Komisijas Regula (EK) Nr. 440/2008 (2008. gada 30. maijs) par testēšanas metožu noteikšanu saskaņā ar Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH) (Dokuments attiecas uz EEZ)

In forceVersion 2008-05-30from 2008-06-01

Grade B

mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.

Ask Gelex about this law

Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/lv

Contents

Preamble
ANNEX
PIELIKUMS A DAĻA: FIZIKĀLI ĶĪMISKO ĪPAŠĪBU NOTEIKŠANAS METODES
A.1.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.4.
1.5. TABULA: METOŽU LIETOJAMĪBA A. B. C. D.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
1.6.1.2. Aprīkojums
1.6.2.
1.6.4.
4.(1)(2)(3)(4)
A.2.
1.
1.4.
1.5. 1. tabula Metožu salīdzinājums
1.6.
1.6.4.
1.6.6.
2. tabula TEMPERATŪRAS KOREKCIJAS KOEFICIENTI fT
A.3.
1.
1.4.
1.4.1.
3. Tabula 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Metožu lietojamība
3. Tabula 1.4.1.1.1.4.1.2. Metožu lietojamība a)
3. Tabula 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Metožu lietojamība a)
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
A.4.
1.
1.4.
1.5. Tabula 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Kvalitātes kritēriji
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.4.
1.6.4.2.
1.6.5.
1.6.6.
1.6.6.1. Inerta gāze
1.6.6.2. Piesātināšanas kolonnas sagatavošana
a)
b)
1.6.7.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
A.5.
1.
1.6.
1.6.4.
1.6.4.1.
1.6.4.1.3. Attēls Mērierīce
1.6.4.2.
1.6.4.2.2. Uzstādīšana
a)
b)
2. Tabula Virsmas spraiguma mērījumu korekcija Tikai ūdens šķīdumiem, ρ ≅ 1 g/cm3
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.6.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Testēšanas gaita
1.6.3.3. Aprīkojums
1.6.3.4. Aprīkojums (skatīt 4. un 3. attēlu)
1.6.4.
2.
3.
A.8.
1.
1.3. Kolbu kratīšanas metode
1.4.
1.5.
1.5.1. Kolbu kratīšanas metode
1.5.2. Kolbu kratīšanas metode
1.5.3. Kolbu kratīšanas metode
1.6.
1.6.2.
1.6.2.1.
1.6.2.3.
1.6.3.
1.6.3.1. Aprīkojums
1.6.3.2. Tukšā laika t0 aprēķināšana
2. Kolbu kratīšanas metode
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
A.9.
1.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Ābela iekārta
A.10.
1.
1.6.
1.6.2.
3.
A.11.
1.
1.6.
A.12.
1.
1.3.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
A.13.
1.
1.6.
1.6.2. a)
2.
A.14
1.
1.1. a)
1.4.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2. a)
1.6.3.
1.6.3.2. a)
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.15.
1.
1.6.
A.16.
1.
1.6.
1.6.1.
4.
1. attēls Pārbaudē izmantojamā 20 mm kuba piegrieztne
2. attēls Raksturīga temperatūras līkne
A.17.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
3.
3.2. a)
A.18.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.19.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.20.
1.
1.5.
1.5.4.
2.
3.
3.1.
A.21.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.2.
2.
2.1. 1. tabula Rezultātu piemēri
3.
3.2. a)
4.(1)
1. attēls Spiedtvertne
2. attēls Statīvs
3. attēls Aizdedzināšanas sistēma
1.
2.
4.
1.2. Cietām vielām
1. Papildinājums Aprēķinu metode IEVADS
2. papildinājums
1. attēls Iekārta tvaika spiediena līknes noteikšanai ar dinamisko metodi
2.a attēls Aparāts tvaika spiediena līknes noteikšanai pēc statiskās metodes (izmantojot U veida caurules manometru)
2.b attēls Aparāts tvaika spiediena līknes noteikšanai pēc statiskās metodes (izmantojot spiediena indikatoru)
3. attēls Izoteniskops (skatīt (7))
4. attēls Iekārta tvaika spiediena līknes noteikšanai ar tvaika spiediena svariem
5. attēls Aparāta paraugs iztvaicēšanai pazeminātā spiedienā ar efūzijas metodi; efūzijas šūnas tilpums 8 cm3
6.a attēls Caurplūdes sistēmas paraugs tvaika spiediena noteikšanai ar gāzes piesātinājuma metodi
6.b attēls Sistēmas paraugs tvaika spiediena noteikšanai pēc gāzes piesātināšanas metodes ar kapilāru, kas ievietots aiz piesātināšanas kameras
7. attēls Eksperimentālās iekārtas shēmas paraugs noteikšanai pēc rotācijas metodes
8. attēls Rotācijas mērierīces paraugs
1. attēls Eluēšanas kolonna ar cirkulācijas sūkni
2. attēls Mikrokolonnas paraugs
3. attēls Mikrokolonnas paraugs
4. attēls Eluēšanas kolonna ar līdzsvarošanas trauku
1. Papildinājums Aprēķinu/novērtēšanas metodes IEVADS
Sadalīšanās koeficienta orientējoša novērtēšana
Aprēķinu metožu būtība
Kvalitātes kritēriji
Aprēķināšanas procedūras Henša [Hansch] π-metode
Piezīmes i)
Pārskats
2. Papildinājums Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijai ieteicamās standartvielas
Attēls Veidne un papildu aprīkojums degšanas ilguma noteikšanai
Attēls Aprīkojums
Termiskās jutības testēšanai vajadzīgo materiālu testēšana (skatīt DIN 1623) 1.2.3.
1. attēls Termiskās jutības testēšanas iekārta
2. attēls Termiskās jutības tests
3. attēls Sildīšanas ātruma kalibrēšana termiskās jutības testēšanai
4. attēls Trieciena testa aparāts
4. attēls (turpinājums)
5. attēls Berzes jutības testēšanas iekārta
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
VISPĀRĪGS IEVADS A.
i)
ii)
B.1.a
1.
1.4.
1.5.
1.5.3.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
B.1.b
1.
1.4.
1.5.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
B.2.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1. a)
B.3.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. Toksicitātes novērtēšana otram dzimumam
3.
B.4.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5.a)(6)(7)(8)(9)
B.5.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.2.3.
1.4.2.7.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6.a)(7)(8)(9)(10)
Radzene
Varavīksnene
Konjunktīva
Hemoze
B.6.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.2.
1.5.1.3.
1.5.2.
1.5.2.2.
1.5.2.3.
3. Testa ziņojums (GPMT un Bīlera tests)
B.7.
1.
1.4.
1.4.2.
1.4.3.
3. TESTA ZIŅOJUMS
B.8.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1.
pt_2 a)
B.9.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
B.10.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2
1.4.3.
2.
3. TESTA ZIŅOJUMS
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
B.11.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
B.12.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
1.5.2. a)
2.
3. TESTA ZIŅOJUMS
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
B.13./14.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
2.
3. TESTA ZIŅOJUMS
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
B.15.
1.
1.6. Sagatavošanas darbi
Metaboliskā aktivācija
Izmantotie rauga celmi
Barotnes
Negatīvā un pozitīvā kontrole
Koncentrācija ekspozīcijas laikā
Inkubācijas apstākļi
Spontāno mutāciju biežums
Replikātu skaits
3.
B.16.
1.
1.6. Sagatavošanas darbi
Metaboliskā aktivācija
Izmantotie rauga celmi
Barotnes
Negatīvā un pozitīvā kontrole
Koncentrācija ekspozīcijas laikā
Inkubācijas apstākļi
Spontānās mitotiskās rekombinācijas biežums
Replikātu skaits
3.
B.17.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. TESTA ZIŅOJUMS
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
B.18.
1.
1.6. Sagatavošanas darbi
Šūnu kultūru skaits
Negatīvā un pozitīvā kontrole
Koncentrācija ekspozīcijas laikā
Šūnas
Metaboliskā aktivācija
Šūnu kultūru sagatavošana
Kultivēto šūnu apstrāde ar pārbaudāmo vielu Primārie žurku hepatocīti
Noteikšana ar autoradiogrāfijas metodi
Noteikšana ar ŠSM
2.
3.
B.19.
1.
1.6.
1.6.2. Testa apstākļi Šūnu kultūru skaits
1.6.3. Testa norise Šūnu kultūru sagatavošana
3.
B.20.
1.
1.6. Sagatavošanas darbi
Ģenētiskais materiāls
Pārbaudāmā viela
Dzīvnieku skaits
Ievadīšanas veids
Negatīvā un pozitīvā kontrole
Koncentrācija ekspozīcijas laikā
3.
B.21.
1.
1.6. Sagatavošanas darbi
Šūnas
Barotne
Pārbaudāmā viela
Metaboliskā aktivācija
Negatīvā un pozitīvā kontrole
Koncentrācija ekspozīcijas laikā
3.
B.22.
1.
1.6. Sagatavošanas darbi
Ievadīšanas veids
Izmēģinājumu dzīvnieki
Dzīvnieku skaits un dzimums
Negatīvā un pozitīvā kontrole
Izmantotās devas
Iedarbīguma robežas noteikšana

EIROPAS KOPIENU KOMISIJA,

ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu,

ņemot vērā Eiropas Parlamenta un Padomes 2006. gada 18. decembra Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH) un ar kuru izveido Eiropas Ķimikāliju aģentūru, groza Direktīvu 1999/45/EK un atceļ Padomes Regulu (EEK) Nr. 793/93 un Komisijas Regulu (EK) Nr. 1488/94, kā arī Padomes Direktīvu 76/769/EEK un Komisijas Direktīvu 91/155/EEK, Direktīvu 93/67/EEK, Direktīvu 93/105/EK un Direktīvu 2000/21/EK, un jo īpaši tās 13. panta 3. punktu,

tā kā:

(1) Saskaņā ar Regulu (EK) Nr. 1907/2006 informācijas iegūšanai par vielu raksturīgajām īpašībām izmantojamās testēšanas metodes jāpieņem Kopienas līmenī.

(2) Vielu un preparātu fizikāli ķīmisko īpašību, toksicitātes un ekotoksicitātes noteikšanas metodes norādītas V pielikumā Padomes 1967. gada 27. jūnija Direktīvā 67/548/EEK par to normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu, kas attiecas uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķēšanu. No 2008. gada 1. jūnija Direktīvas 67/548/EEK V pielikums tiek svītrots ar Eiropas Parlamenta un Padomes Direktīvu 2006/121/EK.

(3) Testēšanas metodes, kas norādītas Direktīvas 67/548/EEK V pielikumā, jāiekļauj šajā regulā.

(4) Ar šo regulu neizslēdz citu testēšanas metožu izmantošanu, ja vien to izmantošana notiek saskaņā ar Regulas (EK) Nr. 1907/2006 13. panta 3. punktu.

(5) Izstrādājot testēšanas metodes, pilnībā jāņem vērā iespējas izmēģinājumus ar dzīvniekiem aizstāt, samazināt to apjomu vai tos pilnveidot, jo īpaši gadījumos, kad kļūst pieejamas attiecīgas validētas metodes, ar kurām izmēģinājumus ar dzīvniekiem var aizstāt, samazināt to apjomu vai tos pilnveidot.

(6) Šīs regulas noteikumi ir saskaņā ar atzinumu, ko sniegusi komiteja, kura izveidota saskaņā ar Regulas (EK) Nr. 1907/2006 133. pantu,

IR PIEŅĒMUSI ŠO REGULU.

1. pants Regulas (EK) Nr. 1907/2006 piemērošanai izmantojamās testēšanas metodes tiek noteiktas šīs regulas pielikumā.

2. pants Lai uzlabotu veidu, kādā veic izmēģinājumus ar mugurkaulniekiem, tos aizstātu vai samazinātu šādu izmēģinājumu apjomu, šajā regulā noteiktās testēšanas metodes Komisija pēc vajadzības pārskata.

3. pants Visas atsauces uz Direktīvas 67/548/EEK V pielikumu uzskata par atsaucēm uz šo regulu.

4. pants Šī regula stājas spēkā nākamajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Savienības Oficiālajā Vēstnesī.

To piemēro no 2008. gada 1. jūnija. Briselē, 2008. gada 30. maijā Komisijas vārdā – Komisijas loceklis Stavros Dimas

ANNEX

PIELIKUMS A DAĻA: FIZIKĀLI ĶĪMISKO ĪPAŠĪBU NOTEIKŠANAS METODES

A.1. KUŠANAS/SASALŠANAS TEMPERATŪRA

A.1.

1. METODE Aprakstīto metožu lielākās daļas pamatā ir ESAO Testēšanas norādījumi (1). Pamatprincipi aprakstīti izmantotās literatūras avotos (2) un (3).

1.

1.1. IEVADS Šeit aprakstītās metodes un ierīces izmantojamas vielu kušanas temperatūras noteikšanai neatkarīgi no to tīrības pakāpes. Izvēloties noteikšanas metodi, jāņem vērā attiecīgās vielas īpašības. Rezultātā ierobežojošais faktors ir tas, vai viela ir viegli saberžama pulvera veidā, saberžama ar grūtībām vai arī tā pulvera veidā nav saberžama. Dažām vielām labāk noteikt sasalšanas vai sacietēšanas temperatūru, tāpēc šajā metodē iekļauti noteikumi par to noteikšanas kārtību. Ja vielas īpašību dēļ nav ērti nosakāms neviens no iepriekšminētajiem rādītājiem, to vietā var noteikt sastingšanas temperatūru.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Kušanas temperatūra ir tāda temperatūra, kurā pie atmosfēras spiediena notiek fāžu pāreja no cieta agregātstāvokļa šķidrā, un šī temperatūra pilnīgi sakrīt ar sasalšanas temperatūru. Tā kā daudzām vielām fāžu pāreja notiek zināmā temperatūras intervālā, to parasti norāda kušanas temperatūras intervāla veidā. Mērvienību pārvēršana (K uz oC) t = T – 273,15 t temperatūra pēc Celsija skalas, Celsija grādi ( oC) T termodinamiskā temperatūra, kelvini (K)

1.3. STANDARTVIELAS Pārbaudot jaunu vielu, ne visos gadījumos jāizmanto standartvielas. Tās galvenokārt izmanto metodes izpildījuma periodiskām pārbaudēm un dažādu metožu salīdzināšanai. Dažas kalibrēšanas vielas ir uzskaitītas izmantotās literatūras sarakstā (4).

1.4. METODES PRINCIPS Nosaka fāžu pārejas temperatūru (temperatūras intervālu) pārejai no cieta agregātstāvokļa šķidrā. Praktiski nosaka parauga kušanas/sasalšanas sākumu un beigas, paraugu sildot/dzesējot. Aprakstītas piecas dažādas metodes, konkrēti – kapilāra metode, metodes, kurās izmanto sildvirsmas, sasalšanas temperatūras noteikšanas metodes, termiskās analīzes metodes un sastingšanas temperatūras noteikšana (naftas eļļām). Dažkārt kušanas temperatūras vietā var būt ērtāk noteikt sasalšanas temperatūru.

1.4.

1.4.1. Kapilāra metode

1.4.1.

1.4.1.1. Kušanas temperatūras noteikšanas ierīces ar šķidruma vannu Nelielu sīki sasmalcinātas vielas daudzumu ievieto kapilārā un sablīvē. Kapilāru kopā ar termometru silda un sildīšanas ātrumu noregulē tā, lai kušanas laikā temperatūra paaugstinātos ne vairāk par 1 K/min. Nosaka temperatūru kušanas sākumā un beigās.

1.4.1.2. Kušanas temperatūras noteikšanas ierīces ar metāla bloku Tāpat kā aprakstīts 1.4.1.1. punktā, izņemot to, ka kapilārs un termometrs ievietoti apsildāmā metāla blokā, un tos var novērot pa blokā izveidotām atverēm.

1.4.1.3. Fotometriska noteikšana Paraugu, kas atrodas kapilārā, automātiski karsē metāla cilindrā. Caur cilindrā izurbtu caurumu gaismas kūli novirza uz vielu un tālāk uz precīzi kalibrētu fotoelementu. Kušanas laikā vielas lielākoties kļūst optiski caurspīdīgas. Uz fotoelementu krītošās gaismas intensitāte palielinās, un tas dod signālu ciparu indikatoram nolasīt sildīšanas kamerā ievietota platīna pretestības termometra rādījumu. Šī metode neder spilgti krāsainām vielām.

1.4.2. Sildvirsmas

1.4.2.

1.4.2.1. Koflera sildvirsma Koflera sildvirsma sastāv no diviem metāla stieņiem ar atšķirīgu siltuma vadītspēju, kurus karsē ar elektrības palīdzību, turklāt pats stienis ir izgatavots tā, lai temperatūras gradients visā tā garumā būtu gandrīz lineārs. Sildvirsmas temperatūru var mainīt no 283 līdz 573 K, un tā aprīkota ar īpašu temperatūras nolasīšanas ierīci, kam ir kustīga bultiņa un skala, kura pielāgota tieši šai sildvirsmai. Kušanas temperatūras noteikšanai vielu plānā slānī uzklāj tieši sildvirsmai. Pēc dažām sekundēm starp šķidro un cieto fāzi parādās skaidri redzama dalījuma līnija. Temperatūru pie dalījuma līnijas nolasa, novietojot bultiņu tieši pie līnijas.

1.4.2.2. Kausējamais mikroskops Kušanas temperatūras noteikšanai, kurai vajadzīgs ļoti mazs vielas daudzums, izmanto vairāku veidu mikroskopus ar apsildāmu galdiņu. Parasti sildāmā galdiņa temperatūras mērīšanai izmanto jutīgu termopāri, tomēr dažkārt izmanto arī dzīvsudraba termometrus. Parasti kušanas temperatūras noteikšanas aparātam ar mikroskopu un sildāmu galdiņu ir sildīšanas kamera, kurā ir metāla plate, uz kuras novieto priekšmetstikliņu ar paraugu. Metāla plates vidū ir atvere, caur kuru krīt gaisma no mikroskopa apgaismošanas spoguļa. Noteikšanas laikā kameru noslēdz ar stikla plāksnīti, lai izspiestu gaisu no parauga zonas. Parauga sildīšanas ātrumu regulē ar reostatu. Augstas precizitātes instrumentos, veicot mērījumus optiski anizotropām vielām, var izmantot polarizētu gaismu.

1.4.2.3. Meniska metode Šo metodi izmanto poliamīdiem. Vizuāli nosaka temperatūru, kurā pārvietojas silikoneļļas menisks, kas atrodas starp sildvirsmu un segstiklu, ar kuru pārklāts poliamīda paraugs.

1.4.3. Sasalšanas temperatūras noteikšanas metode Paraugu ievieto speciālā mēģenē, ko ievieto sasalšanas temperatūras noteikšanas aparātā. Dzesēšanas laikā paraugu pastāvīgi uzmanīgi maisa un ar piemērotiem intervāliem nolasa temperatūru. Tiklīdz temperatūra vairāku nolasījumu laikā nemainās, šo temperatūru (kurai veic termometra kļūdas korekciju) reģistrē kā sasalšanas temperatūru. Jāizvairās paraugu pārdzesēt, pastāvīgi uzturot līdzsvaru starp cieto un šķidro fāzi.

1.4.4. Termiskā analīze

1.4.4.

1.4.4.1. Diferenciālā termiskā analīze (DTA) Pēc šīs metodes reģistrē nosakāmās vielas un standartvielas temperatūras starpību atkarībā no temperatūras, uz vielu un standartvielu iedarbojoties ar vienu un to pašu regulējamas temperatūras programmu. Kad paraugam notiek fāžu pāreja ar entalpijas izmaiņām, par tām liecina endoterma (kušana) vai eksoterma (sasalšana) nobīde no reģistrētās temperatūras bāzes līnijas.

1.4.4.2. Diferenciālā skenēšanas kalorimetrija (DSK) Pēc šīs metodes reģistrē nosakāmās vielas un standartvielas patērētās enerģijas starpību atkarībā no temperatūras, uz vielu un standartvielu iedarbojoties ar vienu un to pašu regulējamas temperatūras programmu. Šī ir enerģija, kas vajadzīga, lai iestātos temperatūras nulles starpība starp nosakāmo vielu un standartvielu. Kad paraugam notiek fāžu pāreja ar entalpijas izmaiņām, par tām liecina endoterma (kušana) vai eksoterma (sasalšana) nobīde no reģistrētās siltumenerģija plūsmas bāzes līnijas.

1.4.5. Sastingšanas temperatūra Šī metode izstrādāta naftas eļļu analīzēm un ir piemērota eļļveida vielām ar zemu kušanas temperatūru. Paraugu vispirms sasilda un pēc tam ar noteiktu ātrumu atdzesē, ik pēc 3 K pārbaudot plūstamību. Par sastingšanas temperatūru uzskata un reģistrē zemāko temperatūru, kurā novērojama vielas kustība.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Dati par kušanas temperatūras/kušanas temperatūras intervāla noteikšanas metožu lietojamību un precizitāti apkopoti turpmāk tabulā:

1.5. TABULA: METOŽU LIETOJAMĪBA A. B. C. D.

Kapilāra metodes Mērīšanas metode Vielas, kuras var saberzt pulverī Vielas, kuras nevar viegli saberzt pulverī Temperatūras diapazons Novērtētā precizitāte Standartmetode Kušanas temperatūras noteikšanas ierīces ar šķidruma vannu jā tikai daļa 273–573 K ±0,3 K JIS K 0064 Kušanas temperatūras noteikšanas ierīces ar metāla bloku jā tikai daļa 293 līdz > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Fotometriska noteikšana jā der dažādām vielām, izmantojot papildierīces 253–573 K ±0,5 K Sildvirsmas metodes un sasalšanas temperatūras noteikšana Mērīšanas metode Vielas, kuras var saberzt pulverī Vielas, kuras nevar viegli saberzt pulverī Temperatūras diapazons Novērtētā precizitāte Standartmetode Koflera sildvirsma jā nē 283 līdz > 573 K ± 1 K ANSI/ASTM D 3451-76 Kausējamais mikroskops jā tikai daļa 273 līdz > 573 K ±0,5 K DIN 53736 Meniska metode nē der tikai poliamīdiem 293 līdz > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Sasalšanas temperatūras noteikšanas metodes jā jā 223 līdz 573 K ±0,5 K e.g. BS 4695 Termiskā analīze Mērīšanas metode Vielas, kuras var saberzt pulverī Vielas, kuras nevar viegli saberzt pulverī Temperatūras diapazons Novērtētā precizitāte Standartmetode Diferenciālā termiskā analīze jā jā 173 līdz 1273 K līdz 600 K ±0,5 K līdz 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Diferenciālā skenēšanas kalorimetrija jā jā 173 līdz 1273 K līdz 600 K ±0,5 K līdz 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Sastingšanas temperatūra Mērīšanas metode Vielas, kuras var saberzt pulverī Vielas, kuras nevar viegli saberzt pulverī Temperatūras diapazons Novērtētā precizitāte Standartmetode Sastingšanas temperatūra naftas eļļām un eļļveida vielām naftas eļļām un eļļveida vielām 223 līdz 323 K ±3,0 K ASTM D 97-66

1.6. METOŽU APRAKSTI Gandrīz visu šeit minēto metožu apraksts ir iekļauts starptautiskos un atsevišķu valstu standartos (skatīt 1. papildinājumu).

1.6.

1.6.1. Kapilāra metodes Lēni paaugstinot temperatūru, smalka pulvera veidā sasmalcinātām vielām parasti novērojamas 1. attēlā parādītās kušanas stadijas.

1.6.1.

1. attēls A stadija B stadija C stadija D stadija E stadija A stadija (Kušanas sākums) sīki pilieni vienmērīgi izvietojas uz kapilāra iekšējās sienas B stadija kušanas sarukuma dēļ starp paraugu un kapilāra sieniņu izveidojas sprauga C stadija sarukušais paraugs sāk slīdēt uz leju un pārvēršas šķidrumā D stadija uz virsmas izveidojas menisks, tomēr ievērojams parauga daudzums nav izkusis E stadija (Kušanas beigas) nav cietu neizkusušu daļiņu Nosakot kušanas temperatūru, reģistrē kušanas sākumā un beigās novēroto temperatūru.

1.6.1.1. Kušanas temperatūras noteikšanas ierīces ar šķidruma vannu Standartizēts kušanas temperatūras noteikšanas aparāts parādīts 2. attēlā (JIS K 0064); visi izmēri norādīti milimetros.

1.6.1.1.

2. attēls A: Mērījumu trauks B: Aizbāznis C: Ventilācijas atvere D: Termometrs E: Papildu termometrs F: Vannas šķidrums G: Stikla kapilārs, 80 līdz 100 mm garš, 1,0 ± 0,2 mm iekšējais diametrs, 0,2 līdz 0,3 mm sieniņu biezums H: Sānu caurule

Vannas šķidrums

Izvēlas piemērotu šķidrumu. Šķidrumu izvēlas atkarībā no nosakāmās kušanas temperatūras, piemēram, vazelīneļļu kušanas temperatūrām līdz 473 K, silikoneļļu temperatūrām līdz 573 K. Kušanas temperatūru noteikšanai, kuras ir lielākas par 523 K, var izmantot maisījumu, kas sastāv no trijām masas daļām sērskābes un divām daļām kālija sulfāta. Izmantojot šāda veida maisījumus, jāievēro visi vajadzīgie piesardzības pasākumi.

Termometrs

Jāizmanto tikai tādi termometri, kuri atbilst šādos vai tiem ekvivalentos standartos noteiktajām prasībām: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Procedūra

Sausu vielu smalki saberž piestā un ievieto kapilārā, kuram viens gals ir aizkausēts, pēc sablīvēšanas tai jāaizņem aptuveni 3 mm no kapilāra garuma. Lai iegūtu vienveidīgu parauga blīvumu, kapilāru iemet apmēram 700 mm garā stikla caurulē, kas stāvus novietota uz pulksteņstikla. Piepildīto kapilāru ievieto vannā tā, lai termometra dzīvsudraba rezervuāra vidusdaļa pieskartos kapilāram vietā, kurā atrodas paraugs. Parasti kapilāru aparātā ievieto tad, kad vannas šķidruma temperatūra ir par apmēram 10 K zemāka par nosakāmo kušanas temperatūru. Šķidruma temperatūru vannā paaugstina ar ātrumu apmēram 3 K/min. Šķidrums vannā jāmaisa. Kad temperatūra ir aptuveni 10 K zem kušanas temperatūras, tā nedrīkst pieaugt ātrāk par 1 K/min.

Aprēķins

Kušanas temperatūru aprēķina šādi: T = TD+0,00016 (TD – TE) n kur: T koriģētā kušanas temperatūra (K), TD D termometra temperatūras rādījums (K), TE E termometra temperatūras rādījums (K), n to D termometra dzīvsudraba stabiņa iedaļu skaits, kuras atrodas virs šķidruma.

1.6.1.2. Kušanas temperatūras noteikšanas ierīces ar metāla bloku

1.6.1.2. Aprīkojums

Iekārtā ietilpst:

cilindrisks metāla bloks ar dobu augšdaļu, kas veido kameru (skatīt 3. attēlu),

metāla aizbāznis ar divām vai vairākām atverēm, caur kurām metāla blokā ievieto kapilārus,

metāla bloka sildīšanas sistēma, piemēram, blokā ievietota elektriskā pretestība,

reostats elektriskās jaudas regulēšanai, ja izmanto elektrisko sildīšanu,

četri termiski izturīga stikla logi kameras pretējās sānu sienās taisnā leņķī vienam pret otru. Pie viena no šiem logiem ir okulārs kapilāra novērošanai. Pārējos trīs logus izmanto iekšējās telpas apgaismošanai ar lampām,

vienā galā noslēgts kapilārs no karstumizturīga stikla (skatīt 1.6.1.1. punktu).

Termometrs

Skatīt 1.6.1.1. punktā minētos standartus. Var izmantot arī termoelektriskās mērierīces ar līdzīgu precizitāti.

3. attēls Termometrs Kapilārs Metāla aizbāznis Okulārs Lampa Elektriska pretestība Metāla sildīšanas bloks

1.6.1.3. Fotometriska noteikšana Aprīkojums un procedūra Iekārta sastāv no metāla kameras ar automātisku apsildes sistēmu. Trīs kapilārus aizpilda, kā tas norādīts 1.6.1.1. punktā, un ievieto kamerā. Aparatūras kalibrēšanai iespējams izmantot lineāru temperatūras paaugstināšanos ar vairākiem ātrumiem, un vajadzīgo temperatūras lineāro paaugstināšanos elektriski regulē ar iepriekš izraudzītu ātrumu. Reģistrācijas ierīces rāda faktisko krāsns temperatūru un kapilāros esošo vielu temperatūru.

1.6.2. Sildvirsmas

1.6.2.

1.6.2.1. Koflera sildvirsma Skatīt papildinājumu.

1.6.2.2. Kausējamais mikroskops Skatīt papildinājumu.

1.6.2.3. Meniska metode (poliamīdiem) Skatīt papildinājumu. Sildīšanas ātrumam kušanas temperatūras diapazonā ap kušanas temperatūru jābūt mazākam par 1 K/min.

1.6.3. Sasalšanas temperatūras noteikšanas metodes Skatīt papildinājumu.

1.6.4. Termiskā analīze

1.6.4.

1.6.4.1. Diferenciālā termiskā analīze Skatīt papildinājumu.

1.6.4.2. Diferenciālā skenēšanas kalorimetrija Skatīt papildinājumu.

1.6.5. Sastingšanas temperatūras noteikšana Skatīt papildinājumu.

2. IEGŪTIE DATI Atsevišķos gadījumos ir jāveic termometra kalibrēšana.

3. PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija: Par kušanas temperatūru uzdod divu tādu mērījumu rezultātu vidējo vērtību, kuri ir novērtētās precizitātes (skatīt tabulā) robežās. Ja temperatūras starpība kušanas sākumā un beigās ir metodes precizitātes robežās, par kušanas temperatūru uzdod temperatūru, kas noteikta kušanas beigu stadijā; pārējos gadījumos uzdod abas temperatūras, kas noteiktas kušanas sākuma un beigu stadijās. Ja vielas sadalās vai sublimējas, nesasniedzot kušanas temperatūru, uzdod temperatūru, kurā novēro minētās parādības. Jāiekļauj visa informācija un piezīmes, kas saistītas ar rezultātu interpretāciju, jo īpaši attiecībā uz vielas piemaisījumiem un tās agregātstāvokli.

lietotā metode,

vielas precīzs apraksts (identifikācija un tīrība), iepriekšēja attīrīšana, ja tiek veikta,

precizitātes novērtējums.

4.(1)(2)(3)(4)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, Vol. II, p. 803–834. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, Vol. 48, p. 505–515.

A.2. VIRŠANAS TEMPERATŪRA

A.2.

1. METODE Aprakstīto metožu lielākās daļas pamatā ir ESAO Testēšanas norādījumi (1). Pamatprincipi aprakstīti izmantotās literatūras avotos (2) un (3).

1.

1.1. IEVADS Šeit aprakstītās metodes un iekārtas var izmantot šķidrām vielām un vielām ar zemu kušanas temperatūru, ja ar tām par viršanas temperatūru zemākā temperatūrā nenotiek ķīmiskas reakcijas (piemēram: autooksidēšanās, pārgrupēšanās, sadalīšanās u. c.). Šīs metodes piemērotas gan attīrītiem, gan neattīrītiem šķidrumiem. Priekšroka dodama metodēm, kurās izmanto fotoelektrisko detektēšanu un termisko analīzi, jo pēc šīm metodēm var noteikt gan kušanas temperatūru, gan viršanas temperatūru. Turklāt mērījumus var veikt automātiskā režīmā. Dinamiskajai metodei ir priekšrocības, kas saistās ar iespēju to izmantot arī tvaika spiediena noteikšanai, un nav jāveic viršanas temperatūras korekcija pēc atmosfēras spiediena normālos apstākļos (101,325 kPa), jo normālo atmosfēras spiedienu var noregulēt mērīšanas laikā ar manostatu. Piezīmes Piemaisījumu ietekme uz viršanas temperatūras noteikšanas rezultātu galvenokārt ir atkarīga no piemaisījumu rakstura. Ja paraugā ir gaistoši piemaisījumi, kuri var ietekmēt viršanas temperatūras noteikšanas rezultātus, vielu pirms tam var attīrīt.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Parasti viršanas temperatūru definē kā temperatūru, kurā šķidruma tvaika spiediens ir 101,325 kPa. Ja viršanas temperatūru nenosaka normālā atmosfēras spiedienā, temperatūras izmaiņu aprakstīšanai atkarībā no spiediena var izmantot Klauziusa-Klapeirona vienādojumu: log p = Δ Hv2,3 RT+const. kur: P vielas tvaika spiediens, paskālos, ΔHv vielas iztvaikošanas siltums, J mol -l , R universālā molārā gāzu konstante = 8,314 J mol-l K-l, T termodinamiskā temperatūra, K. Viršanas temperatūru uzdod kopā ar atmosfēras spiedienu tās noteikšanas laikā. Pārvēršana Spiediens (mērvienības: kPa) 100 kPa 1 bar = 0,1 MPa (bar var joprojām izmantot, lai gan tas nebūtu ieteicams). 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (mērvienības mm Hg un Torr izmantot nav pieļaujams). 1 atm standarta atmosfēra = 101325 Pa (mērvienību atm izmantot nav pieļaujams). Temperatūra (mērvienības: K) t = T – 273,15 t temperatūra pēc Celsija skalas, Celsija grādi ( oC) T termodinamiskā temperatūra, kelvini (K)

1.3. STANDARTVIELAS Pārbaudot jaunu vielu, ne visos gadījumos jāizmanto standartvielas. Tās galvenokārt izmanto metodes izpildījuma periodiskām pārbaudēm un dažādu metožu salīdzināšanai. Dažas kalibrēšanas vielas ir minētas papildinājumā iekļauto metožu aprakstā.

1.4. METODES PRINCIPS Piecas viršanas temperatūras (viršanas temperatūras intervāla) noteikšanas metodes pamatojas uz viršanas temperatūras mērīšanu, bet divām citām izmanto termisko analīzi.

1.4.

1.4.1. Noteikšana ar ebulioskopu Ebulioskopus sākotnēji izveidoja molekulmasas noteikšanai pēc temperatūras paaugstināšanās, taču tie ir piemēroti arī precīzas viršanas temperatūras noteikšanai. Ļoti vienkārša iekārta ir aprakstīta standartā ASTM D 1120-72 (skatīt papildinājumu). Šajā iekārtā līdzsvara apstākļos šķidrumu silda līdz viršanai atmosfēras spiedienā.

1.4.2. Dinamiskā metode Pēc šīs metodes vārīšanās laikā ar piemērotu termometru mēra tvaika kondensācijas temperatūru attecē. Pēc šīs metodes var mainīt spiedienu.

1.4.3. Viršanas temperatūras noteikšana ar destilācijas metodi Ar šo metodi veic tvaika kondensācijas temperatūras mērījumus šķidruma destilācijas laikā un nosaka destilāta daudzumu.

1.4.4. Sivolobova metode Paraugu silda mēģenē, kas iegremdēta šķidrumā sildīšanas vannā. Tajā pašā mēģenē ar paraugu iegremdē aizkausētu kapilāru ar gaisa burbuli apakšējā galā.

1.4.5. Fotometriska noteikšana Saskaņā ar Sivolobova principu automātiski veic fotoelektriskus mērījumus gaisa burbuļu celšanās brīdī.

1.4.6. Diferenciālā termiskā analīze Pēc šīs metodes reģistrē nosakāmās vielas un standartvielas temperatūras starpību atkarībā no temperatūras, uz vielu un standartvielu iedarbojoties ar vienu un to pašu regulējamas temperatūras programmu. Kad paraugam notiek fāžu pāreja ar entalpijas izmaiņām, par tām liecina endoterma (viršana) nobīde no reģistrētās temperatūras bāzes līnijas.

1.4.7. Diferenciālā skenēšanas kalorimetrija Pēc šīs metodes reģistrē nosakāmās vielas un standartvielas patērētās enerģijas starpību atkarībā no temperatūras, uz vielu un standartvielu iedarbojoties ar vienu un to pašu regulējamas temperatūras programmu. Šī ir enerģija, kas vajadzīga, lai iestātos temperatūras nulles starpība starp nosakāmo vielu un standartvielu. Kad paraugam notiek fāžu pāreja ar entalpijas izmaiņām, par tām liecina endoterma (viršana) nobīde no reģistrētās siltumenerģijas plūsmas bāzes līnijas.

1.5. 1. tabula Metožu salīdzinājums

KVALITĀTES KRITĒRIJI Dati par viršanas temperatūras/viršanas temperatūras intervāla noteikšanas metožu lietojamību un precizitāti apkopoti 1. tabulā. Mērīšanas metode Novērtētā precizitāte Standarti Ebulioskopija ±1,4 K (līdz 373 K) ±2,5 K (līdz 600 K) ASTM D 1120-72 Dinamiskā metode ±0,5 K (līdz 600 K) Destilācijas metode (viršanas diapazons) ±0,5 K (līdz 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Sivolobova metode ± 2 K (līdz 600 K) Fotometriska noteikšana ±0,3 K (līdz 373 K) Diferenciālā termiskā analīze ±0,5 K (līdz 600 K) ±2,0 K (līdz 1273 K) ASTM E 537-76 Diferenciālā skenēšanas kalorimetrija ±0,5 K (līdz 600 K) ±2,0 K (līdz 1273 K) ASTM E 537-76

1.6. METOŽU APRAKSTI Dažu šeit minēto metožu apraksts ir iekļauts starptautiskos un atsevišķu valstu standartos (skatīt papildinājumu).

1.6.

1.6.1. Ebulioskopija Skatīt papildinājumu.

1.6.2. Dinamiskā metode Skatīt tvaika spiediena noteikšanas A.4. metodi. Reģistrē viršanas temperatūru, kas novērota 101,325 kPa spiedienā.

1.6.3. Destilācijas metode (viršanas temperatūras intervāls) Skatīt papildinājumu.

1.6.4. Sivolobova metode Apmēram 5 mm diametra parauga mēģenē ievietotu paraugu silda aparātā līdz viršanas temperatūrai (1. attēls). Standartizēts kušanas temperatūras noteikšanas aparāts parādīts 1. attēlā. (JIS K 0064) (aparāts izgatavots no stikla, visi izmēri milimetros). Caurulē ar paraugu ievieto kapilāru (viršanas kapilāru), kas aizkausēts apmēram 1 cm attālumā no apakšējā gala. Pārbaudāmās vielas līmenim jābūt tādam, lai kapilāra aizkausētais posms atrastos zem šķidruma virsmas. Cauruli ar paraugu un viršanas kapilāru piestiprina pie termometra ar tievu gumiju vai šim nolūkam izmanto sānu stiprinājumu (skatīt 2. attēlu). 2. attēls Sivolobova metodes princips 3. attēls Modificētās metodes princips Vannas šķidrumu izvēlas atkarībā no viršanas temperatūras. Temperatūrām līdz 573 K var izmantot silikoneļļu. Šķidro parafīnu var izmantot tikai temperatūrām līdz 473 K. Sākumā šķidrums vannā jāsilda ar ātrumu 3 K/min. Šķidrums vannā ir jāmaisa. Apmēram 10 K zemāk par sagaidāmo viršanas temperatūru sildīšanas intensitāti samazina tā, lai temperatūra paaugstinātos ne vairāk par 1 K/min. Tuvojoties viršanas temperatūrai, viršanas kapilārā sākas strauja burbuļu veidošanās. Viršanas temperatūra ir temperatūra, kurā sākot dzesēšanu burbuļu veidošanās apstājas un kapilārā sākas strauja šķidruma līmeņa celšanās. Attiecīgais termometra rādījums atbilst vielas viršanas temperatūrai. Pēc modificētās metodes (3. attēls) viršanas temperatūru nosaka, izmantojot kušanas temperatūras noteikšanai paredzēto kapilāru. To izstiepj, izveidojot apmēram 2 cm garu smailu galu (a), un tajā iesūc nelielu daudzumu parauga. Kapilāra vaļējo smailo galu aizkausē, atstājot pašā galā mazu gaisa burbuli. Sildot kušanas temperatūras noteikšanas aparātā (b), gaisa burbulis izplešas. Viršanas temperatūra atbilst temperatūrai, kurā viela sasniedz vannas šķidruma virsmu (c).

1.6.4.

1. attēls A: Mērīšanas trauks B: Aizbāznis C: Ventilācijas atvere D: Termometrs E: Papildu termometrs F: Vannas šķidrums G: Parauga mēģene ar ārējo diametru līdz 5 mm; tajā ievietots kapilārs – apmēram 100 mm garš, ar iekšējo diametru apmēram 1 mm un sieniņu biezumu no 0,2 līdz 0,3 mm H: Sānu caurule

1.6.5. Fotometriska noteikšana Kapilāru ar paraugu karsē, tam atrodoties sildāmā metāla blokā. Caur attiecīgām atverēm blokā gaismas kūli caur vielu novada tālāk uz precīzi kalibrētu fotoelementu. Paaugstinoties parauga temperatūrai, no viršanas kapilāra izdalās atsevišķi gaisa burbuļi. Sasniedzot viršanas temperatūru, ievērojami palielinās izdalījušos burbulīšu daudzums. Tas ietekmē gaismas intensitāti, ko reģistrē fotoelements, un mērierīce, kura nolasa platīna pretestības termometra temperatūru blokā, saņem stopsignālu. Šī metode ir īpaši noderīga, jo tā ļauj veikt mērījumus, kad temperatūra ir zemāka par istabas temperatūru, līdz 253,15 K (–20 oC), nemainot pašu iekārtu. Aparāts tikai jāievieto vannā ar dzesēšanas šķidrumu.

1.6.6. Termiskā analīze

1.6.6.

1.6.6.1. Diferenciālā termiskā analīze Skatīt papildinājumu.

1.6.6.2. Diferenciālā skenēšanas kalorimetrija Skatīt papildinājumu.

2. tabula TEMPERATŪRAS KOREKCIJAS KOEFICIENTI fT

DATI Ja novirzes no normālā atmosfēras spiediena ir nelielas (ne vairāk par ± 5 kPa), viršanas temperatūru standartizē līdz Tn pēc Sidneja-Janga vienādojuma: Tn = T + (fT × Δp) kur: Δp (101,325 – p) [ievērot zīmi], P gaisa spiediena mērījums (kPa), fT viršanas temperatūras izmaiņas atkarībā no temperatūras K/kPa, T izmērītā viršanas temperatūra (K), Tn viršanas temperatūra (K), kas koriģēta, ņemot vērā normālu atmosfēras spiedienu. Temperatūras korekcijas koeficienti f, j un aproksimēšanas vienādojumi daudzām vielām norādīti iepriekšminētajos starptautiskajos un valstu standartos. Piemēram, standartā DIN 53171 aplūkotās metodes aprakstā minēti šādi korekcijas koeficienti krāsu šķīdinātājiem: Temperatūra T (K) Korekcijas koeficients fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47

3. PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija: Par viršanas temperatūru uzdod divu tādu mērījumu rezultātu vidējo vērtību, kuri ir novērtētās precizitātes (skatīt 1. tabulu) robežās. Norāda spiedienu kPa, kādā mērīta viršanas temperatūra un noteikta tās vidējā vērtība. Spiedienam jābūt iespējami tuvu normālajam atmosfēras spiedienam. Jāiekļauj jebkura informācija un piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju, jo īpaši par vielas piemaisījumiem un tās agregātstāvokli.

lietotā metode,

vielas precīzs apraksts (identifikācija un tīrība), iepriekšēja attīrīšana, ja tiek veikta,

precizitātes novērtējums.

4.(1)(2)(3) IZMANTOTĀ LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, Vol. II. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter VIII.

A.3. RELATĪVAIS BLĪVUMS

A.3.

1. METODE Aplūkotās metodes balstās uz ESAO Testēšanas norādījumiem (1). Pamatprincipi aprakstīti literatūras avotā (2).

1.

1.1. IEVADS Aprakstītās metodes relatīvā blīvuma noteikšanai ir derīgas cietām vielām un šķidrumiem neatkarīgi no tīrības pakāpes. Izmantojamās metodes ir uzskaitītas 1. tabulā.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Relatīvais blīvums vielām un šķidrumiem ir vielas tilpuma masas pie 20 oC un tāda paša tilpuma ūdens masas pie 4 oC attiecība. Relatīvais blīvums ir bezdimensiju lielums. Vielas blīvums P ir tās masas m un tilpuma v attiecība. Blīvuma p mērvienība SI sistēmā ir kg/m3.

1.3. STANDARTVIELAS (1) (3) Pārbaudot jaunu vielu, ne visos gadījumos jāizmanto standartvielas. Tās galvenokārt izmanto metodes izpildījuma periodiskām pārbaudēm un dažādu metožu salīdzināšanai.

1.4. METOŽU PRINCIPS Izmanto četru veidu metodes.

1.4.

1.4.1. Flotācijas metodes

1.4.1.

1.4.1.1. Areometrs (šķidrām vielām) Pietiekami precīzi un ātri blīvumu var noteikt ar iegremdējamiem areometriem, pēc kuriem šķidruma blīvumu nolasa pēc areometra graduētās daļas skalas iegrimes.

1.4.1.2. Hidrostatiskie svari (šķidrumiem un cietām vielām) Blīvuma noteikšanai var izmantot nosakāmās vielas masas starpību, kas noteikta gaisā un piemērotā šķidrumā (piemēram, ūdenī). Cietām vielām blīvuma mērījumu rezultāti attiecināmi tikai uz vienu konkrētu paraugu. Šķidrumu blīvuma noteikšanai zināma tilpuma (v) ķermeni vispirms nosver gaisā un tad šķidrumā.

1.4.1.3. Iegremdētā ķermeņa metode (šķidrumiem) (4) Ar šo metodi šķidruma blīvumu nosaka pēc svērumu starpības pirms un pēc zināma tilpuma ķermeņa iegremdēšanas šķidrumā, kura blīvums jānosaka.

1.4.2. Piknometriskās metodes Cietām vielām un šķidrumiem var izmantot dažādas formas un zināma tilpuma piknometrus. Blīvumu aprēķina pēc pilna un tukša piknometra masas starpības, ņemot vērā tā tilpumu.

1.4.3. Piknometrs salīdzināšanai ar gaisu (cietām vielām) Jebkuras formas cietvielas blīvumu istabas temperatūrā var noteikt ar gāzu salīdzināšanas piknometru. Vielas tilpumu mēra gaisā vai inertā gāzē, to ievietojot kalibrētā cilindrā ar mainīgu tilpumu. Lai aprēķinātu blīvumu, pēc tilpuma mērījumiem paraugs vienreiz jānosver.

1.4.4. Oscilāciju densimetrs (5) (6) (7) Šķidrumu blīvumu var mērīt ar oscilāciju densimetru. U-veida caurules mehānisko oscilatoru iesvārsta ar oscilatora rezonanses frekvenci, kas ir atkarīga no tā masas. Tajā ievadot paraugu, mainās oscilatora rezonanses frekvence. Šo ierīci kalibrē, izmantojot divus šķidrumus ar zināmu blīvumu. Ieteicams izvēlēties tādas vielas, kuru blīvums aptver visu mērījumu diapazonu.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Tabulā ir apkopotas dažādas metodes, ko izmanto relatīvā blīvuma noteikšanai, norādot to izmantošanas iespējas.

1.6. METOŽU APRAKSTI Piemēru veidā papildinājumā minētajos standartos atrodama papildu tehniskā informācija. Noteikšana jāveic 20 oC temperatūrā, izdarot vismaz divus mērījumus.

2. IEGŪTIE DATI Skatīt standartus.

3. Tabula 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Metožu lietojamība

PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija: Relatīvais blīvums, D204, jāuzdod saskaņā ar 1.2. punktu, norādot vielas agregātstāvokli. Jāiekļauj visa informācija un piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju, jo īpaši par vielas piemaisījumiem un tās agregātstāvokli. Mērīšanas metode Blīvums Maksimāli iespējamā dinamiskā viskozitāte Standartmetode cietvielas šķidrumi Areometrs jā 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Hidrostatiskie svari jā ISO 1183 (A) jā 5 Pa s ISO 901 un 758 Iegremdētā ķermeņa metode jā 20 Pa s DIN 53217 Piknometrs ISO 3507 jā ISO 1183(B), NF T 20-053 jā 500 Pa s ISO 758 Piknometrs salīdzināšanai ar gaisu jā DIN 55990 Teil 3, DIN 53243 Oscilāciju densimetrs jā 5 Pa s

lietotā metode,

vielas precīzs apraksts (identifikācija un tīrība), iepriekšēja attīrīšana, ja tiek veikta.

3. Tabula 1.4.1.1.1.4.1.2. Metožu lietojamība a)

cietām vielām

šķidrumiem

3. Tabula 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Metožu lietojamība a)

cietām vielām

šķidrumiem

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ. , New York, 1959, Vol. I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, Vol. 48, p. 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, Vol. II, 427–430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, Vol. 19, p. 297–302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen -Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, Vol. 37, p. 717–726. Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, Vol. 9, p. 253-255.

A.4. TVAIKA SPIEDIENS

A.4.

1. METODE Aprakstīto metožu lielākās daļas pamatā ir ESAO Testēšanas norādījumi (1). Pamatprincipi aprakstīti literatūras avotos (2) un (3).

1.

1.1. IEVADS Pirms noteikt tvaika spiedienu, ir lietderīgi iegūt sākotnēju informāciju par vielas struktūru, kušanas temperatūru un vārīšanās temperatūru. Nav nevienas mērīšanas metodes, kura būtu izmantojama visā tvaika spiediena diapazonā. Tāpēc tvaika spiediena mērīšanai robežās no < 10-4 līdz 105 Pa tiek ieteiktas vairākas metodes. Tvaika spiedienu parasti ietekmē piemaisījumi, ietekmes lielums galvenokārt ir atkarīgs no piemaisījumu rakstura. Ja paraugā ir gaistoši piemaisījumi, kuri var ietekmēt tvaika spiediena noteikšanas rezultātus, vielu pirms tam var attīrīt. Var būt vajadzīgs norādīt tvaika spiedienu tehniskiem produktiem. Dažās šeit aprakstītajās metodēs izmanto aparatūru ar metāla detaļām; tas jāņem vērā, nosakot korozīvu vielu tvaika spiedienu.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Vielas tvaika spiedienu definē kā piesātināta tvaika spiedienu virs cietas vielas vai šķidruma. Iestājoties termodinamiskajam līdzsvaram, tīras vielas tvaika spiediens ir atkarīgs tikai no temperatūras. Jālieto SI sistēmas mērvienība paskāls (Pa). Šajā tabulā apkopotas agrāk izmantotās mērvienības un to pārvēršanas koeficienti: 1 tors (≡ 1 mm Hg) = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfēra = 1,013 × 105 Pa 1 bārs = 105 Pa SI sistēmā temperatūras mērvienība ir kelvins (K). Gāzu universālā konstante R ir 8,314 J mol-l K-1 Temperatūras sakarību ar tvaika spiedienu izsaka ar Klauziusa-Klapeirona vienādojumu: log p = Δ Hv2,3 RT+const. kur: p vielas tvaika spiediens paskālos, ΔHv vielas iztvaikošanas siltums Jmol-l, R gāzu universālā konstante Jmol-l K-1, T termodinamiskā temperatūra, K.

1.4. NOTEIKŠANAS METOŽU PRINCIPS Tvaika spiediena noteikšanai var izmantot septiņas metodes, kas ir lietojamas dažādos tvaika spiediena intervālos. Visas šīs metodes paredz tvaika spiediena noteikšanu noteiktā temperatūras diapazonā. Ierobežotā temperatūras diapazonā tīras vielas tvaika spiediena logaritms ir apgriezti proporcionāls temperatūrai.

1.4.

1.4.1. Dinamiskā metode Ar dinamisko metodi veic viršanas temperatūras mērījumus noteiktā, iepriekš izvēlētā spiedienā. Ieteicamais diapazons: 103 līdz 105 Pa. Šo metodi ieteicams izmantot viršanas temperatūras noteikšanai, un šim nolūkam to var izmantot viršanas temperatūrai līdz 600 K.

1.4.2. Statiskā metode Ar šo metodi var noteikt tvaika spiedienu, kas rodas kādā noteiktā temperatūrā, slēgtā sistēmā iestājoties termodinamiskajam līdzsvaram. Šī metode ir izmantojama vienkomponenta un vairākkomponentu cietvielu un šķidru vielu sistēmās. Ieteicamais diapazons: 10 līdz 105 Pa. Strādājot prasmīgi, metodi var izmantot arī intervālā no 1 līdz 10 Pa.

1.4.3. Izoteniskops Šī standartmetode arī pieder pie statiskām metodēm, bet to parasti nevar izmantot daudzkomponentu sistēmās. Sīkāka informācija ir atrodama standartā ASTM D-2879-86. Ieteicamais diapazons: no 100 līdz 105 Pa.

1.4.4. Efūzijas metode: tvaika spiediena svari Nosaka vielas daudzumu, kas vienā laika vienībā izplūst no kivetes caur noteikta lieluma atveri pazeminātā spiedienā apstākļos, kad atpakaļ kivetē ieplūst niecīgs vielas daudzums (piemēram, ar jutīgiem svariem mērot tvaika plūsmas radīto impulsu vai mērot masas zudumu). Ieteicamais diapazons: 10-3 līdz 1 Pa.

1.4.5. Efūzijas metode: pēc masas zuduma vai ar tvaika uztveršanu Metode pamatojas uz testējamās vielas masas noteikšanu, kas tvaiku veidā laika vienībā izplūst no Knudsena šūnas (4) ultravakuumā caur mikroatveri. Izplūdušā tvaika masu var noteikt pēc šūnas masas zuduma vai tvaiku kondensējot pazeminātā temperatūrā un iztvaikojušās vielas daudzumu nosakot ar gāzu hromatogrāfiju. Tvaika spiedienu aprēķina, izmantojot Herca-Knudsena sakarību. Ieteicamais diapazons: 10-3 līdz 1 Pa.

1.4.6. Gāzes piesātinājuma metode Inertas nesējgāzes plūsmu laiž pāri vielai tā, lai tā kļūtu piesātināta ar šīs vielas tvaiku. Nosaka noteikta nesējgāzes daudzuma pārnestās vielas masu, to uztverot piemērotā uztvērējā vai izmantojot iekšēju analītisku metodi. Tad to izmanto tvaika spiediena aprēķināšanai attiecīgajā temperatūrā. Ieteicamais diapazons: 10-4 līdz 1 Pa. Strādājot prasmīgi, metodi var izmantot arī intervālā no 1 līdz 10 Pa.

1.4.7. Rotācijas metode Rotora kamerā mērelements ir neliela tērauda lodīte, kas griežas lielā ātrumā un ir pacelta magnētiskajā laukā. Gāzes spiedienu atskaita no tērauda lodītes palēninājuma, kas ir atkarīgs no spiediena. Ieteicamais diapazons: 10-4 līdz 0,5 Pa.

1.5. Tabula 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Kvalitātes kritēriji

KVALITĀTES KRITĒRIJI Salīdzinātas dažādas tvaika noteikšanas metodes pēc to pielietojamības, atkārtojamības, reproducējamības, noteikšanas intervāla un norādīti attiecīgie esošie standarti. Šie dati apkopoti tabulā. Noteikšanas metode Vielas Novērtētā atkārtojamība Novērtētā reproducējamība Ieteicamais diapazons Standartmetode cietvielas šķidrumi Dinamiskā metode ar zemu kušanas temperatūru jā līdz 25 % līdz 25 % 103 Pa līdz 2 × 103 Pa — 1 līdz 5 % 1 līdz 5 % 2 × 103 Pa līdz 105 Pa — Statiskā metode jā jā 5 līdz 10 % 5 līdz 10 % 10 Pa līdz 105 Pa NFT 20-048 (5) Izoteniskops jā jā 5 līdz 10 % 5 līdz 10 % 102 Pa līdz 105 Pa ASTM-D 2879-86 Efūzijas metode: tvaika spiediena svari jā jā 5 līdz 20 % līdz 50 % 10-3 Pa līdz 1 Pa NFT 20-047(6) Efūzijas metode: masas zudums jā jā 10 līdz 30 % — 10-3 Pa līdz 1 Pa — Gāzes piesātinājuma metode jā jā 10 līdz 30 % līdz 50 % 10-4 Pa līdz 1 Pa — Rotācijas metode jā jā 10 līdz 20 % — 10-4 Pa līdz 0,5 Pa —

1.6. METOŽU APRAKSTI

1.6.

1.6.1. Dinamiskā metode

1.6.1.

1.6.1.1. Aprīkojums Mēraparāts parasti sastāv no viršanas trauka ar tam pievienotu dzesinātāju no stikla vai metāla (1. attēls), temperatūras mērīšanas iekārtas un iekārtas spiediena regulēšanai un mērīšanai. Attēlā redzamā parauga mēraparāts izgatavots no karstumizturīga stikla un sastāv no piecām daļām: Platā caurule, kurai daļēji ir dubultsienas, sastāv no pieslīpēta savienojuma, dzesinātāja, dzesēšanas kolbas un ieejas. Stikla cilindrs ar Kotrela sūkni samontēts ar caurules viršanas sekciju, un tam ir raupja virsma no sasmalcināta stikla grūdienu novēršanai vārīšanās laikā. Temperatūras mērīšanai izmanto piemērotu temperatūras sensoru (piemēram, pretestības termometru, termopāra patronu), kas caur piemērotu ieeju iegremdēts aparātā līdz mērīšanas punktam (Nr. 5, 1. attēls). Veic vajadzīgos pieslēgumus spiediena regulēšanas un mērīšanas iekārtai. Apaļkolba, ko izmanto spiediena izlīdzināšanai, savienota ar mērierīci caur kapilāru. Viršanas trauku silda ar sildelementu (piemēram, patronas veidā), kas ievietots stikla aparātā no apakšas. Sildīšanai vajadzīgo strāvu iestata un regulē, izmantojot termopāri. Ar vakuumsūkni rada vajadzīgo retinājumu no 102 Pa līdz aptuveni 105 Pa. Vēdināšanai un spiediena regulēšanai vajadzīgā gaisa vai slāpekļa padevei izmanto piemērotu ventili (intervālā no apmēram 102 līdz apmēram 105 Pa). Spiedienu mēra ar manometru.

1.6.1.2. Mērījumu procedūra Tvaika spiedienu mēra, nosakot viršanas temperatūru pie dažāda spiediena, apmēram no 103 līdz 105 Pa. Temperatūras stabilizēšanās nemainīgā spiedienā liecina, ka viršanas temperatūra ir sasniegta. Šī mērīšanas metode nav izmantojama putojošu vielu tvaika spiediena noteikšanai. Vielu pārnes tīrā un sausā parauga traukā. Problēmas var rasties ar cietvielām, kas nav pulvera veidā, taču dažkārt tās var atrisināt, sildot dzesēšanas apvalku. Kad šis trauks ir piepildīts, savienojuma vietu aparātam hermetizē un vielu atgaiso. Tad iestata zemāko vajadzīgo spiedienu un ieslēdz sildīšanu. Vienlaikus reģistrēšanas iekārtai pievieno temperatūras sensoru. Līdzsvars ir iestājies, kad nemainīgā spiedienā tiek reģistrēta konstanta viršanas temperatūra. Īpaši jāraugās, lai vārīšanās būtu vienmērīga un bez grūdieniem. Turklāt dzesinātājā tvaikam jākondensējas pilnībā. Nosakot tvaika spiedienu cietvielām ar zemu kušanas temperatūru, jāraugās, lai netiktu nobloķēts dzesinātājs. Pēc līdzsvara punkta reģistrēšanas iestata augstāku spiedienu. Šo procedūru turpina, līdz sasniedz 105 Pa spiedienu (kopumā veic apmēram 5–10 mērījumus). Drošības labad līdzsvara punktu noteikšana jāatkārto, spiedienu pakāpeniski samazinot.

1.6.2. Statiskā metode

1.6.2.

1.6.2.1. Aprīkojums Aparāts sastāv no parauga konteinera, sildīšanas un dzesēšanas sistēmas parauga temperatūras regulēšanai un temperatūras mērīšanas ierīces. Aparātā ietilpst arī ierīces spiediena iestatīšanai un mērīšanai. Pamatprincips parādīts 2.a un 2.b attēlā. Parauga kamera (2.a attēls) no vienas puses savienota ar piemērotu dziļam vakuumam paredzētu ventili. No otras puses pievienota U-veida caurule, kurā ir piemērots manometriskais šķidrums. Viens U-veida caurules gals nozarojas uz vakuumsūkni, slāpekļa balonu vai ventilācijas vārstu un manometru. U-veida caurules vietā var izmantot manometru (2.b attēls). Parauga temperatūras regulēšanai parauga trauku kopā ar ventili un U-veida cauruli vai manometru ievieto vannā, kurā ar precizitāti ±0,2 K uztur nemainīgu temperatūru. Temperatūru mēra uz parauga trauka ārējās sienas vai tā iekšienē. Gaisa evakuēšanai no aparāta izmanto vakuumsūkni ar dzesējamu uztvērēju pirms tā. Pēc 2.a metodes vielas tvaika spiedienu mēra netieši, izmantojot nulles indikāciju. Tādējādi tiek ņemts vērā, ka, temperatūrai ievērojami mainoties, mainās arī šķidruma blīvums U-veida caurulē. Atkarībā no spiediena un nosakāmās vielas ķīmiskajām īpašībām U-veida caurulē par nulles indikatoriem var izmantot šādus šķidrumus: šķidros silikonus, ftalātus. Viela, kuras tvaika spiedienu nosaka, nedrīkst kaut nedaudz šķīst U-veida caurulē iepildītajā šķidrumā vai ar to reaģēt. Spiediena intervālā no normāla atmosfēras spiediena līdz 102 Pa manometram var izmantot dzīvsudrabu, savukārt silikoni un ftalāti ir piemēroti izmantošanai spiedienā zem 102 Pa līdz pat 10 Pa. Manometrus ar apsildāmu membrānu var izmantot pat par 10-1 Pa zemāka spiediena mērīšanai. Ir arī citu veidu manometri, kurus var izmantot par 102 Pa zemāka spiediena mērīšanai.

1.6.2.2. Mērījumu procedūra Pirms mērīšanas visiem 2. attēlā redzamo aparātu komponentiem jābūt rūpīgi izmazgātiem un izžāvētiem. Pēc 2.a metodes U-veida caurulē iepilda izraudzīto šķidrumu, kuram pirms nolasījumu veikšanas jābūt degazētam paaugstinātā temperatūrā. Testējamo vielu ievieto aparātā, kuru pēc tam noslēdz, un degazēšanai pazemina temperatūru. Temperatūrai jābūt pietiekami zemai, lai nodrošinātu, ka tiek izsūknēts gaiss, taču attiecībā uz daudzkomponentu sistēmām jāraugās, lai tādējādi neizmainītos maisījuma sastāvs. Ja vajadzīgs, līdzsvaru var panākt ātrāk, maisot sastāvu. Paraugu var atdzesēt līdz ļoti zemai temperatūrai, piemēram, ar šķidro slāpekli (raugoties, lai nenotiktu gaisa vai sūkņa šķidruma kondensācija) vai ar etanola un sausā ledus maisījumu. Mērījumiem zemās temperatūrās izmanto vannu ar regulējamu temperatūru, kas pieslēgta ultrakriostatam. Uz parauga trauku atver ventili un gaisa evakuēšanai uz dažām minūtēm ieslēdz vakuumu. Tad ventili aizver un parauga temperatūru pazemina līdz zemākajam vēlamajam līmenim. Ja vajadzīgs, degazēšanu veic vairākas reizes. Paraugu sildot, paaugstinās tvaika spiediens. Tas izmaina šķidruma līdzsvaru U-veida caurulē. Lai to kompensētu, aparātā caur ventili laiž slāpekli vai gaisu, līdz spiediena indikatora šķidrums atkal iestājas nulles līmenī. Tam vajadzīgo spiedienu var nolasīt istabas temperatūrā ar augstas precizitātes manometru. Šis spiediens atbilst vielas tvaika spiedienam attiecīgi šajā temperatūrā. Līdzīga ir arī 2.b metode, tikai tvaika spiediens tiek nolasīts tieši. Temperatūras un tvaika spiediena sakarību nosaka ar pietiekami nelieliem intervāliem (mērījumus veic pavisam 5 līdz 10 punktos) līdz vajadzīgajam maksimumam. Pārbaudei jāatkārto nolasījumi, temperatūru pazeminot. Ja atkārtotos nolasījumos iegūtās vērtības nav uz līknes, kas iegūta, temperatūru paaugstinot, tam var būt kāds no šādiem cēloņiem:

1.6.2.2.

1. Paraugā (piemēram, ļoti viskozos materiālos) joprojām ir gaiss vai vielas ar zemu viršanas temperatūru, kas izdalās sildīšanas laikā, un var tikt aizvadītas ar sūknēšanu pēc papildu atdzesēšanas līdz zemai temperatūrai.

2. Dzesēšanas temperatūra nav pietiekami zema. Šādā gadījumā dzesēšanai izmanto šķidro slāpekli Abos iepriekšminētajos gadījumos mērījumi ir jāatkārto.

3. Pētītajā temperatūru intervālā ar vielu notiek ķīmiskās reakcijas (piemēram, sadalīšanās, polimerizācija).

1.6.3. Izoteniskops Metodes pilnīgs apraksts dots literatūras avotā (7). Mērīšanas ierīces darbības princips parādīts 3. attēlā. Līdzīgi kā 16.2. punktā aprakstītā metode, izoteniskops izmantojams gan cietvielu, gan šķidrumu tvaika spiediena noteikšanai. Nosakot šķidras vielas tvaika spiedienu, to pašu vielu iepilda arī palīgmanometrā. Izoteniskopā iepilda tādu šķidruma daudzumu, kas ir pietiekams manometra rezervuāra un manometra daļas īsākās caurules piepildīšanai. Izoteniskopu pieslēdz vakuumam gaisa izsūknēšanai un tad piepilda ar slāpekli. Skābekļa pilnīgai aizvadīšanai gaisa izsūknēšanu un sistēmas skalošanu veic divreiz. Piepildīto izoteniskopu novieto horizontāli tā, lai paraugs izveidotu plānu slāni parauga rezervuārā un manometra daļā (U-veida caurules daļā). Spiedienu sistēmā pazemina līdz 133 Pa un uzmanīgi silda tā, lai tas sāktu nedaudz vārīties (izšķīdušo un saistīto gāzu aizvadīšanai). Pēc tam izoteniskopu novieto tā, lai paraugs satecētu atpakaļ un šķidrums pilnīgi piepildītu rezervuāru un manometra īsāko cauruli. Šādu spiedienu uztur degazēšanai; parauga rezervuāra izvilkto galu silda uz nelielas uguns, līdz parauga izdalītais tvaiks pietiekami izplešas, izspiežot daļu parauga no rezervuāra augšējās daļas un manometra caurules izoteniskopa manometra daļā, izveidojot ar tvaiku piepildītu telpu, kurā nav slāpekļa. TEXT Nosakot cietvielu tvaika spiedienu, atkarībā no spiediena un temperatūras intervāliem izmanto 1.6.2.1. punktā uzskaitītos šķidrumus manometriem. Degazētu manometra šķidrumu iepilda izoteniskopa paresninājumā un garākajā caurulē. Tad rezervuārā ievieto cietvielu, kurai jānosaka tvaika spiediens, un rezervuāru degazē paaugstinātā temperatūrā. Pēc tam izoteniskopu pieliec tā, lai manometra šķidrums ieplūstu U-veida caurulē. Tvaika spiediena mērījumus, mainot temperatūru, veic, kā norādīts 1.6.2. punktā.

1.6.4. Efūzijas metode: tvaika spiediena svari

1.6.4.

1.6.4.1. Aprīkojums Literatūrā (1) aprakstīti dažādi aparatūras varianti. Šeit aprakstītais aparāts ilustrē izmantojamo vispārīgo principu (4. attēls). 4. attēlā parādītas galvenās sastāvdaļas aparātam, kas sastāv no dziļam vakuumam pieslēdzama nerūsējoša tērauda vai stikla konteinera, vakuumiekārtas un iekārtas tās radītā retinājuma mērīšanai un iebūvētiem komponentiem tvaika spiediena noteikšanai ar spiediena svariem. Aparātā ir šādi iebūvētie komponenti:

iztvaicēšanas krāsns ar uzmalu un rotācijas ieeju. Iztvaicēšanas krāsns ir cilindrisks trauks, kas izgatavots, piemēram, no vara vai ķīmiski izturīga sakausējuma ar labu siltuma vadītspēju. Var izmantot arī stikla trauku ar vara sienu. Krāsns diametrs ir 3 līdz 5 cm, un tās augstums ir 2 līdz 5 cm. Tai ir no vienas līdz trijām dažāda izmēra atverēm tvaika plūsmai. Krāsni silda uz tai apakšā novietotas sildvirsmas vai ar tai pa ārpusi apvītu sildelementu. Lai siltumenenerģija neizkliedētos pamatplatē, sildītāju pamatplatei piestiprina ar metālu, kuram ir zema siltumvadītspēja (alpaka vai hromniķeļa tērauds), piemēram, alpaka cauruli piestiprina pie rotācijas ieejas, ja izmanto krāsni ar vairākām atverēm. Šādai konstrukcijai ir priekšrocības, ievietojot vara stieni. Tas ļauj dzesēt no ārpuses, izmantojot dzesēšanas vannu,

ja vara krāsns vākam ir trīs dažāda diametra atveres 90o leņķī vienai pret otru, var aptvert visa mērījumu diapazona dažādus intervālus (atveru diametrs aptuveni no 0,30 līdz 4,50 mm). Lielākās atveres izmanto zemākajiem tvaika spiedieniem un otrādi. Krāsni pagriežot, tvaika plūsmā (krāsns atvere – vairogs – svaru kauss) var iestatīt vajadzīgo atveri vai starpstāvokli, un molekulu plūsma caur krāsns atveri tiek izlaista vai novirzīta uz svaru kausu. Vielas temperatūras mērīšanai piemērotā punktā ievieto termopāri vai pretestības termometru,

virs vairoga ir ļoti jutīgu mikrosvaru svaru kauss (skatīt turpmāk). Svaru kausa diametrs ir apmēram 30 mm. Piemērotākais materiāls ir alumīnijs ar zelta pārklājumu,

svaru kausam apkārt ir cilindriska dzesēšanas kamera no misiņa vai vara. Atkarībā no svaru veida tajā ir atveres svaru plecam un vairoga atvere molekulu plūsmai, un tai jānodrošina tvaika kondensācija svaru kausā. Siltuma vadīšanu uz ārieni nodrošina, piemēram, ar vara stieni, kas savienots ar dzesēšanas kameru. Stieni izvada cauri pamatplatei un no tās termiski izolē, piemēram, ar hromniķeļa tērauda cauruli. Stieni iegremdē zem pamatplates novietotā Djuāra traukā ar šķidru slāpekli vai šķidro slāpekli laiž caur stieni. Dzesēšanas kamerā tādējādi tiek uzturēta aptuveni –120 oC temperatūra. Svaru kausa dzesēšana notiek tikai ar starošanu, un tā ir pietiekama nosakāmajam spiedienu intervālam (dzesē apmēram 1 stundu pirms mērījuma sākšanas),

svarus novieto virs dzesēšanas kameras. Piemērotākie svari ir, piemēram, ļoti jutīgi divplecu elektroniskie mikrosvari (8) vai ļoti jutīgi svari ar kustīgu spoli (skatīt ESAO 104. testēšanas norādījumus, 12.5.81. izdevums),

pamatplatē iekļauti arī elektriskie savienojumi termopāriem (vai pretestības termometriem) un sildelementiem,

vakuumu traukā rada, izmantojot parasto vakuumsūkni vai vakuumsūkni dziļa retinājuma iegūšanai (vajadzīgais vakuums ir apmēram 1 līdz 2 × 10-3 Pa, ko iegūst pēc aptuveni divu stundu sūknēšanas). Spiedienu regulē ar piemērotu jonizācijas manometru.

1.6.4.2. Mērījumu procedūra Trauku piepilda ar nosakāmo vielu un noslēdz vāku. Krāsnij pievieno vairogu un dzesēšanas kameru. Aparātu aizver un ieslēdz vakuumsūkņus. Galīgajam spiedienam, pirms sākt mērījumus, ir jābūt apmēram 10-4 Pa. Dzesēšanas kameras dzesēšanu sāk pie 10-2 Pa. Pēc vajadzīgā vakuuma sasniegšanas sāk kalibrēšanu zemākajā vajadzīgajā temperatūrā. Uz vāka iestata vajadzīgo atvērumu, tvaika plūsma iziet caur vairogu tieši virs atveres un atsitas pret svaru kausu, kas tiek dzesēts. Svaru kausam jābūt pietiekami lielam, lai nodrošinātu, ka uz tā nonāk visa caur vairogu virzītā tvaika plūsma. Tvaika plūsmas kinētiskā enerģija rada spēku, kas iedarbojas uz svaru kausu, un molekulas kondensējas uz tā aukstās virsmas. Kinētiskā enerģija un vienlaicīgi notiekošā kondensācija dod signālu uz reģistrēšanas ierīci. Signālus izvērtējot, iegūst divu veidu informāciju: p = G 2 π RT×103M kur: G iztvaikošanas ātrums (kg s-l m-2), M molmasa (g mol-l), T temperatūra (K), R gāzu universālā konstante (Jmol-l K-1), p tvaika spiediens (Pa). Pēc vajadzīgā vakuuma sasniegšanas mērījumu sēriju sāk no zemākās vajadzīgās temperatūras. Tālākos mērījumus veic, ikreiz nedaudz paaugstinot temperatūru, kamēr sasniedz maksimālo izraudzīto temperatūras līmeni. Tad paraugu atkal atdzesē un vajadzības gadījumā reģistrē vēl vienu tvaika spiediena līkni. Ja otrās mērījumu sērijas rezultāti nesakrīt ar pirmās sērijas rezultātiem, tad ir iespējams, ka temperatūrā, kurā veic mērījumus, notiek vielas sadalīšanās.

1.6.4.2.

1. Šeit aprakstītajā aparātā tvaika spiedienu nosaka tieši pēc kinētiskās enerģijas iedarbības uz svaru kausu (nav jāzina molekulmasa (2)). Izvērtējot mērījumu rezultātus, jāņem vērā ģeometriskie izmēri, piemēram, krāsns atveres lielums un molekulu plūsmas leņķis.

2. Vienlaicīgi var noteikt kondensāta masu, pēc kuras aprēķina iztvaikošanas ātrumu. Tvaika spiedienu var aprēķināt arī pēc Herca vienādojuma (2), zinot iztvaikošanas ātrumu un molekulmasu.

1.6.5. Efūzijas metode – pēc masas zuduma

1.6.5.

1.6.5.1. Aprīkojums Efūzijas iekārta sastāv no šādām galvenajām daļām: Piemērā 5. attēlā parādīta alumīnija vakuumtvertne ar elektrisko sildīšanu, kurā ir četras nerūsējošā tērauda efūzijas šūnas. Nerūsējošā tērauda folijā, kuras biezums ir 0,3 mm, ir efūzijas atvere 0,2 līdz 1,0 mm diametrā, un tā ir piestiprināta efūzijas šūnai ar uzskrūvējamu vāku.

termostatējama tvertne, no kuras var izsūknēt gaisu un kurā atrodas efūzijas šūnas,

vakuumsūknis dziļa vakuuma iegūšanai (piemēram, difūzijas sūknis vai turbomolekulārais sūknis ar vakuummetru),

uztvērējs, kurā dzesēšanai izmanto šķidru slāpekli vai sauso ledu.

1.6.5.2. Mērījumu procedūra Standartvielu un vielu, kuras tvaika spiedienu nosaka, iepilda katrā efūzijas šūnā, metāla diafragmu, kurā ir atvere, nostiprina ar uzskrūvējamu vāku, un katru šūnu nosver ar precizitāti līdz 0,1 mg. Šūnu ievieto termostatējamā iekārtā, no kuras izsūknē gaisu līdz retinājumam, kas ir mazāks nekā viena desmitdaļa no sagaidāmā tvaika spiediena. Noteiktos laika intervālos, kas ir 5 līdz 30 stundas, iekārtā ielaiž gaisu un efūzijas šūnas masas zudumu nosaka ar atkārtotu svēršanu. Lai rezultātus neietekmētu gaistoši piemaisījumi, šūnu ar noteiktiem laika intervāliem sver atkārtoti, lai pārbaudītu, vai iztvaikošanas ātrums ir nemainīgs divu pēdējo šādu intervālu laikā. Tvaika spiedienu p efūzijas šūnā aprēķina šādi: p = mKAt2 π R TM kur: P tvaika spiediens (Pa), m vielas masa, kas izplūst no šūnas laikā t (kg), t laiks (s), A atveres laukums (m2), K korekcijas koeficients, R gāzu universālā konstante (Jmol-l K-1), T temperatūra (K), M molmasa (kg mol-1). Korekcijas koeficienta K vērtība ir atkarīga no cilindriskās atveres garuma attiecības pret rādiusu: Attiecība 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Iepriekšējo vienādojumu var pārveidot šādi: p = E mtTM kur E = 1KA2πR: efūzijas šūnas konstante. Efūzijas šūnas konstanti E var noteikt ar standartvielām (2,9), to aprēķinot pēc šāda vienādojuma: E = p(r)tmM(r)T kur: p(r) standartvielas tvaika spiediens (Pa), M(r) standartvielas molmasa (kg × mol-l).

1.6.6. Gāzes piesātinājuma metode

1.6.6.

1.6.6.1. Aprīkojums Parastajā iekārtā, kuru izmanto noteikšanai pēc šīs metodes, ietilpst vairākas sastāvdaļas, kas parādītas 6.a attēlā un turpmāk aprakstītas (1).

1.6.6.1. Inerta gāze

Nesējgāze nedrīkst ķīmiski reaģēt ar vielu. Parasti šim nolūkam pietiekami piemērots ir slāpeklis, taču dažkārt var būt jāizmanto citas gāzes (10). Izmantojamajai gāzei jābūt sausai (skatīt 6.a attēla 4. pozīciju: relatīvā mitruma sensors).

Gāzes plūsmas regulēšana un kontrole

Jābūt pienācīgai regulēšanas un kontroles sistēmai, kas nodrošina gāzes konstantu noteikta lieluma plūsmu caur piesātināšanas kolonnu.

Tvaika uztvērēji

Tvaika uztvērēju izvēle ir atkarīga no konkrētā parauga īpašībām un no izraudzītās analīzes metodes. Tvaiki jāuztver kvantitatīvi un tādā veidā, lai tos varētu turpmāk analizēt. Daļai vielu izmantošanai tvaika uztvērējos ir piemēroti tādi šķidrumi kā heksāns vai etilēnglikols. Daļai citu var izmantot cietus absorbentus. Alternatīva tvaika uztveršanai un tai sekojošai analīzei ir iekšēju analītisko metožu, piemēram, hromatogrāfijas, izmantošana ar konkrētu nesējgāzes daudzumu pārnestā vielas daudzuma kvantitatīvai noteikšanai. Var mērīt arī parauga svara zudumu.

Siltummainis

Ja mērījumus izdara dažādās temperatūrās, iekārta var būt jāpapildina ar siltummaini.

Piesātināšanas kolonna

Vielu, kuras tvaika spiedienu nosaka, no šķīduma izgulsnē uz piemērota inerta nesēja. Pārklāto nesēju iepilda piesātināšanas kolonnā, kuras izmēri un plūsmas ātrums nodrošina pilnīgu nesējgāzes piesātinājumu. Piesātināšanas kolonnai jābūt termostatējamai. Veicot mērījumus par istabas temperatūru augstākā temperatūrā, lai novērstu vielas kondensāciju, iekārtas daļa starp piesātināšanas kolonnu un uztvērējiem jāsilda. Lai samazinātu vielas pārnesi difūzijas veidā, aiz piesātināšanas kolonnas var ievietot kapilāru (6.b attēls).

1.6.6.2. Mērījumu procedūra

1.6.6.2. Piesātināšanas kolonnas sagatavošana

Pārbaudāmās vielas šķīdumu ļoti gaistošā šķīdinātājā pievieno piemērotam daudzumam nesēja. Pārbaudāmā viela jāpievieno pietiekamā daudzumā, lai nodrošinātu piesātinājumu noteikšanas laikā. Šķīdinātāju pilnībā iztvaicē gaisā vai rotācijas ietvaicētājā un piesātināšanas kolonnā iepilda rūpīgi samaisīto materiālu. Paraugu termostatē un iekārtai cauri laiž sausu slāpekli.

Mērījumu veikšana

Uztvērējus vai iekšējā analizatora detektoru savieno ar kolonnas efluenta līniju un reģistrē laiku. Plūsmas ātrumu pārbauda pašā sākumā un pēc tam periodiski izmēģinājuma gaitā ar burbuļu skaitītāju (vai nepārtraukti ar caurteces mērītāju). Jāveic spiediena mērījumi piesātināšanas kolonnas izejā. Tas ir izdarāms: Laiku, kas vajadzīgs, lai iegūtu nepieciešamo pārbaudāmās vielas daudzumu tās noteikšanai ar dažādām metodēm, nosaka orientējošos izmēģinājumos vai pēc aptuveniem aprēķiniem. Alternatīva vielas uztveršanai turpmākām analīzēm ir iekšēja analizatora izmantošana (piemēram, hromatogrāfija). Pirms aprēķināt tvaika spiedienu noteiktā temperatūrā, jāveic orientējoši izmēģinājumi, lai noteiktu maksimālo plūsmas ātrumu, kas nodrošina nesējgāzes pilnīgu piesātinājumu ar vielas tvaiku. Tas tiek nodrošināts, ja nesējgāzi laiž cauri piesātināšanas kolonnai tik lēni, lai pie vēl lēnākas plūsmas iegūtā aprēķinātā tvaika spiediena vērtība vairs nepalielinās. Konkrētas analītiskās metodes (piemēram, gāzu hromatogrāfijas vai gravimetrijas) izvēle ir atkarīga no pārbaudāmās vielas īpatnībām). Nosaka vielas daudzumu, ko pārnes noteikta tilpuma nesējgāze.

a)

starp piesātināšanas kolonnu un uztvērējiem pieslēdzot manometru (tas var nebūt piemērotākais risinājums, jo tādējādi palielinās brīvais tilpums un adsorbējošā virsma); vai

b)

atsevišķā eksperimentā nosakot spiediena kritumus izmantotajā uztveršanas sistēmā atkarībā no plūsmas ātruma (tas var nebūt piemērotākais risinājums uztvērējos ar šķidrumu).

1.6.6.3. Tvaika spiediena aprēķināšana Tvaika spiedienu aprēķina pēc tvaika blīvuma (W/V), izmantojot vienādojumu: p = WV × RTM kur: P tvaika spiediens (Pa), W iztvaikojušās vielas masa (g), V piesātinātās gāzes tilpums (m3), R gāzu universālā konstante (Jmol-l K-1), T temperatūra (K), M molmasa (g mol-l). Tilpuma mērījumu rezultāti jākoriģē, ņemot vērā spiediena un temperatūras starpību caurplūdes mērītājā un termostatējamajā piesātināšanas kolonnā. Ja caurplūdes mērītājs uzstādīts aiz tvaika uztvērēja, jāveic attiecīgā korekcija, ņemot vērā sastāvdaļu iztvaikošanu tvaika uztvērējā (1).

1.6.7. Rotācijas metode (8) (11) (13)

1.6.7.

1.6.7.1. Aprīkojums Noteikšanu pēc rotācijas metodes var veikt, izmantojot rotora viskozimetru, kā parādīts 8. attēlā. Iekārtas shematisks attēls parādīts 7. attēlā. Mēraparatūra sastāv no mērierīces ar rotoru, kura novietota termostatējamā kamerā (kurā temperatūru regulē 0,1 oC robežās). Parauga konteineru ievieto termostatējamā kamerā (kurā temperatūru regulē 0,01 oC robežās), un, lai novērstu kondensāciju, visām pārējām iekārtas daļām jāuztur augstāka temperatūra. Sistēmai caur dziļa vakuuma ventiļiem pievieno vakuumsūkņa ierīci dziļa retinājuma nodrošināšanai. Rotācijas mērierīce sastāv no tērauda lodītes (4 līdz 5 mm diametra), kas ievietota caurulē. Lodīte peld piekarē magnētiskajā laukā, galvenokārt izmantojot pastāvīgos magnētus un vadības indukcijas spoles. Lodīte tiek iegriezta ar rotējošu magnētisko lauku, ko rada indukcijas spoles. Pacēlējas spoles un mērīšana vienmēr rada lodītes nelielu laterālu magnetizēšanos, kas ļauj izmērīt tās rotācijas ātrumu.

1.6.7.2 Mērījumu procedūra Kad lodīte ir sasniegusi vajadzīgo rotācijas ātrumu v(o) (parasti apmēram 400 apgr./s), tai pārtrauc pievadīt enerģiju un gāzes berzes dēļ sākas rotācijas palēnināšanās. Rotācijas ātruma samazināšanos mēra atkarībā no laika. Magnētiskās piekares radītā berze ir neliela salīdzinājumā ar gāzes radīto berzi, un gāzes spiediens ir: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) kur: c— gāzes molekulu vidējais ātrums, R lodītes rādiuss, ρ lodītes masas blīvums, σ tangencialās kinētiskās enerģijas pārneses koeficients (ε = 1 ideāli sfēriskai lodītes virsmai), t laiks, v(t) rotācijas ātrums pēc laika t, v(o) rotācijas sākuma ātrums. Vienādojumu var pārveidot šādi: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 kur tn, tn-1 ir laiks, kas vajadzīgs dotajam apgriezienu skaitam N. Šie laika intervāli tn un tn- seko viens otram, un tn > tn-1. Gāzes molekulas c— vidējais ātrums ir: c— = 8 RTπ M12 kur: T temperatūra, R gāzu universālā konstante, M molmasa.

2. DATI Neatkarīgi no izmantotās metodes tvaika spiediena mērījumi jāveic vismaz divās temperatūrās. Tvaika spiediena līknes linearitātes pārbaudei ieteicams veikt trīs vai vairāk mērījumus temperatūru intervālā no 0 līdz 50 oC.

3. PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija: Ja noteikšanas laikā novēro, ka ar vielu notiek kādas izmaiņas (agregātstāvokļa maiņa, sadalīšanās), jānorāda arī: Jāiekļauj visa informācija un piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju, jo īpaši par vielas piemaisījumiem un tās agregātstāvokli.

lietotā metode,

vielas precīzs apraksts (identifikācija un tīrība), iepriekšēja attīrīšana, ja tiek veikta,

vismaz divas tvaika spiediena un temperatūras vērtības, vēlams, temperatūru intervālā no 0 līdz 50 oC,

visi izejas dati,

log p vērtības atkarībā no 1/T līknes,

20 vai 25 oC temperatūrai aprēķinātais tvaika spiediens.

izmaiņu veids,

temperatūra, kādā šīs izmaiņas notiek pie atmosfēras spiediena,

tvaika spiediens 10 un 20 oC zemāk par šo pārejas temperatūru un 10 un 20 oC augstāk par šo temperatūru (ja nenotiek pāreja no cieta agregātstāvokļa gāzveida stāvoklī).

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, Vol. 34, p. 593. NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use –Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa – Static method. NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use –Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, Vol. 5 (4), p. 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, Vol. 7, p. 1173. B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, Vol. 85, p. 435. G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, Vol. 17 (2), p. 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, VoI. 20 (4), p. 1148. J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, Vol. 3 (3), p. 1715.

A.5. VIRSMAS SPRAIGUMS

A.5.

1. METODE Aprakstīto metožu pamatā ir ESAO Testēšanas norādījumi (1). Pamatprincipi aprakstīti literatūras avotā (2).

1.

1.1. IEVADS Aplūkotās metodes paredzētas ūdens šķīdumu virsmas spraiguma mērīšanai. Pirms šo pārbaužu veikšanas ir lietderīgi jau iepriekš ievākt datus par pārbaudāmās vielas šķīdību ūdenī, tās uzbūvi, hidrolīzes īpašībām un micellu veidošanās robežkoncentrāciju. Šeit aprakstītās metodes ir izmantojamas gandrīz visām ķīmiskajām vielām neatkarīgi no to tīrības. Ar gredzenveida tenzometru var noteikt virsmas spraigumu tikai tādiem ūdens šķīdumiem, kuru dinamiskā viskozitāte ir zemāka par 200 mPa s.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Virsmas spraigums ir virsmas brīvā entalpija uz virsmas laukuma vienību. Virsmas spraigumam ir šādas mērvienības: N/m (SI mērvienība) vai mN/m (SI apakšmērvienība), 1 N/m = 103 dini/cm, 1 mN/m = 1 dins/cm novecojušajā cgs mērvienību sistēmā.

1.3. STANDARTVIELAS Pārbaudot jaunu vielu, ne visos gadījumos jāizmanto standartvielas. Tās galvenokārt izmanto metodes izpildījuma periodiskām pārbaudēm un dažādu metožu salīdzināšanai. Standartvielas, kuru virsmas spraigums aptver plašu diapazonu, ir uzskaitītas izmantotās literatūras sarakstā (1) (3).

1.4. METOŽU PRINCIPS Ar šīm metodēm nosaka maksimālo spēku, kas vertikāli jāpieliek cilpai vai gredzenam, kurš ir saskarē ar pārbaudāmā šķidruma virsmu mērtraukā, lai to atrautu no šīs virsmas, vai spēku, kas jāpieliek plātnei, kuras mala pieskaras šķidruma virsmai, lai pievilktu izveidojušos virsmas slāni. Vielas, kuras ir šķīstošas ūdenī koncentrācijā vismaz līdz 1 mg/l, testē ūdens šķīdumā vienā koncentrācijā.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Šīm metodēm ir augstāka precizitāte par vides novērtējumam vajadzīgo.

1.6. METOŽU APRAKSTI Vielu izšķīdina destilētā ūdenī. Šķīduma koncentrācijai jābūt 90 % no vielas piesātināta šķīduma koncentrācijas; ja šī koncentrācija ir lielāka par 1 g/l, noteikšanu veic šķīdumam ar koncentrāciju 1 g/l. Virsmas spraigums nav jānosaka vielām, kuru šķīdība ir mazāka par 1 mg/l.

1.6.

1.6.1. Plātnes metode Skatīt ISO 304 un NF T 73-060 (Virsmaktīvās vielas – virsmas spraiguma noteikšana, izmantojot šķidrumu plēvītes).

1.6.2. Cilpas metode Skatīt ISO 304 un NF T 73-060 (Virsmaktīvās vielas – virsmas spraiguma noteikšana, izmantojot šķidrumu plēvītes).

1.6.3. Gredzena metode Skatīt ISO 304 un NF T 73-060 (Virsmaktīvās vielas – virsmas spraiguma noteikšana, izmantojot šķidrumu plēvītes).

1.6.4. ESAO gredzena metode

1.6.4.

1.6.4.1. Aprīkojums Šo mērījumu veikšanai der pārdošanā esošie tenzometri. Šīs ierīces sastāv no šādiem mezgliem:

grozāma parauga plate,

dinamometrs,

mērierīce (gredzens),

mērtrauks.

1.6.4.1.

1.6.4.1.1. Grozāma parauga plate Grozāmo plati izmanto kā paliktni termostatējamam mērtraukam, kurā iepilda pārbaudāmo šķidrumu. Tas ir piestiprināts pie statīva kopā ar dinamometru.

1.6.4.1.2. Dinamometrs Dinamometrs (skatīt attēlu) atrodas virs parauga plates. Spēka mērījumu kļūda nedrīkst būt lielāka par ± 10-6 N, kas atbilst masas mērījumu kļūdai ±0,1 mg. Pārdošanā esošo tenzometru mērījumu skala lielākoties kalibrēta mN/m mērvienībās, kas ļauj nolasīt virsmas spraiguma rādījumus tieši mN/m ar 0,1 mN/m precizitāti.

1.6.4.1.3. Mērierīce (gredzens) Gredzenu parasti izgatavo no platīna-indija sakausējuma 0,4 mm stieples, un tā vidējais apkārtmērs ir 60 mm. Stieple parasti ir pacelta horizontālā virzienā no metāla tapas un stieples turētāja, lai izveidotu savienojumu ar dinamometru (skatīt attēlu).

1.6.4.1.3. Attēls Mērierīce

(Visi izmēri norādīti milimetros) Tapa Turētājs Gredzens

1.6.4.1.4. Mērtrauks Mērtraukam, kurā ir pārbaudāmais šķīdums, jābūt izgatavotam no stikla, un tam jābūt termostatējamam. Mērījumu laikā tā konstrukcijai jānodrošina nemainīga temperatūra pārbaudāmā šķīduma šķidrajā fāzē un gāzes fāzē (virs tās) un jānovērš parauga iztvaikošana. Šim nolūkam der stikla cilindri ar iekšējo diametru ne mazāku par 45 mm.

1.6.4.2. Iekārtas sagatavošana

1.6.4.2.

1.6.4.2.1. Tīrīšana Rūpīgi jāgādā par stikla trauku tīrību. Vajadzības gadījumā tos mazgā ar bihromāta šķīdumu un pēc tam ar sīrupveidīgu fosforskābi (83–98 masas % H3PO4), tad rūpīgi skalo ūdensvada ūdenī un visbeidzot skalo ar bidestilātu, kamēr iegūst neitrālu reakciju, un tad traukus žāvē vai skalo ar pārbaudāmo šķidrumu. Gredzenu vispirms rūpīgi skalo ūdenī, lai atbrīvotos no ūdenī šķīstošām vielām, tad uz īsu brīdi to iegremdē bihromāta šķīdumā, skalo bidestilātā, kamēr iegūst neitrālu reakciju, un visbeidzot īslaicīgi karsē virs degoša metanola liesmas. Piezīme No tādiem piemaisījumiem, kas nešķīst un nesadalās bihromāta šķīdumā vai fosforskābē, piemēram, no silikoniem, atbrīvojas, izmantojot piemērotu organisku šķīdinātāju.

1.6.4.2.2. Iekārtas kalibrēšana Iekārtu sagatavojot mērīšanai, pārbauda nulles punktu un to noregulē tā, lai instrumenta rādījumi ļautu iegūt ticamus virsmas spraiguma mērījumu rezultātus mN/m.

1.6.4.2.2. Uzstādīšana

Iekārtu novieto horizontāli uz tenzometra pamatnes, piemēram, izmantojot līmeņrādi un regulējot līmeņotājskrūves pamatnē.

Nulles punkta iestatīšana

Pēc gredzena uzstādīšanas un pirms tā iegremdēšanas šķidrumā tenzometram iestata nulles punktu un pārliecinās, ka gredzena plakne ir paralēla šķidruma virsmai. Šim nolūkam šķidruma virsmu var izmantot kā spoguli.

Kalibrēšana

Iekārtas kalibrēšanu var veikt divējādi:

a)

ar atsvariem: izmantojot uz gredzena novietotus atsvaru jātnieciņus ar masu no 0,1 g līdz 1,0 g. Kalibrēšanas koeficientu Φa, ar kuru jāreizina visi instrumenta rādījumi, aprēķina pēc vienādojuma (1): Φa=σrσa (1) kur: σr=mg2b (mN/m) m svaru jātnieciņa masa (g), g brīvās krišanas paātrinājums (981 cm s-2 jūras līmenī), b gredzena vidējais apkārtmērs (cm), σa tenzometra rādījums pēc jātnieciņa novietošanas uz gredzena (mN/m);

b)

ar ūdeni: izmantojot tīru ūdeni, kura virsmas spraigums, piemēram, 23 oC temperatūrā, ir 72,3 mN/m. Šī procedūra ir vienkāršāka un ātrāka nekā kalibrēšana ar atsvariem, tomēr vienmēr pastāv iespēja, ka ūdens virsmas spraigums mainījies neliela virsmaktīvo vielu izraisīta piesārņojuma dēļ. Kalibrēšanas koeficientu Φb, ar kuru jāreizina visi instrumenta rādījumi, aprēķina pēc vienādojuma (2): Φb=σoσg (2) kur: σo ūdens virsmas spraiguma vērtība pēc literatūras avotu datiem (mN/m), σg ūdens virsmas spraiguma izmērītā vērtība (mN/m), tajā pašā temperatūrā.

1.6.4.3. Paraugu sagatavošana Analizējamās vielas izšķīdina ūdenī vajadzīgajā koncentrācijā, turklāt šķīdumā nedrīkst būt neizšķīdušas vielas daļiņas. Šķīdumi jāuzglabā nemainīgā (±0,5 oC) temperatūrā. Tā kā šķīduma virsmas spraigums mērtraukā mainās laika gaitā, jāveic vairāki mērījumi dažādā laikā un grafiski jāattēlo līkne, kas raksturo virsmas spraiguma izmaiņas laika ritumā. Ja izmaiņas vairs nenotiek, tad ir sasniegts līdzsvara stāvoklis. Putekļi vai gāzveida vielu piemaisījumi ietekmē mērījumu rezultātus. Tāpēc mērījumi jāveic zem aizsargkupola.

1.6.5. Testēšanas apstākļi Mērījumus veic aptuveni 20 oC temperatūrā, tās svārstības nedrīkst pārsniegt ±0,5 oC.

1.6.6. Testēšana Šķīdumu, kura virsmas spraigums jānosaka, pārnes rūpīgi izmazgātā mērtraukā, raugoties, lai tas neputotos, un pēc tam mērtrauku novieto uz mēraparāta galdiņa. Galdiņu ar mērtrauku paceļ, līdz gredzens iegrimst zem šķidruma, kura virsmas spraigums jānosaka. Tad plates virsu pakāpeniski un vienmērīgi nolaiž (ar ātrumu ap 0,5 cm/min), mēģinot atraut gredzenu no šķīduma virsmas, līdz sasniegts maksimālais spēks. Šķidruma slāni, kas saskaras ar gredzenu, nedrīkst atraut no gredzena. Pabeidzot mērījumu, gredzenu atkal iegremdē šķidrumā un atkārto mērījumus, kamēr iegūst nemainīgu virsmas spraiguma lielumu. Katram mērījumam jāatzīmē kopš šķīduma pārnešanas mērtraukā pagājušais laiks. Rezultātus nolasa brīdī, kad pielietots maksimālais spēks, mēģinot atraut gredzenu no šķidruma virsmas.

2. Tabula Virsmas spraiguma mērījumu korekcija Tikai ūdens šķīdumiem, ρ ≅ 1 g/cm3

DATI Virsmas spraiguma aprēķināšanai aparāta nolasījuma vērtību (mN/m) vispirms reizina ar kalibrēšanas koeficientu φa vai φb (atkarībā no izmantotās kalibrēšanas procedūras). Šādi iegūst tikai aptuvenu lielumu, kas ir jākoriģē. Hārkinss [Harkins] un Džordans [Jordan] (4), veicot mērījumus ar gredzena metodi, empīriski noteica virsmas spraiguma korekcijas koeficientus, kas atkarīgi no gredzena izmēriem, šķidruma blīvuma un tā virsmas spraiguma. Tā kā katram mērījumam noteikt korekcijas koeficientu pēc Hārkinsa un Džordana tabulām ir sarežģīti, ūdens šķīdumu virsmas spraiguma aprēķināšanai var izmantot vienkāršotu koriģēto virsmas spraiguma vērtību nolasīšanas procedūru tieši no tabulām. (Rādījumiem, kas nav atrodami tabulā, koriģēto vērtību iegūst interpolējot.) r = 9,55 mm (gredzena rādiusa vidējā vērtība), r = 0,185 mm (gredzena stieples rādiuss). Eksperimentāli noteiktā vērtība (mN/m) Koriģētā vērtība (mN/m) Kalibrēšana ar atsvariem (skatīt 1.6.4.2.2. a)) Kalibrēšana ar ūdeni (skatīt 1.6.4.2.2. b)) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Šī tabula sastādīta pēc Hārkinsa un Džordana korekcijas metodes. Tā ir līdzīga standartā DIN 53914 dotajai tabulai ūdenim un ūdens šķīdumiem (blīvums p = 1 g/cm3) un gataviem nopērkamiem gredzeniem ar gredzena rādiusa vidējo vērtību R = 9,55 mm un gredzena stieples rādiusu r = 0,185 mm. Šajā tabulā ir iekļauti koriģētās virsmas spraiguma vērtības mērījumi, ko veic pēc kalibrēšanas ar atsvariem vai pēc kalibrēšanas ar ūdeni. Pastāv arī iespēja aprēķināt virsmas spraigumu bez iepriekšējas kalibrēšanas pēc šādas formulas: σ=f × F4πR kur: F spēks, kas iedarbojas uz šķidruma virsmas slāni tā atraušanās brīdī (dinamometra rādījums), R gredzena rādiuss, f korekcijas koeficients (1).

3. PĀRSKATS

3.

3.1. TESTĒŠANAS PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

lietotā metode,

izmantotais ūdens vai šķīdums,

precīzs vielas apraksts (identifikācija un piemaisījumi),

mērījumu rezultāti: virsmas spraigums (nolasījums), norādot gan atsevišķos nolasījumus, gan to vidējo aritmētisko vērtību, kā arī vidējā aritmētiskā koriģēto vērtību (ņemot vērā iekārtas koeficientu un korekcijas tabulu),

šķīduma koncentrācija,

temperatūra noteikšanas laikā,

izmantotā šķīduma vecums; jo īpaši no šķīduma pagatavošanas līdz mērījumu veikšanai pagājušais laiks,

virsmas spraiguma izmaiņas laikā pēc šķīduma pārnešanas mērtraukā,

visa informācija un piezīmes, kas vajadzīgas uzdoto rezultātu interpretēšanai, jo īpaši dati par piemaisījumiem un vielas agregātstāvokli.

3.2. REZULTĀTU INTERPRETĒŠANA Ņemot vērā, ka destilēta ūdens virsmas spraigums 20 oC temperatūrā ir 72,75 mN/m, vielas, kuru virsmas spraigums, kas noteikts pēc šīs metodes, ir mazāks par 60 mN/m, ir uzskatāmas par virsmaktīvām vielām.

4.(1)(2)(3)(4)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV. Pure Appl. Chem., 1976, Vol. 48, p. 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, Vol. 52, p. 1751.

A.6. ŠĶĪDĪBA ŪDENĪ

A.6.

1. METODE Aprakstīto metožu pamatā ir ESAO Testēšanas norādījumi (1).

1.

1.1. IEVADS Pirms šīs pārbaudes veikšanas ir lietderīgi jau iepriekš iegūt informāciju par pārbaudāmās vielas struktūrformulu, tvaika spiedienu, disociācijas konstanti un hidrolīzi (atkarībā no pH līmeņa). Nav nevienas metodes, kas būtu izmantojama visā šķīdības diapazonā. Abas turpmāk aprakstītās metodes aptver visu šķīdības diapazonu, taču nav izmantojamas gaistošu vielu šķīdības noteikšanai: Vielas šķīdība ūdenī var būtiski mainīties piemaisījumu ietekmē.

viena no tām izmantojama praktiski tīru, ūdenī stabilu, slikti šķīstošu vielu šķīdības noteikšanai (< 10-2 grami litrā) – kolonnas eluēšanas metode,

otra izmantojama praktiski tīru, ūdenī stabilu, nedaudz labāk šķīstošu vielu šķīdības noteikšanai (> 10-2 grami litrā) – kolbas metode.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Vielas šķīdību ūdenī nosaka pēc vielas piesātinājuma masas koncentrācijas ūdenī kādā noteiktā temperatūrā. Šķīdību ūdenī norāda masas vienībās uz vienu šķīduma tilpuma vienību. SI mērvienība ir kg/m3 (var izmantot arī g/l).

1.4. TESTA METODES PRINCIPS Aptuveno parauga daudzumu un laiku, kas vajadzīgs, lai sasniegtu piesātinājuma masas koncentrāciju, nosaka vienkāršotā orientējošā izmēģinājumā.

1.4.

1.4.1. Kolonnas eluēšanas metode Šīs metodes pamatā ir testējamās vielas eluēšana ar ūdeni no mikrokolonnas, kurā uz inerta nesēja, piemēram, stikla lodītēm vai smiltīm, ir testējamās vielas pārākuma pārklājums. Šķīdību ūdenī nosaka tad, kad eluāta masas koncentrācija kļūst nemainīga. Par to liecina koncentrācijas plato, kas uz šķīdības līknes iestājas pēc noteikta laika.

1.4.2. Kolbas metode Ja izmanto šo metodi, vielu (cietas vielas jāsaberž pulverī) izšķīdina ūdenī temperatūrā, kas ir nedaudz augstāka par temperatūru, kurā nosaka šķīdību. Pēc piesātināta šķīduma iegūšanas maisījumu maisot atdzesē un tur testēšanas temperatūrā, līdz iestājas līdzsvars. Noteikšanu var veikt arī tieši tajā temperatūrā, kurai nosaka šķīdību, ja ar pienācīgu paraugu ņemšanas programmu var nodrošināt piesātinājuma līdzsvara sasniegšanu. Pēc tam ar piemērotu analīzes metodi nosaka vielas masas koncentrāciju ūdens šķīdumā, kas nedrīkst saturēt neizšķīdušas daļiņas.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI

1.5.

1.5.1. Atkārtojamība Kolonnas eluēšanas metodei var sasniegt atkārtojamību < 30 %; pēc kolbas metodes atkārtojamībai jābūt < 15 %.

1.5.2. Jutība Jutība ir atkarīga no noteikšanas metodes, tomēr ir iespējams noteikt masas koncentrācijas līdz pat 10-6 gramiem litrā.

1.6. TESTA METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Testēšanas apstākļi Testēšanu vēlams veikt 20 ±0,5 oC temperatūrā. Ja šķīdība, iespējams, ir atkarīga no temperatūras (> 3 %/ oC), šķīdība jānosaka arī temperatūrā, kas ir vismaz 10 oC virs un vismaz 10 oC zem sākotnēji izraudzītās noteikšanas temperatūras. Šādā gadījumā temperatūra jāmēra un jāuztur ar precizitāti ±0,1 oC. Izraudzītā temperatūra pastāvīgi jāuztur visās attiecīgajās iekārtas daļās.

1.6.2. Orientējoša noteikšana Pie apmēram 0,1 g parauga (cietvielas jāsaberž pulverī) graduētā cilindrā ar stikla aizbāzni istabas temperatūrā pievieno pieaugošā daudzumā destilētu ūdeni saskaņā ar tabulu: 0,1 g vielas, kas izšķīst x mililitros ūdens 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Aptuvenā šķīdība (grami litrā) > 1000 1000 līdz 200 200 līdz 100 100 līdz 50 50 līdz 10 10 līdz 1 < 1 Pēc katra norādītā ūdens daudzuma pievienošanas maisījumu enerģiski krata 10 minūtes un vizuāli konstatē, vai tajā vēl ir neizšķīdušas parauga daļiņas. Ja pēc 10 ml ūdens pievienošanas viss paraugs vai tā daļas nav izšķīdušas, noteikšana jāatkārto 100 ml cilindrā, ņemot lielākus ūdens daudzumus. Vielām ar zemāku šķīdību pilnīgai izšķīšanai vajadzīgais laiks var būt ievērojami lielāks (jāatstāj vismaz uz 24 stundām). Aptuvenā šķīdība ir norādīta tabulā zem tā pievienotā ūdens daudzuma, kurā notiek parauga pilnīga izšķīšana. Ja arī pēc tam viela ir acīm redzami pilnīgi neizšķīdusi, to atstāj uz laiku ilgāku par 24 h (ne vairāk kā līdz 96 stundām) vai atšķaidīšanu turpina, lai pārliecinātos par to, vai šķīdības noteikšana nebūs jāveic pēc kolonnas eluēšanas metodes.

1.6.3. Kolonnas eluēšanas metode

1.6.3.

1.6.3.1. Nesējs, šķīdinātājs un eluents Eluēšanas kolonnās jāizmanto inerts nesējs. Šim nolūkam var izmantot tādus materiālus kā stikla lodītes un smiltis. Pārbaudāmās vielas adsorbēšanai uz nesēja izmanto piemērotu analītiski tīru gaistošu šķīdinātāju. Par eluentu izmanto bidestilētu ūdeni, kas iegūts destilācijas aparātā no stikla vai kvarca. Piezīme Nedrīkst izmantot ūdeni, kas iegūts, tieši izmantojot organiskos jonu apmaiņas sveķus.

1.6.3.2. Nesēja uzpildīšana Apaļkolbā (50 ml) iesver apmēram 600 mg nesēja. Iesver vajadzīgo pārbaudāmās vielas daudzumu un to izšķīdina izvēlētajā šķīdinātājā. Šo šķīdumu vajadzīgajā daudzumā pievieno nesējam. Šķīdinātāju pilnīgi iztvaicē, piemēram, rotācijas vakuumietvaicētājā; citādi sadalīšanās dēļ uz nesēja virsmas netiek panākta nesēja piesātināšanās ar ūdeni. Nesēja uzpildīšana var radīt grūtības (kļūdainus rezultātus), ja pārbaudāmā viela nogulsnējas līdzīgi eļļai vai veido citu kristālisko fāzi. Šīs grūtības jāpārbauda eksperimentāli, un rezultāti jāatspoguļo pārskatā. Sagatavoto nesēju apmēram divas stundas mērcē aptuveni 5 ml ūdens, pēc tam suspensiju iepilda mikrokolonnā. Otra iespēja ir sausu sagatavotu nesēju ievadīt mikrokolonnā, kurā iepildīts ūdens, un apmēram divas stundas uzbriedināt.

1.6.3.2. Testēšanas gaita

Vielas eluēšanu no nesēja var veikt divējādi:

ar cirkulācijas sūkni (skatīt 1. attēlu),

ar savienoto trauku (skatīt 4. attēlu).

1.6.3.3. Eluēšanas kolonna ar cirkulācijas sūkni

1.6.3.3. Aprīkojums

Parastā sistēma shematiski attēlota 1. attēlā. Piemērota mikrokolonna redzama 2. attēlā, lai gan var izmantot dažādu izmēru kolonnas, ja tās atbilst reproducējamības un atkārtojamības kritērijiem. Kolonnas augšdaļai jābūt neaizpildītai vismaz par pieciem ūdens slāņa tilpumiem, un tajā jāietilpst vismaz pieciem paraugiem. Pastāv arī iespēja samazināt izmērus, ja sākotnējo piecu eluāta tilpumu papildināšanai, kuri izvadīti kopā ar piemaisījumiem, no jauna ievada šķīdinātāju. Kolonnu pievieno cirkulācijas sūknim, ar kuru var regulēt šķidruma plūsmas līdz 25 ml/h. Sūkni pievieno, izmantojot politetrafluroetilēna (PTFE) un/vai stikla savienojumus. Pēc kolonnas un sūkņa uzstādīšanas jānodrošina iespēja ņemt efluenta paraugus un līdzsvarot augšgala tilpuma spiedienu ar atmosfēras spiedienu. Nesēju kolonnā palīdz saturēt neliels (5 mm) stikla vates tampons, kas vienlaicīgi aiztur arī neizšķīdušās daļiņas. Par cirkulācijas sūkni var izmantot, piemēram, peristaltisko sūkni vai membrānas sūkni (jāraugās, lai nenotiktu piesārņošana ar caurulīšu materiālu un/vai tā absorbcija).

Mērījumu procedūra

Kolonna sāk darboties. Ieteicamais plūsmas ātrums ir apmēram 25 ml/h (kas atbilst aprakstītās kolonnas 10 slāņa tilpumiem). (Vismaz) piecus pirmos slāņa tilpumus atmet, lai atdalītu ūdenī šķīstošos piemaisījumus. Tad iedarbina cirkulācijas sūkni, kamēr iestājas līdzsvars, par ko liecina pieci secīgi paraugi, kuru koncentrācija neatkarīgi no paraugu secības neatšķiras vairāk par ± 30 %. Šos paraugus ņem ar tādu laika intervālu, lai tajā pagūtu iziet tāds eluenta daudzums, kas atbilst vismaz 10 kolonnas slāņa tilpumiem.

1.6.3.4. Eluēšanas kolonna ar savienoto trauku

1.6.3.4. Aprīkojums (skatīt 4. un 3. attēlu)

Savienotais trauks: savienoto trauku kolonnai pievieno, izmantojot pieslīpēta stikla savienojumu, kas pievienots PTFE caurulei. Ieteicams izmantot plūsmas ātrumu ap 25 ml/h. Pēc secīgu eluāta frakciju savākšanas tās analizē, izmantojot izraudzīto metodi.

Mērījumu procedūra

Vielas šķīdības noteikšanai ūdenī ņem tās eluāta piecas secīgās vidējās frakcijas, kurās vielas koncentrācija nemainās (± 30 %). Pēc abām metodēm (ar cirkulācijas sūkni un ar savienoto trauku) jāsagatavo otra paraugu sērija, ko iegūst ar divreiz mazāku eluēšanas ātrumu nekā pirmo. Ja pēc abām paraugu sērijām iegūtie rezultāti sakrīt, noteikšana veikta pareizi; ja ar mazāku plūsmas ātrumu noteiktā šķīdība ir lielāka, tad plūsmas ātrums divkārt jāsamazina tik ilgi, kamēr pēc divām secīgām paraugu sērijām iegūtie rezultāti sakrīt. Abos gadījumos (izmantojot cirkulācijas sūkni vai savienoto trauku) jāpārbauda, vai frakcijas nesatur koloīdus, par ko liecina Tindala efekts (gaismas izkliede). Šādu daļiņu klātbūtne padara rezultātus neizmantojamus, un noteikšana jāatkārto pēc kolonnas filtrācijas spējas uzlabošanas. Jāreģistrē katra parauga pH līmenis. Pārbaudi atkārto tādā pašā temperatūrā.

1.6.4. Kolbas metode

1.6.4.

1.6.4.1. Aprīkojums Kolbas metodei nepieciešams šāds aprīkojums:

parastie laboratorijas trauki un iekārtas,

pastāvīgā regulējamā temperatūrā šķīdumu maisīšanai piemērota ierīce,

centrifūga (vēlams termostatējama), ja vajadzīga emulsijām, un

iekārta analītiskai noteikšanai.

1.6.4.2. Mērījumu procedūra Pārbaudāmās vielas daudzumu, kas nepieciešams vajadzīgā ūdens tilpuma piesātināšanai, vispirms nosaka orientējošā izmēģinājumā. Vajadzīgais ūdens daudzums ir atkarīgs no analīzes metodes un šķīdības. Katrā no trim stikla traukiem ar stikla aizbāzni (piemēram, centrifūgas mēģenēs vai kolbās) iesver apmēram piecreiz lielāku vielas daudzumu, nekā noteikts iepriekš. Katrā traukā iepilda izvēlēto ūdens tilpumu un traukus cieši noslēdz. Pēc tam noslēgto trauku saturu maisa 30 oC temperatūrā. (Jāizmanto kratītājs vai maisītājs, kas var darboties pastāvīgā temperatūrā, piemēram, jāmaisa ar magnētisko maisītāju termostatējamā ūdens vannā.) Pēc vienas dienas vienu no traukiem izņem un atstāj uz 24 stundām izmēģinājuma temperatūrā, to periodiski sakratot, kamēr atkal iestājas līdzsvara stāvoklis. Trauka saturu tad centrifugē temperatūrā, kurā nosaka šķīdību, un ar piemērotu analītisko metodi nosaka vielas koncentrāciju dzidrajā ūdens šķīdumā. Līdzīgi rīkojas ar pārējām divām kolbām, kad attiecīgi divu un triju dienu laikā ir iestājies līdzsvars 30 oC temperatūrā. Ja iegūtie rezultāti vismaz pēdējos divos traukos atbilst vajadzīgajai reproducējamībai, uzskata, ka noteikšanas rezultāti ir apmierinoši. Izmēģinājums pilnībā jāatkārto, izmantojot ilgāku līdzsvara iestāšanās laiku, ja ar 1., 2. un 3. trauku iegūtajiem rezultātiem ir tendence paaugstināties. Noteikšanu var veikt arī bez iepriekšējas inkubēšanas 30 oC temperatūrā. Lai noteiktu piesātinājuma iestāšanās ātrumu, paraugus ņem līdz laikam, kamēr analizējamā šķīduma koncentrācija vairs nav atkarīga no maisīšanas ilguma. Jāreģistrē katra parauga pH līmenis.

1.6.5. Analīze Šim nolūkam ieteicams izmantot analīzes metodi, kas piemērota tieši šai vielai, jo piemaisījumi pat nelielā daudzumā var radīt nopietnas kļūdas šķīdības mērījumu rezultātos. Kā piemēru var minēt šādas metodes: gāzes šķidruma hromatogrāfija, titrēšanas metodes, fotometriskās metodes, voltampērmetriskās metodes.

2. DATI

2.

2.1. KOLONNAS ELUĒŠANAS METODE Katrā izmēģinājumā jāaprēķina vismaz piecu secīgu paraugu vidējā vērtība, kuri ņemti nemainīgā piesātinājuma fāzē, kā arī standartnovirze. Rezultātus uzdod masas vienībās uz šķīduma tilpumu. Salīdzinot divu noteikšanu rezultātu vidējās vērtības, kuri iegūti ar dažādiem plūsmas ātrumiem, to atkārtojamībai jābūt ne lielākai par 30 %.

2.2. KOLBAS METODE Uzdod atsevišķi noteikšanas rezultātus no visām trijām kolbām un pēc rezultātiem, kuri uzskatāmi par vienādiem (atkārtojamība ne lielāka par 15 %), aprēķina vidējo vērtību, ko izsaka masas vienībās uz šķīduma tilpumu. Šajā gadījumā var gadīties, ka masas vienības jāpārvērš tilpuma vienībās, bet, ja šķīdība ir ļoti augsta (> 100 g/l), jāizmanto blīvums.

3. PĀRSKATS

3.

3.1. KOLONNAS ELUĒŠANAS METODE Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

orientējošas noteikšanas rezultāti,

precīzs vielas apraksts (identifikācija un piemaisījumi),

atsevišķi katram paraugam noteiktās koncentrācijas, plūsmas ātrumi un pH,

no katras paraugu sērijas pēc vismaz pieciem paraugiem no piesātinājuma plato noteiktās vidējās vērtības un standartnovirzes,

divu secīgu pieņemamu rezultātu sēriju vidējās vērtības,

ūdens temperatūra piesātināšanas procesa laikā,

izmantotā analīzes metode,

izmantotais nesējs,

nesēja sagatavošana noteikšanai,

izmantotais šķīdinātājs,

pierādījumi par vielas ķīmisko nestabilitāti noteikšanas laikā un izmantotā metode,

visa informācija un piezīmes, kas vajadzīgas uzdoto rezultātu interpretēšanai, īpaši dati par piemaisījumiem un vielas agregātstāvokli.

3.2. KOLBAS METODE Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

orientējošas noteikšanas rezultāti,

precīzs vielas apraksts (identifikācija un piemaisījumi),

atsevišķo paraugu analīžu rezultāti un vidējās vērtības gadījumos, kad no vienas kolbas iegūti vairāki rezultāti, to vidējā vērtība,

katra parauga reakcija pH,

no vairākām kolbām iegūto sakrītošo rezultātu vidējā vērtība,

noteikšanas temperatūra,

izmantotā analītiskā metode,

pierādījumi par vielas ķīmisko nestabilitāti noteikšanas laikā un izmantotā metode,

visa informācija un piezīmes, kas vajadzīgas uzdoto rezultātu interpretēšanai, īpaši dati par piemaisījumiem un vielas agregātstāvokli.

4.(1)(2)(3) IZMANTOTĀ LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use –Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method. NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use –Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.

A.8. SADALĪŠANĀS KOEFICIENTS

A.8.

1. METODE Aprakstītās kolbu kratīšanas metodes pamatā ir ESAO Testēšanas norādījumi (1).

1.

1.1. IEVADS Pirms noteikt sadalīšanās koeficientu, ir lietderīgi iegūt sākotnēju informāciju par vielas struktūru, disociācijas konstanti, šķīdību ūdenī, hidrolīzi, šķīdību n-oktanolā un virsmas spraigumu. To nosaka tikai jonizējamu vielu nejonizētajām formām (brīvām skābēm vai bāzēm), kas rodas, izmantojot piemērotu buferšķīdumu ar pH, kas ir vismaz vienu pH vienību zem (brīvām skābēm) vai vienu pH vienību virs (brīvām bāzēm) tās pK. Šajā noteikšanas metodē ietilpst divas atsevišķas procedūras: kolbu kratīšanas metode un augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija (HPlc). Pirmo izmanto gadījumos, kad log Pow vērtība (skatīt definīcijas turpmāk) ir no –2 līdz 4, bet otro – ja tā ir no 0 līdz 6. Pirms veikt eksperimentālu noteikšanu pēc kādas no minētajām metodēm, vispirms jāveic sadalīšanās koeficienta orientējoši aprēķini. Kolbu kratīšanas metode izmantojama tikai praktiski tīrām vielām, kuras šķīst ūdenī un n-oktanolā. Tā nav izmantojama virsmaktīvām vielām (kurām norāda aprēķināto vērtību vai novērtējumu pēc šķīdības atsevišķi n-oktanolā un ūdenī). Augstas izšķirtspējas šķidrumu hromatogrāfijas metode nav izmantojama stiprām skābēm un bāzēm, metālu kompleksajiem savienojumiem, virsmaktīvajām vielām un vielām, kuras reaģē ar eluentu. Šīm vielām uzdod sadalīšanās koeficenta aprēķināto vērtību vai pēc šķīdības atsevišķi n-oktanolā un ūdenī novērtēto vērtību. Augstas izšķirtspējas šķidrumu hromatogrāfijas metode ir mazāk jutīga pret nosakāmās vielas piemaisījumiem nekā kolbu kratīšanas metode. Tomēr dažos gadījumos piemaisījumi apgrūtina rezultātu interpretāciju, jo ne vienmēr ir iespējama visu signālu identificēšana. Maisījumiem, kuri dod neidentificētu signālu, jānorāda log P augšējās un apakšējās robežas.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Sadalīšanās koeficientu (P) definē kā izšķīdušās vielas līdzsvara koncentrāciju attiecību (q), iestājoties līdzsvaram divfāžu sistēmā, ko veido divi šķīdinātāji, kam ir savstarpēji ierobežota šķīdība. n-oktanols/ūdens sistēmā: Pow=cn-oktanolscūdens Tātad sadalīšanās koeficients (P) ir divu koncentrāciju attiecība, kas parasti izteikta decimāllogaritma veidā (log P).

1.3. STANDARTVIELAS

1.3. Kolbu kratīšanas metode

Pārbaudot jaunu vielu, ne visos gadījumos jāizmanto standartvielas. Tās galvenokārt izmanto metodes izpildījuma periodiskām pārbaudēm un pēc dažādām metodēm iegūto rezultātu salīdzināšanai.

Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas metode

Lai saistītu savienojuma hromatogrāfijas datus ar tā P vērtību, pēc vismaz 6 punktiem jāizveido kalibrēšanas grafiks par log P vērtību atkarībā no hromatogrāfijas datiem. Piemērotas standartvielas izraugās pats metodes lietotājs. Visos iespējamajos gadījumos vismaz vienas standartvielas Pow ir jābūt zemākai par šā rādītāja vērtību nosakāmajai vielai, bet otras – par to augstākai. Ja log P ir mazāks par 4, kalibrēšanai izmanto pēc kolbu kratīšanas metodes iegūtos datus. Ja log P ir lielāks par 4, kalibrēšanai var izmantot apstiprinātus literatūras datus, ja tie atbilst aprēķinātajām vērtībām. Precizitātes paaugstināšanai ir ieteicams izmantot standartvielas, kuru struktūra ir līdzīga nosakāmās vielas struktūrai. Par daudzām ķīmisko vielu grupām ir publicēti (2) (3) plaši log Pow saraksti. Ja nav datu par sadalīšanās koeficientu vērtībām savienojumiem ar līdzīgu struktūru, var izmantot vispārīgāku kalibrēšanu pēc citām standartvielām. Ieteicamo standartvielu saraksts un to Pow vērtības dotas 2. papildinājumā.

1.4. METODES PRINCIPS

1.4.

1.4.1. Kolbu kratīšanas metode Lai noteiktu sadalīšanās koeficientu, ir jāiestājas līdzsvaram starp visiem mijiedarbībā esošiem sistēmas komponentiem un jānosaka abās fāzēs izšķīdušo vielu koncentrācija. Attiecīgās literatūras norādes liecina par to, ka šo problēmu var atrisināt ar dažādiem tehniskiem paņēmieniem, proti, atdalot abas fāzes pēc to rūpīgas sajaukšanas, lai noteiktu analizējamās vielas koncentrāciju, iestājoties līdzsvaram.

1.4.2. Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas metode Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijai izmanto kolonnas ar gatavas nopērkamas cietās fāzes pildījumu, kas satur garas ogļūdeņražu virknes (piemēram, C8, C18), kas ķīmiski saistītas ar silīcija dioksīdu. Šādā kolonnā ievadītās vielas tajā pārvietojas ar dažādu ātrumu atšķirīgas sadalīšanās dēļ starp kustīgo fāzi un ogļūdeņražu nekustīgo fāzi. Ķīmisko vielu maisījumi eluējas to hidrofobitātes secībā, vispirms eluējas ūdenī šķīstošās vielas, bet pēc tam – eļļās šķīstošās vielas proporcionāli to sadalīšanās koeficientam ogļūdeņražos/ūdenī. Tas rada iespējas noteikt aiztures laika sakarību šādā (apgriezto fāžu) kolonnā ar sadalīšanās koeficientu n-oktanolā/ūdenī. Sadalīšanās koeficientu nosaka pēc ietilpības koeficienta k, kuru aprēķina šādi: k=tr-toto kur tR = ir nosakāmās vielas aiztures laiks un to = ir vidējais laiks, kādā šķīdinātāja molekula iziet cauri kolonnai (tukšais laiks). Kvantitatīva noteikšana nav vajadzīga, un ir jānosaka tikai eluēšanās laiki.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI

1.5.

1.5.1. Atkārtojamība

1.5.1. Kolbu kratīšanas metode

Lai nodrošinātu precīzu sadalīšanās koeficienta noteikšanu, jāveic divi mērījumi trīs dažādos režīmos, turklāt var mainīt pārbaudāmās vielas daudzumu un šķīdinātāju tilpumu attiecību. Eksperimentāli noteiktā sadalīšanās koeficienta decimāllogaritmu atšķirības nedrīkst pārsniegt ±0,3 log vienības.

Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas metode

Lai paaugstinātu mērījumu rezultātu ticamību, noteikšana jāveic divos atkārtojumos. Pēc atsevišķiem mērījumiem noteikto log P vērtību atšķirības nedrīkst pārsniegt ±0,1 log vienības.

1.5.2. Jutība

1.5.2. Kolbu kratīšanas metode

Metodes mērījumu diapazons ir atkarīgs no analītiskās metodes noteikšanas robežas. Tai jādod iespējas noteikt log Pow vērtības robežās no –2 līdz 4 (atsevišķos gadījumos šo intervālu var paplašināt līdz log Pow vērtībām līdz pat 5), ja izšķīdušās vielas koncentrācija kādā no fāzēm nepārsniedz 0,01 mol/l.

Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas metode

Pēc augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas metodes var noteikt sadalīšanās koeficientu log Pow vērtības intervālā no 0 līdz 6. Parasti vielas sadalīšanās koeficientu var noteikt ar precizitāti ± 1 log vienība salīdzinājumā ar kolbu kratīšanas metodi. Korelācijas norādītas literatūras avotos (4) (5) (6) (7) (8). Parasti augstāku precizitāti panāk, ja korelācijas grafikiem izmanto līdzīgas struktūras savienojumus (9).

1.5.3. Specifiskums

1.5.3. Kolbu kratīšanas metode

Nernsta sadalījuma likums attiecas tikai uz atšķaidītiem šķīdumiem, kuru temperatūra, spiediens un pH līmenis ir nemainīgi. To var droši piemērot tīrai vielai, kas sadalījusies starp diviem tīriem šķīdinātājiem. Ja vienā vai abās fāzēs vienlaicīgi atrodas vairākas izšķīdušas vielas, tas var ietekmēt iegūtos rezultātus. Šķīdumā esošo molekulu disociācijas vai asociācijas dēļ novēro atkāpes no Nernsta sadalījuma likuma. Par šādām atkāpēm liecina tas, ka sadalījuma koeficients kļūst atkarīgs no šķīduma koncentrācijas. Tā kā vienlaikus iestājas vairāki sadalījuma līdzsvari, šī metode bez attiecīgas korekcijas nav izmantojama jonizējamiem savienojumiem. Šajā gadījumā var mēģināt ūdens vietā izmantot buferšķīdumus; buferšķīduma pH vismaz par 1 pH vienību jāatšķiras no vielas pKa, un jāņem vērā šā pH ietekme uz vidi.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Sadalīšanās koeficienta orientējoša noteikšana Sadalīšanās koeficientu vēlams noteikt pēc aprēķinu metodes (skatīt 1. papildinājumu) vai attiecīgos gadījumos pēc testējamās vielas šķīdības tīros šķīdinātājos (10).

1.6.2. Kolbu kratīšanas metode

1.6.2.

1.6.2.1. Sagatavošana n-oktanols: sadalīšanās koeficienta noteikšanai izmanto ļoti tīru analītisko reaģentu. Ūdens: izmanto stikla vai kvarca destilācijas aparātā iegūtu destilētu vai bidestilētu ūdeni. Piemērotos gadījumos jonizējamu vielu sadalīšanās koeficienta noteikšanai ūdens vietā jāizmanto buferšķīdumi. Piezīme Nedrīkst izmantot ūdeni, kas tieši iegūts, izmantojot jonu apmaiņas sveķus.

1.6.2.1.

1.6.2.1.1. Šķīdinātāju iepriekšēja piesātināšana Pirms noteikt sadalīšanās koeficientu, šķīdinātāju sistēmas fāzes tiek savstarpēji piesātinātas, kratot noteikšanas temperatūrā. Šim nolūkam iesaka mehāniskajā kratītājā uz 24 stundām ievietot divas lielas pudeles ar analītiski ļoti tīru n-oktanolu vai ūdeni, kam pietiekamā daudzumā pievienots arī otrs šķīdinātājs, un pēc tam nostādina, lai fāzes sadalītos un iestātos piesātinājums.

1.6.2.1.2. Sagatavošanās noteikšanai Divfāžu sistēma pēc tilpuma piepilda gandrīz visu izmēģinājuma trauku. Šādi var novērst vielas iztvaikošanas zudumus. Izmantojamo vielu tilpumu attiecību un daudzumu izvēlas, pamatojoties uz: Jāveic trīs izmēģinājumi. Pirmajā izmanto aprēķināto n-oktanola un ūdens attiecību; otrajā šo attiecību samazina uz pusi; trešajā to divas reizes palielina (piemēram, 1:1, 1:2, 2:1).

sadalīšanās koeficienta orientējošu novērtējumu (skatīt iepriekš),

nosakāmās vielas minimālo daudzumu, kas nepieciešams analīzes veikšanai, un

maksimālās koncentrācijas ierobežojumiem abām fāzēm, kas ir 0,01 mols/l.

1.6.2.1.3. Pārbaudāmā viela Pagatavo vielas standartšķīdumu n-oktanolā, kas piesātināts ar ūdeni. Standartšķīduma faktisko masas koncentrāciju nosaka precīzi, pirms to izmanto sadalīšanās koeficienta noteikšanai. Šo šķīdumu glabā apstākļos, kuros tiek nodrošināta to stabilitāte.

1.6.2.2. Pārbaudes apstākļi Pārbaudes laikā jānodrošina nemainīga (± 1 oC) temperatūra no 20 līdz 25 oC diapazonā.

1.6.2.3. Mērījumu procedūra

1.6.2.3.

1.6.2.3.1. Sadalījuma līdzsvara iestāšanās Izmantošanai katrā noteikšanas režīmā sagatavo divus izmēģinājuma traukus, kas satur abus šķīdinātājus precīzi nomērītā daudzumā, kā arī standartšķīdumu vajadzīgā daudzumā. n-oktanola fāzes mēra pēc tilpuma. Abi izmēģinājuma trauki jāievieto kratītājā vai tie jākrata ar roku. Izmantojot centrifūgas mēģenes, tās ieteicams ātri griezt par 180o ap šķērsasi tā, lai tajās esošais gaiss paceltos cauri abām fāzēm. Pieredze liecina, ka sadalīšanās līdzsvars iestājas pēc apmēram 50 šādiem apgriezieniem. Precizitātes labad ieteicams izdarīt 100 šādus apgriezienus piecu minūšu laikā.

1.6.2.3.2. Fāžu atdalīšana Lai atdalītu fāzes, maisījums jācentrifugē. Šim nolūkam izmanto laboratorijas centrifūgu istabas temperatūrā vai, ja centrifūgai nav termostata, centrifūgas stobriņi pirms analīzes vismaz vienu stundu jāuzglabā noteikšanas temperatūrā, lai atkal iestātos līdzsvars.

1.6.2.4. Analīze Lai iegūtu sadalījuma koeficientu, ir jānosaka pārbaudāmās vielas koncentrācija abās fāzēs. To var izdarīt, paņemot no katras mēģenes visos pārbaudes režīmos alikvoto daļu no abām fāzēm un analizējot tās pēc izvēlētās metodes. Aprēķina vielas kopējo daudzumu abās fāzēs un salīdzina to ar sākotnēji ievadīto vielas daudzumu. Ūdens fāzes paraugi jāņem tā, lai samazinātu iespējas paraugā iekļūt n-oktanolam: ūdens fāzes paraugu ņemšanai var izmantot stikla šļirci ar maināmu adatu. Sākumā šļircei jābūt daļēji piepildītai ar gaisu. Gaisu lēni izspiež, adatu vadot caur oktanola slāni. Šļircē iesūc vajadzīgo ūdens fāzes daudzumu. Šļirci ātri izvelk no šķīduma un noņem adatu. Šļirces saturu var izmantot par ūdens fāzes paraugu. Vielas koncentrāciju abās atdalītajās fāzēs vēlams noteikt ar attiecīgajai vielai piemērotu metodi. Iespējamās analīžu metodes ir:

fotometriskās metodes,

gāzu hromatogrāfija,

augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija.

1.6.3. Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas metode

1.6.3.

1.6.3.1. Sagatavošana

1.6.3.1. Aprīkojums

Ar sūkni, kas nerada pulsācijas, aprīkots šķidruma hromatogrāfs ar piemērotu detektēšanas ierīci. Ieteicams izmantot inžekcijas vārstu ar inžektora cilpu. Polāru grupu klātbūtne nekustīgajā fāzē var nopietni pasliktināt kolonnas darbības efektivitāti. Tāpēc nekustīgajā fāzē jābūt iespējami mazam polāro grupu saturam (11). Var izmantot gatavas nopērkamas kolonnas ar pildījumu vai mikrodaļiņu apgrieztās fāzes pildījumu. Starp inžekcijas sistēmu un analītisko kolonnu var uzstādīt aizsargkolonnu.

Kustīgā fāze

Eluentu pirms lietošanas degazē, un tā pagatavošanai izmanto HPLC tīrības pakāpes metanolu un HPLC tīrības pakāpes ūdeni. Izmanto izokrātisko eluēšanu. Jāizmanto metanola/ūdens maisījumi ar minimālo ūdens saturu 25 %. Parasti ar metanola-ūdens maisījumu 3:1 (v/v) stundas laikā ar plūsmas ātrumu 1 ml/min eluējas savienojumi, kuru log P ir 6. Savienojumiem ar augstu log P vērtību (un arī standartvielām) eluēšanas laiks var būt jāsamazina, samazinot kustīgās fāzes polaritāti vai kolonnas garumu. Vielām ar ļoti zemu šķīdību n-oktanolā pēc augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas metodes nosaka stipri pazeminātas log Pow vērtības; šādu vielu signāli dažkārt ir kopā ar šķīdinātāja fronti. Iespējams, tas ir tādēļ, ka sadalīšanās process notiek pārāk lēni, lai sasniegtu līdzsvaru laikā, kādā parasti augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijā notiek sadalīšanās pa fāzēm. Šādos gadījumos ticamas vērtības noteikšanai var noderēt plūsmas ātruma un/vai metanola/ūdens attiecības samazināšana. Lai nosakāmo vielu un standartvielu varētu detektēt, tām jābūt pietiekamā koncentrācijā šķīstošām kustīgajā fāzē. Piedevas metanola-ūdens maisījumam izmanto tikai izņēmuma gadījumos, jo piedevu ietekmē mainās kolonnas īpašības. Hromatogrammām ar piedevām obligāti jāizmanto tāda paša veida atsevišķa kolonna. Ja metanola-ūdens maisījumu nevar izmantot, var lietot citus maisījumus, piemēram, etanola ūdens vai acetonitrila-ūdens maisījumu. Jonizējamiem savienojumiem ļoti svarīgs eluenta pH. Tam jābūt kolonnas pH darbības intervālā, kas parasti ir no 2 līdz 8. Ieteicams izmantot buferšķīdumus. Jāraugās, lai nenotiktu sāļu nogulsnēšanās un kolonnas bojāšanās, kuru izraisa daži organiskās fāzes/buferu maisījumi. Nav ieteicams augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijai izmantot nekustīgās fāzes uz silīcija dioksīda bāzes ar pH virs 8, jo bāziska kustīgā fāze var izraisīt strauju kolonnas efektivitātes pasliktināšanos.

Šķīdumi

Jāizmanto iespējami tīras standartvielas. Kalibrēšanai izmantojamās vielas, ja iespējams, jāšķīdina kustīgajā fāzē.

Pārbaudes apstākļi

Mērījumu laikā temperatūra nedrīkst mainīties vairāk par ± 2 K.

1.6.3.2. Mērījumi

1.6.3.2. Tukšā laika t0 aprēķināšana

Tukšo laiku t0 var noteikt, izmantojot homologu sērijas (piemēram, n-alkilmetilketonus) vai organiskos savienojumus, kas netiek aizturēti (piemēram, tiourīnviela vai formamīds). Tukšā laika t0 aprēķināšanai, izmantojot homologus, injicē vismaz septiņus homologus un nosaka to aiztures laikus. Neapstrādātus aiztures laikus tr (nc+ 1) izsaka kā tr (nc) funkciju, izmantojot regresijas vienādojuma brīvo locekli a un virziena koeficientu b: tr (n c + 1) = a + b tr (n c) (nc = ir oglekļa atomu skaits). Tukšo laiku t0 tad aprēķina šādi: to = a/(l – b)

Kalibrēšanas līkne

Nākamais posms ir attiecīgajām standartvielām noteikt log k korelāciju ar log P vērtībām. Praktiski vienlaicīgi injicē un nosaka aiztures laikus 5 līdz 10 tādām standartvielām, kuru log P ir sagaidāmajā intervālā, vēlams izmantot reģistrējošu integratoru, kas savienots ar detektēšanas sistēmu. Aprēķina ietilpības koeficientu k attiecīgos logaritmus, kurus izsaka kā log P funkciju, kas noteikta pēc kolbu kratīšanas metodes. Kalibrēšanu veic regulāri vismaz reizi dienā tā, lai varētu ņemt vērā iespējamās kolonnas efektivitātes izmaiņas.

Testējamās vielas ietilpības koeficienta noteikšana

Testējamo vielu injicē iespējami mazā kustīgās fāzes daudzumā. Nosaka aiztures laiku (divos atkārtojumos), pēc kura aprēķina ietilpības koeficientu k. Pēc standartvielu korelācijas grafika interpolē nosakāmās vielas sadalīšanās koeficientu. Ļoti zemas un ļoti augstas sadalīšanās koeficienta vērtības ir jānosaka ekstrapolējot. Šādos gadījumos īpaša vērība jāveltī regresijas līnijas ticamības robežām.

2. DATI

2. Kolbu kratīšanas metode

Noteikto P vērtību ticamību var pārbaudīt, salīdzinot divu mērījumu vidējo vērtību ar kopējo vidējo vērtību.

3. PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

precīzs vielas apraksts (raksturojums un piemaisījumi),

gadījumos, kad aprakstītās metodes nav izmantojamas (piemēram, virsmaktīvām vielām), norāda aprēķināto vērtību vai novērtējumu pēc šķīdības atsevišķi n-oktanolā un ūdenī,

visa informācija un piezīmes, kas vajadzīgas uzdoto rezultātu interpretēšanai, īpaši dati par piemaisījumiem un vielas agregātstāvokli.

orientējošas noteikšanas rezultāti, ja tā veikta,

temperatūra noteikšanas laikā,

dati par analītisko metodi, kas izmantota koncentrācijas noteikšanai,

centrifugēšanas ilgums un ātrums, ja to izmanto,

noteiktās koncentrācijas abās fāzēs katrai noteikšanai (tas nozīmē, ka pavisam jānorāda 12 koncentrācijas),

nosakāmās vielas masa, katras fāzes tilpums katrā izmēģinājuma traukā un pārbaudāmās vielas kopējais aprēķinātais daudzums katrā fāzē pēc līdzsvara iestāšanās,

pārskatā jāiekļauj aprēķinātās sadalīšanās koeficienta (P) vērtības katrā pārbaudes režīmā, kā arī mērījumu rezultātu vidējās vērtības. Ja var secināt, ka sadalīšanās koeficients ir atkarīgs no koncentrācijas, tas jānorāda protokolā,

jānorāda atsevišķo P vērtību standartnovirzes no vidējās vērtības,

jānorāda arī visu mērījumu vidējās P vērtības decimāllogaritms,

aprēķinātā teorētiskā Pow vērtība, ja tāda ir noteikta vai ja mērījumu rezultāts ir > 104,

izmantotā ūdens un ūdens fāzes pH līmenis eksperimenta laikā,

ja izmanto buferšķīdumus, jāpamato, kāpēc tie izmantoti ūdens vietā, buferšķīdumu sastāvs, koncentrācija un pH, ūdens fāzes pH noteikšanas sākumā un beigās.

orientējošas noteikšanas rezultāti, ja tā veikta,

nosakāmā viela, standartvielas, to tīrība,

noteikšanas temperatūru intervāls,

pH, kādā veikta noteikšana,

analītiskās kolonnas un aizsargkolonnas, kustīgās fāzes un detektēšanas līdzekļu apraksts,

kalibrēšanai izmantoto standartvielu aiztures laiku un literatūrā norādītās log P vērtības,

regresijas (log k atkarībā no log P) dati,

testējamās vielas vidējais aiztures laiks un interpolētā log P vērtība,

iekārtas un tās darbības režīma apraksts,

eluēšanās raksturojums,

kolonnā ievadītie testējamās vielas un standartvielu daudzumi,

tukšais laiks un tā noteikšanas paņēmiens.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, Vol. 80, p. 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, Vol. 12, 219 (1981). B. McDuffie, Chemosphere, 1981, Vol. 10, p. 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, Vol. 247, p. 1. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, Vol. 7, p. 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, Vol. 15, p. 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223–339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, Vol. 14, p. 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, Vol. 71, p. 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, Vol. 12, p. 1459. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, Vol. 71, p. 525. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, Vol. 16, p. 1207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, Vol. 8, p. 1113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, Vol. 10, p. 382. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984, Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Base1, 1978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, Vol. 19, p. 615.

A.9. UZLIESMOŠANAS TEMPERATŪRA

A.9.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Pirms šīs pārbaudes veikšanas ir lietderīgi jau iepriekš iegūt informāciju par vielas uzliesmojamību. Šī metode ir izmantojama šķidrumiem, kuru tvaiki var uzliesmot aizdegšanās avotu ietekmē. Ar šeit aplūkotajām noteikšanas metodēm var iegūt ticamus rezultātus tikai tajā uzliesmošanas temperatūras diapazonā, kas noteikts katrai atsevišķai metodei. Izraugoties noteikšanas metodi, jāņem vērā iespējas notikt ķīmiskām reakcijām starp vielu un paraugu turētāju.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Uzliesmošanas temperatūra ir zemākā atmosfēras spiedienam 101,325 kPa koriģētā temperatūra, kurā testēšanas metodē definētajos apstākļos no šķidruma izdalās tvaiki tādā daudzumā, ka testēšanas traukā veidojas uzliesmojošs tvaika/gaisa maisījums. Mērvienības: oC t = T – 273,15 (t atbilst oC, bet T norādīts K mērvienībās)

1.3. STANDARTVIELAS Testējot jaunu vielu, ne visos gadījumos jāizmanto standartvielas. Tās galvenokārt izmanto metodes izpildījuma periodiskām pārbaudēm un pēc dažādām metodēm iegūto rezultātu salīdzināšanai.

1.4. METODES PRINCIPS Vielu pārnes testēšanas traukā un silda vai dzesē līdz testēšanas temperatūrai konkrētajā testēšanas metodē noteiktajā kārtībā. Lai pārliecinātos, vai paraugs testēšanas temperatūrā aizdegas, veic aizdedzināšanas mēģinājumus.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI

1.5.

1.5.1. Atkārtojamība Atkārtojamība ir atkarīga no uzliesmošanas temperatūras intervāla un izmantotās noteikšanas metodes; līdz 2 oC.

1.5.2. Jutība Jutība ir atkarīga no izmantotās noteikšanas metodes.

1.5.3. Specifiskums Dažas noteikšanas metodes izmantojamas tikai noteiktā uzliesmošanas temperatūras diapazonā un ir atkarīgas no vielas īpašībām (piemēram, no viskozitātes).

1.6. METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Sagatavošanās Testējamās vielas paraugu ievieto noteikšanas iekārtā saskaņā ar 1.6.3.1. un/vai 1.6.3.2. punktu. Drošības labad, testējot stipri iedarbīgas vai toksiskas vielas, ieteicams izmantot nelielu paraugu – apm. 2 cm3.

1.6.2. Noteikšanas apstākļi Ciktāl tas atbilst drošības prasībām, aparātam jāatrodas vietā, kur nedarbojas velkme un kas ir pasargāta no caurvēja.

1.6.3. Noteikšana

1.6.3.

1.6.3.1. Līdzsvara metode Skatīt standartus ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2. Bezlīdzsvara metode

1.6.3.2. Ābela iekārta

Skatīt BS 2000 (170. daļa), NF M07-011, NF T66-009.

Ābela-Penska iekārta

Skatīt standartus EN 57, DIN 51755 1. daļu (temperatūras diapazons 5–65 oC), DIN 51755 2. daļu (temperatūra zem 5 oC), NF M07-036.

Taga iekārta

Skatīt ASTM D 56.

Penska-Martensa iekārta

Skatīt standartus ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Piezīmes

Ja ar 1.6.3.2. punktā minēto bezlīdzsvara metodi noteiktā uzliesmošanas temperatūra ir 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC, 55 ± 2 oC, tā jāapstiprina ar līdzsvara metodi, izmantojot to pašu iekārtu. Publicēšanai izmantojamas tikai tādas noteikšanas metodes, pēc kurām var sasniegt uzliesmošanas temperatūru. Uzliesmošanas temperatūras noteikšanai viskoziem šķidrumiem (krāsām, sveķiem u. c.), kas satur šķīdinātājus, jālieto tikai tādas iekārtas un noteikšanas metodes, kuras ir izmantojamas viskozu šķidrumu uzliesmošanas temperatūras noteikšanai. Skatīt standartus ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 1. daļu.

2. IEGŪTIE DATI

3. PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

precīzs vielas apraksts (identifikācija un piemaisījumi),

izmantotā metode, kā arī pieļautās atkāpes no tajā noteiktajām prasībām,

rezultāti un papildu piezīmes, kas vajadzīgas rezultātu interpretācijai.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Nav.

A.10. UZLIESMOŠANAS SPĒJA (CIETAS VIELAS)

A.10.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Pirms šīs pārbaudes veikšanas ir lietderīgi jau iepriekš iegūt informāciju par testējamās vielas iespējamo sprādzienbīstamību. Šī metode izmantojama tikai pulverveida, granulu un pastveida vielu uzliesmošanas spējas noteikšanai. Lai nebūtu jāiekļauj visas vielas, kuras var aizdegties, bet tikai tās, kuras ātri uzliesmo vai kuru degšanas process ir īpaši bīstams, uzskata, ka pie viegli uzliesmojošām vielām pieskaitāmas tikai tādas vielas, kuru degšanas ātrums pārsniedz noteiktu robežvērtību. Tas var būt īpaši bīstami, ja kvēlošana izplatās cauri metāla pulverim tāpēc, ka uguns ir grūti nodzēšama. Metālu pulveri jāuzskata par ļoti uzliesmojošiem, ja to masā noteiktu laiku notiek kvēlošana.

1.2. DEFINĪCIJA UN MĒRVIENĪBAS Degšanas ilgumu norāda sekundēs.

1.3. STANDARTVIELAS Nav norādītas.

1.4. METODES PRINCIPS Vielu izveido vismaz 250 mm garas nepārtrauktas sloksnes vai pulvera joslas veidā, un vispirms veic orientējošu testu, aizdedzinot ar gāzes degļa liesmu, lai noteiktu, vai uguns izplatās ar liesmu vai gruzdot. Ja uguns 200 mm attālumā izplatās noteiktā laikā, testēšanu veic pēc pilnas programmas, lai noteiktu degšanas ātrumu.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav noteikti.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Orientējoša noteikšana Uz nedegošas pamatplates no materiāla bez porām un zemu siltumvadītspēju vielu izveido vismaz 250 mm garas, 20 mm platas un 10 mm nepārtrauktas sloksnes vai pulvera joslas veidā. Pulvera joslu vienā galā dedzina ar karstu gāzes degļa liesmu (minimālais diametrs – 5 mm), līdz pulveris aizdegas, bet ne ilgāk par 2 minūtēm (5 minūtes metālu vai metālu sakausējumu pulveriem). Jānovēro, vai uguns 200 mm joslā izplatās 4 minūšu laikā (40 minūšu laikā metālu pulveriem). Ja viela neaizdegas un uguns neizplatās, degot ar liesmu vai gruzdot 200 mm garumā 4 minūšu (vai 40 minūšu) testēšanas laikā, viela nav uzskatāma par viegli uzliesmojošu un tā vairs nav jātestē. Ja vielā izplatās uguns pulvera joslā 200 mm garumā par 4 minūtēm īsākā laikā vai ātrāk nekā 40 minūtēs metāla pulveros, jāveic turpmāk aprakstītā procedūra (1.6.2. un turpmākajos punktos).

1.6.2. Degšanas ātruma noteikšana

1.6.2.

1.6.2.1. Sagatavošana Pulverveida vielas vai vielas granulu veidā nesablīvējot iepilda 250 mm garā veidnē ar trijstūra šķērsgriezumu, kuras iekšējais augstums ir 10 mm, bet platums – 20 mm. Veidnes abās pusēs garenvirzienā sānu norobežošanai piestiprina divas metāla plāksnes, kuras izvirzītas 2 mm virs trijstūra šķērsgriezuma (skatīt attēlu). Tad veidni ar pārbaudāmo vielu trīs reizes met uz cietas virsmas no 2 cm augstuma. Vajadzības gadījumā veidni pēc tam atkal piepilda. Tad noņem sānu norobežojumus un vielas pārākumu noņem. Veidnei uzliek pamatplati no nedegama materiāla bez porām un zemu siltuma vadītspēju, apgriež otrādi un veidni noņem. Pastveida vielas izlīdzina uz pamatplates no nedegama materiāla bez porām un zemu siltuma vadītspēju 250 mm gara valnīša veidā ar apmēram 1 cm2 šķērsgriezumu.

1.6.2.2. Pārbaudes apstākļi Higroskopiskas vielas pārbauda cik vien ātri iespējams, uzreiz pēc izņemšanas no taras.

1.6.2.3. Pārbaudes norise Pārbaudāmās vielas valnīti ievieto velkmes skapī perpendikulāri gaisa plūsmai. Gaisa plūsmas ātrumu noteikšanas laikā izmainīt nedrīkst, un tam jābūt pietiekami lielam, lai dūmi neiekļūtu laboratorijā. Ap iekārtu jānovieto ekrāns, kas to aizsargā no gaisa plūsmas. Valnīti no viena gala aizdedzina ar karstu gāzes degļa liesmu (minimālais diametrs – 5 mm). Kad valnītis nodedzis 80 mm garumā, reģistrē nākamo 100 mm degšanas ilgumu. Noteikšanu veic sešas reizes, katru reizi ņemot jaunu tīru plati, ja pozitīvs rezultāts netiek novērots ātrāk.

2. DATI Novērtēšanai izmanto orientējošā izmēģinājumā (1.6.1.) noteikto degšanas ilgumu un īsāko no sešās noteikšanas reizēs (1.6.2.3.) noteiktajiem degšanas ilgumiem.

3. PĀRSKATS

3.

3.1. TESTĒŠANAS PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

precīzs vielas apraksts (raksturojums un piemaisījumi),

testējamās vielas apraksts, tās fizikālais stāvoklis un mitruma saturs,

skrīninga orientējošās testēšanas rezultāti un degšanas ātrums, ja tas noteikts,

visas papildu piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju.

3.2. REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA Pulverveida, granulētas un pastveida vielas uzskatāmas par viegli uzliesmojošām, ja degšanas laiks, kas noteikts pēc 1.6.2. punktā aprakstītās procedūras, ir mazāks par 45 sekundēm. Metālu vai to sakausējumu pulveri ir pieskaitāmi pie viegli uzliesmojošām vielām, ja tie spēj aizdegties un liesma vai reakcijas zona aptver visu paraugu ne ilgāk kā 10 minūtēs.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

A.11. UZLIESMOŠANAS SPĒJA (GĀZĒM)

A.11.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Pēc šīs metodes nosaka, vai gāzu maisījumi ar gaisu istabas temperatūrā (apm. 20 oC) un atmosfēras spiedienā ir uzliesmojoši un, ja tie ir uzliesmojoši, tad kādā koncentrāciju intervālā. Palielinot testējamās gāzes koncentrāciju gaisā, pārbauda, kā maisījums reaģē uz elektrisku dzirksteli, un novēro, vai notiek aizdegšanās.

1.2. DEFINĪCIJA UN MĒRVIENĪBAS Uzliesmošanas intervāls ir koncentrāciju intervāls starp apakšējo un augšējo sprādzienbīstamības robežu. Apakšējā un augšējā sprādzienbīstamības robeža ir uzliesmojošas gāzes tāda robežkoncentrācija gaisā, kurā liesma tālāk neizplatās.

1.3. STANDARTVIELAS Nav noteiktas.

1.4. METODES PRINCIPS Gāzes koncentrāciju gaisā pakāpeniski palielina un pēc katras palielināšanas pārbauda, kā maisījums reaģē uz elektrisku dzirksteli.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav noteikti.

1.6. TESTA METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Aprīkojums Testēšanas trauks ir otrādi apgriezts stikla cilindrs ar minimālo iekšējo diametru 50 mm un minimālo augstumu 300 mm. Attālums starp aizdedzināšanas elektrodiem ir 3 līdz 5 mm, un tie novietoti 60 mm attālumā no cilindra apakšas. Cilindrs ir aprīkots ar liekā spiediena vārstuli. Iekārta ir jānodrošina ar aizsargvairogu, lai samazinātu sprādziena radītos bojājumus. Kā aizdegšanās avots kalpo indukcijas dzirkstele, kuras ilgums ir 0,5 s un ko ģenerē augstsprieguma transformators ar izejas spriegumu 10–15 kV (maksimālā ieejas jauda 300 W). Noteikšanai piemērota aparatūra aprakstīta (2).

1.6.2. Pārbaudes apstākļi Testēšanu veic istabas temperatūrā (apm. 20 oC).

1.6.3. Pārbaudes norise Ar dozētājsūkņa palīdzību stikla cilindrā ievada noteiktas koncentrācijas gāzes un gaisa maisījumu. Maisījumā uzšķiļ dzirksteli un novēro, vai liesma spēj atdalīties no aizdegšanās avota un patstāvīgi izplatīties tālāk. Gāzes koncentrāciju pakāpeniski palielina par 1 tilp. %, līdz notiek aizdegšanās iepriekš aprakstītajā veidā. Ja gāzveida vielas ķīmiskā struktūra liecina, ka tā varētu nebūt uzliesmojoša, un ir iespējams aprēķināt stehiometrisko attiecību maisījumam ar gaisu, pakāpeniski ar soli 1 tilp. % testē maisījumus, kuru koncentrācija ir 10 % virs un zem stehiometriskās attiecības.

2. DATI Liesmas izplatīšanās ir vienīgais drošais rādītājs šīs īpašības noteikšanai.

3. PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

precīzs vielas apraksts (raksturojums un piemaisījumi),

izmantotās iekārtas apraksts, norādot tās izmērus,

temperatūra, kurā veikta testēšana,

pārbaudītās koncentrācijas un iegūtie rezultāti,

pārbaudes rezultāts: gāze nav uzliesmojoša vai ir viegli uzliesmojoša,

ja izdarīts secinājums, ka gāze nav uzliesmojoša, norāda koncentrāciju intervālu, kurā tā testēta ar soli 1 tilp. %,

protokolā jānorāda informācija un piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju.

4.(1)(2) IZMANTOTĀ LITERATŪRA NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse – einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing. – Tech. 1984, Vol. 56, 2, p. 126–127. Wortmann, T.Redeker und H.Schacke. Entwicklung.

A.12. UZLIESMOŠANAS SPĒJA (KONTAKTĀ AR ŪDENI)

A.12.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Ar šo metodi var noteikt, vai, vielai reaģējot ar ūdeni, bīstamā daudzumā izdalās viegli uzliesmojošas gāzes. Šo metodi var izmantot gan cietu vielu, gan šķidrumu uzliesmošanas spējas noteikšanai. Šī metode nav izmantojama tādu vielu testēšanai, kuras spontāni aizdegas saskarē ar gaisu.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Viegli uzliesmojošas vielas: vielas, kas saskarē ar ūdeni vai mitru gaisu izdala viegli uzliesmojošas gāzes bīstamā daudzumā vismaz 1 l/kg stundā.

1.3. METODES PRINCIPS Vielu testē posmos turpmāk aprakstītajā secībā; ja notiek aizdegšanās, testēšana nākamajos posmos nav jāturpina. Ja zināms, ka viela ar ūdeni strauji nereaģē, testēšanu veic, kā aprakstīts 4. posmā (1.3.4.).

1.3.

1.3.1. 1. posms Testējamo vielu ievieto tvertnē ar destilētu ūdeni 20 oC temperatūrā un pārbauda, vai izdalījusies gāze aizdegas.

1.3.2. 2. posms Testējamo vielu uzliek uz filtrpapīra, kas peld traukā ar destilētu ūdeni 20 oC temperatūrā, un pārbauda, vai izdalījusies gāze aizdegas. Filtrpapīru izmanto tikai tāpēc, lai viela būtu vienkopus, kas palielina aizdegšanās iespējamību.

1.3.3. 3. posms No testējamās vielas izveido apmēram 2 cm augstu kaudzīti 3 cm diametrā. Uz kaudzītes uzpilina ūdeni un pārbauda, vai izdalījusies gāze aizdegas.

1.3.4. 4. posms Testējamo vielu sajauc ar destilētu ūdeni 20 oC temperatūrā un septiņu stundu laikā ik pēc stundas mēra gāzes izdalīšanās ātrumu. Ja gāze izdalās nevienmērīgi vai izdalīšanās ātrums pēc 7 stundām palielinās, mērījumu ilgums jāpagarina, bet ne vairāk kā līdz 5 dienām. Testēšanu var pārtraukt jebkurā laikā, kad gāzes izdalīšanās ātrums kļūst lielāks par 1 l/kg stundā.

1.4. STANDARTVIELAS Nav noteiktas.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav noteikti.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. 1. posms

1.6.1.

1.6.1.1. Pārbaudes apstākļi Testēšanu veic istabas temperatūrā (apm. 20 oC).

1.6.1.2. Pārbaudes norise Nelielu daudzumu (ap 2 mm diametrā) testējamās vielas ievieto tvertnē ar destilētu ūdeni. Novēro, vai i) izdalās gāze un vai ii) notiek gāzes aizdegšanās. Ja novēro gāzes aizdegšanos, turpmāka vielas testēšana nav nepieciešama, jo tad tā ir pieskaitāma bīstamām vielām.

1.6.2. 2. posms

1.6.2.

1.6.2.1. Aprīkojums Jebkurā piemērotā traukā, piemēram, iztvaicēšanas bļodiņā (diametrs 100 mm) ar destilētu ūdeni, uz ūdens virsmas uzliek filtrpapīru.

1.6.2.2. Pārbaudes apstākļi Testēšanu veic istabas temperatūrā (apm. 20 oC).

1.6.2.3. Pārbaudes norise Nelielu daudzumu testējamās vielas (ap 2 mm diametrā) novieto filtrpapīra vidū. Novēro, vai i) izdalās gāze un vai ii) notiek gāzes aizdegšanās. Ja novēro gāzes aizdegšanos, turpmāka vielas testēšana nav nepieciešama, jo tad tā ir pieskaitāma bīstamām vielām.

1.6.3. 3. posms

1.6.3.

1.6.3.1. Pārbaudes apstākļi Testēšanu veic istabas temperatūrā (apm. 20 oC).

1.6.3.2. Pārbaudes norise No testējamās vielas izveido apmēram 2 cm augstu kaudzīti (3 cm diametrā) ar iedobi virsējā daļā. Šajā iedobē iepilina ūdeni un novēro, vai i) izdalās gāze un vai ii) notiek gāzes aizdegšanās. Ja novēro gāzes aizdegšanos, turpmāka vielas testēšana nav nepieciešama, jo tad tā pieskaitāma bīstamām vielām.

1.6.4. 4. posms

1.6.4.

1.6.4.1. Aprīkojums Sastāda attēlā parādīto aparātu.

1.6.4.2. Pārbaudes apstākļi Jāpārliecinās, ka pārbaudāmās vielas iepakojums nesatur pulveri (daļiņu lielums < 500 μm). Ja pulveris veido vairāk nekā 1 tilp. % no kopējā daudzuma vai ja paraugs ir sagulējies, tas pirms testēšanas jāsaberž pulverī, lai samazinātu daļiņu lielumu uzglabāšanas laikā un pirms izmantošanas; citādi viela jātestē veidā, kādā tā saņemta bez papildu sagatavošanas. Testēšana jāveic istabas temperatūrā (20 oC) un atmosfēras spiedienā.

1.6.4.3. Pārbaudes norise Aparāta pilināmajā piltuvē ielej 10 līdz 20 ml ūdens, bet koniskajā kolbā pārnes 10 g testējamās vielas. Ar jebkuriem piemērotiem līdzekļiem mēra izdalījušās gāzes tilpumu. Koniskajā kolbā ielaiž ūdeni, atverot pilināmās piltuves krānu, un iedarbina hronometru. Izdalījušās gāzes daudzumu septiņu stundu laikā mēra ik pēc stundas. Ja šajā laikā izdalītais gāzes daudzums mainās vai arī minētā perioda beigās gāzes izdalīšanās ātrums palielinās, mērījumi jāturpina līdz piecām dienām. Ja mērījumu laikā gāzes izdalīšanās ātrums pārsniedz 1 l/kg stundā, testēšanu var pārtraukt. Testēšana jāveic trīs reizes. Ja gāzes ķīmiskais sastāvs nav zināms, jāveic tās analīze. Ja gāze satur viegli uzliesmojošus komponentus un nav zināms, vai arī pats maisījums ir viegli uzliesmojošs, jāpagatavo tāda paša sastāva maisījums un tas jāpārbauda pēc A.11. nodaļā aprakstītās metodes.

2. DATI Viela uzskatāma par bīstamu, ja:

kādā testēšanas posmā notiek tā pašaizdegšanās vai

izdalās uzliesmojoša gāze ar ātrumu, kas ir lielāks par 1 l/kg vielas stundā.

3. PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

precīzs vielas apraksts (raksturojums un piemaisījumi),

sīkas ziņas par testējamās vielas sagatavošanu uzliesmošanas spējas noteikšanai,

testēšanas rezultāti (1., 2., 3. un 4. posmā),

izdalījušās gāzes sastāvs,

gāzes izdalīšanās ātrums, ja veikts testēšanas 4. posms (1.6.4.),

jebkuras papildu piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju.

4.(1)(2) IZMANTOTĀ LITERATŪRA Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

A.13. CIETVIELU UN ŠĶIDRUMU PIROFORĀS ĪPAŠĪBAS

A.13.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Testēšanas metode izmantojama cietvielām un šķidrām vielām, kurām nelielos daudzumos pēc saskares ar gaisu istabas temperatūrā (apm. 20 oC) notiek to pašaizdegšanās. Šo metodi neizmanto vielām, kurām, lai notiku pašaizdegšanās, jāatrodas kontaktā ar gaisu istabas temperatūrā vai paaugstinātā temperatūrā vairākas stundas vai dienas.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Uzskata, ka vielas ir piroforas, ja tās 1.6. punktā aprakstītajos apstākļos aizdegas vai izraisa pārogļošanos. Var būt vajadzīgs noteikt šķidrumu pašaizdegšanās spēju pēc metodes A.15. Pašaizdegšanās temperatūra (šķidrumiem un gāzēm).

1.3. STANDARTVIELAS Nav norādītas.

1.4. METODES PRINCIPS Cietvielu vai vielu, kas ir šķidruma veidā, pievieno inertam nesējam un uz piecām minūtēm istabas temperatūrā novieto saskarē ar gaisu. Ja vielas, kas ir šķidrumi, neaizdegas, tās absorbē uz filtrpapīra un piecas minūtes istabas temperatūrā (apm. 20 oC) novieto saskarē ar gaisu. Ja cietviela vai šķidrums aizdegas vai pārogļo filtrpapīru, viela uzskatāma par piroforu.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Atkārtojamība: drošības apsvērumu dēļ viela tiek uzskatīta par piroforu, ja tiek iegūts viens pozitīvs rezultāts.

1.6. TESTĒŠANAS METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Aprīkojums Istabas temperatūrā (apm. 20 oC) porcelāna bļodiņā (diametrs apm. 10 cm) iepilda diatomītu, lai tā augstums būtu aptuveni 5 mm. Piezīme Diatomītu vai kādu citu līdzīgu, viegli pieejamu inertu vielu izmanto par augsnes aizstājēju, modelējot augsnes piesārņošanu ar pārbaudāmo vielu avārijas gadījumā. Sauss filtrpapīrs vajadzīgs tādu šķidrumu testēšanai, kuri uz inerta nesēja neaizdegas kontaktā ar gaisu.

1.6.2. Noteikšana

1.6.2. a)

Pulverveida cietvielas Pulverveida vielu (1–2 cm3) ber no aptuveni 1 m augstuma uz ugunsdrošas virsmas un novēro, vai tā aizdegas krītot vai piecu minūšu laikā pēc nosēšanās. Ja nenotiek aizdegšanās, mēģinājumu atkārto sešas reizes.

Šķidrumi Pārbaudāmo šķidrumu (apm. 5 cm3) lej iepriekš sagatavotā porcelāna bļodiņā un piecas minūtes novēro, vai šī viela aizdegas. Ja sešos mēģinājumos aizdegšanās nenotiek, veic šādas pārbaudes: ar šļirci 0,5 ml testējamā parauga pārnes uz robota filtrpapīra un novēro, vai pēc tam piecu minūšu laikā notiek filtrpapīra aizdegšanās vai pārogļošanās. Ja nenotiek aizdegšanās vai pārogļošanās, mēģinājumu atkārto trīs reizes.

2. DATI

2.

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE Pārbaudi var pārtraukt, tiklīdz kādā no pārbaudēm iegūst pozitīvu rezultātu.

2.2. NOVĒRTĒŠANA Viela uzskatāma par piroforu, ja viela piecu minūšu laikā pēc pievienošanas inertam nesējam gaisā aizdegas vai šķidra viela pārogļo vai aizdedzina filtrpapīru gaisa klātienē piecās minūtēs pēc tās uznešanas filtrpapīram.

3. PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

precīzs vielas apraksts (raksturojums un piemaisījumi),

testēšanas rezultāti,

jebkuras papildu piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju.

4.(1)(2) IZMANTOTĀ LITERATŪRA NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14 . SPRĀDZIENBĪSTAMĪBA

A.14

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Metodē aprakstīta testēšanas shēma, pēc kuras nosaka cietvielu un pastveida vielu sprādzienbīstamību, uz tām iedarbojoties liesmai (termiskā jutība) vai triecieniem vai berzei (jutība uz mehānisku iedarbību), un šķidru vielu sprādzienbīstamību, uz tām iedarbojoties ar liesmu vai triecienu. Metode paredz trīs dažādas pārbaudes: Ar šo metodi var iegūt datus, kas ļauj novērtēt eksplozijas iespējamību dažu plaši izplatītu faktoru ietekmē. Metode nav paredzēta, lai noteiktu, vai viela ir sprādzienbīstama jebkuros apstākļos. Metode piemērota, lai noteiktu vielas sprādzienbīstamību (termisko jutību un jutību uz mehānisko iedarbību) konkrētos apstākļos, kas norādīti direktīvā. Tā pamatojas uz pasaulē plaši izmantotiem vairāku veidu aparātiem, ar kuriem iegūst ticamus rezultātus. Tajā pašā laikā ir jāatzīst, ka šī metode nesniedz galīgu atbildi. Var izmantot ne tikai šeit noteiktos, bet arī citus aparātus, ja tie ir starptautiski atzīti un ar tiem iegūtie rezultāti korelē ar rezultātiem, kuri iegūti ar šeit noteiktajiem aparātiem. Testēšana nav jāveic gadījumos, kad ir pieejami termodinamiskie dati (piemēram, rašanās siltums, sadalīšanās siltums) un/vai molekulā nav dažas reaģētspējīgas grupas (2), kas dod pietiekamu pamatu uzskatīt, ka viela nevar strauji sadalīties, izdalot gāzes vai siltumenerģiju (t. i., viela nav sprādzienbīstama). Šķidrumiem nav jāveic tests mehāniskajai jutībai uz berzes iedarbību.

1.1. a)

termiskās jutības pārbaudi (1);

trieciena iedarbības mehāniskās jutības pārbaudi (1);

berzes iedarbības mehāniskās jutības pārbaudi (1).

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Sprādzienbīstamas vielas: vielas, kuras var eksplodēt, uz tām iedarbojoties liesmai, vai kuras ir jutīgas pret trieciena vai berzes iedarbību noteiktajā aparatūrā (vai kuras ir jutīgākas uz mehānisko iedarbību nekā 1,3-dinitrobenzols alternatīvā aparatūrā).

1.3. STANDARTVIELAS Berzes un trieciena iedarbības noteikšanai: 1,3-dinitrobenzols, tehnisks kristālisks produkts, kas iziet cauri 0,5 mm sietam. Berzes un trieciena iedarbības testēšanas otrajai sērijai: perhidro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazīns (RDX, heksogēns, ciklonīts – CAS 121-82-4), pārkristalizēts no cikloheksanona šķīduma ūdenī, un kas mitrā veidā sijājot iziet cauri a 250 μm sietam un paliek uz 150 μm sieta, žāvēts 103 ± 2 oC temperatūrā (četras stundas).

1.4. METODES PRINCIPS Drošu apstākļu noskaidrošanai, testējot jutību pret triju veidu iedarbību, vispirms jāveic orientējošas pārbaudes.

1.4.

1.4.1. Drošas apiešanās pārbaudes (3) Pirms veikt galvenās pārbaudes, drošības apsvērumu dēļ ļoti mazus vielas paraugus (apm. 10 mg) vaļējā veidā silda gāzes degļa liesmā, pakļauj trieciena iedarbībai, izmantojot āmuru un laktu, un berzes iedarbībai jebkāda veida berzes iekārtā. Tas nepieciešamas, lai noskaidrotu, vai viela ir tik jutīga un sprādzienbīstama, ka noteiktie jutības testi, jo īpaši jutība pret paaugstinātas temperatūras iedarbību, ir tik liela, ka jāveic piesardzības pasākumi, lai to laikā neciestu operators.

1.4.2. Termiskā jutība Pēc šīs metodes vielu karsē tērauda caurulē, kas noslēgta ar plāksnēm, kurās ir dažāda diametra atveres, lai noteiktu, vai viela var eksplodēt, intensīvi sildot definēti norobežotā telpā.

1.4.3. Mehāniskā jutība (pret triecienu) Pēc šīs metodes vielu pakļauj trieciena iedarbībai, ko rada noteikta lieluma masa, krītot no noteikta augstuma.

1.4.4. Mehāniskā jutība (pret berzi) Pēc šīs metodes cietvielu vai pastveida vielu pakļauj berzei starp standartvirsmām, ievērojot norādītos slodzes un savstarpējās kustības apstākļus.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav noteikti.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Termiskā jutība (pret liesmas iedarbību)

1.6.1.

1.6.1.1. Aprīkojums Aparāts sastāv no vienreizlietojamas tērauda caurules un atkārtoti izmantojamas noslēgierīces (1. attēls), kas uzstādīta sildierīcei un aizsargierīcei. Caurule ir izvilkta no lokšņu tērauda (skatīt papildinājumu), un tās iekšējais diametrs ir 24 mm, garums 75 mm un sieniņu biezums 0,5 mm. Caurules vaļējam galam ir atloks, pie kura stiprina mezglu, kurā ietilpst plāksne ar atverēm. Tas sastāv no spiedienizturīgas plāksnes ar atverēm, kurā ir centrālā atvere un kura stingri piestiprināta caurulei ar divdaļīgu skrūvju savienojumu (uzgrieznis un vītņsavienojums). Uzgrieznis un vītņsavienojums izgatavoti no hroma-mangāna tērauda (skatīt papildinājumu), kas nerada dzirksteles līdz 800 oC. Atveres plates ir 6 mm biezas, izgatavotas no karstumizturīga tērauda (skatīt papildinājumu) un ir ar dažādu atveres diametru.

1.6.1.2. Testēšanas apstākļi Parasti vielu testē tādā paša veidā, kādā tā saņemta, lai gan dažkārt, piemēram, ja tā ir sapresēta, kausēta vai citādi sablīvēta, var būt vajadzīgs vielu pirms testēšanas sasmalcināt. Cietvielu testēšanai izmantojamā materiāla masu nosaka, izmantojot divpakāpju procedūru pēc sausā paņēmiena. Tarētā caurulē iepilda 9 cm3 vielas, ko sablīvē ar 80 N spēku, ko pieliek visam caurules šķērsgriezumam. Drošības apsvērumu dēļ vai gadījumos, kad parauga fizikālais stāvoklis pēc saspiešanas var izmainīties, var lietot citus uzpildīšanas paņēmienus; piemēram, ja viela ir ļoti jutīga pret berzes iedarbību, to blīvēt nedrīkst. Ja materiāls ir saspiežams, pieliek un sablīvē tā papildu daudzumu, līdz caurule ir piepildīta līdz 55 mm no caurules augšmalas. Nosaka kopējo vielas masu, kas vajadzīga caurules piepildīšanai līdz 55 mm līmenim, un pievieno vēl divas papildu parauga daļas, kuras katru sablīvē ar 80 N spēku. Tad materiālu pēc vajadzības pievieno sablīvējot vai izņem ārā tā, lai caurule būtu piepildīta līdz 15 mm līmenim no augšmalas. Tad veic otru noteikšanu pēc sausā paņēmiena, sākot ar trešdaļu kopējās masas, kas noteikta pirmajā reizē, un to sablīvējot. Pievieno vēl divas parauga daļas, sablīvējot ar 80 N spēku, un vielas līmeni caurulē noregulē līdz 15 mm no augšmalas, pēc vajadzības vielu pievienojot vai izņemot. Katram izmēģinājumam izmanto cietvielas daudzumu, kas noteikts otrajā mēģinājumā pēc sausā paņēmiena; piepildīšanu veic trijās vienādās daļās, katru no tām saspiežot līdz 9 cm3 ar spēku, kas vajadzīgs šādam nolūkam. (To var veikt, izmantojot atstarpes gredzenus.) Šķidrumus un gelus caurulē iepilda līdz 60 mm augstumam, īpaši raugoties, lai gelos neizveidotos tukšumi. Vītņsavienojumu caurulei uzliek no apakšas, ievieto plāksni ar vajadzīgā lieluma atveri, un pēc ieziešanas ar nelielu daudzumu molibdēna disulfīda ziedes pievelk uzgriezni. Noteikti jāpārbauda, vai testējamā viela nav nokļuvusi starp plāksni un atloku vai uz vītnēm. Karsēšanai izmanto propānu no gāzes balona, kas aprīkots ar spiediena reduktoru (60 līdz 70 mbar) un plūsmas mērītāju un tiek vienādi padots uz četriem gāzes degļiem (vizuāli novērtējot pēc degļu liesmas). Degļus novieto apkārt testēšanas kamerai, kā parādīts 1. attēlā. Visu četru degļu kopējais propāna patēriņš ir apmēram 3,2 litri propāna minūtē. Var izmantot citas gāzes un citādus degļus, tomēr karsēšanas ātrumam jāatbilst 3. attēlā norādītajam. Visiem aparātiem periodiski jāpārbauda karsēšanas ātrums, izmantojot caurules ar dibutilftalāta pildījumu, kā parādīts 3. attēlā.

1.6.1.3. Pārbaužu norise Katru noteikšanu veic tik ilgi, līdz caurule pārsprāgst vai caurule ir karsēta piecas minūtes. Tests, kurā caurule sasprāgst vismaz trijās daļās, kuras dažkārt var turēties kopā ar šaurām metāla sloksnēm, kā parādīts 2. attēlā, tiek novērtēts par sprādzienu. Tests, kurā rodas mazāk caurules gabalu vai tā nesaplīst, netiek novērtēts par sprādzienu. Vispirms trīs reizes testu veic, izmantojot plāksni ar atveri 6,0 mm diametrā, un, ja šādā veidā sprādzieni nenotiek, testu veic vēl trīs reizes, izmantojot plāksni ar atveri 2,0 mm diametrā. Jebkurā izmēģinājumu sērijā notiekot sprādzienam, testēšanu turpināt nav vajadzīgs.

1.6.1.4. Vērtēšana Testēšanas rezultāts uzskatāms par pozitīvu, ja sprādziens notiek kādā no iepriekšminēto izmēģinājumu sērijām.

1.6.2. Mehāniskā jutība (pret triecienu)

1.6.2.

1.6.2.1. Aparatūra (4. attēls) Svarīgākās krītošā āmura iekārtas sastāvdaļas ir liets tērauda bloks ar pamatni, lakta, statnis, vadotnes, krītoši atsvari, palaišanas ierīce un parauga turētājs. Tērauda lakta 100 mm (diametrs) × 70 mm (augstums) ir pieskrūvēta tērauda blokam 230 mm (garums) × 250 mm (platums) × 200 mm (augstums) uz lietas pamatnes 450 mm (garums) × 450 mm (platums) × 60 mm (augstums). Statnis, kas izgatavots no izvilktas bezšuves tērauda caurules, tiek iestiprināts turētājā, kas pieskrūvēts tērauda blokam. Ar četrām enkurskrūvēm iekārta piestiprināta masīvam betona blokam 60 × 60 × 60 cm tā, lai vadotņu sliedes būtu pilnīgi vertikālas un krītošie atsvari brīvi kristu. Lietošanai izmantojami 5 un 10 kg masīva tērauda atsvari. Atsvaru triecienvirsma ir no rūdīta tērauda, HRC 60 līdz 63, ar minimālo diametru 25 mm. Testējamo paraugu ievieto triecienierīcē, kura sastāv no diviem vienam virs otra novietotiem koaksiāliem masīva tērauda cilindriem dobā tērauda cilindrveida vadotnē. Masīva tērauda cilindru diametrs ir 10 (-0,003, -0,005) mm un augstums 10 mm, ar pulētām virsmām, noapaļotām šķautnēm (noapaļojuma rādiuss 0,5 mm) un cietību HRC 58 līdz 65. Dobā cilindra ārējam diametram jābūt 16 mm, pulētu urbumu ar izmēru 10 (+0,005, +0,010) mm un augstumu 13 mm. Triecienierīce samontēta uz starplaktas (diametrs 26 mm un augstums 26 mm), kas izgatavota no tērauda un centrēta, izmantojot gredzenu ar izgriezumiem, pa kuriem izplūst dūmiem.

1.6.2.2. Pārbaudes apstākļi Parauga tilpums ir 40 mm3 vai jebkurš tilpums, kas piemērots attiecīgajām alternatīvajām iekārtām. Cietvielas jātestē sausā veidā, un tās sagatavojamas šādi: Vielas, kuras parasti piegādā pastveidā, ja iespējams, jātestē sausas vai jebkurā gadījumā iespējami pilnīgi atdalot atšķaidītāju. Šķidras vielas testē ar 1 mm atstarpi starp augšējo un apakšējo cilindru.

1.6.2.2. a)

vielas pulvera veidā sijā (caur 0,5 mm sietu); testēšanai izmanto visu caur sietu izgājušo materiālu;

presētas, kausētas vai citādi sablīvētas vielas sasmalcina gabaliņos un sijā; testēšanai izmanto daļiņu frakciju ar izmēru 0,5 līdz 1 mm, un tai jāatbilst sākotnējai vielai.

1.6.2.3. Pārbaužu norise Veic sešu izmēģinājumu sēriju, metot 10 kg lielu masu no 0,40 m augstuma (40 J). Ja sešos izmēģinājumos ar 40 J iegūst eksploziju, jāveic vēl seši izmēģinājumi, metot 5 kg masu no 0,15 m augstuma (7,5 J). Citos aparātos paraugu salīdzina ar izraudzīto standartvielu, ievērojot noteiktu procedūru (piemēram, turp un atpakaļ paņēmienu u. c.).

1.6.2.4. Novērtēšana Testēšanas rezultāts uzskatāms par pozitīvu, ja eksplozija (ar aizdegšanos un/vai novērojums, kas uzskatāms par eksploziju) notiek vismaz vienreiz jebkurā no izmēģinājumiem, izmantojot iepriekš noteikto iekārtu, vai paraugs ir jutīgāks pret trieciena iedarbību nekā 1,3-dinitrobenzolu vai RDX (heksogēnu) alternatīvā izmēģinājumā.

1.6.3. Mehāniskā jutība (pret berzi)

1.6.3.

1.6.3.1. Aparatūra (5. attēls) Berzes iekārta sastāv no lietas tērauda pamatplates, kurai uzmontēta berzes ierīce. Tā sastāv no nekustīgas porcelāna kājas un kustīgas plates no porcelāna. Porcelāna plate ir nostiprināta rāmī, kas pārvietojas divās vadotnēs. Rāmi caur savienotājstieni, ekscentra mehānismu un piemērotu pārvadu piedzen elektromotors tā, ka plāksni tikai vienreiz pārvieto turp un atpakaļ un uz priekšu aiz porcelāna kājas 10 mm. Porcelāna kāju var slogot ar, piemēram, 120 vai 360 N. Līdzenās porcelāna plates ir izgatavotas no tehniskā porcelāna (raupjums 9 līdz 32 μm), un to izmēri ir 25 mm (garums) × 25 mm (platums) × 5 mm (augstums). Cilindriskā porcelāna kāja arī ir izgatavota no baltā tehniskā porcelāna, un tā ir 15 mm gara, 10 mm diametrā un raupjām sfēriskām galu virsmām ar noapaļojuma rādiusu 10 mm.

1.6.3.2. Pārbaudes apstākļi Parauga tilpums ir 10 mm3 vai jebkurš tilpums, kas piemērots attiecīgajām alternatīvajām iekārtām. Cietvielas jātestē sausā veidā, un tās sagatavojamas šādi: Ja iespējams, vielas pastu veidā ir jātestē sausas. Ja vielas testēšanai nevar sagatavot sausā veidā, pastas (pēc iespējami pilnīgas atšķaidītāja atdalīšanas) testē ar šablonu sagatavotas plēves veidā, kuras biezums ir 0,5 mm, platums 2 mm, bet garums 10 mm.

1.6.3.2. a)

vielas pulvera veidā sijā (caur 0,5 mm sietu); testēšanai izmanto visu caur sietu izgājušo materiālu;

presētas, kausētas vai citādi sablīvētas vielas sasmalcina gabaliņos un sijā; testēšanai izmanto frakciju ar daļiņu izmēru < 0,5 mm.

1.6.3.3. Pārbaužu norise Porcelāna kāju novieto uz testējamā parauga un slogo. Porcelāna plāksnītē sūkļa atstātajām švīkām pārbaudes laikā jābūt vērstām šķērsvirzienā attiecībā pret kustības virzienu. Jāpārliecinās, ka kāja atspiežas pret paraugu, ka zem kājas ir pietiekami daudz pārbaudāmās vielas un ka plate zem kājas kustas pareizā virzienā. Pastveida vielas platei uzklāj ar 0,5 mm biezuma kalibru, kura spraugas izmērs ir 2 × 10 mm. Porcelāna platei zem porcelāna kājas 0,44 sekunžu laikā jāpārvietojas turp un atpakaļ 10 mm. Plates virsmas daļas un kāju drīkst izmantot tikai vienreiz; katras kājas abi gali izmantojami diviem izmēģinājumiem, bet katra no abām plates virsmām – trijiem izmēģinājumiem. Veic sešu izmēģinājumu sērijas ar 360 N slodzi. Ja šo sešu izmēģinājumu laikā tiek konstatēts pozitīvs rezultāts, veic vēl sešu izmēģinājumu sēriju ar 120 N slodzi. Citos aparātos paraugu salīdzina ar izraudzīto standartvielu, ievērojot noteiktu procedūru (piemēram, turp un atpakaļ paņēmienu u. c.).

1.6.3.4. Novērtēšana Testēšanas rezultāts uzskatāms par pozitīvu, ja eksplozija (krakšķēšana un/vai aizdegšanās novērojums uzskatāmi par eksploziju) notiek vismaz vienreiz jebkurā no izmēģinājumiem, izmantojot iepriekš noteikto berzes iekārtu, vai atbilst ekvivalentiem kritērijiem alternatīvā berzes izmēģinājumā.

2. DATI Viela principā uzskatāma par sprādzienbīstamu direktīvas nozīmē, ja pozitīvs testēšanas rezultāts iegūts termiskajā, trieciena vai berzes izmēģinājumā.

3. PĀRSKATS

3.

3.1. TESTĒŠANAS PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

testējamās vielas identifikācija, sastāvs, tīrība, mitruma saturs u. c.,

parauga fizikālais stāvoklis, norādes par tā sasmalcināšanu un/vai sijāšanu,

termiskās jutības testēšanas laikā veiktie novērojumi (piemēram, parauga masa, fragmentu skaits u. c.),

mehāniskās jutības testēšanas laikā veiktie novērojumi (piemēram, dūmu veidošanās ievērojamā daudzumā, pilnīga sadalīšanās bez atlikuma, uzliesmošana, dzirksteļošana, krakšķēšana u. c.),

visos testēšanas veidos iegūtie rezultāti,

ja izmantota cita iekārta, šādas izvēles zinātniskais pamatojums, kā arī pierādījums tam, ka iegūtie rezultāti ir salīdzināmi ar rezultātiem, kas iegūti ar iekārtu, kura ieteikta šīs pārbaudes veikšanai,

jebkuras noderīgas piezīmes, piemēram, atsauces uz līdzīgu produktu pārbaudēm, kas var noderēt pienācīgai rezultātu interpretācijai,

jebkuras papildu piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju.

3.2. REZULTĀTU NOVĒRTĒŠANA UN INTERPRETĀCIJA Testēšanas pārskatā jānorāda visi rezultāti, kas uzskatāmi par kļūdainiem, netipiskiem vai nereprezentatīviem. Ja kādi rezultāti nav iekļaujami pārskatā, tas jāpaskaidro, kā arī jānorāda visi citos vai papildu izmēģinājumos iegūtie rezultāti. Ja netipisku rezultātu izskaidrot nevar, tas jāpieņem pēc nominālvērtības un pēc tā viela attiecīgi jāklasificē.

4.(1)(2)(3)(4)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, Vol. 3, p. 6–13 and p. 30–42. NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.

A.15. PAŠAIZDEGŠANĀS TEMPERATŪRA (ŠĶIDRUMI UN GĀZES)

A.15.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Šai pārbaudei pakļauj sprādzienbīstamas vielas un vielas, kas saskarē ar gaisu spontāni aizdegas apkārtējā temperatūrā. Testēšanas procedūra izmantojama gāzēm, šķidrumiem un tvaikiem, kuri gaisa klātbūtnē var aizdegties no karstas virsmas. Pašaizdegšanās temperatūra var ievērojami pazemināties katalītisku piemaisījumu klātbūtnē, no virsmas materiāla vai palielinot testēšanas trauka tilpumu.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Pašaizdegšanās spēju raksturo ar pašaizdegšanās temperatūru. Pašaizdegšanās temperatūra ir zemākā temperatūra, kurā testējamā viela aizdegas, kad to sajauc ar gaisu, ievērojot pārbaudes metodē paredzētos apstākļus.

1.3. STANDARTVIELAS Standartvielas norādītas attiecīgajos standartos (skatīt 1.6.3. punktu). Tās galvenokārt izmanto metodes izpildījuma periodiskām pārbaudēm un dažādu metožu salīdzināšanai.

1.4. METODES PRINCIPS Pēc šīs metodes nosaka kameras iekšējās virsmas minimālo temperatūru, kurā notiek kamerā ievadītās gāzes, tvaika vai šķidruma aizdegšanās.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Atkārtojamība ir atkarīga no pašaizdegšanās temperatūras intervāla un izmantotās noteikšanas metodes. Jutība un specifiskums ir atkarīgi no izmantotās metodes.

1.6. TESTA METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Aprīkojums Šī iekārta ir aplūkota 1.6.3. punktā minētās metodes aprakstā.

1.6.2. Pārbaudes apstākļi Vielas paraugu pārbauda pēc metodes, kas minēta 1.6.3. punktā.

1.6.3. Pārbaudes norise Skatīt IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. DATI Reģistrē temperatūru pārbaudes laikā, atmosfēras spiedienu, izmantotā parauga lielumu, laika sprīdi līdz aizdegšanās brīdim.

3. PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

precīzs vielas apraksts (raksturojums un piemaisījumi),

izmantotā parauga lielums, atmosfēras spiediens,

izmantotā iekārta,

mērījumu rezultāti (temperatūra pārbaudes laikā, rezultāti, kas raksturo aizdegšanos, laika sprīdis līdz aizdegšanās brīdim),

jebkuras papildu piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Nav.

A.16. RELATĪVĀS PAŠAIZDEGŠANĀS TEMPERATŪRAS NOTEIKŠANA CIETVIELĀM

A.16.

1. METODE

1.

1.1 IEVADS Šai pārbaudei pakļauj sprādzienbīstamas vielas un vielas, kas saskarē ar gaisu spontāni aizdegas apkārtējā temperatūrā. Šīs pārbaudes mērķis ir iegūt orientējošu informāciju par cietu vielu pašaizdegšanos paaugstinātā temperatūrā. Ja siltumu, kas rodas, vielai reaģējot ar skābekli vai tai eksotermiski sadaloties, pietiekami ātri neuzņem apkārtējā vide, pašsasilšana izraisa pašaizdegšanos. Tāpēc pašaizdegšanās notiek tad, ja siltuma rašanās ātrums pārsniedz siltuma izkliedēšanās ātrumu. Šī metode ir noderīga, veicot cietu vielu orientējošu testēšanu. Ņemot vērā cietu vielu aizdegšanās un degšanas procesa sarežģīto raksturu, pašaizdegšanās temperatūra, ko nosaka ar šo metodi, ir izmantojama tikai salīdzināšanai.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Pašaizdegšanās temperatūra, ko nosaka ar šo metodi, ir viszemākā apkārtējā temperatūra ( oC), kurā aizdegas konkrēts vielas daudzums, kas pakļauts iepriekš noteiktiem apstākļiem.

1.3. STANDARTVIELA Nav.

1.4. METODES PRINCIPS Noteiktu daudzumu testējamās vielas ievieto krāsnī istabas temperatūrā; parauga centrā uzņem temperatūras izmaiņu līkni atkarībā no laika, līdz krāsns temperatūra sasniedz 400 oC, vai līdz kušanas temperatūrai, ja tā ir zemāka, sildot ar ātrumu 0,5 oC/min. Šajā testā par pašaizdegšanās temperatūru uzskata krāsns temperatūru, kurā parauga temperatūra sasniedz 400 oC pašsakaršanas dēļ.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Aprīkojums

1.6.1.

1.6.1.1. Krāsns Laboratorijas krāsns ar programmējamu temperatūru (tilpums ap 2 l) ir aprīkota ar gaisa apmaiņas sistēmu un preteksplozijas vārstu. Lai novērstu iespējamo sprādzienu, vielas sadalīšanās procesā radušās gāzes nedrīkst nonākt kontaktā ar sildelementiem.

1.6.1.2. Stiepļu pinuma kubs Nerūsējoša tērauda stiepļu pinuma sietu ar acu izmēru 0,045 mm sagriež pēc 1. attēlā dotā parauga. Sietu saloka un nostiprina ar stiepli, izveidojot kubu ar vaļēju augšdaļu.

1.6.1.3. Termopāri Piemēroti termopāri.

1.6.1.4. Pašrakstītājs Der jebkurš divkanālu pašrakstītājs, kas kalibrēts 0–600 oC temperatūrai vai attiecīgajam spriegumam.

1.6.2. Pārbaudes apstākļi Vielas testē veidā, kādā tās saņem.

1.6.3. Pārbaudes norise Kubā iepilda pārbaudāmo vielu un pēc vieglas sakratīšanas to papildina, kamēr kubs ir pilns līdz augšai. Paraugu iekar krāsns vidū istabas temperatūrā. Vienu termoelementu novieto krāsns vidū un otru – krāsns temperatūras reģistrēšanai – starp kubu un krāsns sienu. Kamēr krāsns temperatūra pieaug ar ātrumu 0,5 oC/min līdz 400 oC vai līdz cietās vielas kušanas temperatūrai, nepārtraukti reģistrē krāsns un parauga temperatūru. Vielai aizdegoties, parauga termoelements uzrāda ļoti strauju temperatūras pieaugumu virs krāsns temperatūras.

2. DATI Novērtējumam izmanto krāsns temperatūru, kurā paraugs ir sasniedzis 400 oC pašsakaršanas rezultātā (skatīt 2. attēlu).

3. PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

pārbaudāmās vielas apraksts,

mērījumu rezultāti kopā ar temperatūras līkni,

jebkuras papildu piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

4. 1. attēls Pārbaudē izmantojamā 20 mm kuba piegrieztne

2. attēls Raksturīga temperatūras līkne

parauga temperatūra krāsns temperatūra aizdegšanās-temperatūra Laiks

A.17. OKSIDĒJOŠĀS ĪPAŠĪBAS (CIETVIELAS)

A.17.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Pirms šīs pārbaudes veikšanas ir lietderīgi jau iepriekš iegūt informāciju par pārbaudāmās vielas iespējamo sprādzienbīstamību. Šī metode nav izmantojama šķidrumiem, gāzēm, sprādzienbīstamām vai viegli uzliesmojošām vielām un organiskajiem peroksīdiem. Šis tests nav jāveic gadījumos, kad vielas struktūrformula nepārprotami liecina, ka viela nevar stāties eksotermiskās reakcijās ar viegli uzliesmojošiem materiāliem. Lai noskaidrotu, vai pārbaudes gaitā būtu jāievēro īpaša piesardzība, ir jāveic orientējoši izmēģinājumi.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Degšanas ilgums ir reakcijas ilgums sekundēs, kurā reakcijas zona aptver visu paraugu saskaņā ar 1.6. punktā aprakstīto metodi. Degšanas ātrums: izteikts milimetros sekundē. Maksimālais degšanas ātrums: lielākais degšanas ātrums, kas noteikts maisījumiem, kuros ir 10 līdz 90 masas % oksidētāja.

1.3. STANDARTVIELA Testēšanai un orientējošiem izmēģinājumiem par standartvielu izmanto analītiski tīru bārija nitrātu. Par standartmaisījumu izmanto bārija nitrāta (parasti izmanto 60 masas % bārija nitrāta) maisījumu ar celulozes pulveri, kas pagatavots, kā norādīts 1.6. punktā, un kam piemīt maksimālais degšanas ātrums.

1.4. METODES PRINCIPS Orientējošu izmēģinājumu veic drošības apsvērumu dēļ. Papildu testēšana nav jāveic gadījumos, kad orientējošos izmēģinājumos skaidri redzams, ka vielai ir oksidētāja īpašības. Ja tā nenotiek, testēšanu veic pēc pilnas programmas. Šajā gadījumā pārbaudāmo vielu sajauc ar labi zināmu ugunsnedrošu vielu dažādās attiecībās. Pēc tam no katra maisījuma izveido valnīti un no viena gala to aizdedzina. Iegūto maksimālo degšanas ātrumu salīdzina ar standartmaisījuma maksimālo degšanas ātrumu.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Vajadzības gadījumā var izmantot jebkuru smalcināšanas un sajaukšanas paņēmienu, lai panāktu, ka maksimālais degšanas ātrums sešās atsevišķās pārbaudēs neatšķiras no aritmētiskā vidējā vairāk par 10 %.

1.6. TESTA METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Sagatavošana

1.6.1.

1.6.1.1. Pārbaudāmā viela Samazina pārbaudāmā parauga daļiņu lielumu līdz < 0,125 mm, kā tas norādīts tālāk: vielu sijā un rupjo frakciju sasmalcina, šo procedūru atkārto, līdz viss testējamais vielas daudzums iziet caur sietu. Var izmantot jebkuru smalcināšanas un sijāšanas paņēmienu, kas atbilst kvalitātes kritērijiem. Pirms maisījuma pagatavošanas vielu žāvē 105 oC temperatūrā, līdz tās svars kļūst nemainīgs. Ja pārbaudāmās vielas sadalīšanās temperatūra ir zemāka par 105 oC, tā attiecīgi jāžāvē zemākā temperatūrā.

1.6.1.2. Ugunsnedrošā viela Kā ugunsnedrošo vielu izmanto celulozes pulveri. Šim nolūkam der celuloze, kas paredzēta izmantošanai plānslāņa hromatogrāfijā vai kolonnu hromatogrāfijā. Kā rāda pieredze, tā var būt celuloze, kurai 85 % šķiedru ir garumā no 0,020 līdz 0,075 mm. Celulozes pulveri izsijā caur sietu ar acu izmēru 0,125 mm. Visai testēšanai jāizmanto celulozes no vienas un tās pašas partijas. Pirms maisījuma pagatavošanas celulozes pulveri žāvē 105 oC temperatūrā, līdz tās svars kļūst nemainīgs. Ja orientējošam izmēģinājumam izmanto koksnes putekļus, ņem skujkoku koksnes putekļus, kas izsijāti caur sietu ar acu lielumu 1,6 mm, rūpīgi tās samaisa un tad žāvē četras stundas 105 oC temperatūrā, izklājot tās 25 mm biezā kārtā. Pēc atdzesēšanas tās līdz izmantošanas brīdim (vēlams 24 stundu laikā pēc žāvēšanas) glabā hermētiskā tvertnē, ko piepilda iespējami pilnu.

1.6.1.3. Aizdegšanās avots Par uguns avotu izmanto gāzes degļa karstu liesmu (minimālais diametrs – 5 mm). Ja izmanto citu uguns avotu (piemēram, veicot testēšanu inertā atmosfērā), tas attiecīgi jāapraksta un jāpamato.

1.6.2. Pārbaudes norise Piezīme Oksidētāju maisījumi ar celulozi vai koksnes putekļiem ir sprādzienbīstami, tāpēc ir jāievēro piesardzības pasākumi.

1.6.2.

1.6.2.1. Orientējošs izmēģinājums Izžāvēto vielu sajauc ar sausu celulozi vai koksnes putekļiem, lai pārbaudāmās vielas un celulozes vai koksnes putekļu masas attiecība būtu 2:1, un, iepildot koniskas formas traukā, (piemēram, stikla piltuvē ar aizbāztu kātu) no maisījuma nepieblīvējot izveido nelielu konisku kaudzīti, kuras izmēri ir 3,5 cm (apakšējais diametrs) × 2,5 cm (augstums). Kaudzīti novieto uz vēsas nedegoša materiāla plātnes ar zemu siltumvadītspēju. Pārbaudi veic velkmes skapī, kā norādīts 1.6.2.2. punktā. Ar uguns avotu pieskaras konusam. Novēro un reģistrē notiekošās reakcijas intensitāti un ilgumu. Ja reakcija noris spēji, uzskata, ka vielai ir oksidētāja īpašības. Ja rezultāti vieš šaubas, katrreiz jāveic pilna pārbaude, kā tas norādīts tālāk.

1.6.2.2. Sliedes tests Sagatavo oksidētāja/celulozes maisījumus, kas satur no 10 līdz 90 masas % oksidētāja, ar 10 % palielinājumu. Strīdīgos gadījumos izmanto oksidētāja/celulozes maisījumus ar mazāku palielinājumu, lai precīzāk noteiktu maksimālo degšanas ātrumu. No pārbaudāmās vielas ar veidnes palīdzību izveido valnīti. Veidne ir izgatavota no metāla, tās garums ir 250 mm un trijstūra šķērsgriezumu ar augstumu iekšpusē 10 mm, bet platumu iekšpusē – 20 mm. Veidnes abās pusēs garenvirzienā sānu norobežošanai piestiprina divas metāla plāksnes, kuras izvirzītas 2 mm virs trijstūra šķērsgriezuma (skatīt attēlu). To nesablīvējot piepilda ar maisījumu nelielā pārākumā. Pēc veidnes kritiena uz cietas virsmas no 2 cm augstuma lieko vielu noņem ar slīpi novietotu skārda sloksni. Tad noņem norobežotājplāksnes un atlikušo pulveri izlīdzina ar veltni. Veidnei uzliek pamatplati no nedegoša materiāla bez porām un zemu siltuma vadītspēju, apgriež otrādi un veidni noņem. Pārbaudāmās vielas valnīti ievieto velkmes skapī perpendikulāri gaisa plūsmai. Gaisa plūsmas ātrumam jābūt pietiekami lielam, lai dūmi neiekļūtu laboratorijā, un to nedrīkst mainīt pārbaudes gaitā. Ap iekārtu jānovieto ekrāns, kas to aizsargā no gaisa plūsmas. Ņemot vērā celulozes un pārbaudāmo vielu higroskopiskumu, pārbaude jāveic cik iespējams ātri. Valnīti no viena gala aizdedzina, pieskaroties ar liesmu. Reakcijas ilgumu reģistrē 200 mm posmā pēc tam, kad reakcijas zona ir aptvērusi pirmos 30 mm. Testēšanu veic, izmantojot standartvielu un vismaz vienreiz ar katru no testējamās vielas maisījumiem ar celulozi. Ja tiek konstatēts, ka maksimālais degšanas ātrums ir ievērojami lielāks par standartvielas degšanas ātrumu, testēšanu var neturpināt; citādi izmēģinājums ar trijiem maisījumiem, kuriem ir lielākais degšanas ātrums, ir jāatkārto piecas reizes. Ja ir aizdomas, ka iegūtais rezultāts ir šķietami pozitīvs, tests jāatkārto ar inertu vielu celulozes vietā, kurai ir līdzīgs daļiņu izmērs, piemēram, ar kizelgūru. Otra iespēja ir inertā atmosfērā (< 2 % v/v skābekļa) atkārtoti testēt to testējamās vielas/celulozes maisījumu, kuram ir lielākais degšanas ātrums.

2. DATI Drošības apsvērumu dēļ uzskata, ka pārbaudāmās vielas oksidējošās īpašības raksturo maksimālais degšanas ātrums, nevis tā vidējā vērtība. Novērtēšanai pietiek ar maksimālo degšanas ātrumu, kas noteikts sešu pārbaužu sērijā ar vienu izvēlēto maisījumu. Katram maisījumam konstruē maksimālā degšanas ātruma grafiku atkarībā no oksidētāja koncentrācijas tajā. Pēc šā grafika nosaka maksimālo degšanas ātrumu. Izmēģinājumu sērijā noteiktās sešas noteiktās degšanas ātruma vērtības maisījumam ar maksimālo degšanas ātrumu nedrīkst atšķirties vairāk par 10 % no to vidējās aritmētiskās vērtības; citādi jāpilnveido sasmalcināšanas un maisījumu sagatavošanas metodes. Iegūto maksimālo degšanas ātrumu salīdzina ar standartmaisījuma maksimālo degšanas ātrumu (skatīt 1.3. punktu). Ja testēšanu veic inertā atmosfērā, maksimālo reakcijas ātrumu salīdzina ar standartvielas maksimālo reakcijas ātrumu inertā atmosfērā.

3. PĀRSKATS

3.

3.1. TESTĒŠANAS PĀRSKATS Testēšanas pārskatā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

testējamās vielas identifikācija, sastāvs, tīrība, mitruma saturs u. c.,

analizējamā parauga sagatavošana (piemēram, smalcināšana, žāvēšana u. tml.),

izmēģinājumos izmantotais uguns avots,

mērījumu rezultāti,

reakcijas gaita (piemēram, virsējās kārtas uzliesmošana, visa parauga degšana, jebkuri dati par sadegšanas produktiem u. tml.),

jebkuras papildu piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju, tostarp dati par pārbaudāmās vielas un standartvielas reakcijas intensitāti (uzliesmošana, dzirksteļošana, dūmu rašanās, lēna gruzdēšana utt.) un aptuveno ilgumu, kas gūti sākotnējā drošības pārbaudē vai orientējošā izmēģinājumā,

testēšanas rezultāti ar inertu vielu, ja tie veikti,

testēšanas rezultāti inertā atmosfērā, ja tie veikti.

3.2. REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA Uzskata, ka vielai piemīt oksidējošas īpašības, ja: Lai neiegūtu šķietami pozitīvu rezultātu, rezultātus interpretējot, ņem vērā rezultātus, kuri iegūti, testējamo vielu sajaucot ar inertu materiālu un/vai veicot testēšanu inertā atmosfērā.

3.2. a)

orientējošā izmēģinājumā tā izraisa intensīvu reakciju;

analizējamo maisījumu maksimālais degšanas ātrums pārbaudes laikā pārsniedz vai ir vienāds ar standartmaisījuma (celuloze un bārija nitrāts) maksimālo degšanas ātrumu.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

A.18. POLIMĒRU VIDĒJĀ MOLEKULAS MASA UN MOLEKULAS MASU SADALĪJUMS

A.18.

1. METODE Šī gelhromatogrāfijas metode ir OECD (Ekonomiskās sadarbības un attīstības organizācija) TG 118 (1996) kopija. Pamatprincipi un tehniskā informācija ir izmantotās literatūras sarakstā (1).

1.

1.1. IEVADS Tā kā polimēru īpašības ir tik dažādas, nav iespējams aprakstīt vienu atsevišķu metodi, kas precīzi izklāstītu sadalīšanas un novērtēšanas apstākļus, kuri aptvertu visus gadījumus un specifiskās īpatnības, kuras sastopamas polimēru sadalīšanā. Īpaši sarežģītas polimēru sistēmas bieži nepakļaujas gelhromatogrāfijai (GPC – Gel permeation chromatography). Ja GPC nevar izmantot, molekulas masu var noteikt ar citām metodēm (skatīt pielikumu). Tādos gadījumos būtu jādod visa informācija par lietoto metodi un pamatojums. Aprakstītās metodes pamatā ir DIN (Deutsches Institut fur Normung – Vācijas valsts standartu institūts) standarts 55672 (1). Detalizētu informāciju par to, kā veikt eksperimentus un novērtēt datus, var atrast šajā DIN standartā. Ja eksperimenta apstākļi jāmodificē, šīs izmaiņas jāpamato. Citus standartus var izmantot, ja uz tiem dod pilnīgi visas atsauces. Šī metode apraksta polistirola paraugu ar zināmu polidispersiju izmantošanu kalibrēšanai, un tā varbūt jāmodificē, lai būtu piemērota noteiktiem polimēriem, piemēram, ūdenī šķīstošiem un sazarotiem polimēriem ar garām ķēdītēm.

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Skaitlisko vidējo molekulas masu Mn un masas vidējo molekulas masu Mw nosaka, izmantojot šādus vienādojumus: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi kur: Hi = detektora signāla līmenis no bāzes līnijas aizturēšanas tilpumam Vi, Mi = molekulas masa polimēra frakcijai pie aizturēšanas tilpuma Vi, n = datu punktu skaits. Molekulu masu sadalījuma platumu, kas ir sistēmas dispersijas pakāpes mērs, nosaka attiecība Mw/Mn.

1.3. STANDARTVIELAS Tā kā GPC ir relatīva metode, jāveic kalibrēšana. Šim nolūkam parasti izmanto lineārus polistirola standartus ar šauru sadalījuma diapazonu, zināmām vidējām molekulas masām Mn un Mw un zināmu molekulu masu sadalījumu. Kalibrēšanas līkni, nosakot nezināma parauga molekulas masu, var izmantot tikai tad, ja parauga un standarta sadalīšanas apstākļi ir izvēlēti identiski. Noteiktā attiecība starp molekulas masu un eluēšanas tilpumu ir ticama tikai konkrēta eksperimenta specifiskos apstākļos. Apstākļi vispirms ietver temperatūru, šķīdinātāju (vai šķīdinātāju maisījumu), hromatografēšanas apstākļus un sadalīšanas kolonnu vai kolonnu sistēmu. Šādi noteikto molekulas masu lielumi ir relatīvi, un tos apzīmē kā polistirola ekvivalenta molekulas masas. Tas nozīmē, ka atkarībā no uzbūves un ķīmiskām atšķirībām starp paraugu un standartu molekulu masas var lielākā vai mazākā mērā atšķirties no absolūtās vērtības. Ja lieto citus standartus, piemēram, polietilenglikolu, polietilenoksīdu, polimetilmetakrilātu, poliakrilskābi, tas būtu jāpamato.

1.4. PĀRBAUDES METODES PRINCIPS Izmantojot GPC metodi, var noteikt gan molekulu masu sadalījumu, gan vidējās molekulu masas (Mn un Mw). GPC ir īpaša veida šķidruma hromatogrāfija, kur paraugu sadala atbilstoši atsevišķo sastāvdaļu hidrodinamiskiem tilpumiem (2). Sadalīšana notiek, paraugam izejot caur kolonnu, kas ir pildīta ar porainu materiālu, parasti ar organisku gelu. Mazas molekulas var iespiesties porās, bet lielas molekulas nevar. Lielo molekulu ceļš tādēļ ir īsāks, un tās pirmās tiek eluētas. Vidēji lielas molekulas iekļūst dažās no porām, tādēļ tiek eluētas vēlāk. Mazākās molekulas, kuru hidrodinamiskais rādiuss ir mazāks nekā gela poras, var iekļūt visās porās. Tās tiek eluētas visvēlāk. Ideālā situācijā sadalīšanu pilnībā nosaka molekulu lielums, bet praksē ir grūti izvairīties vismaz no dažiem absorbcijas radītiem traucējumiem. Nevienāds kolonnas pildījums un kolonnā nesorbēto vielu aiztures laiks stāvokli var padarīt vēl sliktāku (2). Noteikšanu veic, piemēram, izmantojot laušanas koeficientu vai UV absorbciju, un iegūst vienkāršu sadalījuma līkni. Tomēr, lai faktiskās molekulas masas vērtības attiecinātu uz līkni, jākalibrē kolonna, izlaižot cauri polimērus ar zināmu molekulas masu un ideālā variantā ar aptuveni līdzīgu uzbūvi, piemēram, dažādas polistirola standartvielas. Parasti iegūst Gausa sadalījuma līkni, dažkārt deformētu ar nelielu asti mazo molekulu masu pusē; uz šī grafika vertikālās ass ir eluēto vielu, kam ir dažāda molekulas masa, svara daudzumi, un uz horizontālās ass ir molekulas masas logaritms.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Eluēšanas tilpuma atkārtojamībai (relatīvā standarta novirze – Relative Standart Deviation: RSD) būtu jābūt labākai par 0,3 %. Analīzes vajadzīgā atkārtojamība jānodrošina ar korekciju, izmantojot iekšējo standartu, ja hromatogramma ir izrādījusies atkarīga no laika un neatbilst iepriekšminētajam kritērijam (1). Polidispersitāte ir atkarīga no standartu molekulu masām. Polistirola standartiem parastās vērtības ir: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp ir standartvielas molekulas masa pīķa maksimuma punktā.)

1.6. PĀRBAUDES METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Polistirola standartšķīduma pagatavošana Polistirola standartus, rūpīgi maisot, izšķīdina izvēlētajā eluentā. Šķīdumus pagatavojot, jāievēro ražotāja instrukcijas. Izvēlētās standartšķīdumu koncentrācijas ir atkarīgas no dažādiem faktoriem, piemēram, iešļircināmā tilpuma, šķīduma viskozitātes un jutības pret analīzes detektoru. Maksimālais iešļircināmais tilpums jāpieskaņo kolonnas garumam, lai izvairītos no pārslodzes. Parasti analītiskām sadalīšanām, izmantojot GPC ar kolonnas izmēriem 30 cm × 7,8 mm, iešļircināmie tilpumi ir starp 40 un 100 μl. Ir iespējams izmantot lielākus tilpumus, bet tiem nevajadzētu pārsniegt 250 μl. Pirms kolonnas faktiskās kalibrēšanas jānosaka optimālā attiecība starp iešļircināmo tilpumu un koncentrāciju.

1.6.2. Parauga šķīduma pagatavošana Principā parauga pagatavošanai ir tādas pašas prasības. Paraugu, uzmanīgi kratot, izšķīdina piemērotā šķīdinātājā, piemēram, tetrahidrofurānā (THF). Nekādā ziņā šķīdināt nedrīkst, izmantojot ultraskaņas vannu. Ja vajag, parauga šķīdumu tīra, filtrējot caur membrānas filtru ar poru diametru starp 0,2 un 2 μm. Neizšķīdušu daļiņu klātiene jāatzīmē beigu protokolā, jo tās var rasties no augstmolekulārām vielām. Jālieto piemērota metode, lai noteiktu izšķīdušo daļiņu svara procentu. Šķīdums jāizlieto 24 stundu laikā.

1.6.3. Aparatūra Jānodrošina, lai GPC sistēma būtu inerta pret lietojamiem šķīdinātājiem (piemēram, izmantojot tērauda kapilārus THF šķīdinātājam).

Šķīdinātāja rezervuārs,

atgāzētājs (ja vajadzīgs),

sūknis,

impulsu dempferis (ja vajadzīgs),

iešļircināšanas sistēma,

hromatogrāfiskā kolonna,

detektors,

plūsmas mērītājs (ja vajadzīgs),

datu reģistrēšanas-apstrādes iekārta,

trauks atkritumiem.

1.6.4. Iešļircināšanas un šķīdinātāja padeves sistēma Parauga šķīduma noteiktu tilpumu ievada kolonnā vai nu ar autosampleru, vai ar roku precīzi noteiktā zonā. Pārāk ātra šļirces virzuļa atvilkšana vai nospiešana ar roku var radīt konstatētā molekulas masu sadalījuma maiņas. Šķīdinātāja padeves sistēmai, ciktāl tas ir iespējams, būtu jādarbojas bez impulsiem, tādēļ ideālā variantā sistēmā būtu jāiemontē impulsu dempferis. Plūsmas ātruma kārtas lielums ir 1 ml/min.

1.6.5. Kolonna Atkarībā no parauga polimēru analizē, izmantojot vai nu vienu kolonnu, vai vairākas secīgas kolonnas. Tirdzniecībā ir pieejami vairāki kolonnu materiāli ar noteiktām īpašībām (piemēram, poru lielumu, molekulas izmēru robežām). Sadalīšanas gela vai kolonnas garuma izvēle ir atkarīga no parauga īpašībām (hidrodinamiskie tilpumi, molekulu masu sadalījums) un sadalīšanas specifiskiem apstākļiem, piemēram, šķīdinātāja, temperatūras un plūsmas ātruma (1) (2) (3).

1.6.6. Teorētiskie šķīvji Sadalīšanai lietojamā kolonna vai kolonnu apvienojums jāraksturo ar teorētisko šķīvju skaitu. Tas ietver, ja par eluēšanas šķīdinātāju lieto THF, etilbenzola vai cita piemērota nepolāra šķīdinātāja ievadīšanu noteikta garuma kolonnā. Teorētisko šķīvju skaitu aprēķina ar šādu vienādojumu: N=5,54VeW1/22 kur: N=16VeW2 kur: N teorētisko šķīvju skaits, Ve eluēšanas tilpums pīķa maksimumā, W pīķa platums pie bāzes līnijas, W1/2 pīķa platums pusē no tā augstuma.

1.6.7. Sadalīšanas efektivitāte Bez teorētisko šķīvju skaita, kas nosaka pīķa platumu, nozīme ir arī sadalīšanas efektivitātei, ko nosaka kalibrācijas līknes stāvums. Kolonnas sadalīšanas efektivitāti var aprēķināt no šādas sakarības: Ve,Mx-Ve,(10Mx)cross sectional area of the column≥6,0 cm3cm2 kur: Ve, Mx eluēšanas tilpums polistirolam ar molekulas masu Mx, Ve,(10M) eluēšanas tilpums polistirolam ar 10 reižu lielāku molekulas masu, L kolonnas šķērsgriezuma laukums. Sistēmas izšķirtspēju parasti definē šādi: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 kur: Ve1, Ve2 divu polistirola standartu eluēšanas tilpumi pīķa maksimuma punktā, W1, W2 pīķa platums pie bāzes līnijas, M1, M2 molekulas masas pīķa maksimumā (tām būtu jāatšķiras 10 reižu). Kolonnas sistēmai R vērtībai būtu jābūt lielākai par 1,7 (4).

1.6.8. Šķīdinātāji Visiem šķīdinātājiem jābūt augstas tīrības pakāpes (THF izmanto ar tīrības pakāpi 99,5 %). Šķīdinātāja rezervuāram (ja vajadzīgs, inertas gāzes atmosfērā) jābūt pietiekami lielam, lai veiktu kolonnas kalibrēšanu un vairākas paraugu analīzes. Pirms šķīdinātāju ievada kolonnā ar sūkni, tam jābūt atbrīvotam no gāzēm.

1.6.9. Temperatūras kontrole Galveno iekšējo sastāvdaļu (inžektora cilpa, kolonnas, detektors un caurules) temperatūrai jābūt konstantai un jāatbilst izvēlētajam šķīdinātājam.

1.6.10. Detektors Detektora uzdevums ir kvantitatīvi reģistrēt parauga, kas eluējas no kolonnas, koncentrāciju. Lai izvairītos no nevēlamas pīķu paplašināšanās, detektora šūnas ķivetes tilpumam jābūt tik mazam, cik iespējams. Tam nevajadzētu būt lielākam par 10 μl, izņemot gaismas izkliedes un viskozitātes detektorus. Detektēšanai parasti izmanto diferenciālo refraktometriju. Tomēr, ja to prasa specifiskas parauga vai eluēšanas šķīdinātāja īpašības, var izmantot citu veidu detektorus, piemēram, UV/VIS, IR, viskozitātes detektorus utt.

2. DATI UN PROTOKOLI

2.

2.1. DATI Par detalizētiem novērtēšanas kritērijiem un prasībām, kas attiecas uz datu savākšanu un apstrādi, skatīt DIN standartu (1). Katram paraugam jāizdara divi neatkarīgi eksperimenti. Tie jāanalizē atsevišķi. Mn, Mw, Mw/Mn un Mp jāsniedz katram mērījumam. Skaidri jānorāda, ka izmērītie lielumi ir relatīvi lielumi, kas ir ekvivalenti izmantoto standartvielu molekulu masām. Pēc aiztures tilpumu vai aiztures laiku noteikšanas (ja iespējams, koriģējot ar iekšējo standartu) uz grafika atliek log Mp (Mp ir kalibrēšanas standarta pīķa maksimums) pret vienu no šiem abiem lielumiem. Uz molekulu masu dekādi ir vajadzīgi vismaz divi kalibrēšanas punkti, un visai kalibrēšanas līknei vajadzīgi vismaz pieci punkti, šai līknei jāietver noteiktā parauga molekulas masa. Kalibrēšanas līknes mazo molekulu masu galapunktu nosaka ar n-heksilbenzolu vai citu piemērotu izšķīdināto vielu. Skaita vidējo vai svara vidējo molekulas masu parasti nosaka, izmantojot elektronisko datu apstrādi, kas pamatojas uz formulām, kas dotas 1.2. sadaļā. Ja datus apstrādā ar roku, var izmantot ASTM D 3536-91 (3). Sadalījuma līkne jāsagatavo tabulas veidā vai līknes veidā (kā diferenciālas frekvences vai procentu no summas attiecība pret log M). Grafiskajā attēlā vienai molekulu masu dekādei parasti būtu jābūt ap 4 cm platai un pīķa maksimumam jābūt ap 8 cm augstam. Integrālai sadalījuma līknei starpībai starp 0 un 100 % uz ordinātas būtu jābūt ap 10 cm.

2.2. PĀRBAUDES PROTOKOLS Pārbaudes protokolā jābūt šādai informācijai:

2.2.

2.2.1. Pārbaudāmā viela

Par pārbaudāmo vielu pieejamā informācija (identiskums, piedevas, piemaisījumi),

parauga apstrādes apraksts, novērojumi, problēmas.

2.2.2. Iekārtas

Eluenta rezervuārs, inerta gāze, eluenta atgāzēšana, eluenta sastāvs, piemaisījumi,

sūknis, impulsu dempferis, iešļircināšanas sistēma,

sadalīšanas kolonnas (ražotājs, visa informācija par kolonnas raksturlielumiem, piemēram, poru izmēri, sadalītājs materiāls utt., izmantoto kolonnu skaits, garums un sakārtojums,

kolonnas (vai to apvienojuma) teorētisko šķīvju skaits, sadalīšanas efektivitāte (sistēmas izšķirtspēja),

informācija par pīķu simetriju,

kolonnas temperatūra, temperatūras kontroles veids,

detektors (mērījumu princips, tips, ķivetes tilpums),

plūsmas mērītājs, ja to lieto (ražotājs, mērīšanas princips),

reģistrēšanas un datu apstrādes sistēma (aparatūra, programmatūra).

2.2.3. Sistēmas kalibrēšana

Kalibrēšanas līknes konstruēšanai izmantotās metodes sīks apraksts,

informācija par šīs metodes kvalitātes kritērijiem (piemēram, korelācijas koeficients, kvadrātisko kļūdu summa utt.),

informācija par visām ekstrapolācijām, eksperimenta procedūru, pieņēmumi un tuvinājumi novērtēšanas un datu apstrādes laikā,

visiem mērījumiem, kas izmantoti kalibrācijas līknes konstruēšanai, jābūt dokumentētiem tabulā, kas ietver šādu informāciju katram kalibrācijas punktam:

parauga nosaukums,

parauga ražotājs,

standartu raksturīgās Mp, Mn, Mw un Mw/Mn vērtības, ko devis ražotājs vai kas iegūtas mērījumos, kā arī noteikšanas metožu detaļas,

iešļircinātais tilpums un iešļircinātā šķīduma koncentrācija,

kalibrēšanā izmantotā Mp vērtība,

eluēšanas tilpums vai koriģētais aiztures laiks, kas izmērīts pīķa maksimumā,

pīķa maksimumā aprēķinātais Mp,

aprēķinātā Mp kļūda procentos un kalibrēšanas vērtība.

2.2.4. Novērtēšana

Novērtēšana, ņemot vērā laiku: metodes, kas izmantotas, lai nodrošinātu vajadzīgo atkārtojamību (koriģēšanas metode, iekšējais standarts utt.),

informācija par to, vai novērtēšana veikta, pamatojoties uz eluēšanas tilpumu vai aiztures laiku,

informācija par novērtēšanas robežām, ja pīķis nav pilnībā izanalizēts,

nogludināšanas metožu apraksts, ja tādas ir lietotas,

parauga iepriekšējās apstrādes un sagatavošanas procedūras,

neizšķīdušu daļiņu klātbūtne, ja tādas ir,

iešļircinātais tilpums μl un iešļircinātā šķīduma koncentrācija (mg/ml),

novērojumi, kas norāda uz ietekmēm, kas rada novirzes no ideāla GPC profila,

visu pārbaudes procedūras grozījumu sīks apraksts,

detaļas par kļūdu diapazonu,

visa pārējā informācija un novērojumi, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju.

3.(1)(2)(3)(4)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.19. MAZU MOLEKULU MASU SATURS POLIMĒROS

A.19.

1. METODE Šī gelhromatogrāfijas metode ir OECD TG 119 (1996) kopija. Pamatprincipi un sīkāka tehniskā informācija ir dota atsaucēs.

1.

1.1. IEVADS Tā kā polimēru īpašības ir tik dažādas, ir neiespējami aprakstīt vienu metodi, kas precīzi izklāstītu sadalīšanas un novērtēšanas apstākļus, kas aptvertu visas iespējamības un īpatnības, kādas sastopamas polimēru sadalīšanā. Jo īpaši ar gelhromatogrāfiju (GPC) bieži nav analizējamas sarežģītas polimēru sistēmas. Ja GPC nav izmantojama, molekulas masu var noteikt ar citām metodēm (skatīt pielikumu). Tādos gadījumos būtu jāsniedz visas izmantotās metodes detaļas un pamatojums. Šeit aprakstītā metode pamatojas uz DIN standartu 55672 (1). Sīki izstrādāta informācija, kā veikt eksperimentus un kā izvērtēt datus, ir atrodama šajā DIN standartā. Ja nepieciešams mainīt eksperimenta apstākļus, šīs izmaiņas jāpamato. Citus standartus var izmantot, ja dod visas atsauces. Šeit aprakstītā metode kalibrēšanai izmanto polistirola paraugus ar zināmu polidispersitāti, un tā varbūt jāmodificē, lai tā atbilstu noteiktiem polimēriem, piemēram, ūdenī šķīstošiem un sazarotiem polimēriem ar garu ķēdi.

1.2. DEFINĪCIJAS UN VIENĪBAS Maza molekulas masa nosacīti ir definēta kā molekulas masa, kas mazāka par 1000 daltoniem. Skaita vidējo molekulas masu Mn un svara vidējo molekulas masu Mw nosaka, izmantojot šādus vienādojumus: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi kur: HI detektora signāla līmenis, skaitot no bāzes līnijas, aiztures tilpumam Vi, Mi polimēra frakcijas molekulas masa ar aiztures tilpumu Vi un n ir datu punktu skaits Molekulu masu sadalījuma līknes platumu, kas ir sistēmas dispersitātes mērs, nosaka attiecība Mw/Mn.

1.3. STANDARTVIELAS Tā kā GPC ir relatīva metode, jāizdara kalibrēšana. Parasti šim nolūkam izmanto lineāras uzbūves polistirola standartvielas ar zināmām molekulu masām Mn un Mw un ar šauru masu sadalījuma diapazonu. Nezināma parauga molekulas masas noteikšanai šo kalibrācijas līkni var izmantot tikai tad, ja sadalīšanas apstākļi paraugam un standartvielām ir izvēlēti identiski. Noteiktā molekulu masu un eluēšanas tilpuma sakarība ir ticama tikai konkrēta eksperimenta specifiskos apstākļos. Šie apstākļi, pirmkārt, ietver temperatūru, šķīdinātāju (vai šķīdinātāju maisījumu), hromatografēšanas apstākļus un sadalīšanas kolonnu vai kolonnu sistēmu. Šādi noteiktās parauga molekulu masas ir relatīvi lielumi, un tos apzīmē kā polistirola ekvivalentās molekulu masas. Tas nozīmē, ka atkarībā no uzbūves un ķīmiskajām atšķirībām starp paraugu un standartiem molekulu masas lielākā vai mazākā mērā var atšķirties no absolūtajiem lielumiem. Ja izmanto citus standartus, piemēram, polietilenglikolu, polietilenoksīdu, polimetilmetakrilātu, poliakrilskābi, iemesls būtu jāpamato.

1.4. PĀRBAUDES METODES PRINCIPS Ar GPC var noteikt gan parauga molekulu masu sadalījumu, gan vidējās molekulu masas (Mn, Mw). GPC ir īpaša veida šķidrumu hromatogrāfija, kas paraugu sadala atbilstīgi atsevišķo sastāvdaļu hidrodinamiskiem tilpumiem (2). Sadalīšana notiek, paraugam ejot caur kolonnu, kas ir pildīta ar porainu materiālu, parasti ar organisku gelu. Mazas molekulas var iekļūt porās, kamēr lielas molekulas tur neiekļūst. Lielo molekulu ceļš tādēļ ir īsāks un tās eluējas pirmās. Vidēji lielas molekulas iekļūst dažās porās un eluējas vēlāk. Vismazākās molekulas, kuru vidējais hidrodinamiskais rādiuss ir mazāks par gela porām, var iekļūt visās porās. Tās eluējas visvēlāk. Ideālā gadījumā sadalīšanu pilnībā nosaka molekulu lielums, bet praksē ir grūti izvairīties vismaz no dažām traucējošām absorbcijas ietekmēm. Nevienāds kolonnas pakojums un kolonnā nesorbēto vielu aiztures laiks var stāvokli vēl pasliktināt (2). Detektēšanu veic, piemēram, izmantojot laušanas koeficientu vai UV absorbciju, un iegūst vienkāršu sadalījuma līkni. Lai uz līkni attiecinātu faktiskos molekulu masu lielumus, tomēr jākalibrē kolonna, caur to laižot polimērus ar zināmu molekulas masu un ideālā gadījumā ar aptuveni līdzīgu uzbūvi, piemēram, dažādus polistirola standartus. Parasti iegūst Gausa sadalījuma līkni, kas dažkārt ir izkropļota ar nelielu asti mazo molekulu masu pusē. Līknes vertikālā koordinātu ass rāda dažādu eluēto molekulu, kam ir atšķirīgas molekulu masas, svara daudzumus un horizontālā ass rāda molekulu masas logaritmu. Mazu molekulu masu saturu izrēķina no šīs līknes. Aprēķins precīzs var būt tikai tad, ja vielas ar mazām molekulu masām izturas tāpat kā polimērs kopumā.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Eluēšanas tilpuma atkārtojamībai (relatīvajai standartnovirzei – Relative Standard Deviation: RSD) būtu jābūt labākai par 0,3 %. Analīzei vajadzīgā atkārtojamība jānodrošina, koriģējot ar iekšējo standartu, ja hromatogramma ir novērtēta kā atkarīga no laika un neatbilst iepriekš minētajam kritērijam (1). Polidispersitāte ir atkarīga no standartvielu molekulu masām. Polistirola standartu gadījumā parastie lielumi ir: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20, 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05, Mp > 106 Mw/Mn < 1,20. (Mp ir standartvielas molekulas masa pīķa maksimumā.)

1.6. PĀRBAUDES METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Polistirola standartšķīdumu pagatavošana Polistirola standartvielas izšķīdina izvēlētajā eluentā, rūpīgi maisot. Gatavojot šķīdumus, jāievēro ražotāja norādījumi. Izvēlētās standartvielu koncentrācijas ir atkarīgas no vairākiem faktoriem, piemēram, iešļircināmā tilpuma, šķīduma viskozitātes un analīzes detektora jutības. Maksimālais iešļircināmais tilpums jāpieskaņo kolonnas garumam, lai izvairītos no pārslodzes. Parasti, izmantojot GPC, ja kolonnas izmēri ir 30 cm × 7,8 mm, iešļircināmie tilpumi analītiskām sadalīšanām ir starp 40 un 100 μl. Ir iespējams izmantot lielākus tilpumus, bet tiem nevajadzētu pārsniegt 250 μl. Pirms kolonnas faktiskās kalibrēšanas jānosaka optimālā attiecība starp iešļircināmo tilpumu un koncentrāciju.

1.6.2. Parauga šķīduma pagatavošana Principā tās pašas prasības attiecas uz parauga šķīduma sagatavošanu. Paraugu izšķīdina piemērotā šķīdinātājā, piemēram, tetrahidrofurānā (THF), uzmanīgi kratot. Nekādā ziņā paraugu nedrīkst šķīdināt, izmantojot ultraskaņu. Ja vajadzīgs, parauga šķīdumu tīra caur membrānas filtru ar poru izmēriem starp 0,2 un 2 μm. Neizšķīdušo daļiņu klātbūtne jāatzīmē galaprotokolā, jo tās var būt radušās vielu, kam ir lielāka molekulu masa, klātbūtnes dēļ. Būtu jāizmanto piemērota metode, lai noteiktu neizšķīdušo daļiņu svara procentus. Šķīdumi būtu jāizlieto 24 stundu laikā.

1.6.3. Korekcija uz piemaisījumu un piedevu saturu Vielu ar M < 1000 satura korekcija uz klātesošiem nepolimēru specifiskiem komponentiem (piemēram, piemaisījumiem vai piedevām) parasti ir nepieciešama, ja vien izmērītais saturs jau nav mazāks par 1 %. To veic ar GPC eluāta vai polimēra šķīduma tiešo analīzi. Gadījumos, kad eluāta šķīdums pēc iznākšanas no kolonnas ir pārāk atšķaidīts tālākai analīzei, tas jāsakoncentrē. Var būt vajadzīgs eluātu ietvaicēt līdz sausam un vēlreiz atšķaidīt. Eluāta koncentrēšana jāveic apstākļos, kas nodrošina, ka eluātā nenotiek nekādas pārmaiņas. Eluāta apstrāde pēc GPC posma ir atkarīga no kvantitatīvai noteikšanai izmantojamās metodes.

1.6.4. Aparatūra GPC iekārtai ir šādas galvenās sastāvdaļas: Jānodrošina, lai GPC sistēma būtu inerta attiecībā uz lietojamiem šķīdinātājiem (piemēram, lietojot tērauda kapilārus THF šķīdinātājam).

šķīdinātāja rezervuārs,

eluenta atgāzētājs (ja vajadzīgs),

sūknis,

impulsu dempferis (ja vajadzīgs),

iešļircināšanas sistēma,

hromatogrāfijas kolonnas,

detektors,

plūsmas mērītājs (ja vajadzīgs),

datu reģistrācijas un apstrādes sistēma,

trauks atkritumiem.

1.6.5. Iešļircināšanas un šķīdinātāja padeves sistēma Parauga šķīduma noteiktu daudzumu ievada kolonnā, vai nu izmantojot autosampleru, vai ar roku precīzi noteiktā zonā. Ja, ievadot ar roku, šļirces virzuli atvelk vai nospiež pārāk ātri, tas var mainīt novērojamo molekulu masu sadalījumu. Šķīdinātāja padeves sistēmai, cik iespējams, būtu jābūt bez impulsiem, ideālā gadījumā tajā būtu jābūt impulsu dempferim. Plūsmas ātruma kārtas lielums ir 1 ml/min.

1.6.6. Kolonna Atkarībā no parauga polimēru analizē, izmantojot vai nu vienu kolonnu, vai vairākas secīgi savienotas kolonnas. Pārdošanā ir pieejami vairāki kolonnu materiāli ar noteiktām īpašībām (piemēram, poru lielumu, izslēgšanas robežas). Sadalītāja gela vai kolonnas garuma izvēle ir atkarīga no parauga īpašībām (hidrodinamiskais tilpums, molekulu masu sadalījums) un no specifiskiem sadalīšanas apstākļiem, piemēram, šķīdinātāja, temperatūras un plūsmas ātruma (1) (2) (3).

1.6.7. Teorētiskie šķīvji Sadalīšanai izmantotā kolonna vai kolonnu apvienojums jāraksturo ar teorētisko šķīvju skaitu. Ja par eluēšanas šķīdinātāju lieto THF, tas ietver etilbenzola vai citas piemērotas nepolāras vielas šķīduma ievadīšanu zināma garuma kolonnā. Teorētisko šķīvju skaitu aprēķina ar šādiem vienādojumiem: N=5,54VeW1/22 vai N=16VeW2 kur: N teorētisko šķīvju skaits, Ve eluētais tilpums pīķa maksimuma punktā, W pīķa platums pie bāzes līnijas, W1/2 pīķa platums pusē no augstuma.

1.6.8. Sadalīšanas efektivitāte In addition to the number of theoretical plates, which is a quantity determining the bandwidth, a part is also played by the separation efficiency, this being determined by the steepness of the calibration curve. The separation efficiency of a column is obtained from the following relationship: Ve,Mx-Ve,(10Mx)cross sectional area of the column≥6,0cm3cm2 kur: Ve, Mx polistirola ar molekulas masu Mx eluētais tilpums, Ve,(10Mx) polistirola ar 10 reižu lielāku molekulas masu eluētais tilpums, L kolonnas šķērsgriezuma laukums Sistēmas izšķirtspēju parasti nosaka šādi: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 kur: Ve1, Ve2 divu polistirola standartu eluēšanas tilpumi pīķa maksimumā, W1, W2 pīķa platumi pie bāzes līnijas, M1, M2 molekulu masas pīķu maksimumos (tām būtu jāatšķiras 10 reižu). Kolonnu sistēmas R lielumam būtu jābūt lielākam par 1,7 (4).

1.6.9. Šķīdinātāji Visiem šķīdinātājiem jābūt augstas tīrības (THF lieto ar tīrības pakāpi 99,5 %). Šķīdinātāja rezervuāram (ja vajadzīgs, inertas gāzes atmosfērā) jābūt pietiekami lielam, lai veiktu kolonnas kalibrēšanu un vairākas paraugu analīzes. Šķīdinātājs jāatbrīvo no gāzēm, pirms to ar sūkni pievada kolonnai.

1.6.10. Temperatūras kontrole Svarīgāko iekšējo sastāvdaļu (inžektora cilpas, kolonnu, detektora un cauruļu) temperatūrai būtu jābūt konstantai un atbilstošai izvēlētajam šķīdinātājam.

1.6.11. Detektors Detektoram kvantitatīvi jāreģistrē no kolonnas eluētā parauga koncentrācija. Lai izvairītos no nevajadzīgas pīķa paplašināšanās, detektora šūnas ķivetes tilpumam vajadzētu būt pēc iespējas mazākam. Tam nevajadzētu būt lielākam par 10 μl, izņemot gaismas izkliedes un viskozitātes detektorus. Parasti detektēšanai izmanto diferenciālo refraktometriju. Tomēr, ja tas vajadzīgs parauga vai eluēšanas šķīdinātāja specifisko īpašību dēļ, var izmantot citu veidu detektorus, piemēram, UV/VIS, IR, viskozitātes detektorus utt.

2. DATI UN PROTOKOLĒŠANA

2.

2.1. DATI Detalizētus izvērtēšanas kritērijus un prasības, kas attiecas uz datu savākšanu un apstrādi, skatīt DIN standartā (1). Katram paraugam jāizdara divi neatkarīgi eksperimenti. Tie jāanalizē atsevišķi. Visos gadījumos ir būtiski svarīgi iegūt arī tukšo mēģinājumu datus tādos pašos apstākļos, kā veikta parauga analīze. Skaidri jānorāda, ka izmērītie lielumi ir relatīvi lielumi, kas ir ekvivalenti lietotā standarta molekulu masām. Pēc aiztures tilpumu vai aiztures laiku noteikšanas (iespējams, koriģējot ar iekšējo standartu) log Mp lielumus (Mp ir kalibrēšanas standarta pīķa maksimuma vērtība) atliek grafikā pret vienu no minētajiem lielumiem. Vajadzīgi vismaz divi kalibrēšanas punkti uz molekulu masas dekādi, visai līknei vajadzīgi vismaz pieci kalibrēšanas punkti, kam būtu jāietver parauga noteiktā molekulas masa. Kalibrēšanas līknes zemāko molekulu masu galapunktu nosaka ar n-heksilbenzolu vai citu piemērotu nepolāru izšķīdināmo vielu. Līknes daļu, kas atbilst molekulu masām zem 1000, nosaka un, ja vajadzīgs, koriģē attiecībā uz piemaisījumiem un piedevām. Eluēšanas līknes parasti izvērtē ar elektronisko datu apstrādi. Skaitļojot ar roku, var konsultācijai izmantot ASTM D 3536-91 (3). Ja kolonnā ir aizturēts kāds nešķīstošs polimērs, tā molekulas masa varētu būt lielāka par šķīstošo frakciju molekulas masu un, ja to neņem vērā, zemo molekulu masu saturu novērtē pārāk augstu. Pielikumā dotas vadlīnijas, kā koriģēt zemo molekulu masu saturu uz nešķīstoša polimēra klātbūtni. Sadalījuma līkne jāsagatavo tabulas vai zīmējuma veidā (diferenciālais biežums vai procenti no summas pret log M). Attēlojot grafiski, vienai molekulu masas dekādei būtu jābūt ap 4 cm platai un pīķa maksimumam būtu jābūt ap 8 cm augstam. Integrālajām sadalījuma līknēm starpībai uz ordinātas starp 0 un 100 % vajadzētu būt ap 10 cm.

2.2. PĀRBAUDES PROTOKOLS Pārbaudes protokolam jāietver šāda informācija:

2.2.

2.2.1. Pārbaudāmā viela

Pieejamā informācija par analizējamo vielu (identiskums, piedevas, piemaisījumi),

parauga apstrādes apraksts, novērojumi, problēmas.

2.2.2. Iekārtas

Eluenta rezervuārs, inerta gāze, eluenta atgāzēšana, eluenta sastāvs, piemaisījumi,

sūknis, impulsu dempferis, inžektora sistēma,

sadalīšanas kolonnas (ražotājs, visa informācija par kolonnas raksturlielumiem, piemēram, poru izmēri, sadalīšanas materiāls utt., izmantoto kolonnu skaits, garums un sakārtojums),

kolonnas (vai to apvienojuma) teorētisko šķīvju skaits, sadalīšanas efektivitāte (sistēmas izšķirtspēja),

informācija par pīķu simetriju,

kolonnas temperatūra, temperatūras kontroles veids,

detektors (mērījumu princips, tips, ķivetes tilpums),

plūsmas mērītājs, ja to lieto (ražotājs, mērīšanas princips),

reģistrēšanas un datu apstrādes sistēma (aparatūra, programmatūra).

2.2.3. Sistēmas kalibrēšana

Kalibrēšanas līknes konstruēšanai izmantotās metodes sīks apraksts,

informācija par šīs metodes kvalitātes kritērijiem (piemēram, korelācijas koeficients, kvadrātisko kļūdu summa utt.),

informācija par visām ekstrapolācijām, eksperimenta procedūru, novērtēšanas un datu apstrādes laikā izdarītie pieņēmumi un tuvinājumi,

visiem mērījumiem, kas izmantoti kalibrācijas līknes konstruēšanai, jābūt dokumentētiem tabulā, kas ietver šādu informāciju katram kalibrācijas punktam:

parauga nosaukums,

parauga ražotājs,

standartu raksturīgās Mp, Mn, Mw un Mw/Mn vērtības, ko devis ražotājs vai kas iegūtas mērījumos, kā arī noteikšanas metožu detaļas,

iešļircinātais tilpums un iešļircinātā šķīduma koncentrācija,

kalibrēšanā izmantotā Mp vērtība,

eluēšanas tilpums vai koriģētais aiztures laiks, kas izmērīts pīķa maksimumā,

pīķa maksimumā aprēķinātais Mp,

aprēķinātā Mp kļūda procentos un kalibrēšanas vērtība.

2.2.4. Informācija par polimēra saturu ar zemu molekulas masu

Analīzē izmantoto metožu apraksts un veids, kā eksperimenti veikti,

informācija par vielu ar mazu molekulas masu procentuālo daudzumu (svars/svars) attiecībā uz visu paraugu,

informācija par piemaisījumiem, piedevām un citu vielu, kas nav polimēri, saturu svara procentos attiecībā uz visu paraugu.

2.2.5. Novērtēšana

Novērtēšana, ņemot vērā laiku: visas metodes, kas izmantotas, lai nodrošinātu vajadzīgo atkārtojamību (koriģēšanas metode, iekšējais standarts utt.),

informācija par to, vai novērtēšana veikta, pamatojoties uz eluēšanas tilpumu vai aiztures laiku,

informācija par novērtēšanas robežām, ja aparatūra pīķi nav pilnīgi izanalizējusi,

nogludināšanas metožu apraksts, ja tādas ir lietotas,

parauga pirmapstrādes un pirmsagatavošanas procedūras,

neizšķīdušu daļiņu klātbūtne, ja tādas ir,

iešļircinātais tilpums (μl) un iešļircinātā šķīduma koncentrācija (mg/ml),

novērojumi, kas norāda uz ietekmēm, kas rada novirzes no ideāla GPC profila,

visu analīzes procedūras grozījumu sīks apraksts,

detaļas par kļūdu diapazonu,

cita informācija un novērojumi, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju.

3.(1)(2)(3)(4)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.20. POLIMĒRU ŠĶĪŠANA/EKSTRAKCIJA ŪDENĪ

A.20.

1. METODE Aprakstītā metode ir OECD TG 120 (1997) pārskatītās versijas kopija. Sīkāku tehnisku informāciju skatīt izmantotās literatūras sarakstā (1).

1.

1.1. IEVADS Dažiem polimēriem, tādiem kā emulsiju polimēri, var būt vajadzīgs sākotnējs sagatavošanas darbs, pirms var izmantot turpmāk aprakstīto metodi. Šo metodi nevar izmantot šķidriem polimēriem un polimēriem, kas analīzes apstākļos reaģē ar ūdeni. Ja metodi izmantot nav praktiski vai nav iespējams, šķīšanu/ekstrakciju var pētīt ar citām metodēm. Tādos gadījumos jādod pilnīgas izmantotās metodes detaļas un pamatojums.

1.2. STANDARTVIELAS Nav.

1.3. PĀRBAUDES METODES PRINCIPS Polimēru šķīšanu/ekstrakciju ūdens vidē nosaka, izmantojot kolbas metodi (skatīt A.6. Šķīdība ūdenī; Kolbas metode), kas ir modificēta, kā aprakstīts turpmāk.

1.4. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.5. PĀRBAUDES METODES APRAKSTS

1.5.

1.5.1. Iekārtas Metodei ir vajadzīgas šādas iekārtas:

sasmalcināšanas ierīce, piemēram, smalcinātājs, lai veidotu zināma lieluma daļiņas,

kratītājs ar temperatūras kontroles iespējām,

membrānas filtru sistēma,

piemērots ķīmiskais aprīkojums,

standartizēti sieti.

1.5.2. Parauga sagatavošana Reprezentatīvs paraugs vispirms jāsamazina līdz daļiņu izmēriem 0,125 un 0,25 mm, izmantojot piemērotus sietus. Parauga stabilizēšanai vai sasmalcināšanas procesam var būt vajadzīga dzesēšana. Sveķiem līdzīgus materiālus var sasmalcināt šķidrā slāpekļa temperatūrā (1). Ja frakcija ar vajadzīgā lieluma daļiņām nav iegūstama, jārīkojas tā, lai daļiņu lielumu samazinātu tik lielā mērā, cik tas iespējams, un rezultāts jāprotokolē. Protokolā jānorāda, kā sasmalcinātais paraugs ir glabāts pirms pārbaudes.

1.5.3. Procedūra Trīs paraugus, kas satur pa 10 g analizējamās vielas, nosver katru savā traukā, kam ir stikla aizbāžņi, un katrā traukā pievieno 1000 ml ūdens. Ja rīcība ar 10 g polimēra izrādās neizpildāma, jāizmanto nākošais lielākais daudzums, ar ko var rīkoties, un attiecīgi jāpieskaņo ūdens tilpums. Traukus cieši noslēdz un pēc tam krata 20o temperatūrā. Jālieto kratīšanas vai maisīšanas ierīce, kas var darboties konstantā temperatūrā. Pēc 24 stundām katra trauka saturu centrifugē vai nofiltrē un ar piemērotu analītisku metodi nosaka polimēra daudzumu dzidrajā ūdens fāzē. Ja ūdens fāzei piemērotas analītiskas metodes nav pieejamas, tad kopējo šķīdību/ekstrahējamību var noteikt no filtrēšanas atlikuma vai centrifugēto nogulšņu sausā atlikuma. Parasti ir nepieciešams kvantitatīvi atšķirt piemaisījumus un piedevas, no vienas puses, un vielas ar mazu molekulas masu, no otras puses. Nosakot gravimetriski, ir arī svarīgi izdarīt tukšo mēģinājumu bez analizējamās vielas, lai ņemtu vērā novirzes, kas rodas eksperimenta procedūras dēļ. Polimēru šķīdību/ekstrahējamību ūdenī pie 37 oC un pH 2 un pH 9 var noteikt tāpat, kā ir aprakstīts eksperimenta izpildei pie 20 oC. Vajadzīgās pH vērtības var sasniegt, pieliekot vai nu piemērotus buferšķīdumus, vai piemērotas skābes vai bāzes, piemēram, sālsskābi, etiķskābi, nātrija vai kālija hidroksīdu(analīžu kvalitātes), vai NH3. Atkarībā no izmantotās analīžu metodes būtu jāizdara viens vai divi mēģinājumi. Ja ir pieejamas pietiekami specifiskas metodes ūdens fāzes tiešai analīzei uz polimēra komponentu, viens mēģinājums, kā aprakstīts iepriekš, ir pietiekams. Ja tādas metodes nav pieejamas un polimēra šķīdības/ekstrahējamības noteikšana ir ierobežota ar netiešu analīzi, nosakot ūdens ekstrakta kopējo oglekļa saturu (Total Organic Carbon Content – TOC), tad tomēr būtu jāveic papildu analīze. Šī papildu analīze būtu jāveic arī trešoreiz, lietojot 10 reizes mazāku polimēra paraugu un to pašu ūdens daudzumu, kas lietots pirmajā mēģinājumā.

1.5.4. Analīze

1.5.4.

1.5.4.1. Mēģinājums, ko veic ar viena lieluma paraugu Var būt pieejamas metodes polimēra komponentu tiešai analīzei ūdens fāzē. Alternatīvi var apsvērt arī izšķīdušo/ekstrahēto polimēru komponentu netiešo analīzi, nosakot kopējo šķīstošo daļu saturu un koriģējot uz nepolimēru specifiskiem komponentiem. Ūdens fāzes analīze kopējā polimēru saturu noteikšanai ir iespējama: vai nu ar pietiekami jutīgu metodi, piemēram: vai ūdens ekstraktu iztvaicējot vakuumā līdz sausam atlikumam un atlikumu analizējot ar spektroskopiskām metodēm (IR, UV utt.) vai ar AAS/ICP analīzi. Ja ūdens fāzes analīzi nevar izdarīt tieši, ūdens ekstrakts būtu jāekstrahē ar šķīdinātāju, kas nejaucas ar ūdeni, piemēram, hloru saturošiem ogļūdeņražiem. Šķīdinātāju pēc tam iztvaicē un atlikumu analizē, lai noteiktu attiecīgā polimēra saturu, kā iepriekš minēts. Visu to komponentu saturs, kas identificēti kā piemaisījumi vai piedevas, jāatņem, lai noteiktu paša polimēra šķīdības/ekstrahēšanas pakāpi. Ja klāt ir relatīvi lieli šādu vielu daudzumi, var būt vajadzīgs atlikumam izdarīt, piemēram, HPLC vai GC analīzi, lai atšķirtu klātesošo monomēru un no monomēriem atvasinātu vielu piemaisījumus tā, lai varētu noteikt šo pēdējo vielu īsto saturu. Dažos gadījumos var būt pietiekami, ja organisko šķīdinātāju vienkārši iztvaicē līdz sausam un sauso atlikumu nosver.

TOC, izmantojot noārdīšanu ar persulfātu vai dihromātu līdz CO2 un sekojošu noteikšanu, izmantojot IR vai ķīmisko analīzi,

atomu absorbcijas spektrometriju (AAS) vai ar tās induktīvi saistīto plazmas (ICP) emisijas ekvivalento metodi silīciju un metālus saturošiem polimēriem,

UV absorbcijas vai spektrofluorimetriju arilpolimēriem,

LC-MS (šķidrumu hromatogrāfija-masspektometrija) paraugiem ar mazu molekulas masu,

1.5.4.2. Analīze parauga diviem dažādiem lielumiem Visus ūdens ekstraktus analizē, lai noteiktu TOC. Gravimetrisko noteikšanu izdara neizšķīdušai/neizekstrahētai parauga daļai. Ja pēc katra trauka satura centrifugēšanas vai filtrēšanas polimēra atlikums paliek pielipis pie trauka sienām, trauks jāskalo ar filtrātu, līdz no trauka ir notīrītas jebkādas redzamas daļiņas. Pēc tam filtrātu vēlreiz centrifugē vai filtrē. Atlikumu, kas palicis uz filtra vai centrifugēšanas caurulītē, žāvē vakuumā 40 oC temperatūrā un nosver. Žāvē līdz konstantam svaram.

2. DATI

2.

2.1. VIENA LIELUMA PARAUGA ANALĪZE Jāuzrāda atsevišķie rezultāti katrai no trim kolbām un vidējie lielumi, kas izteikti masas vienībās šķīduma tilpumā (parasti mg/l) vai masas vienībās uz polimēra masas vienību (parasti mg/g). Bez tam jāuzrāda arī parauga masas zudums (ko aprēķina kā izšķīdušās vielas masas dalījumu ar sākotnējā parauga masu). Jāizrēķina relatīvās standartnovirzes (RSD – relative standart deviation). Jādod arī atsevišķie skaitļi par kopējo analizējamo paraugu (polimērs + svarīgākās piedevas utt.) un pašu polimēru (t. i., pēc šādu piedevu satura atskaitīšanas).

2.2. DIVU DAŽĀDU PARAUGA LIELUMU ANALĪZE Jāsniedz divu trīskārt atkārtotu eksperimentu TOC lielumi ūdens ekstraktiem un katra eksperimenta vidējais lielums, kas izteikts masas vienībās šķīduma tilpumā (parasti mgC/l), kā arī masas vienības uz sākotnējā parauga masu (parasti mgC/g). Ja nav atšķirību starp rezultātiem lielai un mazai parauga/ūdens attiecībai, tas var norādīt, ka ekstrahējamie komponenti tiešām ir ekstrahējušies. Tādā gadījumā parasti tiešā analīze nav vajadzīga. Jādod atsevišķās atlikumu masas, un tās jāizsaka procentos no paraugu sākotnējām masām. Katram eksperimentam jāizrēķina vidējie lielumi. Starpības starp 100 % un atrastajiem procentiem ir šķīstošās un ekstrahējamās vielas procentuālais daudzums sākotnējā paraugā.

3. PROTOKOLI

3.

3.1. PĀRBAUDES PROTOKOLS Pārbaudes protokolā jābūt šādai informācijai:

3.1.

3.1.1. Pārbaudāmā viela

Pieejamā informācija par analizējamo vielu (identitāte, piedevas, piemaisījumi, vielu saturs ar mazu molekulas masu).

3.1.2. Eksperimenta apstākļi

Izmantoto procedūru un eksperimenta apstākļu apraksts,

analīzes un detektēšanas metožu apraksts.

3.1.3. Rezultāti

Šķīdība/ekstrahējamība mg/l; atsevišķie un vidējie lielumi ekstrakcijas analīzēm dažādos šķīdinātājos, atsevišķi uzdodot polimēru saturu un piemaisījumus, piedevas utt.,

polimēra šķīdība/ekstrahējamība mg/g,

ūdens ekstraktu TOC lielumi, izšķīdušās vielas svars un izrēķinātie procenti, ja tie ir mērīti,

katra parauga pH,

informācija par tukšos mēģinājumos iegūtiem lielumiem,

ja vajadzīgs, norādes uz analizējamā parauga nestabilitāti pārbaudes un analīzes procesā,

visa informācija, kas ir svarīga rezultātu interpretācijai.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen fur Prufzwecke.

A.21. OKSIDIZĒJOŠAS ĪPAŠĪBAS (ŠĶIDRUMI)

A.21.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Šī testa metode paredzēta, lai noteiktu šķidruma spēju palielināt degošu vielu degšanas ātrumu vai degšanas intensitāti vai arī spēju veidot pašaizdegošos maisījumu ar degošu vielu, tos rūpīgi sajaucot. Metodes pamatā ir ANO oksidējošu šķidrumu tests (1), un tā ir šim testam līdzvērtīga. Tomēr tāpēc, ka šī metode A21. galvenokārt paredzēta, lai ievērotu Regulu (EK) Nr. 1907/2006, ir nepieciešams salīdzinājums tikai ar vienu standartvielu. Testēšana un salīdzinājums ar papildu standartvielām var būt vajadzīgi gadījumos, kad testu rezultātus izmanto citiem nolūkiem. Šis tests nav jāveic gadījumos, kad vielas struktūrformula nepārprotami liecina, ka viela nevar stāties eksotermiskās reakcijās ar viegli uzliesmojošiem materiāliem. Pirms noteikt šo rādītāju, ir lietderīgi iegūt sākotnēju informāciju par testējamās vielas iespējamo sprādzienbīstamību. Šī metode nav izmantojama cietvielām, gāzēm, sprādzienbīstamām vai viegli uzliesmojošām vielām un organiskajiem peroksīdiem. Testēšana pēc šīs metodes nav jāveic, ja jau ir pieejami attiecīgās vielas testēšanas rezultāti pēc ANO oksidējošu šķidrumu testa (1).

1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Vidējais spiediena paaugstināšanās laiks ir vidējais laiks, kādā testējamais maisījums izraisa spiediena paaugstināšanos no 690 kPa līdz 2070 kPa virs atmosfēras spiediena.

1.3. STANDARTVIELA Par standartvielu izmanto (analītiski tīru) 65 % (masas %) slāpekļskābes ūdens šķīdumu. Ja eksperimentators paredz, ka testēšanas rezultātus, iespējams, izmantos arī citiem nolūkiem, var būt lietderīgi papildus testēt arī citas standartvielas.

1.4. TESTA METODES PRINCIPS Testējamo šķidrumu masas attiecībā 1:1 sajauc ar celulozes šķiedru un ievieto spiedtvertnē. Ja maisījuma sajaukšanas vai ievietošanas laikā notiek pašaizdegšanās, testēšanu neturpina. Ja nenotiek pašaizdegšanās, testēšanu veic pilnībā. Maisījumu spiedientvertnē karsē un nosaka vidējo laiku, kādā spiediens paaugstinās no 690 kPa līdz 2070 kPa virs atmosfēras spiediena. To salīdzina ar vidējo spiediena paaugstināšanās laiku, kāds ir standartvielas(-u) un celulozes maisījumam attiecībā 1:1.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Piecu izmēģinājumu rezultāti ar vienu vielu nedrīkst atšķirties vairāk par 30 % no to vidējās aritmētiskās vērtības. Izbrāķē rezultātus, kas no vidējās aritmētiskās vērtības atšķiras vairāk par 30 %, testēšanu atkārto pēc maisījuma sajaukšanas un ievietošanas procedūras pilnveidošanas.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Sagatavošana

1.6.1.

1.6.1.1. Viegli uzliesmojoša viela Par viegli uzliesmojošu materiālu izmanto sausas celulozes šķiedras ar šķiedru garumu no 50 līdz 250 μm un vidējo diametru 25 μm. Celulozi līdz nemainīgai masai četras stundas žāvē līdz 25 mm biezā slānī 105 oC temperatūrā, pēc tam atdzesē un līdz lietošanai glabā eksikatorā virs žāvētāja. Sausas celulozes mitruma saturs nedrīkst pārsniegt 0,5 % no bezūdens masas. Lai to panāktu, žāvēšanas laiks, ja vajadzīgs, ir jāpagarina. Visai testēšanai jāizmanto celuloze no vienas un tās pašas partijas.

1.6.1.2. Iekārta

1.6.1.2.

1.6.1.2.1. Spiedtvertne Nepieciešama spiedtvertne. Tvertne sastāv no 89 mm gara tērauda spiedtvertnes ar ārējo diametru 60 mm (skatīt 1. attēlu). Cilindra pretējās pusēs izslīpētas divas plakanas virsmas (samazinot šķērsgriezumu līdz 50 mm), ko izmanto fiksēšanai, ieskrūvējot ventilācijas atveres ventili un aizdedzināšanas ventili. Tvertnes abos galos ir izveidots 19 mm dziļš urbums 20 mm diametrā ar iekšējo Lielbritānijas standarta 1' cauruļvītni vai tai līdzvērtīgu metriskās sistēmas vītni. Spiediena novada īscauruli ieskrūvē spiedtvertnes liektajā virsmā 90o leņķī pret izslīpētajām plakanajām virsmām 35 mm attālumā no viena gala. Šim nolūkam līdz 12 mm dziļumam izveido urbumu un iegriež ½' Lielbritānijas standarta cauruļvītni (vai tai līdzvērtīgu metriskās sistēmas vītni), kas atbilst īscaurules vītnei. Ja vajadzīgs, hermētiskuma nodrošināšanai izmanto inerta materiāla blīvi. Īscaurules garums ārpus spiedtvertnes korpusa ir 55 mm, un tās urbuma diametrs ir 6 mm. Īscaurules galā ir urbums ar vītni, kurā ieskrūvē diafragmas tipa spiediena devēju. Var izmantot visas spiediena mērīšanas ierīces, kuru darbību neietekmē karstas gāzes vai sadalīšanās produkti un kuru reakcijas laiks uz spiediena paaugstināšanos no 690 līdz 2070 kPa nepārsniedz 5 m/s. No īscaurules attālāko spiedtvertnes galu noslēdz ar aizdedzināšanas ventili, kas sastāv no diviem elektrodiem, no kuriem viens izolēts no ierīces aizbāžņa, bet otrs ar to savienots. Spiedtvertnes otru galu noslēdz ar pārraujamu disku (pārraušanas spiediens apmēram 2200 kPa), ko nostiprina ar uzgriezni, kurā ir 20 mm diametra urbums. Ja vajadzīgs, aizdedzināšanas ventiļa hermētiskuma nodrošināšanai izmanto inerta materiāla blīvi. Lietošanas laikā ierīci pareizā stāvoklī notur statīvā (2. attēls). Tas parasti sastāv no mazleģēta tērauda pamatloksnes (235 mm × 184 mm x 6 mm) un 180 mm gara doba kvadrātveida šķērsgriezuma (70 mm × 70 mm × 4 mm) profila. No kvadrātveida šķērsgriezuma profila pretējās pusēs vienā galā izveidots izgriezums tā, ka izveidojas konstrukcija ar divām plakanām gludām kājām ar 86 mm garu neskartu daļu. Šīs plakanās daļas nogriež 60o leņķī pret horizontāli un piemetina pamatplatei. Pamatnes augšējā daļā vienā pusē izgriež 22 mm platu 46 mm dziļu spraugu tā, lai, statīvā ievietojot spiedtvertnes mezglu ar aizdedzināšanas ventili uz leju, spraugā atrastos īscaurule. Apakšējai iekšējai virsmai piemetina 30 mm platu un 6 mm biezu tērauda gabaliņu, kas kalpo par starpliku. Spiedtvertni cieši fiksē ar divām pretējā virsmā ieskrūvētām 7 mm spārnskrūvēm. No apakšas spiedtvertni balsta divas 12 mm platas 6 mm biezas tērauda lentes, kas piemetinātas sānu gabaliem un pieguļ pamatnei.

1.6.1.2.2. Aizdedzināšanas sistēma Aizdedzināšanas sistēma sastāv no 25 cm garas 0,6 mm diametra nihroma stieples ar pretestību 3,85 omi/m. Stiepli uz 5 mm diametra stieņa savij spirālē un piestiprina aizdedzināšanas ventiļa elektrodiem. Spirāli savij kādā no 3. attēlā parādītajiem veidiem. Aizdedzināšanas spirāles apakšai jābūt vismaz 20 mm attālumā no tvertnes dibena. Ja elektrodi nav regulējami, aizdedzināšanas stieples gali starp spirāli un tvertnes apakšu jāizolē ar keramikas apvalku. Stiepli sakarsē no pastāvīga barošanas avota, kas nodrošina vismaz 10 A stipru strāvu.

1.6.2. Testa norise Iekārtu ar uzmontētu spiediena devēju un aizdedzināšanas sistēmu, neuzstādot pārraujamo disku, nostiprina statīvā ar aizdedzināšanas ventili uz leju. Stikla vārglāzē ar stikla spieķīti sajauc 2,5 g testējamā šķidruma ar 2,5 g sausas celulozes. Drošības labad sajaukšana jāveic, lietotājam atrodoties aiz aizsargekrāna. Ja maisījums aizdegas tā sajaukšanas vai iepildīšanas laikā, testēšana nav jāturpina. Maisījumu nelielās daļās sablīvējot pārnes spiedtvertnē un raugās, lai maisījums tiktu sablīvēts ap aizdedzināšanas spirāli un ir ar to labā kontaktā. Svarīgi, lai sablīvēšanas laikā spirāle netiktu deformēta, jo tādēļ var iegūt kļūdainus rezultātus. Ievieto pārraujamo disku un to nostiprina, cieši ieskrūvējot uzgriezni. Uzpildīto tvertni ar pārraujamo disku uz augšu ievieto statīvā velkmes skapī vai dedzināšanas kamerā. Aizdedzināšanas ventiļa ārējos izvadus pieslēdz elektrībai un padod 10 A stipru strāvu. Laiks no maisījuma sajaukšanas līdz elektriskās strāvas ieslēgšanai nedrīkst pārsniegt 10 minūtes. Spiediena devēja signālu reģistrē, izmantojot piemērotu reģistrācijas sistēmu, kas nodrošina gan radītā spiediena izmaiņu novērtēšanu, gan pastāvīgu reģistrēšanu (piemēram, pārejas procesu reģistrētājs, kas apvienots ar diagrammas reģistrētāju). Maisījumu karsē, līdz saplīst pārraujamais disks vai vismaz 60 sekundes. Ja pārraujamais disks nesaplīst, pirms iekārtu izjaukt, maisījumam ļauj atdzist, veicot piesardzības pasākumus, kas saistīti ar iespējamo spiediena paaugstināšanos iekārtā. Testējamās vielas un standartvielas(-u) izmēģinājumus atkārto piecas reizes. Atzīmē laiku, kādā paaugstinās spiediens no 690 kPa līdz 2070 kPa virs atmosfēras spiediena. Aprēķina vidējo spiediena paaugstināšanās laiku. Dažkārt vielas var izraisīt spiediena paaugstināšanos (pārlieku augstu vai pārāk zemu) ar to oksidējošajām īpašībām nesaistītu ķīmisko reakciju dēļ. Šādos gadījumos, lai noskaidrotu reakcijas raksturu, testēšana var būt jāatkārto, celulozes vietā izmantojot inertas vielas, piemēram, diatomītu (kizelguru).

2. REZULTĀTI Spiediena paaugstināšanās laiks testējamās vielas un standartvielas(-u) izmēģinājumos. Spiediena paaugstināšanās laiks izmēģinājumos ar inertu vielu, ja tie tiek veikti.

2. 2.1. 1. tabula Rezultātu piemēri

REZULTĀTU APSTRĀDE Aprēķina vidējo spiediena paaugstināšanās laiku testējamajai vielai un standartvielai(-ām). Aprēķina vidējo spiediena paaugstināšanās laiku izmēģinājumos ar inertu vielu (ja tiek veikti). Daži rezultātu piemēri norādīti 1. tabulā. Viela Vidējais spiediena paaugstināšanās laiks 1:1 maisījumam ar celulozi (m/s) Amonija dihromāts, piesātināts ūdens šķīdums 20800 Kalcija nitrāts, piesātināts ūdens šķīdums 6700 Dzelzs nitrāts, piesātināts ūdens šķīdums 4133 Litija perhlorāts, piesātināts ūdens šķīdums 1686 Magnija perhlorāts, piesātināts ūdens šķīdums 777 Niķeļa nitrāts, piesātināts ūdens šķīdums 6250 Slāpekļskābe, 65 % 4767 Perhlorskābe, 50 % 121 Perhlorskābe, 55 % 59 Kālija nitrāts, 30 % ūdens šķīdums 26690 Sudraba nitrāts, piesātināts ūdens šķīdums Nātrija hlorāts, 40 % ūdens šķīdums 2555 Nātrija nitrāts, 45 % ūdens šķīdums 4133 Inerta viela Ūdens – celuloze

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. PĀRSKATS PAR TESTU Pārskatā par testu jāiekļauj šāda informācija:

testējamās vielas identifikācija, sastāvs, tīrība u. c.,

testējamās vielas koncentrācija,

izmantotās celulozes žāvēšanas procedūra,

izmantotās celulozes ūdens saturs,

mērījumu rezultāti,

testēšanas rezultāti ar inertu vielu, ja tā veikta,

aprēķinātais vidējais spiediena paaugstināšanās laiks,

atkāpes no minētās metodes un to iemesli,

papildu informācija vai piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju.

3.2. REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA Testēšanas rezultātus novērtē, ņemot vērā: Šķidrums uzskatāms par oksidētāju, ja: Lai neiegūtu šķietami pozitīvus rezultātus, rezultātu interpretācijai ņem vērā arī rezultātus, kas iegūti, vielu testējot maisījumā ar inertu vielu.

3.2. a)

vai notiek testējamās vielas un celulozes maisījuma pašaizdegšanās; un

vidējā spiediena paaugstināšanās laika no 690 kPa līdz 2070 kPa salīdzinājumu ar standartvielai(-ām) noteikto.

notiek vielas maisījuma ar celulozi masas attiecībā 1:1 pašaizdegšanās, vai

vielas, kuru maisījumiem ar celulozi masas attiecībā 1:1 testējot vidējais spiediena paaugstināšanās laiks ir vienāds vai mazāks nekā 65 masas % no slāpekļskābes ūdens šķīduma un celulozes (1:1 pēc masas) maisījumam noteiktā.

4.(1) IZMANTOTĀ LITERATŪRA Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, p. 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids. Piezīme. Var izmantot jebkuru no abām konfigurācijām.

4.(1)

1. attēls Spiedtvertne

(A) spiedtvertnes korpuss (B) plīstoša pārraujamā diska fiksācijas ventilis (C) aizdedzināšanas ventilis (D) mīksta svina paplāksne (E) pārraujamais disks (F) īscaurule (G) spiediena devēja stiprinājums (H) paplāksne (J) izolētais elektrods (K) iezemētais elektrods (L) izolācija (M) tērauda konuss (N) paplāksni deformējošā rieva

2. attēls Statīvs

3. attēls Aizdedzināšanas sistēma

A – aizdedzināšanas spirāle B – izolācija C – elektrodi D – aizdedzināšanas ventilis

Papildinājums Sīkāki tehniski dati atrodami šādos standartos:

1. Kapilāra metodes

1.

1.1. Kušanas temperatūras noteikšanas ierīces ar šķidruma vannu ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapilarverfarehn JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products

1.2. Kušanas temperatūras noteikšanas ierīces ar metāla bloku DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point

2. Sildvirsmas

2.

2.1. Koflera sildvirsma ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Kausējamais mikroskops DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

2.3. Meniska metode (poliamīdiem) ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du point de fusion méthode du menisque

3. Sasalšanas temperatūras noteikšanas metodes BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de petrole: determination de la temperature de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Methode de determination du point de cristallisation (point de congelation ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Termiskā analīze

4.

4.1. Diferenciālā termiskā analīze ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Diferenciālā skenēšanas kalorimetrija ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Sastingšanas temperatūras noteikšana NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du petrole: Point de trouble et point d'ecoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour point

Papildinājums Papildus tehniskie dati ir ietverti, piemēram, šādos standartos:

1.1.1. Ebulioskops Kušanas temperatūras noteikšanas ierīces ar šķidruma vannu ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Destilācijas metode (viršanas temperatūras intervāls) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation:determination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Diferenciālā thermiskā analīze un diferenciālā skenēšanas kalorimetrija ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

Papildinājums Papildu tehniskie dati ir, piemēram, šādos standartos:

1. Flotācijas metodes

1.

1.1. Areometrs DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2. Hidrostatiskie svari

1.2. Cietām vielām

ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density

Šķidrumiem

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 un ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3. Iegremdētā ķermeņa metode DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2. Piknometra metodes

2.

2.1. Šķidrumiem ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00,10-6 m2 s-1 at 15 oC) DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00, 10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC) DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary – stoppered pycnometer method NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method

2.2. Cietām vielām ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method DIN 19683 Determination of the density of soils

3. Piknometrs salīdzināšanai ar gaisu DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung

1. Papildinājums Aprēķinu metode IEVADS

Tvaika spiediena aprēķinātās vērtības var izmantot:

piemērotāko eksperimentālo metožu izvēlei,

lai noteiktu orientējošu vērtību vai robežvērtību gadījumos, kad tehnisku iemeslu dēļ (arī gadījumos, kad tvaika spiediens ir ļoti zems) nav iespējams izmantot eksperimentālo metodi,

lai identificētu tos gadījumus, kad eksperimentāli mērījumi netiek veikti tāpēc, ka iespējamais tvaika spiediens istabas temperatūrā ir < 10-5 Pa.

APRĒĶINU METODE

Šķidru vielu un cietvielu tvaika spiedienu var aprēķināt pēc modificētās Vatsona korelācijas (a). Šim nolūkam vienīgie vajadzīgie eksperimentālie dati ir viršanas temperatūra normālos apstākļos. Metode izmantojama tvaika spiediena intervālā no 105 Pa līdz l0-5 Pa. Šī metode sīki aprakstīta rokasgrāmatā Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b).

APRĒĶINĀŠANAS PROCEDŪRA

Saskaņā ar (b) tvaika spiedienu aprēķina šādi: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb kur: T = temperatūra, kurai veic aprēķinus, Tb = viršanas temperatūra normālos apstākļos, Pvp = tvaika spiediens temperatūrā T, ΔHvb = iztvaikošanas siltums, ΔZb = saspiežamība (pieņemta 0,97), m = empīrisks koeficients, kas atkarīgs no vielas agregātstāvokļa un temperatūras, kurai veic aprēķinus. Bez tam Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb kur KF ir empīrisks koeficients, kas raksturo vielas polārās īpašības. Vairākiem savienojumu tipiem koeficienta KF vērtības norādītas literatūras avotā (b). Bieži ir pieejami dati par viršanas temperatūru pazeminātā spiedienā. Saskaņā ar (b) šādā gadījumā tvaika spiedienu aprēķina šādi: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 kur T1 ir viršanas temperatūra pazeminātā spiedienā P1.

PĀRSKATS

Izmantojot aprēķinu metodi, testēšanas pārskatā pilnīgi dokumentē aprēķinus.

LITERATŪRA

(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, Vol. 35, p. 398.

(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

2. papildinājums

1. attēls Iekārta tvaika spiediena līknes noteikšanai ar dinamisko metodi

1 = Termopāris 2 = Vakuuma buferis 3 = Manometrs 4 = Vakuums 5 = Mērīšanas punkts 6 = Sildelements apm. 150 W

2.a attēls Aparāts tvaika spiediena līknes noteikšanai pēc statiskās metodes (izmantojot U veida caurules manometru)

1. Testējamā viela 2. Tvaika fāze 3. Dziļa vakuuma ventilis 4. U-veida caurule (papildmanometrs) 5. Manometrs 6. Termostats 7. Temperatūras mērīšanas ierīce 8. Uz vakuumsūkni 9. Ventilācija

2.b attēls Aparāts tvaika spiediena līknes noteikšanai pēc statiskās metodes (izmantojot spiediena indikatoru)

1. Testējamā viela 2. Tvaika fāze 3. Dziļa vakuuma ventilis 4. Manometrs 5. Spiediena indikators 6. Termostats 7. Temperatūras mērīšanas ierīce

3. attēls Izoteniskops (skatīt (7))

1. Uz spiediena regulēšanas un mērīšanas sistēmu 2. 8 mm pārplūdes caurule 3. Sauss slāpeklis spiediena sistēmā 4. Parauga tvaiks 5. Neliels paresninājums 6. Šķidrs paraugs

4. attēls Iekārta tvaika spiediena līknes noteikšanai ar tvaika spiediena svariem

1. Pārbaudāmā viela 2. Tvaika fāze ar tvaika plūsmu 3. Iztvaicēšanas krāsns ar rotācijas ieeju 3.a Krāsns vāks ar atveri 4. Krāsns sildīšana (dzesēšana) 5. Parauga temperatūras mērīšana 6. Dzesēšanas kamera 7. Ekrāns 8. Dzesēšanas kameras dzesinātāja stienis 9. Svaru kauss 10. Mikrosvari 11. Uz reģistrēšanas ierīci 12. Uz vakuumsūkni dziļa retinājuma iegūšanai

5. attēls Aparāta paraugs iztvaicēšanai pazeminātā spiedienā ar efūzijas metodi; efūzijas šūnas tilpums 8 cm3

1. Pieslēgums vakuumam 2. Urbumi platīna pretestības termometram vai temperatūras mērīšanas un regulēšanas ierīcēm 3. Vakuumtvertnes vāks 4. Blīve 5. Vakuumtvertne no alumīnija 6. Ierīce efūzijas šūnu ievietošanai un izņemšanai 7. Uzskrūvējams vāks 8. Spārnuzgriežņi (6) 9. Bultskrūves (6) 10. Nerūsējošā tērauda efūzijas šūnas 11. Sildītāja patronas (6)

6.a attēls Caurplūdes sistēmas paraugs tvaika spiediena noteikšanai ar gāzes piesātinājuma metodi

Uz ventilatoru Kolektors 1 = Plūsmas regulators 2 = Siltummainis 3 = Adatventilis 4 = Relatīvā mitruma sensors 5 = Piesātināšanas kolonnas 6 = Politetrafluoretilēna savienojumi 7 = Plūsmas mērītājs 8 = Uztvērējs (absorbers) 9 = Eļļas uztvērējs 10 = Poraina stikla barbotieris

6.b attēls Sistēmas paraugs tvaika spiediena noteikšanai pēc gāzes piesātināšanas metodes ar kapilāru, kas ievietots aiz piesātināšanas kameras

1. Temperatūras masas plūsmas mērītājs 2. Manometrs 3. Termostatējama kamera 4. Termostatējama spirāle nesējgāzei 5. Termometrs (Pt 100) 6. Gāzes piesātināšanas kamera 7. Kapilārs 8. Absorbcijas trauki 9. Gāzes daudzuma mērītājs 10. Izsaldētājs

7. attēls Eksperimentālās iekārtas shēmas paraugs noteikšanai pēc rotācijas metodes

Tvaika spiediena aparāts A: rotora sensora mērierīce B: parauga šūna C: termostats D: vakuumlīnija (turbosūknis) E: gaisa termostats

8. attēls Rotācijas mērierīces paraugs

1. Lodīte 2. Caurules paplašinājums, no kuras izsūknēts gaiss 3. Pastāvīgie magnēti (2) 4. Vertikālās stabilizācijas spoles (2) 5. Vadības spoles (4) 6. Savienojuma atloks

Papildinājums

1. attēls Eluēšanas kolonna ar cirkulācijas sūkni

Gaisa caurule Plūsmas mērītājs Mikrokolonna Termostatējams cirkulācijas sūknis Cirkulācijas sūknis Divkanālu ventilis paraugu ņemšanai

2. attēls Mikrokolonnas paraugs

(Visi izmēri norādīti milimetros) Vieta slīpēta stikla savienojumam Augšgala tilpums Iekšējais diametrs - 5 Ārējais diametrs - 19 Stikla vates tampons Divceļu krāns

3. attēls Mikrokolonnas paraugs

(Visi izmēri norādīti milimetros) Vieta slīpēta stikla savienojumam Augšgala tilpums Iekšējais diametrs - 5 Ārējais diametrs - 19 Krāns

4. attēls Eluēšanas kolonna ar līdzsvarošanas trauku

1 = Līdzsvarošanas trauks (piemēram, 2,5 l kolba) 2 = Kolonna (skat. 3. attēlu) 3 = Frakciju savācējs 4 = Termostats 5 = Teflona caurules 6 = Slīpēta stikla savienojums 7 = Ūdens līnija (starp termostatu un kolonnu, iekšējais diametrs: aptuveni 8 mm)

1. Papildinājums Aprēķinu/novērtēšanas metodes IEVADS

Vispārīgs aprēķinu metožu apskats, dati un piemēri ir atrodami rokasgrāmatā Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). Pow aprēķinātās vērtības var izmantot:

piemērotāko eksperimentālo metožu izvēlei (kolbu kratīšanas metode: log Pow: –2 līdz 4, HPLC metode: log Pow: 0 līdz 6),

piemērotāko noteikšanas apstākļu izvēlei (piemēram, lai izraudzītos standartvielas HPLC metodei, n-oktanola/ūdens tilpuma attiecības noteikšanai kolbu kratīšanas metodei),

laboratorijas iekšējai pārbaudei iespējamo eksperimentālo kļūdu noteikšanai,

gadījumos, kad tehnisku iemeslu dēļ Pow nav iespējams noteikt eksperimentāli, tā novērtētās vērtības noteikšanai.

NOVĒRTĒJUMA METODE

Sadalīšanās koeficienta orientējoša novērtēšana

Sadalīšanās koeficienta vērtību var novērtēt pēc testējamās vielas šķīdības tīros šķīdinātājos. Šajā gadījumā aptuvenais P novērtējums = piesātinājuma koncentrācija n-oktanolā (C)/piesātinājuma koncentrācija ūdenī (C): Pnovērtētais = piesātinājuma koncentrācija cn-oktanolāpiesātinājuma koncentrācija cūdenī

APRĒĶINA METODES

Aprēķinu metožu būtība

Visu aprēķina metožu pamatā ir molekulas formāla sadalīšana struktūrelementos ar zināmu log Pow. Visas molekulas log Pow aprēķina kā attiecīgo struktūrelementu summu, kurai pieskaita iekšmolekulārās mijiedarbības korekciju. Struktūrelementu fragmentu konstantes un korekcijas atrodamas (b), (c), (d), (e). Daļa no tiem tiek regulāri atjaunināti un papildināti (b).

Kvalitātes kritēriji

Parasti aprēķinu metodes ticamība pazeminās, paaugstinoties testējamā savienojuma struktūras sarežģītībai. Vienkāršām molekulām ar nelielu molekulmasu un vienu vai divām funkcionālajām grupām pēc dažādām sadalīšanās metodēm noteiktās log Pow vērtības var atšķirties no eksperimentāli noteiktajām par 0,1 līdz 0,3 vienībām. Sarežģītākas struktūras savienojumiem šīs atšķirības var būt lielākas. Tās ir atkarīgas no struktūrfragmentu konstanšu pieejamības un to ticamības, kā arī iespējām ņemt vērā iekšmolekulāro mijiedarbību (piemēram, ūdeņraža saites) un korekciju pareizu ieviešanu (šī problēma ir mazāka, izmantojot datorprogrammu CLOGP-3) (b). Savienojumiem, kas jonizējas, svarīgi ir pareizi ņemt vērā lādiņu vai jonizācijas pakāpi.

Aprēķināšanas procedūras Henša [Hansch] π-metode

Sākotnēji hidrofobā aizvietotāja konstanti πx ieviesa Fujita u. c.πx definē šādi: πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH) kur Pow (PhX) ir aromātiskā atvasinājuma sadalīšanās koeficients un Pow (PhH) izejas savienojuma sadalīšanās koeficients (piemēram, πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84 – 2,13 = 0,71). Saskaņā ar definīciju π-metode galvenokārt izmantojama aizvietotajiem aromātiskajiem savienojumiem. Ļoti lielam skaitam aizvietotāju π vērības apkopotas tabulu veidā (b) (c) (d). Tās izmantojamas aromātisko savienojumu vai struktūrelementu log Pow aprēķināšanai.

Rekera [Rekker] metode

Pēc Rekera (g) log Pow vērtību aprēķina šādi: log Pow=Σi ai fi+Σj (korekcijas locekļi) kur fi ir dažādu molekulas fragmentu konstantes un ai ir to parādīšanās biežums pētamajā molekulā. Korekcijas locekļus var izteikt vienas konstantes Cm (t. s. maģiskās konstantes) veselu skaitļu daudzkārtņu veidā. Struktūras fragmentu konstantes fi un Cm noteiktas pēc 1054 eksperimentāli iegūtām Pow vērtībām (825 savienojumi), izmantojot daudzfaktoru regresijas analīzi (c), (h). Korekcijas locekļus nosaka pēc literatūrā (e), (h), (i) aprakstītajiem noteikumiem.

Henša-Leo [Hansch-Leo ]metode

Pēc Henša un Leo (c) log Pow vērtību aprēķina šādi: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj kur fi ir dažādu molekulas fragmentu konstantes, Fi ir korekcijas locekļi, bet ai bj – to parādīšanās biežums. Ar mēģinājumu un kļūdu metodi, izmantojot eksperimentāli noteiktās Pow vērtības, sastādīts atomu un grupu fragmentu vērtību korekcijas locekļu Fj (t. s. koeficientu) saraksts. Korekcijas locekļi iedalīti vairākās klasēs (a) (c). Ņemt vērā visus noteikumus un korekcijas locekļus ir diezgan sarežģīti, un tas prasa daudz laika. Šim nolūkam ir izstrādāta īpaša programmatūra (b).

Kombinētā metode

Sarežģītām molekulām log Pow aprēķinus var ievērojami uzlabot, ja molekulu dala lielākos struktūras fragmentos, kuriem noteiktas ticamas log Pow vērtības, pēc tabulām (b) (c) vai pašu veiktos eksperimentos. Šādus fragmentus (piemēram, heterocikli, antrahinons, azobenzols) pēc tam var apvienot ar Henša π vērtībām vai Rekera vai Leo fragmentu konstantēm.

Piezīmes i)

Aprēķinu metodes var izmantot tikai daļēji vai pilnīgi jonizētiem savienojumiem, kad ir iespējams ņemt vērā vajadzīgos korekcijas koeficientus.

ii)

Ja iespējams, ka savienojumā ir iekšmolekulāras ūdeņraža saites, jāpievieno attiecīgie korekcijas locekļi (apmēram +0,6 līdz +1,0 log Pow vienības) (a). Norādes par šādu saišu esamību var iegūt pēc molekulu struktūras telpiskajiem modeļiem vai spektroskopijas datiem.

iii)

Ja savienojumam iespējamas vairākas tautomērās formas, aprēķinus izdara pēc iespējamākās no tām.

iv)

Uzmanīgi jāseko struktūrfragmentu konstanšu tabulu pārskatīšanai.

Pārskats

Izmantojot aprēķinu/novērtēšanas metodes, testēšanas pārskatā, ja iespējams, iekļauj šādu informāciju:

vielas apraksts (maisījums, piemaisījumi u. c.),

norādes uz iespējamajām iekšmolekulārajām saitēm, disociāciju, lādiņu un dažādiem citiem neraksturīgiem efektiem (piemēram, tautomēriju),

aprēķinu metodes apraksts,

datubāzes identifikācija vai izmantotie dati,

struktūrfragmentu izraudzīšanās īpatnības,

aprēķinu sīka dokumentēšana.

LITERATŪRA

(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, Vol. 71, p. 525.

(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. -Chill. Ther. 1979, Vol. 14, p. 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, Vol. 86, p. 5175.

(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, Vol. 1.

(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, Vol. 12, p. 1459.

(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

2. Papildinājums Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijai ieteicamās standartvielas

Nr. Standartviela log Pow pKa 1. 2-Butanons 0,3 2. 4-Acetilpiridīns 0,5 3. Anilīns 0,9 4. Acetanilīds 1,0 5. Benzilspirts 1,1 6. p-Metoksifenols 1,3 pKa = 10,26 7. Fenoksietiķskābe 1,4 pKa = 3,12 8. Fenols 1,5 pKa = 9,92 9. 2,4-Dinitrofenols 1,5 pKa = 3,96 10. Benzonitrils 1,6 11. Fenilacetonitrils 1,6 12. 4-Metilbenzilspirts 1,6 13. Acetofenons 1,7 14. 2-Nitrofenols 1,8 pKa = 7,17 15. 3-Nitrobenzoskābe 1,8 pKa = 3,47 16. 4-Hloranilīns 1,8 pKa = 4,15 17. Nitrobenzols 1,9 18. Kanēļspirts 1,9 19. Benzoskābe 1,9 pKa = 4,19 20. p-Krezols 1,9 pKa = 10,17 21. Kanēļskābe 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22. Anizols 2,1 23. Metilbenzoāts 2,1 24. Benzols 2,1 25. 3-Metilbenzoskābe 2,4 pKa = 4,27 26. 4-Hlorfenols 2,4 pKa = 9,1 27. Trihloretilēns 2,4 28. Atrazīns 2,6 29. Etilbenzoāts 2,6 30. 2,6-Dihlorbenzonitrils 2,6 31. 3-Hlorbenzoskābe 2,7 pKa = 3,82 32. Toluols 2,7 33. 1-Naftols 2,7 pKa = 9,34 34. 2,3-Dihloranilīns 2,8 35. Hlorbenzols] 2,8 36. Alilfenilēteris 2,9 37. Brombenzols 3,0 38. Etilbenzols 3,2 39. Benzofenons 3,2 40. 4-Fenilfenols 3,2 pKa = 9,54 41. Timols 3,3 42. 1,4-Dihlorbenzols 3,4 43. Difenilamīns 3,4 pKa = 0,79 44. Naftalīns 3,6 45. Fenilbenzoāts 3,6 46. Izopropilbenzols 3,7 47. 2,4,6-Trihlorfenols 3,7 pKa = 6 48. Bifenils 4,0 49. Benzilbenzoāts 4,0 50. 2,4-Dinitro-6 sec. butilfenols 4,1 51. 1,2,4-Trihlorbenzols 4,2 52. Dodekānskābe 4,2 53. Difenilēteris 4,2 54. n-Butilbenzols 4,5 55. Fenantrēns 4,5 56. Fluorantrēns 4,7 57. Dibenzils 4,8 58. 2,6-Difenilpiridīns 4,9 59. Trifenilamīns 5,7 60. DDT 6,2 Citas standartvielas ar zemu log Pow vērtību 1. Nikotīnskābe -0,07

Papildinājums

Attēls Veidne un papildu aprīkojums degšanas ilguma noteikšanai

(Visi izmēri norādīti milimetros) Veidnes garums: 250 mm Materiāls: alumīnijs

Papildinājums

Attēls Aprīkojums

Papildinājums

Termiskās jutības testēšanai vajadzīgo materiālu testēšana (skatīt DIN 1623) 1.2.3.

Caurule: materiāla specifikācija Nr. 1.0336.505 g. Plate ar atveri: materiāla specifikācija Nr. 1.4873. Vītņsavienojums un uzgrieznis: materiāla specifikācija Nr. 1.3817.

1. attēls Termiskās jutības testēšanas iekārta

(visi izmēri norādīti milimetros) l.a att. Tērauda caurule ar piederumiem (1) caurule (1a) ārējais atloks (2) vītņsavienojums; vītne ar mazu berzi (3) plate ar atveri a = 2,0 vai 6,0 mm diam. (4) uzgrieznis b = 10 mm diam. (5) slīpa virsma (6) 2 plakanas virsmas 41. izmēra uzgriežņu atslēgai 1.b att. Sildīšanas un aizsargierīce (7) 2 plakanas virsmas 36. izmēra uzgriežņu atslēgai (8) pret plaisāšanu izturīga kamera (9) 2 balsta stieņi caurulei (10) samontēta caurule (11) vieta aizmugurējam deglim; pārējie degļi attēlā redzami (12) žikleris

2. attēls Termiskās jutības tests

(fragmentācijas paraugi) Nav eksplozijas Nav eksplozijas Eksplozija Eksplozija Eksplozija Eksplozija

3. attēls Sildīšanas ātruma kalibrēšana termiskās jutības testēšanai

Temperatūra (C) Laiks (s) Temperatūras/laika grafiks, kas iegūts, sildot dibutilftalātu (27 cm3) slēgtā caurulē (atveres izmērs 1,5 mm), izmantojot propāna plūsmas ātrumu 3,2 l/min. Temperatūru mēra ar 1 mm diametra hromela/alumela termopāri tērauda apvalkā, kas novietots centrā 43 mm zem caurules atloka. Sildīšanas ātrumam no 135 oC līdz 285 oC ir jābūt no 185 līdz 215 K/min.

4. attēls Trieciena testa aparāts

(visi izmēri norādīti milimetros) (1) pamatne, 450 × 450 × 60 (2) tērauda bloks, 230 × 250 × 200 (3) lakta, 100 diam. × 70 (4) statnis (5) vidējais šķērsis (6) 2 vadotnes (7) zobstienis (8) graduēta skala (9) krītošais āmurs (krītošā masa) (10) turēšanas un palaišanas ierīce (11) pozicionēšanas plate (12) starplakta (maināma) 26 diam. × 26 (13) pozicionēšanas gredzens ar atverēm (14) triecienierīce 4.a att. Krītošais āmurs, priekšskats un sānskats, kopskats 4.b att. Krītošais āmurs, apakšdaļa

4. attēls (turpinājums)

4.c att. Triecienierīce pulverveida vai pastveida vielu testēšanai (1) tērauda cilindri (2) tērauda cilindru vadotne (3) pozicionēšanas gredzens ar atverēm (a) šķērsgriezums (b) augšskats (4) gumijas gredzens (5) šķidra viela (40 mm3) (6) no šķidruma brīva telpa 4.d att. Triecienierīce šķidru vielu testēšanai 4.e att. Āmurs (masa 5 kg) (1) piekārtais ieliktnis (2) augstuma atzīme (3) pozicionēšanas rieva (4) cilindrisks belznis (5) atsitiena uztvērējs

5. attēls Berzes jutības testēšanas iekārta

5.a att. Berzes aparāts; pretskats un augšskats (1) tērauda pamatne (2) kustīgs rāmis (3) porcelāna plate, 25 × 25 × 5 mm, nostiprināta uz rāmja (4) nekustīga porcelāna kāja, 10 diam. × 15 mm (5) testējamais paraugs, apm. 10 mm3 (6) kājas turētājs (7) slodzes svira (8) pretsvars (9) slēdzis (10) rokturis rāmja iestatīšanai sākumstāvoklī (11) elektromotora griešanās virziens 5.b att. Kājas sākumstāvoklis uz plates

Papildinājums

Attēls Veidne un papildu aprīkojums degšanas ilguma noteikšanai

(visi izmēri norādīti milimetros) Veidnes garums: 250 mm Materiāls: alumīnijs

Papildinājums Polimēru skaita vidējā molekulsvara (Mn) citu noteikšanas metožu piemēri

Gelhromatogrāfija (GPC) ir vispiemērotākā metode Mn noteikšanai, īpaši, ja ir pieejams standartu komplekts, kuru uzbūve ir salīdzināma ar polimēra uzbūvi. Tomēr, ja GPC izmantošanā ir praktiskas grūtības vai ir sagaidāms, ka viela neatbildīs noteicošajam Mn kritērijam (kas jāapstiprina), tad ir pieejamas alternatīvas metodes, piemēram:

1.1.1.1.2.1.3.1.4.

No molekulu skaita atkarīgo īpašību izmantošana Ebulioskopija/krioskopija Ietver šķīdinātāja viršanas punkta paaugstinājuma (ebulioskopija) vai sasalšanas temperatūras pazeminājuma (krioskopija) mērīšanu, kad šķīdinātājam ir pievienots polimērs. Metode pamatojas uz to, ka izšķīdušā polimēra ietekme uz šķidruma vārīšanās/sasalšanas temperatūru ir atkarīga no polimēra molekulas masas (1) (2). Pielietojamība: Mn < 20000. Tvaika spiediena pazeminājums Ietver izvēlētā standartšķidruma tvaika spiediena mērījumus pirms un pēc zināmu polimēra daudzumu pievienošanas (1) (2). Pielietojamība: Mn < 20000 (teorētiski; praktiski tomēr metodes vērtība ir ierobežota). Membrānas osmometrija Pamatojas uz osmozes principu, t. i., šķīdinātāja molekulu tieksmi iet cauri puscaurlaidīgām membrānām no atšķaidītāka uz koncentrētāku šķīdumu, lai sasniegtu līdzsvaru. Šķīdinātāja iešana caur membrānu rada spiediena starpību, kas ir atkarīga no polimēra koncentrācijas un molekulu masas (1) (3) (4). Pielietojamība: Mn starp 20000–200000. Tvaika fāzes osmometrija Saistīta ar tīra šķīdinātāja aerosola iztvaikošanas ātruma salīdzināšanu ar vismaz trīs aerosolu, kas satur polimēru dažādās koncentrācijās, iztvaikošanas ātrumu (1) (2) (4). Pielietojamība: Mn < 20000.

2. Gala grupu analīze Lai izmantotu šo metodi, jāzina gan polimēra vispārējā uzbūve, gan ķēdes noslēdzošās grupas (kam jābūt atšķiramām no galvenā skeleta, piemēram, ar KMR metodi vai ar titrēšanu/derivatizāciju). Polimēra gala grupu molekulārās koncentrācijas noteikšana var noskaidrot molekulu masu lielumu (7) (8) (9). Pielietojamība: Mn līdz 50000 (ticamība samazinās, palielinoties molekulu masai).

3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)

Izmantotā literatūra Billmeyer, F.W. Jr. (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York. Glover, C.A. (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79 (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, p. 25–52. ASTM 3592-77 (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M. (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F. (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G. (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, p. 2139–2146.

Papildinājums Norādījumi mazmolekulāru vielu satura koriģēšanai nešķīstoša polimēra klātbūtnē

Ja paraugā ir klāt nešķīstošs polimērs, tad GPC analīzes laikā rodas masas zudums. Nešķīstošo polimēru neatgriezeniski aiztur kolonnā vai uz parauga filtra, bet parauga šķīstošā daļa iziet cauri kolonnai. Ja polimēra laušanas koeficienta inkrementu (dn/dc) var novērtēt vai izmērīt, var novērtēt kolonnā zudušo parauga masu. Šajā gadījumā izdara korekciju, izmantojot ārējo kalibrēšanu ar standartmateriāliem, kam ir zināma koncentrācija un dn/dc, lai nokalibrētu refraktometra atbildes signālu. Turpmāk minētajā piemērā ir izmantots polimetilmetakrilāta (pMMA) standarts. Ārējā kalibrēšanā, lai veiktu akrilpolimēru analīzi ar GPC metodi, analizē zināmas koncentrācijas pMMA standartšķīdumu tetrahidrofurānā un iegūtos datus izmanto, lai atrastu refraktometra konstanti saskaņā ar vienādojumu: K = R/(C × V × dn/dc) kur: K refraktometra konstante (mikrovoltsekundes/ml), R atbildes signāls uz pMMA standartu (mikrovoltsekundes), C pMMA standarta koncentrācija (mg/ml), V iešļircināmais tilpums (ml) un dn/dc laušanas koeficienta inkrements pMMA šķīdumam tetrahidrofurānā (ml/mg). PMMA standartam ir raksturīgi šādi dati: R 2937891, C 1,07 mg/ml, V 0,1 ml, dn/dc 9 × 10-s ml/mg. Iegūto K vērtību 3,05 × 1011 izmanto, lai aprēķinātu detektora teorētisko atbildes signālu, ja 100 % no iešļircinātā polimēra ir eluēts caur detektoru.

B DAĻA: TOKSICITĀTES UN CITU IETEKMJU UZ VESELĪBU NOTEIKŠANAS METODES

VISPĀRĪGS IEVADS A.

TESTA VIELAS RAKSTUROJUMS Pirms toksicitātes pētījuma uzsākšanas ir jābūt zināmai testa vielas uzbūvei, iekļaujot galvenos piemaisījumus, un tās attiecīgajām fizikāli ķīmiskajām īpašībām, iekļaujot stabilitāti. Testa vielas fizikāli ķīmiskās īpašības sniedz svarīgu informāciju, lai izvēlētos ievadīšanas veidu, katra konkrēta pētījuma plānu un veidu, kā rīkoties ar testa vielu un kā to glabāt. Pirms pētījuma uzsākšanas jāizveido analītiskā metode testa vielas kvantitatīvai un kvalitatīvai noteikšanai (ja iespējams, iekļaujot galvenos piemaisījumus) dozēšanas vidē un bioloģiskajā materiālā. Visa informācija, kas attiecas uz testa vielas identifikāciju, fizikāli ķīmiskajām īpašībām, tīrību un izturēšanos, ir jāiekļauj testa ziņojumā.

DZĪVNIEKU KOPŠANA Toksicitātes testos būtiski svarīga ir stingra vides apstākļu kontrole un pareiza dzīvnieku kopšanas tehnika.

i)

Turēšanas apstākļi Vides apstākļiem eksperimenta dzīvnieku telpās vai iežogojumos ir jābūt testa dzīvniekiem piemērotiem. Žurkām, pelēm un jūrascūciņām piemēroti apstākļi ir telpas temperatūra 22 oC ± 3 oC ar relatīvo mitrumu 30 līdz 70 %; trušiem temperatūrai jābūt 20 oC ± 3 oC ar relatīvo mitrumu 30 līdz 70 %. Dažas eksperimenta metodes ir īpaši jutīgas pret temperatūras ietekmi, un tādos gadījumos datus par attiecīgajiem apstākļiem iekļauj testa metodes aprakstā. Visos toksisko ietekmju pētījumos temperatūra un mitrums ir jākontrolē, jāreģistrē un jāiekļauj pētījuma galaziņojumā. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Sīkas ziņas par apgaismojuma apstākļiem ir jāreģistrē un jāiekļauj pētījuma galaziņojumā. Ja metodē nav noteikts citādi, dzīvniekus var turēt atsevišķi vai turēt būros nelielās viena dzimuma grupās; turot grupās, vienā būri nedrīkst ievietot vairāk par pieciem dzīvniekiem. Ziņojumos par eksperimentiem ar dzīvniekiem ir svarīgi norādīt izmantoto būros turēšanas veidu un katrā būrī ievietoto dzīvnieku skaitu gan ķīmiskās vielas iedarbības laikā, gan arī katrā turpmākajā novērošanas laikposmā.

ii)

Barošanas apstākļi Diētai ir jāatbilst visām testējamās sugas vajadzībām attiecībā uz barību. Ja testa vielas dzīvniekiem ievada ar diētu, uzturvērtība var samazināties vielas un diētas sastāvdaļas savstarpējā iedarbībā. Šādas reakcijas iespēja ir jāņem vērā, interpretējot testu rezultātus. Var izmantot parastās laboratorijas diētas ar neierobežotu dzeramā ūdens piegādi. Diētas izvēli var ietekmēt vajadzība nodrošināt piemērotu testa vielas piejaukšanu, ja vielu ievada ar šo metodi. Diētas piesārņotāji, par kuriem ir zināms, ka tie ietekmē toksicitāti, nedrīkst būt klāt iedarbīgās koncentrācijās.

ALTERNATĪVA TESTĒŠANA Eiropas Savienības zinātniskais mērķis ir izveidot un apstiprināt alternatīvas metodes, kas var sniegt to pašu informācijas līmeni kā pašreizējie testi ar dzīvniekiem, bet kas izmanto mazāk dzīvnieku, izraisa mazāk ciešanu vai pilnīgi izvairās izmantot dzīvniekus. Tādas metodes, kad tās kļūst pieejamas, jāņem vērā, kur vien iespējams, lai raksturotu bīstamību un izdarītu piemītošās bīstamības klasifikāciju un marķēšanu.

NOVĒRTĒŠANA UN INTERPRETĀCIJA Novērtējot un interpretējot testus, ir jāņem vērā ierobežojumi, kādā mērā pētījumus ar dzīvniekiem un in vitro pētījumus var tieši ekstrapolēt uz cilvēku, un tādēļ pierādījumus par kaitīgu ietekmi uz cilvēkiem, ja pierādījumi ir pieejami, var izmantot testēšanas rezultātu apstiprināšanai.

LITERATŪRAS NORĀDES Vairums šo metožu ir izveidotas ESAO testēšanas pamatnostādņu programmas satvarā, un tās ir jāveic atbilstīgi Labas laboratorijas prakses principiem, lai iespējami plaši nodrošinātu datu savstarpējo atzīšanu. Papildu informācija ir atrodama ESAO pamatnostādnēs un citur publicētā attiecīgā literatūrā.

B.1.a AKŪTAIS PERORĀLAIS TOKSISKUMS – FIKSĒTĀS DEVAS METODE

B.1.a

1. METODE Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO 420 (2001) vadlīnijā noteiktajai metodei.

1.

1.1. IEVADS Akūtā toksiskuma novērtēšanas tradicionālajās metodēs par beigu punktu izmanto dzīvnieku nobeigšanos. Jaunu pieeju akūtā toksiskuma noteikšanai, kuras pamatā ir vairāku fiksētu devu ievadīšana, 1984. gadā ieteica Britu Toksikoloģijas biedrība (1). Saskaņā ar šo pieeju izvairās par beigu punktu izmantot dzīvnieku nobeigšanos, tās vietā novērojot vairāku fiksētu devu toksiskuma pazīmes. Pēc Apvienotajā Karalistē (2) un starptautiski (3) in vivo veiktajiem validācijas pētījumiem šī procedūra 1992. gadā tika pieņemta par testa metodi. Tādējādi, izmantojot matemātiskos modeļus, fiksēto devu procedūras statistiskie raksturlielumi vēlāk tika novērtēti vairākos pētījumos (4) (5) (6). Modelēšanas pētījumi un in vivo pētījumi uzskatāmi parādījuši, ka procedūra ir reproducējama, tai jāizmanto mazāk dzīvnieku, izraisa mazāk ciešanu nekā tradicionālās metodes un nodrošina iespējas novērtēt vielas līdzvērtīgā veidā kā ar citām akūtā toksiskuma testa metodēm. Norādījumi par katrā konkrētā gadījumā piemērotāko testa metodi atrodami pamatnostādnēs par akūtā perorālā toksiskuma testēšanu Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (7). Šajās pamatnostādnēs ir arī papildu informācija par testa metodes B.1.a veikšanu un pēc tās iegūto rezultātu interpretāciju. Saskaņā ar metodes principu galvenajos pētījumos izmanto tikai mēreni toksiskas devas un jāizvairās lietot tādas devas, kurām varētu būt letāla iedarbība. Tāpat nav jāievada devas, par kurām ir zināms, ka tās izraisa izteiktas sāpju un briesmu sajūtas kodīgo vai stipri kairinošo īpašību dēļ. Bojā ejoši dzīvnieki, kā arī dzīvnieki, kas acīm redzami cieš sāpes vai pārdzīvo stipru un ilgstošu briesmu sajūtu, ir humāni jānonāvē, un, interpretējot testa rezultātus, tie jāņem vērā tieši tāpat kā testos nobeigušies dzīvnieki. Kritēriji, pēc kuriem pieņem lēmumu nonāvēt bojā ejošus dzīvniekus vai dzīvniekus, kuriem ir smagas ciešanas, kā arī norādījumi par paredzamu vai neizbēgamu nobeigšanos norādīti citās pamatnostādnēs (8). Metode sniedz informāciju par bīstamajām īpašībām un dod iespējas novērtēt un klasificēt vielas ar akūti toksisku iedarbību saskaņā ar Vispārējo saskaņoto ķīmisko vielu klasifikācijas sistēmu (VSS) (9). Pirms uzsākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder tās identifikācija un ķīmiskā struktūra, fizikāli ķīmiskās īpašības, citu in vitro vai in vivo veikto testu rezultāti, toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā saistītām vielām, vielas paredzamo(-ajiem) izmantošanas veidu(-iem). Šī informācija ir vajadzīga, lai nodrošinātu, ka testi tiek veikti cilvēku veselības aizsardzībai piemērotā veidā un tiek pareizi izraudzīta sākotnējā deva.

1.2. DEFINĪCIJAS Akūts perorāls toksiskums: attiecas uz to kaitīgo iedarbību, kāda ir 24 stundu laikā pēc vienas vai vairāku vielas devu ievadīšanas caur muti. Aizkavēta nāve: ir tad, ja dzīvnieks 48 stundu laikā nav nobeidzies vai neizbēgami nav gājis bojā, bet krīt vēlāk 14 dienu novērošanas perioda laikā. Deva: ievadītās testējamās vielas daudzums. Devu izsaka testējamās vielas svara veidā uz testa dzīvnieka svara vienību (piemēram, mg/kg). Izteikts toksiskums: ir vispārīgs termins, ar ko raksturo acīm redzamas toksiskas iedarbības pazīmes pēc testējamo vielu ievadīšanas (piemēram, skatīt izmantotās literatūras sarakstā (3)), un nākamās lielākās devas iedarbībā var sagaidīt izmēģinājuma dzīvnieku lielākās daļas nobeigšanos, izraisot stipras sāpes vai smagas un ilgstošas ciešanas (kritēriji noteikti Humane Endpoints Guidance Document (8)). VSS: Vispārējā saskaņotā ķīmisko vielu un maisījumu klasifikācijas sistēma. Kopīgs ESAO (cilvēku veselības un vides aizsardzība), ANO Bīstamo kravu pārvadājumu ekspertu komitejas (fizikāli ķīmiskās īpašības) un ILO – Starptautiskās Darba organizācijas (kaitīguma paziņošana) – pasākums, ko koordinē Ķīmisko vielu drošas apsaimniekošanas starporganizāciju programma (IOMC). Neizbēgama nāve ir, ja miršana vai nāves iestāšanās sagaidāma pirms nākamā plānotā novērojumu laika. Pazīmes, kas liecina par šā stāvokļa iestāšanos grauzējiem var būt konvulsijas, gulēšana uz sāniem vai augšpēdus un drebēšana. (Sīkāk skatīt Humane Endpoint Guidance Document (8).) LD50(vidējā letālā deva): statistiski noteikta vielas deva, kas, ievadot perorāli, var izraisīt 50 % dzīvnieku nobeigšanos. LD50 vērtību izsaka kā testējamās vielas svaru uz testa dzīvnieka svara vienību (mg/kg). Robeždeva attiecas uz devas augšējo ierobežojumu testā (2000 vai 5000 mg/kg). Mirstošs: atrašanās stāvoklī, kad mirst vai nav iespēju izdzīvot, arī saņemot ārstēšanu. (Sīkāk skatīt Humane Endpoint Guidance Document (8).) Prognozējama nāve: klīniskās pazīmes, kas liecina par nāves iestāšanos pēc zināma laika, nesagaidot eksperimenta plānotās beigas, piemēram – nespēja sasniegt ūdeni vai barību. (Sīkāk skatīt Humane Endpoint Guidance Document (8).)

1.3. TESTA METODES PRINCIPS Viena dzimuma dzīvnieku grupām dod pakāpeniski palielinātas fiksētas devas 5, 50, 300 un 2000 mg/kg (izņēmuma gadījumos var izmantot papildu fiksētu devu 5000 mg/kg, skatīt 1.6.2. punktu). Sākotnējās devas līmeni izraugās pēc devu diapazona pētījumiem kā devu, kas var izraisīt toksiskas iedarbības pazīmes, bet kas nav stipri toksiska un neizraisa nobeigšanos. Klīniskās pazīmes un stāvokļi, kas saistīti ar sāpēm, ciešanām un neizbēgamu nāvi, sīki aprakstīti ESAO pamatnostādnēs (8). Atkarībā no toksiskuma pazīmēm vai mirstības papildu dzīvnieku grupām var ievadīt par to augstākas vai zemākas fiksētas devas. Šo procedūru turpina, līdz fiksētā deva izraisa izteiktas toksiskuma pazīmes, tiek konstatēts ne vairāk kā viens nobeigšanās gadījums, augstākajai devai netiek konstatētas toksiskas iedarbības pazīmes vai notiek nobeigšanās zemākās devas iedarbībā.

1.4. TESTA METODES APRAKSTS

1.4.

1.4.1. Dzīvnieku sugu izvēle Ieteicamākā grauzēju suga ir žurkas, kaut arī var izmanot citas grauzēju sugas. Parasti izmanto sievišķā dzimuma īpatņus (7). Tas tāpēc, ka parasto LD50 testu literatūras pārskati liecina, ka abu dzimumu jutība daudz neatšķiras, taču gadījumos, kad tā ir atšķirīga, sievišķā dzimuma īpatņi ir nedaudz jutīgāki (10). Tomēr, ja dati par struktūras ziņā līdzvērtīgu vielu toksikoloģiskajām un toksikokinētiskajām īpašībām liecina, ka uz testējamās vielas iedarbību tēviņi varētu būt jutīgāki, testi jāveic ar vīrišķā dzimuma īpatņiem. Ja testus veic ar vīrišķā dzimuma īpatņiem, tas ir jāpamato. Jāizmanto jauni, veseli, pieauguši parasti izmantojamo laboratorijas līniju dzīvnieki. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Visiem testa dzīvniekiem testēšanas sākumā jābūt 8 līdz 12 nedēļas veciem, un to svaram jābūt ± 20 % no testiem iepriekš izmantoto dzīvnieku vidējā svara.

1.4.2. Turēšanas un barošanas nosacījumi Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 oC (± 3 oC) temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50–60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens piegādi. Dzīvniekus būros var turēt grupās atbilstoši devai, bet to skaits vienā būrī nedrīkst apgrūtināt katra dzīvnieka novērošanu.

1.4.3. Dzīvnieku sagatavošana Veselus, pieaugušus, jaunus dzīvniekus izvēlas izlases veidā, marķē individuālai identificēšanai un tur būros vismaz piecas dienas pirms devu ievadīšanas sākuma, lai aklimatizētu laboratorijas apstākļiem.

1.4.4. Devu sagatavošana Parasti testējamās vielas jāievada visām pārbaudāmajām devām vienādā tilpumā, mainot ievadāmā preparāta koncentrāciju. Taču, ja jātestē galaprodukts, kas ir šķidrums vai maisījums, vielas bīstamības novērtēšanai tā var būt jāizmanto neatšķaidītā testējamās vielas veidā, t. i., ar nemainīgu koncentrāciju, un tā ir arī dažu reglamentējošo iestāžu prasība. Jebkurā gadījumā nedrīkst pārsniegt ievadāmās devas maksimālo tilpumu. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Grauzējiem šis tilpums parasti nedrīkst pārsniegt 1ml/100 g ķermeņa svara; tomēr ūdens šķīdumu gadījumā var ievadīt līdz 2 ml/100 g ķermeņa svara. Ņemot vērā ievadāmā preparāta sastāvu, vienmēr, kad iespējams, ieteicams izmantot šķīdumu/suspensiju/emulsiju ūdenī, ja ne, tad šķīdumu/suspensiju/emulsiju eļļā (piemēram, kukurūzas eļļā) un tikai pēc tam šķīdumu citos nesējos. Ja par nesēju neizmanto ūdeni, jānoskaidro tā toksikoloģiskās īpašības. Ja nav datu par preparāta pietiekamu stabilitāti visā tā lietošanas laikā, devas jāsagatavo neilgi pirms ievadīšanas.

1.5. PROCEDŪRA

1.5.

1.5.1. Devu ievadīšana Testējamo vielu dzīvniekiem ievada vienā devā, mākslīgi barojot, izmantojot kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas kanulu. Ja kādu apstākļu dēļ ievadīt vienā devā nav iespējams, to var dot mazākās daļās laika posmā, kas nepārsniedz 24 stundas. Pirms ievadīšanas dzīvniekus nedrīkst barot (piemēram, žurkas pārstāj barot iepriekšējā dienā, dodot tikai dzert ūdeni; peles nebaro 3–4 stundas iepriekš, dodot dzert tikai ūdeni). Pirms ievada testējamo vielu pēc nebarošanas perioda, dzīvnieki ir jānosver. Pēc testējamās vielas ievadīšanas žurkas var nebarot vēl 3–4 stundas, bet peles – 1–2 stundas. Ja devu ievada pa daļām ilgākā laika posmā, var būt nepieciešams dzīvniekiem dot barību un ūdeni atkarībā no šā laika posma ilguma.

1.5.2. Devu diapazona pētījums Devu diapazona pētījuma mērķis ir noteikt galvenajā pētījumā izmantojamo sākotnējo devu. Testējamo vielu atsevišķiem dzīvniekiem ievada pēc 1. papildinājumā noteiktajām diagrammām. Devu diapazona pētījumu beidz, kad var pieņemt lēmumu par galvenajā pētījumā izmantojamo sākotnējo devu (vai kad pie mazākās fiksētās devas tiek konstatēta dzīvnieku nobeigšanās). Devu diapazona pētījumam attiecībā uz sākotnējo devu izraugās no fiksēto līmeņu devām 5, 50, 300 un 2000 mg/kg to devu, kurai paredzams izteikts toksiskums, par ko, iespējams, ir pierādījumi par tās pašas vielas vai struktūras ziņā līdzvērtīgu vielu in vitro un in vivo testu rezultātiem. Ja šādas informācijas nav, par sākotnējo devu izmanto 300 mg/kg. Katram dzīvniekam vielas ievadīšanas starplaikam jābūt vismaz 24 stundām. Visi dzīvnieki jānovēro vismaz 14 dienas. Augšējo devu 5000 mg/kg var izmantot tikai izņēmuma gadījumos, kad tā ir pamatota ar īpašām reglamentējošām prasībām (skatīt 3. papildinājumu). Pamatojoties ar dzīvnieku labturības apsvērumiem nav ieteicams testēt dzīvniekus ar VSS 5. kategorijas devām (2000–5000 mg/kg), un tās jātestē tikai tādos gadījumos, kad ir lielas iespējas, ka šādu testu rezultāti ir ļoti nepieciešami cilvēku vai dzīvnieku veselības vai vides aizsardzībai. Gadījumos, kad devu diapazona pētījumā nobeidzas dzīvnieks, kuram pārbaudīta mazākās fiksētās devas (5 mg/kg) iedarbība, parasti pētījumu izbeidz un attiecīgo vielu klasificē VSS 1. kategorijā (kā norādīts 1. papildinājumā). Tomēr, ja ir nepieciešams precīzāks klasifikācijas apstiprinājums, papildus var veikt šādu fakultatīvu procedūru. 5 mg/kg devu ievada vēl otram dzīvniekam. Ja arī šis otrs dzīvnieks nobeidzas, VSS 1. kategorija tiek apstiprināta un pētījumi nekavējoties jāizbeidz. Ja šis otrais dzīvnieks nenobeidzas, 5 mg/kg devu ievada vēl ne vairāk kā trijiem dzīvniekiem. Tā kā ir augsts mirstības risks, ievērojot labturības apsvērumus, šiem dzīvniekiem devu ievada noteiktā secībā. Starplaikam, pēc kāda vielu ievada nākamajam dzīvniekam, ir jābūt pietiekami ilgam, lai varētu konstatēt, ka iepriekšējais dzīvnieks varētu izdzīvot. Ja tiek konstatēts otrs bojāejas gadījums, devu ievadīšanas noteikto secību nekavējoties pārtrauc un deva nevienam dzīvniekam vairāk nav ievadāma. Pēc otrā bojāejas gadījuma (neatkarīgi no dzīvnieku skaita, ar kuriem izdarīti testi testēšanas izbeigšanas laikā) tiek noteikts A rezultāts (divi vai vairāki bojāejas gadījumi) un tiek ievērots 2. papildinājumā noteiktais klasifikācijas noteikums par 5 mg/kg fiksēto devu (1. kategorija, ja ir divi vai vairāki bojāejas gadījumi, vai 2. kategorija, ja tiek konstatēts ne vairāk kā viens bojāejas gadījums). Turklāt 4. papildinājumā ir norādījumi par klasifikāciju ES sistēmā līdz laikam, kamēr tiek ieviesta jaunā VSS sistēma.

1.5.3. Galvenais pētījums

1.5.3.

1.5.3.1. Dzīvnieku skaits un devu līmeņi Lēmumi, kas jāpieņem pēc testiem ar sākotnējo devu, ir norādīti diagrammās 2. papildinājumā. Jāpieņem kāds no trijiem lēmumiem – testēšanu pārtraukt un piešķirt atbilstošu bīstamības klasi, veikt testus ar augstāko fiksēto devu vai arī ar zemāko fiksēto devu. Tomēr, pamatojoties uz apsvērumiem, kas saistīti ar dzīvnieku aizsardzību, nav jātestē devu līmenis, kas devu diapazona pētījumā ir izraisījis dzīvnieku nobeigšanos (skatīt 2. papildinājumu). Līdzšinējā pieredze liecina, ka ticamākais sākotnējās devas testu rezultāts ir tāds, ka vielu iespējams klasificēt bez jebkādiem papildu testiem. Katra līmeņa devu testēšanai parasti izmanto pavisam piecus viena dzimuma dzīvniekus. Šo piecu dzīvnieku grupu izvēlas, izmantojot vienu dzīvnieku no devu diapazona pētījuma, kam ievadīta izraudzītā līmeņa deva, un papildus vēl četrus dzīvniekus (izņemot gadījumus, kad galvenajā pētījumā izmantotais devu līmenis nav bijis iekļauts devu diapazona pētījumā, taču parasti tā nav). Vielas ievadīšanas reižu starplaiku katram devu līmenim nosaka atkarībā no toksiskuma pazīmju parādīšanās, ilguma un smaguma. Vielas nākamās devas ievadīšana ir jāatliek līdz laikam, kamēr rodas pārliecība par iepriekš devu saņēmušo dzīvnieku izdzīvošanu. Ja vajadzīgs, lai novērotu aizkavētu toksisko iedarbību, ieteicams ievērot trīs līdz četru dienu starplaiku katrai devu līmeņa ievadīšanai. Starplaiku var koriģēt pēc vajadzības, piemēram, gadījumos, kad atbildes reakcija uz vielas iedarbību nav pārliecinoša. Ja tiek pieņemts lēmums izmantot augstāko fiksēto devu 5000 mg/kg, jāievēro 3. papildinājumā noteiktā procedūra (skatīt arī 1.6.2. punktu).

1.5.3.2. Pieļaujamības tests Pieļaujamības testu galvenokārt izmanto gadījumos, kad eksperimenta veicēja rīcībā ir informācija, kas liecina, ka vielai, iespējams, nav toksiskas iedarbības, t. i., tā ir toksiska tikai devās, kas ierobežotas ar reglamentējošām pieļaujamības devām. Informāciju par testējamās vielas toksiskumu var iegūt pēc testu datiem ar līdzīgiem maisījumiem vai produktiem, ņemot vērā identitāti un to komponentu īpatsvaru, kuru toksiskums ir zināms. Šādās situācijās, kad nav informācijas par toksiskumu vai tā ir nepietiekama, vai arī sagaidāms, ka testējamā viela varētu būt toksiska, ir jāveic galvenais tests. Izmantojot parasto procedūru, devu diapazona pētījuma sākotnējo devu 2000 mg/kg (vai izņēmuma gadījumā 5000 mg/kg) ievada papildu četriem dzīvniekiem, ko izmanto pieļaujamības testam saskaņā ar šiem norādījumiem.

1.6. NOVĒROJUMI Pēc ievadīšanas pirmo 30 minūšu laikā dzīvniekus individuāli novēro vismaz vienreiz, pirmo 24 stundu laikā periodiski, īpašu uzmanību veltot pirmajām četrām stundām un pēc tam reizi dienā, pavisam 14 dienas, izņemot gadījumus, kad tie gājuši bojā vai pētījumi jāizbeidz, dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ tos humāni nonāvējot. Tomēr novērošanas ilgums nav stingri jānosaka. Tas jānosaka pēc toksiskuma reakcijām, to parādīšanās laika un atveseļošanās ilguma, un tādēļ novērojumu ilgumu var pagarināt, ja ir vajadzīgs. Laiki, kad parādās un izzūd toksiskuma pazīmes, ir svarīgi, īpaši, ja tām ir tendence aizkavēties (11). Visus novērojumus regulāri reģistrē, par katru dzīvnieku izdarot individuālus reģistrus. Ja dzīvnieki turpina uzrādīt toksiskas iedarbības pazīmes, ir vajadzīgi papildu novērojumi. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar to ādu un apmatojumu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas. Uzmanība jāpievērš drebuļu, krampju, siekalošanās, caurejas, letarģijas, miega un komas novērojumiem. Jāņem vērā principi un kritēriji, kas apkopoti Humane Endpoints Guidance Document (8). Visi mirstošie dzīvnieki un dzīvnieki, kas izrāda lielu sāpju un ilgstošu briesmu sajūtu pazīmes, ir humāni jānonāvē. Ja dzīvnieki ir nonāvēti humānu apsvērumu dēļ vai atrasti nobeigušies, iespējami precīzi jāreģistrē nāves iestāšanās laiks.

1.6.

1.6.1. Ķermeņa svars Visi dzīvnieki jānosver neilgi pirms testējamās vielas ievadīšanas un pēc tam vismaz reizi nedēļā. Svara izmaiņas ir jāaprēķina un jāreģistrē. Testu beigās izdzīvojušos dzīvniekus nosver, tad humāni nonāvē.

1.6.2. Patoloģija Visiem testa dzīvniekiem (arī tiem, kuri testa laikā nobeigušies vai ar kuriem dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ pētījumi izbeigti) ir jāizdara pilna autopsija. Visas makroskopiskās patoloģiskās izmaiņas jāreģistrē par katru dzīvnieku. Var apsvērt arī orgānu, kuros parādās makroskopiskās patoloģijas pierādījumi, mikroskopisko izmeklēšanu dzīvniekiem, kas pēc sākotnējās devas izdzīvojuši 24 stundas vai ilgāk, jo tāda apskate var sniegt noderīgu informāciju.

2. DATI Norāda datus par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati ir jāapkopo tabulas veidā, norādot dzīvnieku skaitu, kas izmantots katrā testa grupā, dzīvnieku skaitu, kuriem parādījušās toksiskuma pazīmes, dzīvnieku skaitu, kuri testa laikā atrasti nobeigušies vai nonāvēti humānu apsvērumu dēļ, atsevišķo dzīvnieku nobeigšanās laiku, toksiskās iedarbības veidu un to atgriezeniskuma aprakstu un gaitu, kā arī autopsijā iegūtos novērojumus.

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. PĀRSKATS PAR TESTU Pārskatā par testu jāiekļauj šāda informācija.

Testējamā viela:

fizikālās īpašības, tīrība un attiecīgos gadījumos arī fizikāli ķīmiskās īpašības (tostarp izomerizācija),

identifikācijas dati, tostarp CAS numurs.

Nesējs (ja vajadzīgs):

nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens.

Testa dzīvnieki:

izmantotā suga/līnija,

dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms,

dzīvnieku skaits, vecums un dzimums (tostarp, ja vajadzīgs, vīrišķā dzimuma īpatņu izmantošanu sievišķā dzimuma īpatņu vietā),

izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u. c.

Testa apstākļi:

sīkas ziņas par testējamās vielas preparātu, tostarp dati par ievadītā materiāla fizikālo formu,

sīkas ziņas par testējamās vielas ievadīšanu, iekļaujot dozēšanas tilpumus un dozēšanas laikus,

sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot veidu/izcelsmi, ūdens avotu),

sākotnējās devas izvēles pamatojums.

Rezultāti:

datu tabula par atbildes reakcijām un devu līmeņiem (t. i., dzīvniekiem, kas uzrādījuši toksiskuma pazīmes, tostarp nobeigšanās gadījumus, iedarbības veidu, smagumu un ilgumu),

datu tabula par ķermeņa svaru un ķermeņa svara izmaiņām,

katra dzīvnieka svars ievadīšanas dienā un pēc tam ar nedēļas starplaikiem, kā arī nobeigšanās vai nonāvēšanas laikā,

nobeigšanās datums un laiks, ja tā notikusi pirms paredzētās nonāvēšanas,

toksiskuma pazīmju parādīšanās gaita katram dzīvniekam, un vai tās ir bijušas atgriezeniskas,

katra dzīvnieka autopsijas konstatācijas un histopatoloģiskās konstatācijas, ja tās pieejamas.

Rezultātu apspriešana un interpretācija.

Secinājumi.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, p. 85–92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol.‚ 6, p. 279–291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol., 28, p. 469–482. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313–324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol., 14, p. 315–323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183–196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231. Chan P.K and Hayes, A.W. (1994). Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

B.1.b AKŪTS PERORĀLS TOKSISKUMS – AKŪTA TOKISKUMA KLASES METODE

B.1.b

1. METODE Šī testa metode ir līdzvērtīga ESAO 423. (2001) vadlīnijā noteiktajai metodei.

1.

1.1. IEVADS Šajā testā norādītā akūtā toksiskuma klases noteikšanas metode (1) ir posmveida procedūra, kuras katrā posmā izmanto trīs viena dzimuma dzīvniekus. Atkarībā no dzīvnieku mirstības un/vai mirstošo dzīvnieku skaita testējamās vielas akūtā toksiskuma noteikšanai vidēji var būt vajadzīgi 2–4 posmi. Šī procedūra ir reproducējama, tajā izmanto ļoti nelielu skaitu dzīvnieku, un pēc tās iespējams vielas klasificēt līdzvērtīgi kā pēc citām akūtā toksiskuma noteikšanas metodēm. Akūtā toksiskuma klases noteikšanas metodes pamatā ir biometriski novērtējumi (2) (3) (4) (5) ar fiksētām devām, kas ir atbilstoši atdalītas tā, lai vielu varētu novērtēt gan klasifikācijas vajadzībām, gan bīstamības noteikšanai. Kopš tās pieņemšanas 1996. gadā metode plaši in vivo validēta gan valstu līmenī (6), gan starptautiski (7) salīdzinājumā ar datiem, kas iegūti no literatūras. Norādījumi par katrā konkrētā gadījumā piemērotāko testa metodi atrodami pamatnostādnēs par akūtā perorālā toksiskuma testēšanu Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8). Šajās pamatnostādnēs ir arī papildu informācija par testēšanas metodes B.1.b veikšanu un pēc tās iegūto rezultātu interpretāciju. Testējamās vielas devās, par kurām ir zināms, ka tās izraisa izteiktas sāpju un briesmu sajūtas kodīgo vai stipri kairinošo īpašību dēļ, nav jāievada. Bojā ejoši dzīvnieki, kā arī dzīvnieki, kas acīm redzami cieš sāpes vai pārdzīvo stipras un ilgstošas briesmu sajūtas, ir humāni jānonāvē, un, interpretējot testēšanas rezultātus, tie jāņem vērā tieši tāpat kā testos nobeigušies dzīvnieki. Kritēriji, pēc kuriem pieņem lēmumu nonāvēt bojā ejošus dzīvniekus vai dzīvniekus, kuriem ir smagas ciešanas, kā arī norādījumi par paredzamu vai neizbēgamu nobeigšanos doti citās atsevišķās pamatnostādnēs (9). Metodē izmanto iepriekš noteiktas fiksētas devas, un pēc tās iegūtie rezultāti dod iespējas vielas ar akūti toksisku iedarbību novērtēt un klasificēt saskaņā ar Vispārējo saskaņoto ķīmisko vielu klasifikāciju (10). Šī metode principā nav paredzēta precīzai LD50 aprēķināšanai, bet ļauj noteikt iedarbības diapazonu, kurā ir sagaidāms letāls iznākums, jo šā testa galvenais beigu punkts ir kādas testa dzīvnieku daļas nobeigšanās. Pēc šīs metodes LD50 vērtību var noteikt tikai tādos gadījumos, kad vismaz divas devas izraisa nobeigšanos, kas ir augstāka nekā 0 % un zemāka nekā 100 %. Izmantojot iepriekš noteiktas devas, kas nav atkarīgas no konkrētās testējamās vielas, tās klasifikāciju tieši saistot ar dažādos stāvokļos novēroto dzīvnieku skaitu, uzlabo dažādās laboratorijās iegūto rezultātu atbilstību un atkārtojamību. Pirms sākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder tās identifikācija un ķīmiskā struktūra, fizikāli ķīmiskās īpašības, citu in vitro vai in vivo veikto toksiskuma testu rezultāti, toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā līdzīgām vielām, vielas paredzamais(-ie) izmantošanas veids(-i). Šī informācija ir vajadzīga, lai nodrošinātu, ka testi tiek veikti cilvēku veselības aizsardzībai piemērotā veidā un tiek pareizi izraudzīta sākotnējā deva.

1.2. DEFINĪCIJAS Akūts perorāls toksiskums: kaitīgā iedarbība, kāda ir 24 stundu laikā pēc vienas vai vairāku vielas devu ievadīšanas caur muti. Aizkavēta nāve ir tad, ja dzīvnieks 48 stundu laikā nav nobeidzies vai neizbēgami nav gājis bojā, bet nobeidzas vēlāk 14 dienu novērošanas perioda laikā. Deva: ievadītās testējamās vielas daudzums. Devu izsaka testējamās vielas svara veidā uz testa dzīvnieka svara vienību (piemēram, mg/kg). VSS: Vispārējā saskaņotā ķīmisko vielu un maisījumu klasifikācijas sistēma. Kopīgs ESAO (veselības un vides aizsardzība), ANO Bīstamo kravu pārvadājumu ekspertu komitejas (fizikāli ķīmiskās īpašības) un ILO – Starptautiskās Darba organizācijas (kaitīguma paziņošana) – pasākums, ko koordinē Ķīmisko vielu drošas apsaimniekošanas starporganizāciju programma (IOMC). Neizbēgama nāve ir tad, ja miršana vai nāves iestāšanās sagaidāma pirms nākamā plānotā novērojumu laika. Pazīmes, kas liecina par šā stāvokļa iestāšanos grauzējiem var būt konvulsijas, gulēšana uz sāniem vai augšpēdus un drebēšana. (Sīkāk skatīt Humane Endpoint Guidance Document (9).) LD50(vidējā letālā deva): statistiski noteikta vielas deva, kas, ievadot perorāli, var izraisīt 50 % dzīvnieku nobeigšanos. LD50 vērtību izsaka kā testējamās vielas svaru uz testa dzīvnieku svara vienību (mg/kg). Robeždeva attiecas uz devas augšējo ierobežojumu testā (2000 vai 5000 mg/kg). Mirstošs: atrašanās stāvoklī, kad mirst vai nav iespēju izdzīvot, arī saņemot ārstēšanu. (Sīkāk skatīt Humane Endpoint Guidance Document (9).) Prognozējama nāve: klīniskās pazīmes, kas liecina par nāves iestāšanos pēc zināma laika, nesagaidot eksperimenta plānotās beigas, piemēram, nespēja sasniegt ūdeni vai barību. (Sīkāk skatīt Humane Endpoint Guidance Document (9).)

1.3. METODES PRINCIPS Metodes princips ir tāds, ka, pamatojoties uz posmveida procedūru, kuras katrā posmā izmanto minimālu skaitu dzīvnieku, tiek iegūta klasifikācijai pietiekama informācija par testējamās vielas akūto toksiskumu. Vielu izmēģinājuma dzīvnieku grupai ievada perorāli vienā no noteiktajām devām. Vielu testē, izmantojot posmveida procedūru, katrā posmā izmanto trīs viena (parasti sievišķā) dzimuma dzīvniekus. Ar vielu saistīta testa dzīvnieku bojāeja vai tās neesamība nosaka nākamo posmu, t. i.: Testa procedūra sīkāk aprakstīta 1. papildinājumā. Metode dod iespējas testējamo vielu novērtēt, to klasificējot kādā no toksiskuma klasēm, kas noteiktas pēc fiksētām LD50 robežvērtībām.

turpmāka testēšana nav vajadzīga,

to pašu devu ievada vēl trijiem dzīvniekiem,

vēl trijiem dzīvniekiem ievada nākamo augstāko vai zemāko devu.

1.4. METODES APRAKSTS

1.4.

1.4.1. Dzīvnieku sugu izvēle Ieteicamākā grauzēju suga ir žurkas, lai gan var izmanot arī citas grauzēju sugas. Parasti izmanto sieviešu dzimuma īpatņus (9). Tas tāpēc, ka parasto LD50 testu literatūras apskati liecina, ka abu dzimumu jutība daudz neatšķiras, taču gadījumos, kad tā ir atšķirīga, sieviešu dzimuma īpatņi parasti ir nedaudz jutīgāki (11). Tomēr, ja dati par struktūras ziņā līdzīgu vielu toksikoloģiskajām un toksikokinētiskajām īpašībām liecina, ka uz testējamās vielas iedarbību tēviņi varētu būt jutīgāki, tests jāveic ar vīriešu dzimuma īpatņiem. Ja testu veic ar vīrišķā dzimuma īpatņiem, tas ir jāpamato. Ir jāizmanto jauni, veseli, pieauguši parasti izmantojamo laboratorijas līniju dzīvnieki. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Visiem testa dzīvniekiem testēšanas sākumā jābūt 8 līdz 12 nedēļas veciem, un to ķermeņa svaram jābūt ± 20 % no testiem iepriekš izmantoto dzīvnieku vidējā svara.

1.4.3. Dzīvnieku sagatavošana Veselus, pieaugušus, jaunus dzīvniekus izvēlas izlases veidā, marķē individuālai identificēšanai un tur būros vismaz piecas dienas pirms izmēģinājuma sākuma, lai tie aklimatizētos laboratorijas apstākļos.

1.4.4. Devu sagatavošana Parasti testējamās vielas jāievada visām pārbaudāmajām devām vienādā tilpumā, mainot ievadāmā preparāta koncentrāciju. Taču, ja jātestē galaprodukts, kas ir šķidrums vai maisījums, vielas bīstamības novērtēšanai tā var būt jāizmanto neatšķaidītā veidā, t. i., ar nemainīgu koncentrāciju, un tā ir arī dažu reglamentējošo iestāžu prasība. Jebkurā gadījumā nedrīkst pārsniegt ievadāmo devas maksimālo tilpumu. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Žurkām tas parasti nedrīkst pārsniegt 1ml/100 g ķermeņa svara; tomēr ūdens šķīdumus var ievadīt līdz 2 ml/100 g ķermeņa svara. Ņemot vērā ievadāmā preparāta sastāvu, vienmēr, kad iespējams, ieteicams izmantot šķīdumu/suspensiju/emulsiju ūdenī, ja ne, tad šķīdumu/suspensiju/emulsiju eļļā (piemēram, kukurūzas eļļā) un tikai pēc tam šķīdumu citos nesējos. Ja nesējs nav ūdens, jānoskaidro tā toksiskās īpašības. Ja nav datu par preparāta pietiekamu stabilitāti visā tā lietošanas laikā, devas jāsagatavo neilgi pirms ievadīšanas.

1.5. PROCEDŪRA

1.5.

1.5.1. Devu ievadīšana Testējamo vielu dzīvniekiem ievada vienā devā, mākslīgi barojot, izmantojot kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas kanulu. Ja kādu apstākļu dēļ ievadīt vienā devā nav iespējams, to var dot mazākās daļās laika posmā, kas nepārsniedz 24 stundas. Dzīvniekus pirms devu ievadīšanas nebaro (piemēram, žurkas pārtrauc barot iepriekšējā dienā, dodot tikai dzert, bet peles – 3–4 stundas pirms devu ievadīšanas). Pirms ievadīt testējamo vielu pēc nebarošanas perioda, dzīvnieki ir jānosver. Pēc testējamās vielas ievadīšanas žurkas var nebarot vēl 3–4 stundas, bet peles – 1–2 stundas. Ja vielas devu ievada pa daļām kādā laika posmā, atkarībā no tā ilguma var gadīties, ka dzīvnieki ir jānodrošina ar barību un ūdeni.

1.5.2. Dzīvnieku skaits un devu līmeņi Katrā posmā izmato trīs dzīvniekus. Devas līmeni, ko izmanto par sākotnējo devu, izvēlas kā vienu no četriem noteiktiem līmeņiem, t. i., 5, 50, 300 un 2000 mg/kg ķermeņa svara. Sākotnējam devas līmenim jābūt tādam, kas ar lielu varbūtību varētu izraisīt vismaz dažu devu saņēmušo dzīvnieku bojāeju. Diagrammās 1. papildinājumā norādīta procedūra, kas jāievēro atkarībā no sākotnējās devas. Papildus 4. papildinājumā ir norādījumi par klasifikāciju ES sistēmā līdz laikam, kamēr tiek ieviesta jaunā VSS sistēma. Ja pieejamā informācija liek domāt, ka pie lielākā sākotnējās devas līmeņa (2000 mg/kg ķermeņa svara) mirstība ir mazticama, tad ir jāizdara pieļaujamības tests. Ja par testējamo vielu nav informācijas, dzīvnieku labturības dēļ ir ieteicams izmantot sākotnējo devu 300 mg/kg ķermeņa svara. Laika intervālu starp vielas atkārtotu ievadīšanu izmēģinājumu dzīvnieku grupām nosaka atkarībā no toksiskuma pazīmju parādīšanās, ilguma un smaguma. Vielas nākamās devas ievadīšana ir jāatliek līdz laikam, kamēr rodas pārliecība par iepriekš devu saņēmušo dzīvnieku izdzīvošanu. Augšējo devu 5000 mg/kg ķermeņa svara var izmantot tikai izņēmuma gadījumos, kad tā ir pamatota ar īpašām reglamentējošām prasībām (skatīt 2. papildinājumu). Pamatojoties ar dzīvnieku labturības apsvērumiem nav ieteicams ar dzīvniekiem izmēģināt VSS 5. kategorijas devas (2000–5000 mg/kg), un tās jātestē tikai tādos gadījumos, ja ir lielas iespējas, ka šādu testu rezultāti ir ļoti nepieciešami cilvēku vai dzīvnieku veselības vai vides aizsardzībai.

1.5.3. Pieļaujamības tests Pieļaujamības testu galvenokārt izmanto gadījumos, kad eksperimenta veicēja rīcībā ir informācija, kas liecina, ka vielai varētu nebūt toksiskas iedarbības, t. i., tā ir toksiska tikai devās, kas ierobežotas ar reglamentējošiem dokumentiem. Informāciju par testējamā materiāla toksiskumu var iegūt pēc testu datiem ar līdzīgiem maisījumiem vai produktiem, ņemot vērā identitāti un to sastāvdaļu procentuālo īpatsvaru, kuru toksiskums ir zināms. Šādās situācijās, kad nav informācijas par toksiskumu vai tā ir nepietiekama, vai arī paredzams, ka testējamā viela varētu būt toksiska, ir jāveic galvenais tests. Pieļaujamības testu pie viena devas līmeņa 2000 mg/kg ķermeņa svara var izdarīt ar sešiem dzīvniekiem (katrā posmā pa trijiem). Izņēmuma gadījumos pieļaujamības testu var veikt ar devu 5000 mg/kg ķermeņa svara, izmantojot trīs dzīvniekus (skatīt 2. papildinājumu). Ja tiek konstatēta ar vielas ievadīšanu saistīta bojāeja, var būt nepieciešams veikt nākamās zemākās devas testus.

1.6. NOVĒROJUMI Pēc ievadīšanas pirmo 30 minūšu laikā dzīvniekus individuāli novēro vismaz vienreiz, pirmo 24 stundu laikā periodiski, īpašu uzmanību veltot pirmajām četrām stundām, un pēc tam reizi dienā, pavisam 14 dienas, izņemot gadījumus, kad dzīvnieki gājuši bojā vai pētījumi jāizbeidz, dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ tos humāni nonāvējot. Tomēr novērošanas ilgums nav stingri jānosaka. Tas ir jānosaka pēc toksiskās iedarbības reakcijām, to parādīšanās laika un atveseļošanās ilguma, un tādēļ ilgumu var pagarināt, ja uzskata par vajadzīgu. Laiki, kad parādās un izzūd toksiskuma pazīmes, ir svarīgi, īpaši, ja tām ir tendence aizkavēties (12). Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru dzīvnieku izdarot individuālu reģistrēšanu. Ja dzīvniekiem turpinās toksiskās iedarbības pazīmes, ir vajadzīgi papildu novērojumi. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar to ādu un apmatojumu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas. Uzmanība jāpievērš drebuļu, krampju, siekalošanās, caurejas, letarģijas, miega un komas novērojumiem. Jāņem vērā principi un kritēriji, kas apkopoti Humane Endpoints Guidance Document (9). Visi mirstošie dzīvnieki un dzīvnieki, kas izrāda lielu sāpju un ilgstošu briesmu sajūtu pazīmes, ir humāni jānonāvē. Ja dzīvnieki ir nonāvēti humānu apsvērumu dēļ vai atrasti miruši, iespējami precīzi ir jāreģistrē nobeigšanās laiks.

1.6.

1.6.1. Ķermeņa svars Visi dzīvnieki jānosver neilgi pirms testējamās vielas ievadīšanas un pēc tam vismaz reizi nedēļā. Svara izmaiņas ir jāaprēķina un jāreģistrē. Testa beigās pirms humānas nonāvēšanas izdzīvojušos dzīvniekus nosver.

1.6.2. Patoloģija Visiem testa dzīvniekiem (arī tiem, kuri testa laikā nobeigušies vai ar kuriem dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ pētījumi izbeigti) ir jāveic pilna autopsija. Visas patoloģiskās izmaiņas reģistrē par katru dzīvnieku. Var apsvērt arī orgānu, kuros parādās visas patoloģijas pierādījumi, mikroskopisko izmeklēšanu dzīvniekiem, kas izdzīvojuši 24 stundas vai ilgāk, jo tāda apskate var sniegt noderīgu informāciju.

2. DATI Norāda datus par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati ir jāapkopo tabulas veidā, norādot dzīvnieku skaitu, kas izmantots katrā testa grupā, dzīvnieku skaitu, kuriem parādījušās toksiskuma pazīmes, dzīvnieku skaitu, kuri testa laikā atrasti nobeigušies vai nonāvēti humānu apsvērumu dēļ, atsevišķo dzīvnieku nobeigšanās laiku, toksiskās iedarbības veidu un tā atgriezeniskuma aprakstu un gaitu, kā arī autopsijā iegūtos novērojumus.

3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. Pārskats par testu Pārskatā par testu jāiekļauj šāda informācija.

Testējamā viela:

fizikālās īpašības, tīrība un attiecīgos gadījumos arī fizikāli ķīmiskās īpašības (ieskaitot izomerizāciju),

identifikācijas dati, tostarp CAS numurs.

Nesējs (ja vajadzīgs):

nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens.

Testa dzīvnieki:

izmantotā suga/līnija,

dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms,

dzīvnieku skaits, vecums un dzimums (ietverot, ja vajadzīgs, vīrišķā dzimuma īpatņu izmantošanu sievišķā dzimuma īpatņu vietā),

izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u. c.

Testa apstākļi:

informācija par testējamās vielas preparātu, ietverot datus par ievadītā materiāla fizikālo formu,

sīkas ziņas par testējamās vielas ievadīšanu, iekļaujot ievadāmos tilpumus un ievadīšanas laikus,

sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot veidu/izcelsmi, ūdens avotu),

sākotnējās devas izvēles pamatojums.

Rezultāti:

katra dzīvnieka atbildes reakciju datu tabula un devas līmenis (t. i., dzīvniekiem, kas uzrādījuši toksiskuma pazīmes, tostarp nobeigšanās gadījumus, iedarbības veidu, smagumu un ilgumu),

datu tabula par ķermeņa svaru un ķermeņa svara izmaiņām,

katra dzīvnieka svars ievadīšanas dienā un pēc tam ar nedēļas starplaikiem, kā arī nobeigšanās vai nonāvēšanas laikā,

nobeigšanās datums un laiks, ja tā notikusi pirms paredzētās nonāvēšanas,

toksiskuma pazīmju parādīšanās gaita katram dzīvniekam, un vai tās ir bijušas atgriezeniskas,

katra dzīvnieka autopsijā konstatētais un histopatoloģiskās konstatācijas, ja tās pieejamas.

Rezultātu apspriešana un interpretācija.

Secinājumi.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, p. 86. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336–341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559–610. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729–734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, p. 129–134. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, p. 455–470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69,p. 659–670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, p. 223–231. Chan P.K. and A.W. Hayes (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

B.2. AKŪTA TOKSICITĀTE (PĒC IEELPOŠANAS)

B.2.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Lietderīgi iegūt orientējošu informāciju par vielas daļiņu izmēru sadalījumu, tvaika spiedienu, kušanas temperatūru, viršanas temperatūru, uzliesmošanas temperatūru un sprādzienbīstamību (ja vajadzīgs). Skatīt vispārīgā ievada B daļas A iedaļu.

1.2. DEFINĪCIJAS Skatīt vispārīgā ievada B daļas B iedaļu.

1.3. STANDARTVIELAS Nav.

1.4. METODES PRINCIPS Vairākas izmēģinājumu dzīvnieku grupas noteiktu laiku pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai dažādā koncentrācijā, katrai grupai saņemot vienādu koncentrāciju. Pēc tam novēro toksisko iedarbību un reģistrē nāves gadījumus. Izmēģinājuma laikā mirušos dzīvniekus uzšķērž, beidzoties izmēģinājumam, sekciju izdara arī izdzīvojušajiem dzīvniekiem. Dzīvnieki, kas uzrāda smagas un ilgstošas ciešanu un sāpju pazīmes, var būt jānonāvē humānu apsvērumu dēļ. Pārbaudāmo vielu dozēšana nav jāizdara veidā, par ko ir zināms, ka tas izraisa izteiktas sāpes un ciešanas kodīgo un kairinošo īpašību dēļ.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Sagatavošanas darbi Dzīvniekus pirms izmēģinājuma vismaz piecas dienas pieradina pie izmitināšanas un barošanas apstākļiem. Veselus un jaunus dzīvniekus pēc nejaušības principa sadala izmēģinājumu grupās. Ekspozīcijas apstākļu simulāciju veic tikai tad, ja šādu nepieciešamību nosaka izmantojamās iekārtas īpatnības. Pārbaudāmās cietvielas var būt ļoti smalki jāsasmalcina, lai iegūtu vajadzīgā izmēra daļiņas. Vajadzības gadījumā pārbaudāmo vielu sajauc ar piemērotu nesējvielu, kas palīdz iegūt vajadzīgo vielas koncentrāciju atmosfērā, vienlaikus paredzot kontroles grupu, kuru pakļauj nesējvielas iedarbībai. Ja vieglākai dozēšanai izmanto šķīdinātāju vai citas piedevas, jāpārliecinās par to netoksiskumu. Vajadzības gadījumā var izmantot agrāk iegūtus datus.

1.6.2. Pārbaudes apstākļi

1.6.2.

1.6.2.1. Izmēģinājumu dzīvnieki Ja nav citu ieteikumu, vēlams izmantot žurkas. Jāizmanto plaši pazīstamas laboratorijas dzīvnieku līnijas. Abu dzimumu grupās dzīvnieku masas atšķirības izmēģinājuma sākumā nedrīkst būt lielākas par ± 20 % no attiecīgās vidējās vērtības.

1.6.2.2. Dzīvnieku skaits un dzimums Katru koncentrāciju izmēģina vismaz uz 10 grauzējiem (piecas mātītes un pieci tēviņi). Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Piezīme. Akūtās toksicitātes izmēģinājumiem izmantojot par grauzējiem augstāk attīstītus dzīvniekus, jāapsver iespējas izmantot to mazāku skaitu. Devas jāizraugās ļoti rūpīgi, un jācenšas nepārsniegt devas, kurām ir vidēji toksiska iedarbība. Šādos izmēģinājumos izvairās ievadīt tādas pārbaudāmās vielas devas, kurām ir letāla iedarbība.

1.6.2.3. Pārbaudāmās koncentrācijas Jāizvēlas vairākas devas, vismaz trīs devas pietiekami plašā diapazonā, lai izmēģinājumu grupās būtu iespējams novērot atšķirīgu toksisko iedarbību un mirstību. Jāiegūst pietiekami daudz datu, lai varētu noskaidrot mirstības atkarību no koncentrācijas un, ja iespējams, pienācīgi noteikt LD50.

1.6.2.4. Pieļaujamās koncentrācijas tests Ja pēc četru stundu iedarbības uz pieciem vīriešu kārtas un pieciem sieviešu kārtas testa dzīvniekiem, izmantojot 20 mg vielas uz litru gāzes vai 5 mg vielas uz litru aerosola vai makrodaļiņu (vai, ja tas nav iespējams pārbaudāmās vielas fizikālo, ķīmisko īpašību, kā arī sprādzienbīstamības dēļ, izmantojot maksimāli iespējamo koncentrāciju), 14 dienu laikā šis savienojums neizraisa dzīvnieku nāvi, uzskata, ka turpmākā testēšana nav nepieciešama. (18. ATP, Direktīva 93/21/EEK, Ll10/93).

1.6.2.5. Ekspozīcijas ilgums Minimālais ekspozīcijas ilgums ir četras stundas.

1.6.2.6. Iekārta Izmēģinājumos ar dzīvniekiem izmanto inhalācijas iekārtu, kas nodrošina dinamisku gaisa plūsmu un stundas laikā vismaz 12 reizes apmaina gaisu, lai būtu pietiekams skābekļa saturs un vienmērīga atmosfēra ekspozīcijas laikā. Ja izmanto inhalācijas kameru, tās konstrukcijai jābūt tādai, kas neļauj dzīvniekiem drūzmēties un maksimāli nodrošina pārbaudāmās vielas iedarbību ekspozīcijas laikā. Lai kamerā būtu noturīga atmosfēra, izmēģinājumu dzīvnieku kopējais tilpums parasti nedrīkst pārsniegt 5 % no kameras tilpuma. Var izmantot kameras, kas ļauj vielai iedarboties tikai uz mutes un deguna dobumu, galvu vai visu ķermeni; pirmos divos gadījumos līdz minimumam samazināta pārbaudāmās vielas uzņemšana citādā veidā.

1.6.2.7. Novērošanas periods Dzīvniekus novēro vismaz 14 dienas. Tomēr novērošanas ilgumu var ietekmēt dažādi apstākļi. To nosaka novērotās toksiskās reakcijas, to iestāšanās ātrums un dzīvnieku atveseļošanās ilgums; tāpēc vajadzības gadījumā to var pagarināt. Svarīgi zināt brīdi, kad parādās un izzūd toksiskuma pazīmes, un brīdi, kurā iestājas nāve, jo īpaši tad, ja tā iestājas novēloti.

1.6.3. Procedūra Dzīvniekus nosver tieši pirms izmēģinājuma un, kad pārbaudāmās vielas koncentrācija izvēlētajā iekārtā sasniedz līdzsvaru, tos vismaz četras stundas pakļauj vajadzīgās koncentrācijas iedarbībai. Koncentrācijas līdzsvaram jāiestājas īsā laikā. Izmēģinājuma laikā jāuztur 22 ± 3 oC temperatūra. Relatīvo mitrumu vēlams uzturēt robežās no 30 % līdz 70 %, tomēr dažkārt (piemēram, veicot izmēģinājumus ar daļu aerosolu) tas var nebūt iespējams. Kamerā uzturot nedaudz pazeminātu spiedienu (būris, 5 mm ūdens staba), novērš iespējas vielai izplūst apkārtējā vidē. Ekspozīcijas laikā dzīvniekus nebaro un nedzirda. Izmēģinājumu laikā jāizmanto piemērotas atmosfēras temperatūras uzturēšanas un kontroles sistēmas. Sistēmai pēc iespējas ātrāk jānodrošina nemainīgi ekspozīcijas apstākļi. Kameras konstrukcijai un ekspluatācijai jābūt tādai, lai tajā tiktu uzturēta viendabīga testējamā atmosfēra. Jāmēra un jāuzrauga: Iedarbības laikā novērojumus veic un reģistrē sistemātiski; atsevišķi pieraksta datus par katru dzīvnieku. Pirmajā dienā novērošanu veic biežāk. Katru darbdienu vismaz vienreiz veic rūpīgu klīnisko izmeklēšanu, pārējos novērojumus veic ik dienas, pienācīgi gādājot par to, lai samazinātu izmēģinājumu dzīvnieku zudumus, piemēram, mirušos dzīvniekus secē vai ievieto ledusskapī, bet vārgus un mirstošus īpatņus nošķir vai nogalina. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar to ādu un apmatojumu, acis, gļotādas, elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas. Īpaša vērība jāpievērš elpošanas orgānu darbībai, trīcei, konvulsijām, salivācijai, caurejai, letarģijai, miegam un komas stāvoklim. Nāves iestāšanās brīdi reģistrē, cik vien precīzi iespējams. Beidzoties iedarbības laikam, katru dzīvnieku nosver vienreiz nedēļā un pēc nāves iestāšanās. Dzīvniekus, kas miruši testa laikā, un izdzīvojušos dzīvniekus testa beigās secē, īpašu uzmanību pievēršot izmaiņām augšējos un apakšējos elpošanas ceļos. Reģistrē visas novērotās patoloģiskās izmaiņas. Vajadzības gadījumā ņem audu paraugus histopatoloģiskai izmeklēšanai.

1.6.3. a)

gaisa plūsmas ātrums (nepārtraukti);

testa vielas faktiskā koncentrācija, kas mērīta elpošanas zonā vismaz trīs reizes iedarbības laikā (dažām atmosfērām, piemēram, aerosoliem lielās koncentrācijās, var būt vajadzīga biežāka uzraudzība). Vielas koncentrācijas svārstības iedarbības laikā nedrīkst pārsniegt ± 15 % no vidējās vērtības. Tomēr, ja izmanto dažus aerosolus, to nevar panākt, un tad ir pieļaujams plašāks svārstību diapazons. Aerosolu daļiņu lieluma analīze jāveic tik bieži, cik nepieciešams (vismaz vienreiz uz testa grupu);

temperatūra un mitrums, ja iespējams, nepārtraukti.

2. DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot dzīvnieku skaitu katrā grupā pirms testa, nāves iestāšanās brīdi katram dzīvniekam, to dzīvnieku skaitu, kuriem novērotas citas toksiskuma pazīmes, toksiskās ietekmes izpausmes un autopsijas rezultātus. Ja dzīvnieki izdzīvo ilgāk nekā vienu dienu, jāaprēķina un jāpieraksta svara izmaiņas. Dzīvniekus, kas ir humāni nogalināti ar savienojumu saistīto briesmu sajūtu un sāpju dēļ, reģistrē kā mirušus saistībā ar savienojumu. LD50 aprēķina pēc atzītas metodes. Izvērtējot datus, jānoskaidro, vai pastāv korelācija starp testa vielas iedarbību un novēroto anomāliju biežumu un smagumu, ieskaitot uzvedības izmaiņas, klīniskās novirzes, makropatoloģiskās izmaiņas, ķermeņa svara izmaiņas, mirstību un pārējos toksikoloģiskos rādītājus.

3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. TESTA ZIŅOJUMS Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija: Iedarbības režīms Šie dati jāapkopo tabulā, norādot vidējās vērtības, kā arī svārstību diapazonu (piemēram, standartnovirzi), un, ja iespējams, jāiekļauj:

dzīvnieku suga, līnija, izcelsme, vides apstākļi, barība u. tml.,

testa apstākļi: inhalācijas iekārtas apraksts, iekļaujot konstrukciju, tipu, izmērus, gaisa avotu, aerosolu ģenerēšanas sistēmu, gaisa kondicionēšanas metodi un dzīvnieku ievietošanas metodi testa kamerā, ja to izmanto. Jāapraksta temperatūras, mitruma, aerosola koncentrāciju un daļiņu lieluma mērīšanas aprīkojums.

3.1. a)

gaisa plūsmas ātrums caur inhalācijas aprīkojumu;

gaisa temperatūra un mitrums;

nominālās koncentrācijas (inhalācijas iekārtā ievadītais testa vielas kopējais daudzums, kas izdalīts ar gaisa daudzumu);

nesēja veids, ja to izmanto;

faktiskās koncentrācijas testa elpošanas zonā;

masas vidējais aerodinamiskais diametrs (MVAD) un ģeometriskā standartnovirze (ĢSN);

līdzsvara iestāšanās ilgums;

iedarbības ilgums;

atbildes reakcijas datu tabula pēc dzimuma un iedarbības līmeņa (t. i., testa laikā mirušo vai nogalināto dzīvnieku skaits); dzīvnieku skaits, kam parādās toksiskuma pazīmes; iedarbībai pakļauto dzīvnieku skaits,

nāves brīdis iedarbības laikā vai pēc tās, dzīvnieku humānās nogalināšanas iemesli un kritēriji,

visi novērojumi,

LC50 katra dzimuma dzīvniekiem, beidzoties novērošanas laikam (norādot aprēķina metodi),

LD50 95 % ticamības intervāls (ja var aprēķināt),

devas/mirstības līkne un slīpuma koeficients (ja to ļauj noteikšanas metode),

autopsijas konstatācijas,

histopatoloģiskas konstatācijas,

rezultātu apspriešana (īpaša uzmanība jāpievērš, kāda ietekme dzīvnieku humānai nogalināšanai testa laikā varētu būt uz aprēķināto LC50 lielumu),

rezultātu interpretācija.

3.2. IZVĒRTĒJUMS UN INTERPRETĀCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļas D iedaļu.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skatīt vispārīgā ievada B daļas E iedaļu.

B.3. AKŪTĀ TOKSICITĀTE (ĀDAS)

B.3.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Skatīt vispārīgā ievada B daļas A iedaļu.

1.2. DEFINĪCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļas B iedaļu.

1.3. STANDARTVIELAS Nav.

1.4. TESTA METODES PRINCIPS Ar testa vielu pakāpeniskās devās apstrādā ādu vairāku izmēģinājumu grupu dzīvniekiem, katrai grupai saņemot vienādu devu. Pēc tam novēro toksisko iedarbību un reģistrē nāves gadījumus. Testa laikā mirušos dzīvniekus secē, beidzoties testam, secē arī izdzīvojušos dzīvniekus. Dzīvnieki, kas uzrāda smagas un ilgstošas briesmu sajūtas un sāpju pazīmes, var būt humāni jānogalina. Tāda testa devu došana, par ko ir zināms, ka tā izraisa izteiktas sāpes un briesmu sajūtu kodīgo vai kairinošo īpašību dēļ, nav jāveic.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.6. TESTA METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Sagatavošanas darbi Dzīvniekus eksperimenta būros pirms testa vismaz piecas dienas pieradina pie izmitināšanas un barošanas apstākļiem. Pirms testa veselus un jaunus pieaugušus dzīvniekus pēc nejaušības principa sadala izmēģinājumu grupās. Apmēram 24 stundas pirms testa dzīvniekiem nocērp vai noskuj apmatojumu uz muguras. Cērpot vai skujot apmatojumu, nedrīkst nobrāzt ādu, jo tas var izmainīt ādas caurlaidību. Testa vielas uzlikšanai jāsagatavo vismaz 10 % ķermeņa virsmas. Pārbaudot cietas vielas, kuras vajadzības gadījumā var saberzt pulverī, testa viela jāsamitrina ar pietiekamu daudzumu ūdens vai, ja nepieciešams, ar piemērotu nesēju, lai tai būtu laba saskare ar ādu. Ja izmanto nesēju, ir jāņem vērā, ka tas var izmainīt ādas caurlaidību attiecībā pret testa vielu. Analizējamos šķidrumus parasti neatšķaida.

1.6.2. Testa apstākļi

1.6.2.

1.6.2.1. Izmēģinājuma dzīvnieki Var izmantot pieaugušas žurkas vai trušus. Var izmantot arī citas sugas dzīvniekus, bet tad šī izvēle jāpamato. Jāizmanto parasti lietojamās laboratorijas dzīvnieku līnijas. Katra dzimuma dzīvnieku svara atšķirības testa sākumā nedrīkst pārsniegt ± 20 % no attiecīgā vidējā lieluma.

1.6.2.2. Dzīvnieku skaits un dzimums Katrā devas līmenī izmanto vismaz piecus dzīvniekus. Visiem jābūt viena dzimuma. Ja izmanto mātītes, tās nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Ja ir pieejama informācija, kas rāda, ka viens dzimums ir izteikti jutīgāks, devas ir jādod šā dzimuma dzīvniekiem. Piezīme. Akūtās toksicitātes testā ar dzīvniekiem, kas ir augstāki par grauzējiem, ir jāapsver mazāka skaita izmantošana. Devas ir rūpīgi jāizvēlas, un jāpieliek visas pūles, lai nepārsniegtu vidēji toksiskas devas. Tādos testos ir jāizvairās dot testa vielu letālās devās.

1.6.2.3. Devu līmeņi Jāizvēlas vairākas devas, vismaz trīs devas pietiekami plašā diapazonā, lai testa grupās būtu iespējams novērot atšķirīgu toksisko iedarbību un mirstību. Izvēloties devu līmeņus, jāņem vērā tas, ka vielas var būt kairinošas vai kodīgas. Jāiegūst pietiekami daudz datu, lai varētu noskaidrot iedarbības atkarību no devas un, ja iespējams, pienācīgi noteikt LD50.

1.6.2.4. Pieļaujamības tests Pieļaujamības testu pie viena devas līmeņa, kas ir vismaz 2000 mg/kg ķermeņa svara, var izdarīt piecu vīriešu dzimuma un piecu sieviešu dzimuma dzīvnieku grupai, izmantojot turpmāk aprakstīto procedūru. Ja rodas ar savienojumu saistīta mirstība, var būt jāapsver pilns pētījums.

1.6.2.5. Novērošanas laika posms Dzīvniekus novēro vismaz 14 dienas. Tomēr novērošanas ilgumu var ietekmēt dažādi apstākļi. To nosaka novērotās toksiskās reakcijas, to iestāšanās ātrums un dzīvnieku atveseļošanās ilgums; tāpēc vajadzības gadījumā to var pagarināt. Svarīgi zināt brīdi, kad parādās un izzūd toksiskuma pazīmes, to ilgumu un brīdi, kurā iestājas nāve, jo īpaši tad, ja tā iestājas novēloti.

1.6.3. Procedūra Katru dzīvnieku tur atsevišķā būrī. Testa vielu vienmērīgi uztriepj uz ādas, kuras platība veido apmēram 10 % no kopējās ķermeņa virsmas. Ja vielas ir ļoti toksiskas, apstrādājamo ādas platību var samazināt, bet tai jābūt pēc iespējas lielākai, un viela jāuztriepj, cik vien var plāni un vienmērīgi. Testa vielas saskari ar ādu visā 24 stundu garajā iedarbības laikā nodrošina ar porainas marles pārsēju un nekairinošu plāksteri. Apstrādātā vieta pēc tam vēl jāpārklāj tā, lai nostiprinātu marles pārsēju ar testa vielu un lai dzīvnieki nevarētu to norīt. Lai testa viela nenonāktu barības vadā, var daļēji ierobežot dzīvnieku kustību, taču pilnīga imobilizācija nebūtu vēlama. Beidzoties iedarbības laikam, testa vielas atlikumu, ja praktiski iespējams, noņem ar ūdeni vai kādu citu piemērotu ādas mazgāšanas līdzekli. Jāveic regulāri novērojumi, un tie uzreiz jāprotokolē. Atsevišķi pieraksta datus par katru dzīvnieku. Pirmajā dienā novērošanu veic biežāk. Katru darbdienu vismaz vienreiz veic rūpīgu klīnisko izmeklēšanu, pārējos novērojumus veic ik dienas, pienācīgi gādājot par to, lai samazinātu izmēģinājumu dzīvnieku zudumus, piemēram, mirušos dzīvniekus secē vai ievieto ledusskapī, bet vārgus un mirstošus dzīvniekus nošķir vai nogalina. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar apmatojumu, apstrādāto ādu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas. Īpaša vērība jāpievērš trīcei, konvulsijām, salivācijai, caurejai, letarģijai, miegam un komas stāvoklim. Nāves iestāšanās brīdi reģistrē, cik vien precīzi iespējams. Dzīvniekus, kas miruši testa laikā, secē; beidzoties testam, secē arī izdzīvojušos dzīvniekus. Reģistrē visas novērotās patoloģiskās izmaiņas. Vajadzības gadījumā ņem audu paraugus histopatoloģiskai izmeklēšanai.

1.6.3. Toksicitātes novērtēšana otram dzimumam

Pēc pētījuma pabeigšanas ar vienu dzimumu vismaz vienai otra dzimuma piecu dzīvnieku grupai dod devu, lai noskaidrotu, vai šā dzimuma dzīvnieki nav izteikti jutīgāki pret testa vielu. Mazāka dzīvnieku skaita izmantošana var būt pamatota konkrētos apstākļos. Ja ir pieejama pietiekama informācija, lai parādītu, ka testētā dzimuma dzīvnieki ir izteikti jutīgāki, var iztikt bez otra dzimuma dzīvnieku testēšanas.

2. DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot dzīvnieku skaitu katrā grupā pirms testa, nāves iestāšanās brīdi katram dzīvniekam, to dzīvnieku skaitu, kuriem novērotas citas toksiskuma pazīmes, toksiskās iedarbības izpausmes un autopsijas rezultātus. Katra dzīvnieka svaru reģistrē īsi pirms testa vielas pielietošanas, pēc nedēļas un nāves iestāšanās brīdī; ja dzīvnieki izdzīvo ilgāk nekā vienu dienu, jāaprēķina un jāpieraksta svara izmaiņas. Dzīvniekus, kas ir humāni nogalināti ar savienojumu saistīto briesmu sajūtas un sāpju dēļ, reģistrē kā mirušus saistībā ar savienojumu. LD50 aprēķina pēc atzītas metodes. Izvērtējot datus, jānoskaidro, vai pastāv korelācija starp testa vielas iedarbību un novēroto anomāliju biežumu un smagumu, ieskaitot uzvedības izmaiņas, klīniskās novirzes, makropatoloģiskās izmaiņas, ķermeņa svara svārstības, mirstību un pārējos toksikoloģiskos rādītājus.

3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. TESTA ZIŅOJUMS Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

dzīvnieku suga, līnija, izcelsme, turēšanas un barošanas apstākļi, barība u. tml.,

testa apstākļi (iekļaujot ādas notīrīšanas metodi un pārsējuma veidu – okluzīvs vai neokluzīvs),

izmantotās devas (vajadzības gadījumā arī nesējs un koncentrācija),

devu saņēmušo dzīvnieku dzimums,

atbildes reakcijas datu tabula pēc dzimuma un devu līmeņa (t. i., testa laikā nobeigušos vai nogalināto dzīvnieku skaits; dzīvnieku skaits, kam parādās toksiskuma pazīmes; iedarbībai pakļauto dzīvnieku skaits),

nāves brīdis pēc devas saņemšanas, dzīvnieku humānās nogalināšanas iemesli un kritēriji,

visi novērojumi,

LD50 lielums, kas noteikts pēc 14 dienām dzimumam, kam izdarīts pilns pētījums, un noteikšanas metode,

LD50 95 % ticamības intervāls (ja var aprēķināt),

devas/mirstības līkne un slīpuma koeficients (ja to ļauj noteikšanas metode),

autopsijas konstatācijas,

histopatoloģiskas konstatācijas,

testa rezultāti ar otru dzimumu,

rezultātu apspriešana (īpaša uzmanība jāpievērš tam, kāda ietekme dzīvnieku humānai nogalināšanai testa laikā varētu būt uz aprēķināto LD50 lielumu),

rezultātu interpretācija.

3.2. IZVĒRTĒJUMS UN INTERPRETĀCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļas D iedaļu.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skatīt vispārīgā ievada B daļas E iedaļu.

B.4. AKŪTS TOKSISKUMS – KAIRINĀJUMS/KODĪGA IEDARBĪBA UZ ĀDU

B.4.

1. METODE Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO 404. (2002) vadlīnijā noteiktai metodei.

1.

1.1. IEVADS Izstrādājot šo pilnveidoto metodi, īpaša vērība tika veltīta tās iespējamajiem uzlabojumiem, kas attiecas uz dzīvnieku labturību un visas esošās informācijas izvērtēšanu par testējamo vielu, lai neveiktu nevajadzīgus testus ar laboratorijas dzīvniekiem. Šajā metodē ietilpst arī ieteikums pirms vielas aprakstīto kodīgo/kairinošo īpašību pārbaudes in vivo testos par esošajiem atbilstīgajiem datiem veikt zinātnisko datu nozīmīguma analīzi. Ja esošie dati ir nepietiekami, tos var iegūt secīgā testēšanā (1). Testēšanas stratēģijā ietilpst validētu un vispārpieņemtu in vitro testu veikšana, un tā pievienota papildinājumam, kurā aprakstīta šī metode. Bez tam attiecīgā gadījumā ieteicams sākotnējā testa in vivo trīs daļas veikt nevis vienlaicīgi, bet secīgi. Gan zinātniskās precizitātes dēļ, gan ņemot vērā dzīvnieku labturības apsvērumus, in vivo testus neveic, kamēr zinātnisko datu nozīmīguma analīzē nav izvērtēti visi pieejamie dati par vielas kodīgo/kairinošo iedarbību uz ādu. Šādi dati ir – ar cilvēkiem un/vai laboratorijas dzīvniekiem veiktajos pētījumos iegūtie zinātniskie dati, liecības par vienas vai vairāku struktūras ziņā līdzīgu vielu vai vielu maisījumu kodīgajām/kairinošajām īpašībām, dati, kas liecina, ka attiecīgajai vielai ir stipru skābju vai bāzu īpašības (2) (3), kā arī validētos un vispārpieņemtos in vitro vai ex vivo testos iegūti rezultāti (4) (5) (5.a). Šāda analīze samazina nepieciešamību veikt in vivo testus, nosakot kodīgās/kairinošās īpašības tādām vielām, par kurām citos pētījumos jau ir iegūts pietiekami daudz zinātnisku datu par šiem diviem galamērķiem. Ieteicamā secīgā testēšanas stratēģija, pie kuras pieder validētu un vispārpieņemtu in vitro vai ex vivo izmēģinājumu veikšana kodīgo/kairinošo īpašību noteikšanai, ir pievienota šīs metodes papildinājumā. Šo stratēģiju izstrādājusi un vienprātīgi ieteikusi ESAO darba grupa (6), un tā pieņemta par ieteicamo testēšanas stratēģiju Vispārējā saskaņotā ķīmisko vielu klasifikācijas sistēma (VSS) (7). Šo stratēģiju ieteicams ievērot pirms in vivo testiem. Lai iegūtu zinātniski pamatotus datus par konkrētās vielas kodīgajām īpašībām/kairinošo iedarbību, testus ar jaunām vielām ieteicams veikt secīgos posmos. Attiecībā uz esošajām vielām, par kurām nav pietiekamu datu, kas raksturo to kodīgās/kairinošās īpašības, jāizmanto nepieciešamā stratēģija, kas vajadzīga, lai iegūtu trūkstošos datus. Ir jābūt pamatojumam par atšķirīgu testēšanas stratēģiju vai procedūru izmantošanu vai arī par lēmumu – neveikt testu secīgos posmos. Ja kodīgās vai kairinošās īpašības nav iespējams noteikt zinātnisko datu nozīmīguma analīzē, ievērojot secīgās testēšanas stratēģiju, jāveic atbilstoši in vivo testi (skatīt papildinājumā).

1.2. DEFINĪCIJAS Ādas kairinājums: ādas atgriezenisks bojājums, kas rodas pēc testējamās vielas aplicēšanas līdz četru stundas ilgā ekspozīcijas laikā. Kodīga iedarbība uz ādu (ādas saēšana): ādas neatgriezenisku bojājumu radīšana, t. i., nekrozes novērošana caur epidermu un zemādā, kas rodas pēc testējamās vielas aplicēšanas līdz četru stundas ilgā ekspozīcijas laikā. Kodīgajai iedarbībai parasti raksturīgas čūlas, asiņošana, asiņainas kreveles un 14 dienu novērojumu perioda beigās atkrāsošanās ādas izbalēšanas dēļ, rodas zonas, kurās izkritis apmatojums un veidojas rētas. Lai novērtētu neskaidrus bojājumus, jāveic histopataloģiski izmeklējumi.

1.3. TESTA METODES PRINCIPS Uz izmēģinājumu dzīvnieku ādas aplicē vienu devu testējamās vielas. Par kontroli izmanto tā paša izmēģinājumu dzīvnieka ādas neskartās daļas. Nosaka kairinājuma/kodīgās iedarbības pakāpi, ko atzīmē pēc noteiktiem intervāliem un iedarbības pilnīgai novērtēšanai apraksta sīkāk. Pētījumi jāveic tik ilgi, lai varētu novērtēt novērotās iedarbības atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Visos testa posmos dzīvnieki, kuriem ilgstoši novēro stipru ciešanu un/vai sāpju pazīmes, ir humāni jānonāvē, un atbilstoši jānovērtē testējamās vielas iedarbība. Kritēriji, pēc kuriem pieņemami lēmumi par to dzīvnieku humānu nonāvēšanu, kuri iet bojā vai kuriem ir stipras ciešanas, atrodami literatūras sarakstā (8).

1.4. TESTA METODES APRAKSTS

1.4.

1.4.1. Sagatavošana testiem in vivo

1.4.1.

1.4.1.1. Dzīvnieku sugu izvēle Piemērotākais dzīvnieks laboratorijas izmēģinājumiem ir albīnais trusis, tiem izmanto jaunus veselus pieaugušus dzīvniekus. Jābūt atbilstošam pamatojumam, ja izmanto citu sugu dzīvniekus.

1.4.1.2. Dzīvnieku sagatavošana Apmēram 24 stundas pirms testa uzsākšanas dzīvniekiem muguras daļā no ķermeņa nocērp apmatojumu. Jāraugās, lai netiktu noberzta āda, un jāizmanto tikai tie dzīvnieki, kam ir vesela un nebojāta āda. Dažām trušu līnijām ir bieži spalvu kušķi, kas zināmos gadalaikos kļūst biezāki. Šādas vietas, kur apmatojums uz ķermeņa ir ļoti blīvs, testēšanai izmantot nevar.

1.4.1.3. Turēšanas un barošanas nosacījumi Dzīvnieki jātur atsevišķi. Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, trušiem nepieciešama 20 oC (± 3 oC) temperatūra. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50–60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzeramajam ūdenim.

1.4.2. Testa procedūra

1.4.2.

1.4.2.1. Testējamās vielas aplicēšana Testējamo vielu uztriepj uz nelielas ādas virsmas platības (apmēram 6 cm2) un šo vietu pārklāj ar marles gabaliņu, ko piestiprina ar nekairinošu plāksteri. Gadījumos, kad tieša aplicēšana nav iespējama (piemēram, šķidrumiem vai daļai pastu), testējamo vielu vispirms pārnes uz marles tamponu, ar kuru pēc tam apstrādā ādu. Marlei jābūt ne pārāk ciešā saskarē ar ādu, ko panāk, iedarbības laikā izmantojot piemērotu puspiegulošu pārsēju. Ja testējamā viela pārnesta uz marles tampona, tas ādai jāpiestiprina tā, lai vielai ar ādu būtu laba saskare un tā visā laukumā būtu sadalīta vienmērīgi. Jāpanāk, lai dzīvnieki nevarētu aiztikt marli, tādējādi izslēdzot iespēju, ka pārbaudāmā viela nonāk barības vadā vai elpošanas ceļos. Testējamās vielas, kas ir šķidrumi, parasti neatšķaida. Testējot cietvielas (kuras, ja uzskata par vajadzīgu, var saberzt pulverī), testējamā viela jāsamitrina ar ļoti nelielu daudzumu ūdens (vai vajadzības gadījumā citā piemērotā nesējā), kas ir pietiekams labas saskares nodrošināšanai ar ādu. Ja izmanto nevis ūdeni, bet citus nesējus, nesēja kairinošajai iedarbībai uz ādu, ja tāda ir, jābūt iespējami minimālai. Iedarbības perioda beigās, kas parasti ir četras stundas, testējamās vielas atliekas no ādas noņem, ja iespējams, izmantojot ūdeni vai citu piemērotu šķīdinātāju, kas neietekmē izveidojušos atbildes reakciju uz vielu un nerada epidermas bojājumus.

1.4.2.2. Devas līmenis Uz pārbaužu vietas aplicē 0,5 ml šķidruma vai 0,5 g cietvielas vai pastas.

1.4.2.3. Sākotnējs tests (In vivo ādas kairinājuma/kodīgās iedarbības tests, izmantojot vienu dzīvnieku) Testi in vivo noteikti jāsāk ar vienu dzīvnieku, īpaši gadījumos, kad testējamā viela varētu būt kodīga. Tas atbilst secīgas testēšanas stratēģijai (skatīt 1. papildinājumu). Ja, spriežot pēc zinātnisko datu nozīmīguma analīzes, viela ir kodīga, ar dzīvniekiem nav nepieciešams veikt papildu testus. Ar lielāko daļu vielu, kas varētu būt kodīgas, parasti papildu testi in vivo nav vajadzīgi. Tomēr tādos gadījumos, kad nepietiekamu zinātnisku datu dēļ tiek uzskatīts, ka ir jāiegūst papildu dati, ar dzīvniekiem veic ierobežota apjoma testus pēc turpmāk aprakstītās pieejas. Vienam dzīvniekam secīgi aplicē trīs marles tamponus ar testējamo vielu. Pirmo marles tamponu noņem pēc trim minūtēm. Ja netiek novērota nopietna ādas reakcija, uzliek otru marles tamponu, ko noņem pēc stundas. Ja novērojumi šajā testa posmā liecina, ka ir humāni iedarbības laiku pagarināt līdz četrām stundām, uzliek trešo tamponu, ko noņem pēc četrām stundām, un novērtē atbildes reakciju. Ja kodīgā iedarbība tiek novērota pēc jebkuras no trijām secīgi veiktajām testējamās vielas iedarbībām, testus nekavējoties pārtrauc. Ja kodīgā iedarbība netiek konstatēta pēc pēdējā marles tampona noņemšanas, dzīvnieku novēro 14 dienas, ja kodīgā iedarbība neattīstās jau līdz šā termiņa beigām. Gadījumos, kad testējamā viela nevarētu būt kodīga, bet tai iespējama kairinoša iedarbība, vienam dzīvniekam uz četrām stundām aplicē vienu marles tamponu.

1.4.2.4. Apstiprinājuma tests (In vivo ādas kairinājuma tests, izmantojot papildu dzīvniekus) Ja sākotnējā testā kodīgums nav novērots, kairinošā iedarbība vai tās neesamība jāapstiprina izmēģinājumos ar diviem papildu dzīvniekiem, katram aplicējot vienu tamponu, kuru tur četras stundas. Ja kairinošā iedarbība novērota sākotnējā testā, apstiprinājuma testu var veikt secīgi vai arī abus dzīvniekus vienlaicīgi pakļaujot vielas iedarbībai. Izņēmuma gadījumā, kad sākotnējs tests netiek veikts, diviem vai trijiem dzīvniekiem aplicē vienu tamponu, ko noņem pēc četrām stundām. Ja, izmantojot divus dzīvniekus, to abu reakcijas uz vielas iedarbību ir vienādas, turpmāka testēšana nav nepieciešama. Ja tā nav, jāveic testi ar vēl vienu dzīvnieku. Neskaidru reakciju novērtēšanai var būt nepieciešami vairāki papildu dzīvnieki.

1.4.2.5. Novērošanas periods Novērojumi jāveic pietiekami ilgi, lai pilnībā varētu novērtēt novērotās iedarbības atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Taču izmēģinājumi vienmēr jāpārtrauc uzreiz tad, ja dzīvniekiem parādās pastāvīgas smagu sāpju vai ciešanu pazīmes. Lai novērtētu iedarbības atgriezeniskumu, pēc tamponu noņemšanas dzīvnieki jānovēro līdz 14 dienām. Izmēģinājumus attiecīgi beidz drīzāk, ja iedarbības atgriezeniskumu konstatē pirms 14 dienu perioda beigām.

1.4.2.6. Klīniskie novērojumi un ādas reakciju klasificēšana Visiem dzīvniekiem jāpārbauda eritēmas un tūskas veidošanās pazīmes un iedarbība 60 minūtes pēc marles tampona noņemšanas un turpmāk pēc 24, 48 un 72 stundām. Sākotnējā testā ar vienu dzīvnieku tūlīt pēc marles tampona noņemšanas apskata arī testēšanas vietu. Ādas reakcijas novērtē un reģistrē pēc turpmāk dotās klasifikācijas tabulas. Ja ir ādas bojājums, ko pēc 72 stundām nevar identificēt par kairinājumu vai kodīgas iedarbības rezultātu, iedarbības atgriezeniskuma noteikšanai novērojumi var būt jāturpina līdz 14. dienai. Papildus kairinājuma novērojumiem pilnībā jāraksturo un jāreģistrē arī visu veidu lokāla toksiska iedarbība, piemēram, ādas attaukošana un visu veidu sistēmiski kaitīga iedarbība (piemēram, ietekme uz toksiskuma klīniskajām pazīmēm un ķermeņa svara izmaiņām). Neskaidru reakciju noskaidrošanai var būt vajadzīgi histopatoloģiskie izmeklējumi. Ādas reakciju klasifikācija ir neizbēgami subjektīva. Lai veicinātu ādas reakciju klasifikācijas saskaņošanu un palīdzētu testēšanas laboratorijām, novērojumu veicējiem un interpretētājiem, personālam, kas veic novērojumus, jābūt pietiekami apmācītam par izmantojamo klasifikācijas sistēmu (skatīt turpmāko tabulu). Var būt lietderīgi izmantot ilustrētus norādījumus par ādas kairinājuma un citu bojājumu klasifikāciju (9).

2. DATI

2.

2.1. REZULTĀTU NOFORMĒŠANA Pētījumu rezultāti jāapkopo tabulas veidā testēšanas galīgajā pārskatā, kurā jāiekļauj visi 3.1. iedaļā uzskaitītie jautājumi.

2.2. REZULTĀTU IZVĒRTĒŠANA Ādas kairinājums punktos jānovērtē saistībā ar bojājumu raksturu un smagumu, to atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Konkrētie punkti nav uzskatāmi par vielas kairinošo īpašību absolūtu standartu, jo tiek novērtēta arī testējamā materiāla citu veidu iedarbība. Gluži otrādi, atsevišķie punkti uzskatāmi par standartvērtībām, kuras jānovērtē saistībā ar visiem citiem pētījumā veiktajiem novērojumiem. Kairinošās iedarbības novērtējumā jāņem vērā ādas bojājumu atgriezeniskums. Ja līdz 14 dienu novērošanas perioda beigām saglabājas tādas reakcijas kā apmatojuma zaudējums (ierobežotā platībā), hiperkeratoze – ādas pārragošanās, hiperplāzija un plaisāšana, testējamā viela jāuzskata par kairinošu.

3. PĀRSKATS

3.

3.1. TESTĒŠANAS PĀRSKATS Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai.

Pamatojums testu veikšanai in vivo – iepriekš veiktajos testos iegūto zinātnisko datu nozīmīguma analīze, tostarp secīgajā testēšanas stratēģijā iegūto rezultātu analīze:

atbilstošu iepriekš veiktajos testos iegūto datu apraksts,

visos testēšanas stratēģijas posmos iegūtie dati,

in vitro veikto testu apraksts, tostarp sīkas ziņas par izmantotajām procedūrām, rezultātiem, kas iegūti ar testējamajām vielām un standartvielām,

in vivo pētījumam nepieciešamā zinātnisko datu nozīmīguma analīze.

Testējamā viela:

identifikācijas dati, (piemēram, CAS numurs, avots, tīrība, zināmie piemaisījumi, partijas numurs),

fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, pH, gaistamība, šķīdība, stabilitāte),

attiecībā uz maisījumiem to sastāvs un atsevišķo komponentu relatīvais īpatsvars.

Nesējs:

identifikācija, koncentrācija (ja vajadzīgs), izmantotais tilpums,

nesēja izvēles pamatojums.

Testa dzīvnieki:

izmantotā suga/līnija, izvēles pamatojums gadījumos, kad neizmanto albīnos trušus,

katra dzimuma dzīvnieku skaits,

katra dzīvnieka svars testa sākumā un beigās,

vecums izmēģinājumu sākumā,

dzīvnieku izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u. c.

Testa apstākļi:

tampona pielikšanas vietas sagatavošanas paņēmiens,

sīkas ziņas par tamponam izmantotajiem materiāliem un tampona uzlikšanas paņēmienu,

sīkas ziņas par testējamās vielas sagatavošanu, aplicēšanu un noņemšanu.

Rezultāti:

kairinošās/kodīgās iedarbības punktu tabulas veidā apkopoti dati par katru dzīvnieku visos novērojumu laikos,

visu novēroto bojājumu apraksts,

apraksts stāstījuma veidā par novēroto kairinošo iedarbību vai kodīgumu un histopatoloģiskajos izmeklējumos iegūtajiem datiem,

papildu ādas kairinājumam vai kodīgajai iedarbībai citas nevēlamas vietējas (piemēram, ādas attaukošanas) vai sistēmiska rakstura iedarbības apraksts.

Rezultātu izvērtējums.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(5.a)(6)(7)(8)(9)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410–429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicology In Vitro, 2, p. 19–26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, p. 709–720. ECETOC (1990) Monograph No 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483–524. Testing Method B.40 Skin Corrosion. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28thJoint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. (Var saņemt, pieprasot no ESAO sekretariāta.)

I tabula Eritēmas un kreveļu veidošanās Tūskas veidošanās ĀDAS REAKCIJAS KLASIFICĒŠANA

Eritēmas nav … 0 Ļoti viegla eritēma (tikko pamanāma) … 1 Labi izteikta eritrēma … 2 Mērena līdz smaga eritēma … 3 Smaga eritrēma (liellopa gaļas sarkanums) ar kreveļu veidošanos, kas nedod eritrēmas klasifikācijas iespējas … 4 Maksimāli iespējamie: 4 Tūskas nav … 0 Pavisam neliela tūska (tikko pamanāma) … 1 Neliela tūska (skarto vietu var viegli noteikt pēc izteikta pietūkuma) … 2 Mērena tūska (pietūkums apmēram 1 mm augstumā) … 3 Smaga tūska (pietūkums vairāk nekā 1 mm un ir plašāks nekā iedarbības vieta) … 4 Maksimāli iespējamie: 4 Neskaidru reakciju noskaidrošanai var būt vajadzīgi histopatoloģiskie izmeklējumi.

B.5. AKŪTS TOKSISKUMS – KAIRINĀJUMS/KODĪGA IEDARBĪBA UZ ACĪM

B.5.

1. METODE Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO 405. (2002) vadlīnijā noteiktajai metodei.

1.

1.1. IEVADS Izstrādājot šo pilnveidoto metodi, īpaša vērība tika veltīta tās iespējamajiem uzlabojumiem, izvērtējot visu esošo informāciju par testējamo vielu, lai nav jāveic nevajadzīgi testi ar laboratorijas dzīvniekiem un tādējādi ievērotu dzīvnieku labturības prasības. Šajā metodē ietilpst arī ieteikums par zinātnisko datu nozīmīguma analīzes (1) veikšanu saistībā ar esošajiem atbilstošajiem datiem pirms aprakstīto vielas kodīgo/kairinošo īpašību pārbaudes in vivo testos. Ja esošie dati ir pietiekami, tos var iegūt secīgā testēšanā (2) (3). Testēšanas stratēģijā ietilpst validētu un vispārpieņemtu in vitro testu veikšana, un tā pievienota papildinājumam, kurā ir noteikta testa metode. Bez tam, pirms veikt in vivo testus kodīgās iedarbības testēšanai uz acīm, šādas iedarbības prognozēšanai ieteicams veikt in vivo testus kairinošās kodīgās iedarbības noteikšanai uz ādu. Gan zinātniskās precizitātes dēļ, gan ņemot vērā dzīvnieku labturības apsvērumus, in vivo testi nav jāveic, kamēr zinātnisko datu nozīmīguma analīzē nav izvērtēti visi pieejamie atbilstošie dati par vielas iespējamo kodīgo/kairinošo iedarbību uz acīm. Tie ir – ar cilvēkiem un/vai laboratorijas dzīvniekiem veiktajos pētījumos iegūtie dati, liecības par vienas vai vairāku struktūras ziņā saistītu vielu vai vielu maisījumu kodīgajām/kairinošajām īpašībām, dati, kas liecina, ka attiecīgajai vielai ir stipru skābju vai bāzu īpašības (4) (5), kā arī validētos un vispārpieņemtos in vitro vai ex vivo testos iegūti rezultāti par kodīgo un kairinošo iedarbību uz ādu (6) (6.a). Pētījumus var veikt pirms zinātnisko datu nozīmīguma analīzes vai pēc tās. Par dažām vielām šāda analīze var norādīt uz vajadzību veikt in vivo pētījumus par to kodīgumu/kairinošajām īpašībām, iedarbojoties uz acīm. Visos šādos gadījumos, pirms pieņemt lēmumu veikt iedarbības testus uz acīm in vivo, ieteicams vispirms veikt pētījumus in vivo attiecīgās vielas iedarbībai saskarē ar ādu un tos izvērtēt saskaņā ar B.4. testa metodi (7). Izmantojot zinātnisko datu nozīmības analīzi un secīgas testēšanas stratēģiju, samazinās vajadzība veikt in vivo testus to vielu kodīgās/kairinošās iedarbības noskaidrošanai uz acīm, par kurām citos pētījumos iegūti pietiekami zinātniskie dati. Ja kodīgo vai kairinošo iedarbību uz acīm nevar noteikt, drīkst veikt izmēģinājumus in vivo kodīgās/kairinošās iedarbības noteikšanai uz acīm, izmantojot secīgas testēšanas stratēģiju pat pēc tam, kad jau ir veikti izmēģinājumi in vivo tās kodīgās un kairinošās iedarbības noteikšanai uz ādu. Ieteicamā secīgā testēšanas stratēģija, pie kuras pieder validētu un vispārpieņemtu in vitro vai ex vivo testu veikšana kodīgo/kairinošo īpašību noteikšanai, ir pievienota papildinājumā, kurā ir šī testa metode. Šo stratēģiju izstrādājusi un vienprātīgi ieteikusi ESAO darba grupa (8), un tā pieņemta par ieteicamo stratēģiju Vispārīgā saskaņotā ķīmisko vielu klasifikācijas sistēmā (VSS) (9). Šo stratēģiju ieteicams ievērot pirms in vivo testiem. Lai iegūtu zinātniski pamatotus datus par konkrētās vielas kodīgajām īpašībām/kairinošo iedarbību, testus ar jaunām vielām ieteicams veikt secīgos posmos. Jāizmanto nepieciešamā stratēģija trūkstošo datu iegūšanai par esošajām vielām, par kurām nav pietiekamu datu, kas raksturo to kodīgās/kairinošās īpašības. Jābūt pamatojumam par lēmumu, kas attiecas uz atšķirīgu testēšanas stratēģiju vai procedūru izmantošanu vai arī par lēmumu neveikt testu secīgos posmos.

1.2. DEFINĪCIJAS Acu kairinājums: izmaiņas acī, kas rodas pēc testējamās vielas aplikācijas uz acs ābola priekšējās virsmas un ir pilnīgi atgriezeniskas 21 dienas laikā pēc aplikācijas. Kodīga iedarbība uz acīm: acs ābola audu bojājums vai nopietni fiziski redzes bojājumi, kas rodas pēc testējamās vielas aplikācijas uz acs ābola priekšējās virsmas un nav pilnīgi atgriezeniski 21 dienas laikā pēc aplikācijas.

1.3. TESTA METODES PRINCIPS Uz izmēģinājuma dzīvnieka vienas acs ābola aplicē vienu devu testējamās vielas; otru aci izmanto kontroles nolūkos. Kairinājumu/kodīgo iedarbību uz aci novērtē pēc konjunktīvas, radzenes un varavīksnenes bojājumu pakāpes noteiktos laika intervālos. Lai iedarbību novērtētu pilnīgi, apraksta arī citu veidu iedarbību uz aci, kā ar kaitīgu sistēmisku iedarbību. Pētījumi jāveic tik ilgi, lai varētu novērtēt novērotās iedarbības atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Visos testu posmos dzīvnieki, kuriem ilgstoši novēro stipru ciešanu un/vai sāpju pazīmes, ir humāni jānonāvē, un atbilstoši jānovērtē testējamās vielas iedarbība. Kritēriji, pēc kuriem pieņemami lēmumi par to dzīvnieku humānu nonāvēšanu, kuri iet bojā vai kuriem ir stipras ciešanas, atrodami literatūras sarakstā (10).

1.4. TESTA METODES APRAKSTS

1.4.

1.4.1. Sagatavošana testiem in vivo

1.4.1.

1.4.1.2. Dzīvnieku sagatavošana Katram iepriekš atlasītam testa dzīvniekam 24 stundas pirms testa pārbauda abas acis. Dzīvnieki ar acu iekaisumu, okulārajiem defektiem vai radzenes bojājumiem nav izmantojami.

1.4.2. Testa metode

1.4.2.

1.4.2.1. Testējamās vielas aplicēšana Testējamo vielu katram dzīvniekam ievada acs konjunktīvas maisiņā, pirms tam viegli pavelkot apakšējo plakstiņu nost no acs ābola. Pēc tam plakstiņus apmēram vienu sekundi viegli tur kopā, lai viela neizplūstu. Otrā acs paliek neapstrādāta, un to izmanto kontroles nolūkos.

1.4.2.2. Skalošana Testa dzīvniekiem acis nedrīkst skalot vismaz 24 stundas pēc testējamās vielas ievadīšanas, izņemot gadījumus, kad ievada cietvielas (skatīt 1.4.2.3.2. punktu), kā arī tad, kad novērojama tūlītēja kairinoša vai kodīga iedarbība. Vajadzības gadījumā pēc 24 stundām acis var izskalot. Izņemot gadījumus, kad tas ir zinātniski pamatoti, nav ieteicams veikt pētījumus ar otru dzīvnieku grupu, lai noskaidrotu skalošanas ietekmi. Ja ir vajadzīga otra dzīvnieku grupa, tai jāizmanto divi truši. Precīzi jādokumentē skalošanas apstākļi, piemēram, skalošanas laiks; skalojamā šķīduma sastāvs un temperatūra; tās ilgums, apjoms un ātrums.

1.4.2.3. Devas līmenis

1.4.2.3.

1.4.2.3.1. Šķidrumu testēšana Šķidrumu testēšanai izmanto 0,1 ml devu. Vielas ievadīšanai tieši acī nedrīkst izmantot smidzinātājus. Pirms iepilināt acī 0,1 ml šķidra aerosola, tas vispirms jāizsmidzina un jāsavāc tvertnē.

1.4.2.3.2. Cietvielu testēšana Testējot cietvielas, pastas un vielas daļiņu veidā, izmantojamajam daudzumam jābūt 0,1 ml tilpumam vai ne vairāk kā 100 mg. Testējamais materiāls jāsaberž smalkā pulverī. Cietu vielu tilpums jāmēra pēc to vieglas sablīvēšanas, piemēram, mērtvertnē sakratot. Ja testējamā cietviela nav izvadīta no testa dzīvnieka acs ar fizioloģiskiem mehānismiem līdz pirmajam novērojumu termiņam vienu stundu pēc ievadīšanas, aci var izskalot ar sālsūdeni vai destilētu ūdeni.

1.4.2.3.3. Aerosolu testēšana Ieteicams pirms iepilināšanas acī visus ar sūkni vai propellentu izsmidzināmos aerosolus vispirms izsmidzināt un savākt tvertnē. Vienīgais izņēmums ir vielas aerosola balonā, kuras nav iespējams savākt tvertnē iztvaikošanas dēļ. Šādos gadījumos acs jātur atvērta un testējamā viela jāievada acī, to izsmidzinot apmēram vienu sekundi no 10 cm attāluma tieši uz acs ābola. Attālumu var mainīt atkarībā no spiediena aerosola balonā un tā satura. Jāraugās, lai neradītu acs bojājumu no aerosola balona spiediena. Atsevišķos gadījumos var būt vajadzīgs novērtēt acs iespējamos mehāniskos bojājumus no aerosola balona spiediena spēka. Ar aerosola balonu ievadīto devu var noteikt, testu imitējot šādi – vielu izsmidzina uz nosvērta papīra gabala, uz kura novietots ekrāns ar truša acs lieluma atveri. Papīra masas palielinājumu izmanto acī iesmidzinātās devas aptuvenai noteikšanai. Gaistošām vielām devu var noteikt, uztvērēja tvertni nosverot pirms un pēc testējamās vielas izņemšanas.

1.4.2.4. Sākotnējs tests (in vivo acu kairinājuma/kodīgās iedarbības tests, izmantojot vienu dzīvnieku) Kā skaidri noteikts secīgās testēšanas stratēģijā (skatīt 1. papildinājumu), in vivo testi jāsāk, izmantojot vienu dzīvnieku. Ja pēc iepriekš aprakstītās procedūras iegūtie testa rezultāti liecina, ka vielai ir kodīga vai stipri kairinoša iedarbība uz acīm, turpmāko acs kairinājuma testēšanu neveic.

1.4.2.5. Vietējā anestēzija Pēc vajadzības katrā atsevišķā gadījumā var lietot vietējo anestēziju. Ja zinātnisko datu nozīmīguma analīze liecina, ka vielas iedarbība var radīt sāpes, vai arī sākotnējā testā noskaidrojas, ka rodas sāpju reakcija, pirms testējamās vielas iepilināšanas var lietot vietējo anestēziju. Rūpīgi jāizraugās vietējās anestēzijas veids, koncentrācija un deva tā, lai nodrošinātu, ka no tās lietošanas nerodas reakcijas atšķirības uz testējamās vielas iedarbību. Tāda pati anestēzija jādod acij, ko izmanto kontroles nolūkos.

1.4.2.6. Apstiprinājuma tests (in vivo ādas kairinājuma tests, izmantojot papildu dzīvniekus) Ja kodīga iedarbība nav novērota sākotnējā testā, kairinošā iedarbība vai tās neesamība jāapstiprina testos ar vienu vai diviem papildu dzīvniekiem. Ja sākotnējā testā novērota stipri kairinoša iedarbība, kas norāda uz iespējamu stipru (neatgriezenisku) iedarbību apstiprināšanas testā, apstiprinošo testu ieteicams veikt secīgi, vienā reizē izmantojot vienu dzīvnieku, nevis pakļaut vielas iedarbībai abus papildu dzīvniekus vienlaicīgi. Ja otrajam dzīvniekam konstatē kodīgu vai stipri kairinošu iedarbību, tests nav jāturpina. Papildu dzīvnieki var būt vajadzīgi vājas vai mēreni kairinošas iedarbības apstiprināšanai.

1.4.2.7. Novērošanas periods Novērojumi jāveic pietiekami ilgi, lai varētu pilnīgi novērtēt novērotās iedarbības lielumu, atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Taču izmēģinājumi vienmēr uzreiz jāpārtrauc tad, ja dzīvniekiem parādās pastāvīgas smagu sāpju vai ciešanu pazīmes (9). Lai noteiktu iedarbības atgriezeniskumu, dzīvnieki parasti jānovēro 21 dienu pēc testējamās vielas ievadīšanas. Izmēģinājumus attiecīgi beidz drīzāk, ja iedarbības atgriezeniskumu konstatē pirms 21 dienas perioda beigām.

1.4.2.7.

1.4.2.7.1. Klīniskie novērojumi un acs reakciju klasificēšana Acis jāpārbauda 1, 24, 48 un 72 stundas pēc testējamās vielas aplicēšanas. Dzīvnieki testā nav jātur ilgāk par galīgas informācijas iegūšanai vajadzīgo laiku. Dzīvniekus ar ilgstošām smagu sāpju vai ciešanu pazīmēm nekavējoties humāni nonāvē un attiecīgi novērtē testējamo vielu. Humāni nonāvē dzīvniekus, kuriem pēc vielas iepilināšanas rodas šādi acs bojājumi – radzenes perforācija vai radzenes ievērojama čūla, tostarp stafiloma; asinis acs ābola priekšējā kamerā; 4. pakāpes radzenes aptumšošanās, kas saglabājas 48 stundas; nav refleksa uz gaismu (2. pakāpes varavīksnenes reakcija) ilgāk nekā 72 stundas; konjunktīvas plēves čūla; konjunktīvas vai mirkšķināšanas membrānas nekroze; vai noslīdēšana. Tā rīkojas tāpēc, ka šādi bojājumi parasti ir neatgriezeniski. Dzīvniekus, kuriem neveidojas acs bojājumi, var nonāvēt ne ātrāk kā trīs dienas pēc vielas iepilināšanas. Dzīvnieki ar viegliem līdz mēreniem bojājumiem jānovēro, līdz bojājumi beidzas vai 21 dienu, kad pētījumus izbeidz. Novērojumi jāveic pēc 7, 14 un 21 dienas, lai novērtētu bojājumu stāvokli un to atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Acs (konjunktīvas, radzenes, varavīksnenes) reakcijas pakāpes reģistrē visos novērojumos (I tabula). Reģistrē arī visus citus acs bojājumus (piemēram, radzenes apduļķošanos, krāsošanos) un kaitīgu sistēmisku iedarbību. Novēroto reakciju novērošanai var izmantot binokulāro lupu, pārnēsājamu spraugas lampu, bioloģisko mikroskopu vai citas piemērotas ierīces. Kad reģistrēti novērojumi pēc 24 stundām, turpmākām acu pārbaudēm var izmantot fluoresceīnu. Acs reakciju klasifikācija ir neizbēgami subjektīva. Lai veicinātu acu reakciju klasifikācijas saskaņošanu un palīdzētu testēšanas laboratorijām, kā arī novērojumu veicējiem un interpretētājiem, personālam, kas veic novērojumus, jābūt pietiekami apmācītiem par izmantojamo klasifikācijas sistēmu.

2. DATI

2.

2.2. REZULTĀTU IZVĒRTĒŠANA Acu kairinājums jānovērtē saistībā ar bojājumu raksturu un smagumu, to atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Konkrētie punkti nav uzskatāmi par vielas kairinošo īpašību absolūtu standartu, jo tiek novērtēta arī testējamā materiāla citu veidu iedarbība. Tāpēc atsevišķie punkti jāuzskata par standartvērtībām un tiem ir nozīme tikai tad, ja tiek pamatoti ar pilnīgiem aprakstiem un visu novērojumu izvērtējumu.

3. PĀRSKATS

3.

3.1. TESTA PĀRSKATS Testēšanas pārskatā jābūt šādai informācijai. Testa veikšanas in vivo pamatojums:

iepriekš veikto testu rezultātu zinātnisko datu nozīmīguma analīze, tostarp pēc secīgās testēšanas stratēģijas iegūto rezultātu,

atbilstošu iepriekš veiktajos testos iegūto datu apraksts,

visos testēšanas stratēģijas posmos iegūtie dati,

in vitro veikto testu apraksts, tostarp sīkas ziņas par izmantotajām procedūrām, rezultātiem, kas iegūti ar testējamajām un standartvielām,

veikto in vivo ādas kairinājuma/kodīgās iedarbības pētījumu apraksti, tostarp iegūtie rezultāti,

in vivo pētījumam nepieciešamā zinātnisko datu nozīmīguma analīze.

Testējamā viela:

identifikācijas dati (piemēram, CAS numurs, avots, tīrība, zināmie piemaisījumi, partijas numurs),

fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, pH, gaistamība, šķīdība, stabilitāte, reaģētspēja ar ūdeni),

maisījumiem – sastāvs un atsevišķo komponentu relatīvais īpatsvars,

ja izmantota vietējā anestēzija, tās identifikācija, tīrība, veids, deva un iespējamā mijiedarbība ar testējamo vielu.

Nesējs:

identifikācija, koncentrācija (ja vajadzīgs), izmantotais tilpums,

nesēja izvēles pamatojums.

Testa dzīvnieki:

izmantotā suga/līnija, izvēles pamatojums gadījumos, kad neizmanto albīnos trušus,

katra dzīvnieka vecums pētījuma sākumā,

katra dzimuma dzīvnieku skaits testa un kontroles grupās (ja vajadzīgs),

katra dzīvnieka svars testa sākumā un beigās,

izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u. c.

Rezultāti:

visos novērojumu termiņos kairinājuma novērtēšanai izmantoto metožu apraksts (piemēram, pārnēsājamā spraugas lampa, bioloģiskais mikroskops, fluoresceīns),

tabulā apkopoti kairinošās/kodīgās iedarbības dati par katru dzīvnieku visos novērošanas termiņos līdz testa pārtraukšanai ar to,

novērotās kairinošās vai kodīgās iedarbības pakāpes un rakstura apraksts,

citu novēroto acs bojājumu apraksts (piemēram, vaskularizācija, radzenes saduļķošanās, saaugumu, rētaudu veidošanās, krāsojums),

ar aci nesaistīta kaitīga vietēja vai sistēmiska iedarbība un histopatoloģisko izmeklējumu rezultāti, ja tie veikti.

Rezultātu apspriešana.

3.2. REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA Ar dzīvniekiem iegūtu acu kairinājuma pētījumu rezultātu ekstrapolācijas iespējas uz cilvēkiem ir derīgas tikai līdz zināmai pakāpei. Daudzos gadījumos albīnie truši pret acīm kodīgām vai kairinošām vielām ir jutīgāki nekā cilvēki. Interpretējot rezultātus, jāraugās, lai tiktu izslēgts kairinājums, ko rada sekundāra infekcija.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6.a)(7)(8)(9)(10)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410–429. De Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159–164. Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, p. 161–177. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicology In Vitro, 2, p. 19–26. Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227–231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483–524. Testing Method B.40 Skin Corrosion. Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

I tabula ACS BOJĀJUMU KLASIFIKĀCIJA

Radzene

Duļķošanās – blīvuma pakāpe (nolasījumi jāveic visblīvākajā zonā) Nav novērota čūlu veidošanās vai duļķošanās … 0 Izkaisītas vai difūzas duļķošanās zonas (izņemot normāla spīduma vieglu blāvumu); labi redzamas varavīksnenes daļas … 1 Labi izšķirama caurspīdīgā daļa; varavīksnenes daļas redzamas nedaudz neskaidri … 2 Perlamutra zona; varavīksnenes daļas redzamas; acs zīlītes izmērs tikko redzams … 3 Radzene necaurredzama; cauri duļķojumam varavīksnene nav samanāma … 4 Maksimāli iespējamie – 4 PIEZĪMES

Varavīksnene

Norma … 0 Krokas redzami padziļinātas, hiperēmija, pietūkums, mērena radzenes hiperēmija vai asinsizplūdums; varavīksnene reaģē uz gaismu (par reakciju uzskata arī vāju vai lēnu reakciju) … 1 Asiņošana, vispārējs bojājums vai nav reakcijas uz gaismu … 2 Maksimāli iespējamie – 2

Konjunktīva

Apsārtums (attiecas uz plakstiņu un acs ābola konjunktīvu; izņemot radzeni un varavīksneni) Norma … 0 Daži asinsvadi izteikti hiperēmiski (piepildīti) … 1 Difūza, tumšsarkana krāsa; atsevišķie asinsvadi grūti izšķirami … 2 Difūza tumši sarkana liellopu gaļas krāsa … 3 Maksimāli iespējamie – 3

Hemoze

Pietūkums (attiecas uz plakstiņiem un/vai mirkšķināšanas membrānām) Norma … 0 Neliels pietūkums virs normas … 1 Acīm redzams pietūkums ar plakstiņu daļēju izgriešanos … 2 Pietūkums, plakstiņi gandrīz pusaizvērti … 3 Pietūkums, plakstiņi vairāk nekā pusaizvērti … 4 Maksimāli iespējamie – 4

B.6. ĀDAS SENSIBILIZĀCIJA

B.6.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Piezīmes Testu jutīgumu un to spēju noteikt potenciālos cilvēku ādas sensibilizatorus uzskata par svarīgu klasifikācijas sistēmā, kas attiecas uz sabiedrības veselības aizsardzību. Nav vienas testa metodes, kas adekvāti identificētu visas cilvēku ādu potenciāli sensibilizējošas vielas un kas attiektos uz visām vielām. Izvēloties testu, ir jāņem vērā tādi faktori kā vielas fizikālās īpašības, iekļaujot tās spēju iekļūt ādā. Ir izveidoti divi testu tipi, kuros izmanto jūrascūciņas: testi ar adjuvantiem, kuros alerģisko stāvokli veicina, izšķīdinot vai suspendējot testa vielu Freinda pilnajā adjuvantā (FCA), un testi bez adjuvantiem. Testi ar adjuvantiem parasti precīzāk paredz vielas iespējamo sensibilizējošo ietekmi uz cilvēku nekā metodes, kas neizmanto Freinda pilno adjuvantu, un tādēļ tie ir ieteicamākie testi. Maksimizācijas tests jūrascūciņām (GPMT) ir plaši lietojams tests ar adjuvantiem. Kaut arī, lai noteiktu vielas spēju izraisīt ādas sensibilizācijas reakciju, var izmantot vairākas citas metodes, par ieteicamāko metodi ar adjuvantiem uzskata GPMT. Daudzām ķīmisko vielu klasēm testus bez adjuvantiem (ieteicamākais no tiem ir Bīlera tests) uzskata par mazāk jutīgiem. Dažos gadījumos var būt pamatoti iemesli izvēlēties Bīlera testu, kas saistīts ar pielietošanu uz ādas, nevis ar intradermālu injekciju, kuru izmanto jūrascūciņu maksimizācijas testā. Ja izmanto Bīlera testu, ir jāsniedz zinātnisks pamatojums. Jūrascūciņu maksimizācijas tests (GPMT) un Bīlera tests ir aprakstīts šajā metodē. Var izmantot citas metodes ar nosacījumu, ka tās ir labi novērtētas un ir dots zinātnisks pamatojums. Ja atzītā skrīninga testā ir redzams pozitīvs rezultāts, testa vielu var apzīmēt kā potenciālu sensibilizatoru, un turpmāka testa ar jūrascūciņām izdarīšana var nebūt vajadzīga. Tomēr, ja šādā testā ir redzams negatīvs rezultāts, tests ar jūrascūciņām, izmantojot šajā testa metodē aprakstīto procedūru, ir jāizdara. Skatīt arī vispārējā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJAS Ādas sensibilizācija: (alerģiskais kontaktdermatīts) ir imunoloģiski nosacīta ādas reakcija uz vielu. Cilvēka atbildes reakcijas var raksturot nieze, apsārtums, uztūkums, mezgliņi, pūslīši, tulznas vai to apvienojums. Citu sugu atbildes reakcijas var atšķirties, un var būt redzams tikai apsārtums un uztūkums. Pakļaušana inducējošai iedarbībai: pētījuma objekta eksperimentāla pakļaušana testa vielas iedarbībai, lai inducētu hiperjutības stāvokli. Indukcijas laikposms: vismaz vienu nedēļu ilgs laikposms pēc pakļaušanas inducējošai iedarbībai, kura laikā var izveidoties hiperjutības stāvoklis. Provokatīvais mijiedarbības tests iepriekš apstrādāta pētījumu objekta eksperimentāla pakļaušana testa vielas iedarbībai pēc indukcijas laika posma, lai noteiktu, ka pētījumu objekts reaģē hiperjutīgi.

1.3. STANDARTVIELAS Lietotās eksperimenta metodes jutība un ticamība ir jānovērtē reizi sešos mēnešos, izmantojot vielas, par kurām ir zināms, ka tām ir vieglas līdz vidējas ādu sensibilizējošas īpašības. Pareizi izdarītā testā viegliem/vidējiem sensibilizatoriem ir sagaidāma vismaz 30 % atbildes reakcija testā ar adjuvantiem un vismaz 15 % testā bez adjuvantiem. Priekšroka ir dodama šādām vielām: CAS numurs Einecs numurs Einecs nosaukums Parastais nosaukums 101-86-0 202-983-3 α-heksilkaneļaldehīds α-heksilkaneļaldehīds 149-30-4 205-736-8 benzotiazol-2-tiols (merkaptobenzotiazols) kaptakss 94-09-7 202-303-5 benzokaīns nordkaīns Var būt apstākļi, kad ar pienācīgu pamatojumu var izmantot citas kontroles vielas, kas atbilst iepriekšminētajiem kritērijiem.

1.4. TESTA METODES PRINCIPS Testa dzīvniekus sākotnēji pakļauj testa vielas iedarbībai, izmantojot intradermālas injekcijas un/vai pielietojot epidermāli (pakļaušana inducējošai iedarbībai). Pēc 10 līdz 14 dienu miera laikposma (indukcijas laikposms), kura laikā var izveidoties imūnreakcija, dzīvniekus pakļauj provokatīvās devas iedarbībai. Testa dzīvnieku ādas reakcijas apmēru un pakāpi provokatīvajā mijiedarbības testā salīdzina ar to, ko uzrāda kontrolgrupas dzīvnieki, kuriem indukcijas laikā izdarīts tukšais mēģinājums, un iegūst provokatīvo iedarbību.

1.5. TESTA METOŽU APRAKSTS Ja testa vielas noņemšanu uzskata par vajadzīgu, tas jāsasniedz, izmantojot ūdeni vai piemērotu šķīdinātāju, nemainot esošo atbildes reakciju vai epidermas veselumu.

1.5.

1.5.1. Jūrascūciņu maksimizācijas tests (GPMT)

1.5.1.

1.5.1.1. Sagatavošanās Veselas, jaunas, pieaugušas albīnas jūrascūciņas vismaz piecas dienas pirms testa aklimatizē laboratorijas apstākļos. Pirms testa dzīvniekus izvēlas pēc nejaušās izvēles principa un iedala vielas ievadīšanas un kontroles grupās. Apmatojumu noņem cērpot, skujot vai varbūt ar ķīmisko depilāciju atkarībā no izmantotās testa metodes. Jāpievērš vērība, lai nenobrāztu ādu. Dzīvniekus nosver pirms testa uzsākšanas un testa beigās.

1.5.1.2. Testa apstākļi

1.5.1.2.

1.5.1.2.1. Testa dzīvnieki Izmanto parasti izmantojamās albīno jūrascūciņu laboratorijas līnijas.

1.5.1.2.2. Skaits un dzimums Var izmantot vīriešu un/vai sieviešu dzimuma dzīvniekus. Ja izmanto mātītes, tām jābūt nedzemdējušām un negrūsnām. Vielas ievadīšanas grupā izmanto vismaz 10 dzīvniekus un kontrolgrupā vismaz 5 dzīvniekus. Ja izmanto mazāk nekā 20 testa un mazāk nekā 10 kontroles jūrascūciņas un ja nav iespējams secināt, ka testa viela ir sensibilizators, ir noteikti ieteicama papildu dzīvnieku testēšana, lai kopā būtu vismaz 20 testa dzīvnieki un 10 kontroles dzīvnieki.

1.5.1.2.3. Devu līmeņi Katrā pakļaušanā induktīvai iedarbībai testa vielas koncentrācijai jābūt dzīvnieka organismam sistēmiski labi panesamai un tai jābūt lielākajai, kas rada vieglu līdz vidēju ādas kairinājumu. Provokatīvajā mijiedarbības testā izmantotajai koncentrācijai jābūt lielākajai devai, kas kairinājumu nerada. Vajadzības gadījumā atbilstīgās koncentrācijas var noteikt ievadpētījumā, kurā izmanto divus vai trīs dzīvniekus. Jāņem vērā, ka šajā nolūkā jāizmanto dzīvnieki, kas saņem Freinda pilno adjuvantu (FCA).

1.5.1.3. Procedūra

1.5.1.3.

1.5.1.3.1. Indukcija 0. diena – vielas ievadīšanas grupa Pleca rajonā, kas ir atbrīvots no apmatojuma, intradermāli ievada trīs pārus 0,1 ml tilpuma injekciju tā, lai no katra pāra viena injekcija būtu savā viduslīnijas pusē. 1. injekcija: FCA/ūdens vai FCA/fizioloģiskā sāls šķīduma maisījums attiecībā 1:1 (tilp./tilp.). 2. injekcija: testa viela piemērotā nesējā izraudzītajā koncentrācijā. 3. injekcija: testa viela izraudzītajā koncentrācijā, kas sagatavota FCA/ūdens vai FCA/fizioloģiskā sāls šķīduma maisījumā attiecībā 1:1 (tilp./tilp.). 3. injekcijai ūdenī šķīstošās vielas pirms sajaukšanas ar FCA izšķīdina ūdens fāzē. Taukos šķīstošās vai nešķīstošās vielas pirms ūdens fāzes pievienošanas suspendē FCA. Testa vielas galīgā koncentrācija ir vienāda ar koncentrāciju, ko izmanto 2. injekcijā. 1. un 2. injekciju ievada tuvu vienu otrai un tuvāk galvai, bet 3. injekciju ievada testa laukuma kaudālajā daļā. 0. diena – kontroles grupa Intradermāli ievada trīs pārus 0,1 ml tilpuma injekciju tajās pašās vietās kā vielas ievadīšanas grupas dzīvniekiem. 1. injekcija: FCA/ūdens vai FCA/fizioloģiskā sāls šķīduma maisījums attiecībā 1:1 (tilp./tilp.). 2. injekcija: neatšķaidīts nesējs. 3. injekcija: 50 % svars/tilp. attiecībā nesējs samaisīts ar FCA/ūdens vai FCA/fizioloģiskā sāls šķīduma 1:1 (tilp./tilp.) maisījumu. 5.–7. diena – vielas ievadīšanas un kontroles grupa Aptuveni 24 stundas pirms vietējās indukcijas pielietošanas, ja viela nekairina ādu, testa laukumu pēc nocirpšanas tuvu ādai un/vai noskūšanas apstrādā ar 0,5 ml 10 % nātrija laurilsulfāta vazelīnā, lai radītu vietēju kairinājumu. 6.–8. diena – vielas ievadīšanas grupa Testa laukumā vēlreiz notīra apmatojumu. Filtrpapīru (2 × 4 cm) pilnīgi piesātina ar testa vielu piemērotā nesējā, uzliek testa laukumam un tur saskarē ar ādu 48 stundas, izmantojot okluzīvu pārsēju. Nesēja izvēle ir jāpamato. Cietas vielas sasmalcina smalkā pulverī un iejauc piemērotā nesējā. Šķidrumus var attiecīgā gadījumā pielietot neatšķaidītus. 6.–8. diena – kontroles grupa Testa laukumā vēlreiz notīra apmatojumu. Testa laukumā līdzīgi pielieto tikai nesēju un tur saskarē ar ādu 48 stundas, izmantojot okluzīvu pārsēju.

1.5.1.3.2. Provocēšana 20.–22. diena – vielas ievadīšanas un kontroles grupa Vielas ievadīšanas un kontroles dzīvnieku sāniem notīra apmatojumu. Ar testa vielu piesātinātu kompresi vai pildītu iedobi pieliek vienam dzīvnieka sānam un attiecīgā gadījumā ar nesēju piesātinātu kompresi vai pildītu iedobi pieliek otram sānam. Kompreses tur saskarē ar ādu 24 stundas, izmantojot okluzīvu pārsēju.

1.5.1.3.3. Novērošana un izvērtēšana: vielas ievadīšanas un kontroles grupa Ir atbalstāmi aklie nolasījumi testa un kontroles dzīvniekiem. Ja ir jāprecizē pirmajā provocēšanā iegūtie rezultāti, ir jāapsver otrā provocēšana (t. i., atkārtota provocēšana) vajadzības gadījumā ar jaunu kontroles grupu aptuveni nedēļu pēc pirmās provocēšanas. Atkārtoto provocēšanu var izdarīt arī ar sākotnējo kontroles grupu. Visas ādas reakcijas un neparastas konstatācijas, iekļaujot organisma sistēmiskās reakcijas, ko izraisījušas indukcijas un provocēšanas procedūras, ir jānovēro un jāprotokolē saskaņā ar Magnusona/Kligmana novērtējuma skalu (skatīt pielikuma papildinājumu). Lai precizētu neskaidras reakcijas, var izdarīt citas procedūras, piemēram, histopatoloģiskus izmeklējumus, ādas krokas biezuma mērījumus.

Aptuveni 21 stundu pēc kompreses noņemšanas provocēto laukumu notīra un tuvu ādai nocērp un/vai noskuj un vajadzības gadījumā izdara depilāciju,

aptuveni trīs stundas vēlāk (aptuveni 48 stundas pēc provocēšanas sākuma) izdara ādas reakcijas novērojumus un protokolē saskaņā ar pielikumuma papildinājumā parādītajām pakāpēm,

aptuveni 24 stundas pēc šo novērojumu izdarīšanas izdara otru (72 stundu) novērojumu un vēlreiz protokolē.

1.5.2. Bīlera tests

1.5.2.

1.5.2.1. Sagatavošanās Veselas, jaunas, pieaugušas albīnas jūrascūciņas vismaz piecas dienas pirms testa aklimatizē laboratorijas apstākļos. Pirms testa dzīvniekus izvēlas pēc nejaušās izvēles principa un iedala vielas ievadīšanas grupās. Apmatojumu noņem, cērpot, skujot vai varbūt ar ķīmisko depilāciju atkarībā no izmantotās testa metodes. Jāpievērš uzmanība, lai nenobrāztu ādu. Dzīvniekus nosver pirms testa uzsākšanas un testa beigās.

1.5.2.2. Testa apstākļi

1.5.2.2.

1.5.2.2.1. Testa dzīvnieki Izmanto albīno jūrascūciņu parasti izmantojamās laboratorijas līnijas.

1.5.2.2.2. Skaits un dzimums Var izmantot vīriešu un/vai sieviešu dzimuma dzīvniekus. Ja izmanto mātītes, tām jābūt nedzemdējušām un negrūsnām. Vielas ievadīšanas grupā izmanto vismaz 20 dzīvniekus un kontroles grupā vismaz 10 dzīvniekus.

1.5.2.2.3. Devu līmeņi Katrā inducējošā iedarbībā testa vielas koncentrācijai jābūt iespējami lielākajai, kas rada vieglu līdz vidēju ādas kairinājumu. Provokatīvajā mijiedarbības testā izmantotajai koncentrācijai jābūt lielākajai devai, kas kairinājumu nerada. Vajadzības gadījumā atbilstīgās koncentrācijas var noteikt ievadpētījumā, kurā izmanto divus vai trīs dzīvniekus. Par ūdenī šķīstošu testa materiālu nesēju ir lietderīgi izmantot ūdeni vai atšķaidītu nekairinošu virsmaktīvas vielas šķīdumu. Citu testa materiālu indukcijā ir vēlams 80 % etanola/ūdens maisījums un provocēšanā acetons.

1.5.2.3. Procedūra

1.5.2.3.

1.5.2.3.1. Indukcija 0. diena – vielas ievadīšanas grupa Vienam sānam notīra apmatojumu (nocērp tuvu ādai). Testa kompreses sistēmai jābūt pilnīgi piesātinātai ar testa vielu piemērotā nesējā (nesēja izvēle ir jāpamato; šķidras testa vielas var attiecīgā gadījumā pielietot neatšķaidītas). Testa kompreses sistēmu pielieto testa laukumam un tur saskarē ar ādu, izmantojot okluzīvu kompresi vai iedobi un piemērotu pārsēju sešas stundas. Testa kompreses sistēmai jābūt okluzīvai. Kokvilnas spilventiņš ir piemērots un var būt apaļš vai četrstūrains, bet tam jābūt aptuveni 4–6 cm2. Lai nodrošinātu oklūziju, vēlams izmantot fiksāciju ar piemērotu fiksatoru. Ja izmanto apsaitēšanu, var būt vajadzīgas papildu pakļaušanas iedarbībai. 0. diena – kontroles grupa Vienam sānam notīra apmatojumu (nocērp tuvu ādai). Pielieto tikai nesēju līdzīgi kā vielas ievadīšanas grupai. Testa kompreses sistēmu tur saskarē ar ādu sešas stundas, izmantojot okluzīvu kompresi vai iedobi un piemērotu pārsēju. Ja var parādīt, ka tukšā mēģinājuma kontroles grupa nav vajadzīga, var izmantot kontroles grupu, kas neko nesaņem. 6.–8. un 13.–15. diena – vielas ievadīšanas grupa un kontroles grupa Rīkojas tāpat kā 0. dienā ar tā paša sāna to pašu testa laukumu (vajadzības gadījumā notīrot apmatojumu) 6.–8. dienā un vēlreiz 13.–15. dienā.

1.5.2.3.2. Provocēšana 27.–29. diena – vielas ievadīšanas un kontroles grupa Vielas ievadīšanas un kontroles grupas dzīvnieku neapstrādātajam sānam notīra apmatojumu (nocērp tuvu ādai). Okluzīvu kompresi vai iedobi, kas satur atbilstīgu testa vielas daudzumu maksimālā nekairinošā koncentrācijā pielieto uz vielas ievadīšanas un kontroles dzīvnieku neapstrādātā sāna aizmugures daļas. Attiecīgā gadījumā okluzīvu kompresi vai iedobi, kas satur tikai nesēju, arī pielieto uz vielas ievadīšanas un kontroles dzīvnieku neapstrādātā sāna aizmugures daļas. Kompreses vai iedobes sešas stundas tur saskarē ar ādu, izmantojot piemērotu pārsēju.

1.5.2.3.3. Novērošana un izvērtēšana Ir atbalstāmi aklie nolasījumi testa un kontroles dzīvniekiem. Ja ir jāprecizē pirmajā provocēšanā iegūtie rezultāti, ir jāapsver otrā provocēšana (t. i., atkārtota provocēšana) vajadzības gadījumā ar jaunu kontroles grupu aptuveni nedēļu pēc pirmās provocēšanas. Atkārtoto provocēšanu var izdarīt arī ar sākotnējo kontroles grupu. Visas ādas reakcijas un neparastas konstatācijas, iekļaujot organisma sistēmiskās reakcijas, ko izraisījušas indukcijas un provocēšanas procedūras, ir jānovēro un jāprotokolē saskaņā ar Magnusona/Kligmana novērtējuma skalu (skatīt pielikuma papildinājumu). Lai precizētu neskaidras reakcijas, var izdarīt citas procedūras, piemēram, histopatoloģiskus izmeklējumus, ādas krokas biezuma mērījumus.

Aptuveni 21 stundu pēc kompreses noņemšanas provocētajā laukumā notīra apmatojumu,

aptuveni trīs stundas vēlāk (aptuveni 30 stundas pēc provocēšanas kompreses pielietošanas) izdara ādas reakcijas novērojumus un protokolē saskaņā ar pielikuma papildinājumā parādītajām pakāpēm,

aptuveni 24 stundas pēc 30 stundu novērojumiem (aptuveni 54 stundas pēc provocēšanas kompreses pielietošanas) vēlreiz izdara ādas reakcijas novērojumus un protokolē.

2. DATI (GPMT un Bīlera tests) Dati ir jāapkopo tabulas veidā, parādot katra dzīvnieka ādas reakcijas katrā novērošanā.

3. ZIŅOJUMA SASTĀDĪŠANA (GPMT un Bīlera tests) Ja skrīninga testu izdara pirms jūrascūciņu testa, tad testa apraksts vai norāde uz to (piemēram, vietējais limfmezglu tests (LLNA), peļu ausu pietūkuma tests (MEST)), iekļaujot sīkus datus par procedūru, ir jāsniedz kopā ar rezultātiem, kas iegūti ar testa vielām un standartvielām.

3. Testa ziņojums (GPMT un Bīlera tests)

Testa ziņojumā, ja iespējams, iekļauj šādu informāciju.

Testa dzīvnieki:

izmantotā jūrascūciņu līnija,

dzīvnieku skaits, vecums un dzimums,

izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u. c.,

atsevišķo dzīvnieku svars testa sākumā.

Testa apstākļi:

kompreses vietas sagatavošanas paņēmiens,

sīkas ziņas par izmantotajiem kompreses materiāliem un kompreses uzlikšanas paņēmienu,

ievadpētījuma rezultāti ar secinājumu par testā izmantojamām inducēšanas un provocēšanas koncentrācijām,

sīkas ziņas par testa vielas sagatavošanu, pielietošanu un noņemšanu,

nesēja izvēles pamatojums,

inducēšanā un provocēšanā izmantotās nesēja un testa vielas koncentrācijas un inducēšanā un provocēšanā izmantotais kopējais vielas daudzums.

Rezultāti:

pēdējās jutības un ticamības pārbaudes rezultātu kopsavilkums (skatīt 1.3.), iekļaujot informāciju par izmantoto vielu, koncentrāciju un nesēju,

visi novērojumi par katru dzīvnieku, iekļaujot vērtējumu,

sīki izstrādāts apraksts par novēroto ietekmju būtību un pakāpi,

histopatoloģiskas konstatācijas.

Rezultātu izvērtējums.

Secinājumi.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Šī metode ir analoga ESAO TG 406.

B.7. VAIRĀKKĀRTĒJĀS DEVAS (28 DIENU) TOKSICITĀTE (ORĀLĀ)

B.7.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJAS Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.3. TESTA METODES PRINCIPS Testa vielu perorāli ievada katru dienu pakāpeniskās devās vairākām testa dzīvnieku grupām, vienu devas līmeni uz grupu 28 dienu laikposmā. Vielas ievadīšanas laikposmā dzīvniekus katru dienu rūpīgi apskata, vai nav novērojamas toksicitātes pazīmes. Dzīvniekiem, kas nobeidzas vai ko nogalina testa laikā, izdara autopsiju, un eksperimenta beigās izdzīvojušos dzīvniekus nogalina, un tiem izdara autopsiju. Šī metode vairāk uzsver neiroloģiskās ietekmes kā īpašu beigu punktu un uzsver vajadzību izdarīt rūpīgus dzīvnieku klīniskos novērojumus, lai iegūtu iespējami daudz informācijas. Metodei jāidentificē vielas ar neirotoksisku potenciālu, kas varētu radīt vajadzību izdarīt šajā aspektā turpmākus padziļinātus pētījumus. Turklāt metode var dot norādi par imunoloģisko ietekmi un toksicitāti uz reproduktīvajiem orgāniem.

1.4. TESTA METODES APRAKSTS

1.4.

1.4.1. Sagatavošanās Veselus, jaunus, pieaugušus dzīvniekus pēc nejaušās izvēles principa sadala kontroles un vielas saņemšanas grupās. Būrus izvieto tā, lai iespējami samazinātu būru novietojuma varbūtējo ietekmi. Dzīvniekiem piešķir īpašu identifikāciju, un līdz izmēģinājumu sākumam tos vismaz piecas dienas tur būros, lai tie aklimatizētos laboratorijas apstākļos. Testa vielu ievada, mākslīgi barojot vai ar barību vai dzeramo ūdeni. Perorālās ievadīšanas metode ir atkarīga no pētījuma mērķa un no vielu fizikāli ķīmiskajām īpašībām. Vajadzības gadījumā testa vielu izšķīdina vai suspendē piemērotā nesējā. Ir ieteicams, ja tas iespējams, vispirms apsvērt ūdens šķīduma/suspensijas lietošanu, pēc tam apsvērt eļļas (piemēram, kukurūzas eļļas) šķīduma/emulsijas lietošanu un pēc tam iespējamu šķīdināšanu citos nesējos. Ir jābūt zināmām nesēju, kas nav ūdens, toksiskajām īpašībām. Ir jānosaka testa vielas stabilitāte nesējā.

1.4.2. Testa apstākļi

1.4.2.

1.4.2.1. Testa dzīvnieki Ieteicamākā grauzēju suga ir žurkas, kaut arī var izmanot citas grauzēju sugas. Ir jāizmanto jauni, veseli, pieauguši parasti izmantojamo laboratorijas līniju dzīvnieki. Mātītēm jābūt nedzemdējušām un negrūsnām. Dozēšana jāsāk iespējami drīz pēc zīdīšanas pārtraukšanas un katrā ziņā ne vēlāk kā tad, kad dzīvnieki ir deviņas nedēļas veci. Izmēģinājuma sākumā dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un tās nedrīkst pārsniegt ± 20 % no vidējās masas, kas noteikta katram dzimumam atsevišķi. Ja vairākkārtējās devas perorālu pētījumu izdara kā ilgtermiņa pētījuma iepriekšēju pētījumu, ir ieteicams abos pētījumos izmantot vienas līnijas un izcelsmes dzīvniekus.

1.4.2.2. Skaits un dzimums Katram devas līmenim jāizmanto vismaz 10 dzīvnieki (pieci sieviešu dzimuma un pieci vīriešu dzimuma). Ja plāno izdarīt nogalināšanas pētījuma gaitā, skaits ir jāpalielina par tik dzīvniekiem, cik plānots nogalināt pirms pētījuma pabeigšanas. Turklāt 10 dzīvnieku satelītgrupai (pieci katra dzimuma dzīvnieki) var ievadīt augsta līmeņa devu 28 dienas un novērot 14 dienas pēc vielas ievadīšanas attiecībā uz toksisko ietekmju atgriezenību, noturību vai aizkavētu parādīšanos. Izmanto arī 10 kontroles dzīvnieku satelītgrupu (piecus katra dzimuma dzīvniekus).

1.4.2.3. Devu līmeņi Parasti jāizmanto vismaz trīs testa grupas un kontroles grupa. Izņemot testa vielas ievadīšanu, ar kontroles grupas dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar testa grupu dzīvniekiem. Ja vielas ievadīšanā izmanto nesēju, kontroles grupai jāsaņem lielākais izmantotais nesēja tilpums. Ja saskaņā ar citu datu izvērtējumu pie devas līmeņa 1000 mg/kg dzīvnieka svara dienā nav sagaidāma nekāda ietekme, var izdarīt pieļaujamā daudzuma testu. Ja piemēroti dati nav pieejami, var izdarīt diapazona atrašanas pētījumu, kas palīdzētu noteikt izmantojamās devas. Devu līmeņi jāizvēlas, ņemot vērā esošos toksicitātes un (toksisko-)kinētikas datus, kas ir pieejami par vielu vai par radniecīgiem materiāliem. Augstākais devas līmenis ir jāizvēlas ar mērķi izraisīt toksiskas ietekmes, bet ne nobeigšanos vai smagas ciešanas. Pēc tam jāizvēlas devu līmeņi lejupejošā secībā, lai parādītu visas ar dozēšanu saistītās atbildes reakcijas un lai zemākais devas līmenis būtu nenovērotas nelabvēlīgas ietekmes līmenis (NOAEL). Lejupejošo devu līmeņu uzdošanai bieži optimāli ir divkārši līdz četrkārši intervāli un ceturtās testa grupas pievienošana bieži ir ieteicamāka par ļoti plašu (piemēram, vairāk par 10 reizēm) intervālu izmantošanu starp dozēšanām. Vielām, ko ievada ar barību vai dzeramo ūdeni, ir svarīgi nodrošināt, lai iesaistītie testa vielas daudzumi netraucētu normālu barības vai ūdens līdzsvaru. Ja testa vielu ievada ar barību, var izmantot nemainīgu koncentrāciju barībā (milj. daļas) vai nemainīgu devas līmeni uz dzīvnieka ķermeņa svaru; izmantotā alternatīva ir jānorāda. Ja vielu ievada, mākslīgi barojot, deva katru dienu jāievada līdzīgā laikā un pēc vajadzības jāpielāgo, lai uzturētu nemainīgu devas līmeni attiecībā pret dzīvnieka ķermeņa svaru. Ja vairākkārtējās devas pētījumu izmanto kā ilgtermiņa pētījuma iepriekšēju pētījumu, abos pētījumos jāizmanto līdzīga diēta.

1.4.2.4. Pieļaujamā daudzuma tests Ja pie viena devas līmeņa, kas ir vismaz 1000 mg/kg ķermeņa svara dienā vai līdzvērtīgs procentuālais daudzums barībā vai dzeramajā ūdenī, ievadot vielu ar barību vai dzeramo ūdeni (pamatojoties uz ķermeņa svara noteikšanām), testā, kuru izdara ar šā pētījuma veikšanai aprakstītajām procedūrām, nerodas novērojamas toksiskas ietekmes un ja toksicitāte nav sagaidāma, pamatojoties uz datiem par radniecīgas struktūras vielām, tad pilnu pētījumu, kurā izmanto trīs devu līmeņus, nevar uzskatīt par vajadzīgu. Pieļaujamā daudzuma testu pielieto, izņemot gadījumus, kad iedarbība uz cilvēkiem norāda, ka ir jāizmanto augstāks devas līmenis.

1.4.2.5. Novērošanas laikposms Novērošanas laikposmam jābūt 28 dienas. Satelītgrupas dzīvnieki, kas plānoti papildu novērojumiem, ir jātur vismaz vēl 14 dienas bez vielas saņemšanas, lai noteiktu toksisko ietekmju aizkavētu parādīšanos vai noturību vai izveseļošanos no tām.

1.4.3. Procedūra Dzīvniekiem testa vielu ievada katru dienu septiņas dienas nedēļā 28 dienu laika posmā; ja vielu dozē piecas dienas nedēļā, tas ir jāpamato. Ja testa vielu dzīvniekiem ievada ar mākslīgo barošanu, tas jāizdara vienā devā, izmantojot kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas kanulu. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no izmēģinājumu dzīvnieka lieluma. Tilpums nedrīkst pārsniegt 1 ml/100 g ķermeņa svara, izņemot ūdens šķīdumus, ko var ievadīt 2 ml/100 g ķermeņa svara. Izņemot kairinošas un kodīgas vielas, kuru iedarbība lielākās koncentrācijās parasti ir izteiktāka, izmēģinājumiem lietotā tilpuma mainības ietekmi samazina, koriģējot tilpumu tā, lai pie visām devām tas būtu vienāds.

1.4.3.

1.4.3.1. Vispārēji novērojumi Vispārējie klīniskie novērojumi jāizdara vismaz reizi dienā, vēlams, katru dienu vienā(-os) laikā(-os) un ņemot vērā sagaidāmo ietekmju maksimuma laika posmu pēc dozēšanas. Dzīvnieku veselības stāvoklis ir jāprotokolē. Vismaz divreiz dienā visus dzīvniekus novēro attiecībā uz saslimstību un mirstību. Mirstoši dzīvnieki un dzīvnieki, kam ir smagas ciešanas, ja tie ievēroti, ir jāizņem, humāni jānogalina un tiem jāizdara autopsija. Vienreiz pirms pakļaušanas iedarbībai (lai varētu izdarīt salīdzināšanu vienam un tam pašam dzīvniekam) un pēc tam vismaz vienu reizi nedēļā jāizdara detalizēti visu dzīvnieku klīniskie novērojumi. Šie novērojumi jāizdara ārpus dzīvnieka turēšanas krātiņa standartnožogojumā, ieteicams, katru reizi vienā un tajā pašā laikā. Novērojumi rūpīgi jāprotokolē, vēlams izmantot vērtēšanas sistēmas, ko skaidri noteikusi testēšanas laboratorija. Ir jācenšas nodrošināt, lai izmaiņas testa apstākļos būtu minimālas un, ieteicams, lai novērošanu izdarītu novērotāji, kas nav informēti par vielas ievadīšanu. Protokolējamās pazīmēs ir jāiekļauj izmaiņas ādā, apmatojumā, acīs, gļotādā, sekrēcijas, izdalīšanās un veģetatīvā aktivitāte (piemēram, asarošana, piloarekcija, acs zīlītes diametrs un neraksturīga elpošana), bet ar to nav jāaprobežojas. Jāprotokolē arī izmaiņas gaitā, stājā un atbildes reakcijās uz manipulācijām, kā arī klonisko un tonisko kustību klātesamība, izmaiņas stereotipos (piemēram, pārmērīga kopšanās, atkārtota riņķošana) vai savāda izturēšanās (piemēram, pašsakropļošanās, staigāšana atmuguriski). Ceturtajā iedarbības nedēļā ir jānovērtē sensorās reakcijas uz dažāda veida kairinājumiem (piemēram, dzirdes, redzes un proprioceptīvajiem kairinātājiem), kā arī jānovērtē satveršanas stiprums un motoriskā aktivitāte. Sīkāki dati par izmantojamām procedūrām ir izklāstīti literatūrā (skatīt vispārējā ievada B daļu). Ceturtajā iedarbības nedēļā funkcionālos novērojumus var neizdarīt, ja pētījumu veic kā turpmāka subhroniska (90 dienu) pētījuma iepriekšēju pētījumu. Tādā gadījumā funkcionālie novērojumi ir jāiekļauj šajā vēlākajā pētījumā. No otras puses, vairākkārtējās devas pētījumā iegūtie funkcionālo novērojumu dati var atvieglot devu līmeņu izvēli turpmākajam subhroniskās toksicitātes pētījumam. Izņēmuma kārtā funkcionālos novērojumus var neizdarīt arī grupām, kas citā veidā uzrāda tik izteiktas toksicitātes pazīmes, ka tās ievērojami traucētu funkcionālo testu izdarīšanu.

1.4.3.2. Ķermeņa svars un barības/ūdens patēriņš Visi dzīvnieki jāsver vismaz reizi nedēļā. Barības un ūdens patēriņš ir jāmēra vismaz reizi nedēļā. Ja testa vielu ievada ar dzeramo ūdeni, arī ūdens patēriņš ir jāmēra vismaz reizi nedēļā.

1.4.3.3. Hematoloģija Testa laika posma beigās ir jāizdara šādi hematoloģiski izmeklējumi: hematokrītu, hemoglobīna koncentrācijas, eritrocītu skaita, leikocītu skaita un leikocitārās formulas, trombocītu skaita un asins recēšanas laika/spējas noteikšana. Asins paraugi jāņem no nosauktas vietas tieši pirms dzīvnieku nogalināšanas procedūras vai kā daļa no tās un jāglabā piemērotos apstākļos.

1.4.3.4. Klīniskā bioķīmija Klīniskās bioķīmijas noteikšana, lai izpētītu galvenās toksiskās ietekmes audos un konkrēti ietekmes uz nierēm un aknām, jāveic ar tiem asins paraugiem, kuri paņemti no katra dzīvnieka tieši pirms dzīvnieku nogalināšanas procedūras vai kā daļa no tās (tas neattiecas uz dzīvniekiem, kuri atrasti mirstoši un/vai nogalināti pētījuma gaitā). Ir ieteicams nedot dzīvniekiem barību uz nakti pirms asins analīžu ņemšanas. Plazmā vai serumā nosaka nātriju, kāliju, glikozi, kopējo holesterīnu, urīnvielu, kreatinīnu, kopējās olbaltumvielas un albumīnu un vismaz divus fermentus, kas norāda uz hepatocelulārajām ietekmēm (piemēram, alanīna aminotransferāze, aspartāta aminotransferāze, alkalīnfosfatāze, gamma glutamiltranspeptidāze un sorbīta dehidrogenāze). Papildu fermentu (aknu vai citas izcelsmes) un žultsskābju noteikšana var sniegt noderīgu informāciju pie dažiem nosacījumiem. Neobligāti pēdējā pētījuma nedēļā var izdarīt šādas urīna analīzes, izmantojot urīna tilpuma savākšanu noteiktā laikā: izskats, tilpums, osmolalitāte vai īpatsvars, pH, olbaltumvielas, glikoze un asinis/asins šūnas. Turklāt ir jāapsver vispārēju audu bojājumu seruma marķieru pētījumi. Citas noteikšanas, kuras būtu jāveic, ja testa vielas zināmās īpašības ietekmē attiecīgās metaboliskās īpašības vai ja ir aizdomas par tādu ietekmi, iekļauj kalciju, fosforu, tukšas dūšas triglicerīdus, specifiskus hormonus, methemoglobīnu un holīnesterāzi. Tās ir jānosaka dažu klašu vielām vai atkarībā no gadījuma. Vispār ir vajadzīga elastīga pieeja, kas ir atkarīga no sugas un dotajai vielai novērotās un/vai sagaidāmās ietekmes. Ja agrākie izejas dati nav atbilstīgi, ir jāapsver hematoloģisko un klīniskās bioķīmijas rādītāju noteikšana, pirms uzsāk dozēšanu.

1.4.3.5. Autopsija Visiem pētījuma dzīvniekiem izdara pilnu detalizētu autopsiju, kurā iekļauj rūpīgu ķermeņa ārējās virsmas, visu atveru un galvaskausa dobuma, torakālā dobuma un vēdera dobuma un šo dobumu satura apskati. Aknas, nieres, virsnieru dziedzeri, sēklinieki, sēklinieku piedēkļi, liesa, smadzenes un sirds jāatbrīvo no attiecīgajiem apkārtējiem audiem un iespējami drīz pēc secēšanas jānosver, lai izvairītos no izžūšanas. Šādi audi jāglabā vispiemērotākajā fiksācijas vidē audu veida izmeklēšanai un paredzētai vēlākai histopatoloģiskai izmeklēšanai: visi audi ar makroskopiskiem bojājumiem, smadzenes (reprezentatīvi apgabali, iekļaujot lielās smadzenes, smadzenītes un iegarenās smadzenes/smadzeņu tiltu), muguras smadzenes, kuņģis, tievās un resnās zarnas (iekļaujot kopu limfātiskos jeb Peijera mezgliņus), aknas, nieres, virsnieru dziedzeri, liesa, sirds, hipofīze, vairogdziedzeris, traheja un plaušas (konservētas, piepūšot ar fiksatoru un pēc tam iegremdējot), dzimumdziedzeri, akcesorie dzimumorgāni (piemēram, dzemde, prostata), urīnpūslis, limfmezgli (vēlams, viens limfmezgls, kas ir uz ievadīšanas ceļa, un otrs, kas ir attālu no ievadīšanas ceļa, lai konstatētu sistēmiskās ietekmes), perifēriskais nervs (sēžas nervs vai tibiālais nervs), vēlams, tiešā muskuļa tuvumā un kaulu smadzeņu izgriezums (vai, alternatīvi, svaigs kaulu smadzeņu aspirāts). Klīniskās un citas konstatācijas var ierosināt domu par vajadzību papildus izmeklēt citus audus. Ir jāsaglabā arī visi orgāni, ko uzskata par iespējamiem mērķa orgāniem, pamatojoties uz zināmajām testa vielas īpašībām.

1.4.3.6. Histopatoloģiskie izmeklējumi Visu kontroles grupas un lielākās devas grupas dzīvnieku konservētajiem orgāniem un audiem jāizdara pilni histopatoloģiskie izmeklējumi. Ja lielākās devas grupā ir novērotas ar dozēšanu saistītas izmaiņas, minētie izmeklējumi jāpaplašina uz visu citu dozēšanas grupu dzīvniekiem. Jāizmeklē visi makroskopiskie bojājumi. Ja izmanto satelītgrupu, histopatoloģiskā izmeklēšana jāizdara audiem un orgāniem, kuros ietekmes konstatētas vielu saņēmušajām grupām.

2. DATI Norāda datus par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati jāapkopo tabulā, katrai testa grupai parādot dzīvnieku skaitu testa sākumā, dzīvnieku skaitu, kas testa laikā ir nobeigušies vai humānu apsvērumu dēļ nogalināti, un katras nobeigšanās vai humānas nogalināšanas laiku, dzīvnieku skaitu, kam novērotas toksicitātes pazīmes, novēroto toksicitātes pazīmju aprakstu, iekļaujot toksisko ietekmju sākuma laiku, ilgumu un smagumu, dzīvnieku skaitu, kam novēroti audu bojājumi, bojājumu veidus un dzīvnieku, kuriem parādījušies katra tipa bojājumi, procentuālo daudzumu. Ja iespējams, skaitliskie rezultāti jānovērtē ar piemērotu un vispārpieņemtu statistikas metodi. Statistikas metodes un analizējamie dati jāizvēlas, plānojot pētījumu.

3. ZIŅOJUMU SASTĀDĪŠANA

3. TESTA ZIŅOJUMS

Testa ziņojumā, ja iespējams, iekļauj šādu informāciju.

Testa dzīvnieki:

izmantotā suga/līnija,

dzīvnieku skaits, vecums un dzimums,

izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u. c.,

atsevišķo dzīvnieku svars testa sākumā, nedēļas intervālos pēc tam un testa beigās.

Testa apstākļi:

nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens,

devu izvēles pamatojums,

sīkas ziņas par testa vielas preparāta/diētas sagatavošanu, iegūto koncentrāciju, stabilitāti un homogenitāti,

sīkas ziņas par testa vielas ievadīšanu,

testa vielas koncentrācijas (milj. daļas) barībā vai dzeramajā ūdenī pārrēķins faktiskajā dienas devā (mg/kg ķermeņa masas dienā) attiecīgā gadījumā,

sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti.

Rezultāti:

ķermeņa svars/ķermeņa svara izmaiņas,

barības patēriņš un attiecīgā gadījumā ūdens patēriņš,

dati par toksisko atbildes reakciju pa dzimumiem un devu līmeņiem, iekļaujot toksicitātes pazīmes,

klīnisko novērojumu specifika, smagums un ilgums (atgriezenība vai neatgriezenība),

sensorās aktivitātes, tvēriena stipruma un kustību aktivitātes vērtējums,

hematoloģiskie testi ar attiecīgajiem nulles līnijas lielumiem,

klīniskās bioķīmijas testi ar attiecīgajiem nulles līnijas lielumiem,

dati par ķermeņa svaru pēc nogalināšanas un orgānu svaru,

autopsijas konstatācijas,

visu histopatoloģisko konstatāciju sīki izstrādāts apraksts,

absorbcijas dati, ja tie ir pieejami,

attiecīgā gadījumā rezultātu statistiskā apstrāde.

Rezultātu izvērtējums.

Secinājumi.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Šī metode ir analoga ESAO TG 407.

B.8. ATKĀRTOTĀS DEVAS (28 DIENU) TOKSICITĀTE (IEELPOŠANAS)

B.8.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Ir lietderīgi, ja ir iepriekšēja informācija par vielas daļiņu lieluma sadalījumu, tvaika spiedienu, kušanas temperatūru, viršanas temperatūru, uzliesmošanas temperatūru un sprādzienbīstamību (attiecīgā gadījumā). Skatīt arī vispārīgā ievada B daļas A iedaļu.

1.2. DEFINĪCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļas B iedaļu.

1.3. STANDARTVIELAS Nav.

1.4. TESTA METODES PRINCIPS Uz vairākām izmēģinājumu dzīvnieku grupām katru dienu noteiktā laika posmā iedarbojas ar atšķirīgām testa vielas koncentrācijām, kopumā 28 dienas, vienas grupas dzīvnieki saņem vielu vienādā koncentrācijā. Ja izmanto nesēju, kas palīdz iegūt vajadzīgo testa vielas koncentrāciju atmosfērā, jābūt kontroles grupai, uz kuru iedarbojas nesējs. Testa laikā dzīvniekus katru dienu novēro un reģistrē toksiskuma pazīmes. Pārbaudes laikā mirušos dzīvniekus secē, beidzoties pārbaudei, secē arī izdzīvojušos dzīvniekus.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.6. TESTA METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Sagatavošanas darbi Dzīvniekus pirms testa vismaz piecas dienas pieradina pie izmitināšanas un barošanas apstākļiem. Veselus un jaunus dzīvniekus pirms testa pēc nejaušības principa sadala vajadzīgajā skaitā grupu. Ja nepieciešams, testa vielu var sajaukt ar piemērotu nesēju, kas palīdz iegūt vajadzīgo vielas koncentrāciju atmosfērā. Ja izmanto nesēju vai citu piedevu, kas atvieglo dozēšanu, ir jāpārliecinās, ka tās nav toksiskas. Vajadzības gadījumā var izmantot agrāk iegūtus datus.

1.6.2. Testa apstākļi

1.6.2.

1.6.2.1. Izmēģinājumu dzīvnieki Ja nav noteikts citādi, vēlams izmantot žurkas. Jāizmanto jauni un veseli parasti izmantojamu laboratorijas līniju dzīvnieki. Uzsākot testus, dzīvnieku ķermeņa svara atšķirību diapazons nedrīkst pārsniegt ± 20 % no vidējā svara.

1.6.2.2. Skaits un dzimums Katrā testu grupā jābūt vismaz 10 (pieciem sieviešu un pieciem vīriešu dzimuma) dzīvniekiem. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Ja dzīvnieku nonāvēšana paredzēta arī testa laikā, to skaits ir jāpalielina par to dzīvnieku skaitu, kuri tiks nonāvēti testa gaitā. Bez tam var izveidot papildu grupu no 10 dzīvniekiem (pa pieciem no katra dzimuma), kas 28 dienas saņem lielāko koncentrāciju, un 14 dienu laikā pēc apstrādes novēro, vai toksiskā iedarbība ir atgriezeniska, noturīga vai iestājas novēloti. Izmanto arī 10 kontroles dzīvnieku papildu grupu (piecus katra dzimuma dzīvniekus).

1.6.2.3. Koncentrācija, ar ko iedarbojas uz dzīvniekiem Jāizmanto vismaz trīs dažādas koncentrācijas, kā arī jābūt kontroles grupai, bet, ja izmanto nesēju, jābūt arī kontroles dzīvniekiem, kas saņem tikai nesēju (tā lielākajā koncentrācijā). Izņemot apstrādi ar testa vielu, ar kontroles grupas dzīvniekiem rīkojas tāpat kā ar pārējiem dzīvniekiem. Jāizvēlas tāda lielākā koncentrācija, kam ir toksiska ietekme, bet kas neizraisa vai reti izraisa dzīvnieku nāvi. Viela vismazākajā koncentrācijā nedrīkst izraisīt toksisku ietekmi. Ja pieejami provizoriskie dati par to, ar kādu koncentrāciju saskaras cilvēki, vismazākajai koncentrācijai jābūt lielākai par to. Būtu vēlams, ka vidēji lielās koncentrācijas toksicitāte izpaužas minimāli. Ja izmanto vairākas vidējā intervāla koncentrācijas, to toksiskajai iedarbībai jābūt manāmi atšķirīgai. Mazās un vidēji lielās devas grupās, kā arī kontroles grupā jābūt zemai mirstībai, lai iegūtu statistiski nozīmīgus novērtēšanas rezultātus.

1.6.2.4. Iedarbības laiks Iedarbības ilgums katru dienu ir sešas stundas, bet to var mainīt atkarībā no konkrētām prasībām.

1.6.2.5. Iekārta Testos ar dzīvniekiem izmanto inhalācijas iekārtu, kas nodrošina dinamisku gaisa plūsmu ar vismaz 12 gaisa nomaiņām stundā, pietiekamu skābekļa koncentrāciju un vienmērīgu atmosfēras sadalījumu iedarbības laikā. Ja izmanto kameru, tās konstrukcijai jābūt tādai, kas neļauj dzīvniekiem drūzmēties un nodrošina maksimālo testa vielas iedarbību inhalācijas laikā. Lai kamerā būtu noturīga atmosfēra, izmēģinājumu dzīvnieku kopējais tilpums parasti nedrīkst pārsniegt 5 % no testa kameras tilpuma. Var izmantot kameras, kas ļauj vielai iedarboties tikai uz mutes un deguna dobumu, galvu vai visu ķermeni; divas pirmās minētās iespējami samazina vielas uzņemšanu citos veidos.

1.6.2.6. Novērošanas laika posms Visā iedarbības un atveseļošanās laikā izmēģinājumu dzīvniekus katru dienu apskata un reģistrē toksiskuma pazīmes. Tiem reģistrē nāves iestāšanās brīdi, kā arī laiku, kad parādās vai izzūd toksiskuma pazīmes.

1.6.3. Procedūra Dzīvniekus 28 dienu laikā katru dienu no piecām līdz septiņām dienām nedēļā pakļauj testa vielas iedarbībai. Papildu grupu dzīvnieki, kas paredzēti tālākai novērošanai, turpmākās 14 dienas nesaņem testa vielu, lai varētu izsekot tam, kā tie atveseļojas un cik ilgi saglabājas toksiskā ietekme. Testa laikā jānodrošina 22 ± 3 oC temperatūra. Parasti jānodrošina 30 līdz 70 % relatīvais mitrums, lai gan atsevišķos gadījumos (piemēram, aerosolu testos) to nav iespējams panākt. Neliela negatīva spiediena (≤ 5 mm ūdens) uzturēšana kamerā novērsīs testa vielas izplūdi apkārtējā vidē. Iedarbības laikā dzīvniekus nebaro un nedzirda. Jāizmanto dinamiska inhalācijas sistēma, kas nodrošina pienācīgu koncentrācijas kontroli. Lai noteiktu vajadzīgo vielas koncentrāciju, iesaka veikt priekšizmēģinājumu. Gaisa plūsma jānoregulē tā, lai visā inhalācijas kamerā būtu nodrošināti viendabīgi apstākļi. Sistēmai pēc iespējas ātrāk jānodrošina nemainīgi iedarbības apstākļi. Jāmēra un jāuzrauga: Iedarbības laikā un pēc tās novērojumus veic un reģistrē sistemātiski; atsevišķi pieraksta datus par katru dzīvnieku. Dzīvniekus novēro katru dienu, reģistrējot toksiskuma pazīmes, kā arī to parādīšanās brīdi, smaguma pakāpi un ilgumu. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar ādu un apmatojumu, acis, gļotādas, elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas. Dzīvnieki katru nedēļu jānosver. Ieteicams arī katru nedēļu noteikt barības patēriņu. Sistemātiska dzīvnieku novērošana ļauj testa laikā novērst dzīvnieku zudumus kanibālisma, audu autolīzes vai nepiemērotu turēšanas apstākļu dēļ. Beidzoties izmēģinājumam, visus izdzīvojušos dzīvniekus, izņemot papildu grupas dzīvniekus, secē. Mirstoši dzīvnieki un dzīvnieki, kam ir stipra baiļu sajūta vai sāpes, ja tie ievēroti, ir jāizņem, humāni jānogalina, un jāizdara autopsija. Testa beigās visiem dzīvniekiem, arī kontroles dzīvniekiem, veic šādas pārbaudes: Citas analīzes, kas var būt nepieciešamas pienācīgai toksikoloģiskai novērtēšanai, paredz kalcija, fosfora, hlorīdu, nātrija, kālija, tukšas dūšas glikozes, lipīdu, hormonu, skābju/bāzu līdzsvara, methemoglobīna un holīnesterāzes aktivitātes noteikšanu. Vajadzības gadījumā var veikt arī citus klīniskās bioķīmijas izmeklējumus, lai padziļināti izpētītu vielas toksisko ietekmi.

1.6.3. a)

gaisa plūsmas ātrums (nepārtraukti);

testa vielas faktiskā koncentrācija inhalācijas zonā. Vielas koncentrācijas svārstības iedarbības laikā nedrīkst pārsniegt ± 15 % no vidējās vērtības. Tomēr dažu aerosolu gadījumā to nevar panākt, un tad ir pieļaujams plašāks svārstību diapazons. Visu testa laiku, katru dienu jācenšas nodrošināt pēc iespējas nemainīgu vielas koncentrāciju. Katru nedēļu jāveic vismaz viena aerosolu daļiņu lieluma analīze katrai testa grupai;

temperatūra un mitrums, ja iespējams, jāanalizē nepārtraukti.

hematoloģiskās pārbaudes, kas iekļauj vismaz hematokrīta, hemoglobīna koncentrācijas, eritrocītu skaita, leikocītu skaita un leikocitārās formulas noteikšanu, kā arī asins recēšanas mērījumus;

ii)

klīnisko asins bioķīmiju, tai skaitā vismaz vienu aknu un nieru funkcijas parametru: seruma alanīna aminotransferāzes (agrāk pazīstama kā glutamīnpirovīnogskābes transamināze), seruma aspartāta aminotransferāzes (agrāk pazīstama kā glutamīnskābeņetiķskābes transamināze), urīnvielas slāpekļa, albumīna, asins kreatinīna, kopējā bilirubīna un kopējo seruma proteīnu mērījumus.

1.6.3.1. Autopsija Visiem izmēģinājumu dzīvniekiem veic pilnu autopsiju. Vismaz aknas, nieres, virsnieru dziedzerus un sēkliniekus nosver uzreiz pēc sekcijas, lai tie nesažūtu. Orgāni un audi (elpošanas orgāni, aknas, nieres, liesa, sēklinieki, virsnieru dziedzeri, sirds, kā arī pārējie orgāni, ja tiem novēro makroskopiskus bojājumus vai izmaiņas izmēros) jāsaglabā piemērotā vidē turpmākai histopatoloģiskai izmeklēšanai. Plaušas jāizņem neskartas, tās jānosver un jāapstrādā ar piemērotu fiksatoru, kas ļauj saglabāt plaušu struktūru.

1.6.3.2. Histopatoloģiskā izmeklēšana Histoloģiski izmeklē uzglabātos orgānus un audus, kas iegūti no lielākās koncentrācijas grupas dzīvniekiem un no kontroles dzīvniekiem. Ja testa viela lielākajā devā rada bojājumus orgānos un audos, tie jāizmeklē arī visiem pārējiem mazāku devu grupu dzīvniekiem. Histoloģiski izmeklējot papildu grupu dzīvniekus, īpašu uzmanību pievērš tiem orgāniem un audiem, kuros novērotas toksiskuma pazīmes pārējās apstrādes grupās.

2. DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot dzīvnieku skaitu katrā grupā testa sākumā un to dzīvnieku skaitu, kam ir novēroti vienādi bojājumi. Visi iegūtie rezultāti jāizvērtē ar piemērotu statistikas metodi. Var izmantot jebkuru atzītu statistikas metodi.

3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. TESTA ZIŅOJUMS Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

dzīvnieku suga, līnija, izcelsme, turēšanas un barošanas apstākļi, barība u. tml.,

testa apstākļi: inhalācijas iekārtas apraksts, norādot tās konstrukciju, modeli, izmērus, gaisa avotu, aerosolu ģenerēšanas sistēmu, gaisa kondicionēšanas paņēmienu, izplūdes gaisa apstrādi un dzīvnieku izmitināšanas metodi izmēģinājumu kamerā, ja to izmanto. Jāapraksta iekārtas temperatūras, gaisa mitruma un vajadzības gadījumā aerosolu koncentrācijas noturīguma vai daļiņu lielumu sadalījuma noteikšanai. Iedarbības dati Šie dati jāapkopo tabulā, norādot vidējos lielumus, kā arī svārstību diapazonu (piemēram, standartnovirzi) un, ja iespējams, minot:

3.1. pt_2 a)

gaisa plūsmas ātrumu caur inhalācijas iekārtu;

gaisa temperatūru un mitrumu;

nominālo koncentrāciju (inhalācijas iekārtā ievadītais testa vielas kopējais daudzums, kas izdalīts ar gaisa tilpumu);

nesēja veidu, ja to izmanto;

faktiskās koncentrācijas testa elpošanas zonā;

masas vidējo aerodinamisko diametru (MVAD) un ģeometrisko standartnovirzi (ĢSN);

datus par toksiskajām reakcijām atkarībā no dzimuma un koncentrācijas,

nāves iestāšanās brīdi testa laikā vai norādi, ka dzīvnieki ir izdzīvojuši,

toksiskās ietekmes vai citas ietekmes raksturojumu; netoksisko devas līmeni,

atsevišķu anomālu pazīmju parādīšanās brīdi un to tālāko attīstību,

barības patēriņu un ķermeņa svara izmaiņas,

hematoloģiskos izmeklējumus un to rezultātus,

klīniskās bioķīmijas izmeklējumus un to rezultātus,

autopsijas konstatācijas,

visu histopatoloģisko konstatāciju sīki izstrādātu aprakstu,

rezultātu statistisko apstrādi, ja iespējams,

rezultātu iztirzājumu,

rezultātu interpretāciju.

3.2. IZVĒRTĒJUMS UN INTERPRETĀCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļas D iedaļu.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skatīt vispārīgā ievada B daļas E iedaļu.

B.9. ATKĀRTOTĀS DEVAS (28 DIENU) TOKSICITĀTE (ĀDAS)

B.9.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Skatīt vispārīgā ievada B daļas A iedaļu.

1.2. DEFINITIONS Skatīt vispārīgā ievada B daļas B iedaļu.

1.3. STANDARTVIELAS Nav.

1.4. TESTA METODES PRINCIPS Testa vielu dažādās devās katru dienu 28 dienu laikā uztriepj uz ādas vairāku grupu izmēģinājumu dzīvniekiem; vienas grupas dzīvnieki saņem vienādu devu. Vielas pielietošanas laikā dzīvniekus katru dienu novēro un reģistrē toksiskuma pazīmes. Pārbaudes laikā mirušos dzīvniekus secē, beidzoties pārbaudei, secē arī izdzīvojušos dzīvniekus.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.6. TESTA METODES APRAKSTS

1.6.

1.6.1. Sagatavošanas darbi Dzīvniekus pirms testa vismaz piecas dienas pieradina pie izmitināšanas un barošanas apstākļiem. Veselus un jaunus dzīvniekus pirms testa pēc nejaušības principa sadala apstrādes un kontroles grupās. Neilgi pirms testa nocērp apmatojumu uz izmēģinājumu dzīvnieku muguras. Ādu var arī noskūt, bet tas jādara 24 stundas pirms testa. Parasti cirpšanu vai skūšanu apmēram ik pēc nedēļas atkārto. Cērpot vai skujot apmatojumu, jāuzmanās, lai nenobrāztu ādu. Testa vielas uzlikšanai jāsagatavo ne mazāk kā 10 % no ķermeņa virsmas. Lemjot par to, cik lielai ādas virsmai jābūt brīvai no apmatojuma, lai to apstrādātu ar vielu, ņem vērā dzīvnieku svaru. Pārbaudot cietas vielas, kuras vajadzības gadījumā var saberzt pulverī, testa viela jāsamitrina ar pietiekamu daudzumu ūdens vai, ja nepieciešams, ar piemērotu nesēju, lai tai būtu laba saskare ar ādu. Testa šķidrumus parasti neatšķaida. Parasti vielu pielieto vienreiz dienā piecas līdz septiņas dienas nedēļā.

1.6.2. Testa apstākļi

1.6.2.

1.6.2.1. Izmēģinājumu dzīvnieki Var izmantot pieaugušas žurkas, trušus vai jūrascūciņas. Var izmantot arī citas sugas dzīvniekus, bet šī izvēle jāpamato. Uzsākot testus, dzīvnieku ķermeņa svara svārstības nedrīkst pārsniegt ± 20 % no vidējā svara.

1.6.2.2. Dzīvnieku skaits un dzimums Vienu un to pašu devas līmeni izmanto vismaz 10 (pieciem sieviešu un pieciem vīriešu dzimuma) dzīvniekiem ar veselu ādu. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Ja dzīvnieku nonāvēšana paredzēta arī testa laikā, to skaits ir jāpalielina par to dzīvnieku skaitu, kuri tiks nogalināti testa gaitā. Turklāt 10 dzīvnieku papildu grupai (pieci katra dzimuma dzīvnieki) var ievadīt augsta līmeņa devu 28 dienas un novērot 14 dienas pēc vielas ievadīšanas attiecībā uz toksisko ietekmju atgriezeniskumu, noturību vai aizkavētu parādīšanos. Izmanto arī 10 kontroles dzīvnieku papildu grupu (piecus katra dzimuma dzīvniekus).

1.6.2.3. Izmantotās devas Jāizmanto vismaz trīs devas, kā arī jābūt kontrolei, un, ja lieto nesēju, kontroles dzīvniekiem jāsaņem tikai nesējs. Iedarbības laikam jābūt vismaz sešas stundas dienā. Testa vielu pielieto katru dienu vienādā laikā un devas periodiski pielāgo (ik pēc nedēļas vai divām nedēļām), lai tās būtu nemainīgas attiecībā pret dzīvnieku ķermeņa svaru. Ar kontroles dzīvniekiem jārīkojas tāpat kā ar pārējiem dzīvniekiem, tie tikai nesaņem testa vielu. Ja izmanto nesēju, kas atvieglo dozēšanu, kontroles dzīvnieki saņem tādu pašu daudzumu nesēja kā dzīvnieki, kuri saņem lielāko testa vielas devu. Jāizvēlas tāda lielākā deva, kas ir toksiska, bet kas neizraisa vai reti izraisa dzīvnieku nāvi. Vielas mazākā deva nedrīkst izraisīt toksiskuma pazīmes. Ja pieejami provizoriskie dati par to, ar kādām devām saskaras cilvēki, vismazākajai devai jābūt lielākai par tām. Būtu vēlams, ka vidēji lielās devas toksiskums izpaužas minimāli. Ja izmanto vairākas vidējā intervāla devas, to toksiskajai iedarbībai jābūt manāmi atšķirīgai. To dzīvnieku grupās, kas saņem mazo un vidēji lielo devu, jābūt zemam mirstības līmenim, lai varētu statistiski novērtēt rezultātus. Ja testa vielas lietošana izraisa smagu ādas kairinājumu, tās koncentrācija jāsamazina, un tāpēc var samazināties vai neizpausties citas toksiskas reakcijas, lietojot lielo devu. Turklāt, ja āda ir nopietni bojāta, var gadīties, ka ir jāpārtrauc tests un jāizvēlas mazāka koncentrācija.

1.6.2.4. Pieļaujamības tests Ja iepriekšējā pārbaudē izmanto 1000 mg/kg devu vai vēl lielāku devu, kas atbilst devai, ar kādu parasti saskaras cilvēki, ja tāda ir zināma, un nenovēro toksisku ietekmi, var uzskatīt, ka turpmākā pārbaude nav nepieciešama.

1.6.2.5. Novērošanas laika posms Izmēģinājumu dzīvniekus katru dienu novēro un reģistrē toksiskuma pazīmes. Tiem reģistrē nāves iestāšanās brīdi un laiku, kad parādās vai izzūd toksiskuma pazīmes.

1.6.3. Procedūra Katru dzīvnieku tur atsevišķā būrī. Dzīvnieki parasti saņem testa vielu septiņas dienas nedēļā 28 dienu laikā. Dzīvnieki papildu grupās, kas paredzēti tālākai novērošanai, turpmākās 14 dienas nesaņem testa vielu, lai varētu izsekot tam, kā tie atveseļojas un cik ilgi saglabājas toksiskā iedarbība. Iedarbības ilgums ir vismaz sešas stundas dienā. Testa vielu vienmērīgi uztriepj uz ādas, kuras platība veido apmēram 10 % no kopējās ķermeņa virsmas. Ja vielas ir ļoti toksiskas, apstrādājamās ādas laukumu var samazināt, bet tam jābūt pietiekami lielam, un viela jāuztriepj pēc iespējas plānāk un vienmērīgāk. Testa vielas saskari ar ādu iedarbības laikā nodrošina ar poraina marles pārsēja un nekairinoša plākstera palīdzību. Apstrādātā vieta pēc tam vēl jāpārklāj tā, lai nostiprinātu marles pārsēju ar testa vielu un lai dzīvnieki nevarētu to norīt. Lai testa viela nenonāktu barības vadā, var daļēji ierobežot dzīvnieku kustību, taču pilnīga imobilizācija nav ieteicama. Kā alternatīvu var izmantot apkakles veida aizsargierīci. Beidzoties iedarbības laikam, testa vielas atlikumu, ja iespējams, noņem ar ūdeni vai izmanto kādu citu piemērotu ādas notīrīšanas paņēmienu. Visus dzīvniekus novēro katru dienu, reģistrējot toksiskuma pazīmes, to parādīšanās brīdi, smaguma pakāpi un ilgumu. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar to ādu un apmatojumu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas Dzīvnieki katru nedēļu jānosver. Ieteicams arī katru nedēļu noteikt barības patēriņu. Sistemātiska dzīvnieku novērošana ļauj testa laikā novērst dzīvnieku zudumus kanibālisma, audu autolīzes vai nepiemērotu turēšanas apstākļu dēļ. Beidzoties izmēģinājumam, visus izdzīvojušos dzīvniekus, izņemot papildu grupas dzīvniekus, secē. Mirstoši dzīvnieki un dzīvnieki, kam ir stipra baiļu sajūta vai sāpes, ja tie ievēroti, ir jāizņem, humāni jānogalina, un jāizdara autopsija. Testa beigās visiem dzīvniekiem, arī kontroles dzīvniekiem, veic šādas pārbaudes: Citas analīzes, kas var būt nepieciešamas pienācīgai toksikoloģiskai novērtēšanai, paredz kalcija, fosfora, hlorīdu, nātrija, kālija, tukšas dūšas glikozes, lipīdu, hormonu, skābju/bāzu līdzsvara, methemoglobīna un holīnesterāzes aktivitātes noteikšanu. Vajadzības gadījumā var veikt arī citus klīniskās bioķīmijas izmeklējumus, lai padziļināti izpētītu vielas novēroto ietekmi.

1.6.3.

1) hematoloģiskās pārbaudes, kas paredz vismaz hematokrīta, hemoglobīna koncentrācijas, eritrocītu skaita, leikocītu skaita un leikocitārās formulas noteikšanu, kā arī asins recēšanas mērījumus;

2) klīnisko asins bioķīmiju, tai skaitā vismaz vienu aknu un nieru funkcijas parametru: seruma alanīna aminotransferāzes (agrāk pazīstama kā glutamīnpirovīnogskābes transamināze), seruma aspartāta aminotransferāzes (agrāk pazīstama kā glutamīnskābeņetiķskābes transamināze), urīnvielas slāpekļa, albumīna, asins kreatinīna, kopējā bilirubīna un kopējo seruma proteīnu mērījumus.

1.6.4. Autopsija Visiem izmēģinājumu dzīvniekiem veic pilnu autopsiju. Vismaz aknas, nieres, virsnieru dziedzerus un sēkliniekus nosver uzreiz pēc sekcijas, lai novērstu sažūšanu. Orgāni un audi, proti, vesela un apstrādāta āda, aknas, nieres, liesa, sēklinieki, virsnieru dziedzeri, sirds un mērķorgāni (orgāni, kuros novēroti makroskopiski bojājumi vai izmaiņas izmēros), jāsaglabā piemērotā vidē turpmākai histopatoloģiskai izmeklēšanai.

1.6.5. Histopatoloģiskā izmeklēšana Histoloģiski izmeklē saglabātos orgānus un audus, kas iegūti no lielās devas grupas un no kontroles grupas dzīvniekiem. Ja testa viela lielākajā devā rada bojājumus orgānos un audos, tie jāizmeklē arī visiem pārējiem mazāku devu saņēmušo grupu dzīvniekiem. Histoloģiski izmeklējot papildu grupas dzīvniekus, īpašu uzmanību pievērš tiem orgāniem un audiem, kuros novērotas toksiskuma pazīmes pārējās grupās pēc apstrādes.

3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. TESTA ZIŅOJUMS Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šāda informācija:

dati par dzīvniekiem (suga, līnija, izcelsme, turēšanas apstākļi, uzturs u. tml.),

testa apstākļi (iekļaujot pārsēja veidu – okluzīvs vai neokluzīvs),

devu līmeņi (jānorāda arī nesējs, ja tādu izmanto) un koncentrācijas,

netoksiskas devas līmenis, ja var noteikt,

dati par toksiskajām reakcijām atkarībā no dzimuma un devas,

nāves iestāšanās brīdis testa laikā vai norāde, ka dzīvnieki ir izdzīvojuši,

toksiska vai cita ietekme,

katras anomālas pazīmes parādīšanās brīdis un tālākā attīstība,

barības patēriņš un ķermeņa svara izmaiņas,

hematoloģiskie izmeklējumi un to rezultāti,

klīniskās bioķīmijas izmeklējumi un to rezultāti,

autopsijas konstatācijas,

visu histopatoloģisko konstatāciju sīki izstrādāts apraksts,

rezultātu statistiskā apstrāde, ja iespējams,

rezultātu iztirzājums,

rezultātu interpretācija.

3.2. IZVĒRTĒJUMS UN INTERPRETĀCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļas D iedaļu.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skatīt vispārīgā ievada B daļas E iedaļu.

B.10. MUTAGENITĀTE – ZĪDĪTĀJU HROMOSOMU IZMAIŅU TESTS IN VITRO

B.10.

1. METODE Šī metode ir ESAO TG 473 metodes Zīdītāju hromosomu izmaiņu tests in vitro (1997) kopija.

1.

1.1. IEVADS Pēc hromosomu izmaiņu testa in vitro nosaka vielas, kas zīdītāju šūnu kultūrās rada hromosomu struktūras izmaiņas (1) (2) (3). Struktūras izmaiņas var būt divu veidu – hromosomu izmaiņas vai hromatīdu izmaiņas. Lielākā daļa ķīmisko mutagēnu izraisa hromatīdu izmaiņas, tomēr notiek arī hromosomu izmaiņas. Poliploīdijas palielināšanās var liecināt, ka ķīmiskā viela, iespējams, rada hromosomu skaita izmaiņas. Taču šī metode nav paredzēta šādu izmaiņu noteikšanai šūnās, un parasti to tādām vajadzībām neizmanto. Hromosomu mutācijas un ar tām saistītās ģenētiskās pārmaiņas ir daudzu cilvēka ģenētisko slimību cēlonis, turklāt ir pierādīts, ka hromosomu mutācijas un ar tām saistītās pārmaiņas somatiskajās šūnās rada onkogēnu un tumorsupresoro gēnu izmaiņas, izraisot vēzi cilvēkiem un izmēģinājumu dzīvniekiem. Hromosomu izmaiņu testam in vitro var izmantot izveidotas šūnu līnijas, šūnu celmus vai primāro šūnu kultūras. Testam izmantojamās šūnas izvēlas pēc to augšanas spējām kultūrā, kariotipa stabilitātes, hromosomu skaita, hromosomu daudzveidības un hromosomu spontāno izmaiņu biežuma. Testiem, ko izdara in vitro, metaboliskai aktivācijai parasti jāizmanto eksogēns avots. Šāda metaboliskas aktivācijas sistēma nevar pilnībā imitēt apstākļus zīdītāju organismā in vivo. Būtu jāpievērš uzmanība tam, lai testa laikā novērstu apstākļus, kuros iegūtie pozitīvie rezultāti neliecina par testa vielām piemītošo mutagenitāti, bet kuru cēlonis ir vides pH izmaiņas, osmoze vai paaugstināta citotoksicitāte (4) (5). Šo testu izmanto zīdītājiem potenciāli mutagēnu un kancerogēnu vielu skrīningam. Daudzi savienojumi, kam šis tests ir pozitīvs, ir zīdītājiem kancerogēni; tomēr pilnīgas šā testa pozitīva rezultāta korelācijas ar vielas kancerogēnajām īpašībām nav. Korelācija atkarīga no ķimikāliju grupas, pie kuras pieder testa viela, un kļūst skaidrs, ka ar šo testu neatklāj tādus kancerogēnus, kuri tieši nebojā DNS, bet kuriem piemīt cita veida kaitīgā iedarbība. Skatīt arī vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJAS Hromatīdu tipa izmaiņas: hromosomas struktūras bojājumi, kas izpaužas kā viena hromatīda pārrāvums vai hromatīda pārrāvums un tā rekombinācija. Hromatīdu tipa izmaiņas: hromosomas struktūras bojājumi, kas izpaužas kā abu hromatīdu pārrāvums vai pārrāvums un rekombinācija vienā un tajā pašā vietā. Endoreduplikācija: process, kurā pēc DNS replikācijas S perioda nenotiek šūnas kodola mitoze, bet sākas nākamais S periods. Rezultātā izveidojas hromosomas ar 4, 8, 16,… hromatīdiem. Pārrāvums: ahromatisks bojājums ar nelielu hromatīdu nobīdi, kas ir mazāka par viena hromatīda platumu. Mitotiskais indekss: metafāzē esošu šūnu skaita attiecība pret šūnu kopējo skaitu populācijā; raksturo šūnu populācijas vairošanās spēju. Hromosomu skaita izmaiņas: testam izmantojamajām šūnām raksturīgā parastā hromosomu skaita izmaiņas. Poliploīds hromosomu skaits: haploīda hromosomu skaita (n) daudzkārtnis, izņemot hromosomu diploīdu skaitu (t. i., 3n, 4n utt.). Struktūras izmaiņas: hromosomu struktūras izmaiņas, kas redzamas mikroskopā šūnu dalīšanās metafāzē, ko novēro kā trūkstošus posmus, fragmentus, iekšējas vai savstarpējas rekombinācijas.

1.3. TESTA METODES PRINCIPS Šūnas pakļauj testa vielas iedarbībai gan ar metabolisku aktivāciju, gan bez tās. Noteiktos laika intervālos pēc testa vielas iedarbības uz šūnu kultūrām, tās apstrādā ar kādu metafāzi apturošu vielu (piemēram, Colcemid® vai kolhicīnu), šūnas metafāzē savāc, iekrāso un mikroskopiski analizē hromosomu izmaiņas.

1.4. TESTA METODES APRAKSTS

1.4.

1.4.1. Sagatavošana

1.4.1.

1.4.1.1. Šūnas Var izmantot dažādas šūnu līnijas, celmus vai primārās šūnu kultūras (piemēram, Ķīnas kāmju fibroblastus, cilvēku un citu zīdītāju perifēro asiņu limfocītus).

1.4.1.2. Barotnes un kultivēšanas apstākļi Kultūru uzturēšanai lieto piemērotas barotnes un ievēro atbilstošus kultivēšanas apstākļus (trauki kultūrām, CO2 koncentrācija, temperatūra un mitrums). Stabilām šūnu līnijām un celmiem pārbauda hromosomu skaita stabilitāti un mikoplazmas radīto piesārņojumu; piesārņotas šūnu kultūras neizmanto. Jābūt zināmam šūnu cikla ilgumam un šūnu kultivēšanas apstākļiem.

1.4.1.3. Kultūru sagatavošana Stabilas šūnu līnijas un celmi: šūnas pavairo no kultūru krājumiem, ko izsēj barotnē ar tādu blīvumu, lai līdz novākšanas laikam šūnu kultūras nesaplūstu, un inkubē 37 oC temperatūrā. Limfocīti: ar antikoagulantu (piemēram, heparīnu) apstrādātas asinis vai izdalītus limfocītus, kas iegūti no veseliem indivīdiem, pievieno barotnei, kura satur mitogēnu (piemēram, fitohemaglutinīnu), un inkubē 37 oC temperatūrā.

1.4.1.4. Metabolisma aktivācija Šūnas pakļauj testa vielas iedarbībai gan piemērotas metabolisma aktivācijas sistēmas klātbūtnē, gan bez tās. Plašāk izmantojamā aktivācijas sistēma ir ar kofaktoru papildināta pēcmitohondriskā frakcija (S9), ko pagatavo no grauzēju aknām, kas apstrādātas ar enzīmstimulējošām vielām, piemēram, Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) vai fenobarbitona un β-naftoflavona maisījumu (10) (11) (12). Pēcmitahondrālo frakciju parasti izmanto pēdējā testa barotnē koncentrācijā no 1 līdz 10 tilp. %. Metabolisma aktivācijas sistēmas stāvoklis var būt atkarīgs no ķimikāliju grupas, pie kuras pieder testa viela. Dažos gadījumos pēcmitohondriskā frakcija var būt jālieto vairākās koncentrācijās. Endogēnai aktivācijai var izmantot dažādus paņēmienus, arī ar gēnu inženierijas metodēm iegūtas šūnu līnijas, kas izdala īpašus aktivācijas enzīmus. Izmantojamo šūnu līniju izvēlei jābūt zinātniski pamatotai (piemēram, ar citohroma P450 izoenzīma nepieciešamību testa vielas metabolismam).

1.4.1.5. Testa viela/preparāts Pirms šūnu apstrādes ar cietām testa vielām tās vispirms izšķīdina vai suspendē piemērotos šķīdinātājos vai nesējos un, ja vajadzīgs, atšķaida. Šķidras testa vielas var tieši pievienot testa sistēmās un/vai pirms šūnu apstrādes atšķaidīt. Ja dati par testa vielu preparātu stabilitāti rāda, ka tos uzglabāt nevar, pārbaudēm izmanto svaigi pagatavotus preparātus.

1.4.2 Testa apstākļi

1.4.2

1.4.2.1. Šķīdinātājs/nesējs Šķīdinātājs vai nesējs nedrīkst būt reaģētspējīgs ar testa vielu, un tam jābūt saderīgam ar šūnu dzīvotspēju un S9 aktivitāti. Izmantojot kādus citus, mazāk izpētītus šķīdinātājus vai nesējus, jābūt datiem par to saderību. Vienmēr, kad tas iespējams, ieteicams vispirms izmantot ūdeni saturošus šķīdinātājus vai nesējus. Pārbaudot ūdens vidē nestabilas vielas, izmanto bezūdens organiskos šķīdinātājus. Ūdeni var atdalīt, pievienojot molekulāros sietus.

1.4.2.2. Pārbaudāmās koncentrācijas Starp kritērijiem, kas jāņem vērā, nosakot testa vielas lielāko koncentrāciju, ir tās citotoksicitāte, šķīdība testa sistēmā, kā arī ietekme uz pH izmaiņām un osmoze. Citotoksicitāti nosaka galvenajā eksperimentā ar metabolisma aktivāciju un bez tās, izmantojot piemērotus šūnu integritātes un augšanas rādītājus, piemēram, saplūšanas pakāpi, dzīvotspējīgo šūnu skaitu vai mitotisko indeksu. Var būt lietderīgi iepriekšējā eksperimentā noteikt vielas citotoksicitāti un šķīdību. Būtu jāizmanto vismaz trīs analizējamas koncentrācijas. Ja viela ir citotoksiska, koncentrāciju intervālā jāietver maksimāli toksiskās koncentrācijas, kā arī vielas maztoksiskās vai netoksiskās koncentrācijas; parasti koncentrācijām vajadzētu atšķirties ne vairāk kā 2 līdz √10 reizes. Šūnu novākšanas laikā pie lielākās koncentrācijas vajadzētu būt novērojamam būtiskam saplūšanas pakāpes, dzīvotspējīgo šūnu skaita un mitotiskā indeksa samazinājumam (vairāk nekā par 50 %). Mitotiskais indekss citotoksisko vai citostatisko iedarbību raksturo tikai netieši un ir atkarīgs no laika, kas pagājis pēc šūnu apstrādes ar testa vielu. Tomēr mitotiskā indeksa izmantošana ir pieņemama suspensiju kultūrām, kurās citu toksicitāti raksturojošu rādītāju noteikšana var būt apgrūtināta vai pat neiespējama. Kā papildu informāciju var izmantot datus par šūnas cikla kinētiku, piemēram, vidējo ģenerācijas ilgumu (AGT), lai gan tas ir kopējais vidējais rādītājs, kas ne vienmēr liecina par aizkavētu apakšpopulāciju pastāvēšanu, turklāt pat pavisam neliela vidējā ģenerācijas ilguma palielināšanās var būt saistīta ar būtisku tā laika aizturi, pēc kura optimāli novērojamas hromosomu izmaiņas. Vielām ar relatīvi nelielu citotoksicitāti maksimālajai testa koncentrācijai vajadzētu būt 5 μl/ml, 5 mg/ml vai 0,01 M, no kurām izvēlas mazāko. Relatīvi nešķīstošām vielām, kuras nav toksiskas koncentrācijās, kas mazākas par piesātināta šķīduma koncentrāciju, lielākajai pārbaudāmajai devai vajadzētu būt tādai koncentrācijai, kas pārsniedz šķīdības robežu galīgās kultūras barotnē apstrādes perioda beigās. Dažkārt (piemēram, gadījumos, kad viela ir toksiska tikai koncentrācijās, kas pārsniedz piesātināta šķīduma koncentrāciju) ieteicams testam izmantot vielas vairākas koncentrācijas, pie kurām novērojama tās izgulsnēšanās. Var būt lietderīgi novērtēt vielas šķīdību tās apstrādes sākumā un beigās, jo testa sistēmā šķīdība var mainīties šūnu, S9 seruma un citu faktoru ietekmē. Neizšķīdušas vielas klātbūtni var noteikt vizuāli. Neizšķīdušas vielas klātbūtne nedrīkst traucēt skaitīšanu.

1.4.2.3. Negatīvas un pozitīvas kontroles Katrā eksperimentā gan ar metabolisma aktivāciju, gan bez tās vienlaicīgi iekļauj pozitīvu un negatīvu (šķīdinātāja vai nesēja) kontroli. Izmantojot metabolisma aktivāciju, pozitīvai kontrolei izvēlas vielu, kuras mutagēnai iedarbībai ir vajadzīga aktivācija. Pozitīvai kontrolei izmanto zināmu elastogēnu koncentrācijās, kuras dod reproducējamu un nosakāmu palielinājumu virs fona līmeņa, kas skaidri parāda testa sistēmas jutību. Pozitīvās kontroles vielu koncentrācijas izvēlas tā, lai to iedarbība būtu skaidri redzama, tomēr kodēto priekšmetstikliņu identitāti to nolasītājs nevarētu konstatēt uzreiz. Pie pozitīvās kontroles vielām pieder: Metabolisma aktivācijas apstākļi Viela CAS Nr. Einecs Nr. Bez eksogēnas metabolisma aktivācijas metilmetānsulfonāts 66-27-3 200-625-0 etilmetānsulfonāts 62-50-0 200-536-7 nitrozoetilurīnviela 759-73-9 212-072-2 mitomicīns C 50-07-7 200-008-6 4-nitrohinolīn-N-oksīds 56-57-5 200-281-1 Ar eksogēnu metabolisma aktivāciju benozpirēns 50-32-8 200-028-5 ciklofosfamīds ciklofosfamīda monohidrāts 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Pozitīvai kontrolei var izmantot arī citas piemērotas vielas. Ja iespējams, pozitīvai kontrolei izmanto savienojumus, kas pieder pie atbilstošām vielu grupām. Negatīvu kontroli, kur apstrādes barotnē ietilpst tikai šķīdinātājs vai nesējs, iekļauj visās šūnu novākšanas reizēs, un ar to rīkojas tieši tāpat, kā ar apstrādes kultūrām. Turklāt jāizmanto arī tukšie mēģinājumi, izņemot gadījumus, kad ir iepriekš iegūti vēsturiski kontroldati, kas skaidri parāda, ka izvēlētajam šķīdinātājam nav kaitīgas mutagēnas iedarbības.

1.4.3. Procedūra

1.4.3.

1.4.3.1. Iedarbība ar testa vielu Šūnas, kas vairojas, apstrādā ar testa vielu gan piemērotas metabolisma aktivācijas sistēmas klātbūtnē, gan bez tās. Limfocītus apstrādā aptuveni 48 stundas pēc mitozes stimulācijas.

1.4.3.2. Dublikātu kultūras parasti izmanto visām koncentrācijām, un tās noteikti jāizmanto negatīvas/šķīdinātāja kontroles kultūrām. Ja iepriekš iegūtie vēsturiskie dati liecina, ka dublikātu kultūru atšķirības ir minimālas (13) (14), pie katras koncentrācijas var izmantot tikai vienu kultūru. Gāzveida vai gaistošu vielu pārbaudēm jāizmanto atbilstošas metodes, piemēram, kultivēšana hermētiski noslēgtos traukos (15) (16).

1.4.3.3. Kultūru novākšanas laiks Pirmajā eksperimentā šūnas 3–6 stundas pakļauj testa vielas iedarbībai gan ar metabolisma aktivāciju, gan bez tās un ņem paraugu pēc laika perioda, kas atbilst aptuveni 1,5 normāliem šūnas cikliem pēc apstrādes sākuma (12). Ja šādi iegūst negatīvus rezultātus gan ar metabolisma aktivāciju, gan bez tās, izdara papildu eksperimentu bez aktivācijas, ar testa vielu nepārtraukti apstrādājot kultūru līdz parauga ņemšanai, ko veic pēc laika perioda, kas atbilst aptuveni 1,5 normāliem šūnas cikliem. Dažas ķīmiskas vielas var labāk noteikt, ja to apstrādes/paraugu ņemšanas laiks ir ilgāks par 1,5 šūnas cikliem. Negatīvi rezultāti, kas iegūti ar metabolisma aktivāciju, katrā konkrētā gadījumā ir jāapstiprina. Gadījumos, kad negatīvu rezultātu apstiprināšanu uzskata par nevajadzīgu, tas ir jāpamato.

1.4.3.4. Hromosomu sagatavošana Šūnu kultūras 1–3 stundas pirms novākšanas apstrādā ar Colcemid® vai kolhicīnu. Hromosomu preparēšanai paredzētās šūnu kultūras novāc un apstrādā katru atsevišķi. Hromosomu preparēšana ietver šūnu hipotonisku apstrādi, fiksāciju un iekrāsošanu.

1.4.3.5. Analīze Visus priekšmetstikliņus, arī pozitīvas un negatīvas kontroles priekšmetstikliņus, pirms mikroskopiskās analīzes kodē. Tā kā fiksācijā bieži tiek bojātas metafāzes šūnas, zaudējot hromosomas, uzskaitāmajās šūnās jābūt centromēru skaitam, kas vienāds ar modālo skaitli ≠ 2 visiem šūnu tipiem. Uz katru koncentrāciju un kontroli jāuzskaita vismaz 200 labi sadalījušās metafāzes, ko sadala līdzīgās daļās starp dublikātiem gadījumos, kad tos izmanto. Šo skaitli var samazināt gadījumos, kad novēro lielu skaitu izmaiņu. Tā kā testa mērķis ir noteikt hromosomu struktūras izmaiņas, ir jāatzīmē poliploīdija un endoreduplikācija gadījumos, kad šīs parādības tiek novērotas.

2. DATI

2.

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE Eksperimenta vienība ir šūna, tāpēc jānovērtē to šūnu daļa, kurās radušās hromosomu struktūras izmaiņas. Uzskaita dažāda veida hromosomu struktūras izmaiņas, norādot to skaitu un biežumu gan eksperimentālajām, gan kontrolei izmantojamajām kultūrām. Pārrāvumus uzskaita un norāda atsevišķi, bet kopējā izmaiņu biežumā tos parasti neiekļauj. Norāda arī vienlaicīgi veiktos pasākumus citotoksiskuma novēršanai visām apstrādātajām un negatīvas kontroles kultūrām, ko izmanto galvenajam izmaiņu noteikšanas eksperimentam. Norāda datus par atsevišķām kultūrām. Bez tam visus datus apkopo tabulas veidā. Attiecībā uz pozitīvas reakcijas verificēšanu nav noteiktu prasību. Apšaubāmus rezultātus pārbauda, veicot atkārtotu pārbaudi, turklāt papildu testiem vēlams mainīt eksperimenta apstākļus. Negatīvu rezultātu apstiprināšana aprakstīta 1.4.3.3. punktā. Eksperimenta apstākļu parametru izmaiņas novērtē un nosaka kontroles eksperimentos. Eksperimenta parametri, kurus var mainīt, ir pārbaudāmo koncentrāciju atšķirības un metabolisma aktivācijas apstākļi.

2.2. REZULTĀTU NOVĒRTĒŠANA UN INTERPRETĀCIJA Pozitīvu rezultātu nosaka pēc vairākiem kritērijiem, pie kuriem pieder tādi rādītāji kā ar koncentrācijas izmaiņām saistītā to šūnu skaita vai reproducējamā skaita palielināšanās, kurās ir hromosomu izmaiņas. Vispirms rezultātus izvērtē bioloģiski. Kā palīglīdzekli pārbaužu rezultātu izvērtēšanai var izmantot statistikas metodes (3) (13). Statistiskais nozīmīgums nedrīkst būt vienīgais faktors, pēc kā nosaka pozitīvu atbildes reakciju. Poliploīdo šūnu skaita palielināšanās var norādīt uz to, ka testa viela, iespējams, kavē mitotiskos procesus un rada hromosomu skaita izmaiņas. Tādu šūnu skaita palielināšanās, kurās ir endoreduplicētas hromosomas, var norādīt uz to, ka testa viela, iespējams, kavē šūnu cikla attīstību (17) (18). Uzskata, ka testa viela šajā sistēmā nav mutagēna, ja tās pārbaudes rezultāti neatbilst iepriekšminētajiem kritērijiem. Lai gan lielākajā daļā eksperimentu iegūst skaidri pozitīvus vai negatīvus rezultātus, tomēr dažkārt pēc iegūtajiem datiem nevar noteikti spriest par testa vielas aktivitāti. Turklāt rezultāti var būt nedroši vai apšaubāmi arī neatkarīgi no eksperimenta atkārtojumu skaita. Zīdītāju hromosomu izmaiņu testā in vitro iegūti pozitīvi rezultāti liecina, ka testa viela rada zīdītāju somatisko šūnu hromosomu struktūras izmaiņas. Negatīvi rezultāti norāda, ka testa apstākļos testa viela nerada zīdītāju somatisko šūnu hromosomu struktūras izmaiņas.

3. ZIŅOJUMU SASTĀDĪŠANA

3. TESTA ZIŅOJUMS

Testa ziņojumā jābūt šādai informācijai.

Šķīdinātājs/nesējs:

nesēja izvēles pamatojums,

testa vielas stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja tā ir zināma.

Šūnas:

šūnu veids un izcelsme,

izmantoto šūnu kariotipa īpatnības un piemērotība,

mikoplazmas trūkums gadījumos, kad tas vajadzīgs,

dati par šūnas cikla ilgumu,

asinsdonoru dzimums; nesadalītas asinis vai atdalīti limfocīti; izmantotais mitogēns,

pārneses reižu skaits, ja vajadzīgs,

šūnu kultūru uzturēšanas metode, ja vajadzīgs,

hromosomu modālais skaits.

Testa apstākļi:

metafāzes apturēšanai izmantojamās vielas identifikācija, tās koncentrācija un šūnu apstrādes ilgums,

vielas koncentrāciju un šūnu kultūru skaita izvēles pamatojums, piemēram, dati par citotoksicitāti un šķīdības robežām, ja tie ir pieejami,

barotnes sastāvs, CO2 koncentrācija gadījumos, kad to izmanto,

testa vielas koncentrācija,

pievienotā nesēja un testa vielas tilpums,

inkubēšanas temperatūra,

inkubēšanas ilgums,

apstrādes ilgums,

šūnu blīvums to izsējas laikā, gadījumos, kad tas jānorāda,

metabolisma aktivācijas sistēmas veids un sastāvs, norādot pieņemamības kritērijus,

pozitīvas un negatīvas kontroles,

priekšmetstikliņu sagatavošanas metodes,

izmaiņu uzskaites kritēriji,

analizēto metafāžu skaits,

toksicitātes novērtēšanas metodes,

kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai testa rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs.

Rezultāti:

toksicitātes pazīmes, piemēram, saplūšanas pakāpe, dati par šūnas ciklu, šūnu skaitu, mitotisko indeksu,

izgulsnēšanās pazīmes,

dati par apstrādes barotnes pH un osmozi, ja tie noteikti,

izmaiņu veids, ieskaitot pārrāvumus,

to šūnu skaits, kurās ir hromosomu izmaiņas un izmaiņu veids, ko atsevišķi norāda kultūrām, ko apstrādā ar testa vielu, un kontrolei izmantotajām kultūrām,

ploīdijas izmaiņas, ja tās tiek novērotas,

ja iespējams, devas un reakcijas attiecības,

statistiskās analīzes rezultāti, ja tā veikta,

līdztekus iegūtie negatīvas (šķīdinātāja/nesēja) un pozitīvas kontroles rezultāti,

līdzšinējie negatīvas (šķīdinātāja/nesēja) un pozitīvas kontroles rezultāti, norādot robežas, vidējo lielumu un standartnovirzes.

Rezultātu izvērtējums.

Secinājumi.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, p. 1–29. Ishidate, M.Jr. and Sofuni, T. (1985). The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, p. 427–432. Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl. 10), p. 1–175. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, p. 147–204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, p. 297–305. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347–364. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173–215. Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, p. 83–90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, p. 277–290. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, p. 85–88. Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr., Ivett, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, p. 241–261. Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, p. 141–154. Soper, K.A. and Galloway, S.M. (1994). Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, p. 139–149. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91–103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795–801. Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, p. 403–413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362–1364.

B.11. MUTAGENITĀTE – ZĪDĪTĀJU KAULU SMADZEŅU HROMOSOMU IZMAIŅU TESTS IN VIVO

B.11.

1. METODE Šī metode ir ESAO TG 475 metodes Zīdītāju kaulu smadzeņu hromosomu izmaiņu tests (1997) kopija.

1.

1.1. IEVADS Zīdītāju hromosomu izmaiņu testu in vivo izmanto tādu hromosomu struktūras izmaiņu noteikšanai, ko testa viela izraisa dzīvnieku, parasti grauzēju, kaulu smadzeņu šūnās (1) (2) (3) (4). Struktūras izmaiņas var būt divu veidu – hromosomu izmaiņas vai hromatīdu izmaiņas. Poliploīdijas palielināšanās var liecināt, ka ķīmiskā viela, iespējams, rada hromosomu skaita izmaiņas. Lielākā daļa ķīmisko mutagēnu izraisa hromatīdu izmaiņas, tomēr notiek arī hromosomu izmaiņas. Hromosomu mutācijas un ar tām saistītās pārmaiņas ir daudzu cilvēka ģenētisko slimību cēlonis, turklāt ir pierādīts, ka hromosomu mutācijas un ar tām saistītie procesi rada onkogēnu un tumorsupresoro gēnu izmaiņas, izraisot vēzi cilvēkiem un izmēģinājumu dzīvniekiem. Šim testam parasti izmanto grauzējus. Šajā testā mērķaudi ir kaulu smadzenes, jo tās ir ļoti labi apasiņotas, turklāt šo audu šūnu cikls ir īss un tās ir viegli izolējamas un apstrādājamas. Šai metodei neizmanto citu sugu dzīvniekus vai cita veida audus. Šis hromosomu izmaiņu tests ir īpaši piemērots ar vielu mutagēnajām īpašībām saistītā kaitīguma noteikšanai, jo iespējams novērtēt in vivo metabolisma faktorus, farmakokinētiku un DNS reparācijas procesus, kas gan dažādām sugām attiecīgajos audos var būt atšķirīgi. Testu in vivo var izmantot arī in vitro konstatētās mutagēnās iedarbības sīkākai izpētei. Gadījumos, kad noskaidrots, ka testa viela vai tās reaģētspējīgs metabolisma produkts mērķaudos nenonāk, šo testu neizmanto. Skatīt arī vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJAS Hromatīdu tipa izmaiņas: hromosomas struktūras bojājumi, kas izpaužas kā atsevišķu hromatīdu pārrāvumi, vai hromatīdu pārrāvumi un to rekombinācija. Hromosomas tipa izmaiņas: hromosomas struktūras bojājumi, kas izpaužas kā abu hromatīdu pārrāvums vai pārrāvums un rekombinācija vienā un tajā pašā vietā. Endoreduplikācija: process, kurā pēc DNS replikācijas S perioda nenotiek šūnas kodola mitoze, bet sākas otrs S periods. Rezultātā izveidojas hromosomas ar 4, 8, 16,… hromatīdiem. Pārrāvums: ahromatisks bojājums ar nelielu hromatīda(-u) nobīdi, kas ir mazāks par viena hromatīda platumu. Hromosomu skaita izmaiņas: testam izmantojamajām šūnām raksturīgā parastā hromosomu skaita izmaiņas. Poliploīdija: haploīda hromosomu skaita (n) daudzkārtnis, izņemot hromosomu diploīdu skaitu (t. i., 3n, 4n utt). Struktūras izmaiņas: hromosomu struktūras izmaiņas, kas redzamas mikroskopā šūnu dalīšanās metafāzē, ko novēro kā trūkstošus posmus, fragmentus, iekšējas vai savstarpējas rekombinācijas.

1.3. TESTA METODES PRINCIPS Dzīvniekus pakļauj testa vielas iedarbībai, izmantojot piemērotu tās uzņemšanas veidu, un tad nogalina noteiktā laikā pēc apstrādes. Pirms nogalināšanas dzīvniekiem ievada metafāzi apturošu vielu (piemēram, kolhicīnu vai Colcemid®). Tad no kaulu smadzeņu šūnām pagatavo hromosomu preparātus, ko iekrāso, un metafāzes šūnām nosaka hromosomu izmaiņas.

1.4. TESTA METODES APRAKSTS

1.4.

1.4.1. Sagatavošana

1.4.1.

1.4.1.1. Dzīvnieku sugu izvēle Parasti izmanto žurkas, peles un Ķīnas kāmjus, tomēr var izmantot jebkuras piemērotas sugas zīdītājus. Parasti izmanto jaunus, veselīgus, pieaugušus laboratorijas dzīvniekus. Izmēģinājuma sākumā dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un tās nedrīkstētu pārsniegt ± 20 % no vidējās masas, kas noteikta katram dzimumam atsevišķi.

1.4.1.2. Turēšanas un barošanas nosacījumi Piemēro vispārējos nosacījumus, kas minēti vispārīgā ievada B daļā, bet mitrumam vajadzētu būt 50–60 %.

1.4.1.3 Dzīvnieku sagatavošana Veselīgus, jaunus, pieaugušus dzīvniekus pēc gadījuma izvēles principa sadala kontroles un apstrādes grupās. Būrus izvieto tā, lai iespējami samazinātu būru novietojuma varbūtējo ietekmi. Katram dzīvniekam atsevišķi piešķir identifikāciju. Dzīvniekus laboratorijas apstākļiem aklimatizē vismaz piecas dienas.

1.4.1.4. Devu sagatavošana Pirms došanas dzīvniekiem cietas testa vielas vispirms izšķīdina vai suspendē piemērotos šķīdinātājos vai nesējos un, ja vajadzīgs, atšķaida. Šķidras testa vielas var dozēt tieši vai pirms dozēšanas atšķaidīt. Ja dati par testa vielu preparātu stabilitāti liecina, ka tos uzglabāt nevar, pārbaudēm izmanto svaigi pagatavotus preparātus.

1.4.2. Testa apstākļi

1.4.2.

1.4.2.1. Šķīdinātājs/nesējs Lietotajās devās šķīdinātājam vai nesējam nedrīkst būt toksiskas iedarbības, un tas nedrīkst būt reaģētspējīgs ar testa vielu. Izmantojot citus, mazāk izpētītus šķīdinātājus vai nesējus, jābūt datiem par to saderību. Vienmēr, kad tas iespējams, ieteicams vispirms izmantot ūdeni saturošus šķīdinātājus vai nesējus.

1.4.2.2. Kontroles Visos testos katram dzīvnieku dzimumam līdztekus iekļauj pozitīvu un negatīvu (šķīdinātāja/nesēja) kontroli. Izņemot apstrādi ar testa vielu, ar kontroles grupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem. Pozitīvā kontrolē iegūst hromosomu struktūras izmaiņas in vivo pie ekspozīcijas robežvērtībām, kas dod nosakāmu palielinājumu virs fona līmeņa. Pozitīvās kontroles vielu koncentrācijas izvēlas tā, lai to iedarbība būtu skaidri redzama, tomēr kodēto priekšmetstikliņu identitāti to nolasītājs nevarētu konstatēt uzreiz. Pieļaujams, ka pozitīvai kontrolei tiek izmantots cits iedarbības veids nekā testa vielai un paraugu ņem tikai vienreiz. Ja iespējams, kā pozitīvās kontroles vielas izmanto savienojumus, kas pieder pie atbilstošām vielu grupām. Pie pozitīvās kontroles vielām pieder: Viela CAS Nr. Einecs Nr. etilmetānsulfonāts 62-50-0 200-536-7 nitrozoetilurīnviela 759-73-9 212-072-2 mitomicīns C 50-07-7 200-008-6 ciklofosfamīds ciklofosfamīda monohidrāts 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 trietilēnmelamīns 51-18-3 200-083-5 Ja nav pieņemamu vēsturisku kontroles datu par dzīvnieku savstarpējām atšķirībām un tādu šūnu parādīšanās biežumu, kurās ir hromosomu struktūras izmaiņas, katrā paraugu ņemšanas laikā iekļauj negatīvas kontroles dzīvniekus, ko apstrādā tikai ar šķīdinātāju vai nesēju, bet ar ko citādi rīkojas tāpat kā ar apstrādes grupu dzīvniekiem. Ja negatīvai kontrolei paraugus ņem tikai vienreiz, piemērotākais laiks ir pirmā paraugu ņemšanas reize. Turklāt jāizmanto arī tukšie mēģinājumi, izņemot gadījumus, kad ir iepriekš iegūti vēsturiski vai publicēti kontroldati, kas skaidri parāda, ka izvēlētajam šķīdinātājam nav kaitīgas vai mutagēnas iedarbības.

1.5. PROCEDŪRA

1.5.

1.5.1. Dzīvnieku skaits un dzimums Katrā apstrādes un kontroles grupā iekļauj vismaz piecus abu dzimumu dzīvniekus. Ja izmēģinājuma veikšanas laikā ir pieejami citos testos iegūti dati par tās pašas sugas dzīvniekiem, kam izmantots tas pats iedarbības veids, un šie dati liecina, ka toksiskā iedarbība uz abu dzimumu īpatņiem būtiski neatšķiras, testam var izmantot tikai viena dzimuma dzīvniekus. Gadījumos, kad ķīmiskās vielas iedarbība uz cilvēka organismu katram dzimumam var būt atšķirīga, piemēram, dažiem farmaceitiskajiem preparātiem, testu veic ar attiecīgā dzimuma dzīvniekiem.

1.5.2. Apstrādes shēma Ieteicams izmēģināt vienreizēju apstrādi ar vielu. Testa vielas devu var dot arī dalīti, t. i., divreiz vienā un tajā pašā dienā ik pēc dažām stundām, kas var būt vajadzīgs gadījumos, kad jādod liels vielas tilpums. Citiem devu režīmiem jābūt zinātniski pamatotiem. Pēc apstrādes paraugus ņem vienā dienā divos atsevišķos laikos. Grauzējiem pirmais paraugu ņemšanas termiņš ir pēc 1,5 normāliem šūnas cikliem (kas parasti ir 12 līdz 18 stundas pēc apstrādes). Tā kā testa vielas uzņemšanai un metabolismam, kā arī tās iedarbībai uz šūnas cikla kinētiku vajadzīgs laiks, kas var ietekmēt optimālo laiku hromosomu izmaiņu noteikšanai, ieteicams paraugus otrreiz ņemt 24 stundas pēc tam, kad paraugi ņemti pirmoreiz. Ja devu režīms pārsniedz vienas dienas ilgumu, paraugus ņem vienreiz pēc 1,5 šūnas cikliem pēc tam, kad veikta pēdējā apstrāde. Pirms nogalināšanas dzīvniekiem intraperitoniāli injicē atbilstošu devu metafāzi apturošas vielas (piemēram, kolhicīnu vai Colcemid®). Pēc tam ar atbilstošiem intervāliem ņem dzīvnieku paraugus. Pelēm šis intervāls ir aptuveni 3–5 stundas; Ķīnas kāmjiem šis intervāls ir aptuveni 4–5 stundas. Savāc kaulu smadzeņu šūnas, un tām nosaka hromosomu izmaiņas.

1.5.3. Devu lielums Ja atbilstošu datu trūkuma dēļ vispirms veic orientējošu izmēģinājumu, tas jāizdara tajā pašā laboratorijā, kurā veiks galveno izmēģinājumu, izmantojot tās pašas sugas un dzimuma dzīvniekus un ievērojot to pašu apstrādes režīmu (5). Ja viela ir toksiska, pirmajā paraugu ņemšanas reizē izmanto trīs devas. Šo devu intervālā ietver maksimāli toksiskās devas, kā arī vielas maztoksiskās vai netoksiskās devas. Vēlākajā paraugu ņemšanas laikā jāizmanto tikai lielākā deva. Kā lielāko nosaka devu ar tādām pašām toksiskās iedarbības pazīmēm kā lielākajai devai, kam varētu būt letāla iedarbība pēc tāda paša devu režīma. Vielām ar specifisku bioloģisko aktivitāti maztoksiskās un netoksiskās devās (piemēram, hormoniem un mitogēniem) var būt citi devu noteikšanas kritēriji, ko katrā konkrētā gadījumā izvērtē atsevišķi. Kā lielāko var noteikt arī devu, kas liecina par toksisku iedarbību uz kaulu smadzenēm (piemēram, lielāku par tādu devu, kas izraisa mitotiskā indeksa samazināšanos par 50 %).

1.5.4. Iedarbības robežu tests Ja testā ar vienu vielas devu, kas ir vismaz 2000 mg/kg ķermeņa svara, vienā paņēmienā vai divos paņēmienos vienā dienā toksisku iedarbību nekonstatē un pēc datiem par struktūras ziņā līdzīgām vielām var pamatoti uzskatīt, ka viela nav genotoksiska, pilnīgus izmēģinājumus ar trim vielas devām var uzskatīt par nevajadzīgiem. Ilgstošākos izmēģinājumos – līdz 14 dienām – maksimālā dienas deva ir 2000 mg/kg ķermeņa svara un 1000 mg/kg ķermeņa svara izmēģinājumos, kas pārsniedz 14 dienas. Paredzamā iedarbība uz cilvēku var norādīt uz to, ka devu iedarbības robežu pārbaudē jālieto lielāka deva.

1.5.5. Devu došana Testa vielu parasti dod, mākslīgi barojot pa kuņģa caurulīti, piemērotu inkubācijas kanulu vai intraperitonālas injekcijas veidā. Var izmantot arī citus iedarbības veidus, ja šādai rīcībai ir pietiekams pamatojums. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var dot vai injicēt, ir atkarīgs no izmēģinājumu dzīvnieka lieluma. Tilpums nedrīkst pārsniegt 2 ml uz 100 g ķermeņa masas. Lielāka tilpuma lietošana par norādīto ir jāpamato. Izņemot kairinošas un kodīgas vielas, kuru iedarbība lielākās koncentrācijās parasti ir izteiktāka, testos lietotā tilpuma mainības ietekmi samazina, koriģējot tilpumu tā, lai pie visām devām tas būtu vienāds.

1.5.6. Hromosomu sagatavošana Pēc nogalināšanas nekavējoties izņem kaulu smadzenes, tās apstrādā hipotoniskā šķīdumā un fiksē. Tad šūnas uznes uz priekšmetstikliņiem un iekrāso.

1.5.7. Analīze Lai noteiktu citotoksicitāti, jānosaka mitotiskais indekss vismaz 1000 šūnām no katra apstrādātā dzīvnieka (ieskaitot pozitīvas kontroles), kā arī no katra tukšās negatīvas kontroles dzīvnieka. No katra dzīvnieka analizē vismaz 100 šūnu. Šo daudzumu var samazināt gadījumos, kad novēro lielu skaitu hromosomu izmaiņu. Visus priekšmetstikliņus, arī pozitīvas un negatīvas kontroles priekšmetstikliņus, pirms mikroskopiskās analīzes kodē. Tā kā priekšmetstikliņu sagatavošanas procedūrā bieži tiek bojātas metafāzes šūnas, kuras zaudē hromosomas, uzskaitāmajās šūnās jābūt centromēru skaitam, kas vienāds ar 2n ± 2.

2. DATI

2.

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE Datus par katru dzīvnieku apkopo tabulas veidā. Eksperimenta vienība ir viens dzīvnieks. Katram dzīvniekam novērtē uzskaitīto šūnu daudzumu, hromosomu izmaiņu skaitu uz vienu šūnu un šūnu daļu ar hromosomu struktūras izmaiņām. Uzskaita dažāda veida hromosomu struktūras izmaiņas, norādot to skaitu un biežumu gan apstrādātajām, gan kontrolei izmantotajām dzīvnieku grupām. Pārrāvumus uzskaita un norāda atsevišķi, bet kopējā izmaiņu biežumā tos parasti neiekļauj. Ja nekas neliecina par vielas iedarbības atšķirībām atkarībā no dzīvnieku dzimuma, statistiskās analīzes veikšanai par abu dzimumu dzīvniekiem iegūtos datus var apvienot.

2.2. REZULTĀTU NOVĒRTĒŠANA UN INTERPRETĀCIJA Pozitīvu rezultātu nosaka pēc vairākiem kritērijiem, piemēram, ar devu saistīta to šūnu daļas palielināšanās, kurās ir hromosomu struktūras izmaiņas, vai izmainītu šūnu skaita palielināšanās, pārbaudot vienu devu ar vienu paraugu ņemšanas laiku. Vispirms rezultātus izvērtē bioloģiski. Kā palīglīdzekli testa rezultātu izvērtēšanai var izmantot statistikas metodes (6). Statistiskais nozīmīgums nedrīkst būt vienīgais faktors, pēc kā nosaka pozitīvu atbildes reakciju. Apšaubāmus rezultātus pārbauda, veicot testu atkārtoti, turklāt atkārtotiem testiem vēlams mainīt eksperimenta apstākļus. Poliploīdijas palielināšanās var liecināt, ka testa viela, iespējams, rada hromosomu skaita izmaiņas. Tādu šūnu skaita palielināšanās, kurās ir endoreduplicētas hromosomas, var norādīt uz to, ka testa viela, iespējams, kavē šūnu cikla attīstību (7) (8). Uzskata, ka testa vielas mutagēnās īpašības nav konstatētas, ja tās pārbaudes rezultāti neatbilst iepriekšminētajiem kritērijiem. Lai gan lielākajā daļā eksperimentu iegūst nepārprotami pozitīvus vai negatīvus rezultātus, tomēr dažkārt pēc iegūtajiem datiem nevar noteikti spriest par testa vielas aktivitāti. Turklāt rezultāti var būt nedroši vai apšaubāmi arī neatkarīgi no eksperimenta atkārtojumu skaita. Pozitīvi rezultāti hromosomu izmaiņu testā in vivo liecina, ka testa viela izmēģinājumu dzīvnieku sugai izraisa hromosomu izmaiņas kaulu smadzenēs. Negatīvi rezultāti liecina, ka izmēģinājuma apstākļos testa viela izmēģinājumu dzīvnieku sugai nerada hromosomu izmaiņas kaulu smadzenēs. Jāizvērtē varbūtība, ka testa viela vai tās metabolīti sasniedz centrālās asinsrites sistēmu un jo īpaši mērķaudus (piemēram, sistēmiska toksicitāte).

3. ZIŅOJUMU SASTĀDĪŠANA

3.

3.1. TESTA ZIŅOJUMS Testa ziņojumā jābūt šādai informācijai.

Šķīdinātājs/nesējs:

nesēja izvēles pamatojums,

testa vielas stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja tā ir zināma.

Testa dzīvnieki:

izmantotā suga/līnija,

dzīvnieku skaits, vecums un dzimums,

izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u. c.,

dzīvnieku masa testa sākumā, katrā grupā norādot robežas, vidējo lielumu un standartnovirzi.

Testa apstākļi:

pozitīvas un negatīvas (nesēja/šķīdinātāja) kontroles,

devu intervāla noteikšanas testa rezultāti gadījumos, kad tas veikts,

pēc lieluma mazatšķirīgu devu izvēles pamatojums,

informācija par testa vielas sagatavošanu,

informācija par testa vielas došanu,

iedarbības veida izvēles pamatojums,

metodes, ar kurām nosaka, ka testa viela nonākusi centrālajā asinsritē vai mērķaudos gadījumos, kad tas nepieciešams,

testa vielas koncentrācijas (ppm) barībā vai dzeramajā ūdenī pārrēķins faktiskajā dienas devā (mg/kg ķermeņa masas) gadījumos, kad tas nepieciešams,

sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti,

sīks apstrādes un paraugu ņemšanas shēmas apraksts,

toksicitātes novērtēšanas metodes,

metafāzes apturēšanai izmantojamās vielas identifikācija, tās koncentrācija un apstrādes ilgums,

priekšmetstikliņu sagatavošanas metodes,

izmaiņu uzskaites kritēriji,

analizēto šūnu skaits no viena dzīvnieka,

kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai testa rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs.

Rezultāti:

toksicitātes pazīmes,

mitotiskais indekss,

izmaiņu veids un skaits, ko norāda katram dzīvniekam atsevišķi,

kopējais izmaiņu skaits grupās, norādot vidējos lielumus un standartnovirzes,

grupās kopējais šūnu skaits ar izmaiņām, norādot vidējos lielumus un standartnovirzes,

ploīdijas izmaiņas, ja tās tiek novērotas,

ja iespējams, reakcijas uz devu novērtējums,

statistiskās analīzes rezultāti, ja tā veikta,

līdztekus veiktās negatīvās kontroles dati,

līdz šim iegūtie negatīvas kontroles vēsturiskie dati, norādot robežas, vidējos lielumus un standartnovirzes,

līdztekus veiktās pozitīvās kontroles dati.

Rezultātu izvērtējums.

Secinājumi.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA Adler, I.D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275–306. Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, p. 157–165. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141. Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, p. 305–312. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313–319. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge, p. 184–232. Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, p. 403–413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362–1364.

B.12. MUTAGENITĀTE – ZĪDĪTĀJU ERITROCĪTU MIKROKODOLU TESTS IN VIVO

B.12.

1. METODE Šī metode ir ESAO TG 474 metodes Zīdītāju eritrocītu mikrokodolu tests (1997) kopija.

1.

1.1. IEVADS Zīdītāju in vivo mikrokodolu testu izmanto, lai noteiktu testa vielas kaitīgumu eritroblastu hromosomām vai mitotiskajam aparātam, analizējot eritrocītus, kas iegūti no dzīvnieku, parasti grauzēju, kaulu smadzeņu un/vai perifēro asiņu šūnām. Ar mikrokodolu testu nosaka vielas, kas izraisa citoģenētiskus bojājumus, kuru dēļ veidojas mikrokodoli, kuros aizturēti hromosomu fragmenti vai veselas hromosomas. Kad kaulu smadzeņu eritroblasts attīstās par polihromatisku eritrocītu, galvenais kodols tiek izspiests; izveidojušies mikrokodoli var palikt ārpus citādi anukleotīdās citoplazmas. Šajās šūnās tiek veicināta mikrokodolu parādīšanās, jo tām nav galvenā kodola. Tādu polihromatisku eritrocītu skaita pieaugums apstrādātajos dzīvniekos, kas satur mikrokodolus, liecina par izraisītiem hromosomu bojājumiem. Šim testam parasti izmanto grauzēju kaulu smadzenes, jo šajos audos veidojas polihromatiski eritrocīti. Nenobriedušus (polihromatiskus) mikrokodolu eritrocītus perifērajās asinīs var mērīt visām dzīvnieku sugām, kurām konstatēta liesas nespēja aizvākt mikrokodolu eritrocītus vai kuras ir pietiekami jutīgas pret vielām, kas rada hromosomu struktūras vai skaita izmaiņas. Mikrokodolus var atšķirt pēc vairākiem kritērijiem. Pie tiem pieder kinetohoras vai centromēru DNS klātbūtne vai trūkums mikrokodolos. Svarīgākais rādītājs ir nenobriedušu (polihromatisku) mikrokodolu eritrocītu daudzums. Gadījumos, kad izmēģinājuma dzīvniekus ar testa vielu apstrādā vismaz četras nedēļas, kā rādītāju var izmantot arī tādu nobriedušu (normāli hromatisku) eritrocītu skaitu no eritrocītu kopējā skaita perifērajās asinīs, kas satur mikrokodolus. Mikrokodolu in vivo tests grauzējiem ir īpaši piemērots, lai novērtētu mutagenitātes risku, jo tas ļauj novērtēt in vivo metabolisma faktorus, farmakokinētiku un DNS reparācijas procesus, lai gan ģenētiskie raksturlielumi dažādām sugām attiecīgajos audos var būt atšķirīgi. Testu in vivo var izmantot arī in vitro konstatētās mutagēnās iedarbības sīkākai izpētei. Gadījumos, kad noskaidrots, ka testa viela vai tās reaģētspējīgs metabolisma produkts mērķaudos nenonāk, šo testu neizmanto. Skatīt arī vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJAS Centromērs (kinetohors): hromosomas reģions(-i), ar kuru(-iem) šūnas dalīšanās laikā saistās vārpstiņas šķiedras, nodrošinot secīgu meitashromosomu pārvietošanos uz meitasšūnu poliem. Mikrokodoli: mazi kodoli, kas papildus šūnu galvenajiem kodoliem mitozes (mejozes) telofāzē atsevišķi izveidojas, salīpot hromosomu fragmentiem vai veselām hromosomām. Normāli hromatisks eritrocīts: nobriedis eritrocīts, kam nav ribosomu un kuru var atšķirt no nenobriedušiem polihromatiskiem eritrocītiem ar ribosomu selektīvu krāsojumu. Polihromatisks eritrocīts: nenobriedis eritrocīts attīstības vidējā posmā, kas vēl satur ribosomas un kuru tāpēc ar ribosomu selektīvu iekrāsojumu var atšķirt no nobriedušiem normāli hromatiskiem eritrocītiem.

1.3. TESTA METODES PRINCIPS Piemērotā veidā izmēģinājuma dzīvniekus pakļauj testa vielas iedarbībai. Ja izmanto kaulu smadzenes, dzīvniekus pēc apstrādes noteiktos termiņos nogalina, izņem kaulu smadzenes, sagatavo un iekrāso to preparātus (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Ja izmanto perifērās asinis, pēc apstrādes noteiktos termiņos ņem asinis, no kurām sagatavo un iekrāso uztriepes (4) (8) (9) (10). Izmēģinājumos, kuros izmanto perifērās asinis, starplaikam starp pēdējo pakļaušanu iedarbībai un šūnu ņemšanu jābūt iespējami mazam. Preparātos nosaka mikrokodolu klātbūtni.

1.4. TESTA METODES APRAKSTS

1.4.

1.4.1. Sagatavošana

1.4.1.

1.4.1.1. Dzīvnieku sugu izvēle Izmantojot kaulu smadzenes, izmēģinājumiem parasti izvēlas žurkas, tomēr var izmantot jebkuras citas piemērotas sugas zīdītājus. Izmantojot perifērās asinis, ieteicams izmēģinājumiem ņemt peles. Var izmantot jebkuras citas piemērotas sugas zīdītājus ar nosacījumu, ka šīm sugām liesa neaizvāc mikrokodolu eritrocītus, vai sugas, kuras ir pietiekami jutīgas pret vielām, kas izraisa hromosomu struktūras vai skaita izmaiņas. Parasti izmanto jaunus, veselus, pieaugušus laboratorijas dzīvniekus. Izmēģinājuma sākumā dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un tās nedrīkstētu pārsniegt ± 20 % no vidējās masas, kas noteikta katram dzimumam atsevišķi.

1.4.1.2. Turēšanas un barošanas nosacījumi Piemēro vispārējos nosacījumus, kas minēti vispārīgā ievada B daļā, bet mitrumam vajadzētu būt 50–60 %.

1.4.1.3. Dzīvnieku sagatavošana Veselus, jaunus, pieaugušus dzīvniekus pēc gadījuma izvēles principa sadala kontroles un apstrādes grupās. Katram dzīvniekam atsevišķi piešķir identifikāciju. Dzīvniekus laboratorijas apstākļiem aklimatizē vismaz piecas dienas. Būrus izvieto tā, lai iespējami samazinātu būru novietojuma varbūtējo ietekmi.

1.4.2. Testa apstākļi

1.4.2.

1.4.2.2. Kontroles Visos izmēģinājumos katram dzīvnieku dzimumam līdztekus iekļauj pozitīvu un negatīvu (šķīdinātāja/nesēja) kontroli. Izņemot apstrādi ar testa vielu, ar kontrolgrupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādes grupu dzīvniekiem. Pozitīvā kontrolē iegūst mikrokodolus in vivo pie ekspozīcijas robežvērtībām, kas dod nosakāmu palielinājumu virs fona līmeņa. Pozitīvās kontroles vielu koncentrācijas izvēlas tā, lai to iedarbība būtu skaidri redzama, tomēr kodēto priekšmetstikliņu identitāti to nolasītājs nevarētu konstatēt uzreiz. Pieļaujams, ka pozitīvai kontrolei tiek izmantots cits iedarbības veids nekā testa vielai un paraugu ņem tikai vienreiz. Ja iespējams, kā pozitīvās kontroles vielas izmanto savienojumus, kas pieder pie atbilstošām ķīmisko vielu grupām. Pie pozitīvās kontroles vielām pieder: Viela CAS Nr. Einecs Nr. etilmetānsulfonāts 62-50-0 200-536-7 N-etil-N-nitrozourīnviela 759-73-9 212-072-2 mitomicīns C 50-07-7 200-008-6 ciklofosfamīds ciklofosfamīda monohidrāts 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 trietilēnmelamīns 51-18-3 200-083-5 Ja nav pieņemamu vēsturisko datu par dzīvnieku savstarpējām atšķirībām un tādu šūnu parādīšanās biežumu, kurās ir mikrokodoli, katrā paraugu ņemšanas laikā iekļauj negatīvas kontroles dzīvniekus, uz kuriem iedarbojas tikai ar šķīdinātāju vai nesēju, bet citādi ar kontrolgrupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādes grupu dzīvniekiem. Ja negatīvai kontrolei paraugus ņem tikai vienreiz, piemērotākais laiks ir pirmā paraugu ņemšanas reize. Turklāt jāizmanto arī tukšie mēģinājumi, izņemot gadījumus, kad ir iepriekš iegūti vēsturiski vai publicēti kontroldati, kas skaidri parāda, ka izvēlētajam šķīdinātājam/nesējam nav kaitīgas vai mutagēnas iedarbības. Izmantojot perifērās asinis, kā negatīvo kontroli var izmantot neapstrādātus dzīvniekus gadījumos, kad perifērās asinis izmēģinājumiem ņem neilgu laiku (piemēram, pēc 1–3 apstrādēm ar testa vielu), un iegūtie rezultāti ir tādās pašās robežās kā vēsturiskie dati.

1.5. PROCEDŪRA

1.5.

1.5.1. Dzīvnieku skaits un dzimums Katrā apstrādes un kontroles grupā jāiekļauj vismaz pieci dzīvnieki no katra dzimuma (11). Ja izmēģinājuma veikšanas laikā ir pieejami citos izmēģinājumos iegūti dati par tās pašas sugas dzīvniekiem, kam izmantots tas pats iedarbības veids, un šie dati liecina, ka toksiskā iedarbība uz abu dzimumu indivīdiem būtiski neatšķiras, izmēģinājumam var izmantot tikai viena dzimuma dzīvniekus. Gadījumos, kad ķīmisko vielu iedarbība uz cilvēka organismu katram dzimumam var būt atšķirīga, piemēram, dažiem farmaceitiskajiem preparātiem, izmēģinājumu veic ar attiecīgā dzimuma dzīvniekiem.

1.5.2. Apstrādes shēma Nav iespējams ieteikt kādu standarta apstrādes shēmu (piemēram, viena, divas vai vairākas devas ar 24 stundu intervālu). Var ņemt paraugus pēc paplašināta devu režīma, kamēr izmēģinājumā konstatē pozitīvu efektu, vai negatīvam izmēģinājumam – tikmēr, kamēr tiek konstatēts toksiskums vai tiek izmantota robeždeva, un dozēšanu turpina līdz paraugu ņemšanas laikam. Testa vielas devu var dot arī dalīti, t. i., divreiz vienā un tajā pašā dienā ik pēc dažām stundām, kas var būt vajadzīgs gadījumos, kad jādod liels vielas tilpums. Testu var veikt divējādi: Gadījumos, kad tas vajadzīgs, var noteikt papildu paraugu ņemšanas laikus.

1.5.2. a)

ar testa vielu dzīvniekus apstrādā vienreiz. Kaulu smadzeņu paraugus ņem vismaz divreiz; pirmo reizi ne agrāk kā 24 stundas un ne vēlāk kā 48 stundas pēc apstrādes ar piemērotiem starplaikiem starp paraugu ņemšanas reizēm. Paraugu ņemšana agrāk par 24 stundām pēc apstrādes ir jāpamato. Perifēro asiņu paraugus ņem vismaz divreiz; pirmo reizi ne agrāk kā 36 stundas un ne vēlāk kā 48 stundas pēc apstrādes ar piemērotiem starplaikiem starp paraugu ņemšanas reizēm, bet nepārsniedzot 72 stundu starplaiku. Ja pozitīva reakcija konstatēta vienā paraugu ņemšanas reizē, papildu paraugi nav jāņem;

gadījumos, kad veic divas vai vairākas apstrādes (piemēram, divas vai vairākas apstrādes ar 24 stundu starplaiku), paraugus ņem vienreiz 18 līdz 24 stundu laikā pēc pēdējās apstrādes gadījumos, kad ņem kaulu smadzeņu paraugus, un 36 līdz 48 stundu laikā pēc pēdējās apstrādes gadījumos, kad ņem perifēro asiņu paraugus (12).

1.5.3. Devu lielums Ja atbilstošu datu trūkuma dēļ vispirms veic orientējošu izmēģinājumu, tas jāizdara tajā pašā laboratorijā, kurā veiks galveno izmēģinājumu, izmantojot tās pašas sugas, līnijas un dzimuma dzīvniekus un ievērojot to pašu apstrādes režīmu (13). Ja viela ir toksiska, pirmajā paraugu ņemšanas reizē izmanto trīs devas. Šo devu intervālā ietver maksimāli toksiskās devas, kā arī vielas maztoksiskās vai netoksiskās devas. Vēlākajā paraugu ņemšanas laikā jāizmanto tikai lielākā deva. Kā lielāko nosaka devu, kurai ir tādas pašas toksiskās iedarbības pazīmes kā lielākajai devai, kam varētu būt letāla iedarbība pēc tāda paša devu režīma. Vielām ar specifisku bioloģisko aktivitāti maztoksiskās un netoksiskās devās (piemēram, hormoniem un mitogēniem) var būt citi devu noteikšanas kritēriji, ko katrā konkrētā gadījumā izvērtē atsevišķi. Kā lielāko var noteikt arī devu, kas liecina par toksisku iedarbību uz kaulu smadzenēm (piemēram, nenobriedušu eritrocītu skaita samazināšanās salīdzinājumā ar to kopējo skaitu kaulu smadzenēs vai perifērajās asinīs).

1.5.4. Iedarbības robežu tests Ja testā ar vienu vielas devu, kas ir vismaz 2000 mg/kg ķermeņa svara vienā paņēmienā vai divos paņēmienos vienā dienā, toksisku iedarbību nekonstatē un pēc datiem par struktūras ziņā līdzīgām vielām var pamatoti uzskatīt, ka tā nav genotoksiska, pilnīgus izmēģinājumus ar trim vielas devām var uzskatīt par nevajadzīgiem. Ilgstošākos izmēģinājumos – līdz 14 dienām – maksimālā dienas deva ir 2000 mg/kg ķermeņa svara un 1000 mg/kg ķermeņa svara apstrādei, kas pārsniedz 14 dienas. Paredzamā iedarbība uz cilvēku var norādīt uz to, ka devu iedarbības robežu pārbaudē jālieto lielāka deva.

1.5.5. Devu došana Testa vielu parasti dod, mākslīgi barojot pa kuņģa caurulīti, piemērotu inkubācijas kanulu vai intraperitonālas injekcijas veidā. Var izmantot arī citus iedarbības veidus, ja šādai rīcībai ir pietiekams pamatojums. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var dot, mākslīgi barojot vai injicējot, ir atkarīgs no izmēģinājumu dzīvnieka lieluma. Tilpums nedrīkst pārsniegt 2 ml uz 100 g ķermeņa masas. Lielāka tilpuma lietošana par norādīto ir jāpamato. Izņemot kairinošas un kodīgas vielas, kuru iedarbība lielākās koncentrācijās parasti ir izteiktāka, izmēģinājumiem lietotā tilpuma mainības ietekmi samazina, koriģējot tilpumu tā, lai pie visām devām tas būtu vienāds.

1.5.6. Kaulu smadzeņu un asiņu sagatavošana Kaulu smadzeņu šūnas parasti iegūst tūlīt pēc nogalināšanas no augšstilba kaula vai lielkaula. Visbiežāk no augšstilba kaula vai lielkaula iegūtās šūnas preparē un iekrāso ar tradicionālām metodēm. Perifērās asinis iegūst no astes vēnas vai cita piemērota asinsvada. Asins šūnas tūlīt supravitāli iekrāso (8) (9) (10) vai arī vispirms sagatavo uztriepes, ko iekrāso pēc tam. Lietojot DNS specifisku krāsvielu (piemēram, akridīnoranžo (14) vai Hoechst 33258 plus pironīnu-Y (15)), iespējams izvairīties no daļas artefaktu, kas saistīti ar DNS nespecifisku krāsvielu izmantošanu. Šīs priekšrocības neizslēdz parasto krāsvielu (piemēram, Giemsa) lietošanu. Var izmantot arī papildu sistēmas (piemēram, celulozes kolonnas to šūnu atdalīšanai, kurām ir kodoli (16)), ar nosacījumu, ka tās laboratorijā pareizi izmantojamas mikrokodolu preparātu sagatavošanai.

1.5.7. Analīze Nenobriedušo eritrocītu skaita attiecību pret eritrocītu kopējo skaitu (nenobriedušie + nobriedušie) nosaka, saskaitot vismaz 200 eritrocītus no kaulu smadzenēm un vismaz 1000 eritrocītus no perifērajām asinīm (17). Visus priekšmetstikliņus, arī pozitīvas un negatīvas kontroles priekšmetstikliņus, pirms mikroskopiskās analīzes kodē. Sastopot nenobriedušus eritrocītus ar mikrokodoliem, no katra dzīvnieka saskaita vismaz 2000 nenobriedušu eritrocītu. Var iegūt papildu informāciju, saskaitot nobriedušus eritrocītus ar mikrokodoliem. Analizējot priekšmetstikliņus, nenobriedušo eritrocītu attiecība pret eritrocītu kopējo skaitu nedrīkst būt mazāka par 20 % no kontroles lieluma. Apstrādājot dzīvniekus pastāvīgi četras nedēļas vai ilgāk, uz katru dzīvnieku mikrokodolu sastopamības noteikšanai saskaita vismaz 2000 nobriedušu eritrocītu. Ja automātiskās analīzes sistēmas (šūnu suspensiju attēlu analīze un plūsmas citometriskā analīze) ir pienācīgi kalibrētas un verificētas, tās ir pieņemama alternatīva manuālajām novērtēšanas metodēm.

2. DATI

2.

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE Datus par katru dzīvnieku apkopo tabulas veidā. Eksperimenta vienība ir viens dzīvnieks. Katram analizējamajam dzīvniekam atsevišķi uzskaita nenobriedušos eritrocītus, nenobriedušos eritrocītus ar mikrokodoliem un nenobriedušo eritrocītu kopskaitu no visiem eritrocītiem. Ja dzīvniekus pastāvīgi apstrādā četras nedēļas vai ilgāk, jānorāda arī dati par nobriedušajiem eritrocītiem, ja tie tiek iegūti. Par katru dzīvnieku norāda nenobriedušo eritrocītu skaita attiecību pret eritrocītu kopskaitu un, ja tiek uzskatīts par vajadzīgu, arī to eritrocītu daļu, kuriem ir mikrokodoli. Ja nekas neliecina par vielas iedarbības atšķirībām atkarībā no dzīvnieku dzimuma, statistiskās analīzes veikšanai var apvienot datus, kas iegūti par abu dzimumu dzīvniekiem.

2.2. REZULTĀTU NOVĒRTĒŠANA UN INTERPRETĀCIJA Pozitīvu rezultātu nosaka pēc vairākiem kritērijiem, piemēram, ar devu saistīta to šūnu skaita palielināšanās, kurām ir mikrokodoli, vai šādu šūnu skaita palielināšanās, pārbaudot vienu devu ar vienu paraugu ņemšanas laiku. Vispirms rezultātus izvērtē bioloģiski. Kā palīglīdzekli pārbaužu rezultātu izvērtēšanai var izmantot statistikas metodes (18) (19). Statistiskais nozīmīgums nedrīkst būt vienīgais faktors, pēc kura nosaka pozitīvu atbildes reakciju. Apšaubāmus rezultātus pārbauda, veicot testu atkārtoti, turklāt vēlams mainīt eksperimenta apstākļus. Uzskata, ka testa vielas mutagēnās īpašības nav konstatētas, ja tās testa rezultāti neatbilst iepriekšminētajiem kritērijiem. Lai gan lielākajā daļā eksperimentu iegūst nepārprotami pozitīvus vai negatīvus rezultātus, tomēr dažkārt pēc iegūtajiem datiem nevar noteikti spriest par testa vielas aktivitāti. Turklāt rezultāti var būt nedroši vai apšaubāmi arī neatkarīgi no eksperimenta atkārtojumu skaita. Pozitīvi mikrokodolu testa rezultāti liecina, ka testa vielas ietekmē hromosomu bojājumu vai mitotiskā aparāta bojājumu rezultātā izmēģinājumiem izmantotās sugas dzīvnieku eritroblastos veidojas mikrokodoli. Negatīvi rezultāti liecina, ka izmēģinājuma apstākļos testa viela izmēģinājumu dzīvnieku sugai nenobriedušos eritrocītos neizsauc mikrokodolu veidošanos. Jāizvērtē iespējamība, ka testa viela vai tās metabolīti sasniedz centrālās asinsrites sistēmu un jo īpaši mērķaudus (piemēram, sistēmiska toksicitāte).

3. ZIŅOJUMU SASTĀDĪŠANA

3. TESTA ZIŅOJUMS

Testa ziņojumā jābūt šādai informācijai.

Šķīdinātājs/nesējs:

nesēja izvēles pamatojums,

testa vielas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja tā ir zināma.

Testa dzīvnieki:

izmantotā suga/līnija,

dzīvnieku skaits, vecums un dzimums,

izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u. c.,

dzīvnieku masa izmēģinājuma sākumā, katrā grupā norādot robežas, vidējo lielumu un standartnovirzi.

Testa apstākļi:

pozitīvas un negatīvas (nesēja/šķīdinātāja) kontroles dati,

devu intervāla noteikšanas izmēģinājuma rezultāti gadījumos, kad tas veikts,

devu izvēles pamatojums,

informācija par testa vielas sagatavošanu,

informācija par testa vielas došanu,

iedarbības veida izvēles pamatojums,

metodes, ar kurām nosaka, ka testa viela nonākusi centrālajā asinsritē vai mērķaudos gadījumos, kad tas nepieciešams,

testa vielas koncentrācijas (ppm) barībā vai dzeramajā ūdenī pārrēķins faktiskajā dienas devā (mg/kg ķermeņa masas) gadījumos, kad tas nepieciešams,

sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti,

sīks apstrādes un paraugu ņemšanas shēmas apraksts,

priekšmetstikliņu sagatavošanas metodes,

toksicitātes novērtēšanas metodes,

kritēriji, pēc kuriem uzskaita nenobriedušus eritrocītus ar mikrokodoliem,

analizēto šūnu skaits no viena dzīvnieka,

kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai testa rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs.

Rezultāti:

toksicitātes pazīmes,

nenobriedušu eritrocītu skaits no eritrocītu kopējā skaita,

nenobriedušu eritrocītu skaits ar mikrokodoliem, norāda katram dzīvniekam atsevišķi,

nenobriedušu eritrocītu ar mikrokodoliem vidējais skaits ± standartnovirze katrā izmēģinājuma dzīvnieku grupā,

ja iespējams, reakcijas uz devu novērtējums,

statistiskās analīzes rezultāti, ja tā veikta,

līdztekus iegūtie un vēsturiskie negatīvie rezultāti,

līdztekus veiktās pozitīvās kontroles dati.

— Rezultātu izvērtējums.

— Secinājumi.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, p. 187–190. Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, p. 9–15. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res., 123, p. 61–118. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, p. 29–80. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: Developments in Science and Practice of Toxicology, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, p. 555–558. MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res., 189, p. 103–112. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E. (1990). The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol., 14, p. 513–522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, p. 245–249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, p. 83–98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 153–159. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, p. 293–304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalized sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 313–319. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313–319. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, p. 241–247. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, p. 269–275. Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989). The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, p. 91–104. Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, p. 97–99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184–232.

B.13./14. MUTAGENITĀTE – BAKTĒRIJU REVERSĀS MUTĀCIJAS

B.13./14.

1. METODE Šī metode ir ESAO TG 471 metodes Baktēriju reversās mutācijas tests (1997) kopija.

1.

1.1. IEVADS Baktēriju reversās mutācijas testā, lai noteiktu konkrētas mutācijas, pie kurām pieder vienas vai vairāku DNS bāzu pāru aizstāšana, pievienošana vai izslēgšana, izmanto Salmonella typhimurium un Escherichia coli celmus, kam vajadzīgas aminoskābes (1) (2) (3). Šā baktēriju reversās mutācijas testa princips ir tāds, ka ar to nosaka mutācijas, kas izlabo testam izmantojamo celmu mutācijas un atjauno baktēriju funkcionālās spējas sintezēt neaizstājamās aminoskābes. Reversās baktērijas nosaka pēc to augšanas spējas bez aminoskābēm, kas vajadzīgas mātes kontrolcelmam. Noteiktas mutācijas ir daudzu cilvēka ģenētisko slimību cēlonis, turklāt ir pierādīts, ka tās somatiskajās šūnās rada onkogēnu un tumorsupresoro gēnu izmaiņas, izraisot vēzi cilvēkiem un izmēģinājumu dzīvniekiem. Baktēriju reversās mutācijas tests ir ātrs, lēts un diezgan vienkāršs. Daudziem kontrolcelmiem ir vairākas īpatnības, kuru dēļ tie ir jutīgāki mutāciju noteikšanai, ieskaitot atbilstošus DNS posmus reversijas vietās, lielu molekulu caurlaidības palielināšanos šūnās un DNS reparācijas sistēmu izslēgšanu vai nejaušas DNS pasivitātes pastiprināšanās procesus. Kontrolcelmu specifiskās īpašības var sniegt noderīgu informāciju par mutāciju veidiem, ko izraisa genotoksiskas vielas. Ļoti plaša datubāze ir uzkrāta par baktēriju reversās mutācijas testu rezultātiem daudzām un dažādām struktūrām, un ir labi izstrādātas metodikas ķīmisko vielu pārbaudēm ar dažādām fizikāli ķīmiskajām īpašībām, ieskaitot viegli gaistošus savienojumus. Skatīt arī vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJAS Reversās mutācijas testā ar Salmonella typhimurium vai Escherichia coli nosaka tāda celma mutāciju, kam vajadzīga aminoskābe (attiecīgi – histidīns vai triptofāns), par celmu, kam nav vajadzīga aminoskābe no ārēja avota. Mutagēni, kas izraisa bāzu pāra aizvietošanu: vielas, kuras izraisa DNS bāzu izmaiņas. Reversijas testā šīs mutācijas var notikt sākotnējās mutācijas vietā vai bakteriālā genoma citā vietā. Mutagēni, kas izraisa olbaltuma sintēzes nolasīšanas fāzes nobīdi: vielas, kuras izraisa DNS viena vai vairāku bāzu pāru pievienošanu vai izslēgšanu, tādējādi izmainot RNS nolasīšanu.

1.3. SĀKOTNĒJI APSVĒRUMI Baktēriju reversās mutācijas testā izmanto prokariotu šūnas, kas atšķiras no zīdītāju šūnām pēc tādiem faktoriem kā izmantošana, metabolisms, hromosomu struktūra un DNS reparācijas procesi. Testiem, ko izdara in vitro, metaboliskai aktivācijai parasti jāizmanto eksogēns avots. Šāda metaboliskas aktivācijas sistēma nevar pilnībā imitēt apstākļus zīdītāju organismā in vivo. Tāpēc tests nedod tiešu informāciju par mutagēnu un kancerogēnu iedarbību uz zīdītājiem. Baktēriju reversās mutācijas testu parasti izmanto vielas sākotnējai genotoksiskas aktivitātes novērtēšanai, un jo īpaši noteiktu mutāciju izraisīšanas aktivitātes noteikšanai. Plaša datubāze liecina, ka daudzas šajā testā pozitīvas ķīmiskās vielas uzrāda mutagēnu aktivitāti arī citos testos. Tomēr ir gadījumi, kad šajā testā netiek konstatēts, ka vielai ir mutagēnas īpašības; šā trūkuma iemesli saistāmi ar nosakāmā parametra īpašo raksturu, kā arī metabolisma aktivācijas vai bioloģiskās pieejamības atšķirībām. Savukārt faktori, kas palielina baktēriju reversās mutācijas testa jutību, var veicināt vielu mutagēnās aktivitātes pārvērtēšanu. Baktēriju reversās mutācijas tests var nebūt piemērots noteiktām ķīmisko vielu grupām piederīgu savienojumu novērtēšanai, piemēram, tādu savienojumu mutagēnās aktivitātes novērtēšanai, kuriem ir izteikti baktericīdas īpašības (piemēram, dažas antibiotiskās vielas), kā arī savienojumiem, par kuriem ir pamats uzskatīt (vai ir noskaidrots), ka tie ietekmē tikai zīdītāju šūnu replikācijas sistēmu (piemēram, daži topoizomerāzes inhibitori un nukleozīdu analogi). Šādos gadījumos piemērotāki ir mutācijas testi, kuriem izmanto zīdītāju šūnas. Lai gan daudzi savienojumi, kam šis tests ir pozitīvs, ir zīdītājiem kancerogēni, tomēr šī korelācija nav absolūta. Tā atkarīga no ķīmisko vielu grupas, pie kuras pieder pārbaudāmais savienojums, un ir kancerogēni, ko šajā testā noteikt nevar, jo to iedarbībai ir cits mehānisms, kas nav saistīts ar genotoksicitāti un kura nav baktēriju šūnās.

1.4. TESTA METODES PRINCIPS Baktēriju šūnu suspensijas pakļauj testa vielas iedarbībai gan piemērotas metabolisma aktivācijas sistēmas klātbūtnē, gan bez tās. Ar ietveršanas metodi platē šīs suspensijas sajauc ar augšējā slāņa agaru, ar ko nekavējoties pārklāj nelielu barotnes daudzumu. Ar preinkubācijas metodi apstrādēs maisījumu inkubē un pēc tam sajauc ar augšējā slāņa agaru, ar ko pārklāj nelielu barotnes daudzumu. Pēc divas vai trīs dienas ilgas inkubācijas saskaņā ar abām metodēm revertantās kolonijas skaita un salīdzina ar to revertanto koloniju skaitu, kas spontāni izveidojušās uz šķīdinātāja kontrolplatēm. Aprakstītas vairākas baktēriju reversās mutācijas testa procedūras. Pie plašāk izmantotajām pieder ietveršanas metode platē (1) (2) (3) (4), preinkubācijas metode (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluktuācijas metode (9) (10) un suspensijas metode (11). Aprakstītas metodes modifikācijas gāzveida vai gaistošu vielu testēšanai (12). Metodē aprakstītās procedūras pirmām kārtām attiecas uz platē ietveršanas un preinkubācijas metodēm. Tās abas ir piemērotas izmēģinājumiem gan ar metabolisma aktivāciju, gan bez tās. Daļu vielu var labāk noteikt ar preinkubācijas metodi. Šie savienojumi pieder pie tādām ķīmisko vielu grupām kā alifātiskie nitrozoamīni ar īsu ķēdi, divvērtīgie metāli, aldehīdi, azokrāsvielas un diazosavienojumi, pirolizidīna alkaloīdi, alilsavienojumi un nitrosavienojumi (3). Atzīts arī, ka dažas mutagēnu klases ne vienmēr var atklāt, izmantojot standarta procedūras, piemēram, ietveršanas metodi platē vai preinkubācijas metodi. Tās būtu uzskatāmas par īpašiem gadījumiem, un to atklāšanai noteikti jāizmanto citas alternatīvas procedūras. Var izdalīt šādus īpašus gadījumus (kopā ar procedūrām, ko var izmantot to atklāšanai): azokrāsvielas un diazosavienojumi (3) (5) (6) (13), gāzveida un gaistošas vielas (12) (14) (15) (16) un glikozīdi (17) (18). Atkāpes no standarta procedūras zinātniski jāpamato.

1.5. TESTA METODES APRAKSTS

1.5.

1.5.1. Sagatavošana

1.5.1.

1.5.1.1. Baktērijas Svaigas baktēriju kultūras izaudzē līdz eksponenciālās fāzes beigām vai stacionārās fāzes sākumam (aptuveni 109 šūnas mililitrā). Neizmanto kultūras, kas ir stacionārās fāzes beigās. Būtiski, lai izmēģinājumiem izmantojamajām kultūrām būtu augsts dzīvotspējīgo baktēriju titrs. Titru var novērtēt pēc vēsturiskajiem kontroles datiem par augšanas līknēm vai katrā analīzē nosakot dzīvotspējīgo šūnu skaitu ar pārklāšanas eksperimentu. Ieteicamā inkubēšanas temperatūra ir 37 oC. Izmanto vismaz piecus baktērijas celmus. No tiem četriem jābūt S. typhimurium (TA 1535; TA 1537; TA97a vai TA97; TA98; un TA100), jo pierādīts, ka ar tiem iegūst drošus un dažādās laboratorijās atkārtojamus rezultātus. Šiem četriem S. typhimurium celmiem primārās reversijas vietā ir GC bāzu pāri, un noskaidrots, ka ar tiem nevar atklāt dažus oksidējošus mutagēnus, sašūtus aģentus un hidrazīnus. Šīs vielas var detektēt ar E. coli WP2 celmiem vai S. typhimurium TA 102 (19), kuriem primārās reversijas vietā ir AT bāzu pāris. Tāpēc ieteicamā izmantojamo celmu kombinācija ir: Oksidējošu mutagēnu atklāšanai var būt vēlams izmantot TA102 vai pievienot kādu DNS reparācijas E. coli celmu (piemēram, E. coli WP2 vai E. coli WP2 (pKM101)). Rezerves kultūru pagatavošanai, marķeru verificēšanai un glabāšanai izmanto labi izstrādātas procedūras. Aminoskābju nepieciešamība augšanai jāparāda katrai saldētajai rezerves kultūrai (triptofāna vajadzību S. typhimurium celmiem, bet E coli celmiem triptofāna vajadzību). Līdzīgi pārbauda arī citas fenotipa īpašības, proti, gadījumos, kad tas ir vajadzīgs, R-faktora plazmīdu klātbūtni vai trūkumu (t. i., rezistenci pret ampicilīnu TA98, TA100 un TA97a vai TA97, WP2 uvrA un WP2 uvrA (pKM101) celmiem, bet rezistenci pret ampicilīnu un tetraciklīnu TA102 celmam); raksturīgās mutācijas (t. i., rfa mutāciju S. typhimurium pēc jutības uz kristālvioleto un uvrA mutāciju E. coli vai uvrB mutāciju S. typhimurium pēc jutības uz ultravioleto gaismu) (2) (3). Celmiem jādod arī revertantās kolonijas ar parādīšanās biežumu, kas atbilst laboratorijas vēsturiskajiem kontroles datiem, un vēlams, lai tas būtu literatūrā minētajās robežās.

S. typhimurium TA1535 un

S. typhimurium TA1537 vai TA97, vai TA97a, un

S. typhimurium TA98, un

S. typhimurium TA100, un

E. coli WP2 uvrA vai E. coli WP2 uvrA (pKM101), vai S. typhimurium TA102.

1.5.1.2. Barotne Izmanto piemērotu minimālo agaru (kas satur, piemēram, Fogeļa–Bonera (Vogel-Bonner) minimālo barotni E un glikozi) un augšējā slāņa agaru, kas satur histidīnu un biotīnu vai triptofānu dažiem šūnu dalīšanās cikliem vajadzīgajā daudzumā (1) (2) (9).

1.5.1.3. Metabolisma aktivācija Baktērijas pakļauj testa vielas iedarbībai gan piemērotas metabolisma aktivācijas sistēmas klātbūtnē, gan bez tās. Plašāk izmantojamā aktivācijas sistēma ir ar kofaktoru papildināta pēcmitohondriskā frakcija (S9), ko pagatavo no grauzēju aknām, kas apstrādātas ar enzīmstimulējošām vielām, piemēram, Aroclor 1254 (1) (2), vai fenobarbitona un β-naftoflavona maisījumu (18) (20) (21). Pēcmitahondrālo frakciju parasti izmanto S9 maisījumā koncentrācijā no 5 līdz 30 tilp. %. Metabolisma aktivācijas sistēmas izvēle var būt atkarīga no ķimikāliju grupas, pie kuras pieder testa viela. Dažos gadījumos pēcmitohondriskā frakcija var būt jālieto vairākās koncentrācijās. Azokrāsvielu un diazosavienojumu pārbaudēm var būt piemērotāka metabolisma aktivācijas sistēma ar reducējošām īpašībām (6) (13).

1.5.1.4. Testa viela/preparāts Pirms baktēriju apstrādes ar cietām testa vielām, tās vispirms izšķīdina vai suspendē piemērotos šķīdinātājos vai nesējos un, ja vajadzīgs, atšķaida. Šķidras testa vielas var tieši pievienot testa sistēmā un/vai pirms šūnu apstrādes atšķaidīt. Ja dati par testa vielu preparātu stabilitāti liecina, ka tos uzglabāt nevar, izmanto svaigi pagatavotus preparātus. Šķīdinātājs vai nesējs nedrīkst būt reaģētspējīgs ar testa vielu, un tas nedrīkst nelabvēlīgi ietekmēt baktēriju dzīvotspēju un S9 aktivitāti (22). Izmantojot citus, mazāk izpētītus šķīdinātājus vai nesējus, jābūt datiem par to saderību. Vienmēr, kad tas iespējams, ieteicams vispirms izmantot ūdeni saturošus šķīdinātājus vai nesējus. Pārbaudot ūdens vidē nestabilas vielas, izmanto bezūdens organiskos šķīdinātājus.

1.5.2. Testa apstākļi

1.5.2.

1.5.2.1. Testam izmantojamie celmi (skatīt 1.5.1.1.)

1.5.2.2. Pārbaudāmās koncentrācijas Viens no kritērijiem, kas jāņem vērā, nosakot lielāko izmantojamās testa vielas daudzumu, ir tās citotoksicitāte un šķīdība galīgajā apstrādes maisījumā. Var būt lietderīgi iepriekšējā eksperimentā noteikt vielas toksicitāti un šķīdību. Citotoksicitāti var noteikt pēc revertanto koloniju skaita samazināšanās, fona pazušanas vai samazināšanās vai pēc apstrādāto kultūru izdzīvošanas pakāpes. Vielas citotoksicitāte var mainīties metabolisma aktivācijas sistēmu klātbūtnē. To, ka viela ir nešķīstoša, novērtē pēc tās izgulsnēšanās, kas redzama ar neapbruņotu aci, galīgajā maisījumā testa faktiskajos apstākļos. Ieteicamā maksimālā testa koncentrācija vielām, kas nav citotoksiskas, ir 5 mg uz plati vai 5 μl uz plati. Vielām, kas nav citotoksiskas un nav šķīstošas – 5 mg uz plati vai 5 μl uz plati, vienā vai vairākās pārbaudāmajās koncentrācijās jābūt nešķīstošām galīgajā apstrādes maisījumā. Testa vielas, kas ir citotoksiskas jau zem 5 mg uz plati vai 5 μl uz plati, pārbauda koncentrācijās, kas ir mazākas par citotoksisko koncentrāciju. Neizšķīdušas vielas klātbūtne nedrīkst traucēt skaitīšanu. Sākotnējā izmēģinājumā vielu pārbauda vismaz piecās analizējamās koncentrācijās ar apmēram puslogaritmiskiem (t. i., maksimāli √10 reizes) intervāliem starp testa punktiem. Var izmantot mazākus koncentrāciju intervālus gadījumos, kad pēta koncentrāciju ietekmi. Var veikt izmēģinājumus ar koncentrācijām, kas pārsniedz 5 mg vai 5 μl uz plati gadījumos, kad testa viela ievērojamā daudzumā satur potenciāli mutagēnus piemaisījumus.

1.5.2.3. Negatīvas un pozitīvas kontroles Katrā eksperimentā gan ar metabolisma aktivāciju, gan bez tās vienlaicīgi iekļauj celmam piemērotas pozitīvas un negatīvas (šķīdinātāja vai nesēja) kontroles. Pozitīvai kontrolei izvēlas koncentrācijas, kas ir efektīvas visos izmēģinājumos. Izmēģinājumos, kuros izmanto metabolisma aktivācijas sistēmas, standartvielu(-as) pozitīvai kontrolei jāizvēlas atbilstīgi lietoto baktēriju celma tipam. Izmēģinājumos ar metabolisma aktivāciju pozitīvai kontrolei ir piemērotas šādas vielas: CAS Nr. Einecs Nr. Viela 781-43-1 212-308-4 9,10-dimetilantracēns 57-97-6 200-359-5 7,12-dimetilbenzantracēns 50-32-8 200-028-5 benzopirēns 613-13-8 210-330-9 2-aminoantracēns 50-18-0 ciklofosfamīds 6055-19-2 200-015-4 ciklofosfamīda monohidrāts Izmēģinājumiem ar reducējošās metabolisma aktivācijas metodi pozitīvai kontrolei ir piemērota šāda viela: CAS Nr. Einecs Nr. Viela 573-58-0 209-358-4 Kongo sarkanais Kā vienīgo S9 maisījuma iedarbības indikatoru nevar izmantot 2-aminoantracēnu. Gadījumos, kad izmanto 2-aminoantracēnu, katrs S9 paraugs jāraksturo arī ar mutagēnu, kam vajadzīga metabolisma aktivācija ar mikrosomu fermentiem, piemēram, ar benzopirēnu vai dimetilbenzantracēnu. Izmēģinājumos bez eksogēnas metabolisma aktivācijas sistēmas celmam specifiskai pozitīvai kontrolei ir piemērotas šādas vielas: CAS Nr. Einecs Nr. Viela Celms 26628-22-8 247-852-1 nātrija azīds TA 1535 un TA 100 607-57-8 210-138-5 2- nitrofluorēns TA 98 90-45-9 201-995-6 9-aminoakridīns TA 1537, TA 97 un TA 97a 17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 un TA 97a 80-15-9 201-254-7 kumola hidroperoksīds TA 102 50-07-7 200-008-6 mitomicīns C WP2 uvrA un TA102 70-25-7 200-730-1 N-etil-N-nitro-N-nitrozoguanidīns WP2, WP2uvrA un WP2uvrA (pKM101) 56-57-5 200-281-1 4-nitrohinolīn-1-oksīds WP2, WP2uvrA un WP2uvrA (pKM101) 3688-53-7 furilfuramīds (AF2) Plazmīdus saturoši celmi Pozitīvai kontrolei var izmantot arī citas piemērotas standartvielas. Ja iespējams, kā pozitīvās kontroles vielas jāizmanto ķīmiskas vielas, kas pieder pie atbilstošām vielu grupām. Jāiekļauj negatīvas kontroles, kurās ietilpst tikai šķīdinātājs vai nesējs un kurās nav testa vielu; ar tām rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādes grupām. Turklāt jāizmanto arī tukšie mēģinājumi, izņemot gadījumus, kad ir iepriekš iegūti vēsturiski kontroldati, kas skaidri parāda, ka izvēlētajam šķīdinātājam nav kaitīgas mutagēnas iedarbības.

1.5.3. Procedūra Pēc iekļaušanas platē metodes (1) (2) (3) (4) bez metabolisma aktivācijas parasti ņem 0,05 ml vai 0,1 ml testa vielas šķīduma, 0,1 ml svaigas baktēriju kultūras (kurā ir apmēram 108 dzīvotspējīgas šūnas) un 0,5 ml sterila buferšķīduma, ko sajauc ar 2,0 ml augšējā slāņa agara. Izmēģinājumiem ar metabolisma aktivāciju parasti ņem 0,5 ml metabolisma aktivācijas maisījuma, kurā ir vajadzīgais daudzums pēcmitohondriskās frakcijas (metabolisma aktivācijas maisījumā koncentrācijā no 5 līdz 30 tilp. %), ko kopā ar baktērijām un testa vielu vai tās šķīdumu sajauc ar augšējā slāņa agaru (2,0 ml). Mēģeņu saturu sajauc un izlej mazās agara platēs. Pirms inkubācijas augšējā slāņa agaram ļauj sacietēt. Ar preinkubācijas metodes (2) (3) (5) (6) testa vielu vai tās šķīdumu parasti vispirms vismaz 20 minūtes inkubē 30–37 oC temperatūrā kopā ar testam izmantojamo celmu (kas satur apmēram 108 dzīvotspējīgas šūnas) un sterilu buferšķīdumu vai metabolisma aktivācijas sistēmu (0,5 ml), ko pēc tam sajauc ar augšējā slāņa agaru un izlej mazās agara platēs. Parasti 2,0 ml augšējā slāņa agara sajauc ar 0,05 vai 0,1ml testa vielas vai testa šķīduma, 0,1 ml baktēriju un 0,5 ml S9 maisījuma vai sterila buferšķīduma. Preinkubācijas laikā mēģenēm jāveic aerācija, lietojot kratītāju. Pareizai variāciju novērtēšanai visas devas pārbauda trijos atkārtojumos. Izmēģinājumu var veikt divos atkārtojumos gadījumos, kad tam ir zinātnisks pamatojums. Kādas plates zaudējuma dēļ izmēģinājums nav uzskatāms par nederīgu. Gāzveida un gaistošu vielu pārbaudēm izmanto atbilstošas metodes, piemēram, kultivēšanu hermētiski noslēgtos traukos (12) (14) (15) (16).

1.5.4. Inkubēšana Visas viena izmēģinājuma plates inkubē 48–72 stundas 37 oC temperatūrā. Pēc inkubēšanas nosaka revertanto koloniju skaitu uz katras plates.

2. DATI

2.

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE Rezultātus izsaka ar revertanto koloniju skaitu uz plati. Norāda arī revertanto koloniju skaitu gan uz negatīvās kontroles (uz šķīdinātāja kontroles un, ja izmantota, arī tukšā mēģinājuma), gan arī uz pozitīvās kontroles platēm. Testa vielai, pozitīvajai un negatīvajai (neapstrādātai un/vai šķīdinātāju) kontrolei norāda revertanto koloniju skaitu uz platēm, to vidējo skaitu un standartnovirzes. Nav noteiktu prasību attiecībā uz pozitīvas reakcijas verificēšanu. Apšaubāmus rezultātus pārbauda, veicot atkārtoti pārbaudi, turklāt vēlams mainīt eksperimenta apstākļus. Negatīvi rezultāti katrā konkrētā gadījumā ir jāapstiprina. Gadījumos, kad negatīvu rezultātu apstiprināšanu uzskata par nevajadzīgu, tas ir jāpamato. Izmaiņas eksperimenta apstākļu parametros novērtē un nosaka papildu eksperimentos. Eksperimenta parametri, kurus var mainīt, ir pārbaudāmo koncentrāciju atšķirības, apstrādes metode (ietveršana platē vai šķidruma preinkubācija) un metabolisma aktivācijas apstākļi.

2.2. REZULTĀTU NOVĒRTĒŠANA UN INTERPRETĀCIJA Pozitīvu rezultātu nosaka pēc vairākiem kritērijiem, piemēram, atkarībā no koncentrācijas – pēc revertanto koloniju skaita palielināšanās uz plati vai pēc vismaz viena celma revertanto koloniju skaita reproducējamas palielināšanās ar metabolisma aktivācijas sistēmu vai bez tās (23). Vispirms rezultātus izvērtē bioloģiski. Kā palīglīdzekli testu rezultātu izvērtēšanai var izmantot statistikas metodes (24). Tomēr statistiskais nozīmīgums nedrīkst būt vienīgais faktors, pēc kā nosaka pozitīvu atbildes reakciju. Uzskata, ka testa vielas mutagēnās īpašības nav konstatētas, ja tās testa rezultāti neatbilst iepriekšminētajiem kritērijiem. Lai gan lielākajā daļā eksperimentu iegūst nepārprotami pozitīvus vai negatīvus rezultātus, tomēr dažkārt pēc iegūtajiem datiem nevar noteikti spriest par testa vielas aktivitāti. Turklāt rezultāti var būt nedroši vai apšaubāmi arī neatkarīgi no eksperimenta atkārtojumu skaita. Pozitīvi baktēriju reversās mutācijas testa rezultāti liecina, ka testa viela izraisa Salmonella typhimurium un/vai Escherichia coli noteiktas mutācijas ar bāzu aizvietošanu vai olbaltuma sintēzes nolasīšanas fāzes nobīdi genomā. Negatīvi rezultāti liecina, ka testa apstākļos testa viela neizraisa mutācijas pārbaudītajām sugām.

3. ZIŅOJUMU SASTĀDĪŠANA

3. TESTA ZIŅOJUMS

Testa ziņojumā jābūt šādai informācijai.

Šķīdinātājs/nesējs:

šķīdinātāja/nesēja izvēles pamatojums,

testa vielas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja tā ir zināma.

Celmi:

izmantotie baktēriju celmi,

šūnu skaits kultūrā,

celmu raksturojums.

Testa apstākļi:

testa vielas daudzums uz vienu plati (mg/platē vai μl/platē), pamatojot izvēlēto devu un vienas koncentrācijas pārbaudei ņemto plašu skaitu,

izmantotā barotne,

metabolisma aktivācijas sistēmas veids un sastāvs, norādot pieņemamības kritērijus,

apstrādes procedūras.

Rezultāti:

toksicitātes pazīmes,

izgulsnēšanās pazīmes,

koloniju skaits uz katras plates,

vidējais revertanto koloniju skaits uz plati un standartnovirze,

ja iespējams, reakcijas uz devu novērtējums,

statistiskās analīzes rezultāti, ja tā veikta,

līdztekus iegūtie negatīvas (šķīdinātāja/nesēja) un pozitīvas kontroles rezultāti, norādot robežas, vidējos lielumus un standartnovirzes,

līdzšinējie vēsturiskie negatīvas (šķīdinātāja/nesēja) un pozitīvas kontroles rezultāti, norādot robežas, vidējos lielumus un standartnovirzes.

Rezultātu izvērtējums.

Secinājumi.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347–364. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173–215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, p. 217–233. Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V. (1986). The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, p. 69–240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975). Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, p. 91–96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980). Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, p. 273–285. Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R. (1980). Bacterial Mutation Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press, p. 13–61. Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987). Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, p. 167–177. Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976). Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res., 38, p. 33–42. Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984). The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141–161. Thompson, E.D. and Melampy, P.J. (1981). An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, p. 453–465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994). Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, p. 335–344. Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughn, V.L. (1984). Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, p. 33–47. Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992). Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, p. 2–141. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G. (1977). Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, p. 249–258. Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D. (1987). Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, p. 421–441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979). Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium. Cancer Res., 39, p. 3780–3782. Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N. (1980). Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p. 4961–4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G. (1990). Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, p. 285–291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: In Vitro metabolic Activation in Mutagenesis Testing Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, p. 85–88. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175–177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N. (1981). Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., 88, p. 343–350. Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987). Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity. Mutation Res., 189, p. 83–91. Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J. (1989). Analysis of Data from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cambridge University Press, p. 28–65.

B.15. MUTAGENITĀTES NOTEIKŠANA KOPĀ AR KANCEROGENITĀTES PRIEKŠNOVĒRTĒJUMU GĒNU MUTĀCIJAS SACCHAROMYCES CEREVISIAE ŠŪNĀS

B.15.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.3. STANDARTVIELAS Nav.

1.4. METODES BŪTĪBA Gēnu mutāciju noteikšanai, ko inducē ķīmiski aģenti pēc metaboliskās aktivācijas vai bez tās, var izmantot dažādus haploīdus un diploīdus rauga (Saccharomyces cerevisiae) celmus. Šim nolūkam izmanto tādas haploīdu celmu mutāciju noteikšanas sistēmas, kas ļauj kvantitatīvi noteikt turpvērsto mutāciju no sarkaniem adenīnatkarīgiem mutantiem (ade-1, ade-2) uz divkārši adenīnatkarīgiem baltiem mutantiem, kā arī selektīvas sistēmas, piemēram, rezistences inducēšanu pret kanavanīnu un cikloheksimīdu. Visplašāk pārbaudītā atpakaļvērsto mutāciju sistēma ir haploīdais celms XV 185-14C, kas satur ochre nonsensmutācijas ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 un trp 5-48, kuru reversiju var panākt ar bāzu nomaiņas mutagēniem, kas inducē sait-specifiskas mutācijas vai mutācijas ochre supresorgēnā. XV 185-14C satur arī ģenētisko marķieri his 1-7, kas ir misensmutācija, kuras reversiju var galvenokārt panākt ar mutāciju citā saitā, un iezīmētājgēnu hom 3-10, kas revertējams ar fāzes nobīdes mutagēniem. No diploīdiem S. cerevisiae celmiem plaši izmanto tikai celmu D7, kas ir homozigots pēc ilv 1-92.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6. Sagatavošanas darbi

Pārbaudāmo vielu un kontrolvielu šķīdumus attiecīgajā šķīdinātājā gatavo īsi pirms izmēģinājuma. Ja izmanto organiskos savienojumus, kas nešķīst ūdenī, tos izšķīdina tādā organiskā šķīdinātājā kā etanols, acetons vai dimetilsulfoksīds (DMSO), kuru koncentrācija nedrīkst pārsniegt 2 tilp. %. Šķīdinātājs galīgajā koncentrācijā nedrīkst ievērojami ietekmēt šūnu dzīvotspēju un vairošanos.

Metaboliskā aktivācija

Šūnas pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai, pievienojot tām piemērotu eksogēnu metaboliskās aktivācijas sistēmu, vai bez tās. Visplašāk izmanto no grauzēju aknām iegūtu postmitohondriālo frakciju kopā ar kofaktoru, kas iepriekš apstrādāta ar fermentus inducējošiem aģentiem. Metabolisko aktivāciju var panākt, izmantojot arī citas sugas, audus, postmitohondriālās frakcijas vai metodes.

Testa apstākļi

Izmantotie rauga celmi

Gēnu mutāciju pētījumos visbiežāk izmanto haploīdo celmu XV 185-14C un diploīdo celmu D7. Šim nolūkam der arī citi rauga celmi.

Barotnes

Izdzīvojušo un mutanto šūnu skaita noteikšanai izmanto piemērotas barotnes.

Negatīvā un pozitīvā kontrole

Vienlaikus jāizmanto pozitīvā kontrole, kontrole bez apstrādes un kontrole ar šķīdinātāju. Katras konkrētas mutācijas noteikšanai izmanto pozitīvo kontroli ar piemērotām vielām.

Koncentrācija ekspozīcijas laikā

Pārbaudāmās vielas diapazons aptver vismaz piecas atšķirīgas koncentrācijas. Toksiskām vielām izvēlas tādu lielāko koncentrāciju, lai izdzīvotu vismaz 5–10 % šūnu. Vielas, kas samērā slikti šķīst ūdenī, pārbauda koncentrācijā, kas ir tuvu to šķīdības robežai, izmantojot piemērotu metodi. Netoksiskām vielām, kas pilnībā šķīst ūdenī, lielāko koncentrāciju nosaka katrā atsevišķā gadījumā.

Inkubācijas apstākļi

Mikrobioloģiskās plates inkubē 4–7 dienas tumsā 28–30 oC temperatūrā.

Spontāno mutāciju biežums

Jāizmanto subkultūras, kam spontāno mutāciju biežums nepārsniedz pieņemto normu.

Replikātu skaits

Reģistrējot prototrofus, kas radušies gēnu mutāciju rezultātā, katras koncentrācijas pārbaudei un šūnu dzīvotspējas noteikšanai izmanto vismaz trīs replikātus. Ja izmēģinājumā izmanto tādu ģenētisko marķieri kā hom 3–10, kam ir pazemināts mutāciju biežums, plašu skaits ir jāpalielina, lai iegūtu statistiski nozīmīgus datus.

Testa norise

S. cerevisiae celmu apstrādi parasti veic šķidrā barotnē, kad šūnas atrodas stacionārajā fāzē vai vairošanās fāzē. Sākotnēji izmēģinājumus veic ar šūnām vairošanās fāzē (1–5 × 107 šūnu/ml): uz ne vairāk kā 18 stundām tās pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai 28–37 oC temperatūrā, pastāvīgi kratot; šajā laikā atkarībā no apstākļiem tām var vajadzīgā daudzumā pievienot metaboliskās aktivācijas sistēmu. Pēc apstrādes šūnas centrifugē, skalo un iesēj piemērotā barotnē. Pēc inkubācijas pārbauda izdzīvojušo šūnu skaitu un inducēto gēnu mutāciju biežumu. Ja pirmajā izmēģinājumā iegūst negatīvus rezultātus, tad izmēģinājums jāatkārto ar šūnām stacionārajā fāzē. Ja pirmajā izmēģinājumā iegūst pozitīvus rezultātus, tie jāapstiprina vēl vienā neatkarīgā izmēģinājumā.

2. DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot reģistrēto koloniju skaitu, mutantu skaitu, šūnu dzīvotspēju un mutācijas biežumu. Visi šie rezultāti jāapstiprina neatkarīgā izmēģinājumā. Iegūtie dati jāizvērtē, izmantojot piemērotas statistikas metodes.

3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. TESTA ZIŅOJUMS Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šādas ziņas:

izmantotais mikroorganismu celms,

testa apstākļi (šūnas stacionārajā fāzē vai vairošanās fāzē, barotņu sastāvs, inkubācijas temperatūra un ilgums, metaboliskās aktivācijas sistēma),

aplikācijas shēma (izmantotās koncentrācijas, norise un ilgums, temperatūra, pozitīvā un negatīvā kontrole),

reģistrēto koloniju skaits, mutantu skaits, šūnu dzīvotspēja un mutāciju biežums, vajadzības gadījumā devas/iedarbības attiecība, datu statistiskais novērtējums,

rezultātu iztirzājums,

rezultātu interpretācija.

3.2. IZVĒRTĒJUMS UN INTERPRETĀCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

B.16. MITOTISKĀ REKOMBINĀCIJA – SACCHAROMYCES CEREVISIAE ŠŪNĀS

B.16.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.3. STANDARTVIELAS Nav.

1.4. METODES BŪTĪBA Mitotisko rekombināciju Saccharomyces cerevisiae šūnās var novērot gan starp gēniem (vai visbiežāk starp gēnu un centromēru), gan viena gēna ietvaros. Pirmajā gadījumā to dēvē par mitotisko krustmiju un tās rezultātā rodas reciprokie produkti, bet otrajā gadījumā šis process nav reciprokāls un to dēvē par gēnu konversiju. Par krustmiju parasti liecina tas, ka heterozigotiem celmiem rodas recesīvas homozigotas kolonijas vai sektori, savukārt uz gēnu konversiju norāda prototrofu revertantu parādīšanās auksotrofos heteroalēlos celmos, kas vienā gēnā satur divas dažādas bojātas alēles. Mitotiskās gēnu konversijas noteikšanai visplašāk izmanto tādus rauga celmus kā D4 (kas ir heteroalēls pēc ade 2 un trp 5), D7 (heteroalēls pēc trp 5), BZ34 (heteroalēls pēc arg 4) un JD1 (heteroalēls pēc his 4 un trp 5). Mitotisko krustmiju, kuras rezultātā rodas sarkani vai rozā sektori, var noteikt rauga celmam D5 vai D7 (tos izmanto arī mitotiskās gēnu konversijas un atgriezenisko mutāciju noteikšanai ilv 1-92 gēnā); abi šie celmi ir heteroalēli pēc komplementējošajām ade 2 alēlēm.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6. Sagatavošanas darbi

Pārbaudāmo vielu un kontrolvielu vai standartvielu šķīdumus piemērotā šķīdinātājā gatavo īsi pirms izmēģinājuma. Ja izmanto organiskos savienojumus, kas nešķīst ūdenī, tos izšķīdina tādā organiskā šķīdinātājā kā etanols, acetons vai dimetilsulfoksīds (DMSO), kuru koncentrācija nedrīkst pārsniegt 2 tilp. %. Šķīdinātājs galīgajā koncentrācijā nedrīkst ievērojami ietekmēt šūnu dzīvotspēju un vairošanos.

Metaboliskā aktivācija

Šūnas pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai, gan pievienojot tām piemērotu eksogēnu metaboliskās aktivācijas sistēmu, gan bez tās. Visplašāk izmanto no grauzēju aknām iegūtu postmitohondriālo frakciju kopā ar kofaktoru, kas iepriekš apstrādāta ar fermentus inducējošiem aģentiem. Metabolisko aktivāciju var panākt, izmantojot arī citas sugas, audus, pēcmitohondriālās frakcijas vai metodes.

Testa apstākļi

Izmantotie rauga celmi

Visplašāk izmanto diploīdos celmus D4, D5, D7 un JD1. Šim nolūkam var izmantot arī citus rauga celmus.

Barotnes

Izdzīvojušo šūnu skaita un mitotiskās rekombinācijas biežuma noteikšanai izmanto piemērotas barotnes.

Negatīvā un pozitīvā kontrole

Vienlaikus jāizmanto pozitīvā kontrole, kontrole bez apstrādes un kontrole ar šķīdinātāju. Katras konkrētas rekombinācijas noteikšanai izmanto pozitīvo kontroli ar piemērotām vielām.

Koncentrācija ekspozīcijas laikā

Pārbaudāmās vielas diapazons aptver vismaz piecas atšķirīgas koncentrācijas. Cita starpā jāņem vērā tādi faktori kā citotoksicitāte un šķīdība. Viela vismazākajā koncentrācijā nedrīkst nomākt šūnu dzīvotspēju. Toksiskām vielām izvēlas tādu lielāko koncentrāciju, lai izdzīvotu vismaz 5–10 % šūnu. Vielas, kas samērā slikti šķīst ūdenī, pārbauda koncentrācijā, kas ir tuvu to šķīdības robežai, izmantojot piemērotu metodi. Netoksiskām vielām, kas pilnībā šķīst ūdenī, lielāko koncentrāciju nosaka katrā atsevišķā gadījumā. Pārbaudāmās vielas iedarbībai, kas ilgst līdz 18 stundām, var pakļaut šūnas stacionārajā fāzē vai vairošanās fāzē. Bet, ja izmanto garāku ekspozīcijas laiku, mikroskopiski jāpārbauda, vai rauga kultūrās neveidojas sporas, jo tad izmēģinājuma rezultāti būs nederīgi.

Inkubācijas apstākļi

Mikrobioloģiskās plates inkubē 4–7 dienas tumsā 28–30 oC temperatūrā. Plates, ko izmanto sarkano un rozā homozigoto sektoru noteikšanai, kuri veidojas krustmijas rezultātā, pirms to skaitīšanas vēl vienu vai divas dienas glabā ledusskapī (ap 4 oC), ļaujot attīstīties attiecīgās krāsas kolonijām.

Spontānās mitotiskās rekombinācijas biežums

Jāizmanto subkultūras, kurām spontānās mitotiskās rekombinācijas biežums nepārsniedz pieņemto normu.

Replikātu skaits

Reģistrējot prototrofus, kas radušies mitotiskās gēnu konversijas rezultātā, katras koncentrācijas pārbaudei un šūnu dzīvotspējas noteikšanai izmanto vismaz trīs replikātus. Reģistrējot recesīvo homozigotismu pēc mitotiskās krustmijas, izmantoto plašu skaits ir jāpalielina, lai sasniegtu vajadzīgo koloniju daudzumu.

Testa norise

S. cerevisiae celmu apstrādi parasti veic šķidrā barotnē, kad šūnas atrodas stacionārajā fāzē vai vairošanās fāzē. Pirmos izmēģinājumus veic ar šūnām vairošanās fāzē. 1–5 × 107 šūnu/ml uz ne ilgāk kā 18 stundām pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai 28–37 oC temperatūrā, pastāvīgi kratot; šajā laikā, atkarībā no apstākļiem, tām var vajadzīgā daudzumā pievienot metaboliskās aktivācijas sistēmu. Pēc apstrādes šūnas centrifugē, skalo un iesēj piemērotā barotnē. Pēc inkubācijas pārbauda izdzīvojušo šūnu skaitu un inducētās mitotiskās rekombinācijas biežumu. Ja pirmajā izmēģinājumā iegūst negatīvus rezultātus, tad izmēģinājums jāatkārto ar šūnām stacionārajā fāzē. Ja pirmajā izmēģinājumā iegūst pozitīvus rezultātus, tie jāapstiprina neatkarīgā izmēģinājumā.

2. DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot reģistrēto koloniju skaitu, rekombinantu skaitu, izdzīvojušo šūnu skaitu un rekombinācijas biežumu. Šie rezultāti jāapstiprina neatkarīgā izmēģinājumā. Iegūtie dati jāizvērtē ar piemērotu statistikas metodi.

3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. TESTA ZIŅOJUMS Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šādas ziņas:

izmantotais mikroorganismu celms,

testa apstākļi (šūnas stacionārajā fāzē vai vairošanās fāzē, barotņu sastāvs, inkubācijas temperatūra un ilgums, metaboliskās aktivācijas sistēma),

aplikācijas shēma (izmantotās koncentrācijas, norise un ilgums, temperatūra, pozitīvā un negatīvā kontrole),

reģistrēto koloniju skaits, rekombinantu skaits, izdzīvojušo šūnu skaits un rekombinācijas biežums, vajadzības gadījumā devas/iedarbības attiecība, datu statistiskais novērtējums,

rezultātu iztirzājums,

rezultātu interpretācija.

3.2. IZVĒRTĒJUMS UN INTERPRETĀCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

B.17. MUTAGENITĀTE – ZĪDĪTĀJU ŠŪNU GĒNU MUTĀCIJU TESTS IN VITRO

B.17.

1. METODE Šī metode ir ESAO TG 476 metodes Zīdītāju šūnu gēnu mutāciju tests in vitro (1997) kopija.

1.

1.1. IEVADS Zīdītāju šūnu gēnu mutāciju testu in vitro var izmantot ķīmisko vielu izraisīto gēnu mutāciju noteikšanai. Pie šim nolūkam piemērotām šūnu līnijām pieder L5178Y peļu limfomas šūnas, CHO, CHO-AS52 un V79 līniju Ķīnas kāmju šūnas, un TK6 cilvēku limfoblastoīdās šūnas (1). Šīm šūnu līnijām parasti nosaka tādus ģenētiskos raksturlielumus kā mutācija pie timidīnkināzes (TK) un hipoksantīna-guanīna fosforiboziltransferāzes (HPRT), kā arī ksantīna-guanīna fosforiboziltransferāzes (XPRT) transgēna. TK, HPRT un XPRT mutāciju testos nosaka dažādas ģenētiskās norises. Pēc TK un XPRT autosomu atrašanās vietas var noteikt tādas ģenētiskās pārmaiņas (piemēram, lielus izlaidumus), ko nevar noteikt HPRT gēna atrašanās vietā X hromosomās (2) (3) (4) (5) (6). Zīdītāju šūnu gēnu mutāciju testam in vitro var izmantot izveidotas šūnu līnijas vai šūnu celmus. Testam izmatojamās šūnas izvēlas pēc to augšanas spējas kultūrā un spontāno mutāciju biežuma stabilitātes. Testiem, ko izdara in vitro, metaboliskai aktivācijai parasti jāizmanto eksogēns avots. Šāda metaboliskas aktivācijas sistēma nevar pilnībā imitēt apstākļus zīdītāju organismā in vivo. Jāraugās, lai novērstu apstākļus, kuros iegūst rezultātus, kas neraksturo mutagenitāti. Pozitīvus rezultātus, kas neraksturo mutagenitāti, var iegūt no pH izmaiņām, osmozes vai vielu augstas citotoksicitātes dēļ (7). Šo testu izmanto zīdītājiem potenciāli mutagēnu un kancerogēnu vielu skrīningam. Daudzi savienojumi, kam šis tests ir pozitīvs, ir zīdītājiem kancerogēni; tomēr pilnīga korelācija starp šo testu un kancerogenitāti nepastāv. Korelācija ir atkarīga no ķīmisko vielu grupas, pie kuras pieder pārbaudāmais savienojums, un ir arvien vairāk pierādījumu, ka ir kancerogēni, ko ar šo testu noteikt nevar, jo to iedarbībai ir cits mehānisms, kas ar genotoksiskumu nesaistīts vai kura nav baktēriju šūnās (6). Skatīt arī vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJAS Tieša mutācija: gēna mutācija no vecāku tipa mutanta formas, ko rada iekodētā proteīna enzīma funkcijas aktivācijas izmaņas vai zudums. Bāzu pāra aizstājēji mutagēni: vielas, kas izraisa viena vai vairāku DNS bāzu pāru aizstāšanu. Mutagēni, kas izraisa olbaltuma sintēzes nolasīšanas fāzes nobīdi: vielas, kas DNS molekulā izraisa viena vai vairāku bāzu pāru pievienošanu vai izdzēšanu. Fenotipa izpausmes laiks: periods, kura laikā neizmainīti gēnu produkti tiek izspiesti no šūnām, kurās notikušas mutācijas. Mutāciju biežums: mutanto šūnu skaits, ko novēro attiecībā pret dzīvotspējīgo šūnu skaitu. Relatīvais kopējais pieaugums: šūnu skaita palielināšanās laikā salīdzinājumā ar šūnu kontroles populāciju, ko aprēķina, reizinot suspensijas pieauguma attiecību pret negatīvo kontroli ar klonēšanas efektivitātes attiecību pret negatīvo kontroli. Relatīvais suspensijas pieaugums: šūnu skaita palielināšanās izpausmes perioda laikā attiecībā pret negatīvo kontroli. Dzīvotspēja: apstrādāto šūnu klonēšanas efektivitāte laikā, kad pēc izpausmes laika perioda beigām tās novieto uz plates selektīvos apstākļos. Izdzīvošana: pēc apstrādes perioda beigām uz plates novietotu apstrādātu šūnu klonēšanas efektivitāte; izdzīvošanu parasti izsaka attiecībā pret kontrolšūnu populācijas izdzīvošanu.

1.3. TESTA METODES PRINCIPS Šūnas ar timidīnkināzes (TK) deficītu mutācijas TK+/- → TK-/- dēļ ir rezistentas pret pirimidīna analoga trifluortimidīna (TFT) citotoksisko iedarbību. Timidīnkināzes kompetentās šūnas ir jutīgas pret TFT, kas izraisa šūnu metabolisma inhibēšanu un aptur šūnu turpmāko dalīšanos. Tādējādi mutantās šūnas var vairoties TFT klātbūtnē, bet normālām šūnām, kas satur timidīnkināzi, tas nav iespējams. Līdzīgi šūnas, kurās trūkst HPRT vai XPRT, izvēlas pēc rezistences pret 6-tioguanīnu (TG) vai 8-azaguanīnu (AG). Gadījumos, kad bāzes analogu vai savienojumu, kas saistīts ar selektīvo vielu, pēta kādā no zīdītāju šūnu gēnu mutācijas testiem, rūpīgi jāizvērtē testa vielas īpašības. Piemēram, jāizpēta testa vielas iespējamais selektīvais toksiskums gan mutantajām, gan nemutantajām šūnām. Tā jāapstiprina selekcijas sistēmas/vielas īpašības gadījumos, kad pārbauda ķīmiskās vielas, kuru struktūra ir līdzīga selektīvās vielas struktūrai (8). Šūnas suspensijā vai vienslāņa kultūrā noteiktu laiku pakļauj testa vielas iedarbībai gan metabolisma aktivācijas sistēmas klātbūtnē, gan bez tās un pēc tam subkultivē, lai pirms mutanta selekcijas noteiktu citotoksicitāti un izpaustos fenotipiskās īpašības (9) (10) (11) (12) (13). Citotoksicitāti parasti nosaka, novērtējot kultūru relatīvo klonēšanas efektivitāti (izdzīvošanu) vai relatīvo kopējo pieaugumu pēc apstrādes perioda. Apstrādātās kultūras uztur augšanas vidē pietiekami ilgu laiku, kas ir raksturīgs katrai izvēlētajai gēna atrašanās vietai hromosomā un šūnas tipam, un gandrīz optimāli ļauj izpausties izraisīto mutāciju fenotipiskajām īpašībām. Mutāciju biežumu nosaka, izsējot noteiktu skaitu šūnu barotnē, kas satur selektīvo vielu mutanto šūnu noteikšanai, un barotnē bez selektīvās vielas, kurā nosaka klonēšanas efektivitāti (dzīvotspēju). Pēc atbilstoša inkubēšanas perioda saskaita kolonijas. Mutāciju biežumu aprēķina pēc mutanto koloniju skaita selektīvajā vidē un koloniju skaita neselektīvajā vidē.

1.4. TESTA METODES APRAKSTS

1.4.

1.4.1. Sagatavošana

1.4.1.

1.4.1.1. Šūnas Šim testam var izmantot dažādu tipu šūnas, ieskaitot L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 vai TK6 šūnu subklonus. Šūnu tipiem, ko izmanto šim testam, jābūt jutīgiem pret ķīmiskajiem mutagēniem, ar augstu klonēšanas efektivitāti un stabilu spontāno mutāciju biežumu. Šūnām jābūt ar pārbaudītu mikoplazmas piesārņojumu, un piesārņotas šūnas testam nav izmantojamas. Testam jābūt iepriekš noteiktai jutībai un pakāpei. Izmanto šūnu skaitu, kultūras un testa vielas koncentrācijas, kas atbilst šiem noteiktajiem parametriem (14). Minimālo dzīvotspējīgo šūnu skaitu, kas izdzīvo pēc apstrādes un ko izmanto katrā testa posmā, nosaka pēc spontāno mutāciju biežuma. Vispārīgs norādījums ir izmantot šūnu skaitu, kas ir vismaz 10 reizes lielāks par spontāno mutāciju biežumam apgriezto skaitli. Tomēr ieteicams izmantot vismaz 106 šūnas. Lai testam noteiktu konsekventus veiktspējas rādītājus, vajadzīgi pietiekami vēsturiskie dati par šūnu sistēmu.

1.4.1.2. Barotnes un kultivēšanas apstākļi Izmanto piemērotu kultivēšanas barotni, ievērojot attiecīgus inkubēšanas apstākļus (kultivēšanas trauki, temperatūra, CO2 koncentrācija un mitrums). Barotni izvēlas atbilstoši testā izmantojamajām selektīvajām sistēmām un šūnu tipam. Īpaši svarīgi ir izvēlēties tādus kultivēšanas apstākļus, kuros tiek nodrošināta optimāla augšana izpausmes perioda laikā, un koloniju veidošanas spēja gan mutantajām, gan nemutantajām šūnām.

1.4.1.3. Kultūru sagatavošana Šūnas pavairo no rezerves kultūrām, tās izsējot kultivēšanas barotnē un inkubējot 37 oC temperatūrā. Pirms izmantošanas testam, kultūras var būt jāattīra no tajās esošajām mutantajām šūnām.

1.4.1.4. Metabolisma aktivācija Šūnas pakļauj testa vielas iedarbībai gan piemērotas metabolisma aktivācijas sistēmas klātbūtnē, gan bez tās. Plašāk izmantojamā aktivācijas sistēma ir ar kofaktoru papildināta pēcmitohondriskā frakcija (S9), ko pagatavo no grauzēju aknām, kas apstrādātas ar enzīmstimulējošām vielām, piemēram, Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) vai fenobarbitona un β-naftoflavona maisījumu (19) (20). Pēcmitohondrisko frakciju parasti izmanto galīgā testa barotnē koncentrācijā no 1 līdz 10 tilp. %. Metabolisma aktivācijas sistēmas izvēle var būt atkarīga no savienojumu grupas, pie kuras pieder testa viela. Dažos gadījumos pēcmitohondriskā frakcija var būt jālieto vairākās koncentrācijās. Endogēnai aktivācijai var izmantot dažādus paņēmienus, arī ar gēnu inženierijas metodēm iegūtas šūnu līnijas, kas izdala specifiskus aktivācijas enzīmus. Izmantojamo šūnu līniju izvēlei jābūt zinātniski pamatotai (piemēram, ar citohroma P450 izoenzīma nepieciešamību testa vielas metabolismam).

1.4.1.5. Testa vielas sagatavošana Pirms šūnu apstrādes ar cietām testa vielām tās vispirms izšķīdina vai suspendē piemērotos šķīdinātājos vai nesējos un, ja vajadzīgs, atšķaida. Šķidras testa vielas var tieši pievienot testa sistēmā un/vai pirms šūnu apstrādes atšķaidīt. Ja dati par testa vielu preparātu stabilitāti liecina, ka tos uzglabāt nevar, izmanto svaigi pagatavotus preparātus.

1.4.2. Testa apstākļi

1.4.2.

1.4.2.1. Šķīdinātājs/nesējs Šķīdinātājs vai nesējs nedrīkst būt reaģētspējīgs ar testa vielu, un tas nedrīkst nelabvēlīgi ietekmēt šūnu dzīvotspēju un S9 aktivitāti. Izmantojot citus, mazāk izpētītus šķīdinātājus vai nesējus, jābūt datiem par to saderību. Vienmēr, kad tas iespējams, ieteicams vispirms izmantot ūdeni saturošus šķīdinātājus vai nesējus. Pārbaudot ūdens vidē nestabilas vielas, izmanto bezūdens organiskos šķīdinātājus. Ūdeni var atdalīt, pievienojot molekulāros sietus.

1.4.2.2. Pārbaudāmās koncentrācijas Starp kritērijiem, kas jāņem vērā, nosakot testa vielas lielāko koncentrāciju, ir tās citotoksikums, šķīdība testa sistēmā, kā arī ietekme uz pH izmaiņām vai osmoze. Citotoksicitāte jānosaka galvenajā eksperimentā ar metabolisma aktivāciju un bez tās, izmantojot piemērotus šūnu integritātes un augšanas rādītājus, piemēram, klonēšanas relatīvo efektivitāti (izdzīvošanu) vai relatīvo kopējo pieaugumu. Var būt lietderīgi iepriekš orientējošā eksperimentā noteikt vielas citotoksicitāti un šķīdību. Būtu jāizmanto vismaz trīs analizējamas koncentrācijas. Ja viela ir citotoksiska, koncentrāciju intervālā jāietver maksimāli toksiskās koncentrācijas, kā arī vielas maztoksiskās vai netoksiskās koncentrācijas. Parasti tas nozīmē, ka koncentrācijas nedrīkst atšķirties vairāk kā 2 līdz 10 reizes. Ja maksimālo koncentrāciju nosaka pēc citotoksicitātes, tad tai jābūt aptuveni 10–20 % (bet ne mazāk par 10 %) no relatīvās izdzīvošanas (relatīvās klonēšanas efektivitātes) vai relatīvā kopējā pieauguma. Vielām ar relatīvi nelielu citotoksicitāti maksimālajai testa koncentrācijai vajadzētu būt 5 mg/ml, 5 μl/ml vai 1,01 M, no kurām izvēlas mazāko. Relatīvi nešķīstošas vielas pārbauda zem vai virs tās šķīdības robežas kultūras apstākļos. Nešķīdību nosaka galīgajā apstrādes barotnē, kurā šūnas pakļauj testa vielas iedarbībai. Var būt lietderīgi novērtēt vielas šķīdību apstrādes sākumā un beigās, jo šķīdība var mainīties testa sistēmas ietekmē šūnu, S9, seruma un citu faktoru klātbūtnē. Neizšķīdušas vielas klātbūtni var noteikt vizuāli ar neapbruņotu aci. Neizšķīdušas vielas klātbūtne nedrīkst traucēt skaitīšanu.

1.4.2.3. Kontroles Katrā eksperimentā gan ar metabolisma aktivāciju, gan bez tās vienlaicīgi iekļauj pozitīvas un negatīvas (šķīdinātāja vai nesēja) kontroles. Izmantojot metabolisma aktivāciju, pozitīvas kontroles vielas mutagēnai iedarbībai ir vajadzīga aktivācija. Pie pozitīvās kontroles vielām pieder: Metabolisma aktivācijas apstākļi Gēna atrašanās vieta hromosomā Viela CAS Nr. Einecs Nr. Bez eksogēnas metabolisma aktivācijas HPRT Etilmetānsulfonāts 62-50-0 200-536-7 Nitrozoetilurīnviela 759-73-9 212-072-2 TK (mazām un lielām kolonijām) Metilmetānsulfonāts 66-27-3 200-625-0 XPRT Etilmetānsulfonāts 62-50-0 200-536-7 Nitrozoetilurīnviela 759-73-9 212-072-2 Ar eksogēnu metabolisma aktivāciju HPRT 3-Metilholantrēns 56-49-5 200-276-4 N-Nitrozodimetilamīns 62-75-9 200-549-8 7,12-Dimetilbenzantracēns 57-97-6 200-359-5 TK (mazām un lielām kolonijām) Ciklofosfamīds 50-18-0 200-015-4 Ciklofosfamīda monohidrāts 6055-19-2 Benzopirēns 50-32-8 200-028-5 3-Metilholantrēns 56-49-5 200-276-5 XPRT N-Nitrozodimetilamīns (augstiem S9 līmeņiem) 62-75-9 200-549-8 Benzopirēns 50-32-8 200-028-5 Pozitīvai kontrolei var izmantot citas piemērotas standartvielas, piemēram, ja laboratorijā ir vēsturisko datu bāze par 5-brom-2′-dezoksiuridīnu (CAS Nr. 59-14-3, Einecs Nr. 200-415-9) var izmantot arī šo standartvielu. Ja iespējams, kā pozitīvās kontroles vielas izmanto savienojumus, kas pieder pie atbilstošām vielu grupām. Iekļauj arī negatīvu kontroli, kad apstrādes barotnē ietilpst tikai šķīdinātājs vai nesējs, un ar to rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādes grupām. Turklāt jāizmanto arī tukšie mēģinājumi, izņemot gadījumus, kad ir iepriekš iegūti vēsturiskie dati, kas skaidri parāda, ka izvēlētajam šķīdinātājam nav kaitīgas vai mutagēnas iedarbības.

1.4.3. Procedūra

1.4.3.

1.4.3.1. Iedarbība ar testa vielu Ar metabolisku aktivāciju un bez tās uz augošām šūnu kultūrām iedarbojas ar testa vielu. Uz šūnām iedarbojas noteiktu laiku (parasti 3–6 stundas). Iedarbības laiku var pagarināt līdz vienam vai vairākiem šūnu cikliem. Pie katras pārbaudāmās koncentrācijas izmanto vienu vai divas apstrādātas kultūras. Izmantojot vienu kultūru, palielina pārbaudāmo koncentrāciju skaitu, tādējādi nodrošinot pietiekamu analizējamo kultūru skaitu (piemēram, vismaz astoņas analizējamas koncentrācijas). Izmanto dublikātu negatīvās (šķīdinātāja) kontrolkultūras. Gāzveida un gaistošu vielu pārbaudēm jāizmanto atbilstošas metodes, piemēram, kultivēšana hermētiski noslēgtos traukos (21) (22).

1.4.3.2. Izdzīvošanas, dzīvotspējas un mutāciju biežuma noteikšana Pēc iedarbības perioda ar testa vielu, šūnas mazgā un kultivē, lai noteiktu izdzīvošanu un izpaustos mutanto šūnu fenotipa īpašības. Citotoksicitāti parasti nosaka, novērtējot kultūru relatīvo klonēšanas efektivitāti (izdzīvošanu) vai relatīvo kopējo pieaugumu pēc apstrādes perioda. Katrai gēna atrašanās vietai hromosomā ir noteikts minimālais laiks, kurā iespējami optimāli izpaužas no jauna izraisīto mutantu fenotipa īpašības (HPRT un XPRT vajadzīgas vismaz 6–8 dienas, bet TK – vismaz divas dienas). Lai noteiktu mutantu skaitu un klonēšanas efektivitāti, šūnas audzē attiecīgās barotnēs, kam pievienotas selektīvās vielas, un bez tām. Dzīvotspējas noteikšanu (ko izmanto mutāciju biežuma aprēķināšanai) sāk fenotipa īpašību izpausmes perioda beigās, tās izsējot neselektīvā barotnē. Ja L5178Y TK+/- testā pārbaudāmā viela ir pozitīva, vismaz vienai no testa kultūrām (ar lielāko pozitīvo koncentrāciju), kā arī negatīvā un pozitīvā kontrolē nosaka koloniju lielumu. Ja L5178Y TK+/- testā pārbaudāmā viela ir negatīva, koloniju lielumu nosaka negatīvā un pozitīvā kontrolē. Koloniju lielumu var noteikt arī izmēģinājumos, kuriem izmanto TK6TK+/- testu.

2. DATI

2.

2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE Rezultātos ietilpst citotoksicitātes un dzīvotspējas noteikšana, koloniju skaits un mutāciju biežums apstrādātajās un kontroles kultūrās. Ja L5178Y TK+/- tests ir pozitīvs, pie vienas testa vielas koncentrācijas (lielākās pozitīvās koncentrācijas), kā arī negatīvajā un pozitīvajā kontrolē nosaka lielu un mazu koloniju skaitu. Sīki izpēta lielo un mazo koloniju mutantu molekulārās un citoģenētiskās īpašības (23) (24). TK+/- testā kolonijas uzskaita pēc tādiem kritērijiem kā normāla auguma (lielās) un lēni augošas (mazās) kolonijas (25). Mutantu šūnām ar lielākajiem ģenētiskajiem bojājumiem ir ilgāks skaita dubultošanās laiks, un tāpēc tās veido mazas kolonijas. Šie bojājumi parasti ir no vesela gēna zuduma līdz kariotipā redzamām hromosomu izmaiņām. Mazas kolonijas veidojošu mutantu šūnu rašanās saistāma ar vielām, kuras izraisa ievērojamas hromosomu izmaiņas (26). Mazāk bojātu mutantu šūnu augšanas ātrums ir līdzīgs mātesšūnu augšanas ātrumam, un tās veido lielas kolonijas. Būtu jānorāda arī šūnu izdzīvošana (relatīvā klonēšanas efektivitāte) vai relatīvais kopējais pieaugums. Mutāciju biežumu izsaka ar mutantu šūnu skaita attiecību pret izdzīvojušo šūnu skaitu. Norāda datus par atsevišķām kultūrām. Bez tam visus datus apkopo tabulas veidā. Attiecībā uz pozitīvas reakcijas verificēšanu nav noteiktu prasību. Apšaubāmus rezultātus pārbauda, veicot atkārtotu testu, turklāt vēlams mainīt eksperimenta apstākļus. Negatīvi rezultāti katrā konkrētā gadījumā ir jāapstiprina. Gadījumos, kad negatīvu rezultātu apstiprināšanu uzskata par nevajadzīgu, tas ir jāpamato. Iegūstot apšaubāmus vai negatīvus rezultātus, izmēģinājuma parametru izmaiņas novērtē un nosaka kontroles eksperimentos. Izmēģinājuma parametri, kurus var mainīt, ir pārbaudāmo koncentrāciju atšķirības un metabolisma aktivācijas apstākļi.

2.2. REZULTĀTU NOVĒRTĒŠANA UN INTERPRETĀCIJA Pozitīvu rezultātu nosaka pēc vairākiem kritērijiem, tādiem kā ar koncentrācijas izmaiņām saistītā mutāciju biežuma vai reproducējamā biežuma palielināšanās. Vispirms rezultātus izvērtē bioloģiski. Kā palīglīdzekli pārbaužu rezultātu izvērtēšanai var izmantot statistikas metodes. Statistiskais nozīmīgums nedrīkst būt vienīgais faktors, pēc kā nosaka pozitīvu atbildes reakciju. Gadījumos, kad testu rezultāti neatbilst minētajiem kritērijiem, uzskata, ka testa viela šajā sistēmā nav mutagēna. Lai gan lielākajā daļā eksperimentu iegūst nepārprotami pozitīvus vai negatīvus rezultātus, tomēr dažkārt pēc iegūtajiem datiem nevar noteikti spriest par testa vielas aktivitāti. Turklāt rezultāti var būt nedroši vai apšaubāmi arī neatkarīgi no izmēģinājuma atkārtojumu skaita. Zīdītāju šūnu gēnu mutāciju testā in vitro iegūti pozitīvi rezultāti liecina, ka testa viela izraisa izmantoto zīdītāju šūnu kultūru gēnu mutācijas. Lielāka nozīme ir reproducējamam mutāciju skaita pieaugumam, palielinoties testa vielas koncentrācijai. Negatīvi rezultāti liecina, ka izmēģinājuma apstākļos testa viela neizraisa izmantoto zīdītāju šūnu kultūru gēnu mutācijas.

3. ZIŅOJUMU SASTĀDĪŠANA

3. TESTA ZIŅOJUMS

Testa ziņojumā jābūt šādai informācijai.

Šķīdinātājs/nesējs:

šķīdinātāja/nesēja izvēles pamatojums,

testa vielas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja tā ir zināma.

Šūnas:

šūnu veids un izcelsme,

šūnu kultūru skaits,

pārneses reižu skaits, ja vajadzīgs,

šūnu kultūru uzturēšanas metodes, ja vajadzīgs,

mikoplazmas trūkums.

Testa apstākļi:

vielas koncentrāciju un šūnu kultūru skaita izvēles pamatojums, piemēram, dati par citotoksiskajām īpašībām un šķīdības robežām, ja tie ir pieejami,

barotnes sastāvs, CO2 koncentrācija,

testa vielas koncentrācija,

pievienotā nesēja un testa vielas tilpums,

inkubēšanas temperatūra,

inkubēšanas ilgums,

apstrādes ilgums ar testa vielu,

šūnu blīvums apstrādes laikā,

metabolisma aktivācijas sistēmas veids un sastāvs, norādot pieņemamības kritērijus,

pozitīvas un negatīvas kontroles,

fenotipa īpašību izpausmes periods (norādot izsēto šūnu skaitu un subkultūras, barošanas grafiku, ja ir),

selektīvie aģenti,

kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai testa rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs,

dzīvotspējīgo šūnu un mutantu šūnu skaita noteikšanas metodes,

uzskaitīto koloniju lielums un veids (pēc vajadzības norādot kritērijus, pēc kuriem nosaka lielas vai mazas kolonijas).

Rezultāti:

toksicitātes pazīmes,

izgulsnēšanās pazīmes,

dati par pārbaudes barotnes pH un osmozi iedarbības laikā ar testa vielu, ja tie noteikti,

koloniju lielums, ja tas noteikts vismaz negatīvajā un pozitīvajā kontrolē,

laboratorijas iespējas noteikt mazas kolonijas veidojošas mutantu šūnas ar L5178Y TK+/- sistēmu gadījumā, ja tas ir vajadzīgs,

ja iespējams, reakcijas uz devu novērtējums,

statistiskās analīzes rezultāti, ja tā veikta,

līdztekus iegūtie negatīvas (šķīdinātāja/nesēja) un pozitīvas kontroles rezultāti,

līdzšinējie vēsturiskie negatīvas (šķīdinātāja/nesēja) un pozitīvas kontroles rezultāti, norādot robežas, vidējos lielumus un standartnovirzes,

mutāciju biežums.

Rezultātu izvērtējums.

Secinājumi.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)

IZMANTOTĀ LITERATŪRA Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E.H.Y. and Malling, H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, p. 1306–1312. Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982). Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, p. 467–485. Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, p. 394–403. Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, p. 121–128. Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, p. 235–239. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, p. 147–204. Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, p. 225–251. Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 196, p. 17–36. Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O’Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, p. 135–141. Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, p. 9–17. Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate –and ICR 191– Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate –and ICR 191–Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, p. 133–147. Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures for the L5178Y/TK+/- – TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, p. 239–268. Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, p. 66–101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, p. 365–373. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347–364. Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, p. 61–108. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173–215. Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, p. 85–88. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91–103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795–801. Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p. 51–55. Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, p. 161–174. Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, p. 89–102. Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- - 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, p. 609–614.

B.18. DNS BOJĀJUMI UN TO REPARĀCIJA – DNS ĀRPUSFĀZES SINTĒZE – ZĪDĪTĀJU ŠŪNAS IN VITRO

B.18.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.3. STANDARTVIELAS Nav.

1.4. METODES PRINCIPS Ar šo metodi DNS ārpusfāzes sintēzes (DĀS) noteikšanai pēta DNS reparatīvo sintēzi pēc tam, kad no DNS ir izgriezts un izņemts fragments, kas satur ķīmisku vai fizikālu aģentu inducētus bojājumus. Šim nolūkam izmanto ar tritiju iezīmētu timidīnu (3H-TdR), kas iekļaujas DNS struktūrā zīdītāju šūnās, kuras tajā brīdī atrodas ārpus šūnas cikla S fāzes. DNS molekulās uzņemto 3H-TdR apstrādātajās šūnās var noteikt, izmantojot autoradiogrāfiju vai šķidrumscintilāciju metodi (ŠSM). Zīdītāju šūnu kultūras, ja tie nav primārie žurku hepatocīti, apstrādā ar pārbaudāmo vielu, gan pievienojot tām eksogēno metaboliskās aktivācijas sistēmu, gan bez tās. DĀS mērījumiem var izmantot arī in vivo sistēmas.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6. Sagatavošanas darbi

Pārbaudāmās vielas un kontroles vai standartvielas pievieno barotnei vai izšķīdina/suspendē piemērotā šķīdinātājā/vidē un tad atšķaida ar barotni tālākai izmantošanai izmēģinājumā. Šķīdinātājs galīgajā koncentrācijā nedrīkst nomākt šūnu dzīvotspēju. Šim nolūkam var izmantot primārās žurku hepatocītu un cilvēku limfocītu kultūras vai pastāvīgās šūnu līnijas (piemēram, cilvēku diploīdos fibroblastus). Šūnas pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai, gan pievienojot tām piemērotu metaboliskās aktivācijas sistēmu, gan bez tās.

Testa apstākļi

Šūnu kultūru skaits

Katra līknes punkta iegūšanai autoradiogrāfijas vajadzībām izmanto vismaz divas šūnu kultūras un sešas kultūras (vai mazāk, ja to var zinātniski pamatot) DĀS noteikšanai ar ŠSM.

Negatīvā un pozitīvā kontrole

Katrā izmēģinājumā, gan veicot metabolisko aktivāciju, gan bez tās, vienlaikus jāparedz pozitīvā un negatīvā (bez pārbaudāmās vielas un/vai ar šķīdinātāju) kontrole. Kā pozitīvās kontroles piemēru žurku hepatocītu kultūrā var minēt 7,12-dimetilbenzantracēnu (7,12-DMBA) vai 2-acetilaminofluorēnu (2-AAF). Ja izmanto pastāvīgās šūnu līnijas, kā pozitīvās kontroles paraugu gan autoradiogrāfijas, gan ŠSM pētījumiem bez metaboliskās aktivācijas var minēt 4-nitrohinolīn-N-oksīdu (4-NHO); ja izmanto metaboliskās aktivācijas sistēmas, šādas pozitīvās kontroles piemērs ir N-dimetilnitrozamīns.

Koncentrācija ekspozīcijas laikā

Pārbaudāmā viela jāizmanto tādā koncentrāciju diapazonā, kas ļautu veikt vajadzīgos mērījumus. Vielai lielākajā koncentrācijā jāuzrāda citotoksiska iedarbība. Savienojumus, kas samērā slikti šķīst ūdenī, pārbauda koncentrācijā, kas ir tuvu to šķīdības robežai. Netoksiskām ķīmiskām vielām, kas pilnībā šķīst ūdenī, lielāko pārbaudāmo koncentrāciju nosaka katrā atsevišķā gadījumā.

Šūnas

Šūnu kultūras kultivē piemērotā barotnē, nodrošinot vajadzīgo CO2 koncentrāciju, temperatūru un mitrumu. Pastāvīgās šūnu līnijas regulāri pārbauda, lai nodrošinātos pret mikoplazmas kontamināciju.

Metaboliskā aktivācija

Metaboliskās aktivācijas sistēmu neizmanto ar primāro hepatocītu kultūrām. Pastāvīgās šūnu līnijas pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai, gan pievienojot tām piemērotu metaboliskās aktivācijas sistēmu, gan bez tās.

Testa norise

Šūnu kultūru sagatavošana

Pastāvīgās šūnu līnijas iegūst no pamatkultūrām (piemēram, tripsinizējot vai nokratot šūnas), kuras iesēj inkubācijas traukos vajadzīgā blīvumā un kultivē 37 oC temperatūrā. Īslaicīgas žurku hepatocītu kultūras iegūst, ļaujot tikko izdalītiem hepatocītiem piemērotā barotnē piestiprināties pie substrāta. Cilvēka limfocītu kultūras iegūst, izmantojot attiecīgās metodes.

Kultivēto šūnu apstrāde ar pārbaudāmo vielu Primārie žurku hepatocīti

Tikko izdalītiem žurku hepatocītiem uz noteiktu laiku pievieno pārbaudāmo vielu kopā ar barotni, kas satur 3H-TdR. Beidzoties ekspozīcijas laikam, barotni nolej, bet šūnas skalo, apstrādā ar fiksatoru un žāvē. Priekšmetstikliņus iemērc autoradiogrāfijas emulsijā (var izmantot arī novelkamo emulsijas kārtu), eksponē, attīsta, krāso un novērtē.

Pastāvīgās šūnu līnijas un limfocīti

Autoradiogrāfijas metodes. Vajadzīgo laika sprīdi šūnu kultūras pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai un pēc tam apstrādā ar 3H-TdR. Ekspozīcijas laiks ir atkarīgs no vielas īpašībām, metabolisko sistēmu aktivitātes un šūnu tipa. Lai noteiktu DĀS maksimumu, 3H-TdR pievieno reizē ar pārbaudāmo vielu vai dažas minūtes vēlāk, sākoties ekspozīcijas laikam. Kuru no divām iespējām izvēlēties, ir atkarīgs no tā, vai pārbaudāmā viela mijiedarbojas ar 3H-TdR. Lai varētu atšķirt DĀS no DNS puskonservatīvās replikācijas, pēdējo var nomākt, piemēram, izmantojot bezarginīna barotni ar zemu seruma saturu vai pievienojot barotnei oksiurīnvielu. DĀS mērījumi ar ŠSM. Pirms pievienot pārbaudāmo vielu, ir jābloķē šūnu pāreja S fāzē, kā tas aprakstīts iepriekš, un tad šūnas pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai, kā norādīts autoradiogrāfijas metodes aprakstā. Beidzoties inkubācijas laikam, no šūnām izdala DNS un nosaka kopējo DNS saturu, kā arī uzņemtā 3H-TdR daudzumu. Jāpatur prātā, ka, ja saskaņā ar iepriekš minēto metodi izmanto cilvēka limfocītus bez stimulācijas, DNS puskonservatīvā replikācija nav jānomāc.

Analīze

Noteikšana ar autoradiogrāfijas metodi

Nosakot DĀS šūnu kultūrā, neņem vērā šūnu kodolus S fāzē. Pārbaudot katru vielas koncentrāciju, veic vismaz 50 šūnu analīzi. Priekšmetstikliņus pirms skaitīšanas apzīmē ar šifru. Katram priekšmetstikliņam pēc nejaušības principa izskata vairākus citu no cita tālu esošus laukumus. Citoplazmā uzņemtā 3H-TdR daudzumu nosaka, katras saskaitītās šūnas citoplazmā pārbaudot trīs laukumus, kuri pēc lieluma līdzinās šūnas kodolam.

Noteikšana ar ŠSM

Veicot DĀS noteikšanu ar ŠSM, katras koncentrācijas pārbaudei un kontroles grupā izmanto pietiekamu šūnu kultūru skaitu. Visi šie rezultāti jāapstiprina neatkarīgā izmēģinājumā.

2. DATI Iegūtie dati jāapkopo tabulā.

2.

2.1. NOTEIKŠANA AR AUDIORADIOGRĀFIJAS METODI Atsevišķi jāreģistrē citoplazmā iekļautā 3H-TdR daudzums un graudiņu skaits virs šūnas kodola. Citoplazmā ietvertā 3H-TdR daudzuma sadalījumu un graudiņu skaita sadalījumu uz vienu kodolu var raksturot ar vidējās, mediālās un modālās vērtības palīdzību.

2.2. NOTEIKŠANA AR SŠM Veicot noteikšanu ar ŠSM, uzņemtā 3H-TdR daudzumu norāda kā dpm/μg DNS. Uzņemtās radioaktivitātes sadalījumu var raksturot ar dpm/μg DNS vidējo vērtību kopā ar standartnovirzi. Dati jāizvērtē ar piemērotām statistikas metodēm.

3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. TESTA ZIŅOJUMS Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šādas ziņas:

izmantotās šūnas, šūnu slāņa blīvums un pasāžu skaits ekspozīcijas brīdī, šūnu kultūru skaits,

šūnu kultivēšanas metodes, norādot barotni, temperatūru un CO2 koncentrāciju,

pārbaudāmā viela, šķīdinātājs, to koncentrācija un pamatojums eksperimentā izmantoto koncentrāciju izvēlei,

metaboliskās aktivācijas sistēmu raksturojums,

ekspozīcijas shēma,

pozitīvā un negatīvā kontrole,

izmantotā autoradiogrāfijas metode,

paņēmiens, kas izmantots, lai bloķētu šūnu pāreju S fāzē,

metodes, kas izmantotas DNS izdalīšanai un DNS kopējā satura noteikšanai ar ŠSM,

ja iespējams, iedarbības atkarība no devas,

statistiskais novērtējums,

rezultātu iztirzājums,

rezultātu interpretācija.

3.2. IZVĒRTĒJUMS UN INTERPRETĀCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

B.19. MĀSHROMATĪDU APMAIŅAS NOTEIKŠANA IN VITRO

B.19.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.3. STANDARTVIELAS Nav.

1.4. METODES BŪTĪBA Metode māshromatīdu apmaiņas (MHA) noteikšanai ļauj īsā laikā reģistrēt DNS reciproko apmaiņu starp divām replicējošās hromosomas māshromatīdām. MHA laikā notiek DNS replikācijas produktu savstarpējā apmaiņa, kas skar acīmredzami homologos lokusus. Apmaiņas process, iespējams, noris, DNS molekulai pārtrūkstot un atkal savienojoties, lai gan tā molekulārais mehānisms ir maz izpētīts. Lai konstatētu MHA, jārod veids, kā atšķirīgi iezīmēt māshromatīdas; to var panākt, divu šūnas ciklu laikā ļaujot šūnām uzņemt bromdezoksiuridīnu (BrdU) hromosomālajā DNS. Zīdītāju šūnas in vitro pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai, vajadzības gadījumā vienlaikus pievienojot zīdītāju izcelsmes eksogēnu metaboliskās aktivācijas sistēmu un divu replikācijas ciklu laikā kultivējot tās BrdU saturošā barotnē. Pēc apstrādes ar vārpstveida inhibitoru (piemēram, kolhicīnu), kas ļauj uzkrāt šūnas mitozes metafāzei līdzīgā stadijā (c- jeb k-metafāze), šūnas savāc un gatavo hromosomu preparātus.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.6. METODES APRAKSTS

Šim nolūkam var izmantot primārās kultūras (piemēram, cilvēka limfocītus) vai pastāvīgās šūnu līnijas (piemēram, Ķīnas kāmja olnīcu šūnas). Šūnu līnijas jāpārbauda, lai nodrošinātos pret mikoplazmas kontamināciju.

Izmanto piemērotas barotnes un ievēro inkubācijas apstākļus (piemēram, temperatūru, inkubācijas traukus, CO2 koncentrāciju un gaisa mitrumu).

Pārbaudāmās vielas pirms ekspozīcijas var pievienot barotnei vai izšķīdināt/suspendēt piemērotā šķīdinātajā/nesējvielā. Šķīdinātājs/nesējviela galīgajā koncentrācijā nedrīkst ievērojami nomākt šūnu dzīvotspēju vai vairošanās ātrumu inkubācijas sistēmā, tā ietekmi uz MHA biežumu pārbauda, izmantojot kontroli ar šķīdinātāju.

Šūnas pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai, gan pievienojot tām piemērotu eksogēnu metaboliskās aktivācijas sistēmu, gan bez tās. Savukārt, ja izmanto šūnu tipus, kam piemīt iekšējā metaboliskā aktivitāte, šīs metaboliskās sistēmas aktivitātei un īpašībām jābūt saderīgām ar pārbaudāmās ķīmiskās vielas klasi.

1.6. 1.6.2. Testa apstākļi Šūnu kultūru skaits

Viena līknes punkta iegūšanai izmanto vismaz divus šūnu kultūras paraugus.

Negatīvā un pozitīvā kontrole

Katrā eksperimentā jāparedz pozitīvā kontrole, gan izmantojot savienojumu, kam nav vajadzīga metaboliskā aktivācija, gan tādu, kam šāda aktivācija ir vajadzīga; vienlaikus jāizmanto negatīvā kontrole (ar šķīdinātāju). Šeit ir minētas vielas, kuras var izmantot kā pozitīvo kontroli: Vajadzības gadījumā kā papildu pozitīvo kontroli var izmantot vielu no tās pašas ķīmiskās klases, pie kuras pieder pārbaudāmā viela.

viela, kurai nav vajadzīga aktivācija:

etilmetānsulfonāts,

viela, kurai vajadzīga aktivācija:

ciklofosfamīds.

Koncentrācija ekspozīcijas laikā

Pārbaudāmās vielas diapazons aptver vismaz trīs atšķirīgas koncentrācijas. Vielai lielākajā koncentrācijā jābūt ievērojami toksiskai, bet tā nedrīkst nomākt šūnu replikāciju. Vielas, kas samērā slikti šķīst ūdenī, pārbauda koncentrācijā, kas ir tuvu to šķīdības robežai, izmantojot piemērotu metodi. Netoksiskām vielām, kas pilnībā šķīst ūdenī, lielāko pārbaudāmo koncentrāciju nosaka katrā atsevišķā gadījumā.

1.6.3. Testa norise Šūnu kultūru sagatavošana

Pastāvīgās šūnu līnijas iegūst no pamatkultūrām (piemēram, tripsinizējot vai nokratot šūnas), tās iesēj inkubācijas traukos vajadzīgā blīvumā un kultivē 37 oC temperatūrā. Ja izmanto vienslāņa kultūras, šūnu skaitam katrā inkubācijas traukā jābūt tādam, lai šūnu savākšanas brīdī vienlaidu [šūnu] slānis aizņemtu ne vairāk kā 50 % kultūras platības. Pastāv arī iespēja izmantot suspendētu šūnu kultūras. Cilvēka limfocītu kultūras, izmantojot piemērotas metodes, iegūst no asinīm, kam pievienots heparīns, un inkubē 37 oC temperatūrā.

Šūnu apstrāde

Šūnas eksponenciālajā vairošanās fāzē pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai attiecīgajā ekspozīcijas laikā; parasti pietiek ar 1–2 stundām, lai gan atsevišķos gadījumos ekspozīcijas laiku var pagarināt līdz diviem pilniem šūnas cikliem. Šūnām, kurām nepiemīt pietiekama metaboliskā aktivitāte, pārbaudāmo vielu pievieno gan kopā ar piemērotu metabolisma aktivācijas sistēmu, gan bez tās. Beidzoties ekspozīcijas laikam, šūnas skalo, lai tiktu vaļā no pārbaudāmās vielas, un divu replikācijas ciklu garumā tās kultivē BrdU klātbūtnē. Pastāv iespēja šūnas vienlaicīgi pakļaut pārbaudāmās vielas un BrdU iedarbībai divu pilnu šūnas ciklu laikā. Cilvēka limfocītu kultūras apstrādā, kamēr tās atrodas pussinhronā stāvoklī. Šūnas analizē otrās dalīšanās laikā pēc ekspozīcijas, gādājot par to, lai visjutīgākajās šūnas cikla stadijās tās būtu pakļautas vielas iedarbībai. Kamēr šūnas nav savāktas, visas darbības ar šūnu kultūrām, kurām pievienots BrdU, jāveic tumsā vai nespodrā kvēlspuldžu gaismā, lai mazinātu BrdU saturošās DNS fotolīzi.

Šūnu savākšana

Šūnu kultūras apstrādā ar vārpstveida inhibitoru (piemēram, kolhicīnu) 1–4 stundas pirms to savākšanas. Katru šūnu kultūru atsevišķi savāc un apstrādā, lai vēlāk sagatavotu hromosomu preparātus.

Hromosomu apstrāde un krāsošana

Hromosomu preparātus gatavo pēc citoģenētikas standartmetodēm. Priekšmetstikliņus MHA noteikšanai var krāsot, izmantojot dažādas metodes (piemēram, fluorescences metodi kopā ar Gīmsa metodi).

Preparātu analīze

Analizējamo šūnu skaits ir atkarīgs no spontānās MHA biežuma kontroles šūnās. Parasti MHA noteikšanai analizē vismaz 25 labi izkliedētas metafāzes no katras šūnu kultūras. Priekšmetstikliņus pirms analīzes apzīmē ar šifru. Kas attiecas uz cilvēka limfocītiem, analizē tikai tās metafāzes, kurās ir 46 centromēras. Pastāvīgo šūnu līniju preparātos analizē tikai metafāzes, kurās centromēru skaits atbilst modālajam skaitam ± 2 centromēras. Jānorāda, vai marķējuma izmaiņas ap centromēru ir uzskatāmas par MHA. Iegūtie rezultāti jāapstiprina neatkarīgā eksperimentā.

2. DATI Dati jāapkopo tabulā. Visām apstrādātām šūnu kultūrām un kontroles kultūrām atsevišķi jānorāda MHA biežums katrā metafāzē un MHA biežums uz vienu hromosomu katrā metafāzē. Iegūtie dati jāizvērtē ar piemērotām statistikas metodēm.

3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. TESTA ZIŅOJUMS Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šādas ziņas:

izmantotās šūnas, šūnu kultivēšanas paņēmieni,

testa apstākļi (barotņu sastāvs, CO2 koncentrācija, pārbaudāmās vielas koncentrācija, izmantotais šķīdinātājs, inkubācijas temperatūra, ekspozīcijas ilgums, izmantotais vārpstas inhibitors, tā koncentrācija un apstrādes ilgums, izmantotā zīdītāju izcelsmes metaboliskās aktivācijas sistēma, pozitīvā un negatīvā kontrole),

šūnu kultūru skaits uz vienu eksperimentālās līknes punktu,

hromosomu preparātu izgatavošanas apraksts,

analizēto metafāžu skaits (atsevišķi dati par katru šūnu kultūru),

MHA vidējais biežums uz vienu šūnu un uz vienu hromosomu (atsevišķi dati par katru šūnu kultūru),

MHA uzskaites kritēriji,

devu izvēles pamatojums,

vajadzības gadījumā – iedarbības atkarība no devas,

statistiskais novērtējums,

rezultātu iztirzājums,

rezultātu interpretācija.

3.2. IZVĒRTĒJUMS UN INTERPRETĀCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

B.20. AR DZIMUMU SAISTĪTO RECESĪVO LETĀLO MUTĀCIJU NOTEIKŠANA (DROSOPHILA MELANOGASTER)

B.20.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.3. STANDARTVIELAS Nav.

1.4. METODES BŪTĪBA Metode ar dzimumu saistīto recesīvo letālo mutāciju noteikšanai (SLRL tests) ļauj reģistrēt mutāciju (gan punktmutāciju, gan nelielu delēciju) parādīšanos Drosophila melanogaster dzimumšūnās. Šim nolūkam pārbauda turpvērstās mutācijas, kas var skart vienu no aptuveni 800 X hromosomas lokusiem, kuri veido gandrīz 80 % no to kopējā skaita X hromosomās. X hromosomā atrodas apmēram piektā daļa no visa haploīdā genoma. Mutācijas Drosophila melanogaster X hromosomā fenotipiski izpaužas tēviņos, kuri ir mutantā gēna nesēji. Ja mutācija ir letāla hemizigotajā stāvoklī, par tās klātbūtni var spriest pēc tā, ka novēro tikai vienu no divām vīrišķo pēcnācēju klasēm, kuras parasti iegūst no heterozigotas mātītes. Uz šiem atzinumiem balstās SLRL tests, kurā izmanto īpaši marķētas un pārveidotas hromosomas.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6. Sagatavošanas darbi

Ģenētiskais materiāls

Šim nolūkam der tēviņi no labi izpētītas savvaļas tipa populācijas un mātītes no populācijas Muller-5. Var izmantot arī citas attiecīgi marķētas mātīšu populācijas, kuru X hromosomas satur vairākas inversijas.

Pārbaudāmā viela

Pārbaudāmās vielas izšķīdina ūdenī. Vielas, kas nešķīst ūdeni, var izšķīdināt vai suspendēt piemērotā šķīdinātājā/nesējvielā (piemēram, etilspirta un Tween 60 vai Tween 80 maisījumā), un tad pirms ievadīšanas tās atšķaida ar ūdeni vai fizioloģisko šķīdumu; šim nolūkam nebūtu ieteicams izmantot dimetilsulfoksīdu (DMSO).

Dzīvnieku skaits

Pirms izmēģinājuma jau iepriekš jānosaka tā precizitāte un ticamības pakāpe. Hromosomu skaits, kas jāanalizē pēc vielas aplikācijas, ir lielā mērā atkarīgs no spontāno mutāciju biežuma, ko novēro kontroles grupā.

Ievadīšanas veids

Vielu var ievadīt perorāli, injekcijas veidā vai izmantot gāzes vai tvaikus. Pārbaudāmo vielu var iebarot kopā ar cukura šķīdumu. Vajadzības gadījumā vielas var izšķīdināt 0,7 % NaCl šķīdumā un injicēt tās krūšu vai vēdera apvidū.

Negatīvā un pozitīvā kontrole

Jāizmanto negatīvā (ar šķīdinātāju) un pozitīvā kontrole. Taču, ja attiecīgie kontroles dati jau iegūti iepriekš, var iztikt bez kontroles izmēģinājumiem.

Koncentrācija ekspozīcijas laikā

Jāizmanto trīs dažādas koncentrācijas. Iepriekšējai novērtēšanai var izmantot vienu pārbaudāmās vielas koncentrāciju, izvēloties maksimāli pieļaujamo koncentrāciju vai tādu koncentrāciju, kas izraisa toksicitātes simptomus. Ja vielas nav toksiskas, tās izmanto pēc iespējas lielākā koncentrācijā.

Testa norise

Savvaļas tipa tēviņus (3 līdz 5 dienas vecus) pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai un katru atsevišķi sapāro ar vairākām neapaugļotām mātītēm no Muller-5 populācijas vai no citas attiecīgi marķētas (X hromosomas satur vairākas inversijas) populācijas. Mātītes ik pēc 2–3 dienām aizstāj ar citām neapaugļotām mātītēm, lai būtu aptverts viss dzimumšūnu attīstības cikls. Šo mātīšu pēcnācējiem reģistrē to letāļu biežumu, kuras radušās pēc iedarbības uz nobriedušiem spermatozoīdiem, vidējās vai vēlīnās attīstības stadijas spermatīdiem, agrīnajiem spermatīdiem, spermatocītiem un spermatogonijiem. Heterozigotās F1 mātītes, kas iegūtas pēc iepriekš minētās krustošanas, katru atsevišķi (proti, vienā stobriņā pa vienai mātītei) sapāro ar saviem brāļiem. Katru F2 paaudzes kultūru pārbauda, vai tajā atrodami savvaļas tipa tēviņi. Ja atklājas, ka kultūra radusies no F1 mātītes, kuras tēvišķajā X hromosomā ir letālais gēns (proti, tajā nenovēro tēviņus ar savvaļas tipa hromosomu), ir jāpārbauda šīs mātītes meitas ar tādu pašu genotipu, lai noskaidrotu letalitātes parādīšanos nākamajās paaudzēs.

2. DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot pārbaudīto X hromosomu skaitu, neauglīgo tēviņu skaitu un letālo mutāciju skaitu pēc katras koncentrācijas iedarbības, kuras novērotas katram apstrādātajam tēviņam pēc katras pārošanās reizes. Norāda arī dažāda lieluma klasteru skaitu uz vienu tēviņu. Šie rezultāti jāapstiprina neatkarīgā eksperimentā. SLRL testa rezultāti jāizvērtē ar piemērotu statistikas metodi. Jāizpēta un piemērotā veidā statistiski jāizvērtē tādu recesīvo letālo mutāciju klasteru veidošanās, kas nāk no viena un tā paša tēviņa.

3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. TESTA ZIŅOJUMS Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šādas ziņas:

ģenētiskais materiāls (izmantotās Drosophila populācijas vai līnijas, mušiņu vecums, apstrādāto tēviņu skaits, sterilo tēviņu skaits, iegūto F2 kultūru skaits, F2 kultūru skaits, kam nav pēcnācēju, hromosomu skaits ar letālajām mutācijām, kas reģistrētas katrā dzimumšūnu attīstības stadijā),

kritēriji, pēc kuriem nosaka apstrādāto grupu lielumu,

testa apstākļi (sīks apstrādes un paraugu ņemšanas shēmas apraksts, izmantotās koncentrācijas, toksicitātes dati, negatīvā (ar šķīdinātāju) un pozitīvā kontrole, ja izmanto),

letālo mutāciju uzskaites kritēriji,

ja iespējams, jānorāda iedarbības atkarība no devas,

datu izvērtējums,

rezultātu iztirzājums,

rezultātu interpretācija.

3.2. IZVĒRTĒJUMS UN INTERPRETĀCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

B.21. ZĪDĪTĀJU ŠŪNU TRANSFORMĀCIJA IN VITRO

B.21.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.3. STANDARTVIELAS Nav.

1.4. METODES BŪTĪBA Zīdītāju šūnu kultūras in vitro var izmantot ķīmiski inducētu fenotipisko izmaiņu noteikšanai, kuras saista ar ļaundabīgu transformāciju in vivo. Šim nolūkam plaši izmanto tādas šūnas kā CH310T ½, SHE, Fišera žurku šūnas, pētot izmaiņas šūnu morfoloģijā, transformācijas perēkļu veidošanos vai spēju vairoties mīkstajā agarā. Retāk izmanto tādas sistēmas, kas ļauj reģistrēt citas fizioloģiskas vai morfoloģiskas izmaiņas pēc ķīmisku kancerogēnu iedarbības. Nevienam in vitro pētāmajam parametram nav pierādīta cēloniska sakarība ar vēzi. Dažas eksperimentālās sistēmas var izmantot audzēju promotoru noteikšanai. Par citotoksicitāti var spriest pēc pārbaudāmās vielas ietekmes uz koloniju veidošanos (klonēšanas efektivitāti) šūnu kultūrās vai to vairošanās ātrumu. Citotoksicitātes mērījumi ļauj secināt, ka pārbaudāmās vielas iedarbība ir toksikoloģiski determinēta, taču to nevar visos gadījumos izmantot transformācijas biežuma aprēķināšanai, jo tas dažreiz paredz ilgāku inkubāciju un/vai šūnu atkārtotu izsēšanu.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6. Sagatavošanas darbi

Šūnas

Atkarībā no transformācijas noteikšanas metodes var izmantot dažādas šūnu līnijas vai primārās šūnu kultūras. Jāpārliecinās, ka izmēģinājumā izmantotās šūnas ļauj novērot noteiktas fenotipiskās izmaiņas pēc zināmu kancerogēnu iedarbības un ka laboratorijā izmantotā metode ir dokumentāri pierādīta par derīgu un uzticamu.

Barotne

Jāizmanto tādas barotnes un izmēģinājuma apstākļi, kas ir saderīgi ar transformācijas noteikšanas metodi.

Pārbaudāmā viela

Pārbaudāmās vielas pirms šūnu apstrādes var pievienot barotnei vai izšķīdināt/suspendēt piemērotā šķīdinātājā/nesējvielā. Šķīdinātājs/nesējviela galīgajā koncentrācijā nedrīkst nomākt šūnu dzīvotspēju, vairošanās ātrumu vai transformācijas biežumu.

Metaboliskā aktivācija

Šūnas pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai gan kopā ar piemērotu metaboliskās aktivācijas sistēmu, gan bez tās. Turpretī, ja izmanto šūnu tipus, kam piemīt iekšējā metaboliskā aktivitāte, šīs metaboliskās sistēmas aktivitātei un īpašībām jābūt saderīgām ar pārbaudāmās ķīmiskās vielas klasi.

Testa apstākļi

Negatīvā un pozitīvā kontrole

Katrā eksperimentā jāparedz pozitīvā kontrole, gan izmantojot savienojumu, kam nav vajadzīga iepriekšējā metaboliskā aktivācija, gan tādu, kam tā ir vajadzīga; tāpat jāizmanto negatīvā kontrole (ar šķīdinātāju/nesējvielu). Šeit ir minētas vielas, kuras var izmantot kā pozitīvo kontroli: Ja iespējams, kā papildu pozitīvā kontrole jāizmanto viela no tās pašas ķīmiskās klases, pie kuras pieder pārbaudāmā viela.

vielas, kurām nav vajadzīga aktivācija:

etilmetānsulfonāts,

β-propiolaktons,

savienojumi, kam ir vajadzīga metaboliskā aktivācija:

2-acetilaminofluorēns,

4-dimetilaminoazobenzols,

7,12-dimetilbenzantracēns.

Koncentrācija ekspozīcijas laikā

Pārbaudāmā viela jāizmanto vairāku koncentrāciju diapazonā. Vielai šajā koncentrāciju diapazonā jāuzrāda toksicitāte, kas ir atkarīga no koncentrācijas, turklāt lielākās koncentrācijas ietekmē šūnu izdzīvošanai jābūt zemai, bet mazākās koncentrācijas ietekmē tai jābūt apmēram tādai pašai kā negatīvajā kontrolē. Vielas, kas samērā slikti šķīst ūdenī, pārbauda koncentrācijā, kas ir tuvu to šķīdības robežai, izmantojot piemērotu metodi. Netoksiskām vielām, kas pilnībā šķīst ūdenī, lielāko pārbaudāmo koncentrāciju nosaka katrā atsevišķā gadījumā.

Testa norise

Vajadzīgajā laika sprīdī, kas atkarīgs no izmantotās eksperimentālās sistēmas, šūnas pakļauj vielas iedarbībai un, ja izmanto garāku ekspozīcijas laiku, vielu var ievadīt atkārtoti, vienlaikus apmainot barotni (un vajadzības gadījumā arī metaboliskās aktivācijas sistēmu). Šūnām, kuru iekšējā metaboliskā aktivitāte nav pietiekami augsta, pārbaudāmo vielu pievieno gan kopā ar nepieciešamo metaboliskās aktivācijas sistēmu, gan bez tās. Beidzoties ekspozīcijas laikam, šūnas skalo, lai atbrīvotos no pārbaudāmās vielas, un, ievērojot apstākļus, kas ļauj izpausties transformēto šūnu fenotipam, kultivē tālāk, reģistrējot transformācijas biežumu. Visi iegūtie rezultāti jāapstiprina neatkarīgā eksperimentā.

2. DATI Dati jāapkopo tabulā atkarībā no izmantotās metodes, piemēram, norādot plašu skaitu, plates, kurās novērota transformācija, vai transformēto šūnu skaitu. Vajadzības gadījumā izdzīvojušo šūnu skaitu norāda procentos no attiecīgā skaita kontroles kultūrās un transformācijas biežumu aprēķina kā transformēto šūnu skaitu attiecībā pret izdzīvojušo šūnu skaitu. Dati jāizvērtē ar piemērotām statistikas metodēm.

3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA

3.

3.1. TESTA ZIŅOJUMS Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šādas ziņas:

izmantotais šūnu tips, šūnu kultūru skaits, šūnu kultivēšanas paņēmieni,

testa apstākļi (pārbaudāmās vielas koncentrācija, izmantotais šķīdinātājs/nesējviela, inkubācijas ilgums, ekspozīcijas ilgums un biežums, šūnu slāņa blīvums apstrādes laikā, izmantotās eksogēnās metaboliskās aktivācijas sistēmas tips, pozitīvā un negatīvā kontrole, kontrolējamā fenotipa raksturojums, selektīvā sistēma (ja izmanto), izvēlēto devu pamatojums),

izmantotā dzīvotspējīgu un transformētu šūnu uzskaites metode,

statistiskais novērtējums,

rezultātu iztirzājums,

rezultātu interpretācija.

3.2. IZVĒRTĒJUMS UN INTERPRETĀCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

B.22.

1. METODE

1.

1.1. IEVADS Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.2. DEFINĪCIJA Skatīt vispārīgā ievada B daļu.

1.3. STANDARTVIELAS Nav.

1.4. METODES BŪTĪBA Dominantās letāles izraisa embriju vai augļu bojāeju. Dominanto letāļu indukcija ķīmiskas vielas ietekmē norāda uz to, ka šī viela iedarbojas uz izmēģinājumu dzīvnieku ģeneratīvajiem audiem. Parasti uzskata, ka dominantās letāles rodas hromosomu bojājumu (strukturālu un skaitlisku anomāliju) rezultātā. Mātītēm pēc vielas iedarbības embriju bojāeja var iestāties arī toksicitātes ietekmē. Parasti tēviņus pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai un tad sapāro ar neapaugļotām mātītēm. Izmantojot secīgus pārošanas intervālus, var atsevišķi pārbaudīt [vielas ietekmi uz] katru dzimumšūnu attīstības stadiju. Par mirstību pēc implantācijas var secināt, ja aprēķina nedzīvo implantu skaita pieaugumu uz vienu mātīti apstrādātajā grupā attiecībā pret šo skaitu kontroles grupā. Mirstību pirms implantācijas var aplēst pēc dzelteno ķermeņu skaita vai salīdzinot implantu kopējo skaitu uz vienu mātīti apstrādes un kontroles grupā. Dominanto letāļu kopējo skaitu veido kopējā mirstība pirms un pēc implantācijas. Aprēķinot dominanto letāļu kopējo skaitu, salīdzina dzīvo implantu skaitu uz vienu mātīti izmēģinājumu grupā ar dzīvo implantu skaitu uz vienu mātīti kontroles grupā. Implantu skaita samazināšanās dažās grupās pēc pārošanās var būt izskaidrojama ar šūnu (t. i., spermatocītu un/vai spermatogoniju) bojāeju.

1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Nav.

1.6. METODES APRAKSTS

1.6. Sagatavošanas darbi

Pārbaudāmās vielas, ja iespējams, izšķīdina vai suspendē izotoniskā sāls šķīdumā. Ķīmiskas vielas, kas nešķīst ūdenī, var izšķīdināt vai suspendēt piemērotā šķīdinātājā. Izmantotais šķīdinātājs nedrīkst ietekmēt pārbaudāmās vielas iedarbību vai būt toksisks. Izmanto tikko pagatavotus pārbaudāmās vielas šķīdumus vai suspensijas.

Testa apstākļi

Ievadīšanas veids

Parasti pārbaudāmo vielu ievada tikai vienreiz. Pamatojoties uz toksikoloģijas datiem, var veikt atkārtotu apstrādi. Parasti izmanto perorālu intubāciju vai intraperitoniālu injekciju. Var izmantot arī citus aplikācijas veidus.

Izmēģinājumu dzīvnieki

Izmēģinājumos ieteicams izmantot žurkas vai peles. Veselus dzīvniekus, kas pilnībā sasnieguši dzimumgatavību, pēc nejaušības principa sadala kontroles un apstrādes grupās.

Dzīvnieku skaits un dzimums

Apstrādāto tēviņu skaits ir atkarīgs no analizējamās bioloģiskās pazīmes spontānās mainības biežuma. Izvēloties dzīvnieku skaitu, jau iepriekš jāapsver izmantotās metodes precizitāte un ticamības pakāpe. Piemēram, uzsākot eksperimentu, katrā dzīvnieku grupā, kas saņem vienādu devu, parasti jābūt tādam tēviņu skaitam, lai vienā pārošanās periodā varētu iegūt 30 līdz 50 grūsnu mātīšu.

Negatīvā un pozitīvā kontrole

Parasti katrā izmēģinājumā vienlaikus jāparedz pozitīvā un negatīvā (ar šķīdinātāju) kontrole. Ja tajā pašā laboratorijā nesen iegūti apmierinoši pozitīvās kontroles rezultāti, tos var izmantot jaunajā eksperimentā pozitīvās kontroles vietā. Pozitīvās kontroles vielas ievada samērā nelielā devā (piemēram, MMS, intraperitoniāli, 10 mg/kg), lai noteiktu metodes precizitāti.

Izmantotās devas

Parasti izmanto trīs dažādas devas. Jāizvēlas tāda lielākā deva, kas ir toksiska vai kuras ietekmē samazinās dzīvnieku auglība. Atsevišķos gadījumos var pietikt ar vienu lielu devu.

Iedarbīguma robežas noteikšana

Netoksisku vielu testēšanai izmanto 5 g/kg devu, ja to ievada vienreiz, vai 1 g/kg/dienā, ja to ievada atkārtoti.

Testa norise

Pastāv vairākas aplikācijas shēmas. Visbiežāk pārbaudāmo vielu ievada tikai vienreiz. Var izmantot arī citas aplikācijas shēmas. Katru atsevišķu tēviņu pēc apstrādes secīgi sapāro ar vienu vai divām neapaugļotām un neapstrādātām mātītēm, ievērojot vajadzīgos intervālus. Mātīte paliek kopā ar tēviņu vismaz vienu estrālo ciklu vai līdz brīdim, kad ir notikusi pārošanās, par ko liecina sperma vai embols makstī. Pārošanās reižu skaits pēc apstrādes ir atkarīgs no aplikācijas shēmas, un tam jāaptver visas dzimumšūnu attīstības stadijas. Mātītes nonāvē grūtniecības otrajā puslaikā un pārbauda dzemdes saturu, reģistrējot nedzīvo un dzīvo implantu skaitu. Dažreiz pārbauda olnīcas, lai noteiktu dzelteno ķermeņu skaitu.

2. DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot tēviņu skaitu, grūsno mātīšu skaitu, kā arī to mātīšu skaitu, kurām nav iestājusies grūtniecība. Atsevišķi jānorāda katras pārošanās rezultāti kopā ar katra tēviņa un mātītes raksturojumu. Katrai mātītei norāda pārošanās nedēļu, devu, ko saņēmis tēviņš, kā arī dzīvo un nedzīvo implantu skaitu. Aprēķinot kopējo dominanto letāļu skaitu, salīdzina dzīvo implantu skaitu uz vienu mātīti izmēģinājuma grupā ar dzīvo implantu skaitu uz vienu mātīti kontroles grupā. Lai noteiktu mirstību pēc implantācijas, salīdzina un analizē dzīvo un nedzīvo implantu attiecību apstrādāto dzīvnieku grupā un kontroles grupā. Ja atsevišķi reģistrē agrīnas un vēlīnas mirstības gadījumus, šie dati jāiekļauj tabulā. Ja ir aplēsta mirstība pirms implantācijas, tā jānorāda ziņojumā. Mirstību pirms implantācijas var aprēķināt pēc dzelteno ķermeņu un implantu skaita starpības vai pēc implantu vidējā skaita samazinājuma vienā dzemdē, salīdzinot ar kontroles dzīvnieku pārošanās rezultātiem. Datus izvērtē ar piemērotām statistikas metodēm.

izmantoto dzīvnieku suga, līnija, vecums un svars, dzīvnieku skaits izmēģinājumu un kontroles grupās pēc dzimuma,

pārbaudāmā viela, šķīdinātājs, pārbaudītās devas un izvēlēto devu pamatojums, negatīvā un pozitīvā kontrole, toksicitātes dati,

aplikācijas veids un shēma,

pārošanās shēma,

metode veiksmīgas pārošanās noteikšanai,

dzīvnieku nokaušanas brīdis,

dominanto letāļu uzskaites kritēriji,

vajadzības gadījumā, iedarbības atkarība no devas,

statistiskais novērtējums,

3231 more provisions are not shown here; each has its own address.

Versions

2008-05-30