka). Relativna odstupanja etalona (RSD) treba izračunati. Podatke treba dati odvojeno za ukupnu tvar (polimer + glavni aditivi itd.) i odvojeno samo za polimer (tj. nakon oduzimanja udjela aditiva).

2.2. ISPITIVANJE PROVEDENO NA DVIJE RAZLIČITE VELIČINE UZORKA Pojedinačne vrijednosti ukupnog sadržaja ugljika vodenih ekstrakata iz dvaju trostrukih pokusa i prosječnu vrijednost za svaki pokus treba izraziti u jedinicama mase po volumenu otopine (obično mgC/l), ali i u jedinicama mase po početnoj težini uzorka (obično mgC/g). Ako nema razlike između rezultata velikih i malih omjera uzorak/voda, to može ukazivati da su sve izdvojive komponente zaista izdvojene. U tom slučaju, izravna analiza obično nije potrebna. Pojedinačne težine taloga treba izraziti u postotku početnih težina uzoraka. Za svaki pokus treba izračunati prosječnu vrijednost. Razlike između 100 % i utvrđenog postotka predstavljaju topljiv i izdvojiv materijal u prvobitnom uzorku.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljedeće informacije:

3.1.

3.1.1. Ispitivana tvar:

dostupne informacije o tvari koja se ispituje (identitet, aditivi, nečistoće, sadržaj vrsta male molekulske težine).

3.1.2. Uvjeti pokusa:

opis primijenjenih postupaka i uvjeta pokusa,

opis analitičke metode i metode otkrivanja.

3.1.3. Rezultati:

rezultati topljivosti/sposobnosti ekstrakcije u mg/l; pojedinačne i srednje vrijednosti za ispitivanja ekstrakcije u raznim otopinama, razložene na sadržaj polimera i nečistoće, aditive itd.,

rezultati topljivosti/sposobnosti izdvajanja u mg/g polimera,

vrijednosti ukupnog sadržaja ugljika vodenih ekstrakata, težina topljive tvari i izračunani postoci, ako je mjereno,

pH vrijednost svakog uzorka,

informacije o vrijednostima dobivenim u slijepim probama,

po potrebi, upute na kemijsku nestabilnost tvari koja se ispituje, tijekom postupka ispitivanja i postupka analize,

sve informacije koje su važne za tumačenje rezultata.

4.(1) REFERENCE DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

A.21. SVOJSTVA OKSIDACIJE (TEKUĆINE)

A.21.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Ova je ispitna metoda namijenjena za određivanje sposobnosti tekuće tvari da poveća brzinu gorenja ili jačinu gorenja zapaljive tvari, ili da sa zapaljivom tvari formira mješavinu koja će se spontano zapaliti ako se te dvije tvari homogeno izmiješaju. Temelji se na UN-ovom testu za oksidirajuće tekućine (1) i ekvivalentna je tom pokusu. Međutim, budući da je metoda A.21. razvijena prvenstveno kako bi se udovoljilo zahtjevima Uredbe (EZ) br. 1907/2006, propisuje se usporedba sa samo jednom referentnom tvari. Ispitivanje i uspoređivanje s dodatnim referentnim tvarima može biti potrebno ako se očekuje da se rezultati ispitivanja koriste u druge svrhe. Ovaj test ne treba provoditi kad je ispitivanjem strukturne formule sa sigurnošću utvrđeno da tvar nije u stanju egzotermno reagirati sa zapaljivim materijalom. Prije provođenja ovog ispitivanja korisno je posjedovati preliminarne informacije o mogućim eksplozivnim svojstvima tvari. Ovo se ispitivanje ne primjenjuje na krutine, plinove, eksplozivne ili lako zapaljive tvari, ili organske perokside. Ovo ispitivanje nije nužno provoditi ako su za ispitivanu tvar već dostupni rezultati u okviru UN-ovog ispitivanja za oksidirajuće tekućine (1).

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE Srednje vrijeme porasta tlaka je prosječno izmjereno vrijeme u kojem mješavina koja se ispituje proizvede porast tlaka od 690 kPa do 2070 kPa iznad atmosferskog tlaka.

1.3. REFERENTNA TVAR Propisano je da referentna tvar bude 65 % (m/m) vodena nitritna kiselina (analitičke kvalitete). Postoji mogućnost da, ako ispitivač predvidi da bi se rezultati ovog ispitivanja mogli koristiti u druge svrhe 3, je prikladno ispitati i druge referentne tvari.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Tekućina koje se ispituje miješa se s vlaknastom celulozom u omjeru 1 prema 1 masenog udjela i uvodi u tlačnu posudu. Ako tijekom miješanja ili punjenja spontano dođe do zapaljenja, daljnje ispitivanje nije potrebno. Ako do spontanog zapaljenja ne dođe, provodi se puno ispitivanje. Mješavina se zagrijava u tlačnoj posudi te se određuje srednje vrijeme koje je potrebno da bi se tlak podigao s 690 kPa na 2070 kPa iznad atmosferskog. To se uspoređuje sa srednjim vremenom porasta temperature za mješavinu 1:1 jedne ili više referentnih tvari i celuloze.

1.5. KRITERIJI KVALITETE U nizu od pet pokusa s jednom tvari niti jedan rezultat ne bi se smio razlikovati od aritmetičke sredine za više od 30 %. Rezultate koji se od aritmetičke sredine razlikuju za više od 30 % treba odbaciti, poboljšati postupak miješanja i punjenja te ponoviti ispitivanje.

1.6. OPIS METODE

1.6.

1.6.1. Priprema

1.6.1.

1.6.1.1. Zapaljiva tvar Kao zapaljivi materijal koristi se sušena, vlaknasta celuloza duljine vlakana između 50 i 250 μm i srednjeg promjera vlakana 25 μm. Suši se na stalnu težinu u sloju debljine najviše 25 mm na 105 °C tijekom četiri sata i drži u eksikatoru, sa sredstvom za upijanje vlage, dok se ne ohladi i bude potrebna za upotrebu. Sadržaj vode sušene celuloze treba biti manji od 0,5 % suhe mase. Po potrebi, vrijeme sušenja treba produžiti kako bi se to postiglo. U cijelom ispitivanju treba koristiti istu partiju celuloze.

1.6.1.2. Uređaj

1.6.1.2.

1.6.1.2.1. Tlačna posuda Potrebna je tlačna posuda. To je cilindrična čelična tlačna posuda dugačka 89 mm, vanjskog promjera 60 mm (vidjeti sliku 1.). Na suprotnim stranama strojno su obrađene dvije ravnine (koje smanjuju poprečni presjek posude na 50 mm) kako bi se olakšalo držanje prilikom ugradnje mehanizma za paljenje i odzračnika. Posuda, koja ima provrt promjera 20 mm, s unutrašnje strane na oba kraja smanjena je na dubinu od 19 mm i urezan je navoj za cijev 1” prema Britanskom standardu za cijevi (BSP) ili drugoj ekvivalentnoj metričkoj normi. Ventil za oduzimanje tlaka, u obliku bočno postavljenog rukavca, vijkom je pričvršćen za zakrivljenu površinu tlačne posude 35 mm od jednog kraja i na 90° prema strojno obrađenim ravninama. Podloga za to probušena je do dubine od 12 mm i ima urezan navoj za cijev 1/2” prema BSP-u ili drugoj ekvivalentnoj metričkoj normi, u koji se pričvršćuje bočni rukavac. Po potrebi ugrađuje se brtva od inertnog materijala kako bi se osigurala plinonepropusnost. Bočni rukavac izlazi iz tijela tlačne posude u duljinu od 55 mm i ima provrt od 6 mm. Kraj rukavca je smanjen i ima navojni priključak za pretvarač tlaka s dijafragmom. Može se koristiti bilo koja vrsta mjerača tlaka pod uvjetom da na njega ne djeluju vrući plinovi ili proizvodi razlaganja i da je u stanju reagirati na brzine porasta tlaka od 690-2070 kPa u najviše 5 ms. Kraj tlačne posude koji je najdalje od bočnog rukavca zatvoren je mehanizmom za paljenje koji ima dvije elektrode, jednu izoliranu od tijela mehanizma, a drugu uzemljenu. Drugi kraj tlačne posude zatvoren je rasprskavajućom pločom (tlak raspsrkavanja približno 2200 kPa) učvršćen je vijkom s provrtom od 20 mm. Po potrebi, uz mehanizam za paljenje ugrađuje se brtva od inertnog materijala, čime se osigurava plinonepropusnost. Potporni stalak (Slika 2.) drži cijeli sklop u pravilnom položaju tijekom upotrebe. Stalak se obično sastoji od temeljne ploče od mekog čelika veličine 235 mm × 184 mm × 6 mm i šupljeg četvrtastog profila 70 mm × 70 mm × 4 mm, dugačkog 185 mm. S jednog kraja četvrtastog profila izrezane su po dužini dvije nasuprotne stranice, na način da se iznad dobije konstrukcija dijela netaknutog kućišta dužine 86 mm na dvije noge ravnih stranica. Krajevi tih ravnih stranica odrežu se pod kutom od 60° na horizontalnu ravninu i zavare na temeljnu ploču. Na jednoj strani gornjeg kraja podloge strojno se obradi utor 22 mm širine × 46 mm dubine kako bi se, kad se sklop tlačne posude spusti u potporni stalak dijela kućišta, s tim da prvo ide kraj s mehanizmom za paljenje, bočni rukavac namjestio u utor. Na donju unutarnju površinu dijela kućišta zavari se komad čelika širine 30 mm i debljine 6 mm koji ima ulogu držača razmaka. Dva 7 milimetarska pritezna vijka postavljena u suprotne strane čvrsto drže tlačnu posudu. S donje strane tlačnu posudu nose dvije 12 mm široke čelične trake debljine 6 mm zavarene na bočne strane podnožja kućišta.

1.6.1.2.2. Sustav paljenja Sustav paljenja sastoji se od Ni/Cr žice duljine 25 cm promjera 0,6 mm i otpora 3,85 om/m. Žica je namotana na šipku promjera 5 mm, u obliku svitka i prigrađena na elektrode mehanizma za paljenje. Svitak bi trebao imati jedan od oblika prikazanih na slici 3. Razmak između dna posude i donje strane svitka za paljenje treba biti 20 mm. Ako elektrode nisu podesive, krajeve žice za paljenje između svitka i dna posude treba izolirati keramičkom oblogom. Žica se grije stalnim izvorom koji može dati struju jačine najmanje 10 A.

1.6.2. Provođenje ispitivanja Potpuno montiran uređaj zajedno s pretvornikom tlaka i sustavom zagrijavanja, ali bez postavljenog rasprskavajućeg diska, postavljen je u svoj stalak mehanizmom za paljenje prema dolje. 2,5 g tekućine koja se ispituje miješa se s 2,5 g sušene celuloze u staklenoj čaši pomoću staklenog štapića za miješanje. Iz sigurnosnih razloga miješanje treba vršiti na način da između vršitelja pokusa i mješavine postoji sigurnosni štit. Ako se mješavina zapali tijekom miješanja ili punjenja, daljnje ispitivanje nije potrebno. Mješavina se u tlačnu posudu dodaje u malim količinama laganim tapkanjem kako bi se mješavina dobro sabila oko svitka za paljenje i bila u dobrom dodiru s njim. Važno je da se tijekom postupka sabijanja elektroda ne izvije jer to može dovesti do pogrešnih rezultata. Rasprskavajuća ploča i vijak koji je drži čvrsto se stegnu. Napunjena posuda prenese se u potporni stalak za paljenje, s tim da je rasprskavajuća ploča u krajnjem gornjem položaju, koji treba biti smješten u odgovarajući obloženi digestor ili ćeliju za paljenje. Izvor napajanja priključi se na vanjske stezaljke mehanizma za paljenje i pusti se struja jačine 10 A. Vrijeme između početka miješanja i uključivanja napajanja ne bi smjelo biti duže od 10 minuta. Signal koji proizvodi pretvornik tlaka bilježi se u odgovarajućem sustavu koji omogućuje i procjenu i trajnu evidenciju kretanja tlaka u vremenu (npr. zapisivač prijenosa spojen na uređaj za ispisivanje krivulje). Mješavina se zagrijava sve dok se rasprskavajuća ploča ne rasprsne ili do isteka najmanje 60 s. Ako se rasprskavajuća ploča ne rasprsne, mješavinu treba ostaviti da se ohladi prije nego se uređaj oprezno rastavi, uz mjere opreza i vodeći računa o eventualnoj pojavi tlaka. S ispitivanom tvari i jednom ili više referentnih tvari provodi se pet pokusa. Bilježi se vrijeme koje je potrebno da tlak poraste od 690 kPa do 2070 kPa iznad atmosferskog. Izračunava se srednje vrijeme porasta tlaka. U nekim slučajevima, tvari mogu proizvesti porast tlaka (prevelik ili premali) uslijed kemijskih reakcija koje nisu karakteristične za oksidativna svojstva tvari. U takvim slučajevima možda će trebati ponoviti ispitivanje s inertnom tvari, npr. dijatomejskom zemljom, umjesto celuloze kako bi se razjasnila priroda reakcije.

2. PODACI Vremena porasta tlaka i kod ispitivane tvari i kod jedne ili više referentnih tvari. Vremena porasta tlaka za ispitivanja s inertnim tvarima, ako su provedena.

2.

2.1. Tablica 1. Primjeri rezultata

OBRADA REZULTATA Izračunavaju se srednja vremena porasta tlaka i za ispitivanu tvar i za jednu ili više referentnih tvari. Izračunava se srednje vrijeme porasta tlaka za ispitivanja s inertnim tvarima (ako su provedena). Neki primjeri rezultata prikazani su u tablici 1. Tvar Srednje vrijeme porasta tlaka za mješavinu celuloze 1:1 (ms) Amonijev dikromat, zasićena vodena otopina 20800 Kalcijev nitrat, zasićena vodena otopina 6700 Željezov nitrat, zasićena vodena otopina 4133 Litijev perklorat, zasićena vodena otopina 1686 Magnezijev perklorat, zasićena vodena otopina 777 Niklov nitrat, zasićena vodena otopina 6250 Nitratna kiselina, 65 % 4767 Perklorna kiselina, 50 % 121 Perklorna kiselina, 55 % 59 Kalijev nitrat, 30 % vodena otopina 26690 Srebrov nitrat, zasićena vodena otopina Natrijev klorat, 40 % vodena otopina 2555 Kalijev nitrat, 45 % vodena otopina 4133 Inertna tvar Voda, celuloza

3. IZVJEŠĆE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU U izvješću o ispitivanju treba, ako je moguće, navesti sljedeće informacije:

identitet, sastav, čistoća itd. ispitivane tvari,

koncentracija ispitivane tvari,

primijenjeni postupak sušenja celuloze,

sadržaj vode u celulozi koja je korištena,

rezultati mjerenja,

rezultati ispitivanja s inertnom tvari, ako su provedena,

izračunana srednja vremena porasta tlaka,

eventualna odstupanja od ove metode i razloge za njih,

sve dodatne napomene relevantne za tumačenje rezultata.

3.2. TUMAČENJE REZULTATA Rezultati ispitivanja procjenjuju se na temelju: Tekuća tvar smatra se oksidansom ako: Kako bi se izbjegli lažni pozitivni rezultati, prilikom tumačenja rezultata po potrebi isto tako treba uzeti u obzir rezultate dobivene kod ispitivanja tvari s inertnim materijalom.

3.2.

(a) činjenice je li se mješavina ispitivane tvari i celuloze spontano zapalila; i

(b) uspoređivanja srednjeg vremena koje je potrebno da tlak poraste s 690 kPa na 2070 kPa i srednjeg vremena jedne ili više referentnih tvari.

(a) se mješavina u omjeru 1:1 težinskog udjela tvari i celuloze spontano zapali; ili

(b) mješavina tvari i celuloze u omjeru 1:1 masenog udjela tvari i celuloze pokazuje srednje vrijeme porasta temperature koje je manje od ili jednako srednjem vremenu porasta temperature mješavine 1:1 masenog udjela 65 % (m/m) vodene nitratne kiseline i celuloze.

4.(1) REFERENCE Recommandations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, str. 342. Test O.2: Test for oxidising liquids. Napomena: može se koristiti bilo koja od ovih konfiguracija.

4.(1)

Slika 1 Tlačna posuda

(A)Kućište tlačne posude (B) Nosač rasprskavajuće ploče (C) Mehanizam za paljenje (D) Podloška od mekog olova (E) Rasprskavajuća ploča (F)Bočni rukavac (G)Glava pretvornika tlaka (H)Podloška (J)Izolirana elektroda (K)Uzemljena elektroda (L) Izolacija (M) Čelični konus (N)Utor za podlošku

Slika 2. Nosivi stalak

Slika 3. Sustav paljenja

(A) Svitak za paljenje (B) Izolacija (C) Elektrode (D) Mehanizam za paljenje

Dodatak Dodatne tehničke pojedinosti moguće je naći npr. u sljedećim normama:

1. Metode kapilara

1.

1.1. Uređaj za određivanje temperature taljenja u kupki ASTM E 324–69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapilarverfarehn JIS K 00–64 Testing methods for melting point of chemical products

1.2. Uređaj za određivanje temperature taljenja u metalnom bloku DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point

2. Vruće faze

2.

2.1. Koflerov vrući štap ANSI/ASTM D 3451–76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Mikroskop za taljenje DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

2.3. Metoda meniska (poliamidi) ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point ANSI/ASTM D 2133–66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51–050 Resines de polyamides. Détermination du point de fusion méthode du menisque

3. Metode određivanja temperature skrućivanja BS 4633 Method for the determination of crystallizing BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsiiuren NF T 60–114 Point de fusion des paraffines NF T 20–051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Termička analiza

4.

4.1. Diferencijalna termička analiza ASTM E 537–76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473–85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472–86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Diferencijalna pretražna kalorimetrija ASTM E 537–76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473–85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472–86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Određivanje točke stinjavanja NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d’écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour point

Dodatak Dodatne tehničke pojedinosti moguće je naći npr. u sljedećim normama:

1.1.1. Ebuliometar Uređaji za mjerenje temperature taljenja u kupki ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Postupak destilacije (područje vrenja) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l’intervalle de distillation

3. Diferencijalna termička analiza i diferencijalna pretražna kalorimetrija ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe

Dodatak Dodatne tehničke pojedinosti moguće je naći npr. u sljedećim normama:

1. Metode uzgona

1.

1.1. Hidrometar DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardised sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2. Hidrostatska vaga

1.2. Za krute tvari

ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density

Za tekuće tvari

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 i ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3. Metoda uronjenog tijela DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2. Metode piknometrom

2.

2.1. Za tekuće tvari ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 °C DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00. 10-6 m2 s-1 at 15 °C) DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00. 10-6 m2 s-1 at 15 °C applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 °C) DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: Testing of min eral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary – stoppered pycnometer method NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method

2.2. Za krute tvari ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics. NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solidsin powder and liquids – Pyknometric method DIN 19683 Determination of the density of soils

3. Usporedba sa zrakom pomoću piknometra DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung

Dodatak 1. Metoda procjene

UVOD

Izračunane vrijednosti tlaka pare mogu se primijeniti:

za donošenje odluke o tome koja je eksperimentalna metoda primjerena,

za postavljanje procijenjene ili granične vrijednosti ako iz tehničkih razloga eksperimentalna metoda nije primjenljiva (uključujući i slučaj vrlo niskog tlaka pare),

radi lakše identifikacije slučajeva u kojima je opravdano ne provoditi eksperimentalno mjerenje jer je vjerojatno da će tlak pare biti < 10–5 Pa na temperaturi okoline.

METODA PROCJENE

Tlak pare tekućina i krutina može se procijeniti primjenom modificirane Watsonove korelacije (a). Jedini potreban eksperimentalni podatak je uobičajeno vrelište. Metoda je primjenljiva na cijelo područje tlakova od 105 do 10–5 Pa. Iscrpne informacije o metodi date su u Handbook of Chemical Property Estimation Methods (Priručnik o metodama procjene kemijskih svojstava) (b).

POSTUPAK IZRAČUNA

U skladu s (b), tlak pare izračunava se kako slijedi: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1–3 – 2TTbmTTb – 2m3 – 2TTbm – 1ln TTb gdje je: T odabrana temperatura Tb uobičajeno vrelište Pvp tlak pare kod temperature T Δ Hvb toplina isparavanja Δ Zb faktor kompresije (procijenjen na 0,97) m empirijski faktor koji ovisi o fizikalnom stanju kod odabrane temperature nadalje: ΔHvbTb=KF8,75 + R ln Tb gdje je Kf empirijski faktor kojim se uzima u obzir polaritet tvari. Za nekoliko tipova spojeva, Kf faktori nabrojani su u referenci (b). Često se događa da su dostupni podaci o vrelištu koji su dobiveni kod smanjenog tlaka. U takvim slučaju, u skladu s (b), tlak pare izračunava se kako slijedi. ln Pvp ≈ ln P1 + ΔHv1ΔZbRT11 – 3 – 2TT1m T1T – 2m3 – 2 TT1m – 1 ln TT1 gdje je T1 vrelište kod smanjenog tlaka P1.

IZVJEŠĆE

Kad se primjenjuje metoda procjene, izvješće treba sadržavati opsežnu dokumentaciju na temelju koje je izračun napravljen.

LITERATURA

(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, str. 398.

(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

Dodatak 2.

Slika 1. Uređaj za određivanje krivulje tlaka pare prema dinamičkoj metodi

1 = Termopar 2 = Pufer spremnik 3 = Mjerač tlaka 4 = Vakuum 5 = Mjerna točka 6 = Grijaći element oko 150 W

Slika 2.a Uređaj za određivanje krivulje tlaka pare prema statističkoj metodi (pomoću manometarske U-cijevi)

1.Ispitivana tvar 2.Faza pare 3.Vakuumski ventil 4.U-cijev (pomoćni manometar) 5.Manometar 6.Kupka za održavanje temperature 7.Uređaj za mjerenje temperature 8.Prema vakuumskoj pumpi 9.Ventilacija

Slika 2.b Uređaj za određivanje krivulje tlaka pare prema statičkoj metodi (pomoću pokazivača tlaka)

1.Ispitivana tvar 2.Faza pare 3.Vakuumski ventil 4.Mjerač tlaka 5.Pokazivač tlaka 2.Kupka za održavanje temperature 7.Uređaj za mjerenje temperature

Slika 3. Izoteniskop (vidjeti referencu 7.)

1.Prema sustavu za mjerenje i regulaciju tlaka 2.Cijev vanjskog promjera 8 mm 3.Suhi dušik u tlačnom sustavu 4.Uzorak pare 5.Vršak 6.Tekući uzorak

Slika 4. Uređaj za određivanje krivulje tlaka pare prema metodi vaganja tlaka pare

1.Ispitivana tvar 2.Faza pare koja struji 3.Peć za isparavanje s okretnim otvorom 3a.Otvor na poklopcu peći 4.Zagrijavanje (hlađenje) peći 5.Mjerenje temperature uzorka 6.Rashladno kućište 7.Štitnik 8. Rashladna šipka za rashladno kućište 9.Posuda vage 10.Mikrovaga 11.Prema zapisivaču 12.Prema vakuumskoj crpki

Slika 5. Primjer uređaja za isparivanje kod niskog tlaka metodom efuzije, s ćelijom za istjecanje zapremnine 8 cm3

1.Priključak na vakuum 2. Provrt za otporničke termometre s platinom ili mjerenje i regulaciju temperature (2) 3.Poklopac na vakuumskom spremniku 4.O-prsten 5.Aluminijski vakuumski spremnik 6.Uređaj za ugradnju i demontažu ćelija za istjecanje 7.Poklopac s navojem 8.Leptir matice (6) 9.Vijci (6) 10.Ćelije za istjecanje od nehrđajućeg čelika 11.Ulošci zagrijača (6)

Slika 6.a Primjer sustava protoka za određivanje tlaka pare metodom zasićenja plina

1.=Regulator toka 2.=Izmjenjivač topline 3.=Igličasti ventili 4.=Osjetnik relativne vlage 5.=Kolone za saturaciju 6.=Teflonske brtve 7.=Mjerač protoka 8.=Skupljač (upijač) 9.=Uljna tava 10.=Kalcinirana cjevčica za stvaranje mjehurića

Slika 6.b. Primjer sustava za određivanje tlaka pare metodom zasićenja plina, s kapilarom postavljenom iza komore za zasićenje

1.Mjerač protoka 2.Manometar 3.Komora s reguliranom temperaturom 4. Termostatski svitak za nosivi plin 5.Termometar (Pt 100) 6.Komora za zasićenje plina 7.Kapilara 8.Posude za apsorpciju 9.Mjerač plina 10.Posuda za skupljanje

Slika 7. Primjer eksperimentalne postave za metodu s rotorom koji se vrti

Uređaj za određivanje tlaka pare A. glava osjetnika na rotoru koji se vrti; B. ćelija s uzorkom; C. Termostat; D. vakuumski cjevovod (turbo crpka); E. termostat za zrak.

Slika 8. Primjer mjerne glave na rotoru koji se vrti

1. Kuglica; 2. Evakuirano cijevno produljenje pozicije 6; 3. Trajni magneti (2); 4. Svici za vertikalnu stabilizaciju; 5. Pogonski svici (4); 6. Priključna prirubnica.

Dodatak

Slika 1. Metoda eluiranja kolone pomoću crpke za recirkulaciju

Atmosfersko uravnoteženje Mjerač protoka Recirkulacijska crpka Mikro-kolona Termostatski regulirana crpka za cirkulaciju Dvoputni ventil za uzorkovanje

Slika 2. Tipična mikro-kolona (Sve dimenzije izražene su u milimetrima)

Priključak za ubrušeni stakleni spoj Prostor u koloni Unutrašnji 5 Vanjski 19 Čep od staklene vune Zaporni ventil s dvosmjernim djelovanjem

Slika 3. Tipična mikro-kolona (Sve dimenzije izražene su u milimetrima)

Priključak za ubrušeni stakleni spoj Prostor u koloni Unutrašnji 5 Vanjski 19 Zaporni ventil

Slika 4. Metoda eluiranja kolone pomoću nivelacijske posude

1 = Nivelacijska posuda (npr. 2,5-litarska tikvica) 2 = Kolona (vidjeti sliku 3.) 3 = Skupljač frakcije 4 = Termostat 5 = Teflonski cjevovod 6 = Ubrušeni stakleni spoj 7 = Cjevovod vode (između termostata i kolone, unutarnjeg promjera približno 8 mm)

Dodatak 1. Metode izračuna/procjene

UVOD

Općeniti uvod u metode, podaci i primjeri izračuna navedeni su u priručniku o metodama procjene kemijskih svojstava Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) Izračunane vrijednosti Pow mogu se koristiti:

za donošenje odluke o tome koja je eksperimentalna metoda primjerena (područje metode protresanjem tikvice: log Pow: – 2 do 4, područje metode HPLC: log Pow: 0 do 6),

za odabir primjerenih ispitnih uvjeta (npr. referentne tvari za postupke kromatografije HPLC, omjer volumena n-oktanol/voda za metodu protresanjem tikvice),

kao vlastita provjera radi otkrivanja eventualnih pogrešaka u pokusu koju provodi sam laboratorij,

kao procijenjene vrijednosti Pow u slučajevima kad iz tehničkih razloga nije moguće primijeniti eksperimentalne metode.

METODA PROCJENE Preliminarna procjena koeficijenta razdjeljenja

Vrijednost koeficijenta razdjeljenja može se procijeniti pomoću topljivosti ispitivanih tvari u čistim otapalima. Tada je: Pprocijenjeni =zasićenje cn-oktanolzasićenje cvoda

METODE IZRAČUNA Načelo metoda izračuna

Sve metode izračuna temelje se na formalnoj fragmentaciji molekule na odgovarajuće pod-strukture za koje su prirasti vrijednosti log Pow poznati. Log Pow cijele molekule tada se izračunava kao zbroj odgovarajućih vrijednosti njezinih fragmenata uvećan za zbroj korektivnih članova za intramolekulske interakcije. Postoje popisi konstanti fragmenata i korektivnih članova (b)(c)(d)(e) od kojih se neki redovito ažuriraju (b).

Kriteriji kvalitete

Općenito, što je složeniji spoj koji se proučava, pouzdanost metode izračuna je manja. Kad se radi o jednostavnim molekulama male molekulske težine i molekulama koje sadrže jednu ili dvije funkcionalne skupine, između rezultata različitih metoda fragmentacije i izmjerene vrijednosti može se očekivati odstupanje od 0,1 do 0,3 log Pow jedinica. Kad se radi o složenijim molekulama, margina greške može biti veća. To će ovisiti o pouzdanosti i dostupnosti konstanti fragmenata, kao i o sposobnosti prepoznavanja intramolekulskih interakcija (npr. vodikove veze) i pravilne primjene korektivnih članova (nije toliki problem kod računalnog programa CLOGP-3) (b). Kad se radi o ionizirajućim spojevima, važno je uzeti u obzir točan naboj ili stupanj ionizacije.

Postupci izračuna

Hanschova π-metoda

Konstanta originalnog supstituenta, π, koju su uveli Fujira i ostali (f) definira se kao: πx = log Pow (PhX) – log Pow (PhH) gdje je Pow (PhX) koeficijent razdjeljenja aromatskog derivata, a Pow (PhH) koeficijent razdjeljenja roditeljskog spoja (npr. πCl = log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6) = 2,84 – 2,13 = 0,71). Prema definiciji π-metoda primjenljiva je pretežito na aromatsku supstituciju. Prikupljene su π-vrijednosti za velik broj supstituenata (b)(c)(d). Pomoću njih se izračunava log Pow za aromatske molekule i podstrukture.

Rekkerova metoda

Prema Rekkeru (g), vrijednost log Pow izračunava se kako slijedi: log Pow = Σi aifi + Σj (interaktivni članovi) gdje fi predstavlja konstante različitih molekulskih fragmenata, a a1 učestalost njihovog pojavljivanja u molekuli koja se ispituje. Korektivni članovi mogu se izraziti kao integralni višekratnik samo jedne konstante Cm (takozvane magične konstante). Konstante fragmenata, fi i Cm određene su iz popisa koji sadrži 1054 ekperimentalnu vrijednost Pow (825 spojeva) primjenom višestruke regresijske analize (c)(h). Određivanje faktora interakcije provodi se u skladu s utvrđenim pravilima kako su opisana u literaturi (e)(h)(i).

Hansch-Leova metoda

Prema Hanschu i Leu (c), vrijednost log Pow izračunava se iz: log Pow = Σi ai fi + Σj bj Fj gdje fi predstavlja konstante različitih molekulskih fragmenata, Fj korektivne faktore, a ai, bj predstavljaju njihovu učestalost pojavljivanja. Izvedeni iz ekperimentalnih vrijednost Pow, popis atomskih i grupnih fragmentiranih vrijednosti i popis korektivnih članova Fj (tzv. faktori) određeni su putem pokušaja i pogreške. Korektivni članovi svrstani su u nekoliko različitih klasa (a)(c). Prilično je složeno i vremenski zahtjevno uzeti u obzir sva pravila i korektivne članove. Razvijeni su programski paketi (b).

Kombinirana metoda

Izračun vrijednost log Pow složenih molekula moguće je znatno unaprijediti ako se molekula rasiječe na veće podstrukture za koje su pouzdane vrijednosti log Pow dostupne bilo iz tablica (b)(c) ili iz vlastitih mjerenja. Takve fragmente (npr. heterocikli, antrakinon, azobenzen) tada je moguće kombinirati s Hanschovim π-vrijednostima ili s Rekkerovim i Leovim konstantama fragmenata.

Napomene

i.

Metode izračuna mogu se primijeniti na djelomično ili potpuno ionizirane spojeve samo kad je moguće uzeti u obzir potrebne korektivne faktore;

ii.

Ako se može pretpostaviti prisutnost intramolekulske vodikove veze, obvezno treba dodati odgovarajuće korektivne članove (približno + 0,6 do + 1,0 log Pow jedinica) (a). Pokazatelji prisutnosti tih veza dobivaju se stereo modelima ili spektroskopskim podacima o molekuli;

iii.

Ako je nekoliko tautomernih oblika moguće, najvjerojatniji oblik treba uzeti kao osnovu izračuna;

iv.

Revizije popisa konstanti fragmenata treba pažljivo pratiti.

Izvješće

Kad se koriste metode izračuna/procjene, izvješća o ispitivanju, ako je moguće, moraju sadržavati sljedeće informacije:

opis tvari (mješavina, nečistoće itd.),

indikaciju eventualne intramolekulske vodikove veze, disocijacije, naboja ili drugih neuobičajenih učinaka (npr. tautomerija),

opis metode izračuna,

identifikacija ili porijeklo baze podataka,

pojedinosti o izboru fragmenata,

sveobuhvatna dokumentacija izračuna.

LITERATURA

(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971., vol. 71, str. 525.

(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. -Chill. Ther. 1979., vol. 14, str. 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964., vol. 86, str. 5175.

(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, NewYork, 1977., vol. 1.

(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983., vol. 12, str. 1459.

(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984., Symposium Series 255, str. 225.

Dodatak 2. Preporučene referentne tvari za metodu HLPC

Br. Referentna tvar log Pow pKa 1 2- butanon 0,3 2 4-acetilpiridin 0,5 3 Anilin 0,9 4 Acetanilid 1,0 5 Benzilalkohol 1,1 6 p-metoksifenol 1,3 pKa = 10,26 7 Fenoksi octena kiselina 1,4 pKa = 3,12 8 Fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 10 Benzonitril 1,6 11 Fenilacetonitril 1,6 12 4-metilbenzil alkohol 1,6 13 Acetofenon 1,7 14 2-nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 15 3- nitrobenzojeva kiselina 1,8 pKa = 3,47 16 4-kloranilin 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobenzen 1,9 18 Cinaminski alkohol 1,9 19 Benzojeva kiselina 1,9 pKa = 4,19 20 p-krezol 1,9 pKa = 10,17 21 Cinaminska kiselina 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Anizol 2,1 23 Metilbenzoat 2,1 24 Benzen 2,1 25 3-metilbenzojeva kiselina 2,4 pKa = 4,27 26 4-klorofenol 2,4 pKa = 9,1 27 Tri-kloretilen 2,4 28 Atrazin 2,6 29 Etilbenzoat 2,6 30 2,6-diklorobenzonitril 2,6 31 3-klorobenzojeva kiselina 2,7 pKa = 3,82 32 Toluen 2,7 33 1-naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dikloroanilin 2,8 35 Klorobenzen 2,8 36 Alil-fenileter 2,9 37 Bromobenzen 3,0 38 Etilbenzen 3,2 39 Benzofenon 3,2 40 4-fenilfenol 3,2 pKa = 9,54 41 Timol 3,3 42 1,4-diklorobenzen 3,4 43 Difenilamin 3,4 pKa = 0,79 44 Naftalen 3,6 45 Fenilbenzoat 3,6 46 Izopropilbenzen 3,7 47 2,4,6-triklorofenol 3,7 pKa = 6 48 Bifenil 4,0 49 Benzilbenzoat 4,0 50 2,4-dinitro-6 sec. butilfenol 4,1 51 1,2,4-triklorobenzen 4,2 52 Dodekanska kiselina 4,2 53 Difenileter 4,2 54 n-butilbenzen 4,5 55 Fenantren 4,5 56 Floranten 4,7 57 Dibenzil 4,8 58 2,6-difenilpiridin 4,9 59 Trifenilamin 5,7 60 DDT 6,2 Ostale referentne tvari niskog log Pow 1 Nikotinska kiselina –0,07

Dodatak

Slika Kalup i pribor za pripremu hrpice

(Sve dimenzije izražene su u milimetrima) Duljina kalupa: 250 mm Materijal: aluminij

Dodatak

Slika Uređaj

Dodatak

Primjer specifikacije materijala za ispitivanje termičke osjetljivosti (vidjeti normu DIN 1623) (1)(2)(3)

Cijev: Specifikacija materijala br. 1.0336.505 g Mjerna prigušnica: Specifikacija materijala br. 1.4873 Navojna obujmica i matica: Specifikacija materijala br. 1.3817

Slika 1. Uređaj za ispitivanje termičke osjetljivosti

(sve dimenzije izražene su u milimetrima) Slika 1.a Čelična cijev i pribor (1)cijev (1a)vanjska prirubnica (2) navojna obujmica; navoj s malim trenjem (3) mjerna prigušnica a = 2,0 ili 6,0 mm u promjeru (4)matica b = 10 mm u promjeru (5)površina sa žlijebovima (6) 2 ravne površine za natezač veličine 41 Slika 1.b Sigurnosni uređaj za zagrijavanje (7) 2 ravne površine za natezač veličine 36 (8)kućište otporno na krhotine (9)2 potporne šipke za cijev (10)montirana cijev (11) položaj za stražnji gorač; ostali gorači se vide (12)mlaznica

Slika 2. Ispitivanje termičke osjetljivosti

(primjer fragmentacije) Nema eksplozije Nema eksplozije Eksplozija Eksplozija Eksplozija Eksplozija

Slika 3. Kalibracija brzine zagrijavanja za ispitivanje termičke osjetljivosti

Temperatura (°C) Vrijeme (s) Krivulja temperature u odnosu na vrijeme koja se dobije zagrijavanjem dibutil ftalata (27 cm3) u zatvorenoj (mjerna prigušnica s otvorom 1,5 mm) cijevi kod brzine protoka propana od 3,2 litre/minuti. Temperatura se mjeri termoparom od kromela/alumela u omotaču od nehrđajućeg čelika promjera 1 mm, postavljenim u središte 43 mm ispod ruba cijevi. Brzina zagrijavanja između 135 °C i 285 °C treba biti između 185 i 215 K/minuti.

Slika 4. Uređaj za ispitivanje osjetljivosti na udarac

(sve dimenzije izražene su u milimetrima) Slika 4.a Padajući malj, prednja i bočna strana, općenito (1)temeljna ploča, 450 × 450 × 60 (2)čelični blok, 230 × 230 × 200 (3) nakovanj, ø 100 × 70 (4) kolona (5)srednji poprečni članak (6)2 vodilice (7) nazubljeno polužje Slika 4.b Padajući malj, donji dio (8) stupnjevana vaga (9)padajući malj (masa koja pada) (10)element za držanje i otpuštanje (11)ploča za postavljanje u položaj (12) među-nakovanj (zamjenljivi) ø 26 × 26 (13)prsten s otvorima (14)udarni element

Nastavak s prethodne stranice

Slika 4.c Uređaj za ispitivanje osjetljivosti na udarac za praškaste tvari ili paste (1)čelični cilindri (2)prstenasta vodilica za čelične cilindre (3) prsten s otvorima za postavljanje u položaj (a)vertikalni presjek (b)tlocrt (4)gumeni prsten (5)tekuća tvar (40 mm3) (6)prostor bez tekućine Slika 4.d Uređaj za ispitivanje osjetljivosti na udarac za tekuće tvari Slika 4.e Malj (masa koja pada težine 5 kg) (1)ovjes (2)označivač visine (3)utor za pozicioniranje (4)cilindrična udarna glava (5)odbojnik

Slika 5. Uređaj za ispitivanje osjetljivosti na trenje

Slika 5.a Uređaj za ispitivanje osjetljivosti na trenje; nacrt i tlocrt (1)čelično postolje (2)pomični klizač (3) porculanska ploča, 25 × 25 × 5 mm, koju drži klizač (4)fiksni porculanski klin, ø 10 × 15 mm (5)uzorak koji se ispituje, približno 10 mm3) Slika 5.b Početni položaj klina na uzorku (6)držač klina (7)ručka za punjenje (8) protuuteg (9)sklopka (10) kolo za postavljanje klizača u početni položaj (11)smjer prema elektromotornom pogonu

Dodatak

Slika Kalup i pribor za pripravu hrpice

(Sve dimenzije izražene su u milimetrima) Duljina kalupa: 250 mm Materijal: aluminij

Dodatak Primjeri ostalih metoda za određivanje prosjeka molekulske težine (Mn) za polimere

Metoda kromatografije na permeabilnom gelu (GPC) poželjna je metoda za određivanje Mn, pogotovo ako je dostupan komplet etalona čija je struktura usporediva sa strukturom polimera. Međutim ako postoje praktične poteškoće u korištenju metode GPC, ili ako se unaprijed očekuje da tvar neće zadovoljiti regulatorni kriterij za Mn (što se mora potvrditi), dostupne su alternativne metode, kao npr.:

1.1.1.1.2.1.3.1.4.

Metoda koligativnih svojstava Ebulioskopija/Krioskopija obuhvaća mjerenje podizanja vrelišta (ebulioskopija) ili spuštanja ledišta (krioskopija) otapala, ako se dodaje polimer. Metoda se zasniva na činjenici da učinak otopljenog polimera na vrelište/ledište tekućine zavisi o molekulskoj težini polimera (1)(2). Primjenljivost, Mn < 20000. Snižavanje tlaka pare obuhvaća mjerenje tlaka pare odabrane referentne tekućine prije i nakon dodavanja poznatih količina polimera (1)(2). Primjenljivost, Mn < 20000 (teoretski; međutim, njezina je vrijednost u praksi ograničena). Membranska osmometrija temelji se na načelu osmoze, tj. prirodne sklonosti molekula otapala da prolaze kroz polu-propusnu membranu iz razrijeđene u koncentriranu otopinu radi postizanja ravnoteže. U ispitivanju, razrijeđena otopina je nulte koncentracije, dok koncentrirana otopina sadrži polimer. Učinak provlačenja otapala kroz membranu uzrokuje diferencijalni tlak koji zavisi o koncentraciji i molekulskoj težini polimera (1)(3)(4). Primjenljivost, Mn između 20000-200000. Osmometrija faze pare obuhvaća uspoređivanje brzine isparavanja aerosola čistog otapala do najmanje tri aerosola koji sadrže polimer u različitim koncentracijama (1)(2)(4). Primjenljivost, Mn < 20000.

2. Analiza krajne grupe Za primjenu ove metode potrebno je poznavati i ukupnu strukturu polimera i vrstu lanca kojim završavaju krajnje grupe (koji se mora razlikovati od glavnog kostura po, npr. NMR ili titraciji/derivatizaciji). Određivanje molekulske koncentracije krajnjih grupa koje se nalaze na polimeru može dovesti do vrijednosti molekulske težine (7)(8)(9). Primjenljivost, Mn do 50000 (uz smanjenje pouzdanosti).

3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)

Reference Billmeyer, F.W. Jr., (1984) Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York. Glover, C.A., (1975) Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979) Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989) Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52. ASTM 3592-77, (1977) Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989) Vapour Pressure Osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989) Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G., (1975) End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990) Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

Dodatak Smjernice za korekciju sadržaja male molekulske mase s obzirom na prisutnost netopljivih polimera

Prisutnost netopljivog polimera u uzorku ima za posljedicu gubitak mase tijekom analize metodom GPC. Netopljivi polimer trajno se zadržava na koloni ili filtru uzorka dok topljivi dio uzorka prolazi kroz kolonu. Ako je prirast refrakcijskog indeksa (dn/dc) polimera moguće procijeniti ili izmjeriti, moguće je procijeniti i gubitak mase uzorka na koloni. U tom se slučaju radi korekcija putem vanjske kalibracije, a za etalone se uzimaju materijali poznate koncentracije i omjera dn/dc, kako bi se kalibrirala reakcija refraktometra. U primjeru koji slijedi kao etalon upotrijebljen je poli(metil metakrilat) (pMMA). U vanjskoj kalibraciji, za analizu akrilnih polimera, etalon pMMA poznate koncentracije u tetrahidrofuranu, analiziran je metodom GPC, a dobiveni podaci upotrijebljeni su kako bi se odredila konstanta refraktometra prema jednadžbi: K = R/(C × V × dn/dc) gdje je: K konstanta refraktometra (u mikrovolt sekundama/ml), R reakcija etalona pMMA (u mikrovolt/sekundi), C koncentracija etalona pMMA (u mg/ml), V volumen ubrizgavanja (u ml), i dn/dc prirast refrakcijskog indeksa za pMMA u tetrahidrofuranu (u ml/mg) Sljedeći podaci tipični su za etalon pMMA: R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 × 10-5 ml/mg. Dobivena vrijednost K 3,05 × 1011 zatim se koristi za izračun teoretske reakcije detektora ako je 100 % ubrizganog polimera eluiralo kroz detektor.

DIO B METODE UTVRĐIVANJA TOKSIČNOSTI I DRUGIH UČINAKA NA ZDRAVLJE

OPĆI UVOD A.

KARAKTERIZACIJA ISPITIVANE TVARI Prije početka bilo kakve studije toksičnosti treba biti poznat sastav ispitivane tvari, uključujući glavne nečistoće, te njezina relevantna fizikalno-kemijska svojstva koja uključuju i stabilnost. Fizikalno-kemijska svojstva ispitivane tvari osiguravaju važne informacije za odabir puta primjene, planiranje studije, te rukovanje ispitivanim tvarima i njihovo pohranjivanje. Početku studije mora prethoditi razvijanje analitičke metode za kvalitativno i kvantitativno određivanje ispitivane tvari (uključujući glavne nečistoće kada je moguće) u sredstvu za doziranje i biološkom materijalu. Izvješće o ispitivanju treba sadržavati sve informacije vezane uz identifikaciju, fizikalno-kemijska svojstva, čistoću i ponašanje ispitivane tvari.

ZAŠTITA ŽIVOTINJA Kod ispitivanja toksičnosti bitna je stroga kontrola okolišnih uvjeta i pravilne metode zaštite životinja.

i.

Smještajni uvjeti Okolišni uvjeti u prostorijama i ograđenim prostorima za držanje pokusnih životinja moraju odgovarati vrsti kojoj one pripadaju. Za štakore, miševe i zamorce odgovarajući su uvjeti sobna temperatura od 22 °C ± 3 °C uz relativnu vlažnost zraka od 30 do 70 %; za kuniće temperatura treba biti 20 °C ± 3 °C uz relativnu vlažnost zraka od 30 do 70 %. Neke pokusne tehnike posebno su osjetljive na djelovanje temperature i u takvim su slučajevima pojedinosti o odgovarajućim uvjetima uključeni u opis ispitne metode. Pri svim istraživanjima toksičkih učinaka temperaturu i vlažnost zraka treba pratiti, bilježiti i uključiti u završno izvješće o studiji. Osvjetljenje treba biti umjetno i mora se u slijedu izmjenjivati 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Pojedinosti o svjetlosnom režimu treba zabilježiti i uključiti u završno izvješće o studiji. Ako u metodi nije predviđeno drugačije, životinje mogu biti smještene pojedinačno ili se u kavezima mogu držati u malim skupinama istog spola; u slučaju skupnog smještaja, u jedan kavez ne smije se staviti više od pet životinja. U izvješćima o pokusima na životinjama važno je navesti tip kaveza i broj životinja smještenih u svakom kavezu za vrijeme izloženosti kemikaliji, kao i tijekom opažanja koje slijedi nakon toga.

ii.

Prehrambeni uvjeti Prehrana treba zadovoljavati sve nutritivne zahtjeve životinjske vrste koja se koristi u ispitivanju. Kad se ispitivane tvari životinjama daju u hrani, nutritivna se vrijednost može sniziti međusobnim djelovanjem ispitivane tvari i nekog prehrambenog sastojka. Pri tumačenju rezultata ispitivanja treba uzeti u obzir mogućnost takve reakcije. Može se primjenjivati standardna hrana za laboratorijske životinje uz neograničene količine vode za piće. Kad se ispitivana tvar primjenjuje ovom metodom, na izbor hrane može utjecati potreba da se u toj hrani osigura odgovarajuća primjesa ispitivane tvari. Prehrambeni kontaminanti za koje se zna da utječu na toksičnost ne smiju biti prisutni u koncentracijama u kojima bi utjecali na rezultate.

ALTERNATIVNA ISPITIVANJA Europska unija obvezala se promicati razvoj i validaciju alternativnih tehnika koje mogu osigurati jednaku razinu informacija kao i testovi koji se sada obavljaju na životinjama, ali se pri njihovoj primjeni koristi manji broj životinja, uzrokuje manje patnje ili se u potpunosti izbjegava korištenje životinja. Kad takve metode postanu dostupne, kad god je moguće mora se razmotriti mogućnost njihove primjene pri karakterizaciji opasnosti na kojoj se temelji klasifikacija kemikalija, označivanje kemikalija s obzirom na intrinzičke opasnosti te procjena njihove sigurnosti.

OCJENA I TUMAČENJE REZULTATA Kod ocjenjivanja i tumačenja rezultata ispitivanja obvezno treba uzeti u obzir granice do kojih se rezultati studija na životinjama i studija in vitro mogu izravno ekstrapolirati na čovjeka, pa se prema tome dokazi o štetnom djelovanju na ljude, kada su dostupni, mogu upotrijebiti za potvrdu rezultata ispitivanja.

REFERENTNA LITERATURA Većina navedenih metoda razvijena je u okviru programa OECD-a za Smjernice za ispitivanja i treba ih primjenjivati u skladu s načelima dobre laboratorijske prakse, kako bi se osiguralo što je moguće šire međusobno prihvaćanje podataka. Dodatne informacije mogu se naći u referencama navedenim u OECD-ovim smjernicama i drugdje objavljenoj relevantnoj literaturi.

B.1 bis. AKUTNA ORALNA TOKSIČNOST – METODA S FIKSNOM DOZOM

B.1 bis.

1. METODA Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 420 (2001.)

1.

1.1. UVOD Kod tradicionalnih metoda za ocjenjivanje akutne toksičnosti, smrt životinje predstavlja krajnji toksički učinak. 1984. Britansko toksikološko društvo predložilo je novi pristup ispitivanju akutne toksičnosti koji se temelji na primjeni niza fiksnih doza (1). Ovaj pristup nije uključivao smrt životinje kao krajnju točku toksičkog učinka već se umjesto toga temeljio na jasnim znakovima toksičnosti kod primjene jedne od niza fiksnih doza. Nakon britanskih (2) i međunarodnih (3) validacijskih studija in vivo, postupak je 1992. prihvaćen kao ispitna metoda. Kasnije su vrednovana statistička svojstva postupka s fiksnim dozama pomoću matematičkih modela upotrijebljenih u nizu studija (4)(5)(6). I modelske studije i studije in vivo pokazale su da je postupak ponovljiv, da je za njegovu primjenu potreban manji broj životinja, da uzrokuje manje trpljenja nego tradicionalne metode, te da omogućuje rangiranje tvari na sličan način kao i druge razvijene metode za ispitivanje akutne toksičnosti. Upute za odabir najprikladnije ispitne metode za određenu namjenu mogu se naći u Smjernicama za ispitivanje akutne oralne toksičnosti (7). Ovaj dokument isto tako sadrži dodatne informacije o primjeni i tumačenju ispitne metode B.1bis. Načelo ove metode je da se u glavnoj studiji koriste samo blago toksične doze, a da se izbjegava primjena doza za koje se pretpostavlja da bi mogle biti smrtonosne. Isto tako ne treba primjenjivati doze koje uzrokuju znatnu bol ili stres kod životinja zbog nagrizajućeg ili jakog nadražujućeg djelovanja. Životinje koje su na umoru ili životinje koje očito trpe intenzivnu bol ili pokazuju znakove jakog i dugotrajnog stresa humano se usmrćuju, a pri tumačenju rezultata ispitivanja tretiraju se jednako kao i životinje koje su uginule tijekom ispitivanja. Kriteriji za donošenje odluke o usmrćivanju životinja koje su na umoru ili jako trpe i smjernice za prepoznavanje simptoma predvidive ili neminovne smrti navedeni su u zasebnom dokumentu (8). Ova metoda osigurava podatke o opasnim svojstvima i omogućuje rangiranje i klasifikaciju tvari prema Globalno usklađenom sustavu (GHS) za klasifikaciju kemikalija koje uzrokuju akutnu toksičnost (9). Prije početka studije ispitni laboratorij treba razmotriti sve raspoložive podatke o ispitivanoj tvari. Ti podaci uključuju identitet i kemijsku strukturu tvari; njezina fizikalno-kemijska svojstva; rezultate drugih toksikoloških ispitivanja in vitro ili in vivo obavljenih na toj tvari; toksikološke podatke o tvarima koje su joj srodne po strukturi; kao i predviđenu primjenu tvari. Ovi su podaci neophodni kako bi se svim zainteresiranim stranama dokazalo da je ispitivanje važno za zaštitu ljudskog zdravlja, te će pomoći u odabiru odgovarajuće početne doze.

1.2. DEFINICIJE Akutna oralna toksičnost: odnosi se na štetne učinke koji se javljaju nakon primjene jedne doze ispitivane tvari ili nakon nekoliko doza danih unutar 24 sata. Odgođena smrt: znači da unutar 48 sati životinja ne ugine niti pokazuje znakove umiranja, već ugine kasnije tijekom 14-dnevnog razdoblja opažanja. Doza: količina ispitivane tvari koja se primjenjuje. Doza se izražava kao masa ispitivane tvari po jedinici mase pokusne životinje (mg/kg). Evidentna toksičnost: opći naziv koji opisuje jasne znakove toksičnosti nakon primjene ispitivane tvari (vidjeti (3) za primjere) koji su takvi da se kod sljedeće više fiksne doze kod većine životinja može očekivati ili jaka bol i trajni znaci jakog stresa, stanje umiranja (kriteriji su prikazani u Smjernicama za humano usmrćivanje (8)), ili vjerojatna smrt. GHS: Globalno usklađeni sustav klasifikacije kemijskih tvari i mješavina. Zajednički projekt OECD-a (ljudsko zdravlje i okoliš), UN-ovog Odbora stručnjaka za prijevoz opasnih tereta (fizikalno-kemijska svojstva), te ILO-a (obavještavanje o opasnostima), koordiniran Međuorganizacijskim programom za pravilno rukovanje kemikalijama (IOMC). Neminovna smrt: kad se stanje umiranja ili smrt životinje očekuje prije idućeg planiranog vremena opažanja. Simptomi koji ukazuju na ovo stanje kod glodavaca uključuju grčeve, bočni položaj, ležanje i drhtavicu. (Za više pojedinosti vidjeti Smjernice za humano usmrćivanje (8)). LD50 (srednja smrtonosna doza): statistički određena jednokratna doza tvari za koju se očekuje da će kod 50 posto životinja izazvati smrt ako se primjeni oralnim putem. Vrijednost LD50 izražava se kao masa ispitivane tvari po jedinici mase pokusne životinje (mg/kg). Granična doza: odnosi se na gornju graničnu dozu koja se primjenjuje u ispitivanju (2000 ili 5000 mg/kg). Stanje umiranja: kad je životinja na umoru, odnosno kad ne bi mogla preživjeti čak ni da se liječi. (Za više pojedinosti vidjeti Smjernice za humano usmrćivanje (8)). Predvidiva smrt: prisutnost kliničkih znakova koji pokazuju da će smrt nastupiti u znanom budućem vremenu prije planiranog kraja pokusa, na primjer: nesposobnnost životinje da dosegne vodu ili hranu. (Za više pojedinosti vidjeti Smjernice za humano usmrćivanje (8)).

1.3. NAČELO ISPITNE METODE Na skupine životinja istog spola postupno se primjenjuju fiksne doze od 5, 50, 300 i 2000 mg/kg (iznimno može doći u obzir i primjena dodatne fiksne doze od 5000 mg/kg, vidjeti odjeljak 1.6.2). Početna doza odabire se na temelju prethodnih opažanja kao doza za koju se očekuje da će uzrokovati pojavu nekih znakova toksičnosti, ali neće izazvati jaki toksički učinak ili smrtnost. Klinički znakovi i stanja uz koja je vezana izrazita bol, trpljenje i neminovna smrt životinje detaljno su opisani u posebnim Smjernicama OECD-a (8). Na sljedeće skupine životinja mogu se primjenjivati više ili niže fiksne doze, ovisno o prisutnosti ili odsutnosti znakova toksičnsti ili smrtnosti. Ovaj se postupak nastavlja sve dok se ne utvrdi doza koja uzrokuje evidentnu toksičnost ili najviše jednu smrt, odnosno dok se ne utvrdi da nakon primjene najviše doze nema vidljivih toksičkih učinaka, ili pak da najniža doza uzrokuje smrt.

1.4. OPIS ISPITNE METODE

1.4.

1.4.1. Odabir životinjske vrste Najčešće korištena vrsta glodavaca je štakor, iako se mogu koristiti i neke druge vrste. Uobičajeno je koristiti ženke (7). Razlog je tome što je pretraživanjem literature o uobičajenim testovima u kojima se primjenjuje LD50 utvrđeno da razlike u osjetljivosti spolova gotovo da i nema, ali u slučajevima gdje su razlike opažene, ženke općenito pokazuju nešto veću osjetljivost (10). Međutim, ako saznanja o toksikološkim ili toksikokinetičkim svojstvima strukturno srodnih kemikalija ukazuju na to da bi osjetljiviji mogli biti mužjaci, treba koristiti mužjake. Ako se ispitivanja provode na mužjacima, potrebno je navesti razloge za to. U ispitivanjima treba koristiti zdrave mlade odrasle primjerke životinja koje pripadaju najčešće korištenim sojevima laboratorijskih životinja. Treba koristiti ženke koje nisu imale potomstvo i nisu gravidne. Na početku primjene doze svaka životinja treba biti između 8 i 12 tjedana starosti, a njezina masa treba biti u okviru ± 20 % srednje mase životinja kojima je tvar bila dozirana u prijašnjim ispitivanjima.

1.4.2. Uvjeti držanja i hranjenja životinja Temperatura prostorije za držanje pokusnih životinja treba biti 22 °C (± 3 °C). Iako relativna vlažnost zraka treba biti najmanje 30 % i po mogućnosti ne više 70 %, osim za vrijeme čišćenja prostorije, treba je nastojati održavati na 50-60 %. Osvjetljenje treba biti umjetno i mora se u slijedu izmjenjivati 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Što se tiče hranjenja, može se primjenjivati standardna hrana za laboratorijske životinje uz neograničene količine pitke vode. Životinje se mogu u kavezima držati skupno, razvrstane prema dozama, s tim da broj životinja koje se drže u jednom kavezu ne smije ometati nesmetano opažanje svake životinje.

1.4.3. Priprema životinja Životinje se odabiru nasumce, označavaju se kako bi se mogle pojedinačno razlikovati i drže u kavezima barem 5 dana prije početka primjene doza kako bi se prilagodile laboratorijskim uvjetima.

1.4.4. Priprema doza Općenito, ispitivane tvari treba primjenjivati u rasponu doza jednakog volumena, a mijenjati treba koncentraciju pripravka koji se dozira. Međutim, pri ispitivanju nekog tekućeg krajnjeg proizvoda ili mješavine, za kasniju ocjenu opasnosti ispitivane tvari može biti relevantnija primjena te tvari u nerazrijeđenom obliku, tj. pri stalnoj koncentraciji, što neka regulatorna tijela postavljaju kao zahtjev. U svakom slučaju ne smije se prekoračiti maksimalni volumen doze određene za primjenu. Maksimalni volumen tekućine koji se smije odjednom primijeniti ovisi o veličini pokusne životinje. Kod glodavaca, taj volumen obično ne smije biti veći od 1ml/100 g mase životinje: međutim, u slučaju primjene vodenih otopina može doći u obzir i doza od 2 ml/100 g mase životinje. Što se tiče formulacije pripravka koji se dozira, gdje god je moguće preporuča se upotreba vodene otopine/suspenzije/emulzije, a tek onda, po prioritetnom redoslijedu, uljne otopine/suspenzije/emulzije (npr. kukuruzno ulje) ili otopine za koje se koriste drugi nosači. Za sve nosače, osim vode, moraju biti poznata njihova toksikološka svojstva. Doze se moraju pripremati neposredno prije primjene, osim ako se radi o pripravku za koji se zna da će tijekom upotrebe zadržati prihvatljivu stabilnost.

1.5. POSTUPAK

1.5.

1.5.1. Primjena doza Ispitivana se tvar primjenjuje u jednoj dozi oralnom intubacijom pomoću želučane sonde ili odgovarajuće intubacijske kanile. U izvanrednim okolnostima, kada jednokratna primjena doze nije moguća, jedna se doza može dati i u nekoliko manjih dijelova tijekom vremenskog razdoblja ne dužeg od 24 sata. Prije primjene doza životinje trebaju postiti (npr. u slučaju štakora, hranu, ali ne i vodu treba uskratiti preko noći; kod miševa, hranu, ali ne i vodu treba uskratiti na 3-4 sata). Nakon posta životinje treba izvagati te primijeniti ispitivanu tvar. Nakon što se tvar primijeni, hrana se može uskratiti sljedeća 3-4 sata kad su u pitanju štakori ili 1-2 sata kad se radi o miševima. U slučajevima kad se doza primjenjuje u nekoliko manjih dijelova kroz određeno vremensko razdoblje, ovisno o dužini tog razdoblja, moguće je da će životinjama trebati dati hranu i vodu.

1.5.2. Inicijalna studija Svrha inicijalne studije je odabiranje odgovarajuće početne doze za glavnu studiju. Ispitivana tvar se primjenjuje na pojedinačne životinje po redoslijedu prikazanom u dijagramu toka u Dodatku 1. Inicijalna studija završava kada je moguće odrediti početnu dozu (ili ako dođe do smrtnog ishoda već kod najniže fiksne doze). Početna doza za inicijalnu studiju odabire se među fiksnim koncentracijama od 5, 50, 300 i 2000 mg/kg kao doza za koju se očekuje da će izazvati evidentnu toksičnost na temelju dokaza koje, ako je moguće, treba temeljiti na podacima dobivenim ispitivanjima iste kemikalije ili strukturno srodnih kemikalija in vivo i in vitro. Ako takvih informacija nema, za početnu dozu uzima se koncentracija od 300 mg/kg. Između doza koje se primjenjuju na pojedinačne životinje treba napraviti pauzu od najmanje 24 sata. Životinje treba opažati najmanje 14 dana. Iznimno, i samo u slučajevima kad je to opravdavano posebnim regulatornim potrebama, može se razmotriti primjena dodatne, više fiksne doze od 5000 mg/kg (vidjeti Dodatak 3). Zbog brige o dobrobiti životinja, ispitivanje na životinjama u okviru GHS kategorije 5 (2000-5000 mg/kg) ne preporuča se i može doći u obzir samo u slučajevima kad postoji velika vjerojatnost da će rezultati takvog ispitivanja biti od neposrednog značaja za zaštitu ljudskog zdravlja, zdravlja životinja, ili za zaštitu okoliša. U slučajevima kad u okviru inicijalne studije pokusna životinja ugine već kod primjene najniže fiksne doze (5 mg/kg), uobičajeni je postupak da se studija prekine, a ispitivana tvar svrsta u GHS kategoriju 1 (kako je prikazano u Dodatku 1). Međutim, ako je za ovakvu klasifikaciju potrebna dodatna potvrda, može se provesti još jedno dodatno neobvezno ispitivanje, na sljedeći način. Doza od 5 mg/kg primijeni se na još jednu životinju. Ako i ta druga životinja ugine, GHS kategorija 1 se potvrđuje i studija se odmah prekida. Ako druga životinja preživi, doza od 5 mg/kg primjenjuje se na još najviše tri životinje. Zbog visokog stupnja opasnosti od smrtnosti, doza se primjenjuje u slijedu na jednu po jednu životinju, radi zaštite njihove dobrobiti. Vremenski interval između davanja doze svakoj životinji treba biti dovoljno dug da se utvrdi vjerojatnost da će prethodna životinja preživjeti. Ako se dogodi i druga smrt, slijed davanja odmah se prekida i doza se više ne smije primijeniti niti na jednu životinju. Budući da pojava drugog smrtnog slučaja (bez obzira na broj životinja koje se testiraju u vrijeme prekida) spada pod ishod A (dvije ili više smrti) za fiksnu dozu od 5 mg/kg primjenjuje se pravilo klasifikacije iz Dodatka 2. (kategorija 1 u slučaju dviju ili više smrti ili kategorija 2 u slučaju najviše jedne smrti). Osim toga, u Dodatku 4. dane su smjernice za klasificiranje u sustavu EU-a dok se ne počne primjenjivati novi GHS.

1.5.3. Glavna studija

1.5.3.

1.5.3.1. Broj životinja i visina doza Na dijagramu toka u Dodatku 2. prikazano je kako nastaviti s ispitivanjem nakon primjene prve fiksne doze. Treba poduzeti jedan od tri koraka: prekinuti ispitivanje i ispitivanu tvar svrstati u odgovarajuću klasu opasnih tvari, nastaviti ispitivanje s višom fiksnom dozom, ili nastaviti ispitivanje s nižom fiksnom dozom. Međutim, radi zaštite životinja, doza koja je u inicijalnoj studiji uzrokovala smrt životinje u glavnoj se studiji neće primjenjivati (vidjeti Dodatak 2). Iskustvo pokazuje da će najvjerojatniji ishod ispitivanja s početnom dozom biti takav da će se tvar moći klasificirati i da daljnja ispitivanja neće biti potrebna. Za svaku visinu doze koja se ispituje obično se koristi po pet životinja istog spola. Na tu skupinu od pet životinja, koju čini jedna životinja korištena u inicijalnoj studiji i još četiri životinje, primjenjuje se odabrana doza (osim u slučajevima kad neka doza koja se koristi u glavnoj studiji nije bila korištena u inicijalnoj studiji, što nije uobičajeno). Vremenski interval između primjene doza različitih visina određuje se prema početku, trajanju i jačini znakova toksičnosti. Tretiranje životinja sljedećom dozom treba odgoditi dok se ne utvrdi sigurno preživljavanje svih životinja na koje je primijenjena prethodna doza. Preporuča se da između primjene dvije različite doze prođe tri ili četiri dana, prema potrebi, kako bi se mogli uočiti odgođeni simptomi toksičnosti. Taj se vremenski interval može prilagođavati prema potrebi, npr. u slučaju reakcije na temelju koje se ne može donijeti zaključak. Kad se razmatra primjena gornje fiksne doze od 5000 mg/kg, treba slijediti postupak opisan u Dodatku 3. (vidjeti također odjeljak 1.6.2.).

1.5.3.2. Granični test Granični se test prvenstveno koristi u situacijama kad izvoditelj ispitivanja ima informacije koje kazuju da ispitivani materijal vjerojatno nije toksičan, tj. da postaje toksičan samo iznad regulatornih graničnih doza. Informacije o toksičnosti ispitivanog materijala mogu se temeljiti na saznanjima o sličnim ispitanim spojevima ili sličnim ispitanim mješavinama ili proizvodima, uzimajući u obzir identitet i postotak komponenata za koje se zna da su toksikološki značajne. U situacijama kad podataka o toksičnosti ima malo ili ih uopće nema, ili kad se očekuje da će ispitivani materijal biti toksičan, treba obaviti glavni test. Kao granični test u okviru ovih smjernica primjenjuje se uobičajeni postupak, odnosno primjena početne doze za inicijalnu studiju od 2000 mg/kg (ili, iznimno, 5000 mg/kg) iza čega slijedi primjena jednako visoke doze na još četiri životinje.

1.6. OPAŽANJA Nakon primjene doze životinje se pojedinačno opažaju barem jedanput tijekom prvih 30 minuta, povremeno tijekom prva 24 sata, uz posebnu pozornost tijekom prva 4 sata, a zatim jednom dnevno u trajanju od ukupno 14 dana, osim u slučajevima kada je životinju potrebno izlučiti iz studije i humano usmrtiti zbog njezine dobrobiti ili ako se utvrdi smrt životinje. Međutim, trajanje opažanja ne bi smjelo biti strogo određeno. Treba ga utvrditi na temelju toksičkih reakcija, početka i trajanja oporavka i prema potrebi ga se može produžiti. Važno je vrijeme pojave i nestajanja prvih znakova toksičnosti, posebno ako postoji tendencija da se znakovi toksičnosti pojave s odgodom (11). Svi rezultati opažanja sustavno se bilježe, pri čemu se za svaku životinju vodi posebna evidencija. Dodatna opažanja bit će potrebna ako životinje nastave pokazivati znakove toksičnosti. Treba opažati promjene na koži i dlaci, očima i sluznicama, na dišnom i cirkulacijskom sustavu, te na autonomnom i centralnom živčanom sustavu, kao i promjene u somatomotoričkoj aktivnosti i obrascu ponašanja. S posebnom pozornošću treba opažati drhtavicu, grčeve, slinjenje, proljev, otupjelost, san i komu. Treba poštovati načela i kriterije navedene u Smjernicama za humano usmrćivanje (8). Životinje za koje se utvrdi da su u stanju umiranja i životinje koje pokazuju da trpe jake bolove ili dugotrajni stres treba humano usmrtiti. U slučajevima kad se životinja usmrćuje iz humanih razloga, ili se utvrdi njezina smrt, vrijeme smrti treba što točnije zabilježiti.

1.6.

1.6.1. Tjelesna masa Pojedinačnu masu životinja treba utvrditi neposredno prije primjene ispitivane tvari, a nakon tog najmanje jednom tjedno. Promjene u masi treba izračunati i zabilježiti. Na kraju ispitivanja preživjele se životinje izvažu i potom humano usmrte.

1.6.2. Patologija Sve pokusne životinje (uključujući i one koje uginu za vrijeme ispitivanja ili ih se izluči iz studije zbog zaštite dobrobiti životinja) treba podvrgnuti obdukciji. Za svaku životinju treba zabilježiti sve veće patološke promjene. Treba razmotriti i mogućnost obavljanja mikroskopskog pregleda organa životinja koje su nakon primjene prve doze preživjele 24 ili više sati i na kojima su obdukcijom utvrđene velike patološke promjene, budući da se na taj način mogu prikupiti korisne informacije.

2. PODACI Treba prikupiti podatke o svakoj pojedinačnoj životinji. Osim toga, sve podatke treba rezimirati u obliku tablice u kojoj će za svaku ispitnu skupinu biti naveden broj upotrijebljenih životinja, broj životinja koje su pokazale znakove toksičnosti, broj životinja kod kojih je tijekom ispitivanja utvrđena smrt ili su iz humanih razloga bile usmrćene, vrijeme smrti svake pojedinačne životinje, te opis i vremenski tijek toksičkih učinaka i reverzibilnosti, kao i nalazi obdukcije.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijedeće informacije, prema potrebi:

ispitivana tvar:

fizikalni oblik, čistoća i, tamo gdje je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (uključujući izomerizaciju),

identifikacijski podaci, uključujući CAS broj.

Nosač (prema potrebi):

obrazloženje za odabir nosača, ako se ne radi o vodi.

Pokusne životinje:

upotrijebljena vrsta/soj,

mikrobiološki status životinje, ako je poznat,

broj, starost i spol životinja (uključujući, prema potrebi, razloge za korištenje mužjaka umjesto ženki),

podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.

Uvjeti ispitivanja:

pojedinosti o formulaciji ispitivane tvari, uključujući pojedinosti o fizikalnom obliku primijenjenog materijala,

pojedinosti o primjeni ispitivane tvari koji uključuju volumene doza i vrijeme njihove primjene,

pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uključujući pojedinosti o vrsti i izvoru vode),

obrazloženje za odabir početne doze.

Rezultati:

tablični prikaz podataka o reakcijama i visini doza za svaku životinju (npr. životinje koje pokazuju znakove toksičnosti, uključujući smrtnost, te prirodu, jačinu i trajanje toksičkog učinka),

tablični prikaz tjelesne mase i promjena u tjelesnoj masi,

masa pojedinačnih životinja na dan primjene doze, zatim u tjednim intervalima, te u vrijeme smrti ili usmrćivanja,

datum i vrijeme smrti, ako do nje dođe prije planiranog usmrćivanja,

vrijeme pojavljivanja znakova toksičnosti i jesu li ti znakovi bili reverzibilni kod svake životinje,

nalazi obdukcije i histopatološki nalazi za svaku životinju, ako su dostupni.

Diskusija i tumačenje rezultata.

Zaključci.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)

REFERENCE: British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984) Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, str. 85-92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O (1987) Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol.‚ 6, str. 279-291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P (1990) The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, str. 469-482. Whitehead, A. and Curnow, R.N (1992) Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, str. 313-324. Stallard, N. and Whitehead, A (1995) Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, str. 315-323. Stallard, N., Whitehead, A and Ridgeway, P. (2002) Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, str. 183-196. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment No 19. OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, str. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/ home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C (1995) Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, str. 223-231. Chan P.K and A. W Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd. New York, USA.

B.1 tris. AKUTNA ORALNA TOKSIČNOST – METODA UTVRĐIVANJA KLASA AKUTNE TOKSIČNOSTI

B.1 tris.

1. METODA Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 423 (2001.)

1.

1.1. UVOD Metoda utvrđivanja klasa akutne oralne toksičnosti (1) prikazana u ovom ispitivanju fazni je postupak u kojemu se u svakoj fazi koriste po tri životinje istog spola. Za utvrđivanje toksičnosti ispitivane tvari u prosjeku mogu biti potrebne dvije do četiri faze, što ovisi o tome kad će kod životinje nastupiti smrt i/ili stanje umiranja. Ovaj je postupak ponovljiv, za njega se koristi vrlo mali broj životinja i omogućuje rangiranje tvari na sličan način kao i ostale metode ispitivanja akutne toksičnosti. Metoda utvrđivanja klasa akutne toksičnosti temelji se na biometrijskim procjenama (2)(3)(4)(5) s fiksnim dozama, koje su na primjeren način odvojene kako bi se omogućilo rangiranje tvari u svrhu klasifikacije i procjene opasnosti. Nakon usvajanja 1996. provedena je obimna validacija ove metode in vivo uz korištenje usporednih podataka o LD50 dobivenih iz literature, kako na nacionalnoj (6) tako i na međunarodnoj razini (7). Upute za odabir najprimjerenije ispitne metode za određenu svrhu mogu se pronaći u Smjernicama za ispitivanje akutne oralne toksičnosti (Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing) (8). Taj dokument sadrži i dodatne informacije o provođenju i tumačenju rezultata ispitne metode B.1tris. Ispitivane tvari ne treba primjenjivati u dozama za koje je poznato da uzrokuju znatnu bol i stres zbog nagrizajućeg i izrazito nadražujućeg djelovanja. Životinje koje su na umoru, odnosno životinje koje očito trpe jake bolove ili pokazuju znakove jakog i dugotrajnog stresa treba humano usmrtiti, a pri tumačenju rezultata ispitivanja tretirati jednako kao i životinje koje su uginule tijekom ispitivanja. Kriteriji za donošenje odluke o usmrćivanju životinja koje su na umoru ili jako trpe i upute o prepoznavanju predvidive ili neminovne smrti, predmet su zasebnog dokumenta sa smjernicama (9). U metodi se koriste unaprijed određene doze, a rezultati omogućuju da se tvar rangira i klasificira prema Globalnom usklađenom sustavu za razvrstavanje kemikalija koje uzrokuju akutnu toksičnost (10). U načelu ova metoda nije predviđena za točno izračunavanje LD50, ali ona omogućuje utvrđivanje definiranog raspona izloženosti kod kojega se očekuje smrtnost, budući da smrt određenog broja životinja još uvijek predstavlja glavnu završnu točku ovog ispitivanja. Metoda dozvoljava utvrđivanje vrijednosti LD50 samo u slučajevima kad najmanje dvije doze rezultiraju smrtnošću višom od 0 % i nižom od 100 %. Upotreba odabranih unaprijed utvrđenih doza, neovisno o ispitnoj tvari, uz klasifikaciju koja je izričito povezana s brojem životinja opažanih u različitim stanjima pruža laboratorijima bolje mogućnosti u pogledu ponovljivosti i dosljednosti pri izvještavanju. Prije početka studije ispitni laboratorij mora razmotriti sve informacije o ispitivanoj tvari. Te informacije uključuju identitet i kemijsku strukturu tvari, njezina fizikalno-kemijska svojstva, rezultate bilo kojih drugih in vivo ili in vitro ispitivanja toksičnosti te tvari, toksikološke podatke o strukturno srodnim tvarima, kao i predviđenu primjenu tvari. Te su informacije neophodne kako bi se sve zainteresirane strane uvjerile da je predmetno ispitivanje relevantno za zaštitu ljudskog zdravlja i da će pomoći pri odabiru najprikladnije početne doze.

1.2. DEFINICIJE Akutna oralna toksičnost: odnosi se na štetne učinke koji se javljaju nakon primjene prve doze ispitivane tvari ili nakon nekoliko doza danih unutar 24 sata. Odgođena smrt: znači da životinja ne ugine niti se čini da je na umoru unutar 48 sati, već ugine kasnije tijekom 14-dnevnog razdoblja opažanja. Doza: količina ispitivane tvari koja se primjenjuje. Doza se izražava kao masa ispitivane tvari po jedinici mase pokusne životinje (mg/kg). GHS: Globalno usklađeni sustav klasifikacije kemijskih tvari i mješavina. Zajednički projekt OECD-a (ljudsko zdravlje i okoliš), UN-ovog Odbora stručnjaka za prijevoz opasnih tereta (fizikalno-kemijska svojstva), te ILO-a (obavještavanje o opasnostima), koordiniran Međuorganizacijskim programom za pravilno rukovanje kemikalijama (IOMC). Neminovna smrt: kad se stanje umiranja ili smrt životinje očekuje prije idućeg planiranog vremena opažanja. Simptomi koji ukazuju na ovo stanje kod glodavaca uključuju grčeve, bočni položaj, ležanje i drhtavicu. (Za više pojedinosti vidjeti Smjernice za humano usmrćivanje (9)). LD50 (srednja smrtonosna doza): statistički određena jednokratna doza tvari za koju se očekuje da će kod 50 posto životinja izazvati smrt ako se primjeni oralnim putem. Vrijednost LD50 izražava se kao masa ispitivane tvari po jedinici mase pokusne životinje (mg/kg). Granična doza: odnosi se na gornju graničnu dozu koja se primjenjuje u ispitivanju (2000 ili 5000 mg/kg). Stanje umiranja: kad je životinja na umoru, odnosno kad ne može preživjeti čak ni ako se tretira (Za više pojedinosti vidjeti Smjernice za humano usmrćivanje (9)). Predvidiva smrt: prisutnost kliničkih znakova koji ukazuju na smrt koja će nastupiti u znanom budućem vremenu prije planiranog kraja pokusa, na primjer: nemogućnost životinje da dosegne vodu ili hranu. (Za više pojedinosti vidjeti Smjernice za humano usmrćivanje (9)).

1.3. NAČELO ISPITIVANJA Načelo ovog ispitivanja je da se na temelju faznog postupka uz upotrebu minimalnog broja životinja u svakoj fazi dobije dovoljna količina informacija o akutnoj toksičnosti ispitivane tvari koja će omogućiti klasifikaciju te tvari. Tvar se oralno daje skupini pokusnih životinja u jednoj od utvrđenih doza. Tvar se ispituje uz primjenu faznog postupka kod kojega se u svakoj fazi koriste po tri životinje istog spola (obično ženke). Izostanak ili prisutnost smrtnosti životinja na koje je doza bila primijenjena u jednoj fazi odredit će sljedeću fazu, npr.: Pojedinosti o ispitnom postupku navedene su u Dodatku 1. Ova metoda omogućuje procjenu u svrhu klasifikacije ispitivane tvari u jednu od klasa toksičnosti utvrđenih na temelju fiksne granične vrijednosti LD50.

daljnje ispitivanje nije potrebno,

primjena jednake doze na sljedeće tri životinje,

primjena sljedeće više ili sljedeće niže doze na sljedeće tri životinje.

1.4. OPIS METODE

1.4.

1.4.1. Odabir životinjske vrste Najprimjerenija vrsta glodavaca je štakor, iako se mogu koristiti i neke druge vrste glodavaca. Uobičajeno je koristiti ženke (9). Razlog je tome što je pretraživanjem literature o uobičajenim testovima u kojima se primjenjuje LD50 utvrđeno da razlike u osjetljivosti spolova gotovo da i nema, ali u slučajevima gdje su razlike opažene, ženke općenito pokazuju nešto veću osjetljivost (11). Međutim, ako saznanja o toksikološkim ili toksikokinetičkim svojstvima strukturno srodnih kemikalija ukazuju na to da bi osjetljiviji mogli biti mužjaci, treba koristiti mužjake. Ako se ispitivanja provode na mužjacima, treba navesti razloge za njihovo korištenje. U ispitivanjima treba koristiti zdrave mlade odrasle primjerke životinja koje pripadaju najčešće korištenim sojevima laboratorijskih životinja. Treba koristiti ženke koje nisu imale potomstvo i nisu gravidne. Na početku primjene doza svaka životinja treba biti između 8 i 12 tjedana starosti, a njezina masa treba biti u okviru ± 20 % srednje mase svih prethodno testiranih životinja.

1.4.2. Uvjeti držanja i hranjenja životinja Temperatura prostorije za držanje pokusnih životinja treba biti 22 °C (± 3 °C). Iako relativna vlažnost zraka treba biti barem 30 % i po mogućnosti ne prelaziti 70 %, osim za vrijeme čišćenja prostorije, treba je nastojati održavati na 50-60 %. Osvjetljenje treba biti umjetno i mora se u slijedu izmjenjivati 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Što se tiče hranjenja, može se primjenjivati standardna hrana za laboratorijske životinje uz neograničene količine pitke vode. Životinje se mogu u kavezima držati skupno, razvrstane prema primijenjenim dozama, ali broj životinja koji se drži u jednom kavezu ne smije ometati nesmetano opažanje svake životinje.

1.4.3. Priprema životinja Životinje se nasumce odabiru, označavaju, kako bi se mogle pojedinačno razlikovati, i drže u kavezima barem 5 dana prije početka primjene doza da bi se prilagodile laboratorijskim uvjetima.

1.4.4. Priprema doza Općenito, ispitivane tvari treba primjenjivati u rasponu doza jednakog volumena, a mijenjati treba koncentraciju pripravka koji se dozira. Međutim, kada treba testirati neki tekući krajnji proizvod ili mješavinu, za kasniju ocjenu opasnosti ispitivane tvari relevantnija može biti primjena te tvari u nerazrijeđenom obliku, tj. pri stalnoj koncentraciji, a neka regulatorna tijela takvu primjenu postavljaju kao zahtjev. U svakom slučaju, kod primjene se ne smije prekoračiti maksimalni volumen doze. Maksimalni volumen tekućine koji se smije odjednom primijeniti ovisi o veličini pokusne životinje. Kod glodavaca, taj volumen obično ne smije biti veći od 1 ml/100 g mase životinje: međutim, u slučaju primjene vodenih otopina može doći u obzir i doza od 2 ml/100 g mase životinje. Što se tiče formulacije pripravka koji se dozira, gdje god je moguće preporuča se upotreba vodene otopine/suspenzije/emulzije, a tek onda, po prioritetnom redoslijedu, uljne otopine/suspenzije/emulzije (npr. kukuruzno ulje) ili otopine za koje se koriste drugi nosači. Za sve nosače, osim vode, moraju biti poznata njihova toksikološka svojstva. Doze se moraju pripremati neposredno prije primjene, osim ako se radi o pripravku za koji se zna da će tijekom upotrebe zadržati prihvatljivu stabilnost.

1.5. POSTUPAK

1.5.

1.5.1. Primjena doza Ispitivana se tvar primjenjuje u jednoj dozi oralnom intubacijom pomoću želučane sonde ili odgovarajuće intubacijske kanile. U izvanrednim okolnostima, kad jednokratna primjena doze nije moguća, jedna se doza može dati i razdijeljena u nekoliko manjih dijelova tijekom vremenskog razdoblja ne dužeg od 24 sata. Prije primjene doza životinje trebaju postiti (npr. u slučaju štakora, hranu, ali ne i vodu treba uskratiti preko noći; kod miševa, hranu, ali ne i vodu treba uskratiti na 3-4 sata). Nakon posta životinje treba izvagati te primijeniti ispitivanu tvar. Nakon što se tvar primijeni, hrana se može uskratiti sljedeća 3-4 sata kod štakora ili 1-2 sata kod miševa. U slučajevima kad se doza primjenjuje u nekoliko manjih dijelova kroz određeno vremensko razdoblje, ovisno o dužini tog razdoblja možda će biti potrebno životinjama dati hranu i vodu.

1.5.2. Broj životinja i visina doza U svakoj se fazi koriste po tri životinje. Doza koja će se koristiti kao početna doza odabire se između četiri fiksne doze od 5, 50, 300 i 2000 mg/kg tjelesne mase. Početna doza treba biti ona za koju je najvjerojatnije da će prouzročiti smrtnost nekih od životinja na koje se primijeni. Dijagrami toka iz Dodatka 1. opisuju postupak koji treba provesti za svaku od početnih doza. Osim toga, u Dodatku 4. dane su smjernice za klasifikaciju u sustavu EU-a, dok se ne počne primjenjivati novi GHS. Kad se iz raspoloživih informacija može zaključiti da smrtnost pri najvišoj početnoj dozi (2000 mg/kg tjelesne mase) nije vjerojatna, treba obaviti granični test. Ako o tvari koju treba ispitati nema nikakvih informacija, radi dobrobiti životinja preporuča se primjena početne doze od 300 mg/kg tjelesne mase. Vremenski interval između tretiranja dviju skupina ovisi o nastupu, trajanju i jačini znakova toksičnosti. Tretiranje životinja sljedećom dozom treba odgoditi dok nije sigurno preživljavanje životinja koje su primile prethodnu dozu. Iznimno, i samo u slučajevima kad je to opravdavano posebnim regulatornim potrebama, može se razmotriti primjena dodatne, više fiksne doze od 5000 mg/kg (vidjeti Dodatak 2). Zbog brige o dobrobiti životinja, ispitivanje na životinjama u okviru GHS kategorije 5 (2000-5000 mg/kg) ne preporuča se i može doći u obzir samo u slučajevima kad postoji velika vjerojatnost da će rezultati takvog ispitivanja biti od neposrednog značaja za zaštitu ljudskog zdravlja, zdravlja životinja, ili za zaštitu okoliša.

1.5.3. Granični test Granični se test prvenstveno koristi u situacijama kad izvoditelj ispitivanja ima informacije koje kazuju da ispitivani materijal vjerojatno nije toksičan, tj. da postaje toksičan samo iznad regulatornih graničnih doza. Informacije o toksičnosti ispitivanog materijala mogu se temeljiti na saznanjima o sličnim ispitivanim spojevima ili sličnim ispitivanim mješavinama ili proizvodima, uzimajući u obzir identitet i postotak komponenata za koje se zna da su toksikološki značajne. U situacijama kad podataka o toksičnosti ima malo ili ih uopće nema, ili kada se očekuje da će ispitivani materijal biti toksičan, treba obaviti glavni test. Granični test uz primjenu jedne doze od 2000 mg/kg tjelesne mase može se obaviti na šest životinja (po tri životinje u svakoj fazi). Iznimno se može obaviti granični test uz primjenu jedne doze od 5000 mg/kg na tri životinje (vidjeti Dodatak 2.). Ako ispitivana tvar uzrokuje smrt životinje, možda će biti potrebno daljnje ispitivanje sa sljedećom nižom dozom.

1.6. OPAŽANJA Nakon primjene doze životinje se opažaju pojedinačno, barem jedanput tijekom prvih 30 minuta, periodično tijekom prva 24 sata, uz posebnu pozornost tijekom prva 4 sata, a zatim jednom dnevno u trajanju od ukupno 14 dana, osim u slučajevima kada je životinju potrebno izlučiti iz studije i humano usmrtiti zbog njezine dobrobiti ili ako se utvrdi smrt životinje. Međutim, trajanje opažanja ne bi smjelo biti strogo određeno. Treba ga utvrditi na temelju toksičkih reakcija, početka i trajanja oporavka i prema potrebi ga se može produžiti. Važno je vrijeme pojave i nestajanja prvih znakova toksičnosti, posebno ako postoji tendencija da se znakovi toksičnosti pojave kasnije (12). Svi se rezultati opažanja sustavno bilježe, pri čemu se o svakoj životinji vode posebni zapisi. Dodatna opažanja bit će potrebna ako životinje nastave pokazivati znakove toksičnosti. Treba opažati promjene na koži i dlaci, očima i sluznicama, na dišnom i cirkulacijskom sustavu, te na autonomnom i centralnom živčanom sustavu, kao i promjene u somatomotoričkoj aktivnosti i ponašanju. S posebnom pozornošću treba opažati drhtavicu, grčeve, slinjenje, proljev, otupjelost, san i komu. Treba poštovati načela i kriterije navedene u Smjernicama za humano usmrćivanje (9). Životinje za koje se utvrdi da su u stanju umiranja i životinje koje pokazuju da trpe jake bolove ili dugotrajni stres treba humano usmrtiti. U slučajevima kad se životinje usmrćuje iz humanih razloga ili se utvrdi njihova smrt, vrijeme smrti treba zabilježiti što točnije.

1.6.

1.6.1. Tjelesna masa Pojedinačnu masu životinja treba utvrditi neposredno prije primjene ispitivane tvari, a nakon toga najmanje jednom tjedno. Promjene u masi treba izračunati i zabilježiti. Na kraju ispitivanja preživjele se životinje izvažu i potom humano usmrte.

1.6.2. Patologija Sve pokusne životinje (uključujući i one koje uginu za vrijeme ispitivanja ili ih se izluči iz studije zbog njihove dobrobiti) treba podvrgnuti obdukciji. Za svaku životinju posebno treba zabilježiti sve veće patološke promjene. Treba razmotriti i mogućnost obavljanja mikroskopskog pregleda organa životinja koje su nakon primjene prve doze preživjele 24 ili više sati i na kojima su obdukcijom utvrđene velike patološke promjene, budući da se na taj način mogu prikupiti korisne informacije.

2. PODACI Treba prikupiti podatke za svaku pojedinačnu životinju. Osim toga, sve podatke treba rezimirati u obliku tablice u kojoj će za svaku ispitnu skupinu biti naveden broj upotrijebljenih životinja, broj životinja koje su pokazale znakove toksičnosti, broj životinja kod kojih je tijekom ispitivanja utvrđena smrt ili su bile usmrćene iz humanih razloga, vrijeme smrti svake pojedinačne životinje, te opis i vremenski tijek toksičkih učinaka i reverzibilnosti, kao i nalazi obdukcije.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. Izvješće o ispitivanju Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijedeće informacije, prema potrebi:

ispitivana tvar:

fizikalni oblik, čistoća i, tamo gdje je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (uključujući izomerizaciju),

identifikacijski podaci, uključujući CAS broj.

Nosač (prema potrebi):

obrazloženje za odabir nosača, ako se ne radi o vodi.

Pokusne životinje:

upotrijebljena vrsta/soj,

mikrobiološki status životinje, ako je poznat,

broj, starost i spol životinja (uključujući, prema potrebi, razloge za korištenje mužjaka umjesto ženki),

podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.

Uvjeti ispitivanja:

pojedinosti o formulaciji ispitivane tvari, uključujući pojedinosti o fizikalnom obliku materijala koji se primjenjivao,

pojedinosti o primjeni ispitivane tvari koji uključuju volumene doza i vrijeme doziranja,

pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uključujući pojedinosti o vrsti i izvoru vode),

obrazloženje za odabir početne doze.

Rezultati:

tablični prikaz podataka o reakcijama i visini doza za svaku životinju (npr. životinje koje pokazuju znakove toksičnosti, uključujući smrtnost, te priroda, jačina i trajanje toksičkog učinka),

tablični prikaz tjelesne mase i promjena u tjelesnoj masi,

masa pojedinačnih životinja na dan primjene doze, zatim u tjednim intervalima, te u vrijeme smrti ili usmrćivanja,

datum i vrijeme smrti, ako do nje dođe prije planiranog usmrćivanja,

vrijeme pojavljivanja znakova toksičnosti i jesu li ti znakovi bili reverzibilni kod svake životinje,

nalazi obdukcije i histopatološki nalazi za svaku životinju, ako su dostupni.

Diskusija i tumačenje rezultata.

Zaključci.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)

REFERENCE: Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D (1986) New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, str. 86. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D (1989) Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, str. 336-341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E (1994) The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, str. 559-610. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., (1995) The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, str. 729-734. Diener W., and Schlede E., (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, str. 129-134. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D., (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method — An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D., (1994) The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, str. 659-670. OECD, (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris. OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, str. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R. L., Cotruvo, J.A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel K. A., Walker A. P., Chu I.; Goddard M., Segal L., Springer J. A. and Myers R. C. (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, str. 223-231. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

B.2. AKUTNA TOKSIČNOST (INHALACIJSKA)

B.2.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Korisno je imati preliminarne podatke o tvari kao što su raspored veličine čestica, tlak para, talište, vrelište, točka zapaljenja i eksplozivnost (ako je tvar eksplozivna). Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (A).

1.2. DEFINICIJE Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (B).

1.3. REFERENTNE TVARI Nema ih.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Nekoliko se skupina pokusnih životinja izlaže kroz određeno vremensko razdoblje ispitivanoj tvari u postupno sve većim koncentracijama, pri čemu se na jednu skupinu životinja primjenjuje jedna koncentracija. Nakon tog opažaju se učinci i smrtnost. Životinje koje uginu tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a po završetku ispitivanja životinje koje su preživjele ispitivanja usmrćuju se i obduciraju. Životinje koje pokazuju izrazite znakove stresa i boli treba na humani način usmrtiti. Ispitivane tvari ne smije se dozirati na način za koji se zna da životinjama uzrokuje znatnu bol i stres zbog snažnih nagrizajućih i nadražujućih svojstava tvari.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6.

1.6.1. Priprema Životinje se drže i hrane u pokusnim uvjetima najmanje pet dana prije pokusa. Prije ispitivanja zdrave mlade životinje nasumce se odabiru i raspoređuju u potreban broj skupina. Prethodno ih ne treba podvrgavati simuliranom izlaganju, ako to ne nalaže vrsta izloženosti i aparat koji se pri tom koristi. Kod krutih ispitivanih tvari može biti potrebna mikronizacija da bi se dobile čestice odgovarajuće veličine. Tamo gdje je to potrebno ispitivanoj tvari može se dodati odgovarajući nosač koji će omogućiti da se u atmosferi stvori odgovarajuća koncentracija ispitivane tvari, i u tom slučaju se koristi kontrolna skupina životinja za ispitivanje otapala. Ako se radi lakšeg doziranja upotrebljava nosač ili neki drugi dodaci, za njih se mora pouzdano znati da nemaju toksičko djelovanje.

1.6.2. Uvjeti ispitivanja

1.6.2.

1.6.2.1. Pokusne životinje Ako ne postoje kontraindikacije, preporuča se korištenje štakora. Treba koristiti sojeve koji se obično koriste u laboratorijima. Kod svakog spola na početku ispitivanja raspon težina životinja ne smije varirati za više od ± 20 % od odgovarajuće srednje vrijednosti.

1.6.2.2. Broj i spol Za ispitivanje svake razine koncentracije koristi se barem 10 glodavaca (pet ženki i pet mužjaka). Treba koristiti ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. Napomena: kod ispitivanja akutne toksičnosti na životinjama višeg reda od glodavaca, treba razmotriti upotrebu manjeg broja životinja. Treba pažljivo odabrati doze i poduzeti sve što je moguće da se ne premaše umjereno toksične doze. Kod takvih ispitivanja primjenu smrtonosnih doza ispitivane tvari treba izbjegavati.

1.6.2.3. Koncentracije pri izlaganju Potreban je dovoljan broj izlaganja, najmanje tri, u odgovarajućim vremenskim intervalima, kako bi se dobile ispitne skupine kod kojih se uočavaju različiti toksički učinci i stope smrtnosti. Ti podaci trebaju biti dovoljni da se na temelju njih napravi krivulja smrtnosti u ovisnosti o koncentracijama i, tamo gdje je to moguće, da se utvrdi vrijednost LC50.

1.6.2.4. Granični test Ako izloženost pokusnih životinja, od kojih je pet mužjaka i pet ženki, dozi od 20 mg po litri plina, ili 5 mg po litri aerosola, ili krutih čestica, u trajanju od četiri sata (ili ako tu koncentraciju nije moguće postići zbog fizikalnih ili kemijskih svojstava ispitivane tvari, koja uključuju i eksplozivnost, nakon izloženosti maksimalnoj koncentraciji koju je moguće postići) ne uzrokuje smrtnost vezanu uz ispitivani spoj u roku 14 dana, daljnje se ispitivanje ne smatra potrebnim (18. ATP, Dir. 93/21/EEZ, Ll10/93).

1.6.2.5. Vrijeme izloženosti Vrijeme izloženosti treba biti 4 sata.

1.6.2.6. Oprema Životinje treba testirati pomoću inhalacijske opreme čija konstrukcija omogućuje protok zraka s najmanje 12 potpunih izmjena u jednom satu, kako bi se osigurao odgovarajući sadržaj kisika i atmosfera u kojoj je tvar kojoj se životinja izlaže jednakomjerno raspoređena. Ako se za ispitivanje koristi komora, njezina konstrukcija treba omogućiti minimalnu naguranost životinja i maksimalnu inhalacijsku izloženost ispitivanoj tvari. Da bi se osigurala stabilnost atmosfere u komori, primjenjuje se opće pravilo da ukupan volumen pokusne životinje ne smije biti veći od 5 % volumena ispitne komore. Mogu se koristiti različiti tipovi komora koji omogućuju izloženost samo oro-nazalnih (usno-nosnih) otvora, samo glave ili čitavog tijela pojedinačne životinje; prva dva tipa omogućuju da se unošenje ispitivane tvari u organizam životinje drugim putevima svede na minimum.

1.6.2.7. Vrijeme opažanja Opažanje treba trajati najmanje 14 dana. Međutim, trajanje pojedinačnih opažanja ne treba biti strogo određeno. Treba ga odrediti na temelju toksičkih reakcija, brzine njihova pojavljivanja i vremena potrebnog za oporavak; tako se u slučaju potrebe vrijeme opažanja može produžiti. Vrijeme pojavljivanja ili nestajanja znakova toksičnosti i vrijeme smrti su važni, posebno ako postoji tendencija kasnijeg nastupanja smrti.

1.6.3. Postupak Neposredno prije izlaganja životinje treba izvagati i potom izložiti ispitnoj koncentraciji u trajanju od četiri sata u za to predviđenoj napravi, nakon uspostavljanja ujednačene koncentracije u komori. Vrijeme ujednačavanja koncentracije mora biti kratko. Temperaturu na kojoj se obavlja ispitivanje treba održavati na 22 ± 3 °C. Relativnu je vlažnost najbolje održavati između 30 % i 70 %, ali u nekim slučajevima (npr. pri ispitivanju nekih aerosola) to može biti neizvedivo. Održavanje laganog podtlaka u komori (≥ 5 mm H2O) spriječit će istjecanje ispitivane tvari u okolni prostor. Za vrijeme izloženosti životinjama se ne smije davati hrana i voda. Za uspostavljanje i praćenje ispitne atmosfere treba koristiti odgovarajuće sustave. Takav sustav treba osigurati postizanje stabilnih uvjeta izloženosti u što kraćem vremenu. Konstrukcija i način upravljanja komorom trebaju omogućiti održavanje homogene distribucije ispitne atmosfere unutar komore: Treba mjeriti i pratiti: Tijekom izloženosti životinja obavlja se sustavno opažanje i bilježenje rezultata opažanja; za svaku životinju treba voditi zasebnu evidenciju. Tijekom prvog dana opažanja trebaju biti česta. Temeljiti klinički pregled treba obaviti najmanje jednom svakog radnog dana, druga opažanja treba obavljati jednom dnevno, uz poduzimanje odgovarajućih mjera kako bi se gubitak životinja u studiji sveo na minimum, npr. obdukcija ili pohranjivanje uginulih životinja u hladnjak i izolacija ili usmrćivanje slabih životinja i životinja na umoru. Treba opažati promjene na koži i dlaci, očima i sluznicama, na dišnom i cirkulacijskom sustavu, te na autonomnom i centralnom živčanom sustavu, kao i promjene u somatomotoričkoj aktivnosti i ponašanju. S posebnom pozornošću treba opažati promjene u disanju, drhtavicu, grčeve, slinjenje, proljev, otupjelost, san i komu. Vrijeme smrti treba zabilježiti što preciznije. Pojedinačnu masu životinja treba mjeriti svaki tjedan nakon izlaganja, i kad nastupi smrt. Životinje koje uginu tijekom ispitivanja i one koje prežive do kraja ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, pri čemu se posebna pozornost posvećuje svim promjenama u gornjem i donjem dišnom traktu. Sve veće patološke promjene treba zabilježiti. Kad za to postoje indikacije, treba uzeti uzorak tkiva za histopatološki pregled.

1.6.3.

(a) brzinu protoka zraka (neprekidno);

(b) stvarnu koncentraciju ispitivane tvari koja se mjeri u zoni disanja najmanje tri puta tijekom izlaganja (neke vrste atmosfere, npr. aerosole visokih koncentracija, može biti potrebno mjeriti češće). Tijekom razdoblja izlaganja koncentracija ne smije varirati za više od ± 15 % srednje vrijednosti. Međutim, kod nekih aerosola ovu razinu kontrole može biti nemoguće postići i u takvim je slučajevima prihvatljiv veći raspon. Kod aerosola analizu veličine čestica treba raditi onoliko često koliko je to potrebno (najmanje jednom za svaku pokusnu skupinu);

2. PODACI Podatke treba rezimirati u obliku tablice u kojoj će za svaku ispitnu skupinu biti naveden broj životinja na početku ispitivanja, vrijeme smrti svake životinje, broj životinja koje pokazuju druge znakove toksičnosti, opis toksičkih učinaka i nalazi obdukcije. Ako životinja preživi duže od jednog dana, moraju se izračunati i zabilježiti promjene u masi. Životinje koje se humano usmrte zbog stresa i boli izazvanih ispitivanom tvari svrstavaju se pod slučajeve smrti povezane s tom tvari. LC50 treba utvrditi prema nekoj od priznatih metoda. Ocjena podataka treba uključivati odnos, ako postoji, između izloženosti životinje ispitivanoj tvari i pojave i ozbiljnosti svih abnormalnih pojava, uključujući abnormalnosti u ponašanju i kliničke abnormalnosti, velike lezije, promjene u tjelesnoj masi, smrtnost i druge toksičke učinke.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju treba, ako je moguće, sadržavati slijedeće informacije: Podaci o izlaganju Ovi podaci trebaju biti navedeni u obliku tablice i prikazani kao srednje vrijednosti i mjera varijabilnosti (npr. standardno odstupanje) i po mogućnosti uključivati sljedeće:

vrsta, soj, podrijetlo, okolišni uvjeti, prehrana itd.,

uvjeti ispitivanja: opis naprave za izlaganje, uključujući konstrukciju, tip, dimenzije, izvor zraka, sustav za proizvodnju aerosola, metodu kondicioniranja zraka i metodu smještanja životinja u ispitnoj komori u slučaju da se ona koristi. Treba opisati opremu za mjerenje temperature, vlažnosti, te koncentracije i raspoređenosti veličine čestica aerosola.

3.1.

(a) brzina protoka zraka kroz inhalacijsku opremu;

(b) temperatura i vlažnost zraka

(c) nazivne koncentracije (ukupna količina ispitivane tvari koja se stavlja u inhalacijsku opremu podijeljena s volumenom zraka);

(d) vrsta nosača, ako je upotrijebljen;

(e) stvarne koncentracije u ispitnoj zoni disanja;

(f) srednji aerodinamični promjer čestica (MMAD) i geometrijska standardna devijacija (GSD);

(g) razdoblje ujednačavanja koncentracije;

(h) razdoblje izloženosti;

tabelarni prikaz podataka po spolu i razini izloženosti (tj. broj životinja uginulih ili usmrćenih tijekom ispitivanja, broj životinja koje pokazuju znakove toksičnosti, broj izloženih životinja),

vrijeme smrti tijekom ili nakon izloženosti, razlozi i kriteriji za humano usmrćivanje životinja,

sva opažanja,

vrijednost LC50 utvrđena za svako razdoblje opažanja (navedenom metodom izračunavanja),

interval 95 %-tne pouzdanosti za LC50 (kad ga je moguće navesti)

krivulja doze i smrtnosti i nagib krivulje (gdje to dopušta metoda određivanja),

nalazi obdukcije,

svi histopatološki nalazi,

diskusije o rezultatima (posebnu pozornost treba posvetiti mogućem učinku humanog usmrćivanja životinja tijekom ispitivanja na izračunanu vrijednost LC50),

tumačenje rezultata.

3.2. OCJENA I TUMAČENJE REZULTATA Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (D).

4. REFERENCE Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (E).

B.3. AKUTNA TOKSIČNOST (DERMALNA)

B.3.

1. METODA

1.

1.2. DEFINICIJE Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (B).

1.3. REFERENTNE TVARI Nema ih.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Ispitivana se tvar u stupnjevanim dozama nanosi na kožu nekoliko skupina pokusnih životinja, pri čemu se na svaku skupinu primjenjuje po jedna visina doze. Nakon tog opažaju se učinci i smrtnost. Životinje koje uginu tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a po završetku ispitivanja životinje koje su preživjele ispitivanje usmrćuju se i obduciraju. Životinje koje pokazuju izrazite znakove stresa i boli treba humano usmrtiti. Ispitivane tvari ne smiju se primjenjivati na način za koji je poznato da životinjama uzrokuje znatnu bol i stres zbog snažnih nagrizajućih i nadražujućih svojstava.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6.

1.6.1. Priprema Životinje se drže u kavezima za obavljanje ispitivanja, u pokusnim uvjetima što se tiče smještaja i hranjenja, najmanje pet dana prije početka pokusa. Prije ispitivanja zdrave mlade životinje nasumce se odabiru i raspoređuju u skupine u kojima će biti tretirane. Približno 24 sata prije ispitivanja na hrptenom dijelu trupa životinja treba ukloniti dlaku šišanjem ili brijanjem. Pri šišanju ili brijanju treba izbjeći struganje kože, jer bi to moglo promijeniti njezinu propusnost. Za nanošenje ispitivane tvari dlaku treba ukloniti s najmanje 10 % tjelesne površine. Pri ispitivanju krutih tvari koje se prema potrebi mogu usitniti u prah, ispitivanu tvar treba u dovoljnoj mjeri navlažiti vodom ili, tamo gdje je to potrebno, odgovarajućim nosačem, kako bi se osigurao dobar kontakt s kožom. Kad se upotrebljava nosač, u obzir treba uzeti utjecaj tog nosača na prodiranje ispitivane tvari u kožu. Tekuće ispitivane tvari općenito se primjenjuju nerazrijeđene.

1.6.2. Uvjeti ispitivanja

1.6.2.

1.6.2.1. Pokusne životinje Mogu se koristiti odrasli štakori ili kunići. Moguće je koristiti i druge vrste, ali je za to potrebno navesti opravdane razloge. Treba koristiti sojeve životinja koji se obično koriste u laboratorijima. Na početku ispitivanja, bez obzira na spol, masa životinja ne smije varirati za više od ± 20 % odgovarajuće srednje vrijednosti.

1.6.2.2. Broj i spol Za svaku visinu doze treba upotrijebiti najmanje pet životinja. Sve moraju biti istog spola. Ako se koriste ženke, treba koristiti one koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. U slučajevima kad postoje informacije koje dokazuju da je jedan od spolova izrazito osjetljiviji, doze treba primjenjivati na životinje tog spola. Napomena: kod ispitivanja akutne toksičnosti na životinjama višeg reda od glodavaca, treba razmotriti mogućnost upotrebe manjeg broja životinja. Treba pažljivo odabirati doze i poduzeti sve mjere da se ne premaše srednje toksične doze. U ovakvim ispitivanjima treba izbjegavati primjenu smrtonosnih doza ispitivane tvari.

1.6.2.3. Visine doza Treba koristiti dovoljan broj različitih doza, najmanje tri, te ih primjenjivati u odgovarajućim vremenskim intervalima kako bi se na ispitnim skupinama mogli uočiti različiti toksički učinci i različite stope smrtnosti. Kod odabiranja visine doze treba uzeti u obzir nadražujuća i nagrizajuća svojstva ispitivane tvari. Ti podaci moraju biti dostatni da se na temelju njih izradi krivulja doza i reakcija i, kada je izvedivo, da omoguće prihvatljivo utvrđivanje vrijednosti LD50.

1.6.2.4. Granični test Na skupini od pet mužjaka i pet ženki može se obaviti granični test uz primjenu samo jedne visine doze, najmanje 2000 mg/kg tjelesne mase, primjenjujući gore opisani postupak. U slučaju pojave smrtnosti povezane s ispitivanom tvari, možda će biti potrebna cijela studija.

1.6.2.5. Razdoblje opažanja Razdoblje opažanja treba biti najmanje 14 dana. Međutim, trajanje opažanja ne treba biti strogo određeno. Treba ga odrediti na temelju toksičkih reakcija, brzine njihova pojavljivanja i vremena potrebnog za oporavak; ako se smatra potrebnim ono se može produžiti. Vrijeme pojavljivanja ili nestajanja znakova toksičnosti i vrijeme smrti su važni, posebno ako postoji tendencija kasnijeg nastupanja smrti.

1.6.3. Postupak U kavezu treba držati po jednu životinju. Ispitivanu tvar treba jednakomjerno nanijeti na površinu koja čini oko 10 % ukupne površine tijela. Kad su u pitanju visoko toksične tvari, površina nanošenja može biti i manja, ali i na takvu površinu tvar treba nanijeti u što tanjem i ravnomjernijem sloju. Ispitivanu tvar treba držati u kontaktu s kožom tijekom cijelog 24-satnog razdoblja izloženosti pomoću poroznog obloga od gaze i samoljepive trake koja ne nadražuje kožu. Ispitnu površinu treba dodatno prekriti na odgovarajući način kako bi oblog i ispitivana tvar ostali na mjestu i kako bi se osiguralo da životinje ne mogu ispitivanu tvar unijeti ingestijom (oralno). Da bi se životinju spriječilo da ispitivanu tvar unese ingestijom (oralnim putem) mogu se upotrijebiti pomagala za sputavanje, ali potpuna imobilizacija nije preporučena metoda. Na kraju razdoblja izloženosti ostatke ispitivane tvari treba ukloniti, ako je moguće vodom ili primjenom neke druge prikladne metode čišćenja kože. Rezultate opažanja treba sustavno bilježiti redoslijedom kojim se obavljaju. Za svaku životinju treba voditi zasebnu evidenciju. Tijekom prvog dana životinje treba opažati često. Najmanje jednom svakog radnog dana treba obaviti temeljiti klinički pregled, a ostala opažanja treba obavljati dnevno, uz poduzimanje odgovarajućih mjera kako bi se gubitak životinja tijekom studije sveo na minimum, npr. obdukcija ili pohranjivanje uginulih životinja u hladnjak i izolacija ili usmrćivanje slabih životinja i životinja na umoru. Opažati treba promjene na dlaci, tretiranoj koži, očima i sluznicama, na dišnom i cirkulacijskom sustavu, te na autonomnom i centralnom živčanom sustavu, kao i promjene u somatomotoričkoj aktivnosti i obrascu ponašanja. S posebnom pozornošću treba opažati drhtavicu, grčeve, slinjenje, proljev, otupjelost, san i komu. Vrijeme smrti mora se zabilježiti što je moguće preciznije. Životinje koje uginu tijekom ispitivanja kao i one koje prežive do kraja ispitivanja podvrgavaju se obdukciji. Treba zabilježiti sve veće patološke promjene. Kad za to postoje indikacije, treba uzeti uzorak tkiva za histopatološki pregled.

1.6.3. Ocjenjivanje toksičnosti kod drugog spola

Po završetku studije na jednom spolu doza se primjenjuje na najmanje jednu skupinu od pet životinja drugog spola kako bi se utvrdilo da životinje tog spola nisu izrazito osjetljivije na ispitivanu tvar. U određenim okolnostima može biti opravdano koristiti manji broj životinja. Ako već postoje odgovarajući podaci koji pokazuju da su životinje ispitanog spola izrazito osjetljivije, ispitivanje na životinjama drugog spola može se izostaviti.

2. PODACI Podatke treba rezimirati u obliku tablice, u kojoj će za svaku ispitnu skupinu biti naveden broj životinja na početku ispitivanja, vrijeme smrti svake životinje, broj životinja koje pokazuju druge znakove toksičnosti, opis toksičkih učinaka i nalazi obdukcije. Masu svake pojedinačne životinje treba utvrditi i zabilježiti neposredno prije nanošenja ispitivane tvari, a zatim jednom tjedno i nakon smrti; promjene u masi treba izračunavati u slučajevima kad životinja preživi duže od jednog dana. Životinje koje se humano usmrte zbog stresa i boli izazvanih ispitivanom tvari svrstavaju se pod slučajeve smrti povezane s tom tvari. LD50 treba utvrditi prema nekoj od priznatih metoda. Ocjena podataka treba uključivati eventualni odnos između izloženosti životinje ispitivanoj tvari i pojave i ozbiljnosti svih abnormalnosti, uključujući abnormalnosti u ponašanju, kliničke abnormalnosti, velike lezije, promjene u tjelesnoj masi, smrtnost i druge toksičke učinke.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju treba, po mogućnosti, sadržavati slijedeće informacije:

vrsta, soj, podrijetlo, okolišni uvjeti, prehrana itd.,

uvjeti ispitivanja (uključujući metodu čišćenja kože i vrstu obloga: okluzivni ili neokluzivni),

visine doza (s otapalom, ako se koristi, i koncentracijama),

spol životinja kojima se tvar dozira,

tabelarni prikaz podataka o reakcijama (tj. broj životinja koje su uginule ili bile usmrćene tijekom ispitivanja, broj životinja koje pokazuju znakove toksičnosti, broj izloženih životinja),

sva opažanja,

vrijednost LD50 za spol na kojem je provedena studija, utvrđena nakon 14 dana prema navedenoj metodi utvrđivanja,

interval 95 %-tne pouzdanosti za LD50 (kad ga je moguće navesti),

krivulja doza/smrtnost i nagib krivulje (gdje to dopušta metoda određivanja),

nalazi obdukcije,

svi histopatološki nalazi,

rezultati svih ispitivanja na drugom spolu,

diskusija o rezultatima (posebnu pozornost treba posvetiti mogućem učinku humanog usmrćivanja životinja tijekom ispitivanja na izračunanu vrijednost LD50),

tumačenje rezultata.

3.2. OCJENA I TUMAČENJE REZULTATA Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (D).

4. REFERENCE Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (E).

B.4. AKUTNA TOKSIČNOST: NADRAŽIVANJE/NAGRIZANJE KOŽE

B.4.

1. METODA Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 404 (2002.).

1.

1.1. UVOD Kod pripreme ove nove dopunjene metode posebna je pozornost posvećena mogućim poboljšanjima s obzirom na dobrobit životinja, kao i procjeni svih postojećih informacija o ispitivanoj tvari kako bi se izbjegla nepotrebna ispitivanja na laboratorijskim životinjama. Ova metoda sadrži preporuku da se prije provođenja opisanog ispitivanja nagrizajućih/nadražujućih svojstava tvari in vivo, obavi analiza već postojećih relevantnih znanstvenih dokaza. Ako nema dovoljno raspoloživih podataka, moguće ih je dobiti kroz primjenu sekvencijskog ispitivanja (1). Strategija ispitivanja uključuje provođenje validiranih i prihvaćenih ispitivanja in vitro, a opisana je u Dodatku ovoj metodi. Osim toga, prema potrebi, kod inicijalnog ispitivanja in vivo preporuča se postupna, a ne istovremena primjena triju ispitnih krpica (patch test) na životinju. U interesu ispravnog korištenja znanosti i dobrobiti životinja, ispitivanja in vivo ne bi se smjela obavljati dok se putem analize postojećih znanstvenih dokaza ne procijene svi raspoloživi podaci koji su relevantni za nagrizajuće/nadražujuće djelovanje predmetne tvari na kožu. Takvi će podaci obuhvaćati dokaze koji proizlaze iz postojećih studija provedenih na ljudima i/ili laboratorijskim životinjama, dokaze o nagrizajućim/nadražujućim svojstvima jedne ili više strukturno srodnih tvari ili mješavina tih tvari, podatke koji ukazuju na jaku kiselost ili lužnatost ispitivane tvari (2)(3) i rezultate validiranih i prihvaćenih in vitro ili ex vivo ispitivanja (4)(5)(5a). Ova bi analiza trebala smanjiti potrebu za in vivo ispitivanjima nagrizajućeg/nadražujućeg djelovanja tvari na kožu, za koje u tom smislu postoji već dovoljno dokaza na temelju drugih studija. Strategija sekvencijskog ispitivanja kojoj se daje prednost i koja uključuje provođenje validiranih i prihvaćenih in vitro i ex vivo ispitivanja nagrizajućih/nadražujućih svojstava tvari sadržana je u Dodatku ovoj metodi. Ova je strategija razvijena u okviru radionice u organizaciji OECD-a (6) i sudionici te radionice jednoglasno je preporučuju, a usvojena je kao preporučena strategija ispitivanja u okviru Globalno usklađenog sustava klasifikacije kemijskih tvari (GHS) (7). Preporuča se primjena ove strategije prije ispitivanja in vivo. Kad su u pitanju nove tvari, za ispitivanja se preporuča fazni pristup, kako bi se o nagrizajućim/nadražujućim svojstvima ispitivane tvari dobili znanstveno ispravni podaci. Kad su u pitanju otprije poznate tvari o čijem nagrizajućem/nadražujućem djelovanju na kožu i oči nema dovoljno podataka, istu strategiju treba primijeniti za dopunu podataka. Za primjenu drugačije strategije ili postupka ispitivanja, odnosno za odluku da se ne primijeni metoda faznog ispitivanja, treba navesti razloge. Ako se nagrizajuća i nadražujuća svojstva ne mogu utvrditi na temelju analize već postojećih znanstvenih dokaza, u skladu sa strategijom sekvencijskog ispitivanja, treba razmotriti mogućnost provođenja ispitivanja in vivo (vidjeti Dodatak).

1.2. DEFINICIJE Nadraživanje kože: uzrokovanje reverzibilnog oštećenja kože nakon primjene ispitivane tvari tijekom razdoblja od najviše 4 sata. Nagrizanje kože: uzrokovanje ireverzibilnog oštećenja kože; točnije, pojava vidljive nekroze epiderme i derme, nakon primjene ispitivane tvari tijekom razdoblja od najviše 4 sata. Za nagrizanje kože tipična je pojava čireva, krvarenja, krvavih krasta te, do kraja opažanja od 14 dana, gubitak boje kože zbog nestajanja pigmenta, čitave površine zahvaćene alopecijom (gubitak dlake) i ožiljci. Za ocjenjivanje sumnjivih lezija treba razmotriti mogućnost histopatoloških pretraga.

1.3. NAČELO ISPITNE METODE Jedna doza ispitivane tvari nanosi se na kožu pokusne životinje; netretirani dijelovi kože pokusne životinje služe za kontrolu. Stupanj nadraženosti/nagriženosti kože očitava se i bilježi u određenim vremenskim intervalima i zatim se dodatno opisuje kako bi se mogla napraviti kompletna ocjena učinaka. Studija treba trajati dovoljno dugo da bude moguće ocijeniti jesu li opaženi učinci reverzibilni ili ireverzibilni. Životinje koje pokazuju stalne znakove jakog stresa i/ili boli u bilo kojoj fazi ispitivanja treba humano usmrtiti, a ispitivanu tvar ocijeniti s tim u skladu. Kriteriji za donošenje odluke o humanom usmrćivanju životinja koje su na umoru i koje jako pate mogu se naći u referentnoj literaturi pod brojem (8).

1.4. OPIS ISPITNE METODE

1.4.

1.4.1. Priprema za ispitivanje in vivo

1.4.1.

1.4.1.1. Odabir životinjske vrste Preporuča se korištenje albino kunića, i to zdravih odraslih primjeraka. U slučaju da se koristi neka druga životinjska vrsta, treba navesti razloge za to.

1.4.1.2. Priprema životinja Otprilike 24 sata prije ispitivanja životinjama se s leđnog dijela trupa uklanja dlaka šišanjem neposredno uz kožu. Pritom treba paziti da se koža ne ošteti, a treba koristiti samo životinje sa zdravom, netaknutom kožom. Kod nekih su sojeva kunića određeni dijelovi kože prekriveni vrlo gustom dlakom, što je posebno izraženo u određeno doba godine. Na takvima se gusto obraslim dijelovima kože ispitivanja ne bi smjela obavljati.

1.4.1.3. Uvjeti držanja i hranjenja životinja Životinje trebaju biti smještene pojedinačno. Temperatura prostorije za držanje pokusnih životinja, kad su u pitanju kunići, treba biti 20 °C (± 3 °C). Iako relativna vlažnost zraka treba biti najmanje 30 % i po mogućnosti ne više od 70 %, osim za vrijeme čišćenja prostorije, treba je nastojati održavati na 50-60 %. Osvjetljenje treba biti umjetno i mora se u slijedu izmjenjivati 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Što se tiče hranjenja, može se primjenjivati standardna hrana za laboratorijske životinje uz neograničene količine pitke vode.

1.4.2. Ispitni postupak

1.4.2.

1.4.2.1. Nanošenje ispitivane tvari Ispitivanu tvar treba nanijeti na malu površinu (približno 6 cm2) kože i prekriti gazenom krpicom koju treba pričvrstiti nenadražujućom ljepljivom trakom. U slučajevima kad izravno nanošenje nije moguće (npr. tekućine ili neke paste) ispitivanu tvar treba nanijeti na gazenu krpicu koja se zatim stavi na kožu. Krpicu treba držati labavo u kontaktu s kožom pomoću odgovarajućeg poluokluzivnog obloga tijekom čitavog razdoblja izlaganja. Ako se ispitivana tvar nanese na krpicu, na kožu je treba pričvrstiti na takav način da se ostvari dobar kontakt između tvari i kože i da tvar bude jednoliko raspoređena po koži. Životinju treba spriječiti da dosegne kompresu i tvar unese u organizam kroz usta ili udisanjem. Tekuće ispitivane tvari općenito se koriste nerazrijeđene. Kad se ispituju krute tvari (koje mogu biti usitnjene u prah (ako se to smatra potrebnim), ispitivanu tvar treba navlažiti najmanjom mogućom količinom vode (ili, prema potrebi, nekim drugim odgovarajućim nosačem) dovoljnom da omogući dobar kontakt s kožom. Kad se koriste drugi nosači, a ne voda, potencijalni utjecaj nosača na nadraženost kože izazvanu ispitivanom tvari treba biti minimalan, ili nikakav. Na kraju izlaganja koje obično traje četiri sata, ostatke ispitivane tvari treba ukloniti po mogućnosti vodom ili odgovarajućim otapalom, ne mijenjajući nastalu reakciju ili integritet epiderme.

1.4.2.2. Visina doze Na pripremljeni dio kože nanosi se od 0,5 ml tvari u tekućem obliku ili 0,5 g u krutom obliku ili u obliku paste.

1.4.2.3. Inicijalni test (ispitivanje nadražujućih/nagrizajućih svojstava in vivo na jednoj životinji) Posebno se preporuča da se ispitivanje in vivo najprije provede na jednoj životinji, posebno ako se pretpostavlja da bi ispitivana tvar mogla imati nagrizajuća svojstva. Ova je preporuka u skladu sa strategijom sekvencijskog ispitivanja (vidjeti Dodatak 1). Ako se na temelju postojećih znanstvenih dokaza ocijeni da je neka tvar nagrizajuća, daljnja ispitivanja na životinjama nisu potrebna. U načelu, za većinu tvari za koje se sumnja da imaju nagrizajuća svojstva in vivo ispitivanja nisu potrebna. Međutim, u slučajevima kad se zbog nedovoljnih dokaza osjeća da bi trebalo prikupiti dodatne podatke, mogu se provesti ograničena ispitivanja na životinjama primjenjujući sljedeći pristup: na kožu jedne životinje u slijedu se stavljaju najviše tri krpice. Prva se krpica uklanja nakon tri minute. Ako se na koži ne uoči jaka reakcija stavlja se druga krpica koja se uklanja nakon jednog sata. Ako se na temelju opažanja u ovoj fazi može zaključiti da ne bi bilo nehumano produžiti izlaganje, stavlja se treća krpica koja se uklanja nakon četiri sata i utvrđuje stupanj reakcije. Ako se nakon bilo kojega od tri izlaganja u nizu opazi nagrizajuće djelovanje, ispitivanje se odmah prekida. Ako se nakon uklanjanja prve krpice ne uoči nagrizajuće djelovanje, životinje se opažaju 14 dana, osim u slučaju da do nagrizanja dođe ranije. U slučajevima kad se ne očekuje da će ispitivana tvar uzrokovati nagrizanje, ali da može biti nadražujuća treba na jednu životinju staviti jednu krpicu i držati je četiri sata.

1.4.2.4. Potvrdni test (ispitivanje nadraživanja kože in vivo na dodatnim životinjama) Ako se tijekom inicijalnog testa ne opazi nagrizajući učinak, nadražujući učinak ili negativan nalaz treba potvrditi ispitivanjem na najviše dvije dodatne životinje, od kojih na svaku treba primijeniti po jednu krpicu u trajanju od četiri sata. Ako se tijekom inicijalnog testa opazi nadražujući učinak, potvrdni se test može izvesti sekvencijski, ili istovremenim izlaganjem dviju dodatnih životinja. U iznimnim slučajevima kod kojih se inicijalni test ne provodi, može se tretirati dvije ili tri životinje sa po jednom krpicom koja se nakon četiri sata uklanja. Ako pri korištenju dviju životinja obje pokažu istu reakciju, daljnje ispitivanje nije potrebno. U suprotnom se ispitivanju podvrgava i treća životinja. Nejasne reakcije ponekad treba ocijeniti ispitivanjem na dodatnim životinjama.

1.4.2.5. Razdoblje opažanja Opažanje treba trajati dovoljno dugo da se u potpunosti može utvrditi reverzibilnost opažanih učinaka. Međutim pokus treba prekinuti u bilo kojem trenutku ako životinja pokazuje trajne znakove jake boli ili stresa. Da bi se utvrdila reverzibilnost učinaka, životinje treba opažati do 14 dana nakon uklanjanja krpica. Ako se reverzibilnost utvrdi prije isteka 14 dana, pokus odmah treba prekinuti.

1.4.2.6. Klinička opažanja i stupnjevanje reakcija na koži Sve životinje treba pregledati kako bi se vidjelo pokazuju li znakove crvenila kože (eritema) ili oteklina (edema) i to nakon 60 minuta, a zatim nakon 24, 48 i 72 sata po skidanju krpice. Stupanj reakcije na koži utvrđuje se i bilježi prema stupnjevima opisanim u donjoj tablici. Ako se na koži pojavi oštećenje koje se nakon 72 sata ne može definirati kao nadraženost ili nagriženost, možda će za utvrđivanje reverzibilnosti učinaka biti potrebno opažanje u trajanju od 14 dana. Uz opažanja vezana uz nadraženost kože treba detaljno opisati i zabilježiti sve lokalne toksičke učinke, kao što je isušivanje kože, i sve sustavne štetne učinke (npr. klinički znakovi toksičnosti i promjene u tjelesnoj masi). U slučaju nejasnih reakcija treba obaviti histopatološki pregled. Stupnjevanje kožnih reakcija po svojoj je prirodi subjektivno. Da bi se poboljšala usklađenost u stupnjevanju kožnih reakcija te da bi se u tom smislu pomoglo ispitnim laboratorijima i laboratorijima u kojima se obavljaju opažanja i tumače rezultati, osoblje koje obavlja te poslove treba proći odgovarajuću obuku za primjenu sustava ocjenjivanja (vidjeti tablicu dolje). Od pomoći bi mogao biti i ilustrirani priručnik za utvrđivanje stupnja nadraženosti i drugih lezija kože (9).

2. PODACI

2.

2.1. TUMAČENJE REZULTATA Rezultate studije, koji obuhvaćaju sve stavke iz odjeljka 3.1., treba rezimirati u obliku tablice u konačnom izvješću o ispitivanju.

2.2. OCJENA REZULTATA Pokazatelje nadraženosti kože treba ocijeniti ovisno o vrsti i stupnju lezija i o njihovoj reverzibilnosti ili ireverzibilnosti. Pojedinačni rezultati ne predstavljaju apsolutni standard za nadražujuća svojstva nekog materijala, budući da se ocjenjuju i njegovi drugi učinci. Umjesto toga, na pojedinačne rezultate treba gledati kao na referentne vrijednosti koje se ocjenjuju u kombinaciji sa svim ostalim opažanjima iz studije. Kod ocjenjivanja nadraženosti kože treba uzeti u obzir reverzibilnost lezija. Ako reakcije kao što su alopecija (ograničena površina), hiperkeratoza, hiperplazija i perutanje ostanu prisutne do kraja 14-dnevnog razdoblja opažanja, ispitivanu tvar treba smatrati nadražujućom.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljedeće informacije:

Razloge za ispitivanje in vivo: analiza postojećih znanstvenih dokaza koji se temelje na ranijim ispitivanjima, uključujući rezultate dobivene primjenom strategije sekvencijskog ispitivanja:

opis relevantnih podataka dobivenih ranijim ispitivanjima,

podaci dobiveni u svakoj fazi primijenjene strategije ispitivanja,

opis obavljenih in vitro ispitivanja, uključujući pojedinosti o postupku i rezultate dobivene ispitivanjem ispitivane/referentne tvari,

analiza postojećih znanstvenih dokaza radi provođenja studije in vivo.

Ispitivana tvar:

identifikacijski podaci (npr. CAS broj, podrijetlo, čistoća, poznate nečistoće, broj šarže),

fizikalno stanje i fizikalno-kemijska svojstva (npr. pH, hlapljivost, topljivost, stabilnost)

ako se radi o mješavini, sastav i relativni postoci komponenata.

Nosač:

identifikacijska oznaka, koncentracija (prema potrebi), upotrijebljeni volumen,

obrazloženje za odabir nosača.

Pokusne životinje:

upotrijebljena vrsta/soj, razlozi za korištenje drugih životinja umjesto albino kunića,

broj životinja svakog spola,

tjelesna masa pojedinačnih životinja na početku i na kraju ispitivanja,

starost na početku studije,

podrijetlo životinja, uvjeti držanja, prehrana itd.

Uvjeti ispitivanja:

tehnika pripreme površine za stavljanje krpice,

pojedinosti o materijalu koji se koristi za krpice i tehnika primjene krpice,

pojedinosti o pripremi ispitivane tvari, nanošenju i uklanjanju.

Rezultati:

tablični prikaz stupnjeva reakcije na nadraživanje/nagrizanje za svaku životinju za svako razdoblje opažanja,

opis svih opaženih lezija,

narativni opis vrste i stupnja opažene nadraženosti ili nagrizanja i svi histopatološki nalazi,

opis drugih štetnih lokalnih (npr. isušivanje kože) i sustavnih promjena koje se javljaju pored nadraživanja i nagrizanja kože.

Diskusija o rezultatima

4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)

REFERENCE Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, str. 410-429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicollogy In Vitro, 2, str. 19-26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, str. 709-720. ECETOC (1990) Monograph No 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, str. 483-524. Ispitna metoda B.40 Nagrizanje kože. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. (Mogu se dobiti na zahtjev u tajništvu OECD-a).

Tablica 1. Nastanak eritema i eshara (crvenila kože i krasta) Nastanak edema UTVRĐIVANJE STUPNJA KOŽNE REAKCIJE

Nema eritema 0 Lagano izraženi eritemi (jedva uočljivi) 1 Dobro definirani eritemi 2 Srednje do jako izraženi eritemi 3 Jako izraženi eritemi (tamno crvenilo, poput boje govedine) uz stvaranje eshara koje sprečavaju utvrđivanje stupnja eritema 4 Najviši mogući stupanj: 4 Nastanak edema 0 Nema edema 1 Lagani edemi (rubovi površine izdignuti i jasno definirani) 2 Srednji edemi (izdignuti približno 1 mm) 3 Jaki edemi (izdignuti više od 1 mm i šire se izvan površine izlaganja) 4 Najviši mogući stupanj: 4 U slučaju nejasnih reakcija može se obaviti histopatološki pregled.

B.5. AKUTNA TOKSIČNOST: NADRAŽIVANJE/NAGRIZANJE OČIJU

B.5.

1. METODA Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 405 (2002.).

1.

1.1 UVOD Kod pripreme ove nove dopunjene metode posebna pozornost posvećena je mogućim poboljšanjima u smislu procjenjivanja svih postojećih informacija o ispitivanoj tvari kako bi se izbjeglo nepotrebno ispitivanje na laboratorijskim životinjama i pridonijelo njihovoj dobrobiti. Ova metoda sadrži preporuku da se prije provođenja opisanog in vivo ispitivanja akutnog nagrizajućeg/nadražujućeg djelovanja tvari na oči obavi analiza već postojećih relevantnih znanstvenih dokaza (1). Ako nema dovoljno raspoloživih podataka, preporuča se njihovo prikupljanje kroz primjenu sekvencijskog ispitivanja (2)(3). Strategija ispitivanja uključuje provođenje validiranih i prihvaćenih ispitivanja in vitro, a opisana je u Dodatku ispitnoj metodi. Osim toga, preporuča se primjena testa na nadraživanje/nagrizanje kože kako bi se nagrizajuće djelovanje na oči moglo predvidjeti prije razmatranja mogućnosti provođenja in vivo ispitivanja na očima. U interesu ispravnog korištenja znanosti i dobrobiti životinja, ispitivanja in vivo ne bi smjela doći u obzir sve dok se primjenom analize postojećih znanstvenih dokaza ne procijene svi raspoloživi podaci koji su relevantni za nagrizajuće/nadražujuće djelovanje predmetne tvari na oči. Takvi će podaci obuhvaćati dokaze koji proizlaze iz postojećih studija provedenih na ljudima i/ili laboratorijskim životinjama, dokaze o nagrizajućim/nadražujućim svojstvima jedne ili više strukturno srodnih tvari ili mješavina tih tvari, podatke koji ukazuju na jaku kiselost ili lužnatost ispitivane tvari (4)(5) i rezultate validiranih i prihvaćenih in vitro ili ex vivo ispitivanja (6)(6a). Te studije mogu se obaviti prije analize postojećih znanstvenih dokaza, ili mogu proizaći iz te analize. Kod nekih tvari takva analiza može ukazati na potrebu za in vivo ispitivanjem potencijalnog nadražujućeg/nagrizajućeg djelovanja tvari na oči. U svim se takvim slučajevima prije razmatranja primjene in vivo testa na očima preporuča provesti in vivo studiju djelovanja tvari na kožu i ocijeniti je u skladu s Ispitnom metodom B.4. (7). Primjena analize postojećih znanstvenih dokaza i strategija sekvencijskog ispitivanja trebala bi smanjiti potrebu za in vivo ispitivanjem nagrizajućeg/nadražujućeg djelovanja tvari na oči, za koje postoje dostatni dokazi iz drugih studija. Ako se potencijal tvari za nagrizajuće ili nadražujuće djelovanje na oči ne može odrediti primjenom strategije sekvencijskog ispitivanja, čak ni nakon provedene in vivo studije nagrizajućeg i nadražujućeg djelovanja na kožu, in vivo ispitivanje nagrizajućeg/nadražujućeg djelovanja na oči smije se provesti. Strategija sekvencijskog ispitivanja kojoj se daje prednost i koja uključuje provođenje validiranih i prihvaćenih in vitro i ex vivo ispitivanja nagrizajućih/nadražujućih svojstava tvari sadržana je u Dodatku ovoj metodi. Ova je strategija razvijena u okviru radionice u organizaciji OECD-a (8) i sudionici te radionice jednoglasno je preporučuju, a usvojena je kao preporučena strategija ispitivanja u okviru Globalno usklađenog sustava klasifikacije kemijskih tvari (GHS) (9). Primjena ove strategije preporuča se prije ispitivanja in vivo. Kad su u pitanju nove tvari, za ispitivanja se preporuča fazni pristup, kako bi se o nagrizajućim/nadražujućim svojstvima tih tvari dobili znanstveno ispravni podaci. Kad su u pitanju otprije poznate tvari o čijem nagrizajućem/nadražujućem djelovanju na kožu i oči nema dovoljno podataka, istu strategiju treba primijeniti za dopunu podataka. Za primjenu drugačije strategije ili postupka ispitivanja, odnosno za odluku da se ne primijeni metoda faznog ispitivanja, treba navesti razloge.

1.2. DEFINICIJE Nadraživanje oka: promjene na oku koje su rezultat primjene ispitivane tvari na vanjsku površinu oka i koje su potpuno reverzibilne u roku 21 dan nakon primjene tvari. Nagrizanje oka: oštećenja oka, ili ozbiljno fizičko pogoršanje vida, koje je rezultat primjene ispitivane tvari na vanjsku površinu oka i koje nisu u potpunosti reverzibilne u roku 21 dan nakon primjene tvari.

1.3. NAČELO ISPITNE METODE Jedna doza ispitivane tvari primjenjuje se na jedno oko pokusne životinje; netretirano oko služi za kontrolu. Stupanj nadraženosti/nagriženosti oka ocjenjuje se na temelju zabilježenih lezija očne spojnice (sluznice), rožnice i šarenice u određenim intervalima. Opisuju se i ostale promjene na oku, kao i sustavne promjene, kako bi se osigurala kompletna procjena djelovanja tvari. Studija treba trajati dovoljno dugo da se ocijeni reverzibilnost, odnosno ireverzibilnost učinaka. Životinje koje pokazuju stalne znakove jakog stresa i/ili boli u bilo kojoj fazi ispitivanja treba humano usmrtiti, a ispitivanu tvar ocijeniti s tim u skladu. Kriteriji za donošenje odluke o humanom usmrćivanju životinja koje su na umoru i koje jako pate mogu se naći u referentnoj literaturi pod brojem (10).

1.4. OPIS ISPITNE METODE

1.4.

1.4.1. Priprema za ispitivanje in vivo

1.4.1.

1.4.1.1. Odabir životinjske vrste Preporuča se korištenje albino kunića, i to zdravih odraslih primjeraka. U slučaju da se koristi neka druga životinjska vrsta, treba navesti razloge za to.

1.4.1.2. Priprema životinja Oba oka svake pokusne životinje odabrane za ispitivanje treba pregledati 24 sata prije početka ispitivanja. Životinje kod kojih se utvrdi nadraženost očiju, očni defekti ili već postojeća ozljeda rožnice ne smiju se koristiti.

1.4.1.3. Uvjeti držanja i hranjenja životinja Životinje trebaju biti smještene pojedinačno. Kad su u pitanju kunići, temperatura prostorije u kojoj se životinje drže treba biti 20 °C (± 3 °C). Iako relativna vlažnost zraka treba biti najmanje 30 % i po mogućnosti ne više od 70 %, osim za vrijeme čišćenja prostorije, treba je nastojati održavati na 50-60 %. Osvjetljenje treba biti umjetno i mora se u slijedu izmjenjivati 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Što se tiče hranjenja, može se primjenjivati standardna hrana za laboratorijske životinje uz neograničene količine pitke vode.

1.4.2. Ispitni postupak

1.4.2.

1.4.2.1. Primjena ispitivane tvari Ispitivanu tvar treba staviti u konjunktivalnu vrećicu jednog oka svake životinje, pri čemu donji kapak treba lagano odmaknuti od očne jabučice. Kapke zatim treba lagano držati spojenima oko jedne sekunde da bi se spriječilo istjecanje materijala. Drugo oko koje se ne tretira služi za kontrolu.

1.4.2.2. Ispiranje Oči pokusnih životinja ne smiju se ispirati najmanje 24 sata od primjene ispitivane tvari, osim ako su u pitanju krute tvari (vidjeti odjeljak 1.4.2.3.2.) te u slučaju da odmah dođe do nagrizajućeg ili nadražujućeg djelovanja. Nakon 24 sata oči se mogu isprati, ako se to smatra potrebnim. Upotreba satelitske skupine životinja za istraživanje utjecaja ispiranja ne preporučuje se ako za to ne postoji znanstveno opravdanje. Ako je satelitska skupina potrebna, treba upotrijebiti dva kunića. Uvjete ispiranja treba detaljno dokumentirati, npr. vrijeme ispiranja; sastav i temperatura otopine za ispiranje; trajanje, količina i brzina primjene otopine.

1.4.2.3. Visina doze

1.4.2.3.

1.4.2.3.1. Ispitivanje tekućina Za ispitivanje tekućina koristi se doza od 0,1 ml. Sprejevi na pumpicu ne smiju se koristiti za primjenu tvari izravno na oko. Ako je tekućina u spreju, najprije je treba istisnuti u posudu, iz nje uzeti 0,1 ml i nakapati u oko.

1.4.2.3.2. Ispitivanje krutih tvari Kad se ispituju krute tvari, paste i tvari u obliku čestica, volumen korištene doze treba iznositi 0,1 ml, odnosno njena masa ne smije biti veća od 100 mg. Ispitni materijal treba biti usitnjen u fini prah. Volumen krutog materijala treba izmjeriti nakon što se lagano natisne, npr. lupkanjem po mjernoj posudi. Ako kruta tvar nije odstranjena iz oka pokusne životinje djelovanjem fizioloških mehanizama kod prvog opažanja, jedan sat nakon tretiranja oko se može isprati fiziološkom otopinom ili destiliranom vodom.

1.4.2.3.3. Ispitivanje aerosola U slučaju sprejeva na pumpicu i aerosola, prije kapanja u oko preporuča se tekućinu staviti u posudu. Jedini izuzetak čine tvari u obliku aerosola pod tlakom koje se u posudu ne mogu staviti zbog hlapljenja. U takvim slučajevima oko treba držati otvorenim i ispitivanu tvar nanijeti na oko jednostavnim prskanjem u trajanju od oko 1 sekunde, s udaljenosti od oko 10 cm ravno ispred oka. Ova razdaljina može varirati ovisno o tlaku i sadržaju spreja. Mora se paziti da ne dođe do oštećenja oka koje može izazvati tlak spreja. U nekim slučajevima može biti potrebno procijeniti mogućnost mehaničkih ozljeda koje bi mogao izazvati jaki mlaz iz spreja. Procjena doze iz aerosola može se napraviti simuliranjem testa na sljedeći način:tvar se spreja na papir za vaganje kroz otvor veličine oka kunića postavljen ravno ispred papira. Povećanje težine papira približno odgovara količini tekućine koja se naspreja u oko. Kod hlapljivih tvari doza se može utvrditi vaganjem posude u koju se naspreja ispitivana tvar prije i nakon pražnjenja posude.

1.4.2.4. Inicijanli test (ispitivanje nadraživanja/nagrizanja oka in vivo na jednoj životinji). Kako je navedeno u strategiji sekvencijskog ispitivnja (vidjeti Dodatak 1.), čvrsta je preporuka da se test in vivo na početku provodi samo na jednoj životinji. Ako rezultati ovog testa pokažu da tvar uz primjenu opisanog postupka djeluje na oko nagrizajuće ili jako nadražujuće, daljnja ispitivanja nadraživanja oka ne smiju se provoditi.

1.4.2.5. Lokalni anestetici Od slučaja do slučaja mogu se upotrijebiti lokalni anestetici. Ako analiza postojećih znanstvenih dokaza pokaže da bi ispitivana tvar mogla izazvati bol, ili ako inicijalno ispitivanje pokaže da će doći do bolne reakcije, prije primjene ispitivane tvari može se upotrijebiti neki lokalni anestetik. Vrstu, koncentraciju i dozu lokalnog anestetika treba pažljivo odabrati kako bi se osiguralo da njegova upotreba neće izazvati drugačiju reakciju životinje na ispitivanu tvar. Anesteziju treba primijeniti i na kontrolno oko.

1.4.2.6. Potvrdni test (ispitivanje nadraživanja/nagrizanja oka in vivo na dodatnim životinjama) Ako se nagrizajuće djelovanje ne opazi tijekom inicijalnog testa, nadražujuću ili negativnu reakciju treba potvrditi koristeći do dvije dodatne životinje. Ako se tijekom inicijalnog testa opazi jako nadražujuće djelovanje koje upućuje na mogući jaki (ireverzibilni) učinak kod potvrdnog testa, preporuka je da se potvrdni test obavi sekvencijski, na jednoj po jednoj životinji, a ne da se istodobno izlože dvije dodatne životinje. Ako se na drugoj životinji otkrije nagrizajuće ili jako nadražujuće djelovanje, ispitivanje se ne nastavlja. U slučaju slabih ili srednje jakih nadražujućih učinaka može se ukazati potreba za korištenjem dodatnih životinja.

1.4.2.7. Razdoblje opažanja Opažanje treba trajati dovoljno dugo da se u potpunosti može utvrditi jačina i reverzibilnost opaženih učinaka. Međutim, pokus treba prekinuti čim životinja počne pokazivati trajne znakove jake boli ili stresa (9). Da bi se utvrdila reverzibilnost učinaka, životinje obično treba opažati 21 dan od primjene ispitivane tvari. Ako se reverzibilnost uoči prije 21. dana, pokus treba odmah prekinuti.

1.4.2.7.

1.4.2.7.1. Klinička opažanja i stupnjevanje reakcija oka Oči treba pregledati nakon jednog, 24, 48 i 72 sata od primjene ispitivane tvari. Životinje ne treba držati u uvjetima ispitivanja duže nego što je potrebno za dobivanje konačnih rezultata. Životinje koje pokazuju znakove trajne jake boli ili stresa treba bez odlaganja humano usmrtiti, a tvar ocijeniti u skladu s tim. Životinje kod kojih se nakon primjene tvari uoče sljedeće lezije oka treba humano usmrtiti: perforacija ili znatna ulceracija rožnice, uključujući stafilom; krv u prednjoj očnoj komori; zamućenje rožnice 4. stupnja u trajanju od 48 sati; nedostatak svjetlosnog refleksa (reakcija šarenice 2. stupnja) u trajanju od 72 sata; ulceracija konjunktivalne membrane; nekroza očne spojnice (konjunktive) ili trećeg kapka (membrane nictitans); ili ljuštenje. Razlog je tome što takve lezije općenito nisu reverzibilne. Životinje kod kojih se ne pojave očne lezije mogu se usmrtiti najranije tri dana nakon primjene tvari. Životinje s laganim do srednjim lezijama treba opažati dok lezije ne nestanu ili 21 dan, kada se ispitivanje prekida. Opažanja treba provoditi sedmi, 14., i 21. dan kako bi se utvrdilo stanje lezija i njihova reverzibilnost ili i reverzibilnost. Kod svakog pregleda treba zabilježiti stupnjeve reakcija oka (očne spojnice, rožnice i šarenice) (Tablica 1.). Isto tako treba zabilježiti bilo kakve druge lezije oka (npr. panus, obojenje), kao i sustavne štetne učinke. Pregled reakcija može se olakšati upotrebom binokularne lupe, ručne slit-lampe, biomikroskopa i drugih prikladnih pomagala. Nakon bilježenja opažanja nakon 24 sata, oči se mogu dodatno pregledati pomoću fluoroesceina. Stupnjevanje očnih reakcija po svojoj je prirodi subjektivno. Da bi se poboljšala usklađenost u stupnjevanju kožnih reakcija te da bi se u tom smislu pomoglo ispitnim laboratorijima i laboratorijima u kojima se obavljaju opažanja i tumače rezultati, osoblje koje obavlja te poslove treba proći odgovarajuću obuku za primjenu sustava ocjenjivanja.

2. PODACI

2.

2.2. OCJENA REZULTATA Pokazatelje nadraženosti očiju treba ocijeniti ovisno o vrsti i stupnju lezija i o njihovoj reverzibilnosti ili ireverzibilnosti. Pojedinačni rezultati ne predstavljaju apsolutni standard za nadražujuća svojstva nekog ispitnog materijala, budući da se ocjenjuju i njegovi drugi učinci. Umjesto toga, na pojedinačne rezultate treba gledati kao na referentne vrijednosti koje imaju značenje samo ako su potkrijepljene potpunim opisom i ocjenom svih opažanja.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljedeće informacije:

razlozi za ispitivanje in vivo: analiza postojećih znanstvenih dokaza koji se temelje na ranijim ispitivanjima, uključujući rezultate dobivene primjenom strategije sekvencijskog ispitivanja:

opis relevantnih podataka dobivenih ranijim ispitivanjima,

podaci dobiveni u svakoj fazi strategije ispitivanja,

opis obavljenih in vitro ispitivanja, uključujući pojedinosti o postupku i rezultate dobivene ispitivanjem ispitivane/referentne tvari,

opis obavljene in vivo studije nadražujućeg/nagrizajućeg djelovanja na kožu, uključujući dobivene rezultate,

analiza postojećih znanstvenih dokaza radi provođenja studije in vivo.

Ispitivana tvar:

identifikacijski podaci (npr. CAS broj, podrijetlo, čistoća, poznate nečistoće, broj šarže),

fizikalno stanje i fizikalno-kemijska svojstva (npr. pH, hlapljivost, topljivost, stabilnost, reaktivnost s vodom),

ako se radi o mješavini, sastav i relativni postotci komponenata,

ako se koristi lokalni anestetik, identifikacijska oznaka, čistoća, vrsta, doza i moguća interakcija s ispitivanom tvari.

Nosač:

identifikacijska oznaka, koncentracija (prema potrebi), upotrijebljeni volumen,

obrazloženje za odabir nosača.

Pokusne životinje:

upotrijebljena vrsta/soj, razlozi za korištenje drugih životinja umjesto albino kunića,

starost svake životinje na početku studije,

broj životinja svakog spola u ispitnim i kontrolnim skupinama (prema potrebi),

tjelesna masa pojedinačnih životinja na početku i na kraju ispitivanja,

podrijetlo životinja, uvjeti držanja, prehrana itd.

Rezultati:

opis upotrijebljene metode za utvrđivanje stupnja nadraženosti kod svakog opažanja (npr. ručna slit-lampa, biomikroskop, fluorescein),

tablični prikaz podataka o reakcijama na nadraživanje/nagrizanje za svaku životinju kod svakog opažanja sve do izlučivanja životinje iz ispitivanja,

narativni opis stupnja i vrste opažene nadraženosti ili nagriženosti,

opis svih drugih lezija opaženih na oku (npr. vaskularizacija, formiranje panusa, adhezije),

opis štetnih lokalnih i sustavnih štetnih učinaka koji nisu na oku i histopatološki nalazi, ako postoje.

Diskusija o rezultatima.

3.2. TUMAČENJE REZULTATA Ekstrapolacija rezultata studija nadraživanja oka kod laboratorijskih životinja na ljude valjana je samo do određene granice. U mnogim slučajevima albino kunići puno su osjetljiviji na tvari koje nadražuju ili nagrizaju oči. Pri tumačenju podataka treba paziti da se isključi nadraženost uzrokovana sekundarnom infekcijom.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)

REFERENCE Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, str. 410-429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N., (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, str. 159-164. Worth A.P. and Fentem J.H., (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, str. 161-177 Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicollogy In Vitro, 2, str. 19-26. Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, str. 227-231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, str. 483-524. Ispitna metoda B.40 Nagrizanje kože. Ispitna metoda B.4. Akutna toksičnost: nadraživanje/nagrizanje kože. OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6. htm). OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos. htm).

Tablica 1. STUPNJEVANJE OČNIH LEZIJA

Rožnica

Zamućenost: stupanj neprozirnosti (treba očitati vrijednosti za najneprozirniji dio rožnice Nema ulceracije ni zamućenosti 0 Razbacana ili difuzna područja zamućenosti (osim blagog zamućenja normalnog sjaja); detalji šarenice jasno vidljivi 1 Jasno vidljiva prozirna područja; detalji šarenice lagano zasjenjeni 2 Sedefasta područja; nisu vidljivi detalji šarenice; veličina zjenice jedva vidljiva 3 Zamućena rožnica: šarenica se ne razaznaje zbog zamućenosti 4 Najviši mogući stupanj: 4

NAPOMENE Šarenica

Normalno 0 Izrazito produbljeni nabori, kongestija, oteklina, umjerena hiperemija oko rožnice; ili kongestija (proširenje krvnih sudova); šarenica reagira na svjetlo (usporena reakcija smatra se takvim učinkom ispitivane tvari) 1 Krvarenje, veliko oštećenje, ili nema reakcije na svjetlo 2 Najviši mogući stupanj: 2

Očna spojnica (konjunktiva) Crvenilo (odnosi se na palpebralnu i bulbarnu konjunktivu; isključujući rožnicu i šarenicu)

Normalno 0 Neki krvni sudovi hiperemični (pokazuju abnormalnu akumulaciju krvi) 1 Difuzna, skarletno crvena boja; pojedinačni sudovi ne mogu se jasno razaznati 2 Difuzno tamno crvenilo (boje mesa) 3 Najviši mogući stupanj: 3

Kemoza

Oteklina (odnosi se na kapak i/ili treći kapak) Normalno 0 Oteklina nešto iznad normale 1 Očita oteklina, s djelomičnim iskretanjem kapka prema van (everzija) 2 Oteklina, kapak napola zatvoren 3 Oteklina, kapak više od napola zatvoren 4 Najviši mogući stupanj: 4

B.6. SENZIBILIZACIJA KOŽE

B.6.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Napomene: Osjetljivost testova i njihova sposobnost otkrivanja mogućih senzibilizatora ljudske kože smatraju se važnima u sustavu klasifikacije toksičnosti relevantne za ljudsko zdravlje. Ne postoji niti jedna ispitna metoda kojom se na primjeren način mogu utvrditi sve tvari koje mogu senzibilizirati ljudsku kožu i koja je relevantna za sve tvari. Pri odabiru testa treba uzeti u obzir čimbenke kao što su fizikalna svojstva predmetne tvari, uključujući njezinu sposobnost prodiranja u kožu. Razvijene su dvije vrste testova koji se provode na zamorcima: testovi u kojima se koristi adjuvans, kod kojih se alergijska reakcija pojačava otapanjem ili suspendiranjem ispitivane tvari u Freundovom potpunom adjuvansu (FCA) i testovi u kojima se adjuvans ne koristi. U načelu su testovi kod kojih se upotrebljava adjuvans točniji u predviđanju vjerojatnog senzibilizacijskog učinka tvari na ljudsku kožu od onih kod kojih se Freundov potpuni adjuvans ne upotrebljava, pa su zato kao metoda primjereniji. Maksimizacijski test sa zamorcima (GPMT) često je primjenjivani test s adjuvansom. Iako se može koristiti nekoliko drugih metoda za utvrđivanje potencijala tvari da prouzroči senzibilizacijsku reakciju kože, GPMT se smatra najprimjerenijom tehnikom u kojoj se koristi adjuvans. Za mnoge se kemijske klase manje osjetljivima smatraju testovi u kojima se adjuvans ne koristi (preferira se Buehlerov test). U određenim slučajevima mogu postojati utemeljeni razlozi za odabir Buehlerovog testa u kojem se ispitivana tvar primjenjuje lokalno, a ne intramedalnom injekcijom koja se koristi u maksimizacijskom testu sa zamorcima. U slučajevima kad se koristi Buehlerov test potrebno je dati znanstveno opravdanje. Maksimizacijski test na zamorcima (GPMT) i Buehlerov test opisani su u ovoj metodi. Druge se metode mogu koristiti ako su ispravno validirane i znanstveno opravdane. Ako se kod nekog priznatog testa probira utvrdi pozitivan rezultat, ispitivana se tvar može odrediti kao potencijalni senzibilizator pa nije potrebno provoditi daljnja ispitivanja na zamorcima. Međutim, ako se kod takvog testa utvrdi negativan rezultat, mora se provesti ispitivanje na zamorcima, uz primjenu postupka opisanog u ovoj ispitnoj metodi. Vidjeti također Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJE Senzibilizacija kože: (alergijski kontaktni dermatitis) imunološki posredovana kožna reakcija na određenu tvar. Kod ljudi reakciju može karakterizirati pruritis (svrbež), eritemi (crvenilo), edemi (otekline), papule (kožne izbočine), vezikule (mjehurići), bule (mjehuri) ili kombinacija navedenog. Kod drugih životinjskih vrsta reakcije se mogu razlikovati, te se mogu javiti samo eritemi i edemi. Indukcijsko izlaganje: pokusno izlaganje subjekta ispitivanoj tvari s namjerom izazivanja stanja preosjetljivosti. Indukcijsko razdoblje: razdoblje od najmanje jednog tjedna nakon indukcijske izloženosti tijekom kojega se može razviti stanje preosjetljivosti. Provokacijsko izlaganje: pokusno izlaganje prethodno tretiranog subjekta ispitivanoj tvari nakon indukcijskog razdoblja, kako bi se utvrdilo javlja li se kod subjekta reakcija preosjetljivosti.

1.3. REFERENTNE TVARI: Osjetljivost i pouzdanost pokusne tehnike koja se koristi treba ocjenjivati svakih šest mjeseci pomoću tvari za koje se zna da izazivaju blagu do srednju preosjetljivost kože. Kod pravilno provedenog ispitivanja tvari koje izazivaju blagu do srednju preosjetljivost treba očekivati reakciju od najmanje 30 % u testu u kojem se adjuvans koristi i najmanje 15 % u testu u kojem se adjuvans ne koristi. Prvenstveno se upotrebljavaju sljedeće tvari: CAS brojevi EINECS brojevi EINECS nazivi Uobičajeni nazivi 101-86-0 202-983-3 α-heksilcinamaldehid α-heksilcinamaldehid 149-30-4 205-736-8 benzotiazol-2-tiol (merkaptobenzotiazol) kaptaks 94-09-7 202-303-5 benzokain norkain U nekim se okolnostima, ako za to postoji primjereno opravdanje, mogu koristiti neke druge kontrolne tvari koje ispunjavaju gore navedeni kriterije.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Na početku se pokusne životinje izlažu ispitivanoj tvari intramedalnim injekcijama i/ili epidermalnim nanošenjem (indukcijsko izlaganje). Nakon razdoblja odmora od 10 do 14 dana (indukcijsko razdoblje), tijekom kojega se može razviti imuna reakcija, životinje se izlažu provokacijskoj dozi. Obim i stupanj kožne reakcije na provokacijsku izloženost kod pokusnih životinja uspoređuje se s reakcijama opaženim kod kontrolnih životinja koje se tijekom indukcije podvrgavaju simuliranom tretiranju i primaju provokacijsku dozu.

1.5. OPIS ISPITNIH METODA Ako se uklanjanje ispitivane tvari smatra neophodnim, to treba učiniti vodom ili odgovarajućom otopinom, ne izazivajući promjene u postojećoj reakciji i ne narušavajući cjelovitost epiderme.

1.5.

1.5.1. Maksimizacijski test na zamorcima (GPMT)

1.5.1.

1.5.1.1. Priprema Zdravi mladi odrasli albino zamorci prilagođavaju se laboratorijskim uvjetima najmanje pet dana prije ispitivanja. Životinje se prije testa nasumce biraju i raspoređuju u skupine za tretiranje. Dlaka se odstranjuje šišanjem, brijanjem ili eventualno kemijskom depilacijom, ovisno o ispitnoj metodi koja se koristiti. Mora se paziti da se pritom ne ošteti površina kože. Životinje se važu prije nego ispitivanje započne i na kraju ispitivanja.

1.5.1.2. Uvjeti ispitivanja

1.5.1.2.

1.5.1.2.1. Pokusne životinje Koriste se albino zamorci sojeva koji se obično koriste u laboratorijima.

1.5.1.2.2. Broj i spol Mogu se koristiti mužjaci i/ili ženke. Ako se koriste ženke, treba koristiti one koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. Koristi se najmanje 10 životinja u skupini za tretiranje i najmanje pet životnija u kontrolnoj skupini. Ako se upotrijebi manje od 20 pokusnih i 10 kontrolnih zamoraca i pritom nije moguće zaključiti da ispitivana tvar spada u senzibilizatore, posebno se preporuča ispitivanje na dodatnim životinjama kako bi se dobio ukupan broj od najmanje 20 pokusnih i 10 kontrolnih životinja.

1.5.1.2.3. Visina doza Koncentracija ispitivane tvari koja se koristi za svako indukcijsko izlaganje treba biti koncentracija koju životinja sustavno dobro podnosi i najviša koncentracija koja izaziva blagu do srednju nadraženost kože. Koncentracija koja se koristi za provokacijsko izlaganje treba odgovarati najvišoj dozi koja ne izaziva nadraženost. Odgovarajuće koncentracije treba utvrditi na temelju pilotske studije provedene na dvije ili tri životinje, ako nisu raspoložive druge informacije. Treba paziti da se za tu svrhu koriste životinje tretirane uz primjenu potpunog Freundovog adjuvansa (FCA).

1.5.1.3. Postupak

1.5.1.3.

1.5.1.3.1. Indukcija Dan 0 – tretirana skupina U području ramena, s kojega je prethodno odstranjena dlaka, daju se tri para intradermalnih injekcija volumena 0,1 ml, po jedna injekcija iz svakog para sa svake strane zamišljene središnje linije. Injekcija 1: mješavina 1:1 (v/v) FCA/voda ili fiziološka otopina. Injekcija 2: ispitivana tvar u odabranoj koncentraciji u odgovarajućoj otopini. Injekcija 3: ispitivana tvar u odabranoj koncentraciji, formulirana u mješavini 1:1 (v/v) FCA/voda ili fiziološka otopina. U injekciji 3 tvari topljive u vodi otopljene su u vodenoj fazi prije miješanja s potpunim Freundovim adjuvansom (FCA). Tvari koje su topljive u mastima ili netopljive suspendiraju se u potpunom Freundovom adjuvansu (FCA) prije miješanja s vodenom fazom. Konačna koncentracija ispitivane tvari mora biti jednaka koncentraciji upotrijebljenoj u injekciji 2. Injekcije 1 i 2 daju se blizu jedna drugoj i najbliže glavi, dok se injekcija 3 daje više prema kaudalnom (zadnjem) kraju ispitne površine. Dan 0 – kontrolna skupina Na ista područja kao i kod tretiranih životinja daju se po tri para intradermalnih injekcija volumena 0,1 ml. Injekcija 1: mješavina 1:1 (v/v) FCA/voda ili fiziološka otopina. Injekcija 2: nerazrijeđeni nosač. Injekcija 3: 50 %-tna w/v formulacija nosača u mješavini 1:1 (v/v) FCA/voda ili fiziološka otopina. Dan 5-7 – tretirana i kontrolna skupina Oko 24 sata prije lokalne indukcijske primjene, ako tvar ne nadražuje kožu, ispitna se površina nakon šišanja uz kožu i/ili brijanja tretira s 0,5 ml 10 %-tne otopine natrijevog lauril sulfata u vazelinu, kako bi se izazvala lokalna nadraženost. Dan 6-8 – tretirana skupina S ispitne površine se ponovo odstranjuje dlaka. Filtarski papir (2 × 4 cm), potpuno se natopi ispitivanom tvari u odgovarajućem nosaču, stavi na ispitnu površinu i drži u kontaktu s kožom 48 sati pomoću okluzivnog obloga. Treba navesti razloge za odabir nosača. Krute se tvari usitne u fini prah i sjedine u odgovarajućem nosaču. Prema potrebi, tekućine se mogu nanositi nerazrijeđene. Dan 6-8 – kontrolna skupina S ispitne se površine ponovo odstranjuje dlaka. Na sličan se način na ispitnu površinu nanosi sami nosač i pomoću okluzivnog obloga drži u kontaktu s kožom 48 sati.

1.5.1.3.2. Provokacija Dan 20-22 – tretirana i kontrolna skupina Sa slabina tretiranih i kontrolnih životinja odstrani se dlaka. Krpica ili okluzivna komora (HTC) s ispitivanom tvari stavi se na jednu stranu slabina životinje i, ako je to relevantno za pokus, isto se tako može staviti jedna krpica ili okluzivna komora (HTC) koja sadrži samo nosač. Krpice se 24 sata drže u kontaktu s kožom pomoću okluzivnog obloga.

1.5.1.3.3. Opažanje i ocjenjivanje: tretirana i kontrolna skupina Preporuča se slijepa proba na pokusnim i kontrolnim životinjama. Ako rezultate dobivene u prvoj provokaciji treba pojasniti, treba razmotriti mogućnost izvedbe druge provokacije (tj. ponovne provokacije) na novoj kontrolnoj skupini, tamo gdje je to primjereno, oko tjedan dana nakon prve provokacije. Ponovna provokacija može se jednako tako provesti na istoj kontrolnoj skupini. Sve kožne reakcije i sve neuobičajene nalaze, uključujući sustavne reakcije, koji proizlaze iz indukcijskog i provokacijskog postupka treba opažati i bilježiti prema skali za stupnjevanje po Magnussonu/Kligmanu (vidjeti Dodatak). U svrhu pojašnjavanja dvojbenih rezultata mogu se provoditi i drugi postupci, npr. histopatološki pregled, mjerenje debljine kožnih nabora.

oko 21 sat nakon skidanja komprese provokacijska površina se opere i ošiša uz kožu i/ili obrije i, ako je potrebno, depilira,

oko tri sata kasnije (oko 48 sati od početka provokacijske primjene) kožna se reakcija opaža i bilježi prema stupnjevima prikazanim u Dodatku,

oko 24 sata nakon ovog opažanja provodi se drugo opažanje (72 sata), a rezultati se ponovo bilježe.

1.5.2. Buehlerov test

1.5.2.

1.5.2.1. Priprema Zdravi mladi odrasli albino zamorci prilagođavaju se laboratorijskim uvjetima najmanje pet dana prije ispitivanja. Životinje se prije testa nasumce biraju i raspoređuju u skupine za tretiranje. Dlaka se odstranjuje šišanjem, brijanjem ili eventualno kemijskom depilacijom, ovisno o ispitnoj metodi koja će se koristiti. Mora se paziti da se pritom ne ošteti površina kože. Životinje se važu prije početka ispitivanja i na kraju ispitivanja.

1.5.2.2. Uvjeti ispitivanja

1.5.2.2.

1.5.2.2.1. Pokusne životinje Koriste se albino zamorci sojeva koji se obično koriste u laboratorijima.

1.5.2.2.2. Broj i spol Mogu se koristiti mužjaci i/ili ženke. Ako se koriste ženke, treba koristiti one koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. Koristi se najmanje 20 životinja u skupini za tretiranje i najmanje 10 životinja u kontrolnoj skupini.

1.5.2.2.3. Visina doza Koncentracija ispitivane tvari koja se koristi za svako indukcijsko izlaganje treba biti najviša moguća koncentracija koja izaziva blagu, a ne pretjeranu nadraženost kože. Koncentracija koja se koristi za provokacijsko izlaganje treba odgovarati najvišoj dozi koja ne izaziva nadraženost. Ako je potrebno, odgovarajuće koncentracije mogu se utvrditi na temelju pilotske studije provedene na dvije ili tri životinje. Kad se radi o tvarima topljivima u vodi, kao nosač je primjereno koristiti vodu ili razrijeđenu nenadražujuću otopinu surfaktanta. Za druge ispitivane tvari primjerenija je 80 %-tna mješavina etanola i vode za indukciju i aceton za provokaciju.

1.5.2.3. Postupak

1.5.2.3.

1.5.2.3.1. Indukcija Dan 0 – tretirana skupina S jedne strane slabina odstrani se dlaka (šišanjem uz kožu). Ispitni epikutani sustav (patch sustav) treba biti potpuno natopljen ispitivanom tvari u odgovarajućem nosaču (za odabir nosača treba navesti razloge; tekuće ispitivane tvari mogu se prema potrebi primijeniti nerazrijeđene). Ispitni epikutani sustav stavi se na ispitnu površinu i drži u kontaktu s kožom pomoću okluzivne krpice ili komore (HTC) i odgovarajućeg obloga šest sati. Ispitni epikutani sustav mora biti okluzivan. Primjereno je upotrijebiti pamučnu blazinicu koja može biti okrugla ili četverokutna, približne površine 4-6 cm2. Da bi se osigurala okluzija preporuča se životinju sputati pomoću odgovarajućeg pomagala za sputavanje. Ako se upotrijebi oblog možda će biti potrebna dodatna izlaganja. Dan 0 – kontrolna skupina S jedne strane slabina odstrani se dlaka (šišanjem uz kožu). Na ispitnu se površinu nanese sami nosač, na isti način koji se primjenjuje na tretiranu skupinu. Ispitni epikutani sustav drži se u kontaktu s kožom pomoću okluzivne krpice ili komore (HTC) i odgovarajućeg obloga šest sati. Ako se može dokazati da lažna kontrolna skupina nije potrebna, može se upotrijebiti netretirana kontrolna skupina. Dan 6-8 i 13-15 – tretirana i kontrolna skupina Na dan 6-8 i zatim ponovo na dan 13-15 ispitivana tvar se nanese jednako kao na dan 0 na isto područje (s kojeg se prema potrebi odstrani dlaka).

1.5.2.3.2. Provokacija Dan 27-29 – tretirana i kontrolna skupina S netretirane strane slabina tretiranih i netretiranih životinja odstrani se dlaka (šišanjem uz kožu). Okluzivna krpica ili komora (HTC) koja sadrži odgovarajuću količinu ispitivane tvari u maksimalnoj koncentraciji koja ne izaziva nadraženost stavi se na stražnji dio netretirane strane slabina tretiranih i kontrolnih životinja. U slučajevima kad je to relevantno, okluzivna krpica ili komora (HTC) natopljena samo nosačem stavi se na prednji dio netretirane strane slabina kako tretiranih tako i kontrolnih životinja. Krpice ili komore (HTC) drže se u kontaktu s kožom pomoću odgovarajućeg obloga šest sati.

1.5.2.3.3. Opažanje i ocjenjivanje Preporuča se slijepa proba na pokusnim i kontrolnim životinjama. Ako je potrebno pojasniti rezultate dobivene u prvoj provokaciji, treba razmotriti mogućnost izvedbe druge provokacije (tj. ponovne provokacije) na novoj kontrolnoj skupini, tamo gdje je to primjereno, oko tjedan dana nakon prve provokacije. Ponovna provokacija može se provesti na istoj kontrolnoj skupini. Sve kožne reakcije i sve neuobičajene nalaze, uključujući sustavne reakcije, koji proizlaze iz indukcijskog i provokacijskog postupka treba opažati i bilježiti prema skali za stupnjevanje po Magnussonu/Kligmanu (vidjeti Dodatak). U svrhu pojašnjavanja dvojbenih rezultata mogu se provoditi i drugi postupci, npr. histopatološki pregled, mjerenje debljine kožnih nabora.

oko 21 sat nakon skidanja komprese s provokacijske se površine odstrani dlaka,

oko tri sata kasnije (oko 30 sati nakon primjene krpice za provokaciju) kožne se reakcije opažaju i bilježe prema stupnjevima prikazanim u Dodatku,

približno 24 sata nakon 30-satnog opažanja (oko 54 sata nakon stavljanja krpice za provokaciju) kožne se reakcije ponovo opažaju i bilježe.

2. PODACI (GPMT i Buehlerov test) Podatke treba rezimirati u obliku tablice u kojoj će biti prikazane kožne reakcije za svaku životinju, zabilježene kod svakog opažanja.

3. IZVJEŠĆIVANJE (GPMT i Buehlerov test) Ako se prije testa na zamorcima provede test probira, pored rezultata dobivenih s ispitivanom i referentnom tvari, mora se dati opis ili uputa na taj test (npr. test oticanja ušiju kod miševa (MEST) uključujući detaljne podatke o postupku.

3. Izvješće o ispitivanju (GPMT i Buehlerov test)

Izvješće o ispitivanju treba, ako je moguće, sadržavati sljedeće informacije:

pokusne životinje:

upotrijebljeni soj zamoraca,

broj, starost i spol životinja,

podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,

tjelesna masa pojedinačnih životinja na početku ispitivanja.

Uvjeti ispitivanja:

tehnika pripremanja mjesta na koje će se staviti krpica,

pojedinosti o upotrijebljenim materijalima i tehnici stavljanja krpice,

rezultat pilotske studije sa zaključkom o indukcijskim i provokacijskim koncentracijama koje će se koristiti u ispitivanju,

pojedinosti o pripremi, nanošenju i uklanjanju ispitivane tvari,

obrazloženje za odabir nosača,

koncentracije nosača i ispitivane tvari, korištene pri indukcijskom i provokacijskom izlaganju i ukupna količina tvari upotrijebljene za indukciju i provokaciju.

Rezultati:

kratki pregled rezultata zadnje provjere osjetljivosti i pouzdanosti (vidjeti 1.3.) uključujući informacije o upotrijebljenoj tvari, koncentraciji i nosaču,

za svaku životinju, uključujući sustav stupnjevanja,

narativni opis vrste i stupnja opaženih učinaka,

svi histopatološki nalazi.

Diskusija o rezultatima.

Zaključci.

4. REFERENCE Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 406.

B.7. TOKSIČNOST (ORALNA) PRI PONOVLJENOJ DOZI (28 DANA)

B.7.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJE Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.3. NAČELO ISPITNE METODE Ispitivana tvar oralno se primjenjuje svaki dan u sve većim dozama na nekoliko skupina pokusnih životinja, jedna visina doze po skupini, tijekom 28 dana. Tijekom razdoblja primjene životinje se svaki dan pozorno opažaju kako bi se otkrili znakovi toksičnosti. Životinje koje uginu ili ih se usmrti tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a preživjele se životinje na kraju ispitivanja usmrćuju i potom podvrgavaju obdukciji. Ova metoda jači naglasak stavlja na neurološke reakcije kao specifični konačni učinak, a naglašava i potrebu za pozornim kliničkim opažanjem životinja kako bi se dobilo što je moguće više informacija. Cilj je ove metode identificirati kemikalije koje imaju neuro toksički potencijal, što može zahtijevati daljnja podrobna istraživanja ovog aspekta. Osim toga, ova metoda može pokazati imunološke učinke i reproduktivnu toksičnost.

1.4. OPIS ISPITNE METODE

1.4.

1.4.1. Priprema Zdrave mlade odrasle životinje nasumce se raspoređuju u kontrolnu skupine i skupine koja će se tretirati. Kaveze treba tako rasporediti da se učinci do kojih bi moglo doći zbog njihovog položaja svedu na minimum. Životinje treba označiti jedinstvenim oznakama i držati u kavezima najmanje pet dana prije početka studije, kako bi se mogle prilagoditi laboratorijskim uvjetima. Ispitivana se tvar primjenjuje pomoću želučane sonde ili preko hrane ili vode za piće. Metoda oralne primjene ovisi o namjeni studije i o fizikalnim/kemijskim svojstvima tvari. Prema potrebi tvar se otopi ili suspendira u odgovarajućem nosaču. Preporuča se, kad god je to moguće, najprije razmotriti mogućnost upotrebe vodene otopine/suspenzije, zatim uljne otopine/suspenzije (npr. kukuruzno ulje) i tek onda mogućnost upotrebe otopina u drugim nosačima. Ako se koriste drugi nosači, a ne voda, moraju biti poznata toksička svojstva tih nosača. Treba utvrditi stabilnost ispitivane tvari u nosaču.

1.4.2. Uvjeti ispitivanja

1.4.2.

1.4.2.1. Pokusne životinje Najčešće korištena vrsta glodavaca je štakor, iako se mogu koristiti i neke druge vrste. Treba koristiti mlade, zdrave, odrasle životinje sojeva koji se obično koriste u laboratoriju. Ženke ne smiju prethodno imati potomstvo i ne smiju biti gravidne. Primjena doza treba započeti čim prije nakon odbijanja od sise i, u svakom slučaju, prije nego što životinje napune devet tjedana starosti. Na početku studije razlike u masi korištenih životinja trebaju biti minimalne i ne smiju prijeći ± 20 % od srednje mase životinja svakog spola. Ako se kao preliminarni test za dugoročnu studiju provodi studija s ponavljanjem oralnog doziranja, preporuča se u obje studije koristiti životinje istog soja i istog podrijetla.

1.4.2.2. Broj i spol Za svaku visinu doze treba upotrijebiti najmanje 10 životinja (pet ženki i pet mužjaka). Ako se planira usmrćivanje životinja u međuvremenu, prije završetka studije, navedeni broj treba povećati za broj životinja predviđen za takvo usmrćivanje. Osim toga, jedna satelitska skupina od 10 životinja (po pet od svakog spola) može se 28 dana tretirati visokom dozom i sljedećih 14 dana opažati s obzirom na reverzibilnost, trajanje ili odgođenu pojavu toksičkih učinaka. Koristi se i jedna satelitska skupina od 10 kontrolnih životinja (po pet životinja od svakog spola).

1.4.2.3. Visina doza Općenito, treba upotrijebiti najmanje tri ispitne skupine i jednu kontrolnu skupinu. Izuzimajući tretiranje ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnoj skupini treba postupati jednako kao sa životinjama u ispitnoj skupini. Ako se kod primjene ispitivane tvari koristi nosač, kontrolna skupina treba primiti nosač u najvećoj količini koja se koristi u ispitivanju. Ako se na temelju procjene drugih podataka ne očekuju nikakvi učinci pri dozi od 1000 mg/kg tjelesne mase/dan, može se provesti granični test. Ako nema odgovarajućih podataka, može se provesti studija utvrđivanja količinskog raspona da bi se lakše utvrdile doze koje će se primjenjivati. Visine doza treba odabrati uzimajući u obzir sve raspoložive podatke o toksičkim i (toksiko-) kinetičkim svojstvima ispitivane tvari ili materijala koji su joj srodni. Treba odabrati najvišu dozu s ciljem da se izazove toksičko djelovanje, ali ne i smrt ili teška patnja. Nakon toga treba odabrati niz sve nižih doza kako bi se dobile sve reakcije vezane uz doziranje i na kraju najniža doza kod koje nema vidljivih toksičkih učinaka (NOAEL). Za utvrđivanje sve nižih razina doza često je najbolje doze primijeniti u dva do četiri kraća intervala te je često bolje dodati četvrtu ispitnu skupinu nego između dva doziranja imati jako dugi interval (npr. gdje je faktor veći od 10). Ako se ispitivane tvari primjenjuju preko hrane ili vode za piće važno je osigurati da upotrijebljena količina tvari ne utječe na normalnu prehranu ili ravnotežu napajanja. Ako se ispitivana tvar daje s hranom može se upotrijebiti ili u stalnoj koncentraciji u hrani (ppm) ili u stalnoj dozi s obzirom na tjelesnu masu životinje; upotrijebljena alternativa mora se navesti. Ako se tvar primjenjuje pomoću želučane sonde, dozu treba unositi približno u isto vrijeme svaki dan i prema potrebi prilagođavati kako bi se održavala stalna visina doze u odnosu na tjelesnu masu životinje. Ako se prije dugoročne studije provede studija s ponavljanom dozom, u obje studije treba upotrijebiti sličnu prehranu.

1.4.2.4. Granični test Ako test pri jednoj visini doze od najmanje 1000 mg/kg tjelesne mase/dan ili, ako se primjenjuje u hrani ili vodi, pri jednakovrijednoj koncentraciji u hrani ili pitkoj vodi (koja se određuje na temelju tjelesne mase) uz primjenu postupka opisanog za ovu studiju, ne proizvede vidljive toksičke učinke i ako se na temelju podataka o strukturno srodnim tvarima toksičnost ne očekuje, potpuna studija uz primjenu tri visine doza može se smatrati nepotrebnom. Granični test ne vrijedi samo ako ljudska izloženost ukazuje na potrebu za primjenom viših doza.

1.4.2.5. Razdoblje opažanja Razdoblje opažanja treba trajati 28 dana. Životinje iz satelitske skupine koje su predviđene za dodatna opažanja treba držati najmanje još 14 dana bez tretiranja kako bi se otkrila odgođena pojava, trajnost, ili nestanak toksičkih učinaka.

1.4.3. Postupak Životinjama se dozira ispitivana tvar svaki dan sedam dana u tjednu tijekom razdoblja od 28 dana; za primjenu petodnevnog tjednog režima doziranja treba navesti razloge. Ako se ispitivana tvar primjenjuje oralnom intubacijom, životinji treba dati jednu dozu koristeći želučanu sondu ili odgovarajuću intubacijsku kanilu. Maksimalni volumen tekućine koji se može primijeniti odjednom ovisi o veličini pokusne životinje. Taj volumen ne smije biti veći od 1 ml/100 g tjelesne mase, osim kad se radi o vodenim otopinama koje dopuštaju primjenu volumena od 2 ml/100 g tjelesne mase. Osim kod nadražujućih i nagrizajućih tvari, koje pri višim koncentracijama odmah izazivaju pogoršanje, variranje ispitnih volumena treba svesti na minimum podešavanjem koncentracije, kako bi se kod svih visina doza osigurao stalni volumen.

1.4.3.

1.4.3.1. Opća opažanja Opća klinička opažanja treba provoditi najmanje jednom dnevno, po mogućnosti svaki dan u isto vrijeme, vodeći računa o razdoblju najvećeg intenziteta očekivanih učinaka nakon primjene doze. Zdravstveno stanje životinja treba bilježiti. Najmanje dva puta dnevno treba provjeravati ima li slučajeva pobolijevanja ili smrti životinja. Životinje u stanju umiranja ili one koje trpe jaki stres ili bol treba odmah po uočavanju izlučiti, humano usmrtiti i podvrgnuti obdukciji. Jednom prije prvog izlaganja (kako bi se omogućila usporedba na istom subjektu) i najmanje jednom tjedno nakon tog treba obavljati klinička opažanja svih životinja. Ta opažanja treba obavljati izvan kaveza u kojima se životinje drže, u standardnom ograđenom prostoru i, po mogućnosti, svaki put u isto vrijeme. Opažanja treba temeljito zabilježiti, po mogućnosti koristeći sustav stupnjevanja koji jasno definira ispitni laboratorij. Treba učiniti sve što je neophodno da variranje ispitnih uvjeta bude minimalno i da opažanje obavljaju osobe koje nisu upoznate s tretiranjem. Znakovi koji se bilježe trebaju uključivati, ali ne biti ograničeni na, promjene na koži, dlaci, očima, sluznicama, na pojavu iscjedaka, na izlučine i autonomne aktivnosti (lakrimacija (lučenje suza), piloerekcija, veličina zjenica, nepravilnosti u disanju). Promjene u kretanju, držanju i reakcijama na rukovanje, kao i prisutnost kloničnih ili toničnih kretnji, stereotipa (npr. prekomjerno njegovanje dlake, stalno kretanje u krug) ili bizarno ponašanje (npr. samoranjavanje, hodanje unatrag) također treba zabilježiti. U četvrtom tjednu izlaganja treba provesti ocjenjivanje senzoričke reaktivnosti na različite podražaje (npr. auditorne (slušne), vizualne (vidne) i proprioceptivne podražaje), sposobnost zahvaćanja i motorne aktivnosti. Više pojedinosti o postupcima koji se mogu primijeniti dane su u literaturi (vidjeti Opći uvod, dio B). Funkcionalna opažanja provedena u četvrtom tjednu izlaganja mogu se izostaviti ako se studija provodi kao preliminarna studija za kasniju studiju subkronične toksičnosti (u trajanju od 90 dana). U tom slučaju funkcionalna opažanja treba uključiti u tu drugu studiju. S druge strane, postojanje podataka o funkcionalnim opažanjima iz studije s ponavljanim dozama može olakšati odabir visine doza za kasniju studiju subkronične toksičnosti. Iznimno se funkcionalna opažanja mogu izostaviti i kod skupina koje inače pokazuju znakove toksičnosti takvog stupnja da bi to moglo utjecati na izvedbu funkcionalnog ispitivanja.

1.4.3.2. Tjelesna masa i unos hrane/vode Sve životinje treba vagati najmanje jednom tjedno. Najmanje jednom tjedno treba mjeriti unos hrane i vode. Ako se ispitivana tvar primjenjuje preko vode za piće, unos vode isto tako treba mjeriti najmanje jednom tjedno.

1.4.3.3. Hematologija Na kraju razdoblja ispitivanja treba obaviti sljedeće hematološke pretrage: hematokrit, koncentracija hemoglobina, broj eritrocita, ukupan i diferencijalni broj leukocita, broj trombocita (krvnih pločica) i vrijeme/mogućnost zgrušavanja. Uzorke krvi treba uzeti iz određenog područja neposredno prije ili tijekom postupka usmrćivanja životinja i pohraniti u odgovarajućim uvjetima.

1.4.3.4. Klinička biokemija Kliničke biokemijske pretrage cilj kojih je istražiti toksičko djelovanje na tkiva, a posebno na bubrege i jetru, treba obaviti na uzorcima krvi koji se svim životinjama uzimaju neposredno prije ili tijekom postupka usmrćivanja (osim onih kod kojih se utvrdi stanje umiranja i/ili ih se usmrti tijekom pokusa). Preporuča se da preko noći prije uzimanja uzorka krvi životinje poste. Pretrage plazme ili seruma uključuju i određivanje razine natrija, kalija, glukoze, ukupnog kolesterola, ureje, kreatinina, ukupnih proteina i albumina, najmanje dva enzima koja su pokazatelji hepatocelularnih učinaka (kao što su alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, alkalna fosfataza, gama glutamil transpeptidaza i sorbitol dehidrogenaza). Mjerenja dodatnih enzima (hepatičkog ili nekog drugog podrijetla) i žučnih kiselina mogu u određenim uvjetima pružiti korisne informacije. Po izboru se u zadnjem tjednu studije mogu obaviti i analitičke pretrage urina prikupljenog u određenom vremenu, kojima se utvrđuje: izgled, količina, osmolalnost ili specifična težina, pH, protein, glukoza i krv/krvne stanice u urinu. Osim toga, treba razmotriti i mogućnost provođenja studija s ciljem utvrđivanja serumskih markera koji upućuju na opće oštećenje tkiva. Ostale pretrage, koje bi trebalo obaviti u slučaju da poznata svojstva ispitivane tvari mogu, ili se sumnja da bi mogla, utjecati na povezane metaboličke profile uključuju utvrđivanje razine kalcija, fosfata, triglicerida natašte, razine specifičnih hormona, metemoglobina i aktivnosti kolinesteraze. Sve je ove parametre potrebno odrediti za tvari svrstane u određene klase ili od slučaja do slučaja. Općenito je potreban fleksibilan pristup koji će ovisiti o vrsti pokusne životinje i o opažanom i/ili očekivanom učinku predmetne tvari. Ako podaci dobiveni prijašnjim ispitivanjima nisu dovoljni, prije početka primjene doza treba razmotriti mogućnost utvrđivanja hematoloških i kliničko-biokemijskih varijabli.

1.4.3.5. Makroskopska analiza (obdukcija) Sve životinje korištene u studiji moraju se podvrgnuti kompletnoj, detaljnoj makroskopskoj analizi koja uključuje pažljivi regled vanjske površine tijela, svih otvora te lubanjske, prsne i trbušne šupljine i njihovog sadržaja. S jetre, bubrega, nadbubrežne žlijezde, testisa, sjemenovoda, timusa, slezene, mozga i srca svih životinja treba obrezati svo okolno tkivo, prema potrebi, te ih još mokre izvagati što prije nakon sekcije, kako bi se izbjeglo sušenje organa. Slijedeća tkiva treba čuvati u sredstvu za fiksiranje koje je najprimjerenije i za vrstu tkiva i za planirani kasniji histopatološki pregled: sva tkiva s velikim lezijama, mozak (reprezentativne regije, uključujući veliki mozak, mali mozak i most), leđnu moždinu, želudac, tanko i debelo crijevo (uključujući Peyerove ploče), jetra, bubrege, nadbubrežne žlijezde, slezenu, srce, timus, štitnjaču, dušnik, pluća (prepariraju se upuhivanjem fiksativa i zatim uranjanjem), spolne žlijezde, pomoćne spolne organe (npr. maternicu, prostatu), mokraćni mjehur, limfne čvorove (po mogućnosti, jedan uzet s puta unosa ispitivane tvari u organizam i drugi, udaljen od puta unosa, kako bi se vidjeli sistemski učinci), periferni živac (bedreni (n. ischiadicus) ili tibijalni (n. tibialis)) po mogućnosti smješten uza sam mišić, i odsječak koštane srži (ili, alternativno, svježi aspirat koštane srži). Klinički i drugi nalazi mogu uputiti na potrebu za ispitivanjem dodatnih tkiva. Treba sačuvati i sve one organe za koje se na temelju saznanja o svojstvima ispitivane tvari smatra da bi mogli biti ciljni.

1.4.3.6. Histopatološki pregled Na sačuvanim organima i tkivima svih životinja iz kontrolne grupe i grupe izložene visokim dozama treba napraviti kompletan histopatološki pregled. Ako se u životinja na koje su primijenjene visoke doza ispitivane tvari primijete promjene, tada histopatološka ispitivanja treba obaviti i na životinjama iz svih ostalih skupina. Treba pregledati sve veće lezije. Ako se koristi satelitska skupina, histopatološkoj obradi treba podvrći ona tkiva i organe na kojima su u tretiranih životinja primijećene promjene.

2. PODACI Za svaku životinju treba imati zasebne podatke. Osim toga, podatke je najbolje rezimirati u obliku tablice u kojoj je za svaku testiranu skupinu prikazan broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje su uginule ili su usmrćene iz humanih razloga tijekom ispitivanja i vrijeme smrti ili humanog usmrćivanja, broj životinja kod kojih su opaženi znakovi toksičnosti, opis opažanih znakova toksičnosti, uključujući vrijeme pojavljivanja, trajanje i stupanj svih toksičkih učinaka, broj životinja kod kojih su se javile lezije, vrsta lezija i postotak životinja koje pokazuju određene vrste lezija. Tamo gdje je to moguće, sve rezultate treba analizirati uz primjenu odgovarajuće opće prihvatljive statističke metode. Statističke metode treba odabrati još u fazi planiranja studije.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU

Izvješće o ispitivanju treba, ako je moguće, sadržavati sljedeće informacije:

pokusne životinje:

upotrijebljena vrsta/soj,

broj, starost i spol životinja,

podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,

tjelesna masa pojedinačnih životinja na početku ispitivanja, zatim u tjednim intervalima i na kraju ispitivanja.

Uvjeti ispitivanja:

obrazloženje za odabir nosača, ako se ne radi o vodi,

obrazloženje za odabir visine doze,

pojedinosti o formulaciji ispitivane tvari/pripravi hrane, postignutim koncentracijama, stabilnosti i homogenosti pripravka,

pojedinosti o primjeni ispitivane tvari,

metoda preračunavanja koncentracije ispitivane tvari predviđene za primjenu putem hrane ili vode (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne težine/dan), ovisno o slučaju,

pojedinosti o kvaliteti hrane i vode.

Rezultati:

tjelesna masa/promjene u tjelesnoj masi,

unos hrane i unos vode, prema potrebi,

toksičke reakcije po spolu i visini doze, uključujući znakove toksičnosti,

vrsta, stupanj i trajanje kliničkih promjena (jesu li reverzibilne ili nisu),

ocjena senzoričke aktivnosti, snage stiska i motoričke aktivnosti,

hematološka ispitivanja s relevantnim ishodnim vrijednostima (na početku ispitivanja),

kliničko-biokemijska ispitivanja s relevantnim ishodnim vrijednostima (na početku ispitivanja),

podaci o tjelesnoj masi pri usmrćivanju i o masi organa,

nalazi obdukcije,

detaljan opis svih histopatoloških nalaza,

podaci o apsorpciji, ako su raspoloživi,

statistička obrada podataka, prema potrebi.

Diskusija o rezultatima.

Zaključci.

4. REFERENCE Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 407.

B.8. TOKSIČNOST (INHALACIJSKA) PRI PONAVLJANOJ DOZI (28 DANA)

B.8.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Korisno je imati preliminarne informacije o distribuciji veličine čestica, tlaku para, talištu, vrelištu, točki zapaljenja i eksplozivnosti tvari (prema potrebi). Isto tako vidjeti Opći uvod, dio B slovo (A).

1.2. DEFINICIJE Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (B).

1.3. REFERENTNE TVARI Nema ih.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Nekoliko se skupina pokusnih životinja svakodnevno izlaže ispitivanoj tvari u postupno sve većim koncentracijama kroz vremensko razdoblje od 28 dana, s tim da se na jednu skupinu životinja primjenjuje jedna koncentracija. Ako se za lakše postizanje odgovarajuće koncentracije ispitivane tvari u atmosferi koristi nosač, kontrolnu skupinu životinja treba upotrijebiti i za ispitivanje otapala. Tijekom razdoblja primjene obavlja se svakodnevno opažanje životinja radi otkrivanja znakova toksičnosti. Životinje koje uginu tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a po završetku ispitivanja životinje koje su preživjele ispitivanje usmrćuju se i obduciraju.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6.

1.6.1. Priprema Životinje se drže u pokusnim uvjetima u pogledu smještaja i hranjenja najmanje pet dana prije početka pokusa. Prije ispitivanja zdrave mlade životinje nasumce se biraju i raspoređuju u potreban broj skupina. Prema potrebi se u ispitivanu tvar može dodati odgovarajući nosač koji omogućava postizanje odgovarajuće koncentracije tvari u atmosferi. Ako se nosač ili neki drugi dodatak dodaje radi lakšeg doziranja, mora se za njega znati da ne proizvodi toksičke učinke. Ovisno o slučaju, mogu se upotrijebiti podaci iz prethodnih studija.

1.6.2. Uvjeti ispitivanja

1.6.2.

1.6.2.1. Pokusne životinje Ako nema kontraindikacija, preporuča se korištenje štakora i to onih sojeva koji se najčešće koriste u laboratorijima. Na početku ispitivanja raspon masa pojedinačnih životinja ne bi smio prelaziti ± 20 % od odgovarajuće srednje vrijednosti.

1.6.2.2. Broj i spol U svakoj ispitnoj skupini treba biti najmanje 10 životinja (5 ženki i pet mužjaka). Ženke ne smiju prethodno imati potomstvo i ne smiju biti gravidne. Ako se planira usmrćivanje životinja u međuvremenu, prije završetka studije, navedeni broj treba povećati za broj životinja predviđen za takvo usmrćivanje. Osim toga, jedna satelitska skupina od 10 životinja (po pet od svakog spola) može se 28 dana tretirati visokom dozom i nakon tretiranja 14 dana opažati s obzirom na reverzibilnost, trajanje ili odgođenu pojavu toksičkih učinaka. Isto se tako koristi jedna satelitska skupina od 10 kontrolnih životinja (po pet životinja od svakog spola).

1.6.2.3. Visine doza Potrebne su najmanje tri koncentracije s jednom kontrolom ili, ako se koristi nosač, s kontrolom nosača (čija koncentracija odgovara koncentraciji nosača koji se dodaje kod najviše doze). Izuzimajući tretiranje ispitivanom tvari, sa životinjama iz kontrolne skupine treba postupati na jednak način kao sa životinjama koje se podvrgavaju ispitivanju. Najviša koncentracija treba izazvati toksičke učinke, ali smrtnih ishoda ne smije biti ili se mogu javiti u rijetkim slučajevima. Najniža koncentracija ne bi smjela prouzročiti nikakve toksičke učinke. Tamo gdje postoji primjenljiva procjena razine ljudske izloženosti, najniža koncentracija treba biti malo viša od te procijenjene razine. U idealnom slučaju, srednja koncentracija bi trebala proizvesti minimalne vidljive toksičke učinke. Ako se između najviše i najniže koncentracije koristi više od jedne koncentracije, one se moraju primjenjivati u intervalima kako bi se njihovi toksički učinci mogli stupnjevati. U skupinama tretiranim niskim i srednjim dozama i u kontrolnim skupinama, stopa smrtnosti treba biti niska da bi ocjena rezultata uopće imala smisla.

1.6.2.4. Vrijeme izlaganja Dnevno izlaganje treba trajati šest sati, ali za ispunjavanje posebnih zahtjeva možda će to razdoblje trebati mijenjati.

1.6.2.5. Oprema Životinje treba testirati pomoću inhalacijske opreme čija konstrukcija omogućuje protok zraka s najmanje 12 potpunih izmjena u jednom satu, kako bi se osigurao odgovarajući sadržaj kisika i atmosfera u kojoj je tvar kojoj se životinja izlaže jednakomjerno raspoređena. Ako se za ispitivanje koristi komora, njezina konstrukcija treba omogućiti minimalnu naguranost životinja i maksimalnu inhalacijsku izloženost ispitivanoj tvari. Da bi se osigurala stabilnost atmosfere u komori, primjenjuje se opće pravilo da ukupan volumen pokusne životinje ne smije biti veći od 5 % volumena ispitne komore. Mogu se koristiti različiti tipovi komora koji omogućuju izloženost samo oro-nazalnih (usno-nosnih) otvora, samo glave ili čitavog tijela pojedinačne životinje; prva dva tipa omogućuju da se unošenje ispitivane tvari u organizam životinje drugim putevima svede na minimum.

1.6.2.6. Razdoblje opažanja Opažanje pokusnih životinja radi otkrivanja znakova toksičnosti treba provoditi svakodnevno tijekom cijelog razdoblja tretiranja i oporavka. Vrijeme smrti kao i vrijeme pojave i nestanka znakova toksičnosti treba zabilježiti.

1.6.3. Postupak Životinje se izlažu ispitivanoj tvari svaki dan, pet do sedam dana u tjednu, tijekom razdoblja od 28 dana. Životinje iz bilo koje satelitske skupine predviđene za daljnje opažanje treba držati još 14 dana bez tretiranja, kako bi se mogao uočiti oporavak od, ili postojanost toksičkih učinaka. Temperaturu pri kojoj se provodi ispitivanje treba održavati na 22 ± 3 °C. Idealno bi bilo relativnu vlažnost zraka održavati između 30 i 70 %, ali u nekim slučajevima (npr. testiranje nekih aerosola) to može biti neizvedivo. Održavanje laganog podtlaka u komori (≤ 5 mm vode) spriječit će istjecanje ispitivane tvari u okolni prostor. Za vrijeme izloženosti životinjama se ne smije davati hrana i voda. Treba koristiti dinamički inhalacijski sustav s odgovarajućim analitičkim sustavom za kontrolu koncentracije. Za utvrđivanje odgovarajućih koncentracija izlaganja preporuča se provođenje probnog testa. Protok zraka treba podesiti tako da se u cijeloj komori za izlaganje osiguraju ujednačeni uvjeti. Sustav treba u što kraćem vremenu omogućiti postizanje stabilnih uvjeta izlaganja. Treba mjeriti i pratiti: Tijekom i nakon izlaganja sustavno se izvode i bilježe opažanja; za svaku životinju treba voditi zasebne bilješke. Sve životinje treba svakodnevno opažati i bilježiti znakove toksičnosti, pri čemu treba navesti vrijeme njihovog pojavljivanja, njihov stupanj i trajanje. Opažanja trebaju obuhvaćati promjene na koži i dlaci, očima i sluznicama, na dišnom i cirkulacijskom sustavu, te na autonomnom i centralnom živčanom sustavu, kao i promjene u somatomotoričkoj aktivnosti i ponašanju. Svaki tjedan treba mjeriti tjelesnu masu životinja. Isto se tako preporuča tjedno mjerenje unosa hrane. Redovito je opažanje životinja neophodno da bi se spriječio gubitak životinja iz razloga kao što su kanibalizam, autoliza tkiva ili stavljanje u krive komore. Na kraju studije sve preživjele životinje osim onih iz satelitskih grupa podvrgavaju se obdukciji. Životinje na umoru i životinje koje trpe jaki stres ili bol treba po uočavanju ukloniti, humano usmrtiti i obducirati. Na kraju ispitivanja na svim životinjama, uključujući i kontrolne životinje, obavljaju se sljedeće pretrage: Druge pretrage koje mogu biti potrebne za adekvatnu toksikološku ocjenu uključuju određivanje kalcija, fosfora, klorida, natrija, kalija, glukoze (natašte), analizu lipida, hormona, ravnoteže kiselina i lužina, metemoglobina i aktivnosti kolinesteraze. Za detaljnije proučavanje toksičkih učinaka mogu se po potrebi obaviti dodatne kliničke biokemijske analize.

1.6.3.

(a) brzinu protoka zraka (neprekidno);

(b) stvarnu koncentraciju ispitivane tvari izmjerenu u zoni disanja. Tijekom dnevnog razdoblja izlaganja koncentracija ne smije varirati za više od ± 15 % srednje vrijednosti. Međutim, kad se radi o nekim aerosolima ova se razina kontrole možda neće moći postići pa bi u tom slučaju bio prihvatljiv i veći raspon odstupanja. Tijekom ukupnog trajanja pokusa, dnevne koncentracije treba održavati što je moguće stabilnijima. Kod aerosola treba obaviti barem jednu analizu veličine čestica tjedno za svaku skupinu životinja;

hematološke, koje uključuju najmanje utvrđivanje hematokrita, koncentracije hemoglobina, broj eritrocita, ukupni i diferencijalni broj leukocita i mjerenje sposobnosti zgrušavanja;

ii.

kliničke biokemijske pretrage krvi koje uključuju najmanje jedan parametar funkcije jetre i bubrega: serumska alanin aminotransferaza (prije poznata pod nazivom glutamat-piruvat transaminaza), serumska aspartat aminotransferaza (prije poznata pod nazivom glutamat-oksaloacetat transaminaza), dušik u ureji, albumin, kreatinin u krvi, ukupni bilirubin i ukupne serumske bjelančevine;

1.6.3.1. Makroskopska obdukcija Sve životinje iz studije treba podvrgnuti detaljnoj makroskopskoj obdukciji. Jetru, bubrege, nadbubrežne žlijezde, pluća i testise treba izvagati mokre, a da bi se spriječilo njihovo isušivanje to treba učiniti čim prije nakon seciranja. Organe i tkiva, tj. normalnu i tretiranu kožu, jetru, bubrege, slezenu, testise, nadbubrežne žlijezde, srce i ciljne organe (to jest sve organe na kojima su vidljive makroskopske lezije i promjene u veličini) treba čuvati (konzervirati) u odgovarajućem mediju za eventualne daljnje histopatološke pretrage. Pluća treba izvaditi bez oštećenja, izvagati i tretirati odgovarajućim fiksativom kako bi se sačuvala njihova struktura.

1.6.3.2. Histopatološki pregled Kod skupine tretirane visokim koncentracijama i kod kontrolne(-ih) skupne(-a) treba obaviti histološki pregled sačuvanih organa i tkiva. Organi i tkiva s oštećenjima koja se mogu pripisati visokim koncentracijama ispitivane tvari, moraju se detaljno ispitati i kod životinja iz skupina tretiranih niskim koncentracijama. Životinje iz satelitskih skupina treba histološki obraditi s posebnim naglaskom na one organe i tkiva kod kojih su u drugim tretiranim skupinama bili utvrđeni toksički učinci.

2. PODACI Podatke je najbolje rezimirati u obliku tablice u kojoj je za svaku testiranu skupinu životinja prikazan broj životinja na početku ispitivanja i broj životinja koje pokazuju pojedine vrste lezija. Sve dobivene rezultate treba analizirati prema odgovarajućoj statističkoj metodi. Može se koristiti bilo koja priznata statistička metoda.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju treba, ako je moguće, sadržavati sljedeće informacije:

vrsta, soj i podrijetlo životinja, okolišni uvjeti, prehrana itd.,

uvjeti ispitivanja. Opis aparature za izlaganje koji obuhvaća konstrukciju, tip, dimenzije, izvor zraka, sustav za proizvodnju aerosola, metodu klimatizacije zraka, pročišćavanje ispušnog zraka i način držanja životinja u ispitnoj komori, ako je bila korištena. Treba opisati i opremu za mjerenje temperature, vlažnosti zraka i, tamo gdje je to primjereno, stabilnosti koncentracija ili distribucije veličine čestica aerosola. Podaci o izlaganju: Ti podaci trebaju biti tablično prikazani zajedno sa srednjim vrijednostima i mjerilom varijabilnosti (npr. standardna devijacija) i po mogućnosti uključivati sljedeće:

3.1. pt_2

(a) brzina protoka zraka u inhalacijskoj opremi;

(b) temperatura i vlažnost zraka;

(c) nominalne koncentracije (ukupna količina ispitivane tvari stavljene u inhalacijsku opremu, podijeljena s volumenom zraka);

(d) vrsta nosača, ako je korišten;

(e) stvarne koncentracije u ispitnoj zoni disanja;

(f) srednji maseni aerodinamički promjer (MMAD) i geometrijska standardna devijacija (GSD);

podaci o toksičkim reakcijama po spolu i koncentracijama,

vrijeme smrti tijekom studije, odnosno podaci o preživljavanju životinja do usmrćivanja,

opis toksičkih i drugih učinaka, visine doza bez učinaka,

vrijeme opažanja svakog znaka abnormalnosti i kasnije promjene,

podaci o hrani i tjelesnoj masi,

obavljena hematološka ispitivanja i dobiveni rezultati,

obavljena klinička biokemijska ispitivanja i rezultati,

nalazi obdukcije,

detaljni opis svih histopatoloških nalaza,

statistička obrada rezultata tamo gdje je to moguće,

diskusija o rezultatima,

tumačenje rezultata.

3.2. OCJENA I TUMAČENJE REZULTATA Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (D).

4. REFERENCE Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (E).

B.9. TOKSIČNOST (DERMALNA) PRI PONAVLJANOJ DOZI (28 DANA)

B.9.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (A).

1.2. DEFINICIJE Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (B).

1.3. REFERENTNE TVARI Nema ih.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Ispitivana se tvar 28 dana svakodnevno nanosi na kožu nekoliko skupina pokusnih životinja u stupnjevanim dozama, pri čemu se na svaku skupinu primjenjuje po jedna visina doze. Tijekom razdoblja nanošenja tvari, životinje se svaki dan opažaju kako bi se otkrili znakovi toksičnosti. Životinje koje uginu tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a po završetku ispitivanja životinje koje su preživjele ispitivanje usmrćuju se i obduciraju.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6.

1.6.1. Priprema Životinje se drže u pokusnim uvjetima u pogledu smještaja i hranjenja najmanje pet dana prije početka pokusa. Prije ispitivanja zdrave mlade životinje nasumce se odabiru i raspoređuju u skupine za tretiranje i u kontrolne skupine. Neposredno prije ispitivanja na hrptenom dijelu trupa pokusnih životinja ošiša se dlaka. Dlaka se može i obrijati, ali to treba napraviti približno 24 sata prije ispitivanja. Šišanje ili brijanje treba ponavljati otprilike svaki tjedan. Pri šišanju ili brijanju dlake treba paziti da se ne ostruže koža. Za nanošenje ispitivane tvari najmanje 10 % tjelesne površine mora biti bez dlake. Pri odlučivanju o površini s koje će odstraniti dlaka i o dimenzijama krpice kojom će se ta površina prekriti treba uzeti u obzir tjelesnu masu životinje. Kad se ispituju krute tvari koje se prema potrebi mogu usitniti u prah, ispitivanu tvar treba u dovoljnoj mjeri navlažiti vodom ili, tamo gdje je to potrebno, odgovarajućim nosačem kako bi se osigurao dobar kontakt s kožom. Tekuće ispitivane tvari općenito se primjenjuju nerazrijeđene. Ispitivana se tvar nanosi jednom na dan, pet do sedam dana u tjednu.

1.6.2. Uvjeti ispitivanja

1.6.2.

1.6.2.1. Pokusne životinje Mogu se koristiti odrasli štakori ili kunići. Moguće je koristiti i druge vrste, ali je za to potrebno navesti opravdane razloge. Na početku studije tjelesna masa korištenih životinja ne smije varirati za više od ± 20 % odgovarajuće srednje vrijednosti.

1.6.2.2. Broj i spol Za svaku visinu doze treba upotrijebiti najmanje 10 životinja (pet ženki i pet mužjaka) koji imaju zdravu kožu. Ženke ne smiju prethodno imati potomstvo i ne smiju biti gravidne. Ako se planira usmrćivanje životinja u međuvremenu, prije završetka studije, navedeni broj treba povećati za broj životinja predviđen za takvo usmrćivanje. Osim toga, jednu se satelitsku skupinu od 10 životinja (po pet od svakog spola) može tretirati visokom dozom 28 dana, te nakon tretiranja opažati s obzirom na reverzibilnost, trajanje ili odgođenu pojavu toksičkih učinaka. Koristi se i jedna satelitska skupina od 10 kontrolnih životinja (po pet životinja od svakog spola).

1.6.2.3. Visina doza Potrebne su najmanje 3 visine doza s jednom kontrolom ili, ako se koristi otapalo, s kontrolom koju čini otapalo. Izlaganje treba trajati najmanje šest sati dnevno. Ispitivanu tvar treba nanositi u približno isto vrijeme svaki dan, uz povremena podešavanja (u tjednim ili dvotjednim intervalima) kako bi se održala stalna visina doze s obzirom na tjelesnu masu životinje. Izuzimajući tretiranje ispitivanom tvari, sa životinjama iz kontrolne skupine treba postupati na jednak način kao sa životinjama koje se podvrgavaju ispitivanju. Ako se radi lakšeg doziranja koristi nosač, kontrolnoj skupini na koju se primjenjuje nosač doze se daju na jednak način kao i tretiranim skupinama i one moraju primiti iste količine kao skupina tretirana najvišom dozom. Najviša koncentracija treba izazvati toksičke učinke, ali smrtnih ishoda ne smije biti ili se mogu javiti u rijetkim slučajevima. Najniža koncentracija ne bi smjela izazvati nikakve znakove toksičkog učinka. Tamo gdje postoji primjenljiva procjena razine ljudske izloženosti, najniža koncentracija treba biti malo viša od te procijenjene razine. U idealnom slučaju, srednja bi koncentracija trebala proizvesti minimalne vidljive toksičke učinke. Ako se između najviše i najniže koncentracije koristi više od jedne koncentracije, one se moraju primjenjivati u intervalima, kako bi se njihovi toksički učinci mogli stupnjevati. U skupinama tretiranim niskim i srednjim dozama i u kontrolnim skupinama, stopa smrtnosti treba biti niska da bi ocjena rezultata uopće imala smisla. Ako primjena ispitivane tvari izazove tešku nadraženost kože, koncentracije treba smanjiti, što može dovesti do smanjenja ili izostanka drugih toksičkih učinaka kod primjene visokih doza. Štoviše, ako dođe do jakog oštećenja kože, možda će trebati prekinuti studiju i započeti novu s nižim koncentracijama.

1.6.2.4. Granični test Ako u preliminarnom ispitivanju primjena doze od 1000 mg/kg ili više, doze vezane uz moguću ljudsku izloženost, ako je poznata, ne proizvede nikakve toksičke učinke, daljnje ispitivanje smatra se nepotrebnim.

1.6.2.5. Razdoblje opažanja Opažanje pokusnih životinja radi otkrivanja znakova toksičnosti treba provoditi svakodnevno. Vrijeme smrti kao i vrijeme pojave i nestanka znakova toksičnosti treba zabilježiti.

1.6.3. Postupak Životinje treba smjestiti u kaveze pojedinačno. U idealnim uvjetima, životinje se tretiraju sedam dana u tjednu, kroz vremensko razdoblje od 28 dana. Životinje iz bilo koje satelitske skupine koje su predviđene za dodatna opažanja treba držati dodatnih 14 dana bez tretiranja kako bi se utvrdio oporavak od toksičkih učinaka ili njihova trajnost. Izlaganje treba trajati najmanje šest sati dnevno. Ispitivanu tvar treba jednakomjerno nanijeti na površinu koja čini približno 10 % ukupne tjelesne površine. Kod jako toksičnih tvari površina na koju se tvar nanosi može biti i manja, ali čim veći dio te površine treba prekriti što tanjim i jednakomjernijim slojem. Tijekom izlaganja ispitivana tvar se drži u kontaktu s kožom pomoću poroznog obloga od gaze i samoljepljive trake koja ne nadražuje kožu. Ispitnu površinu treba dodatno prekriti na odgovarajući način kako bi oblog i ispitivana tvar ostali na mjestu i kako bi se osiguralo da životinje ne mogu ispitivanu tvar unijeti oralno. Da bi se životinju spriječilo da ispitivanu tvar unese oralnim putem mogu se upotrijebiti pomagala za sputavanje, ali potpuna imobilizacija nije preporučena metoda. Kao alternativno rješenje može se koristiti zaštitni ovratnik. Na kraju razdoblja izloženosti ostatke ispitivane tvari treba ukloniti, ako je moguće vodom ili primjenom neke druge prikladne metode čišćenja kože. Sve životinje treba opažati svaki dan i bilježiti znakove toksičnosti, navodeći vrijeme njihove pojave, stupanj i trajanje. Opažanje treba obuhvaćati promjene na koži i dlaci, očima i sluznicama, na dišnom i cirkulacijskom sustavu, te na autonomnom i centralnom živčanom sustavu, kao i promjene u somatomotoričkoj aktivnosti i obrascu ponašanja. Svaki tjedan treba mjeriti tjelesnu masu životinja. Isto se tako preporučuje tjedno mjeriti unos hrane. Redovito je opažanje životinja neophodno da bi se spriječio gubitak životinja uslijed kanibalizma, autolize tkiva ili pogrešnog smještanja. Na kraju studije sve preživjele životinje iz nesatelitskih tretiranih skupina podvrgavaju se obdukciji. Životinje na umoru i životinje koje trpe jaki stres ili bol treba po uočavanju ukloniti, humano usmrtiti i obducirati. Na kraju ispitivanja na svim životinjama, uključujući i kontrolne životinje, obavljaju se sljedeće pretrage: Druge pretrage koje mogu biti potrebne za adekvatnu toksikološku ocjenu uključuju određivanje kalcija, fosfora, klorida, natrija, kalija, glukoze (natašte), analizu lipida, hormona, ravnoteže kiselina i lužina, metemoglobina i aktivnosti kolinesteraze. Za detaljnije proučavanje toksičkih učinaka mogu se po potrebi obaviti dodatne kliničke biokemijske analize.

1.6.3.

(1) hematološke, koje uključuju najmanje utvrđivanje hematokrita, koncentracije hemoglobina, broj eritrocita, ukupni i diferencijalni broj leukocita i mjerenje sposobnosti zgrušavanja;

(2) kliničke biokemijske pretrage krvi koje uključuju najmanje jedan parametar funkcije jetre i bubrega: serumsku alanin aminotransferazu (prije poznatu pod nazivom glutamat-piruvat transaminaza), serumsku aspartat aminotransferazu (prije poznatu pod nazivom glutamat-oksaloacetat transaminaza), dušik u ureji, albumin, kreatinin u krvi, ukupni bilirubin i ukupne serumske bjelančevine.

1.6.4. Makroskopska obdukcija Sve životinje iz studije treba podvrgnuti detaljnoj makroskopskoj obdukciji. Najmanje jetru, bubrege, nadbubrežne žlijezde, pluća i testise treba izvagati mokre, čim prije nakon seciranja, kako bi se spriječilo njihovo isušivanje. Organe i tkiva, tj. normalnu i tretiranu kožu, jetru, bubrege, slezenu, testise, nadbubrežne žlijezde, srce i ciljne organe (to jest sve organe na kojima su vidljive makroskopske lezije i promjene u veličini) treba čuvati u odgovarajućem mediju za eventualne daljnje histopatološke pretrage.

1.6.5. Histopatološki pregled Kod skupine tretirane visokim koncentracijama i kod kontrolne skupne treba obaviti histološki pregled sačuvanih organa i tkiva. Organi i tkiva s oštećenjima koja se mogu pripisati visokim koncentracijama ispitivane tvari moraju se detaljno ispitati i kod životinja iz skupina tretiranih niskim koncentracijama. Životinje iz satelitskih skupina treba histološki obraditi s posebnim naglaskom na one organe i tkiva kod kojih su u drugim tretiranim skupinama bili utvrđeni toksički učinci.

2. PODACI Podatke je najbolje rezimirati u obliku tablice u kojoj je za svaku testiranu skupinu životinja prikazan broj životinja na početku ispitivanja i broj životinja koje pokazuju pojedine vrste lezija. Sve dobivene rezultate treba ocijeniti prema odgovarajućoj statističkoj metodi. Može se koristiti bilo koja priznata statistička metoda.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju treba, ako je moguće, sadržavati sljedeće informacije:

podaci o životinjama (vrsta, soj, podrijetlo, okolišni uvjeti, prehrana itd.),

uvjeti ispitivanja (uključujući vrstu obloga: okluzivni ili neokluzivni),

visine doza (uključujući nosač, ako se koristio) i koncentracije,

razina kod koje nema toksičkih učinaka, tamo gdje je to moguće,

podaci o toksičkim reakcijama po spolu i dozi,

vrijeme smrti tijekom studije, odnosno podaci o preživljavanju životinja do kraja ispitivanja,

toksički i drugi učinci,

vrijeme opažanja svakog znaka abnormalnosti i kasnije promjene,

podaci o hrani i tjelesnoj masi,

obavljena hematološka ispitivanja i dobiveni rezultati,

obavljena klinička biokemijska ispitivanja i dobiveni rezultati,

nalazi obdukcije,

detaljni opis svih histopatoloških nalaza,

statistička obrada rezultata tamo gdje je to moguće,

diskusija o rezultatima,

tumačenje rezultata.

3.2. OCJENA I TUMAČENJE REZULTATA Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (D).

4. REFERENCE Vidjeti Opći uvod, dio B slovo (E).

B.10. MUTAGENOST – IN VITRO TEST ZA DOKAZIVANJE KROMOSOMSKIH ABERACIJA KOD SISAVACA

B.10.

1. METODA Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 473, In vitro ispitivanje kromosomskih aberacija kod sisavaca (1997.)

1.

1.1. UVOD Svrha in vitro testa za dokazivanje kromosomskih aberacija je utvrđivanje agensa koji uzrokuju strukturne kromosomske aberacije u uzgojenim stanicama sisavaca (1)(2)(3). Postoje dvije vrste strukturnih aberacija, kromosomska i kromatidna. Aberacije koje izaziva većina mutagena kromatidnog su tipa, ali javljaju se i aberacije kromosomskog tipa. Povećanje poliploidnosti može ukazivati na to da kemikalija ima potencijal za izazivanje numeričkih aberacija. Međutim, ta metoda nije namijenjena za mjerenje numeričkih aberacija i rutinski se ne koristi u tu svrhu. Kromosomske mutacije i srodne pojave uzrok su mnogih genetskih oboljenja ljudi i postoje čvrsti dokazi da su kromosomske mutacije i srodne pojave koje uzrokuju promjene u onkogenima i genima supresorima tumora somatskih stanica povezane s pojavom raka kod ljudi i pokusnih životinja. Kod in vitro testa za dokazivanje kromosomskih aberacija mogu se koristiti kulture trajnih staničnih linija, stanični sojevi ili primarne stanične kulture. Stanice koje se koriste odabiru su na temelju sposobnosti rasta u kulturi, stabilnosti kariotipa, broja kromosoma, raznolikosti kromosoma i spontane učestalosti kromosomskih aberacija. Ispitivanja koja se obavljaju in vitro općenito zahtijevaju korištenje egzogenih izvora metaboličke aktivacije. Taj sustav metaboličke aktivacije ne može u cijelosti oponašati in vivo uvjete kod sisavaca. Mora se paziti da se izbjegava stvaranje uvjeta koji bi doveli do pozitivnih rezultata koji ne odražavaju suštinsku mutagenost i mogu proizaći iz promjena u pH, osmolalnosti ili iz visokih razina citotoksičnosti (4)(5). Ovaj se test koristi za pregledavanje tvari koje mogu mutageno i karcinogeno djelovati na sisavce. Mnoge tvari koje su u tom testu pozitivne karcinogene su za sisavce; međutim, ne postoji savršena povezanost između tog testa i karcinogenosti. Ta povezanost ovisi o klasi opasnosti u koju je kemikalija svrstana i sve je više dokaza da postoje karcinogeni koji se ovim testom ne otkrivaju jer izgleda da djeluju kroz druge mehanizme, a ne na način da izravno oštećuju DNA. Vidjeti i Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJE Aberacija kromatidnog tipa: strukturno oštećenje kromosoma izraženo kao lom pojedinačnih kromatida ili lom i ponovno spajanje kromatida. Aberacija kromosomskog tipa: strukturno oštećenje kromosoma izraženo kao lom ili lom i ponovno spajanje obiju kromatida na istom mjestu. Endoreduplikacija: proces kod kojeg nakon S razdoblja DNA replikacije jezgra ne ulazi u mitozu, nego započinje drugo S razdoblje. Rezultat su kromosomi s četiri, osam, 16,... kromatida. Prekid (tijesni spoj): akromatska lezija manja od širine jedne kromatide i s minimalnim otklonom (neporavnatošću) kromatida. Mitotski indeks: omjer stanica u metafazi podijeljen s ukupnim brojem stanica opažanih u populaciji stanica; pokazatelj stupnja proliferacije (umnožavanja) te populacije. Numerička aberacija: promjena u broju kromosoma u odnosu na normalni broj koji je karakterističan za korištene stanice. Poliploidnost: višekratnik haploidnog broja kromosoma (n) osim diploidnog broja (tj. 3n, 4n itd.). Strukturna aberacija: promjena u strukturi kromosoma koja se može otkriti mikroskopskim pregledom podjele stanica u metafazi, koja se opaža kao delecije i fragmenti, inverzija ili translokacija.

1.3. NAČELO ISPITNE METODE Stanične kulture izlažu se ispitivanoj tvari s metaboličkom aktivacijom i bez nje. Nakon izlaganja ispitivanoj tvari stanične se kulture u prethodno određenim vremenskim intervalima tretiraju tvarima za zaustavljanje metafaze (npr. Colcemid® ili kolchicin), izdvoji se i oboji dio staničnog materijala te se metafazne stanice mikroskopski analiziraju na prisutnost kromosomskih aberacija.

1.4. OPIS ISPITNE METODE

1.4.

1.4.1. Priprema

1.4.1.

1.4.1.1. Stanice Mogu se koristiti različite stanične linije, sojevi ili primarne stanične kulture, ukljujući ljudske stanice (npr. fibroblasti kineskog hrčka, limfociti periferne krvi čovjeka ili drugih sisavaca).

1.4.1.2 Hranjive podloge i uvjeti za uzgoj kultura Za održavanje kultura treba upotrijebiti hranjive podloge za uzgoj kultura i osigurati uvjete za inkubaciju (posude za kulture, koncentracija CO2, temperatura i vlažnost). Trajne stanične linije i sojevi moraju se rutinski pregledati na stabilnost u modalnom broju kromosoma i odsustvo mikoplazmatske kontaminacije, te se ne smiju koristiti ako su kontaminirane. Mora se znati normalno trajanje staničnog ciklusa i uvjeti za uzgoj kulture koja se koristi.

1.4.1.3. Priprema kultura Trajne stanične linije i sojevi: stanice se razmnožavaju iz matičnih kultura koje se nasade na hranjivu podlogu za uzgoj kultura tako gusto da kulture ne dosegnu konfluenciju prije izdvajanja stanica, te se inkubiraju na 37 °C. Limfociti: puna krv tretirana antikoagulantom (npr. heparinom) ili izdvojeni limfociti dobiveni od zdrave životinje stavljaju se u hranjivu podlogu za uzgoj kultura koja sadrži neki mitogen (npr. fitohemaglutinin) te se inkubiraju na 37 °C.

1.4.1.4. Metabolička aktivacija Stanice treba izložiti ispitivanoj tvari uz prisutnost i bez prisutnosti prikladnog sustava za metaboličku aktivaciju. Najčešće korišteni sustav je post-mitohodrijska frakcija (S9) u kompleksu s kofaktorom, pripremljena od jetre glodavaca tretiranih sredstvima za enzimsku indukciju kao što su: Aroclor 1254 (6)(7)(8)(9), ili mješavina fenobarbitona i ß-naftoflavona (10)(11)(12). Post-mitohondrijska frakcija obično se koristi u koncentracijama u rasponu od 1-10 % v/v u konačnoj ispitnoj podlozi. Primjena sustava metaboličke aktivacije može ovisiti o klasi opasnosti u koju je svrstana kemikalija koja se ispituje. U nekim slučajevima može biti prikladno koristiti više od jedne koncentracije post-mitohondrijske frakcije. Više promjena, uključujući genetski uzgojene stanične linije u kojima su izraženi specifični aktivacijski enzimi, može odrediti potencijal za endogenu aktivaciju. Odabir korištenih staničnih linija mora biti znanstveno opravdan (npr. relevantnost citokromnog P450 izoenzima za metabolizam ispitivane tvari).

1.4.1.5. Ispitivana tvar/priprema Krute ispitivane tvari treba otopiti ili suspendirati u odgovarajućim otapalima ili nosačima i prije tretiranja stanica prema potrebi razrijediti. Tekuće ispitivane tvari mogu se u sustave ispitivanja dodavati izravno i/ili se prije obrade mogu razrijediti. Treba koristiti svježe pripravke ispitivane tvari, osim u slučaju da podaci o stabilnosti pokazuju da ih je prihvatljivo pohranjivati.

1.4.2. Uvjeti ispitivanja

1.4.2.

1.4.2.1. Otapalo/nosač Ne smije postojati sumnja da će otapala/nosači kemijski reagirati s ispitivanim tvarima te oni trebaju biti pogodni za preživljavanje stanica i djelovanje S9. Ako se primjenjuju manje poznata otapala/nosači, njihovo bi uključivanje u ispitivanje trebalo biti potkrijepljeno podacima koji dokazuju njihovu pogodnost. Kad god je to moguće, preporučuje se najprije razmotriti mogućnost primjene vodenog otapala/nosača. Pri ispitivanju tvari koje su u vodi nestabilne, ne smiju se koristiti organska otapala koja sadrže vodu. Voda se može ukloniti pomoću molekularnog sita.

1.4.2.2 Koncentracije izlaganja Među kriterijima koja treba razmotriti kod određivanja najviših koncentracija su toksičnost, topljivost u ispitnom sustavu i promjene u pH ili osmolalnost. Citotoksičnost treba odrediti sa i bez metaboličke aktivacije u glavnom pokusu, uz korištenje ogovarajućih pokazatelja staničnog integriteta i rasta, kao što su stupanj konfluencije, broj živih stanica ili mitotski indeks. Može biti korisno preliminarnim pokusom odrediti citotoksičnost i topljivost. Treba koristiti najmanje tri koncentracije koje se mogu analizirati. U slučajevima gdje se javlja citotoksičnost, te koncentracije moraju pokrivati raspon od maksimalne do male ili nikakve toksičnosti; to obično znači da razlika među koncentracijama ne bi smjela biti veća od faktora između 2 i √10. U vrijeme izdvajanja stanica pri najvišoj koncentraciji treba biti vidljivo znatno smanjenje stupnja konfluencije (stvaranja sloja), broja stanica ili mitotskog indeksa (sve iznad 50 %). Mitotski indeks samo je posredni kriterij citotoksičkih/citostatskih učinaka i ovisi o vremenu koje prođe nakon obrade. Međutim, mitotski indeks prihvatljiv je za suspenzijske kulture, kod kojih bi druga mjerenja toksičnosti mogla biti komplicirana i nepraktična. Informacije o kinetici staničnog ciklusa kao što je prosječno vrijeme generiranja (AGT) može se koristiti kao dodatna informacija. Međutim, AGT je prosječna vrijednost koja ne otkriva uvijek postojanje kasnijih subpopulacija, a čak i mali porast prosječnog vremena generiranja može se povezati sa značajnim kašnjenjem u nastajanju optimalnog broja aberacija. Za relativno necitotoksične tvari, najviša koncentracija kod ispitivanja treba biti 5 μl/ml, 5 mg/ml ili 0,01 M, ovisno o tome koja je niža. Za relativno netopljive tvari koje nisu toksične pri koncentracijama nižim od onih u kojima su netopljive, najviša korištena doza treba biti koncentracija iznad granice topljivosti u konačnoj hranjivoj podlozi za uzgoj kultura na kraju razdoblja tretiranja. U nekim slučajevima (npr. kad se toksičnost pojavljuje samo kod koncentracija koje su više od najnižih koncentracija pri kojima tvar nije topljiva), savjetuje se obavljanje ispitivanja na više od jedne koncentracije s vidljivim taloženjem. Moglo bi biti korisno procijeniti topljivost na početku i na kraju tretiranja, jer se ona može za vrijeme izloženosti mijenjati u ispitnom sustavu uslijed prisutnosti stanica, S9, seruma itd. Netopljivost se može otkriti golim okom. Talog ne smije utjecati na određivanje stupnja toksičnosti.

1.4.2.3. Negativne i pozitivne kontrole U svaki pokus treba istodobno uključiti pozitivne i negativne kontrole (otapala ili nosači) sa i bez metaboličke aktivacije. Kad se primjenjuje metabolička aktivacija kemikalija za pozitivnu kontrolu treba koristiti kemikalije kod kojih je za mutagenu reakciju potrebna aktivacija. Kod pozitivnih kontrola treba koristiti poznati klastogen na razinama izlaganja kod kojih se očekuje ponovljivo povećanje koje se može uočiti u odnosu na podlogu (pozadinu), koji pokazuje osjetljivost ispitnog sustava. Koncentracije pozitivne kontrole moraju biti odabrane tako da učinci budu jasni, ali da osoba koja očitava rezultate ne može odmah vidjeti identitet kodiranih mikroskopskih preparata. Treba razmotriti korištenje kemikalija za pozitivnu kontrolu koje spadaju u istu klasu opasnosti kao i ispitivana tvar, ako su takve kemikalije raspoložive. Primjeri tvari za pozitivnu kontrolu obuhvaćaju: Stanje metaboličke aktivacije Tvar CAS br. EINECS br. Odsutnost egzogene metaboličke aktivacije Metil metansulfonat 66-27-3 200-625-0 Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 Etil nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 4-Nitrokinolin-N-oksid 56-57-5 200-281-1 Prisutnost egzogene metaboličke aktivacije Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 Ciklofosfamid Ciklofosfamid monohidrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Za pozitivnu kontrolu mogu se koristiti i druge tvari. Treba razmotriti mogućnost korištenja kemikalija za pozitivnu kontrolu koje spadaju u istu klasu opasnosti kao i ispitivana tvar, ako su takve kemikalije raspoložive. Kod svakog izdvajanja stanica treba uključiti i negativne kontrole koje se sastoje samo od otapala ili nosača u hranjivoj podlozi za tretiranje i tretirane su na jednak način kao i kulture. Dodatno treba upotrijebiti i netretirane kontrole, osim ako postoje podaci iz ranijih studija koji dokazuju da odabrano otapalo ne proizvodi nikakve štetne ili mutagene učinke.

1.4.3. Postupak

1.4.3.

1.4.3.1. Tretiranje ispitivanom tvari Stanice koje se razmonožavaju tretiraju se ispitivanom tvari uz prisutnost i odsutnost metaboličkog aktivacijskog sustava. Tretiranje limfocita treba započeti oko 48 sati nakon mitogene stimulacije.

1.4.3.2. Obično se kod svake koncentracije koriste dvije usporedne kulture, a upotreba dviju usporednih kultura posebno se preporučuje kod negativnih kontrolnih kultura/kultura koje se tretiraju samo s otapalima. Ako se na temelju podataka iz ranijih studija dokaže da su razlike između dviju usporednih kultura minimalne (13)(14), može biti prihvatljiva upotreba samo po jedne kulture za svaku koncentraciju. Plinovite ili hlapive tvari treba ispitivati odgovarajućim metodama, na primjer u nepropusnim posudama za kulture (15)(16).

1.4.3.3. Vrijeme izdvajanja (ubiranja) stanica iz kulture U prvom pokusu stanice treba tri do šest sati izlagati ispitivanoj tvari sa i bez metaboličke aktivacije i uzorkovati ih po isteku vremena koje odgovara vremenu 1,5 normalnog staničnog ciklusa od početka tretiranja (12). Ako se ovim postupkom dobiju negativni rezultati sa i bez aktivacije, treba obaviti još jedan pokus bez aktivacije, uz neprekidno tretiranje sve do uzorkovanja po isteku vremena koje odgovara vremenu 1,5 normalnog staničnog ciklusa. Neke će kemikalije možda biti lakše otkriti ako vrijeme tretiranja/vrijeme do uzorkovanja bude duže od 1,5 dužine ciklusa. Negativne rezultate s metaboličkom aktivacijom treba potvrditi od slučaja do slučaja. U onim slučajevima gdje se potvrda negativnih rezultata ne smatra potrebnom, nužno je navesti razloge za to.

1.4.3.4. Priprema kromosoma Stanične kulture tretiraju se Colcemidom® ili kolhicinom, obično jedan do tri sata prije izdvajanja stanica. Iz svake stanične kulture zasebno izdvajaju se i obrađuju stanice za pripremu kromosoma. Priprema kromosoma obuhvaća hipotoničku obradu stanica, fiksiranje i bojenje.

1.4.3.5. Analiza Sve preparate, uključujući i preparate pozitivnih i negativnih kontrola, treba prije mikroskopske analize nezavisno kodirati. Budući da postupak fiksiranja često uzrokuje lomljenje jednog dijela metafaznih stanica uz gubitak kromosoma, stanice koje se očitavaju moraju sadržavati broj centromera koji je jednak modalnom broju ± 2 za sve vrste stanica. Za svaku koncentraciju i kontrolu treba očitati najmanje 200 dobro vidljivih (raširnih) metafaza jednakomjerno raspodijeljenih u usporednim kulturama. Ako se opazi visoki broj aberacija taj se broj može smanjiti. Iako je svrha ovog testa otkrivanje kromosomskih aberacija, važno je zabilježiti poliploidnost i endoreduplikaciju, u slučaju da se opaze te pojave.

2. PODACI

2.

2.1. OBRADA REZULTATA Pokusna jedinica je stanica i stoga treba utvrditi postotak stanica sa strukturnim kromosomskim aberacijama. Različite vrste strukturnih kromosomskih aberacija treba zabilježiti zajedno s njihovim brojevima i učestalošću za pokusne i kontrolne kulture. Prekidi (tijesni spojevi) se upisuju odvojeno i navode u izvješću, no općenito nisu uključeni u ukupnu učestalost aberacija. Isto tako treba zabilježiti i rezultate istodobnog mjerenja citotoksičnosti za sve tretirane i negativne kontrolne kulture u glavnim pokusima za dokazivanje aberacija. Podaci se navode za svaku kulturu zasebno. Dodatno sve podatke treba rezimirati u tabličnom obliku. Potvrda jasne pozitivne reakcije nije potrebna. Dvosmislene rezultate treba pojasniti daljnjim ispitivanjem, po mogućnosti uz izmjenu pokusnih uvjeta. O potrebi za potvrđivanjem negativnih rezultata govori se u točki 1.4.3.3. U daljnjim pokusima treba razmotriti mogućnost izmjene ispitnih parametara, kako bi se povećao obim uvjeta koji se analiziraju. Parametri koji bi se mogli izmijeniti uključuju vremenske intervale između primjena različitih koncentracija i uvjete metaboličke aktivacije.

2.2. OCJENA I TUMAČENJE REZULTATA Postoji više kriterija za utvrđivanje pozitivnog rezultata, kao na primjer koncentracijom uvjetovano ili ponovljivo povećanje broja stanica s kromosomskim aberacijama. Najprije treba razmotriti biološku relevantnost rezultata. Kao pomoć u ocjeni rezultata ispitivanja mogu se koristiti statističke metode (3)(13). Kod utvrđivanja pozitivne reakcije statistički značaj ne može biti jedini odlučujući faktor. Porast broja poliploidnih stanica može značiti da ispitivana tvar može inhibirati mitotske procese i izazvati numeričke kromosomske aberacije. Povećanje broja stanica s endoredupliciranim kromosomima može značiti da ispitivana tvar može inhibirati progresiju (odvijanje) staničnog ciklusa (17)(18). Smatra se da ispitivana tvar kod koje rezultati ne udovoljavaju gore navedenim kriterijima u ovom sustavu nije mutagena. Iako će većina pokusa dati jasne pozitivne ili negativne rezultate, u rijetkim slučajevima određeni će podaci onemogućiti donošenje konačne procjene djelovanja ispitivane tvari. Rezultati mogu ostati dvosmisleni ili upitni bez obzira na to koliko se puta eksperiment ponavlja. Pozitivni rezultati in vitro testa za dokazivanje kromosomskih aberacija pokazuju da ispitivana tvar izaziva strukturnu aberaciju kromosoma u uzgojenim somatskih stanicama sisavaca. Negativni rezultati pokazuju da ispitivana tvar u ispitnim uvjetima ne izaziva kromosomsku aberaciju u uzgojenim somatskim stanicama sisavaca.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU

Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijedeće informacije:

Otapalo/nosač:

opravdanje za odabir nosača,

topljivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosaču, ako su poznate.

Stanice:

vrsta i podrijetlo stanica,

kariotipne karakteristike i podesnost korištene vrste stanica,

odsustvo mikoplazme, ovisno o slučaju,

podaci o dužini staničnog ciklusa,

spol davatelja krvi, puna krv ili izdvojeni limfociti, upotrijebljeni mitogen,

broj postupaka, ovisno o slučaju,

metode za održavanje stanične kulture, ovisno o slučaju,

modalni broj kromosoma.

Uvjeti ispitivanja:

identifikacijska oznaka (naziv) tvari za zaustavljanje metafaze, njena koncentracija i trajanje izlaganja stanica,

obrazloženje za odabir koncentracija i broj kultura, uključujući npr. podatke o citotoksičnosti i granicama topljivosti, ako su raspoloživi,

sastav hranjive podloge, koncentracija CO2, ovisno o slučaju,

koncentracija ispitivane tvari,

volumen nosača i dodane ispitivane tvari,

temperatura inkubacije,

vrijeme inkubacije,

trajanje tretiranja,

gustoća stanica kod nasađivanja, ovisno o slučaju,

vrsta i sastav sustava metaboličke aktivacije, uključujući kriterije prihvatljivosti,

pozitivne i negativne kontrole,

metode pripreme mikroskopskih preaprata,

kriteriji za ocjenjivanje (očitavanje) aberacija,

broj analiziranih metafaza,

metode za mjerenje toksičnosti,

kriteriji na temelju kojih se studija smatra pozitivnom, negativnom ili dvosmislenom.

Rezultati:

znakovi toksičnosti, tj. stupanj združivanja (konfluencije), podaci o staničnom ciklusu, broj stanica, mitotski indeks,

znakovi taloženja,

podaci o pH i osmolalnosti podloge za tretiranje, ako su utvrđeni,

definicija aberacija, uključivši oštećenja (prekide),

broj stanica s kromosomskim aberacijama i vrste kromosomskih aberacija, zasebno za svaku tretiranu i kontrolnu kulturu,

promjene u ploidnosti, ako su opažene,

ovisnost reakcije o dozi, tamo gdje je moguće,

statističke analize, ako su rađene,

podaci o istovremenim negativnim (otapalo/nosač) i pozitivnim kontrolama,

podaci o ranije obavljenim negativnim (otapalo/nosač) i pozitivnim kontrolama, uključujući raspone, sredstva i standardne devijacije.

Diskusija o rezultatima.

Zaključci.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)

REFERENCE Evans, H. J., (1976) Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, str. 1-29. Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T., (1985). The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, str. 427-432. Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E., (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl. 10), str. 1-175. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res, 257, str. 147-204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, str. 297-305. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, str. 347-364. Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, str. 173-215. Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N., (1976) Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, str. 83-90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr., (1979) Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, str. 277-290. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, str. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, str. 85-88. Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr., Ivett, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T., (1994) Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, str. 241-261. Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B., (1989) Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, str. 141-154. Soper, K.A. and Galloway, S.M., (1994) Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, str. 139-149. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, str. 91-103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, str. 795-801. Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, str. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, str. 1362-1364.

B.11. MUTAGENOST – IN VIVO TEST ZA DOKAZIVANJE KROMOSOMSKIH ABERACIJA KOŠTANE SRŽI SISAVACA

B.11.

1. METODA Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 475, Test za dokazivanje kromosomskih aberacija koštane srži sisavaca (1997.).

1.

1.1. UVOD In vivo test za dokazivanje kromosomskih aberacija sisavaca primjenjuje se za utvrđivanje strukturnih kromosomskih aberacija u stanicama koštane srži životinja, obično glodavaca (1)(2)(3)(4). Postoje dva tipa strukturnih aberacija kromosoma – kromosomski i kromatidni. Povećanje poliploidnosti može značiti da kemikalija ima potencijal za induciranje (izazivanje) numeričkih aberacija. Kod većine kemijskih mutagena inducirane aberacije kromatidnog su tipa, ali javljaju se i aberacije kromosomskog tipa. Kromosomske mutacije i srodne pojave uzrok su mnogih genetskih oboljenja ljudi i postoje dostatni dokazi da su kromosomske mutacije i srodne pojave koje uzrokuju promjene u onkogenima i genima supresorima tumora povezane s pojavom raka kod ljudi i u pokusnim sustavima. U ovom se ispitivanju rutinski koriste glodavci. Ciljno tkivo u ovom ispitivanju je koštana srž, budući da je to tkivo jako prokrvljeno i sadrži populaciju stanica čiji se ciklus odvija brzo i koje se mogu lako izolirati i obrađivati. Ostale životinjske vrste i ciljna tkiva nisu predmet ove metode. Ovo ispitivanje kromosomskih aberacija posebno je relevantno za procjenjivanje opasnosti od mutagenosti, budući da omogućuje analizu faktora metabolizma, farmakokonetike i procesa popravljanja DNK in vivo, iako oni kod različitih životinjskih vrsta i tkiva mogu biti različiti. In vivo test također je koristan za daljnja istraživanja mutagenih učinaka koji se otkriju in vitro testovima. Ako ima dokaza da ispitivana tvar ili reaktivni metabolit neće stići do ciljnog tkiva, ovo ispitivanje nije primjereno provoditi. Vidjeti i Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJE Aberacija kromatidnog tipa: strukturno oštećenje kromosoma izraženo kao lom samo jedne kromatide ili lom i ponovno spajanje kromatida. Aberacija kromosomskog tipa: strukturno oštećenje kromosoma izraženo kao lom ili lom i ponovno spajanje obiju kromatida na istom mjestu. Endoreduplikacija: proces kod kojeg nakon S faze replikacije DNA ne slijedi mitoza (dioba) jezgre, nego započinje druga S faza. Rezultat su kromosomi s četiri, osam, 16,... kromatida. Prekid (tijesni spoj): akromatska lezija manja od širine jedne kromatide i s minimalnim otklonom (neporavnatošću) kromatida. Numerička aberacija: promjena u broju kromosoma u odnosu na normalni broj koji je karakterističan za korištene stanice. Poliploidnost: višekratnik haploidnog broja kromosoma (n) osim diploidnog broja (tj. 3n, 4n itd.). Strukturna aberacija: promjena u strukturi kromosoma koja se može otkriti mikroskopskim pregledom podjele stanica u metafazi, koja se opaža kao delecije i ulomci, intrakromosomske promjene ili interkromosomske promjene.

1.3. NAČELO ISPITNE METODE Životinje se na odgovarajući način izlažu ispitivanoj tvari te se u odgovarajuće vrijeme nakon tretiranja usmrćuju. Prije usmrćivanja, životinje se tretiraju agensom za zaustavljanje metafaze (npr. Colcemidom® ili kolhicinom). Nakon toga, naprave se i oboje kromosomski preparati stanica koštane srži te se analizom utvrđuju kromosomske aberacije metafaznih stanica.

1.4. OPIS ISPITNE METODE

1.4.

1.4.1. Priprema

1.4.1.

1.4.1.1. Odabir životinjske vrste Obično se koriste štakori, miševi i kineski hrčci, iako može poslužiti bilo koja odgovarajuća vrsta sisavaca. Treba koristiti mlade zdrave odrasle životinje sojeva koji su uobičajeni u laboratorijskoj praksi. Na početku studije variranje tjelesne mase životinja treba biti što manje i ne smije prelaziti ± 20 % od odgovarajuće srednje vrijednosti mase svakog spola.

1.4.1.2. Uvjeti držanja i prehrana Primjenjuju se opći uvjeti iz Općeg uvoda u dijelu B, iako ciljna vlažnost zraka treba biti 50-60 %.

1.4.1.3. Priprema životinja Zdrave mlade odrasle životinje nasumce se raspoređuju u kontrolne skupine i skupine koje će se tretirati. Kaveze treba smjestiti tako da se učinci do kojih bi moglo doći zbog njihovog položaja svedu na minimum. Životinje se označavaju jedinstvenim oznakama. Životinje se najmanje pet dana prilagođavaju laboratorijskim uvjetima.

1.4.1.4. Priprema doza Krute ispitivane tvari treba otopiti ili suspendirati u odgovarajućim otapalima ili nosačima i prije doziranja životinjama prema potrebi razrijediti. Tekuće ispitivane tvari može se dozirati izravno i/ili ih se prije obrade može razrijediti. Treba koristiti svježe pripravke ispitivane tvari, osim u slučajevima kad podaci o stabilnosti pokazuju da ih je prihvatljivo pohraniti.

1.4.2. Uvjeti ispitivanja

1.4.2.

1.4.2.1. Otapalo/nosač Otapalo/nosač ne smije proizvesti toksičke učinke pri upotrijebljenim visinama doza i ne smije postojati sumnja da će kemijski reagirati s ispitivanom tvari. Ako se primjenjuju manje poznata otapala/nosači, njihovo bi uključivanje u ispitivanje trebalo biti potkrijepljeno podacima iz kojih je vidljivo da su prikladni. Kad god je to moguće, preporučuje se najprije razmotriti mogućnost primjene vodenog otapala/nosača.

1.4.2.2 Kontrole U svaki test treba uključiti istovremene pozitivne i negativne kontrole (otapalo/nosač) za svaki spol. Izuzimajući tretiranje ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati jednako kao sa životinjama u tretiranim skupinama. Pozitivne bi kontrole trebale proizvesti strukturne aberacije in vivo pri razinama izlaganja kod kojih se očekuje povećanje koje je vidljivo u odnosu na pozadinu. Doze pozitivnih kontrola treba odabrati tako da učinci budu jasni, ali da osoba koja očitava rezultate ne može odmah vidjeti identitet kodiranih mikroskopskih preparata. Prihvatljivo je pozitivne kontrole primjenjivati na životinje drugim putevima, različitim od puteva korištenih za primjenu ispitivane tvari, te ih uzorkovati samo jednom. Može se razmotriti korištenje kemikalija za pozitivnu kontrolu koje spadaju u istu klasu opasnosti kao i ispitivana tvar, ako su takve kemikalije raspoložive. Primjeri tvari za pozitivnu kontrolu obuhvaćaju: Tvar CAS br. EINECS br. Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 Etil nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 Ciklofosfamid Ciklofosfamid monohidrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietilenmelamin 51-18-3 200-083-5 Kod svakog uzorkovanja treba upotrijebiti negativne kontrolne skupine tretirane samo otapalom ili nosačem, s kojima se inače postupa jednako kao i s tretiranim skupinama, osim kad podaci iz prijašnjih studija ukazuju na prihvatljivu varijabilnost i učestalost pojave stanica s kromosomskim aberacijama među drugim životinjama. Dodatno treba upotrijebiti i netretirane kontrolne skupine, osim ako postoje podaci iz ranijih studija koji dokazuju da odabrano otapalo ne proizvodi nikakve štetne niti mutagene učinke.

1.5. POSTUPAK

1.5.

1.5.1. Broj i spol životinja Svaka tretirana i kontrolna skupina mora uključivati najmanje pet životinja svakog spola koje je moguće analizirati. Ako su u vrijeme studije raspoloživi podaci iz studija provedenih na istoj životinjskoj vrsti uz primjenu istog puta izlaganja, koji dokazuju da nema znatnih razlika u toksičnosti s obzirom na spol, ispitivanje na jednom spolu bit će dovoljno. U slučajevima kad izloženost ljudi nekoj kemikaliji može biti vezana uz spol, kao što je slučaj s nekim farmaceutskim sredstvima, ispitivanja treba obaviti na životinjama odgovarajućeg spola.

1.5.2. Režim tretiranja Ispitivane tvari najbolje je primijeniti jednokratno. Ispitivanu je tvar moguće primijeniti u dozi podijeljenoj u dva dijela, tj. dva doziranja isti dan u razmaku od najviše nekoliko sati, kako bi se olakšala primjena velike količine materijala. Za druge režime doziranja treba postojati znanstveno opravdanje. Kod skupine na koju se primjenjuje najviša doza, nakon tretiranja uzorke treba uzeti dvaput. Prvi interval uzorkovanja nakon tretiranja glodavaca po dužini je jednak 1,5 normalnom staničnom ciklusu (s tim da normalni ciklus obično traje 12-18 sati). Budući da vrijeme potrebno za unos i metabolizam (metaboličku izmjenu) ispitivane tvari, kao i za njezino djelovanje na kinetiku staničnog ciklusa, može utjecati na optimalno vrijeme potrebno za otkrivanje kromosomskih aberacija, preporuča se još jedno uzimanje uzorka 24 sata nakon prvog uzimanja. Ako se koriste režimi kod kojih primjena doza traje duže od jednog dana, nakon posljednjeg tretiranja treba obaviti jedno uzorkovanje s vremenskim odmakom koji po dužini odgovara 1,5 normalnom staničnom ciklusu. Prije usmrćivanja životinjama se intraperitonealno ubrizga odgovarajuća doza sredstva za zaustavljanje metafaze (npr. Colcemida® ili kolhicina). Životinjama se nakon toga u odgovarajućim vremenskim intervalima uzimaju uzorci. Za miševe taj interval iznosi približno tri do pet sati; za kineske hrčke je to interval od približno 4-5 sati. Stanice se izdvajaju iz koštane srži i analiziraju radi otkrivanja kromosomskih aberacija.

1.5.3. Visina doza Ako se provodi studija za utvrđivanje raspona doza jer nema raspoloživih odgovarajućih podataka, treba je provesti u istom laboratoriju, koristeći životinje iste vrste, soja i spola, i isti režim tretiranja koji će se koristiti i u glavnoj studiji (5). Ako toksičnost postoji, za prvo uzorkovanje koriste se tri visine doza. Te visine doza trebaju pokriti raspon od maksimalne do male toksičnosti, odnosno netoksičnosti. Za kasnija uzorkovanja treba primjenjivati samo najviše doze. Najviša se doza definira kao doza koja uzrokuje takve znakove toksičnosti da je za očekivati da bi više doze pri istom režimu doziranja prouzročile smrt. Tvari (poput hormona i mitogena) koje u niskim netoksičnim dozama imaju specifično biološko djelovanje mogu biti izuzete od kriterija za utvrđivanje doza te ih se može ocjenjivati od slučaju do slučaja. Najviša se doza isto tako može definirati kao doza koja uzrokuje pojavu nekih pokazatelja toksičnosti u koštanoj srži (npr. smanjenje mitotskog indeksa preko 50 %).

1.5.4. Granični test Ako test s jednom visinom doze od najmanje 2000 mg/kg tjelesne mase, koja se primijeni odjednom ili u dva puta u istom danu, ne proizvede nikakve vidljive toksičke učinke i ako se na temelju podataka o strukturno srodnim tvarima ne očekuje genotoksičnost, kompletna studija uz primjenu tri visine doze ne smatra se potrebnom. Granična doza za dugotrajnije studije je 2000 mg/kg tjelesne mase/dan za tretiranje do 14 dana, odnosno 1000 mg/kg tjelesne mase/dan za tretiranje koje traje duže od 14 dana. Očekivana izloženost čovjeka može ukazati na potrebu za primjenom viših doza u graničnom testu.

1.5.5. Primjena doza Ispitivana se tvar obično primjenjuje oralnom intubacijom pomoću želučane sonde ili odgovarajuće intubacijske kanile, ili pomoću intraperitonealne injekcije. Drugi putevi primjene mogu biti prihvatljivi ako za to postoji opravdanje. Maksimalni volumen tekućine koji se odjednom može primijeniti putem sonde ili injekcije ovisi o veličini pokusne životinje. Taj volumen ne smije biti veći od 2 ml/100 g tjelesne mase. Primjenu većih volumena od navedenog treba opravdati. Osim kod nadražujućih i nagrizajućih tvari, koje pri višim koncentracijama obično izazivaju negativne učinke, variranje ispitnih volumena treba podešavanjem koncentracije svesti na minimum kako bi se kod svih koncentracija osigurao stalni volumen.

1.5.6. Kromosomski preparat Odmah po usmrćivanju životinje koštana se srž uzme, izloži hipotoničkoj otopini i fiksira. Stanice se zatim nanesu na mikroskopsko stakalce i oboje.

1.5.7. Analiza Kao mjerilo toksičnosti treba odrediti mitotski indeks u najmanje 1000 stanica po životinji za sve tretirane životinje (uključujući pozitivne kontrole) i netretirane životinje koje služe kao negativna kontrola. Za svaku životinju treba analizirati najmanje 100 stanica. Ako se opazi veliki broj aberacija ovaj se broj može smanjiti. Sve preparate, uključujući i preparate pozitivnih i negativnih kontrola, treba nezavisno kodirati prije mikroskopske analize. Budući da postupak pripreme preparata često za posljedicu ima lom određenog broja metafaza uz gubitak kromosoma, stanice koje ulaze u očitavanje rezultata trebale bi zato sadržavati broj centromera jednak broju 2n ± 2.

2. PODACI

2.

2.1 OBRADA REZULTATA Podatke o pojedinačnim životinjama treba prikazati u obliku tablice. Pokusna jedinica je životinja. Za svaku je životinju potrebno odrediti broj vrednovanih (očitanih) stanica, broj aberacija po stanici i postotak stanica sa strukturnim kromosomskim aberacijama. Treba navesti različite vrste strukturnih kromosomskih aberacija zajedno s njihovim brojem i učestalošću za tretirane i kontrolne skupine. Kromosomski se prekidi bilježe odvojeno i navode u izvješću, ali se općenito ne uključuju u ukupnu učestalost aberacija. Ako ne postoje dokazi o razlikama u reakcijama među spolovima, u statističkoj analizi mogu se kombinirati podaci dobiveni ispitivanjima na oba spola.

2.2. OCJENA I TUMAČENJE REZULTATA Postoji više kriterija za utvrđivanje pozitivnog rezultata, kao što je povećanje relativnog broja stanica s kromosomskim aberacijama vezano uz visinu doze ili jasno povećanje broja stanica s aberacijama u skupini koja je primala istu dozu, uočeno kod jednog uzorkovanja. Najprije treba razmotriti biološku relevantnost rezultata. Statističke metode mogu se primijeniti kao pomoćno sredstvo za vrednovanje rezultata ispitivanja (6). Kod utvrđivanja pozitivne reakcije statistički značaj ne bi trebao biti jedini odlučujući faktor. Dvosmislene rezultate treba pojasniti daljnjim ispitivanjima, najbolje uz izmjene u pokusnim uvjetima. Porast broja poliploidnih stanica može značiti da ispitivana tvar može inducirati numeričke kromosomske aberacije. Povećanje učestalosti endoreduplikacije može značiti da ispitivana tvar može inhibirati progresiju staničnog ciklusa (7)(8). Kod ovog se testa smatra da ispitivana tvar kod koje rezultati ne udovoljavaju gore navedenim kriterijima nije mutagena. Iako će većina pokusa dati jasne pozitivne ili negativne rezultate, u rijetkim slučajevima na temelju dobivenih podataka nije moguće donijeti konačan zaključak o djelovanju ispitivane tvari. Rezultati mogu ostati dvosmisleni ili upitni bez obzira na to koliko se puta pokus ponavlja. Pozitivni rezultati ispitivanja kromosomske aberacije in vitro pokazuju da ispitivana tvar u koštanoj srži sisavaca izaziva strukturnu aberaciju kromosoma. Negativni rezultati pokazuju da u ispitnim uvjetima ispitivana tvar u koštanoj srži testiranih vrsta ne izaziva kromosomsku aberaciju. Treba razmotriti koja je vjerojatnost da ispitivana tvar ili njeni metaboliti dopru do glavnog krvotoka ili, konkretno, do ciljnog tkiva (npr. sustavna toksičnost).

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijedeće informacije:

otapalo/nosač:

opravdanje za odabir nosača,

topljivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosaču, ako su poznate,

pokusne životinje:

upotrijebljena vrsta/soj,

broj, starost i spol životinja,

podrijetlo životinja, uvjeti držanja, prehrana itd.,

tjelesna masa pojedinačnih životinja na početku ispitivanja, uključujući raspon masa, srednju i standardnu devijaciju za svaku skupinu,

uvjeti ispitivanja:

pozitivna i negativna (nosač/otapalo) kontrola,

podaci iz studije za utvrđivanje raspona, ako je obavljena,

obrazloženje za odabir visine doza,

pojedinosti o pripravljanju ispitivane tvari,

pojedinosti o primjeni ispitivane tvari,

obrazloženje za odabir puta primjene,

metode potvrđivanja da je ispitivana tvar stigla do glavnog krvotoka ili ciljnog tkiva, ovisno o slučaju,

način preračunavanja koncentracije ispitivane tvari u hrani/vodi za piće (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne težine/dan), ovisno o slučaju,

pojedinosti o kvaliteti hrane i vode,

detaljan opis rasporeda tretiranja i uzorkovanja,

metode mjerenja toksičnosti,

naziv tvari koja zaustavlja metafazu, njena koncentracija i trajanje tretiranja,

metode pripravljanja mikroskopskih preparata,

kriteriji za ocjenjivanje aberacija,

broj analiziranih stanica po životinji,

kriteriji prema kojima se studija smatra pozitivnom, negativnom ili dvosmislenom.

Rezultati:

znakovi toksičnosti,

mitotski indeks,

vrsta i broj aberacija, navedeni zasebno za svaku životinju,

ukupan broj aberacija po skupini, sa srednjim vrijednostima i standardnim odstupanjima,

broj stanica s aberacijama po skupini, sa srednjim vrijednostima i standardnim odstupanjima,

promjene u ploidnosti, ako su zamijećene,

odnos doze i reakcije, tamo gdje je moguće,

statističke analize, ako postoje,

podaci o istovremenoj negativnoj kontroli,

podaci o negativnim kontrolama iz prijašnjih studija s rasponima, prosječnim vrijednostima i standardnim odstupanjima,

podaci o istovremenoj pozitivnoj kontroli.

Diskusija o rezultatima.

Zaključci.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)

REFERENCE Adler, I.D., (1984) Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., str. 275-306. Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, str. 157-165. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L., (1990) In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, str. 115-141. Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, str. 305-312. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, str. 313-319. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge. str. 184-232. Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, str. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, str. 1362-1364.

B.12. MUTAGENOST – IN VIVO MIKRONUKLEUS TEST NA ERITROCITIMA SISAVACA

B.12.

1. METODA Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 474, Mikronukleus test na eritrocitima sisavaca (1997.) (Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test (1997)).

1.

1.1. UVOD In vivo mikronukleus test kod sisavaca koristi se za otkrivanje oštećenja koja ispitivana tvar izaziva na kromosomima ili mitotskom aparatu eritroblasta, na temelju analize eritrocita uzorkovanih iz koštane srži i/ili perifernih krvnih stanica životinja, obično glodavaca. Svrha mikronukleus testa je identificirati tvari koje izazivaju citogenetska oštećenja zbog kojih dolazi do stvaranja mikronukleusa koji sadrže zaostale fragmente kromosoma ili čitave kromosome. Kad se eritroblast koštane srži razvije u polikromatski eritrocit, glavni nukleus (stanična jezgra) biva istisnut; bilo koji nastali mikronukleus može zaostati u citoplazmi koja inače nema jezgru. Vidljivost mikronukleusa u ovim je stanicama olakšana s obzirom da im nedostaje glavni nukleus (jezgra). Povećanje učestalosti polikromatskih eritrocita s mikronukleusima kod tretiranih životinja pokazatelj je izazvanih kromosomskih oštećenja. Za ovo se ispitivanje obično koristi koštana srž glodavaca budući da polikromatski eritrociti nastaju u tom tkivu. Mjerenje nezrelih (polikromatskih) eritrocita s mikronukleusima u perifernoj krvi jednako je prihvatljivo kod bilo koje vrste kod koje je dokazano da slezena ne može ukloniti eritrocite s mikronukleusima, ili koja je pokazala odgovarajuću osjetljivost na otkrivanje agensa koji uzrokuju strukturne ili numeričke kromosomske aberacije. Mikronukleuse je moguće razlikovati na temelju više kriterija. Ti kriteriji obuhvaćaju identifikaciju postojanja ili nepostojanja kinetohore ili centromerne DNA u mikronukleusima. Učestalost nezrelih (polikromatskih) eritrocita s mikronukleusima predstavlja glavnu krajnju točku ispitivanja. Broj zrelih (normokromatskih) eritrocita s mikronukleusima, koji se nalaze u perifernoj krvi uz određeni broj zrelih eritrocita, također je moguće koristiti kao krajnju točku ispitivanja u slučajevima kad se životinje neprekidno tretiraju tijekom 4 tjedna ili duže. Ovaj in vivo mikronukleus test na sisavcima posebno je relevantan za ocjenjivanje opasnosti od pojave mutagenosti zato što omogućuje sagledavanje faktora in vivo metabolizma, farmakokinetku i procese popravka DNA, iako oni mogu varirati kod različitih životinjskih vrsta, različitih tkiva, kao i kod različitih genetskih konačnih učinaka. Ispitivanje in vivo isto je tako korisno za daljnja istraživanja mutagenih učinaka otkrivenih pomoću nekog sustava in vitro. Ako se pojave dokazi da ispitivana tvar ili reaktivni metabolit neće stići do ciljnog tkiva, ovo ispitivanje nije primjereno provoditi. Vidjeti također Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJE Centromer (kinetohora): područje(-a) kromosoma s kojima su tijekom stanične diobe povezane niti diobenog vretena, što omogućuje uredno kretanje kromosoma kćeri prema polovima stanica kćeri. Mikronukleusi: Maleni nukleusi (jezgre), koji se nalaze uz glavne stanične jezgre i od njih su odvojeni, koje tijekom telofaze mitoze (mejoze) proizvode zaostali fragmenti kromosoma ili čitavi kromosomi. Normokromatski eritrocit: Zreli eritrocit kojemu nedostaju ribosomi i moguće ga je razlikovati od nezrelih polikromatskih eritrocita pomoću bojila selektivnih za ribosome. Polikromatski eritrocit: Nezreli eritrocit u prijelaznoj fazi razvoja koji još uvijek sadrži ribosome pa ga je moguće razlikovati od zrelih, normokromatskih eritrocita pomoću bojila selektivnih za ribosome.

1.3. NAČELO ISPITNE METODE Životinje se na odgovarajući način izlažu ispitivanoj tvari. Ako se koristi koštana srž, životinje se po isteku odgovarajućih vremenskih razdoblja nakon tretiranja usmrćuju, uzima se koštana srž i rade se odgovarajući mikroskopski preparati koji se zatim boje (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Kad se koristi periferna krv, po isteku odgovarajućih vremenskih razdoblja nakon tretiranja uzima se krv i rade odgovarajući mikroskopski preparati koji se zatim boje (4)(8)(9)(10). Kod studija s perifernom krvi, između zadnjeg izlaganja i izdvajanja stanica treba proći što manje vremena. Preparati se analiziraju na prisutnost mikronukleusa.

1.4. OPIS ISPITNE METODE

1.4.

1.4.1. Preparati

1.4.1.

1.4.1.1. Odabir životinjske vrste Ako se koristi koštana srž preporučuju se miševi ili štakori, iako se može koristiti bilo koja druga odgovarajuća vrsta sisavaca. Kad se koristi periferna krv, preporučuju se miševi. Međutim, može se koristiti bilo koja druga odgovarajuća vrsta sisavaca, pod uvjetom da se radi o vrsti kod koje slezena ne uklanja eritrocite s mikronukleusima, odnosno o vrsti koja je pokazala primjerenu osjetljivost za otkrivanje agensa koji uzrokuju strukturne ili numeričke aberacije kromosoma. Treba koristiti sojeve mladih zdravih životinja koji se obično koriste u laboratorijima. Na početku studije raspon tjelesnih masa životinja ne smije varirati za više od ± 20 % od odgovarajuće srednje tjelesne mase svakog spola.

1.4.1.2. Uvjeti držanja i hranjenja Primjenjuju se opći uvjeti iz Općeg uvoda u dijelu B, iako ciljna vlažnost treba iznositi 50-60 %.

1.4.1.3. Priprema životinja Prije ispitivanja odabiru se zdrave mlade životinje i nasumce raspoređuju u kontrolne skupine i skupine za tretiranje. Životinje se označavaju jedinstvenim oznakama. Životinje se najmanje pet dana prilagođavaju laboratorijskim uvjetima. Kaveze treba tako rasporediti da se učinci do kojih bi moglo doći zbog položaja kaveza svedu na minimum.

1.4.1.4. Priprema doza Krute ispitivane tvari treba otopiti ili suspendirati u odgovarajućim otapalima ili nosačima i prije doziranja životinjama prema potrebi razrijediti. Tekuće ispitivane tvari mogu se odmah dozirati ili razrijediti prije doziranja. Treba koristiti svježe preparate ispitivane tvari, osim ako podaci o njihovoj stabilnosti dokazuju da je njihovo pohranjivanje prihvatljivo.

1.4.2. Uvjeti ispitivanja

1.4.2.

1.4.2.1. Otapalo/nosač Otapalo/nosač ne smije izazvati toksičke učinke pri dozama koje se primjenjuju, i ne smije postojati sumnja da bi s ispitivanom tvari mogli proizvesti kemijsku reakciju. Ako se koriste otapala/nosači koji nisu dobro poznati, njihovo uključivanje u ispitivanje treba potkrijepiti referentnim podacima koji pokazuju njihovu sukladnost. Preporuka je da se, kad god je to moguće, najprije razmotri mogućnost upotrebe vodenog otapala/nosača.

1.4.2.2. Kontrole Za svaki spol u svaki test treba uključiti paralelne pozitivne i negativne (otapalo/nosač) kontrole. Izuzimajući tretiranje ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnoj skupini treba postupati na jednaki način kao sa životinjama u skupinama koje se tretiraju. Tvari koje se koriste za pozitivnu kontrolu trebale bi, pri razinama izloženosti za koje se očekuje da će izazvati uočljivo povećanje s obzirom na podlogu, trebale prouzročiti nastanak mikronukleusa in vivo. Pozitivne kontrole treba dozirati tako da njihovi učinci budu jasni, ali da osobi koja očitava rezultate ne otkriju odmah identitet kodiranih mikroskopskih preparata. Prihvatljivo je za pozitivne kontrole koristiti puteve primjene različite od onih koji se koriste za primjenu ispitivane tvari, a uzorke uzeti samo jednom. Osim toga, ako su raspoložive, kao pozitivne kontrole smiju se upotrijebiti kemikalije koje su svrstane u istu klasu opasnosti kao i ispitivana kemikalija. Primjeri pozitivnih kontrola uključuju sljedeće tvari: Tvar CAS br. EINECS br. Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 N-etil-N-nitrozourea 759-73-9 212-072-2 Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 Ciklofosfamid Ciklofosfamid monohidrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietilenmelamin 51-18-3 200-083-5 Životinje za negativnu kontrolu koje se tretiraju samo otapalom ili nosačem, a s kojima se inače postupa jednako kao s tretiranim skupinama, treba uključiti u svako uzorkovanje, osim u slučajevima kad podaci o kontrolama u prijašnjim ispitivanjima pokazuju prihvatljivu varijabilnost među životinjama i učestalost stanica s mikronukleusima. Ako se za negativnu kontrolu uzima samo jedan uzorak, najbolje ga je uzeti kod prvog uzorkovanja. Osim toga, treba upotrijebiti i netretirane kontrolne životinje osim ako postoje prijašnji ili objavljeni podaci koji dokazuju da odabrano otapalo/nosač ne izaziva mutagene učinke. Ako se koristi periferna krv, uzorak koji se uzme prije tretiranja prihvatljiv je kao negativni kontrolni uzorak, ali samo u studijama periferne krvi (npr. 1-3 tretiranja) kad su rezultati u okviru raspona koji se očekuje na temelju prijašnjih kontrola.

1.5. POSTUPAK

1.5.

1.5.1. Broj i spol životinja U svakoj tretiranoj i kontrolnoj skupini mora biti najmanje po pet životinja svakog spola koje je moguće analizirati (11). Ako su u vrijeme studije raspoloživi podaci iz studija obavljenih na istim životinjskim vrstama uz upotrebu istog puta primjene, koji dokazuju da među spolovima nema značajnih razlika u toksičnosti, dovoljno će biti testiranje na jednom spolu. U slučajevima kad izloženost kemikalijama može biti vezana uz jedan spol, na primjer kad se radi o određenim farmaceutskim sredstvima, test treba obaviti na životinjama odgovarajućeg spola.

1.5.2. Režim tretiranja Ne može se preporučiti nijedan standardni režim tretiranja (npr. jedno, dva ili više tretiranja u vremenskim razmacima od 24 sata). Uzorci uzeti nakon primjene produženog režima doziranja prihvatljivi su pod uvjetom da je u toj studiji bio dokazan pozitivan učinak, ili kod negativne studije, pod uvjetom da je bila dokazana toksičnost ili da je bila korištena granična doza, te da je doziranje bilo nastavljeno do uzorkovanja. Ispitivane tvari mogu se primjenjivati i u podijeljenoj dozi koja se daje npr. u dva puta u istom danu, u razmaku od najviše nekoliko sati, kako bi se olakšalo davanje velikog volumena materijala. Ispitivanje se može obaviti na dva načina: Mogu se uzeti i dodatni uzorci u drugim vremenskim razmacima, kada je to relevantno.

1.5.2.

(a) životinje se ispitivanom tvari tretiraju jedanput. Uzorci koštane srži uzimaju se najmanje dvaput, prvi put najranije 24 sata nakon tretiranja ili najkasnije 48 sati nakon tretiranja, uz odgovarajuće intervale između uzorkovanja. Ako se prvi uzorak uzme prije isteka 24 sata nakon tretiranja, za to treba navesti opravdane razloge. Uzorci periferne krvi uzimaju se najmanje dvaput, počevši najranije 36 sati nakon tretiranja i nakon tog u odgovarajućim vremenskim razmacima, ali ukupni postupak ne smije biti duži od 72 sata. Ako se kod jednog od uzorkovanja opazi pozitivna reakcija, dodatno uzorkovanje nije potrebno;

(b) ako se doza primjenjuje dva ili više puta dnevno (npr. dva ili više tretiranja u vremenskim razmacima od 24 sata) uzorke treba uzeti jedanput u razdoblju između 18 i 24 sata nakon zadnjeg tretiranja kad se radi o koštanoj srži i jedanput u razdoblju između 36 i 48 sati nakon zadnjeg tretiranja kad je u pitanju periferna krv (12).

1.5.3. Visina doza Ako je potrebno napraviti studiju radi utvrđivanja raspona doza jer nema raspoloživih odgovarajućih podataka, tu studiju treba provesti u istom laboratoriju, uz korištenje iste životinjske vrste i soja te režima doziranja koji će se koristiti u glavnoj studiji (13). Ako toksičnost postoji, za prvo uzorkovanje upotrebljavaju se tri visine doza. Te doze trebaju pokriti raspon od maksimalne do male toksičnosti ili netoksičnosti. Kod kasnijih uzorkovanja treba koristiti samo najvišu dozu. Najviša doza definira se kao doza koja uzrokuje takve znakove toksičnosti da je za očekivati da će pri istom režimu doziranja više doze prouzročiti smrt. Tvari sa specifičnim biološkim djelovanjem pri niskim netoksičnim dozama (kao što su hormoni i mitogeni) mogu se izuzeti od kriterija za utvrđivanje doza i treba ih ocjenjivati od slučaja do slučaja. Najviša doza može se definirati i kao doza koje izaziva neke znakove toksičnosti u koštanoj srži (npr. smanjenje udjela nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita u koštanoj srži ili perifernoj krvi).

1.5.4. Granični test Ako test s jednom dozom od najmanje 2000 mg/kg tjelesne mase, koja se primijeni odjednom ili u dva puta isti dan, ne prouzroči primjetljive toksične učinke i ako se na temelju podataka o strukturno srodnim tvarima ne očekuje genotoksičnost, potpuna studija uz primjenu tri razine doza ne smatra se potrebnom. Za dugotrajnije studije granična doza je 2000 mg/kg tjelesne mase/dan za tretiranje do 14 dana i 1000 mg/kg tjelesne mase/dan za tretiranje duže od 14 dana. Očekivana izloženost ljudi može ukazati na potrebu za primjenom više doze u graničnom testu.

1.5.5. Primjena doza Ispitivana se tvar obično primjenjuje oralnom intubacijom pomoću želučane sonde ili odgovarajuće intubacijske kanile ili ubrizgavanjem pomoću intraperitonealne injekcije. Prihvatljivi su i drugi putevi primjene ako za to postoje opravdani razlozi. Maksimalni volumen tekućine koji se odjednom može primijeniti pomoću sonde ili injekcije ovisi o veličini pokusne životinje. Taj volumen ne smije biti veći od 2 ml/100 g tjelesne mase. Za primjenu većih volumena od navedenog moraju postojati opravdani razlozi. Izuzimajući nadražujuće ili nagrizajuće tvari koje pri višim koncentracijama obično djeluju štetno, variranje ispitnih volumena treba svesti na minimum podešavanjem koncentracije i tako osigurati stalni volumen pri svim visinama doza.

1.5.6. Preparati koštane srži/krvi Stanice koštane srži obično se uzimaju iz femura (bedrene kosti) ili tibije (potkoljenice) odmah nakon usmrćivanja. Stanice se obično iz bedrene kosti ili potkoljenice vade, prepariraju i boje uz primjenu uobičajenih metoda. Periferna krv vadi se iz repne vene ili nekog drugog odgovarajućeg krvnog suda. Krvne stanice odmah se supravitalno oboje (8)(9)(10) ili se naprave preparati razmaza koji se zatim oboje. Upotreba boja koje su specifične za DNK (npr. akridin oranž (14) ili Hoechst 33258 i pironin-Y (15)) može spriječiti stvaranje nekih od artefakta koji se povezuju s upotrebom bojila koja nisu specifična za DNK. Ova prednost ne isključuje upotrebu konvencionalnih bojila (npr. Giemsa). Mogu se upotrebljavati i dodatni sustavi (npr. celuloznih kolona za uklanjanje stanica s jezgrom (16)) pod uvjetom da se pokazalo da navedeni sustavi funkcioniraju na odgovarajući način prilikom izrade mikronukleusnih preparata u laboratoriju.

1.5.7. Analiza Za svaku se životinju utvrđuje udio nezrelih eritrocita u ukupnom broju (nezrelih + zrelih) eritrocita, tako da se ukupno prebroji najmanje 200 eritrocita kad je u pitanju koštana srž i 1000 eritrocita kad je u pitanju periferna krv (17). Sve mikroskopske preparate, uključujući i pozitivne i negativne kontrole, treba prije mikroskopske analize nezavisno kodirati. Za utvrđivanje incidencije (učestalosti) eritrocita s mikronukleusima za svaku životinju treba pregledati najmanje 2000 nezrelih eritrocita. Dodatne informacije mogu se dobiti utvrđivanjem broja zrelih eritrocita s mikronukleusima. Kod analize mikroskopskih preparata, udio nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita ne bi smio prijeći 20 % kontrolne vrijednosti. Kad se životinje neprekidno tretiraju četiri tjedna ili više, incidencija mikronukleusa može se utvrditi analizom najmanje 2000 zrelih eritrocita po životinji. Sustavi za automatsku analizu (slikovna analiza i protočna citometrija staničnih suspenzija) prihvatljiva su alternativa za ručno prebrojavanje, ako su primjereno opravdani i validirani.

2. PODACI

2.

2.1. OBRADA REZULTATA Podatke za pojedinačne životinje treba prikazati u tabličnom obliku. Pokusna jedinica je životinja. Za svaku analiziranu životinju posebno treba navesti utvrđeni broj nezrelih eritrocita, broj nezrelih eritrocita s mikronukleusima i broj nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita. Ako se životinje neprekidno tretiraju četiri ili više tjedana, treba navesti i podatke o zrelim eritrocitima, ako su prikupljeni. Za svaku životinju treba navesti, ako se to smatra primjerenim, udio nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita i, postotak eritrocita s mikronukleusima. Ako nema dokaza o razlikama u reakcijama među spolovima, za statističku analizu mogu se kombinirati podaci prikupljeni za oba spola.

2.2. OCJENA I TUMAČENJE REZULTATA Postoji više kriterija za utvrđivanje pozitivnog rezultata, kao na primjer povećanje broja stanica s mikronukleusima povezano s dozom ili jasni porast broja stanica s mikronukleusima utvrđen na temelju samo jednog uzorkovanja kod skupine na koju je primijenjena samo jedna doza. Najprije treba razmotriti biološku relevantnost rezultata. Kao pomoć pri ocjenjivanju rezultata ispitivanja mogu se koristiti statističke metode (18)(19). Statistički značaj ne može biti jedini odlučujući faktor pri utvrđivanju pozitivne reakcije. Nejasne rezultate treba pojasniti daljnjim ispitivanjima, po mogućnosti uz variranje uvjeta pokusa. Smatra se da ispitivana tvar za koju rezultati ovog testa ne ispunjavaju gore navedene kriterije nije mutagena. Iako će većina pokusa dati jasne pozitivne ili negativne rezultate, u rijetkim slučajevima dobiveni podaci neće omogućiti donošenje definitivne ocjene o djelovanju ispitivane tvari. Rezultati mogu ostati nejasni ili upitni bez obzira na broj ponavljanja pokusa. Pozitivni rezultati u mikronukleus testu znače da tvar uzrokuje stvaranje mikronukleusa, koji su posljedica oštećenja kromosoma ili oštećenja mitotskog aparata kod eritroblasta pokusne vrste. Negativni rezultati znače da ispitivana tvar u ispitnim uvjetima ne uzrokuje stvaranje mikronukleusa u nezrelim eritrocitima pokusne vrste. Treba razmotriti vjerojatnost da ispitivana tvar ili njezini metaboliti uđu u glavni krvotok i posebno u ciljno tkivo (npr. sustavna toksičnost).

3. IZVJEŠĆIVANJE

3. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU

Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljedeće informacije:

otapalo/nosač:

obrazloženje za odabir nosača,

topljivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosaču, ako je poznata.

Pokusne životinje:

upotrijebljena vrsta/soj,

broj, starost i spol životinja,

podrijetlo životinja, uvjeti držanja, prehrana itd.

tjelesna masa pojedinačnih životinja na početku ispitivanja, uključujući raspon masa te srednju i standardnu devijaciju za svaku skupinu.

Uvjeti ispitivanja:

podaci o pozitivnim i negativnim kontrolama (nosač/otapalo),

podaci iz studije za utvrđivanje raspona, ako je obavljena,

obrazloženje za odabir visina doza,

pojedinosti o pripravljanju ispitivane tvari,

pojedinosti o primjeni ispitivane tvari,

obrazloženje za odabir puta primjene,

metode potvrđivanja da je ispitivana tvar stigla do glavnog krvotoka ili ciljnog tkiva, ako je primjereno,

način preračunavanja koncentracije ispitivane tvari u hrani/vodi za piće (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne težine/dan), ako je primjereno,

pojedinosti o kvaliteti hrane i vode,

detaljan opis rasporeda tretiranja i uzorkovanja,

metode pripreme mikroskopskih preparata,

metode mjerenja toksičnosti,

kriteriji za utvrđivanje nezrelih eritrocita s mikronukleusima,

broj analiziranih stanica po životinji,

kriteriji prema kojima se studija smatra pozitivnom, negativnom ili dvosmislenom.

Rezultati:

znakovi toksičnosti,

udio nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita,

broj nezrelih eritrocita s mikronukleusima, naveden zasebno za svaku životinju,

srednja ± standardna devijacija nezrelih eritrocita s mikronukleusima za svaku skupinu,

odnos reakcije i doze, tamo gdje je moguće,

primijenjene statističke analize i metode,

podaci o paralelnim i prijašnjim negativnim kontrolama,

podaci o paralelnim pozitivnim kontrolama.

Diskusija o rezultatima.

Zaključci.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)

REFERENCE Heddle, J.A., (1973) A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, str. 187-190. Schmid, W., (1975) The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, str. 9-15. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res., 123, str. 61-118. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A., (1990) The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, str. 29-80. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M., (1983) Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. Iin: Developments in Science and Practice of Toxicology, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, str. 555-558. MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D., (1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res., 189, str. 103-112. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E., (1990) The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol., 14, str. 513-522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1990) The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, str. 245-249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test, (1992) Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., str. 278, 83-98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), (1995) Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, str. 153-159. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, str. 293-304. Higashikuni, N. and Sutou, S., (1995) An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, str. 313-319. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M., (1992) Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, str. 313-319. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1983) An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, str. 241-247. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G., (1983) A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, str. 269- 275. Romagna, F. and Staniforth, C.D., (1989) The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, str. 91-104. Gollapudi, B. and McFadden, L.G., (1995) Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, str. 97-99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L., (1990) In Vivo Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, str. 115-141. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K., (1989) Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, str. 184-232.

B.13./14. MUTAGENOST: TEST ZA OTKRIVANJE POVRATNIH MUTACIJA POMOĆU BAKTERIJA

B.13./14.

1. METODA Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 471, Bakterijski test povratnih mutacija (Bacterial Reverse Mutation Test) (1997.).

1.

1.1. UVOD Pri ispitivanju povratnih mutacija koriste se sojevi bakterija Salmonella typhimurium i Escherichia coli kojima su potrebne aminokiseline, za otkrivanje točkastih mutacija koje uključuju supstituciju, adiciju ili deleciju jednog ili više baznih parova DNK (1)(2)(3). Načelo ovog bakterijskog testa povratnih mutacija je da test otkriva mutacije koje povratno djeluju na mutacije prisutne kod pokusnih sojeva i ponovo uspostavljaju funkcionalnu sposobnost bakterija da sintetiziraju esencijalne amino kiseline. Povratno mutirane bakterije raspoznaju se po njihovoj sposobnosti rasta u odsutnosti aminokiseline koja je potrebna za rast roditeljskom pokusnom soju. Točkaste mutacije uzrokuju mnoge genetske bolesti u ljudi i postoje čvrsti dokazi da su povratne mutacije u onkogenima i tumor-supresorskim genima somatskih stanica povezane s nastajanjem tumora kod ljudi i pokusnih životinja. Test bakterijskih povratnih mutacija je brz, jeftin i relativno lako izvediv. Mnogi od pokusnih sojeva imaju nekoliko svojstava koja ih čine osjetljivijima za otkrivanje mutacija, uključujući i osjetljive nizove DNK na mjestima povratnih mutacija, povećanu propusnost stanica za velike molekule i eliminaciju sustava za popravak DNK ili poticanje procesa popravljanja DNK podložnih pojavi grešaka. Na specifičnostima pokusnih sojeva mogu se temeljiti neke korisne informacije o vrstama mutacija koje uzrokuju genotoksični agensi. Za testove bakterijskih povratnih mutacija postoji vrlo velika baza podataka u kojoj su sadržani rezultati za veliki broj različitih struktura, a razvijene su i dobro uhodane metode za ispitivanje kemikalija različitih fizikalno-kemijskih svojstava, uključujući hlapive spojeve. Vidjeti također Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJE Test povratnih mutacija na bakterijama Salmonella typhimurium ili Escherichia coli otkriva mutacije kod sojeva kojima je potrebna aminokiselina (histidin odnosno triptofan) za stvaranje sojeva koji ne ovise egzogenoj opskrbi aminokiselinom. Mutageni supstitucije baznih parova su agensi koji uzrokuju zamjenu baza DNK. Kod testa povratnih mutacija ova se zamjena u bakterijskom genomu može javiti na mjestu izvorne mutacije ili na nekom drugom mjestu. Frameshift mutageni (mutageni pomaka očitavanja) su agensi koji uzrokuju adiciju ili deleciju jednog ili više baznih parova u DNK, mijenjenjući na taj način okvir očitavanja RNK.

1.3. UVODNA RAZMATRANJA Kod bakterijskog testa povratnih mutacija koriste se prokariotske stanice, koje se razlikuju od stanica sisavaca po faktorima kao što su unos, metabolizam, struktura kromosoma i procesi popravljanja DNK. In vitro testovi općenito zahtijevaju upotrebu egzogenog izvora metaboličke aktivacije. Sustavi metaboličke aktivacije in vitro ne mogu u potpunosti oponašati in vivo uvjete kod sisavaca. Prema tome, ovaj test ne pruža izravne informacije o mutagenom i karcinogenom potencijalu tvari s obzirom na sisavce. Bakterijski test povratnih mutacija obično se koristi kao inicijalni probir za genotoksičko djelovanje i posebno za djelovanje koje uzrokuje točkaste mutacije. Obimna baza podataka dokazuje da mnoge kemikalije koje su pozitivne na ovaj test pokazuju mutageno djelovanje i u drugim testovima. Postoje primjeri mutagenih agensa koje ovaj test ne otkriva; razlozi za taj nedostatak mogu se pripisati specifičnoj prirodi krajnjeg učinka koji se otkriva, razlike u metaboličkoj aktivaciji ili razlike u bioraspoloživosti. S druge strane, faktori koji pojačavaju osjetljivost bakterijskog testa povratnih mutacija mogu dovesti do precjenjivanja mutagenog djelovanja. Bakterijski test povratnih mutacija možda nije pogodan za ocjenjivanje nekih klasa kemikalija kao što su spojevi s jakim baktericidnim djelovanjem (npr. neki antibiotici) i spojevi koji posebno utječu na sustav razmnožavanja stanica sisavaca (npr. neki inhibitori topoizomeraze i neki nukleozidni analozi). U takvim slučajevima mogli bi biti prikladniji testovi mutacija koji se provode na sisavcima. Iako su se mnogi spojevi koji su pozitivni na ovaj test pokazali karcinogenima za sisavce, ova korelacija nije apsolutna. Ona ovisi o kemijskoj klasi, a postoje i karcinogeni koje ovaj test ne otkriva jer djeluju preko drugih, negenotoksičkih mehanizama ili mehanizama kojih u bakterijskim stanicama nema.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Suspenzije bakterijskih stanica izlažu se ispitivanoj tvari uz prisutnost ili odsutnost egzogenog sustava metaboličke aktivacije. Kod metode inkorporacije u agarnu ploču, te se suspenzije pomiješaju s top agarom i razliju izravno na minimalnu podlogu. Kod metode predinkubacije mješavina za tretiranje najprije se inkubira i potom pomiješa s top agarom, prije razlijevanja na minimalnu podlogu. Kod obje tehnike, nakon dva ili tri dana inkubacije, prebroje se kolonije revertanata (mutanti dobiveni povratnom mutacijom) i uspoređuju s brojem kolonija spontanih revertanata na kontrolnim pločama s otapalom. Opisano je više postupaka za izvođenje bakterijskog testa povratne mutacije. Među onima koji se obično koriste su metoda inkorporacije u agarnu ploču (1)(2)(3)(4), metoda predinkubacije (2)(3)(5)(6)(7)(8), metoda fluktuacije (9)(10) i metoda suspenzije (11). Opisane su i prilagodbe za ispitivanje plinova ili para (12). Postupci opisani u ovoj metodi odnose se prvenstveno na metode inkorporacije i predinkubacije. Obje su prihvatljive za izvođenje pokusa sa i bez metaboličke aktivacije. Neke se tvari mogu lakše otkriti primjenom metode predinkubacije. Te tvari spadaju u klase kemikalija koje uključuju kratkolančane alifatske nitrozamine, dvovalentne metale, aldehide, azo-bojila i diazo spojeve, pirolizidinske alkaloide, alilne spojeve i nitro spojeve (3). Priznaje se da neke klase mutagena nije uvijek moguće otkriti standardnim postupcima kao što su metoda inkorporacije u agarnu ploču ili metoda predinkubacije. Njih treba smatrati posebnim slučajevima i čvrsto se preporučuje da se za njihovo otkrivanje primijene alternativni postupci. U takve posebne slučajeve mogu se svrstati (zajedno s primjerima postupaka koji se mogu upotrijebiti za njihovo otkrivanje): azo-bojila i diazo spojevi (3)(5)(6)(13), plinovi i hlapive kemikalije (12)(14)(15)(16) i glikozidi (17)(18). Odstupanja od standardnog postupka treba znanstveno opravdati.

1.5. OPIS ISPITNE METODE

1.5.

1.5.1. Priprema

1.5.1.

1.5.1.1. Bakterije Svježe kulture bakterija treba uzgojiti do kasne eksponencijalne ili rane stacionarne faze rasta (oko 109 stanica na ml). Kulture u kasnoj stacionarnoj fazi ne treba koristiti. Bitno je da kulture upotrijebljene u pokusu sadrže visoki titar živih bakterija. Taj se titar može utvrditi ili na temelju kontrolnih podataka o krivuljama rasta iz ranijih ispitivanja ili na temelju svakog ispitivanja kod kojega se utvrđuje broj živih stanica u kulturama uzgojenim na agarnim pločama. Preporučena temperatura inkubacije je 37 °C. Treba upotrijebiti najmanje pet sojeva bakterija. Oni trebaju uključivati četiri soja S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 ili TA97a ili TA97; TA98 i TA100) koji su u laboratorijskoj praksi pokazali da su pouzdani i da su njihove reakcije ponovljive. Ta četiri soja S. typhimurium imaju na primarnom mjestu povratne mutacije bazne parove GC i poznata je mogućnost da oni neće pokazati neke oksidirajuće mutagene, agense koji stvaraju poprečne veze i hidrazine. Takve tvari mogu se otkriti pomoću sojeva E.coli WP2 ili S. typhimurium TA102 (19) koji na primarnom mjestu povratne mutacije imaju bazni par AT. Prema tome, preporučena kombinacija sojeva je: Da bi se otkrili mutageni koji stvaraju poprečne veze, možda bi bilo bolje uključiti TA102 ili dodati soj E. coli koji ima sposobnost popravljanja DNA (npr. E. coli WP2 ili E. coli WP2 (pKM101)). Treba koristiti utvrđene postupke za pripravljanje matičnih kultura, provjeru markera i pohranjivanje. Za svaki pripravak liofilizirane matične kulture treba dokazati da je toj kulturi za rast potrebna aminokiselina (histidin za sojeve S. typhimurium i triptofan za sojeve E. coli). Slično treba provjeriti i druge fenotipske karakteristike, na primjer: prisutnost ili odsutnost r-plazmida, tamo gdje je to primjereno (tj. otpornost na ampicilin kod sojeva TA98, TA100 i TA97a ili TA97, WP2 uvrA i WP2 uvrA (pKM101), te otpornost na ampicilin + tetraciklin kod soja TA 102G); prisutnost karakterističnih mutacija (tj. rfa mutacije kod S. typhimurium kroz osjetljivost na kristal ljubičasto i uvrA mutacije kod S. typhimurium ili uvrB mutacije kod S. typhimurium kroz osjetljivost na ultraljubičasto svjetlo) (2)(3). Ti sojevi također trebaju proizvesti broj kolonija spontanih revertanata (spontanih povratnih mutanata) u okvirima učestalosti koja se očekuje na temelju kontrolnih podataka iz prijašnjih ispitivanja i po mogućnosti unutar okvira navedenih u literaturi.

S. typhimurium TA1535, i

S. typhimurium TA1537 ili TA97 ili TA97a, i

S. typhimurium TA98, i

S. typhimurium TA100, i

E. coli WP2 uvrA, ili E. coli WP2 uvrA (pKM101), ili S. typhimurium TA102.

1.5.1.2. Hranjiva podloga Koristi se odgovarajući minimalni agar (npr. koji sadrži Vogel-Bonnerovu minimalnu podlogu E i glukozu) i top agar koji sadrži histidin i biotin ili triptofan, koji omogućuju nekoliko staničnih dioba (1)(2)(9).

1.5.1.3. Metabolička aktivacija Bakterije treba izložiti ispitivanoj tvari uz prisutnost i uz odsutnost odgovarajućeg metaboličkog aktivacijskog sustava. Najčešće upotrebljavani sustav je postmitohondrijska frakcija s dodanim kofaktorom (S9) pripravljena od jetre glodavaca tretiranih agensima za enzimsku indukciju, kao što su Aroclor 1254 (1)(2), ili kombinacija fenobarbitona i β-naftoflavona (18)(20)(21). Postmitohondrijska frakcija obično se upotrebljava u koncentracijama od 5 do 30 % v/v u mješavini S9. Izbor i stanje sustava mataboličke aktivacije može ovisiti o klasi opasnosti kemikalije koja se testira. U nekim slučajevima može biti primjereno upotrijebiti više od jedne koncentracije postmitohondrijske frakcije. Za azo-bojila i diazo spojeve možda je primjerenija upotreba redukcijskog sustava metaboličke aktivacije (6)(13).

1.5.1.4. Ispitivana tvar/priprema Krute ispitivane tvari treba otopiti ili suspendirati u odgovarajućim otapalima ili nosačima i prema potrebi razrijediti prije tretiranja bakterija. Tekuće ispitivane tvari mogu se izravno dodati u ispitne sustave i/ili razrijediti prije tretiranja. Treba koristiti svježe preparate ispitivane tvari, osim ako podaci o njihovoj stabilnosti dokazuju da je njihovo pohranjivanje prihvatljivo. Ne smije postojati sumnja da bi otapalo/nosač s ispitivanom tvari moglo/mogao proizvesti kemijsku reakciju i treba biti pogodno/pogodan za preživljavanje bakterija i djelovanje S9 (22). Ako se koriste otapala/nosači koji nisu dobro poznati, njihovo uključivanje u ispitivanje treba potkrijepiti referentnim podacima koji dokazuju njihovu prikladnost. Preporuka je da se, kad god je to moguće, najprije razmotri mogućnost upotrebe vodenog otapala/nosača. Kad se ispituju tvari koje u vodi nisu stabilne, korištena organska otapala ne smiju sadržavati vodu.

1.5.2. Uvjeti ispitivanja

1.5.2.

1.5.2.1. Pokusni sojevi (vidjeti 1.5.1.1.)

1.5.2.2. Koncentracije izlaganja Među kriterijima koje treba uzeti u obzir kod utvrđivanja najveće količine tvari koja će se koristiti su citotoksičnost i topljivost u konačnoj mješavini za tretiranje. Može biti korisno toksičnost i netopljivost utvrditi preliminarnim pokusom. Citotoksičnost se može otkriti po smanjenju broja kolonija revertanata, po čistim dijelovima ili smanjenju površine podloge, ili po stopi preživljavanja tretiranih kultura. Citotoksičnost tvari može se promijeniti uz prisutnost sustava metaboličke aktivacije. Netopljivost se može ocijeniti kao talog u konačnoj mješavini u stvarnim ispitnim uvjetima koji je vidljiv prostim okom. Preporučena maksimalna ispitna koncentracija za topljive necitotoksične tvari je 5 mg/ploča ili 5μl/ploča. Za necitotoksične tvari koje nisu topljive pri koncentraciji od 5 mg/ploča ili 5μl/ploča, jedna ili više testiranih koncentracija treba biti netopljiva u konačnoj mješavini za tretiranje. Ispitivane tvari koje su citotoksične već pri koncentracijama ispod 5 mg/ploča ili 5μl/ploča treba testirati do citotoksične koncentracije. Talog ne smije smetati očitavanju. Za inicijalni pokus treba koristiti najmanje pet različitih koncentracija ispitivane tvari koje je moguće analizirati, s intervalima od približno pola log (tj. √10) između ispitnih točaka. Manji intervali mogu biti primjereni kad se istražuje ovisnost između koncentracija i reakcija. Kad se ocjenjuju tvari koje sadrže značajne količine potencijalno mutagenih nečistoća može se razmotriti mogućnost testiranja s koncentracijama viši od 5 mg/ploča ili 5 μl/ploča.

1.5.2.3. Negativne i pozitivne kontrole U svaki pokus treba uključiti paralelne pozitivne i negativne kontrole (otapalo ili nosač), specifične za određene sojeve, sa i bez metaboličke aktivacije. Treba odabrati koncentracije pozitivnih kontrola koje dokazuju učinkovitost izvedbe svakog pokusa. Kod pokusa kod kojih se koristi sustav metaboličke aktivacije, referentna(-e) tvar(-i) treba odabrati na temelju bakterijskih sojeva koji se koriste. Sljedeće tvari su primjeri odgovarajućih pozitivnih kontrola za pokuse s metaboličkom aktivacijom: CAS broj EINECS broj Naziv tvari 781-43-1 212-308-4 9,10-dimetilantracen 57-97-6 200-359-5 7,12-dimetilbenz [α]antracen 50-32-8 200-028-5 benzo[a]piren 613-13-8 210-330-9 2-aminoantracen 50-18-0 ciklofosfamid 6055-19-2 200-015-4 ciklofosfamid monohidrat Sljedeća tvar je odgovarajuća pozitivna kontrola za metodu redukcijske metaboličke aktivacije: CAS broj EINECS broj Naziv tvari 573-58-0 209-358-4 kongo crvenilo 2-aminoantracen ne treba koristiti kao jedini pokazatelj učinkovitosti mješavine S9. Ako se koristi 2-aminoantracen, svaku šaržu S9 isto tako treba okarakterizirati pomoću mutagena kojemu je potrebna metabolička aktivacija mikrosomskim enzimima, npr. benzo[a]piren, dimetilbenzantracen. Sljedeće tvari su primjeri pozitivnih kontrola specifičnih za određene sojeve, za pokuse koji se izvode bez egzogenog sustava metaboličke aktivacije: CAS brojevi EINECS brojevi Naziv tvari Soj 26628-22-8 247-852-1 natrijev azid TA 1535 i TA 100 607-57-8 210-138-5 2-nitrofluoren TA 98 90-45-9 201-995-6 9-aminoakridin TA 1537, TA 97 i TA 97a 17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 i TA 97a 80-15-9 201-254-7 kumen hidroperoksid TA 102 50-07-7 200-008-6 mitomicin C WP2 uvrA i TA l02 70-25-7 200-730-1 N-metil-N-nitro-N-nitrozogvanidin WP2, WP2uvrA i WP2uvrA(pK M101) 56-57-5 200-281-1 4-nitrokinolin-1-oksid WP2, WP2uvrA in WP2uvrA(pK M101) 3688-53-7 furilfuramid (AF2) tvari koje sadrže plazmide Mogu se koristiti i druge odgovarajuće referentne tvari pozitivne kontrole. Treba razmotriti mogućnost upotrebe kontrolnih kemikalija svrstanih u istu klasu opasnosti kao ispitivana tvar, ako su takve kemikalije raspoložive. Treba koristiti i negativne kontrole koje se sastoje samo od otapala ili nosača, bez ispitivane tvari, s kojima se inače postupa jednako kao s tretiranim skupinama. Osim toga treba koristiti i netretirane kontrole osim ako postoje podaci o kontrolama iz ranijih pokusa koji dokazuju da odabrano otapalo ne izaziva nikakve štetne ili mutagene učinke.

1.5.3. Postupak Kod metode inkorporacije u agarnu ploču (1)(2)(3)(4), bez metaboličke aktivacije, obično se pomiješa 0,05 ml ili 0,1 ml ispitne otopine, 0,1 ml svježe bakterijske kulture (koja sadrži približno 108 živih stanica) i 0,5 ml sterilnog pufera s 2,0 ml top agara. Kod pokusa s metaboličkom aktivacijom obično se 0,5 ml mješavine za metaboličku aktivaciju koja sadrži odgovarajuću količinu post-mitohondrijske frakcije (u rasponu od 5 do 30 % v/v u mješavini za metaboličku aktivaciju) pomiješa se s top agarom (2,0 ml), kao i s bakterijama i ispitivanom tvari/ispitnom otopinom. Sadržaj svake epruvete se promiješa i prelije po površini minimalne agarne podloge. Prije inkubacije top agar treba pustiti da se stvrdne. Kod predinkubacijske metode (2)(3)(5)(6), uobičajeno je da se ispitivana tvar/ispitna otopina predinkubira zajedno s pokusnim sojem (oko 108 živih stanica) i sterilnim puferom ili sustavom za metaboličku aktivaciju (0,5 ml), obično 20 minuta ili duže na 30-37 °C, prije nego se pomiješa s top agarom i prelije po površini minimalne agarne podloge. Obično se 0,05 ml ili 0,1 ml ispitivane tvari/ispitne otopine, 0,1 ml bakterija i 0,5 ml mješavine S9 ili sterilnog pufera pomiješa s 2,0 ml top agara. Za vrijeme predinkubacije epruvete treba prozračivati pomoću tresilice. Za adekvatnu procjenu varijacija, za svaku visinu doze treba nasaditi po tri ploče. Upotreba dviju ploča je prihvatljiva ako za to postoji znanstveno opravdanje. Ako se povremeno dogodi da se ploča izgubi, to ne mora nužno značiti da su rezultati pokusa nevažeći. Plinovite ili hlapive tvari treba ispitivati odgovarajućim metodama, na primjer u nepropusnim posudama (12)(14)(15)(16).

1.5.4. Inkubacija Sve ploče u određenom pokusu treba inkubirati 48-72 sata na 37 °C. Nakon inkubacije na svakoj se ploči utvrđuje broj kolonija revertanata.

2. PODACI

2.

2.1. OBRADA PODATAKA Podatke treba prikazati kao broj kolonija revertanata po agarnoj ploči. Treba navesti i broj kolonija revertanata na agarnim pločama negativne kontrole (kontrolni uzorak tretiran otapalom i, ako se koristi, netretirani kontrolni uzorak) i pozitivne kontrole. Treba navesti ukupni broj na pojedinačnim pločama, srednju vrijednost broja kolonija revertanata po ploči i standardnu devijaciju za ispitivanu tvar kao i za pozitivne i negativne kontrole (netretirane i/ili kontrole tretirane otapalom). Potvrđivanje jasne pozitivne reakcije nije potrebno. Nejasne rezultate treba pojasniti daljnjim ispitivanjima, po mogućnosti uz modifikaciju uvjeta ispitivanja. Negativne rezultate treba potvrđivati od slučaja do slučaja. Kad se smatra da potvrda negativnih rezultata nije potrebna, takvo mišljenje treba znanstveno opravdati. U daljnjim pokusima treba razmotriti mogućnost modifikacije ispitnih parametara kako bi se povećao broj uvjeta koji će se analizirati. Ispitni parametri koji se mogu modificirati uključuju vremenske razmake između primjene različitih koncentracija, metode tretiranja (inkorporacija u ploču ili predinkubacija u tekućini) i uvjete metaboličke aktivacije.

2.2. OCJENA I TUMAČENJE REZULTATA Ima više kriterija za utvrđivanje pozitivnih rezultata, kao što je povećanje broja kolonija revertanata vezano uz koncentraciju unutar ispitivanog raspona i/ili ponovljivi porast pri jednoj ili više koncentracija po ploči, kod najmanje jednog soja, sa ili bez sustava za metaboličku aktivaciju (23). Najprije treba razmotriti biološku relevantnost rezultata. Kao pomoć pri ocjenjivanju rezultata ispitivanja mogu se koristiti statističke metode (24). Međutim, statistički značaj ne smije biti jedini odlučujući faktor za utvrđivanje pozitivne reakcije. Kod ovog se testa smatra da ispitivana tvar kod koje rezultati ne udovoljavaju gore navedenim kriterijima nije mutagena. Iako će većina pokusa dati jasne pozitivne ili negativne rezultate, u rijetkim slučajevima dobiveni podaci neće omogućiti donošenje definitivne ocjene o djelovanju ispitivane tvari. Rezultati mogu ostati nejasni ili upitni bez obzira na broj ponavljanja pokusa. Pozitivni rezultati testa povratnih mutacija znače da tvar uzrokuje točkaste mutacije zamjenom baza ili pomakom okvira očitavanja u genomu bakterije Salmonella typhimurium i/ili Escherichia coli. Negativni rezultati znače da, u uvjetima pokusa, ispitivana tvar nije mutagena za pokusnu vrstu.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU

Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijedeće informacije:

Otapalo/nosač:

obrazloženje za odabir otapala/nosača,

topljivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosaču, ako su poznate.

Sojevi:

upotrijebljeni sojevi,

broj stanica po kulturi,

karakteristike soja.

Uvjeti ispitivanja:

količina ispitivane tvari po ploči (mg/ploča ili μl/ploča) kao i razlozi za odabir doze i broja ploča za svaku koncentraciju,

upotrijebljene hranjive podloge,

vrsta i sastav sustava metaboličke aktivacije, uključujući kriterije prihvatljivosti,

postupci tretiranja.

Rezultati:

znakovi toksičnosti,

znakovi taloženja,

ukupan broj na pojedinačnim pločama,

srednji broj kolonija revertanata po ploči i standardna devijacija,

ovisnost doze i reakcije, tamo gdje je moguće,

statističke analize, ako su rađene,

podaci o istovremenim negativnim (otapalo/nosač) i pozitivnim kontrolama, s rasponima, srednjim vrijednostima i standardnim devijacijama,

podaci o negativnim (otapalo/nosač) i pozitivnim kontrolama iz prijašnjih ispitivanja, s rasponima, srednjim vrijednostima i standardnim devijacijama.

Diskusija o rezultatima.

Zaključci.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)

REFERENCE Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E., (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, str. 347-364. Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, str. 173-215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E., (1994) Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, str. 217-233. Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V., (1986) The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, str. 69-240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y., (1975) Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, str. 91-96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M., (1980) Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. str. 273-285. Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R., (1980) Bacterial Mutation Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press, str. 13-61. Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L., (1987) Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, str. 167-177. Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A., (1976) Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res., 38, str. 33-42. Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984) The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, str. 141-161. Thompson, E.D. and Melampy, P.J., (1981) An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, str. 453-465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994) Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, str. 335-344. Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughn, V.L., (1984) Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, str. 33-47. Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K., (1992) Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, str. 2-141. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G., (1977) Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, str. 249-258. Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D., (1987) Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, str. 421-441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T., (1979) Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium. Cancer Res., 39, str. 3780-3782. Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N., (1980) Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, str. 4961-4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G., (1990) Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, str. 285-291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: In vitro metabolic Activation in Mutagenesis Testing Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, str. 85-88. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992) Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, str. 175-177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N., (1981) Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., str. 88343-350. Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E., (1987) Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity. Mutation Res. 189, str. 83-91. Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J., (1989) Analysis of Data from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cambridge University Press, str. 28-65.

B.15. ISPITIVANJE MUTAGENOSTI I PROBIRNI TEST NA GENSKE MUTACIJE KOJE UKAZUJU NA KARCINOGENOST– SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.15.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJA Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.3. REFERENTNE TVARI Nema ih.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Za mjerenje nastanka genskih mutacija induciranih kemijskim agensima sa ili bez metaboličke aktivacije može se koristiti niz haploidnih i diploidnih sojeva kvasca Saccharomyces cerevisiae. Koriste se sustavi naprednih mutacija u haploidnim sojevima, kao što je mjerenje mutacije iz crvenih mutanata kojima je potreban adenin (ade-1, ade-2) u dvostruke bijele mutante kojima je potreban adenin i selektivni sustavi kao što je indukcija otpornosti na kanavnain i cikloheksamid. Najopsežnije validirani sustav povratnih mutacija uključuje upotrebu haploidnog soja XV 185-14C koji nosi oker besmislene mutacije ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 i trp 5-48, koje su povratne pod utjecajem mutagena bazne supstitucije koji induciraju mutacije specifične za mjesto pojavljivanja ili oker supresorske mutacije. XV 185-14C isto tako nosi marker his 1-7, odnosno mutaciju krivog smisla koja postaje povratnom uglavnom mutiranjem na drugom mjestu i marker hom 3-10, mutaciju koja postaje povratnom pod utjecajem frameshift mutagena (mutagena pomaka očitavanja). Što se tiče diploidnih sojeva S. cerevisiae jedini soj koji se koristi u velikoj mjeri je D7 koji je homozigotan za ilv1-92.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6. Priprema

Prije ispitivanja treba pripremiti otopinu ispitivane tvari i kontrole, koristeći odgovarajući nosač. Kad se radi o organskim spojevima koji nisu topljivi u vodi, treba upotrijebiti najviše 2 %-tnu otopinu v/v organskog otapala kao što je etanol, aceton ili dimetilsulfoksid (DMSO). Konačna koncentracija nosača ne smije znatno utjecati na sposobnost preživljavanja stanica i karakteristike rasta.

Metabolička aktivacija

Stanice treba izlagati ispitivanim kemikalijama u prisutnosti i u odsutnosti odgovarajućih egzogenih sustava metaboličke aktivacije. Najčešće upotrebljavani sustav je postmitohondrijska frakcija s dodanim kofaktorom, iz jetre glodavaca prethodno tretiranih agensima za enzimsku indukciju. Isto tako za metaboličku aktivaciju može biti primjerena i upotreba drugih vrsta, tkiva, postmitohondrijskih frakcija ili postupaka.

Uvjeti ispitivanja

Pokusni sojevi

Haploidni soj XV 185-14C i diploidni soj D7 najčešće se koriste u studijama mutacije gena. Mogu biti pogodni i neki drugi sojevi.

Hranjive podloge

Za utvrđivanje stope preživljavanja i broja mutanata koriste se odgovarajuće hranjive podloge za uzgoj kultura.

Upotreba negativnih i pozitivnih kontrola

Pozitivne kontrole, kontrole bez tretiranja i kontrole uz upotrebu otopina treba obavljati istodobno. Za svaki specifični konačni mutacijski učinak treba upotrijebiti odgovarajuće kemikalije pozitivne kontrole.

Koncentracije izlaganja

U odgovarajućim vremenskim razmacima treba upotrijebiti najmanje pet koncentracija ispitivane tvari. Kad su u pitanju toksične tvari, pri najvišim koncentracijama preživljavanje ne smije pasti ispod 5 do 10 %. Tvari koje su relativno netopljive u vodi treba ispitivati do granice njihove topljivosti primjenjujući odgovarajuće postupke. Za netoksične tvari koje su lako topljive u vodi gornje koncentracije treba utvrđivati od slučaja do slučaja.

Uvjeti inkubacije

Ploče se inkubiraju u mraku četiri do sedam dana na 28 do 30 °C.

Učestalost spontanih mutacija

Treba koristiti subkulture s učestalošću spontanih mutacija unutar prihvaćenog normalnog raspona.

Broj replikata

Za analizu prototrofa nastalih genskom mutacijom i sposobnosti preživljavanja stanica, za svaku koncentraciju treba upotrijebiti najmanje tri jednake ploče (replikata). Kad se radi o pokusima kod kojih se koriste markeri kao što je hom 3-10 s niskom stopom mutacija, broj upotrijebljenih ploča mora biti veći kako bi se osigurali statistički relevantni podaci.

Postupak

Tretiranje sojeva S. cerevisiae obično se izvodi ispitnim postupkim u tekućini, koji se primjenjuje ili na stacionarne ili na rastuće stanice. Inicijalne pokuse treba obaviti na rastućim stanicama: 1-5 × 107 stanica/ml izlaže se ispitivanoj kemikaliji do 18 sati na 28 do 37 °C, uz tresenje. Tijekom tretiranja prema potrebi se dodaju odgovarajuće količine metaboličkog aktivacijskog sustava. Na kraju tretiranja stanice se centrifugiraju, isperu i nasade ne odgovarajuću hranjivu podlogu za uzgoj kultura. Nakon inkubacije ploče se očitavaju radi utvrđivanja stope preživaljavanja i indukcije genskih mutacija. Ako je prvi pokus negativan, treba napraviti drugi pokus za koji se koriste stanice u stacionarnoj fazi rasta (u fazi mirovanja). Ako je prvi pokus pozitivan, potvrđuje se odgovarajućim nezavisnim pokusom.

2. PODACI Podatke treba prikazati u tabličnom obliku, pri čemu treba navesti broj prebrojenih kolonija, broj mutanata te učestalost preživljavanja i pojave mutanata. Sve rezultate treba potvrditi nezavisnim pokusom. Podatke treba ocijeniti uz primjenu odgovarajućih statističkih metoda.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju treba, ako je moguće, sadržavati sljedeće informacije:

upotrijebljeni soj,

uvjeti ispitivanja: stanice u stacionarnoj fazi (u fazi mirovanja) ili fazi rasta, sastav hranjive podloge, temperatura i trajanje inkubacije, sustav metaboličke aktivacije,

uvjeti tretiranja: razine izlaganja, postupak i trajanje tretiranja, temperatura tretiranja, pozitivne i negativne kontrole,

broj prebrojenih kolonija, broj mutanata, učestalost preživljavanja i pojave mutacija, odnos doze i reakcije, ovisno o slučaju, statistička procjena podataka,

diskusija o rezultatima,

tumačenje rezultata.

3.2. OCJENA I TUMAČENJE Vidjeti Opći uvod, dio B.

4. REFERENCE Vidjeti Opći uvod, dio B.

B.16. MITOTSKA REKOMBINACIJA – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.16.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Vidjeti Opći uvod dio B.

1.2. DEFINICIJA Vidjeti Opći uvod dio B.

1.3. REFERENTNE TVARI Nema ih.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Mitotska rekombinacija u Saccharomyces Cerevisiae može se otkriti između gena (ili općenitije između gena i njegovog centromera) i unutar gena. Prvi je slučaj poznat kao krosing-over i stvara recipročne produkte, dok je drugi najčešće nerecipročan i naziva se genskom konverzijom. Krosing-over se općenito analizira prema proizvodnji recesivnih homozigotnih kolonija ili sektora koji nastanu u heterozigotnom soju, dok se genska konverzija analizira na temelju proizvodnje prototrofnih revertanata koji nastanu u auksotrofnom heteroalelnom soju koji nosi dva različita defektna alela istoga gena. Najčešće korišteni sojevi za otkrivanje mitotske konverzije gena su sojevi D4 (heteroalelni na ade 2 i trp 5), D7 (heteroalelni na trp 5), BZ34 (heteroalelni na arg 4) i JDl (heteroalelni na his 4 i trp 5). Mitotski krosing-over koji proizvodi crvene i ružičaste homozigotne sektore može se analizirati u D5 ili u D7 (čime se također mjeri mitotska konverzija gena i povratne mutacije na ilv 1-92), pri čemu su oba soja heteroalelna za komplementarne alele ade 2.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6. Priprema

Otopine ispitivanih kemikalija i kontrole ili referentne spojeve treba pripremiti neposredno prije ispitivanja, uz upotrebu odgovarajućeg nosača. Kad se radi o organskim spojevima koji nisu topljivi u vodi, treba upotrijebiti najviše 2 %-tnu otopinu v/v organskog otapala kao što je etanol, aceton ili dimetilsulfoksid (DMSO). Konačna koncentracija nosača ne smije znatno utjecati na sposobnost preživljavanja stanica i karakteristike rasta.

Metabolička aktivacija

Stanice treba izlagati ispitivanim kemikalijama u prisutnosti i u odsutnosti odgovarajućih egzogenih sustava metaboličke aktivacije. Najčešće upotrebljavani sustav je postmitohondrijska frakcija s dodanim kofaktorom iz jetre glodavaca prethodno tretiranih agensima za enzimsku indukciju. Isto tako za metaboličku aktivaciju može biti primjerena i upotreba drugih životinjskih vrsta, tkiva, postmitohondrijskih frakcija ili postupaka.

Uvjeti ispitivanja

Pokusni sojevi

Najčešće korišteni sojevi su diploidi D4, D5, D7 i JDl. Mogu biti pogodni i neki drugi sojevi.

Hranjive podloge

Za utvrđivanje stope preživljavanja i učestalosti mitotske rekombinacije koriste se odgovarajuće hranjive podloge za uzgoj kultura.

Upotreba negativnih i pozitivnih kontrola

Pozitivne kontrole, kontrole bez tretiranja i kontrole s otopinama treba obavljati paralelno. Za svaki specifični konačni učinak rekombinacije treba upotrijebiti odgovarajuće kemikalije pozitivne kontrole.

Koncentracije izlaganja

U odgovarajućim vremenskim razmacima treba upotrijebiti najmanje pet koncentracija ispitivane tvari. Najniža koncentracija ne smije utjecati na sposobnost preživljavanja stanica. Kad su u pitanju toksične tvari, pri najvišim koncentracijama preživljavanje ne smije pasti ispod 5 do 10 %. Tvari koje su relativno netopljive u vodi treba ispitivati do granice njihove topljivosti, primjenjujući odgovarajuće postupke. Za netoksične tvari koje su dobro topljive u vodi gornje koncentracije treba utvrđivati od slučaja do slučaja. Stanice se mogu izlagati ispitivanim kemikalijama ili u stacionarnoj fazi (fazi mirovanja) ili tijekom rasta u trajanju od najviše 18 sati. Međutim, u slučaju dugotrajnijeg tretiranja kulture treba mikroskopski pregledati na stvaranje spora čija prisutnost test čini nevažećim.

Uvjeti inkubacije

Ploče se inkubiraju u mraku četiri do sedam dana na 28 °C do 30 °C. Ploče koje se koriste za analizu crvenih ili ružičastih homozigotnih sektora nastalih mitotskim krosing-overom treba držati u hladnjaku (oko 4 °C) daljnjih dan dva prije očitavanja kako bi se omogućio razvoj odgovarajućih pigmentiranih kolonija.

Učestalost spontanih mitotskih rekombinacija

Treba koristiti subkulture s učestalošću spontanih mitotskih rekombinacija u okviru prihvaćenog normalnog raspona.

Broj jednakih agarnih ploča

Za svaku koncentraciju treba upotrijebiti najmanje tri jednake agarne ploče za analizu prototrofa nastalih mitotskom konverzijom i sposobnosti preživljavanja stanica. U slučaju analize recesivne homozigotnosti nastale mitotskim krosing-overom, broj ploča treba povećati kako bi se dobio adekvatan broj kolonija.

Postupci

Tretiranje sojeva S. cerevisiae obično se provodi u okviru ispitnog postupka u tekućini, uz korištenje stanica u stacionarnoj fazi ili stanica u fazi rasta. Inicijalne pokuse treba provoditi na rastućim stanicama. 1-5 × 107 stanica/ml izlaže se ispitivanoj kemikaliji do 18 sati na 28 °C do 37 °C, uz protresanje; prema potrebi se tijekom tretiranja dodaje odgovarajuća količina sustava za metaboličku aktivaciju. Na kraju tretiranja stanice se centrifugiraju, peru i nasađuju na odgovarajuću podlogu za uzgoj kultura. Nakon inkubacije ploče se očitavaju s obzirom na stupanj preživljavanja i indukciju mitotske rekombinacije. Ako je prvi pokus negativan, treba napraviti drugi pokus sa stanicama u stacionarnoj fazi. Ako je prvi pokus pozitivan, potvrđuje ga se neovisnom pokusom.

2. PODACI Podatke treba prikazati u obliku tablice iz koje se može vidjeti ukupni broj kolonija, broj rekombinanata, stopa preživljavanja i učestalost rekombinanata. Rezultate treba potvrditi nezavisnim pokusom. Podatke treba ocijeniti uz primjenu odgovarajućih statističkih metoda.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju treba, ako je moguće, sadržavati sljedeće informacije:

upotrijebljeni soj,

uvjeti ispitivanja: stanice u stacionarnoj fazi (u fazi mirovanja) ili fazi rasta, sastav hranjive podloge, temperatura i trajanje inkubacije, sustav metaboličke aktivacije,

uvjeti tretiranja: koncentracije izlaganja, postupak i trajanje tretiranja, temperatura tretiranja, pozitivne i negativne kontrole,

utvrđeni broj kolonija, broj rekombinanata, učestalost preživljavanja i pojave rekombinacija, odnos doze i reakcije, ovisno o slučaju, statistička procjena podataka,

diskusija o rezultatima,

tumačenje rezultata.

3.2. OCJENA I TUMAČENJE Vidjeti Opći uvod, dio B.

4. REFERENCE Vidjeti Opći uvod, dio B.

B.17. IN VITRO TEST GENSKIH MUTACIJA STANICA SISAVACA

B.17.

1. METODA Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 476, In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997) (In vitro test genskih mutacija stanica sisavaca (1997.)).

1.

1.1. UVOD In vitro test genskih mutacija stanica sisavaca može se koristiti za otkrivanje genskih mutacija induciranih (uzrokovanih) kemijskim tvarima. Odgovarajuće stanične linije uključuju stanice limfoma miša L5178Y, linije stanica kineskog hrčka CHO, CHO-AS52 i V79 i stanice ljudskih limfoblastoidnih stanica TK6 (1). Kod tih staničnih linija na temelju najčešće primjenljivanih konačnih genetskih učinaka mjeri se mutacija na timidin kinazi (TK) i hipoksantin-guanin-fosforibozil-transferazi (HPRT) te na transgenu ksantin-guanin-fosforibozil-transferaze (XPRT). Testovi mutacija TK, HPRT i XPRT otkrivaju različite spektre genetskih pojava. Autosomalna lokacija TK i XPRT može omogućiti otkrivanje genetskih pojava (npr. velike delecije) koje se ne otkriju na lokusu HPRT-a na X-kromosomima (2)(3)(4)(5)(6). U in vitro testu genskih mutacija stanica sisavaca mogu se koristiti kulture trajnih staničnih linija ili staničnih sojeva. Stanice koje se koriste biraju se na temelju sposobnosti rasta u kulturi i stabilnosti učestalosti spontanih mutacija. Testovi koji se obavljaju in vitro zahtijevaju primjenu egzogenog (vanjskog) izvora metaboličke aktivacije. Taj sustav metaboličke aktivacije ne može u potpunosti oponašati uvjete in vivo kod sisavaca. Treba paziti da se izbjegavaju uvjeti koji bi doveli do rezultata koji ne odražavaju intrinzičnu mutagenost. Pozitivni rezultati koji ne odražavaju intrinzičnu mutagenost mogu proizaći iz promjena u pH, osmolalnosti ili visoke razine citotoksičnosti (7). Ovaj se test koristi za probir na moguće mutagene i karcinogene u sisavaca. Mnogi spojevi koji se kod ovog testa pokažu pozitivnim karcinogeni su za sisavce; međutim, ne postoji savršena korelacija između ovog testa i karcinogenosti. Korelacija ovisi o klasi opasnosti kemikalije i sve je više dokaza da postoje karcinogeni koje ovaj test ne otkriva jer izgleda da djeluju kroz druge negenotoksičke mehanizme ili mehanizme kojih nema u bakterijskim stanicama (6). Vidjeti također Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJE Napredna mutacije: genska mutacija od roditeljskog tipa u mutantni oblik, koja uzrokuje promjenu ili gubitak enzimskog djelovanja kodirane bjelančevine. Mutageni supstitucije baznih parova: tvari koje uzrokuju supstituciju jednog ili više baznih parova u DNK. Mutageni pomaka okvira očitavanja (frameshift mutageni): tvari koje uzrokuju adiciju ili deleciju jednog ili više baznih parova u molekuli DNK. Vrijeme ekspresije fenotipa: razdoblje tijekom kojega se nepromijenjeni genski produkti odstranjuju iz novomutiranih stanica. Učestalost pojave mutanata: broj opaženih mutiranih stanica podijeljen s brojem živih stanica. Relativni ukupan rast: povećanje broja stanica tijekom vremena u usporedbi s kontrolnom populacijom stanica; izračunava se kao umnožak rasta u suspenziji u odnosu na negativnu kontrolu i učinkovitosti kloniranja u odnosu na negativnu kontrolu. Relativni rast u suspenziji: povećanje broja stanica tijekom razdoblja ekspresije u odnosu na negativnu kontrolu. Sposobnost preživljavanja: učinkovitost kloniranja tretiranih stanica u vrijeme nasađivanja nakon razdoblja ekspresije u selektivnim uvjetima. Preživljavanje: učinkovitost kloniranja tretiranih stanica kad se nasade na kraju tretiranja; preživljavanje se obično izražava u odnosu na preživljavanje populacije kontrolnih stanica.

1.3. NAČELO ISPITNE METODE Stanice bez timidin kinaze (TK) su radi mutacije TK +/– →TK+/– otporne na citotoksičko djelovanje analoga primidona, trifluorotimidina (TFT). Stanice koje sadrže dosta timidin kinaze osjetljive su na TFT, što uzrokuje inhibiciju staničnog metabolizma i daljnju diobu stanica. Tako se mutantne stanice uz prisutnost TFT-a mogu razmnožavati dok se normalne stanice koje sadrže timidin kinazu ne mogu. Isto tako, stanice koje nemaju HPRT ili XPRT selektiraju se prema otpornosti na 6-tioguanin (TG) ili 8-azoguanin (AG). Ako se u okviru bilo kojeg testa genskih mutacija stanica sisavaca ispituje neki bazni analog ili spoj srodan selektivnom agensu pažljivo treba razmotriti svojstva ispitivane tvari. Na primjer, treba istražiti svaku pretpostavljenu selektivnu toksičnost ispitivane tvari za mutirane i nemutirane stanice. Prema tome, kad se testiraju kemikalije koje su strukturno srodne selektivnom agensu, mora se potvrditi djelovanje selektivnog sustava/agensa (8). Stanice u suspenziji ili jednoslojnoj kulturi izlažu se u odgovarajućem trajanju ispitivanoj tvari, sa i bez metaboličke aktivacije, i uzgoji se subkultura na novoj podlozi, da bi se utvrdila citotoksičnost i omogućila ekspresija fenotipa prije selekcije mutanata (9)(10)(11)(12)(13). Citotoksičnost se obično utvrđuje mjerenjem relativne učinkovitosti kloniranja (preživljavanje) ili relativnog ukupnog rasta kultura nakon razdoblja tretiranja. Tretirane se kulture drže u hranjivoj podlozi za rast tijekom dovoljno dugog vremenskog razdoblja koje je karakteristično za svaki odabrani lokus i tip stanice, što omogućuje skoro optimalnu ekspresiju fenotipa induciranih mutacija. Učestalost pojave mutanata utvrđuje se nasađivanjem poznatog broja stanica na hranjivu podlogu koja sadrži selektivni agens za otkrivanje mutantnih stanica, a u podlozi bez selektivnog agensa za određivanje učinkovitosti kloniranja (sposobnosti preživljavanja). Nakon odgovarajućeg razdoblja inkubacije kolonije se prebroje. Učestalost pojave mutanata dobije se iz broja mutiranih kolonija u selektivnoj hranjivoj podlozi i broja kolonija u neselektivnoj hranjivoj podlozi.

1.4. OPIS ISPITNE METODE

1.4.

1.4.1. Priprema

1.4.1.

1.4.1.1. Stanice Postoji više vrsta stanica koje se mogu koristiti u ovom testu, uključujući i podklonove stanica L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 ili TK6. Vrste stanica koje se koriste u ovom testu trebaju imati dokazanu osjetljivost na kemijske mutagene, visoku učinkovitost kloniranja i stabilnu učestalost spontanih mutacija. Stanice treba provjeriti na prisutnost mikoplazmatske kontaminacije i ako su kontaminirane ne smiju se koristiti. Test treba biti dizajniran tako da njegova osjetljivost i jakost budu unaprijed određene. Broj stanica, kultura i koncentracije ispitivane tvari koje se koriste trebaju odražavati tako definirane parametre (14). Minimalni broj živih stanica koje se koriste u svakoj fazi ispitivanja a prežive tretiranje treba se temeljiti na učestalosti spontanih mutacija. Opća je uputa da se koristi broj stanica koji je najmanje 10 puta obrnuto proporcionalan s učestalošću spontanih mutacija. Međutim, preporučuje se korištenje najmanje 106 stanica. Kako bi se pokazalo da se test provodi dosljedno, trebali bi biti dostupni odgovarajući povijesni podaci o upotrijebljenom staničnom sustavu.

1.4.1.2. Hranjive podloge i uvjeti za uzgoj kultura Treba koristiti odgovarajuće hranjive podloge za uzgoj kultura i osigurati odgovarajuće uvjete za inkubaciju (posude za uzgoj kultura, temperatura, koncentracija CO2, vlažnost zraka). Hranjive podloge treba odabrati prema selektivnim sustavima i vrsti stanica koji se koriste u testu. Posebno je važno odabrati uvjete za uzgoj kultura koji osiguravaju optimalni rast stanica tijekom razdoblja ekspresije i sposobnost stvaranja kolonija kako mutiranih tako i nemutiranih stanica.

1.4.1.3. Priprema kultura Stanice se dobivaju iz matičnih kultura, nasađuju u/na podlogu za uzgoj kultura i inkubiraju na 37 °C. Prije upotrebe u ovom testu iz kultura će možda trebati odstraniti mutirane stanice koje postoje otprije.

1.4.1.4. Metabolička aktivacija Stanice treba izlagati ispitivanoj tvari u prisutnosti i u odsutnosti odgovarajućeg sustava za aktivaciju metabolizma. Najčešće upotrebljavani sustav je postmitohondrijska frakcija s dodanim kofaktorom (S9) pripravljena od jetre glodavaca tretiranih agensima za enzimsku indukciju, kao što su Aroclor 1254 (15)(16)(17)(18), ili kombinacijom fenobarbitona i β-naftoflavona (19)(20). Postmitohondrijska frakcija obično se upotrebljava u koncentracijama od 1 do 10 % v/v u konačnoj ispitnoj podlozi. Izbor i stanje sustava mataboličke aktivacije može ovisiti o klasi opasnosti kemikalije koja se testira. U nekim slučajevima može biti primjereno upotrijebiti više od jedne koncentracije postmitohondrijske frakcije. Više promjena, uključujući stvaranje staničnih linija s izraženim specifičnim aktivacijskim enzimima pomoću genetskog inženjeringa može osigurati potencijal za endogenu aktivaciju. Odabir staničnih linija koje se koriste treba biti znanstveno opravdan (npr. na temelju relevantnosti izoenzima citokrom P450 za metabolizam ispitivane tvari).

1.4.1.5. Ispitivana tvar/priprema Krute ispitivane tvari treba prije tretiranja stanica otopiti ili suspendirati u odgovarajućim otapalima ili nosačima i prema potrebi razrijediti. Tekuće ispitivane tvari mogu se izravno dodati u ispitne sustave i/ili prije tretiranja razrijediti. Treba koristiti svježe preparate ispitivane tvari, osim ako podaci o njihovoj stabilnosti dokazuju da je njihovo pohranjivanje prihvatljivo.

1.4.2. Uvjeti ispitivanja

1.4.2.

1.4.2.1. Otapalo/nosač Ne smije postojati sumnja da bi otapalo/nosač s ispitivanom tvari moglo/mogao proizvesti kemijsku reakciju i treba biti pogodno/pogodan za preživljavanje bakterija i djelovanje S9. Ako se koriste otapala/nosači koji nisu dobro poznati, njihovo uključivanje u ispitivanje treba potkrijepiti podacima koji ukazuju na njihovu prikladnost. Preporuka je da se, kad god je to moguće, najprije razmotri mogućnost upotrebe vodenog otapala/nosača. Kad se ispituju tvari koje u vodi nisu stabilne, korištena organska otapala ne smiju sadržavati vodu. Voda se može odstraniti pomoću molekularnog sita.

1.4.2.2. Koncentracije izlaganja Među kriterijima koje treba razmotriti pri utvrđivanju najviše koncentracije su citotoksičnost, topljivost u ispitnom sustavu i promjene u pH ili osmolalnosti. Citotoksičnost treba utvrditi sa i bez metaboličke aktivacije u glavnom pokusu uz upotrebu odgovarajućih pokazatelja staničnog integriteta i rasta, kao što je relativna učinkovitost kloniranja (preživljavanje) ili relativni ukupni rast. Može biti korisno preliminarnim pokusom utvrditi citotoksičnost i topljivost. Treba upotrijebiti najmanje četiri koncentracije koje je moguće analizirati. Ako postoji citotoksičnost, te koncentracije trebaju biti u rasponu od maksimalne do male toksičnosti, ili netoksičnosti; to najčešće znači da razlika u razinama koncentracija ne smije biti veća od faktora 2 i √10. Ako se najviša koncentracija temelji na citotoksičnosti, rezultat njezine primjene trebala bi biti relativna stopa preživljavanja (relativna učinkovitost kloniranja) ili relativan ukupni rast od 10-20 % (ali ne ispod 10 %). Za relativno necitotoksične tvari maksimalna ispitna koncentracija treba biti 5 mg/ml, 5μl/ml ili 0,01 M, ovisno o tome koja je od njih najniža. Tvari koje su relativno netopljive u vodi treba ispitivati do granice njihove topljivosti u uvjetima kultiviranja. Dokaze o netopljivosti treba utvrditi u konačnom sredstvu za tretiranje kojem se stanice izlažu. Može biti korisno procijeniti topljivost na početku i na kraju tretiranja, budući da se ona tijekom izlaganja u ispitnom sustavu može promijeniti zbog prisutnosti stanica, S9, seruma itd. Netopljivost se može otkriti golim okom. Talog ne smije smetati očitavanju.

1.4.2.3. Kontrole U svaki pokus treba uključiti istovremene pozitivne i negativne (otapalo ili nosač) kontrole, sa i bez metaboličke aktivacije. Kad se koristi metabolička aktivacija, kemikalija pozitivne kontrole treba biti kemikalija kojoj je potrebna aktivacija da bi proizvela mutagenu reakciju. Primjeri pozitivnih kontrolnih tvari uključuju: Stanje metaboličke aktivacije Lokus Tvar CAS br. EINECS br. Odsutnost egzogene metaboličke aktivacije HPRT Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 Etil-nitrozourea 759-73-9 212-072-2 TK (male i velike kolonije Metil metansulfonat 66-27-3 200-625-0 XPRT Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 Etil-nitrozourea 759-73-9 212-072-2 Odsutnost egzogene metaboličke aktivacije HPRT 3-metilkolantren 56-49-5 200-276-4 N-nitrozodimetilamin 62-75-9 200-549-8 7,12-dimetilbenzantracen 57-97-6 200-359-5 TK (male i velike kolonije Ciklofosfamid 50-18-0 200-015-4 Ciklofosfamid monohidrat 6055-19-2 Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 3-metilkolantren 56-49-5 200-276-5 XPRT N-nitrozodimetilamin (za visoke razine S-9) 62-75-9 200-549-8 Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 Mogu se upotrijebiti i druge odgovarajuće referentne tvari pozitivne kontrolne, npr. ako laboratorij ima bazu podataka o ranijim ispitivanjima 5-bromo 2’-deoksiuridina (CAS br. 59-14-3, EINECS br. 200-415-9) može se upotrijebiti i ova referentna tvar. Treba razmotriti mogućnost upotrebe kemikalija pozitivne kontrole koje spadaju u istu klasu opasnosti kao i ispitivana tvar, kad god su raspoložive. Treba uključiti i negativne kontrole koje se sastoje samo od otapala ili nosača u podlozi za tretiranje i s kojima se postupa na jednaki način kao s tretiranim skupinama. Osim toga, treba koristiti i netretirane kontrole ako ne postoje podaci o prijašnjim kontrolama koji dokazuju da odabrano otapalo ne izaziva nikakve mutagene učinke.

1.4.3. Postupak

1.4.3.

1.4.3.1. Tretiranje ispitivanom tvari Stanice koje se razmnožavaju treba izlagati ispitivanoj tvari sa i bez metaboličke aktivacije. Izlaganje treba trajati odgovarajuće vrijeme (obično je dovoljno tri do šest sati). Vrijeme izlaganja može obuhvatiti jedan ili više staničnih ciklusa. Za svaku ispitivanu koncentraciju mogu se paralelno koristiti dvije kulture ili samo jedna. Kad se koristi samo jedna kultura, broj koncentracija treba povećati kako bi se osigurao dovoljan broj kultura za analizu (npr. najmanje osam koncentracija koje se mogu analizirati). Treba koristiti dvostruke negativne kontrole (otapalo). Plinovite ili hlapive tvari treba testirati primjenjujući odgovarajuće metode, npr. u nepropusnim posudama za uzgoj kultura (21)(22).

1.4.3.2. Mjerenje stope preživljavanja, sposobnosti preživljavanja i učestalosti pojave mutanata Na kraju razdoblja izlaganja stanice se isperu i kultiviraju kako bi se utvrdila stopa preživljavanja i omogućila ekspresija fenotipa mutanata. Mjerenje citotoksičnosti utvrđivanjem relativne učinkovitosti kloniranja (preživljavanja) ili relativnog ukupnog rasta kultura obično započinje nakon tretiranja. Za svaki lokus utvrđeno je minimalno vrijeme koje je potrebno da bi bila moguća optimalna ekspresija fenotipa novoinduciranih mutacija (za HPRT i XPRT potrebno je najmanje šest do osam dana, a za TK najmanje dva dana). Stanice se uzgajaju u podlozi sa i bez selektivnih agensa za utvrđivanje broja mutanata, odnosno učinkovitosti kloniranja. Mjerenje stope preživljavanja (koja se koristi za izračunavanje učestalosti pojave mutanata) započinje na kraju razdoblja ekspresije nasađivanjem na neselektivnu hranjivu podlogu. Ako je ispitivana tvar u testu L5178Y TK+/– pozitivna, treba razvrstati po veličini kolonije najmanje jedne od ispitnih kultura (najviša pozitivna koncentracija) kao i negativnih i pozitivnih kontrola. Ako je ispitivana tvar u testu L5178Y TK+/– negativna, po veličini treba razvrstati kolonije negativnih i pozitivnih kontrola. Razvrstavanje kolonija po veličini može se obaviti i u studijama kod kojih se koristi TK6TK+/–.

2. PODACI

2.

2.1. OBRADA REZULTATA Obrađuju se podaci o mjerenju citotoksičnosti i sposobnosti preživljavanja, broju kolonija i učestalosti pojave mutanata za tretirane i kontrolne kulture. Kad je kod testa L5178Y TK+/– rezultat pozitivan, kolonije se razvrstavaju prema kriterijima za male i velike kolonije kod najmanje jedne koncentracije ispitivane tvari (najviša pozitivna koncentracija) i kod negativnih i pozitivnih kontrola. Molekularna i citogenetska svojstva mutanata u velikim i malim kolonijama detaljno su ispitana (23)(24). Kod testa TK+/– kolonije se razvrstavaju prema kriterijima za kolonije normalnog rasta (velike) i sporog rasta (male) (25). Kod kolonija mutanata koje su pretrpjele najveća genetska oštećenja vrijeme udvostručivanja je duže i zato tvore male kolonije. Tipično je za ova oštećenja da variraju od gubitka čitavoga gena do kariotipski vidljivih kromosomskih aberacija. Indukcija mutanata koji tvore male kolonije povezuje se s kemikalijama koje izazivaju velike kromosomske aberacije (26). Manje oštećene mutirane stanice rastu brzinom sličnom brzini rasta roditeljskih stanica i stvaraju velike kolonije. Treba navesti stopu preživljavanja (relativnu učinkovitost kloniranja) ili relativni ukupni rast. Učestalost pojave mutanata treba izraziti kao broj mutantnih stanica u odnosu na broj preživjelih stanica. Treba navesti podatke za pojedinačne kulture. Osim toga, sve podatke treba rezimirati u obliku tablice. Jasne pozitivne reakcije nije potrebno verificirati. Nejasne rezultate treba pojasniti daljnjim ispitivanjima, po mogućnosti uz promjenu pokusnih uvjeta. Negativne rezultate treba potvrđivati od slučaja do slučaja. U slučajevima kod kojih se smatra da potvrda negativnih rezultata nije potrebna, za to treba navesti opravdane razloge. U daljnjim ispitivanjima koja se obavljaju u slučaju nejasnih ili negativnih rezultata treba razmotriti mogućnost izmjene ispitnih parametara kako bi se povećao obim analiziranih uvjeta. Ispitni parametri koji bi se mogli modificirati uključuju intervale primjene različitih koncentracija i uvjete metaboličke aktivacije.

2.2. OCJENA I TUMAČENJE REZULTATA Postoji više kriterija za utvrđivanje pozitivnih rezultata, kao na primjer povećanje ili ponovljivo povećanje učestalosti pojave mutanata povezano s koncentracijom. Najprije treba razmotriti biološku relevantnost podataka. Statističke metode mogu se koristiti kao pomoć u ocjenjivanju rezultata ispitivanja. Statistički značaj ne smije biti jedini odlučujući faktor za pozitivnu reakciju. Ispitivana tvar čija ispitivanja ne ispunjavaju gornje kriterije u ovom se sustavu ne smatra mutagenom. Iako će većina studija dati jasne pozitivne ili negativne rezultate, u rijetkim slučajevima na temelju dobivenih podataka neće se moći donijeti konačno mišljenje o djelovanju ispitivane tvari. Rezultati mogu ostati nejasni ili upitni bez obzira na broj ponavljanja pokusa. Pozitivni rezultati in vitro testa genskih mutacija stanica sisavaca pokazuju da ispitivana tvar izaziva genske mutacije u upotrijebljenim uzgojenim stanicama sisavaca. Ponovljiva pozitivna reakcija na određenu koncentraciju je najznačajnija. Negativni rezultati znače da ispitivana tvar u uvjetima ispitivanja ne izaziva genske mutacije kod upotrijebljenih uzgojenih stanica sisavaca.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU

Izvješće o ispitivanju mora uključivati sljedeće informacije:

otapalo/nosač:

obrazloženje za odabir otapala/nosača,

topljivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosaču, ako je poznata.

Stanice:

vrsta i podrijetlo stanica,

broj pasaža stanica, ako je primjereno,

metode održavanja staničnih kultura, ako je primjereno,

odsutnost mikoplazme.

Uvjeti ispitivanja:

obrazloženje za odabir koncentracija i broj kultura, uključujući npr. podatke o citotoksičnosti i granice topljivosti, ako su raspoloživi,

sastav hranjivih podloga, koncentracija CO2,

koncentracija ispitivane tvari,

volumen dodanog nosača i ispitivane tvari,

temperatura inkubacije,

vrijeme inkubacije,

trajanje tretiranja,

gustoća stanica za vrijeme tretiranja,

vrsta i sastav sustava metaboličke aktivacije, uključujući kriterije prihvatljivosti,

pozitivne i negativne kontrole,

dužina razdoblja ekspresije (uključujući broj nasađenih stanica te režim uzgoja podkultura i dodavanja hranjivih tvari, ako je primjereno),

selektivni agensi,

kriteriji na temelju kojih se test smatra pozitivnim, negativnim ili dvosmislenim,

metode korištene za utvrđivanje broja živih i mutiranih stanica,

definicija kolonija kod kojih se razmatra veličina i vrsta (uključujući kriterije za male i velike kolonije, ako je primjereno).

Rezultati:

znakovi toksičnosti,

znakovi taloženja,

podaci o pH i osmolalnosti tijekom izloženosti ispitivanoj tvari, ako su utvrđeni,

veličina kolonija, ako je utvrđena, barem za negativne i pozitivne kontrole,

osposobljenost laboratorija za otkrivanje malih kolonija mutanata pomoću sustava L5178Y TK+/–, ako je primjereno,

odnos doza i reakcija, ako je moguće,

statističke analize, ako su rađene,

podaci o paralelnim negativnim (otapalo/nosač) i pozitivnim kontrolama,

podaci o negativnim (otapalo/nosač) i pozitivnim kontrolama iz prijašnjih ispitivanja s rasponima, srednjim vrijednostima i standardnim devijacijama,

učestalost pojave mutanata.

Diskusija o rezultatima.

Zaključci.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)

REFERENCE Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.), (1987) Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E.H.Y. and Malling, H.V., (1968) Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, str. 1306-1312. Liber, H.L. and Thilly, W.G., (1982) Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, str. 467-485. Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L., (1989) Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, str. 394-403. Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F., (1989) Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, str. 121-128. Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E., (1994) Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, str. 235-239. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, str. 147-204. Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H., (1983) Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, str. 225-251. Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S., (1988) A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 196, str. 17-36. Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O’Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L., (1987) A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, str. 135-141. Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B., (1989) A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, str. 9-17. Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W., (1986) Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, str. 133-147. Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D., (1984) Procedures for the L5178Y/TK+/- — TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, str. 239-268. Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C., (1989) Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, str. 66-101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A., (1977) Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, str. 365-373. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, str. 347-364. Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M., (1979) Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, str. 61-108. Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, str. 173-215. Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, str. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, str. 85-88. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, str. 91-103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, str. 795-801. Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C., (1990) Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, str. 51-55. Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J., (1985) Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, str. 161-174. Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B., (1990) Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, str. 89-102. Moore, M.M. and Doerr, C.L., (1990) Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- - 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, str. 609-614.

B.18. OŠTEĆENJE I POPRAVAK – NEPLANIRANA SINTEZA DNK – STANICE SISAVACA IN VITRO

B.18.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJA Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.3. REFERENTNE TVARI Nema ih.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Testom neplanirane sinteze DNK (UDS) mjeri se reparaturna sinteza DNK nakon ekscizije (izrezivanja) i odstranjivanja dijela DNK na kojem se nalazi područje oštećenja izazvanog kemijskim i fizikalnim agensima. Test se temelji na inkorporaciji timidina označenog tritijem (3H-TdR) u DNK stanicama sisavaca koje nisu u S-fazi staničnog ciklusa. Unos 3H-TdR može se utvrditi autoradiografijom ili brojenjem DNK iz tretiranih stanica pomoću tekućinskog scintilacijskog brojača (LSC). Stanice sisavaca u kulturi, ako se ne koriste primarni hepatociti štakora, tretiraju se ispitnim agensom sa ili bez egzogene metaboličke aktivacije. UDS se isto tako može mjeriti u in vivo sustavima.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6. Priprema

Ispitivane tvari i kontrolne ili referentne tvari treba pripremiti u hranjivoj podlozi za rast, odnosno otopiti ili suspendirati u odgovarajućim nosačima, a zatim za upotrebu u pokusu dodatno razrijediti u hranjivoj podlozi za rast. Konačna koncentracija nosača ne smije utjecati na sposobnost preživljavanja stanica. U pokusu se mogu koristiti kulture primarnih hepatocita štakora, ljudskih limfocita ili trajnih staničnih linija (npr. ljudski diploidni fibroblasti). Stanice treba izlagati ispitivanoj kemikaliji u prisutnosti i u odsutnosti odgovarajućeg sustava metaboličke aktivacije.

Uvjeti ispitivanja

Broj kultura

Za svaku fazu pokusa potrebne su najmanje dvije stanične kulture za autoradiografiju i šest kultura (ili manje ako je to znanstveno opravdano) za utvrđivanje neplanirane sinteze DNK (UDS) pomoću tekućinskog scintilacijskog brojača (LSC).

Upotreba negativnih i pozitivnih kontrola

U svaki pokus treba uključiti paralelne pozitivne i negativne kontrole (netretirane i/ili tretirane nosačem) sa i bez metaboličke aktivacije. Primjeri pozitivnih kontrolnih tvari za pokus s hepatocitima štakora uključuju 7,12- dimetilbenzatracen (7,12- DMBA) ili 2-acetilaminofluoren (2-AAF). Kada se radi o trajnim staničnim linijama, 4-nitrokvinolin-N-oksid (4-NQO) je primjer pozitivne kontrolne tvari i za autoradiografske pokuse i za pokuse s tekućinskim scintilacijskim brojačem obavljene bez metaboličke aktivacije; N-dimetilnitrozamin je primjer kontrolnog pozitivnog spoja ako se koriste sustavi metaboličke aktivacije.

Koncentracije izlaganja

Treba upotrijebiti više koncentracija ispitivane tvari u rasponu adekvatnom za definiranje reakcija. Najviše koncentracije bi trebale izazvati neke cititoksičke učinke. Spojeve koji su relativno netopljivi u vodi treba testirati do granice njihove topljivosti. Za netoksične kemikalije koje su lako topljive u vodi gornju ispitnu koncentraciju treba utvrditi za svaki slučaj posebno.

Stanice

Za održavanje kultura treba upotrijebiti odgovarajuće hranjive podloge za rast, odgovarajuću koncentraciju CO2, temperaturu i vlažnost zraka. Trajne stanične linije treba periodično provjeravati s obzirom na eventualnu kontaminaciju mikoplazmom.

Metabolička aktivacija

Sustavi metaboličke aktivacije ne upotrebljavaju se kod kultura primarnih hepatocita. Trajne stanične linije i limfociti izlažu se ispitivanoj tvari u prisutnosti i u odsutnosti odgovarajućeg sustava metaboličke aktivacije.

Postupak

Priprema kultura

Trajne stanične linije dobivaju se iz matičnih kultura (npr. tripsinizacijom ili otresanjem), nasađuju se u odgovarajućoj gustoći u posude za uzgoj kultura i inkubiraju na 37 °C. Kratkotrajne kulture hepatocita štakora pripremaju se tako da se svježe izdvojeni hepatociti suspendirani u odgovarajućoj podlozi stave na hranjivu podlogu za rast dok se ne pričvrste za njezinu površinu. Kulture ljudskih limfocita pripremaju se uz primjenu odgovarajućih tehnika.

Tretiranje kultura ispitivanom tvari Primarni hepatociti štakora

Svježe izolirani hepatociti štakora tretiraju se u odgovarajućem vremenskom razdoblju ispitivanom tvari u tekućoj podlozi koja sadrži 3H-TdR. Na kraju razdoblja tretiranja podlogu treba ocijediti sa stanica koje se potom ispiru, fiksiraju i osuše. Mikroskopske preparate treba namočiti u autoradiografsku emulziju (alternativno se preparat može prekriti tankim slojem emulzije (stripping film)).

Trajne stanične linije i limfociti

Autoradiografske tehnike: stanične kulture izlažu se ispitivanoj tvari tijekom odgovarajućeg vremena, nakon čega se tretiraju 3H-TdR-om. Vrijeme tretiranja ovisit će o vrsti tvari, djelovanju metaboličkih sustava i vrsti stanica. Za otkrivanje vrhunca neplanirane sinteze DNK (UDS) 3H-TdR treba dodati ili istodobno s ispitivanom tvari ili u roku od nekoliko minuta nakon izlaganja ispitivanoj tvari. Na odabir jednog od ova dva postupka utječu moguće interakcije između ispitivane tvari i 3H-TdR. Da bi se mogla razlikovati neplanirana sinteza DNK (UDS) od semikonzervativne replikacije DNK, ova druga se može inhibirati, na primjer primjenom podloge bez arginina, niskog sadržaja seruma ili pomoću hidroksiureje u hranjivoj podlozi za uzgoj kultura. Mjerenje neplanirane sinteze DNK pomoću tekućinskog scintilacijskog brojača (LSC): prije tretiranja ispitivanom tvari treba blokirati ulazak stanica u S-fazu, kako je opisano gore; stanice zatim treba izložiti ispitivanoj kemikaliji, kako je opisano u slučaju radiografije. Na kraju inkubacije DNK treba ekstrahirati iz stanica i utvrditi njezin ukupni sadržaj, kao i stupanj inkorporacije 3H-TdR. Treba napomenuti da kod primjene gore opisanih tehnika na ljudske limfocite, u nestimuliranim kulturama supresija semikonzervativne replikacije DNK nije potrebna.

Analiza

Autoradiografska mjerenja

Pri utvrđivanju neplanirane sinteze DNK (UDS) stanica u kulturi, za vrijeme S-faze jezgre se ne broje. Treba prebrojiti najmanje 50 stanica po koncentraciji. Prije brojenja preparate treba kodirati. Na svakom preparatu treba prebrojiti nekoliko široko razmaknutih nepravilnih polja. Količinu 3H-TdR inkorporiranog u citoplazmu treba utvrditi prebrojavanjem triju područja veličine jezgre u citoplazmi svake prebrojene stanice.

Mjerenje pomoću tekućinskog scintilacijskog brojača (LSC)

Kod utvrđivanja neplanirane sinteze DNK (UDS) pomoću tekućinskog scintilacijskog brojača (LSC) pri svakoj koncentraciji treba upotrijebiti odgovarajući broj kultura. Sve rezultate treba potvrditi nezavisnim pokusima.

2. PODACI Podatke treba prikazati u obliku tablice.

2.

2.1. AUTORADIOGRAFSKA MJERENJA Stupanj inkorporacije 3H-TdR u citoplazmi i broj zrnaca nađenih na staničnoj jezgri treba zabilježiti posebno. Za opis distribucije stupnja inkorporacije 3H-TdR u citoplazmi i broj zrnaca po jezgri mogu se koristiti aritmetička sredina, medijana i modus.

2.2. MJERENJE POMOĆU TEKUĆINSKOG SCINTILACIJSKOG BROJAČA (LSC) Kod mjerenja pomoću tekućinskog scintilacijskog brojača (LSC) inkorporaciju 3H-TdR treba prikazati kao dpm/μg DNK. Za opis distribucije inkorporacije može se upotrijebiti srednja vrijednost (aritmetička sredina) dpm/μg DNK sa standardnom devijacijom. Podatke treba ocjenjivati uz primjenu odgovarajućih statističkih metoda.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju treba, ako je moguće, sadržavati sljedeće informacije:

upotrijebljene stanice, gustoća i broj pasaža u vrijeme tretiranja, broj staničnih kultura,

metode korištene za održavanje staničnih kultura, uključujući hranjive podloge, temperature i koncentracije CO2,

ispitivana tvar, nosač, koncentracije i obrazloženje za odabir koncentracija korištenih u pokusu,

pojedinosti o sustavima metaboličke aktivacije,

režim tretiranja,

pozitivne i negativne kontrole,

upotrijebljena autoradiografska tehnika,

primijenjeni postupci za blokiranje ulaska stanice u S-fazu,

primijenjeni postupci za ekstrakciju i utvrđivanje ukupnog sadržaja DNK pri mjerenju pomoću tekućinskog scintilacijskog brojača (LSC),

odnos doza/reakcija, gdje je moguće,

statistička procjena,

diskusija o rezultatima,

tumačenje rezultata.

3.2. OCJENA I TUMAČENJE Vidjeti Opći uvod, dio B.

4. REFERENCE Vidjeti Opći uvod, dio B.

B.19. IN VITRO ANALIZA IZMJENE SESTRINSKIH KROMATIDA

B.19.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJA Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.3. REFERENTNE TVARI Nema ih.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Analiza izmjene sestrinskih kromatida je kratkotrajni test za otkrivanje recipročnih izmjena DNK između dviju sestrinskih kromatida kromosoma koji se udvostručuju. Izmjena sestrinskih kromatida (SCE) predstavlja međusobnu razmjenu produkata replikacije DNK na naizgled homolognim lokusima. Pretpostavka je da proces izmjene uključuje lom i ponovno spajanje DNK, iako se malo zna o njegovoj molekularnoj osnovi. Za otkrivanje izmjena sestrinskih kromatida (SCE) potrebno je imati neko sredstvo za diferencijalno označivanje sestrinskih kromatida, a to se može postići inkorporacijom bromodeoksiuridina (BrdU) u kromosomsku DNK za dva stanična ciklusa. Stanice sisavaca izlažu se ispitivanoj kemikaliji in vitro sa ili bez egzogenog sustava metaboličke aktivacije za sisavce, ako je primjereno, i kultiviraju dva kruga replikacije u hranjivoj podlozi koja sadrži BrdU. Nakon tretiranja inhibitorom diobenog vretena (npr. kolhicinom), da bi se stanice akumulirale u fazi mitoze koja izgleda poput metafaze (c-metafaza), stanice se izdvajaju iz kulture i pripremaju se kromosomski preparati.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6.

1.6.1. Priprema

U pokusu se mogu upotrijebiti primarne kulture (ljudski limfociti) ili trajne stanične linije (npr. stanice jajnika kineskog hrčka). Stanične linije treba provjeriti na eventualnu kontaminaciju mikoplazmom,

treba primjenjivati odgovarajuće hranjive podloge za uzgoj kultura i odgovarajuće uvjete inkubacije (npr. temperatura, posude za uzgoj kultura, koncentracije CO2 i vlažnost zraka),

ispitivane tvari mogu se pripremiti u hranjivoj podlozi za uzgoj kultura, odnosno otopiti ili suspendirati u odgovarajućim nosačima prije tretiranja stanica. Konačna koncentracija nosača u sustavu kulture ne smije znatno utjecati na sposobnost preživljavanja ili na rast stanica, a djelovanje na izmjenu sestrinskih kromatida (SCE) treba često nadzirati kroz primjenu kontrole pomoću otapala,

stanice treba izlagati ispitivanoj tvari u prisutnosti i u odsutnosti egzogenog sustava metaboličke aktivacije. Alternativno, kad se upotrebljavaju vrste stanica s intrinzičnom (endogenom) metaboličkom aktivacijom, stupanj i vrsta aktivnosti trebaju odgovarati klasi u koju je svrstana kemikalija koja se ispituje.

1.6.2. Uvjeti ispitivanja

1.6.2. Broj kultura

Za svaku pokusnu točku treba upotrijebiti najmanje po dvije jednake kulture.

Primjena negativnih i pozitivnih kontrola

Pozitivne kontrole, kod kojih se koriste i spojevi direktnog djelovanja i spojevi za koje je potrebna metabolička aktivacija, treba uključiti u svaki pokus: treba primjenjivati i kontrolu pomoću otapala. Slijede primjeri tvari koje se mogu upotrijebiti kao pozitivne kontrole. Prema potrebi se može uključiti i dodatna pozitivna kontrola svrstana u istu klasu opasnosti kao i kemikalija koja se ispituje.

spoj direktnog djelovanja:

etilmetansulfonat,

spoj indirektnog djelovanja:

ciklofosfamid.

Koncentracije izlaganja

U odgovarajućim vremenskim razmacima treba upotrijebiti najmanje tri koncentracije. Najviša koncentracija treba izazvati značajan toksički učinak, ali ipak mora omogućiti odvijanje odgovarajuće replikacije stanica. Tvari koje su relativno netopljive u vodi treba ispitivati do granice njihove topljivosti, primjenjujući odgovarajuće postupke. Za netoksične ispitivane tvari koje su lako topljive u vodi gornje koncentracije treba utvrđivati od slučaja do slučaja.

1.6.3. Postupak

1.6.3. Priprema kultura

Trajne stanične linije dobivaju se iz matičnih kultura (npr. tripsinizacijom ili otresanjem), nasađuju se u odgovarajućoj gustoći u posude za uzgoj kultura i inkubiraju na 37 °C. Kad se radi o jednoslojnim kulturama broj stanica po posudi za uzgoj kultura treba prilagoditi tako da kulture u vrijeme izdvajanja stanica ne budu konfluentne za puno više od 50 %. Alternativno se stanice mogu koristiti u suspenzijskoj kulturi. Kulture ljudskih limfocita dobivaju se uz primjenu odgovarajućih tehnika iz heparinizirane krvi i inkubiraju na 37 °C.

Tretiranje

Stanice u fazi eksponencijalnog rasta izlažu se ispitivanoj tvari tijekom odgovarajućeg vremenskog razdoblja; u većini slučajeva učinkovito je već izlaganje od jednog do dva sata, ali vrijeme izlaganja može se produžiti do trajanja dva kompletna stanična ciklusa. Stanice čija intrinzična (endogena) metabolička aktivnost nije dovoljna treba izložiti ispitivanoj kemikaliji u prisutnosti ili odsutnosti odgovarajućeg sustava za metaboličku aktivaciju. Na kraju razdoblja izlaganja ispire se ispitivana tvar sa stanica koje se zatim kultiviraju uz prisutnost BrdU-a u trajanju od dva kruga replikacije. Alternativni je postupak da se stanice istodobno izlažu ispitivanoj tvari i BrdU-u tijekom cijele kultivacije u trajanju od dva stanična ciklusa. Kulture ljudskih limfocita tretiraju se dok su u polusinkronom stanju. Stanice se analiziraju tijekom njihove druge diobe koja slijedi nakon tretiranja, s tim da se mora paziti da su stanice bile izložene kemikaliji u najosjetljivijim fazama staničnog ciklusa. Svim kulturama kojima se dodaje BrdU sve do izdvajanja stanica treba rukovati u mraku ili uz prigušeno svjetlo lampi sa žarnom niti, kako bi se fotoliza DNK koja sadrži BrdU svela na minimum.

Izdvajanje stanica

Stanične kulture tretiraju se inhibitorom diobenog vretena (npr. kolhicinom) jedan do četiri sata prije izdvajanja stanica. Iz svake se kulture stanice izdvajaju zasebno i obrađuju za pripravu preparata kromosoma.

Priprava preparata i bojenje kromosoma

Preparati kromosoma pripravljaju se uz primjenu standardnih citogenetskih tehnika. Bojenje preparata radi prikaza izmjene sestrinskih kromatida (SCE) može se izvesti uz primjenu više tehnika (npr. fluorescencija plus Giemsa metoda).

Analiza

Broj analiziranih stanica temelji se na učestalosti spontane kontrole izmjene sestrinskih kromatida (SCE). Obično se na izmjenu sestrinskih kromatida (SCE) analizira najmanje 25 dobro raširenih metafaza. Prije analize se mikroskopski preparati kodiraju. Kod ljudskih limfocita analiziraju se samo metafaze koje sadrže 46 centromera. Kod trajnih staničnih linija analiziraju se samo metafaze koje sadrže ± 2 centromera. Treba navesti je li centromerna zamjena oznaka zabilježena kao izmjena sestrinskih kromatida. Rezultate treba potvrditi nezavisnim pokusom.

2. PODACI Podatke treba prikazati u tabličnom obliku. Za svaku tretiranu i kontrolnu kulturu zasebno treba navesti broj izmjena sestrinskih kromatida (SCE).

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju treba, ako je moguće, sadržavati sljedeće informacije:

upotrijebljene stanice, metode održavanja staničnih kultura,

uvjeti ispitivanja: sastav hranjive podloge, koncentracija CO2, koncentracija ispitivane tvari, upotrijebljeni nosač, temperatura inkubacije, vrijeme tretiranja, upotrijebljeni inhibitor diobenog vretena, njegova koncentracija i vrijeme tretiranja njime, vrsta upotrijebljenog sustava metaboličke aktivacije, pozitivne i negativne kontrole,

broj staničnih kultura po pokusnoj točki,

pojedinosti o tehnici upotrijebljenoj za pripremu mikroskopskih preparata,

broj analiziranih metafaza (podaci navedeni zasebno za svaku kulturu),

srednji broj izmjena sestrinskih kromatida (SCE) po stanici i po kromosomu (podaci navedeni zasebno za svaku kulturu),

kriteriji za utvrđivanje broja izmjena sestrinskih kromatida (SCE),

obrazloženje za odabir doze,

odnos doze i reakcije, ako je primjereno,

statistička procjena,

diskusija o rezultatima,

tumačenje rezultata.

3.2. OCJENA I TUMAČENJE Vidjeti Opći uvod dio B.

4. REFERENCE Vidjeti Opći uvod, dio B.

B.20. TEST SPOLNO UVJETOVANE RECESIVNE SMRTNOSTI KOD VINSKE MUŠICE DROSOPHILA MELANOGASTER

B.20.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJA Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.3. REFERENTNE TVARI Nema ih.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Testom spolno uvjetovane recesivne smrtnosti kod kojeg se koristi vinska mušica Drosophila melanogaster, u zametnoj lozi insekta otkriva se pojava mutacija, uključujući točkaste mutacije i male delecije. Ovaj se test sastoji u analizi naprednih mutacija, koja omogućuje probir na mutacije oko 800 lokusa na kromosomu X; oni čine oko 80 % svih lokusa kromosoma X. Kromosom X predstavlja oko jedne petine čitavog haploidnoga genoma. Mutacije u kromosomu X vinske mušice Drosophila melanogaster fenotipski su izražene kod mužjaka koji nose mutirani gen. Kad je mutacija smrtonosna u hemizigotnom stanju, o njezinoj se prisutnosti zaključuje na temelju izostanka jedne fenotipske klase u muškom potomstvu, od dvije koje obično proizvede heterozigotna ženka. U testu spolno uvjetovane recesivne smrtnosti (SLRL) navedene se činjenice koriste kroz primjenu posebno označenih i strukturiranih kromosoma.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6. Priprema

Matične skupine

Mogu se upotrijebiti mužjaci iz dobro definiranih matičnih skupina divljeg tipa ili ženke iz matičnih skupina tipa Muller-5. Mogu se upotrijebiti i primjereno označene matične skupine ženki s višestruko invertiranim kromosomom X.

Ispitivana tvar

Ispitivanu tvar treba otopiti u vodi. Tvari koje su netopljive u vodi mogu se otopiti ili suspendirati u odgovarajućim nosačima (npr. mješavina etanola i Tween-60 ili 80) i zatim prije primjene razrijediti u vodi ili fiziološkoj otopini. Korištenje dimetilsulfoksida (DMSO) kao nosača treba izbjegavati.

Broj životinja

Test treba osmisliti tako da njegova osjetljivost i snaga budu unaprijed određene. Učestalost spontanih mutacija koje se opažaju u odgovarajućim kontrolama snažno će utjecati na broj tretiranih kromosoma koje se mora analizirati.

Put primjene

Izlaganje može biti oralno, putem injekcije, ili se koristi inhalacijski put primjene plinova, ili para. Ispitivana se tvar može davati oralno u šećernoj otopini. Prema potrebi tvari se mogu otopiti u 0,7 %-tnoj otopini soli i ubrizgati u toraks (grudni koš) ili abdomen (trbuh).

Upotreba negativnih i pozitivnih kontrola

U test treba uključiti negativne (nosači) i pozitivne kontrole. Međutim, ako postoje odgovarajući laboratorijski kontrolni podaci iz ranijih ispitivanja, paralelne kontrole nisu potrebne.

Razine izloženosti

Primjenjuju se tri razine izloženosti. Kod preliminarnog ocjenjivanja može se primijeniti jedna razina izloženosti ispitivanoj tvari, s tim da se pritom koriste najviša prihvatljiva koncentracija ili koncentracija koja već izaziva neke znakove toksičnosti. Kad su u pitanju netoksične tvari životinje treba izložiti najvišim koncentracijama koje je moguće primijeniti.

Postupak

Mužjaci divljeg tipa (stari tri do pet dana) tretiraju se ispitivanom tvari i pojedinačno se pare s brojnim ženkama, koje se prethodno nisu parile, iz matične skupine Muller-5 ili iz neke druge matične skupine, primjereno označene (višestruko invertiranim kromosomima X). Ženke se svaka dva do tri dana zamjenjuju novim ženkama koje se još nisu parile, kako bi se obuhvatio cijeli ciklus zametnih stanica. Kod potomaka tih ženki bilježe se smrtonosni učinci koji odgovaraju učincima na zreloj spermi, spermatidima srednje ili zadnje faze, ranim spermatidima, spermatocitima i spermatogonijima u vrijeme tretiranja. Heterozigotnim ženkama F1 dobivenim gore navedenim križanjem omogući se pojedinačno parenje (tj. jedna ženka po bočici (fijali)) s njihovom braćom. U generaciji F2 kod svake se kulture bilježi odsutnost mužjaka divljeg tipa. Ako se čini da kultura potječe od ženke F1 koja u roditeljskom kromosomu X nosi smrtonosni gen (tj. ne opaža se nijedan mužjak s tretiranim kromosomom), kćeri te ženke s istim genotipom treba testirati kako bi se utvrdilo ponavlja li se smrtnost u sljedećoj generaciji.

2. PODACI Podatke treba prikazati u obliku tablice u kojoj će biti naveden broj testiranih kromosoma X, broj sterilnih mužjaka i broj smrtonosnih kromosoma pri svakoj koncentraciji izlaganja i to za svako razdoblje parenja svakog tretiranog mužjaka. Treba navesti i broj klastera (skupina) različitih veličina po mužjaku. Predmetne rezultate treba potvrditi zasebnim pokusom. Kod ocjenjivanja testa spolno uvjetovane recesivne smrtnosti treba primjenjivati odgovarajuće statističke metode. Statistički treba analizirati i ocijeniti nakupljanje recesivnih smrtonosnih gena koji potječu od jednog mužjaka.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju treba, ako je moguće, sadržavati sljedeće informacije:

matične skupine: korištene matične skupine, odnosno sojevi mušice Drosophila, dob insekata, broj tretiranih mužjaka, broj sterilnih mužjaka, broj utvrđenih F2 kultura, broj F2 kultura bez potomstva, broj kromosoma koji nose smrtonosne gene opažene u svakom stadiju zametne stanice,

kriteriji za utvrđivanje veličine tretiranih skupina,

uvjeti ispitivanja, detaljan režim tretiranja i uzorkovanja, razine izlaganja, podaci o toksičnosti, negativne (otapalo) i pozitivne kontrole, ovisno o slučaju,

kriteriji za bilježenje smrtonosnih mutacija,

odnos izloženosti i učinaka, gdje je moguće,

ocjenjivanje podataka,

diskusija o rezultatima,

tumačenje rezultata.

3.2. OCJENA I TUMAČENJE Vidjeti Opći uvod, dio B.

4. REFERENCE Vidjeti Opći uvod, dio B.

B.21. IN VITRO TESTOVI TRANSFORMACIJA STANICA SISAVACA

B.21.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJA Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.3. REFERENTNE TVARI Nema ih.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Sustavi kultura stanica sisavaca mogu se koristiti za otkrivanje fenotipskih promjena in vitro izazvanih kemijskim tvarima koje su povezane s malignim transformacijama in vivo. Najčešće se koriste stanice C3H10T1/2, 3T3, SHE, te stanice štakora soja Fischer, a testovi se temelje na promjenama u staničnoj morfologiji, formiranju fokusa (guste nakupine stanica koje su izgubile kontaktnu inhibiciju) ili promjenama u ovisnosti rasta stanica o tvrdoj podlozi za prihvaćanje u polukrutom agaru (u kojem inače ne bi rasle). Nijedan od konačnih učinaka in vitro testa nema utvrđenu mehanističku vezu s karcinomom. Neki od ispitnih sustava mogu otkriti promotore tumora. Citotoksičnost se može utvrditi mjerenjem učinka ispitnog materijala na sposobnost stvaranja kolonija (učinkovitost kloniranja) ili na brzinu rasta kultura. Mjerenjem citotoksičnosti treba utvrditi je li izlaganje ispitivanoj kemikaliji bilo toksikološki relevantno, ali se ono ne može upotrijebiti za izračunavanje transformacije učestalosti kod svih analiza s obzirom da neke od njih mogu uključivati produženu inkubaciju i/ili ponovno nasađivanje na agarne ploče.

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6. Priprema

Stanice

Ovisno o testu transformacije koji se provodi, raspoloživ je čitav niz različitih staničnih linija ili primarnih stanica. Ispitivač se mora pobrinuti da u testu koji se obavlja stanice pokažu odgovarajuće fenotipske promjene nakon izlaganja poznatim karcinogenima i da za valjanost i pouzdanost testa koji se provodi u laboratoriju ispitivača postoje dokumentirani dokazi.

Hranjiva podloga

Treba primjenjivati hranjive podloge i pokusne uvjete koji odgovaraju analizi transformacija koja se primjenjuje.

Ispitivana tvar

Ispitivane tvari mogu se pripremiti u hranjivoj podlozi za uzgoj kultura, odnosno otopiti ili suspendirati u odgovarajućim nosačima prije tretiranja stanica. Konačna koncentracija nosača u sustavu kulture ne smije utjecati na sposobnost preživljavanja stanica, brzinu rasta ili pojavu transformacija.

Metabolička aktivacija

Stanice treba izlagati ispitivanoj tvari u prisutnosti i u odsutnosti odgovarajućeg sustava metaboličke aktivacije. Alternativno, u slučajevima korištenja staničnih tipova s endogenom (intrinzičnom) metaboličkom aktivnošću unaprijed treba biti poznato da ta aktivnost po svojoj prirodi odgovara klasi opasnosti u koju je svrstana kemikalija koja se ispituje.

Uvjeti ispitivanja

Primjena negativnih i pozitivnih kontrola

U svaki pokus treba uključiti pozitivne kontrole uz primjenu spojeva izravnog djelovanja, kao i spojeva kojima je potrebna metabolička aktivacija; isto tako treba primjenjivati i negativne kontrole (nosač). Slijede primjeri tvari koje se mogu upotrijebiti kao pozitivne kontrole: Prema potrebi u ispitivanje treba uključiti dodatnu pozitivnu kontrolu svrstanu u istu klasu kemikalija kao i spoj koji se ispituje.

Kemikalije izravnog djelovanja:

etilmetansulfonat.

β-propiolakton,

Spojevi koji zahtijevaju metaboličku aktivaciju:

2-acetilaminofluoren,

4-dimetilaminoazobenzen,

7,12-dimetilbenzantracen.

Koncentracije izlaganja

Treba upotrijebiti nekoliko koncentracija ispitivane tvari. Navedene koncentracije trebaju prouzročiti toksički učinak razmjeran koncentraciji, pri čemu će pri najvišoj koncentraciji razina preživljavanja biti niska, dok će preživljavanje kod najniže koncentracije biti otprilike jednako onome koje izaziva negativna kontrola. Tvari koje su relativno netopljive u vodi treba ispitivati do granice njihove topljivosti, primjenjujući odgovarajuće postupke. Za netoksične tvari koje su lako topljive u vodi gornje koncentracije treba utvrđivati od slučaja do slučaja.

Postupak

Stanice se izlažu ispitivanoj tvari tijekom odgovarajućeg vremenskog razdoblja, ovisno o ispitnom sustavu koji se primjenjuje, što u slučaju produženog izlaganja može uključivati i ponovljeno doziranje uz promjenu hranjive podloge (te, ako je potrebno, svježu mješavinu za metaboličku aktivaciju). Stanice bez dovoljne endogene (intrinzične) metaboličke aktivnosti treba izlagati ispitivanoj tvari u prisutnosti i odsutnosti odgovarajućeg sustava metaboličke aktivacije. Po završetku razdoblja izlaganja stanice se ispiru radi uklanjanja ostataka ispitivane tvari i kultiviraju u uvjetima koji pogoduju pojavljivanju transformiranog fenotipa koji se promatra, te se utvrđuje pojava transformacija. Svi se rezultati potvrđuju nezavisnim pokusom.

2. PODACI Podatke treba prikazati u obliku tablice, što se može učiniti na više načina ovisno o provedenom ispitivanju, na primjer, može se navesti ukupan broj stanica, broj pozitivnih agarnih ploča, ili broj transformiranih stanica. Tamo gdje je to primjereno, razina preživljavanja iskazuje se u obliku postotka kontrolnih razina, a učestalost transformacija kao broj transformanata (transformiranih stanica) u odnosu na broj preživjelih stanica. Podatke treba ocijeniti uz primjenu odgovarajućih statističkih metoda.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU Izvješće o ispitivanju treba, ako je moguće, sadržavati sljedeće informacije:

upotrijebljena vrsta stanica, broj staničnih kultura, metode održavanja staničnih kultura,

uvjeti ispitivanja: koncentracija ispitivane tvari, upotrijebljeni nosač, vrijeme inkubacije, trajanje i učestalost tretiranja, gustoća stanica tijekom tretiranja, vrsta upotrijebljenog egzogenog sustava metaboličke aktivacije, pozitivne i negativne kontrole, detaljan opis promatranog fenotipa, upotrijebljeni selektivni sustav (ovisno o slučaju), obrazloženje za odabir doze,

metoda upotrijebljena za brojenje živih i transformiranih stanica,

statistička ocjena,

diskusija o rezultatima,

tumačenje rezultata.

3.2. OCJENA I TUMAČENJE Vidjeti Opći uvod, dio B.

4. REFERENCE Vidjeti Opći uvod, dio B.

B.22.

1. METODA

1.

1.1. UVOD Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.2. DEFINICIJA Vidjeti Opći uvod, dio B.

1.3. REFERENTNE TVARI Nema ih.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE Učinci dominantnih letalnih gena uzrokuju embrionalnu ili fetalnu smrt. Indukcija dominantnih letalnih gena izlaganjem kemijskoj tvari ukazuje na činjenicu da je tvar djelovala na zametno tkivo ispitivane životinjske vrste. Općenito je prihvaćeno mišljenje da su dominantni letalni geni posljedica kromosomskih oštećenja (strukturnih i numeričkih anomalija). Isto tako, ako se tretiraju ženke, toksički učinci mogu dovesti do embrionalne smrti. Obično se životinje muškog roda izlažu djelovanju ispitivanog spoja te se pare s netretiranim ženkama koje se prethodno nisu parile. Različite stadije zametnih stanica može se odvojeno ispitati primjenom uzastopnih intervala parenja. Povećanje broja mrtvih implanata po ženki u tretiranoj skupini u odnosu na broj mrtvih implanata po ženki u kontrolnoj skupini odražava postimplantacijski gubitak. Predimplantacijski gubitak može se procijeniti na temelju broja žutih tijela ili usporedbom ukupnog broja implanata po ženki u kontrolnoj i tretiranoj skupini. Ukupni učinak dominantnih letalnih gena predstavlja zbroj pred- i post- implantacijskoga gubitka. Izračun ukupnog učinka dominantnih letalnih gena temelji se na usporedbi živih implanata po ženki u ispitnoj skupini i živih implanata po ženki u kontrolnoj skupini. Smanjenje broja implanata u određenim vremenskim razmacima može biti posljedica ubijanja stanica (tj. spermatocita i/ili spermatogonija).

1.5. KRITERIJI KVALITETE Nema ih.

1.6. OPIS ISPITNE METODE

1.6. Priprema

Kada je moguće, ispitivane tvari treba otopiti ili suspendirati u izotoničnoj fiziološkoj otopini. Kemikalije netopljive u vodi mogu se otopiti ili suspendirati u odgovarajućim nosačima. Nosač koji se koristi ne smije utjecati na djelovanje ispitivane kemikalije, niti izazivati toksične učinke. Treba koristiti svježe pripravke ispitivane kemikalije.

Uvjeti ispitivanja

Put primjene

Ispitivani se spoj općenito primjenjuje samo jednom. Na temelju toksikoloških informacija može se primijeniti režim ponavljanog tretiranja. Uobičajeni putevi primjene su oralna intubacija ili intraperitonealna injekcija. Prikladni mogu biti i drugi putevi primjene.

Pokusne životinje

Za pokusne životinje se kao vrsta preporučuju štakori i miševi. Zdrave i potpuno spolno zrele životinje nasumce se biraju i raspoređuju u skupine predviđene za tretiranje, odnosno kontrolu.

Broj i spol

Treba koristiti odgovarajući broj tretiranih mužjaka, pri čemu treba uzeti u obzir spontano variranje bioloških svojstava koja se ocjenjuju. Odabrani broj trebao bi se temeljiti na unaprijed utvrđenoj osjetljivosti detekcije i snazi testa koji će proizvesti učinke od statističkog značaja. Na primjer, kod tipičnog testa broj mužjaka u svakoj skupini koja prima određenu dozu trebao bi biti dovoljan da osigura između 30 i 50 gravidnih ženki po intervalu parenja.

Primjena negativnih i pozitivnih kontrola

Općenito u svaki pokus treba uključiti paralelne pozitivne i negativne (nosač) kontrole. Kad postoje prihvatljivi rezultati pozitivne kontrole, dobiveni nedavno obavljenim pokusima u istom laboratoriju, ti se rezultati mogu upotrijebiti umjesto paralelne pozitivne kontrole. Tvari pozitivne kontrole trebale bi se koristiti u odgovarajućoj niskoj dozi (npr. MMS, intraperitonealno pri 10 mg/kilogram), da bi se dokazala osjetljivost ispitivanja.

Visine doza

Obično se koriste tri visine doza. Visoka doza treba dovesti do pojave znakova toksičnosti ili smanjene plodnosti kod tretiranih životinja. U nekim slučajevima može biti dovoljna samo jedna razina doziranja.

Granični test

Netoksične tvari treba ispitati pri koncentraciji od 5 g/kilogram nakon jednog doziranja ili pri koncentraciji od 1 g/kilogram/dan nakon ponovljenog doziranja.

Postupak

Postoji više vremenskih režima tretiranja. Najčešće se primjenjuje jednokratno doziranje ispitivane tvari. Moguća je i primjena ostalih vremenskih režima. Svaki se mužjak u odgovarajućim vremenskim razmacima po tretiranju uzastopno pari s jednom ili dvije netretirane ženke koje se prethodno nisu parile. Ženke treba ostaviti s mužjacima barem tijekom jednog estrusnog ciklusa ili dok ne dođe do parenja, što se utvrđuje na temelju prisutnosti sperme u vagini ili na temelju prisutnosti vaginalnog čepa. Broj parenja nakon tretiranja ovisi o režimu tretiranja i trebao bi biti dovoljan da se uzmu uzorci zametnih stanica u svim stadijima staničnog ciklusa koji slijede iza tretiranja. U drugoj polovini gravidnosti ženke se usmrćuju i pregledava se sadržaj maternice kako bi se utvrdio broj mrtvih i živih implanata. Mogu se pregledati jajnici kako bi se utvrdio broj žutih tijela.

2. PODACI Podatke treba prikazati u obliku tablice iz koje se može vidjeti broj mužjaka, broj gravidnih ženki i broj negravidnih ženki. Rezultate svakog parenja, uključujući identifikacijsku oznaku svakog mužjaka i ženke, treba bilježiti pojedinačno. Za svaku ženku treba zabilježiti tjedan u kojemu je došlo do parenja, visinu doze koju su primili mužjaci, kao i učestalost pojave živih i mrtvih implanata. Izračun ukupnog učinka dominantnih letalnih gena temelji se na usporedbi živih implanata po ženki u tretiranoj skupini sa živim implantima po ženki u kontrolnoj skupini. Analizira se omjer mrtvih i živih implanata iz tretirane skupine u usporedbi s istim omjerom u kontrolnoj skupini kako bi se utvrdio postimplantacijski gubitak. Ako se zabilježeni podaci odnose na slučajeve rane i kasne smrti, iz tablica to treba biti jasno vidljivo. Ako su procijenjeni gubici prije implantacije, treba ih zabilježiti. Predimplantacijski gubitak može se izračunati kao razlika između broja žutih tijela i broja implanata, ili kao smanjenje prosječnog broja implanata po maternici u usporedbi s brojem implanata dobivenih parenjima u kontrolnoj skupini. Podaci se ocjenjuju uz primjenu odgovarajućih statističkih metoda.

upotrijebljeni soj, starost i tjelesna masa upotrijebljenih životinja, broj životinja svakog spola u pokusnim i kontrolnim skupinama,

ispitivana tvar, nosač, ispitivane visine doza i obrazloženje za njihov odabir, negativne i pozitivne kontrole, podaci o toksičnosti,

put primjene i vremenski režim tretiranja,

vremenski režim parenja,

metoda korištena da bi se utvrdilo da je došlo do parenja,

vrijeme usmrćivanja,

kriteriji za utvrđivanje dominantnih letalnih gena

odnos doze i reakcije, ako je primjereno,

statistička ocjena,

3232 more provisions are not shown here; each has its own address.

Versions

2008-05-30