Komisijos reglamentas (EB) NR. 440/2008 2008 m. gegužės 30 d. nustatantis bandymų metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH) (Tekstas svarbus EEE)

In forceVersion 2008-05-30from 2008-06-01

Grade B

mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.

Ask Gelex about this law

Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/lt

Contents

Preamble
ANNEX
PRIEDAS A DALIS. FIZINIŲ IR CHEMINIŲ SAVYBIŲ NUSTATYMO
A.1.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.4.
1.5. METODŲ TAIKOMUMO LENTELĖ A. B. C. D.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
1.6.1.2. Aparatūra
1.6.2.
1.6.4.
A.2.
1.
1.4.
1.5. 1 lentelė Metodų palyginimas
1.6.
1.6.4.
1.6.6.
2 lentelė Temperatūra. Korekcijos koeficientai fT
A.3.
1.
1.4.
1.4.1.
3. Lentelė 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Metodų pritaikymas
3. Lentelė 1.4.1.1.1.4.1.2. Metodų pritaikymas a)
3. Lentelė 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Metodų pritaikymas a)
4.1)2)3)4)5)6)7)
A.4.
1.
1.4.
1.5.1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.4.
1.6.4.2.
1.6.5.
1.6.6.
1.6.6.1. Inertinės dujos
1.6.6.2. Soties kolonėlės paruošimas
a)
b)
1.6.7.
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)
A.5.
1.
1.6.
1.6.4.
1.6.4.1.
1.6.4.1.3. Paveikslas Matavimo kūnas
1.6.4.2.
1.6.4.2.2. Montažas
a)
b)
2. Lentelė Matuotos paviršiaus įtempties korekcija Tik vandeniniams tirpalams, ρ ≡ 1 g/cm3
3.
A.6.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Bandymo eiga
1.6.3.3. Aparatūra
1.6.3.4. Aparatūra (žr. 3 ir 4 pav.)
1.6.4.
2.
3.
A.8.
1.
1.3. Kratomos kolbos metodas
1.4.
1.5.
1.5.1. Kratomos kolbos metodas
1.5.2. Kratomos kolbos metodas
1.5.3. Kratomos kolbos metodas
1.6.
1.6.2.
1.6.2.1.
1.6.2.3.
1.6.3.
1.6.3.1. Aparatūra
1.6.3.2. Nulinio laiko to apskaičiavimas
2. Kratomos kolbos metodas
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)20)21)22)23)
A.9.
1.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2 Abel aparatas:
A.10.
1.
1.6.
1.6.2.
3.
A.11.
1.
1.6.
A.12.
1.
1.3.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
A.13.
1.
1.6.
1.6.2. a)
2.
A.14.
1.
1.1.
1.4.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2. a)
1.6.3.
1.6.3.2. a)
3.
A.15.
1.
1.6.
A.16.
1.
1.6.
1.6.1.
4.
1 paveikslas 20 mm bandymo kubo pavyzdys
2 paveikslas Tipiška temperatūros kitimo laike kreivė
A.17.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
3.
3.2. a)
A.18.
1.
1.6.
2.
2.2.
A.19.
1.
1.6.
2.
2.2.
A.20.
1.
1.5
1.5.4.
2.
3.
3.1.
A.21.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.2.
2.
2.1. 1 lentelė Rezultatų pavyzdžiai
3.
3.2. a)
4.
1 paveikslas Slėginis indas
2 paveikslas Laikantysis stovas
3 paveikslas Uždegimo sistema
1.
2.
4.
1.2. Kietosioms medžiagoms
1 priedėlis Apskaičiavimų metodas ĮVADAS
a)
b)
2 priedėlis
1 paveikslas Garų slėgio kreivės nustatymo pagal dinaminį metodą aparatūra
2a paveikslas Garų slėgio kreivės nustatymo pagal statinį metodą (naudojant U formos manometrą) aparatūra
2b paveikslas Garų slėgio kreivės nustatymo pagal statinį metodą (naudojant slėgio indikatorių) aparatūra
3 paveikslas Izoteniskopas (žr. 7 nuorodą)
4 paveikslas Garų slėgio kreivės nustatymo pagal garų slėgio pusiausvyros metodą aparatūra
5 paveikslas Aparatūros garinimui žemame slėgyje efuzijos metodu, efuzijos elemento tūris 8 cm3, pavyzdys
6a paveikslas Srauto sistemos pavyzdys garų slėgiui nustatyti dujų soties metodu
6b paveikslas Garų slėgo nustatymo dujų soties metodu pavyzdys su kapiliariniu vamzdeliu, įtaisytu už įsotinimo kameros sistemos
7 paveikslas Eksperimentinės įrangos pavyzdys sukamojo rotoriaus metodui
8 paveikslas Sukamojo rotoriaus matavimo galvutės pavyzdys
1 paveikslas Kolonėlės eliuavimo metodas su recirkuliaciniu siurbliu
2 paveikslas Tipiška mikrokolonėlė
3 paveikslas Tipiška mikrokolonėlė
4 paveikslas Kolonėlės eliuavimo metodas su išlyginamuoju indu
1 priedėlis Apskaičiavimo (vertinimo) metodai ĮVADAS
Išankstinis pasiskirstymo koeficiento įvertis
Apskaičiavimo metodų esmė
Kokybės kriterijai
Apskaičiavimo metodai Hansch π-metodas
Pastabos i)
Ataskaita
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
2 priedėlis Etaloninės medžiagos, rekomenduojamos naudoti taikant HPLC (high power liquid chromatography) – efektyviąją skysčių chromatografiją
Paveikslas Forma ir priedai krūvelei ruošti
Paveikslas Aparatas
Terminio jautrumo bandyme naudojamų medžiagų specifikacijos pavyzdys (žr. DIN 1623) 1)2)3)
1 paveikslas Terminio jautrumo bandymo aparatas
2 paveikslas Terminio jautrumo bandymas
3 paveikslas Kaitinimo spartos kalibravimas terminio jautrumo bandymui
4 paveikslas Jautrumo smūgiui bandymo aparatas
4 paveikslo tąsa
5 paveikslas Jautrumo trinčiai bandyo aparatas
Paveikslas Krūvelei ruošti naudojama forma ir priedai
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
3.1)2)3)4)5)6)7)8)9)
BENDRASIS ĮVADAS A.
i)
ii)
B.1 BIS.
1.
1.4
1.5
1.5.3
1.6
3.
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)
B.1 TRIS.
1.
1.4
1.5
1.6
3.
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)
B.2.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1. a)
B.3.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. Priešingos lyties toksiškumo įvertinimas
3.
B.4.
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
2.
3.
4.1)2)3)4)5)5a)6)7)8)9)
B.5.
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.2.3
1.4.2.7
2.
3.
4.1)2)3)4)5)6)6a)7)8)9)10)
1 LENTELĖ. AKIŲ PAŽEIDIMO VERTINIMO BALAIS SKALĖ Ragena
B.6.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.2.
1.5.1.3.
1.5.2.
1.5.2.2.
1.5.2.3.
3. Tyrimo ataskaita (JKMT ir Buehlerio)
B.7.
1.
1.4.
1.4.2.
1.4.3.
3. Tyrimo ataskaita
B.8.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1.
pt_2 a)
B.9.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
B.10.
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.3
2.
3. TYRIMO ATASKAITA
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)
B.11.
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.5
2.
3.
4.1)2)3)4)5)6)7)8)
B.
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.5
1.5.2 a)
2.
3. TYRIMO ATASKAITA
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)20)21)22)23)24)
B.15.
1.
1.6. Pasiruošimas tyrimui
Metabolitinė aktyvacija
Tiriamieji kamienai
Terpė
Teigiamos ir neigiamos kontrolės
Veikimo koncentracija
Inkubacijos sąlygos
Spontaninių mutacijų dažniai
Tikslių kopijų skaičius
3.
B.16.
1.
1.6. Pasiruošimas tyrimui
Metabolitinė aktyvacija
Tiriamieji kamienai
Terpė
Teigiamos ir neigiamos kontrolės
Veikimo koncentracijos
Inkubacijos sąlygos
Spontaninės mitozinės rekombinacijos dažniai
Tikslių kopijų skaičius
3.
B.17.
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.3
2.
3. ATASKAITA APIE TYRIMĄ
4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)20)21)22)23)24)25)26)
1.6. Pasiruošimas tyrimui
Kultūrų skaičius
Teigiamos ir neigiamos kontrolės
Veikimo koncentracijos
Ląstelės
Metabolinė aktyvacija
Kultūrų paruošimas
Kultūrų veikimas tiriamąja medžiaga Pirminiai žiurkių hepatocitai
Autoradiografiniai nustatymai
Skystosios scintiliacijos įvykių nustatymai
B.19.
1.
1.6. Tyrimo sąlygos
Kultūrų skaičius
Teigiamos ir neigiamos kontrolės
Veikimo koncentracijos
Kultūrų paruošimas
Veikimas
Ląstelių surinkimas
Chromosomų paruošimas ir dažymas
Analizė
3.
B.20.
1.
1.6. Pasiruošimas tyrimui
Padermės
Tiriamoji medžiaga
Gyvūnų skaičius
Davimo būdas
Teigiamų ir neigiamų kontrolių naudojimas
Veikimo dozė
3.
B.21.
1.
1.6. Pasiruošimas tyrimui
Ląstelės
Terpė
Tiriamoji medžiaga
Metabolitinė aktyvacija
Teigiamų ir neigiamų kontrolių naudojimas
Veikimo koncentracijos
3.
B.22.
1.
1.6. Pasiruošimas tyrimui
Davimo būdas
Eksperimentiniai gyvūnai
Skaičius ir lytis
Teigiamų ir neigiamų kontrolių naudojimas
Veikimo dozė
Ribų tyrimas

EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA,

atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį,

atsižvelgdama į 2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), įsteigiantį Europos cheminių medžiagų agentūrą, iš dalies keičiantį Direktyvą 1999/45/EB bei panaikinantį Tarybos reglamentą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos reglamentą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direktyvą 76/769/EEB ir Komisijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 93/105/EB bei 2000/21/EB, ypač į jo 13 straipsnio 3 dalį,

kadangi:

(1) Remiantis Reglamentu (EB) Nr. 1907/2006, Bendrijos lygmeniu reikia nustatyti bandymų metodus, kurie būtų taikomi tais atvejais, kai norint surinkti informaciją apie cheminių medžiagų savybes būtina atlikti cheminių medžiagų bandymus.

(2) 1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvos 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo V priede nustatyti cheminių medžiagų bei preparatų fizinių ir cheminių savybių, toksiškumo ir ekotoksiškumo nustatymo metodai. Direktyvos 67/548/EEB V priedas išbrauktas Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2006/121/EB, kuri bus taikoma nuo 2008 m. birželio 1 d.

(3) Direktyvos 67/548/EEB V priede nurodytus bandymų metodus reikėtų įtraukti į šį reglamentą.

(4) Šiuo Reglamentu neuždraudžiama taikyti ir kitus bandymų metodus su sąlyga, kad jie būtų taikomi atsižvelgiant į Reglamento 1907/2006 13 straipsnio 3 dalį.

(5) Kuriant bandymų metodus reikėtų labai gerai atsižvelgti į bandymų su gyvūnais pakeitimo, patobulinimo ir jų skaičiaus sumažinimo principus, visų pirma tais atvejais, kai tinkamais patvirtintais metodais galima pakeisti, patobulinti bandymus su gyvūnais arba sumažinti jų skaičių.

(6) Šio reglamento nuostatos atitinka pagal Reglamento (EB) Nr. 1907/2006 133 straipsnį įsteigto komiteto nuomonę,

PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ:

1 straipsnis Įgyvendinant Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 taikomi bandymų metodai nustatyti šio reglamento priede.

2 straipsnis Siekdama pakeisti, patobulinti bandymus su stuburiniais gyvūnais arba sumažinti jų skaičių, Komisija prireikus persvarsto šiame reglamente nurodytus bandymų metodus.

3 straipsnis Nuorodos į Direktyvos 67/548/EEB V priedą laikomos nuorodomis į šį reglamentą.

4 straipsnis Šis reglamentas įsigalioja kitą dieną po jo paskelbimo Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje.

Jis taikomas nuo 2008 m. birželio 1 d. Priimta Briuselyje 2008 m. gegužės 30 d. Komisijos vardu Stavros Dimas Komisijos narys

ANNEX

PRIEDAS A DALIS. FIZINIŲ IR CHEMINIŲ SAVYBIŲ NUSTATYMO

A.1. LYDYMOSI/UŽŠALIMO TEMPERATŪRA.

A.1.

1. METODAS Dauguma apibūdintų metodų yra pagrįsti OECD Test Guidelines (1). Pagrindiniai principai yra pateikti 2 ir 3 nuorodoje.

1.

1.1. ĮVADAS Apibūdintieji metodai ir prietaisai turi būti taikomi nustatant medžiagų lydymosi temperatūrą, netaikant jokių apribojimų jų grynumo laipsniui. Metodo parinkimas priklauso nuo svarbiausių tiriamos medžiagos savybių. Todėl ribinis koeficientas priklausys nuo to, ar galima, ar negalima tą medžiagą lengvai, sunkiai pulverizuoti, ar visai neįmanoma. Kai kurioms medžiagoms labiau tinka nustatyti užšalimo arba kietėjimo temperatūrą, jų nustatymo standartai taip pat yra įtraukti į šį metodą. Jeigu dėl tam tikrų medžiagos savybių minėtų parametrų neįmanoma tinkamai išmatuoti, gali tikti skystėjimo temperatūra.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Lydymosi temperatūra – tai temperatūra, kuriai esant fazinis virsmas iš kietosios būsenos į skystąją vyksta atmosferos slėgyje ir ši temperatūra tiksliai atitinka užšalimo temperatūrą. Kadangi daugumos medžiagų fazinis virsmas vyksta virš temperatūrų ribos, ji dažnai apibūdinama kaip lydymosi riba. Vienetų atitikmenys (iš K į oC) t = T - 273,15 t Celsijaus temperatūra, Celsijaus laipsniai ( oC). T termodinaminė temperatūra, kelvinai (K).

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nebūtina naudoti etalonines medžiagas visais tais atvejais, kai tiriama nauja medžiaga. Pirmiausia jos turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant šio metodo veikimą ir siekiant palyginti gautus rezultatus su kitų metodų rezultatais. Kai kurios kalibravimo medžiagos yra pateiktos nuorodose (4).

1.4. TYRIMO METODO ESMĖ Nustatoma fazinio virsmo iš kietosios būsenos į skystąją arba iš skystosios būsenos į kietąją temperatūra (temperatūrų riba). Praktikoje šildant/aušinant bandomos medžiagos mėginį atmosferos slėgyje, yra nustatoma pradinė lydymosi/užšalimo temperatūra ir galutinės lydymosi/užšalimo stadijos temperatūra. Apibūdinami penki metodų tipai, būtent: kapiliarinis metodas, karštosios pakopos metodai, užšalimo temperatūros nustatymas, terminės analizės metodai ir skystėjimo temperatūros nustatymas (pvz., naftos riebalų). Tam tikrais atvejais vietoje lydymosi temperatūros yra patogu matuoti užšalimo temperatūrą.

1.4.

1.4.1. Kapiliarinis metodas

1.4.1.

1.4.1.1. Lydymosi temperatūros matavimo prietaisai su skysčių vonia Nedidelis kiekis gerai susmulkintos medžiagos dedamas į kapiliarinį vamzdelį ir tvirtai užspaudžiamas. Kapiliarinis vamzdelis šildomas kartu su termometru, lydymosi metu nustatomas mažesnis nei apytikriai 1 K/min. temperatūros pakitimas. Nustatoma pradinė ir galutinė lydymosi temperatūra.

1.4.1.2. Lydymosi temperatūros imitavimo prietaisai su metaliniu bloku Taip kaip apibūdinta 1.4.1.1 punkte, išskyrus tai, kad kapiliarinis vamzdelis ir termometras dedami į pašildytą metalinį bloką, ir jie stebimi per bloke esančias skylutes.

1.4.1.3. Detekcija fotoelementu Kapiliariniame vamzdelyje esantis mėginys yra automatiškai šildomas metaliniame cilindre. Šviesos spindulys nukreipiamas pro medžiagą per cilindre esančią skylutę į tiksliai kalibruotą fotoelementą. Daugumos besilydančių medžiagų optinės savybės keičiasi nuo matinių iki skaidrių. Į fotoelementą patenkančios šviesos intensyvumas didėja ir siunčia sustabdymo signalą į skaitmeninį indikatorių, kuris rodo kaitinimo kameroje esančio platininio varžinio termometro temperatūrą. Šis metodas netinka kai kurioms ryškią spalvą turinčioms medžiagoms.

1.4.2. Lydymosi pakopos

1.4.2.

1.4.2.1. Kofler karštasis strypas Kofler karštajame strype naudojami du metalo gabalai, turintys skirtingą terminį laidumą, šildomi elektra, kur strypas sukonstruojamas taip, kad temperatūros gradientas būtų beveik linijinis per visą jo ilgį. Karštojo strypo temperatūra gali svyruoti nuo 283 iki 573 K kartu su specialiu prietaisu temperatūrai parodyti, kurį sudaro judantis velenėlis su rodykle ir kilpelė, skirta konkrečiam strypui. Kad būtų nustatyta lydymosi temperatūra, labai plonas medžiagos sluoksnis dedamas tiesiai ant karšto strypo paviršiaus. Po kelių sekundžių taip skystosios ir kietosios fazės pasirodo ryški skiriamoji linija. Temperatūra skiriamojoje linijoje yra užrašoma rodyklę nustatant taip, kad ji būtų ant linijos.

1.4.2.2. Lydymosi temperatūros mikroskopas Keletas mikroskopo karštųjų stadijų yra naudojamos nustatant lydymosi temperatūrą esant labai mažam medžiagos kiekiui. Daugumoje karštųjų stadijų temperatūra yra matuojama jautriu termoelementu, bet kartais naudojami ir gyvsidabrio termometrai. Tipiškame mikroskopiniame karštosios pakopos lydymosi temperatūros nustatymo aparate yra kaitinimo kamera, kurią sudaro metalinė plokštelė, virš kurios ant šliaužiklio yra dedamas mėginys. Metalinės plokštelės centre yra skylė, per kurią patenka šviesa nuo mikroskopo apšvietimo veidrodėlio. Naudojimo metu kamera uždengiama stiklo plokštele, kad į erdvę, kurioje yra mėginys, nepatektų oro. Mėginio kaitinimą reguliuoja reostatas. Atliekant labai tikslius matavimus optinėmis anizotropinėmis medžiagomis, gali būti naudojama poliarizuota šviesa.

1.4.2.3. Menisko metodas Šis metodas yra visų pirma naudojamas poliamidams. Temperatūra, kurioje išnyksta silikoninės alyvos meniskas, esantis taip karštosios pakopos ir uždengiančiojo stiklo, prie kurio pridėtas poliamidinis pavyzdys, yra nustatoma vizualiai.

1.4.3. Užšalimo temperatūros nustatymo metodas Mėginys dedamas į specialų mėgintuvėlį, kuris įdedamas į aparatą užšalimo temperatūrai nustatyti. Aušinimo metu mėginys atsargiai ir nuolatos maišomas, o jo temperatūra yra matuojama atitinkamais intervalais. Kai kelis kartus užrašius rodmenis temperatūra nusistovi, ši temperatūra (su pakoreguota termometro paklaida) yra užrašoma kaip užšalimo temperatūra. Peršaldymo turi būti vengiama norint išlaikyti pusiausvyrą taip kietosios ir skystosios fazės.

1.4.4. Terminė analizė

1.4.4.

1.4.4.1. Diferencinė ir terminė analizė (DTA) Pagal šią metodiką medžiagos ir etaloninės medžiagos temperatūrų skirtumas yra užrašomas kaip temperatūros funkcija, kai tai medžiagai ir etaloninei medžiagai yra naudojama ta pati kontroliuojamos temperatūros programa. Jeigu mėginyje įvyksta virsmas, kurio metu pakinta entalpija, tokį pasikeitimą parodo endoterminis (lydymosi) arba egzoterminis (užšalimo) nukrypimas nuo užrašytos temperatūros pagrindinės linijos.

1.4.4.2. Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija (DSK) Pagal šią metodiką įvesties energijų skirtumas medžiagoje ir etaloninėje medžiagoje užrašomas kaip temperatūros funkcija, kai tai medžiagai ir etaloninei medžiagai yra naudojama ta pati kontroliuojamos temperatūros programa. Ši energija – tai energija, reikalinga nustatyti medžiagos ir etaloninės medžiagos nuliniam temperatūrų skirtumui. Jeigu mėginyje įvyksta virsmas, kurio metu pakinta entalpija, tokį pasikeitimą parodo endoterminis (lydymosi) arba egzoterminis (užšalimo) nukrypimas nuo užrašyto šilumos srauto pagrindinės linijos.

1.4.5. Skystėjimo temperatūra Šis metodas buvo sukurtas naudoti naftos alyvoms, jis taip pat tinka aliejinėms medžiagoms, kurių lydymosi temperatūra yra žema. Iš anksto pašildytas mėginys atvėsinamas ypač greitai ir yra tikrinamas 3 K intervalais srauto charakteristikoms nustatyti. Žemiausia temperatūra, kuriai esant nustatytas medžiagos judėjimas, yra užrašoma kaip skystėjimo temperatūra.

1.5. KOKYBES KRITERIJAI Įvairių metodų, naudojamų lydymosi temperatūrai/lydymosi intervalui nustatyti, pritaikomumas ir tikslumas yra pateikti šioje lentelėje:

1.5. METODŲ TAIKOMUMO LENTELĖ A. B. C. D.

Kapiliarinis metodas Matavimo metodas Medžiagos, kurias galima pulverizuoti Medžiagos, kurių negalima pulverizuoti Temperatūrų intervalas Apskaičiuotas tikslumas Galiojantis standartas Lydymosi temperatūros prietaisai su skysčių vonia Taip Tik keletas 273–573 K ±0,3 K JIS K 0064 Lydymosi temperatūros priemonės su metaliniu bloku Taip Tik keletas 293– >573 K +0,5 K ISO 1218(E) Detekcija fotoelementu Taip Keletas, naudojant prietaisus 253–573 K +0,5 K Karštosios stadijos ir užšalimo metodai Matavimo metodas Medžiagos, kurias galima pulverizuoti Medžiagos, kurių negalima lengvai pulverizuoti Temperatūrų intervalas Apskaičiuotas tikslumas Galiojantis standartas Kofler karšta-sis strypas Taip Ne 283–>573 K ±1 K ANSI/ASTM D 3451-76 Lydymosi temperatūros mikroskopas Taip Tik keletas 273–>573 K +0,5 K DIN 53736 Menisko metodas Ne Ypač poliamidams 293–>573 K ±0,5 K ISO 1218(E) Užšalimo temperatūros nustatymo metodai Taip Taip 223–573 K ±0,5 K Pvz.. BS 4695 Terminė analizė Matavimo metodas Medžiagos, kurias galima pulverizuoti Medžiagos, kurių negalima lengvai pulverizuoti Temperatūrų intervalas Apskaičiuotas tikslumas Galiojantis standartas Diferencinė terminė analizė Taip Taip 173–1273 K Iki 600 K ±0,5 K iki 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija Taip Taip 173–1273 K Iki 600 K ±0,5 K iki 1273 K ± 2,0 K ASTM E 537-76 Skystėjimo temperatūra Matavimo metodas Medžiagos, kurias galima pulverizuoti Medžiagos, kurių negalima lengvai pulverizuoti Temperatūrų intervalas Apskaičiuotas tikslumas Galiojantis standartas Skystėjimo temperatūra Naftos alyvoms ir alyvinėms medžiagoms Naftos alyvoms ir alyvinėms medžiagoms 223-323 K ±3,0 K ASTM D 97-66

1.6. METODŲ APIBŪDINIMAS Beveik visų tyrimo metodų darbo eiga yra aprašyta tarptautiniuose ir nacionaliniuose standartuose (žr. 1 priedėlį).

1.6.

1.6.1. Kapiliariniai metodai Jeigu smulkiai pulverizuotų medžiagų temperatūra yra didinama pamažu, paprastai būna lydymosi pakopos, parodytos 1 pav.

1.6.1.

1 paveikslas A pakopa B pakopa C pakopa D pakopa E pakopa A pakopa (lydymosi pradžia): smulkūs lašeliai vienodai prilimpa prie vidinės kapiliarinio vamzdelio sienelės. B pakopa tarp mėginio ir vidinės sienelės atsiranda tarpas dėl lydinio suslūgimo. C pakopa suslūgęs mėginys pradeda smukti žemyn ir skystėti. D pakopa paviršiuje susidaro meniskas, bet matomo kiekio mėginys lieka kietas. E pakopa (baigiamoji lydymosi pakopa): kietųjų dalelių nebėra. Lydymosi temperatūros nustatymo metu temperatūra yra užrašoma lydymosi pradžioje ir baigiamojoje stadijoje.

1.6.1.1. Lydymosi temperatūros prietaisai su skysčių vonios aparatu 2 pav. parodytas standartizuotas stiklinis lydymosi temperatūros nustatymo aparatas (JIS K 0064); visos charakteristikos pateiktos milimetrais.

1.6.1.1.

2 paveikslas A: Matavimo indas B: Kamštis C: Ventiliatorius D: Termometras E: Papildomas termometras F: Vonios skystis G: Stiklinis kapiliaras, 80-100 mm ilgio, vidinis skersmuo - 1,0 ± 0,2 mm sienelės storis-0,2 -0,3 mm H: Šoninis vamzdelis

Vonios skystis

Turi būti parenkamas atitinkamas skystis. Skysčio pasirinkimas priklauso nuo lydymosi temperatūros, kurią reikia nustatyti, pvz., parafininė alyva – temperatūra ne aukštesnė kaip 473 K, silikoninė alyva – temperatūra ne aukštesnė kaip 573 K. Jei lydymosi temperatūra aukštesnė negu 523 K, gali būti naudojamas mišinys iš trijų dalių sieros rūgšties ir dviejų dalių kalio sulfato (pagal masių santykį). Jeigu naudojamas toks mišinys, reikia imtis atitinkamų atsargumo priemonių.

Termometras

Turi būti naudojami tik tokie termometrai, kurie atitinka žemiau toliau pateiktų arba lygiaverčių standartų reikalavimus: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Darbo eiga

Sausoji medžiaga grūstuvėje sutrinama į smulkius miltelius ir dedama į kapiliarinį vamzdelį, kurio vienas galas užlydytas, kad jį užpildžius medžiagos sluoksnis, stipriai ją suslėgus, būtų 3 mm storio. Norint gauti tolygiai suslėgtą mėginį, kapiliarinį vamzdelį iš apytikriai 700 mm aukščio reikėtų vertikalia kryptimi paleisti per stiklinį vamzdelį ant laikrodžio stiklo. Užpildytas kapiliarinis vamzdelis dedamas į vonią taip, kad vidurinė gyvsidabrio termometro galiuko dalis liestų vamzdelį toje vietoje, kur yra mėginys. Paprastai kapiliarinis vamzdelis dedamas į aparatą, kurio temperatūra yra apie 10 K žemesnė negu lydymosi temperatūra. Vonios skystis šildomas taip, kad temperatūra didėtų apie 3 K/min. Skystį reikia maišyti. Kai temperatūra yra 10 K žemesnė negu laukiama lydymosi temperatūra, temperatūros didėjimo greitis yra nustatomas taip, kad neviršytų 1 K/min.

Apskaičiavimas

Lydymosi temperatūra apskaičiuojama taip: T = TD+0,00016 (TD - TE)n kai: T koreguota lydymosi temperatūra, K Td D termometro parodymai, K TE E termometro parodymai, K n D termometro gyvsidabrio stulpelio padalų skaičius ant iškilusios jo dalies.

1.6.1.2. Lydymosi temperatūros nustatymo prietaisai su metaliniu bloku

1.6.1.2. Aparatūra

Ją sudaro:

cilindrinis metalinis blokas, kurio viršutinė dalis yra tuščia ir sudaro ertmę (žr. 3 pav.),

metalinis kaištis su dviem ar keliomis skylutėmis, per kurias kapiliaras įstatomas į metalinį bloką,

metalinio bloko kaitinimo sistema, kuri, pavyzdžiui, yra tiekiama per bloke įtaisytą elektriną varžą,

reostatas energijos padavimui reguliuoti, jeigu kaitinimui naudojama elektra,

keturi langeliai iš šilumai atsparaus stiklo išorinėse kameros sienose, esantys visiškai priešingose pusėse statmenai vienas kitam. Priešais vieną iš šių langelių yra mikroskopo okuliaras kapiliariniam vamzdeliui stebėti. Kiti trys langeliai naudojami aparato vidui apšviesti lempomis,

kaitrai atsparaus stiklo kapiliarinis vamzdelis vienu uždaru galu (žr. 1.6.1.1).

Termometras

Žiūrėti 1.6.1.1 punkte nurodytus standartus. Taip pat naudojami panašaus tikslumo termoelektriniai matavimo prietaisai.

3 paveikslas Termometras Kapiliaras Metalinis kaištis Okuliaras Lempa Elektrinė varža Metalinis kaitinimo blokas

1.6.1.3. Detekcija fotoelementu Aparatūra ir darbo eiga Aparatūrą sudaro metalinė kamera su automatizuota kaitinimo sistema. Trys kapiliarai užpildomi pagal 1.6.1.1 ir dedami į krosnį. Aparatui kalibruoti galima kelis kartus linijiniu būdu padidinti temperatūrą, o atitinkamai padidinta temperatūra yra elektriniu būdu suderinama pagal iš anksto pasirinktą konstantą ir tiesinį koeficientą. Savirašiai parodo tikrąją krosnies temperatūrą bei kapiliaruose esančios medžiagos temperatūrą.

1.6.2. Karštosios stadijos

1.6.2.

1.6.2.1. Kofler karštasis strypas Žr. priedėlį.

1.6.2.2. Lydymosi temperatūros mikroskopas Žr. priedėlį.

1.6.2.3. Menisko metodas (poliamidai) Žr. priedėlį. Kaitinimo sparta lydymosi temperatūroje turėtų būti ne mažesnė kaip 1 K/min.

1.6.3. Užšalimo temperatūros nustatymo metodai Žr. priedėlį.

1.6.4. Terminė analizė

1.6.4.

1.6.4.1. Diferencinė terminė analizė Žr. priedėlį.

1.6.4.2. Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija Žr. priedėlį.

1.6.5. Skystėjimo temperatūros nustatymas Žr. priedėlį.

2. DUOMENYS Kai kuriais atvejais reikalinga termometro korekcija.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS Į mėginio ataskaitą, jeigu įmanoma, įtraukiama tokia informacija: Ne mažiau kaip dviejų matavimų, patenkančių į apskaičiuotą tikslumo intervalą (žr. 1 lentelę), vidutinė temperatūra nurodoma kaip lydymosi temperatūra. Jei temperatūrų skirtumas tarp pradinės temperatūros ir temperatūros galutinėje lydymosi fazėje yra metodo tikslumo ribose, galutinės lydymosi fazės temperatūra yra laikoma lydymosi temperatūra; kitu atveju imamos dvi temperatūros. Jei medžiaga suyra ar išgaruoja prieš pasiekiant lydymosi temperatūrą, imama ta temperatūra, kuriai esant įvyko šis efektas. Visa informacija ir pastabos, svarbios duomenų aiškinimui, turi būti pateikiamos ataskaitoje, ypač atsižvelgiant į priemaišas ir medžiagos fizinę būseną.

naudotas metodas,

tikslios medžiagos charakteristikos (identiškumas ir priemaišos) ir išankstinio gryninimo, jeigu toks naudojamas, stadija,

tikslumo apskaičiavimas.

4.1)2)3)4) LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 (final). IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, p. 803–834. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 505–515.

A.2. VIRIMO TEMPERATŪRA

A.2.

1. METODAS Dauguma apibūdintų metodų yra pagrįsti OECD Test Guideline (1). Pagrindiniai principai pateikti 2 ir 3 nuorodoje.

1.

1.1. ĮVADAS Čia apibūdinti metodai ir prietaisai gali būti naudojami skystoms ir blogai besilydančioms medžiagoms, jei cheminių reakcijų, kuriose jos naudojamos, temperatūra nėra žemesnė nei virimo temperatūrą (pvz., autooksidacija, persigrupavimas, skilimas ir pan.). Šiuos metodus galima taikyti grynoms ir priemaišų turinčioms skystosioms medžiagoms. Ypatingas dėmesys atkreiptinas į tuos metodus, kuriuose naudojama detekcija fotoelementu ir terminė analizė, kadangi šiais metodais galima nustatyti tiek lydimosi, tiek virimo temperatūrą. Be to, matavimus galima atlikti automatiškai. Dinaminis metodas geras tuo, kad jį taip pat galima naudoti nustatant garų slėgį ir nebūtina virimo temperatūrą koreguoti iki normalaus slėgio (101,325 kPa), kadangi normalus slėgis matavimų metu gali būti nustatomas manostatu. Pastabos Priemaišų įtaka nustatant virimo temperatūrą labai priklauso nuo priemaišų svarbiausių savybių. Jeigu mėginyje yra lakiųjų priemaišų, kurios galėtų turėti įtakos rezultatams, medžiagą reikia išgryninti.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Normali virimo temperatūra yra apibrėžiama kaip temperatūra, kurioje skysčių garų slėgis yra lygus 101,325 kPa. Jeigu virimo temperatūra matuojama ne normaliame atmosferos slėgyje, temperatūros priklausomybė nuo garų slėgio gali būti apibūdinama Clausius-Clapeyron lygtimi: log p = Δ Hv2,3 RT+const. kai: p medžiagos garų slėgis paskaliais Δ Hv garavimo šiluma, J mol-1 R universalioji molinė dujų konstanta = 8,314 J mol-1K-1 T termodinaminė temperatūra, K Virimo temperatūra yra nustatoma atsižvelgiant į matavimo metu esantį aplinkos slėgį. Vienetų atitikmenys Slėgis (vienetai: kPa) 100 kPa 1 baras = 0,1 MPa (baras vis dar leistinas, bet nerekomenduojamas) 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (neleistini vienetai mm Hg ir Torr) 1 atm standartinė atmosfera = 101325 Pa (neleistinas vienetas atm) Temperatūra (vienetai: K) t = T -273,15 t Celsijaus temperatūra, Celsijaus laipsniai (° C) T termodinaminė temperatūra, kelvinai (K)

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nebūtina naudoti etalonines medžiagas visais tais atvejai, jeigu tiriama nauja medžiaga. Pirmiausia jos turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant šio metodo veikimą ir gautų rezultatų lyginimui su kitų metodų rezultatais. Kai kurias kalibravimo medžiagas galima rasti priede išvardytuose metoduose.

1.4. TYRIMO METODO ESMĖ Penki virimo temperatūros (virimo intervalo) nustatymo metodai yra pagrįsti virimo temperatūros matavimu, kiti du pagrįsti termine analize.

1.4.

1.4.1. Nustatymas ebulioskopu Iš pradžių ebulioskopai buvo sukurti molekuliniam svoriui nustatyti didinant virimo temperatūrą, bet jie taip pat tinka tiksliems virimo temperatūros matavimams atlikti. Labai paprastas aparatas yra apibūdintas ASTM D 1120-72 (žr. priedėlį). Šiame aparate skystis šildomas aplinkos sąlygomis atmosferos slėgyje, kol užverda.

1.4.2. Dinaminis metodas Šį metodą sudaro garų pakartotino suskystinimo temperatūros matavimas atitinkamu termometru esant deflegmacijai verdant. Taikant šį metodą galima keisti slėgį.

1.4.3. Distiliacijos metodas virimo temperatūrai nustatyti Šį metodą sudaro skysčio distiliavimas ir garų pakartotino suskystinimo temperatūros matavimas bei distiliato kiekio nustatymas.

1.4.4. Siwoloboff metodas Mėginys šildomas mėgintuvėlyje, panardintame į kaitinimo vonioje esantį skystį. Užlydytas kapiliarinis vamzdelis, kurio apatinėje dalyje yra oro burbuliukas, panardinamas į tą patį mėgintuvėlį.

1.4.5. Detekcija fotoelementu Pagal Siwoloboff metodą atliekamas automatinis fotoelektrinis matavimas, naudojant kylančius burbuliukus.

1.4.6. Diferencinė terminė analizė Pagal šią metodiką yra užrašomi medžiagos ir etaloninės medžiagos temperatūrų skirtumai kaip temperatūros funkcija, kai medžiagai ir etaloninei medžiagai yra taikoma ta pati kontroliuojama temperatūrą programa. Jeigu mėginyje įvyksta virsmas, kurio metu pasikeičia entalpija, tą pokytį parodo endoterminis nuokrypis (virimas) nuo pagrindinės užrašytų temperatūrų linijos.

1.4.7. Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija Šia metodika skirtumas tarp energijos įvesties į medžiagą ir į etaloninę medžiagą yra užrašomas kaip temperatūros funkcija, kai medžiagai ir etaloninei medžiagai yra taikoma ta pati kontroliuojama temperatūrų programa. Ši energija – tai energija, reikalinga nustatyti medžiagos ir etaloninės medžiagos nulinį temperatūrų skirtumą. Jeigu mėginyje įvyksta virsmas, kurio metu pasikeičia entalpija, tą pokytį parodo endoterminis nuokrypis (virimas) nuo pagrindinės užrašytų temperatūrų linijos.

1.5. 1 lentelė Metodų palyginimas

KOKYBĖS KRITERIJAI Skirtingų metodų, naudojamų virimo temperatūrai/virimo intervalui nustatyti, taikymas ir tikslumas yra pateikti 1 lentelėje. Matavimo metodas Apskaičiuotas tikslumas Galiojantis standartas Ebulioskopas ± 1,4 K (iki 373 K) ±2,5 K (iki 600 K) ASTM D 1120-72 Dinaminis metodas ±0,5 K (iki 600 K) Distiliavimo procesas (virimo intervalas) ±0,5 K (iki 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Pagal Siwoloboff ±0,2 K (iki 600 K) Detekcija fotoelementu ±0,3 K (373 K) Diferencinė terminė kalorimetrija ±0,5 K (iki 600 K) ±0,2 K (iki 1273 K) ASTM E 537-76 Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija ±0,5 K (iki 600 K) ±0,2 K (iki 1273 K) ASTM E 537-76

1.6. METODŲ APIBŪDINIMAS Kai kurių mėginio metodų darbo eiga yra apibūdinta tarptautiniuose ir nacionaliniuose standartuose (žr. priedą).

1.6.

1.6.1. Ebulioskopas Žr. priedėlį

1.6.2. Dinaminis metodas Žr. A.4 tyrimo metodą. Garų slėgio nustatymas. Užrašoma stebėtoji virimo temperatūra, kai slėgis 101,325 kPa.

1.6.3. Distiliavimo procesas (virimo intervalas) Žr. priedėlį.

1.6.4. Siwoloboff metodas Mėginys kaitinamas mėgintuvėlyje, kurio skersmuo apie 5 mm, lydimosi temperatūros nustatymo aparate (1 pav.). 1 pav. pavaizduotas standartizuotas lydymosi ir virimo temperatūros nustatymo aparatas (JIS K 0064) (stiklinis, visi duomenys nurodyti milimetrais). Kapiliarinis vamzdelis (virinimo kapiliarinis vamzdelis), kuris užlydytas 1 cm virš apatinio galo, dedamas į mėgintuvėlio vamzdelį. Mėginio yra dedama tiek, kad užlydytoji kapiliarinio vamzdelio dalis būtų žemiau skysčio paviršiaus. Mėgintuvėlio vamzdelis su virinimo kapiliariniu vamzdeliu yra pritaisomas arba prie termometro gumine juostele, arba pritvirtinamas laikikliu iš šono (žr. 2 pav.). 2 pav. Pagal Siwoloboff 3 pav. Modifikuotas variantas Vonios skystis parenkamas pagal virimo temperatūrą. Kai temperatūra siekia 573 K, gali būti naudojama silikoninė alyva. Parafininė alyva gali būti naudojama tik iki 473 K. Vonios skystis kaitinamas taip, kad temperatūra iš pradžių didėtų 3 K/min. Vonioje esantis skystis turi būti maišomas. Kai temperatūra siekia apie 10 K žemiau laukiamos virimo temperatūros, kaitinimas sumažinamas taip, kad temperatūros didėjimo greitis būtų 1 K/min. Pasiekus virimo temperatūrą, iš virinimo kapiliarinio vamzdelio pradeda kilti burbuliukai. Virimo temperatūra yra ta temperatūra, kai staiga atvėsinus burbuliukų nebelieka, o skystis staiga pradeda kilti kapiliariniu vamzdeliu. Termometras atitinkamai rodo medžiagos virimo temperatūrą. Modifikuotame variante (3 pav.) virimo temperatūra nustatoma lydimosi temperatūros nustatymo kapiliariniame vamzdelyje. Jis yra išploninamas ištempiant apie 2 cm (a), išsiurbiamas nedidelis kiekis mėginio. Atvirasis plonojo vamzdelio galiukas yra užlydomas taip, kad jo gale liktų mažas oro burbuliukas. Kaitinant aparatą lydimosi temperatūroje (b), oro burbuliukas plečiasi. Virimo temperatūra atitinka temperatūrą, kurioje medžiagos gumulėlis pasiekia vonioje esančio skysčio paviršių (c).

1.6.4.

1 paveikslas A: Matavimo indas B: Kamštis C: Ventiliatorius D: Termometras E: Papildomas termometras F: Vonios skystis G: Mėgintuvėlio vamzdelis, didžiausias išorinis skersmuo - 5 mm; kuriame yra apie 100 mm ilgio kapiliaras, vidinis skersmuo apie 1 mm, o sienelės storis - apie 0,2 - 0,3 mm H: Šoninis vamzdelis

1.6.5. Detekcija fotoelementu Kapiliariniame vamzdelyje esantis mėginys kaitinamas įkaitintame metaliniame bloke. Šviesos spindulys nukreipiamas pro bloke esančias tam tinkančias skylutes per medžiagą į tiksliai kalibruotą fotoelementą. Didėjant mėginio temperatūrai virinimo kapiliariniame vamzdelyje atsiranda pavienių oro burbuliukų. Pasiekus virimo temperatūrą, burbuliukų labai padaugėja. Dėl to pasikeičia šviesos intensyvumas, kurį užregistruoja fotoelementas, ir paduodamas sustabdymo signalas į indikatorių, parodantį bloke esančio platininio varžinio termometro parodymus. Šis metodas yra ypač naudingas, kadangi leidžia nustatyti iki 253,15 K (-20 oC) žemesnę negu kambario temperatūrą nedarant jokių pakeitimų aparate. Prietaisas paprasčiausiai turi būti dedamas į aušinimo vonią.

1.6.6. Terminė analizė

1.6.6.

1.6.6.1 Diferencinė terminė analizė Žr. priedėlį.

1.6.6.2 Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija Žr. priedėlį.

2 lentelė Temperatūra. Korekcijos koeficientai fT

DUOMENYS Esant nedideliems nukrypimams nuo normalaus slėgio (daugiausiai ± 5 kPa), virimo temperatūra normalizuojama iki Tn naudojantis tokiomis Sidney Young skaitmeninių verčių lygties vidutinėmis vertėmis: Tn = T + (fT x Δp) kai: Δ p (101,325 – p) [pastaba] P slėgio matavimas, kPa fT virimo temperatūros pokyčio greitis, slėgis K/kPa T išmatuota virimo temperatūra, K Tn virimo temperatūra, koreguota iki normalaus slėgio, K Daugumos medžiagų temperatūros korekcijos koeficientai fT ir jų aproksimavimo lygtys yra įtrauktos į pirmiau minėtus tarptautinius ir nacionalinius standartus. Pavyzdžiui, DIN 53171 metodas nurodo tokias apytikres korekcijas dažuose esantiems tirpikliams: Temperatūra T (K) Korekcijos koeficientas fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS Į mėginio ataskaitą, jeigu įmanoma, įtraukiama tokia informacija: Ne mažiau kaip dviejų matavimų, patenkančių į apskaičiuotą tikslumo intervalą (žr. 1 lentelę), vidutinė temperatūra nurodoma kaip virimo temperatūra. Nurodomos išmatuotos virimo temperatūros ir jų vidurkiai, o slėgis(iai), kuriame buvo atlikti šie matavimai, nurodomas kPa. Pageidautina, kad slėgis būtų artimas normaliam atmosferos slėgiui. Visa informacija ir pastabos, svarbios duomenų aiškinimui, turi būti pateikiamos ataskaitoje, ypač atsižvelgiant į priemaišas ir medžiagos fizinę būseną.

naudotas metodas,

tikslios medžiagos charakteristikos (identiškumas ir priemaišos) ir išankstinio gryninimo, jeigu toks naudojamas, stadija,

tikslumo apskaičiavimas.

4.1)2)3) LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, volume II. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.

A.3. SANTYKINIS TANKIS

A.3.

1. METODAS Apibūdintieji metodai yra pagrįsti OECD Test Guideline (1). Pagrindiniai principai yra pateikti 2 nuorodoje.

1.

1.1. ĮVADAS Apibūdintieji santykinio drėgnumo nustatymo metodai yra be apribojimų taikomi kietosioms ir skystosioms medžiagoms atsižvelgiant į jų grynumo laipsnį. Naudotini metodai pateikti 1 lentelėje.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Kietųjų kūnų arba skysčių santykinis tankis D420 yra tikrinamos medžiagos tūrio masės, nustatytos 20 °C temperatūroje, santykis su tokio paties tūrio vandens mase, nustatyta 4 °C temperatūroje. Santykinis tankis dimensijos neturi. Medžiagos tankis ρ yra jos masės m ir tūrio v dalmuo. Tankis ρ nurodomas SI vienetais – kg/m3.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS (1) (3) Nebūtina etalonines medžiagas naudoti visais atvejais, kai tyrinėjama nauja medžiaga. Pirmiausia jos turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant metodo veikimą ir lyginant gautus rezultatus su kitais metodais gautais rezultatais.

1.4. METODŲ ESMĖ Naudojamos keturios metodų klasės.

1.4.

1.4.1. Plūdrumo metodai

1.4.1.

1.4.1.1. Areometras (skystosioms medžiagoms) Tankis gali būti pakankamai tiksliai ir greitai nustatomas plūduriuojančiu areometru, kuriuo įmanoma nustatyti skysčio tankį pagal imersijos gylį remiantis graduotos skalės parodymais.

1.4.1.2. Hidrostatinė pusiausvyra (skystosioms ir kietosioms medžiagoms) Mėginio, pasverto ore ir atitinkamame skystyje (pvz., vandenyje) svorių skirtumas gali būti naudojamas tankiui nustatyti. Kietiesiems kūnams matuojamas tankis – tai vienintelis naudoto konkretaus mėginio pavyzdys. Nustatant skysčių tankį, žinomo tūrio v kūnas yra sveriamas iš pradžių ore, po to – skystyje.

1.4.1.3. Panardintų kūnų metodas (skystosioms medžiagoms) (4) Pagal šį metodą skysčio tankis yra nustatomas pagal duomenų, gautų sveriant skystį prieš žinomo tūrio kūno panardinimą į jį, panardinus į jį ir ištraukus iš jo, skirtumą.

1.4.2. Piknometro metodai Kietiesiems kūnams ir skysčiams gali būti naudojami įvairių formų ir žinomo tūrio piknometrai. Tankis apskaičiuojamas paėmus pilno ir tuščio piknometro svorio ir jo žinomo tūrio skirtumą.

1.4.3. Oro palyginimo piknometras (kietiesiems kūnams) Bet kokios formos kietojo kūno tankį galima išmatuoti kambario temperatūroje su dujų palyginimo piknometru. Medžiagos tūris matuojamas įvairiai kalibruotame tūrio cilindre ore arba inertinėse dujose. Užbaigus tūrio matavimą, tankio apskaičiavimams vieną kartą matuojama masė.

1.4.4. Virpesių densitometras (5) (6) (7) Skysčio tankis gali būti matuojamas virpesių densitometru. U raidės formos mechaninis osciliatorius vibruojamas osciliatoriaus rezonanso dažniu, kuris priklauso nuo jo masės. Dedant mėginio, keičiasi osciliatoriaus rezonanso dažnis. Aparatas turi būti kalibruojamas pagal dvi žinomo tankio skystąsias medžiagas. Geriau šias medžiagas parinkti taip, kad jų tankiai apimtų matuotiną intervalą.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Skirtingų metodų, naudojamų santykiniam tankiui nustatyti, pritaikymo galimybė pateikta lentelėje.

1.6. METODŲ APIBŪDINIMAS Standartai, kuriuose, pavyzdžiui, reikėtų ieškoti informacijos apie papildomus techninius ypatumus, yra pateikti priede. Tyrimai turi vykti 20 oC temperatūroje, atliekant ne mažiau kaip du matavimus.

2. DUOMENYS Žr. standartus.

3. Lentelė 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Metodų pritaikymas

ATASKAITOS PATEIKIMAS Ataskaitoje apie tyrimą, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija: Santykinis tankis D204 pateikiamas kaip apibrėžta 1.2 punkte, kartu pateikiant duomenis apie matuotos medžiagos fizinę būseną. Pateikiama visa informacija ir pastabos, svarbios aiškinant rezultatus, kuriuos reikia pateikti ataskaitoje, ypač atsižvelgiant į priemaišas ir medžiagos fizinę būseną. Matavimo metodas Tankis Didžiausia galima dinaminė klampa Galiojantis standartas Kietieji kūnai Skysčiai Areometras Taip 5 Pa s ISO 387 ISO 649-2 NF T 20-050 Hidrostatinė pusiausvyra Taip ISO 1183 (A) Taip 5 Pa s ISO 901 ir 758 Panardintų kūnų metodas Taip 20 Pa s DIN 53217 Piknometras ISO 3507 Taip ISO 1183(B) NF T 20-053 Taip 500 Pa s ISO 758 Oro palyginamasis piknometras Taip DIN 55990 Teil 3 DIN 53243 Virpesių densitometras Taip 5 Pa s

naudotas metodas,

tikslios medžiagos charakteristikos (identiškumas ir priemaišos) bei išankstinio gryninimo, jeigu toks naudojamas, stadija.

3. Lentelė 1.4.1.1.1.4.1.2. Metodų pritaikymas a)

kietieji kūnai

skysčiai

3. Lentelė 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Metodų pritaikymas a)

kietieji kūnai

skysčiai

4.1)2)3)4)5)6)7)

LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.ll, p. 427–430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, p. 297–302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen –Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, p. 717–726. Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, p. 253–255.

A.4. GARŲ SLĖGIS

A.4.

1. METODAS Dauguma apibūdintų metodų yra pagrįsti OECD Test Guideline (1). Pagrindiniai principai pateikti 2 ir 3 nuorodoje.

1.

1.1. ĮVADAS Naudinga turėti išankstinę informaciją apie šiam tyrimui reikalingos medžiagos struktūrą, lydymosi temperatūrą ir virimo temperatūrą. Nėra vienintelės matavimų eigos, taikytinos įvairiems garų slėgiams. Todėl garų slėgiui nuo < 10-4 iki 105 Pa matuoti rekomenduojama naudoti kelis metodus. Paprastai priemaišos turi įtakos garų slėgiui ir tai visų pirma priklauso nuo priemaišų rūšies. Jeigu bandinyje yra lakių priemaišų, kurios galėtų turėti įtakos rezultatams, medžiaga gali būti gryninama. Taip pat tiktų nustatyti garų slėgį techninėms medžiagoms. Kai kuriuose čia apibūdintuose metoduose naudojamas aparatas su metalinėmis dalimis; į tai turėtų būti atsižvelgiama tiriant ėsdinančias (ardančias) medžiagas.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Medžiagos garų slėgis yra apibrėžiamas kaip sočiųjų garų slėgis virš kietosios arba skystosios medžiagos. Esant termodinaminei pusiausvyrai grynos medžiagos garų slėgis – tai tik temperatūros funkcija. Naudotinas slėgio vienetas SI turėtų būti paskalis (Pa). Vienetai, kurie buvo istoriškai naudojami, kartu su atitikmenų koeficientais: 1 toras(1mmHg) = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfera = 1,013 × 105 Pa 1 baras = 105 Pa Temperatūros vienetas SI sistemoje – kelvinas (K). Universalioji molinė dujų konstanta R = 8,314 J mol-1 K-1. Dujų slėgio temperatūrinė priklausomybės yra apibūdinta Clausius-Clapeyron lygtimi: log p = Δ Hv2,3 RT+const. kai: p medžiagos garų slėgis paskaliais Δ Hy garinimo šiluma, J mol-1 R universalioji molinė dujų konstanta, J mol-1 K-1 T termodinaminė temperatūra, K

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nebūtina naudoti etaloninių medžiagų visais tais atvejais, kai tiriama nauja medžiaga. Pirmiausia jos turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant šio metodo veikimą ir gautiems rezultatams palyginti su kitų metodų rezultatais.

1.4. TYRIMO METODŲ ESMĖ Garų slėgiui nustatyti yra siūlomi septyni metodai, kuriuos galima taikyti skirtingiems garų slėgio intervalams. Kiekvienu metodu garų slėgis yra nustatomas įvairiose temperatūrose. Kai temperatūrų intervalas ribotas, grynosios medžiagos garų slėgio logaritmas yra temperatūros inversijos tiesinė funkcija.

1.4.

1.4.1. Dinaminis metodas Dinaminiu metodu yra matuojama virimo temperatūra, kuri priklauso nuo apibrėžto slėgio. Rekomenduojamas intervalas: 10–10 Pa. Šis metodas taip pat rekomenduojamas nustatant normalią virimo temperatūrą ir yra patogus, kai temperatūra yra iki 600 K.

1.4.2. Statinis metodas Statiniuose procesuose, esant termodinaminei pusiausvyrai, uždaroje sistemoje susidaręs garų slėgis yra nustatomas apibrėžtoje temperatūroje. Šis metodas tinka vienkomponentėms ir daugiakomponentėms kietosioms ir skystosioms medžiagoms. Rekomenduojamas intervalas: 10–10 Pa. Šis metodas taip pat gali būti naudojamas 1–10 Pa intervale, jeigu atsargiai elgiamasi.

1.4.3. Izoteniskopas Šis standartizuotas metodas taip pat yra statinis metodas, bet paprastai netinka daugiakomponentėms sistemoms. Papildomos informacijos galima gauti: ASTM metodas D-2879-86. Rekomenduojamas intervalas: nuo 100 iki 10 Pa.

1.4.4. Efuzijos metodas: garų slėgio pusiausvyra Medžiagos kiekis, išeinantis iš elemento per laiko vienetą per žinomo dydžio apertūrą yra nustatomas vakuume taip, kad medžiagos sugrįžimas į elementą būtų nedidelis (pvz., matuojant impulsą, generuotą jautrioje pusiausvyroje garų čiurkšle arba matuojant prarastą svorį). Rekomenduojamas intervalas: 10-3–1 Pa.

1.4.5. Efuzijos metodas: svorio praradimu arba sugaudant išgaravusias medžiagas Metodas pagrįstas tiriamos medžiagos, garų pavidalu išlekiančios iš Knudsen elemento (4) per laiko vienetą per angą ultravakuumo sąlygomis, masės apskaičiavimui. Ištekėjusių garų masę galima gauti nustatant elemento prarastą masę arba kondensuojant garus žemoje temperatūroje ir nustatant išgarintos medžiagos kiekį chromatografinės analizės būdu. Garų slėgis apskaičiuojamas naudojant Hertz-Knudsen priklausomybę. Rekomenduojamas intervalas: 10-3–1 Pa.

1.4.6. Dujų soties metodas Inertinių nešančiųjų dujų srovė leidžiama virš medžiagos taip, kad ji įsisotina jų garais. Medžiagos, perneštos žinomu nešančiųjų dujų kiekiu, kiekis yra matuojamas arba surenkant į tinkamą gaudyklę, arba betarpiška analizine technika. Tai naudojama garų slėgiui apskaičiuoti esant tam tikrai temperatūrai. Rekomenduojamas intervalas: 10-4–1 Pa. Šį metodą taip pat galima naudoti 1–10 Pa intervale, jeigu atsargiai elgiamasi.

1.4.7. Sukamasis rotorius Sukamojo rotoriaus manometre tikrasis matavimo elementas – plieno rutuliukas, kybantis magnetiniame lauke ir besisukantis labai dideliu greičiu. Dujų slėgis yra nustatomas pagal nuo slėgio priklausantį plieno rutuliuko lėtėjimą. Rekomenduojamas intervalas: 10-4–0,5 Pa.

1.5.1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7.

KOKYBĖS KRITERIJAI Įvairūs garų slėgio nustatymo metodai yra palyginami pagal jų taikytinumą, pasikartojamumą, atkuriamumą, matavimo intervalą, galiojantį standartą. Tai padaryta šioje lentelėje. Matavimo metodas Medžiagos Apskaičiuojamas pasikartojamumas Apskaičiuotas atkuriamumas Rekomenduojamas intervalas Galiojantis standartas kietosios skystosios Dinaminis metodas Mažai tirpios Taip Iki 25 % Iki 25 % Nuo 103 Pa iki 2 × 103 Pa — 1–5 % 1–5 % Nuo 2 × 103 Pa iki 105 Pa — Statinis metodas Taip Taip 5–10 % 5–10 % 10 Pa– 105 Pa NFT 20-048 (5) Izoteniskopas Taip Taip 5–10 % 5–10 % 102 Pa– 105 Pa ASTM-D 2879-86 Efuzijos metodas – garų slėgio pusiausvyra Taip Taip 5–20 % Iki 50 % 10 -3 Pa– 1 Pa NFT 20-047(6) Efuzijos metodas – svorio praradimas Taip Taip 10–30 % — 10-3 Pa–1 Pa — Dujų soties metodas Taip Taip 10–30 % Iki 50 % 10-4 Pa– 1 Pa — Sukamojo rotoriaus metodas Taip Taip 10–20 % — 10-4 Pa– 0,5 Pa —

1.6. METODŲ APIBŪDINIMAS

1.6.

1.6.1. Dinaminis matavimas

1.6.1.

1.6.1.1. Aparatūra Paprastai matavimo aparatūrą sudaro virinimo indas su stikliniu arba metaliniu aušintuvu (1 pav), temperatūros matavimo įrenginys ir slėgio reguliavimo ir matavimo įrenginys. Paveiksle parodytas paprastas matavimo aparatas yra padarytas iš karščiui atsparaus stiklo ir sudarytas iš penkių dalių. Didelį, iš dalies dvigubų sienelių vamzdį sudaro matinio gaubto jungtis, aušintuvas, aušinimo indas ir įsiurbimo anga. Stiklo cilindras su Cottrellsiurbliu yra įtaisomas vamzdyje virinimo dalyje, o smulkinto stiklo paviršius yra nelygus, kad būtų išvengiama kunkuliavimo virinimo metu. Temperatūra matuojama atitinkamu temperatūros jutikliu (pvz., varžiniu termometru, gaubto termoelementas, panardintas aparate iki matavimo padalos (1 pav, Nr. 5) per atitinkamą įsiurbimo angą (pvz., vidinį šlifą). Reikalingos jungtys yra padarytos taip, kad būtų galima reguliuoti slėgį ir tiktų matavimo įrenginiui. Kolba, kuri veikia kaip buferinis tūris, su matavimo aparatu yra sujungta kapiliariniu vamzdeliu. Virinimo indas kaitinamas kaitinimo elementu, iš apačios įdėtu į stiklinį aparatą. Kaitinimui reikalinga srovė nustatoma ir reguliuojama termoelementu. Vakuuminiu siurbliu sudaromas būtinas vakuumas tarp 102 Pa ir apytikriai 105 Pa. Slėgiui reguliuoti naudojamas atitinkamas vožtuvas orui arba azotui matuoti (matavimo intervalas apytikriai 102–105 Pa) ir ventiliuoti. Slėgis matuojamas manometru.

1.6.1.2. Matavimo eiga Garų slėgis matuojamas nustatant mėginio temperatūrą įvairiuose apibrėžtuose slėgiuose, apie 103–105 Pa. Nekintanti temperatūra esant pastoviam slėgiui rodo, kad pasiekta virimo temperatūra. Šio metodo negalima naudoti putokšliams matuoti. Medžiaga dedama į švarų sausą indą. Gali būti sunkumų naudojant nemiltelinius kietuosius kūnus, bet jų kartais nelieka pašildant aušinimo gaubtą. Kai tik indas užpildomas, aparato jungė užsandarinama, o medžiaga degazuojama. Tada nustatomas žemiausias norimas slėgis ir įjungiamas kaitinimas. Tuo pačiu metu temperatūros jutiklis sujungiamas su savirašiu. Pusiausvyra pasiekiama, kai esant pastoviam slėgiui užregistruojama pastovi temperatūra. Reikia būti ypač atsargiems ir virinimo metu vengti kunkuliavimo. Be to, ant aušintuvo turi vykti kondensacija. Nustatant blogai besilydančių medžiagų garų slėgį, stebėti, kad neužsikimštų kondensatorius. Užregistravus pusiausvyros tašką, nustatomas didesnis slėgis. Ši darbo eiga tęsiama, kol pasiekiama 105 Pa (iš viso apie 5–10 matavimo taškų). Kontrolei matavimo taškai turi būti kartojami slėgiui mažėjant.

1.6.2. Statinis matavimas

1.6.2.

1.6.2.1. Aparatūra Aparatą sudaro indas su mėginiu, kaitinimo ir aušinimo sistema mėginio temperatūrai reguliuoti ir temperatūrai matuoti. Į aparatą taip pat įeina prietaisai slėgiui nustatyti ir matuoti. 2a ir 2b paveiksluose parodyti pagrindiniai naudoti principai. Prie mėginio kameros (2a pav.) iš vienos pusės yra pritvirtinamas atitinkamas didelio slėgio vožtuvas. U formos vamzdelis, kuriame yra atitinkamas manometro skystis, yra pritvirtinamas iš kitos pusės. Vienas U formos vamzdelio galas atsišakoja į vakuuminį siurblį, azoto cilindrą arba ventiliacijos vožtuvą ir manometrą. Vietoje U formos vamzdelio gali būti naudojamas manometras su slėgio indikatoriumi (2b pav.). Mėginio temperatūrai reguliuoti, mėginio indas su vožtuvu ir U formos vamzdeliu arba manometru dedamas į vonią, kurioje palaikoma pastovi ±0,2 K temperatūra. Temperatūra matuojama išorinėje indo, kuriame yra mėginys, sienelės pusėje arba pačiame inde. Vakuuminis siurblys su prieš srovę veikiančiu aušinimo sifonu naudojamas sudaryti vakuumą aparate. 2a metodu medžiagos garų slėgis yra matuojamas netiesiogiai naudojant nulinį indikatorių. Tokiu būdu atsižvelgiama į tai, kad U formos vamzdelyje esančio skysčio tankis pasikeičia, jeigu temperatūra smarkiai keičiasi. Manometre gali būti naudojamas gyvsidabris, esant įprastam slėgiui iki 102 Pa, o silikatinės alyvos bei ftalatai tinka naudoti, kai slėgis yra žemesnis nei 102 Pa, bet ne žemesnis nei 10 Pa. Kai slėgis žemesnis nei 10-1 Pa, galima naudoti netgi manometrus su kaitinamosiomis membranomis. Kai slėgis žemesnis nei 102 Pa, naudojami ir kitokie manometrai.

1.6.2.2. Matavimų eiga Prieš matuojant visos 2 pav. pavaizduoto prietaiso dalys turi būti kruopščiai išvalytos ir išdžiovintos. Pagal 2a metodą U formos vamzdelis užpildomas pasirinktu skysčiu, kuris prieš užrašant parodymus gali būti degazuotas aukštesnėje temperatūroje. Tiriamoji medžiaga dedama į aparatą, kuris po to uždaromas, o temperatūra sumažinama tiek, kad būtų galima atlikti degazavimą. Temperatūra turi būti pakankamai žema, kad būtų užtikrintas oro išsiurbimas, bet daugiakomponenčių sistemų atveju tai neturi pakeisti medžiagos struktūros. Jeigu reikia, maišant galima greičiau nustatyti pusiausvyrą. Mėginį galima peršaldyti, pvz., skystu azotu (stengiantis, kad neįvyktų oro arba siurblyje esančio skysčio kondensacija) arba etanolio ir sauso ledo mišiniu. Žemai temperatūrai matuoti naudojama reguliuojamos temperatūros vonia, sujungta su ypač žemos temperatūros matuokliu. Atidarius mėginio indo vožtuvą, siurbiama kelias minutes, kad būtų pašalintas oras. Po to vožtuvas uždaromas, o mėginio temperatūra sumažinama iki žemiausio norimo lygio. Prireikus degazavimo veiksmai turi būti pakartojami kelis kartus. Mėginį kaitinant garų slėgis kyla. Tai pakeičia U formos vamzdelyje esančio skysčio pusiausvyrą. Jai atstatyti į aparatą per vožtuvą leidžiama azoto arba oro, kol slėgio indikatoriaus skystis vėl bus ties nuline padala. Tam reikalingą slėgį gali kambario temperatūroje parodyti precizinis manometras. Šis slėgis atitinka medžiagos garų slėgį tam tikroje matuojamoje temperatūroje. 2b metodas yra panašus, bet garų slėgio parodymai nuskaitomi tiesiogiai. Garų slėgio priklausomybė nuo temperatūros yra nustatoma mažais intervalais (iš viso apytikriai 5-10 matavimo taškų) iki norimo maksimumo. Žemos temperatūros parodymus reikia pakartotinai išmatuoti. Jeigu iš pakartotinių matavimų gautos vertės nesutampa su esančiomis kreivėje, gautoje padidinus temperatūrą, tai gali būti dėl vienos iš šių priežasčių:

1.6.2.2.

1. Mėginyje tebėra oro (pvz., didelio klampumo medžiagose) arba liko medžiagų, kurių virimo temperatūra yra žema ir kuri/kurios išsiskiria kaitinimo metu. Jos gali būti pašalinamos išsiurbiant po papildomo peršaldymo.

2. Aušinimo temperatūra yra nepakankamai žema. Šiuo atveju skystasis azotas naudojamas kaip aušalas. Tiek 1, tiek 2 atveju matavimai turi būti pakartojami.

3. Medžiagoje vyksta cheminė reakcija tyrinėjamame temperatūrų intervale (pvz., skilimas, polimerizacija).

1.6.3. Izoteniskopas Išsamų šio metodo aprašymą galima rasti 7 nuorodoje. Šio matavimo prietaiso principas pavaizduotas 3 paveiksle. Panašiai kaip statinis metodas, apibūdintas 1.6.2, izoteniskopas tinka tyrinėti kietuosius ir skystuosius kūnus. Jeigu tai skystieji kūnai, pati medžiaga naudojama kaip skystis pagalbiniame manometre. Į izoteniskopą dedamas toks kiekis skysčio, kurio pakanka kolbai užpildyti, ir prie izoteniskopo pritaisoma trumpoji manometro kojelė. Izoteniskopas pritaisomas prie vakuuminės sistemos, iš jos išsiurbiamas oras, po to užpildoma azotu. Sistemos išsiurbimas ir išvalymas kartojamas du kartus, kad būtų pašalinamas liekamasis deguonis. Užpildytas izoteniskopas dedamas horizontaliai, kad mėginys mėginio kolboje ir manometro sekcijoje (U dalis) pasklistų plonu sluoksniu. Slėgis sistemoje sumažinamas iki 133 Pa, o mėginys yra iš lengvo šildomas, kol ima virti (ištirpusių sujungtųjų dujų pašalinimas). Tada izoteniskopas dedamas taip, kad mėginys vėl atsirastų kolboje ir trumpojoje manometro kojelėje ir abu būtų pilni skysčio. Palaikomas toks pat slėgis kaip degazuojant; išsikišęs mėginio kolbos galiukas šildomas nedidelėje liepsnoje, kol išsiskyrę mėginio garai gerai pasklis ir išstums dalį mėginio iš viršutinės kolbos dalies ir manometro kojelės į izoteniskopo manometro sekciją, sudarydami garų pripildytą be azoto erdvę. Po to izoteniskopas dedamas į pastovios temperatūros vonią, azoto slėgis derinamas tol, kol jo slėgis tampa lygus mėginio slėgiui. Slėgio pusiausvyrą parodo izoteniskopo manometro sekcija. Pusiausvyros sąlygomis azoto garų slėgis yra lygus medžiagos garų slėgiui. Kietosioms medžiagoms, atsižvelgiant į slėgį ir temperatūrų intervalą, yra naudojami manometro skysčiai, nurodyti 1.6.2.1. Tokiu atveju kietasis kūnas, kurį reikia ištirti, dedamas į kolbą ir degazuojamas padidintoje temperatūroje. Degazuotas manometro skystis pilamas į ilgosios izoteniskopo kojelės kolbelę. Po to izoteniskopas palenkiamas taip, kad manometre esantis skystis nutekėtų į U formos vamzdelį. Garų slėgis, kaip temperatūros funkcija, yra matuojamas pagal 1.6.2.

1.6.4. Efuzijos metodas: garų slėgio pusiausvyra

1.6.4.

1.6.4.1. Aparatūra Įvairūs aparatūros variantai yra apibūdinti literatūros 1 nuorodoje. Joje apibūdintas aparatas iliustruoja bendrą naudojamą principą (4 pav.). 4 paveiksle parodytos pagrindinės aparato sudedamosios dalys: tai didelio vakuumo nerūdijančio plieno arba stiklo indas, įranga vakuumui sudaryti ir matuoti bei įmontuotos sudedamosios dalys garų slėgiui matuoti svarstyklėmis. Į aparatą įmontuotos šios sudedamosios dalys:

garinimo krosnis su junge ir sukamąja įsiurbimo anga. Garinimo krosnis – tai cilindrinis indas, pavyzdžiui, iš vario arba chemiškai atsparaus, gero šiluminio laidumo lydinio. Taip pat galima naudoti stiklinį indą vario sienelėmis. Krosnies skersmuo apie 3-5 cm, aukštis – 2-5 cm. Garų srovė išleidžiama per skirtingo dydžio angas, kurių būna nuo vienos iki trijų. Krosnis šildoma apačioje esančia kaitinimo plokšte arba iš išorės apvyniota spirale. Kad šiluma nebūtų veltui eikvojama pagrindinei plokštei kaitinti, šildytuvas ant pagrindinės plokštės tvirtinamas mažo terminio laidumo metalu (melchioras arba chromnikelinis plienas), pvz., melchioro vamzdelis pritaisomas prie sukamosios angos, jeigu naudojama krosnis su keliomis angomis. Šio įtaiso privalumas – galima įtaisyti varinį strypą. Taip galima aušinti iš išorinės pusės naudojant aušinimo vonią,

jeigu varinės krosnies dangtelyje yra trys skirtingo skersmens angos, viena nuo kitos esančios 90o kampu, galima apimti įvairius garų slėgio intervalus per visą matavimų intervalą (angų skersmuo apytikriai 0,30–4,50 mm). Didelės angos naudojamos mažam garų slėgiui ir atvirkščiai. Sukant krosnį galima nustatyti norimą angą arba tarpinę padėtį garų srovėje (krosnies skylė – skydas – svarstyklių lėkštė), išsiskiria molekulių srautas arba jis nukreipiamas per krosnies angą į svarstyklių lėkštę. Kad būtų išmatuota medžiagos temperatūra, termoelementas arba varžinis termometras dedamas tinkamoje vietoje,

virš skydo yra labai jautrių mikrosvarstyklių lėkštė (žr. toliau). Svarstyklių lėkštės skersmuo yra apie 30 mm. Paauksuotas aliuminis yra tam tinkanti medžiaga,

svarstyklių lėkštė yra apgaubta cilindrine žalvarine arba varine šaldymo dėže. Atsižvelgiant į svarstyklių rūšį joje yra angos svarstyklių svirtelei ir anga dangtyje molekulių srovei, kuri turėtų garantuoti visišką garų kondensaciją ant svarstyklių lėkštės. Šilumos išsiskyrimas į išorę, pavyzdžiui, yra užtikrinamas vario strypeliu, sujungtu su šaldymo dėže. Strypelis yra ištraukiamas per pagrindinę plokštę ir nuo jos termiškai izoliuojamas, pavyzdžiui, chromnikelio plieno vamzdeliu. Strypelis panardinamas į Diuaro indą su skystu azotu, esančiu po pagrindine plokšte, arba skystasis azotas cirkuliuoja strypeliu. Taip šaldymo dėžė yra laikoma apytikriai –120 oC temperatūroje. Svarstyklių lėkštė aušinama tik spinduliavimu, kurio pakanka, kad tiriamasis slėgio intervalas būtų pakankamas (aušinama apie 1 valandą iki matavimų pradžios),

svarstyklės dedamos virš šaldymo dėžės. Tinka, pavyzdžiui, labai jautrios svarstyklės, 2 pečių elektroninės mikrosvarstyklės (8) arba labai jautrus judamosios ritės prietaisas (žr. OECD Test Guideline 104, Edition 12.05.81),

pagrindinėje plokštelėje taip pat yra elektrinės jungtys termoelementams (arba varžiniams termometrams) ir kaitinimo ritėms,

vakuumas inde sudaromas naudojant dalinį vakuuminį siurblį (reikalingas vakuumas apytikriai 1-2 × 10-3 Pa, gaunamas po 2 valandų siurbimo). Slėgis reguliuojamas atitinkamu jonizacijos manometru.

1.6.4.2. Matavimų eiga Indas užpildomas tiriamąja medžiaga ir uždaromas dangteliu. Gaubtas ir šaldytuvo dėžė įstumiami į krosnį. Aparatas uždaromas ir įjungiami vakuumo siurbliai. Slėgis prieš pradedant matavimus turėtų būti apie 10-4 Pa. Šaldymo dėžės aušinimas pradedamas esant 10-2 Pa. Kai pasiekiamas reikalingas vakuumo lygis, pradedama kalibravimo serija žemiausioje reikalaujamoje temperatūroje. Nustatoma atitinkama anga dangtelyje, garų srovė teka per gaubtą tiesiai virš angos, į ataušintą svarstyklių lėkštę. Svarstyklių lėkštė turi būti pakankamai didelė, kad visa per gaubtą nukreipta srovė patektų į ją. Garų srovės savo jėga veikia į svarstyklių lėkštę, ir molekulės kondensuojasi ant vėsaus paviršiaus. Dėl vienkartinės ir vienalaikės kondensacijos reaguoja savirašis. Įvertinus signalus gaunama dviejų rūšių informacija: p = G 2 π RT×103M kai: G garavimo koeficientas (kg s-1 m-2) M molinė masė (g mol-1) T temperatūra (K) R universalioji molinė dujų konstanta (J mol-1 K-1) p garų slėgis (Pa) Pasiekus reikalingą vakuumą, pradedami matavimai žemiausioje norimoje matavimų temperatūroje. Tolesniems matavimams temperatūra didinama mažais intervalais, kol pasiekiama didžiausia norima temperatūros vertė. Po to mėginys aušinamas ir galima užrašyti antrą garų slėgio kreivę. Jeigu antro matavimo metu nepavyksta patvirtinti pirmo matavimo rezultatų, gali būti, kad medžiaga irsta matuojamame temperatūros intervale.

1.6.4.2.

1. Čia apibūdintame aparate garų slėgis yra nustatomas tiesiogiai pagal garų postūmio kiekį į svarstyklių lėkštę (čia nereikia žinoti molekulinio svorio (2)). Kai vertinami parodymai, turi būti atsižvelgiama į tokius geometrinius veiksnius, kaip krosnies anga ir molekulinio srauto kampas.

2. Tuo pačiu metu kondensato masę galima matuoti ir taip galima apskaičiuoti garavimo koeficientą. Taip pat galima apskaičiuoti garų slėgį pagal garavimo koeficientą ir molekulinį svorį pagal Herzo lygtį (2).

1.6.5. Efuzijos metodas – pagal prarastą svorį

1.6.5.

1.6.5.1. Aparatūra Efuzijos aparatą sudaro šios pagrindinės dalys: Kaip pavyzdys 5 paveiksle pavaizduotas elektra šildomas aliumininis vakuumo rezervuaras su 4 nerūdijančio plieno efuzijos elementais. Apytikriai 0,3 mm storio nerūdijančio plieno folijoje yra 0,2–1,0 mm skersmens efuzijos antgaliai, prie efuzijos elemento pritaisyti įsriegiamu dangteliu.

rezervuaras, kuriame galima nustatyti pastovią temperatūrą ir jį galima išsiurbti ir kur sudėti efuzijos elementai,

didelio vakuumo siurblys (pvz., difuzinis siurblys arba turbomolekulinis siurblys) su vakuumo matuokliu,

gaudyklė, kurioje naudojamas suskystintas azotas arba sausasis ledas.

1.6.5.2. Matavimo eiga Etalonine ir tiriamąja medžiagomis užpildomas kiekvienas efuzijos elementas, metalinė diafragma su antgaliu yra apsaugota įsriegtu dangteliu, kiekvienas elementas pasveriamas 0,1 mg tikslumu. Elementas dedamas į aparatą su nustatyta temperatūra, kuriame oras išsiurbiamas tiek, kad slėgis būtų viena dešimtąja mažesnis negu reikalaujama. Apibrėžtais laiko intervalais nuo 5 iki 30 valandų į aparatą įleidžiama oro, o efuzijos elemento masės nuostolis nustatomas pakartotinai ją pasveriant. Norint užtikrinti, kad lakiosios priemaišos neturėtų įtakos rezultatams, elementas pakartotinai sveriamas apibrėžtais laiko intervalais, kad būtų patikrinama, ar garavimo sparta yra pastovi ne mažiau kaip du tokius laiko intervalus. Garų slėgis p efuzijos elemente gaunamas: p = mKAt2 π R TM kai: p garų slėgis (Pa) m medžiagos, išeinančios iš elemento per laiką t, masė (kg) t laikas (s) A skylės plotas (m2) K korekcijos koeficientas R universalioji dujų konstanta (J mol-1 K-1) T temperatūra (K) M molekulinė masė (kg mol-1) Korekcijos koeficientas K priklauso nuo cilindrinio antgalio ilgio santykio su jo spinduliu: Koeficientas 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Pirmiau pateikta lygtis gali būti užrašoma taip: p = E mtTM kai E = 1KA2πR ir tai yra efuzijos elemento konstanta. Ši efuzijos elemento konstanta E gali būti nustatoma su etaloninėmis medžiagomis (2,9) pagal šią lygtį: E = p(r)tmM(r)T kai: p(r) etaloninės medžiagos garų slėgis (Pa) M(r) etaloninės medžiagos molekulinė masė (kg. × mol-l)

1.6.6. Dujų soties metodas

1.6.6.

1.6.6.1. Aparatūra Tipišką aparatą, naudojamą šiam tyrimui atlikti, sudaro keletas sudedamųjų dalių, nurodytų 6a paveiksle, kurios apibūdinamos toliau (1).

1.6.6.1. Inertinės dujos

Nešančiosios dujos neturi sukelti cheminės reakcijos su tiriamąja medžiaga. Paprastai šiam tikslui tinka azotas, bet kartais gali būti reikalingos kitos dujos (10). Naudojamos dujos turi būti sausos (žr. 6a paveikslą, 4 punktą: santykinio drėgnio jutiklis).

Srauto kontrolė

Atitinkama dujų kontrolės sistema yra reikalinga tam, kad būtų užtikrinta, jog per soties kolonėlę einantis srautas būtų pastovus ir toks, koks pasirinktas.

Garų surinkimo gaudyklės

Tai priklauso nuo tam tikrų bandinio ypatybių ir pasirinkto analizės metodo. Garų turėtų būti sugaunamas toks kiekis ir taip, kad po to būtų galima atlikti analizę. Tam tikroms tiriamosioms medžiagoms tinka gaudyklės su tokiais skysčiais kaip heksanas arba etilenglikolis. Kitoms medžiagoms gali būti naudojami kietieji absorbentai. Kaip garų sugaudymo ir po to atliekamos analizės alternatyva gali būti naudojama betarpiška tyrimų technika, pavyzdžiui, chromatografas, gali būti naudojama kiekybiškai nustatyti kiekį medžiagos, perneštos žinomu kiekiu nešančiųjų dujų. Be to, galima išmatuoti mėginio masės nuostolius.

Šilumokaitis

Matuojant skirtingose temperatūrose gali reikėti į agregatą įmontuoti šilumokaitį.

Sotintuvo kolonėlė

Mėginys iš tirpalo dedamas ant atitinkamo nejudančio laikiklio. Apdengtas laikiklis dedamas į soties kolonėlę, kurios dydžiai ir srauto greitis turėtų būti tokie, kad būtų užtikrinta visiška nešančiųjų dujų sotis. Soties kolonėlėje turi būti pastovi temperatūra. Matuojant aukštesnėje negu kambario temperatūroje, vieta tarp soties kolonėlės ir gaudyklių turėtų būti šildoma, kad būtų išvengta tiriamos medžiagos kondensacijos. Kad būtų sumažintas masės pernešimas, pasireiškiantis difuzija, kapiliarinis vamzdelis gali būti įtaisomas už soties kolonėlės (6b pav.)

1.6.6.2. Matavimo darbo eiga

1.6.6.2. Soties kolonėlės paruošimas

Tiriamos medžiagos tirpalas labai lakiame tirpiklyje dedamas į atitinkamą laikiklio kiekį. Turėtų būti dedamas pakankamas kiekis mėginio, kad tyrimo metu išliktų sotis. Visas tirpiklis išgarinamas ore arba sukamajame garintuve, ir gerai išmaišyta medžiaga dedama į sotintuvo kolonėlę. Nustačius pastovią bandinio temperatūrą, sausas azotas leidžiamas per aparatą.

Matavimas

Gaudyklės arba betarpiškai įtaisytas detektorius yra sujungti su kolonėlės nutekamuoju vamzdeliu, užrašomas laikas. Srauto greitis yra tikrinamas pradžioje ir reguliariais intervalais eksperimento eigoje, naudojant barboterį (arba visą laiką – debitmačiu). Turi būti matuojamas slėgis prie sotintuvo išėjimo angos. Tai gali būti daroma vienu iš būdu: Laikas, reikalingas surinkti tokį tiriamos medžiagos kiekį, reikalingą skirtingiems analizės metodams, yra nustatomas atliekant išankstinius matavimus arba apskaičiavimus. Medžiagos surinkimas tolesniems mėginiams gali vykti naudojant betarpiškai įmontuotą kiekio tyrimo techniką (pvz., chromatografą). Prieš apskaičiuojant garų slėgį tam tikroje temperatūroje, turi būti atliekami išankstiniai matavimai, norint nustatyti didžiausią srauto greitį, kuris visiškai įsotins nešančiąsias dujas medžiagos garais. Tai garantuojama, jeigu nešančiosios dujos yra leidžiamos per sotintuvą pakankamai lėtai, kad mažesnis greitis nesukeltų didesnio apskaičiuotojo garų slėgio. Specialus analizės metodas nustatomas pagal tiriamos medžiagos prigimtį (pvz., dujų chromatografija arba gravimetrija). Nustatomas medžiagos kiekis, perneštos žinomu nešančiųjų dujų tūriu.

a)

įmontuojant manometrą tarp sotintuvo ir gaudyklių (to gali nepakakti, kadangi taip padidėja įrangos užimama erdvė ir adsorbcinis paviršius); arba

b)

nustatant staigų slėgio mažėjimą visoje konkrečioje sugaudymo sistemoje, atskirame eksperimente naudojamą kaip srauto greičio funkcija (tai gali nelabai tikti skysčių gaudyklėms).

1.6.6.3. Garų slėgio apskaičiavimas Garų slėgis apskaičiuojamas pagal garų slėgį (W/V) tokia lygtimi: p = WV × RTM kai: p garų slėgis (Pa) W išgarinto mėginio masė (g) V įsotintų dujų tūris (m3) R universalioji molinė dujų konstanta (J mol-1 K1) T temperatūra (K) M tiriamos medžiagos molinė masė (g mol-1) Matuojamiems tūriams turi būti koreguojami debitmačio ir sotintuvo su nustatyta temperatūra slėgio bei temperatūrų skirtumai. Jeigu debitmatis yra žemiau garų gaudyklės, koregavimas gali būti reikalingas atsižvelgiant į išgarintos gaudyklės ingredientus (1).

1.6.7. Sukamasis rotorius (8, 11, 13)

1.6.7.

1.6.7.1. Aparatūra Sukamojo rotoriaus metodu gali būti naudojamas sukamojo rotoriaus klampumo matuoklis, kaip parodyta 8 paveiksle. Eksperimentinės konstrukcijos schema parodyta 7 paveiksle. Paprastai matavimo aparatas susideda iš sukamojo rotoriaus matavimo galvutės, įdėtos į apvalkalą su nustatyta temperatūra (reguliuojama 0,1 oC ribose). Konteineris su mėginiu dedamas į apvalkalą su nustatyta temperatūra (reguliuojama 0,01 oC ribose), o visos kitos konstrukcijos dalys yra laikomos aukštesnėje temperatūroje, kad būtų išvengiama kondensacijos. Didelio vakuumo siurblys sujungiamas su sistema didelio vakuumo vožtuvais. Sukamojo rotoriaus matavimo galvutę sudaro vamzdelyje esantis plieninis rutuliukas (4–5 mm skersmens). Rutuliukas kybo magnetiniame lauke, jam stabilizuoti paprastai naudojamas nuolatinio magneto ir reguliavimo ričių derinys. Rutuliukas sukamas ričių sukeliamu sukamuoju lauku. Griebiančiosios ritės, matuojančios visada egzistuojantį žemą šoninį kamuoliuko įmagnetinimą, naudojamos išmatuoti jo sukimosi greitį.

1.6.7.2. Matavimų eiga Kai rutuliukas pasiekia tam tikrą sukimosi greitį v(o) (paprastai apie 400 sūkių per sekundę), tolesnis energijos padavimas liaujasi ir dėl dujų trinties įvyksta stabdymas. Sukimosi greičio sumažėjimas matuojamas kaip laiko funkcija. Kadangi trintis dėl magnetinio sustabdymo palyginti su dujų trintimi yra nežymi, dujų slėgis p apskaičiuojamas taip: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) kai: c— vidutinis dujų molekulių greitis r rutuliuko spindulys p rutuliuko tankis σ liestinio judesio kiekio perdavos koeficientas (ε = 1, kai rutuliuko paviršius idealiai sferinis) t laikas v(t) sukimosi greitis, praėjus laikui t v(o) pradinis sukimosi greitis Ši lygtis gali būti užrašyta taip: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 kai tn, tn-1 yra laikas, reikalingas tam tikram apsisukimų skaičiui N atlikti. Šie laiko intervalai tn ir tn-1 eina vienas paskui kitą, o tn > tn-1. Vidutinis dujų molekulių greitis apskaičiuojamas pagal: c— = 8 RTπ M12 kai: T temperatūra R universalioji molinė dujų konstanta M molio masė

2. DUOMENYS Bet kuriame iš ankstesnių metodų garų slėgis turėtų būti nustatomas naudojant mažiausiai dvi temperatūras. Kai ribos yra nuo 0 iki 50 oC, norint patikrinti garų slėgio kreivės tiesiškumą, reikėtų naudoti tris arba daugiau temperatūras.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija: Jei pastebimas keitimasis (būklės keitimasis, skilimas), reikia pažymėti šią informaciją: Visa rezultatų aiškinimui svarbi informacija ir pastabos turi būti pateikiamos ataskaitoje, ypač reikia pateikti informaciją apie medžiagos priemaišas ir fizinę būklę.

taikytas tyrimo metodas;

tikslios medžiagos charakteristikos (identiškumas ir priemaišos) ir išankstinio gryninimo pakopa, jeigu tokia yra,

mažiausiai du garų slėgio ir temperatūros dydžiai, pageidautina 0–50 C ribose,

visi neapdoroti duomenys,

log p ir 1/T kreivės santykis,

garų slėgio apskaičiavimas ribose, esant 20 arba 25 oC.

keitimosi pobūdis,

temperatūra, kurioje esant atmosferiniam slėgiui prasideda keitimasis,

garų slėgis 10 ir 20 oC žemiau keitimosi temperatūros ir 10 ir 20 C aukščiau šios temperatūros (jei keitimasis nėra iš kietos į dujinę būseną).

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)

LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, p. 593. NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa – Static method. NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure- temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987,'VoI. 5 (4), p. 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, p. 1173. B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, p. 435. G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, Vol. 17 (2), p. 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, voI. 20 (4), p. 1148. J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, Vol. 3 (3), p. 1715.

A.5. PAVIRŠIAUS ĮTEMPTIS

A.5.

1. METODAS Apibūdintieji metodai yra pagrįsti OECD Test Guideline (1). Pagrindiniai principai pateikti 2 nuorodoje.

1.

1.1. ĮVADAS Apibūdintieji metodai turi būti taikomi vandeninių tirpalų paviršiaus įtempties matavimuose. Naudinga prieš atliekant šiuos bandymus iš anksto turėti informaciją apie medžiagos micelių tirpumą vandenyje, struktūrą, hidrolizines savybes ir kritines koncentracijas. Toliau išvardyti metodai yra taikytini daugumai cheminių medžiagų, netaikant jokių apribojimų jų grynumo laipsniui. Paviršiaus įtempties matavimuose cikliniu tenzometru apsiribojama vandeniniais tirpalais, kurių dinaminis klampumas mažesnis negu apytikriai 200 mPa s.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Gibso paviršiaus energija vienam paviršiaus vienetui laikoma paviršiaus įtemptimi. Paviršiaus įtemptis nurodoma: N/m (SI vienetais) arba mN/m (SI pogrupiais) 1 N/m = 103 dinų/cm 1 mN/m = 1 dina/cm nebevartojamoje cgs sistemoje

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Etaloninių medžiagų nereikia naudoti visais tais atvejais, kai tyrinėjama nauja medžiaga. Jos pirmiausia turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant metodų veikimą ir lyginti rezultatus su kitais metodais gautais rezultatais. Etaloninės medžiagos, kurios įeina į didelę grupę paviršiaus įtempčių, pateiktos 1 ir 3 nuorodose.

1.4. METODŲ ESMĖ Šie metodai yra pagrįsti matavimais didžiausios jėgos, reikalingos vertikaliai įtempti ant ąselės arba žiedo, esančio sąlytyje su matavimo stiklinėje esančio tiriamojo skysčio paviršiumi, norint skystį atskirti nuo to paviršiaus arba plokštelės, kurios kraštas liečiasi su tuo paviršiumi, kad būtų pritraukta susidariusi plėvelė. Vandenyje tirpios medžiagos, kai jų koncentracija ne mažesnė kaip 1 mg/l, yra tiriamos vandeniniuose tirpaluose esant pavienei koncentracijai.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Šie metodai yra žymiai tikslesni, negu tai gali būti reikalinga aplinkosaugai įvertinti.

1.6. METODŲ APIBŪDINIMAS Medžiagos tirpalas paruošiamas distiliuotame vandenyje. Šio tirpalo koncentracija turėtų sudaryti 90 % medžiagos soties tirpumo vandenyje; jeigu ši koncentracija viršija 1 g/l, tyrimui naudojama 1 g/l koncentracija. Medžiagų, kurių tirpumas vandenyje mažesnis kaip 1 mg/l, nereikia tirti.

1.6.

1.6.1. Anodinis metodas Žr. ISO 304 ir NF T 73-060 (Paviršinio aktyvumo reagentai – paviršiaus įtempties nustatymas tempiant skystąsias plėveles).

1.6.2. Ąselės metodas Žr. ISO 304 ir NF T 73-060 (Paviršinio aktyvumo reagentai – paviršiaus įtempties nustatymas tempiant skystąsias plėveles).

1.6.3. Žiedo metodas Žr. ISO 304 ir NF T 73-060 (Paviršinio aktyvumo reagentai – paviršiaus įtempties nustatymas tempiant skystąsias plėveles).

1.6.4. OECD suderintas cirkuliarinis metodas

1.6.4.

1.6.4.1. Aparatūra Parduodami tenzometrai tinka šiems matavimams. Juos sudaro šie elementai:

kilnojamasis mėginio stalelis,

matavimo sistema,

1.6.4.1.

1.6.4.1.1. Kilnojamasis mėginio stalelis Kilnojamasis mėginio stalelis naudojamas kaip kontroliuojamos temperatūros matavimo indo, kuriame yra tiriamasis skystis, atrama. Kartu su jėgos matavimo sistema jis dedamas ant stovo.

1.6.4.1.2. Jėgos matavimo sistema Jėgos matavimo sistema (žr. paveikslą) yra virš mėginio stalelio. Jėgos matavimo paklaida neturi viršyti ±10-6 N, atitinkančią paklaidos ribą ±0,1 mg matuojant masę. Daugeliu atvejų parduodamų tenzometrų matavimo skalė yra kalibruota mN/m taip, kad paviršiaus įtemptis gali būti tiesiogiai parodoma mN/m, 0,1 mN/m tikslumu.

1.6.4.1.3. Matavimo kūnas (žiedas) Paprastai žiedas yra padarytas iš platinos ir iridžio vielos, kurios storis 0,4 mm, o perimetras 60 mm. Vielos žiedas pakabinamas horizontaliai ant metalinės ašies ir montažinio laikytuvo, kad būtų galima sujungti su jėgos matavimo sistema (žr. paveikslą).

1.6.4.1.3. Paveikslas Matavimo kūnas

(Visi matmenys nurodyti milimetrais) Ašis Montažinis laikytuvas Žiedas

1.6.4.1.4. Matavimo indas Matavimo indas su tiriamu tirpalu, kuris turi būti išmatuotas – tai stiklinis indas su kontroliuojama temperatūra. Jo konstrukcija turi būti tokia, kad matavimo metu tiriamo tirpalo skysčio temperatūra ir dujų fazė virš jo paviršiaus išliktų pastovios ir kad mėginys negaruotų. Tinka cilindriniai stikliniai indai, kurių vidinis skersmuo ne mažesnis kaip 45 mm.

1.6.4.2. Aparatūros paruošimas

1.6.4.2.

1.6.4.2.1. Valymas Stikliniai indai turi būti kruopščiai išvalomi. Jeigu reikia, jie išplaunami karšta chromo sieros rūgštimi, o po to sirupo tirštumo sieros rūgštimi (83–98 % H3PO4 svorio) kruopščiai nuskalaujami vandeniu iš čiaupo ir galiausiai nuplaunami du kartus distiliuotu vandeniu, kol bus gaunama neutrali reakcija, po to išdžiovinama arba nuskalaujama dalimi mėginio tirpalo, kurį reikia išmatuoti. Žiedas iš pradžių turi būti gerai nuskalaujamas vandeniu, kad būtų pašalinamos bet kokios vandenyje tirpios medžiagos, trumpam pamerkiamas į chromo sieros rūgštį, nuplaunamas du kartus distiliuotu vandeniu, kol bus gaunama neutrali reakcija, ir galiausiai lengvai pašildomas virš metanolio liepsnos. Pastaba Tarša medžiagomis, kurios neištirpsta arba nesuyra veikiamos chromo sieros rūgštimi arba fosforo rūgštimi, pavyzdžiui, silikonai, yra pašalinama atitinkamais organiniais tirpikliais.

1.6.4.2.2. Aparato kalibravimas Aparatas patvirtinamas patikrinant nulinį tašką ir suderinant taip, kad prietaiso parodymai leistų patikimai nustatyti mN/m.

1.6.4.2.2. Montažas

Aparatas išlyginamas, pavyzdžiui, pagal tenzometro pagrindo spirito lygį, suderinant pagrinde esančius koreguojančius varžtus.

Nulinio taško derinimas

Įtaisius žiedą ant aparato ir prieš pamerkiant jį į skystį, tenzometro parodymai suderinami taip, kad rodytų nulį, ir patikrinama, kad žiedas kabėtų lygiagrečiai skysčio paviršiui. Tam tikslui skysčio paviršius gali būti naudojamas kaip veidrodis.

Kalibravimas

Tikrasis bandymo kalibravimas gali būti atliekamas naudojant dvi darbo eigas:

a)

naudojant masę: darbo eiga naudojant žinomos masės, 0,1–1,0 g, pasvarėlius, uždedamus ant žiedo. Kalibravimo koeficientas Φa, iš kurio turi būti padauginamas kiekvienas prietaiso parodymas, nustatomas pagal šią lygtį (1): Φa=σrσa kai: σr=mg2b (mN/m) m pasvarėlio masė (g) g sunkio greitėjimas (981 cm s-2 jūros lygyje) b vidutinis žiedo perimetras (cm) σa tenzometro parodymai po to, kai ant žiedo uždedami pasvarėliai (mN/m).

b)

naudojant vandenį: darbo eiga naudojant gryną vandenį, kurio paviršiaus įtemptis, kai temperatūra, pavyzdžiui, lygi 23 oC, yra 72,3 mN/m. Ši darbo eiga greitesnė negu svorio kalibravimas, bet visuomet yra pavojus, kad vandens paviršiaus įtemptį iškreips taršos paviršinio aktyvumo medžiagomis pėdsakai. Kalibravimo koeficientas Φb, iš kurio padauginami visi prietaiso parodymai, yra nustatomas pagal lygtį (2): Φb=σoσg kai: σo nuorodoje apie vandens paviršiaus įtemptį nurodyta vertė (mN/m) σg nuorodoje apie vandens paviršiaus įtemptį nurodyta vertė (mN/m) Abi tokioje pat temperatūroje

1.6.4.3. Mėginių paruošimas Vandeniniai tirpalai paruošiami iš tiriamųjų medžiagų naudojant reikalingas koncentracijas vandenyje, juose neturi būti jokių neištirpusių medžiagų. Tirpalas turi būti laikomas pastovioje temperatūroje (±0,5 oC). Kadangi tirpalo, esančio matavimo inde, paviršiaus įtemptis kinta laike, atliekami keli matavimai skirtingu laiku ir brėžiama kreivė, parodanti paviršiaus įtemptį kaip laiko funkciją. Jeigu niekas toliau nesikeičia, tai pusiausvyros būsena pasiekta. Tarša kitų medžiagų dulkėmis ir dujomis trukdo matavimams. Todėl darbas turi būti atliekamas po apsauginiu gaubtu.

1.6.5. Bandymo sąlygos Matavimai atliekami apytikriai 20 oC temperatūroje ir kontroliuojami ±0,5o C ribose.

1.6.6. Bandymo vykdymas Matuojami tirpalai perpilami į kruopščiai išvalytą matavimo indą stengiantis, kad nesusidarytų putų, po to matavimo indas dedamas ant bandymo aparato stalelio. Stalelio viršus su matavimo indu keliamas aukštyn, kol žiedas panyra žemiau matuojamo tirpalo paviršiaus. Po to stalelio viršus pamažu ir tolydžiai nuleidžiamas (apie 0,5 cm/min. greičiu), atskiriant žiedą nuo paviršiaus, kol bus pasiekta maksimali jėga. Skysčio sluoksnis, besiliečiantis su žiedu, neturi atsiskirti nuo žiedo. Užbaigus matavimus, žiedas vėl iškeliamas į paviršių, matavimai kartojami tol, kol bus gauta pastovi paviršiaus įtempties vertė. Kiekvienam nustatymui užrašomas tirpalo perpylimo į matavimo indą laikas. Matavimai užrašomi esant maksimaliai jėgai, reikalingai atskirti žiedą nuo skysčio paviršiaus.

2. Lentelė Matuotos paviršiaus įtempties korekcija Tik vandeniniams tirpalams, ρ ≡ 1 g/cm3

DUOMENYS Norint apskaičiuoti paviršiaus įtemptį, aparato parodyta vertė mN/m pirma dauginama iš kalibravimo koeficiento Φa arba Φb (priklausomai nuo naudotos kalibravimo darbo eigos). Taip bus gaunama vertė, kuri taikoma tik apytikriai ir todėl ją reikia koreguoti. Harkins ir Jordan (4) paviršiaus įtempties vertėms, matuotoms žiedo metodu, empiriškai nustatė korekcijos koeficientus, kurie priklauso nuo žiedo matmenų, skysčio tankio ir jo paviršiaus įtempties. Kadangi korekcijos koeficiento nustatymas kiekvienam atskiram matavimui pagal Harkins ir Jordan lenteles yra daug pastangų reikalaujantis darbas, vandeninių tirpalų paviršiaus įtempčiai apskaičiuoti gali būti naudojama supaprastinta koreguotų paviršiaus įtempties verčių skaitymo tvarka tiesiogiai iš šios lentelės. (Interpoliacija turi būti naudojama parodymams, svyruojantiems tarp lentelėje pateiktų verčių). r = 9,55 mm (vidutinis žiedo spindulys) r = 0,185 mm (vidutinis laido spindulys) Eksperimentinė vertė (mN/m) Koreguotoji vertė (mN/m) Svorio kalibravimas (žr. 1.6.4.2.2 (a)) Vandens kalibravimas (žr. 1.6.4.2.2 (b)) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Ši lentelė buvo sudaryta remiantis Harkins-Jordan korekcijomis. Ji panaši į vandens ir vandeninių tirpalų (tankis p = 1 g/cm) DIN standartą (DIN 53914) ir taikoma pardavinėjamam žiedui, kurio dimensijos R = 9,55 mm (vidutinis žiedo spindulys) ir r = 0,185 mm (žiedo laido spindulys). Lentelėje yra pateiktos koreguotos paviršiaus įtempties matavimų vertės, paimtos po kalibravimo su svoriais arba kalibravimo su vandeniu. Kitaip, be išankstinio kalibravimo, paviršiaus įtemptis gali būti apskaičiuojama pagal šią formulę: σ=f × F4πR kai: F jėga, matuota dinamometru plėvelės nutrūkimo taške R žiedo spindulys f korekcijos koeficientas (1)

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS

3.

3.1. BANDYMO ATASKAITA Bandymo ataskaitoje, kiek įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:

naudotas metodas,

naudoto vandens arba tirpalo rūšis,

tikslus ir išsamus medžiagos apibūdinimas (identiškumas ir priemaišos),

matavimo rezultatai: paviršiaus įtemptis (parodymai), nurodant tiek atskirus parodymus ir jų aritmetinį vidurkį, tiek koreguotą vidurkį (atsižvelgiant į įrangą ir korekcijos lentelę),

tirpalo koncentracija,

bandymo temperatūra,

naudoto tirpalo amžius; ypač laikas nuo paruošimo iki tirpalo matavimo,

paviršiaus įtempties priklausomybės nuo laiko perpylus tirpalą į matavimo indą apibūdinimas,

visa informacija ir pastabos, svarbios rezultatų, apie kuriuos reikia pranešti, aiškinimui, ypač atsižvelgiant į priemaišas ir medžiagos fizikinę būseną.

3.2. REZULTATŲ AIŠKINIMAS Laikant, kad 20 oC temperatūroje distiliuoto vandens paviršiaus įtemptis lygi 72,75 mN/m, medžiagos, kurių paviršiaus įtemptis mažesnė kaip 60 mN/m, pagal šio bandymo sąlygas, turėtų būti laikomos paviršinio aktyvumo medžiagomis.

4.1)2)3)4) LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, p. 1751.

A.6. TIRPUMAS VANDENYJE

A.6.

1. METODAS Apibūdintasis metodas yra pagrįstas OECD Test Guideline (1).

1.

1.1. ĮVADAS Šiam bandymui atlikti naudinga turėti išankstinių duomenų apie medžiagos struktūrinę formulę, garų slėgį, disociacijos konstantą ir hidrolizę (pH funkciją). Nėra atskiro metodo, apimančio visą tirpumo vandenyje intervalą. Du toliau apibūdinti bandymų metodai apima visą tirpumo intervalą bet nėra taikytini lakiosioms medžiagoms: Tiriamosios medžiagos tirpumą vandenyj e gali stipriai paveikti joje esančios priemaišos.

vienas, taikomas iš tikrųjų grynoms mažo tirpumo medžiagoms (< 10 gramų viename litre), ir kurios stabilios vandenyje, nurodytas kaip kolonėlės eliuavimo metodas,

kitas, kuris taikomas iš tikrųjų grynoms didesnio tirpumo medžiagoms (> 10 gramų viename litre) ir kurios yra pastovios vandenyje, nurodytas kaip kolbos metodas.

1.2. APIBRĖŽIMAS IR VIENETAI Medžiagos tirpumas vandenyje yra apibrėžiamas medžiagos soties masės koncentracija vandenyje tam tikroje temperatūroje. Tirpumas vandenyje yra apibrėžiamas masės vienetais tirpalo tūryje. SI vienetai – tai kg/m (taip pat gali būti naudojama gramai litre).

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Etaloninių medžiagų nereikia naudoti visais tais atvejais, kai tyrinėjama nauja medžiaga. Pirmiausiai jos turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant metodo veikimą ir palyginti gautus rezultatus su kitais metodais gautais rezultatais.

1.4. BANDYMO METODO ESMĖ Apytikris bandinio kiekis ir laikas, reikalingas soties masės koncentracijai gauti, turėtų būti nustatomas paprastu išankstiniu bandymu.

1.4.

1.4.1. Kolonėlės reliuavimo metodas Šis metodas pagrįstas bandomosios medžiagos eliuavimu su vandeniu iš mikrokolonėlės, pakrautos inertine indiferentine medžiaga, pavyzdžiui, stiklo rutuliukais arba smėliu, padengta bandomosios medžiagos pertekliumi. Tirpumas vandenyje yra nustatomas tada, kai eliuato masės koncentracija yra pastovi. Tai parodoma koncentracijos kreivės plokščiąja dalimi kaip laiko funkcija.

1.4.2. Kolbos metodas Šiuo metodu medžiaga (kietosios medžiagos turi būti pulverizuojamos) ištirpinama vandenyje, kurio temperatūra šiek tiek aukštesnė negu bandymo temperatūra. Pasiekus sotį, mišinys ataušinamas ir laikomas bandymo temperatūroje, maišant tiek, kiek to reikia pusiausvyrai pasiekti. Matavimas gali būti atliekamas ir tiesiogiai bandymo temperatūroje, jeigu tinkamu bandinių parinkimu užtikrinama, kad bus pasiekta soties pusiausvyra. Po to medžiagos masės koncentracija vandeniniame tirpale, kuriame neturi būti jokių neištirpusių dalelių, yra nustatoma atitinkamu analitiniu metodu.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

1.5.

1.5.1. Pakartojamumas Kolonėlės eliuavimo metodu pakartojamumas gali būti < 30 %; kolbos metodu turėtų būti nustatoma < 15 %.

1.5.2. Jautrumas Tai priklauso nuo analizės metodo, bet masės koncentracija gali būti nustatoma iki 10-6 gramų viename litre.

1.6. METODO APIBŪDINIMAS

1.6.

1.6.1. Bandymo sąlygos Bandymą geriau atlikti 20 ±0,5 oC temperatūroje. Jeigu manoma, kad tirpumas priklauso nuo temperatūros (> 3 % vienam oC), turėtų būti taip pat naudojamos dar dvi temperatūros vertės, ne mažiau kaip 10 oC didesnė ir mažesnė už iš pradžių pasirinktą temperatūrą. Tokiu atveju temperatūra turėtų būti kontroliuojama ±0,1 oC ribose. Pasirinktoji temperatūra turėtų būti išlaikoma pastovi visose svarbiose įrangos dalyse.

1.6.2. Išankstinis bandymas Į apytikriai 0,1 g bandinio (kietosios medžiagos turi būti pulverizuojamos), esančio stikliniu kamščiu užkimštame 10 ml graduotame cilindre kambario temperatūroje, palaipsniui pilami vis didesni distiliuoto vandens tūriai, nurodyti žemiau pateiktoje lentelėje: 0,1 g, ištirpstantis x ml vandens 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Apytikris tirpumas (gramai litre) > 1000 1000–200 200–100 100–50 50–10 10–1 < 1 Kiekvieną kartą įpylus nurodytą kiekį vandens, mišinys stipriai kratomas 10 minučių ir vizualiai tikrinama, ar nėra neištirpusių mėginio dalelių. Jeigu, pridėjus 10 ml vandens, mėginys arba jo dalys neištirpsta, eksperimentas turi būti pakartojamas 100 ml matavimo cilindre su didesniais tūriais vandens. Jeigu tirpumas mažesnis, laikas, reikalingas medžiagai ištirpinti, gali būti žymiai ilgesnis (turėtų būti skiriamos ne mažiau kaip 24 valandos). Apytikris tirpumas lentelėje yra pateiktas tokiame įdedamo vandens tūryje, kuriame mėginys visiškai ištirpsta. Jeigu medžiaga vis tiek yra akivaizdžiai netirpi, turėtų būti skiriama daugiau negu 24 valandos (daugiausiai 96 val.), arba reikėtų toliau skiesti, išsiaiškinant, ar turėtų būti naudojamas kolonėlės eliuavimo arba tirpumo kolboje metodas.

1.6.3. Kolonėlės eliuavimo metodas

1.6.3.

1.6.3.1. Pagalbinė medžiaga, tirpiklis ir eliuatas Kolonėlės eliuavimo metode pagalbinė medžiaga turėtų būti inertiška. Medžiagos, kurias galima naudoti – tai stiklo rutuliukai ir smėlis. Atitinkamas lakus tirpiklis, atitinkantis analizinio reagento kokybę, turėtų būti naudojamas bandomajai medžiagai uždėti ant pagalbinės medžiagos. Du kartus distiliuotas stikliniame arba kvarciniame aparate destiliuotas vanduo, turėtų būti naudojamas kaip eliuatas. Pastaba Vanduo tiesiai iš organinio jonitinio filtro neturi būti naudojamas.

1.6.3.2. Pagalbinės medžiagos pakrovimas Pasveriama apie 600 mg pagalbinės medžiagos ir perpilama į 50 ml apvaliadugnę kolbą. Tinkamas, pasvertas bandomos medžiagos kiekis ištirpinamas pasirinktame tirpiklyje. Atitinkamas šio tirpalo kiekis dedamas į pagalbinę medžiagą. Tirpiklis turi būti visiškai išgarinamas, pavyzdžiui, sukamajame garintuve; priešingu atveju pagalbinės medžiagos soties nebus pasiekta dėl pasiskirstymo reiškinių ant pagalbinės medžiagos paviršiaus. Pagalbinės medžiagos pakrovimas gali sukelti problemų (klaidingi rezultatai), jeigu tiriamoji medžiaga yra nusodinama kaip alyva arba skirtinga kristalo fazė. Problemą reikėtų spręsti eksperimentiniu būdu ir apie tai pateikti išsamią informaciją. Pakrauta pagalbinė medžiaga paliekama įmirkti apie dvi valandas apytikriai 5 ml vandens, po to suspensija dedama į mikrokolonėlę. Kitais atvejais pakraunama sausa pagalbinė medžiaga gali būti supilama į vandens pripildytą mikrokolonėlę, po to apie dvi valandas leidžiama nusistovėti pusiausvyrai.

1.6.3.2. Bandymo eiga

Medžiagos eliuavimas iš pagalbinės medžiagos gali būti atliekamas dviem skirtingais būdais:

recirkuliaciniu siurbliu (žr. 1 paveikslą),

lyginančiuoju indu (žr. 4 paveikslą).

1.6.3.3. Kolonėlės eliuavimo metodas su recirkuliaciniu siurbliu

1.6.3.3. Aparatūra

Tipinės sistemos schema pateikta 1 paveiksle. Tinkanti mikrokolonėlė parodyta 2 paveiksle, nors tinka ir bet kokio kito dydžio, jeigu atitinka atkuriamumo ir jautrumo kriterijus. Kolonėlėje turėtų būti tiek laisvos erdvės, kad tilptų ne mažiau kaip penki vandens sluoksnio tūriai ir mažiausiai penki mėginiai. Kitais atvejais dydį galima sumažinti, jeigu naudojamas užkraunamasis tirpiklis, naudojamas pakeisti pradinius su priemaišomis pašalinamus penkis sluoksnio tūrius. Kolonėlė turėtų būti sujungta su recirkuliaciniu siurbliu, kuriuo galima kontroliuoti apytikriai 25 ml/h srautus. Siurblys sujungiamas su politetrafluoretileno (P.T.F.E) ir(arba) stiklinėmis jungtimis. Kolonėlė ir siurblys, juos sumontavus, turėtų paimti išmetamą kiekį ir nustatyti sluoksnio tūrio pusiausvyrą atmosferos slėgyje. Į kolonėlėje esančią medžiagą papildomai dedamas nedidelis (5 mm) stiklo vatos kaištis, kuris taip pat naudojamas dalelytėms filtruoti. Recirkuliacinis siurblys, pavyzdžiui, gali būti peristaltiniu siurbliu arba membraniniu siurbliu (reikia imtis atsargumo priemonių, kad vamzdyje esanti medžiaga nebūtų užteršiama ir(arba) neįvyktų absorbcija).

Matavimo eiga

Srautas leidžiamas per kolonėlę. Rekomenduojama, kad būtų naudojamas apytikriai 25 ml/val. debitas (apibūdintai kolonėlei tai – 10 sluoksnio tūrių/val.). Pirmieji penki sluoksnio tūriai (mažiausiai) yra išpilami, kad būtų pašalinamos vandenyje tirpios priemaišos. Po to recirkuliacinis siurblys dirba tol, kol pasiekiama pusiausvyra, kaip nustatyta penkiais vienas po kito dedamais mėginiais, kurių koncentracijos skiriasi ne daugiau kaip ± 30 % juos atsitiktinai parenkant. Šie mėginiai turėtų būti vienas nuo kito atskiriami laiko intervalais, kurio metu pasikeičia ne mažiau kaip 10 eliuato sluoksnio tūrių.

1.6.3.4. Kolonėlės eliuavimo metodas su išlyginančiuoju indu

1.6.3.4. Aparatūra (žr. 3 ir 4 pav.)

Išlyginantysis indas: išlyginančiojo indo jungtis yra padaroma iš matinio stiklo jungties, kuri sujungta PTFE vamzdeliais. Rekomenduojamas apie 25 ml/val. debitas. Viena po kitos sekančios eliuato frakcijos turėtų būti surenkamos ir analizuojamos pasirinktu metodu.

Matavimo eiga

Tos vidurinio eliuato intervalo frakcijos, kurių koncentracijos yra pastovios (± 30 %) ne mažiau kaip penkiose iš eilės einančiose frakcijose, yra naudojamos nustatyti tirpumą vandenyje. Abiem atvejais (naudojant recirkuliacinį siurblį arba išlyginantį indą) viską reikia dar kartą pakartoti su puse pirmojo debito kiekio. Jeigu abu rezultatai sutampa, bandymas yra patenkinamas; jeigu esant mažesniam debitui nustatomas akivaizdžiai didesnis tirpumas, debitas turi būti dalijamas pusiau, kol dviem vienas po kito einančiais matavimais bus nustatytas toks pat tirpumas. Abiem atvejais (naudojant recirkuliacinį siurblį arba išlyginantį indą) frakcijos turėtų būti patikrinamos, ar nėra koloidinių medžiagų, tikrinant, ar nėra Tindalio reiškinio (šviesos sklaidos). Dėl tokių dalelių rezultatai tampa negaliojančiais, o bandymas turėtų būti pakartojamas, pagerinant kolonėlės filtravimo darbo eigą. Turėtų būti užrašomas kiekvieno bandinio pH. Darbo eiga turėtų būti kartojama tokioje pat temperatūroje.

1.6.4. Kolbos metodas

1.6.4.

1.6.4.1. Aparatūra Kolbos metodui reikalingos tokios medžiagos:

paprasti laboratoriniai stikliniai indai ir prietaisai,

prietaisas, tinkantis tirpalams suplakti kontroliuojamoje pastovioje temperatūroje,

centrifuga (geriau su reguliuojama temperatūra), jeigu reikia, su emulsijomis, ir

įrenginys analiziniam nustatymui.

1.6.4.2. Matavimo eiga Medžiagos kiekis, reikalingas norimam vandens tūriui įsotinti, yra apskaičiuojamas išankstiniu bandymu. Reikalingas vandens tūris priklauso nuo analizės metodo ir tirpumo intervalo. Apytikriai penki anksčiau nustatyti medžiagos kiekiai pasveriami į kiekvieną iš trijų stiklinių indų su stikliniais kamščiais (pvz., centrifugos vamzdžiai, kolbos). Pasirinktas vandens kiekis pilamas į kiekvieną indą, kiekvienas indas sandariai užkemšamas. Užkimšti indai kratomi 30 oC temperatūroje. (Turėtų būti naudojamas kratytuvas arba maišytuvas, galintys dirbti pastovioje temperatūroje, pvz., magnetinis maišymas termostatu kontroliuojamoje vandens vonioje). Po paros vienas indas išimamas ir pakartotinai nustatoma pusiausvyra per 24 valandas bandymo temperatūroje retsykiais pakratant. Inde esantis turinys centrifuguojamas bandymo temperatūroje, mėginio aiškioje hidratuotoje fazėje koncentracija nustatoma atitinkamu analiziniu metodu. Su kitomis dviem kolbomis elgiamasi taip pat, prieš tai nustatant pradinę pusiausvyrą 30 oC temperatūroje atitinkamai per dvi ir tris paras. Jeigu duomenys apie koncentraciją, gauti ne mažiau kaip iš paskutiniųjų dviejų indų, atitinka reikalavimus, bandymas yra patenkinamas. Visas bandymas turėtų būti pakartojamas naudojant ilgesnius pusiausvyros nustatymo laikus, jeigu 1, 2 ir 3 indo rezultatai krypsta į didesnes vertes. Matavimo eigą taip pat galima atlikti be išankstinio inkubacinio laikotarpio 30 oC temperatūroje. Kad būtų galima įvertinti soties pusiausvyros nustatymo koeficientą, mėginiai yra imami tada, kai maišymo laikas nebeturi įtakos tiriamojo tirpalo koncentracijai. Turėtų būti užrašomas kiekvieno mėginio pH.

1.6.5. Analizė Atliekant šiuos nustatymus pasirenkamas tai medžiagai tinkantis analizės metodas, kadangi nedideli tirpių medžiagų kiekiai gali būti didelių matuojamo tirpumo paklaidų priežastis. Tokių metodų pavyzdžiai: dujų arba skysčių chromatografija, titravimo metodai, fotometriniai metodai, voltamperometriniai metodai.

2. DUOMENYS

2.

2.1. KOLONĖLĖS ELIUAVIMO METODAS Vidutinė vertė, gauta iš ne mažiau kaip penkių mėginių, iš eilės paimtų iš soties kreivės plokščiosios dalies, turėtų būti apskaičiuojama kiekvienam matavimui, kaip ir standartinis nuokrypis. Duomenys turėtų būti pateikiami tokiais vienetais: masė tirpalo tūriui. Vidurkiai, apskaičiuojami naudojant skirtingus dviejų bandymų srautus, yra palyginami, o jų pakartojamumas turėtų būti mažesnis kaip 30 %.

2.2. KOLBOS METODAS Duomenys turėtų būti gaunami kiekvienai iš trijų kolbų, o iš tų duomenų, kurie laikomi esantys pastovūs (pakartojamumas mažesnis kaip 15 %), išvedamas vidurkis ir pateikiamas masės vienam tirpalo tūriui vienetais. Tam gali tekti masės vienetus pakartotinai paversti tūrio vienetais, naudojant tankį, jeigu tirpumas labai didelis (> 100 gramų viename litre).

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS

3.

3.1. KOLONĖLĖS ELIUAVIMO METODAS Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:

išankstinio bandymo rezultatai,

išsamios medžiagos charakteristikos (tapatybė ir priemaišos),

kiekvieno mėginio individualiosios koncentracijos, debitai ir pH,

ne mažiau kaip penkių mėginių vidutinės vertės ir standartiniai nuokrypiai, paimti iš soties kreivės plokščiosios dalies,

dviejų, vienas paskui kitą sekančių matavimų bendrasis vidurkis,

vandens temperatūra įsisotinimo metu,

naudotas analizės metodas,

naudotos pagalbinės medžiagos charakteristikos,

pagalbinės medžiagos pakrovimas,

naudotas tirpiklis,

bet kokio medžiagos cheminio nepastovumo įrodymai bandymo metu ir naudotas metodas

visa informacija, svarbi rezultatų aiškinimui, ypač apie priemaišas ir medžiagos fizinę būseną.

3.2. KOLBOS METODAS Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:

išankstinio bandymo rezultatai,

išsamios medžiagos charakteristikos (identiškumas ir priemaišos),

kiekvienas individualus nustatymas ir vidurkis, jeigu kiekvienai kolbai buvo nustatoma daugiau negu viena vertė,

kiekvieno mėginio pH,

skirtingų kolbų, kurių duomenys sutampa, bendrasis vertės vidurkis,

bandymo temperatūra,

naudotas analizės metodas,

bet kokio medžiagos cheminio nepastovumo įrodymai bandymo metu ir naudotas metodas,

visa informacija, svarbi rezultatų aiškinimui, ypač apie priemaišas ir medžiagos fizinę būseną.

4.1)2)3) LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method. NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.

A.8. PASISKIRSTYMO KOEFICIENTAS

A.8.

1. METODAS Apibūdintasis kratomos kolbos metodas yra pagrįstas OECD Test Guideline (1).

1.

1.1. ĮVADAS Šiam bandymui naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos struktūrinę formulę, disociacijos konstantą, tirpumą vandenyje, hidrolizę, tirpumą n-oktanolyje ir paviršiaus įtemptį. Matavimai turėtų būti atliekami su jonizuojamomis medžiagomis, esančiomis tik nejonizuota forma (laisvoji riebalų rūgštis arba laisvoji bazė) ir gaunamomis naudojant atitinkamą buferinį tirpalą, kurio pH ne mažiau kaip vienu vienetu mažesnis (laisvoji riebalų rūgštis) arba didesnis (laisvoji bazė) kei pK. Šį bandymo metodą sudaro dvi atskiros darbo eigos: kratomos kolbos metodas ir efektyvoji skysčių chromatografija (HPLC). Pirmoji yra taikoma, kai log Pow vertė (žr. toliau esančius apibrėžimus) yra 2–4 ribose, o antroji – 0–6 ribose. Prieš atliekant bet kurį iš šių eksperimentų, pirma turėtų būti iš anksto apskaičiuojamas pasiskirstymo koeficientas. Kratomos kolbos metodas taikomas tik visiškai grynoms, vandenyje ir n-oktanolyje tirpioms medžiagoms. Jis netaikomas paviršinio aktyvumo medžiagoms (kurioms turėtų būti pateikiama apskaičiuota vertė arba apskaičiavimai, pagrįsti individualiu tirpumu n-oktanolyje ir vandenyje). HPLC metodas neturi būti taikomas stiprioms rūgštims ir bazėms, metalų kompleksiniams junginiams, paviršinio aktyvumo medžiagoms arba medžiagoms, reaguojančioms su eliuatu. Šioms medžiagoms turėtų būti pateikiama apskaičiuotoji vertė arba apskaičiavimas, pagrįstas individualiuoju tirpumu n-oktanolyje arba vandenyje. HPLC metodas yra mažiau jautrus priemaišoms, esančioms bandomajame junginyje, negu kratomos kolbos metodas. Nepaisant to, dėl priemaišų buvimo kai kuriais atvejais rezultatų aiškinimas tampa sudėtingas, kadangi tampa sunku priskirti smailes. Mišiniams, kurių juostos neišskaidytos, turėtų būti nustatomos viršutinė ir apatinė log P ribos.

1.2. APIBRĖŽIMAS IR VIENETAI Pasiskirstymo koeficientas (P) yra apibrėžiamas kaip medžiagos, ištirpintos dviejų fazių sistemoje, sudarytoje iš dviejų nesimaišančių tirpiklių, pusiausvyros koncentracijų (c) santykis. Jeigu tai n-oktanolis ir vanduo: pow=cn-octanolcwater Todėl pasiskirstymo koeficientas (P) yra dviejų koncentracijų dalmuo ir paprastai pateikiamas kaip jo dešimtainis logaritmas (log P).

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

1.3. Kratomos kolbos metodas

Etaloninių medžiagų nereikia naudoti visais tais atvejais, kai tyrinėjama nauja medžiaga. Pirmiausiai jos turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant metodo veikimą ir palyginti gautus rezultatus su kitais metodais gautais rezultatais.

HPLC metodas

Norint išmatuotus HPLC duomenis apie junginį susieti su jo P verte, turi būti brėžiamas kalibravimo log P palyginimo su chromatografiniais duomenimis grafikas, panaudojant ne mažiau kaip 6 pamatinius taškus. Vartotojas sprendžia, kokias tinkamas etalonines medžiagas naudoti. Jeigu įmanoma, ne mažiau kaip vieno etaloninio junginio Pow turėtų būti didesnis negu bandomosios medžiagos, o kitas P turėtų būti mažesnis negu bandomosios medžiagos. Jeigu log Pow vertės yra mažesnės nei 4, kalibravimas gali būti pagrindžiamas duomenimis, gautais kratomos kolbos metodu. Kai log P vertės didesnės nei 4, kalibravimas gali būti pagrindžiamas literatūroje patvirtintomis vertėmis, jeigu jos atitinka apskaičiuotąsias vertes. Norint gauti tikslesnes vertes, geriau pasirinkti tuos etaloninius junginius, kurie struktūros požiūriu yra susiję su bandomąja medžiaga. Išsamų daugumos chemikalų log Pow verčių sąrašą galima rasti 2 ir 3 nuorodose. Jeigu duomenų apie struktūriškai susijusių junginių pasiskirstymo koeficientus neįmanoma gauti, tada gali būti naudojamas bendresnio pobūdžio kalibravimas, nustatytas su kitais etaloniniais junginiais. Rekomenduojamų etaloninių medžiagų ir jų Pow verčių sąrašas pateiktas 2 priedėlyje.

1.4. METODO ESMĖ

1.4.

1.4.1. Kratomos kolbos metodas Pasiskirstymo koeficientui nustatyti turi būti pasiekiama pusiausvyra tarp visų sąveikaujančių sistemos sudedamųjų dalių ir turi būti nustatytos koncentracijos medžiagų, ištirpintų tose dviejose fazėse. Šiam klausimui skirtos literatūros nagrinėjimas rodo, kad problemai spręsti gali būti naudojamos kelios metodikos, pvz., kruopštus dviejų fazių sumaišymas ir po to vykstantis jų atskyrimas, norint nustatyti tyrinėjamos medžiagos pusiausvyros koncentraciją.

1.4.2. HPLC metodas HPLC yra atliekama su analizinėmis kolonėlėmis, įkrautomis prekyboje esančiomis kietosiomis fazėmis su ilgomis angliavandenių grandinėmis (pvz., C8, C18), chemiškai sujungtomis su kvarcu. Chemikalai, įšvirkšti ant tokios kolonėlės, juda išilgai skirtingais greičiais, kadangi pasiskirstymas tarp judančiosios būsenos ir angliavandenio nuostoviosios būsenos yra skirtingo laipsnio. Chemikalų mišiniai dėl jų hidrofobiškumo yra pirma eliuliuojami vandenyje tirpiais chemikalais, po to alyvoje tirpiais chemikalais proporcingai jų angliavandenio ir vandens pasiskirstymo koeficientui. Tai leidžia nustatyti santykį tarp sulaikymo trukmės tokioje kolonėlėje (atvirkštinė fazė) ir n-oktanolio/vandens pasiskirstymo koeficientą. Pasiskirstymo koeficientas yra nustatomas iš talpinio faktoriaus k, gaunamo iš lygties: k=tr-toto kai tR – bandomosios medžiagos sulaikymo trukmė, o to – vidutinis laikas, reikalingas tirpiklio molekulei pereiti per kolonėlę (pradinis laikas). Kiekybiniai analizės metodai nereikalingi, reikia tik nustatyti eliuavimo laiką.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

1.5.

1.5.1. Pakartojamumas

1.5.1. Kratomos kolbos metodas

Norint užtikrinti pasiskirstymo koeficiento tikslumą, turi būti atliekami dvigubi nustatymai esant trims skirtingoms bandymo sąlygoms, kuriomis apibrėžtas medžiagos kiekis, taip pat tirpiklio tūriai gali būti keičiami Nustatytos pasiskirstymo koeficiento vertės, išreikštos bendruoju logaritmu, turėtų patekti į ±0,3 log vienetų intervalą.

HPLC metodas

Norint padidinti pasikliovimą matavimais, turi būti atliekami kartotiniai nustatymai. Log P vertės, gautos iš pavienių matavimų, turėtų patekti į ±0,1 log vienetų intervalą.

1.5.2. Jautrumas

1.5.2. Kratomos kolbos metodas

Metode naudojamas matavimų intervalas yra nustatomas pagal analizės darbo eigos aptikimo ribą. Tai turėtų leisti įvertinti log Pow vertes intervale nuo 2 iki 4 (kartais, kai to reikalauja tam tikros sąlygos, šis intervalas log Pow gali būti išplečiamas iki 5), jeigu tirpinio koncentracija bet kokioje būsenoje nėra didesnė negu 0,01 molio viename litre.

HPLC metodas

HPLC metodas leidžia įvertinti log Pow pasiskirstymo koeficientus intervale 0–6. Paprastai junginio pasiskirstymo koeficientas gali būti įvertinamas iki ±0,1 log vienetų kratomos kolbos vertės. Tipiška koreliacija gali būti randama 4, 5, 6, 7, 8 literatūros nuorodose. Didesnį tikslumą galima pasiekti, jeigu koreliacijos grafikai yra pagrindžiami struktūriškai susijusiais etaloniniais junginiais (9).

1.5.3. Tikslumas

1.5.3. Kratomos kolbos metodas

Nernsto pasiskirstymo dėsnis praskiestiems tirpalams taikomas tik esant pastoviai temperatūrai, slėgiui ir pH. Jis taikomas tiktai grynai medžiagai, ištirpintai dviejuose grynuose tirpikliuose. Jeigu tuo pačiu metu keli skirtingi tirpiniai yra vienoje arba abiejose būsenose, tai gali turėti įtakos rezultatams. Dėl ištirpusių molekulių disociacijos arba asociacijos yra gaunami nukrypimai nuo Nersto pasiskirstymo dėsnio. Tokius nukrypimus rodo tai, kad pasiskirstymo koeficientas tampa priklausomu nuo tirpalo koncentracijos. Dėl naudojamos daugkartinės pusiausvyros šis bandymo metodas neturėtų būti naudojamas jonizuojamiems junginiams, jeigu nenaudojama korekcija. Tokiems junginiams reikėtų apsvarstyti galimybę vietoje vandens naudoti buferinius tirpalus; buferinio tirpalo pH turėtų būti ne mažesnis kaip vienas medžiagos pKa vienetas, ir reikėtų atsižvelgti į šio pH tinkamumą aplinkai.

1.6. METODO APIBŪDINIMAS

1.6.

1.6.1. Išankstinis pasiskirstymo koeficiento įvertinimas Pasiskirstymo koeficientą geriau vertinti naudojant apskaičiavimo metodą (žr. 1 priedėlį) arba atitinkamais atvejais pagal bandomosios medžiagos tirpumo koeficientą grynuose tirpikliuose (10).

1.6.2. Kratomos kolbos metodas

1.6.2.

1.6.2.1. Preparatas n-oktanolis: pasiskirstymo koeficiento nustatymas turėtų būti atliekamas su didelio grynumo analiziniais reagentais. Vanduo: turėtų būti naudojamas distiliuotas arba du kartus distiliuotas vanduo, naudojant stiklinį arba kvarcinį aparatą. Jonizuojamiems junginiams, jeigu tai pagrįsta, vietoje vandens turėtų būti naudojami buferiniai tirpalai. Pastaba Vanduo, paimtas tiesiogiai iš jonitinio filtro, neturėtų būti naudojamas.

1.6.2.1.

1.6.2.1.1. Išankstinis tirpiklių sotinimas Prieš nustatant pasiskirstymo koeficientą, tirpiklio sistemos fazės yra abipusiai sotinamos purtant eksperimento temperatūroje. Kad tai būtų atlikta, pakanka ant mechaninės purtyklės 24 valandas purtyti du didelius standartinius butelius, kuriuose yra didelio grynumo analizinis n-oktanolis arba vanduo su pakankamu kiekiu kito tirpiklio, po to leidžiama pakankamai ilgai nusistovėti, kad atsiskirtų fazės ir nusistovėtų sotis.

1.6.2.1.2. Bandymo paruošimas Visas dviejų fazių sistemos tūris turėtų beveik užpildyti bandymo indą. Taip bus išvengta medžiagos nuostolių dėl lakumo. Naudotini tūrio koeficientas ir medžiagos kiekiai pasirenkami taip: Atliekami trys bandymai. Pirmajame naudojamas apskaičiuotas n-oktanolio ir vandens tūrio santykis; antrajame – šis santykis dalinamas iš dviejų; o trečiajame – šis santykis dauginamas iš dviejų (pvz., 1:1; 1:2; 2:1).

išankstinis pasiskirstymo koeficiento apskaičiavimas (žr. ankstesnį punktą),

mažiausias bandomos medžiagos kiekis, reikalingas analizei atlikti, ir

didžiausios koncentracijos apribojimas bet kurioje fazėje 0,01 molio vienam litrui.

1.6.2.1.3. Bandymo medžiaga Pagrindinis tirpalas paruošiamas iš anksto vandeniu įsotintame n-oktanolyje. Šio pagrindinio tirpalo koncentracija turėtų būti tiksliai nustatoma prieš jį naudojant pasiskirstymo koeficiento nustatymui. Šis tirpalas turėtų būti laikomas pastovumą užtikrinančiomis sąlygomis.

1.6.2.2. Bandymo sąlygos Turėtų būti išlaikoma pastovi bandymo temperatūra (± 1 oC), o temperatūros intervalas – 20–25 oC.

1.6.2.3. Matavimo eiga

1.6.2.3.

1.6.2.3.1. Pasiskirstymo pusiausvyros nustatymas Kiekvienai bandymo sąlygai turėtų būti paruošiami dvigubi bandymo indai su reikalingu tiksliai pamatuotu dviejų tirpiklių kiekiu su būtinu pagrindinio tirpalo kiekiu. n-oktanolio fazės turėtų būti matuojamos pagal tūrį. Bandymo indai turėtų būti dedami arba į tinkamą purtyklę arba kratomi ranka. Jeigu naudojamas centrifugos vamzdis, rekomenduojama greitai sukti vamzdį 180 o apie jo skersinę ašį taip, kad bet koks pagautas oro kiekis iškiltų per tas dvi fazes. Patirtis parodė, kad pasiskirstymo pusiausvyrai nustatyti paprastai pakanka 50 tokių apsukų. Kad nekiltų abejonių, rekomenduojama 100 apsukų per penkias minutes.

1.6.2.3.2. Fazių atskyrimas Jeigu reikia, kad fazės atsiskirtų, mišinys centrifuguojamas. Tai turėtų būti atliekama laboratorine centrifuga kambario temperatūroje arba, jeigu naudojama centrifuga su nekontroliuojama temperatūra, centrifugos vamzdžiai, siekiant nustatyti pusiausvyrą, turėtų būti bandymo temperatūroje ne trumpiau kaip vieną valandą iki analizės.

1.6.2.4. Analizė Nustatant pasiskirstymo koeficientą yra būtina nustatyti bandomos medžiagos koncentracijas abiejose fazėse. Tą galima atlikti iš kiekvieno vamzdžio imant kiekvienos iš dviejų fazių alikvotinę dalį kiekvienai bandymo sąlygai ir jas analizuoti pagal pasirinktą darbo eigą. Visas medžiagos, esančios abiejose fazėse, kiekis turėtų būti apskaičiuojamas ir palyginamas su iš pradžių dėtos medžiagos kiekiu. Hidratuotos fazės mėginiai turėtų būti imami tokia tvarka, kad būtų kaip galima labiau sumažinamas pavojus įtraukti n-oktanolio pėdsakus: hidratuotos fazės mėginiui paimti gali būti naudojamas stiklinis švirkštas su nuimama adata. Iš pradžių švirkštas turėtų būti iš dalies pripildytas oro. Oras turėtų būti švelniai išstumiamas tuo pačiu metu įterpiant adatą per n-oktanolio sluoksnį. Į švirkštą įtraukiamas pakankamas tūris hidratuotos fazės. Švirkštas greitai ištraukiamas iš tirpalo ir nuimama adata. Švirkšto turinys gali būti naudojamas kaip hidratuotas mėginys. Dviejų atskirtų fazių koncentraciją geriau nustatyti tai medžiagai tinkamu metodu. Analizės metodų, kurie gali būti tinkami, pavyzdžiai:

fotometrinis metodas,

dujų chromatografija,

efektyvioji skysčių chromatografija.

1.6.3. HPLC metodas

1.6.3.

1.6.3.1. Pasiruošimas

1.6.3.1. Aparatūra

Reikalingas skysčių chromatografas su įtaisytu impulsų nesukeliančiu siurbliu ir atitinkamu detektoriumi. Rekomenduojama naudoti injekcinį vožtuvą su injekcinėmis kilpomis. Tai, kad nuostoviojoje fazėje yra polinės grupės, gali smarkiai pakenkti HPLC kolonėlės darbą. Todėl nuostoviosiose fazėse turėtų būti mažiausias procentas polinių grupių (11). Gali būti naudojamos parduodamos mikrodalelių atvirkštinių fazių įkrovos arba jau įkrautos kolonėlės. Apsaugos kolonėlė gali būti dedama tarp įšvirkštimo sistemos ir analizinės kolonėlės.

Judančioji fazė

HPLC tinkantis metanolis ir HPLC tinkantis vanduo naudojami eliuentiniam tirpikliui paruošti, kuris prieš naudojimą degazuojamas. Turėtų būti naudojamas izokratinis eliuavimas. Turėtų būti naudojami metanolio/vandens santykiai su mažiausiu 25 % vandens kiekiu. Paprastai pakanka 3:1 (v/v) metanolio-vandens mišinio log P 6 junginiams eliuuoti per vieną valandą, kai debitas 1 ml/min. Jeigu junginių log P didelis, gali reikėti sutrumpinti eliuavimo laiką (taip pat ir etaloninių junginių), sumažinant judančiosios fazės poliškumą arba kolonėlės ilgį. Medžiagos, kurių tirpumas n-oktanolyje yra mažas, turi polinkį mažoms log Pow vertėms, kai naudojamas HPLC metodas; tokių junginių smailės kartais atsiranda įvykus tirpiklio frontui. Tai tikriausiai vyksta dėl to, kad pasiskirstymo procesas yra per lėtas pusiausvyrai pasiekti per normalų atskyrimo HPLC laiką. Tada debito mažinimas ir/arba metanolio/vandens santykio mažinimas gali būti veiksminga priemonė patikimai vertei gauti. Bandymo ir etaloniniai junginiai turėtų būti tirpūs judančiojoje fazėje ir pakankamos koncentracijos, kad juos būtų galima aptikti. Tik išimtiniais atvejais gali būti naudojami priedai su metanolio ir vandens mišiniu, kadangi priedai pakeičia kolonėlės savybes. Chromatogramose su priedais yra privaloma naudoti tokios pat rūšies atskirą kolonėlę. Jeigu metanolio ir vandens mišinys netinka, gali būti naudojami kiti organiniai vandenyje tirpūs mišiniai, pvz., etanolis ir vanduo arba acetonitrilas ir vanduo. Eliuato pH yra ypač svarbus jonizuojamiems junginiams. Jis turėtų būti kolonėlės eksploatacijos pH intervalo ribose, kuris paprastai yra 2-8. Rekomenduojama atlikti buferinius veiksmus. Reikia stengtis išvengti druskų nuosėdų ir kolonėlės gedimų, kurie pasireiškia dėl tam tikrų organinės fazės/buferinių mišinių. Nepatartina matuoti HPLC kvarcinėmis stacionariomis fazėmis, kai pH didesnis negu 8, kadangi dėl naudojamos šarminės judančiosios fazės gali greitai pablogėti kolonėlės veikimas.

Tirpiniai

Etaloniniai junginiai turėtų būti kiek įmanoma grynesni. Junginiai, kurie turi būti naudojami bandyme arba kalibravimui, jeigu įmanoma, ištirpinami judančiojoje fazėje.

Bandymo sąlygos

Matavimų metu temperatūra neturėtų svyruoti daugiau negu ± 2 K.

1.6.3.2. Matavimas

1.6.3.2. Nulinio laiko to apskaičiavimas

Nulinį laiką to galima nustatyti naudojant homologinę eilę (pvz., n-alkilmetilketonus) arba nepasiskirsčiusius organinius junginius (pvz., tiokarbamidas arba formamidas). Apskaičiuojant nulinį laiką to naudojant homologinę eilę, įšvirkščiami ne mažiau kaip septyni homologinės eilės nariai ir nustatomos atitinkamos sulaikymo trukmės. Neapdorotos sulaikymo trukmės tr(nc + 1) brėžiamos kaip tr(nc + 1) funkcija, o regresijos lygties – a ir b: tr (n c + 1) = a + b tr (n c) (nc – anglies atomų skaičius). Po to gaunamas nulinis laikas to pagal:

Kalibravimo grafikas

Po to sudaromas log k verčių ir log P santykio koreliacijos grafikas atitinkamiems etaloniniams junginiams. Praktiškai vienu metu įšvirkščiama nuo 5 iki 10 standartinių etaloninių junginių, kurių log P maždaug atitinka tikėtiną intervalą, ir nustatomos sulaikymo trukmės, geriau ant įrašančiojo integratoriaus, sujungto su aptikimo sistema. Apskaičiuojami atitinkami talpos koeficiento logaritmai log k ir brėžiamas log P, nustatyto kratomos kolbos metodu, funkcijos grafikas. Kalibruojama reguliariais intervalais, ne rečiau kaip kartą per dieną, kad būtų galima atlikti galimus pakitimus kolonėlės darbe.

Mėginio talpos koeficiento nustatymas

Įšvirkščiamas kiek įmanoma mažesnis mėginio judančiosios fazės kiekis. Nustatoma tokia sulaikymo trukmė (dvigubas nustatymas), kad būtų galima apskaičiuoti talpos koeficientą k. Iš etaloninių junginių koreliacijos grafiko galima interpoliuoti mėginio pasiskirstymo koeficientą. Jeigu pasiskirstymo koeficientas labai mažas arba labai didelis, būtina ekstrapoliacija. Tokiais atvejais ypač reikia atsižvelgti į regresijos tiesės pasikliovimo ribas.

2. DUOMENYS

2. Kratomos kolbos metodas

Nustatytų P verčių patikimumas gali būti patikrinamas palyginant dvigubo nustatymo vidurkius su suminiu vidurkiu.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:

tikslios medžiagos charakteristikos (identiškumas ir priemaišos),

jeigu metodų neįmanoma panaudoti (pvz., paviršinio aktyvumo medžiaga), turėtų būti pateikiama apskaičiuotoji vertė arba duomenys, pagrįsti individualiu tirpumu n-oktanolyje ir vandenyje,

visa informacija ir pastabos, svarbios duomenų aiškinimui, ypač atsižvelgiant į medžiagoje esančias priemaišas ir jos fizinę būseną.

išankstinio įvertinimo, jei toks buvo, rezultatai,

temperatūros nustatymas,

duomenys apie analizės procedūras, naudotas nustatant koncentracijas,

centrifugavimo, jei jis buvo naudotas, laikas ir greitis,

kiekvienam nustatymui matuotos koncentracijos abiejose fazėse (tai reiškia, kad ataskaitoje bus pateikta iš viso 12 koncentracijų),

mėginio svoris, kiekvienos naudotos fazės tūris kiekviename mėgintuvėlyje ir visas apskaičiuotas mėginio kiekvienoje fazėje kiekis nusistovėjus pusiausvyrai,

apskaičiuotos pasiskirstymo koeficiento (P) vertės ir vidutinė vertė turėtų būti pateikiamos ataskaitoje kiekvienai bandymo sąlygų grupei, kaip ir visų nustatymų vidutinės vertės. Jeigu galima prielaida, kad koncentracija priklauso nuo pasiskirstymo koeficiento, tai turėtų būti nurodoma ataskaitoje,

turėtų būti pateikiami standartiniai individualiųjų P verčių nuokrypiai nuo vidutinės vertės,

visų nustatymų vidurkis P turėtų būti išreiškiamas logaritmu (dešimtainis logaritmas),

teoriškai apskaičiuotas P, jei ši vertė buvo nustatyta arba jeigu matuotoji vertė > 104,

naudoto vandens ir hidratuotos fazės pH eksperimento metu,

jeigu naudojami buferiai, buferių naudojimo vietoje vandens pagrindimas, buferių sudėtis, koncentracija ir pH, hidratuotos fazės pH prieš eksperimentą ir po jo.

išankstinių vertinimų, jeigu tokie buvo, rezultatai,

mėginiai ir etaloninės medžiagos, jų grynumas,

nustatymo temperatūros intervalas,

pH dydis, kuriam esant buvo atliekamas nustatymas,

išsami informacija apie analizes ir apsauginę kolonėlę, judančiąją fazę ir nustatymo vidurkius,

duomenys apie kalibravimui naudotų etaloninių junginių sulaikymo ir literatūroje randamas trukmes

išsami informacija apie regresijos tiesės sudarymą (log k santykis su log P),

vidutiniai bandomo junginio duomenys apie sulaikymo trukmes ir interpoliuotą log P vertę,

įrenginių ir darbo sąlygų apibūdinimas,

eliuavimo profiliai,

į kolonėlę pakrautų mėginių ir etaloninių medžiagų kiekiai,

nulinis laikas ir kaip jis buvo matuojamas.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)20)21)22)23)

LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. SundstrĖm and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, p. 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, p. 219. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, p. 675 S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, p. 787 O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, p. 223–339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, p. 479 A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459 A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525 C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, p. 1113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, p. 382 J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984, Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Base11978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, p. 615.

A.9. PLIŪPSNIO TEMPERATŪRA

A.9.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Prieš atliekant šį bandymą, naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos degumą. Bandymo metodika taikytina skystosioms medžiagoms, kurių garai gali būti padegti uždegimo priemonėmis. Šiame tekste pateikti metodai patikimi tiktai tame pliūpsnio temperatūros intervale, kuris yra tam metodui nurodytas. Renkantis taikytiną metodą, būtina atsižvelgti į reakcijos tarp mėginio ir mėginio indo galimybę.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Pliūpsnio temperatūra – tai mažiausia temperatūra, su pataisa 101,325 kPa slėgiui, kurioje bandymo metodui apibrėžtomis sąlygomis virš skysčio atsiranda tiek garų, kad mėginio inde susidaro degus garų ir oro mišinys. Vienetai: oC; t = T -273,15; (t vienetai – oC, T vienetai – K).

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Etalonines medžiagas nebūtina naudoti kiekvienu atveju tiriant naują medžiagą. Daugiausia jos turi būti naudojamos, kai reikia kartais tikrinti metodo veikimą ir norint lyginti su rezultatais, gautais kitais metodais.

1.4. METODO ESMĖ Medžiaga pilama į mėginio indą ir pagal atskiram bandymo metodui naudojamą metodiką šildoma arba aušinama iki bandymo temperatūros. Užsidegimo bandymai atliekami norint nustatyti, ar mėginys bandymo temperatūroje užsiliepsnoja ar neužsiliepsnoja.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

1.5.

1.5.1. Pakartojamumas Pakartojamumas kinta atsižvelgiant į pliūpsnio temperatūros intervalą ir taikomą bandymo metodą; didžiausias kintamumas 2 oC.

1.5.2. Jautrumas Jautrumas priklauso nuo taikyto bandymo metodo.

1.5.3. Specifiškumas Kai kurių bandymo metodų specifiškumas apribotas tam tikrais pliūpsnio temperatūros intervalais ir priklauso nuo medžiagai būdingų savybių (pvz., didelės klampos).

1.6. METODO APRAŠYMAS

1.6.

1.6.1. Ruošimas Bandomosios medžiagos mėginys įpilamas į bandymo aparatą pagal 1.6.3.1 ir (arba) 1.6.3.2. Saugai užtikrinti rekomenduojama, kad intensyviai reaguojančių ir nuodingų medžiagų mėginys būtų mažas, maždaug 2 cm3.

1.6.2. Bandymo sąlygos Aparatas, kiek tai atitinka saugą, turi būti dedamas nuo traukos apsaugotoje vietoje.

1.6.3. Bandymo eiga

1.6.3.

1.6.3.1 Pusiausvirasis metodas Žr. ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2 Nepusiausvirasis metodas

1.6.3.2 Abel aparatas:

žr. BS 2000 170 dalį, NF M07-011, NF T66-009.

Abel-Pensky aparatas:

žr. EN 57, DIN 51755 1 dalį (temperatūra 5–65 oC), DIN 51755 2 dalį (temperatūra mažesnė nei 5 oC), NF M07-036.

Tag aparatas:

žr. ASTM D 56.

Pensky-Martens aparatas:

žr. ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Pastabos

Kai nepusiausviruoju metodu pagal 1.6.3.2 nustatoma, kad pliūpsnio temperatūra lygi 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC arba 55 ± 2 oC, jos vertė turi būti patvirtinta pusiausviruoju metodu, naudojant tą patį aparatą. Skelbti rezultatams gali būti taikomi tik tokie metodai, kuriais galima nustatyti pliūpsnio temperatūrą. Klampių skysčių (dažų, dervų ir panašių medžiagų), turinčių tirpiklių, pliūpsnio temperatūrai nustatyti gali būti taikomas tik klampių medžiagų pliūpsnio temperatūrai nustatyti tinkamas metodas. Žr. ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 1 dalį.

2. DUOMENYS

3. ATASKAITA Jei įmanoma, bandymo ataskaitoje turi būti tokia informacija:

tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimas ir priemaišos),

turi būti nurodytas taikytas metodas, taip pat visi galimi nukrypimai,

rezultatai ir visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.

4. NUORODOS Nėra

A.10. DEGUMAS (KIETOSIOS MEDŽIAGOS)

A.10.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Prieš atliekant šį bandymą, naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos potencialias sprogstamąsias savybes. Šis bandymas turi būti taikomas tik medžiagoms, turinčioms miltelių, granulių arba pastos pavidalą. Nenorint įtraukti visas medžiagas, kurios gali būti padegtos, tačiau tik greitai degančias arba kurių elgsena degant bet kuriuo atveju yra ypač pavojinga, labai degiomis medžiagomis laikomos tik tos medžiagos, kurių degimo greitis yra didesnis nei tam tikra ribinė vertė. Gali būti ypač pavojinga, jei įkaitimo zona plinta metaliniuose milteliuose, kadangi gesinant liepsną kyla sunkumų. Metaliniai milteliai turi būti laikomi labai degiomis medžiagomis, jei jie palaiko įkaitimo zonos plitimą miltelių masėje per tam tikrą laiką.

1.2. APIBRĖŽIMAS IR VIENETAI Degimo laikas reiškiamas sekundėmis.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nenurodytos.

1.4. METODO ESMĖ Formuojamas maždaug 250 mm ilgio vientisas medžiagos strypas arba miltelių juosta ir atliekamas išankstinis atrankos bandymas, norint nustatyti, ar padegus dujiniu degikliu vyksta degančios liepsnos plitimas ar rusenimas. Jei plitimas 200 mm juosta įvyksta per nustatytą laiką, tuomet degimo greičiui nustatyti bandymas atliekamas pagal visą programą.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nenurodyti.

1.6. METODO APRAŠYMAS

1.6.

1.6.1. Išankstinis atrankos bandymas Ant nedegios, neakytos ir šilumai nelaidžios pagrindo plokštės formuojamas maždaug 250 mm ilgio, 20 mm pločio ir 10 mm aukščio medžiagos strypas arba miltelių juosta. Vienas miltelių juostos galas karšta dujų degiklio liepsna (mažiausias skersmuo 5 mm) veikiamas tol, kol milteliai užsidega arba ne ilgiau kaip 2 minutes (metalų arba metalų lydinių milteliai veikiami 5 minutes). Reikia pasižymėti, ar degimo zona išilgai 200 mm plinta 4 min. bandymo laiko (arba 40 minučių metalų miltelių atveju). Jei medžiaga neužsidega ir degimo zona išilgai 200 mm miltelių juostos plinta su liepsna arba rusenant 4 minutes (arba 40 minučių) bandymo laiko, medžiaga neturi būti laikoma labai degia ir toliau jos bandyti nereikia. Jei degimo zona 200 mm ilgio medžiagos miltelių juosta plinta mažiau kaip 4 minutes arba mažiau kaip 40 minučių, jei tai metaliniai milteliai, turi būti atliekama toliau aprašyta veiksmų seka (1.6.2 punktas ir toliau).

1.6.2. Degimo greičio bandymas

1.6.2.

1.6.2.1. Ruošimas Medžiagos milteliai arba granulės suberiamos į 250 mm ilgio formą, turinčią trikampio formos skerspjūvį, kurio vidinis aukštis 10 mm ir plotis 20 mm. Abejose formos pusėse išilgine kryptimi tvirtinamos dvi iš šonų ribojančios metalinės plokštės, kurios yra 2 mm aukštesnės nei viršutinis trikampio skerspjūvio kraštas (žr. paveikslą). Forma tris kartus numetama iš 2 cm aukščio ant kieto paviršiaus. Jei reikia, forma vėl pripildoma. Šoninės ribojančios plokštės nuimamos ir medžiagos perteklius nubraukiamas. Ant formos viršaus uždedama nedegi, neakyta ir blogai šilumą leidžianti pagrindo plokštė, įtaisas apverčiamas ir forma nuimama. Pastos pavidalo medžiagos dedamos ant nedegios, neakytos ir blogai šilumą leidžiančios pagrindo plokštės, pagaminant iš jų 250 mm ilgio juostelę, kurios skerspjūvio plotas apie 1 cm2.

1.6.2.2. Bandymų sąlygos Jei bandoma drėgmei jautri medžiaga, bandymas ją išėmus iš indo turi būti atliekamas kiek įmanoma greičiau.

1.6.2.3. Bandymo eiga Krūvelė dedama į traukos spintą skersai traukos krypčiai. Oro greitis turi būti pakankamas, kad dūmai negalėtų patekti į laboratoriją, ir bandymo metu turi nesikeisti. Apie įtaisą turi būti įtaisytas nuo traukimo saugantis ekranas. Krūvelei viename gale padegti naudojama karšta dujų degiklio liepsna (mažiausias skersmuo 5 mm). Kai krūvelė sudega 80 mm atstumu, kitoje 100 mm atkarpoje matuojamas degimo greitis. Bandymas atliekamas šešis kartus, jei teigiamas rezultatas negaunamas anksčiau, kiekvieną kartą naudojant švarią šaltą plokštę.

2. DUOMENYS Vertinant rezultatus, reikalinga degimo trukmė, nustatyta išankstiniame atrankos bandyme (1.6.1.) ir trumpiausia degimo trukmė, gauta ne daugiau kaip šešiuose bandymuose (1.6.2.3.).

3. ATASKAITA

3.

3.1. BANDYMŲ ATASKAITA Jei įmanoma, bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:

tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimas ir priemaišos),

bandomosios medžiagos apibūdinimas, jos fizinė būsena, įskaitant drėgmės kiekį,

išankstinių atrankos bandymų ir degimo greičio bandymo, jei buvo atliekamas, rezultatai,

visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.

3.2. REZULTATŲ AIŠKINIMAS Miltelių, granulių ir pastos pavidalo medžiagos turi būti laikomos labai degiomis, jei degimo trukmė bet kuriame bandyme, atliktame pagal 1.6.2 aprašytą metodiką, yra mažesnė kaip 45 sekundės. Metalų arba metalų lydinių milteliai laikomi labai degiais, jei jie gali būti padegti ir liepsna arba reakcijos zona visu bandiniu plinta 10 minučių arba mažiau.

4. NUORODOS NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

A.11. DEGUMAS (DUJOS)

A.11.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Šis metodas leidžia nustatyti, ar dujos, sumaišytos su oru kambario temperatūroje (maždaug 20 oC) ir atmosferos slėgyje, yra degios, o jei degios, tai koks yra degumo koncentracijos intervalas. Didinamos koncentracijos bandomųjų dujų mišiniai su oru veikiami elektros kibirkštimi ir stebima, ar mišinys užsidega.

1.2. APIBRĖŽIMAS IR VIENETAI Degumo intervalas yra intervalas tarp apatinės ir viršutinės sprogimo ribinės koncentracijos. Apatinė ir viršutinė sprogimo ribinė koncentracija yra tokia degių dujų mišinio su oru ribinė koncentracija, kuriai esant liepsnos plitimas nevyksta.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nenurodytos.

1.4. METODO ESMĖ Dujų koncentracija ore didinama pakopomis ir kiekvienos pakopos dujų mišinys veikiamas elektros kibirkštimi.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Neapibrėžti.

1.6. METODO APRAŠYMAS

1.6.

1.6.1. Aparatūra Bandymo indas – vertikaliai pastatytas stiklinis cilindras, kurio mažiausias vidinis skersmuo 50 mm ir mažiausias aukštis 300 mm. Uždegimo elektrodai, tarp kurių yra 3-5 mm atstumas, įdedami 60 mm nuo cilindro dugno. Cilindras turi slėgio mažinimo angą. Norint apriboti bet kokio sprogimo padarytą žalą, aparatas turi būti apsaugotas skydu. Uždegimo šaltiniu naudojama stovinčioji indukcinė 0,5 s trukmės kibirkštis, generuojama aukštos įtampos transformatoriaus, kurio išėjimo įtampa 10-15 kV (didžiausia imamoji galia 300 W). Tinkamos aparatūros pavyzdys aprašytas (2) nuorodoje.

1.6.2. Bandymo sąlygos Bandymas turi būti atliekamas kambario temperatūroje (maždaug 20 oC).

1.6.3. Bandymo eiga Žinomos koncentracijos dujų mišinys su oru leidžiamas į cilindrą, naudojant dozavimo siurblius. Per mišinį leidžiama kibirkštis ir stebima, ar liepsna atsiskiria nuo liepsnos šaltinio ir plinta savaime ar taip nevyksta. Dujų koncentracija keičiama 1 % tūr. pakopomis tol, kol dujos užsidega, kaip tai aprašyta anksčiau. Jei cheminė dujų sandara rodo, kad jos neturėtų būti degios, ir gali būti apskaičiuota jų stechiometrinio mišinio su oru sudėtis, tai 1 % pakopomis reikia tikrinti pradedant mišiniu, kuriame dujų yra 10 % mažiau nei stechiometrinės sudėties mišinyje, ir baigiant mišiniu, kuriame dujų yra 10 % daugiau nei stechiometrinės sudėties mišinyje.

2. DUOMENYS Šiai savybei nustatyti reikalingi tik duomenys apie liepsnos plitimą.

3. ATASKAITA Jei įmanoma, bandymo ataskaitoje turi būti tokia informacija:

tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimas ir priemaišos),

naudotos aparatūros aprašymas, nurodant matmenis,

temperatūra, kurioje bandymas buvo atliekamas,

bandytos koncentracijos ir gauti rezultatai,

bandymo rezultatas: nedegios dujos ar labai degios dujos,

jei padaryta išvada, kad dujos nedegios, tai turi būti nurodytas koncentracijos intervalas, kuriame tai buvo bandoma 1 % pakopomis,

turi būti pateikta visa rezultatams aiškinti reikalinga informacija ir pastabos.

4.1)2) NUORODOS NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse- einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.- Tech. 1984, vol. 56, 2, p. 126–127.Wortmann, T.Redeker und H.Schacke. 'Entwicklung

A.12. DEGUMAS (SĄLYTIS SU VANDENIU)

A.12.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Šis bandymo metodas gali būti taikomas norint nustatyti, ar dėl medžiagos reakcijos su vandeniu arba drėgme nesusidaro pavojingas kiekis vienos arba keleto rūšių dujų, kurios galėtų būti labai degios. Bandymo metodas gali būti taikomas kietosioms ir skystosioms medžiagoms. Šis metodas netaikytinas medžiagoms, kurios užsidega ore.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Labai degios: medžiagos, kurios sąlytyje su vandeniu arba drėgnu oru pavojingais kiekiais ne mažesne kaip 1 litras/kg per valandą sparta išskiria labai degias dujas.

1.3. METODO ESMĖ Medžiaga bandoma laikantis toliau aprašytos pakopų sekos; jei dujos kurios nors pakopoje užsiliepsnoja, toliau bandyti nebūtina. Jei žinoma, kad medžiaga su vandeniu intensyviai nereaguoja, pradėkite nuo 4 pakopos (1.3.4).

1.3.

1.3.1. 1 pakopa Bandomoji medžiaga dedama į lovelį su distiliuotu vandeniu 20 oC temperatūroje ir stebima, ar išsiskiriančios dujos užsiliepsnoja ar neužsiliepsnoja.

1.3.2. 2 pakopa Bandomoji medžiaga dedama ant filtravimo popieriaus, padėto į lėkštelę su distiliuotu vandeniu 20 oC temperatūroje, ir stebima, ar išsiskiriančios dujos užsiliepsnoja ar neužsiliepsnoja. Filtravimo popierius skirtas tik tam, kad medžiaga būtų vienoje vietoje, kas padidintų užsiliepsnojimo galimybę.

1.3.3. 3 pakopa Iš bandomosios medžiagos padaroma krūvelė, kurios aukštis apie 2 cm ir skersmuo 3 cm. Ant krūvelės lašinami keli lašai vandens ir stebima, ar išsiskiriančios dujos užsiliepsnoja ar neužsiliepsnoja.

1.3.4. 4 pakopa Bandomoji medžiaga maišoma su distiliuotu vandeniu 20 oC temperatūroje ir kas valandą septynias valandas matuojama dujų išsiskyrimo sparta. Jei dujų skyrimosi sparta svyruoja arba septynias valandas didėja, matavimo trukmė turi būti padidinta ne ilgiau kaip iki penkių parų. Bandymas gali būti sustabdytas, jei išsiskyrimo sparta kuriuo nors momentu yra didesnė kaip 1 litras/kg per valandą.

1.4 ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nenurodytos.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

1.6. METODŲ APRAŠYMAS

1.6.

1.6.1. 1 pakopa

1.6.1.

1.6.1.1. Bandymo sąlygos Bandymas atliekamas kambario temperatūroje (maždaug 20 oC).

1.6.1.2. Bandymo eiga Nedidelis kiekis (skersmuo maždaug 2 mm) bandomosios medžiagos turi būti įdėta į lovelį su distiliuotu vandeniu. Reikia stebėti, ar i) skiriasi kokios nors dujos ir ii) ar jos užsiliepsnoja. Jei dujos užsiliepsnoja, medžiagos toliau bandyti nereikia, nes medžiaga laikoma pavojinga.

1.6.2. 2 pakopa

1.6.2.

1.6.2.1. Aparatūra Filtravimo popierius dedamas distiliuoto vandens, įpilto į bet kokį tinkamą indą, pvz., 100 mm skersmens garinimo lėkštelę, paviršiuje.

1.6.2.2. Bandymo sąlygos Bandymas atliekamas kambario temperatūroje (maždaug 20 oC).

1.6.2.3. Bandymo eiga Nedidelis kiekis (skersmuo maždaug 2 mm) bandomosios medžiagos dedamas filtravimo popieriaus centre. Reikia stebėti, ar i) skiriasi kokios nors dujos ir ii) ar jos užsiliepsnoja. Jei dujos užsiliepsnoja, medžiagos toliau bandyti nereikia, nes medžiaga laikoma pavojinga.

1.6.3. 3 pakopa

1.6.3.

1.6.3.1. Bandymo sąlygos Bandymas atliekamas kambario temperatūroje (maždaug 20 oC).

1.6.3.2. Bandymo eiga Iš bandomosios medžiagos daroma krūvelė, kurios aukštis apie 2 cm ir skersmuo 3 cm ir kurios viršuje yra padarytas įdubimas. Į įdubimą lašinami keli lašai vandens ir stebima, ar i) skiriasi kokios nors dujos ir ii) ar jos užsiliepsnoja. Jei dujos užsiliepsnoja, medžiagos toliau bandyti nereikia, nes medžiaga laikoma pavojinga.

1.6.4. 4 pakopa

1.6.4.

1.6.4.1. Aparatūra Surenkamas paveiksle parodytas aparatas.

1.6.4.2. Bandymo sąlygos Apžiūrėkite talpyklą su bandomąja medžiaga, ar jame nėra miltelių < 500 μm (dalelių dydis). Jei milteliai sudaro daugiau kaip 1 % visos medžiagos masės arba jei medžiaga yra trapi, tai norint atsižvelgti į dalelių dydžio mažėjimą laikymo ir krovimo metu, prieš bandymus visa medžiaga turi būti sumalta į miltelius; kitu atveju medžiaga turi būti bandoma tokia, kokia gauta. Bandymas turi būti atliekamas kambario temperatūroje (maždaug 20 oC) ir atmosferiniame slėgyje.

1.6.4.3. Bandymo eiga Į aparato lašinamąjį piltuvą įpilama 10-20 ml vandens, o į kūginę kolbą įdedama 10 g bandomosios medžiagos. Išsiskyrusių dujų tūris gali būti išmatuotas bet kuriuo tinkamu būdu. Atidaromas lašinamojo piltuvo čiaupas, kad vanduo galėtų tekėti į kūginę kolbą, ir paleidžiamas sekundmatis. Išsiskyrusių dujų kiekis kas valandą matuojamas septynias valandas. Jei per šį laiką išsiskyrusių dujų kiekis svyruoja arba jei šio laikotarpio pabaigoje išsiskyrusių dujų kiekis didėja, matavimai turi būti tęsiami ne ilgiau kaip penkias paras. Jei kuriuo nors matavimo momentu dujų išsiskyrimo sparta yra didesnė kaip 1 litras/kg per valandą, bandymą galima nutraukti. Šis bandymas turi būti pakartotas tris kartus. Jei cheminė dujų sudėtis nežinoma, dujos turi būti analizuojamos. Jei dujose yra labai degių komponentų ir nėra žinoma, ar visas mišinys yra labai degus, turi būti paruoštas ir pagal A. 11 metodą išbandytas tokios pačios sudėties mišinys.

2. DUOMENYS Medžiaga laikoma pavojinga, jei:

bet kurioje bandymo pakopoje įvyksta užsidegimas, arba

degios dujos skiriasi didesne kaip 1 litras/kg bandomosios medžiagos per valandą sparta.

3. ATASKAITA Bandymų ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti tokia informacija:

tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimas ir priemaišos),

bet kokio bandomosios medžiagos pradinio ruošimo detalės,

bandymų rezultatai (1,2,3 ir 4 pakopos),

išsiskyrusių dujų cheminė sudėtis,

dujų išsiskyrimo sparta, jei vykdoma 4 pakopa (1.6.4),

visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.

4.1)2) NUORODOS Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

A.13. PIROFORINĖS KIETŲJŲ MEDŽIAGŲ IR SKYSČIŲ SAVYBĖS

A.13.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Bandymo metodikos taikytinos kietosioms ir skystosioms medžiagoms, kurių maži kiekiai užsidega po trumpalaikio sąlyčio su oru kambario temperatūroje (maždaug 20 oC). Šis bandymo metodas netaikomas medžiagoms, kurios kambario temperatūros ore užsidega tik po kelių valandų arba dienų arba kurioms reikia aukštesnės temperatūros.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Laikoma, kad medžiagos turi piroforinių savybių, jei 1.6 apibrėžtomis sąlygomis jos užsidega arba apanglėja. Savaiminį skysčių užsidegimą gali tekti bandyti taikant A.15 metodą Savaiminio užsidegimo temperatūra (skysčiai ir dujos).

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nenurodytos.

1.4. METODO ESMĖ Kieta arba skysta medžiaga maišoma su inertišku nešikliu ir kambario temperatūroje penkias minutes laikoma ore. Jei skystos medžiagos neužsidega, jos sugeriamos filtravimo popieriumi ir kambario temperatūroje (maždaug 20 oC) penkias minutes laikomos ore. Kieta arba skysta medžiaga laikoma piroforine, jei ji užsidega, arba skystis uždega ar apdegina filtravimo popierių.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Pakartojamumas: kadangi tai labai svarbu saugai, vienintelio teigiamo rezultato pakanka, kad medžiaga būtų laikoma piroforine.

1.6. BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS

1.6.

1.6.1. Aparatūra Maždaug 10 cm skersmens porcelianinė lėkštutė kambario temperatūroje (maždaug 20 oC) apytikriai iki 5 mm pripildoma diatomito. Pastaba Diatomitas arba kuri nors kita panaši inertiška medžiaga, kurią būtų galima visur gauti, turi būti imama vietoje žemės, ant kurios bandomoji medžiaga galėtų būti išpilta avarijos atveju. Bandyti skysčiams, kurie neužsidega ore sumaišyti su inertiniu nešikliu, reikia turėti sausą filtravimo popierių.

1.6.2. Bandymo eiga

1.6.2. a)

Milteliai 1-2 cm3 bandomosios kietos medžiagos miltelių iš maždaug 1 m aukščio beriama ant nedegaus paviršiaus ir žiūrima, ar medžiaga užsidega krisdama arba per penkias minutes po nusėdimo. Bandymas kartojamas šešis kartus, jei medžiaga neužsidega.

Skysčiai Maždaug 5 cm3 bandomojo skysčio supilama į paruoštą porcelianinę lėkštutę ir stebima, ar medžiaga užsidega per penkias minutes. Jei per šešis bandymus medžiaga neužsidega, daromi tokie bandymai: 0,5 ml mėginys švirkštu užpilamas ant akyto filtravimo popieriaus ir stebima, ar per penkias minutes po suvilgymo filtravimo popierius užsidega ar anglėja. Bandymas atliekamas tris kartus, jei popierius neužsidega arba neanglėja.

2. DUOMENYS

2.

2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS Bandymas gali būti nutrauktas, kai kurio nors bandymo rezultatas yra teigiamas.

2.2. VERTINIMAS Jei su inertišku nešikliu sumaišyta ir ore padėta medžiaga užsidega per penkias minutes arba jei skystoji medžiaga per penkias minutes apdegina arba uždega joje suvilgytą ir ore padėtą filtravimo popierių, ji laikoma piroforine medžiaga.

3. ATASKAITA Bandymų ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti tokia informacija:

tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimas ir priemaišos),

bandymų rezultatai,

visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.

4.1)2) NUORODOS NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14. SPROGSTAMOSIOS SAVYBĖS

A.14.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Šis metodas pateikia bandymo schemą norint nustatyti, ar kelia sprogimo pavojų kieta arba pastos pavidalo medžiaga, veikiant liepsnai (terminis jautrumas) arba smūgiui ar trinčiai (jautrumas mechaniniams veiksniams), ir ar kelia sprogimo pavojų skysta medžiaga, veikiant liepsnai arba smūgiui. Metodas susideda iš trijų dalių: Šiuo metodu gauti duomenis leidžia įvertinti tikimybę įvykti sprogimui, jei veikia kai kurie įprasti veiksniai. Metodas neskirtas nustatyti, ar medžiaga gali sprogti bet kokiomis sąlygomis. Metodas tinka nustatyti, ar tam tikromis direktyvoje apibrėžtomis sąlygomis medžiaga kelia sprogimo pavojų (terminis ir mechaninis jautrumas). Jame naudojama kelių tipų aparatūra, kuri turi platų pritaikymą tarptautiniu mastu (1) ir kurią naudojant paprastai gaunami reikšmingi duomenys. Reikia pripažinti, kad metodas nėra tikslus. Be nurodytos aparatūros gali būti naudojami alternatyvūs aparatai, jei jie turi tarptautinį pripažinimą o rezultatai gali būti atitinkamai susieti su rezultatais, gautais nurodyta aparatūra. Bandymų atlikti nereikia, kai turima informacija apie medžiagos termodinamines savybes (pvz., susidarymo šilumą skilimo šilumą) ir (arba) kai kurių chemiškai aktyvių grupių (2) nebuvimas struktūrinėje formulėje leidžia pagrįstai neabejoti, kad medžiaga negali greitai suirti skiriantis dujoms arba šilumai (t.y. medžiaga nekelia jokio sprogimo pavojaus). Su skysčiais nereikia atlikti mechaninio jautrumo trinčiai bandymo.

1.1.

(a) terminio jautrumo bandymas (1);

(b) mechaninio jautrumo smūgiui bandymas (1);

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Sprogstamosios medžiagos: medžiagos, kurios gali sprogti veikiant liepsnai arba kurios yra jautrios smūgiui ar trinčiai nurodytame aparate (arba mechaniškai yra jautresnės nei 1,3-dinitrobenzenas alternatyviame aparate).

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS 1,3-dinitrobenzenas, techniškai gryna kristalinė medžiaga, išsijota per 0,5 mm sietą skirta trinties ir smūgio metodams. Perhidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazinas (RDX, heksogenas, ciklonitas – CAS 121-82-4), perkristalintas iš vandeninio cikloheksanono tirpalo, drėgnas išsijotas per 250 μm sietą ir išlikęs ant 150 μm sieto bei išdžiovintas 103 ± 2 oC temperatūroje (4 valandas), skirtas antros eilės trinties ir smūgio bandymams.

1.4. METODO ESMĖ Norint nustatyti trijų jautrumo bandymų saugos sąlygas, būtina atlikti išankstinius bandymus.

1.4.

1.4.1. Saugaus naudojimo bandymai (3) Rūpinantis sauga, prieš atliekant pagrindinius bandymus labai maži medžiagos mėginiai (maždaug 10 mg) atviroje vietoje kaitinami dujų liepsnoje, veikiami smūgio bet kokiame patogios formos aparate ir veikiami trinties, naudojant medinį plaktuką ir priekalą arba bet kokios rūšies trinties aparatą. Tikslas – nustatyti, ar medžiaga yra tiek jautri ir sprogi, kad paskirtieji jautrumo bandymai, ypač terminio jautrumo bandymas, turi būti atliekami laikantis specialių saugos priemonių, kad būtų išvengta pavojaus sužeisti operatorių.

1.4.2. Terminis jautrumas Norint nustatyti, ar medžiaga gali sprogti intensyvaus kaitinimo ir apibrėžto uždaro tūrio sąlygomis, ji pagal šį metodą kaitinama plieniniame vamzdyje, uždarytame diafragma, turinčia skirtingą angos skersmenį.

1.4.3. Mechaninis jautrumas (smūgis) Taikant šį metodą medžiaga veikiama smūgio, kai nustatyto dydžio masė metama iš nustatyto aukščio.

1.4.4. Mechaninis jautrumas (trintis) Taikant šį metodą kietos arba pastos pavidalo medžiagos veikiamos trinties tarp standartinių paviršių nustatytomis apkrovos ir santykinio judėjimo sąlygomis.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nenurodyti.

1.6. METODO APRAŠYMAS

1.6.

1.6.1. Terminis jautrumas (liepsnos veikimas)

1.6.1.

1.6.1.1. Aparatūra Aparatą sudaro vienkartinio naudojimo plieninis vamzdis su jam skirtu daugkartinio naudojimo uždarymo įtaisu (1 paveikslas), įstatytas į kaitinimo ir apsauginį įtaisą. Kiekvienas vamzdis yra giliojo tempimo plonalakščio plieno vamzdis (žr. priedėlį), vamzdžio vidinis skersmuo 24 mm, ilgis 75 mm, sienelių storis 0,5 mm. Atviras vamzdžio galas užriečiamas, kad jį būtų galima uždaryti diafragmos bloku. Jį sudaro slėgiui atspari diafragma, kurios centre esanti anga yra gerai pritvirtinta prie vamzdžio dviejų dalių sriegine jungtimi (veržle ir sandarikliu su sriegiu). Veržlė ir sandariklis su sriegiu pagaminti iš chromo manganinio plieno (žr. priedėlį), kuris nekibirkščiuoja iki 800 oC. Diafragmos yra 6 mm storio, pagamintos iš kaitrai atsparaus plieno (žr. priedėlį), ir turi įvairaus skersmens angas.

1.6.1.2. Bandymų sąlygos Paprastai medžiaga yra bandoma tokia, kokia yra gauta, nors kai kuriais atvejais, pvz., jei ji yra presuota, lieta arba kitokiu būdu tankinta, prieš bandant ją gali tekti smulkinti. Jei bandomos kietosios medžiagos, kiekvienam bandymui reikalingos medžiagos masė nustatoma atliekant dviejų pakopų tuščiąjį bandymą. Pasvertas vamzdis pripildomas 9 cm3 medžiagos, toliau medžiaga plūkama 80 N jėga, tenkančia visam vamzdžio skerspjūviui. Kad būtų saugu arba tais atvejais, kai bandinio fizinė forma dėl spaudimo gali pasikeisti, gali būti taikomos kitos pripildymo metodikos; pvz., jei medžiaga yra labai jautri trinčiai, plūkimas netinka. Jei medžiaga yra spūdi, jos dedama daugiau ir ji plūkama, kol vamzdis pripildomas tiek, kad iki viršaus lieka 55 mm. Nustatoma bendra masė, kurios reikia pripildyti iki 55 mm lygio, ir dedamos dar dvi tokios dalys, kiekvieną kartą plukant 80 N jėga. Po to plukant arba išimant medžiagos dedama tiek, kad iki vamzdžio viršaus liktų 15 mm. Atliekamas antras tuščiasis bandymas, iš pradžių su suplūktu kiekiu, kuris sudarytų vieną trečdalį pirmame tuščiajame bandyme nustatytos masės. Įdedamos dar dvi tokios dalys plukant 80 N jėga, po to, prireikus, įdedant arba išimant dalį medžiagos nustatomas jos 15 mm lygis iki viršaus. Kietosios medžiagos kiekis, nustatytas antrame tuščiajame bandyme, naudojamas kiekvienam bandymui, pripildant tris kartus vienodais kiekiais, kiekvieną kartą suspaudžiant iki 9 cm3 reikalinga tam jėga. (Tai galima palengvinti naudojant tarpinius žiedus). Skysčių ir gelių dedama į vamzdį iki 60 mm aukščio, ypatingą dėmesį kreipiant į gelių dėjimą, kad būtų išvengta tuštumų susidarymo. Ant vamzdžio iš apačios užstumiamas sandariklis su sriegiu, įstatoma diafragma su reikiamo skersmens anga ir, šiek tiek sutepus molibdeno disulfido pagrindu pagamintu tepalu, užsukama veržlė. Yra labai svarbu kontroliuoti, kad medžiaga visiškai nepatektų tarp jungės ir diafragmos arba tarp sriegių. Kaitinama propano dujomis iš pramoninio baliono, turinčio reduktorių (60-70 mbar), leidžiamomis per debitmatį ir tolygiai vamzdynu paskirstomomis (kaip rodo degiklių liepsnos stebėjimas) keturiems degikliams. Degikliai išdėstyti apie bandymo kamerą, kaip parodyta 1 paveiksle. Keturi degikliai bendrai suvartoja 3,2 litro propano per minutę. Galima deginti kitokias dujas ir naudoti kitokius degiklius, tačiau kaitinimo sparta turi būti tokia, kokia nurodyta 3 paveiksle. Visuose aparatuose kaitinimo sparta turi būti periodiškai tikrinama, naudojant dietilftalatu pripildytus vamzdžius, kaip parodyta 3 paveiksle.

1.6.1.3. Bandymų eiga Kiekvienas bandymas atliekamas tol, kol vamzdis sutrūkinėja į dalis, arba jis kaitinamas penkias minutes. Vertinama, kad bandyme įvyko sprogimas, jei jis baigiasi vamzdžio sutrūkimu į tris arba daugiau skeveldrų, kurios kai kuriais atvejais gali jungtis siauromis metalo juostomis, kaip parodyta 2 paveiksle. Jei bandymo metu susidaro mažiau skeveldrų arba jų visai nesusidaro, tuomet nelaikoma, kad įvyko sprogimas. Iš pradžių atliekama trijų bandymų serija su 6,0 mm skersmens diafragma, ir jei sprogimų neįvyksta, atliekama antroji trijų bandymų serija su 2 mm skersmens diafragma. Jei sprogimas įvyksta bet kurioje bandymų serijoje, tolesni bandymai nereikalingi.

1.6.1.4. Vertinimas Bandymų rezultatas laikomas teigiamu, jei sprogimas įvyksta bet kurioje anksčiau nurodytų bandymų serijoje.

1.6.2. Mechaninis jautrumas (smūgis)

1.6.2.

1.6.2.1. Aparatūra (4 paveikslas) Pagrindinės tipiško aparato su krintančiu kūju dalys yra lietas plieninis blokas su pagrindu, priekalas, kolona, kreipikliai, krintantys svarsčiai, paleidžiantysis įtaisas ir mėginio laikiklis. Plieninis priekalas, 100 mm (skersmuo) × 70 mm (aukštis), varžtais tvirtinamas ant plieninio bloko, 230 mm (aukštis) × 250 mm (plotis) × 200 mm (aukštis), esančio ant lieto pagrindo 450 mm (ilgis) × 450 mm (plotis) × 60 mm (aukštis). Kolona, pagaminta iš besiūlio trauktinio plieninio vamzdžio, tvirtinama laikiklyje, priveržtame užpakalinėje plieninio bloko sienoje. Keturiais varžtais aparatas tvirtinamas prie vientiso betoninio bloko, 60 × 60 × 60 cm, tokiu būdu, kad kreipiklių strypai būtų vertikalūs ir krintantis svarstis kristų laisvai. Naudojami 5 ir 10 kg svarsčiai, pagaminti iš vientiso plieno. Visų svarsčių smogiamoji galvutė pagaminta iš grūdinto plieno, HRC 60–63, ir jos mažiausias skersmuo lygus 25 mm. Mėginys dedamas į smūgiavimo įtaisą, kurį sudaro du vienas ant kito uždėti koaksialūs plieniniai cilindrai, esantys tuščiaviduriame cilindro formos plieniniame kreipiamajame žiede. Vientiso plieno cilindrai turi būti 10 (-0,003, -0,005) mm skersmens ir 10 mm aukščio, jų paviršius turi būti poliruotas, kraštai apvalinti (kreivės spindulys 0,5 mm) ir HRC 58-65 kietumo. Tuščiavidurio cilindro išorinis skersmuo turi būti lygus 16 mm, poliruotos ištekintos angos skersmuo 10 (+0,005, +0,010) mm ir aukštis 13 mm. Smogiamasis įtaisas surinktas ant tarpinio priekalo (26 mm skersmuo ir 26 mm aukštis), pagaminto iš plieno, ir centruotas žiedu su angomis dujoms išleisti.

1.6.2.2. Bandymų sąlygos Mėginio tūris turi būti lygus 40 mm3, arba tūris turi atitikti bet kokį alternatyvųjį aparatą. Kietos medžiagos turi būti išbandytos sausos ir ruošiamos taip: Medžiagos, kurios paprastai tiekiamos pastos pavidalo, turi būti, jei tai įmanoma, bandomos išdžiovintos arba bet kuriuo atveju pašalinus kuo didesnę dalį skiediklio. Skysčiai bandomi tarp viršutinio ir apatinio cilindro esant 1 mm tarpui.

1.6.2.2. a)

milteliai sijojami (sieto akučių dydis 0,5 mm); bandoma visa tai, kas išbyra per sietą;

presuotos, lietos ar kitu būdu tankintos medžiagos smulkinamos į mažus gabalus ir sijojamos; bandoma sijota 0,5-1 mm skersmens dalelių frakcija, kuri turi būti reprezentatyvi pradinės medžiagos dalis.

1.6.2.3. Bandymų eiga Atliekama šešių bandymų serija, metant 10 kg masės svarstį iš 0,40 m aukščio (40 J). Jei 40 J atveju šešių bandymų metu sprogimas įvyksta, turi būti atliekama kita 6 bandymų serija, metant 5 kg masės svarstį iš 0,15 m aukščio (7,5 J). Kituose aparatuose bandinys lyginamas su pasirinktąja etalonine medžiaga, naudojant nustatytą metodiką (pvz., kėlimo-metimo metodiką ir t. t.).

1.6.2.4. Vertinimas Bandymų rezultatas laikomas teigiamu, jei bent vieno bandymo metu, naudojant nurodytą smūgiavimo įtaisą, įvyksta sprogimas (liepsnos blyksniai ir (arba) garsas, prilygstantis sprogimo garsui) arba bandinys yra jautresnis nei 1,3-dinitrobenzenas ar heksogenas atliekant alternatyvų smūgio bandymą.

1.6.3. Mechaninis jautrumas (trintis)

1.6.3.

1.6.3.1. Aparatūra (5 paveikslas) Trinties aparatą sudaro lieto plieno pagrindo plokštė, ant kurios montuojamas trinties įtaisas. Jį sudaro nejudantis porcelianinis kaištis ir judanti porcelianinė plokštė. Porcelianinė plokštė privirtinta prie vežimėlio, kuris juda dviem kreipikliais. Vežimėlis prijungtas prie elektros variklio jungiamuoju strypu, ekscentriniu krumpliaračiu ir atitinkama pavara tokiu būdu, kad porcelianinė plokštė po porcelianiniu kaiščiu juda tik kartą 10 mm į priekį ir atgal. Porcelianinį kaištį galima apkrauti, pvz., 120 arba 360 N apkrova. Plokščios porcelianinės plokštės pagamintos iš balto techninio porceliano (šiurkštumas nuo 9 iki 32 μm), jų matmenys: 25 mm (ilgis) × 25 mm (plotis) × 5 mm (storis). Cilindrinis 15 mm ilgio porcelianinis kaištis taip pat pagamintas iš balto techninio porceliano, jo skersmuo lygus 10 mm, ir galai turi šiurkštintą sferinį paviršių, kurio kreivės spindulys lygus 10 mm.

1.6.3.2. Bandymų sąlygos Bandinio tūris turi būti lygus 10 mm3 arba bandinio tūris turi atitikti bet kurį alternatyvų aparatą. Kietos medžiagos išbandomos sausos ir ruošiamos taip: Medžiagos, kurios paprastai tiekiamos pastos pavidalu, turi būti bandomos sausos, jei galima. Jei sauso medžiagos pavidalo paruošti neįmanoma, pasta (pašalinus kiek įmanoma didesnį kiekį skiediklio) bandoma šablonu pagaminant 0,5 mm storio, 2 mm pločio ir 10 mm ilgio plėvelę.

1.6.3.2. a)

milteliai sijojami (sieto akučių dydis 0,5 mm); bandoma visa tai, kas iškrenta per sietą;

presuotos, lietos ar kitu būdu sutankintos medžiagos smulkinamos į mažus gabalus ir sijojamos; bandymuose naudojama sijota frakcija, kurios dalelių skersmuo < 0,5 mm.

1.6.3.3. Bandymų eiga Porcelianinis kaištis uždedamas ant bandomosios medžiagos ir veikiamas apkrova. Atliekant bandymą porceliano plokštės akytumo žymės turi būti skersai judėjimo krypties. Kaištis turi būti ant bandinio, po kaiščiu turi būti pakankamas kiekis bandinio medžiagos ir plokštė po kaiščiu turi judėti teisingai. Plokštelę padengti pastos pavidalo medžiaga naudojamas 0,5 mm storio saikiklis, turintis 2 × 10 mm griovelį. Porcelianinė plokštelė turi judėti po porcelianiniu kaiščiu 10 mm į priekį ir atgal per 0,44 sekundės. Kiekviena plokštelės ir kaiščio paviršiaus dalis turi būti naudojama tik vieną kartą; du kiekvieno kaiščio galai naudojami dviems bandymams ir kiekvienas iš dviejų plokštelės paviršių naudojamas trims bandymams. Atliekama šešių bandymų serija, naudojant 360 N apkrovą. Jei šių šešių bandymų metu gaunamas teigiamas rezultatas, turi būti atlikta kita šešių bandymų serija su 120 N apkrova. Kituose aparatuose bandinys lyginamas su pasirinkta etalonine medžiaga, taikant nustatytą metodiką (pvz., kėlimo-metimo metodiką ir t. t.).

1.6.3.4. Vertinimas Bandymų rezultatai laikomi teigiamais, jei kurio nors šių bandymų metu naudojant nustatytą Trinties aparatą įvyksta bent vienas sprogimas (prilygstantis sprogimui traškesys ir (arba) sprogimą primenantis garsas arba liepsnos blyksnis) arba jei jie atitinka lygiaverčius kriterijus vykdant alternatyvų trinties bandymą.

2. DUOMENYS Iš esmės medžiaga pagal šią direktyvą laikoma kelianti sprogimo pavojų, jei terminio jautrumo, jautrumo smūgiui arba trinčiai bandymo rezultatas yra teigiamas.

3. ATASKAITA

3.

3.1. BANDYMŲ ATASKAITA Bandymų ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti tokia informacija:

bandomosios medžiagos identiškumas, sudėtis, grynumas, drėgmės kiekis ir t. t.,

bandinio fizinė forma ir ar jis buvo smulkinamas, trupinamas ir (arba) sijojamas,

stebėjimai vykdant terminio jautrumo bandymus (pvz., bandinio masė, skeveldrų skaičius ir t. t.),

stebėjimai vykdant mechaninio jautrumo bandymus (pvz., didelio dūmų kiekio susidarymas arba visiškas medžiagos irimas be garso, liepsnos, kibirkščių, traškesio ir t. t.),

kiekvieno tipo bandymų rezultatai,

jei buvo naudojamas alternatyvus aparatas, turi būti pateiktas mokslinis pagrindimas, taip pat duomenys apie koreliaciją tarp rezultatų, gautų nustatytu aparatu, ir rezultatų, gautų lygiaverčiu aparatu,

visi naudingi komentarai, pvz., nuoroda į panašių medžiagų bandymus, kurie galbūt tiktų tinkamai paaiškinti rezultatus,

visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.

3.2. REZULTATŲ AIŠKINIMAS IR VERTINIMAS Bandymų ataskaitoje turi būti paminėti visi rezultatai, kurie laikomi klaidingais, anomaliais arba nereprezentatyviais. Jei kokius nors rezultatus reikia atmesti, turi būti pateiktas aiškinimas ir visų alternatyvių arba papildomų bandymų rezultatai. Jei anomalus rezultatas negali būti paaiškintas, jis turi būti priimtas toks, koks yra, ir turi būti naudojamas medžiagai atitinkamai klasifikuoti.

4.1)2)3)4) NUORODOS Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol.3, p. 6–13 ir 30–42. NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.

A.15. UŽSIDEGIMO TEMPERATŪRA (SKYSČIAI IR DUJOS)

A.15.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Šiuo bandymu neturi būti bandomos sprogstamosios medžiagos ir medžiagos, kurios užsidega sąlytyje su oru esant kambario temperatūrai. Bandymo metodika taikytina dujoms, skysčiams ir garams, kurie ore gali užsidegti susilietę su karštu paviršiumi. Užsidegimo temperatūra gali žymiai sumažėti, jei yra katalizinių priemaišų, dėl paviršiaus medžiagos arba dėl didesnio bandymo indo tūrio.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Užsidegimo laipsnis išreikiamas užsidegimo temperatūra. Užsidegimo temperatūra yra mažiausia temperatūra, kurioje bandomoji medžiaga užsidega, sumaišyta su oru esant bandymo metode apibrėžtoms sąlygoms.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Etaloninės medžiagos nurodytos standartuose (žr. 1.6.3). Jos pirmiausiai turi būti naudojamos tikrinti metodo veikimą ir lyginti rezultatus, gautus taikant kitus metodus.

1.4. METODO ESMĖ Taikant šį metodą nustatoma mažiausia gaubto vidinio paviršiaus temperatūra, kurioje užsidega po gaubtu įpurkštos dujos, garai arba skystis.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Pakartojamumas kinta atsižvelgiant į užsidegimo temperatūros intervalą ir taikytą metodą. Jautrumas ir specifiškumas priklauso nuo taikyto bandymo metodo.

1.6. METODO APRAŠYMAS

1.6.

1.6.1. Aparatūra Aparatas aprašytas 1.6.3 nurodytame metode.

1.6.2. Bandymo sąlygos Bandomosios medžiagos bandinys yra bandomas pagal 1.6.3 nurodytą metodą.

1.6.3. Bandymo eiga Žr. IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. DUOMENYS Užrašykite bandymų temperatūrą, atmosferos slėgį, naudotą bandinio kiekį ir bandinio užsidegimo vėlinimosi trukmę.

3. ATASKAITA Jei įmanoma, bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:

tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimas ir priemaišos),

naudotas bandinio kiekis, atmosferos slėgis,

naudota apatatūra,

matavimų rezultatai (bandymų temperatūra, užsidegimo rezultatai, atitinkamų vėlinimosi trukmė),

visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.

4. NUORODOS Nėra.

A.16. KIETŲJŲ MEDŽIAGŲ SANTYKINĖ UŽSIDEGIMO TEMPERATŪRA

A.16.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Šiuo bandymu neturi būti bandomos sprogiosios medžiagos ir medžiagos, kurios sąlytyje su oru užsidega kambario temperatūroje. Šio bandymo tikslas – gauti išankstinę informaciją apie kietųjų medžiagų užsidegimą aukštesnėje temperatūroje. Jei medžiagos reakcijos su deguonimi arba egzoterminio jos skilimo metu susidariusi šiluma aplinkoje išsisklaido nepakankamai greitai, dėl savaiminio įkaitimo įvyksta užsidegimas. Taigi, užsidegimas įvyksta, kai šilumos susidarymo greitis yra didesnis nei jos netekimo greitis. Bandymo metodika yra naudinga kaip išankstinis kietųjų medžiagų atrankos bandymas. Atsižvelgiant į sudėtingą kietųjų medžiagų užsidegimo ir degimo prigimtį, šiuo metodu nustatyta užsidegimo temperatūra turi būti taikoma tik palyginimui.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Pagal šį metodą nustatyta užsidegimo temperatūra yra mažiausia aplinkos temperatūra, išreikšta oC, kurioje tam tikras medžiagos kiekis užsidega apibrėžtomis sąlygomis.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nenurodytos.

1.4. METODO ESMĖ Tam tikras bandomosios medžiagos kiekis kambario temperatūroje dedamas į krosnį; užrašoma bandinio viduje matuojamos temperatūros kitimo laike kreivė, krosnies temperatūrą 0,5 oC/min sparta didinant iki 400 oC arba iki lydymosi temperatūros, jei ji žemesnė. Šiame bandyme krosnies temperatūra, kurioje bandinio temperatūra pasiekia 400 C dėl savaiminio įkaitimo, vadinama užsidegimo temperatūra.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.6. METODO APRAŠYMAS

1.6.

1.6.1. Aparatūra

1.6.1.

1.6.1.1. Krosnis Laboratorinė krosnis (tūris apie 2 litrus), kuri turėtų programuojamą temperatūros reguliavimą ir kurioje būtų savaiminė oro cirkuliacija bei sprogimo slėgio mažinimo vožtuvas. Norint išvengti galimo sprogimo pavojaus, bet kokios skilimo metu susidarančios dujos turi nepatekti ant elektrinių kaitinimo elementų.

1.6.1.2. Kubas iš vielos tinklelio Iš nerūdijančio plieno pagamintas vielos tinklelis su 0,045 mm akutėmis turi būti supjaustytas pagal 1paveiksle pateiktą pavyzdį. Tinklelis turi būti sulankstytas kubu su atviru viršumi ir sutvirtintas viela.

1.6.1.3. Termoelementai Tinkami termoelementai.

1.6.1.4. Savirašis Bet koks dviejų koordinačių savirašis, kalibruotas nuo 0 oC iki 600 oC arba pagal atitinkamą įtampą.

1.6.2. Bandymo sąlygos Medžiagos bandomos tokios, kokios yra gaunamos.

1.6.3. Bandymo eiga Kubas pildomas bandomąja medžiaga ir švelniai tapšnojant jos dedama daugiau, kol kubas visiškai prisipildo. Toliau kubas kambario temperatūroje pakabinamas krosnies viduryje. Vienas termoelementas dedamas kubo viduryje, o temperatūrai krosnyje registruoti kitas termoelementas dedamas tarp kubo ir krosnies sienos. Krosnies ir bandinio temperatūra nuolat užrašoma, krosnies temperatūrą 0,5 oC/min sparta didinant iki 400 oC arba iki lydymosi temperatūros, jei ji yra žemesnė. Kai medžiaga užsidega, bandinyje esantis termoelementas rodys labai staigų temperatūros didėjimą palyginti su krosnies temperatūra.

2. DUOMENYS Norint vertinti, svarbu žinoti krosnies temperatūrą, kurioje bandinio temperatūra dėl jo savaiminio įkaitimo pasiekia 400 oC (žr. 2 paveikslą).

3. ATASKAITA Jei įmanoma, ataskaitoje turi būti tokia informacija:

bandyti pateiktos medžiagos apibūdinimas,

matavimo rezultatai, įskaitant temperatūros kitimo laike kreivę,

visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.

4. NUORODOS NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

4. 1 paveikslas 20 mm bandymo kubo pavyzdys

2 paveikslas Tipiška temperatūros kitimo laike kreivė

Bandinio temperatūra Krosnies temperatūra Užsidegimo temperatūra Laikas

A.17. OKSIDACINĖS SAVYBĖS (KIETOSIOS MEDŽIAGOS)

A.17.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Prieš atliekant šį bandymą naudinga turėti išankstinę informaciją apie bet kurias medžiagos potencialias sprogumo savybes. Šis bandymas netaikomas skysčiams, dujoms, sprogstamosioms arba labai degioms medžiagoms arba organiniams peroksidams. Šio bandymo atlikti nereikia, jei struktūrinės formulės analizė leidžia pagrįstai neabejoti, kad medžiaga negali egzotermiškai reaguoti su degiąja medžiaga. Norint išsiaiškinti, ar bandymas turi būti atliekamas taikant ypatingas saugumo priemones, turi būti daromas išankstinis bandymas.

1.2. APIBRĖŽIMAS IR VIENETAI Degimo trukmė: reakcijos laikas, kurį reakcijos zona sklinda palei krūvelę, bandymą atliekant pagal 1.6 aprašytą metodiką. Degimo greitis: išreikštas milimetrais per sekundę. Didžiausias degimo greitis: degimo greičio didžiausia vertė, gauta deginant mišinius, kuriuose oksidatorius sudaro nuo 10 % iki 90 % mišinio masės.

1.3. ETALONINĖ MEDŽIAGA Bandyme ir išankstiniame bandyme kaip etaloninė medžiaga naudojamas bario nitratas (analiziškai grynas). Etaloninis mišinys yra toks bario nitrato ir celiuliozės miltelių mišinys, paruoštas pagal 1.6, kurio degimo greitis yra didžiausias (paprastai tai mišinys, kuriame bario nitrato yra 60 % masės).

1.4. METODO ESMĖ Išankstinis bandymas atliekamas saugos tikslais. Toliau bandyti nereikia, jei išankstiniu bandymu nustatoma, kad bandomoji medžiaga turi oksidacinių savybių. Jei taip nėra, su medžiaga turi būti atliktas visas bandymas. Atliekant visą bandymą, bandomoji medžiaga ir atitinkama degioji medžiaga maišomos įvairiais santykiais. Iš kiekvieno mišinio paruošiama krūvelė, kuri viename gale padegama. Nustatytas didžiausias degimo greitis lyginamas su etaloninio mišinio didžiausiu degimo greičiu.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Jei reikia, tinka bet kuris malimo ir maišymo būdas su sąlyga, kad šešių atskirų bandymų didžiausio degimo greitis nuo aritmetinio vidurkio vertės skiriasi ne daugiau kaip 10 %.

1.6. METODO APRAŠYMAS

1.6.

1.6.1. Paruošimas

1.6.1.

1.6.1.1. Bandomoji medžiaga Bandinį smulkinkite, kad dalelių dydis būtų < 0,125 mm pagal tokią metodiką: bandomąją medžiagą sijokite, likusiąją dalį malkite ir vėl sijokite, kol per sietą išsijojamas visas bandinys. Galima taikyti bet kokį malimo ir sijojimo būdą, kuris atitiktų kokybės kriterijus. Prieš ruošiant mišinį medžiaga išdžiovinama 105 oC temperatūroje iki pastoviosios masės. Jei bandomosios medžiagos skilimo temperatūra yra mažesnė kaip 105 oC, medžiaga turi būti išdžiovinta atitinkamoje mažesnėje temperatūroje.

1.6.1.2. Degiosios medžiagos Degioji medžiaga yra celiuliozės milteliai. Celiuliozės rūšis turi atitikti plonasluoksnėje chromatografijoje arba kolonėlinėje chromatografijoje naudojamą celiuliozę. Tinkama nustatyta celiuliozės rūšis, kurios daugiau kaip 85 % plaušelių ilgis yra nuo 0,020 iki 0,075 mm. Celiuliozės milteliai sijojami per sietą, kurio akučių dydis 0,125 mm. Visą bandymą turi būti naudojama celiuliozė iš tos pačios partijos. Prieš ruošiant mišinį celiuliozės milteliai džiovinami 105 oC temperatūroje iki pastoviosios masės. Jei išankstiniam bandymui naudojami medienos miltai, ruošiami spygliuočių medienos miltai, surinkus tą dalį, kuri nusisijoja per 1,6 mm dydžio akučių sietą, ji gerai sumaišoma, po to ne didesnis kaip 25 mm storio sluoksnis keturias valandas džiovinamas 105 oC temperatūroje. Atšaldoma ir laikoma sandariame inde, jį pripildžius kuo pilniau, kol reikės naudoti, geriausiai per 24 valandas po džiovinimo.

1.6.1.3. Padegimo šaltinis Padegimo šaltiniu turi būti naudojama karšta dujų degiklio liepsna (mažiausias skersmuo 5 mm). Jei naudojamas kitas uždegimo šaltinis (pvz., bandant inertinių dujų atmosferoje), būtina pateikti aprašymą ir pagrindimą.

1.6.2. Bandymo eiga Pastaba Oksidatorių mišiniai su celiulioze arba medienos miltais turi būti laikomi potencialiai sprogiais mišiniais ir su jais turi būti elgiamasi kiek galima atsargiau.

1.6.2.

1.6.2.1. Išankstinis bandymas Išdžiovinta medžiaga gerai sumaišoma su išdžiovinta celiulioze arba medienos miltais imant 2 masės dalis bandomosios medžiagos ir 1 masės dalį celiuliozės arba medienos miltų ir mišinys, pripildant be plūkimo kūgio formos šabloną (pvz., laboratorinį stiklinį piltuvą, užkimšus jo kojelę), formuojamas į kūgio formos krūvelę, kurios matmenys 3,5 cm (pagrindo skersmuo) × 2,5 cm (aukštis). Krūvelė dedama ant šaltos nedegios, neakytos ir blogai šilumą praleidžiančios pagrindo plokštės. Bandymas turi būti atliktas traukos spintoje, kaip aprašyta 1.6.2.2. Padegimo šaltiniu prisiliečiama prie kūgio. Stebimas ir užrašomas vykstančios reakcijos intensyvumas ir trukmė. Jei reakcija vyksta intensyviai, medžiaga turi būti laikoma oksiduojančia. Kiekvienu atveju, jei kyla abejonių, būtina atlikti toliau aprašytą bandinių eilės bandymą.

1.6.2.2. Bandinių eilės bandymas Paruoškite oksidatoriaus ir celiuliozės mišinius, kuriuose oksidatoriaus kiekis kinta kas 10 % nuo 10 % iki 90 % masės. Norint degimo greičio didžiausią vertę gauti tiksliau, kraštiniams atvejams turi būti naudojami tarpinės sudėties oksidatoriaus ir celiuliozės mišiniai. Krūvelei paruošti naudojama forma. Iš metalo pagaminta forma yra 250 mm ilgio, o jos skerspjūvis yra trikampis, kurio vidinis aukštis 10 mm ir vidinis ilgis 20 mm. Abejose formos pusėse išilgine kryptimi tvirtinamos dvi šoninės metalinės plokštės, kurios yra 2 mm aukštesnės nei viršutinis trikampio skerspjūvio kraštas (žr. paveikslą). Šis įtaisas pripildomas mišinio, jo neplakant ir įpilant nedidelį perteklių. Forma vieną kartą numetama iš 2 cm aukščio ant kieto paviršiaus, o medžiagos perteklius nubraukiamas įstrižai pasukta plokštele. Šoninės plokštės nuimamos ir likę milteliai lyginami velenėliu. Po to ant formos viršaus uždedama nedegi, neakyta ir blogai šilumą praleidžianti pagrindo plokštė, įtaisas apverčiamas ir forma nuimama. Krūvelė dedama į traukos spintą skersai traukos krypčiai. Oro greitis turi būti pakankamas, kad dūmai negalėtų patekti į laboratoriją, ir bandymo metu turi nesikeisti. Apie įtaisą turi būti įtaisytas nuo traukimo saugantis ekranas. Kadangi celiuliozė ir kai kurios bandomosios medžiagos yra higroskopiškos, bandymas turi būti atliekamas kiek įmanoma greičiau. Vieną krūvelės galą padekite, prikišę prie jo liepsną. Po to, kai reakcijos zona įveikia pradinį 30 mm atstumą, matuokite reakcijos trukmę 200 mm atstumu. Bandymas atliekamas su etalonine medžiaga ir bent vieną kartą su kiekvienu iš bandomosios medžiagos mišinių su celiulioze. Jei nustatoma, kad didžiausias degimo greitis yra žymiai didesnis nei etaloninio mišinio didžiausias degimo greitis, bandymas gali būti nutrauktas; priešingu atveju bandymas turi būti pakartotas penkis kartus su kiekvienu iš trijų mišinių, kuriems gautas didžiausias degimo greitis. Jei kyla įtarimas, kad rezultatas yra klaidingai teigiamas, bandymas turi būti pakartotas vietoje celiuliozės naudojant inertišką medžiagą, kurios dalelių dydis būtų panašus, pvz., diatomitą. Be to, bandomosios medžiagos ir celiuliozės mišinys, kurio degimo greitis yra didžiausias, turi būti pakartotinai išbandytas inertiškoje atmosferoje (deguonies < 2 % pagal tūrį).

2. DUOMENYS Saugos tikslais turi būti laikoma, kad didžiausias degimo greitis, o ne jo vidutinė vertė yra bandomosios medžiagos oksidacines savybes apibūdinantis parametras. Vertinant imama didžiausia degimo greičio vertė, gauta atlikus šešis atitinkamo mišinio bandymus. Nubrėžkite kiekvieno mišinio didžiausiojo degimo greičio priklausomybės nuo oksidatoriaus koncentracijos kreivę. Iš kreivės nustatykite didžiausiąją degimo greičio vertę. Šešios išmatuotos degimo greičio vertės, gautos atliekant bandymus su mišiniu, kuriam nustatytas didžiausias degimo greitis, turi nesiskirti nuo aritmetinio vidurkio vertės daugiau kaip 10 %; kitu atveju turi būti patobulinti malimo ir maišymo metodai. Gautą didžiausiąjį degimo greitį palyginkite su etaloninio mišinio didžiausiuoju degimo greičiu (žr. 1.3). Jei bandymai atliekami inertiškoje atmosferoje, didžiausias reakcijos greitis lyginamas su etaloninio mišinio degimo inertiškoje atmosferoje didžiausiu greičiu.

3. ATASKAITA

3.

3.1. BANDYMŲ ATASKAITA Jei įmanoma, bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:

bandomosios medžiagos identifikavimas, sudėtis, grynumas, drėgmės kiekis ir t. t.,

kiekvienas bandinio apdorojimo būdas (pvz., malimas, džiovinimas),

bandymuose naudotas uždegimo šaltinis,

matavimų rezultatai,

reakcijos pobūdis (pvz., degimas pliūpsniais paviršiuje, degimas visoje bandinio masėje, visa informacija apie degimo produktus ir t. t.),

visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus, įskaitant degimo intensyvumo aprašymą (liepsnojimas, kibirkščiavimas, rūkimas, lėtas rusenimas ir t. t.) ir apytikrę degimo trukmę, nustatytą išankstiniame saugos (atrankos) bandyme bandomajai ir etaloninei medžiagoms,

bandymų su inertiška medžiaga rezultatai, jei yra,

bandymų inertiškoje atmosferoje rezultatai, jei yra.

3.2. REZULTATŲ AIŠKINIMAS Laikoma, kad medžiaga yra oksiduojanti, jei: Norint išvengti klaidingai teigiamų rezultatų, juos aiškinant turi būti atsižvelgta į rezultatus, gautus atliekant medžiagos mišinių su inertiška medžiaga bandymus ir (arba) inertiškoje atmosferoje atliktų bandymų rezultatus.

3.2. a)

išankstinio bandymo reakcija vyksta intensyviai,

atliekant išsamų bandymą bandomųjų mišinių degimo greitis yra didesnis arba lygus celiuliozės ir bario nitrato etaloninio mišinio didžiausiajam degimo greičiui.

4. NUORODOS NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

A.18. POLIMERŲ SKAITINĖS VIDUTINĖS MOLEKULINĖS MASĖS IR MOLEKULINĖS MASĖS PASISKIRSTYMAS

A.18.

1. METODAS Šis gel chromatografijos (Gel Permeation Chromatographic) metodas yra OECD TG 118 (1996) kopija. Pagrindiniai principai ir papildoma techninė informacija pateikta 1 nuorodoje.

1.

1.1. ĮVADAS Kadangi polimerų savybės yra labai skirtingos, neįmanoma aprašyti vieną atskirą metodą tiksliai nustatantį atskyrimo ir vertinimo sąlygas, kurios apimtų visas galimybes ir specifinius atvejus, pasitaikančius atskiriant polimerus. Ypač sudėtingas polimerų sistemas dažnai neįmanoma paruošti gel chromatografijai (GPC). Kai GPC nenaudotina, molekulinę masę galima nustatyti kitų metodų pagalba (žr. papildymą). Tokiais atvejais turi būti pateiktos visos taikyto metodo detalės ir pagrindimas. Aprašytas metodas paruoštas DIN 55672 standarto (1) pagrindu. Visa detali informacija apie tai, kaip atlikti bandymus ir kaip vertinti duomenis, galima rasti šiame DIN standarte. Tuo atveju, kai būtina keisti bandymo sąlygas, šie keitimai turi būti pagrįsti. Galima taikyti kitus standartus, jei jie yra visiškai aprašyti. Aprašytame metode kalibravimui naudojami žinomo polidispersiškumo polistireno bandiniai ir metodą gali tekti keisti, pritaikant kai kuriems polimerams, pvz., vandenyje tirpiems ir ilgos šakotos grandinės polimerams.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Skaitinė vidutinė molekulinė masė Mn ir masinė vidutinė molekulinė masė Mw nustatomos taikant tokias lygtis: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi kuriose: Hi yra nuo pagrindo linijos išmatuotas detektoriaus signalo lygis sulaikymo tūriui Vi, Mi sulaikymo tūrį Vi atitinkančios polimero frakcijos molekulinė masė ir n yra duomenų taškų skaičius. Molekulinės masės skirstinio plotį, kuris yra sistemos dispersiškumo matas, nustato santykis Mw/Mn.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Kadangi GPC yra santykinis metodas, turi būti atliekamas kalibravimas. Paprastai šiam tikslui naudojami siaurame intervale pasiskirstę linijinės sandaros polistireno etalonai, kurių vidutinės molekulinės masės Mn ir Mw ir molekulinės masės pasiskirstymas yra žinomi. Kalibravimo kreivę nežinomo bandinio molekulinei masei nustatyti galima naudoti tik tuomet, jei bandiniui ir etalonams atskirti naudotos sąlygos buvo parinktos identišku būdu. Nustatyta priklausomybė tarp molekulinės masės ir eliuavimo tūrio galioja tik konkretaus bandymo specifinėmis sąlygomis. Svarbiausios sąlygos yra temperatūra, tirpiklis (arba tirpiklių mišinys), chromatografavimo sąlygos ir atskyrimo kolonėlė arba kolonėlių sistema. Taip nustatytos bandinio molekulinės masės yra santykinės vertės ir vadinamos molekulinėmis masėmis pagal polistireną. Tai reiškia, kad dėl sandaros ir cheminių skirtumų tarp bandinio ir etalonų molekulinės masės nuo absoliučiųjų verčių gali skirtis didesniu arba mažesniu laipsniu. Jei naudojami kiti etalonai, pvz., polietilenglikolis, polioksietilenas, polimetilmetakrilatas, poliakrilo rūgštis, turi būti nurodyta priežastis.

1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ Bandinio molekulinės masės skirstinys ir vidutinės molekulinės masės (Mn, Mw) gali būti nustatyti taikant GPC. GPC yra specialus skysčių chromatografijos metodas, kuriame bandinys atskiriamas pagal atskirų komponentų hidrodinaminius tūrius (2). Atskyrimas vyksta, kai bandinys praeina per kolonėlę, užpildytą poringa medžiaga, dažniausiai organiniu geliu. Mažos molekulės gali įsiskverbti į poras, tuo tarpu didelės molekulės ekskliuduojamos. Todėl didelių molekulių kelias yra trumpesnis ir jos išplaunamos pirmos. Vidutinio dydžio molekulės įsiskverbia į kai kurias poras ir išplaunamos vėliau. Mažiausios molekulės, kurių vidutinis hidrodinaminis spindulys yra mažesnis nei gelio poros, gali įsiskverbti į visas poras. Šios molekulės išplaunamos paskutinės. Teoriškai atskyrimą apsprendžia vien tik molekulių dydis, tačiau praktikoje sunku išvengti kai kurių trukdančių sugerties veiksnių. Netolygus kolonėlės užpildymas ir nenaudingi tūriai gali bloginti padėtį (2). Aptikimas atliekamas, pvz., matuojant lūžio rodiklį arba UV-sugertį, taip gaunama paprasta pasiskirstymo kreivė. Tačiau norint kreivei priskirti tikrąsias molekulinės masės vertes, kolonėlę reikia kalibruoti, leidžiant per ją žinomos molekulinės masės polimerus ir geriausiai būtų apskritai panašios sandaros polimerus, pvz., įvairius polistireno etalonus. Vertikaliojoje ašyje žymint įvairios molekulinės masės išplautų dalelių kiekį, kuris reiškiamas mase, o horizontaliojoje ašyje – molekulinės masės logaritmą, dažniausiai gaunama Gauso kreivė, kartais mažos molekulinės masės pusėje iškreipta nedidele uodega.

1.5. KOKYBĖS KERITERIJAI Eliuavimo tūrio pakartojamumas (variacijos koeficientas) turi būti geresnis nei 0,3 %. Jei vertinant skirtingu laiku darytą chromatogramą, ji neatitinka tik ką minėto kriterijaus, reikiamas analizės pakartojamumas turi būti užtikrintas atliekant pataisą vidiniu etalonu (1). Polidispersiškumas priklauso nuo etalonų molekulinės masės. Polistireno etalonų atveju tipiškos vertės yra tokios: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp yra etalono molekulinė masė, atitinkanti smailės viršūnę)

1.6. BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS

1.6.

1.6.1. Etaloninių polistireno tirpalų ruošimas Polistireno etalonai ištirpinami juos kruopščiai sumaišant su pasirinktu eliuentu. Ruošiant tirpalus turi būti atsižvelta į gamintojo rekomendacijas. Pasirinktų etalonų koncentracijos priklauso nuo įvairių veiksnių, pvz., injekcijos tūrio, tirpalo klampio ir analizinio detektoriaus jautrumo. Norint išvengti perkrovos, didžiausias injekcijos tūris turi būti pritaikytas kolonėlės ilgiui. Taikant GPC medžiagų atskyrimui analizėje, tipiški injekcijos tūriai 30 cm × 7,8 mm kolonėlei paprastai yra 40-100 μ 1. Galima naudoti didesnį tūrį, tačiau jis neturi viršyti 250 μ 1. Prieš pradedant tikrąjį kolonėlės kalibravimą, turi būti nustatytas optimalus santykis tarp injekcijos tūrio ir koncentracijos.

1.6.2. Bandinio tirpalo ruošimas Iš esmės tie patys reikalavimai taikomi ruošiant bandinių tirpalus. Bandinys ištirpinamas tinkamame tirpiklyje, pvz., tetrahidrofurane, kruopščiai maišant. Jokiu būdu negalima tirpinti naudojant ultragarsinę vonią. Jei būtina, bandinio tirpalas gryninamas, filtruojant per membraninį filtrą, kurio porų dydis 0,2-2 μm. Galutinėje ataskaitoje turi būti pažymėta, ar buvo neištirpusių dalelių, nes tai gali būti didelės molekulinės masės medžiagų dalelės. Ištirpusių dalelių procentinei masės daliai nustatyti turi būti taikomas tinkamas metodas. Tirpalai turi būti panaudoti per 24 valandas.

1.6.3. Aparatūra Turi būti užtikrinta, kad GPC sistema būtų inertiška naudojamiems tirpikliams (pvz., naudoti plieninius kapiliarus, jei tirpiklis tertrahidrofuranas).

rezervuaras tirpikliui,

nudujinimo įtaisas (jei reikia),

siurblys,

pulsacijų slopintuvas (jei reikia),

injekcijos sistema,

chromatografinės kolonėlės,

detektorius,

debitmatis (jei reikia),

duomenų registruotuvas-procesorius,

atliekų indas.

1.6.4. Injekcijos ir tirpiklio tiekimo sistema Tam tikras bandinio tirpalo tūris griežtai nustatytoje zonoje įleidžiamas į kolonėlę, naudojant automatinį bandinio tiektuvą arba rankiniu būdu. Švirkšto plunžerio per greitas ištraukimas arba spaudimas įleidžiant rankiniu būdu gali būti molekulinių masių stebimo pasiskirstymo pokyčių priežastimi. Kiek įmanoma, tirpiklio tiekimo sistema turi būti be pulsacijų, geriausiu atveju jai reikia pulsacijų slopintuvo. Srautas yra apie 1 ml/min.

1.6.5. Kolonėlė Atsižvelgiant į bandinį, polimeras tiriamas naudojant vieną paprastą kolonėlę arba kelias nuosekliai sujungtas kolonėles. Prekyboje yra keletas kolonėlėms užpildyti naudojamų poringų medžiagų su apibrėžtomis savybėmis (pvz., porų dydžiu, ekskliudavimo ribomis). Atskyrimui naudojamo gelio arba kolonėlės aukščio pasirinkimas priklauso ir nuo bandinio savybių (hidrodinaminių tūrių, molekulinės masės pasiskirstymo) ir nuo specifinių atskyrimo sąlygų, pvz., tirpiklio, temperatūros ir srauto (1) (2) (3).

1.6.6. Teorinės lėkštelės Atskyrimui naudojama kolonėlė arba kolonėlių sistema turi būti apibūdinta teorinių lėkštelių skaičiumi. Tetrahidrofurano kaip eliuento atveju reikia į žinomo ilgio kolonėlę įleisti etilbenzeno arba kito tinkamo nepolinio tirpiklio tirpalą. Teorinių lėkštelių skaičius randamas pagal tokią lygtį: N=5,54VeW1/22 arba N=16VeW2 kurioje: N teorinių lėkštelių skaičius Ve smailės viršūnę atitinkantis eliuavimo tūris W smailės plotis pagrindo linijoje W1/2 smailės plotis per smailės aukščio vidurį

1.6.7. Atskyrimo efektyvumas Be teorinių lėkštelių skaičiaus, kuris apsprendžia juostos plotį, tam tikrą vaidmenį vaidina atskyrimo efektyvumas, kurį apibūdina kalibracinės kreivės statumas. Kolonėlės atskyrimo efektyvumas nustatomas pagal tokią priklausomybę: Ve,Mx-Ve,(10Mx)≥6,0 cm3cm2 kurioje: Ve, Mx polistireno, turinčio molekulinę masę Mx, eliuavimo tūris, Ve, (10Mx) polistireno, turinčio 10 kartų didesnę molekulinę masę, eliuavimo tūris. Sistemos atskiriamoji galia dažniausiai apibrėžiama taip: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 čia: Ve1, V e2 dviejų polistireno etalonų eliuavimo tūriai, atitinkantys smailės viršūnę, W1, W2 smailių pločiai pagrindo linijoje, M1, M2 molekulinės masės, atitinkančios smailių viršūnes (turi skirtis 10 kartų). Kolonėlės sistemai R vertė turi būti didesnė kaip 1,7 (4).

1.6.8. Tirpikliai Visi tirpikliai turi būti labai gryni (tetrahidrofurano grynumas 99,5 %). Tirpiklio indas (jei reikia, su inertinių dujų atmosfera) turi būti pakankamai didelis kolonėlei kalibruoti ir kelių bandinių analizei atlikti. Tirpiklis, prieš jį tiekiant siurbliu į kolonėlę, turi būti nudujintas.

1.6.9. Temperatūros reguliavimas Svarbių vidinių komponentų (injekcijos kilpos, kolonėlių, detektoriaus ir vamzdžių) temperatūra turi būti pastovi ir atitikti pasirinktą tirpiklį.

1.6.10. Detektorius Detektoriaus paskirtis – kiekybiškai registruoti iš kolonėlės išplauto bandinio koncentraciją. Norint, kas smailės nebūtų labai plačios, detektoriaus kiuvetės tūris turi būti kuo mažesnis. Jis neturi būti didesnis kaip 10 μl, išskyrus šviesos sklaidos ir klampio detektorius. Detektavimui paprastai naudojama diferencinė refraktometrija. Tačiau, jei to reikalauja bandinio specifinės savybės arba eliuavimo tirpiklis, gali būti naudojami kitų tipų detektoriai, pvz., UV/VIS, IR, klampio detektoriai ir t. t.

2. DUOMENYS IR ATASKAITA

2.

2.1. DUOMENYS Išsamių vertinimo kriterijų, taip pat duomenų kaupimui ir apdorojimui keliamų reikalavimų reikia ieškoti DIN standarte (1). Kiekvienam bandiniui turi būti atlikti du nepriklausomi bandymai. Bandiniai turi būti analizuojami atskirai. Kiekvieną kartą matuojant reikia gauti Mn, Mw, Mw/Mn ir Mp vertes. Būtina aiškiai nurodyti, kad išmatuotos vertės yra santykinės vertės, atitinkančios naudojamų etalonų molekulinę masę. Po sulaikymo tūrio arba sulaikymo trukmės verčių (galbūt pataisytų naudojant vidinį etaloną) nustatymo vienam šių dydžių atidedamos log Mp vertės (Mp yra kalibravimo etalono smailės viršūnę atitinkanti vertė). Kiekvienai molekulinės masės dešimtainei skilčiai būtina turėti bent du kalibravimo taškus, o visai kalibracinei kreivei, kuri turi apimti įvertintą bandinio molekulinę masę, turi būti bent penki matavimų taškai. Mažą molekulinę masę atitinkantis kalibracinės kreivės galinis taškas nustatomas pagal n – heksilbenzeną arba kitokį tinkamą nepolinį tirpiklį. Skaitinė vidutinė ir masinė vidutinė molekulinės masės paprastai apskaičiuojamos elektroninėmis duomenų apdorojimo priemonėmis, taikant 1.2 skyriaus formules. Atliekant apskaičiavimus rankiniu būdu, galima pasižiūrėti į ASTM D 3536-91 (3). Pasiskirstymo kreivė turi būti pateikta lentelės pavidalu arba kaip grafikas (diferencinis dažnis arba bendrojo kiekio procentinės dalys pagal log M). Vaizduojant grafiškai viena molekulinės masės dešimtainė skiltis paprastai turi būti 4 cm pločio, o smailės viršūnės aukštis turi būti apie 8 cm. Integralinių pasiskirstymo kreivių atveju atstumas ordinatėje tarp taškų, atitinkančių 0 ir 100 %, turi būti apie 10 cm.

2.2. BANDYMŲ ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:

2.2.

2.2.1. Bandymų medžiaga

turima informacija apie bandomąją medžiagą (identiškumas, priedai, priemaišos),

bandinio apdorojimo aprašymas, pastebėjimai, problemos.

2.2.2. Aparatūra

tirpiklio rezervuaras, inertinės dujos, eliuento nudujinimas, eliuento sudėtis, priemaišos,

siurblys, pulsacijų slopintuvas, injekcijos sistema,

atskyrimo kolonėlės (gamintojas, visa informacija apie kolonėlių chakteristikas, pvz., porų dydis, atskyrimo medžiagos rūšis ir t. t., naudotų kolonėlių skaičius, ilgis ir jungimo tvarka),

kolonėlės (arba jų rinkinio) teorinių lėkštelių skaičius, atskyrimo efektyvumas (sistemos atskyrimo galia),

informacija apie smailių simetriją,

kolonėlės temperatūra, temperatūros reguliavimo būdas,

detektorius (matavimo principas, tipas, kiuvetės tūris),

debitmatis, jei buvo naudotas (gamintojas, matavimo principas),

duomenų registravimo ir apdorojimo sistema (aparatinė įranga ir programinė įranga).

2.2.3. Sistemos kalibravimas

kalibracinės kreivės gavimo metodo detalus aprašymas,

informacija apie šio metodo kokybės kriterijus (pvz., koreliacijos koeficientą, paklaidų kvadratų sumą ir t. t.),

informacija apie visas ekstrapoliacijas, prielaidas ir aproksimacijas, darytas bandymo eigoje ir vertinant bei apdorojant duomenis,

visi matavimai, naudoti kalibracinei kreivei gauti, turi būti dokumentuoti lentelėje, kurioje kiekvienam kalibravimo taškui būtų pateikta tokia informacija:

bandinio pavadinimas,

bandinio gamintojas,

etalonų būdingosios vertės Mp, Mn, Mw ir Mw/Mn, kokias pateikė gamintojas, arba gautos vėlesniuose matavimuose, kartu nurodant nustatymo metodo detales,

injekcijos tūris ir injekcijos koncentracija,

kalibravimui naudota Mp vertė,

išmatuotas eliuavimo tūris arba pataisyta sulaikymo trukmė, atitinkantys smailės viršūnę,

smailės viršūnę atitinkanti apskaičiuota Mp vertė,

apskaičiuotos ir kalibravimui naudotos Mp vertės procentinė paklaida.

2.2.4. Vertinimas:

vertinimas laiko pagrindu: metodai taikyti reikiamam pakartojamumui užtikrinti (pataisų darymo metodas, vidinis standartas ir t.t),

informacija apie tai, ar vertinimas buvo atliekamas pagal eliuavimo tūrį ar pagal sulaikymo trukmę,

informacija apie vertinimo ribas, jei smailė nėra iki galo analizuota,

suglodinimo metodų aprašymas, jei jie buvo taikyti,

bandinio ruošimo ir išankstinio apdorojimo metodikos,

duomenys apie neištirpusias daleles, jei yra,

injekcijos tūris (μ l) ir injekcijos koncentracija (mg/ml)

stebėjimų duomenys, nurodantys veiksnius, kurie yra nukrypimų nuo teorinio GPC profilio priežastis,

bandymo metodikose darytų visų keitimų detalus aprašymas,

detalės apie paklaidų intervalus,

bet kokia kita informacija ir stebėjimų duomenys, reikalingi duomenims interpretuoti.

3.1)2)3)4) NUORODOS DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.19. MAŽOS MOLEKULINĖS MASĖS MEDŽIAGŲ KIEKIS POLIMERUOSE

A.19.

1. METODAS Šis gelchromatografijos (Gel Permeation Chromatographic) metodas yra OECD TG 119 (1996) kopija. Pagrindiniai principai ir papildoma techninė informacija pateikta nuorodose.

1.

1.1. ĮVADAS Kadangi polimerų savybės yra labai skirtingos, neįmanoma aprašyti vieną atskirą metodą, tiksliai nustatantį atskyrimo ir vertinimo sąlygas, kurios apimtų visas galimybes ir specifinius atvejus, pasitaikančius atskiriant polimerus. Ypač sudėtingas polimerų sistemas dažnai neįmanoma paruošti gelchromatografijai (GPC). Kai GPC nenaudotina, molekulinę masę galima nustatyti kitų metodų pagalba (žr. papildymą). Tokiais atvejais turi būti pateiktos visos taikyto metodo detalės ir pagrindimas. Aprašytas metodas paruoštas DIN 55672 standarto (1) pagrindu. Visa detali informacija apie tai, kaip atlikti bandymus ir kaip vertinti duomenis, galima rasti šiame DIN standarte. Tuo atveju, kai būtina keisti bandymo sąlygas, šie keitimai turi būti pagrįsti. Galima taikyti kitus standartus, jei jie yra visiškai aprašyti. Aprašytame metode kalibravimui naudojami žinomo polidispersiškumo polistireno bandiniai ir metodą gali tekti keisti, pritaikant kai kuriems polimerams, pvz., vandenyje tirpiems ir ilgos šakotos grandinės polimerams.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Mažesnė nei 1000 daltonų molekulinė masė sąlygiškai apibrėžiama kaip maža molekulininė masė. Skaitinė vidutinė molekulinė masė Mn ir masinė vidutinė molekulinė masė Mw nustatomos taikant tokias lygtis: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi kuriose: Hi yra nuo pagrindo linijos išmatuotas detektoriaus signalo lygis sulaikymo tūriui Vi, Mi sulaikymo tūrį Vi atitinkančios polimero frakcijos molekulinė masė ir n yra duomenų taškų skaičius. Molekulinės masės skirstinio plotį, kuris yra sistemos dispersiškumo matas, duoda santykis Mw/Mn.

1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ Bandinio molekulinės masės skirstinys ir vidutinės molekulinės masės (Mn, Mw) gali būti nustatyti taikant GPC. GPC yra specialus skysčių chromatografijos metodas, kuriame bandinys atskiriamas pagal atskirų komponentų hidrodinaminius tūrius (2). Atskyrimas vyksta, kai bandinys praeina per kolonėlę, užpildytą poringa medžiaga, dažniausiai organiniu geliu. Mažos molekulės gali įsiskverbti į poras, tuo tarpu didelės molekulės ekskliuduojamos. Todėl didelių molekulių kelias yra trumpesnis ir jos išplaunamos pirmos. Vidutinio dydžio molekulės įsiskverbia į kai kurias poras ir išplaunamos vėliau. Mažiausios molekulės, kurių vidutinis hidrodinaminis spindulys yra mažesnis nei gelio poros, gali įsiskverbti į visas poras. Šios molekulės išplaunamos paskutinės. Teoriškai atskyrimą apsprendžia vien tik molekulių dydis, tačiau praktikoje sunku išvengti kai kurių trukdančių sugerties veiksnių. Netolygus kolonėlės užpildymas ir nenaudingi tūriai gali bloginti padėtį (2). Aptikimas atliekamas, pvz., matuojant lūžio rodiklį arba UV sugertį, gaunama paprasta pasiskirstymo kreivė. Tačiau norint kreivei priskirti tikrąsias molekulinės masės vertes, kolonėlę reikia kalibruoti, leidžiant per ją žinomos molekulinės masės polimerus ir geriausiai būtų apskritai panašios sandaros polimerus, pvz., įvairius polistireno etalonus. Vertikaliojoje ašyje žymint įvairios molekulinės masės išplautų dalelių kiekį, kuris reiškiamas mase, o horizontaliojoje ašyje – molekulinės masės logaritmą, paprastai gaunama Gauso kreivė, kartais mažos molekulinės masės pusėje iškreipta nedidele uodega. Pagal šią kreivę nustatomas mažos molekulinės masės medžiagų kiekis. Apskaičiavimas gali būti tikslus tik tuo atveju, jei mažos molekulinės masės dalelių atsakas yra ekvivalentiškas jų masės daliai polimere.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Eliuavimo tūrio pakartojamumas (variacijos koeficientas) turi būti geresnis nei 0,3 %. Jei vertinant skirtingu laiku darytą chromatogramą, ji neatitinka tik ką minėto kriterijaus, reikiamas analizės pakartojamumas turi būti užtikrintas atliekant korekciją vidiniu etalonu (1). Polidispersiškumas priklauso nuo etalonų molekulinės masės. Polistireno etalonų atveju tipiškos vertės yra tokios: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp yra etalono molekulinė masė, atinkanti smailės viršūnę).

1.6. BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS

1.6.

1.6.2. Bandinio tirpalo ruošimas Iš esmės tie patys reikalavimai taikomi ruošiant bandinių tirpalus. Bandinys ištirpinamas tinkamame tirpiklyje, pvz., tetrahidrofurane, kruopščiai maišant. Jokiu būdu negalima tirpinti naudojant ultragarsinę vonią. Jei būtina, bandinio tirpalas gryninamas, filtruojant per membraninį filtrą, kurio porų dydis 0,2–2 μm. Galutinėje ataskaitoje turi būti pažymėta, ar buvo neištirpusių dalelių, nes tai gali būti didelės molekulinės masės medžiagų dalelės. Ištirpusių dalelių procentinei masės daliai nustatyti turi būti taikomas tinkamas metodas. Tirpalai turi būti panaudoti per 24 valandas.

1.6.3. Pataisos atsižvelgiant į priemaišų ir priedų kiekį Paprastai būtina daryti medžiagų, kurių molekulinė masė M < 1000, kiekio pataisas atsižvelgiant į esančių nepolimerinių medžiagų (pvz., priemaišų ir (arba) priedų) indėlį, išskyrus kai nustatytas kiekis ir taip jau < 1 %. Tai daroma polimero tirpalo arba GPC eliuato tiesioginės analizės būdu. Tais atvejais, kai išėjusio iš kolonėlės eliuato koncentracija tolesnei analizei per maža, jis turi būti koncentruojamas. Gali prireikti eliuatą išgarinti iki sauso likučio ir vėl jį ištirpinti. Eliuato koncentravimas turi būti atliktas tokiomis sąlygomis, kurios užtikrintų, kad eliuatas išliks nepakitęs. Eliuato apdorojimas po GPC pakopos priklauso nuo kiekybiniam nustatymui taikomo metodo.

1.6.4. Aparatūra Turi būti užtikrinta, kad GPC sistema būtų inertiška naudojamiems tirpikliams (pvz., naudojant plieninius kapiliarus, jei tirpiklis tetrahidrofuranas).

rezervuaras tirpikliui,

nudujinimo įtaisas (jei reikia),

siurblys,

pulsacijų slopintuvas (jei reikia),

injekcijos sistema,

chromatografinės kolonėlės,

detektorius,

debitmatis (jei reikia),

duomenų registruotuvas-procesorius,

atliekų indas.

1.6.5. Injekcijos ir tirpiklio tiekimo sistema Tam tikras bandinio tirpalo tūris griežtai nustatytoje zonoje įleidžiamas į kolonėlę, naudojant automatinį bandinio tiektuvą arba rankiniu būdu. Švirkšto plunžerio per greitas ištraukimas arba spaudimas įleidžiant rankiniu būdu gali būti molekulinių masių stebimo pasiskirstymo pokyčių priežastimi. Kiek įmanoma, tirpiklio tiekimo sistema turi būti be pulsacijų, geriausiu atveju jai reikia pulsacijų slopintuvo. Srautas yra apie 1 ml/min.

1.6.6. Kolonėlė Atsižvelgiant į bandinį, polimeras tiriamas naudojant vieną paprastą kolonėlę arba kelias nuosekliai sujungtas kolonėles. Prekyboje yra keletas kolonėlėms užpildyti naudojamų poringų medžiagų su apibrėžtomis savybėmis (pvz., porų dydžiu, ekskliudavimo ribomis). Atskyrimui naudojamo gelio arba kolonėlės aukščio pasirinkimas priklauso ir nuo bandinio savybių (hidrodinaminių tūrių, molekulinės masės pasiskirstymo) ir nuo specifinių atskyrimo sąlygų, pvz., tirpiklio, temperatūros ir srauto (1) (2) (3).

1.6.7. Teorinės lėkštelės Atskyrimui naudojama kolonėlė arba kolonėlių sistema turi būti apibūdinta teorinių lėkštelių skaičiumi. Tetrahidrofurano kaip eliuento atveju reikia į žinomo ilgio kolonėlę įleisti etilbenzeno arba kito tinkamo nepolinio tirpiklio tirpalą. Teorinių lėkštelių skaičius randamas pagal tokią lygtį: N=5,54VeW1/22 arba N=16VeW2 kurioje: N teorinių lėkštelių skaičius, Ve smailės viršūnę atitinkantis eliuavimo tūris, W smailės plotis pagrindo linijoje, W1/2 smailės plotis per smailės aukščio vidurį.

1.6.8. Atskyrimo efektyvumas Be teorinių lėkštelių skaičiaus, kuris apsprendžia juostos plotį, tam tikrą vaidmenį vaidina atskyrimo efektyvumas, kurį apibūdina kalibracinės kreivės statumas. Kolonėlės atskyrimo efektyvumas nustatomas pagal tokią priklausomybę: Ve,Mx-Ve,(10Mx)kolonelės skerspjūvio plotas≥6,0cm3cm2 kurioje: Ve, Mx polistireno, turinčio molekulinę masę Mx, eliuavimo tūris, Ve, (10Mx) polistireno, turinčio 10 kartų didesnę molekulinę masę, eliuavimo tūris. Sistemos atskiriamoji galia dažniausiai apibrėžiama taip: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 čia: Ve1, Ve2 dviejų polistireno etalonų eliuavimo tūriai, atitinkantys smailės viršūnę, W1, W2 smailių pločiai pagrindo linijoje, M1, M2 molekulinės masės, atitinkančios smailių viršūnes (turi skirtis 10 kartų). Kolonėlės sistemai R vertė turi būti didesnė kaip 1,7 (4).

1.6.9. Tirpikliai Visi tirpikliai turi būti labai gryni (tetrahidrofurano grynumas 99,5 %). Tirpiklio indas (jei reikia inertinių dujų atmosferoje) turi būti pakankamai didelis kolonėlei kalibruoti ir kelių bandinių analizei atlikti. Tirpiklis, prieš tai kaip jį tiekti siurbliu į kolonėlę, turi būti nudujintas.

1.6.10. Temperatūros reguliavimas Svarbių vidinių komponentų (injekcijos kilpos, kolonėlių, detektoriaus ir vamzdžių) temperatūra turi būti pastovi ir atitikti pasirinktą tirpiklį.

1.6.11. Detektorius Detektoriaus paskirtis – kiekybiškai registruoti iš kolonėlės išplauto bandinio koncentraciją. norint, kas smailės nebūtų labai plačios, detektoriaus kiuvetės tūris turi būti kuo mažesnis. Jis neturi būti didesnis kaip 10 μl, išskyrus šviesos sklaidos ir klampio detektorius. Detektavimui paprastai naudojama diferencinė refraktometrija. Tačiau, jei to reikalauja bandinio specifinės savybės arba eliuavimo tirpiklis, gali būti naudojami kitų tipų detektoriai, pvz., UV/VIS, IR, klampio detektoriai ir t. t.

2. DUOMENYS IR ATASKAITA

2.

2.1. DUOMENYS Išsamių vertinimo kriterijų, taip pat duomenų kaupimui ir apdorojimui keliamų reikalavimų reikia ieškoti DIN standarte (1). Kiekvienam bandiniui turi būti atlikti du nepriklausomi bandymai. Bandiniai turi būti analizuojami atskirai. Visais atvejais taip pat yra svarbu apskaičiuoti tuščiųjų bandinių, apdorojamų vienodai su bandiniu, duomenis. Būtina aiškiai nurodyti, kad išmatuotos vertės yra santykinės vertės, atitinkančios naudojamų etalonų molekulinę masę. Po sulaikymo tūrio arba sulaikymo trukmės verčių (galbūt pataisytų naudojant vidinį etaloną) nustatymo vienam šių dydžių atidedamos log Mp vertės (Mp yra kalibravimo etalono smailės viršūnę atitinkanti vertė). Kiekvienai molekulinės masės dešimtainei skilčiai būtina turėti bent du kalibravimo taškus, o visai kalibracinei kreivei, kuri turi apimti įvertintą bandinio molekulinę masę, turi būti bent penki matavimų taškai. Mažą molekulinę masę atitinkantis kalibracinės kreivės galinis taškas nustatomas pagal n – heksilbenzeną arba kitokį tinkamą nepolinį tirpiklį. Kreivės dalis, atitinkanti mažesnę nei 1000 molekulinę masę, apskaičiuojama ir prireikus pataisoma atsižvelgiant į priemaišas ir priedus. Eliavimo kreivės paprastai vertinamos elektroninio duomenų apdorojimo būdu. Atliekant apskaičiavimus rankiniu būdu, galima pasižiūrėti į ASTM D 3536-91 (3). Jei kolonėlėje sulaikomas koks nors netirpus polimeras, jo molekulinė masė greičiausiai yra didesnė nei tirpiosios dalies, ir jei į jo kiekį neatsižvelgti, gaunamas mažos molekulinės masės medžiagų kiekio pervertinimas. Papildyme pateikiamos rekomendacijos, kaip daryti mažos molekulinės masės medžiagų kiekio pataisą atsižvelgiant į netirpų polimerą. Pasiskirstymo kreivė turi būti pateikta lentelės pavidalu arba kaip grafikas (diferencinis dažnis arba bendrojo kiekio procentinės dalys pagal log M). Vaizduojant grafiškai viena molekulinės masės dešimtainė skiltis paprastai turi būti 4 cm pločio, o smailės viršūnės aukštis turi būti apie 8 cm. Integralinių pasiskirstymo kreivių atveju atstumas ordinatėje tarp taškų, atitinkančių 0 ir 100 %, turi būti apie 10 cm.

2.2. BANDYMŲ ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:

2.2.

2.2.1. Bandymų medžiaga

turima informacija apie bandomąją medžiagą (identiškumas, priedai, priemaišos),

bandinio apdorojimo aprašymas, pastebėjimai, problemos.

2.2.2. Aparatūra

tirpiklio rezervuaras, inertinės dujos, eliuento nudujinimas, eliuento sudėtis, priemaišos,

siurblys, pulsacijų slopintuvas, injekcijos sistema,

atskyrimo kolonėlės (gamintojas, visa informacija apie kolonėlių chakteristikas, pvz., porų dydis, atskyrimo medžiagos rūšis ir t. t., naudotų kolonėlių skaičius, ilgis ir jungimo tvarka),

kolonėlės (arba jų rinkinio) teorinių lėkštelių skaičius, atskyrimo efektyvumas (sistemos atskyrimo galia),

informacija apie smailių simetriją,

kolonėlės temperatūra, temperatūros reguliavimo būdas,

detektorius (matavimo principas, tipas, kiuvetės tūris),

debitmatis, jei buvo naudotas (gamintojas, matavimo principas),

duomenų registravimo ir apdorojimo sistema (aparatinė įranga ir programinė įranga).

2.2.3. Sistemos kalibravimas

kalibracinės kreivės gavimo metodo detalus aprašymas,

informacija apie šio metodo kokybės kriterijus (pvz., koreliacijos koeficientą, paklaidų kvadratų sumą ir t. t.),

informacija apie visas ekstrapoliacijas, prielaidas ir aproksimacijas, darytas bandymo eigoje ir vertinant bei apdorojant duomenis,

visi matavimai, naudoti kalibracinei kreivei gauti, turi būti dokumentuoti lentelėje, kurioje kiekvienam kalibravimo taškui būtų pateikta tokia informacija:

bandinio pavadinimas,

bandinio gamintojas,

etalonų būdingosios vertės Mp, Mn, Mw ir Mw/Mn, kokias pateikė gamintojas, arba gautos vėlesniuose matavimuose, kartu nurodant nustatymo metodo detales,

injekcijos tūris ir injekcijos koncentracija,

kalibravimui naudota Mp vertė,

išmatuotas eliuavimo tūris arba pataisyta sulaikymo trukmė, atitinkantys smailės viršūnę,

smailės viršūnę atitinkanti apskaičiuota Mp vertė,

apskaičiuotos ir kalibravimui naudotos Mp vertės procentinė paklaida.

2.2.4. Informacija apie mažą molekulinę masę turinčio polimero kiekį

analizei taikytų metodų aprašymas ir bandymų atlikimo eiga,

informacija apie mažos molekulinės masės medžiagų procentinę dalį (m/m), apskaičiuotą viso bandinio masei,

informacija apie priemaišų, priedų ir kitų nepolimerinių medžiagų masės procentinę dalį, apskaičiuotą viso bandinio masei.

2.2.5. Vertinimas:

vertinimas laiko pagrindu: visi metodai taikyti reikiamam pakartojamumui užtikrinti (pataisų darymo metodas, vidinis standartas ir t. t.),

informacija apie tai, ar vertinimas buvo atliekamas pagal eliuavimo tūrį ar pagal sulaikymo trukmę,

informacija apie vertinimo ribas, jei smailė nėra iki galo analizuota,

suglodinimo metodų aprašymas, jei jie buvo taikyti,

bandinio ruošimo ir išankstinio apdorojimo metodikos,

duomenys apie neištirpusias daleles, jei yra,

injekcijos tūris (μ l) ir injekcijos koncentracija (mg/ml),

stebėjimų duomenys, nurodantys veiksnius, kurie yra nukrypimų nuo teorinio GPC profilio priežastis,

bandymo metodikose darytų visų keitimų detalus aprašymas,

detalės apie paklaidų intervalus,

bet kokia kita informacija ir stebėjimų duomenys, reikalingi duomenims interpretuoti.

3.1)2)3)4) NUORODOS DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.20. POLIMERŲ TIRPIMAS (EKSTRAHAVIMAS) VANDENYJE

A.20.

1. METODAS Aprašytas metodas yra OECD TG 120 (1997) pataisytos versijos kopija. Kita techninė informacija pateikta (1) nuorodoje.

1.

1.1. ĮVADAS Prieš taikant toliau išdėstytą metodą, kai kuriems polimerams, pvz., emulsiniams polimerams, gali būti reikalingi paruošiamieji darbai. Metodas netaikomas skystiesiems polimerams ir polimerams, kurie bandymo sąlygomis reaguoja su vandeniu. Kai metodą taikyti netikslinga arba neįmanoma, polimerų tirpimas (ekstrahavimas) gali būti tiriamas kitų metodų pagalba. Tokiais atvejais turi būti pateiktos visos metodo detalės ir pagrindimas.

1.2 ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nėra.

1.3 BANDYMŲ METODO ESMĖ Polimerų tirpimas (ekstrahavimas) vandeninėje terpėje nustatomas taikant kolbos metodą (žr. A.6 tirpumas vandenyje, kolbos metodas), kuriame daromi toliau aprašyti pakeitimai.

1.4 KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.5 BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS

1.5

1.5.1. Įranga Bandant šiuo metodu reikalinga tokia įranga:

trupintuvas, pvz., malūnas žinomo dydžio dalelėms gauti,

purtyklė, kurioje būtų galima reguliuoti temperatūrą,

membraninių filtrų sistema,

atitinkama analizinė įranga,

standartizuoti sietai.

1.5.2. Bandinių ruošimas Reprezentatyvus bandinys iš pradžių turi būti susmulkintas iki 0,125-0,25 mm dydžio dalelių, naudojant atitinkamus sietus. Bandinio patvarumui užtikrinti arba malimo procese gali būti reikalingas aušinimas. Medžiagos gumos pagrindu gali būti trupinamos skystojo azoto temperatūroje (1). Jei reikiamo dydžio dalelių frakcijos gauti negalima, turi būti imtasi veiksmų dalelių dydžiui kiek įmanoma sumažinti, o rezultatas turi būti pateiktas ataskaitoje. Ataskaitoje būtina nurodyti būdą, kaip sutrupintas bandinys buvo laikomas prieš bandymą.

1.5.3. Bandymo eiga Į tris indus su stikliniais kamščiais atskirai pasveriami trys bandomosios medžiagos 10 g masės bandiniai ir į kiekvieną indą įpilama 1000 ml vandens. Jei pasirodo, kad 10 g polimero apdoroti nėra galimybės, turi būti naudojamas kitas gretimas didžiausias kiekis, kurį galima apdoroti, o vandens tūris atitinkamai keičiamas. Indai gerai užkemšami ir purtomi 20 oC temperatūroje. Turi būti naudojamas purtymo arba maišymo įtaisas, galintis veikti pastovioje temperatūroje. Po 24 valandų kiekvieno indo turinys centrifuguojamas arba filtruojamas ir atinkamu analizės metodu skaidrioje vandeninėje fazėje nustatoma polimero koncentracija. Jei tinkamų metodų analizuoti vandeninėje terpėje nėra, bendrasis tirpumas (ekstrahuojamumas) gali būti nustaytas pagal sauso likučio ant filtro arba sausų centrifugavimo nuosėdų masę. Paprastai būtina kiekybiškai atskirti priemaišas ir priedus nuo mažos molekulinės masės medžiagų. Gravimetrinio nustatymo atveju, norint atsižvelgti į likučius, atsirandančius dėl bandymo metodikos taikymo, svarbu atlikti tuščiąjį bandymą be bandomosios medžiagos. Polimerų tirpimas (ekstrahavimas) vandenyje 37 oC temperatūros ir pH 2 bei pH 9 sąlygomis gali būti nustatytas tokiu pat būdu, kuris aprašytas atliekant bandymą 20 oC temperatūroje. pH vertė gali būti reguliuojama pridedant tinkamo buferinio tirpalo arba tinkamų rūgščių ar šarmų, pvz., druskos rūgšties, acto rūgšties, analiziškai gryno natrio ar kalio hidroksido, arba NH3. Atsižvelgiant į taikomą analizės metodą turi būti atliekami vienas arba du bandymai. Kai yra pakankamai specifiniai tiesioginės polimerų komponentų analizės vandeninėje terpėje metodai, turėtų pakakti vieno anksčiau aprašyto bandymo. Tačiau kai tokių metodų nėra, o polimero tirpimo (ekstrahavimo) nustatymas apribotas tik netiesiogine analize, vandeniniame ekstrakte nustatant tik bendrosios organinės anglies kiekį (BOA), turi būti atliktas papildomas bandymas. Be to, šis papildomas bandymas turi būti atliekamas tris kartus, naudojant 10 kartų mažesnius polimero bandinius ir tuos pačius vandens kiekius, kurie buvo naudojami pirmajame bandyme.

1.5.4. Analizė

1.5.4.

1.5.4.1. Vieno dydžio bandinio analizė Gali būti tiesioginės polimero komponentų analizės vandeninėje terpėje metodai. Kaip alternatyvą galima būtų svarstyti galimybę netiesiogiai analizuoti ištirpintų (ekstrahuotų) polimerų komponentus, nustatant bendrąjį tirpiųjų dalių kiekį ir darant pataisas dėl polimerams nebūdingų komponentų buvimo. Analizė vandeninėje fazėje visų polimerinių medžiagų bendrajam kiekiui nustatyti galima: jei taikomas pakankamai jautrus metodas, pvz.: arba atliekamas vandeninio ekstrakto garinimas vakuume iki sauso likučio ir jo spektrinė analizė (IR, UV ir t. t.) arba likučio AAS (ICP) analizė. Jei pačios vandeninės fazės analizė neįmanoma, vandeninis ekstraktas turi būti ekstrahuojamas organiniu tirpikliu, kuris nesimaišo su vandeniu, pvz., chlorintuoju angliavandeniliu. Tirpiklis vėliau išgarinamas, o likutis analizuojamas, kaip anksčiau nurodyta, polimero kiekiui nustatyti. Visų šio likučio komponentų, kurie identifikuojami kaip priemaišos arba priedai, kiekis turi būti atimtas, kad būtų galima nustatyti paties polimero tirpimo (ekstrahavimo) laipsnį. Kai tokių medžiagų kiekis yra gana didelis, likutį gali tekti analizuoti, pvz., HPLC (didelio efektyvumo skysčių chromatografijos) arba GPC (gelchromatografijos) metodais, kurių pagalba priemaišos būtų atskirtos nuo monomero ir jo darinių, kad būtų galima nustatyti tikrąjį pastarųjų medžiagų kiekį. Kai kuriais atvejais gal būt pakaktų tiesiog išgarinti organinį tirpiklį iki sauso likučio ir jį pasverti.

BOA nustatymas, taikant šlapią suardymą persulfatu arba dichromatu CO2 gauti, kurio kiekis įvertinamas IR arba cheminės analizės metodu,

atominė absorbcinė analizė (AAS) arba jos induktyviai sužadintos plazmos (ICP) emisijos atitikmuo silicio arba metalų turintiems polimerams nustatyti,

UV absorbcija arba spektrofluorimetrija arilų polimerams,

LC-MS (skysčių chromatografija – masių spektroskopija) mažos molekulinės masės bandiniams,

1.5.4.2. Bandymas su dviem skirtingo dydžio bandiniais Visuose vandeniniuose ekstraktuose atliekama BOA analizė. Neištirpusi bandinio dalis (likutis po ekstrahavimo) analizuojama gravimetriškai. Jei po kiekvieno indo turinio centrifugavimo arba filtravimo, polimero likučiai lieka ant indo sienelių, indas turi būti skalaujamas filtratu tol, kol inde nelieka jokių matomų likučių. Toliau filtratas vėl centrifuguojamas arba filtruojamas. Ant filtro arba centrifugavimo mėgintuvėlyje esantis likutis džiovinamas vakuume 40 oC temperatūroje ir sveriamas. Džiovinama tol, kol gaunama pastovi masė.

2. DUOMENYS

2.

2.1. BANDYMAS, ATLIKTAS NAUDOJANT VIENO DYDŽIO BANDINĮ Turi būti pateikti kiekvienai iš trijų kolbų gauti atskiri rezultatai ir jų vidutinės vertės, išreiškiant masės vienetais tirpalo tūriui (paprastai mg/1) arba masės vienetais polimero masei (paprastai mg/g). Taip pat papildomai turi būti pateiktas bandinio masės nuostolis (apskaičiuotas tirpinio masę dalinant iš pradinio bandinio masės). Turi būti apskaičiuoti variacijos koeficientai. Atskiri skaičiai turi būti pateikti visai medžiagai (polimeras + pagrindiniai priedai ir t. t.) ir tik polimerui (t. y. atimant tokių priedų indėlį).

2.2. BANDYMAS, ATLIKTAS NAUDOJANT DU SKIRTINGO DYDŽIO BANDINIUS Turi būti pateiktos atskiros BOA kiekio vandeniniuose ekstraktuose vertės, gautos dviejuose trigubuose bandymuose, ir kiekvieno bandymo vidutinė vertė, išreiškiant masės vienetais tirpalo tūriui (paprasta mgC/l), taip pat masės vienetais pradinio bandinio masei (paprastai mgC/g). Jei tarp rezultatų, gautų dideliam ir mažam bandinio masės bei vandens santykiui, skirtumo nėra, tai galėtų rodyti, kad visi ekstrahuojami komponentai buvo iš tikrųjų ekstrahuoti. Tokiu atveju, tiesioginė analizė paprastai nebūtina. Turi būti pateiktos likučių atskiros masės ir išreikštos pradinės bandinio masės procentais. Turi būti apskaičiuojamos bandyme gautos vidutinės vertės. Skirtumas tarp 100 ir nustatyto procentinio kiekio rodo tirpios ir ekstrahuojamos medžiagos procentinį kiekį pradiniame bandinyje.

3. ATASKAITA

3.

3.1. BANDYMŲ ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:

3.1.

3.1.1. Bandomoji medžiaga

turima informacija apie bandomąją medžiaga (identiškumas, priedai, priemaišos, mažos molekulinės masės medžiagų kiekis).

3.1.2. Bandymų sąlygos

naudotų metodikų ir bandymų sąlygų aprašymas,

analizės ir aptikimo metodų aprašymas.

3.1.3. Rezultatai

tirpumo (ekstahuojamumo) rezultatai, mg/1; atskiros ir vidutinės vertės ekstrahavimo bandymuose įvairiuose tirpaluose, suardyto polimero kiekis ir priemaišos, priedai ir t. t.,

tirpumo (ekstrahuojamumo) rezultatai mg/g polimero,

vandeninių ekstraktų BOA vertės, tirpalo masė ir apskaičiuotas kiekis procentais, jei matuotas,

kiekvieno bandinio pH,

informacija apie tuščiajame bandyme gautas vertes,

jei būtina, nuorodos į bandymo medžiagos nepatvarumą bandymo ir analizės eigoje,

visa informacija, kuri yra svarbi interpretuojant rezultatus.

4.1) NUORODOS DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

A.21. OKSIDUOJAMOSIOS SAVYBĖS (SKYSČIAI)

A.21.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Šis bandymų metodas skirtas matuoti skystosios medžiagos gebą padidinti degiosios medžiagos degimo greitį arba degimo intensyvumą arba sudaryti mišinį su degiąja medžiaga, kuris užsidega savaime, kai dvi medžiagos sumaišomos kartu. Jis yra pagrįstas JT bandymu, taikomu oksiduojamiesiems skysčiams (1), ir jį atitinka. Tačiau, kadangi šis A.21 metodas visų pirma rengiamas siekiant atitikti Direktyvos 67/548 reikalavimus, reikia lyginti tik su viena etalonine medžiaga. Bandymas ir lyginimas su papildomomis etaloninėmis medžiagomis gali būti reikalingas, kai bandymų rezultatus numatoma naudoti kitais tikslais. Šio bandymo daryti nereikia, kai tiriant struktūrinę formulę neabejotinai nustatoma, kad medžiaga negali egzotermiškai reaguoti su degiąja medžiaga. Prieš darant šį bandymą naudinga turėti išankstinės informacijos apie visas galimas medžiagos sprogiąsias savybes. Šis bandymas netaikomas kietosioms medžiagoms, dujoms, sprogiosioms ar labai degioms medžiagoms arba organiniams peroksidams. Šio bandymo galima nedaryti, jei bandomosios medžiagos rezultatai jau yra gauti darant JT oksiduojamųjų skysčių bandymą.

1.2. APIBRĖŽTYS IR VIENETAI Vidutinė slėgio didėjimo trukmė – išmatuoto bandomojo mišinio slėgio didėjimo, palyginti su atmosferos slėgiu, nuo 690 kPa iki 2070 kPa trukmės verčių vidurkis.

1.3. ETALONINĖ MEDŽIAGA Kaip etaloninė medžiaga naudojamas 65 % (m/m) vandeninis azoto rūgšties (analiziškai grynos) tirpalas. Be to, jei bandytojas numato, kad šio bandymo rezultatai gali būti naudojami kitais tikslais, pasirinktinai gali būti tikslinga naudoti papildomas etalonines medžiagas.

1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ Bandomasis skystis maišomas masių santykiu 1:1 su pluoštine celiulioze ir mišinys dedamas į slėginį indą. Jei maišant arba dedant įvyksta savaiminis užsidegimas, toliau bandymo daryti nereikia. Jei mišinys savaime neužsidega, daromas visas bandymas. Mišinys kaitinamas slėgio inde ir nustatomas vidutinis laikas, per kurį slėgis, palyginti su atmosferos slėgiu, padidėja nuo 690 kPa iki 2070 kPa. Šis padidėjęs slėgis lyginamas su vidutine etaloninės (-ių) medžiagos (-ų) ir celiuliozės santykio 1:1 mišinio slėgio didėjimo trukme.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Darant penkis vienos medžiagos bandymus, aritmetinis vidurkis ir atskiri rezultatai turi skirtis ne daugiau kaip 30 %. Rezultatai, kurie palyginti su vidurkiu skiriasi daugiau kaip 30 %, turi būti atmesti, maišymo ir pripildymo metodika patobulinta ir bandymas pakartotas.

1.6. METODO APRAŠYMAS

1.6.

1.6.1. Pasiruošimas

1.6.1.

1.6.1.1. Degioji medžiaga Kaip degioji medžiaga naudojama sausa pluoštinė celiuliozė, kurios plaušelių ilgis 50–250 μm, o vidutinis skersmuo – 25 μm. Ne didesnio kaip 25 mm storio celiuliozės sluoksnis 4 h džiovinamas iki pastoviosios masės esant 105 oC ir aušinamas bei prieš bandymą laikomas eksikatoriuje su džiovikliu. Vandens kiekis išdžiovintoje celiuliozėje turi būti mažesnis kaip 0,5 % sausos medžiagos masės. Prireikus džiovinimo trukmė turi būti padidinta tokiam drėgmės kiekiui pasiekti. Viso bandymo metu turi būti naudojama ta pati celiuliozės siunta.

1.6.1.2. Aparatūra

1.6.1.2.

1.6.1.2.1. Slėginis indas Būtina turėti slėginį indą. Slėginį indą sudaro 89 mm ilgio ir 60 mm išorinio skersmens plieninis cilindras (žr. 1 paveikslą). Staklėmis gaminamos dvi plokštelės priešingiems cilindro galams (sumažinančios skerspjūvį iki 50 mm), kurios padėtų įtvirtinti cilindrą, įstatant uždegimo žvakę ir ventiliavimo angos aklidangtį. Indas su 20 mm skersmens anga iš abiejų galų viduje platinamas iki 19 mm gylio ir sriegiamas 1 Britų standarto vamzdinis sriegis arba jo metrinis atitikmuo. Slėgio mažinimo atvamzdis įsriegiamas į kreivąjį slėginio indo paviršių 35 mm nuo vieno galo ir 90o kampu ištekintoms plokštelėms. Gręžiama 12 mm gylio anga, kurioje daromas sriegis įsukti atvamzdžiui, turinčiam Britų standarto vamzdinį (arba jo metrinio atitikmens) sriegį. Prireikus įstatomas inertinės medžiagos sandariklis hermetiškumui užtikrinti. Atvamzdžio ilgis, matuojant nuo slėginio indo korpuso, lygus 55 mm, jame išgręžiama 6 mm skersmens anga. Atvamzdžio galas platinamas ir įsriegiamas diafragminio tipo slėgio keitliui įsukti. Galima naudoti bet kurį slėgio matavimo įtaisą, kurio neveiktų karštos dujos arba skilimo produktai ir kuris galėtų matuoti slėgio didėjimo greitį nuo 690 iki 2070 kPa ne ilgiau kaip per 5 ms. Į tolesnį nuo atvamzdžio slėginio indo galą įsukama uždegimo žvakė, turinti du elektrodus, vieną izoliuotą nuo korpuso, o kitą įžemintą žvakės korpuse. Į kitą slėginio indo galą įstatoma trūkioji membrana (trūkimo slėgis maždaug 2200 kPa), kurią laiko kamštis su 20 mm anga. Prireikus uždegimo žvakė sandarinama inertinės medžiagos sandarikliu hermetiškumui užtikrinti. Visą sąranka tvirtinama laikančiajame stove naudojimui tinkamame aukštyje (2 paveikslas). Stovą paprastai sudaro mažaanglio plieno pagrindo plokštė, kurios matmenys yra 235 mm × 184 mm × 6 mm, ir 185 mm ilgio kvadratinė tuščiavidurė sekcija, kurios matmenys – 70 mm × 70 mm × 4 mm. Vienas kvadratinės tuščiavidurės sekcijos galas nupjaunamas iš abiejų priešingų šonų dviem plokščiabriaunėms 86 mm ilgio kojoms gauti. Šių plokščiųjų šonų galai nupjaunami 60o horizontalės atžvilgiu ir privirinami prie pagrindo plokštės. Viename viršutinio galo šone išpjaunama 22 mm pločio ir 46 mm gylio išdroža, į kurią įsistato slėginio indo atvamzdis, kai visa slėginio indo sąranka uždegimo žvake žemyn nuleidžiama į laikantįjį stovą. Prie žemesnės tuščiavidurės sekcijos sienos iš vidaus privirinamas 30 mm pločio ir 6 mm storio plieninis fiksatorius. Priešingoje sienoje įsriegiamos angos dviem 7 mm ilgio sparnuotiesiems varžtams, kurie neleistų slėginiam indui judėti. Slėginiam indui laikyti iš apačios prie šoninių sienų privirinamos dvi 12 mm pločio ir 6 mm storio plieninės juostos, įremtos į tuščiavidurės sekcijos pagrindą.

1.6.1.2.2. Uždegimo sistema Uždegimo sistemą sudaro 25 cm ilgio ir 0,6 mm skersmens Ni/Cr viela, kurios savitoji varža yra 3,85 Ω/m. Viela susukama į apviją naudojant 5 mm skersmens strypą ir tvirtinama prie uždegimo žvakės elektrodų. Apvijos konfigūracija turi atitikti vieną iš pavaizduotų 3 paveiksle. Atstumas nuo slėginio indo dugno iki apatinės uždegimo apvijos pusės turi būti 20 mm. Jei elektrodų ilgis nereguliuojamas, uždegimo vielos galai nuo apvijos iki slėginio indo dugno turi būti izoliuoti keraminiu apvalkalu. Viela kaitinama naudojant stabilizuotos įtampos srovės šaltinį, kuris galėtų tiekti mažiausiai 10 A stiprumo srovę.

1.6.2. Bandymo eiga Aparatas su slėgio keitliu ir kaitinimo sistema, bet be trūkiosios membranos, tvirtinamas stove uždegimo žvake žemyn. Cheminėje stiklinėje stikline lazdele sumaišoma 2,5 g bandomojo skysčio ir 2,5 g išdžiovintos celiuliozės. Saugai užtikrinti, maišant tarp operatoriaus ir mišinio turi būti saugos skydas. Jei mišinys užsidega maišant arba pilant į indą, toliau bandyti nereikia. Mišinį reikia dėti į slėginį indą mažomis dalimis tapšnojant ir užtikrinti, kad jis būtų dedamas apie uždegimo apviją ir gerai su ja liestųsi. Svarbu kad dedant mišinį apvija nebūtų deformuota, kadangi dėl to gali būti gauti klaidingi rezultatai. Trūkioji membrana dedama į vietą ir gerai užsukamas tvirtinimo kamštis. Indas su įkrova trūkiąja membrana į viršų įstatomas į laikantįjį stovą, kuris turi būti statomas tinkamoje šarvuotoje traukos spintoje arba deginimo kameroje. Prie uždegimo žvakės kontaktų jungiamas maitinimo šaltinis ir įjungiama 10 A srovė. Laikas nuo maišymo pradžios iki maitinimo įjungimo turi būti ne didesnis kaip 10 min. Slėgio keitliu gautas signalas užrašomas tinkama sistema, kuri leistų gauti nepertraukiamą laiko slėgio kitimo laike kreivę ir kartu ją analizuoti (pvz., pereinamųjų vyksmų sąvirašis, sujungtas su diagramų sąvirašiu). Mišinys kaitinamas tol, kol plyšta trūkioji membrana, arba bent 60 s. Jei trūkioji membrana neplyšta, mišinys paliekamas aušti prieš jį atsargiai atidarant, imantis atsargumo priemonių, jei slėginiame inde dar būtų per didelis slėgis. Medžiaga ir kiekviena etaloninė medžiaga bandoma penkis kartus. Užrašomas laikas, per kurį slėgis padidėja nuo 690 kPa iki 2070 kPa virš atmosferos slėgio. Apskaičiuojama vidutinė slėgio didėjimo trukmė. Kartais medžiagos gali sukelti slėgio didėjimą (per didelį arba per mažą), kurio priežastis cheminės reakcijos, neapibūdinančios medžiagos oksiduojamųjų savybių. Tokiais atvejais norint nustatyti reakcijos tipą, bandymą gali tekti kartoti, vietoj celiuliozės naudojant inertinę medžiagą, pvz., diatomitą.

2. DUOMENYS Bandomosios medžiagos ir etaloninės (-ių) medžiagos (-ų) slėgio didėjimo trukmės vertės. Bandymų su inertine medžiaga slėgio didėjimo trukmės vertės, jei tokie bandymai daromi.

2. 2.1. 1 lentelė Rezultatų pavyzdžiai

REZULTATŲ APDOROJIMAS Apskaičiuojamos bandomosios medžiagos ir etaloninės (-ių) medžiagos (-ų) vidutinės slėgio didėjimo trukmės vertės. Apskaičiuojama bandymų su inertine medžiaga slėgio didėjimo trukmės vertė, jei tokie bandymai daromi. Kai kurie rezultatų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje Medžiaga 1:1 mišinio su celiulioze vidutinė slėgio didėjimo trukmė (ms) Amonio dichromatas, sotusis vandeninis tirpalas 20800 Kalcio nitratas, sotusis vandeninis tirpalas 6700 Geležies (III) nitratas, sotusis vandeninis tirpalas 4133 Ličio perchloratas, sotusis vandeninis tirpalas 1686 Magnio perchloratas, sotusis vandeninis tirpalas 777 Nikelio nitratas, sotusis vandeninis tirpalas 6250 Azoto rūgštis, 65 % 4767 Perchlorato rūgštis, 50 % 121 Perchlorato rūgštis, 55 % 59 Kalio nitratas, 30 % vandeninis tirpalas 26690 Sidabro nitratas, sotusis vandeninis tirpalas Natrio chloratas, 40 % vandeninis tirpalas 2555 Natrio nitratas, 45 % vandeninis tirpalas 4133 Inertinė medžiaga Vanduo: celiuliozė

3. ATASKAITA

3.

3.1. BANDYMŲ ATASKAITA Bandymų ataskaitoje pateikiama ši informacija:

bandomosios medžiagos identiškumas, sudėtis, grynumas ir kitos savybės,

bandomosios medžiagos koncentracija,

naudojamos celiuliozės džiovinimo metodika,

drėgmės kiekis naudojamoje celiuliozėje,

matavimų rezultatai,

inertinės medžiagos bandymų rezultatai, jei yra,

apskaičiuotosios vidutinės slėgio didėjimo trukmės vertės,

visi nukrypimai nuo šio metodo ir jų pagrįstumas,

visa papildoma informacija arba pastabos rezultatams interpretuoti.

3.2. REZULTATŲ AIŠKINIMAS Bandymų rezultatai įvertinti: Skystoji medžiaga turi būti laikoma oksidatoriumi, kai: Siekiant išvengti klaidingų teigiamų rezultatų, interpretuojant juos reikėtų atsižvelgti į rezultatus, gautus bandant medžiagą su inertine medžiaga.

3.2. a)

pagal tai, ar bandomosios medžiagos ir celiuliozės mišinys užsidega savaime; ir

lyginant medžiagos ir etaloninės (-ių) medžiagos (-ų) vidutinę slėgio didėjimo nuo 690 kPa iki 2070 kPa trukmę.

medžiagos ir celiuliozės santykio 1:1 mišinys, masės dalimis, užsidega savaime; arba

medžiagos ir celiuliozės santykio 1:1 mišinio, masės dalimis, vidutinė slėgio didėjimo trukmė yra mažesnė arba lygi 65 % (m/m) vandeninio azoto rūgšties tirpalo ir celiuliozės santykio 1:1 mišinio, masės dalimis, vidutinei slėgio didėjimo trukmei.

4. NUORODOS Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids. Pastaba: galima naudoti bet kurią iš šių schemų.

4. 1 paveikslas Slėginis indas

(A) Slėginio indo korpusas (B) Trūkiosios membranos tvirtinimo kamštis (C) Uždegimo žvakė (D) Minkštas švininis tarpiklis (E) Trūkioji membrana (F) Atvamzdis (G) Slėgio keitlio galvutė (H) Tarpiklis (J) Izoliuotas elektrodas (K) Įžemintas elektrodas (L) Izoliacija (M) Plieninis kūgis (N) Tarpiklio deformavimo griovelis

2 paveikslas Laikantysis stovas

3 paveikslas Uždegimo sistema

(A) Uždegimo apvija (B) Izoliacija (C) Elektrodai (D) Uždegimo žvakė

Priedėlis Papildomos techninės informacijos, pavyzdžiui, galima ieškoti šiuose standartuose.

1. Kapiliariniai metodai

1.

1.1. Lydymosi temperatūros nustatymo prietaisai su skysčių vonia ASM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 46-34 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schnelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products.

1.2. Lydymosi temperatūros nustatymo prietaisai su metaliniu bloku DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmeltztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics- polyamides -determination of melting point

2. Karštosios stadijos

2.

2.1. Kofler karštasis strypas ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Lydymosi temperatūros mikroskopas DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmeltztemperatur von eilkristallinen Kunststoffen.

2.3. Menisko metodas (poliamidai) ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Resines de poliamides. Determination du point de fusion metode du menisque

3. Užšalimo temperatūros nustatymo metodai BS 4633 Method for determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmun des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de petrole: determination de la temperature de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsauren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Metode de determination du point de cristallisation (point de congelation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Terminė analizė

4.

4.1. Diferencinė terminė analizė ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differencial thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Skystėjimo temperatūros nustatymas ASTM D 97-66 Echantillonnage et analyse des produits du ASTM D 97-66 Standard tes methos for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour point

Priedėlis Papildomos techninės informacijos, pavyzdžiui, galima ieškoti šiuose standartuose.

1. Ebulioskopas ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Distiliavimo procesas (virimo intervalas) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for determination of distillation characteristics DIN 53171 Losungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Diferencinė terminė analizė ir diferencinė skenuojamoji kalorimetrija ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-8 Standard practice for reporting thermaanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe

Priedėlis Papildomos techninės informacijos, pavyzdžiui, galima ieškoti šiuose standartuose:

1. Klampumo metodai

1.

1.1. Areometras DIN 12790, ISO 387 Areometras; bendrosios instrukcijos DIN 12791 I dalis. Tankio areometrai; konstrukcija II dalis. Tankio areometrai; standartizuoti matmenys, paskirtis III dalis. Naudojimas ir tyrimas ISO 649-2 Laboratoriniai stikliniai indai. Bendros paskirties tankio areometrai NF T 20-050 Cheminiai produktai pramoniniam naudojimui. Skysčių tankio Nustatymas. Areometrinis metodas DIN 12793 Laboratoriniai stikliniai indai: intervalo nustatymo areometrai

1.2. Hidrostatinė pusiausvyra

1.2. Kietosioms medžiagoms

ISO 1183 A metodas. Plastikų tankio ir santykinio tankio nustatymo metodai, išskyrus akytųjų plastikų NF T 20-049 Cheminiai produktai pramoniniam naudojimui. Kietųjų kūnų, išskyrus miltelių ir akytųjų medžiagų, tankio nustatymas. Hidrostatinės pusiausvyros metodas ASTM-D-792 Plastmasių savitasis sunkis ir tankis DIN 53479 Plastmasių ir elastinių medžiagų tyrimas; tankio nustatymas

Skystosioms medžiagoms

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Mineralinių alyvų ir susijusių medžiagų tyrimas; tankio nustatymas ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 ir ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Nevalytos naftos ir skystų naftos produktų tankio, savitojo sunkio arba API sunkio nustatymas areometrijos metodu BS 4714 Nevalytos naftos ir skystų naftos produktų tankio, savitojo sunkio arba API sunkio nustatymas areometrijos metodu

1.3. Panardintų kūnų metodas DIN 53217 Dažų, lakų ir panašių dengiančiųjų medžiagų tyrimas; tankio nustatymas; panardintų kūnų metodas

2. Piknometrijos metodai

2.

2.1. Skystosioms medžiagoms ISO 3507 Piknometrai ISO 758 Skystieji cheminiai produktai; tankio nustatymas 20 oC temperatūroje DIN 12797 Gay-Lussac piknometras (nelakiems skysčiams, kurie nėra per klampūs) DIN 12798 Lipkin piknometras (skysčiams, kurių kinematinė klampa mažesnė kaip 100 × 10-6 m2 s-1 15 oC temperatūroje) DIN 12800 Sprengel piknometras (skysčiams kaip DIN 12798) DIN 12801 Reischauer piknometras (skysčiams, kurių kinematinė klampa mažesnė kaip 100 × 10-6 m2 s-1 20 oC temperatūroje, taip pat taikoma angliavandeniams ir vandens tirpalams su aukštesniu garų slėgiu, apytiksliai 1 baras 90 oC temperatūroje) DIN 12806 Hubbard piknometras (visų rūšių klampiems skysčiams, kurių slėgis nėra per aukštas, ypač dažams, lakui ir bitumui) DIN 12807 Bingham piknometras (skysčiams, kaip DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes piknometras (ypač etanoliui ir vandens tirpalui) DIN 12809 Piknometras su pagrindiniu termometru ir kapiliariniu vamzdeliu (skysčiams, kurie nėra per klampūs) DIN 53217 Dažų, lakų ir panašių produktų tyrimas; tankio nustatymas piknometru DIN 51757 7 punktas. Mineralinių alyvų ir susijusių medžiagų tyrimas; tankio nustatymas ASTM D 297 15 skirsnis. Gumos produktai – cheminė analizė ASTM D 2111 C metodas. Halogenizuoti organiniai junginiai BS 4699 Naftos produktų savitojo sunkio ir tankio nustatymo metodas (graduoto bikapiliarinio piknometro metodas) BS 5903 Naftos produktų santykinio tankio ir tankio nustatymo metodas kapiliariniu – užkimštu piknometru NF T 20-053 Cheminiai produktai pramoniniam naudojimui. Milteliuose ir skysčiuose esančių kietųjų dalelių tankio nustatymas

2.2. Kietosioms medžiagoms ISO 1183 B metodas. Plastikų, išskyrus akytųjų, tankio ir santykinio tankionustatymo metodai NF T 20-053 Cheminiai produktai pramoniniam naudojimui. Milteliuose ir skysčiuose esančių kietųjų dalelių tankio nustatymas. Piknometro metodas DIN 19683 Dirvožemių tankio nustatymas

3. Oro palyginimo piknometras DIN 55990 3 dalis: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; chlorhaltige Polymere; Prüfung

1 priedėlis Apskaičiavimų metodas ĮVADAS

Apskaičiuotosios garų slėgio vertės gali būti naudojamos:

nusprendžiant, kuris eksperimentinis metodas tinkamas,

pateikiant apskaičiavimus arba ribinę vertę tais atvejais, kai eksperimentinio metodo negalima taikyti dėl techninių priežasčių (taip pat ir kai garų slėgis labai žemas),

padėti nustatyti tuos atvejus, kai pagrįstai neatliekami eksperimentiniai matavimai, kadangi aplinkos temperatūroje garų slėgis gali būti < 10-5 Pa.

APSKAIČIAVIMO METODAS

Skystųjų ir kietųjų kūnų garų slėgis gali būti apskaičiuojamas naudojant pakeistą Watson koreliaciją (a). Vieninteliai reikalingi eksperimentiniai duomenys – tai normali virimo temperatūra. Metodas turi būti taikomas visame slėgių intervale nuo 105 Pa iki 10-5 Pa. Išsami informacija apie metodą pateikta leidinyje Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b).

APSKAIČIAVIMŲ TVARKA

Pagal b nuorodą garų slėgis apskaičiuojamas taip: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb kai: T = norima temperatūra Tb = normali virimo temperatūra Pvp = garų slėgis temperatūroje T ΔHvb = garinimo šiluma ΔZb = spūdumo koeficientas (apskaičiuotas esant 0,97) m = empirinis koeficientas, priklausantis nuo fizikinės būsenos norimoje Toliau Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb kai KF – empirinis koeficientas atsižvelgiant į medžiagos poliškumą. Kelių junginių rūšims KF koeficientai yra išvardyti b nuorodoje. Gana dažnai galima gauti duomenis, kur virimo temperatūra pateikiama sumažintame slėgyje. Tokiu atveju pagal b nuorodą garų slėgis apskaičiuojamas taip: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 kai T1 – virimo temperatūra sumažintame slėgyje P1.

ATASKAITA

Naudojant apskaičiavimo metodą ataskaitoje pateikiama išsami apskaičiavimų dokumentacija.

LITERATŪRA

a)

K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, p. 398.

b)

W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

2 priedėlis

1 paveikslas Garų slėgio kreivės nustatymo pagal dinaminį metodą aparatūra

1 = Termoelementas 2 = Vakuumo buferinis tūris 3 = Manometras 4 = Vakuumas 5 = Matavimo taškas 6 = Šildymo elementas circa 150 W

2a paveikslas Garų slėgio kreivės nustatymo pagal statinį metodą (naudojant U formos manometrą) aparatūra

1. Mėginys 2. Garų fazė 3. Didelio vakuumo vožtuvas 4. U formos (papildomas) manometras 5. Manometras 6. Vonia su nustatoma temperatūra 7. Temperatūros matavimo prietaisas 8. Į vakuumo siurblį 9. Ventiliacija

2b paveikslas Garų slėgio kreivės nustatymo pagal statinį metodą (naudojant slėgio indikatorių) aparatūra

1. Mėginys 2. Garų fazė 3. Didelio vakuumo vožiuvas 4. Slėgio matuoklis 5. Slėgio indikatorius 6. Vonia su nustatoma temperatūra 7. Temperatūros matavimo prietaisas

3 paveikslas Izoteniskopas (žr. 7 nuorodą)

1. Į slėgio kontrolės ir matavimo sistemą 2. 8 mm OD vamzdelis 3. Sausas azotas slėgio sistemoje 4. Mėginio garai 5. Mažas antgalis 6. Skystas mėginys

4 paveikslas Garų slėgio kreivės nustatymo pagal garų slėgio pusiausvyros metodą aparatūra

1. Mėginys 2. Garų fazė su garų srove 3. Garinimo krosnis su sukamąja įsiurbimo anga; 3a. Krosnies dangtis su anga 4. Krosnies šildymas (šaldymas) 5. Mėginio temperatūros matavimas 6. Šaldymo dėžė 7. Gaubtas 8. Saldymo dėžės šaldymo strypas 9. Svarstyklių lėkštė 10. Mikrosvarstyklės 11. Į savirašį 12. Į didelio vakuumo siurblį

5 paveikslas Aparatūros garinimui žemame slėgyje efuzijos metodu, efuzijos elemento tūris 8 cm3, pavyzdys

1 Jungtis su vakuumu 2 Ertmės platinos varžiniams termometrams arba temperatūrai matuoti bei kontroliuoti (2) 3 Vakuumo rezervuaro dangtis 4 O formos žiedas 5 Aliumininis vakuumo rezervuaras 6 Prietaisas efuzijos elementams įtaisyti ir išimti 7 Įsriegiamas dangtis 8 Sparnuotosios veržlės (6) 9 Varžtai (6) 10 Nerūdijančio plieno efuzijos elementai 11 Kaitinimo elementai (6)

6a paveikslas Srauto sistemos pavyzdys garų slėgiui nustatyti dujų soties metodu

Vent Monfold 1 = Srauto reguliatorius 2 = Šilumokaitis 3 = Adatiniai vožtuvai 4 = Santykinio drėgniojutiklis 5 = Soties kolonėlės 6 = PTFE jungtys 7 = Debitmatis 8 = Gaudyklė (absorberis) 9 = Alyvos gaudyklė 10 = Frituotasis barboteris

6b paveikslas Garų slėgo nustatymo dujų soties metodu pavyzdys su kapiliariniu vamzdeliu, įtaisytu už įsotinimo kameros sistemos

1. Terminis masės debitmatis 2. Manometras 3. Kamera su kontroliuojama temperatūra 4. Nešančiųjų dujų ritė, nustatanti temperatūrą 5. Termometras (Pt 100) 6. Dujų įsotinimo kamera 7. Kapiliarinis vamzdelis 8. Absorbcijos indai 9. Dujomatis 10. Šaltoji gaudyklė

7 paveikslas Eksperimentinės įrangos pavyzdys sukamojo rotoriaus metodui

Garų slėgio aparatas A. Sukamojo rotoriaus jutiklio galvutė; B. Mėginio elementas; C. Termostatas; D. Vakuumo linija (turbosiurblys); E. Oro termostatas.

8 paveikslas Sukamojo rotoriaus matavimo galvutės pavyzdys

1. Rutuliukas; 2. 6 išsiurbtas vamzdinis ilgintuvas; 3. Nuolatiniai magnetai (2); 4. Ritės (2) vertikaliai stabilizacijai; 5. Varančiosios ritės (4); 6. Jungiamasis tarpiklis.

Priedėlis

1 paveikslas Kolonėlės eliuavimo metodas su recirkuliaciniu siurbliu

Atmosferinis pusiausvirinimas Debitmatis Mikrokolonėlė Termostatu kontroliuojamas cirkuliacinis siurblys Recirkuliacinis siurblys Dvipusis vožtuvas

2 paveikslas Tipiška mikrokolonėlė

(Visi matmenys pateikti milimetrais) (matinio stiklo jungties prijungimas) Viršerdvė Vidinė dalis 5 Išorinė dalis 19 Stiklinės vatos kaištis Dvieigis uždaromasis čiaupas

3 paveikslas Tipiška mikrokolonėlė

(Visi matmenys pateikti milimetrais) Matinio stiklo jungties prijungimas Viršerdvė Vidinė dalis 5 Išorinė dalis 19 Uždaromasis čiaupas

4 paveikslas Kolonėlės eliuavimo metodas su išlyginamuoju indu

1 = Išlyginamasis indas (pvz., 2,5 litrų kolba) 2 = Kolonėlė (žr. 3 pav.) 3 = Frakcijos rinktuvas 4 = Termostatas 5 = Teflono vamzdeliai 6 = Matinio stiklo jungtis 7 = Vamzdelis vandeniui (tarp termostato ir kolonėlės, vidinis skersmuo: apie 8 mm).

1 priedėlis Apskaičiavimo (vertinimo) metodai ĮVADAS

Apskaičiavimo metodų, duomenų ir pavyzdžių bendrasis įvadas pateiktas Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). Apskaičiuotosios Pow vertės gali būti naudojamos:

spręsti apie eksperimentinių metodų tinkamumą (kratomos kolbos metodo intervalas: log Pow vertės nuo 2 iki 4, HPLC intervalas: log Pow: nuo 0 iki 6),

bandymo tinkamoms sąlygoms parinkti (pvz., etalonines medžiagas HPLC metodikose, n-oktanolio ir vandens tūrių santykį kratomos kolbos metode),

galimų eksperimentinių paklaidų laboratorijos vidinės kontrolės priemone,

Pow įverčiui gauti tais atvejais, kai eksperimentiniai metodai negali būti taikomi dėl techninių priežasčių.

VERTINIMO METODAS

Išankstinis pasiskirstymo koeficiento įvertis

Pasiskirstymo koeficientas gali būti įvertintas, naudojant bandomosios medžiagos tirpumo grynuose tirpikliuose vertes: Taigi: Pestimate = saturation cn-octanolsaturation cwater

APSKAIČIAVIMO METODAI

Apskaičiavimo metodų esmė

Visi apskaičiavimo metodai remiasi formaliuoju molekulės dalinimu į atitinkamas mažesnes struktūras, kurių log Pow tikrieji pokyčiai yra žinomi. Tuomet visos molekulės log Pow apskaičiuojamas kaip atitinkamų dalių verčių suma pridedant pataisos dėl sąveikų molekulės viduje dėmenų sumą. Dalių konstantų ir pataisos dėmenų sąrašus galima rasti (b), (c), (d), (e). Kai kurie sąrašai yra nuolat atnaujinami (b).

Kokybės kriterijai

Paprastai apskaičiavimo metodo patikimumas mažėja kuo sudėtingesnė junginio sandara. Paprastų molekulių, turinčių mažą molekulinę masę ir vieną arba dvi funkcines grupes, atveju, tarp įvairiais fragmentavimo metodais gautų rezultatų ir išmatuotos vertės galima laukti 0,1 - 0,3 log Pow vieneto nuokrypio. Sudėtingesnių molekulių atveju paklaidos ribos gali būti didesnės. Tai priklauso nuo fragmentų konstantų patikimumo ir jų buvimo, taip pat nuo sugebėjimo įvertinti intramolekulines sąveikas (pvz., vandenilio jungtis) ir pataisos dėmenų teisingo naudojimo (mažiau problemų turint kompiuterinę programą CLOGP-3) (b). Joninių junginių atveju svarbu teisingai įvertinti krūvį arba jonizacijos laipsnį.

Apskaičiavimo metodai Hansch π-metodas

Pradinė hidrofobinio pakaito darinio konstanta, π, įvesta Fujira et al. (f) apibrėžiama taip: πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH) kai: Pow (PhX) aromatinio darinio pasiskirstymo koeficientas ir Pow (PhH) pradinio junginio pasiskirstymo koeficientas (pvz., pCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84-2,13 = 0,71). Pagal jo apibrėžimą π metodas labiausiai taikytinas pakaitų aromatiniame žiede atveju, π vertės didelei daliai pakaitų yra pateiktos lentelėse (b), (c), (d). Jos taikomos apskaičiuoti aromatinių molekulių arba aromatinių struktūrinių fragmentų log Pow.

Rekker metodas

Pagal Rekker (g) log Pow vertė apskaičiuojama taip: log Pow=Σi ai fi+Σj (sąveikos dėmenų) kai fi atstovauja įvairių molekulės fragmentų konstantoms ir ai – jų pasikartojimo dažnį tiriamoje molekulėje. Pataisos dėmenys gali būti išreikšti kaip vienos atskiros Cm, (vadinamosios magiškosios konstantos) sveikasis kartotinis. Fragmentų konstantos fi ir Cm buvo nustatytos iš 1054 eksperimentinių Pow verčių sąrašo (825 junginiai), naudojant daugianarę regresinę analizę (c), (h). Sąveikos dėmenų nustatymas atliekamas pagal nustatytas taisykles, kurios aprašytos literatūroje (e), (h), (i).

Hansch-Leo metodas

Pagal Hansch ir Leo (c) log Pow vertė apskaičiuojama taip: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj kai fi atstovauja įvairių molekulės fragmentų konstantoms, F – pataisos dėmenis ir ai, bj – atitinkamus pasikartojimo dažnius. Atomų ir grupių fragmentinių verčių sąrašas ir pataisos dėmenų fi (vadinamųjų faktorių) sąrašas buvo nustatyti bandymų ir klaidų metodu, naudojant eksperimentines Pow vertes. Pataisos dėmenys buvo suskirstyti į keletą skirtingų klasių (a), (c). Atsižvelgti į visas taisykles ir pataisos dėmenis yra gana sudėtinga ir reikalauja daug laiko. Yra sukurti programų paketai (b).

Kombinuotasis metodas

Sudėtinių molekulių log Pow apskaičiavimas gali būti iš esmės pagerintas, jei molekulė dalinama į didesnes struktūrines dalis, kurių log Pow patikimos vertės randamos lentelėse (b), (c) arba gaunamos naudojant pačių atliktus matavimus. Vėliau tokie fragmentai (pvz., heterociklai, antrachinonas, azobenzenas) gali būti derinami Hansch π-vertėmis arba su Rekker arba Leo fragmentų konstantomis.

Pastabos i)

Apskaičiavimo metodai gali būti taikomi tik iš dalies arba visiškai jonizuotiems junginiams, jei įmanoma atsižvelgti į būtinuosius pataisos faktorius.

ii)

Jei gali būti padaryta prielaida apie tarpmolekulinių vandenilinių jungčių buvimą, turi būti pridedami atitinkami pataisos dėmenys (maždaug nuo +0,6 iki +1,0 log Pow vieneto) (a). Tokių ryšių buvimo požymiai gali būti gauti naudojant molekulės erdvinius modelius arba spektroskopinius duomenis.

iii)

Jei galimos kelios tautomerinės formos, apskaičiavimai turi remtis pačia patikimiausia forma.

iv)

Būtina kruopščiai sekti fragmentų konstantų sąrašų pataisas.

Ataskaita

Taikant apskaičiavimo (vertinimo) metodus, bandymų ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti tokia informacija:

medžiagos aprašymas (mišinys, priemaišos ir t. t.),

kokio nors galimo intramolekulinio vandenilinio ryšio, disociacijos, krūvio ir visų kitų neįprastų veiksnių (pvz., tautomerijos) požymiai,

apskaičiavimo metodo aprašymas,

duomenų bazės identifikavimas arba šaltinis,

ypatumai pasirenkant fragmentus,

išsamus apskaičiavimo dokumentavimas.

NUORODOS

a)

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

b)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

c)

C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

d)

Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

e)

R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. -Chill. Ther. 1979, vol. 14, 479.

f)

T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.

g)

R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977,vol.1.

h)

C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,1459.

i)

R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

2 priedėlis Etaloninės medžiagos, rekomenduojamos naudoti taikant HPLC (high power liquid chromatography) – efektyviąją skysčių chromatografiją

Nr. Etaloninė medžiaga Log Pow pKa 1 2-butanonas 0,3 2 4-acetilpiridinas 0,5 3 Anilinas 0,9 4 N-fenilacetamidas 1,0 5 Benzilo alkoholis 1,1 6 p-metoksifenolis 1,3 pKa = 10,26 7 Feniloksiacto rūgštis 1,4 pKa = 3,12 8 Fenolis 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenolis 1,5 pKa = 3,96 10 Benznitrilas 1,6 11 Fenilacetonitrilas 1,6 12 4-metilbenzilo alkoholis 1,6 13 Acetofenonas 1,7 14 2-nitrofenolis 1,8 pKa = 7,17 15 3-nitrobenzenkarboninė rūgštis 1,8 pKa = 3,47 16 4-chloranilinas 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobenzenas 1,9 18 3-fenilpropen-2-olis 1,9 19 Benzenkarboninė rūgštis 1,9 pKa = 4,19 20 p-krezolis 1,9 pKa = 10,17 21 3-fenilakrilo rūgštis 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Metilfenileteris 2,1 23 Metibenzoatas 2,1 24 Benzenas 2,1 25 3-metilbenzenkarboninė rūgštis 2,4 pKa = 4,27 26 4-chlorfenolis 2,4 pKa = 9,1 27 Trichloretilenas 2,4 28 Atrazinas 2,6 29 Etilbenzoatas 2,6 30 2,6-dichlorbenznitrilas 2,6 31 3-chlorbenzenkarboninė rūgštis 2,7 pKa = 3,82 32 Toluenas 2,7 33 1-naftolis 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dichloranilinas 2,8 35 Chlorbenzenas 2,8 36 Alilfenileteris 2,9 37 Brombenzenas 3,0 38 Etilbenzenas 3,2 39 Benzofenonas 3,2 40 4-fenilfenolis 3,2 pKa = 9,54 41 Timolis 3,3 42 1,4-dichlorbenzenas 3,4 43 Difenilaminas 3,4 pKa = 0,79 44 Naftalinas 3,6 45 Fenilbenzoatas 3,6 46 [zopropilbenzenas 3,7 47 2,4,6-trichlorfenolis 3,7 pKa =6 48 Difenilas 4,0 49 Benzilbenzoatas 4,0 50 2,4-dinitro-6-(antr- butil)-fenolis 4,1 51 1,2,4-trichlorbenzenas 4,2 52 Dodekankarboninė rūgštis 4,2 53 Difenileteris 4,2 54 n-butilbenzenas 4,5 55 Fenantrenas 4,5 56 Fluorantenas 4,7 57 Dibenzilas 4,8 58 2,6-difenilpiridinas 4,9 59 Trifenilaminas 5,7 60 DDT [2,2,2-trichlor-1,1-bis-(p-chlorfenil)etanas] 6,2 Kitos mažą log Pow turinčios etaloninės medžiagos 1 Nikotino rūgštis -0,07

Priedėlis

Paveikslas Forma ir priedai krūvelei ruošti

(Visi matmenys milimetrais) Formos ilgis: 250 mm Medžiaga: aliuminis

Priedėlis

Paveikslas Aparatas

Priedėlis

Terminio jautrumo bandyme naudojamų medžiagų specifikacijos pavyzdys (žr. DIN 1623) 1)2)3)

Vamzdis: medžiagos specifikacija Nr. 1.0336.505 g Diafragma: medžiagos specifikacija Nr. 1.4873 Sandariklis su sriegiu ir veržlė: medžiagos specifikacija Nr. 1.3817

1 paveikslas Terminio jautrumo bandymo aparatas

(visi matmenys milimetrais) 1a pav. Plieninis vamzdi s ir priedai (1) vamzdis (1a) išorinė jungė (2) sandariklis su sriegiu; mažo trinties koeficiento sriegs (3) diafragma: skersmuo a = 2,0 arba 6,0 mm (4) veržlė b = 10 mm skersmuo (5) nuožulnus paviršius (6) 2 briaunos 41 dydžio raktui lb pav. Kaitinimo ir apsauginis įtaisas (7) 2 briaunos 36 dydžio raktui (8) skeveldroms atspari dėžė (9) 2 strypai vamzdžiui laikyti (10) surinktas vamzdis (11) užpakalinio degiklio padėtis, kiti degikliai matomi (12) tuščiosios eigos purkštukas

2 paveikslas Terminio jautrumo bandymas

(skeveldrų susidarymo pavyzdžiai) Sprogimas neįvyko Sprogimas neįvyko Sprogimas Sprogimas Sprogimas Sprogimas

3 paveikslas Kaitinimo spartos kalibravimas terminio jautrumo bandymui

Temperatūra (°C) Laikas (s) Temperatūros ir laiko priklausomybės kreivė gauta kaitinant dibutilftalatą (27 cm3) uždarame (1,5 mm diafragma) vamzdyje, naudojant propano 3,2 litro per minutę srautą. Temperatūra matuota 1 mm skersmens chromelio/aliumelio termoelementas, įdėtas į apvalkalą iš nerūdijančio plieno ir įstatytas vamzdžio viduryje 43 mm žemiau jo briaunos. Kaitinimo sparta 135 oC–285 oC temperatūroje turi būti nuo 185 iki 215 K/minutę.

4 paveikslas Jautrumo smūgiui bandymo aparatas

(visi matmenys milimetrais) (1) pagrindas, 450 × 450 × 60 (2) plieninis blokas, 230 × 250 × 200 (3) priekalas, 100 skersmuo × 70 (4) kolona (5) vidurinioji skersė (6) 2 kreipikliai (7) krumplinis stovas (8) graduotoji skalė (9) krintantis kūjis (tvoklė) (10) laikantysis ir paleidžiantysis įtaisas (11) nustatymo plokštė (12) tarpinis priekalas (keičiamas), 26 skersmuo × 26 (13) nustatymo žiedas su angomis (14) smūgiavimo įtaisas 4a pav. Krintantis kūjis, priekis ir šonas, bendras vaizdas 4b pav. Krintantis kūjis, apatinė dalis

4 paveikslo tąsa

4c pav. Smūgiavimo įtaisas miltelių arba pastos pavidalo medžiagoms (1) plieniniai cilindrai (2) plieninių cilindrų kreipiamasis žiedas (3) nustatymo žiedas su angomis (a) vertikalusis pjūvis (b) honzontalioji projekcija (4) guminis žiedas (5) skystoji medžiaga (40 mm3) (6) erdvė be skysčio 4e pav. Kūjis (kūjo masė 5 kg) (1) pakabos mova (2) aukščio žymeklis (3) padėties nustatymo griovelis (4) cilindrinė smūgiavimo galvutė (5) gaudyklė

5 paveikslas Jautrumo trinčiai bandyo aparatas

5a pav. Trinties aparatas, vertikalusis ir horizontalusis vaizdas (1) plieninis pagrindas (2) judamasis vežimėlis (3) porcelianinė plokštelė, 25 * 25 * 5 mm, dedama ant vežimėlio (4) nejudantis porcelianinis kaištis 10 mm skersmuo » 15mm (5) bandinys, apytikriai 10 mm3 (6) kaiščio laikiklis (7) apkrovos svirtis (8) atsvaras (9) jungiklis (10) ratas vežimėlio pradinei padėčiai nustatyti (11) Į elektrinės pavaros variklį 5b pav. Kaiščio ant bandinio pradinė padėtis

Priedėlis

Paveikslas Krūvelei ruošti naudojama forma ir priedai

(visi matmenys milimetrais) Formos ilgis: 250 mm Medžiaga: aliuminis

Priedas Kitų metodų polimerų skaitinei vidutinei molekulinei masei nustatyti pavyzdžiai

Gelchromatografija (GPC) yra labiausiai tinkamas būdas Mn nustatyti, ypač, jei yra rinkinys etalonų, kurių sandara yra panaši į polimero sandarą. Tačiau, jei norint taikyti GPC kyla praktinių sunkumų arba kai jau iš anksto tikimasi, kad medžiaga neatitiks Mn nustatyto kriterijaus (kas turi būti patvirtinta), yra alternatyvūs metodai, pvz.:

1.1.1.1.2.1.3.1.4.

Koligatyviųjų savybių naudojimas Ebulioskopija (krioskopija): matuojamas tirpiklio virimo temperatūros didėjimas (ebulioskopija) arba užšąlimo temperatūros mažėjimas (krioskopija), kai jame ištirpinama polimero. Metodas remiasi faktu, kad ištirpinto polimero įtaką virimo (užšalimo) temperatūros pokyčiui apsprendžia polimero molekulinė masė (1) (2). Taikomumas: Mn < 20000. Garų slėgio mažėjimas: matuojamas pasirinkto etaloninio skysčio garų slėgis prieš įdedant polimero ir po žinomų polimero kiekių pridėjimo (1) (2). Taikomumas: Mn < 20000 (teoriškai; tačiau praktikoje metodo reikšmė ribota). Membraninė osmometrija: remiasi osmoso principu, t. y. tirpiklio molekulių savaiminiu perėjimu per puslaidę membraną iš praskiesto tirpalo į koncentruotą tirpalą. Bandyme praskiesto tirpalo koncentracija yra nulinė, o koncentruotame tirpale yra polimero. Dėl tirpiklio siurbimo per membraną susidaro slėgių skirtumas, kurio dydis priklauso nuo polimero koncentracijos ir molekulinės masės (1) (3) (4). Taikomumas: Mn20000–200000 intervale. Osmometrija garų fazėje: gryno tirpiklio aerozolio garavimo greitis lyginamas su bent trijų aerozolių, turinčių skirtingos koncentracijos polimero, garavimo greičiu (1) (2) (4). Taikomumas: Mn < 20000.

2. Galinių grupių analizė Norint taikyti šį metodą, reikia žinoti bendrąją polimero sandarą ir jo galinių grupių (kurias nuo pagrindinės grandinės turi būti galima atskirti, pvz., taikant branduolių magnetinio rezonanso metodą arba titravimo (derivatizavimo) metodą) prigimtį. Pagal polimere esančių galinių grupių molekulinę koncentraciją gali būti nustatyta jo molekulinės masės vertė (7) (8) (9). Taikomumas: Mn iki 50000 (pasikliovimui mažėjant).

3.1)2)3)4)5)6)7)8)9)

Nuorodos Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York. Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, p. 25–52. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. SchrĖder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139–2146.

Priedas Nurodymai, kaip daryti mažos molekulinės masės medžiagos kiekio pataisas dėl netirpaus polimero buvimo

Kai bandinyje yra netirpaus polimero, GPC analizės metu prarandama masė. Netirpus polimeras negrįžtamai sulaikomas kolonėlėje arba ant bandinio filtro, o tirpioji bandinio dalis praeina per kolonėlę. Jei galima įvertinti arba išmatuoti polimero lūžio rodiklio pokytį (dn/dc), tai galima įvertinti kolonėlėje prarastą masę. Tokiu atveju pataisa daroma, naudojant išorinį kalibravimą žinomos koncentracijos etaloninėmis medžiagomis bei dn/dc refraktometro atsakui kalibruoti. Čia pateiktame pavyzdyje naudojamas polimetilmetakrilato (pMMA) etalonas. Norint akrilo polimerų analizėje atlikti išorinį kalibravimą, GPC metodu analizuojamas žinomos koncentracijos pMMA tirpalas tetrahidrofurane ir gauti duomenys naudojami refraktometro konstantai nustatyti pagal lygtį: K = R/(C × V × dn/dc), kurioje: K refraktometro konstanta (mikrovoltas iš sekundės mililitrui), R pMMA etalono atsakas (mikrovoltas iš sekundės), C pMMA etalono koncentracija (mg/ml), V injekcijos tūris (ml), ir dn/dc tetrahidrofurane ištirpinto pMMA lūžio rodiklio pokytis (ml/mg). Tipiniai pMMA etalono duomenys: R 2937 891, C 1,07 mg/ml, V 0,1 ml, dn/dc 9 × 10-5 ml/mg. Toliau gautoji K vertė 3,05 × 1011 naudojama apskaičiuoti teoriškam detektoriaus atsakui, jei pro detektorių butų išplauta 100 % įšvirkšto polimero kiekio.

B DALIS. TOKSIŠKUMO IR KITO POVEIKIO SVEIKATAI NUSTATYMO METODAI

BENDRASIS ĮVADAS A.

TIRIAMOSIOS MEDŽIAGOS APIBŪDINIMAS Tiriamosios medžiagos sudėtį, taip pat ir pagrindines priemaišas, bei jos svarbiausias fizines ir chemines savybes, tarp jų pastovumą, reikėtų žinoti dar prieš bet kokio toksikologinio tyrimo planavimą. Tiriamosios medžiagos fizinės ir cheminės savybės nulemia medžiagos patekimo kelio pasirinkimą, kai kurių tyrimo detalių planavimą, elgimąsi su medžiaga bei jos laikymą. Tiriamosios medžiagos (jeigu įmanoma ir pagrindinių priemaišų) dozuojamoje terpėje ar biologinėje medžiagoje nustatymo kokybinius ir kiekybinius analitinius metodus reikėtų parengti dar prieš tyrimą. Visa informacija susijusi su medžiagos nustatymu, fizikinėmis ir cheminėmis jos savybėmis, grynumu, tiriamosios medžiagos elgesiu reikėtų įtraukti į tyrimo ataskaitą.

GYVŪNŲ PRIEŽIŪRA Giežta aplinkos sąlygų kontrolė ir tinkama gyvūnų priežiūra yra būtini toksikologiniame tyrime.

i)

Laikymo sąlygos Eksperimentinių gyvūnų kambarių ar aptvarų aplinkos sąlygos turėtų būti tinkamos tiriamosioms rūšims. Žiurkėms, pelėms ir jūrų kiaulytėms kambario temperatūra turėtų būti 22 oC ± 3 oC, santykinis drėgnis nuo 30 iki 70 %; triušiams temperatūra turėtų būti 20 ± 3 oC, santykinis drėgnis nuo 30 iki 70 %. Kai eksperimentinė įranga yra ypač jautri temperatūros poveikiui, tiriamajame metode reikėtų aprašyti jai tinkamas sąlygas. Visuose toksinių poveikių tyrimuose temperatūra ir drėgnis turėtų būti stebimi, registruojami ir įtraukiami į tyrimo baigiamąją ataskaitą. Apšvietimas turi būti dirbtinis, šviesos režimas – 12 valandų šviesos/12 valandų tamsos. Apšvietimo detalės turėtų būti registruojamos ir įtraukiamos į baigiamąją tyrimo ataskaitą. Jei metode kitaip nenurodoma, gyvūnai gali būti laikomi po vieną arba tos pačios lyties individų grupėmis, tačiau viename narve neturėtų būti daugiau negu penki gyvūnai. Eksperimentų su gyvūnais ataskaitose svarbu nurodyti gyvūnų laikymo būdą bei jų skaičių viename narve medžiagos poveikio bei vėlesniu stebėjimo periodu.

ii)

Šėrimas Tyrimo metu gyvūnams duodami pašarai turi atitikti visus tos gyvūnų rūšies mitybos reikalavimus. Tais atvejais, kai tiriamoji medžiaga dedama į pašarus, jų galiojimo laikas turėtų būti sutrumpinamas dėl tiriamosios medžiagos sąveikos su pašaro sudedamosiomis dalimis. Į tokios reakcijos galimybę turėtų būti atsižvelgiama interpretuojant tyrimų rezultatus. Standartiniai laboratorinių gyvūnų pašarai turėtų būti duodami neribojant geriamo vandens kiekio. Pasirenkant minėtą poveikio metodą, pašaro turėtų būti duodama tiek, kad tai užtikrintų reikiamą tiriamosios medžiagos gaunamą kiekį. Maisto teršalai, kurie yra toksiški, neturėtų viršyti interferuojančių koncentracijų.

ALTERNATYVUS TYRIMAS Europos Sąjunga siekia vystyti ir tvirtinti alternatyvius metodus, kurie teiktų panašią informaciją kaip ir įprasti gyvūnų tyrimai, tačiau naudotų mažiau gyvūnų, sukeltų jiems mažiau skausmo arba visiškai išvengtų jų panaudojimo. Kai tik tokie metodai įsigalioja, juos privaloma taikyti rizikos įvertinimui, vėlesniam klasifikavimui ir kenksmingumo ženklinimui.

ĮVERTINIMAS IR INTERPRETACIJA Vertinant ir interpretuojant gyvūnų ir in vitro tyrimų rezultatus, reikia atsižvelgti į jų tiesioginės ekstrapoliacijos žmogui ribotumą, todėl gavus įrodymą apie medžiagos neigiamą poveikį žmonėms, tai turėtų patvirtinti gyvūnų tyrimų rezultatus.

LITERATŪROS ŠALTINIAI Dauguma šių metodų remiasi EBPO programos tyrimo Gairėmis ir turėtų būti atliekami pagal Geros laboratorinės praktikos principus, tam kad užtikrinti kuo didesnį duomenų pripažinimą. Papildomą informaciją galima būtų rasti EBPO gairėse ir bet kurioje tinkamoje spausdintoje literatūroje.

B.1 BIS. ŪMUS ORALINIS TOKSIŠKUMAS. FIKSUOTŲJŲ DOZIŲ METODAS

B.1 BIS.

1. METODAS Šis bandymų metodas atitinka OECD TG 420 (2001)

1.

1.1 ĮVADAS Taikant tradicinius metodus ūmaus toksiškumo poveikis įvertinamas pagal gyvūno žūtį. Britų toksikologų draugija (British Toxicology Society) 1984 m. pasiūlė naują ūmaus toksiškumo bandymo būdą, pagrįstą kelių fiksuoto dydžio dozių davimu (1). Taikant šį būdą išvengiama gyvūnų žūties, kuri būtų poveikio įrodymas; jis pagrįstas aiškių toksiškumo požymių pasireiškimu, kai iš dozių serijos duodama viena fiksuoto dydžio dozė. Pasibaigus JK (2) ir tarptautinio (3) tinkamumo patvirtinimo tyrimui in vivo, 1992 m. ši procedūra buvo patvirtinta kaip bandymo metodas. Vėliau, taikant matematinius modelius, daugelyje tyrimų buvo įvertintos statistinės fiksuotų dozių metodikos savybės (4)(5)(6). Kartu daromi in vivo ir modeliavimo tyrimai įrodė metodikos atkuriamumą; ją taikant naudojama mažiau gyvūnų, jiems sukeliamos mažesnės kančios nei taikant tradicinius metodus ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus. Rekomendacijas dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Rekomendaciniame ūmaus oralinio toksiškumo bandymo dokumente (7). Be to, šiame rekomendaciniame dokumente yra papildomos informacijos apie B.1 bis bandymo metodo taikymą ir aiškinimą. Metodo esmę sudaro tai, kad darant pagrindinį tyrimą skiriamos vidutinio toksiškumo dozės ir išvengiama dozių, kurios sukeltų žūtį. Be to, nereikia skirti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ėsdinančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai nužudomi ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi darant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo nužudyti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro rekomendacinio dokumento objektas (8). Taikant metodą gaunama informacijos apie medžiagos pavojingas savybes, todėl ją galima įvertinti ir klasifikuoti pagal visuotinai suderintą sistemą (Globally Harmonised System (GHS), skirtą ūmų toksiškumą sukeliančioms cheminėms medžiagoms klasifikuoti (9). Prieš tyrimo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudarytų medžiagos identiškumas ir cheminė struktūra, jos fizikocheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksikologiniai duomenys ir numatomas (-i) medžiagos naudojimo būdas (-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę.

1.2 SĄVOKOS Ūmus oralinis toksiškumas – taikomas tam neigiamam poveikiui, kuris atsiranda davus per burną vieną medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h. Uždelsta mirtis – kai gyvūnas nežūsta arba nepanašus į gaištantį per 48 h, bet žūsta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį. Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg). Akivaizdus toksiškumas – bendrasis terminas, aprašantis aiškius toksiškumo požymius, atsiradusius davus bandomosios medžiagos (pavyzdžiai pateikti (3), kai davus kitą didžiausią fiksuotą dozę, galima laukti, kad didelio skausmo ir ilgalaikių didelių kančių požymiai, gaišimo būsenos požymiai (kriterijai pateikti rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8) pasireikš arba galima žūtis ištiks didesnę dalį gyvūnų. GHS – visuotinai suderinta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (OECD) (žmonių sveikata ir aplinka), JT pavojingų prekių gabenimo ekspertų komiteto (fizikocheminės savybės) ir Tarptautinės darbo organizacijos (ILO) (pavojų pranešimas) bendroji veikla, koordinuojama Tarporganizacinės cheminių medžiagų tinkamos vadybos programos (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)). Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsenos arba žūties reikia laukti anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Šios graužikų būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. (Daugiau detalių pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)). LD50 (medianinė mirtina dozė) – statistiškai apskaičiuojama viena medžiagos dozė, nuo kurios yra tikimybė žūti 50 % gyvūnų, gavusių dozę per burną. LD50 vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (mg/kg). Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2000 arba 5000 mg/kg). Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba kai neišgyvena net gydomas gyvūnas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)). Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį tam tikru momentu ateityje prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandenį arba pašarą, buvimas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)).

1.3 BANDYMO METODO ESMĖ Vienos lyties gyvūnų grupėms nuosekliai duodamos fiksuotos 5, 50, 300 ir 2000 mg/kg dozės (išimtiniais atvejais galima spręsti apie papildomos fiksuotos 5000 mg/kg dozės davimą, žr. 1.6.2 skirsnį). Pradinė dozė pasirenkama atsižvelgiant į orientacinį tyrimą, kaip dozė, kuri galėtų sukelti kai kuriuos toksiškumo požymius, bet kuri nebūtų sunkaus toksiško poveikio arba žūties priežastimi. Klinikiniai požymiai ir sąlygos, susijusios su skausmu, kančia ir neišvengiama žūtimi, išsamiai aprašytos atskirame OECD rekomendaciniame dokumente (8). Kitoms gyvūnų grupėms gali būti duodamos didesnės arba mažesnės fiksuotos dozės, atsižvelgiant į toksiškumo arba gaištamumo požymių buvimą arba nebuvimą. Ši procedūra tęsiama tol, tol identifikuojama dozė, sukelianti akivaizdų toksiškumą arba ne daugiau kaip vieno gyvūno žūtį, arba kai nėra jokio poveikio esant didžiausiai dozei ar kai gyvūnai žūsta esant mažiausiai dozei.

1.4 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.4

1.4.1 Gyvūnų rūšies pasirinkimas Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės (7). Pasirinkimą lėmė tipinių LD50 bandymų informacinės apžvalgos, kurios parodė, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie pastebimi, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės (10). Tačiau, jei giminingos struktūros cheminių junginių toksikologinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad patinai gali būti jautresni, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai daromi su patinais, pateikiami atitinkami tai patvirtinantys duomenys. Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti dar be vados ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš duodant dozę turi būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20 % tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę.

1.4.2 Laikymo ir šėrimo sąlygos Bandomų gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Gyvūnai gali būti laikomi narveliuose pagal dozes, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti aiškiai matyti kiekvieną gyvūną.

1.4.3 Gyvūnų ruošimas Gyvūnai atrenkami atsitiktinai, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių davimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad galėtų priprasti prie laboratorinių sąlygų.

1.4.4 Dozių ruošimas Apskritai visų dydžių bandomosios medžiagos dozės skiriamos kaip pastovaus tūrio dozės, keičiant ruošiamos dozės koncentraciją. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui, galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias duodamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima duoti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai neturi būti didesnis kaip 1ml/100g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima naudoti 2 ml/100g kūno masės. Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama tirpalui (emulsijai, suspensijai) aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet naudojami tirpalai kituose nešikliuose. Jei nešiklis ne vanduo, turi būti žinomos jo toksikologinės charakteristikos. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat davimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu.

1.5 DARBO EIGA

1.5

1.5.1 Dozių davimas Bandomoji medžiaga duodama kaip viena dozė per skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma duoti vienos dozės, ji gali būti duodama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h. Prieš duodant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės negauna pašaro, išskyrus vandenį, per naktį; pelės gauna vandens, bet negauna pašaro 3–4 h). Pasibaigus badavimo laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir duodama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pelės nešeriamos 1–2 h. Jei dozė duodama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę.

1.5.2 Orientacinis tyrimas Orientacinio tyrimo tikslas – leisti pasirinkti atitinkamą pradinę pagrindinio tyrimo dozę. Bandomoji medžiaga nuosekliai duodama atskiriems gyvūnams pagal 1 priedo diagramą. Orientacinis tyrimas baigiamas, kai galima priimti sprendimą dėl pagrindinio tyrimo pradinės dozės (arba jei gyvūnai žūsta esant mažiausiai fiksuotai dozei). Orientacinio tyrimo pradinė dozė pasirenkama iš 5, 50, 300 ir 2000 mg/kg dozių, kaip dozė, kuri galėtų parodyti akivaizdų toksiškumą, pagrįstą, jei įmanoma, in vivo ir in vitro duomenimis apie tą pačią cheminę medžiagą ir struktūriniu požiūriu giminingas chemines medžiagas. Neturint tokios informacijos, pradinė dozė būtų 300 mg/kg. Tarp dozių davimo kiekvienam gyvūnui turi būti mažiausiai 24 h laiko tarpas. Visi gyvūnai turėtų būti stebimi mažiausiai 14 parų. Išimtiniais atvejais ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5000 mg/kg dydžio dozę (žr. 3 priedą). Dėl priežasčių, susijusių su gyvūnų gerove, neskatinama daryti bandymo taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2000–5000 mg/kg) ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga. Tais atvejais, kai darant orientacinį tyrimą žūsta gyvūnas, gavęs mažiausią fiksuotą dozę (5 mg/kg), taikant įprastą procedūrą tyrimą reikia nutraukti ir medžiagą priskirti GHS 1 kategorijai (kaip nurodyta 1 priede). Tačiau jei reikalingas tolesnis klasifikavimo patvirtinimas, gali būti atliekama ši neprivaloma papildoma procedūra. 5 mg/kg dozė duodama antram gyvūnui. Jei šis antras gyvūnas žūsta, GHS 1 kategorija patvirtinama ir tyrimas iš karto nutraukiamas. Jei antras gyvūnas išgyvena, 5 mg/kg dozę gauna ne daugiau kaip trys papildomi gyvūnai. Kadangi yra didelė žūties rizika, gyvūnų gerovei apsaugoti jie turi gauti šią dozę paeiliui. Laiko tarpo tarp dozės davimo kiekvienam gyvūnui turi pakakti nustatyti, ar pirmiau dozę gavęs gyvūnas turi galimybę išgyventi. Jei žūsta antras gyvūnas, dozių davimas iš karto nutraukiamas ir nei vienas papildomas gyvūnas dozės nebegauna. Kadangi žuvus antram gyvūnui (neatsižvelgiant į bandymo nutraukimo momentu panaudotų gyvūnų skaičių) rezultatas yra A (2 arba daugiau žūčių), taikoma 2 priedo klasifikavimo taisyklė esant 5 mg/kg fiksuotai dozei (1 kategorija, jei žuvo 2 arba daugiau gyvūnų, 2 kategorija, jei žuvo ne daugiau kaip 1 gyvūnas). Be to, 4 priede pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, laukiant naujos GHS įgyvendinimo.

1.5.3 Pagrindinis tyrimas

1.5.3

1.5.3.1 Gyvūnų skaičius ir dozių dydis Veiksmai, kurių turi būti imamasi po bandymo su pradine doze, nurodyti 2 priede pateiktose schemose. Yra trys būdai: nutraukti bandymą ir priskirti medžiagą atitinkamai pavojaus klasei, bandyti esant didesnei fiksuotai dozei arba bandyti esant mažesnei fiksuotai dozei. Tačiau siekiant apsaugoti gyvūnus, darant pagrindinį tyrimą nebus kartojama dozė, sukėlusi žūtį darant orientacinį tyrimą (žr. 2 priedą). Patyrimas rodo, kad labiausiai tikėtinas pradinės dozės davimo rezultatas pasireikš tuo, kad medžiaga galės būti klasifikuota ir tolesnis bandymas nebus būtinas. Kiekvienai tiriamai dozei paprastai bus naudojama iš viso po penkis vienos lyties gyvūnus. Penkis gyvūnus sudarys vienas gyvūnas iš orientacinio tyrimo, gavusio pasirinktą dozę, ir keturi papildomi gyvūnai (išskyrus neįprastus atvejus, kai pagrindinio tyrimo dozė nebuvo įtraukta į orientacinį tyrimą). Laiko tarpą tarp kiekvieno dydžio dozių skyrimo lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės davimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai. Rekomenduojamas 3 arba 4 parų laikotarpis tarp kiekvieno dydžio dozės, jei prireikia, uždelstam toksiškumui stebėti. Laiko tarpas prireikus gali būti reguliuojamas, pvz., reakcijos be traukulių atveju. Kai sprendžiama, ar skirti didžiausią fiksuotą 5000 mg/kg dozę, reikėtų laikytis 3 priede aprašytos metodikos (dar žr. 1.6.2 skirsnį).

1.5.3.2 Ribinis bandymas Ribinis bandymas visų pirma daromas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t.y., toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Informacijos apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima gauti pasinaudojus žiniomis apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius arba produktus, atsižvelgiant į toksikologinį reikšmingumą turinčių komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos išvis nėra arba kai pagal tą informaciją bandomoji medžiaga gali būti toksiška, turi būti daromas pagrindinis bandymas. Taikant įprastą procedūrą, šioje rekomendacijoje ribiniu bandymu būtų orientacinis tyrimas esant 2000 mg/kg (arba išimtinais atvejais 5000 mg/kg), po kurio keturiems papildomiems gyvūnams būtų skirta tokio pat dydžio dozė.

1.6 STEBĖJIMAI Gavę dozę gyvūnai atskirai mažiausiai vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, ypač per pirmąsias 4 h, ir toliau kasdien stebimi visas 14 parų, išskyrus kai gyvūnams reikia nutraukti tyrimą ir humaniškai nužudyti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksiškumo reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei jie vėluoja atsirasti (11). Visi stebėjimai yra sistemingai užrašomi atskirai apie kiekvieną gyvūną. Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9). Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai nužudyti. Kai gyvūnai nužudomi dėl humaniškų priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kiek įmanoma tiksliau.

1.6

1.6.1 Kūno masė Atskira gyvūnų masė nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos davimą ir vėliau – mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas masės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai sveriami ir humaniškai nužudomi.

1.6.2 Patologija Visiems bandymo gyvūnams (įskaitant nugaišusius darant bandymą arba pašalintus iš tyrimo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) daromas bendrasis skrodimas. Aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai. Gyvūnams, kurie po dozės gavimo išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų daryti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos.

2. DUOMENYS Turi būti pateikiami atskirų gyvūnų duomenys. Be to, visi duomenys suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas naudotų gyvūnų skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, darant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių nužudytų gyvūnų skaičius, atskirų gyvūnų žūties laikas, toksiško poveikio aprašymas, to poveikio kitimas laike ir grįžtamumas, skrodimo duomenys.

3. ATASKAITOS RENGIMAS

3.

3.1 BANDYMŲ ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei tinka:

Bandomoji medžiaga:

fizinė būsena, grynumas ir, jei tinka, fizikocheminės savybės (įskaitant izomerizavimą),

identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį.

Nešiklis (jei tinka):

nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.

Bandymo gyvūnai:

naudota rūšis ir veislė,

mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma,

gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei tinka, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą),

šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.

Bandymo sąlygos:

išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparatą, įskaitant duodamos medžiagos fizikinį pavidalą,

išsami informacija apie bandomosios medžiagos davimą, įskaitant dozavimo tūrį ir davimo laiką,

išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą (šaltinį), vandens šaltinį),

pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas.

Rezultatai:

kiekvieno gyvūno reakcijos duomenų ir dozės dydžio lentelės (t. y. gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, įskaitant gaištamumą, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę),

kūno masės ir jos kitimo lentelės,

atskirų gyvūnų masė dozės davimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba nužudymo dieną,

žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį nužudymą,

toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir vystymasis, jų galimas grįžtamumas,

kiekvieno gyvūno skrodimo ir histopatologiniai duomenys, jei yra.

Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.

Išvados.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)

NUORODOS British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, p. 85–92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O., (1987) Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279–291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P., (1990) The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469–482. Whitehead, A. and Curnow, R.N., (1992) Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313–324. Stallard, N. and Whitehead, A., (1995) Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, p. 315–323. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P., (2002) Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183–196. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment No 19. OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C., (1995) Comparison of the Up-and- Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223–231. Chan, P.K and Hayes, A.W., (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd. New York, USA.

B.1 TRIS. ŪMUS ORALINIS TOKSIŠKUMAS. ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLASĖS METODAS

B.1 TRIS.

1. METODAS Šis bandymų metodas atitinka OECD TG 423 (2001)

1.

1.1 ĮVADAS Šiame bandyme taikomas ūmaus toksiškumo klasės metodas (1) – tai nuosekli procedūra, pagal kurią vienai pakopai naudojami 3 vienos lyties gyvūnai. Atsižvelgiant į gaištamumą ir (arba) gyvūno gaišimo būseną, vidutiniškai gali prireikti 2-4 pakopų, kad būtų galima spręsti apie bandomosios medžiagos toksiškumą. Ši metodika yra atkuriama, ją taikant naudojama daug mažiau gyvūnų ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus. Ūmaus toksiškumo klasės metodas pagrįstas biometriniais įvertinimais (2) (3) (4) (5), naudojant fiksuotas dozes, kurios pakankamai skiriasi, kad medžiagą būtų galima klasifikuoti ir įvertinti jos pavojų. 1996 m. priimto metodo tinkamumas buvo plačiai patvirtintas nacionaliniu (6) ir tarptautiniu mastu (7) darant in vivo bandymus ir lyginant su literatūroje pateiktais LD50 duomenimis. Rekomendacijas dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Rekomendaciniame ūmaus oralinio toksiškumo bandymo dokumente (8). Be to, šiame Rekomendaciniame dokumente yra papildomos informacijos apie B.l tris bandymo metodo taikymą ir aiškinimą. Nereikia duoti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ėsdinančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai nužudomi ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi darant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo nužudyti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro rekomendacinio dokumento objektas (9). Metode naudojamos iš anksto nustatyto dydžio dozės, o rezultatai leidžia medžiagą įvertinti ir klasifikuoti pagal visuotinai suderintą sistemą {Globally Harmonised System (GHS)), skirtą ūmų toksiškumą sukeliančioms cheminėms medžiagoms klasifikuoti (10). Iš esmės šis metodas nėra skirtas tikslioms LD50 vertėms apskaičiuoti, bet juo galima nustatyti apibrėžtus žūtį sukeliančių dozių intervalus, kadangi tokio bandymo tikslas ir yra nustatyti, ar dalis gyvūnų žūsta. Šiuo metodu galima nustatyti LD50 vertę tik tais atvejais, kai mažiausiai dviejų dozių sukeliamas gaištamumas yra didesnis kaip 0 % ir mažesnis kaip 100 %. Kai skiriamos iš anksto pasirinktos dozės neatsižvelgiant į bandomąją medžiagą, o klasifikavimas tiesiogiai siejamas su stebimų skirtingos būsenos gyvūnų skaičiumi, laboratorijoms didėja galimybė pasiekti suderinamų ir atkartojamų rezultatų. Prieš tyrimo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudarytų medžiagos identiškumas ir cheminė struktūra, jos fizikocheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksikologiniai duomenys ir numatomas (-i) medžiagos naudojimo būdas (-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę.

1.2 SĄVOKOS Ūmus oralinis toksiškumas – taikomas tam neigiamam poveikiui, kuris atsiranda davus per burną vieną medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h. Uždelsta mirtis – kai gyvūnas nežūsta arba nepanašus į gaištantį per 48 h, bet žūsta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį. Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg). GHS – visuotinai suderinta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema {Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). OECD (žmonių sveikata ir aplinka), JT pavojingų prekių pervežimo ekspertų komiteto (fizikocheminės savybės) ir ILO (pavojų pranešimas) bendroji veikla, koordinuojama Tarporganizacinės cheminių medžiagų tinkamos vadybos programos {Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)). Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsenos arba žūties reikia laukti anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Šios graužikų būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9).). LD50(medianinė mirtina dozė) – tai statistiškai apskaičiuojama viena medžiagos dozė, nuo kurios yra tikimybė žūti 50 % gyvūnų, gavusių dozę per burną. LD50 vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (mg/kg). Ribinė dozė –dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2000 arba 5000 mg/kg). Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba kai neišgyvena net gydomas gyvūnas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9)). Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį tam tikru momentu ateityje prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandenį arba pašarą, buvimas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9)).

1. 3 BANDYMO METODO ESMĖ Šio bandymo esmę sudaro nuosekli metodika, pagal kurią vienai pakopai naudojant mažiausią įmanomą gyvūnų skaičių gaunama pakankamai informacijos apie bandomosios medžiagos ūmų toksiškumą, kad būtų galimą ją klasifikuoti. Grupė bandymo gyvūnų per burną gauna viena iš nustatytų bandomosios medžiagos dozių. Medžiaga bandoma taikant nuoseklią metodiką, kiekvienai pakopai naudojami trys vienos lyties gyvūnai (paprastai patelės). Su junginiu siejamas dozę gavusių gyvūnų gaišimas arba negaišimas per vieną iš pakopų lemia kitą pakopą, t. y.: Bandymo metodika išsamiai aprašyta 1 priede. Metodas leidžia spręsti, ar bandomąją medžiagą priskirti vienai iš toksiškumo klasių, apibrėžtų fiksuotomis LD50 intervalo ribinėmis vertėmis.

toliau bandyti nereikia,

duoti tokią pat dozę dar trims gyvūnams,

trims papildomiems gyvūnams duoti kitą didesnę arba mažesnę dozę.

1.4 METODO APRAŠYMAS

1.4

1.4.1 Gyvūnų rūšies pasirinkimas Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės (9). Pasirinkimą lėmė tipinių LD50 bandymų informacinės apžvalgos, kurios parodė, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie pastebimi, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės (11). Tačiau jei giminingos struktūros cheminių junginių toksikologinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad patinai gali būti jautresni, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai daromi su patinais, turėtų būti pateikti atitinkami tai patvirtinantys duomenys. Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti dar be vados ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš skiriant dozę turėtų būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20 % tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę.

1.4.2 Laikymo ir šėrimo sąlygos Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Gyvūnai gali būti laikomi narveliuose pagal dozes, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti aiškiai matyti kiekvieną gyvūną.

1.4.4 Dozių ruošimas Apskritai visų dydžių bandomosios medžiagos dozės duodamos kaip pastovaus tūrio dozės, keičiant ruošiamos dozės koncentraciją. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias skiriamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima duoti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai neturėtų būti didesnis negu 1 ml/100g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima naudoti 2 ml/100g kūno masės. Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama tirpalui (emulsijai, suspensijai) aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet naudojami tirpalai kituose nešikliuose. Jei nešiklis yra ne vanduo, turi būti žinomos jo toksikologinės charakteristikos. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat davimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu.

1.5 DARBO EIGA

1.5

1.5.1 Dozių davimas Bandomoji medžiaga duodama kaip viena dozė per skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma duoti vieną dozę, ji gali būti duodama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h. Prieš duodant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės negauna pašaro, išskyrus vandenį, per naktį; pelės gauna vandens, bet negauna pašaro 3–4 h). Pasibaigus badavimo laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir duodama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pelės nešeriamos 1–2 h. Jei dozė duodama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę.

1.5.2 Gyvūnų skaičius ir dozių dydis Kiekvienai pakopai imami trys gyvūnai. Dozė, kuri turi būti naudojama kaip pradinė dozė, pasirenkama iš keturių fiksuotų dydžių: 5, 50, 300 ir 2000 mg/kg kūno masės. Kaip pradinė turėtų būti pasirinkta dozė, kuriai esant tikrai nugaištų kai kurie iš dozę gavusių gyvūnų. Schemose, pateiktose 1 priede, aprašyta procedūra, kurios reikėtų laikytis kiekvienai pradinei dozei. Be to, 4 priede pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, laukiant naujos GHS įgyvendinimo. Kai turimoje informacijoje nurodoma, kad gyvūnai neturėtų gaišti esant didžiausiai pradinei dozei (2000 mg/kg kūno masės), reikėtų daryti ribinį bandymą. Neturint informacijos apie bandomąją medžiagą, bet rūpinantis gyvūnų gerove, pradine doze reikėtų pasirinkti 300 mg/kg kūno masės. Laiko tarpą tarp kiekvieno dydžio dozių davimo lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės davimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai. Išimtiniais atvejais ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotos 5000 mg/kg dydžio dozę (žr. 2 priedą). Dėl su gyvūnų gerove susijusių priežasčių, neskatinama daryti bandymą taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2000–5000 mg/kg) ir apie tokio bandymo reikalingumą turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos arba aplinkos apsauga.

1.5.3 Ribinis bandymas Ribinis bandymas visų pirma daromas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t. y., toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima sužinoti remiantis informacija apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius ar produktus, atsižvelgiant į toksikologinį reikšmingumą turinčių komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos visai nėra arba kai pagal tą informaciją bandomoji medžiaga gali būti toksiška, turi būti daromas pagrindinis bandymas. Kai skiriama viena 2000 mg/kg kūno masės dozė, ribiniam bandymui galima imti šešis gyvūnus (po tris vienai pakopai). Išimtiniais atvejais, kai skiriama viena 5000 mg/kg dozė, ribiniam bandymui galima naudoti tris gyvūnus (žr. 2 priedą). Jei pastebimas su medžiaga siejamas gaišimas, gali tekti daryti bandymą esant gretimai mažesnei dozei.

1.6 STEBĖJIMAI Gavę dozę gyvūnai atskirai mažiausiai vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, ypač per pirmąsias 4 h, ir toliau kasdien stebimi visas 14 parų, išskyrus kai gyvūnams reikia nutraukti tyrimą ir humaniškai nužudyti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksiškumo reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei jie vėluoja atsirasti (12). Visi stebėjimai yra sistemingai užrašomi atskirai apie kiekvieną gyvūną. Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9). Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai nužudyti. Kai gyvūnai nužudomi dėl humaniškų priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kiek įmanoma tiksliau.

1.6

1.6.1 Kūno masė Atskira gyvūnų masė turi būti nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos davimą ir vėliau mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas masės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai pasveriami ir humaniškai nužudomi.

1.6.2 Patologija Visiems bandomiesiems gyvūnams (įskaitant nugaišusius darant bandymą arba pašalintus iš tyrimo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) daromas bendrasis skrodimas. Turėtų būti aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai. Gyvūnams, kurie išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų atlikti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos.

2. DUOMENYS Turėtų būti pateikiami atskirų gyvūnų duomenys. Be to, visi duomenys suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas naudotų gyvūnų skaičius, gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, skaičius, darant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių nužudytų gyvūnų skaičius, atskirų gyvūnų žūties laikas, toksiškumo poveikio aprašymas, tokio poveikio kitimas laike ir grįžtamumas, skrodimo duomenys.

3. ATASKAITOS RENGIMAS

3.

3.1 BANDYMŲ ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei tinka:

Bandomoji medžiaga:

fizikinė būsena, grynumas ir, jei tinka, fizikocheminės savybės (įskaitant izomerizavimą),

identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį.

Nešiklis (jei tinka):

nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.

Bandymo gyvūnai:

naudota rūšis ir veislė,

mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma,

gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei tinka, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą),

šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.

Bandymo sąlygos:

išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparatą, įskaitant duodamos medžiagos fizikinį pavidalą,

išsami informacija apie bandomosios medžiagos davimą, įskaitant dozavimo tūrį ir davimo laiką,

išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą (šaltinį), vandens šaltinį),

pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas.

Rezultatai:

kiekvieno gyvūno reakcijos duomenų ir dozės dydžio lentelės (t. y. gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, įskaitant gaištamumą, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę),

kūno masės ir jos kitimo lentelės,

atskirų gyvūnų masė dozės davimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba nužudymo dieną,

žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį nužudymą,

toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir vystymasis, jų galimas grįžtamumas,

kiekvieno gyvūno skrodimo ir histopatologiniai duomenys, jei yra.

Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.

Išvados.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)

NUORODOS Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, p. 86 Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336–341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559–610 Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729–734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, p. 129–134 Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, p. 455–470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659–670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF .html]. Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, p. 223–231. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

B.2. ŪMINIS TOKSIŠKUMAS (INHALIACINIS)

B.2.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos dalelių dydžio pasiskirstymą, garų slėgį, lydymosi temperatūrą, virimo temperatūrą, pliūpsnio temperatūrą ir sprogumą (jeigu tinka). Taip pat žr. bendrąją įvadinę B(A) dalį.

1.2. SĄVOKOS Žr. bendrąją įvadinę B(B) dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nėra.

1.4. BANDYMO METODO ESMĖ Kelios eksperimentinių gyvūnų grupės yra veikiamos tiriamąja medžiaga apibrėžtą laikotarpį tam tikra tvarka suskirstytomis koncentracijomis, viena koncentracija naudojama vienai grupei. Po to atliekami poveikio ir žūties atvejų stebėjimai. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, atliekama autopsija, o užbaigus bandymą – likusiems gyviems gyvūnams atliekama autopsija. Gyvūnus, kurie turi aiškių ir ilgalaikių kančios ir skausmo požymių, reikia humaniškai nužudyti. Jeigu žinoma, kad dėl medžiagų, naudojamų dozavimo bandymuose, gali kilti skausmas ir kančia dėl jų ardančių (ėsdinančių) arba dirginančių savybių, tokie bandymai neturėtų būti atliekami.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.6. BANDYMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6.

1.6.1. Pasirengimas Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis laikymo ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento. Prieš bandymą sveiki jauni gyvūnai yra randomizuojami ir suskirstomi į reikalingą grupių skaičių. Jie neturi patirti dirbtinai sukurto poveikio, išskyrus atvejus, jei tai daryti rekomenduojama dėl tam tikro poveikio aparato tipo. Kietąsias tiriamas medžiagas gali tekti mikronizuoti, kad būtų gaunamos atitinkamo dydžio dalelės. Prireikus į tiriamąją medžiagą gali būti dedama atitinkamo tirpiklio, kad būtų gaunama atitinkama tiriamos medžiagos koncentracija atmosferoje, po to turėtų būti naudojama kontrolinė tirpiklių grupė. Jeigu tirpiklis ar kiti priedai yra naudojami dozavimui palengvinti, turėtų būti žinoma, kad jie nesukels toksiško poveikio. Atitinkamais atvejais gali būti naudojamasi ankstesniais duomenimis.

1.6.2. Bandymo sąlygos

1.6.2.

1.6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai Jeigu nėra kontraindikacijų, pirmenybė atiduodama žiurkėm s. Turėtų būti panaudojamos plačiai naudojamos laboratorinės veislės. Kiekvienai lyčiai bandymo pradžioje naudojamų gyvūnų svorio įvairavimas neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.

1.6.2.2. Skaičius ir lytis Ne mažiau kaip dešimt graužikų (penki patinėliai ir penkios patelės) yra naudojami kiekvienai koncentracijai. Patelės turėtų būti neturėjusios jauniklių ir nevaikingos. Pastaba: Atliekant ūminio toksiškumo bandymus su aukštesniaisiais negu graužikai gyvūnais turi būti apsvarstoma galimybė naudoti mažesnį gyvūnų skaičių. Dozės turėtų būti atidžiai parenkamos ir turėtų būti dedamos visos pastangos neviršyti vidutiniškai toksiškų dozių. Tokiuose bandymuose turėtų būti vengiama įvesti mirtinas tiriamosios medžiagos dozes.

1.6.2.3. Poveikio koncentracijos Koncentracijų skaičius turėtų būti pakankamas, ne mažiau trijų, ir taip paskirstytų, kad susidarytų bandymo grupės, turinčios tam tikrą toksiško poveikio intervalą ir mirštamumo procentą. Duomenų turi būti tiek, kad pakaktų sudaryti mirtinų koncentracijų kreivę ir atitinkamais atvejais būtų galima tinkamai nustatyti LC50.

1.6.2.4. Ribinis bandymas Jeigu penkis bandomus patinėlius ir penkias bandomas pateles paveikus 5 mg skystos arba kietos medžiagos viename litre dujų arba aerozolio (arba, jeigu tai neįmanoma dėl tiriamos medžiagos fizikinių arba cheminių, taip pat ir sprogumo savybių – maksimalia pasiekiama koncentracija) keturias valandas, per 14 dienų nebūna su tuo cheminiu junginiu susijusių nugaišimo atvejų, laikoma, kad tolesnis bandymas yra nereikalingas. (18th ATP, dir. 93/21/EEC, L1 10/93)

1.6.2.5. Poveikio trukmė Poveikio trukmė turėtų būti lygi keturioms valandoms.

1.6.2.6. Įrenginiai Gyvūnai turėtų būti bandomi inhaliaciniais įrenginiais, skirtais išlaikyti dinaminį oro srautą ne mažiau kaip 12 oro pasikeitimų per valandą, kad būtų užtikrintas pakankamas deguonies kiekis ir vienodai pasiskirstytų poveikio atmosfera. Jeigu naudojama kamera, ji turėtų būti tokios konstrukcijos, kad kaip galima būtų sumažinamas gyvūnų susigrūdimas ir kad jie įkvėptų kaip galima daugiau tiriamosios medžiagos. Paprastai, norint užtikrinti kameros atmosferos pastovumą, visas bandomų gyvūnų tūris neturėtų viršyti 5 % bandymo kameros tūrio. Atskiroje kameroje gali būti paveikiama burna ir nosis, tik galva arba visas kūnas; du pirmieji būdai padeda sumažinti tiriamos medžiagos patekimą kitais keliais.

1.6.2.7. Stebėjimo laikotarpis Stebėjimo laikotarpis turėtų būti ne trumpesnis kaip 14 dienų. Tačiau stebėjimo trukmė neturėtų būti griežtai nustatoma. Ji turėtų būti nustatoma pagal toksines reakcijas, jų pasireiškimo dažnumą ir sveikimo laikotarpio trukmę; todėl, jeigu laikoma reikalinga, jis gali būti pailginamas. Labai svarbus yra laikas, kada toksiškumo požymiai atsiranda ir išnyksta, bei nugaišimo laikas, ypač jeigu yra tendencija, kad žūtis pasireiškia vėliau.

1.6.3. Darbo eiga Prieš pat poveikį gyvūnai yra sveriami ir po to paveikiami tiriama koncentracija tam skirtame aparate keturias valandas po to, kai kameroje nustatoma koncentracijos pusiausvyra. Pusiausvyros nustatymo trukmė turi būti trumpa. Temperatūra, kurioje vykdomas bandymas, turėtų būti išlaikoma 22 ± 3 oC. Tinkamiausias santykinis drėgnumas yra tarp 30 % ir 70 %, bet tam tikrais atvejais (pvz., atliekant tam tikrus aerozolių bandymus), tai gali būti neįgyvendinama. Išlaikant nedidelį neigiamą slėgį kameros viduje (≥ 5 mm vandens) užkertamas kelias tiriamajai medžiagai patekti į aplinką. Poveikio metu turėtų būti duodama pašaro ir vandens. Turėtų būti naudojamos atitinkamos bandymo atmosferos generavimo ir stebėsenos sistemos. Tokia sistema turėtų užtikrinti, kad kaip galima greičiau bus pasiektos pastovios poveikio sąlygos. Kamera turėtų būti tokios konstrukcijos ir taip veikti, kad kameros viduje būtų palaikomas vienodas bandymo atmosferos pasiskirstymas. Turėtų būti atliekami šie matavimai arba stebėsena: Poveikio metu ir po jo atliekami stebėjimai, kurie sistemingai užrašomi; apie kiekvieną gyvūną turėtų būti daromi atskiri įrašai. Pirmą dieną stebėjimai turėtų būti atliekami dažnai. Kruopštus klinikinis ištyrimas turėtų būti atliekamas ne rečiau kaip vieną kartą kiekvieną darbo dieną, kiti stebėjimai turėtų būti vykdomi kiekvieną dieną, imantis atitinkamų veiksmų iki minimumo sumažinti bandymo metu prarandamų gyvūnų skaičių, pvz., rastų negyvų gyvūnų autopsija arba užšaldymas ir nusilpusių arba gaištančių gyvūnų izoliavimas arba nužudymas. Stebimi odos ir kailio, akių, gleivinės pasikeitimai, taip pat respiratorinės, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos ir elgsenos pasikeitimai. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tremorų, konvulsijų, salivacijos, diarėjos, letargo, miego ir komos stebėjimams. Nugaišimo laikas turėtų būti užrašomas kaip galima tiksliau. Kiekvieno gyvūno svoris turėtų būti nustatomas kiekvieną savaitę po poveikio ir šiam nugaišus. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, ir tiems, kurie išlieka gyvi bandymą sustabdžius, atliekama autopsija, ypač atkreipiant dėmesį į visus viršutinių ir apatinių kvėpavimo takų pokyčius. Turėtų būti užregistruojami visi dideli patologiniai pokyčiai. Jeigu reikalaujama, turėtų būti paimami audiniai histopatologiniam tyrimui.

1.6.3. a)

oro srauto greičio (visą laiką),

tikrosios tiriamos medžiagos koncentracijos, matuojamos kvėpavimo zonoje ne mažiau kaip tris kartus poveikio metu (esant tam tikrai atmosferai, pvz., naudojant didelės koncentracijos aerozolius, gali tekti vykdyti dažnesnį monitoringą). Poveikio metu koncentracija neturėtų keistis daugiau negu ± 15 % vidutinės vertės. Tačiau naudojant tam tikrus aerozolius, šio kontrolės lygio gali būti neįmanoma pasiekti, tokiu atveju būtų priimtinas platesnis intervalas. Aerozolių dalelių dydžio analizė turėtų būti atliekama reikiamu dažnumu (ne rečiau kaip vieną kartą vienai bandomajai grupei),

temperatūros ir drėgnumo, j eigų įmanoma, visą laiką.

2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti apibendrinami lentelėse, nurodant kiekvienos bandomos grupės gyvūnų skaičių bandymo pradžioje, kiekvieno gyvūno nugaišimo laiką, gyvūnų, turinčių kitokius toksiškumo požymius, skaičių, pateikiant toksiškų poveikių ir autopsijos duomenų aprašymą. Turėtų būti apskaičiuojami ir registruojami svorio pasikeitimai, jeigu išgyvenama ilgiau negu vieną dieną. Gyvūnai, kurie humaniškai nužudomi dėl cheminio junginio sukeliamų kančių ir skausmo, yra užregistruojami kaip nugaišimo atvejai, kurių priežastis – cheminis junginys. LD50 gali būti nustatomas pripažintu metodu. Į duomenų vertinimą turėtų įeiti sąryšis, jeigu toks yra, tarp gyvūnų poveikio tiriamąja medžiaga ir visų specifinių rodiklių dažnumo ir stiprumo, taip pat ir elgsenos ir klinikinių parodymų, didesnių audinių pakitimų, kūno svorio pasikeitimų, mirštamumo ir kitų toksikologinių poveikių.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS

3.

3.1. BANDYMO ATASKAITA Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija: Duomenys apie poveikį Jie turėtų būti pateikiami lentelėse vidutinėmis vertėmis ir kintamumo vienetais (pvz., standartinis nuokrypis) ir, jeigu įmanoma, į juos turėtų būti įtraukti:

rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, aplinkos sąlygos, pašarai ir pan.;

bandymo sąlygos: poveikio aparato apibūdinimas, taip pat aparato konstrukcija, tipas, dydžiai, oro šaltinis, aerozolių generavimo sistema, oro kondicionavimo metodas ir gyvūnų laikymo bandymo kameroje, jeigu tokia naudojama, būdas. Turėtų būti apibūdinama temperatūros, drėgnumo matavimo įranga, aerozolio koncentracijos ir dalelių dydžio pasiskirstymas.

3.1. a)

oro srauto, tekančio inhaliacijos įrenginiu, greitis;

oro temperatūra ir drėgnumas;

nominalios koncentracijos (visas tiriamos medžiagos kiekis, įdėtas į inhaliacijos įrenginį, padalytas iš oro tūrio);

tirpiklio, jeigu naudotas, rūšis;

faktinės koncentracij os kvėpavimo bandymo zonoj e;

masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAD) ir geometrinis standartinis nuokrypis (GSD);

pusiausvyros nustatymo periodas;

poveikio periodas;

duomenų apie reakciją pagal lytį ir poveikį surašymas į lenteles (pvz., gyvūnų, kurie nugaišo arba buvo nužudyti bandymo metu, skaičius; toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius; paveiktų gyvūnų skaičius),

nugaišimo laikas poveikio metu arba po jo, priežastys ir kriterijai, kuriais naudotasi humaniškai nužudant gyvūnus,

visi pastebėjimai,

LC50 vertė kiekvienai lyčiai, nustatyta stebėjimo laikotarpio pabaigoje (nurodant apskaičiavimo metodą),

LC50 95 % pasikliautinasis intervalas (tais atvejais, kai gali būti pateikta),

dozės ir mirštamumo kreivė ir statumas (jeigu įmanoma pagal nustatymo metodą),

autopsijos duomenys,

visi histopatologiniai duomenys,

rezultatų aptarimas (ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tam, kokį poveikį humaniškas gyvūnų nužudymas bandymo metu galėtų turėti apskaičiuojamai LC50 vertei),

rezultatų aiškinimas.

3.2. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS IR AIŠKINIMAS Žr. bendrąją įvadinę B(D) dalį.

4. LITERATŪRA Žr. bendrąją įvadinę B(E) dalį.

B.3. ŪMINIS TOKSIŠKUMAS (PER ODĄ)

B.3.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Žr. bendrąją įvadinę B(A) dalį.

1.2. SĄVOKOS Žr. bendrąją įvadinę B(B) dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nėra.

1.4. BANDYMO METODO ESMĖ Tiriamoji medžiaga dedama ant odos suskirstytomis dozėmis kelioms eksperimentinių gyvūnų grupėms, viena dozė – vienai grupei. Po to atliekami poveikio ir nugaišimo atvejų stebėjimai. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, atliekama autopsija, ir, užbaigus bandymą, autopsija daroma išlikusiems gyviems gyvūnams. Gyvūnus, kurie turi aiškių ir ilgalaikių kančios ir skausmo požymių, reikia humaniškai nužudyti. Jeigu žinoma, kad dėl medžiagų, naudojamų dozavimo bandymuose, gali kilti skausmas ir kančia dėl jų ardančių (ėsdinančių) arba dirginančių savybių, tokie bandymai neturėtų būti atliekami.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.6. BANDYMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6.

1.6.1. Pasirengimas Gyvūnai laikomi eksperimentiniuose narveliuose eksperimentinėmis laikymo ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento pradžios. Prieš bandymą sveiki jauni suaugę gyvūnai randomizuojami ir paskiriami į apdorojimo grupes. Apytikriai 24 valandas iki bandymo nuo gyvūno kūno sprando srityje pašalinamas kailis, jį nukerpant arba nuskutant. Jeigu kailis kerpamas arba skutamas, reikia stengtis nenubrūžinti odos, tai gali pakeisti pralaidumą. Tiriamajai medžiagai uždėti turėtų būti nukirpta ar nuskusta ne mažiau kaip 10 % kūno paviršiaus. Jeigu bandomos kietosios medžiagos, kurios atitinkamais atvejais gali būti pulverizuojamos, tiriamoji medžiaga turėtų būti pakankamai sudrėkinama vandeniu arba, jeigu reikia, atitinkamu tirpikliu, kad būtų užtikrinamas geras sąlytis su oda. Jeigu naudojamas tirpiklis, turėtų būti atsižvelgiama į tirpiklio poveikį tiriamosios medžiagos įsiskverbimui į odą. Skystos tiriamosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos.

1.6.2. Bandymo sąlygos

1.6.2.

1.6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai Gali būti naudojamos suaugusios žiurkės arba triušiai. Gali būti naudojamos kitos rūšys, bet jų naudojimas turėtų būti pagrindžiamas. Turėtų būti panaudojamos plačiai naudojamos veislės. Kiekvienai lyčiai bandymo pradžioje naudojamų gyvūnų svorio įvairavimo intervalas neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.

1.6.2.2. Skaičius ir lytis Kiekvienai dozei naudojama ne mažiau 5 gyvūnų. Jie visi turėtų būti vienos lyties. Jeigu naudojamos patelės, jos turėtų būti neturėjusios jauniklių ir būti nevaikingos. Jeigu galima gauti informacijos, parodančios, kad kuri nors lytis yra daug jautresnė, dozė taikoma tai lyčiai. Pastaba. Atliekant ūminio toksiškumo bandymus su aukštesniaisiais negu graužikai gyvūnais reikėtų išnagrinėti galimybę naudoti mažesnį gyvūnų skaičių. Dozės turėtų būti kruopščiai parenkamos, ir stengiamasi neviršyti vidutinio toksiškumo dozių. Tokių bandymų metu turėtų būti vengiama įvesti mirtinas tiriamosios medžiagos dozes.

1.6.2.3. Dozės Jų turėtų būti pakankamas skaičius, ne mažiau kaip trys, ir atitinkamai paskirstytų, kad susidarytų tiriamosios grupės, turinčios atitinkamą toksiško poveikio intervalą ir mirštamumo procentą. Duomenų turėtų būti tiek, kad būtų galima sudaryti dozės ir reakcijos kreivę ir, jeigu įmanoma, būtų galima nustatyti LD50.

1.6.2.4. Ribinis bandymas Jeigu naudojami graužikai, ribinis bandymas suleidžiant vieną dozę, ne mažesnę kaip 2000 mg/kg kūno svorio, gali būti atliekamas su penkių patinėlių ir penkių patelių grupe, naudojant aukščiau apibūdintą darbo eigą. Jeigu cheminis junginys tampa nugaišimo priežastimi, reikėtų apsvarstyti, ar nereikėtų atlikti išsamų tyrimą.

1.6.2.5. Stebėjimo laikotarpis Stebėjimo laikotarpis turėtų būti ne trumpesnis kaip 14 dienų. Tačiau stebėjimų trukmė neturėtų būti griežtai nustatoma. Ji turėtų būti nustatoma pagal toksines reakcijas, jų pasireiškimo dažnumą ir sveikimo laikotarpio trukmę; todėl jis gali būti pailginamas, jeigu laikoma, kad to reikia. Svarbus yra laikas, per kurį toksiškumo požymių atsiranda ir išnyksta, taip pat nugaišimo laikas, ypač jeigu yra tendencija, kad žūtis pasireiškia vėliau.

1.6.3. Darbo eiga Gyvūnai turėtų būti laikomi atskiruose narveliuose. Tiriamoji medžiaga turėtų būti tolygiai uždedama ant plotelio, kurio dydis sudaro apie 10 % viso kūno paviršiaus. Jeigu medžiagos labai toksiškos, paveikiamas paviršius gali būti mažesnis, bet kaip galima didesnis plotas turėtų būti padengiamas kiek įmanoma plonesnių ir lygesniu sluoksniu. Tiriamoji medžiaga turėtų liestis su oda akytu marlės tvarsčiu ir nedirginančia lipnia juostele per visą 24 valandų poveikio laiką. Tiriamoji vieta ir toliau turėtų būti atitinkamai padengta, kad būtų išsaugotas marlės tvarstis ir tiriamoji medžiaga bei užtikrinama, kad gyvūnai nepraris tiriamosios medžiagos. Gali būti naudojami ribotuvai, kad tiriamoji medžiaga nebūtų praryjama, bet visiško imobilizavimo metodas nerekomenduojamas. Poveikio laikotarpio pabaigoje tiriamosios medžiagos likutis turėtų būti nuimamas, paprastai naudojant vandenį ar kokį kitą atitinkamą odos valymo būdą. Poveikio metu atliekami stebėjimai, kurie sistemingai užrašomi. Apie kiekvieną gyvūną turėtų būti daromi atskiri įrašai. Pirmą dieną stebėjimai turėtų būti atliekami dažnai. Kruopštus klinikinis ištyrimas turėtų būti atliekamas ne rečiau kaip vieną kartą kiekvieną darbo dieną, kiti stebėjimai turėtų būti vykdomi kiekvieną dieną, imantis atitinkamų veiksmų iki minimumo sumažinti bandymo metu prarandamų gyvūnų skaičių, pvz., rastų negyvų gyvūnų autopsija arba užšaldymas ir nusilpusių arba gaištančių gyvūnų izoliavimas arba nužudymas. Turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimai, taip pat respiratorinės, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos ir elgsenos pasikeitimai. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tremorų, konvulsijų, salivacijos, diarėjos, letargo, miego ir komos stebėjimams. Nugaišimo laikas turėtų būti užrašomas kaip galima tiksliau. Gyvūnams, kurie nugaišo bandymo metu ir kurie išliko gyvi dėl bandymo nutraukimo, yra atliekama autopsija. Visi dideli patologiniai pokyčiai turėtų būti registruojami. Jeigu nurodyta, turėtų būti paimami audiniai histopatologiniam ištyrimui.

1.6.3. Priešingos lyties toksiškumo įvertinimas

Užbaigus bandymą su viena lytimi, dozė skiriama ne mažiau kaip vienai grupei, susidedančiai iš 5 priešingos lyties gyvūnų, kad būtų nustatyta, ar šios lyties gyvūnai nėra labiau jautresni tiriamai medžiagai. Esant kitokioms sąlygoms, mažesnio gyvūnų skaičiaus naudojimas turėtų būti pagrindžiamas. Jeigu galima gauti pakankamai informacijos, įrodančios, kad tiriamos lyties gyvūnai yra daug jautresni, galima apsieiti be priešingos lyties gyvūnų bandymo.

2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti apibendrinami lentelėse, kiekvienai grupei nurodant gyvūnų skaičių bandymo pradžioje, kiekvieno gyvūno nugaišimo laiką, gyvūnų, turinčių kitokius toksiškumo požymius, skaičių, pateikiant toksiškų poveikių ir autopsijos duomenų aprašymą. Turėtų būti nustatomas kiekvieno gyvūno svoris ir užrašomas prieš pat įvedant tiriamąją medžiagą, po to kartą per savaitę ir nugaišimo metu; turėtų būti apskaičiuojami svorio pasikeitimai ir užrašomi, jeigu išgyvenama ilgiau negu vieną dieną. Gyvūnai, kurie humaniškai nužudomi dėl cheminio junginio sukeliamų kančių ir skausmo, yra užregistruojami kaip žūties atvejai, kurių priežastis – cheminis junginys. LD50 gali būti nustatomas pripažintu metodu. Į duomenų vertinimą turėtų įeiti sąryšis, jeigu toks yra, tarp gyvūnų, paveiktų tiriamąja medžiaga, ir visų specifinių rodiklių dažnumo ir stiprumo, taip pat ir elgsenos ir klinikinių parodymų, didesnių audinių pakitimų, kūno svorio pasikeitimų, mirštamumo ir kitų toksikologinių poveikių.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS

3.

3.1. BANDYMO ATASKAITA Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, turėtų būti pateikiama tokia informacija:

rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, aplinkos sąlygos, pašaras ir pan.,

bandymo sąlygos (taip pat odos nuvalymo metodas ir tvarstymo būdas: uždaras arba neuždaras),

dozės (nurodant tirpiklį, jeigu naudojamas, ir koncentracijas),

gyvūnų, kuriems įvestos dozės, lytis,

duomenų lentelės pagal lytį ir dozes (t. y. gyvūnų, kurie nugaišo arba buvo nužudyti bandymo metu, skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, paveiktų gyvūnų skaičius),

nugaišimo laikas įvedus dozę, priežastys ir kriterijai, kuriais naudotasi humaniškai nužudant gyvūnus,

visi pastebėjimai,

išsamiame bandyme dalyvavusių lyčių LD50 vertės, kurios nustatytos per 14 dienų (nurodant apibrėžtą nustatymo metodą),

LD50 95 % pasikliautinasis intervalas (tais atvejais, kai gali būti pateikta),

dozės ir mirštamumo kreivė ir statumas, jeigu įmanoma nustatyti pagal nustatymo metodą,

autopsijos duomenys,

visi histopatologiniai duomenys,

bet kurio bandymo su priešinga lytimi rezultatai,

rezultatų aptarimas (ypatingas dėmesys turėtų būti atkreipiamas į tai, kokį poveikį apskaičiuojamai LD50 vertei gali turėti humaniškas gyvūnų nužudymas bandymo metu),

duomenų aiškinimas.

3.2. DUOMENŲ APSKAIČIAVIMAS IR AIŠKINIMAS Žr. bendrąją įvadinę B(D) dalį.

4. LITERATŪRA Žr. bendrąją įvadinę B(E) dalį.

B.4. ŪMUS TOKSIŠKUMAS. ODOS DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS

B.4.

1. METODAS Šis metodas atitinka OECD TG 404 (2002).

1.

1.1 ĮVADAS Rengiant šį atnaujintą metodą ypatingas dėmesys buvo kreipiamas į galimą gyvūnų gerovės pagerinimą ir į visos turimos informacijos apie bandomąją medžiagą įvertinimą, siekiant išvengti nebūtinų bandymų su laboratoriniais gyvūnais. Šiame metode rekomenduojama prieš darant aprašytą medžiagos ėsdinimo ar dirginimo in vivo bandymą daryti turimų atitinkamų duomenų įrodomosios vertės analizę. Jei duomenų nepakanka, jų galima gauti darant nuoseklųjį bandymą (1). Į bandymo strategiją, pateikiamą kaip šio metodo priedas, įtraukti įteisinti ir priimti in vitro bandymai. Be to, jei tinka, darant pradinį in vivo bandymą vietoj vienalaikio rekomenduojamas nuoseklusis trijų bandomųjų tamponų uždėjimo gyvūnui bandymas. Siekiant užtikrinti ir duomenų mokslinį patikimumą, ir gyvūnų gerovę, in vivo bandymai nedaromi tol, kol darant duomenų įrodomosios vertės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apibūdinantys galimą medžiagos ėsdinamąjį ar dirginamąjį poveikį odai. Tokius duomenis sudarys turimų tyrimų su žmonėmis ir (arba) laboratoriniais gyvūnais rezultatai, ėsdinimo ar dirginimo duomenys, gauti apie vieną arba kelias medžiagas, turinčias giminingą struktūrą, arba apie jų mišinius, duomenys, patvirtinantys medžiagos stiprias rūgštines arba šarmines savybes (2) (3), be to, įteisintų ir priimtų in vitro arba ex vivo bandymų rezultatai (4) (5) (5a). Ši analizė turėtų sumažinti poreikį in vivo bandyti tas medžiagas, apie kurių odos ėsdinamąjį ar dirginamąjį poveikį jau turima pakankamai kitų tyrimų metu gautų duomenų. Pirmenybė teikiama į šio metodo priedą įtrauktai nuosekliųjų bandymų strategijai, kurią sudaro įteisinti ir priimti in vitro arba ex vivo odos ėsdinimo ar dirginimo bandymai. Strategiją parengė ir vienbalsiai rekomendavo OECD seminaro dalyviai (6), ji buvo priimta ir rekomenduota kaip visuotinai suderintos cheminių medžiagų klasifikavimo sistemos (GHS) bandymų strategija (7). Rekomenduojama laikytis šios bandymų strategijos prieš pradedant in vivo bandymus. Naujoms medžiagoms rekomenduojamas nuoseklusis bandymo būdas moksliškai pagrįstiems duomenims apie medžiagos ėsdinimo ar dirginimo savybes gauti. Turimoms medžiagoms, apie kurių odos ėsdinimo ar dirginimo savybes duomenų nepakanka, ši strategija turėtų būti taikoma, jei trūksta duomenų. Kitokios bandymo strategijos arba metodikos taikymas arba sprendimas netaikyti nuoseklaus bandymų metodo turi būti pagrįstas. Jei ėsdinimo arba dirginimo savybių negalima nustatyti, darant duomenų įrodomosios vertės analizę, atitinkančią nuoseklaus bandymo strategiją, reikėtų spręsti klausimą apie in vivo bandymą (žr. priedą).

1.2 SĄVOKOS Odos dirginimas: išnykstantis odos pažeidimas, bandomąja medžiaga veikiant ne ilgiau kaip 4 h. Odos ėsdinimas – neišnykstantis odos pažeidimas; būtent, matomoji nekrozė per epidermį ir odos nekrozė po bandomosios medžiagos uždėjimo ne ilgiau kaip keturioms valandoms. Ėsdinimo požymiai yra opos, kraujavimas, kruvini šašai ir, baigiantis 14 parų stebėjimo laikotarpiui, odos blukimas dėl jos šutimo, visiškai nuplikusios vietos ir randai. Neaiškiems pažeidimams nustatyti galima būtų daryti histopatologinį tyrimą.

1.3 BANDYMO METODO ESMĖ Ant bandomo gyvūno odos dedama viena bandomosios medžiagos dozė; nepaveiktos gyvūno odos vietos naudojamos kontrolei. Nustatytais laiko tarpais nustatomas ir balais įvertinamas dirginimo ar ėsdinimo laipsnis, kuris papildomai aprašomas, siekiant išsamiai įvertinti poveikį. Tyrimo trukmės turi pakakti stebimo poveikio grįžtamumui arba negrįžtamumui įvertinti. Gyvūnai, kuriems kurioje nors bandymo stadijoje pasireiškia nuolatiniai sunkių kančių ir (arba) skausmo požymiai, turi būti humaniškai nužudomi, o medžiaga atitinkamai įvertinama. Kriterijai, pagal kuriuos priimamas sprendimas dėl humaniško gaištančių ir labai kenčiančių gyvūnų nužudymo, aprašyti (8) nuorodoje.

1.4 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.4

1.4.1 Pasiruošimas in vivo bandymui

1.4.1

1.4.1.1 Gyvūnų rūšies pasirinkimas Tinkamiausias laboratorinis gyvūnas – baltasis triušis; naudojami sveiki, jauni ir suaugę triušiai. Kitų rūšių naudojimas turi būti pagrįstas.

1.4.1.2 Gyvūnų ruošimas Maždaug 24 h prieš bandymą nuo gyvūno reikia pašalinti kailį, jį trumpai nukerpant nugaros srityje. Reikia stengtis nenutrinti odos ir naudoti tik tuos gyvūnus, kurių oda yra sveika ir nepažeista. Kai kurių veislių triušiai turi tankių plaukų vietas, kurios labiau matomos tam tikrais metų laikais. Tokios tankių plaukų vietos neturi būti naudojamos bandymui.

1.4.1.3 Laikymo ir šėrimo sąlygos Gyvūnai turi būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandomieji triušiai, temperatūra turi būti 20 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50-60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio.

1.4.2 Bandymo eiga

1.4.2

1.4.2.1 Bandomosios medžiagos uždėjimas Bandomoji medžiaga uždedama ant mažo odos ploto (maždaug 6 cm) ir uždengiama marlės tamponu, kuris tvirtinamas nedirginančia lipnia juosta. Jei tiesiogiai uždėti neįmanoma (pvz., skysčiai arba kai kurios pastos), bandomąją medžiagą reikėtų dėti ant marlės tampono, kuris būtų dedamas ant odos. Visą veikimo laikotarpį tamponas turi laisvai liesti odą, naudojant pusiau uždarą tvarstį. Jei bandomoji medžiaga dedama ant tampono, jis dedamas ant odos taip, kad medžiaga gerai liestųsi su oda ir tolygiai pasiskirstytų ant jos. Gyvūnai neturi pasiekti tampono ir praryti arba įkvėpti bandomosios medžiagos. Skystos bandomosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos. Bandant kietąsias medžiagas (kurios gali būti purškiamos, jei būtų manoma, kad tai daryti yra būtina), bandomąją medžiagą reikėtų sudrėkinti kiek įmanoma mažesniu vandens kiekiu (arba prireikus kitu tinkamu nešikliu), kurio pakaktų geram sąlyčiui su oda užtikrinti. Kai nešiklis yra ne vanduo, galima nešiklio įtaka bandomosios medžiagos dirginamajam poveikiui turi būti kiek įmanoma mažesnė. Pasibaigus veikimo laikotarpiui, kurio trukmė paprastai yra 4 h, bandomosios medžiagos likutis turi būti nuplautas, jei įmanoma, vandeniu arba kitu tinkamu tirpikliu, nepakeičiant odos reakcijos arba epidermio vientisumo.

1.4.2.2 Dozės dydis Ant bandymo vietos dedama 0,5 ml skysčio arba 0,5 g kietosios medžiagos arba pastos dozė.

1.4.2.3 Pradinis bandymas (in vivo odos dirginimo ar ėsdinimo bandymas su vienu gyvūnu) Labai rekomenduojama in vivo bandymą iš pradžių daryti su vienu gyvūnu, ypač kai yra įtarimas dėl ėsdinančiųjų medžiagos savybių. Tai atitinka nuosekliųjų bandymų strategiją (žr. 1 priedą). Kai po duomenų įrodomosios vertės analizės padaroma išvada, kad medžiaga yra ėsdinanti, bandymų su gyvūnais daryti nereikia. Didesnei daliai medžiagų, kurias galima laikyti ėsdinančiomis, in vivo bandymai paprastai nebūtini. Tačiau tais atvejais, kai turimi duomenys atrodo nepakankamai įrodantys, galima daryti ribotą bandymą su gyvūnais, taikant šį būdą: ant gyvūno paeiliui dedami ne daugiau kaip trys tamponai. Pirmasis tamponas nuimamas po trijų minučių. Jei jokios sunkios odos reakcijos nėra, dedamas antras tamponas, kuris nuimamas po valandos. Jei šioje stadijoje stebėjimai rodo, kad veikimą galima humaniškai pratęsti keturioms valandoms, dedamas trečias tamponas, kuris nuimamas po keturių valandų, ir odos reakcija įvertinama balais. Jei ėsdinantis poveikis pastebimas po bet kurio iš trijų nuoseklių paveikimų, bandymas nedelsiant baigiamas. Jei ėsdinančio poveikio nėra, nuėmus paskutinį tamponą, gyvūnas stebimas 14 parų, jei ėsdinimo požymių neatsiranda anksčiau. Tai atvejais, kai nesitikima, kad bandomoji medžiaga sukels ėsdinantį poveikį, o tik dirginantį, vienam gyvūnui keturioms valandoms dedamas vienas tamponas.

1.4.2.4 Patvirtinamasis bandymas (in vivo odos dirginimo bandymas su papildomais gyvūnais) Jei darant pradinį bandymą ėsdinančio poveikio nėra, dirginantis poveikis arba neigiama reakcija turi būti patvirtinti naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus su vienu tamponu ir esant keturių valandų veikimo trukmei. Jei dirginantis poveikis pastebimas darant pradinį bandymą, patvirtinamąjį bandymą galima daryti nuosekliu būdu arba veikiant du papildomus gyvūnus vienu metu. Išimtiniais atvejais, kai pradinis bandymas nedaromas, dviem arba trims gyvūnams gali būti dedamas vienas tamponas, kuris nuimamas po keturių valandų. Kai naudojami du gyvūnai ir abiejų reakcija vienoda, toliau bandyti nereikia. Priešingu atveju dar daromas bandymas su trečiu gyvūnu. Neaiškias reakcijas gali tekti įvertinti naudojant papildomą gyvūną.

1.4.2.5 Stebėjimo laikotarpis Stebėjimo laikotarpio trukmės turi pakakti pastebėto poveikio grįžtamumui visiškai įvertinti. Tačiau bandymas turi būti nutrauktas bet kuriuo momentu, kai tik gyvūnui pasireiškia ilgalaikiai didelio skausmo arba kančios požymiai. Poveikio grįžtamumui nustatyti gyvūnai po tamponų nuėmimo stebimi iki 14 parų. Jei grįžtamumas pastebimas anksčiau kaip po 14 parų, bandymas nutraukiamas tuo momentu.

1.4.2.6 Klinikiniai stebėjimai ir odos reakcijos įvertinimas balais Stebima, ar visi gyvūnai neturi eritemos ir edemos požymių, o reakcija įvertinama po 60 minučių nuėmus tamponą vėliau – po 24, 48 ir 72 valandų. Darant pradinį bandymą su vienu gyvūnu, bandymo vieta taip pat tiriama iškart po tampono nuėmimo. Odos reakcija įvertinama balais ir užrašoma pagal lentelėje pateiktą gradavimo skalę. Jei odai padarytas pažeidimas po 72 h negali būti identifikuotas kaip dirginimas arba ėsdinimas, poveikio grįžtamumui nustatyti stebėjimą gali tekti tęsti iki 14 parų. Be dirginamojo poveikio stebėjimo, turi būti išsamiai apibūdintas ir užrašytas bet koks vietinis toksiškas poveikis, pvz., odos džiūvimas, ir bet koks sisteminis neigiamas poveikis (pvz., poveikis, pasireiškiantis kaip klinikiniai toksiškumo požymiai, ir poveikis kūno masei). Neaiškiems pažeidimams išaiškinti galima būtų daryti histopatologinį tyrimą. Odos reakcijos įvertinimas balais yra neišvengiamai subjektyvus. Siekiant labiau suderinti odos reakcijos įvertinimą balais, padėti bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina stebėjimus, juos vykdantis personalas turi būti atitinkamai apmokytas taikyti įvertinimo balais sistemą (žr. toliau pateiktą lentelę). Tam galėtų būti naudingas iliustruotas odos dirginimo ir kitų pažeidimų įvertinimo vadovas (9).

2. DUOMENYS

2.

2.1 REZULTATŲ PATEIKIMAS Galutinėje ataskaitoje tyrimo rezultatai turi būti apibendrinti lentelėje, į kurią būtų įtraukti visi 3.1 skirsnio punktai.

2.2 REZULTATŲ ĮVERTINIMAS Odos sudirginimo rezultatai turi būti įvertinti pagal pažeidimų tipą ir sunkumą bei atsižvelgiant į grįžtamumą arba į jo nebuvimą. Atskiri rezultatai nėra medžiagos dirginamųjų savybių absoliutusis įvertis, kadangi dar vertinamas kitas bandomosios medžiagos poveikis. Į šiuos atskirus rezultatus reikėtų žiūrėti kaip į pamatines vertes, kurios turi būti vertinamos kartu su visais kitais tyrimo rezultatais. Vertinant sudirginimą turėtų būti atsižvelgta į odos pažeidimų grįžtamumą. Kai reakcija, pvz., plikimas (ribotame plote), hiperkeratozė, hiperplazija ir pleiskanojimas, pasireiškia baigiantis stebėjimo laikotarpio 14 parai, bandomoji medžiaga priskiriama dirginančioms.

3. ATASKAITOS RENGIMAS

3.

3.1 BANDYMŲ ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:

In vivo bandymo pagrindimas: jau turimų bandymo duomenų įrodomosios vertės analizė, įskaitant nuosekliųjų bandymų strategijos taikymo rezultatus:

ankstesnių bandymų atitinkamų duomenų aprašymas,

duomenys, gauti kiekvienoje bandymų strategijos stadijoje,

darytų in vitro bandymų aprašymas, įskaitant išsamią informaciją apie metodikas, rezultatus, gautus tiriant bandomąją ar etaloninę medžiagą,

duomenų įrodomosios vertės analizė in vivo tyrimui daryti.

Bandomoji medžiaga:

identifikavimo duomenys (pvz., CAS numeris, šaltinis, grynumas, žinomos priemaišos, siuntos numeris),

fizinė būsena ir fizikocheminės savybės (pvz., pH, lakumas, tirpumas, stabilumas),

sudėtis ir komponentų procentinė dalis, jei tai mišinys.

Nešiklis:

identifikavimas, koncentracija (jei tinka), naudojamas tūris,

nešiklio pasirinkimo pagrindimas.

Bandymo gyvūnai:

naudota rūšis ir veislė, kitų, ne baltųjų triušių, naudojimo pagrindimas,

kiekvienos lyties gyvūnų skaičius,

atskirų gyvūnų masė bandymo pradžioje ir pabaigoje,

amžius tyrimo pradžioje,

gyvūnų šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.

Bandymo sąlygos:

tampono dėjimo vietos ruošimo technika,

išsami informacija apie naudojamas tampono medžiagas ir tampono dėjimo techniką,

išsami informacija apie bandomosios medžiagos ruošimą, dėjimą ir nuėmimą.

Rezultatai:

kiekvieno gyvūno dirginimo ar ėsdinimo reakcijos balų, gautų visuose matavimo laiko taškuose, lentelių sudarymas,

visų pastebėtų pažeidimų aprašymas,

pastebėto dirginimo arba ėsdinimo tipo ir laipsnio pasakojamasis aprašymas ir visi histopatologinio tyrimo rezultatai,

kito kartu su dirginimu arba ėsdinimų pasireiškiančio neigiamo vietinio (pvz., odos džiūvimo) ir sisteminio poveikio aprašymas.

Rezultatų aptarimas.

4.1)2)3)4)5)5a)6)7)8)9)

NUORODOS Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410–429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, p. 19–26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, p. 709–720. ECETOC (1990) Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483–524. Testing Method B.40 Skin Corrosion. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecdl.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecdl.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecdl .org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Paprašius, galima gauti OECD sekretoriate].

I LENTELĖ Eritemos ir šašų atsiradimas Edemos atsiradimas ODOS REAKCIJOS VERTINIMO BALAIS SKALĖ

Eritemos nėra … 0 Labai nedidelė eritema (vos pastebima) … 1 Aiškiai apibrėžta eritema … 2 Nuo vidutinės iki didelės eritemos … 3 Didelė eritema (burokėlio raudonumo) arba šašų susidarymas, trukdantis įvertinti eritemą … 4 Didžiausias įmanomas: 4 Edemos nėra … 0 Labai nedidelė edema (vos pastebima) … 1 Nedidelė edema (plotelio kraštai aiškiai apibrėžti, nes yra pakilę) … 2 Vidutinė edema (kraštai pakilę maždaug 1 mm) … 3 Didelė edema (pakilusi daugiau kaip 1 mm ir išplitusi už veikiamo ploto ribų) … 4 Didžiausias įmanomas: 4 Neaiškiems pažeidimams paaiškinti galima būtų daryti histopatologinį tyrimą.

B.5. ŪMUS TOKSIŠKUMAS. AKIŲ DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS

B.5.

1. METODAS Šis metodas atitinka OECD TG 405 (2002).

1.

1.1 ĮVADAS Rengiant šį atnaujintą metodą ypatingas dėmesys buvo kreipiamas į galimą gyvūnų gerovės pagerinimą ir į visos turimos informacijos apie bandomąją medžiagą įvertinimą, siekiant išvengti nebūtinų bandymų su laboratoriniais gyvūnais. Šiame metode rekomenduojama prieš darant aprašytą medžiagos ūmaus akių ėsdinimo ar dirginimo bandymą in vivo atlikti turimų atitinkamų duomenų įrodomosios vertės analizę (1). Jei duomenų nepakanka, jų galima gauti darant nuoseklųjį bandymą (2)(3). Į bandymo strategiją įtraukti šio metodo priede aprašyti įteisinti ir priimti in vitro bandymai. Be to, prieš numatant daryti in vivo akių bandymą akių ėsdinimui prognozuoti, rekomenduojama taikyti in vivo odos dirginimo ar ėsdinimo bandymą. Siekiant vienu metu užtikrinti duomenų mokslinį patikimumą ir gyvūnų gerovę, in vivo bandymai neturėtų būti numatomi tol, kol darant duomenų įrodomosios vertės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apibūdinantys galimą medžiagos ėsdinamąjį ar dirginamąjį poveikį akims. Tokius duomenis sudarys turimų tyrimų su žmonėmis ir (arba) laboratoriniais gyvūnais rezultatai, ėsdinimo ar dirginimo duomenys, gauti apie vieną arba kelias medžiagas, turinčias giminingą struktūrą, arba jų mišinius, duomenys, patvirtinantys medžiagos stiprias rūgštines arba šarmines savybes (4)(5), be to, įteisintų ir priimtų in vitro arba ex vivo odos ėsdinimo ir dirginimo bandymų rezultatai (6)(6a). Tyrimai gali būti daromi prieš duomenų įrodomosios vertės analizę arba kaip jos rezultatas. Tokia kai kurių medžiagų analizė gali parodyti, kad reikia daryti medžiagos akių ėsdinimo ar dirginimo gebos in vivo tyrimus. Visais šiais atvejais prieš numatant daryti in vivo akių bandymą, iš pradžių reikėtų daryti medžiagos poveikio odai in vivo tyrimą ir ją įvertinti pagal B.4 bandymo metodą (7). Duomenų įrodomosios vertės analizės ir nuosekliųjų bandymų strategijos taikymas turėtų sumažinti poreikį in vivo bandyti tokių medžiagų, apie kurias jau yra gauta pakankamai duomenų darant kitus tyrimus, akių ėsdinimo ar dirginimo poveikį. Jei taikant nuosekliųjų bandymų strategiją akių ėsdinimo arba dirginimo geba negali būti nustatyta net po odos ėsdinimo ir dirginimo in vivo tyrimo, galima daryti in vivo akių ėsdinimo ar dirginimo bandymą. Pirmenybė teikiama į šio metodo priedą įtrauktai nuosekliųjų bandymų strategijai, kurią sudaro įteisinti ir priimti in vitro arba ex vivo odos ėsdinimo ar dirginimo bandymai. Strategiją parengė ir vienbalsiai rekomendavo OECD seminaro dalyviai (8), ji buvo priimta ir rekomenduota kaip visuotinai suderintos cheminių medžiagų klasifikavimo sistemos (GHS) bandymų strategija (9). Rekomenduojama laikytis šios bandymų strategijos prieš pradedant in vivo bandymus. Naujoms medžiagoms rekomenduojamas nuoseklusis bandymo būdas moksliškai pagrįstiems duomenims apie medžiagos ėsdinimo ar dirginimo savybes gauti. Turimoms medžiagoms, apie kurių odos ėsdinimo ar dirginimo savybes duomenų nepakanka, ši strategija turėtų būti taikoma, jei trūksta duomenų. Kitokios bandymo strategijos arba metodikos taikymas arba sprendimas netaikyti nuoseklaus bandymų metodo turi būti pagrįstas.

1.2 SĄVOKOS Akių dirginimas – akių pokyčių sukėlimas, paveikus bandomąja medžiaga priekinį akies paviršių, kai pokyčiai visiškai išnyksta per 21 parą po veikimo. Akių ėsdinimas – akies audinių pažeidimas arba sunkus regėjimo pablogėjimas, paveikus bandomąja medžiaga priekinį akies paviršių, kai pažeidimai ne visiškai išnyksta per 21 parą po veikimo.

1.3 BANDYMO METODO ESMĖ Ant bandomo gyvūno vienos akies dedama viena bandomosios medžiagos dozė; nepaveikta gyvūno akis naudojama kontrolei. Apibrėžtais laiko tarpais nustatomi ir balais įvertinami junginės, ragenos ir rainelės pažeidimai. Be to, poveikio išsamiam įvertinimui aprašomas bet koks kitas poveikis ir neigiamas sisteminis poveikis. Tyrimo trukmė turi būti pakakama poveikio grįžtamumui arba negrįžtamumui įvertinti. Gyvūnai, kuriems kurioje nors bandymo stadijoje pasireiškia nuolatiniai sunkių kančių ir (arba) skausmo požymiai, turi būti humaniškai nužudomi, o medžiaga atitinkamai įvertinama. Kriterijai, pagal kuriuos priimamas sprendimas dėl humaniško gaištančių ir labai kenčiančių gyvūnų nužudymo, aprašyti (10) nuorodoje.

1.4 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.4

1.4.1 Pasiruošimas in vivo bandymui

1.4.1

1.4.1.1 Gyvūnų rūšies pasirinkimas Tinkamiausias laboratorinis gyvūnas – baltasis triušis; naudojami sveiki, jauni ir suaugę triušiai. Kitų rūšių naudojimas turi būti pagrįstas.

1.4.1.2 Gyvūnų ruošimas Abi kiekvieno bandymui numatyto gyvūno akys patikrinamos per 24 h iki bandymo pradžios. Gyvūnai, kuriems nustatomas akių dirginimas, akių defektai arba prieš tai buvęs ragenos pažeidimas, neturi būti naudojami.

1.4.1.3 Laikymo ir šėrimo sąlygos Gyvūnai turi būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandymo triušiai, temperatūra turi būti 20 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio.

1.4.2 Bandymo eiga

1.4.2

1.4.2.1 Bandomosios medžiagos dėjimo būdas Bandomoji medžiaga dedama į kiekvieno gyvūno vienos akies junginės maišelį, švelniai atitraukiant apatinį voką nuo akies obuolio. Vokai švelniai suspaudžiami maždaug vienai sekundei, kad būtų išvengta medžiagos nuostolių. Kita neapdorota akis naudojama kontrolei.

1.4.2.2 Akių plovimas Bandomo gyvūno akių, įdėjus bandomosios medžiagos, reikėtų neplauti mažiausiai 24 h, išskyrus kietąsias medžiagas (žr. 1.4.2.3.2 skirsnį) ir jei iš karto pasireiškia ėsdinimo arba dirginimo poveikis. Po 24 h akis galima plauti, jei manoma, kad tai reikia daryti. Nerekomenduojama naudoti pagalbinės gyvūnų grupės plovimo įtakai tirti, išskyrus kai tai yra moksliškai pagrįsta. Prireikus pagalbinės grupės, reikėtų naudoti du gyvūnus. Kruopščiai aprašomos plovimo sąlygos, pvz., plovimo laikas, plovimo tirpalo sudėtis ir temperatūra, trukmė, tūris ir tiekimo greitis.

1.4.2.3 Dozės dydis

1.4.2.3

1.4.2.3.1 Skysčių bandymas Bandant skysčius, naudojama 0,1 ml dozė. Nereikėtų naudoti purškiklio medžiagai tiesiai į akį purkšti. Prieš įpurškiant 0,1 ml į akį, skystis iš pradžių pumpuojamas ir surenkamas į indą.

1.4.2.3.2 Kietųjų medžiagų bandymas Bandant kietąsias medžiagas, pastą ir daleles, naudojamos medžiagos tūris turi būti 0,1 ml arba masė – ne didesnė kaip 100 mg. Bandomoji medžiaga turi būti sumalta į smulkias dulkes. Kietosios medžiagos tūris matuojamas ją švelniai sutankinus, pvz., tapšnojant matavimo indą. Jei stebint pirmą kartą, praėjus 1 h po akies apdorojimo, kieta bandomoji medžiaga nepašalinama iš bandomo gyvūno akies veikiant fiziologiniams mechanizmams, akį galima praplauti fiziologiniu tirpalu arba distiliuotu vandeniu.

1.4.2.3.3. Aerozolių bandymas Prieš įlašinant į akį rekomenduojama visas purškiamąsias medžiagas ir aerozolius iš pradžių surinkti į indą. Viena išimtis daroma slėgimuose aerozolių purkštuvuose esančioms medžiagoms, kurių negalima sukaupti dėl garavimo. Tokiais atvejais akis atmerkiama ir bandomoji medžiaga maždaug vieną sekundę tiesiog švirkščiama į akį stačiu kampu iš 10 cm atstumo. Šis atstumas gali būti kitoks, atsižvelgiant į purkštuvo ir jo turinio slėgį. Reikia imtis atsargumo priemonių nepažeisti akies veikiant purškimo slėgiui. Atitinkamais atvejais gali tekti įvertinti mechaninio akies pažeidimo srauto jėga galimybę. Aerozolio dozei įvertinti galima modeliuoti šį įpurškimo bandymą: per triušio akies dydžio angą medžiaga purškiama ant pasverto popieriaus lapo, dedamo tiesiai prieš akį. Popieriaus masės padidėjimas naudojamas apytikriam į akį įpurkšto kiekio įvertinimui. Lakiųjų medžiagų dozė gali būti įvertinta pasveriant indą su medžiaga prieš įpurškimą ir po jo.

1.4.2.4 Pradinis bandymas (in vivo akies dirginimo ar ėsdinimo bandymas su vienu gyvūnu) Kaip aiškiai nurodyta nuosekliųjų bandymų strategijos aprašyme (žr. 1 priedą), labai rekomenduojama in vivo bandymą iš pradžių daryti su vienu gyvūnu. Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad taikant aprašytąją metodiką medžiaga yra akį ėsdinanti arba labai ją dirginanti, kiti akies dirginimo bandymai neturi būti daromi.

1.4.2.5 Vietinis nuskausminimas Galima naudoti vietinio nuskausminimo priemones atsižvelgiant į kiekvieną atskirą atvejį. Jei duomenų įrodomosios vertės analizė rodo, kad medžiaga gali sukelti skausmą arba pradinis bandymas rodo skausmingą gyvūno reakciją, prieš įlašinant bandomąją medžiagą galima naudoti vietinio nuskausminimo priemonę. Reikia kruopščiai parinkti vietinio nuskausminimo priemonės tipą, koncentraciją ir dozę, siekiant užtikrinti, kad dėl jos naudojimo nebūtų reakcijos į bandomosios medžiagos poveikį skirtumų. Kontrolinė akis nuskausminama panašiu būdu.

1.4.2.6 Patvirtinamasis bandymas (in vivo akies dirginimo bandymas su papildomais gyvūnais) Jei darant pradinį bandymą ėsdinantis poveikis nepastebimas, dirginantis poveikis arba neigiama reakcija turi būti patvirtinta naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus. Jei darant pradinį bandymą pastebimas labai didelis dirginantis poveikis, rodantis galimą stiprų (neišnykstantį) poveikį darant patvirtinamąjį bandymą, šį bandymą rekomenduojama daryti nuosekliu būdu ir vietoj dviejų papildomų gyvūnų vienu metu naudoti vieną gyvūną. Jei antrajam gyvūnui pasireiškia ėsdinamasis arba sunkus dirginamasis poveikis, bandymas nutraukiamas. Silpnam arba vidutinio dydžio dirginamajam poveikiui patvirtinti gali būti reikalingi papildomi gyvūnai.

1.4.2.7 Stebėjimo laikotarpis Stebėjimo laikotarpio trukmės turi pakakti stebimo poveikio dydžiui ir grįžtamumui visiškai įvertinti. Tačiau bandymas turi būti baigtas bet kuriuo momentu, kai tik gyvūnui pasireiškia ilgalaikiai didelio skausmo arba kančios požymiai (9). Poveikio grįžtamumui nustatyti gyvūnai paprastai stebimi 21 parą po bandomosios medžiagos davimo. Jei grįžtamumas pastebimas anksčiau nei baigiantis 21 parai, bandymas nutraukiamas tuo momentu.

1.4.2.7

1.4.2.7.1 Klinikiniai stebėjimai ir akių reakcijos įvertinimas balais Akys tiriamos praėjus 1, 24, 48, ir 72 h po bandomosios medžiagos įdėjimo. Gyvūnai bandomi ne ilgiau, nei būtina galutinei informacijai gauti. Gyvūnai, kuriems pasireiškia ilgalaikis didelis skausmas arba kančia, turi būti iš karto humaniškai nužudyti, o medžiaga atitinkamai įvertinta. Turi būti humaniškai nužudomi gyvūnai, kuriems po įlašinimo atsiranda šie pažeidimai: ragenos pradūrimas arba didelės ragenos opos, įskaitant stafilomą; kraujo atsiradimas priekinėje akies kameroje; 4 balų ragenos drumstumas, kuris nepraeina po 48 h; šviesos reflekso nebuvimas (2 balų rainelės reakcija) ilgiau kaip 72 h; junginės membranos opos; junginės arba niktitacinės membranos nekrozė, arba nekrozinio audinio lupimasis. Nužudyti reikia todėl, kad tokie pažeidimai paprastai yra negrįžtami. Bandymas su gyvūnais, kuriems akių pažeidimų nepastebima, gali būti baigti ne anksčiau kaip ketvirtą parą po įlašinimo. Gyvūnai su nedideliais ir vidutiniais pažeidimais turi būti stebimi tol, kol pažeidimai pranyksta, arba 21 parą, t. y. iki tyrimo pabaigos. Apžiūrėti reikia po 7, 14 ir 21 paros, kad būtų galima nustatyti pažeidimų tipą ir jų grįžtamumą arba negrįžtamumą. Akių pažeidimo balai (junginės, ragenos ir rainelės) užrašomi kiekvienos apžiūros metu (1 lentelė). Be to, nurodomi visi kiti akies pažeidimai (pvz., panuso, dėmių atsiradimas) arba sisteminis neigiamas poveikis. Reakcijos tikrinimą galima palengvinti naudojant binokulinę lupą, rankinę plyšinę lempą, biologinį mikroskopą arba kitokį tinkamą įtaisą. Užrašius 24 h stebėjimus, akys gali būti tiriamos naudojant fluoresceiną. Akių reakcijos įvertinimas balais neišvengiamai yra subjektyvus. Siekiant labiau suderinti akių reakcijos įvertinimą balais ir padėti bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina stebėjimus, juos vykdantis personalas turi būti atitinkamai mokomas taikyti įvertinimo balais sistemą.

2. DUOMENYS

2.

2.2 REZULTATŲ ĮVERTINIMAS Akių dirginimo rezultatai įvertinami pagal pažeidimų tipą ir sunkumą bei atsižvelgiant į grįžtamumą arba į jo nebuvimą. Atskiri rezultatai nėra medžiagos dirginamųjų savybių absoliučiuoju įverčiu, kadangi dar įvertinamas kitas bandomosios medžiagos poveikis. Į šiuos atskirus rezultatus reikėtų žiūrėti kaip į pamatines vertes, reikšmingas tik tais atvejais, kai jas patvirtina išsamus visų kitų stebėjimų aprašymas ir įvertinimas.

3. ATASKAITOS RENGIMAS

3.

3.1 BANDYMŲ ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:

In vivo bandymo pagrindimas: jau turimų bandymo duomenų įrodomosios vertės analizė, įskaitant nuosekliųjų bandymų strategijos taikymo rezultatus:

ankstesnių bandymų atitinkamų duomenų aprašymas,

duomenys, gauti kiekvienoje bandymų strategijos stadijoje,

darytų in vitro bandymų aprašymas, įskaitant išsamią informaciją apie procedūras, rezultatus, gautus tiriant bandomąją ar etaloninę medžiagai,

daryto in vivo odos dirginimo ar ėsdinimo tyrimo aprašymas, įskaitant gautus rezultatus,

duomenų įrodomosios vertės analizė in vivo tyrimui daryti.

Bandomoji medžiaga:

identifikavimo duomenys (pvz., CAS numeris, šaltinis, grynumas, žinomos priemaišos, siuntos numeris),

fizikinė būsena ir fizikocheminės savybės (pvz., pH, lakumas, tirpumas, stabilumas, reagavimas su vandeniu),

sudėtis ir komponentų procentinė dalis, jei tai mišinys,

jei naudojama vietinio nuskausminimo priemonė: identifikavimas, grynumas, tipas, dozė ir galima sąveika su bandomąja medžiaga.

Nešiklis:

identifikavimas, koncentracija (jei tinka), naudojamas tūris,

nešiklio pasirinkimo pagrindimas.

Bandymo gyvūnai:

naudota rūšis ar veislė, kitų nei baltųjų triušių naudojimo pagrindimas,

kiekvieno gyvūno amžius tyrimo pradžioje,

kiekvienos lyties gyvūnų skaičius bandymo ir kontrolinėje (jei reikia) grupėje,

atskirų gyvūnų masė bandymo pradžioje ir pabaigoje,

gyvūnų šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir kt.

Rezultatai:

metodo, taikyto dirginimui kiekvienu stebėjimo momentu įvertinti balais (pvz., rankinė plyšinė lempa, biologinis mikroskopas, fluoresceinas), aprašymas,

kiekvieno gyvūno dirginimo ar ėsdinimo reakcijos duomenų, gautų kiekvienu stebėjimo momentu iki gyvūno pašalinimo iš bandymo, lentelių sudarymas,

stebimo dirginimo arba ėsdinimo tipo ir laipsnio pasakojamasis aprašymas,

visų kitų akies pažeidimų aprašymas (pvz., vaskuliarizacija, panuso susidarymas, sąaugų, dėmių atsiradimas),

bet kokio ne akims daromo neigiamo vietinio ir sisteminio poveikio aprašymas, visi histopatologinio tyrimo rezultatai, jei yra.

Rezultatų aptarimas.

3.2 REZULTATŲ AIŠKINIMAS Akių dirginimo rezultatų, gautų laboratoriniams gyvūnams, ekstrapoliavimas žmonėms tinka tik tam tikru laipsniu. Daugeliu atvejų baltieji triušiai yra jautresni akis dirginančioms arba ėsdinančioms medžiagoms nei žmonės. Aiškinant rezultatus reikia neįtraukti antrinės infekcijos sukelto dirginimo.

4.1)2)3)4)5)6)6a)7)8)9)10)

NUORODOS Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410–429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G, Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159–164. Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, p. 161–177 Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, p. 19–26. Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227–231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483–524. Testing Method B.40 Skin Corrosion. Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicol ogical Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 – 24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

1 LENTELĖ. AKIŲ PAŽEIDIMO VERTINIMO BALAIS SKALĖ Ragena

Drumstis: tankumo laipsnis (duomenys imami iš tankiausios srities) Opėjimo arba drumsties nėra … 0 Išsibarsčiusios arba išsklaidytos drumsties sritys (išskyrus nedidelį normalaus blizgesio sumažėjimą), rainelės elementai aiškiai matomi … 1 Lengvai įžiūrima pusiau skaidri sritis, rainelės elementai šiek tiek dulsvi … 2 Perlamutrinės sritys, rainelės elementai nematomi, vyzdžio dydis vos įžiūrimas … 3 Ragena matinė, dėl drumsties rainelės nesimato … 4 Didžiausias įmanomas: 4 PASTABOS

Rainelė

Normali … 0 Labai pagilėjusios raukšlės, kongestija, pabrinkimas, vidutiniškajunginės apie rageną hiperemija; arba injekcija; rainelė vis dar reaguoja į šviesą (vangi reakcija laikoma poveikiu) … 1 Kraujavimas, stiprus suardymas arba nėra reakcijos į šviesą … 2 Didžiausias įmanomas: 2

Junginė

Raudonumas (taikoma voko ir obuolio j unginei, išskyrus rageną ir rainelę) Normali … 0 Kai kurie kraujo indai aiškiai hiperemiški (įšvirkšta) … 1 Išsklaidyta tamsiai raudona spalva, atskiri indai sunkiai įžiūrimi … 2 Išsklaidyta jautienos raudonumo spalva … 3 Didžiausias įmanomas: 3

Chemozė

Paburkimas (taikoma vokams ir (arba) niktitacinėms membranoms) Paburkimo nėra … 0 Nedidelis paburkimas, didesnis nei normalus … 1 Akivaizdus paburkimas, vokai iš dalies išvirsta … 2 Paburkimas, pusiau užmerkti vokai … 3 Paburkimas, vokai užmerkti daugiau nei per pusę … 4 Didžiausias įmanomas: 4

B.6. ODOS SENSIBILIZACIJA

B.6.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Pastabos Jautrūs ir galintys aptikti potencialius žmogaus odos alergenus tyrimai yra svarbūs klasifikuojant pavojus, kylančius žmonių sveikatai. Nėra vieno tyrimo metodo, tiksliai nustatančio visas odą galinčias sensibilizuoti medžiagas bei tinkančio visoms medžiagoms. Pasirenkant tyrimą, reikia atsižvelgti į medžiagos fizikines savybes, taip pat ir sugebėjimą prasiskverbti pro odą. Sukurti dviejų tipų tyrimai, naudojant jūrų kiaulytes, t. y. adjuvantiniai tyrimai, kuriais alerginės reakcijos sustiprinamos tiriamąją medžiagą ištirpinant (ar padarant suspensiją) Freudo pilname adjuvante (FPA) ir neadjuvantiniai tyrimai. Adjuvantiniai tyrimai tiksliau nustato žmogaus odą galinčias sensibilizuoti medžiagas negu tyrimai, kurie nenaudoja Freudo pilno adjuvanto. Nors gali būti naudojami ir kiti metodai, nustatantys odą sensibilizuoti galinčias medžiagas, jūrų kiaulytės maksimizacijos tyrimas (JKMT) yra plačiausiai naudojamas adjuvantinis tyrimas. Manoma, kad neadjuvantiniai tyrimai (plačiausiai naudojamas Buehlerio tyrimas) daugeliui medžiagų klasių yra mažiau jautrūs. Kartais dėl svarių priežasčių pasirenkamas Buehlerio tyrimas, naudojantis antodines aplikacijas, o ne jūrų kiaulytės maksimizacijos tyrimas, naudojantis įodines injekcijas. Naudojant Buehlerio tyrimą, tai reikėtų moksliškai pagrįsti. Šiame metode aprašyti jūrų kiaulytės maksimizacijos tyrimas (JKMT) ir Buehlerio tyrimas. Moksliškai pagrindus, galima naudoti ir kitus standartizuotus metodus. Pripažintam atrankos tyrimui pateikus teigiamą rezultatą, tiriamoji medžiaga gali būti apibūdinama kaip potencialus alergenas, ir tolesnis jūrų kiaulytės tyrimas nebūtinas. Pateikus neigiamą rezultatą, turi būti atliktas jūrų kiaulytės tyrimas, remiantis šiame metode aprašyta procedūra. Taip pat žiūrėkite Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS Odos sensibilizacija (alerginis kontaktinis dermatitas) – tai imuninės kilmės odos reakcija į medžiagą. Žmonėms atsakas gali pasireikšti odos niežėjimu, paraudimu, patinimu, spuogeliais, pūslėmis, pūslelėmis ar jų deriniu. Gyvūnų odos reakcijos skiriasi, jos pasireiškia paraudimu ir patinimu. Indukcinis poveikis – eksperimentinis organizmo poveikis tiriamąja medžiaga, siekiant sukelti organizmo padidėjusio jautrumo būklę. Indukcinis periodas – ne trumpesnis negu viena savaitė po indukcinio poveikio; jo metu gali išsivystyti organizmo padidėjusio jautrumo būklė. Provokacinis poveikis – pakartotinis organizmo poveikis tiriamąja medžiaga po indukcinio periodo, siekiant nustatyti, ar organizmas reaguoja padidintai jautriai (alergiškai).

1.3. KONTROLINĖS MEDŽIAGOS Naudojamos eksperimentinės technikos jautrumas ir rezultatų patikimumas turi būti įvertinamas kas šeši mėnesiai, naudojant medžiagas žinomas kaip silpno ar vidutinio stiprumo odos sensibilizatoriai. Tinkamai atlikus tyrimą, adjuvantiniame bandyme mažiausiai 30 %, o neadjuvantiniame bandyme mažiausiai 15 % gyvūnų atsakų rodo silpną/vidutinio stiprumo sensibilizatorių (alergeną). Yra naudojamos šios medžiagos: CAS Nr. EINECS Nr. EINECS pavadinimas Įprastas pavadinimas 101-86-0 202-983-3 cinamono rūgšties heksialdehidas cinamono rūgšties heksialdehidas 149-30-4 205-736-8 benztiazol-2-tiolis (2-merkaptobenztiazolas) kaptaksas 94-09-7 202-303-5 benzokainas nordkainas Esant svarioms priežastims, atitinkamai pagrindus, galima naudoti kitas kontrolines medžiagas.

1.4. TIRIAMOJO METODO PRINCIPAS Iš pradžių tiriamieji gyvūnai paveikiami tiriamosios medžiagos įodinėmis injekcijomis ir (arba) antodinėmis aplikacijomis (indukcinis periodas). Praėjus 10-14 dienų poilsio laikotarpiui (indukciniam periodui), kurio metu gali pasireikšti imuninis atsakas, gyvūnai paveikiami provokacine doze. Tiriamųjų gyvūnų odos reakcijos į provokacinį poveikį apimtis ir laipsnis yra lyginami su kontrolinių gyvūnų, kurie patyrė imitacinį (nesensibilizuojančios medžiagos) indukcijos ir provokacijos poveikį.

1.5. TIRIAMOJO METODO APRAŠYMAS Jeigu tiriamąją medžiagą būtina nuplauti, reikia naudoti vandenį ar tinkamą tirpiklį, kad nepakistų gautas atsakymas ar odos vientisumas.

1.5.

1.5.1. Jūrų kiaulytės maksimizacijos tyrimas (JKMT)

1.5.1.

1.5.1.1. Pasiruošimas Sveikos jaunos suaugę jūros kiaulytės mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Gyvūnai prieš tyrimą atsitiktinės atrankos būdu paskirstomi į tyrimo grupes. Kailis gali būti pašalinamas žirklėmis, skutimu ar chemine depiliacija, stengiantis išvengti odos įbrėžimų. Gyvūnai pasveriami prieš tyrimo pradžią ir jo pabaigoje.

1.5.1.2. Tyrimo sąlygos

1.5.1.2.

1.5.1.2.1. Tiriamieji gyvūnai Naudojamos baltų jūros kiaulyčių įprastinės linijos.

1.5.1.2.2. Skaičius ir lytis Gali būti naudojami patinai ir (arba) patelės. Patelės turi būti nevedusios jauniklių ir nepastojusios. Tiriamojoje grupėje turi būti mažiausiai 10 gyvūnų, o kontrolinėje mažiausiai 5. Panaudojus mažiau negu 20 tiriamųjų ir 10 kontrolinių jūros kiaulyčių, neįmanoma padaryti išvados, kad tiriamoji medžiaga yra alergenas; tiriant papildomą gyvūnų skaičių, griežtai rekomenduojamas bendras tiriamųjų gyvūnų skaičius turi būti ne mažesnis už 20, kontrolinių – ne mažesnis už 10.

1.5.1.2.3. Dozių lygiai Kiekvienam indukciniam poveikiui naudojama gerai organizmo toleruojama didžiausia tiriamosios medžiagos koncentracija, sukelianti nuo silpno iki vidutinio stiprumo odos sudirginimą. Provokaciniam poveikiui naudojama didžiausia nedirginanti odos tiriamosios medžiagos koncentracija. Jeigu būtina, tinkamos koncentracijos nustatomos parengtiniu tyrimu, naudojant du ar tris gyvūnus. Šiam tikslui galima būtų panaudoti ir FPA paveiktus gyvūnus.

1.5.1.3. Procedūra

1.5.1.3.

1.5.1.3.1. Indukcija 0 diena – tiriamoji grupė Menčių srityje atliekamos 0,1 ml tūrio trys poros įodinių injekcijų. Menčių srityje kailis pašalinamas taip, kad kiekvienos poros dalis yra kitoje nugaros vidurio pusėje. 1 injekcija: FPA/vandens ar fiziologinio tirpalo mišinys santykiu 1:1 2 injekcija: tiriamosios medžiagos, ištirpintos tinkamame tirpiklyje, pasirinkta koncentracija 3 injekcija: tiriamosios medžiagos pasirinkta koncentracija, pagaminta panaudojant mišinį -FP A/vanduo ar fiziologinis tirpalas santykiu 1:1. Ruošiant 3 injekciją, vandenyje tirpios medžiagos tirpinamos vandenyje, po to maišomos su FPA. Kai medžiagos tirpios riebaluose ir netirpios vandenyje, pirmiausia padaroma suspensija su FPA, po to įpilama vandens. Tiriamosios medžiagos galutinė koncentracija turi būti tokia pati, kaip ir antrojoje injekcijoje. 1 ir 2 injekcijos suleidžiamos arčiau galvos viena šalia kitos, tuo tarpu 3 injekcija suleidžiama arčiau uodegos esančiame tiriamajame plote. 0 diena – kontrolinė grupė Tose pat vietose kaip ir tiriamiesiems gyvūnams atliekamos 0,1 ml tūrio trys poros įodinių injekcijų. 1 injekcija: FPA/vandens ar fiziologinio tirpalo mišinys santykiu 1:1 2 injekcija: neskiestas tirpiklis 3 injekcija: tirpiklio 50 % tirpalas, pagamintas panaudojant mišinį – FP A/vanduo ar fiziologinis tirpalas santykiu 1:1. 5–7 diena – tiriamoji ir kontrolinės grupės Jeigu tiriamoji medžiaga nedirgina odos, apytikriai 24 valandas prieš antodines indukcines aplikacijas, nuo tų pačių odos plotelių nukirpus ir (ar) nuskutus kailį, tepamas 0,5 ml 10 % natrio laurilo sulfato tirpalas vazeline (siekiant sukelti vietinį dirginimą). 6–8 diena – tiriamoji grupė Nuo tiriamojo ploto vėl pašalinamas kailis. Filtravimo popierius (2 × 4 cm) sudrėkinamas (padengiamas) tiriamąja medžiaga, ištirpinta tirpiklyje, uždedamas ant tiriamojo ploto ir fiksuojamas okliuzine (nepralaidžia) tvarstomąja medžiaga 48 valandoms. Tirpiklio pasirinkimą reikia pagrįsti. Kietosios medžiagos yra susmulkinamos ir sumaišomos tirpiklyje. Skysčiai gali būti naudojami neskiesti. 6-8 diena – kontrolinė grupė Nuo tiriamojo ploto vėl pašalinamas kailis. Viskas atliekama tai pat kaip ir tiriamojoje grupėje, vietoj tiriamosios medžiagos naudojant tirpiklį; vėliau viskas fiksuojama okliuzine (nepralaidžia) tvarstomąja medžiaga 48 valandoms.

1.5.1.3.2. Provokacija 20–22 diena – tiriamoji ir kontrolinė grupės Nuo tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų šonų pašalinamas kailis. Lopas, sudrėkintas (padengtas) tiriamąja medžiaga, uždedamas ant vieno šono odos plotelio. Jeigu reikia, ant kito šono uždedamas lopas, sudrėkintas tirpikliu. Lopas yra fiksuojamos okliuzine tvarstomąja medžiaga 24 valandoms.

1.5.1.3.3. Stebėjimas ir vertinimas: tiriamoji ir kontrolinė grupės Skatinamas tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų vertinimas aklu būdu. Jeigu būtina išryškinti pirmoje provokacijoje pastebėtus rezultatus, praėjus maždaug vienai savaitei, atliekama antra provokacija (t. y. reprovokacija) su atitinkama nauja kontrolės grupe. Reprovokaciją taip pat galima atlikti su pradine kontroline grupe. Dėl indukcinių ir provokacinių procedūrų kilusios visos odos ir bet kokios neįprastos, taip pat ir somatinės, reakcijos, stebimos ir įvertinamos pagal Magnussono/Kligmano skalę (žiūrėti priedą). Kitos procedūros, pvz., histopatologinis tyrimas, odos raukšlės sustorėjimo matavimas, gali būti atliekamos tik išryškėjus neaiškioms reakcijoms.

praėjus maždaug 21 valandai po lopo nuėmimo, provokacinis plotas nuvalomas, nukerpamas ir (arba) nuskutamas, o jeigu būtina, depiliuojamas,

maždaug po 3 valandų (praėjus maždaug 48 valandoms nuo provokacinės aplikacijos pradžios) apžiūrima odos reakcija ir įvertinama balais, taip kaip paaiškinta priede,

praėjus maždaug 24 valandoms po šio apžiūrėjimo, odos reakcija apžiūrima antrą kartą (72 valandos) ir įvertinama balais.

1.5.2. Buehlerio tyrimas

1.5.2.

1.5.2.1. Pasiruošimas Sveikos jaunos suaugusios jūros kiaulytės mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Gyvūnai prieš tyrimą atsitiktinės atrankos būdu paskirstomi į tyrimo grupes. Kailis gali būti pašalinamas žirklėmis, skutimu ar chemine depiliacija, stengiantis išvengti odos įbrėžimų. Gyvūnai pasveriami prieš tyrimo pradžią ir jo pabaigoje.

1.5.2.2. Tyrimo sąlygos

1.5.2.2.

1.5.2.2.1. Tiriamieji gyvūnai Naudojamos baltų jūros kiaulyčių įprastinės linijos.

1.5.2.2.2. Skaičius ir lytis Gali būti naudojami patinai ir (arba) patelės. Patelės turi būti nevedusios jauniklių ir nepastojusios. Mažiausiai 20 gyvūnų naudojama tiriamojoje ir mažiausiai 10 gyvūnų kontrolinėje grupėse.

1.5.2.2.3. Dozių lygiai Kiekvienam indukciniam poveikiui naudojama didžiausia tiriamosios medžiagos koncentracija, sukelianti silpną ne pernelyg didelį odos sudirginimą. Provokaciniam poveikiui naudojama didžiausia nedirginanti odos tiriamosios medžiagos koncentracija. Jeigu būtina, tinkamos koncentracijos nustatomos parengtiniu tyrimu, naudojant du ar tris gyvūnus. Vandenyje tirpioms tiriamosioms medžiagoms tirpikliu naudojamas vanduo ar atskiestas nedirginantis ploviklio (detergento) tirpalas. Kitoms tiriamosioms medžiagoms indukcijai tirpikliu naudojamas 80 % etanolis, o provokacijai acetonas.

1.5.2.3. Procedūra

1.5.2.3.

1.5.2.3.1. Indukcija 0 diena – tiriamoji grupė Nuo vieno gyvūno šono pašalinamas kailis. Tyrimui naudojamas lopas turi būti pilnai prisigėręs tiriamosios medžiagos, ištirpintos tirpiklyje (tirpiklio pasirinkimą reikia pagrįsti; skystos tiriamosios medžiagos gali būti neskiedžiamos). Tyrimui naudojamas lopas (kompresas) pridedamas prie bandomojo ploto ir 6 h laikomas prispaustas prie odos okliuziniu lopu arba gaubteliu ir tinkama tvarstomąja medžiaga. Tyrimui naudojamas lopas turi būti okliuzinis. Jam tinka vatos sluoksnis, jis gali būti apvalus ar kvadratinis, maždaug 4-6 cm . Nepralaidi medžiaga geriausiai užtikrina okliuziją. Naudojant kitokią medžiagą, lopą reiktų ilgiau laikyti. 0 diena – kontrolinė grupė Nuo vieno gyvūno šono pašalinamas kailis. Viskas atliekama tai pat kaip ir tiriamojoje grupėje, vietoj tiriamosios medžiagos naudojant tik tirpiklį. Tyrimui naudojamas lopas fiksuojamas tinkama tvarstomąja medžiaga 6 valandoms. Jeigu parodoma, kad imitacinė kontrolinė grupė nebūtina, gali būti naudojama paprasta kontrolinė grupė. 6–8 ir 13–15 diena – tiriamoji ir kontrolinė grupė 6–8 ir 13–15 dienomis ant to paties šono tiriamojo ploto (jei būtina, pašalinus kailį) atliekamos tokios pačios pakartotinos aplikacijos kaip ir 0 dieną.

1.5.2.3.2. Provokacija 27–29 diena – tiriamoji ir kontrolinė grupė Nuo netirto tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų šono pašalinamas kailis. Ant tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų užpakalinio netirto šono dedamas prisigėręs reikiamo kiekio tiriamosios medžiagos okliuzinis lopas. Medžiaga turi būti didžiausios nedirginančios koncentracijos. Kada reikia, ant tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų priekinio netirto šono dedamas okliuzinis lopas, prisigėręs tik tirpiklio. Viskas fiksuojama tinkama tvarstomąja medžiaga 6 valandoms.

1.5.2.3.3. Stebėjimas ir vertinimas Skatinamas tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų vertinimas akluoju būdu. Jeigu būtina išryškinti pirmoje provokacijoje pastebėtus rezultatus, praėjus maždaug vienai savaitei, atliekama antra provokacija (t. y. reprovokacija) su atitinkama nauja kontrolės grupe. Reprovokaciją taip pat galima atlikti su pradine kontroline grupe. Dėl indukcinių ir provokacinių procedūrų kilusios visos odos ir bet kokios neįprastos, tame tarpe somatinės, reakcijos, stebimos ir įvertinamos pagal Magnussono/Kligmano skalę (žiūrėti priedėlį). Kitos procedūros, pvz., histopatologinis tyrimas, odos raukšlės sustorėjimo matavimas, gali būti atliekamos tik išryškėjus neaiškioms reakcijoms.

praėjus maždaug 21 valandai po lopo nuėmimo, nuo provokacinio ploto pašalinamas kailis,

maždaug po 3 valandų (praėjus maždaug 30 valandų nuo provokacinės aplikacijos) apžiūrima odos reakcija ir įvertinama balais, taip kaip paaiškinta priede,

praėjus maždaug 24 valandoms po 30 valandų apžiūrėjimo (maždaug 54 valandoms po provokacinės aplikacijos), odos reakcija apžiūrima antrą kartą ir įvertinama balais.

2. DUOMENYS (JKMT IR BUEHLERIO) Duomenys turi būti pateikti lentelės forma, parodant kiekvieno gyvūno odos reakciją kiekvieno stebėjimo metu.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS (JKMT IR BUEHLERIO) Jeigu prieš bandymą su jūrų kiaulytėmis buvo atliktas atrankos tyrimas, jo aprašymas ir šaltiniai (pvz., vietinio limfinio mazgo tyrimas, pelės akies patinimo tyrimas) turi būti pateikiami kartu su tiriamosios ir kontrolinės medžiagų gautais rezultatais.

3. Tyrimo ataskaita (JKMT ir Buehlerio)

Tyrimo ataskaitoje turėtų būti ši informacija.

Tiriamieji gyvūnai:

panaudotos jūrų kiaulyčių linijos,

skaičius, amžius ir gyvūnų lytis,

gavimo šaltinis, laikymo sąlygos, pašarai ir kt.,

kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje.

Tyrimo sąlygos:

ploto aplikacijai paruošimo technika,

detalės apie lopui panaudotas medžiagas ir techniką,

atrankos tyrimo rezultatai su išvada apie indukcijai ir provokacijai naudotinas koncentracijas,

detalės apie tiriamosios medžiagos paruošimą, aplikaciją ir nuėmimą,

tirpiklio parinkimo pagrindimas,

tirpiklio ir tiriamosios medžiagos koncentracijos, naudotos indukciniam ir provokaciniam poveikiui bei bendras medžiagos kiekis, sunaudotas indukcijai ir provokacijai.

Rezultatai:

rezultatų suvestinė su paskutiniu jautrumo ir patikimumo patikrinimu (žr. 1.3), be to, informacija apie panaudotą medžiagą, koncentraciją ir tirpiklį,

kiekvieno gyvūno įvertinimas balais kartu su vertinimo sistema,

sukeltų poveikių prigimties ir laipsnio pasakojamasis aprašymas,

histopatologiniai duomenys.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4. LITERATŪRA Šis metodas yra analogiškas EBPO 406 tyrimo gairėms.

B.7. PAKARTOTINĖS DOZĖS (28 DIENŲ) TOKSIŠKUMAS (PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ)

B.7.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Žiūrėti Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS Žiūrėti Bendrojo įvado B dalį.

1.3. TIRIAMOJO METODO PRINCIPAS Tiriamosios medžiagos dozės duodamos 28 dienas kasdien paeiliui kelioms eksperimentinių gyvūnų grupėms – po vieną dozės lygį vienai grupei. Kiekvieną dieną medžiagos davimo periodu gyvūnai atidžiai stebimi toksiškumo požymiams nustatyti. Tyrimo metu žuvę arba nužudyti gyvūnai skrodžiami, o tie, kurie išgyveno, nužudomi ir skrodžiami tyrimo pabaigoje. Šio tiriamojo metodo specifinis tikslas yra medžiagos neurologinio poveikio nustatymas, o tai reikalauja labai atidžių gyvūnų klinikinių stebėjimų. Šis metodas nustato potencialiai neurotoksinius chemikalus, kas sąlygoja vėlesnius tyrimus šiuo aspektu. Be to šis metodas gali suteikti duomenų apie medžiagos imunologinį poveikį bei poveikį reproduktyvumui.

1.4. TIRIAMOJO METODO APRAŠYMAS

1.4.

1.4.1. Pasiruošimas Sveiki jauni suaugę gyvūnai atsitiktinės atrankos principu suskirstomi į kontrolinę ir tiriamąsias grupes. Galimas narvų išdėstymo poveikis tyrimo rezultatams turėtų būtų minimalus. Kiekvienas gyvūnas individualiai pažymimas ir mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamas narvuose laboratorijos sąlygomis. Tiriamoji medžiaga leidžiama zondu arba duodama su pašarais ar geriamu vandeniu. Medžiagos patekimo į virškinamąjį traktą kelias priklauso nuo tyrimo tikslų bei fizikinių ir cheminių medžiagos savybių. Jeigu būtina, tiriamoji medžiaga yra ištirpinama arba padaroma jos suspensija tirpiklyje. Pirmiausia rekomenduojamas vandens tirpalas/suspensija, esant svarioms priežastims naudojamas aliejaus (pvz., kukurūzų) tirpalas/suspensija ir tik po to galimi tirpalai kituose tirpikliuose. Naudojamo tirpiklio (ne vandens) toksinės savybės turi būti žinomos. Turėtų būti nustatytas tiriamosios medžiagos pastovumas tirpiklyje.

1.4.2. Tyrimo sąlygos

1.4.2.

1.4.2.1. Tiriamieji gyvūnai Nors gali būti naudojamos ir kitos graužikų rūšys, pirmenybė teikiama žiurkėms. Naudojamos jaunų sveikų suaugusių gyvūnų įprastos laboratorinės linijos. Patelės turi būti nevedę jauniklių ir nepastojusios. Medžiagos dozavimas prasideda tuoj po nujunkymo, bet ne vėliau nei gyvūnams sueina devynios savaitės. Tyrimo pradžioje gyvūnų kūno masės skirtumai turi būti minimalūs ir neviršyti tos lyties kūno masės vidurkio ± 20 %. Jeigu prieš ilgalaikį atliekamas preliminarinis pakartotinos dozės per virškinamąjį traktą tyrimas, abiejuose tyrimuose naudojami gyvūnai turi būti tos pačios linijos ir gauti iš to paties šaltinio.

1.4.2.2. Skaičius ir lytis Kiekvienam dozės lygiui turėtų būti panaudota mažiausiai 10 gyvūnų (penki patinai ir penkios patelės). Jeigu bandymo eigoje planuojamas dalies gyvūnų žudymas, tai pradinis jų skaičius turėtų būti tiek pat padidintas. Tam, kad 14 dienų po dozavimo būtų galima tirti toksinių poveikių grįžtamumą, pastovumą ar uždelstumą gali būti sudaryta papildoma 10 gyvūnų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus), 28 dienas gaunanti didelę medžiagos dozę. Tokiais atvejais naudojama ir papildoma 10 gyvūnų kontrolinė grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus).

1.4.2.3. Dozių lygiai Iš viso turėtų būti panaudotos mažiausiai trys tiriamosios ir viena kontrolinė grupės. Su kontrolinės grupės gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat kaip ir su tiriamaisiais gyvūnais, išskyrus tai, kad jie negauna tiriamosios medžiagos. Jeigu duodant tiriamąją medžiagą naudojamas tirpiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti didžiausią tiriamojoje grupėje panaudotą tirpiklio tūrį. Jeigu įvertinus turimus duomenis, nesitikima jokio 1000 mg/kg k. m./d medžiagos dozės poveikio, galima atlikti ribinį bandymą. Jeigu dozių nustatymui nėra tinkamų duomenų, galima atlikti papildomus tyrimus. Dozės lygius reikia parinkti atsižvelgiant į jau turimus tiriamosios ar jai giminingos medžiagos toksiškumo ir (toksiko-) kinetinius duomenis. Pasirinktas aukščiausias dozės lygis turi sukelti toksinius poveikius, tačiau nesukelti gyvūno žūties ar nepakeliamų kančių. Kiti mažesni dozių lygiai turėtų sukelti atitinkamai mažesnius pokyčius (atsakus), o mažiausias dozės lygis turi turėti nepastebimą neigiamą poveikį (NNPL). Mažėjančia tvarka einantys dozių lygiai vienas nuo kito turėtų skirtis du-keturis kartus, tik ketvirtai papildomai tiriamajai grupei dažnai parenkamas didesnis intervalas tarp dozių (pvz., faktorius didesnis negu 10). Tiriamosios medžiagos, duodamos su pašarais ar geriamu vandeniu turi netrukdyti normaliam gyvūnų maitinimuisi ar vandens balansui. Kai tiriamoji medžiaga duodama su pašarais, jos dozė gali būti išreiškiama kaip pastovi pašarų koncentracija (ppm) arba kaip pastovus dozės lygis gyvūno kūno masės vienetui; kitus pasirinktus dozės išraiškos būdus reikėtų tiksliai apibrėžti. Zondu medžiagas reikia suleisti kasdien tuo pačiu laiku, be to, medžiagos dozės lygis gyvūno kūno masės vienetui turėtų būti pastovus. Jeigu prieš ilgalaikį atliekamas preliminarus pakartotinos dozės tyrimas, abiejuose tyrimuose gyvūnams turi būti duodami panašūs pašarai.

1.4.2.4. Ribinis bandymas Jeigu vieno dozės lygio, ne žemesnio negu 1000 mg/kg k. m./d, ir atitinkamo procento pašaruose ar geriamame vandenyje (nustatant pagal gyvūno kūno masę, gaunant su pašarais ar geriamu vandeniu), tyrimas nesukelia pastebimų toksinių poveikių ir jeigu iš turimų duomenų apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, pilnas trijų dozių lygių tyrimas nebūtinas. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia naudoti didesnes dozes.

1.4.2.5. Stebėjimo periodas Stebėjimo periodas turėtų trukti 28 dienas. Papildoma gyvūnų grupė dar mažiausiai 14 dienų po tiriamosios medžiagos gavimo galėtų būti stebima, nustatant poveikių uždelstumą, pastovumą ar atsigavimą nuo jų.

1.4.3. Procedūra Gyvūnams tiriamoji medžiaga duodama 28 dienas kasdien septynias dienas savaitėje; jeigu laikomasi penkių dienų savaitėje režimo, tai reikia pagrįsti. Vienkartinė tiriamosios medžiagos dozė suleidžiama zondu, naudojant skrandžio vamzdelį ar tinkamą intubavimo (įleidimo) kaniulę. Maksimalus vienkartinis suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tiriamosios medžiagos tirpalo tūris neturi viršyti 1 ml/100 g kūno masės, tačiau naudojant vandeninį tiriamosios medžiagos tirpalą galima suleisti 2 ml/100 g kūno masės. Dirginamųjų ir ardančiųjų medžiagų, kurių didelės koncentracijos sukelia sunkius poveikius, tūrio svyravimai turi būti minimalūs.

1.4.3.

1.4.3.1. Bendri stebėjimai Bendrus klinikinius stebėjimus reikia atlikti mažiausiai kartą per dieną geriausiai – tuo pačiu dienos metu, atsižvelgiant į laukiamų poveikių piką. Gyvūnų sveikatos būklę reikia registruoti. Mažiausiai du kartus per dieną visi gyvūnai turėtų būti patikrinami – ar sveiki, ar nepadvėsę. Dvesiantys ar patiriantys dideles kančias ir skausmą gyvūnai turi būti iškeliami iš narvų, pažymimi, humaniškai nužudomi ir skrodžiami. Prieš viso tyrimo pradžią atliekami atidesni klinikiniai visų gyvūnų stebėjimai (individų palyginimui), o vėliau mažiausiai kartą per savaitę. Kiekvieną kartą šie stebėjimai atliekami tuo pačiu metu, perkėlus gyvūną iš narvo į tam skirtą vietą. Geriausia, kai stebėjimai yra kruopščiai registruojami pagal toje laboratorijoje tiksliai apibūdintą vertinimo sistemą. Tyrimo aplinkybių svyravimas turi būti minimalus ir stebėtojai apie tyrimą turėtų nežinoti. Stebėjimo metu nereikėtų apsiriboti odos, kailio, akių, gleivinės pakitimų, išskyrų atsiradimų, autonominio aktyvumo (pvz., ašarojimo, plaukų pašiaušimo, vyzdžio dydžio, neįprastų kvėpavimo pakitimų) registravimu. Reikėtų registruoti eisenos, pozos, reakcijos į paėmimą rankomis pakitimus, kloninių ar toninių judesių atsiradimą bei stereotipinį (pvz., besaikį valymąsi, pasikartojantį sukimąsi ratu) ar keistą (pvz., savęs luošinimą, vaikščiojimą atbulomis) elgesį. Ketvirtą poveikio savaitę turėtų būti įvertintas juntamasis reaktyvumas į skirtingų tipų stimulą (pvz., klausos, regėjimo ir proprioreceptorinį), jėgos (spaudimo) stiprumas bei judamasis aktyvumas. Procedūrų papildomos detalės pateiktos Bendrojo įvado B dalyje. Jeigu prieš subchroninį (90 dienų) atliekamas preliminarinis pakartotinos dozės tyrimas, funkciniai stebėjimai ketvirtą savaitę gali būti neatliekami. Tokiu atveju šie stebėjimai atliekami subchroninio tyrimo metu. Iš kitos pusės, tokie funkciniai stebėjimai pakartotinos dozės tyrime padidina galimybę geriau parinkti dozių lygius tolesniam subchroniniam tyrimui. Išimtiniais atvejais funkciniai stebėjimai neatliekami ir tose grupėse, kuriose toksiškumo požymiai nustatomi tokio laipsnio, kad reikšmingai trukdo funkciniams tyrimams.

1.4.3.2. Kūno masė ir maisto/vandens suvartojimas Visus gyvūnus mažiausiai vieną kartą per savaitę reikia pasverti. Mažiausiai vieną kartą per savaitę reikia išmatuoti maisto ir vandens suvartojimą. Jeigu tiriamoji medžiaga yra duodama su geriamu vandeniu, vandens suvartojimas taip pat turi būti išmatuojamas nerečiau kaip kartą per savaitę.

1.4.3.3. Hematologija Tyrimo pabaigoje nustatoma: hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocitų kiekis, bendras ir atskiras leukocitų kiekis, trombocitų kiekis ir kraujo krešėjimo laikas/potencialas. Kraujo pavyzdžius reikėtų paimti iš nurodomų vietų dar prieš arba gyvūnų žudymo metu ir saugoti atitinkamomis sąlygomis.

1.4.3.4. Klinikinė biochemija Tam, kad ištirti pagrindinius toksinius poveikius audiniams, o ypač inkstams ir kepenims, dar prieš arba gyvūnų žudymo metu (neskaitant dvesiančių gyvūnų ar nužudytų bandymo metu), reikėtų atlikti kraujo klinikinius biocheminius tyrimus. Prieš kraujo pavyzdžių paėmimą rekomenduojama iš vakaro gyvūnams badauti. Kraujo plazmoje arba serume tiriama: natris, kalis, bendras cholesterolis, šlapalas, kreatininas, bendras baltymas ir albuminas, mažiausiai du fermentai, rodantys poveikį kepenų ląstelėms (tokie kaip alaninaminotransferazė, aspartataminotransferazė, šarminė fosfatazė, gamaglutamiltranpeptidazė ir sorbitoldehidrogenazė). Tam tikromis aplinkybėmis papildomi fermentų (hepatinės ar kitos kilmės) ir tulžies rūgščių tyrimai gali suteikti naudingos informacijos. Jeigu paskutinę tyrimų savaitę atliekami neprivalomi šlapimo tyrimai, jis surenkamas per nurodytą laiko tarpą bei nustatoma: šlapimo tūris, išvaizda, kvapas, lyginamasis svoris, pH, baltymai, gliukozė ir kraujo ląstelės. Galima atlikti papildomus serumo rodiklių, rodančių pagrindinių audinių pažeidimus, tyrimus. Jeigu žinomas ar įtariamas tiriamosios medžiagos poveikis organizmo medžiagų apykaitai, galima tirti kalcį, fosforą trigliceridus badavus, specifinius hormonus, methemoglobiną bei cholinesterazę. Tam tikrų grupių medžiagoms arba pastebėjus kai kuriuos neigiamus pakitimus tokie tyrimai būtini. Naudojamos gyvūnų rūšys, pastebėti ir (ar) laukiami tiriamos medžiagos sukelti pokyčiai verčia lanksčiai pasirinkti tiriamuosius rodiklius. Jeigu turimi duomenys apie medžiagą yra prieštaringi, pagrindinį dėmesį dar prieš dozavimo pradžią reikėtų kreipti į hematologinių ir klinikinių biocheminių kintamųjų nustatymo kokybę.

1.4.3.5. Bendrasis skrodimas Kiekvienas tiriamasis gyvūnas turi būti skrodžiamas, atidžiai ištiriamas jo kūno paviršius bei visos jo angos, kaukolė, krūtinės ląsta, pilvo ertmės bei jų turinys. Vengiant išdžiuvimo, visų gyvūnų kepenys, inkstai, antinksčiai, sėklidės, prielipai, užkrūčio liauka, blužnis, smegenys bei širdis turi būti nuvalyti nuo prigludusių pašalinių audinių ir kuo greičiau pasverti. Audinius reikia konservuoti geriausiai jiems tinkamoje fiksavimo terpėje. Histopatologiškai reikėtų ištirti visus bendruosius pakenkimus, smegenis (jų būdingiausias dalis – didžiąsias smegenis, smegenėles ir smegenų tiltą), nugaros smegenis, skrandį, mažąsias ir didžiąsias žarnas (taip pat Peyerio plokšteles), kepenis, inkstus, antinksčius, blužnį, širdį, užkrūčio liauką skydliaukę, trachėją ir plaučius (pripučiant fiksuojamosios medžiagos, o po to panardinant), lytines liaukas, papildomus lytinius organus (pvz., gimdą, prostatą), šlapimo pūslę, limfinius mazgus (vienas limfinis mazgas turėtų atspindėti medžiagos patekimo kelią o kitas, esantis tolėliau, turėtų atspindėti sisteminius poveikius), esantį arčiau raumens periferinį nervą (sėdimąjį arba blauzdikaulio) bei kaulų čiulpų dalį (arba šviežiai paruoštą kaulų čiulpų punkciją). Gauti klinikiniai ir kitokie duomenys gali pareikalauti ištirti papildomus audinius. Be to, turėtų būti konservuojami visi numanomi tiksliniai organai.

1.4.3.6. Histopatologinis ištyrimas Visų kontrolinės ir didžiausios dozės grupių gyvūnų organus ir audinius reikia visiškai histopatologiškai ištirti. Jeigu didžiausios dozės gyvūnų grupėje dėl medžiagos poveikio kilo pakitimai, histopatologiškai ištirti galima ir kitų grupių gyvūnus. Visus bendruosius pakenkimus reikia ištirti. Papildomos grupės gyvūnų pakenktus audinius ir organus taip pat reikia histopatologiškai ištirti.

2. DUOMENYS Turėtų būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to visi duomenys turėtų būti sutraukti į lenteles, pateikiant kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičių tyrimų pradžioje, padvėsusių gyvūnų ar tyrimo metu humaniškumo sumetimais nužudytų bei gyvūnų su toksinio poveikio požymiais skaičių, kiekvienos žūties ar nužudymo laiką, pastebėtų toksinio poveikio požymių apibūdinimą, tame tarpe jų pasireiškimo pradžią, trukmę ir sunkumo laipsnį, gyvūnų su pakenkimais skaičių, pakenkimų tipą ir gyvūnų su įvairių tipų pakenkimais procentą. Jeigu įmanoma, skaitmeniniai rezultatai turėtų būti apdoroti tinkamais ir priimtinais statistiniais metodais. Statistiniai metodai turėtų būti pasirinkti planuojant tyrimą.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS

3. Tyrimo ataskaita

Tyrimo ataskaitoje turėtų būti ši informacija:

Tiriamieji gyvūnai:

panaudotos rūšys/linijos,

gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,

gavimo šaltinis, laikymo sąlygos, pašarai ir kt.,

kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje, kiekvieną savaitę ir tyrimo pabaigoje.

Tyrimo sąlygos:

pagrindimas, jeigu tirpikliu pasirinktas ne vanduo,

dozių lygių parinkimo paaiškinimas,

detalės apie tiriamosios medžiagos mišinio su pašarais paruošimą, preparato gauta koncentracija, pastovumas ir homogeniškumas,

poveikio tiriamąja medžiaga detalės,

perskaičiavimas tiriamosios medžiagos koncentracijos maiste/vandenyje (ppm) į faktinę dozę (mg/kg k. m./d), jeigu įmanoma,

maisto ir vandens kokybė.

Rezultatai:

kūno masė/kūno masės pokyčiai,

maisto ir vandens suvartojimas, jeigu įmanoma,

duomenys apie atsaką į toksinį poveikį, taip pat ir toksiškumo požymius, pagal lytį ir dozės lygį,

klinikinių stebėjimų tipas, sunkumo laipsnis ir trukmė (kurie grįžtami, kurie ne),

juntamojo aktyvumo, spaudimo (jėgos) stiprumo ir judamojo aktyvumo įvertinimas,

hematologiniai tyrimai su svarbiausiomis palyginamosiomis reikšmėmis;

klinikiniai biocheminiai tyrimai su svarbiausiomis palyginamosiomis reikšmėmis,

kūno masė nužudymo metu bei organų masė,

skrodimo duomenys,

visų histopatologinių duomenų smulkus aprašymas,

absorbcijos duomenys, jeigu yra,

statistinis rezultatų apdorojimas ten, kur tinka.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4. LITERATŪRA Šis metodas yra analogiškas EBPO 407 tyrimo gairėms.

B.8. KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENOS) TOKSIŠKUMAS (INHALIACINIS)

B.8.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos dalelių dydžio pasiskirstymą, garų slėgį, lydymosi temperatūrą, virimo temperatūrą, pliūpsnio temperatūrą ir sprogumą (atitinkamais atvejais). Taip pat žr. bendrąją įvadinę B(A) dalį.

1.2. SĄVOKOS Žr. bendrąją įvadinę B(B) dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nėra.

1.4. BANDYMO METODO ESMĖ Kelios eksperimentinių gyvūnų grupės kiekvieną dieną apibrėžtu laikotarpiu yra paveikiamos tiriamąja medžiaga suskirstytomis koncentracijomis, viena koncentracija naudojama vienai grupei 28 dienas. Jeigu tirpiklis naudojamas tam, kad būtų lengviau gaunama atitinkama tiriamosios medžiagos koncentracija aplinkoje, turėtų būti naudojama kontrolinė tirpiklio grupė. Medžiagos įvedimo laikotarpiu gyvūnai stebimi kiekvieną dieną toksiškumo požymiams nustatyti. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, atliekama autopsija, o bandymui pasibaigus, išlikusiems gyviems gyvūnams daroma autopsija.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.6. BANDYMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6.

1.6.1. Pasirengimas Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis laikymo ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento pradžios. Prieš bandymą sveiki jauni gyvūnai randomizuojami ir suskirstomi į reikalingą skaičių grupių. Tam tikrais atvejais į tiriamąją medžiagą gali būti dedama atitinkamo tirpiklio, kad būtų lengviau gaunama atitinkama medžiagos koncentracija aplinkoje. Jeigu tirpiklis arba kiti priedai naudojami dozavimui palengvinti, turi būti žinoma, kad jie nesukelia toksiško poveikio. Atitinkamais atvejais gali būti naudojami ankstesnių bandymų duomenys.

1.6.2. Bandymo sąlygos

1.6.2.

1.6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai Jeigu nėra kontraindikacijų, pirmenybė atiduodama žiurkėms. Naudojamos įprastų laboratorinių veislių jauni, sveiki gyvūnai. Bandymą užbaigus naudotų gyvūnų svorio pokyčiai neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.

1.6.2.2. Skaičius ir lytis Kiekvienoje bandymo grupėje turėtų būti naudojama ne mažiau 10 gyvūnų (penkios patelės ir penki patinėliai). Patelės turėtų būti neturėjusios jauniklių ir būti nevaikingos. Jeigu planuojami tarpiniai nužudymai, gyvūnų skaičius turėtų būti padidinamas tokiu gyvūnų skaičiumi, kuris buvo planuojamas nužudyti iki bandymo pabaigos. Be to, papildoma 10 gyvūnų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus) gali būti paveikiama didele koncentracija 28 dienas ir po poveikio 14 dienų stebimi toksinių poveikių grįžtamumo, stabilumo arba uždelsto atsiradimo požymiai. Taip pat naudojama papildoma kontrolinė 10 gyvūnų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus).

1.6.2.3. Poveikio koncentracija Turi būti ne mažiau kaip trys tiriamosios medžiagos koncentracijos ir viena kontrolinė arba tirpiklio kontrolinė grupė (atitinkanti didžiausios dozės tirpiklio koncentraciją), jeigu naudojamas tirpiklis. Išskyrus tuos atvejus, kai paveikiama tiriamąja medžiaga, su kontrolinės grupės gyvūnais turėtų būti elgiamasi visiškai taip pat, kaip su bandomosios grupės gyvūnais. Didžiausia koncentracija turėtų sukelti toksiškumo, poveikį, bet neturi būti mirštamumo arba tik kelių tokių atvejų priežastimi. Mažiausia koncentracija neturėtų sukelti jokio toksiškumo požymio. Jeigu yra praktinis poveikio žmogui įvertinimas, mažiausia dozė jį turėtų viršyti. Geriausia, jeigu vidurinė dozė galėtų sukelti mažiausius pastebimus toksiškumo poveikius. Jeigu naudojama daugiau negu viena tarpinė dozė, dozės turėtų būti išskirstomos intervalais taip, kad toksiškus poveikius būtų galima grupuoti. Mažų ir tarpinių dozių bei kontrolinėje grupėse žūties atvejų paplitimas turėtų būti nedidelis, kad būtų galima prasmingai įvertinti rezultatus.

1.6.2.4. Poveikio trukmė Kiekvienos dienos poveikio trukmė turėtų būti šešios valandos, bet gali būti reikalingi kitokie laikotarpiai, kad atitiktų specialius reikalavimus.

1.6.2.5. Įrenginiai Gyvūnai turėtų būti bandomi inhaliacinėje įrangoje, sukonstruotoje taip, kad būtų išlaikomas dinaminis oro srautas, kuriam esant per valandą oras pasikeičia ne mažiau kaip 12 kartų, užtikrinant pakankamą deguonies kiekį ir vienodą poveikio atmosferos pasiskirstymą. Jeigu naudojama kamera, ji turėtų būti taip suprojektuota, kad bandomieji gyvūnai nesibūriuotų ir kad įkvepiant tiriamosios medžiagos būtų kiek įmanoma padidintas poveikis. Paprastai, norint užtikrinti kameros atmosferos pastovumą, visas bandomųjų gyvūnų tūris neturėtų viršyti 5 proc. bandymo kameros tūrio. Gali būti naudojamas burnos ir nosies, tik galvos arba atskirai viso kūno poveikis kameroje; du pirmieji sumažins kitais dviem atvejais sunaudojamą kiekį.

1.6.2.6. Stebėjimo laikotarpis Toksiškumo požymiai eksperimentiniams gyvūnams turėtų būti stebimi kiekvieną dieną viso poveikio metu ir sveikimo laikotarpiu. Nugaišimo laikas ir tas laikas, kai pasireiškia ir išnyksta toksiškumo požymiai, turėtų būti registruojamas.

1.6.3. Darbo eiga Gyvūnai 28 dienų laikotarpiu nuo penkių iki septynių dienų per savaitę kiekvieną dieną yra veikiami tiriamąja medžiaga. Gyvūnai, esantys bet kurioje papildomoje grupėje, kuri toliau stebima, turėtų būti laikomi dar 14 dienų neatliekant bandymų, kad būtų galima nustatyti atsigavimą po toksiškų poveikių arba tokių poveikių išsilaikymą. Temperatūra, kuriai esant vykdomas bandymas, turėtų būti palaikoma 22 ± 3 oC. Tinkamiausias santykinis drėgnumas yra tarp 30 ir 70 %, bet tam tikrais atvejais (pvz., atliekant tam tikrų aerozolių bandymus) tai gali būti neįgyvendinama. Išlaikant kameros viduje nedidelį neigiamą slėgį (≤ 5 mm vandens), tiriamoji medžiaga negalės patekti į aplinką. Poveikio metu neturi būti duodama pašaro ir vandens. Turėtų būti naudojama dinaminė inhaliacijos sistema, kartu su atitinkama analizės koncentracijos kontrolės sistema. Tinkamas poveikio koncentracijas rekomenduojama nustatyti bandomuoju tyrimu. Oro srautas turėtų būti nustatomas taip, kad poveikio kameroje būtų užtikrinamos vienarūšės sąlygos. Tokia sistema turėtų užtikrinti, kad kaip galima greičiau būtų nustatomos pastovios poveikio sąlygos. Turėtų būti matuojama arba kontroliuojama: Poveikio metu ir po jo vykdomi nuolatiniai stebėjimai ir registravimas; kiekvienam gyvūnui turėtų būti daromi atskiri įrašai. Visi gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną, o toksiškumo požymiai registruojami nurodant pasireiškimo laiką, jų laipsnį ir trukmę. Turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir akies gleivinės pokyčiai, taip pat kvėpavimo, kraujo apytakos, vegetacinės ir centrinės nervų sistemų pokyčiai, somatomotorinės veiklos ir elgsenos sutrikimai. Kiekvieną savaitę turėtų būti nustatomas gyvūnų svoris. Taip pat rekomenduojama kiekvieną savaitę matuoti suvartoto pašaro kiekį. Reguliarus gyvūnų stebėjimas yra reikalingas tam, kad būtų užtikrinama, jog kiek įmanoma bus stengiamasi bandymo metu neprarasti gyvūnų dėl tokių priežasčių kaip kanibalizmas, audinių autolizė arba dėl netinkamo taikymo metodo. Bandymo laikotarpio pabaigoje išlikusiems gyviems nepagalbinio poveikio grupių gyvūnams atliekama autopsija. Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kenčiantys dideles kančias ar skausmą, kai tai pastebima, turėtų būti pašalinami, humaniškai nužudomi ir atliekama autopsija. Bandymo pabaigoje visiems gyvūnams, taip pat ir kontroliniams, atliekami tokie tyrimai: Kitus nustatymus, kurie gali būti reikalingi kompetentingam toksikologiniam įvertinimui atlikti, sudaro kalcio, fosforo, chloro, natrio, kalio, badavimo gliukozės nustatymas, lipidų, hormonų, rūgščių ir šarmų pusiausvyros, methemoglobino, cholinesterazės aktyvumo analizė. Atitinkamais atvejais gali būti naudojama papildoma klinikinė biochemija stebėtų toksiškumo poveikių tyrinėjimui išplėsti.

1.6.3. a)

oro srauto greitis (nenutrūkstamai);

tikroji tiriamosios medžiagos koncentracija, matuojama kvėpavimo zonoje. Kasdieninio poveikio laikotarpiu koncentracija neturėtų svyruoti daugiau negu ±15 % vidutinės vertės. Tačiau tam tikrų aerozolių atveju šio kontrolės lygio neįmanoma pasiekti, tada būtų priimtinas platesnis intervalas. Viso bandymo metu kiekvienos dienos koncentracijos turėtų būti, kiek tai praktiškai įmanoma, išlaikomos pastovios. Aerozoliams ne mažiau kaip viena dalelių dydžio analizė turėtų būti atliekama kiekvienai bandomajai grupei per savaitę;

temperatūra ir drėgnumas, jeigu įmanoma nenutrūkstamai.

hematologija, taip pat bent jau kraujo kūnelių, hemoglobino koncentracijos, eritrocitų kiekio apskaičiavimas, visas ir diferencinis leukocitų kiekis ir krešėjimo matavimas;

ii)

klinikinė kraujo biochemija, taip pat įtraukiant ne mažiau kaip vieną kepenų ir inkstų funkcijų parametrą: alanino aminotransferazės serumas (anksčiau žinomas kaip glutamo piruvo transaminazė), aspartate aminotransferazės serumas (anksčiau žinomas kaip glutamo oksalato transminazė), šlapimo azotas, albuminas, kraujo kreatininas, visas bilirubino kiekis ir visas serumo baltymų kiekis;

1.6.3.1. Bendroji nekroskopija Visiems bandymo gyvūnams turi būti atliekama visa bendroji nekroskopija. Bent jau kepenys, inkstai, antinksčiai, plaučiai ir sėklidės turėtų būti pasveriami drėgni tuojau pat po skrodimo, kad neišdžiūtų. Organai ir audiniai (kvėpavimo traktas, kepenys, inkstai, blužnis, sėklidės, antinksčiai, širdis ir visi kiti organai, kurie turi didelių matomų pažeidimų arba kurių dydis pasikeitęs) turėtų būti konservuojami atitinkamoje terpėje galimam histopatologiniam ištyrimui ateityje. Plaučiai turėtų būti išimami sveiki, pasveriami ir apdorojami atitinkamu fiksatyvu užtikrinant, kad bus išsaugota plaučių struktūra.

1.6.3.2. Histopatologinis ištyrimas Didelių koncentracijų grupėje ir kontrolinėje grupėj e(-se) turėtų būti atliekamas užkonservuotų organų ir audinių histologinis ištyrimas. Organai ir audiniai, pažeisti tiriamosios medžiagos, kuri įvesta didžiausiomis dozėmis, turėtų būti ištiriami visose mažesnių dozių grupėse. Visų papildomų grupių gyvūnai turėtų būti ištiriami histologiškai, ypatingą dėmesį skiriant tiems organams ir audiniams, kuriems nustatyta, kad kitose paveiktose grupėse tie poveikiai pasireiškė.

2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti apibendrinami lentelėse, nurodant gyvūnų skaičių kiekvienos grupės bandymo pradžioje ir gyvūnų, kuriems atsirado kiekvienos rūšies pakenkimų, skaičių. Visi stebėti rezultatai turėtų būti įvertinami naudojant atitinkamą statistikos metodą. Gali būti naudojamas bet kuris pripažintas statistikos metodas.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS

3.

3.1. BANDYMO ATASKAITA Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:

rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, aplinkos sąlygos, pašaras ir pan.;

bandymo sąlygos. Poveikio aparato apibūdinimas bei brėžinys, tipas, matmenys, taip pat oro šaltinis, aerozolių generavimo sistema, oro kondicionavimo metodas ir gyvūnų laikymo sąlygų bandymo kameroje, jeigu tokia naudojama, apibūdinimas. Turėtų būti apibūdinama temperatūra, drėgnumo matavimo įranga ir atitinkamais atvejais aerozolio koncentracijų pastovumas ir dalelių dydžio pasiskirstymas. Duomenys apie poveikį Jie turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant vidutines vertes ir kintamumo vienetus (t. y. standartinis nuokrypis) ir, jeigu įmanoma, į juos turėtų būti įtraukiami:

3.1. pt_2 a)

oro srauto, tekančio per inhaliacijos įrenginį, greitis;

oro temperatūra ir drėgnumas;

nominalios koncentracijos (visas tiriamos medžiagos kiekis, įdėtas į inhaliacijos įrenginį, padalytas iš oro tūrio);

tirpiklio rūšis, jeigu naudotas;

faktinės koncentracijos bandymo kvėpavimo zonoje;

masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAD) ir geometrinis standartinis nuokrypis (GSD);

duomenys apie toksinę reakciją pagal lytį ir koncentraciją;

nugaišimo laikas poveikio metu arba nurodant, ar gyvūnai išgyveno iki pabaigos;

toksiškų arba kitokių poveikių apibūdinimas; poveikių nesukeliančios koncentracijos;

kiekvieno ypatingo požymio stebėjimo laikas ir tolesnė jo eiga;

duomenys apie maistą ir kūno svorį;

naudoti hematologiniai bandymai ir jų rezultatai;

naudoti klinikiniai biocheminiai bandymai ir jų rezultatai;

autopsijos duomenys;

išsamus visų histopatologinių duomenų aprašymas;

statistinis duomenų apdorojimas, jeigu įmanomas;

duomenų aptarimas;

duomenų aiškinimas.

3.2. DUOMENŲ APSKAIČIAVIMAS IR AIŠKINIMAS Žr. bendrąją įvadinę B(D) dalį.

4. LITERATŪRA Žr. bendrąją įvadinę B(E) dalį.

B.9. KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENOS) TOKSIŠKUMAS (PER ODĄ)

B.9.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Žr. bendrąją įvadinę B(A) dalį.

1.2. SĄVOKOS Žr. bendrąją įvadinę B(B) dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nėra.

1.4. BANDYMO METODO ESMĖ Tiriamoji medžiaga 28 dienas kiekvieną dieną dedama ant odos pamatuotomis dozėmis kelioms eksperimentinių gyvūnų grupėms, viena dozė – vienai grupei. Poveikio metu gyvūnai stebimi kiekvieną dieną toksiškumo požymiams nustatyti. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, atliekama autopsija, bandymą užbaigus likusiems gyviems gyvūnams atliekama autopsija.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.6. BANDYMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6.

1.6.1. Pasirengimas Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis laikymo ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento pradžios. Prieš bandymą sveiki jauni gyvūnai randomizuojami ir paskiriami į poveikio ir kontrolines grupes. Prieš pat bandymą nuo bandomųjų gyvūnų kūno sprando srityje nukerpamas kailis. Galima ir skusti, bet tai turėtų būti atliekama apytikriai prieš 24 valandas iki bandymo. Pakartotinai kirpti arba skusti paprastai reikia apytikriai kas savaitę. Jeigu kailis kerpamas arba skutamas, reikia stengtis nenubrūžinti odos. Tiriamajai medžiagai uždėti turėtų būti nukerpama ne mažiau kaip 10 % proc. kūno paviršiaus. Turėtų būti atsižvelgiama į gyvūno kūno svorį, nusprendžiant, koks plotas turėtų būti be kailio, ir į apdangalo dydį. Jeigu bandomos kietosios medžiagos, kurios prireikus gali būti pulverizuojamos, tiriamoji medžiaga turėtų būti pakankamai sudrėkinama vandeniu arba, tam tikrais atvejais, atitinkamu tirpikliu, kad būtų užtikrinamas geras sąlytis su oda. Skystos tiriamosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos. Dedamos nuo penkių iki septynių kartų per savaitę.

1.6.2. Bandymo sąlygos

1.6.2.

1.6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai Gali būti naudojamos suaugusios žiurkės, triušiai arba jūrų kiaulytės. Gali būti naudojamos kitos rūšys, bet jų naudojimas turėtų būti pagrindžiamas. Bandymo pradžioje naudojamų gyvūnų svorio pakitimo intervalas neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.

1.6.2.2. Skaičius ir lytis Kiekvienai dozei turėtų būti naudojama ne mažiau 10 gyvūnų (penkios patelės ir penki patinėliai), turinčių sveiką odą. Patelės turėtų būti neturėjusios jauniklių ir būti nevaikingos. Jeigu planuojami tarpiniai nužudymai, gyvūnų skaičius turėtų būti padidinamas tokiu gyvūnų skaičiumi, kuris buvo planuojamas nužudyti iki bandymo pabaigos. Be to, papildoma 10 gyvūnų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus) gali būti veikiama didele doze 28 dienas ir po poveikio 14 dienų stebimi toksinio poveikio grįžtamumo, stabilumo arba uždelsto atsiradimo požymiai. Taip pat naudojama papildoma 10 kontrolinių gyvūnų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus).

1.6.2.3. Dozės Reikalingos ne mažiau kaip trys dozės, kontrolinė grupė arba tirpiklio kontrolinė grupė, jeigu naudojamas tirpiklis. Poveikio laikas turėtų būti ne trumpesnis kaip šešios valandos per dieną. Tiriamoji medžiaga turėt būti uždedama panašiu laiku kiekvieną dieną ir intervalai (kas savaitę arba kas dvi savaites) suderinami taip, kad gyvūno kūno svorio atžvilgiu būtų išlaikoma pastovi dozė. Išskyrus tuos atvejus, kai paveikiama tiriamąja medžiaga, su kontrolinės grupės gyvūnais turėtų būti elgiamasi visiškai taip pat, kaip ir su bandomosios grupės objektais. Jeigu dozavimui palengvinti naudojamas tirpiklis, kontrolinei grupei turi būti skiriamos tokios pat dozės su tirpikliu, kokio skiriamos veikiamai grupei, ir ji turi gauti tokį patį tirpiklio kiekį, kurį gauna didžiausios dozės grupė. Didžiausia dozė turėtų sukelti toksiškumo poveikį, bet neturi būti mirštamumo arba tik kelių tokių atvejų priežastimi. Mažiausia dozė neturėtų sukelti jokių toksiškumo požymių. Jeigu yra praktini poveikio žmogui įvertinimas, mažiausia dozė jį turėtų viršyti. Geriausia, jeigu vidurinė dozė galėtų sukelti mažiausius pastebimus toksiškus poveikius. Jeigu naudojama daugiau negu viena tarpinė dozė, dozės turėtų būti išskirstomos intervalais taip, kad susidarytų toksiškų poveikių intensyvumo vertinimo skalė. Mažų ir tarpinių dozių bei kontrolinėse grupėse nugaišimo atvejų dažnumas turėtų būti nedidelis, kad būtų galima prasmingai įvertinti rezultatus. Jeigu tiriamoji medžiaga sukelia stiprų odos dirginimą, koncentracijos turėtų būti sumažinamos, ir dėl to, naudojant dideles dozes, turėtų susilpnėti kiti toksiški poveikiai arba jų nebūti. Be to, jeigu oda labai stipriai pažeidžiama, reikia bandymą nutraukti ir pradėti naują bandymą naudojant mažesnių koncentracijų dozes.

1.6.2.4. Ribinis bandymas Jeigu išankstinis bandymas naudojant 1000 mg/kg dozę arba didesnę dozę, susijusią su tikėtinu poveikiu žmogui, jeigu toks žinomas, nesukelia aiškaus toksiškumo, laikoma, kad bandymo nereikia tęsti.

1.6.2.5. Stebėjimo laikotarpis Eksperimentiniai gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną, ar neatsiranda toksiškumo požymių. Turėtų būti registruojamas nugaišimo laikas ir laikas, kada atsirado ir išnyko toksiškumo požymiai.

1.6.3. Darbo eiga Gyvūnai turėtų būti laikomi atskiruose narveliuose. Gyvūnai yra paveikiami tiriamąja medžiaga, geriausiai – 28 dienas septynias dienas per savaitę. Gyvūnai, esantys bet kurioje papildomoje grupėje, kuri toliau stebima, turėtų būti laikomi dar 14 dienų neatliekant bandymų, kad būtų galima nustatyti atsigavimą po toksiškų poveikių arba tokių poveikių išsilaikymą. Poveikio laikas neturėtų būti trumpesnis kaip šešios valandos per dieną. Tiriamoji medžiaga turėtų būti tolygiai uždedama ant plotelio, kurio dydis sudaro apie 10 % viso kūno paviršiaus. Jeigu medžiagos labai toksiškos, paveikiamas paviršius gali būti mažesnis, bet kaip galima didesnis plotas turėtų būti padengiamas kiek įmanoma plonesniu ir vienodu sluoksniu. Tiriamoji medžiaga turėtų liestis su oda akytu marlės tvarsčiu ir nedirginančia lipnia juostele. Tiriamoji vieta ir toliau turėtų būti atitinkamai padengta, kad būtų išsaugotas marlės tvarstis ir tiriamoji medžiaga bei užtikrinama, kad gyvūnai nepraris tiriamosios medžiagos. Gali būti naudojami ribotuvai, kad tiriamoji medžiaga nebūtų praryjama, bet visiško imobilizavimo metodas nerekomenduojamas. Gali būti taikomas ir apsauginio antkaklio metodas. Poveikio laikotarpio pabaigoje tiriamosios medžiagos likutis turėtų būti nuimamas, jeigu tai praktiškai įvykdoma – naudojant vandenį ar kokį kitą atitinkamą odos valymo būdą. Visi gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną, o toksiškumo požymiai registruojami nurodant pasireiškimo laiką, jų laipsnį ir trukmę. Turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir akies gleivinės pokyčiai, taip pat kvėpavimo, kraujo apytakos, vegetacinės ir centrinės nervų sistemų pokyčiai, somatomotorinės veiklos ir elgsenos sutrikimai. Kiekvieną savaitę turėtų būti nustatomas gyvūnų svoris. Taip pat rekomenduojama kiekvieną savaitę matuoti suvartoto pašaro kiekį. Reguliarus gyvūnų stebėjimas yra reikalingas tam, kad būtų užtikrinama, jog kiek įmanoma bus stengiamasi neprarasti gyvūnų dėl tokių priežasčių kaip kanibalizmas, audinių autolizė arba dėl netinkamo taikymo metodo. Bandymo laikotarpio pabaigoje išlikusiems gyviems nepagalbinio poveikio grupių gyvūnams atliekama autopsija. Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kenčiantys dideles kančias ar skausmą, kai tai pastebima, turėtų būti pašalinami, humaniškai nužudomi ir atliekama autopsija. Bandymo pabaigoje visiems gyvūnams, taip pat ir kontroliniams atliekami tokie tyrimai: Kitus tyrimus, kurie gali būti reikalingi kompetentingam toksikologiniam įvertinimui atlikti, sudaro kalcio, fosforo, chloro, natrio, kalio, badavimo gliukozės nustatymas, lipidų, hormonų, rūgščių/šarmų pusiausvyros, methemoglobino, cholinesterazės aktyvumo analizė. Atitinkamais atvejais gali būti naudojama papildoma klinikinė biochemija stebėtų toksiškumo poveikių tyrinėjimui išplėsti.

1.6.3.

1) hematologija, taip pat bent jau kraujo kūnelių, hemoglobino koncentracijos, eritrocitų kiekio apskaičiavimas, visas ir diferencinis leukocitų kiekis ir krešėjimo matavimas;

2) klinikinė kraujo biochemija, taip pat įtraukiant ne mažiau kaip vieną kepenų ir inkstų funkcijų parametrą: alanino aminotransferazės serumas (anksčiau žinomas kaip glutamo piruvo transaminazė), aspartate aminotransferazės serumas (anksčiau žinomas kaip glutamo oksalato transminazė), šlapimo azotas, albuminas, kraujo kreatininas, visas bilirubino kiekis ir visas serumo baltymų kiekis.

1.6.4. Bendroji nekroskopija Visiems bandomiems gyvūnams turėtų būti atliekama visa bendroji nekroskopija. Bent jau kepenys, inkstai, antinksčiai ir sėklidės turėtų būti pasveriami drėgni tuojau pat po skrodimo, kad neišdžiūtų. Organai ir audiniai (tai yra tie organai, kurie turi didelių matomų pakenkimų arba kurių dydis pakitęs) turėtų būti konservuojami atitinkamoje terpėje galimam histopatologiniam ištyrimui ateityje.

1.6.5. Histopatologinis ištyrimas Didelių dozių grupėje ir kontrolinėje grupėje turėtų būti atliekamas užkonservuotų organų ir audinių histologinis ištyrimas. Organai ir audiniai, kurie turi defektų, atsirandančių įvedus didžiausias tiriamosios medžiagos dozes, turėtų būti ištiriami visose mažesnių dozių grupėse. Papildomos grupės gyvūnai turėtų būti ištiriami histologiškai, ypatingą dėmesį skiriant tiems organams ir audiniams, jeigu nustatyta, kad kitose paveiktose grupėse tie poveikiai pasireiškė.

2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti apibendrinami lentelėse, kiekvienai bandomai grupei nurodant gyvūnų skaičių bandymo pradžioje ir gyvūnų, kuriems atsirado kiekvienos rūšies pakenkimų, skaičių. Visi stebėti rezultatai turi būti įvertinami naudojant atitinkamą statistikos metodą. Gali būti naudojamas bet kuris pripažintas statistikos metodas.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS

3.

3.1. BANDYMO ATASKAITA Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:

duomenys apie gyvūnus (rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, aplinkos sąlygos, pašaras ir pan.);

bandymo sąlygos (taip pat tvarstymo būdas: uždaras ar neuždaras);

dozės (nurodant tirpiklį, j jeigu naudotas) ir koncentracijos;

poveikio nesukelianti dozė, jeigu įmanoma;

duomenys apie toksines reakcijas pagal lytį ir dozę;

nugaišimo laikas bandymo metu arba nurodant, ar gyvūnas išgyveno iki pabaigos;

toksiški arba kitokie poveikiai;

visų nenormalių požymių pastebėjimo laikas ir tolesnė eiga;

duomenys apie pašarą ir kūno svorį;

naudoti hematologiniai bandymai ir jų rezultatai;

naudoti klinikiniai biocheminiai bandymai ir jų rezultatai;

nekroskopijos duomenys;

išsamus visų histopatologinių duomenų aprašymas;

statistinis duomenų apdorojimas, jeigu įmanomas;

duomenų aptarimas;

duomenų aiškinimas.

3.2. DUOMENŲ APSKAIČIAVIMAS IR AIŠKINIMAS Žr. bendrąją įvadinę B(D) dalį.

4. LITERATŪRA Žr. bendrąją įvadinę B(E) dalį.

B.10. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJŲ TYRIMAS IN VITRO

B.10.

1. METODAS Šis metodas pakartoja OECD TG 473 Žinduolių chromosomų aberacijos tyrimą in vitro (1997).

1.

1.1. ĮVADAS Chromosomų aberacijų tyrimo tikslas – identifikuoti agentus, sukeliančius žinduolių ląstelių, kultivuojamų in vitro, chromosomų aberacijas (1) (2) (3). Struktūrinės aberacijos gali būti dviejų tipų – chromosominės arba chromatidinės. Nors dauguma cheminių mutagenų sukelia chromatidines aberacijas, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Poliploidiškumo reiškimosi intensyvumas rodo, kad cheminė medžiaga gali sukelti chromosomų skaičiaus pasikeitimus. Tačiau šio metodo tikslas nėra išmatuoti chromosomų skaičiaus pokyčius, ir paprastai tam jis nėra taikomas. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai; esama pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl chromosomų mutacijų bei su jomis susijusių įvykių. Tiriant chromosomų aberacijas in vitro galima naudoti gerai žinomų ląstelių linijų, ląstelių kamienų arba pirminių ląstelių kultūras. Naudojamos ląstelės pasirenkamos pagal jų sugebėjimą augti kultūroje, kariotipų stabilumą, chromosomų skaičių, chromosomų įvairovę ir spontaninį chromosomų aberacijų dažnį. Atliekant tyrimus in vitro reikia naudoti egzogeninį metabolinės aktyvacijos šaltinį. Ši metabolinės aktyvacijos sistema negali visiškai pakeisti žinduolių in vivo sąlygų. Reikia stengtis išvengti tokių sąlygų, kurioms esant būtų gaunami teigiami rezultatai, neatspindintys vidinio mutageniškumo ir galintys atsirasti pakeitus pH, osmosinį slėgį arba ypač padidėjus citotoksiškumui (4) (5). Šis tyrimas atliekamas, kai ieškoma galimų žinduolių mutagenų ar karcinogenų. Daugelis cheminių junginių, naudojant šį tyrimą, duodančių teigiamus rezultatus, yra žinduolių karcinogenai; tačiau nėra aiškaus ryšio tarp šio tyrimo ir karcinogeniškumo. Ryšys priklauso nuo cheminių medžiagų klasės; yra neginčijamų įrodymų kad šio tyrimo metu negalima nustatyti tam tikrų karcinogenų, nes pasirodo, jog jie veikia kitaip, ne tiesiogiai suardo DNR. Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2 SĄVOKOS Chromatidinė aeracija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip pavienių chromatidžių suardymas arba kaip chromatidžių suardymas ir susijungimas. Chromotidinė aeracija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip abiejų seserinių chromatidžių trūkis arba arba kaip jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje. Endoreduplikacija – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos S (sintezės) periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S (sintezės) periodas. Šitaip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 ir t. t. chromatidžių. Plyšys – achromatinė, mažesnė nei vienos chromatidės plotis spraga, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių. Mitozinis indeksas – itozės metafazėje esančių ląstelių santykis, padalintas iš viso ląstelių populiacijos skaičiaus, rodantis tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį. Chromosomų skaičiaus aberacija – ląstelėse esančių chromosomų skaičiaus pokytis palyginus su normaliu jų skaičiumi, būdingu panaudotoms ląstelėms. Poliploidiškumas – haploidinio chromosomų skaičiaus (n), išskyrus diploidinį skaičių (t. y. 3n, 4n ir t. t.), kartotinis. Struktūrinė aeracija – chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti, dalijimosi ciklo metafazėje esančias ląsteles tiriant mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, pokyčiai grandinių viduje ar tarp grandinių.

1.3 TYRIMO METODO PRINCIPAS Ląstelių kultūros veikiamos tiriamąja chemine medžiaga esant metabolinei aktyvacijai arba jos nesant. Ląstelių kultūras paveikus tiriamąja medžiaga, tam tikrais laiko tarpais jos yra veikiamos ląstelių dalijimąsi metafazėje stabdančia medžiaga (pavyzdžiui Kolcemidu arba kolchicinu), surenkamos, dažomos, o metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu, kad būtų nustatomos chromosomų aberacijos.

1.4 TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.4

1.4.1 Preparatai

1.4.1

1.4.1.1 Ląstelės Galima naudoti įvairiausias ląstelių linijas, kamienus arba pirmines ląstelių, tarp jų ir žmonių ląstelių kultūras (pvz, kiniško žiurkėno fibroblastus, žmogaus ar kitų žinduolių periferinio kraujo limfocitus).

1.4.1.2 Terpė ir kultivavimo sąlygos Kultūros turėtų būti kultivuojamos reikiamoje terpėje, esant reikiamoms inkubacijos sąlygoms (kultivavimui skirtuose induose, esant reikiamai CO2 koncentracijai, temperatūrai ir drėgmei). Pastoviai tikrinama, ar gerai žinomų ląstelių linijos ir kamienai išlaiko pastovų modalinį chromosomų skaičių, ar jos neužsikrėtusios mikoplazmomis, o jei yra užkrėstos, tai toliau nebenaudojamos. Turi būti žinoma ląstelių ciklo trukmė bei taikomos kultivavimo sąlygos.

1.4.1.3 Kultūrų paruošimas Gerai žinomos ląstelių linijos ir kamienai: ląstelės yra padauginamos iš kamieninių kultūrų, pasėjamos kultūrinėje terpėje tokiu tankumu, kad prieš ląsteles surenkant, kultūros nesusilietų,, po to jos inkubuojamos 37 oC temperatūroje. Limfocitai: į kultūrinę terpę, turinčią mitogeno (pvz., fitohemagliutinino), įnešamas sveikų tiriamųjų kraujo, paveikto antikoaguliantu (pvz., heparinu), mėginys arba iš to kraujo išskirti limfocitai ir inkubuojama 37 oC temperatūroje.

1.4.1.4 Metabolinė aktyvacija Ląstelės turėtų būti paveikiamos tiriamąja chemine medžiaga tiek esant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai, tiek ir nesant. Plačiausiai naudojama sistema yra iš graužikų kepenų, paveiktų tokiais fermentinį aktyvumą skatinančiais agentais kaip AROCLOR 1254 (6) (7) (8) (9) ar fenobarbitono ir ß-naftoflavono mišiniu (10) (11) (12), postmitochondrinė frakcija, praturtinta kofaktoriumi. Post-mitochondrinė frakcija paprastai naudojama tokių koncentracijų, kurių intervalas tyrimo metu naudojamoje galutinėje terpėje siekia 1–10 % (v/v). Metabolinės aktyvacijos sistema gali priklausyti nuo tiriamosios cheminės medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga naudoti daugiau nei vieną post-mitochondrinės frakcijos koncentraciją. Endogeninę aktyvaciją gali pagerinti, taikant tokias naujoves kaip genetinės inžinerijos pagalba gautas ląstelių linijas, gaminančias specifinius, aktyvacijoje dalyvaujančius fermentus. Tyrime naudojamų ląstelių linijų pasirinkimas turėtų būti moksliškai pagrįstas (pvz, pagal citochromo P450 izofermento svarbą tiriamos cheminės medžiagos metabolizmui).

1.4.1.5 Tiriama cheminė medžiaga/preparatas Kietosios tiriamosios medžiagos turėtų būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinančiuosiuose įrenginiuose, o jeigu reikia, tai prieš paveikiant ląsteles šia medžiaga, ir praskiestos. Prieš tyrimą į tiriamąją sistemą gali būti tiesiogiai įnešamos ir (arba) praskiedžiamos skystosios tiriamosios medžiagos. Turėtų būti naudojami naujai paruošti tiriamosios medžiagos preparatai, jeigu šių medžiagų stabilumo tyrimo duomenys nerodo, kad juos galima saugoti.

1.4.2 Tyrimo sąlygos

1.4.2

1.4.2.1 Tirpiklis/tirpinantysis Įrenginys Neturėtų būti manoma, kad tirpiklis/tirpinantysis įrenginys chemiškai reaguos su tiriamąja chemine medžiaga ir turėtų būti užtikrinta, kad ląstelės liks išsaugotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai/tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturėtų būti vandens. Vandenį galima pašalinti molekuliniu filtru.

1.4.2.2 Veikimo koncentracijos Parenkant pačią didžiausią koncentraciją, vadovaujamasi tokiais kriterijais, kaip citotoksiškumu, tirpumu tiriamojoje sistemoje ir pH arba osmosinio slėgio pokyčiais. Citotoksiškumas turėtų būti nustatomas pagrindinio eksperimento metu, esant metabolinei aktyvacijai, remiantis atitinkamais ląstelių vientisumo ir augimo rodikliais, tokiais kaip ląstelių kolonijų susiliejimo laipsnis, gyvų ląstelių skaičius arba mitozinis indeksas. Pirminio ekperimento metu būtų naudinga nustatyti toksiškumą ir tirpumą. Turėtų būti naudojamos bent trys koncentracijos. Jei nustatomas citotoksiškumas, tai šios koncentracijos turėtų svyruoti nuo maksimalaus iki minimalaus citotoksiškumo laipsnio arba jo apskritai neturėtų būti; tai reikš, kad koncentracijos turės būti atskirtos tiktai faktoriumi, esančiu tarp 2 ir √10. Ląstelių surinkimo metu didžiausia koncentracija turėtų parodyti, kad gerokai sumažėjo ląstelių kolonijų susiliejimo laipsnis ir ląstelių skaičius arba mitozinis indeksas (visi sumažėjo daugiau nei 50 %). Mitozinis indeksas yra tik netiesioginis citotoksinių/citostatinių efektų įvertinimo matas ir priklauso nuo laiko praėjusio po tiriamosios medžiagos poveikio. Tačiau mitozinis indeksas tinka ląstelių, auginamų suspensijoje, kultūroms, kuriose kiti toksiškumo tyrimai gali būti sudėtingi ir nepraktiški. Duomenys apie ląstelių ciklo kinetinius parametrus, tokius kaip vidutinis ląstelių kartos susiformavimo laikas, gali būti panaudoti kaip pagalbinė informacija. Tačiau vidutinis ląstelių kartos susiformavimo laikas, laikomas bendru vidurkiu, ne visada parodo, kad egzistuoja sulėtinto vystymosi subpopuliacijos, ir netgi menkas ląstelių susiformavimo laiko pailgėjimas gali būti susijęs su kur kas ilgesne optimalaus aberacijų skaičiaus atsiradimo trukme. Kai medžiagos yra pakankamai necitotoksinės, tai didžiausia tiriamoji koncentracija turėtų būti 5 μl/ml, 5,5 mg/ml arba 0,01 M, priklausomai nuo to, kuri iš visų išvardytų koncentracijų yra pati mažiausia. Kai medžiagos yra gana netirpios ir nėra toksiškos, o jų koncentracijos yra mažesnės už tas, kurioms esant medžiagos netirpsta, tai baigiantis veikimui tiriamąja medžiaga, didžiausios naudojamos dozės koncentracija turėtų viršyti tirpumo ribą paruoštoje, kultivavimui skirtoje terpėje. Kai kuriais atvejais, pavyzdžiui, kai toksiškumas pasireiškia tik tada, kai medžiagos koncentracija yra truputį didesnė už pačią mažiausią koncentraciją, kuriai esant medžiaga visiškai netirpsta, rekomenduojama patikrinti daugiau nei vieną koncentraciją, kurioje susiformuoja matomas precipitatas. Derėtų įvertinti tirpumą prieš veikimą tiriamąja chemine medžiaga, ir po jo, kadangi veikiant tiriamąja medžiaga, tirpumas gali pakisti dėl ląstelių ir S9 serumo, esančių tiriamojoje sistemoje. Netirpumą galima nustatyti plika akimi. Precipitato susidarymas neturėtų trukdyti įvertinti duomenis.

1.4.2.3 Neigiami ir teigiami kontroliniai mėginiai Atliekant kiekvieną eksperimentą, esant metabolinei aktyvacijai, arba jos nesant, tuo pačiu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpikliai, tirpinntysis įrenginys) kontroliniai mėginiai. Kai naudojamasi metaboline aktyvacija, tai kartu su teigiamu kontroliniu mėginiu turi būti naudojama aktyvuojanti cheminė medžiaga tam, kad būtų sukuriamas atsakas į mutageną. Teigiamuose kontroliniuose mėginiuose turi būti tokios žinomo elastogeno koncentracijos, kurioms esant, bei veikiant tiriamąja medžiaga, būtų galima nesunkiai sumažinti pašalinį foną pakartotinai, o tai parodo tiriamosios sistemos jautrumą. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami efektai būtų ryškūs, bet tyrėjas ne iš karto atskleistų užkoduotas skaidres. Žemiau pateikiami teigiamuose kontroliniuose mėginiuose esančių cheminių medžiagų pavyzdžiai: Metabolinės aktyvacijos sąlygos Medžiaga CAS Nr. EINECS Nr. Egzogeninė metabolinė aktyvacija nevyksta metilmetansulfonatas 66-27-3 200-625-0 etilmetansulfonatas 62-50-0 200-536-7 etilnitrošlapalas 759-73-9 212-072-2 mitomicinas C 50-07-7 200-008-6 4-nitrokvinolino-N-oksidas 56-57-5 200-281-1 Egzogeninė metabolinė aktyvacija vyksta benzopirenas 50-32-8 200-028-5 ciklofosfamidas ciklofosfamido-monohidratas 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Galima naudoti ir kitas teigiamas kontrolines chemines medžiagas. Kai įmanoma, tai apsvarstomas teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų, priklausančių konkrečiai klasei, panaudojimas. Auginant kiekvieną ląstelių rinkinį, reikia naudoti neigiamus kontrolinius mėginius, sudarytus iš terpėje esančio pavienio tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio ir kurie paveikiami šia terpe lygiai taip pat kaip ir ląstelių kultūros. Taip pat reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į tai, kad anksčiau atliktų eksperimentų aprašuose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio.

1.4.3 Tyrimo atlikimo metodika

1.4.3

1.4.3.1 Veikimas tiriamąja chemine medžiaga Proliferuojančios ląstelės veikiamos tiriamąja medžiaga esant metabolinės aktyvacijos sistemai arba jos nesant. Limfocitai veikiami tiriamąja medžiaga, praėjus maždaug 48 valandoms po stimuliacijos mitogenu.

1.4.3.2 Paprastai naudojamos kiekvienos koncentracijos pakartotinės kultūros, ypač rekomenduojama tai daryti, kai kultivuojamos neigiamos kontrolinės kultūros, terpėje esant vien tik tirpiklio. Jeigu remiantis anksčiau atliktų eksperimentų aprašymais galima parodyti, kad tarp kartotinio pasėjimo kultūrų egzistuoja minimalus skirtumai 13, 14, tada pavienes kultūras bus galima tirti, terpėje esant skirtingoms tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijoms. Dujinės ir lakiosios medžiagos tiriamos atitinkamais metodais, tokiais kaip kultivavimas užsandarintuose induose 15, 16.

1.4.3.3 Kultūrų surinkimo laikas Atliekant pirmąjį eksperimentą, ląstelės, esant metabolinės aktyvacijos sistemai arba jos nesant tiriamąja chemine medžiaga veikiamos 3-6 valandas ir yra surenkamos praėjus maždaug kas 1,5 normalaus ląstelinio ciklo nuo poveikio pradžios 12. Jeigu eksperimentas atliekamas pagal šį protokolą, esant metabolinės aktyvacijos sistemai arba jos nesant ir gaunami neigiami rezultatai, tai reikia atlikti papildomą poveikio tiriamąja medžiaga eksperimentą, nesant metabolinės aktyvacijos sistemos ir ląstelės surenkamos, praėjus laiko tarpui, maždaug lygiam 1,5 ląstelinio ciklo trukmės. Kai kurios cheminės medžiagos yra lengviau nustatomos, jei tiriamąja medžiaga veikiama ilgiau, o mėginiai paimami tada, kai praeina daugiau nei 1,5 ląstelinio ciklo. Neigiami duomenys, gauti tuo metu, kai buvo naudojama metabolinė aktyvacija, turi būti patvirtinami kiekvienu atveju. Jei manoma, kad nereikia patvirtinti neigiamų rezultatų, tai privalo būti pagrįsta.

1.4.3.4 Chromosomų paruošimas Paprastai likus 1–3 valandoms iki surinkimo ląstelių kultūros yra paveikiamos Kolcemidu® arba kolchicinu. Kiekviena ląstelių kultūra surenkama ir atskirai apdorojama tam, kad chromosomos būtų paruoštos. Ruošiant chromosomas, ląstelės paveikiamos hipotoniniu šoku, fiksuojamos ir dažomos.

1.4.3.5 Analizė Prieš pradedant mikroskopinę analizę, visos skaidrės, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius mėginius, yra atskirai koduojamos. Kadangi fiksavimo metu metafazėje esančios ląstelės dažnai suyra bei prarandamos chromosomos, tai suskaičiuotos ląstelės turės centromeras, kurių skaičius bus lygus visų tipų ląstelių modaliniam skaičiui ≠2. Jei tiriant kartotinio pasėjimo kultūras, galima naudotis ta pačia kontrole, tai nustatytas centromerų skaičius bus lygus 200 gerai matomų metafazių. Centromerų skaičius gali sumažėti, kai stebima daug aberacijų. Nors šio tyrimo tikslas yra nustatyti chromosomų struktūrines aberacijas, svarbu poliploidiją bei endoduplikaciją registruoti tada, kai tai yra matoma.

2. DUOMENYS

2.

2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS Ląstelė yra eksperimentinis vienetas, todėl nustatomas ląstelių, turinčių struktūrines aberacijas, išreiškiamas procentais. Reikia išvardinti chromosomų struktūrinių aberacijų skirtingus tipus, nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį tiriamose ir kontrolinėse ląstelių kultūrose. Atskirai registruojami chromosomų plyšiai, tačiau į juos neatsižvelgiama nustatant absoliutų aberacijos dažnį. Reikia taip pat registruoti tarpusavyje sutampančias priemones, kurios naudojamos citotoksiškumui vertinti visose paveiktose ir neigiamose kontrolinėse kultūrose, kai yra atliekami pagrindiniai eksperimentai, kurių metu nustatomos aberacijos. Reikėtų pateikti ir pavienius duomenis. Be to visus duomenis reikėtų pateikti apibendrintai, lentelių forma. Nėra reikalaujama, kad būtų patvirtintas aiškus teigiamas atsakas. Abejotini rezultatai patvirtinami, Atliekant toliau tyrimą, o pirmiausia pakeičiant eksperimento sąlygas, įsitikinama tuo, kad anksčiau gauti rezultatai yra abejotini. 1.4.3.3 skyriuje buvo aptarta būtinybė patvirtinti, kad buvo gauti neigiami rezultatai. Vėlesnių eksperimentų metu reikia apsvarstyti tiriamų parametrų pakeitimus, tam, kad ištirtų sąlygų spektras būtų praplėstas. Koncentracijų intervalo išretinimas bei metabolinės aktyvacijos sąlygos priklauso tiriamiesiems parametrams, kuriuos galima keisti.

2.2. REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS Egzistuoja keli kriterijai, tokie, kaip nuo koncentracijos priklausomas bei pakartojamas chromosomines aberacijas turinčių ląstelių skaičiaus padidėjimas, kuriuo remiantis, nustatoma ar gautas rezultatas yra teigiamas. Pirmiausia reikia aptarti gautų rezultatų biologinę reikšmę. Vertinant tyrimo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus 3, 13. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis faktorius, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas. Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti mitozę ir sukelti chromosomų skaičiaus ląstelėje pakitimus. Ląstelių, turinčių endoreduplikuotas chromosomas, skaičiaus padidėjimas gali parodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti ląstelinį ciklą 17, 18. Jei tiriant medžiagą, buvo gauti rezultatai, neatitinkantys aukščiau išvardintų kriterijų, tai šioje sistemoje medžiaga laikoma nemutageniška. Nors atliekant daugelį eksperimentų, bus gauti aiškūs teigiami ir neigiami rezultatai, tačiau retais atvejais, remiantis gautų duomenų visuma, nebus galima padaryti konkrečios išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Net ir daug kartų pakartojus eksperimentą, rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs. Tiriant chromosomų aberacijas in vitro, gauti teigiami rezultatai, gauti atlikus tyrimą, rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas kultivuotose somatinėse žinduolių ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, kad esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų kultivuotose somatinėse žinduolių ląstelėse.

3. ATASKAITA

3. TYRIMO ATASKAITA

Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija:

Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys:

priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas tirpinantysis įrenginys,

tiriamosios medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.

Ląstelės:

ląstelių tipas ir šaltinis,

panaudoto ląstelių tipo kariotipo ypatybės ir tinkamumas,

ar ląstelės neužsikrėtusios mikoplazmomis, jei tai įmanoma nustatyti,

informacija apie ląstelinio ciklo trukmę,

kraujo donorų, iš kurių buvo gauti viso kraujo mėginiai ar iš kurių kraujo buvo išskirti limfocitai, lytis bei panaudotas mitogenas,

ląstelių persėjimų skaičius, jei tai įmanoma nustatyti,

ląstelių kultivavimo metodai, jei tai galima nustatyti,

modalinis chromosomų skaičius.

Tyrimo sąlygos:

metafazę sustabdančios cheminės medžiagos prigimtis, koncentracija bei laiko tarpas, per kurį ši medžiaga veikė ląsteles,

pagrindinė priežastis, dėl kurios buvo pasirinktos koncentracijos ir ląstelių kultūrų kultivavimo skaičius nurodant, jei įmanoma, citotoksiškumo tyrimo duomenis ir tirpumo ribas,

terpės sudėtis ir CO2 koncentracija, jei tai įmanoma nurodyti,

tiriamosios medžiagos koncentracija,

tirpinančiojo įrenginio darbinė talpa bei į jį įneštos tiriamosios medžiagos tūris,

inkubacijos temperatūra,

inkubacijos laikas,

veikimo tiriamąja medžiaga trukmė,

ląstelių tankis pasėjimo metu, jei tai įmanoma nurodyti,

metabolinės aktyvacijos sistemos tipas ir sudėtis, įskaitant tinkamumo kriterijus,

teigiami ir neigiami kontroliniai mėginiai,

skaidrių paruošimo būdai,

aberacijų vertinimo kriterijai,

ištirtų metafazių skaičius,

toksiškumo įvertinimo būdai,

kriterijai, pagal kuriuos sprendžiama, ar tyrimų metu gauti rezultatai teigiami, neigiami bei abejotini.

Rezultatai:

toksiškumo požymiai, pvz., ląstelių kultūrų kolonijų susiliejimo laipsnis, ląstelinio ciklo duomenys, ląstelių skaičius, mitozinis indeksas,

precipitacijos požymiai,

duomenys apie terpės, kurioje buvo atliekamas veikimas, pH ir osmosinį slėgį, jei tai buvo nustatyta,

aberacijų, įskaitant plyšius, apibūdinimas,

ląstelių, esančių tiriamąja medžiaga veiktose bei kontrolinėse kolonijose ir turinčių chromosomų aberacijas, skaičius bei chromosomų aberacijų tipas,

ploidiškumo pokyčiai, jei pastebimi,

dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma,

statistinės analizės, jei tokios buvo atliktos,

vienu metu gauti neigiamų (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) ir teigiamų kontrolinių mėginių tyrimų duomenys,

duomenys, gauti anksčiau atliktų tyrimų metu išanalizavus neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis prietaisas) ir teigiamus kontrolinius mėginius, kartu nurodant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)

NUORODOS Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, p. 1–29. Ishidate, MJr. and Sofuni, T. (1985). The in Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, p. 427–432. Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C, Colman, S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl.10), p. 1–175. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, MJr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res,. 257, p. 147–204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, p. 297–305. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347–364. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173–215. Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogei, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, p. 83–90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, p. 277–290. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G, Gibson, GG, Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, p. 85–88. Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, MJr., Ivett, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, p. 241–261. Richardson, C, Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, p. 141–154. Soper, K.A. and Galloway, S.M. (1994). replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, p. 139–149. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91–103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795–801. Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, p. 403–413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362–1364.

B.11. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ KAULŲ ČIULPŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJOS TYRIMAS IN VIVO

B.11.

1. METODAS Šis metodas pakartoja OECD TG 475, Žinduolių kaulų čiulpų chromosomų aberacijos tyrimą (1997).

1.

1.1 ĮVADAS Žinduolių chromosomų aberacijų tyrimas in vitro naudojamas nustatyti struktūrinėms chromosomų aberacijoms, kurias tiriamoji cheminė medžiaga sukelia žinduolių, paprastai griaužikų, kaulų čiulpų ląstelėse (1) (2) (3) (4). Chromosomų struktūrinės aberacijos gali būti dviejų tipų – chromosominės arba chromatidinės. Poliploidiškumo reiškimosi intensyvumas rodo, kad cheminė medžiaga gali sukelti chromosomų skaičiaus pasikeitimus. Dauguma cheminių mutagenų sukelia chromatidines aberacijas, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai; esama pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl chromosomų mutacijų bei su jomis susijusių įvykių. Šiam tyrimui paprastai naudojamas griaužikų stuburo skliautas. Pagrindinis tiriamasis audinys yra kaulų čiulpai, kadangi jie yra išvagoti daugybės kraujagyslių, o be to, kaulų čiulpuose yra daug greitai besidauginančių ląstelių, kurios yra lengvai išskiriamos ir apdorojamos. Šio tyrimo metu nėra tiriami kitų rūšių žinduoliai bei jų audiniai. Šis chromosomų aberacijos tyrimas ypač svarbus, kai įvertinama mutagenų daroma žala, nes šio tyrimo metu galima ištirti metabolizmo, farmakokinetikos ir DNR pažaidų reparacinių procesų veiksnius in vivo, nors jie gali varijuoti tarp skirtingų žinduolių rūšių ir skirtingų audinių. Tyrimas in vivo naudingas ir tuo, kad vėliau galima ištirti mutageninius efektus, nustatytus in vitro. Jeigu įrodoma, kad tiriamoji cheminė medžiaga arba reaktyvus metabolitas neįsiskverbia į audinį, į kurį buvo nukreiptas, jis nėra naudojamas šiam tyrimui. Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2 SĄVOKOS Chromatidinė aeracija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip pavienių chromatidžių suardymas arba kaip chromatidžių suardymas ir susijungimas. Chromotidinė aeracija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip abiejų seserinių chromatidžių trūkis arba arba kaip jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje. Endoreduplikacija – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos S (sintezės) periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S (sintezės) periodas. Šitaip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 ir t. t. chromatidžių. Plyšys – achromatinė, mažesnė nei vienos chromatidės plotis spraga, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių. Mitozinis indeksas – mitozės metafazėje esančių ląstelių santykis, padalintas iš viso ląstelių populiacijos skaičiaus, rodantis tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį. Chromosomų skaičiaus aeracija – ląstelėse esančių chromosomų skaičiaus pokytis palyginus su normalių jų skaičiumi, būdingu panaudotoms ląstelėms. Poliploidiškumas – haploidinio chromosomų skaičiaus (n), išskyrus diploidinį skaičių (t. y. 3n, 4n ir t. t.), kartotinis. Struktūrinė aeracija – chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti, dalijimosi ciklo metafazėje esančias ląsteles tiriant mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, pokyčiai grandinių viduje ar tarp grandinių.

1.3 TYRIMO METODO PRINCIPAS Gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga pagal atitinkamą poveikio chemine medžiaga procedūrą ir atitinkamais laiko tarpais, praėjusiais po veikimo yra numarinami. Prieš numarinimą gyvūnai paveikiami agentu, sustabdančiu ląstelių dalijimąsi metafazėje (pvz., Kolcemidu® arba kolchicinu). Po to iš kaulų čiulpų ląstelių išskiriamos chromosomos, jos dažomos, ir metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu, kad būtų nustatytos chromosomų aberacijos.

1.4 TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.4

1.4.1 Preparatai

1.4.1

1.4.1.1 Gyvūnų rūšies pasirinkimas Paprastai naudojamos žiurkės, pelės ir kiniški žiurkėnai, tačiau gali būti panaudotos ir kitos atitinkamos žinduolių rūšys. Reikia panaudoti dažniausiai vartojamus jaunų sveikų suaugusių gyvūnų laboratorinius kamienus. Turimo pradžioje gyvūnų svorio variacijos turi būti minimalios ir neperžengti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūnų vidutinio svorio.

1.4.1.2 Laikymo ir maitinimo sąlygos Taikomos Pagrindinio įvado B dalyje nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad drėgmė siektų 50–60 %.

1.4.1.3 Gyvūnų paruošimas Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę bei tiriamąją (kuriai priskirti individai bus veikiami medžiaga) grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos poveikiai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas turi savo identifikacijos ženklą. Gyvūnams ne mažiau kaip 5 dienas leidžiama prisitaikyti prie laboratorinių sąlygų.

1.4.1.4 Dozių paruošimas Kietosios tiriamosios medžiagos turėtų būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinančiuosiuose įrenginiuose, o jeigu reikia, tai prieš paveikiant ląsteles šia medžiaga, ir praskiestos. Prieš tyrimą į tiriamąją sistemą gali būti tiesiogiai įnešamos ir (arba) praskiedžiamos skystosios tiriamosios medžiagos. Turėtų būti naudojami naujai paruošti tiriamosios medžiagos preparatai, jeigu šių medžiagų stabilumo tyrimo duomenys nerodo, kad juos galima saugoti.

1.4.2 Tyrimo sąlygos

1.4.2

1.4.2.2 Kontroliniai mėginiai Kiekvieno tyrimo metu turi būti tiriami iš kiekvienai lyčiai priklausančių gyvūnų paimti bei tuo pačiu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai. Išskyrus tą atvejį, kai gyvūnai yra veikiami tiriamąja chemine medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti tiriamąja chemine medžiaga (tiriamoji grupė). Teigiamuose kontroliniuose mėginiuose, paveiktuose tokia pačia tiriamosios cheminės medžiagos doze in vivo, turi būti aptinkamos struktūrinės aberacijos, kurioms esant, bei veikiant tiriamąja medžiaga, būtų galima nesunkiai sumažinti pašalinį foną pakartotinai, o tai parodo tiriamosios sistemos jautrumą. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami efektai būtų ryškūs, bet tyrėjas ne iš karto atskleistų užkoduotas skaidres. Priimtina, kad teigiami kontroliniai mėginiai būtų suleisti gyvūnams tokiu būdu, kuris skiriasi nuo tiriamosios cheminės medžiagos suleidimo būdo bei būtų tik vienąkart dozuojami. Jeigu yra įmanoma, tai galima apsvarstyti teigiamų kontrolinių medžiagų, priklausančių cheminių medžiagų klase, panaudojimą. Toliau pateikiami teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai: Medžiaga CAS Nr. EINECS Nr. etilo metansulfonatas 62-50-0 200-536-7 etilo nitroslapalas 759-73-9 212-072-2 mitomicinas C 50-07-7 200-008-6 ciklofosfamidas ciklofosfamido monohidratas 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 trietilenmelaminas 51-18-3 200-083-5 Neigiami kontroliniai mėginiai, paveikti arba vien tirpikliu arba vien tik tirpinančiuoju įrenginiu arba kiti mėginiai paveikti tuo pačiu būdu kaip ir tiriamosios grupės, turi būti paimami kiekvieną kartą nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų metu gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad variacijos laipsnis tarp gyvūnų ir ląstelių, kuriose stebimos chromosomų aberacijos, yra tinkamas. Jei neigiami kontroliniai mėginiai paimami tik vieną kartą tai pirmojo paėmimo laikas yra tinkamiausias. Taipogi reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesioį tai, kad anksčiau atliktų eksperimentų aprašuose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio.

1.5 BANDYMO ATLIKIMO METODIKA

1.5

1.5.1 Gyvūnų skaičius ir lytis Kiekvienoje tiriamojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti ne mažiau kaip 5 vienos lyties gyvūnai. Jei tyrimo metu galima gauti anksčiau atliktų tyrimų, kai buvo panaudota ta pati gyvūnų rūšis ir tas pats poveikio tiriama medžiaga būdas, duomenis, kurie rodo, kad toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, tai tada užteks ištirti vienos lyties gyvūnus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis yra veikiamas, priklauso nuo lyties, pvz., jautrumas kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms, tai reikia ištirti atitinkamos lyties gyvūną.

1.5.2 Veikimo tvarkaraštis Pirmiausia tik vieną kartą veikiama tiriamosiomis cheminėmis medžiagomis. Tiriamosiomis cheminėmis medžiagomis galima veikti, taikant vadinamąją išskaidytą dozę, kai tą pačią dieną du kartus paveikiama tiriamąja medžiaga ir padarius ne daugiau kaip keleto valandų pertrauką tam, kad būtų paveikta pakankamai dideliu tiriamosios medžiagos tūriu. Kitų dozių davimo tvarka turi būti moksliškai pagrindžiama. Veikiant tiriamąja medžiaga vienos dienos bėgyje, prieš tai reikia dukart atskirai paimti mėginius. Tiriant graužikus, pirmasis mėginys paimamas, praėjus maždaug 1,5 ląstelinio ciklo (šis normaliai trunka 12–18 valandų) po veikimo. Kadangi tiriamosios medžiagos įsiskverbimas bei metabolizmas o taipogi jos įtaka ląsteliniam ciklui gali paveikti optimalų laiką per kurį nustatomos chromosomų aberacijos, tai rekomenduojama, kad antrasis mėginys būtų paimamas būtų atliekamas praėjus 24 valandoms po veikimo. Jei dozės duodamos daugiau nei vieną dieną tai mėginys paimamas, praėjus po veikimo laiko tarpui, lygiam maždaug normalaus 1,5 ląstelinio ciklo trukmės. Prieš numarinant, atitinkama dozė metafazę sustabdančio agento (pvz., Kolcemido® ar kolchicino) suleidžiama gyvūnams į pilvo plėvę Po atitinkamo intervalo iš gyvūnų paimami mėginiai. Pelėms tas intervalas yra maždaug 3–5 valandos, kiniškiems žiurkėnams – 4–5 valandos. Iš kaulų čiulpų išskiriamos ląstelės ir analizuojamos, siekiant nustatyti chromosomų aberacijas.

1.5.3 Dozės dydis Jeigu tyrimas atliekamas, siekiant surasti intervalą, nes nėra apie tai duomenų, tai jis turi būti atliekamas to pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei veikiant juos tiriamąja chemine medžiaga pagal tą patį tvarkaraštį, kuris buvo naudojamas pagrindinio tyrimo metu (5). Jeigu nustatomas toksiškumas, tai pirmąkart imant mėginius, naudojami trys doziniai lygiai. Šie doziniai lygmenys turi apimti visą intervalą, pradedant nuo maksimumo ir baigiant minimumu arba tokia doze, kuri visiškai nėra toksiška. Vėlesniu mėginių paėmimo metu naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės požymiai, pasirodantys, kai naudojant tokį pat dozavimo tvarkaraštį, yra suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina. Cheminės medžiagos, kurios pasižymi specifiniu biologiniu aktyvumu, kai jų dozės būna mažos ir netoksinės (pavyzdžiui tokios kaip hormonai ir mitogenai) gali būti laikomos išimtimi, kai joms taikomi dozę nustatantys kriterijai ir tada jos tiriamos kiekvienu atveju atskirai. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kurią suleidus į kaulų čiulpus, pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, mitozinis indeksas sumažėja daugiau nei 50 %).

1.5.4 Ribų paieškos tyrimas Jeigu tyrimas atliekamas, esant vienam dozės lygmeniui, kuris, per vieną dieną atliekant pavienį arba du poveikius tiriamąja medžiaga, mažiausiai sudaro 2000 mg/kg kūno masės ir jei nepastebima jokių toksinių efektų bei, remiantis struktūriškai panašių cheminių medžiagų tyrimų duomenimis, nebus tikimasi užregistruoti genotoksiškumo, tai tada laikomasi nuostatos, kad yra tikslinga atlikti pilną tyrimą panaudojant tris dozinius lygmenis. Atliekant ilgiau trunkančius tyrimus ir tiriamąja medžiaga veikiant iki 14 dienų, ribinė dozė turi siekti 2000 mg/kg kūno masės, tuo atveju kai tiriamąja medžiaga veikiama ilgiau nei 14 dienų - 1000 mg/kg kūno masės. Numatomas tiriamosios medžiagos poveikis žmogui gali parodyti, kad atliekant ribų paieškos tyrimą reikalingas aukštesnis dozinis lygmuo.

1.5.5 Dozių davimas Tiriamoji medžiaga paprastai yra duodama, priverstinai maitinant per vamzdelį, įstatant jį į skrandį, tinkamai įvedant kanulę per vamzdelį arba injekciją į pilvą. Tiriamąją medžiagą galima įterpti ir kitais būdais, jei jie yra pagrindžiami. Maksimalus skysčio, priverstinai duodamo per vamzdelį arba įšvirkščiamo į pilvą vienu metu, tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 mg kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių davimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus sujaudrinančias ar irimą sukeliančias medžiagas, kurios, būdamos didesnių koncentracijų, sukelia žalingus reiškinius, tiriamosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad esant visiems dozės lygiams, tūris būtų pastovus.

1.5.6 Chromosomų paruošimas Kai tik gyvūnai numarinami, iš jų iškart išimami kaulų čiulpai, pamerkiami į hipotoninį tirpalą ir fiksuojami. Vėliau kaulų čiulpų ląstelės išsklaidomos ant tepinėlių ir nudažomos.

1.5.7 Analizė Mitozinis indeksas nustatomas įvertinant citotoksiškumą mažiausiai 1000 ląstelių, gautų iš 1 gyvūno ir tai atliekama, ištiriant visus tiriamąja medžiaga veiktus (įskaitant teigiamus kontrolinius) ir neveiktus (neigiamus kontrolinius) gyvūnus. Išanalizuojama mažiausiai 100 ląstelių, gautų iš 1 gyvūno. Šis skaičius gali būti sumažinamas, jei stebima daug chromosomų aberacijų. Visos skaidrės (įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių mėginių skaidres) turi būti užkoduojamos nepriklausomai viena nuo kitos tam, kad jas būtų galima ištirti mikroskopu. Kadangi ruošiant skaidres, dažnai suardoma metafazėje esančios ląstelės bei prarandamos chromosomos, tai vėliau suskaičiuotos ląstelės turi turėti tokį centromerų skaičių, kuris būtų lygus 2n ± 2.

2. DUOMENYS

2.

2.1 REZULTATŲ APDOROJIMAS Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Reikia nustatyti kiekvieno gyvūno ląstelių, chromosomų aberacijų vienoje ląstelėje skaičius bei ląstelių, turinčių chromosomas su struktūrinėmis aberacijomis, skaičių, išreiškiamą procentais. Reikia išvardinti skirtingus chromosomų struktūrinių aberacijų tipus, nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį gyvūnų, paveiktų ir nepaveiktų tiriamąja chemine medžiaga, grupėse. Atskirai registruojami plyšiai, tačiau į juos neatsižvelgiama, nustatant absoliutų aberacijos dažnį. Jeigu tarp atskirų lyčių nenustatoma jokių skirtumų pagal atsaką, tai abiejų lyčių tyrimo duomenys apjungiami tam, kad būtų galima atlikti statistinę analizę.

2.2 REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS Egzistuoja keli kriterijai, tokie, kaip nuo koncentracijos priklausomas bei pakartojamas chromosomines aberacijas turinčių ląstelių skaičiaus padidėjimas, kuriuo remiantis, nustatoma ar gautas rezultatas yra teigiamas. Pirmiausia reikia aptarti gautų rezultatų biologinę reikšmę. Vertinant tyrimo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus6. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis faktorius, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas. Abejotini rezultatai turėtų būti išsiaiškinti toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia pakeičiant eksperimento sąlygas. Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti mitozę ir sukelti chromosomų skaičiaus ląstelėje pakitimus. Ląstelių, turinčių endoreduplikuotas chromosomas, skaičiaus padidėjimas gali parodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti ląstelinį ciklą (7), (8). Jei tiriant medžiagą buvo gauti rezultatai, neatitinkantys aukščiau išvardytų kriterijų, tai šioje sistemoje medžiaga laikoma nemutageniška. Nors atliekant daugelį eksperimentų, bus gauti aiškūs teigiami ir neigiami rezultatai, tačiau retais atvejais, remiantis gautų duomenų visuma, nebus galima padaryti konkrečios išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Net ir daug kartų pakartojus eksperimentą rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs. Tiriant chromosomų aberacijas in vitro, teigiami rezultatai, gauti atlikus tyrimą, rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas tirtos gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, kad esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų tirtos gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. Reikia aptarti tą galimybę, ar tiriamoji medžiaga ar jos metabolitai pasieks bendrąją cirkuliaciją ar specifiniu būdu tą audinį, į kurį jie yra nukreipti (pvz., sisteminio toksiškumo atveju).

3. ATASKAITA

3.

3.1. TYRIMO ATASKAITA Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikiama tokia informacija:

Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys:

priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas tirpinantysis įrenginys,

tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.

Tiriamieji gyvūnai:

panaudota rūšis ar kamienas,

gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,

šaltinis, laikymo sąlygos, maitinimas ir pan.,

kiekvieno gyvūno svoris prieš pradedant tyrimą ir kiekvienos grupės svorio intervalas, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.

Tyrimo sąlygos:

teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai,

ribų paieškos tyrimo, jei jis buvo vykdomas, duomenys,

pagrindinė priežastis, nulėmusios arti ribos esančio lygio pasirinkimą

tiriamosios medžiagos paruošimo apibūdinimas,

tiriamosios medžiagos davimo apibūdinimas,

priežastys, nulėmusios davimo būdo pasirinkimą

metodai, kuriais patvirtinama, kad tiriamoji cheminė medžiaga pateko į bendrąją cirkuliaciją ar audinį, į kurį ji buvo nukreipta, jei tai buvo padaryta,

tiriamosios cheminės medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (pm) pervertimas į tikrąją dozę (mg/kūno masės kg/dienai), jei tai įmanoma,

duomenys apie pašarų ir geriamojo vandens kokybę,

detalus veikimo tiriamąja medžiaga atlikimo ir mėginio paėmimo tvarkaraščio aprašymas,

metodai toksiškumui įvertinti,

metafazę sustabdančios medžiagos prigimtis, jos koncentracija bei veikimo ja trukmė,

skaidrių paruošimo būdai,

aberacijų įvertinimo kriterijai,

ląstelių, kurios buvo išskirtos iš vieno gyvūno bei išanalizuotos, skaičius,

teigiamų, neigiamų ar abejotinų rezultatų nustatymo kriterijai.

Rezultatai:

toksiškumo požymiai,

mitozinis indeksas,

kiekvieno gyvūno ląstelėse esančių aberacijų tipas ir skaičius,

absoliutus aberacijų vieno grupės gyvūnų ląstelėse skaičius, kartu nurodant vidurkius ir standartinius nukrypimus,

ląstelėse esančių aberacijų skaičius, kartu nurodant vidurkius ir standartinius nukrypimus,

ploidiškumo pasikeitimai, jei buvo tokie stebimi,

dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,

statistinės analizės, jei tokios buvo atliktos,

vienu metu gauti neigiami kontroliniai duomenys,

anksčiau gauti neigiami kontroliniai duomenys, kartu pateikiant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus,

vienu metu gauti teigiami kontroliniai duomenys.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)

NUORODOS Adler, ID. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275–306. Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, p. 157–165. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141. Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, p. 305–312. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G, Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313–319. Loveli, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge. p. 184–232. Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, p. 403–413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362–1364.

B.

12. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ ERITROCITŲ MAŽŲJŲ BRANDUOLIŲ TYRIMAS IN VIVO

1. METODAS Šis metodas pakartoja OECD TG 474, žinduolių eritrocitų mažųjų branduolių tyrimą (1997).

1.

1.1 ĮVADAS Žinduolių mažųjų branduolių tyrimas in vivo naudojamas, kad analizuojant gyvūnų, paprastai graužikų, kaulų čiulpų eritrocitus bei periferinio kraujo ląsteles būtų galima nustatyti tiriamosios cheminės medžiagos pažeidimus, padarytus eritroblastų chromosomose arba mitoziniame aparate. Mažųjų branduolių tyrimo tikslas – identifikuoti chemines medžiagas, kurios sukeliančias citogenetinius pažeidimus, dėl kurių susiformuoja mažieji branduoliai, kai chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos įgyja pirminę struktūrą (išnyksta). Kai kaulų čiulpų eritroblastas vystydamasis metu virsta polichromatiniu eritrocitu, pagrindinis (didysis) branduolys yra suspaudžiamas ir bet kuris susiformavęs mažasis branduolys gali likti už citoplazmos, neturinčios branduolio, ribų. Šiose ląstelėse galima pamatyti mažuosius branduolius, nes ląstelė yra praradusi savo pagrindinį branduolį. Jei gyvūnuose, paveiktuose tiriamąja chemine medžiaga, padaugėja polichromatinių eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, tai šitai rodo, kad chromosomos buvo pažeistos. Atliekant šį tyrimą paprastai naudojami graužikų kaulų čiulpai, nes būtent šiame audinyje susiformuoja polichromatiniai eritrocitai. Periferinio kraujo polichromatinių (nesubrendusių, turinčių mažuosius branduolius) eritrocitų tyrimą galima atlikti su bet kuria rūšimi, kurios blužnis nesugebėjo pašalinti eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, arba kuri buvo pakankamai jautri nustatytiems agentams, sukeliantiems chromosomų aberacijas, atžvilgiu. Mažuosius branduolius galima atskirti, pagal daugelį kriterijų. Vienas jų yra kinetochorų arba centromerinės DNR, esančios arba nesančios mažuosiuose branduoliuose, nustatymas. Tyrimo, kai gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga kelias ar daugiau savaičių, pagrindinis tikslas taipogi gali būti periferiniame kraujyje esančių subrendusių (normochromatinių) eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skaičiaus, palyginimas su subrendusių eritrocitų skaičiumi. Šis žinduolių mažųjų branduolių tyrimas in vivo yra ypač svarbus, įvertinant mutagenų daromą žalą, pagal kurią galima spręsti apie metabolizmą, farmakokinetiką bei DNR pažaidų reparaciją in vivo nulemiančius veiksnius, nors jie gali skirtis pagal gyvūnų rūšį, audinį ir genetinį lygmenį. Tyrimas in vivo taip pat naudingas toliau tiriant mutageninius efektus, nustatytus in vitro. Jeigu nustatoma, kad tiriamoji medžiaga ar reaktyvus metabolitas neįsiskverbė į audinį, į kurį buvo nukreiptas, tai atliekant šį tyrimą, jis nebenaudojamas. Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2 SĄVOKOS Centromera (kinetochoras) – chromosomos regionas, su kuriuo ląstelės dalijimosi metu asocijuojasi verpstės siūlai ir dėl to dukterinės chromosomos tvarkingai išsidėsto dukterinių ląstelių poliuose. Mažieji branduoliai – branduoliai, kurie yra atskirti nuo didžiojo ląstelės branduolio, tačiau jie yra papildomi branduoliai, susidarantys tada, kai mitozės telofazės metu chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos įgauna pirminę struktūrą (išnyksta). Normochromatinis eritrocitas – subrendęs, neturintis ribosomų eritrocitas, kuris skiriasi nuo nesubrendusio polichromatinio eritrocito pagal taip, kaip dažais, ribosomų dažosi specifiškais dažais. Polichromatinis eritrocitas – nesubrendęs, tarpinėje vystymosi stadijoje esantis eritrocitas, kuris vis dar tebeturi ribosomas ir gali būti atskirtas nuo subrendusio normochromatinio eritrocito pagal kaip ribosomų atžvilgiu dažosi specifiniais dažais.

1.3 TYRIMO METODO PRINCIPAS Gyvūnai veikiami tiriamąja medžiaga pasirinktu būdu. Jeigu naudojami kaulų čiulpai, tai praėjus tam tikriems laiko tarpams po veikimo tiriamąja medžiaga, gyvūnai numarinami, iš jų išimami kaulų čiulpai, paruošiami ir nudažomi jų preparatai (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Kai naudojamas periferinis kraujas, tai po veikimo tiriamąja medžiaga praėjus atitinkamiems laiko tarpams, paruošiami tepinėliai, kurie vėliau nudažomi (4) (8) (9) (10). Tiriant periferinį kraują, kaip galima mažiau laiko turi praeiti tarp paskutinio veikimo ir ląstelių surinkimo. Preparatai analizuojami, siekiant identifikuoti mažuosius branduolius.

1.4 TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.4

1.4.1 Preparatai

1.4.1

1.4.1.1 Gyvūno rūšies pasirinkimas Kai naudojami kaulų čiulpai, rekomenduojama pasirinkti peles ar žiurkes, nors galima pasirinkti ir bet kokias kitas žinduolių rūšis. Kai naudojamas periferinis kraujas, rekomenduojama pasirinkti peles. Tačiau galima naudoti bet kokias kitas žinduolių rūšis, jeigu parodoma, kad tos rūšies žinduolio blužnis nesugeba pašalinti eritrocitus, turinčius mažuosius branduolius arba tos rūšies žinduolis pakankamai jautrus žinomiems agentams, struktūrines chromosomų aberacijas arba chromosomų skaičiaus viename chromosomų rinkinyje pakitimus. Rekomenduojama panaudoti įprastinius jaunų ir sveikų gyvūnų laboratorinius kamienus. Tyrimo pradžioje gyvūnų svorio variacijos turi būti minimalios ir neperžengti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūno vidutinio svorio.

1.4.1.2 Laikymo ir maitinimo sąlygos Taikomos Pagrindinio įvado B dalyje nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad drėgmė siektų 50–60 %.

1.4.1.3 Gyvūnų paruošimas Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę bei tiriamąją (kuriai priskirti individai bus veikiami chemine medžiaga) grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos efektai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas turi savo identifikacijos ženklą. Gyvūnams leidžiama aklimatizuotis prie laboratorinių sąlygų mažiausiai per 5 dienas.

1.4.1.4 Dozių paruošimas Kietosios tiriamosios cheminės medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinamuosiuose įrenginiuose ir jei reikia, tai, prieš paruošiant jų dozes, skirtas gyvūnams, jos praskiedžiamos. Skystųjų tiriamųjų medžiagų dozės ruošiamos iškart arba prieš dozių paruošimą, jos praskiedžiamos. Prieš kiekvieną bandymą šviežiai paruošiami tiriamosios cheminės preparatai ir neatsižvelgiama į stabilumo tyrimo metu gautus duomenis, rodančius, kad medžiaga atitinka jos laikymui keliamus reikalavimus.

1.4.2 Tyrimo sąlygos

1.4.2

1.4.2.1 Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys Tirpiklis ar tirpinantysis prietaisas neturėtų sukelti jokio toksinio efekto, atitinkančio vartojamas dozes ir neturėtų kilti spėlionių, kad jis gali chemiškai reaguoti su tiriamąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrengimai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį.

1.4.2.2 Kontroliniai mėginiai Kiekvieno tyrimo metu turi būti tiriami iš kiekvienai lyčiai priklausančių gyvūnų paimti tarpusavyje sutampantys teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai. Išskyrus tą atvejį, kai gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti tiriamąja chemine medžiaga (tiriamoji grupė). Teigiamuose mėginiuose in vivo sąlygomis turi susidaryti mažieji branduoliai, esant tokiam veikimui, kuris kaip tikimasi, užgoš pašalinį foną. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami efektai būtų ryškūs, bet kad tyrėjas ne iškart atskleistų užkoduotas skaidres. Priimtina, kad teigiamas kontrolinis mėginys būtų duodamas kitu būdu nei tiriamoji cheminė medžiaga ir mėginiai būtų tik vienąkart paimami. Be to, jei įmanoma, tai galima apsvarstyti teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų, priklausančių konkrečiai cheminių medžiagų klasei, panaudojimą. Žemiau pateikiami teigiamų kontrolinių medžiagų pavyzdžiai: Medžiaga CAS Nr. EINECS Nr. etilo metansulfonatas 62-50-0 200-536-7 N-etil-N- nitroslapalas 759-73-9 212-072-2 mitomicinas C 50-07-7 200-008-6 ciklofosfamidas ciklofosfamido monohidratas 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 trietilenmelaminas 51-18-3 200-083-5 Neigiami kontroliniai mėginiai, paveikti arba vien tirpikliu arba vien tik tirpinamuoju įrenginiu arba kiti mėginiai paveikti tuo pačiu būdu kaip ir tiriamosios grupės turi būti kiekvienąkart paimami, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų metu gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad variacijos laipsnis tarp gyvūnų ir ląstelių, turinčių mažuosius branduolius, yra priimtini. Jei neigiami kontroliniai mėginiai paimami tik vieną kartą tai pirmojo paėmimo laikas yra pats priimtiniausias. Be to reikia papildomai panaudoti tiriamąja medžiaga nepaveiktus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų bei išspausdintus duomenis, rodančius, kad pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokių žalingų ar mutageninių efektų. Jei naudojamas periferinis kraujas, tai mėginys, naudojamas prieš veikimą tiriamąja medžiaga, gali būti naudojamas kaip neigiama kontrolė, tačiau tik trumpai trunkančių periferinio kraujo tyrimų metu (pavyzdžiui, 1–3 kartus veikiant tiriamąja medžiaga), kai gaunami duomenys atitinka pageidaujamą anksčiau naudotos kontrolės intervalą

1.5 TYRIMO ATLIKIMO METODIKA

1.5

1.5.1 Gyvūnų skaičius ir lytis Kiekvienoje tiriamojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti mažiausiai 5 vienos lyties gyvūnai. Jei tyrimo metu galima gauti anksčiau atliktų tyrimų, panaudojant tą pačią gyvūnų rūšį ir tą patį veikimo tiriamąja medžiaga būdą, duomenis, kurie rodo, toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, tai tada užteks ištirti vienos lyties gyvūnus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis veikiamas, priklauso nuo lyties, kaip antai jautrumo kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms atveju, tai reikia ištirti atitinkamą gyvūnų rūšį.

1.5.2 Veikimo tvarkaraštis Nerekomenduojama laikytis veikimo tiriamąja chemine medžiaga atlikimo standartinio tvarkaraščio (t. y. 1, 2 ar daugiau veikimų atliekami kas 24 valandos). Geriau naudoti mėginius, kurių dozės davimo trukmė yra prailginta iki tol, kol šio tyrimo metu buvo nustatytas teigiamas efektas arba atliekant neigiamą kontrolinį tyrimą tol, kol buvo nustatytas toksiškumas arba buvo panaudota ribota dozė buvo duodama iki mėginio paėmimo. Tiriamosios cheminės medžiagos gali būti duodamos ir esant išskaidytai jų doze, t. y. per 1 dieną atliekami 2 poveikiai tiriamąja medžiaga ir abi procedūras skiria ne ilgesnis kaip kelių valandų laikotarpis tam, kad būtų duotas didelis medžiagos tūris. Tyrimas gali būti atliekamas 2 būdais: Mėginiai gali būti papildomai paimami ir kitu laiko metu, jeigu tai manoma esą svarbu.

1.5.2 a)

gyvūnai vienąkart veikiami tiriamąja chemine medžiaga. Kaulų čiulpų mėginiai paimami mažiausiai 2 kartus, ne anksčiau kaip praėjus 24 valandoms po veikimo tiriamąja medžiaga, bet ne vėliau kaip praėjus 48 valandoms po veikimo ir be to mėginiai paimami atitinkamu laiko momentu. Jeigu mėginiai imami anksčiau nei praėjus 24 valandoms po veikimo, tai turi būti nurodomos priežastys, paskatinusios imtis tokių veiksmų. Periferinio kraujo mėginiai imami mažiausiai 2 kartus, ne anksčiau kaip praėjus 36 valandoms po veikimo, atitinkamais laiko, praėjusio nuo to, kai buvo paimtas pirmasis mėginys, intervalais, bet ne ilgesniu kaip 72 valandų laikotarpiu. Kai paėmus vieną mėginį, nustatomas teigiamas atsakas, tai papildomas mėginio paėmimas nėra būtinas;

jei per dieną atliekami du ir daugiau veikimų (pavyzdžiui, atliekami du ir daugiau veikimų kas 24 valandos), tai mėginiai paimami vienąkart, praėjus 18–24 valandoms po paskutinio kaulų čiulpų paveikimo tiriamąja medžiaga vienąkart, praėjus 36–48 valandoms po paskutinio periferinio kraujo ląstelių paveikimo tiriamąja medžiaga (12).

1.5.3 Dozės dydis Jeigu atliekamas tyrimas, siekiant surasti intervalą, nes nėra duomenų apie tai, tai jis turi būti atliekamas to pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei veikiant juos tiriamąja chemine medžiaga pagal tą patį tvarkaraštį, kuris buvo naudojamas pagrindinio tyrimo metu (13). Jeigu nustatomas toksiškumas, tai pirmąkart imant mėginius, naudojami 3 doziniai lygiai. Šie doziniai lygmenys turi apimti visą intervalą, pradedant nuo maksimumo ir baigiant minimumu arba tokia doze, kuri visiškai nėra toksiška. Vėlesniu mėginių paėmimo metu naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės požymiai, tokie, kurie pasirodo, kai naudojant tokį pat dozavimo tvarkaraštį, suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina. Cheminės medžiagos, kurios pasižymi specifiniu biologiniu aktyvumu, kai jų dozės būna žemos ir netoksinės (pavyzdžiui tokios kaip hormonai ir mitogenai) gali būti laikomos išimtimi, kai joms taikomi dozę nustatantys kriterijai ir tada jos tiriamos kiekvienu atveju atskirai. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kurią suleidus į kaulų čiulpus, pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (nesubrendusių eritrocitų skaičius, lyginant su absoliučiu visų eritrocitų, esančių kaulų čiulpuose ir periferiniame kraujyje, skaičiumi, sumažėja).

1.5.4 Ribų paieškos tyrimas Jeigu tyrimas atliekamas, esant vienam doziniam lygmeniui, kuris, per vieną dieną atliekant pavienį arba du poveikius tiriamąja medžiaga, mažiausiai sudaro 2000 mg/kūno/kg ir jei nepastebima jokių toksinių efektų bei, remiantis struktūriškai panašių cheminių medžiagų tyrimų duomenimis, nebus tikimasi užregistruoti genotoksiškumo, tai tada laikomasi nuostatos, kad yra tikslinga atlikti pilną tyrimą, panaudojant 3 dozinius lygmenis. Atliekant ilgiau užtrunkančius tyrimus ir tiriamąja medžiaga veikiant iki 14 dienų, ribinė dozė turi siekti 2000 mg/kūno/kg, tuo atveju kai tiriamąja medžiaga veikiama ilgiau nei 14 dienų – 1000 mg/kūno/kg. Numatomas tiriamosios medžiagos poveikis žmogui gali parodyti, kad, atliekant ribų paieškos tyrimą reikia naudoti aukštesnį dozinį lygmenį.

1.5.5 Dozių davimas Tiriamoji medžiaga yra paprastai duodama, priverstinai maitinant per vamzdelį, įstatant jį į skrandį, tinkamai įvedant kanulę per vamzdelį arba injekciją į pilvą. Tiriamąją medžiagą galima įvesti ir kitais būdais, jei jie yra pagrindžiami. Maksimalus skysčio, priverstinai duodamo per vamzdelį arba įšvirkščiamo į pilvą vienu metu, tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 mg kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių davimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus suaudrinančias ar irimą sukeliančias medžiagas, kurios, būdamos didesnėmis koncentracijomis, sukelia žalingus efektus, tiriamosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad esant visiems doziniams lygmenims, tūris būtų pastovus.

1.5.6 Kaulų čiulpų/kraujo paruošimas Kaulų čiulpų ląstelės paprastai gaunamos iš numarintų gyvūnų šlaunikaulių ir blauzdikaulių. Bendru atveju iš šlaunikaulių ir blauzdikaulių išskiriamos ląstelės ir, panaudojant gerai žinomus metodus, paruošiami jų preparatai, kurie po to nudažomi. Periferinis kraujas imamas iš uodeginės venos ar kito atitinkamo kraujo indo. Iš kraujo išskirtos ląstelės arba iškart dažomos supravitaliniais dažais (8) (9) (10) arba paruošiami tepinėliai, kurie vėliau yra nudažomi. DNR atžvilgiu naudojami specifiniai dažai, tokie kaip akridino oranžinis 14 arba Hoechst 33258 dažas, turintis pironino-Y 15, gali pašalinti kai kuriuos artefaktus, kurie atsiranda, naudojant DNR atžvilgiu nespecifinius dažus. Tačiau šis privalumas neatmeta galimybės naudoti ir įprastinius dažus (pavyzdžiui, Giemsa dažą). Galima naudoti ir papildomas sistemas, tokias kaip celiulioze užpildytas chromatografines kolonėles, skirtas branduolius turinčioms ląstelėms pašalinti (16), kadangi buvo parodyta, kad naudojant šias sistemas, mažuosius branduolius galima tinkamai išskirti laboratorinėmis sąlygomis.

1.5.7 Analizė Nustatomas kiekvieno gyvūno nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykis, suskaičiuojant mažiausiai 200 eritrocitų, esančių kaulų čiulpuose ir 1000 eritrocitų, esančių periferiniame kraujyje (17). Prieš pradedant mikroskopinę analizę, visos skaidrės, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius mėginius, užkoduojamos nepriklausomai vienos nuo kitų. Tam, kad identifikuoti nesubrendusius, mažuosius branduolius turinčius eritrocitus, reikia suskaičiuoti mažiausiai 2000 eritrocitų, gautų iš vieno gyvūno. Papildoma informacija gali būti gaunama, kai skaičiuojami subrendę eritrocitai, turintys mažuosius branduolius. Kai skaidrės analizuojamos, tai nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykis turi būti ne mažesnis kaip 20 % kontrolinė vertės. Tuo atveju, kai gyvūnai buvo veikiami tiriamąja medžiaga mėnesį ir ilgiau, tai reikia suskaičiuoti mažiausiai 2000 eritrocitų, gautų iš vieno gyvūno tam, kad galima būtų identifikuoti ląsteles, turinčias mažuosius branduolius. Vietoj rankinio įvertinimo galima naudoti automatizuotas analizės sistemas (vaizdo analizės ir ląstelių suspensijos srauto tėkmės citometrinės analizės sistemas), jeigu jos atitinkamai yra patvirtintos ir pagrįstos.

2. DUOMENYS

2.

2.1 REZULTATŲ APDOROJIMAS Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Turi būti nustatytas kiekvieno gyvūno nesubrendusių eritrocitų ir nesubrendusių eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skaičius bei nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis. Jeigu gyvūnai pastoviai veikiami tiriamąja medžiaga mėnesį ar ilgiau, tai turi būti pateikti duomenys apie subrendusius eritrocitus, jei tokie duomenys buvo renkami. Jeigu įmanoma, tai kiekvieno gyvūno atveju pateikiamas nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis bei eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skaičius, išreikštas procentais Jeigu nenustatoma jokių atsako skirtumų tarp atskirų lyčių, tai abiejų lyčių tyrimo duomenys sujungiami tam, kad būtų galima atlikti statistinę analizę.

2.2 REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS Teigiamą rezultatą galima įvertinti keletu kriterijų, tokiais kaip nuo dozės priklausomas ląstelių, turinčių mažuosius branduolius skaičiaus padidėjimas arba akivaizdus ląstelių, turinčių mažuosius branduolius ir priklausančių pavienės dozės grupei pagal vienkartinį mėginio paėmimo laiką, skaičiaus padidėjimas. Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Įvertinant tyrimo metu gautus rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais metodais (18) (19). Statistinis reikšmingumas turėtų būti vienintelis faktorius, pagal kurį sprendžiama, ar atsakas teigiamas, ar ne. Abejotini rezultatai turėtų būti išaiškinti, toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia pakeičiant eksperimentines sąlygas. Jei tiriant medžiagą gaunami rezultatai, neatitinkantys aukščiau išvardytų kriterijų, ši tiriamoji medžiaga laikoma nemutageniška. Nors daugumos eksperimentų metu buvo gauti aiškiai teigiami ar neigiami rezultatai, išimtiniais atvejais gautų rezultatų rinkinys neleis padaryti teisingos išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs, nepriklausomai nuo atliktų eksperimentų skaičiaus. Tiriant mažuosius branduolius in vitro, gauti teigiami rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia mažųjų branduolių, kuriuos sąlygoja tiriamosios rūšies gyvūnų eritroblastų chromosomų ar mitozinio aparato pažeidimai, pasireiškimą. Neigiami rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga nesukelia mažųjų branduolių atsiradimo tiriamos rūšies gyvūnų nesubrendusiuose eritroblastuose. Reikia aptarti tą galimybę, kai tiriamoji medžiaga arba jos metabolitai specifiniu būdu pasieks bendrąją cirkuliaciją ar tą audinį, į kurį jie yra nukreipti (pavyzdžiui, sisteminio toksiškumo atveju).

3. ATASKAITA

3. TYRIMO ATASKAITA

Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikiama tokia informacija:

Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys:

priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,

tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.

Tiriamieji gyvūnai:

panaudota rūšis ar kamienas,

gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,

šaltinis, laikymo sąlygos, maitinimas ir pan.,

kiekvieno gyvūno svoris prieš pradedant tyrimą ir kiekvienos grupės svorio riba, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.

Tyrimo sąlygos:

teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai,

ribų paieškos tyrimo, jei jis buvo vykdomas, rezultatai,

pagrindinė priežastis, nulėmusi arti ribos esančio lygio pasirinkimą

duomenys apie tiriamosios medžiagos paruošimą,

duomenys apie tiriamosios medžiagos davimą,

pagrindinė priežastis, nulėmusi davimo būdo pasirinkimą

metodai, kuriais patvirtinama, kad tiriamoji cheminė medžiaga pateko į bendrąją cirkuliaciją ar audinį, į kurį ji buvo nukreipta, jei tai buvo padaryta,

tiriamosios cheminės medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (pm) pervertimas į tikrąją dozę (mg/kūno masės kg/dienai), jei tai įmanoma,

duomenys apie pašarų ir geriamojo vandens kokybę,

detalus veikimo tiriamąja medžiaga atlikimo ir mėginio paėmimo tvarkaraščio aprašymas,

skaidrių paruošimo metodai,

metodai toksiškumui įvertinti,

nesubrendusių eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skaičiavimo kriterijai,

iš vieno gyvūno išskirtų bei išanalizuotų ląstelių skaičius,

teigiamų, neigiamų ar abejotinų rezultatų nustatymo kriterijai.

Rezultatai:

toksiškumo požymiai,

nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis,

kiekvieno gyvūno nesubrendusių, turinčių mažuosius branduolius, eritrocitų skaičius,

kiekvienos grupės nesubrendusių, mažuosius branduolius turinčių eritrocitų skaičiaus vidurkis ir standartinis nukrypimas,

dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,

statistinės analizės, jei bet kokios buvo atliktos,

vienu metu naudojamų neigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenys,

vienu metu naudojamų teigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenys.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)

NUORODOS Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, p. 187–190. Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, p. 9–15. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123, p. 61–118. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, p. 29–80. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, CM. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice in: Developments in Science and Practice of Toxicology, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, p. 555–558. MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C, Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res. 189, p. 103–112. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E. (1990). The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol, 14, p. 513–522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, p. 245–249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, p. 83–98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan)(1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 153–159. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, p. 293–304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalized sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 313–319. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G, Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313–319. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, p. 241–247. MacGregor, J.T., Wehr, CM. and Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, p. 269–275. Romagna, F. and Staniforth, CD. (1989). The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, p. 91–104. Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, p. 97–99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141. Loveli, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G, Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184–232.

13/14. MUTAGENIŠKUMAS. GRĮŽTAMŲJŲ MUTACIJŲ BAKTERIJOSE TYRIMAS

1. METODAS Šis metodas pakartoja OECD TG 471, grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimą (1997).

1.

1.1. ĮVADAS Tiriant grįžtamąsias mutacijas bakterijose, naudojami aminorūgščių reikalaujantys Salmonella typhimurium ir Escherichia coli kamienai tam, kad būtų galima nustatyti taškines mutacijas, tokias kaip vienos ar kelių DNR bazių porų pakaitos, intarpai ar delecijos (1) (2) (3). Šio grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimo principas yra tai, kad jo metu nustatomos mutacijos, kurios pakeičia tiriamuosiuose kamienuose esančias mutacijas taip, kad atkuria bakterijų funkcinį sugebėjimą sintetinti pagrindinę amino rūgštį. Bakterijos-revertantai aptinkamos pagal savo sugebėjimą augti terpėje, kurioje nėra amino rūgšties, reikalingos jų tėviniam tiriamajam kamienui. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra taškinės mutacijos bei su jomis susiję įvykiai ir egzistuoja pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl taškinių mutacijų. Grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimas yra nebrangus ir greitai bei pakankamai lengvai atliekamas. Dauguma tiriamųjų kamienų pasižymi keletu ypatybių, pagal kurias juos galima lengvai nustatyti, analizuojant mutacijas, DNR sekose, esančiose grįžtamųjų mutacijų vyksmo vietose bei sukuriančiose atsaką į signalą, padidintą ląstelių pralaidumą didelės molekulinės masės molekulėms ir DNR pažaidų atstatymo sistemų sunaikinimą arba pažaidoms atsparių DNR atkūrimo procesų suintensyvėjimą. Tiriant kamienų specifiškumą gaunama vertingos informacijos apie genotoksiškų agentų sukeltų mutacijų tipus. Tiriant chemines medžiagas, tarp jų ir lakius junginius, pasižyminčius skirtingomis fizikinėmis bei cheminėmis savybėmis, buvo sukaupta didelė duomenų apie įvairiausias struktūras bazė, kuri vartojama, vykdant grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimus bei naudojantis visuotinai pripažintais metodais. Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS Grįžtamųjų mutacijų tyrimasSalmonella typhimurium arba Escherichia coli kamienuose nustato kamieno, kuriam reikalinga aminorūgštis (atitinkamai histidinas ar triptofanas), mutaciją, dėl kurios atsiranda kamienas, kuriam nereikalinga aminorūgštis, tiekiama egzogeniniu būdu. Mutagenai, sukeliantys bazių porų pakaitas – agentai, sukeliantys DNR bazių porų pakaitas. Atliekant reversijos tyrimą nustatoma, kad pakaita gali vykti pradinės mutacijos ar kitoje bakterijos genomo vietoje. Mutagenai, sukeliantys skaitymo rėmelio pasislinkimą – agentai, sukeliantys vienos ar kelių DNR bazių porų intarpus ar delecijas, o dėl to pasislenka RNR molekulėje esantis skaitymo rėmelis.

1.3. PRADINIAI SVARSTYMAI Atliekant grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimą naudojamos prokariotinės ląstelės, kurios skiriasi nuo žinduolių ląstelių pagal tokius faktorius, kaip medžiagų transportas į ląstelę, metabolizmas, chromosomų struktūra bei DNR pažaidų atstatymo procesai. Paprastai atliekant tyrimus in vitro, reikia naudoti metabolinės aktyvacijos egzogeninį šaltinį. Metabolinės aktyvacijos sistemos in vitro negali absoliučiai imituoti žinduolių metabolinės aktyvacijos sąlygų in vivo. Taigi atliekant tyrimą negaunama tiesioginės informacijos apie žinduolių cheminių medžiagų mutageniškumą ir karcinogeniškumą. Grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimas paprastai naudojamas pirmiausia atrankai pagal genotoksiškumą o konkrečiai, pagal sugebėjimą sukelti taškines mutacijas. Gausi duomenų bazė parodė, kad daugelio cheminių medžiagų genotoksiškumas buvo nustatytas tiek grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimo tiek ir kitų tyrimų metu. Tačiau šio tyrimo metu negalima nustatyti keleto mutagenų ir šito priežastis yra dėl grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimo pagrindinio tikslo savitumo, metabolinės aktyvacijos skirtumų bei mutagenų paplitimo gamtoje skirtumų. Kita vertus, atsižvelgus į faktorius, padidinančius grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimo jautrumą, galima pervertinti mutageninį medžiagų aktyvumą. Grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimas netinka konkrečių cheminių medžiagų klasėms, pavyzdžiui junginiams, pasižymintiems pernelyg dideliu baktericidiniu aktyvumu (konkretūs antibiotikai) ir tiems junginiams, kurie, kaip manoma, blokuoja žinduolių ląstelių DNR replikacijos sistemą (keletas topoizomerazių inhibitorių ir nukleozidų analogų). Tokiais atvejais labiau tinka tirti žinduolių mutacijas. Nors vykdant šį tyrimą nustatoma, kad daugelis junginių karcinogeniški žinduolių atveju, tačiau šio tarpusavio ryšio nereikia suabsoliutinti. Tai priklauso nuo cheminių medžiagų klasės ir atliekant šį tyrimą neįmanoma nustatyti tam tikrų karcinogenų, kadangi jų veikimo mechanizmas nesiremia genotoksiškumu arba jie veikia visai kitaip nei bakterinėse ląstelėse.

1.4. TYRIMO METODO PRINCIPAS Bakterinės ląstelės veikiamos tiriamąja medžiaga esant arba nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos sistemos. Pagal inkorporacijos į lėkštelę metodą šios suspensijos padengiamos agaru ir užliejamos ant minimalios terpės. Pagal išankstinės inkubacijos metodą suspensija iš pradžių inkubuojama su medžiaga, kuria bus veikiamos bakterinės ląstelės, o vėliau padengiama agaru ir po to užpilama ant minimalios terpės. Panaudojant abu metodus ir praėjus 2–3 inkubacijos dienoms, skaičiuojamos revertantų kolonijos ir lyginamos su spontaninių revertantų kolonijomis, auginamomis kontrolinėse lėkštelėse, tirpiklyje, skaičiumi. Atliekant grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimą dažniausiai naudojama keletas procedūrų, tokių kaip inkorporacijos į lėkštelę (1) (2) (3) (4), išankstinės inkubacijos (2) (3) (5) (6) (7) (8), fliuktuacijos (9) (10) ir suspendavimo metodai. Taipogi buvo aprašytos dujinių ir lakiųjų medžiagų tyrimo modifikacijos (12). Tyrimo metodo aprašyme pateiktos bandymo atlikimo metodikos pirmiausia siejasi su inkorporacijos į lėkštelę ir išankstinės inkubacijos metodais. Šios dvi bandymo atlikimo metodikos tinka, atliekant eksperimentus, kai naudojama arba nenaudojama metabolinė aktyvacijos sistema. Kai kurios medžiagos priklauso tokioms cheminių medžiagų klasėms, kaip alifatiniai aminai, turintys trumpąją grandinę, dvivalenčiai metalai, turintys NO grupę, alkaloidai, turintys pirolizidiną, alilo grupę turintys junginiai bei azoto junginiai (3). Taip pat pripažįstama, kad naudojant tokias standartines tyrimo metodikas, kaip inkorporacijos į lėkštelę bei išankstinės inkubacijos metodus, ne visada galima nustatyti tam tikroms klasėms priklausančius mutagenus. Šie mutagenai yra laikomi ypatingais atvejais ir ypač rekomenduojama, kad jų nustatymui būtų panaudojamos ir kitos, alternatyvios bandymo atlikimo metodikos. Šiuos ypatingus atvejus galima identifikuoti, kartu pateikiant ir jų nustatymo metodikas: azodažai, diazo grupę turintys junginiai (3) (5) (6) (13), dujos bei lakiosios medžiagos (12) (14) (15) (16) ir glikozidai (17) (18). Nukrypimas nuo standartinės bandymo atlikimo metodikos turi būti moksliškai pagrįstas.

1.5. TYRIMO METODO APRAŠYMAS

1.5.

1.5.1. Preparatai

1.5.1.

1.5.1.1. Bakterijos Grynos bakterijų kultūros auginamos tol, kol pasiekia vėlyvąją eksponentinę ir ankstyvąją plato augimo fazę (apie 109 ląstelių/ml). Kultūros, pasiekusios vėlyvąją plato augimo fazę, neturi būti naudojamos. Svarbu yra tai, kad bakterijų kultūrose, kurios naudojamos eksperimentams, būtų didelis gyvų bakterijų ląstelių titras. Titras nustatomas arba pagal anksčiau gautas augimo kreives arba kiekvieno bandymo metu nustatant gyvų ląstelių skaičių pagal jų augimą lėkštelėje. Rekomenduojama inkubacijos temperatūra yra 37 oC Turi būti naudojami mažiausiai 5 bakterijų kamienai. Jų tarpe turi būti keturi Salmonella typhimurium kamienai (TA 1535, TA 1537 arba TA 97a arba TA 97; TA 98 ir TA 100), kurie, kaip buvo įrodyta daugelyje laboratorijų, yra patikimi ir atkuria atsaką. Šių keturių Salmonella typhimurium kamienų pirminės reversijos vietoje lokalizuota GC bazių pora ir yra žinoma, kad panaudojant šiuos kamienus, negalima identifikuoti kryžmiškai rišančių mutagenų ir hidrazinų. Šios medžiagos nustatomos, panaudojant Escherichia coli WP2 ir Salmonella typhimurium TA 102 kamienus (19), kurių pirminėje reversijos vietoje lokalizuota AT bazių pora. Taigi rekomenduojamas sekantis kamienų derinys: Tam, kad kryžmiškai surišantys mutagenai būtų nustatyti, reikia papildomai panaudoti S. typhimurium TA 102 arba E. coli WP 2 ar WP 2 (pKM 101) kamienus, sugebančius taisyti DNR pažaidas. Reikia naudoti gerai žinomas pagrindinės kultūros paruošimo, žymės patvirtinimo bei saugojimo metodikas. Reikia parodyti, kad aminorūgštis yra būtina kiekvieno preparato, paruošto iš užšaldytos pradinės kultūros, augimui (histidinas – S. typhimurium kamienams, o triptofanas – E. coli kamienams). Kitos fenotipinės charakteristikos, o būtent plazmidžių, turinčių R-faktorių, egzistavimas arba neegzistavimas, jei tai yra reikalinga (kamienų TA 98, TA 100 it TA 97a arba TA 97, WP 2 uvrA ir WP 2 uvrA (pKM 101) atsparumas ampicilinui bei kamieno TA 102 atsparumas ampicilinui ir tetraciklinui), būdingos mutacijos (S. typhimurium rfa mutacija, apsprendžianti jautrumą violetinei šviesai, E. coli uvr A mutacija arba S.typhimurium uvr B mutacija, nulemianti jautrumą ultravioletinei šviesai) (2) (3). Kamienai turi spontaniškai sukurti revertantų kolonijas, kurių skaičius turi atitikti dažnumo ribas, numatomas, remiantis anksčiau gautais laboratorijoje duomenimis ir pirmiausia turi atitikti literatūroje nurodytas ribas.

S. typhimurium TA1535, ir

S. typhimurium TA1537 arba TA97 arba TA97a, ir

S. typhimurium TA98, ir

S. typhimurium TA100 ir

E.coli WP2 uvrA arba E. coli WP2 uvrA (pKM10l) arba S. typhimurium TA102.

1.5.1.2. Terpė Naudojamas atitinkamas minimalus agaras (pavyzdžiui, turintis minimalios Vogel-Bonner terpės E ir gliukozės) ir ant viršaus užliejamas agaras, turintis histidino ir biotino arba triptofano tam, kad vyktų keleto ląstelių dalijimasis (1) (2) (9).

1.5.1.3. Metabolinė aktyvacija Bakterijos turi būti veikiamos tiriamąja medžiaga, tiek esant tiek ir nesant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai. Plačiausiai vartojama sistema yra iš graužikų kepenų, paveiktų tokiais fermentinį aktyvumą skatinančiais agentais kaip AROCLOR 1254 (1) (2) ar fenobarbitono ir P-naftoflavono mišiniu (18) (20) (21), post-mitochondrinė frakcija, praturtinta kofaktoriumi. Post-mitochondrinė frakcija paprastai vartojama koncentracijomis, kurių intervalas S9 mišinyje siekia nuo 5 iki 30 % (v/v). Metabolinės aktyvacijos sistema pasirenkama priklausomai nuo tiriamosios cheminės medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga varoti daugiau nei post-mitochondrinės frakcijos koncentraciją. Tiriant azodažus ir diazo grupę turinčius junginius, labiau tikslinga naudoti redukcinę metabolinę aktyvacijos sistemą (6) (13).

1.5.1.4. Tiriamoji medžiaga/preparatas Kietosios tiriamosios medžiagos turi būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinančiuosiuose įrenginiuose ir, jei reikia, tai prieš paveikiant jomis bakterijas, jos praskiedžiamos. Skystosios tiriamosios medžiagos įnešamos tiesiogiai į tyrimo sistemas ir/ar praskiedžiamos prieš veikiant jomis bakterijas. Kiekvieno bandymo metu turi būti paruošiami švieži preparatai, nekreipiant dėmesio į stabilumo tyrimo duomenis, rodančius, kad tiriamosios medžiagos atitinka saugojimui keliamus reikalavimus. Neturi kilti abejonių dėl to, kad tirpiklis/tirpinantysis įrenginys gali chemiškai reaguoti su tiriamąja medžiaga ir be to tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys turi būti suderintas su bakterijų išgyvenimu bei S9 aktyvumu (22). Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrengimai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrengimą. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturi būti vandens.

1.5.2. Tyrimo sąlygos

1.5.2.

1.5.2.1. Tiriamieji kamienai (žr. 1.5.1.1.)

1.5.2.2. Veikimo koncentracija Kriterijai, į kuriuos reikia atsižvelgti, nustatant didžiausią tiriamosios medžiagos koncentracija, yra medžiagos citotoksiškumas ir tirpumas galutiniame veikimo mišinyje. Būtų naudinga nustatyti toksiškumą bei netirpumą preliminarinio eksperimento metu. Citotoksiškumas gali būti nustatomas pagal revertantų skaičiaus sumažėjimą, šalutinės terpės praskaidrėjimą ar sunykimą arba pagal kultūrų, paveiktų tiriamąja medžiaga, išgyvenimo laipsnį. Medžiagos citotoksiškumas gali kisti dėl metabolinės aktyvacijos sistemų egzistavimo. Netirpumas gali būti įvertinamas plika akimi stebint precipitato susidarymą galutiniame reakciniame mišinyje, esant šiuo metu atliekamo eksperimento sąlygoms. Maksimali rekomenduojama tiriamų tirpių medžiagų, nepasižyminčių citotoksiškumu, koncentracija yra 5 mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje. Jei medžiagos, nepasižyminčios citotoksiškumu, netirpsta, jų koncentracijoms esant 5 mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje, tai esant vienai ar daugiau tirtų koncentracijų, tos medžiagos visai netirpsta galutiniame reakciniame mišinyje, skirtame, paveikti bakterijas. Tiriamosios medžiagos, kurios yra citotoksiškos, kai jų koncentracijos yra mažesnės nei 5 mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje, turi būti tiriamos tol, kol nustatoma koncentracija, kuriai esant, medžiagos pasižymi citotoksiniu aktyvumu. Precipitato susidarymas neturi trukdyti įvertinti duomenis. Reikia panaudoti mažiausiai 5 išanalizuojamas tiriamosios medžiagos koncentracijas, kurių vertes pradinio eksperimento metu skirtų intervalai, lygūs pusei log (V 10). Mažesni skiriamieji intervalai tinka tada, kai tiriama atsako priklausomybė nuo koncentracijos. Koncentracija, mažesnė už 5 mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje, pasirenkama tuo atveju, jei tiriamųjų medžiagų mutageniškumas yra gana neaiškus.

1.5.2.3. Neigiami ir teigiami kontroliniai mėginiai Atliekant kiekvieną eksperimentą kartu su metaboline aktyvacija arba be jos būtina vienu metu naudoti neigiamus (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) bei teigiamus kontrolinius mėginius, specifiškus bakterijų kamienui. Kai bandymų metu naudojama metabolinės aktyvacijos sistema, tai teigiama kontrolinė etaloninė medžiaga pasirenkama pagal naudoj amą bakterinio kamieno tipą. Žemiau pateikiami tinkamų teigiamų kontrolinių medžiagų, naudojamų, esant metabolinei aktyvacijai, pavyzdžiai: CAS Nr. EINECS Nr. Medžiaga 781-43-1 212-308-4 9,10-dimetilantracenas 57-97-6 200-359-5 7,12-dimetilbenzaantracenas 50-32-8 200-028-5 benzpirenas 613-13-8 210-330-9 2-aminoantracenas 50-18-0 ciklofosfamidas 6055-19-2 200-015-4 ciklofosfamido monohidratas Žemiau pateikiama tinkama teigiama kontrolinė medžiaga, kai naudojamas redukcinės metabolinės aktyvacijos metodas: CAS Nr. EINECS Nr. Medžiaga 573-58-0 209-358-4 Kongo raudonasis 22-aminoantracenas neturi būti naudojamas kaip vienintelis S9 mišinio veikimo efektyvumo indikatorius. Jei 2-aminoantracenas yra naudojamas, tai kiekviena S9 mišinio partija išanalizuojama, panaudojant mutageną, kuriam yra reikalinga metabolinė aktyvacija mikrosominių fermentų pagalba, pavyzdžiui, benzpireną ar dimetilbenzaantraceną. Toliau pateikiami tinkamų teigiamų kontrolinių medžiagų, specifiškų bakterijų kamienui, naudojamų, nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos, pavyzdžiai: CAS Nr. EINECS Nr. Medžiaga Kamienas 26628-22-8 247-852-1 Natrio azidas TA 1535 ir TA 100 607-57-8 210-138-5 2-nitrofluorenas TA 98 90-45-9 201-995-6 9-aminoakridinas TA 1537, TA 97 ir TA 97a 17070-45-0 241-129-4 ICD 191 TA 1537, TA 97 ir TA 97a 80-15-9 201-254-7 kumeno hidroksiperoksidas TA 102 50-07-7 200-008-6 mitomicinas C WP2 uvrA ir TA102 70-25-7 200-730-1 N-etil-N-nitro-N-nitrozoguanidinas WP2, WP2uvrA ir WP2uvrA(pK M101) 56-57-5 200-281-1 4-nitrokvinolino-1- oksidas WP2, WP2uvrA ir WP2uvrA(pK M101) 3688-53-7 Furilfuramidas (AF2) kamienai, turintys plazmidžių Kitas atitinkamas etalonines medžiagas irgi galima naudoti kaip teigiamus kontrolinius mėginius. Jei įmanoma, tai apsvarstomas konkrečios klasės cheminių medžiagų, kaip teigiamų kontrolinių mėginių, panaudojimas. Reikia panaudoti ir neigiamus kontrolinius mėginius, sudarytus vien tik iš tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio ir neturinčius tiriamosios medžiagos bei veiktus tokiu pat būdu kaip ir tiriamieji mėginiai. Be to reikia naudoti ir tiriamąja medžiaga neveiktus neigiamus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į anksčiau gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad pasirinktas tirpiklis nėra žalingas ir mutageniškas.

1.5.3. Bandymo atlikimo metodika Atliekant bandymą pagal inkorporacijos į lėkštelę metodą (1) (2) (3) (4), 2 ml padengiančiojo agaro sumaišoma su 0,05 ar 0,1 ml šviežiai išaugintos bakterijų kultūros (turinčios apie 108 gyvų ląstelių) ir 0,5 ml sterilaus buferio. Įprastiniu atveju atliekant bandymą, kai naudojama metabolinė aktyvacija, 0,5 ml metabolinės aktyvacijos mišinio, turinčio pakankamą post-mitochondrinės frakcijos kiekį (intervalo 5–30 % v/v ribose, metabolinės aktyvacijos mišinyje), sumaišoma su 2 ml padengiančiojo agaro, bakterijomis ir tiriamąja medžiaga/tiriamuoju tirpalu. Kiekvieno mėgintuvėlio turinys suplakamas ir užpilamas ant minimalaus agaro, esančio lėkštelėje, paviršiaus. Prieš inkubaciją padengiančiajam agarui leidžiama sukietėti. Atliekant bandymą pagal išankstinės inkubacijos metodą (2) (3) (5) (6), tiriamoji medžiaga/tiriamasis tirpalas iš anksto inkubuojamas su tiriamuoju bakteriniu kamienu (turinčiu apie 108 gyvų ląstelių) ir steriliu buferiu arba metabolinės aktyvacijos sistema (0,5 ml) ir įprastiniu atveju inkubuojamas 20 ar daugiau minučių 30–37 oC temperatūroje prieš sumaišant su padengiančiuoju agaru ir užpilant ant minimalaus agaro, esančio lėkštelėje, paviršiaus. Įprastiniu atveju 2 ml padengiančiojo agaro sumaišoma su 0,05 ar 0,1 ml tiriamosios medžiagos/tiriamojo tirpalo, 0,1 ml bakterijų ir 0,5 ml S9 mišinio ar sterilaus buferio. Atliekant išankstinę inkubaciją, mėgintuvėliai purtomi ant kratytuvo, kad jų turinys prisisotintų oro. Tam, kad tiriant kiekvieną dozę, būtų gaunamas patenkinamas variacijos koeficientas, atliekamas bakterijų išsėjimas į 3 lėkšteles. Jeigu atliekamas išsėjimas tik į 2 lėkšteles, tai jis moksliškai pagrindžiamas. Atsitiktinis lėkštelės praradimas nereiškia, kad bandymas nepavyko. Dujinės bei lakios medžiagos turi būti tiriamos atitinkamais metodais, jas laikant užsandarintuose induose (12) (14) (15) (16).

1.5.4. Inkubacija Atliekant konkretų bandymą visos lėkštelės turi būti inkubuojamos 48-72 valandas 37 oC temperatūroje. Po inkubacijos nustatomas revertantų kolonijų, esančių kiekvienoje lėkštelėje skaičius.

2. DUOMENYS

2.

2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS Pateikiant rezultatus, nurodomas revertantų kolonijų, esančių vienoje lėkštelėje, skaičius. Taip pat reikia nurodyti revertantų kolonijų, esančių tiek teigiamose, tiek ir neigiamose (tirpiklio kontrolinis mėginys ir tiriamąja medžiaga neveiktas kontrolinis mėginys) kontrolinėse lėkštelėse, skaičių. Pateikiant duomenis apie tiriamąją medžiagą ir teigiamuss bei neigiamus (tirpiklio kontrolinis mėginys ir (ar) tiriamąja medžiaga neveiktas kontrolinis mėginys) kontrolinius mėginius, nurodomas revertantų kolonijų, esančių kiekvienoje lėkštelėje, skaičius, jo vidurkis bei standartinis nukrypimas. Nėra reikalaujama, kad būtų patvirtinta, jog buvo gautas aiškus teigiamas rezultatas. Abejotini rezultatai išaiškinami, tęsiant tyrimus, modifikuojant eksperimento sąlygas. Neigiami rezultatai patvirtinami kiekvienu atskiru atveju. Tais atvejais, kai manoma, jog nebūtina patvirtinti, kad buvo gauti neigiami rezultatai, šitai turi būti pagrįsta. Tęsiant eksperimentus apsvarstoma, ar reikia modifikuoti tiriamus parametrus tam, kad būtų išplėstas įvertinamų sąlygų intervalas. Tiriamieji parametrai, kuriuos galima modifikuoti, yra ribos, skiriančios koncentracijas, bandymo atlikimo metodai (inkorporacijos į lėkštelę bei išankstinės inkubacijos) bei metabolinės aktyvacijos sąlygos.

2.2. REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS Egzistuoja keletas teigiamo rezultato įvertinimo kriterijų, tokių kaip su koncentracija susijęs mažiausiai vieno kamieno revertantų kolonijų, esančių vienoje lėkštelėje, skaičiaus padidėjimas virš tiriamos ribos, kai naudojama arba nenaudojama metabolinės aktyvacijos sistema ir/ar jį atkartojant, kai naudojama viena ar daugiau koncentracijų (23). Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Įvertinant tyrimo rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais metodais (24). Tačiau statistikos svarba neturėtų tapti vieninteliu faktoriumi, apsprendžiančiu teigiamą atsaką. Jei tiriant medžiagą, gaunami rezultatai, neatitinkantys aukščiau minėtų kriterijų, tai medžiaga laikoma nemutageniška. Nors daugumos eksperimentų metu gaunami aiškiai teigiami arba neigiami rezultatai, tačiau išimtiniais atvejais, remiantis visais gautais rezultatais, negalima padaryti tinkamos išvados apie tiriamos medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs, nepriklausomai nuo to, kiek kartų eksperimentas buvo pakartotas. Tiriant grįžtamąsias mutacijas bakterijose, gauti rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia taškines mutacijas (bazių pakaitas arba skaitymo rėmelio pasislinkimą) arba Salmonella typhimurium ir (arba) Escherichia coli genome. Neigiami rezultatai rodo, kad esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia mutacijų tiriamose bakterijų rūšyse.

3. ATASKAITA

3. ATASKAITA APIE TYRIMĄ

Ataskaitoje apie tyrimą turi būti pateikiama tokia informacija:

Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys:

priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,

tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.

Kamienai:

panaudoti kamienai,

ląstelių, esančių vienoje kultūroje, skaičius,

kamieno charakteristikos.

Tyrimo sąlygos:

tiriamosios medžiagos kiekis vienoje lėkštelėje (mg/lėkštelė arba μl/lėkštelė), nurodant pagrindinę priežastį dėl kurios tiriant vieną koncentraciją, buvo pasirinkta konkreti dozė bei lėkštelių skaičius,

panaudota terpė,

metabolinės aktyvacijos sistemos tipas ir sudėtis, įskaitant ir sistemos tinkamumo kriterijus,

poveikio tiriamąja medžiaga atlikimo metodiką.

Rezultatai:

toksiškumo požymiai,

precipitacij os požymiai,

kolonijų vienoje lėkštelėje skaičius,

revertantų kolonijų vienoje lėkštelėje skaičiaus vidurkis bei standartinis nukrypimas,

dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei jį įmanoma nurodyti,

bet kokios statistinės analizės,

vienu metu naudojamų neigiamų (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) ir teigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenys, nurodant intervalus, vidurkius bei standartinius nukrypimus,

anksčiau gauti neigiamų (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) ir teigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenys, nurodant intervalus, vidurkius bei standartinius nukrypimus.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)20)21)22)23)24)

NUORODOS Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347–364. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173–215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, p. 217–233. Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V. (1986). The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, p. 69–240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975). Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, I, p. 91–96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980). Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York., p. 273–285. Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R. (1980). Bacterial Mutation Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press, p. 13–61. Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987). Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, p. 167–177. Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976). Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res., 38, p. 33–42. Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984). The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, p. 141–161. Thompson, E.D. and Melampy, P. J. (1981). An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, p. 453–465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994). Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, p. 335–344. Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughn, V.L. (1984). Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, p. 33–47. Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992). Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, p. 2–141. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G. (1977). Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, p. 249–258. Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D. (1987). Vaporization Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, p. 421–441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979). Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium. Cancer Res., 39, p. 3780–3782. Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N. (1980). Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p. 4961–4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G. (1990). Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, p. 285–291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: In Vitro metabolic Activation in Mutagenesis Testing Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, p. 85–88. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G, Gibson, GG, Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175–177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N. (1981). Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., 88, p. 343–350. Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987). Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity. Mutation Res. 189, p. 83–91. Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J. (1989). Analysis of Data from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cambridge University Press, p. 28–65.

B.15. MUTAGENIŠKUMO TYRIMAS IR ATRANKA PAGAL KARCINOGENIŠKUMĄ GENŲ MUTACIJOS – SACCAROMYCES CEREVISIAE

B.15.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nėra.

1.4. TYRIMO METODO PRINCIPAS Siekiant įvertinti cheminių agentų (esant arba nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos) sukeliamas genų mutacijas, gali būti naudojami įvairiausi haploidiniai ir diploidiniai Saccaromyces cerevisiae kamienai. Haploidiniuose kamienuose gali būti naudojamos tiesioginės mutacinės sistemos, tokios kaip mutacinis virsmas iš raudonos spalvos mutantų, kurių augimui reikalingas adeninas (ade-l, ade-2) į dvigubus baltos spalvos mutantus, kurių augimui reikalingas adeninas bei atrankos sistemos, tokios kaip atsparumo kanavalinui ir cikloheksimidui indukcinė sistema. Plačiausiai naudojamą grįžtamųjų mutacijų tyrimo sistemą sudaro haploidinis kamienas XV 185-14C, kuris turi geno, koduojančio ochros spalvą, beprasmes mutacijas ade 2-1, org 4-17, lys 1-1, trp 5-48, kurios tampa grįžtamosiomis mutacijomis atlikus bazių pakeitimą mutagenais, sukeliančiais vietos atžvilgiu specifines mutacijas arba geno, koduojančio ochros spalvą, veiklą slopinančias mutacijas. Kamienas XV 185-14C taip pat turi žymę his 1-7 –beprasmę mutaciją, kuri gali virsti grįžtamąja mutacija, įvykus mutacijai antroje vietoje, bei žymę hom 3-10, kuri tampa grįžtamąja mutacija paveikus ją mutagenais, sukeliančiais skaitymo rėmelio pasislinkimą. Tarp diploidinių S. cerevisiae kamienų plačiausiai naudojamas tėra tik vienas D7 kamienas, kuris yra homozigotiškas pagal i lv 1-92.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.6. TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6. Pasiruošimas tyrimui

Prieš pradedant tyrimą, panaudojant atitinkamą prietaisą, reikėtų paruošti tiriamųjų ir kontrolinių medžiagų tirpalus. Jei tiriami organiniai, vandenyje netirpūs junginiai, tai reikėtų naudoti ne daugiau kaip 2 % organinių tirpiklių, tokių kaip etanolis, acetonas ar dimetilsulfoksidas (DMSO), tirpalus (v/v). Naudojant prietaisą galutinė tirpalo koncentracija neturėtų labai įtakoti ląstelių gyvybingumo bei augimo parametrų.

Metabolitinė aktyvacija

Ląstelės turėtų būti veikiamos tiriamosiomis medžiagomis, esant arba nesant egzogeninės metabolitinės aktyvacijos sistemos. Graužikų, iš anksto paveiktų fermentus skatinančiais agentais, kepenų postmitochondrinė frakcija, praturtinta kofaktoriumi yra plačiausiai naudojama metabolitinė aktyvacijos sistema. Metabolitinei aktyvacijai galima naudoti ir kitų rūšių bei audinių postmitochondrines frakcijas bei procedūras.

Tyrimo sąlygos

Tiriamieji kamienai

Atliekant genų mutacijų tyrimus labiausiai yra naudojami haploidinis kamienas XV 185-14C ir diploidinis kamienas D7. Galima naudoti ir kitus kamienus.

Terpė

Nustatant kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko mutacijos, skaičių, naudojama atitinkama kultivavimui skirta terpė.

Teigiamos ir neigiamos kontrolės

Reikėtų vienu metu naudoti teigiamas, nepaveiktas tiriamąja medžiaga ir tirpiklio kontroles. Nustatant kiekvieną specifinę galutinę mutaciją, naudojamos atitinkamos teigiamos kontrolės.

Veikimo koncentracija

Reikėtų naudoti mažiausiai penkias, tinkamai atskirtas tiriamosios medžiagos koncentracijas. Toksinių medžiagų atveju, didžiausia tiriamoji koncentracija neturėtų sumažinti kolonijų išgyvenimo mažiau nei 5–10 %. Reikėtų tirti santykinai vandenyje netirpstančių medžiagų tirpumo ribą pagal atitinkamas procedūras. Lengvai vandenyje tirpstančių netoksiškų medžiagų didžiausia koncentracija turėtų būti nustatoma kiekvienu atveju.

Inkubacijos sąlygos

Lėkštelės inkubuojamos 4–7 dienoms 28-30 oC temperatūroje, tamsoje.

Spontaninių mutacijų dažniai

Reikėtų naudoti subkultūras, kuriose spontaninių mutacijų dažniai yra normalūs.

Tikslių kopijų skaičius

Atliekant prototrofų, atsirandančių dėl genų mutacijų bei ląstelių gyvybingumo tyrimą, reikėtų naudoti mažiausiai tris vienos koncentracijos tikslių kolonijų kopijų lėkšteles. Jei eksperimentų metu naudojamos tokios žymės kaip hom 3-10, pasižyminčios nedideliu mutacijų dažniu, reikėtų naudoti daugiau tikslių kolonijų kopijų lėkštelių tam, kad gaunami duomenys būtų statistiškai patikimi.

Procedūra

S. cerevisiae kamienai paprastai veikiami tiriamąja medžiaga, ląstelėms esant stacionarinėje arba augimo stadijoje skystoje terpėje. Iš pradžių eksperimentai atliekami su ląstelėmis, esančiomis augimo stadijoje; 1-5x10 ląstelių/ml veikiamos tiriamąja medžiaga 18 valandų 28–37 oC temperatūroje ant kratyklės; jeigu reikia, veikimo metu į terpę įnešamas atitinkamas metabolitinės aktyvacijos sistemos kiekis. Baigiantis veikimui, ląstelės centrifuguojamos, plaunamos ir pasėjamos į atitinkamą kultivavimui skirtą terpę. Po inkubacijos nustatomas plokštelėse kolonijų, kuriose neįvyko arba įvyko genų mutacijos, skaičius. Jei pirmojo eksperimento gauti rezultatai yra neigiami, tai antrasis eksperimentas atliekamas naudojant ląsteles, esančias stacionarinėje fazėje. Jeigu pirmojo eksperimento metu gauti rezultatai teigiami, jie patvirtinami atlikus atitinkamą nepriklausomą eksperimentą.

2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant kolonijų skaičių, kolonijų, kuriose neįvyko ir kuriose įvyko mutacijos kiekį bei mutacijos dažnį. Visi rezultatai turėtų būti patvirtinti, atlikus nepriklausomą bandymą. Duomenis reikėtų įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.

3. ATASKAITA

3.

3.1. TYRIMO ATASKAITA Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:

panaudotas kamienas,

tyrimo sąlygos: ląstelių stacionarioji ar augimo fazė, terpės sudėtis, inkubacijos temperatūra ir trukmė, metabolitinės aktyvacijos sistema,

veikimo sąlygos: veikimo laipsnis, veikimo procedūra ir trukmė, veikimo temperatūra, teigiamos ir neigiamos kontrolės,

kolonijų skaičius, kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko mutacijos bei mutacijos dažnis, dozės ir atsako sąsaja, jei įmanoma nurodyti, statistinis duomenų įvertinimas,

rezultatų aptarimas,

rezultatų interpretavimas.

3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

4. NUORODOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

B.16. MITOZINĖ REKOMBINACIJA – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.16.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nėra.

1.4. TYRIMO METODO PRINCIPAS Mitozinė rekombinacija Saccharomyces cerevisiae gali būti nustatoma tarp genų (arba konkrečiau, tarp geno ir jo centromeros) ir genų viduje. Ši rekombinacija, vykstanti tarp genų, yra vadinama mitoziniu krosingoveriu, kurio metu susiformuoja atvirkštiniai produktai, tuo tarpu, kai rekombinacijos genų viduje metu susidaro neatvirkštiniai produktai, vadinami genų konversijomis. Apskritai, krosingoveris įvertinamas pagal homozigotinių kolonijų arba sektorių, turinčių recesyvinius genų alelius, produkcijos laipsnį heterozigotiniame kamiene, tuo tarpu genų konversija vertinama pagal prototrofinių revertantų, susiformavusių auksotrofiniame heteroaleliniame kamiene, turinčiame du neveiklius to paties geno alelius, skaičių. Siekiant nustatyti mitozinio geno konversiją, dažniausiai naudojami šie kamienai: D4 (heteroalelinis pagal ade 2 ir trp 5), D7 (heteroalelinis pagal trp 5), BZ34 (heteroalelinis pagal org 4) ir JD1 (heroalelinis pagal his 4 ir trp 5). Raudonos ir violetinės spalvos homozigotiniai sektoriai, sukuriantys mitozinį krosingoverį, gali būti vertinami, naudojant D5 arba D7 kamienus (taipogi galima įvertinti mitozinę genų konversiją ir grįžtamąją mutaciją, vykstančią ilv 1-92), kurie yra heteroaleliški pagal papildančiuosius geno ade 2 alelius.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.6. TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6. Pasiruošimas tyrimui

Prieš pradedant tyrimą, panaudojant atitinkamą prietaisą, reikėtų paruošti tiriamųjų ir kontrolinių medžiagų tirpalus. Jei tiriami organiniai, vandenyje netirpūs junginiai, reikėtų naudoti ne daugiau kaip 2 % organinių tirpiklių, tokių kaip etanolis, acetonas ar dimetilsulfoksidas (DMSO), tirpalus (v/v). Naudojant prietaisą, galutinė tirpalo koncentracija neturėtų labai įtakoti ląstelių gyvybingumo bei augimo parametrų.

Metabolitinė aktyvacija

Ląstelės turėtų būti veikiamos tiriamosiomis medžiagomis, esant arba nesant egzogeninės metabolitinės aktyvacijos sistemos. Graužikų, iš anksto paveiktų fermentus skatinančiais agentais, kepenų postmitochondrinė frakcija praturtinta kofaktoriumi yra plačiausiai naudojama metabolitinė aktyvacijos sistema. Metabolitinei aktyvacijai galima naudoti ir kitų rūšių bei audinių postmitochondrines frakcijas bei procedūras.

Tyrimo sąlygos

Tiriamieji kamienai

Dažniausiai naudojami diploidiniai D4, D5, D7 ir JD1. Galima naudoti ir kitus kamienus.

Terpė

Nustatant kolonijų, kuriose neįvyko mitozinė rekombinacija, skaičių ir kolonijų, kuriose įvyko mitozinė rekombinacija, dažnį, naudojama atitinkama terpė skirta kultivavimui.

Teigiamos ir neigiamos kontrolės

Reikėtų vienu metu naudoti teigiamas, nepaveiktas tiriamąja medžiaga ir tirpiklio kontroles. Nustatant kiekvieną specifinę galutinę rekombinaciją, naudojamos atitinkamos teigiamos kontrolės.

Veikimo koncentracijos

Reikėtų naudoti mažiausiai penkias, tinkamai atskirtas tiriamosios medžiagos koncentracijas. Reikėtų apsvarstyti citotoksiškumą ir tirpumą. Mažiausia koncentracija neturi įtakoti ląstelių gyvybingumo. Toksinių medžiagų atveju, didžiausia tiriamoji koncentracija neturėtų sumažinti kolonijų išgyvenimo mažiau nei 5–10 %. Reikėtų tirti santykinai vandenyje netirpstančių medžiagų tirpumo ribą pagal atitinkamas procedūras. Lengvai vandenyje tirpstančių netoksiškų medžiagų didžiausia koncentracija turėtų būti nustatoma kiekvienu atveju.

Inkubacijos sąlygos

Lėkštelės inkubuojamos 4–7 dienoms 28–30 oC temperatūroje, tamsoje. Analizei naudojamos plokštelės, kuriose, dėka mitozinio krosingoverio, atsiranda raudonos ir violetinės spalvos sektoriai, turėtų būti laikomos šaldytuve (apie 4 oC temperatūroje) papildomai vieną arba dvi dienas prieš nustatant atitinkamai nusidažiusių kolonijų skaičių.

Spontaninės mitozinės rekombinacijos dažniai

Reikėtų naudoti subkultūras, kuriose spontaninės mitozinės rekombinacijos dažniai yra normalūs.

Tikslių kopijų skaičius

Atliekant prototrofų, atsirandančių dėl mitozinio geno konversijos bei ląstelių gyvybingumo tyrimą, reikėtų naudoti mažiausiai tris vienos koncentracijos tikslių kolonijų kopijų lėkšteles. Tiriant recesyvinį homozigotiškumą, atsirandantį dėl mitozinio krosingoverio, reikėtų panaudoti daugiau lėkštelių, kad būtų galima nustatyti tinkamą kolonijų skaičių.

Procedūra

S.cerevisiae kamienai paprastai veikiami tiriamąja medžiaga, ląstelėms esant stacionarinėje arba augimo stadijoje skystoje terpėje. Iš pradžių eksperimentai atliekami su ląstelėmis, esančiomis augimo stadijoje; 1–5×107 ląstelių/ml veikiamos tiriamąja medžiaga 18 valandų 28–37 oC temperatūroje ant kratyklės; jeigu reikia, tai veikimo metu į terpę įnešamas atitinkamas metabolitinės aktyvacijos sistemos kiekis. Baigiantis veikimui, ląstelės centrifuguojamos, plaunamos ir pasėjamos į atitinkamą kultivavimui skirtą terpę. Po inkubacijos nustatomas plokštelėse kolonijų, kuriose neįvyko arba įvyko mitozinė rekombinacija, skaičius. Jei pirmojo eksperimento gauti rezultatai yra neigiami, tai antrasis eksperimentas atliekamas, naudojant ląsteles, esančias stacionarinėje fazėje. Jeigu pirmojo eksperimento metu gauti rezultatai teigiami, jie patvirtinami atlikus atitinkamą nepriklausomą eksperimentą.

2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant kolonijų skaičių, kolonijų, kuriose neįvyko ir kuriose įvyko mitozinė rekombinacija, kiekį bei rekombinacijų dažnį. Visi rezultatai turėtų būti patvirtinti atlikus nepriklausomą bandymą. Duomenis reikėtų įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.

3. ATASKAITA

3.

3.1. TYRIMO ATASKAITA Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:

panaudotas kamienas,

tyrimo sąlygos: ląstelių stacionarioji ar augimo fazė, terpės sudėtis, inkubacijos temperatūra ir trukmė, metabolitinės aktyvacijos sistema,

veikimo sąlygos: veikimo laipsnis, veikimo procedūra ir trukmė, veikimo temperatūra, teigiamos ir neigiamos kontrolės,

kolonijų skaičius, kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko rekombinacijos bei rekombinacijos dažnis, dozės ir atsako sąsaja, jei įmanoma nurodyti, statistinis duomenų įvertinimas,

rezultatų aptarimas,

rezultatų interpretavimas.

3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

4. NUORODOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

B.17. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ LĄSTELIŲ GENŲ MUTACIJŲ TYRIMAS IN VITRO

B.17.

1. METODAS Šis metodas pakartoja OECD TG 476, žinduolių ląstelių genų mutacijų tyrimą in vitro (1997).

1.

1.1 ĮVADAS Žinduolių ląstelių genų mutacijų tyrimas in vitro gali būti naudojamas siekiant aptikti cheminių medžiagų sukeltas mutacijas. Tinkamoms ląstelių linijoms priklauso pelių limfomos ląstelių linija L5178Y, kiniškojo žiurkėno ląstelių linijos CHO, CHO-ASS2 bei V79 ir žmogaus limfoblastų linija TK (1). Naudojant šias linijas, dažniausiai įvertinamos timidinkinazę (TK) bei hipoksantinguaninfosforiboziltransferazę (HFRT) koduojančių genų bei ksantinguaninfosforiboziltransferazę (KFRT) koduojančio transgeno mutacijos. Atliekant TK, KFRT bei HFRT koduojančių genų mutacijų tyrimus, nustatomi ir skirtingi genetinių įvykių spektrai. Dėl to, kad TK ir KFRT koduojantys genai yra lokalizuoti autosominėse chromosomose, galima nustatyti genetinius įvykius (pavyzdžiui, didelių genų segmentų delecijas), kurie nėra nustatomi HFRT koduojančio geno, esančio X chromosomose, lokuse (2) (3) (4) (5) (6). Atliekant žinduolių ląstelių genų mutacijų tyrimą in vitro, galima naudoti gerai žinomas ląstelių linijas ar kamienus. Tyrimo metu naudojamos ląstelės atrenkamos pagal sugebėjimą augti kultūroje bei stabilumą spontaniškai vykstančių mutacijų atžvilgiu. Bendru atveju, kai tyrimai atliekami in vitro, reikia naudoti egzogeninį metabolinės aktyvacijos šaltinį. Ši metabolinė aktyvacijos sistema negali absoliučiai atitikti žinduolių sąlygų in vivo. Reikia stengtis vengti tokių sąlygų, kurioms esant bus gaunami rezultatai, neatspindintys vidinio mutageniškumo. Teigiami rezultatai, neatspindintys vidinio mutageniškumo, gali būti gaunami dėl pH ir osmosinio slėgio pokyčių bei didelio citotoksiškumo laipsnio (7). Šis tyrimas naudojamas atrinkti galimus žinduolių mutagenus bei karcinogenus. Daugelis junginių, kurie šio tyrimo metu pasirodo esą teigiami, yra žinduolių karcinogenai, tačiau nėra aiškaus tarpusavio ryšio tarp šio tyrimo ir karcinogeniškumo. Tarpusavio ryšys priklauso nuo cheminių medžiagų klasės ir vis daugėja įrodymų, kad šio tyrimo metu negalima nustatyti kai kurių karcinogenų, galbūt dėl to, kad jie nepasižymi genotoksiškumu arba bakterinėse ląstelėse veikia visiškai kitaip (6). Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2 SĄVOKOS Tiesioginės mutacijos – geno tėvinio tipo mutantinės formos mutacija, dėl kurios šio geno koduojamas baltymas praranda fermentinį aktyvumą arba šis pakinta. Bazių porų pakaitas sukeliantys mutagenai – medžiagos, sukeliančios vienos ar kelių bazių porų, esančių DNR molekulėje, pakaitas. Skaitymo rėmelio poslinkį sukeliantys mutagenai – medžiagos, sukeliančios vienos ar daugelio bazių porų intarpus ar iškritas. Fenotipinės ekspresijos laikas – laiko periodas, per kurį nepakitusio geno produktai pašalinami iš naujai mutavusių ląstelių. Mutavimo dažnis – mutantinių ir gyvų ląstelių skaičiaus santykis. Absoliutus santykinis augimas – per konkretų laiko tarpą ląstelių, lyginant su kontroline populiacija, padidėjęs skaičius, įvertinamas kaip suspensijos augimas, lyginant su neigiamos kontrolinės ląstelių grupės kloninio augimo efektyvumu, o pastarasis lyginamas su neigiamu kontroliniu mėginiu. Santykinis suspensijos augimas – fenotipinės ekspresijos periodu padidėjęs ląstelių, lyginant su neigiamu kontroliniu mėginiu, skaičius. Gyvybingumas – ląstelių, paveiktų tiriamąja medžiaga, kloninio augimo efektyvumas tuo metu, kai, pasibaigus ekspresijai, jos pasėjamos į terpę, esant sąlygoms, naudojamoms atrankai. Išgyvenimas – ląstelių, paveiktų tiriamąja medžiaga, kloninio augimo efektyvumas tuo metu, kai baigiantis veikimui tiriamąja medžiaga, jos pasėjamos į terpę; bendru atveju išgyvenimas lyginamas su kontrolinės ląstelių populiacijos išgyvenimu.

1.3 TYRIMO METODO PRINCIPAS Ląstelės, nesugebančios sintetinti timidinkinazės (TK) dėl mutacijos TK+/- -> TK-/- , yra atsparios pirimidino analogo – trifluortimidino (TFT) – sukeliamiems citotoksiniams efektams. Ląstelės, sugebančios sintetinti TK, yra jautrios TFT, kuris blokuoja ląstelės metabolizmą bei sustabdo tolimesnį jos dalijimąsi. Taigi mutantinės ląstelės sugeba proliferuoti, esant terpėje TFT, kai tuo tarpu normalios ląstelės, sintetinančios TK, šito padaryti negali. Ląstelės nesugebančios sintetinti HFRT ir KFRT yra panašiai atrenkamos pagal atsparumą 6-tioguaninui (TG) arba 8-azaguaninui (AG). Jeigu žinduolių genų mutacijos yra tiriamos, panaudojant agentą, kuris yra naudojamas ląstelių atrankai ir yra bazių analogas arba cheminis junginys, tai reikia ypač atkreipti dėmesį į tiriamosios cheminės medžiagos savybes. Pavyzdžiui, reikia tirti bet kokį įtarimą keliantį tiriamosios medžiagos toksiškumą mutantinių ir normalių ląstelių atžvilgiu. Taigi atrankos sistemos arba atrankos agento parinkimas turi būti patvirtinamas tada, kai tiriamos cheminės medžiagos, savo struktūra panašios į agentą (8). Ląstelės, esančios suspensijoje arba vienasluoksnėje kultūroje, veikiamos tiriamąja medžiaga, esant arba nesant metabolinės aktyvacijos sistemos ir prieš pradedant tyrimą šiek tiek pakultivuojamos tam, kad būtų nustatytas citotoksiškumas bei vyktų fenotipo ekspresija (9) (10) (11) (12) (13). Įprastiniu atveju citotoksiškumas nustatomas pagal santykinį kloninio augimo efektyvumą ar absoliutų santykinį kultūros augimą, matuojamą tada, kai baigiasi ląstelių veikimas tiriamąja medžiaga. Kultūros, paveiktos tiriamąja medžiaga, palaikomos terpėje tam tikrą laiką, būdingą kiekvienam lokusui bei ląstelių tipui tam, kad vyktų beveik optimali atsiradusių mutacijų fenotipo ekspresija. Mutavimo dažnis nustatomas, pasėjant žinomą ląstelių skaičių į terpę, turinčią atrankai naudojamo agento tam, kad, siekiant įvertinti kloninio augimo efektyvumą, būtų identifikuotos mutantinės ląstelės, esančios terpėje, neturinčioje atrankai naudojamo agento. Pasibaigus inkubacijai, suskaičiuojamos kolonijos. Mutavimo dažnis nustatomas, suskaičiavus kolonijas, kuriose įvyko mutacijos ir kurios buvo auginamos terpėje, turinčioje arba neturinčioje atrankai naudojamo agento.

1.4 TYRIMO METODO APRAŠYMAS

1.4

1.4.1 Preparatai

1.4.1

1.4.1.1 Ląstelės Šio tyrimo metu galima naudoti įvairius ląstelių tipus, įskaitant L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 klonus arba TK6 ląsteles. Tyrimo metu naudojami ląstelių tipai turi būti jautrūs cheminiams mutagenams, jų kloninio augimo efektyvumas turi būti pakankamai didelis bei jose vykstančių spontaninių mutacijų dažnis turi būti pakankamai stabilus. Ląstelės turi būti patikrintos, ar neužkrėstos mikoplazmomis, nes priešingu atveju, atliekant šį tyrimą, jos nėra naudojamos. Tyrimas parengiamas taip, kad jis būtų atliekamas, esant kuo didesniam nustatymo jautrumui bei visapusiškumui. Naudojamų ląstelių bei jų kultūrų skaičius ir tiriamosios medžiagos koncentracijos turi atspindėti šiuos apibrėžtus parametrus (14). Minimalus, gyvų ląstelių, išlikusių po veikimo tiriamąja medžiaga bei naudojamų kiekviename tyrimo etape, skaičius turi būti pagrįstas spontaninių mutacijų dažniu. Rekomenduojama panaudoti mažiausiai 10 6 ląstelių. Turi būti sudaryta galimybė susipažinti su anksčiau gautais duomenimis apie ląstelinę sistemą, rodančiais, kad tyrimas atliekamas nuosekliai.

1.4.1.2 Terpė ir kultivavimo sąlygos Reikia naudoti atitinkamą terpę, skirtą kultivavimui bei laikytis atitinkamų inkubavimo sąlygų (kultivavimo indai, temperatūra, CO2 koncentracija ir drėgmė). Terpė turi būti parinkta atsižvelgiant į šio tyrimo metu naudojamas atrankos sistemas bei ląstelių tipą. Ypač svarbu tai, kad pasirinktos kultivavimo sąlygos užtikrintų optimalų ląstelių augimą ekspresijos metu bei normalių ir mutantinių ląstelių sugebėjimą suformuoti kolonijas.

1.4.1.3 Kultūrų paruošimas Ląstelės padauginamos iš kamieninių kultūrų, pasėjamos į terpę, skirtą kultivavimui ir inkubuojamos 37 oC temperatūroje. Prieš pradedant šį tyrimą, kultūros turi būti išgryninamos, kad būtų atsikratyta jau anksčiau esančių mutantinių ląstelių.

1.4.1.4 Metabolinė aktyvacija Ląstelės inkubuojamos su tiriamąja chemine medžiaga, tiek esant, tiek ir nesant atitinkamos metabolinės aktyvacijos sistemos. Plačiausiai vartojama sistema yra post-mitochondrinė frakcija, išskirta iš griaužikų kepenų, paveiktų tokiais fermentinį aktyvumą skatinančiais agentais kaip AROCLOR 1254 (15) (16) (17) (18) ar fenobarbitono ir β-naftoflavono mišiniu (19) (20) bei praturtinta kofaktoriumi. Post-mitochondrinė frakcija paprastai vartojama koncentracijomis, kurių intervalas tyrimo metu naudojamoje galutinėje terpėje siekia nuo 1–10 % (v/v). Metabolinės aktyvacijos sistema pasirenkama priklausomai nuo tiriamosios cheminės medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga varoti daugiau nei post-mitochondrinės frakcijos koncentraciją. Endogeninę aktyvaciją gali pagerinti daug tuo tikslu padarytų pasiekimų, įskaitant ir genetinės inžinerijos pagalba gautos ląstelių linijas, kurios gamina specifinius fermentus, dalyvaujančius aktyvacijoje. Tyrime naudojamos ląstelių linijos pasirenkamos moksliškai pagrįstai (pavyzdžiui pagal citochromo P450 izofermento svarbą tiriamos cheminės medžiagos metabolizmui).

1.4.1.5 Tiriamosios medžiagos/Paruošimas Kietosios tiriamosios medžiagos turi būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinamuosiuose įrenginiuose ir, jeigu reikia, tai prieš tai, kai šia medžiaga bus paveiktos ląstelės, jos yra praskiedžiamos. Prieš paveikiant ląsteles skystosiomis tiriamosiomis medžiagomis arba po veikimo, šios medžiagos gali būti tiesiogiai įnešamos į tiriamąsias sistemas ir praskiedžiamos. Tiriamosios medžiagos preparatai gaminami prieš kiekvieną tyrimą, neatsižvelgiant į tai, kad šių medžiagų stabilumo tyrimo duomenys tenkina saugojimo sąlygas.

1.4.2 Tyrimo sąlygos

1.4.2

1.4.2.1 Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys Nesitikima, kad tirpiklis/tirpinantysis įrenginys chemiškai nereaguos su tiriamąja chemine medžiaga ir atitiks ląstelių išgyvenimą bei S9 aktyvumą. Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrenginiai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturi būti vandens. Vandenį galima pašalinti, papildomai naudojant molekulinį filtrą.

1.4.2.2 Veikimo koncentracijos Kai parenkama pati didžiausia koncentracija, tai vadovaujamasi tokiais kriterijais kaip citotoksiškumas, tirpumas tiriamojoje sistemoje ir pH arba osmosinio slėgio pokyčiai. Citotoksiškumas turi būti nustatomas pagrindinio eksperimento, naudojant arba nenaudojant metabolinės aktyvacijos sistemos, metu, remiantis atitinkamais rodikliais, rodančiais, kad ląstelės yra vientisos ir kad jos auga – santykiniu kloninio augimo efektyvumu arba absoliučiu santykiniu augimu. Būtų naudinga citotoksiškumą bei tirpumą nustatyti išankstinio eksperimento metu. Turi būti naudojamos bent 4 ištiriamos koncentracijos. Jei citotoksiškumas pasireiškia, tai šios koncentracijos turėtų svyruoti nuo maksimalaus iki minimalaus citotoksiškumo laipsnio arba jo apskritai neturėtų būti; šitai paprastai reikš, kad koncentracijos turės būti atskirtos tiktai faktoriumi, esančiu tarp 2 ir √10. Jei didžiausia koncentracija yra pagrįsta citotoksiškumu, tai esant jai, santykinis išgyvenimas arba santykinis absoliutus augimas turi sudaryti apie 10–20 % (bet ne mažiau kaip 10 %). Santykinai necitotoksiškų medžiagų atveju maksimali tiriamoji koncentracija turi būti 5 mg/ml, 5 μl/ml arba 1,01 M, bet kuriai esant mažiausiai. Santykinai netirpios medžiagos turi būti tiriamos kultivavimo sąlygomis, jų tirpumui siekiant ribą arba esant už jos. Netirpumas turi būti nustatomas galutinėje terpėje, kuria paveikiamos ląstelės. Prieš pradedant ir baigiant veikimą tiriamąja medžiaga, būtų naudinga nustatyti tirpumą, kadangi veikimo metu tirpumas gali pakisti dėl tiriamojoje sistemoje esančių ląstelių, S9 mišinio, serumo ir pan. netirpumą galima įvertinti plika akimi. Precipitatas neturi trukdyti rezultatų vertinimui.

1.4.2.3 Kontroliniai mėginiai Atliekant kiekvieną eksperimentą, vienu metu reikia naudoti teigiamus ir neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontrolinius mėginius, esant arba nesant metabolinės aktyvacijos sistemos. Kai naudojama metabolinė aktyvacija, tai teigiamas kontrolinis mėginys turi būti cheminė medžiaga, kuria reikia aktyvuoti tam, kad ši sukeltų mutageninį atsaką. Teigiamų kontrolinių medžiagų pavyzdžiai: Metabolinės aktyvacijos sąlygos Lokusas Medžiaga CAS Nr. EINECS Nr. Egzogeninės metabolinės aktyvacijos nėra HPRT Etilmetansulfonatas 62-50-0 200-536-7 Etilnitrozošlapalas 759-73-9 212-072-2 TK (mažos ir didelės kolonijos) Metilmetansulfonatas 66-27-3 200-625-0 XPRT Etilmetansulfonatas 62-50-0 200-536-7 Etilnitrozošlapalas 759-73-9 212-072-2 Egzogeninė metabolinė aktyvacijos sistema yra HPRT 3-Metilcholantrenas 56-49-5 200-276-4 N-nitrozodietilaminas 62-75-9 200-549-8 7,12-Dimetilbenzantracenas 57-97-6 200-359-5 TK (mažos ir didelės kolonijos) Ciklofosfamidas 50-18-0 200-015-4 Ciklofosfamidmonohidr atas 6055-19-2 Benzpirenas 50-32-8 200-028-5 XPRT N-nitrozodimetilaminas (esant dideliems S9 mišinio kiekiams) 62-75-9 200-549-8 Benzpirenas 50-32-8 200-028-5 Galima naudoti ir kitas teigiamas kontrolines etalonines medžiagas, pavyzdžiui, jei laboratorijoje buvo anksčiau gauti duomenys apie 5-bromo-2'-dezoksiuridiną (CAS Nr. 59– 14–3; Einecs Nr. 200–415–9), tai galima naudoti šią etaloninę medžiagą. Kai yra įmanoma, tai reikia apsvarstyti konkrečios klasės cheminių medžiagų, kaip teigiamų kontrolinių mėginių, panaudojimą. Reikia panaudoti ir neigiamus kontrolinius mėginius, sudarytus vien tik iš tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio ir neturinčius tiriamosios medžiagos bei paveiktus tokiu pat būdu kaip ir tiriamieji mėginiai. Be to reikia naudoti ir tiriamąja medžiaga neveiktus neigiamus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į anksčiau gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad pasirinktas tirpiklis nėra žalingas ir mutageniškas.

1.4.3 Bandymo atlikimo metodika

1.4.3

1.4.3.1 Veikimas tiriamąja medžiaga Proliferuojančios ląstelės paveikiamos tiriamąja medžiaga, tiek esant tiek ir nesant metabolinės aktyvacijos. Poveikis turi trukti atitinkamą laiką (efektyvus poveikis paprastai užtrunka 3–6 valandas). Poveikio trukmė gali būti prailginama vienu ar keliais ląstelės ciklais. Tiriant kiekvieną koncentraciją gali būti atliekami kultūrų, paveiktų tiriamąja medžiaga, 1 ar 2 pakartojimai. Kai atliekamas kultūrų, paveiktų tiriamąja medžiaga, vienetinis pakartojimas, tai koncentracijų skaičius padidinamas, kad užtikrinti, jog susidarys pakankamas analizuojamų kultūrų skaičius (turi būti naudojamos mažiausiai 8 tiriamosios koncentracijos). Reikia mažiausiai dukart panaudoti neigiamas (tirpikliu paveiktas) kontrolines kultūras. Dujinės ir lakios medžiagos turi būti tiriamos atitinkamais metodais, panaudojant užsandarintus indus (21), (22).

1.4.3.2 Išgyvenimo, gyvybingumo bei mutavimo dažnio nustatymas Baigiantis veikimui tiriamąja medžiaga, ląstelės perplaunamos ir pakultivuojamos, siekiant nustatyti jų išgyvenimą bei užtikrinti mutantinio fenotipo ekspresiją. Pasibaigus veikimui tiriamąja medžiaga, iškart nustatomas citotoksiškumas, įvertinant santykinį kloninio augimo efektyvumą (išgyvenimą) arba absoliutų santykinį augimą. Kiekvienas lokusas turi apibrėžtą mažiausią laiko tarpą, per kurį turi įvykti beveik optimali naujai atsiradusio mutantinio fenotipų ekspresija (HFRT ir KFRT fenotipas turi mažiausiai ekspresuotis 6-8 dienas, o TK fenotipas – mažiausiai 2 dienas). Ląstelės auginamos terpėje, turinčioje arba neturinčioje agento, kurio pagalba mutantai atrenkami pagal kloninio augimo efektyvumą bei nustatomas jų skaičius. Gyvybingumas pradedamas nustatinėti (tam, kad būtų galima apskaičiuoti mutavimo dažnį) baigiantis ekspresijai, kai kamienai pasėjami į lėkštelę su terpe, kuri nėra skirta atrankai (nes neturi atrankai naudojamo agento). Jei L5178Y TK+/- tyrimo metu nustatoma, kad tiriamoji medžiaga yra teigiama, tai mažiausiai vienąkart nustatomas tiriamųjų kultūrų (esant pačiai didžiausiai teigiamai koncentracijai) bei teigiamų ir neigiamų kontrolinių kultūrų dydis. Jei L5178Y TK+/- tyrimo metu nustatoma, kad tiriamoji yra neigiama, tai nustatomas teigiamų bei neigiamų kontrolinių kolonijų skaičius. Atliekant TK6TK+/- tyrimą, taipogi galima įvertinti kolonijų dydį.

2. DUOMENYS

2.

2.1 REZULTATŲ APDOROJIMAS Pateikiant duomenis, turi būti nurodytas kontrolinių bei paveiktų tiriamąja medžiaga kultūrų nustatytas citotoksiškumas, gyvybingumas, kolonijų skaičius bei mutavimo dažnis. Jei atliekant L5178Y TK+/- tyrimą buvo gautas teigiamas atsakas, tai kolonijos vertinamos, panaudojant kriterijus, skirtus mažiausiai 1 tiriamosios medžiagos koncentracijai, kuria buvo veikiamos mažos ir didelės kolonijos bei teigiamos ir neigiamos kontrolinės kolonijos. Didelėse bei mažose kolonijose esančių mutantų molekulinė ir citogenetinė prigimtis buvo detaliai ištirta (23), (24). Atliekant TK+/- tyrimą, kolonijos buvo vertinamos, panaudojant normalaus augimo (didelės kolonijos) ir sulėtinto augimo (mažos kolonijos) kriterijus (25). Mutantinės ląstelės, kuriose įvyko dideli genetiniai pažeidimai, pasižymi ilgesniu nei paprastai dalijimosi periodu ir todėl jos suformuoja mažas kolonijas. Šis sutrikimas įprastiniu atveju gali pasireikšti arba kaip atskiro geno praradimas arba kariotipiškai įvertinamomis chromosomų aberacijomis. Cheminės medžiagos, sukeliančios gigantinių chromosomų aberacijas, skatina mažas kolonijas sudarančių mutantų susiformavimą (26). Mažiau pažeistos mutantinės ląstelės auga panašiai kaip ir tėvinės ląstelės bei sudaro dideles kolonijas. Reikia pateikti išgyvenimo (santykinio kloninio augimo efektyvumo) ar absoliutaus santykinio augimo duomenis. Mutavimo dažnis turi būti išreiškiamas kaip mutantinių ir išgyvenusių ląstelių skaičiaus santykis. Kiekvienos kultūros tyrimų duomenys pateikiami atskirai. Be to visi duomenys turi būti pateikiami apibendrintai, lentelių forma. Nėra būtina patvirtinti, kad buvo gautas teigiamas atsakas. Abejotini rezultatai išaiškinami tęsiant tyrimus, kurių metu pirmiausia pakeičiamos eksperimentinės sąlygos. Neigiami rezultatai patvirtinami kiekvienu atveju. Jei manoma, jog nėra reikalo patvirtinti, kad buvo gauti neigiami rezultatai, tai reikia pateikti pateisinančias aplinkybes. Vėliau atliekant eksperimentus, reikia apsvarstyti tiriamų parametrų pakeitimus tam, kad, analizuojant abejotinus bei neigiamus rezultatus, būtų išplėstas įvertinamų sąlygų spektras. Koncentracijas skiriančiosios ribos bei metabolinės aktyvacijos sąlygos yra tiriamieji parametrai, kuriuos galima modifikuoti.

2.2 REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS Egzistuoja keli teigiamo rezultato įvertinimo kriterijai, tokie kaip nuo koncentracijos priklausantis arba atkartojamas mutavimo dažnio padidėjimas. Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Įvertinant tyrimo rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais metodais. Tačiau statistikos svarba neturėtų tapti vieninteliu faktoriumi, apsprendžiančiu teigiamą atsaką. Jei tiriant medžiagą, gaunami rezultatai, neatitinkantys aukščiau minėtų kriterijų, tai medžiaga laikoma nemutageniška. Nors daugumos eksperimentų metu gaunami aiškiai teigiami arba neigiami rezultatai, tačiau išimtiniais atvejais, remiantis visais gautais rezultatais, negalima padaryti tinkamos išvados apie tiriamos medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs, nepriklausomai nuo to, kiek kartų eksperimentas buvo pakartotas. Teigiami rezultatai, gauti, tiriant žinduolių ląstelių genų mutacijas, rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia genų mutacijas panaudotose žinduolių ląstelėse. Nuo koncentracijos priklausantis teigiamas atsakas yra svarbiausias. Neigiami rezultatai rodo, kad, esant tyrimo sąlygoms tiriamoji medžiaga nesukelia genų mutacijų panaudotose žinduolių ląstelėse.

3. ATASKAITA

3. ATASKAITA APIE TYRIMĄ

Ataskaitoje apie tyrimą turi būti pateikiama tokia informacija:

Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys:

priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,

tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.

Ląstelės:

ląstelių tipas ir šaltinis,

ląstelių kultūrų skaičius,

ląstelių persėjimų skaičius (jei jį galima nurodyti),

ląstelių kultūros palaikymo metodai (jei juos galima nurodyti),

ar neužsikrėtusios mikoplazmomis.

Tyrimo sąlygos:

pagrindinė priežastis, nulėmusi koncentracijų bei kultūrų skaičiaus pasirinkimą, įskaitant citotoksiškumo nustatymo duomenis bei tirpumo apribojimus (jei juos įmanoma nurodyti),

terpės sudėtis ir CO2 koncentracija,

tiriamosios medžiagos sudėtis,

tirpinančiojo įrenginio darbinė talpa bei į jį įdėtos medžiagos tūris,

inkubacijos temperatūra,

inkubacijos trukmė,

veikimo tiriamąja medžiaga trukmė,

ląstelių tankis veikimo metu,

metabolinės aktyvacijos sistemos tipas bei sudėtis,

teigiami bei neigiami kontroliniai mėginiai, įskaitant jų tinkamumo kriterijus,

ekspresijos trukmė (įskaitant pasėtų ląstelių skaičių, subkultivavimo bei mitybai skirtų medžiagų įnešimo tvarkaraščiai, jei juos įmanoma pateikti),

atrankos agentai,

kriterijai, kuriais vadovaujamasi, sprendžiant, ar tyrimų metu gauti rezultatai yra teigiami, neigiami ar abejotini,

gyvų bei mutantinių ląstelių skaičiaus nustatymo metodai,

kolonijų dydis ir tipas (įskaitant mažų bei didelių kolonijų vertinimo kriterijus, kaip yra numatyta).

Rezultatai:

toksiškumo požymiai,

precipitacijos požymiai,

duomenys apie pH bei osmosinį slėgį, veikiant tiriamąja medžiaga (jei tai buvo tiriama),

kolonijų dydis, jei buvo vertinamos bent neigiamos arba teigiamos kontrolės,

laboratorijos kompetentingumas L5178Y TK+/- sistemos pagalba nustatyti mutantus, sudarančius mažas kolonijas (jei tai būtina nurodyti),

dozės ir atsako tarpusavio ryšys (jei įmanoma nurodyti),

statistinės analizės (jei bet kokios buvo atliktos),

duomenys apie vienu metu naudojamus neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) ir teigiamus kontrolinius mėginius,

anksčiau gauti duomenys apie neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) bei teigiamus kontrolinius mėginius, kartu nurodant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus,

mutavimo dažnis.

Rezultatų aptarimas.

Išvados.

4.1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)12)13)14)15)16)17)18)19)20)21)22)23)24)25)26)

NUORODOS Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E.H.Y. and Mailing, H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, p. 1306–1312. Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982). Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, p. 467–485. Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, p. 394–403. Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, p. 121–128. Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, p. 235–239. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, p. 147–204. Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, p. 225–251. Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 196, p. 17–36. Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, p. 135–141. Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, p. 9–17. Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, p. 133–147. Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures for the L5178Y/TK+/- – TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, p. 239–268. Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, p. 66–101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, p. 365–373. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347–364. Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, p. 61–108. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173–215. Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis,_7, p. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, p. 85–88. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91–103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795–801. Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p. 51–55. Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C, Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, p. 161–174. Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, p. 89–102. Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- - 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, p. 609–614.

B.

18. DNR PAŽAIDOS IR JŲ REPARACIJA – NEPLANUOTA DNR SINTEZĖ – ŽINDUOLIŲ LĄSTELĖSE IN VITRO

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nėra.

1.4. TYRIMO METODO PRINCIPAS Neplanuotos DNR sintezės (NDS) tyrimo metu įvertinama DNR sintezė reparacijos metu, kai iškerpama bei pašalinama cheminiais ar fiziniais agentais pažeista DNR atkarpa. Tyrimas paremtas tričiu žymėto timidino (3H-TdR) įjungimu į žinduolių ląstelių, nesančių ląstelinio ciklo S (sintezės) fazėje, DNR. 3H -TdR įsijungimas į DNR gali būti nustatomas atliekant paveiktų ląstelių DNR autoradiografiją arba registruojant skystosios scintiliacijos įvykius (SSĮ). Išskyrus pirminius žiurkių hepatocitus, naudojamos žinduolių ląstelės kultivuojamos kartu su tyrimo agentu, esant arba nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos. Taipogi NDS galima įvertinti ir sistemose in vivo.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.6. TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6. Pasiruošimas tyrimui

Tiriamosios, kontrolinės ar etaloninės medžiagos turėtų būti paruošiamos kultivavimui skirtoje terpėje arba, panaudojant atitinkamus prietaisus, ištirpinamos ar suspenduojamos ir vėliau praskiedžiamos kultivavimui skirta terpe, kad tyrimo metu būtų galima jas naudoti. Galutinė medžiagų koncentracija, pasiekta naudojant prietaisą, neturėtų įtakoti ląstelių gyvybingumo. Tyrimo metu galima naudoti žiurkių hepatocitų pirmines kultūras, žmogaus limfocitus arba gerai žinomas ląstelių linijas (pvz., žmogaus diploidinius fibroblastus). Ląstelės turėtų būti veikiamos tiriamąja medžiaga, esant arba nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos.

Tyrimo sąlygos

Kultūrų skaičius

Atliekant neplanuotos DNR sintezės tyrimą autoradiografijos metodu, reikėtų naudoti mažiausiai dvi ląstelių kultūras, o skystosios scintiliacijos įvykių registravimo metodu –mažiausiai šešias kultūras (arba mažiau, jei moksliškai pagrindžiama), būtinas kiekvienam eksperimento etapui.

Teigiamos ir neigiamos kontrolės

Atliekant kiekvieną eksperimentą, reikėtų vienu metu naudoti teigiamas ir neigiamas (neveiktas ir (ar) su prietaisu) kontroles, esant ar nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos. Atliekant tyrimą ir naudojant žiurkių hepatocitų pirmines kultūras, naudojamos teigiamos kontrolės – 7,12-dimetilbenzantracenas (7,12-DMBA) arba 2-acetilaminofluorenas (2-AAF). Jei naudojamos gerai žinomos ląstelių linijos ir atliekamas neplanuotos DNR sintezės tyrimas tiek autoradiografijos, tiek ir skystosios scintiliacijos įvykių registravimo metodais, nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos, 4-nitrokvinolin-N-oksidas naudojamas kaip teigiama kontrolė, o esant metabolitinės aktyvacijos sistemai – N-dimetilnitrozaminas.

Veikimo koncentracijos

Reikėtų naudoti daug tiriamosios medžiagos koncentracijų, išdėstytų dideliame intervale, pakankame atsakui nustatyti. Didžiausios koncentracijos tiriamoji medžiaga turėtų sukelti keletą citotoksinių efektų. Turėtų būti ištirti santykinai vandenyje netirpūs junginiai, kad būtų nustatyta jų tirpumo riba. Pavienio tyrimo metu turėtų būti nustatyta laisvai vandenyje tirpstančių netoksinių junginių didžiausia tiriamoji koncentracija.

Ląstelės

Kultivuojant kultūras reikėtų naudoti atitinkamą terpę ir laikytis atitinkamos CO2 koncentracijos, temperatūros bei drėgmės. Reikėtų periodiškai tikrinti gerai žinomas ląstelių linijas, siekiant nustatyti mikoplazmų sukeliamą infekciją.

Metabolinė aktyvacija

Kai tiriamos pirminės hepatocitų kultūros, metabolinės aktyvacijos nenaudojamos. Gerai žinomos ląstelių linijos bei limfocitai veikiami tiriamąja medžiaga, esant ar nesant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai.

Procedūra

Kultūrų paruošimas

Gerai žinomos ląstelių linijos paruošiamos iš kamieninių kultūrų (veikiant tripsinu arba kratymu), pasėjamos atitinkamu tankumu į terpę kultivavimui skirtuose induose ir inkubuojamos 37 oC temperatūroje. Trumpalaikės žiurkių hepatocitų kultūros sukuriamos šviežiai disocijuotus hepatocitus pasėjant į atitinkamą terpę ir leidžiant jiems prisitvirtinti prie augimo paviršiaus. Žmogaus limfocitų kultūros paruošiamos atitinkamais metodais.

Kultūrų veikimas tiriamąja medžiaga Pirminiai žiurkių hepatocitai

Šviežiai išskirti žiurkių hepatocitai veikiami tiriamąja medžiaga terpėje, turinčioje 3H-TdR, atitinkamą laiko tarpą. Baigiantis veikimui, terpė atskiriama nuo ląstelių, kurios vėliau sudrėkinamos, fiksuojamos bei išdžiovinamos. Skaidres reikėtų panardinti į autoradiografinę emulsiją (galima naudoti ir fotografinę juostelę), eksponuoti, išryškinti nudažyti ir suskaičiuoti ląsteles.

Gerai žinomos ląstelių linijos ir limfocitai

Autoradiografija: Ląstelių kultūros veikiamos tiriamąja medžiaga atitinkamą laiko tarpą, po to veikiamos 3H-TdR. Laiko trukmė parenkama atsižvelgiant į tiriamosios medžiagos prigimtį, metabolitinių sistemų aktyvumus bei ląstelių tipą. Tam, kad būtų pasiekta pati intensyviausia neplanuota DNR sintezė, 3H-TdR turi būti įnešamas arba vienu metu su tiriamąja medžiaga arba praėjus kelioms minutėms po to, kai buvo įnešta tiriamoji medžiaga. Kuri procedūra bus pasirinkta, nulems tarpusavio sąveika tarp tiriamosios medžiagos ir 3H-TdR.. Siekiant atskirti neplanuotą DNR sintezę nuo pusiau konservatyvios DNR sintezės, pastaroji turi būti blokuojama, pvz., panaudojant neturinčią arginino terpę arba terpę, turinčią nedaug serumo, arba pridedant į terpę hidroksišlapalo. Skystosios scintiliacijos įvykių registacija: Prieš veikiant tiriamąja medžiaga, ląstelių perėjimas į S fazę turėtų būti blokuojamas taip, kaip aprašyta anksčiau; vėliau ląstelės veikiamos tiriamąja medžiaga taip, kaip tai atliekama autoradiografijos metu. Baigiantis inkubacijos periodui, iš ląstelių išskiriama DNR ir nustatomas absoliutus DNR bei į ją įsijungusio 3H-TdR kiekis. Reikėtų pabrėžti, kad jei, dirbant remiantis aprašytu metodu, naudojami žmogaus limfocitai, tai nestimuliuotų kultūrų atveju pusiau konservatyvios DNR sintezės nėra būtina blokuoti.

Analizė

Autoradiografiniai nustatymai

Įvertinant neplanuotos DNR sintezės intensyvumą ląstelių kultūroje, neskaičiuojami branduoliai, esantys S fazėje. Reikėtų suskaičiuoti mažiausiai 50 ląstelių, esant vienai koncentracijai. Kiekvienoje skaidrėje reikia suskaičiuoti keletą atsitiktinių regionų, plačiai atskirtų vienas nuo kito. Į citoplazmą įsijungusio 3H-TdR kiekis turėtų būti nustatomas, suskaičiuojant tris branduolio apribotus laukelius, esančius jau suskaičiuotų ląstelių citoplazmoje.

Skystosios scintiliacijos įvykių nustatymai

Siekiant įvertinti neplanuotos DNR sintezės intensyvumą pagal užregistruotus skystosios scintiliacijos įvykius, reikėtų naudoti atitinkamą ląstelių kultūrų kiekį, esant kiekvienai koncentracijai tiriamajame bei kontroliniame mėginiuose. Visi rezultatai turėtų būti patvirtinti, atlikus nepriklausomą bandymą.

2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse.

2.

2.1. AUTORADIOGRAFINIAI NUSTATYMAI Reikėtų atskirai registruoti į citoplazmą įsijungusio 3H-TdR kiekį bei ląstelės branduolyje esančių granulių skaičių. Apibūdinant į citoplazmą įsijungusio 3H-TdR kiekio bei ląstelės branduolyje esančių granulių skaičiaus pasiskirstymą, galima naudoti vidurkį, medianą ir modą.

2.2. SKYSTOSIOS SCINTILIACIJOS ĮVYKIŲ NUSTATYMAI Nustatant skystosios scintiliacijos įvykius, 3H-TdR įsijungimą išreikšti dpm/μg DNR. Apibūdinant įsijungimo pasiskirstymą, galima panaudoti dpm/ug DNR vidurkį bei standartinį nukrypimą. Duomenis reikėtų įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.

3. ATASKAITA

3.

3.1. TYRIMO ATASKAITA Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:

panaudotos ląstelės, tankumas ir peršėjimo numeris veikimo metu, ląstelių kultūrų skaičius,

ląstelių kultūrų kultivavimo metodai, įskaitant terpę, temperatūrą ir CO2 koncentraciją,

tiriamoji medžiaga, priemonė, koncentracijos ir tyrimo metu naudojamų koncentracijų pasirinkimo kriterijai,

metabolitinės aktyvacijos sistemų apibūdinimas,

veikimo tvarkaraštis,

teigiamos ir neigiamos kontrolės,

panaudotas autoradiografinis metodas,

ląstelių patekimo į S fazę blokavimo procedūros,

DNR išskyrimo ir absoliutaus kiekio nustatymo procedūros, atliekant skystosios scintiliacijos įvykių registraciją,

dozės ir atsako sąsaja, jei įmanoma,

statistinis įvertinimas,

rezultatų aptarimas,

rezultatų interpretavimas.

3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

4. NUORODOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

B.19. APSIKEITIMO SESERINĖMIS CHROMATIDEMIS TYRIMAS IN VITRO

B.19.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nėra.

1.4. TYRIMO METODO PRINCIPAS Apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis (ASC) tyrimas trunka trumpai ir jo metu nustatomi grįžtamieji apsikeitimai DNR tarp dviejų seserinių chromatidžių, esančių vienoje dvigubėjančioje chromosomoje. Apsikeitimas seserinėmis chromatidėmis pasikeitimą DNR replikacijos produktais iš pažiūros homologiškuose lokusuose. Pasikeitimo proceso metu neabejotinai įvyksta DNR trūkis ir susiuvimas, tačiau nedaug žinoma apie šio proceso molekulinius mechanizmus. Apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis nustatymui reikia skirtingai pažymėti seserines chromatides ir šitai galima padaryti, įjungiant bromdeoksiuridiną (BrdU) į chromosominę DNR dviejų ląstelinių ciklų metu. Žinduolių ląstelės veikiamos tiriamąja medžiaga in vitro,, naudojant arba nenaudojant žinduolių metabolitinę aktyvacijos sistemą, jeigu reikia, ir kultivuojamos dviejų replikacijos ciklų laikotarpiu terpėje, turinčioje bromdeoksiuridino. Paveikus vertės išsisukimo inhibitoriumi (pvz., kolchicinu), ląstelės surenkamos ir paruošiami chromosomų preparatai.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.6. TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

Tyrimo metu galima naudoti pirmines kultūras (žmogaus limfocitai) arba gerai žinomas ląstelių linijas (pvz., kiniškojo žiurkėnų kiaušidžių ląsteles). Reikėtų patikrinti, ar ląstelių linijos neužsikrėtusios mikoplazmomis.

Reikėtų naudoti atitinkamą kultivavimui skirtą terpę bei parinkti inkubacijos sąlygas (pvz., temperatūra, indai, skirti kultivavimui, CO2 koncentracija bei drėgmė).

Prieš veikiant ląsteles tiriamosiomis medžiagomis, šios turi būti paruoštos kultivavimui skirtoje terpėje arba, panaudojant atitinkamus prietaisus, ištirpintos ar suspenduotos. Panaudojant tirpiklį kaip kontrolę, reikėtų stebėti, kad, naudojant atitinkamą prietaisą, pasiekta tiriamosios medžiagos galutinė koncentracija kultivavimui skirtoje sistemoje ypatingai neįtakotų ląstelių gyvybingumo ar augimo greičio bei apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis dažnumo.

Ląstelės turėtų būti veikiamos tiriamąja medžiaga, esant arba nesant egzogeninei žinduolių metabolitinės aktyvacijos sistemai. Jei naudojami ląstelių, turinčių metabolitinę aktyvacijos sistemą, tipai, tai aktyvumo greitis ir prigimtis turėtų atitikti tiriamąją cheminių junginių klasę.

1.6. Tyrimo sąlygos

Kultūrų skaičius

Kiekvieno eksperimento etapo metu reikėtų naudoti mažiausiai dvi kultūras.

Teigiamos ir neigiamos kontrolės

Kiekvieno eksperimento metu reikėtų naudoti teigiamas kontroles, sudarytas tiek iš tiesiogiai veikiančio junginio, tiek junginio, kurį reikia metabolitiškai aktyvuoti; taipogi reikėtų naudoti kontrolę kartu su priemone. Toliau pateikiamos medžiagos, kurias galima naudoti kaip teigiamas kontroles: Jeigu reikia, galima naudoti ir papildomą teigiamą kontrolę, priklausančią tai pačiai cheminių junginių klasei kaip ir tiriamoji medžiaga.

tiesiogiai veikiąs junginys:

etilmetansulfonatas,

netiesiogiai veikiąs junginys:

ciklofosfamidas.

Veikimo koncentracijos

Reikėtų naudoti mažiausiai tris tiriamosios medžiagos koncentracijas, tinkamai atskirtas vieną nuo kitos. Didžiausia koncentracija turėtų sukelti intensyvų toksinį efektą, tačiau nesutrukdyti ląstelių replikacijos ciklui vykti. Panaudojant atitinkamas procedūras turėtų būti tiriami santykinai vandenyje netirpūs junginiai, kad būtų nustatyta jų tirpumo riba. Pavienio tyrimo metu turėtų būti nustatyta laisvai vandenyje tirpstančių netoksinių junginių didžiausia tiriamoji koncentracija.

Procedūra

Kultūrų paruošimas

Gerai žinomos ląstelių linijos paruošiamos iš kamieninių kultūrų (veikiant tripsinu arba kratymu), pasėjamos atitinkamu tankumu į terpę kultivavimui skirtuose induose ir inkubuojamos 37 oC temperatūroje. Vienasluoksnių kultūrų atveju ląstelių, esančių kultivavimui skirtame inde, skaičius turėtų būti sureguliuotas taip, kad ląstelių surinkimo metu kultūros susimaišymas siektų ne daugiau 50 %. Ląsteles galima kultivuoti ir suspensijoje. Žmogaus limfocitų kultūros paruošiamos iš heparinizuoto kraujo, panaudojant atitinkamas procedūras ir inkubuojami 37 oC temperatūroje.

Veikimas

Ląstelės, esančios eksponentinėje augimo fazėje, veikiamos tiriamąja medžiaga atitinkamą laiko tarpą; dažniausiai užtenka 1-2 valandų, tačiau konkrečiais atvejais veikimas gali būti pratęsiamas iki dviejų ląstelinių ciklų. Ląstelės, nepasižyminčios pakankamu metabolitiniu aktyvumu, turėtų būti veikiamos tiriamąja medžiaga, esant ar nesant atitinkamai metabolitinės aktyvacijos sistemai. Baigiantis veikimui, ląstelės atplaunamos nuo neprisirišusios tiriamosios medžiagos ir kultivuojamos du replikacijos periodus terpėje, turinčioje bromdeoksiuridino. Ląsteles galima veikti vienu metu tiriamąja medžiaga ir bromdeoksiuridinu dviejų ląstelinių ciklų trukmės laiko periodu. Žmogaus limfocitų kultūros veikiamos tuo metu, kai jos yra pusiau sinchroninėje būsenoje. Ląstelės analizuojamos tada, kai jos pradeda dalintis antrą kartą po veikimo, užtikrinant, kad tiriamąja medžiaga buvo paveiktos ląstelės, esančios pačiuose jautriausiose medžiagos atžvilgiu ląstelinio ciklo fazėse. Visos kultūros, į kurias buvo įneštas bromdeoksiuridinas, laikomos tamsoje arba blankioje dienos šviesos lempų šviesoje iki tol, kol bus surinktos ląstelės tam, kad būtų sumažinta DNR, turinčios bromdeoksiuridino, fotolizė.

Ląstelių surinkimas

Prieš surenkant ląsteles, šios veikiamos verpstės išsisukimo inhibitoriumi (pvz., kolchicinu) 1-2 valandas. Kiekviena kultūra surenkama ir apdorojama atskirai, kad chromosomos būtų paruoštos.

Chromosomų paruošimas ir dažymas

Chromosomos paruošiamos standartiniais citogenetiniais metodais. Skaidrės, skirtos apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis demonstravimui, gali būti dažomos keliais būdais (pvz., panaudojant fluorescencinius dažus ir Giemsa dažymą).

Analizė

Analizuojamų ląstelių skaičius turėtų būti pagrįstas apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis spontaniniu kontroliniu dažniu. Įprastiniu atveju, tiriant apsikeitimą seserinėmis chromatidėmis, mažiausiai 25 gerai matomos metafazės yra analizuojamos. Skaidrės užkoduojamos prieš analizę. Žmogaus limfocitų atveju, analizuojamos tik metafazėje esančios chromosomos, turinčios 46 chromatides. Gerai žinomų ląstelių linijų atveju analizuojamos tik tos metafazinės chromosomos, kurios turi ± 2 modalinį skaičių centromerų. Reikėtų nurodyti ar, tiriant apsikeitimą seserinėmis chromatidėmis, skaičiuojamas žymės centromerinis perjungimas. Rezultatai turi būti patvirtinti, atlikus nepriklausomą eksperimentą.

2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti pateikti lentelėse. Atskirai nuo paveiktų ir kontrolinių kultūrų turėtų būti atskirai pateiktas apsikeitimų seserinėmis chromosomomis kiekvienoje metafazinėje ir nemetafazinėje chromosomoje skaičius. Rezultatai turėtų būti įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.

3. ATASKAITA

3.

3.1 TYRIMO ATASKAITA Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:

panaudotos ląstelės, ląstelių kultūrų kultivavimo metodai,

tyrimo sąlygos: terpės sudėtis, CO2 koncentracija, tiriamosios medžiagos koncentracija, panaudota priemonė, inkubacijos temperatūra, veikimo laikas, panaudotas verpstės išsisukimo inhibitorius, jo koncentracija ir veikimo inhibitoriumi trukmė, panaudotos žinduolių metabolitinės aktyvacijos sistemos tipas, teigiamos ir neigiamos kontrolės,

ląstelių kultūrų, naudotų kiekviename eksperimento etape, skaičius,

skaidrių paruošimo metodo aprašymas,

išanalizuotų metafazių skaičius (kiekvienos kultūros tyrimų duomenys pateikiami atskirai),

apsikeitimų seserinėmis chromatidėmis vienoje ląstelėje ir vienoje chromosomoje vidurkis (kiekvienos kultūros tyrimų duomenys pateikiami atskirai),

apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis vertinimo kriterijai,

dozės pasirinkimo kriterijai,

dozės ir atsako sąsaja, jei įmanoma,

statistinis įvertinimas,

rezultatų aptarimas,

rezultatų interpretavimas.

3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

4. NUORODOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

B.20. SU LYTIMI SUSIJĘS RECESYVINIS LETALUS TESTAS DROSOPHILA MELANOGASTER TARPE

B.20.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nėra.

1.4. TYRIMO METODO PRINCIPAS Su lytimi susijusio recesyvinio letalaus (LSRL) testo, panaudojant Drosophila melanogaster, metu vabzdžio embrioninės linijos ląstelėse nustatomos mutacijos, tiek taškinės, tiek ir nedidelės delecijos. Šis testas yra skirtas tiesioginėms mutacijoms analizuoti ir jo metu galima nustatyti mutacijas, lokalizuotas apie 800 lokusų, sudarančių apie 80 % visų X-chromosomos lokusų. X-chromosoma sudaro maždaug penktadalį haploidinio Drosophila genomo. Drosophila melanogaster X-chromosomoje vykstančios mutacijos pasireiškia fenotipiškai patinuose, turinčiuose mutantinį geną. Kada mutacija yra letali hemizigotinėmis sąlygomis, tai jos egzistavimas reiškia, kad viena iš dviejų patinų grupių neturės palikuonių, kuriuos normaliomis sąlygomis atsiveda heterozigotinės patelės. Atliekant LSRL testą, pasinaudojama šia informacija, specifiškai pažymint bei išdėstant chromosomas.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.6. TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6. Pasiruošimas tyrimui

Padermės

Gali būti naudojami gerai žinomos laukinės padermės patinai ir padermės Muller-5 patelės. Taipogi galima naudoti kitas atitinkamai pažymėtas patelių padermes, turinčias daug invertuotų X-chromosomų.

Tiriamoji medžiaga

Tiriamosios medžiagos turėtų būti tirpinamos vandenyje. Prieš pradedant veikimą, vandenyje netirpstančios medžiagos gali būti ištirpinamos arba suspenduojamos panaudojus atitinkamas priemones (pvz., etanolio ir Tween-60 arba Tween-80 mišinį), o tada praskiedžiamos vandeniu ar druskų tirpalu. Reikėtų vengti naudoti dimetilsulfoksidą (DMSO) kaip tirpinimo priemonę.

Gyvūnų skaičius

Testą reikėtų taip suplanuoti, kad iš anksto būtų numatytas jo jautrumas ir skiriamoji geba. Dažnai pasireiškiančios spontaninės mutacijos, stebimos atitinkamose kontrolėse turės didelės įtakos chromosomų, paveiktų tiriamąja medžiaga ir kurios turi būti analizuojamos, skaičiui.

Davimo būdas

Tiriamoji medžiaga gali būti duodama per os būdu, ją injekuojant arba veikiant dujomis ar garais. Tiriamąją medžiagą galima duoti ir su maistu, tačiau šitai daroma naudojant cukraus tirpalą. Jeigu reikia, medžiagos gali būti ištirpinamos 0,7 % NaCl tirpale ir injekuojamos į stemplę ar pilvelį.

Teigiamų ir neigiamų kontrolių naudojimas

Reikėtų naudoti neigiamas (priemonė) ir teigiamas kontroles. Tačiau, jei galima pasinaudoti anksčiau atliktų laboratorinių tyrimų duomenimis, tuo pačiu metu kontrolių naudoti nereikia.

Veikimo dozė

Reikėtų naudoti tris veikimo dozes. Atliekant išankstinį tiriamosios medžiagos įvertinimą, galima naudoti vieną dozę, kuri yra arba didžiausia toleruojamoji koncentracija, arba kuri sukelia kai kuriuos toksiškumo požymius. Veikiant netoksinėmis medžiagomis, reikėtų vatoti maksimalią veikimo koncentraciją.

Procedūra

Laukinio tipo patinai (3-5 dienų amžiaus) veikiami tiriamąja medžiaga ir poruojami individualiai su daugeliu Muller-5 ar kitos atitinkamai pažymėtos (turinčios daug invertuotų X-chromosomų) padermės nekaltų patelių. Kiekvieną 1-3 dieną apvaisintos patelės keičiamos nekaltomis patelėmis tam, kad būtų panaudotas visas embrioninių ląstelių ciklas. Šių patelių palikuonys vertinami pagal letalius efektus subrendusios spermos, vidurinėje ar vėlyvojoje stadijoje esančių spermatidžių, spermatocitų ir spermatogonijų atžvilgiu veikimo metu. Ankstesniuose kryžminimuose naudotoms heterozigotinėms pirmos palikuonių kartos (F1) patelėms leidžiama kryžmintis individualiai (viena patelė inde) su jų broliais. Kiekviena F2 karta įvertinama pagal laukinio tipo patinų neegzistavimą. Jei nustatoma, kad kultūra yra paimta iš F1 patelės, turinčios letalią X-chromosomos mutaciją (pvz., nebuvo pastebėta patinų su paveikta chromosoma), tai turėtų būti tiriamos tą patį genotipą turinčios šios patelės dukterys tam, kad būtų galima įsitikinti jog letalumas pasikartoja kitoje kartoje.

2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti pateikti lentelėse, nurodant ištirtų X-chromosomų skaičių, nevaisingų patinų skaičių ir kiekvieno paveikto patino kiekvieno poravimosi periodo metu nustatytų letalių chromosomų skaičių, esant kiekvienai tiriamosios medžiagos koncentracijai, reikėtų registruoti skirtingų dydžių genų klasterių kiekvieno patino genome skaičių. Šie rezultatai turi būti patvirtinti, atlikus atskirą eksperimentą. Įvertinant su lytimi sukibusių recesyvių letalių genų testų rezultatus, reikėtų panaudoti atitinkamus statistinius metodus. Remiantis atitinkamais statistiniais metodais, reikėtų įvertinti ir apsvarstyti vieno patino recesyvių letalių genų kaupimąsi.

3. ATASKAITA

3.

3.1. TYRIMO ATASKAITA Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:

padermė: panaudotos Drosophila padermės ar kamienai, vabzdžių amžius, paveiktų patinų skaičius, streilių patinų skaičius, sukurtų F2 kartos kultūrų skaičius, F2 kultūrų, neturinčių palikuonių, skaičius, chromosomų, turinčių letalią mutaciją, nustatytą embrioninės linijos ląstelėse, skaičius,

grupių, kurios veikiamos, dydžio nustatymo kriterijai,

tyrimo sąlygos: detalus veikimo ir mėginių paėmimo tvarkaraštis, veikimo koncentracijos, toksiškumo tyrimo duomenys, neigiamos (tirpiklis) ir teigiamos kontrolės, jeigu reikia,

letalių mutacijų įvertinimo kriterijai,

dozės ir atsako sąsaja, jei įmanoma,

duomenų įvertinimas,

rezultatų aptarimas,

rezultatų interpretavimas.

3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

4. NUORODOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

B.21. ŽINDUOLIŲ LĄSTELIŲ TRANSFORMACIJOS TESTAI IN VITRO

B.21.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nėra.

1.4. TYRIMO METODO PRINCIPAS Siekiant nustatyti cheminių agentų, sukeliančių ląstelių piktybinę transformaciją in vivo ir ląstelių fenotipo pokyčius in vitro, gali būti naudojamos žinduolių ląstelių kultūrų sistemos. Plačiai naudojamoms ląstelių linijoms priklauso C3H10T1/2, 3T3, SHE bei Fischer žiurkių ląstelės ir testai grindžiami ląstelių morfologijos pokyčiais, ligos židinio formavimosi bei pri si tvirtinimo prie pusiau kieto agaro pokyčių tyrimais. Mažiau naudojamoms sistemoms priklauso tos, kurios naudojamos fiziologiniams bei morfologiniams ląstelių, paveiktų karcinogeninėmis cheminėmis medžiagomis, pokyčiams nustatyti. Nė vieno in vitro, testų metu nebuvo nustatyta mechanistinio ryšio tarp vėžio ir ląstelių pokyčiu. Naudojant kai kurias tiriamąsias sistemas, galima nustatyti protoonkogenų promotorius. Įvertinant tiriamosios medžiagos įtaką ląstelių kultūrų sugebėjimui suformuoti kolonijas (klonavimo efektyvumas) arba augimo greičiams, galima nustatyti citotoksiškumą. Citotoksiškumo įvertinamas tam, kad būtų nustatyta, jog tiriamoji medžiaga, kuria buvo veikiama, sukelia toksikologinį efektą ir kurios negalima naudoti visuose tyrimuose, apskaičiuojant transformacijos dažnį, kadangi šiuo atveju ląstelių inkubaciją ar persėjimą reikėtų pratęsti.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.6. TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6. Pasiruošimas tyrimui

Ląstelės

Priklausomai nuo naudojamo testo transformacijai įvertinti, galima naudoti įvairiausias ląstelių linijas ar pirmines ląsteles. Tyrėjas privalo užtikrinti, kad tiriamąsias ląsteles paveikus žinomais karcinogenais, šiose pasireiškia atitinkami fenotipiniai pokyčiai ir kad įrodyta bei dokumentiškai patvirtinta, jog tyrėjo laboratorijoje vartojamas testas yra oficialiai pripažįstamas ir patikimas.

Terpė

Atliekant transformacijos tyrimą, reikėtų naudoti atitinkamą terpę bei parinkti atitinkamas eksperimentines sąlygas.

Tiriamoji medžiaga

Prieš veikiant ląsteles, tiriamosios medžiagos gali būti paruošiamos kultivavimui skirtoje terpėje arba ištirpinamos ar suspenduojamos atitinkamomis priemonėmis. Tirpinančiosios priemonės galutinė koncentracija ląstelių kultūrų sistemoje neturėtų įtakoti ląstelių gyvybingumo, augimo greičio ar pasitaikančios transformacijos.

Metabolitinė aktyvacija

Ląstelės turėtų būti veikiamos tiriamąja medžiaga, tiek esant, tiek ir nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos. Kai naudojami ląstelių, pasižyminčių metabolitiniu aktyvumu, tipai, tai aktyvumo prigimtis turėtų atitikti tą klasę, kuriai priklauso naudojamas cheminis junginys.

Tyrimo sąlygos

Teigiamų ir neigiamų kontrolių naudojimas

Kiekvieno eksperimento metu reikėtų naudoti teigiamas kontroles, sudarytas tiek iš tiesiogiai veikiančio junginio, tiek iš junginio, kurį reikia metabolitiškai aktyvuoti; taipogi reikėtų naudoti ir neigiamas (priemonė) kontroles. Žemiau pateikiamos medžiagos, kurias galima naudoti kaip teigiamas kontroles: Jeigu reikia, galima naudoti ir papildomą teigiamą kontrolę, priklausančią tai pačiai cheminių junginių klasei kaip ir tiriamoji medžiaga.

tiesiogiai veikiantys junginiai:

etilmetansulfonatas,

β-opropiolaktonas,

junginiai, kuriuos reikia aktyvuoti metabolitiškai:

2-acetilaminofluorenas,

4-dimetilaminobenzenas,

7,12-dimetilbenzantracenas.

Veikimo koncentracijos

Tiriamąją medžiagą reikėtų vartoti keliomis koncentracijomis. Šios koncentracijos turėtų sukelti nuo koncentracijos priklausomą toksinį efektą, esant didžiausiai koncentracijai, ląstelių išgyvenimas turėtų sumažėti, tačiau esant mažiausiai koncentracijai, jis turėtų būti toks, kaip ir neigiamai kontrolei esant terpėje. Panaudojant atitinkamas procedūras turėtų būti tiriami santykinai vandenyje netirpūs junginiai, kad būtų nustatyta jų tirpumo riba. Pavienio tyrimo metu turėtų būti nustatyta laisvai vandenyje tirpstančių netoksinių junginių didžiausia tiriamoji koncentracija.

Procedūra

Ląstelės turėtų būti veikiamos atitinkamą laiką, priklausomai nuo naudojamos tyrimo sistemos ir veikimo metu galima pakartotinai veikti su ta pačia medžiagos doze, pakeičiant terpę (jei būtina, į terpę įnešama šviežiai paruošto metabolitinės aktyvacijos mišinio), jei veikimo laikas pailginamas. Ląstelės, nepasižyminčios efektyviai veikiančia metabolitine aktyvacija, turėtų būti veikiamos tiriamąja medžiaga, esant arba nesant atitinkamai metabolitinės aktyvacijos sistemai. Baigiantis veikimui, ląstelės atplaunamos nuo neprisirišusios tiriamosios medžiagos ir, kai nustatoma transformacija bei pasirodo transformuotas fenotipas, kultivuojamos atitinkamomis sąlygomis. Visi rezultatai patvirtinami, atlikus nepriklausomą eksperimentą.

2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti pateikti lentelėse įvairiausiomis formomis, priklausomai nuo atlikto tyrimo, pvz., nurodant lėkštelių skaičių, teigiamas lėkšteles ar transformuotų ląstelių skaičių. Jeigu reikia, išgyvenimas išreiškiamas procentais kontrolės laipsnio atžvilgiu ir transformacijos dažnis išreiškiamas transformuotų ląstelių, esančių išgyvenusių ląstelių tarpe, skaičiumi.

3. ATASKAITA

3.

3.1. TYRIMO ATASKAITA Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:

panaudotų ląstelių tipas, ląstelių kultūrų skaičius, ląstelių kultūrų kultivavimo metodai,

tyrimo sąlygos: tiriamosios medžiagos koncentracija, panaudota priemonė, inkubacijos laikas, veikimo trukmė ir dažnis, ląstelių populiacijos tankis veikimo metu, panaudotos egzogeninės metabolitinės aktyvacijos sistemos tipas, teigiamos ir neigiamos kontrolės, stebimo ląstelių fenotipo ypatumai, panaudota atrankos sistema (jei įmanoma), dozės pasirinkimo kriterijai,

gyvų ir transformuotų ląstelių skaičiaus nustatymo metodas,

statistinis įvertinimas,

rezultatų aptarimas,

rezultatų interpretavimas.

3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

4. NUORODOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

B.22.

1. METODAS

1.

1.1. ĮVADAS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.2. SĄVOKOS Žr. Bendrojo įvado B dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Nėra.

1.4. TYRIMO METODO PRINCIPAS Dominantiniai letalūs efektai sukelia embriono arba gemalo mirtį. Veikiant chemine medžiaga, sukeliami dominantiniai letalūs efektai, kurie rodo, kad tiriamoji medžiaga paveikė tiriamosios rūšies gyvūnų embrionų audinius. Apskritai manoma, kad dominantiniai letalūs efektai pasireiškia dėl chromosomų pažeidimų (struktūrinės anomalijos arba chromosomų skaičiaus pokyčiai). Jei patelės paveikiamos medžiaga, ir jų embrionai žūsta, tai šitai taipogi įvyksta dėl toksinių efektų. Apskritai, gyvūnų patinai paveikiami tiriamąja medžiaga, o vėliau poruojami su nekaltomis patelėmis, nepaveiktomis tiriamąja medžiaga. Poruojant individus paeiliui, tam tikrais laiko tarpais, galima atskirai tirti įvairius embrioninės ląstelės vystymosi etapus. Jei, lyginant su kontrolinės grupės patelių negyvų implantų skaičiumi, šių implantų skaičius padaugėja kiekvienoje paveiktos grupės patelėje, tai rodo, kad implantacija nepavyko. Nesėkmė, atliekant išankstinę implantaciją, gali būti vertinama pagal corpora lutea kiekį arba lyginant absoliutų implantų tiriamos bei kontrolinės grupės patelėse skaičių. Absoliutus dominantinis letalus efektas apima nesėkmes, atliekant išankstinę bei vėlesnę implantacijas. Absoliutaus dominantinio letalaus efekto įvertinimas paremtas gyvų implantų, esančių tiriamos bei kontrolinės grupės patelėse, kiekio palyginimu. Konkrečiais laiko intervalais dėl ląstelių (tokių kaip spermatocitų ir (ar) spermatogonijų) žūties gali sumažėti implantų skaičius.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Nėra.

1.6. TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6. Pasiruošimas tyrimui

Jei įmanoma, tiriamosios medžiagos turėtų būti ištirpintos ar suspenduotos izotoniniame druskų tirpale. Vandenyje netirpios cheminės medžiagos turi būti ištirpintos ar suspenduotos, panaudojus atitinkamas priemones. Naudojama priemonė neturi trukdyti nei tiriamajai cheminei medžiagai veikti, nei toksiniams efektams pasireikšti. Reikėtų naudoti šviežiai paruoštus tiriamosios cheminės medžiagos preparatus.

Tyrimo sąlygos

Davimo būdas

Paprastai tiriamasis junginys turėtų būti duodamas vienąkart. Remiantis toksikologine informacija, veikimą galima pakartoti. Paprastai tiriamoji medžiaga duodama per os, į trachėją įvedamu vamzdeliu arba injekuojant tiriamąją medžiagą į pilvą. Medžiagą galima duoti ir kitais būdais.

Eksperimentiniai gyvūnai

Rekomenduojama tirti žiurkes arba peles. Sveiki visiškai lytiškai subrendę gyvūnai atsitiktinai pasirenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolines grupes.

Skaičius ir lytis

Atsižvelgiant į spontaninę tiriamos biologinės rūšies variaciją, reikėtų naudoti pakankamą skaičių patinų, paveiktų tiriamąja medžiaga. Skaičius turėtų būti pasirenkamas, remiantis iš anksto nustatytu tyrimo testo jautrumu bei gaunamų duomenų patikimumu. Pavyzdžiui, atliekant tipinį testą, patinų, priklausančių grupėms, kurių kiekvienai duodama skirtinga dozė, turi būti tiek, kad vieno poravimosi periodo metu būtų apvaisinta 30–50 patelių.

Teigiamų ir neigiamų kontrolių naudojimas

Atliekant kiekvieną eksperimentą, paprastai vienu metu reikėtų naudoti teigimą bei neigiamą (priemonė) kontroles. Kai galima susipažinti su toje pačioje laboratorijoje ką tik atliktų eksperimentų, naudojant teigiamas kontroles, gautais patenkinamais rezultatais, tai šiuos rezultatus galima naudoti vietoj teigiamos kontrolės, naudojamos tuo pačiu metu. Teigiamos kontrolinės medžiagos turėtų būti naudojamos atitinkamomis mažomis dozėmis (pvz., MMS, injekuojamos į pilvą, dozė turi siekti 10 mg/kg), kad būtų parodytas tyrimo testo jautrumas.

Veikimo dozė

Reikėtų naudoti tris veikimo dozes. Didelė dozė turėtų sukelti toksiškumo požymius arba sumažinti gyvūnų, paveiktų tiriamąja medžiaga, vaisingumą. Konkrečiais atvejais užtenka ir pavienės didelės dozės.

Ribų tyrimas

Duodant netoksines tiriamąsias medžiagas vienąkart, jų koncentracija turi siekti 5 g/kg, o duodant pakartotinai – 1 g/kg.

Procedūra

Tiriamąsias medžiagas galima duoti įvairiai. Dažniausiai tiriamoji medžiaga duodama vienąkart. Pasibaigus veikimui, atitinkamais laiko tarpais pavieniai patinai paeiliui poruojami su tiriamąja medžiaga nepaveiktomis nekaltomis patelėmis. Patelės paliekamos su patinais laiko tarpui, lygiam vienai rujai arba tol, kol jie susiporuos, o tai nustatoma pagal spermos patekimą į makštį arba pagal makšties kamščio susidarymą. Pasibaigus veikimui, atliekama tiek poravimų, kiek yra numatyta veikimo tvarkaraštyje bei turėtų būti užtikrinta, kad pasibaigus veikimui, mėginai paimami atskirais embrioninės ląstelės vystymosi etapais. Patelės numarinamos praėjus pusei nėštumo periodo ir gimdos turinys tiriamas tam, kad būtų nustatytas gyvų bei žuvusių implantų skaičius. Reikia ištirti kiaušides, kad būtų nustatytas corpora lutea skaičius.

2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant patinų ir nėščių bei nenėščių patelių skaičių. Reikėtų atskirai registruoti kiekvieno suporavimo rezultatus, nurodant kiekvieno patino ir patelės tapatybę. Taipogi kiekvienos patelės atveju reikėtų registruoti suporavimo savaitę, dozę, gautą iš patinų, gyvų bei negyvų implantų egzistavimo dažnį. Absoliutus dominantinių letalių efektų skaičius nustatomas, lyginant gyvų implantų skaičių tiriamosios bei kontrolinės grupės patelėse. Tiriamosios grupės patelių gyvų bei negyvų implantų skaičiaus santykis palyginamas su tokiu pačiu kontrolinės grupės implantų skaičiaus santykiu tam, kad nustatyti, ar implantacija nepavyko. Jei tarp pateikiamų duomenų, nurodomos ankstyvosios bei vėlyvosios mirtys, tai šitai turi būti aiškiai parodyta lentelėse. Jeigu nustatoma, kad išankstinė implantacija nepavyko, tai ji turi būti užregistruota. Ar išankstinė implantacija pavyko ar ne, sprendžiama, lyginant pagal corpora lutea ir implantų skaičiaus skirtumus arba pagal vidutinio implantų gimdoje skaičiaus sumažėjimą tiriamoj oje grupėje, lyginant su poravimais kontrolinėje grupėje. Rezultatai turėtų būti įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.

rūšis, kamienas, panaudotų gyvūnų amžius bei svoris, eksperimentinėje bei kontrolinėse grupėse esančių kiekvienos lyties gyvūnų skaičius,

tiriamoji medžiaga, priemonė, dozės, ir dozių pasirinkimo kriterijai, neigiamos ir teigiamos kontrolės, toksiškumo tyrimų duomenys,

davimo būdas ir veikimo tvarkaraštis,

suporavimo tvarkaraščiai,

metodas, kuriuo nustatoma, kad suporavimas įvyko,

numarinimo laikas,

dominantinių letalių mutacijų įvertinimo kriterijai,

dozės ir atsako sąsaja, jei įmanoma,

statistinis įvertinimas,

rezultatų aptarimas,

rezultatų interpretavimas.

3229 more provisions are not shown here; each has its own address.

Versions

2008-05-30