Regolamento (CE) N. 440/2008 della Commissione del 30 maggio 2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH) (Testo rilevante ai fini del SEE)

In vigoreVersione 2008-05-30dal 2008-06-01

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Indice

Preambolo
1. Articolo 1
2. Articolo 2
3. Articolo 3
4. Articolo 4
ANNEX
ALLEGATO PARTE A: METODI PER LA DETERMINAZIONE DELLE PROPRIETÀ FISICO-CHIMICHE
A.1.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.4.
1.5. TABELLA: APPLICABILITÀ DEI METODI A. B. C. D.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
1.6.1.2. Apparecchiatura:
1.6.2.
1.6.4.
4.(1)(2)(3)(4)
A.2.
1.
1.4.
1.5. Tabella 1 Confronto dei metodi
1.6.
1.6.4.
1.6.6.
2. Tabella 2 Coefficienti di correzione della temperatura fT
A.3.
1.
1.4.
1.4.1.
3. Tabella 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Applicabilità dei metodi
3. Tabella 1.4.1.1.1.4.1.2. Applicabilità dei metodi a)
3. Tabella 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Applicabilità dei metodi a)
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
A.4.
1.
1.4.
1.5. Tabella 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Criteri di qualità
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.4.
1.6.4.2.
1.6.5.
1.6.6.
1.6.6.1. Gas inerte:
1.6.6.2. Preparazione della colonna di saturazione:
a)
b)
1.6.7.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
A.5.
1.
1.6.
1.6.4.
1.6.4.1.
1.6.4.1.3. Figura Elemento di misura
1.6.4.2.
1.6.4.2.2. Montaggio:
a)
b)
2. Tabella Correzione dei valori sperimentali della tensione superficiale Valida soltanto per soluzioni acquose con p = 1 g/cm3
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.6.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Procedimento di determinazione
1.6.3.3. Apparecchiatura
1.6.3.4. Apparecchiatura (si vedano le figure 3 e 4):
1.6.4.
2.
3.
A.8.
1.
1.3. Metodo del dibattimento in pallone
1.4.
1.5.
1.5.1. Metodo del dibattimento in pallone
1.5.2. Metodo del dibattimento in pallone
1.5.3. Metodo del dibattimento in pallone
1.6.
1.6.2.
1.6.2.1.
1.6.2.3.
1.6.3.
1.6.3.1. Apparecchiatura
1.6.3.2. Calcolo del tempo morto to
2. Metodo del dibattimento in pallone
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
A.9.
1.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Apparecchio di Abel:
A.10.
1.
1.6.
1.6.2.
3.
A.11.
1.
1.6.
A.12.
1.
1.3.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
A.13.
1.
1.6.
1.6.2. a)
2.
A.14.
1.
1.1. a)
1.4.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2. a)
1.6.3.
1.6.3.2. a)
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.15.
1.
1.6.
A.16.
1.
1.6.
1.6.1.
4.(1)
Figura 1 Sviluppo di un cubo di prova da 20 mm
Figura 2 Curva tipica temperatura/tempo
A.17.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
3.
3.2. a)
A.18.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.19.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.20.
1.
1.5.
1.5.4.
2.
3.
3.1.
A.21.
1.
1.6
1.6.1
1.6.1.2
2.
2.1 Tabella 1 Esempi di risultati
3.
3.2 a)
4.(1)
Figura 1 Recipiente a pressione
Figura 2 Base d'appoggio
Figura 3 Sistema di accensione
1.
2.
4.
1.2. Per sostanze solide
Appendice 1 Metodo di stima
INTRODUZIONE
METODO DI STIMA
PROCEDURA DI CALCOLO
RELAZIONE
BIBLIOGRAFIA
Appendice 2
Figura 1 Apparecchio per la determinazione della curva di tensione di vapore mediante il metodo dinamico
Figura 2a Apparecchio per la determinazione della curva della tensione di vapore secondo il metodo statico (con l'uso di un manometro con tubo ad U)
Figura 2b Apparecchio per la determinazione della curva della tensione di vapore secondo il metodo statico (con l'uso di un indicatore di pressione)
Figura 3 Isoteniscopio (rif. bibl. 7)
Figura 4 Apparecchio per la determinazione della curva della tensione di vapore secondo il metodo della bilancia a tensione di vapore
Figura 5 Esempio di apparecchio per l'evaporazione a bassa pressione mediante il metodo di effusione, con una cella di effusione del volume di 8 cm3
Figura 6a Esempio di sistema di flusso per la determinazione della tensione di vapore mediante il metodo della saturazione gassosa
Figura 6b Esempio di sistema per la determinazione della tensione di vapore mediante il metodo della saturazione di gas, con un capillare disposto a valle della camera di saturazione
Figura 7 Esempio della disposizione sperimentale per il metodo del rotore
Figura 8 Esempio di testina di misurazione a rotore
Figura 1 Metodo dell'eluizione su colonna con pompa di circolazione
Figura 2 Microcolonna tipica
Figura 3 Microcolonna tipica
Figura 4 Metodo dell'eluizione su colonna con recipiente di livellamento
Stima preliminare del coefficiente di ripartizione
METODI DI CALCOLO
Principio dei metodi di calcolo
Criteri di qualità
Procedure di calcolo Metodo del π di Hansch
Osservazioni i)
Relazione
Figura Stampo e accessori per la preparazione del campione
Figura Apparecchiatura
Esempi di specifiche dei materiali per la prova di sensibilità termica (vedi DIN 1623) (1)(2)(3)
Figura 1 Apparecchio per la prova della sensibilità termica
Figura 2 Prova di sensibilità termica
Figura 3 Taratura della velocità di riscaldamento per la prova di sensibilità termica
Figura 4 Apparecchio per le prove d'urto
Figura 5 Apparecchio per la sensibilità all'attrito
Allegato Esempi di altri metodi per la determinazione del peso molecolare medio numerico (MN) di polimeri
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
Allegato Indicazioni per la correzione del contenuto di specie di basso peso molecolare in funzione della presenza di polimero insolubile
PARTE B METODI PER LA DETERMINAZIONE DELLA TOSSICITÀ E DEGLI ALTRI EFFETTI SULLA SALUTE
INTRODUZIONE GENERALE A.
B.1. bis.
1.
1.4.
1.5.
1.5.3.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
B.1ter.
1.
1.4
1.5
1.6
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
B.2.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
3.1.
B.3.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. Valutazione della tossicità nell'altro sesso
3.
B.4.
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
Tabella I Eritema e formazione di escara Formazione di edema CLASSIFICAZIONE DELLE REAZIONI CUTANEE
B.5.
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.2.3
1.4.2.7
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
Tabella I CLASSIFICAZIONE DELLE LESIONI OCULARI
Cornea
Iride
Congiuntive
Chemosi
B.6
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.2.
1.5.1.3.
1.5.2.
1.5.2.2.
1.5.2.3.
3. Relazione sul saggio (GPMT E SAGGIO DI BUEHLER)
B.7
1.
1.4.
1.4.2.
1.4.3.
3.
B.8.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
3.1.
pt_2 a)
B.9.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. i)
3.
B.10.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. RELAZIONE SUL SAGGIO
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
B.11.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
B.12.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
1.5.2.
2.
3. RELAZIONE SUL SAGGIO
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
B.13/14.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
2.
3. RELAZIONE SUL SAGGIO
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
B.15
1.
1.6. Preparati
Attivazione metabolica
Ceppi
Terreni di coltura
Uso di controlli negativi e positivi
Concentrazioni
Condizioni di incubazione
Frequenze delle mutazioni spontanee
Numero delle repliche
3.
B.16
1.
1.6. Preparazioni
Attivazione metabolica
Ceppi
Terreni di coltura
Uso di controlli negativi e positivi
Concentrazioni
Condizióni di incubazione
Frequenze della ricombinazione mitotica spontanea
Numero delle repliche
3.
B.17.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. RELAZIONE SUL SAGGIO
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
B.18
1.
1.6. Preparazioni
Numero di colture
Uso di controlli negativi e positivi
Concentrazioni
Cellule
Attivazione metabolica
Preparazione delle colture
Trattamento delle colture con la sostanza in esame Epatociti primari di ratto
Determinazioni autoradiografiche
Determinazioni LSC
2.
3.
B.19
1.
1.6. Condizioni sperimentali
Numero di colture
Uso di controlli positivi e negativi
Concentrazioni
Preparazione delle colture
Trattamento
Raccolta delle cellule
Preparazione e colorazione dei cromosomi
Analisi
3.
B.20
1.
1.6. Preparazioni
Ceppi
Sostanza in esame
Numero di animali
Vie di somministrazione
Uso di controlli negativi e positivi
Concentrazioni
3.
B.21
1.
1.6. Preparazioni
Cellule
Terreni di coltura
Sostanza in esame
Attivazione metabolica
Uso di controlli positivi e negativi
Concentrazioni
3.
B.22
1.
1.6. Preparazioni
Vie di somministrazione
Animali da esperimento
Numero e sesso
Uso di controlli negativi e positivi
Livelli delle dosi
Saggio del limite

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità europea,

visto il regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 18 dicembre 2006, concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), che istituisce un'Agenzia europea per le sostanze chimiche, che modifica la direttiva 1999/45/CE e abroga il regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 1488/94 della Commissione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Consiglio e le direttive della Commissione 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE e, in particolare, l'articolo 13, paragrafo 3, del medesimo,

considerando quanto segue:

(1) A norma del regolamento (CE) n. 1907/2006, ai fini dello svolgimento di test sulle sostanze occorre adottare metodi di prova a livello comunitario qualora tali test siano finalizzati ad acquisire informazioni sulle proprietà intrinseche delle sostanze.

(2) La direttiva 67/548/CEE del Consiglio, del 27 giugno 1967, concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari e amministrative relative alla classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura delle sostanze pericolose istituiva, all'allegato V, i metodi per determinare le proprietà fisico-chimiche, la tossicità e l'ecotossicità delle sostanze e dei preparati. L'allegato V della direttiva 67/548/CEE è stato soppresso dalla direttiva 2006/121/CE del Parlamento europeo e del Consiglio a decorrere dal 1o giugno 2008.

(3) I metodi di prova contenuti nell'allegato V della direttiva 67/548/CEE devono essere integrati nel presente regolamento.

(4) Questo regolamento non esclude l'uso di altri metodi di prova, a condizione che il loro uso sia conforme all'articolo 13, paragrafo 3, del regolamento (CE) n. 1907/2006.

(5) Nella concezione dei metodi di prova occorre tener conto dei principi finalizzati a rimpiazzare, ridurre e raffinare le tecniche per l'uso degli animali nelle procedure, in particolare quando diventano disponibili opportuni metodi convalidati per sostituire, ridurre o raffinare la sperimentazione sugli animali.

(6) Le disposizioni di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato istituito dall'articolo 133 del regolamento (CE) n. 1907/2006,

HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:

Articolo 1

I metodi di prova applicabili ai fini del regolamento (CE) n. 1907/2006 sono definiti nell'allegato al presente regolamento.

Articolo 2

La Commissione riesamina, ove opportuno, i metodi di prova contenuti nel presente regolamento al fine di sostituire, ridurre o raffinare i test sugli animali vertebrati.

Articolo 3

I riferimenti all'allegato V della direttiva 67/548/CEE si intendono fatti al presente regolamento.

Articolo 4

Il presente regolamento entra in vigore il giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell'Unione europea.

Esso si applica a decorrere dal 1o giugno 2008. Fatto a Bruxelles, il 30 maggio 2008. Per la Commissione Stavros Dimas Membro della Commissione

ANNEX

ALLEGATO PARTE A: METODI PER LA DETERMINAZIONE DELLE PROPRIETÀ FISICO-CHIMICHE

A.1. TEMPERATURA DI FUSIONE/CONGELAMENTO

A.1.

1. METODO La maggior parte dei metodi descritti si basano sulle linee direttrici OCSE (1). I principi fondamentali sono riportati nei riferimenti (2) e (3).

1.

1.1. INTRODUZIONE I metodi e le apparecchiature qui illustrati si applicano alla determinazione della temperatura di fusione di sostanze senza alcuna limitazione rispetto al loro grado di purezza. La scelta del metodo più idoneo dipende dalla natura delle sostanze in esame. Di conseguenza, il fattore limitante sarà inerente ai fatto che la sostanza sia facilmente, difficilmente o per nulla polverizzabile. Per alcune sostanze, la determinazione della temperatura di congelamento o di solidificazione risulta più appropriata e pertanto in questo metodo sono state incluse anche le norme per queste determinazioni. Dove, a motivo delle particolari proprietà della sostanza, non sia possibile misurare in modo adatto alcuni dei parametri suddetti, può essere appropriato un punto di scorrimento.

1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ La temperatura di fusione è definita come la temperatura alla quale si verifica la transizione di fase dallo stato solido allo stato liquido a pressione atmosferica, e questa temperatura nel caso ideale corrisponde alla temperatura di congelamento. Poiché per molte sostanze la transizione di fase si verifica in un intervallo di temperatura ampio, questo viene spesso descritto come intervallo di fusione. Conversione delle unità (da K a oC): t = T - 273,15 t temperatura Celsius, gradi Celsius ( oC) T temperatura termodinamica, kelvin (K)

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Non è necessario utilizzare sostanze di riferimento ogni volta che si esamina una nuova sostanza. Esse devono principalmente venire impiegate per controllare periodicamente i risultati ottenuti col metodo e per permettere confronti con i risultati ottenuti con altri metodi. Alcune sostanze di riferimento sono elencate nel riferimento bibliografico (4).

1.4. PRINCIPIO DEL METODO Si determina la temperatura (o l’intervallo di temperatura) della transizione di fase dallo stato solido allo stato liquido o dallo stato liquido allo stato solido. In pratica si determina la temperatura di fusione/congelamento incipiente e di fusione/congelamento finale curante il riscaldamento/raffreddamento di un campione della sostanza in esame a pressione atmosferica. Sona descritti 5 metodi, e precisamente il metodo del capillare, il metodo degli elementi riscaldanti, la determinazione del punto di congelamento, i metodi di analisi termica e la determinazione del punto di scorrimento (come è stata sviluppata per gli olii di origine petrolifera). In alcuni casi, può essere conveniente misurare la temperatura di congelamento invece della temperatura di fusione.

1.4.

1.4.1. Metodo del capillare

1.4.1.

1.4.1.1. Apparecchi per la determinazione del punto di fusione tramite bagno liquido Una piccola quantità della sostanza finemente macinata viene introdotta in un tubo capillare e compattata fortemente. Il tubo viene riscaldato, insieme ad un termometro, e l'aumento di temperatura viene regolato in modo che sia inferiore a circa 1 K/min durante la fusione propriamente detta. Si determinano quindi le temperature iniziale e finale di fusione.

1.4.1.2. Apparecchi per la determinazione del punto di fusione a blocco metallico Si procede come indicato al punto 1.4.1.1, salvo il fatto che i tubo capillare ed il termometro sono collocati in un blocco di metallo riscaldante, attraverso alcuni fori del quale è possibile la loro osservazione.

1.4.1.3. Determinazione tramite fotocellula Il campione contenuto nel tubo capillare viene riscaldato automaticamente in un cilindro metallico. Attraverso un foro praticato nel cilindro un raggio luminoso viene convogliato sulla sostanza e raggiunge poi una fotocellula accuratamente tarata. Per la maggior parte delle sostanze le proprietà ottiche si modificano durante la fusione, passando dall'opacità alla trasparenza. L'intensità della luce che raggiunge la fotocellula aumenta fino ad inviare un segnale di arresto all'indicatore numerico di un termometro a resistenza di platino collocato nella camera di riscaldamento. Questo metodo non è adatto per alcune sostanze fortemente colorate.

1.4.2. Elementi riscaldanti

1.4.2.

1.4.2.1. Banco riscaldante di Kofler Il banco riscaldante di Kofler fa uso di due corpi metallici di diversa conducibilità termica, riscaldati elettricamente; la sbarra è progettata in modo tale che per tutta la sua lunghezza il gradiente di temperatura è virtualmente costante. La temperatura dell'elemento riscaldante può variare da 283 K a 573 K; essa viene letta su un apposito strumento costituito da un cursore provvisto di indice e di linguetta specificamente realizzati per ogni banco. Per determinare una temperatura di fusione, la sostanza viene distribuita in uno strato sottile direttamente sulla superficie dell'elemento riscaldante. In pochi secondi appare una linea di separazione netta tra la fase solida e quella liquida. La temperatura corrispondente a questa linea di separazione viene letta facendovi coincidere l'indice dello strumento.

1.4.2.2. Microscopio di fusione Numerosi sono gli elementi riscaldanti forniti di microscopio utilizzati per la determinazione del punto di fusione con quantità molto piccole di materiale. Nella maggioranza di questi strumenti, la temperatura viene determinata mediante una termocoppia sensibile, ma talvolta si usano anche termometri a mercurio. La versione tipica di un apparecchio per la determinazione del punto di fusione ad elemento riscaldante con microscopio è dotata di una camera di riscaldamento contenerne una piastra metallica sopra la quale si pone il campione, distribuito su un vetrino. Al centro della piastra metallica si trova un foro che permette il passaggio della luce proveniente dallo specchio di illuminazione del microscopio. Durante la misura la camera viene chiusa da una piastra di vetro in modo da escludere l'aria dalla zona del campione. Il riscaldamento del campione è regolato da un reostato. Per misure di grande precisione e nel caso di sostanze otticamente anisotrope, si può utilizzare luce polarizzata.

1.4.2.3. Metodo del menisco Questo metodo è specifico per le poliammidi. Si determina visivamente la temperatura alla quale si verifica lo spostamento di un menisco di olio siliconico compreso tra un elemento riscaldante e un copri-oggetti sostenuto dal campione di poliammide in esame.

1.4.3 Metodo per determinare la temperatura di congelamento Il campione viene posto in una provetta speciale e inserito in un apparecchio per la determinazione della temperatura di congelamento. Il campione viene agitato con delicatezza e continuità durante il raffreddamentoe la temperatura viene misurata ad intervalli adatti. Non appena la temperatura si mantiene costante per qualche lettura, si registra tale temperatura (corretta per l'errore termometrico) come temperatura di congelamento. Si deve evitare un sovraraffreddamento mantenendo l'equilibrio tra le fasi solida e liquida.

1.4.4. Analisi termica

1.4.4.

1.4.4.1. Analisi termica differenziale (ATD) Questa tecnica registra la differenza di temperatura tra la sostanza e un materiale di riferimento in funzione della temperatura stessa mentre la sostanza e il materiale di riferimento sono sottoposti allo stesso programma controllato di temperatura. Quando il campione subisce una transizione che implica una variazione di entalpia, tale variazione è indicata da una deviazione endotermica (fusione) o esotermica (congelamento) dalla linea di base del tracciato della temperatura.

1.4.4.2. Calorimetria differenziale a scansione (CDS) Questa tecnica registra la differenza tra l'energia introdotta in una sostanza e quella introdotta in un materiale di riferimento, in funzione della temperatura, mentre la sostanza e il materiale di riferimento sono sottoposti allo stesso programma controllato di temperatura. Questa energia è l'energia necessaria per mantenere nulla la differenza di temperatura tra la sostanza e il materiale di riferimento. Quando il campione subisce una transizione che implica una variazione di entalpia, tale variazione è indicata da una deviazione endotermica (fusione) o esotermica (congelamento) dalla linea di base del tracciato del flusso termico.

1.4.5. Punto di scorrimento Questo metodo è stato sviluppato per l'uso con gli olii di origine petrolifera ed è adatto per l'uso con sostanze oleose aventi una bassa temperatura di fusione. Dopo un riscaldamento preliminare, il campione viene raffreddato ad una velocità specifica mentre, ad intervalli di 3 K, se ne esaminano le caratteristiche di scorrimento. La temperatura più bassa alla quale si osserva un movimento della sostanza viene registrata come punto di scorrimento.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ L'applicabilità e l'accuratezza dei vari metodi impiegati per la determinazione della temperatura di fusione/intervallo di fusione sono indicate nella seguente tabella.

1.5. TABELLA: APPLICABILITÀ DEI METODI A. B. C. D.

Metodi con impiego di capillare Metodo di misura Sostanze polverizzabili Sostanze difficilmente polverizzabili Intervallo di temperatura Accuratezza stimata Norme esistenti Apparecchi per il punto di fusione a bagno liquido Sì Soltanto per alcune Da 273 a 573 K ±0,3 K JIS K 0064 Apparecchi per il punto di fusione con blocco metallico Sì Soltanto per alcune Da 293 a > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Determinazione con fotocellula Sì Svariate, con uso di accessori Da 253 a 573 K ±0,5 K Metodi con impiego di elementi riscaldanti e metodi di congelamento Metodo di misura Sostanze polverizzabili Sostanze difficilmente polverizzabili Intervallo di temperatura Accuratezza stimata Norme esistenti Banco riscaldante di Kofler Sì No Da 283 a > 573 K ±1,0 K ANSI/ASTM D 345176 Microscopio di fusione Sì Soltanto per alcune Da 273 a > 573 K ±0,5 K DIN 53736 Metodo del menisco No Specifico per le poliammidi Da 293 a > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Metodo del punto di congelamento Sì Sì Da 223 a 573 K ±0,5 K per esempio BS 4695 Analisi termica Metodo di misura Sostanze polverizzabili Sostarne difficilmente polverizzabili Intervallo di temperatura Accuratezza stimata Norme esistenti Analisi termica differenziale Sì Sì Da 173 a 1273 K Fino a 600 K ±0,5 K Fino a 1273 K ±2,0 K ASTM E 53776 Calorimetria differenziate a scansione Sì Sì Da 173 a 1273 K Fino a 600 K ±0,5 K Fino a 1273 K ±2,0 K ASTM E 53776 Punto di scorrimento Metodo di misura Sostanze polverizzabili Sostanze difficilmente polverizzabili Intervallo di temperatura Accuratezza stimata Norme esistenti Punto di scorrimento Per olii di origine petrolifera e sostanze oleose Per olii di origine petrolifera e sostanze oleose Da 223 a 323 K ±0,3 K ASTM D 9766

1.6. DESCRIZIONE DEI METODI Le procedure relative a quasi tutti i metodi di determinazione sono state descritte in varie norme internazionali nazionali (vedi appendice 1).

1.6.

1.6.1. Metodi con tubo capillare Quando vengono sottoposte ad un lento aumento di temperatura, sostanze finemente polverizzate mostrano solitamente gli stadi di fusione mostrati in figura 1.

1.6.1.

figura 1. Stadio A Stadio B Stadio C Stadio D Stadio E Stadio A (inizio della fusione): minuscole goccioline aderiscono uniformemente alla parete interna del capillare; Stadio B in seguito alla contrazione del fuso, va evidenziandosi uno spazio libero tra il campione e la parete interna; Stadio C dopo essersi contratto, il campione inizia a scivolare in basso ed a liquefarsi; Stadio D si ha la formazione di un menisco completo alla superficie, ma una quantità apprezzabile del campione rimane solida; Stadio E (stadio finale della fusione): non restano più particelle solide. Durante la determinazione della temperatura di fusione viene registrata la temperatura all'inizio delia fusione e nello stadio finale.

1.6.1.1. Apparecchi per il punto di fusione a bagno liquido La figura 2 presenta un tipo di apparecchio normalizzato, realizzato in vetro, per la temperatura di fusione (JIS K0064): tutte le quote sono date in mm.

1.6.1.1.

Figura 2 A: Recipiente di misura B: Tappo di sughero C: Sfogo D: Termometro E: Termometro ausiliario F: Bagno liquido G: Tubo capillare in vetro: lunghezza da 80 a 10 mm ; diametro interno 1 ± 0,2 mm ; spessore da 0,2 a 0,3 mm H: Tubo laterale

Bagno liquido:

Si deve scegliere un liquido adatto. La scelta del liquido dipende dalla temperatura di fusione da determinare, per esempio paraffina liquida per temperature di fusione non superiori a 473 K, olio di silicone per temperature di fusione non maggiori di 573 K. Per temperature di fusione superiori a 523 K, si può usare una miscela costituita da 3 parti di acido solforico e 2 parti di solfato di potassio (rapporto in peso). Se si usa una miscela di questo tipo occorre prendere opportune precauzioni.

Termometro:

Vanno impiegati soltanto termometri che soddisfano le prescrizioni delle norme ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001, o di norme equivalenti. ASTM E 1671, DIN 12770, JIS K 8001.

Modalità operative:

La sostanza secca va polverizzata finemente in un mortaio e posta in un tubo capillare, chiuso per fusione ad una estremità, in modo che, dopo assestamento nella maniera più compatta possibile, l'altezza del riempimento sia di 3 mm circa. Per ottenere un assestamento uniforme del campione, il tubo capillare deve essere lasciato cadere attraverso una canna di vetro su un vetro da orologio da un'altezza di circa 700 mm. Il capillare riempito viene posto nel bagno in modo tale che la parte centrale del bulbo del termometro a mercurio sia in contatto con il tubo capillare nella zona dove è collocato il campione. Il tubo capillare viene di solito introdotto nell'apparecchio a temperatura inferiore di circa 10 K a quella della temperatura di fusione. Il bagno liquido viene riscaldato in modo che l'aumento di temperatura corrisponda a circa 3 K/min. Il liquido va mantenuto sotto agitazione. A circa 10 K al di sotto della temperatura prevista di fusione, la velocità di incremento della temperatura va regolata ad un massimo di 1 K/min.

Calcolo:

La temperatura fusione si calcola con la formula seguente: T = TD + 0,00016 (TD - TE)n dove: T temperatura di fusione corretta, in K, TD temperatura letta sul termometro D, in K, TE temperatura letta sul termometro E, in K, n numero di graduazioni della colonnina di mercurio sul termometro D sulla parte di stelo emergente.

1.6.1.2. Apparecchi per la temperatura di fusione con blocco metallico

1.6.1.2. Apparecchiatura:

La strumentazione consiste in:

un blocco cilindrico di metallo, la cui parte superiore è cava e forma una camera (vedi figura 3);

un tappo metallico provvisto di due o più fori per permettere l'inserimento dei tubi capillari nel blocco metallico;

un sistema di riscaldamento per il blocco metallico realizzato, per esempio, tramite una resistenza elettrica incorporata nel blocco;

un reostato per la regolazione della potenza applicata, se si fa uso del riscaldamento elettrico;

quattro finestre di vetro resistente al calore sulle pareti laterali della camera, disposte diametralmente ad angolo retto l'una rispetto all'altra. Di fronte ad una di esse è montato un oculare per l'osservazione del capillare. Le altre tre finestre vengono usate per illuminare l'interno per mezzo di lampade;

un capillare di vetro resistente al calore chiuso ad una estremità (vedi punto 1.6.1.1).

Termometro :

Vedi norme citate al punto 1.6.1.1. Possono utilizzarsi anche strumenti di misura termoelettrici di analoga accuratezza.

Figura 3 Termometro Capillare Tappo di metallo Oculare Lampada Resistenza elettrica Blocco riscaldante di metallo

1.6.1.3. Determinazione tramite fotocellula Apparecchiatura e modalità operative: La strumentazione consiste in una camera metallica con un sistema automatico di riscaldamento. Si riempiono tre capillari secondo le indicazioni del punto 1.6.1.1 e si pongono nella camera. Per la taratura dell'apparecchio sono disponibili diverse velocità di incremento lineare della temperatura e l'aumento di temperatura opportuno viene regolato elettricamente su una velocità costante e lineare preselezionata. La temperatura effettiva nel forno e la temperatura della sostanza nei tubi capillari sono indicare da registratori.

1.6.2. Elementi riscaldanti

1.6.2.

1.6.2.1. Banco riscaldante di Kofler Vedi appendice.

1.6.2.2. Microscopio di fusione Vedi appendice.

1.6.2.3. Metodo del menisco (per poliammidi) Vedi appendice. La velocità di riscaldamento nella zona di passaggio attraverso la temperatura di fusione deve essere inferiore a 1 K/min.

1.6.3. Metodi per la determinazione della temperatura di congelamento Vedi appendice.

1.6.4. Analisi termica

1.6.4.

1.6.4.1. Analisi termica differenziale Vedi appendice.

1.6.4.2. Calorimetria differenziale a scansione Vedi appendice.

1.6.5. Determinazione del punto di scorrimento Vedi appendice.

2. DATI In alcuni casi si rende necessaria una correzione della lettura termometrica.

3. RELAZIONE La relazione sulla prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni: Come temperatura di fusione viene riportata la media di almeno due misure che cadano nel campo di accuratezza stimata (vedi tabelle). Se la differenza tra la temperatura all'inizio e allo stadio finale della fusione ricade nei limiti di accuratezza del metodo, si prende come punto di fusione la temperatura dello stadio finale della fusione; altrimenti vengono riportate ambedue le temperature. Se la sostanza si decompone o sublima prima del raggiungimento della temperatura di fusione, si riporterà la temperatura alla quale si osserva l'effetto. Devono essere riportate tutte le informazioni e osservazioni utili per l'interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurezze e lo stato fisico della sostanza.

metodo utilizzato;

descrizione precisa della sostanza (identità e impurezze) ed eventuale stadio preliminare di purificazione;

stima dell'accuratezza.

4.(1)(2)(3)(4)

BIBLIOGRAFIA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials, from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol, 48, 505-515.

A.2. TEMPERATURA DI EBOLLIZIONE

A.2.

1. METODO La maggior parte dei metodi descritti sono basati sulle linee direttrici OCSE (1). I principi fondamentali sono riportati nei riferimenti (2) e (3).

1.

1.1. INTRODUZIONE I metodi e le apparecchiature qui illustrati possono essere applicati a sostanze liquide e a bassa temperatura di fusione, purché queste non siano soggette a reazioni chimiche al di sotto della temperatura di ebollizione (per esempio: autoossidazione, trasposizione, degradazione, ecc.). I metodi possono essere applicati a sostanze liquide sia pure che impure. Si dà particolare risalto ai metodi che utilizzano la determinazione tramite fotocellula e l'analisi termica perché questi metodi permettono la determinazione sia della temperatura di fusione che della temperatura di ebollizione. Inoltre, le misure possono essere eseguite in automatico. Il metodo dinamico ha il vantaggio di poter essere applicato anche alla determinazione della tensione di vapore e di non richiedere la correzione della temperatura di ebollizione per riferirla alla pressione normale (101,325 kPa) dal momento che la pressione normale può essere regolata durante la misura mediante un manostato. Osservazioni: L'influenza delle impurezze sulla determinazione della temperatura di ebollizione dipende in notevole misura dalla natura delle impurezze. Quando il campione contiene impurezze volatili che possono alterare i risultati, la sostanza può venire purificata.

1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ La temperatura di ebollizione normale è definita come la temperatura alla quale la tensione di vapore di un liquido è di 101,325 kPa. Se la temperatura di ebollizione non viene misurata alla pressione atmosferica normale, la dipendenza della tensione di vapore dalla temperatura può essere descritta mediante l'equazione di Clausius-Clapeyron: log p = Δ Hv2,3 RT+cost. dove: p tensione di vapore della sostanza in Pascal, Δ Hv calore di evaporazione in J mol-1, R costante universale dei gas = 8,314 J mol-1 K-1, T temperatura termodinamica in K. La temperatura di ebollizione è riferita alla pressione ambiente al momento della misura. Fattori di conversione Pressione (unità: kPa) 100 kPa 1 bar = 0,1 MPa (bar è ancora ammissibile, ma non raccomandato). 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (le unità mm Hg e Torr non sono permesse). 1 atm atmosfera standard = 101325 Pa (l'unità atm non è permessa). Temperatura (unità: K) t = T - 273,15 t temperatura Celsius, gradi Celsius ( oC) T temperatura termodinamica, Kelvin (K)

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Non è necessario utilizzare sostanze di riferimento in tutti i casi in cui si esamina una nuova sostanza. Esse servono principalmente per controllare periodicamente l'accuratezza del metodo e per permettere un confronto coi risultati ottenuti con altri metodi. Alcune sostanze di riferimento sono elencate nei metodi riportati in appendice.

1.4. PRINCIPIO DEI METODI Cinque metodi per la determinazione della temperatura di ebollizione (intervallo di ebollizione) sono basati sulla misura della temperatura di ebollizione, altri due sono basati sull'analisi termica.

1.4.

1.4.1. Determinazione tramite ebulliometro Gli ebulliometri sono stati originariamente concepiti per la determinazione del peso molecolare tramite l'innalzamento della temperatura di ebollizione, ma si prestano anche per accurate misure della temperatura di ebollizione. Una apparecchiatura molto semplice è descritta nella norma ASTM D 1120-72 (vedi appendice). Con questo strumento il liquido viene riscaldato fino all'ebollizione in condizioni di equilibrio a pressione atmosferica.

1.4.2. Metodo dinamico Questo metodo implica la misura della temperatura di ricondensazione del vapore mediante un appropriato termometro nella zona di riflusso durante l'ebollizione. Questo metodo permette di variare la pressione.

1.4.3. Metodo della distillazione per la temperatura di ebollizione Il metodo si basa sulla distillazione del liquido e sulla misura della temperatura di ricondensazione del vapore con determinazione della quantità di distillato.

1.4.4. Metodo di Siwoloboff Il campione viene riscaldato in una provetta immersa a sua volta nel liquido di un bagno riscaldante. Nella provetta contenente il campione viene introdotto un capillare, chiuso per fusione ad un estremo e contenente una bollicina d'aria nella parte inferiore.

1.4.5. Determinazione tramite fotocellula Si impiega il metodo Siwoloboff, applicando tuttavia la misura fotoelettrica della fase di emissione delle bollicine.

1.4.6. Analisi termica differenziale Questa tecnica registra la differenza di temperatura tra la sostanza e un materiale di riferimento, in funzione della temperatura, mentre la sostanza e il materiale di riferimento sono sottoposti allo stesso programma controllato di variazione della temperatura. Quando il campione subisce una transizione che implica una variazione di entalpia, tale variazione è indicata da un allontanamento endotermico (ebollizione) dalla linea di base nella registrazione della temperatura.

1.4.7. Calorimetria differenziale a scansione Questa tecnica registra la differenza di energia introdotta in una sostanza e in un materiale di riferimento in funzione della temperatura mentre la sostanza e il materiale di riferimento vengono sottoposti allo stesso programma controllato di variazione della temperatura. Questa energia è l'energia necessaria per mantenere a zero la differenza di temperatura tra la sostanza e il materiale di riferimento. Quando il campione subisce una transizione che implica una variazione di entalpia, tale variazione è indicata da un allontanamento endotermico (ebollizione) dalla linea di base della registrazione del flusso di calore.

1.5. Tabella 1 Confronto dei metodi

CRITERI DI QUALITÀ La tabella 1 riporta l'applicabilità e l'accuratezza dei vari metodi utilizzati per la determinazione della temperatura di ebollizione/intervallo di ebollizione. Metodo di misura Accuratezza stimata Norme esistenti Ebulliometro ±1,4 K (fino a 373 K) ±2,5 K (fino a 600 K) ASTM D 1120-72 Metodo dinamico ±0,5 K (fino a 600 K) Processo di distillazione (intervallo di ebollizione) ±0,5 k (fino a 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Metodo di Siwoloboff ± 2 K (fino a 600 K) Rivelazione mediante fotocellula ±0,3 K (a 373 K) Analisi termica differenziale ±0,5 K (fino a 600 K) ±2,0 K (fino a 1273 K) ASTM E 537-76 Calorimetria differenziale a scansione ±0,5 K (fino a 600 K) ±2,0 K (fino a 1273 K) ASTM E 537-76

1.6. DESCRIZIONE DEI METODI I procedimenti relativi ad alcuni dei metodi citati sono descritti in varie norme internazionali e nazionali (vedi appendice).

1.6.

1.6.1. Ebulliometro Vedi appendice.

1.6.2. Metodo dinamico Vedi metodo A.4. per la determinazione della tensione di vapore. Si assume come temperatura di ebollizione quella misurata in corrispondenza di una pressione di 101,325 kPa.

1.6.3. Metodo della distillazione (intervallo di ebollizione) Vedi appendice.

1.6.4. Metodo di Siwoloboff Il campione viene riscaldato in una apparecchiatura per il punto di fusione in una provetta di diametro approssimato di 5 mm (figura 1). La figura 1 presenta un tipo di apparecchiatura standardizzata per la determinazione della temperatura di fusione e di ebollizione (JIS K 0064) (realizzata in vetro; tutte le quote sono in mm). Nella provetta viene posto un tubo capillare (capillare di ebollizione) fuso a circa 1 cm dall'estremità inferiore. Il livello di riempimento della sostanza in esame deve essere tale che la parte fusa del capillare si trovi al di sotto della superficie del liquido. La provetta contenente il capillare di ebollizione può essere assicurata al termometro con un elastico oppure fissata tramite un sostegno laterale (vedi figura 2). Figura 2 Principio secondo Siwoloboff Figura 3 Principio modificato Il liquido per il bagno va scelto in funzione della temperatura di ebollizione. Per temperature fino a 573 K si può impiegare olio di silicone. La paraffina liquida può essere impiegata solo fino a 473 K. Il riscaldamento del bagno liquido deve essere regolato in modo che l'incremento di temperatura sia inizialmente di circa 3 K/min. Il liquido del bagno va tenuto in agitazione. A circa 10 K al di sotto della temperatura di ebollizione prevista, il riscaldamento va diminuito in maniera da ridurre la velocità di aumento della temperatura a meno di 1 K/min. In prossimità della temperatura di ebollizione, dal capillare in ebollizione incominciano a emergere rapidamente delle bollicine. La temperatura di ebollizione è la temperatura alla quale, per raffreddamento temporaneo, la serie di bollicine s'arresta e il fluido inizia improvvisamente a risalire nel capillare. La corrispondente lettura termometrica rappresenta la temperatura di ebollizione della sostanza. Secondo il principio modificato (vedi figura 3) la temperatura di ebollizione viene determinata in un capillare per la temperatura di fusione. Questo viene sfinato per circa 2 cm (a) e con esso si aspira una piccola quantità del campione. L'estremità aperta della parte sfinata viene chiusa alla fiamma in modo da far restare una bollicina d'aria in vicinanza della punta. Durante il riscaldamento nell'apparecchio per la temperatura di fusione (b) la bolla d'aria si dilata. La temperatura di ebollizione corrisponde alla temperatura alla quale il menisco superiore della sostanza raggiunge il livello della superficie del bagno liquido (c).

1.6.4.

Figura 1 A: Recipiente di misura B: Tappo C: Sfogo D: Termometro E: Termometro ausiliario F: Bagno liquido G: Provetta contenente il campione: diametro esterno massimo 5 mm; contenente un tubo capillare di lunghezza di 100 mm circa, diametro interno di 1 mm circa e con spessore della parete da 0,2 a 0,3 mm H: Tubo laterale

1.6.5. Determinazione tramite fotocellula Il campione viene riscaldato in un tubicino capillare all'interno di un blocco metallico riscaldante. Tramite opportune aperture sul blocco, un raggio di luce viene fatto passare attraverso la sostanza e colpisce una fotocellula accuratamente tarata. Durante l'aumento della temperatura del campione, dal capillare di ebollizione emergono bollicine d'aria isolate. Quando viene raggiunta la temperatura di ebollizione, il numero di bollicine aumenta enormemente. Ciò fa variare l'intensità della luce misurata dalla fotocellula, inviando un segnale di arresto all'indice di un termometro a resistenza di platino collocato nel blocco. Questo metodo risulta particolarmente vantaggioso poiché permette determinazioni al di sotto della temperatura ambiente fino a 253,15 K (- 20 oC) senza modifiche dell'apparecchiatura. È semplicemente necessario porre lo strumento in un bagno di raffreddamento.

1.6.6. Analisi termica

1.6.6.

1.6.6.1. Analisi termica differenziale Vedi appendice

1.6.6.2. Calorimetria differenziale a scansione Vedi appendice

2. Tabella 2 Coefficienti di correzione della temperatura fT

DATI Per piccole deviazioni dalla pressione normale (max. ± 5 kPa), le temperature di ebollizione vengono normalizzate a Tn mediante la seguente equazione numerica di Sidney-Young: Tn = T + (fT × Δ p) dove: Δ p (101,325 — p) [notare il segno], p valore misurato della pressione, in kPa, fT coefficiente di correzione della temperatura di ebollizione con la pressione, in K/kPa, T valore misurato della temperatura, in K, Tn temperatura di ebollizione corretta a pressione normale, in K. Per molte sostanze i coefficienti di correzione della temperatura fT e le equazioni per il calcolo approssimativo sono indicati nelle norme internazionali e nazionali prima citate. A titolo di esempio, il metodo DIN 53171 cita i seguenti coefficienti approssimativi per i solventi contenuti nelle vernici: Temperatura T in K Coefficiente di correzione fT (K/kPa 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47

3. RELAZIONE La relazione sulla prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni: Come temperatura di ebollizione viene riportata la media di almeno due misure che ricadano nel campo dell'accuratezza stimata (vedi tabella 1). Devono essere riportate le temperature di ebollizione misurate e la loro media, e le pressioni alle quali sono state effettuate le misure devono essere riportate in kPa. La pressione deve preferibilmente essere prossima alla normale pressione atmosferica. Vanno fornite tutte le informazioni e osservazioni utili per l'interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurezze e lo stato fisico della sostanza.

metodo usato;

descrizione precisa della sostanza (identità e impurezze) e dell'eventuale stadio preliminare di purificazione;

una stima dell'accuratezza.

4.(1)(2)(3) BIBLIOGRAFIA OCDE, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.

A.3. DENSITÀ RELATIVA

A.3.

1. METODO I metodi descritti si basano sulle linee direttrici (OCSE) (1). I principi fondamentali sono riportati nel riferimento (2).

1.

1.1. INTRODUZIONE I metodi qui illustrati si applicano alle sostanze solide e liquide senza alcuna limitazione rispetto al loro grado di purezza. I vari metodi da utilizzare sono elencati nella tabella 1.

1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ La densità relativa, D204, di solidi o liquidi è il rapporto tra la massa di un determinato volume della sostanza in esame, misurata a 20 oC, e la massa di un ugual volume di acqua, misurata a 4 oC. La densità relativa è una grandezza adimensionale. La densità, ρ, di una sostanza è il rapporto tra una determinata massa m e il volume corrispondente v. In unità SI la densità, ρ, viene espressa in kg/m3.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO (1) (3) Non è necessario utilizzare sostanze di riferimento in rutti i casi in cui si esamina una nuova sostanza. Esse servono principalmente per controllare periodicamente l'accuratezza del metodo e per permettere un confronto con risultati ottenuti con altri metodi.

1.4. PRINCIPIO DEI METODI Si utilizzano quattro classi di metodi.

1.4.

1.4.1. Metodi per galleggiamento

1.4.1.

1.4.1.1. Idrometro (per sostanze liquide) Determinazioni rapide e sufficientemente accurate della densità possono essere eseguite per mezzo di idrometri galleggianti, che permettono di dedurre la densità di un liquido dal grado di immersione desunto da una scala graduata.

1.4.1.2. Bilancia idrostatica (per sostanze solide e liquide) La differenza tra il peso di un campione in aria e quello in un liquido adatto (per esempio acqua) può essere utilizzata per determinare la densità. Nel caso dei solidi, la densità cosi misurata va considerata valida solo per il particolare campione in esame. Per la determinazione della densità dei liquidi, un corpo di volume V noto viene pesato prima in aria e poi nel liquido stesso.

1.4.1.3. Metodo ad immersione di sfera (per sostanze liquide) (4) In questo metodo la densità di un liquido viene determinata in base alla differenza tra i valori ottenuti pesando il liquido prima e dopo l'immersione di una sfera di volume noto nel liquido stesso.

1.4.2. Metodi picnometrici Per solidi o liquidi possono impiegarsi picnometri di varia forma e di volume noto. La densità si calcola in base alla differenza di peso tra il picnometro pieno e quello vuoto ed in base al suo volume noto.

1.4.3. Picnometro di comparizione ad aria (per solidi) La densità di un solido di forma qualsiasi può essere determinata a temperatura ambiente con il picnometro di comparazione a gas. Il volume di una sostanza viene misurato in aria o in un gas inerte all'interno di un cilindro tarato di volume variabile. Per il calcolo della densità va effettuata una misura di massa successivamente a quella di volume.

1.4.4. Densimetro oscillante (5) (6) (7) La densità di un liquido può essere determinata per mezzo di un densimetro oscillante. Un oscillatore meccanico costruito a forma di un tubo a U viene fatto vibrare alla frequenza di risonanza dell'oscillatore, che dipende dalla sua massa. L'introduzione di un campione modifica! a frequenza di risonanza dell'oscillatore. L'apparecchio deve essere calibrato mediante due sostanze liquide di densità nota. Tali sostanze vanno preferibilmente selezionate in modo da coprire l'intervallo di densità in cui si effettuano le misure.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ L'applicabilità dei vari metodi impiegati per la determinazione della densità relativa è indicata nella tabella.

1.6. DESCRIZIONE DEI METODI Nell'appendice sono riportate a titolo di esempio alcune delle norme da consultare per ulteriori dettagli tecnici. Le prove vanno eseguite a 20 oC effettuando almeno due misure.

2. DATI Vedi norme

3. Tabella 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Applicabilità dei metodi

RELAZIONE La relazione sulla prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni: La densità relativa D204 deve essere indicata secondo quanto prescritto al punto 1.2., insieme allo stato fisico della sostanza esaminata. Vanno fomite tutte le informazioni ed osservazioni utili per l'interpretazione dei risultati, in modo particolare per quel che riguarda le impurezze e lo stato fisico della sostanza. Metodi di misura Densità Viscosità dinamica massima possibile Norme esistenti solidi liquidi Idrometro sì 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 bilancia idrostatica sì ISO 1183 (A) sì 5 Pa s ISO 901 e 758 metodo della sfera immersa sì 20 Pa s DIN 53217 picnometro ISO 3507 sì ISO 1183 (B), NF T 20-053 sì 500 Pa s ISO 758 picnometro di comparazione ad aria sì DIN 55990 parte 3, DIN 53243 densimetro oscillante sì 5 Pa s

metodo usato;

descrizione precisa della sostanza (identità e impurezze) e dell'eventuale stadio preliminare di purificazione;

3. Tabella 1.4.1.1.1.4.1.2. Applicabilità dei metodi a)

solidi

liquidi

3. Tabella 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Applicabilità dei metodi a)

solidi

liquidi

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

BIBLIOGRAFIA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry. Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 427-430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253—255.

A.4. TENSIONE DI VAPORE

A.4.

1. METODO La maggior parte dei metodi descritti sono basati sulle linee direttrici OCSE (1). I principi fondamentali sono presentati nei riferimenti (2) e (3).

1.

1.1. INTRODUZIONE Per eseguire questa prova è utile avere informazioni preliminari sulla struttura, la temperatura di fusione e la temperatura di ebollizione della sostanza. Non esiste un procedimento unico che sia applicabile a tutto l'intervallo dei valori di tensione di vapore. Si raccomanda pertanto di usare più di un metodo per la misura di tensione di vapore da < 10-4 Pa a 105 Pa. Le impurezze influiscono normalmente sulla tensione di vapore, e in una misura che dipende ampiamente dal tipo di impurezza. Nel caso in cui nel campione siano presenti impurezze volatili che potrebbero influire sul risultato, la sostanza può venire purificata. Può anche essere opportuno indicare la tensione di vapore del materiale tecnico. Alcuni dei metodi qui descritti utilizzano apparecchiature con parti metalliche; di ciò si deve tenere conto quando si analizzano sostanze corrosive.

1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ La tensione di vapore di una sostanza è definita come la pressione di saturazione al di sopra di un solido o di un liquido. All'equilibrio termodinamico, la tensione di vapore di una sostanza pura è funzione della sola temperatura. L'unità SI di pressione da utilizzare è il Pascal (Pa). Altre unità impiegate in passato sono elencate qui di seguito con i relativi fattori di conversione: 1 Torr (= 1 mm Hg) = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfera = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa L'unità SI di temperatura è il grado Kelvin (K). La costante universale dei gas R è 8,314 J mol-1 K-1. La dipendenza della tensione di vapore dalla temperatura è descritta dalla equazione di Clausius-Clapeyron: log p = Δ Hv2,3 RT+cost. dove: p tensione di vapore della sostanza in Pascal Δ Hv calore di evaporazione in J mol -1 R costante universale dei gas = 8,314 J mol-1 K-1 T temperatura termodinamica in K

1.4. PRINCIPIO DEL METODO Per la determinazione della tensione di vapore si propongono sette metodi, che possono essere applicati a diversi intervalli della tensione di vapore. Per ciascun metodo, la tensione di vapore viene determinata a varie temperature. In un intervallo di temperatura limitato, il logaritmo della tensione di vapore di una sostanza pura è funzione lineare del reciproco della temperatura.

1.4.

1.4.1. Metodo dinamico Il metodo dinamico prevede la misura della temperatura di ebollizione corrispondente ad una determinata pressione. Intervallo di valori raccomandato: da 103 a 105 Pa. Questo metodo è stato raccomandato anche per la determinazione della temperatura di ebollizione normale, ed a questo fine esso è utilizzabile fino a 600 K.

1.4.2. Metodo statico Tramite il processo statico si determina la tensione di vapore che si stabilisce ad una determinata temperatura in un sistema chiuso in equilibrio termodinamico. Questo metodo si presta per sostanze solide e liquide ad una o più fasi. Intervallo di valori raccomandato: da 10 Pa fino a 105 Pa. Questo metodo può venire utilizzato anche nel campo da 1 a 10 Pa purché si proceda con attenzione.

1.4.3. Isoteniscopio Questo metodo standardizzato è a sua volta un procedimento statico, ma non è generalmente utilizzabile per sistemi a più componenti. Ulteriori dettagli sono reperibili nel metodo ASTM D-2879-86. Intervallo di valori raccomandato: da 100 Pa a 105 Pa.

1.4.4. Metodo di effusione: bilancia a tensione di vapore Si determina la quantità di sostanza che, nell'unità di tempo, abbandona una cella attraverso un'apertura di dimensioni note e sotto condizioni di vuoto in modo che il ritorno della sostanza nella cella sia trascurabile (per esempio, tramite determinazione dell'impulso trasmesso ad una bilancia sensibile da un getto di vapore, oppure misurando la perdita di peso). Intervallo di valori raccomandato: da 10-3 Pa a 1 Pa.

1.4.5. Metodo di effusione: per perdita di peso o per cattura del vaporizzato Il metodo è basato sulla stima della massa della sostanza in esame che esce nell'unità di tempo da una cella di Knudsen (4) in forma di vapore, attraverso un micro-orificio, in condizioni di vuoto spinto. La massa di vapore effusa può essere ottenuta o determinando la perdita di massa della cella o condensando il vapore a bassa temperatura e determinando la quantità di sostanza volatilizzata mediante l'uso dell'analisi cromatografica. La tensione di vapore viene calcolata applicando la relazione di Hertz-Knudsen. Intervallo di valori raccomandato: da 10-3 a 1 Pa.

1.4.6. Metodo di saturazione del gas Una corrente di gas di trasporto inerte viene fatta passare sopra alla sostanza in modo tale che detto gas si saturi del vapore della sostanza stessa. La quantità di materiale trasportata da una quantità nota di gas di trasporto può essere misurata o mediante raccolta in una trappola adatta o mediante una tecnica analitica a flusso continuo. Questo valore viene poi usato per calcolare la tensione di vapore ad una data temperatura. Intervallo di valori raccomandato: da 10-4 a 1 Pa. Questo metodo può venire usato anche nel campo da 1 a 10 Pa purché si proceda con attenzione.

1.4.7. Rotore Nel manometro a rotore, l'elemento di misura effettivo è una pallina d'acciaio sospesa in un campo magnetico, che ruota ad alta velocità. La pressione del gas viene ricavata dal rallentamento della pallina d'acciaio, che dipende dalla pressione. Intervallo di valori raccomandato: 10-4 a 0,5 Pa.

1.5. Tabella 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Criteri di qualità

CRITERI DI QUALITÀ Si confrontano i vari metodi per la determinazione della tensione di vapore per quanto riguarda la loro applicabilità, ripetibilità, riproducibilità, intervallo di misura e standard esistenti. Il confronto è riportato nella seguente tabella. Metodo di misura Sostanze Ripetibilità stimata Riproducibilità stimata Intervallo raccomandato Norme esistenti solide liquide Metodo dinamico basso-fondenti sì fino al 25 % fino al 25 % da 103 Pa a 2 × 103 Pa — 1-5 % 1-5 % da 2 × 103 Pa a 105 Pa — Metodo statico sì sì 5-10 % 5-10 % da 10 Pa a 105 Pa NFT 20-048 (5) Isoteniscopio sì sì 5-10 % 5-10 % da 102 Pa a 105 Pa ASTM-D 2879-86 Metodo di effusione: bilancia a tensione di vapore sì sì 5-20 % fino al 50 % da 10-3 Pa a 1 Pa NFT 20-047 (6) Metodo di effusione: perdita di peso sì sì 10-30 % — da 10-3 Pa a 1 Pa — Metodo di saturazione del gas sì sì 10-30 % fino al 50 % da 10-4 Pa a 1 Pa — Metodo del rotore sì sì 10-20 % — da 10-4 Pa a 0,5 Pa —

1.6. DESCRIZIONE DEI METODI

1.6.

1.6.1. Misura dinamica

1.6.1.

1.6.1.1. Apparecchiatura L'apparecchio di misura consiste generalmente in un recipiente per l'ebollizione provvisto di un refrigerante in vetro o metallo (vedi figura 1), strumenti per misurare la temperatura e apparecchi per regolare e misurare la pressione. Un tipico apparecchio di misura è realizzato, come mostra la figura, in vetro resistente al calore ed è composto di 5 parti: Il tubo grande, parzialmente a doppia parete, consiste in un giunto smerigliato a camicia, un recipiente di raffreddamento ed un ingresso. Il cilindro di vetro, provvisto di pompa Cottrell, è montato sulla sezione di ebollizione del tubo ed è fornito di una superficie scabra di frammenti di vetro per evitare la formazione di grosse bolle durante il processo di ebollizione. La temperatura viene misurata con un adatto sensore di temperatura (per esempio un termometro a resistenza, una termocoppia incamiciata) immerso nell'apparecchiatura fino al punto di misurazione (figura 1, numero 5) attraverso un passaggio adatto (per esempio un giunto smerigliato maschio). Devono essere realizzati i necessari collegamenti con l'apparecchiatura di regolazione e misura della flessione. Il bulbo, che agisce da polmone, è collegato allo strumento di misura mediante un tubo capillare. Il recipiente di ebollizione è riscaldato mediante un elemento riscaldante (per esempio un riscaldatore a cartuccia) inserito dal basso nell'apparecchiatura di vetro. La corrente di riscaldamento richiesta viene fissata e regolata tramite una termocoppia. Il vuoto necessario tra 102 Pa e approssimativamente 105 Pa viene prodotto mediante una pompa a vuoto. Per dosare l'aria o l'azoto per la regolazione della pressione (campo di misura approssimativamente 102-105 Pa) e per la ventilazione si usa una valvola adatta. La pressione viene misurata con un manometro.

1.6.1.2. Procedimento di misura La tensione di vapore viene misurata determinando la temperatura di ebollizione del campione a varie pressioni prestabilite approssimativamente tra 103 e 105 Pa. Una temperatura constante a pressione costante indica che è stata raggiunta la temperatura di ebollizione. Questo metodo non è adatto per la determinazione nel caso di sostanze che fanno schiuma. La sostanza viene posta in un porta campioni pulito ed asciutto. Con solidi non in forma di polvere si possono incontrare dei problemi, ma questi possono talvolta essere risolti riscaldando la camicia di raffreddamento. Dopo che il recipiente è stato riempito, l'apparecchiatura viene sigillata in corrispondenza della flangia e la sostanza viene degassata. Viene poi impostata la pressione minima desiderata e si accende il riscaldamento. Nello stesso tempo, il sensore di temperatura è collegato ad un registratore. L'equilibrio è raggiunto quando viene registrata una temperatura di ebollizione costante a pressione costante. Bisogna porre una particolare cura per evitare una formazione di grosse bolle durante l'ebollizione. Inoltre, sul refrigerante deve avvenire una condensazione completa. Quando si determina la tensione di vapore di solidi basso-fondenti, bisogna porre attenzione ad evitare il bloccaggio del condensatore. Dopo aver registrato il punto di equilibrio così raggiunto, si regola la pressione su un valore più elevato. Questa procedura va ripetuta fino a raggiungere una pressione di 105 Pa (per un totale da 5 a 10 punti di misura). A titolo di controllo, la determinazione dei punti di equilibrio deve essere ripetuta a pressioni decrescenti.

1.6.2. Misura statica

1.6.2.

1.6.2.1. Apparecchiatura L'apparecchiatura comprende un contenitore per il campione, un sistema di riscaldamento e raffreddamento per regolare la temperatura del campione e per misurare la temperatura. L'apparecchio comprende anche strumenti per impostare e misurare la pressione. Le figure 2a e 2b illustrano i principi fondamentali implicati. La camera del campione (figura 2a) è collegata da una parte con un'adatta valvola per alto vuoto e dall'altra con un tubo ad U contenente un opportuno fluido manometrico. Una estremità del tubo ad U è collegata con la pompa da vuoto, la bombola dell'azoto o la valvola di ventilazione, ed un manometro. Al posto del tubo ad U si può usare un manometro con indicatore di pressione (figura 2b). Allo scopo di regolare la temperatura del campione, il recipiente del campione, insieme con la valvola e il tubo ad U o il manometro, viene posto in un bagno mantenuto ad una temperatura costante ±0,2 K. Le misure di temperatura vengono effettuate sulla parete esterna del recipiente contenente il campione o nel recipiente stesso. Per evacuare l'apparecchio si utilizza una pompa da vuoto a monte della quale vi è una trappola refrigerante. Nel metodo 2a, la tensione di vapore della sostanza viene misurata indirettamente utilizzando un indicatore di zero. Questo tiene conto del fatto che la densità del fluido nel tubo ad U risulta alterata se la temperatura cambia in maniera consistente. Come indicatori di zero per il tubo ad U, sono adatti secondo il campo di pressioni e il comportamento chimico della sostanza in esame, i seguenti fluidi: fluidi siliconici, ftalati. La sostanza in esame non deve sciogliersi in maniera apprezzabile o reagire con il fluido del tubo ad U. Per il manometro può venire usato il mercurio nel campo dalla normale pressione atmosferica fino a 102 Pa, mentre per l'uso tra 102 Pa e 10 Pa sono adatti i fluidi siliconici e gli ftalati. I manometri capacitivi a membrana riscaldabile possono essere usati anche al di sotto di 10-1 Pa. Esistono anche altri manometri che possono essere usati al di sotto di 102 Pa.

1.6.2.2. Procedimento di misura Prima della misura, tutti i componenti dell'apparecchio mostrato in figura 2 devono essere puliti e asciugati accuratamente. Per il metodo 2a, riempire il tubo ad U con il liquido scelto, che deve essere degassato a temperatura elevata prima di procedere alla lettura. La sostanza in esame viene posta nell'apparecchio, che viene poi chiuso, e la temperatura viene ridotta in modo sufficiente per il degassaggio. La temperatura deve essere sufficientemente bassa per assicurare che l'aria sia aspirata fuori ma — nel caso di sistema a componenti multipli — non deve alterare la composizione del materiale. Se richiesto, l'equilibrio può essere raggiunto più rapidamente mediante agitazione. Il campione può essere sovrarraffreddato, per esempio con azoto liquido (attenzione: condensazione dell'aria, fluido di pompaggio) o con una miscela di etanolo e ghiaccio secco. Per misure a bassa temperatura, usare un bagno con regolazione della temperatura collegato ad un ultracriostato. Con la valvola sopra al recipiente del campione aperta, si applica il vuoto per qualche minuto per rimuovere l'aria. La valvola viene poi chiusa e la temperatura del campione viene ridotta al livello minimo desiderato. Se necessario, l'operazione di degassaggio deve essere ripetuta più volte. Quando il campione viene riscaldato, la tensione di vapore aumenta. Ciò altera l'equilibrio del fluido nel tubo ad U. Per compensare questo effetto, lasciare entrare azoto o aria nell'apparecchio attraverso una valvola fino a che il fluido indicatore di pressione è nuovamente a zero. La pressione richiesta a questo scopo può essere letta da un manometro di precisione a temperatura ambiente. Questa pressione corrisponde alla tensione di vapore della sostanza a quella particolare temperatura di misura. Il metodo 2b è simile, ma la tensione di vapore viene letta direttamente. La dipendenza dalla temperatura della tensione di vapore viene determinata ad intervalli adeguatamente piccoli (approssimativamente da 5 a 10 punti di misura in totale) fino al valore massimo desiderato. Le letture a bassa temperatura devono essere ripetute per verifica. Se i valori ottenuti dalla ripetizione delle letture non coincidono con la curva ottenuta per la temperatura crescente, la ragione può essere una delle seguenti:

1.6.2.2.

1. Il campione contiene ancora aria (per esempio materiali ad elevata viscosità) o sostanze basso-bollenti, che vengono liberate durante il riscaldamento e possono essere rimosse mediante applicazione di vuoto dopo ulteriore sovrarraffreddamento.

2. La temperatura di raffreddamento non è sufficientemente bassa. In questo caso si usa come agente refrigerante azoto liquido. Se vale il caso 1 o 2, le misure devono essere ripetute.

3. La sostanza subisce una reazione chimica nel campo di temperature studiato (per esempio decomposizione, polimerizzazione).

1.6.3. Isoteniscopio Una descrizione completa del metodo è reperibile in letteratura (7). Il principio dell'apparecchio di misura è illustrato nella figura 3. Analogamente al metodo statico descritto al punto 1.6.2, l'isoteniscopio si presta all'esame di solidi e liquidi. Nel caso dei liquidi, la sostanza in esame serve essa stessa da fluido nel manometro ausiliario. Una quantità di liquido sufficiente per riempire il bulbo e il gambo corto della sezione del manometro viene introdotta nell'isoteniscopio. L'isoteniscopio viene poi collegato ad un sistema di vuoto; l'isoteniscopio viene evacuato e poi riempito con azoto. L'evacuazione e la bonifica del sistema vengono ripetute due volte per rimuovere l'ossigeno residuo. L'isoteniscopio riempito viene posto in posizione orizzontale in modo che il campione si sparga in uno strato sottile nel bulbo del campione e nella sezione manometrica (parte ad U). La pressione del sistema viene ridotta a 133 Pa e il campione viene riscaldato delicatamente fino a quando incomincia a bollire (rimozione dei gas fissi disciolti). L'isoteniscopio viene poi sistemato in modo che il campione ritorni nel bulbo e nel gambo corto del manometro, di modo che siano ambedue completamente riempiti di liquido. La pressione viene mantenuta allo stesso livello usato per il degassaggio; la punta stirata del bulbo porta campione viene riscaldata con una fiamma piccola fino a che i vapori del campione liberati si espandono in modo sufficiente per spostare parte del campione dalla parte superiore del bulbo e del braccio manometrico nella sezione manometrica dell'isoteniscopio, creando uno spazio riempito di vapore ed esente da azoto. L'isoteniscopio viene posto in un bagno a temperatura costante e la pressione dell'azoto viene regolata fino a quando coincide con la pressione del campione. L'equilibrio della pressione è indicato dalla sezione manometrica dell'isoteniscopio. All'equilibrio, la tensione di vapore dell'azoto è uguale alla tensione di vapore della sostanza. Nel caso di solidi, si usano i liquidi manometrici elencati in 1.6.2.1, secondo il campo di pressioni e di temperature. Il liquido manometrico degassato viene introdotto in una boccia sul braccio lungo dell'isoteniscopio. Il solido in esame viene poi posto nel bulbo e degassato a temperatura elevata. Dopo di ciò si inclina l'isoteniscopio in modo che il fluido manometrico possa defluire nel tubo ad U. La misura della tensione di vapore in funzione della temperatura viene effettuata come indicato al punto 1.6.2.

1.6.4. Metodo di effusione: bilancia a tensione di vapore

1.6.4.

1.6.4.1. Apparecchiatura In letteratura (1) sono descritte varie versioni dell'apparecchiatura. L'apparecchiatura qui descritta illustra il principio generale implicato (figura 4). La figura 4 mostra i componenti principali dell'apparecchiatura, che comprendono un contenitore d'acciaio inossidabile o vetro per alto vuoto, strumenti per produrre e misurare il vuoto e componenti incorporati per misurare la tensione di vapore su una bilancia. Nell'apparecchio sono incorporati i seguenti componenti:

Un forno evaporatore provvisto di flangia e ingresso rotativo. Il forno evaporatore è un recipiente cilindrico, fatto per esempio di rame o di lega chimicamente resistente con buona conducibilità termica. Può essere usato anche un recipiente di vetro con parete di rame. Il forno ha un diametro approssimativo di 3-5 cm e un'altezza di 2-5 cm e presenta da 1 a 3 aperture di differenti dimensioni per la corrente di vapore.

Il forno è riscaldato o mediante una piastra riscaldante sottostante o mediante una spirale riscaldante avvolta intorno. Per impedire la dissipazione di calore verso la piastra di base, il riscaldatore è attaccato alla piastra di base mediante un metallo di bassa conducibilità termica (nichel-argento o acciaio al cromo-nichel), per esempio un tubo di nichel-argento collegato ad un ingresso rotativo se si usa un forno con più aperture. Questa disposizione ha il vantaggio di permettere l'introduzione di una barra di rame. Ciò permette di effettuare il raffreddamento dall'esterno utilizzando un bagno di raffreddamento. Se il coperchio del forno di rame presenta tre aperture di differenti diametri, a 90 o una rispetto all'altra, è possibile coprire vari intervalli di tensione di vapore all'interno dell'intervallo di misura globale (diametri delle aperture compresi approssimativamente tra 0,30 e 4,50 mm). Le aperture più grandi vengono usate per le basse tensioni di vapore, e viceversa. Ruotando il forno, si può selezionare l'apertura desiderata o una posizione intermedia per la corrente di vapore (apertura del forno — schermo — piatto della bilancia) liberando la corrente molecolare o deviandola, attraverso l'apertura del forno, sul piatto della bilancia. Allo scopo di misurare la temperatura della sostanza, in un punto opportuno si posiziona una termocoppia o un termometro a resistenza.

Al di sopra dello schermo vi è il piatto di una microbilancia di alta sensibilità (vedi avanti). Il piatto della bilancia ha un diametro approssimativo di 30 mm. Un materiale adatto è alluminio placcato d'oro.

Il piatto della bilancia è circondato da una cassetta di refrigerazione cilindrica di ottone o rame. Secondo il tipo di bilancia, essa presenta aperture per il giogo della bilancia e un'apertura nello schermo per la corrente molecolare, e deve garantire una condensazione completa del vapore sul piatto della bilancia. La dissipazione del calore verso l'esterno è assicurata, per esempio, mediante una barra di rame collegata alla cassetta di refrigerazione. La barra passa attraverso la piastra di base ed è isolata termicamente da essa, per esempio, con un tubo di acciaio al cromo-nichel. La barra è immersa in una bottiglia di Dewar contenente azoto liquido posta sotto la piastra di base, oppure azoto liquido viene fatto circolare attraverso la barra. La cassetta di refrigerazione viene così mantenuta a circa — 120 oC. Il piatto della bilancia è raffreddato esclusivamente per irraggiamento ed è soddisfacente per il campo di pressioni in esame (raffreddare approssimativamente per 1 ora prima dell'inizio della misura).

La bilancia viene posizionata sopra alla cassetta di refrigerazione. Bilance adatte sono, per esempio, una microbilancia elettronica a 2 bracci di alta sensibilità (8) o uno strumento a spirale mobile di elevata sensibilità (vedi linee direttrici OCSE 104, edizione 12.5.1981).

La piastra di base contiene anche connessioni elettriche per termocoppie (o termometri a resistenza) e serpentine di riscaldamento.

Nel recipiente viene prodotto il vuoto usando una pompa per vuoto parziale o una pompa per alto vuoto (vuoto richiesto: circa da 1 a 2.10-3 Pa, ottenuto dopo 2 ore di pompaggio). La pressione viene regolata con un adatto manometro a ionizzazione.

1.6.4.2. Procedimento di misura Il recipiente viene riempito con la sostanza in esame e il coperchio viene chiuso. Lo schermo e la cassetta di refrigerazione vengono portati sopra al forno. L'apparecchiatura viene chiusa e le pompe a vuoto vengono accese. La pressione finale prima di iniziare le misure deve essere di circa 10-4 Pa. Il raffreddamento della cassetta di refrigerazione parte da 10-2 Pa. Dopo aver raggiunto il vuoto richiesto, partire con la serie di taratura alla temperatura più bassa richiesta. Si seleziona l'apertura corrispondente del coperchio, e la corrente di vapore passa attraverso lo schermo direttamente sopra all'apertura e colpisce il piatto della bilancia raffreddato. Il piatto della bilancia deve essere sufficientemente grande per assicurare che l'intera corrente guidata dallo schermo lo colpisca. La quantità di moto della corrente di vapore agisce da forza contro il piatto della bilancia e le molecole condensano sulla sua superficie raffreddata. La quantità di moto e la condensazione simultanea producono un segnale sul registratore. La valutazione dei segnali fornisce due elementi di informazione: p = G 2 π RT×103M dove: G velocità di evaporazione (kg s-1 m-2) M massa molare (g mol-1) T temperatura (K) R costante universale dei gas (J mol-1 K-1) p tensione di vapore (Pa) Dopo aver raggiunto il vuoto necessario, si inizia la serie delle misure alla temperatura di misurazione minima desiderata. Per ulteriori misure, la temperatura viene aumentata per piccoli incrementi fino a che si raggiunge il massimo valore desiderato della temperatura. Il campione viene poi nuovamente raffreddato e si può registrare una seconda curva della tensione di vapore. Se la seconda prova non conferma i risultati della prima prova, può darsi che la sostanza si decomponga nell'intervallo di temperature oggetto delle misure.

1.6.4.2.

1. Nell'apparecchiatura qui descritta la tensione di vapore è determinata direttamente dalla quantità di moto sul piatto della bilancia [a questo scopo non è necessario conoscere il peso molecolare (2)]. Nella valutazione delle letture, bisogna tenere conto dei fattori geometrici, come l'apertura del forno e l'angolo della corrente molecolare.

2. Contemporaneamente si può misurare la massa del condensato e calcolare da ciò la velocità di evaporazione. La tensione di vapore può essere calcolata anche dalla velocità di evaporazione e dal peso molecolare utilizzando l'equazione di Hertz (2)

1.6.5. Metodo di effusione: per perdita di peso

1.6.5.

1.6.5.1. Apparecchiatura L'apparecchiatura di effusione è costituita dai seguenti componenti fondamentali: In figura 5 è mostrato un esempio di un recipiente da vuoto in alluminio, riscaldato elettricamente, con 4 celle di effusione in acciaio inossidabile. Il foglio d'acciaio inossidabile dello spessore di circa 0,3 mm presenta un orificio di effusione da 0,2 mm a 1,0 mm di diametro ed è collegato alla cella di effusione mediante un coperchio a vite.

un serbatoio che può essere termostatato ed evacuato e nel quale sono posizionate le celle di effusione;

una pompa per alto vuoto (per esempio una pompa a diffusione o una pompa turbomolecolare) con vacuometro;

una trappola, in cui si usa azoto liquefatto o ghiaccio secco.

1.6.5.2. Procedimento di misura La sostanza di riferimento e la sostanza in esame sono introdotte nella cella di effusione, il diaframma metallico con l'orificio viene fissato mediante il coperchio a vite e la cella viene pesata con un'approssimazione di 0,1 mg. La cella viene poi posta nell'apparecchio termostatato, che viene poi evacuato a meno di 1/10 della tensione prevista. Ad intervalli di tempo definiti, che variano da 5 a 30 ore, si introduce aria nell'apparecchio e si determina la perdita di massa della cella di effusione ripesandola. Allo scopo di assicurare che i risultati non siano influenzati da impurezze volatili, la cella viene ripesata ad intervalli di tempo definiti per controllare che la velocità di evaporazione sia costante su almeno due intervalli di tempo. La tensione di vapore p nella cella di effusione è data da: p = mKAt2 π R TM dove: p tensione di vapore (Pa) m massa della sostanza che lascia la cella nel tempo t (kg) t tempo (S) A area del foro (m2) K fattore di correzione R costante universale dei gas (J mol-1 K-1) T temperatura (K) M massa molecolare (kg mol-l) Il fattore di correzione K dipende dal rapporto tra la lunghezza e il raggio dell'orificio cilindrico: rapporto 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K: 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 L'equazione vista sopra può essere scritta nella forma: p = E mtTM dove E = 1KA2πR è la costante di effusione della cella. Questa costante di effusione della cella E può essere determinata mediante sostanze di riferimento (2,9), usando la seguente equazione: E = p(r)tmM(r)T dove: p(r) tensione di vapore della sostanza di riferimento (Pa) M(r) massa molecolare della sostanza di riferimento (kg.mol-1)

1.6.6. Metodo della saturazione del gas

1.6.6.

1.6.6.1. Apparecchiatura Un apparecchio tipico usato per eseguire questa prova comprende un certo numero di componenti presentati in figura 6a e descritti nel seguito (1).

1.6.6.1. Gas inerte:

Il gas di trasporto non deve reagire chimicamente con la sostanza in esame. A tale scopo è in genere sufficiente l'azoto, ma talvolta possono essere necessari altri gas (10). Il gas impiegato deve essere secco (vedi figura 6a, riferimento 4: sensore dell'umidità relativa).

Controllo del flusso:

Per assicurare un flusso costante e regolabile del gas attraverso la colonna del saturatore va impiegato un adatto sistema di controllo.

Condensatori di raccolta del vapore:

I condensatori da impiegare dipendono dalle caratteristiche del particolare campione e dal metodo di analisi prescelto. Il vapore deve essere condensato quantitativamente ed in una forma che ne consenta la successiva analisi. Per talune sostanze saranno adatti condensatori contenenti liquidi, quali l'esano od il glicol etilenico. Per altre sostanze possono essere impiegati assorbenti solidi. In alternativa alla condensazione dei vapori e successiva analisi, si possono usare tecniche analitiche a flusso continuo, come la cromatografia, per determinare quantitativamente la quantità di materiale trasportato da una quantità nota di gas di trasporto. Inoltre, si può misurare la perdita di massa del campione.

Scambiatore di calore:

Per misure a temperature diverse, può essere necessario includere nell'apparecchiatura uno scambiatore di calore.

Colonna di saturazione:

La sostanza in esame, sotto forma di soluzione, viene depositata su di un adatto supporto inerte. Il supporto così ricoperto viene introdotto nella colonna di saturazione, le cui dimensioni cosi come la velocità di flusso del gas di trasporto devono essere tali da assicurare una completa saturazione di quest'ultimo. La colonna di saturazione va termostatata. Per misure al di sopra di temperatura ambiente, la zona compresa tra la colonna del saturatore ed i dispositivi di condensazione del vapore deve essere riscaldata in modo da evitare la condensazione della sostanza in esame. Al fine di ridurre il trasporto di massa per diffusione, a valle della colonna di saturazione si può disporre un capillare (figura 6b).

1.6.6.2. Procedimento di misura

1.6.6.2. Preparazione della colonna di saturazione:

Una soluzione della sostanza in esame in un solvente altamente volatile viene aggiunta ad un'adeguata quantità di supporto. Si deve impiegare una sufficiente quantità di sostanza per mantenere la saturazione per tutta la durata della prova. Si evapora completamente il solvente, in aria o mediante un evaporatore rotante, e si introduce nella colonna di saturazione il materiale ben miscelato. Dopo aver regolato il termostato, si fa passare azoto secco attraverso l'apparecchio.

Misura:

I condensatori o i rivelatori a flusso continuo sono collegati alla linea di efflusso della colonna e si registra il tempo. La portata viene controllata all'inizio e ad intervalli regolari durante l'esperimento usando un misuratore a bolle (o in continuo con un flussimetro di massa). Si deve misurare la pressione all'uscita verso il saturatore. Ciò può essere fatto: Il tempo richiesto per raccogliere la quantità di sostanza in esame necessaria per i differenti metodi d'analisi viene determinato in prove preliminari o stimato per calcolo. In alternativa alla raccolta della sostanza per l'ulteriore analisi, si può usare una tecnica analitica quantitativa a flusso continuo (per esempio la cromatografia). Prima di calcolare la tensione di vapore ad una data temperatura, vanno eseguite prove preliminari per stabilire la velocità di flusso massima ancora capace di saturare completamente il gas di trasporto con il vapore della sostanza. Ciò viene assicurato se il gas di trasporto passa attraverso la colonna di saturazione tanto lentamente che una velocità ancora minore non conduce alla misura di una tensione di vapore superiore. Il metodo analitico specifico (per esempio gascromatografia o gravimetria) verrà scelto in funzione della sostanza in esame. Si determina la quantità di sostanza trasportata da un volume noto di gas di trasporto.

a)

includendo un manometro tra il saturatore e i condensatori (questa soluzione può non essere soddisfacente in quanto aumenta lo spazio morto e la superficie di adsorbimento);

b)

determinando la caduta di pressione attraverso il particolare sistema di condensazione impiegato in funzione della velocità di flusso, eseguendo una determinazione a parte (questo metodo può essere non molto soddisfacente per i condensatori a liquido).

1.6.6.3. Calcolo della tensione di vapore La tensione di vapore è calcolata in base alla densità di vapore (W/V), mediante i'equazione: p = WV × RTM dove: p tensione di vapore (Pa) W massa di sostanza in esame evaporata (g) V volume di gas saturato (m3) R costante universale molare dei gas (J mol-1 K-1) T temperatura (K) M massa molare della sostanza in esame (g mol-1) I volumi misurati vanno corretti per tenere conto delle differenze di temperatura e di pressione tra il flussimetro e la colonna di saturazione termostatata. Se il flussimetro si trova a valle del condensatore del vapore, possono essere necessarie correzioni che tengano conto degli eventuali prodotti di evaporazione provenienti da esso (1).

1.6.7. Rotore (8, 11, 13)

1.6.7.

1.6.7.1. Apparecchiatura La tecnica del rotore può venire messa in atto usando un viscosimetro a rotore come mostrato in figura 8. Un disegno schematico della disposizione sperimentale è mostrato in figura 7. L'apparecchio di misura è costituito tipicamente da una testa di misurazione a rotore posta in un recipiente termostatato (regolato con l'approssimazione di 0,1 oC). Il contenitore del campione viene posto in un recipiente termostatato (regolato con un'approssimazione di 0,01 oC), e tutte le parti dell'apparecchiatura vengono tenute ad una temperatura più elevata del contenitore del campione per impedire la condensazione. Un dispositivo di pompa ad alto vuoto viene collegato al sistema mediante valvole per alto vuoto. La testina di misurazione a rotore è costituita da una pallina d'acciaio (diametro da 4 a 5 mm) disposta in un tubo. La pallina è sospesa e stabilizzata in un campo magnetico, generalmente con l'uso di una combinazione di magneti permanenti e bobine di controllo. La palla viene fatta ruotare da campi rotanti prodotti dalle bobine. Bobine di trasduzione, che misurano la leggera magnetizzazione laterale sempre presente della pallina, permettono di misurare la sua velocità di rotazione.

1.6.7.2. Procedimento dì misura Quando la pallina ha raggiunto una determinata velocità di rotazione v(o) (di solito circa 400 giri al secondo), si interrompe la fornitura di energia ed avviene una decelerazione dovuta all'attrito col gas. La riduzione della velocità di rotazione viene misurata in funzione del tempo. Poiché l'attrito provocato dalla sospensione magnetica è trascurabile in confronto con l'attrito gassoso, la pressione del gas p è data da: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) dove: c— velocità media delle molecole del gas r raggio della pallina ρ densità di massa della pallina σ coefficiente di trasferimento tangenziale della quantità di moto (σ = 1 per una superficie sferica ideale della pallina) t tempo v(t) velocità di rotazione dopo il tempo t v(o) velocità di rotazione iniziale Questa equazione può anche essere scritta nella forma: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 dove tn, tn_] sono i tempi occorrenti per un determinato numero N di rotazioni. Questi intervalli di tempo tn e tn-1 si succedono uno all'altro, e si ha tn > tn-1. La velocità media delle molecole di gas Ec è data da: c— = 8 RTπ M12 dove: T temperatura (K) R costante molare universale dei gas M massa molare

2. DATI La tensione di vapore misurata mediante uno qualunque dei metodi precedenti deve essere determinata per almeno due temperature. Tre o più temperature diverse nell'intervallo da 0 a 50 oC sarebbero preferibili per verificare la linearità della curva di tensione di vapore.

3. RELAZIONE La relazione sulla prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni: Qualora si osservi una transizione (cambiamento di stato, decomposizione), saranno fornite le informazioni seguenti: Devono essere riportate tutte le informazioni e osservazioni significative per l'interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurezze e lo stato fisico della sostanza.

metodo usato;

descrizione precisa della sostanza (identità e impurezze) ed eventuale stadio preliminare di purificazione;

almeno due valori di tensione di vapore e di temperatura; preferibilmente nel campo da 0 a 50 oC;

tutti i dati grezzi;

una curva di log p contro 1/T;

una stima della tensione di vapore a 20 o 25 oC.

la natura del cambiamento;

la temperatura a cui il cambiamento si verifica sotto la pressione atmosferica;

la tensione di vapore a 10 oC e a 20 oC al di sotto della temperatura di transizione, nonché a 10 oC e a 20 oC al di sopra di tale temperatura (a meno che la transizione non consista in un passaggio dallo stato solido allo stato gassoso).

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)

BIBLIOGRAFIA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry. Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593. NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa — Static method. NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa — Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure-temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Röhl. G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol. (A), 1987. vol. 5 (4), 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173. B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435. G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), 642. G. Reich, J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148. J.K. Fremerey, J. Vac. Sci. Technol. (A), 1985, vol. 3 (3), 1715.

A.5. TENSIONE SUPERFICIALE

A.5.

1. METODO I metodi descritti si basano sulle linee direttrici OCSE (1) I principi fondamentali sono presentati nel riferimento (2).

1.

1.1. INTRODUZIONE I metodi qui illustrati si applicano alla misura della tensione superficiale di soluzioni acquose. Prima di effettuare le prove, è utile disporre di dati preliminari su alcune caratteristiche della sostanza in esame, quali la solubilità in acqua, la struttura, il comportamento all’idrolisi e la concentrazione critica per la formazione di micelle. I metodi qui illustrati si applicano alla maggior parte delle sostanze chimiche senza alcuna limitazione rispetto al loro grado di purezza. La misura della tensione superficiale col metodo del tensiometro ad anello può essere effettuata soltanto su soluzioni acquose con viscosità dinamica inferiore a 200 mPa s circa.

1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ Per tensione superficiale si intende l'entalpia libera superficiale per unità di area. La tensione superficiale si misura in: N/m (unità SI) oppure in mN/m (sottomultipli della unità SI); 1 N/m = 103 dine/cm, 1 mN/m = 1 dine/cm nel vecchio sistema cgs.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Non è necessario utilizzare sostanze di riferimento ogni volta che si esamina una nuova sostanza. Esse servono principalmente per controllare periodicamente l'attendibilità del metodo e per permettere il confronto dei risultati ottenuti con altri metodi. Nei riferimenti bibliografici (1) e (3) sono citate varie sostanze di riferimento in grado di coprire un ampio campo di valori della tensione superficiale.

1.4. PRINCIPIO DEI METODI I metodi si basano sulla misura della massima forza che è necessario esercitare in senso verticale ad una staffa o ad un anello a contatto con la superficie del liquido in esame posto in un recipiente di misura affinché detto liquido si distacchi dalla superficie stessa, ovvero ad una lamina che abbia un bordo a contatto con la superficie suddetta per sollevare la pellicola che si è formata. Le sostanze che sono solubili in acqua ad una concentrazione di almeno 1 mg/l sono esaminate in soluzione acquosa ad un'unica concentrazione.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ I metodi descritti permettono misure più precise di quanto possa essere necessario per valutazioni di ordine ambientale.

1.6. DESCRIZIONE DEI METODI Si prepara una soluzione della sostanza in acqua distillata. La concentrazione di questa soluzione dovrebbe essere il 90 % del valore corrispondente alla concentrazione di saturazione della sostanza in acqua; quando questa concentrazione supera 1 g/l, si usa per la prova una concentrazione di 1 g/l. Non è necessario eseguire il saggio su sostanze con una solubilità in acqua minore di 1 mg/1.

1.6.

1.6.1. Metodo della lamina Vedi ISO 304 e NF T 73-060 (Tensioattivi — Determinazione della tensione superficiale attraverso il sollevamento di pellicole liquide).

1.6.2. Metodo della staffa Vedi ISO 304 e NF T 73-060 (Tensioattivi — Determinazione della tensione superficiale attraverso il sollevamento di pellicole liquide).

1.6.3. Metodo dell'anello Vedi ISO 304 e NF T 73-060 (Tensioattivi — Determinazione della tensione superficiale attraverso il sollevamento di pellicole liquide).

1.6.4. Metodo armonizzato dell'anello secondo l'OCSE

1.6.4.

1.6.4.1. Apparecchiatura I tensiometri reperibili in commercio risultano adeguati a questo tipo di misura. Essi consistono delle parti seguenti:

tavolo mobile per il campione,

sistema di misurazione della forza,

elemento di misura (anello),

recipienti di misura.

1.6.4.1.

1.6.4.1.1. Tavolo mobile per il campione Il tavolo mobile per il campione viene usato come piano d'appoggio per il recipiente di misura termostatato contenente la soluzione in esame. Detto tavolo è montato su di un sostegno assieme al sistema di misurazione della forza.

1.6.4.1.2. Sistema di misurazione della forza Il sistema di misurazione della forza (vedi la figura) è collocato al di sopra del tavolo che sostiene il campione. L'errore nella misura della forza non deve essere maggiore di ± 10-6N, corrispondente ad un limite d'errore di ±0,1 mg in unità di massa. Nella maggioranza dei casi, la scala di misura dei tensiometri reperibili in commercio è tarata in mN/m, in modo che la tensione superficiale possa essere direttamente letta in mN/m con una incertezza di 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3. Elemento di misura (anello) L'anello è generalmente costituito da un filo di platino-iridio di circa 0,4 mm di spessore ed avente una circonferenza media di 60 mm. L'anello è sospeso orizzontalmente ad uno stelo metallico e ad una forcella di supporto in filo metallico che costituiscono il collegamento con il sistema di misurazione della forza (vedi la figura).

1.6.4.1.3. Figura Elemento di misura

(Tutte le quote sono in mm) Forcella montante Stelo Anello

1.6.4.1.4. Recipiente di misura Il recipiente di misura contenente la soluzione in esame deve essere in vetro e permettere la termostatazione. Esso deve essere progettato in modo che, durante la misura, la temperatura della soluzione liquida in esame e della fase gassosa sovrastante la sua superficie rimanga costante e che il campione non possa evaporare. Sono accettabili recipienti cilindrici in vetro di diametro interno non inferiore a 45 mm.

1.6.4.2. Preparazione dell'apparecchiatura

1.6.4.2.

1.6.4.2.1. Pulizia I recipienti di vetro devono essere accuratamente puliti. Se necessario, essi vanno lavati con miscela solfo-cromica bollente, poi con acido fosforico sciropposo (dall'83 al 98 % in peso di H3PO4), abbondantemente risciacquati con acqua di rubinetto, lavati con acqua bidistillata fino a reazione neutra ed infine asciugati o risciacquati con parte del campione liquido in esame. L'anello deve essere innanzitutto abbondantemente risciacquato con acqua per eliminare ogni sostanza idrosolubile, poi immerso per breve tempo nella miscela solfo-cromica, lavato con acqua bidistillata fino a reazione neutra ed infine riscaldato brevemente su una fiamma a metanolo. Nota: Eventuali sostanze contaminanti che non possano essere disciolte o distrutte dalla miscela solfo-cromica o dall'acido fosforico, come ad esempio siliconi, vanno eliminate mediante un opportuno solvente organico.

1.6.4.2.2. Taratura dell'apparecchio La convalida dell'apparecchiatura consiste nel controllo del punto di zero e nella regolazione dello strumento in modo che esso permetta determinazioni attendibili in mN/ra.

1.6.4.2.2. Montaggio:

La base dell'apparecchio deve essere posta perfettamente in piano, per esempio utilizzando una livella a bolla d'aria e regolando le apposite viti di livellamento.

Azzeramento dell'apparecchio:

Dopo aver montato l'anello sull'apparecchio e prima di immergerlo nel liquido, il tensiometro deve essere azzerato, controllando inoltre il parallelismo dell'anello con la superficie della soluzione. A tale scopo la superficie della soluzione può essere usata come uno specchio.

Taratura:

La taratura può essere effettuata tramite uno dei due procedimenti seguenti:

a)

per mezzo di una massa: il procedimento si basa sull'impiego di cavalieri di massa nota compresa tra 0,1 e 1,0 g, da collocare sull'anello. Il fattore di calibrazione Φa, per il quale tutte le letture dell'apparecchio devono essere moltiplicate, va determinato con la seguente equazione (1): Φa=σrσa (1) dove: σr=mg2b (mN/m) m massa del cavaliere (in g), g accelerazione di gravità (981 cm.s-2 al livello del mare), b circonferenza dell'anello (in cm), σa lettura al tensiometro dopo collocamento del cavaliere sull'anello (in mN/m);

b)

per mezzo dell'acqua: il procedimento si basa sull'impiego di acqua pura, la cui tensione superficiale è nota; per esempio, a 23 oC essa è di 72,3 mN/m. Questo metodo è più rapido della taratura con pesi, ma comporta sempre il rischio che la tensione superficiale dell'acqua risulti alterata a causa della contaminazione con tensioattivi in traccia. Il fattore di taratura Φb, per il quale tutte le letture dell'apparecchio devono essere moltiplicate, va determinato con la seguente equazione (2): Φb=σoσg (2) dove: σo valore riportato in letteratura per la tensione superficiale dell'acqua (in mN/m), σg valore misurato della tensione superficiale dell'acqua (in mN/m) entrambi riferiti alla stessa temperatura.

1.6.4.3. Preparazione dei campioni Vanno preparate soluzioni acquose delle sostanze da esaminare alle concentrazioni richieste ed in assenza di alcun corpo di fondo. La soluzione deve essere mantenuta a temperatura costante (±0,5 oC). Poiché la tensione superficiale di una soluzione nel recipiente di misura varia con il tempo, devono essere effettuate più misure a distanza l'una dall'altra, in modo da poter tracciare un grafico rappresentante le variazioni della tensione superficiale in funzione del tempo. Lo stato di equilibrio si considera raggiunto quando non si riscontrano più variazioni. La polvere e la contaminazione gassosa ad opera di altre sostanze interferiscono con le misure. Queste devono pertanto essere effettuate sotto una copertura di protezione.

1.6.5. Condizioni sperimentali Le misure vanno eseguite a 20 oC circa con variazioni non superiori a ±0,5 oC.

1.6.6. Esecuzione della prova Le soluzioni da sottoporre a misura devono essere trasferite nel recipiente di misura accuratamente pulito, avendo cura di evitare la formazione di schiuma, e successivamente il recipiente di misura va collocato sul tavolo dell'apparecchio di prova. Il piano dei tavolo va alzato insieme ai recipiente fino ad immergere l'anello sotto la superficie della soluzione in esame. Il piano del tavolo va poi abbassato gradualmente ed uniformemente (ad una velocità di circa 0,5 cm/min), in modo da staccare l'anello dalla superficie, fino a raggiungere il massimo della forza. Lo strato liquido attaccato all'anello non deve separarsi da esso. Al termine della misura, l'anello va nuovamente immerso sorto la superficie della soluzione ed il procedimento ripetuto finché si ottenga un valore costante della tensione superficiale. In ciascuna determinazione va registrato il tempo trascorso dal trasferimento della soluzione nel recipiente di misura. Le letture devono essere effettuate in corrispondenza dello sforzo massimo necessario per distaccare l'anello dalla superficie del liquido.

2. Tabella Correzione dei valori sperimentali della tensione superficiale Valida soltanto per soluzioni acquose con p = 1 g/cm3

DATI Per calcolare la tensione superficiale, il valore in mN/m letto sull'apparecchio va innanzitutto moltiplicato per il fattore di calibrazione Φa o Φb, (secondo il procedimento di taratura adottato). Si otterrà così un valore approssimativo, che deve essere a sua volta opportunamente corretto. Harkins e Jordan (4) hanno determinato alcuni fattori di correzione empirici per i valori della tensione superficiale misurata col metodo dell'anello, i quali dipendono dalle dimensioni dell'anello, dalla densità del liquido e dalla sua tensione superficiale. Poiché la determinazione del fattore di correzione con le tabelle di Harkins e Jordan per ciascuna singola misura di tensione superficiale risulta troppo laboriosa, per le soluzioni acquose può applicarsi un metodo semplificato, consistente nel desumere la tensione superficiale corretta direttamente dalla tabella qui di seguito riportata (per valori compresi tra quelli tabulati si può ricorrere all'interpolazione). R = 9,55 mm (raggio medio dell'anello). r = 0,185 mm (spessore medio del filo metallico). Valore sperimentale (mN/m) Valore corretto (mN/m) Taratura con pesi (vedi punto 1.6.4.2.2, lettera a) Taratura con acqua (vedi punto 1.6.4.2.2, lettera b) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Questa tabella è stata compilata sulla base della correzione secondo Harkins e Jordan, in modo analogo alla norma DIN 53914 per l'acqua e le soluzioni acquose (densità p = 1 g/cm3) e per anelli reperibili in commercio aventi dimensioni di R = 9,55 mm (raggio medio dell'anello) e r = 0,185 mm (spessore del filo metallico). La tabella fornisce i valori corretti per le misure di tensione superficiale effettuate dopo taratura con pesi o con acqua. In alternativa, la tensione superficiale può essere calcolata senza taratura preliminare ricorrendo alla formula seguente: σ=fxF4πR dove: F forza misurata al dinamometro al punto di rottura della pellicola, R raggio dell'anello, f fattore di correzione (1).

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

metodo usato;

tipo d'acqua o soluzione impiegata;

descrizione precisa della sostanza (identità e impurezze);

risultati delle misure: tensione superficiale (lettura), indicando sia le singole letture e la loro media che la media corretta (tenendo conto del fattore specifico dell'apparecchio e della tabella di correzione);

concentrazione della soluzione;

temperatura di esecuzione delle prove;

età della soluzione impiegata; in particolare il tempo trascorso tra la preparazione della soluzione e le misure;

descrizione della variazione della tensione superficiale col tempo dopo il trasferimento della soluzione nel recipiente di misura;

tutte le informazioni e osservazioni utili per l'interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurezze e lo stato fisico della sostanza.

3.2. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Considerando che l'acqua distillata ha una tensione superficiale di 72,75 mN/m a 20 oC, le sostanze che presentano una tensione superficiale minore di 60 mN/m nelle condizioni di misura previste da questo metodo devono essere considerate come materiali tensioattivi.

4.(1)(2)(3)(4)

BIBLIOGRAFIA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Chapter XIV, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, vol. 52, 1751.

A.6. IDROSOLUBILITÀ

A.6.

1. METODO I metodi descritti sono basati sulle linee direttrici OCSE (1).

1.

1.1. INTRODUZIONE Per l'esecuzione della prova in oggetto è utile disporre di informazioni preliminari sulla formula di struttura, la tensione di vapore, la costante di dissociazione e l'idrolisi (in funzione del pH) della sostanza in esame. Non esiste un procedimento unico che sia applicabile a tutto l'intervallo delle possibili solubilità in acqua. I due metodi di prova descritti nel seguito coprono l'intera gamma della solubilità, ma non sono applicabili a sostanze volatili: La solubilità in acqua della sostanza esaminata può essere considerevolmente alterata dalla presenza di impurezze.

il primo si applica a sostanze essenzialmente pure, scarsamente solubili (< 10-2 g/l) e stabili in acqua, e viene definito metodo della eluizione su colonna;

il secondo si applica a sostanze essenzialmente pure con solubilità più elevata (>10–2 g/l) e stabili in acqua, e viene definito metodo del matraccio.

1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ La solubilità in acqua di una sostanza è definita come la concentrazione di saturazione della sostanza in acqua ad una determinata temperatura. La solubilità in acqua è espressa in unità di massa per volume di soluzione. L'unità SI è il kg/m3 (si può anche far uso del g/l).

1.4. PRINCIPIO DEL METODO Tramite una semplice prova preliminare si stabilisce la quantità approssimativa del campione ed il tempo necessario per raggiungere la concentrazione di saturazione.

1.4.

1.4.1. Metodo dell'eluizione su colonna Questo metodo si basa sull'eluizione con acqua della sostanza in esame da una microcolonna riempita con materiale di supporto inerte, come perline di vetro o sabbia, con un eccesso della sostanza stessa. La solubilità in acqua viene valutata quando la concentrazione della sostanza nell'eluato è costante. Ciò si deduce dal fatto che la concentrazione in funzione del tempo raggiunge un valore costante.

1.4.2. Metodo del matraccio In questo metodo la sostanza (polverizzata, se solida) è disciolta in acqua ad una temperatura leggermente superiore a quella del saggio. Quando si raggiunge la saturazione, la miscela viene raffreddata e mantenuta alla temperatura della determinazione, agitando per tutto il tempo necessario a raggiungere l'equilibrio. In alternativa, la misura può essere eseguita direttamente alla temperatura di prova se, mediante un appropriato campionamento, si può essere sicuri di avere raggiunto l'equilibrio di saturazione. Successivamente, si determina mediante un opportuno metodo analitico la concentrazione della massa della sostanza nella soluzione acquosa, quest'ultima non deve contenere particelle indisciolte.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ

1.5.

1.5.1. Ripetibilità Per il metodo dell'eluizione su colonna, si può ottenere una ripetibilità inferiore al 30 %; per il metodo del matraccio essa dovrebbe essere inferiore al 15 %.

1.5.2. Rivelabiltà La rivelabilità dipende dal metodo d'analisi; si possono comunque effettuare determinazioni della concentrazione di massa fino a 10 –6 g/l.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO

1.6.

1.6.1. Condizioni di determinazione La prova deve essere eseguita preferibilmente a 20 oC ±0,5 oC. Se si presume che ci sia una dipendenza della solubilità anche dalla temperatura (> 3 % per oC), la prova deve essere eseguita ad altre due temperature di almeno 10 oC al di sopra e al di sotto di quella scelta inizialmente. In questo caso il controllo della temperatura deve rientrare in ±0,1 oC. La temperatura prescelta deve essere mantenuta costante in tutti i componenti importanti della strumentazione.

1.6.2. Prova preliminare In un cilindro graduato da 10 ml, chiuso con tappo di vetro e contenente all'incirca 0,1 g del campione (le sostanze solide devono essere polverizzate), vengono versati volumi crescenti di acqua distillata a temperatura ambiente, secondo le indicazioni riportate nella seguente tabella: 0,1 g solubili in x ml di acqua 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Solubilità approssimativa (g/l) > 1000 1000-200 200-100 100-50 50-10 10-1 < 1 Dopo ciascuna aggiunta delle quantità d'acqua indicate, la miscela viene vigorosamente agitata per 10 minuti e controllata visualmente per accertare la presenza di particelle non disciolte del campione. Se, dopo l'aggiunta di 10 ml d'acqua, il campione, o parte di esso, rimane indisciolto, l'esperimento deve essere ripetuto in un cilindro graduato da 100 ml con volumi d'acqua maggiori. Per solubilità inferiori, il tempo necessario per sciogliere la sostanza può essere considerevolmente più lungo (si devono prevedere almeno 24 ore). La solubilità approssimativa è indicata nella tabella in corrispondenza del volume d'acqua aggiunto per ottenere la dissoluzione completa del campione. Se la sostanza è ancora manifestamente insolubile, occorre attendere più di 24 ore (fino ad un massimo di 96 ore), oppure si deve effettuare un'ulteriore diluizione per accertarsi se debba essere usato il metodo dell'eluizione su colonna o il metodo del matraccio.

1.6.3. Metodo dell'eluizione su colonna

1.6.3.

1.6.3.1. Materiale di supporto, solvente ed eluente II materiale di supporto per il metodo dell'eluizione su colonna deve essere inerte. Possibili materiali adatti allo scopo sono perline di vetro e sabbia. Per distribuire la sostanza in esame sul materiale di supporto, va utilizzato un opportuno solvente volatile di purezza analitica. Come eluente va utilizzata acqua bidistillata ottenuta tramite apparecchi in vetro od in quarzo. Nota: Non deve utilizzarsi acqua proveniente direttamente da scambiatore di ioni di natura organica.

1.6.3.2. Caricamento del supporto Si pesano circa 600 mg del materiale di supporto, che si trasferiscono poi in un pallone a base tonda da 50 ml. Si scioglie nel solvente prescelto una quantità pesata opportuna della sostanza da esaminare. Una quantità appropriata di questa soluzione viene aggiunta al materiale di supporto. Il solvente deve essere completamente evaporato, ad esempio in un evaporatore rotante. In caso contrario non si raggiunge la saturazione con acqua del supporto a causa degli effetti di ripartizione sulla superficie del materiale di supporto. Il caricamento del materiale di supporto può causare problemi (risultati erronei) se la sostanza di prova si deposita sotto forma di olio o di una differente fase cristallina. Il problema deve essere esaminato sperimentalmente e i dettagli riportati nella relazione. Il materiale di supporto così caricato viene lasciato a bagno approssimativamente per 2 ore in circa 5 ml di acqua, e quindi la sospensione viene introdotta nella microcolonna. In alternativa, si può versare il materiale di supporto già ricoperto della sostanza ed essiccato nella microcolonna previamente riempita d'acqua e quindi lasciare il tutto ad equilibrarsi per circa 2 ore.

1.6.3.2. Procedimento di determinazione

L'eluizione della sostanza dal materiale di supporto può essere eseguita in due modi diversi:

con una pompa di circolazione (si veda la figura 1),

con un recipiente di livellamento (si veda la figura 4).

1.6.3.3. Metodo dell'eluizione su colonna con pompa di circolazione

1.6.3.3. Apparecchiatura

La rappresentazione schematica di un sistema convenzionale è riportata nella figura 1. La figura 2 presenta una microcolonna di adatte caratteristiche, che peraltro può avere altre misure, purché vengano rispettati i criteri di riproducibilità e sensibilità. La colonna deve comprendere uno spazio di testa pari ad almeno cinque volte il volume del letto d'acqua ed essere in grado di contenere un minimo di cinque campioni. In alternativa, le dimensioni possono anche essere ridotte qualora si impieghi un solvente di riempimento per sostituire i primi cinque volumi del letto d'acqua, scartati perché contenenti impurezze. La colonna deve essere collegata ad una pompa di circolazione capace di assicurare una portata di circa 25 ml/h. La pompa è collegata mediante giunti in politetrafluoroetilene (PTFE) e/o in vetro. La colonna e la pompa, dopo il montaggio, devono permettere il campionamento dell'effluente e l'equilibrazione dello spazio di testa a pressione atmosferica. Il materiale della colonna è sostenuto da un batuffolo di lana di vetro (5 mm), che serve anche da filtro per le particelle. La pompa di circolazione può essere ad esempio una pompa peristaltica od una pompa a membrana (si deve fare attenzione affinché non ci sia contaminazione e/o adsorbimento da parte del materiale del tubo).

Procedimento di misura

Si avvia il flusso attraverso la colonna. Si raccomanda di usare una portata di approssimativamente 25 ml/h (che corrisponde a 10 volumi del letto per ora per la colonna descritta). Si devono scartare almeno i primi cinque volumi per allontanare le impurezze solubili in acqua. Successivamente si lascia funzionare la pompa di circolazione fino al raggiungimento dell'equilibrio; ciò viene accertato sulla base di cinque campioni successivi, le concentrazioni dei quali non differiscono più del ± 30 % con distribuzione casuale. Questi campioni devono essere distanziati l'uno dall'altro da intervalli di tempo corrispondenti al passaggio di almeno dieci volte il volume del letto di eluente.

1.6.3.4. Metodo dell'eluizione su colonna con recipiente di livellamento

1.6.3.4. Apparecchiatura (si vedano le figure 3 e 4):

Recipiente di livellamento: il collegamento con il recipiente di livellamento si realizza tramite un giunto di vetro smerigliato, connesso con un tubo in teflon. Si raccomanda una velocità di flusso di circa 25 ml/h. Frazioni eluite consecutivamente vanno prelevate ed analizzate con il metodo prescelto.

Procedimento di misura

Per determinare la solubilità in acqua si utilizzano le frazioni eluite nella fase centrale, dove le concentrazioni devono risultare costanti (± 30 %) in almeno cinque frazioni consecutive. In ambedue i casi (sia che si usi una pompa di circolazione sia che si usi un vaso di livellamento), si deve eseguire una seconda prova con una velocità di flusso uguale alla metà di quella della prima prova. Se i risultati delle due prove concordano, la determinazione è soddisfacente. Se si misura una solubilità manifestamente superiore alla portata minore, il dimezzamento della velocità di flusso va proseguito finché due prove successive non forniscano lo stesso valore della solubilità. In entrambi i casi (utilizzando una pompa di circolazione od un recipiente di livellamento), l'eventuale presenza di materia colloidale va controllata tramite l'effetto Tyndall (diffusione della luce). La presenza di tali particelle toglie validità ai risultati e pertanto si deve ripetere la determinazione migliorando l'azione filtrante della colonna. Va registrato il pH di ogni campione. Deve essere eseguita una seconda prova alla stessa temperatura.

1.6.4. Metodo del matraccio

1.6.4.

1.6.4.1. Apparecchiatura Per il metodo del matraccio è necessario il seguente materiale:

normale strumentazione e vetreria di laboratorio,

un apparecchio adatto per l'agitazione delle soluzioni a temperatura costante e controllata,

una centrifuga (preferibilmente con termostato), se necessaria quando siano presenti emulsioni, e

apparecchiatura per determinazioni analitiche.

1.6.4.2. Procedimento di misura La quantità di materiale necessario per saturare il volume di acqua viene valutata in base alla prova preliminare. Il volume di acqua necessario dipenderà dal metodo analitico e dall'intervallo di solubilità. Una quantità di materiale pari a cinque volte quella determinata in conformità a quanto detto sopra viene pesata direttamente in tre recipienti di vetro (per esempio, provette da centrifuga, beute) provvisti di tappi di vetro. A ciascun recipiente viene aggiunto il volume prescelto di acqua e quindi i recipienti vengono chiusi ermeticamente. Questi sono poi agitati a 30 oC si deve utilizzare un apparecchio di agitazione o di mescolamento che funzioni a temperatura costante, per esempio un agitatore magnetico in bagno d'acqua termostato). Dopo un giorno, uno dei recipienti viene prelevato e riequilibrato per 24 ore alla temperatura della determinazione, con agitazione intermittente. Il contenuto del recipiente viene poi centrifugato alla temperatura di prova, e si misura con un opportuno metodo analitico ia concentrazione del composto nella fase acquosa limpida. Gli altri due recipienti vengono trattati in modo analogo dopo una equilibrazione iniziale a 30 oC per due e tre giorni, rispettivamente. Se i valori di concentrazione concordano, nei limiti richiesti per la riproducibilità, almeno per i due ultimi campioni, la prova è positiva. Se invece i dati relativi ai recipienti 1, 2 e 3 mostrano una tendenza verso valori crescenti, l'intera prova deve essere ripetuta utilizzando tempi di equilibrazione più lunghi. Il procedimento di misura può anche venire eseguito senza preincubazione a 30 oC. Allo scopo di stimare la velocità con cui si stabilisce l'equilibrio di saturazione, si prelevano dei campioni fino a che il tempo di agitazione non influisce più sulla concentrazione della soluzione di prova. Va riportato il pH di ciascun campione.

1.6.5. Analisi Per queste determinazioni va preferito un metodo analitico specifico per la sostanza in esame, poiché piccole quantità di impurezze solubili possono causare forti errori nella misura della solubilità. Esempi di tali metodi sono la gascromatografia, la cromatografia liquida, procedimenti di titolazione, procedimenti fotometrici, procedimenti voltammetrici.

2. DATI

2.

2.1. METODO DELL'ELUIZIONE SU COLONNA Per ciascuna prova si deve calcolare il valore medio di almeno cinque campioni consecutivi, prelevati in corrispondenza della fase di costanza di saturazione, nonché la deviazione standard. I risultati devono essere presentati in unità di massa per volume di soluzione. Le medie calcolate su due prove con l'utilizzo di portate differenti vengono confrontate e devono presentare una ripetibilità inferiore al 30 %.

2.2. METODO DEL MATRACCIO Si devono riportare i singoli risultati per ciascuno dei tre matracci e i risultati giudicati costanti (ripetibilità entro il 15 %) devono essere mediati e presentati in unità di massa per volume di soluzione. Ciò può richiedere la conversione delle unità di massa in unità di volume, utilizzando la densità quando la solubilità sia molto elevata (> 100 g/l).

3. RELAZIONE

3.

3.1. METODO DELLA ELUIZIONE SU COLONNA La relazione sulla prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

i risultati della prova preliminare,

la descrizione precisa della sostanza (identità e impurezze),

le concentrazioni, flussi e pH individuali di ciascun campione

le medie e le deviazioni standard di almeno cinque campioni nella zona di saturazione costante per ciascuna prova,

la media delle due prove successive accettabili,

la temperatura dell'acqua durante il processo di saturazione,

il metodo di analisi utilizzato,

la natura del materiale di supporto utilizzato,

il procedimento di carica del materiale di supporto,

il solvente utilizzato,

l'indicazione di eventuale instabilità chimica della sostanza durante la prova e il metodo utilizzato,

tutte le informazioni attinenti all'interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurezze e lo stato fisico della sostanza.

3.2. METODO DEL MATRACCIO La relazione sulla prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

i risultati della prova preliminare,

la descrizione precisa della sostanza (identità ed impurezze),

le singole determinazioni analitiche e la media nel caso in cui più di un valore sia stato determinato per ciascun matraccio,

il pH di ciascun campione,

la media dei valori per i diversi matracci, i cui risultati siano concordanti,

la temperatura di determinazione,

il metodo analitico utilizzato,

l'indicazione di eventuale instabilità chimica della sostanza durante la prova e il metodo utilizzato,

tutte le informazioni attinenti all'interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurezze e lo stato fisico della sostanza.

4.(1)(2)(3) BIBLIOGRAFIA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF T 20-045 (AFNOR) (September 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method. NF T 20-046 (AFNOR) (September 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.

A.8. COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE

A.8.

1. METODO Il metodo del dibattimento in pallone descritto è basato sulle linee direttrici OCSE (1).

1.

1.1. INTRODUZIONE Per eseguire questa prova è utile disporre di informazioni preliminari sulla formula di struttura, la costante di dissociazione, la solubilità in acqua, l'idrolisi, la solubilità in n-ottanolo e la tensione superficiale della sostanza. La misura sulle sostanze ionizzabili deve essere eseguita solo nella loro forma non ionizzata (acido libero o base libera), prodotta mediante l'uso di un tampone appropriato con un pH di almeno una unità inferiore (acido libero) o superiore (base libera) al pK. Questo metodo di prova include due procedure separate — il metodo dell'agitazione in pallone e la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Il primo può essere applicato quando il valore di log Poa (per le definizioni si veda più avanti) ricade nel campo da — 2 a 4 e il secondo nel campo da 0 a 6. Prima di eseguire una delle due procedure sperimentali, si deve ricavare una stima preliminare del coefficiente di ripartizione. Il metodo del dibattimento in pallone vale solo per sostanze essenzialmente pure, solubili in acqua e in n-ottanolo. Non è applicabile a materiali tensioattivi (per i quali si deve fornire un valore calcolato o una stima basata sulle solubilità individuali in n-ottanolo e in acqua). Il metodo HPLC non è applicabile ad acidi e basi forti, complessi metallici, materiali tensioattivi o sostanze che reagiscono con l'eluente. Per questi materiali, si deve fornire un valore calcolato o una stima basata sulle solubilità individuali in n-ottanolo e acqua. Il metodo HPLC è meno sensibile alla presenza di impurezze nei composto in esame che non il metodo dell'agitazione in pallone. Tuttavia, in alcuni casi, le impurezze possono rendere difficile l'interpretazione dei risultati perché l'assegnazione dei picchi diventa incerta. Per le miscele che forniscono una banda non risolta, si devono indicare i limiti inferiore e superiore di log P,

1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ Il coefficiente di ripartizione (P) si definisce come il rapporto tra le concentrazioni all'equilibrio (Ci) di una sostanza disciolta in un sistema costituito da due solventi pressoché immiscibili. Nel caso del n-ottanolo e dell'acqua: pow=cn-octanolcwater Il coefficiente di ripartizione (P) è pertanto il quoziente di due concentrazioni e viene generalmente espresso sotto forma del suo logaritmo decimale (log P).

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO

1.3. Metodo del dibattimento in pallone

Non è necessario utilizzare sostanze di riferimento ogni volta che si esamina una nuova sostanza. Esse servono principalmente per controllare periodicamente l'attendibilità del metodo e per permettere il confronto con risultati ottenuti mediante altri metodi.

Metodo HPLC

Allo scopo di correlare i dati di un composto misurati per HPLC con il suo P, si deve tracciare un grafico di taratura di log P contro i dati cromatografici utilizzando almeno 6 punti di riferimento. Sta all'utilizzatore selezionare le sostanze di riferimento appropriate. Se possibile, almeno un composto di riferimento deve avere un Poa al di sopra di quello della sostanza in esame e un altro un Poa al di sotto di quello della sostanza in esame. Per valori di log P minori di 4, la taratura può essere basata su dati ottenuti mediante il metodo del dibattimento in pallone. Per valori di log P maggiori di 4, la taratura può essere basata su valori di letteratura convalidati, purché siano in accordo con i valori calcolati. Per una migliore accuratezza, è preferibile scegliere composti di riferimento strutturalmente simili alla sostanza in esame. Sono disponibili elenchi estesi di valori di log Poa per molti gruppi di composti chimici (2) (3). Se non sono disponibili dati di coefficienti di ripartizione di composti strutturalmente simili, si può allora usare una taratura più generale basata su altri composti di riferimento. In appendice 2 è fornito un elenco di sostanze di riferimento raccomandate e dei loro valori di Poa.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO

1.4.

1.4.1. Metodo del dibattimento in pallone Per determinare il coefficiente di ripartizione è necessario raggiungere l'equilibrio tra tutti i componenti che interagiscono nel sistema, e si devono determinare le concentrazioni delle sostanze disciolte nelle due fasi. Un esame della letteratura sull'argomento indica che si possono utilizzare varie tecniche per risolvere questo problema, cioè l'accurata miscelazione delle due fasi seguita dalla loro separazione per poter determinare la concentrazione all'equilibrio della sostanza in esame.

1.4.2. Metodo HPLC La misura viene eseguita su colonne analitiche impaccate con una fase solida disponibile in commercio contenente idrocarburi a catena lunga (ad esempio C8, C18) chimicamente legati su silice. I prodotti chimici iniettati su una colonna si muovono lungo di essa a velocità differenti a causa del differente grado di ripartizione tra la fase mobile e la fase stazionaria idrocarbonica. Miscele di composti chimici vengono eluite nell'ordine della loro idrofobicità, dove i composti chimici solubili in acqua sono eluiti per primi e i composti chimici liposolubili per ultimi, in proporzione al loro coefficiente di ripartizione idrocarburo-acqua. Questo permette di stabilire la relazione esistente tra il tempo di ritenzione su tale colonna (a fase inversa) e il coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua. Il coefficiente di ripartizione viene dedotto dal fattore di capacità k, fornito dall'espressione: k=tR-toto in cui tr = tempo di ritenzione della sostanza in esame e to = tempo medio richiesto perché una molecola di solvente passi attraverso la colonna (tempo morto). Non sono richiesti metodi analitici quantitativi, ed è necessaria solo la determinazione dei tempi di eluizione.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ

1.5.

1.5.1. Ripetibilità

1.5.1. Metodo del dibattimento in pallone

Per assicurare l'accuratezza del coefficiente di ripartizione, vanno eseguite determinazioni in doppio in tre diverse condizioni sperimentali, così da poter variare la quantità della sostanza considerata nonché il rapporto tra i volumi dei solventi. I valori determinati per il coefficiente di ripartizione, espressi come logaritmi decimali, devono essere compresi in un intervallo di ±0,3 unità logaritmiche.

Metodo HPLC

Al fine di aumentare la validità della misura, si devono eseguire determinazioni in doppio. I valori di log P derivati dalle singole misure devono essere compresi in un intervallo di ±0,1 unità logaritmiche.

1.5.2. Sensibilità

1.5.2. Metodo del dibattimento in pallone

L'intervallo di misura del metodo è definito dal limite di rivelabilità del procedimento analitico. Questo deve essere sufficiente per permettere la valutazione dei valori di log Poa nel campo da — 2 a 4 (occasionalmente, quando si verificano le opportune condizioni, questo intervallo può essere esteso ad un log Poa fino a 5) quando la concentrazione del soluto in una delle due fasi non è superiore a 0,01 mol/l.

Metodo HPLC

Il metodo HPLC permette di stimare i coefficienti di ripartizione nel campo di log Poa da 0 a 6. Normalmente, il coefficiente di ripartizione di un composto può essere stimato entro ± 1 unità logaritmica del valore ottenibile con il metodo del dibattimento in pallone. In letteratura è possibile trovare correlazioni tipiche (4) (5) (6) (7) (8). Un'accuratezza più elevata si può in genere ottenere con grafici di correlazione basati su composti di riferimento di struttura simile (9).

1.5.3. Specificità

1.5.3. Metodo del dibattimento in pallone

La legge di ripartizione di Nernst si applica esclusivamente a soluzioni diluite a temperatura, pressione e pH costanti. Essa è rigorosamente valida solo per una sostanza pura dispersa tra due solventi puri. Qualora in una delle due fasi, od in ambedue, siano presenti più soluti diversi, ciò può alterare i risultati. La dissociazione o l'associazione delle molecole disciolte portano a deviazioni dalla legge di ripartizione di Nernst. Tali deviazioni sono evidenziate dal fatto che il coefficiente di ripartizione varia in funzione della concentrazione della soluzione. Dati gli equilibri multipli che hanno luogo, questo metodo non può essere applicato a composti ionizzabili senza ricorrere ad opportuni fattori di correzione. Per tali composti si deve prendere in considerazione l'uso di soluzioni tampone invece di acqua; il pH del tampone deve differire di almeno un'unità di pH dal pKa della sostanza, tenendo presente la significatività di questo pH per l'ambiente.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO

1.6.

1.6.1. Stima preliminare del coefficiente di ripartizione II coefficiente di ripartizione viene stimato preferibilmente utilizzando un metodo di calcolo (si veda l'appendice 1), o, dove appropriato, dal rapporto delle solubilità della sostanza in esame nei solventi puri (10).

1.6.2. Metodo del dibattimento in pallone

1.6.2.

1.6.2.1. Preparazione n-ottanolo: la determinazione del coefficiente di ripartizione deve essere eseguita con reattivi per analisi di elevata purezza. Acqua: va impiegata acqua distillata o bidistillata in apparecchi di vetro o quarzo. Per i composti ionizzabili, si devono usare soluzioni tampone al posto dell'acqua, se giustificato. Nota: Non si deve usare acqua prelevata direttamente da uno scambiatore di ioni.

1.6.2.1.

1.6.2.1.1. Presaturazione dei solventi Prima di determinare il coefficiente di ripartizione, le fasi del sistema di solventi devono essere mutuamente saturate mediante agitazione alla temperatura della determinazione. Per far ciò è vantaggioso agitare per 24 ore con un agitatore meccanico due grandi bottiglie di riserva contenenti rispettivamente n-ottanolo ed acqua, entrambi di grande purezza, addizionati ciascuno di una adeguata quantità dell'altro solvente, e poi lasciate riposare abbastanza a lungo da consentire la separazione delle fasi ed il raggiungimento dello stato di saturazione.

1.6.2.1.2. Preparazione per la determinazione L'intero volume del sistema bifasico deve riempire quasi completamente il recipiente di misura. Ciò permetterà di evitare le perdite di materiale per volatilizzazione. I rapporti in volume e le quantità delle sostanze da impiegare devono essere stabilite tenendo conto: Si eseguono tre determinazioni. Nella prima, si usa il rapporto in volume calcolato di n-ottanolo ad acqua; nella seconda, questo rapporto viene diviso per due; e nella terza questo rapporto viene moltiplicato per due (ad esempio 1:1, 1:2, 2:1).

della valutazione preliminare del coefficiente di ripartizione (si veda sopra),

della quantità minima di sostanza da esaminare per il procedimento analitico,

della limitazione della concentrazione ad un massimo di 0,01 mol/l per ognuna delle due fasi.

1.6.2.1.3. Sostanza da esaminare Si prepara una soluzione di riserva in n-ottanolo presaturato con acqua. La concentrazione di questa soluzione di riserva deve essere determinata con precisione prima di impiegarla nella determinazione del coefficiente di ripartizione. Questa soluzione deve essere conservata in condizioni che assicurino la sua stabilità.

1.6.2.2. Condizioni sperimentali La temperatura della determinazione deve essere mantenuta costante (± 1 oC) ed essere compresa nell'intervallo 20-25 oC.

1.6.2.3. Procedimento di misura

1.6.2.3.

1.6.2.3.1. Raggiungimento dell'equilibrio di ripartizione Per ciascuna condizione sperimentale si devono preparare in doppio i recipienti contenenti la quantità richiesta dei due solventi, esattamente misurata, insieme all'opportuna quantità della soluzione di riserva. Le fasi in n-ottanolo devono essere misurate in volume. I recipienti per la determinazione devono essere collocati in un opportuno agitatore o essere agitati manualmente. Un metodo raccomandato è quello di fare ruotare rapidamente di 180o la provetta da centrifuga intorno al suo asse trasversale in modo che l'eventuale aria intrappolata risalga attraverso le due fasi. L'esperienza ha mostrato che 50 rotazioni così effettuate sono in generale sufficienti per raggiungere l'equilibrio di ripartizione. Per sicurezza sono raccomandate 100 rotazioni in 5 minuti.

1.6.2.3.2. Separazioni delle fasi Quando è necessario, allo scopo di separare le fasi si deve effettuare una centrifugazione della miscela. Ciò dovrebbe essere fatto mediante una centrifuga da laboratorio mantenuta a temperatura ambiente o, se si usa una centrifuga non termostatata, le provette da centrifuga devono essere riequilibrate alla temperatura di determinazione per almeno 1 ora prima dell'analisi.

1.6.2.4. Analisi Per la determinazione del coefficiente di ripartizione è necessario misurare la concentrazione della sostanza in esame in ambedue le fasi. Ciò può essere fatto prelevando un'aliquota di entrambe le fasi da ciascuna provetta per ciascuna condizione sperimentale ed analizzando ciascuna aliquota mediante il procedimento prescelto. La quantità totale delle sostanze presenti in ambedue le fasi deve essere calcolata e confrontata con la quantità della sostanza inizialmente introdotta. Il prelievo di un campione della fase acquosa va eseguito con un procedimento che renda minimo il rischio di inclusione di tracce di n-ottanolo; a tal fine si può impiegare una siringa in vetro con ago asportabile. All'inizio, la siringa deve essere parzialmente riempita d'aria. L'aria deve essere espulsa cautamente mentre si inserisce l'ago attraverso lo strato di ottanolo. Si aspira nella siringa un adeguato volume di fase acquosa. Si toglie rapidamente la siringa dalla soluzione e si rimuove l'ago. Il contenuto della siringa può quindi essere impiegato come campione della fase acquosa. La concentrazione nelle due fasi separate va determinata preferibilmente attraverso un metodo specifico per la sostanza. Esempi di determinazioni chimico-fisiche che possono essere adatte sono i seguenti:

metodi fotometrici,

gascromatografia,

cromatografia liquida ad alte prestazioni.

1.6.3. Metodo HPLC

1.6.3.

1.6.3.1. Preparazione

1.6.3.1. Apparecchiatura

È necessario un cromatografo liquido equipaggiato con pompa esente da pulsazioni e con un adatto dispositivo di rivelazione. Si raccomanda di usare una valvola di iniezione con serbatoi di iniezione. La presenza di gruppi polari nella fase stazionaria può peggiorare gravemente le prestazioni della colonna HPLC. Pertanto, le fasi stazionarie devono contenere una percentuale minima di gruppi polari (11). Si possono usare riempimenti commerciali a fase inversa a microparticelle o colonne preimpaccate. Si può posizionare una colonna di protezione tra il sistema di iniezione e la colonna analitica.

Fase mobile

Per preparare il solvente di eluizione si usano metanolo per HPLC e acqua per HPLC e il solvente viene degassato prima dell'uso. Si deve ricorrere all'eluizione isocratica. Si devono usare rapporti metanolo/acqua con un contenuto minimo d'acqua del 25 %. Normalmente, una miscela metanolo/acqua 3:1 (v/v) è soddisfacente per eluire composti con log P 6 in un'ora ad una portata di 1 ml/min. Per composti con log P elevato, può essere necessario abbreviare il tempo di eluizione (e quello dei composti di riferimento) diminuendo la polarità della fase mobile oppure la lunghezza della colonna. Sostanze con solubilità molto bassa in n-ottanolo tendono a fornire dei valori anormalmente bassi di log Poa con il metodo HPLC; i picchi di tali composti accompagnano talvolta il fronte del solvente. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che il processo di ripartizione è troppo lento perché raggiunga l'equilibrio nel tempo normalmente richiesto da una separazione mediante HPLC. Una diminuzione del flusso e/o una diminuzione del rapporto metanolo/acqua può essere efficace per arrivare ad un valore affidabile. Il composto in esame e i composti di riferimento devono essere solubili nella fase mobile in concentrazioni sufficienti per permetterne la rivelazione. Solo in casi eccezionali si possono usare degli additivi con la miscela metanolo-acqua perché questi modificano le proprietà della colonna. Per i cromatografi con additivi, è obbligatorio usare una colonna separata dello stesso tipo. Se la miscela metanolo/acqua non è appropriata, si possono usare altre miscele solvente organico/acqua, ad esempio etanolo/acqua o acetonitrile/acqua. Il pH dell'eluente è critico per i composti ionizzabili. Esso deve rientrare nel campo operativo di pH della colonna, che di solito è compreso tra 2 e 8. Si raccomanda di tamponare la soluzione. Occorre aver cura di evitare la precipitazione di sali e il deterioramento della colonna che si verificano con alcune miscele di fase organica/tampone. Le misure mediante HPLC con fasi stazionarie a base di silice al di sopra di pH 8 non sono consigliabili perché l'uso di una fase mobile alcalina può provocare un rapido scadimento delle prestazioni della colonna.

Soluti

I composti di riferimento devono essere i più puri disponibili. I composti da usare a scopo di prova o di taratura devono, se possibile, essere disciolti nella fase mobile.

Condizioni sperimentali

La temperatura durante le misure non deve variare di oltre ± 2 K.

1.6.3.2. Misure

1.6.3.2. Calcolo del tempo morto to

Il tempo morto to può venire determinato usando o una serie omologa di sostanze (ad esempio n-alchilmetilchetoni) o composti organici non trattenuti (ad esempio tiourea o formammide). Per il calcolo del tempo morto to mediante l'uso di una serie omologa, si inietta una successione di almeno 7 elementi di una serie omologa e si determinano i rispettivi tempi di ritenzione. I tempi di ritenzione grezzi tr(nc +1) sono riportati in grafico in funzione di tr(nc), determinano la intercetta a e il coefficiente angolare b della equazione di regressione: tr(nc +1) = a + b tr(nc) (nc = numero di atomi di carbonio). Il tempo morto o è rappresentato allora da: t0 = a/(1 - b)

Grafico di taratura

La fase successiva consiste nella costruzione di un tracciato di correlazione di log k contro log P per appropriati composti di riferimento. Nella pratica, si effettua la determinazione su un gruppo di 5-10 composti standard di riferimento, il cui log P cade nei dintorni dell'intervallo previsto, iniettandoli simultaneamente ed effettuando preferibilmente la determinazione con un registratore integratore collegato al sistema di rivelazione. I logaritmi dei fattori di capacità corrispondenti, log k, vengono calcolati e riportati sul tracciato in funzione del log P determinato mediante il metodo del dibattimento in pallone. La taratura viene eseguita a intervalli regolari ed almeno una volta al giorno, in modo da tenere conto di possibili variazioni delle prestazioni della colonna.

Determinazioni del fattore di capacità della sostanza in esame

La sostanza in esame viene iniettata nella più piccola quantità possibile di fase mobile. Viene determinato il tempo di ritenzione (in doppio) e questo permette il calcolo del fattore di capacità k. Dal grafico di correlazione dei composti di riferimento, si può interpolare il coefficiente di ripartizione della sostanza in esame. Per coefficienti di ripartizione sia molto bassi che molto elevati è necessario ricorrere alla estrapolazione. In tali casi bisogna porre particolare attenzione ai limiti di validità della retta di regressione.

2. DATI

2. Metodo del dibattimento in pallone

L'affidabilità dei valori di P determinati può essere controllata confrontando le medie delle determinazioni in doppio con la media globale.

3. RELAZIONE La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

indicazione precisa della sostanza (identità e impurezze),

quando i metodi non siano applicabili (ad esempio materiale tensioattivo), deve essere fornito un valore calcolato o una stima basata sulle singole solubilità in n-ottanolo e acqua,

ogni informazione e osservazione significativa per l'interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurezze e lo stato fisico della sostanza.

il risultato dell'eventuale stima preliminare,

la temperatura di determinazione,

i dati sui procedimenti analitici impiegati per determinare le concentrazioni,

il tempo e la velocità di centrifugazione, se quest'ultima è stata applicata,

le concentrazioni misurate in ambedue le fasi per ciascuna determinazione (ciò significa che dovrà essere riportato un totale di 12 concentrazioni),

il peso della sostanza in esame, il volume di ciascuna fase impiegata in ciascun recipiente di prova e la quantità totale calcolata della sostanza in esame presente in ciascuna fase dopo equilibrazione,

i valori calcolati per il coefficiente di ripartizione (P), e le medie per ciascuna serie di condizioni sperimentali, nonché la media per tutte le determinazioni. Se esiste il sospetto di una dipendenza dalla concentrazione del coefficiente di ripartizione, ciò va menzionato nella relazione,

la deviazione standard dei singoli valori di P rispetto alla loro media,

il valore medio di P risultante da tutte le determinazioni deve pure essere espresso come logaritmo (base 10),

il valore teorico calcolato per Poa quando esso è stato determinato o quando il valore misurato è > 104,

il pH dell'acqua impiegata e della fase acquosa durante l'esperimento,

se vengono usati dei tamponi, giustificazione del loro uso al posto dell'acqua, composizione, concentrazione, e pH dei tamponi, pH della fase acquosa prima e dopo l'esperimento.

il risultato dell'eventuale stima preliminare,

sostanze in esame e di riferimento e loro purezza,

intervallo di temperatura delle determinazioni,

pH al quale vengono effettuate le determinazioni,

dettagli relativi alla colonna analitica e di protezione, alla fase mobile e al dispositivo di rivelazione,

dati di ritenzione e valori di log P desunti dalla letteratura per i composti di riferimento usati nella taratura,

dettagli della curva di regressione risultante (log k contro log P),

dati di ritenzione media e valore interpolato di log P per il composto in esame,

descrizione dell'apparecchiatura e delle condizioni operative,

profili di eluizione,

quantità delle sostanze in esame e di riferimento introdotte nella colonna,

tempo morto e metodo secondo il quale questo è stato misurato.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)

BIBLIOGRAFIA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A.J. Leo, Substiruent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medical Chemistry Project, 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1981, vol. 80, 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr, 1982, vol. 247, 1. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liquid, Chromat., 1984, vol. 7, 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houbenm Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/l, 223—339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ, Sci, Technol., 1974, vol. 8, 1113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984. Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.

A.9. PUNTO D'INFIAMMABILITÀ

A.9.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Prima di procedere all'esecuzione della prova sarà utile disporre di informazioni preliminari sulla infiammabilità della sostanza. Il metodo è applicabile a sostanze liquide i cui vapori possono infiammarsi mediante sorgenti di accensione. I metodi sperimentali elencati in questo testo sono affidabili solo per gli intervalli del punto di infiammabilità specificati nei singoli metodi. Quando si sceglie il metodo da usare, bisogna considerare la possibilità di reazioni chimiche tra la sostanza e il porta campioni.

1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ Il punto di infiammabilità è la temperatura più bassa, corretta alla pressione di 101,325 kPa, alla quale un liquido sviluppa vapori, nelle condizioni definite nel metodo sperimentale, in quantità tali da produrre una miscela vapore/aria infiammabile nel recipiente di prova. unità: oC t = T - 273,15 (t in oC e T in K)

1.4. PRINCIPIO DEL METODO La sostanza viene posta in un recipiente di prova e riscaldata o raffreddata alla temperatura sperimentale secondo la procedura descritta nei singoli metodi sperimentali. Vengono eseguite delle prove di accensione allo scopo di accertare se il campione si infiamma o non si infiamma alla temperatura di prova.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ

1.5.

1.5.1. Ripetibilità La ripetibilità varia secondo l'intervallo del punto di infiammabilità e secondo il metodo sperimentale usato; massimo 2 oC.

1.5.2. Sensibilità La sensibilità dipende dal metodo sperimentale applicato.

1.5.3. Specificità La specificità di alcuni metodi sperimentali è limitata a particolari intervalli di punto di infiammabilità e dipende dalle caratteristiche delle sostanze (come ad esempio una elevata viscosità).

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO

1.6.

1.6.1. Preparazioni Un campione della sostanza in esame viene posto in un apparecchio di prova in conformità a quanto indicato nei punti 1.6.3.1 e/o 1.6.3.2. Per ragioni di sicurezza, si raccomanda di usare un metodo che utilizzi un campione di piccole dimensioni, circa 2 cm3, per le sostanze di elevato contenuto energetico o tossiche.

1.6.2. Condizioni di prova L'apparecchio, nei limiti in cui ciò sia in linea con le esigenze di sicurezza, deve essere collocato lontano da correnti d'aria.

1.6.3. Esecuzione della prova

1.6.3.

1.6.3.1. Metodo dell'equilibrio Vedi norme ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523 e ISO 3679.

1.6.3.2. Metodo basato sul non equilibrio

1.6.3.2. Apparecchio di Abel:

Vedi norme BS 2000, parte 170, NF M07-011 e NF T66-009.

Apparecchio di Abel-Pensky:

Vedi norme EN 57, DIN 51755 — parte 1 — (per temperature comprese tra 5 oC e 65 oC) e DIN 51755 — parte 2 — (per temperature al di sotto di 5 oC), NF M07-036

Apparecchio di Tag:

Vedi norma ASTM D 56.

Apparecchio di Pensky-Martens:

Vedi norme ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34 e NF M 07-019.

Osservazioni:

Quando il punto di infiammabilità, determinato mediante un metodo non di equilibrio scelto tra quelli elencati al punto 1.6.3.2, risulta essere pari a 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC, o 55 ± 2 oC, occorre confermarlo con un metodo all'equilibrio, utilizzando la stessa apparecchiatura. Ai fini della notifica possono applicarsi solo i metodi che forniscono la temperatura del punto di infiammabilità. Per determinare il punto di infiammabilità di liquidi viscosi (vernici, gomme e prodotti analoghi) contenenti solventi, possono impiegarsi soltanto apparecchiature e metodi di prova adatti alla determinazione del punto di infiammabilità di liquidi viscosi. Vedi norme ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523 e DIN 53213, parte 1.

2. DATI

3. RELAZIONE La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

la descrizione precisa della sostanza (identità e impurezze presenti),

l'indicazione del metodo impiegato e di eventuali deviazioni da esso,

i risultati e tutte le osservazioni aggiuntive utili ai fini dell'interpretazione dei risultati.

4. BIBLIOGRAFIA Nessuna.

A.10. INFIAMMABILITÀ (SOLIDI)

A.10.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Prima di effettuare la prova sarà utile disporre di informazioni preliminari sulle eventuali proprietà esplosive della sostanza. La presente prova dovrebbe essere applicata esclusivamente a sostanze in polvere, granulari e pastose. Evitando di considerare tutte le sostanze capaci di infiammarsi e limitandosi soltanto a quelle che bruciano rapidamente o il cui comportamento alla combustione presenta particolari pericoli di qualsiasi genere, si considerano come facilmente infiammabili soltanto le sostanze la cui velocità di combustione supera un certo valore limite. Può essere particolarmente pericoloso se l'incandescenza si propaga lungo una polvere metallica a motivo della difficoltà di estinguere l'incendio. Le polveri metalliche sono da considerarsi facilmente infiammabili se sostengono la diffusione dell'incandescenza attraverso la massa entro un tempo specificato.

1.2. DEFINIZIONE E UNITÀ La velocità di combustione è espressa in secondi.

1.3. COMPOSTI DI RIFERIMENTO Non specificati.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO La sostanza viene sagomata in una striscia continua o in una miccia di polvere della lunghezza di circa 250 mm e si esegue una prova preliminare orientativa per determinare se, all'accensione mediante una fiamma gassosa, si verifica la propagazione per combustione con fiamma o senza fiamma. Se entro un tempo specificato si verifica la propagazione su 200 mm della massa di campione, allora si esegue un programma completo di prova per determinare la velocità di combustione.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ Non definiti.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO

1.6.

1.6.1. Prova preliminare orientativa La sostanza viene sagomata in una striscia continua o in una miccia di polvere per una lunghezza di circa 250 mm per 20 mm di larghezza per 10 mm di altezza su una lastra di base non combustibile, non porosa e di bassa conducibilità termica. Ad una estremità della miccia in polvere si applica una fiamma di alta temperatura generata da un bruciatore a gas (diametro minimo 5 mm) fino a che la polvere si accende oppure per un massimo di 2 minuti (5 minuti per polveri di metalli o leghe metalliche). Ciò che deve essere osservato è se la combustione si propaghi per 200 mm della miccia entro un tempo di prova di 4 minuti (o 40 minuti per polveri metalliche). Se la sostanza non si accende e non propaga la combustione bruciando con fiamma o senza fiamma su 200 mm della miccia di polvere entro 4 minuti (o 40 minuti) nel periodo di prova, allora la sostanza non è da considerarsi come facilmente infiammabile e non sono richieste ulteriori prove. Se la sostanza propaga la combustione per un tratto di 200 mm della miccia di polvere in meno di 4 minuti o in meno di 40 minuti per le polveri metalliche, si deve eseguire il procedimento descritto di seguito (punto 1.6.2. e successivi).

1.6.2. Prova della velocità di combustione

1.6.2.

1.6.2.1. Preparazione Le sostanze in polvere o granulari vengono introdotte in modo sfuso in uno stampo della lunghezza di 250 mm con sezione trasversale triangolare ed altezza interna di 10 mm e larghezza di 20 mm. Su ambedue i lati dello stampo, in senso longitudinale, sono montate due lastrine di metallo, con la funzione di limiti laterali; esse devono sporgere di 2 mm oltre il bordo superiore della sezione triangolare (vedi figura). Lo stampo viene poi lasciato cadere per tre volte su una superficie solida, dall'altezza di 2 cm. Se necessario, lo stampo viene nuovamente riempito. I limiti laterali vengono poi rimossi e la sostanza in eccesso viene asportata. Sopra allo stampo si pone una piastra non combustibile, non porosa e con una bassa conducibilità termica che funge da piastra di base, si rovescia l'apparecchio e si rimuove lo stampo. Le sostanze pastose sono sparse su una piastra di base non combustibile, non porosa e di bassa conducibilità termica in forma di un cordone della lunghezza di 250 mm con una sezione trasversale di circa 1 cm2.

1.6.2.2. Condizioni sperimentali Nel caso di una sostanza sensibile all'umidità, la prova deve essere effettuata con la massima rapidità possibile subito dopo aver tolto la sostanza stessa dal recipiente.

1.6.2.3. Esecuzione della prova Disporre il campione nella corrente di una cappa per l'aspirazione dei fumi. La velocità dell'aria deve essere sufficiente per impedire ai fumi di sfuggire verso il laboratorio e non deve venire modificata durante la prova. L'apparecchio deve essere schermato dalla corrente d'aria. Per accendere l'ammasso ad una estremità, si utilizza una fiamma calda di un bruciatore a gas (diametro minimo 5 mm). Quando l'ammasso è bruciato per un tratto di 80 mm, si misura la velocità di combustione sui successivi 100 mm. L'esperimento viene eseguito sei volte usando ogni volta una piastra pulita e fredda, salvo che si osservi prima un risultato positivo.

2. DATI Il tempo di combustione risultante dalla prova preliminare orientativa (1.6.1) e il minimo tempo di combustione su un massimo di sei prove (1.6.2.3) sono i dati utili ai fini della valutazione.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

l'indicazione esatta della sostanza (identificazione e impurezze),

una descrizione della sostanza esaminata e dei suo stato fisico, incluso il contenuto di umidità,

i risultati della prova preliminare orientativa e della prova della velocità di combustione, se eseguita,

tutte le osservazioni aggiuntive significative ai fini dell'interpretazione dei risultati.

3.2. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Le sostanze in polvere, granulari o pastose sono da considerarsi facilmente infiammabili se il tempo di combustione in una qualunque delle prove eseguite secondo la procedura sperimentale descritta al punto 1.6.2. è minore di 45 secondi. Le polveri di metalli o leghe metalliche sono considerate facilmente infiammabili quando sono suscettibili di accensione e la fiamma o la zona di reazione si propaga sull'intero campione in 10 minuti o meno.

4.(1) BIBLIOGRAFIA NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

A.11. INFIAMMABILITÀ (GAS)

A.11.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Questo metodo permette di determinare se gas miscelati con aria a temperatura ambiente (circa 20 oC) e pressione atmosferica sono infiammabili e, in tale caso, in quale intervallo di concentrazioni. Miscele a concentrazioni crescenti del gas in esame con l'aria vengono esposte a una scintilla elettrica e si osserva se ha luogo l'accensione.

1.2. DEFINIZIONE E UNITÀ L'intervallo d'infiammabilità è l'intervallo di concentrazione compreso fra il limite minimo e il limite massimo di esplosione. I limiti minimo e massimo di esplosione sono quei limiti di concentrazione del gas infiammabile in miscela con l'aria ai quali non si verifica la propagazione della fiamma.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Non specificate

1.4. PRINCIPIO DEL METODO La concentrazione del gas nell'aria viene aumentata gradualmente e ad ogni livello di concentrazione la miscela viene esposta ad una scintilla elettrica.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ Non stabiliti

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO

1.6.

1.6.1. Apparecchiatura Il recipiente di prova è costituito da un cilindro verticale di vetro con un diametro interno di almeno 50 mm ed un’altezza di 300 mm. Gli elettrodi di accensione, separati da una distanza di 3-5 mm, sono collocati 60 mm al di sopra del fondo del cilindro. Il cilindro è provvisto di un'apertura per lo sfogo della pressione. L'apparecchio deve essere schermato in modo da limitare gli eventuali danni dovuti ad esplosione. Come fonte di accensione si impiega una scintilla ad induzione permanente della durata di 0,5 s, generata da un trasformatore ad alto voltaggio con una tensione di uscita compresa fra 10 e 15 kV (potenza massima di entrata: 300 W). Un esempio di un apparecchio adatto è descritto nel riferimento bibliografico (2).

1.6.2. Condizioni sperimentali La prova deve essere eseguita a temperatura ambiente (circa 20 oC).

1.6.3. Esecuzione della prova Usando pompe dosatrici, si introduce nel cilindro di vetro una miscela gas/aria di concentrazione nota. Si fa passare una scintilla attraverso la miscela e si osserva se si stacca o no dalla fonte di accensione una fiamma che si propaga indipendentemente. La concentrazione del gas viene variata per incrementi dell'1 % in volume fino a quando si verifica l'accensione sopra descritta. Se la struttura chimica del gas indica che esso non dovrebbe essere infiammabile e si può calcolare la composizione della miscela stechiometrica con aria, si effettua allora la prova solo su miscele nell'intervallo dal 10 % al di sotto della composizione stechiometrica al 10 % al di sopra di questa composizione in incrementi dell'1 %.

2. DATI La propagazione della fiamma è l'unico fenomeno significativo per la determinazione di questa proprietà.

3. RELAZIONE La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

la descrizione esatta della sostanza (identità e impurezze presenti),

la descrizione dell'apparecchiatura utilizzata con l'indicazione delle dimensioni,

la temperatura alla quale la prova è stata eseguita,

le diverse concentrazioni impiegate e i risultati ottenuti,

il risultato della prova: gas non infiammabile o gas facilmente infiammabile,

se si conclude che il gas non è infiammabile, si deve allora dichiarare l'intervallo di concentrazioni nel quale esso è stato provato in incrementi dell'1 %;

tutte le informazioni e osservazioni significative per l'interpretazione dei risultati.

4.(1)(2) BIBLIOGRAFIA NF T 20-041 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W. Berthoid, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker und H. Schacke Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol. 56, 2, 126-127.

A.12. INFIAMMABILITÀ (CONTATTO CON L'ACQUA)

A.12.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Questo metodo sperimentale può essere usato per determinare se la reazione di una sostanza con acqua o aria umida porta allo sviluppo di quantità pericolose di gas che possono essere facilmente infiammabili. Il metodo è applicabile alle sostanze solide e liquide. Questo metodo non è applicabile a sostanze che si infiammano spontaneamente a contatto con l'aria.

1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ Facilmente infiammabili: sostanze che, a contatto con l'acqua o con l'aria umida, sviluppano gas facilmente infiammabili in quantità pericolose ad una velocità minima di 1 l/kg per ora.

1.3. PRINCIPIO DEL METODO La sostanza viene saggiata secondo il procedimento per gradi descritto nel seguito; se ad uno qualsiasi dei livelli si verifica l'accensione, non è necessario proseguire nella prova. Se è noto che la sostanza non reagisce violentemente con l'acqua, procedere allora al livello 4 (1.3.4).

1.3.

1.3.1. Livello 1 La sostanza in esame viene versata in un recipiente contenente acqua distillata a 20 oC e si osserva se il gas sviluppato si infiamma o meno.

1.3.2. Livello 2 La sostanza in esame viene posta su un foglio di carta da filtro galleggiante sulla superficie di un recipiente contenente acqua distillata a 20 oC e si osserva se il gas sviluppato si infiamma o meno. La carta da filtro ha semplicemente la funzione di evitare la dispersione della sostanza in acqua, aumentando così le possibilità di accensione.

1.3.3. Livello 3 La sostanza in esame viene disposta in forma approssimativamente cilindrica di circa 2 cm di altezza e 3 cm di diametro. Si aggiungono alcune gocce di acqua e si osserva se il gas sviluppato si infiamma.

1.3.4. Livello 4 La sostanza in esame viene mescolata con acqua distillata a 20 oC e si misura la velocità di sviluppo del gas per un periodo di 7 ore ad intervalli di un'ora. Se la velocità di formazione del gas non è costante, o è ancora in aumento dopo 7 ore, si deve prolungare il tempo di misurazione fino ad un massimo di 5 giorni. La prova può essere sospesa in qualsiasi momento se la velocità di sviluppo del gas supera 1 l/kg per ora.

1.4. SOSTANZA DI RIFERIMENTO Non specificata.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ Non stabiliti.

1.6. DESCRIZIONE DEI METODI

1.6.

1.6.1. Livello 1

1.6.1.

1.6.1.1. Condizioni di prova La prova va eseguita a temperatura ambiente (circa 20 oC).

1.6.1.2. Esecuzione della prova Una piccola quantità (2 mm circa di diametro; della sostanza da esaminare viene posta in un recipiente contenente acqua distillata. Si deve osservare: i) se si ha sviluppo di gas; ii) se si verifica l'accensione del gas. Se si verifica l'accensione del gas, non sono necessarie ulteriori prove, poiché la sostanza deve essere considerata pericolosa.

1.6.2. Livello 2

1.6.2.

1.6.2.1. Apparecchiatura Un foglio di carta da filtro viene fatto galleggiare sulla superficie di acqua distillata contenuta in un qualsiasi recipiente idoneo, ad esempio una capsula da evaporazione del diametro di 100 mm.

1.6.2.2. Condizioni di prova La prova va eseguita a temperatura ambiente (circa 20 oC).

1.6.2.3. Esecuzione della prova Una piccola quantità della sostanza in esame (2 mm circa di diametro) viene posta al centro del foglio di carta da filtro. Si deve osservare: i) se si ha sviluppo di gas; ii) se si verifica l'accensione del gas. Se si verifica l'accensione del gas, non sono necessarie ulteriori prove, poiché la sostanza deve essere considerata pericolosa.

1.6.3. Livello 3

1.6.3.

1.6.3.1. Condizioni di prova La prova deve essere eseguita a temperatura ambiente.

1.6.3.2. Esecuzione della prova La sostanza da esaminare viene disposta in forma approssimativamente cilindrica di circa 2 cm d'altezza e 3 cm di diametro, con una leggera concavità sulla cima. Si aggiungono alcune gocce di acqua e si osserva: i) se si ha sviluppo di gas; ii) se si verifica l'accensione del gas. Se si verifica l'accensione del gas, non sono necessarie ulteriori prove, poiché la sostanza deve essere considerata pericolosa.

1.6.4. Livello 4

1.6.4.

1.6.4.1. Apparecchiatura L'apparecchiatura viene montata come mostrato in figura.

1.6.4.2. Condizioni di prova Controllare il contenitore della sostanza da esaminare per accertare l'eventuale presenza di polveri al di sotto di 500 μm (dimensioni delle particelle). Se il contenuto in polvere supera l'1 % (p/p) del totale, o se il campione è friabile, tutta la sostanza deve essere ridotta in polvere prima della prova, per tener conto della riduzione di formato delle particelle durante l'immagazzinamento e la manipolazione; in caso contrario, la sostanza deve essere saggiata così come ricevuta. La prova deve essere eseguita a temperatura ambiente (circa 20 oC) e a pressione atmosferica.

1.6.4.3. Esecuzione della prova Si introducono da 10 a 20 ml d'acqua nel contagocce dell'apparecchiatura e 10 g di sostanza nella beuta. Il volume del gas sviluppato può essere misurato mediante qualsiasi mezzo opportuno. L'imbuto del contagocce viene aperto per immettere l'acqua nella beuta e si avvia un cronometro. Lo sviluppo del gas viene misurato ogni ora per un periodo di 7 ore. Se durante questo periodo lo sviluppo del gas è irregolare o se, al termine di questo periodo, la velocità di sviluppo del gas è in aumento, le misure devono essere continuate fino a 5 giorni. Se in qualunque momento durante la misura la velocità di sviluppo del gas è superiore a 1 l/kg per ora, la prova può essere interrotta. La prova va eseguita in triplo. Se l'identità chimica del gas è sconosciuta, il gas deve essere analizzato. Quando il gas contiene componenti facilmente infiammabili e non si sa se l'intera miscela sia facilmente infiammabile, si deve preparare e saggiare secondo il metodo A.11 una miscela avente la stessa composizione.

2. DATI La sostanza viene considerata pericolosa se:

a qualsiasi livello della procedura sperimentale si verifica l'accensione spontanea, o

avviene uno sviluppo di gas infiammabile ad una velocità maggiore dì 1 l/kg della sostanza per ora.

3. RELAZIONE La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

l'indicazione precisa della sostanza (identificazione e impurezze),

dettagli dell'eventuale preparazione iniziale della sostanza in esame,

i risultati delle prove (livelli 1, 2, 3 e 4),

l'identità chimica del gas sviluppato,

la velocità di sviluppo del gas se viene eseguito il livello 4 (1.6.4),

ogni ulteriore osservazione significativa ai fini dell'interpretazione dei risultati.

4.(1)(2) BIBLIOGRAFIA Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

A.13. PROPRIETÀ PIROFORICHE DI SOLIDI E LIQUIDI

A.13.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE La procedura sperimentale può essere applicata a sostanze solide o liquide che, in piccole quantità, si accendano spontaneamente poco tempo dopo essere venute in contatto con l'aria a temperatura ambiente (circa 20 oC). Questo metodo di prova non considera le sostanze che devono essere esposte all'aria per ore o giorni a temperatura ambiente o a temperature elevate prima che si verifichi l'accensione.

1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ Si considera che una sostanza presenti proprietà piroforiche se si accende o carbonizza nelle condizioni descritte in 1.6. Può anche essere necessario controllare l'autoinfiammabilità dei liquidi usando il metodo A.15 (Temperatura di autoaccensione liquidi e gas).

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Non specificate.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO La sostanza solida o liquida viene aggiunta ad un veicolo inerte e portata in contatto con aria a temperatura ambiente per un periodo di 5 minuti. Se le sostanze liquide non si accendono, esse vengono assorbite su carta da filtro ed esposte all'aria a temperatura ambiente (circa 20 oC) per 5 minuti. Se un solido o un liquido si infiammano, o se un liquido provoca l'accensione o la carbonizzazione della carta da filtro, la sostanza è considerata piroforica.

1.5. CRITERIO DI QUALITÀ Ripetibilità: per motivi di sicurezza, un singolo risultato positivo è sufficiente perché la sostanza sia considerata piroforica.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA

1.6.

1.6.1. Apparecchiatura Una capsula di porcellana del diametro di circa 10 cm viene riempita con farina di diatomee per un'altezza di circa 5 mm a temperatura ambiente (circa 20 oC). Nota: La farina di diatomee, o qualsiasi altra sostanza inerte paragonabile facilmente reperibile, sarà considerata rappresentativa di un suolo su cui può riversarsi, in caso di incidente, la sostanza in esame. Per l'analisi di liquidi che non si accendono a contatto con l'aria quando siano in contatto con un veicolo inerte, è necessaria carta da filtro asciutta.

1.6.2. Esecuzione della prova

1.6.2. a)

Solidi in polvere Da 1 a 2 cm3 della sostanza in polvere da esaminare vengono versati da un'altezza di circa 1 m su una superficie non combustibile e si osserva se la sostanza si infiamma durante la caduta o entro 5 minuti dopo la caduta. La prova viene eseguita fino a quando si verifica l'accensione, per un massimo di 6 volte.

Liquidi Circa 5 cm3 del liquido in esame vengono versati nella capsula di porcellana preparata e si osserva se la sostanza si infiamma entro 5 minuti. Se nelle 6 prove non si verifica accensione, eseguire la prova seguente: un campione da 0,5 ml viene applicato mediante siringa su una carta da filtro dentellata e si osserva se avviene l'accensione o la carbonizzazione della carta da filtro entro 5 minuti dall'aggiunta del liquido. La prova viene eseguita fino a quando si verifica l'accensione o la carbonizzazione, per un massimo di tre volte.

2. DATI

2.

2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI La prova può essere interrotta non appena si verifichi un risultato positivo in una qualunque delle prove.

2.2. VALUTAZIONE Se la sostanza si accende entro 5 minuti da quando viene aggiunta ad un veicolo inerte ed esposta all'aria, oppure se una sostanza liquida carbonizza o provoca l'accensione di una carta da filtro entro 5 minuti da quando è stata aggiunta ed esposta all'aria, tale sostanza viene considerata piroforica.

3. RELAZIONE La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

l'indicazione precisa della sostanza (identificazione e impurezze),

i risultati delle prove,

ogni ulteriore osservazione significativa ai fini dell'interpretazione dei risultati.

4.(1)(2) BIBLIOGRAFIA NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14. PROPRIETÀ ESPLOSIVE

A.14.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Il metodo fornisce uno schema di prove per determinare se una sostanza solida o pastosa presenti un pericolo di esplosione quando viene sottoposta all'effetto di una fiamma (sensibilità termica) o ad urti o sfregamenti (sensibilità agli stimoli meccanici) e se una sostanza liquida presenti un pericolo di esplosione quando viene sottoposta all'effetto di una fiamma o di un urto. Il metodo comprende tre parti: Il metodo fornisce dei dati per valutare la probabilità che certe sollecitazioni comuni possano dar luogo ad una esplosione. Il metodo non è previsto per stabilire se una sostanza sia in grado di esplodere in qualsiasi condizione. Il metodo è appropriato per determinare se una sostanza presenti un pericolo di esplosione (sensibilità termica e meccanica) nelle particolari condizioni specificate nella direttiva. Questo metodo è basato su un certo numero di tipi di apparecchi ampiamente usati a livello internazionale (1) e che danno normalmente dei risultati significativi. Si riconosce che il metodo non è definitivo. Apparecchi alternativi a quelli specificati possono essere usati purché siano internazionalmente riconosciuti e i risultati possano adeguatamente venire correlati con quelli ricavabili dall'apparecchio specificato. Non è necessario eseguire le prove quando le informazioni termodinamiche disponibili (ad esempio il calore di formazione, calore di decomposizione) e/o l'assenza di certi gruppi reattivi (2) nella formula di struttura permettano di stabilire al di là di ogni ragionevole dubbio che la sostanza non è soggetta a rapida decomposizione con sviluppo di gas o liberazione di calore (cioè che il materiale non presenta alcun rischio di esplosione). Per i liquidi non è richiesto un saggio di sensibilità allo sfregamento.

1.1. a)

una prova di sensibilità termica (1);

una prova di sensibilità meccanica relativa agli urti (1);

una prova di sensibilità meccanica relativa allo sfregamento (1).

1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ Esplosivi: Sostanze che possono esplodere sotto l'effetto di una fiamma o che sono sensibili agli urti o all'attrito nell'apparecchiatura specificata (o che presentano una sensibilità meccanica maggiore dell’1,3-dinitrobenzene in un apparecchio alternativo).

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO 1,3-dinitrobenzene tecnico cristallino passante un setaccio da 0,5 mm per il metodo dello sfregamento e dell'urto. Peridro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX, esogeno, ciclonite — CAS 121-82-4), ricristallizzata da cicloesanone acquoso, setacciata a umido attraverso un setaccio da 250 μm e trattenuta su un setaccio da 150 μm, essiccata a 103 ± 2 oC (per 4 ore) per la seconda serie di prove di sfregamento e urto.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO Per stabilire le condizioni di sicurezza per l'esecuzione delle tre prove di sensibilità sono necessarie delle prove preliminari.

1.4.

1.4.1. Prove di sicurezza di manipolazione (3) Per ragioni di sicurezza, prima di eseguire le prove principali campioni molto piccoli (circa 10 mg) della sostanza vengono sottoposti a riscaldamento senza restrizioni fisiche in una fiamma gassosa, ad urti in qualunque tipo di apparecchio adatto e allo sfregamento con l'impiego di un mazzuolo contro un incudine o qualsiasi altro tipo di macchina che produca attrito. Obiettivo della prova è di stabilire se la sostanza sia sensibile ed esplosiva in misura tale che le prove di sensibilità prescritte, in particolare quella della sensibilità termica, debbano essere eseguite con precauzioni particolari per evitare danni all'operatore.

1.4.2. Sensibilità termica Il metodo prevede di riscaldare la sostanza in un tubo d'acciaio chiuso con piastre forate di differente diametro del foro per determinare se la sostanza tenda ad esplodere nelle condizioni di intensa sollecitazione termica e delimitazione spaziale definita.

1.4.3. Sensibilità meccanica (urti) Il metodo prevede di sottoporre la sostanza all'urto di una massa specificata lasciata cadere da un'altezza specificata.

1.4.4. Sensibilità meccanica (sfregamento) Il metodo prevede di sottoporre le sostanze solide o pastose ad attrito tra superfici standard in condizioni specificate di carico e movimento relativo.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ Non stabiliti.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO

1.6.

1.6.1. Sensibilità termica (effetto di una fiamma)

1.6.1.

1.6.1.1. Apparecchiatura L'apparecchiatura è costituita da un tubo d'acciaio non riutilizzabile con il suo dispositivo di chiusura riutilizzabile (figura 1), installato in un dispositivo di riscaldamento e protezione. Ciascun tubo è ottenuto per imbutitura da una lamiera d'acciaio (vedi appendice) e presenta un diametro interno di 24 mm, una lunghezza di 75 mm e uno spessore delle pareti di 0,5 mm. I tubi sono flangiati all'estremità aperta per permetterne la chiusura mediante la piastra forata. Questa è costituita da una piastra forata resistente alle alte pressioni, dotata di un foro centrale, saldamente fissata ad un tubo con un giunto a vite a due parti (dado e collare filettato). Il dado e il collare filettato sono in acciaio al cromo-manganese (vedi appendice) che non genera scintille fino a 800 oC. Le piastre forate hanno uno spessore di 6 mm, sono in acciaio resistente al calore (vedi appendice) e sono disponibili con aperture di vario diametro.

1.6.1.2. Condizioni di prova Normalmente la sostanza viene controllata cosi come fornita, benché in certi casi, ad esempio se è pressata, colata o altrimenti condensata, possa essere necessario triturarla prima di esaminarla. Per i solidi, la massa di materiale da usarsi in ciascuna prova viene determinata secondo un procedimento a secco in due stadi. Un tubo tarato viene riempito con 9 cm3 di sostanza e la sostanza viene compattata con una forza di 80 N applicata alla sezione trasversale totale del tubo. Per ragioni di sicurezza o nei casi in cui la forma fisica del campione possa essere modificata per compressione, si possono usare differenti procedure di riempimento; ad esempio, se la sostanza è molto sensibile all'attrito la pigiatura non è appropriata. Se il materiale è comprimibile, se ne aggiunge dell'altro e lo si pigia fino a che il tubo è riempito fino a 55 mm dal bordo. Si determina la massa totale usata per riempire il tubo fino al livello di 55 mm e se ne aggiungono due ulteriori aliquote, pigiata ciascuna con una forza di 80 N. Poi, secondo le necessità, si aggiunge ulteriore materiale pigiandolo oppure lo si toglie per lasciare il rubo riempito fino a 15 mm dal bordo. Si esegue una seconda prova a secco partendo con una quantità pigiata pari a un terzo della massa totale trovata nella prima prova a secco. Si aggiungono altre due di queste aliquote pigiandole a 80 N e il livello della sostanza nel tubo viene regolato a 15 mm dal bordo mediante l'aggiunta o la sottrazione di materiale secondo le necessità. La quantità di solido usata in ciascuna prova è quella determinata nella seconda prova a secco; il riempimento viene eseguito in tre quantità uguali, compresse ciascuna a 9 cm3 con la forza necessaria, qualunque essa sia. (Ciò può essere facilitato mediante l'uso di anelli distanziatori.) I liquidi e i gel sono caricati nel tubo fino ad un'altezza di 60 mm ponendo particolare attenzione con i gel per impedire la formazione di vuoti. Il collare filettato viene fatto scivolare sul tubo dal basso, si inserisce l'appropriato piatto forato e si serra il dado dopo aver applicato un po' di lubrificante a base di disolfuro di molibdeno. È essenziale controllare che non vi sia sostanza intrappolata tra la flangia e la piastra né nella filettatura. Per il riscaldamento si utilizza propano prelevato da una bombola industriale dotata di regolatore di pressione (60-70 mbar), passandolo attraverso un manometro e distribuendolo in modo uniforme (come indicato dall'osservazione visiva delle fiamme uscenti dai bruciatori) a 4 bruciatori mediante un collettore. I bruciatori sono disposti intorno alla camera di prova come mostrato in figura 1. I quattro bruciatori hanno un consumo totale di circa 3,2 litri di propano al minuto. È possibile usare gas combustibili e bruciatori alternativi, ma la velocità di riscaldamento deve essere quella specificata in figura 3. Per tutte le apparecchiature, si deve controllare periodicamente la velocità di riscaldamento con l'uso di tubi riempiti di dibutilftalato, come indicato in figura 3.

1.6.1.3. Esecuzione delle prove Ciascuna prova viene eseguita fino a quando il tubo si frammenta o è stato riscaldato per 5 minuti. Una prova che dia come risultato la frammentazione del tubo in tre o più pezzi, che in alcuni casi possono essere collegati uno all'altro da sottili strisce di metallo come è illustrato in figura 2, viene valutata come esplosione. Se una prova dà come risultato un minor numero di frammenti o nessuna frammentazione, si considera che non abbia dato luogo ad esplosione. Si esegue inizialmente una serie di tre prove con una piastra con orificio da 6,0 mm di diametro e, se non si ottengono esplosioni, si esegue una seconda serie di tre prove con una piastra avente un orificio del diametro di 2,0 mm. Se avviene un'esplosione durante una delle serie di prova non sono necessarie prove ulteriori.

1.6.1.4. Valutazione II risultato della prova è considerato positivo se si verifica un'esplosione in una delle serie di prove sopra descritte.

1.6.2. Sensibilità meccanica (urti)

1.6.2.

1.6.2.1. Apparecchiatura (figura 4) Le parti essenziali di una tipica apparecchiatura a martello cadente sono un blocco d'acciaio fuso con base, incudine, colonna, guide, pesi cadenti, dispositivo di rilascio e porta campione. L'incudine d'acciaio da 100 mm di diametro per 70 mm di altezza è avvitata su un blocco d'acciaio da 230 mm di lunghezza per 250 mm di larghezza per 200 mm d'altezza con una base fusa da 450 mm di lunghezza per 450 mm di larghezza per 60 mm d'altezza. Sul retro del blocco d'acciaio è avvitato un sostegno nel quale è fissata una colonna in tubo d'acciaio trafilato senza saldatura. Quattro viti ancorano l'apparecchio ad un blocco massiccio di cemento da 60 × 60 × 60 cm in modo che le guide siano assolutamente verticali e il peso cadente possa cadere liberamente. Per l'uso sono disponibili pesi di acciaio massiccio da 5 e 10 kg. La testa di impatto dei pesi è di acciaio temprato da 60 a 63 HRC e presenta un diametro minimo di 25 mm. Il campione da esaminare viene posto in un dispositivo per prove d'urto costituito da due cilindri massicci d'acciaio coassiali e sovrapposti in un cilindro cavo d'acciaio che funge da guida. I cilindri d'acciaio massiccio devono avere un diametro di 10 (-0,003, -0,005) mm e un'altezza di 10 mm e superfici levigate, spigoli arrotondati (raggio di curvatura 0,5 mm) e una durezza HRC da 58 a 65. Il cilindro cavo deve avere un diametro esterno di 16 mm, un foro levigato di 10 (+0,005, +0,010) mm e un'altezza di 13 mm. Il dispositivo per le prove d'urto è montato su un'incudine intermedia d'acciaio (diametro 26 mm, altezza 26 mm) e centrato mediante un anello con fori di sfogo dei fumi.

1.6.2.2. Condizioni sperimentali Il volume del campione dovrebbe essere di 40 mm3, o un volume adatto per eventuali apparecchi alternativi. Le sostanze solide dovrebbero essere provate allo stato secco e preparate come segue: Le sostanze che si presentano normalmente sotto forma di pasta dovrebbero essere saggiate per quanto possibile alla stato secco o comunque dopo aver rimosso la maggior quantità possibile di diluente.

1.6.2.2. a)

le sostanze in polvere sono setacciate (maglie da 0,5 mm); per le prove si usa tutto il materiale passato attraverso il setaccio;

le sostanze pressate, fuse o altrimenti condensate vengono rotte in pezzettini e setacciate. Per le prove si usa la frazione di setacciatura compresa tra 0,5 e 1 mm di diametro, e questa deve essere rappresentativa della sostanza originale.

1.6.2.3. Esecuzione delle prove Si esegue una serie di 6 prove lasciando cadere la massa di 10 kg da 0,40 m (40 J). Se durante le sei prove a 40 J si ottiene un'esplosione, si deve eseguire una serie ulteriore di 6 prove lasciando cadere una massa di 5 kg da 0,15 m (7,5 J). In altri apparecchi, il campione viene confrontato con la sostanza di riferimento scelta usando una procedura di provata validità (ad esempio tecnica su e giù, ecc.).

1.6.2.4. Valutazione Il risultato della prova viene considerato positivo se si verifica un'esplosione (l'accensione violenta e/o un colpo sono equivalenti a un'esplosione) almeno una volta in qualsiasi delle prove con l'apparecchio per prove d'urto specificato oppure se il campione è più sensibile dello 1,3-dinitrobenzene o della RDX in una prova d'urto alternativa.

1.6.3. Sensibilità meccanica (attrito)

1.6.3.

1.6.3.1. Apparecchiatura (figura 5) L'apparecchiatura per le prove d'attrito è costituita da una piastra di base d'acciaio fuso sulla quale è montato il dispositivo di sfregamento, costituito da una barra fissa di porcellana con una piastra mobile di porcellana. La piastra di porcellana è tenuta in una slitta che corre su due guide. La slitta è collegata ad un motore elettrico mediante un'asta di collegamento, un eccentrico e una trasmissione adatta perché la piastra di porcellana venga spostata, una sola volta, avanti e indietro sotto la barra di porcellana per un tratto di 10 mm. La barra di porcellana può essere sottoposta ad un carico per esempio di 120 o 360 newton. Le piastre di porcellana piatte sono fatte di porcellana tecnica bianca (ruvidità da 9 a 32 μm) e hanno le seguenti dimensioni: 25 mm di lunghezza × 25 mm di larghezza × 5 mm di altezza. La barra cilindrica di porcellana è fatta anch'essa di porcellana bianca tecnica ed ha una lunghezza di 15 mm, un diametro di 10 mm e superfici terminali sferiche irruvidite con un raggio di curvatura di 10 mm.

1.6.3.2. Condizioni sperimentali Il volume del campione dovrebbe essere di 10 mm3 o un volume adatto ad eventuale apparecchio alternativo. Le sostanze solide sono controllate allo stato secco e preparate come segue: Le sostanze che si presentano normalmente sotto forma di pasta devono essere provate per quanto possibile allo stato secco. Se la sostanza non può essere preparata allo stato secco, la pasta (dopo rimozione della maggior quantità possibile di diluente) viene provata in forma di una pellicola da 0,5 mm di spessore, 2 mm di larghezza e 10 mm di lunghezza preparata con un attrezzo opportuno.

1.6.3.2. a)

le sostanze in polvere sono setacciate (maglie da 0,5 mm); per la prova si utilizza tutto il materiale passato attraverso il setaccio;

le sostanze pressate, fuse o altrimenti condensate vengono rotte in pezzettini e setacciate. La frazione di setacciatura < 0,5 mm viene usata per le prove.

1.6.3.3. Esecuzione delle prove La base di porcellana viene portata sul campione in esame e si applica il peso. Durante l'esecuzione della prova, la struttura spugnosa superficiale della piastra di porcellana deve giacere trasversalmente rispetto alla direzione di movimento. Bisogna fare attenzione che la barra sia appoggiata sul campione, che vi sia una quantità sufficiente di materiale in esame sotto alla barra e inoltre che la piastra si muova correttamente sotto la barra. Per le sostanze pastose si usa un calibro dello spessore di 0,5 mm con una fessura da 2 × 10 mm per applicare la sostanza alla piastra. La piastra di porcellana deve muoversi 10 mm avanti e indietro sotto alla barra di porcellana in un tempo di 0,44 secondi. Ciascuna parte della superficie della piastra e della barra deve essere usata una sola volta; le due estremità di ciascuna barra serviranno per due prove e le due superfici di una piastra serviranno ciascuna per tre prove. Si esegue una serie di sei prove con un carico di 360 N. Se in queste sei prove si ottiene un evento positivo, si deve eseguire un'ulteriore serie di sei prove con un carico di 120 N. In altri apparecchi, il campione viene confrontato con la sostanza di riferimento scelta usando una procedura di provata validità (ad esempio tecnica su e giù, ecc.).

1.6.3.4. Valutazione Il risultato della prova viene considerato positivo se si verifica un'esplosione (crepitio e/o una accensione violenta o una fiammata sono equivalenti ad un'esplosione) almeno una volta in una qualunque delle prove con l'apparecchio di attrito specificato o se soddisfa i criteri equivalenti in una prova di attrito alternativa.

2. DATI In linea di principio, si considera che una sostanza presenti un pericolo di esplosione ai sensi della direttiva se si ottiene un risultato positivo nella prova di sensibilità termica, agli urti o all'attrito.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

identità, composizione, purezza, umidità e così via della sostanza esaminata,

la forma fisica del campione e se esso sia o no stato macinato, triturato e/o setacciato,

osservazioni effettuate durante le prove di sensibilità termica (ad esempio massa del campione, numero di frammenti),

osservazioni eseguite durante le prove di sensibilità meccanica (ad esempio la formazione di quantità considerevoli di fumo o la decomposizione completa senza accensione violenta, fiamme, scintille, crepitii, ecc.),

risultati di ciascun tipo di prova,

se è stato usato un apparecchio alternativo, bisogna fornire una giustificazione scientifica e una prova della correlazione tra i risultati ottenuti con l'apparecchio specificato e quelli ottenuti con l'apparecchio equivalente,

qualsiasi commento utile, come riferimenti a prove con prodotti simili, che possono essere significativi per una corretta interpretazione dei risultati,

tutte le osservazioni addizionali significative per l'interpretazione dei risultati.

3.2. INTERPRETAZIONE E VALUTAZIONE DEI RISULTATI La relazione di prova deve citare gli eventuali risultati considerati falsi, anormali o non rappresentativi. Se qualcuno dei risultati deve essere scartato, deve essere fornita una spiegazione e i risultati di prove alternative o complementari. I risultati anormali, salvo che essi possano venire spiegati, devono essere accettati con i valori sperimentali e usati per classificare conformemente la sostanza.

4.(1)(2)(3)(4)

BIBLIOGRAFIA Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 and 30-42. NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial use — Determination of explosion risk.

A.15. TEMPERATURA DI AUTOACCENSIONE (LIQUIDI E GAS)

A.15.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE A questa prova non devono essere sottoposte le sostanze esplosive e le sostanze che si accendono spontaneamente a contatto con l'aria a temperatura ambiente. La procedura d'esame è applicabile a gas, liquidi e vapori che in presenza dell'aria possono essere infiammati da una superficie calda. La temperatura di autoaccensione può essere ridotta considerevolmente dalla presenza di impurezze catalitiche, dal materiale della superficie o da un maggiore volume del recipiente di prova.

1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ Il grado di autoinfiammabilità è espresso in termini di temperature di autoaccensione. La temperatura di autoaccensione è la temperatura minima alla quale la sostanza in esame si infiamma quando sia miscelata con aria nelle condizioni definite nel metodo di prova.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Le sostanze di riferimento sono citate nelle norme (vedi 1.6.3). Queste sostanze servono principalmente per verificare periodicamente la precisione del metodo e per permettere il confronto coi risultati ottenuti mediante altri metodi.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO Il metodo determina la temperatura minima della superficie interna di un recipiente chiuso che da luogo all'accensione di un gas, vapore o liquido iniettato nel recipiente chiuso.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ La ripetibilità varia secondo l'intervallo delle temperature di autoaccensione e il metodo di prova usato. La sensibilità e la specificità dipendono dal metodo di prova utilizzato.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO

1.6.

1.6.1. Apparecchiatura L'apparecchiatura è descritta nel metodo di cui al punto 1.6.3.

1.6.2. Condizioni di prova Un campione della sostanza in esame viene saggiato in conformità al metodo di cui al punto 1.6.3.

1.6.3. Esecuzione della prova Vedi IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. DATI Registrare la temperatura di prova, la pressione atmosferica, la quantità di campione usato e l'intervallo di tempo dopo il quale si verifica l'accensione.

3. RELAZIONE La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

l'indicazione precisa della sostanza (identificazione e impurezze),

la quantità di campione usato, la pressione atmosferica,

l'apparecchiatura usata,

i risultati delle misure (temperature di prova, risultati relativi all'accensione, e corrispondenti ritardi temporali),

tutte le osservazioni aggiuntive significative per l'interpretazione dei risultati.

4. BIBLIOGRAFIA Nessuna.

A.16. TEMPERATURA DI AUTOACCENSIONE RELATIVA DEI SOLIDI

A.16.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Non devono essere sottoposte a questa prova le sostanze esplosive e le sostanze che si infiammano spontaneamente a contatto con l'aria a temperatura ambiente. Lo scopo della prova è di fornire informazioni preliminari sull'autoinfiammabilità di sostanze solide a temperature elevate. Se il calore sviluppato dalla reazione della sostanza con l'ossigeno o dalla sua decomposizione esotermica non viene ceduto con sufficiente rapidità all'ambiente circostante, si ha un autoriscaldamento che porta all'autoaccensione. L'autoaccensione si verifica quindi quando la velocità di produzione di calore supera quella della sua dispersione. Il procedimento è utile come saggio preliminare per le sostanze solide. Data la complessità dei processi di accensione e di combustione dei solidi, la temperatura di autoaccensione determinata con questo metodo deve essere utilizzata soltanto a scopo di confronto.

1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ La temperatura di autoaccensione ottenuta secondo il presente metodo è la minima temperatura, espressa in oC, alla quale un dato volume di una sostanza si infiamma in determinate condizioni.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO In un forno a temperatura ambiente viene posto un certo volume della sostanza da esaminare; si registra la curva temperatura/tempo relativa alle condizioni esistenti al centro del campione mentre la temperatura del forno viene aumentata fino a 400 oC o fino al punto di fusione, se inferiore, ad una velocità di 0,5 oC/min. Ai fini di questa prova, la temperatura del forno alla quale la temperatura del campione raggiunge i 400 oC per autoriscaldamento è detta temperatura di autoaccensione.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ Nessuno.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO

1.6.

1.6.1. Apparecchiatura

1.6.1.

1.6.1.1. Forno Forno da laboratorio a temperatura programmata (volume circa 2 litri) con circolazione d'aria naturale e sfogo per esplosioni. Per evitare un rischio potenziale di esplosione, si deve impedire che eventuali gas di decomposizione vengano in contatto con gli elementi riscaldanti elettrici.

1.6.1.2. Cubo di rete metallica Ritagliare un pezzo di rete d'acciaio inossidabile con luce di 0,045 mm secondo il modello della figura 1. Piegare la rete e fissarla con filo metallico in forma di cubi con la faccia superiore aperta.

1.6.1.3. Termocoppie Termocoppie adatte.

1.6.1.4. Registratore Qualsiasi registratore a due canali tarato da 0 a 600 oC o tensione corrispondente.

1.6.2. Condizioni di prova Le sostanze vengono sottoposte a prova nella forma in cui vengono ricevute.

1.6.3. Esecuzione della prova Il cubo viene riempito con la sostanza da esaminare e battuto leggermente, aggiungendo ulteriore sostanza fino a quando è completamente pieno. Il cubo viene poi sospeso al centro del forno a temperatura ambiente. Una termocoppia viene posta al centro del cubo e l'altra tra il cubo e la parete del forno per registrare la temperatura del forno. Le temperature del forno e del campione vengono registrate in continuo mentre la temperatura del forno viene aumentata fino a 400 oC o fino al punto di fusione, se inferiore, ad una velocità di 0,5 oC/min. Quando la sostanza si infiamma, la temperatura del campione presenterà un aumento brusco della temperatura al di sopra di quella del forno.

2. DATI Rilevante ai fini della valutazione è la temperatura del forno alla quale la temperatura del campione raggiunge i 400 oC per autoriscaldamento (vedi figura 2).

3. RELAZIONE La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

descrizione della sostanza in esame,

risultati delle misure, inclusa la curva temperatura/tempo,

tutte le osservazioni aggiuntive significative per l'interpretazione dei risultati.

4.(1) BIBLIOGRAFIA NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

4.(1)

Figura 1 Sviluppo di un cubo di prova da 20 mm

Figura 2 Curva tipica temperatura/tempo

Temperature del campione Temperature del forno Temperatura accensione Tempo

A.17. PROPRIETÀ OSSIDANTI (SOLIDI)

A.17.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE È utile avere informazioni preliminari sulle potenziali proprietà esplosive della sostanza prima di effettuare la prova. Questa prova non si applica ai liquidi e ai gas, alle sostanze esplosive o altamente infiammabili, e ai perossidi organici. Non occorre eseguire questa prova quando l'esame delle formule di struttura stabilisce, al di là di ogni ragionevole dubbio, che la sostanza non è suscettibile di reagire esotermicamente con materiale combustibile. Per appurare se la prova debba essere condotta con precauzioni particolari, è opportuno effettuare un test preliminare.

1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ Tempo di combustione: tempo di reazione, in secondi, riferito allo spostamento della zona di reazione lungo il cumulo, seguendo la procedura descritta nel punto 1.6. Velocità di combustione: espressa in mm/s. Velocità di combustione massima: il valore più elevato della velocità di combustione ottenuto con miscele contenenti dal 10 % al 90 %, in peso, di ossidante.

1.3. SOSTANZA DI RIFERIMENTO Per la prova e per la prova preliminare si usa il nitrato di bario (grado analitico) come sostanza di riferimento. La miscela di riferimento è costituita da una miscela di nitrato di bario e di polvere di cellulosa, preparata secondo il punto 1.6, che presenta la massima velocità di combustione (di solito una miscela con il 60 % in peso di nitrato di bario).

1.4. PRINCIPIO DEL METODO Per sicurezza si esegue una prova preliminare. Quando la prova preliminare indica chiaramente che la sostanza in esame presenta proprietà ossidanti, non sono necessarie prove ulteriori. Quando ciò non si verifica, la sostanza deve essere sottoposta alla prova completa. Nella prova completa, la sostanza da esaminare e una sostanza combustibile definita vengono miscelate in vari rapporti. Si formano altrettanti cumuli con le varie miscele e si procede all'accensione di un'estremità di ognuno di essi. La velocità massima determinata viene poi confrontata con la velocità massima di combustione di una miscela di riferimento.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ Qualsiasi metodo di macinazione e mescolamento è valido a condizione che la differenza fra le velocità massime di combustione in ciascuna delle 6 prove non differisca dal valore della media aritmetica di oltre il 10 %.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO

1.6.

1.6.1. Preparazione

1.6.1.

1.6.1.1. Sostanza in esame Ridurre il campione da esaminare ad una granulometria < 0,125 mm usando la seguente procedura: setacciare la sostanza di prova, macinare la frazione rimanente, ripetere la procedura fino a quando tutta la porzione di prova è passata dal setaccio. Per la macinatura e la setacciatura si può usare qualsiasi apparecchio che soddisfi i criteri di qualità. Prima di preparare la miscela, la sostanza viene essiccata a 105 oC fino a peso costante. Se la temperatura di decomposizione della sostanza da esaminare è inferiore a 105 oC, la sostanza deve essere essiccata ad una temperatura opportunamente inferiore.

1.6.1.2. Sostanza combustibile. Come sostanza combustibile si usa la cellulosa in polvere del tipo impiegato per la cromatografia a strato sortile o in colonna. È risultato idoneo un tipo di cellulosa con fibre di lunghezza compresa per l'85 % tra 0,020 mm e 0,075 mm. La polvere di cellulosa viene fatta passare attraverso un setaccio a maglia da 0,125 mm. Per tutta la prova deve essere usata la stessa partita di cellulosa. Prima di preparare la miscela, la cellulosa in polvere deve essere essiccata a 105 oC fino a peso costante. Se nella prova preliminare si usa farina di legno, preparare farina di legno dolce raccogliendo la porzione che passa attraverso un setaccio da 1,6 mm, miscelare accuratamente e poi essiccare a 105 oC per 4 ore in uno strato di spessore non superiore a 25 mm. Raffreddare e conservare in un contenitore a tenuta d'aria riempito il più possibile fino a quando serva, preferibilmente entro 24 ore dall'essiccazione.

1.6.1.3. Fonte di ignizione Come fonte di ignizione si dovrebbe usare una fiamma calda di un bruciatore a gas (diametro minimo 5 mm). Se si usa un'altra fonte di ignizione (ad esempio quando si effettua la prova in atmosfera inerte), devono essere riportate la descrizione e la giustificazione.

1.6.2. Esecuzione della prova Nota: Le miscele di ossidanti con cellulosa o farina di legno devono essere trattate come potenzialmente esplosive e maneggiate con la dovuta attenzione.

1.6.2.

1.6.2.1. Prova preliminare La sostanza essiccata viene accuratamente miscelata con cellulosa o farina di legno essiccata nel rapporto 2 parti di sostanza in esame/1 parte di cellulosa o farina di legno (in peso) e la miscela viene ammucchiata in forma di un piccolo cono con un diametro di base di 3,5 cm × 2,5 d'altezza, riempiendo, senza compattazione, un recipiente di forma conica, (ad esempio un imbuto da laboratorio con il gambo tappato). Il mucchietto viene posto su una piastra di base fredda, non combustibile, non porosa e di bassa conducibilità termica. La prova deve essere eseguita sotto cappa di aspirazione dei fumi come indicato al punto 1.6.2.2. La sorgente di ignizione viene posta in contatto con il cono, e si osservano e registrano il vigore e la durata della reazione risultante. La sostanza deve essere considerata ossidante se la reazione è vigorosa. Nei casi in cui il risultato sia dubbio, è necessario completare l'intera sequenza di prova descritta di seguito.

1.6.2.2. Prova sequenziale Preparare miscele ossidante/cellulosa contenenti dal 10 al 90 % in peso di ossidante in incrementi del 10 %. Per i casi limite, usare miscele ossidante/cellulosa intermedie per ottenere con maggior precisione la massima velocità di combustione. Il mucchietto viene formato mediante uno stampo di metallo, che presenta una lunghezza di 250 mm e una sezione trasversale triangolare con altezza interna di 10 mm e larghezza interna di 20 mm. Su ambedue i lati dello stampo, nella direzione longitudinale, sono montate due lastre metalliche come limitazioni laterali che sporgono di 2 mm sopra al bordo superiore della sezione triangolare (figura). Questo dispositivo viene riempito con un leggero eccesso di miscela. Dopo aver lasciato cadere una volta lo stampo da un'altezza di 2 cm su una superficie solida, la sostanza in eccesso rimanente viene rimossa con un foglio disposto obliquamente. Le delimitazioni laterali vengono rimosse e la polvere rimanente viene lisciata con l'uso di un rullo. Sopra allo stampo si pone poi una piastra di base non combustibile, non porosa, e di bassa conducibilità termica, l'apparecchio viene invertito e lo stampo rimosso. Disporre il mucchietto nella corrente d'aria in una cappa. La velocità dell'aria deve essere sufficiente per impedire ai fumi di propagarsi nel laboratorio e non deve venire variata durante la prova. Intorno all'apparecchio deve essere montato uno schermo per la corrente. Data l'igroscopicità della cellulosa e di alcune sostanze da esaminare, la prova deve essere eseguita più velocemente possibile. Accendere un'estremità del cumulo toccandolo con la fiamma. Misurare il tempo di reazione su una distanza di 200 mm dopo che la zona di reazione si è propagata per una distanza iniziale di 30 mm. La prova viene eseguita con la sostanza di riferimento e almeno una volta con ciascuna miscela di sostanze di prova e cellulosa della serie. Se si trova che la velocità massima di combustione è significativamente maggiore di quella della miscela di riferimento, la prova può essere interrotta. Altrimenti la prova deve essere ripetuta 5 volte per ciascuna delle 3 miscele che danno la velocità di combustione più elevata. Se si sospetta che il risultato sia un falso positivo, ripetere la prova usando una sostanza inerte con granulometria simile, come farina fossile, al posto della cellulosa. In alternativa, la miscela sostanza in esame/cellulosa che presenta la velocità di combustione più elevata deve essere ricontrollata in atmosfera inerte (contenuto d'ossigeno < 2 % v/v).

2. DATI Per ragioni di sicurezza, deve essere considerato come caratteristica della proprietà ossidante della sostanza in prova il valore massimo della velocità di combustione e non il valore medio. Ai fini della valutazione si prende in considerazione il più alto valore della velocità di combustione rilevato su una serie di 6 prove su una determinata miscela. Riportare in grafico il valore più elevato di velocità di combustione per ciascuna miscela contro la concentrazione dell'ossidante. Ricavare dal grafico la velocità massima di combustione. I sei valori di velocità di combustione misurati in una prova effettuata sulla miscela che presenta la più elevata velocità di combustione non devono differire dalla loro media aritmetica per oltre il 10 %; altrimenti deve essere migliorato il metodo di macinatura e miscelazione. Confrontare la velocità di combustione massima ottenuta con la massima velocità di combustione della miscela di riferimento (vedi 1.3.). Se le prove vengono condotte in atmosfera inerte, la velocità di reazione massima viene confrontata con quella della miscela di riferimento in atmosfera inerte.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

l'identità, composizione, purezza, umidità ecc. della sostanza esaminata,

eventuali trattamenti del campione in esame (per esempio macinatura, essiccazione, ecc.),

la fonte di ignizione usata nelle prove,

i risultati delle misure,

la modalità di reazione (per esempio fiammata superficiale, combustione attraverso l'intera massa, eventuali informazioni relative ai prodotti di combustione, ecc),

ogni osservazione aggiuntiva significativa per l'interpretazione dei risultati, inclusa una descrizione del vigore (la miscela arde, produce scintille, esala fumi, brucia senza fiamma, ecc.) e la durata approssimata prodotta nella prova preliminare di sicurezza/vagliatura per la sostanza in esame e la sostanza di riferimento,

i risultati delle prove eventuali con sostanze inerti,

i risultati delle prove eventuali in atmosfera inerte.

3.2. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Una sostanza è considerata come ossidante quando: Al fine di evitare un falso positivo, i risultati ottenuti nella prova della sostanza miscelata con un materiale inerte e/o sotto atmosfera inerte devono essere tenuti in considerazione nell'interpretazione dei risultati.

3.2. a)

nella prova preliminare c'è una reazione vigorosa;

nella prova, la velocità massima di combustione delle miscele analizzate è maggiore o uguale alla velocità di combustione della miscela di cellulosa e di nitrato di bario.

4.(1) BIBLIOGRAFIA NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

A.18. PESO MOLECOLARE MEDIO NUMERICO E DISTRIBUZIONE DEL PESO MOLECOLARE DI POLIMERI

A.18.

1. METODO Il presente metodo cromatografico a permeazione di gel corrisponde al metodo OCSE TG 118 (1996). I principi fondamentali e ulteriori informazioni tecniche sono riportati nel riferimento bibliografico (1).

1.

1.1. INTRODUZIONE Data la varietà delle proprietà dei polimeri, è impossibile descrivere un singolo metodo che definisca con precisione condizioni di separazione e di valutazione tali da coprire tutte le particolarità e specificità che si incontrano nella separazione di polimeri. In particolare, sistemi di polimeri complessi spesso non sono adatti alla cromatografia a permeazione di gel (GPC). Quando non si può ricorrere alla GPC, il peso molecolare può venire determinato mediante altri metodi (vedi allegato). In tali casi, fornire ampi dettagli e la motivazione del metodo usato. Il metodo descritto è basato sulla norma DIN 55672 (1), nella quale si trovano informazioni dettagliate su come eseguire gli esperimenti e valutare i dati. Nel caso siano necessarie modifiche delle condizioni sperimentali, queste modifiche devono essere motivate. Si possono usare altre norme purché fornite con riferimenti completi. Il metodo descritto ricorre a campioni di polistirene di polidispersità nota per la taratura e può richiedere modifiche per adeguarlo a certi polimeri, per esempio polimeri solubili in acqua e ramificati a catena lunga.

1.2. DEFINIZIONE E UNITÀ Il peso molecolare medio numerico Mn e il peso molecolare medio ponderale Mw vengono determinati con le seguenti equazioni. Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi x MiΣni=1Hi in cui Hi è il livello del segnale del rivelatore relativo alla linea di base per il volume di ritenzione Vi, Mi è il peso molecolare della frazione di polimero in corrispondenza del volume di ritenzione Vi, e n è il numero di punti. L'ampiezza della distribuzione del peso molecolare, che è una misura della dispersità del sistema, è data dal rapporto Mw/Mn.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Poiché la GPC è un metodo relativo, è necessaria una taratura. A questo scopo vengono di norma utilizzati standard di polistirene a struttura lineare con pesi molecolari medi Mn e Mw noti e distribuzione nota del peso molecolare. La curva di taratura può venire usata nella determinazione del peso molecolare del campione sconosciuto solo se le condizioni scelte per la separazione del campione e degli standard sono identiche. Una determinata relazione tra il peso molecolare e il volume di eluizione è valida solo nelle specìfiche condizioni del particolare esperimento. Queste condizioni includono soprattutto la temperatura, il solvente (o miscele di solventi), le condizioni cromatografiche e la colonna e il sistema di colonne di separazione. I pesi molecolari del campione determinati in questo modo sono valori relativi e sono descritti come pesi molecolari equivalenti in polistirene. Questo significa che, secondo le differenze strutturali e chimiche tra il campione e gli standard, i pesi molecolari possono deviare dai valori assoluti in misura più o meno grande. Se si usano altri standard, per esempio polietilenglicole, polietilenossido, poli-metil-metacrilato, acido poliacrilico, indicarne la ragione.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI ANALISI Utilizzando la GPC, si possono determinare sia la distribuzione del peso molecolare del campione che i pesi molecolari medi (Mn, Mw). La GPC è un particolare tipo di cromatografia liquida in cui il campione viene separato in base ai volumi idrodinamici dei singoli costituenti (2). La separazione viene effettuata mentre il campione passa attraverso una colonna riempita di un materiale poroso, tipicamente un gel organico. Le molecole piccole possono penetrare nei pori, mentre le molecole grandi ne sono escluse. Il percorso delle molecole grandi è pertanto più breve e queste vengono eluite per prime. Le molecole di medie dimensioni penetrano in alcuni dei pori e vengono eluite più tardi. Le molecole più piccole, con un raggio idrodinamico più piccolo dei pori del gel, possono penetrare in tutti i pori. Queste vengono eluite per ultime. In una situazione ideale, la separazione è determinata unicamente dalla dimensione delle specie molecolari, ma in pratica è difficile evitare l'interferenza di almeno qualche effetto di assorbimento. Un riempimento disuniforme della colonna e volumi morti possono peggiorare la situazione (2). La rivelazione viene effettuata per esempio mediante l'indice di diffrazione o l'assorbimento nell'UV e fornisce una curva di distribuzione semplice. Tuttavia, per attribuire valori effettivi di peso molecolare alla curva, è necessario tarare la colonna facendo passare attraverso di essa polimeri di peso molecolare noto, possibilmente anche di struttura approssimativamente simile, per esempio vari standard di polistirene. Tipicamente si ottiene una curva gaussiana, talvolta distorta con una piccola coda verso il lato dei pesi molecolari bassi, in cui l'asse verticale indica la quantità in peso delle specie di vario peso molecolare eluite e l'asse orizzontale indica il logaritmo del peso molecolare.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ La ripetibilità (deviazione standard relativa — Relative Standard Deviation: RSD) de! volume di eluizione dovrebbe essere migliore dello 0,3 %. Se un cromatogramma viene valutato in funzione del tempo e non corrisponde al criterio succitato, la ripetibilità di analisi richiesta deve essere garantita mediante correzione attraverso uno standard interno (1). Le polidispersità dipendono dal peso molecolare degli standard. Nel caso degli standard di polistirene valori tipici sono: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 < Mp < 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp è il peso molecolare dello standard in corrispondenza del massimo del picco)

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI ANALISI

1.6.

1.6.1. Preparazione delle soluzioni di polistirene standard Gli standard di polistirene vengono sciolti mediante accurata miscelazione nell'eluente scelto. Nella preparazione delle soluzioni tener conto delle raccomandazioni del produttore. La scelta delle concentrazioni degli standard dipende da vari fattori, per esempio il volume di iniezione, la viscosità della soluzione e la sensibilità del rivelatore analitico. Il volume massimo di iniezione deve essere adeguato alla lunghezza della colonna allo scopo di evitare un sovraccarico. Volumi di iniezione tipici per separazioni analitiche con la GPC su una colonna da 30 cm × 7,8 mm sono normalmente compresi tra 40 e 100 μl. Sono possibili volumi più elevati, ma non devono superare i 250 μl. Il rapporto ottimale tra il volume di iniezione e la concentrazione va determinato prima dell'effettiva taratura della colonna.

1.6.2. Preparazione della soluzione campione In linea di principio, per la preparazione delle soluzioni campione valgono gli stessi requisiti. Il campione viene sciolto in un solvente adatto, per esempio, tetraidrofurano (THF), mediante un accurato sbattimento. In nessun caso deve essere sciolto utilizzando un bagno ad ultrasuoni. Se necessario, la soluzione campione viene purificata su un filtro a membrana con dimensione dei pori compresa tra 0,2 e 2 μm. Nella relazione finale deve essere registrata l'eventuale presenza di particelle indisciolte perché queste possono essere dovute a specie di peso molecolare elevato. Usare un metodo appropriato per determinare la percentuale in peso delle particelle indisciolte. Utilizzare le soluzioni entro 24 ore.

1.6.3. Apparecchiature Assicurarsi che il sistema GPC sia inerte rispetto ai solventi utilizzati (p. es. mediante l'uso di capillari d'acciaio se come solvente si usa il THF).

serbatoio del solvente,

degasatore (se del caso),

pompa,

ammortizzatore di pulsazioni (se del caso),

sistema di iniezione,

colonne per cromatografia,

rivelatore,

flussimetro (se del caso),

registratore-elaboratore dati,

recipiente di scarico.

1.6.4. Sistema di iniezione e di erogazione del solvente Caricare nella colonna un volume definito della soluzione campione utilizzando un autocampionatore oppure manualmente in una zona nettamente definita. Nel caso di una operazione manuale, se lo stantuffo della siringa viene tirato o spinto troppo rapidamente la distribuzione dei pesi molecolari osservata può variare. Nei limiti del possibile il sistema di erogazione del solvente deve essere esente da pulsazioni e l'ideale sarebbe che vi fosse incorporato un attenuatore delle pulsazioni. La portata è dell'ordine di 1 ml/min.

1.6.5. Colonna Secondo il campione, il polimero viene caratterizzato utilizzando una colonna semplice o più colonne collegate in serie. In commercio sono disponibili vari materiali porosi per colonne con proprietà (p. es. dimensione dei pori, limiti di esclusione) definite. La scelta del gel di separazione o della lunghezza della colonna dipende sia dalle proprietà del campione (volumi idrodinamici, distribuzione dei pesi molecolari) che dalle specifiche condizioni di separazione come il solvente, la temperatura e la portata (1) (2) (3).

1.6.6. Piatti teorici La colonna o la combinazione di colonne utilizzata per la separazione deve essere caratterizzata mediante il numero di piatti teorici. Questo, nel caso venga utilizzato il THF come solvente di eluizione, implica di caricare una soluzione di etilbenzene o altro adatto soluto apolare su una colonna di lunghezza nota. Il numero di piatti teorici è dato dall'equazione seguente: N=5,54VeW1/22 o N=16VeW2 in cui N è il numero di piatti teorici Vc è il volume di eluizione al massimo del picco W è la larghezza del picco alla linea di base W1/2 è la larghezza del picco a mezza altezza.

1.6.7. Efficienza di separazione Oltre al numero di piatti teorici, che è una quantità che determina l'ampiezza della banda, è importante anche l'efficienza di separazione, che è determinata dalla rapidità della curva di taratura. L'efficienza di separazione di una colonna si ottiene dalla seguente relazione: Ve,Mx-Ve,(10Mx)≥6,0 cm3cm2 in cui Ve.Mx è il volume di eluizione per polistirene di peso molecolare Mx Ve(10Mx) è il volume di eluizione per polistirene di peso molecolare dieci volte maggiore. La risoluzione del sistema è definita in generale come segue: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 in cui, Ve1, Ve2 sono i volumi di eluizione dei due standard di polistirene al massimo del picco W1, W2 sono le larghezze del picco alla linea di base M1, M2, sono i pesi molecolari al massimo del picco (dovrebbero differire di un fattore 10) Il valore di R del sistema di colonne deve essere maggiore di 1,7 (4).

1.6.8. Solventi Tutti i solventi devono essere di purezza elevata (per il THF si utilizza una purezza del 99,5 %). Il serbatoio del solvente (se necessario sotto atmosfera di gas inerte) deve essere sufficientemente grande per la taratura della colonna e per l'analisi di parecchi campioni. Degasare il solvente prima di trasportarlo alla colonna mediante la pompa.

1.6.9. Controllo della temperatura La temperatura dei componenti interni critici (ansa di iniezione, colonne, rivelatore e tubature) deve essere costante e coerente con il solvente scelto.

1.6.10. Rivelatore La funzione del rivelatore è di registrare quantitativamente la concentrazione del campione eluito dalla colonna. Per evitare un inutile allargamento dei picchi, il volume della cuvetta della celia del rivelatore deve essere il più piccolo possibile. Salvo per rivelatori a diffrazione della luce e rivelatori di viscosità, questo volume non deve superare i 10 μl. Il metodo di solito utilizzato per la rivelazione è la rifrattometria differenziale. Tuttavia, se richiesto dalle proprietà specifiche del campione o del solvente di eluizione, si possono utilizzare altri tipi di rivelatori, per esempio UV/VIS, IR, rivelatori viscosimetrici, ecc.

2. DATI E RELAZIONE

2.

2.1. DATI Fare riferimento alla norma DIN (1) per i criteri di valutazione dettagliati e per i requisiti di raccolta ed elaborazione dei dati. Per ciascun campione eseguire due esperimenti indipendenti, che dovranno venire analizzati singolarmente. Per ogni misura si devono ottenere i valori di Mn, Mw, Mw/Mn e Mp . È necessario indicare esplicitamente che i valori misurati sono valori relativi equivalenti al peso molecolare dello standard usato. Dopo la determinazione dei volumi di ritenzione o dei tempi di ritenzione (possibilmente corretti usando uno standard interno), i valori di log Mp (Mp sono i massimi dei picchi dello standard di taratura) vengono riportati contro una delle suddette quantità. Per ogni decade di peso molecolare sono necessari almeno due punti di taratura e per la curva totale sono richiesti almeno cinque punti di misura, che devono coprire il peso molecolare stimato del campione. L'estremità della curva di taratura corrispondente al basso peso molecolare è definita da n-esilbenzene o altro soluto apolare adatto. I pesi molecolari medi numerico e ponderale vengono in generale determinati mediante sistemi elettronici di elaborazione dati sulla base delle formule riportate nella sezione 1.2. Se si utilizza una digitalizzazione manuale, si può consultare il metodo ASTM D 3536-91 (3). La curva di distribuzione deve essere fornita come tabella o come figura (frequenza differenziale o sommatoria delle percentuali contro log M). Nella rappresentazione grafica, una decade di peso molecolare deve avere normalmente una larghezza di circa 4 cm e il massimo del picco deve avere un'altezza di circa 8 cm. Nel caso di curve di distribuzione integrali la differenza in ordinata tra lo 0 e il 100 % deve essere di circa 10 cm.

2.2. RELAZIONE D'ANALISI La relazione d'analisi deve includere le seguenti informazioni:

2.2.

2.2.1. Sostanza in esame:

informazioni disponibili sulla sostanza in esame (identità, additivi, impurezze),

descrizione del trattamento del campione, osservazioni, problemi.

2.2.2. Strumentazione:

serbatoio dell'eluente, gas inerte, degasaggio dell'eluente, composizione dell'eluente, impurezze,

pompa, attenuatore di pulsazioni, sistema di iniezione,

colonne di separazione (fabbricante, tutte le informazioni sulle caratteristiche delle colonne, come dimensione dei pori, tipo di materiale di separazione ecc, numero, lunghezza e ordine delle colonne usate),

numero di piatti teorici della colonna (o combinazione di colonne), efficienza di separazione (risoluzione del sistema),

informazioni sulla simmetria dei picchi,

temperatura della colonna, tipo di controllo della temperatura,

rivelatore (principio di misurazione, tipo, volume della cuvetta),

flussimetro se usato (produttore, principio di misurazione),

sistema di registrazione ed elaborazione dati (hardware e software).

2.2.3. Taratura del sistema:

descrizione dettagliata del metodo usato per costruire la curva di taratura,

informazioni sui criteri di qualità per questo metodo (p. es. coefficiente di correlazione, varianza ecc),

informazioni su tutte le estrapolazioni, ipotesi e approssimazioni fatte durante la procedura sperimentale e durante la valutazione e l'elaborazione dei dati,

tutte le misure usate per costruire la curva di taratura devono essere documentate in una tabella includente le seguenti informazioni per ciascun punto di taratura:

nome del campione,

produttore del campione,

valori caratteristici degli standard Mp , Mn , Mw , Mw/Mn , forniti dal produttore o ricavati da misure successive, insieme con dettagli relativi al metodo di determinazione,

volume di iniezione e concentrazione di iniezione,

valore di Mp usato per la taratura,

volume di eluizione o tempo di ritenzione corretto misurato in corrispondenza del massimo dei picchi,

Mp calcolato al massimo del picco,

errore percentuale dell' Mp calcolato e del valore di taratura.

2.2.4. Valutazione:

valutazione su base temporale: metodi usati per garantire la riproducibilità richiesta (metodo di correzione, standard interno ecc),

indicazione se la valutazione sia stata effettuata sulla base del volume di eluizione o del tempo di ritenzione,

informazioni riguardo ai limiti della valutazione se un picco non viene analizzato completamente,

descrizione dei metodi di lisciatura, se usati,

procedure di preparazione e pretrattamento del campione,

presenza di eventuali particelle indisciolte,

volume dì iniezione (μl) e concentrazione di iniezione (mg/ml),

osservazioni indicanti effetti che portano a deviazioni dal profilo GPC ideale,

descrizione dettagliata di tutte le modifiche applicate alle procedure di analisi,

dettagli sugli intervalli di errore,

qualsiasi altra informazione e osservazione utile all'interpretazione dei risultati.

3.(1)(2)(3)(4)

BIBLIOGRAFIA DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elution-smittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly. D.,D,. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.19. CONTENUTO DI FRAZIONI A BASSO PESO MOLECOLARE IN POLIMERI

A.19.

1. METODO Questo metodo cromatografico a permeazione di gel corrisponde al metodo OCSE TG 119 (1996). I principi fondamentali e ulteriori informazioni tecniche sono presentati nei riferimenti bibliografici.

1.

1.1. INTRODUZIONE Data la varietà delle proprietà dei polimeri, è impossibile descrivere un singolo metodo che definisca con precisione condizioni di separazione e di valutazione tali da coprire tutte le particolarità e specificità che si incontrano nella separazione di polimeri. In particolare, sistemi di polimeri complessi spesso non sono adatti alla cromatografia a permeazione di gel (GPC). Quando non si può ricorrere alla GPC, il peso molecolare può venire determinato mediante altri metodi (vedi allegato). In tali casi, fornire ampi dettagli e la motivazione del metodo usato. Il metodo descritto è basato sulla norma DIN 55672 (1), che contiene informazioni dettagliate su come eseguire gli esperimenti e valutare i dati. Nel caso siano necessarie modifiche delle condizioni sperimentali, queste modifiche devono essere motivate. Si possono usare altre norme purché fornite con riferimenti completi. Il metodo descritto ricorre a campioni di polistirene di polidispersità nota per la taratura e può richiedere modifiche per adeguarlo a certi polimeri, per esempio polimeri solubili in acqua e ramificati a catena lunga.

1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ Un basso peso molecolare è definito arbitrariamente come un peso molecolare inferiore a 1000 dalton. Il peso molecolare medio numerico Mn e il peso molecolare medio ponderale Mw vengono determinati con le seguenti equazioni: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1HixMiΣni=1Hi in cui Hi è il livello del segnale del rivelatore relativo alla linea di base per il volume di ritenzione Vi Mi è il peso molecolare della frazione di polimero in corrispondenza del volume di ritenzione Vi e n è il numero di punti. L' ampiezza della distribuzione del peso molecolare, che è una misura della dispersità del sistema, è data dal rapporto Mw/Mn .

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Poiché la GPC è un metodo relativo, è necessaria una taratura. A questo scopo vengono di norma utilizzati standard di polistirene a struttura lineare con pesi molecolari medi Mn e Mw noti e distribuzione nota del peso molecolare. La curva di taratura può venire usata nella determinazione del peso molecolare del campione sconosciuto solo se le condizioni scelte per la separazione del campione e degli standard sono identiche. Una determinata relazione tra il peso molecolare e il volume di eluizione è valida solo nelle specifiche condizioni del particolare esperimento. Queste condizioni includono soprattutto la temperatura, il solvente (o miscele di solventi), le condizioni cromatografiche e la colonna e il sistema di colonne di separazione. I pesi molecolari del campione determinati in questo modo sono valori relativi e sono descritti come pesi molecolari equivalenti in polistirene. Questo significa che, secondo le differenze strutturali e chimiche tra il campione e gli standard, i pesi molecolari possono deviare dai valori assoluti in misura più o meno grande. Se si usano altri standard, per esempio polietilenglicole, polietilenossido, poli-metil-metacrilato, acido poliacrilico, indicarne la ragione.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI ANALISI Utilizzando la GPC, si possono determinare sia la distribuzione del peso molecolare del campione che i pesi molecolari medi (Mn, Mw). La GPC è un particolare tipo di cromatografia liquida in cui il campione viene separato in base ai volumi idrodinamici dei singoli costituenti (2). La separazione viene effettuata mentre il campione passa attraverso una colonna riempita di un materiale poroso, tipicamente un gel organico. Le molecole piccole possono penetrare nei pori, mentre le molecole grandi ne sono escluse. Il percorso delle molecole grandi è pertanto più breve e queste vengono eluite per prime. Le molecole di medie dimensioni penetrano in alcuni dei pori e vengono eluite più tardi. Le molecole più piccole, con un raggio ìdrodinamico più piccolo dei pori del gel, possono penetrare in tutti i pori. Queste vengono eluite per ultime. In una situazione ideale, la separazione è determinata unicamente dalla dimensione delle specie molecolari, ma in pratica è difficile evitare l'interferenza di almeno qualche effetto di assorbimento. Un riempimento disuniforme della colonna e volumi morti possono peggiorare la situazione (2). La rivelazione viene effettuata per esempio mediante l'indice di diffrazione o l'assorbimento nell'UV e fornisce una curva di distribuzione semplice. Tuttavia, per attribuire valori effettivi di peso molecolare alla curva, è necessario tarare la colonna facendo passare attraverso di essa polimeri di peso molecolare noto, possibilmente anche di struttura approssimativamente simile, per esempio vari standard di polistirene. Tipicamente si ottiene una curva gaussiana, talvolta distorta con una piccola coda verso il lato dei pesi molecolari bassi, in cui l'asse verticale indica la quantità in peso delle specie di vario peso molecolare eluite, e l'asse orizzontale ìndica il logaritmo del peso molecolare. Il contenuto di sostanze a basso peso molecolare si ricava da questa curva. Il calcolo può essere accurato solo se le specie di basso peso molecolare hanno una risposta, riferita alla massa, equivalente al polimero nel suo complesso.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ La ripetibilità (deviazione standard relativa — Relative Standard Deviation: RSD) del volume di eluizione dovrebbe essere migliore dello 0,3 %. Se un cromatogramma viene valutato in funzione del tempo e non corrisponde al criterio succitato, la ripetibilità di analisi richiesta deve essere garantita mediante correzione attraverso uno standard interno (1). Le polidispersità dipendono dal peso molecolare degli standard. Nel caso degli standard di polistirene valori tipici sono: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 < Mp < 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp is the molecular weight of the standard at the peak maximum)

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI ANALISI

1.6.

1.6.1. Preparazione delle soluzioni di polistirene standard Gli standard di polistirene vengono sciolti mediante accurata miscelazione nell'eluente scelto. Nella preparazione delle soluzioni tener conto delle raccomandazioni del produttore. La scelta delle concentrazioni degli standard dipende da vari fattori, per esempio il volume di iniezione, la viscosità della soluzione e la sensibilità del rivelatore analitico. Il volume massimo di iniezione deve essere adeguato alla lunghezza della colonna allo scopo di evitare un sovraccarico. Volumi di iniezione tipici per separazioni analitiche con la GPC su una colonna da 30 cm × 7,8 mm sono normalmente compresi tra 40 e 100 μl. Sono possibili volumi più elevati, ma non devono superare i 250 μl.. Il rapporto ottimale tra il volume di iniezione e la concentrazione deve essere determinato prima dell'effettiva taratura della colonna.

1.6.2. Preparazione della soluzione campione In linea di principio, per la preparazione delle soluzioni campione valgono gli stessi requisiti. Il campione viene sciolto accuratamente in un solvente adatto, per esempio tetraidrofurano (THF), per sbattimento. In nessun caso deve essere sciolto utilizzando un bagno ad ultrasuoni. Se necessario, la soluzione campione viene purificata su un filtro a membrana con dimensione dei pori compresa tra 0,2 e 2 μm. Nella relazione finale deve essere registrata l'eventuale presenza di particelle indisciolte perché queste possono essere dovute a specie di peso molecolare elevato. Usare un metodo appropriato per determinare la percentuale in peso delle particelle indisciolte. Utilizzare le soluzioni entro 24 ore.

1.6.3. Correzione dell'errore dovuto a impurezze e additivi É di solito necessaria una correzione del contenuto di specie M < 1000 che tenga conto del contributo di componenti specifici non polimerici presenti (p. es. impurezze e/o additivi), salvo che il contenuto misurato sia già < 1 %. Questo si ottiene mediante l'analisi diretta della soluzione di polimero o dell'eluato della GPC. Se, dopo il passaggio attraverso la colonna, l'eluato è troppo diluito per un'ulteriore analisi, occorre concentrarlo. Può essere necessario evaporare l'eluato a secchezza e scioglierlo di nuovo. La concentrazione dell'eluato deve essere condotta in condizioni tali da garantire che non si abbiano cambiamenti nell'eluato. Il trattamento dell'eluato dopo lo stadio di GPC dipende dal metodo analitico usato per la determinazione quantitativa.

1.6.4. Apparecchiature L'apparecchiatura GPC comprende i seguenti componenti: Assicurarsi che il sistema GPC sia inerte rispetto ai solventi utilizzati (p. es. mediante l'uso di capillari d'acciaio se come solvente si usa il THF).

serbatoio del solvente,

degasatore (se del caso),

pompa,

ammortizzatore di pulsazioni (se del caso),

sistema di iniezione,

colonne per cromatografia,

rivelatore,

flussimetro (se del caso),

registratore-elaboratore dati,

recipiente di scarico.

1.6.5. Sistema di iniezione e di erogazione del solvente Caricare nella colonna un volume definito della soluzione campione utilizzando un autocampionatore oppure manualmente in una zona nettamente definita. Nel caso di una operazione manuale; se lo stantuffo della siringa viene tirato o spinto troppo rapidamente, la distribuzione dei pesi molecolari osservata può variare. Nei limiti del possibile il sistema di erogazione del solvente deve essere esente da pulsazioni e l'ideale sarebbe che vi fosse incorporato un attenuatore delle pulsazioni. La portata è dell ordine di 1 ml/min.

1.6.6. Colonna Secondo il campione, il polimero viene caratterizzato utilizzando una colonna semplice o più colonne collegate in serie. In commercio sono disponibili vari materiali porosi per colonne con proprietà (p. es. dimensione dei pori, limiti di esclusione) definite. La scelta del gel di separazione o della lunghezza della colonna dipende sia dalle proprietà del campione (volumi idrodinamici, distribuzione dei pesi molecolari) che dalle specifiche condizioni di separazione come il solvente, la temperatura e la portata (1) (2) (3).

1.6.7. Piatti teorici La colonna o la combinazione di colonne utilizzata per la separazione deve essere caratterizzata dal numero di piatti teorici. Questo, nel caso venga utilizzato il THF come solvente di eluizione, implica di caricare una soluzione di etilbenzene o altro adatto soluto apolare su una colonna di lunghezza nota. Il numero di piatti teorici è dato dall'equazione seguente: N=5,54VeW1/22 o N=16VeW2 in cui, N è il numero di piatti teorici Ve è il volume di eluizione al massimo del picco W è la larghezza del picco alla linea di base W1/2 è la larghezza del picco a mezza altezza

1.6.8. Efficienza di separazione Oltre al numero di piatti teorici, che è una quantità che determina l'ampiezza della banda, è importante anche l'efficienza di separazione, che è determinata dalla ripidità della curva di taratura. L'efficienza di separazione di una colonna si ottiene dalla seguente relazione: Ve,Mx-Ve,(10Mx)cross sectional area of the column≥6,0cm3cm2 in cui VeMx è il volume di eluizione per polistirene di peso molecolare Mx Ve,(10Mu) è il volume di eluizione per polistirene di peso molecolare dieci volte maggiore. La risoluzione del sistema è definita in generale come segue: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 in cui, Ve1, Ve2 sono i volumi di eluizione dei due standard di polistirene al massimo del picco W1, W2 sono le larghezze del picco alla linea di base M1, M2 sono i pesci molecolari al massimo del picco (dovrebbero differire di un fattore 10). Il valore di R per il sistema di colonne deve essere maggiore di 1,7 (4).

1.6.9. Solventi Tutti i solventi devono essere di purezza elevata (per il THF si usa una purezza del 99,5 %). Il serbatoio del solvente (se necessario sotto atmosfera di gas inerte) deve essere sufficientemente grande per la taratura della colonna e per l'analisi di parecchi campioni. Degasare il solvente prima di trasportarlo alla colonna mediante la pompa.

1.6.10. Controllo della temperatura La temperatura dei componenti interni critici (ansa di iniezione, colonne, rivelatore e tubature) deve essere costante e coerente con il solvente scelto.

1.6.11. Rivelatore La funzione del rivelatore è di registrare quantitativamente la concentrazione del campione eluito dalla colonna. Per evitare un inutile allargamento dei picchi, il volume della cuvetta della cella del rivelatore deve essere il più piccolo possibile. Salvo per rivelatori a diffrazione della luce e rivelatori a viscosità, questo volume non deve superare i 10 μl. Il metodo di solito utilizzato per la rivelazione è la rifrattometria differenziale. Tuttavia, se richiesto dalle proprietà specifiche del campione o del solvente di eluizione, si possono utilizzare altri tipi di rivelatori, per esempio UV/VIS, IR, rivelatori viscosimetrici ecc.

2. DATI E RELAZIONE

2.

2.1. DATI Fare riferimento alla norma DIN (1) per i criteri di valutazione dettagliati e per i requisiti di raccolta ed elaborazione dei dati. Per ciascun campione eseguire due esperimenti indipendenti, che dovranno venire analizzati singolarmente. In ogni caso è essenziale determinare i dati anche sui bianchi trattati nelle stesse condizioni del campione. È necessario indicare esplicitamente che i valori misurati sono valori relativi equivalenti al peso molecolare dello standard usato. Dopo la determinazione dei volumi di ritenzione o dei tempi di ritenzione (possibilmente corretti usando uno standard interno), i valori di log Mp (Mp sono i massimi dei picchi dello standard di taratura) vengono riportati contro una delle suddette quantità. Per ogni decade di peso molecolare sono necessari almeno due punti di taratura e per la curva totale sono richiesti almeno cinque punti di misura, che devono coprire il peso molecolare stimato del campione. L'estremità della curva di taratura corrispondente al basso peso molecolare è definita da n-esilbenzene o altro soluto apolare adatto. Si determina la porzione della curva corrispondente a pesi molecolari inferiori a 1000 e, se necessario, la si corregge per compensare impurezze e additivi. In genere le curve di eluzione vengono valutate con sistemi elettronici di elaborazione. Se si utilizza una digitalizzazione manuale, si può consultare il metodo ASTM D 3536-91 (3). Se eventuali polimeri insolubili vengono trattenuti sulla colonna, è probabile che il loro peso molecolare sia più elevato di quello della frazione solubile, e non considerandolo si sovrastimerebbe il contenuto di sostanze di basso peso molecolare. Nell'allegato sono fornite indicazioni per la correzione del contenuto di sostanze a basso peso molecolare per tener conto del polimero insolubile. La curva di distribuzione deve essere fornita come tabella o come figura (frequenza differenziale o sommatoria delle percentuali contro log M). Nella rappresentazione grafica, una decade di peso molecolare deve avere normalmente una larghezza di circa 4 cm e il massimo del picco deve avere un'altezza di circa 8 cm. Nel caso di curve di distribuzione integrali la differenza in ordinata tra lo 0 e il 100 % deve essere di circa 10 cm.

2.2. RELAZIONE D'ANALISI La relazione d'analisi deve includere le seguenti informazioni:

2.2.

2.2.1. Sostanza in esame

informazioni disponibili sulla sostanza in esame (identità, additivi, impurezze),

descrizione del trattamento del campione, osservazioni, problemi.

2.2.2. Strumentazione

serbatoio dell'eluente, gas inerte, degasaggio dell'eluente, composizione dell'eluente, impurezze,

pompa, attenuatore di pulsazioni, sistema di iniezione,

numero di piatti teorici della colonna (o combinazione di colonne), efficienza di separazione (risoluzione del sistema),

informazioni sulla simmetria dei picchi,

temperatura della colonna, tipo di controllo della temperatura,

rivelatore (principio di misurazione, tipo, volume della cuvetta),

flussimetro se usato (produttore, principio di misurazione),

sistema di registrazione ed elaborazione dati (hardware e software).

2.2.3. Taratura del sistema

descrizione dettagliata del metodo usato per costruire la curva di taratura,

informazioni sui criteri di qualità per questo metodo (coefficiente di correlazione, varianza ecc),

informazioni su tutte le estrapolazioni, ipotesi e approssimazioni fatte durante la procedura sperimentale e durante la valutazione e l'elaborazione dei dati,

tutte le misure usate per costruire la curva di taratura devono essere documentate in una tabella includente le seguenti informazioni per ciascun punto di taratura:

nome del campione,

produttore del campione,

valori caratteristici degli standard Mp , Mn , Mw , Mw/Mn, forniti dal produttore o ricavati da misure successive, insieme con dettagli relativi al metodo di determinazione,

volume di iniezione e concentrazione di iniezione,

valore di Mp usato per la taratura,

volume di eluizione o tempo di ritenzione corretto misurato in corrispondenza del massimo dei picchi,

Mp calcolato al massimo del picco,

errore percentuale dell'Mp calcolato e del valore di taratura.

2.2.4. Informazioni sul contenuto di polimero a basso peso molecolare

descrizione dei metodi usati nell'analisi e del modo in cui sono stati condotti gli esperimenti,

informazioni sul contenuto percentuale (p/p) di specie di basso peso molecolare riferito al campione totale;

informazioni sulle impurezze, gli additivi e altre specie non polimeriche in percentuale in peso riferita al campione totale.

2.2.5. Valutazione

valutazione su base temporale: metodi usati per garantire la riproducibilità richiesta (metodo di correzione, standard interno ecc),

indicazione se la valutazione sia stata effettuata sulla base del volume di eluizione o del tempo di ritenzione,

informazioni riguardo ai limiti della valutazione se un picco non viene analizzato completamente,

descrizione dei metodi di lisciatura, se usati,

procedure di preparazione e pretrattamento del campione,

presenza di eventuali particelle indisciolte,

volume di iniezione (μl) e concentrazione di iniezione (mg/ml),

osservazioni indicanti effetti che portano a deviazioni dal profilo GPC ideale,

descrizione dettagliata di tutte le modifiche applicate alle procedure di analisi,

dettagli sugli intervalli di errore,

qualsiasi altra informazione e osservazione utile all'interpretazione dei risultati.

3.(1)(2)(3)(4)

BIBLIOGRAFIA DIN 55672 (1995). Geldpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J.Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.20. COMPORTAMENTO DI SOLUZIONE/ESTRAZIONE DEI POLIMERI IN ACQUA

A.20.

1. METODO II metodo descritto corrisponde alla versione riveduta del metodo OCSE TG 120 (1997). Ulteriori informazioni tecniche sono fornite nel riferimento bibliografico (1).

1.

1.1. INTRODUZIONE Per certuni polimeri, come i polimeri in emulsione, può essere necessario un lavoro di preparazione iniziale prima di poter utilizzare il metodo qui presentato. Il metodo non può essere applicato a polimeri liquidi e a polimeri che reagiscono con l'acqua nelle condizioni del saggio. Quando il metodo non è pratico o è impossibile da applicare, il comportamento di soluzione/estrazione può essere studiato mediante altri metodi. In tal caso,. fornire dettagli completi e la motivazione del metodo usato.

1.2. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.3. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO II comportamento di soluzione/estrazione di polimeri in un ambiente acquoso viene determinato con il metodo del pallone (cfr. A.6. Solubilità in acqua, metodo del pallone) con le modifiche descritte nel seguito.

1.4. CRITERI DI QUALITÀ Nessuno.

1.5. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.5.

1.5.1. Apparecchiatura Per il metodo occorre la seguente apparecchiatura:

dispositivo di triturazione, per esempio un macinino, per la produzione di particelle di dimensioni note,

apparecchiature di scuotimento con possibilità di controllo della temperatura,

sistema di filtrazione su membrana,

apparecchiature analitiche appropriate,

setacci standardizzati.

1.5.2. Preparazione del campione Un campione rappresentativo deve innanzitutto venire ridotto ad una dimensione granulometrica compresa tra 0,125 e 0,25 mm con l'utilizzo di appropriati setacci. Può essere richiesto un raffreddamento ai fini della stabilità del campione o per la macinazione. Materiali di natura gommosa possono venire tritati alla temperatura dell'azoto liquido (1). Se non è possibile ottenere la frazione di dimensione granulometrica richiesta, ridurre il più possibile le dimensioni delle particelle e indicare il risultato nella relazione. Nella relazione è necessario indicare come è stato conservato il campione tritato prima dell'analisi.

1.5.3. Procedura Tre campioni da 10 g della sostanza in analisi vengono pesati in tre recipienti dotati di tappi di vetro e in ciascun recipiente si aggiungono 1000 ml di acqua. Se ia manipolazione di una quantità di 10 g di polimero si dimostra irrealizzabile, utilizzare la massima quantità manipolabile e regolare in proporzione il volume d'acqua. I recipienti vengono tappati ermeticamente ed agitati a 20 oC. Usare un dispositivo di agitazione in grado di funzionare a temperatura costante. Dopo un periodo di 24 ore, il contenuto di ciascun recipiente viene centrifugato o filtrato e si determina la concentrazione del polimero nella fase acquosa limpida mediante un adatto metodo analitico. Se non sono disponibili metodi analitici adatti per la fase acquosa, si può stimare la solubilità/estrattività totale del peso secco del residuo trattenuto sul filtro o del precipitato centrifugato. Di solito è necessario distinguere quantitativamente le impurezze e gli additivi, da una parte, dalle specie di basso peso molecolare, dall'altra parte. Nel caso di una determinazione gravimetrica, è importante anche eseguire una prova in bianco senza sostanza in esame per tener conto di residui dovuti alla procedura sperimentale. Il comportamento di soluzione/estrazione di polimeri in acqua a 37 oC a pH 2 e pH 9 può venire determinato come descritto per l'esperimento a 20 oC. Questi pH si possono ottenere mediante l'aggiunta di adatti tamponi o di acidi o basi appropriate, come acido cloridrico, acido acetico, idrossido di sodio o di potassio per analisi o NH3. Secondo il metodo di analisi usato, si devono eseguire una o due prove. Quando sono disponibili metodi sufficientemente specifici per determinare il componente polimerico mediante l'analisi diretta della fase acquosa, dovrebbe essere sufficiente una prova eseguita come descritto sopra. Se invece tali metodi non sono disponibili e la determinazione del comportamento di soluzione/estrazione del polimero è limitata all'analisi indiretta mediante la sola determinazione del carbonio organico totale (TOC) contenuto nell'estratto acquoso, si dovrebbe eseguire una prova addizionale. Anche questa prova addizionale deve essere eseguita in triplo utilizzando campioni di polimero dieci volte più piccoli e le stesse quantità di acqua usate nella prima prova.

1.5.4. Analisi

1.5.4.

1.5.4.1. Saggio condotto con una sola dimensione del campione Se disponibili, usare metodi per l'analisi diretta dei componenti polimerici nella fase acquosa. In alternativa, si può prendere in considerazione anche un'analisi indiretta dei componenti de! polimero disciolti/estratti mediante determinazione del contenuto totale di parti solubili e correzione per tener conto dei componenti non specifici del polimero. Per determinare le specie polimeriche totali è possibile effettuare l'analisi della fase acquosa: o mediante un metodo di sufficiente sensibilità, per esempio: oppure mediante evaporazione a secchezza sotto vuoto dell'estratto acquoso e analisi spettroscopica (IR, UV, ecc.) o AAS/ICP del residuo. Se l'analisi della fase acquosa tal quale non è praticabile, l'estratto acquoso dovrebbe venire estratto con un solvente organico immiscibile con l'acqua, per esempio un idrocarburo clorurato. Il solvente viene poi evaporato e il residuo viene analizzato come sopra per determinare il contenuto di polimero di cui sopra. I componenti di questo residuo identificati come impurezza o additivo devono venire sottratti per determinare così il grado di soluzione/estrazione del polimero stesso. Quando tali sostanze sono presenti in quantità relativamente grandi, può essere necessario sottoporre il residuo per esempio ad un'analisi HPLC o GC per distinguere le impurezze dal monomero e dalle specie derivate dal monomero presenti, in modo che sia possibile determinare il reale contenuto di queste ultime. In alcuni casi può essere sufficiente una semplice evaporazione a secchezza del solvente seguita dalla pesata del residuo secco.

TOC mediante digestione con persolfato o dicromato a dare CO2, e stima mediante IR o analisi chimica,

spettrometria di assorbimento atomico (AAS) o il suo equivalente emissione a plasma accoppiato induttivamente (ICP) per polimeri contenenti silicio o metalli,

assorbimento UV o spettrofluorimetria per i polimeri acrilici,

LC-MS per campioni di basso peso molecolare,

1.5.4.2. Prova condotta con due differenti dimensioni del campione Si determina il TOC su tutti gli estratti acquosi. Eseguire una determinazione gravimetrica sulla parte indisciolta/non estratta del campione. Se, dopo centrifugazione o filtrazione del contenuto di ciascun recipiente, rimangono residui di polimero attaccati alla parete del recipiente, risciacquarlo con il filtrato fino a rimuoverne tutti i residui visibili, dopo di che il filtrato viene di nuovo centrifugato o filtrato. I residui che rimangono sul filtro o nella provetta da centrifuga vengono essiccati a 40 oC sotto vuoto e pesati. Continuare l'essiccazione fino a peso costante.

2. DATI

2.

2.1. PROVA CONDOTTA CON UNA SOLA DIMENSIONE DEL CAMPIONE Indicare i singoli risultati di ciascuno dei tre palloni e valori medi, in unità di massa per volume della soluzione (tipicamente mg/1) o di massa per massa del campione di polimero (tipicamente mg/g). Indicare anche la perdita di peso del campione (calcolata come peso del soluto diviso per il peso del campione iniziale). Si dovrebbero calcolare le deviazioni standard relative (RSD). Indicare i singoli valori per la sostanza totale (polimero più additivi essenziali ecc.) e per il solo polimero (cioè dopo aver sottratto il contributo di tali additivi).

2.2. PROVA CONDOTTA CON DUE DIFFERENTI DIMENSIONI DEL CAMPIONE Fornire i singoli valori di TOC degli estratti acquosi dei due esperimenti in triplo e il valore medio di ciascun esperimento in unità di massa per volume della soluzione (tipicamente mg C/g), nonché in unità di massa per peso del campione iniziale (tipicamente mg C/g). Se non vi sono differenze tra i risultati ai rapporti campione/acqua alto e basso, questo può indicare che effettivamente sono stati estratti tutti i componenti estraibili. In tal caso normalmente non sarà necessaria l'analisi diretta. Indicare i singoli pesi dei residui espressi in percentuale del peso iniziale dei campioni. Per ogni esperimento calcolare le medie. Le differenze tra 100 e le percentuali trovate rappresentano le percentuali di materiale solubile ed estraibile contenuto nel campione originario.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO La relazione sul saggio deve includere le informazioni seguenti:

3.1.

3.1.1. Sostanza esaminata:

informazioni disponibili sulla sostanza esaminata (identità, additivi, impurezze, contenuto di specie di basso peso molecolare).

3.1.2. Condizioni sperimentali:

descrizione delle procedure usate e delle condizioni sperimentali,

descrizione dei metodi analitici e di rivelazione.

3.1.3. Risultati:

risultati di solubilità/estraibilità in mg/l; valori singoli e valori medi delle prove di estrazione nelle varie soluzioni, scomposti in contenuto di polimero e impurezze, additivi ecc.,

risultati di solubilità/estraibilità in mg/g di polimero,

valori di TOC per gli estratti acquosi, peso del soluto e percentuali calcolate, se misurati,

pH di ciascun campione,

informazioni riguardo ai valori del bianco,

se necessario, indicazioni sulla instabilità chimica della sostanza in esame sia durante il processo di saggio che durante il processo analitico,

tutte le informazioni ritenute importanti per l'interpretazione dei risultati.

4.(1) BIBLIOGRAFIA DIN 53733 (1976). Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen fùr Priifzwecke.

A.21. PROPRIETÀ COMBURENTI (LIQUIDI)

A.21.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Il presente metodo di test è disegnato per misurare il potenziale che una sostanza liquida ha di aumentare la velocità o l'intensità di combustione di una sostanza combustibile, o di formare con una sostanza combustibile una miscela capace di autoaccensione, quando le due sostanze vengono perfettamente miscelate. Il metodo si basa sul test ONU per i liquidi comburenti (1) ed è equivalente ad esso. Poiché tuttavia il presente metodo A.21 deve fondamentalmente soddisfare i requisiti del regolamento 1907/2006, esso può limitarsi a richiedere solo un confronto con un'unica sostanza di riferimento. L'analisi e il confronto con altre sostanze di riferimento possono risultare necessari quando occorre utilizzare i risultati del test per altri scopi. Non occorre eseguire questo test quando l'esame della formula di struttura conferma oltre ogni ragionevole dubbio che la sostanza non è in grado di reagire esotermicamente con un materiale combustibile. Prima di eseguire il test è utile possedere informazioni preliminari su eventuali potenziali proprietà esplosive della sostanza. Il test non è applicabile a solidi, gas, sostanze esplosive o altamente infiammabili, né a perossidi organici. L'esecuzione di questo test può essere evitata qualora la sostanza in esame sia già stata analizzata con il test ONU sui liquidi comburenti (1).

1.2 DEFINIZIONI E UNITÀ Per tempo medio di aumento della pressione si intende la media dei tempi misurati perché una miscela in esame produca un aumento della pressione da 690 kPa a 2070 kPa in autoclave.

1.3 SOSTANZA DI RIFERIMENTO Come sostanza di riferimento si utilizza acido nitrico acquoso al 65 % (p/p) (grado analitico). A scelta, se lo sperimentatore prevede che i risultati di questo test possano alla fine essere impiegati per altri scopi, può risultare appropriato eseguire il test anche con altre sostanze di riferimento.

1.4 PRINCIPIO DEL METODO UTILIZZATO Il liquido da sottoporre a test viene miscelato con cellulosa fibrosa in rapporto 1:1 (per massa) e introdotto in un recipiente a pressione. Se durante la miscelatura o il riempimento si verifica un'accensione spontanea non occorre proseguire il test. Se non si verifica un'accensione spontanea il test va eseguito interamente. Dopo aver riscaldato la miscela in un recipiente a pressione si misura il tempo medio di aumento della pressione da 690 kPa a 2070 kPa in autoclave, infine si confronta il risultato con il tempo medio di aumento della pressione rilevato per la miscela 1:1 della/e sostanza/e di riferimento con cellulosa.

1.5 CRITERI DI QUALITÀ In una serie di cinque prove eseguite su un'unica sostanza i risultati non devono differire di oltre il 30 % dalla media aritmetica; in caso contrario vanno scartati. Se ciò dovesse succedere, occorre provvedere a migliorare la procedura di miscelazione e di riempimento prima di ripetere il test.

1.6 DESCRIZIONE DEL METODO

1.6

1.6.1 Preparazione

1.6.1

1.6.1.1 Sostanza combustibile Come materiale combustibile viene impiegata cellulosa essiccata fibrosa con fibre di lunghezza compresa fra 50 e 250 μm e diametro medio di 25 μm. L'essiccazione avviene a peso costante formando uno strato di spessore non superiore a 25 mm, ad una temperatura di 105 oC per un periodo di 4 ore. La sostanza viene dunque conservata in un essiccatore in presenza di un essiccante nella fase di raffreddamento e comunque fino al momento del suo utilizzo. Il tenore di acqua della cellulosa essiccata deve essere inferiore allo 0,5 % della massa secca, eventualmente, se necessario, prolungando il tempo di essiccazione. Per tutto il test va utilizzato un unico lotto di cellulosa.

1.6.1.2 Apparecchiatura

1.6.1.2

1.6.1.2.1 Recipiente a pressione Si utilizza un recipiente a pressione formato da un cilindro di acciaio lungo 89 mm e avente un diametro esterno di 60 mm (vedi figura 1). Sui lati opposti occorre lavorare due superfici piane (che riducono la sezione trasversale del recipiente a 50 mm) per facilitare la presa mentre si preparano la spina di accensione e il tappo-sfiatatoio. Il recipiente, che ha un diametro interno di 20 mm, presenta alle due estremità una smussatura interna per una profondità di 19 mm ed è filettato in modo da accomodare filettature British Standard Pipe (BSP) da 1" o l'equivalente metrico. Un limitatore di pressione, formato da un braccio laterale, è avvitato sul lato curvo del recipiente a pressione a 35 mm da una delle estremità e a 90o rispetto alle superfici piane lavorate. L'incavo per il limitatore è perforato per una profondità di 12 mm e filettato in modo da accomodare il filo del BSP da 1/2" (o l'equivalente metrico) all'estremità del braccio laterale. Se necessario si inserisce un sigillo di materiale inerte per assicurare la tenuta stagna contro la fuoriuscita di gas. Il braccio laterale si estende per 55 mm oltre il corpo del recipiente a pressione e presenta un foro di 6 mm. L'estremità del braccio laterale è smussata e filettata in modo da accomodare un trasduttore di pressione del tipo a membrana. È possibile utilizzare qualunque tipo di misuratore di pressione, a condizione che non sia sensibile alla temperatura dei gas o ai prodotti della decomposizione e che sia in grado di rilevare l'aumento di pressione tra 690 e 2070 kPa in meno di 5 millisecondi. L'estremità del recipiente a pressione più lontana dal braccio laterale è chiusa con la spina di accensione provvista di due elettrodi, uno isolato dal corpo della spina e l'altro collegato a massa. L'altra estremità del recipiente a pressione è chiusa da un disco di rottura (pressione di scoppio di circa 2200 kPa) mantenuto in sede con un tappo di ritenuta provvisto di un'apertura di 20 mm. Se necessario la spina di accensione può essere dotata di un sigillo di materiale inerte per assicurare la tenuta stagna contro la fuoriuscita di gas. Una base appoggio (figura 2) mantiene l'assemblato nella posizione corretta durante l'utilizzo. In genere si ricorre ad una piastra di base in acciaio dolce di 235 mm x 184 mm × 6 mm provvista di un profilato cavo di 185 mm di lunghezza a sezione quadra di dimensioni di 70 mm x 70 mm × 4 mm. Da ciascuno dei lati opposti di un'estremità del profilato viene tagliata una sezione, in modo da formare una struttura a due gambe con i lati piatti sormontata da un tratto di profilato a sezione intatta della lunghezza di 86 mm. Le estremità di questi lati piatti sono tagliate ad angolo di 60o in orizzontale e sono saldate alla piastra di base. In un lato dell'estremità superiore della sezione della base viene eseguita una scanalatura di 22 mm di larghezza × 46 mm di profondità tale che, quando l'assemblato del recipiente a pressione viene calato dal lato dell'estremità della spina di accensione nel supporto del profilato squadrato, il braccio laterale possa inserirsi nella scanalatura. Un pezzo di acciaio largo 30 mm e spesso 6 mm viene saldato al lato inferiore interno della sezione quadra per fungere da distanziatore. Due viti a testa piatta da 7 mm inserite nella faccia opposta servono a mantenere fisso in posizione il recipiente a pressione. Due strisce d'acciaio larghe 12 mm e spesse 6 mm, saldate alle parti laterali lungo la base della sezione quadra, sostengono il recipiente a pressione dal di sotto.

1.6.1.2.2 Sistema di accensione Il sistema di accensione è formato da un filo in Ni/Cr lungo 25 cm con diametro di 0,6 mm e resistenza di 3,85 ohm/m. Mediante un'asta del diametro di 5 mm, il filo è arrotolato a formare una bobina ed è collegato agli elettrodi della spina di accensione. La bobina deve avere una delle configurazioni mostrate nella figura 3. La distanza fra il fondo del recipiente e la parte inferiore della bobina di accensione deve essere preferibilmente di 20 mm. Se gli elettrodi non sono regolabili, le estremità del filo di accensione fra la bobina e il fondo del recipiente vanno isolate con una guaina in ceramica. Il filo è riscaldato da un alimentatore a corrente continua di almeno 10 A.

1.6.2 Esecuzione del test L'apparecchiatura, assemblata con il trasduttore di pressione e il sistema di riscaldamento ma senza il disco di rottura posizionato, viene appoggiata con il lato della spina di accensione verso il basso. In un bicchiere di vetro si mescolano 2,5 g del liquido da esaminare con 2,5 g di cellulosa essiccata, utilizzando un agitatore in vetro. Per sicurezza, quando si miscelano le due sostanze occorre inserire uno schermo di protezione fra l'operatore e la miscela. Se la miscela si incendia durante il mescolamento o il riempimento, non occorre proseguire il test. La miscela va versata nel recipiente a pressione in piccole quantità, tamburellando sul contenitore e facendo in modo che essa si concentri intorno alla bobina di accensione e sia perfettamente a contatto con essa. È importante che durante questo processo di impaccamento la bobina non venga deformata per evitare risultati sfalsati. Il disco di rottura viene messo in posizione e il tappo di ritenuta viene avvitato saldamente. Il recipiente carico viene trasferito sulla base di appoggio per l'accensione, con il disco di rottura in alto e il tutto viene sistemato in un apposito armadio aspirato corazzato da laboratorio o in una camera di scoppio. L'alimentatore viene collegato ai terminali esterni della spina di accensione e impostato su 10 A. Il tempo fra l'inizio della miscelazione e l'accensione dell'alimentatore non deve superare i 10 minuti. Il segnale prodotto dal trasduttore di pressione viene registrato mediante sistema apposito che consenta sia la valutazione dei dati, sia la generazione di un registro permanente del profilo tempo-pressione ottenuto (ad esempio un registratore di segnali transitori unito a un registratore su carta). La miscela viene scaldata fino a rottura del disco o finché siano trascorsi almeno 60 s. Se la rottura del disco non si verifica, occorre lasciare raffreddare la miscela prima di smontare con cautela l'apparecchiatura, prendendo precauzioni per tenere conto dell'eventuale pressurizzazione. In totale vengono eseguite cinque prove con la sostanza in esame e la/le sostanza/e di riferimento. Si rileva e registra il tempo impiegato dalla pressione per aumentare da 690 kPa a 2070 kPa in autoclave. Infine si calcola il tempo medio di aumento della pressione. In alcuni casi le sostanze possono generare un aumento di pressione eccessivamente alto o basso dovuto a reazioni chimiche che non caratterizzano le proprietà comburenti della sostanza in questione. In tali casi può essere necessario ripetere il test con una sostanza inerte, come la diatomite (terra a diatomee), in luogo della cellulosa, allo scopo di chiarire la natura della reazione.

2. DATI Tempi di aumento della pressione sia per la sostanza in esame che per la/le sostanze di riferimento. Tempi di aumento della pressione per la sostanza inerte eventualmente utilizzata.

2. 2.1 Tabella 1 Esempi di risultati

TRATTAMENTO DEI RISULTATI Si calcolano i tempi medi di aumento della pressione, sia per la sostanza in esame che per la/le sostanze di riferimento. Si calcola il tempo medio di aumento della pressione per la sostanza inerte eventualmente utilizzata. La tabella 1 mostra alcuni esempi di risultati. preparata fresca per ciascun test. Sostanza Tempo medio di aumento della pressione per una miscela 1:1 con cellulosa (ms) Dicromato di ammonio, soluzione acquosa satura 20800 Nitrato di calcio, soluzione acquosa satura 6700 Nitrato di ferro, soluzione acquosa satura 4133 Perclorato di litio, soluzione acquosa satura 1686 Perclorato di magnesio, soluzione acquosa satura 777 Nitrato di nickel, soluzione acquosa satura 6250 Acido nitrico, 65 % 4767 Acido perclorico, 50 % 121 Acido perclorico, 55 % 59 Nitrato di potassio, soluzione acquosa al 30 % 26690 Nitrato di argento, soluzione acquosa satura Clorato di sodio, soluzione acquosa al 40 % 2555 Nitrato di sodio, soluzione acquosa al 45 % 4133 Sostanza inerte Acqua:cellulosa

3. RELAZIONE

3.

3.1 RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DEL TEST La relazione deve contenere le seguenti informazioni:

identità, composizione, purezza, ecc. della sostanza di prova,

concentrazione della sostanza di prova,

procedura di essiccazione della cellulosa,

contenuto di acqua della cellulosa,

risultati delle misurazioni,

risultati degli eventuali test con sostanza inerte,

tempi medi calcolati di aumento della pressione,

eventuali deviazioni dal metodo descritto e motivazioni,

qualunque informazione od osservazione rilevante per l'interpretazione dei risultati.

3.2 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI I risultati del test devono essere valutati in base ai seguenti criteri: Una sostanza liquida è considerata comburente quando: Allo scopo di evitare un risultato falso positivo, in sede di interpretazione dei risultati occorre, se necessario, tenere conto anche dei risultati ottenuti testando la sostanza con un materiale inerte.

3.2 a)

eventuale accensione spontanea della miscela formata dalla sostanza di prova e dalla cellulosa;

confronto del tempo medio impiegato dalla pressione per aumentare da 690 kPa a 2070 kPa con quello della/e sostanza/e di riferimento.

una miscela 1:1, per massa, di sostanza e cellulosa prende fuoco spontaneamente; oppure

una miscela 1:1, per massa, di sostanza e cellulosa presenta un tempo medio di aumento della pressione inferiore o uguale al tempo medio di aumento della pressione di una miscela 1:1, per massa, di acido nitrico acquoso al 65 % (p/p) e cellulosa.

4.(1) BIBLIOGRAFIA Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids. Nota: entrambe queste configurazioni possono essere utilizzate.

4.(1)

Figura 1 Recipiente a pressione

(A) Corpo del recipiente a pressione (B) Tappo di ritenuta del disco di rottura (C) Spina di accensione (D) Rondella di piombo dolce (E) Disco di rottura (F) Braccio laterale (G) Testa del trasduttore di pressione (H) Rondella (J) Elettrodo isolato (K) Elettrodo collegato a terra (L) Isolante (M) Cono d’acciaio (N) Scanalatura per deformazione rondella

Figura 2 Base d'appoggio

Figura 3 Sistema di accensione

(A) Bobina di accensione (B) Isolante (C) Elettrodi (D) Spina di accensione

Appendice Per ulteriori particolari tecnici, si possono consultare ad esempio le seguenti norme:

1. Metodi basati sull'impiego di capillari

1.

1.1. Apparecchi per la determinazione del punto di fusione a bagno liquido ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products

1.2. Apparecchi per la determinazione della temperatura di fusione a blocco di metallo DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics — polyarnides — determination of melting point

2. Apparecchi ed elementi riscaldanti

2.

2.1. Banco riscaldante di Kofler ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing; polymeric powder coatings

2.2. Microscopio di fusione DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

2.3. Metodo del menisco (poliammidi) ISO 1218 (E) Plastics — polyarnides — determination of melting point ANSI/ASTM D2133-66 Standard specification for acetal resin injection; moulding and extrusion materials NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du point de fusion. Méthode du ménisque

3. Metodi per la determinazione della temperatura di congelamento BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for determination of melting point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsauren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristalisation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Analisi termica

4.

4.1. Analisi termica differenziale ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Calorimetria differenziale a scansione ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Determinazione del punto di scorrimento NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite — Monstememing en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils — Determination of pour point.

Appendice Per ulteriori particolari tecnici, si possono ad esempio consultare le seguenti norme:

1. Ebulliometro ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Metodo della distillazione (intervallo di ebollizione) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Analisi termica differenziale e calorimetria differenziale a scansione ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe

Appendice Per ulteriori particolari tecnici, possono essere consultate, a titolo d'esempio, le seguenti norme:

1. Metodi per galleggiamento

1.

1.1. Idrometro DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers: construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers: standardized sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Chemical products for industrial use. Determination of density of liquids — Areometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2. Bilancia idrostatica

1.2. Per sostanze solide

ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Chemical products for industrial use — Determination of the density of solids other than powders and cellular products — Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density

Per sostanze liquide

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 and ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3. Metodo della sfera immersa DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2. Metodi picnometrici

2.

2.1. Per sostanze liquide ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematìc viscosity of less than 100,10-6 m2 s-1 at 15 oC) DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC) DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have a too high vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol-water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products — chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method NF T 20-053 Chemical products for industrial use — Determination of density of solids in powder and liquids — Pycnometric method

2.2. Per sostanze solide ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics. NT T 20-053 Chemical products for industrial use — Determination of density of solids in powder and liquids — Pycnometric method DIN 19683 Determination of the density of soils

3. Picnometro di comparazione ad aria DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung

Appendice 1 Metodo di stima

INTRODUZIONE

I valori calcolati della tensione di vapore possono essere utilizzati:

per decidere quale dei metodi sperimentali sia appropriato;

per fornire un valore di stima o un valore limite nei casi in cui il metodo sperimentale non possa esser applicato per ragioni tecniche (incluso il caso in cui la tensione di vapore sia molto bassa);

per aiutare ad identificare i casi nei quali è giustificato omettere la misura sperimentale perché la tensione di vapore è probabile che sia < 10-5 Pa a temperatura ambiente.

METODO DI STIMA

La tensione di vapore dei liquidi e solidi può essere stimata mediante l'uso della correlazione di Watson modificata (a). L'unico dato sperimentale richiesto è il punto di ebollizione normale. Questo metodo è applicato sull'intervallo di pressioni da 105 Pa a 10-5 Pa. Informazioni più precise sul metodo sono fornite nello Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b).

PROCEDURA DI CALCOLO

Secondo (b), la tensione di vapore viene calcolata come segue: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb dove: T temperatura di interesse Tb punto di ebollizione normale Pvp tensione di vapore alla temperatura T Δ Hvb calore di vaporizzazione Δ Zb, fattore di compressibilità (stimato in 0,97) m fattore empirico che dipende dallo stato fisico alla temperatura di interesse inoltre Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb dove Kp è un fattore empirico che tiene conto della polarità della sostanza. Per diversi tipi di composto, i fattori Kp sono elencati nel riferimento (b). Molto spesso, sono disponibili dei dati nei quali è fornito un punto di ebollizione a pressione ridotta. In tale caso, secondo (b), la tensione di vapore si calcola come segue: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 dove T1 è il punto di ebollizione alla pressione ridotta P1.

RELAZIONE

Quando si usa il metodo della stima, la relazione deve includere una documentazione completa del calcolo.

BIBLIOGRAFIA

(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem., 1943, vol. 35, 398.

(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, 1982.

Appendice 2

Figura 1 Apparecchio per la determinazione della curva di tensione di vapore mediante il metodo dinamico

1 = Termocoppia 2 = Polmone per il vuoto 3 = Manometro 4 = Al vuoto 5 = Punto di misura 6 = Elemento riscaldante (150 W circa)

Figura 2a Apparecchio per la determinazione della curva della tensione di vapore secondo il metodo statico (con l'uso di un manometro con tubo ad U)

1. Sostanza in esame 2. Fase vapore 3. Valvola per alto vuoto 4. Tubo ad U (manometro ausiliario) 5. Manometro 6. Bagno termostatico 7. Dispositivo di misura della temperatura 8. Verso la pompa a vuoto 9. Ventilazione

Figura 2b Apparecchio per la determinazione della curva della tensione di vapore secondo il metodo statico (con l'uso di un indicatore di pressione)

1. Sostanze in esame 2. Fase vapore 3. Valvola per alto vuoto 4. Manometro 5. Indicatore di pressione 6. Bagno termostatico 7. Dispositivo di misura della temperatura

Figura 3 Isoteniscopio (rif. bibl. 7)

1. A sistema di controllo e misura della pressione 2. Tubo da 8 mm di diametro esterno 3. Azoto secco nel sistema di pressione 4. Vapore del campione 5. Estremo inferiore 6. Campione liquido

Figura 4 Apparecchio per la determinazione della curva della tensione di vapore secondo il metodo della bilancia a tensione di vapore

1. Sostanza in esame 2. Fase vapore con corrente di vapore 3. Forno di evaporazione con ingresso rotativo 3a. Coperchio del forno con apertura 4. Riscaldamento (refrigerazione) del forno 5. Misura della temperatura del campione 6. Recipiente refrigerante 7. Schermo 8. Barra di raffreddamento per il recipiente refrigerante 9. Piatto della bilancia 10. Microbilancia 11. Al registratore 12. Alla pompa ad alto vuoto

Figura 5 Esempio di apparecchio per l'evaporazione a bassa pressione mediante il metodo di effusione, con una cella di effusione del volume di 8 cm3

1. Connessione al vuoto 2. Pozzetti per il termometro a resistenza di platino o per la misura e il controllo della temperatura (n. 2) 3. Coperchio del recipiente da vuoto 4. O-ring 5. Recipiente da vuoto in alluminio 6. Dispositivo per installare e rimuovere le celle di effusione 7. Coperchio a vite 8. Dadi ad alette (n. 6) 9. Bulloni (n. 6) 10. Celle di effusione in acciaio inossidabile 11. Cartucce riscaldanti (n. 6)

Figura 6a Esempio di sistema di flusso per la determinazione della tensione di vapore mediante il metodo della saturazione gassosa

1 = Regolatore di flusso 2 = Scambiatore di calore 3 = Valvola a spillo 4 = Sensore umidità relativa 5 = Colonne di saturazione 6 = Giunti in teflon 7 = Flussimetro 8 = Condensatore per il vapore (adsorbente) 9 = Condensatore ad olio 10 = Gorgogliatore in vetro sinterizzato Apertura Rampa

Figura 6b Esempio di sistema per la determinazione della tensione di vapore mediante il metodo della saturazione di gas, con un capillare disposto a valle della camera di saturazione

1. Flussimetro di massa termico 2. Manometro 3. Camera a temperatura controllata 4. Serpentino di termostatazione per il gas di trasporto 5. Termometro (Pt 100) 6. Camera di saturazione del gas 7. Capillare 8. Vasi di adsorbimento 9. Contatore di gas 10. Trappola fredda

Figura 7 Esempio della disposizione sperimentale per il metodo del rotore

Apparecchio per la tensione di vapore A. Testina del sensore a rotore B. Cella del campione C. Termostato D. Linea del vuoto (turbopompa) E. Termostato ad aria

Figura 8 Esempio di testina di misurazione a rotore

1. Sfera; 2. Estensione tubolare evacuata di 6 3. Magneti permanenti (n. 2); 4. Bobine (n. 2) per la stabilizzazione verticale; 5. Bobine di azionamento (n. 4); 6. Flangia di collegamento.

Appendice

Figura 1 Metodo dell'eluizione su colonna con pompa di circolazione

Equilibrazione atmosferica Misuratore di flusso Microcolonna Pompa di circolazione termostata Pompa di circolazione Valvola a due vie per il compionamento

Figura 2 Microcolonna tipica

(tutte le quote sono in mm) Connessione per il giunto di vetro smerigliato Spazio di testa Diametro interno 5 Diametro esterno 19 Batuffolo di lana di vetro Rubinetto a due vie

Figura 3 Microcolonna tipica

(tutte le quote sono in mm) Connessione per il giunto di vetro smerigliato Spazio di testa Diametro interno 5 Diametro esterno 19 Rubinetto

Figura 4 Metodo dell'eluizione su colonna con recipiente di livellamento

1 = Recipiente di livellamento (per esempio bottiglia da 2,5 litri) 2 = Colonna (vedi figura 3) 3 = Collettore di frazioni 4 = Termostato 5 = Tubo in teflon 6 = Tappo di vetro (per connessione in vetro smerigliato) 7 = Tubi per l’acqua (tra il termostato e la colonna, diametro interno: 8 mm circa)

Appendice 1 Metodi di calcolo/stima

INTRODUZIONE

Un'introduzione generale ai metodi di calcolo, dati ed esempi si trova nello Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). I valori calcolati di Poa possono essere usati:

per decidere quale dei metodi sperimentati sia appropriato (intervallo del metodo di dibattimento in pallone: log Poa da — 2 a 4, intervallo del metodo in HPLC: log Poa da 0 a 6),

per scegliere le condizioni sperimentali appropriate (ad esempio, sostanze di riferimento per i procedimenti HPLC, rapporto in volume n-ottanolo/acqua per il metodo del dibattimento in pallone),

come verifica interna di laboratorio per possibili errori sperimentali,

per ottenere una stima di Poa nei casi in cui i metodi sperimentali non possano essere applicati per ragioni tecniche.

METODO DI STIMA

Stima preliminare del coefficiente di ripartizione

Il valore del coefficiente di ripartizione può essere stimato mediante l'uso delle solubilità della sostanza in esame nei solventi puri: a tale scopo: Pestimate = saturation cn-octanolsaturation cwater

METODI DI CALCOLO

Principio dei metodi di calcolo

Tutti i metodi di calcolo sono basati sulla frammentazione formale della molecola in sottostrutture adatte per le quali sono noti incrementi di log Poa affidabili. Il log Poa della molecola intera viene poi calcolato come somma dei valori corrispondenti dei suoi frammenti più la somma di termini di correzione per le interazioni intramolecolari. Sono disponibili elenchi delle costanti di frammentazione e dei termini di correzione (b) (c) (d) (e). Alcuni di questi vengono regolarmente aggiornati (b).

Criteri di qualità

In generale, l'affidabilità del metodo di calcolo diminuisce al crescere della complessità del composto in esame. Nel caso di molecole semplici di basso peso molecolare e con uno o due gruppi funzionali, ci si può attendere una deviazione da 0,1 a 0,3 unità di log Poa tra i risultati dei metodi di frammentazione e il valore misurato. Nel caso di molecole più complesse, il margine d'errore può essere più grande. Questo dipenderà dall’affidabilità e disponibilità delle costanti dei frammenti, nonché dalla capacità di riconoscere le interazioni intramolecolari (ad esempio i legami idrogeno) e dall'uso corretto dei termini di correzione (problema di non difficile soluzione utilizzando un elaboratore di calcolo e il programma CLOGP-3) (b). Nel caso di composti che si ionizzano, è importante considerare correttamente la carica e il grado di ionizzazione.

Procedure di calcolo Metodo del π di Hansch

La costante del sostituente idrofobo originale, π, introdotta da Fujita et al. (f) è definita come: πx = log Poa (PhX) - log Poa (PhH) dove Poa (PhX) è il coefficiente di ripartizione di un derivato aromatico e Poa (PhH) quello del composto capostipite (e.g. πCl = log Poa (C6H5Cl) - log Poa (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71). Secondo la sua definizione, il metodo del π può essere applicato principalmente per la sostituzione aromatica. Valori di π per un gran numero di sostituenti sono stati tabulati in (b) (c) (d). Essi vengono usati per il calcolo di log Poa di molecole o sottostrutture aromatiche.

Metodo di Rekker

Secondo Rekker (g), il valore di log Poa viene calcolato come segue: log Pow=Σi ai fi+Σj (termini di interazione) dove f, rappresenta la costante dei differenti frammenti molecolari e a, la frequenza con cui essi si presentano nella molecola in esame. I termini di correzione possono essere espressi come multiplo intero di una costante singola Cm (la cosiddetta costante magica). Le costanti di frammento fi e Cm sono state ricavate da un elenco di 1054 valori sperimentali di Poa (825 composti) utilizzando l'analisi di regressione multipla (c) (h). La determinazione dei termini di interazione viene eseguita secondo regole fisse descritte in letteratura (e) (h) (i).

Metodo di Hansch-Leo

Secondo Hansch e Leo (c), il valore di log Poa si calcola dalla relazione: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj in cui fi, rappresenta la costante per differenti frammenti molecolari, Fj il termine di correzione e ai, bj le corrispondenti frequenze con cui essi si presentano. Una serie di valori di frammenti costituiti da atomi e gruppi e una serie di termini di correzione Fj (i cosiddetti fattori) sono stati determinati per approssimazioni successive derivandoli da valori sperimentali di Poa. I termini di correzione sono stati ordinati in varie classi (a) (c). E relativamente complicato e lungo tener conto di tutte le regole e dei termini di correzione. Sono stati sviluppati a tale scopo dei pacchetti di programma (b).

Metodo combinato

Il calcolo del log Poa di molecole complesse può venire migliorato considerevolmente se la molecola viene divisa in strutture più semplici per le quali sono disponibili valori affidabili di log Poa ottenuti o da tabelle (b) (c) o da proprie misure. Tali frammenti (ad esempio sostanze eterocidiche, antrachinoni, azobenzene) possono poi venire combinati con i valori di π di Hansch o con le costanti di frammento di Rekker o Leo.

Osservazioni i)

I metodi di calcolo possono essere applicati a composti parzialmente o completamente ionizzati solo quando è possibile tener conto dei necessari fattori di correzione.

ii)

Se si può assumere che vi siano dei legami idrogeno intramolecolari, i corrispondenti termini di correzione (approssimativamente da +0,6 a +1,0 unità di log Poa) devono venire aggiunti (a). Indicazioni della presenza di tali legami si possono ottenere da modelli tridimensionali o da dati spettroscopici della molecola.

iii)

Se sono possibili varie forme tautomere, sì deve assumere come base di calcolo la forma più probabile.

iv)

È opportuno seguire con attenzione le revisioni degli elenchi delle costanti di frammento.

Relazione

Quando si utilizzano metodi di calcolo/stima, la relazione deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

descrizione della sostanza (miscela, impurezze, e così via),

indicazione di ogni possibile legame idrogeno intramolecolare, dissociazione, carica e altri effetti insoliti (ad esempio tautomeria),

descrizione del metodo di calcolo,

identificazione o fornitura della base di dati,

peculiarità della scelta dei frammenti,

documentazione completa del calcolo.

BIBLIOGRAFIA

(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chill. Ther., 1979, vol. 14, 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.

(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, vol. 1, Elsevier, New York, 1977.

(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.

(i) R.A. Scherrer, ACS — American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Appendice 2 Sostanze di riferimento raccomandate per il metodo HPLC

N. Sostanza di riferimento log Poa pKa 1 2-butanone 0,3 2 4-acetilpiridina 0,5 3 anilina 0,9 4 acetanilide 1,0 5 alcool benzilico 1,1 6 p-metossifenolo 1,3 pKa = 10,26 7 acido fenossiacetico 1,4 pKa = 3,12 8 fenolo 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenolo 1,5 pKa = 3,96 10 benzonitrile 1,6 11 fenilacetonitrile 1,6 12 alcool 4-metilbenzilico 1,6 13 acetofenone 1,7 14 2-nitrofenolo 1,8 pKa = 7,17 15 acido 3-nitrobenzoico 1,8 pKa = 3,47 16 4-cloroanilina 1,8 pKa = 4,15 17 nitrobenzene 1,9 18 alcool cinnamico 1,9 19 acido benzoico 1,9 pKa = 4,19 20 p-cresolo 1,9 pKa = 10,17 21 acido cinnamico 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 anisolo 2,1 23 metilbenzoato 2,1 24 benzene 2,1 25 acido 3-metilbenzoico 2,4 pKa = 4,27 26 4-clorofenolo 2,4 pKa = 9,1 27 tricloroetilene 2,4 28 atrazina 2,6 29 etilbenzoato 2,6 30 2,6-diclorobenzonitrile 2,6 31 acido 3-clorobenzoico 2,7 pKa = 3,82 32 toluene 2,7 33 1-naftolo 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-didoroanilina 2,8 35 clorobenzene 2,8 36 allilfenil etere 2,9 37 bromobenzene 3,0 38 etilbenzene 3,2 39 benzofenone 3,2 40 4-fenilfenolo 3,2 pKa = 9,54 41 timolo 3,3 42 1,4-diclorobenzene 3,4 43 difenilammina 3,4 pKa = 0,79 44 naftalene 3,6 45 fenilbenzoato 3,6 46 isopropilbenzene 3,7 47 2,4,6-triclorofenolo 3,7 pKa = 6 48 bifenile 4,0 49 benzilbenzoato 4,0 50 2,4-dinitro-6-sec.butilfenolo 4,1 51 1,2,4-triclorobenzene 4,2 52 acido dodecanoico 4,2 53 difeniletere 4,2 54 n-burilbenzene 4,5 55 fenantrene 4,5 56 fluorantene 4,7 57 dibenzile 4,8 58 2,6-difenilpiridina 4,9 59 trifenilammina 5,7 60 DDT 6,2 Altre sostanze di riferimento di basso Poa 1 acido nicotinico -0,07

Appendice

Figura Stampo e accessori per la preparazione del campione

(Tutte le dimensioni sono espresse in mm) Lunghezza dello stampo: 250 mm Materiale: alluminio

Appendice

Figura Apparecchiatura

Appendice

Esempi di specifiche dei materiali per la prova di sensibilità termica (vedi DIN 1623) (1)(2)(3)

Tubo: specifica materiali numero 1.0336.505 g Piastra forata: specifica materiali numero 1.4873 Collare filettato e dado: specifica materiali numero 1.3817

Figura 1 Apparecchio per la prova della sensibilità termica

(quote espresse in millimetri) Figura 1a Tubo d’acciaio e accessori (1) tubo (1a) flangia esterna (2) collare filettato: filetto a basso attrito (3) piastra forata, diametro a = 2,0 o 6,0 mm (4) dado diametro b = 10 mm (5) superficie smussata (6) 2 facce per chiave n. 41 Figura 1b Dispositivo di riscaldamento e protezione (7) due facce per chiave numero 36 (8) scatola resistente alle schegge (9) due aste di supporto per il tubo (10) tubo assemblato (11) posizione del bruciatore posteriore; gli altri bruciatori sono visibili

Figura 2 Prova di sensibilità termica

(esempi di frammentazione) Non esploso Non esploso Esploso Esploso Esploso Esploso

Figura 3 Taratura della velocità di riscaldamento per la prova di sensibilità termica

Temperatura (°C) Tempo (s) Curva temperatura/tempo ottenuta riscaldando dibutilftalato (27 cm3 in un tubo chiuso (piastra forata da 1,5 mm) con propano ad una portata di 3,2 litri al minuto. La temperatura viene misurata con una termocoppia cromel/alumel con guaina d'acciaio inossidabile del diametro di 1 mm disposta centralmente 43 mm al di sotto del bordo del tubo. La velocità di riscaldamento tra 135 oC e 285 oC deve essere compresa tra 185 e 215 K/min.

Figura 4 Apparecchio per le prove d'urto

(quote espresse in millimetri) (1) base, 450 x 450 x 60 (2) blocco d’acciaio, 230 x 250 x 200 (3) incudine, diametro 100 x 70 (4) colonna (5) traversa mediana (6) due guide (7) cremagliera (8) scala graduata (9) martello cadente (massa cadente) (10) dispositivo di ritenzione e liberazione (11) piastra di posizionamento (12) incudine intermedia (sostituibile) diametro 26 x 26 (13) anello di posizionamento con orifici (14) dispositivo d’urto Figura 4a Martello cadente, vista generale frontale e laterale Figura 4b Martello cadente, parte inferiore

(segue)

Figura 4d Dispositivo d’urto per sostanze liquide Figura 4c Dispositivo d’urto per sostanze in polvere o in pasta (1) cilindri d’acciaio (2) anello di guida per i cilindri d’acciaio (3) anello di posizionamento con orifici (a) sezione verticale (b) pianta (4) anello di gomma (5) sostanza liquida (40 mm3) (6) spazio libero sopra al liquido Figura 4e Martello (massa di caduta di 5 kg) (1) giunto di sospensione (2) indicatore d’altezza (3) solco di posizionamento (4) testa d’urto cilindrica (5) dente d’arresto

Figura 5 Apparecchio per la sensibilità all'attrito

Figura 5a Apparecchio di sfregamento: vista in elevazione e in pianta (1) base d’acciaio (2) carrello mobile (3) piastra di porcellana, 25 x 25 x 5 mm, portata sul carrello (4) barra di porcellana fissa, diametro 10 x 15 mm (5) campione in esame, approssimativamente 10 mm 3 (6) supporto della barra (7) braccio di armatura (8) contrappeso (9) interruttore (10) ruota per regolare il carrello nella posizione di partenza (11) direzione verso il motore elettrico Figura 5b Posizione di partenza della barra sul campione

Appendice

Figura Stampo e accessori per la preparazione del campione

(Tutte le dimensioni sono espresse in mm) Lunghezza dello stampo: 250 mm Materiale: alluminio

Allegato Esempi di altri metodi per la determinazione del peso molecolare medio numerico (MN) di polimeri

La cromatografia a permeazione di gel (GPC) è il metodo preferito per la determinazione di Mn, in particolare quando sia disponibile una serie di standard la cui struttura è confrontabile con quella del polimero. Tuttavia, nel caso vi siano difficoltà pratiche per usare la GPC o si preveda già che la sostanza non rispetti un criterio normativo di Mn (che richiede conferma), sono disponibili metodi alternativi come:

1.1.1.1.2.1.3.1.4.

Uso di proprietà colligative Ebullioscopia/crioscopia: prevede la misura dell'innalzamento del punto di ebollizione (ebullioscopia) o dell'abbassamento del punto di congelamento (crioscopia) dì un solvente quando si aggiunge un polimero. Il metodo è basato sul fatto che l'effetto del polimero disciolto sul punto di ebollizione/congelamento del liquido dipende dal peso molecolare del polimero (1) (2). Applicabilità: Mn < 20000. Abbassamento della tensione di vapore: prevede la misura della tensione di vapore di un dato liquido di riferimento prima e dopo l'aggiunta di quantità note di polimero (1) (2). Applicabilità: Mn < 20000 (in teoria; in pratica però di valore limitato). Qsometria su membrana: è basata sul principio dell'osmosi, cioè della tendenza naturale delle molecole di solvente a passare attraverso una membrana semipermeabile da una soluzione diluita verso una soluzione concentrata fino a raggiungere l'equilibrio. Nel saggio, la soluzione diluita è a concentrazione zero, mentre la soluzione concentrata contiene il polimero. L'effetto di aspirazione del solvente attraverso la membrana dà luogo ad un differenziale di pressione che dipende dalla concentrazione e dal peso molecolare del polimero (1) (3) (4). Applicabilità: Mn compreso tra 20000 — 200000. Osmometria in fase vapore: prevede il confronto della velocità di evaporazione di un aerosol del solvente puro con almeno tre aerosol contenenti il polimero a varie concentrazioni (1) (2) (4). Applicabilità: Mn < 20000.

2. Analisi dei gruppi terminali Per usare questo metodo è necessario conoscere sia la struttura complessiva del polimero che la natura dei gruppi terminali delle catene (che devono poter essere distinti dallo scheletro principale per esempio mediante NMR o titolazione/derivatizzazione). La determinazione della concentrazione molecolare dei gruppi terminali presenti sul polimero può portare ad un valore del peso molecolare (7) (8) (9). Applicabilità: Mn fino a 50000 (con affidabilità decrescente).

3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)

Bibliografia Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn, John Wiley, New York. Glover, CA, (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989), Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pag. 25-52. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989), Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E. Muller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Cari Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G. (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed, Marcel Dekker, New York. Amiya, S, et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

Allegato Indicazioni per la correzione del contenuto di specie di basso peso molecolare in funzione della presenza di polimero insolubile

Quando in un campione è presente polimero insolubile, si verifica una perdita di massa durante l'analisi GPC. Il polimero insolubile viene trattenuto in modo irreversibile sulla colonna o sul filtro del campione, mentre la porzione solubile del campione passa attraverso la colonna. Se l'incremento dell'indice di rifrazione (dn/dc) del polimero può essere stimato o misurato, si può stimare la massa di campione persa sulla colonna. In tal caso si effettua una correzione usando una taratura esterna con materiali standard di concentrazione nota e dn/dc noto per tarare la risposta del rifrattometro. Nel seguente esempio si usa uno standard di poli(metilmetacrilato) (pMMA). Nella taratura esterna per l'analisi di polimeri acrilici, si analizza uno standard di pMMA di concentrazione nota in tetraidrofurano mediante GPC e i dati risultanti vengono usati per trovare la costante del rifrattometro secondo l'equazione: K = R/(C × V × dn/dc) in cui: K è la costante del rifrattometro (in microvolt secondi/ml), R è la risposta dello standard di pMMA (in microvolt/secondi), C è la concentrazione dello standard di pMMA (in mg/ml), V è il volume di iniezione (in ml) e dn/dc è l'incremento di indice di rifrazione per il pMMA in tetraidrofurano (in ml/mg). I seguenti sono dati tipici di uno standard di pMMA: R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 × 10-5 ml/mg. II valore di K risultante, 3,05 × 1011 viene poi utilizzato per calcolare la risposta teorica del rivelatore se il 100 % del polimero iniettato fosse stato eluito attraverso il rivelatore.

PARTE B METODI PER LA DETERMINAZIONE DELLA TOSSICITÀ E DEGLI ALTRI EFFETTI SULLA SALUTE

INTRODUZIONE GENERALE A.

CARATTERIZZAZIONE DELLA SOSTANZA IN ESAME Prima dell'inizio di qualsiasi studio di tossicità occorre conoscere la composizione della sostanza in esame, incluse le impurità principali e le proprietà fisico-chimiche pertinenti, compresa la stabilità. Le proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame forniscono informazioni importanti per la scelta della via di somministrazione, per la progettazione dei vari studi e per il trattamento e la conservazione della sostanza in esame. L'elaborazione di un metodo analitico per la determinazione qualitativa e quantitativa della sostanza in esame (comprese, se possibile, le principali impurità) nel mezzo di dosaggio e nel materiale biologico deve precedere l'inizio dello studio. Tutte le informazioni relative all'identificazione, alle proprietà fisico-chimiche, alla purezza e al comportamento della sostanza devono essere riportate nella relazione del saggio.

CURA DEGLI ANIMALI Nei saggi di tossicità è indispensabile esercitare un rigoroso controllo delle condizioni ambientali e utilizzare tecniche adeguate per la cura degli animali.

(i) Condizioni di alloggiamento Le condizioni ambientali nei locali o nei recinti degli animali da laboratorio devono essere appropriate per le specie sperimentali. Per ratti, topi e porcellini d'India è indicata una temperatura ambiente di 22 oC ±3 oC con un'umidità relativa del 30-70 %. Per i conigli, la temperatura deve essere di 20 ± 3 oC con un'umidità relativa del 30-70 %. Talune tecniche sperimentali sono particolarmente sensibili agli effetti della temperatura e, in tali casi, la descrizione del metodo di saggio comprende indicazioni precise sulle condizioni adeguate. In tutti gli studi di tossicità, la temperatura e l'umidità devono essere controllate, registrate e riportate nella relazione finale dello studio. L'illuminazione deve essere artificiale ed alternare 12 ore di luce e 12 ore di oscurità. Le condizioni di illuminazione devono essere dettagliatamente registrate e riportate nella relazione finale dello studio. Salvo nel caso in cui venga diversamente specificato nel metodo, gli animali dovranno essere alloggiati in gabbie individuali o contenenti piccoli gruppi dello stesso sesso. In questo caso il numero degli animali non dovrà essere superiore a cinque. Nelle relazioni sugli esperimenti effettuati su animali dovranno essere indicati il tipo di gabbie utilizzate e il numero di animali alloggiati in ogni gabbia sia durante l'esposizione alla sostanza chimica che durante tutto il periodo successivo di osservazione.

(ii) Condizioni di alimentazione La dieta deve soddisfare tutte le esigenze nutrizionali della specie utilizzata per il saggio. Qualora le sostanze in esame vengano somministrate agli animali nella loro dieta, il valore nutrizionale degli alimenti potrebbe essere ridotto per effetto dell'interazione tra la sostanza ed un costituente dietetico. Nell'interpretazione dei risultati dei saggi si dovrà tener conto di questa possibilità. Gli animali potranno essere nutriti con diete convenzionali da laboratorio ed abbeverati con acqua a sazietà. La scelta della dieta potrà essere condizionata dalla necessità di garantire un apporto adeguato della sostanza in esame, qualora essa venga somministrata con gli alimenti. I contaminanti dietetici suscettibili di influenzare la tossicità non dovrebbero essere presenti in condizioni tali da causare interferenze.

METODI ALTERNATIVI L'Unione europea è impegnata a sviluppare e collaudare tecniche alternative che consentano di ottenere lo stesso livello di informazioni degli attuali esperimenti su animali, riducendo tuttavia il numero di animali utilizzati e le sofferenze ad essi inflitte o evitando del tutto il ricorso agli animali. Non appena perfezionati, tali metodi dovranno costituire, ove possibile, la scelta d'elezione per gli studi miranti alla caratterizzazione dei rischi e alla conseguente classificazione ed etichettatura delle sostanze in funzione dei rischi intrinseci.

VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE Nella valutazione ed interpretazione dei saggi occorre tener conto dei limiti entro i quali i risultati di studi su animali e in vitro possono essere estrapolati direttamente all'uomo; laddove si abbia evidenza di effetti avversi per l'uomo, questa potrà essere utilizzata per confermare i risultati sperimentali.

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI La maggior parte di detti metodi è stata messa a punto nell'ambito del programma per la definizione di linee guida elaborato dall'OCSE in materia di saggi. Essi dovranno essere applicati in conformità con i principi delle buone pratiche di laboratorio allo scopo di garantire il più possibile il reciproco riconoscimento dei dati. Ulteriori informazioni sono reperibili nei riferimenti citati nelle linee guida dell'OCSE e nell'ampia letteratura esistente in materia.

B.1. bis. TOSSICITÀ ORALE ACUTA — METODO A DOSE FISSA

B.1. bis.

1. METODO Questo metodo di prova è equivalente al metodo OCSE TG 420 (2001)

1.

1.1. INTRODUZIONE I metodi tradizionali di valutazione della tossicità acuta utilizzano come endpoint la morte degli animali. Nel 1984, la British Toxicology Society ha proposto un nuovo metodo, basato sulla somministrazione di una serie di dosi fisse (1), che invece di utilizzare come endpoint la morte degli animali prevede l'osservazione di segni evidenti di tossicità in seguito alla somministrazione di una dose facente parte di una serie prestabilita. In seguito a studi di validazione in vivo eseguiti nel Regno Unito (2) e a livello internazionale (3), il procedimento è stato adottato come metodo di prova nel 1992. Successivamente, le proprietà statistiche del metodo a dose fissa sono state oggetto di valutazione in una serie di studi basati sull'impiego di modelli matematici (4)(5)(6). Sia gli studi in vivo sia quelli di modellizzazione hanno dimostrato che il procedimento è riproducibile, utilizza un minor numero di animali provocando meno sofferenze rispetto ai metodi tradizionali, e permette di classificare le sostanze in maniera analoga agli altri metodi di prova della tossicità acuta. Per indicazioni sulla scelta del metodo di prova più adatto per un determinato scopo, si rimanda alle linee guida OCSE sui test di tossicità orale acuta (7), che contengono ulteriori informazioni sull'esecuzione e sull'interpretazione del metodo di prova B.1 bis. Il metodo prevede che nello studio principale si utilizzino solo dosi a moderata tossicità, evitando di somministrare dosi che possano avere un effetto letale. Inoltre non è necessario somministrare dosi che provocano notoriamente dolore e sofferenze gravi per effetto dell'azione corrosiva o fortemente irritante. Gli animali moribondi o che manifestano dolore evidente o segni di sofferenza grave e persistente devono essere sottoposti a eutanasia e ai fini dell'interpretazione dei risultati devono essere assimilati agli animali morti durante lo svolgimento del test. I criteri da applicare per decidere la soppressione degli animali moribondi o in stato di grave sofferenza sono oggetto di specifiche linee guida, che indicano anche come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente (8). Il metodo fornisce informazioni sulla pericolosità della sostanza esaminata, permettendone la classificazione secondo il GHS (Global Harmonized System), sistema armonizzato su scala mondiale per la classificazione delle sostanze chimiche che causano tossicità acuta (9). Prima di effettuare lo studio, il laboratorio che esegue il test deve consultare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza di prova, tra cui l'identità e la struttura chimica, le proprietà chimico-fisiche, i risultati di eventuali altri test di tossicità in vitro o in vivo eseguiti sulla sostanza, i dati tossicologici su sostanze strutturalmente affini, l'impiego o gli impieghi previsti. Queste informazioni sono necessarie per provare a tutti i soggetti interessati l'adeguatezza del test per la protezione della salute umana e servono a scegliere la giusta dose iniziale.

1.2. DEFINIZIONI Tossicità orale acuta: effetti avversi che si verificano in seguito alla somministrazione orale di una singola dose o di più dosi di una sostanza nell’arco di 24 ore. Morte tardiva: termine usato per indicare che l’animale non muore né appare moribondo nelle 48 ore successive alla somministrazione, ma muore successivamente, durante il periodo di osservazione di 14 giorni. Dose: quantità di sostanza somministrata. Viene espressa in peso della sostanza di prova per unità di peso dell’animale sottoposto al test (ad es. mg/kg). Tossicità manifesta: termine generale che indica la presenza di chiari segni di tossicità in seguito alla somministrazione della sostanza di prova [per alcuni esempi, cfr. (3)], tali da far prevedere alla dose fissa immediatamente superiore manifestazioni di dolore intenso e segni persistenti di grave sofferenza, uno stato di agonia [i criteri che definiscono tale stato sono illustrati nelle linee guida OCSE citate in bibliografia al n. (8)] o la morte della maggior parte degli animali. GHS (Globally Harmonized System): sistema armonizzato globale per la classificazione delle sostanze e delle miscele chimiche. Si tratta di un'iniziativa congiunta dell'OCSE (salute umana e ambiente), del Comitato di esperti delle Nazioni Unite sul trasporto delle merci pericolose (proprietà fisico-chimiche) e dell'Organizzazione internazionale del lavoro (comunicazione del rischio), coordinata dal programma IOMC per la gestione ottimale delle sostanze chimiche (Inter-organization programme for the sound management of chemicals). Morte imminente: stato in cui si prevede l'agonia o la morte dell'animale prima della successiva osservazione in programma. Per i roditori tra i segni indicativi di morte imminente figurano le convulsioni, la posizione laterale o prona e il tremore [per maggiori indicazioni, cfr. le linee guida OCSE citate in bibliografia al n. (8)]. DL50(dose letale 50): la singola dose di sostanza, determinata statisticamente, capace di provocare la morte del 50 % degli animali a cui viene somministrata per via orale. Il valore della DL50 viene espresso in peso della sostanza di prova per unità di peso dell'animale usato per il saggio (mg/kg). Dose limite: dose corrispondente al limite superiore fissato per il test (2000 o 5000 mg/kg). Stato di agonia: fase in cui l'animale è moribondo o non è in grado di sopravvivere, nemmeno se sottoposto a trattamento [per maggiori indicazioni, cfr. le linee guida OCSE citate in bibliografia al n.(8)]. Morte prevedibile: presenza di segni clinici, come ad esempio l'incapacità di raggiungere il cibo o l'acqua, che indicano che l'animale morirà prima della conclusione programmata dell'esperimento [per maggiori indicazioni, cfr. le linee guida OCSE citate in bibliografia al n. (8)].

1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI PROVA La sostanza viene somministrata a gruppi di animali dello stesso sesso seguendo un procedimento articolato in più fasi successive che prevede la somministrazione di dosi fisse di 5, 50, 300 e 2000 mg/kg (in casi eccezionali può essere prevista una dose fissa aggiuntiva di 5000 mg/kg: cfr. punto 1.6.2). Il livello di dose iniziale è scelto sulla base di uno studio di osservazione, ed è la dose alla quale si prevede che si manifestino alcuni segni di tossicità, senza tuttavia causare effetti tossici gravi o la morte degli animali. I segni clinici e le condizioni associate a dolore, sofferenza e morte imminente sono descritti in apposite linee guida OCSE (8). A seconda della presenza o dell'assenza di segni di tossicità o mortalità, la sostanza in esame può essere somministrata ad altri gruppi di animali a dosi superiori o inferiori. La procedura prosegue fino a quando viene identificata la dose che causa tossicità manifesta o la morte di un solo animale o fino alla somministrazione della dose più elevata, se non vengono riscontrati effetti, mentre viene immediatamente interrotta se si verificano decessi alla dose più bassa.

1.4. DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA

1.4.

1.4.1. Scelta delle specie animale È preferibile utilizzare il ratto, ma è possibile ricorrere anche ad altre specie di roditori. Normalmente vengono utilizzati animali di sesso femminile (7), perché la letteratura esistente sui test convenzionali DL50 indica che, pur non essendovi grandi differenze di sensibilità tra i due sessi, nei casi in cui sono state osservate differenze in genere le femmine sono risultate leggermente più sensibili (10). Tuttavia se le informazioni disponibili sulle proprietà tossicologiche o tossicocinetiche di sostanze chimiche strutturalmente affini indicano la probabilità che i maschi siano più sensibili delle femmine, si devono utilizzare animali di sesso maschile. In quest'ultimo caso, occorre fornire un'adeguata giustificazione. Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani, appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. Le femmine devono essere nullipare e non gravide. All'inizio del trattamento ciascun animale deve avere un'età compresa tra 8 e 12 settimane ed un peso del ± 20 % del peso medio degli animali a cui è già stata somministrata la sostanza.

1.4.2. Condizioni di stabulazione e di alimentazione La temperatura dello stabulario deve essere di 22 oC (± 3 oC). L'umidità relativa deve essere preferibilmente del 50-60 %; in ogni caso non deve essere inferiore al 30 % e possibilmente non superiore al 70 %, tranne durante la pulizia dei locali. L'illuminazione deve essere artificiale, alternando 12 ore di luce e 12 ore di oscurità. Per l'alimentazione si possono utilizzare diete convenzionali da laboratorio con acqua ad libitum. Nelle gabbie, gli animali possono essere raggruppati in funzione della dose somministrata, ma il numero di animali per gabbia non deve impedire la corretta osservazione di ciascun esemplare.

1.4.3. Preparazione degli animali Gli animali sono scelti in modo casuale, marchiati per consentire l'individuazione dei singoli esemplari e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell'inizio del trattamento, in modo da consentirne l'acclimatazione alle condizioni di laboratorio.

1.4.4. Preparazione delle dosi In genere la sostanza di prova va somministrata a volume costante per tutte le dosi, variando la concentrazione del preparato da somministrare. Tuttavia, se il test viene eseguito su prodotti o miscele allo stato liquido, ai fini della valutazione del rischio può essere opportuno usare la sostanza non diluita, cioè a concentrazione costante; alcune autorità di regolamentazione impongono obbligatoriamente l'uso della sostanza non diluita. In ogni caso, non deve essere superato il volume massimo della dose somministrabile. Il volume massimo di liquido somministrabile in una sola volta dipende dalla taglia dell'animale, e nei roditori non deve di norma superare 1 ml/100 g di peso corporeo, tranne nel caso delle soluzioni acquose, per le quali si possono prevedere 2 ml/100 g di peso corporeo. Quanto alla formulazione del preparato da somministrare, si raccomanda di usare ove possibile una soluzione/sospensione/emulsione acquosa, seguita in ordine di preferenza da una soluzione/sospensione/emulsione in olio (per esempio olio di mais) e infine da una soluzione in altri veicoli. Per i veicoli diversi dall'acqua devono essere note le caratteristiche tossiche. Le dosi devono essere preparate poco prima della somministrazione, tranne nel caso in cui la stabilità del preparato nell'arco del periodo di utilizzo sia nota e ritenuta accettabile.

1.5. PROCEDIMENTO

1.5.

1.5.1. Somministrazione delle dosi La sostanza da esaminare viene somministrata in un'unica dose mediante sonda gastrica o apposita cannula per intubazione. Nel remoto caso in cui non sia possibile somministrare l'intera quantità in un'unica dose, ques'ultima può essere frazionata e somministrata in un arco di tempo non superiore a 24 ore. Prima della somministrazione della sostanza gli animali devono essere tenuti a digiuno (ad esempio, l'alimentazione, a esclusione dell'acqua, deve essere sospesa a partire dalla sera precedente per i ratti e per 3-4 ore nei topi). Dopo il periodo di digiuno, si pesano gli animali e si somministra la sostanza da esaminare. A somministrazione avvenuta, l'alimentazione può essere sospesa per altre 3-4 ore nei ratti o 1-2 ore nei topi. Qualora la dose venga frazionata e somministrata nell'arco di un certo periodo di tempo, a seconda della durata del periodo di somministrazione può essere necessario alimentare e abbeverare gli animali.

1.5.2. Studio di osservazione Lo scopo dello studio di osservazione è di consentire la scelta della giusta dose iniziale per lo studio principale. La sostanza in esame viene somministrata in maniera sequenziale a singoli animali, secondo il diagramma di flusso riportato nell'allegato 1. Lo studio di osservazione si conclude quando è possibile decidere la dose iniziale da utilizzare nello studio principale (o se la dose fissa più bassa provoca la morte di un animale). La dose iniziale da utilizzare nello studio di osservazione, scelta tra i livelli di dose fissi di 5, 50, 300 e 2000 mg/kg, è la dose che si prevede possa provocare tossicità manifesta sulla base, ove possibile, di dati in vivo e in vitro relativi alla stessa sostanza chimica e a sostanze di struttura affine. In mancanza di questi dati, si utilizza una dose iniziale di 300 mg/kg. Tra le somministrazioni a ciascun animale devono trascorrere almeno 24 ore. Tutti gli animali devono essere tenuti in osservazione per almeno 14 giorni. In casi eccezionali, e solo se giustificato da specifiche esigenze normative, può essere previsto un ulteriore livello di dose fisso pari a 5000 mg/kg (cfr. allegato 3). Per il benessere degli animali, si sconsiglia di effettuare sperimentazioni su animali alla dose stabilita per la categoria GHS 5 (2000-5000 mg/kg); l'utilizzo di questa dose va preso in considerazione solo se vi è una probabilità elevata che i risultati del test abbiano rilevanza diretta per la tutela della salute umana o animale o per la protezione dell'ambiente. Se la somministrazione della dose fissa più bassa (5 mg/kg) provoca la morte dell'animale nel corso dello studio di osservazione, la procedura normale prevede l'interruzione dello studio e l'assegnazione della sostanza alla categoria GHS 1 (cfr. allegato 1). Tuttavia, qualora sia necessaria un'ulteriore conferma della classificazione, può essere utilizzata la seguente procedura supplementare facoltativa: la sostanza viene somministrata a un secondo animale alla dose di 5 mg/kg; se questo secondo animale muore, viene confermata la classificazione nella categoria GHS 1 e lo studio viene immediatamente interrotto; se invece sopravvive, la sostanza viene somministrata alla dose di 5 mg/kg a non più di altri tre animali. A causa dell'elevato rischio di mortalità, per proteggere gli animali la sostanza esaminata deve essere somministrata in maniera sequenziale. L'intervallo di tempo tra le somministrazioni ai diversi animali deve essere sufficiente ad accertare che l'animale trattato in precedenza riesca a sopravvivere. Se si verifica un secondo decesso, la sequenza deve essere immediatamente interrotta e la sostanza non deve essere somministrata ad altri animali. Dal momento che il verificarsi di un secondo decesso (indipendentemente dal numero di animali a cui è già stata somministrata la sostanza al momento dell'interruzione) rientra nel risultato A (2 o più decessi), si applica la regola di classificazione di cui all'allegato 2 alla dose fissa di 5 mg/kg (categoria 1 se vi sono 2 o più morti o categoria 2 se c'è un'unica morte). L'allegato 4 riporta la classificazione prevista dal sistema UE in attesa dell'applicazione del nuovo sistema GHS.

1.5.3. Studio principale

1.5.3.

1.5.3.1. Numero di animali e livelli di dose I diagrammi di flusso di cui all'allegato 2 illustrano le tappe da seguire dopo la somministrazione del livello di dose iniziale. Vi sono tre possibilità: interrompere il test e assegnare la sostanza alla classe di rischio appropriata; effettuare il test a una dose fissa superiore; effettuare il test a una dose fissa inferiore. Tuttavia, per salvaguardare gli animali, se un livello di dose ha causato la morte di un animale durante lo studio di osservazione, questo livello non deve più essere utilizzato nello studio principale (cfr. allegato 2). L'esperienza indica che dopo la somministrazione del livello di dose iniziale in genere è possibile classificare la sostanza senza bisogno di effettuare ulteriori test. Per ciascun livello di dose, normalmente si usano in tutto cinque animali dello stesso sesso: l'animale a cui nello studio di osservazione è stato somministrato lo stesso livello di dose, più altri quattro animali (tranne nel caso remoto in cui un livello di dose utilizzato nello studio principale non sia stato incluso nello studio di osservazione). L'intervallo di tempo tra le somministrazioni dei vari livelli di dose ai diversi animali viene determinato in funzione della comparsa, della durata e della gravità dei segni di tossicità, avendo cura di procedere alla somministrazione della dose successiva solo una volta accertata la sopravvivenza degli animali trattati precedentemente. Si consiglia di far trascorrere, se necessario, 3 o 4 giorni tra le somministrazioni per consentire l'osservazione di eventuali segni di tossicità tardiva. L'intervallo di tempo può essere modificato secondo necessità, ad esempio in caso di risposte non convincenti. Quando si prevede di utilizzare una dose fissa superiore di 5000 mg/kg, è necessario attenersi alla procedura descritta nell'allegato 3 (cfr. anche punto 1.6.2).

1.5.3.2. Saggio limite Il saggio limite viene utilizzato principalmente quando lo sperimentatore dispone di informazioni che indicano che la sostanza in esame non è probabilmente tossica, cioè causa tossicità solo in dosi superiori alle dosi limite previste per legge. Le informazioni sulla tossicità della sostanza in esame possono essere ricavate da test su composti, miscele o prodotti simili, tenendo conto dell'identità e della percentuale dei componenti dei quali è nota la rilevanza tossicologica. Se le informazioni sulla tossicità della sostanza sono scarse o nulle o si prevede che la sostanza in esame sia tossica occorre eseguire lo studio principale. Ai fini delle presenti linee-guida, per il saggio limite si utilizza, seguendo il procedimento normale, una dose iniziale di 2000 mg/kg (o in casi eccezionali 5000 mg/kg) nello studio di osservazione, quindi si somministra la stessa dose ad altri quattro animali.

1.6. OSSERVAZIONI Dopo la somministrazione, gli animali sono esaminati individualmente almeno una volta nei primi 30 minuti, quindi periodicamente nelle prime 24 ore, prestando particolare attenzione alle prime 4 ore, e successivamente una volta al giorno per 14 giorni, a meno che non muoiano o non sia necessario ritirarli dallo studio e sottoporli a eutanasia per risparmiare loro sofferenze eccessive. Tuttavia, la durata del periodo di osservazione non è tassativa, ma va stabilita in funzione della natura delle reazioni tossiche, del momento della loro comparsa e dei tempi di recupero e può quindi essere prolungata in caso di necessità. Un parametro importante è rappresentato dal momento della comparsa e della scomparsa dei segni di tossicità, soprattutto se questi ultimi tendono ad apparire tardivamente (11). Tutte le osservazioni devono essere sistematicamente registrate su schede individuali per ogni animale. Qualora gli animali presentino segni persistenti di tossicità sono necessarie ulteriori osservazioni, che devono riguardare le modificazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso autonomo e centrale, dell'attività somatomotoria e del comportamento. Particolare attenzione deve essere rivolta all'osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. Si devono tenere in considerazione i principi e i criteri riassunti nelle linee guida OCSE citate in bibliografia al punto (8). Gli animali agonizzanti o che manifestano dolore intenso o segni di sofferenza grave e persistente devono essere sottoposti a eutanasia. Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, occorre registrare con la massima precisione possibile il momento del decesso.

1.6.

1.6.1. Peso corporeo 1 singoli animali devono essere pesati poco prima della somministrazione della sostanza di prova e in seguito almeno una volta alla settimana. Occorre calcolare e registrare le variazioni ponderali. Al termine del test, gli animali sopravvissuti devono essere pesati prima di essere sottoposti a eutanasia.

1.6.2. Esame patologico Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso del test e quelli che sono ritirati dallo studio per risparmiare loro eccessive sofferenze) devono essere sottoposti a necroscopia macroscopica. Per ogni animale devono essere registrate tutte le modificazioni patologiche di rilievo. Per gli animali sopravvissuti almeno 24 ore, può essere opportuno l'esame microscopico degli organi recanti alterazioni patologiche evidenti, che potrebbe fornire indicazioni utili.

2. DATI Occorre fornire risultati individuali per ciascun animale. Tutti i dati devono essere riassunti in una tabella nella quale devono essere indicati per ciascun gruppo sottoposto al test il numero di animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni di tossicità, il numero di animali rinvenuti morti durante il test o sottoposti a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione degli effetti tossici, il loro decorso e l'eventuale reversibilità e i risultati della necroscopia.

3. PRESENTAZIONE DEI DATI

3.

3.1. RAPPORTO DI PROVA Il rapporto di prova deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi:

Sostanza di prova:

natura fisica, purezza e (se pertinenti) proprietà fisico-chimiche (compresa 1'isomerizzazione),

dati identificativi, compreso il numero CAS.

Veicolo (se pertinente):

motivazione della scelta del veicolo utilizzato, se diverso dall'acqua.

Animali da esperimento:

specie/ceppo utilizzato,

condizioni microbiologiche degli animali, qualora siano note,

numero, età e sesso degli animali (compresa l'eventuale giustificazione dell'uso di esemplari maschi anziché femmine),

provenienza, condizioni di stabulazione, dieta ecc.

Condizioni del test:

informazioni dettagliate sulla formulazione della sostanza di prova, comprese informazioni sullo stato fisico del preparato somministrato,

modalità di somministrazione della sostanza di prova, compreso il volume delle dosi e l'orario di somministrazione,

informazioni dettagliate sulla qualità del cibo e dell'acqua (compresi tipo di dieta/provenienza degli alimenti, provenienza dell'acqua),

motivazione della scelta della dose iniziale.

Risultati:

tabella con risposta e livello di dose per ciascun animale (animali che manifestano segni di tossicità, mortalità compresa; natura, gravità e durata degli effetti),

tabella del peso corporeo e delle variazioni ponderali,

peso dei singoli animali nel giorno della somministrazione, e in seguito ad intervalli di una settimana e al momento della morte o del sacrificio,

data e ora della morte, se questa avviene prima del sacrificio programmato,

momento della comparsa dei segni di tossicità, decorso ed eventuale reversibilità per ciascun animale,

referto necroscopico e referto istopatologico per ciascun animale, se disponibili.

Discussione e interpretazione dei risultati.

Conclusioni.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 62, 79-291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation ofthe revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use ofClinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, Approvato alla 28a riunione congiunta del Chemicals Committee e del Working Party on Chemicals nel novembre 1998, parte 2, pag. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no- 0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231. Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Cap. 16 Acute Toxicity and Eye Irritation, in A.W. Hayes (a cura di), Principles and Methods of Toxicology, terza edizione, Raven Press, Ltd. New York, USA.

B.1ter. TOSSICITÀ ACUTA PER VIA ORALE — METODO DELLA CLASSE DI TOSSICITÀ ACUTA

B.1ter.

1. METODO Questo metodo di saggio è equivalente al metodo OCSE TG 423 (2001).

1.

1.1 INTRODUZIONE Il metodo della classe di tossicità acuta (1) qui descritto è un procedimento articolato in più fasi successive che prevede l'uso di 3 animali dello stesso sesso in ogni fase. In media, per valutare la tossicità acuta di una sostanza sono necessarie 2-4 fasi, in funzione del numero di animali morti e/o moribondi. Il procedimento è riproducibile, utilizza un numero molto limitato di animali e permette di classificare le sostanze in maniera analoga agli altri metodi di determinazione della tossicità acuta. Il metodo della classe di tossicità acuta si basa su valutazioni biometriche (2)(3)(4)(5) e utilizza dosi fisse, opportunamente separate, per consentire la classificazione della sostanza ai fini dell'assegnazione a una particolare categoria e della valutazione dei rischi. Il metodo, adottato nel 1996, è stato ampiamente convalidato in vivo mediante dati sulla DL50 ricavati dalla letteratura esistente, sia a livello nazionale (6) che a livello internazionale (7). Per indicazioni sulla scelta del metodo di prova più adatto per scopi specifici, si rimanda al documento orientativo sui saggi di tossicità acuta per via orale dell'OCSE (8). Tale documento contiene anche ulteriori informazioni sull'applicazione e sull'interpretazione del metodo di saggio B.1 ter. Non è necessario somministrare le sostanze da esaminare in dosi che provocano notoriamente dolore e sofferenze gravi per effetto delle proprietà corrosive o fortemente irritanti delle sostanze stesse. Ai fini dell'interpretazione dei risultati del saggio, gli animali moribondi o che manifestano segni evidenti di dolore o di sofferenza grave e persistente devono essere sottoposti a eutanasia e assimilati agli animali morti spontaneamente nel corso dell'esperimento. I criteri da applicare per decidere in merito al sacrificio degli animali moribondi o in stato di grave sofferenza sono oggetto di uno specifico documento orientativo, che riporta anche indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente (9). Il metodo utilizza dosi prestabilite e i risultati che se ne ricavano permettono di classificare la sostanza esaminata conformemente al sistema armonizzato su scala mondiale (GHS) per la classificazione delle sostanze chimiche che causano tossicità acuta (10). In linea di principio, il metodo non ha lo scopo di determinare una DL50 precisa, ma consente di stabilire range di esposizione verosimilmente letali: la morte di una certa percentuale di animali, infatti, costituisce ancora l'endpoint principale di questo saggio. Il metodo consente di determinare un valore di DL50 solo quando almeno due dosi provocano una mortalità superiore allo 0 % e inferiore al 100 %. L'uso di dosi prestabilite, indipendentemente dalla sostanza in esame, e la classificazione esplicitamente legata al numero di animali osservati in diversi stati favoriscono la congruenza e la ripetibilità dei dati presentati dai vari laboratori. Il laboratorio che esegue il saggio deve consultare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza in esame prima di effettuare lo studio. Tali informazioni devono riguardare quantomeno l'identità e la struttura chimica; le proprietà chimico-fisiche; i risultati di eventuali altri saggi di tossicità in vitro o in vivo eseguiti sulla sostanza; i dati tossicologici su sostanze di struttura affine; l'impiego o gli impieghi previsti. Queste informazioni sono necessarie per provare a tutti i soggetti interessati la rilevanza del saggio per la protezione della salute degli esseri umani, e sono utili per la scelta della dose iniziale più appropriata.

1.2 DEFINIZIONI Tossicità acuta per via orale: effetti avversi che si verificano in seguito alla somministrazione orale di una singola dose di una sostanza o di più dosi nell'arco di 24 ore. Morte tardiva: termine usato per indicare che l'animale non muore né appare moribondo nelle 48 ore successive alla somministrazione, ma muore successivamente nei 14 giorni del periodo di osservazione. Dose: quantità di sostanza somministrata. Viene espressa in peso per unità di peso dell'animale usato per il saggio (p. es. mg/kg). GHS: sistema armonizzato su scala mondiale per la classificazione delle sostanze chimiche e dei relativi miscugli. Si tratta di un'iniziativa congiunta dell'OCSE (salute degli esseri umani e ambiente), del Comitato di esperti delle Nazioni Unite sul trasporto delle sostanze pericolose (proprietà fisico-chimiche) e dell'ILO (comunicazione dei rischi), coordinata dal programma inter-organizzazioni per una gestione responsabile delle sostanze chimiche (IOMC). Morte imminente: stato in cui si prevede che l'animale sarà moribondo o morto prima della successiva osservazione in programma. Nei roditori, tra i segni indicativi di morte imminente sono compresi convulsioni, posizione laterale o prona e tremore [per maggiori indicazioni, vedi il documento orientativo sugli endpoint non crudeli (9)]. DL50(dose letale mediana): la singola dose di sostanza, determinata statisticamente, che si prevede causi la morte del 50 % degli animali a cui viene somministrata per via orale. Il valore della DL50 viene espresso in peso per unità di peso dell'animale usato per il saggio (mg/kg). Dose limite: dose corrispondente al limite superiore fissato per il saggio (2000 o 5000 mg/kg). Moribondo: che sta morendo o non è in grado di sopravvivere, nemmeno se sottoposto a trattamento [per maggiori indicazioni, vedi il documento orientativo sugli endpoint non crudeli (9)]. Morte prevedibile: presenza di segni clinici, ad esempio incapacità di raggiungere il cibo o l'acqua, che indicano che l'animale morirà prima della conclusione programmata dell'esperimento [per maggiori indicazioni, vedi il documento orientativo sugli endpoint non crudeli (9)].

1.3 PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO Il metodo prevede l'applicazione di un procedimento articolato in fasi successive che richiede l'uso di un numero minimo di animali in ciascuna fase e permette di ricavare informazioni sufficienti per la classificazione della tossicità acuta della sostanza in esame. La sostanza viene somministrata per via orale a un gruppo di animali da laboratorio in una delle dosi prestabilite. Il saggio viene effettuato seguendo un procedimento in fasi successive; in ciascuna fase vengono utilizzati tre animali dello stesso sesso (normalmente femmine). In funzione della presenza o assenza di mortalità riferibile alla sostanza in esame tra gli animali trattati, per ciascuna fase si possono avere tre esiti diversi: Lo schema dettagliato del procedimento è riportato nell'allegato 1. Il metodo consente di valutare la sostanza allo scopo di assegnarla a una delle classi di tossicità definite da valori discriminanti fissi di DL50.

interruzione del saggio

somministrazione della sostanza ad altri tre animali, alla stessa dose

somministrazione della sostanza ad altri tre animali al livello di dose immediatamente superiore o inferiore.

1.4 DESCRIZIONE DEL METODO

1.4

1.4.1 Scelta delle specie di animali La specie di roditori da preferirsi è rappresentata dal ratto, ma è possibile utilizzare anche altre specie di roditori. Normalmente vengono utilizzati animali di sesso femminile (9), perché la letteratura esistente circa i saggi convenzionali sulla DL50 indica che, pur non essendovi grandi differenze di sensibilità tra i due sessi, nei casi in cui sono state osservate differenze in genere le femmine sono risultate leggermente più sensibili (11). Peraltro, se le informazioni disponibili sulle proprietà tossicologiche o tossicocinetiche di sostanze chimiche di struttura affine indicano che i maschi sono verosimilmente più sensibili delle femmine, si devono usare animali di sesso maschile. Qualora vengano usati animali di sesso maschile, se ne deve fornire un'adeguata motivazione. Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Ciascun animale, all'inizio del trattamento, deve essere di età compresa fra 8 e 12 settimane e di peso del ± 20 % del peso medio di eventuali animali a cui è stata precedentemente somministrata la sostanza in esame.

1.4.2 Condizioni di stabulazione e di alimentazione La temperatura dello stabulario deve essere di 22 oC (± 3 oC). L'umidità relativa deve essere preferibilmente del 50-60 %; in ogni caso deve essere non inferiore al 30 % e possibilmente non superiore al 70 %, tranne durante la pulizia dei locali. L'illuminazione deve essere artificiale e alternare 12 ore di luce e 12 ore di oscurità. Per l'alimentazione si possono utilizzare diete convenzionali da laboratorio con acqua ad libitum. Nelle gabbie, gli animali possono essere raggruppati in funzione della dose, ma il numero di animali per gabbia non deve essere tale da impedire la corretta osservazione di ciascun esemplare.

1.4.3 Preparazione degli animali Gli animali devono essere scelti in modo casuale, marchiati per consentire l'individuazione dei singoli esemplari e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell'inizio del trattamento, in modo da consentirne l'acclimatazione alle condizioni di laboratorio.

1.4.4 Preparazione delle dosi In genere le somministrazioni delle sostanze in esame devono avere un volume costante per tutte le dosi oggetto del saggio; a questo scopo, si varia la concentrazione del preparato da somministrare. Tuttavia, se il saggio viene eseguito su prodotti o miscugli che si presentano in forma liquida, ai fini della successiva valutazione del rischio può essere opportuno usare la sostanza non diluita, cioè a concentrazione costante; peraltro, l'uso della sostanza non diluita è prescritto da alcune autorità di regolamentazione. In ogni caso, non si deve superare il volume massimo somministrabile. Il volume massimo di liquido somministrabile in una sola volta dipende dalla taglia dell'animale. Nei roditori, di norma non deve superare 1 ml/100 g di peso corporeo tranne nel caso delle soluzioni acquose, per le quali si possono prevedere 2 ml/100 g di peso corporeo. Quanto alla formulazione del preparato da somministrare, si raccomanda di usare ove possibile una soluzione/sospensione/emulsione acquosa oppure, in ordine di preferenza, una soluzione/sospensione/emulsione in olio (per esempio olio di mais) o una soluzione in altri veicoli. Nel caso in cui si utilizzino veicoli diversi dall'acqua, devono essere note le caratteristiche di tossicità degli stessi. Le dosi devono essere preparate poco prima della somministrazione, tranne nel caso in cui la stabilità del preparato nell'arco del periodo di utilizzo sia nota e si sia dimostrata accettabile.

1.5 PROCEDIMENTO

1.5

1.5.1 Somministrazione delle dosi La sostanza da saggiare viene somministrata in un'unica dose mediante sonda gastrica o idonea cannula per intubazione. Nel caso infrequente in cui non sia possibile somministrare l'intera quantità in un'unica dose, si può procedere al frazionamento della stessa e alla somministrazione delle varie frazioni nell'arco di un periodo non superiore a 24 ore. Gli animali devono essere tenuti a digiuno prima della somministrazione della sostanza (p. es. l'alimentazione, a esclusione dell'acqua, deve essere sospesa a partire dalla sera precedente nei ratti e per 3-4 ore nei topi). Dopo il periodo di digiuno, si pesano gli animali e si somministra la sostanza da esaminare. A somministrazione avvenuta, il cibo può essere sospeso per altre 3-4 ore nei ratti o 1-2 ore nei topi. Qualora la dose venga frazionata e somministrata nell'arco di un certo periodo di tempo, può essere necessario alimentare e abbeverare gli animali in misura adeguata alla durata del periodo di somministrazione.

1.5.2 Numero di animali e livelli di dose Si utilizzano tre animali in ciascuna fase. La dose iniziale viene scelta fra quattro livelli fissi: 5, 50, 300 e 2000 mg/kg di peso corporeo. Il livello di dose iniziale deve essere quello che con maggior probabilità provoca la morte di una parte degli animali trattati. I diagrammi di flusso dell'allegato 1 illustrano il procedimento da seguire per ciascuna delle dosi iniziali, mentre l'allegato 4 riporta indicazioni sulla classificazione secondo il sistema UE in attesa dell'applicazione del nuovo sistema GHS. Qualora, alla luce delle informazioni disponibili, la mortalità risulti improbabile al livello di dose iniziale più elevato (2000 mg/kg di peso corporeo), si deve fare ricorso a un saggio limite. In mancanza di informazioni su una sostanza da esaminare, per il benessere degli animali si raccomanda di utilizzare la dose iniziale di 300 mg/kg di peso corporeo. L'intervallo di tempo tra il trattamento dei diversi gruppi viene determinato in funzione dell'esordio, della durata e della gravità dei segni di tossicità, avendo cura di procedere al trattamento degli animali alla dose successiva solo una volta accertata la sopravvivenza degli animali trattati precedentemente. In casi eccezionali, e solo se specifiche esigenze normative lo giustificano, può essere previsto un ulteriore livello di dose fisso superiore pari a 5000 mg/kg (vedi allegato 2). Per il benessere degli animali, si sconsiglia di effettuare sperimentazioni su animali alle dosi stabilite per la categoria GHS 5 (2000-5000 mg/kg); l'utilizzo di tali dosi è da prevedere solo se vi è una probabilità elevata che i risultati del saggio abbiano rilevanza diretta per la tutela della salute degli animali o dell'uomo o per la salvaguardia dell'ambiente.

1.5.3 Saggio limite Il saggio limite viene utilizzato principalmente quando lo sperimentatore dispone di informazioni che indicano che la sostanza in esame è verosimilmente non tossica, cioè causa tossicità solo in dosi superiori alle dosi limite previste per legge. Le informazioni sulla tossicità della sostanza in esame possono essere ricavate da conoscenze su composti, miscugli o prodotti simili esaminati, tenendo conto dell'identità e della percentuale dei componenti dei quali è nota la rilevanza tossicologica. Nel caso in cui le informazioni sulla tossicità della sostanza siano scarse o nulle, o in cui ci si attenda che la sostanza in esame sia tossica, il saggio principale deve essere eseguito. Il saggio limite si effettua con un unico livello di dose di 2000 mg/kg di peso corporeo su sei animali (tre animali per fase). In casi eccezionali, si può utilizzare un unico livello di dose di 5000 mg/kg su tre animali (vedi allegato 2). Se si osservano decessi riferibili alla sostanza in esame, può essere necessario eseguire un altro saggio al livello di dose immediatamente inferiore.

1.6 OSSERVAZIONE Dopo la somministrazione, gli animali sono esaminati individualmente almeno una volta nei primi 30 minuti, quindi periodicamente nelle prime 24 ore, ponendo particolare attenzione nelle prime 4 ore, e successivamente una volta al giorno per 14 giorni in tutto, tranne nel caso in cui sia necessario ritirarli dallo studio e sottoporli a eutanasia per motivi legati al loro benessere, o nel caso in cui vengano rinvenuti morti. Tuttavia, la durata dell'osservazione non è tassativa, e va stabilita in funzione delle reazioni tossiche, del momento della loro insorgenza e della durata del periodo di recupero; se necessario, quindi, è possibile prolungarla. Un parametro importante è rappresentato dal momento della comparsa e della scomparsa dei segni di tossicità, soprattutto se negli animali è rilevabile una tendenza a manifestare segni di tossicità tardiva (12). Tutte le osservazioni devono essere sistematicamente registrate su schede individuali per ogni animale. Ulteriori osservazioni sono necessarie qualora gli animali presentino segni persistenti di tossicità. Dette osservazioni devono comprendere le modificazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso autonomo e centrale, dell'attività e del comportamento somatomotori. Particolare attenzione deve essere rivolta all'osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. Si devono tenere in considerazione i principi e i criteri riassunti nel documento orientativo sugli endpoint non crudeli (9). Gli animali moribondi o che manifestano dolore intenso o segni di sofferenza grave e persistente devono essere sottoposti a eutanasia. Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, il momento del decesso deve essere registrato con la massima precisione possibile.

1.6

1.6.1 Peso corporeo I singoli animali devono essere pesati poco prima della somministrazione della sostanza da saggiare e in seguito almeno una volta alla settimana. Le variazioni ponderali devono essere calcolate e registrate. Al termine del saggio, gli animali sopravvissuti devono essere pesati e sottoposti a eutanasia.

1.6.2 Esame patologico Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso del saggio e quelli che sono ritirati dallo studio per motivi legati al loro benessere) devono essere sottoposti a necroscopia macroscopica. Per ogni animale devono essere registrate tutte le modificazioni patologiche di rilievo. Per gli animali sopravvissuti almeno 24 ore, l'esame microscopico degli organi recanti alterazioni patologiche evidenti potrebbe fornire indicazioni utili ed essere quindi opportuno.

2. DATI Devono essere forniti dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i dati devono essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo del saggio, il numero di animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni di tossicità, il numero di animali rinvenuti morti durante il saggio o sottoposti a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione degli effetti tossici con indicazioni sul decorso e sulla reversibilità, e i risultati della necroscopia.

3. RELAZIONE

3.

3.1 Relazione sul saggio La relazione sul saggio deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi:

Sostanza in esame:

natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (compresa l'isomerizzazione);

dati identificativi, compreso il numero CAS.

Veicolo (se del caso):

motivazione della scelta del veicolo utilizzato, se diverso dall'acqua.

Animali da esperimento:

specie/ceppo utilizzato;

condizioni microbiologiche degli animali, qualora siano note;

numero, età e sesso degli animali (compresa, se del caso, la motivazione dell'uso di esemplari maschi anziché femmine);

provenienza, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.;

Condizioni sperimentali:

informazioni dettagliate sulla formulazione della sostanza in esame, comprese informazioni sulla forma fisica del preparato somministrato;

modalità precise di somministrazione della sostanza in esame, compresi volumi e orari delle somministrazioni;

informazioni dettagliate sulla qualità del cibo e dell'acqua (compresi tipo di dieta/provenienza, provenienza dell'acqua);

motivazione della scelta della dose iniziale.

Risultati:

tabella con risposta e livello di dose per ciascun animale (vale a dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità compresa; natura, gravità e durata degli effetti);

tabella del peso corporeo e delle relative modificazioni;

peso dei singoli animali il giorno della somministrazione, quindi a intervalli di una settimana, e infine al momento della morte o del sacrificio;

data e ora della morte, se questa avviene prima del sacrificio programmato;

momento della comparsa dei segni di tossicità, loro decorso ed eventuale reversibilità, per ciascun animale;

reperti necroscopici ed eventuali reperti istopatologici per ciascun animale.

Discussione e interpretazione dei risultati.

Conclusioni.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86 Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610 Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134 Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method — An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66,455-470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69,659-670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

B.2. TOSSICITÀ ACUTA PER INALAZIONE

B.2.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE È utile avere informazioni preliminari sulla distribuzione della dimensione delle particelle, la tensione di vapore, il punto di fusione, punto di ebollizione, il punto di infiammabilità e l'esplosività (se del caso) della sostanza. Si veda anche introduzione generale, parte B (A).

1.2. DEFINIZIONI Vedi introduzione generale, parte B (B).

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO Diversi gruppi di animali da esperimento sono esposti a concentrazioni graduate della sostanza in esame per un determinato periodo di tempo (una concentrazione per gruppo). Si procede poi all'osservazione degli effetti e degli eventi letali. Gli animali che muoiono durante l'esperimento sono sottoposti a necroscopia e quelli che sopravvivono sono sottoposti a necroscopia alla fine dell'esperimento. Può essere necessario sopprimere umanamente gli animali che mostrano segni gravi e persistenti di sofferenza e di dolore. Non è necessario eseguire la somministrazione di dosi delle sostanze in esame in una maniera che può provocare dolore e sofferenza marcate a motivo di proprietà corrosive o gravemente irritanti.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ Nessuno.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.6.

1.6.1. Preparazioni Prima del saggio gli animali sono tenuti nelle condizioni di stabulazione e di alimentazione dell'esperimento per un periodo di almeno 5 giorni. Prima del saggio gli animali, che dovranno essere giovani adulti e sani sono scelti con metodo casuale e assegnati ai gruppi necessari per il saggio. Non è necessario sottoporre gli animali a una esposizione simulata, a meno che ciò non sia richiesto dal tipo di dispositivo utilizzato per l'esposizione. Le sostanze di prova solide possono richiedere una micronizzazione allo scopo di ottenere particelle di dimensione appropriata. Ove necessario, alla sostanza in esame può essere aggiunto un veicolo idoneo per facilitare una concentrazione appropriata della sostanza in esame nell'atmosfera e, in tal caso, deve essere utilizzato un gruppo di controllo per il veicolo. Se per facilitare il dosaggio si impiega un veicolo o altri additivi, questi non dovrebbero produrre effetti tossici. Se appropriato, possono essere utilizzati dati storici.

1.6.2. Condizioni per il saggio

1.6.2.

1.6.2.1. Animali da esperimento Salvo controindicazioni, il ratto è la specie d'elezione. Si dovrebbero utilizzare ceppi di laboratorio comunemente usati. Per ciascun sesso, all'inizio del saggio la variazione ponderale degli animali utilizzati non dovrebbe superare del ± 20 % il valore medio.

1.6.2.2. Numero e sesso Per ogni livello di concentrazione vengono utilizzati almeno dieci roditori (5 di sesso femminile e 5 di sesso maschile). Le femmine dovrebbero essere nullipare e non gravide. Nota: nei saggi di tossicità acuta con animali di ordine superiore ai roditori, si dovrebbe prendere in considerazione l'uso di un numero minore di animali. Le dosi devono essere accuratamente scelte e si deve fare ogni sforzo possibile per non superare dosi moderatamente tossiche. In tali prove si dovrebbe evitare la somministrazione di dosi letali della sostanza in esame.

1.6.2.3. Concentrazioni di esposizione Queste dovranno essere in numero sufficiente, almeno tre, e opportunamente intervallate, onde produrre nei gruppi trattati una graduazione di effetti tossici e di mortalità. I risultati dovrebbero essere sufficienti per fornire una curva mortalità-concentrazione e, quando possibile, permettere un'accettabile determinazione della CL50.

1.6.2.4. Saggio limite Se un'esposizione di 5 animali maschi e di 5 animali femmine da esperimento per 4 ore a 20 mg/l di un gas o 5 mg/l di un aerosol o di una sostanza particellata (o, se ciò non è possibile, a causa di proprietà fisiche o chimiche, comprese quelle esplosive della sostanza in esame, alla concentrazione massima raggiungibile) non provoca entro 14 giorni mortalità legata al composto in esame, si può considerare che non sono necessarie ulteriori prove.

1.6.2.5. Tempo di esposizione Il periodo di esposizione dovrà essere di 4 ore.

1.6.2.6. Attrezzatura Gli animali dovranno essere sottoposti all'esperimento con dispositivi per l'inalazione appositamente progettati per consentire un flusso d'aria dinamico di almeno 12 ricambi d'aria all'ora, per assicurare un adeguato contenuto di ossigeno e un'atmosfera di esposizione distribuita uniformemente. Qualora sia usata una camera, essa dovrà essere progettata in modo da evitare l'affollamento degli animali da esperimento e al tempo stesso rendere massima l'esposizione alla sostanza in esame mediante inalazione. Come regola generale, onde garantire la stabilità dell'atmosfera nella camera, il volume complessivo degli animali del saggio non dovrebbe superare il 5 % di quello della camera di saggio. Si può ricorrere ad una esposizione oro-nasale, della sola testa o di tutto il corpo in camera singola; le prime due modalità di esposizione aiuteranno a rendere minimo l'assorbimento delle sostanze attraverso altre vie.

1.6.2.7. Periodo di osservazione Il periodo di osservazione dovrebbe essere di almeno 14 giorni. Tuttavia la durata dell'osservazione non dovrebbe essere fissata rigidamente. Essa dovrebbe essere determinata dalla natura delle reazioni tossiche, dalla velocità del loro insorgere e dalla durata del periodo di recupero; essa può, quindi, essere estesa se considerato necessario. Il momento in cui si manifestano e scompaiono i sintomi di tossicità e quello nel quale interviene il decesso, sono importanti, soprattutto quando la sostanza tenda a causare mortalità ritardata.

1.6.3. Procedimento Gli animali sono pesati poco prima dell'esposizione e quindi esposti alla concentrazione di saggio nell'apposito dispositivo, per un periodo di 4 ore, dopo aver effettuato l'equilibramento della concentrazione nella camera di inalazione. Il tempo di equilibramento dovrebbe essere breve. Il saggio dovrebbe essere effettuato ad una temperatura di 22 oC ± 3 oC. Da un punto di vista ottimale l'umidità relativa dovrebbe essere mantenuta tra il 30 e il 70 % ma, in taluni casi (ad esempio, prove di aerosol), ciò può non essere realizzabile. Mantenendo una pressione leggermente negativa all'interno della camera (≥ 5 mm di acqua) si impedirà un trafilamento della sostanza in esame nell'area circostante. Durante l'esposizione, la somministrazione di cibo e acqua deve essere sospesa. Si devono usare sistemi adatti per la generazione e il controllo dell'atmosfera d'esame. Il sistema dovrà assicurare che condizioni di esposizione stabili vengano realizzate il più rapidamente possibile. La camera deve essere progettata e fatta funzionare in modo da mantenere una distribuzione omogenea dell'atmosfera sperimentale all'interno della camera. Si dovranno misurare o controllare: Durante e dopo l'esposizione, si procede all'effettuazione e alla registrazione sistematica delle osservazioni effettuate; registrazioni individuali dovranno essere tenute per ciascun animale. Durante il primo giorno le osservazioni dovrebbero essere frequenti. Un attento esame clinico dovrà essere effettuato almeno una volta al giorno per cinque giorni per settimana. Altre osservazioni dovranno essere effettuate quotidianamente con azioni appropriate per minimizzare la perdita di animali da studiare, ad esempio necroscopia e refrigerazione degli animali trovati morti e isolamento o sacrificio degli animali deboli e moribondi. Le osservazioni dovrebbero comprendere le alterazioni della cute e del pelo, degli occhi, delle membrane mucose e del sistema respiratorio, circolatorio, nervoso autonomo e centrale, dell'attività somatomotoria e del comportamento dell'animale. Particolare attenzione dovrebbe essere rivolta all'osservazione del comportamento respiratorio, di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. Il momento in cui sopraggiunge il decesso dell'animale dovrà essere registrato con la massima precisione possibile. I valori ponderali degli animali dovranno essere determinati settimanalmente dopo l'esposizione e al momento del decesso. Gli animali che muoiono durante il saggio e quelli che sopravvivono a conclusione dello stesso sono sottoposti a necroscopia con particolare riferimento alle alterazioni del tratto respiratorio superiore e inferiore. Si dovranno registrare tutti i cambiamenti patologici macroscopici. Ove del caso, i tessuti dovrebbero essere prelevati per l'esame istopatologico.

1.6.3.

(a) la velocità del flusso d'aria (in continuo).

(b) la concentrazione effettiva della sostanza in esame misurata nella zona di respirazione almeno tre volte durante l'esposizione (alcune atmosfere, per esempio aerosoli ad alta concentrazione, possono richiedere un controllo più frequente). Durante il periodo di esposizione, la concentrazione non dovrebbe variare più del ± 15 % del valore medio. Tuttavia nel caso di alcuni aerosol questo livello di regolazione può non essere realizzabile, e in tal caso è accettabile un intervallo più ampio. Per gli aerosol, si deve eseguire con la frequenza necessaria (almeno una volta per gruppo di prova) l'analisi della dimensione delle particelle.

2. DATI I dati dovranno essere riassunti in una tabella indicante per ogni gruppo di saggio il numero di animali all'inizio del saggio, il momento del decesso di ciascun animale, il numero di animali che presentano altri sintomi di tossicità, la descrizione degli effetti tossici e i risultati della necroscopia. Le variazioni ponderali devono essere calcolate e registrate quando la sopravvivenza sia superiore ad un giorno. Gli animali che sono soppressi per motivi umanitari in conseguenza di sofferenze e dolore dovuti al composto sono registrati come morti dovute al composto. La CL50 dovrà essere determinata con un metodo riconosciuto. La valutazione dei dati dovrà comprendere il rapporto, se esistente, tra l'esposizione degli animali alla sostanza in esame e l'incidenza e gravità di tutte le alterazioni incluse quelle comportamentali e cliniche, le lesioni macroscopiche, le variazione del peso corporeo, la mortalità e qualsiasi altro effetto tossico.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni: Dati sull'esposizione: Questi dati dovranno essere raccolti in tabelle e presentati con i valori medi e con una misura di variabilità (ad esempio, deviazione standard) e dovranno, se possibile, includere:

specie, ceppo, origine degli animali, condizioni ambientali, dieta ecc.;

condizioni del saggio: descrizione dell'apparecchiatura usata per l'esposizione, incluso il modello, il tipo, le dimensioni, la sorgente d'aria, il sistema per la generazione degli aerosol, il metodo di condizionamento dell'aria e il metodo di alloggiamento degli animali nella camera di prova quando questa venga usata. Si dovrà descrivere anche l'apparecchiatura per la misura della temperatura, dell'umidità e della concentrazione di aerosol e della distribuzione delle dimensioni delle particelle di aerosol.

3.1.

(a) velocità del flusso d'aria attraverso l'apparecchiatura di inalazione,

(b) temperatura e umidità dell'aria,

(c) concentrazioni nominali (quantitativo totale della sostanza in esame introdotta nel dispositivo per l'inalazione diviso per il volume d'aria);

(d) natura dell'eventuale veicolo, se usato;

(e) concentrazioni effettive nella zona di respirazione;

(f) il diametro aerodinamico mediano in massa (DAMM) e la deviazione standard geometrica (DSG);

(g) periodo di equilibratura;

(h) periodo di esposizione;

tabulazione dei dati di risposta per sesso e per livello di esposizione (cioè il numero di animali morti o sacrificati durante la prova; il numero di animali che presentano sintomi di tossicità; numero di animali esposti);

momento della morte durante o dopo l'esposizione, ragioni e criteri usati per la eutanasia di animali;

tutte le osservazioni;

CL50 per ciascun sesso determinata alla fine del periodo di osservazione (specificando il metodo di calcolo);

intervallo di confidenza statistica del 95 % per la CL50 (quando questo possa venire fornito);

curve dose-mortalità e relativo coefficiente angolare (se il metodo di determinazione lo permette);

risultati dell'esame necroscopico;

qualsiasi risultato istopatologico;

discussione dei risultati (particolare attenzione deve essere dedicata all'effetto che la eutanasia di animali durante la prova può avere sul valore calcolato della CL50);

interpretazione dei risultati.

3.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE Vedi introduzione generale, parte B (punto D).

4. BIBLIOGRAFIA Vedi introduzione generale, parte B (punto E).

B.3. TOSSICITÀ ACUTA PER VIA CUTANEA

B.3.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Vedi introduzione generale, parte B (punto A).

1.2. DEFINIZIONI Vedi introduzione generale, parte B (punto B).

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO La sostanza in esame viene applicata a livelli di dose graduati, un livello di dose per gruppo, sulla cute di vari gruppi di animali di saggio. Si procede poi all'osservazione degli effetti e degli eventi letali. Gli animali morti o sacrificati durante il saggio sono sottoposti a necroscopia e i sopravvissuti lo sono a conclusione del saggio. Può essere necessario sottoporre a eutanasia gli animali che mostrano segni gravi e persistenti di sofferenza e di dolore; non bisogna eseguire la somministrazione di dosi delle sostanze in esame in una maniera che notoriamente provoca dolore e sofferenza marcate a motivo delle proprietà corrosive o gravemente irritanti.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ Nessuno.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO ADOTTATO PER IL SAGGIO

1.6.

1.6.1. Preparazioni Per almeno cinque giorni prima dell'esperimento, gli animali sono tenuti nelle gabbie usate per il saggio nelle stesse condizioni di stabulazione e di alimentazione dell'esperimento. Prima del saggio, gli animali che dovranno essere giovani adulti e sani, sono scelti con metodo casuale e assegnati ai gruppi sperimentali. Circa 24 ore prima del saggio, si effettua il taglio o la rasatura del pelo nella parte dorsale del corpo della cavia. Durante le operazioni di taglio o rasatura, si deve badare a non ledere la cute dell'animale per evitarne l'abrasione che potrebbe alterarne la permeabilità. Si dovrà preparare almeno il 10 % della superficie corporea per l'applicazione della sostanza in esame. Le sostanze solide, che potranno essere eventualmente ridotte in polvere, dovrebbero essere inumidite con acqua o, se necessario, con un veicolo adatto ad assicurare un buon contatto con la cute. Se viene utilizzato un veicolo, si dovrà tener conto dell'influenza dello stesso sulla penetrazione cutanea della sostanza in esame. Le sostanze liquide generalmente vengono saggiate senza diluizione.

1.6.2. Condizioni del saggio

1.6.2.

1.6.2.1. Animali da esperimento Possono essere utilizzati ratti o conigli adulti. Si possono utilizzare altre specie animali, ma il loro uso dovrebbe essere giustificato. Dovrebbero essere utilizzati ceppi di laboratorio comunemente usati. Per ciascun sesso, all'inizio della prova l'intervallo di variazione del peso degli animali utilizzati non dovrebbe essere superiore a ± 20 % del valore medio.

1.6.2.2. Numero e sesso Per ciascun saggio vengono usati almeno 5 animali a ciascun livello di dosaggio. Essi dovrebbero essere tutti dello stesso sesso. Se si usano femmine, dovrebbero esse nullipare e non gravide. Nel caso siano disponibili informazioni che dimostrano che un sesso è nettamente più sensibile, si dovrebbero usare animali di questo sesso. Nota: nei saggi di tossicità acuta con animali di ordine superiore ai roditori, si dovrà prendere in considerazione l'uso di un numero minore di animali. Le dosi devono essere accuratamente scelte e si deve fare ogni sforzo possibile per non superare dosi moderatamente tossiche. In tali prove si dovrebbe evitare la somministrazione di dosi letali della sostanza in esame.

1.6.2.3. Livelli di dosaggio Questi dovranno essere in numero sufficiente, almeno 3, e adeguatamente intervallati per produrre uno spettro di effetti tossici e di tassi di mortalità. Nel decidere i dosaggi occorre tener presente qualsiasi effetto irritante o corrosivo. I dati dovrebbero essere sufficienti per ottenere una curva dose-risposta e, quando possibile, permettere una determinazione accettabile della DL50.

1.6.2.4. Saggio limite Si può eseguire un saggio limite ad un livello di dosaggio di almeno 2000 mg/kg peso corporeo su un gruppo di 5 animali maschi e 5 femmine usando le procedure sopra descritte. Se si produce una mortalità dovuta al composto, può essere necessario considerare uno studio completo.

1.6.2.5. Periodo di osservazione Il periodo di osservazione dovrebbe essere almeno di 14 giorni. Tuttavia tale durata non è tassativa. Essa dovrebbe dipendere dalla natura delle reazioni tossiche, dalla velocità della loro insorgenza e dalla lunghezza del periodo di guarigione; se necessario, quindi, essa potrà essere prolungata. Il momento in cui compaiono e spariscono i sintomi di tossicità, la loro durata e il momento in cui interviene il decesso, sono importanti soprattutto nel caso in cui la sostanza tenda a causare mortalità ritardata.

1.6.3. Procedimento Ogni gabbia deve contenere un solo animale. La sostanza in esame dovrà essere applicata uniformemente su una superficie pari a circa il 10 % della superficie corporea totale. Per le sostanze altamente tossiche, la superficie può essere inferiore, ma dovrà essere ricoperta da uno strato per quanto possibile sottile e uniforme. Durante il periodo di esposizione di 24 ore, le sostanze in esame dovranno essere tenute a contatto diretto della cute mediante una garza porosa e un cerotto non irritante. La parte su cui viene applicata la sostanza dovrebbe essere ulteriormente coperta in modo opportuno per tenere ferma la garza e la sostanza in esame e assicurare che gli animali non ingeriscano la sostanza stessa. Dispositivi per la limitazione dei movimenti possono essere usati per impedire agli animali di ingerire la sostanza in esame, ma l'immobilizzazione completa non è consigliabile. Alla fine del periodo di esposizione si dovrà rimuovere la sostanza residua utilizzando acqua, se possibile, o altri prodotti idonei per la pulizia della pelle. Le osservazioni dovranno essere registrate sistematicamente non appena fatte, badando a tenere separati i dati per ciascun animale. Durante il primo giorno le osservazioni dovranno essere frequenti. Un attento esame clinico dovrà essere effettuato almeno una volta al giorno per 5 giorni per settimana. Le altre osservazioni dovrebbero essere effettuate quotidianamente, agendo appropriatamente per minimizzare la perdita di animali da studiare, ad esempio necroscopia o refrigerazione degli animali trovati morti e isolamento o sacrificio degli animali deboli o moribondi. Le osservazioni dovrebbero tener conto delle alterazioni riscontrate nel pelo, nella cute trattata, negli occhi e nelle membrane mucose e anche nel sistema respiratorio, circolatorio, nel sistema nervoso autonomo e centrale, nell'attività somatomotoria e nel comportamento dell'animale. Particolare attenzione dovrebbe essere rivolta all'osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. Il momento in cui sopraggiunge il decesso deve essere registrato con la massima precisione possibile. Gli animali che muoiono durante il saggio e quelli che sopravvivono alla fine del saggio sono sottoposti a necroscopia. Tutte le variazioni patologiche macroscopiche dovranno essere registrate. Ove del caso, dovrebbero essere prelevati tessuti per l'esame istopatologico.

1.6.3. Valutazione della tossicità nell'altro sesso

Dopo il completamento dello studio su un sesso, si somministra almeno un intervallo di dose ad un gruppo di 5 animali dell'altro sesso per controllare che gli animali di questo sesso non siano nettamente più sensibili alla sostanza in esame. In circostanze particolari può essere giustificato l'uso di un minor numero di animali. Nel caso in cui siano disponibili informazioni adeguate che dimostrano che gli animali del sesso controllato sono nettamente più sensibili, si può fare a meno di effettuare la prova su animali dell'altro sesso.

2. DATI I risultati dovranno essere riassunti in forma tabellare indicante per ogni singolo gruppo di saggio il numero di animali presenti all'inizio del saggio, il momento del decesso di ciascun animale, il numero di animali che presentano altri segni di tossicità, la descrizione degli effetti tossici e i risultati della necroscopia. Il peso di ciascun animale dovrà essere determinato e registrato poco prima dell'applicazione della sostanza, poi settimanalmente e al momento del decesso; le variazioni ponderali dovranno essere calcolate e registrate quando la sopravvivenza sia superiore a un giorno. Gli animali che vengono sottoposti ad eutanasia in conseguenza di sofferenza e dolore dovuti al composto vengono registrati come morti in conseguenza del composto. La DL50 può essere determinata con un metodo riconosciuto. La valutazione dei dati dovrebbe includere il rapporto, se esistente, tra l'esposizione degli animali alla sostanza in esame e l'incidenza e gravità di tutte le alterazioni, incluse quelle comportamentali e cliniche, le lesioni macroscopiche, le variazioni del peso corporeo, la mortalità e qualsiasi altro effetto tossico.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

specie, ceppo, origine degli animali, condizioni ambientali, dieta, ecc.;

condizioni sperimentali (inclusa la tecnica di pulizia della cute e il tipo di medicazione; occlusiva o non occlusiva);

livelli di dosaggio (col veicolo, se usato, e concentrazione);

sesso degli animali sottoposti a somministrazione;

tabulato dei dati di risposta per dose e livello di dosaggio (cioè il numero di animali morti o sacrificati durante la prova; numero di animali che presentano sintomi di tossicità; numero di animali esposti);

tempo intercorso tra la somministrazione della sostanza e la morte, ragioni e criteri usati per la eutanasia di animali;

tutte le osservazioni;

valore della DL50 per il sesso sottoposto ad uno studio completo, determinato dopo 14 giorni, specificando il metodo di determinazione;

intervallo di confidenza statistica del 95 % per la DL50 (se può essere fornito);

curva dose-mortalità e relativo coefficiente angolare (se il metodo di determinazione lo consente);

risultati necroscopici;

qualsiasi altro reperto istopatologico;

risultati di eventuali saggi sull'altro sesso;

discussione dei risultati (occorre dedicare una particolare attenzione all'effetto che la eutanasia di animali durante la prova può avere sul valore calcolato della DL50);

interpretazione dei risultati.

3.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE Vedi introduzione generale, parte B (punto D).

4. BIBLIOGRAFIA Vedi introduzione generale, parte B (punto E).

B.4. TOSSICITÀ ACUTA: IRRITAZIONE/CORROSIONE CUTANEA

B.4.

1. METODO Questo metodo corrisponde al TG 404 (2002) dell'OCSE.

1.

1.1 INTRODUZIONE Nella preparazione di questo metodo aggiornato è stata dedicata particolare attenzione ai miglioramenti possibili in relazione al benessere degli animali e alla valutazione di tutte le informazioni disponibili sulla sostanza in esame, per evitare prove non necessarie sugli animali da laboratorio. Il metodo comprende la raccomandazione di eseguire, prima di effettuare il saggio in vivo descritto per la corrosione/irritazione, un'analisi dell'importanza delle prove (weight-of-the-evidence analysis) sui dati pertinenti esistenti. Qualora i dati disponibili fossero insufficienti, si raccomanda di svilupparli mediante l'applicazione di saggi sequenziali (1). La strategia di saggio raccomandata comprende l'esecuzione di saggi in vitro validati ed accettati ed è descritta nell'Allegato al presente metodo. Nel saggio iniziale in vivo si raccomanda inoltre di applicare, ove opportuno, all'animale i tre cerotti per il saggio da contatto uno dopo l'altro, anziché simultaneamente. Nell'interesse sia dell'accuratezza scientifica, sia del benessere degli animali, non bisogna prendere in considerazione i saggi in vivo finché non siano stati valutati, in un'analisi dell'importanza delle prove, tutti i dati disponibili pertinenti circa la potenziale corrosività/irritazione cutanea della sostanza. Tali dati devono comprendere prove derivanti da studi esistenti su soggetti umani e/o animali da laboratorio, prove di corrosività/irritazione di una o più sostanze strutturalmente correlate o miscele di tali sostanze, dati dimostranti l'elevata acidità o alcalinità della sostanza (2)(3), nonché i risultati di test in vitro o ex vivo validati ed accettati (4)(5)(5a). Questa analisi deve ridurre la necessità di eseguire test in vivo della corrosività/irritazione delle sostanze per le quali esistono già prove sufficienti derivanti da altri studi in relazione a questi due fattori. Nell'Allegato al presente metodo è inclusa e consigliata una strategia a tappe, che prevede l'esecuzione di saggi validati in vitro o ex vivo per la corrosione/irritazione. Tale strategia è stata sviluppata e raccomandata all'unanimità dai partecipanti a un workshop dell'OCSE (6), ed è stata adottata come strategia raccomandata di test nel GHS (Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Substances) (Sistema globale armonizzato per la classificazione delle sostanze chimiche) (7). Si raccomanda di adottare la strategia prima di passare ai saggi in vivo. Nel caso di nuove sostanze, si raccomanda di adottare un approccio graduale per sviluppare dati scientificamente validi sulla corrosività/irritazione della sostanza. Se per le sostanze esistenti i dati sulla corrosione/irritazione cutanea sono insufficienti, si può usare tale strategia per ottenere i dati mancanti. È necessario giustificare l'uso di una strategia o procedura di saggio differente, nonché l'eventuale decisione di non usare un approccio di saggio graduale. Se non è possibile determinare la corrosività o il potere irritante usando un'analisi dell'importanza delle prove, coerente con la strategia di saggi sequenziali, va preso in considerazione un saggio in vivo (cfr. Allegato).

1.2 DEFINIZIONI Irritazione cutanea: produzione di danni reversibili alla pelle in seguito all'applicazione di una sostanza in esame per un massimo di 4 ore. Corrosione cutanea: produzione di danni irreversibili alla pelle; in particolare, necrosi visibile attraverso l'epidermide e all'interno del derma, in seguito all'applicazione della sostanza in esame per un massimo di quattro ore. Le reazioni corrosive sono caratterizzate da ulcere, emorragie, escare sanguinanti e, alla fine dell'osservazione, il giorno 14, da alterazione del colore dovuta a pallore della cute, zone di completa alopecia e cicatrici. Per valutare le lesioni dubbie effettuare eventualmente un esame istopatologico.

1.3 PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO La sostanza in esame è applicata in un'unica dose sulla pelle della cavia; le zone di pelle non trattate dell'animale servono da controllo. A intervalli specificati si valuta e si attribuisce un punteggio al grado di irritazione/corrosione, che va ulteriormente descritto per fornire una valutazione completa degli effetti. La durata dello studio deve essere sufficiente a valutare la reversibilità o irreversibilità degli effetti osservati. Gli animali che presentano segni prolungati di grave sofferenza e/o dolore, in qualsiasi fase del saggio, vanno soppressi con metodi non cruenti e la sostanza va valutata di conseguenza. Cfr. bibliografia per i criteri da seguire nel decidere di sopprimere gli animali moribondi o che soffrono gravemente (8).

1.4 DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.4

1.4.1 Preparazione per il saggio in vivo

1.4.1

1.4.1.1 Selezione delle specie L'animale da laboratorio di elezione è il coniglio albino; usare giovani adulti sani. Giustificare l'eventuale uso di altre specie.

1.4.1.2 Preparazione degli animali All'incirca 24 ore prima del saggio occorre rasare il pelo nella zona dorsale del tronco degli animali evitando di scorticare la pelle. Usare solo animali la cui pelle è sana e intatta. Alcuni ceppi di coniglio presentano zone di pelo più denso che sono più evidenti in alcuni periodi dell'anno. Tali aree di crescita densa del pelo non vanno usate come punti per il saggio.

1.4.1.3 Condizioni di alloggio e alimentazione Gli animali vanno posti in gabbie singole. La temperatura del locale deve essere di 20 oC (± o3 C) per i conigli. L'umidità relativa deve raggiungere almeno il 30 % e preferibilmente non superare il 70 %, tranne che nel corso delle pulizie degli ambienti, ma occorre puntare a un valore del 50-60 %. L'illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 di oscurità. Per l'alimentazione, attenersi alle diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata di acqua potabile.

1.4.2 Procedura

1.4.2

1.4.2.1 Applicazione della sostanza in esame La sostanza in esame va applicata su una zona ridotta (circa 6 cm2) di pelle e coperta con una garza fissata con un cerotto non irritante. Nei casi in cui non è possibile l'applicazione diretta (ad es. liquidi e alcune paste), la sostanza in esame va prima applicata sulla garza, che poi è a sua volta applicata sulla pelle. La garza va mantenuta a contatto con la pelle, ma allentata, mediante una fasciatura semiocclusiva, per tutta la durata del periodo di esposizione. Se la sostanza in esame è applicata sulla garza, essa va appoggiata sulla pelle in modo che la sostanza sia bene a contatto e si distribuisca uniformemente. Occorre impedire che l'animale abbia accesso alla garza e ingerisca o inali la sostanza in esame. Le sostanze sperimentali liquide si usano generalmente non diluite. Per l'esame dei solidi (che possono essere ridotti in polvere, se ritenuto necessario) la sostanza in esame va inumidita con la minor quantità d'acqua (o, ove necessario, di un altro eccipiente adeguato) sufficiente ad assicurare un buon contatto con la pelle. Se si impiegano eccipienti diversi dall'acqua, la potenziale influenza dell'eccipiente sull'irritazione della pelle da parte della sostanza in esame deve essere minima o nulla. Al termine del periodo di esposizione, che è normalmente di 4 ore, la sostanza in esame residua va rimossa, ove possibile, usando acqua o un solvente adeguato senza alterare la risposta da essa provocata e l'integrità dell'epidermide.

1.4.2.2 Livello di dosi Sul punto prescelto per il saggio va applicata una dose di 0,5 ml di liquido o 0,5 g di solido o pasta.

1.4.2.3 Saggio iniziale (Saggio di irritazione/corrosione cutanea in vivo su un solo animale) Si raccomanda caldamente di eseguire inizialmente il saggio in vivo usando un solo animale, soprattutto quando si sospetta che la sostanza sia potenzialmente corrosiva, in conformità alla strategia dei saggi sequenziali (cfr. Allegato 1). Quando una sostanza è stata giudicata corrosiva sulla base di un'analisi dell'importanza delle prove, non è necessario eseguire ulteriori saggi su animali. Per la maggior parte delle sostanze sospettate di essere corrosive, non è normalmente necessario eseguire ulteriori saggi in vivo. Tuttavia, nei casi in cui si ritiene giustificato ottenere altri dati, in quanto le prove sono insufficienti, è possibile effettuare saggi limitati su animali secondo l'approccio seguente: all'animale si applicano un massimo di tre cerotti con garza per il saggio da contatto, in sequenza. Il primo cerotto è tolto dopo tre minuti. Se non si osservano reazioni cutanee gravi, si applica un secondo cerotto, che è rimosso dopo un'ora. Se le osservazioni in questa fase indicano che è possibile estendere l'esposizione a quattro ore, senza causare sofferenze, si applica un terzo cerotto, che è rimosso dopo quattro ore, e si valuta la reazione. Se dopo una qualsiasi delle tre esposizioni in sequenza si osserva un effetto corrosivo, il saggio va immediatamente interrotto. Se dopo la rimozione dell'ultimo cerotto non si osserva alcun effetto corrosivo, si mantiene l'animale sotto osservazione per 14 giorni, a meno che la corrosione non si manifesti più precocemente. Nei casi in cui non si prevede che la sostanza in esame produca corrosione, ma che possa essere irritante, applicare un unico cerotto a un solo animale per quattro ore.

1.4.2.4 Saggio di conferma (saggio di irritazione cutanea in vivo con ulteriori animali) Se nel saggio iniziale non si osservano effetti corrosivi, confermare la reazione irritante o negativa su due altri animali al massimo, ciascuno con un cerotto, per un periodo di esposizione di quattro ore. Se nel saggio iniziale si osserva un effetto irritante, il saggio di conferma può essere condotto in maniera sequenziale, oppure esponendo contemporaneamente due altri animali. Nel caso eccezionale in cui non sia eseguito il saggio iniziale, è possibile trattare due o tre animali con un solo cerotto, che è poi asportato dopo quattro ore. Quando si usano due animali, se entrambi evidenziano la stessa reazione, non sono necessari altri saggi, altrimenti si sottopone al saggio anche il terzo animale. È possibile che siano necessari altri animali per valutare le reazioni dubbie.

1.4.2.5 Periodo di osservazione La durata del periodo di osservazione deve essere sufficiente a valutare completamente la reversibilità degli effetti osservati. Interrompere però l'esperimento in qualsiasi momento se l'animale mostra segni continui di dolore o sofferenza gravi. Per determinare la reversibilità degli effetti, gli animali vanno osservati per un massimo di 14 giorni dopo la rimozione dei cerotti. In caso di reversibilità prima dei 14 giorni, interrompere subito l'esperimento.

1.4.2.6 Osservazioni cliniche e classificazione delle reazioni cutanee Esaminare tutti gli animali per vedere se presentano segni di eritema e di edema e valutare le reazioni a 60 minuti e successivamente a 24, 48 e 72 ore dopo la rimozione del cerotto. Per il saggio iniziale su un solo animale, esaminare subito la zona prescelta per il saggio dopo la rimozione del cerotto. Le reazioni cutanee sono classificate e registrate in base ai gradi indicati nella tabella allegata. Se la pelle presenta una lesione che non può essere identificata come irritazione o corrosione a 72 ore, può essere necessario proseguire le osservazioni fino al giorno 14, per determinare la reversibilità degli effetti. Oltre alle osservazioni dell'irritazione, descrivere e documentare tutti gli effetti tossici locali, come la perdita del grasso cutaneo, ed eventuali effetti sistemici negativi (ad es. effetti sui segni clinici di tossicità e sul peso corporeo). Per chiarire le reazioni dubbie, valutare l'opportunità di eseguire un esame istopatologico. La classificazione delle reazioni cutanee è necessariamente soggettiva. Per favorirne l'armonizzazione e per assistere i laboratori e le persone che eseguono il saggio e interpretano le osservazioni, istruire adeguatamente il personale sul sistema di punteggio usato (cfr. tabella più avanti). Potrebbe essere utile una guida illustrata per la classificazione dell'irritazione cutanea e di altre lesioni (9).

2. DATI

2.

2.1 PRESENTAZIONE DEI RISULTATI I risultati dello studio vanno riassunti sotto forma di tabella nella relazione finale sul saggio e devono coprire tutte le voci elencate al punto 3.1.

2.2 VALUTAZIONE DEI RISULTATI Valutare il grado di irritazione cutanea insieme alla natura e alla gravità delle lesioni, nonché alla loro reversibilità o irreversibilità. Le reazioni individuali non rappresentano uno standard assoluto per le proprietà irritanti di un materiale, in quanto si valutano anche altri effetti del materiale in esame. I risultati individuali vanno invece considerati come valori di riferimento e devono essere valutati insieme a tutte le altre osservazioni emerse dallo studio. Nella valutazione delle reazioni irritanti è necessario considerare la reversibilità delle lesioni cutanee. Quando reazioni quali alopecia (zona limitata), ipercheratosi, iperplasia e desquamazione persistono fino alla fine del periodo di osservazione di 14 giorni, la sostanza in esame va considerata irritante.

3. RAPPORTO

3.

3.1 RAPPORTO SUL SAGGIO Il rapporto deve contenere le seguenti informazioni:

Giustificazione del saggio in vivo: analisi dell'importanza delle prove di dati pre-esistenti, compresi i risultati della strategia dei saggi sequenziali:

descrizione dei dati pertinenti disponibili da saggi precedenti;

dati ricavati in ciascuna fase della strategia dei saggi;

descrizione dei saggi in vitro eseguiti, con i dettagli delle procedure, i risultati ottenuti con le sostanze in esame/di riferimento;

analisi dell'importanza delle prove per l'esecuzione dello studio in vivo.

Sostanza in esame:

dati di identificazione (ad es. numero CAS, origine, purezza, impurità note, numero di lotto);

natura fisica e proprietà fisico-chimiche (ad es. pH, volatilità, solubilità, stabilità);

se si tratta di una miscela, composizione e percentuali relative dei componenti.

Eccipiente:

identificazione, concentrazione (ove pertinente), volume usato;

giustificazione della scelta dell'eccipiente.

Cavie:

specie/ceppo usato, motivazione per l'uso di animali diversi dal coniglio albino;

numero di animali di ciascun sesso;

peso di ciascun singolo animale all'inizio e alla conclusione del saggio;

età all'inizio dello studio;

origine, condizioni di alloggio, dieta, ecc.

Condizioni del saggio:

tecnica di preparazione del punto di applicazione del cerotto;

dettagli relativi al materiale del cerotto e alla tecnica di applicazione del cerotto;

dettagli relativi a preparazione, applicazione e rimozione della sostanza in esame.

Risultati:

tabulazione dei punteggi delle reazioni di irritazione/corrosione per ciascun animale in tutti i momenti di misurazione;

descrizione di tutte le lesioni osservate;

descrizione della natura e del grado di irritazione o corrosione osservate e degli eventuali reperti istopatologici;

descrizione di altri effetti negativi locali (ad es. perdita del grasso cutaneo) e sistemici oltre all'irritazione e alla corrosione cutanea.

Discussione dei risultati

4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)

BIBLIOGRAFIA Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23,410-429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720. ECETOC (1990) Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524. Metodo di prova B.40 Corrosione cutanea. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996. (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998. (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Available from OECD Secretariat upon request].

Tabella I Eritema e formazione di escara Formazione di edema CLASSIFICAZIONE DELLE REAZIONI CUTANEE

Assenza di eritema 0 Eritema molto lieve (appena percettibile) 1 Eritema ben definito 2 Eritema da moderato a grave 3 Eritema grave (rosso vivo) fino alla formazione di escara che impedisce la classificazione dell'eritema 4 Massimo possibile: 4 Assenza di edema 0 Edema molto lieve (appena percettibile) 1 Edema lieve (bordi dell'area ben definiti dal gonfiore) 2 Edema moderato (area sollevata di circa 1 mm) 3 Edema grave (area sollevata di oltre 1 mm ed estesa oltre la zona di esposizione) 4 Massimo possibile: 4 Per chiarire le reazioni dubbie è possibile eseguire un esame istopatologico.

B.5. TOSSICITÀ ACUTA: IRRITAZIONE/CORROSIONE OCULARE

B.5.

1. METODO Questo metodo corrisponde al TG 405 (2002) dell'OCSE.

1.

1.1 INTRODUZIONE Nella preparazione di questo metodo aggiornato è stata dedicata particolare attenzione ai possibili miglioramenti, mediante la valutazione di tutte le informazioni disponibili circa la sostanza in esame, per evitare prove non necessarie sugli animali da laboratorio e tener conto del benessere degli animali. Questo metodo include la raccomandazione, prima di effettuare il saggio in vivo descritto per l'irritazione/corrosione oculare acuta, di una analisi accurata dei dati disponibili e pertinenti (weight-of-the-evidence analysis) (1) sui dati pertinenti esistenti. Qualora i dati disponibili fossero insufficienti, si raccomanda di ottenerli mediante l'applicazione di saggi sequenziali (2)(3). La strategia di saggio raccomandata comprende l'esecuzione di saggio in vitro validati ed accettati ed è descritta nell'Allegato al metodo. Inoltre, si raccomanda l'uso di un saggio di irritazione/corrosione cutanea in vivo per prevedere la corrosione oculare prima di considerare un saggio oculare in vivo. Nell'interesse dell'accuratezza scientifica e del benessere degli animali, non bisogna prendere in considerazione i saggi in vivo finché non siano stati valutati, considerando l'importanza delle prove, tutti i dati disponibili pertinenti circa la potenziale corrosività/irritazione oculare della sostanza. Tali dati devono comprendere prove derivanti da studi esistenti su soggetti umani e/o animali da laboratorio, prove di corrosività/irritazione di una o più sostanze strutturalmente correlate o miscele di tali sostanze, dati dimostranti l'elevata acidità o alcalinità della sostanza (4)(5), nonché i risultati di saggi in vitro o ex vivo validati ed accettati per la corrosione e l'irritazione cutanea (6)(6a). Gli studi possono essere stati condotti prima di un'analisi dell'importanza delle prove, o in conseguenza di essa. Per alcune sostanze, un'analisi di questo tipo può indicare la necessità di studi in vivo del potenziale di corrosione/irritazione oculare. In tutti questi casi, prima di considerare l'uso del saggio oculare in vivo, va preferibilmente condotto uno studio sugli effetti cutanei in vivo della sostanza, e valutate in base al metodo B.4 (7). L'applicazione di un'analisi dell'importanza delle prove e la strategia dei saggi sequenziali dovrebbe ridurre la necessità di eseguire saggi in vivo della corrosività/irritazione delle sostanze per le quali esistano già prove sufficienti derivanti da altri studi. Qualora non sia possibile determinare il potenziale di corrosione o irritazione oculare usando la strategia dei saggi sequenziali, anche dopo l'esecuzione di uno studio in vivo della corrosione e dell'irritazione della cute, si può effettuare un saggio in vivo della corrosione/irritazione oculare. Nell'Allegato al presente metodo di prova è inclusa la strategia dei saggi sequenziali da preferirsi, che prevede l'esecuzione di saggi validati in vitro o ex vivo per la corrosione/irritazione. Tale strategia è stata sviluppata e raccomandata all'unanimità dai partecipanti a un workshop dell'OCSE (8), ed è stata adottata come strategia raccomandata di saggio nel GHS (Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Substances) (Sistema globale armonizzato per la classificazione delle sostanze chimiche) (9). Si raccomanda di seguire questa strategia prima di passare al saggio in vivo. Per le nuove sostanze, si raccomanda di adottare una strategia a tappesaggio (stepwise), per sviluppare dati scientificamente validi sulla corrosività/irritazione della sostanza. Se per le sostanze esistenti i dati sulla corrosione/irritazione oculare e cutanea sono insufficienti, si può usare tale strategia per recuperare i dati mancanti. È necessario giustificare l'uso di una strategia o procedura di saggio differente, nonché l'eventuale decisione di non usare un approccio di saggio per gradi.

1.2 DEFINIZIONI Irritazione oculare: produzione di alterazioni nell'occhio in seguito all'applicazione della sostanza in esame sulla superficie anteriore dell'occhio, completamente reversibili entro 21 giorni dall'applicazione. Corrosione oculare: produzione di lesioni del tessuto oculare o di un grave deterioramento fisico della vista, in seguito all'applicazione della sostanza in esame sulla superficie anteriore dell'occhio, non completamente reversibili entro 21 giorni dall'applicazione.

1.3 PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO La sostanza in esame è applicata in un'unica dose su uno degli occhi dell'animale sperimentale; l'occhio non trattato serve da controllo. Il grado di irritazione/corrosione è valutato dando un punteggio alle lesioni di congiuntiva, cornea e iride, a intervalli di tempo specifici. Sono descritti anche altri effetti sull'occhio ed effetti negativi sistemici, con l'obiettivo di fornire una valutazione completa degli effetti. La durata dello studio deve essere sufficiente a valutare la reversibilità o irreversibilità degli effetti. Gli animali che presentano segni prolungati di grave sofferenza e/o dolore, in qualsiasi fase del saggio, vanno soppressi con metodi non cruenti e la sostanza va valutata di conseguenza. Cfr. bibliografia per i criteri da seguire nel decidere l'eutanasia di animali moribondi o che soffrono gravemente (10).

1.4 DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.4

1.4.1 Preparazione per il saggio in vivo

1.4.1

1.4.1.1 Selezione delle specie L'animale da laboratorio di elezione è il coniglio albino, del quale vanno utilizzati giovani adulti sani. Giustificare l'eventuale uso di altri ceppi o specie.

1.4.1.2 Preparazione degli animali Entro 24 ore dall'inizio del saggio è necessario esaminare entrambi gli occhi di ciascun animale sperimentale provvisoriamente selezionato per il saggio. Non vanno utilizzati animali che presentino irritazione oculare, difetti degli occhi o preesistenti lesioni corneali.

1.4.1.3 Condizioni di alloggio e alimentazione Gli animali vanno posti in gabbie singole. La temperatura del locale deve essere di 20 oC (± 3 oC) per i conigli. Sebbene l'umidità relativa debba raggiungere almeno il 30 % e preferibilmente non superare il 70 %, tranne che nel corso delle pulizie degli ambienti, occorre puntare a un valore del 50-60 %. L'illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 di oscurità. Per l'alimentazione, attenersi alle diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata di acqua potabile.

1.4.2 Procedura

1.4.2

1.4.2.1 Applicazione della sostanza in esame La sostanza in esame va posta nel sacco congiuntivale di un occhio di ciascun animale, dopo aver allontanato delicatamente la palpebra inferiore dal bulbo. Le palpebre vanno poi tenute unite con delicatezza per circa un secondo, per evitare la fuoriuscita del materiale. L'altro occhio, che non viene trattato, serve da controllo.

1.4.2.2 Irrigazione Gli occhi degli animali sperimentali non vanno lavati per almeno 24 ore dopo l'instillazione della sostanza in esame, tranne nel caso di saggio di sostanze solide (cfr. punto 1.4.2.3.2), e nel caso di effetti corrosivi o irritanti immediati. Dopo 24 ore è possibile effettuare un lavaggio, se lo si considera necessario. Non si raccomanda l'uso di un gruppo satellite di animali per studiare l'influenza del lavaggio oculare, a meno che ciò non risulti scientificamente giustificato. Qualora sia necessario un gruppo satellite, vanno usati due conigli. Le condizioni del lavaggio vanno documentate accuratamente: momento del lavaggio, composizione e temperatura della soluzione di lavaggio, durata, volume e velocità di applicazione.

1.4.2.3 Livello di dosi

1.4.2.3

1.4.2.3.1 Saggio di liquidi Per saggiare i liquidi usare una dose di 0,1 ml. Non usare spray per instillare la sostanza direttamente nell'occhio; lo spray liquido va spruzzato e raccolto in un contenitore prima di instillarne 0,1 ml nell'occhio.

1.4.2.3.2 Saggio di solidi Nel saggio di sostanze solide, paste e sostanze particellari, la quantità impiegata deve avere un volume di 0,1 ml o un peso non superiore a 100 mg. Il materiale in esame va ridotto in polvere fine. Prima della misurazione del volume, il materiale solido va delicatamente compattato, ad esempio picchiettando sul contenitore per la misurazione. Se la sostanza in esame solida non è stata rimossa dall'occhio dell'animale da meccanismi fisiologici, al primo tempo di osservazione un'ora dopo il trattamento, si può sciacquare l'occhio con soluzione salina o acqua distillata.

1.4.2.3.3 Saggio di aerosol Si raccomanda di raccogliere tutti gli spray e gli aerosol prima dell'instillazione nell'occhio. L'unica eccezione riguarda le sostanze in contenitori pressurizzati per aerosol, che non possono essere raccolte a causa della vaporizzazione. In questi casi l'occhio va tenuto aperto e la sostanza va somministrata nell'occhio con un unico spruzzo di circa un secondo, da una distanza di 10 cm, direttamente davanti all'occhio. La distanza può variare a seconda della pressione dello spray e del suo contenuto. Evitare di danneggiare l'occhio con la pressione dello spray. In alcuni casi può essere necessario valutare il potenziale di danno meccanico all'occhio dovuto alla forza dello spray. È possibile ottenere una stima della dose di un aerosol simulando il saggio come segue: spruzzare la sostanza attraverso un'apertura delle dimensioni dell'occhio di un coniglio posta esattamente di fronte ad un foglio di carta. L'aumento di peso della carta viene usato quindi per approssimare la quantità spruzzata nell'occhio. Per le sostanze volatili, la dose può essere stimata pesando un contenitore ricevente prima e dopo la rimozione del materiale in esame.

1.4.2.4 Saggio iniziale (saggio di irritazione/corrosione oculare in vivo su un solo animale) Come descritto nella strategia dei saggi sequenziali (cfr. Allegato 1), si raccomanda caldamente di eseguire inizialmente il saggio in vivo usando un solo animale. Se con la procedura descritta, i risultati di tale saggio indicano che la sostanza è corrosiva o gravemente irritante per l'occhio, non eseguire altri saggi di irritazione oculare.

1.4.2.5 Anestetici locali È possibile applicare anestetici locali, valutandone la necessità caso per caso. Se l'analisi dell'importanza delle prove indica che la sostanza può provocare dolore, e se il saggio iniziale dimostra che si verificherà una reazione dolorosa, prima dell'instillazione della sostanza in esame si può applicare un anestetico locale. Il tipo, la concentrazione e la dose dell'anestetico locale vanno attentamente selezionati in modo da assicurare che il suo uso non modifichi la reazione alla sostanza in esame. Anche l'occhio di controllo va anestetizzato analogamente.

1.4.2.6 Saggio di conferma (saggio di irritazione oculare in vivo con animali supplementari) Se nel saggio iniziale non si osservano effetti corrosivi, confermare la reazione irritante o negativa su un massimo di altri due animali. Se nel saggio iniziale è stato osservato un effetto fortemente irritante che indica un possibile effetto grave (irreversibile) si raccomanda di eseguire il saggio di conferma in maniera sequenziale su un solo animale per volta, anziché esporre contemporaneamente i due animali. Se il secondo animale rivela effetti corrosivi o gravemente irritanti, interrompere il saggio. È possibile che siano necessari altri animali per confermare le reazioni irritanti deboli o moderate.

1.4.2.7 Periodo di osservazione La durata del periodo di osservazione deve essere sufficiente a valutare completamente l'entità e la reversibilità degli effetti osservati. Interrompere però l'esperimento in qualsiasi momento se l'animale mostra segni continui di dolore o sofferenza gravi (9). Per determinare la reversibilità degli effetti, gli animali vanno osservati di norma per 21 giorni successivamente alla somministrazione della sostanza in esame. In caso di reversibilità prima dei 21 giorni, interrompere subito l'esperimento.

1.4.2.7

1.4.2.7.1 Osservazioni cliniche e classificazione delle reazioni oculari Gli occhi vanno esaminati a 1, 24, 48 e 72 ore dopo l'applicazione della sostanza in esame. Gli animali devono essere sottoposti a saggio per il tempo minimo necessario per ottenere informazioni definitive. Gli animali che presentano grave dolore o sofferenza vanno soppressi al più presto con metodi non cruenti e la sostanza va valutata di conseguenza. Sopprimere con metodi non cruenti gli animali che, dopo l'instillazione, presentano le seguenti lesioni oculari: perforazione corneale o ulcerazione corneale di rilievo, compreso stafiloma; sangue nella camera anteriore dell'occhio; opacità corneale di grado 4 che persista per 48 ore; assenza di riflesso pupillare alla luce (risposta dell'iride di grado 2) che persista per 72 ore; ulcerazione della membrana congiuntivale; necrosi della congiuntiva o della membrana nittitante; distacco epidermico. Tali lesioni sono infatti generalmente irreversibili. Gli animali che non sviluppano lesioni oculari possono essere soppressi non prima di 3 giorni dopo l'instillazione. Gli animali con lesioni lievi o moderate vanno tenuti sotto osservazione fino alla scomparsa delle lesioni, oppure per 21 giorni, momento in cui lo studio si conclude. Effettuare le osservazioni nei giorni 7,14 e 21, con l'obiettivo di determinare lo stato delle lesioni e la loro reversibilità o irreversibilità. In occasione di ciascun esame, registrare i gradi della reazione oculare (congiuntiva, cornea e iride) (Tabella I). Annotare anche qualsiasi altra lesione dell'occhio (ad es. panno corneale, macchie) e qualsiasi effetto sistemico negativo. L'esame delle reazioni può essere facilitato usando una lente binoculare, una lampada manuale a fessura, un biomicroscopio o altro dispositivo idoneo. Dopo aver registrato le osservazioni a 24 ore, è possibile esaminare ulteriormente gli occhi con l'ausilio di fluoresceina. La classificazione delle reazioni oculari è necessariamente soggettiva. Per favorirne l'armonizzazione e per assistere i laboratori e le persone che eseguono e interpretano le osservazioni, istruire adeguatamente il personale sul sistema di punteggio utilizzato.

2. DATI

2.

2.2 VALUTAZIONE DEI RISULTATI Valutare i punteggi dell'irritazione oculare insieme alla natura e alla gravità delle lesioni, nonché alla loro reversibilità o irreversibilità. I punteggi individuali non rappresentano uno standard assoluto per le proprietà irritanti di un materiale, in quanto si valutano anche altri effetti del materiale in esame. I punteggi individuali vanno invece considerati come valori di riferimento e hanno significato solo se corredati da una descrizione e una valutazione complete di tutte le osservazioni.

3. RAPPORTO

3.

3.1 RAPPORTO DI PROVA Il rapporto deve contenere le seguenti informazioni:

Motivazione per il saggio in vivo: analisi dei dati relativi a saggi precedenti, compresi i risultati della strategia dei saggi sequenziali

descrizione dei dati pertinenti disponibili da saggi precedenti;

dati ricavati in ciascuna fase della strategia di saggio;

descrizione dei saggi in vitro eseguiti, con i dettagli delle procedure, i risultati ottenuti con le sostanze in esame/di riferimento;

descrizione dello studio di irritazione/corrosione cutanea in vivo eseguito, con i risultati ottenuti;

analisi dell'importanza delle prove per l'esecuzione dello studio in vivo

Sostanza in esame:

dati di identificazione (ad es. numero CAS, origine, purezza, impurità note, numero di lotto);

natura fisica e proprietà fisico-chimiche (ad es. pH, volatilità, solubilità, stabilità, reattività con l’acqua);

se si tratta di una miscela, composizione e percentuali relative dei componenti;

se si usa un anestetico locale, identificazione, purezza, tipo, dose e potenziale interazione con la sostanza in esame.

Eccipiente:

identificazione, concentrazione (ove pertinente), volume usato;

giustificazione della scelta dell'eccipiente.

Animali sperimentali:

specie/ceppo usato, motivazione dell'uso di animali diversi dal coniglio albino;

età di ciascun animale all'inizio dello studio;

numero di animali di ciascun sesso nei gruppi sperimentali e di controllo (ove necessario);

peso di ciascun singolo animale all'inizio e alla conclusione del saggio;

origine, condizioni di alloggio, dieta, ecc.

Risultati:

descrizione del metodo usato per assegnare un punteggio all'irritazione in ciascun momento di osservazione (ad es. lampada manuale a fessura, biomicroscopio, fluoresceina);

tabella dei dati relativi alla reazione irritante/corrosiva per ciascun animale e in ciascun momento di osservazione fino alla fine del saggio

descrizione del grado e della natura dell'irritazione o della corrosione osservata;

descrizione di qualsiasi altra lesione osservata nell'occhio (ad es. vascolarizzazione, formazione di panno oculare, aderenze, macchie);

descrizione degli eventuali effetti negativi non oculari locali e sistemici e degli eventuali reperti istopatologici.

Discussione dei risultati.

3.2 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI L'estrapolazione dei risultati degli studi sull'irritazione oculare negli animali da laboratorio agli esseri umani ha un valore solo limitato. In molti casi, il coniglio albino è più sensibile dell'uomo alle sostanze irritanti o corrosive per l'occhio. È necessario interpretare con attenzione i dati per escludere l'irritazione dovuta a infezione secondaria.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)

BIBLIOGRAFIA Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164. Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26. Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524. Metodo di prova B.40 Corrosione cutanea. Metodo di prova B.4. Tossicità acuta: irritazione/corrosione cutanea. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tabella I CLASSIFICAZIONE DELLE LESIONI OCULARI

Cornea

Opacità: grado di densità (le misure vanno prese dalle zone più dense) Assenza di ulcerazione e opacità 0 Zone di opacità sparse o diffuse (diverse dal lieve appannamento della normale lucentezza); dettagli dell'iride visibili chiaramente 1 Zone traslucide facilmente individuabili; dettagli dell'iride lievemente offuscati 2 Zona madreperlacea; nessun dettaglio visibile dell'iride; dimensioni della pupilla appena distinguibili 3 Cornea opaca; iride non distinguibile attraverso l'opacità 4 Massimo possibile: 4 NOTE

Iride

Normale 0 Rughe notevolmente approfondite, congestione, edema, moderata iperemia circumcorneale; oppure iniezione; iride reattiva alla luce (una reazione lenta è considerata positiva) 1 Emorragia, distruzione macroscopica, oppure assenza di reazione alla luce 2 Massimo possibile: 2

Congiuntive

Rossore (relativo alla congiuntiva palpebrale e bulbare; escluse cornea e iride) Normale 0 Alcuni vasi sanguigni iperemici (iniettati) 1 Colore cremisi diffuso; singoli vasi non facilmente distinguibili 2 Rosso acceso diffuso 3 Massimo possibile: 3

Chemosi

Edema (relativo alle palpebre e/o alle membrane nittitanti) Normale 0 Edema appena superiore alla norma 1 Edema evidente, con parziale eversione delle palpebre 2 Edema, con palpebre semichiuse 3 Edema, con palpebre più che semichiuse 4 Massimo possibile: 4

B.6 SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA

B.6

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Note: La sensibilità dei saggi e la loro efficacia nell'individuazione di potenziali sensibilizzatori della cute umana costituiscono parametri importanti in un sistema di classificazione della tossicità per la tutela della salute pubblica. Non esiste un unico metodo sperimentale atto a identificare correttamente tutte le sostanze dotate di un potenziale sensibilizzante per la cute umana e quindi sistematicamente applicabile. Nella scelta del metodo occorre tener conto di fattori quali le caratteristiche fisiche di una sostanza, compresa la sua capacità di penetrazione cutanea. Sono stati elaborati due tipi di saggio su porcellini d'India: il saggio con utilizzo di adiuvanti, nel quale uno stato allergico viene potenziato sciogliendo o sospendendo la sostanza in esame in adiuvante completo di Freund (ACF), e il saggio senza utilizzo di adiuvante. I saggi con utilizzo di adiuvante offrono generalmente un più elevato grado di precisione nell'individuare un potenziale di sensibilizzazione cutanea nell'uomo rispetto ai metodi che non prevedono l'uso dell'adiuvante completo di Freund. Essi sono pertanto preferibili. Il Guinea-Pig Maximisation Test (GPMT) è un test con utilizzo di adiuvante ampiamente usato. Malgrado esistano diversi altri metodi per identificare il potenziale di sensibilizzazione cutanea di una sostanza, il GPMT è considerato il metodo con adiuvante d'elezione. Per molte classi di sostanze chimiche, i saggi senza utilizzo di adiuvante (fra cui il più diffuso è quello di Buehler) sono considerati meno sensibili. In alcuni casi il saggio di Buehler, che prevede un'applicazione topica della sostanza, può risultare preferibile all'iniezione intradermica utilizzata nel Guinea-Pig Maximisation Test. Qualora si opti per il saggio di Buehler, si dovrà fornire una giustificazione scientifica. Il Guinea-Pig Maximisation Test (GPMT) e il saggio di Buehler sono descritti nel presente metodo. È possibile il ricorso ad altri metodi, purché siano debitamente convalidati e venga fornita una giustificazione scientifica. In caso di risultato positivo di un saggio di screening riconosciuto, la sostanza in esame può essere considerata un potenziale sensibilizzante e non è necessario condurre un ulteriore test GPMT. Tuttavia in caso di risultato negativo del saggio di screening è necessario condurre un test GPMT attenendosi alla procedura descritta nel presente metodo di saggio. Vedi anche introduzione generale, parte B.

1.2. DEFINIZIONI Sensibilizzazione cutanea: (dermatite allergica da contatto) è una reazione cutanea a una sostanza mediata da fattori immunologici. Nell'uomo la reazione può essere caratterizzata da prurito, eritema, edema, papule, vescicole, bolle o da una combinazione di queste manifestazioni. In altre specie le reazioni possono differire e limitarsi alla comparsa di eritemi e di edemi. Esposizione di induzione: esposizione sperimentale di un soggetto alla sostanza in esame al fine di indurre uno stato di ipersensibilità. Periodo di induzione: periodo della durata minima di una settimana, successivo all'esposizione di induzione, entro il quale può manifestarsi uno stato di ipersensibilità. Esposizione di provocazione: in un soggetto già trattato, esposizione sperimentale alla sostanza in esame, effettuata successivamente al periodo di induzione al fine di accertare se il soggetto sviluppa una reazione di ipersensibilità.

1.3 SOSTANZE DI RIFERIMENTO La sensibilità e l'attendibilità della tecnica sperimentale utilizzata devono essere verificate ogni sei mesi utilizzando sostanze notoriamente dotate di proprietà di sensibilizzazione cutanea di grado leggero-medio. In un saggio eseguito correttamente, per sensibilizzanti di tipo leggero-medio si dovrebbe avere una risposta pari ad almeno il 30 % con il metodo con adiuvanti e ad almeno il 15 % con il metodo senza adiuvanti. Si farà preferibilmente ricorso alle seguenti sostanze: Numero CAS- Numero EINECS- Denominazione EINECS Denominazione corrente 101-86-0 202-983-3 α-esilcinnamaldeide α-esilcinnamaldeide 149-30-4 205-736-8 benzothiazol-2-tiolo (mercapto-benzothiaziolo) kaptax 94-09-7 202-303-5 benzocaina norcaina Qualora le circostanze lo giustifichino, potranno essere utilizzate altre sostanze di controllo conformi ai criteri suelencati.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO In un primo tempo gli animali vengono esposti alla sostanza da saggiare con iniezioni intradermiche e/o applicazione epidermica (esposizione di induzione). Dopo un periodo di riposo di 10-14 giorni (periodo di induzione), in cui si può sviluppare una risposta immunitaria, essi vengono esposti alla dose di provocazione. L'estensione e la gravità della reazione cutanea all'esposizione di provocazione vengono confrontate con la reazione sviluppata dagli animali di controllo trattati con un placebo nella fase di induzione e sottoposti all'esposizione di provocazione.

1.5. DESCRIZIONE DEI METODI DI SAGGIO Se lo si ritiene necessario, si procederà alla rimozione della sostanza da saggiare utilizzando acqua o un solvente appropriato, in modo da non alterare la reazione in corso, né intaccare l'integrità dell'epidermide.

1.5.

1.5.1. Guinea-Pig Maximistlion Test (GMPT)

1.5.1.

1.5.1.1. Preparazioni Porcellini d'India albini, giovani e sani, vengono acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno 5 giorni prima dell'inizio del saggio. Prima dell'esperimento, gli animali vengono suddivisi in modo casuale ed assegnati al gruppo da trattare o al gruppo di controllo. In funzione del metodo di saggio utilizzato, il pelo verrà tagliato, rasato o rimosso con una sostanza depilatoria, avendo cura di non danneggiare la cute. Gli animali vengono pesati all'inizio e alla fine del saggio.

1.5.1.2. Condizioni sperimentali

1.5.1.2.

1.5.1.2.1. Animali da esperimento Si utilizzano porcellini d'India albini di ceppi comunemente usati in laboratorio.

1.5.1.2.2. Numero e sesso Si utilizzano animali di sesso maschile e/o femminile. Le femmine dovranno essere nullipare e non gravide. Il gruppo sottoposto a trattamento deve essere composto da almeno 10 animali, il gruppo di controllo da un minimo di 5. Qualora il primo gruppo comprenda meno di 20 esemplari ed il secondo meno di 10 e non sia possibile concludere che la sostanza in esame è un sensibilizzante, si consiglia di proseguire lo studio fino a disporre di almeno 20 animali trattati e 10 di controllo.

1.5.1.2.3. Livelli di dosaggio La concentrazione della sostanza in esame utilizzata per ogni esposizione di induzione deve essere ben tollerata a livello sistemico e corrispondere alla dose massima suscettibile di produrre un'irritazione cutanea di grado leggero-medio. La concentrazione utilizzata per l'esposizione di provocazione deve corrispondere alla dose massima che non cagioni irritazione. Se necessario, la concentrazione appropriata può essere determinata con uno studio pilota condotto su due o tre animali. A questo scopo è preferibile utilizzare animali trattati con l'adiuvante completo di Freund.

1.5.1.3. Procedimento

1.5.1.3.

1.5.1.3.1. Induzione Giorno 0 — gruppo trattato Nella regione della spalla, debitamente depilata, si praticano tre serie di due iniezioni intradermiche da 0,1 ml ciascuna. Le due iniezioni di ciascuna serie devono essere praticate l'una a sinistra e l'altra a destra della linea mediana. Iniezione 1: miscela 1:1 (v/v) ACF/acqua o soluzione salina fisiologica Iniezione 2: la sostanza in esame in un veicolo adatto alla concentrazione selezionata Iniezione 3: la sostanza in esame alla concentrazione desiderata, formulata in una miscela 1:1 (v/v) ACF/acqua o soluzione salina fisiologica. Nell'iniezione 3, le sostanze idrosolubili vengono disciolte nella fase acquosa prima di essere miscelate con l'ACF. Le sostanze liposolubili o insolubili vengono messe in sospensione nell'ACF prima di essere combinate con la fase acquosa. La concentrazione finale della sostanza in esame deve essere uguale a quella utilizzata nell'iniezione 2. Le iniezioni 1 e 2 vengono praticate l'una accanto all'altra e quanto più possibile in prossimità della testa, mentre la 3 è praticata verso la parte caudale della zone d'esame. Giorno 0 — gruppo di controllo Tre serie di due iniezioni intradermiche, ciascuna del volume di 0,1 ml, sono praticate negli stessi punti scelti per gli animali trattati. Iniezione 1: miscela 1:1 (v/v) ACF/acqua o soluzione salina fisiologica Iniezione 2: il veicolo non diluito Iniezione 3: formulazione 50 % p/v del veicolo in una miscela 1:1 (v/v) ACF/acqua o soluzione salina fisiologica. Giorno 5-7 — gruppo trattato e gruppo di controllo Circa 24 ore prima dell'applicazione topica di induzione, se la sostanza non è un irritante cutaneo, l'area di prova, debitamente tosata e/o rasata, viene trattata con 0,5 ml di laurilsoliato di sodio al 10 % in vaselina, al fine di provocare un'irritazione locale. Giorno 6-8 — gruppo trattato L'area di prova viene nuovamente depilata. Una carta da filtro (2 × 4 cm), impregnata della sostanza in esame incorporata in un veicolo adatto, viene applicata sull'area di prova e tenuta in contatto con la cute per 48 ore mediante una medicazione occlusiva. La scelta del veicolo deve essere motivata. Le sostanze solide vengono ridotte in polvere e incorporate in un veicolo adatto. I liquidi, se del caso, possono essere applicati direttamente. Giorno 6-8 — gruppo di controllo L'area di prova viene nuovamente depilata. Il solo veicolo viene applicato con le stesse modalità sull'area di prova e tenuto a contatto per 48 ore mediante una medicazione occlusiva.

1.5.1.3.2. Provocazione (challenge) Giorno 20-22 — gruppo trattato e gruppo di controllo Si rimuove il pelo dai fianchi degli animali trattati e degli animali di controllo. Su un fianco si applica una garza o una compressa impregnata della sostanza in esame e, se opportuno, sull'altro si applica una garza o una compressa impregnata del solo veicolo. Le compresse vengono tenute a contatto con la cute per 24 ore mediante una medicazione occlusiva.

1.5.1.3.3. Osservazione e valutazione: gruppo trattato e gruppo di controllo È consigliabile procedere ad una lettura cieca nei due gruppi di animali. Qualora sia necessario chiarire i risultati ottenuti nel primo challenge, una seconda esposizione di provocazione, ove del caso con un nuovo gruppo di controllo, potrà essere effettuata a circa una settimana di distanza dalla prima. Il nuovo challenge potrà essere realizzato anche sul gruppo di controllo iniziale. Tutte le reazioni cutanee e qualsiasi risultato insolito, comprese le reazioni sistemiche, derivanti dall'esposizione di induzione e di provocazione, dovranno essere osservate e classificate in base alla scala di valutazione di Magnusson/Kligman (vedi appendice). Per chiarire eventuali reazioni dubbie si potrà far ricorso ad altre tecniche, quali l'esame istopatologico o la misurazione dello spessore delle pieghe cutanee.

circa 21 ore dopo la rimozione della compressa, la zona sottoposta a challenge viene pulita e tosata e/o rasata e depilata, se necessario;

circa 3 ore più tardi (approssimativamente 48 ore dall'inizio dell'applicazione di provocazione) la reazione cutanea viene esaminata e classificata in base alla scala di valutazione riportata in appendice;

circa 24 ore dopo detto esame si procede a una seconda osservazione (72 ore) e a una nuova classificazione delle reazioni cutanee.

1.5.2. Saggio di Buehler

1.5.2.

1.5.2.1. Preparazioni Porcellini d'India albini, giovani e sani, vengono acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno 5 giorni prima dell'inizio del saggio. Prima dell'esperimento, gli animali vengono suddivisi in modo casuale ed assegnati al gruppo da trattare o al gruppo di controllo. In funzione del metodo di saggio utilizzato, il pelo verrà tagliato, rasato o rimosso con una sostanza depilatoria, avendo cura di non danneggiare la cute. Gli animali vengono pesati all' inizio e alla fine del saggio.

1.5.2.2. Condizioni sperimentali

1.5.2.2.

1.5.2.2.1. Animali da esperimento Si utilizzano porcellini d'India albini di ceppi comunemente usati in laboratorio.

1.5.2.2.2. Numero e sesso Si utilizzano animali di sesso maschile e/o femminile. Le femmine dovranno essere nullipare e non gravide. Il gruppo sottoposto a trattamento deve essere composto da almeno 20 animali, il gruppo di controllo da un minimo di 10.

1.5.2.2.3. Livelli di dosaggio La concentrazione della sostanza in esame utilizzata per ogni esposizione di induzione deve corrispondere alla dose massima suscettibile di produrre un'irritazione cutanea moderata e non eccessiva. La concentrazione utilizzata per l'esposizione di provocazione deve corrispondere alla dose massima che non cagioni irritazione. Se necessario, la concentrazione appropriata può essere determinata con uno studio pilota condotto su due o tre animali. Nel caso di sostanze idrosolubili, l'acqua o una soluzione diluita non irritante di surfactante rappresentano il veicolo più appropriato. Per le altre sostanze si preferiranno una miscela di etanolo all'80 % ed acqua per la fase di induzione e dell'acetone per la fase di provocazione.

1.5.2.3. Procedimento

1.5.2.3.

1.5.2.3.1. Induzione Giorno 0 — gruppo trattato Gli animali vengono tosati su un fianco. La compressa utilizzata per il saggio viene impregnata della sostanza in esame incorporata in un veicolo idoneo (la scelta del veicolo deve essere motivata; se del caso, le sostanze liquide possono essere applicate non diluite). La compressa viene applicata sull'area di prova e tenuta a contatto con la pelle per sei ore mediante un cerotto occlusivo e una fasciatura adeguata. La medicazione deve essere occlusiva. Si potrà ricorrere a un tampone d'ovatta, rotondo o quadrato e di circa 4-6 cm2. Per garantire l'occlusione, è opportuno limitare la libertà di movimento degli animali con un sistema adeguato. Se si utilizza una fasciatura, possono essere necessarie esposizioni supplementari. Giorno 0 — gruppo di controllo Gli animali vengono tosati su un fianco. Il solo veicolo viene applicato con modalità analoghe a quelle utilizzate per il gruppo trattato. La compressa viene tenuta a contatto con la pelle per sei ore mediante un cerotto occlusivo e una fasciatura adeguata. Se si dimostra che non è necessario disporre di un gruppo di controllo cui sia stato somministrato un placebo, si potrà utilizzare un gruppo di controllo non sottoposto a tale trattamento. Giorni 6-8 e 13-15 — gruppo trattato e gruppo di controllo Si esegue la stessa applicazione del giorno 0 sulla medesima area di prova (rasata, se necessario) sulla stesso fianco il giorno 6-8 e nuovamente il giorno 13-15.

1.5.2.3.2. Provocazione (challenge) Giorno 27-29 — gruppo trattato e gruppo di controllo Il fianco non trattato degli animali trattati e degli animali di controllo viene tosato. Si procede quindi all'applicazione di un cerotto occlusivo o di una compressa contenente un'adeguata quantità della sostanza in esame, alla massima concentrazione non irritante, sulla parte posteriore del fianco non trattato in entrambi i gruppi di animali. Se necessario, si applica inoltre un cerotto occlusivo o una compressa contenente il solo veicolo sulla parte anteriore del fianco non trattato di entrambi i gruppi di animali. Il cerotto o la compressa vengono tenuti a contatto con la pelle per 6 ore mediante un'adeguata medicazione.

1.5.2.3.3. Osservazione e valutazione È consigliabile procedere ad una lettura cieca nei due gruppi di animali. Qualora sia necessario chiarire ulteriormente i risultati ottenuti nel primo challenge, una seconda esposizione di provocazione, ove del caso con un nuovo gruppo di controllo, potrà essere effettuata a circa una settimana di distanza dalla prima. Il nuovo challenge potrà essere realizzato anche sul gruppo di controllo iniziale. Tutte le reazioni cutanee e qualsiasi risultato insolito, comprese le reazioni sistemiche, derivanti dall'esposizione di induzione e di provocazione, dovranno essere osservate e classificate in base alla scala di valutazione di Magnusson/Kligman (vedi appendice). Per chiarire eventuali reazioni dubbie si potrà far ricorso ad altre tecniche, quali l'esame istopatologico o la misurazione dello spessore delle pieghe cutanee.

Circa 21 ore dopo la rimozione del cerotto, la zona sottoposta a challenge viene depilata;

circa tre ore più tardi (approssimativamente 30 ore dopo l'applicazione di provocazione) le reazioni cutanee vengono esaminate e classificate in base alla scala di valutazione riportata in appendice;

circa 24 ore dopo detto esame (approssimativamente 54 ore dopo l'applicazione di provocazione) si procede a una seconda osservazione e a una nuova classificazione delle reazioni cutanee.

2. DATI (GPMT E SAGGIO DI BUEHLER) I dati saranno riassunti in forma tabulare, indicando, per ogni animale, le reazioni cutanee rilevate nel corso di ogni osservazione.

3. RELAZIONE (GPMT E SAGGIO DI BUEHLER) Se il saggio sul porcellino d'India è preceduto da una prova preliminare, si avrà cura di fornirne la descrizione o il riferimento [per es. Local Lymph Node Assay (LLNA), Mouse Ear Swelling Test (MEST)], compreso il procedimento particolareggiato, insieme ai risultati ottenuti con le sostanze da saggiare e le sostanze di riferimento.

3. Relazione sul saggio (GPMT E SAGGIO DI BUEHLER)

La relazione sul saggio deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

Animali da esperimento

ceppo di porcellino d'India utilizzato;

numero, età e sesso degli animali;

origine, condizioni di alloggiamento, dieta, ecc;

peso di ogni singola cavia all'inizio dell'esperimento.

Condizioni sperimentali:

tecnica di preparazione dell'area di applicazione della compressa;

materiali utilizzati e tecnica di preparazione e di applicazione della compressa;

risultato dello studio pilota e conclusioni relative alle concentrazioni di induzione e di provocazione da utilizzare nel saggio;

modalità di preparazione, applicazione e rimozione della sostanza in esame;

motivazione della scelta del veicolo;

concentratzioni del veicolo e della sostanza utilizzate per le esposizioni di induzione e di provocazione, nonché quantità totale di sostanza applicata per l'induzione e la provocazione.

Risultati:

un riepilogo dei risultati dell'ultimo controllo di sensibilità e attendibilità (vedi 1.3), comprese le informazioni sulla sostanza, la concentrazione e il veicolo utilizzato;

tutte le osservazioni effettuate su ogni singolo animale, compreso il sistema di classificazione;

la descrizione della natura e dell'entità degli effetti osservati;

tutti i reperti dell'esame istopatologico.

Discussione dei risultati.

Conclusioni.

4. RIFERIMENTI Il presente metodo corrisponde al metodo OCSE TG 406.

B.7 TOSSICITÀ A DOSE RIPETUTA (28 GIORNI) PER VIA ORALE

B.7

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

1.2. DEFINIZIONI Vedi introduzione generale, parte B.

1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO La sostanza in esame viene somministrata in dosi giornaliere graduate ad alcuni gruppi di animali da esperimento, un livello di dose per gruppo, per un periodo di 28 giorni. Durante il periodo di somministrazione gli animali vengono giornalmente esaminati al fine di rilevare eventuali segni di tossicità. Gli animali deceduti o soppressi durante l'esperimento vengono sottoposti a necroscopia. Al termine del saggio gli animali superstiti vengono soppressi e sottoposti a necroscopia. Il presente metodo attribuisce particolare importanza agli effetti neurologici in quanto parametro specifico di valutazione e comporta la necessità di un'accurata osservazione clinica degli animali per ottenere il maggior numero possibile di informazioni. Tale metodo è finalizzato all'individuazione di sostanze chimiche dotate di un potenziale neurotossico, che potranno successivamente richiedere indagini più approfondite al riguardo. Esso può inoltre fornire indicazioni sugli effetti immunologici e sulla tossicità per l'apparato riproduttivo.

1.4. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.4.

1.4.1. Preparazioni Animali adulti, giovani e sani, vengono suddivisi in modo casuale e assegnati a gruppi da trattare e a gruppi di controllo. Le gabbie dovranno essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. Gli animali vengono identificati individualmente e tenuti nelle loro gabbie per un periodo di almeno 5 giorni prima dell'inizio del saggio, in modo da potersi acclimatare alle condizioni di laboratorio. La sostanza in esame viene somministrata a mezzo di sonda gastrica, con gli alimenti e con l'acqua. La modalità di somministrazione orale viene scelta in funzione della finalità dello studio e delle proprietà fisico-chimiche della sostanza. Se necessario, la sostanza in esame viene disciolta o messa in sospensione in un veicolo adeguato. Ove possibile, si preferirà una soluzione/sospensione acquosa, o, come seconda alternativa, una soluzione/emulsione in olio (per esempio olio di mais), o ancora, infine, una soluzione in altri veicoli. Per i veicoli non acquosi, dovranno esserne note le caratteristiche di tossicità. È opportuno determinare la stabilità della sostanza in esame nel veicolo.

1.4.2. Condizioni sperimentali

1.4.2.

1.4.2.1. Animali da esperimento Il ratto è la specie d'elezione, ma sono ammesse anche altre specie di roditori. Si utilizzeranno animali adulti, giovani e sani, di ceppi comunemente usati in laboratorio. Le femmine dovranno essere nullipare e non gravide. La somministrazione dovrà iniziare prima possibile al termine dello svezzamento, e comunque non oltre la nona settimana di vita. All'inizio dello studio, la variazione di peso degli animali dovrà essere minima e non essere superiore al ± 20 per cento del peso medio per ogni sesso. Qualora, prima di uno studio a lungo termine, si effettui uno studio preliminare con somministrazione orale ripetuta, si utilizzeranno di preferenza in entrambi ammali provenienti dallo stesso ceppo e aventi la medesima origine.

1.4.2.2. Numero e sesso Per ciascun livello di dosaggio dovranno essere utilizzati almeno 10 animali (cinque femmine e 5 maschi). Se il protocollo sperimentale prevede la soppressione di animali nel corso dello studio, il numero totale dovrà essere aumentato in ragione del numero di animali che si prevede di sacrificare. Inoltre, un gruppo satellite di 10 animali (cinque per sesso) potrà essere trattato alla dose massima per 28 giorni e tenuto in osservazione nei 14 giorni successivi al fine di valutare la reversibilità, la persistenza o la comparsa tardiva di effetti tossici. È altresi previsto l'utilizzo di un gruppo satellite di 10 animali di controllo (cinque animali per sesso).

1.4.2.3. Livelli di dosaggio Si utilizzano generalmente almeno tre gruppi da trattare e un gruppo di controllo. Quest'ultimo, fatta eccezione per la somministrazione della sostanza in esame, dovrà essere trattato in modo identico ai gruppi sottoposti a trattamento. Qualora la sostanza da saggiare venga incorporata in un veicolo, al gruppo di controllo verrà somministrato il medesimo veicolo nel volume massimo utilizzato. Se, in base alla valutazione di altri dati, sussistono motivi per ritenere che un dosaggio di 1000 mg/kg pc/d non dovrebbe produrre effetti, è possibile eseguire un saggio limite. In mancanza di dati al riguardo, potrà essere effettuato uno studio finalizzato alla determinazione di un range entro il quale selezionare le dosi da somministrare. I livelli di dosaggio dovranno essere selezionati tenendo conto di tutti i dati esistenti sulla tossicità e le caratteristiche (tossico-)cinetiche della sostanza da saggiare o di sostanze affini. Il livello massimo di dosaggio dovrà essere tale da indurre effetti tossici senza tuttavia cagionare la morte o sofferenze gravi. Sarà inoltre definita una serie decrescente di dosaggi al fine di individuare eventuali risposte a dosi determinate e dimostrare l'assenza di effetti avversi al dosaggio minimo (NOAEL, no-observed-adverse effects). Per la determinazione dei livelli decrescenti di dosaggio risulta spesso ottimale applicare un fattore di divisione compreso tra due e quattro; è comunque preferibile aggiungere un quarto gruppo di studio piuttosto che avere uno scarto eccessivo (superiore ad un fattore 10) tra una dose e l'altra. Se la sostanza è somministrata con gli alimenti o con l'acqua, è importante verificare che le quantità di sostanza necessarie non alterino il bilancio idrico o nutrizionale. Se la sostanza in esame è somministrata con la dieta, si può utilizzare sia una concentrazione dietetica (ppm), sia un livello di dosaggio costante in funzione del peso degli animali, avendo cura di specificare quale sia l'alternativa prescelta. Se la sostanza è somministrata tramite sonda gastrica, la dose deve essere somministrata ogni giorno alla stessa ora e modificata in modo da mantenere un dosaggio costante in funzione del peso dell'animale. Qualora, prima di uno studio a lungo termine, si effettui uno studio preliminare con somministrazione orale ripetuta, la dieta degli animali dovrà essere identica in entrambi.

1.4.2.4. Saggio limite Qualora un saggio, effettuato in conformità con il metodo descritto, con un livello di dosaggio di almeno 1000 mg/kg di peso corporeo/giorno o, in caso di somministrazione con gli alimenti o l'acqua, ad una concentrazione equivalente (in funzione del peso corporeo), non produca effetti tossici evidenti e se i dati relativi a sostanze di struttura affine non sono suggestivi di tossicità, può non essere necessario eseguire uno studio completo utilizzando tre dosaggi. Il saggio limite è giustificato, salvo nel caso in cui l'esposizione umana comporti la necessità di utilizzare un più elevato livello di dosaggio.

1.4.2.5. Periodo di osservazione Il periodo di osservazione ha una durata di 28 giorni. Gli animali del gruppo satellite selezionati per effettuare ulteriori osservazioni dovranno essere esaminati per almeno altri 14 giorni senza alcun trattamento al fine di individuare l'insorgenza, la persistenza o la scomparsa tardiva degli effetti tossici.

1.4.3. Procedimento La sostanza in esame viene somministrata agli animali giornalmente, sette giorni su sette, per un periodo di 28 giorni. La scelta di somministrare la sostanza cinque giorni alla settimana deve essere opportunamente motivata. Se effettuata mediante intubazione, la somministrazione avverrà in una singola dose mediante sonda gastrica o apposita cannula. Il volume massimo di liquido somministrabile in una sola volta dipende dalla taglia dell'animale. Esso non dovrebbe superare 1 ml/100 g di peso corporeo, eccetto nel caso di soluzioni acquose, dove sono ammessi 2 ml/100 g di peso corporeo. Salvo nel caso di sostanze irritanti o corrosive, suscettibili di produrre effetti esacerbati a concentrazioni più elevate, la variabilità del volume di saggio dovrà essere ridotta al minimo ritoccando la concentrazione, in modo da mantenere un volume costante per qualsiasi livello di dosaggio.

1.4.3.

1.4.3.1. Osservazioni generali Osservazioni cliniche generali devono essere effettuate almeno una volta al giorno, preferibilmente alla stessa ora e tenendo conto del periodo probabile di massima intensità degli effetti dopo la somministrazione. Si registreranno informazioni concernenti le condizioni di salute degli animali. Almeno due volte al giorno, tutti gli animali vengono esaminati al fine di determinare la morbilità e la mortalità. Gli animali moribondi o recanti segni di grave sofferenza o dolore saranno immediatamente esclusi dallo studio, sottoposti ad eutanasia e a necroscopia. Prima dell’esposizione iniziale (per consentire un confronto sullo stesso soggetto) e almeno una volta alla settimana successivamente tutti gli animali vengono sottoposti ad osservazioni cliniche particolareggiate. A tale scopo gli animali vengono tolti dalle gabbie, collocati in un recinto standard ed esaminati di preferenza sempre alla stessa ora. Le osservazioni vengono accuratamente registrate, possibilmente utilizzando sistemi di punteggio esplicitamente definiti dal laboratorio che esegue il saggio. Si avrà cura di ridurre al minimo le variazioni delle condizioni sperimentali e le osservazioni saranno condotte di preferenza da persone che non siano al corrente del trattamento. Si terrà conto, tra l'altro, di tutte le alterazioni della cute, del pelo, degli occhi, delle membrane mucose, della comparsa di secrezioni ed escrezioni e dell'attività del sistema nervoso autonomo (per es. lacrimazione, piloerezione, ampiezza pupillare, ritmo respiratorio insolito). Verranno inoltre registrate le modifiche osservate nel comportamento, nella postura e nella risposta alla manipolazione, come pure la presenza di movimenti clonici o tonici, stereotipi (per es. tolettatura eccessiva, continuo girare in tondo) o comportamenti insoliti (per es. automutilazione, marcia a ritroso). Nella quarta settimana di esposizione si procede alla valutazione della reattività sensoriale a diversi tipi di stimolo (p. es. uditivi, visivi e propriocettivi), della forza di prensione e dell'attività motoria. Ulteriori dettagli sui metodi utilizzabili sono riportati in letteratura (vedi introduzione generale, parte B). Le osservazioni funzionali previste per la quarta settimana di esposizione possono essere evitate nel caso di uno studio preliminare ad un successivo studio subcronico (90 giorni). In questa eventualità, le osservazioni funzionali saranno incluse nello studio complementare. D'altro canto, le informazioni ricavate possono essere utili nella determinazione dei livelli di dosaggio per un successivo studio subcronico. In via eccezionale, le osservazioni funzionali potranno essere evitate anche per i gruppi che presentino segni di tossicità suscettibili di interferire in modo significativo con i risultati delle prove funzionali.

1.4.3.2. Peso corporeo e consumo di cibo e di acqua Tutti gli animali devono essere pesati almeno una volta alla settimana. Il consumo di cibo e di acqua viene determinato con scadenza almeno settimanale. Se la sostanza in esame viene somministrata con l'acqua, anche il consumo di acqua deve essere misurato almeno una volta alla settimana.

1.4.3.3. Ematologia Al termine del periodo di prova si effettueranno i seguenti controlli ematologici: ematocrito, concentrazione dell'emoglobina, conteggio degli eritrociti, conteggio dei leucociti totali e formula leucocitaria, conteggio delle piastrine e determinazione del tempo/potenziale di coagulazione. I campioni di sangue devono essere prelevati in un sito determinato immediatamente prima o durante la soppressione degli animali e conservati in condizioni adeguate.

1.4.3.4. Biochimica clinica Esami biochimico-clinici finalizzati allo studio dei principali effetti tossici sui tessuti ed in particolare sui reni e sul fegato dovranno essere effettuati sui campioni di sangue prelevati da tutti gli animali immediatamente prima o durante la loro soppressione (eccetto gli animali trovati moribondi e/o soppressi nel corso del saggio). È preferibile che gli animali vengano tenuti a digiuno dalla sera precedente il prelievo di sangue. Le analisi sul plasma o sul siero comprenderanno il sodio, il potassio, il glucosio, il colesterolo totale, l'urea, la creatinina, le proteine totali e l'albumina, almeno due enzimi indicatori degli effetti epatocellulari (come l'alanina aminotransferasi, l'aspartato aminotransferasi, la fosfatasi alcalina, la gamma-glutamil transpeptidasi e la sorbitol deidrogenasi). Determinazioni di altri enzimi (di origine epatica o altro) e degli acidi biliari possono talvolta fornire indicazioni utili. I seguenti esami delle urine possono essere facoltativamente effettuati nell'ultima settimana dello studio utilizzando un volume d'urina raccolto ad orari fissi: aspetto, volume, osmolalità o densità relativa, pH, albumina, glucosio e sangue-eritrociti. Sono inoltre raccomandati studi sui marker serici delle lesioni tissutali generali. Altre determinazioni dovranno essere eseguite qualora si abbia motivo di ritenere o di sospettare che le proprietà della sostanza in esame possano alterare i profili metabolici riguardanti il calcio, il fosfato, i trigliceridi a digiuno, gli ormoni specifici, la metemoglobina e la colinesterasi. Tali parametri dovranno essere determinati per certe classi di sostanze o determinati composti specifici. Nel complesso è opportuno adottare un approccio flessibile, che tenga conto della specie utilizzata e degli effetti osservati e/o previsti della sostanza in esame. Se i dati storici di base risultano inadeguati, è opportuno determinare i parametri ematologici e biochimico-chimici prima dell'inizio del saggio.

1.4.3.5. Necroscopia macroscopica Tutti gli animali dello studio dovranno essere sottoposti ad una necroscopia completa, comprendente un accurato esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi, della cavità cranica, toracica e addominale e del loro contenuto. Il fegato, i reni, le ghiandole surrenali, i testicoli, gli epididimi, il timo, la milza, il cervello e il cuore di tutti gli animali saranno opportunamente sezionati e pesati quanto più rapidamente possibile onde evitarne la disidratazione. I seguenti tessuti dovranno essere conservati nel mezzo di fissazione più adeguato in funzione del tipo di tessuto e degli esami istopatologici previsti: tutti i tessuti recanti lesioni macroscopiche, encefalo (le regioni rappresentative comprendono cervello, cervelletto e ponte), midollo spinale, stomaco, intestino tenue e crasso (comprese le placche di Peyer), fegato, reni, ghiandole surrenali, milza, cuore, timo, tiroide, trachea e polmoni (conservati con insufflazione di un fissativo e successiva immersione), gonadi, organi genitali accessori (per es. utero, prostata), vescica, linfonodi (preferibilmente un linfonodo sulla via di somministrazione e un linfonodo distante da essa, in modo da coprire gli effetti sistemici), nervi periferici (nervo sciatico o nervo tibiale), possibilmente in stretta prossimità del muscolo, e una sezione del midollo osseo (o, in alternativa, un preparato fresco di midollo osseo aspirato). In base all'esito dell'esame clinico e ad altri risultati può risultare opportuno esaminare altri tessuti. Dovranno inoltre essere conservati tutti gli organi ritenuti organi bersaglio potenziali in funzione delle proprietà note della sostanza in esame.

1.4.3.6. Esame istopatologico Un esame istopatologico completo sarà effettuato sugli organi e i tessuti conservati di tutti gli animali del gruppo di controllo e del gruppo trattato con dosaggio elevato. Detto esame sarà esteso agli animali degli altri gruppi di dosaggio qualora nel gruppo a dosaggio elevato vengano osservate alterazioni indotte dalla sostanza. Si procederà all'esame di tutte le lesioni macroscopiche. Nel caso si utilizzi un gruppo satellite, un esame istopatologico dovrà essere eseguito sui tessuti e gli organi per i quali siano stati osservati effetti nei gruppi trattati.

2. DATI Dovranno essere forniti i dati individuali di ciascun animale. Inoltre, tutti i dati dovranno essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo, il numero di animali all'inizio del saggio, il numero di animali rinvenuti morti durante il saggio o sottoposti ad eutanasia nonché il momento del decesso o della soppressione di ciascun animale, il numero di animali recanti segni di tossicità, una descrizione degli effetti tossici con indicazione del momento della comparsa, della durata e della gravità di detti effetti, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesione e la percentuale di animali per ogni tipo di lesione. Se possibile, i risultati numerici devono essere valutati sulla base di un metodo statistico adeguato e generalmente riconosciuto. I metodi statistici devono essere selezionati durante la fase di progettazione dello studio.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO La relazione sul saggio deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

Animali da esperimento:

specie/ceppo utilizzati;

numero, età e sesso degli animali;

origine, condizioni di alloggiamento, dieta ecc;

peso di ciascun animale determinato all'inizio del saggio, con cadenza settimanale nel periodo successivo e al termine del saggio.

Condizioni sperimentali:

motivazione della scelta del veicolo utilizzato, se diverso dall'acqua;

motivazione della scelta del livello di dosaggio;

informazioni dettagliate sulla formulazione della sostanza e sulla preparazione della dieta, concentrazione ottenuta, stabilità e omogeneità della preparazione;

modalità precise di somministrazione della sostanza in esame;

se del caso, conversione della concentrazione della sostanza somministrata con gli alimenti o con l'acqua (ppm) in dose effettiva (mg/kg di peso corporeo/giorno);

informazioni dettagliate sulla qualità del cibo e dell'acqua.

Risultati:

peso corporeo/modificazioni del peso corporeo;

consumo di cibo e, se del caso, consumo di acqua;

dati concernenti la risposta tossica per sesso e per dose, compresi i segni di tossicità;

natura, gravità e durata degli effetti clinici osservati (ed eventuale reversibilità);

valutazione dell'attività sensoriale, della forza di prensione e dell'attività motoria;

esami ematologici e relativi valori di riferimento;

esami biochimico-clinici e relativi valori di riferimento;

peso corporeo al momento della soppressione degli animali e peso degli organi;

esito dell'esame necroscopico;

una descrizione particolareggiata di tutti i reperti istopatologici;

dati relativi all'assorbimento, se disponibili;

ove del caso, elaborazione statistica dei risultati.

Discussione dei risultati.

Conclusioni.

4. RIFERIMENTI Il presente metodo corrisponde al metodo OCSE TG 407.

B.8. TOSSICITÀ A DOSE RIPETUTA (28 GIORNI) PER INALAZIONE

B.8.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE È utile avere informazioni preliminari sulla distribuzione delle dimensioni delle particelle, la tensione di vapore, il punto di fusione, il punto di ebollizione, il punto di infiammabilità e la esplosività (se del caso) della sostanza. Vedi anche introduzione generale, parte B (punto A).

1.2. DEFINIZIONI Vedi introduzione generale, parte B (punto B).

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO Diversi gruppi di animali da esperimento sono esposti quotidianamente per un periodo determinato a concentrazioni graduate della sostanza in esame; si utilizza una concentrazione per gruppo, somministrata per 28 giorni. Se si fa uso di un veicolo per ottenere una concentrazione appropriata della sostanza in esame nell'atmosfera, si dovrà prevedere anche un gruppo di animali di controllo trattati con il veicolo. Durante il periodo di trattamento, gli animali vengono esaminati quotidianamente per rilevare i sintomi di tossicità. Gli animali che muoiono durante il saggio e quelli che sopravvivono sono sottoposti a necroscopia alla fine del saggio.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ Nessuno.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.6.

1.6.1. Preparazioni Per almeno 5 giorni prima dell'esperimento gli animali sono mantenuti nelle stesse condizioni di stabulazione e di alimentazione dell'esperimento. Prima del saggio, gli animali, che dovranno essere giovani e sani, sono scelti con metodo casuale e assegnati ai vari gruppi previsti. Se necessario, alla sostanza in esame può essere aggiunto un veicolo idoneo per facilitare la generazione di una concentrazione appropriata della sostanza in esame nell'atmosfera. Se per facilitare il dosaggio si utilizza un veicolo o altri additivi, questi dovranno non produrre effetti tossici. Se appropriato, possono essere utilizzati i dati storici.

1.6.2. Condizioni per il saggio

1.6.2.

1.6.2.1. Animali da esperimento Salvo controindicazione, il ratto è la specie d'elezione. Si dovranno utilizzare animali giovani e sani da ceppi di laboratorio comunemente usati. All'inizio dello studio, l'intervallo di variazione ponderale degli animali usati non dovrebbe superare ± 20 % del valore medio.

1.6.2.2. Numero e sesso Per ogni gruppo in esame dovranno essere utilizzati almeno 10 animali (5 di sesso maschile e 5 di sesso femminile). Le femmine dovrebbero essere nullipare e non gravide. Ove siano programmati sacrifici intermedi, il numero degli animali dovrà essere aumentato per includere quello degli animali da sacrificare prima del termine della prova. Inoltre, un gruppo satellite di 10 animali (5 animali per sesso) può essere sottoposto al trattamento con il livello superiore di dosaggio per 28 giorni ed esaminato, nei seguenti 14 giorni, per quanto riguarda la reversibilità o la persistenza o l'insorgenza ritardata degli effetti tossici. Inoltre si userà, in tale caso, un gruppo satellite pure di 10 animali di controllo (5 animali per sesso).

1.6.2.3. Concentrazioni di esposizione Sono richieste almeno tre concentrazioni con un controllo, oppure, se viene utilizzato un veicolo, un controllo del veicolo (corrispondente alla massima concentrazione del veicolo). Gli animali del gruppo di controllo dovranno essere trattati in modo identico agli animali dei gruppi trattati, ad eccezione del trattamento con la sostanza in esame. La massima concentrazione dovrebbe produrre effetti tossici, ma senza causare mortalità, o almeno causando una mortalità molto bassa. La concentrazione più bassa non dovrebbe causare alcun sintomo di tossicità. Nei casi in cui sia possibile stimare l'esposizione umana prevista, il livello di dosaggio più basso dovrebbe superare questo livello. Dal punto di vista ottimale la concentrazione intermedia dovrebbe produrre effetti tossici minimi. Nel caso in cui siano utilizzate più concentrazioni intermedie, queste dovrebbero essere intervallate in modo tale da produrre una graduazione di effetti tossici. Nei gruppi esposti alle concentrazioni bassa e intermedia e nei controlli, l'incidenza dei decessi dovrebbe essere bassa al fine di consentire una valutazione significativa dei risultati.

1.6.2.4. Tempo di esposizione La durata dell'esposizione giornaliera dovrà essere di 6 ore. Tuttavia, per esigenze specifiche, si possono utilizzare esposizioni di diversa durata.

1.6.2.5. Apparecchiature Gli animali dovranno essere esposti al composto in dispositivi per l'inalazione appositamente progettati per consentire un flusso dinamico dell'aria di almeno 12 ricambi l'ora per garantire un adeguato contenuto di ossigeno e un'atmosfera uniformemente distribuita. Qualora sia usata una camera, essa deve essere progettata in modo da minimizzare l'affollamento degli animali da esperimento e al tempo stesso rendere massima l'esposizione mediante inalazione alla sostanza in esame. Come regola generale per garantire la stabilità dell'atmosfera della camera, il volume complessivo degli animali di saggio non dovrebbe superare il 5 % di quello della camera di saggio. Si può ricorrere ad una esposizione oro-nasale, della sola testa, oppure di tutto il corpo in camera individuale; le prime due modalità d'esposizione renderanno minima l'assunzione delle sostanze attraverso altre vie.

1.6.2.6. Periodo di osservazione Durante l'intero trattamento e il periodo di recupero, gli animali dovranno essere esaminati quotidianamente per rilevare i segni di tossicità. Il momento del decesso e il momento in cui si manifestano e scompaiono i sintomi di tossicità dovranno essere registrati.

1.6.3. Procedimento Gli animali vengono esposti giornalmente alla sostanza in esame per 5-7 giorni alla settimana per un periodo di 28 giorni. Gli animali di ogni gruppo satellite, previsto per proseguire le osservazioni, dovranno essere tenuti per altri 14 giorni, senza alcun trattamento, al fine di rilevare la scomparsa oppure la persistenza degli effetti tossici. L'esperimento dovrà essere effettuato ad una temperatura di 22 oC ± 3 oC. Dal punto di vista ottimale, l'umidità relativa dovrà essere mantenuta tra il 30 e il 70 % ma, in taluni casi (ad esempio prove di alcuni aerosol), ciò può non essere realizzabile. Mantenendo una leggera pressione negativa all'interno della camera (≤ 5 mm d'acqua) si impedirà il trafilamento della sostanza in esame nell'area circostante. Durante l'esposizione, la somministrazione di cibo e acqua dovrebbe essere sospesa. Dovrà essere realizzato un sistema dinamico d'inalazione con un adeguato sistema analitico di controllo della concentrazione. Si raccomanda di effettuare un esperimento di prova per stabilire le concentrazioni idonee di esposizione. La velocità di flusso dell'aria dovrà essere regolata in modo da rendere uniformi le condizioni nella camera di esposizione. Il sistema dovrebbe consentire di raggiungere al più presto possibile le condizioni d'esposizione stabili. Dovranno essere misurati o controllati: Durante e dopo l'esposizione si procede all'effettuazione e alla registrazione sistematica delle osservazioni; registri individuali dovranno essere mantenuti per ciascun animale. Tutti gli animali dovranno essere esaminati giornalmente e dovranno essere registrati i sintomi di tossicità, compresi il momento del loro insorgere, il loro grado e la loro durata. Le osservazioni effettuate dovrebbero comprendere le alterazioni della cute e del pelo, degli occhi, delle membrane mucose e dei sistemi respiratorio, circolatorio, nervoso autonomo e centrale, dell'attività somatomotoria e del comportamento dell'animale, La misura del peso degli animali dovrà essere effettuata ogni settimana. Si raccomanda, inoltre, che anche il consumo di alimento sia misurato ogni settimana. L'osservazione regolare degli animali è necessaria per minimizzare la perdita di animali da studiare causata da cannibalismo, autolisi dei tessuti o errata collocazione. Al termine dello studio, gli animali sopravvissuti, esclusi quelli del gruppo satellite, vengono sottoposti ad esame necroscopico. Gli animali moribondi e gli animali in stato di grave sofferenza o dolore dovrebbero essere rimossi appena notati, soppressi umanamente e sottoposti a necroscopia. Al termine del saggio tutti gli animali, compresi quelli di controllo, saranno sottoposti ai seguenti esami: Altre determinazioni che possono risultare necessarie per una adeguata valutazione tossicologica comprendono il calcio, il fosforo, il cloruro, il sodio, il potassio, il glucosio a digiuno, l'analisi dei lipidi, gli ormoni, l'equilibrio acido/base, la metaemoglobina, l'attività colinesterasica. Ove necessario, si possono effettuare altre analisi biochimico-cliniche per estendere l'indagine degli effetti osservati.

1.6.3.

(a) la velocità del flusso d'aria (in continuo);

(b) la concentrazione effettiva della sostanza in esame nella zona di respirazione. Durante il periodo giornaliero di esposizione, la concentrazione non dovrà variare oltre il ± 15 % del valore medio. Tuttavia, nel caso di alcuni aerosol, questo livello di controllo potrebbe non essere realizzabile, e sarebbe quindi accettabile un intervallo più ampio. Per tutta la durata dello studio, le concentrazioni dovranno essere mantenute per quanto possibile costanti da un giorno all'altro. Per gli aerosol, si dovrà eseguire almeno un'analisi delle dimensioni di particelle per gruppo di prova e per settimana.

ematologia, comprendente almeno l'ematocrito, la concentrazione di emoglobina, la conta degli eritrociti, la conta totale e differenziale dei leucociti e una misura del potenziale di coagulazione;

ii)

biochimica clinica del sangue, comprendente almeno un parametro della funzionalità epatica e renale nel siero: alanina aminotransferasi (prima conosciuta come glutammico-piruvico transaminasi), aspartato aminotransferasi (prima conosciuta come glutammico-ossalacetico transaminasi), azoto ureico, albumina, creatinina ematica, bilirubina totale e proteine seriche totali.

1.6.3.1. Necroscopia Tutti gli animali usati nello studio dovrebbero esser sottoposti a necroscopia completa. Per evitare la disidratazione, almeno il fegato, i reni, le ghiandole surrenali, i polmoni e i testicoli dovrebbero essere pesati a umido appena possibile dopo la dissezione. Organi e tessuti (il tratto respiratorio, fegato, reni, milza, testicoli, ghiandole surrenali, cuore e qualsiasi organo presentante lesioni macroscopiche o variazioni delle dimensioni) dovrebbero essere conservati in un materiale idoneo per un eventuale futuro esame istopatologico. I polmoni dovrebbero essere asportati intatti, pesati e trattati con un fissatore idoneo ad assicurare che la struttura dei polmoni venga mantenuta.

1.6.3.2. Esame istopatologico Gli organi e i tessuti degli animali del gruppo trattato con la concentrazione più elevata e del gruppo di controllo dovranno essere sottoposti ad esame istologico. Gli organi e i tessuti che presentano alterazioni attribuibili alla sostanza in esame, somministrata al più alto livello di dosaggio, dovranno essere esaminati in tutti i gruppi trattati con i dosaggi inferiori. Gli animali di ogni gruppo satellite dovranno essere sottoposti ad esame istologico, in particolare per gli organi e i tessuti che risultano colpiti da effetti tossici negli altri gruppi trattati.

2. DATI I risultati dovranno essere riassunti sotto forma tabellare indicante, per ogni gruppo trattato, il numero di animali all'inizio e il numero di animali che presentano ciascun tipo di lesione. Tutti i risultati osservati dovrebbero essere valutati secondo un adeguato metodo statistico. Può essere utilizzato qualsiasi metodo statistico riconosciuto.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

specie, ceppo, origine degli animali, condizioni ambientali, dieta, ecc.;

condizioni del saggio: Descrizione dell'apparecchiatura di esposizione, incluso il disegno, tipo, dimensioni, la fonte d'aria, il sistema per la formazione degli aerosol, il metodo di condizionamento dell'aria, il trattamento dell'aria di scarico e il metodo di stabulazione degli animali in una camera sperimentale, quando questa venga usata. Dovrebbe essere fornita una descrizione della strumentazione usata per misurare la temperatura, l'umidità e, se del caso, la stabilità delle concentrazioni di aerosol o la distribuzione delle dimensioni delle particelle. Dati relativi all'esposizione: Essi dovrebbero essere tabulati e presentati con valori medi e con una misura della variabilità (ad esempio deviazione standard) e dovrebbero includere:

3.1. pt_2 a)

velocità del flusso d'aria attraverso l'apparecchiatura di inalazione;

temperatura e umidità dell'aria;

concentrazioni nominali (quantitativo globale della sostanza in esame introdotta nel dispositivo di inalazione diviso per il volume dell'aria);

tipo di veicolo, se usato;

concentrazioni effettive nella zona di respirazione;

diametro aerodinamico mediano in massa (DAMM) e deviazione standard geometrica (DSG);

dati relativi agli effetti tossici per sesso e per concentrazione;

momento del decesso durante lo studio, o se gli animali sono sopravvissuti sino al suo termine;

descrizione di effetti tossici o altri effetti; livello senza effetti;

momento in cui è stato rilevato ciascun sintomo anormale e suo decorso;

dati relativi al consumo di alimento e al peso corporeo;

analisi ematologiche effettuate e loro risultati;

analisi biochimiche-cliniche effettuate e loro risultati;

risultati della necroscopia;

descrizione dettagliata di tutti i risultati istopatologici;

elaborazione statistica dei risultati, ove possibile;

discussione dei risultati;

interpretazione dei risultati.

3.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE Vedi introduzione generale, parte B (punto D).

4. BIBLIOGRAFIA Vedi introduzione generale, parte B (punto E)

B.9. TOSSICITÀ A DOSE RIPETUTA (28 GIORNI) PER VIA CUTANEA

B.9.

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Vedi introduzione generale, parte B (punto A).

1.2. DEFINIZIONI Vedi introduzione generale, parte B (punto B).

1.3. SOSTANZA DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO La sostanza in esame è applicata ogni giorno sulla pelle di alcuni gruppi di animali da esperimento, in dosi graduate, un livello di dose per gruppo, per un periodo di 28 giorni. Durante il periodo di applicazione, gli animali vengono osservati quotidianamente per rilevare i sintomi di tossicità. Si sottopongono a necroscopia gli animali morti durante la prova e al termine del saggio vengono sottoposti a necroscopia gli animali sopravvissuti.

1.5. CRITERI DI QUALITÀ Nessuno.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.6.

1.6.1. Preparazioni Per un periodo di almeno 5 giorni prima della prova gli animali sono mantenuti nelle stesse condizioni di stabulazione e di alimentazione del saggio. Prima del saggio gli animali, che dovranno essere giovani e sani, sono scelti con metodo casuale e assegnati ai gruppi previsti per il trattamento e per il controllo. Poco prima dell'esperimento si effettua il taglio del pelo nella parte dorsale del corpo degli animali. Si può procedere alla rasatura, ma essa dovrebbe essere effettuata circa 24 ore prima dell'esperimento. Di norma è necessario ripetere il taglio o la rasatura a intervalli di circa una settimana. Durante il taglio o la rasatura si dovrà badare a non ledere la cute dell'animale. Per l'applicazione della sostanza in esame, si dovrebbe preparare almeno il 10 % della superficie corporea. Nel determinare l'entità dell'area da preparare e le dimensioni della copertura è opportuno tenere presente il peso dell'animale. Le sostanze solide, che possono essere ridotte in polvere se appropriato, dovranno essere inumidite sufficientemente con acqua o, se necessario, con un veicolo adatto ad assicurare un buon contatto con la pelle. In generale le sostanze liquide sono saggiate in forma non diluita. Dal punto di vista ottimale, applicazioni quotidiane vengono effettuate sulla base di 5-7 giorni per settimana.

1.6.2. Condizioni per il saggio

1.6.2.

1.6.2.1. Animali per l'esperimento Possono essere utilizzati ratti adulti, conigli o porcellini d'India. Si possono utilizzare altre specie animali, ma il loro uso dovrà essere giustificato. All'inizio dello studio l'intervallo di variazione di peso degli animali non dovrebbe superare ± 20 % del valore medio

1.6.2.2. Numero e sesso Per ciascun livello di dosaggio dovrebbero essere utilizzati almeno 10 animali (5 di sesso femminile e 5 di sesso maschile) con cute sana. Le femmine dovrebbero essere nullipare e non gravide. Qualora siano stati programmati sacrifici intermedi di alcuni animali, il numero degli animali dovrà essere aumentato per includere quello degli animali da sacrificare prima del termine della prova. Inoltre, un altro gruppo (gruppo satellite) di 10 animali (5 animali per sesso) può essere sottoposto al trattamento con il livello massimo di dosaggio per 28 giorni e tenuto in osservazione per 14 giorni dopo il trattamento per rilevare la reversibilità, la persistenza o l'insorgenza ritardata degli effetti tossici. Inoltre si utilizzerà in tale caso pure un gruppo satellite di 10 animali di controllo (5 animali per sesso).

1.6.2.3. Livelli di dosaggio Sono richiesti almeno 3 livelli di dosaggio, almeno 6 ore al giorno, con un gruppo di controllo oppure, nel caso venga usato un veicolo, con un gruppo di controllo del veicolo. L'applicazione della sostanza in esame dovrebbe essere effettuata ogni giorno alla stessa ora e modificata ad intervalli (settimanali e bisettimanali) al fine di mantenere un livello di dosaggio costante in funzione del peso dell'animale. Gli animali del gruppo di controllo dovranno essere trattati in modo identico agli animali del saggio, ad eccezione che per l'applicazione delle sostanze da saggiare. Se, per facilitare il dosaggio, viene utilizzato un veicolo, al gruppo di controllo dovrà essere somministrato il veicolo allo stesso modo che ai gruppi trattati e nella stessa quantità somministrata al gruppo con il dosaggio più elevato. Il livello di dosaggio più elevato della sostanza in esame dovrebbe causare effetti tossici ma senza causare mortalità oppure causando una mortalità molto limitata. Il livello di dosaggio più basso non dovrebbe provocare alcun sintomo di tossicità. Nei casi in cui vi sia una stima utilizzabile dell'esposizione umana, il livello di dosaggio più basso dovrebbe superarla. Dal punto di vista ottimale, il livello intermedio dovrebbe provocare effetti tossici osservabili minimi. Nei casi in cui siano usati più livelli di dosaggio intermedi, essi dovrebbero essere intervallati al fine di causare una graduazione di effetti tossici. Nei gruppi a livello di dosaggio basso e medio e di controllo, l'incidenza dei decessi dovrebbe essere bassa per consentire una valutazione significativa dei risultati. Se l'applicazione della sostanza in esame dovesse causare una grave irritazione della cute, sarà opportuno ridurne le concentrazioni, e ciò può causare una diminuzione oppure l'assenza degli altri effetti tossici al livello di dosaggio più elevato. Inoltre, se la cute à stata gravemente danneggiata, può essere necessario interrompere il saggio e iniziarne uno nuovo a concentrazioni più basse.

1.6.2.4. Saggio limite Qualora un saggio preliminare, effettuato con un livello di dosaggio di 1000 mg/kg di peso corporeo, oppure con una dose superiore in relazione all'eventuale esposizione umana, se nota, non causi effetti tossici, ulteriori saggi possono essere considerati non necessari.

1.6.2.5. Periodo di osservazione Gli animali da esperimento dovrebbero essere esaminati quotidianamente al fine di rilevare i segni della tossicità. Il momento del decesso e quello in cui appaiono e scompaiono i sintomi di tossicità dovrebbero essere registrati.

1.6.3. Procedimento Ogni gabbia dovrebbe contenere un solo animale. Da un punto di vista ottimale, la sostanza in esame viene applicata agli animali 7 giorni la settimana per un periodo di 28 giorni. Gli animali di ogni eventuale gruppo satellite previsto per proseguire le osservazioni dovrebbero essere tenuti per altri 14 giorni, senza subire trattamenti, al fine di rilevare l'eventuale guarigione o la persistenza degli effetti tossici, La durata dell'esposizione dovrebbe essere almeno di 6 ore/giorno. La sostanza in esame dovrebbe essere applicata uniformemente su un'area pari a circa il 10 % della superficie corporea totale. Per le sostanze altamente tossiche, la superficie coperta può essere inferiore, ma la maggior parte dell'area trattata dovrebbe essere ricoperta da uno strato per quanto possibile sottile e uniforme. Durante il periodo di esposizione, la sostanza in esame viene tenuta a contatto della cute mediante una garza porosa e un cerotto non irritante. La parte su cui viene applicata la sostanza dovrà essere ulteriormente coperta in modo opportuno per tenere ferma la garza e la sostanza in esame e affinché gli animali non possano ingerire la sostanza stessa. Dispositivi per la limitazione dei movimenti possono essere utilizzati per impedire agli animali di ingerire la sostanza in esame, ma non è consigliabile l'immobilizzazione completa dell'animale. Come alternativa si può usare un dispositivo protettivo a collare. Alla fine del periodo di esposizione, la sostanza residua dovrà essere rimossa utilizzando acqua, se possibile, o altri prodotti idonei per la pulizia della pelle. Tutti gli animali dovranno essere esaminati quotidianamente e dovranno essere registrati i segni di tossicità, inclusi il momento dell'insorgenza, il loro grado e durata. Le osservazioni dovrebbero includere le alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle membrane mucose, e anche dei sistemi respiratorio, circolatorio, nervoso autonomo e centrale, dell'attività somatomotoria e del comportamento dell'animale. La misura del peso degli animali dovrà essere effettuata ogni settimana. Si raccomanda, inoltre, che il consumo sia anche misurato ogni settimana. L'esame periodico degli animali è necessario per impedire la perdita degli animali dello studio, dovuta a cause come cannibalismo, autolisi dei tessuti o errata collocazione. Al termine del saggio, tutti gli animali sopravvissuti, ad eccezione del gruppo satellite, sono sottoposti a necroscopia. Gli animali moribondi e gli animali in condizioni di grave sofferenza o dolore dovranno essere rimossi appena notati, soppressi umanamente e sottoposti a necroscopia. Al termine del saggio tutti gli animali, compresi quelli di controllo, saranno sottoposti ai seguenti esami: Altre determinazioni, che possono risultare necessarie per un'adeguata valutazione tossicologica, comprendono il calcio, il fosforo, il cloruro, il sodio, il potassio, il glucosio a digiuno, l'analisi dei lipidi, gli ormoni, l'equilibrio acido/base, la metaemoglobina, l'attività colinesterasica. Per estendere l'indagine degli effetti osservati, se necessario, si possono utilizzare ulteriori esami biochimico-clinici.

1.6.3. i)

ematologia, comprendente almeno l'ematocrito, la concentrazione di emoglobina, la conta degli eritrociti, la conta totale e differenziale dei leucociti e una misura del potenziale di coagulazione;

ii)

1.6.4. Necroscopia Tutti gli animali dello studio dovranno essere sottoposti a necroscopia completa. Per evitare la disidratazione, il fegato, i reni, le ghiandole surrenali e i testicoli dovrebbero essere pesati umidi al più presto possibile dopo la dissezione. Gli organi e i tessuti, cioè la cute normale e trattata, il fegato, i reni, la milza, i testicoli, le ghiandole surrenali, il cuore e gli organi bersaglio (cioè gli organi che presentano lesioni macroscopiche o variazioni di dimensioni) dovranno essere conservati in un mezzo adatto per l'eventuale futuro esame istopatologico.

1.6.5. Esame istopatologico Gli organi e i tessuti degli animali del gruppo ad alto dosaggio e del gruppo di controllo opportunamente preservati dovranno essere sottoposti ad esame istologico. Gli organi e i tessuti che presentano lesioni attribuibili alla sostanza in esame somministrata al dosaggio più elevato dovranno essere esaminati anche per i gruppi a dosaggio inferiore. Gli animali dell'eventuale gruppo satellite dovranno essere sottoposti ad esame istologico, in particolare per gli organi e i tessuti che risultano colpiti da effetti tossici negli altri gruppi trattati.

2. DATI I risultati dovranno essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo trattato, il numero di animali all'inizio del saggio e il numero di animali che mostra ciascun tipo di lesione. Tutti i risultati osservati dovranno essere valutati con un adeguato metodo statistico. Può essere utilizzato qualsiasi metodo statistico riconosciuto.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti informazioni:

dati sugli animali (specie, ceppo, origine, condizioni ambientali, dieta, ecc.);

condizioni di prova (incluso il tipo di medicazione: occlusiva o non occlusiva);

livello di dosaggio (incluso il veicolo, se usato) e concentrazioni;

livello senza effetti, dove possibile;

effetti tossici per sesso e dosaggio;

il momento del decesso durante il saggio, oppure se gli animali sono sopravvissuti sino al termine;

effetti tossici o altri effetti;

momento dell'osservazione di ciascun sintomo anomalo e suo successivo decorso;

dati relativi al consumo di alimenti e al peso corporeo;

esami ematologici effettuati e loro risultati;

esami biochimico-clinici effettuati e loro risultati;

risultati della necroscopia;

descrizione dettagliata di tutti i risultati istopatologici;

elaborazione statistica dei risultati, ove possibile;

discussione dei risultati;

interpretazione dei risultati.

3.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE Vedi introduzione generale, parte B (punto D).

4. BIBLIOGRAFIA Vedi introduzione generale, parte B (punto E)

B.10. MUTAGENICITÀ — TEST IN VITRO DI ABERRAZIONE CROMOSOMICA NEI MAMMIFERI

B.10.

1. METODO Il metodo è ripreso dal metodo OECD TG 473, In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test (1997).

1.

1.1. INTRODUZIONE Il saggio in vitro di aberrazione cromosomica è destinato ad identificare gli agenti che causano aberrazioni cromosomiche strutturali in una coltura di cellule di mammifero (1) (2) (3). Le aberrazioni strutturali possono essere di due tipi: cromosomiche o cromatidiche. La maggior parte dei mutageni chimici induce aberrazioni cromatidiche, benché si verifichino anche aberrazioni cromosomiche. Un aumento della poliploidia può indicare che una sostanza chimica ha la capacità di indurre aberrazioni numeriche. Questo metodo tuttavia non è inteso a misurare le aberrazioni numeriche e non viene usato di norma per tale scopo. Le mutazioni cromosomiche e i fenomeni ad esse correlati sono causa di molte malattie genetiche umane e vi sono prove concrete che mutazioni cromosomiche e fenomeni ad esse correlati, che causano alterazioni degli oncogeni e dei geni soppressori dei tumori nelle cellule somatiche, sono implicati nella comparsa delle neoplasie umane come in quelle sperimentalmente indotte negli animali da laboratorio. Nei test in vitro sulle aberrazioni cromosomiche si possono usare colture di linee cellulari stabilizzate, ceppi cellulari o colture cellulari primarie. Le cellule sono scelte in funzione della capacità di crescita in coltura, della stabilità del cariotipo, del numero e della diversità dei cromosomi e della frequenza di aberrazioni cromosomiche spontanee. I test in vitro richiedono in generale l'uso di una fonte esogena di attivazione metabolica. Tale sistema di attivazione metabolica non può simulare perfettamente le condizioni in vivo nel mammifero. Si evitino accuratamente condizioni che porterebbero a risultati positivi che non riflettono una mutagenicità intrinseca ma che possono avere origine da cambiamenti di pH o dell'osmolalità o da livelli elevati di citotossicità (4) (5). Questi test sono utilizzati per individuare potenziali mutageni e cancerogeni per i mammiferi. Molti composti che risultano positivi al test sono cancerogeni per i mammiferi; tuttavia la correlazione tra il test e la cancerogenicità non è assoluta: dipende dalla classe chimica e vi sono sempre più elementi che inducono a ritenere che esistono cancerogeni non rivelati da questi test, perché sembrano agire attraverso meccanismi diversi dal danno diretto al DNA. Cfr. anche Introduzione generale parte B.

1.2. DEFINIZIONI Aberrazione cromatidica: danno cromosomico strutturale che si manifesta nella rottura di un singolo cromatide o nella rottura e ricongiunzione di cromatidi. Aberrazione cromosomica: alterazione cromosomica strutturale, che si manifesta nella rottura, o nella rottura e ricongiunzione, di entrambi i cromatidi in uno stesso punto. Endoriduplicazione: processo nel quale, dopo una fase S di replicazione del DNA, il nucleo non inizia la mitosi ma inizia una nuova fase S. Ne risultano cromosomi con 4, 8, 16, ... cromatidi. Gap: lesione acromatica, di ampiezza inferiore a un cromatide, con minimo disallineamento dei cromatidi. Coefficiente mitotico: numero delle cellule in metafase diviso per il numero totale di cellule della popolazione: costituisce un'indicazione del grado di proliferazione della popolazione cellulare. Aberrazione numerica: variazione del numero di cromosomi rispetto al numero diploide caraneristico della specie. Poliploidia: numero di cromosomi multiplo superiore a due del numero aploide (cioè 3n, 4n ecc.). Aberrazione strutturale: alterazione della struttura cromosomica visibile all'esame microscopico dello stadio di metafase, che si presenta con delezioni, perdita di segmenti, scambi intercromosomici e intracromosomici.

1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO L'azione della sostanza in esame è saggiata sulle colture cellulari, con e senza attivazione metabolica. Dopo l'esposizione alla sostanza in esame, le colture cellulari sono trattate, a determinati intervalli, con un inibitore della metafase (per esempio Colcemid® o colchicina), raccolte, sottoposte a un processo di colorazione e le cellule in metafase sono esaminate al microscopio per determinare la presenza di aberrazioni cromosomiche.

1.4. DESCRIZIONE DEL METODO

1.4.

1.4.1. Preparazioni

1.4.1.

1.4.1.1. Cellule Si possono usare varie linee cellulari, ceppi o colture cellulari primarie, fra cui cellule umane (per esempio fibroblasti del criceto cinese, linfociti del sangue periferico umano o di altri mammiferi).

1.4.1.2. Terreni e condizioni di coltura Si usino terreni di coltura e condizioni di incubazione (recipienti per coltura, concentraazione di CO2, temperatura e umidità) adeguati alle colture. Si controlli periodicamente la stabilità del numero modale dei cromosomi e l'assenza di contaminazione da micoplasma nelle linee cellulari stabilizzate e nei ceppi; non si usino ceppi contaminati. Dovrebbero essere note la durata normale del ciclo cellulare e le condizioni di coltura utilizzate.

1.4.1.3. Preparazione delle colture Linee cellulari stabilizzate e ceppi: le cellule provenienti da colture primarie vengono inoculate in un terreno di coltura ad una densità tale da impedire che le colture raggiungano la confluenza prima della raccolta, e incubate a 37 oC. Linfociti: sangue intero trattato con un anticoagulante (per esempio eparina) o linfociti isolati, prelevati da soggetti sani, sono posti in un terreno di coltura contenente un mitogeno (per esempio fitoemoagglutinina) e incubati a 37 oC.

1.4.1.4. Attivazione metabolica Le cellule dovrebbero essere esposte alla sostanza in esame sia in presenza che in assenza di un adeguato sistema di attivazione metabolica. Il sistema più comunemente usato è una frazione post-mitocondriale integrata di cofattori (S9) ricavata dal fegato di roditori trattati con induttori enzimatici, per esempio: Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9), o con un combinazione di fenobarbitone e/3-naftoflavone (10) (11) (12). La frazione post-mitocondriale viene di solito usata a concentrazioni comprese tra 1 e 10 % v/v nel terreno di coltura. Le condizioni del sistema di attivazione metabolica dipendono dalla classe chimica della sostanza in esame. In alcuni casi può essere opportuno utilizzare varie concentrazioni della frazione post-mitocondriale. Vari nuovi procedimenti, tra cui la creazione di linee cellulari modificate mediante ingegneria genetica che esprimono enzimi attivatori specifici, possono fornire il potenziale di attivazione endogena. La scelta delle linee cellulari deve essere scientificamente motivata (per esempio in funzione dell'importanza dell'isoenzima del citocromo P450 nel metabolismo della sostanza in esame).

1.4.1.5. Sostanza in esame/Preparazione Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione in adeguati solventi o mezzi disperdenti e, se necessario, diluite prima del trattamento delle cellule. Le sostanze liquide possono essere aggiunte direttamente alla coltura o diluite prima del trattamento. Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano disponibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conservazione è accettabile.

1.4.2. Condizioni di esperimento

1.4.2.

1.4.2.1. Solvente/mezzo disperdente Il solvente/mezzo disperdente non deve reagire chimicamente con la sostanza in esame e deve essere compatibile con la sopravvivenza delle cellule e con l'azione di S9, L'uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilità. Si raccomanda di prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l'uso di un solvente/mezzo disperdente acquoso. Nell'esame di sostanze instabili in acqua, si usi un solvente organico anidro. L'acqua può essere rimossa mediante un setaccio molecolare.

1.4.2.2. Concentrazioni di esposizione Fra i criteri da considerare nel determinare la concentrazione massima si citano la citotossicità, la solubilità nel sistema di prova e le variazioni di pH o di osmolalità. La citotossicità deve essere determinata con e senza attivazione metabolica nel test principale, sulla base di un'indicatore adeguato dell'integrità e della moltiplicazione cellulare, come il grado di confluenza, il conteggio delle cellule vitali o il coefficiente mitotico. Può essere utile determinare la citotossicità e la solubilità in un esperimento preliminare. Si usino almeno tre concentrazioni analizzagli. In caso di sostanze citotossiche, le concentrazioni devono andare dalla tossicità massima ad una tossicità assente o modica; le concentrazioni devono cioè essere di norma separate al massimo da un fattore compreso tra 2 e v 10. Al momento della raccolta la concentrazione più elevata deve presentare una riduzione significativa (superiore al 50 %) del grado di confluenza, del numero delle cellule o del coefficiente mitotico. Il coefficiente mitotico è solo una misura indiretta di effetti citotossici/citostatici e dipende dal tempo trascorso dopo il trattamento. È tuttavia accettabile per colture in sospensione, per le quali altre misure della tossicità possono essere complesse e poco pratiche. Dati relativi alla cinetica cellulare, per esempio il tempo medio di moltiplicazione, possono fornire informazioni supplementari. Il tempo medio di moltiplicazione tuttavia è una media generale, che non sempre rivela l'esistenza di sottopopolazioni con ritardi di crescita, e anche piccoli aumenti di esso possono essere associati ad un ritardo sostanziale del tempo di comparsa delle aberrazioni. Per sostanze a basso grado di citotossicità la concentrazione massima di prova dovrebbe essere pari a 5 ul/ml, 5 mg/ml o 0,01 M (si scelga il valore più basso). Per sostanze difficilmente solubili e non tossiche a concentrazioni inferiori al limite di solubilità, la dose massima dovrebbe essere una concentrazione superiore al limite di solubilità nel terreno di coltura, al termine del trattamento. In alcuni casi (per esempio quando si verifica tossicità solo a concentrazioni superiori alla concentrazione minima insolubile) è opportuno eseguire prove a più di una concentrazione, con precipitazione visibile. Può essere utile valutare la solubilità all'inizio e al termine del trattamento, perché questa può variare nel corso dell'esposizione durante il saggio, per la presenza di cellule, S9, siero ecc. L'insolubilità può essere rilevata ad occhio nudo. Il precipitato non deve interferire con la valutazione.

1.4.2.3. Controlli negativi e positivi Ogni test dovrà comprendere controlli positivi e negativi (solvente o mezzo disperdente) trattati in parallelo, con e senza attivazione metabolica. Quando si usa l'attivazione metabolica, la sostanza usata per i controlli positivi deve esigere attivazione per dare una risposta mutagenica. Come controllo positivo si utilizzi un clastogeno noto, a livelli ai quali ci si attende un aumento riproducibile e individuabile rispetto ai valori normali, che dimostri la sensibilità del test. La concentrazione del controllo positivo deve essere tale che gli effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente al lettore l'identità dei vetrini codificati. Esempi di sostanze di controllo positive: Condizione di attivazione metabolica Sostanza N. CAS N. Einecs Assenza di attivazione metabolica esogena Metansolfonato di metile 66-27-3 200-625-0 Metansolfonato di etile 62-50-0 200-536-7 Etilnitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomicina C 50-07-7 212-072-2 4-Nitrochinolina-N-ossido 56-57-5 200-281-1 Presenza di attivazione metabolica esogena Benzo[a]pirene 50-32-8 200-028-5 Ciclofosfammide Ciclofosfammide monoidrato 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Si possono usare altre adeguate sostanze per i controlli positivi. Si usino, se disponibili, sostanze di una classe chimica correlata. Si effettuino anche controlli negativi, con solvente o mezzo disperdente usati da soli sul terreno di coltura; i controlli vanno trattati come le colture di trattamento, per ogni fase di raccolta. Si proceda inoltre a controlli non trattati, salvo che dati precedenti provino che il solvente scelto non induce effetti nocivi o mutageni.

1.4.3. Procedura

1.4.3.

1.4.3.1. Trattamento con la sostanza in esame Le cellule in proliferazione sono trattate con la sostanza in esame in presenza e in assenza di un sistema di attivazione metabolica. 11 trattamento dei linfociti deve iniziare circa 48 ore dopo la stimolazione mitogenica.

1.4.3.2. Dovrebbero essere usate di norma colture in doppio per ogni concentrazione, anche per le colture di controllo con solo solvente. Se esistono precedenti dati che provano che le variazioni tra colture in doppio sono minime (13) (14), si può accettare l'uso di una sola coltura per concentrazione. 1 test con sostanze gassose o volatili devono essere condotti con metodi adeguati, per esempio in recipienti di coltura ermetici (15) (16)

1.4.3.3. Raccolta delle colture Nel primo esperimento si espongano le cellule alla sostanza in esame, sia con che senza attivazione metabolica, per 3-6 ore e si proceda al campionamento quando sia trascorso un periodo equivalente a circa una volta e mezza la durata del ciclo cellulare normale dall'inizio del trattamento (12). Se i risultati sono negativi, sia con che senza attivazione, si esegua un ulteriore esperimento senza attivazione, con trattamento continuo fino al campionamento, dopo un periodo equivalente a circa una volta e mezzo la durata del ciclo cellulare normale. Alcune sostanze chimiche possono essere individuate più facilmente con tempi di trattamento/campionamento superiori a una volta e mezzo la durata del ciclo cellulare. I risultati negativi nei testi con attivazione metabolica devono essere confermati caso per caso. Se non si ritiene necessaria la conferma dei risultati negativi, se ne fornisca la motivazione.

1.4.3.4. Preparazione dei cromosomi Le colture cellulari sono trattate con Colcemid8 o colchicina, di norma per un periodo variabile da una a tre ore prima della raccolta. Ogni coltura cellulare viene raccolta e trattata separatamente per la preparazione dei cromosomi. La preparazione dei cromosomi comprende il trattamento ipotonico delle cellule, il fissaggio e la colorazione.

1.4.3.5. Analisi Tutti i vetrini, compresi quelli dei controlli positivi e negativi, devono essere codificati individualmente prima dell'esame al microscopio. Poiché le procedure di fissaggio provocano spesso la rottura di una parte delle cellule in metafase, con perdita di cromosomi, le cellule classificate devono contenere un numero di centromeri pari al numero modale ± 2 per tutti i tipi di cellule. Per ogni concentrazione e per ogni controllo si devono valutare almeno 200 cellule in metafase ben distribuite e adeguatamente suddivise, se possibile tra le prove in doppio. Tale numero può essere ridotto quando si osserva un gran numero di aberrazioni. Anche se il test è destinato a rivelare aberrazioni cromosomiche strutturali, è importante registrare eventuali casi di poliploidia e di endoriduplicazione.

2. RISULTATI

2.

2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI L'unità sperimentale è la cellula; pertanto si deve valutare la percentuale di cellule che presentano una o più aberrazioni cromosomiche strutturali. Per le colture sperimentali e per le colture di controllo si indichino i vari tipi di aberrazioni cromosomiche strutturali, con numero e frequenza. I gap vanno registrati separatamente e indicati nella relazione, ma non vanno inclusi nella frequenza totale delle aberrazioni. Si riportino anche le misure di citotossicità condotte in parallelo per tutte le colture trattate e i controlli negativi nei principali test di aberrazione. 1 dati saranno presentati separatamente per le singole colture e riassunti in tabelle. Non è necessario verificare le risposte positive inequivocabili. I risultati ambigui devono essere chiariti mediante prove ulteriori, preferibilmente modificando le condizioni di esperimento. La necessità di confermare i risultati negativi è stata discussa al punto 1.4.3.3. Nei test successivi si dovrebbero modificare i parametri di studio, per estendere la gamma delle condizioni valutate. Fra i parametri di studio modificabili si citano l'intervallo fra i livelli di concentrazione e le condizioni di attivazione metabolica.

2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, per esempio un aumento correlato alla concentrazione o un aumento riproducibile del numero di cellule che presentano aberrazioni cromosomiche. Si consideri in primo luogo la rilevanza dei risultati dal punto di vista biologico. Si possono usare metodi statistici come ausilio nella valutazione dei risultati sperimentali (3) (13). ma la significatività statistica non dovrebbe essere l'unico fattore determinante di una risposta positiva. Un aumento del numero di cellule poliploidi può significare che la sostanza in esame è in grado di inibire processi miratici e di indurre aberrazioni numeriche nei cromosomi. Un aumento del numero di cellule con cromosomi endoriduplicati può indicare che la sostanza in esame è in grado di inibire il ciclo cellulare (17) (18). Una sostanza che fornisca risultati non corrispondenti ai criteri di cui sopra è considerata non mutagena in questo test. La maggior parte degli esperimenti fornirà indubbiamente risultati palesemente positivi o negativi, ma in alcuni casi i dati ottenuti non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull'azione della sostanza in esame. 1 risultati possono rimanere ambigui nonostante l'esperimento venga ripetuto più volte. Risultati positivi del saggio di aberrazione cromosomica in vitro indicano che la sostanza in esame induce aberrazioni cromosomiche strutturali in colture di cellule somatiche di mammifero. Risultati negativi indicano che, nelle condizioni di test, la sostanza in esame non induce aberrazioni cromosomiche in colture di cellule somatiche di mammifero.

3. RELAZIONE

3. RELAZIONE SUL SAGGIO

La relazione sul saggio dovrà contenere le seguenti informazioni:

Solvente/mezzo disperdente:

motivazione della scelta del mezzo disperdente,

solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo disperdente, se nota.

Cellule:

tipo e origine delle cellule,

caratteristiche del cariotipo e idoneità del tipo di cellula usato,

assenza di micoplasma, se del caso,

informazioni sulla durata del ciclo cellulare,

sesso dei donatori di sangue, sangue intero o linfociti isolati, mitogeno usato,

eventuale numero di passaggi in coltura, se del caso,

metodi usati per la conservazione della coltura cellulare, se del caso,

numero modale dei cromosomi.

Condizioni di esperimento:

natura e concentrazione dell'inibitore della metafase, durata di esposizione delle cellule,

criteri di selezione delle concentrazioni e del numero di colture, per esempio dati sulla citotossicità e sui limiti di solubilità, se disponibili,

composizione del terreno di coltura, concentrazione di CO2 se del caso,

concentrazione della sostanza in esame.

volume del mezzo disperdente e della sostanza in esame aggiunti,

temperatura di incubazione,

tempo di incubazione,

durata del trattamento,

densità delle cellule al momento dell'inoculazione, se del caso,

tipo e composizione del sistema di attivazione metabolica, compresi i criteri di accettabilità.

controlli positivi e negativi,

metodi di preparazione dei vetrini,

criteri di conteggio delle aberrazioni,

numero di metafasi analizzate,

metodi di misura della tossicità,

criteri in base ai quali i risultati sono giudicati positivi, negativi o ambigui.

Risultati:

indizi di tossicità, per esempio grado di confluenza, dati sul ciclo cellulare, conta delle cellule, coefficiente mitotico,

segni di precipitazione,

dati sul pH e sull'osmolalità del terreno di trattamento, se determinati,

definizione delle aberrazioni, compresi i salti,

numero di cellule con aberrazioni cromosomiche e tipi di aberrazioni, indicati separatamente per ciascuna coltura trattata e di controllo,

eventuali cambiamenti di ploidia,

relazione dose-risposta, se possibile,

eventuali analisi statistiche,

dati sui controlli negativi (solvente/mezzo disperdente) e positivi paralleli,

precedenti dati sui controlli negativi (solvente/mezzo disperdente) e positivi, con variazioni, medie e deviazioni standard.

Discussione dei risultati.

Conclusioni.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)

BIBLIOGRAFIA Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Voi. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29. lshidate, M. Jr. and Sofuni, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Ham ster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Voi. 5. Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford. pp. 427-432. Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., Brown, B., Camion, C, Blooin, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M, Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Andersen, G. and Zeiger, E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs. Moke. Mutagen 10 (suppl. 10), pp. 1-175. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., lshidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 25.7 pp. 147-204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, 1. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, pp. 297-305. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for thè Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res.. 113, pp. 173-215. Natarajan, A. T., Tares, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, J. Induction of Chro mosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitro- samine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, pp. 277-290. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclar 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polvchlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, E. J., Fouts, J. R., Berid, J. R. and Philpot, R. M. (eds). In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier. North-Holland, pp. 85-88. Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Iven, J. L, Kirkland, D. J., Morita. T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241-261. Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analy sis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154. Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139-149. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects o/Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103. Zamora, P. 0., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, j. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364...

B.11. MUTAGENICITA — TEST IN VIVO DI ABERRAZIONE CROMOSOMICA SUL MIDOLLO OSSEO DI MAMMIFERI

B.11.

1. METODO Il metodo è ripreso dal metodo OECD TG 475, Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test (1997).

1.

1.1. INTRODUZIONE I testi di aberrazione cromosomica in vivo nei mammiferi sono destinati ad individuare aberrazioni cromosomiche strutturali indotte dalla sostanza in esame nelle cellule del midollo osseo di animali, di solito roditori (1) (2) (3) (4). Le aberrazioni cromosomiche strutturali possono essere di due tipi: cromosomiche o cromatidiche. Un aumento della poliploidia può significare che una sostanza chimica è in grado di indurre aberrazioni numeriche. La maggior parte dei mutageni chimici induce aberrazioni cromatidiche, ma si verificano anche aberrazioni cromosomiche. Le mutazioni cromosomiche e i fenomeni ad esse correlati sono causa di molte malattie genetiche umane e vi sono prove concrete che mutazioni cromosomiche e fenomeni ad esse correlati, che causano alterazioni degli oncogeni e dei geni soppressori di tumori, sono implicati nella comparsa delle neoplasie umane e di quelle sperimentalmente indotte negli animali da laboratorio. Per i test si usano solitamente roditori. Il midollo osseo è il tessuto bersaglio, in quanto è altamente vascolarizzato e contiene una popolazione di cellule a ciclo rapido, che possono essere agevolmente isolate e trattate. Altre specie e altri tessuti bersaglio non sono oggetto della presente metodica. Il test di aberrazione cromosomica è particolarmente idoneo a valutare il rischio mutagenico, in quanto per mette di considerare fattori del metabolismo in vivo, aspetti farmacocinetici e processi di riparazione del DNA, che peraltro possono variare in funzione della specie e del tipo di tessuto. Un test in vivo è utile anche per verificare l'effetto mutageno rivelato da un test in vitro. Se è evidente che la sostanza in esame, o un metabolita reattivo, non raggiungono il tessuto bersaglio, il test non è idoneo. Cfr. anche Introduzione generale parte B.

1.2. DEFINIZIONI Aberrazione cromatica: danno strutturale dei cromosomi che si manifesta nella rottura di un singolo cromatide o nella rottura e ricongiunzione di cromatidi. Aberrazione cromosomica: alterazione cromosomica strutturale, che si manifesta nella rottura, o nella rottura e ricongiunzione, di entrambi i cromatidi in uno stesso punto. Endoriduplicazione: processo nel quale, dopo una fase S di replicazione del DNA, il nucleo non inizia la mitosi ma inizia una nuova fase S. Ne risultano cromosomi con 4, 8, 16, ... cromatidi. Gap: lesione acromatica, di ampiezza inferiore a un cromatide, con minimo disallineamento dei cromatidi. Coefficiente mitotico: numero delle cellule in metafase diviso per il numero totale di cellule della popolazione: costituisce un'indicazione del grado di proliferazione della popolazione cellulare. Aberrazione numerica: variazione del numero di cromosomi rispetto al numero diploide caraneristico della specie. Poliploidia: numero di cromosomi multiplo superiore a due del numero aploide (cioè 3n, 4n, ecc). Aberrazione strutturale: alterazione della struttura cromosomica visibile all'esame microscopico dello stadio di metafase, che si presenta con perdita di segmenti, riordinamenti intercromosomici e intracromosomici.

1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO Gli animali sono esposti alle sostanze in esame per una via adeguata e vengono quindi sacrificati a tempo debito, dopo somministrazione di un inibitore della metafase (per esempio colchicina o Colcemid05). Sono poi approntate e sottoposte a un processo di colorazione le preparazioni cromosomiche delle cellule di midollo osseo, e se ne analizzano le cellule in metafase per determinare le aberrazioni cromosomiche.

1.4. DESCRIZIONE DEL METODO

1.4.

1.4.1. Preparazioni

1.4.1.

1.4.1.1. Scelta delle specie animali Ratti, topi e criceti cinesi sono gli animali più comunemente usati, ma si può usare qualsiasi specie adeguata di mammifero. Si scelgano individui adulti, giovani e in buona salute, provenienti da ceppi di animali da laboratorio. All'inizio dello studio le variazioni di peso tra gli animali devono essere minime e non superare il ±20 % del peso medio per sesso.

1.4.1.2. Condizioni di stabulazione e alimentazione Valgono le condizioni generali citate nell'Introduzione generale alla parte B; l'umidità ideale è pari al 50-60 %.

1.4.1.3. Preparazione degli animali Gli animali adulti, sani e giovani sono suddivisi a caso in gruppi di controllo e di trattamento. Le gabbie devono essere disposte in modo da minimizzare eventuali effetti dovuti alla posizione. Gli animali vanno identificati inequivocabilmente e acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno cinque giorni.

1.4.1.4. Preparazione delle dosi Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione in adeguati solventi o mezzi disperdenti e, se necessario, diluite prima del trattamento degli animali. Le sostanze liquide possono essere somministrate direttamente o diluite prima del trattamento. Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano disponibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conservazione è ammissibile.

1.4.2. Condizioni di esperimento

1.4.2.

1.4.2.1. Solvente/mezzo disperdente 11 solvente/mezzo disperdente non deve produrre effetti tossici alle dosi usate e non deve reagire chimicamente con la sostanza in esame. L'uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilita. Si raccomanda di prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l'uso di un solvente/mezzo disperdente acquoso.

1.4.2.2. Controlli Ogni test dovrà comprendere controlli positivi e negativi (solvente/mezzo disperdente), trattati in parallelo per ciascun sesso. Gli animali dei gruppi dovranno essere trattati in modo identico, salvo per la somministrazione della sostanza in esame, I controlli positivi dovrebbero indurre aberrazioni strutturali in vivo a livelli di esposizione ai quali è previsto un aumento rilevabile rispetto alla media. Le dosi dei controlli positivi devono essere scelte in modo che gli effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente al lettore l'identità dei vetrini codificati. E ammissibile che le sostanze per i controlli positivi siano somministrate per una via diversa dalla sostanza in esame ed e sufficiente un solo prelievo per campione. È anche ammissibile l'uso per i controlli positivi di sostanze di una classe chimica correlata, se ne esistono. Fra gli esempi di sostanze per i controlli positivi si citano: Sostanza N. CAS N. Einecs Metansolfonato di etile 62-50-0 200-536-7 Etilnitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 Ciclofosfammide Ciclofosfammide monoidrato 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietilenmelammina 51-18-3 200-083-5 In ogni fase del campionamento si proceda a controlli negativi, cui sia somministrato solo il solvente o il mezzo disperdente, senza altre differenze di trattamento, salvo che dati precedenti dimostrino che la variabilità intraspecifica e la frequenza di cellule con aberrazioni cromosomiche sono accettabili. Se per i controlli negativi si procede ad un solo campionamento, il momento più adeguato è quello del primo prelievo. Si ricorra anche a controlli negativi non trattati, salvo che dati precedenti dimostrino che il solvente/mezzo disperdente scelto non induce effetti nocivi o mutageni.

1.5. PROCEDURA

1.5.

1.5.1. Numero e sesso degli animali Ogni gruppo trattato e ogni gruppo di controllo deve essere composto di almeno 5 animali analizzabili per sesso. Se al momento della sperimentazione sono disponibili dati relativi a sperimentazioni sulla stessa specie, con la medesima via di esposizione, che dimostrano che non vi sono sostanziali differenze di tossicità tra i sessi, sarà sufficiente effettuare i test su un solo sesso. Qualora l'esposizione umana alle sostanze chimiche sia specifica per un sesso, come per esempio nel caso di alcuni prodotti farmaceutici, i test devono essere eseguiti su animali di tale sesso.

1.5.2. Protocollo di trattamento Le sostanze in esame sono somministrate di preferenza in un'unica dose. Possono essere somministrate anche in dosi frazionate, per esempio in due dosi nello stesso giorno, a distanza di qualche ora al massimo, per agevolare la somministrazione, trattandosi di dosi di volume elevato. Se si usa una posologia diversa, se ne fornisca la motivazione scientifica. Dopo il trattamento si proceda al prelievo dei campioni in due momenti diversi dello stesso giorno. Per i roditori il primo prelievo dopo il trattamento è effettuato quando sia trascorso un periodo equivalente ad una volta e mezza la durata del ciclo cellulare (che è di norma di 12-18 ore). Poiché il tempo necessario affinché la sostanza in esame sia assorbita e metabolizzata e produca effetti sulla cinetica del ciclo cellulare può influire sul momento ottimale per l'individuazione delle aberrazioni cromosomiche, si raccomanda di prelevare un altro campione 24 ore dopo. Se il protocollo di trattamento è più lungo di un giorno, si proceda ad un unico campionamento quando sia trascorso un periodo equivalente ad una volta e mezza la durata normale del ciclo cellulare dopo l'ultima somministrazione. Prima di sacrificare gli animali si inietti per via interperitoneale una dose adeguata di un inibitore della meta-fase (per esempio Colcemid® o colchicina). Gi animali saranno quindi sacrificati dopo un adeguato lasso di tempo: 3-5 ore circa per i topi, 4-5 ore circa per i criceti cinesi. Si prelevino quindi le necessarie cellule del midollo osseo e si rilevino le aberrazioni cromosomiche.

1.5.3. Dosi Se si procede a uno studio per individuare l'intervallo di dosi, non essendo disponibili dati utili in materia, questo va eseguito nello stesso laboratorio, sulla stessa specie, ceppo e sesso, con il medesimo protocollo usato nel test principale (5). In caso di tossicità si usino per la prima fase di campionamento tre dosi diverse, che vadano dalla tossicità massima ad una tossicità assente o modica. Per il campionamento successivo si usi solo la dose massima. La dose massima è definita come dose che produce segni di tossicità tali che livelli più elevati, con la stessa posologia, sarebbero presumibilmente letali. Sostanze con azione biologica specifica, a dosi basse non tossiche (come ormoni e mitogeni) possono costituire eccezione rispetto ai criteri di definizione della dose e vanno valutate caso per caso. La dose massima può essere definita anche come dose che produce qualche segno di tossicità nel midollo osseo (per esempio una riduzione del coefficiente mitotico superiore al 50 %).

1.5.4. Saggio con dose limite Se la somministrazione di una quantità di sostanza pari ad almeno 2000 mg per kg di peso corporeo in dose unica o in due dosi nello stesso giorno non produce effetti tossici rilevabili, e se non vi sono ragioni di sospettare un'azione genotossica sulla base di dati relativi a sostanze strutturalmente correlate, si può considerare che non è necessario procedere alla sperimentazione completa con tre dosi diverse. Per studi di maggiore durata la dose limite è pari a 2000 mg/kg di peso corporeo al giorno, da somministrare per 14 giorni al massimo; è pari a 1000 mg/kg di peso corporeo al giorno per un trattamento più lungo. Sulla base della esposizione umana prevista per la sostanza in esame, può essere necessario usare una dose più elevata nel test con dose limite.

1.5.5. Somministrazione La sostanza in esame viene di solito somministrata con sonda gastrica o cannula di intubazione, oppure mediante iniezione intraperitoneale. Possono essere accettate altre vie se esiste una valida ragione. Il volume massimo di liquido somministrabile in un'unica volta con sonda gastrica o con iniezione dipende dalle dimensioni dell'animale da laboratorio; non deve superare i 2 ml/100 g di peso corporeo. L'uso di volumi più elevati deve essere motivato. Salvo per sostanze irritanti o corrosive, che di norma riveleranno effetti esacerbati a concentrazioni più elevate, le variazioni di volume devono essere minimizzate, regolando la concentrazione in modo da garantire un volume costante a tutte le dosi.

1.5.6. Preparazione dei cromosomi Non appena l'animale è stato sacrificato, si prelevi il midollo osseo, lo si esponga ad una soluzione ipotonica e lo si fissi. Le cellule siano poi poste su vetrini e sottoposte a un processo di colorazione.

1.5.7. Analisi Si determini il coefficiente mitotico come misura della citotossicità in almeno 1000 cellule per animale, in tutti gli animali trattati (compresi i controlli positivi) e nei controlli negativi, non trattati. Per ogni animale si analizzino almeno 100 cellule. Tale numero può essere ridotto qualora si rilevi un alto numero di aberrazioni. Tutti i vetrini, compresi quelli dei controlli positivi e negativi, devono essere codificati indipendentemente prima dell'esame al microscopio. Poiché le procedure di preparazione dei vetrini causano spesso la rottura di un parte delle cellule in metafase, con perdita di cromosomi, le cellule trattate devono contenere un numero di centromeri pari a 2n ± 2.

2. RISULTATI

2.

2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI I dati relativi ai singoli animali vanno presentati in forma di tabelle. L'unità sperimentale è l'animale. Per ciascun animale si indichi il numero di cellule analizzate e si valuti il numero di aberrazioni per cellula e la percentuale di cellule con una o più aberrazioni cromosomiche strutturali. Per i gruppi di trattamento e di controllo si elenchino i vari tipi di aberrazioni cromosomiche strutturali, il loro numero e la loro frequenza. I gap devono essere registrati separatamente e indicati nella relazione, ma non inclusi nella frequenza totale delle aberrazioni. Se non c'è un'evidente differenza di risposta tra i sessi, i dati relativi ai due sessi possono essere combinati nell'analisi statistica.

2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, per esempio un aumento del numero relativo di cellule che presentano aberrazioni cromosomiche, correlato alla dose somministrata, o un palese aumento del numero di cellule con aberrazioni nei campioni, prelevati alla stessa fase di campionamento e provenienti da un gruppo cui è stata somministrata la stessa dose della sostanza in esame. Si consideri per prima cosa la rilevanza dei risultati dal punto di vista biologico. Si possono usare metodi statistici come ausilio nella valutazione dei risultati sperimentali (6), ma la significatività statistica non dovrebbe essere l'unico fattore determinante di una risposta positiva. Eventuali risultati ambigui possono essere chiariti mediante test ulteriori, preferibilmente in condizioni sperimentali modificate. Un aumento del numero di cellule poliploidi può significare che la sostanza in esame è in grado di indurre aberrazioni numeriche nei cromosomi. Un aumento del numero di cellule che presentano endoriduplicazione può significare che la sostanza in esame è in grado di inibire il ciclo cellulare (7) (8). Una sostanza che fornisca risultati non corrispondenti ai criteri di cui sopra è considerata non mutagena in questo test. La maggior parte degli esperimenti fornirà indubbiamente risultati chiaramente positivi o negativi ma occasionalmente i dati ottenuti non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull'azione della sostanza in esame. I risultati possono rimanere ambigui nonostante l'esperimento venga ripetuto più volte. Risultati positivi del saggio di aberrazione cromosomica in vivo indicano che una sostanza induce aberrazioni cromosomiche nel midollo osseo della specie usata per i test. Risultati negativi indicano che nelle condizioni di test la sostanza in esame non induce aberrazioni cromosomiche nel midollo osseo della specie usata per i test. Si vaglino le probabilità che la sostanza in esame o i suoi metaboliti entrino in circolo o specificamente raggiungano il tessuto bersaglio (tossicità sistemica).

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO La relazione sul saggio dovrà contenere le seguenti informazioni:

Solvente/mezzo disperdente:

motivazione della scelta del mezzo disperdente,

solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo disperdente, se nota.

Animali da laboratorio:

specie/ceppo usato,

numero, età e sesso degli animali,

provenienza, condizioni di stabulazione, dieta, ecc,

peso dei singoli animali all'inizio degli esperimenti, con range, valore medio e deviazione standard per ciascun gruppo.

Condizioni di esperimento:

controlli positivi e negativi (mezzo disperdente/solvente),

risultati dello studio per individuare l'intervallo di dosi, se effettuato.,

criteri di selezione delle dosi,

illustrazione particolareggiata della preparazione della sostanza in esame,

illustrazione particolareggiata della somministrazione della sostanza in esame,

metodi di misura della tossicità,

criteri di selezione della via di somministrazione,

metodi usati per verificare che la sostanza in esame sia entrata in circolo o abbia raggiunto il tessuto bersaglio, se del caso,

conversione della concentrazione (ppm) della sostanza in esame nel cibo o nell'acqua potabile nella dose effettiva (mg/kg di peso corporeo/giorno), se del caso,

dettagli relativi alla qualità del cibo e dell'acqua,

descrizione dettagliata dei protocolli di trattamento e di campionamento,

natura e concentrazione dell'inibitore della metafase, durata del trattamento,

metodi di preparazione dei vetrini,

criteri di conteggio delle aberrazioni,

numero di cellule analizzate per animale,

criteri in base ai quali i risultati sono giudicati positivi, negativi o ambigui.

Risultati:

segni di tossicità,

coefficiente mitotico,

tipo e numero delle aberrazioni, indicati separatamente per ciascun animale,

numero totale delle aberrazioni per gruppo, con medie e deviazioni standard,

numero di cellule che presentano aberrazioni per gruppo, con medie e deviazioni standard,

eventuali cambiamenti del numero cromosomico,

relazione dose-risposta, se possibile,

eventuali analisi statistiche,

dati sui controlli negativi paralleli,

dati sui controlli negativi precedenti, con range, medie e deviazioni standard,

dati sui controlli positivi paralleli.

Discussione dei risultati.

Conclusioni.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)

BIBLIOGRAFIA Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds.). 1RL Press, Oxford, Washington D. C., 275-306. Preston, R. J,, Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H,, McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, 157-165. Richold, M., Chandly, A., Ashby, J., Gatehouse D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland, (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report. Part 1 revised, Cambridge University Press, Cambridge, New Cork, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Tice, R. R, Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Paccierotti, F., Preston R. J., Romagna F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312. Fielder, R. J., Alleen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D.]., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis. 7, pp. 313-319. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland, (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res. 119, pp. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1363-1364.

B.12. MUTAGENICITÀ — TEST IN VIVO SUI MICRONUCLEI NEGLI ERITROCITI DI MAMMIFERO

B.12.

1. METODO Il metodo è ripreso dal metodo OECD TG 474, Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test (1997).

1.

1.1. INTRODUZIONE Il test in vivo sui micronuclei dei mammiferi è usato per individuare i danni indotti dalla sostanza in esame ai cromosomi o all'apparato mitotico degli eritroblasti; si effettua analizzando gli eritrociti provenienti dal midollo osseo e/o dalle cellule del sangue periferico di animali, di norma roditori. È destinato a identificare sostanze che provocano danni citogenetici, che si manifestano nella formazione di micronuclei contenenti frammenti di cromosomi o cromosomi interi. Quando da un eritroblasto del midollo osseo si sviluppa un eritrocita policromatico, il nucleo principale viene espulso; i micronuclei formatisi possono rimanere nel citoplasma che non contiene più il nucleo principale, cosa che rende più agevole la visualizzazione dei micronuclei. L'aumento della frequenza di eritrociti policromatici contenenti micronuclei negli animali trattati è un'indicazione di danno cromosomico indotto. In questo test si usa solitamente il midollo osseo di roditori: il midollo osseo è il tessuto in cui sono prodotti gli eritrociti policromatici. Il conteggio degli eritrociti immaturi (policromatici) contenenti micronuclei nel sangue periferico è ugualmente accettabile nelle specie in cui è stata provata l'incapacità della milza di svolgere la funzione emocatecretica sugli eritrociti contenenti micronuclei o che sia risultata particolarmente sensibile per l'individuazione di agenti che provocano aberrazioni cromosomiche strutturali o numeriche. Per distinguere i micronuclei si possono usare vari criteri, tra cui la presenza o l'assenza del cinetocore, o del centromero, nei micronuclei. L'elemento conclusivo è la frequenza degli eritrociti immaturi (policromatici) contenenti micronuclei. Quando gli animali vengono trattati in continuo per quattro settimane o più, come elemento conclusivo si può usare anche la percentuale di eritrociti maturi (ortocromatici) del sangue periferico che contengono micronuclei. L'esame dei micronuclei dei mammiferi in vivo è particolarmente idoneo a valutare il rischio mutagenico, in quanto permette di prendere in considerazione elementi del metabolismo, della farmacocinetica e dei processi di riparazione del DNA in vivo, anche se questi possono variare in funzione della specie, dei tessuti e dell'effetto genetico indagato. 1 test in vivo sono utili anche ad approfondire gli studi di un effetto mutagenico rilevato in vitro. Qualora risulti che la sostanza in esame, o un suo metabolita reattivo, non raggiungono il tessuto bersaglio, il test non è adeguato. Cfr. anche Introduzione generale, parte B.

1.2. DEFINIZIONI Centromero (cinetocoro): regione/i di un cromosoma sede di attacco del fuso durante la divisione cellulare, che permette il corretto movimento dei cromosomi figli verso i poli delle cellule figlie. Micronuclei: piccoli nuclei sovrannumerari, separati dal nucleo principale delle cellule, prodotti durante la telofase della mitosi (meiosi) da frammenti residui di cromosomi o da cromosomi interi. Eritrocita ortocromatico: eritrocita maturo in cui mancano i ribosomi, che può essere distinto dagli eritrociti policromatici immaturi mediante coloranti selettivi per i ribosomi. Eritrocita policromatico: eritrocita immaturo, in uno stadio di sviluppo intermedio, che contiene ancora ribosomi e che pertanto può essere distinto dagli eritrociti ortocromatici maturi mediante coloranti selettivi per i ribosomi.

1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO Gli animali sono esposti alla sostanza in esame tramite una via adeguata. Se si utilizza il midollo osseo, gli animali sono sacrificati a tempo debito dopo il trattamento; il midollo osseo viene quindi prelevato, preparato e colorato (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Se si utilizza sangue periferico, questo viene raccolto a tempo debito dopo il trattamento, si preparano quindi gli strisci e si colorano (4) (8) (9) (10). Per i test eseguiti con sangue periferico l'intervallo fra l'ultima esposizione della sostanza e la raccolta delle cellule dovrebbe essere minimo. Si individuano quindi i micronuclei nei preparati.

1.4. DESCRIZIONE DEL METODO

1.4.

1.4.1. Preparazioni

1.4.1.

1.4.1.1. Scelta delle specie animali Se si usa il midollo osseo si raccomanda di servirsi di topi o ratti, benché si possa usare qualsiasi specie adeguata di mammifero. Se si usa il sangue periferico si raccomanda di servirsi di topi, ma si può utilizzare qualsiasi specie adeguata di mammifero, purché sia una specie in cui la milza non espleta la funzione emocateretica sugli eritrociti micronucleati e che si è rivelata sufficientemente sensibile per l'individuazione degli agenti che causano aberrazioni cromosomiche strutturali o numeriche. Si scelgano individui giovani e in buona salute provenienti da ceppi di animali da laboratorio. All'inizio dell'esperimento le variazioni di peso fra gli animali devono essere minime: non possono superare il 20 % del peso medio per sesso.

1.4.1.2. Condizioni di stabulazione e alimentazione Valgono le condizioni generali citate nell'Introduzione generale alla parte B: l'umidità ideale è pari al 50-60 %.

1.4.1.3. Preparazione degli animali Gli animali adulti, sani e giovani vengono suddivisi a caso in gruppi di controllo e di trattamento. Le gabbie devono essere disposte in modo da minimizzare eventuali effetti dovuti alla posizione. Gli animali vanno identificati inequivocabilmente e acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno cinque giorni.

1.4.1.4. Sostanza in esame/Preparazione Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione in adeguati solventi o mezzi disperdenti e, se necessario, diluite prima del trattamento degli animali. Le sostanze liquide possono essere aggiunte direttamente alla coltura o diluite prima del trattamento. Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano disponibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conservazione è ammissibile.

1.4.2. Condizioni di esperimento

1.4.2.

1.4.2.1. Solvente/mezzo disperdente Il solvente/mezzo disperdente non deve produrre effetti tossici alle dosi usate e non deve reagire chimicamente con la sostanza in esame. L'uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilità. Si raccomanda di prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l'uso di un solvente/mezzo disperdente acquoso.

1.4.2.2. Controlli Ogni test dovrà comprendere controlli positivi e negativi (solvente/mezzo disperdente), trattati in parallelo per ciascun sesso. Gli animali dei due gruppi dovranno essere trattati in modo identico, salvo per la somministrazione della sostanza in esame. I controlli positivi dovrebbero produrre micronuclei in vivo a livelli di esposizione che provocano un aumento rilevabile rispetto alla media. Le dosi dei controlli positivi devono essere scelte in modo che gli effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente al lettore l'identità dei vetrini codificati. È ammissibile che le sostanze per i controlli positivi siano somministrate per una via diversa dalla sostanza in esame ed è sufficiente un solo prelievo per campione. È anche ammissibile l'uso per i controlli positivi di sostanze di una classe chimica correlata, se ne esistono. Fra gli esempi di sostanze per i controlli positivi si citano: Sostanza N: CAS N. Einecs Metansolfonato di etile 62-50-0 200-536-7 N-ethil-N-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 Ciclofosfammide Ciclofosfammide monoidrato 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietilenmelammina 51-18-3 200-083-5 In ogni fase del campionamento si proceda a controlli negativi, cui sia somministrato solo il solvente o il mezzo disperdente, senza altre differenze di trattamento, salvo che dai dati precedenti risulti che la variabilità intraspecifica e la frequenza di cellule con micronuclei sono accettabili. Se per i controlli negativi si procede ad un solo campionamento, lo si effettui al momento del primo prelievo. Si ricorra anche a controlli negativi non trattati, salvo che dati precedenti dimostrino che il solvente/mezzo disperdente scelto non induce effetti nocivi o mutageni. Se si usa sangue periferico come controllo negativo parallelo è ammissibile anche un campione prelevato prima del trattamento, solo però negli studi brevi sul sangue periferico (che vanno per esempio da 1 a 3 somministrazioni), qualora i dati ottenuti rientrino nel range previsto in letteratura.

1.5. PROCEDURA

1.5.

1.5.1. Numero e sesso degli animali Ogni gruppo trattato e ogni gruppo di controllo deve essere composto di almeno 5 animali analizzabili per sesso (11). Se al momento della sperimentazione sono disponibili dati relativi a sperimentazioni sulla stessa specie e con la medesima via di esposizione, che dimostrano che non vi sono sostanziali differenze di tossicità tra i sessi, sarà sufficiente effettuare i test su un unico sesso. Qualora l'esposizione umana alle sostanze chimiche sia specifica per un sesso, come per esempio nel caso di alcuni prodotti farmaceutici, i test devono essere eseguiti su animali di tale sesso.

1.5.2. Protocollo di trattamento Non si può raccomandare un protocollo standard (cioè 1, 2 o più somministrazioni a intervalli di 24 ore). I campioni ottenuti dopo somministrazione protratta sono accettabili purché sia comprovato un effetto positivo o, per uno studio negativo, ne sia stata dimostrata la tossicità o sia stata usata la dose limite, continuando la somministrazione fino al prelievo dei campioni. La sostanza in esame può essere somministrata anche in dosi frazionate, per esempio a due riprese nello stesso giorno, a intervalli non superiori a qualche ora, per agevolarne la somministrazione, trattandosi di un prodotto di grande volume. Il test può essere eseguito in due modi: Se del caso, possono essere effettuati ulteriori campionamenti.

1.5.2.

(a) la sostanza è somministrata agli animali in un'unica dose. Sono prelevati campioni di midollo osseo almeno due volte, ad adeguati intervalli, la prima volta almeno 24 ore dopo il trattamento, l'ultima non dopo 48 ore. Se il prelievo è effettuato meno di 24 ore dopo la somministrazione se ne fornisca la ragione. I campioni di sangue periferico vanno prelevati almeno due volte, ad adeguati intervalli, la prima volta almeno 36 ore dopo la somministrazione, l'ultima non dopo 72 ore. Quando in una delle fasi si abbia una risposta positiva non è necessario procedere ad altri prelievi;

(b) se si procede a due o più somministrazioni giornaliere (per esempio due o più somministrazioni ad intervalli di 24 ore), i campioni vanno prelevati un'unica volta, fra le 18 e le 24 ore dopo l'ultima somministrazione per il midollo osseo e tra le 36 e le 48 ore dopo l'ultima somministrazione per il sangue periferico (12).

1.5.3. Dosi Se si procede a uno studio per individuare l'intervallo di dosi, non essendo disponibili dati utili in materia, questo va eseguito nello stesso laboratorio, sulla stessa specie, ceppo e sesso, con il medesimo protocollo usato nel test principale (13). In caso di tossicità si usino per la prima fase di campionamento tre dosi diverse, che vanno dalla tossicità massima ad una tossicità assente o modica. Per il campionamento successivo si usi solo la dose massima. La dose massima è definita come dose che produce segni di tossicità tali che livelli più elevati, con la stessa posologia, sarebbero presumibilmente letali. Sostanze con azione biologica specifica, non tossiche a dosi basse (come ormoni e mitogeni) possono costituire un'eccezione rispetto ai criteri di definizione della dose e vanno valutate caso per caso. La dose massima può essere definita anche come dose che produce qualche segno di tossicità nel midollo osseo (per esempio una riduzione della percentuale di eritrociti immaturi nel midollo osseo o nel sangue periferico).

1.5.4. Test con dose limite Se la somministrazione di una quantità di sostanza pari ad almeno 2000 mg per kg di peso corporeo in dose unica o in due dosi nello stesso giorno non produce effetti tossici rilevabili, e se non vi sono ragioni di sospettare un'azione genotossica sulla base di dati relativi a sostanze strutturalmente correlate, si può considerare che non è necessario procedere alla sperimentazione completa con tre dosi diverse. Per studi di maggiore durata la dose limite è pari a 2000 mg/kg di peso corporeo al giorno, da somministrare per 14 giorni al massimo; per un trattamento più lungo è pari a 1000 mg/kg di peso corporeo al giorno. Sulla base della esposizione umana prevista per la sostanza in esame, può essere necessario usare una dose più elevata nel test con dose limite.

1.5.5. Somministrazione La sostanza in esame viene di solito somministrata con sonda gastrica o cannula di intubazione, oppure mediante iniezione intraperitoneale. Possono essere accettate altre vie se esiste una valida ragione. Il volume massimo di liquido somministrabile in una volta con sonda gastrica o con iniezione dipende dalle dimensioni dell'animale da laboratorio; non deve superare i 2 ml/100 g di peso corporeo. L'uso di volumi più elevati deve essere motivato. Salvo per sostanze irritanti o corrosive, che di norma riveleranno effetti esacerbati a concentrazioni più elevate, le variazioni di volume devono essere minimizzate, regolando la concentrazione in modo da garantire un volume costante a tutte le dosi.

1.5.6. Preparazione di midollo osseo/sangue Le cellule del midollo osseo vengono di solito prelevate dal femore o dalla tibia immediatamente dopo che l'animale è stato sacrificato. Le cellule sono prelevate, preparate e sottoposte a un processo di colorazione con metodi di accertata validità. Il sangue periferico è prelevato dalla vena caudale o da altro vaso sanguigno adeguato. Le cellule ematiche vengono immediatamente sottoposte a un processo di colorazione in condizioni sopravitali (8) (9) (10), oppure si preparano strisci che sono poi colorati. L'uso di un colorante specifico per il DNA [per esempio arancio acridina (14) o Hoechst 33258 più pironina-Y (15)] può eliminare alcuni degli artefatti dovuti all'uso di un colorante non specifico per il DNA. Ciò non esclude l'uso di coloranti convenzionali (per esempio Giemsa). Si possono usare anche altri sistemi [per esempio colonne di cellulosa per la rimozione delle cellule nucleate (16)], se ne è provata l'efficacia per la preparazione dei micronuclei in laboratorio.

1.5.7. Analisi La percentuale degli eritrociti immaturi rispetto al totale (immaturi + maturi) viene determinata per ciascun animale contando in tutto almeno 200 eritrociti per il midollo osseo e 1000 per il sangue periferico (17). Tutti i vetrini, compresi i controlli positivi e negativi, devono essere codificati indipendentemente prima dell'esame al microscopio. Si esaminino almeno 2000 eritrociti immaturi per animale per determinare la frequenza degli eritrociti immaturi micronucleati. Informazioni ulteriori si possono ottenere dal conteggio dei micronuclei negli eritrociti maturi. Nell'analisi dei vetrini, la proporzione degli eritrociti immaturi sugli eritrociti totali non deve essere inferiore al 20 % del valore dei controlli. Quando gli animali sono trattati in continuo per 4 settimane o più, si può anche determinare la frequenza degli eritrociti con micronuclei su almeno 2000 eritrociti maturi per animale. In alternativa alle tecniche manuali, si possono accettare sistemi di analisi automatica (analisi dell'immagine e citometria a flusso continuo su cellule in sospensione), se adeguatamente motivati e di provata efficacia.

2. DATI

2.

2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI I dati relativi a ciascun animale vanno presentati sotto forma di tabella. L'unità sperimentale è l'animale. Il numero degli eritrociti immaturi e degli di eritrociti immaturi con micronuclei, nonché la percentuale degli eritrociti immaturi, devono essere elencati separatamente per ciascun animale. Quando gli animali sono trattati in continuo per 4 settimane o più, si forniscano anche i dati relativi agli eritrociti maturi, se sono stati rilevati. Si indichi per ciascun animale la percentuale degli eritrociti immaturi sul totale e, se ritenuta utile, la percentuale degli eritrociti micronucleati. Se non c'è un'evidente differenza di risposta tra i sessi, i dati dei due sessi possono essere combinati nell'analisi statistica.

2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, per esempio un aumento correlato alla dose somministrata del numero di cellule contenenti micronuclei, o un evidente aumento del numero di cellule contenenti micronuclei nei campioni prelevati alla medesima fase di campionamento e provenienti da un gruppo cui è stata somministrata la stessa dose. Si consideri per prima cosa la rilevanza dei risultati dal punto di vista biologico. Si possono usare metodi statistici come ausilio nella valutazione dei risultati sperimentali (18) (19), ma la significatività statistica non dovrebbe essere l'unico fattore determinante di una risposta positiva. Eventuali risultati ambigui possono essere chiariti mediante test ulteriori, preferibilmente in condizioni sperimentali modificate. Una sostanza che fornisca risultati non corrispondenti ai criteri di cui sopra è considerata non mutagena in questo test. La maggior parte degli esperimenti fornirà indubbiamente risultati chiaramente positivi o negativi ma occasionalmente i dati ottenuti non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull'azione della sostanza in esame. I risultati possono rimanere ambigui nonostante l'esperimento venga ripetuto più volte. Risultati positivi del saggio significano che la sostanza induce la formazione di micronuclei, che sono il risultato di un danno cromosomico o di un danno all'apparato mitotico negli eritroblasti della specie in esame. Risultati negativi indicano che, nelle condizioni di esperimento, la sostanza in esame non produce micronuclei negli eritrociti immaturi della specie in esame. Si vagli la possibilità che la sostanza in esame o i suoi metaboliti entrino in circolo o raggiungano specifica-mente il tessuto bersaglio (tossicità sistemica).

3. RELAZIONE

3. RELAZIONE SUL SAGGIO

La relazione deve comprendere le seguenti informazioni:

Solvente/mezzo disperdente:

motivazione della scelta del mezzo disperdente,

solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo disperdente, se noto.

Animali da laboratorio:

specie/ceppo usato,

numero, età e sesso degli animali,

provenienza, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.,

peso dei singoli animali all'inizio degli esperimenti, con range, valore medio e deviazione standard per ciascun gruppo.

Condizioni di esperimento:

controlli positivi e negativi (mezzo disperdente/solvente),

risultati dello studio per individuare l'intervallo di dosi, se effettuato,

criteri di selezione delle dosi,

illustrazione particolareggiata della preparazione della sostanza in esame,

illustrazione particolareggiata della somministrazione della sostanza in esame,

criteri di selezione della via di somministrazione,

metodi usati per verificare che la sostanza in esame sia entrata in circolo o abbia raggiunto il tessuto ber saglio, se del caso,

conversione della concentrazione (ppm) della sostanza in esame nel cibo o nell'acqua potabile nella dose effettiva (mg/kg di peso corporeo/giorno), se del caso,

dettagli relativi alla qualità del cibo e dell'acqua,

descrizione dettagliata dei protocolli di trattamento e campionamento,

metodi di preparazione dei vetrini,

metodi di misura della tossicità,

criteri di conteggio degli eritrociti immaturi contenenti micronuclei,

numero di cellule analizzate per animale,

criteri in base a cui i risultati sono giudicati positivi, negativi o ambigui.

Risultati:

segni di tossicità,

proporzione degli eritrociti immaturi sugli eritrociti totali,

numero di eritrociti immaturi contenenti micronuclei per animale,

media ± deviazione standard degli eritrociti immaturi contenenti micronuclei per gruppo,

relazione dose-risposta, se possibile,

analisi statistiche e metodi applicati,

controlli negativi paralleli e in letteratura,

controlli positivi paralleli.

— Discussione dei risultati.

— Conclusioni.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)

BIBLIOGRAFIA Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15. Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61-118. Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80. MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N., and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya, Elsevier, Amster dam, pp., 555-558. MacGregor, J. T., Heddle, J. A., Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R. and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronu cleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245. pp. 245-249. The Collaborative Study Group for thè Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peri pheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Col laborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-terni mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 153-159. Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), In Vivo, Rodent Ery- throcyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293-304. Higashikuni, N. and Sutou, S, (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313-319. Fielder, R.)., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe,]., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson- Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247. MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, pp, 269-275. Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104. Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97-99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures,UK.EMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Pap- worth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kir- kland (ed.), .Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

B.13/14. MUTAGENICITÀ — TEST DI REVERSIONE SU BATTERI

B.13/14.

1. METODO Il metodo è ripreso dal metodo OECD TG 471 Bacterial Reverse Mutation Test (1997).

1.

1.1. INTRODUZIONE I1 saggio di retromutazione su batteri utilizza ceppi di Salmonella typhimurium e Escherichia coli auxotrofi nei confronti di un amminoacido per identificare mutazioni puntiformi che implicano sostituzione, addizione o delezione di una o più paia di basi del DNA (1) (2) (3). Il principio su cui è basato questo saggio è la sua capacità di rivelare, nei ceppi sperimentali, retromutazioni che ripristinano la capacità funzionale dei batteri di sintetizzare un amminoacido essenziale. I batteri retromutanti sono individuati in base alia capacità di crescere in assenza dell'amminoacido di cui ha invece bisogno il ceppo sperimentale progenitore. Le mutazioni puntiformi sono causa di molte malattie genetiche umane e vi sono prove concrete che mutazioni puntiformi in oncogeni e geni soppresori dei tumori di cellule somatiche sono implicate nella comparsa delle neoplasie umane come in quelle sperimentalmente indotte negli animali da laboratorio. Il saggio di retro-mutazione batterica è rapido, poco costoso e relativamente facile da eseguire. Molti ceppi sperimentali presentano caratteristiche che le rendono più sensibili per l'identificazione di mutazioni, in particolare sequenze di DNA sensibili nei siti di reversione, maggior permeabilità cellulare per le grandi molecole e assenza dei sistemi di riparazione del DNA, o rafforzamento dei sistemi soggetti a errore. La specificità dei ceppi sperimentali può fornire informazioni utili sul tipo di mutazioni indotte da agenti genotossici. Per i testi di retromutazione batterica esiste una vastissima base dati, che contiene i risultati per una grande varietà di strutture e sono stati sviluppati metodi ormai classici per l'analisi chimica di prodotti con proprietà chimico-fisiche diverse, compresi i composti volatili. Vedi anche introduzione generale parte B.

1.2. DEFINIZIONI Un test di reversione in Salmonella typhimurium o Escherichia coli rivela in un ceppo auxotrofo, che necessita l'apporto di un amminoacido (rispettivamente istidina o triptofano), una mutazione che lo trasforma in un ceppo che non necessita l'apporto dell'amminoacido. Mutageni che provocano la sostituzione di coppie di basi sono agenti che provocano un cambiamento di basi nel DNA. In un test di reversione questo cambiamento può verificarsi nel sito della mutazione originale o in un altro sito del genoma batterico. Mutageni che provocano la mutazione della fase di lettura sono agenti che provocano l'inserzione o la delezione di una o più basi nel DNA, modificando cosi la fase di lettura nell'RNA.

1.3. CONSIDERAZIONI INIZIALI Nel saggio di reversione batterica si usano cellule procariote, che differiscono dalle cellule dei mammiferi in fattori come l'assorbimento, il metabolismo, la struttura cromosomica e i meccanismi di riparazione del DNA. I test in vitro richiedono in genere una fonte esogena di attivazione metabolica, i sistemi di attivazione metabolica in vitro non sono in grado di simulare perfettamente le condizioni in vivo nei mammiferi. Il test, pertanto, non fornisce informazioni dirette sul potenziale mutageno e cancerogeno di una sostanza nei mammiferi. Il saggio di reversione batterica è comunemente impiegato come prima tappa per individuare l'azione genotossica e, in particolare, la capacità di indurre mutazioni puntiformi. Numerosi dati dimostrano che molte sostanze chimiche che risultano positive a questo saggio presentano attività mutagena anche in altri test. Vi sono esempi di agenti mutageni che non sono rivelati da questo test; le ragioni di questi insuccessi possono essere ricondotte alla natura specifica della mutazione, a differenze di attivazione metabolica o a differenze di biodisponibilità. D'altra parte, i fattori che aumentano la sensibilità del test possono indurre a sopravvalutare l'azione mutagena. Il test di retromutazione batterica può non essere adatto per la valutazione di alcune classi di sostanze chimiche, per esempio i composti fortemente battericidi (come alcuni antibiotici) e quelli di cui si suppone (o si sa) che interferiscano specificamente con il sistema di moltiplicazione cellulare nei mammiferi (per esempio, alcuni inibitori delle topoisomerasi e alcuni analoghi di nucleosidi). In tali casi possono essere più adeguati test su mammiferi. Molti composti che risultano positivi al test sono cancerogeni nei mammiferi, tuttavia la correlazione non è assoluta: dipende dalla classe chimica. Inoltre vi sono cancerogeni che non sono rivelati da questo saggio, perché agiscono con meccanismi diversi, non genotossici, o con meccanismi assenti nelle cellule batteriche.

1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO Le cellule batteriche in sospensione sono esposte alla sostanza in esame in presenza e in assenza di un sistema esogeno di attivazione metabolica. Nel metodo di incorporazione su piastra, tali sospensioni sono miscelate con un agar di copertura e piastrate immediatamente su terreno minimo. Nel metodo di preincubazione, il composto di trattamento è posto in incubazione, mescolato ad un agar di copertura, poi piastrato su terreno minimo. In entrambe le tecniche, dopo due o tre giorni di incubazione si contano le colonie revertanti e se ne confronta il numero con quello delle colonie revertanti spontanee su piastre di controllo esposte al solo solvente. Per i test di reversione batterica sono state descritte varie procedure. Quelle più comunemente usate sono: il metodo di incorporazione su piastra (1) (2) (3) (4), il metodo di preincubazione (2) (3) (5) (6) (7) (8), il metodo di fluttuazione (9) (10) e il metodo di sospensione (11). Sono state descritte modifiche per i test su gas o vapori (12). Le procedure descritte riguardano principalmente i metodi di incorporazione su piastra e di preincubazione. Sono entrambi ammissibili per l'esecuzione di esperimenti con e senza attivazione metabolica. Per alcune sostanze è più efficace il metodo di preincubazione. Si tratta di sostanze appartenenti alle classi chimiche che includono le nitrosammine alifatiche a catena corta, i metalli bivalenti, a aldeidi, i coloranti azoici e i composti diazoici, gli alcaloidi pirollizidinici, i composti allilici e i nitrocomposti (3). È noto anche che alcune classi di mutageni non sono sempre identificabili con procedure standard come il metodo di incorporazione su piastra o il metodo di preincubazione. Devono essere considerate casi speciali e si raccomanda vivamente di usare altri metodi di rilevazione. Sono stati identificati i seguenti casi speciali (con esempi di possibili metodi di rilevazione): coloranti azoici e composti diazoici (3) (5) (6) (13), gas e sostanze chimiche volatili (12) (14) (15) (16) e glicosidi (17) (18). Le deviazioni dalla procedura standard devono essere scientificamente motivate.

1.5. DESCRIZIONE DEL METODO

1.5.

1.5.1. Preparazioni

1.5.1.

1.5.1.1. Butteri Si lascino sviluppare le colture fresche di batteri fino alla fase esponenziale tardiva o alla fase stazionaria precoce (approssimativamente 109 cellule per ml). Non si usino colture in fase stazionaria tardiva. E essenziale che le colture usate nell'esperimento contengano un titolo elevato di batteri vitali. Il titolo può essere provato sulla base di dati di controllo precedenti sulle curve di crescita, oppure, nei singoli saggi, determinando il numero di cellule vitali mediante un test di piastramento. La temperatura di incubazione raccomandata è di 37 oC. Si usino almeno cinque ceppi di batteri, tra cui quattro ceppi di S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 o TA97a o TA97; TA98; e TA100) la cui affidabilità è provata e che forniscono risposte riproducibili. I ceppi di S. typhimurium contengono paia di basi GC sul sito di reversione primario ed è noto che non permettono di identificare alcuni mutageni ossidanti, agenti che provocano cross-linking e idrazine. Tali sostanze possono essere individuate con ceppi di E. coli YVP2 o da S. typhimurium TA102 (19) che hanno una coppia di basi AT sul sito di reversione primaria. La combinazione di ceppi raccomandata è pertanto: Al fine di rilevare mutageni che provocano cross-linking, può essere preferibile includere TA102 o aggiungere un ceppo di E. coli con sistema di riparazione del DNA privo di errore [per esempio, E. coli WP2 o E. Coli WP2 (pKM101)] Si usino metodi di provata validità per la preparazione delle colture primarie, la verifica dei marcatori e la conservazione. La necessità dell'amminioacido in supplemento nutritivo per la crescita deve essere dimostrata per ciascuna delle colture congelate (istidina per ceppi di S. typhimurium, e triptofano per ceppi di E. coli). Si controllino anche altre caratteristiche fenotipiche, e cioè: la presenza o l'assenza di plasmidi R [resistenza all'ampicillina nei ceppi TA98, TA100 e TA97a o TA97, WP2 uvtA e WP2 uvrA (pKM101), e resistenza a ampicillina + tetraciclina nel ceppo TA102], se del caso; la presenza di mutazioni caratteristiche (cioè la mutazione rfa in S. typhimurium attraverso la sensibilità al cristalvioletto e la mutazione uvtA in E. coli o la mutazione uvtB in S. typhimurium, attraverso la sensibilità all'ultravioletto) (2) (3). I ceppi devono produrre un certo numero di colonie retromutanti spontanee per piastra, situato entro il range di frequenze rapportato ai valori precedenti ottenuti nel laboratorio e, possibilmente, ai valori del range riportati in letteratura.

S. typhimurium TA1535, e

S. typhimurium TA1537 o TA97 o TA97a, e

S. typhimurium TA98, e

S. typhimurium TA100, e

E. coli WP2 uvrA. o E. coli WP2 uvtA (pKM101), o S. typhimurium Ta102.

1.5.1.2. Terreno di coltura Si usi una minima quantità di agar adeguato (per esempio contenente una minima quantità di terreno E di Vogel-Bonner e glucosio) e un agar di copertura contenente istidina e biotina o triptofano, tale da permettere un certo numero di divisioni cellulari (1) (2) (9).

1.5.1.3. Attivazione metabolica i batteri dovrebbero essere esposti alla sostanza in esame sia in presenza che in assenza di un adeguato sistema di attivazione metabolica. Il sistema più comunemente usato è una frazione post-mitocondriale integrata di cofattore (S9), prelevata dal fegato di roditori trattati con induttori enzimatici come Aroclor 1254 (1) (2), o una combinazione di fenobarbitone e β-naftoflavone (18) (20) (21). La frazione post-mitocondriale viene usata di solito a concentrazioni comprese fra 5 e 30 % v/v nel composto S9. La scelta e le condizione di un sistema di attivazione metabolica dipendono dalla classe chimica della sostanza in esame. In alcuni casi può essere opportuno utilizzare più di una concentrazione della frazione post-mitocondriale. Per coloranti azoici e composti diazoici, può essere più adeguato un sistema di attivazione metabolica riduttivo (6) (13).

1.5.1.4. Sostanza in esame/Preparazione Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione in adeguati solventi o mezzi disperdenti e, se necessario, diluite prima del trattamento dei batteri. Le sostanze liquide possono essere aggiunte diretta-mente alla coltura o diluite prima del trattamento. Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano disponibili dati sulla sua stabilità, che dimostrino che la conservazione è accettabile. Il solvente/mezzo disperdente non deve reagire chimicamente con la sostanza in esame e deve essere compatibile con la sopravvivenza dei batteri e con l'attività di S9 (22). L'uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilità. Si raccomanda di prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l'uso di un solvente/mezzo disperdente acquoso. Se si procede all'esame di sostanze instabili in acqua, si usino solventi organici anidri.

1.5.2. Condizioni di esperimento

1.5.2.

1.5.2.1. Ceppi sottoposti a test (vedi 1.5.1.1)

1.5.2.2. Concentrazione di esposizione l criteri da considerare per determinare la quantità massima di sostanza da usare sono la citotossicità e la solubilità nel composto di trattamento finale. Può essere utile determinare la tossicità e l'insolubilità in un esperimento preliminare. La citotossicità può essere rivelata da una riduzione del numero di colonie revertanti, dalla comparsa di una crescita anormale del fondo, o dal grado di sopravvivenza delle colture trattate. La citotossicità di una sostanza può risultare alterata in presenza di sistemi di attivazione metabolica. L'insolubilità è dimostrata dalla presenza di un precipitato nel composto finale, visibile ad occhio nudo nelle condizioni di esperimento effettive. La concentrazione massima raccomandata per sostanze non citotossiche solubili è di 5 mg/piastra o 5 μl/piastra. Per sostanze non citotossiche insolubili a 5 mg/piastra o 5 pi/piastra, una o più concentrazioni devono essere insolubili nelle ultime miscele di trattamento. Le sostanze citotossiche a concentrazione inferiori a 5 mg/piastra o 5 μl/piastra devono essere saggiate fino ad una concentrazione citotossica. Il precipitato non deve interferire con la valutazione dei risultati. Si usino almeno cinque diverse concentrazioni analizzabili della sostanza in esame, ad intervalli approssimativamente semilogaritmici (cioè 10) per i primi esperimenti. Per l'analisi della relazione concentrazione-rispo-sta, può essere necessario ridurre gli intervalli. Nella valutazione di sostanze che contengono quantità sostanziali di impurezza potenzialmente mutagene si possono prendere in considerazione concentrazioni superiori a 5 mg/piastra o 5 (il/piastra.

1.5.2.3. Controlli negativi e positivi Ogni test dovrà comportare controlli positivi e negativi (solvente o mezzo disperdente) paralleli, con e senza attivazione metabolica. Per i controlli positivi, si scelgano concentrazioni che dimostrino la validità di ogni test. Quando si usa un sistema di attivazione metabolica, le sostanze per i controlli positivi di riferimento devono essere scelte in funzione del tipo di ceppo batterico. Le seguenti sostanze sono esempi di controlli positivi adatti per saggi con attivazione metabolica: Denominazione Numero CAS Numero Einecs 9,10-dimetilanthracene 781-43-1 212-308-4 7,1 2-dimetilbenz[a]antracene 57-97-6 200-359-5 3enzo[a]pirene 50-32-8 200-028-5 2-amminoantracene 613-13-8 210-330-9 ciclofosfammide 50-18-0 ciclofosfammide monoidrato 6055-19-2 200-015-4 Le seguente sostanza è un controllo positivo adatto per il metodo di attivazione metabolica riduttiva: Denominazione Numero CAS Numero Einecs Congo Red 573-58-0 209-358-4 Il 2-amminoantracene non dovrebbe essere usato come unico indicatore dell'efficacia del composto S9. Se si usa il 2-amminoantracene, si caratterizzi ogni lotto di S9 anche con un mutageno che richiede attivazione metabolica da parte di enzimi microsomiali, per esempio benzo[a]pirene. dimetilbenzantracene. Le seguenti sostanze sono esempi di controlli positivi a specificità di ceppo per esperimenti eseguiti senza sistema di attivazione metabolica esogeno: Denominazione Numero CAS Numero Einecs Ceppo sodio azide 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 e TA 100 2-nitrofluorene 607-57-8 210-138-5 TA 98 9-amminoacridina 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 e TA 97a 1CR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 e TA 97a idroperossido di cumene 80-15-9 201-254-7 TA 102 mitomicina C 50-07-7 200-008-6 WP2uvrA e TA 102 N-ethil-N-nitro-N-nitrosoguanidina 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2uvrA e-WP2uvrA(pKM101) 4-nitrochinolina-l-ossido 56-57-5 200-281-1 WP2. WP2uvrA e-WP2uvrA(pKM101) furilfurammide (AF2) 3688-53-7 ceppi contenenti plasmidi Si possono usare altre adeguate sostanze di riferimento per i controlli positivi. Si usino, se disponibili, sostanze di una classe chimica correlata. Si effettuino anche controlli negativi, usando solo il solvente o il mezzo disperdente sul terreno di coltura: i controlli vanno trattati come le colture che contengono la sostanza oggetto del test. Si proceda inoltre a controlli non trattati, salvo che esistano precedenti dati di controllo che dimostrano che il solvente scelto non induce effetti nocivi o mutageni.

1.5.3. Procedura Per il metodo di incorporazione su piastra (1) (2) (3) (4), senza attivazione metabolica, di norma si mescolano 0,05 ml o 0,1 ml della soluzione, 0,1 ml di coltura batterica fresca (contenente approssimativamente 108 cellule vitali) e 0,5 ml di tampone sterile con 2,0 ml di agar di copertura. Per i test con attivazione metabolica, si mescolano di norma 0,5 ml del composto di attivazione metabolica contenente una quantità adeguata di frazione post-mitocondriale (dal 5 al 30 % v/v) von l'agar di copertura (2,0 ml), i batteri e la sostanza in esame o la soluzione. Il contenuto di ciascuna provetta viene mescolato e piastrato su terreno minimo (agar). Prima dell'incubazione si lascia solidificare l'agar di copertura. Per il metodo di preincubazione (2) (3) (5) (6), la sostanza in esame/soluzione è preincubata con il ceppo batterico (contenente approssimativamente 108 cellule vitali) e con un tampone sterile o con il sistema di attivazione metabolica (0,5 ml), di norma per 20 minuti o più, a 30-37 oC: è quindi mescolata all'agar di copertura e piastrata su terreno minimo (agar). Di norma si mescolano 0,05 o 0,1 ml di sostanza in esame/soluzione, 0,1 ml di batteri e 0,5 ml di composto S9 o di tampone sterile con 2,0 ml di agar di copertura. Durante la preincubazione le provette vanno aerate con un agitatore. Per una valida stima della variazione, si usino piastre in triplo a ciascuna dose. L'uso di piastre in doppio è accettabile se scientificamente motivato. La perdita occasionale di una piastra non invalida necessariamente il test. I test con sostanze gassose o volatili devono essere condotti con metodi adeguati, per esempio in recipienti ermetici (12) (14) (15) (16).

1.5.4. Incubazione Tutte le piastre di un esperimento devono essere poste in incubazione a 37 oC per 48-72 ore; si rilevi quindi il numero di colonie revertanti per piastra.

2. RISULTATI

2.

2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI I dati devono essere presentati come numero di colonie revertanti per piastra. Si fornisca anche il numero di colonie revertanti sulle piastre dei controlli negativi (controllo trattato con solo solvente e controllo non trattato, se effettuato) e positivi. Per la sostanza in esame e per i controlli, positivi e negativi (non trattati o con solo solvente), si indichino le cifre per le singole piastre, il numero medio di colonie revertanti per piastra e la deviazione standard. In caso di risposta inequivocabilmente positiva non sono necessarie verifiche. I risultati ambigui devono essere chiariti mediante prove ulteriori, preferibilmente in condizioni di esperimento modificate. I riusultati negativi devono essere confermati caso per caso. Se non si ritiene necessaria la conferma dei risultati negativi, se ne indichino le ragioni. Nei test successivi si dovrebbero modificare i parametri di studio per estendere la gamma delle condizioni in esame. Fra i parametri modificabili si citano l'intervallo tra le concentrazioni, il metodo di trattamento (incorporazione su piastra o preincubazione in ambiente liquido) e le condizioni di attivazione metabolica.

2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, per esempio un aumento, correlato con la concentrazione, per tutte le concentrazioni sottoposte a esame e/o un aumento riproducibile, ad una o più concentrazioni, del numero di colonie revertanti per piastra per almeno un ceppo, con o senza sistema di attivazione metabolica (23). Si consideri in primo luogo la rilevanza dei risultati dal punto di vista biologico. Si possono usare metodi statistici come ausilio nella valutazione dei risultati sperimentali (24), ma la significatività statistica non dovrebbe essere l'unico fattore determinante di una risposta positiva. Una sostanza che fornisca risultati non corrispondenti ai criteri di cui sopra è considerata non mutagena in questo test. La maggior parte degli esperimenti fornirà indubbiamente risultati palesemente positivi o negativi, ma in alcuni casi i dati ottenuti non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull'azione della sostanza in esame. I risultati possono rimanere ambigui, nonostante l'esperimento venga ripetuto più volte. Risultati positivi del saggio di retromutazione batterica dimostrano che la sostanza induce mutazioni puntiformi per sostituzioni di basi o mutazione della fase di lettura nel genoma di Salmonella typhimurium o Escherichia coli. Risultati negativi indicano che, nelle condizioni di test, la sostanza in esame non induce mutazioni nella specie sottoposta al test.

3. RELAZIONE

3. RELAZIONE SUL SAGGIO

La relazione dovrà contenere le seguenti informazioni:

Solvente/mezzo disperdente:

motivazione della scelta del solvente/mezzo disperdente;

solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo disperdente, se nota.

Ceppi:

ceppi usati:

numero per cellule per coltura:

caratteristiche dei ceppi.

Condizioni di esperimento:

quantità della sostanza in esame per piastra (mg/piastra o (μl/piastra/e criteri di selezione della concentrazione e del numero di piastre per concentrazione;

terreni usati;

tipo e composizione del sistema di attivazione metabolica, criteri di accettabilità;

procedura di trattamento.

Risultati:

segni di tossicità,

segni di precipitazione,

conteggi per le singole piastre,

numero medio di colonie revertanti per piastra e deviazione standard,

relazione dose-risposta, se possibile,

eventuali analisi statistiche,

dati sui controlli paralleli negativi (solvente/mezzo disperdente) e positivi, con intervalli, medie e devia zioni standard,

dati sui controlli negativi (solvente/mezzo disperdente) e positivi precedenti, con intervalli, medie e devia zioni standard.

Discussione dei risultati

Conclusioni.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)

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B.15 SAGGIO DI MUTAGENESI E PRESCREENING DI CANCEROGENESI MUTAZIONE GENICA: SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.15

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

1.2. DEFINIZIONI Vedi introduzione generale, parte B.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO Per misurare l'induzione di mutazioni geniche indotte da agenti chimici, con e senza attivazione metabolica, può essere fatto uso di una varietà di ceppi aploidi e diploidi del lievito Saccharomyces cerevisiae. Sono stati utilizzati sistemi di mutazione in avanti in ceppi aploidi, come la misura della mutazione da mutanti rossi, richiedenti adenina (ade-I, ade-2), a doppi mutanti bianchi richiedenti adenina; e sistemi selettivi come l'induzione della resistenza alla canavanina. Il sistema di retromutazione più largamente convalidato comporta l'uso del ceppo aploide XV 185-14C che porta le mutazioni di tipo senza senso (ochre) ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 e trp 5-48, le quali possono essere revertite da mutageni che inducono sostituzioni di base nel sito specifico o mutazioni che sopprimono ochre. Il ceppo XV 185-14C porta altresi il marcatore his 1-7, mutazione di tipo senso sbagliato revertita principalmente da mutazioni nel secondo sito, e il marcatore hom 3-10 che viene revertito da mutageni che inducono mutazioni del tipo inserzione-delezione. Fra i ceppi diploidi del S. cerevisiae il solo largamente convalidato è il ceppo D7, omozigote per ilv 1-92.

1.5. CRITERI QUALITATIVI Nessuno.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.6. Preparati

È opportuno preparare le soluzioni delle sostanze in esame e dei composti di controllo o di riferimento, servendosi di un veicolo appropriato, al momento dell'effettuazione del test. Con i composti organici non solubili in acqua si devono usare soluzioni di solventi organici quali l'etanolo, l'acetone e il dimetilsolfossido (DMSO) a non più del 2 % in volume (v/v). La concentrazione finale del solvente non dovrebbe influenzare in modo significativo la vitalità cellulare e le caratteristiche di crescita.

Attivazione metabolica

Le cellule vanno esposte alle sostanze in esame sia in presenza che in assenza di un sistema appropriato di attivazione metabolica esogena. Il sistema più comunemente usato è una frazione postmitocondriale integrata con cofattori, ottenuta dai fegati di roditori pretrattati con agenti che inducono enzimi. Per l'attivazione metabolica può essere appropriato anche l'uso di altre specie, di altri tessuti, di altre frazioni postmitocondriali o di altri procedimenti.

Condizioni di effettuazione del saggio

Ceppi

I ceppi più largamente usati negli studi sulle mutazioni geniche sono il ceppo aploide XV 185-14C e il ceppo diploide D7. Possono essere appropriati anche altri ceppi.

Terreni di coltura

Per la determinazione della sopravvivenza delle cellule e del numero dei mutanti è fatto uso di terreni di coltura appropriati.

Uso di controlli negativi e positivi

È opportuno procedere in parallelo a controlli positivi, non trattati e con il solo solvente. Per ciascun evento genetico specifico vanno usate appropriate sostanze di controllo positivo.

Concentrazioni

Occorre far uso di almeno 5 concentrazioni adeguatamente intervallate della sostanza in esame. Per le sostanze tossiche la concentrazione più elevata usata nel test non deve ridurre la sopravvivenza a meno del 5-10 %. Le sostanze relativamente insolubili in acqua vanno saggiate fino al loro limite di solubilità secondo procedimenti appropriati. Per le sostanze non tossiche completamente solubili in acqua la concentrazione massima va determinata caso per caso.

Condizioni di incubazione

Le piastre vengono incubate per 4-7 giorni a temperatura da 28o a 30 oC nell'oscurità.

Frequenze delle mutazioni spontanee

È opportuno usare subcolture con frequenze delle mutazioni spontanee entro i limiti accettati come normali.

Numero delle repliche

Per la determinazione dei prototrofi che si inducono per mutazione genica e della sopravvivenza cellulare è opportuno fare uso di almeno tre piastre di replica per concentrazione. Nel caso di esperimenti nei quali si usino marcatori a bassa frequenza di mutazione, quali hom 3-10, per poter ottenere dati aventi rilevanza statistica è necessario aumentare il numero delle piastre.

Procedimento

Il trattamento dei ceppi di S. cerevisiae viene normalmente effettuato secondo un procedimento di test in sospensione liquida con impiego di cellule quiescenti o in crescita. Gli esperimenti iniziali dovrebbero essere condotti su cellule in crescita. Si espongono alla sostanza in esame per una durata fino a 18 ore a temperatura da 28o a 37 oC e in agitazione 1-5 X 1O7 cellule/mi; in casi opportuni, nel corso del trattamento si aggiunge una quantità adeguata di un sistema di attivazione metabolica. Al termine del trattamento si procede alla centrifugazione ed al lavaggio delle cellule ed alla loro semina su un terreno di coltura appropriato. Dopo incubazione si analizzano le piastre per la determinazione della sopravvivenza e dell'induzione della mutazione genica. Se il primo esperimento è negativo il secondo esperimento dovrebbe essere condotto su cellule quiescenti; se il primo esperimento è positivo, viene confermato in un appropriato esperimento indipendente.

2. DATI 1 dati devono essere presentati in forma di tabelle, con indicazione del numero delle colonie contate, del numero di mutanti, della sopravvivenza e della frequenza dei mutanti. Tutti i risultati devono essere confermati in un esperimento indipendente. I dati devono essere stabiliti secondo metodi statistici appropriati.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:

ceppo usato,

condizioni di effettuazione del test: cellule in fase stazionaria o in crescita, composizione dei terreni, temperatura e durata dell'incubazione, sistemi di attivazione metabolica,

condizioni del trattamento: livelli di esposizione, procedimento e durata del trattamento, temperatura di trattamento, controlli positivi e negativi,

numero delle colonie contate, numero di mutanti, sopravvivenza e frequenza dei mutanti, relazione dose/risposta se disponibile, valutazione statistica dei dati,

discussione dei risultati,

interpretazione dei risultati.

3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

4. RIFERIMENTI Vedi introduzione generale, parte B.

B.16 RICOMBINAZIONE MITOTICA: SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.16

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

1.2. DEFINIZIONI Vedi introduzione generale, parte B.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO La ricombinazione mitotica in Saccharomyces cerevisiae può essere rilevata fra geni (o in linea più generale fra un gene e il suo centromero) e all'interno dei geni. La prima delle due eventualità è denominata crossing-over mitotico e genera prodotti reciproci, mentre la seconda eventualità è per lo più non reciproca ed è denominata conversione genica. Il crossing-over viene generalmente determinato mediante la produzione di colonie o settori recessivi omozigoti in un ceppo eterozigote, mentre la conversione genica viene determinata attraverso la produzione di revertanti prototrofici in un ceppo auxotrofico eteroallelomorfo portante due diversi alleli del medesimo gene. I ceppi più comunemente usati per la rilevazione della conversione genica mitotica sono i ceppi D4 (eteroallelomorfo irí ade 2 e trp5),D7 (eteroallelomorfo in trp 5),BZ34 (eteroallelomorfo in arg 4)e JDl (eteroallelomorfo in his 4 e trp 5). Il crossing-over mitotico producente settori omozigoti di colore rosso e rosa può essere determinato nel ceppo D5 o in D7 (che misura anche la conversione genica mitotica e la retromutazione in ilv 1-92), essendo entrambi i ceppi eteroallelomorfi per alleli complementanti di ade 2.

1.5. CRITERI QUALITATIVI Nessuno.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.6. Preparazioni

È opportuno preparare le soluzioni della sostanza in esame e dei composti di controllo o di riferimento, facendo uso di un solvente appropriato, al momento di procedere all'effettuazione del test. Con i composti organici non solubili in acqua è opportuno usare solventi organici come l'etanolo, l'acetone e il dimetilsolfossido (DMSO) a non più del 2 % (v/v). La concentrazione finale del solvente non dovrebbe alterare significativamente la vitalità cellulare e le caratteristiche di crescita.

Attivazione metabolica

Le cellule devono essere esposte alle sostanze in esame sia in presenza che in assenza di un sistema appropriato di attivazione metabolica esogena. Il sistema più comunemente usato è una frazione postmitocondriale supplementare con cofattori e ottenuta dai fegati di roditori pretrattati con agenti che inducono enzimi. Per l'attivazione metabolica può essere appropriato anche l'impiego di altre specie, di altri tessuti, di altre frazioni postmitocondriali o di altri procedimenti.

Condizioni sperimentali

Ceppi

I ceppi più frequentemente usati sono i ceppi diploidi D4, D5, D7, e JD1. Può essere appropriato anche l'impiego di altri ceppi.

Terreni di coltura

Per la determinazione della sopravvivenza e della frequenza della ricombinazione mitotica si devono usare terreni di coltura appropriati.

Uso di controlli negativi e positivi

È opportuno effettuare in parallelo controlli positivi, controlli non trattati o trattati con solo solvente. Per ciascun tipo specifico di ricombinazione devono essere usate le appropriate sostanze di controllo positivo.

Concentrazioni

È opportuno fare uso di almeno cinque concentrazioni della sostanza in esame adeguatamente intervallate. Tra i fattori da prendere in considerazione vi sono la citotossicità e la solubilità. La concentrazione più bassa non deve produrre alcun effetto sulla vitalità cellulare. Per le sostanze tossiche, la più alta concentrazione saggiata non deve ridurre la sopravvivenza a meno del 5-10 %. Le sostanze relativamente insolubili in acqua devono essere saggiate fino al loro limite di solubilità secondo procedimenti appropriati. Per le sostanze non tossiche altamente solubili in acqua la concentrazione massima del test va determinata caso per caso. Le cellule possono essere esposte alle sostanze in esame in fase stazionaria o in fase di crescita per periodi fino a 18 ore. Nel caso di tempi di trattamento prolungati occorre tuttavia accertare mediante esame microscopico che nelle culture non vi sia formazione di spore, la cui presenza invaliderebbe il test.

Condizióni di incubazione

Le piastre vengono incubate nell'oscurità per 4-7 giorni a temperatura da 28 o a 30 oC. Le piastre usate per l'analisi dei settori omozigoti di colore rosso e roseo derivanti dal crossing-over mitotico vanno tuttavia tenute in frigorifero (4 oC) per un altro ciclo di uno o due giorni prima dell'analisi, per dare tempo allo sviluppo del pigmento nelle colonie ricombinanti.

Frequenze della ricombinazione mitotica spontanea

È opportuno usare subcolture con frequenze di ricombinazione mitotica spontanea entro i limiti accettati come normali.

Numero delle repliche

Per la determinazione dei prototrofi prodotti dalla conversione genica mitotica e per quella della sopravvivenza è opportuno fare uso di un minimo di tre piastre di replica per concentrazione. Nella determinazione della omozigosi recessiva derivante dal crossing-over mitotico il numero delle piastre va aumentato in modo da ottenere un numero adeguato di colonie.

Procedimento

Il trattamento dei ceppi di S. cerevisiae viene normalmente effettuato in un procedimento di test in sospensione liquida con cellule in fase stazionaria o in fase di crescita. Esperimenti iniziali dovrebbero essere condotti su cellule in fase di crescita. Si espongono alla sostanza in esame per una durata fino a 18 ore a temperatura da 28 o a 37 oC con scuotimento 1-5 × 107 cellule/mi; nel corso del trattamento, nei casi opportuni si aggiunge una quantità adeguata di un sistema di attivazione metabolica. Al termine del trattamento si procede alla centrifugazione ed al lavaggio delle cellule ed alla loro semina su un terreno di coltura appropriato. Dopo l'incubazione si analizzano le piastre per la determinazione della sopravvivenza e dell'induzione della ricombinazione mitotica. Se il primo esperimento è negativo il secondo dovrebbe essere eseguito su cellule quiescenti; se il primo esperimento è positivo, il secondo viene confermato in un esperimento indipendente appropriato.

2. DATI I dati devono essere presentati in forma di tabelle, con indicazione del numero dei ricombinanti, della sopravvivenza e della frequenza dei ricombinanti. Tutti i risultati devono essere confermati in un esperimento indipendente. I dati vanno stabiliti per valutazione secondo metodi statistici appropriati.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile;

ceppo usato,

condizioni di effettuazione del test: cellule in fase stazionaria o di crescita, composizione dei terreni, temperatura e durata dell'incubazione, sistemi di attivazione metabolica,

condizioni del trattamento: concentrazione di esposizione, procedimento e durata del trattamento, tempera tura di trattamento, controlli positivi e negativi,

numero di colonie contate, numero dei ricombinanti, frequenza della sopravvivenza e della ricombinazione, relazione dose/risposta se possibile, valutazione statistica dei dati,

discussione dei risultati,

interpretazione dei risultati.

3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

4. RIFERIMENTI Vedi introduzione generale, parte B.

B.17. MUTAGENICITÀ — TEST IN VITRO DI MUTAZIONE GENICA SU CELLULE DI MAMMIFERO

B.17.

1. METODO Il metodo è ripreso dal metodo OECD TG 476, In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997).

1.

1.1. INTRODUZIONE Il test in vitro di mutazione genica su cellule di mammifero permette di identificare mutazioni geniche indotte da sostanze chimiche. Fra le linee cellulari adeguate si citano le cellule di linfoma di topo L5178Y, le linee CHO, CHO-AS52 e V79 di cellule di criceto cinese, le cellule linfoblastoidi umane TK6 (1). In queste linee cellulari di norma si misurano le mutazioni sui loci della timidina chinasi (TK) e dell'ipoxantina-guanina fosfori-bosil trasferasi (HPRT) e su un transgene della xantina-guanina fosforibosil trasferasi (XPRT). 1 saggi di mutazione TK, HPRT e XPRT rivelano varie categorie di fenomeni genetici. La posizione autosomica di TK e XPRT può permettere di individuare effetti genetici (per esempio grandi delezioni) non individuati sul locus HPRT dei cromosomi X (2) (3) (4) (5) (6). Nel test in vitro di mutazione genica su cellule di mammifero si possono usare colture di linee cellulari stabilizzate o ceppi cellulari. Le cellule sono scelte in base alla capacità di crescita in coltura e alla stabilità della frequenza di mutazioni spontanee. I saggi in vitro richiedono in generale l'uso di una fonte esogena di attivazione metabolica. Tale sistema di attivazione metabolica non può simulare perfettamente le condizioni in vivo nel mammifero. Si evitino condi zioni che porterebbero a risultati che non riflettono una mutagenicità intrinseca. Risultati positivi che non riflettono una mutagenicità intrinseca possono avere origine da cambiamenti di pH e di osmolalità o da ele vati livelli di citotossicità (7). II saggio è usato per individuare potenziali mutageni e cancerogeni per i mammiferi. Molti composti positivi a questo test sono cancerogeni per i mammiferi, tuttavia la correlazione non è assoluta, ma dipende dalla classe chimica: vi sono sempre più elementi che inducono a ritenere che esistono cancerogeni che non sono rivelati da questi test perché sembrano agire attraverso altri meccanismi, non genotossici. Cfr. anche Introduzione generale parte B.

1.2. DEFINIZIONI Mutazione in avanti: una mutazione genica in cui dal tipo parentale alla forma mutante si ha alterazione o perdita dell'attività enzimatica o della funzione della proteina codificata. Mutageni che provocano la sostituzione di coppie di basi: sostanze che provocano la sostituzione di una o più coppie di basi del DNA. Mutageni che provocano la mutazione della fase di lettura: Sostanze che provocano l'inserzione o la delezione di una o più coppie di basi nella molecola di DNA. Tempo di espressione fenotipica: il periodo durante il quale i prodotti genici inalterati scompaiono dalle cellule recentemente mutate. Frequenza dei mutanti: numero di cellule mutanti diviso per il numero di cellule vitali. Crescita totale relativa: aumento del numero di cellule nel tempo, in confronto con una popolazione di cellule di controllo: si calcola moltiplicando la crescita in sospensione rispetto al controllo negativo per l'efficienza di clonazione del controllo negativo. Crescita relativa in sospensione: aumento del numero di cellule nel corso del periodo di espressione rispetto al controllo negativo. Vitalità: l'efficienza di clonazione delle cellule trattate al momento del piastramento in condizioni selettive dopo il periodo di espressione. Sopravvivenza: l'efficienza di clonazione delle cellule trattate al momento del piastramento, al termine del trattamento; il tasso di sopravvivenza viene espresso di solito in relazione alla sopravvivenza della popolazione di cellule di controllo.

1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO Le cellule carenti di timidina chinasi (TK) a causa della mutazione TK+/- —> TK-/- sono resistenti agli effetti citotossici dell'analogo pirimidinico trifluorotimidina (TFT). Le cellule capaci di produrre la timidina chinasi sono sensibili alla TFT, che provoca l'inibizione del metabolismo cellulare e arresta la divisione cellulare. Di conseguenza, le cellule mutanti sono in grado di proliferare in presenza di TFT, mentre le cellule normali, che contengono timidina chinasi, non lo sono. Analogamente le cellule carenti di HPRT o XPRT sono selezionate in base alla resistenza alla 6-tioguanina (TG) o alla 8-azaguanina (AG). Le proprietà della sostanza in esame devono essere studiate accuratamente quando in uno dei test di mutazione genica su cellule di mammifero si sperimenta un analogo di una base o un composto correlato all'agente selettivo. Per esempio, è necessario controllare la sospetta tossicità selettiva della sostanza in esame nei confronti di cellule mutanti e non mutanti. Quando sono sottoposte a test sostanze chimiche strutturalmente correlate all'agente selettivo (8). deve quindi essere confermata l'efficacia del sistema o dell'agente selettivo. Le cellule in sospensione o in coltura monostrato sono esposte alla sostanza in esame, con e senza attivazione metabolica, per un tempo adeguato, poi reinoculate per determinare la citotossicità e permettere l'espressione fenotipica prima della selezione dei mutanti (9) (10) (11) (12) (13). La citotossicità è determinata di norma misurando l'efficacia relativa di clonazione (sopravvivenza) o la crescita totale relativa delle colture dopo il trattamento. Le colture trattate sono mantenute nel terreno di coltura per un periodo sufficiente, specifico per ciascun locus e tipo cellulare, per permettere l'espressione fenotipica ottimale delle mutazioni indotte. La frequenza di mutanti è determinata mediante inseminazione di un numero noto di cellule in terreno contenente l'agente selettivo, per rilevare le cellule mutanti, e in terreno non contenente l'agente selettivo, per determinare l'efficacia di clonazione (vitalità). Dopo un adeguato periodo di incubazione le colonie sono contate. La frequenza dei mutanti è costituita dal rapporto tra il numero di colonie mutanti nel terreno selettivo e in quello non selettivo.

1.4. DESCRIZIONE DEL METODO

1.4.

1.4.1. Preparazioni

1.4.1.

1.4.1.1. Cellule I tipi di cellule adatti sono molti, per esempio i subcloni delle cellule L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 o TK6. Le cellule usate per questo test devono essere notoriamente sensibili ai mutageni chimici e presentare elevata efficienza di clonazione e frequenza stabile delle mutazioni spontanee. Si controlli che non siano contaminate da micoplasma: non si usino i ceppi contaminati. Il test deve essere impostato in modo da avere sensibilità ed efficacia predeterminate. Il numero di cellule, di colture e di concentrazioni della sostanza in esame deve riflettere tali parametri predefiniti (14). Ad ogni sta dio del test il numero minimo di cellule vitali che sopravvivono al trattamento deve essere basato sulla fre quenza delle mutazioni spontanee. Come regola generale si può usare un numero di cellule pari almeno al decuplo dell'inverso della frequenza di mutazioni spontanee. Si raccomanda comunque di utilizzare almeno 106 cellule. Dovrebbero essere disponibili risultati di precedenti esperienze sul sistema cellulare, che indichino che le prestazioni del test sono costanti.

1.4.1.2. Terreni e condizioni di coltura Si usino adeguati terreni di coltura e condizioni di incubazione (recipienti di coltura, temperatura, concentrazione di CO2, e umidità). I terreni devono essere scelti in funzione dei sistemi selettivi e del tipo di cellule. E particolarmente importante che le condizioni di coltura siano scelte in modo da garantire la crescita ottimale delle cellule durante il periodo di espressione e la capacità di formare colonie da parte delle cellule mutanti e non mutanti.

1.4.1.3. Preparazione delle colture Le cellule provenienti da colture primarie sono inoculate in un terreno di coltura e incubate a 37 oC. Prima di iniziare il test può rivelarsi necessario asportare dalle colture eventuali cellule mutanti preesistenti.

1.4.1.4. Attivazione metabolica Le cellule dovrebbero essere esposte alla sostanza in esame sia in presenza che in assenza di un adeguato sistema di attivazione metabolica. Il sistema più comunemente usato è una frazione post-mitocondriale integrata di cofattore (S9), ricavata dal fegato di roditori trattati con induttori enzimatici come Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18), o una combinazione di fenobarbitone e β-naftoflavone (19) (20). La frazione post-mitocondriale è di solito usata a concentrazioni finali dell'1-10 % v/v nel terreno di coltura. La scelta e le condizioni di un sistema di attivazione metabolica dipendono dalla classe chimica della sostanza in esame. In alcuni casi può essere opportuno utilizzare più di una concentrazione della frazione post-mito-condriale. Vari nuovi procedimenti, tra cui la creazione mediante ingegneria genetica di linee cellulari che esprimono enzimi attivatori specifici, possono fornire le risorse potenziali per l'attivazione endogena. La scelta delle linee cellulari deve essere scientificamente motivata (per esempio dall'importanza dell'isoenzima del citocromo P450 per il metabolismo della sostanza in esame).

1.4.1.5. Sostanza in esame/Preparazione Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione in adeguati solventi o mezzi disperdenti e, se necessario, diluite prima del trattamento delle cellule. Le sostanze liquide possono essere aggiunte diretta-mente alla coltura o diluite prima del trattamento. Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano disponibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conservazione è accettabile.

1.4.2. Condizioni di esperimento

1.4.2.

1.4.2.1. Solvente/mezzo disperdente 11 solvente/mezzo disperdente non deve reagire chimicamente con la sostanza in esame e deve essere compatibile con la sopravvivenza delle cellule e con l'azione di S9. L'uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilita. Si raccomanda di prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l'uso di un solvente/mezzo disperdente acquoso. Nell'esame di sostanze instabili in acqua, si usi un solvente organico anidro. L'acqua può essere rimossa mediante un setaccio molecolare.

1.4.2.3. Controlli Ogni test dovrà comprendere controlli positivi e negativi (solvente o mezzo disperdente) trattati in parallelo, con e senza attivazione metabolica. Quando si usa l'attivazione metabolica, la sostanza usata per i controlli positivi deve esigere attivazione per dare una risposta mutagenica. Fra gli esempi di sostanze per i controlli positivi si citano: Condizione di attivazione metabolica Locus Sostanza Numero CAS Numero EINECS Assenza di attivazione metabolica esogena HPRT Metansolfonato di etile 62-50-0 200-536-7 Etilnitrosourea 759-73-9 212-072-2 TK (colonie piccole e grandi) Metansolfonato di metile 66-27-3 200-625-0 XPRT Metansolfonato d'etile 62-50-0 200-536-7 Etilnitrosourea 759-73-9 212-072-2 Presenza di attivazione metabolica esogena HPRT 3-Metilcolantrene 56-49-5 200-276-4 N-Nitrosodimentilammina 62-75-9 200-549-8 7,12-Dimetilbenzantracene 57-97-6 200-359-5 TK (colonie piccole e grandi) Ciclofosfammide 50-18-0 200-015-4 Ciclofosfammide monoidrato 6055-19-2 Benzo[a]pirene 50-32-8 200-028-5 3-Metilcolantrene 56-49-5 200-276-5 XPRT N-Nitrosodimetilammina (per livelli elevati di S-9) 62-75-9 200-549-8 Benzo[a]pirene 50-32-8 200-028-5 Si possono usare altre sostanze adeguate per i controlli positivi, per esempio, la 5-bromo 2'-deossiuridina (CAS n. 59-14-3, EINECS n. 200-415-9) se il laboratorio dispone di una base dati su tale sostanza, desunti da precedenti esperimenti. Per i controlli positivi si usino, se possibile, sostanze chimiche di una classe chimica correlata alla sostanza saggiata. Si effettuino anche controlli negativi, con solvente o mezzo disperdente usato da solo sul terreno di coltura; i controlli vanno trattati come le colture che contengono la sostanza sottoposta al test. Si proceda inoltre a controlli non trattati, salvo che precedenti esperimenti dimostrino che il solvente scelto non induce effetti nocivi o mutageni.

1.4.3. Procedura

1.4.3.

1.4.3.1. Trattamento con la sostanza in esame Le cellule in proliferazione sono esposte alla sostanza in esame con e senza attivazione metabolica. L'esposizione deve protrarsi per un periodo adeguato (si considera che di norma tre-sei ore danno buoni risultati). Il tempo di esposizione può corrispondere a uno o più cicli cellulari. Si possono usare colture in doppio o in singolo per ciascuna delle concentrazioni. Quando si usano colture singole, il numero di concentrazioni deve essere aumentato, per garantire un adeguato numero di colture per l'analisi (per esempio, almeno 8 concentrazioni analizzabili). Le colture dei controlli negativi (solvente) devono essere in doppio. 1 test con sostanze gassose o volatili devono essere condotti con metodi adeguati, per esempio in recipienti di coltura ermetici (21) (22).

1.4.3.2. Misura del tasso di sopravvivenza, della vitalità e della frequenza delle mutazioni Al termine del periodo di esposizione, le cellule sono lavate e messe in coltura per determinare la sopravvivenza e permettere l'espressione del fenotipo mutante. La misura della citotossicità mediante determinazione dell'efficacia relativa di clonazione (sopravvivenza) o della crescita totale relativa delle colture inizia di solito dopo il periodo di trattamento. A ciascun locus corrisponde un determinato tempo minimo, necessario per permettere l'espressione subottimale del fenotipo dei mutanti neoindotti (HPRT e XPRT richiedono almeno 6-8 giorni, e TK almeno 2 giorni). Le cellule sono coltivate in terreno con e senza agenti selettivi per determinare rispettivamente il numero di mutanti e l'efficacia di clonazione. La vitalità (usata per il calcolo della frequenza di mutanti) si misura al termine del tempo di espressione, piastrando le colture in terreno non selettivo. Se la sostanza in esame è positiva a test su L5178Y TK+/-, la dimensione delle colonie deve essere rilevata almeno su una delle colture trattate (quella con la concentrazione positiva più alta) e sui controlli negativi e positivi. Se la sostanza in esame è negativa al test su L5178Y TK+/-, la dimensione va rilevata sui controlli negativi e positivi. Anche negli studi condotti su TK6TK+/-, si può rilevare la dimensione delle colonie mutanti.

2. DATI

2.

2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI I dati devono comprendere la determinazione di citotossicità e di vitalità, il conteggio delle colonie e la fre quenza dei mutanti nelle colture trattate e di controllo. In caso di risposta positiva al test su L5178Y TK+/-, si contino le colonie, distinguendo fra piccole e grandi, almeno per una concentrazione della sostanza in esame (concentrazione positiva massima) e per i controlli negativi e positivi. La natura molecolare e citogenetica dei due tipi di mutanti (quelli che producono colonie grandi e quelli che producono colonie piccole) è stata stu diata particolareggiatamente (23) (24). Nel saggio TK+/-, le colonie sono recensite sulla base del criterio della crescita: normale (colonie grandi) e lenta (colonie piccole) (25). Le cellule mutanti che hanno subito altera zioni genetiche più gravi hanno tempi di duplicazione più lunghi e formano di conseguenza colonie piccole. II danno può andare dalla perdita dell'intero gene ad aberrazioni cromosomiche che si manifestano nel cario tipo. La presenza di mutanti che producono colonie piccole è stata messa in relazione con sostanze chimiche che causano aberrazioni cromosomiche rilevanti (26). Le cellule mutanti che hanno subito alterazioni meno gravi crescono a velocità simile a quella delle cellule parentali, formando colonie grandi. Si indichi il tasso di sopravvivenza (efficacia relativa di clonazione) o la crescita totale relativa. La frequenza dei mutanti deve essere espressa come rapporto fra il numero delle cellule mutanti e quello delle cellule sopravvisute. Si presentino i dati relativi alle singole colture. Tutti i dati inoltre vanno riassunti in una tabella. Non è necessario verificare una risposta palesemente positiva. 1 risultati ambigui devono essere chiariti mediante prove ulteriori, preferibilmente in condizioni di esperimento modificate. I risultati negativi devono essere confermati caso per caso. Se non si considera necessaria la conferma di risultati negativi, se ne fornisca la ragione. Se si procede a test ulteriori in caso di risultati ambigui o negativi, si dovrebbero modificare i parametri di studio, per ampliare la gamma delle condizioni valutate. Fra i parametri di studio modificabili si citano l'intervallo tra le dosi saggiate e le condizioni di attivazione metabolica.

2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, per esempio un aumento correlato alla dose o un aumento riproducibile della frequenza dei mutanti. Si consideri per prima cosa la rilevanza biologica dei risultati. Si possono usare metodi statistici come ausilio nella valutazione dei risultati sperimentali, ma la significatività statistica non dovrebbe essere l'unico fattore determinante di una risposta positiva. Una sostanza che fornisca risultati non corrispondenti ai criteri di cui sopra è considerata non mutagena in questo test. La maggior parte degli esperimenti fornirà indubbiamente risultati chiaramente positivi o negativi, ma occasionalmente i dati ottenuti non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull'azione della sostanza in esame. I risultati possono rimanere ambigui, nonostante l'esperimento venga ripetuto più volte. Risultati positivi del saggio in vitro di mutazione genica su cellule di mammifero indicano che la sostanza in esame induce mutazioni geniche nelle cellule di mammifero utilizzate nelle colture. Una riproducibile correlazione fra l'entità della risposta positiva e la dose è maggiormente significativa. Risultati negativi significano che nelle condizioni del test la sostanza in esame non induce mutazioni geniche nelle cellule di mammifero usate nella coltura.

3. RELAZIONE

3. RELAZIONE SUL SAGGIO

La relazione sul saggio dovrà contenere le seguenti informazioni:

Solvente/mezzo disperdente:

motivazione della scelta del mezzo disperdente:

solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo disperdente, se nota;

Cellule:

tipo e origine delle cellule;

numero di colture cellulari;

eventuale numero di passaggi in coltura, se del caso;

metodi usati per la conservazione della cultura cellulare, se del caso;

assenza di micoplasma.

Condizioni di esperimento:

criteri di selezione delle concentrazioni e del numero di colture, per esempio i dati relativi alla citotossicità e ai limiti di solubilità, se disponibili;

composizione del terreno, concentrazione di CO2;

concentrazione della sostanza in esame;

volume del mezzo disperdente e della sostanza in esame aggiunto;

temperatura di incubazione;

tempo di incubazione;

durata del trattamento;

densità delle cellule durante il trattamento;

tipo e composizione del sistema di attivazione metabolica, compresi i criteri di accettabilità;

controlli positivi e negativi;

durata del periodo di espressione (con numero di cellule inseminate, subcolture e protocolli di alimenta zione, se del caso):

agenti selettivi;

criteri in base ai quali i risultati sono considerati positivi, negativi o ambigui;

metodi usati per contare il numero di cellule vitali e mutanti;

definizione delle colonie considerate, per dimensione e tipo (compresi i criteri in base a cui le colonie sono considerate piccole o grandi, se del caso).

Risultati:

segni di tossicità;

segni di precipitazione;

dati sul pH e l'osmolalità durante l'esposizione alla sostanza in esame, se determinati;

dimensioni delle colonie, se registrate almeno per i controlli negativi e positivi;

idoneità del laboratorio a individuare mutanti in colonie piccole con il sistema L5178Y TK+/-, se del caso;

relazione dose-risposta, se possibile;

eventuali analisi statistiche;

dati sui controlli negativi (solvente/mezzo disperdente) e positivi paralleli;

dati sui precedenti controlli negativi (solvente/mezzo disperdente) e positivi, con ranges, medie e devia zioni standard;

frequenza dei mutanti.

Discussione dei risultati.

Conclusioni.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)

BIBLIOGRAFIA Moore, M.M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindall, K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E. H. Y. and Malling, H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306-1312. Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res., 94, pp. 467-485. Moore, M. M., Harington-Brock, K.. Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis. 4, pp. 394-403. Aaron, C. S. and Stankowski, Jr. L. F. (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res., 223, pp. 121-128. Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. 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B.18 DANNO E RIPARAZIONE DEL DNA: SINTESI NON PROGRAMMATA DEL DNA — CELLULE DI MAMMIFERO IN VITRO

B.18

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

1.2. DEFINIZIONI Vedi introduzione generale, parte B.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO Il test della sintesi non programmata del DNA — Unscheduled DNA Syntesis (UDS) — misura la sintesi di riparazione del DNA dopo l'escissione e la rimozione di un tratto di DNA contenente la zona del danno indotto da agenti chimici e fisici. Il test si basa sull'incorparazione di timidina marcata con tritio (3H-TdR) nel DNA di cellule di mammiferi che non si trovano nella fase S del ciclo cellulare. L'assunzione di 3H-TdR può essere determinata per autoradiografia oppure mediante conteggio per scintillazione in fase liquida — liquid scintillation counting (LSC) — del DNA dalle cellule trattate. Le cellule di mammiferi in coltura, salvo nel caso che si faccia uso di epatociti primari di topo, vengono trattate con l'agente all'esame con e senza un sistema di attivazione metabolica esogena. La UDS può essere misurata anche in sistemi in vivo.

1.5. CRITERI QUALITATIVI Nessuno.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.6. Preparazioni

Le sostanze in esame e quelle di controllo o di riferimento vanno preparate in terreno di crescita ovvero disciolte o poste in sospensione in veicoli appropriati e poi ancora diluite in terreno di crescita prima di essere utilizzate per il test. La concentrazione finale del veicolo non deve produrre alcun effetto sulla vitalità delle cellule. Nel test possono essere utilizzate colture primarie di epatociti di ratto, di linfociti umani o di linee cellulari stabilizzate (ad esempio fibroblasti diploidi umani). È opportuno esporre le cellule alla sostanza in esame sia in presenza che in assenza di un sistema appropriato di attivazione metabolica.

Condizioni sperimentali

Numero di colture

Sono necessarie almeno due colture di cellule per l'autoradiografia e sei colture (o meno, se giustificato scientificamente) per le determinazioni LSC e UDS per ogni punto sperimentale.

Uso di controlli negativi e positivi

È opportuno includere in ciascun esperimento controlli simultanei positivi e negativi (non trattati e/o del solo veicolo), con e senza attivazione metabolica. Esempi di controlli positivi per il test su epatociti di ratto sono il 7,12-DMBA (7,12-dimetilbenzatracene) e il 2-AAF (2-acetilaminofluorene). Nel caso delle linee cellulari stabilizzate un esempio di controllo positivo sia per le determinazioni autoradiografiche che per le determinazioni LSC effettuate senza attivazione metabolica è la 4-NQO (4-nitrochinolina-N-ossido); la N-dimetilnitrosamina è a sua volta un esempio di composto per controllo positivo quando sia fatto uso di sistemi di attivazione metabolica.

Concentrazioni

È opportuno fare uso di concentrazioni multiple della sostanza in esame in una gamma adeguata ai fini della determinazione della risposta. La concentrazione più elevata deve dar luogo a qualche effetto citotossico. I composti relativamente insolubili in acqua vanno saggiati fino al loro limite di solubilità. Per le sostanze non tossiche altamente solubili in acqua la concentrazione massima della sostanza in esame va determinata caso per caso.

Cellule

Per il mantenimento delle colture è opportuno fare uso di terreni di crescita, di concentrazioni di CO2 e di condizioni di temperatura e di umidità appropriate. Le linee cellulari stabilizzate devono essere controllate periodicamente per escludere la presenza di contaminazione da micoplasma.

Attivazione metabolica

Con le colture primarie di epatociti non si fa uso di sistemi di attivazione metabolica. Le* linee cellulari stabilizzate ed i linfociti vengono esposti alla sostanza in esame sia in presenza che in assenza di un sistema appropriato di attivazione metabolica.

Procedimento

Preparazione delle colture

La linee cellulari stabilizzate vengono generate da coltura stock (ad esempio per tripsinizzazione o mediante separazione per scuotimento), seminate in recipienti di coltura a densità appropriata ed incubate a 37 oC. Colture a breve termine di epatociti di ratto vengono preparate dando modo a epatociti dissociati di fresco in un terreno appropriato di attaccarsi alla superficie di crescita. Le colture di linfociti umani vengono preparate secondo tecniche appropriate.

Trattamento delle colture con la sostanza in esame Epatociti primari di ratto

Gli epatociti di ratto isolati di fresco vengono trattati con la sostanza in esame in un terreno contenente 3H-TdR per una durata appropriata. Al termine del periodo di trattamento le cellule vanno tolte mediante filtraggio dal terreno, risciacquate, fissate ed essiccate. I vetrini vanno immersi in emulsione autoradiografica (alternativamente si possono usare pellicole adatte), esposti, sviluppati, colorati ed enumerati.

Linee cellulari stabilizzate e linfociti

Tecniche autoradiografiche: Le colture di cellule vengono esposte alla sostanza in esame per una durata appropriata e successivamente trattate con 3H-TdR. La durata sarà determinata dalla natura della sostanza, dall'attività del sistema metabolizzante e dal tipo delle cellule. Per rilevare il valore massimo di UDS, è opportuno aggiungere 3H-TdR contemporaneamente alla sostanza all'esame, ovvero entro pochi minuti dall'esposizione alla sostanza stessa. La scelta fra i suddetti due procedimenti sarà fatta in relazione alla possibilità di interazioni fra la sostanza all'esame e 3H-TdR. Al fine di poter distinguere fra UDS e la replicazione semi-conservativa di DNA si può inibire quest'ultima, ad esempio facendo uso di un terreno deficiente di arginina, a basso contenuto di siero o con idrossiurea nel mezzo di coltura. Misure LSC di UDS: Prima del trattamento con la sostanza in esame è opportuno bloccare nel modo che si è descritto sopra l'entrata delle cellule nella fase S. Le cellule vengono poi esposte alla sostanza in esame nel modo che si è descritto per l'autoradiografia. Al termine del periodo di incubazione si estrae il DNA dalle cellule e si determinano il contenuto totale di DNA e la misura della incorporazione di 3H-TdR. Occorre rilevare che quando si fa uso delle tecniche sopra descritte di linfociti umani, la soppressione della replicazione semi-conservativa di DNA non è necessaria in colture non stimolate.

Analisi

Determinazioni autoradiografiche

Nella determinazione di UDS nelle cellule in coltura non si contano i nuclei in fase S. È opportuno contare almeno 50 cellule per concentrazione. Le lastrine vanno codificate prima del conteggio, È opportuno contare su ciascuna piastrina diversi campi a caso interamente separati tra loro. Per la determinazione della quantità di incorporazione di 3H-J-TdR nel citoplasma è bene contare nel citoplasma di ciascuna cellula conteggiata tre aree delle dimensioni del nucleo.

Determinazioni LSC

Nelle determinazioni LSC UDS occorre fare uso di un numero adeguato di colture per ogni concentrazione e per i controlli. Tutti i risultati dovrebbero essere confermati in un esperimento indipendente.

2. DATI I dati devono essere presentati in forma di tabelle.

2.

2.1. DETERMINAZIONI AUTORADIOGRAFICHE Della entità dell'incorporazione di 3H-TdR nel citoplasma e del numero dei granuli osservati nel nucleo delle cellule va presa nota separatamente. Per descrivere la distribuzione dell'entità dell'incorporazione di 3H-TdR nel citoplasma e del numero dei granuli per nucleo può essere fatto riferimento alla media, alla mediana ed al modo.

2.2. DETERMINAZIONI LSC Per le determinazioni LSC, l'incorporazione di 3H-TdR va indicata in termini di dpm/μg di DNA. Il valore medio di dpm/μg di DNA con la deviazione standard può essere usato per descrivere la distribuzione della incorporazione. I dati devono essere valutati secondo metodi statistici appropriati.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:

cellule usate, densità e numero dei passagi al momento del trattamento, numero delle colture di cellule,

metodi usati per il mantenimento delle colture di cellule, con indicazione del terreno, della temperatura e della concentrazione di CO2,

sostanza in esame, veicolo, concentrazioni e ragioni della scelta delle concentrazioni usate nella determinazione,

dettagli riguardanti i sistemi di attivazione metabolica,

programmi di trattamento,

controlli positivi e negativi,

tecnica autoradiografica usata,

procedimenti usati per bloccare l'entrata delle cellule nella fase S,

procedimenti usati per l'estrazione di DNA e per la determinazione del contenuto totale di DNA nelle determinazioni LSC,

relazione dose-risposta se del caso,

valutazione statistica,

discussione dei risultati,

interpretazione dei risultati.

3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

4. RIFERIMENTI Vedi introduzione generale, parte B.

B.19 SAGGIO DEGLI SCAMBI TRA CROMATIDI FRATELLI IN VITRO

B.19

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

1.2. DEFINIZIONI Vedi introduzione generale, parte B.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO Quello degli scambi tra cromatidi fratelli — Sister chromatid exchange (SEC) — è un test a breve termine per la rilevazione degli scambi reciproci di DNA fra due cromatidi fratelli di un cromosoma in duplicazione. Gli SCE rappresentano l'interscambio di prodotti della replicazione di DNA in corrispondenza di loci apparentemente omologhi. Il processo di scambio comporta presumibilmente la rottura e la riunione di DNA, ma sulla sua base molecolare non si conosce in realtà molto. La rilevazione degli SCE richiede qualche mezzo per marcare in modo differenziale i cromatidi fratelli, e questo può essere ottenuto mediante incorporazione di bromodeossiurtdina (BrdU) nel DNA cromosomico per due cicli cellulari. Colture in vitro di cellule di mammiferi vengono esposte alla sostanza in esame con e senza un sistema esogeno di attivazione metabolica dei mammiferi, se appropriato, e poste in coltura per due cicli di replicazione in terreno contenente BrdU. Dopo un trattamento con un inibitore del fuso (ad esempio la colchicina) per accumulare cellule in uno stadio di mitosi di tipo metafasico (c-metafase), le cellule vengono raccolte e si procede alle preparazioni cromosomiche.

1.5. CRITERI QUALITATIVI Nessuno.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

Nel saggio si possono usare colture primarie (linfociti umani) o linee cellulari stabilizzate (ad esempio cellule di ovario di hamster cinese). Le linee cellulari devono essere controllate per escludere la presenza di contaminazione da Mycoplasma.

Vanno usati terreni di coltura e condizioni di incubazione (temperatura, recipienti di coltura, concentrazione di CO2 ed umidità) appropriati.

Le sostanze in esame possono essere preparate in terreni di coltura ovvero disciolte o poste in sospensione in veicoli appropriati prima del trattamento delle cellule. La concentrazione finale dei veicoli nei sistemi di coltura non deve influire in maniera significativa sulla vitalità o sul tasso di crescita delle cellule, ed è parallelamente opportuno verificare la frequenza degli SCE per mezzo di un controllo con solvente.

E opportuno esporre le cellule alla sostanza in esame sia in presenza che in assenza di un sistema esogeno di attivazione metabolica di mammiferi. Alternativamente, ove si faccia uso di tipi di cellule con attività metabolica endogena, l'intensità e la natura dell'attività devono essere appropriate per la classe chimica sottoposta all'esame.

1.6. Condizioni sperimentali

Numero di colture

Per ciascun punto sperimentale dovrebbero essere usate colture almeno in duplicato.

Uso di controlli positivi e negativi

È opportuno includere in ciascun esperimento dei controlli positivi, facendo uso sia di un composto ad azione diretta che di un composto richiedente attivazione metabolica, ed è opportuno anche effettuare un controllo del veicolo. Quali esempi di sostanze che si prestano ad essere usate come controlli positivi si possono citare: Se del caso, può essere incluso nell'esperimento un controllo positivo supplementare della medesima classe chimica della sostanza in esame.

come composto ad azione diretta:

l'etilmetansulfonato,

come composto ad azione indiretta:

la ciclofosfamide.

Concentrazioni

È opportuno fare uso di almeno tre concentrazioni adeguatamente intervallate della sostanza in esame. La concentrazione più elevata deve dar luogo ad un effetto tossico significativo, ma deve ancora consentire il verificarsi di una replicazione adeguata delle cellule. Le sostanze relativamente insolubili in acqua vanno saggiate fino al loro limite di solubilità secondo procedimenti appropriati. Per le sostanze non tossiche altamente solubili in acqua la concentrazione massima della sostanza in esame va determinata caso per caso.

Procedimento

Preparazione delle colture

Linee cellulari stabilizzate vengono generate da colture stock (ad esempio per tripsinizzazione o mediante distacco per scuotimento), seminate in recipienti di coltura a densità appropriata ed incubate a 37 oC. Nel caso di coltura monostrato, il numero delle cellule per ogni recipiente di coltura va regolato in modo che le colture non siano confluenti in misura molto maggiore del 50 % al momento della raccolta. Alternativamente, le cellule possono essere usate in forma di coltura in sospensione. Le colture di linfociti umani sono ottenute da sangue eparinizzato secondo tecniche appropriate ed incubate a 37 oC.

Trattamento

Vengono esposte alla sostanza in esame per una durata adeguata cellule in uno stadio di crescita esponenziale; nella maggior parte dei casi può essere efficace una durata da una a due ore, ma la durata del trattamento può in taluni casi essere prolungata fino a due cicli cellulari completi. Le cellule non aventi una sufficiente attività metabolica endogena vanno esposte alla sostanza in esame sia in presenza che in assenza di un sistema appropriato di attivazione metabolica. Al termine del periodo di esposizione le cellule vengono lavate da ogni traccia della sostanza in esame e coltivate per due cicli di replicazione in presenza di BrdU. In un procedimento alternativo si possono esporre le cellule contemporaneamente alla sostanza in esame e al BrdU per la durata completa di coltura di due cicli cellulari. Le colture di linfociti umani vengono trattate mentre si trovano in condizione semisincrona. Le cellule vengono analizzate alle loro seconda divisione dopo il trattamento, per assicurarsi che siano state esposte alla sostanza negli stadi più sensibili del ciclo cellulare. Tutte le colture alle quali si aggiunge BrdU, vanno manipolate nell'oscurità o in luce attenuata di lampade ad incandescenza fino al momento della raccolta delle cellule, allo scopo di ridurre per quanto possibile la fotolisi del DNA contenente BrdU.

Raccolta delle cellule

Le colture di cellule vengono trattate con un inibitore del fuso (ad esempio colchicina) da 1 a 4 ore prima della raccolta. Ciascuna coltura viene raccolta e trattata separatamente per la preparazione dei cromosomi.

Preparazione e colorazione dei cromosomi

I preparati di cromosomi vengono ottenuti secondo le tecniche citogenetiche correnti. La colorazione dei vetrini per l'evidenziazione degli SCE può essere effettuata secondo diverse tecniche (ad esempio con il metodo della fluorescenza più Giemsa).

Analisi

Il numero di cellule analizzate deve essere basato sulla frequenza spontanea di controllo degli SCE. Normalmente si analizzano per gli SCE almeno 25 metafasi ben spaziate per coltura. I vetrini vengono codificati prima dell'analisi. Nei linfociti umani si analizzano soltanto metafasi contenenti 46 centromeri. Nelle linee cellulari stabilizzate si analizzano a loro volta soltanto metafasi contenenti ± 2 centromeri del numero modale. E opportuno indicare se il salto di marcatura a livello del centromero viene o non viene conteggiato come SCE. I risultati dovrebbero essere confermati in un esperimento indipendente.

2. DATI I dati devono essere presentati in forma di tabelle. Il numero degli SCE per metafase e il numero degli SCE per cromosoma vanno indicati separatamente per tutte le colture trattate e quelle di controllo. I dati devono essere definiti secondo metodi statistici appropriati.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:

cellule usate, metodi di mantenimento della coltura cellulare,

condizioni sperimentali: composizione dei mezzi, concentrazione di CO2, concentrazione della sostanza all'esame, veicolo usato, temperatura di incubazione, tempo di trattamento, inibitore del fuso usato, sua concentrazione e durata del trattamento connesso, tipo di sistema di attivazione di mammiferi usato, controlli positivi e negativi,

numero di colture di cellule per punto sperimentale,

dettagli della tecnica usata per la preparazione delle lastrine,

numero delle metafasi analizzate (indicazione separata dei dati per ciascuna coltura),

numero medio di SCE per cellula e per cromosoma (indicazione separata dei dati per ciascuna coltura),

criteri per il riscontro degli SCE,

criteri di selezione delle dosi,

relazione dose/risposta se del caso,

valutazione statistica,

discussione dei risultati,

interpretazione dei risultati.

3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

4. RIFERIMENTI Vedi introduzione generale, parte B.

B.20 SAGGIO DEI LETALI RECESSIVI LEGATI AL SESSO: DROSOPHILA MELANOGASTER

B.20

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

1.2. DEFINIZIONI Vedi introduzione generale, parte B.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO Il saggio dei letali recessivi legati al sesso — sex-linked recessive lethal (SLRL) — nel quale è fatto uso della Drosophila melanogaster, permette di rilevare l'induzione sia di mutazioni puntiformi che di piccole delezioni nella linea germinale dell'insetto. Si tratta di un saggio capace di rivelare mutazioni in circa 800 loci sul cromosoma X; questa cifra rappresenta circa l'80 % di tutti i loci del cromosoma X; quest'ultimo rappresenta a sua volta circa un quinto dell'intero genoma aploide. Le mutazioni nel cromosoma X nella D. melanogaster sono espresse fenotipicamente nei maschi portanti il gene mutante. Quando la mutazione è letale nella condizione emizigote, la sua presenza si desume dall'assenza di una delle due classi di discendenza maschile che sono normalmente prodotte da una femmina eterozigote. Il saggio SLRL si basa sulla disponibilità di cromosomi specificamente marcati.

1.5. CRITERI QUALITATIVI Nessuno.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.6. Preparazioni

Ceppi

Possono essere usati maschi di un ceppo ben definito di tipo selvatico e femmine del ceppo Muller-5. Possono altresi essere usati altri ceppi di femmine marcate in modo appropriato con cromosomi X multipli invertiti.

Sostanza in esame

Le sostanze in esame vanno disciolte in acqua. Le sostanze non solubili in acqua possono essere disciolte o poste in sospensione in solventi appropriati (ad esempio una miscela di etanolo e Tween-60 o 80), e successivamente diluite in acqua o in soluzione salina prima della somministrazione. E opportuno evitare quale solvente il dimetilsol-fossido (DMSO).

Numero di animali

Il saggio va programmato con una sensibilità ed una potenza predeterminati. Sul numero di cromosomi trattati che devono essere analizzati influirà fortemente la frequenza delle mutazioni spontanee osservata nel controllo appropriato.

Vie di somministrazione

L'esposizione può essere orale, per iniezione o per esposizione a gas o a vapori. La somministrazione della sostanza in esame può essere fatta in forma di soluzione zuccherina. Se necessario, le sostanze possono essere disciolte in soluzione di NaCl allo 0,7 % ed iniettate nel torace o nell'addome.

Uso di controlli negativi e positivi

È opportuno includere nell'esperimento controlli negativi (del solvente) e positivi. Ove tuttavia siano disponibili appropriati dati storici di controllo del laboratorio, non sono necessari controlli concomitanti.

Concentrazioni

È opportuno fare uso di tre concentrazioni. Per una valutazione preliminare può essere fatto uso di una sola concentrazione della sostanza in esame, che può essere quella massima tollerata o quella che dà luogo ad una qualche indicazione di tossicità. Per le sostanze non tossiche è opportuno adottare l'esposizione alla concentrazione massima praticabile.

Procedimento

Maschi di tipo selvatico (di età da 3 a 5 giorni) vengono trattati con la sostanza in esame e accoppiati individualmente con un numero maggiore di femmine vergini dello stock Muller-5 o di altro stock marcato in maniera appropriata (con cromosomi X multipli invertiti). Le femmine vengono sostituite con vergini fresche ogni due, tre giorni cosi da coprire l'intero ciclo delle cellule germinali. Sulla prole di dette femmine viene effettuata l'analisi degli effetti letali corrispondenti agli effetti sullo sperma maturo, sugli spermatidi di stadio medio o avanzato, sugli spermatidi precoci, sugli spermaticiti e sugli spermatogoni al momento del trattamento. Le femmine eterozigoti F1, degli incroci di cui sopra sono fatte accoppiare individualmente (ossia in ragione di una femmina per bottiglietta) con i loro fratelli. Nella generazione F2 si procede su ciascuna coltura all'analisi dell'assenza di maschi del tipo selvatico. Se da una femmina F1 appare essere derivata una coltura portante un letale nel cromosoma X dei genitori (ossia se non si osservano maschi con il cromosoma trattato) si devono mettere alla prova figlie di quella femmina con il medesimo genotipo per stabilire se la letalità si ripete nella generazione successiva.

2. DATI I dati devono essere disposti in forma di tabelle con indicazione del numero dei cromosomi X saggiati, del numero dei maschi non fertili e del numero dei cromosomi letali per ciascuna concentrazione di esposizione e per ciascun periodo di accoppiamento per i singoli maschi trattati. Deve essere riportato per ciascun maschio il numero degli aggregati di differenti dimensioni, I risultati del test devono essere confermati in un esperimento a parte. Per la valutazione del saggio dei letali recessivi legati al sesso deve essere fatto uso di metodi statistici appropriati. L'agglomerazione di letali recessivi aventi origine da un medesimo maschio dev'essere considerata e valutata secondo criteri statistici appropriati.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:

stock: stock o ceppi di Drosophila usati, età degli insetti, numero dei maschi trattati, numero dei maschi sterili, numero di colture F2 costituite, numero di colture F2 senza progenie, numero di cromosomi portanti un letale individuati per ciascuno stadio delle cellule germinali,

criteri per la definizione delle dimensioni dei gruppi trattati,

condizioni di effettuazione del saggio: descrizione dettagliata dei programmi di trattamento e di campionatura, livelli di esposizione, dati della tossicità, controlli negativi (del solvente) e positivi, se del caso,

criteri per il riscontro delle mutazioni letali,

relazione esposizione/effetto se del caso,

valutazione statistica,

discussione dei risultati,

interpretazione dei risultati.

3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

4. RIFERIMENTI Vedi introduzione generale, parte B.

B.21 SAGGIO IN VITRO DI TRASFORMAZIONE DI CELLULE DI MAMMIFERO

B.21

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

1.2. DEFINIZIONI Vedi introduzione generale, parte B.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO Per la rilevazione di cambiamenti fenotipici in vitro indotti da sostanze chimiche associate con una trasformazione maligna in vivo può essere fatto uso di sistemi di coltura di cellule di mammiferi. Fra le cellule più largamente usate figurano le cellule C3H10T1/2, 3T3, SHE, le cellule di ratto Fisher; i saggi si fondano su cambiamenti della morfologia cellulare, sulla formazione di foci e sulla perdita della dipendenza da ancoraggio in agar semisolido. Esistono anche altri sistemi meno largamente usati i quali mettono in luce altri tipi di cambiamenti fisiologici o morfologici nelle cellule successivamente all'esposizione a sostanze chimiche carcinogene. Nessuno degli eventi finali dei test in vitro ha un legame meccanicistico accertato con il cancro. Alcuni fra i saggi sono in grado di evidenziare agenti promotori dei tumori. La citotossicità può essere determinata attraverso la misura dell'effetto della sostanza in esame sulla capacità di formazione di colonie (efficienza di clonaggio) o sul tasso di crescita delle colture. La misurazione della citotossicità ha lo scopo di stabilire se l'esposizione alla sostanza in esame abbia avuto carattere rilevante dal punto di vista tossicologico, ma non può essere usata per calcolare la frequenza della trasformazione in tutti i saggi poiché alcuni di essi possono comportare un'incubazione prolungata e/o un ripiastramento delle cellule.

1.5. CRITERI QUALITATIVI Nessuno.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.6. Preparazioni

Cellule

È disponibile tutta una varietà di linee cellulari o di cellule primarie, in relazione al saggio di trasformazione che si intende effettuare. Il ricercatore deve accertarsi che nel saggio che si sta effettuando le cellule presentino dopo esposizione a carcinogeni noti l'appropriato cambiamento fenotipico, e che il saggio nel suo laboratorio sia di provata e documentata validità e attendibilità.

Terreni di coltura

Devono essere usati terreni di coltura e condizioni sperimentali appropriati per il saggio di trasformazione che si effettua.

Sostanza in esame

Le sostanze in esame possono essere preparate in mezzi di coltura ovvero disciolte o poste in sospensione in veicoli appropriati, prima del trattamento delle cellule. La concentrazione finale del veicolo nel sistema di coltura non deve influire sulla vitalità o sul tasso di crescita delle cellule né sull'incidenza della trasformazione.

Attivazione metabolica

Le cellule vanno esposte alla sostanza in esame sia in presenza che in assenza di un sistema esogeno di attivazione metabolica dei mammiferi. Alternativamente, quando sia fatto uso di tipi di cellule che possiedono un'attività metabolica endogena deve essere accertato che la natura dell'attività stessa sia appropriata per la classe chimica sottoposta all'esame.

Condizioni sperimentali

Uso di controlli positivi e negativi

È opportuno includere in ciascun esperimento dei controlli positivi, con impiego sia di un composto ad azione diretta che di un composto richiedente attivazione metabolica; è altresì opportuno fare uso di un controllo negativo (del solvente). Quali esempi di sostanze che si prestano ad essere usate come controlli positivi si possono citare: Se del caso, è opportuno includere un controllo positivo supplementare della medesima classe chimica del composto in esame.

sostanze ad azione diretta:

etilmetansulfonato,

β-propiolattone;

composti richiedenti un'attivazione metabolica:

2-acetilaminofluorene,

4-dimetilaminoazobenzene,

7,12-dimetilbenzantracene.

Concentrazioni

È opportuno usare varie concentrazioni della sostanza in esame. Dette concentrazioni devono dar luogo ad un effetto tossico correlato con la concentrazione, nel senso che la concentrazione più elevata produce un livello ridotto di sopravvivenza, mentre alla concentrazione più bassa la sopravvivenza è approssimativamente dello stesso ordine che nel controllo negativo. Le sostanze relativamente insolubili in acqua vanno saggiate fino al loro limite di solubilità secondo procedure appropriate. Per le sostanze non tossiche altamente solubili in acqua la concentrazione massima della sostanza va determinata caso per caso.

Procedimento

L'esposizione delle cellule deve avere una durata appropriata in relazione al sistema di saggio adottato, e questo, quando l'esposizione è prolungata, può comportare un ridosaggio con cambio del mezzo e, se necessario, con miscela di attivazione metabolica fresca. Le cellule non aventi un'attività metabolica endogena sufficiente vanno esposte alla sostanza in esame sia in presenza che in assenza di un sistema di attivazione metabolica appropriato. Al termine del periodo di esposizione le cellule vengono lavate da ogni traccia della sostanza in esame e coltivate in condizioni appropriate per la comparsa del fenotipo trasformato che si sta studiando, e viene infine determinata l'incidenza della trasformazione. Tutti i risultati devono essere confermati in un esperimento indipendente.

2. DATI I dati vanno presentati in forma di tabella e possono assumere forme diverse a seconda del tipo di determinazione effettuato, ad esempio numero di foci o di colonie per piastre, piastre positive o numero delle cellule trasformate. La sopravvivenza va espressa quale percentuale dei livelli di controllo, e la frequenza della trasformazione sotto forma del numero di trasformanti in relazione al numero dei sopravvissuti. I dati devono essere valutati secondo metodi statistici appropriati.

3. RELAZIONE

3.

3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:

tipo di cellule usato, numero delle colture cellulari, metodi di mantenimento delle colture,

condizioni di effettuazione del saggio, concentrazione della sostanza in esame, veicolo usato, temperatura di incubazione, durata dell'incubazione, durata e frequenza del trattamento, densità delle cellule durante il trattamento, tipo di sistema di attivazione metabolica esogena usato, controlli positivi e negativi, specificazione del fenotipo studiato, sistema selettivo usato (se del caso), criteri per la scelta delle dosi,

metodo seguito per l'enumerazione delle cellule vitali e delle cellule trasformate,

valutazione statistica,

discussione dei risultati,

interpretazione dei risultati.

3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

4. RIFERIMENTI Vedi introduzione generale, parte B.

B.22

1. METODO

1.

1.1. INTRODUZIONE Vedi introduzione generale, parte B.

1.2. DEFINIZIONI Vedi introduzione generale, parte B.

1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Nessuna.

1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO Gli effetti dei letali dominanti provocano la morte dell'embrione o del feto. L'induzione di letali dominanti per effetto dell'esposizione ad una sostanza chimica indica che la sostanza in causa ha attaccato il tessuto germinale della specie all'esame. E generalmente ammesso che i letali dominanti sono dovuti a un danno cromosomico (anomalie strutturali e numeriche). La morte dell'embrione in femmine trattate può altresì essere il risultato di effetti tossici. Come criterio generale si espongono animali maschi al composto in esame e si accoppiano i medesimi con femmine vergini non trattate. I diversi stadi delle cellule germinali possono essere saggiati separatamente mediante l'osservanza di intervalli in successione negli accoppiamenti. L'aumento degli impianti morti per femmina nel gruppo trattato in confronto con gli impianti morti per femmina nel gruppo di controllo rispecchia la perdita successiva all'impianto. La perdita anteriore all'impianto può essere stimata sulla base di conteggi dei corpi lutei oppure attraverso il raffronto del totale degli impianti per femmina nel gruppo trattato e in quello di controllo. L'effetto letale dominante complessivo è rappresentato dalla somma della perdita anteriore e successiva all'impianto. Il calcolo dell'effetto letale dominante complessivo si basa sul raffronto fra gli impianti vivi per femmina nel gruppo trattato e gli impianti vivi per femmina nel gruppo di controllo. Una riduzione del numero di impianti a determinati intervalli può essere il risultato dell'uccisione di cellule (vale a dire, di spermatociti e/o di spermagoni).

1.5. CRITERI QUALITATIVI Nessuno.

1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO

1.6. Preparazioni

In tutti i casi in cui ciò sia possibile, le sostanze in esame vanno disciolte o poste in sospensione in soluzione salina isotonica. Le sostanze non solubili in acqua possono essere disciolte o sospese in solventi appropriati. Il solvente usato non deve né interferire con la sostanza in esame né produrre effetti tossici. È opportuno fare uso di preparazioni fresche della sostanza in esame.

Condizioni sperimentali

Vie di somministrazione

Il composto in esame va in generale somministrato una sola volta. Sulla base di informazioni tossicologiche può essere adottato un programma di trattamento ripetuto. Le vie di somministrazione correnti sono l'intubazione orale e l'iniezione intraperitoneale. Possono altresì essere appropriate altre vie di somministrazione.

Animali da esperimento

Quali specie da sottoporre al saggio sono raccomandati i ratti o i topi. Animali sani nella piena maturità sessuale vengono randomizzati ed assegnati al gruppo per il trattamento e al gruppo di controllo.

Numero e sesso

Occorre fare uso di un numero adeguato di maschi trattati in modo da tener conto della variazione spontanea del carattere biologico di cui si effettua la valutazione. Il numero scelto deve essere basato sulla sensibilità di rilevazione e sul valore di significatività determinati in precedenza. Ad esempio, in un esperimento tipico, il numero dei maschi per ciascun gruppo/dose deve essere sufficiente per dare da 30 a 50 femmine gravide per ogni intervallo di accoppiamento.

Uso di controlli negativi e positivi

È opportuno in linea generale includere in ciascun esperimento dei controlli simultanei positivi e negativi (del veicolo). Quando siano disponibili risultati accettabili di controlli positivi relativi ad esperimenti effettuati di recente nel medesimo laboratorio, al posto di un controllo positivo simultaneo può essere fatto uso di detti risultati. Le sostanze per i controlli positivi vanno usate a dosi opportunamente basse (ad esempio MMS, intraperitoneale, a 10 mg/kg) allo scopo di dimostrare la sensibilità del saggio.

Livelli delle dosi

Di norma va fatto uso di tre livelli di dosaggio. La dose più alta deve produrre segni di tossicità o di riduzione della fertilità negli animali trattati. In taluni casi può essere sufficiente un solo livello elevato di dosaggio.

Saggio del limite

Le sostanze non tossiche vanno saggiate a 5 g/kg con una sola somministrazione o a 1 g/kg/giorno con somministrazione ripetuta.

Procedimento

Sono possibili vari schemi di trattamento. Il tipo di trattamento più largamente usato è quello della somministrazione singola della sostanza in esame. Possono essere applicati anche altri schemi di trattamento. I singoli maschi vengono accoppiati in successione con una o due femmine vergini non trattate ad intervalli appropriati dopo il trattamento. Le femmine vanno lasciate con i maschi almeno per la durata di un ciclo di estro o fino a che sia avvenuto l'accoppiamento, da determinare in base alla presenza di sperma nella vagina o di un tappo vaginale. II numero degli accoppiamenti successivi al trattamento è determinato in base al programma di trattamento e deve essere tale che vengano esaminati dopo il trattamento tutti gli stadi delle cellule germinali. Le femmine vengono sacrificate nella seconda metà del periodo di gravidanza, e si procede all'esame del contenuto uterino per la determinazione del numero degli impianti morti e viventi. Si possono anche esaminare le ovaie per determinare il numero dei corpi lutei.

2. DATI I dati devono essere disposti in forma di tabelle con indicazione del numero dei maschi, del numero delle femmine gravide e del numero delle femmine non gravide. I risultati di ciascun accoppiamento, con indicazione dell'identità dei singoli soggetti maschi e femmine, vanno riportati individualmente. Per ciascuna femmina va indicata la settimana di accoppiamento, e per i maschi il livello di dosaggio, nonché rispettivamente le frequenze degli impianti vivi e degli impianti morti. Il calcolo dell'effetto complessivo letale dominante si basa sul raffronto fra gli impianti vivi per femmina nel gruppo sottoposto al saggio e gli impianti vivi per femmina nel gruppo di controllo. Il rapporto' fra gli impianti morti e quelli vivi del gruppo trattato posto a raffronto con il rapporto corrispondente del gruppo di controllo viene analizzato ai fini dell'indicazione della perdita successiva all'impianto. Se i dati sono registrati come morti precoci e morti tardive, ciò deve risultare dalle tabelle. Se la perdita anteriore all'impiantazione è stimata, ne deve essere dato ragguaglio. La perdita anteriore all'impianto può essere calcolata come discrepanza fra il numero dei corpi lutei e il numero degli impianti, ovvero come riduzione del numero medio di impianti per utero in confronto con gli accoppiamenti di controllo. I dati vengono valutati secondo metodi statistici appropriati.

specie, ceppo, età e peso degli animali usati, numero degli animali dell'uno e dell'altro sesso nei gruppi sottoposti al saggio e nei gruppi di controllo,

sostanza in esame, solvente, livelli di dosaggio saggiati e ragioni della scelta delle dosi, controlli negativi e positivi, dati della tossicità,

via e durata dell'esposizione,

ordine degli accoppiamenti,

metodo usato per stabilire l'avvenuto accoppiamento,

metodo del sacrificio,

criteri per l'analisi dei letali dominanti,

relazione dose/risposta, se del caso,

valutazione statistica,

Altre 3223 disposizioni non sono mostrate qui; ognuna ha il proprio indirizzo.

Versioni

2008-05-30