Regolament tal-Kummissjoni (KE) nru 440/2008 tat-30 ta' Mejju 2008 li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skond ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH) (Test b'rilevanza għaż-ŻEE)

In forceVersion 2008-05-30from 2008-06-01

Grade B

mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.

Ask Gelex about this law

Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/mt

Contents

Preamble
ANNEX
A.1.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.4.
1.5. TABELLA: APPLIKABILITÀ TAL-METODI A. B. C. D.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
1.6.1.2 Apparat:
1.6.2.
1.6.4.
4.(1)(2)(3)(4)
A.2.
1.
1.4.
1.5. Tabella 1 Paragun tal-metodi
1.6.
1.6.4.
1.6.6.
2. Tabella 2 Temperatura – il-fatturi ta' korrezzjonijiet ft
A.3.
1.
1.4.
1.4.1.
3. Tabella 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.31.4.4. Applikabilità tal-metodi
3. Tabella 1.4.1.1.1.4.1.2. Applikabilità tal-metodi
3. Tabella 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Applikabilità tal-metodi
M4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
A.4.
1.
1.4.
1.5.1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.4.
1.6.4.2.
1.6.5.
1.6.6.
1.6.6.1. Gass inert:
1.6.6.2. Preparazzjoni tal-kolonna ta' saturazzjoni:
1.6.7.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
A.5.
1.
1.6.
1.6.4.
1.6.4.1.
1.6.4.1.3. Figura Korp tal-kejl
1.6.4.2.
1.6.4.2.2. Immuntar:
2. Tabella Korrezzjoni tat-tensjoni tas-superfiċje mkejla Għal soluzzjonijiet fl-ilma biss, ρ = 1 g/cm3
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.6.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Proċedura tat-test:
1.6.3.3. Apparat
1.6.3.4. Apparat (ara figuri 4 u 3)
1.6.4.
2.
3.
A.8.
1.
1.3. Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun
1.4.
1.5.
1.5.1. Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun
1.5.2. Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun
1.5.3. Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun
1.6.
1.6.2.
1.6.2.1.
1.6.2.3.
1.6.3.
1.6.3.1. Apparat
1.6.3.2. Kalkolu tal-ħin mejjet to
2. Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
A.9.
1.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Apparat Abel:
A.10.
1.
1.6.
1.6.2.
3.
A.11.
1.
1.6.
A.12.
1.
1.3.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
A.13.
1.
1.6.
1.6.2. a)
2.
A.14.
1.
1.1.
1.4.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.3.
1.6.3.2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.15.
1.
1.6.
A.16.
1.
1.6.
1.6.1.
4.
Figura 1 Disinn ta' kubu tat-test ta' 20 mm
Figura 2 Kurva tipika tat-temperatura/ħin
A.17.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
3.
3.2.
A.18.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.19.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.20.
1.
1.5.
1.5.4.
2.
3.
3.1.
A.21.
1.
1.6
1.6.1
1.6.1.2
2.
2.1 Tabella 1 Eżempji tar-riżultati
3.
3.2 a)
4.(1)
Figura 1 Reċipjent tal-Pressjoni
Figura 2 Stend għall-irfid
Figura 3 Sistema li tqabbad
1.
2.
4.
1.2 Għal sustanzi solidi
Appendiċi 1 Metodu ta' stima
DAĦLA
METODU TA' STIMA
PROĊEDURA TA' KALKOLU
RAPPORT
LETTERATURA
Appendiċi 2
Figura 1 Apparat għad-determinazzjoni tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar skond il-metodu dinamiku
Figura 2a Apparat għad-determinazzjoni tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar skond il-metodu statiku (bl-użu ta' manometru b'tubu-U)
Figura 2b Apparat għad-determinazzjoni tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar skond il-metodu statiku (bl-użu ta' indikatur tal-pressjoni)
Figura 3 Isoteniskopju (ara ir-referenza 7)
Figura 4 Apparat għad-determinazzjoni tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar skond il-metodu bil-miżien tal-pressjoni tal-fwar
Figura 5 Eżempju ta' apparat għall-evaporazzjoni fi pressjoni baxxa bil-metodu ta' effużjoni, b'volum ta' ċellula ta' effużjoni ta 8 cm3
Figura 6a Eżempju ta' sistema ta' fluss għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar bil-metodu ta' saturazzjoni bil-gass
Figura 6 b Eżempju ta' sistema għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar bil-metodu ta' saturazzjoni tal-gass, b'kapillari mqiegħed wara l-kopartiment ta' saturazzjoni.
Figura 7 Eżempju ta' apparat sperimentali armat għall-metodu ta' l-iskrun li jdur
Figura 8 Eżempju tal-parti ta' fuq li tintuża għall-kejl ta'skrun li jdur
Figura 1 Metodu ta' elużjoni ta' kolonna bil-pompa li tiċċirkola mill-ġdid
Figura 2 Mikro-kolonna tipika
Figura 3 Mikro-kolonna tipika
Figura 4 Metodu ta' elużjoni tal-kolonna b'reċipjent ta' invellar
METODI TA' KALKOLU Prinċipju tal-Metodi ta' Kalkolu
Il-metodu Hansch π-
Metodu Rekker
Il-metodu Hansch-Leo
Metodu Kombinat
i)
ii)
iii)
iv)
Appendici 2 Sustanzi ta' Referenza Rakkomandati għal Metodu HPLC
Figura Forom u aċċessorji għall-preparazzjoni tal-gozz
Figura Apparat
Eżempju ta' speċifikazzjoni ta' materjal għal test ta' sensittività termika (ara DIN 1623) (1)(2)(3)
Figura 1 Apparat għat-test tas-sensittività termika
Figura 2 Test tas-sensittività termika
Figura 3 Il-kalibrazzjoni tar-rata ta' tisħin għat-test tas-sensittività termika
Figura 4 Apparat għat-test bix-xokk
Figura 5 Apparat għas-sensittività tal-frizzjoni.
Figura Forma u aċċessorji għall-preparazzjoni tal-gozz
1.1.11.21.31.4
3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
PARTI B METODI GĦAD-DETERMINAZZJONI TAT-TOSSIĊITÀ U EFFETTI OĦRA TAS-SAĦĦA
DAĦLA ĠENERALI A.
B.1 BIS.
1.
1.4.
1.5.
1.5.3.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
B.1TRIS.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
B.2.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
3.1.
B.3.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. Valutazzjoni tat-tossiċità fis-sess l-ieħor.
3.
B.4.
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
Tabella I Il-Formazzjoni ta’ l-Eritema u l-Eskar Formazzjoni ta’ l-odema IGGRADAR TAR-REAZZJONIJIET TAL-ĠILDA
B.5.
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.2.3
1.4.2.7
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
Tabella I L-IGGRADAR TAL-FERITI OKULARI
Il-kornea
L-iris
Conjunctivae
Chemosis
B.6.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.2.
1.5.1.3.
L-osservazzjoni u l-iggradar: gruppi ta’ kontroll trattati
1.5.2.
1.5.2.2.
1.5.2.3.
3. Rapport tat-test (GPMT u t-test Buehler)
B.7.
1.
1.4.
1.4.2.
1.4.3.
3. IR-RAPPORT TAT-TEST
B.8.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
3.1.
pt_2
B.9.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
B.10.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
B.11.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
B.12.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
1.5.2.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
B.13/14.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
B.15.
1.
1.6. Preparazzjonijiet
L-attivazzjoni metabolika
Razez użati għat-test
Mezzi
L-użu ta’ kontrolli pożittivi u negattivi
Il-konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni
Kundizzjonijiet għall-inkubazzjoni
Frekwenzi ta’ tibil spontanju
Numru ta’ repliki
3.
B.16.
1.
1.6. Preparazzjonijiet
Attivazzjoni Metabolika
Razez użati għat-test
Mezzi
L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi
Il-konċentrazzjonijiet ta’ l-espożizzjoni
Kundizzjonijiet għall-inkubazzjoni
Frekwenzi ta’ rikombinazzjoni mitotika spontanja
Numru ta’ repliki
3.
B.17.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
B.18.
1.
1.6. Preparazzjonijiet
Numru ta’ kulturi
L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi
Konċentrazzjonijiet ta’ l-espożizzjoni
Ċelloli
L-attivazzjoni Metabolika
Preparazzjoni tal-kulturi
Trattament tal-kulturi bis-sustanza tat-test Hepatocytes primarji tal-ġrieden
Determinazzjonijiet awtoradjografiċi
Determinazzjonijiet LSC
2.
3.
B.19.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
B.20.
1.
1.6. Preparazzjonijiet
Stokk
Sustanza tat-test
In-numru ta’ annimali
Ir-rotta ta’ l-amministrazzjoni
L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi
Livelli ta’ espożizzjoni
3.
B.21
1.
1.6. Preparazzjonijiet
Ċelloli
Mezz
Sustanza tat-test
L-attivazzjoni metabolika
L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi
Konċentrazzjonijiet ta’ l-espożizzjoni
3.
B.22.
1.
1.6. Preparazzjonijiet
Rotta ta’ l-amministrazzjoni
Annimali sperimentali
In-numru u s-sess
L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi
Livell tad-doża
Test tal-limitu

IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ,

Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komuità Ewropea,

Wara li kkunsidrat ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-18 ta' Diċembru 2006 dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH), li jistabbilixxi Aġenzija Ewropea għas-Sustanzi Kimiċi, li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li jħassar ir-Regolament tal-Kunsill (KEE) Nru 793/93 u r-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 1488/94 kif ukoll id-Direttiva tal-Kunsill 76/769/KEE u d-Direttivi tal-Kummissjoni 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE, u b'mod partikolari l-Artikolu 13(3) tiegħu,

Billi:

(1) Skond ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006, metodi ta' ttestjar għandhom jiġu adottati fuq il-livell tal-Komunità għall-finijiet ta' testijiet fuq sustanzi fejn tali testijiet huma meħtieġa biex jiġġeneraw l-informazzjoni dwar il-karatteristiċi intrinsiċi ta' sustanzi.

(2) Id-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE tas-27 ta' Ġunju 1967 rigward l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-dispożizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta' sustanzi perikolużi stipulat, fl-Anness V, metodi għad-determinazzjoni tal-proprjetajiet fiżikokimiċi, it-tossiċità u l-ekotossiċità ta' sustanzi u preparati. L-Anness V għad-Direttiva 67/548/KEE tħassret bid-Direttiva 2006/121/KE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill, b'effett mill-1 ta' Ġunju 2008.

(3) Il-metodi ta' ttestjar li hemm fl-Anness V għad-Direttiva 67/548/KEE għandhom jiġu inkorporati f'dan ir-Regolament.

(4) Dan ir-Regolament ma jeskludix l-użu ta' metodi oħra ta' l-ittestjar, sakemm l-użu tagħhom ikun kompatibbli ma' l-Artikolu 13(3) tar-Regolament 1907/2006.

(5) Il-prinċipji tas-sostituzzjoni, it-tnaqqis u l-irfinar ta' l-użu ta' l-annimali fi proċeduri għandhom jiġu kkunsidrati bis-sħiħ fid-disinn tal-metodi ta' ttestjar, partikolarment meta metodi f'lokhom u validati jsiru disponibbli biex jissostitwixxu, inaqqsu jew jirfinaw l-ittestjar fuq l-annimali.

(6) Id-dispożizzjonijiet ta' dan ir-Regolament huma konformi ma' l-opinjoni tal-Kumitat stabbilit skond l-Artikolu 133 tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006,

ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT:

Artikolu 1 Il-metodi ta' ttestjar li għandhom jiġu applikati għall-finijiet tar-Regolament 1907/2006/KE huma stipulati fl-Anness għal dan ir-Regolament.

Artikolu 2 Il-Kummissjoni għandha teżamina mill-ġdid, meta dan ikun f'loku, il-metodi ta' ttestjar li fih dan ir-Regolament, bil-għan li tissostitwixxi, tnaqqas jew tirfina l-ittestjar fuq l-annimali vertebrati.

Artikolu 3 Ir-referenzi kollha għall-Anness V għad-Direttiva 67/548/KEE għandhom jinftiehmu bħala referenzi għal dan ir-Regolament.

Artikolu 4 Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fl-għoxrin jum wara dak tal-pubblikazzjoni tiegħu fil-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea.

Għandu japplika mill-1 ta' Ġunju 2008. Magħmul fi Brussell, 30 ta' Mejju 2008. Għall-Kummissjoni Stavros Dimas Membru tal-Kummissjoni

ANNEX

ANNESS PARTI A: METODI GĦAD-DETERMINAZZJONI TAL-PROPRJETAJIET FIŻIKO-KIMIĊI

A.1. TEMPERATURA TA' TIDWIB/IFFRIŻAR

A.1.

1. METODU Il-maġġoranza tal-metodi mfissra huma bbażati fuq il-linja gwida ta' l-OECD Test (1). Il-prinċipji fundamentali huma mogħtija fir-referenzi (2) u (3).

1.

1.1. DAĦLA Il-metodi u l-apparati mfissra għandhom ikunu applikati għad-determinazzjoni tat-temperatura ta' tidwib ta' sustanzi, mingħajr ebda restrizzjoni fir-rigward tal-grad ta' purità tagħhom. L-għażla tal-metodu hija dipendenti fuq in-natura tas-sustanza li se tiġi ttestjata. Bħala konsegwenza l-fattur ta' limitazzjoni jkun skond, jekk is-sustanza tistax tiġi mfarrka malajr jew le, b'diffikultà, jew xejn affattu. Għal xi sustanzi, id-determinazzjoni tat-temperatura ta' l-iffriżar jew solidifikazzjoni hija aktar xierqa u l-istandards għal dawn id-determinazzjonijiet ġew inklużi wkoll f'dan il-metodu. Fejn, minħabba il-proprjetajiet partikulari tas-sustanza, ebda wieħed mill-parametri t'hawn fuq ma jista' jkun mkejjel b'mod konvenjenti, punt ta' tferriegħ jista' jkun xieraq.

1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET It-temperatura tat-tidwib hija mfissra bħala t-temperatura li fiha t-transizzjoni f’fażi minn stat solidu għal dak likwidu ssir fi pressjoni atmosferika u din it-temperatura tikkorrispondi idealment mat-temperatura ta' l-iffriżar. Peress li t-transizzjoni f’fażi ta' bosta sustanzi titwettaq fuq skala ta' temperatura, ta' spiss hija mfissra bħala l-iskala tat-tidwib. Konverżjoni ta' unitajiet (K għal oC) t = T -273,15 t Temperatura Celsius, grad Celsius ( oC) T temperatura termodinamika, kelvin (K)

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA Sustanzi ta' referenza mhumiex meħtieġa li jintużaw fil-każijiet kollha meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma għandhom iservu primarjament biex jiċċekkjaw ir-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra. Xi sustanzi ta' kalibrazzjoni huma mniżżla fir-referenzi (4).

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR It-temperatura (l-iskala tat-temperatura) tat-transizzjoni f’fażi mill-istat solidu għal dak likwidu jew mill-istat likwidu għal dak solidu hija determinata. Fil-prattika waqt it-tisħin/tkessiħ ta' kampjun tas-sustanza għall-ittestjar fi pressjoni atmosferika t-temperaturi ta' tidwib/iffriżar inizjali u l-istadju finali tat-tidwib/iffriżar jiġu determinati. Ħames tipi ta' metodi huma mfissra, jiġifieri metodu kapillari, metodi ta' uċuh ta'sħana, determinazzjonijiet ta' temperatura ta' ffriżar, metodi ta' analiżi termika, u determinazzjoni ta' punt ta' tferriegħ (kif żviluppat għaż-żjut tal-pitrolju). F’ċerti każijiet, jista' jkun konvenjenti li titkejjel it-temperatura ta' l-iffriżar flok it-temperatura ta' tidwib.

1.4.

1.4.1. Metodu kapillari

1.4.1.

1.4.1.1. Apparati li jiffissaw it-temperatura tat- tidwib b'banju ta' likwidu Ammont żgħir tas-sustanza mfarrka sewwa jitpoġġa f’tubu kapillari u jiġi ppakkjat sewwa. It-tubu jissaħħan, flimkien ma' termometru, u ż-żieda fit-temperatura tiġi aġġustata għal inqas minn madwar l K/min matul it-tidwib innifsu. It-temperaturi tat-tidwib inizjali u finali jiġu determinati.

1.4.1.2. Apparati li jiffissaw it-temperatura tat-tidwib bi blokka tal-metall Kif imfisser taħt 1.4.1.1., ħlief li t-tubu kapillari u t-termometru jitpoġġew fi blokka msaħħna tal-metall, u jistgħu jkunu osservati minn ġo toqob fil-blokka.

1.4.1.3. Determinazzjoni permezz ta' fotoċellula Il-kampjun fit-tubu kapillari huwa msaħħan awtomatikament f'ċilindru tal-metall. Raġġ ta' dawl huwa dirett minn ġos-sustanza, permezz ta' toqba fiċ-ċilindru, sa fotoċellula kalibrata b'mod preċiż. Il-proprjetajiet ottiċi ta' ħafna sustanzi jinbidlu minn opak għal trasparenti meta jkunu qed jiddewbu. L-intensità tad-dawl li tilħaq lill-fotoċellula tiżdied u tibgħat sinjal ta' waqfien lill-indikatur diġitali li jkun qed jaqra t-temperatura tat-termometru ta' reżistenza tal-platinu li jkun jinsab fil-kompartiment tat-tisħin. Dan il-metodu mhuwiex adattat għal xi sustanzi b'kuluri qawwija.

1.4.2. Uċuh ta' Sħana

1.4.2.

1.4.2.1. Il-bank sħun Kofler Il-bank sħun Kofler juża biċċtejn tal-metall ta' konduttività termika differenti, imsaħħna b'mod elettriku, bil-bank iddisinjat sabiex il-gradjent tat-temperatura huwa kwazi lineari matul it-tul tiegħu. It-temperatura tal-bank sħun tista' tinfirex minn 283 sa 573 K b'apparat speċjali li jaqra t-temperatura li jinkludi runner b'indiċi u marka ta' identifikazzjoni maħsubin għall-bank speċifiku. Bil-għan li tkun determinata temperatura tat-tidwib, is-sustanza titqiegħed, f’saff irqiq, direttament fuq il-wiċċ tal-bank sħun. Fi ftit sekondi tiżviluppa linja ta' separazzjoni netta bejn il-fażi fluwida u dik solida. It-temperatura fil-linja ta' separazzjoni tinqara bl-aġġustament ta' l-indiċi mal-bqija tal-linja.

1.4.2.2. Mikroskopju tat-tidwib Bosta uċuh sħan tal-mikroskopju jintużaw għad-determinazzjoni tat-temperaturi tat-tidwib bi kwantitajiet żgħar ferm ta' materjal. F'ħafna minn dawn l-uċuh sħan it-temperatura titkejjel b'termokoppja sensittiva iżda xi drabi jintużaw termometri tal-merkurju. Apparat tipiku għad-determinazzjoni tal-punt tat-tidwib fi stadju sħun għandu kompartiment ta' sħana li fiha pjanċa metallika li fuqha jitqiegħed il-kampjun fuq slide. Iċ-ċentru tal-pjanċa metallika għandu toqba li tippermetti d-dħul tad-dawl mill-mera illuminanti tal-mikroskopju. Meta tkun qed tintuża, il-kompartiment tingħalaq bi pjanċa tal-ħġieġ biex teskludi l-arja miż-żona tal-kampjun. It-tisħin tal-kampjun huwa regolat minn reostat. Għal kejl preċiż ħafna fuq sustanzi ottikament anisotropiċi, jista' jintuża dawl polarizzat.

1.4.2.3. Metodu tal-menisku Dan il-metodu jintuża b'mod speċifiku għal poliamidi It-temperatura li fiha l-ispostament tal-menisku taż-żejt tas-silikone, maqbud bejn il-wiċċ sħun u għatu tal-ħġieġ sostnut mill-kampjun tal-poliamide li jkun qed jigi ttestjat.

1.4.3. Metodu biex tkun determinata t-temperatura ta' l-iffriżar Il-kampjun jitpoġġa f’tubu tat-testijiet speċjali u jitpoġġa f’apparat għad-determinazzjoni tat-temperatura ta' l-iffriżar. Il-kampjun jiġi mħawwad b'ġentilezza u kontinwament matul it-tkessiħ u t-temperatura tiġi mkejla f’intervalli adattati. Hekk kif it-temperatura tibqa' kostanti għal qari din it-temperatura (korretta għall-iżball tat-termometru) tiġi reġistrata bħala t-temperatura ta' l-iffriżar. Għandu jkun evitat is-supercooling billi jinżamm l-ekwilibriju bejn il-fażijiet solidi u likwidi.

1.4.4. Analiżi termika

1.4.4.

1.4.4.1 Analiżi termika differenzjali (ATD) Din it-teknika tirreġistra d-differenza fit-temperaturi bejn is-sustanza u l-materjal ta' referenza bħala funzjoni tat-temperatura, waqt li s-sustanza u l-materjal ta' referenza huma suġġetti għall-istess programm ta' temperatura kontrollata. Meta l-kampjun jgħaddi minn transizzjoni li tinvolvi bidla ta' entalpija, dik il-bidla hija indikata b'devjazzjoni endotermika (tidwib) jew eżotermika (iffriżar) mil-linja tal-bażi tar-reġistru tat-temperatura.

1.4.4.2 Kalorimetrija differenzjali ta'l-iskennjar (KDS) Din it-teknika tirreġistra d-differenza fl-enerġija introdotta f’sustanza u dik introdotta f'materjal ta' referenza, bħala funzjoni tat-temperatura, waqt li s-sustanza u l-materjal ta' referenza huma suġġetti għall-istess programm ta' temperatura kontrollata. Din l-enerġija hija l-enerġija meħtieġa biex tinżamm żero d-differenza tat-temperatura bejn is-sustanza u l-materjal ta' referenza. Meta l-kampjun jgħaddi minn transizzjoni li tinvolvi bidla ta' entalpija, dik il-bidla hija indikata b'devjazzjoni endotermika (tidwib) jew eżotermika (iffriżar) mil-linja ta' bażi tar-reġistru tal-fluss tas-sħana.

1.4.5. Punt ta' tferriegħ Dan il-metodu kien żviluppat biex jintużaw maż-żjut tal-pitrolju u huwa adattat għal użu ma' sustanzi żejtnin b'temperaturi baxxi ta' l-iffriżar. Wara tisħin preliminari, il-kampjun jitkessaħ b'rata speċifika u eżaminat f’intervalli ta' 3 K għall-karatteristiċi tat-tferriegħ. L-inqas temperatura li fiha jiġi osservat moviment tas-sustanza tiġi reġistrata bħala l-punt ta' tferrigħ.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ L-applikabilità u l-eżattezza tal-metodi differenti użati għad-determinazzjoni tat-temperatura tat-tidwib/skala tat-tidwib huma mniżżla fit-tabella li ġejja:

1.5. TABELLA: APPLIKABILITÀ TAL-METODI A. B. C. D.

Metodi kapillari Metodu ta' kejl Sustanzi li jistgħu jitfarrku Sustanzi li ma jintaħnux malajr Skala ta' temperatura Kalkolu ta' l-eżattezza Standards eżistenti Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib b'banju ta' likwidu iva għal ftit biss 273 sa 573 K ±0,3 K JIS K 0064 Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib bi blokka tal-metall iva għal ftit biss 293 sa >573 K ±0,5 K ISO 1218(E) Determinazzjoni permezz ta' fotoċellula iva Bosta b'apparati ta' tagħmir 253 sa 573 K ±0,5 K Uċuh sħan u metodi ta' ffriżar Metodu ta' kejl Sustanzi li jistgħu jitfarrku Sustanzi li ma jitfarrkux malajr Skala ta' temperatura Kalkolu ta' l-eżattezza Standards eżistenti Il-bank sħun Kofler iva le 283 sa >573 K ± 1K ANSI/ASTM D 3451-76 Mikroskopju tat-tidwib iva għal ftit biss 273 sa >573 K ±0,5 K DIN 53736 Metodu tal-menisku le Speċifikament għal poliamidi 293 sa >573 K ±0,5 K ISO 1218(E) Temperatura ta' l-iffriżar iva iva 223 sa 573 K ±0,5 K eż. BS 4695 Analiżi termika Metodu ta' kejl Sustanzi li jistgħu jitfarrku Sustanzi li ma jitfarrkux malajr Skala ta' temperatura Kalkolu ta' l-eżattezza Standards eżistenti Analiżi termika differenzjali iva Iva 173 sa 1273 K sa 600 K ±0,5 K sa 1273 K ±2,0K ASTM E 537-76 Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar iva iva 173 sa 1273 K sa 600 K ±0,5K sa 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Punt ta' tferrigħ Metodu ta' kejl Sustanzi li jistgħu jitfarrku Sustanzi li ma jitfarrkux malajr Skala ta' temperatura Kalkolu ta' l-eżattezza Standards eżistenti Punt ta' tferrigħ għal żjut tal-pitrolju u sustanzi żejtnin għal żjut tal-pitrolju u sustanzi żejtnin 223 sa 323 K ±0,3 K ASTM D 97-66

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODI Il-proċeduri għal kważi l-metodi ta' ttestjar kollha tfissru fi standards internazzjonali u nazzjonali (Ara Appendiċi 1)

1.6.

1.6.1. Metodi permezz ta' tubu kapillari Meta jkunu suġġetti għal żieda bil-mod tat-temperatura, sustanzi mfarrka f’mod fin is-soltu juru l-istadji ta' tidwib murija fil-figura 1.

1.6.1.

Figura 1 Stadju A Stadju B Stadju C Stadju D Stadju E Stadju A (Bidu tat-tidwib): Qtar żgħar jeħlu b’mod uniformi ma’ ġewwa tat-tubu kapillari Stadju B jidher spazju vojt bejn il-kampjun u l-ġewwa tat-tubu minħabba li t-tidwiba tiċkien Stadju C il-kampjun mċekken jibda jikkollassa ‘l isfel u jillikwifa ruħu Stadju D menisku komplet jiġi ffurmat fil-wiċċ iżda ammont apprezzabbli tal-kampjun jibqa’ solidu Stadju E (FI-istadju finali tat-tidwib): ma hemm ebda partikuli solidi Matul id-determinazzjoni tat-temperatura tat-tidwib, it-temperaturi jiġu reġistrati fil-bidu ta' l-istadju tat-tidwib u b'dak finali.

1.6.1.1. Tagħmir li jiffissa t-temperatura ta' tidwib b'apparat ta' banju ta' likwidu Il-Figura 2 turi tip ta' apparat standardizzat tat-temperatura ta' tidwib magħmul mill-ħġieġ (JIS K 0064); l-ispeċifikazzjonijiet kollha huma b'millimetri.

1.6.1.1.

Figura 2 A: Reċipjent tal-kejl B: Tapp C: Fetħa D: Termometru E: Termometru awżiljarju F: Banju ta’ likwidu G: Tubu kapillari magħmul mill-ħġieġ, minn 80 sa 100 mm fit-tul 1,0 ± 0,2 mm dijametru intern, minn 0,2 sa 0,3 mm ħxuna tas-superfiċje tat-tubu H: Tubu tal-ġenb

Banju ta' likwidu:

Għandu jingħażel likwidu adattat. L-għażla tal-likwidu tiddependi fuq it-temperatura tat-tidwib li għandha tiġi determinata, eż. paraffin likwidu għal temperaturi tad-tidwib mhux ogħla minn 473 K, żejt tas-silikone għal temperaturi tat-tidwib mhux ogħla minn 573 K Għal temperaturi tat-tidwib fuq il-523 K, tista' tintuża taħlita li tikkonsisti minn tliet partijiet aċidu sulfuriku u żewġ partijiet sulfat tal-potassju (fi proporzjon tal-piż). Għandhom jittieħdu prekawzjonijiet xierqa jekk tintuża taħlita bħal din.

Termometru:

Għandhom jintużaw biss dawk it-termometri li jissodisfaw ir-rekwiżiti ta' l-istandards li ġejjin jew l-ekwivalenti tagħhom: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Proċedura:

Is-sustanza niexfa titfarrak b'mod fin ħafna fi trab u titpoġġa f’tubu kapillari, magħluq f’tarf minnhom, bil-għan li l-livell tal-mili jkun approssimattivament 3 mm wara li jkun ippakkjat sewwa. Biex jinkiseb kampjun ippakkjat uniformi, it-tubu kapillari għandha jitwaqqa' minn għoli approssimattiv ta' 700 mm minn tubu tal-ħġieġ b'mod vertikali fuq watchg. It-tubu kapillari mimli jitpoġġa fil-banju sabiex il-parti tan-nofs tal-bozza tal-merkurju tat-termometru tmiss it-tubu kapillari fil-parti fejn hemm il-kampjun. Is-soltu t-tubu kapillari jiġi introdott fl-apparat madwar 10 K taħt it-temperatura tat-tidwib. Il-banju ta' likwidu jissaħħan sabiex it-temperatura ogħla sa approssimattivament 3 K/min. Il-likwidu għandu jitħawwad. F’madwar 10 K taħt it-temperatura tat-tidwib mistennija r-rata taż-żieda fit-temperatura tiġi aġġustata għal massimu ta' 1 K/min.

Kalkolu:

Il-kalkolu tat-temperatura tat-tidwib hija kif ġej: T = TD+0,00016 (TD -TE) n fejn: T it-temperatura tat-tidwib korretta f’K TD qari tat-temperatura mit-termometru D f’K TE qari tat-temperatura mit-termometru E f’K n numru ta' gradazzjonijiet tal-ħajta tal-merkurju fuq termometru D fil-parti li qiegħda fil-wiċċ ta' l-ilma

1.6.1.2 Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib bi blokka tal-metall

1.6.1.2 Apparat:

Dan jikkonsist fi:

blokka ċilindrika tal-metall, li l-parti ta' fuq tagħha hija konkava u tifforma kompartiment (ara figura 3),

tapp tal-metall, b'żewġ toqob jew aktar, li jippermetti li tubi jiġu mmuntati fil-blokka tal-metall,

sistema ta' tisħin, għall-blokka tal-metall, provduta, eż., minn reżistenza elettrika inkorporata fil-blokka,

reostat għar-regolazzjoni tal-qawwa applikata, jekk jintuża tisħin elettriku.

erba' twieqi ta' ħġieġ li jiflaħ għas-sħana fuq il-ġnub laterali tal-kompartiment, imqiegħda dijametrikalment f’anglu rett ma' xulxin. Quddiem waħda minnhom tkun immuntata lenti għall-osservazzjoni tat-tubu kapillari. It-tliet twieqi l-oħra jintużaw biex jinxtegħel l-intern permezz ta' lampi,

tubu kapillari ta' ħġieġ li jirreżisti s-sħana magħluq minn naħa waħda (ara 1.6.1.1).

Ara l-istandards imsemmija f’ 1.6.1.1. Jistgħu jintużaw ukoll apparati tal-kejl termoelettriċi b'eżattezza komparabbli.

Figura 3 Termometru Tubu kapillari Tapp tal-metall Lenti Lampa Reżistenza elettrika Blokka tal-metall għat-tisħin

1.6.1.3. Determinazzjoni permezz ta' fotoċellula Apparat u proċedura: L-apparat jikkonsisti f’ kompartiment tal-metall b'sistema awtomatizzata ta' tisħin. Tliet kapillari jimtlew skond il-1.6.1.1. u jitpoġġew fil-forn. Huma disponibbli bosta żidiet lineari biex ikun kalibrat l-apparat u ż-żieda adattata fit-temperatura hija aġġustata bl-elettriku b'rata kostanti u lineari magħżula minn qabel. Reġistri juru t-temperatura attwali fil-forn u t-temperatura tas-sustanza fit-tubi kapillari.

1.6.2. Uċuh sħan

1.6.2.

1.6.2.1. Il-bank sħun Kofler Ara l-Appendiċi

1.6.2.2. Mikroskopju tat-tidwib Ara l-Appendiċi

1.6.2.3. Metodu tal-menisku (poliamidi) Ara l-Appendiċi Ir-rata tat-tisħin mit-temperatura tat-tidwib għandha tkun inqas minn 1 K/min.

1.6.3. Metodi għad-determinazzjoni tat-temperatura ta' l-iffriżar Ara l-Appendiċi

1.6.4. Analiżi termika

1.6.4.

1.6.4.1. Analiżi termika differenzjali Ara l-Appendiċi

1.6.4.2. Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar Ara l-Appendiċi

1.6.5. Determinazzjoni tal-punt tat-tferrigħ Ara l-Appendiċi

2. DATA Korrezzjoni tat-termometru hija neċessarja f’ xi każijiet.

3. RAPPURTAR Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja: Il-medja talanqas żewġ kejlijiet li huma fl-iskala ta' l-eżattezza kalkulata (ara t-tabelli) hija reġistrata bħala t-temperatura tat-tidwib. Jekk id-differenza bejn it-temperatura fil-bidu u fl-istadju finali tat-tidwib hija fil-limiti ta' l-eżattezza tal-metodu, it-temperatura fl-istadju finali tat-tidwib tittieħed bħala t-temperatura tat-tidwib; inkella ż-żewġ temperaturi għandhom ikunu rapportati. Jekk is-sustanza tiddekomponi jew tissaffa bis-sublimazzjoni qabel ma tintlaħaq it-temperatura, it-temperatura li fiha jiġi osservat l-effett għandha tkun rapportata. L-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rapportati, b'mod speċjali fir-rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.

metodu użat

speċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet) u l-pass preliminari ta' purifikazzjoni, jekk ikun hemm,

kalkolu ta' l-eżattezza

4.(1)(2)(3)(4)

REFERENZI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803–834. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505–515.

A.2. TEMPERATURA TAT-TGĦOLIJA

A.2.

1. METODU Il-maġġoranza tal-metodi mfissra huma bbażati fuq il-linjagwida tat-Test OECD (1). Il-prinċipji fundamentali huma mogħtija fir-referenzi (2) u (3).

1.

1.1. DAĦLA Il-metodi u l-apparati mfissra hawnhekk jistgħu jiġu applikati għal likwidu u għal sustanzi li jiddewbu bil-mod f’ temperatura baxxa, bil-kondizzjoni li dawn ma jkollhomx xi reazzjoni kimika taħt it-temperatura tat-tgħolija (eż.: awto-ossidazzjoni, traspożizzjoni, degradazzjoni, eċċ.). Il-metodi jistgħu jiġu applikati għal sustanzi likwidi puri u impuri. Issir enfasi fuq il-metodi li jużaw osservazzjoni permezz ta' fotoċellula u analiżi termika, għaliex dawn il-metodi jippermettu d-determinazzjoni tat-temperaturi tat-tidwib kif ukoll dawk tat-tgħolija. Barra dan, il-kejlijiet jistgħu jsiru b'mod awtomatiku. Il-metodu dinamiku għandu l-vantaġġ li jista' jiġi applikat ukoll għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar u mhuwiex neċessarju li t-temperatura tat-tgħolija tkun korretta sal-pressjoni normali (101,325 kPa) għaliex il-pressjoni normali tista' tiġi aġġustata matul il-kejl minn manostat. Rimarki: L-influwenza ta' impuritajiet fuq id-determinazzjoni tat-temperatura tat-tgħolija tiddependi l-aktar fuq in-natura ta' l-impurità. Meta fil-kampjun ikun hemm impuritajiet volatili, li jistgħu jaffetwaw ir-riżultati, is-sustanza tista' tiġi ppurifikata.

1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET It-temperatura normali tat-tgħolija hija mfissra bħala t-temperatura li fiha l-pressjoni tal-fwar tal-likwidu hija 101,325 kPa. Jekk it-temperatura tat-tgħolija ma titkejjilx fi pressjoni atmosferika normali, id-dependenza tat-temperatura fuq il-pressjoni tal-fwar tista' tiġi deskritta bl-ekwazzjoni Clausius-Clapeyron: log p = Δ Hv2,3 RT+const. fejn: P il-pressjoni tal-fwar tas-sustanza f’ pascals ΔHv is-sħana ta' evaporizzazzjoni tiegħu f’ J mol-1 R il-kostanti universali molari tal-gass = 8,314 mol-1 K-1 T it-temperatura termodinamika, f’ K It-temperatura tat-tgħolija hija murija skond il-pressjoni ta' l-ambjent matul il-kejl. Bdil Pressjoni (unitajiet: kPa) 100 kPa 1 bar = 0,1 MPa (bar għadha permessa iżda mhux rakkomandata) 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (l-unitajiet mm Hg u Tor mhumiex permessi). 1 atm atmosfera standard = 101325 Pa (l-unità atm mhix permessa). Temperatura (unitajiet: K) t = T -273,15 K t temperatura Celsius, grad Celsius ( oC) T temperatura termodinamika, kelvin (K)

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA M'hemmx bżonn li jintużaw sustanzi ta' referenza fil-każijietjiet kollha kull meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma primarjament qegħdin biex ikun iċċekkjat ir-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu paragun ma' riżultati minn metodi oħra. Xi sustanzi ta' kalibrazzjoni jinsabu fil-metodi elenkati fl-Appendiċi.

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU TA' L-ITTESTJAR Ħames metodi għad-determinazzjoni tat-temperatura tat-tgħolija (skala tat-temperatura tat-tgħolija) huma bbażati fuq il-kejl tat-temperatura tat-tgħolija, tnejn oħra huma bbażati fuq analiżi termika.

1.4.

1.4.1. Determinazzjoni bl-użu ta' l-ebulliometer L-ebulliometers kienu żviluppati oriġinarjament għad-determinazzjoni tal-piż molekulari permezz taż-żieda fit-temperatura tat-tgħolija, iżda huma adattati wkoll għal kejl eżatt tat-temperatura tat-tgħolija. Apparat sempliċi ħafna huwa mfisser fl-ASTM D 1120-72 (ara l-Appendiċi). Il-likwidu jissaħħan f’ dan l-apparat taħt kondizzjonijiet ta' ekwilibriju fi pressjoni atmosferika sakemm jiftaħ jagħli.

1.4.2. Metodu dinamiku Dan il-metodu jinvolvi il-kejl tat-temperatura tar-rikondensazzjoni tal-fwar permezz ta' termometru adattat fir-rifluss waqt it-tgħolija. B'dan il-metodu l-pressjoni tista' tiġi varjata.

1.4.3. Metodu ta' distillazzjoni għat-temperatura tat-tgħolija Dan il-metodu jinvolvi d-distillazzjoni tal-likwidu u l-kejl tat-temperatura tar-rikondensazzjoni tal-fwar u d-determinazzjoni ta' l-ammont ta' l-iddistillat.

1.4.4. Metodu skond Siwoloboff Kampjun jissaħħan f’ tubu għall-kampjun, li jkun mgħaddas f’ likwidu ġo banju sħun. Kapillari mgħaqqda, li fiha bużżieqa ta' l-arja fil-parti t'isfel, tiġi mgħaddsa fit-tubu bil-kampjun.

1.4.5. Determinazzjoni permezz ta' fotoċellula Skond il-prinċipju Siwoloboff, kejl foto-elettriku awtomatiku jsir bit-tlugħ tal-bżieżaq.

1.4.6. Analiżi termika differenzjali Din it-teknika tirreġistra d-differenza fit-temperaturi bejn is-sustanza u l-materjal ta' referenza bħala funzjoni tat-temperatura, waqt li s-sustanza u l-materjal ta' referenza huma suġġetti għall-istess programm kontrollat ta' temperatura. Meta l-kampjun jgħaddi minn transizzjoni li tinvolvi bidla ta' entalpija, dik il-bidla hija indikata b'devjazzjoni endotermika (tidwib) jew eżotermika (iffriżar) mil-linja ta' bażi tar-reġistru tat-temperatura.

1.4.7. Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar Din it-teknika tirreġistra d-differenza fl-enerġija introdotta f’ sustanza u dik introdotta f'materjal ta' referenza, bħala funzjoni tat-temperatura, waqt li s-sustanza u l-materjal ta' referenza huma suġġetti għall-istess programm kontrollat ta' temperatura. Din l-enerġija hija l-enerġija meħtieġa biex id-differenza tat-temperatura bejn is-sustanza u l-materjal ta' referenza tinżamm żero. Meta l-kampjun jgħaddi minn transizzjoni li tinvolvi bidla ta' entalpija, dik il-bidla hija indikata b'devjazzjoni endotermika (tgħolija) mil-linja ta' bażi tar-reġistru tal-fluss tas-sħana.

1.5. Tabella 1 Paragun tal-metodi

KRITERJI TA' KWALITÀ L-applikabbiltà u l-eżattezza tal-metodi differenti użati għad-determinazzjoni tat-temperatura tat-tgħolija/ta' l-iskala tat-tgħolija huma mniżżla fit-tabella 1: Metodu ta' kejl Kalkolu ta' l-eżattezza Standard eżistenti L-ebulliometer ±1,4 K (sa 373 K) ±2,5 K (sa 600 K) ASTM D 1120-72 Il-metodu dinamiku ±0,5 K (sa 600 K) Il-proċess ta' distillazzjoni (skala ta'tgħolija) ±0,5 K (sa 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Il-metodu skond Siwoloboff ± 2 K (sa 600 K) Osservazzjoni permezz ta' fotoċellula ±0,3 K (sa 373 K) Il-kalorimetrija termika differenzjali ±0,5 K (sa 600 K) ±2,0 K (sa 1273 K) ASTM E 537-76 Il-kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar ±0,5 K (sa 600 K) ±2,0 K (sa 1273 K) ASTM E 537-76

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODI Kważi l-proċeduri għall-metodi ta' ttestjar kollhatfissru fi standards internazzjonali u nazzjonali (Ara l-Appendiċi).

1.6.

1.6.1. L-ebulliometer Ara l-Appendiċi.

1.6.2. Il-metodu dinamiku Ara l-metodu ta' ttestjar A.4. għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar. It-temperatura tat-tgħolija osservata bi pressjoni applikata ta' 101,325 kPa hija reġistrata.

1.6.3. Il-proċess ta' distillazzjoni (skala tat-tgħolija) Ara l-Appendiċi.

1.6.4. Il-metodu skond Siwoloboff Il-kampjun jissaħħan f'apparat ta' temperatura tat-tidwib f'tubu għall-kampjun, b'dijametru ta' approssimattivament 5 mm (figura 1). Il-figura 1 turi tip ta' apparat standardizzat ta' temperatura tat-tidwib u tat-tgħolija (JIS K 0064) (magħmul mill-ħġieġ, l-ispeċifikazzjonijiet kollha f’ millimetri). Tubu kapillari (kapillari tat-tgħolija) li huwa magħluq madwar 1 cm ’il fuq mill-parti t’isfel tat-tubu jitpoġġa fit-tubu għall-kampjun. Is-sustanza tat-test tiżdied sa livell tali li l-parti mgħaqqda tal-kapillari tkun taħt il-wiċċ tal-likwidu. It-tubu għall-kampjun li fih il-kapillari tat-tgħolija huwa marbut mat-termometru permezz ta' lastiku jew huwa mwaħħal b'irfid mal-ġenb (ara figura 2). Figura 2 Il-prinċipju skond Siwoloboff Figura 3 Il-prinċipju mmodifikat Il-banju ta' likwidu jintgħażel skond it-temperatura tat-tgħolija. F’ temperaturi ta' 573 K, jista' jintuża żejt tas-silikone. Il-paraffina likwida tista' tintuża biss sa 473 K. Għall-bidu t-tisħin tal-banju ta'likwidu għandu jkun aġġustat sa żieda fit-temperatura ta' 3 K/min. Il-banju ta' likwidu jrid jitħawwad. F’ madwar 10 K taħt it-temperatura tat-tgħolija mistennija, it-tisħin jitnaqqas sabiex ir-rata fiż-żieda tat-temperatura tkun anqas minn 1 K/min. Meta tkun se tintlaħaq it-temperatura tat-tgħolija, jibdew jitfaċċaw b'mod rapidu bżieżaq fil-kapillari li tkun qed tagħli. It-temperatura tat-tgħolija hija dik it-temperatura li, fil-waqt ta' tkessiħ momentarju, is-serje ta' bżieżaq tieqaf u l-fluwidu f’ daqqa waħda jerġa' jibda tiegħla fil-kapillari. Il-qari korrispondenti tat-termometru huwa t-temperatura tat-tgħolija tas-sustanza. Fil-prinċipju mmodifikat (figura 3) t-temperatura tat-tgħolija hija ddeterminata f’kapillari ta' temperatura tat-tidwib. Hija tiġġebbed sa punt fin ta' madwar 2 cm fit-tul (a) u ammont żgħir tal-kampjun jinġibed ’il fuq. Il-parti l-miftuħa tal-kapillari fin tingħalaq billi tiddewweb, b'mod li jkun hemm buieqa ta' l-arja fit-tarf. Waqt it-tisħin fl-apparat tat-temperatura tat-tidwib (b) l-bużżieqa ta' l-arja tespandi. It-temperatura tat-tgħolija tikkorrispondi mat-temperatura li fiha t-tapp tas-sustanza jilħaq il-livell tas-superfiċje tal-banju ta' likwidu (ċ).

1.6.4.

Figura 1 A: Reċipjent tal-kejl B: Tapp C: Fetħar D: Termometru E: Termometru awżiljarju F: Banju ta’ likwidu G: Tubu għall-kampjun, b’dijametru massimu estern ta’ 5mm; li fih tubu kapillari, approssimattivament 100 mm twil, approssimattivament dijametru intern ta’ 1 mm u ħxuna tas-superfiċje tat-tubu approssimattivament minn 0,2 sa 0,3 mm H: Tubu tal-ġenb

1.6.5. Osservazzjoni permezz ta' fotoċellula Il-kampjun jissaħħan f-tubu kapillari ġo blokka tal-metall imsaħħna. Raġġ ta' dawl jiġi dirett, f’toqob adattati fil-blokka, minn ġo s-sustanza għal fuq fotoċellula kkalibrata b'mod preċiż. Waqt iż-żieda fit-temperatura tal-kampjun, bżieżaq ta' l-arja singoli jitfaċċaw mill-kapillari li tkun qed tagħli. Meta tintlaħaq it-temperatura tat-tgħolija n-numru ta' bżieżaq jiżdied ħafna. Dan jikkawża bidla fl-intensità tad-dawl, irreġistrata minn fotoċellula, u jagħti sinjal ta' waqfien lill-indikatur li jkun qed jaqra t-temperatura tat-termometru tal-platinu ta' reżistenza li jkun fil-blokka. Dan il-metodu huwa speċjalment utli għaliex jippermetti determinazzjonijiet taħt it-temperatura ambjentali sa 253,15 K (-20 oC) mingħajr ebda bidliet fl-apparat. Kemm jitpoġġa l-istrument f'banju li jkessaħ.

1.6.6. Analiżi termika

1.6.6.

1.6.6.1. Analiżi termika differenzjali Ara l-Appendiċi.

1.6.6.2. Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar Ara l-Appendiċi.

2. Tabella 2 Temperatura – il-fatturi ta' korrezzjonijiet ft

DATA B'devjazzjonijiet żgħar mill-pressjoni normali (max. ± 5 kPa) it-temperaturi tat-tgħolija huma normalizzati sa Tn permezz ta' l-ekwazzjoni numru-valur minn Sidney Young li ġejja: Tn = T + (fT x Δp) fejn: Δp (101,325 – p) [nnota s-sinjal] P il-kejl tal-pressjoni f’kPa fT ir-rata ta' bidla fit-temperatura tat-tgħolija bi pressjoni f’K/kPa T it-temperatura tat-tgħolija mkejla f’K Tn it-temperatura tat-tgħolija korretta sal-pressjoni normali f’K Għal ħafna sustanzi l-fatturi tal-korrezzjoni tat-temperatura, fT, u l-ekwazzjonijiet għall-approssimazzjoni tagħhom huma inklużi fl-istandards internazzjonali u nazzjonali msemmija hawn fuq. Eż, il-metodu tad-DIN 53171 isemmi l-korrezzjonijiet mhux bilfors eżatti li ġejjin għal solventi inklużi fiż-żebgħa: Temperatura T (K) Fattur ta' korrezzjoni fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,4 548,15 0,45 573,15 0,47

3. RAPPURTAR Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja: Il-medja ta' mill-inqas żewġ temperaturi li huma fl-iskala tal-kalkolu ta' l-eżattezza (ara t-Tabella 1) hija rrapurtata bħala t-temperatura tat-tgħolija. It-temperaturi tat-tgħolija mkejla u l-medji tagħhom għandhom ikunu ddikjarati u l-pressjoni (jiet) li fihom saru l-kejlijiet għandhom ikunu rrapurtati f’kPa. Il-pressjoni għandha tkun preferibbilment qrib il-pressjoni atmosferika normali. L-informazzjoni kollha u r-rimarki relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rrapurtati, b'mod speċjali rigward l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.

il-metodu użat

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet) u l-istadju preliminarju ta' purifikazzjoni, jekk hemm,

kalkolu ta' l-eżattezza.

4.(1)(2)(3) REFERENZI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, volume II. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.

A.3. DENSITÀ RELATTIVA

A.3.

1. METODU Il-maġġoranza tal-metodi mfissra huma bbażati fuq il-linja gwida tat-Test OECD (1). Il-prinċipji fundamentali huma mogħtija fir-referenzi (2) u (3).

1.

1.1. DAĦLA Il-metodi għad-determinazzjoni tad-densità relattiva mfissra hawn huma applikabbli għal sustanzi solidi u likwidi, mingħajr restrizzjoni fir-rigward tal-grad ta' purità tagħhom. Id-diversi metodi li għandhom jintużaw huma mniżżla fit-tabella 1.

1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET Id-densità relattiva D204 ta' solidi jew likwidi hija l-proporzjoni bejn il-piż ta' volum tas-sustanza li trid tiġi eżaminata, iddeterminata f’temperatura ta' 20 oC, u l-piż ta' l-istess volum ta' ilma, iddeterminata f’temperatura ta' 4 oC. Id-densità relattiva ma għandhiex dimensjoni. Id-densità, P, ta' sustanza hija l-kwozjent tal-piż, m, u l-volum tagħha, v. Id-densità, P, tingħata f’unitajiet SI, f’kg/m3.

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA (1) (3) M'hemmx bżonn li jintużaw sustanzi ta' referenza kull meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma primarjament qegħdin biex ikun iċċekkjat ir-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu paragun ma' riżultati minn metodi oħra.

1.4. TQABBIL TAL-METODI Jintużaw erba' klassijiet ta' metodi

1.4.

1.4.1. Il-metodi taż-żamma fil-wiċċ

1.4.1.

1.4.1.1. Idrometru (għal sustanzi likwidi) Jistgħu jinkisbu determinazzjonijiet tad-densità rapidi u eżatti biżżejjed permezz ta' idrometri li jżommu fil-wiċċ, li jippermettu li d-densità ta' likwidu titqies mill-fond ta' l-immersjoni bil-qari ta' skala bi gradazzjoni.

1.4.1.2. Miżien idrostatiku (għal sustanzi likwidi u solidi) Id-differenza bejn il-piż tal-kampjun għat-test imkejjel fl-ajru u f'likwidu adattat (eż. l-ilma) tista' tintuża biex tiddetermina d-densità tiegħu. Għal solidi, id-densità mkejla hija kkunsidrata valida biss għal kampjun partikolari li jkun qed jiġi eżaminat. Għad-determinazzjoni tad-densità tal-likwidi, oġġett ta' volum magħruf, v, jintiżen l-ewwel fl-arja u imbagħad fil-likwidu.

1.4.1.3. Il-metodu ta' l-oġġett mgħaddas (għal sustanzi likwidi) (4) F’dan il-metodu, id-densità ta' likwidu hija ddeterminata mid-differenza bejn ir-riżultati ta' kejl tal-likwidu qabel u wara l-immersjoni ta' oġġett ta' volum magħruf fil-likwidu tat-test.

1.4.2. Metodi piknometriċi Għal solidi jew likwidi, jistgħu jintużaw piknometri ta' diversi forom u ta' volumi magħrufa. Id-densità hija kkalkulata mid-differenza fil-piż bejn il-piknometru mimli u vojt u l-volum magħruf tiegħu.

1.4.3. Piknometru għal paragun fl-arja (għal solidi) Id-densità ta' solidu fi kwalunkwe forma tista' titkejjel f’temperatura ambjentali b'piknometru għal paragun bil-gass. Il-volum tas-sustanza jitkejjel fl-arja jew f’gass inert f’ċilindru ta' volum varjabbli ikkalibrat. Għal kalkolu tad-densità jittieħed kejl wieħed tal-piż wara li jsir il-kejl tal-volum.

1.4.4. Densitometru li joxxilla (5) (6) (7) Id-densità ta' likwidu tista' titkejjel f’densitometru li joxxilla. Oxxillatur mekkaniku mibni fil-forma ta' tubu-U jiġi vvibrat bil-frekwenza ta' reżonanza ta' l-oxxilatur li tiddependi fuq il-piż tiegħu. L-introduzzjoni ta' kampjun tbiddel il-frekwenza ta' reżonanza ta' l-oxxillatur. L-apparat għandu jiġi kkalibrat b'żewġ sustanzi likwidi ta' densitajiet magħrufa. Dawn is-sustanzi għandhom ikunu preferibbilment magħżula b'tali mod li d-densitajiet tagħhom ikopru l-iskala kollha li se titkejjel.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ L-applikabilità tal-metodi differenti użati għad-determinazzjoni tad-densità relattiva hija mniżżla fit-tabella.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODI L-istandards mogħtija bħala eżempji, li għandhom ikunu kkonsultati għal dettalji tekniċi addizzjonali, huma mehmuża fl-Appendiċi. Il-testijiet għandhom isiru f’temperatura ta' 20 oC, u għandhom isiru għall-inqas żewġ kejlijiet.

2. DATA Ara l-istandards.

3. Tabella 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.31.4.4. Applikabilità tal-metodi

RAPPURTAR Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja: Id-densità relattiva, D204, għandha tkun irrappurtata kif imfisser f’1.2, flimkien ma' l-istat fiżiku tas-sustanza mkejla. L-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rrapportati, b'mod speċjali fir-rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza. Metodu ta' kejl Densità Viskożità dinamika massima possibbli Standards eżistenti solidu likwidu Idrometru iva 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Miżien Idrostatiku iva ISO 1183 (A) iva 5 Pa s ISO 90 u 758 Il-metodu ta' l-oġġett mgħaddas iva 20 Pa s DIN 53217 Piknometru ISO 3507 iva ISO 1183(B), NF T 20-053 iva 500 Pa s ISO 758 Piknometru għal paragun fl-arja iva DIN 55590 Teil 3, DIN53243 Densitometru li joxxilla iva 5 Pa s

il-metodu użat,

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet) u l-istadju preliminarju ta' purifikazzjoni, jekk hemm,

3. Tabella 1.4.1.1.1.4.1.2. Applikabilità tal-metodi

(a) solidsi

(b) likwidi

3. Tabella 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Applikabilità tal-metodi

(a) solidi

(b) likwidi

M4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

REFERENZI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ. , New York, 1959, vol. I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.ll, 427–430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297–302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen -Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717–726. Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253–255.

A.4. PRESSJONI TAL-FWAR

A.4.

1. METODU Il-maġġoranza tal-metodi mfissra huma bbażati fuq il-linja gwida tat-Test OECD (1). Il-prinċipji fundamentali huma mogħtija fir-referenzi (2) u (3).

1.

1.1. DAĦLA Biex isir it-test huwa utli li jkollok informazzjoni preliminari dwar l-istruttura, it-temperatura tat-tidwib u t-temperatura tat-tgħolija tas-sustanza. Ma hemmx proċedura waħda ta' kejl applikabbli għall-iskala kollha tal-pressjonijiet tal-fwar. Għalhekk, huma rakkomandati bosta metodi għal kejl tal-pressjoni tal-fwar minn < 10-4 sa 105 Pa. L-impuritajiet is-soltu jaffettwaw il-pressjoni tal-fwar, u dan sa limitu li jiddependi ħafna fuq ix-xorta ta' impurità. Fejn ikun hemm impuritajiet volatili fil-kampjun, li jistgħu jaffettwaw ir-riżultat, is-sustanza tista' tiġi ppurifikata. Jista' jkun ukoll xieraq li tkun ikkwotata l-pressjoni tal-fwar għall-materjal tekniku. Uħud mill-metodi mfissra hawnhekk jużaw apparat b'partijiet metalliċi; għalhekk dan għandu jkunu kkunsidrat meta jsir test fuq sustanzi korrużivi.

1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET Il-pressjoni tal-fwar ta' sustanzi hija mfissra bħala l-pressjoni ta' saturazzjoni 'il fuq mis-sustanza solida jew likwida. Fl-ekwilibriju termodinamiku, il-pressjoni tal-fwar ta' sustanza pura hija l-funzjoni tat-temperatura biss. L-unità tal-pressjoni SI li għandha tintuża hija l-pascal (Pa). L-unitajiet li storikament ġew użati, flimkien mal-fatturi tal-konverżjoni tagħhom, huma: 1 Torr (≡1 mm Hg) = 1,333x102 Pa 1 atmosfera = 1,013 x 105 Pa 1 bar = 105 Pa L-unità SI tat-temperatura hija l-kelvin (K). Il-kostanti universali molari tal-gass R huwa 8,314 mol-1 K-1 Id-dipendenza tat-temperatura tal-pressjoni tal-fwar hija mfissra mill-ekwazzjoni Clausius-Clapeyron: log p = Δ Hv2,3 RT+const. fejn: p il-pressjoni tal-fwar tas-sustanza f’pascals ΔHv is-sħana ta' evaporizzazzjoni tagħha f’J mol-1 R il-kostanti universali tal-gass molari f’J mol-1 K-1 T it-temperatura termodinamika f’K

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA Sustanzi ta' referenza mhumiex meħtieġa li jintużaw fil-każijietjiet kollha meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma għandhom iservu primarjament biex jiċċekkjaw r-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra.

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODI TA' TTESTJAR Għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar, huma proposti seba' metodi li jistgħu jiġu applikati fi skali differenti tal-pressjoni tal-fwar. Għal kull metodu, il-pressjoni tal-fwar hija ddeterminata f’temperaturi diversi. Fi skala limitata ta' temperatura, il-logaritmu tal-pressjoni tal-fwar ta' sustanza pura huwa l-funzjoni lineari ta' l-invers tat-temperatura.

1.4.

1.4.1. Metodu dinamiku Fil-metodu dinamiku, titkejjel it-temperatura tat-tgħolija li tirrigwarda l-pressjoni speċifikata. Skala rakkomandata 103 sa 105 Pa. Dan il-metodu huwa rakkomandat ukoll għad-determinazzjoni tat-temperatura tat-tgħolija normali u jintuża għal dan il-għan sa 600 K.

1.4.2. Metodu statiku Fil-proċess statiku, f’ekwilibriju termodinamiku, il-pressjoni tal-fwar stabbilita f’sistema magħluqa hija ddeterminata f’temperatura speċifikata. Dan il-metodu huwa adattat għall-komponent wieħed u solidi u likwidi multikomponenti. Skala rakkomandata: 10 sa 105 Pa. Dan il-metodu jista' jintuża wkoll fl-iskala 1 sa 10 Pa, kemm-il darba tingħata attenzjoni xierqa.

1.4.3. Isoteniskopju Dan il-metodu standardizzat huwa wkoll metodu statiku iżda s-soltu mhuwiex adattat għal sistemi multikomponenti. Informazzjoni addizzjonali hija disponibbli fil-metodu ASTM D-2879-86. Skala rakkomandata: Minn 100 sa 105 Pa.

1.4.4. Metodu bl-effużjoni: Miżien bi pressjoni tal-fwar Il-kwantità ta' sustanza li tħalli ċellula għal kull unità ta' ħin minn ġo fetħa ta' daqs magħruf hija ddeterminata taħt kondizzjonijiet ta' vakwu b'tali mod li r-ritorn tas-sustanza fiċ-ċellula jkun insinifikanti (eż. bil-kejl ta' tektika ġġenerata fuq miżien sensittiv minn merżuq fwar jew bil-kejl tat-telf fil-piż). Skala rakkomandata: 10-3 sa 1 Pa.

1.4.5. Metodu bl-effużjoni: Bit-telf fil-piż jew bil-qbid tat-tifwir Il-metodu huwa bbażat fuq l-estimu tal-piż tas-sustanza għat-test li tkun qed toħroġ ma' kull unità ta' ċellula Knudsen (4) fil-forma ta' fwar, permezz ta' fetħa ta' daqs mikro taħt kondizzjonijiet ta' ultravakwu. Il-piż ta' fwar effuż jista' jinkiseb jew bid-determinazzjoni tat-telf ta' piż taċ-ċellula jew bl-ikkondensar tal-fwar f’temperatura baxxa u bid-determinazzjoni ta' l-ammont ta' sustanza volatilizzata bl-użu ta' analiżi kromografika. Il-pressjoni tal-fwar hija kkalkulata bl-applikazzjoni tar-relazzjoni Kertz-Knudsen. Skala rakkomandata: 10-3 sa 1 Pa.

1.4.6. Metodu bis-saturazzjoni tal-gass Fluss ta' gass trasportatur inert jiġi mgħoddi fuq is-sustanza b'tali mod li hija ssir saturata bil-fwar tagħha. L-ammont ta' materjal trasportat minn ammont magħruf ta' gass trasportatur jitqies jew bil-kollezzjoni f’kumpartiment għall-ġbir adattat jew b'teknika analitika intrain. Dan imbagħad jintuża biex tkun ikkalkulata l-pressjoni f’temperatura stabbilita. Skala rakkomandata: 10-4 sa 1 Pa. Dan il-metodu jista' jintuża wkoll fl-iskala 1 sa 10 Pa, kemm-il darba tingħata attenzjoni xierqa.

1.4.7. Skrun li jdur Fil-gejġ ta' l-iskrun li jdur, l-element tal-kejl attwali huwa ballun żgħir ta' l-azzar li huwa sospiż f’kamp manjetiku u li jdur b'veloċità kbira. Il-pressjoni tal-gass tiġi dedotta mit-tnaqqis fid-dawran tal-ballun ta' l-azzar li jiddependi mill-pressjoni. Skala rakkomandata: 10-4 sa 0,5 Pa.

1.5.1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7.

KRITERJI TA' KWALITÀ Id-diversi metodi ta' determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar huma mqabbla ma' dak li għandu x'jaqsam ma' l-applikazzjoni, ir-ripetibilità, ir-riproduċibilità, l-iskala ta' kejl u l-istandard eżistenti. Dan isir fit-tabella li ġejja. Metodu ta' kejl Sustanzi Ripetibilità stmata Riproduċibilità stmata Skala rakkomandata Standard Eżistenti solidi likwidi Metodu dinamiku Tidwib baxx iva Sa 25 % sa 25 % 103 Pa sa 2x103 Pa — 1 sa 5 % 1 sa 5 % 2 x 103 Pa sa 105 Pa — Metodu statiku iva iva 5 sa 10 % 5 sa 10 % 10Pa sa 105 Pa NFT 20-048 (S) Iżoteniskopju iva iva 5 sa 20 % 5 sa 10 % 10-3 Pa sa 1 Pa ASTM-D 2879-86 Metodu ta' efużjoni Miżien tal-pressjoni tal-fwar iva iva 5 sa 20 % sa 50 % 10-3 Pa sa 1 Pa NFT 20-047(6) Metodu ta efużjoni Telf ta' piż iva iva 10 sa 30 % — 10-3 Pa sa 1 Pa — Metodu ta' saturazzjoni tal-gass iva iva 10 sa 30 % sa 50 % 10-4 Pa sa 1 Pa — Metodu ta' skrun li jdawwar iva iva 10 sa 20 % — 10-4 Pa sa 0,5 Pa —

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODI

1.6.

1.6.1. Kejl dinamiku

1.6.1.

1.6.1.1. Apparat L-apparat tal-kejl jikkonsisti tipikament f'reċipjent għat-tgħolija b'apparat li jżomm il-kesħa mqabbad miegħu li huwa magħmul mill-ħġieġ jew mill-metall (figura 1), tagħmir għall-kejl tat-temperatura, u tagħmir għar-regolazzjoni u l-kejl tal-pressjoni. Apparat tal-kejl tipiku muri fid-disinn huwa magħmul minn ħġieġ reżistenti għas-sħana u jikkonsisti minn ħames partijiet: It-tubu l-kbir b'superfiċje parzjalment doppja jikkonsisti f’ġonta li torbot mal-qiegħ, apparat li jkessaħ, reċipjent għat-tkessiħ u fetħa għad-dħul. Iċ-ċilindru tal-gass, b'pompa Cottrel, huwa mmuntat fit-taqsima tat-tgħolija tat-tubu u għandu superfiċje ħarxa ta' ħġieġ imfarrak biex jevita ħbit matul il-proċess tat-tgħolija. It-temperatura titkejjel b' senser tat-temperatura adattat (eż. termometru ta' reżistenza jew b' jacket thermocouple) imdaħħal fl-apparat sal-punt tal-kejl (Nru 5, figura 1) permezz ta' dħul adattat (eż. ġonta male li torbot mal-qiegħ). Il-konnessjonijiet neċessarji jsiru għar-regolazzjoni tal-pressjoni u tat-tagħmir tal-kejl. Il-bozza, li sservi bħala volum ta' protezzjoni, hija mgħaqqda ma' l-apparat tal-kejl permezz ta' tubu kapillari. Ir-reċipjent tat-tgħolija jissaħħan b'element tat-tisħin (eż. ħiter bil-cartridge) imdaħħal fl-apparat tal-ħġieġ minn taħt. Il-kurrent tat-tisħin meħtieġ huwa stabbilit u rregolat permezz ta' termokoppja. Il-vakwu neċessarju ta' bejn 102 Pa u approssimattivament 105 Pa jiġi prodott b'pompa tal-vakwu. Jintuża valv adattat biex ikejjel l-arja jew in-nitroġenu għar-regolazzjoni tal-pressjoni (skala ta' kejl approssimattivament 102 sa 105 Pa) u l-ventilazzjoni. Il-pressjoni titkejjel permezz ta' manometru.

1.6.1.2. Proċedura tal-kejl Il-pressjoni tal-fwar titkejjel bid-determinazzjoni tat-temperatura tat-tgħolija tal-kampjun b'diversi pressjonijiet speċifikati bejn wieħed u ieħor bejn 103 u 105 Pa. Temperatura stabbli taħt pressjoni kostanti tindika li t-temperatura tat-tgħolija tkun intlaħqet. Sustanzi bir-ragħwa ma jistgħux jitkejlu bl-użu ta' dan il-metodu. Is-sustanza titqiegħed f’reċipjent li jkun fih il-kampjun nadif u niexef. Jistgħu jinqalgħu problemi b'solidi mhux imfarrka iżda dawk kultant jistgħu jinħallu bit-tisħin tal-cooling jacket. Ladarba r-reċipjent jimtela’ l-apparat jiġi ssiġġillat fil-flanġ u jitneħħa l-gass mis-sustanza. L-inqas pressjoni mixtieqa imbagħad tiġi stabbilita u jinxtegħel l-apparat għat-tisħin. Fl-istess ħin, is-senser tat-temperatura jiġi kkonnettjat mar-rekorder. L-ekwilibriju jinkiseb meta temperatura tat-tgħolija kostanti tiġi rreġistrata fi pressjoni kostanti. Għandha tingħata attenzjoni partikulari biex ikun evitat ħbit matul t-tgħolija. Barra dan, trid issir kondensazzjoni kompleta fuq l-apparat li jżomm il-kesħa. Meta tkun qed tiġi ddeterminata l-pressjoni tal-fwar ta' solidi li jinħallu bil-mod, għandu tinghata attenzjoni sabiex il-kondensatur ma jiġix imblukkat. Wara li jkun irreġistrat dan il-punt ta' ekwilibriju, għandha tiġi stabbilita pressjoni ogħla. Il-proċess jitkompla b'dan il-mod sakemm jintlaħqu l-105 Pa (approssimattivament minn 5 sa 10 punti ta' kejl b'kollox). Bħala ċċekkjar, il-punti ta' ekwilibriju għandhom ikunu ripetuti taħt pressjonijiet dixxendentali.

1.6.2. Kejl statiku

1.6.2.

1.6.2.1. Apparat L-apparat jinkludi kontenitur għall-kampjun, sistema ta' tisħin u ta' tkessiħ biex tirregola t-temperatura tal-kampjun u tkejjel it-temperatura. L-apparat jinkludi wkoll strumenti biex jiffissaw u jkejlu l-pressjoni. Il-figura 2a u 2b jillustraw il-prinċipji bażiċi involuti. Il-kompartiment għall-kampjun (figura 2a) hija marbuta fuq naħa waħda minn valv ta' vakwu għoli adattat. Tubu-U li jinkludi fluwidu tal-manometru adattat huwa mehmuż man-naħa l-oħra. Naħa mit-tubu-U toħroġ 'il barra mill-pompa tal-vakwu, miċ-ċilindru tan-nitroġenu jew mill-valv ta' ventilazzjoni, u minn manometru. Gejġ tal-pressjoni b'indikatur tal-pressjoni jista' jintuża flok tubu-U (Figura 2b). Bil-għan li tkun irregolata t-temperatura tal-kampjun, ir-reċipjent bil-kampjun flimkien mal-valv u t-tubu-U jew il-gejġ tal-pressjoni jitqiegħed f‘banju li jinżamm f’temperatura kostanti ta' 0,2 K. Il-kejl tat-temperatura jittieħed fuq in-naħa ta' barra tar-reċipjent bil-kampjun jew fir-reċipjent innifsu. Pompa tal-vakwu b'nassa li tkessaħ il-fluss tiela' 'l fuq tintuża biex tbattal l-apparat. Fil-metodu 2a l-pressjoni tal-fwar tas-sustanza titkejjel b'mod indirett bl-użu ta' indikatur żero. Dan jikkunsidra l-fatt li d-densità tal-fluwidu fit-tubu-U tinbidel jekk it-temperatura tinbidel ħafna. Il-fluwidi li ġejjin huma adattati għall-użu bħala indikaturi żero għat-tubu-U, skond l-iskala tal-pressjoni u l-proprjetajiet kimiċi tas-sustanza għat-test: fluwidi tas-silikone, ftalati. Is-sustanzi għat-test m'għandhomx jinħallu b'mod notevoli jew jirreaġixxu mal-fluwidu fit-tubu-U. Għall-manometru, jista' jintuża l-merkurju fl-iskala tal-pressjoni normali ta' l-arja sa 102 Pa, waqt li fluwidi tas-silikone u ftalati huma adattati għall-użu taħt l-102 Pa sa 10 Pa. Manometri ta' kapaċità b'membrana li jissaħħnu jistgħu jintużaw anke taħt l-10-1 Pa. Hemm ukoll gejġis tal-pressjoni oħra li jistgħu jintużaw taħt l-102 Pa.

1.6.2.2. Proċedura tal-kejl Qabel ma jsir il-kejl, il-komponenti kollha ta' l-apparat murija fil-figura 2 iridu jitnaddfu u jitnixxfu għal kollox. Għall-metodu 2a, it-tubu-U għandu jimtela’ bil-likwidu magħżul, li jrid jitneħħilu l-gass f’temperatura elevata qabel ma jittieħed il-qari. Is-sustanza għat-test titqiegħed fl-apparat, li mbagħad jingħalaq u t-temperatura titnaqqas b'mod suffiċjenti biex jitneħħa l-gass. It-temperatura trid tkun baxxa biżżejjed biex tiżgura li l-arja tinġibed 'il barra, iżda – fil-każ ta' sistema b'komponenti multipli – ma tridx tibdel il-kompożizzjoni tal-materjal. Jekk ikun meħtieġ, l-ekwilibriju jista' jiġi stabbilit aktar malajr permezz ta' tħawwid. Il-kampjun jista' jiġi mkessaħ ħafna eż. bin-nitroġenu likwidu (trid tingħata attenzjoni biex tkun evitata l-kondensazzjoni ta' l-arja jew il-pompa fluwida) jew b'taħlita ta' etanol u silġ niexef. Għal kejl f’temperatura baxxa għandu jintuża banju rregolat bit-temperatura kkonnettjat ma' ultra-cryomat. Bil-valv fuq ir-reċipjent tal-kampjun miftuħ, jiġi applikat ġbid għal diversi minuti biex titneħħa l-arja. Il-valv imbagħad jingħalaq u t-temperatura tal-kampjun titnaqqas għall-iktar livell baxx mixtieq. Jekk neċessarju, l-operazzjoni tat-tneħħija tal-gass trid tiġi ripetuta diversi drabi. Meta l-kampjun jissaħħan il-pressjoni tal-fwar togħla. Dan ibiddel l-ekwilibriju tal-fluwidu fit-tubu-U. Biex ikun hemm kumpens għal dan, jiddaħħal nitroġenu jew tiddaħħal arja fl-apparat permezz ta' valv sakemm il-fluwidu ta' l-indikatur tal-pressjoni jerġa' jinżel għal żero. Il-pressjoni meħtieġa għal dan tista' tinqara permezz ta' manometru ta' preċiżjoni f’temperatura ambjentali. Din il-pressjoni tikkorrispondi għall-pressjoni tal-fwar tas-sustanza f’dik it-temperatura partikulari tal-kejl. Il-metodu 2b huwa simili iżda l-pressjoni tal-fwar tinqara direttament. Id-dipendenza fuq it-temperatura tal-pressjoni tal-fwar hija ddeterminata b'intervalli żgħar adattati (approssimattivament minn 5 sa 10 punti ta' kejl b'kollox) sal-massimu mixtieq. Qari ta' temperatura baxxa jrid jiġi ripetut bħala kontroll. Jekk il-valuri miksuba minn qari ripetut ma jaqblux mal-kurva miksuba għat-temperatura li tkun qed tiżdied, dan jista' jkun minħabba waħda mir-raġunijiet li ġejjin:

1.6.2.2.

1. Il-kampjun għad fih l-arja (eż. materjali b'viskożità għolja) jew sustanzi li jagħlu bil-mod, li tinħareġ/jinħarġu matul it-tisħin u jistgħu jitneħħew bil-ġbid wara aktar supercooling.

2. It-temperatura tat-tkessiħ mhijiex baxxa biżżejjed. F’dan il-każ in-nitroġenu likwidu jintuża bħala aġent ta' tkessiħ. Jekk raġuni 1 jew raġuni 2 tapplika, il-kejl irid jiġi ripetut.

3. Is-sustanza jkollha reazzjoni kimika fl-iskala ta' temperatura rreġistrata (eż. dekompożizzjoni, polimerizzazzjoni).

1.6.3. Isoteniskopju Deskrizzjoni kompluta ta' dan il-metodu tista' tinsab fir-referenza 7. Il-prinċipju ta' l-apparat tal-kejl jidher fil-figura 3. L-istess bħall-metodu statiku mfisser f'1.6.2, l-isoteniskopju huwa adattat għall-investigazzjoni ta' solidi jew likwidi. Fil-każ ta' likwidi, is-sustanza nnifisha sservi bħala l-fluwidu fil-manometru awżiljarju. Kwantità ta' likwidu, suffiċjenti biex timtela' l-bozza jew is-sieq il-qasira tat-taqsima tal-manometru titqiegħed fl-isoteniskopju. L-isoteniskopju jitwaħħal mas-sistema tal-vakwu u jiġi evakwat, imbagħad jimtela’ bin-nitroġenu. L-evakwazzjoni u t-tindif tas-sistema huma ripetuti darbtejn biex jitneħħa l-ossiġenu residwu. L-isoteniskopju mimli jitpoġġa f’pożizzjoni orizzontali sabiex il-kampjun jinfirex fuq saff irqiq fil-bozza bil-kampjun u t-taqsima tal-manometru (parti-U). Il-pressjoni tas-sistema titnaqqas għal 133 Pa u l-kampjun jissaħħan bil-mod sakemm jiftaħ jagħli (tneħħija ta' gassijiet fissi maħlula). L-isoteniskopju mbagħad jitpoġġa b'tali mod li l-kampjun jerġa' lura fil-bozza u s-sieq l-qasira tal-manometru, sabiex it-tnejn li huma jintlew għal kollox bil-likwidu. Il-pressjoni tinżamm bħal meta jitneħħa l-gass; il-parti tal-bozza bil-kampjun miġbuda 'l barra tissaħħan bi fjamma żgħira sakemm il-fwar tal-kampjun rilaxxat jespandi b'mod suffiċjenti biex jieħu post parti mill-kampjun mill-parti ta' fuq tal-bozza u mid-driegħ tal-manometru fit-taqsima tal-manometru ta' l-isoteniskopju, u b'hekk jinħoloq spazju mimli bil-fwar mingħajr nitroġenu. L-isoteniskopju mbagħad jitpoġġa f’banju b'temperatura kostanti, u l-pressjoni tan-nitroġenu tiġi aġġustata sakemm il-pressjoni tiegħu tkun ugwali għal dik tal-kampjun. Il-bilanċ tal-pressjoni huwa indikat mit-taqsima tal-manometru ta' l-isoteniskopju. Fl-ekwilibriju, il-pressjoni tal-fwar tan-nitroġenu tkun ugwali għall-pressjoni tal-fwar tas-sustanza. Fil-każ ta' solidi, dipendenti fuq il-pressjoni u l-iskala tat-temperatura, jintużaw il-likwidi tal-manometru mniżżla f’1.6.2.1. Il-likwidu tal-manometru li jitneħħilu l-gass jintefa’ fin-nefħa tad-driegħ it-twil ta' l-isoteniskopju. Imbaghad is-solidu biex ikun investigat jitqiegħed fil-bozza u jitneħħilu l-gass f'temperatura elevata. Wara dan l-isoteniskopju jiġi inklinat sabiex il-likwidu tal-manometru jista' joħroġ fit-tubu-U. Il-kejl tal-pressjoni tal-fwar bħala funzjoni tat-temperatura jsir skond 1.6.2.

1.6.4. Metodu bl-effużjoni: Miżien bi pressjoni tal-fwar

1.6.4.

1.6.4.1. Apparat Verżjonijiet diversi ta' l-apparat huma mfissra fil-letteratura (1). L-apparat imfisser hawnhekk juri l-prinċipji ġenerali involuti (figura 4). Il-Figura 4 turi l-komponenti ewlenin ta' l-apparat, li jinkludu kontenitur ta' l-azzar li ma jsaddadx jew tal-ħġieġ b'vakwu għoli, tagħmir li jipproduċi u jkejjel il-vakwu u komponenti mibnija fih stess biex ikejlu l-pressjoni tal-fwar fuq il-miżien. Dawn il-komponenti mibnija fl-apparat stess li ġejjin huma inklużi fl-apparat:

forn evaporatur bi flanġ u dħul li jdur. Il-forn evaporatur huwa reċipjent ċilindriku, magħmul minn eż. ramm jew minn liega kimikament reżistenti b'konduttività termika tajba. Reċipjent tal-ħġieġ bil-ġnub tar-ram. Il-forn għandu dijametru ta' madwar 3 sa 5 cm u huwa minn 2 sa 5 cm għoli. Hemm minn waħda sa tliet fetħiet ta' qisien differenti għall-fluss tal-fwar. Il-forn jissaħħan bi spiral li jsaħħan mdawwar mal-forn minn barra. Biex is-sħana ma tgħaddix lejn pjanċa tal-qiegħ, il-ħiter huwa marbut mal-pjanċa tal-qiegħ b'metall ta' konduttività termika baxxa (azzar magħmul minn nikil u fidda jew kromju u nikil), eż. pajp tan-nikil u fidda mwaħħal ma' fetħa għad-dħul li ddur jekk ikun qed jintuża forn b'diversi fetħiet. Dan l-arranġament għandu l-vantaġġ li jippermetti l-introduzzjoni ta' faxxa tar-ram. Dan jippermetti tkessiħ minn barra bl-użu ta' banju tat-tkessiħ.

jekk l-għatu tal-forn tar-ram għandu tliet fetħiet ta' dijametri differenti f’angolu ta' 90o waħda ma' l-oħra, diversi skali tal-pressjoni tal-fwar fil-kamp tal-varjazzjoni tal-kejl kollu jistgħu jiġu koperti (fetħiet b'dijametru approssimattivament bejn 0,30 u 4,50 mm). Fetħiet kbar jintużaw għall-pressjoni tal-fwar baxxa u viċi versa. Il-fetħa mixtieqa jew il-pożizzjoni intermedjarja fil-fluss tal-fwar (il-fetħa tal-forn – it-tarka – il-platt tal-miżien), tista' tkun issettjata billi jiddawwar il-forn u l-fluss tal-molekuli jinħeles jew jitwassal mill-fetħa tal-forn għal fuq il-platt tal-miżien. Sabiex titkejjel it-temperatura tas-sustanza, termokoppja jew termometru ta' reżistenza titqiegħed/jitqiegħed f’punt adattat.

'il fuq mit-tarka hemm il-platt tal-miżien li jagħmel parti minn miżien mikro b'sensittività għolja (ara hawn taħt). Il-platt tal-miżien għandu dijametru ta' approssimattivament 30 mm. Aluminju maħsul bid-deheb huwa materjal adattat.

il-platt tal-miżien huwa mdawwar b'kaxxa ċilindrika tar-ram isfar jew b'kaxxa ta' tkessiħ tar-ram. Ikun hemm fetħiet għal ġot-travu tal-miżien u fetħa fit-tarka għall-fluss tal-molekuli, skond it-tip tal-miżien, u għandhom jiggarantixxu kondensazzjoni kompleta tal-fwar fuq il-platt tal-miżien. It-tixrid il barra tas-sħana huwa żgurat eż. permezz ta' strixxa tar-ram ikkonnettjata mal-kaxxa tat-tkessiħ. L-istrixxa tgħaddi mill-pjanċa tal-qiegħ u hija iżolata minnha termikament, eż. permezz ta' tubu ta' l-azzar magħmul minn kromju u nikil. L-istrixxa hija mgħaddsa fi flixkun Dewar li fih nitroġenu likwidu taħt il-pjanċa tal-qiegħ jew nitroġenu likwidu jiġi ċċirkolat minn ġo l-istrixxa. Għalhekk, il-kaxxa tat-tkessiħ tinżamm approssimattivament f’-120 oC. Il-platt tal-miżien jitkessaħ esklussivament bir-radjazzjoni u huwa sodisfaċenti għall-skala tal-pressjoni li qed jiġi investigat (tkessiħ ta' approssimattivament siegħa qabel jibda l-kejl),

il-miżien jitqiegħed fuq il-kaxxa tat-tkessiħ. Imwieżen, eż miżien elettroniku mikro sensittiv b'żewġt dirgħajn (8) jew strument b'bobina li tiċċaqlaq ta' sensittività għolja ħafna (ara l-Linjagwida tat-Test OECD, l-Edizzjoni ta' 12.05.81).

il-pjanċa tal-qiegħ tinkorpora wkoll konnessjonijiet elettriċi għal termokoppji (jew termometri ta' reżistenza) u bobina tas-sħana,

fir-reċipjent jiġi prodott vakwu permezz ta' pompa ta' vakwu parzjali jew pompa ta' vakwu qawwi (il-vakwu meħtieġ huwa ta' approssimattivament minn 1 sa 1 x10-3 Pa, li jinkiseb wara ippompjar għal sagħtejn). Il-pressjoni hija rregolata b'manometru ta' jonizzazzjoni adattata.

1.6.4.2. Proċedura tal-kejl Ir-reċipjent jimtela bis-sustanza għat-test u l-għatu jingħalaq. It-tarka u l-kaxxa tat-tkessiħ tiġi mżerżqa fuq il-forn. L-apparat jingħalaq u l-pompi tal-vakwu jinxtegħlu. Il-pressjoni finali qabel il-bidu tat-teħid tal-kejl għandha tkun ta' approssimattivament 10-4 Pa. It-tkessiħ tal-kaxxa tat-kessiħ jibda f’10-2 Pa. Ladarba jinkiseb l-vakwu meħtieġ, ibda s-sensiela ta' kalibrazzjoni fl-inqas temperatura meħtieġa. Il-fetħa korrispondenti fl-għatu tiġi ffissata, il-fluss tal-fwar jgħaddi mit-tarka direttament fuq il-fetħa u jolqot il-platt tal-miżien imkessaħ. Il-platt tal-miżien irid ikun kbir biżżejjed biex jiżgura li jintalaqt mill-fluss kollu mgħoddi minn ġot-tarka. Il-momentum tal-fluss tal-fwar jaġixxi bħala qawwa kontra l-platt tal-miżien u l-molekuli jikkondensaw fuq is-superfiċje kiesħa tiegħu. Il-momentum u l-kondensazzjoni simultanja jipproduċu sinjal fuq ir-rekorder. VALUTAZZJONI tas-sinjali tipprovdi biċċtejn informazzjoni: p = G 2 π RT×103M fejn: G ir-rata ta' evaporazzjoni (kgs-l m-2) M il-piż molari (g mol-l) T it-temperatura T (K) R il-kostanti universali tal-gass molari (Jmol-1 K-1) p il-pressjoni tal-fwar (Pa) Meta jintlaħaq il-vakwu neċessarju, is-serje ta' kejl tibda ma' l-inqas temperatura tal-kejl mixtieqa. Għal aktar kejl, it-temperatura hija miżjuda b'intervalli żgħar sakemm jintlaħaq il-valur tat-temperatura massima mixtieqa. Il-kampjun imbagħad jitkessaħ għal darb'oħra u t-tieni kurva tal-pressjoni tal-fwar tiġi rreġistrata. Jekk it-tieni test ma jikkonfermax ir-riżultati ta' l-ewwel test, allura huwa possibli li s-sustanza qed tiddekomponi fl-iskala tat-temperatura li qed titkejjel.

1.6.4.2.

1. Fl-apparat imfisser hawnhekk il-pressjoni tal-fwar hija ddeterminata direttament mill-momentum fuq il-platt tal-miżien (mhuwiex neċessarju li jkun magħruf il-piż molekulari għal dan (2)). Fatturi ġeometriċi bħal ma huma l-fetħa tal-forn u l-angolu tal-fluss molekulari jridu jiġu kkunsidratu meta jkun evalwat il-qari li jsir.

2. Il-piż tal-kondensat jista' jitkejjel fl-istess ħin u r-rata ta' evaporazzjoni tista' tkun ikkalkulata minn dan. Il-pressjoni tal-fwar tista' tkun ikkalkulata wkoll mir-rata ta' evaporazzjoni u mill-piż molekulari bl-użu tal-ekwazzjoni Hertz (2).

1.6.5. Metodu b'effużjoni – bit-telf ta' piż

1.6.5.

1.6.5.1. Apparat L-apparat ta' effużjoni jikkonsisti mill-partijiet bażiċi li ġejjin: Tank tal-vakwu ta' l-aluminju msaħħan bl-elettriku b'erba' ċelluli ta' effużjoni ta' azzar li ma jsaddadx huwa muri fil-figura 5 bħala eżempju. Folja ta' azzar li ma jsaddadx ta' madwar 0,3 mm ħxuna għandha fetħa ta' effużjoni ta' dijametru minn 0,2 sa 1,0 mm u hija mwaħħla maċ-ċellula ta' effużjoni permezz ta' għatu bil-viti.

it-tank li jista' jiġi ttermostat u evakwat u li fih hemm iċ-ċelluli ta' effużjoni,

il-pompa ta' vakwu għoli (eż. pompa ta' tixrid jew pompa turbomolekulari) b'gejġ ta' vakwu,

nassa, bl-użu ta' nitroġenu likwifikat jew silġ mnixxef.

1.6.5.2. Proċedura tal-kejl Is-sustanza ta' referenza u s-sustanza għat-test jiġu mimlija f’kull ċellula ta' effużjoni, id-dijaframma tal-metall bil-ftuħ hija mwaħħla permezz ta' l-għatu bil-viti, u kull ċellula tintiżen sa eżattezza ta' 0,1 mg. Iċ-ċellula titpoġġa f’apparat termostatiku, li mbagħad jitbattal sa taħt waħda mill-għaxar pressjonijiet previsti. F’intervalli ta' ħin iffissati li jvarjaw minn 5 sa 30 siegħa, l-arja tiddaħħal fl-apparat, u t-telf fil-piż taċ-ċellula ta' effużjoni jiġi ddeterminat billi tintiżen mill-ġdid. Bil-għan li jkun żgurat li r-riżultati ma jkunux influwenzati minn impuritajiet volatili, iċ-ċellula terġa' tintiżen f’intervalli ta' ħin iffissati biex ikun ikkontrollat li r-rata ta' evaporazzjoni tkun kostanti fuq ta' l-inqas tnejn minn dawn l-intervalli ta' ħin. Il-pressjoni tal-fwar p fiċ-ċellula ta' effużjoni tingħata minn: p = mKAt2 π R TM fejn: p il-pressjoni tal-fwar (Pa) m il-piż tas-sustanza li toħroġ miċ-ċellula matul il-ħin t (kg) t il-ħin (s) A l-erja tat-toqba (m2) K il-fattur ta' korrezzjoni R il-kostanti universali tal-gass (Jmol-1 K-1) T it-temperatura (K) M il-piż molekulari (kg mol-l) Il-fattur ta' korrezzjoni K jiddependi fuq il-proporzjon tat-tul mar-raġġ tat-toqba ċilindrika. proporzjon 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 L-ekwazzjoni t’hawn taħt tista' tinkiteb: p = E mtTM Fejn E = 1KA2πR u hija l-kostanti taċ-ċellula ta' effużjoni. Din il-kostanti E taċ-ċellula ta' effużjoni tista' tiġi ddeterminata b'sustanzi ta' referenza (2,9), bl-użu ta' l-ekwazzjoni li ġejja: E = p(r)tmM(r)T fejn: p(r) il-pressjoni tal-fwar tas-sustanza ta' referenza (Pa) M(r) il-piż molekulari tas-sustanza ta' referenza (kg x mol-l)

1.6.6. Metodu bis-saturazzjoni tal-gass

1.6.6.

1.6.6.1. Apparat Apparat tipiku użat biex jitwettaq dan it-test jinkludi numru ta' komponenti mogħtija fil-figura 6a u mfissra taħt (1).

1.6.6.1. Gass inert:

Il-gass trasportatur ma jridx jirreaġixxi kimikament mas-sustanza tat-test. In-nitroġenu s-soltu huwa suffiċjenti għal dan il-għan iżda f’xi okkażżjonijiet gassijiet oħra jistgħu jkunu meħtieġa (10). Il-gass użat irid ikun niexef (ara figura 6a, tifsira 4: senser ta' l-umdità relattiva).

Kontroll tal-fluss:

Sistema adattata għall-kontroll tal-gass hija meħtieġa biex tiżgura fluss kostanti u magħżul mill-kolonna tas-saturatur.

Kumpartimenti li jiġbru l-fwar:

Dawn huma dipendenti fuq il-karatteristiċi partikulari tal-kampjun u l-metodu ta' analiżi magħżul. Il-fwar irid jinqabad fi kwantità u f’forma li tippermetti analiżi sussegwenti. Għal xi sustanzi għat-test, kondensaturi li fihom likwidi bħal hexane u glikol etilene huma adattati. Għall-oħrajn, jistgħu japplikaw assorbenti solidi. Bħala alternattiva għall-kondensazzjoni tal-fwar u l-analiżi sussegwenti, jistgħu jintużaw tekniki analitiċi in-train, bħall-kromatografija, biex jiddeterminaw b'mod kwantitattiv l-ammont ta' materjal trasportat minn ammont magħruf ta' gass trasportatur. Barra dan, jista' jitkejjel it-telf tal-piż tal-kampjun.

Apparat li jibdel is-sħana:

Għal kejl f’temperaturi differenti jista' jkunu neċessarju li fl-apparat ikun inkluż apparat li jibdel is-sħana.

Kolonna ta' saturazzjoni:

Is-sustanza għat-test tiġi ddepożitata minn soluzzjoni fuq irfid inert adattat. L-irfid miksi jiġi introdott fil-kolonna ta' saturazzjoni, li d-dimensjoni u r-rata tal-fluss tagħha għandhom ikunu tali li tiġi assigurata saturazzjoni kompleta tal-gass trasportatur. Il-kolonna ta' saturazzjoni għandha tkun bit-termostat. Għal kejl ogħla mit-temperatura ambjentali, iż-żona bejn il-kolonna ta' saturazzjoni u l-kumpartimenti għall-ġbir għandha tissaħħan biex tevita l-kondensazzjoni tas-sustanza għat-test. Bil-għan li tnaqqas it-trasport tal-piż b'diffużjoni, jista' jitqiegħed kapillari wara l-kolonna ta' saturazzjoni (figura 6b).

1.6.6.2. Proċedura tal-kejl

1.6.6.2. Preparazzjoni tal-kolonna ta' saturazzjoni:

Soluzzjoni tas-sustanza għat-test f’solvent volatili ħafna tiżdied ma' ammont adattat ta' rfid. Kwantità suffiċjenti mis-sustanza għat-test għandha tiżdied biex tinżamm is-saturazzjoni għaż-żmien tat-test. Is-solvent jiġi evaporat totalment fl-arja jew f’evaportatur li jdur, u l-materjal imħawwad tajjeb jiġi miżjud mal-kolonna ta' saturazzjoni. Wara li jkun irregolat il-kampjun bit-termostat, nitroġenu niexef jiġi mgħoddi mill-apparat.

Kejl:

Il-kompartimenti għall-ġbir jew id-ditekters in-train jiġu kkonnettjati mal-linja effluwenti tal-kolonna u l-ħin jiġi rreġistrat. Ir-rata tal-fluss tiġi kkontrollata fil-bidu u f’intervalli regolari matul l-esperiment, bl-użu ta' miter tal-bużżieqa (jew kontinwament b'miter tal-fluss tal-piż). Il-pressjoni fil-fetħa tal-ħruġ għandha titkejjel. Dan jista' jsir jew: Iż-żmien meħtieġ għall-kollezzjoni ta' kwantità ta' sustanza għat-test li hija neċessarja għal metodi differenti ta' analiżi huwa ddeterminat b'testijiet preliminari jew bi stimi. Bħala alternattiva għall-ġbir tas-sustanza għal aktar analiżi, tista' tintuża teknika analitika kwantitattiva bil-fluss (eż. kromatografija). Qabel il-kalkolu tal-pressjoni tal-fwar f’temperatura mogħtija, iridu jsiru testijiet preliminari biex tkun iddeterminata r-rata ta' fluss massima li tissatura kompletament il-gass trasportatur mal-fwar tas-sustanza. Din hija garantita jekk il-gass trasportatur jiġi mgħoddi mill-kolonna ta' saturazzjoni suffiċjentement bil-mod sabiex rata baxxa ma tagħtix kalkolu tal-pressjoni tal-fwar akbar. Il-metodu analitiku speċifiku jkun determinat min-natura tas-sustanza għat-test (eż. kromatografija tal-gass jew gravimetrija). Il-kwantità ta' sustanza ttrasportata minn volum magħruf ta' gass trasportatur hija ddeterminata.

(a) bl-inklużjoni ta' gejġ tal-pressjoni bejn is-saturatur u l-kumpartimenti għall-ġbir (dan jista' ma jkunx sodisfaċenti għax iżid l-ispazju mejjet u s-superfiċje li tassorbixxi); jew

(b) bid-determinazzjoni ta' l-inżul tal-pressjoni f’sistema partikulari ta' kumpartimenti għall-ġbir użata bħala funzjoni tar-rata tal-fluss f’esperiment separat (dan jista' ma jkunx sodisfaċenti ħafna għall-kondensaturi tal-likwidu).

1.6.6.3. Kalkolu tal-pressjoni tal-fwar Il-pressjoni tal-fwar hija kkalkulata mid-densità tal-fwar, W/V, permezz ta' l-ekwazzjoni: p = WV × RTM fejn: P il-pressjoni tal-fwar (Pa) W il-piż ta' sustanza għat-test evaporata (g) V il-volum ta' gass saturat (m3) R il-kostanti universali molari tal-gass (J mol-1 K-1) T it-temperatura (K) M piż molari tas-sustanza għat-test (g mol-l) Volumi mkejla jridu jkunu korretti għad-differenzi fil-pressjoni u fit-temperatura bejn il-miter tal-fluss u s-saturatur b'termostat. Jekk il-miter tal-fluss qiegħed l isfel mill-kompartiment għall-ġbir tal-fwar, jistgħu jkunu neċessarji korrezzjonijiet biex tingħata kunsiderazzjoni għal xi ingredjenti vaporizzati fil-kompartiment għall-ġbir (1).

1.6.7. Skrun li jdur (8, 11, 13)

1.6.7.

1.6.7.1. Apparat It-teknika ta' l-iskrun li jdur tista' titwettaq bl-użu ta' gejġ tal-visżkożità ta' l-iskrun li jdur kif murija fil-figura 8. Disinn skematiku ta' l-esperiment jidher fil-figura 7. L-apparat tal-kejl jikkonsisti tipikament minn skrun li jdawwar li l-parti ta' fuq tiegħu tintuża għall-kejl, impoġġija fi spazju magħluq b'termostat (irregolat sa 0,1 oC). Il-kontenitur għall-kampjun jitpoġġa fi spazju magħluq b'termostat (irregolat sa 0,1 oC), u l-partijiet l-oħra kollha ta' l-apparat jinżammu f’temperatura ogħla biex tiġi evitata l-kondensazzjoni. Apparat ta' pompa b'vakwu għoli huwa kkonnettjat mas-sistema permezz ta' valvijiet b'vakwu għoli. Il-parti ta' fuq ta' l-iskrun li jdur li tintuża għall-kejl tikkonsisti minn ballun ta' l-azzar (minn 4 sa 5 mm dijametru) f’tubu. Il-ballun huwa sospiż u stabbilizzat f’kamp manjetiku, ġeneralment bl-użu ta' kombinazzjoni ta' kalamiti permanenti u bobini ta' kontroll. Il-ballun jiddawwar mill-kampijiet li jduru prodotti mill-bobini. Bobini pick-up, li jkejlu l-manjetizzazzjoni baxxa laterali dejjem preżenti tal-ballun, jippermettu li r-rata ta' dawran tkun imkejla.

1.6.7.2 Proċedura tal-kejl Meta l-ballun ikun laħaq veloċità determinata ta' rotazzjoni v(o) (is-soltu madwar 400 revoluzzjoni kull sekonda), tieqaf il-fornitura ta' l-enerġija u titnaqqas il-veloċità, minħabba l-frizzjoni mal-gass. It-tnaqqis fil-veloċità tar-rotazzjoni titkejjel bħala funzjoni tal-ħin. Peress li l-frizzjoni kkawżata mis-sospensjoni manjetika hija insinifikanti meta mqabbla mal-frizzjoni tal-gass, il-pressjoni tal-gass p tinsab minn: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) fejn c— il-veloċità medja tal-molekuli tal-gass r ir-raġġ tal-ballun ρ id-densità tal-piż tal-ballun σ il-koeffiċjent tat-trasferiment tanġenzjali tal-momentum (ε = għal superfiċje sferikali ideali tal-ballun) t il-ħin v(t) il-veloċità tar-rotazzjoni wara l-ħin t v(o) il-veloċità tar-rotazzjoni inizjali L-ekwazzjoni tista' tinkiteb ukoll: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 fejn tn, tn - 1 huma l-ħinijiet meħtieġa għal numru determinat N ta' revoluzzjonijiet. Dawn l-intervalli ta' ħin tn u tn-1 jiġu wara xulxin, u tn > t n - 1. Il-veloċità medja tal-molekula tal-gass c— hija mogħtija bi: c— = 8 RTπ M12 fejn: T it-temperatura R il-kostanti molari universali tal-gass M il-piż molari

2. DATA Il-pressjoni tal-fwar minn kwalunkwe metodu preċedenti għandha tkun iddeterminata għal ta' l-inqas żewġ temperaturi. Tlieta jew aktar huma preferuti fl-iskala minn 0 sa 50 oC, bil-għan li tkun ikkontrollata l-linearità tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar.

3. RAPPURTAR Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja: Jekk tkun osservata xi transizzjoni (bdil fl-istat, dekompożizzjoni), l-informazzjoni li ġejja għandha tkun innotata: L-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rrapportati, b'mod speċjali fir-rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.

il-metodu użat,

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet) u l-istadju preliminarju ta' purifikazzjoni, jekk hemm,

ta' l-inqas żewġ valuri tal-pressjoni tal-fwar u tat-temperatura, preferibbilment fl-iskala minn 0 sa 50 oC,

id-DATA kollha mhux maħduma,

il-kurva log p versus 1/T,

l-istima tal-pressjoni tal-fwar f’20 jew 25 oC.

in-natura tal-bidla,

it-temperatura li fiha saret il-bidla fi pressjoni atmosferika,

il-pressjoni tal-fwar f’10 u 20 oC taħt it-temperatura ta' transizzjoni u 10 u 20 oC fuq din it-temperatura (kemm-il darba it-transizzjoni ma tkunx minn solidu għall-gass).

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)

REFERENZI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593. NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa -Static method. NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa -Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure- temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987,'VoI. 5 (4),2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173. B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435. G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, Vol. 17 (2),642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, voI. 20 (4),1148. J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, Vol. 3 (3),1715.

A.5. TENSJONI TAS-SUPERFIĊJE

A.5.

1. METODU Il-metodi mfissra huma bbażati fuq il-linja gwida tat-Test OECD (1). Il-prinċipji fundamentali huma mogħtija fir-referenzi (2).

1.

1.1. DAĦLA Il-metodi mfissra għandhom jiġu applikati għall-kejl tat-tensjoni fuq is-superfiċje ta' soluzzjonijiet ta' l-ilma. Qabel ma jsiru dawn it-testijiet huwa utli li jkollok informazzjoni preliminari dwar is-solubilità ta' l-ilma, l-istruttura, il-proprjetajiet ta' l-idrolisi u l-konċentrazzjoni għall-formazzjoni ta' micelles mis-sustanza. Il-metodi li ġejjin japplikaw għall-parti l-kbira tas-sustanzi kimiċi, mingħajr ebda restrizzjoni fir-rigward tal-grad tal-purità tagħhom. Il-kejl tat-tensjoni tas-superfiċje bil-metodu tat-tensiometer bil-ħolqa huwa ristrett għal soluzzjonijiet fl-ilma b’viskożità dinamika ta' inqas minn approssimattivament 200 mPa s.

1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET L-entalpija ħielsa tas-superfiċje għal kull unità ta' l-erja tas-superfiċje hija msejħa t-tensjoni tas-superfiċje. It-tensjoni tas-superfiċje tingħata bħala: N/m (unità SI) jew mN/m (sub-unità SI) 1 N/m = 103 dini/cm 1 mN/m = 1 dina/cm fis-sistema cgs li m'għadhiex tintuża

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA Sustanzi ta' referenza mhumiex meħtieġa li jintużaw fil-każijiet kollha meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma għandhom iservu primarjament biex minn żmien għal żmien jiċċekkjaw ir-rendiment tal-metodu u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra. Sustanzi ta' referenza li jkopru firxa kbira ta' tensjoni tas-superfiċje jingħataw fir-referenzi 1 u 3.

1.4. PRINĊIPJI TAL-METODI Il-metodi huma bbażati fuq il-kejl tal-qawwa massima li hemm bżonn li tkun eżerċitata b'mod vertikali, fuq staffa jew ħolqa f’kuntatt mas-superfiċje tal-likwidu li jkun qed jiġi eżaminat imqiegħed f’reċipjent tal-kejl, bil-għan li jkun separat minn din is-superfiċje, jew fuq pjanċa, bit-tarf f’kuntatt mas-superfiċje, bil-għan li tinġibed ir-rita li tkun ffurmat. Sustanzi li jinħallu fl-ilma f’millinqas konċentrazzjoni ta' 1 mg/l jiġu ttestjati f’soluzzjoni fl-ilma f’konċentrazzjoni waħda.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ Dawn il-metodi kapaċi jagħtu preċiżjoni akbar milli mistennija li tkun meħtieġa għall-valutazzjoni ambjentali.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODI Soluzzjoni tas-sustanza titħejja f’ilma distillat. Il-konċentrazzjoni ta' din is-soluzzjoni għandha tkun 90 % tas-solubilità tas-saturazzjoni tas-sustanza fl-ilma, meta din il-konċentrazzjoni taqbeż 1 g/l, konċentrazzjoni ta' 1 g/l tiġi użata għat-test. Mhux meħtieġ li jkunu ttestjati sustanzi b'solubilità fl-ilma ta' inqas minn 1 mg/l.

1.6.

1.6.1. Il-metodu tal-pjanċa Ara ISO 304 u NF T 73-060 (Aġenti attivi fis-superfiċje – determinazzjoni tat-tensjoni tas-superfiċje bil-ġbid tar-rita tal-likwidu).

1.6.2. Metodu ta' l-istaffa Ara ISO 304 u NF T 73-060 (Aġenti attivi fis-superfiċje – determinazzjoni tat-tensjoni tas-superfiċje bil-ġbid tar-rita tal-likwidu).

1.6.3. Metodu tal-ħolqa Ara ISO 304 u NF T 73-060 (Aġenti attivi fis-superfiċje – determinazzjoni tat-tensjoni tas-superfiċje bil-ġbid tar-rita tal-likwidu).

1.6.4. Il-metodu armonizzat tal-ħolqa ta' l-OECD

1.6.4.

1.6.4.1. Apparat Tensiometers disponibbli kummerċjalment huma adegwati għal dan il-kejl. Huma jikkonsistu minn dawn l-elementi:

il-mejda mobbli għall-kampjun,

is-sistema ta' kejl tal-qawwa,

korp tal-kejl,

reċipjent tal-kejl.

1.6.4.1.

1.6.4.1.1. Mejda mobbli għall-kampjun Il-mejda mobbli għall-kampjun tintuża bħala rfid għar-reċipjent ta' kejl kontrollat tat-temperatura li jżomm il-likwidu għat-test. Flimkien mas-sistema ta' kejl tal-qawwa, hija mmuntata fuq struttura wieqfa.

1.6.4.1.2. Sistema ta' kejl tal-qawwa Is-sistema ta' kejl tal-qawwa (ara l-figura) tinsab fuq il-mejda li żżomm il-kampjun. L-iżball ta' kejl tal-qawwa m'għandux jaqbeż ± 10-6 N, li jikkorrispondi mal-limitu ta' żball ta' ±0,1 mg f’kejl ta' piż. F’bosta każijietjiet, l-iskala tal-kejl ta' tensiometers disponibbli kummerċjalment hija kkalibrata fi mN/m sabiex it-tensjoni tas-superfiċje tista' tinqara direttament f’mN/m b'eżattezza ta' 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3. Korp ta' kejl (ħolqa) Il-ħolqa hija magħmula normalment minn wajer ta' platinu-iridju ta' madwar 0,4 mm ħxuna u ċirkumferenza medja ta' 60 mm. Il-ħolqa tal-wajer hija sospiża orizzontalment minn pinn tal-metall u brazz tal-wajer għall-immuntar biex tkun stabbilita l-konnessjoni mas-sistema tal-kejl tal-forza (ara l-figura).

1.6.4.1.3. Figura Korp tal-kejl

(Id-dimensjonijiet kollha f’millimetri) Pin Bracket Ħolqa għall-irfid

1.6.4.1.4. Reċipjent tal-kejl Ir-reċipjent tal-kejl li fih is-sustanza tat-test li se tiġi mkejla għandu jkun tal-ħġieġ b'temperatura kkontrollata. Huwa għandu jkun iddisinjat b'tali mod li matul il-kejl it-temperatura tal-likwidu tas-soluzzjoni għat-test u l-fażi tal-gass il fuq mis-superfiċje tibqa kostanti u li l-kampjun ma jistax jevapora. Huma aċċettabbli reċipjenti ċilindriċi tal-ħġieġ li jkollhom dijametru intern ta' mhux inqas minn 45 mm.

1.6.4.2. Preparazzjoni ta' l-apparat

1.6.4.2.

1.6.4.2.1. Tindif Reċipjenti tal-ħġieġ għandhom jitnaddfu bl-attenzjoni. Jekk neċessarju huma għandhom jinħaslu b'aċidu kromo-sulfuriku, imbagħad b'aċidu fosforiku bħall-ġulepp (minn 83 % sa 98 % mill-piż H3PO4), imlaħlaħ sewwa fl-ilma tal-vit u fl-aħħar maħsul b'ilma distillat għal darbtejn sakemm tinkiseb reazzjoni newtrali u sussegwentement imnixffa jew imlaħalħa b'parti mil-likwidu tal-kampjun li se jitkejjel. Il-ħolqa trid l-ewwel titlaħlaħ sewwa fl-ilma biex jitneħħew xi sustanzi li jinħallu fl-ilma, titgħaddaa għal ftit fl-aċidu kromo-sulfuriku, tinħasel f’ilma distillat għal darbtejn sakemm tinkiseb reazzjoni newtrali u finalment tissaħħan ftit fuq fjamma tal-metanol. Nota: Il-kontaminazzjoni minn sustanzi li ma jinħallux jew li jinqerdu minn aċidu kromo-sulfuriku jew aċidu fosforiku, bħas-silikone, għandha titneħħa permezz ta' solvent organiku adattat.

1.6.4.2.2. Kalibrazzjoni ta' l-apparat Il-validazzjoni ta' l-apparat tikkonsisti mill-verifika tal-punt żero u minn aġġustament sabiex l-indikazzjoni ta' l-istrument tippermetti determinazzjonali affidabbli f’mN/m.

1.6.4.2.2. Immuntar:

L-apparat għandu jkun invellat, eżempju permezz ta' livell ta' l-ispirtu fuq il-bażi tat-tensiometer, billi jiġu aġġustati l-viti fil-bażi.

Aġġustament tal-punt żero:

Wara l-immuntar tal-ħolqa fuq l-apparat u qabel ma tkun mgħaddsa fil-likwidu, l-indikazzjoni tat-tensiometer għandha tkun aġġustata għal żero u l-ħolqa ċċekkjata għall-parallelliżmu mal-likwidu tas-superfiċje. Għal dan il-għan, il-likwidu tas-superfiċje jista' jintuża bħala mera.

Kalibrazzjonijiet:

Il-kalibrazzjoni tat-test attwali tista' ssir permezz ta' waħda minn dawn iż-żewġ proċeduri:

(a) Bl-użu ta' piż: proċedura bl-użu ta' rikkieba ta' piż magħruf bejn 0,1 u 1,0 g mqiegħdin fuq il-ħolqa. Il-fattur ta' kalibrazzjoni, Φa li miegħu jrid jiġi mmultiplikat il-qari kollu ta' l-istrumenti, għandu jkun ddeterminat skond l-ekwazzjoni (1). Φa=σrσa (1) fejn: σr=mg2b (mN/m) m il-piż tar-rikkieb (g) g l-aċċellerazzjoni tal-gravità (981 cm s-2 fil-livell tal-baħar) b iċ-ċirkumferenza medja tal-ħolqa (cm) σa il-qari tat-tensiometer wara li jitpoġġa r-rikkieb fuq il-ħolqa (mN/m).

(b) Bl-użu ta' l-ilma: proċedura li tuża ilma pur li t-tensjoni tas-superfiċje tiegħu f’eżempju 23 oC hija ugwali għal 72,3 mN/m. Din il-proċedura titwettaq b'aktar ħeffa mill-kalibrazzjoni tal-piż iżda dejjem hemm il-periklu li t-tensjoni tas-superfiċje ta' l-ilma tkun iffalsifikata minn traċċi ta' kontaminazzjoni mis-surfattanti. Il-fattur ta' kalibrazzjoni, Φa li miegħu jrid jiġi mmultiplikat il-qari kollu ta' l-istrument, għandu jkunu ddeterminat skond l-ekwazzjoni (2). Φb=σoσg (2) fejn: σo il-valur ċitat fil-letteratura għat-tensjoni tas-superfiċje ta' l-ilma (mN/m) σg il-valur mkejjel tat-tensjoni tas-superfiċje ta' l-ilma (mN/m) it-tnejn fl-istess temperatura.

1.6.4.3. Preparazzjoni tal-kampjuni Soluzzjonijiet fl-ilma għandhom jitħejjew mis-sustanzi li se jkunu ttestjati, bl-użu tal-konċentrazzjonijiet meħtieġa fl-ilma, u m'għandhomx jinkludu xi sustanzi li ma nħallux. Is-soluzzjoni trid tinżamm f’temperatura kostanti (±0,5 oC). Ladarba t-tensjoni tas-superficje tas-soluzzjoni fir-reċipjent tal-kejl tinbidel fuq perjodu ta' żmien, diversi kejlijiet għandhom isiru f’ħinijiet differenti u ssir kurva li turi t-tensjoni tas-superfiċje bħala funzjoni taż-żmien. Meta ma ssir ebda bidla oħra, ikun intlaħaq stat ta' ekwilibriju. Kontaminazzjoni ta' trab jew ta' gassijiet minn sustanzi oħra tinterferixxi mal-kejl. Ix-xogħol għalhekk għandu jitwettaq taħt għata ta' protezzjoni.

1.6.5. Kondizzjonijiet tat-test Il-kejl għandu jsir f’approssimattivament 20 oC u għandu jkun ikkontrollat sa ±0,5 oC,

1.6.6. L-eżekuzzjoni tat-test Is-soluzzjonijiet biex jiġu mkejla għandhom ikunu trasferiti fir-reċipjent tal-kejl imnaddaf sewwa, bl-attenzjoni biex ma jkunx hemm ragħwa, u sussegwentement ir-reċipjent tal-kejl għandu jitpoġġa fuq il-mejda ta' l-apparat tat-test. Il-wiċċ tal-mejda bir-reċipjent tal-kejl għandu jittella sakemm il-ħolqa titgħaddas taħt il-wiċċ tas-soluzzjoni li se titkejjel. Sussegwentement, il-wiċċ tal-mejda jitbaxxa gradwalment u b'mod ibbalanċjat b'rata ta' approssimattivament 0,5 cm/min) biex tinqala’ l-ħolqa mill-wiċċ sakemm tintlaħaq il-forza massima. Is-saff likwidu mwaħħal mal-ħolqa ma jridx jissepara mill-ħolqa. Wara li jintemmu l-kejlijiet, il-ħolqa għandha titbaxxa għal darb'oħra taħt il-wiċċ u l-kejl jiġi ripetut sakemm jintlaħaq valur ta' tensjoni tas-superfiċje kostanti. Il-ħin tat-trasferiment tas-soluzzjoni għar-reċipjent tal-kejl għandu jkun irreġistrat għal kull determinazzjoni. Il-qari għandu jittieħed fil-forza massima meħtieġa biex il-ħolqa tinqala’ mill-wiċċ tal-likwidu.

2. Tabella Korrezzjoni tat-tensjoni tas-superfiċje mkejla Għal soluzzjonijiet fl-ilma biss, ρ = 1 g/cm3

DATA Bil-għan li tkun ikkalkulata t-tensjoni tas-superfiċje, il-valur moqri f’mN/m fuq l-apparat għandu l-ewwel jiġi mmultiplikat bil-fattur tal-kalibrazzjoni Φa u Φb (jiddependi fuq il-proċedura ta' kalibrazzjoni użata). Dan jagħti valur li japplika biss approssimattivament u għalhekk jeħtieġ korrezzjoni. Harkins u Jordan (4) iddeterminaw b'mod empiriku fatturi ta' korrezzjoni għall-valuri tat-tensjoni tas-superfiċje mkejla bil-metodu tal-ħolqa li huma dipendenti fuq id-dimensjonijiet tal-ħolqa, id-densità tal-likwidu u t-tensjoni tas-superfiċje tiegħu. Peress li d-determinazzjoni tal-fattur ta' korrezzjoni għal kull kejl individwali mit-tabelli Harkins and Jordan teħtieġ ħafna xogħol, sabiex tkun ikkalkulata t-tensjoni tas-superfiċje għal soluzzjonijiet fl-ilma tista’ tintuża l-proċedura simplifikata tal-qari tal-valuri kkorreġuti tat-tensjoni tas-superfiċje direttament mit-tabella. (Għandha tintuża l-interpolazzjoni għall-qari fl-iskala bejn il-valuri tabulari). r = 9,55 mm (raġġ medju tal-ħolqa) r = 0,185 mm (raġġ medju tal-ħolqa) Valur Sperimentali (mN/m) Valur Ikkoreġut (mN/m) Kalibrazzjoni tal-piż (ara 1.6.4.2.2(a)) Kalibrazzjoni ta' l-ilma (ara 1.6.4.2.2(b)) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Din it-tabella ġiet kompilata abbażi tal-korrezzjoni Harkins-Jordan. Hija simili għal dik fid-DIN Standard (DIN 53914) għall-ilma u soluzzjonijiet fl-ilma(densità ρ = 1 g/cm3) u hija għall-ħolqa disponibbli kummerċjalment li għandha d-dimensjonijiet R = 9,55 mm (raġġ medju tal-ħolqa) u r = 0,185 mm (raġġ tal-wajer tal-ħolqa). It-tabella tipprovdi valuri kkorreġuti għall-kejl tat-tensjoni tas-superfiċje meħuda wara l-kalibrazzjoni bil-piżijiet jew il-kalibrazzjoni bl-ilma. Alternattivament, mingħajr il-kalibrazzjoni preċedenti, it-tensjoni tas-superfiċje tista' tkun ikkalkulata skond il-formula li ġejja: σ=fxF4πR fejn: F il-forza mkejla fuq id-dinamometru fil-punt tal-ksur tar-rita R ir-raġġ tal-ħolqa f il-fattur ta' korrezzjoni (1)

3. RAPPURTAR

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

il-metodu użat,

it-tip ta' ilma jew is-soluzzjoni użat/a.

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),

ir-riżultati tal-kejl: it-tensjoni tas-superfiċje (qari) li juri kemm il-qari individwali u l-medja aritmetika tagħhom kif ukoll il-medja kkorreġuta (jikkunsidraw il-fattur tat-tagħmir u t-tabella ta' korezzjoni),

il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni,

it-temperatura tat-test,

l-età tas-soluzzjoni użata; b'mod partikulari l-ħin bejn it-Preparazzjoni u l-kejl tas-soluzzjoni,

id-deskrizzjoni tad-dipendenza fuq il-ħin tat-tensjoni tas-superfiċje wara t-trasferiment tas-soluzzjoni fir-reċipjent tal-kejl.

l-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rrapportati, b'mod speċjali fir-rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.

3.2. INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI Meta jkun ikkunsidrat il-fatt li l-ilma distillat għandu tensjoni tas-superfiċje ta' 72,75 mN/m f’20 C, sustanzi li juru tensjoni tas-superfiċje inqas minn 60 mN/m taħt il-kondizzjonijiet ta' dan il-metodu għandhom jitqiesu bħala materjali attivi fis-superfiċje.

4.(1)(2)(3)(4)

REFERENZI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.

A.6. SOLUBILITÀ TA' L-ILMA

A.6.

1. METODU Il-metodi mfissra huma bbażati fuq il-linja gwida tat-Test OECD (1).

1.

1.1 DAĦLA Biex isir it-test huwa utli li jkollok informazzjoni preliminari dwar il-formula strutturali, il-pressjoni tal-fwar, il-kostanti ta' dissoċjazzjoni u l-idrolisi (bħala funzjoni ta' pH) tas-sustanza. Ebda metodu singolu m'huwa disponibbli biex ikopri l-firxa kollha ta' solubilitajiet fl-ilma. Iż-żewġ metodi ta' test mfissra hawn taħt ikopru l-firxa kollha tas-solubilitajiet iżda m'humiex applikabbli għal sustanzi volatili: Is-solubiltà ta' l-ilma tas-sustanza għat-test tista’ tkun affettwata b’mod konsiderevoli bil-preżenza ta' impuritajiet.

wieħed japplika għal sustanzi essenzjalment puri b'solubilitajiet baxxi, (< 10-2 grammi kull litru), u li huma stabbli fl-ilma, imfisser bħala l-metodu ta' elużjoni tal-kolonna,

l-ieħor japplika għal sustanzi essenzjalment puri b'solubilitajiet ogħla, (< 10-2 grammi kull litru), u li huma stabbli fl-ilma, imfisser bħala l-metodu tal-flixkun.

1.2. TIFSIRA U UNITAJIET Is-solubiltà fl-ilma tas-sustanza hija speċifikata bis-saturazzjoni tal-piż ta' konċentrazzjoni tas-sustanza fl-ilma f’temperatura mogħtija. Is-solubilità fl-ilma hija speċifikata f’unitajiet ta' piż għal kull volum ta' soluzzjoni. L-unità SI hija kg/m3 (grammi għal kull litru tista' tintuża wkoll).

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA Sustanzi ta' referenza mhumiex meħtieġa li jintużaw fil-każijiet kollha meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma għandhom iservu primarjament biex jiċċekkjaw r-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra.

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST L-ammont approssimattiv tal-kampjun u l-ħin neċessarju biex tintlaħaq il-konċentrazzjoni tas-saturazzjoni tal-piż għandu jkun ddeterminat f’test preliminari sempliċi.

1.4.

1.4.1. Il-metodu ta' elużjoni tal-kolonna Dan il-metodu huwa bbażat fuq l-elużjoni tas-sustanza għat-test bl-ilma minn mikro-kolonna li hija mimlija b'materjal ta' appoġġ inert, bħal boċċi tal-ħġieġ jew ramel, miksija b'eċċess ta' sustanza għat-test. Is-solubiltà ta' l-ilma tigi ddeterminata meta l-konċentazzjoni tal-piż tas-sustanza li titneħħa bl-elużjoni tkun kostanti. Din tintwera bil-konċentrazzjoni bħala funzjoni tal-ħin.

1.4.2. Il-metodu tal-flixkun F’dan il-metodu, is-sustanza (is-solidi jridu jitfarrku) tinħall fl-ilma f’temperatura ftit ogħla mit-temperatura tat-test. Meta tinkiseb is-saturazzjoni t-taħlita titkessaħ u tinżamm fit-temperatura tat-test, bi tħawwid sakemm neċessarju biex jintlaħaq l-ekwilibriju. Alternattivament, il-kejl jista' jitwettaq direttament fit-temperatura tat-test, jekk ikun assigurat bit-teħid adattat ta' kampjuni li ntlaħaq l-ekwilibriju tas-saturazzjoni. Sussegwentement, il-konċentrazzjoni tal-piż tas-sustanza fis-soluzzjoni fl-ilma, li ma tridx tinkludi xi partikoli mhux maħlula, hija determinata b'metodu analitiku adattat.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ

1.5.

1.5.1. Ripetibiltà Għall-metodu ta' elużjoni tal-kolonna, jista' jinkiseb < 30 % ; għall-metodu tal-flixkun, għandu jkun osservat < 15 %.

1.5.2. Sensittività Din tiddependi fuq il-metodu ta' analiżi, iżda determinazzjonijiet tal-konċentrazzjoni tal-piż sa 10-6 grammi għal kull litru jistgħu jkunu determinati.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.6.

1.6.1. Kondizzjonijiet tat-test It-test isir preferibbilment f’20 ±0,5 oC. Jekk ikun hemm suspett ta' dipendenza fuq it-temperatura fis-solubiltà (> 3 % għal kull oC), għandhom jintużaw żewġ temperaturi oħra ta' mill-inqas 10 oC fuq u taħt it-temperatura magħżula inizjalment. F’dan il-każ, il-kontroll tat-temperatura għandu jkun ±0,1 oC. It-temperatura magħżula għandha tinżamm kostanti fil-parti relevanti kollha tat-tagħmir.

1.6.2. Test preliminari Ma' approssimattivament 0,1 g ta' kampjun (is-sustanzi solidi għandhom jintaħnu) f’ċilindru bi gradazzjoni ta' 10ml magħluq b'tapp tal-ħġieġ, volumi ta' ilma distillat għandhom jiżdiedu f’temperatura ambjentali skond l-indikazzjonijiet murija fit-tabella hawn taħt: 0,1 g solubbli f’ x ml ta' ilma 0,1 0,5 1 2 10 100 >100 Solubilità approssimattiva (grammi għal kull litru) >1000 1000 sa 200 200 sa 1000 100 sa 50 50 sa 10 10 sa 1 <1 Wara kull żieda ta' l-ammont indikat ta' ilma, it-taħlita titħawwad bis-saħħa għal 10 minuti u hija kkontrollata viżwalment għal xi partijiet tal-kampjun mhux maħlula. Jekk, wara ż-żieda ta' 10 ml ta' ilma, il-kampjun jew partijiet minnu jibqgħu mhux maħlula, l-esperiment għandu jiġi ripetut b'ċilindru tal-kejl ta' 100 ml b'volumi akbar ta' ilma. F’solubilitajiet aktar baxxi l-ħin meħtieġ biex tinħall sustanza jista' jkun iktar b'mod konsiderevoli (ta’ l-inqas għandhom jingħataw 24 siegħa). Is-solubiltà approssimattiva hija mogħtija fit-tabella taħt dak il-volum ta' ilma miżjud li fih iseħħ it-taħlil komplet tal-kampjun. Jekk is-sustanza apparentement tkun għadha mhux maħlula, għandhom jingħataw aktar minn 24 siegħa (massimu ta' 96 siegħa), jew għandha ssir aktar dilwazzjoni biex ikun aċċertat jekk għandhiex tintuża l-elużjoni tal-kolonna jew il-solubilità fil-flixkun.

1.6.3. Il-metodu ta' elużjoni tal-kolonna

1.6.3.

1.6.3.1. Materjal ta' appoġġ, solvent u fluwidu li jintuża għall-elużjoni Il-materjal ta' appoġġ għall-metodu ta' elużjoni tal-kolonna għandu jkun inert. Boċċi tal-ħġieġ u ramel huma materjali li jistgħu possibbilment jintużaw. Solvent volatili adattat ta' kwalità ta' reaġenti analitiku għandu jintuża biex tkun applikata s-sustanza għat-test mal-materjal ta' appoġġ. Ilma li kien distillat għal darbtejn f’apparat tal-ħġieġ jew kwarz għandu jintuża bħala l-eluwent. Nota: M'għandux jintuża ilma direttament minn apparat li jbiddel jone organiku.

1.6.3.2. Preparazzjoni ta' l-appoġġ Madwar 600 mg ta' materjal ta' appoġġ jintiżen u jiġi trasferit fi flixkun ta' 50 ml b'qiegħ tond. Ammont adattat miżun ta' sustanza għat-test jiġi maħlul fis-solvent magħżul. Ammont adattat ta' din is-soluzzjoni tiġi miżjuda mal-materjal ta' appoġġ. Is-solvent irid ikun evaporat kompletament, eż. f’evaporatur li jdur, inkella s-saturazzjoni ta' l-ilma ta' l-appoġġ ma tinkisibx minħabba l-effetti ta' partizzjoni fuq is-superfiċje tal-materjal ta' appoġġ. It-Preparazzjoni tal-materjal ta' appoġġ jista' jikkawża problemi (riżultati żbaljati) jekk is-sustanza għat-test tiddepożita bħala żejt jew bħala fażi kristallina differenti. Il-problema għandha tiġi eżaminata b'mod sperimentali u d-dettalji rrapurtati. Huwa permess li l-materjal ta' appoġġ imħejji jixxarrab għal madwar sagħtejn f’approssimattivament 5 ml ta' ilma, u imbagħad is-sospensjoni tiġi miżjuda mal-mikrokolonna. Alternattivament, materjal ta' appoġġ niexef imħejji jista' jitferra' fil-mikrokolonna, li imtliet bl-ilma, u mbagħad ekwilibrata għal madwar sagħtejn.

1.6.3.2. Proċedura tat-test:

L-elużjoni tas-sustanza mill-materjal ta' appoġġ tista' titwettaq b'wieħed minn żewġ modi differenti:

il-pompa ta' ċirkolazzjoni mill-ġdid (ara l-figura 1),

ir-reċipjent ta' livellar (ara l-figura 4).

1.6.3.3. Metodu ta' elużjoni tal-kolonna bil-pompa li tiċ ċirkola mill-ġdid

1.6.3.3. Apparat

Arranġament skematiku ta' sistema tipika huwa rrappreżentat fil-figura 1. Mikrokolonna adattata hija murija fil-figura 2, għalkemm kwalunkwe qies huwa aċċettabbli, bil-kondizzjoni li jissodisfa l-kriterji ta' riproduċibilità u sensittività. Il-kolonna għandha tipprovdi għal spazju ta' fuq li jesa' ta' l-inqas ħames volumi ta' ilma tal-qiegħ u tkun kapaċi żżomm minimu ta' ħames kampjuni. Alternattivament, id-daqs jista' jitnaqqas jekk is-solvent għall-mili jintuża biex jieħu post il-ħames volumi tal-qiegħ inizjali mneħħija ma' l-impuritajiet. Il-kolonna għandha tiġi kkonnettjata ma' pompa li tiċċirkola mill-ġdid kapaċi tikkontrolla flussi ta' madwar 25 ml/h. Il-pompa hija kkonnettjata b'politetetrafluworoetilene (P.T.F.E.) u/jew konnessjonijiet tal-ħġieġ. Il-kolonna u l-pompa, meta mmuntati, għandu jkollhom provvediment għat-teħid tal-kampjuni mill-effluwent u għall-ekwilibrazzjoni ta' l-ispazju ta' fuq fi pressjoni atmosferika. Il-materjal tal-kolonna huwa appoġġat minn tapp żgħir (5 mm) glass wool, li jservi wkoll biex jiffiltra l-partikoli. Il-pompa li tiċċirkola mill-ġdid tista' tkun, eż. pompa peristaltika jew pompa bil-membrana (għandha tingħata attenzjoni sabiex ma jsir ebda kontaminazzjoni ma' u/jew assorbiment fil-materjal tat-tubu).

Proċedura tal-kejl

Jibda l-fluss mill-kolonna. Huwa rrakkomandat li tintuża r-rata tal-fluss ta' madwar 25 ml/hr (din tikkorrispondi għal 10 volumi tal-qiegħ/siegħa għal kolonna msemmija). L-ewwel ħames volumi tal-qiegħ (minimu) jkunu skartati sabiex jitneħħew impuritajiet li jinħallu fl-ilma. Wara dan, il-pompa li tiċċirkola mill-ġdid titħalla taħdem sakemm jiġi stabbilit ekwilibriju, kif definit minn ħames kampjuni suċċessivi li l-konċentrazzjonijiet tagħhom ma jiddifferenzjawx b'aktar minn ± 30 % b'għażla bbażata bl-inzertaturi. Dawn il-kampjuni għandhom ikunu separati wieħed mill-ieħor b'intervalli ta' ħin li jikkorrispondu għall-passaġġ ta' mill-inqas 10 volumi tal-qiegħ ta' l-eluwent.

1.6.3.4. Metodu ta' elużjoni b'reċipjent ta' livellar

1.6.3.4. Apparat (ara figuri 4 u 3)

Reċipjent ta' livellar: Il-konnessjoni mar-reċipjent ta' livellar ssir bl-użu ta' ġonta tal-qiegħ tal-ħġieġ li hija kkonnettjata b'tubu PTFE. Huwa rakkomandat li tkun użata rata ta' fluss ta' approssimattivament 25 ml/hr. Frazzjonijiet suċċessivi ta' materjal ta' elużjoni għandhom jinġabru u jiġu analizzati bil-metodu magħżul.

Proċedura tal-kejl

Dawk il-frazzjonijiet mill-iskala tan-nofs ta' materjal ta' elużjoni fejn il-konċentrazzjonijiet huma kostanti (± 30 %) f’mill-inqas ħames frazzjonijiet konsekuttivi jintużaw biex tkun iddeterminata s-solubiltà fl-ilma. Fiż-żewġ każijiet (l-użu ta' pompa li tiċċirkola mill-ġdid jew reċipjent ta' livellar), it-tieni test għandu jitwettaq b'nofs ir-rata ta' fluss ta' l-ewwel. Jekk ir-riżultati taż-żewġ testijiet jaqblu, it-test huwa sodisfaċenti; jekk hemm solubilità ogħla apparenti mar-rata ta' fluss aktar baxxa, imbagħad it-tnaqqis tar-rata ta' fluss bin-nofs għandu jkompli sakemm żewġ testijiet konsekuttivi jagħtu l-istess solubiltà. Fiż-żewġ każijiet (bl-użu tal-pompa li tiċċirkola mill-ġdid jew b'reċipjent ta' livellar) il-frazzjonijiet għandhom jiġu kkontrollati għall-preżenza ta' materja li twaħħal permezz ta' eżami bl-effett Tyndall (diffużjoni tad-dawl). Preżenza ta' partikoli bħal dawn tinvalida r-riżultati, u t-test għandu jkun ripetut b'titjib fl-azzjoni filtranti tal-kolonna. Il-pH ta' kull kampjun għandu jkun reġistrat. Għandu jitwettaq test ieħor bl-istess temperatura.

1.6.4. Metodu tal-flixkun

1.6.4.

1.6.4.1. Apparat Għall-metodu tal-flixkun hemm bżonn il-materjal li ġej:

l-apparat tal-ħġieġ u strumentazzjoni normali ta' laboratorju,

l-apparat adattat għall-aġitazzjoni tas-soluzzjonijiet ta' temperaturi kostanti kontrollati,

il-magna ċentifruga (preferibbilment bit-termostat), jekk ikun meħtieġ b'emulsjonijiet, u

t-tagħmir għal determinazzjoni analitika.

1.6.4.2. Proċedura tal-kejl Il-kwantità ta' materjal neċessarju biex jiġi saturat il-volum mixtieq ta' ilma hija stmata mit-test preliminari. Il-volum ta' l-ilma meħtieġ ikun jiddependi fuq l-metodu analitiku u l-iskala ta' solubilità. Jintiżen madwar ħames darbiet il-kwantità ta' materjal ddeterminat hawn fuq f’kull wieħed mit-tliet reċipjenti tal-ħġieġ mgħammra b'tappijiet tal-ħġieġ (eż. tubi ċentrifugi, fliexken). Il-volum magħżul ta' ilma jiżdied f’kull reċipjent, u r-reċipjenti jingħalqu sewwa. Ir-reċipjenti magħluqa imbagħad jiġu mċaqalqa fi 30 oC. (Għandu jintuża apparat li jċaqlaq jew iħawwad kapaċi li jaħdem f’temperatura kostanti, eż. taħwid manjetiku b'banju ta' l-ilma kkontrollat termostatikament). Wara ġurnata, wieħed mir-reċipjenti jitneħħa u jiġi ekwilibrat mill-ġdid għal 24 siegħa fit-temperatura tat-test b'ċaqliq okkażjonali. Il-kontenuti tar-reċipjent imbagħad jiġu ċċentrifugati fit-temperatura tat-test, u l-konċentrazzjoni tas-sustanza għat-test f’fażi ċara fl-ilma hija ddeterminata b'metodu analitiku adattat. Iż-żewġt iflixken l-oħra jiġu ttrattati bl-istess mod wara ekwilibrazzjoni inizjali f’30 oC għal jumejn u tlitt ijiem, rispettivament. Jekk ir-riżultati tal-konċentrazzjoni f’mill-anqas l-aħħar żewġ reċipjenti jaqblu mar-riproduċibbiltà, it-test huwa sodisfaċenti. It-test kollu għandu jkun ripetut, bl-użu ta' ħinijiet ta' ekwilibrazzjoni itwal, jekk ir-riżultati mir-reċipjenti 1, 2 u 3 juru tendenza ta' valuri li jiżdiedu. Il-proċedura ta' kejl tista' titwettaq ukoll mingħajr pre-inkubazzjoni fi 30 oC. Bil-għan li tkun stmata r-rata li biha jkun stabbilit l-ekwilibriju tas-saturazzjoni, jittieħdu kampjuni sakemm il-ħin tat-tħawwid ma jinfluwenzax aktar il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni għat-test. Il-pH ta' kull kampjun għandu jkun reġistrat.

1.6.5. Analiżi Metodu analitiku speċifiku għas-sustanza huwa preferut għal dawn id-determinazzjonijiet, ladarba ammont żgħar ta' impuritajiet li jinħallu jistgħu jikkawżaw żbalji kbar fis-solubiltà mkejla. Eżempji ta' metodi bħal dawn huma: Kromatografija tal-gass jew likwidu, metodi ta' titrazzjoni, metodi fotometriċi, metodi voltametriċi.

2. DATA

2.

2.1. IL-METODU TA' ELUŻJONI TAL-KOLONNA Il-valur medju ta' mill-inqas ħames kampjuni konsekuttivi meħuda mill-fażi ta' saturazzjoni kostanti għandu jkun ikkalkulat għal kull test, kif ukoll id-devjazzjoni standard. Ir-riżultati għandhom jingħataw f’unitajiet ta' piż għal kull volum ta' soluzzjoni. Il-medji kkalkulati fuq żewġ testijiet bl-użu ta' flussi differenti jiġu mqabbla u għandhom jkollhom ripetibilità ta' anqas minn 30 %.

2.2. METODU TAL-FLIXKUN Ir-riżultati individwali għandhom jingħataw għal kull wieħed mit-tlitt iflixken u dawk ir-riżultati meqjusa kostanti (ripetibilità ta' anqas minn 15 %) għandha titteħdilhom il-medja u jingħataw f’unitajiet ta' piż għal kull volum ta' soluzzjoni. Dan jista' jeħtieġ il-konverżjoni mill-ġdid ta' l-unitajiet ta' piż għall-unitajiet ta' volum, bl-użu tad-densità meta s-solubilità hija għolja ħafna (> 100 gramma għal kull litru).

3. RAPPURTAR

3.

3.1. IL-METODU TA' ELUŻJONI TAL-KOLONNA Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

ir-riżultati tat-test preliminari,

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),

il-konċentrazzjonijiet individwali, rati ta' fluss u l-pH ta' kull kampjun,

id-devjazzjonijiet medji u standard ta' mill-anqas ħames kampjuni mil-livell kostanti ta' saturazzjoni ta' kull test,

il-medja ta' żewġ testijiet aċċettabbli, suċċessivi,

it-temperatura ta' l-ilma matul il-proċess ta' saturazzjoni,

il-metodu ta' analiżi użat,

in-natura ta' materjal ta' appoġġ użat,

il-preparazzjoni tal-materjal ta' appoġġ.

is-solventi użati,

ix-xhieda ta' kwalunkwe instabbiltà kimika tas-sustanza matul it-test u l-metodu użat,

l-informazzjoni kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati, b'mod speċjali fir-rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.

3.2. METODU TAL-FLIXKUN Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

ir-riżultati tat-test preliminari,

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),

id-determinazzjonijiet analitiċi individwali u l-medja fejn aktar minn valur wieħed kien determinat għal kull flixkun.

il-pH ta' kull kampjun,

il-medja tal-valur għall-fliexken differenti li kienu jaqblu,

it-temperatura tat-test,

il-metodu analitiku użat,

ix-xhieda ta' kwalunkwe instabbiltà kimika tas-sustanza matul it-test u l-metodu użat,

l-informazzjoni kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati, b'mod speċjali fir- rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.

4.(1)(2)(3) REFERENZI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility -Column elution method NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility -Flask method

A.8. KOEFFIĊJENT TAL-QSIM

A.8.

1. METODU Il-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun imfisser huwa bbażat fuq il-linja gwida tat-Test OECD (1).

1.

1.1. DAĦLA Biex isir it-test huwa utli li jkollok informazzjoni preliminari dwar il-formula strutturali, il-kostanti ta' dissoċjazzjoni, is-solubiltà ta' l-ilma, l-idrolisi, is-solubiltà ta' l-n-oktanol, it-tensjoni tas-superfiċje tas-sustanza. Il-kejlijiet għandhom jittieħdu fuq sustanzi jonizzabbli biss fil-forma mhux jonizzata tagħhom (aċidu ħieles jew bażi ħielsa) prodotti bl-użu ta' sustanza adattata b'pH ta' mill-anqas unità pH taħt (aċidu ħieles) jew fuq (bazi ħielsa) il-pK. Dan il-metodu tat-test jinkludi żewġ proċeduri separati: il-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun u l-kromatografija likwida ta' rendiment għoli (HPLC). Ta' l-ewwel hija applikabbli meta l-valur tal-log Pow (ara isfel għad-definizzjonijiet) jaqa' fl-iskala minn - 2 sa 4 u ta' l-aħħar fl-iskala minn 0 sa 6. Qabel ma titwettaq xi waħda mill-proċeduri sperimentali għandha l-ewwel tinkiseb stima preliminari tal-koeffiċjent tal-qsim. Il-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun japplika biss għal sustanzi essenzjalment puri li jinħallu fl-ilma u fl-n-oktanol. Ma japplikax għall-materjali attivi fuq is-superfiċje (li għalihom għandu jkun provdut valur ikkalkulat jew stima bbażata fuq is-solubilitajiet individwali fl-n-oktanol u l-ilma). Il-metodu HPLC ma japplikax għall-aċidi u l-bażijiet qawwija, komplessi metalliċi, materjali attivi fuq is-superficje jew sustanzi li jirreaġġixxu ma' l-eluwent. Għal dawn il-materjali, għandu jkun provdut valur ikkalkulat jew stima bbażata fuq is-solubilitajiet individwali fl-n-oktanol u l-ilma. Il-metodu HPLC huwa inqas sensittiv għall-preżenza ta' impuritajiet fil-kompost għat-test milli huwa l-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun. Madankollu, f’xi każijietjiet impuritajiet jistgħu jagħmlu l-interpretazzjoni tar-riżultati diffiċli minħabba li l-assenjazzjoni tal-quċċata ssir inċerta. Għal taħlitiet li jagħtu faxxa mhux riżolta, għandhom ikunu ddikjarati l-ogħla u l-inqas limiti tal-log P.

1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET Il-koeffiċjent tal-qsim (P) huwa mfisser bħala l-proporzjon tal-konċentrazzjonijiet ta' l-ekwilibriju (ci) tas-sustanza maħlula f’sistema ta' żewġ fażijiet li tikkonsisti f’żewġ solventi li ma jistgħux jitħalltu. Fil-każ ta' l-n-oktanol u l-ilma: pow=cn-octanolcwater Il-koeffiċjent tal-qsim (P) għalhekk huwa l-kwozjent taż-żewġ konċentrazzjonijiet u normalment jingħata fil-forma tal-logaritmu tiegħu sa bażi 10 (log P).

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA

1.3. Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun

Sustanzi ta' referenza mhumiex meħtieġa li jintużaw fil-każijiet kollha meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma għandhom iservu primarjament biex jiċċekkjaw r-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra.

Metodu HPLC

Bil-għan li d-DATA mkejla għall-HPLC tal-kompost tkun relatata mal-valur P tiegħu, għandu jkun stabbilit graff tal-log P vs DATA kromatografika bl-użu ta' mill-inqas 6 punti ta' referenza. Huwa f’idejn dak li qed juża l-apparat li jagħżel is-sustanzi ta' referenza adattati. Fejn huwa possibli, ta' l-inqas żewġ komposti ta' referenza għandu jkollhom Pow akbar minn dak tas-sustanza għat-test, u Pow ieħor taħt dak tas-sustanza għat-test. Għall-valuri ta' log P inqas minn 4, il-kalibrazzjoni tista' tkun ibbażata fuq DATA miksuba bil-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun. Għall-valuri ta' log P inqas minn 4, il-kalibrazzjoni tista' tkun ibbażata fuq il-valuri validati tal-letteratura jekk dawn jaqblu mal-valuri kkalkulati. Għal aktar eżattezza, huwa preferibbli li jintgħażlu komposti ta' referenza li huma strutturalment relatati mas-sustanza għat-test. Listi estensivi ta' log Pow għal bosta gruppi ta' kimiċi huma disponibbli (2)(3). Jekk m'hemmx disponibbli DATA dwar il-koeffiċjenti tal-qsim ta' komposti relatati strutturalment, imbagħad tista' tintuża kalibrazzjoni aktar ġenerali, stabbilita ma' komposti ta' referenza oħra. Lista ta' sustanzi ta' referenza rakkomandati u l-valuri Pow huma mogħtija fl-Appendiċi 2.

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODI

1.4.

1.4.1. Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun Biex ikun iddeterminat il-koeffiċjent tal-qsim, irid jinkiseb ekwilibriju bejn il-komponenti kollha li jagħmlu interazzjoni fis-sistema, u l-konċentrazzjonijiet tas-sustanzi maħlula fiż-żewġ fażijiet jridu jkunu ddeterminati. Studju tal-letteratura fuq dan is-suġġett jindika li jistgħu jintużaw bosta tekniki differenti biex tiġi solvuta din il-problema, i.e. it-taħlit sewwa taż-żewġ fażijiet segwit bis-separazzoni tagħhom bil-għan li tkun iddeterminata l-konċentrazzjoni ta' l-ekwilibriju għas-sustanza li tkun qed tiġi eżaminata.

1.4.2. Metodu HPLC L-HPLC jitwettaq fuq kolonni analitiċi ppakkjati b'fażi solida disponibbli kummerċjalment li fihom idrokarburi b'katina twila (eż. C8, C18) kimikament mgħaqqda fuq is-silika. Kimiċi injettati f’kolonna bħal din jimxu magħha b'rati differenti minħabba l-gradi differenti tal-qsim bejn il-fażi mobbli u l-fażi stazzjonarja idrokarbonika. Taħlitiet ta' kimiċi jitneħħewlhom is-sustanzi fl-ordni ta' l-idrofobiċità tagħhom, l-ewwel il-kimiċi li jinħallu fl-ilma u t-tieni l-kimiċi li jinħallu fiż-żejt, fi proporzjon mal-koeffiċjent tal-qsim idrokarburi-ilma tagħhom. Dan jippermetti li tkun stabbilita r-relazzjoni bejn il-ħin ta' retenzjoni fuq kolonna bħal din (fażi bil-kontra) u l-koeffiċjent ta' l-n-oktanol/ilma. Il-koeffiċjent tal-qsim jiġi dedott mill-fattur ta' kapaċità k, mogħti bl-espressjoni: k=tr-toto li fiha, tr = huwa l-ħin ta' retenzjoni tas-sustanza għat-test, u to = il-ħin medju li teħtieġ molekula solventi biex tgħaddi mill-kolonna (ħin mejjet). Mhumiex meħtieġa metodi analitiċi kwantitattivi u hija neċessarja biss id-determinazzjoni tal-ħin ta' elużjoni.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ

1.5.

1.5.1. Ripetibilità

1.5.1. Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun

Bil-għan li tkun assigurata l-eżattezza tal-koeffiċjent tal-qsim, determinazzjonijiet duplikati jridu jsiru taħt tliet kondizzjonijiet ta' test differenti, fejn il-kwantità tas-sustanza speċifikata kif ukoll il-proporzjon tal-volumi tas-solvent jistgħu jvarjaw. Il-valuri ddeterminati tal-koeffiċjent tal-qsim espressi bħala l-logaritmi komuni tagħhom għandhom jidħlu fil-kamp ta' varjabbiltà ta' ±0,3 unitajiet logaritmiċi.

Metodu HPLC

Bil-għan li tikber il-fiduċja fil-kejl, jridu jsiru determinazzjonijiet duplikati. Il-valuri ta' log P meħuda minn kejl individwali għandhom jaqgħu fil-kamp ta' varjabbiltà ta' ±0,1 unitajiet logaritmiċi.

1.5.2. Sensittività

1.5.2. Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun

L-iskala ta' kejl tal-metodu hija ddeterminata bil-limitu ta' tfittxija tal-proċedura analitika. Dan għandu jippermetti l-valutazzjoni tal-valuri ta' log Pow fil-kamp ta' varjabbiltà ta' - 2 sa 4 (f’okkażżjonijiet meta kondizzjonijiet japplikaw, dan il-kamp ta' varjabbiltà jista' jitkabbar għall-log Pow sa 5) meta l-konċentrazzjoni ta' sustanza maħlula f’xi waħda mill-fażijiet mhijiex aktar minn 0,01 mol għal kull litru.

Metodu HPLC

Il-metodu HPLC jippermetti koeffiċjenti tal-qsim li jkun stmat fil-log Pow fil-kamp ta' varjabbiltà minn 0 sa 6. Normalment, il-koeffiċjent tal-qsim ta' kompost jista' jkun stmat sa ± 1 unità logaritmika tal-valur taċ-ċaqliq tal-flixkun. Korrelazzjonijiet tipiċi jistgħu jinstabu fil-letteratura (4)(5)(6)(7)(8). Eżattezza ogħla s-soltu tista' tinkiseb meta grafiċi ta' korrelazzjoni huma bbażati fuq komposti ta' referenza ta' struttura simili (9).

1.5.3. Speċifiċità

1.5.3. Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun

Il-Liġi tal-Qsim ta' Nernst tapplika biss għal soluzzjonijiet dilwiti f’temperatura, pressjoni u pH kostanti. Hija tapplika strettament għal sustanza pura mxerrda bejn żewġ solventi puri. Jekk bosta sustanzi differenti maħlula jseħħu f’fażi waħda miż-żewġ fażijiet jew fiż-żewġ fażijiet fl-istess ħin, ir-riżultati jistgħu jiġu affettwati. Dissoċjazzjoni jew assoċjazzjoni tal-molekuli maħlula tirriżulta f’devjazzjonijiet mill-Liġi tal-Qsim ta' Nernst. Devjazzjonijiet bħal dawn huma indikati mill-fatt li l-koeffiċjent tal-qsim isir dipendenti fuq il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni. Minħabba l-ekwilibriji multipli li huma mdaħħla, dan il-metodu ta' test m'għandux ikun applikat għal komposti jonizzati mingħajr ma tkun applikata korrezzjoni. L-użu ta' sustanza ta' protezzjoni flok l-ilma għandu jkun ikkunsidrat għal komposti bħal dawn; il-pH ta' protezzjoni għandu jkun ta' l-inqas unità ta' 1 pH mill-pKa tas-sustanza u tingħata attenzjoni għar-relevanza ta' dan il-pH għall-ambjent.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.6.

1.6.1. Stima preliminari tal-koeffiċjent tal-qsim Il-koeffiċjent tal-qsim jiġi stmat preferibbilment bl-użu ta' metodu ta' kalkolu (ara Appendiċi 1), jew fejn adattat, mill-proporzjon tas-solubilitajiet tas-sustanza għat-test fis-solventi puri (10).

1.6.2. Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun

1.6.2.

1.6.2.1. Preparazzjoni n-Oktanol: Id-determinazzjoni tal-koeffiċjent tal-qsim għandha ssir b'rijaġent ta' analiżi ta' purità għolja. Ilma: ilma distillat jew li kien distillat għal darbtejn f’apparat tal-ħġieġ jew kwarz għandu jintuża. Għal komposti jonizzati, soluzzjonijiet ta' protezzjoni flok l-ilma għandhom jintużaw jekk possibbli. Nota: M'għandux jintuża ilma direttament minn apparat li jbiddel il-jone.

1.6.2.1.

1.6.2.1.1. Pre-saturazzjoni tas-solventi Qabel ma koeffiċjent tal-qsim jiġi ddeterminat, il-fażijiet tas-sistema tas-solvent jiġu reċiprokament saturati biċ-ċaqliq fit-temperatura ta' l-esperiment. Biex isir dan, hija ħaġa prattika li ċċaqlaq żewġt ifliexken kbar bl-n-oktanol jew bl-ilma t-tnejn ta' purezza għolja bi kwantità suffiċjenti tas-solvent l-ieħor fuq xejker mekkaniku għal 24 siegħa u mbagħad jitħallew joqgħodu għal ħin twil biżżejjed li jippermetti li l-fażijiet jisseparaw u jiksbu stat ta' saturazzjoni.

1.6.2.1.2. Preparazzjoni għat-test Il-volum sħiħ tas-sistema b'żewġ fażijiet kważi jimla' r-reċipjent tat-test. Dan jgħin biex jevita telf ta' materjali minħabba volatilizzazzjoni. Il-proporzjon tal-volum u l-kwantitajiet tas-sustanza li għandha tintuża huma stabbiliti f’dawn li ġejjin: Isiru t-tliet testijiet. F’ ta’ l-ewwel, tintuża l-proporzjon ta' volum ikkalkulata ta' n-oktanol għall-ilma; fit-tieni, din il-proporzjon tinqasam fi tnejn; u fit-tielet, din il-proporzjon tiġi mmultiplikat bi tnejn (eż. 1:1, 1:2, 2:1).

il-valutazzjoni preliminari tal-koeffiċjent tal-qsim (ara hawn fuq),

il-kwantità minima tas-sustanza għat-test meħtieġa għall-proċedura analitika, u

l-limitazzjoni tal-konċentrazzjoni massima għal kull fażi ta' 0,01 mol għal kull litru.

1.6.2.1.3. Is-sustanza għat-test Titħejja soluzzjoni ta' riżerva f’n-oktanol pre-saturat fl-ilma. Il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni ta' riżerva għandha tkun iddeterminata bi preċiżjoni qabel ma tintuża fid-determinazzjoni tal-koeffiċjent tal-qsim. Is-soluzzjoni għandha tinħażen taħt kondizzjonijiet li jiżguraw l-istabbiltà tagħha.

1.6.2.2. Kondizzjonijiet tat-test It-temperatura tat-test għandha tinżamm kostanti (± 1 oC) u fil-kamp ta' varjabbiltà ta' 20 sa 25 oC.

1.6.2.3. Proċedura tal-kejl

1.6.2.3.

1.6.2.3.1. Kisba ta' l-ekwilibriju tal-qsim Għal kull kondizzjoni tat-test għandhom jitħejjew reċipjenti tat-test doppji li jkun fihom l-ammonti meħtieġa, taż-żewġ solventi flimkien imkejla b'eżattezza bil-kwantità neċessarja ta' soluzzjoni ta' riżerva. Il-fażijiet ta' l-n-oktanol għandhom jitkejlu bil-volum. Ir-reċipjenti tat-test għandhom jew jitpoġġew f’xejker adattat jew jiċċaqalqu manwalment. Fejn jintuża tubu ċentrifugu, metodu rakkomandat huwa li t-tubu jiddawwar malajr 180o madwar l-assi trasversali tiegħu sabiex kwalunkwe arja maqbuda titla’ miż-żewġ fażijiet. L-esperjenza wriet li 50 dawra bħal din is-soltu huma suffiċjenti għall-kisba ta' l-ekwilibriju tal-qsim. Għaċ-ċertezza, huma rakkomandati 100 dawra f'ħames minuti.

1.6.2.3.2. Separazzjoni tal-fażi Meta huwa neċessarju, bil-għan li jkunu separati l-fażijiet, għandha titwettaq ċentrifugazzjoni tat-taħlita. Dan għandu jsir fiċ-ċentrifugu tal-laboratorju miżmum f'temperatura ambjentali, jew, jekk jintuża ċentrifugu mhux kontrollat permezz tat-temperatura, it-tubi taċ-ċentrifugu għandhom jinżammu għall-ekwilibrazzjoni fit-temperatura tat-test għall-millanqas siegħa qabel l-analiżi.

1.6.2.4. Analiżi Għad-determinazzjon tal-koeffiċjent tal-qsim, huwa neċessarju li jkunu determinati l-konċentrazzjonijiet tas-sustanza għat-test fiż-żewġ fażijiet. Dan jista' jsir billi tittieħed alikwota ta' kull wieħed miż-żewġ fażijiet minn kull tubu għal kull kondizzjoni ta' test u tiġi analizzata bil-proċedura magħżula. Il-kwantità totali ta' sustanza preżenti fiż-żewġ fażijiet għandha tkun ikkalkulata u mqabbla mal-kwantità tas-sustanza introdotta oriġinarjament. Għandu jittieħed kampjun tal-fażi fl-ilma bi proċedura li timminimizza r-riskju li jkunu introdotti traċċi ta' n-oktanol. Tista' tintuża siringa tal-ħġieġ b'labbra li tista' tintrema biex jittieħed kampjun tal-fażi ta' l-ilma. Inizjalment is-siringa għandha tkun parzjalment mimlija bl-arja. L-ajra għandha titneħħa bil-mod waqt li tkun qed tiddaħħal is-siringa fis-saff ta' l-n-oktanol. Volum adattat tal-fażi fl-ilma jinġibed fis-siringa. Is-siringa titneħħa malajr mis-soluzzjoni u l-labbra maqlugħa. Il-kontenut tas-siringa jista' mbagħad jintuża bħala kampjun fl-ilma. Il-konċentrazzjoni fiż-żewġ fażijiet separati għandha preferibbilment tkun iddeterminata minn metodu speċifiku għas-sustanza. Eżempji ta' metodi analitiċi li jistgħu jkunu adattati huma:

il-metodi fotometriċi,

il-kromatografija tal-gass,

il-kromatogrfija likwida ta' rendiment għoli.

1.6.3. Metodu HPLC

1.6.3.

1.6.3.1. Preparazzjoni

1.6.3.1. Apparat

Huwa meħtieġ kromatografu likwidu, mgħammar b'pompa mingħajr vibrazzjoni u apparat ta' osservazzjoni adattat. Huwa rakkomandat li jintuża valv ta' injezzjoni b'ċirku ta' injezzjoni. Il-preżenza ta' gruppi polari fil-fażi stazzjonarja tista' tfixkel serjament il-prestazzjoni tal-kolonna HPLC. Għalhekk, fażijiet stazzjonarji għandhom ikollhom il-perċentwali minima tal-gruppi polari (11). Jista' jintuża ppakkjar kummerċjali ta' mikropartikulati b'fażi b'lura jew kolonni diġà ppakkjati. Kolonna ta' protezzjoni tista' titpoġġa bejn is-sistema ta' injezzjoni u l-kolonna analitika.

Fażi mobbli

Biex jitħejja s-solvent ta' elużjoni jintużaw metanol iggradat għall-HPLC jew ilma ggradat għall-HPLC u s-solvent jitneħħilu l-gass qabel l-użu. Għandha tintuża elużjoni isokratika. Għandhom jintużaw proporzjonijiet ta' metanol/ilma b'kontenut minimu ta' ilma ta' 25 %. Tipikament taħlita ta' 3:1 (v/v) metanol-ilma hija sodisfaċenti għall-elużjoni ta' komposti ta' log P 6 fi żmien siegħa, b'rata ta' fluss ta' 1 ml/min. Għal komposti ta' log P għoli jista' jkun neċessarju li jitqassrilhom iż-żmien ta' l-elużjoni (u dak tal-komposti ta' referenza) billi titnaqqas il-polarità tal-fażi mobbli jew it-tul tal-kolonna. Sustanzi b'solubiltà baxxa ħafna f’n-oktanol għandhom tendenza li jagħtu valuri ta' log Pow baxxi u mhux normali bil-metodu HPLC; il-quċċata ta' komposti bħal dawn xi drabi takkumpanja l-front tas-solvent. Dan probabbilment huwa minħabba l-fatt li l-proċess tal-qsim huwa bilmod wisq biex jintlaħaq ekwilibriju fiż–żmien normalment meħtieġ għal separazzjoni HPLC. It-tnaqqis tar-rata tal-fluss u/jew it-tbaxxija tal-proporzjon metanol/ilma tista’/jistgħu mbagħad tkun/ikunu effettivi biex jinkiseb valur affidabbli. Il-komposti għat-test u ta' referenza għandhom ikunu solubbli fil-fażi mobbli f’konċentrazzjonijiet suffiċjenti li jippermettu l-osservazzjoni tagħhom. F’każijiet eċċezzjonali biss jistgħu jintużaw additivi mat-taħlita metanol/ilma, għaliex l-additivi jibdlu l-proprjetajiet tal-kolonna. Għal kromatogrammi b'additivi huwa obbligatorju li tintuża kolonna separata ta' l-istess tip. Jekk il-metanol/ilma mhuwiex adattat, taħlitiet oħra ta' solvent organiku-ilma jistgħu jintużaw, eż. etanol-ilma jew acetonitrile-ilma. Il-pH ta' l-eluwent huwa kritiku għal komposti jonizzabbli. Huwa għandu jkun fl-iskala operattiva tal-pH tal-kolonna, li s-soltu hija bejn 2 u 8. Hija rakkomandata protezzjoni. Għandha tingħata attenzjoni biex ikun evitat il-preċipitazzjoni tal-melħ u t-taħsir tal-kolonna li jseħħu b'xi taħlitiet ta' fażi organika/ta, protezzjoni. Kejl HPLC b'fażijiet stazzjonarji bbażati fuq is-silika 'l fuq minn pH8 mhuwiex rakkomandat għaliex l-użu ta' fażi alkalina, mobbli tista' tikkawża nuqqas rapidu ta' prestazzjoni tal-kolonna.

Sustanzi maħlula

Il-komposti ta' referenza għandhom ikunu fil-forma l-aktar pura disponibbli. Komposti li se jiġu użati għal skopijiet ta' test jew ta' kalibrazzjoni jiġu maħlula jekk huwa possibli fil-fażi mobbli.

Kondizzjonijiet tat-test

It-temperatura matul il-kejl m‘għandhiex tvarja b’aktar minn ± 2 K.

1.6.3.2. Kejl

1.6.3.2. Kalkolu tal-ħin mejjet to

Il-ħin mejjet to jista' jkun iddeterminat bl-użu jew ta' serje omologa (eż. n-alkyl methyl ketones) jew mill-komposti organiċi mhux miżmuma (eż. thiourea jew formamide). Għal kalkolu tal-ħin mejjet to bl-użu tas-serje omologa, sett ta' mill-anqas seba' membri tas-serje omologa jiġi injettat u ż-żmien ta' retenzjoni rispettivament jiġi ddeterminat. Il-ħinijiet ta' retenzjoni mhux analizzati tr (n c + 1) jiġu pplottjati bħala funzjoni ta' tr(n c) u l-linja bejn żewġ punti ta' interċezzjoni a u l-anglu b ta' l-ekwazzjoni ta' regressjoni: tr(nc + 1) = a + b tr(nc) jiġu ddeterminati (nc = n-numru ta' l-atomi tal-karbonju). Il-ħin mejjet to mbagħad huwa mogħti bi: to = a/(1-b)

Graff ta' kalibrazzjoni

Il-pass li jmiss huwa li tinbena plott ta' korrelazzjoni tal-valuri log k kontra log p għall-komposti ta' referenza adattati. Fil-prattika, sett ta' bejn 5 u 10 komposti ta' referenza standard li l-log p tagħhom hija madwar l-iskala mistennija jiġu injettati flimkien u jiġu ddeterminati l-ħinijiet ta' retenzjoni, preferibbilment fuq integratur ta' l-irrekordjar mgħaqqad mas-sistema tat-tiftix. Il-logaritmi korrispondenti tal-fatturi ta' kapaċità, log k, huma kkalkulati u pplottjati bħala funzjoni tal-log p ddeterminat bil-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun. Il-kalibrazzjoni titwettaq f’intervalli regolari, għall-inqas darba kuljum, sabiex ikunu jistgħu jiġu kkunsidrati l-bidliet possibbli fil-prestazzjoni tal-kolonna.

Determinazzjoni tal-fattur tal-kapaċità tas-sustanza għat-test

Is-sustanza għat-test tiġi injettata fi kwantità żgħira kemm jista' jkun ta' fażi mobbli. Il-ħin ta' retenzjoni jiġi ddeterminat (għal darbtejn), u b'hekk jippermetti l-kalkolu tal-fattur ta' kapaċità k. Mill-graff tal-korrelazzjoni tal-komposti ta' referenza, il-koeffiċjent tas-sustanza għat-test jista' jiġi interpolat. Għal koeffiċjenti baxxi ħafna u għolja ħafna, hija neċessarja l-estrapolazzjoni. F’dawk il-każijiet trid tingħata attenzjoni partikulari għal-limiti ta' validità tal-linja ta' rigressjoni.

2. DATA

2. Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun

L-affidabbiltà tal-valuri ddeterminati ta' P jistgħu jkunu ppruvati bi tqabbil mal-mezzi tad-determinazzjonijiet dupplikati mal-medja globali.

3. RAPPURTAR Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),

meta l-metodi ma japplikawx (eż. materjal attiv fuq is-superfiċje), għandhom ikun pprovdut valur ikkalkulat jew stima bbażat/a fuq is-solubilitajiet individwali fl-n-oktanol u fl-ilma,

l-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rrapportati, b'mod speċjali fir-rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.

ir-riżultat ta' l-istima preliminari, jekk ikun hemm,

it-temperatura tad-determinazzjoni,

id-DATA dwar il-proċeduri analitiċi użati fid-determinazzjoni tal-konċentrazzjonijiet,

il-ħin u l-veloċità taċ-ċentrifugazzjoni, jekk użata,

il-konċentrazzjonijiet imkejla biż-żewġ fażijiet għal kull determinazzjoni (dan ifisser li total ta' 12-il konċentrazzjoni jiġu rrappurtati),

il-piż tas-sustanza għat-test, il-volum ta' kull fażi użata f’kull reċipjent tat-test u l-ammont totali kkalkulat ta' sustanza għat-test preżenti f’kull fażi wara l-ekwilibrazzjoni,

il-valuri kkalkulati tal-koeffiċjent tal-qsim (P) u l-medja għandhom ikunu rrapurtati għal kull sett ta' kondizzjonijiet tat-test kif għandu jsir ukoll għall-medja tad-determinazzjonijiet kollha. Jekk hemm suspett ta' dipendenza tal-konċentrazzjoni fuq il-koeffiċjent tal-qsim, dan għandu jkun imniżżel fir-rapport,

id-devjazzjoni standard tal-valuri individwali P madwar il-medja tagħhom għandha tkun rrapurtata,

il-valur medju P tad-determinazzjonijiet kollha għandu jkun espress ukoll bħala logartimu tiegħu stess (bażi 10),

il-Pow teoretiku kkalkulat meta dan il-valur ġie ddeterminat jew meta l-valur imkejjel huwa > 104,

il-pH ta' l-ilma użat u tal-fażi fl-ilma matul l-esperiment,

jekk jintużaw protezzjonijiet, ġustifikazzjoni għall-użu tal-protezzjonijiet flok l-ilma, il-kompożizzjoni, il-konċentrazzjoni u l-pH tal-protezzjonijiet, il-pH tal-fażi fl-ilma qabel u wara l-esperiment.

ir-riżultat ta' l-istima preliminari, jekk ikun hemm,

is-sustanza għat-test u ta' referenza u l-purità tagħhom,

l-iskala tat-temperatura tad-determinazzjonijiet,

il-pH li fih isiru d-determinazzjonijiet,

id-dettalji tal-kolonna analitika u ta' protezzjoni, tal-fażi mobbli u tal-mezzi tat-tiftix,

id-DATA ta' retenzjoni u l-valuri tal-log P fil-letteratura għall-komposti ta' referenza użati fil-kalibrazzjoni,

id-dettalji tal-linja ta' rigressjoni riżultanti (log K kontra log P),

id-DATA ta' retenzjoni medja u l-valur interpolat ta' log P għall-kompost għat-test,

id-deskrizzjoni tat-tagħmir u l-kondizzjonijiet operattivi,

il-profili ta' l-elużjoni,

il-kwantitajiet ta' sustanzi għat-test u ta' referenza mdaħħla fil-kolonna,

il-ħin mejjet u kif tkejjel.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)

REFERENZI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) -Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219 (1981). B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675 S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787 O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223–339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479 A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial use -Determination of partition coefficient -Flask shaking method. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459 A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525 C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10 ,382 J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984, Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Base11978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.

A.9. IL-PUNT TA' FJAMMABILITÀ

A.9.

1. METODU

1.

1.1. DAĦLA Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminari dwar il-fjammabilità tas-sustanza qabel jitwettaq dan it-test. Il-proċedura tat-test hija applikabbli għas-sustanzi likwidi fejn il-fwar jista' jitqabbad permezz ta' għejun ta' fjammabilità tan-nar. Il-metodi tat-test mniżżla f’dan it-test huma biss affidabbli għall-iskala ta' punti ta' fjammabilità li huma speċifikati fil-metodi individwali. Il-possibiltà ta' reazzjonijiet kimiċi bejn is-sustanza u fejn jinżamm il-kampjun għandha tkun ikkunsidrata meta jintgħażel il-metodu li se jintuża.

1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET Il-punt ta' infjammabilità huwa l-inqas temperatura, korretta għal pressjoni ta' 101,325 kPa, li fiha likwidu jevolvi l-fwar, taħt kondizzjonijiet imfissra fil-metodu tat-test, f’dak l-ammont li l-fwar fjammabbli/t-taħlita ta' arja huwa/hija prodott/a fir-reċipjent tat-test. Unitajiet: °C t = T - 273,15 (t f’ oC u T f’K)

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODI Is-sustanza titpoġġa fir-reċipjent tat-test u tissaħħan jew titkessaħ sat-temperatura tat-test skond il-proċedura mfissra fil-metodu tat-test individwali. Testijiet dwar il-fjammabilità jitwettqu bil-għan li jkun aċċertat jekk il-kampjun qabadx jew le fit-temperatura tat-test.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ

1.5.

1.5.1. Ripetibbilità Ir-ripetibbilità tvarja skond l-iskala tal-fjammabilità u l-metodu tat-test użat; sa massimu ta' 2 oC.

1.5.2. Sensittività Is-sensittività tiddependi fuq il-metodu tat-test użat.

1.5.3. Speċifiċità L-ispeċifiċità ta' wħud mill-metodi tat-test hija limitata għal ċerti skali ta' punti ta' fjammabilità u suġġetti għal DATA relatata mas-sustanza (eż. viskożità għolja).

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.6.

1.6.1. Preparazzjonijiet Kampjun tas-sustanza għat-test jitpoġġa f’apparat għat-test skond 1.6.3.1 u/jew 1.6.3.2. Għas-sikurezza, huwa rakkomandat li metodu li jutilizza daqs żgħir ta' kampjun, circa 2 cm3, jintuża għal sustanzi enerġetiċi jew tossiċi.

1.6.2. Kondizzjonijiet tat-test L-apparat, għandu, sakemm ikun konsistenti mas-sikurezza, jitpoġġa f’pożizzjoni 'l-bogħod mill-kurrent ta' l-arja.

1.6.3. L-eżekuzzjoni tat-test

1.6.3.

1.6.3.1. Metodu ta' l-ekwilibriju Ara ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2. Metodu ta' non-ekwilibriju

1.6.3.2. Apparat Abel:

Ara BS 2000 parti 170, NF M07-011, NF T66-009.

Apparat Abel-Pensky:

Ara EN 57, DIN 51755 parti 1 (għal temperaturi minn 5 sa 65 oC), DIN 51755 parti 2 (għal temperaturi taħt il-5 C), NF M07-036.

Apparat Tag:

Ara ASTM D 56.

Apparat Pensky-Martens:

Ara ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Rimarki:

Meta l-punt ta' fjammabilità, iddeterminat permezz ta' metodu ta' non-ekwlibriju f’1.6.3.2., jinstab li huwa 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC jew 55 ± 2 oC, għandu jkun ikkonfermat b'metodu ta' ekwilibriju bl-użu ta' l-istess apparat. Il-metodi li jagħtu t-temperatura tal-punt ta' fjammabilità biss jistgħu jintużaw għal notifikazzjoni. Biex ikun iddeterminat il-punt ta' fjammabilità ta' likwidi viskożi (żebgħa, gomom u simili) li fihom solventi, jista' jintuża biss apparat u jintużaw biss metodi tat-test adattati għad-determinazzjoni tal-punt ta' fjammabilità ta' likwidi viskożi. Ara ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 parti 1.

2. DATA

3. RAPPURTAR Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),

il-metodu użat għandu jkun dikjarat kif ukoll xi devjazzjonijiet possibbli,

ir-riżultati u xi rimarki addizzjonali relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.

4. REFERENZI Xejn.

A.10. FJAMMABILITÀ (SOLIDI)

A.10.

1. METODU

1.

1.1. DAĦLA Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminari dwar proprjetajiet splussivi potenzjali tas-sustanza qabel jitwettaq dan it-test. Dan it-test għandu jkun applikat biss għal sustanzi tat-trab, mrammla jew qishom kolla. Bil-għan li ma jiġux inklużi s-sustanzi kollha li jistgħu jinxtegħlu imma dawk biss li jinħarqu malajr jew dawk li l-imġiba tal-ħruq tagħhom hija fi kwalunkwe mod speċjalment perikoluża, sustanzi li l-veloċità tal-ħruq tagħhom taqbeż ċertu valur ta' limitu biss huma kkunsidrati bħala fjammabbli ħafna. B'mod speċjali jista' jkun perikoluż li inkandexxenza timxi permezz ta' trab metalliku minħabba d-diffikultajiet fit-tifi ta' nar. Trabijiet metalliċi għandhom ikunu kkunsidrati bħala fjammabli ħafna jekk huma jgħinu t-tixrid ta' l-inkandexxenza fil-piż fi żmien speċifikat.

1.2. TIFSIRA U UNITAJIET Il-ħin tal-ħruq huwa muri f’sekondi.

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA Mhux speċifikati

1.4. PRINĊIPJU TAL-METOD Is-sustanza tiġi ffurmata fi strixxa mhix maqtugħa jew miċċa tat-trab ta' madwar 250 mm tul u test preliminari ta' orjentazzjoni jiġi esegwit biex ikun iddeterminat jekk, mal-fjammabilità ta' fjamma tal-gass, issirx propagazzjoni bil-ħruq tal-fjamma jew bi ħruq bati mingħajr fjamma. Jekk isseħħ propagazzjoni fuq 200 mm tal-miċċa f’ħin speċifikat allura jitwettaq programm ta' test sħiħ biex tkun iddeterminata r-rata ta' ħruq.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ Mhux definiti.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.6.

1.6.1. Test preliminari ta' orjentazzjoni Is-sustanza tiġi ffurmata fi strixxa mhux miksura jew miċċa tat-trab madwar 250 mm tul u 20 mm wiesa’ b’10 mm għoli fuq pjanċa tal-bażi mhux kombustibbli, mhux poruża u b'konduċibilità ta' sħana baxxa. Fjamma b’temperatura għolja minn berner tal-gass (dijametru minimu ta' 5 mm) tiġi applikata fuq tarf tal-miċċa tat-trab sakemm it-trab jaqbad jew għal massimu ta' 2 minuti (5 minuti għal trab tal-metall jew għal liegi metalliċi). Għandu jkun innotat jekk il-kombustjoni timxix matul 200 mm tal-miċċa fil-perjodu ta' test ta' 4 minuti (jew 40 minuta għal trabijiet tal-metall). Jekk is-sustanza ma taqbadx u ma tmexxix il-kombustjoni permezz tal-fjammabilità bil-fjamma jew bin-nati bati bla fjamma matul 200 mm tal-miċċa tat-trab fil-perjodu ta' test ta’4 minuti (jew 40 minuta), allura s-sustanza m'għandhiex titqies bħala fjammabbli ħafna u mhuwa meħtieġ ebda test ieħor. Jekk is-sustanza tmexxi l-fjammabilità fuq 200 mm tal-miċċa tat-trab f’inqas minn 4 minuti, jew inqas minn 40 minuta għal trabijiet metalliċi, għandha titwettaq il-proċedura mfissra hawn taħt (punt 1.6.2 u ta' wara).

1.6.2. It-test tar-rata ta' fjammabilità

1.6.2.

1.6.2.1. Preparazzjoni Sustanzi f'forma ta' trab jew mrammla jiġu mimlija sfużi f’forma ta' 250 mm tul b'taqsima trasversali trijangulari ta' għoli intern ta' 10 mm u wisa' ta' 20 mm. Żewġ pjanċi tal-metall jiġu mmuntati fuq iż-żewġ naħat tal-forma bħala limitazzjonijiet laterali li joħorġu 2 mm ’il barra mit-tarf l-għoli tat-taqsima trasversali trijangulari (figura). Il-forma mbagħad titwaddab tliet darbiet minn għoli ta' 2 cm fuq superfiċje solida. Jekk ikun neċessarju l-forma terġa’ tiġi mimlija. Il-limitazzjonijiet laterali mbagħad jitneħħew u s-sustanza żejda titneħħa. Pjanċa tal-bażi mhux kombustibbli, mhux poruża u b’konduċibilità ta' sħana baxxa titpoġġa fuq il-forma, l-apparat jinqaleb u l-forma titneħħa. Sustanzi bħall-pejst jiġu mdellka fuq pjanċa tal-bażi mhux kombustibbli, mhux poruża u b’konduċibilità ta' sħana baxxa fil-forma ta' ħabel 250 mm fit-tul b'sezzjoni trasversali ta' madwar 1 cm2.

1.6.2.2. Kondizzjonijiet tat-test Fil-każ ta' sustanza sensittiva għall-umdità, it-test għandu jitwettaq malajr kemm jista' jkun wara li jitneħħa mill-kontenitur.

1.6.2.3. L-eżekuzzjoni tat-test Irranġa l-gozz f’kurrent ta' arja f’armarju li jiġbed id-duħħan. Il-veloċità ta' l-arja trid tkun suffiċjenti biex tevita li d-duħħan joħroġ fil-laboratorju u m'għandhiex tkun varjata matul it-test. L-apparat irid ikun protett mill-kurrent ta' l-arja. Fjamma taħraq minn berner tal-gass (dijametru minimu ta' 5mm) jintuża biex ikun mixgħul il-gozz minn naħa waħda. Meta l-gozz ikun inħaraq sa distanza ta' 80 mm, titkejjel ir-rata ta' ħruq fuq il-100 mm li jmiss. It-test jitwettaq sitt darbiet, bl-użu ta' pjanċa nadifa u kiesħa kull darba, kemm-il darba ma jkunx osservat riżultat pożittiv qabel.

2. DATA Il-ħin tal-ħruq mit-test ta' orjentazzjoni preliminari (1.6.1.) u l-inqas ħin ta' ħruq sa sitt testijiet (1.6.2.3.) huma relevanti għall-valutazzjoni.

3. RAPPURTAR

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identifikazzjoni u impuritajiet),

id-deskrizzjoni tas-sustanza għat-test, l-istat fiżiku tagħha inkluż il-kontenut ta' l-umdità,

ir-riżultati mit-testijiet ta' orjentazzjoni preliminari u mit-test tar-rata ta' ħruq jekk ikunu saru,

ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI Sustanzi f'forma ta' trab, imrammla jew bħall-pejst għandhom jiġu kkunsidrati bħala fjammabbli ħafna meta l-ħin tal-ħruq fi kwalunkwe test skond il-proċedura tat-test mfisser f'1.6.2 huwa inqas minn 45 sekonda. Trabijiet tal-metall u liegi tal-metall huma kkunsidrati bħala fjammabbli ħafna meta huma jistgħu jitqabbdu u l-fjamma jew iż-żona ta' reazzjoni tinfirex fuq il-kampjun kollu f’10 minuti jew inqas.

4. REFERENZI NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

A.11. FJAMMABILITÀ (GASSIJIET)

A.11.

1. METODU

1.

1.1. DAĦLA Dan il-metodu jippermetti d-determinazzjoni ta' jekk gassijiet imħallta ma' l-arja f’temperatura ambjentali (circa 20 oC) u l-pressjoni atmosferika humiex fjammabbli u, jekk huma hekk, fuq liema skala ta' konċentrazzjonijiet. Taħlitiet ta' konċentrazzjonijiet li jiżdiedu tal-gass għat-test ma' l-arja jiġu esposti għal spark elettriku u jiġi osservat jekk jaqbdux.

1.2. TIFSIRA U UNITAJIET L-iskala ta' fjammabilità hija l-iskala ta' konċentrazzjoni bejn l-inqas u l-ogħla limiti ta' splużjoni. L-inqas u l-ogħla limiti ta' splużjoni huma dawk il-limiti ta' konċentrazzjoni ta' gass fjammabbli mħallat ma' l-arja li fih ma sseħħx propagazzjoni tal-fjamma.

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA Mhux speċifikati

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU Il-konċentrazzjoni tal-gass fl-arja tiżdied pass pass u t-taħlita hija esposta f’kull stadju għal spark elettriku.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ Mhux definiti.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.6.

1.6.1. Apparat Ir-reċipjent għat-test huwa ċilindru tal-ħġieġ vertikali li għandu dijametru intern ta' 50 mm u għoli minimu ta' 300 mm. L-elettrodi għall-fjammabilità huma separati b'distanza ta' 3 sa 5 mm u huma mpoġġija 600 mm fuq il-qiegħ taċ-ċilindru. Iċ-ċilindru huwa mgħammar bi ftuħ għar-rilaxx tal-pressjoni. L-apparat għandu jkollu protezzjoni biex inaqqas kwalunkwe ħsara minn splużjoni. Bħala sors ta' fjammabilità jintuża spark ta' induzzjoni permanenti ta' dewmien ta' 0,5 s, li huwa ġġenerat minn transformer ta' vultaġġ għoli b'vultaġġ ta' ħruġ minn 10 sa 15 kV (massimu ta' enerġija ta' dħul 300 W). Eżempju ta' apparat adattat huwa mfisser fir-referenza (2).

1.6.2. Kondizzjonijiet tat-test It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20 oC).

1.6.3. L-eżekuzzjoni tat-test Konċentrazzjoni magħrufa ta' gass fl-arja tiġi mdaħħla fiċ-ċilindru tal-gass, permezz ta' pompi li jippompjaw proporzjon tad-doża. Spark jiġi mgħoddi mit-taħlita u jiġi osservat jekk il-fjamma tinqatax waħedha jew mill-għajn tal-fjammabilità u tinfirix b'mod indipendenti. Il-konċentrazzjoni tal-gass tvarja fi stadji ta' 1 % vol. sakemm isseħħ il-fjammabilità kif imfisser hawn fuq. Jekk l-istruttura kimika tal-gass tindika li ma tkunx fjammabbli u tista' tiġi kkalkulata l-kompożizzjoni tat-taħlita stojkjometrika bl-arja, imbagħad taħlitiet fl-iskala minn 10 % anqas mill-kompożizzjoni stojkjometrika sa 10 % aktar minn din il-kompożizzjoni biss jeħtieġ li jkunu ttestjati fi stadji ta' 1 %.

2. DATA L-okkorrenza tat-tixrid tal-fjamma hija l-unika DATA ta' informazzjoni relevanti għad-determinazzjoni ta' din il-proprjetà.

3. RAPPURTAR Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identifikazzjoni u impuritajiet),

deskrizzjoni, bid-dimensjonijiet, ta' l-apparat użat,

it-temperatura li fiha twettaq it-test ,

il-konċentrazzjonijiet ippruvati u r-riżultati miksuba,

ir-riżultat tat-test: gass mhux fjammabbli jew gass fjammabbli ħafna,

jekk ikun konkluż li l-gass mhuwiex fjammabbli allura l-iskala ta' konċentrazzjoni li fuqha kien ippruvat fi stadji ta' 1 % għandha tkun iddikjarata,

ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rrapurtati.

4.(1)(2) REFERENZI NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse- einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.- Tech. 1984, vo156, 2, 126-127.Wortmann, T.Redeker und H.Schacke. 'Entwicklung

A.12. FJAMMABILITÀ (KUNTATT MA' L-ILMA)

A.12.

1. METODU

1.

1.1. DAĦLA Dan il-metodu ta' test jista' jintuża biex ikun iddeterminat jekk ir-reazzjoni ta' sustanza ma' l-ilma jew l-arja umda twassalx għall-iżvilupp ta' ammonti perikolużi ta' gass jew gassijiet li jistgħu jkunu fjammabbli ħafna. Il-metodu jista' jiġi applikat għal sustanzi likwidi kif ukoll solidi. Dan il-metodu mhux applikabbli għal sustanzi li jitqabbdu spontanjament meta jiġu f’kuntatt ma' l-arja.

1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET Fjammabbli ħafna: sustanzi li, f’kuntatt ma' l-ilma jew l-arja umda, jevolvu gassijiet fjammabbli ħafna fi kwantitajiet perikolużi b'rata minima ta' 1 litru/kg għal kull siegħa.

1.3. PRINĊIPJU TAL-METODU Is-sustanza hija ttestjata skond is-sekwenza pass wara pass imfissra hawn taħt; jekk il-fjammabilità isseħħ fi kwalunkwe pass, ebda test ieħor mhuwa meħtieġ. Jekk ikun magħruf li s-sustanza ma tirreaġixxix b'mod vjolenti ma' l-ilma allura jsir pass 4 (1.3.4).

1.3.

1.3.1. Pass 1 Is-sustanza għat-test titpoġġa f’reċipjent bl-ilma distillat f’20 oC u jiġi nnotat jekk il-gass li evolva jaqbadx jew le.

1.3.2. Pass 2 Is-sustanza għat-test titpoġġa fuq karta filtru fuq il-wiċċ ta' dixx li fih ilma distillat f’20 oC u jiġi nnotat jekk il-gass li evolva jaqbadx jew le. Il-karta filtru tintuża biss biex iżżomm lis-sustanza f’post wieħed biex jikbru ċ-ċansijiet tal-fjammabilità.

1.3.2. Pass 3 Is-sustanza għat-test hija magħmula f’gozz approssimattivament 2 cm għoli u 3 cm dijametru. Ftit qtar ta' ilma jiżdiedu mal-gozz u jiġi nnotat jekk il-gass evolut jaqbadx jew le.

1.3.4. Pass 4 Is-sustanza għat-test tiġi miżjuda ma' ilma distillat f’20 C u r-rata ta' evoluzzjoni tal-gass titkejjel fuq perjodu ta' seba' sigħat, f’intervalli ta' siegħa. Jekk ir-rata ta' evoluzzjoni mhijiex kostanti, jew qed tiżdied wara seba’ sigħat, il-ħin tal-kejl għandu jittawwal għal massimu ta' ħamest ijiem. It-test jista' jitwaqqaf jekk ir-rata fi kwalunkwe ħin taqbeż il-1 litru/kg għal kull siegħa.

1.4. SUSTANZI TA' REFERENZA Mhux speċifikati

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ Mhux definiti.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.6.

1.6.1. Pass 1

1.6.1.

1.6.1.1. Kondizzjonijiet tat-test It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20 C).

1.6.1.2. L-eżekuzzjoni tat-test Kwantità żgħira (approssimattivament 2 mm dijametru) tas-sustanza għat-test għandha titpoġġa f'reċipjent li fih ilma distillat. Għandu jkun innotat jekk (i) evolviex xi gass u (ii) jekk seħħitx il-fjammabbiltà tal-gass. Jekk isseħħ il-fjammabbiltà tal-gass mhuwa meħtieġ l-ebda test ieħor tas-sustanza għaliex is-sustanza hija meqjusa bħala perikoluża.

1.6.2. Pass 2

1.6.2.

1.6.2.1. Apparat Karta filtru titpoġġa tgħum fil-wiċċ ta' l-ilma distillat fi kwalunkwe reċipjent adattat, eż. dixx għall-evaporazzjoni b'dijametru ta' 100 mm.

1.6.2.2. Kondizzjonijiet tat-test It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20 oC).

1.6.2.3. L-eżekuzzjoni tat-test Kwantità żgħira tas-sustanza għat-test (approssimattivament 2 mm dijametru) għandha titpoġġa fin-nofs tal-karta filtru. Għandu jkun innotat jekk (i) evolviex xi gass u (ii) jekk seħħitx il-fjammabilità tal-gass. Jekk isseħħ it-tqabbid tal-gass mhuwa meħtieġ l-ebda test ieħor tas-sustanza għaliex is-sustanza hija meqjusa bħala perikoluża.

1.6.3. Pass 3

1.6.3.

1.6.3.1. Kondizzjonijiet tat-test It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20 oC).

1.6.3.2. L-eżekuzzjoni tat-test Is-sustanza għat-test hija magħmula f’gozz approssimattivament 2 cm għoli u 3 cm dijametru bi ftit fond fil-quċċata. Jiżdiedu ftit qtar ta' ilma fil-post fond u għandu jkun innotat jekk (i) evolviex xi gass u (ii) jekk seħħitx il-fjammabilità tal-gass. Jekk isseħħ il-fjammabbiltà tal-gass mhuwa meħtieġ l-ebda test ieħor tas-sustanza għaliex is-sustanza hija meqjusa bħala perikoluża.

1.6.4. Pass 4

1.6.4.

1.6.4.1. Apparat L-apparat jiġi mmuntat kif jidher fil-figura.

1.6.4.2. Kondizzjonijiet tat-test Spezzjona l-kontenitur tas-sustanza għat-test għal xi trab < 500 μm (daqs tal-partikula). Jekk it-trab jikkostitwixxi aktar minn 1 % w/w tat-total, jew jekk il-kampjun jista' jitfarrak malajr, allura l-ammont kollu tas-sustanza għandu jitfarrak fi trab qabel it-test sabiex jippermetti tnaqqis fid-daqs tal-partikula matul il-ħażna u l-immaniġġar; inkella s-sustanza għandha tkun ittestjata kif tkun irċevuta. It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20 oC) u pressjoni atmosferika.

1.6.4.3. L-eżekuzzjoni tat-test Minn 10 sa 20 ml ta' ilma jitpoġġew fil-lembut tal-qtar ta' l-apparat u 10 g tas-sustanza jitpoġġew fi flixkun koniku. Il-volum tal-gass li jevolvi jista' jitkejjel bi kwalunkwe mezz adattat. It-tapp tal-lembut tal-qtar jiġi miftuħ biex iħalli l-ilma jidħol fil-flixkun koniku u l-arloġġ tal-ħin jibda jitħaddem. L-evoluzjoni tal-gass titkejjel kull siegħa matul perjodu ta' seba’ sigħat. Jekk, matul dan il-perjodu, l-evoluzzjoni tal-gass hija irregolari, jew jekk, fi tmiem dan il-perjodu, ir-rata ta' l-evoluzzjoni tal-gass qed tiżdied, allura l-kejl għandu jitkompla sa ħamest ijiem. Jekk, fi kwalunkwe ħin tal-kejl ir-rata tal-gass taqbeż il-1 litru/kg għal kull siegħa, it-test għandu jieqaf. It-test għandu jsir għal tliet darbiet. Jekk l-identità kimika tal-gass ma tkunx magħrufa, il-gass għandu jkun analizzat. Meta l-gass jinkludi komponenti fjammabbli ħafna u mhux magħruf jekk it-taħlita kollha hijiex fjammabbli ħafna, taħlita ta' l-istess kompożizzjoni għandha titħejja u tkun ppruvata skond il-metodu A.11.

2. DATA Is-sustanza titqies li hija perikoluża jekk:

isseħħ fjammabilità spontanja f’kull stadju tal-proċedura tat-test, jew

hemm evoluzzjoni ta' gass fjammabbli b'rata akbar minn 1 litru/kg tas-sustanza għal kull siegħa.

3. RAPPURTAR Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identifikazzjoni u impuritajiet),

dettalji ta' kwalunkwe Preparazzjoni inizjali tas-sustanza għat-test,

ir-riżultati tat-testijiet (passi 1, 2, 3 u 4),

l-identità kimika tal-gass evolut,

ir-rata ta' evoluzzjoni ta' gass jekk pass 4 (1.6.4) jitwettaq,

kwalunkwe rimarki relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.

4.(1)(2) REFERENZI Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

A.13. PROPRJETAJIET PIROFORIĊI TA' SOLIDI U LIKWIDI

A.13.

1. METODU

1.

1.1. DAĦLA Il-proċedura tat-test hija applikabbli għal sustanzi solidi jew likwidi, li, f’ammonti żgħar, jaqbdu spontanjament f’ħin qasir wara li jagħmlu kuntatt ma' l-arja f’temperatura ambjentali (circa 20 oC). Sustanzi li jeħtieġ li jkunu esposti għall-arja għal sigħat jew ġranet f’temperatura ambjentali jew f’temperaturi elevati qabel ma sseħħ il-fjammabilità mhumiex koperti b'dan il-metodu ta' test.

1.2 TIFSIRIET U UNITAJIET Sustanzi huma kkunsidrati li għandhom proprjetajiet piroforiċi jekk huma jaqbdu jew jikkawżaw ħruq sakemm l-oġġett isir faħam skond il-kondizzjonijiet mfissra f’1.6. L-awto-fjammabilità ta' likwidi tista' tkun ittestjata bl-użu tal-metodu A.15 Temperatura ta' awto-fjammabilità (likwidi u gassijiet).

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA Mhux speċifikati.

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU Is-sustanza, kemm jekk solida kif ukoll likwida, tiżdied ma' carrier inert u titqiegħed f’kuntatt ma' l-arja f’temperatura ambjentali għal perjodu ta' ħames minuti. Jekk is-sustanzi likwidi ma jaqbdux allura huma assorbiti f’karta filtru u esposti għall-arja f’temperatura ambjentali (circa 20 oC) għal ħames minuti. Jekk solidu jew likwidu jaqbad, jew likwidu jaqbad jew jagħmel ifaħħam karta filtru, allura s-sustanza hija meqjusa bħala piroforika.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ Ripetibbilità: minħabba l-importanza fir-rigward tas-ikurezza, riżultat pożittiv wieħed huwa suffiċjenti biex is-sustanza tiġi kkunsidrata bħala piroforika.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' TEST

1.6.

1.6.1. Apparat Kapsula tal-porċellana ta' dijametru circa 10 cm tiġi mimlija bi trab diatomaceous sa għoli ta' madwar 5 mm f’temperatura ambjentali (circa 20 oC). Nota: It-trab diatomaceous jew kwalunkwe sustanza inerta komparabbli oħra li hija disponibbli b'mod ġenerali għandha titqies bħala rappreżentattiva ta' ħamrija li fiha s-sustanza għat-test tista' tintefa' f'każ ta' inċident. Karta filtru niexfa hija meħtieġa biex ikunu ttestjati likwidi li ma jaqbdux f'kuntatt ma' l-arja meta jkunu f'kuntatt ma' carrier inert.

1.6.2. L-eżekuzzjoni tat-test

1.6.2. a)

Solidi trab Minn 1 sa 2 cm3 mis-sustanza għat-test jitferraw minn għoli ta' circa 1 m fuq superfiċje mhux kombustibbli u jiġi osservat jekk is-sustanza taqbadx matul it-tferrigħ jew fi żmien ħames minuti wara li toqgħod. It-test jitwettaq sitt darbiet kemm-il darba ma sseħħx il-fjammabilità.

Likwidi Madwar 5 cm3 mil-likwidu għat-test jitferra’ f’kapsula tal-porċellana mħejjija u jiġi osservat jekk is-sustanza taqbadx fi żmien ħames minuti. Jekk ma sseħħ l-ebda fjammabilità f’sitt testijiet, għandhom jitwettqu dawn it-testijiet: Kampjun ta' 0,5 mm jintefa' permezz ta' siringa fuq karta filtru bit-tarf f’forma ta' serrieq u jiġi osservat jekk isseħħx fjammabilità jew ħruq sakemm titfaħħam il-karta filtru fi żmien ħames minuti li jiżdied il-likwidu. It-test jitwettaq tliet darbiet kemm-il darba ma sseħħx il-fjammabbiltà u t-tfaħħim.

2. DATA

2.

2.1. INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI It-test jista' jitwaqqaf hekk kif iseħħ riżultat pożittiv f’xi wieħed mit-testijiet.

2.2. VALUTAZZJONI Jekk is-sustanza taqbad fi żmien ħames minuti meta tiżdied ma' courier inert u tkun esposta għall-arja, jew jekk sustanza likwida tinħaraq sakemm issir faħam jew tqabbad karta filtru fi żmien ħames minuti meta miżjuda jew esposta għall-arja, hija kkkunsidrata bħala piroforika.

3. RAPPURTAR Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identifikazzjoni u impuritajiet),

ir-riżultat tat-test,

kwalunkwe rimarka relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.

4.(1)(2) REFERENZI NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14. PROPRJETAJIET ESPLOŻIVI

A.14.

1. METODU

1.

1.1. DAĦLA Il-metodu jipprovdi skema ta' testijiet biex jiġi ddeterminat jekk sustanza solida jew f’forma ta' pejst tippreżentax perikolu ta' splużjoni meta tkun sottomessa għall-effett ta' fjamma (sensittività termika), jew għal xokk jew frizzjoni (sensittività għal stimuli mekkaniċi), u jekk sustanza likwida tippreżentax periklu ta' splużjoni meta sottomessa għall-effett ta' fjamma jew xokk. Il-metodu fih tliet partijiet: Il-metodu jforni DATA biex tkun evalwata l-probabbiltà li tinbeda splużjoni permezz ta' ċerti stimuli komuni. Il-metodu mhuwiex maħsub biex jaċċerta jekk sustanza hijiex kapaċi li tesplodi taħt kwalunkwe kondizzjonijiet. Il-metodu huwa adattat biex ikun iddeterminat jekk sustanza tippreżentax periklu ta' splużjoni (termika jew sensittività mekkanika) taħt kondizzjonijiet partikulari speċifikati fid-Direttiva. Huwa bbażat fuq numru ta' tipi ta'apparati li huma użati ħafna internazzjonalment (1) u li s-soltu jagħtu riżultati sinifikattivi. Huwa rikonoxxut li l-metodu mhuwiex definittiv. Apparat alternattiv għal dak speċifikat jista' jintuża kemm-il darba huwa rikonoxxut internazzjonalment u li r-riżultati jistgħu jkunu korrelatati adegwatament ma' dawk minn apparat speċifikat. M'hemmx għalfejn jitwettqu t-testijiet meta informazzjoni termodinamika hija disponibbli (eż. is-sħana tal-formazzjoni, is-sħana tad-dekompożizzjoni) u/jew l-assenza ta' ċerti gruppi reattivi (2) fil-formula strutturali tistabbilixxi mingħajr dubju raġjonevoli li s-sustanza mhijiex kapaċi li tiddekomponi malajr bl-evoluzzjoni tal-gassijiet jew bir-rilaxx ta' sħana (i.e. il-materjal ma jippreżenta l-ebda riskju ta' splużjoni). Test ta' sensittività mekkanika fir-rigward ta' frizzjoni mhuwiex meħtieġ għal-likwidi.

1.1.

(a) test ta' sensittività termika (1);

(b) test ta' sensittività mekkanika fir-rigward ta' xokk (1);

(ċ) test ta' sensittività mekkanika fir-rigward ta' frizzjoni (1).

1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET Esplożiv: Sustanzi li jistgħu jisplodu taħt l-effett ta' fjamma jew li huma sensittivi għal xokk jew frizzjoni fl-apparat speċifikat (jew li huma sensittivi mekkanikament aktar minn 1,3 dinitrobenzene f’apparat alternattiv).

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA 1,3-dinitrobenzene, prodott ta' kristallina teknika mgħarbul biex jgħaddi minn 0,5 mm, għall-metodi ta' frizzjoni u ta' xokk. Perhydro-1.3.5-trinitro-1.3.5-triazine (RDX, hexogen, ċiklonite-CAS 121-82-4), rikristallizzat minn cyclohexogen fl-ilma, mgħarbel fl-ilma minn 250 μm u miżmum fuq għarbiel ta' 150 μm u mnixxef f’103 ± 2 oC (għal erba' sigħat) għat-tieni serje ta' frizzjoni u testijiet ta' xokk.

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU Testijiet preliminari huma neċessarji biex ikunu stabbiliti kondizzjonijiet bla periklu għall-eżekuzzjoni tat-tliet testijiet ta' sensittività.

1.4.

1.4.1. Testijiet ta' sikurezza fl-immaniġġjar (3) Għal raġunijiet ta' sikurezza, qabel jitwettqu t-testijiet ewlenin, kampjuni żgħar ħafna (madwar 10 mg) tas-sustanza jiġu soġġetti għas-sħana mingħajr għeluq fi fjamma tal-gass, għal xokk fi kwalunkwe forma konvenjenti ta' apparat u għal frizzjoni bl-użu ta' martell b'ras ta' l-injam kontra inkwina jew kwalunkwe forma ta' magna għall-frizzjoni. L-għan huwa li jkun assigurat jekk is-sustanza hijiex daqshekk sensittiva u esplożiva li t-testijiet ta' sensittività preskritti, b'mod partikolari dak tas-sensittività termika, għandhomx jitwettqu bi prekawzjonijiet speċjali sabiex jiġi evitat korriment ta' l-operatur.

1.4.2. Sensittività termika Il-metodu jinvolvi t-tisħin tas-sustanza f’tubu ta' l-azzar, magħluq bi pjanċi miftuħa b'dijametri ta' toqob differenti, biex ikun iddeterminat jekk is-sustanza għandhiex tendenza li tisplodi taħt kondizzjonijiet ta' sħana intensa u għeluq definit.

1.4.3. Sensittività mekkanika (xokk) Il-metodu jinvolvi li s-sustanza tkun soġġetta għal xokk minn piż speċifikat mwaqqa’ minn għoli speċifikat.

1.4.4. Sensittività mekkanika (frizzjoni) Il-metodu jinvoli li sustanza solida jew f’forma ta' pejst tkun soġġetta għal frizzjoni bejn spuperfiċje standard taħt kondizzjonijiet speċifiċi ta' tagħbija u moviment relattiv.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ Mhux definiti.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.6.

1.6.1. Sensittività termika (effett ta' fjamma)

1.6.1.

1.6.1.1. Apparat L-apparat jikkonsisti f’tubu ta' l-azzar li ma jerġax jintuża bi strument li jagħlaq u li jerġa' jintuża (figura 1) installat fi strument ta' sħana u ta' protezzjoni. Kull tubu huwa miġbud minn pjanċa ta' l-azzar (ara l-Appendiċi) u li għandu dijametru intern ta' 24 mm, tul ta' 75 mm u ħxuna tal-qoxra ta' 0,5 mm. It-tubu għandu flanġ fil-ġenb tal-ftuħ biex ikun jista' jingħalaq bl-immuntar tal-pjanċa miftuħa. Dan jikkonsisti fi pjanċa miftuħa li tirreżisti l-pressjoni, b'toqba ċentrali, marbuta sewwa ma' tubu bl-użu ta' vit f’żewġ partijiet (vit u skorfina bil-kamin). Il-vit u l-iskorfina bil-kamin huma magħmulin minn azzar tal-kromju-manganiż (ara l-Appendiċi) li ma jisparkjax sa 800 oC. Il-pjanċi miftuħin huma 6 mm ħoxnin, magħmula minn azzar reżistenti għas-sħana, u huma disponibbli b'firxa ta' dijametri fil-ftuħ.

1.6.1.2. Kondizzjonijiet tat-test Normalment is-sustanza tiġi ttestjata kif tkun riċevuta għalkemm f’ċerti każijiet, eż. jekk ippressata, magħmula f’forma jew ikkondensata b'xi mod ieħor, ikun neċessarju li s-sustanza tiġi ttestjata wara it-tifrik. Għal solidi, il-piż tal-materjal għall-użu f’kull test huwa ddeterminata bl-użu ta' testijiet f’żewġ stadji f’forma niexfa. Tubu miksi bil-qatran jimtela b9 cm3 ta' sustanza u s-sustanza tiġi kompatta b'forza ta' 80 N applikata fuq it-trasversali totali tat-tubu. Għal raġunijiet ta' sikurezza jew f’każijiet fejn il-forma fiżika tal-kampjun tista' tinbidel b'kompressjoni jistgħu jintużaw proċeduri ta' mili oħrajn, eż. jekk is-sustanza hija sensittiva ħafna għal frizzjoni allura l-ikkompattjar mhuwiex adattat. Jekk il-materjal huwa kompressibbli jiżdied aktar materjal u jiġi kkompattjat sakemm it-tubu jimtela sa 55 mm minn fuq. Il-piż totali użat biex jimtela’ t-tubu sal-livell ta' 55 mm huwa ddeterminat u jsiru żewġ żidiet oħra, kull waħda kkompattjata b'forza ta' 80N. Imbagħad jiżdied il-materjal jew bl-ikkompattjar, jew billi jinħareġ barra, kif ikun meħtieġ, sabiex it-tubu jitħalla mimli sa livell ta' 15 mm minn fuq. Jitwettaq test ieħor niexef, fil-bidu bi kwantità kkompattjata ta' terz mill-piż totali misjuba fl-ewwel test niexef. Żewġ żidiet oħra minn dawn isiru flimkien ma' ikkompattjar ta' 80 N u l-livell tas-sustanza fit-tubu jiġi aġġustat sa 15 mm minn fuq biż-żieda jew bit-tnaqqis tal-materjal kif meħtieġ. L-ammont ta' solidu ddeterminat fit-tieni test niexef jintuża f’kull test; billi l-mili jitwettaq fi tliet ammonti ugwali, kull wieħed kompressat sa 9 cm3 b'kull mod ta' forza neċessarju. (Dan jista' jkun iffaċilitat bl-użu ta' ħoloq li joħolqu spazju). Likwidi u ġels jintefgħu fit-tubu sa għoli ta' 60 mm b'attenzjoni partikulari fejn jidħlu l-ġels biex tkun evitata l-formazzjoni ta' spazju vojt. L-iskorfina bil-kamin tiddaħħal madwar it-tubu mill-qiegħ, tiddaħħal il-pjanċa mtaqqba u l-vit jiġi ssikkat wara l-applikazzjoni ta' ftit lubrikant bbażat fuq disulphide tal-molibdenu. Huwa essenzjali li jiġi ċċekkjat li xejn mis-sustanza ma jinqabad bejn il-flanġ u l-pjanċa, jew fil-ħjut. Is-sħana tiġi pprovduta mill-propan meħud minn ċilindru industrijali, mgħammar b'regolatur tal-pressjoni (60 sa 70 mbar), permezz ta' arloġġ u distribwit ugwalment (kif indikat b'osservazzjoni viżwali tal-fjammi mill-berners) minn manifold għal erba' berners. Il-berners huma lokalizzati madwar il-kompartiment tat-test kif jidher f’figura 1. L-erba' berners flimkien għandhom konsum ta' madwar 3,2 litri ta' propan għal kull minuta. Jistgħu jintuża gassijiet kombustibbli u berners alternattivi iżda r-rata tat-tisħin trid tkun kif speċifikata fil-figura 3. Għall-apparati kollha, ir-rata tat-tisħin trid tkun iċċekkjata perjodikament bl-użu ta' tubi mimlija b’dibutyl phthalate kif indikat fil-figura 3.

1.6.1.3. L-eżekuzzjoni tat-testijiet Kull test jitwettaq sakemm jew it-tubu jitfarrak jew it-tubu jkun issaħħan għal ħames minuti. Test li jirriżulta fil-frammentazzjoni tat-tubu fi tliet biċċiet jew aktar, li f’xi każijiet jistgħu jkunu kkonnettjati ma' xulxin bi strixxi dojoq tal-metall kif muri fil-figura 2, huwa evalwat bħala wieħed li jagħti splużjoni. Test li jirriżulta f’biċċiet inqas jew ebda frammentazzjoni jiġi meqjus bħala wieħed li ma tax splużjoni. L-ewwel titwettaq serje ta' tliet testijiet bi pjanċa mtaqqba b'dijametru ta' 6,0 mm u, jekk ma tinkiseb ebda splużjoni, titwettaq serje oħra ta' tliet testijiet bi pjanċa mtaqqba b'dijametru ta' 2,0 mm. Jekk isseħħ splużjoni matul xi waħda mis-serje ta' testijiet allura mhumiex meħtieġa aktar testijiet.

1.6.1.4. Valutazzjoni Ir-riżultat tat-test jiġi kkunsidrat bħala pożittiv jekk isseħħ splużjoni f’xi waħda mis-serje ta' testijiet t'hawn fuq.

1.6.2. Sensittività mekkanika (xokk)

1.6.2.

1.6.2.1. Apparat (figura 4) Il-partijiet essenzjali ta' apparat bil-martell li jaqa' tipiku huma blokka ta' l-azzar fondut bil-bażi, inkwina, kolonna, gwidi, piżijiet li jaqgħu, apparat għar-rilaxx u reċipjent għall-kampjun. L-inkwina ta' l-azzar 100 mm (dijametru) x 70 mm (għoli) tiġi invitata mal-wiċċ tal-blokka ta' l-azzar 230 mm (twila) x 250 mm (wiesa’) x 200 mm (għolja) b'bażi fonduta 450 mm (twila) x 450 mm (wiesa’) x 60 mm (għolja). Kolonna magħmula minn tubu ta' l-azzar mingħajr saldatura, tintrabat mar-reċipjent invitat ma' wara tal-blokka ta' l-azzar. Erba' viti jorbtu lill-apparat ma' blokka tal-konkrit solida 60 x 60 x 60 cm b'tali mod li l-gwidi huma assolutament vertikali u l-piżijiet li jaqgħu jistgħu jaqgħu liberament. Piżijiet ta' 5 u 10 kg, magħmula minn azzar solidu, huma disponibbli għall-użu. Il-parti ta' fuq li tagħmel impatt għal kull piż hija ta' azzar imwebbes, HRC 60 sa 63, u għandha dijametru minimu ta' 25 mm. Il-kampjun għat-test jingħalaq f’apparat għax-xokk li jikkonsistit f’żewġ ċilindri ta' l-azzar solidu koassjali, wieħed fuq l-ieħor, f'ħolqa gwida ċilindrika mħaffra. Iċ-ċilindri ta' l-azzar solidu għandhom ikunu ta' 10 (-0,003, -0,005) mm dijamtru u 10 mm għoli u jkollhom uċuħ ippolixxjati, ġnub fit-tond (raġġ tal-kurvatura ta' 0,5 mm) u l-għebusija ta' HRC minn 58 sa 65. Iċ-ċilindru mħaffer irid ikollu dijametru estern ta' 16 mm, toqba ppolixxjata ta' 10 (+0,005, +0,010) mm u għoli ta' 13 mm. L-apparat għax-xokk jiġi mmuntat fuq inkwina intermedjarja (26 mm dijametru u 26 mm għoli) magħmula minn azzar u ċċentrata b'ħolqa b'perforazzjonijiet biex tippermetti l-ħruġ ta' dħaħen.

1.6.2.2. Kondizzjonijiet tat-test Il-volum tal-kampjun irid ikun 40 mm3, jew volum li huwa adattat ma' kwalunkwe apparat alternattiv. Sustanzi solidi għandhom ikunu ppruvati fi stat niexef u mħejjija kif ġej: Sustanzi pprovduti normalment bħala pejst għandhom ikunu ppruvati fi stat niexef fejn possibbli jew, wara t-tneħħija ta' l-ammont massimu possibbli ta' dilwent. Sustanzi likwidi jiġu ppruvati bi spazju ta' 1 mm bejn iċ-ċilindri ta' l-azzar ta' fuq u t’isfel.

1.6.2.2.

(a) sustanzi mfarrka jiġu mgħarbula (daqs tat-toqba ta' l-għarbiel 0,5 mm); dak kollu li jgħaddi mill-għarbiel jintuża għat-test;

(b) sustanzi ppressati, fonduti jew altrimenti kondensati jiġu mkissra fi bċejjeċ żgħar u mgħarbula; il-frazzjoni mgħarbula minn 0,5 sa 1 mm dijametru tintuża għat-test u għandha tkun rappreżentattiva tas-sustanza oriġinali.

1.6.2.3. L-eżekuzzjoni tat-testijiet Jitwettqu serje ta' sitt testijiet bit-twaqqigħ tal-piż ta' 10 kg minn 0,40 m (40 J). Jekk tinkiseb splużjoni matul is-sitt testijiet f’40 J, trid titwettaq serje oħra ta' sitt testijiet, bit-twaqqigħ ta' piż ta' 5 kg minn 0,15 m (7,5 J). F’apparati oħrajn, il-kampjun jitqabbel mas-sustanza ta' referenza magħżula bl-użu ta' proċedura stabbilita (eż. bit-teknika ta' 'l fuq u 'l isfel eċċ.).

1.6.2.4. Valutazzjoni Ir-riżultat tat-test jiġi kkunsidrat pożittiv jekk splużjoni (il-bidu ta' fjamma u/jew ta' rapport huma ekwivalenti għal splużjoni) isseħħ ta' l-inqas darba f'xi wieħed mit-testijiet bl-apparat għax-xokk speċifikat jew il-kampjun huwa aktar sensittiv minn 1, 3–dinitrobenzene jew RDX f’test tax-xokk alternattiv.

1.6.3. Sensittività mekkanika (frizzjoni)

1.6.3.

1.6.3.1. Apparat (figura 5) L-apparat tal-frizzjoni jikkonsisti fi pjanċa tal-bażi magħmula minn azzar fondut li fuqha jiġi mmuntat l-apparat ta' frizzjoni. Dan jikkonsisti f’ċilindru fiss tal-porċellana u pjanċa mobbli tal-porċellana. Il-pjanċa tal-porċellana tinżamm fuq keriġ li tiġri fuq żewġ gwidi. Il-keriġ tiġi kkonnettjata ma' mutur ta' l-elettriku permezz ta' virga li tikkonnettja, kamm eċċentriku u apparat ta' trażmissjoni adattat biex il-pjanċa tal-porċellana titmexxa, darba waħda, lura u'l quddiem taħt iċ-ċilindru tal-porċellana għal distanza ta' 10 mm. Iċ-ċilindru jista' jitgħabba b'eż. 120 jew 360 newtons. Il-pjanċi ċatti tal-porċellana huma magħmula minn porċellana teknika bajda (ħruxija minn 9 sa 32 μm) u għandhom dimensjonijiet 25 mm (tul) x 25 mm (wisa') × 5 mm (għoli). Iċ-ċilindru tal-porċellana huwa magħmul ukoll minn porċellana teknika bajda u huwa twil 15 m, għandu dijametru ta' 10 mm u wċuħ tal-ġnub sferikali ħorox b'raġġ ta' kurvatura ta' 10 mm.

1.6.3.2. Kondizzjonijiet tat-test Il-volum tal-kampjun irid ikun ta' 10 mm3, jew volum li huwa adattat għal kwalunkwe apparat alternattiv. Sustanzi solidi għandhom ikunu ttestjati fi stat niexef u mħejjija kif ġej: Sustanzi forniti normalment bħala pejsts għandhom ikunu ppruvati fi stat niexef fejn huwa possibbli. Jekk is-sustanza ma tistax titħejja fi stat niexef, il-pejst (wara t-tneħħija ta' l-ammont massimu possibbli ta' dilwent) jiġi ppruvat bħala liega 0,5 mm ħoxna, 2 mm wiesa’, 10 mm twila, ippreparata ma' ta' qabel.

1.6.3.2.

(a) sustanzi mfarrka jiġu mgħarbula (daqs tat-toqba ta' l-għarbiel 0,5 mm); dak kollu li jgħaddi mill-għarbiel jintuża għat-test;

(b) sustanzi ppressati, fonduti jew altrimenti kkondensati jiġu mkissra fi bċejjeċ żgħar u mgħarbula; il-frazzjoni mgħarbula ta' < 0,5 mm dijametru tintuża għat-test.

1.6.3.3. L-eżekuzzjoni tat-testijiet Iċ-ċilindru tal-porċellana jiddaħħal fil-kampjun għat-test u tiġi applikata l-forza. Meta jkun qed jitwettaq it-test, il-marki ta' l-isponża tal-pjanċa tal-porċellana jridu jkunu b'mod trasversali mad-direzzjoni tal-moviment. Trid tingħata attenzjoni li ċ-ċilindru jistrieħ fuq il-kampjun, li jkun hemm materjal tat-test suffiċjenti taħt iċ-ċilindru u anke li l-pjanċa timxi b'mod korrett taħt iċ-ċilindru. Għal sustanzi f’forma ta' pejst, gejġ bi ħxuna ta' 0,5 mm b'xaqq ta' 2 x 10 mm jintuża biex tkun applikata s-sustanza mal-pjanċa. Il-pjanċa tal-porċellana trid timxi 10 mm il quddiem u lura taħt iċ-ċilindru tal-porċellana f’ħin ta' 0,44 sekondi. Kull parti tas-superfiċje tal-pjanċa trid tintuża darba biss; iż-żewġt itruf ta' kull ċilindru jservu għal żewġ provi u kull waħda miż-żewġ superfiċji tal-pjanċa sservi għal tliet provi. Jitwettqu serje ta'sitt testijiet b'tagħbija ta' 360 N. Jekk riżultat pożittiv jinkiseb matul dawn is-sitt testijiet, serje oħra ta' sitt testijiet trid titwettaq b'tagħbija ta' 120 N. F’apparati oħra, il-kampjun huwa mqabbel ma' sustanza ta' referenza magħżula bl-użu ta' proċedura stabbilita (eż. teknika ta' ‘l fuq u ‘l isfel, eċċ.).

1.6.3.4. Valutazzjoni Ir-riżultat tat-test jiġi kkunsidrat pożittiv jekk splużjoni (tifqigħ u/jew rapport jew kombustibilità fi fjamma huma ekwivalenti għal splużjoni) titwettaq għall-inqas darba f'xi wieħed mit-testijiet bl-apparat speċifiku ta' frizzjoni jew il-kriterji ekwivalenti f'test ta' frizzjoni alternattiv ikunu ssodisfati.

2. DATA Fil-prinċipju, sustanza hija kkunsidrata li tippreżenta periklu ta' splużjoni fis-sens tad-Direttiva jekk riżultat pożittiv jinkiseb fit-test termiku, bix-xokk jew bis-sensittività tal-frizzjoni.

3. RAPPURTAR

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

identità, kompożizzjoni, purità, kontenut ta' umdità eċċ. tas-sustanza ttestjata.

il-forma fiżika tal-kampjun u jekk kienx imfarrak, miksur u/jew mgħarbul,

l-osservjazzjonijiet matul it-testijiet għas-sensittività termika (eż. piż b'kampjun, numru ta' frammenti eċċ.),

l-osservjazzjonijiet matul it-testijiet għas-sensittività mekkanika (eż. il-formazzjoni ta' ammonti konsiderevoli ta' duħħan jew dekompożizzjoni kompleta mingħajr rapport, fjammi, sparks, rapport, tifqigħ eċċ.),

ir-riżultati ta' kull test,

jekk intuża apparat alternattiv, trid tingħata ġustifikazzjoni alternattiva kif ukoll xhieda ta' korelazzjoni bejn riżultati miksuba b'apparat speċifiku u dawk miksuba b'apparat ekwivalenti,

kwalunkwe kummenti utli bħal referenza għal testijiet bi prodotti simili li jistgħu jkunu relevanti għall-interpretazzjoni proprja tar-riżultati,

ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. INTERPRETAZZJONI U VALUTAZZJONI TA' RIŻULTATI Ir-rapport tat-test irid isemmi kwalunkwe riżultati li huma kkunsidrati foloz, anomali jew mhux rappreżentattivi. Jekk xi wieħed mir-riżultati għandu jitwarrab, għandha tingħata spjegazzjoni u r-riżultati ta' l-ittestjar supplimentari. Sakemm riżultat anomalu ma jkunx spjegat, irid ikun aċċettat skond l-apparenza u użat biex tkun ikklassifikata s-sustanza skond il-każ.

4.(1)(2)(3)(4)

REFERENZI Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol.3, 6-13 and 30-42. NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of explosion risk.

A.15. TEMPERATURA TA' AWTO-FJAMMABILITÀ (LIKWIDI U GASSIJIET)

A.15.

1. METODU

1.

1.1. DAĦLA Sustanzi esplożivi u sustanzi li jaqbdu spontanjament f’kuntatt ma' l-arja f’temperatura ambjentali m‘għandhomx ikunu sottomessi għal dan it-test. Il-proċedura tat-test hija applikabbli għal gassijiet, likwidi u fwawar li, fil-preżenza ta' l-arja, jistgħu jitqabbdu b'superfiċje sħuna. It-temperatura ta' l-awto-fjammabilità tista' titqies imnaqqsa b'mod konsiderevoli bil-preżenza ta' impuritajiet katalitiċi, b'materjal tas-superfiċje u b'volum akbar tar-reċipjent tat-test.

1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET Il-grad ta' l-awto-fjammabilità huwa espress f’termini ta' temperatura ta' awto-fjammabilità. It-temperatura ta' l-awto-fjammabilità hija l-inqas temperatura li fiha s-sustanza għat-test taqbad meta mħallta ma' l-arja taħt kondizzjonijiet imfissra fil-metodu tat-test.

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA Sustanzi ta' referenza huma ċitati fl-istandards (ara 1.6.3.). Huma għandhom iservu primarjament biex jiċċekkjaw ir-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra.

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU Il-metodu jiddetermina t-temperatura minima tal-qoxra ta' ġewwa ta' reċipjent magħluq li tirriżulta fil-fjammabilità ta' gass, fwar jew likwidu injettat fir-reċipjent.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ Ir-ripetibbilità tvarja skond l-iskala ta' l-awto-fjammabilità u l-metodu tat-test użat. Is-sensittività u l-ispeċifiċità jiddependu fuq il-metodu tat-test użat.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.6.

1.6.1. Apparat L-apparat huwa mfisser fil-metodu riferut f’1.6.3.

1.6.2. Kondizzjonijiet tat-test Kampjun tas-sustanza tat-test jiġi ttestjat skond il-metodu msemmi f’1.6.3.

1.6.3. L-eżekuzzjoni tat-test Ara IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. DATA Irreġistra t-temperatura tat-test, il-pressjoni atmosferika, il-kwantità użata mill-kampjun u l-intervall ta' ħin sakemm issir il-fjammabilità.

3. RAPPURTAR Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identifikazzjoni u impuritajiet),

il-kwantità ta' kampjun użata, il-pressjoni atmosferika,

l-apparat użat,

ir-riżultat tal-kejl (temperaturi tat-test, riżultati li jirrigwardaw il-fjammabilità, u l-intervalli ta' ħin korrispondenti),

ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.

4. REFERENZI Xejn.

A.16. TEMPERATURA TA' AWTO-FJAMMABILITÀ RELATTIVA GĦAL SOLIDI

A.16.

1. METODU

1.

1.1 DAĦLA Sustanzi esplożivi u sustanzi li jaqbdu spontanjament f’kuntatt ma' l-arja f’temperatura ambjentali m'għandhomx ikunu sottomessi għal dan it-test. L-għan ta' dan it-test huwa li jipprovdi informazzjoni preliminari dwar l-awto-fjammabilità ta' sustanzi solidi f’temperaturi elevati. Jekk is-sħana li tiżviluppa jew b'reazzjoni tas-sustanza ma' l-ossiġenu jew b’dekompożizzjoni eżotermika ma tintilifx malajr biżżejjed fil-madwar, iseħħ awto-tisħin li jwassal għall-awto-fjammabilità. Awto-fjammabilità għalhekk isseħħ meta r-rata ta' produzzjoni tas-sħana taqbeż ir-rata tat-telf tas-sħana. Il-proċedura tat-test hija utli bħala test ta' skrinjar preliminari għal sustanzi solidi. Minħabba n-natura komplessa tal-fjammabilità u l-kombustjoni ta' solidi, it-temperatura ta' l-awto-fjammabilità ddeterminata skond dan il-metodu ta' test għandha tintuża għal għanijiet ta' tqabbil biss.

1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET It-temperatura ta' awto-fjammabilità kif miksuba b'dan il-metodu hija t-temperatura ambjentali minima espressa f’ oC li fiha ċertu volum ta' sustanza jaqbad taħt kondizzjonijiet definiti.

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA Xejn.

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU Ċertu volum tas-sustanza għat-test jitpoġġa f’forn f’temperatura ambjentali; il-kurva tat-temperatura/ħin relatata mal-kondizzjonijiet f’nofs il-kampjun tiġi rreġistrata waqt li t-temperatura tal-forn tiżdied sa 400 oC, jew sal-punt tat-tidwib jekk dan huwa iżgħar, b'rata ta' 0,5 oC/min. Għall-għan ta' dan it-test, it-temperatura tal-forn li fiha t-temperatura tal-kampjun tilħaq 400 C b'awto-tisħin tissejjaħ it-temperatura ta' l-awto-fjammabilità.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ Xejn.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.6.

1.6.1. Apparat

1.6.1.

1.6.1.1. Forn Forn tal-laboratorju pprogrammat b'temperatura (volum ta' madwar 2 litri) mgħammar b'ċirkolazzjoni ta' l-arja naturali u bi sfog għal splużjoni. Bil-għan li jkun evitat ir-riskju ta' splużjoni potenzjali, kwalunkwe gassijiet ta' dekompożizzjoni m‘għandhomx jitħallew jagħmlu kuntatt ma' l-elementi elettriċi tat-tisħin.

1.6.1.2. Kubu b'xibka tal-wajer irqiq Biċċa xibka tal-wajer irqiqa ta' l-azzar li ma jissaddadx b'fetħiet ta' 0,045 mm għandha tinqata' skond id-disinn f'figura 1. Ix-xibka għandha tintewa u tintrabat b'wajer f'forma ta' kubu bil-parti ta' fuq miftuħa.

1.6.1.3. Termokoppji Termokoppji adattati.

1.6.1.4. Rekorder Kwalunkwe rekorder b'żewġ kanali kkalibrati minn 0 sa 600 oC jew vultaġġ korrispondenti.

1.6.2. Kondizzjonijiet tat-test Is-sustanzi jiġu ttestjati kif riċevuti.

1.6.3. L-eżekuzzjoni tat-test Il-kubu jimtela bis-sustanza għat-test u jittaptap bil-mod, u tiżdied aktar sustanza sakemm il-kubu jkun mimli kompletament. Il-kubu mbagħad jiġi sospiż fiċ-ċentru tal-forn f’temperatura ambjentali. Termokoppja titpoġġa fiċ-ċentru tal-kubu u oħra bejn il-kubu u l-ġenb tal-forn biex tirreġistra t-temperatura tal-forn. It-temperaturi tal-forn u tal-kampjun jiġu rreġistrati kontinwament waqt li t-temperatura tal-forn tiġi miżjuda għal 400 C, jew għat-temperatura tat-tidwib jekk din tkun iżgħar, bir-rata ta' 0,5 oC/min. Meta s-sustanza tqabbad it-termokoppja kampjun turi żieda qawwija fit-temperatura ogħla mit-temperatura tal-forn.

2. DATA It-temperatura tal-forn li fiha t-temperatura kampjun tilħaq l-400 oC b'awto-tisħin hija relevanti għal valutazzjoni (ara figura 2).

3. RAPPURTAR Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

deskrizzjoni tas-sustanza għat-test,

ir-riżultati tal-kejl inkluża l-kurva tat-temperatura/ħin,

ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.

4. REFERENZI NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

4.

Figura 1 Disinn ta' kubu tat-test ta' 20 mm

Figura 2 Kurva tipika tat-temperatura/ħin

sample temperature oven temperature ignition temperature Time

A.17. PROPRJETAJIET OSSIDANTI (SOLIDI)

A.17.

1. METODU

1.

1.1. DAĦLA Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminari dwar proprjetajiet esplożivi potenzjali tas-sustanza qabel jitwettaq dan it-test. Dan it-test mhuwiex applikabbli għal likwidi, gassijiet, sustanza fjammabbli jew esplożivi ħafna, jew perrossidi organiċi. Dan it-test jista' ma jsirx meta eżami tal-formula strutturali jistabbilixxi mingħajr ebda dubju raġjonevoli li s-sustanza mhijiex kapaċi li tirreaġixxi eżotermikament ma' materjal kombustibbli. Bil-għan li jkun żgurat jekk it-test għandux jitwettaq bi prekawzjonijiet speċjali, għandu jitwettaq test preliminari.

1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET Ħin tal-kombustjoni: żmien ta' reazzjoni, f’sekondi, meħud għaż-żona ta' reazzjoni biex timxi mal-gozz, wara l-proċedura mfissra f’1.6. Rata ta' kombustjoni: espressa f’millimetri għal kull sekonda. Rata massima ta' kombustjoni: l-ogħla valur ta' rati ta' kombustjoni miksuba b'taħlitiet li jinkludu minn 10 sa 90 % bil-piż ta' ossidant.

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA Nitrat tal-barju (grad analitiku) huwa użat bħala sustanza ta' referenza għat-test u t-test preliminari. It-taħlita ta' referenza hija dik it-taħlita ta' nitrat tal-barju b'ċelluloża f’forma ta' trab, ippreparat skond 1.6, li għandu rata ta' kombustjoni massima (is-soltu taħlita b’60 % nitrat tal-barju bil-piż).

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU Test preliminari jitwettaq fl-interess tas-sikurezza. Ma jkunx meħtieġ aktar ittestjar meta t-test preliminari jindika b'mod ċar li s-sustanza għat-test għandha proprjetajiet ossidanti. Meta dan mhuwiex il-każ, is-sustanza mbagħad għandha tkun soġġetta għat-test sħiħ. Fit-test sħiħ, is-sustanza għat-test u sustanza kombustibbli definita tiġi mħallta fi proporzjonijiet diversi. Kull taħlita mbagħad tiġi ffurmata f’gozz u l-gozz jitqabbad f’tarf minnu. Ir-rata ta' kombustjoni massima ddeterminata titqabbel mar-rata ta' kombustjoni massima tat-taħlita ta' referenza.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ Jekk ikun meħtieġ, kwalunkwe metodu ta' tħin u taħlit huwa validu bil-kondizzjoni li d-differenza fir-rata ta' kombustjoni massima fis-sitt testijiet separati tarja mill-valur medju aritmetiku b'mhux aktar minn 10 %.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.6.

1.6.1. Preparazzjoni

1.6.1.

1.6.1.1. Is-sustanza għat-test Naqqas il-kampjun għat-test għal daqs ta' partikula < 0,125 mm bl-użu tal-proċedura li ġejja: għarbel is-sustanza għat-test, itħan il-frazzjoni li jkun baqa', irrepeti l-proċedura sakemm il-porzjon kollha għat-test tkun għaddiet mill-għarbiel. Jista' jintuża kwalunkwe metodu ta' tħin jew ta' tgħarbil li jissodisfa l-kriterji ta' kwalità. Qabel titħejja t-taħlita s-sustanza titnixxef f’105 oC, sakemm jinkiseb il-piż kostanti. Jekk it-temperatura ta' dekompożizzjoni tas-sustanza għat-test hija taħt il-105 oC, is-sustanza għandha titnixxef b'temperatura adattata iktar baxxa.

1.6.1.2. Sustanza kombustibbli Ċelluloża f’forma ta' trab hija użata bħala sustanza kombustibbli. Iċ-ċelluloża għandha tkun tat-tip użata għal kromatografija ta' saff irqiq jew għal kromatograija tal-kolonna. Waħda tat-tip b'fibri ta' tul ta' aktar minn 85 % bejn 0,020 u 0,075 mm instabu li kienu adattati. It-trab taċ-ċelluloża jiġi mgħoddi minn għarbiel b'toqob ta' daqs ta' 0,125 mm. L-istess lott ta' ċelluloża għandu jintuża matul it-test. Qabel titħejja t-taħlita, iċ-ċelluloża f’forma ta' trab titnixxef f’105 oC, sakemm jinkiseb piż kostanti. Jekk tintuża ċ-ċana ta' l-injam fit-test preliminari, allura pprepara ċ-ċana ta' l-injam artab billi tiġbor il-porzjon li tgħaddi minn għarbiel b'toqob ta' 1,6 mm, ħallat sewwa, imbagħad nixxef f’105 oC għal erba' sigħat f’saff ta' mhux oħxon aktar minn 25 mm. Kessaħ u aħżen f’kontenitur li fih ma jidħolx arja mimli kemm sa kemm huwa prattiku u sakemm ikun meħtieġ, preferibbilment fi żmien 24 siegħa mit-tnixxif.

1.6.1.3. Għajn ta' fjammabiltà Fjamma taħraq minn berner tal-gass (dijametru minimu ta' 5 mm) għandha tintuża bħala l-għajn ta' fjammabilità. Jekk tintuża għajn ta' fjammabbiltà oħra (eż. meta jsir it-test f’atmosfera inerta), id-deskrizzjoni u l-ġustifikazzjoni għandhom ikunu rrapurtati.

1.6.2. L-eżekuzzjoni tat-test Nota: Taħlitiet ta' ossidaturi ma' ċelluloża jew ċana ta' l-injam iridu jkunu ttrattati bħala potenzjalment splussivi u mmaniġġjati b'attenzjoni xierqa.

1.6.2.

1.6.2.1. Test preliminari Is-sustanza mnixxfa hija mħallta sewwa ma' ċelluloża mnixxfa jew ċana ta' l-injam fil-proporzjonijiet ta' 2 ta' sustanza għat-test għal 1 ta' ċelluloża jew ċana ta' l-injam bil-piż u t-taħlita tiġi ffurmata f’gozz żgħir forma ta' kon ta' dimensjonijiet 3,5 cm (dijametru tal-bażi) x 2,5 cm (għoli) pemezz tal-mili, mingħajr rass, ta' oġġett li jifforma kon (eż. lembut tal-ħġieġ tal-laboratorju biż-żennuna magħluqa). Il-gozz jitpoġġa fuq pjanċa tal-bażi li mhijiex kombustibbli, mhux poruża u b'konduttività baxxa ta' sħana. It-test għandu jitwettaq f’armarju tad-duħħan bħal f’1.6.2.2. L-għajn tal-fjammabbiltà jitressaq f’kuntatt mal-kon. Is-saħħa u d-dewmien tar-reazzjoni riżultanti għandhom ikunu osservati u rreġistrati. Is-sustanza għandha tkun ikkunsidrata bħala ossidanti jekk ir-reazzjoni hija qawwija. Fi kwalunkwe każ fejn ir-riżultat huwa dubjuż, imbagħad ikun neċessarju li jsir it-test kollu mfisser hawn taħt.

1.6.2.2. It-test tas-serje Ipprepara taħlitiet ta' ossidatur ċelluloża li jkun fihom minn 10 sa 90 % piż ta' ossidatur f’żidiet ta' 10 %. F'każijiet li kważi qegħdin fl-istess limiti, taħlitiet ta' ossidatur ċelluloża intermedji għandhom jintużaw biex tinkiseb ir-rata ta' fjammabbiltà massima b'aktar preċiżjoni. Il-gozz ikun iffurmat permezz ta' forma. Din il-forma magħmula mill-metall, għandha tul ta' 250 mm b'taqsima trasversali trijangulari ta' għoli intern ta' 10 mm u wisa' interna ta' 20 mm. Żewġ pjanċi tal-metall jiġu mmuntati fuq iż-żewġ naħat tal-forma f’direzzjoni lonġitudinali bħala limitazzjonijiet laterali li joħorġu 2 mm il barra mit-tarf l-għoli tat-taqsima trasversali trijangulari (figura). Dan l-arranġament jimtela liberament bi ftit taħlita żejda. Wara li l-forma tintefa għal darba waħda minn għoli ta' 2 cm fuq superfiċje solida, is-sustanza żejda li tibqa’ titneħħa b’karta milwija. Il-limitazzjonijiet laterali jitneħħew u t-trab li jibqa' jiħi ċċattjat, permezz ta' romblu. Pjanċa ta' bażi mhux kombustibbli, mhux poruża u b’konduttività ta' sħana baxxa mbagħad titpoġġa fuq il-forma, l-apparat jinqaleb u l-forma titneħħa. Irranġa l-gozz fil-kurrent ta' l-arja f’armarju li jiġbed id-duħħan. Il-veloċità ta' l-arja trid tkun suffiċjenti biex tevita li d-duħħan joħroġ fil-laboratorju u m'għandhiex tkun varjata matul it-test. L-apparat irid ikun protett mill-kurrent ta' l-arja. Minħabba l-igroskopiċità taċ-ċelluloża u ta' wħud mis-sustanzi għat-test, it-test għandu jitwettaq malajr kemm jista' jkun. Qabbad ġenb wieħed tal-gozz billi tressqu mal-fjamma. Kejjel il-ħin tar-reazzjoni fuq distanza ta' 200 mm wara li ż-żona ta' reazzjoni tinfirex sa distanza inizjali ta' 30 mm. It-test jitwettaq bis-sustanza ta' referenza u ta' l-inqas darba b'kull waħda mill-firxa ta' taħlitiet tas-sustanza għat-test maċ-ċelluloża. Jekk ir-rata ta' fjammabilità massima tinsab li hija akbar b'mod sinifikanti minn dik tat-taħlita ta' referenza, it-test jista' jitwaqqaf; inkella t-test għandu jkun ripetut għal ħames darbiet għal kull waħda mit-tliet taħlitiet li jagħtu l-aktar rata veloċi ta' fjammabilità. Jekk hemm suspett li r-riżultat huwa pożittiv falz, allura t-test għandu jkun ripetut bl-użu ta' sustanza inerta bl-istess daqs ta' partikula, bħall-kieselguhr, flok iċ-ċelluloża. Alternattivament, it-taħlita tas-sustanza għat-test maċ-ċelluloża, li għandha l-aktar rata veloċi ta' fjammabilità, għandha tkun ittestjata mill-ġdid f’atmosfera inerta (< 2 % v/v kontenut ta' ossiġnu).

2. DATA Għal raġunijiet ta' sikurezza r-rata ta' fjammabilità massima – mhux il-valur medju – għandha tkun ikkunsidrata bħala l-proprjetà ossidanti karatteristika tas-sustanza għat-test. L-ogħla valur tar-rata tal-fjammabilità f’serje ta' sitt testijiet ta' taħlita definita huwa relevanti għall-valutazzjoni. Pinġi graff ta' l-ogħla valur tar-rata tal-fjammabilità għal kull taħlita kontra l-konċentrazzjoni ta' l-ossidatur. Mill-graff ħu r-rata tal-fjammabilità massima. Is-sitt valuri mkejla tar-rata tal-fjammabilità f’serje miksuba mit-taħlita mar-rata ta' fjammabilità massima ma tridx tiddiferenzja mill-valur medju aritmetiku b'aktar minn 10 %; inkella l-metodi tat-tħin u t-taħlit jridu jittejbu. Qabbel ir-rata ta' fjammabilità massima miksuba mar-rata ta' fjammabilità massima tat-taħlita ta' referenza (ara 1.3). Jekk it-testijiet jitwettqu f’atmosfera inerta, ir-rata ta' reazzjoni massima titqabbel ma' dik tat-taħlita ta' referenza f’atmosfera inerta.

3. RAPPURTAR

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

l-identità, il-kompożizzjoni, il-purità, il-kontenut ta' umdità eċċ. tas-sustanza ttestjata;

kwalunkwe trattament tal-kampjun għat-test (eż. tħin, tnixxif);

l-għajn tal-fjammabbiltà użata fit-testijiet;

ir-riżultati tal-kejl;

il-mod ta' reazzjoni (eż. fjammabilità lelliexa fuq is-superfiċje, fjammabilità tul il-massa kollha, kwalunkwe informazzjoni li tirrgwarda l-prodotti ta' kombustjoni, ...);

ir-rimarki rilevanti kollha għall-interpretazzjoni tar-riżultati, inkluża deskrizzjoni ta' l-enerġija fiżika (fjamma, spark, duħħan, ħruq bil-mod sakemm isir faħam, eċċ.) u t-tul ta' żmien approssimattiv prodott fit-test preliminari tas-sikurezza/skrinjar kemm għas-sustanza għat-test kif ukoll għal dik ta' referenza;

ir-riżultati minn testijiet b'sustanza inerta, jekk hemm;

ir-riżultati minn testijiet f’atmosfera inerta, jekk hemm.

3.2. INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI Sustanza titqies li hija sustanza ossidanti meta: Bil-għan li jkun evitat pożittiv falz, ir-riżultati miksuba meta s-sustanza għat-test titħallat ma' materjal inert u/jew meta jsir l-ittestjar taħt atmosfera inerta, għandhom jiġu kkunsidrati wkoll fl-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2.

(a) fit-test preliminari, hemm reazzjoni vigoruża;

(b) fit-test sħiħ, ir-rata ta' fjammabilità massima tat-taħlitiet ittestjati hija ogħla minn jew ugwali għar-rata ta' fjammabilità massima tat-taħlita ta' referenza taċ-ċelluloża u n-nitrat tal-barju.

4. REFERENZI NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

A.18. IL-MEDJA TAL-PIŻ MOLEKULARI TAN-NUMRU U D-DISTRIBUZZJONI TAL-PIŻ MOLEKULARI TAL-POLIMERI

A.18.

1. METODU Dan il-metodu Kromotografiku bil-Permeazzjoni tal-Ġel huwa replika tal-OECD TG 118 (1996). Il-prinċipji fundamentali u aktar informazzjoni teknika jinsabu fir-referenza 1.

1.

1.1. DAĦLA Ladarba l-proprjetajiet tal-polimeri huma daqshekk differenti, huwa impossibbli li jiġi deskritt metodu wieħed li jagħti l-kondizzjonijiet preċiżi għas-separazzjoni u l-valutazzjoni li japplikaw għal kull sitwazzjoni u għal kull ħaġa li tiġri waqt is-separazzjoni tal-polimeri. Partikolarment u ta' spiss, sistemi ta' polimeri komplessi mhumiex soġġetti għall-kromatografija bil-permeazzjoni tal-ġel (GPC). Meta l-GPC mhuwiex prattikabbli, l-piż molekulari jista' jiġi deċiż b'metodi oħrajn (ara l-Anness). F'dawn il-każijiet, għandhom jingħataw id-dettalji u l-ġustifikazzjonijiet kollha għall-metodu użat. Il-metodu deskritt huwa bbażat fuq l-istandard DIN 55671 (1). F'dan l-istandard DIN tinsab informazzjoni dettaljata fuq kif għandhom jitmexxew dawn l-esperimenti u kif għandha tiġi vvalutata d-DATA. F'każ illi hemm bżonn li l-kondizzjonijiet ta' l-esperiment jinbidlu, dawn il-bidliet iridu jiġu ġustifikati. Jistgħu jintużaw standards oħrajn jekk ikun hemm ir-referenzi kollha. Il-metodu deskritt juża kampjuni tal-polisterin ta' politixrid magħruf għall-kalibrazzjoni, u jista' jagħti l-każ li jrid jiġi modifikat biex jaqbel ma' ċerti polimeri, eż. polimeri li jinħallu fl-ilma u polimeri long-chain branched.

1.2. DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET Il-medja tal-piż molekulari tan-numru Mn u l-medja tal-piż molekulari tal-piż Mw huma ddeterminati skond l-ekwazzjonijiet li ġejjin: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1HixMiΣni=1Hi fejn, Hi huwa l-livell tas-sinjal ta' osservazzjoni mil-linja ta' bażi għall-volum ta' retenzjoni Vi, Mi huwa l-piż molekulari tal-frazzjoni tal-polimeri fil-volum ta' retenzjoni Vi, u n huwa n-numru tal-punti ta' DATA. Il-wisa' tad-distribuzzjoni tal-piż molekulari, li hija miżura tat-tixrid tas-sistema, tingħata bil-proporzjon Mw/Mn.

1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA Ladarba l-GPC huwa metodu relattiv, hemm bżonn ta' kalibrazzjoni. Normalment jintużaw standards tal-polistiren b'distribuzzjoni limitata u mibnija linearment u li għandhom piż molekulari medju Mn u Mw u distribuzzjoni ta' piż molekolari magħrufa. Il-kurva tal-kalibrazzjoni tista' tintuża biss fid-determinazzjoni tal-piż molekulari tal-kampjun mhux magħruf jekk il-kondizzjonijiet għas-separazzjoni tal-kampjun u l-istandards intgħażlu b'mod preċiżament l-istess. Ir-relazzjoni ddeterminata bejn il-piż molekulari u l-volum ta' elużjoni huwa validu biss taħt il-kondizzjonijiet speċifiċi ta' l-esperiment partikolari. Il-kondizzjonijiet fuq kollox jinkludu t-temperatura, s-solvent (jew taħlita tas-solventi), il-kondizzjonijiet tal-kromatografija u l-kolonna tas-separazzjoni jew is-sistemi tal-kolonni. Il-piż molekulari tal-kampjuni ddeterminati b'dan il-mod huma valuri relattivi u huma deskritti bħala piżijiet molekulari ekwivalenti għall-polistiren. Dan ifisser illi skond id-differenzi strutturali u kimiċi bejn il-kampjun u l-istandards, il-piżijiet molekulari jistgħu jiddevjaw mill-valuri assoluti sa grad iktar jew inqas. Jekk jintużaw standards oħrajn, eż. il-glikol tal-polietilin, l-ossidu tal-politin, il-metakrilat tal-polimetil, aċidu poliakriliku, għandha titniżżel ir-raġuni.

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU TA' L-EŻAMI Kemm id-distribuzzjoni tal-piż molekulari tal-kampjun kif ukoll il-piżijiet molekulari medji (Mn, Mw) jistgħu jiġu ddeterminati billi jintuża l-GPC. Il-GPC huwa metodu speċjali ta' kromatografija likwida fejn il-kampjun jiġi separat skond il-valuri idrodinamiċi tal-kostitwenti individwali (2). Is-separazzjoni ssir kif il-kampjun jgħaddi minn ġo kolonna mimlija b'materjal poruż, tipikament ġel organiku. Molekoli żgħar jistgħu jippenetraw il-pori filwaqt li l-molekoli kbar ma jistgħux. Il-passaġġ tal-molekoli kbar huwa, għalhekk, iqsar u għalhekk huma jippenetraw l-ewwel. Il-molekoli ta'daqs medju jippenetraw minn uħud mill-pori u jgħaddu iktar tard. L-iżgħar molekoli, b'raġġ idrodinamiku medju iżghar mill-pori tal-ġel jistgħu jippenetraw il-pori kollha. Dawn ikun elużi l-aħħar. Idealment, is-separazzjoni hija ddeterminata biss skond id-daqs ta' l-ispeċi tal-molekoli, imma fil-prattika huwa diffiċli li wieħed jevita xi interferenza mill-assorbiment L-ippakkjar mhux ugwali tal-kolonni u volumi mejtin jistgħu jaggravaw is-sitwazzjoni (2). L-osservazzjoni hija effetwata minn, eż. l-indiċi refrattiv jew l-assorbiment tal-UV u tagħti kurva tad-distribuzzjoni sempliċi. Madankollu, biex il-kurva tingħata valuri attwali tal-piż molekulari, huwa neċessarju li l-kolonna tiġi kkalibrata billi polimeri ta' piż molekulari magħruf u, idealment, ta' struttura simili ħafna, jitniżżlu l isfel, eż. standards tal-polistiren varji. B'mod tipiku, għandha tirriżulta kurva Gaussian, xi drabi mgħawwġa minħabba denb fuq in-naħa baxxa tal-piż molekulari, fejn il-fus vertikali jindika l-kwantità, skond il-piż, ta' l-ispeċi tal-piż molekulari varji, u l-fus orizzontali l-piż molekulari rreġistrat.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ Ir-ripetibilità (Devjazzjoni ta' Livell Stabbilit: RSD) tal-volum ta' l-elużjoni għandha tkun aħjar minn 0,3 %. Ir-ripetibilità mixtieqa ta' l-analiżi għandha tiġi żgurata permezz ta' korrezzjoni skond standard intern jekk kromatogram huwa evalwat b'mod li huwa dipendenti fuq il-ħin u ma jaqbilx mal-kriterju msemmi hawn fuq (1). Il-politixrid jiddependi fuq il-piżijiet molekulari ta' l-istandards. Fil-każ ta' standards tal-polistirene, valuri tipiċi huma: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp huwa l-piż molekulari ta' l-istandard fil-quċċata tal-massimu)

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' L-EŻAMI

1.6.

1.6.1. Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet standard tal-polistiren L-istandards tal-polistiren għandhom jinħallu billi jitħalltu b'attenzjoni fl-eluwent magħżul. Ir-rakkomandazzjonijiet tal-fabbrikant għandhom jiġu kkunsidrati waqt il-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet. Il-konċentrazzjonijiet ta' l-istandards magħżula jiddependu fuq diversi fatturi: eż. il-volum ta' l-injezjoni, il-viskożità tas-soluzzjoni u s-sensittività tad-ditekter analitiku. Il-volum massimu ta' l-injezzjoni għandu jiġi adattat għat-tul tal-kolonna biex tiġi evitata tagħbija żejda. Volumi ta' injezzjoni tipiċi għas-separazzjonijiet analitiċi bl-użu tal-GPC b'kolonna ta' 30 cm × 7,8 mm huma normalment bejn 40 u 100 μl. Volumi ogħla huma possibbli, imma m'għandhomx jaqbu 250 μl. L-aħjar proporzjon ta' bejn il-volum ta' l-injezzjoni u l-konċentrazzjoni għandha tiġi ddeterminata qabel ma tiġi kkalibrata l-kolonna.

1.6.2. Preparazzjoni tal-kampjun tas-soluzzjoni Fil-prinċipju, l-istess ħtiġijiet japplikaw għall-preparazzjoni tal-kampjuni tas-soluzzjonijiet. Il-kampjun għandu jinħall f’solvent xieraq, eż. it-tetraidrofuran (THF), billi jitħawwad bil-galbu. Taħt l-ebda ċirkostanza m'għandu jinħall permezz ta' banju ultrasoniku. Fejn huwa neċessarju, il-kampjun tas-soluzzjoni għandu jiġi ppurifikat permezz ta' filtru tal-membrana b'pori ta' daqs bejn 0,2 u 2 μm. Il-preżenza ta' partikoli li ma nħallux għanda titniżżel fir-rapport finali għar-raġuni li dawn jistgħu jirriżultaw minn speċi ta' piż molekulari għoli. Għandu jintuza metodu xieraq biex jiġi ddeterminat il-perċentaġġ skond il-piż tal-partikoli li nħallu. Is-soluzzjonijiet għandhom jintużaw fi-żmien 24 siegħa.

1.6.3. L-apparat Għandu jiġi żgurat li s-sistema GPC hija inerta fir-rigward tas-solventi użati (eż. bl-użu ta' kapillari ta' l-azzar għas-solvent THF).

ġibjuni tas-solventi:

degasser (fejn xieraq),

pompa

apparat biex inaqqas l-impuls (fejn hemm bżonn)

sistema ta' injezzjoni,

kolonni tal-kromatografija,

ditekter

flowmeter (fejn hemm bżonn),

proċessur li jirrekordja d-DATA,

kontenitur għall-iskart

1.6.4. L-injezzjoni u s-sistema li twassal s-solventi Volum definit tal-kampjun tas-soluzzjoni jitgħabba fuq il-kolonna bl-użu ta' auto-sampler jew manwalment f'żona definita preċiżament. L-irtirar jew l-għafis tal-plunger tas-siringa b'mod mgħaġġel, jekk isir manwalment, jista' jikkawża bidliet fid-distribuzzjoni tal-piż molekulari osservata. Is-sistema tat-twassil tas-solvent għandha, safejn huwa possibbli, tkun ħielsa mill-impulsi u idealment għandha tinkludi apparat li jnaqqas l-impulsi. Il-flowrate tkun madwar 1 ml/min.

1.6.5. Il-kolonna Skond il-kampjun, il-polimer ikun karatterizzat mill-użu ta' kolonna sempliċi jew minn numru ta' kolonni konnessi f’sekwenza. Għadd ta' materjali porużi tal-kolonni bi proprjetajiet definiti (eż. daqs tal-pori, limiti ta' esklużjoni) huma disponibbli kummerċjalment. L-għażla tal-ġel ta' separazzjoni jew tat-tul tal-kolonna jiddependi fuq il-proprjetajiet tal-kampjun (volumi idrodinamiċi, distribuzzjoni tal-piż molekulari) u l-kondizzjonijiet speċifiċi għas-separazzjoni bħas-solventi, t-temperatura u l-flowrate (1) (2) (3).

1.6.6. Il-pjanċi teoretiċi Il-kolonna jew il-kombinazzjoni tal-kolonni użati għas-separazzjoni għandhom jiġu karatterizzati skond in-numru ta' pjanċi teoretiċi. Dan jinvolvi, f’każ meta t-THF huwa s- solvent eluwent, it-tagħbija ta' soluzzjoni ta' etile benżin jew ta' sustanza maħlula mhux b'polarità xierqa fuq kolonna ta' tul magħruf. In-numru ta' pjanċi teoretiċi huwa mogħti skond l-ekwazzjoni li ġejja: N=5,54VeW1/22 or N=16VeW2 fejn, N in-numru tal-pjanċi teoretiċi Ve il-volum ta' elużjoni fil-quċċata tal-massimu W il-quċċata tal-wisa' tal-linja bażi W1/2 il-quċċata tal-wisa' fin-nofs ta' l-għoli

1.6.7. L-effiċjenza tas-separazzjoni Flimkien ma' l-ammont tal-pjanċi teoretiċi, li hija kwantità li tistabbilixxi il-bandwidth, l-effiċjenza tas-separazzjoni għandha sehem ukoll, u din hija stabbilita skond kemm hi wieqfa l-kurva tal-kalibrazzjoni. L-effiċjenza tas-separazzjoni ta' kolonna tinkisebskond ir-relazzjoni li ġejja: Ve,Mx-Ve,(10Mx)cross sectional area of the column≥6,0 cm3cm2 fejn, Ve, Mx il-volum ta' elużjoni għall-polistiren b'piż molekulari Mx Ve,(10.Mx) il-volum ta' elużjoni għall-polistiren b'piż molekulari ta' għaxar darbiet iktar Ir-riżoluzzjoni tas-sistema hija normalment definita kif ġej: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 fejn, Ve1, Ve2 il-volumi ta' elużjoni taż-żewġ standards tal-polistiren fil-quċċata tal-massimu W1, W2 il-quċċata tal-wisat tal-linji ta' bażi M1, M2 il-piżijiet molekulari fil-quċċata tal-massimu (għandu jkun hemm differenza b' fattur ta' 10) Il-valur R għas-sistema tal-kolonni għandu jkun ikbar minn 1.7 (4).

1.6.8. Solventi Is-solventi kollha għandhom ikollhom purità għolja (għat-THF tintuża purità ta' 99,5 %). Id-depożitu tas-solventi (f'atmosfera ta' gass inert, jekk huwa neċessarju) għandu jkun kbir biżżejjed għall-kalibrazzjoni tal-kolonna u għal diversi analiżijiet tal-kampjuni. Il-gass għandu jitneħħa mis-solvent qabel ma jgħaddi għall-kolonna minn ġo pompa.

1.6.9. Kontroll tat-temperatura It-temperatura tal-komponenti kruċjali interni (iċ-ċirku ta' injezzjoni (injection loop), il-kolonni, id-ditekter, u t-tubi) għandha tkun kostanti u konsistenti skond l-għażla tas-solvent.

1.6.10. Ditekter Il-funzjoni tad-ditekter hija li jirreġistra b'mod kwantitattiv il-konċentrazzjoni tal-kampjun li ġie elwat mill-kolonna. Biex jiġi evitat li l-quċċati jitwessgħu, il-volum tal-cuvette taċ-ċellula tad-ditekter għandu jinżamm żgħir kemm jista' jkun. M'għandux ikun akbar minn 10 μl ħlief għal ditekters li jxerrdu d-dawl u għal ditekters tal-viskożità. Normalment tintuża rifrattometrija differenzjali għall-osservazzjoni. Madankollu, jekk meħtieġ mill-proprjetajiet speċifiċi tal-kampjun jew tas-solvent ta' elużjoni, jistgħu jintużaw ditekters oħrajn, eż. UV/VIS, IR, ditekters tal-viskożità, eċċ.

2. DATA U RAPPURTAR

2.

2.1. DATA L-istandard DIN (1) għandu jiġi kkonsultat għall-kriterji ta' valutazzjoni dettaljata kif ukoll għall-kondizzjonijiet għall-ġbir u għall-proċessar ta' DATA. Għal kull kampjun għandhom isiru żewġ esperimenti indipendenti. Għandhom jiġu analizzati individwalment. Mn, Mw, Mw/Mn u Mp għandhom jiġu pprovduti għal kull kejl. Huwa neċessarju li jiġi espliċitament indikat li l-valuri mkejla huma valuri relattivi ekwivalenti għall-piżijiet molekulari ta' l-istandard użat. Wara li jiġu ddeterminati il-volumi ta' ritenzjoni jew il-ħinijiet ta' ritenzjoni (possibbilment irranġati permezz ta' standard intern), valuri log Mp (fejn Mp huwa l-massimu tal-quċċata ta' l-istandard tal-kalibrazzjoni) għandhom jitniżżlu ma' wieħed minn dawk il-kwantitajiet. Mill-inqas żewġ punti ta' kalibrazzjoni huma neċessarji għal kull sett ta' għaxar piżijiet molekulari, u mill-inqas ħames punti ta' kejl huma meħtieġa għall-kurva totali, u dan għandu jkopri l-piż molekulari stmat tal-kampjun. It-tarf baxx tal-kurva tal-kalibrazzjoni tal-piż molekulari huwa definit permezz ta' benżin n-hexyl jew sustanza maħlula mhux polari oħra.xierqa Il-medja tan-numru u l-medja tal-piż molekulari huma ġeneralment iddeterminati permezz ta' proċessar tad-DATA elettronika bbażata fuq il-formuli tas-sezzjoni 1.2. F'każ li tintuża d-diġitazzjoni manwali, ASTM D 3536-91 jista' jiġi kkonsultat (3). Il-kurva tad-distribuzzjoni għandha tiġi pprovduta f'forma ta' tabella jew figura (frekwenza differenzjali jew persentaġġi tas-somom ma' log M). Fir-rappreżentazzjoni grafika, sett wieħed ta' għaxar piżijiet molekulari huwa normalment wiesa 4 cm u l-massimu tal-quċċata għandu jkun twil xi 8 cm. F'każ ta' kurvi tad-distribuzzjoni integrali, d-differenza fil-koordinat bejn 0 u 100 % għandha tkun ta' xi 10 cm.

2.2. IR-RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

2.2.

2.2.1. Sustanza tat-test

informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza tat-test (identità, addittivi, impuritajiet),

deskrizzjoni tat-trattament tal-kampjun, osservazzjonijiet, problemi.

2.2.2. Strumentazzjoni

kontenitur ta' l-eluwent, gass inert, tneħħija ta' gass żejjed ta' l-eluwent, kompożizzjoni ta' l-eluwent, impuritajiet,

pompa, apparat li jnaqqas il-polz, sistema ta' injezzjoni,

kolonni tas-separazzjoni (il-fabbrikant, l-informazzjoni kollha dwar il-karatteristiċi tal-kolonni bħad-daqs tal-pori, it-tip ta' materjal ta' separazzjoni eċċ., in-numru, it-tul u l-ordni tal-kolonni użati),

numru ta' pjanċi teoretiċi tal-kolonni (jew kombinazzjoni), effiċjenza tas-separazzjoni (riżoluzzjoni tas-sistema).

informazzjoni dwar is-simetrija tal-quċċati,

temperatura tal-kolonni, tip ta' kontroll tat-temperatura,

indikatur (prinċipju tal-kejl, tip, cuvette, volum),

flowmeter jekk użat (il-fabbrikant, il-prinċipju tal-kejl),

sistema għar-reġistrazzjoni u proċessar tad-DATA (hardware u software)

2.2.3. Kalibrazzjoni tas-sistema

deskrizzjoni dettaljata tal-metodu użat biex tinbena l-kurva tal-kalibrazzjoni,

informazzjoni dwar il-kriterji ta' kwalità ta' dan il-metodu (eż. koeffiċjent tal-korrelazzjoni, error sum of squares eċċ.),

informazzjoni dwar l-estrapolazzjonijiet, l-assunzjonijiet u l-approssimazzjonijiet li saru waqt il-proċedura esperimentali u l-valutazzjoni u l-proċessar tad-DATA,

il-kejl kollu użat għall-kostruzzjoni tal-kurva ta' kalibrazzjoni għandu jiġi dokumentat f'tabella li tinkludi l-informazzjoni li ġejja għal kull punt ta' kalibrazzjoni:

l-isem tal-kampjun,

il-fabbrikant tal-kampjun,

il-valuri karatteristiċi ta' l-istandards Mp, Mn, Mw u Mw/Mn, kif ipprovduti mill-fabbrikant jew kif miġjuba minn kejl sussegwenti, flimkien ma' dettalji dwar il-metodu ta' determinazzjoni,

il-volum ta' l-injezzjoni u l-konċentrazzjoni ta' l-injezzjoni,

il-valur Mp użat għall-kalibrazzjoni,

il-valur ta' l-elużjoni jew il-ħin taż-żamma kkoreġut imkejjel fl-ogħla punt massimu,

l-Mp kkalkulat fl-ogħla punt massimu,

il-persentaġġ ta' żball ta' l-Mp kkalkulat u l-valur tal-kalibrazzjoni.

2.2.4. Valutazzjoni:

valutazzjoni fuq bażi ta' ħin: il-metodi użati biex tkun żgurata r-riproduzzjoni meħtieġa (metodu ta' korrezzjoni, standard intern, eċċ.),

informazzjoni dwar jekk l-istima ġietx affettwata fuq il-bażi tal-volum ta' l-elużjoni jew il-ħin taż-żamma,

informazzjoni dwar il-limiti tal-valutazzjoni jekk quċċata mhijiex analizzata kompletament,

deskrizzjoni ta' metodi li jneħħu x-xkiel, jekk użati,

proċeduri ta' preparazzjoni u trattament minn qabel tal-kampjun,

il-preżenza ta' partikoli mhux maħlulin, jekk hemm,

il-volum ta' l-injezzjoni (μl) u l-konċentrazzjoni ta' l-injezzjoni (mg/ml),

osservazzjonijiet li jindikaw effetti li jwasslu għal devjazzjonijiet mill-profil GPC ideali,

deskrizzjoni dettaljata tal-modifikazzjonijiet kollha fil-proċeduri ta' l-ittestjar,

dettalji ta' l-iskali ta' żbalji,

kwalunkwe informazzjoni oħra u osservazzjonijiet rilevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati,

3.(1)(2)(3)(4)

REFERENZI DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W. W., Kirkland, J. J., u Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.19. KONTENUT TA' POLIMERI TA' PIŻ MOLEKULARI BAXX

A.19.

1. METODU Dan il-metodu ta' kromatografija bil-permeazzjoni tal-ġel hu ripetizzjoni ta' l-OECD TG 119 (1996). Il-prinċipji fundamentali u iktar informazzjoni teknika jinsabu bħala riferenzi.

1.

1.1. DAĦLA Ladarba l-proprjetajiet tal-polimeri huma daqshekk varji, huwa impossibbli li jiġi deskritt metodu wieħed li jagħti l-kondizzjonijiet preċiżi għas-separazzjoni u l-valutazzjoni li japplikaw għal kull sitwazzjoni u għal kull ħaġa li tiġri waqt is-separazzjoni tal-polimeri. Ta' spiss u b'mod partikolari, sistemi ta' polimeri kumplessi mhumiex soġġetti għall-kromatografija bil-permeazzjoni tal-ġel (GPC). Meta il-GPC mhuwiex prattikabbli, il-piż molekulari jista' jiġi deċiż b'metodi oħrajn (ara l-Anness). F'dawn il-każijiet, għandhom jingħataw id-dettalji u l-ġustifikazzjonijiet kollha għall-użu ta' dak il-metodu. Il-metodu deskritt huwa bbażat fuq l-istandard DIN 55671 (1). F'dan l-istandard DIN tinsab informazzjoni dettaljata fuq kif għandhom jitmexxew dawn l-esperimenti u kif għandha tiġi vvalutata d-DATA. F'każ illi hemm bżonn li l-kondizzjonijiet ta' l-esperiment jinbidlu, dawn il-bidliet iridu jiġu ġġustifikati. Jistgħu jintużaw standards oħrajn jekk ikun hemm ir-referenzi kollha. Il-metodu deskritt juża kampjuni tal-polisterin ta' politixrid magħruf għall-kalibrazzjoni, u jista' jagħti l-każ li jrid jiġi modifikat biex jaqbel ma' ċerti polimeri, eż. polimeri li jinħallu fl-ilma u polimeri long-chain branched.

1.2. DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET Piż molekulari baxx huwa deskritt arbitrarjament bħala piż molekulari ta' inqas minn 1000 dalton. Il-medja tal-piż molekulari tan-numru Mn u l-medja tal-piż molekulari tal-piż Mw huma ddeterminati skond l-ekwazzjonijiet li ġejjin: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1HixMiΣni=1Hi fejn, HI il-livell tas-sinjal tad-ditekter mil-linji bażi għall-volum ta' retenzjoni Vi, Mi Mi huwa t-toqol molekulari tal-frazzjoni tal-polimeri fil-volum ta' retenzjoni Vi, u n huwa n-numru tal-punti tad-DATA. Il-wisa' tad-distribuzzjoni tat-toqol molekulari, li hija miżura tat-tixrid tas-sistema, huwa mogħti bil-proporzjon Mw/Mn.

1.3. SUSTANZI TA' RIFERENZA Ladarba l-GPC huwa metodu relattiv, hemm bżonn ta' kalibrazzjoni. Normalment jintużaw standards tal-polistiren b'distribuzzjoni limitata u mibnija linearment u li għandhom piż molekulari medju Mn u Mw u distribuzzjoni ta' piż molekolari magħrufa. Il-kurva tal-kalibrazzjoni tista' tintuża biss fid-determinazzjoni tal-piż molekulari tal-kampjun mhux magħruf jekk il-kondizzjonijiet għas-separazzjoni tal-kampjun u l-istandards intgħażlu b'mod preċiżament l-istess. Ir-relazzjoni ddeterminata bejn il-piż molekulari u l-volum ta' elużjoni huwa validu biss taħt il-kondizzjonijiet speċifiċi ta' l-esperiment partikolari. Il-kondizzjonijiet fuq kollox jinkludu t-temperatura, s-solvent (jew taħlita tas-solventi), il-kondizzjonijiet tal-kromatografija u l-kolonna tas-separazzjoni jew is-sistemi tal-kolonni. Il-piż molekulari tal-kampjuni ddeterminati b'dan il-mod huma valuri relattivi u huma deskritti bħala piżijiet molekulari ekwivalenti għall-polistiren. Dan ifisser illi skond id-differenzi strutturali u kimiċi bejn il-kampjun u l-istandards, il-piżijiet molekulari jistgħu jiddevjaw mill-valuri assoluti sa grad iktar jew inqas. Jekk jintużaw standards oħrajn, eż. il-glikol tal-polietilin, l-ossidu tal-politin, il-metakrilat tal-polimetil, aċidu poliakriliku, għandha titniżżel ir-raġuni.

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU TA' L-EŻAMINAZZJONI Kemm id-distribuzzjoni tal-piż molekulari tal-kampjun kif ukoll il-piżijiet molekulari medji (Mn, Mw) jistgħu jiġu ddeterminati billi jintuża l-GPC. Il-GPC huwa metodu speċjali ta' kromatografija likwida fejn il-kampjun jiġi separat skond il-valuri idrodinamiċi tal-kostitwenti individwali (2). Is-separazzjoni ssir kif il-kampjun jgħaddi minn ġo kolonna mimlija b'materjal poruż, tipikament ġel organiku. Molekoli żgħar jistgħu jippenetraw il-pori filwaqt li l-molekoli kbar ma jistgħux. Il-passaġġ tal-molekoli kbar huwa, għalhekk, iqsar u għalhekk huma jippenetraw l-ewwel. Il-molekoli ta'daqs medju jippenetraw minn uħud mill-pori u jgħaddu iktar tard. L-iżgħar molekoli, b'raġġ idrodinamiku medju iżgħar mill-pori tal-ġel jistgħu jippenetraw il-pori kollha. Dawn ikun elużi l-aħħar. Idealment, is-separazzjoni hija ddeterminata biss skond id-daqs ta' l-ispeċi tal-molekoli, imma fil-prattika huwa diffiċli li wieħed jevita xi interferenza mill-assorbiment L-ippakkjar mhux ugwali tal-kolonni u volumi mejtin jistgħu jaggravaw is-sitwazzjoni (2). L-osservazzjoni hija effetwata minn, eż. l-indiċi refrattiv jew l-assorbiment tal-UV u tagħti kurva tad-distribuzzjoni sempliċi. Madankollu, biex il-kurva tingħata valuri attwali tal-piż molekulari, huwa neċessarju li l-kolonna tiġi kkalibrata billi polimeri ta' piż molekulari magħruf u, idealment, ta' struttura simili ħafna, jitniżżlu l isfel, eż. standards tal-polistiren varji. B'mod tipiku, għandha tirriżulta kurva Gaussian, xi drabi mgħawwġa minħabba denb fuq in-naħa baxxa tal-piż molekulari, fejn il-fus vertikali jindika l-kwantità, skond il-piż, ta' l-ispeċi tal-piż molekulari varji, u l-fus orizzontali l-piż molekulari rreġistrat. Il-kontenut tal-piż molekulari baxx huwa derivat minn din il-kurva. Il-kalkolu jista' jkun eżatt biss jekk l-ispeċi ta' piż molekulari baxx iġibu ruħhom bl-istess mod fuq bażi ta' piż għall-polimer sħiħ.

1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ Ir-ripetibilità (Devjazzjoni ta' Standard Relattiv: RSD) tal-volum ta' l-elużjoni għandha tkun aħjar minn 0,3 %. Ir-ripetibilità mixtieqa ta' l-analiżi għandha tiġi żgurata permezz ta' korrezzjoni skond standard intern jekk kromatogram huwa evalwat b'mod li huwa dipendenti fuq il-ħin u ma jaqbilx mal-kriterju msemmi hawn fuq (1). Il-politixrid jiddependi fuq il-piżijiet molekulari ta' l-istandards. Fil-każ ta' standards tal-polisterin, valuri tipiċi huma: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp huwa l-piż molekulari ta' l-istandard fil-quċċata tal-massimu)

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' L-EŻAMINAZZJONI

1.6.

1.6.1. Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet standard tal-polistirene L-istandards tal-polisterin huma maħlula permezz ta' taħlit bil-galbu fl-eluwent magħżul. Ir-rakkomandazzjonijiet tal-fabbrikant għandhom jiġu kkunsidrati waqt il-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet. Il-konċentrazzjonijiet ta' l-istandards li ntagħżlu huma dipendenti fuq fatturi varji, eż. il-volum ta' injezzjoni, il-viskożità tas-soluzzjoni u s-sensittività ta' l-indikatur analitiku. Il-volum massimu ta' injezzjoni għandu jiġi adattat għat-tul tal-kolonna, sabiex tiġi evitata t-tagħbija żejda. Il-volumi tipiċi ta' injezzjoni għal separazzjonijiet analitiċi bl-użu ta' GPC b'kolonna ta' 30 cm × 7,8 mm huma normalment bejn 40 u 100 μl. Volumi ogħla huma possibbli, imma m'għandhomx ikunu aktar minn 250 μl. L-aħjar proporzjon ta' volum ta' injezzjoni ma' konċentrazzjoni għandha tiġi ddeterminata qabel il-kalibrazzjoni attwali tal-kolonna.

1.6.2. Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun Bħala prinċipju, l-istess ħtiġijiet japplikaw għall-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tal-kampjun. Il-kampjun hu maħlul f'solvent xieraq, e.g. tetraidrofuran (THF), billi jitħawwad bil-galbu. Taħt l-ebda ċirkustanzi m'għandu jiġi maħlul permezz ta' banju ultrasoniku. Meta meħtieġ, is-soluzzjoni tal-kampjun hija ppurifikata permezz ta' filtru tal-membrana b'daqs tal-pori ta' bejn 0,2 u 2 μm. Il-preżenza ta' partikoli mhux maħlula għandha tiġi rreġistrata fir-rapport finali peress li dawn jistgħu jkunu minħabba speċi ta' piż molekulari għoli. Metodu xieraq għandu jintuża' biex jiġi ddeterminat il-persentaġġ f’piż tal-partikoli mhux maħlula. Is-soluzzjonijiet għandhom jintużaw fi żmien 24 siegħa.

1.6.3. Korrezzjoni għal kontenut ta' impuritajiet u addittivi Korrezzjoni tal-kontenut ta' speċi ta' M < 1000 għall-kontribuzzjoni minn komponenti speċifiċi mhux polimeri preżenti (eż. impuritajiet u/jew addittivi) hija ġeneralment meħtieġa, sakemm il-kontenut imkejjel mhux diġà <1 %. Dan jinkiseb permezz ta' analiżi diretta tas-soluzzjoni polimera jew l-elużjoni GPC. F'każijiet fejn l-elużjoni, wara passaġġ mill-kolonna, hija wisq dilwita għal analiżi ulterjuri, din għandha tiġi kkonċentrata. Jista' jkun hemm il-ħtieġa li l-elużjoni tiġi evaporata san-nixfa u maħlula mill-ġdid. Konċentrazzjoni ta' l-elużjoni għandha tiġi miksuba taħt kondizzjonijiet li jassiguraw li l-ebda bidliet ma jseħħu fl-elużjoni. It-trattament ta' l-elużjoni wara l-pass tal-GPC hu dipendenti fuq il-metodu analitiku użat għad-determinazzjoni kwantitattiva.

1.6.4. Apparat L-apparat GPC jinkludi l-komponenti li ġejjin: Għandu jiġi żgurat li s-sistema GPC hija inerta fir-rigward tas-solventi użati (eż. bl-użu ta' kapillari ta' l-azzar għas-solvent THF).

reservoir tas-solventi,

degasser (fejn hemm bżonn),

pompa,

apparat li jnaqqas l-impuls (fejn hemm bżonn),

sistema ta' injezzjoni,

kolonni tal-kromatografija,

indikatur,

flowmeter (fejn hemm bżonn)

reġistratur-proċessur tad-data,

reċipjent għall-iskart.

1.6.5. L-injezzjoni u s-sistema li twassal s-solventi Volum definit tal-kampjun tas-soluzzjoni jitgħabba fuq il-kolonna bl-użu ta' auto-sampler jew manwalment f'żona definita preċiżament. L-irtirar jew l-għafis tal-plunger tas-siringa b'mod mgħaġġel, jekk isir manwalment, jista' jikkawża bidliet fid-distribuzzjoni tal-piż molekulari osservata. Is-sistema tat-twassil tas-solvent għandha, safejn huwa possibbli, tkun ħielsa mill-impulsi u idealment għandha tinkludi apparat li jnaqqas l-impulsi. Il-flowrate tkun madwar 1 ml/min.

1.6.6. Il-kolonna Skond il-kampjun, il-polimer ikun karatterizzat mill-użu ta' kolonna sempliċi jew minn numru ta' kolonni konnessi f’sekwenza. Għadd ta' materjali porużi tal-kolonni bi proprjetajiet definiti (eż. daqs tal-pori, limiti ta' esklużjoni) huma disponibbli kummerċjalment. L-għażla tal-ġel ta' separazzjoni jew tat-tul tal-kolonna jiddependi fuq il-proprjetajiet tal-kampjun (volumi idrodinamiċi, distribuzzjoni tal-piż molekulari) u l-kondizzjonijiet speċifiċi għas-separazzjoni bħas-solventi, t-temperatura u l-flowrate (1) (2) (3).

1.6.7. Il-pjanċi teoretiċi Il-kolonna jew il-kombinazzjoni tal-kolonni użati għas-separazzjoni għandhom jiġu karatterizzati skond in-numru ta' pjanċi teoretiċi. Dan jinvolvi, f’każ meta t-THF huwa s- solvent eluwent, it-tagħbija ta' soluzzjoni ta' etile benżin jew ta' sustanza maħlula mhux b'polarità xierqa fuq kolonna ta' tul magħruf. In-numru ta' pjanċi teoretiċi huwa mogħti skond l-ekwazzjoni li ġejja: N=5,54VeW1/22 or N=16VeW2 fejn, N in-numru tal-pjanċi teoretiċi Ve il-volum ta' elużjoni fil-quċċata tal-massimu W il-quċċata tal-wisa' tal-linja bażi W1/2 il-quċċata tal-wisa' fin-nofs ta' l-għoli

1.6.8. L-effiċjenza tas-separazzjoni Flimkien ma' l-ammont tal-pjanċi teoretiċi, li hija kwantità li tistabbilixxi il-bandwidth, l-effiċjenza tas-separazzjoni għandha sehem ukoll, u din hija stabbilita skond kemm hi wieqfa l-kurva tal-kalibrazzjoni. L-effiċjenza tas-separazzjoni ta' kolonna tinkisebskond ir-relazzjoni li ġejja: Ve,Mx-Ve,(10Mx)cross sectional area of the column≥6,0cm3cm2 fejn, Ve, Mx il-volum ta' elużjoni għall-polistiren b'piż molekulari Mx Ve,(10.Mx) il-volum ta' elużjoni għall-polistiren b'piż molekulari ta' għaxar darbiet iktar Ir-riżoluzzjoni tas-sistema hija normalment definita kif ġej: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 fejn, Ve1, Ve2 il-volumi ta' elużjoni taż-żewġ standards tal-polistiren fil-quċċata tal-massimu W1, W2 il-quċċata tal-wisat tal-linji ta' bażi M1, M2 il-piżijiet molekulari fil-quċċata tal-massimu (għandu jkun hemm differenza b' fattur ta' 10) Il-valur R għas-sistema tal-kolonni għandu jkun ikbar minn 1,7 (4).

1.6.9. Solventi Is-solventi kollha għandhom ikollhom purità għolja (għat-THF tintuża purità ta' 99,5 %). Id-depożitu tas-solventi (f'atmosfera ta' gass inert, jekk huwa neċessarju) għandu jkun kbir biżżejjed għall-kalibrazzjoni tal-kolonna u għal diversi analiżijiet tal-kampjuni. Il-gass għandu jitneħħa mis-solvent qabel ma jgħaddi għall-kolonna minn ġo pompa.

1.6.10. Kontroll tat-temperatura It-temperatura tal-komponenti kruċjali interni (iċ-ċirku ta' injezzjoni (injection loop), il-kolonni, id-ditekter, u t-tubi) għandha tkun kostanti u konsistenti skond l-għażla tas-solvent.

1.6.11. Ditekter Il-funzjoni tad-ditekter hija li jirreġistra b'mod kwantitattiv il-konċentrazzjoni tal-kampjun li ġie elwat mill-kolonna. Biex jiġi evitat li l-quċċati jitwessgħu, il-volum tal-cuvette taċ-ċellula tad-ditekter għandu jinżamm żgħir kemm jista' jkun. M'għandux ikun akbar minn 10 μl ħlief għal ditekters li jxerrdu d-dawl u għal ditekters tal-viskożità. Normalment tintuża rifrattometrija differenzjali għall-osservazzjoni. Madankollu, jekk meħtieġ mill-proprjetajiet speċifiċi tal-kampjun jew tas-solvent ta' elużjoni, jistgħu jintużaw ditekters oħrajn, eż. UV/VIS, IR, ditekters tal-viskożità, eċċ.

2. DATA U RAPPURTAR

2.

2.1. DATA L-istandard DIN (1) għandu jiġi kkonsultat għall-kriterji ta' valutazzjoni dettaljata kif ukoll għall-kondizzjonijiet għall-ġbir u għall-proċessar ta' DATA. Għal kull kampjun għandhom isiru żewġ esperimenti indipendenti. Għandhom jiġu analizzati individwalment. Fil-każijietjiet kollha hu essenjzali li tiġi ddeterminata wkoll DATA minn blanks, ittrattati taħt l-istess kondizzjonijiet tal-kampjun. Huwa meħtieġ li jiġi indikat b'mod espliċitu li l-valuri mkejla huma valuri relattivi ekwivalenti għall-piż molekulari ta' l-istandard użat. Wara determinazzjoni tal-volumi taż-żamma jew tal-ħinijiet taż-żamma (possibilment ikkoreġuti bl-użu ta' standard intern), valuri log Mp (Mp meqjus bħala l-ogħla quċċata ta' l-istandard tal-kalibrazzjoni) jitniżżlu ħdejn waħda minn dawn il-kwantitajiet. Mill-inqas żewġ punti ta' kalibrazzjoni huma meħtieġa għal kull sett ta' għaxaa piżijiet molekulari, u mill-inqas ħames punti ta' kejl huma meħtieġa għall-kurva totali, li għandha tkopri l-piż molekulari stmat għall-kampjun. Il-punt ta' tmiem baxx tal-piż molekulari tal-kurva ta' kalibrazzjoni huwa mfisser minn n-hexyl benżin jew minn soluzzjonimaħlula mhux polari oħra xierqa. Il-porzjon tal-kurva li jikkorrispondi għall-piż molekulari taħt 1000 huwa ddeterminat u kkoreġut kif meħtieġ għall-impuritajiet u l-addittivi. Il-kurvi ta' l-elużjoni huma ġeneralment stmati permezz ta' l-ipproċessar elettroniku tad-DATA. Fil-każ li tintuża diġitazzjoni manwali, ASTM D 3536-91 jista' jiġi kkonsultat (3). Jekk kwalunkwe polimer li ma jinħallx jinżamm fil-kolonna, il-piż molekulari tiegħu x'aktarx li jkun ogħla minn dak tal-frazzjoni li tinħall, u jekk ma jiġix ikkunsidrat jista' jirriżulta fi stima eċċessiva tal-kontenut tal-piż molekulari baxx. Gwida għall-korrezzjoni tal-kontenut tal-piż molekulari baxx għall-polimer li ma jinħallx hija prevista fl-Anness. Il-kurva tad-distribuzzjoni għandha tiġi pprovduta f'forma ta' tabella jew figura (frekwenza differenzjali jew persentaġġi tas-somom ma' log M). Fir-rappreżentazzjoni grafika, sett wieħed ta' għaxar piżijiet molekulari huwa normalment wiesa 4 cm u l-massimu tal-quċċata għandu jkun twil xi 8 cm. F'każ ta' kurvi tad-distribuzzjoni integrali, d-differenza fil-koordinat bejn 0 u 100 % għandha tkun ta' xi 10 cm.

2.2. IR-RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

2.2.

2.2.1. Sustanza tat-test

informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza tat-test (identità, addittivi, impuritajiet),

deskrizzjoni tat-trattament tal-kampjun, osservazzjonijiet, problemi.

2.2.2. Strumentazzjoni

kontenitur ta' l-eluwent, gass inert, tneħħija ta' gass żejjed ta' l-eluwent, kompożizzjoni ta' l-eluwent, impuritajiet,

pompa, apparat li jnaqqas il-polz, sistema ta' injezzjoni,

numru ta' pjanċi teoretiċi tal-kolonni (jew kombinazzjoni), effiċjenza tas-separazzjoni (riżoluzzjoni tas-sistema).

informazzjoni dwar is-simetrija tal-quċċati,

temperatura tal-kolonni, tip ta' kontroll tat-temperatura,

indikatur (prinċipju tal-kejl, tip, cuvette, volum),

flowmeter jekk użat (il-fabbrikant, il-prinċipju tal-kejl),

sistema għar-reġistrazzjoni u proċessar tad-DATA (hardware u software)

2.2.3. Kalibrazzjoni tas-sistema

deskrizzjoni dettaljata tal-metodu użat biex tinbena l-kurva tal-kalibrazzjoni,

informazzjoni dwar il-kriterji ta' kwalità ta' dan il-metodu (eż. koeffiċjent tal-korrelazzjoni, error sum of squares eċċ.),

informazzjoni dwar l-estrapolazzjonijiet, l-assunzjonijiet u l-approssimazzjonijiet li saru waqt il-proċedura esperimentali u l-valutazzjoni u l-proċessar tad-DATA,

il-kejl kollu użat għall-kostruzzjoni tal-kurva ta' kalibrazzjoni għandu jiġi dokumentat f'tabella li tinkludi l-informazzjoni li ġejja għal kull punt ta' kalibrazzjoni:

l-isem tal-kampjun,

il-fabbrikant tal-kampjun,

il-valuri karatteristiċi ta' l-istandards Mp, Mn, Mw u Mw/Mn, kif ipprovduti mill-fabbrikant jew kif miġjuba minn kejl sussegwenti, flimkien ma' dettalji dwar il-metodu ta' determinazzjoni,

il-volum ta' l-injezzjoni u l-konċentrazzjoni ta' l-injezzjoni,

il-valur Mp użat għall-kalibrazzjoni,

il-valur ta' l-elużjoni jew il-ħin taż-żamma kkoreġut imkejjel fl-ogħla punt massimu,

l-Mp kkalkulat fl-ogħla punt massimu,

il-persentaġġ ta' żball ta' l-Mp kkalkulat u l-valur tal-kalibrazzjoni.

2.2.4. Informazzjoni dwar il-kontenut polimeru ta' piż molekulari baxx

deskrizzjoni tal-metodi użati fl-analiżi u l-mod li bih twettqu l-esperimenti;

informazzjoni dwar il-persentaġġ ta' kontenut ta' speċi ta' piż molekulari baxx (w/w) relatat mal-kampjun totali,

informazzjoni dwar impuritajiet, addittivi u speċi oħra mhux polimeri f'persentaġġ f’piż relatat mal-kampjun totali.

2.2.5. Valutazzjoni:

valutazzjoni fuq bażi ta' ħin: il-metodi użati biex tkun żgurata r-riproduzzjoni meħtieġa (metodu ta' korrezzjoni, standard intern, eċċ.),

informazzjoni dwar jekk l-istima ġietx affettwata fuq il-bażi tal-volum ta' l-elużjoni jew il-ħin taż-żamma,

informazzjoni dwar il-limiti tal-valutazzjoni jekk quċċata mhijiex analizzata kompletament,

deskrizzjoni ta' metodi li jneħħu x-xkiel, jekk użati,

proċeduri ta' preparazzjoni u trattament minn qabel tal-kampjun,

il-preżenza ta' partikoli mhux maħlulin, jekk hemm,

il-volum ta' l-injezzjoni (μl) u l-konċentrazzjoni ta' l-injezzjoni (mg/ml),

osservazzjonijiet li jindikaw effetti li jwasslu għal devjazzjonijiet mill-profil GPC ideali,

deskrizzjoni dettaljata tal-modifikazzjonijiet kollha fil-proċeduri ta' l-ittestjar,

dettalji ta' l-iskali ta' żbalji,

kwalunkwe informazzjoni oħra u osservazzjonijiet rilevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati,

3.(1)(2)(3)(4)

REFERENZI DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.20. L-IMĠIBA TAS-SOLUZZJONI/TA' L-ESTRAZZJONI TA' POLIMERI FL-ILMA

A.20.

1. METODU Il-metodu deskritt huwa repetizzjoni tal-verżjoni reveduta ta' l-OECD TG 120 (1997). Aktar informazzjoni teknika tingħata bħala referenza (1).

1.

1.1. DAĦLA Għal ċerti polimeri, bħall-polimeri ta' emulsjoni, xogħol ta' preparazzjoni inizjali jista' jkun meħtieġ qabel ma jista' jintuża' l-metodu stabbilit minn hawn 'il quddiem. Il-metodu mhuwiex applikabbli għal polimeri likwidi u għal polimeri li jirreaġixxu ma' l-ilma taħt il-kondizzjonijiet ta' l-ittestjar. Meta l-metodu mhuwiex prattiku jew mhuwiex possibbli, l-imġiba tas-soluzzjoni/ta’ l-estrazzjoni tista' tiġi investigata permezz ta' metodi oħrajn. F'każijiet bħal dawn, dettalji sħaħ u ġustifikazzjoni sħiħa għandhom jingħataw għall-metodu użat.

1.2. SUSTANZI TA' REFERENZA Xejn.

1.3. IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR L-imġiba tas-soluzzjoni/ta’ l-estrazzjoni ta' polimeri f'sustanza ta' l-ilma hija ddeterminata bl-użu tal-metodu tal-flixkun (ara A.6 is-solubilità fl-ilma, metodu tal-flixkun) bil-modifikazzjonijiet deskritti hawn taħt.

1.4. KRITERJI TA' KWALITÀ Xejn.

1.5. DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' TTESTJAR

1.5.

1.5.1. Apparat L-apparat li ġej hu meħtieġ għall-metodu:

mezz ta' tifrik, eż. mola għall-produzzjoni ta' partikoli ta' daqs magħruf,

apparat għat-tħawwid bil-possibiltà ta' kontroll tat-temperatura,

sistema ta' l-iffiltrar tal-membrana,

apparat analitiku xieraq,

għarbiela standardizzati.

1.5.2. Preparazzjoni tal-kampjun Kampjun rappreżentattiv għandu l-ewwel jitnaqqas sa daqs ta' partikolu bejn 0,125 u 0,25 mm bl-użu ta' għarbiela xierqa. Jista' jkun meħtieġ tkessiħ għall-istabbilità tal-kampjun jew għall-proċess tad-tħin. Materjali ta' natura li tixbah il-lastiku jistgħu jitfarrku fit-temperatura tan-nitroġenu likwidu (1). Jekk il-frazzjon tad-daqs tal-partikolu meħtieġ ma jistax jinkiseb, għandha tittieħed azzjoni biex kemm jista' jkun jitnaqqas id-daqs tal-partikoli u r-riżultat jiġi rrappurtat. Fir-rapport, huwa meħtieġ li jiġi indikat il-mod li bih il-kampjun imfarrak kien maħżun qabel it-test.

1.5.3. Proċedura Tliet kampjuni ta' 10g tas-sustanza tat-test jintiżnu f'kull wieħed minn tliet kontenituri li għandhom stopper tal-ħġieġ u jiżdiedu 1000 ml ta' ilma f’kull kontenitur. Jekk it-trattament ta' ammont ta' polimeru ta' 10 g jidher li mhuwiex prattikabbli, l-ogħla ammont li jmiss li jista' jiġi ttrattat għandu jintuża' u l-volum ta' ilma jiġi aġġustat skond dan. Stoppers jitqiegħdu fuq il-kontenituri u jiġu ssikkati u mbgħad jitħawdu f'temperatura ta' 20 oC. Għandu jintuża apparat ta' ċaqliq jew tħawwid li kapaċi jaħdem f'temperatura kostanti. Wara perjodu ta' 24 siegħa, il-kontenut ta' kull kontenitur huwa ċċentrifugat u ffiltrat u l-konċentrazzjoni ta' polimer fil-fażi ċara ta' l-ilma hija ddeterminata permezz ta' metodu analitiku xieraq. Jekk metodi analitiċi xierqa għall-fażi ta' l-ilma mhumiex disponibbli, is-solubilità/l-estrattività totali tista' tiġi stmata mill-piż niexef tar-residwu tal-filtru jew tal-preċipitat iċċentrifugat. Is-soltu ikun hemm il-ħtieġa li jkun hemm differenza kwantitattiva bejn l-impuritajiet u l-addittivi min-naħa l-waħda u l-ispeċi ta' piż molekulari baxx min-naħa l-oħra. Fil-każ ta' determinazzjoni gravimetrika, huwa importanti wkoll li titwettaq prova blank mingħajr sustanza għat-test sabiex jinkiseb għarfien dwar residwi li ġejjin mill-proċedura esperimentali. L-imġiba tas-soluzzjoni/ta’ l-estrazzjoni ta' polimeri fl-ilma f’temperatura ta' 37 oC f’pH 2 u pH 9 tista' tiġi ddeterminata bl-istess mod kif deskritt fit-twettiq ta' l-esperiment f‘temperatura ta' 20 oC. Il-valuri tal-pH jistgħu jinkisbu biż-żieda jew sustanzi ta' protezzjoni xierqa jew ta' aċidi jew ta' bażi xierqa bħal aċidu idrokloriku, aċidu aċetiku, sodju ta' grad analitiku jew idrossidu tal-potassju jew NH3. Skond il-metodu ta' analiżi użat, għandhom jitwettqu test wieħed jew żewġ testijiet. Meta metodi speċifiċi biżżejjed ikunu disponibbli għall-analiżi diretta tal-fażi ta' l-ilma għall-komponent tal-polimer, test wieħed kif deskritt hawn fuq għandu jkun biżżejjed. Madankollu, meta dawn il-metodi mhumiex disponibbli u d-determinazzjoni ta' l-imġiba tas-soluzzjoni/ta’ l-estrazzjoni tal-polimer hija limitata għall-analiżi indiretta billi jiġi iddeterminat biss il-kontenut totali ta' karbonju organiku (TOC) ta' l-estratt ta' l-ilma, test addizzjonali għandu jitwettaq. Dan it-test addizzjonali għandu wkoll jsir tliet darbiet, bl-użu ta' kampjuni ta' polimeri li huma 10 darbiet iżgħar u bl-istess ammonti ta' ilma użati fl-ewwel test.

1.5.4. Analiżi

1.5.4.

1.5.4.1. Test imwettaq b'daqs wieħed ta' kampjun Jista' jkun hemm metodi disposnibbli għall-analiżi diretta ta' komponenti polimeri fil-fażi ta' l-ilma. Inkella, analiżi indiretta ta' komponenti polimeri maħlula/estratti, permezz tad-determinazzjoni tal-kontenut totali ta' partijiet li jinħallu u l-korrezzjoni għal komponenti polimeri mhux speċifiċi, tista' wkoll tiġi kkunsidrata. Analiżi tal-fażi ta' l-ilma għall-ispeċi polimerika totali hija possibbli: jew permezz ta' metodu sensittiv biżżejjed, eż. jew permezz ta' evaporazzjoni b'vakwu san-nixfa ta' l-estratt ta' l-ilma u analiżi spettroskopika (IR, UV, eċċ.) jew AAS/ICP tar-residwu. Jekk analiżi tal-fażi ta' l-ilma fiha nnifisha mhijiex prattikabbli, l-estratt ta' l-ilma għandu jiġi estratt b'solvent organiku li ma jistax jitħallat ma' l-ilma, eż. idrokarbonju klorinat. Is-solvent huwa mbagħad evaporat u r-residwu huwa analizzat kif imsemmi hawn fuq għall-kontenut polimeru notifikat. Kwalunkwe komponenti f'dan ir-residwu li huma identifikati bħala impuritajiet jew addittivi għandhom jitnaqqsu għall-iskop tad-determinazzjoni tal-grad ta' soluzzjoni/ta l-estrazzjoni tal-polimer nnifsu. Meta kwantitajiet relattivament kbar ta' dawn il-materjali huma preżenti, jista' jkun meħtieġ li r-residwu jiġi soġġett għal, eż. analiżi HPLC jew GC biex jiġu differenzjati l-impuritajiet preżenti li ġejjin mill-ispeċi monomeri jew li ġejjin mill-monomeri sabiex il-kontenut veru ta' dawn ta' l-aħħar jista' jiġi ddeterminat. F'xi każijiet, jista' jkun suffiċjenti li ssir evaporazzjoni sempliċi tas-solvent organiku san-nixfa u li jintiżen ir-residwu niexef.

TOC li tuża diġestjoni ta' persulfat jew dikromata biex tagħti CO2 segwita bi stima permezz ta' IR jew ta' analiżi kimika,

spettrometrija atomika ta' l-assorbiment (AAS) jew l-emissjoni tal-plasma tagħha magħquda b'mod induttiv (ICP) ekwivalenti għal silikone jew polimer li jkun fih il-metall,

assorbiment ta' l-UV jew spettrofluworimetrija għall-polimeri aryl,

LC-MS għal kampjuni ta' piż molekulari baxx.

1.5.4.2. Test imwettaq b'żewġ daqsijiet differenti ta' kampjun L-estratti ta' l-ilma kollha huma analizzati għat-TOC. Determinazzjoni gravimetrika titwettaq fuq il-parti mhux maħlula/mhux estratta tal-kampjun. Jekk, wara ċ-ċentrifugazzjoni jew l-iffiltrar tal-kontenut ta' kull kontenitur, residwi polimeri jibqgħu mwahħlin mal-ħajt tal-kontenitur, il-kontenitur għandu jitlaħlaħ bil-filtrat sa kemm il-kontenitur jitnaddaf mir-residwi viżibbli kollha. Wara dan, il-filtrat huwa ċċentrifugat jew iffiltrat għal darb'oħra. Ir-residwi li jibqgħu fuq il-filtru jew fit-tubu taċ-ċentrifugu jitnixxfu f’temperatura ta' 40 oC taħt vakwu u jintiżnu. It-tnixxif jitkompla sakemm jintlaħaq piż kostanti.

2. DATA

2.

2.1. TEST IMWETTAQ B'DAQS WIEĦED TAL-KAMPJUN Ir-riżultati individwali għal kull wieħed mit-tliet fliexken u l-valuri medji għandhom jingħataw u għandhom ikunu espressi f'unitajiet ta' piż għal kull volum tas-soluzzjoni (tipikament mg/l) jew piż għal kull piż ta' kampjun tal-polimeru (tipikament mg/g). Barra dan, it-telf ta' piż tal-kampjun (ikkalkulat bħala l-piż tas-sustanza maħlula mnaqqsa mill-piż tal-kampjun inizjali) għandu wkoll jingħata. Id-devjazzjonijiet relattivi standard (RSD) għandhom jiġu kkalkulati. Figuri individwali għandhom jingħataw għas-sustanza totali (polimer + addittivi essenzjali, eċċ.) u għall-polimer biss (jiġifieri wara t-tnaqqis tal-kontribuzzjoni minn dawn l-addittivi).

2.2. TEST IMWETTAQ B'ŻEWĠ DAQSIJIET DIFFERENTI TAL-KAMPJUN Il-valuri TOC individwali ta' l-estratt ta' l-ilma taż-żewġ esperimenti ripetuti għal tliet darbiet u l-valur medju għal kull esperiment għandu jingħata espress bħala unità ta' piż għal kull volum ta' soluzzjoni (tipikament mgC/1), kif ukoll f'unità ta' piż għal kull piż tal-kampjun inizjali (tipikament mgC/g). Jekk m'hemm l-ebda differenza bejn ir-riżultati fil-proporzjonijiet għolja u baxxi tal-kampjun/ilma, dan jista' jindika li l-komponenti li setgħu jiġu estratti kienu fil-fatt estratti kollha. F'dan il-każ, analiżi diretta m'għandhiex normalment tkun meħtieġa. Il-piżijiet individwali tar-residwi għandhom jingħataw u jiġu espressi f'persentaġġ tal-piżijiet inizjali tal-kampjuni. Il-medji għandhom jiġu kkalkulati għal kull esperiment. Id-differenzi bejn 100 u l-persentaġġi li nstabu jirrappreżentaw il-persentaġġi ta' materjal li jinħall u li jista' jiġi estratt fil-kampjun oriġinali.

3. RAPPURTAR

3.

3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

3.1.

3.1.1. Is-sustanza għat-test

informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza għat-test (identità, addittivi, impuritajiet, kontenut ta' speċi ta' piż molekulari baxx).

3.1.2. Kondizzjonijiet esperimentali

deskrizzjoni tal-proċeduri użati u kondizzjonijiet esperimentali,

deskrizzjoni tal-metodi analitiċi u ta' osservazzjoni.

3.1.3. Riżultati

riżultati tal-kapaċità li jinħall/jiġi estratt f’mg/l; valuri medji u individwali għat-testijiet ta' l-estrazzjoni fis-soluzzjonijiet varji, imqassmin f'kontenut polimeru u impuritajiet, addittivi, eċċ.,

riżultati tal-kapaċità li jinħall/jiġi estratt f’mg/g ta' polimer,

valuri TOC ta' estratti ta' l-ilma, piż tas-sustanza li tinħall u l-persentaġġi kkalkulati, jekk imkejlin,

il-pH ta' kull kampjun,

informazzjoni dwar il-valuri vojta,

fejn meħtieġ, referenzi għall-instabilità kimika tas-sustanza tat-test, kemm matul il-proċess ta' l-ittestjar kif ukoll il-proċess analitiku,

l-informazzjoni kollha li hija importanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.

4.(1) REFERENZI DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

A.21. PROPRJETAJIET OSSIDIZZANTI (LIKWIDI)

A.21.

1. METODU

1.

1.1 INTRODUZZJONI Dan il-metodu tat-test huwa ddisinjat sabiex ikejjel il-potenzjal ta' sustanza likwida li żżid ir-rata tal-ħruq jew l-intensità tal-ħruq ta' sustanza kombustibbli, jew li tifforma taħlita ma' sustanza kombustibbli li tieħu n-nar b'mod spontanju, meta it-tnejn ikunu kompletament imħallta. Dan huwa bbażat fuq it-test tan-NU dwar likwidi ossidizzanti (1) u huwa ekwivalenti għalih. B'danakollu, minħabba li dan il-metodu A.21 huwa primarjament iddisinjat biex jissodisfa l-ħtiġijiet tar-Regolament 1907/2006, huwa meħtieg il-paragun ma' sustanza ta' referenza waħda. It-testijiet u l-paragun ma' sustanzi addizzjonali ta' referenza jistgħu jkunu meħtieġa meta jkun mistenni li r-riżultati tat-test se jintużaw għal skopijiet oħrajn. Dan it-test mhux bil-fors li jitwettaq meta l-eżami tal-formula struttrali jistabbilixxi lil hinn minn kull dubbju raġjonevoli li s-sustanza ma jistax ikollha reazzjoni eżotermika ma' materjal kombustibbli. Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminarja dwar il-potenzjal tal-proprjetajiet esplożivi tas-sustanza qabel ma jitwettaq it-test. Dan it-test mhux applikabbli għal solidi, gassijiet, sustanzi li huma ferm fjammabbli jew splussivi, jew perossidi organiċi. Dan it-test jista' ma jsirx meta r-riżultati tas-sustanza għat-test fit-test tan-NU għal likwidi ossidanti (1) ikunu diġà disponibbli.

1.2 DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET Iż-żieda fil-ħin tal-pressjoni medja hija l-medja tal-ħinijiet imkejla għal taħlita li tkun għat-test sabiex tipproduċi żieda fil-pressjoni minn 690 kPa sa 2070 kPa aktar minn dik atmosferika.

1.3 SUSTANZA TA' REFERENZA 65 % (w/w) aċidu nitriku fl-ilma (grad analitiku) huwa meħtieġ bħala sustanza ta' referenza. L-aħjar, jekk l-esperiment jipprevedi li r-riżultati ta' dan it-test jistgħu eventwalment ikunu użati għal skopijiet oħrajn, l-ittestjar ta' sustanzi ta' referenza addizzjonali jista' jkun xieraq ukoll.

1.4 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Il-likwidu għat-test jitħawwad fi proporzjon ta' 1: 1, bil-piż, ma' ċellulożi fibruża u jiġi introdott f’reċipjent ta' pressjoni. Jekk waqt it-taħlit jew waqt il-mili jaqbad b'mod spontanju, l-ebda test ieħor ma jkun meħtieġ. Jekk ma jaqbadx b'mod spontanju it-test kollu għandu jitwettaq. It-taħlita tisaħħan f'reċipjent ta' pressjoni u l-ħin medju jkun irreġistrat għall-pressjoni li titla’ minn 690 kPa sa 2070 kPa aktar mill-pressjoni atmosferika. Dan jitqabbel maż-żieda fil ħin tal-pressjoni medja għat-taħlita 1: 1 tas-sustanza(i) ta' referenza u ċ-ċellulożi.

1.5 KRITERJA TA' KWALITÁ F'serje ta' ħames provi fuq sustanza waħda l-ebda riżultat m'għandu jiddiferixxi b'aktar minn 30 % mill-medja aritmetika. Ir-riżultati li jiddiferixxu b'aktar minn 30 % minn dik il-medja għandhom jitwarrbu, il-proċedura tat-taħlit jew tal-mili tittejjeb u t-test jiġi ripetut.

1.6 DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.6

1.6.1 Preparazzjoni

1.6.1

1.6.1.1 Sustanza kombustibbli Sustanza xotta, fibruża, biċ-ċellulożi b'fibra b'tul ta' bejn 50 u 250 μm u dijametru medju ta' 25 μm, tintuża bħala l-materjal kombustibbli. Din titnixxef għal piż kostanti f'saff ta' mhux aktar minn 25 mm ħxuna f’105 oC għal 4 sigħat u tinżamm f'dessikatur, bid-dessikant, sakemm tibred u tkun meħtieġa għall-użu. Il-kontenut ta' l-ilma taċ-ċellulożi xotta għandu jkun anqas minn 0,5 % f’piż xott. Jekk meħtieġ, il-ħin tat-tnixxif għandu jittawwal sabiex jintlaħaq dan il-livell. L-istess lott ta' ċellulożi għandu jintuża matul it-test kollu.

1.6.1.2 Apparat

1.6.1.2

1.6.1.2.1 Reċipjent ta' pressjoni Reċipjent ta‘ pressjoni huwa meħtieġ. Ir-reċipjent jikkonsisti minn reċipjent ċilindriku ta' pressjoni ta' l-azzar 89 mm tul u 60 mm dijametru estern (ara l-figura 1). Żewġ pjanċi huma msawwra b'magna fuq in-naħat opposti (il-cross section tar-reċipjent b'hekk tonqos għal 50 mm) sabiex ikun iffaċilitat it-twaħħil tal-plagg li jqabbad u tat-tapp tal-vent. Ir-reċipjent, b'ċirkonfernza interna ta' 20 mm u ribattut f'kull tarf għall-fond ta' 19 mm u b'kamin li jaċċetta 1” British Standard Pipe (BSP) jew l-ekwivalenti metriku. It-take-off tal-pressjoni, fl-għamla ta' driegħ laterali, tiġi invitata fuq il-wiċċ tal-kurva tar-reċipjent ta' pressjoni, 35 mm minn tarf wieħed u 90o mill-pjanċi msawwra b'magna. Il-plagg għal dan jitħaffer għal fond ta' 12 mm u jingħata l-kamin sabiex jaċċetta 1/2” BSP (jew metriku ekwivalenti) fit-tarf l-ieħor tad-driegħ. Jekk meħtieġ, siġill inert jitwaħħal sabiex jassigura siġill li ma jgħaddix gass minnu. Id-driegħ tal-ġenb jestendi għall-55 mm lil hinn mil-qafas tar-reċipjent ta' pressjoni u jkollu ħofra interna ta' 6 mm. It-tarf tad-driegħ tal-ġenb ikun ribattut u jkollu kamin sabiex jaċċetta transducer tal-pressjoni tat-tip bid-dijaframma. Kwalunkwe apparat li jkejjel il-pressjoni jista' jintuża basta dan ma jkunx effettwat minn gassijiet sħan jew minn dikompożizzjoni ta' prodotti u jkun kapaċi jirrispondi għal rati ta' żieda fil-pressjoni ta' 690-2070 kPa f'mhux aktar minn 5ms. It-tarf l-aktar 'il bogħod mid-driegħ tal-ġenb tar-reċipjent ta‘ pressjoni jingħalaq bi plagg li jqabbad u li jkun mgħammar b'żewg elettrodi, waħda insulata minn ġewwa, u l-oħra mwaħħla ma' l-earth, mal-plagg taċ-ċilindru. It-tarf l-ieħor tar-reċipjent ta‘ pressjoni jingħaluq b'disk li tinfaqa' (pressjoni tat-tifqigħ ta' madwar 2200 kPa) miżmuma fil-post b'plagg li jżomm li jkollu ħofra ta' 20 mm. Jekk meħtieġ, siġill inert jintuża mal-plagg li jqabbad sabiex jiżgura rabta tajba li ma jgħaddix gass minnha. Stend ta' frid (il-figura 2) iservi sabiex iżomm l-immuntar fil-pożizzjoni t-tajba matul l-użu. Dan normalment ikun jinkludi pjanċa ta' l-azzar artab b'kejl ta' 235 mm × 184 mm × 6 mm u 185 mm tul b'sezzjoni kwadra mħaffra (S.H.S.) 70 mm × 70 mm × 4 mm. Sezzjoni tkun maqtugħa minn kull wieħed mill-ġnub opposti fit-tarf ta' l-S.H.S. hekk li tirriżulta struttura b'żewġ saqajn bil-ġenb ċatt li fuqha tistrieħ box section intatta b'tul ta' 86 mm. It-truf ta' dawn il-ġnub ċatti huma maqtugħa għal angolu ta' 60o mal-lat orizzontali u iwweldjati mal-pjanċa tal-qiegħ. Qasma bil-kejl ta' 22 mm wisa' x 46 mm fond tinqata’ b'mod mekkaniku fuq naħa waħda fit-tarf ta' fuq tas-sezzjoni tal-qiegħ hekk li l-immuntar tar-reċipjent ta' pressjoni jitniżżel, it-tarf tal-plagg li jqabbad jiddaħħal l-ewwel, fil-box section ta' l-irfid tas-sezzjoni, bid-driegħ tal-ġenb akkomodat f'dik il-qasma. Biċċa azzar 30 mm wisa' u 6 mm ħxuna tkun iwweldjata mal-wiċċ intern l-aktar baxx tas-sezzjoni tal-box section sabiex taġixxa bħala spacer. Żewġ skorfini butterfly, bil-kamin fuq il-wiċċ oppost, iservu sabiex iżommu r-reċipjent ta' pressjoni f'pożizzjoni soda. Żewġ strippi 12 mm wiesa' magħmulin minn azzar ta' 6 mm ħxuna, iwweldjati mal-biċċiet tal-ġenb li joħorġu mill-bażi tal-box section, jirfdu r-reċipjent tal-pressjoni minn taħt.

1.6.1.2.2 Sistema li tagħti n-nar Is-sistema li tagħti n-nar tikkonsisti minn wajer ta' Ni/Cr twil 25 cm b'dijametru ta' 0,6 mm u b’reżistenza ta' 3,85 ohm/m. Il-wajer jinbaram, bl-użu ta' virga b'dijametru ta' 5 mm, f'għamla ta' romblu u jintrabat ma' l-elettrodi tal-plagg li jqabbad. Ir-romblu għandu jkollu waħda mill-konfigurazzjonijiet murija fil-figura 3. Id-distanza bejn il-qiegħ tar-reċipjent u l-parti t'isfel tar-romblu li jqabbad għandha tkun 20 mm. Jekk l-elettrodi ma jkunux aġġustabbli, it-trufijiet tal-wajer li jqabbad bejn ir-romblu u l-qiegħ tar-reċipjent għandhom ikunu insulati b'kisja taċ-ċeramika. Il-fil jissaħħan b'kurrent kostanti ta' l-elettriku li jista' jforni mill-anqas 10 A.

1.6.2 It-twettiq tat-test L-apparat, immuntat kollu kemm hu bit-transducer tal-pressjoni u s-sistema tas-sħana imma mingħajr il-plattina li tinfaqa', huwa mirfud bit-tarf tal-plagg li jqabbad fin-naħa t'isfel. 2,5 g mill-likwidu tat-test jitħallat ma' 2,5 g taċ-ċelluloża mnixxfa f'beaker tal-ħġieġ bl-użu ta' virga tal-ħġieġ għat-tħawwid. Bħala prekawzjoni kontra l-periklu, it-tħawwid għandu jitwettaq wara tarka tas-sikurezza bejn l-operatur u t-taħlita. Jekk it-taħlita taqbad matul it-tħawwid jew waqt il-mili, il-kumplament tat-test mhux meħtieġ. It-taħlita tiżdied, fi porzjonijiet żgħar u bit-taptip, fir-reċipjent tal-pressjoni waqt li jkun żgurat li t-taħlita tkun ippakkjata madwar il-bobina li tqabbad u li tkun f'kuntatt tajjeb magħha. Huwa importanti li l-bobina ma titgħaffiġx waqt il-proċess ta' l-ippakkjar minħabba li dan jista' jwassal għal riżultati ħżiena. Il-plattina ti tinfaqa' titqiegħed f'postha u l-plagg li jżomm jiġi invitat sewwa. Ir-reċipjent kif hekk imħejji jkun trasferit għal fuq l-istand ta' rfid ta' tqabbid, bil-plattina li tinfaqa' fuq in-naħa ta' fuq, u r-reċipjent għandu jkun lokalizzat f'armarju ventilat xieraq jew inkella f'ċellula li tqabbad. L-għejun ta' l-elettriku jintrabat mat-trufijiet esterni tal-plagg li jqabbad u jiġu applikati 10 A. Il-ħin minn meta jibda t-taħlit u jinxtegħel l-elettriku m'għandux jeċċedi l-10 minuti. Is-sinjal prodott mit-transducer tal-pressjoni jkun irreġistrat fuq sistema xierqa li tippermetti kemm il-valutazzjoni u kif ukoll il-ġenerazzjoni ta' reġistrazzjoni permanenti tal-profil tal-ħin mal-pressjoni (eż. reġistratur b'kurrent qasir ma' reġistratur chart). It-taħlita tissaħħan sakem il-plattina li tinfaqa' tinkiser jew sakemm mill-anqas ikunu għaddew 60 s. Jekk il-plattina li tinfaqa' ma tinkisirx, it-taħlita għandha titħalla tibdred qabel ma, b'galbu kbir, l-apparat jiżżarma, billi jittieħdu l-prekawzjonijiet għal xi forza ta' pressjoni li jista jkun hemm. Għandhom jitwettqu ħames provi bis-sustanza tat-test u bis-sustanza(i) tar-referenza. Il-ħin meħtieġ sabiex il-pressjoni titla’ minn 690 kPa sa 2070 kPa aktar mill-pressjoni atmosferika għandu jkun innotat. Il-ħin taż-żieda medja fil-pressjoni tkun ikkalkulata. F'ċerti każijiet, is-sustanzi jistgħu jiġġeneraw żieda fil-pressjoni (għolja wisq jew baxxa wisq), minħabba r-reazzjonijiet kimiċi li ma jkunux jikkaratterizzaw il-proprjetajiet ossidanti tas-sustanza. F'dawn il-każijiet, jista' jkun hemm il-ħtieġa li jkun ripetut it-test b'sustanza inerta, eż. diatomit (kieselguhr), minflok iċ-ċelluloża, sabiex tkun iċċarata n-natura tar-reazzjoni.

2. DATA Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni kemm għas-sustanza tat-test u wkoll għas-sustanza(i) ta' referenza. Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni għat-testijiet b'sustanza inerta, jekk imwettqa.

2.

2.1 Tabella 1 Eżempji tar-riżultati

TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni kemm għas-sustanza tat-test u wkoll għas-sustanza(i) ta' referenza jkunu ikkalkulati. Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni għat-testijiet b'sustanza inerta, (jekk imwettqa) jkunu ikkalkulati. Uħud mill-eżempji tar-riżultati huma murija fit-Tabella 1 Sustanza Il-ħin taż-żieda medja fil-pressjoni ta' taħlita ta' 1:1 maċ-ċelluloża (ms) Dikromat ta' l-ammonju, taħlita saturata fl-ilma 20800 Nitrat tal-kalċju, taħlita saturata fl-ilma 6700 Nitrat ferriku, taħlita saturata fl-ilma 4133 Perklorat tal-litjum, taħlita saturata fl-ilma 1686 Perklorat tal-magneżju, taħlita saturata fl-ilma 777 Nitrat tan-nikil, taħlita saturata fl-ilma 6250 Aċidu nitriku, 65 % 4767 Aċidu perkoriku, 50 % 121 Aċidu perkoriku, 55 % 59 Nitrat tal-potassju, 30 % taħlita fl-ilma 26690 Nitrat tal-fidda, taħlita saturata fl-ilma — Klorat tas-sodju, 40 % taħlita fl-ilma 2555 Nitrat tas-sodju, 45 % taħlita fl-ilma 4133 Sustanza inerta Ilma:Ċelluloża —

3. RAPPORT

3.

3.1 RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

l-identità, il-kompożizzjoni, il-purità, eċċ. tas-sustanza għat-test;

il-konċentrazzjoni tas-sustanza għat-test;

il-proċedura użata għat-tnixxif taċ-ċelluloża;

il-kontenut ta' l-ilma użat fiċ-ċelluloża;

ir-riżultati tal-kejl;

ir-riżultati mit-testijiet b'sustanza inerta, jekk ikun hemm;

il-ħinijiet medji taż-żieda fil-pressjoni kkalkulati;

xi devjazzjonijiet minn dan il-metodu u r-raġunijiet ta' dawn;

l-informazzjoni addizzjonali kollha, jew ir-rimarki, dwar l-interpretazzjoni tar-riżultati;

3.2 INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI Ir-riżultati tat-test huma vvalutati fuq il-bażi ta': Sustanza likwida għandha titqies ossidanti, meta: Sabiex ikunu evitati riżultati pożittivi foloz, ir-riżultati mogħtija meta tiġi ttestjata s-sustanza għat-test ma' materjal inert, għandhom jitqiesu wkoll fl-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2 a)

jekk it-taħlita tas-sustanza għat-test u ċ-ċelluloża jaqbdux b'mod spontanju; u

il-paragun fil-ħin medju meħtieġ sabiex il-pressjoni titla’ minn 690 kPa għal 2070 kPa, mas-sustanza(i) ta' referenza.

taħlita 1:1, fil-piż, tas-sustanza u ċ-ċelluloża taqbad b'mod spontanju; jew

taħlita 1:1, fil-piż, tas-sustanza u ċ-ċelluloża turi żieda fil-ħin tal-medja tal-pressjoni li tkun anqas minn jew ugwali għal, żieda fil-ħin għal taħlita 1:1 fil-piż, ta' 65 % (w/w) aċidu nitriku fl-ilma u ċelluloża.

4.(1) REFERENZI Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. It-tielet edizjoni riveduta. Pubblikazzjoni tal-NU, Nru.: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, paġna 342. Test O.2: Test għall-likwidu ossidanti Nota: tista' tintuża kwalunkwe konfigurazzjoni minn dawn.

4.(1)

Figura 1 Reċipjent tal-Pressjoni

(A) Il-qafas tar-reċipjent tal-pressjoni (B) Il-plagg li jżomm id-disk li jinfaqa’ (C) Il-plagg li jqabbad (D) Washer minn ċomb artab (E) Id-disk li jinfaqa’ (F) Id-driegħ tal-ġenb (G) Ir-ras tat-transducer tal-pressjoni (H) Il-washer (J) L-elettrodu bl-in-sulazzjoni (K) L-elettrodu ma’ l-earth (L) L-insulazzjoni (M) Il-kona ta’ l-azzar (N) Il-kanal li jobronn il-washer

Figura 2 Stend għall-irfid

Figura 3 Sistema li tqabbad

(A) Bobina li tqabbad (B) Insulazzjoni (C) Elettrodi (D) Plagg li jqabbad

Appendiċi Għal dettalji tekniċi addizzjonali, l-istandards li ġejjin jistgħu jkunu kkonsultati bħala eżempju.

1. Metodi kapillari

1.

1.1. Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib b'banju ta' likwidu ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapilarverfarehn JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products.

1.2 Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib bi blokka tal-metall DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics- polyamides -determination of melting point

2. Elementi Imsaħħnin

2.

2.1. Il-bank sħun Kofler ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Mikroskopju tat-tidwib DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen.

2.3. Metodu tal-menisku (poliamidi) ISO 1218 (E) Plastics -poly ami des -determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Resines de polyamides. Determination du point de fusion methode du menisque

3. Metodi għad-determinazzjoni tat-temperatura ta' l-iffriżar BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de petrole: determination de la temperature de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsiiuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Methode de determination du point de cristallisation (point de Congelation ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Analiżi termika

4.

4.1. Analiżi termika differenzjali ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical DATA DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical DATA DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Determinazzjoni tal-punt tat-tferriegħ NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du petrole: Point de trouble et point d'ecoulement limite -Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils –Determination of pour point

Appendiċi Għal dettalji tekniċi addizzjonali, l-istandards li ġejjin jistgħu jkunu kkonsultati bħala eżempju.

1.1.1 L-ebulliometer Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib b'banju ta' likwidu ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Il-proċess ta' distillazzjoni (l-iskala tat-tgħolija) ISO 918:1989: Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation:determination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. L-analiżi termika differenzjali u l-kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

Appendiċi Għal dettalji tekniċi addizzjonali, l-istandards li ġejjin jistgħu jkunu kkonsultati bħala eżempju.

1. Il-metodi taż-żamma fil-wiċċ

1.

1.1 Idrometru DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2 Miżien idrostatiku

1.2 Għal sustanzi solidi

ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density

Għal sustanzi likwidi

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 and ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3 Metodu tat-tagħdis ta' l-oġġett DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2. Metodi piknometriċi

2.

2.1. Għal sustanzi likwidi ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00 . 10-6 m2 s-1 at 15 oC) DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00 . 10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC) DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary- stoppered pycnometer method NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method

2.2. Għal sustanzi solidi ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-053 Chemical products for industrial use -Determination of density of solids in powder and liquids -Pyknometric method DIN 19683 Determination of the density of soils

3. Piknometru għat-tqabbil ma' l-arja DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung

Appendiċi 1 Metodu ta' stima

DAĦLA

Il-valuri kkalkulati tal-pressjoni tal-fwar jistgħu jintużaw:

biex ikun deċiż liema mill-metodi sperimentali huwa adattat,

biex tkun provduta stima jew valur ta' limitu f'każijiet fejn il-metodu sperimentali ma jistax jiġi applikat minħabba raġunijiet tekniċi (anke fejn il-pressjoni tal-fwar hija baxxa ħafna),

biex jgħinu l-identifikazzjoni ta' dawk il-każijietjiet fejn huwa ġġustifikat li jitħalla barra l-kejl sperimentali għax il-pressjoni tal-fwar hija mistennija li tkun < 10 -5 Pa f'temperatura ambjentali.

METODU TA' STIMA

Il-pressjoni tal-fwar tal-likwidi u solidi tista' tkun stmata bl-użu tal-Watson Correlation (a) immodifikata. L-unika DATA sperimentali meħtieġa hija t-temperatura normali tat-tgħolija. Il-metodu japplika fuq l-iskala tal-pressjoni minn 105 Pa to 10-5 Pa. Informazzjoni dettaljata dwar il-metodu hija mogħtija fil-Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b).

PROĊEDURA TA' KALKOLU

Skond (b) il-pressjoni tal-fwar hija kkalkulata kif ġej: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb fejn: T = it-temperatura ta' interess Tb = it-temperatura normali bit-tgħolija Pvp = il-pressjoni tal-fwar f'temperatura T ΔHvb = is-sħana ta' l-evaporazzjoni ΔZb = il-fattur ta' kompressibilità (stmata f’0,97) m = il-fattur empiriku li jiddependi fuq l-istat fiżiku fit-temperatura ta' interess Ma' dan Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb fejn Kf huwa l-fattur empiriku meta tkun ikkunsidrata l-polarità tas-sustanza. Għal diversi tipi ta' komposti, fatturi Kf huma mniżżla fir-referenza (b). Spiss mhux ħażin, ikun hemm disponibbli d-DATA li tingħata meta t-temperatura tat-tgħolija tkun fi pressjoni mnaqqsa. F'każ bħal dan, skond (b), il-pressjoni tal-fwar hija kkalkulata kif ġej: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 fejn T1 hija t-temperatura tat-tgħolija fi pressjoni mnaqqsa P1.

RAPPORT

Fejn jintuża l-metodu ta' stima, ir-rapport għandu jinkludi dokumentazzjoni komprensiva tal-kalkolu.

LETTERATURA

(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, 398.

(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

Appendiċi 2

Figura 1 Apparat għad-determinazzjoni tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar skond il-metodu dinamiku

1 = Termokoppja 2 = Volum ta’ vakwu ta’ protezzjoni 3 = Gejġ tal-pressjoni 4 = Vakwu 5 = Punt ta’ kejl 6 = Element tat-tisħin circa 150 W

Figura 2a Apparat għad-determinazzjoni tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar skond il-metodu statiku (bl-użu ta' manometru b'tubu-U)

1. Sustanza għat-test 2. Fażi ta’ fwar 3. Valv għal vakwu qawwi 4. Tubu-U (manometru awżiljarju) 5. Manometru 6. Banju tat-temperatura 7. Apparat għall-kejl tat-temperatura 8. Lejn il-pompa tal-vakwu 9. Ventilazzjoni

Figura 2b Apparat għad-determinazzjoni tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar skond il-metodu statiku (bl-użu ta' indikatur tal-pressjoni)

1. Sustanza għat-test 2. Fażi tal-fwar 3. Valv għal vakwu qawwi 4. Gejġ tal-pressjoni 5. Indikatur tal-pressjoni 6. Banju għat-temperatura 7. Apparat għall-kejl tat-temperatura

Figura 3 Isoteniskopju (ara ir-referenza 7)

1. Lejn sistema ta’ kontroll tal-pressjoni u tal-kejl 2. Tubu OD ta’ 8 mm 3. Nitroġenu niexef f sistema tal-pressjoni 4. Kampjun tal-fwar 5. Ponta żgħira 6. Kampjun tal-likwidu

Figura 4 Apparat għad-determinazzjoni tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar skond il-metodu bil-miżien tal-pressjoni tal-fwar

1. Sustanza għat-test 2. Fażi tal-fwar bi fluss ta’ fwar 3. Forn ta’ evaporazzjoni b’fetħa għad-dħul li ddur 4. Tisħin bil-forn (tkessiħ) 5. Kejl tat-temperatura tas-sustanza 6. Kaxxa tat-tkessiħ 7. Tarka 8. Strixxa ta’ tkessiħ għall-kaxxa tat-tkessiħ 9. Platt tal-miżien 10. Mikro-miżien 11. Lejn ir-rekorder 12. Lejn il-pompa b’vakwu qawwi

Figura 5 Eżempju ta' apparat għall-evaporazzjoni fi pressjoni baxxa bil-metodu ta' effużjoni, b'volum ta' ċellula ta' effużjoni ta 8 cm3

1. Konnessjoni mal-vakwu 2. Bjar għat-termometru ta’ reżistenza tal-platinu jew għall-kejl u l-kontroll tat-temperatura 3. Għatu għat-tank bil-vakwu 4. Ħolqa-O 5. Tank ta’ l-aluminju bil-vakwu 6. Apparat għall-installar u t-tneħħija ta’ ċelluli ta’ effużjoni 7. Għatu bil-kamin 8. Butterfly nuts 9. Viti 10. Ċelluli ta’ effużjoni ta’ azzar li ma jsaddadx 11. Cartridges li jsaħħnu

Figura 6a Eżempju ta' sistema ta' fluss għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar bil-metodu ta' saturazzjoni bil-gass

Vent Manifold 1 = Regolatur tal-fluss 2 = Tagħmir għat-trasferiment tas-sħana 3 = Valvi bil-labbra 4 = Senser għall-umdità relattiva 5 = Kolonni ta’ saturazzjoni 6 = Ġonot PTFE 7 = Miter tal-fluss 8 = Kondensatur (assorbitur) 9 = Kondensatur għaż-żejt 10 = Fritted bubbler

Figura 6 b Eżempju ta' sistema għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar bil-metodu ta' saturazzjoni tal-gass, b'kapillari mqiegħed wara l-kopartiment ta' saturazzjoni.

1. Miter termiku tal-fluss 2. Manometru 3. Kompartiment b’temperatura kontrollata 4. Bobina ta’ termostatizzazzjoni għall-gass trasportatur 5. Termometru (Pt 100) 6. Kompartiment ta’ saturazzjoni 7. Kapillari 8. Reċipjent ta’ assorbiment 9. Miter tal-gass 10. Kondensatur kiesaħ

Figura 7 Eżempju ta' apparat sperimentali armat għall-metodu ta' l-iskrun li jdur

Apparat tal-pressjoni tal-fwar A. l-parti ta’ fuq tas-senser ta’ l-iskrun li jdur; B. ċellula tal-kampjun; C. termostat; D. linja ta’ vakwu (pompa turbo); E. termostat ta’ l-arja.

Figura 8 Eżempju tal-parti ta' fuq li tintuża għall-kejl ta'skrun li jdur

1. Sfera 2. Estensjoni tubulari evakwata ta’ 6 3. Kalamiti permanenti (2) 4. Bobini (2) għal stabizzazzjoni vertikali 5. Bobini ta’ forza (4) 6. Flanġ ta’ konnessjoni

Appendiċi

Figura 1 Metodu ta' elużjoni ta' kolonna bil-pompa li tiċċirkola mill-ġdid

Ekwilibrazzzjoni atmosferika Miter tal-fluss Mikro-kolonna Pompa li tiċċirkola mill-ġdid ikkontrollata termostatikament Pompa li tiċċirkola mill-ġdid Valv b’żewġ direzzjonijiet għat-teħid tal-kampjun

Figura 2 Mikro-kolonna tipika

(Id-dimensjonijiet kollha f'millimetri) (Konnessjoni għall-ġonta tal-qiegħ tal-ħġieġ) Spazju ta’ fuq Parti Interna 5 Parti Esterna19 Tapp tal-glass wool Stopcock b’azzjoni f’ żewġ direzzjonijiet

Figura 3 Mikro-kolonna tipika

(Id-dimensjonijiet kollha f'millimetri) Konnessjoni għall-ġonta tal-qiegħ tal-ħġieġ Spazju ta’ fuq Parti Interna 5 Parti Esterna 19 Stopcock

Figura 4 Metodu ta' elużjoni tal-kolonna b'reċipjent ta' invellar

1 = Reċipjent ta’ invellar (eż. flixkun ta’ 2.5 litri) 2 = Kolonna (ara figura 3) 3 = Kollettur tal-frazzjoni 4 = Termostat 5 = Tubu tat-teflon 6 = Ġonta tal-ħġieġ imfarrak 7 = Linja ta’ l-ilma (bejn it-termostat u l-kolonna, dijametru ta’ ġewwa: approssimattivament 8 mm)

Appendiċi 1 Metodi ta' stima/kalkolu

DAĦLA

Daħla ġenerali għall-metodi ta' kalkolu, DATA u eżempji huma pprovduti fil-Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). Il-valuri kkalkulati tal-Pow jistgħu jintużaw:

biex ikun deċiż liema mill-metodi sperimentali huma adattati (skala taċ-ċaqliq tal-flixkun: log Pow: minn - 2 sa 4, skala HPLC: log Pow: minn 0 sa 6),

għall-għażla tal-kondizzjonijiet għat-test adattati (eż. sustanzi ta' referenza għal proċeduri HPLC, proporzjon tal-volum n-oktanol/ilma għall-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun),

bħala verifika interna tal-laboratorju ta' żbalji sperimentali possibli,

għall-għoti ta' stima ta' Pow- f'każijiet fejn il-metodi sperimentali ma jistgħux jiġu applikati għal raġunijiet tekniċi.

METODU TA' STIMA Stima preliminari tal-koeffiċjent tal-qsim

Il-valur tal-koeffiċjent tal-qsim jista' jkun stmat bl-użu tas-solubilitajiet tas-sustanza tat-test f'solventi puri: Għal din: Pstmat = saturazzjoni cn-oktanolsaturazzjoni cilma

METODI TA' KALKOLU Prinċipju tal-Metodi ta' Kalkolu

Il-metodi kollha ta' kalkolu huma bbażati fuq il-frammentazzjoni formali tal-molekula b'sub-strutturi adattati li għalihom huma magħrufa żidiet affidabbli tal-log Pow. Il-log Pow tal-molekula kollha huwa mbagħad ikkalkulat bħala s-somma tal-valur tal-framment korrispondenti tiegħu flimkien mas-somma tat-termini ta' korrezzjoni għal interazzjonijiet intramolekulari. Lista ta' kostanti ta' frammenti u termini ta' korrezzjoni huma disponibbli (b)(c)(d)(e);. Uħud huma regolarment aġġornati (b).

Kriterji ta' kwalità

B'mod ġenerali, l-affidabbiltà tal-metodu ta' kalkolu tonqos jekk tiżdied il-komplessità tal-kompost taħt studju. Fil-każ ta' molekuli sempliċi b'piż molekulari baxx u grupp funzjonali jew tnejn, tista' tkun mistennija devjazzjoni ta' 0,1 sa 0,3 unitajiet ta' log Pow bejn ir-riżultati tal-metodi ta' frammentazzjoni differenti u l-valur mkejjel. Fil-każ ta' molekuli aktar komplessi l-marġni ta' l-iżball jista' jkun akbar. Dan se jiddependi fuq l-affidabbiltà u d-disponibbiltà ta' kostanti ta' framment, kif ukoll fuq l-abbiltà biex jintgħarfu l-interazzjonijeit intramolekulari (eż.. ir-rabtiet ta' l-idroġenu) u l-użu korrett tat-termini ta' korrezzjoni (inqas ta' problema bis-software tal-kompjuter CLOGP-3) (b). Fil-każ ta' komposti jonizzanti l-konsiderazzjoni korretta taċ-ċarġ u l-grad ta' jonizzazzjoni hija importanti.

Proċedura ta' kalkolu

Il-metodu Hansch π-

Il-kostanti tas-sostitwent idrofobiku oriġinali, π, introdott minn Fujira et al. (f) huwa mfisser bħala: πx = log Pow (PhX) -log Pow (PhH) fejn Pow (PhX) huwa l-koeffiċjent tal-qsim ta' derivattiv aromatiku u Pow (PhH) dak tal-kompost ewlieni (eż.. πCl = log Pow (C6H5Cl) -log Pow (C6H6) = 2,84 – 2,13 = 0,71). Skond id-definizzjoni tiegħu l-metodu π japplika b'mod predominanti għal sostituzzjoni aromatika. Valuri π għal għadd kbir ta' sostitwenti ngħataw f'tabelli (b)(c)(d). Huma użati għall-kalkolu ta' log Pow għall-molekuli jew substrutturi aromatiċi.

Metodu Rekker

Skond Rekker (g) il-valur tal-log Pow huwa kkalkulat kif ġej: log Pow=Σi ai fi+Σj (termini ta' interazzjoni). fejn fi jirrappreżenta l-kostanti tal-frammenti molekulari differenti u ai il-frekwenza ta' l-okkorrenza fil-molekula taħt eżami. It-termini ta' korrezzjoni jistgħu jiġu espressi bħala multiplu integrali ta' kostanti wieħed Cm (l-hekk imsejjaħ kostanti maġiku). Il-kostanti tal-frammenti fi u Cm kienu ddeterminati minn lista ta' 1,054 valur sperimentali ta' Pow (825 kompost) bl-użu ta' l-analiżi ta' rigressjoni multipla (c)(h). Id-determinazzjoni tat-termini ta' interazzjoni titwettaq skond regoli fissi mfissra fil-letteratura (e)(h)(i).

Il-metodu Hansch-Leo

Skond Hansch u Leo (c) il-valur tal-log Pow huwa kkalkulat kif ġej: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj fejn fi jirrapreżenta l-kostanti tal-frammenti molekulari differenti, Fj it-termini ta' korrezzjoni u ai il-frekwenzi korrispondenti ta' l-okkorrenza. Lista ta' valuri atomiċi u ta' gruppi frammentali u lista ta' termini ta' korrezzjoni Fj (l-hekk imsejħa fatturi) iddeterminati bl-approssimazzjoni, inkisbet mill-valuri sperimentali Pow. It-termini ta' korrezzjoni kienu ordnati f'diversi klassijiet differenti (a)(c). Huwa relattivament komplikat u jitteħed wisq ħin biex ikunu kkunsidrati r-regoli u t-termini ta' korrezzjoni kollha. Pakketti tas-software ġew żviluppati (b).

Metodu Kombinat

Il-kalkolu tal-log Pow tal-molekuli komplessi tista' titjieb konsiderevolment, jekk il-molekula tiġi tinqasam f'substrutturi akbar li għalihom hemm disponibbli valuri affidabbli tal-log Pow jew mit-tabelli (b)(c) jew mill-kejl li wieħed jagħmel. Frammenti bħal dawn (eż.. eteroċikli, antrakinone, ażobenżin) jistgħu mbagħad jiġu kkombinati mal-valuri Hansch π jew mal-kostanti tal-frammenti Rekker jew Leo.

Rimarki

i)

Il-metodi ta' kalkolu jistgħu jkunu applikati biss għal komposti jonizzati parzjalment jew sħaħ meta huwa possibli li jiġu kkunsidrati l-fatturi ta' korrezzjoni neċessarji.

ii)

Jekk wieħed jassumi li hemm rabtiet idroġeni intramolekulari, it-termini ta' korrezzjoni korrispondenti (approssimattivament unitajiet +0,6 to +1,0 log Pow) jridu jiġu miżjuda (a). Indikazzjoni tal-preżenza ta' rabtiet bħal dawn jistgħu jinkisbu mill-mudelli tridimensjonali jew mid-DATA spettroskopika tal-molekula.

iii)

Jekk huma possibli bosta forom tawtomeriċi, l-aktar forma probabbli għandha tintuża bħala bażi għall-kalkolu.

iv)

Ir-reviżjonijiet tal-listi tal-kostanti tal-frammenti għandhom jkunu segwiti bl-attenzjoni kollha.

Rapport

Meta jkunu qed jintużaw metodi ta' kalkolu/stima, ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

id-deskrizzjoni tas-sustanza (identità, impuritajiet, eċċ.),

l-indikazzjoni ta' kwalunkwe rabta idroġena intramolekulari possibli, dissoċjazzjoni, taċ-ċarġ u kwalunkwe effett mhux tas-soltu ieħor (eż.. tawtomeriżmu) ,

id-deskrizzjoni tal-metodu ta' kalkolu,

l-identifikazzjoni jew il-provvista ta' database,

il-pekularitajiet fil-għażla tal-frammenti,

id-dokumentazzjoni komprensiva tal-kalkolu.

LETTERATURA

(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(ċ) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71,525.

(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. -Chill. Ther. 1979, vol. 14,479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86,5175.

(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977,vol.1.

(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,1459.

(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Appendici 2 Sustanzi ta' Referenza Rakkomandati għal Metodu HPLC

No. Reference Substance log Pow pKa 1 2-Butanone 0,3 2 4-Acetylpyridine 0,5 3 Aniline 0,9 4 Acetanilide 1,0 5 Benzylalcohol 1,1 6 p-Methoxyphenol 1,3 pKa = 10,26 7 Phenoxy acetic acid 1,4 pKa = 3,12 8 Phenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-Dinitrophenol 1,5 pKa = 3,96 10 Benzonitrile 1,6 11 Phenylacetonitrile 1,6 12 4-Methylbenzyl alcohol 1,6 13 Acetophenone 1,7 14 2-Nitrophenol 1,8 pKa = 7,17 15 3-Nitrobenzoic acid 1,8 pKa = 3,47 16 4-Chloraniline 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobenzene 1,9 18 Cinnamic alcohol 1,9 19 Benzoic acid 1,9 pKa = 4,19 20 p-Cresol 1,9 pKa = 10,17 21 Cinnamic acid 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Anisole 2,1 23 Methylbenzoate 2,1 24 Benzene 2,1 25 3-Methylbenzoic acid 2,4 pKa = 4,27 26 4-Chlorophenol 2,4 pKa = 9,1 27 Trichloroethylene 2,4 28 Atrazine 2,6 29 Ethylbenzoate 2,6 30 2,6-Dichlorobenzonitrile 2,6 31 3-Chlorobenzoic acid 2,7 pKa = 3,82 32 Toluene 2,7 33 1-Naphthol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-Dichloroaniline 2,8 35 Chlorobenzene 2,8 36 Allyl-phenylether 2,9 37 Bromobenzene 3,0 38 Ethylbenzene 3,2 39 Benzophenone 3,2 40 4-Phenylphenol 3,2 pKa = 9,54 41 Thymol 3,3 42 1,4-Dichlorobenzene 3,4 43 Diphenylamine 3,4 pKa = 0,79 44 Naphthalene 3,6 45 Phenylbenzoate 3,6 46 Isopropylbenzene 3,7 47 2,4,6-Trichlorophenol 3,7 pKa = 6 48 Biphenyl 4,0 49 Benzylbenzoate 4,0 50 2,4-Dinitro-6 sec. butyophenol 4,1 51 1,2,4-Trichlorobenzene 4,2 52 Dodecanoic acid 4,2 53 Diphenylether 4,2 54 n-Butylbenzene 4,5 55 Phenanthrene 4,5 56 Fluoranthene 4,7 57 Dibenzyl 4,8 58 2,6-Diphenylpyridine 4,9 59 Triphenylamine 5,7 60 DDT 6,2 Other reference substances of low log Pow 1 Nicotinic acid -0,07

Appendiċi

Figura Forom u aċċessorji għall-preparazzjoni tal-gozz

(Id-dimensjonijiet kollha f'millimetri) Tul tal-forma: 250 mm Materjal: aluminju

Appendiċi

Figura Apparat

Appendiċi

Eżempju ta' speċifikazzjoni ta' materjal għal test ta' sensittività termika (ara DIN 1623) (1)(2)(3)

Tubu: Speċifikazzjoni tal-materjal Nru 1.0336.505 g Pjanċa mħaffra: Speċifikazzjoni tal-materjal Nru 1.4873 Il-vit fil-kamin u l-iskorfina: Speċifikazzjoni tal-materjal Nru 1.3817

Figura 1 Apparat għat-test tas-sensittività termika

(d-dimensjonijiet kollha f'millimetri) Fig. 1a Tubu ta’ l-azzar u aċċessorji (1) tubu (1a) flanġ ta’ barra (2) vit bil-kamin; ħajta bi frzzjoni żgħira (3) pjanċa miftuħa a = dijametru ta’ 2.0 jew 6.0 mm (4) skorfina b = dijametru 10 mm (5) superfiċje ċanfrin (6) 2 flat għal spanner qies 41 Fig. 1b Apparat ta’ tisħin u protettiv (7) 2 flat għal spanner qies 36 (8) kaxxa li ma tinkisirx (9) 2 vireg ta’ rfid għat-tubu (10) tubu mmuntat (11) pożizzjoni għall-berner ta’ wara; il-berners l-oħra jidhru (12) merżuq pilota

Figura 2 Test tas-sensittività termika

(eżempju ta' frammentazzjoni) Ebda splużjoni Ebda splużjoni Splużjoni Splużjoni Splużjoni Splużjoni

Figura 3 Il-kalibrazzjoni tar-rata ta' tisħin għat-test tas-sensittività termika

Temperature (°C) Time (s) Il-kurvatura tat-temperatura/ħin miksuba bit-tisħin ta' dibutyl phtalate (27 cm3) f'tubu magħluq (1,5 mm pjanċa mħaffra) bl-użu ta' rata ta' fluss tal-propan ta' 3,2 litru/minuta. It-temperatura tiġi mkejla b'termokoppja ta' azzar li ma jissaddadx miksi b’chromel/alumel ta' 1mm dijametru, impoġġija fiċ-ċentru 43 mm taħt ix-xifer tat-tubu. Ir-rata tat-tisħin bejn 135 oC u 285 oC għandha tkun bejn 185 u 215 K/minuta.

Figura 4 Apparat għat-test bix-xokk

(i-dimensjonijiet huma kollha f'millimetri) Fig 4a martell li jaqa’, id-dehra ġenerali ta’ quddiem u tal-ġenb Fig 4b Martell li jaqa’, il-parti t’isfel (1) bażi, 450 × 450 × 60 (2) blokka ta’ l-azzar, 230 × 250 × 200 (3) inkwina, 100 dijametru × 70 (4) kolonna (5) angolu li jsaħħaħ medjan (6) 2 gwidi (7) ingranaġġ bis-snien (8) skala ggradata (9) martell li jaqa’ (piż li jaqa’) (10) apparat li jżomm u jeħles (11) pjanċa li torbot (12) inkwina intermedjarja (li tinbidel), 26 dijametru × 26 (13) ħolqa li torbot bit-toqob (14) apparat għall-impatt

Kontinwazzjoni

Fig. 4c Apparat tax-xokk għal sustanzi forma ta’ trab jew pejst Fig 4d. Apparat tax-xokk għal sustanzi likwidi (1) ċilindri ta’ l-azzar (2) ħolqa gwida għaċ-ċilindri ta’ l-azzar (3) ħolqa li torbot b’fetħiet (a) taqsima vertikali (b) pjan (4) ħolqa tal-lastiku (5) sustanza likwida (40 mm3) (6) space free from liquid Fig. 4e Martell (piż li jaqa’ ta’ 5 kg) (1) plagg għas-sospensjoni (2) werrej ta’ l-għoli (3) groove għall-pożizzjoni (4) ras ċilindrika għad-daqqa (5) molla li treġġa’ lura

Figura 5 Apparat għas-sensittività tal-frizzjoni.

Fig 5a. Apparat ta’frizzjoni; elevazzjoni u veduta mill-ġenb (1) bażi ta’ l-azzar (2) keriġ li terfa’ u timxi (3) pjanċa tal-porċellana, 25 × 25 × 5 mm fuq il-keriġ (4) ċilindru fiss tal-porċellana 10 dijametru × 15 mm (5) il-kampjun għat-test, approssimattivament 10 mm3 (6) apparat li jżomm iċ-ċilindru (7) driegħ li jgħafas (8) kontrapiż (9) swiċċ (10) rota biex tissettja l-keriġ fil-pożizzjoni tal-bidu (11) direzzjoni lejn il-mutur ta’ l-elettriku Fig 5b Pożizzjoni tal-bidu taċ-ċilindru fuq il-kampjun

Appendiċi

Figura Forma u aċċessorji għall-preparazzjoni tal-gozz

(Id-dimensjonijiet kollha f'millimetri)

Appendiċi Eżempji ta' metodi oħra għad-determinazzjoni tal-piż numru medju molekulari (mn) għall-polimeri

Il-kromatografija bil-permeazzjoni tal-ġel (GPC) hija l-metodu preferut għad-determinazzjoni ta' Mn, speċjalment meta huwa disponibbli sett ta' standards, li l-istruttura tagħhom hija komparabbli ma' l-istruttura tal-polimer. Madankollu, fejn hemm diffikultajiet prattiċi fl-użu tal-GPC jew fejn diġà mistenni li s-sustanza ma tgħaddix mill-kriterju regolatorju Mn (u li jeħtieġ konferma), metodi alternattivi oħra huma disponibbli, bħal:

1.1.11.21.31.4

Użu ta' Proprjetajiet Kolligativi Ebulljoskopija/Krijoskopija tinvolvi l-kejl ta' l-elevazzjoni tat-temperatura tat-tgħolija (ebulljoskopija) jew id-depressjoni tat-temperatura ta' l-iffriżar (krijoskopija) ta' solvent, meta jiżdied il-polimer. Il-metodu huwa bbażat fuq il-fatt li l-effett tal-polimer maħlul fuq it-temperatura tat-tgħolija/ta' l-iffriżar tal-likwidu jiddependi fuq il-piż molekulari tal-polimer (1)(2). Applikabilità, Mn < 20000. Tbaxxija tal-Pressjoni tal-Fwar tinvolvi l-kejl tal-pressjoni tal-fwar minn likwidu ta' referenza magħżul qabel u wara ż-żieda ta' kwantitajiet magħrufa ta' polimer (1)(2). Applikabilità, Mn < 20000 (teoretikament; iżda fil-prattika ta' valur limitat). L-Ożmometrija tal-Membrana hija bbażata fuq il-prinċipju ta' l-ożmosi, i.e. it-tendenza naturali ta' molekuli solventi li jgħaddu minn membrana semi-permeabbli minn soluzzjoni dilwita għal soluzzjoni konċentrata biex jinkiseb l-ekwilibriju. Fit-test, is-soluzzjoni dilwita hija f'konċentrazzjoni żero, waqt li s-soluzzjoni konċentrata fiha l-polimer. L-effett tal-ġbid tas-solvent mill-membrana jikkawża differenzjal tal-pressjoni li huwa dipendenti fuq il-konċentrazzjoni u l-piż molekulari tal-polimer (1)(3)(4). Applikabilità, Mn < 20000 – 200000. Ożmometrija tal-Fażi tal-Fwar. tinvolvi l-paragun tar-rata ta' evaporazzjoni ta' aerosol tas-solvent pur ma' mill-anqas tliet aerosols li fihom il-polimer f'konċentrazzjonijiet varji (1)(5)(6) Applikabbiltà Mn < 20000. Analiżi tal-Grupp Terminali Mn < 20000.

2. Analiżi tal-Grupp Terminali Biex jintuża dan il-metodu, huwa meħtieġ għarfien kemm ta' l-istruttura komplessiva tal-polimer kif ukoll in-natura tal-gruppi terminali tal-katina (li jridu jkunu distinti mill-iskeletru ewlieni b'eż.. NMR jew titrazzjoni/derivatizzazzjoni). Id-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni molekulari tal-gruppi terminali preżenti fuq il-polimer tista' twassal għal valur għall-piż molekulari (7) (8) (9). Applikabbiltà, Mn sa 50000 (b'affidabilità li tonqos).

3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)

Referenzi Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York. Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

Appendiċi Gwida għall-korrezzjoni tal-kontenut molekulari baxx għall-preżenza ta' polimeri insolubbli

Meta hemm polimer insolubbli f'kampjun, dan jirriżulta f'telf tal-piż matul l-analiżi GPC. Il-polimer insolubbli jinżamm b'mod irriversibbli fuq il-kolonna jew il-filtru tal-kampjun waqt li l-porzjon solubbli tgħaddi mill-kolonna. Fil-każ fejn iż-żieda fl-indiċi rifrattiva (dn/dc) tal-polimer tista' tkun stmata jew imkejla, wieħed jista' jistma’ l-piż tal-kampjun mitluf fuq il-kolonna. F'dak il-każ, wieħed jagħmel korrezzjoni bl-użu ta' kalibrazzjoni esterna b'materjali standard ta' konċentrazzjoni magħrufa u dn/dc magħruf sabiex ikun ikkalibrat ir-reazzjoni tar-rifrattometru. Fl-eżempju hawn taħt jintuża standard poly(methyl methacrylate) (pMMA). Fil-kalibrazzjoni esterna għall-analiżi ta' polimeri akriliċi, standard pMMA ta' konċentrazzjoni magħrufa fit-tetraidrofuran, jiġi analizzat bil-GPC u d-data li tirriżulta tintuża biex jinsab il-kostanti tar-rifrattometru skond l-ekwazzjoni: K = R/(C x V x dn/dc) fejn : K il-kostanti tar-rifrattometru (f'microvolt second/ml), R it-tweġiba ta' l-istandard pMMA (f'microvolt/second), C il-konċentrazzjoni ta' l-istandard pMMA (f'mg/ml), V il-volum ta' l-injezzjoni (f'ml) u dn/dc iż-żieda fl-indiċi rifrattiv għall-pMMA f'tetraidrofuran (f'ml/mg). The following data are typical for a pMMA standard: R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 x 10-5 ml/mg Il-valur K li jirriżulta, 3,05 x 1011 imbagħad jintuża biex tkun ikkalkulata r-reazzjoni teoretika tad-ditekter jekk 100 % tal-polimer injettat kien elwat permezz tad-ditekter.

PARTI B METODI GĦAD-DETERMINAZZJONI TAT-TOSSIĊITÀ U EFFETTI OĦRA TAS-SAĦĦA

DAĦLA ĠENERALI A.

KARATTERIZZAZZJONI TAS-SUSTANZA GĦAT-TEST Il-kompożizzjoni tas-sustanza għat-test, inklużi l-impuritajiet l-iktar importanti, u l-proprjetajiet fiżiko-kimiċi relevanti tagħha inkluża l-istabilità, għandha tkun magħrufa qabel il-bidu ta’ kwalunkwe studju għat-tossiċità. Il-proprjetajiet fiżiko-kimiċi tas-sustanza għat-test jagħtu informazzjoni importanti fl-għażla election of the route of administration, the design of each particular study and the handling and storage of the test substance. L-iżvilupp ta’ metodu analitiku għad-determinazzjoni tas-sustanza għat-test (inklużi l-impuritajiet prinċipali meta hu possibbli) fil-midjum tad-dożaġġ u l-materjal bijoloġiku għandu jiġi qabel il-bidu ta’ l-istudju. L-informazzjoni kollha li għandha x’taqsam ma’ l-identifikazzjoni, il-proprjetajiet fiżiko-kimiċi, il-purità, u l-imġiba tas-sustanza għat-test għandhom jiġu inklużi fir-rapport tat-test.

KURA TA’ L-ANNIMALI Il-kontroll strett tal-kundizzjonijiet ambjentali u l-kura b’sengħa ta’ l-annimali huma essenzjali fl-ittestjar tat-tossiċità

(i) Il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpoġġew l-annimali Il-kundizzjonijiet ambjentali fil-kmamar sperimentali jew l-ispazji magħluqa ta’ l-annimali għandhom ikunu xierqa għall-ispeċi li se jiġu ttestjati. Għall-firien, ġrieden u fniek ta’ l-indi, il-kundizzjonijiet xierqa huma temperatura tal-kamra ta’ 22 oC ± 3 oC b’umdità relattiva minn 30 sa 70 %; għall-fniek it-temperatura għandha tkun ta’ 20 oC ± 3 oC b’umdità relattiva minn 30 sa 70 %. Ċerti tekniki sperimentali huma partikularment sensittivi għall-effetti tat-temperatura u, f’dawn il-każijiet, id-dettalji tal-kundizzjonijiet xierqa huma inklużi fid-deskrizzjoni tal-metodu tat-test. Fl-investigazzjonijiet kollha ta’ l-effetti tossiċi, it-temperatura u l-umdità għandhom jiġu mmoniterjati, irrekordjati, u inklużi fir-raport finali ta’ l-istudju. Id-dwal għandhom ikunu artifiċjali, is-sekwenza għandha tkun ta’ 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Id-dettalji tas-sekwenza tad-dwal għandhom jiġu rrekordjati u inklużi fir-rapport finali ta’ l-istudju. Sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor fil-metodu, l-annimali jistgħu jitpoġġew individwalment, jew jinqaflu fi gruppi żgħar ta’ l-istess sess; biex jinqaflu fi grupp, m’għandux ikun hemm iktar minn ħames annimali f’kull gaġġa. Fir-rapporti ta’ l-esperimenti fuq l-annimali, huwa importanti li jidher ċar kif qed jiġu maqfula l-annimali u n-numru ta’ annimali mpoġġija f’kull gaġġa kemm waqt l-espożizzjoni għall-kimika u kemm waqt kwalunkwe perjodu ta' osservazzjoni li jiġi wara.

(ii) Kundizzjonijiet ta’ l-għalf Id-dieti għandhom jissodisfaw il-ħtiġiet nutrizzjonali kollha ta’ l-ispeċi li qed jiġu ttestjati. Fejn jiġu amministrati s-sustanzi għat-test fid-dieta ta' l-annimali il-valur nutrizzjonali jista’ jonqos permezz ta' l-effett li s-sustanza u l-kostitwent tad-dieta jagħmlu fuq xulxin. Il-possibbiltà ta’ reazzjoni bħal din għandha tiġi meqjusa meta jiġu interpretati ir-riżultati tat-testijiet. Id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu jintużaw b'forniment illimitat ta' ilma għax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata mil-ħtieġa li tiġi żgurata taħlita xierqa tas-sustanza għat-test meta tiġi somministrata b'dan il-metodu. Il-kontaminanti tad-dieta li jinfluwenzaw it-tossiċità m’għandhomx ikunu preżenti f’konċentrazzjonijiet li jinterferixxu.

ITTESTJAR ALTERNATTIV L-Unjoni Ewropea għandha l-impenn li tippromwovi l-iżvilupp u l-validazzjoni ta’ tekniki alternattivi li jistgħu jipprovdu l-istess livell ta’ informazzjoni bħala testijiet kurrenti għall-annimali, iżda li jużaw inqas annimali, jikkawżaw inqas tbatija jew jevitaw kompletament l-użu ta' annimali. Metodi bħal dawn, meta jsiru disponibbli, għandhom jiġu kkunsidrati fejn hu possibbli għall-karatterizzazzjoni tal-periklu u l-klassifikazzjoni u l-ittikettjar konsegwenti għall-perikli intrinsiċi u l-valutazzjoni għas-sigurtà tal-kimika.

EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI Meta t-testijiet jiġu evalwati u interpretati, il-limitazzjonijiet safejn ir-riżultati ta' l-istudji ta' l-annimali u ta' l-in vitro jistgħu jkunu estrapolati direttament lill-bniedem iridu jiġu kkunsidrati u għalhekk, l-evidenza ta’ effetti avversi fil-bnedmin, fejn huma disponibbli, jistgħu jintużaw għall-konfermazzjoni tar-riżultati ta’ l-ittestjar.

REFERENZI TA’ LETTERATURA Bosta minn dawn il-metodi huma żviluppati fi ħdan l-istruttura tal-programm OECD Testing Guidelines, u għandhom isiru skond il-prinċipji tal-Good Laboratory Practice, sabiex jiżguraw ‘l-aċċettazzjoni reċiproka tad-data’ kemm jista’ jkun. Informazzjoni addizzjonali tinsab fir-referenzi msemmija fil-linji gwida ta' l-OECD u l-etteratura relevanti ppubblikata x’imkien ieħor.

B.1 BIS. TOSSIĊITÀ ORALI AKUTA – PROĊEDURA GĦAL DOŻA FISSA

B.1 BIS.

1. METODU Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalenti għal OECD TG 420 (2001)

1.

1.1. DAĦLA Il-metodi tradizzjonali għall-istudju tat-tossiċità akuta bl-użu tal-mewt ta' l-annimali bħala l-għan ewlieni. Fil-1984, resqien ġdid dwar it-testijiet tat-tossiċità akuta kien ġie suġġerit mill-British Toxocology Society li huwa ibbażat fuq l-amministrazzjoni f'serje ta' livelli ta' dożi fissi (1). Ir-resqien evita l-użu tal-mewt ta' l-annimali bħala l-għan ewlieni, u minflok straħ fuq l-osservazzjonijiet ta' sinjali ċari tat-tossiċità f'wieħed mis-serje ta' livelli ta' dożi fissi. Bsegwiment ta' studji in vivo tal-validazzjoni fil-UK (2) u f'medda internazzjonali (3), il-proċedura kienet adottata bħala metodu tat-test fil-1992. Sussegwentament, il-propjetajiet statistiċi tal-Proċedura ta' Doża Fissa kienu ġew evalwati bl-użu ta' mudelli matematiċi f'serje ta' studji (4) (5) (6). Flimkien, l-istudji in vivo u l-mudellar kienu were li l-proċedura hija riproduċibbli, bl-użu anqas ta' annimali u tikkawża anqas tbagħtija mill-metodi tradizzjonali u hija kapaċi li tiggrada s-sustanzi f'manjera simili mal-metodi l-oħrajn tat-testijiet tat-tossiċità akuta. Gwida dwar l-għażla tal-metodu tat-test l-aktar xieraq għal skop partikolari tista’ tinstab fid-Dokument ta' Gwida dwar it-Testijiet tat-Tossiċità Akuta Orali (7). Dan id-Dokument ta' Gwida fih ukoll informazzjoni addizzjonali dwar it-twettieq u l-interpretazzjoni tal-Metodu tat-test B.1 bis. Huwa prinċipju tal-metodu li fl-istudju ewlieni dożi tossiċi moderati biss ikunu użati, u li l-amministrazzjoni tad-dożi li jkunu mistenna bħala letali għandhom ikunu evitati. Ukoll, id-dożi li huma magħrufa bħala li jikkawżaw uġiegħ u tqallib żejjed, minħabba l-azzjonijiet korrossivi jew ta' irritazzjoni qawwija, ma jkunx hemm ħtieġa li jkunu amministrati. Annimali moridondi, jew annimali li ovvjament ikunu bl-uġiegħ jew li juru sinjali ta' tqallib sever u dewwiemi għandhom ikunu maqtula b'mod uman, u huma meqjusa fl-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test bl-istess mezz bħal dawk l-annimali li jkunu mietu waqt it-test. Il-kriterja ta' kif tittieħed id-deċiżjoni sabiex ikunu maqtula l-annimali moribondi jew dawk li jkunu fi tbagħtija kbira, u l-gwida għar-rikonoxximent ta' mewt prevista jew mistennija, huma s-suġġett ta' Dokument ta' Gwida separat (8). Il-metodu jipprovdi informazzjoni dwar il-propjetajiet perikolużi u jippermetti li s-sustanza tkun iggradata u ikklassifikata skond il-Globally Harmonised System (GHS) (Sistema Armonizzata Globali) għall-klassifika ta' kimika li toħloq tossiċità akuta (9). Il-laboratorju tat-test għandu jikkonsidra l-informazzjoni disponibbli kollha dwar is-sustanza tat-test qabel ma jwettaq l-istudju. Tali informazzjoni għandha tinkludi l-identifikaazzjoni u l-istruttura kimika tas-sustanza; il-propjetajiet fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultati ta' xi testijiet oħrajn In vitro jew in vivo dwar is-sustanza' id-dettalji tossikoloġiċi dwar sustanzi struttalment relatati; u l-użu(i) antiċipati tas-sustanza. Din l-informazzjoni hija meħtieġa sabiex tissodisfa lil dawk kollha ikkonċernati li t-test huwa relevanti għall-protezzjoni tas-saħħa umana, u li jkun jgħin fil-għażla ta' doża xierqa għal-bidu.

1.2. DEFINIZZJONIJIET Tossiċita akuta orali: Tirreferi għall-effetti ħżiena li jseħħu wara l-amministrazzjoni orali ta' doża waħda ta' sustanza jew dożi multipli, matul 24 siegħa. Mewt imdewma: Tfisser li l-annimal ma jkunx u ma jidhirx moribond fi żmien 48 siegħa, imma li jmut aktar tard matul il-perjodu ta' osservazzjoni ta' 14-il jum. Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test li tkun somministrata. Id-doża hija espressa bħala l-piż tas-susatanza tat-test għal kull unità tal-piż ta' l-annimal tat-test (eż. mg/kg). Tossiċità evidenti: Hija terminoloġija ġenerali li tiddeskrivi sinjali ċari tat-tossiċita bħala segwiment ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test (ara (3) għall-eżempji) bħal ma hija d-doża fissa segwenti aktar għolja li toħloq uġiegħ waqqi jew sinjali dewwiema ta' tbagħtija qawwija, l-istatus ta' moribond (il-kriterja hija ippreżentatha fil-Humane Endpoints Guidance Document (8) (Dokument ta' Gwida dwar l-Għanijiet Umani)), jew li l-probabbiltà ta' mortalità f'bosta annimali tista’ tkun mistennija. GHS:Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures. (Sistema tal-Klassifikazzjoni Armonizzata Globali dwar Sustanzi u Taħlitiet Kimiċi.) Attività konġunta tal-OECD (is-saħħa umana u l-ambjent), il-Kumitat tan-NU ta' l-Esperti dwar it-Trasport ta' Oġġetti Perikolużi (il-propjetajiet fiżiċi/kimiċi) u l-ILO (kommunikazzjoni ta' periklu) u kordinata mill-Programm Interorganizzazzjonali għal Amministrazzjoni Soda tal-Kimika (IOMC). Mewt iminenti: Meta l-istat ta' moribond jew mewt ikun mistenni qabel il-ħin ta' l-osservazzjoni segwenti ippjanata. Sinjali indikattivi ta' dan l-istat f'annimali gerriema jistgħu jinkludu konvulżjonijiet, posizzjoni laterali, mimduda, u roda. (Ara d-Dokument ta' Gwida dwar l-Umanita Immirata (8) għal aktar dettalji). LD50 (doża letali medja): Hija akkwistata b'mod statistiku minn doża waħda ta' sustanza li tista’ tkun mistennija li tikkaġuna mewt f'50 fil-mija ta' l-annimali meta amministrati permezz tar-rotta orali. Il-valur LD50 huwa espress f'termini ta' piż tas-sustanza tat-test għal kull unità tal-piż ta' l-annimal tat-test (mg/kg). Limitu tad-doża: Tirreferi għal doża fil-litu l-aktar għoli tagħha waqt it-testijiet (2000 jew 5000 mg/kg). L-istat moribondi: Huwa l-istat ta' qabel il-mewt jew ta' l-inabbiltà tas-sopravivenza, anki jekk ikun hemm trattament. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (8) dwar aktar dettalji). Mewt mistennija: Il-preżenza ta' sinjali kliniċi indikattivi tal-mewt fi żmien mistenni jew inkella fil-ġejjieni imma qabel it-tmiem ippjanat ta' l-esperiment, per eżempju: l-inabbiltà li jersaq lejn l-ilma u lejn l-ikel. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (8) dwar aktar dettalji).

1.3. IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Gruppi ta' annimali ta' sess wieħed huma mogħtija doża fi proċedura mtarrġa bl-użu ta' dożi fissi ta' 5, 50, 300 u 2000 mg/kg (eċċezzjonalment għal doża fissa addizzjonali ta' 5000 mg/kg li tista’ tkun ikkonsidrata, ara s-sezzjoni 1.6.2.). Il-livell inizjali tad-doża huwa magħżul fuq il-bażi ta' l-istudju tas-sejbien bħala d-doża mistennija li tipproduċi xi sinjali ta' tassiċità mingħajr ma toħloq l-effetti ta' tossiċità severa jew tal-mortalità. Is-sinjali kliniċi u l- kundizzjonijiet assoċjati ma l-uġiegħ, sofferenza, u mewt iminenti, huma deskritti fid-dettall fi Gwida OECD separata, id-Dokument (8). L-annimali jistgħu jingħataw doża aktar għolja jew aktar baxxa, jiddependi mill-preżenza jew in-nuqqas ta' sinjali ta' tossiċità jew mortalità. Din il-proċedura tinżamm sakemm id-doża li toħloq tossiċità evidenti jew ta' mewt waħda jew aktar, ikunu identifikati, jew meta l-ebda effetti ma jkunu jidhru fid-doża l-aktar għolja jew meta l-imwiet iseħħu fid-doża l-aktar baxxa.

1.4. ID–DESKRIZZJONI TAL–METODU TAT–TEST

1.4.

1.4.1. L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali L-ispeċi preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, għalkemm speċi oħrajn ta' annimali gerriema tista’ tkun użata. Normalment ikunu wżata il-femminili (7). Dan huwa minħabba li listħarriġ letterarju tat-testijiet konvenzjonali LD50 juru li normalment ikun hemm ftit differenza fis-sensittività bejn is-sessi, imma li f'dawk il-każi meta d-differenzi jkunu osservati, in-nisa ikunu ġeneralment kemm xejn aktar sensittivi (10). B'dana kollu, jekk tagħrif dwar il-propjetajiet tossikoloġiċi jew tossikinetiċi ta' kimiċi strutturament relatati jindika li l-irġiel aktarx li jkunu aktar sensittivi, allura dak is-sess għandu jkun użat. Meta t-test ikun imwettaq fuq maskili, ġustifikazzjoni adekwata għandha tkun ipprovduta. Annimali żgħażagħ adulti u b'saħħithom tas-siltiet normalment użati fil-laboratorju għandhom ikunu utilizzati. Il-femminili għandhom ikunu tali li qatt ma jkunu weldu u ma jkunux tqal. Kull annimal, fil-bidu ta' meta jkun sejjer jingħata doża, għandu jkun f'età ta' bejn 8 u 12 il-ġimgħa u l-piż tiegħu għandu jkun fil-medda ta' ± 20 % tal-piż medju ta' dawk l-annimali li preċedentament ikun u ntużaw għad-dożi.

1.4.2. Il-kundizzjonijiet tal-gaġeġ u ta' l-għalf It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 oC (± 3 oC). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-annimali jistgħu ikunu miġbura flimkien bħala grupp skond id-doża, imma n-numru ta' l-annimali f'kull gaġġa m'għandux ifixkel l-osservazzjonijiet ċari ta' kull annimal.

1.4.3. Preparazzjoni ta' l-annimali L-animmali għandhom ikunu magħżula kif jinzerta, immarkati sabiex jippermettu identifikazzjoni individwali, u miżmuma fil-gaġġeġ tagħhom għal mill-anqas 5 tijiem qabel il-bidu tad-dożi sabiex jippermettu li jkunu akklamattiżati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju.

1.4.4. Preparazzjoni tad-dożi Ġeneralment, is-sustanzi tat-test għandhom ikunu amministrati f'volum kostanti matul medda ta' dożi tat-testijiet bil-varjazzjoni tal-konċentrazzjoni fil-preparazzjoni tad-dożi. Meta, b'dana kollu, likwidu jew taħlita ikunu l-prodott finali, l-użu ta' sustanza tat-test mingħajr trattib, i.e. konċentrazzjoni kostanti, tista’ tkun aktar relevanti għall-istudju sussegwenti tar-riskju ta' dik is-sustanza, u hija ħtieġa għal uħud mill-awtoritajiet regolatorji. Fi kwalunkwe każ, il-volum massimu tad-doża għall-amminsitrazzjoni m'għandux ikunu misbuq. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jkun amministrat f'waqt wieħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Fl-annimali gerriema, il-volum m'għandux normalment jeċċedi 1ml/100g tal-piż tal-ġisem: b'dana kollu fil-każ ta' taħlitiet akweji, 2 ml/100g tal-piż tal-ġisem jista’ jkun ikkonsidrat. Fir- rigward tal-formulazzjoni tal-preparazzjoni tad-doża, l-użu ta' taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni akweja hija rakkommandata kull meta possibbli, segwita f'ordni ta' preferenza bit-taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħ-ir- rum) u mbagħad il-possibbiltà ta' likwidi oħrajn. Għal likwidi oħrajn apparti milli l-ilma, il- karatteristiċi tossikoloġiċi tal-likwidu għandhom ikunu magħrufa. Id-dożi għandhom ikunu ippreparati ftit qabel l-amministrazzjoni, sakemm l-istabbilità tal-preparazzjoni matul il- perjodu ta' l-użu tkun magħruha u turi li tkun aċċettabbli.

1.5. PROĊEDURA

1.5.

1.5.1. Amministrazzjoni tad-dożi Is-sustanza tat-tes hija somministrata f'doża waħda b'mod sfurzat bl-użu ta' tubu sa l-istonku jew b'xi intubazzjoni canula xierqa. F'ċirkostanzi mhux tas-soltu li fihom doża waħda ma tkunx possibbli, id-doża tista’ tingħata fi frazzjonijiet iżgħar matul perjodu li ma jeċċedix l-24 siegħa. L-annimali għandhom ikunu msajma qabel ma jingħataw id-doża (eż. għall-firien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul il-lejl sal-ħin ta' l-esperiment; fil-każ ta' ġurdien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul 3-4 siegħat). Wara l-perjodu tas-sawma, l-annimali għandhom ikunu miżuna u s-sustanza tat-test tkun somministrata. Wara li s-sustanza tat-test tkun somministrata, l-ikel jista’ jkun imċaħħad għal 3-4 siegħat oħra fil-każ tal-firien jew 1-2 siegħat fil-każ tal-ġrieden. Meta d-doża tkun somministrata fi frazzjonijiet matul perjodu ta' żmien, jista’ jkun meħtieġ li l-annimali jkunu ipprovduti b'ikel u ilma, jiddependi mit-tul tal-perjodu.

1.5.2. Studju ta' l-osservazzjoni L-iskop ta' l-istudju ta' l-osservazzjoni huwa li jippermetti l-għażla xierqa tad-doża tal-bidu li tintuża fl-istudju ewlieni. Is-sustanza tat-test hija somministrata lill-annimali singoli b'manjera sekwenzali skond il-karti tan-nixxija fl-Anness 1. L-istudju ta' l-osservazzjoni ikunu komplut meta d-deċiżjoni dwar il-bidu tad-doża għall-istudju ewlieni tkun tista’ tittieħed (jew jekk il-mewt tkun apparenti fid-doża l-baxxa kif stabbilita). Id-doża tal-bidu għall-istudju ta' l-oisservazzjoni hija magħżulha minn livelli fissi ta' dożi ta' 5, 50, 300 u 2000 mg/kg bħala doża mistennija li tipproduċi tossiċità evidenti ibbażata, meta possibbli, fuq evidenza mid-dettalji In vivo u In vitro mill-istess kimika jew il-kimiċi ta' struttura relatata. Fin-nuqqas ta' tali informazzjoni, id-doża tal-bidu għandha tkun 3000 mg/kg. Perijodu ta' mill-anqas 24 siegħa għandu jkun imħolli bejn l-għoti tad-doża lil kull annimal. L-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal mil anqas 14-il jum. B'mod eċċezzjonali, u biss meta iġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji speċifiċi, l-użu ta' doża addizzjonali iffissata fil-livel għoli ta' 5000 mg/kg tista’ tkun ikkonsidrata (ara l-Anness 3). Għal raġunijiet li jikkonċernaw il-ġid ta' l-annimali, it-testijiet ta' l-annimali skond GHS, il-Kategorija 5, il-meded (2000-5000 mg/kg huma ferm skorraġiti u għandhom biss ikunu ikkonsidrati meta jkun hemm possibbiltà qawwija li r-riżultati minn tali test ikollu relevanza diretta għall-rotezzjoni umana jew tas-saħħa ta' l-annimali jew dik ambjentali. Fil-każi meta annimal ikun ittestjat fil-livell l-aktar baxx ta' doża fissa (5 mg/kg) fl-istudju ta' l-osservazzjoni imut, il-proċeduira normali hija li jkun terminat l-istudju u li s-sustanza tkun assanjata għal-GHS, Kategorija 1 (kif muri fl-Anness 1). B'dana kollu, jekk aktar konferma tal-klassifika tkun meħtieġa, proċedura supplementari voluntarja tista’ tkun imwettqa, kif ġej: It-tieni annimal ikunu mogħti d-doża f’5 mg/kg. Jekk dan it-tieni annimal imut, allura il-Kategorija 1 GHS tkun ikkonfermata u l-istudju jkun terminat immedjetament. Jekk it-tieni annimali jibqa ħaj, allura massimu ta' tlett annimali addizjnonali ikunu mogtoja d-doża ta' 5 mg/kg. Minħabba li jkun hemm riskju kbir ta' mortalità, dawn l-annimali għandhom ikunu mogjħtija d-doża b'mod sekwenzali sabiex ikun imħares il-ġid ta' l-annimali. Fl-intervall ta' ħin bejn kull doża għal kull annimal għandu jkun suffiċjenti sabiex ikun stabbilit jekk l-annimal preċedenti jkunx sejjer jibqa ħaj. Jekk isseħħ it-tieni mewt, is-sekwenza tad-doża għandha tkun terminata immedjetament u l-ebda annimali oħrajn ma jingħataw id-doża. Minħabba l-okkorrenza tat-tieni mewt (irrispettivemanet min-numru ta' l-annimali ittestjati fil-waqt tat-terminazzjoni) tidħol fl-eżitu A (2 jew aktar imwiet), ir-regola tal-klassifika ta' l-Anness 2 fi 5 mg/kg doża fissa tkun segwita (il-Kategorija 1 jew ikun hemm 2 jew aktar imwiet, jew il-Kategorija 2 jekk ikun hemm mhux aktar minn mewt waħda). B'żieda, l-Anness 4 jagħti gwida dwar il-klassifika fis-sistema UE sakemm GHS ġdida tkun implementata.

1.5.3. Studju ewlieni

1.5.3.

1.5.3.1. Numru ta' l-annimali u l-livelli tad-dożi L-azzjoni li għandha tittieħed b'segwiment tat-testijiet fid-doża tal-livell tal-bidu hija indikata fil-karti nixxija fl-Anness 2. Waħda mit-tlett azzjonijiet tkun meħtieġa; jew li jieqfu t-testijiet u li tkun assenjata l-klassifikazzjoni tal-klassi tal-periklu xierqa, it-test f'doża ta' livell għola jew test f'doża f'livell aktar baxx. B'dana kollu, għall-protezzjoni ta' l-annimali, livell ta' doża li jikkaġuna l-mewt fl-istudju ta' l-osservazzjoni m'għandhiex tkun użata mill-ġdid fl-istudju ewlieni (ara l-Anness 2). L-esperjenza wriet li r-riżultat probabbli fil-livell tad-doża tal-bidu ikun dak li s-sustanza tista’ tkun klassifikata u li l-ebda aktar testijiet ma jkunu meħtieġa. Total ta' ħames annimali ta' sess wieħes ikun normalment użat għal kull livell ta' doża investigata. Il-ħames annimali għandhom ikunu magħmula minn annimal wieħed mill-istudju ta' l-osservazzjoni li jkun ħa doża fil-livell magħżul flimkien ma erba annimali addizzjonali oħrajn (apparti, ħaġa mhux tas-soltu, jekk il-livell tad-doża użat ma kienx inkluż fl-istudju ta' l-osservazzjoni). L-intervall tal-ħin bejn id-dożi f'kull wieħed mill-livelli huwa determinat bl-iskoppjar, it-tul, u s-severità, tas-sinjali tossiċi. It-trattament ta' l-annimali fid-doża segwenti għandu jkun imdewwem sakemm wieħed ikun żgur bis-sopravivenza ta' l-annimali li jkunu ireċevew id-doża preċedentament. Perijodu ta' minn 3 sa 4 ijiem bejn id-dożi f'kull livell huma rakkommandabbli, jekk maħtieġ, sabiex jippermetti għall-osservazzjoni tat-tossiċità mdewma. L-intervall tal-ħin jista’ jkun aġġustat kif xieraq, eż. fil-każ ta' reazzjoni mhux konklussiva. Meta l-użu tad-doża l-aktar għolja ta' 5000 mg/kg ikun ikkonsidrat, il-proċedura kif elenkata fl-Appendiċi 3 għandha tkun segwita (ara wkoll is-sezzjoni 1.6.2.).

1.5.3.2. Test tal-limitu It-test tal-limitu huwa primarjament użat f'sitwazzjonijiet meta dak li jwettaq l-esperiment ikollu informazzjoni li tindika li l-materjal tat-test ma jkunx tossiku, i.e. li jkollu tossiċita biss aktar mil-limitu regolatorju tad-dożi. L-informazzjoni dwar it-tossiċità tal-materjal tat-test tista’ tkun akkwistat mit-tagħrif dwar komposti simili li kienu ġew ittestjati jew minn taħlitiet jew prodotti simili li kienu ġew ittestjati, billi tkun meqjusa l-identità u l-persentaġġ tal-komponenti magħrufa li huma ta' sinifikanza tossikoloġika. F'dawk is-sitwazzjonijiet meta ftit jew l-ebda informazzjoni ma tkun disponibbli dwar it-tossiċità tagħha, jew meta l-materjal tat-test ikun mistenni li huwa tossiku, it-test ewlieni għandu jkun imwettaq. Bl-użu tal-proċedura normali, studju ta' l-osservazzjoni li jibda b'doża ta' 2000 mg/kg (jew b'mod eċċezzjonali 5000 mg/kg) segwit b'doża fuq erba’ annimali oħrajn f'dan il-livell iservi bħala test tal-limitu għal din il-linja ta' gwida.

1.6. OSSERVAZZJONIJIET L-annimali osservati individwalment wara l-ewwel doża mill-anqas darba matul l-ewwel 30 minuta, perdodikament matul l-ewwel 24 siegħa, b'attenzjoni speċjali mogħtija matul l-ewwel 4 siegħat, u ta' kull minn hemm il-quddiem, għal total ta' 14-il jum, apparti minn meta jkun meħtieġ li dawn jitneħħew mill-istudju u li jkunu maqtula b'mod umanesk għal raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali jew inkella li jinsabu mejta. B'dana kollu, it-tul ta' l-osservazzjoni m'għandhux ikun iffissat b'mod rigoruż. Għandu jkun determinat bir-reazzjoni tossika, il-ħin ta' l-iskoppjar u t-tul tal-perjodu ta' l-irkupru, u jista’ b'hekk ikun estiż meta ikkonsidrat bħala meħtieġ. Il-ħinijiet ta' meta jidhru jew jisparixxu s-sinjali tat-tossiċità huma importanti, speċjalment jekk ikun hemm tendenza li s-sinjali tossiċi jkunu mdewwma (11). L-osservazzjonijiet kollha huma sistematista’ment irreġistrati, b'dettalji individwali jkunu jinżammu għal kull annimal. Osservazzjonijiet addizzjonali jkunu meħtieġa jekk l-annimali jkomplu juru sinjali ta' tossiċità. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu xi tibdil fil-ġilda u s-suf, l-għajnejn, fil-membrani mukaneji, u wkoll fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tan-nervituri ċentrali, u l-attività somatomuturali u t-tip ta' l-imġieba. Attenzjoni għandha tkun diretta għall-osservazzjonijiet ta' roda, konvulżjonijiet, rieq, dijarrea, letarġija, irqad u koma. Il-prinċipji u l-kriterja kif aggruppati fid-Dokument ta' Gwida dwar il-Miri Umanitarji għandhom ikunu ikkonsidrati (8). L-annimali misjuba f'kundizzjoni moribonda u l-annimali li juru sinjali ta' uġieħ qawwi jew li jgħaddu minn sinjali ta' tbgħatija, għandhom ikunu maqtula b'mod umanitarju. Meta l-annimali jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji jew jekk jinstabu mejta, il-ħin tal-mewt għandu jkun reġistrat bi preċiżjoni kemm jista’ jkun possibbli.

1.6.

1.6.1. Piż tal-Ġisem Il-piżijiet ta' l-annimali individwali għandhom ikunu determinati kemxejn qabel ma s-sustanza tat-test tkun somministrata u mill-anqas darba fil-ġimgħa wara dan. Tibdiliet fil-piż għandhom ikunu ikkalkolati u rreġistrati. Fit-tmiem tat-test, l-annimali li jibqgħu ħajjin għandhom ikunu miżuna w imbagħas maqtula b'mod umanitarju.

1.6.2. Patoloġija L-annimali kolha tat-test (inklużi dawk li jmutu matul it-test jew li jkunu mneħħija mill-istudju minħabba raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali) għandhom ikunu suġġetti għal nekropsija ġenerali. It-tibdiliet patoloġiċi ġenerali għandhom ikunu irreġistrati għal kull annimal. Eżaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi li juri evidenza patoloġika ġenerali fl- annimali li jibqgħu ħajjin għa 24 siegħa jew aktar wara li jkunu rċevew id-doża inizjali għandha wkoll tkun ikkunsidrata minħabba li din tista’ tforni informazzjoni utili.

2. DATA Data ta' l-annimal individwali għandha tkun ipprovduta. B'żieda ma dan, id-dettalji kollha għandhom ikunu miġbura f'sommarju, li juru għal kull grupp tat-test, in-numru ta' l-annimali użati, in-numru ta' annimali ji jkollhom sinjali ta' tossiċità, in-numru ta' annimali li jinstabu mejta matul it-test jew li jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji, il-ħin tal-mewt ta' l-annimali individwali, deskrizzjoni u l-korsa tal-ħin ta' l-effetti tossiċi, u r-riversabbiltà ta' dawn, u s-sejbiet tan-nekropsija.

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skond kif xieraq:

Is-sustanza tat-test:

in-natura fiżika, il-purità, u meta relevanti, il-propjetajiet fiżiko-kimiċi (inkluża l- iżomerizzazzjoni);

dettalji ta' l-identifikazzjoni, inkluż in-numru CAS.

Mezz (jekk applikabbli):

ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz, jekk mhux sempliċement ilma.

Annimali tat-test:

speċi/tipi użati;

l-istatus mikrobioloġiku ta' l-annimali, meta magħruf;

in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali (inklużi, meta xieraq, raġornament dwar l-użu ta' maskili minflok femminili);

is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc.

Kondizzjonijiet tat-test:

dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi dettalji dwar l-għamla fiżika tal-materjal amministrat;

dettalji dwar l-amminstrazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi l-volumi tad-dożi u l-ħin ta' meta tkun ingħata id-doża;

dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u ta' l-ilma (inklużi t-tip/sorsi tad-dieta, is-sorsi ta' l-ilma);

ir-raġjonar għall-għażla tad-doża tal-bidu.

Riżultati:

tabulazzjoni tad-dettalji tar-reazzjoni u tal-livell tad-doża għal kull animal (i.e. l-annimali li juru sinjali ta' tossiċità, inklużi l-effetti tal-mortalità, in-natura, is-severanza u t-tul ta' l-effetti);

tabulazzjoni tal-piż tal-ġisem u tat-tibdiliet fil-piż tal-ġisem;

il-piżijiet ta' l-annimali individwali fil-jum ma meta jirċievi d-doża, u wara dan matul intervalli ta' darba fil-ġimgħa, u il-ħin tal-mewt jew ta' meta jkunu maqtula;

id-data u l-ħin tal-mewt jekk qabel il-qtil previst;

il-korsa tal-ħin ta' kif jiskoppjaw is-sinjali tat-tossiċità u jekk dawn kienux riversibbli għal kull animal individwali;

is-sejbiet tan-nekropsija u s-sejbiet ħispatoloġiċi għal kull animal, jekk disponibbli.

Diskussjoni u interpretazzjoni tar-riżultati.

Kunklużjonijiet.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)

REFERENZI British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 ġhttp://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.htmlħ. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231. Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

B.1TRIS. TOSSIĊITÀ ORALI AKUTA – METODU TAL-KLASSIFIKA TOSSIKA AKUTA

B.1TRIS.

1. METODU Dan il-metodu huwa ekwivalnti għal OECD TG 423 (2001)

1.

1.1. INTRODUZZJONI Il-metodu tal-klassi tat-tossiċità akuta (1) kif stabbilit f'dan it-test huwa l-proċedura sussegwenti ma l-użu ta' 3 annimali ta' sess wieħed għal kull pass. Jiddependi mill-mortalità u/jew l-istat ta' modibondi li jkunu fih l-annimali, bħala medja 2-3 passi jkunu meħtieġa sabiex jippermeti li jsir ġudizju dwar it-tossiċità akuta tas-sustanza tat-test. Din il-proċedura hija riproduċibbli, tuża ftit annimali u hija kapaċi li tiggrada sustanzi b'manjera simili għall-metodi l-oħrajn tat-testijiet dwar it-tossiċità akuta. Il-metodu tal-klassi tat-tossiċità akuta huwa bbażat fuq evalwazzjonijiet biometriċi (2) (3) (4) (5) b'dożi fissi, separati b'mod adekwat sabiex jippermettu li sustanza tkun iggradata għall-iskopijiet tal-klassifika u ta' l-assessjar tal-periklu. Il-metodu kif adottat fil-1996 kien ġie validat b'mod estensiv in vivo bi tqabbil mad-dettalji JD50 akkwistati mil-letteratura, kemm nazzjonali (6) u dik internazzjonali (7). Gwida dwar l-għażla tal-metodu tat-test l-aktar xieraq għal skop partikolari tista’ tinstab fid-Dokument ta' Gwida dwat it-Testijiet tat-Tossiċità Orali Akuta (8). Dan id-Dokument ta' Gwida fih ukoll informazzjoni addizzjonali dwar it-twettieq u l-interpretazzjoni tal-metodu tat-test B. 1 tris. Is-sustanzi tat-test, fid-dożi li huma magħrufa li jikkaġunaw uġiegħ qawwi u tbatija minħabba l-azzjonijiet korrossivi jew severament irritanti, ma jistgħux ikunu amministrati. Annimali fl-għafja tal-mewt, jew annimali avvjament bl-uġiegħ jew li juru sinjali ta' tbagħtija qawwija għandhom ikun u maqtula b'mod umanitarju, u huma meqjusa fl-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test bl-istess mod bħal dawk l-annimali li jmutu matul it-test. Il-kriterja sabiex tittieħed id-deċiżjoni li jkunu maqtula l-annimali fl-għafja tal-mewt jew dawk li jkunu jbagħtu ħafna, u l-gwida dwar ir-rikonoxximent ta' mewt mistennija jew prevista, huma s-suġġett ta' Dokument ta' Gwida separat (9). Dan il-metodu jutilizza dożi definiti bil-quddiem u r-riżultati jippermettu li sustanza tkun gradata u klassifikata skond is-Sistema Globali Armonizzata għall-klassifika ta' kimiċi li jikkaġunaw tossiċità akuta (10). Bħala prinċipju, il-metodu mhux intiż li jippermetti l-kalkolu ta' LD50 preċiża, imma fil-fatt jipperemetti għad-determinazzjoni ta' medded ta' esposizzjoni definita meta l-letalità tkun mistennija minħabba li l-mewt ta' proporzjoni ta' l-annimali tkun xorta waħda l-għan finali ewlieni ta' dan it-test. Il-metodu jippermetti għad-determinazzjoni tal-valur LD50 biss meta mill-anqas żewġ dożi jirriżultaw f'mortalità għola minn 0 % u anqas minn 100 %. L-użu ta' għażla ta' dożi definiti bil-quddiem, independentament mis-sustanza tat-test, bil-klassifika espliċitament marbuta man-numri ta' l-annimali osservati f'diversi sitwazzjonijiet ittejjeb l-opportunità għar-rapurtaġġ ta' bejn laboratorju u laboratorju, b'konsistenza u repatabbilità. Il-laboratorju tat-test għandu jikkonsidra l-informazzjoni disponibbli kollha dwar is-sustanza tat-test qabel ma jwettaq l-istudju. Tali informazzjoni għandha tinkludi l-identità u l-istruttura kimika tas-sustanza, il-propjetajiet fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultat ta' xi testijiet oħrajn In vivo jew in vitro dwar is-sustanza; id-dettalji tossikoloġiċi dwar is-sustanzi strutturament relatati; u l-użu antiċipat tas-sustanza. Din l-informazzjhoni hija meħtieġa sabiex tissodisfa lil dawk kollha ikkonċernati li t-test huwa relevanti għall-protezzjoni tas-saħħa umana u li jkun ta' għajnuna fl-għażla tad-doża tal-bidu l-aktar xierqa.

1.2. DEFINIZZJONIJIET Tossiċità akuta orali: Tirreferi għal dawk l-effetti ħżiena li jseħħu wara l-amministrazzjoni orali ta' doża singola ta' sustanza jew ta' dożi multipli mogħtija matul 24 siegħa. Mewt imdewma: Tfisser li annimal ma jmutx u ma jkunx jidher f'għafja tal-mewt fi żmien 48 siegħa imma li jmut aktar tard matul il-perjodu ta' l-osservazzjoni ta' 14-il jum. Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test kif somministrata. Id-doża hija espressa bħala piż tas-sustanza tat-test għal kull unità tal-piż ta' l-annimal ittestjat (eż. mg/kg). GHS: Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures. Is-Sistema tal-Klassifika Globali Armonizzata għal Sustanzi u Taħlitiet Kimiċi. Attività konġunta tal-OECD (is-saħħa umana u l-ambjent), Il-Kumitat ta' Esperti tal-NU dwar it-Trasport ta' Oġġetti Perikolużi (il-propjetajiet fiżiċi/kimiċi) u l-ILO (kommunikazzjoni perikoluża) u l-kordinazzjoni mill-Programm Interorganizzazzjonali għal Amministrazzjoni Soda tal-Kimika (IOMC). Imwiet imminenti: Meta l-istat fl-għafja tal-mewt jew il-mewt ikunu mistennija qabel il-ħin ippjanat segwenti ta' l-osservazzjoni. Sinjali indikattivi għal dan l-istat f'annimali gerriema jistgħu jinkludu konvulżjonijiet, posizzjoni ta' serħan fuq il-ġemb, mitluqa fuq darhom, u tregħid (Ara d-Dokument ta' Gwida ta' l-Għan Finali b'mod Umanitarju (9) għal aktar dettalji). LD50 (doża orali medja ta' l-mwiet): Hija doża akkwistata b'mod statistiku ta' sustanza li tista’ tkun mistennija li tikkaġuna l-mewt fi 50 fil-mija ta' l-annimali meta amminsitrata bir-rotta orali. Il-valur LD50 huwa espress f'termini ta' piż tas-sustanza tat-test għal kull unità piż ta' l-annimal tat-test (mg/kg). Doża b'limitu: Tirreferi għad-doża fil-limitu l-aktar għoli tat-testijiet (2000 jew 5000 mg/kg). Stat moribund (fl-għafja tal-mewt): Huwa l-istat li jwassal għall-mewt jew ta' nuqqas ta' kapaċità għal ħajja, anki jekk ittrattat (ara d-Dokument ta' Gwida dwar it-Tmiem Finali b'mod Umanitarju (9) dwar aktar dettalji). Mewt mistennija: Il-preżenza ta' sinjali kliniċi indikattivi tal-mewt fi żmien mistenni jew inkella fil-ġejjieni imma qabel it-tmiem ippjanat ta' l-esperiment, per eżempju: l-inabbiltà li jersaq lejn l-ilma u lejn l-ikel. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (9) dwar aktar dettalji).

1.3. IL-PRINĊIPJU TAT-TEST Huwa l-prinċipju tat-test li, ibbażat fuq il-proċedura ta' pass b'pass, bl-użu ta' numru minimu ta' annimali kull pass, informazzjoni suffiċjenti tkun akkwista dwar it-tossiċità akuta tas- sustanza tat-test sabiex tiffaċilita l-klassifika tagħha. Is-sustanza hija ammenistrata b'mod orali fuq grupp ta' annimali esperimentali b'waħda mid-dożi definiti. Is-sustanza hija ittestjata bl-użu tal-proċedura tal-pass b'pass, kull pass jutilizza tlett annimali ta' sess wieħed (normalment nisa). In-nuqqas jew il-preżenza ta' mortalità relatata mal-kompost ta' l-anniamli bid-doża. Ta' l-ewwel pass tkun tiddetermina l-pass segwenti, i.e.: Id-dettalji tal-proċedura tat-test huma deskritti fl-Anness I. Il-metodu ikun jiffaċilita ġudizju fir-rigward tal-klassifika ta' sustanza tat-test lejn waħda mis-serje tal-klassijiet ta' tossiċità definiti bil-valuri fissi LD-50 bħala waqfien.

l-ebda aktar testijiet ma jkunu meħtieġa,

id-doża fuq tlett annimali, bl-istess doża,

id-doża fuq tlett annimali addizzjonali fil-livell aktar għoli segwenti jew fil-livell aktar baxx preċedenti.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.4.

1.4.1. L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali L-ispeċi preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, għalkemm speċi oħrajn ta' annimali gerriema tista’ tkun użata. Normalment ikunu wżata il-femminili (9). Dan huwa minħabba li listħarriġ letterarju tat-testijiet konvenzjonali LD-50 juru li normalment ikun hemm ftit differenza fis-sensittività bejn is-sessi, imma li f'dawk il-każi meta d-differenzi jkunu osservati, in-nisa ikunu ġeneralment kemm xejn aktar sensittivi (11). B'dana kollu, jekk tagħrif dwar il-propjetajiet tossikoloġiċi jew tossikinetiċi ta' kimiċi strutturament relatati jindika li l-irġiel aktarx li jkunu aktar sensittivi, allura dak is-sess għandu jkun użat. Meta t-test ikun imwettaq fuq maskili, ġustifikazzjoni adekwata għandha tkun ipprovduta. Annimali żgħażagħ adulti u b'saħħithom tas-siltiet normalment użati fil-laboratorju għandhom ikunu utilizzati. Il-femminili għandhom ikunu tali li qatt ma jkunu weldu u ma jkunux tqal. Kull annimal, fil-bidu ta' meta jkun sejjer jingħata doża, għandu jkun f'età ta' bejn 8 u 12 il-ġimgħa u l-piż tiegħu għandu jkun fil-medda ta' ± 20 % tal-piż medju ta' dawk l-annimali li preċedentament ikun u ntużaw għad-dożi.

1.4.2. Il-kundizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 oC (± 3 oC). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-annimali jistgħu ikunu miġbura flimkien bħala grupp skond id-doża, imma n-numru ta' l-annimali f'kull gaġġa m'għandux ifixkel l-osservazzjonijiet ċari ta' kull annimal.

1.4.3. Preparazzjoni ta' l-annimali L-annimali għandhom ikunu magħżula kif jinzerta, immarkati sabiex jippermettu identifikazzjoni individwali, u miżmuma fil-gaġġeġ tagħhom għal mil anqas 5 tijiem qabel il-bidu tad-dożi sabiex jippermettu li jkunu akklamattiżati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju.

1.4.4. Preparazzjoni tad-dożi Ġeneralment, is-sustanzi tat-test għandhom ikunu amministrati f'volum kostanti matul medda ta' dożi tat-testijiet bil-varjazzjoni tal-konċentrazzjoni fil-preparazzjoni tad-dożi. Meta, b'dana kollu, likwidu jew taħlita ikunu l-prodott finali, l-użu ta' sustanza tat-test mingħajr trattib, i.e. konċentrazzjoni kostanti, tista’ tkun aktar relevanti għall-istudju sussegwenti tar-riskju ta' dik is-sustanza, u hija ħtieġa għal uħud mill-awtoritajiet regolatorji. Fi kwalunkwe każ, il-volum massimu tad-doża għall-amminsitrazzjoni m'għandux ikunu misbuq. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jkun amministrat f'waqt wieħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Fl-annimali gerriema, il-volum m'għandux normalment jeċċedi 1ml/100g tal-piż tal-ġisem: b'dana kollu fil-każ ta' taħlitiet akweji, 2 ml/100g tal-piż tal-ġisem jista’ jkun ikkonsidrat. Fir- rigward tal-formulazzjoni tal-preparazzjoni tad-doża, l-użu ta' taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni akweja hija rakkommandata kull meta possibbli, segwita f'ordni ta' preferenza bit-taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħ-ir- rum) u mbagħad il-possibbiltà ta' likwidi oħrajn. Għal likwidi oħrajn apparti milli l-ilma, il- karatteristiċi tossikoloġiċi tal-likwidu għandhom ikunu magħrufa. Id-dożi għandhom ikunu ppreparati ftit qabel l-amministrazzjoni, sakemm l-istabbiltà tal-preparazzjoni matul il- perjodu ta' l-użu tkun magħrufa u turi li tkun aċċettabbli.

1.5. PROĊEDURA

1.5.

1.5.1. Amministrazzjoni tad-dożi Is-sustanza tat-test hija somministrata f'doża waħda b'mod sfurzat bl-użu ta' tubu sa l-istonku jew b'xi intubazzjoni canula xierqa. F'ċirkostanzi mhux tas-soltu li fihom doża waħda ma tkunx possibbli, id-doża tista’ tingħata fi frazzjonijiet iżgħar matul perjodu li ma jeċċedix l-24 siegħa. L-annimali għandhom ikunu msajma qabel ma jingħataw id-doża (eż. għall-firien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul il-lejl sal-ħin ta' l-esperiment; fil-każ ta' ġurdien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul 3-4 siegħat). Wara l-perjodu tas-sawma, l-annimali għandhom ikunu miżuna u s-sustanza tat-test tkun somministrata. Wara li s-sustanza tat-test tkun somministrata, l-ikel jista’ jkun imċaħħad għal 3-4 siegħat oħra fil-każ tal-firien jew 1-2 siegħat fil-każ tal-ġrieden. Meta d-doża tkun somministrata fi frazzjonijiet matul perjodu ta' żmien, jista’ jkun meħtieġ li l-annimali jkunu ipprovduti b'ikel u ilma, jiddependi mit-tul tal-perjodu.

1.5.2. Numru ta' l-annimali u l-livelli tad-dożi Tlett annimali huma użati għal kull pass. Il-livell tad-doża li għandu jkun użat bħala d-doża tal-bidu jkun magħżul minn wieħed minn erba’ livelli fissi, 5, 50, 300 u 2000 mg/kg piż tal-ġisem. Il-livell tad-doża tal-bidu għandu jkun dak li jkun l-aktar probabbli li jipproduċi mortalità f'uħud mill-animali li jkunu reċevew id-doża. Il-karti tan-nixxija ta' l-Anness 1 jiddeskrivu l-proċedura li għandha tkun segwita għal kull waħda mid-dożi tal-bidu. B'żieda, l-Anness 4 jagħti gwida dwar il-klassifika fis-sistema UE sakemm GHS ġdida tkun implementata. Meta l-informazzjoni disponibbli tissuġġerixxi li l-lortalità pjuttost li ma sseħħx fl-għola livell tal-bidu (2000 mg/kg piż tal-ġisem), allura test tal-limitu għandu jkun imwettaq. Meta ma jkunx hemm informazzjoni dwar xi sustanza li għandha tkun ittestjata, għal raġunijiet tal-ġid ta' l-annimali, huwa rakkommandabbli li jsir użu minn doża tal-bidu ta' 300 mg/kg piż tal-ġisem. L-intervall tal-ħin bejn id-dożi f'kull wieħed mill-livelli huwa determinat bl-iskoppjar, it-tul, u s-severità, tas-sinjali tossiċi. It-trattament ta' l-annimali fid-doża segwenti għandu jkun imdewwem sakemm wieħed ikun żgur bis-sopravivenza ta' l-annimali li jkunu ireċevew id-doża preċedentament. B'mod eċċezzjonali, u biss meta iġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji speċifiċi, l-użu ta' doża addizzjonali iffissata fil-livel għoli ta' 5000 mg/kg tista’ tkun ikkonsidrata (ara l-Anness 2). Għal raġunijiet li jikkonċernaw il-ġid ta' l-annimali, it-testijiet ta' l-annimali skond GHS, il-Kategorija 5, il-meded (2000-5000 mg/kg huma ferm skorraġiti u għandhom biss ikunu ikkonsidrati meta jkun hemm possibbiltà qawwija li r-riżultati minn tali test ikollu relevanza diretta għall-rotezzjoni umana jew tas-saħħa ta' l-annimali jew dik ambjentali.

1.5.3. Test tal-limitu It-test tal-limitu huwa primarjament użat f'sitwazzjonijiet meta dak li jwettaq l-esperiment ikollu informazzjoni li tindika li l-materjal tat-test ma jkunx tossiku, i.e. li jkollu tossiċita biss aktar mil-limitu regolatorju tad-dożi. L-informazzjoni dwar it-tossiċità tal-materjal tat-test tista’ tkun akkwistat mit-tagħrif dwar komposti simili li kienu ġew ittestjati jew minn taħlitiet jew prodotti simili li kienu ġew ittestjati, billi tkun meqjusa l-identità u l-persentaġġ tal-komponenti magħrufa li huma ta' sinifikanza tossikoloġika. F'dawk is-sitwazzjonijiet meta jkun ftit jew l-ebda informazzjoni dwar. It-tossiċità tagħha, jew li fiha l-materjal tat-test ikun mistenni li jirriżulta tossiku, it-test ewlieni għandu jkun imwettaq. Test tal-limitu f'doża waħda fil-livell ta' 2000 mg/kg piż tal-ġisem jista’ jitwettaq fuq sitt annimali (tlett annimali kull pass). B'mod eċċezzjonali, test tal-limitu b'doża waħda fil-livell ta' 5000 mg/kg jista’ jkun imwettaq fuq tlett annimali (ara l-Anness 2). Jekk il-mortalità tat-test relatata mas-sustanza tirriżulta, aktar testijiet fil-livell preċedenti aktar baxx jista’ jkun hemm il-ħtieġa li jitwettqu.

1.6. OSSERVAZZJONIJIET L-annimali osservati individwalment wara l-ewwel doża mill-anqas darba matul l-ewwel 30 minuta, perjodikament matul l-ewwel 24 siegħa, b'attenzjoni speċjali mogħtija matul l-ewwel 4 siegħat, u ta' kull minn hemm il-quddiem, għal total ta' 14-il jum, apparti minn meta jkun meħtieġ li dawn jitneħħew mill-istudju u li jkunu maqtula b'mod umanesk għal raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali jew inkella li jinsabu mejta. B'dana kollu, it-tul ta' l-osservazzjoni m'għandhux ikun iffissat b'mod rigoruż. Għandu jkun determinat bir-reazzjoni tossika, il-ħilata' l-iskoppjar u t-tul tal-perjodu ta' l-irkupru, u jista’ b'hekk ikun estiż meta ikkonsidrat bħala meħtieġ. Il-ħinijiet li fihom is-sinjali tat-tassiċità) jkunu apparaenti jew li jisparixxu huma. Importanti, speċjalment meta jkun hemm tendenza li s-sinjali tossiċi jkunu mdewma (12). L-osservazzjonijiet kollha huma sistematista’ment irreġistrati, b'dettalji individwali jkunu jinżammu għal kull annimal. Osservazzjonijiet addizzjonali jkunu meħtieġa jekk l-annimali jkomplu juru sinjali ta' tossiċità. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu xi tibdil fil-ġilda u s-suf, l-għajnejn, fil-membrani mukaneji, u wkoll fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tan-nervituri ċentrali, u l-attività somatomuturali u t-tip ta' l-imġieba. Attenzjoni għandha tkun diretta għall-osservazzjonijiet ta' roda, konvulżjonijiet, rieq, dijarrea, letarġija, irqad u koma. Il-prinċipji u l-kriterja kif aggruppati fid-Dokument ta' Gwida dwar il-Miri Umanitarji għandhom ikunu ikkonsidrati (9). L-annimali misjuba f'kundizzjoni moribonda u l-annimali li juru sinjali ta' uġieħ qawwi jew li jgħaddu minn sinjali ta' tbgħatija, għandhom ikunu maqtula b'mod umanitarju. Meta l-annimali jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji jew jekk jinstabu mejta, il-ħin tal-mewt għandu jkun reġistrat bi preċiżjoni kemm jista’ jkun possibbli.

1.6.

1.6.1. Piż tal-ġisem Il-piżijiet ta' l-annimali individwali għandhom ikunu determinati kemxejn qabel ma s-sustanza tat-test tkun somministrata u mill-anqas darba fil-ġimgħa wara dan. Tibdiliet fil-piż għandhom ikunu ikkalkolati u rreġistrati. Fit-tmiem tat-test, l-annimali li jibqgħu ħajjin għandhom ikunu miżuna w imbagħas maqtula b'mod umanitarju.

1.6.2. Patoloġija L-annimali kolha tat-test (inklużi dawk li jmutu matul it-test jew li jkunu mneħħija mill-istudju minħabba raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali għandhom ikunu suġġetti għal nekropsija ġenerali. It-tibdiliet patoloġiċi ġenerali għandhom ikunu irreġistrati għal kull annimal. Eżaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi li juri evidenza patoloġika ġenerali fl-annimali li jibqgħu ħajjin għa 24 siegħa jew aktar wara li jkunu rċevew id-doża inizjali għandha wkoll tkun ikkunsidrata minħabba li din tista’ tforni informazzjoni utili.

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1. Rapport tat-test Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skond kif xieraq:

Is-sustanza tat-test:

in-natura fiżika, il-purità, u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżiko-kimiċi (inkluża l- iżomerizzazzjoni);

dettalji ta' l-identifikazzjoni, inkluż in-numru CAS.

Mezz (jekk applikabbli):

ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz, jekk mhux sempliċement ilma.

Annimali tat-test:

speċi/tipi użati;

l-istatus mikrobioloġiku ta' l-annimali, meta magħruf;

in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali (inklużi, meta xieraq, raġornament dwar l-użu ta' maskili minflok femminili);

is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc.

Kondizzjonijiet tat-test:

dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi dettalji dwar l-għamla fiżika tal-materjal amministrat;

dettalji dwar l-amminstrazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi l-volumi tad-dożi u l-ħin ta' meta tkun ingħata d-doża;

dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u ta' l-ilma (inklużi t-tip/sorsi tad-dieta, is-sorsi ta' l-ilma);

ir-raġjonar għall-għażla tad-doża tal-bidu.

Riżultati:

tabulazzjoni tal-piż tal-ġisem u tat-tibdiliet fil-piż tal-ġisem;

il-piżijiet ta' l-annimali individwali fil-jum ma meta jirċievi d-doża, u wara dan matul intervalli ta' darba fil-ġimgħa, u l-ħin tal-mewt jew ta' meta jkunu maqtula;

id-data u l-ħin tal-mewt jekk qabel il-qtil previst;

il-korsa tal-ħin ta' kif jiskoppjaw is-sinjali tat-tossiċità u jekk dawn kienux riversibbli għal kull animal individwali;

is-sejbiet tan-nekropsija u s-sejbiet ħispatoloġiċi għal kull animal, jekk disponibbli.

Diskussjoni u interpretazzjoni tar-riżultati.

Konklużjonijiet.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)

REFERENZI Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 (http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html). Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

B.2. TOSSIĊITÀ AKUTA (TEĦID MAN-NIFS)

B.2.

1. METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminarja dwar id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli, l-pressjoni tal-fwar, il-punt tat-taħlil, il-punt tat-togħlija, il-punt tal-leħħa jew ta’ l-isplussività (jekk applikabbli) tas-sustanza. Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (A).

1.2. DEFINIZZJONIJIET Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (B).

1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA Xejn

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Diversi gruppi ta’ annimali sperimentali huma esposti għal perjodu definittiv lejn is-sustanza tat-test f’konċentrazzjonini bi gradwazzjonijiet, b’konċentrazzjoni waħda tkun użata għal kull grupp. Sussegwentement l-effetti u l-imwiet jiġu osservati. Annimali li jmutu matul it-test ikollhom awtopsija tal-mewt u l-konklużjoni tat-test li l-annimali li jibqgħu ħajjin ikollhom ukoll l-awtopsija ta’ wara l-mewt Jista’ jagħti l-każ li l-annimali li juru sinjali qawwija u li jtulu ta’ tbatija u uġigħ jinqatlu b’mod uman. Sustanzi f’dożaġġi għat-test li huma magħrufa li jikkawżaw it-tbatija u l-uġigħ minħabba proprjetajiet korrużivi jew ta’ irritazzjoni qawwija jistgħu ma jintużawx.

1.5. KRITERJI TA’ KWALITÀ Xejn.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6.

1.6.1. Preparazzjonijiet L-annimali huma miżmuma b’fondi sperimentali u f’kundizzjonijiet ta’ l-għalf għal mill-anqas ħamest ijiem qabel l-esperiment. Qabel it-test, annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma magħżula b’mod kif jinzerta u assenjati lejn in-numru meħtieġ ta’ gruppi. M’hemmx bżonn ikunu suġġetti għal espożizzjoni simulata sakemm dan ma jkunx indikat mit-tip ta’ apparat t’espożizzjoni li qed jintuża. Sustanzi għat-test solidi jistgħu jkunu mikronizzati sabiex jinkisbu l-partiċelli ta’ daqs xieraq. Meta meħtieġ, materjal adattat jista’ jkun miżjud mas-sustanza tat-test sabiex jgħin fil-ġenerazzjoni ta’ konċentrazzjoni xierqa tas-sustanza tat-test fl-atmosfera. Jekk xi materjal jew addittivi oħrajn ikunu użati għall-faċilizzazzjoni tad-doża, dawn għandhom ikunu magħrufa li ma jipproduċu l-ebda effetti tossiċi. Data storika tista’ tkun użata, jekk xieraq.

1.6.2. Il-kundizzjonijiet tat-test

1.6.2.

1.6.2.1. Annimali sperimentali Sakemm ma jkunx hemm indikazzjonijiet mod ieħor, il-far huwa l-ispeċi preferita. Is-siltiet normalment użati fil-laboratorju ta’ l-annimali żgħażagħ b’saħħithom għandhom ikunu użati. Fil-bidu ta’ kull test, il-medda tal-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandhiex teċċedi ± 20 % tal-valur medju kif xieraq.

1.6.2.2. Numru u sess. Mill-anqas 10 gerriema (ħamsa femminili u ħamsa maskili) għandhom ikunu użati f’kull livell ta’ doża. Jekk ikunu użati femminili, dawn għandhom ikunu femminili li qatt ma welldu u li ma humiex tqal. Nota: F’testijiet ta’ tossoċità akuta b’annimali ta’ ordni ogħla mill-gerriema għandhom jintużaw numri iżgħar. Id-dożi għandhom jingħażlu bl-attenzjoni u għandu jsir kull sforz sabiex ma jinqabżux id-dożi li huma xi ftit tossiċi. F’testijiet bħal dawn għandha tiġi evitata l-amministrazzjoni ta’ dożi letali tas-sustanza għat-test.

1.6.2.3. Konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni Dawn għandhom ikunu biżżejjed fin-numru, mill-inqas tlieta, u spazjati b’mod xieraq biex jipproduċu gruppi ta’ test b’medda ta’ effetti tossiċi u rati ta’ mortalità. Id-data għandha tkun biżżejjed biex tipproduċi kurva ta’ konċentrazzjoni ta’ mortalità u, fejn hu possibbli, tippermetti determinazzjoni aċċettabbli ta’ test tal-limitu LC50 1.6.2.4.

1.6.2.4. Test tal-limitu Jekk ħames annimali għat-test maskili u ħamsa femminili jiġu esposti għal erba’ sigħat għal 20 mg għal kull litru ta’ gass jew 5 rug għal kull litru ta’ aerosol jew ta’ partiċella (jew fejn dan mhuwiex possibbli minħabba xi proprjetajiet tas-sustanza għat-test li huma fiżiċi jew kimiċi u inklużi dawk splussivi, il-massimu ta’ konċentrazzjoni li tista’ tintlaħaq) u ma tirriżulta l-ebda mortalità compound-related fi żmien 14-il jum iktar ittestjar jista’ ma jkunx meħtieġ. (18th ATP, dir. 93/21/KEE, Ll10/93)

1.6.2.5 Ħin ta’ l-espożizzjoni It-tul ta’ l-espożizzjoni għandu jkun ta’ erba’ sigħat.

1.6.2.6. Apparat: L-annimali għandhom ikunu ttestjati bl-apparat tan-nifs iddisinjat għas-sostenn ta’ nixxija ta’ arja dinamika ta’ mill-anqas 12-il kambjamenti ta’ l-arja fis-siegħa, sabiex ikun assigurat kontenut adekwat ta’ l-ossiġenu u espożizzjoni ta’ l-atmosfera mqassma b’mod egwali. Meta kabina tkun użata, d-disinn tagħha għandu jimminimizza l-iffullar ta’ l-annimali tat-test u jimminimizzaw l-espożizzjoni tagħhom man-nifs tas-sustanza tat-test. Bħala regola ġenerali sabiex tkun assigurata l-istabbilità ta’ l-atmosfera fil-kabina il-volum totali ta’ l-annimali tat-test m’għandux jeċċedi 5 % tal-volum tal-kabina tat-test. Ħalq-nażali, ir-ras biss, jew l-ispazji tal-kabina ta’ l-espożizzjoni jista’ jkun użat; bl-ewwel tnejn għandhom jgħinu li jimminimizzaw l-ammont tas-sustanza tat-test b’meżżi oħrajn.

1.6.2.7. Perijodu ta’ l-Osservazzjoni Il-perjodu ta’ osservazzjoni għandu jkun mill-inqas ta’ 14-il jum. Madankollu, id-dewmien ta’ l-osservazzjonijiet m’għandux ikun strettament fiss. Għandu jkun determinat mir-reazzjonijiet tossiċi, ir-rata tagħhom ta’ onset u t-tul ta’ żmien ta’ rkupru, għalhekk meta hu meħtieġ jista’ jiġi estiż. Il-ħin li fih is-sinjali ta’ tossiċità jidhru u jisparixxu u l-ħin tal-mewt huma importanti, speċjalment jekk hemm it-tendenza li l-imwiet itulu.

1.6.3. Il-proċedura Ftit qabel l-espożizzjoni, l-annimali jintiżnu, imbagħad jiġu esposti għall-konċentrazzjoni tat-test fl-apparat magħżul għal erba’ sigħat, wara l-ekwilibrazzjoni tal-konċentrazzjoni tal-kabina. It-temperatura li fiha t-test ikun imwettaq għandha tinżamm fi 22 ± 3 oC. Idealment, l-umdità relattiva għandha tinżamm bejn 30 u 70 %, imma f’ċerti kazi (eż. it-testijiet ta’ uħud mill-aerosols) dan jista’ ma jkunx prattikabbli. Iż-żamma ta’ pressjoni kemxejn negattiva ġewwa l-kabina (≥ 5 mm ta’ ilma) tkun tipprevjeni l-ħruġ tas-sustanza tat-test fiż-żona tal-madwar. L-ikel u l-ilma għandhom ikunu miċħuda matul l-espożizzjoni. Sistemi xierqa għandhom jintużaw għall-ġenerazzjoni u l-monitoraġġ ta’ l-atmosfera tat-test. Is-sistema għandha tassigura li kundizzjonijiet stabbli ta’ l-espożizzjoni jintlaħqu malajr kemm jista’ jkun. Il-kurrent ta’ l-arja għandu jkun aġġustat sabiex jassigura li l-kundizzjonijiet matul il-kabina ta’ l-espożizzjoni jkunu omoġenji. Il-kejl jew l-moniteraġġ għandu jsir: Matul u wara l-espożizzjoni, osservazzjoni hija mwettqa u reġistrata b’mod sistematiku; dettalji individwali għandhom jinżammu għal kull annimal. L-osservazzjonijiet għandhom isiru ta’ spiss fl-ewwel jum. Mill-inqas darba kuljum għandha ssir eżaminazzjoni klinika tajba, osservazzjonijiet oħra għandhom isiru kuljum b’azzjonijiet xierqa li jittieħdu sabiex jimminimizzaw it-telf ta’ l-annimali mill-istudju, eż. In-nekropsija jew refriġerazzjoni ta’ dawk l-annimali li jinstabu mejta u l-iżolament jew il-qtil ta’ annimali dgħajfa jew qed imutu. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u l-pil, fl-għajnejn u membrani mukożji, u anki s-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tas-sistema ċentrali tan-nervituri, l-attività somatomotori u l-istil ta’ l-imġiba. Attenzjoni partikulari għandha tingħata għall-osservazzjoni ta’ l-imġiba respiratorja, it-tkexkix, il-konvulżjonijiet, ir-rieq, id-dijareja, il-letarġija, l-irqad u l-koma. Il-ħin tal-mewt għandu jittieħed kemm jista’ jkun bl-eżatt. Il-piżijiet individwali ta’ l-annimali għandhom jiġu determinati fil-ġimgħa wara l-espożizzjoni u mal-mewt. L-annimali li jmutu waqt it-test u dawk li jibqgħu ħajjin fl-aħħar tat-test huma suġġetti għan-nekropsija b’referenza partikulari għal kwalunkwe bidliet fil-parti respiratorja ta’ fuq u t’isfel. It-tibdil patoloġiku kbir għandu jiġi rrekordjat. Fejn hu indikat, għandhom jittieħdu t-tessuti għall-eżaminazzjoni ħispatoloġika.

1.6.3.

(a) tar-rata tal-kurrent ta’ l-arja (b’mod kontinwu).

(b) il-konċentrazzjoni attwali tas-sustanza tat-test imkejla fiż-żona ta’ fejn jittieħed in-nifs mill-inqas tliet darbiet waqt l-espożizzjoni (x’uħud mill-atmosferi, eż. L-aerosols f’konċentrazzjonijiet għoljin jistgħu jeħtieġu monitoraġġ iktar frekwenti). Il-konċentrazzjonijiet m’għandhomx ivarjaw b’aktar minn ± 15 % tal-medja tal-valur. B’danakollu, fil-każ ta’ uħud mill-aerosols, dan il-livell ta’ kontroll ma jistax ikun milħuq u medda aktar wiesa tkun għalhekk aċċettabbli. Għall-aerosols għandhom isiru analiżi għad-daqs tal-partiċelli kemm hemm bżonn (mill-inqas darba kull grupp ta’ test).

(ċ) tat-temperatura u l-umdità, kontinwament jekk possibbli.

2. DATA Id-data għandha tkun miġbura u mqassra f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, il-ħin tal-mewt ta’ l-annimali, in-numru ta’ l-annimali li għandhom sinjali oħra ta’ tossiċità, id-deskrizzjoni ta’ l-effetti tossiċi u s-sejbiet ta’ nekropsija It-tibdiliet fil-piż iridu jiġu kkalkulati u rrekordjati meta l-annimali jgħixu iktar minn jum wieħed. Dawk l-annimali li jmutu b’mod uman minħabba tbatija li compound-related u minħabba l-uġigħ jiġu rrekordjati bħala mwiet compound-related. L- LC50 għandu jiġi determinat permezz ta’ metodu rikonoxxut. L-evalwazzjoni tad-data għandha tinkludi r-relazzjoni, jekk ikun hemm, bejn l-espożizzjoni ta’ l-annimal għas-sustanza tat-test u l-okkorrenza u l-gravità ta’ l-anormalitajiet kollha nklużi l-anormalitajiet kliniċi u fl-imġiba, feriti, tibdil fil-piż tal-ġisem, mortalità u effetti tossiċi oħra.

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja: Data ta’ l-espożizzjoni: Dawn għandhom ikunu tabulati u preżentati mal-valuri medji u l-kejl tal-varjabbiltà (eż. devjazzjoni normali) u għandhom, meta possibbli, jinkludu:

l-ispeċi, is-silta, is-sorsi, il-kundizzjonijiet ambjentali, id-dieta, eċċ.,

il-kundizzjonijiet tat-test: Deskrizzjoni ta’ l-apparat ta’ l-espożizzjoni, inkluż id-disinn, it-tip, il-qisien, is-sorsi ta’ l-arja, is-sistema għall-ġenerazzjoni ta’ l-aerosols, metodu għall-kondizzjonar ta’ l-arja u l-metodu taż-żamma ta’ lannimali fil-kabina tat-test, meta din tkun użata. L-apparat għall-kejl tat-temperatura, l-umdità, il-koncentrazzjonijiet ta’ l-aerosol u d-distrubuzzjoni tad-daqs tal-particelli, għandhom ikunu deskritti.

3.1.

(a) ir-rati tal-kurrent ta’ l-arja matul l-apparat tat-teħid man-nifs;

(b) it-temperatura u l-umdità ta’ l-arja;

(ċ) il-konċentrazzjonijiet nominali (l-ammont totali tas-sustanza ta’ kif infuża fl-apparat tat-teħid man-nifs, diviża bil-volum ta’ l-arja);

(d) in-natura tal-mezz, jekk użat;

(e) il-konċentrazzjonijiet attwali fiż-żona tat-teħid tan-nifs waqt it-test;

(f) Il-massa tad-dijametru erodinamiku medjan (MMAD) u d-devjazzjoni ġeometrika normali (GSD);

(g) Il-perjodu ta’ l-ekwilibrazzjoni;

(h) Il-perjodu ta’ l-espożizzjoni;

it-tabulazzjoni tad-data ta’ rispons bil-livell tas-sess u espożizzjoni (i.e. in-numru ta’ annimali li mietu jew inqatlu waqt it-test, in-numru ta’ annimali li juru sinjali ta’ tossiċità; in- numru ta’ annimali esposti);

il-ħin tal-mewt matul jew wara l-espożizzjoni, ir-raġunijiet u l-kriterji użati għall-qtil uman ta’ l-annimali,

l-osservazzjonijiet kollha;

il-valur LC50 għal kull sess determinat fi tmiem il-perjodu t’osservazzjoni; (bil-metodu tal-kalkulazzjoni speċifikat);

95 % ta’ l-intervall ta’ kunfidenza għall- LC50 (fejn dan jista’ jiġi provdut);

il-kurva tad-doża/mortalità (fejn hu permess bil-metodu tad-determinazzjoni);

sejbiet tan-nekropsija;

kwalunkwe sejbiet hispatoloġiċi;

id-diskussjoni tar-riżultati (għandha tingħata attenzjoni partikulari lill-effett li l-qtil uman ta’ l-annimali waqt it-test jista’ jkollu fuq il-valur LC50 kalkulat);

deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha;

l-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. L-EVALWAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (D).

4. REFERENZI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (E).

B.3. TOSSIĊITÀ AKUTA (DERMALI)

B.3.

1. METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (A).

1.2. DEFINIZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (B).

1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA Xejn.

1.4. IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Is-sustanza tat-test tiġi applikata fuq il-ġilda f’dożi ggradwati lil bosta gruppi ta’ annimali sperimentali, doża waħda użata għal kull grupp. Sussegwentement, isiru l-osservazzjonijiet ta’ l-effetti u ta’ l-imwiet. L-annimali, li jmutu waqt it-test issirilhom in-nekropsija u fl-aħħar tat-test din issir fuq dawk l-annimali li baqgħu ħajjin. Jista’ jagħti l-każ li l-annimali li juru sinjali gravi u li jtulu ta’ tbatija u uġigħ jinqatlu b’mod uman. Is-sustanzi għat-test f’dożaġġi magħrufa li jikkawżaw l-uġigħ u t-tbatija minħabba proprjetajiet korrużivi jew ta’ irritazzjoni m’għandhomx għalfejn jitwettqu.

1.5. KRITERJI TAL-KWALITÀ Xejn

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6.

1.6.1. Preparazzjonijiet L-annimali huma miżmuma f’fondi sperimentali u f’kundizzjonijiet ta’ l-għalf għal mill-anqas ħamest ijiem qabel l-esperiment. Qabel it-test, annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma magħżula b’mod kif jinzerta u assenjati lejn gruppi għat-trattament. Xi ftit qabel it-testijiet, il-pil huwa maqtugħ miż-żona dorsali tad-dahar ta’ l-annimali tat-test. It-tqaxxir jista’ jkun użat imma għandu jkun imwettaq madwar 24 siegħa qabel it-test. Meta jsir il-qtugħ jew it-tqaxxir tal-pil, kura għandha tittieħed sabiex ikun evitat xi grif fil-ġilda li jkunu jistgħu jibdlu l-permeabbiltà tagħha. Mhux anqas minn 10 % tal-wiċċ tal-ġisem għandu jkun imnaddaf għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Meta jsiru testijiet tas-solidi, li jistgħu ikunu pulverizzati jekk xieraq, is-sustanza tat-test għandha tkun b’umidità suffiċjenti bl-ilma, jew, meta meħtieġ, apparat adattat sabiex jassigura kuntatt tajjeb mal-ġilda. Meta jiġi użat xi mezz, għandha tiġi kkunsidrata l-influwenza tiegħu fuq il-penetrazzjoni tal-ġilda bis-sustanza għat-test. Is-sustanzi għat-test likwidi ġeneralment jintużaw mhux maħlula.

1.6.2. Kundizzjonijiet tat-test

1.6.2.

1.6.2.1. Annimali sperimentali Firien jew fniek, jew fniek ta’ l-indi adulti jistgħu jintużaw. Speċje oħrajn jistgħu jiġu użati imma l-użu tagħhom ikun jeħtieġ ġustifikazzjoni. Għandhom jintużaw karatteristiċi tal-laboratorju użati b’mod komuni. Fil-bidu ta’ kull test, il-medda tal-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandhiex teċċedi ± 20 % tal-valur medju kif xieraq.

1.6.2.2. Numru u sess. Mill-anqas 5 annimali huma użati f’kull livell tad-doża. Iridu jkunu ta’ l-istess sess. Jekk jintużaw dawk femminili, dawn qatt ma jkunu welldu u mhumiex tqal. Fejn l-informazzjoni hija disponibbli li turi li s-sess partikulari huwa iktar sensittiv, l-annimali ta’ dan is-sess għandhom jingħataw id-doża. Nota: F’testijiet ta’ tossiċità akuta b’annimali t’ordni ogħla minn tal-gerriema, l-użu ta’ numri iżgħar għandu jiġi kkunsidrat. Id-dożi għandhom jingħażlu bl-attenzjoni, u għandu jsir kull sforz sabiex id-dożi li huma xi ftit tossiċi ma jinqabżux. F’testijiet bħal dawn, l-amministrazzjoni tad-dożi letali tas-sustanza għat-test għandha tiġi evitata.

1.6.2.3. Livelli tad-doża Dawn għandhom ikunu biżżejjed bħala numru, mill-inqas tlieta, u spazjati b’mod xieraq sabiex jipproduċu gruppi ta’ test b’medda ta’ effetti tossiċi u rati ta’ mortalità. Kwalunkwe effetti korrużivi jew ta’ irritazzjoni għandhom jiġu kkunsidrati meta jiġu deċiżi l-livelli tad-doża. Id-data għandha tkun biżżejjed biex tipproduċi kurva li turi d-doża/ir-rispons u, fejn hu possibbli, tippermetti determinazzjoni aċċettabbli ta’ l- LD50

1.6.2.4. Test ta’ limitazzjoni Test ta’ limitu f’livell wieħed ta’ doża ta’ mill-inqas 2000 mg/kg ta’ piż tal-ġisem jista’ jitwettaq fi gruppi ta’ 5 annimali maskili u 5 femminili, bl-użu tal-proċeduri deskritti hawn fuq. Jekk ikun hemm mortalità compound-related jista’ jiġi kkunsidrat studju sħiħ.

1.6.2.5. Perijodu ta’ l-Osservazzjoni Il-perjodu ta’ osservazzjoni għandu jkun ta’ mill-inqas 14-il jum. Madankollu, it-tul ta’ l-osservazzjoni m’għandux ikun issettjat strettament. Għandu jkun determinat mir-reazzjonijiet tossiċi, ir-rata ta’ onset tagħhom u t-tul tal-perjodu ta’ rkupru, u għalhekk jista’ jiġi estiż jekk ikun meħtieġ. Il-ħin li fih is-sinjali tat-tossiċità jidhru u jisparixxu, iż-żmien li jieħdu u l-ħin tal-mewt huma importanti, speċjalment jekk ikun hemm it-tendenza li jtulu l-imwiet.

1.6.3. Il-proċedura L-annimali għandhom jinżammu f’gaġeġ individwali. Is-sustanza għat-test għandha tiġi applikata b’mod uniformi fuq żona, li hija bejn wieħed u ieħor 10 % taż-żona totali tal-wiċċ tal-ġisem B’sustanzi ferm tossiċi, iż-żona tal-wiċċ koperta tista’ tkun anqas imma kemm jista’ jkun miż-żona għandha tkun koperta b’saff irqieq u uniformi kemm jista’ jkun possibbli Matul l-24 siegħa tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni s-sustanza tat-test tinżamm f’kuntatt mal-ġilda b’garża poruża u faxxa mhux irritanti.Is-sit tat-test għandu jkun aktar kopert b’mod xieraq sabiex iżomm il-faxxex bil-garża u s-sustanza tat-test u jassiguraw li l-annimali ma jkunux jistgħu jilgħaqu u jieklu s-sustanza tat-test. Restrizzjonijiet jistgħu jintużaw sabiex jipprevjenu l-inġestjoni tas-sustanza tat-test, imma l-immobilizzazzjoni kompleta mhix metodu rakkommandat. Fi tmiem il-perjodu ta’ l-espożizzjoni, għandhom jitneħħew ir-residwi tas-sustanza għat-test, fejn hu prattikabbli, permezz ta’ l-ilma jew xi metodu xieraq ieħor ta’ tindif tal-ġilda. L-osservazzjonijiet għandhom jiġu rrekordjati sistematikament kif isiru. Ir-rekords individwali għandhom jinżammu għal kull animal. L-osservazzjonijiet għandhom isiru ta’ spiss fl-ewwel jum. Eżaminazzjoni klinika bil-galbu għandha ssir mill-inqas darba kull ġurnata ta’ xogħol, l-osservazzjonijiet l-oħra għandhom isiru kuljum b’azzjonijiet xierqa sabiex jiġi minimizzat it-telf ta’ annimali mill-istudju eż. In-nekropsija jew ir-refriġerazzjoni ta’ dawk l-annimali li jinstabu mejta u l-iżolament jew il-qtil ta’ annimali dgħajfa jew li qed imutu. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u l-pil, fl-għajnejn u membrani mukożji, u anki fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tas-sistema ċentrali tan-nervituri; l-attività somatomotori u l-istil ta’ l-imġiba. Għandha tingħata attenzjoni partikulari għall-osservazzjoni ta’ tkexkix, konvulżjonijiet, ir-rieq, dijareja, il-letarġija, l-irqad u l-koma. Il-ħin tal-mewt għandu jiġi rrekordjat kemm jista’ jkun bl-eżatt. L-annimali li jmutu waqt it-test u dawk li jibqgħu ħajjin fi tmiem it-test huma suġġetti għan-nekropsija. It-tibdil kollu patoloġiku kbir għandu jiġi rrekordjat. Fejn hu indikat, it-tessuti għandhom jittieħdu għall-eżaminazzjoni ħispatoloġika.

1.6.3. Valutazzjoni tat-tossiċità fis-sess l-ieħor.

Wara tmiem l-istudju ta’ sess wieħed, mill-inqas grupp wieħed ta’ 5 annimali tas-sess l-ieħor jingħata d-doża biex jiġi stabbilit li l-annimali ta’ dan is-sess mhumiex iktar sensittivi għas-sustanza tat-test. L-użu ta’ inqas annimali jista’ jkun ġustifikat f’ċirkostanzi individwali. Fejn hemm informazzjoni xierqa disponibbli li turi li l-annimali tas-sess li qed jiġi ttestjat huma iktar sensittivi, l-ittestjar fuq l-annimali tas-sess l-ieħor jista’ ma jsirx.

2. DATA Id-data għandha tkun riassunta f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, il-ħin tal-mewt ta’ l-annimali individwali, in-numru ta’ l-annimali li juru sinjali oħra ta’ tossiċità, id-deskrizzjoni ta’ l-effetti tossiċi u s-sejbiet ta’ nekropsija. Il-piżijiet individwali ta’ l-annimali għandhom jiġu determinati u rrekordjati ftit qabel is-sustanza għat-test tiġi applikata. Wara, dan isir kull ġimgħa u mal-mewt it-tibdiliet fil-piż għandhom jiġu kkalkulati u rrekordjati meta l-annimali jibqgħu ħajjin sa ġurnata wara. L-annimali li jiġu maqtula b’mod uman minħabba t-tbatija u l-uġigħ li huma compound related huma rrekordjati bħala mwiet compound-related. L-LD50 għandu jiġi determinat minn metodu rikonoxxut. Il-valutazzjoni tad-data għandha tinkludi l-valutazzjoni tar-relazzjonijiet, jekk ikun hemm, bejn l-espoħizzjoni ta’ l-annimali għas-sustanza tat-test u l-okkorrenza u l-gravità ta’ l-anormalitajiet kollha, inklużi dawk ta’ imġiba u dawk kliniċi, feriti kbar, tibdil fil-piż tal-ġisem, il-mortalità u kwalunkwe effetti tossiċi oħra.

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu, jekk inhu possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

l-ispeċje, is-silta, is-sors, il-kundizzjonijiet ambjentali, dieta, eċċ.;

kundizzjonijiet tat-test (inklużu t-tip ta’ faxex: okklussivi jew mhux okklussivi);

il-livelli tad-doża (inkluż il-mezz, jekk użat, u l-konċentrazzjoninijiet);

is-sess ta’ l-annimal li qed jingħata d-doża;

it-tabulazzjoni tad-data ta’ rispons tas-sess u l-livell tad-doża (i.e. in-numru ta’ l-annimali li mietu jew inqatlu waqt it-test; in-numru ta’ annimali li juru sinjali ta’ tossiċità; in-numru ta’ annimali esposti);

il-ħin tal-mewt wara d-dożaġġ, ir-raġunijiet u l-kriterji użati għall-qtil b’mod uman ta’ l-annimali;

l-osservazzjonijiet kollha;

il-valur LD50 għas-sess suġġett għal studju komplet, determinat f’14-il jum bil-metodu ta’ determinazzjoni speċifikat;

95 % ta’ l-intervall ta’ kunfidenza għall- LD50 (fejn dan huwa provdut);

Il-kurva li turi id-doża/il-mortalità fejn hu permess bil-metodu tad-determinazzjoni

Is-sejbiet tan-nekropsija;

Kwalunkwe sejbiet ħispatoloġiċi;

Ir-riżultati ta’ kwalunkwe test fuq is-sess l-ieħor;

Id-diskussjoni tar-riżultati (b’attenzjoni partikulari għall-effett li l-qtil b’mod uman ta’ l-annimali jista’ jkollu fuq il-valur kalkulat LD50);

L-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (D).

4. REFERENZI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (E).

B.4. TOSSIĊITÀ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRUŻJONITAL-ĠILDA

B.4.

1. METODU Dan il-metodu huwa ekwivalnti għal OECD TG 404 (2002)

1.

1.1 INTRODUZZJONI Fil-preparazzjoni ta' dan il-metodu aġġornat, attenzjoni speċjali kienet mogħtija għat-titjib possibbli b'relazzjoni ma dak li jikkonċerna l-ġid ta' l-annimali u ta' l-evalwazzjoni ta' l-informazzjoni eżistenti kollha dwar is-sustanza tat-test sabiex ikunu evitati testijiet mingħajr ħtieġa ta' l-annimali fil-laboratorju. Dan il-metodu jinkludi r-rakkommandazzjonijiet li qabel ma jibda l-impenn deskritt għat-test in vivo dwar il-korrużjoni/irrirtazzjoni tas-sustanza, l-analiżi ta' l-evidenza peżata għandu jkun imwettaq skond id-dettalji relevanti eżistenti. Meta d-disponabbiltà ta' dettalji mhux suffiċċjenti, dawn jistgħu ikunu żviluppati permezz ta' l-applikazzjoni ta' testijiet sekwenzali (1). L-istrateġija tat-testijiet tinkludi t-twettieq ta' testijiet validati u aċċettabbli ta' in vitro u kemm provvediment dwarha bħala Anness ta' dan il-metodu. B'żieda, meta xieraq, l-applikazzjoni suċċessiva, minflok simultanja, tat-tlett impjastri tat-test fuq l-annimal, fit-test inizjali in vivo, hija rakkommandata. Fl-interess kemm ta' xjenza għaqlija u tal-ġid ta' l-annimali, testijiet in vivo m'għandhomx iseħħu qabel ma d-dettalji relevanti disponibbli kollha dwar il-potenzal ta' korrossività/irritazzjoni tal-ġilda mis-sustanza jkunu ġew evalwati b'analiżi tal-peżar bl-evidenza. Tali dettalji għandhom jinkludu evidenza minn studju eżistenti kemm fuq il-bnedmin u/jew l-annimali tal-laboratorju, l-evidenza ta' korrossività/irritazzjoni ta' sustanza waħda struttarament relatati u it-taħlitiet ta' tali sustanzi, id-dettalji li juru aċidità jew alkalinità qawwija tas-sustanza (2) (3), u r-riżultati minn testijiet validati u aċċettati kemm in vitro jew ex vivo (4) (5) (5a). Din l-analiżi għandha tnaqqas il-ħtieġa ta' testijiet in vivo dwar is-sustanzi b'korrossività/irritazzjoni tal-ġilda li dwarha evidenza suffiċjenti tkun diġa eżistenti minn studju oħrajn rigward iż-żewġ għanijiet aħħarija. Strateġija preferuta sekwenzali ta' testijiet, li tinkludi t-twettieq ta testijiet validati u aċċettabbli, in vitro jew ex vivo, dwar il-korrożjoni/irritazzjoni, hija inkluża bħala Anness għal dan il-metodu. L-istrateġija kienet żviluppata fi, u rakkommandata b'mod unanimu, mill-parteċipanti ta' laqgħa ta' studju ta' l-OECD (6), u kienet ġiet adottata bħala l-istrateġija rakkommandata tat-testijiet fis-Sistema Armonizzata Globali għall-Klassifika ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) (7). Huwa rakkommandabbli li din l-istrateġija tat-testijiet tkun segwita qabel ma jindew xi testijiet in vivo. Għal sustanzi ġodda huwa rakkommandabbli r-resqien ta' testijiet pass b'pass għall-iżvilupp ta' informazzjoni xjentifikament soda dwar il-korrosività/irritazzjoni mis-sustanza. Għal sustanzi eżistenti b'informazzjoni mhux suffiċjenti dwar il-korrożjoni/irritazzjoni tal-ġilda, l-istrateġija għanha tkun użata sabiex timla l-vojt fin-nuqqas tad-dettalji. L-użu ta' strateġija jew proċedura differenti tat-testijiet, jew ta' deċiżjoni li ma jkunx utilizzat it-test ta' pass b'pass, għandha tkun ġustifikata. Jekk determinazzjoni tal-korrossività jew irritazzjoni ma tkuns tista’ ssir bl-użu ta' l-analiżi tal-peżar ta' l-evidenza, konsistenti mal-istrateġija sekwenzali tat-testijiet, test in vivo għandu jkun ikkonsidrat (ara l-Anness).

1.2 DEFINIZZJONIJIET Irritazzjoni dermali (tal-ġilda): Hija l-produzzjoni ta' ħsara riversibbli tal-ġilda bħala segwiment ta' l-applikazzjoni ta' sustanza tat-test għal 4 siegħat. Korrożjoni dermali (tal-ġilda): Hija l-produzzjoni ta' ħsara irrevirsibbli tal-ġilda nekrożi viżibbli mill-epidermis u sa ġewwa d-dermis, bħala segwiment ta' l-applikazzjoni ta' sustanza tat-test għal sa 4 siegħat. Ir-reazzjonijiet korrossivi huma tipifikati b'ulċeri, nixxija ta' demm, qoxra bid-demm, u, fit-tmiem ta' l-osservazzjoni matul 14-il jum, b'tibdil tal-kulur minħabba l-bjudija tal-ġilda, żoni sħaħ bi alopecia u farretti. Il-ħispatoloġija għandha tkun ikkonsidrata sabiex tevalwa feriti dubbjużi.

1.3 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Is-sustanza li għandha tkun ittestjata hija applikata f'doża singola mal-ġilda ta' annimal sperimentli; żoni tal-ġilda mhux trattati ta' l-annimal tat-test iservu għall-kontroll. Il-grad tal-korrożjoni/irritazzjoni ikun moqri u rreġistrat matul intervalli speċifiċi u jkun aktar deskritt sabiex jipprovdi evalwazzjoni sħiħa ta' l-effetti. It-tul ta' żmien ta' l-istudju għandu jkun suffiċjenti sabiex tkun evalwata r-riversabbilità jew in-nuqqas ta' riversabbilità ta' l-effetti osservati. L-annimali li juru sinjali kontinwi ta' dwejjaq u/jew uġiegħ severi, fi kwalunkwe waqt tat-test, għandhom ikunu maqtula b'mod umanitarju, u s-sustanza tkun assessjata kif xieraq. Il-kriterja sabiex tittieħed id-deċiżjoni li jkunu maqtula b'mod umanitarju l-annimali moribondi jew li jkunu jsofru ħafna tista’ tinstgħab fir-referenza (8).

1.4 DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4

1.4.1 Preparazzjoni tat-test in vivo

1.4.1

1.4.1.1 L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali Il-fenek albino huwa l-annimal preferut tal-laboratorju, u fniek żgħażagħ adulti huma użati. Ir-raġuni għall-użu ta' speċje oħrajn għandha tkun mogħtija.

1.4.1.2 Preparazzjoni ta' l-annimali Madwar 24 siegħa qabel it-test, is-suf għandu jkun imneħħi bi tqaxxir taż-żona dorsali minn fuq id-dhar ta' l-annimali. Kura għandha tingħata li jkunu evitati xi brix tal-ġilda, u biss l-anniamli li huma b'saħħithom, b'ġilda ntatta, għandhom ikunu użati. Uħud mit-tip tal-fniek għandhom irqajja folti ta' suf li huma aktar prominenti f'ċerti żminijiet tas-sena. Tali żoni ta' tkabbir ta' suf folt m'għandhomx ikunu użati bħala s-siti tat-testijiet.

1.4.1.3 Il-kundizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf L-annimali għandhom jinzammi f'gaġġeġ individwali. It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 20 oC (± 3 oC), għall-fniek. Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb.

1.4.2 Proċedura tat-test

1.4.2

1.4.2.1 L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test Is-sustanza tat-test għandha tkun applikata fuq żona żgħira (madwar 6 cm2) tal-ġilda u miksija b'biċċa garża, li tinżamm fil-post bi stikk mhux irritanti. Fil-każi meta l-applikazzjoni diretta ma tkunx possibbli (eż. likwidi u ċerti dlik), is-sustanza tat-test għandha l-ewwel tkun applikata fuq biċċa garża, li imbagħad tkun applikata mal-ġilda. Il-biċċa għandha tinżamm f'kuntatt ħafif mal-ġilda permezz ta' faxxa adattata semi-okklussiva, għal matul il-perjodu ta' l-espożizzjoni. Jekk is-sustanza tat-test tkun applikata fuq biċċa, din għandha tkun imwaħħla mal-ġilda b'tali mod li jkun hemm kuntatt tajjeb u distribuzzjoni uniformi tas-sustanza mal-ġilda. Aċċess mill-annimal lejn il-biċċa, jew l-inġestjoni li t-teħid man-nifs tas-sustanza tat-test m'għandux jitħalla li jseħħ. Is-sustanzi likwidi huwa ġeneralment użati mingħajr ma jkunu mrattba. Meta jsiru t-testijiet ta' solidi (li jistgħu ikunu pulverizzati, jekk hekk ikun meqjus bħala meħtieġ), is-sustanza tat-test għandha tkun niedja b'ammont żgħir ilma (jew, meta meħtieġ, b'xi likwidu adattat ieħor) li jkun suffiċjenti sabiex jassigura kuntatt tajjeb mal-ġilda. Meta likwidi oħrajn apparti milli l-ilma jkunu użati, l-influwenza potenzali tal-likwidu fuq l-irritazzjoni tal-ġilda mis-sustanza tat-test għand tkun ferm minima, jekk ikun hemm. Fit-tmiem tal-perjodu ta' l-espożizzjoni, li normalment ikun ta' 4 siegħat, is-sustanza residwa tat-test għandha tkun imneħħija, meta prattikabbli, bl-użu ta' ilma jew b'xi solvent xieraq mingħajr ma jbiddel ir-reazzjoni eżistenti jew l-integrità ta' l-epidermis.

1.4.2.2 Livell tad-doża Doża ta' 0,5 ml likwidu jew 0,5 g solidu jew dlik hija applikata maż-żona tat-test.

1.4.2.3 It-test inizjali (It-test in vivo bl-irritazzjoni/korrożjoni dermali bl-użu ta' annimal wieħed) Huwa ferm rakkommandabbli li t-test in vivo jkun imwettaq inizjalment bl-użu ta' annimal wieħed, speċjalment meta s-sustanza tkun issusspetata li jkollha potenzal korrossiv. Dan huwa skond l-istrateġija tat-testijiet sekwenzali (ara l-Anness 1). Meta sustanza tkun ġiet iġġudikata bħala korrossiva fuq il-bażi ta' l-analiżi ta' l-evidenza peżata, l-ebda aktar testijiet fuq l-annimali ma jkunu meħtieġa. Għal bosta mis-sustanzi li huma issusspettati bħala korrossivi, aktar testijiet in vivo ma jkunux normalment meħtieġa. B'dana kollu, f'dawk il-każi meta informazzjoni addizzjonali tinħass li tkun meħtieġa minħabba l-evidenza mhux suffiċjenti, testijiet limitati ta' l-annimali jistgħu jitwettqu bl-użu ta' dan il-metodu: Sa tlett biċċiet tat-test huma applikati b'mod sekwenzali fuq l-annimal. L-ewwel biċċa tkun imneħħija wara tlett minuti. Jekk l-ebda reazzjoni tal-ġilda ma tkun osservata, it-tieni biċċa tkun applikata u mneħħija wara siegħa. Jekk l-osservazzjonijiet f'dan l-istadju jindikaw li l-espożizzjoni tista’ titħalla b'mod umanitarju, allura t-test ikun estiż għal erba' siegħat, it-tielet biċċa tkun applikata u mneħħija wara erba' siegħat, u r-reazzjoni tkun gradata. Jekk effett korrossiv ikun osservat wara kwalunkwe mit-tlett espżizzjonijiet sekwenzali, it-test ikun immedjetament terminat. Jekk effett korrossiv ma jkunx osservat wara li l-aħħar biċċa tkun imneħħija, l-annimal ikun osservat għal 14-il jum, sakemm il-korrożjoni ma tkunx żviluppat f'xi punt aktar kmieni. F'dawk il-każi li fihom is-sustanza tat-test ma tkunx mistennija li tipproduċi korrożjoni imma li tista’ tkun irritanti, biċċa waħda għandha tkun applikata ma annimal wieħed għal erba' siegħat.

1.4.2.4 Test konfermatorju (It-test in vivo ta' l-irritazzjoni tal-ġilda b'annimali addizzjonali) Jekk effett korrossiv ma jkunx osservat fit-test inizjali, l-irritant jew ir-reazzjoni negattiva għandhom ikunu ikkonfermati bl-użu ta' żewġ annimali oħrajn, kull wieħed b'biċċa waħda, għal perjodu ta' espożizzjoni ta' erba' siegħat. Jekk effett irritanti jkun osservat fit-test inizjali, it-test konfermatorju jista’ jitwettaq b'mod sekwenzali, jew bl-espożizzjoni ta' żewġ annimali simultanjament. Fil-każ eċċezzjoni, li fih it-test inizjali ma jkunx imwettaq, tnejn jew tlett annimali jistgħu ikunu ittrattati b'biċċa waħda, li tkun imneħħija wara erba' siegħat. Meta żewġ annimali huma użati, jekk it-tnejn li huma juru l-istess reazzjoni, l-ebda testijiet oħrajn ma huma meħtieġa. Inkella, it-tielet annimal ikun ukoll ittestjat. Reazzjonijiet ekwoviċi ikunu jeħtieġu avalwazzjoni bl-użu ta' annimali addizzjonali.

1.4.2.5 Perijodu ta' osservazzjoni It-tul ta' żmien ta' l-istudju gġandu jkun suffiċjenti sabiex tkun evalwata r-riversabbiltà jew in-nuqqas ta' riversabbiltà ta' l-effetti osservati. B'dana kollu l-esperiment għandu jkun terminat fi kwalunkwe ħin jekk dak l-annimal ikollu sinjali kontinwi ta' uġiegħ jew tbagħtija qawwija. Sabiex ikunu determinati l-effetti tar-riversabbilità, l-annimali għandhom ikunu osservati sa 14-il jum wara t-tneħħija tal-biċċiet. Jekk l-irriversibbiltà tkun osservata qabel l-14-il jum, l-esperiment għandu jkun imwaqqaf f'dak il-waqt.

1.4.2.6 Osservazzjonijiet kliniċi u l-iggradar tar-reazzjonijiet tal-ġilda L-annimali kollha għandhom ikunu eżaminati għal sinjali ta' eritema u odema, u r-reazzjoni rreġistrati wara 60 minuta, u imbagħad fi 24, 48 u 72 siegħa, wara t-tneħħija tal-biċċa. Għattest inizjali fuq annimal wieħed, is-sit tat-test ikun ukoll eżaminat immedjetament wara li l-biċċ tkun imneħħija. Ir-reazzjoni dermali huma ggradati u rreġistrati skond il-gradi fit-tabella ta' hawn taħt. Jekk ikun hemm ħsara għall-ġilda li ma tistgħax tkunidentifikata bħala irritazzjoni jew korrożjoni wara 72 siegħa, l-osservazzjonijiet jistgħu ikunu meħtieġa sal-jum 14 sabiex tkun determinata r-riversibbiltà ta' l-effetti. B'żieda ma l-osservazzjonijiet ta' l-irritazzjoni, l-effetti tossiċi kollha, bħal ma huma n-nuqqas ta' xaħam min taħt il-ġilda, u xi effett kuntrarji sistematiċi (eż. l-effetti fuq sinjali kliniċi ta' tossiċità u l-piż tal-ġisem), għandhom ikunu deskritti bis-sħiħ u rreġistrati. L-eżaminazzjoni ħistoġatoloġika għandha tkun ikkonsidrata sabiex tikklarifika r-reazzjonijiet b'mod ekwivoku. Il-gradar tar-reazzjonijiet tal-ġilda hija neċċessarjament suġġestiva. Sabiex tkun imħġeġġa l-armonizzazzjoni fil-gradar tar-reazzjoni tal-ġilda u sabiex ikunu mgħejjuna l-laboratorji tat-testijiet u dawk involuti fiż-żamma ta' l-osservazzjonijiet u ta' l-interpretazzjoni tagħhom, il-persunal li jwettaq l-osservazzjonijiet jeħtieġu li jkunu adekwatament imħarrġa fis-sistema ta' l-iggradat kif użata (ara t-Tabella ta' hawn taħt). Gwida illustrata dwar l-iggradar ta' l-irritazzjoni tal-ġilda u feriti oħrajn tista’ tkun ta' għajnuna (9).

2. DATA

2.

2.1 PREŻENTAZZJONI TAR-RIŻULTATI Ir-riżultati ta' l-istudju għandhom ikunu miġbura f'sommarju f'għamla tabulari fir-rapport finali tat-test u għandhom ikopru l-punti kollha elenkati fis-sezzjoni 3.1.

2.2 EVALWAZZJONI TAR-RIŻULTATI Il-marki ta' l-irritazzjoni dermali għandhom ikunu evalwati b'konnessjoni man-natura u s-severità tal-feriti, u r-riversibbilità tagħhom, jew tan-nuqqas ta' riversibbilità. Il-marki individwali ma jkunux jirrapreżentaw norma assoluta għall-propjetajiet irritanti ta' xi materjaa, minħabba li effetti oħrajn tal-materjal taat-test huma wkoll evalwati. Minflok, marki individwali għandhom ikunu meqjusa bħala valuri ta' referenza, li jeħtieġu li jkunu evalwati flimkien ma l-osservazzjonijiet l-oħrajn kolha li jirriżultaaw mill-istudju. Ir-riversibbilità tal-feriti dermali għandha wkoll tkun ikkunsidrata fl-evalwazzjoni tar-reazzjoni irritanti. Meta r-reazzjonijiet bħal ma huma l-alopeċja (żoma limitat), iperkeratożi, iperplażja u qxur, jippersistu fit-tmiem talk-perjodu ta' 14-il jum osservazzjoni, is-sustanza tat-test għandha tkun meqjusha bħala irritanti.

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1 RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Raġġunar dwar it-test in vivo: Analiżi ta' l-evidenza mal-piż ra' informazzjoni pre-eżistenti qabel it-test, inklużi r-riżultati minn strateġija ta' testijiet sekwenzali:

deskrizzjoni tad-dettalji relevanti disponibbli minn testijiet preċedenti;

informazzjoni akkwistat f’kull stadju ta’ l-istrateġija ta’ l-ittestjar;

deskrizzjoni tat-testijiet in vitro kif imwettqa, inklużi d-dettalji tal-proċeduri, ir-riżultati akkwistati bis-sustanza tat-test/referenza;

analiżi ta’ l-evidenza peżata għat-twettieq ta’ l-istudju in vivo.

Is-sustanza tat-test:

dettalji ta’ l-identifikazzjoni (eż. numru CAS; sorsi; purità; impuritajiet magħrufa; n-numru tal-lot);

in-natura fiżika u l-propjetajiet fiżikokimiċi (eż. pH, volatilità, solubilità, stabbilità);

jekk taħlita, il-komposizzjoni u l-persentaġġi relattivi tal-komponenti.

Mezz:

l-identifikazzjoni, il-konċentrazzjoni (meta xieraq), il-volum użat;

il-ġustifikazzjoni tal-mezz użat.

Annimali tat-test:

l-ispeċji/tipi użati, ir-raġjunar għall-użu ta’ l-annimali apparti milli fniek albino;

in-numru ta’ l-annimaali għal kull sess;

il-piżijiet ta’ l-annimali individwali, kemm fil-bidu u wkoll fil-konklużjoni tat-test;

l-età fil-bidu ta’ l-istudju;

is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, eċċ.

Kundizzjonijiet tat-test:

it-teknika taal-preparazzjoni tas-sit tal-biċċa;

id-dettalji tal-materjali użat fil-biċċa u t-teknika tat-twaħħil tal-biċċa;

dettalji dwar il-preparazzjoni, l-applikazzjoni u t-tneħħija tas-susstanza tat-test.

Riżultati:

tabulazzjoni tal-marki tar-reazzjoni/korrożjoni għal kull annimal fil-punti kollha tal-ħin tal-kejl;

deskrizzjonijiet tal-feriti kollha, kif osservati;

deskrizzjoni narrattiva tan-natura u l-grad ta’ l-irritazzjoni jew tal-korrożjoni osservati, u xi sejbiet ħistopatoloġiċi;

id-deskrizzjoni ta’ xi Danni lokali oħrajn (eż. tneħħija tax-xaħam minn taħt il-ġilda) u l-effetti sistematiċi b’żieda ma l-irritazzjoni jew il-korrożjoni dermali.

Diskussjoni tar-riżultati.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)

REFERENZI Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In vitro, 2, 19-26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720. ECETOC (1990) Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). 1. L-istudju ECVAM tal-validazzjoni internazzjonali dwar testijiet in vitro għall-korrossività tal-ġilda. 2. Ir-riżultati u l-evalwazzjoni mill-Grupp Amministrattiv Toxicology in vitro 12, pp. 483-524. Metodu tat-test B.40, Korrożjoni tal-Ġilda Programm ta’ Linji ta’ Gwida għat-Test OECD (1996): Rapport Finali tal-Grupp ta’ Studju OECD dwar l-Armonizzazzjoni tal-Validazzjoni u l-Aċċettazzjoni tal-Kriterja dwar Metodi Alternattivi għal-Testijiet Tossikoloġiċi. Li kien inżamm fi Solna, l-Isvezjam fit-22 – 24 ta’ Jannar 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998), Is-Sistema tal-Klassifika Integrata Armonizzata tal-Perikoli għas-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kumiċi, kif approvat mit-28 Laqgħa Konġunta tal-Kumitat tal-Kimika u tal-Grupp ta’ Ħidma dwart il-Kimika, Novembru 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Dokument ta’ Gwida dwar ir-Rikonoxximent, l-Assessjar u l-Użu ta’ Sinjali Kliniċi bħala għanijiet finali umanitarji għall-annimali Sperimenti Użati fl-Evalwazzjoni tas-Sigurtà. OECD, Pubblikazzjonijiet dwar is-Saħħa u s-Sigurtà Ambjentali. Serje dwar it-Testijiet u l-Assessjar Nru. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas tal-Feriti Dermali, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. ; (Disponibbli ma talba minn għand is-Segretarjat ta’ l-OECD).

Tabella I Il-Formazzjoni ta’ l-Eritema u l-Eskar Formazzjoni ta’ l-odema IGGRADAR TAR-REAZZJONIJIET TAL-ĠILDA

L-ebda eritema … 0 Eritema ferm ħafifa (bill-kemm tidher) … 1 Eritema definita sewwa … 2 Eritima moderata jew severa … 3 Eritema severa (ħmura ta’ laħam nej) għall-formazzjoni ta’ l-eskar għall-prevenzjoni ta’ l-eritema gradata … 4 Massimu possibli: 4 L-ebda oredma … 0 Odema ferm ħafifa (bill-kemm tidher) … 1 Odema ħafifa (it-trufijiet taż-żona definiti sewwa b’ħanek definit) … 2 Odema moderata (imqabbża b’madwar 1 mm) … 3 Odema severa (imqabbża b’aktar minn 1 mm u testendi lil hinn miż-żona esposta) … 4 Massimu possibli: 4 L-eżaminazzjoni ħistoġatoloġika għandha titwettaq sabiex tikklarifika r-reazzjonijiet b’mod ekwoviku.

B.5. TOSSIĊITÀ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRUŻJONI TA' L-GĦAJNEJN

B.5.

1. METODU Dan il-metodu huwa ekwivalnti għal OECD TG 405 (2002)

1.

1.1 INTRODUZZJONI Fil-preparazzjoni ta' dan il-metodu aġġornat, attenzjoni speċjali kienet mogħtija għat-titjib possibbli b'relazzjoni ma dak li jikkonċerna l-ġid ta' l-annimali u ta' l-evalwazzjoni ta' l-informazzjoni eżistenti kollha dwar is-sustanza tat-test sabiex ikunu evitati testijiet mingħajr ħtieġa ta' l-annimali fil-laboratorju. Dan il-metodu jinkludi r-rakkommandazzjonijiet li qabel ma jibda l-impenn deskritt għat-est in vivo dwar il-korrużjoni/irrirtazzjoni tas-sustanza, l-analiżi ta' l-evidenza peżata għandu jkun imwettaq (1) skond id-dettalji relevanti eżistenti. Meta d-disponabbiltà ta' dettalji mhux suffiċċjenti, dawn jistgħu ikunu żviluppati permezz ta' l-applikazzjoni ta' testijiet sekwenzali (2)(3). L-istrateġija tat-testijiet tinkludi it-twettieq ta' testijiet validati u aċċettabbli ta' in vitro u kemm provvediment dwarha bħala Anness ta' dan il-metodu. B'żieda, l-użu tat-test in vivo ta' l-irritazzjoni/korrużjoni dermali, sabiex ikun hemm tbassir tal-korrużjoni ta' l-għajnejn qabel il–kunsiderazzjoni tat-test in vivo ta' l-għajnejn, huwa rakkommandabbli. Fl-interess kemm ta' xjenza għaqlija u tal-ġid ta' l-annimali, testijiet in vivo m'għandhomx iseħħu qabel ma d-dettalji relevanti disponibbli kollha dwar il-potenzal ta' korrossività/irritazzjoni tal-ġilda mis-sustanza jkunu ġew evalwati b'analiżi tal-peżar bl-evidenza. Tali dettalji għandhom jinkludu evidenza minn studju eżistenti kemm fuq il-bnedmin u/jew l-annimali tal-laboratorju, l-evidenza ta' korrossività/irritazzjoni ta' sustanza waħda struttarament relatati u it-taħlitiet ta' tali sustanzi, id-dettalji li juru aċidità jew alkalinità qawwija tas-sustanza (4) (5), u r-riżultati minn testijiet validati u aċċettati kemm in vitro jew ex vivo (6) (6a). L-istudji setgħu kienu ġew imwettqa preċedentament għal, jew bħala riżultat ta', l-analiżi ta' l-evidenza peżata. Għal-ċerti sustanzi, tali analiżi tista’ tindika l-ħtieġa għal studji in vivo dwar il-potenzal tas-sustanza għal korrożjoni/irritazzjoni okulari. F'tali każi, qabel ma jkun ikkunsidrat l-użu tat-test in vivo fuq l-għajnejn, studju preferibbilemt in vivo ta' l-effetti dermali mis-sustanza għandu jkun l-ewwel nett imwettaq u evalwat bi qbil mal-metodu tat-testijiet B.4 (7). L-applikazzjoni ta' l-analiżi ta' l-evidenża peżata u ta' l-istrateġija sekwenzali tat-testijiet għandhom inaqqsu l-ħtieġa tat-testijiet in vivo dwar il-korrossività/irritazzjoni ta' l-għajnejn mis-sustanza li dwarha evidenza suffiċjenti tkun diġa teżisti minn studju oħrajn. Jekk id-determinazzjoni tal-potenzal tal-korrożjoni jew l-irritazzjoni ta' l-għajnejn ma tistgħax issir bl-istrateġija tat-testijier sekwenzali, anki wara t-twettieq ta' studju in vivo tal-korrożjoni u l-irritazzjoni dermali, test in vivo tal-korrożjoni/irritazzjoni ta' l-għajnejn jista’ jkun imwettaq. Strateġija preferuta sekwenzali ta' testijiet, li tinkludi t-twettieq ta' testijiet validati u aċċettabbli, in vitro jew ex vivo, dwar il-korrożjoni/irritazzjoni, hija inkluża bħala Anness għal dan il-metodu. L-istrateġija kienet żviluppata fi, u rakkommandata b'mod unanimu, mill-parteċipanti ta' laqgħa ta' studju ta' l-OECD (8), u kienet ġiet adottata bħala l-istrateġija rakkommandata tat-testijiet fis-Sistema Armonizzata Globali għall-Klassifika ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) (9). Huwa rakkommandabbli li din l-istrateġija tat-testijiet tkun segwita qabel ma jindew xi testijiet in vivo. Għal sustanzi ġodda huwa rakkommandabbli r-resqien ta' testijiet pass b'pass għall-iżvilupp ta' informazzjoni xjentifikament soda dwar il-korrosività/irritazzjoni mis-sustanza. Għal sustanzi eżistenti b'informazzjoni mhux suffiċjenti dwar il-korrożjoni/irritazzjoni tal-ġilda, l-istrateġija għanha tkun użata sabiex timla l-vojt fin-nuqqas tad-dettalji. L-użu ta' strateġija jew proċedura differenti tat-testijiet, jew ta' deċiżjoni li ma jkunx utilizzat it-test ta' pass b'pass, għandha tkun ġustifikata.

1.2 DEFINIZZJONIJIET Irritazzjoni għal għajnejn: Hija l-produzzjoni ta' tibdiliet fil-għajnejn b'segwiment ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test mal-part esterna ta' l-għajn, li huma kompletament riversibbli xi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Korrożjoni ta' l-għajnejn: Hija l-produzzjoni ta' tibdiliet fil-għajnejn b'segwiment ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test mal-part esterna ta' l-għajn, li huma kompletament riversibbli xi żmien 21 jum mill-applikazzjoni.

1.3 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Is-sustanza tat-test hija applikata f'doża singola ma waħda mill-għajnejn ta' l-annimal tal-prova; l-għajn mhux trattata isservi bħala kontroll. Il-grad ta' l-irritazzjoni/korrożjoni ta' l-għajn huwa evalwat billi jkunu immarkati l-feriti ta' konġunktiva, l-kornea, u l-iris, matul intervalli speċifiċi. Effetti oħrajn fil-għajn u l-effetti kuntrarji sistematiċi huma wkoll deskritti sabiex jipprovdu evalwazzjoni sħiħa ta' l-effetti. It-tul ta' żmien ta' l-istudju għandu jkun suffiċjenti sabiex tkun evalwata r-riversabbilità jew in-nuqqas ta' riversabbilità ta' l-effetti osservati. L-annimali li juru sinjali kontinwi ta' dwejjaq u/jew uġiegħ severi, fi kwalunkwe waqt tat-test, għandhom ikunu maqtula b'mod umanitarju, u s-sustanza tkun assessjata kif xieraq. Il-kriterja sabiex tittieħed id-deċiżjoni li jkunu maqtula b'mod umanitarju l-annimali moribondi jew li jkunu jsofru ħafna tista’ tinstgħab fir-referenza (10).

1.4 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4

1.4.1 Preparazzjoni tat-test in vivo

1.4.1

1.4.1.2 Preparazzjoni ta' l-annimali Iż-żewġ għajnejn ta' kull annumal sperimentali proviżjonalment magħżul għat-testijiet għandu jkun eżaminat fi żmien 24 siegħa qabel ma jibda t-test. L-annimali li juru irritazzjoni fl-għajnejn, difetti okulari, jew li ħsara korneali pre-eżistenti m'għandhomx ikunu użati.

1.4.2 Proċedura tat-test

1.4.2

1.4.2.1 L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test Is-sustanza tat-test għandha tkun imqiegħda fuq il-ħofra konġunktivali ta' waħda mill-għajnejn ta' kull annimal wara li l-għatu tan-naħa t'isfel ta' l-għajn ikun inġibed lil himm mill-boċċa ta' l-għajn. Il-għotjien jkunu imbagħad b'ġentilezza miżmuma flimkien għal madwar sekonda sabiex ikun prevenut it-telf tal-materjal. L-għajn l-oħra, li tibqa mingħajr trattament, isservi bħala kontroll.

1.4.2.2 Irrigazzjoni L-għajnejn ta' l-annimali tat-test m'għandhomx ikunu maħsula għal mill-anqas 24 siegħa wara li tkun saret l-istallazzjoni tas-sustanza tat-test, apparti milli fil-każ ta' solidi (ara s-sezzjoni 1.4.2.3.2), u fil-każ ta' effetti korrossivi jew irritanti immedjati. Wara 24 siegħa, hasla sewwa tista’ ssir jekk dan ikun meqjus bħala xieraq. L-użu ta' grupp satellit ta' annimali għall-inverigazzjoni ta' l-infuwenza tal-ħasil mhux rakkommandabbi, sakemm ma jkunx xjetifikament ġustifikat. Jekk grupp satellit ikun meħtieġ, għandhom ikunu użati żewġt ifniek. Il-kundizzjonijiet tal-ħasil gġandhom ikunu dokumentati bir-reqqa, eż. il-ħiun tal-ħasil; il-komposizzjoni u t-temperatura tat-taħlita tal-ħasil; it-tul ta' żmien, il-volum, u l-veloċità ta' l-applikazzjoni.

1.4.2.3 Livell tad-doża

1.4.2.3

1.4.2.3.1 It-testijiet tal-likwidi Għat-testijiet tal-likwidi, doża ta' 0,1 ml hija użata. Tbexxix bil-pompa m'għandux ikunu użat għall-istallazzjoni diretta ġewwa il-għajn. It-tbexxix tal-likwidu għandu jkun imneħħi u miġbur f'kontenitur qabel ma jkun installat 0,1 ml ġewwa l-għajn.

1.4.2.3.2 Testijiet tas-solidi Meta jsiru t-testijiet ta' solidi, dlik, u sustanzi partikolati, l-ammont użat għandu jkollu volum ta' 0,1 ml jew ġiż ta' mhux aktar minn 100 mg. Il-materjal tat-test għandu jkun mitħun fi trab fin. Il-volum tal-materjal solidu għandu jkun imkejjel wara li jkun kumpatt b'ġentilezza, eż. bit-tektik tal-kontenitur tal-kejl. Jekk is-sustanza solida tat-test ma tkun ġiet imneħħija mill-għajn ta' l-annimal tat-tesr b'mekkaniżmi fiżjoloġiċi waqt l-ewwel punt fil-ħin ta' l-osserazzjoni ta' siegħa wara t-trattament, il-għajn tista’ tkun imlaħalħa b'ilma bil-melħ jew distillat.

1.4.2.3.3 Testijiet ta' aerosols Huwa rakkommandat li t-tbexxix kollu bil-pompa u l-aerosols ikun miġbur qabel l-istallazzjoni ġewwa l-għajn. L-eċċezzjoni waħda hija għas-sustanzi f'kontenituri aerosol taħt pressjoni, li ma jistgħux ikunu miġbura minħabba l-vaporizzazzjoni. F'tali każi, l-għajn għandha tinżamm miftuħha, u s-sustanza tat-test somministrata fuq l-għajn bi spunt wieħed għal madwar sekonda, minn distanza ta' 10 cm, direttament minn quddiem il-għajn. Din id-distanza tista’ tvarja jiddependi mill-pressa tat-tbexxix u l-kontenuti. Kura għandha tittieħed li ma ssirx ħsara lill-għajn mill-pressa tat-tbexxix. F'każi xierqa, jista’ jkun hemm il-ħtieġa li jkun evalutat il-potenzal dwar ħsara mekkaanika ta' l-għajn mill-qawwa tat-tbexxix. Estimi tad-doża minn aerosol jistgħu isiru bit-test tas-simulazzjoni kif ġej: Is-sustanza hija mbexxa fuq karta ta' l-użin minn fetħa d-daqs ta' għajn ta' fenek imqiegħda direttament qabel il-karta. Iż-żieda fil-piż tal-karta hija użata sabiex ikun ikkalkolat l-ammont imbexxex fuq il-għajn. Għal sustanzi volatili, id-doża tista’ tkun ikkalkolata bl-użin ta' kontenitur riċevitur qabel u wara t-tneħħija tal-matyerjal tat-test.

1.4.2.4 It-test inizjali (It-test in vivo bl-irritazzjoni/korrożjoni ta' l-għajn bl-użu ta' annimal wieħed) Kif spjegat fl-istrateġija sekwenzali tat-testijiet (ara l-Anness 1), huwa ferm rakkommandabbli li t-test in vivo ikun imwettaq inizjalment bl-użu ta' annimal wieħed. Jekk ir-riżultati ta' dan it-test jindikaw li s-sustanza tkun severament irritanti jew korrosiva għall-għajnejn bl-użu tal-proċedura deskritta, aktar testiet dwar l-irritazzjoni okulari ma jkunx meħtieġa.

1.4.2.5 Anastesija lokali L-anastesija lokali tista’ tkun użata fuq il-bażi ta' każ b'każ. Jekk l-analiżi ta' l-evidenza peżata jindika li s-sustanza jkollha l-potenzal li tikkaġuna l-uġiegħ, jew jekk test inizzjali juri li reazzjoni ta' uġiegħ tkun tirriżulta, anastesija lokali tista’ tkun użata qabel l-istallazzjoni tas-sustanza tat-test. It-tip, il-konċentrazzjoni, u d-doża ta' l-anastesija lokali għandhom ikunu magħżula bir-reqqa sabiex jassiguraw li d-differenzi fir-reazzjoni għas-sustanza tat-test ma jkunux jirriżultaw mill-użu tiegħu. Il-għajn tal-kontrol għandha bl-istess mod tkun anastetizzata.

1.4.2.6 Test konfermatorju (It-test in vivo ta' l-irritazzjoni ta' l-għajn b'annimali addizzjonali) Jekk effett korrossic ma jkunx osservat fit-test inizjali, ir-reazzjoni irritanti jew negattiva għandha tkun ikkonfermata bl-użu ta' sa żewġ annimali addizzjonali. Jekk effett irritanti sever ikun osservat fit-test inizjali li jindika l-possibbiltà ta' effett qawwi (mhux riversibbli) fit-testijiet konformatorji, huwa rakkommandat li t-test konformatorju jkun imwettaq b'manjera sekwenzali fuq annimal wieħed kull darba, pjuttost milli l-espożizzjoni ta' żewġ annimali b'mod simultanju. Jekk it-tieni annimal jiżvela effetti severi korrossivi jew irritanti, it-test m'gġandux jitkompla. Annimali addizzjonali jistgħu ikunu meħtieġa sabiex jikkonfermaw ir-reazzjonijiet ħfief jew moderati ta' l-irritant.

1.4.2.7 Perijodu ta' osservazzjoni It-tul ta' żmien ta' l-istudju għandu jkun suffiċjenti sabiex tkun evalwata r-riversabbilità jew in-nuqqas ta' riversabbilità ta' l-effetti osservati. B'dana kollum l-esperiment għandu jkun terminat fi kwalunkwe ħin jekk dak l-annimal ikollu sinjali kontinwi ta' uġiegħ jew tbagħtija qawwija. Sabiex ikunu determinati l-effetti riversibbli, l-annimali għandhom ikunu osservati normalment għal 21 jum wara l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test. Jekk l-irriversibbiltà tkun osservata qabel l-21 jum, l-esperiment għandu jkun imwaqqaf f'dak il-waqt.

1.4.2.7

1.4.2.7.1 Osservazzjonijiet kliniċi u l-iggradar tar-reazzjonijiet ta' l-għajn L-għajnejn għandhom ikunu eżaminati fi 1, 24, 48 u 72 siegħa wara l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. L-annimali għandhom jinżammu fit-test mhux aktar milli meħtieġ la darba informazzjoni definita tkun ġiet akkwistata. L-annimali li juru kon tinwament uġiegħ u tbagħtija severa għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk, mingħajt dewmien, u s-sustana tkun assessjata kif applikabbli. L-annimali b'dawn il-feriti ta' l-għajnejn wara li jkun kellhom l-istallazzjoni għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk: Xi toqba fil-kornea jew ulċera sinifikanti tal-kornea, inkluża s-stafiloma; demm fil-parti anterjuri ta' l-għajn; opaċità grad 4 tal-kornea li tippersisti għal 48 siegha; nuqqas ta' reazzjoni għad-dawl (nuqqas ta' reazzjoni radiali grad 2) li tippersisti għal 72 siegha; ulċera fil-membrana konjunktivali; nekrożi tal-membrana konjunktivali jew niktitanti; jew qoxra mejta. Dan huwa minħabba l-fatt li tali feriti, ġeneralment, ma humiex riversibbli. L-annimali li ma jiżviluppawx feriti okulari jistgħu ikunu mneħħija mhux aktar kmieni minn 3 ijiem wara l-istallazzjoni. L-annimali b'feriti ħfief jew moderati għandhom ikunu osservati sakemm il-ferita tkun fieqet, jew għal 21 jum, f'liema waqt l-istudju jkun terminat. L-osservazzjonijiet għandhom ikunu mwettqa fi 7, 14, u 21 jum sabiex ikun determinat l-istat tal-feriti, u r-riversabbiltà jew in-non-riversabbiltà tagħhom. Il-gradi tar-reazzjoni okkulati (konġunktiva, kornea u iris) għandhom ikunu irreġistrati wara kull eżami (Tabella I). Xi feriti oħrajn ta' l-għajnejn (eż. imtappna, imtebba) jew effetti ħżiena sistematiċi għandhom ukoll ikunu rrapurtati. L-eżami tar-reazzjonijiet jistgħu ikunu faċilitati bl-użu tal-loupe binokulari, lampa-maqsuma ta' l-idejn, biomikroskopju, jew xi apparat ieħor xieraq. Wara r-reġistrazzjoni ta' l-osservazzjoni fi 24 siegħa, il-għajnejn jistgħu wkoll ikunu eżaminati bil-għajnuna tal-florixxin. Il-gradar tar-reazzjonijiet okulari hija neċċessarjament suġġestiva. Sabiex tkun imħġeġġa l-armonizzazzjoni fil-gradar tar-reazzjoni okulari u sabiex ikunu mgħejjuna l-laboratorji tat-testijiet u dawk involuti fiż-żamma ta' l-osservazzjonijiet u ta' l-interpretazzjoni tagħhom, il-persunall li jwettaq l-osservazzjonijiet jeħtieġu li jkunu adekwatament imħarrġa fis-sistema ta' l-iggradat kif użata ara t-Tabella ta' hawn taħt).

2. DATA

2.

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1 RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Raġunar dwar it-test in vivo: Analiżi ta' l-evidenza peżata ta' informazzjoni pre-eżistenti qabel it-test, inklużi r-riżultati minn strateġija ta' testijiet sekwenzali:

deskrizzjoni tad-dettalji relevanti disponibbli minn testijiet preċedenti;

informazzjoni akkwistat f'kull stadju ta' l-istrateġija ta' l-ittestjar;

deskrizzjoni tat-testijiet in vitro kif imwettqa, inklużi d-dettalji tal-proċeduri, ir-riżultati akkwistati bis-sustanza tat-test/referenza;

deskrizzjoni ta' l-istudju in vivo dwar l-irritazzjoni/korrożjoni dermali li jkun ġie mwettaq, inklużi r-riżultati akkwistati;

analiżi ta' l-evidenza peżata għat-twettieq ta' l-istudju in vivo

Is-sustanza tat-test:

dettalji ta' l-identifikazzjoni (eż. numru CAS; sorsi; purità; impuritajiet magħrufa; n-numru tal-lot);

in-natura fiżika u l-propjetajiet fiżikokimiċi (eż. pH, volatilità, solubilità, stabbilità, reattività fl-ilma);

jekk taħlita, il-komposizzjoni u l-persentaġġi relattivi tal-komponenti;

jekk anastesija lokali tkun ġiet użata, l-identifikazzjoni, il-purità, it-tip, id-doża, u l-potenzal ta' interazzjoni mas-sustanza tat-test.

Mezz:

l-identifikazzjoni, il-konċentrazzjoni (meta xieraq), il-volum użat;

il-ġustifikazzjoni tal-mezz użat.

Annimali tat-test:

l-ispeċji/tipi użati, ir-raġjunar għall-użu ta' l-annimali apparti milli fniek albino;

l-età ta' kull annimal fil-bidu ta' l-istudju;

in-numru ta' l-annimali ta' kull sess użati fit-test u fil-grupp ta' kontroll (jekk meħtieġ);

il-piżijiet ta' l-annimali individwali, kemm fil-bidu u wkoll fil-konklużjoni tat-test;

is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, eċċ.

Riżultati:

deskrizzjoni tal-metodu użat biex tkun immarkata l-irritazzjoni f'kull ħil ta' l-osservazzjoni (eż. lampa maqsuma ta' l-idejn, bimikroskopju, florexxin);

tabulazzjoni tad-dettalji tar-reazzjoni dwar l-irritamnt/korrosiv għal kull annimali f'kull ħin ta' l-osservazzjoni jew sa kemm kull animal ikun tneħħa mit-test;

deskrizzjoni narrattiva tal-grad u n-natura ta' l-irritazzjoni jew tal-korrożjoni osservata;

deskrizzjoni ta' xi ferita oħra osservata fil-għajn (eż. vaskularizzazzjoni, formazzjoni imtappna, waħħalija, tgħagħjja);

deskrizzjoni ta' effetti ħżiena mhux okulari, lokali u sistematiċi, u s-sejbiet ħistopatoloġiċi, jekk ikun hemm.

Diskussjoni tar-riżultati.

3.2 INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI L-estrapolazzjoni tar-rżultati ta' l-istudji dwar l-irritazzjoni ta' l-għajn li jkun twettqu fuq l-annimali tal-laboratorju lejn bnedmin umani hija valida biss sa grad limitat. F'ħafna każi, il-fenek albimo huwa iktar sensittiv mill-bnedmin dwar l-irritanti okulari jew għall-korrossivi. Attenzjoni għandha tingħata fl-interpretazzjoni tad-dettalji sabiex tkun eskluża xi irritazzjoni li tirriżulta minn infezzjoni sekondarja.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)

REFERENZI Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164. Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In vitro, 2, 19-26. Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) L-istudju ta' validazzjoni internazzjonali ECVAM dwar it-testijiet in vitro għall-korrossività tal-ġilda. 2. Ir-riżultati u l-evalwazzjoni mill-Grupp Amministrattiv Toxicology in vitro 12, pp. 483–524. Metodu tat-test B.40, Korrożjoni tal-Ġilda Metodu tat-testijiet B.4. Tossiċità akuta Irritazzjoni/korrużjoni dermali. Programm ta' Linji ta' Gwida għat-Test OECD (1996): Rapport Finali tal-Grupp ta' Studju OECD dwar l-Armonizzazzjoni tal-Validazzjoni u l-Aċċettazzjoni tal-Kriterja dwar Metodi Alternattivi għal-Testijiet Tossikoloġiċi. Li inżamm fi Solna, l-Isvezja, 22-24 ta' Jannar 1996. (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998), Is-Sistema tal-Klassifika Integrata Armonizzata tal-Perikoli għas-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kumiċi, kif approvat mit-28 Laqgħa Konġunta tal- Kumitat tal-Kimika u tal-Grupp ta' Ħidma dwart il-Kimika, Novembru 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). Dokument ta' Gwida dwar ir-Rikonoxximent, l-Assessjar u l-Użu ta' Sinjali Kliniċi bħala għanijiet finali umanitarji għall-annimali Sperimenti Użati fl-Evalwazzjoni tas-Sigurtà. OECD, Pubblikazzjonijiet dwar is-Saħħa u s-Sigurtà Ambjentali. Serje dwar it-Testijiet u l-Istudju Nru. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tabella I L-IGGRADAR TAL-FERITI OKULARI

Il-kornea

L-opaċità: il-grad ta’ densità (il-qari għandu jsittieħed mill-iktar żona densa) L-ebda ulċerazzjoni jew opaċità … 0 Żoni mferrxa jew diffużi ta’ opaċità (minnbarra l-oskurità ħafifa jew il-leqqa normali); id-dettaliji ta’ l-iris huma viżibbli sew … 1 Żona transluscent li tidher faċilment; id-dettalji ta’ l-iris kemmxejn imdallma … 2 Żona nacrous; l-ebda dettal ta’ l-iris ma jidher; id-daqs tal-pupill bilkemm jidher … 3 Kornea opaka; l-iris ma tidhirx mill-opaċità … 4 Il-massimu possibbli: 4 NOTI

L-iris

Normali … 0 Tikmix fond, konġestjoni, infiħ, circumcorneal hyperaemia ħafifa; Jew l-injezzjoni; l-iris li tirreaġixxi għad-dawl (reazzjoni għajjiena hija meqjusa bħala effetts) … 1 Emoraġġija, ħsara grossa, jew l-ebda reazzjoni għad-dawl … 2 Il-massimu possibbli: 2

Conjunctivae

Il-ħmura (tirreferi għall- conjunctivae palpebrali u bulbari; il-kornea u l-iris huma esklużi) Normali … 0 Xi vini tad-demm hyperaemic (injettati) … 1 Diffuż, kulur aħmar skur; il-vini individwali ma jidhrux faċilment … 2 Diffuż aħmar mimli … 3 Il-massimu possibbli: 3

Chemosis

l-infiħ (jirreferi għall-kpiepel u/jew il-membrani li jiċċaqalqu) Normali … 0 Xi nfiħ iktar min-normal … 1 Infiħ ovvju, b’averżjoni parzjali tal-kpiepel … 2 L-infiħ, bil-kpiepel kważi nofshom magħluqin … 3 L-infiħ, bil-kpiepel iktar minn nofshom magħluqin … 4 Il-massimu possibbli: 4

B.6. SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA

B.6.

1. METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Rimarki: Is-sensittività u l-abbiltà tat-testijiet li jintebħu b’sensitizzaturu potenzali għall-ġilda umana huma meqjusa bħala importanti fis-sistema tal-klassifikazzjoni dwar it-tossiċità relevanti għas-saħħa pubblika. M’hemm l-ebda metodu wieħed ta’ test li b’mod adegwat jidentifika s-sustanzi kollha bil-potenzjal għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda umana u li huwa relevanti għas-sustanzi kollha. Fatturi bħalma huma l-karatteristċi fiżiċi ta’ sustanza, inkluża l-abbiltà tagħha li tippenetra l-ġilda, għandhom ikunu meqjusa fil-għażla tat-test. Żewġ tipi ta’ testijiet bl-użu tal-fniek ta’ l-indi ġew żviluppati: testijiet tat-tip adġuvanti, li fihom l-istat ellerġiku jkun ippotenzjat bit-taħlil jew bis-sospensjoni tas-sustanza tat-test fi Freunds Complete Adjuvant (FCA), u f’testijiet mhux adġuvanti. Testijiet tat-tip adġuvanti pjuttost li jkunu aktar eżatti fit-tbassir ta’ effett sensitizzanti probabbli tal-ġilda ta’ sustanza fuq il-bniedem milli dawk il-metodi li ma jutilizzawx il-Freunds Complete Adjuvant u huma għalhekk il-metodi preferiti. It-test tal-Massimizzazzjoni tal-Fenek ta’ l-Indi (GPMT) huwa test tat-tip adġuvanti ferm użat. Għalkemm diversi metodi oħrajn jistgħu jkunu użati għas-sejbien tal-potenzjal ta’ sustanza li tikkaġuna reazzjoni ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda, il-GPMT huwa meqjusa bħala li huma t-teknika adġuvinanti preferuta. B’ħafna mill-klassijiet kimiċi, testijiet mhux-adġuvinanti (dak preferut huwa t-test Buehler) huma meqjusa bħala li huma anqas sensittivi. F’ċerti każi jista’ jkun hemm raġunijiet tajbin għall-għażla tat-test Buehler li jinvolvi applikazzjoni topika pjuttost milli l-injezzjoni intradermali użata fit-Test tal-Massimizzazzjoni tal-Fenek ta’ l-Indi. Ġustifikazzjoni xjentifika għandha tkun mogħtija meta t-test Buehler ikun użat. It-Test tal-Massimizzazzjoni tal-fenek ta’ l-Indi (GPMT) u t-test Buehler huma deskritti f’dan il-metodu. Metodi oħrajn jistgħu ikunu użati basta li dawn ikunu validati tajjeb u l-ġustifikazzjoni xjentifika tkun mogħtija. Jekk ikun jidher riżultat pożittiv f’test ta’ screening rikonoxxut, sustanza tat-test jista’ jiġi ddisinjat bħala sensitizzatur potenzjali, u jista’ ma jkunx meħtieġ test ieħor fuq il-fniek ta’ l-Indi. Madankollu, jekk ikun hemm riżultat negattiv f’test bħal dan, it-test fuq il-fniek ta’ l-Indi jrid isir bil-proċedura deskritta f’dan il-metodu tat-test. Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B

1.2. DEFINIZZJONIJIET Is-sensitizzazzjoni tal-ġilda: (kuntatt allerġiku dermatitis) hija reazzjoni immunoloġikament cutaneous għas-sustanza. Fil-bniedem, ir-rispons jista’ jkun karatterizzat minn pruritis, erythema, oedema, papules, vesicles, bullae jew kombinazzjoni ta’ dawn. Fi speċje oħra ir-reazzjonijiet jistgħu ivarjaw u l-erythemau l- oedema biss jistgħu jidhru. Espożizzjoni ta’ induzzjoni: espożizzjoni sperimentali ta’ suġġett għal sustanza tat-test bil-ħsieb li joħloq stat ipersensittiv. Il-perjodu ta’ induzzjoni: perjodu ta’ mill-inqas ġimgħa wara l-espożizzjoni ta’ induzzjoni li matulu jista’ jiżviluppa stat ipersensittiv. Espożizzjoni ta’ tħaqqieq: espożizzjoni sperimentali ta’ suġġett li jkun ġie trattat qabel għas-sustanza tat-test wara l-perjodu ta’ induzzjoni, sabiex jiġi determinat jekk is-suġġett jirreaġixxix b’mod ipersensittiv.

1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA Is-sensittività u l-kredibilità tat-teknika sperimentali għandha tiġi valutata kull sitt xhur bl-użu tas-sustanzi, li huma magħrufa li jkollhom proprjetajiet ta’ sensitizzazzjoni għall-ġilda ħfief għal moderati. F’test magħmul sew, huwa mistenni li għal sesitizzaturi ħfief għal moderati jkun hemm rispons ta’ mill-inqas 30 % f’test adġuvinanti u mill-inqas 15 % f’test li mhux adġuvinanti. Is-sustanzi li ġejjin huma preferuti. Numri CAS Numri EINECS Ismijiet EINECS Ismijiet komuni 101-86-0 202-983-3 α-hexylcinnamaldehyde α-hexylcinnamaldehyde 149-30-4 205-736-8 Benzothiazole-2-thiol (mercaptobenzothiazole) kaptax 94-09-7 202-303-5 Benzocaine norcaine Jista’ jkun hemm ċirkustanzi fejn, b’ġustifikazzjoni adegwata mogħtija jistgħu jintużaw sustanzi ta’ kontroll oħra li jissodisfaw il-kriterji t’hawn fuq.

1.4. IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST L-annimali għat-test huma esposti fil-bidu għas-sustanza tat-test permezz ta’ injezzjonijiet intradermali u/jew applikazzjoni epidermali espożizzjoni ta’ induzzjoni). Wara perjodu ta’ waqfa ta’ minn 10 sa 14-il jum (perjodu ta’ induzzjoni), li matulu jista’ jiżviluppa rispons ta’ immunità, l-annimali jiġu esposti għal doża ta’ tħaqqieq. Il-grad u l-firxa tar-reazzjoni tal-ġilda għall-espożizzjoni ta’ tħaqqieq fl-annimali għat-test huma mqabbla ma’ dak li ntwera fl-annimali ta’ kontroll li jġarrbu l-istess trattament waqt l-induzzjoni u jirċievu l-espożizzjoni ta’ tħaqqieq.

1.5. DESKRIZZJONI TAL-METODI TAT-TEST Jekk it-tneħħija tas-sustanza tat-test hija meħtieġa, dan għandu jinkiseb bl-użu ta’ l-ilma jew solvent xieraq mingħajr bidla fir-rispons li jkun hemm jew fl-integrità ta’ l-epidermi.

1.5.

1.5.1. Test ta’ Massimizzazzjoni tal-Fniek ta’ l-Indi (TMFI)

1.5.1.

1.5.1.1. Preparazzjonijiet Fniek ta’ l-indi albino, żgħażagħ u b’saħħithom jadattaw għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju mill-inqas 5 ijiem qabel it-test. Qabel it-test, l-annimali jingħażlu bl-addoċċ fi gruppi ta’ trattament. It-tneħħija tax-xagħar isir permezz ta’ l-ikklippjar, tqaxxir jew possibilment depolazzjoni kemikali, skond il-metodu tat-test użat. Għandha tingħata attenzjoni sabiex il-ġilda ma tiġix migrufa. L-annimali jintiżnu qabel jibda t-test u fi tmiemu.

1.5.1.2. Kundizzjonijiet tat-test

1.5.1.2.

1.5.1.2.1. Annimali għat-test Razzez tal-fniek ta’ l-indi albino normalment użati fil-laboratorju huma utilizzati

1.5.1.2.2. In-numru u s-sess Annimali maskili u/jew femminili jistgħu ikunu użati. Jekk ikunu użati femminili, dawn għandhom ikunu femminili li qatt ma welldu u li mhumiex tqal. Minimu ta’ 10 annimali huma użati fil-grupp ittrattat u mill-anqas 5 fil-grupp tal-kontroll. Meta inqas minn 20 test u 10 fniek ta’ l-Indi jkunu ntużaw, u mhux possibbli tikkonkludi li s-sustanza għat-test hija sensitizzatur, huwa rakkomandat ħafna li jiġu ttestjati iktar annimali sabiex ikun hemm mill-inqas total ta’ 20 test u 10 annimali tal-kontroll.

1.5.1.2.3. Livelli tad-dożi Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija aġġustata lejn livell li jipproduċi xi ftit ta’ l-evidenza ta’ l-irritazzjoni tal-ġilda, imma li tkun tollerata tajjeb mill-annimali matul kull stadju ta’ l-induzzjoni. Il-konċentrazzjoni użata għandha tkun il-massimu li ma jipproduċi l-ebda evidenza ta’ l-irritazzjoni tal-ġilda f’annimali li mhumiex sensitizzati. Dawn il-konċentrazzjoninijiet jistgħu jkunu determinati fi skala żgħira b’żewġ jew tliet annimali waqt l-istudju pilota ladarba informazzjoni oħra ma tkunx disponibbli. L-annimali trattati bl-FCA għandhom jiġu kkunsidrati għal dan il-għan.

1.5.1.3. Il-Proċedura

1.5.1.3.

1.5.1.3.1. L-induzzjoni Jum 0 – il-grupp ittrattat Il-pari segwenti ta’ injezzjonijiet intradermali, kull waħda ta’ 0,1 ml, huma mogħtija fiż-żona ta’ l-ispalla li ma jkollhiex suf hekk li kull wieħed mill-pari jkun fuq kull naħa taċ-ċentru ta’ l-annimal. Injezzjoni 1: it-taħlita ta’ (v/v) FCA/l-ilma jew salin fiżjoloġiku 1:1 Injezzjoni 2: is-sustanza tat-test, bil-mezz xieraq u bil-konċentrazzjoni magħżula Injezzjoni 3:is-sustanza tat-test bil-konċentrazzjoni magħżula fformulata f’taħlita 1:1 (v/v) FCA/ilma jew salin fiżjoloġiku Fl-injezzjoni 3, is-sustanzi li jinħallu fl-ilma huma mdewba fil-fażi akweja qabel it-taħlit ma’ l-FCA. Is-sustanzi liposolubbli jew insolubbli huma mdendla fl-FCA qabel il-kombinazzjoni mal-fażi akweja. Il-konċentrazzjoni finali tas-sustanza għat-test għandha tkun ugwali għal dik użata fit-2 injezzjoni. L-injezzjonijiet 1 u 2 jingħataw waħda wara l-oħra u qrib ir-ras kemm jista’ jkun, waqt illi l-injezzjoni 3 tkun lejn il-parti kawdjali taż-żona tat-test. Jum 0 – il-grupp tal-kontroll It-tliet pari ta’ injezzjonijiet intradermali ta’ 0,1 ml f’volum il-waħda jingħataw fl-istess żoni bħal fl-annimali trattati. Injezzjoni 1: it-taħlita (v/v) FCA/ilma jew salin fiżjoliġiku 1:1 Injezzjoni 2: il-mezz mhux maħlul fl-ilma Injezzjoni 3: formulazzjoni ta’ 50 % w/v tal-mezz f’taħlita (v/v) FCA/ilma jew salin fiżjoloġiku 1:1 5-7 jum – gruppi ta’ kontroll trattati Bejn wieħed u ieħor erbgħa u għoxrin siegħa qabel l-applikazzjoni ta’ l-induzzjoni topikali, jekk is-sustanza mhix irritanti għall-ġilda, iż-żona tat-test, wara l-ikklippjar u/jew it-tqaxxir tiġi trattata b’0,5 ml ta’ 10 % mis- sulfat lawrju tas-sodju fil-vażelina, sabiex tinħoloq irritazzjoni lokali. Jum 6-8 tal-grupp trattat Iż-żona tat-test terġa’ titnaddaf mis-suf. Filter paper (2 x 4 ċm) titgħabba kollha bis-sustanza għat-test f’mezz xieraq u applikata fuq iż-żona tat-test u miżmuma f’kuntatt permezz ta’ faxxa okklussiva għal 48 siegħa. L-għażla tal-mezz għandha tkun ġustifikata. Is-solidi jiġu pulverizzati b’mod fin u inkorporati f’mezz xieraq. Il-likwidi jistgħu jiġu applikati mingħajr taħlit bl-ilma jekk inhu xieraq. Jum 6-8 grupp ta’ kontroll Iż-żona tat-test terġa’ titnaddaf mis-suf. Il-mezz biss huwa applikat b’mod simili liż-żona tat-test u miżmum f’kuntatt permezz ta’ faxxa okklussiva għal 48 siegħa.

1.5.1.3.2. It-tħaqqieq Jum 20-22 gruppi ta’ kontroll trattati Il-ġenbejn huma trattati u l-annimali tal-kontroll huma mnaddfa mix-xagħar. Biċċa jew kapsula li jkun fiha s-sustanza tat-test hija applikata ma’ wieħed mill-ġnub ta’ l-annimali ittratati u l-biċċa jew il-kapsula mil-mezz biss mal-ġemb l-ieħor. Il-biċċiet huma miżmuma b’faxxa okklussiva għal 24 siegħa.

L-osservazzjoni u l-iggradar: gruppi ta’ kontroll trattati

Il-qari bl-addoċċ ta’ l-annimali ta’ kontroll u tat-test huwa nkuraġġit. Sabiex ikunu kjarifikati r-riżultati miksuba fl-ewwel tħaqqieqa, t-tieni tħaqqieqa, fejn hu xieraq mal-grupp tal-kontroll ġdid, għandha tkun meqjusa madwar ġimgha minn wara l-ewwel waħda. Tħaqqieq għat-tieni darba jista’ jsir ukoll fuq il-grupp ta’ kontroll oriġinali. Ir-reazzjoni kollha tal-ġilda f’xi sejbiet mhux tas-soltu inklużi r-reazzjonijiet sistematiċi li jirriżultaw mill-proċeduri ta’ l-induzzjoni u tat-tħaqqieq ghandhom ikunu osservati u rrekordjati skond l-iskala ta’ gradazzjoni ta’ Magnusson/Kligman (Ara l-appendiċi). Proċeduri oħra, eż. L-eżaminazzjoni ħispatoloġika, il-kejl tal-ħxuna tat-tinja tal-ġilda, tista’ titwettaq sabiex jiġu ċċarati ir-reazzjonijiet dubbjużi.

Bejn wieħed u ieħor 21 siegħa wara t-tneħħija tal-biċċa, iż-żona mħaqqa hija mnaddfa u kklippjata u/jew imqaxxra u depilata jekk ikun meħtieġ,

Bejn wieħed u ieħor 3 sigħat wara (bejn wieħed u ieħor 48 siegħa mill-bidu ta’ l-applikazzjoni tat-tħaqqieq) ir-reazzjoni tal-ġilda hija osservata u rrekordjata skond il-gradi li jidhru fl-appendiċi;

Bejn wieħed u ieħor 24 siegħa wara din l-osservazzjoni, it-tieni osservazzjoni (72 siegħa) hija mwettqa u rrekordjata għal darb’oħra.

1.5.2. It-test Buehler

1.5.2.

1.5.2.1. Preparazzjonijiet Fniek ta’ l-indi albino, żgħażagħ u b’saħħithom jadattaw għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju 5 ijiem qabel it-test. Qabel it-test, l-annimali jinġabru kif jinzerta u assenjati għall-gruppi ta’ trattament. Il-pil jitneħħa billi jiġi kklippjat, imqaxxar jew possibilment depilat kimikament skond il-metodu tat-test użat. Għandha tingħata attenzjoni sabiex tkun evitata li ssir xi ħsara lill-ġilda. L-annimali jintiżnu qabel ma jibda t-test u fi tmiemu.

1.5.2.2. Il-kundizzjonijiet tat-test

1.5.2.2.

1.5.2.2.1. L-annimali għat-test Razez tal-fniek ta’ l-indi albino normalment użati fil-labortatorju huma utlizzati.

1.5.2.2.2. Numru u sess. Annimali maskili u/jew femminili jistgħu jintużaw. Jekk ikunu użati femminili, dawn għandhom ikunu femminili li qatt ma welldu u li mhumiex tqal. Minimu ta’ 20 annimal huma użati fil-grupp ittrattat u mill-anqas 10 fil-grupp tal-kontroll.

1.5.2.2.3. Il-livelli tad-dożi Għal kull stadju ta’ l-induzzjoni, il-konċentrazzjonini tas-sustanza tat-test hija aġġustata għal-ogħla livell possibbli biex tipproduċi irritazzjoni ħafifa imma mhux eċċessiva. Il-konċentrazzjoni mħaqqa għandha tkun il-massimu tad-doża mhux irritanti. Jekk ikun meħtieġ il-konċentrazzjonini xierqa tista’ tiġi determinata minn studju pilota bl-użu ta’ żewġ jew tliet annimali. Għall-materjali tat-test li jinħallu fl-ilma, huwa xieraq li jintuża l-ilma jew soluzzjoni mħallta bl-ilma li ma tikkawżax irritazzjoni ta’ surfactant bħala l-mezz. Għal materjali tat-test oħra 80 % ta’ l-etanol/l-ilma huwa preferut għall-induzzjoni u t-tħaqqieq ta’ l- acetone.

1.5.2.3. Il-proċedura

1.5.2.3.

1.5.2.3.1. L-induzzjoni Jum 0 – il-grupp trattat Ġenb wieħed huwa mnaddaf mill-pil (ikklippjat). Is-sistema tal-biċċa għat-test għandha titgħabba tajjeb bis-sustanza għat-test f’mezz xieraq (l-għażla tal-mezz għandha tkun ġustifikata; is-sustanzi għat-test likwidi jistgħu jiġu applikati mingħajr ma jitħalltu bl-ilma, jekk ikun xieraq). Is-sistema tal-biċċa għat-test hija applikata fuq iż-żona tat-test u miżmuma f’kuntatt permezz ta’ biċċa okklussiva jew kapsula u faxxa xierqa għal 6 sigħat. Is-sistema tal-biċċa għat-test trid tkun okklussiva. Biċċa tal-qoton hija adattata u tista’ tkun tonda jew kwadra, iżda għandha tkun bejn wieħed u ieħor minn 4-6 cm2. Iż-żamma permezz ta’ żamma xierqa hija preferuta sabiex tiżgura l-okklużjoni. Jekk jiġi użat it-tqarwis, espożizzjonijiet addizzjonali jistgħu jkunu meħtieġa. Jum 0 – il-grupp tal-kontroll Ġenb wieħed huwa mnaddaf mill-pil (bl-ikklippjar). Il-mezz biss huwa applikat b’manjera simili bħal dik għall-grupp trattat. Is-sistema tal-biċċa għat-test tinżamm f’kuntatt mal-ġilda b’biċċa jew kapsula oklussiva u faxxa xierqa għal 6 sigħat. Jekk jista’ jintwera li grupp ta’ kontroll falz mhux meħtieġ, jista’ jintuża grupp ta’ kontroll naive. Jiem 6-8 u 13-15 – il-grupp ta’ kontroll trattat Titwettaq l-istess applikazzjoni bħal fil-jum 0 fuq l-istess żona għat-test (nadifa mill-pil jekk ikun meħtieġ) tal-ġenb fil-jum 6-8, u għal darb’oħra fil-jum 13-15.

1.5.2.3.2. It-tħaqqieq Il-jum 27-29 – il-grupp ta’ kontroll trattat Il-ġenb li ma ġiex trattat ta’ l-annimali ta’ kontroll u trattati jitnaddaf mill-pil (bl-ikklippjar). Biċċa okklussiva jew kabina li jkun fiha l-ammont xieraq tas-sustanza għat-test tiġi applikata fil-massimu tal-konċentrazzjoni li mhix irritanti fuq il-ġenb mhux trattat ta’ wara ta’ l-annimali ta’ kontroll u trattati. Fejn jgħodd, biċċa okklussiva jew kabina bil-mezz biss tiġi applikata fuq il-ġenb mhux trattat ta’ quddiem ta’ l-annimali li huma kemm kontrollati u kemm trattati. Il-biċċiet jew kabini huma miżmuma f’kuntatt permezz ta’ faxex xierqa għal 6 sigħat.

1.5.2.3.3. L-osservazzjoni u l-iggradar Il-qari bl-addoċċ ta’ l-annimali ta’ kontroll u għat-test huwa nkuraġġit. Sabiex ikunu kjarifikati r-riżultati miksuba fl-ewwel tħaqqieqa, t-tieni tħaqqieqa, fejn hu xieraq mal-grupp tal-kontroll ġdid, għandha tkun meqjusa madwar ġimgha minn wara l-ewwel waħda. Tħaqqieq għat-tieni darba jista’ jsir ukoll fuq il-grupp ta’ kontroll oriġinali. Ir-reazzjoni kollha tal-ġilda f’xi sejbiet mhux tas-soltu inklużi r-reazzjonijiet sistematiċi li jirriżultaw mill-proċeduri ta’ l-induzzjoni u tat-tħaqqieq ghandhom ikunu osservati u rrekordjati skond l-iskala ta’ gradazzjoni ta’ Magnusson/Kligman (Ara l-appendiċi). Proċeduri oħra, eż. L-eżaminazzjoni ħispatoloġika, il-kejl tal-ħxuna tat-tinja tal-ġilda, tista’ titwettaq sabiex jiġu ċċarati ir-reazzjonijiet dubbjużi

Bejn wieħed u ieħor 21 siegħa wara t-tneħħija tal-biċċa, ż-żona mħaqqa hija mnaddfa mill-pil;

Bejn wieħed u ieħor tliet sigħat aktar tard (bejn wieħed u ieħor 30 siegħa mill-bidu ta’ l-applikazzjoni tal-biċċa tat-tħaqqieq) ir-reazzjoni tal-ġilda hija osservata u rrekordjata skond il-gradi murija fl-appendiċi;

Bejn wieħed u ieħor 24 siegħa wara l-osservazzjoni ta’ 30 siegħa, (bejn wieħed u ieħor 54 siegħa wara l-applikazzjoni tal-biċċa tat-tħaqqieq) ir-reazzjonijiet tal-ġilda huma għal darb’oħra osservati u rrekordjati.

2. DATA (GPMT u t-test buehler) Id-data għandha tkun riassunta f’għamla tabulari, li turi għal kull annimal individwali r-reazzjonijiet tal-ġilda għal kull perjodu ta’ l-osservazzjoni.

3. RAPPURTAĠĠ (GPMT u t-test Buehler) Jekk l-iscreening isir qabel it-test fuq il-fenek ta’ l-Indi, id-deskrizzjoni jew ir-referenza tat-test (eż. It-Test ta’ l-Infiħ tal-Widnejn tal-Ġurdien (TIWĠ), inklużi d-dettalji tal-proċedura, iridu jingħataw flimkien mar-riżultati miksuba mas-sustanzi tat-test u tar-referenza.

3. Rapport tat-test (GPMT u t-test Buehler)

Ir-rapport tat-test għandu, jekk inhu possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Annimali għat-test:

ir-razza tal-fniek ta’ l-indi użata;

in-numru, l-età u s-sess ta’ l-annimali;

is-sors. Il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpoġġew. Id-dieta eċċ.;

il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test u fi tmiemu.

Il-kundizzjonijiet tat-test

it-teknika tal-preparazzjoni taż-żona tal-biċċa;

id-dettalji tal-materjali tal-biċċa użati u t-teknika tal-biċċa;

ir-riżultat ta’ l-istudju pilota bil-konklużjoni fuq l-induzzjoni u l-konċentrazzjonijiet tat-tħaqqieq li jridu jintużaw fit-test;

id-dettalji tal-preparazzjoni tas-sustanza għat-test, l-applikazzjoni u t-tneħħija;

il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-mezz;

il-mezz u l-konċentrazzjonijiet tas-sustanza għat-test użati għall-induzzjoni u l-espożizzjonijiet tat-tħaqqieq u l-ammont totali tas-sustanza applikata għall-induzzjoni u għattħaqqieq.

Ir-riżultati:

taqsira tar-riżultati ta’ l-aħħar ċekkjatura għas-sensittività u għall-kredibilità (ara 1.3) inkluża l-informazzjoni fuq is-sustanza, il-konċentrazzjoni u l-mezz użat;

ta’ kull annimal inkluża s-sistema ta’ gradazzjoni;

deskrizzjoni narrativa ta’ l-effetti tan-natura u tal-gradi osservati;

kwalunkwe sejbiet hispatoloġiċi.

Id-diskussjoni tar-riżultati

Kunklużjonijiet.

4. REFERENZI Dan il-metodu huwa analogu għal OECD TG 406

B.7. DOŻA REPETUTA (28 JUM) TOSSIĊITÀ (ORALI)

B.7.

1. METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.2. DEFINIZZJONIJIET Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.3. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Is-sustanza tat-test hija somministrata b’mod orali, ta’ kuljum, b’dożi meqjusa lil diversi gruppi ta’ annimali sperimentali, b’doża waħda tkun użata ma’ kull grupp matul perjodu ta’ 28 jum. Matul il-perjodu ta’ l-amministrazzjoni, l-annimali huma osservati kuljum sabiex ikunu skoperti sinjali tat-tossiċità. Annimali li jmutu jew jinqatlu matul it-test ikollhom awtopsija tal-mewt u l-konklużjoni tat-test li l-annimali li jibqgħu ħajjin jinqatlu u jkollhom ukoll l-awtopsija ta’ wara l-mewt. Dan il-metodu jenfasizza ħafna iktar fuq l-effetti newroloġiċi bħala endpoint, u fuq il-ħtieġa ta’ osservazzjonijiet kliniċi u tal-galbu ta’ l-annimali, sabiex tinkiseb kemm jista’ jkun informazzjoni. Il-metodu għandu jidentifika il-kimiċi li għandhom potenzjal newrotossiku, li jista’ jwassal għal iktar investigazzjoni bir-reqqa fuq dan l-aspett. Barra minn hekk, il-metodu jista’ jagħti indikazzjoni ta’ l-effetti immunoloġiċi u tat-tossiċità ta’ l-organu riproduttiv.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.

1.4.1. It-tħejjija L-annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma magħżula b’mod kif jinzerta u assenjati lejn gruppi ta’ kontroll u ta’ trattament. Il-gaġeġ għandhom jitqiegħdu b’tali mod li l-effetti possibbli jiġu minimizzati minħabba kif ikunu mqiegħda l-gaġeġ. L-annimali huma identifikati wieħed wieħed u miżmuma fil-gaġeġ tagħhom għal mill-inqas ħamest ijiem qabel il-bidu ta’ l-istudju sabiex l-annimali jidraw il-kundizzjonijiet tal-laboratorju. Is-sustanza tat-test tista’ tiġi somministrata ma’ l-ikel, bl-għalf sfurzat, jew fl-ilma tax-xorb. Il-metodu ta’ l-amministrazzjoni orali jiddependi fuq l-iskop ta’ l-istudju, u l-propjetajiet fiżiko/kimiċi tas-sustanza. Fejn hu meħtieġ, is-sustanza għat-test tinħall jew tipi sospiża f’mezz xieraq. Huwa rakkomandat li, kull fejn hu possibbli, l-użu ta’ soluzzjoni/sospensjoni akwea tiġi kkunsidrata l-ewwel, u wara tiġi kkunsidrata is-soluzzjoni/emulsjoni fiż-żejt (eż. Żejt tal-qamħ) u mbagħad permezz ta’ soluzzjoni possibbli f’mezzi oħra. Għal mezzi li mhumiex l-ilma l-karatteristiċi tossiċi tal-mezz iridu jkunu magħrufa. L-istabilità tas-sustanza għat-test fil-mezz għandha tiġi determinata.

1.4.2. Il-kundizzjonijiet tat-test

1.4.2.

1.4.2.1. L-annimali għat-test Il-far huwa l-ispeċi preferita fir-razza tal-gerriema għalkemm speċji oħra ta’ gerriema jistgħu jintużaw. Razez komuni użati fil-laboratorju ta’ annimali żgħażagħ b’saħħithom għandhom ikunu użati. In-nisa iridu jkunu qatt ma welldu qabel u mhumiex tqal. Id-dożaġġ għandu jibda malajr kemm jista’ jkun wara l-fatma u qabel ma l-annimali jkollhom disa’ ġimgħat. Fil-bidu ta’ l-istudju l-medda tal-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandhiex teċċedi ± 20 % tal-valur medju ta’ kull sess. Fejn ikun hemm studju tad-doża ripetuta orali bħala studju preliminari għal ieħor fit-tul, preferebbilment għandhom jintużaw annimali mill-istess razza u sors fiż-żewġ studji.

1.4.2.2. Numru u sess Mill-anqas 10 annimali gerriema (ħamsa femminili u ħamsa maskili) għandhom ikunu użati f’kull livell ta’ doża. Jekk sagrifikar interim huwa ppjanat, in-numru ta’ l-annimali għandu jkun miżjud bin-numru ta’ l-annimali skedati li jkunu sagrifikati qabel it-tkomplija ta’ l-istudju. Barra minn hekk, grupp satellita ta’ 10 annimali (ħames annimali kull sess) jista’ jiġi trattat bil-livell għoli ta’ doża għal 28 jum u osservat għar-riversibbiltà, għall-persistenza, jew għad-dewmien fl-okkorrenza ta’ l-effetti tossiċi għal 14-il jum ta’ wara t-trattament. Grupp satellita ta’ 10 annimali ta’ kontroll (ħames annimali kull sess) huwa użat ukoll.

1.4.2.3. Livelli tad-dożi Ġeneralment, mill-anqas tliet gruppi għat-test u grupp ta’ kontroll għandhom ikunu użati. Appart milli t-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom ikunu trattati b’mod identiku bħal dawk suġġetti għat-test. Meta mezz ikun użat sabiex tiġi somministrata s-sustanza għat-test, il-grupp ta’ kontroll għandu jilqa’ l-mezz fl-ogħla volum użat. Jekk mill-valutazzjoni ta’ data oħra, ma jkunu mistennija l-ebda effetti fid-doża ta’ 1000 mg/kg bw/d, test ta’ limitu jista’ jitwettaq. Jekk m’hemm l-ebda data xierqa disponibbli, studju għat-tiftix tal-medda jista’ jsir biex jgħin id-determinazzjoni tad-dożi li se jintużaw. Livelli ta’ dożi għandhom jingħażlu billi titqies kwalunkwe tossiċità u data (tossiku-) kinetika disponibbli għas-sustanza tat-test jew materjai relatati. L-ogħla livell tad-doża għandu jingħażel bl-għan li jwassal għal effetti tossiċi iżda mhux għal mewt jew tbatija qawwija. Wara, sekwenza li tinżel ta’ livelli tad-dożi għandha tingħażel bil-ħsieb li turi kwalunkwe rispons li għandu x’jaqsam mad-dożaġġ u l-ebda effetti avversi osservati fl-inqas livell tad-doża. Minn tnejn sa erba’ fold intervals huma ta’ spiss ottimali għall-issettjar ta’ l-inżul tal-livelli tad-dożi u ż-żieda tar-raba’ grupp għat-test huwa ta’ spiss iktar preferut milli l-intervalli kbar ħafna (eż. Iżjed minn fattur ta’ 10) bejn id-dożaġġi. Għas-sustanzi amministrati bid-dieta jew bl-ilma għax-xorb huwa importanti li jiġi żgurat li l-kwantitajiet tas-sustanza għat-test involuti ma jfixklux in-nutrizzjoni normali jew il-bilanċ ta’ l-ilma. Meta is-sustanza għat-test tiġi somministrata fid-dieta jista’ jintuża jew konċentrazzjoni ta’ dieta kostanti (ppm) jew livell ta’ dożi kostanti f’termini tal-piż tal-ġisem ta’ l-annimali. L-użu alternattiv irid jiġi speċifikat. Għal sustanza somministrata bil-fors id-doża trid tingħata f’ħinijiet simili kuljum, u aġġustati kif ikun meħtieġ sabiex jinżamm livell kostanti tad-doża f’termini tal-piż tal-ġisem ta’ l-annimal. Fejn jintuża studju ta’ doża repetuta bħala studju preliminarju għal ieħor twil, dieta simili għandha tintuża fiż-żewġ studji.

1.4.2.4. Test tal-limitazzjoni Jekk test ta’ livell ta’ doża waħda ta’ mill-inqas 1000 mk/kg tal-piż tal-ġisem/kuljum jew, għall-amministrazzjoni ta’ l-ikel jew ilma għax-xorb, persentaġġ ekwivalenti fid-dieta jew fl-ilma għax-xorb (ibbażat fuq id-determinazzjonijiet tal-piż tal-ġisem), bl-użu tal-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, ma jipproduċi l-ebda effetti tossiċi li jistgħu jiġu osservati u jekk it-tossiċità ma tkunx mistennija bbażata fuq id-data minn sustanzi relatati, mela studju komplut bl-użu ta’ tliet livelli ta’ dożi jista’ ma jkunx meħtieġ. It-test tal-limitu japplika ħlief meta l-espożizzjoni umana tindika l-ħtieġa ta’ l-użu ta’ livell ta’ doża ogħla

1.4.2.5 Perijodu ta’ l-osservazzjoni Il-perjodu ta’ osservazzjoni għandu jkun ta’ 28 jum. L-annimali fi grupp satellita skedat għall-osservazzjoni b’segwiment għandhom jinżammu għal mill-inqas 14-il jum mingħajr trattament sabiex jidher id-dewmien fl-okkorrenza, jew il-persistenza ta’ jew l-irkupru minn effetti tossiċi.

1.4.3. Il-proċedura L-annimali jirċievu d-doża bis-sustanza tat-test kuljum sebat ijiem fil-ġimgħa għal perjodu ta’ 28 jum; l-użu ta’ dieta ta’ żamest ijiem fil-ġimgħa jrid jiġi ġustifikat. Meta s-sustanza tat-test tiġi somministrata bil-fors, dan għandu jsir f’doża waħda lill-annimali bl-użu ta’ tubu fl-istonku jew intubazzjoni cannula xierqa. Il-volum massimu tal-likwidu li jista’ jiġi amministrat f’darba jiddependi mid-daqs ta’ l-annimal għat-test. Il-volum m’għandux jaqbeż .il-1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem, ħlief fil-każ ta’ soluzzjonijiet akwei fejn 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem jista’ jintuża. Ħlief għal sustanzi korrużivi jew li jikkawżaw irritazzjoni, li normalment jiżvelaw effetti agħar b’konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tkun minimizzata bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fil-livelli tad-dożi kollha.

1.4.3.

1.4.3.1 Osservazzjonijiet ġenerali L-osservazzjonijiet kliniċi ġenerali għandhom isiru mill-inqas darba kuljum, preferibbilment fl-istess ħin (ħinijiet) kuljum u jiġi kkunsidrat il-perjodu peak ta’ l-effetti antiċipati wara d-dożaġġ. Il-kundizzjonijiet tas-saħħa ta’ l-annimali għandha tiġi rrekordjata. Mill-inqas darbtejn kuljum, l-annimali kollha jiġu osservati għall-morbidità u għall-mortalità. L-annimali li qed imutu u dawk li qegħdin fi tbatija jew uġigħ qawwija għandhom jitneħħew, jinqatlu b’mod uman u ssir fuqhom in-nekropsija. Darba qabel l-ewwel espożizzjoni (biex tippermetti l-paraguni fi ħdan is-suġġett), u mill-inqas darba fil-ġimgħa wara dan, osservazzjonijiet kliniċi u dettaljati għandhom isiru fl-annimali kollha. Dawn l-osservazzjonijiet għandhom isiru barra l-gaġġa f’arena standard u preferebbilment fl-istess ħin kull darba. Għandhom ikunu rrekordjati b’attenzjoni, preferebbilment bl-użu ta’ sistemi ta’ mmarkar, definiti espliċitament mil-laboratorju ta’ l-ittestjar. Għandu jsir sforz sabiex jiġi żgurat li l-varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet tat-test huma minimali u li l-osservazzjonijiet isiru preferebbilment minn osservaturi li ma jafux bit-trattament. Is-sinjali nnotati għandhom jinkludu, iżda mhux ikunu limitati għal, tibdiliet fil-ġilda, fil-pil, fl-għajnejn, fil-membrani mukożji, l-okkorrenza ta’ taqtir u eskrezzjonijiet u attività awtonomika (eż. lacrimation, piloerection, id-daqs tal-pupill, disinn respiratorju mhux tas-soltu). It-tibdiliet fil-gait, fil-pożizzjoni u rispons għall-immaniġġjar kif ukoll il-preżenza ta’ ċaqliq kloniku jew toniku, sterjotipi (eż. Grooming eċċessiv, tidwir f’ċirku repetittiv) jew imġiba stramba (eż. Awto-mutilazzjoni, mixi b’lura) għandhom jiġu rrekordjati wkoll. Fir-raba’ ġimgħa ta’ espożizzjoni għandhom isiru reattività sensorja għal tipi differenti ta’ stimuli (eż. Stimuli awditorjali, viżwali u proprioceptive), il-valutazzjoni tas-saħħa fil-qabda ta’ l-id u fil-motor activity. Iktar dettalji tal-proċeduri li jistgħu jiġu wara jinsabu fil-letteratura (ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B). Osservazzjonijiet funzjonali li jitwettqu fir-raba’ ġimgħa ta’ espożizzjoni jistgħu jitħallew barra meta l-istudju jsir bħala studju preliminarju għal studju subkroniku sussegwenti (90 jum). F’dak il-każ, l-osservazzjonijiet funzjonali għandhom jiġu inklużi f’dan l-istudju. Minnaħa l-oħra, id-disponibbiltà tad-data fuq l-osservazzjonijiet funzjonali mid-doża repetuta tista’ żżid l-abbiltà għall-għażla tal-livelli tad-doża għal studju subkroniku sussegwenti. B’eċċezzjoni, l-osservazzjonijiet funzjonali jistgħu jitħallew barra għal gruppi li juru sinjali ta’ tossiċità tant li jinterferixxu b’mod sinifikanti fil-prestazzjoni funzjonali tat-test.

1.4.3.2. Il-piż tal-ġisem u l-konsum ta’ l-ikel/xorb L-annimali kollha għandhom jintiżnu mill-inqas darba fil-ġimgħa. Il-konsum ta’ l-ikel u tax-xorb għandu jitkejjel għallinqas kull ġimgħa. Jekk is-sustanza għat-test hija somministrata permezz ta’ l-ilma għax-xorb, il-konsum ta’ l-ilma għandu jitkejjel għallinqas fil-ġimgħa wkoll.

1.4.3.3. Ħematoloġija L-eżaminazzjonijiet ħematoloġiċi li ġejjin għandhom isiru fl-aħħar tal-perjodu għat-test: Haematocrit, konċentrazzjoni ta’ haemoglobin, l-għadd ta’ l- erythrocyte, l-għadd totali u differenzjali tal-leucocyte , l-għadd tal- platelet u l-kejl tal-ħin/potenzjali tal-boċċi fid-demm. Il-kampjuni tad-demm għandhom jittieħdu minn site imsemmija eżatti qabel jew bħala parti mill-proċedura tal-qtil ta’ l-annimali, u maħżuna f’kundizzjonijiet xierqa.

1.4.3.4. Il-bijokemistrija klinika Id-determinazzjonijiet tal-bijokemistrija klinika biex jinvestigaw effetti prinċipali tossiċi fit-tessuti u, speċifikament, l-effetti fuq il-kliewi u fuq il-fwied, għandhom isiru fuq il-kampjuni tad-demm miksuba mill-annimali kollha eżatti qabel jew bħala parti mill-proċedura tal-qtil ta’ l-annimali (apparti ta’ dawk li jinstabu qed imutu u/jew jinqatlu). Huwa rakkomandat is-sawm mal-lejl ta’ l-annimali qabel it-teħid tal-kampjuni tad-demm. L-investigazzjonijiet tal-plasma jew serum għandhom jinkludu is-sodju, il-putassa, il-glokożju, il-kolestorol totali, l-urea, il-creatinine, il-proteini u l-albumin totali, mill-inqas żewġ enzimi indikattivi ta’ effetti epatoċellulari (bħalma huma l-alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, alkaline phosphatase, gamma glutamyl transpeptidase, u sorbitol dehydrogenase). Il-kejl ta’ enzimi addizzjonali (ta’ oriġini epatika jew oħra) u aċidi tal-bile jista’ jipprovdi informazzjoni utli taħt ċerti ċirkostanzi. B’għażla, id-determinazzjonijiet ta’ l-analiżi ta’ l-urina li ġejjin jistgħu jsiru waqt l-aħħar ġimgħa ta’ l-istudju bl-użu tal-ġbir bil-ħin tal-volum ta’ l-urina; l-apparenza, il-volum, l-osmolality jew gravità speċifika, pH, il-proteini, il-glukożju u d-demm/iċ-ċelloli tad-demm. Barra minn hekk, studji biex jinvestigaw l-immarkar tas-serum ta’ ħsara ġenerali għat-tessuti għandhom jiġu kkunsidrati. Determinazzjonijiet oħra li għandhom jitwettqu jekk il-proprjetajiet magħrufa tas-sustanza għat-test jistgħu, jew huma suspettati li jaffettwaw il-profili metaboliċi relatati jinkludu il-kalċju, il-fasting triglycerides, l-ormoni speċifiċi, il-methaemoglobin u l-cholinesterase. Dawn iridu jiġu identifikati għas-sustanzi f’ċerti klassijiet jew fuq bażi ta’ kull każ. Fuq kollox, hemm il-bżonn ta’ attitudni flessibbli skond l-ispeċje u l-effett osservat u/jew mistenni mas-sustanza mogħtija. Jekk id-data storika mhix adegwata, għandha tingħata kunsiderazzjoni lid-determinazzjoni tal-varjabbli tal-bijokemistrija klinika u ematoloġika qabel ma jibda d-dożaġġ.

1.4.3.5. Nekropsija Grossa L-annimali kollha fl-istudju għandhom ikunu suġġetti għall-awtopsja sħiħa grossa ta’ wara l-mewt li tinkludi eżaminazzjoni bir-reqqa tal-wiċċ tal-ġisem, l-orifiċi kollha, u l-kavitajiet tal-kranju, tat-toraċi u dawk addominali u l-kontenut tagħhom. Il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, it-testi, l-epididymides, it-thymus, il-milsa, il-moħħ u l-qalb ta’ l-annimali kollha għandhom jiġu trimmjati minn kwalunkwe tessut aderenti, kif xieraq, u għandhom ikunu mwieżna niedja malajr kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni sabiex ma jinxfux. It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati fl-iktar medium xieraq għal kemm it-tip ta’ tessut u kemm għall-eżaminazzjoni ħispatoloġika maħsuba sussegwenti: il-feriti kbar kollha, il-moħħ (partijiet rappreżentattivi inklużi iċ-ċerebrum, iċ-ċerebellum u l-pons), il-korda spinali, l-istonku, l-intestini żgħar u kbar (inklużi l-Peyer's patches), il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, il-milsa, il-qalb, it-thymus, it-tajrojd, it-trakea u l-pulmuni (ippreservati bl-inflazzjoni bil-fixative imbagħad bl-immersjoni), il-gonads, l-organi sesswali aċċessorili (eż. L-utru, il-prostata), il-bużżieqa ta’ l-urina, in-noduli limfatiċi (preferibbilment nodulu limfatiku wieħed li jkopri r-rotta ta’ l-amministrazzjoni u oħra distanti mir-rotta ta’ l-amministrazzjoni biex tkopri l-effetti sistematiċi), in-nerv periferali (sciatic jew tibial) preferebbilment viċin il-muskolu, u biċċa mill-mudullun (jew, a fresh mounted bone marrow aspirate). Is-sejbiet klinikali u oħrajn jista’ jkollhom bżonn li jeżaminaw tessuti addizzjonali. Kwalunkwe organi li jistgħu jkunu organi-mira bbażati fuq il-proprjetajiet magħrufa tas-sustanza tat-test għandhom jiġu preservati.

1.4.3.6. Eżaminazzjoni ħistopatoloġika Il-ħispatoloġija kompluta għandha titwettaq fuq l-organi u t-tessuti ppreservati ta’ l-annimali kollha fil-gruppi ta’ kontroll u ta’ doża għolja. Dawn l-eżaminazzjonijiet għandhom jiġu estiżi għall-annimali tal-gruppi ta’ dożaġġ l-oħrajn ukoll, jekk it-tibdil relatat mat-trattament jiġi osservat fil-grupp ta’ doża għolja. Il-feriti grossi kollha għandhom jiġu eżaminati. Meta jintuża grupp satellita il-ħistopatoloġija għandha ssir fuq it-tessuti u l-organi identifikati bħala li qed juru l-effetti fil-gruppi trattati.

DATA

Id-data individwali għandha tiġi provduta. Barra minn hekk, id-data kollha għandha tkun riassunta f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta’ l-annimali nstabu maqtula waqt it-test jew li nqatlu għal raġunijiet umani u l-ħin ta’ kwalunkwe mewt jew qtil umanm in-numru li juri sinjali ta’ tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossiċità osservati, inkluż il-ħin ta’ l-onset, it-tul, il-qawwa ta’ kwalunkwe effetti tossiċi, in-numru ta’ l-annimali li għandhom il-feriti, it-tip ta’ feriti u l-perċentwal ta’ l-annimali li juri kull tip ta’ ferita. Fejn hu possibbli ir-riżultati numeriċi għandhom ikunu evalwati b’metodu statistiku ġeneralment aċċettat xieraq. Il-metodi statistiċi għandhom jingħażlu waqt id-disinn ta’ l-istudju.

3. IR-RAPPURTAĠĠ

3. IR-RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

L-annimali tat-test:

l-ispeċi/is-silta użati;

in-numru, l-età u s-sess ta’ l-annimali;

is-sors, il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpoġġew, id-dieta eċċ.;

il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, wara dan f’intervalli ta’ ġimgħa u fi tmiem it-test Il-kundizzjonijiet tat-test:

il-ġustifikazzjoni għall-aħażla tal-mezz, jekk mhuwiex l-ilma;

ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża;

id-dettalji tat-tħejjija tal-formulazzjoni/dieta tas-sustanza għat-test, il-konċentrazzjoni

miksuba u l-omoġeneità tat-tħejjija;

id-dettalji ta’ l-amministrazzjoni tas-sustanza għat-test;

il-konverżjoni mill-konċentrazzjoni tat-test għas-sustanza tad-dieta/l-ilma għax-xorb (ppm) għad-doża propja (mg/kg piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli;

id-dettalji tal-kwalità ta’ l-ikel u ta’ l-ilma.

Ir-riżultati:

Il-piż tal-ġisem/it-tibdil fil-piż tal-ġisem;

Il-konsum ta’ l-ikel u ta’ l-ilma jekk applikabbli;

Id-data tar-rispons tossiku bis-sess u bil-livell tad-doża, inklużi s-sinjali tat-tossiċità;

In-natura, il-qawwa u t-tul ta’ l-osservazzjonijiet kliniċi (jekk humiex riversibbli jew le);

l-attività sensorjali, is-saħħa tal-qabda ta’ l-id u l-valutazzjonijiet motor activity;

it-testijiet ematoloġiċi bil-baluri base-line relevanti;

it-testijiet tal-bijokemistrija kemikali bil-valuri base-line relevanti;

id-data tal-piż tal-ġisem fil-qtil u ta’ l-organi;

is-sejbiet tan-nekropsija;

deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha;

Id-data ta’ l-assorbiment jekk hi disponibbli;

trattament statistiku tar-riżultati, fejn hu xieraq.

Id-diskussjoni tar-riżultati;

Kunklużjonijiet.

4. REFERENZI Dan il-metodu huwa analogu għall-OECD TG 407

B.8. DOŻI REPETUTI (28 JUM) TOSSIĊITÀ (TEĦID MAN-NIFS)

B.8.

1. METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Huwa utili li jkun hemm informazzjoni preliminarja dwar id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli, l-pressjoni tal-fwar, il-punt tat-taħlil, il-punt tat-togħlija, il-punt tal-leħħa jew tal-isplussività (jekk applikabbli) tas-sustanza. Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (A).

1.2. DEFINIZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (B).

1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA Xejn.

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Diversi gruppi ta’ annimali sperimentali huma esposti għal perjodu definittiv lejn is-sustanza tat-test f’konċentrazzjonini bi gradwazzjonijiet, b’konċentrazzjoni waħda tkun użata għal kull grupp, għall-perjodu ta’ 28 jum. Meta mezz ikun użat sabiex jgħin fil-ġenerazzjoni b’konċentrazzjoni xierqa tas-sustanzi tat-test fl-atmosfera, mezz ta’ grupp ta’ kontroll għandu jkun użat. Matul il-perjodu ta’ l-amministrazzjoni, l-annimali huma osservati kuljum sabiex ikunu skoperti sinjali tat-tossiċità. Annimali li jmutu matul it-test ikollhom awtopsija tal-mewt u l-konklużjoni tat-test li l-annimali li jibqgħu ħajjin ikollhom ukoll l-awtopsija ta’ wara l-mewt.

1.5. KRITERJA TAL-KWALITÀ Xejn.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6.

1.6.1. Preparazzjonijiet L-annimali huma miżmuma b’fondi sperimentali u f’kundizzjonijiet tal-għalf għal mill-anqas ħamest ijiem qabel l-esperiment. Qabel it-test, annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma magħżula b’mod kif jinzerta u assenjati lejn in-numru meħtieġ ta’ gruppi. Meta meħtieġ, materjal adattat jista’ jkun miżjud mas-sustanza tat-test sabiex jgħin fil-ġenerazzjoni ta’ konċentrazzjonini xierqa tas-sustanza tat-test fl-atmosfera. Jekk xi materjal jew addittivi oħrajn ikunu użati għall-faċilizzazzjoni tad-doża, dawn għandhom ikunu magħrufa li ma jipproduċu l-ebda effetti tossiċi. Data storika tista’ tkun użata, jekk xieraq.

1.6.2. Il-kundizzjonijiet tat-test

1.6.2.

1.6.2.2. Numru u sess. Mill-anqas 10 annimali (ħamsa femminili u ħamsa maskili) għandhom ikunu użati f’kull livell ta’ doża. Jekk ikunu użati femminili, dawn għandhom ikunu femminili li qatt ma welldu u li ma humiex tqal. Jekk sagrifikar interim huwa pjanat, in-numru ta’ l-annimali għandu jkun miżjud bin-numru ta’ l-annimali skedati li jkunu sagrifikati qabel it-tkomplija ta’ l-istudju. B’żieda, grupp satellita ta’ 10 annimali (ħames annimali kull sess) jistgħu jkunu trattati b’doża ta’ livell għoli għal 28 jum u osservati għar-riversabbiltà, l-persistenza, jekk l-okkurenza mdewma ta’ l-effetti tossiċi tkun għal 14-il jum wara t-trattament. Grupp satellita ta’ 10 annimali ta’ kontroll (ħames annimali kull sess) huwa wkoll użat.

1.6.2.3. Konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni Mill-anqas tlett konċentrazzjoninijiet huma meħtieġa, b’kontroll jew mezz ta’ kontroll (korrespondenti għall-konċentrazzjoni tal-mezz fil-livell l-aktar għoli) tal-mezz jekk użat. Appart milli t-trattament tas-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom ikunu trattati b’mod identiku bħal dawk suġġetti għat-test. Il-livell ta’ l-ogħla doża għandu jirriżulta f’effetti tossiċi imma ma jipproduċi l-ebda, jew ftit, imwiet. Il-livell tad-doża l-aktar baxxa m’għandux jipproduċi xi evidenza ta’ tossiċità. Meta jkun hemm estimi użabbli ta’ l-espożizzjoni umana, il-livell l-aktar baxx għandu jeċċedi dan. Idealment, il-livell medju tad-doża għandu jipproduċi effetti tossiċi minimi osservabbli. Jekk aktar minn doża intermedja waħda tkun użata, l-livelli tad-doża għandhom ikunu spazjati bi gradjazzjoni ta’ l-effetti tossiċi. Fil-gruppi baxxi jew intermedji u f’dawk tal-kontroll, l-inċidenza ta’ xi fatalitajiet għandha tkun baxxa sabiex tippermetti ewalwazzjoni sensibbli tar-riżultati.

1.6.2.4. Ħin ta’ l-espożizzjoni It-tul ta’ l-espożizzjoni ta’ kuljum għandu jkun ta’ sitt siegħat imma perijodi oħrajn jistgħu ikunu meħtieġa sabiex jilħqu l-ħtiġiet speċifiċi.

1.6.2.5. Apparat L-annimali għandhom ikunu testjati bl-apparat tan-nifs iddisinjat għas-sostenn ta’ nixxija ta’ arja dinamika ta’ mill-anqas 12-il kambjamenti ta’ l-arja fis-siegħa, sabiex ikun assigurat kontenut adekwat ta’ l-ossiġenu u espożizzjoni ta’ l-atmosfera mqassma b’mod egwali. Meta kabina tkun użata, d-disinn tagħha għandu jimminimizza l-iffullar ta’ l-annimali tat-test u jimminimizzaw l-espożizzjoni tagħhom man-nifs tas-sustanza tat-test. Bħala regola ġenerali sabiex tkun assigurata l-istabbilità ta’ l-atmosfera fil-kabina il-volum totali ta’ l-annimali tat-test m’għandux jeċċedi 5 % tal-volum tal-kabina tat-test. Ħalq-nażali, ir-ras biss, jew l-ispazji tal-kabina ta’ l-espożizzjoni jista’ jkun użat; bl-ewwel tnejn għandhom jgħinu li jimminimizzaw l-ammont tas-sustanza tat-test b’meżżi oħrajn.

1.6.2.6. Perijodu ta’ l-Osservazzjoni L-annimali sperimentali għandhom ikunu osservati ta’ kuljum għal sinjali ta’ tossiċità matul il-perjodu kollu tat-trattament u ta’ l-irkupru. Il-ħin tal-mewt u ż-żmien li fih tidher jew tisparixxi t-tossiċità għandhom ukoll ikunu reġistrati.

1.6.3. Il-proċedura L-annimali jirċievu d-doża bis-sustanza tat-test idealment fis-sebat ijiem tal-ġimgħa għal perjodu ta’ 28 jum. L-annimali f’xi grupp satellita skedat għall-osservazzjoni b’segwiment għandhom jinżammu għal 14-il jum ieħor mingħajr trattament sabiex tkun żvelata xi rkupru minn, jew il-persistenza ta’, l-effetti tossiċi. It-temperatura li fiha t-test ikun imwettaq għandha tinżamm fi 22 ± 3 oC. Idealment, l-umdità relattiva għandha tinżamm bejn 30 u 70 %, imma f’ċerti kazi (eż. it-testijiet ta’ uħud mill-aerosols) dan jista’ ma jkunx prattikabbli. Il-manteniment ta’ pressjoni kemxejn negattiva ġewwa l-kabina (= 5 mm ta’ ilma) tkun tipprevjeni l-ħruġ tas-sustanza tat-test fiż-żona tal-madwar. L-ikel u l-ilma għandhom ikunu miċħuda matul l-espożizzjoni. Sistema ta’ inħalazzjoni dinamika b’konċentrazzjoni analitika xierqa tas-sistema tal-kontroll għandha tkun użata. Sabiex tkun stabbilita espożizzjoni xierqa tal-konċentrazzjoni, test bi prova huwa rakkomandat. Il-kurrent ta’ l-arja għandu jkun aġġustat sabiex jassigura li l-kundizzjonijiet matul il-kabina ta’ l-espożizzjoni jkunu omoġenji. Is-sistema għandha tassigura li kundizzjonijiet stabbli ta’ l-espożizzjoni jintlaħqu malajr kemm jista’ jkun possibbli. Il-kejl u l-moniteraġġ għandu jsir: Matul u wara l-espożizzjoni, osservazzjoni hija mwettqa u reġistrata b’mod sistematiku; dettalji individwali għandhom jinżammu għal kull annimal. L-annimali kollha għandhom ikunu osservati kuljum u s-sinjali tossiċi reġistrati jkunu inklużi, meta jsir it-tfaqqiegħ, il-grad u t-tul ta’ żmien tagħhom. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u l-pil, fl-għajnejn u membrani mukożji, u anki s-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tas-sistema ċentrali tan-nervaturi, l-attività somatomotori u l-istil ta’ l-imġieba. Il-kejl għandu jsir ta’ kull ġimgħa dwar il-piż ta’ l-annimali. Huwa wkoll rakkomandat li l-konsum ta’ l-ikel ikun imkejjel ta’ kull ġimgħa. Osservazzjonijiet regolari ta’ l-annimali huma meħtieġa sabiex jassiguraw li l-annimali jkunu, sakemm ikun possibbli, m’humiex mitlufa mill-istudju minħabba kawżi oħrajn bħalma huma kannibaliżmu, awtolożi tan-nisġa jew mitlufa. Fit-tmiem tal-perjodu ta’ l-istudju, dawk kollha li jkunu għadhom ħajjin fil-gruppi tat-trattament mhux-satellita, jkunu maqtula u awtopsija tkun imwettqa immedjatament. Annimali moribondi u annimali f’uġiegħ jew li ghaddejjin minn strapazz sever għandhom ikunu mneħħija meta dan ikun innutat, u maqtula sabiex tkun evitata l-moħqrija, waqt li titwettaq awtopsija ta’ wara l-mewt. L-eżami li ġejja għandha sseħħ fit-tmiem tal-perjodu tat-test għall-annimali kollha, inklużi dawk tal-kontrolli: Determinazzjonijiet oħrajn li jistgħu jinħtieġu għal evalwazzjoni tossikoloċika adekwata, inkluż il-kalċju, l-fosfru, l-klorid, is-sodju, l-putassa, l-glokożju tas-sawm, l-analiżi tal-lipidi, l-ormoni, l-bilanċ tal-aċidu/bażi, il-metaemoglobina, l-attività kolinesterażi. Biokemistrija klinika addizzjonali tista’ tkun użata, meta meħtieġ, sabiex tkun estiża l-investigazzjoni ta’ l-effetti osservati.

1.6.3.

(a) tar-rata tal-kurrent ta’ l-arja (b’mod kontinwu).

(b) il-konċentrazzjoni attwali tas-sustanza tat-test imkejla fiż-żona ta’ fejn jittieħed in-nifs. Matul il-perjodu ta’ l-espożizzjoni, l-konċentrazzjonijiet m’għandhomx ivarjaw b’aktar minn ± 15 % tal-medja tal-valur. B’danakollu, fil-każ ta’ uħud mill-aerosols, dan il-livell ta’ kontroll ma jistax ikun milħuq u medda aktar wiesgħa tkun għalhekk aċċettabbli. Matul iż-żmien totali ta’ l-istudju, l-konċentrazzjonijiet minn jum għal jum għandhom jinżammu kostanti kemm jista’ jkun possibbli. Għall-aerosols, mill-anqas analiżi ta’ partikola waħda għandha tkun imwettqa darba fil-ġimgha għal kull grupp;

(ċ) tat-temperatura u l-umidità, kontinwament jekk possibbli.

(i) ħematoloġija, inkluża mill-anqas il-ħematokrità, l-konċentrazzjonini tal-ħemaglobulini, l-għadd ta’ l-eritroċiti, l-għadd totali u differenzali tal-lewtoċiti, u l-kejl tal-potenzal ta’ boċċi fid-demm;

(ii) biokemistrija klinika tad-demm, inkluż mill-anqas parametru wieħed tal-fwied u tal-funzjoni tal-kliewi: aminotransferażi ta’ l-alanina (qabel kienet magħrufa bħala t-transaminażi piruvika glutamika), l-aminotransferażi aspartata tas-serum (qabel kienet magħrufa bħala t-transaminażi ossalo-aċetika glutamika), in-nitroġenu ta’ l-urea, l-albumina, l-kreatinin tad-demm, il-bilirubin totali u l-protein totali tas-serun.

1.6.3.1. Nekropsija Grossa (awtopsija ta’ wara l-mewt) L-annimali kollha fl-istudju għandhom ikunu suġġetti għall-awtopsija sħiħa grossa ta’ wara l-mewt. Mill-anqas il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, u t-testi għandhom ikunu mwieżna niedja malajr kemm jista’ jkun poissibbli wara d-dissikazzjoni sabiex ikun evitat li jinxfu. Organi u ċerti nsiġ tal-ġisem (fwied, kliewi, il-milsa (l-marrara), t-testi, l-adrenali, l-qalb, u xi organi oħrajn li juru feriti kbar jew tibdil fid-daqs) għandhom ikunu preservati f’medja xierqa għall-possibbiltà ta’ eżami fuut ħistopatoloġiku. Il-pulmuni għandhom jinqalgħu intatti, miżuna u ittrattati b;’fissattiv xieraq sabiex ikun assigurat li l-istruttura tal-pulmun tkun miżmumha.

1.6.3.2. Eżaminazzjoni ħistopatoloġika Fil-grupp ta’ doża għolja u fil-grupp ta’ kontroll, l-eżaminazzjoni ħistoloġika għandha tkun imwettqa fuq l-organi u l-insiġ ippreservati. Organi u nsiġ li juru difetti attribwibbli għas-sustanza tat-test fil-livell ta’ l-għola doża għandhom ikunu eżaminati fil-gruppi kollha tad-doża l-baxxa. L-annimali f’xi grupp satellita għandhom ikunu eżaminati ħistoloġikalment b’enfasi partikolari fuq l-organi u nsiġ identifikati bħala li juru effetti fil-gruppi l-oħrajn ittrattati.

2. DATA Id-data għandha tkun riassunta f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test u n-numru ta’ l-annimali li jiżvelaw kull tip ta’ ferita. Ir-riżultati osservati kollha għabdhom ikunu evalwati b’metodu statistiku xieraq. Kwalunkwe metodu statistiku rikonoxxut jista’ jkun użat.

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

l-ispeċi, s-silta, s-sorsi, l-kundizzjonijiet ambjentali, id-dieta, eċċ.;

il-kundizzjoni tat-test. Deskrizzjoni ta’ l-apparat ta’ l-espożizzjoni, inkluż id-disinn, it-tip, il-qisien, is-sorsi ta’ l-arja, is-sistema għall-ġenerazzjoni ta’ l-aerosols, metodu għall-kondizzjonar ta’ l-arja u l-metodu taż-żamma ta’ l-annimali fil-kabina tat-test, meta din tkun użata. L-apparat għall-kejl tat-temperatura, l-umidità, il-koncentrazzjonijiet ta’ l-aerosol u d-distrubuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli, għandhom ikunu deskritti. Data ta’ l-espożizzjoni: Dawn għandhom ikunu tabulati u preżentati mal-valuri medji u l-kejl tal-varjabbiltà (eż. devjazzjoni normali) u għandhom, meta possibbli, jinkludu:

3.1. pt_2

(a) ir-rati tal-kurrent ta’ l-arja matul l-apparat tat-teħid man-nifs;

(b) it-temperatura u l-umidità ta’ l-arja;

(ċ) konċentrazzjonijiet nominali (ammont totali tas-sustanza ta’ kif infuża fl-apparat tat-teħid man-nifs, diviża bil-volum ta’ l-arja);

(d) in-natura tal-mezz, jekk użat;

(e) il-konċentrazzjonijiet attwali fiż-żona tat-teħid tan-nifs waqt it-test;

(f) Il-massa tad-dijametru erodinamiku medjan (MMAD) u d-devjazzjoni ġeometrika normali (GSD);

dettalji dwar ir-reazzjoni tossika bis-sess u d-doża;

il-ħin tal-mewt matul l-istudju jew meta l-annimali jkunu baqgħu ħajjin fit-terminazzjoni tat-test;

deskrizzjoni ta’ l-effetti tossiċi u oħrajn; il-livell ta’ l-ebda effett;

il-ħin ta’ l-osservazzjoni u kull sinjal annormali u l-korsa sussegwenti tiegħu;

dettalji dwar l-ikel u piż tal-ġisem;

testijiet ħematoloġiċi użati u r-riżultati kollha;

testijiet ħematoloġiċi kliniċi użati u r-riżultati kollha;

is-sejbiet ta’ l-awtopsja ta’ wara l-mewt;

deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha;

trattament statistiku tar-riżultati, meta xieraq;

diskussjoni tar-riżultati;

l-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (D).

4. REFERENZI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (E).

B.9. DOŻI REPETUTI (28 JUM) TOSSIĊITÀ (DERMALI)

B.9.

1. METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (A).

1.2. DEFINIZZJONIJIET Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (B).

1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA Xejn.

1.4. PRINCIPJU TAL-METODU TAT-TEST Is-sustanza tat-test hija somministrata b’mod orali, ta’ kuljum, b’dożi meqjusa lil diversi gruppi ta’ annimali sperimentali, b’doża waħda tkun użata ma kull grupp matul perjodu ta’ 28 jum. Matul il-perjodu ta’ l-amministrazzjoni, l-annimali huma osservati ta’ kuljum sabiex ikunu skoperti sinjali tat-tossiċità. Annimali li jmutu matul it-test ikollhom awtopsija tal-mewt u l-konklużjoni tat-test li l-annimali li jibqgħu ħajjin ikollhom ukoll l-awtopsija ta’ wara l-mewt.

1.5. KRITERJA TAL-KWALITÀ Xejn.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6.

1.6.1. Preparazzjonijiet L-annimali huma miżmuma f’fondi sperimentali u f’kundizzjonijiet tal-għalf għal mill-anqas ħamest ijiem. Qabel it-test, annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma magħżula b’mod kif jinzerta u assenjati lejn gruppi għat-trattament. Xi ftit qabel it-testijiet, il-pil huwa maqtugħ miż-żona dorsali tad-dahar ta’ l-annimali tat-test. It-tqaxxir jista’ jkun użat imma għandu jkun imwettaq madwar 24 siegħa qabel it-test. Ir-repetizzjoni tal-qtugħ jew tat-tqaxxir normalment ikun meħtieġ f’intervalli ta’ madwar darba fil-ġimgħa. Meta jsir il-qtugħ jew it-tqaxxir tal-pil, kura għandha tittieħed sabiex ikun evitat xi grif fil-ġilda li jkunu jistgħu jibdlu l-permeabbiltà tagħha. Mhux anqas minn 10 % tal-wiċċ tal-ġisem għandu jkun imnaddaf għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Il-piż ta’ l-annimali għandu jkun meqjus meta tkun deċiża ż-żona li għandha tkun imnaddfa u l-qisien kollha tal-koperta. Meta jsiru testijiet tas-solidi, li jistgħu ikunu pulverizzati jekk xieraq, is-sustanza tat-test għandha tkun b’umidità suffiċjenti bl-ilma, jew, meta meħtieġ, apparat adattat sabiex jassigura kuntatt tajjeb mal-ġilda. Sustanzi likwidi tat-test huma ġeneralment użati mingħajr ma jkunu mrattba. Applikazzjoni odjerna bħala bażi ta’ minn ħamsa sa sebat ijiem fil-ġimgħa hija użata.

1.6.2. Kundizzjonijiet tat-test

1.6.2.

1.6.2.1. Annimali sperimentali Firien jew fniek, jew fniek ta’ l-indi adulti jistgħu ikunu użati. Speċje oħrajn jistgħu ikunu użati imma l-użu tagħhom ikun jeħtieġ ġustifikazzjoni. Fil-bidu ta’ kull test, il-medda tal-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandhiex teċċedi ± 20 % tal-valur medju kif xieraq.

1.6.2.2. Numru u sess. Mill-anqas 10 annimali gerriema (ħamsa femminili u ħamsa maskili) għandhom ikunu użati f’kull livell ta’ doża. Jekk ikunu użati femminili, dawn għandhom ikunu femminili li qatt ma weldu u li ma humiex tqal. Jekk sagrifikar interim huwa ippjanat, in-numru ta’ l-annimali għandu jkun miżjud bin-numru ta’ l-annimali skedati li jkunu sagrifikati qabel it-tkomplija ta’ l-istudju. B’żieda, grupp satellita ta’ 10 annimali (ħames annimali kull sess) jistgħu ikunu ittrattati b’doża ta’ livell għoli għal 28 jum u osservati għar-riversabbiltà, persistenza, jew ghal okkurrenza mdewma ta’ l-effetti tossiċi għal 14-il jum ta’ wara t-trattament. Grupp satellita ta’ 10 annimali ta’ kontroll (ħames annimali kull sess) huwa wkoll użat.

1.6.2.3. Livell tad-doża Mill-anqas tlett livelli ta’ dożi huma meħtieġa bil-kontroll u mezz ta’ kontroll, jekk mezz ikun użat. Il-perjodu ta’ l-osservazzjoni għandu jkun ta’ mill-anqas ta’ sitt siegħat kuljum. Għal sustanzi amministrati bi tmiegħ sfurzat, id-doża għandha tkun mogħtija f’ħinijiet simili f’kull jum u l-livelli tad-doża għandhom ikunu aġġustati matul l-intervalli (ta’ kull ġimgha jew ta’ darbtejn fil-gimgħa) sabiex jinżamm livell ta’ doża kostanti f’termini tal-piż ta’ l-annimal. Apparti milli t-trattament tas-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom ikunu trattati b’mod identiku bħal dawk suġġetti għat-test. Meta mezz ikun użat sabiex jiffaċilita l-għoti tad-doża, l-kontrolli għandhom ikollhom doża bil-mezz bl-istess mod bħal gruppi ittrattati, u jirċievu l-istess ammont ta’ mezz bħal dak li jkunu irċevew il-grupp bil-livell ta’ l-ogħla doża. Il-livell ta’ l-ogħla doża għandu jirriżulta f’effetti tossiċi imma ma jipproduċi l-ebda, jew ftit, imwiet. Il-livell tad-doża l-aktar baxxa m’għandux jipproduċi xi evidenza ta’ tossiċità. Meta jkun hemm estimi użabbli ta’ l-espożizzjoni umana, il-livell l-aktar baxx għandu jeċċedi dan. Idealment, il-livell medju tad-doża għandu jipproduċi effetti tossiċi minimi osservabbli. Jekk aktar minn doża intermedja waħda tkun użata, l-livelli tad-doża għandhom ikunu spazzjati bi gradjazzjoni ta’ l-effetti tossiċi. Fil-gruppi baxxi jew intermedji u f’dawk tal-kontroll, l-inċidenza ta’ xi fatalitajiet għandha tkun baxxa sabiex tippermetti ewalwazzjoni sensibbli tar-riżultati. Jekk l-applikazzjoni tas-sustanzi tat-test tipproduċi irritazzjoni severa tal-ġilda, l-konċentrazzjonijiet għandhom ikunu mnaqqsa u dan jista’ jirriżulta fi tnaqqis fil, jew fl-assenza ta’, l-effetti tossiċi l-oħrajn, fil-livell għoli tad-doża. Aktar minn hekk, jekk il-ġilda tkon sofriet ħsara qawwija, jista’ jkun meġtieġ li jkun imwaqqaf l-istudju u li jinbeda studju ġdid b’konċentrazzjoni aktar baxxa.

1.6.2.4. Test ta’ limitazzjoni Jekk studju preliminari fil-livell ta’ doża ta’ 1000 mg/kg, jew livell ta’ doża ogħla relattat ma l-espożizzjoni umana possibbli meta dan ikunu magħruf, ma jipproduċi l-ebda effetti tossiċi, aktar testijiet ma jkunu aktar meqjusa bħala meħtieġa.

1.6.2.5. Perijodu ta’ l-Osservazzjoni L-annimali sperimentali għandhom ikunu osservati ta’ kuljum għal sinjali tat-tossiċità. Il-ħin tal-mewt u ż-żmien li fih tidher jew tisparixxi t-tossiċità għandhom ukoll ikunu irreġistrati.

1.6.3. Il-proċedura L-annimali għandhom jinżammu f’gaġġeġ individwali. L-annimali jirċievu d-doża bis-sustanza tat-test idealment fis-sebat ijiem tal-ġimgħa għal perjodu ta’ 28 jum. L-annimali f’xi grupp satellita skedat għall-osservazzjoni b’segwiment għandhom jinżammu għal 14-il jum ieħor mingħajr trattament sabiex tkun żvelata xi irkupru minn, jew il-persistenza ta’, l-effetti tossiċi. Il-perjodu ta’ l-osservazzjoni għandu jkun ta’ mill-anqas ta’ sitt siegħat kuljum. Is-sustanza tat-test għandha tkun applikata b’mod uniformi fuq żona li hija madwar 10 % taż-żona totali tal-wiċċ tal-ġisem. B’sustanzi ferm tossiċi, iż-żona tal-wiċċ koperta tista’ tkun anqas imma kemm jista’ jkun miż-żona għandha tkun koperta b’saff irqieq u uniformi kemm jista’ jkun possibbli. Matul l-espożizzjoni s-sustanza tat-test tinżamm f’kuntatt mal-ġilda b’garża poruża u faxxa mhux irritanti. Is-sit tat-test għandu jkun aktar kopert b’mod xieraq sabiex iżomm il-faxxex bil-garża u s-sustanza tat-test u jassiguraw li l-annimali ma jkunux jistgħu jilgħaqu u jieklu s-sustanza tat-test. Restrizzjonijiet jistgħu jintużaw sabiex jipprevjenu l-inġestjoni tas-sustanza tat-test, imma immobilizzazzjoni kompleta mhix metodu rakkommandat. Bħala alternattiva, apparat b’għonq protettiv jista’ jkun użat. Fit-tmiem tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni, ir-residwu tas-sustanza tat-test għandu jkun imneħħi, meta prattikabbli, bl-użu ta’ ilma jew xi metodu xieraq ieħor tat-tindif tal-ġilda. L-annimali kollha għandhom ikunu osservati ta’ kuljum u s-sinjali tossiċi irreġistrati jkunu inklużi, meta jsir it-tfaqqiegħ, il-grad u t-tul ta’ żmien tagħhom. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u l-pil, fl-għajnejn u membrani mukożji, u anki fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tas-sistema ċentrali tan-nervituri; l-attività somatomotori u l-istil ta’ l-imġieba. Il-kejl għandu jsir ta’ kull ġimgħa dwar il-piż ta’ l-annimali. Huwa wkoll rakkommandat li l-konsum ta’ l-ikel ikun imkejjel ta’ kull ġimgħa. Osservazzjonijiet regolari ta’ l-annimali huma meħtieġa sabiex jassiguraw li l-annimali jkunu, sakemm ikun possibbli, mhux mitlufa mill-istudju minħabba kawżi oħrajn bħalma huma kannibaliżmu, awtolożi tan-nisġa jew mitlufa. Fit-tmiem tal-perjodu ta’ l-istudju, dawk kollha li jkunu għadhom ħajjin fil-gruppi tat-trattament mhux-satellita, jkunu maqtula u awtopsija tkun imwettqa immedjatament. Annimali moribondi u annimali f’uġiegħ jew strapazz sever għandhom ikunu mneħħija meta dan ikun innutat, u maqtula sabiex tkun evitata l-moħqrija u titwettaq awtopsja ta’ wara l-mewt. L-eżami li ġejja għandha sseħħ fit-tmiem tal-perjodu tat-test għall-annimali kollha, inklużi dawk tal-kontrolli: Determinazzjonijiet oħrajn li jistgħu jkunu meħtieġa għal evalwazzjoni tossikologika adekwata, inkluż il-kalċju, l-fosfru, l-klorid, is-sodju, il-putassa, l-glokożju tas-sawm, l-analiżi tal-lipidi, l-ormoni, l-bilanċ tal-aċidu/bażi, l-metaemoglobina, l-attività kolinesterażi. Biokemistrija klinika addizzjonali tista’ tkun użata, meta meħtieġ, sabiex tkun estiża l-investigazzjoni ta’ l-effetti osservati.

1.6.3.

1) ħematoloġija, inkluża mill-anqas il-ħematokrità, l-konċentrazzjoni tal-ħemaglobulini, l-għadd ta’ l-eritroċiti, l-għadd totali u differenzali tal-lewtoċiti, u l-kejl tal-potenzal ta’ boċċi fid-demm;

2) biokemistrija klinika tad-demm, inkluż mill-anqas parametru wieħed tal-fwied u tal-funzjoni tal-kliewi: aminotransferażi ta’ l-alanina tas-serum (qabel kienet magħrufa bħala t-transaminażi piruvika glutamika), il-aminotransferażi aspartata tas-serum (qabel kienet magħrufa bħala t-transaminażi ossalo-aċetika glutamika), in-nitroġenu ta’ l-urea, l-albumina, il-kreatinin tad-demm, il-bilirubin totali u l-protein totali tas-serun.

1.6.4. Nekopsija Grossa (awtopsija ta’ wara l-mewt) L-annimali kollha fl-istudju għandhom ikunu suġġetti għall-awtopsja sħiħa grossa ta’ wara l-mewt. Mill-anqas il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, u t-testi għandhom ikunu miżuna niedja malajr kemm jista’ jkun poissibbli wara d-dissikazzjoni sabiex ikun evitat li jinxfu. Organi u ċerti nsiġ tal-ġisem (fwied, kliewi, il-milsa (l-marrara), it-testi, l-adrenali, l-qalb, u xi organi oħrajn li juru feriti kbar jew tibdil fid-daqs) għandhom ikunu ippreservati f’medja xierqa għall-possibbiltà ta’ eżami futura ħistopatoloġika.

1.6.5. Eżaminazzjoni ħistopatoloġika Fil-grupp ta’ doża għolja u fil-grupp ta’ kontroll, l-eżaminazzjoni ħistoloġika għandha tkun imwettqa fuq l-organi u l-insiġ ippreservati. Organi u nsiġ li juru difetti attribwibbli għas-sustanza tat-test fil-livell ta’ l-ogħla doża għandhom ikunu eżaminati fil-gruppi kollha tad-doża l-baxxa. L-annimali f’xi grupp satellita għandhom ikunu eżaminati ħistoloġikalment b’enfasi partikolari fuq l-organi u nsiġ identifikati bħala li juru effetti fil-gruppi l-oħrajn ittrattati.

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

id-dettalji dwar l-annimal (l-ispeċje, silta, sorsi, il-kundizzjonijiet ambjentali, dieta, eċċ.);

kundizzjonijiet tat-test (inklużu t-tip ta’ faxex: okklussivi jew mhux okklussivi);

il-livelli tad-doża (inkluż il-mess, jekk użat), u l-konċentrazzjonijiet;

il-livell ta’ l-ebda effett, meta possibbli;

dettalji dwar ir-reazzjoni tossika bis-sess u d-doża;

il-ħin tal-mewt matul l-istudju jew meta l-annimali jkunu baqgħu ħajjin fit-terminazzjoni tat-test;

l-effetti tossiċi jew oħrajn;

il-ħin ta’ l-osservazzjoni u kull sinjal annormali u l-korsa sussegwenti tiegħu;

dettalji dwar l-ikel u piż tal-ġisem;

testijiet ħematoloġiċi użati u r-riżultati kollha;

testijiet ħematoloġiċi kliniċi użati u r-riżultati kollha;

is-sejbiet ta’ l-awtopsja ta’ wara l-mewt;

deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha;

trattament statistiku tar-riżultati, meta xieraq;

diskussjoni tar-riżultati;

interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (D).

4. REFERENZI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (E).

B.10. MUTAĠENIĊITÀ – TEST IN VITRO DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMITAL-MAMMIFERI

B.10.

1. METODU Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 473, Test in vitro dwar Anormalità fil-Kromożomi tal-Mammiferi (1997).

1.

1.1. INTRODUZZJONI L-għan tat-test in vitro dwar anormalità fil-kromożomi huwa biex jiġu identifikati aġenti li jikkawżaw anormalitajiet strutturali fil-kromożomi f'kulturi ta' Ċelloli tal-mammiferi (1) (2) (3). Anormalitajiet strutturali jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomi jew kromatidi. Fil-maġġoranza ta' mutaġeni kimiċi, anormalitajiet imġiegħela huma tat-tip kromatidu, iżda jirrikorru wkoll anormalitajiet tat-tip ta' kromożomi. Żieda fil-poliplojdi tista’ tindika li kimika għandha l-potenzal li ġġib magħha anormalitajiet numeriċi. Madankollu, dan il-metodu mhux maħsub biex iqis anormalitajiet numeriċi u ma jintużax normalment għal dak il-għan. Mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm xhieda sostanzjali li mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati li jikkawżaw alterazzjonijiet f'onkoġeni u f'ġeni ta' Ċelloli somatiċi li jrażżnu t-tumuri huma involuti fil-ħolqien tal-kanċer fil-bniedem u annimali sperimentali. It-test in vitro ta' anormalità fil-kromożomi jista’ jagħmel użu minn kulturi ta' linji ta' Ċelloli stabbiliti, tipi ta' Ċelloli, jew kulturi ta' Ċelloli primarji. Iċ-ċelluli jingħażlu fuq bażi ta' kemm jistgħu jikbru fil-kultura, l-istabbilità tal-karjotip, għadd ta' kromożomi, diversità ta' kromożomi u frekwenza spontanea ta' anormalitajiet fil-kromożomi. Testijiet magħmula in vitro ġeneralment jeħtieġu l-użu ta' għejun essoġenu ta' attivazzjoni metabolika. Din is-sistema ta' attivazzjoni metabolika ma tista’x kompletament tkun bħall-kundizzjonijiet in vivo tal-mammiferi. Għandha tingħata attenzjoni biex jiġu evitati kundizzjonijiet li jwasslu għal riżultati pożittivi li ma jirriflettux mutaġeneċità intrinsika u jistgħu jinħolqu minn bidliet fil-pH, osmolalità jew livelli għoljin ta' ċitotossiċità (4) (5). It-test jintuża biex jiġi kontrollat hemmx mutaġeni jew karċinoġeni fil-mammiferi. Ħafna komposti li huma pożittivi f'dan it-test huma karċinoġeni fil-mammiferi; madankollu ma hemmx korrelazzjoni perfetta bejn dan it-test u l-karċinoġeniċità. Il-korrelazzjoni tiddependi fuq il-klassi kimika u hemm xiedha dejjem tikber li jeżistu karċinoġeni li ma jiġux żvelati b'dan it-test għax jidher li jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi li huma differenti minn ħsara diretta fid-DNA. Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali Taqsima B.

1.2. DEFINIZZJONIJIET Anormalità tat-tip kromatidu : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi. Anormalità tat-tip tal-kromożomi: ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f'sit identiku. Endoreduplikazzjoni: proċess li fih wara perjodu S ta' replikazzjoni ta' DNA, in-nukleu ma jispiċċax f'mitożi iżda jerġa' jibda perjodu ieħor S. Ir-riżultat hu kromożomi bi 4, 8, 16,… kromatidi. Vojt: leżjoni akromatika iżgħar mill-wisgħa ta' kromatid wieħed, u b'misallinjament minimu tal-kromatidi. Indiċi mitotiku: il-paragun ta' Ċelloli fil-metafażi diviżi min-numru totali ta' Ċelloli osservati f'popolazzjoni ta' Ċelloli; indikazzjoni tal-livell ta' profilerazzjoni ta' dik il-popolazzjoni. Anormalità numerika: bidla fin-numru ta' kromożomi min-numru karatteristku normali ta' Ċelloli utilizzati. Poliplojdi: multiplu tan-numru aplojdu ta' kromożomi (n) minbarra n-numru diplojdu (jiġifieri 3n, 4n, eċċetera). Anormalità strutturali: bidla fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku ta' l-istadju metafażiku tad-diviżjoni ta' ċelluli, osservati bħala tħassir u biċċiet, bidliet minn ġewwa u bidliet bejniethom.

1.3. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Kulturi ta' Ċelloli huma esposti għas-sustanza tat-test kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. F'intervalli predeterminati wara l-espożizzjoni ta' kulturi ta' Ċelloli għas-sustanza tat-test, jiġu ttrattati b'sustanza li twaqqaf il-metafażi (eż. Colcemid® jew kolċiċina), Ċelloli maħsudin, mtebbgħin u matafażiċi jiġu analizzati taħt mikroskopju għall-preżenza ta' anormalitajiet fil-kromożomi.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.

1.4.1. Preparazzjonijiet

1.4.1.

1.4.1.1. Ċelloli Jistgħu jintużaw varjetà ta' linji ta' Ċelloli, tipi ta' Ċelloli jew kulturi primarji ta' Ċelloli, inklużi Ċelloli umani (eż. fibroblasti ta' Chinese hamster, limfoċiti tad-demm umani jew periferali mal-mammiferi oħrajn).

1.4.1.2. Il-kundizzjonijiet tal-medjum u tal-kulturi Għandhom jintużaw medjum xieraq ta' kulturi, u kundizzjonijiet ta' inkubazzjoni (kontenituri għall-kulturi, konċentrazzjoni CO2, temperatura u umdità) sabiex jinżammu l-kulturi. Linji u tipi ta' ċelluli stabbiliti għandhom jiġu kontrollati kull tant żmien għall-istabbilità fl-għadd ta' kromożomi modali u għan-nuqqas ta' kontaminazzjoni minn mikoplasma u m'għandhomx jintużaw jekk ikunu kontaminati. Għandu jkun magħruf ukoll il-perjodu normali ta' ċiklu ta' ċellula għaċ-ċelluli u għall-kundizzjonijiet tal-kulturi.

1.4.1.3. Preparazzjoni tal-kulturi Linji u tipi ta' Ċelloli stabbiliti: iċ-ċelluli huma mnisslin minn ħażniet ta' kulturi, miżrugħa f'medjum ta' kulturi f'dik id-densità li tiżgura li l-kulturi ma jilħqux konfluwenza qabel il-ħsad, u inkubati f'teperatura ta' 37 oC. Limfoċiti: demm sħiħ trattat b'antikoagulant (eż. heparin) jew limfoċiti separati miksubin minn suġġetti b'saħħithom jiżdiedu mal-madju tal-kulturi li jkun fih mitoġenu (eż. fitohaemagglutinin) u inkubati f'temperatura ta' 37 oC.

1.4.1.4. Attivazzjoni metabolika Iċ-ċelluli għandhom jiġu esposti għas-sustanza tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fin-nuqqas ta' sistema xierqa ta' attivazzjoni metabolika. Is-sistema li l-aktar tintuża huja dik tal-cofactor-supplemented post-mitochondrial fraction (S9) preparata mill-fwied ta' annimali gerriema trattat b'aġenti li jġibu l-enżimi bħal ma huma l-Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9), jew taħlita ta' fenobarbitone u β-naftoflavone (10) (11) (12). Il-frazzjon post-mitochondrial tintuża ġeneralment f'konċentrazzjonijiet fil-medda minn 1-10 % v/v fil-medju finali tat-test. Is-sistema ta' attivazzjoni metabolika tista’ tiddependi fuq il-klassi tal-kimika li qed tiġi ttestjata. F'ċerti każijiet jista’ jkun xieraq li tintuża aktar minn konċentrazzjoni waħda għall-frazzjon post-mitochondrial. Numru ta' żviluppi, inkluż il-ħolqien ta' linji ta' Ċelloli ġenetikament iġġenerati li jesprimu enżimi attivanti speċifiċi, jistgħu jkunu ta' potenzal għal attivazzjoni endoġenea. L-għażla tal-linji ta' Ċelloli użati għandha tkun ġustifikata xjentifikament (eż. bir-rilevanza tal-ċitikromu P450 isoenzim għall-metaboliżmu tas-sustanza tat-test).

1.4.1.5. Sustanza tat-test/Preparazzjoni Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewwbin jew sospiżi f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament taċ-Ċelloli. Jistgħu jiżdiedu sustanzi likwidi tat-test direttament mas-sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix l-aċċettabbilità tal-ħażna.

1.4.2. Kundizzjonijiet tat-test

1.4.2.

1.4.2.1. Solvent/mezz Ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika bejn is-solvent/mezz u s-sustanza tat-test, u s-solvent/mezz għandu jkun kompatibbli mas-sopravivenza taċ-Ċelloli u l-attività S9. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra minflok dawk l-aktar magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Hu rakkomandat li kemm jista’ jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akwuż. Meta jiġu ttestjati sustanzi li mhumiex stabbli fl-ilma, is-solventi organiċi li jintużaw għandhom jkunu mingħajr ilma. L-ilma jista’ jitneħħa billi jintuża passatur molekulari.

1.4.2.2. Konċentrazzjonijiet ta' espożizzjoni Fost il-kriterji li għandhom jitqiesu biex tiġi stabbilita l-ogħla konċentrazzjoni hemm iċ-ċitotossiċità, is-solubbilità fis-sistema tat-test u bidliet fil-pH jew osmolalità. Iċ-ċitossiċità għandha tiġi stabbilita kemm b'attivazzjoni metabolika, kif ukoll mingħajrha, fl-esperiment prinċipali billi tintuża indikazzjoni xierqa ta' l-integrità u tkabbir taċ-Ċelloli, bħal ma huma gradi ta' konfluwenza, għadd ta' Ċelloli vijabbli, jew indiċi mitotiku. Jista’ jkun utli li jiġu stabbiliti ċ-ċitossiċità u s-solubbilità f'esperiment preliminari. Għandhom jintużaw għall-inqas tliet konċentrazzjonijiet analizzabbli. Fejn ikun hemm iċ-ċitossiċità, dawn il-konċentrazzjonijiet għandhom ikopru medda mill-massimu għal ftit tossiċità jew xejn; ġeneralment dan ifisser li l-konċentrazzjonijiet għandhom jiġu separati b'xejn aktar minn fattur bejn 2 u√10. Fiż-żmien tal-ħsad, l-ogħla konċentrazzjoni għandha turi riduzzjoni sinjifikanti fil-livell ta' konfluwenza, fgħadd ta' Ċelloli jew indiċi mitotiku (kollha ogħla minn 50 %). L-indiċi mitotiku huwa biss miżura indiretta ta' l-effetti ċitotossiċi/ċitostatiċi u jiddependi fuq il-ħin wara t-trattament. Madankollu, l-indiċi mitotiku huwa aċċettabbli għal kulturi ta' sospensjoni li fihom qisien tossiċi oħra jistgħu jkunu diffiċli u mhux prattiċi. Bħala informazzjoni supplimentari tista’ tintuża informazzjoni dwar kinetika taċ-ċiklu taċ-Ċelloli, bħal ma huwa ż-żmien medju ta' ġenerazzjoni (AGT). Iżda l-AGT huwa medja totali li mhux dejjem tiżvela l-eżistenza ta' subpopolazzjonijiet li għadhom ma jidhrux, u żidiet minimi wkoll fiż-żmien medju ta' ġenerazzjoni jistgħu jiġu assoċjati ma' dewmien sostanzjali fil-ħin ta' l-aħjar riżultati dwar anormalitajiet. Għal sustanzi li relativament mhumiex ċitotossiċi, l-konċentrazzjoni massima tat-test għandha tkun 5μl/ml, 5 mg/ml jew 0,01 M, liema minnhom ikun l-anqas. Għal sustanzi li relativament mhumiex solubbli li mhumiex tossiċi f'konċentrazzjonijiet anqas mill-konċentrazzjoni li mhix solubbli, l-ogħla doża li tintuża għandha tkun konċentrazzjoni ogħla mil-limitu ta' solubbilità fil-medjum finali tal-kultura fl-aħħar tal-perjodu ta' trattament. F'ċerti każijiet (eż. meta t-tossiċità tirrikorri biss fuq livell ogħla mill-anqas konċentrazzjoni li mhix solubbli), hu tajjeb li jsir test b'aktar minn konċentrazzjoni waħda bi preċipitazzjoni viżibbli. Jista’ jkun utli li ssir stima tas-solubbilità fil-bidu u fl-aħħar tat-trattament, għax is-solubbilità tista’ tinbidel waqt l-espożizzjoni fis-sistema tat-test minħabba fil-preżenza ta' Ċelloli, serum S9, eċċ. L-insolubbilità tista’ tintnebah bil-vista mingħajr ebda għajnuna. Dak li jippreċipita m'għandux ifixkel l-għadd.

1.4.2.3. Kontrolli negattivi u pożittivi Għandhom jiġu inklużi f'kull esperiment kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent jew mezz), kemm b'attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. Meta tintuża l-attivazzjoni metabolika, l-kimika ta' kontroll pożittiv għandha tkun dik li teħtieġ l-attivazzjoni biex tagħti riżultati mutaġeniċi. Il-kontrolli pożittivi għandhom jagħmlu użu minn elastoġen magħruf f'livelli ta' espożizzjoni li huma mistennija li jagħtu żieda riproduċibbli u li tingħaraf fuq l-isfond li juri s-sensitività tas-sistema tat-test. Għandhom jingħażlu konċentrazzjonijiet ta' kontrolli pożittivi sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tad-dijappożittivi kodifikati għal min jaqrahom. Eżempji ta' sustanzi pożittivi ta' kontroll jinkludu: Kondizzjoni ta' attivazzjoni metabolika Sustanza Nru SAK Nru Einecs Nuqqas ta' attivazzjoni essoġenea metabolika Activation Metil metanesulfonat 66-27-3 200-625-0 Etil metanesulfonat 62-50-0 200-536-7 Etil nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomiċina 50-07-7 200-008-6 4-Nitrokwinolina-N-ossidu 56-57-5 200-281-1 Preżenza ta' attivazzjoni essoġenea metabolika Activation Benżo(a)pirene 50-32-8 200-028-5 Ċiklofosfamid Ċiklofosfamide monojdrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Jistgħu jintużaw sustanzi oħra ta' kontroll pożittiv xieraq. Għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittiv li huma relatati mal-klassi tal-kimika, meta dan hu disponibbli. F'kull żmien ta' ħsad għandhom jiġu inklużi kontrolli negattivi, li jikkonsistu f'soilvent jew mezz biss fil-medjum tat-trattament, u ttrattati bl-istess mod bħal kulturi ta' trattament. Barra minn dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ikun hemm informazzjoni storika ta' kontrolli li turi li ma jkunx hemm effetti ta' ħsara jew mutaġeniċi mill-użu tas-solvent magħżul.

1.4.3. Proċedura

1.4.3.

1.4.3.1. Trattament bis-sustanza tat-test Celluli li jipproliferaw huma ttrattati bis-sustanza tat-test fil-preżenza u fin-nuqqas ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika. It-trattament ta' limfoċiti għandu jibda madwar 487 siegħa wara l-istimulazzjoni mitoġenika.

1.4.3.2. Normalment jintużaw kulturi duplikati f'kull konċentrazzjoni, u dan huwa rakkomandat bil-qawwi għal kulturi ta' kontroll negattiv/solvent. Billi varjazzjoni minima bejn kulturi duplikati tista’ tidher (13) (14), mill-informazzjoni storika, jista’ jkun aċċettabbli li jintużaw kulturi singoli f'kull konċentrazzjoni. Sustanzi gassużi jew volatili għandhom jiġu ttestjati b'metodi xierqa, bħal ma huma mezzi ta' kulturi magħluqin (15) (16).

1.4.3.3. Żmien tal-ħsad tal-kulturi Fl-ewwel esperiment, iċ-Ċelloli għandhom jiġu esposti għas-sustanza tat-test, kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha, għal 3-6 siegħat, u jittieħed kampjun f'ħin ekwivalenti għal madwar 1,5 it-tul taċ-ċiklu ta' ċellula normali wara li jkun beda t-trattament (12). Jekk dan il-protokoll jagħti riżultati negattivi kemm bl-attivazzjoni kif ukoll mingħajrha, għandu jsir esperiment addizzjonali mingħajr attivazzjoni, bi trattament kontinwu sakemm jittieħed kampjun f'ħin ekwivalenti għal 1,5 it-tul taċ-ċiklu ta' ċellula normali. Ċerti kimiċi jistgħu jintnebħu aktar faċilment b'ħinijiet ta' trattament/teħid ta' kampjuni itwal minn 1,5 it-tul taċ-ċiklu. Riżultati negattivi b'attivazzjoni metabolika għandhom jiġu konfermati għal kull każ partikolari. F'dawk il-każijiet fejn mhux meqjus neċessarju li jkun hemm konferma tar-riżultati negattivi, għandha tingħata ġustifikazzjoni.

1.4.3.4. Preparazzjoni tal-kromożomi Il-kulturi taċ-Ċelloli jiġu ttrattati bi Colcemid® jew kolċiċina normalment għal 1-3 siegħat qabel il-ħsad. Kull kultura ta' ċellula tinħasad u tiġi proċessata separatament għall-preparazzjoni tal-kromożomi. Il-preparazzjoni tal-kromożomi tinvolvi t-trattament ipotoniku ta' Ċelloli, il-fissazzjoni u li jingħataw kulur.

1.4.3.5. Analiżi Id-dijapożittivi kollha, inklużi dawk ta' kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati indipendentement qabel l-analiżi mikroskopika. Peress li l-proċeduri ta' fissazzjoni ta' spiss jirriżultaw fil-ksur ta' għadd ta' Ċelloli metafażiċi bit-telf ta' kromożomi, iċ-Ċelloli li jingħaddu għandu għalhekk ikollhom numru ta' ċentromeri ekwivalenti għan-numru modali ≠ 2 għat-tipi kollha ta' Ċelloli. Għandhom jingħaddu għall-inqas 200 metafażi mifruxa sew għal kull konċentrazzjoni u kontroll, maqsumin b'mod ugwali bejn id-duplikati, jekk ikun applikabbli. Dan in-numru jista’ jitnaqqas meta jiġi osservat numru akbar ta' anormalitajiet. Għalkemm l-għan tat-test huwa biex jinkixfu anormalitajiet strutturali fil-kromożomi, u importanti li wieħed jirreġistra poliplojdi u endoreduplikazzjoni meta wieħed jinduna b'dawn.

2. DATA

2.

2.1. TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI L-unità sperimentali hija ċ-ċellula, u għalhekk għandha ssir valutazzjoni tal-perċentwali ta' Ċelloli b'anormalità (jiet) strutturali fil-kromożomi. Għandhom jiġu elenkati t-tipi differenti ta' anormalitajiet strutturali fil-kromożomi bl-għadd u l-frekwenzi tagħhom għal kulturi ta' esperimenti u ta' kontroll. Il-vojt jiġi reġistrat separatament u jsir rapport dwaru iżda ġeneralment ma jiġix inkluż fil-frekwenza totali ta' l-anormalità. Għandhom jiġu reġistrati ukoll miżuri ta' ċitotossiċità li jittieħdu fl-istess ħin għall-kulturi kollha ta' kontroll trattati u negattivi fl-esperimenti prinċipali dwar l-anormalitajiet. Għandha tingħata l-informazzjoni dwar kultura individwali. Barra minn dan, l-informazzjoni għandha tingħata sommarjament f'forma ta' tabella. Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' riżultat pożittiv ċar. Riżultati ekwivoċi għandhom jiġu ċċarati b'testijiet oħra preferibbilment billi jkun hemm modifika tal-kundizzjonijiet sperimentali. Il-ħtieġa li riżultati negattivi jiġu konfermati ġiet diskussa fi 1.4.3.3. Il-modifika ta' parametri ta' studju biex tiġi estiża l-medda tal-kundizzjonijiet stmati għandha tiġi kkunsidrata f'esperimenti li jsiru wara. Il-parametri ta' studju li jistgħu jiġu modifikati jinkludu l-ispazju tal-konċentrazzjoni u l-kundizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika.

2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit riżultat pożittiv, bħal ma hi żieda relatata mal-konċentrazzjoni jew żieda riproduċibbli f'għadd ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromożomi. L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet (3) (13), jistgħu jintużaw metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal riżultat pożittiv. Żieda fin-numru ta' Ċelloli poliplojdi tista’ tindika li s-sustanza tat-test għandha l-potenzal li twaqqaf il-proċessi mitotiċi u li twassal għal anormalitajiet numeriċi fil-kromożomi. Żieda fl-għadd ta' ċelluli bi kromożomi endoreduplikati tista’ tindika li s-sustanza tat-test għandha l-potenzal li twaqqaf il-progressjoni taċ-ċiklu taċ-Ċelloli (17) (18). Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma jilħqux il-kriterji fuq imsemmija titqies bħala mhux mutaġenika f'din is-sistema. Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment. Ir-riżultati pożittivi minn test in vitro ta' anormalitajiet fil-kromożomi jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq anormalitajiet strutturali fil-kromożomi f'Ċelloli somatiċi ta' kulturi ta' mammiferi. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, taħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx anormalitajiet fil-kromożomi f'Ċelloli somatiċi ta' kulturi ta' mammiferi.

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja:

Solvent/mezz:

ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz;

solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.

Ċelloli:

tip u għejun taċ-Ċelloli;

karatteristiċi karjotipiċi u adattibilità tat-tip ta' ċellula użata;

nuqqas ta' mikoplasma, jekk ikun applikabbli;

informazzjoni dwar it-tul taċ-ċiklu taċ-ċellula;

sess ta' min jagħti d-demm, demm sħiħ jew limfoċiti separati, nitroġenu użat;

numru ta' passaġġi, jekk ikun applikabbli;

metodi għall-manutenzjoni tal-kulturi taċ-Ċelloli, jekk jkun applikabbli;

għadd modali ta' kromożomi.

Kundizzjonijiet tat-test:

identità tas-sustanza li twaqqaf il-metafażi, il-konċentrazzjoni tagħha u kemm iddum l-espożizzjoni taċ-ċellula;

raġuni prinċipali għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet u għadd ta' kulturi inklużi, eż. informazzjoni dwar ċitotossiċità u limitazzjonijiet dwar solubbilità, jekk ikunu disponibbli;

komposizzjoni tal-medja, konċentrazzjoni CO2 jekk tkun applikabbli;

konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test;

volum tal-mezz u sustanza tat-test miżjuda;

temperatura ta' l-inkubazzjoni;

perjodu ta' inkubazzjoni;

kemm idum it-trattament;

densità taċ-ċellula fiż-żriegħ, jekk ikun xieraq;

tip u komposizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika, inklużi krierji ta' aċċettabilità;

kontrolli pożittivi u negattivi;

metodi ta' preparazzjoni ta' dijapożitivi;

kriterji għall-għadd ta' anormalitajiet;

numru ta' metafażijiet analizzati;

metodi biex titqies it-tossiċità;

kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi.

Riżultati:

sinjali ta' tossiċità, eż. grad ta' konfluwenza, informazzjoni dwar iċ-ċiklu taċ-ċellula, għadd ta' Ċelloli, indiċi mitotiku;

sinjali ta' preċipitazzjoni;

informazzjoni dwar pH u l-osmolalità tal-medjum tat-trattament, jekk ikun stabbilit;

definizzjoni għall-anormalitajiet, inkluż il-vojt;

numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromożomi u tip ta' anormalitajiet fil-kromożomi mogħtija separatament għal kull kultura trattata u ta' kontroll;

bidliet fil-plojdi, jekk jidhru;

relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli;

analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;

informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv (solvent/mezz) u pożittiv;

informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard.

Diskussjoni dwar ir-riżultati.

Kunklużjonijiet.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)

REFERENZI Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29. Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (1985), The In vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432. Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1-175. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, pp. 297-305. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215. Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In vitro, Mutation Res., 66, pp. 277-290. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In vitroMetabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994), Report from Working Group on in In vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241-261. Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154. Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139-149. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.

B.11. MUTAĠENIĊITÀ -TEST IN VIVO DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMITAL-MUDULLUN TAL-MAMMIFERI

B.11.

1. METODU Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 475, Test dwar Anormalità fil-Kromożomi tal-Mudullun tal-Mammiferi (1997).

1.

1.1. INTRODUZZJONI It-test in vivo dwar anormalitajiet fil-kromożomi tal-mammiferi jintuża biex jinstabu anormalitajiet strutturali fil-kromożomi miġjuba mis-sustanza tat-test fiċ-Ċelloli tal-mudullun ta' annimali, normalment annimali gerriema (1) (2) (3)(4). Anormalitajiet strutturali fil-kromożomi jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomi jew kromatidi. Żieda fil-poliplojdi tista’ tindika li kimika għandha l-potenzal li ġġib magħha anormalitajiet numeriċi. Fil-maġġoranza ta' mutaġeni kimiċi, anormalitajiet imġiegħela huma tat-tip kromatidu, iżda jirrikorru wkoll anormalitajiet tat-tip ta' kromożomi. Mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm xhieda sostanzjali li mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati li jikkawżaw alterazzjonijiet f'onkoġeni u f'ġeni li jrażżnu t-tumuri huma involuti fil-ħolqien tal-kanċer fil-bniedem u sistemi sperimentali. Annimali gerriema jintużaw ġeneralment f'dan it-test. Il-mudullun huwa t-tessut immirat f'dan it-test, għax huwa tessut vaskularizzat immense, u fih popolazzjoni ta' ċelluli li jiċċiklaw rapidament li jistgħu jkunu faċilment iżolati u proċessati. Speċi oħra u tessuti mmirati mhumiex is-suġġett ta' dan il-metodu. Dan it-test ta' anormalitajiet fil-kromożomi huwa rilevanti speċjalment fil-valutazzjoni ta' perikli mutaġeniċi għax jippermetti l-kunsiderazzjoni ta' fatturi ta' metaboliżmu in vivo, farmakokinetika u proċessi ta' tiswija ta' DNA għalkemm dawn jistgħu jvarjaw fost l-ispeċi u fost it-tessuti. Test in vivo huwa utli ukoll għal investigazzjoni ulterjuri ta' effett mutaġeniku żvelat minn test in vitro. Jekk hemm xiedha li s-sustanza tat-test, jew metabolit reattiv, ma jwasslux għat-tessut immirat, mhux xieraq li jintuża dan it-test. Ara ukoll Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.

1.2. DEFINIZZJONIJIET Anormalità tat-tip kromatidu: ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi. Anormalità tat-tip tal-kromożomi: ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f'sit identiku. Endoreduplikazzjoni: proċess li fih wara perjodu S ta' replikazzjoni ta' DNA, in-nukleu ma jispiċċax f'mitożi iżda jerġa' jibda perjodu ieħor S. Ir-riżultat hu kromożomi bi 4, 8, 16,… kromatidi. Vojt: leżjoni akromatika iżgħar mill-wisgħa ta' kromatid wieħed, u b'misallinjament minimu tal-kromatidi. Anormalità numerika: bidla fin-numru ta' kromożomi min-numru karatteristku normali ta' Ċelloli utilizzati. Poliplojdi: multiplu tan-numru aplojdu ta' kromożomi (n) minbarra n-numru diplojdu (jiġifieri 3n, 4n, eċċetera). Anormalità strutturali: bidla fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku ta' l-istadju metafażiku tad-diviżjoni ta' ċelluli, osservati bħala tħassir u biċċiet, bidliet minn ġewwa u bidliet bejniethom.

1.3. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Annimali huma esposti għas-sustanza tat-test b'rotta xierqa ta' espożizzjoni u huma sakrifikati f'ħinijiet xierqa wara t-trattament. Qabel ma jiġu sakrifikati, l-annimali huma ttrattati b'aġent li jwaqqaf l-metafażi (eż. kolċiċina jew Colcemid®). Imbagħad isiru preparazzjonijiet ta' kromożomi miċ-Ċelloli tal-mudullun u jiġu mtebbgħin, u ċ-ċelluli metafażiċi jiġu analizzati għal anormalitajiet fil-kromożomi.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.

1.4.1. Preparazzjonijiet

1.4.1.

1.4.1.1. Selezzjoni ta' l-ispeċi ta' l-annimali Normalment jintużaw far, ġrieden u Ħamsters ċiniżi, iżda jista’ jintuża kull annimal xieraq ta' l-ispeci tal-mammiferi. Għandhom jintużaw razez, li komunement jintużaw fil-laboratorji, ta' annimali adulti b'saħħithom u żgħar. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali għandha tkun minima u ma teċċedix ± 20 % tal-medja tal-piż ta' kull sess.

1.4.1.2. Kundizzjonijiet ta' fejn jinżammu u x'jieklu Għandhom japplikaw il-kundizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Introduzzjoni ġenerali għat-Taqsima B iżda l-mira dwar l-umdità għandha tkun 50-60 %.

1.4.1.3. Preparazzjoni ta' l-annimali Annimali adulti żgħar u b'saħħithom jiġu assenjati mingħajr skema għall-gruppi ta' kontroll u trattament. Il-gaġeġ għandhom jitqiegħdu b'tali mod li jiġu minimizzati effetti possibbli li jirriżultaw minn kif jitqiegħdu l-gaġeġ. L-annimali jiġu identifikati wieħed wieħed. L-annimali jiġu akklimatizzati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju għall-inqas għal ħamest ijiem.

1.4.1.4. Preparazzjoni tad-dożi Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewwbin jew sospiżi f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiġu ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix laċċettabbilità tal-ħażna.

1.4.2. Kundizzjonijiet tat-test

1.4.2.

1.4.2.1. Solvent/mezz Is-solvent/mezz ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli ta' doża użata, u ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra minflok dawk l-aktar magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Hu rakkomandat li kemm jista’ jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akwuż.

1.4.2.2. Kontrolli Għandhom jiġu inklużi għal kull wieħed mis-sessi f'kull test kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom jiġu trattati bl-istess mod bħall-annimali fil-grupp ta' trattament. Il-kontrolli pożittivi għandhom jipproduċu anormalitajiet strutturali in vivo f'livelli ta' espożizzjoni li huma mistennija li jagħtu żieda li tkun tidher fuq l-isfond. Trattamenti ta' kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx l-identità tad-dijapożitivi kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettat li l-kontroll pożittiv jiġi somministrat minn rotta differenti minn dik tas-sustanza tat-test u jittieħed kampjun darba waħda biss. Jista’ jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittivi relatati mal-klassi ta' kimiċi, meta dawn ikunu disponibbli. Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll pożittivi jinkludu: Sustanza Nru SAK Nru EINECS Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 Etil nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomiċina C 50-07-7 200-008-6 Ciklofosfamide Ciklofosfamide monojdrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trijetilenemelamina 51-18-3 200-083-5 Il-kontrolli negattivi, trattati biss bis-solvent jew bil-mezz, u mod ieħor trattati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, għandhom jiġu inklużi għal kull perjodu ta' teħid ta' kampjuni, sakemm ma jkunux disponibbli varjabbilità aċċettabbli bejn l-annimali u frekwenżi ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromożomi mill-informazzjoni storika tal-kontroll. Jekk jiġi applikat it-teħid ta' kampjun singolu, l-aktar żmien xieraq huwa l-ewwel darba li jittieħed il-kampjun. Barra minn dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ma jkunx hemm informazzjoni ta' kontroll pubblikata u storika li turi li jkun hemm effetti ta' ħsara u mutaġeniċi bl-uzu tas-solvent/mezz magħżul.

1.5. PROĊEDURA

1.5.

1.5.1. Numru u sess ta' l-annimali Kull grupp ta' trattament u ta' kontroll għandu jinkludi fih għall-inqas ħames annimali analizzabbli għal kull sess. Jekk fiż-żmien ta' l-istudju jkun hemm informazzjoni disponibbli minn studji fl-istess speċi u bl-użu ta' l-istess rotta ta' espożizzjoni li juru li ma hemm l-ebda differenzi sostanzjali fit-tossiċità bejn is-sessi, allura jkun suffiċjenti li l-ittestjar isir fuq sess wieħed. Fejn l-espożizzjoni umana għall-kimiċi tista’ tiddependi fuq is-sess, bħal per eżempju b'ċerti aġenti farmaċewtiċi, it-test għandu jitwettaq b'annimali tas-sess xieraq.

1.5.2. Skeda tat-trattament Is-sustanzi tat-test huma preferibbilment somministrati bħala trattament singolu. Is-sustanzi tat-test jistgħu wkoll jiġu somministrati bħala doża maqsuma, jiġifieri żewġ trattamenti fl-istess ġurnata separati b'mhux aktar minn ftit sigħat, biex tiġi faċilitata s-somministrazzjoni ta' volum qawwi ta' materjal. Reġimi ta' dożi oħra għandhom ikunu ġustifikati xjentifikament. Il-kampjuni għandhom jittieħdu f'żewġ ħinijiet separati wara t-trattament f'ġurnata waħda. Għal annimali ġerriema l-ewwel intervall bejn it-teħid ta' kampjuni huwa ta' tul ta' 1,5 iċ-ċiklu normali ta' ċellula (dan ta' l-aħħar huwa normalment ta' 12-18-il siegħa) wara t-trattament. Ladarba l-ħin meħtieġ għall-bidu u l-metaboliżmu tas-sustanza tat-test kif ukoll l-effetti tiegħu fuq il-kinetika taċ-ċikli taċ-Ċelloli jistgħu jaffettwaw iż-żmien ottimali biex wieħed jintnebaħ bl-anormalitajiet fil-kromożomi, huwa rakkomandat li jittieħed kampjun ieħor 24 siegħa wara li jkun ttieħed l-ewwel kampjun. Jekk jintużaw metodi ta' dożi ta' aktar minn ġurnata waħda, għandu jkun hemm ħin ta' teħid ta' kampjun wieħed f'tulijiet ta' 1,5 iċ-ċikli normali ta' ċellula wara l-aħħar trattament. Qabel is-sagrifiċċju, l-annimali huma injettati intraperitonalment b'doża xierqa ta' aġent li jwaqqaf l-metafażi (eż. Colcemid® jew kolċiċina). Wara dan, jittieħed kampjun mill-annimali f'intervalli xierqa. Għall-ġrieden dan l-intervall huwa ta' madwar 3-5 siegħat; għal Ħamsters ċiniżi dan l-intervall huwa ta' madwar 4-5 siegħat. Iċ-Ċelloli jinħasdu mill-mudullun u jiġu analizzati għal anormalitajiet fil-kromożomi.

1.5.3. Livelli ta' doża Jekk jitwettaq studju biex tiġi skoperta l-medda għax ma jkunx hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, jintużaw l-istess speċi, razza, sess u metodu ta' trattament li għandhom jintużaw fl-istudju prinċipali (5). Jekk ikun hemm tossiċità, jintużaw tliet livelli ta' doża għall-ewwel perjodu ta' teħid ta' kampjuni. Dawn il-livelli ta' doża għandhom jkopru medda mill-massimu għal ftit jew l-ebda tossiċità. L-ogħla doża hija mfissra bħala s-sinjali ta' tossiċità li jipproduċu d-dożi hekk li livelli ogħla tad-doża, bbażati fuq l-istess reġim ta' dożaġġ, huma mistennija li jikkawżaw il-mewt. Is-sustanzi b'attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossiċi (bħal ma huma ormoni u nitroġeni) jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' l-issettjar tad-dożi u għandhom jiġu valutati fuq bażi ta' każ b'każ. L-ogħla doża tista’ ukoll tfisser id-doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità fil-mudullun (eż. ogħla minn riduzzjoni ta' 50 % fl-indiċi mitotiku).

1.5.4. Test tal-limitu Jekk test ta' doża waħda ta' livell ta' għall-inqas 2000 mg/kg piż tal-ġisem meta jitwettaq trattament wieħed, jew bħala żewġ trattamenti fl-istess ġurnata, ma jipproduċix effetti tossiċi li wieħed jinduna bihom, u jekk ma tkun mistennija l-ġenotossiċità fuq il-bażi ta' l-informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun neċessarju li jsir studju komplet bl-użu ta' tliet livelli ta' dożaġġ. Għal studji li jdumu aktar, il-limitu tad-doża huwa 2000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum għal trattament sa 14-il ġurnata, u 1000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum għal trattament ta' aktar minn 14-il ġurnata. L-espożizzjoni umana mistennija tista’ tindika l-ħtieġa ta' livell ogħla ta' doża li għandu jintuża fit-test tal-limitu.

1.5.5. Somministrazzjoni ta' dożi Normalment is-sustanza tat-test tiġi somministrata b'gavage billi jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni, jew bl-injezzjoni intraperitonali. Fejn ikunu ġustifikati, jistgħu jiġu aċċettati rotot oħra ta' espożizzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f'ħin wieħed jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux ikun aktar minn 2 ml/100g piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ogħla minn dawn għandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-każ ta' sustanzi li jirritaw jew korrożivi li normalment juru effetti aggravati b'konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbilita fil-volum tat-test għandha titnaqqas bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fuq il-livelli kollha tad-doża.

1.5.6. Preparazzjoni tal-kromożomi Minnufih wara s-sagrifiċċju, il-mudullun jiġi miksub, espost għal soluzzjoni ipotonika u ffissat. Iċ-Ċelloli imbagħad jinfirxu fuq dijapożitivi u jingħataw kulur.

1.5.7. Analiżi L-indiċi mitotiku għandu jiġi stabbilit bħala miżura ta' ċitotossiċita f'għall-inqas 1000 ċellula għal kull annimal għal kull annimal trattat (inklużi kontrolli pożittivi) u annimali kontrollati negativament mhux trattati. Għandhom jiġu analizzati għall-inqas 100 ċellula għal kull annimal. Dan in-numru jista’ jitnaqqas meta jiġi nnotat għadd kbir ta' anormalitajiet. Id-dijapożitivi kollha, inklużi dawk ta' kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati indipendentement qabel l-analiżi mikroskopika. Billi l-proċeduri tal-preparazzjoni ta' dijapożitivi jirriżultaw ħafna drabi fil-ksur ta' għadd ta' metafażi bit-telf ta' kromożomi, iċ-Ċelloli li jingħaddu għandu għalhekk ikun fihom numru ta' ċentromeri ugwali għan-numru 2n ± 2.

2. DATA

2.

2.1. TRATTAMENT TAR- RIŻULTATI L-informazzjoni dwar annimali individwali għandha tingħata f'forma ta' tabella. L-unità sperimentali hija l-annimal. Għal kull annimal għandhom jiġu valutati n-numru ta' Ċelloli li jingħaddu, in-numru ta' anormalitajiet f'kull ċellula u l-perċentwali ta' Ċelloli b'anormalità (jiet) strutturali fil-kromożomi. Għandhom jiġu elenkati t-tipi differenti ta' anormalitajiet strutturali fil-kromożomi bl-għadd u l-frekwenzi tagħhom għal gruppi ta' trattament u ta' kontroll. Il-vojt jiġi reġistrat separatament u jsir rapport dwaru iżda ġeneralment ma jiġix inkluż fil-frekwenza totali ta' l-anormalità. Jekk ma hemmx xiehda ta' differenza fir-riżultat bejn iż-żewġ sessi, l-informazzjoni dwar iż-żewġ sessi tista’ tingħaqad għall-analiżi statistika.

2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit riżultat pożittiv, bħal ma hi żieda relatata mad-doża fl-għadd relattiv ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromożomi jew żieda ċara fin-numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet fi grupp singolu ta' trattament fi żmien singolu ta' teħid ta' kampjuni. L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet (6), jistgħu jintużaw metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal riżultat pożittiv. Riżultati ekwivoċi għandhom jiġu ċċarati b'testijiet ulterjuri preferibilment billi tintuża modifika tal-kundizzjonijiet ta' l-esperiment. Żieda fil-poliplojdi tista’ tindika li s-sustanza tat-test għandha l-potenzal li twassal għal anormalitajiet numeriċi fil-kromożomi. Żieda fl-endoreduplikazzjoni tista’ tindika li s-sustanza tat-test għandha l-potenzal li twaqqaf il-progressjoni taċ-ċiklu taċ-Ċelloli (7) (8). Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma jilħqux il-kriterji fuq imsemmija titqies bħala mhux mutaġenika f'dan it-test. Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment. Ir-riżultati pożittivi minn test in vivo ta' anormalitajiet fil-kromożomi jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq anormalitajiet strutturali fil-kromożomi fil-mudullun ta' l-ispeċi ttestjata. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, taħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx anormalitajiet fil-mudullun ta' l-ispeċi ttestjata. Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test jew il-metaboliti tagħha jilħqu ċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew speċifikatament it-tessut immirat (eż. tossiċità sistemika).

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja:

Solvent/mezz:

ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz;

solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.

Annimali ttestjati:

speċi/razza użati;

numru, età u sess ta' l-annimali;

għejun, kundizzjonijiet dwar fejn jinżammu, dieta, eċċ.;

piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inkluża l-medda ta' piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard għal kull grupp.

Kundizzjonijiet tat-test:

kontrolli pożittivi u negattivi (mezz/solvent);

informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar;

raġuni prinċipali għall-għażla tad-doża;

dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test;

dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test;

raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni;

metodi biex jiġi verifikat li s-sustanza tat-test waslet għaċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew it-tessut immirat;

konverżjoni mill-konċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test dieta/ilma għax-xorb għad doża attwali (mg/kg piż tal-ġisem/jum) jekk tkun applikabbli;

dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma;

deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u teħid ta' kampjuni;

metodi biex titqies it-tossiċità;

identità tas-sustanza li twaqqaf il-metafażi, il-konċentrazzjoni tagħha u kemm idum it-trattament;

metodi tal-preparazzjoni tad-dijapożitivi;

kriterji għall-għadd ta' anormalitajiet;

numru ta' Ċelloli analizzati kull annimal;

kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi.

Riżultati:

sinjali ta' tossiċità;

indiċi mitotiku;

tip u numru ta' anormalitajiet, mogħtija separatament għal kull annimal;

numru totali ta' anormalitajiet għal kull grupp bil-mezzi u devjazzjonijiet standard;

numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet f'kull grupp bil-mezzi u devjazzjonijiet standard;

bidliet fil-plojdi, jekk jidhru;

relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli;

analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;

informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv;

informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz), bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard;

informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin pożittiv.

Diskussjoni dwar ir-riżultati.

Kunklużjonijiet.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)

REFERENZI Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D.C., pp. 275-306. Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157-165. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha- radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.

B.12. MUTAĠENIĊITÀ-TEST MIKRONUKLEUIN VIVO GĦAL ERITROĊITE FIL-MAMMIFERI

B.12.

1. METODU Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 474, Test Mikronukleu għal Eritroċite fil-Mammiferi (1997).

1.

1.1. INTRODUZZJONI It-test mikronukleu in vivo fil-mammiferi jintuża biex jinstab jekk hemmx ħsara li tinġieb mis-sustanza tat-test lill-kromożomi jew l-apparat mitotiku ta' eritroblasti bl-analiżi ta' eritroċiti meħuda bħala kampjuni fil-mudullun u/jew Ċelloli periferali tad-demm ta' annimali, ġeneralment annimali gerriema. L-għan tat-test mikronukleu huwa biex jiġu identifikati sustanzi li jikkawżaw ħsara ċitoġenetika li tirriżulta fil-formazzjoni ta' mikronukleji li jkun fihom biċċiet ta' residwi ta' kromożomi jew kromożomi sħaħ. Meta eritroblast tal-mudullun jiżviluppa f'eritroċite polikromatika, joħroġ in-nukleu prinċipali; kull mikronukleu li jkun ġie ffurmat jista’ jibqa' lura fiċ-ċitoplasma mod ieħor anukleat. Il-viżwalizzazzjoni tal-mikronukleji hija faċilitata f'dawn iċ-Ċelloli għax ma għandhomx nukleu prinċipali. Żieda fil-frekwenza ta' eritroċiti polikromatiċi mikronukleati fl-annimali trattati hija indikazzjoni ta' ħsara miġjuba fil-kromożomi. Ġeneralment f'dan it-test jiġi użat il-mudullun ta' annimali gerriema għax l-eritroċiti polikromatiċi huma prodotti f'dak it-tessut. Il-qisien ta' eritroċiti mikronukleati immaturi (polikromatiċi) fid-demm periferali huwa ugwalment aċċettat f'kull speċi li fiha ġiet murija l-inabbiltà tal-milsa li tneħħi eritroċiti mikronukleati, jew li tkun uriet sensittività adegwata biex tiskopri aġenti li jikkawżaw anormalitajiet fil-kromożomi strutturali jew numeriċi. Il-mikronukleji jistgħu differenzati b'għadd ta' kriterji. Dawn jinkludu l-identifikazzjoni tal-preżenza jew nuqqas ta' DNA kinetoċoru jew ċentromeriku fil-mikronukleji. Il-frekwenza ta' eritroċiti mikronukleati immaturi (polikromatiċi) hija l-punt prinċipali ta' konklużjoni. L-għadd ta' eritroċiti maturi (normokromatiċi) fid-demm periferali li jkun fihom mikronukleji fost numru stabbilit ta' eritroċiti maturi jista’ jintuża ukoll bħala l-punt ta' konklużjoni tal-valutazzjoni meta l-annimali jiġu ttrattati għal erba' ġimgħat jew aktar. Dan it-test mikronukleu in vivo fil-mammiferi huwa speċjalment rilevanti fil-valutazzjoni ta' perikli mutaġeniċi għax jippermetti l-kunsiderazzjoni ta' fatturi ta' metaboliżmu in vivo, farmakokinetika u proċessi ta' tiswija tad-DNA għalkemm dawn jistgħu jvarjaw fost l-ispeċi, fost it-tessuti u fost il-punti ġenetiċi ta' konklużjoni. Eżami in vivo huwa utli ukoll għal investigazz ulterjuri ta' effett mutaġeniku żvelat b'sistema in vitro. Jekk ikun hemm xiedha li s-sustanza tat-test, jew metabolit reattiv, ma jilħaqx it-tessut immirat, mhux xieraq li jintuża dan it-test. Ara ukoll l-Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.

1.2. DEFINIZZJONIJIET Ċentromeru (Kinetoċoru): reġjun(i) ta' kromożomu li magħha huma assoċjati fibri irqaq waqt d-diviżjoni taċ-ċellula, li jippermettu l-moviment b'ċertu ordni ta' kromożomi sekondarji għat-truf ta' Ċelloli sekondarji. Mikronukleji: nukleji żgħar, separate minn u addizzjonali għan-nukleji prinċipali ta' Ċelloli, prodotti waqt it-telofażi ta' mitożi (mejożi) permezz ta' biċċiet ta' residwi ta' kromożomi jew kromożomi sħaħ. Eritroċite normokromatika: eritroċite matura li ma għandhiex ribosomi u li tista’ tiġi differenzata minn eritroċiti polikromatiċi immaturi bit-tebgħat selettivi għal ribosomi. Entroċite polikromatika: eritroċite immatura, fi stadju intermedju ta' żvilupp, li xorta waħda fiha ribosomi u għalhekk tista’ tiġi differenzata minn eritroċiti normokromatiċi maturi bit-tebgħat selettivi għal ribosomi.

1.3. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST L-annimali huma esposti għas-sustanza tat-test permezz ta' rotta xierqa. Jekk jintuża l-mudullun, l-annimali jiġu sakrifikati fi żminijiet xierqa wara t-trattament, jitneħħa l-mudullun, u l-preparazzjonijiet jsiru u jingħataw il-kulur (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Meta jintuża demm periferali, id-demm jinġabar f'ħinijiet xierqa wara t-trattament u wara li jsiru l-preparazzjonijiet u jingħataw il-kulur (4) (8) (9) (10). Għal studji b'demm periferali, għandu jgħaddi perjodu kemm jista’ jkun żgħir bejn l-aħħar espożizzjoni u l-ħsad taċ-ċellula. Il-preparazzjonijiet jiġu analizzati għall-preżenza ta' mikronukleji.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.

1.4.1. Preparazzjonijiet

1.4.1.

1.4.1.1. Għażla ta' l-ispeċi ta' l-annimali Hu rakkomandat li jintużaw ġrieden jew far, jekk jintuża l-mudullun, iżda jista’ jintuża kull annimal xieraq ta' l-ispeci tal-mammiferi. Meta jintuża demm periferali, hu rakkomandat li jintużaw ġrieden. Iżda kull speċi xierqa ta' mammiferi tista’ tintuża sakemm tkun speċi li fiha l-milsa ma tneħħix eritroċiti mikronukleati, jew speċi li tkun uriet sensittività adegwata biex tiskopri aġenti li jikkawżaw anormalitajiet fil-kromożomi strutturali jew numeriċi. Għandhom jintużaw razez, li komunement jintużaw fil-laboratorji, ta' annimali adulti b'saħħithom u żgħar. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali għandha tkun minima u ma teċċedix ± 20 % tal-medja tal-piż ta' kull sess.

1.4.1.3. Preparazzjoni ta' l-annimali Annimali adulti żgħar u b'saħħithom jiġu assenjati mingħajr skema għall-gruppi ta' kontroll u trattament. L-annimali jiġu identifikati wieħed wieħed. L-annimali jiġu akklimatizzati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju għall-inqas għal ħamest ijiem.. Il-gaġeġ għandhom jitqiegħdu b'tali mod li jiġu minimizzati effetti possibbli li jirriżultaw minn kif jitqiegħdu l-gaġeġ.

1.4.2. Kundizzjonijiet tat-test

1.4.2.

1.4.2.2. Kontrolli Għandhom jiġu inklużi għal kull wieħed mis-sessi f'kull test kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom jiġu trattati bl-istess mod bħall-annimali fil-gripp ta' trattament. Il-kontrolli pożittivi għandhom jipproduċu mikronukleji in vivo f'livelli ta' espożizzjoni li huma mistennija li jagħtu żieda li tkun tidher fuq l-isfond. Trattamenti ta' kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx l-identità tad-dijapożitivi kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettat li l-kontroll pożittiv jiġi somministrat minn rotta differenti minn dik tas-sustanza tat-test u jittieħed kampjun darba waħda biss. Barra minn dan, jista’ jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittivi relatati mal-klassi ta' kimiċi, meta dawn ikunu disponibbli. Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll pożittivi jinkludu: Sustanza Nru SAK Nru Einecs Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 N-etil-N-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomiċina C 50-07-7 200-008-6 Ciklofosfamide ciklofosfamide monojdrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trijetilenemelamina 51-18-3 200-083-5 Il-kontrolli negattivi, trattati biss bis-solvent jew bil-mezz, u mod ieħor trattati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, għandhom jiġu inklużi għal kull perjodu ta' teħid ta' kampjuni, sakemm ma jkunux disponibbli varjabbilità aċċettabbli bejn l-annimali u frekwenżi ta' Ċelloli b'mikronuleji mill-informazzjoni storika tal-kontroll. Jekk jiġi applikat it-teħid ta' kampjun singolu, l-aktar żmien xieraq huwa l-ewwel darba li jittieħed il-kampjun. Barra minn dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ma jkunx hemm informazzjoni ta' kontroll pubblikata u storika li turi li jkun hemm effetti ta' ħsara u mutaġeniċi bl-uzu tas-solvent/mezz magħżul. Jekk jintuża demm periferali, ħampjun ta' qabel it-trattament jista’ jkun aċċettabbli bħala kontroll negattiv fl-istess ħin, iżda fi studji qosra ta' demm periferali biss (eż. 1-3 trattament(i)) meta l-informazzjoni li tirriżulta tkun fil-medda mistennija għall-kontroll storiku.

1.5. PROĊEDURA

1.5.

1.5.1. Numru u sess ta' l-annimali Kull grupp ta' trattament u ta' kontroll għandu jinkludi fih għall-inqas ħames annimali analizzabbli għal kull sess (11). Jekk fiż-żmien ta' l-istudju jkun hemm informazzjoni disponibbli minn studji fl-istess speċi u bl-użu ta' l-istess rotta ta' espożizzjoni li juru li ma hemm l-ebda differenzi sostanzjali fit-tossiċità bejn is-sessi, allura jkun suffiċjenti li l-ittestjar isir fuq sess wieħed. Fejn l-espożizzjoni umana għall-kimiċi tista’ tiddependi fuq is-sess, bħal per eżempju b'ċerti aġenti farmaċewtiċi, it-test għandu jitwettaq b'annimali tas-sess xieraq.

1.5.2. Skeda tat-trattament Ma jista’ jiġi rakkomandat l-ebda trattament standard (jiġifieri trattament wieħed, żewġ trattament jew aktar b'intervalli ta' 24 siegħa). Il-kampjuni minn reġimi ta' dożi estiżi huma aċċettabbli sakemm ikun ġie muri effett pożittiv għal dan l-istudju jew, għal studju negattiv, sakemm tkun ġiet murija tossiċità sakemm tintuża d-doża sal-limitu, u tingħata doża sal-ħin tat-teħid ta' kampjuni. Is-sustanzi tat-test jistgħu ukoll jiġu somministrati bħala doża maqsuma, jiġifieri żewġ trattament fl-istess ġurnata separati b'mhux aktar minn ftit sigħat, biex tiġi faċilitata s-somministrazzjoni ta' volum kbir ta' materjal. It-test jista’ jsir f'żewġ modi: Jistgħu jintużaw metodi oħra ta' teħid ta' kampjuni, fejn dawn ikunu rilevanti.

1.5.2.

(a) l-annimali jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test darba. Il-kampjuni tal-mudullun jittieħdu għall-inqas darbtejn, l-ewwel wieħed mhux qabel 24 siegħa wara t-trattament, iżda mhux aktar minn 48 siegħa wara t-trattament b'intervalli xierqa bejn it-teħid ta' kampjuni. It-teħid ta' kampjuni qabel 24 siegħa wara t-trattament għandu jkun ġustifikat. Il-kampjuni ta' demm periferali jittieħdu għall-inqas darbtejn, l-ewwel wieħed mhux qabel 36 siegħa wara t-trattament, b'intervalli xierqa wara t-teħid ta' l-ewwel kampjun, iżda mhux aktar minn 72 siegħa. Meta jiġi rikonoxxut riżultat pożittiv wara t-teħid wieħed ta' kampjuni, ma jkunx meħtieġ aktar teħid ta' kampjuni;

(b) Jekk jintużaw żewġ trattament jew aktar kuljum (eż. żewġ trattamenti jew aktar f'intervalli ta' 24 siegħa), għandhom jinġabru kampjuni darba bejn 18 u 24 siegħa wara l-aħħar trattament riward il-mudullun u darba bejn 36 u 48 siegħa wara l-aħħar trattament rigward demm periferali (12).

1.5.3. Livelli ta' doża Jekk jitwettaq studju biex tiġi skoperta l-medda għax ma jkunx hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, jintużaw l-istess speċi, razza, sess u metodu ta' trattament li għandhom jintużaw fl-istudju prinċipali (13). Jekk ikun hemm tossiċità, jintużaw tliet livelli ta' doża għall-ewwel perjodu ta' teħid ta' kampjuni. Dawn il-livelli ta' doża għandhom jkopru medda mill-massimu għal ftit jew l-ebda tossiċità. Fil-ħin ta' l-aħħat teħid ta' kampjuni, l-ogħla doża biss hi meħtieġa li tintuża. L-ogħla doża hija mfissra bħala d-doża li tipproduċi sinjali ta' tossiċità hekk li livelli ogħla tad-doża, bbażati fuq l-istess reġim ta' dożaġġ, huma mistennija li jikkawżaw il-mewt. Is-sustanzi b'attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossiċi (bħal ma huma ormoni u nitroġeni) jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' l-issettjar tad-dożi u għandhom jiġu valutati fuq bażi ta' każ b'każ. L-ogħla doża tista’ ukoll tfisser id-doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità fil-mudullun (eż. tnaqqqis fil-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali fil-mudullun jew demm periferali).

1.5.4. Test tal-limitu Jekk test ta' doża waħda ta' livell ta' għall-inqas 2000 mg/kg piż tal-ġisem meta jitwettaq trattament wieħed, jew bħala żewġ trattamenti fl-istess ġurnata, ma jipproduċix effetti tossiċi li wieħed jinduna bihom, u jekk ma tkunx mistennija l-ġenotossiċità fuq il-bażi ta' l-informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun neċessarju li jsir studju komplet bl-użu ta' tliet livelli ta' dożaġġ. Għal studji li jdumu aktar, il-limitu tad-doża huwa 2000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum għal trattament sa 14-il ġurnata, u 1000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum għal trattament ta' aktar minn 14-il ġurnata. L-espożizzjoni umana mistennija tista’ tindika l-ħtieġa ta' livell ogħla ta' doża li għandu jintuża fit-test tal-limitu.

1.5.5. Somministrazzjoni ta' dożi Normalment is-sustanza tat-test tiġi somministrata b'gavage billi jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni, jew bl-injezzjoni intraperitonali. Fejn ikunu ġustifikati, jistgħu jiġu aċċettati rotot oħra ta' espożizzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f'ħin wieħed jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux ikun aktar minn 2 ml/100g piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ogħla minn dawn għandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-każ ta' sustanzi li jirritaw jew korrożivi li normalment juru effetti aggravati b'konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbilità fil-volum tat-test għandha titnaqqas bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fuq il-livelli kollha tad-doża.

1.5.6. Preparazzjoni tal-mudullun/demm Iċ-Ċelloli tal-mudullun ġeneralment jinkisbu mill-wirk jew mill-qasba tas-sieq minnufih wara s-sagrifiċċju. Komunement, iċ-ċelluli jitneħħew mill-wirk jew mit-qasba tas-sieq, preparati u mogħtija kulur permezz ta' metodi stabbiliti. Demm periferali jinkiseb mill-vina tad-denb jew arterja/vina oħra xierqa. Iċ-Ċelloli tad-demm huma minnufih mogħtija kulur supravitalment (8) (9) (10) jew isiru preparazzjonijiet biex jingħataw il-kulur. L-użu ta' kulur speċifiku ta' DNA (eż. oranġjo akridin (14) jew Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)) jista’ jelimina xi uħud mill-prodotti assoċjati ma' l-użu ta' kulur mhux speċifiku DNA. Dan il-vantaġġ ma jipprekludix l-użu ta' kuluri konvenzjonali (eż. Giemsa). Jistgħu jintużaw ukoll sistemi addizzjonali (eż. kolonni ta' ċelluloża biex jitneħħu Ċelloli nukleati (16)) iżda dawn is-sistemi intwerew li jaħdmu adegwatament għall-preparazzjoni ta' mikronukleji fil-laboratorju.

1.5.7. Analiżi Il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali (immaturi + maturi) tiġi stabbilita għal kull annimal billi jingħaddu għall-inqas 200 eritroċiti għall-mudullun u 1000 eritroċiti għad-demm periferali (17). Id-dijapożitivi kollha, inklużi dawk ta' kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati indipendentement qabel l-analiżi mikroskopika. Jingħaddu għall-inqas 2000 eritroċiti immaturi għall-inċidenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati. Tista’ tinkiseb iktar informazzjoni billi jingħaddu eritroċiti maturi għal mikronukleji. Meta jiġu analizzati d-dijapożitivi, il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali ma għandhiex tkun inqas minn 20 % tal-valur ta' kontroll. Meta l-annimali jiġu ttrattati kontinwament għal erba' ġimgħat jew aktar, jistgħu jingħaddu ukoll għall-inqas 2000 eritroċiti maturi għal kull annimal għall-inċidenza ta' mikronukleji. Is-sistemi ta' analiżi awtomatizzata (analiżi ta' l-immaġini u analiżi tal-fluss ċitometriku ta' sospensjonijiet ta' Ċelloli) huma aċċettabbli bħala alternattivi għall-valutazzjoni manwali jekk ikunu ġustifikati u validati kif xieraq.

2. DATA

2.

2.1. TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI L-informazzjoni dwar annimali individwali għandha tingħata f'forma ta' tabella. L-unità sperimentali hija l-annimal. Għal kull annimal li jiġi analizzat għandhom jiġu elenkati separatament in-numru ta' eritroċiti immaturi li jingħaddu, in-numru ta' eritroċiti immaturi mikronukleati, u n-numru ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali. Meta l-annimali jiġu ttrattati kontinwament għal erba' ġimgħat jew aktar, għandha tingħata wkoll l-informazzjoni dwar l-eritroċiti maturi jekk din tinġabar. Għal kull annimal tingħata l-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali u, jekk jitqies applikabbli, il-perċentwali ta' eritroċiti mikronukleati. Jekk ma hemmx xiehda ta' differenza fir-riżultat bejn iż-żewġ sessi, l-informazzjoni dwar iż-żewġ sessi tista’ tingħaqad għall-analiżi statistika.

2.2. EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit riżultat pożittiv, bħal ma hi żieda relatata mad-doża fl-għadd relattiv ta' Ċelloli mikronukleati jew żieda ċara fin-numru ta' Ċelloli mikronukleati fi grupp singolu ta' trattament fi żmien singolu ta' teħid ta' kampjuni. L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet (18) (19), jistgħu jintużaw metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal riżultat pożittiv. Riżultati ekwivoċi għandhom jiġu ċċarati b'testijiet ulterjuri preferibilment billi tintuża modifika tal-kundizzjonijiet ta' l-esperiment. Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma jilħqux il-kriterji fuq imsemmija titqies bħala mhux mutaġenika f'dan it-test. Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment. Ir-riżultati pożittivi minn test mikronukleu jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq mikronukleji li huma r-riżultat ta' ħsara fil-kromożomi jew ħsara lill-apparat mitotiku fl-eritroblasti ta' l-ispeċi ttestjata. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, taħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx mikronukleji fl-eritroċiti immaturi ta' l-ispeċi ttestjata. Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test jew il-metaboliti tagħha jilħqu ċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew speċifikatament it-tessut immirat (eż. tossiċità sistemika).

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Solvent/mezz:

ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz;

solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.

Annimali ttestjati:

speċi/razza użati,

numru, età u sess ta' l-annimali;

għejun, kundizzjonijiet dwar fejn jinżammu, dieta, eċċ.;

piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inkluża l-medda ta' piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard għal kull grupp.

Kundizzjonijiet tat-test:

kontrolli pożittivi u negattivi (mezz/solvent);

informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar;

raġuni prinċipali għall-għażla ta' livell tad-doża;

dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test;

dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test;

raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni;

metodi biex jiġi verifikat li s-sustanza tat-test waslet għaċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew it-tessut immirat, jekk tkun applikabbli;

konverżjoni mill-konċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test dieta/ilma għax-xorb għad doża attwali (mg/kg piż tal-ġisem/jum) jekk tkun applikabbli;

dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma;

deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u teħid ta' kampjuni;

metodi tal-preparazzjoni tad-dijapożitivi;

metodi biex titqies it-tossiċità;

kriterji għall-għadd ta' eritroċiti immaturi mikronukleati;

numru ta' ċelluli analizzati kull annimal;

kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi.

Riżultati:

sinjali ta' tossiċità;

proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali;

numru ta' eritroċiti immaturi mikronukleati, mogħtija separatament għal kull annimal;

devjazzjoni standard medja ± ta' eritroċiti immaturi mikronukleati għal kull grupp;

relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli;

analiżi statistiċi u metodi applikati;

informazzjoni negattiva kurrenti u storika;

informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin pożittiv.

Diskussjoni dwar ir-riżultati.

Kunklużjonijiet.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)

REFERENZI Heddle, J. A. (1973), A Rapid In vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15. Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61-118. Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80. MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558. MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245-249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 53-159. Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. (1994), in vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293-304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313-319. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319. Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247. MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, pp. 269-275. Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104. Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97-99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part 1, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

B.13/14. MUTAĠENIĊITÀ -TEST TA' MUTAZZJONI RIVERSIVA TA' BATTERJI

B.13/14.

1. METODU Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 471, Test ta' Mutazzjoni Riversiva ta' Batterji (1997).

1.

1.1. INTRODUZZJONI It-test ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji juża aċidu amino li jeħtieġ kundizzjonijiet ta' Salmonella typhimurium u Escherichia coli biex jiġu żvelati mutazzjonijiet f'punti, li jinvolvu sostituzzjoni, żjieda jew tħassir ta' par wieħed jew aktar ta' bażijiet DNA (1) (2) (3). Il-prinċipju tat-test ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji huwa li jiskopri mutazzjonijiet li jirrivertu mutazzjonijiet preżenti fil-kundizzjonijiet tat-test u jirrestitwixxu l-kapaċità funzjonali tal-batterja biex tissintesizza aċidu amino essenzali. Il-batterji li jiġu lura jiġu skoperti mill-kapaċità tagħhom li jikbru fl-assenza ta' l-aċidu amino meħtieġ mill-kundizzjonijiet tal-ġenitur tat-test. Mutazzjonijiet f'punti huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm xiehda sostanzjali li mutazzjonijiet f'punt f'onkoġeni u fil-ġeni ta' ċelluli somatiċi li jrażżnu t-tumuri huma involuti fil-formazzjoni ta' tumuri fil-bniedem u f'annimali ta' esperimenti. It-test ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji huwa rapidu, mhux għali u relattivament faċli biex jitwettaq. Ħafna mill-kundizzjonijiet tat-test għandhom diversi karatteristiċi li jagħmuluhom aktar sensittivi għall-iskoperta ta' mutazzjonijiet inklużi sekwenzi DNA responsivi fis-siti ta' reversjoni, permeabilità miżjuda ta' Ċelloli għal molekuli kbar u l-eliminazzjoni ta' sistemi ta' riparazzjoni ta' DNA jew titjib ta' proċessi ta' riparazzjoni ta' DNA li huma suxxettibbli għall-iżbalji. L-ispeċifiċità tal-kundizzjonijiet tat-test jistgħu jipprovdu informazzjoni utli dwar it-tipi ta' mutazzjonijiet li huma kkaużati mill-aġenti ġenotossiċi. Bażi ta' informazzjoni kbira ħafna ta' riżultati għal varjetà wiesgħa ta' strutturi hija disponibbli għal testijiet ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji u ġew żviluppati metodoloġiji stabbiliti sew biex jittestjaw il-kimiċi b'karatteristiċi diversi fiżiko kimiċi, inklużi komposti li jiżvintaw. Ara wkoll l-Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.

1.2. DEFINIZZJONIJIET Test ta' mutazzjoni riversiva jew fi Salmonella typhimurium jew f'Escherichia coli jiżvela mutazzjoni f'amino aċidu li jeħtieġ karatteristika (histidine jew tryptophan, rispettivament) biex jipproduċi karatteristika indipendenti minn fornitura minn barra ta' aċidu amino. Mutaġeni li jġibu s-sostituzzjoni ta' koppji ta' bażijiet huma aġenti li jikkawżaw bidla fil-bażi tad-DNA. F'test reversiv din il-bidla tista’ tirrikorri fil-lok tal-mutazzjoni oriġinali, jew f'xi tieni lok fil-genome batteriku. Mutaġeni li jġibu l-mutazzjoni tal-fażi tal-qari huma aġenti li jikkawżaw iż-żieda jew ittħassir ta' pari ta' bażi waħda jew aktar fid-DNA, u b'hekk jibdlu l-fażi tal-qari tar-RNA.

1.3. KONSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU It-test tal-mutazzjoni batterika reversiva jutilizza Ċelloli prokarijotiċi, li huma differenti minn Ċelloli tal-mammiferi fil-karatteristiċi bħal ma huma l-assorbiment, il-metaboliżmu, l-istruttura tal-kromożomi u l-proċessi ta' riparazzjoni tad-DNA. It-testijiet li jitwettqu in vitro ġeneralment jeħtieġu l-użu ta' għejun esoġenu għall-attivazzjoni metabolika. Sistemi ta' attivazzjoni metabolika in vitro ma jistgħux jissimulaw kompletament il-kundizzjonijiet in vivo fil-mammiferi. Għalhekk it-test ma jagħtix informazzjoni diretta fuq il-qawwa mutaġenika u karċinoġenika ta' sustanza fil-mammiferi. It-test tal-mutazzjoni riversiva batterika normalment jintuża bħala l-ewwel pass għall-attività ġenolossika u, b'mod partikolari, għall-attività li toħloq mutazzjoni puntiformi. Informazzjoni estensiva wriet li ħafna kimiċi li huma posittivi f'dan it-test juru wkoll attività mutaġenika f'testijiet oħra. Hemm eżempji ta' aġenti mutaġeniċi li ma jiġux żvelati b'dan it-test; ir-raġunijiet għal dawn in-nuqqasijiet jistgħu jkunu attribwiti għan-natura speċifika tal-punt ta' laħħar żvelat, differenzi fl-attivazzjoni metabolika, jew differenzi fil-bijodisponibbilità. Minnaħa l-oħra, l-fatturi li jsaħħu s-sensitività tat-test tal-mutazzjoni riversiva batterika jistgħu jwasslu għal sopravalutazzjoni ta' l-attivita mutaġenika. It-test tal-mutazzjoni riversiva batterika jista’ ma jkunx xieraq għall-valutazzjoni ta' ċerti klassijiet ta' kimiċi, per eżempju komposti b'qawwa kbira batteriċida (eż. ċerti antibijotiċi) li dawk li huma maħsuba (jew huma magħrufa) li jiddisturbaw speċifikatament is-sitema ta' replika ta' Ċelloli fil-mammiferi (eż. inibituri tat-topojsomerasi u ċerti analogi nukleosidi). F'dawn il-każijiet jistgħu jkunu aktar xierqa testijiet fuq mutazzjoni fil-mammiferi. Minkejja li ħafna mill-komposti li huma posittivi f'dan it-test huna karċinoġeni tal-mammiferi, il-korrelazzjoni mhijiex assoluta. Tiddependi fuq il-klassi tal-kimika u hemm karċinoġeni li ma jiġux żvelati b'dan it-test għax jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi oħra li mhumiex ġenotossiċi jew mekkaniżmi li ma jeżistux f'ċelluli batteriċi.

1.4. PRINĊIPJI TAL-METODU TAT-TEST Is-sospensjonijiet taċ-Ċelloli batteriċi jiġu esposti għas-sustanza tat-test fil-presenza u fl-assenza ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika esoġenea. Fil-metodu ta' inkorporazzjonmi fuq bażi, dawn is-sospensjonijiet jitħalltu ma' agar ta' kopertura u jitqiegħdu fuq il-bażi minnufih fuq medjum minimu. Fil-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni, it-taħlita tat-trattament tiġi inkubata u imbagħad imħallta ma' agar ta' kopertura qabel titqiegħed fuq bażi fuq medjum minimu. Għaż-żewġ metodi ta' teknika, wara jumejn ta' inkubazzjoni jew tlieta, jingħaddu l-kolonji revertanti u jiġu mqabbla man-numru ta' kolonji revertanti spontanji fuq il-bażijiet ta' kontroll tas-solvent. Ġew deskritti ħafna proċeduri għat-twettiq tat-test tal-mutazzjoni riversiva batterika. Fost dawk li ġeneralment jintużaw hemm il-metodu ta' inkorporazzjoni fuq bażi (1) (2) (3) (4), il-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni (2) (3) (5) (6) (7) (8), il-metodu ta' fluttwazzjoni (9) (10), u l-metodu tas-sospensjoni (11). Ġew deskritti modifiki għall-ittestjar ta' gassijiet jew fwar (12). Il-proċeduri deskritti fil-metodu jappartjenu primarjament għall-metodi ta' l-inkorporazzjoni fuq bażi u ta' qabel l-inkubazzjoni. Kull wieħed minnhom huwa aċċettabbli biex isiru esperimenti kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. Ċerti sustanzi jistgħu jiġu żvelati b'mod aktar effiċjenti meta jintuża l-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni. Dawn is-sustanzi jappartjenu għal klassijiet kimiċi li jinkludu nitrosamini alifatiċi short chain, metalli divalenti, aldejidi, komposti ta' koloranti ażo u dijażo, alkalojdi pirolliżidini, komposti allil u nitro komposti (3). Hu rikonoxxut ukoll li ċerti klassijiet ta' mutaġeni mhux dejjem jiġu żvelati meta jintużaw proċeduri standard bħal ma huma l-metodu ta' inkorporazzjoni fuq bażi u l-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni. Dawn għandhom jitqiesu bħala każijiet speċjali hu huwa bil-qawwa rakkomandat li jintużaw proċeduri alternattivi biex jiġu żvelati. Il-każijiet speċjali li ġejjin jistgħu jiġu identifikati (flimkien ma' eżempji ta' proċeduri li jistgħu jintuiżaw biex jiġu żvelati): komposti ta' koloranti ażo u dijażo (3) (5) (6) (13), kimiċI ta' gasssijiet u fwar (12) (14) (15) (16) u glikosidi (17) (18). Kull devjazzjoni mill-proċedura standard teħtieġ li tkun ġustifikata xjentifikament.

1.5. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.5.

1.5.1. Preparazzjonijiet

1.5.1.

1.5.1.1. Batterja Kulturi friski ta' batterja għandhom jitħallew jiżviluppaw sal-fażi esponenzali tardiva jew il-fażi bikrija stazzjonarja ta' l-Iżvilupp (madwar 109 Ċelloli kull ml). Ma għandhomx jintużaw kulturi fil-fażi stazzjonarja tardiva. Huwa essenzali li l-kulturi li jintużaw fl-esperiment ikun fihom titolu għoli ta' batterja vijabbli. It-titolu jista’ jintwera jew mill-informazzjoni storika ta' kontroll fuq il-fażijiet ta' żvilupp, jew minn kull analiżi permezz tad-determinazzjoni ta' l-għadd ta' Ċelloli vijabbli bl-esperiment tal-bażi. It-temperatuta rakkomandata għall-inkubazzjoni hi ta' 37 oĊ. Għandhom jintużaw għallinqas ħames karatteristiċi ta' batterji. Dawn għandhom jinkludu erba' karatteristiċi ta' S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 jew TA97a jew TA97; TA98; u TA100) li ġew pruvati li huma ta' min wieħed jorbot fuqhom u responsivi għar-riproduzzjoni bejn laboratorji. Dawn l-erba' karatteristiċi S. typhimurium għandhom pari bażiċi GC fuq il-lok ta' reversjoni primarja u huwa magħruf li jistgħu ma jiżvelawx ċerti mutaġeni ossidanti, aġenti li jipprovokaw il-cross-linking u idrażini. Dawn is-sustanzi jistgħu jiġu żvelati bil-karatteristiċi ta' E. coli WP2 jew S. typhimurium TA102 (19) li jkollhom par ta' bażi AT fil-lok primarju ta' reversjoni. Għalhekk it-tagħqid rakkomandat ta' karatteristiċi huwa: Biex jiġu żvelati mutaġeni cross-linking jista’ jkun preferibbli li wieħed jinkludi TA102 jew li tiżdied karatteristika ta' riparazzjoni tad-DNA ta' E. coli (eż. E. coli WP2 jew E. coli WP2 (pKM101)). Għandhom jintużaw proċeduri stabbiliti għall-preparazzjoni ta' kulturi primarji, verifika ta' l-immarkar u l-ħażna. Għandha tintwera l-ħtieġa ta' l-amino aċidu għall-Iżvilupp għal kull kultura primarja ffriżata (istidina għal karatteristiċi ta' S. typhimurium, u triptofan għal karatteristiċi ta' E. coli). Karatteristiċi oħra fenotipiċi għandhom jiġu verifikati bl-istess mod, jiġfieri: il-presenza jew l-assenza ta' plasmidi tal-fattur R fejn ikun xieraq (jiġifieri r-resistenza għall-ampiċillina fil-karatteristiċi ta' TA98, TA100, u TA97a jew TA97, WP2 uvrA u WP2 uvrA (pKM101), u resistenza għall-ampiċillina + tetraċiklina fil-karatteristika TA 102); il-presenza ta' mutazzjonijiet karatteristiċi (jiġifieri mutazzjoni rfa mutation fi S. typhimurium permezz ta' senmsitività għal kristalvjola, u mutazzjoni uvrA fi E. coli jew mutazzjoni uvrB mutation fi S. typhimurium, permezz ta' sensitività għal dawl ultravjola) (2) (3). Il-karatteristiċi għandhom ukoll jipproduċu numru ta' bażijiet ta' kolonji revertanti spontanji fi ħdan il-meddiet ta' frekwenza mistennija mill-informazzjoni storika ta' kontroll tal-laboratorji u preferibbilment fil-medda msemmija fil-letteratura.

S. typhimurium TA1535, u

S. typhimurium TA1537 jew TA97 jew TA97a, u

S. typhimurium TA98, u

S. typhimurium TA100, u

E. coli WP2 uvrA, jew E. coli WP2 uvrA (pKM101), jew S. typhimurium TA102.

1.5.1.2. Medjum Jintuża agar minimu xieraq (eż. li jkun fih medjum E minimu ta' Vogel-Bonner u glukożju), u agar ta' kopertura li jkun fih istidina u bijotin jew triptofan biex jippermetti ftit diviżjonijiet ta' Ċelloli (1) (2) (9).

1.5.1.3. Attivazzjoni metabolika Il-batterja għandha tiġi esposta għas-sustanza tat-test kemm fil-presenza kif ukoll fl-assenza ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika xierqa. Is-sistema li normalment l-aktar tintuża hija frazzjoni post mitokondrijali integrata ta' kofattur (S9) ippreparata mill-fwied ta' annimali gerriema trattata b'aġenti li jipprokuraw l-enżimi bħal ma huma l-Aroclor 1254 (1) (2) jew komposizzjoni ta' phenobarbitone u β-naphthoflavone (18) (20) (21). Il-frazzjoni post mitokondrijali normalment tintuża f'konċentrazzjonijiet fil-medda minn 5 sa 30 % v/v fit-taħlita S9. L-għażla u l-kundizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika tista’ tiddependi fuq il-klassi tal-kimika li tintuża. F'ċerti każijiet, jista’ jkun xieraq li jintużaw aktar minn konċentrazzjoni waħda ta' frazzjon post mitokondrijali. Għal komposti ta' koloranti ażo u dijażo, jista’ jkun aktar xieraq li tintuża sistema ta' attivazzjoni metabolika (6) (13).

1.5.1.4. Sustanza/preparazzjoni tat-test Sustanzi solidi tat-test għandhom jiddewbu jew jiġu sospiżi f'solventi jew mezzi xierqa u dilwiti kif ikun xieraq qabel ma tiġi ttrattata l-batterja. Sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiżdiedu direttament mas-sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda sakemm l-informazzjoni ta' l-istabbilità ma turix li jistgħu jinħażnu. Ma għandhux jkun hemm suspett ta' reazzjoni kimika tas-solvent/mezz mas-sustanza tat-test u dan is-solvent/mezz għandu jkun kompatibbli mas-sopravvivenza tal-batterja u ma' l-attività S9 (22). Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompattibilità tagħhom. Huwa rakkomandat li kull fejn ikun possibbli għandu l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akkwuż. Meta jiġu ttestjati sustanzi li mhumiex stabbli fl-ilma, is-solventi organiċi li jintużaw ma għandux ikollhom ilma.

1.5.2. Kundizzjonijiet tat-test

1.5.2.

1.5.2.1. Karatteristiċi tat-test (Ara 1.5.1.1)

1.5.2.2. Konċentrazzjoni ta' l-espożizzjoni Fost il-kriterji li għandhom jitqiesu meta jiġi determinat l-ogħla ammont tas-sustanza tat-test li għandha tintuża hemm il-ċitotossiċità u s-solubbilità fit-taħlita ta' trattament finali. Jista’ jkun utli li jiġu stabbiliti t-tossiċità u l-insolubbilità f'esperiment preliminari. Iċ-ċitossiċità tista’ tiġi żvelata b'riduzzjoni fl-għadd ta' konolonji revertanti, bid-dehra ta' żvilupp a normali tal-fond, jew bil-grad ta' sopravivenza tal-kulturi ttratati. Iċ-ċitossiċità ta' sustanza tista’ tinbidel fil-preżenza ta' sistemi ta' attivazzjoni metabolika. L-insolubbilità għandha tiġi stmata bħala preċipitazzjoni fit-taħlita finali taħt il-kundizzjonijiet attwali tat-test u tkun evidenti għall-għajn mingħajr għanjuna. Il-konċentrazzjoni massima rakkomandata għat-test għal sustanzi solubbli li mhumiex ċitotossiċi hija 5mg/bażi jew 5μl/bażi. Għal sustanzi li mhumiex ċitotossiċi u li ma jinħallux fuq 5mg/bażi jew 5 μl/bażi u waħda mill-konċentrazzjonijiet ittestjati jew aktar għandha tkun mhux solubbli fit-taħlita finali tat-trattament. Sustanzi tat-test li huma diġà ċitotossiċi taħt il-5mg/bażi jew 5 μl/bażi għandhom jiġu ttestjati sa konċentrazzjoni ċitotossika. Dak li jippreċipita ma għandux jiddisturba l-għadd. Għandhom jintużaw għallinqas ħames konċentrazzjonijiet differenti analizzabbli tas-sustanza tat-test b'madwar intervalli ta' semi logarittmi (jiġifieri √10) bejn punti tat-test għal esperiment inizjali. Jistgħu ikunu xierqa intervalli iqsar meta jkun qed jiġi investigat rispons ta' konċentrazzjoni. Testjar għola mill-ċonċentrazzjoni ta' 5mg/bażi jew 5 μl/bażi jista’ jiġi kkunsidrat meta ssir il-valutazzjoni ta' sustanzi li jkollhom ammonti sostanzjali ta' impuritajiet potenzalment mutaġeniċi.

1.5.2.3. Kontrolli negattivi u pożittivi Kontrolli (solvent jew mezz) pożittivi u negattivi konkurrenti speċifiċi għall-kwalitajiet, kemm b'attivazzjoni metabolika jew mingħajr, għandhom jiġu inklużi f'kull eżami. Għandhom jintgħażlu konċentrazzjonijiet ta' kontrolli pożittivi li juru l-prestazzjoni effettiva ta' kull eżami. Għal eżamijiet li jagħmlu użu minn sistema ta' attivazzjoni metabolika, is-sustanza (i) ta' referenza ta' kontoll pożittiv għandha(hom) tingħażel fuq bażi tat-tip tal-kwalitajiet ta' batterja użati. Is-sustanzi li ġejjin huma eżemmpji ta' kontrolli pożittivi xierqa għal eżamijiet ta' attivazzjoni metabolika: Nri CA NRI EINECS Ismijiet 781-43-1 212-308-4 9,10- Dimetil-antraċena 57-97-6 200-359-5 7,12- Dimetilbenż(a)antraċena 50-32-8 200-028-5 Benzo(a)pirena 613-13-8 210-330-9 2-Amino-antraċena 50-18-0 Ċiklofosfamida 6055-19-2 200-015-4 Monoidrat taċ-ċiklofosfamida Is-sustanza li ġejja hija kontroll pożittiv xieraq għall-metodu ta' attivazzjoni metabolika riduttiva: Nri CA NRI EINECS Ismijiet 573-58-0 209-358-4 Congo Red It-2-Aminoantraċena ma għandhiex tintuża bħala l-uniku indikatur ta' l-effikaċja tat-taħlita S9. Jekk tintuża t-2-aminoantraċena, kull lott ta' S9 għandu jkun karatteriżat b'mutaġen li jeħtieġ l-attivazzjoni metabolika b'enżimi mikrosomali, eż. benzo(a)pirena, dimetilbenzantraċena. Is-sustanzi li ġejjin huma eżempji ta' kontrolli pożittivi skond karatteristiċi speċifiċi għal eżamijiet imwettqa mingħajr is-sistema ta' attivazzjoni metabolika essoġena: NRI CAS NRI EINECS ISMIJIET Strain 26628-22-8 247-852-1 Ażidu tas-sodju TA 1535 u TA 100 607-57-8 210-138-5 2 Mikro-fluworena TA 98 90-45-9 201-995-6 9 Amino-akridina TA 1537, TA 97 u TA 97a 17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 u TA 97a 80-15-9 201-254-7 Iperossidu tal-Kumena TA 102 50-07-7 200-008-6 Mitomycin C WP2 uvrA u TA102 70-25-7 200-730-1 N-etil-N-nitro-3-nitro-N-nitrosogwanidina WP2, WP2uvrA u WP2uvrA (pK M101) 56-57-5 200-281-1 4-Nitrokwinolina-1-ossidu WP2, WP2uvrA u WP2uvrA(pK M101) 3688-53-7 Furilfuramida (AF2) Karatteristiċi li fihom il-plasmid Jistgħu jintużaw sustanzi ta' referenza ta' kontroll pożittiv xierqa oħra. Għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittiv li huma relatati ma' klassijiet ta' kimiċi, meta dan ikun possibbli. Għandhom jiġu inklużi kontrolli negattivi, li jikkonsistu biss f'solvent jew mezz, mingħajr sustanza tat-test, u mod ieħor ittrattati bl-istess mod bħal gruppi ta' trattament. B'żieda ma dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakamm ma jkunx hemm informazzjoni storika ta' kontroll li turi li s-solvent magħżul ma jġibx effetti ta' ħsara jew mutaġeniċi.

1.5.3. Proċedura Għall-metodu ta' inkorporazzjoni fuq bażi (1) (2) (3) (4), mingħajr l-attivazzjoni metabolika, normalment 0,05 jew 0,1 ml tas-soluzzjonijiet tat-test, 0,1 ml ta' kulturi friski ta' batterja (li jkun fihom madwar 108 ċelloli vijabbli u 0,5 ml ta' tarka sterili jitħalltu ma' 2,0 ml ta' agar ta' kopertura. Għall-eżami bl-attivazzjoni metabolika, normalment 0,5 ml tat-taħlita ta' l-attivazzjoni metabolika li jkun fiha ammont adegwat ta' frazzjoni post mitokondrijali (fil-medda ta' 5 sa 30 % v/v fit-taħlita ta' l-attivazzjoni metabolika) jitħalltu ma' agar ta' kopertura (2,0 ml) flimkien mal-batterja u mas-sustanza tat-test/soluzzjoni tat-test. Il-kontenut ta' kull tubu jiġi mħallat u jitferra fuq superfiċi ta' bażi b'agar minimu. L-agar ta' kopertura jitħalla jsir solidu qabel l-inkubazzjoni. Għall-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni (2) (3) (5) (6), is-sutanza tat-test/soluzzjoni tat-test tiġi inkubata minn qabel mal-karatteristika tat-test (li jkun fiha madwar 108 Ċelloli vijabbli u t-tarka sterili jew is-sistema ta' attivazzjoni metabolika, 0,5ml) ġeneralment għal 20 minuta jew aktar f'temperatura ta' 30- 37Ċ qabel ma titħallat ma' l-agar ta' kopertura u titferra fuq superfiċi ta' bażi ta' agar minimu. Ġeneralment 0,05 jew 0,1 ml tas-sustanza tat-test/soluzzjoni tat-test, 0,1 ml ta' batterja u 0,5ml ta' taħlita S9 jew tarka sterili jitħalltu ma' 2,0 ml ta' agar ta' kopertura. It-tubi għandhom jitħallew li tidħol l-arja fihom fl-istadju ta' qabel l-inkubazzjoni billi jintuża aġitatur. Biex issir stima xierqa tal-varjazzjoni, għandhom jintużaw tarki ittriplikati għal kull livell ta' doża. L-użu ta' tarka duplikata hija aċċettabbli meta xjentement ġustifikata. It-telfa ta' kull tant ta' bażi ma tinvalidax it-test neċessarjament. Sustanzi gassużi jew volatili għandhom jiġu ttestjati b'metodi xierqa, bħalma huma mezzi magħluqa (12) (14) (15) (16).

1.5.4. Inkubazzjoni Il-bażijiet kollha f'eżami partikolari għandhom jiġu inkubati ta' 37 oC għal 48-72 siegħa. Wara l-perjodu ta' inkubazzjoni, għandu jingħadd in-numru ta' kolonji revertanti kull bażi.

2. DATA

2.

2.1. TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI Informazzjoni għandha tiġi preżentata bħala numru ta' kolonji revertanti kull bażi. Għandu jingħata wkoll in-numru ta' kolonji revertanti kemm dwar bażijiet ta' kontroll negattivi (kontroll tas-solvent, u kontroll mhux trattat, jekk ikun ġie użat) kif ukoll bażijiet ta' kontroll pożittivi. L-għadd ta' bażijiet individwali, in-numru medju ta' kolonji revertanti kull bażi u d-devjazzjoni standard għandhom jiġu preżentati għas-sustanza tat-test u għall-kontrolli pożittivi u negattivi (mhux trattati u/jew tas-solvent). Ma hemmx ħtieġa ta' verifika għal rispons pożittiv ċar. Riżultati ambigwi għandhom jiġu ċċarati b'permezz ta' aktar testijiet preferibbilment billi jkun hemm modifika fil-kundizzjonijiet ta' l-esperiment. Riżultati negattivi għandhom jiġu konfermati fuq il-bażi ta' każ b'każ. F'dawk il-każijiet fejn il-konferma ta' riżultati negattivi mhiex ikkunsidrata bħala negattiva, trid tingħata ġustifikazzjoni. Modifikazzjonijiet ta' parametri ta' studju sabiex tiġi estiża l-medda tal-kundizzjonijiet stmati għandha tiġi kkonsidrata f'esperimenti ta' wara. Parametri ta' studju li jisgħu jiġu modifikati jinkludu l-ispazjar tal-konċentrazzjoni, il-metodu ta' trattament (inkorporazzjoni mal-bażi jew qabel l-inkubazzjoni fil-likwidu), u kundizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika.

2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TA' RIŻULTATI Hemm diversi kriterji sabiex jiġi determinat riżultat pożittiv, bħal żieda ta' relata mal-konċentrazzjoni matul il-medda ttestjata u/jew żieda riproduċibbli f'konċentrazzjoni waħda jew aktar fin-numru ta' kolonji revertanti kull bażi f'mill-inqas karatteristika waħda b'sistema ta' attivazzjoni metabolika jew mingħajrha (23). Għandha tiġi kunsidrata l-ewwel ir-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Jistgħu jintużaw metodi ta' statistika bħala għanjuna għal valutazzjoni tar-riżultati tat-test (24). Madankollu, is-sinjifikanza statistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal rispons pożittiv. Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma josservawx il-kriterji fuq imsemmija hija kkunsidrata bħala mhux mutaġenika f'dan it-test. Minkejja li ħafna esperimenti jagħtu riżultati ċari, pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni mogħtija ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività tas-sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ambigwi jew dubbjużi rrispettivament min-numru ta' drabi li jiġi ripetut l-esperiment. Riżultati pożittivi mit-test ta' mutazzjoni reversibbli batterika jindikaw li s-sustanza tiġġenera mutazzjonijiet mal-punt permezz ta' sostituzzjonijiet fuq il-bażi jew tibdiliet fil-parametri tal-ġenomu ta' jew Salmonella typhimurium u/jew Escherichia coli. Riżultati negattivi jindikaw li taħt il-kundizzjonijiet tat-test is-sustanza tat-test mhix mutaġenika fl-ispeċi ttestjati.

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Solvent/mezz:

ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/mezz;

solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.

Karatteristiċi:

Karatteristiċi użati;

numru ta' ċelluli kull kultura;

dettalji tal-karatteristiċi.

Kundizzjonijiet tat-Test:

ammont tas-sustanza tat-test kull bażi (mg/bażi jew μl/bażi) flimkien mar-raġuni bażija għall-għażla tad-doża u n-numru ta' bażijiet kull konċentrazzjoni;

medja użata;

tip u komposizzjoni ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika, inklużi l-kriterji ta' aċċettazzjoni;

proċeduri tat-trattament.

Riżultati:

sinjali ta' tossiċità;

sinjali ta' preċipitazzjoni;

għadd ta' bażijiet individwali;

in-numru medju ta' kolonji rivertanti kull bażi u devjazzjoni standard;

ir-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli;

analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;

informazzjoni dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, fl-istess ħin, bil-meded, mezzi, u devjazzjonjiet standard;

informazzjoni dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, storiċi, bil-meded, mezzi, u devjazzjonjiet standard.

Diskussjoni tar-riżultati.

Konklużjonijiet.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)

REFERENZI Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233. Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69-240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, pp. 91-96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285. Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61. Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, pp. 167-177. Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, pp. 33-42. Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161. Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453-465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335-344. Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47. Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258. Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780-3782. Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285-291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350. Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91. Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, pp. 28-65.

B.15. IT-TIBDIL TAL-ĠENE – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.15.

1. IL-METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.2. TIFSIRA Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.3 SUSTANZI GĦAR-REFERENZA Xejn.

1.4 IL-PRINĊIPJU TAL-METODU GĦAT-TEST Hemm varjetà ta’ razez ta’ l-aplojde u tad-diplojde tal-ħmira Saccharomyces cerevisiae li jistgħu jintużaw biex tkun ikkalkulata il-produzzjoni ta’ tibdil tal-ġene li huwa kkaġunat minn aġenti kimiċi bl-attivazzjoni metabolika u mingħajr dik l-attivazzjoni. Kienu użati sistemi ta’ tibdil ‘il-quddiem f’razez ta’ l-aplojde, bħall-kalkolu tat-tibdil minn mutanti (ade-1, ade-2) ħomor li jeħtieġu l-adenina, għal mutanti bojod doppji li jeħtieġu l-adenina u sistemi selettivi bħall-ikkaġunar ta’ reżistenza għall-canavnaine u għaċ-ċiklohessimida. Is-sistema ta’ tibdil b’lura li hija validata bil-mod l-iktar estensiv tinvolvi l-użu tar-razza ta’ l-aplojde XV 185-14C li ġġorr il-bidliet nonsense ta’ l-okra ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 u trp 5-48, li jistgħu jinqalbu lura b’mutaġeni li jissostitwixxu l-bażi u li jikkaġunaw tibdil speċifiku għas-sit jew tibdil li jrażżnu l-okra. XV 185-14C iġorr ukoll is-sinjal his 1-7, li huwa bidla missense li tista’ tinqaleb lura prinċipalment b’tibdil tat-tieni sit, u s-sinjal hom 3-10 li jista’ jinqaleb lura permezz ta’ mutaġeni frameshift.. F’razez diplojdiċI ta’ l-S. cerevisiae l-unika razza li tintuża b’mod estensiv hija D7 li hija omozigota għal ilv 1-92.

1.5. KRITERJI GĦALL-KWALITÀ Xejn.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6. Preparazzjonijiet

Is-soluzzjonijiet tal-kimiċi tat-test u l-kontroll għandhom ikunu ppreparati eżatt qabel l-ittestjar, bl-użu ta’ vettura xierqa. Fil-każ ta’ komposti organiċi li ma jinħallux fl-ilma, m’għandhiex tintuża iktar minn taħlita ta’ 2 % v/v ta’ solventi organiċi bħall-etanol, l-aċetun jew id-dimetilsulfossidu (DMSO). Il-konċentrazzjoni finali tal-vettura m’għandhiex taffettwa b’mod sinifikanti il-vijabilità taċ-ċelluli u l-karatteristiċi tat-tkabbir.

L-attivazzjoni metabolika

Iċ-ċelluli għandhom ikunu esposti għall-kimiċi tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema ta’ l-attivazzjoni metabolika esoġena xierqa. Is-sistema li tintuża l-iktar spiss hija frazzjoni post-mitokondrijali supplimentata minn ko-fattur mill-fwied ta’ mammali gerriema trattati minn qabel b’aġenti li jikkaġunaw l-enzimi. L-użu ta’ speċi, tessuti, frazzjonijiet post-mitokondrijali, jew proċeduri oħrajn jistgħu ukoll ikunu xierqa għall-attivazzjoni metabolika.

Kundizzjonijiet għat-test

Razez użati għat-test

Ir-razza aplojdika XV 185-14C u r-razza diplojdika D7 huma dawk li jintużaw l-iktar fl-istudji dwar it-tibdil fil-ġeni. Razez oħrajn jistgħu ikunu xierqa ukoll.

Mezzi

Mezzi xierqa tal-kultura huma użati għad-determinazzjoni tan-numri tas-sopravivenza u tat-tibdil.

L-użu ta’ kontrolli pożittivi u negattivi

Kontrolli tas-solventi, posittivi, li m’humiex trattati għandhom isiru fl-istess ħin. Kimiċi xierqa għall-kontroll posittiv għandhom jintużaw għal kull tarf speċifiku ta’ tibdil.

Il-konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni

Għall-inqas ħames konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test mqassmin b’mod adegwat għandhom jintużaw. Għal sustanzi tossiċi, l-ogħla konċentrazzjoni ttestjata m’għandhiex tnaqqas is-sopravivenza għal inqas minn 5 % sa 10 %. Sustanzi li relattivament ma jinħallux fl-ilma għandhom ikunu ttestjati sal-limitu tas-solubilità tagħhom, bl-użu ta’ proċeduri xierqa. Għal sustanzi li jinħallu b’mod faċli fl-ilma u li m’humiex tossiċi, l-ogħla konċentrazzjoni għandha tkun determinata skond il-każ.

Kundizzjonijiet għall-inkubazzjoni

Il-platti huma inkubati għal erba’ sa sebat ijiem f’28 sa 30 oC fid-dlam.

Frekwenzi ta’ tibil spontanju

Għandhom jintużaw sub-kulturi b’frekwenzi ta’ tibdil spontanju ġewwa l-medda normali aċċettata.

Numru ta’ repliki

Għandhom jintużaw għall-inqas tliet repliki tal-platti għal kull konċentrazzjoni għall-analiżi tal-prototrophs li jinħalqu bit-tibdil tal-ġeni u għall-vijabilità taċ-ċelluli. Fil-każ ta’ esperimenti li jużaw sinjali bħal hom 3-10 b’rata baxxa ta’ tibdil, in-numru ta’ platti li jintużaw għandu jkun ikbar biex tinkiseb data rilevanti fis-sens statistiku.

Il-Proċedura

It-trattament tar-razez S. cerevisiae isir normalment bil-proċedura ta’ test likwidu li jinvolvi Ċelloli wieqfin jew li qed jikbru. Esperimenti inizjali għandhom isiru fuq Ċelloli li qed jikbru: 1-5 x 10 Ċelloli/ml huma esposti għall-kimika tat-test għal perjodu ta’ ħin sa 18-il siegħa f’temperatura ta’ 28-37 oC biċ-ċaqliq; ammont adegwat tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika huwa miżjud waqt it-trattament meta xieraq. Fl-aħħar tat-trattament, iċ-Ċelloli huma ċentrifugati, maħsulin u miżrugħin f’mezz ta’ kultura xieraq. Wara l-inkubazzjoni, il-platti jiġu eżaminati għas-sopravivenza u għall-ikkaġunar tat-tibdil tal-ġeni. Jekk l-ewwel esperiment ikun negattiv, għandu jsir esperiment ieħor bl-użu ta’ Ċelloli fil-fażi wieqfa. Jekk l-ewwel esperiment huwa pożittiv irid ikun ikkonfermat f’esperiment indipendenti xieraq.

2. ID-DATA Id-data għandha tkun ippreżentata fil-forma ta’ tabelli li jindikaw in-numru ta’ kolonji mgħadda, in-numru ta’ mutanti, is-sopravivenza u l-frekwenza tal-mutanti. Ir-riżultati kollha għandhom ikunu kkonfermati f’esperiment indipendenti. Id-data għandha tkun evalwata bl-użu ta’ metodi statistiċi xierqa.

3. IR-RAPPURTAĠĠ

3.

3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandhu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni il ġejja:

ir-razza użata;

il-kundizzjonijiet tat-test: Ċelloli f’fażi wieqfa jew Ċelloli li qed jikbru, komposizzjoniiet tal-mezzi, it-temperatura u t-tul ta’ l-inkubazzjoni, is-sistema għall-attivazzjoni metabolika;

il-kundizzjonijiet tat-trattament: il-livelli ta’ l-espożizzjoni, il-proċedura u t-tul tat-trattament, it-temperatura tat-trattament, kontrolli pożittivi u negattivi;

in-numru ta’ kolonji mgħadda, in-numru ta’ mutanti, is-sopravivenza u l-frekenza tal-mutanti, ir-relazzjoni doża/risposta fejn tapplika, il-valutazzjoni statistika ta-data;

id-diskussjoni tar-riżultati;

l-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

4. REFERENZI Ara l-Introduzjoni Ġenerali Parti B.

B.16. IR-RIKOMBINAZZJONI MITOTIKA- SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.16.

1. METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.2. TIFSIRA Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.3. SUSTANZI TAR-REFERENZA Xejn.

1.4. IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Ir-rikombinazzjoni mitotika fis-Saccharomyces cerevisiae tistà tkun osservata bejn il-ġeni (jew b’mod iktar ġenerali bejn ġene u ċ-ċentromeru tagħha) u ġewwa l-ġeni. L-ewwel każ jissejjaħ il-qsim mitotiku u jiġġenera prodotti reċiproki filwat li t-tieni każ iktar spiss ma jkunx reċiproku u jissejjaħ il-konversjoni tal-ġeni. Il-qsim huwa ġeneralment analizzat permezz tal-produzzjoni ta’ kolonji jew setturi omozigoti reċessivi prodotti f’razza eterozigota, filwaq li l-konversjoni tal-ġeni hija analizzata permezz tal-produzzjoni ta’ revertants protorofiċi prodotti f’razza eteroallelika auxotrophic li tkun qed iġġorr żewġ alleli difettivi differenti ta’ l-istess ġene. Ir-razez li jintużaw l-iktar spiss għall-iskoperta tal-konversjoni mitotika tal-ġeni huma D4 (eteroalleliku f’ade 2 u trp 5) D7 (eteroalleliku f’trp 5) BZ34 (eteroalleliku f’arg 4) u JD1 (eteroalleliku f’his 4 u trp 5). Il-qsim mitotiku li jipproduċi setturi omozigoti ħomor u roża jistgħu ikunu analizzati f’D5 jew D7 (li jikkalkula ukoll il-konversjoni mitotika tal-ġeni u t-tibdil b’lura f’ilv 1-92) fejn iż-żewġ razez huma eteroalleliċi għax jikkumplimentaw alleli ta’ ade 2.

1.5. KRITERJI TAL-KWALITÀ Xejn.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6. Preparazzjonijiet

It-taħlitiet tal-kimiċi tat-test u l-komposti għal-kontroll u għar-referenza għandhom ikunu ppreparati eżatt qabel l-ittestjar, bl-użu ta’ vettura xierqa. Fil-każ ta’ komposti organiċi li ma jinħallux fl-ilma, m’għandhiex tintuża iktar minn taħlita ta’ 2 % v/v ta’ solventi organiċi bħall-etanol, l-aċetun jew id-dimetilsulfossidu (DMSO). Il-konċentrazzjoni finali tal-vettura m’għandhiex taffettwa b’mod sinifikanti il-vijabilità taċ-ċelluli u l-karatteristiċi tat-tkabbir.

Attivazzjoni Metabolika

Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti għall-kimiċi tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema ta’ l-attivazzjoni metabolika esoġena xierqa. Is-sistema li tintuża l-iktar spiss hija frazzjoni post-mitokondrijali supplimentata minn ko-fattur mill-fwied ta’ mammali gerriema trattati minn qabel b’aġenti li jikkaġunaw l-enzimi. L-użu ta’ speċi, tessuti, frazzjonijiet post-mitokondrijali, jew proċeduri oħrajn jistgħu ukoll ikunu xierqa għall-attivazzjoni metabolika.

Kundizzjonijiet għat-test

Razez użati għat-test

Ir-razez użati l-iktar spiss huma d-diplojdi D4, D5, D7 u JD1. L-użu ta’ razez oħrajn jista’ jkun xieraq.

Mezzi

Mezzi xierqa tal-kultura huma użati għad-determinazzjoni tas-sopravivenza u tal-frekwenza tar-rikombinazzjoni mitotika.

L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi

Kontrolli tas-solventi, pożittivi, li m’humiex trattati għandhom isiru fl-istess ħin. Kimiċi xierqa għall-kontroll pożittiv għandhom jintużaw għal kull tarf speċifiku tar-rikombinazzjoni.

Il-konċentrazzjonijiet ta’ l-espożizzjoni

Għall-inqas ħames konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test mqassmin b’mod adegwat għandhom jintużaw. Fost il-fatturi li għandu jittieħed qies tagħhom hemm iċ-ċitotossiċità u s-solubilità. Il-konċentrazzjoni l-iktar baxxa m’għandha jkollha l-ebda effett fuq il-vijabilità taċ-ċelluli. Għal kimiċi tossiċi, l-ogħla konċentrazzjoni ttestjata m’għandhiex tnaqqas is-sopravivenza għal inqas minn 5 % sa 10 %. Kimiċi li relattivament ma jinħallux fl-ilma għandhom ikunu ttestjati sal-limitu tas-solubilità tagħhom, bl-użu ta’ proċeduri xierqa. Għal sustanzi li jinħallu b’mod faċli fl-ilma u li m’humiex tossiċi, l-ogħla konċentrazzjoni għandha tkun determinata skond il-każ. Iċ-Ċelloli jistgħu ikunu esposti għall-kimiċi tat-test jew fil-fażi wieqfa tagħhom jew waqt li jkunu qed jikbru għal perjodi ta’ ħin sa 18-il siegħa. Madankollu, għal ħinijiet twal ta’ trattament il-kulturi għandhom ikunu spezzjonati b’mikroskopju għal formazzjonijiet ta’ spori, li l-preżenza tagħhom twassal għall-invalidità tat-test.

Kundizzjonijiet għall-inkubazzjoni

Il-platti huma inkubati fid-dlam għal erba’ sa sebat ijiem f’28 sa 30 oC. Il-platti użati għal setturi omożigoti ħomor u roża li huma prodotti permezz tal-qsim mitotiku għandhom jinżammu f’refriġerejter (madwar 4 oC) għal ġurnata jew tnejn iktar qabel ma jiġu eżaminati jitħallew jiżviluppaw il-kolonji ippigmentati adegwati.

Frekwenzi ta’ rikombinazzjoni mitotika spontanja

Għandhom jintużaw sub-kulturi b’frekwenzi ta’ tibdil ta’ rikombinazzjonijiet mitotiċi spontanji ġewwa l-medda normali aċċettata.

Numru ta’ repliki

Għandhom jintużaw għall-inqas tliet repliki tal-platti għal kull konċentrazzjoni għall-analiżi tal-prototrophs li jinħalqu bil-konversjoni tal-ġeni mitotiċi u għall-vijabilità. Fil-każ ta’ l-analiżi ta’ l-omozigosi reċessiva prodotta bil-qsim mitotiku, in-numru ta’ platti għandu jiżdied biex ikun provvdut numru adegwat ta’ kolonji

Il-Proċeduri

It-trattament tar-razez S. cerevisiae isir normalment bil-proċedura ta’ test likwidu li jinvolvi Ċelloli wieqfin jew li qed jikbru. Esperimenti inizjali għandhom isiru fuq Ċelloli li qed jikbru: 1-5 × 107 Ċelloli/ml huma esposti għall-kimika tat-test għal perjodu ta’ ħin sa 18-il siegħa f’temperatura ta’ 28-37 oC biċ-ċaqliq; ammont adegwat tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika huwa miżjud waqt it-trattament meta xieraq. Fl-aħħar tat-trattament, iċ-ċelluli huma ċentrifugati, maħsulin u miżrugħin f’mezz ta’ kultura xieraq. Wara l-inkubazzjoni, il-platti jiġu eżaminati għas-sopravivenza u għall-ikkaġunar tar-rikombinazzjoni mitotika. Jekk l-ewwel esperiment ikun negattiv, għandu jsir esperiment ieħor bl-użu ta’ Ċelloli fil-fażi wieqfa. Jekk l-ewwel esperiment huwa pożittiv irid ikun ikkonfermat f’esperiment indipendenti.

2. ID-DATA Id-data għandha tkun ippreżentata fil-forma ta’ tabelli li jindikaw in-numru ta’ kolonji mgħadda, in-numru ta’ rikombinanti, is-sopravivenza u l-frekwenza tar-rikombinanti. Ir-riżultati għandhom ikunu kkonfermati f’esperiment indipendenti. Id-data għandha tkun evalwata bl-użu ta’ metodi statistiċi xierqa.

3. IR-RAPPURTAĠĠ

3.

3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni li ġejja:

ir-razza użata;

il-kundizzjonijiet tat-test: Ċelloli f’fażi wieqfa jew Ċelloli li qed jikbru, komposizzjoni tal-mezzi, it-temperatura u t-tul ta’ l-inkubazzjoni, is-sistema għall-attivazzjoni metabolika;

il-kundizzjonijiet tat-trattament: il-konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni, il-proċedura u t-tul tat-trattament, it-temperatura tat-trattament, kontrolli pożittivi u negattivi;

in-numru ta’ kolonji mgħadda, in-numru ta’ rikombinanti, is-sopravivenza u l-frekwenza tal-mutanti, ir-relazzjoni doża/risposta fejn tapplika, il-valutazzjoni statistika ta-data;

id-diskussjoni tar-riżultati;

l-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

4. REFERENZI Ara l-Introduzjoni Ġenerali Parti B.

B.17. MUTAĠENEĊITÀ –TEST TAL-MUTAZZJONI TAL-ĠENETAĊ-ĊELLULA TAL-MAMMIFERI IN VITRO

B.17.

1. METODU Dan il-metodu huwa replika tal-OECD TG 476, Test tal-Mutazzjoni tal-Ġene taċ-Ċellula tal-Mammiferi In vitro (1997).

1.

1.1. INTRODUZZJONI It-test tal-mutazzjoni tal-ġene taċ-ċellula tal-mammiferi in vitro jista’ jintuża biex jiġu żvelati mutazzjonijiet tal-ġene miġjuba minn sustanzi kimiċi. Il-linji ta' Ċelloli xierqa jinkludu L5178Y Ċelloli mouse lymphoma, il-linji CHO, CHO-AS52 u V79 ta' ċelluli ta' Chinese hamster, u ċ-Ċelloli umani lymphoblastoid TK6 (1). F'dawn il-linji ta' Ċelloli l-punti tat-truf ġenetiċi li l-aktar jintużaw ikejlu l-mutazzjoni fi thymidine kinase (TK) u hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT), u transġene ta' xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (XPRT). It-testijiet ta' mutazzjoni TK, HPRT u XPRT jiżvelaw dehriet differenti ta' ġrajjiet ġenetiċi. Il-lok awtosomali ta' l-TK u l-XPRT jista’ jippermetti l-iżvelar ta' ċerti ġrajjiet ġenetiċi (eż. ħafna tħassir) li mhumiex żvelati fil-locus HPRT locus fuq kromożomi X (2)(3)(4)(5)(6). Fit-test tal-mutazzjoni tal-ġene taċ-ċellula tal-mammiferi in vitro, jistgħu jintużaw kulturi ta' linji ta' Ċelloli jew karatteristiċi ta' Ċelloli. Iċ-Ċelloli li jintużaw jingħażlu fuq il-bażi tal-kapaċità tagħhom li jiżviluppaw f'kultura u l-istabbilità fil-frekwenza ta' mutazzjoni spontanea. Ġeneralment it-testijiet imwettqa in vitro jeħtieġu l-użu ta' għejun esoġeneu ta' attivazzjoni metabolika. Din is-sistema ta' attivazzjoni metabolika ma tista’x tikkopja kompletament il-kundizzjonijiet in vivo fil-mammiferi. Wieħed għandu jevita kundizzjonijiet li jistgħu jwasslu għal riżultati li ma jirriflettux mutaġeneċità intrinsika. Jista’ jkun hemm riżultati posittivi li ma jirriflettux mutaġeneċità intrinsika minn bidliet fil-pH, osmolalità jew livelli għolja ta' ċitotossiċità (7). Dan it-test jintuża biex tiġi individwata l-possibbiltà ta' mutaġeni u karċinoġeni fil-mammiferi. Ħafna komposti li huma posittivi f'dan it-test huma karċinoġeni fil-mammiferi; madankollu, m'hemmx korrelazzjoni perfetta bejn dan it-test u l-karċinoġeniċità. Il-korrelazzjoni tiddependi fuq il-klassi kimika u hemm evidenza dejjem tiżdied li jeżistu karċinoġeni li ma jiġux żvelati b'dan it-test għax jidhru li jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi oħra mhux ġenotossiċi jew mekkaniżmi li ma jeżistux f'Ċelloli batteriċi (6). Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali Taqsima B:

1.2. DEFINIZZJONIJIET Mutazzjoni 'l quddiem: mutazzjoni tal-ġene mit-tip parental ital-forma mutanti li toħloq alterazzjoni jew telf ta' l-attività enżimatika tal-funzjoni tal-proteina kodifikata. Mutaġeni li jġibu s-sostituzzjoni tal-koppji tal-bażi: sustanzi li jikkawżaw is-sostituzzjoni ta' koppji tal-bażi waħda jew aktar fid-DNA. Mutaġeni li jġibu l-mutazzjoni tal-fażi tal-qari: sustanzi li jikkawżaw iż-żieda jew ittħassir ta' pari ta' bażi waħda jew multipli fil-molekula tad-DNA. Ħin ta' espressjoni fenotipika: perjodu li fih prodotti ta' ġene mhux mibdula jitneħħew mill-għadd ta' Ċelloli vijabbli. Frekwenza mutanti: l-għadd ta' Ċelloli mutanti osservati diviżi bl-għadd ta' Ċelloli vijabbli. Żvilupp totali relattiv: żieda fl-għadd taċ-Ċelloli tul iż-żmien komparata ma' popolazzjoni ta' Ċelloli ta' kontroll; kalkolat bħala l-prodott ta' l-iżvilupp tas-sospensjoni relattiv għaż-żminijiet ta' kontroll negattiv għall-effiċjenza tal-klonazzjoni relattiva għall-kontroll negattiv. Żvilupp tas-sospensjoni relattiv: żieda fl-għadd taċ-Ċelloli tul il-perjodu ta' espressjoni relattiv għall-kontroll negattiv. Vijabilità: l-effiċjenza tal-klonazzjoni taċ-ċelluli trattati fil-ħin ta' meta jitqiegħdu fuq bażi f'kundizzjonijiet selettivi wara l-perjodu ta' espressjoni. Sopravivenza: l-effiċjenza tal-klonazzjoni taċ-Ċelloli trattati meta jitqiegħdu fuq bażi wara li jintemm il-perjodu ta' trattament; ġeneralment is-sopravivenza hija espresso paragunata mas-sopravivenza tal-popolazzjoni taċ-Ċelloli ta' kontroll.

1.3. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Iċ-Ċelloli li għandhom nuqqas ta' thymidine kinase (TK) minħabba fil-mutazzjoni TK+/- > TK-/- huma reżistenti għall-effetti ċitotossiċi tal-pyrimidine analogue trifluorothymidine (TFT). Iċ-ċelluli profiċenti tat-Thymidine kinase huma sensittivi għat-TFT, li joħloq l-inibizzjoni tal-metaboliżmu ċellulari u jwaqqaf aktar diviżjoni fiċ-Ċelloli. B'hekk Ċelloli mutanti jistgħu jipproliferaw fil-presenza tat-TFT, waqt li Ċelloli normali, li jkun fihom it-thymidine kinase, ma jistgħux. Bl-istess mod, Ċelloli li għandhom nuqqas ta' HPRT jew XPRT jingħażlu skond ir-reżistenza għal 6-thioguanine (TG) jew 8-azaguanine (AG). Il-karatteristiċi tas-sustanza tat-test għandhom jiġu meqjusa sew jekk jiġi ttestjat analogu tal-bażi jew compost relatat ma' l-aġent selettiv f'xi wieħed mit-testijiet tal-mutazzjoni tal-ġene taċ-ċellula fil-mammiferi. Bħala eżempju, għandha tiġi investigata kull tossiċità selettiva suspettata bis-sustanza tat-test għal ċelluli mutanti u mhux mutanti. Għalhekk, il-prestazzjoni tas-sistema/aġent tas-selezzjoni għandha tiġi konfermata meta jiġu ttestjati kimiċi li huma strutturalment relatati ma' l-aġent selettiv (8). Iċ-Ċelloli f'sospensjoni jew kultura monostrata huma esposti għas-sustanza tat-test, kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha, gġal perjodu ta' żmien xieraq u subkulturati biex jippermettu l-espressjoni fenotipika qwabel is-selezzjoni mutanti (9) (10) (11) (12) (13). Normalment iċ-ċitossiċità tiġi stabbilita billi titkejjel l-effiċjenza ta' klonazzjoni relattiva (sopravivenza) jew l-iżvilupp totali relattiv tal-kulturi wara l-perjodu ta' trattament. Il-kulturi ttrattati jinżammu f'medjum ta' żvilupp għal perjodu ta' żmien suffiċjenti, karatteristiku ta' kull locus magħżul u tip ta' ċellula, biex jippermetti l-espressjoni fenotipika kważi ottimali tal-mutazzjonijiet magħmula. Il-frekwenza mutanti tiġi stabbilita bl-inseminazzjoni ta; għadd magħruf ta' Ċelloli f'medjum li jkun fih l-aġent selettiv biex jiġu żvelati Ċelloli mutanti u f'medjum mingħajr aġent selettiv biex tiġi żvelata l-effiċjenza tal-klonazzjoni (vijabilità). Wara perjodu xieraq ta' inkubazzjoni, jingħaddu l-kolonji. Il-frekwenza mutanti hi derivate mill-għadd ta' kolonji mutanti f'medjum selettiv u l-għadd ta' kolonji f'medjum mhux selettiv.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.4.

1.4.1. Preparazzjonijiet

1.4.1.

1.4.1.1. Ċelloli Hemm varjetà ta' Ċelloli disponibbli għall-użu għal dan it-test inklużi subkloni ta' Ċelloli ta' L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 jew TK6. It-tipi ta' Ċelloli użati f'dan it-test għandhom ikunu ddimostraw sensitività għal mutaġeni kimiċi, effiċjenza għolja ta' klonazzjoni u frekwenza mutanti spontanea stabbli. Iċ-Ċelloli għandhom jiġu kontrollati għal kontaminazzjoni mill-mikoplasma u m'għandhomx jintużaw jekk ikunu kontaminati. It-test għandu jkun iddisinjat biex ikollu sensitività u qawwa prederterminata. L-għadd ta' ċelluli, kulturi u konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test użati għandhom jirriflettu dawn il-parametri definiti (14). L-għadd minimu ta' Ċelloli vijabbli li jinqgħu ħajjin wara it-trattament u li jintużaw f'kull stadju tat-test għandu jkun msejjes fuq il-frekwenza tal-mutazzjoni spontanea. Gwida ġenerali hija li jintuża għadd ta' Ċelloli li hu għall-inqas 10 darbiet l-invers tal-frekwenza tal-mutazzjoni spontanea. Madankollu, huwa rakkomandat li jiġu utilizzati għall-inqas 106 Ċelloli. Informazzjoni storika xierqa dwar is-sistema taċ-ċellula użata għandha tkun disponibbli biex tindika l-prestazzjoni konsistenti tat-test.

1.4.1.2. Postijiet u kundizzjonijiet tal-kulturi Għandhom jintużaw postijiet tal-kulturi xierqa, u kundizzjonijiet ta' inkubazzjoni (kontenituri tal-kulturi, temperatura, konċentrazzjoni ta' CO2 u umdità). Il-postijiet għandhom jingħażlu skond is-sistemi selettivi u t-tip ta' ċellula użati f'dan it-test. Huwa partikolarment importanti li l-kundizzjonijiet tal-kulturi jingħażlu hekk li jiżguraw l-iżvilupp ottimali taċ-Ċelloli waqt il-perjodu ta' espressjoni u l-kapaċità tal-formazzjoni ta' kolonji ta' kemm iċ-ċelluli mutanti kif ukoll dawk mhux mutanti.

1.4.1.3. Preparazzjoni tal-kulturi Iċ-Ċelloli huma propagati minn ħażniet ta' kulturi, inseminati f'medjum ta' kultura u inkubati f'temperatura ta' 37 oC. Qabel ma jintużaw f'dan it-test, il-kulturi għandhom jitnaddfu minn Ċelloli mutanti pre-eżistenti.

1.4.1.4. Attivazzjoni metabolika Iċ-ċelluli għandhom jiġu esposti għas-sustanza tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika xierqa. Is-sistema l-aktar użata hija frazzjoni post mitokondrijali supplimentata b'kofattur (S9) preparata mill-fwied ta' annimali gerriema trattat b'aġenti li jġibu l-enżimi bħal ma huma l-Aroklor 1254 (15) (16) (17) (18) jew taħlita ta' phenobarbitone u β-naphthoflavone (19) (20). Normalment il-frazzjon post mitokondrijali tintuża f'konċentrazzjonijiet fil-medda minn 1-10 % v/v fil-medjum finali tat-test. L-għażla u l-kundizzjoni ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika tista’ tiddependi fuq il-klassi tal-kimika li tkun qed tiġi ttestjata. F'ċerti każijiet jista’ jkun xieraq li tiġi utilizzata iktar minn konċentrazzjoni waħda tal-frazzjon post mitokondrijali. Numru ta' żviluppi, inkluża l-kostruzzjoni ta' linji ta' Ċelloli ta' inġinerija ġenetika li jesprimu enżimi ta' attivazzjoni speċifika, jistgħu jipprovdu l-potenzal għall-attivazzjoni endoġenea. L-għażla tal-linji taċ-Ċelloli użati għandha tkun ġustifikata xjentifikament (eż. bir-rilevanza ta' l-isoenżim ċitokromu P450 għall-metaboliżmu tas-sustanza tat-test).

1.4.1.5. Preparazzjoni tas-sustanza tat-test Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewba jew sospiżi f'solventi jew mezzi xierqa u dilwiti jekk ikun xieraq qabel it-trattament taċ-Ċelloli. Sustanzi tat-test likwidi jistgġu jiżdiedu direttament mas-sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda tas-sustanza tat-test sakemm l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix l-aċċettabbilità tal-ħażna.

1.4.2. Kundizzjonijiet tat-test

1.4.2.

1.4.2.1. Solvent/mezz Ma għandux jkun hemm suspett ta' reazzjoni kimika tas-solvent/mezz mas-sustanza tat-test u s-solvent/mezz għandu jkun kompatibbli mas-sopravivenza taċ-Ċelloli u l-attività S9. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Huwa rakkomandat li kull fejn ikun possibbli l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akkwuż. Meta jiġu testjati sustanzi li mhumiex stabbli fl-ilma, is-solventi organiċi li jintużaw ma għandhux ikollhom ilma. L-ilma jista’ jitneħħa billi jiżdied passatur molekulari.

1.4.2.2. Konċentrazzjonijiet ta' espożizzjoni Fost il-kriterji li għandhom jitqiesu biex tiġi stabbilita l-ogħla konċentrazzjoni hemm iċ-ċitossiċità, is-solubbilità fis-sistema tat-test u bidliet fil-pH jew osmolalità. Iċ-ċitossiċita għandha tiġi stabbilita bl-attività metabolika jew mingħajrha fl-esperiment prinċipali bl-użu ta' indikazzjoni xierqa ta' integrità u żvilupp taċ-Ċelloli, bħal ma huma l-effiċjenza tal-klonazzjoni relattiva (sopravivenza) jew l-iżvilupp totali relattiv. Jista’ jkun utli li jiġu determinati ċ-ċitossiċità u s-solubbilità f'esperiment preliminari. Għandhom jintużaw għall-inqas erba' konċentrazzjonijiet analizzabbli. Fejn ikun hemm iċ-ċitossiċità, dawn il-konċentrazzjonijiet għandhom ikopru medda mill-massimu għal ftit jew l-ebda ċitossiċità. Dan normalment ifisser li l-livelli ta' ċitossiċità għandhom jiġu separati b'mhux iżjed minn fattur bejn 2 u √10. Jekk il-konċentrazzjoni massima hi msejsa fuq iċ-ċitossiċità allura għandha tirriżulta f'madwar 10-20 % (iżda mhux inqas minn 10 %) sopravivenza relattiva (effiċjenza ta' klonazzjoni relattiva) jew żvilupp totali relattiv. Għal sustanzi relattivament mhux tossiċi, il-konċentrazzjoni massima tat-test għandha tkun 5 mg/ml, 5 μl/ml, jew 1,01 M, liema minnhom ikun l-anqas. Sustanzi relattivament mhux solubbli għandhom jiġu ttestjati sa jew lil hinn mil-limitu tagħhom ta' solubilità taħt kundizzjonijiet ta' kulturi. Il-prova tas-solubbilità għandha tiġi stabbilita fil-medjum tat-trattament finali li għalih huma esposti ċ-Ċelloli. Jista’ jkun utli li tiġi valutata s-solubilità fil-bidu u fl-aħħar tat-trattament, għax is-solubilità tista’ tinbidel waqt il-kors ta' l-espożizzjoni fis-sistema tat-test minħabba fil-preżenza ta' Ċelloli, S9, serum eċċ. L-insolublità tista’ tiġi żvelata mingħajr għajnuna lill-għajn. Il-preċipitat m'għandux jostakola l-għadd.

1.4.2.3. Kontrolli Għandhom jiġu inklużi f'kull esperiment kontrolli posittivi u negattivi fl-istess ħin (solvent jew mezz), kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. Meta tintuża l-attivazzjoni metabolika, il-kimika ta' kontroll posittiva għandha tkun dik li-teħtieġ li l-attivazzjoni tagħti rispons mutaġeniku. Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll posittiv jinkludu: Kondizzjoni ta' attivazzjoni metabolika Post Sustanza Nru CAS Nru EINECS Assenza ta' attivazzjoni metabolika essoġenea HPRT Metansulfonat ta' l-etil 62-50-0 200-536-7 Ethyl nitrosourea 759-73-9 212-072-2 TK (kolonji żgħar u kbar) Methyl methanesulphonate 66-27-3 200-625-0 XPRT Etil methanesulphonate 62-50-0 200-536-7 Nitrosourea ta' l-etil 759-73-9 212-072-2 Preżenza ta' attivazzjoni metabolika essoġenea HPRT 3-Methylcholanthrene 56-49-5 200-276-4 N-Nitrosodimethylamine 62-75-9 200-549-8 7,12-Dimethylbenzanthracen e 57-97-6 200-359-5 TK (kolonji żgħar u kbar) Cyclophosphamide 50-18-0 200-015-4 Cyclophosphamide monohydrate 6055-19-2 Benżo(a)pirena 50-32-8 200-028-5 3-Metilkolantrena 56-49-5 200-276-5 XPRT N-Nitrosodimethylamine (għal livelli għoljin ta' S-9) 62-75-9 200-549-8 Benżo(a)pirena 50-32-8 200-028-5 Jistgħu jintużaw sustanzi ta' referenza ta' kontroll posittiv oħra xierqa, eż. jekk laboratorju jkollu bażi ta' informazzjoni storika fuq 5-bromo 2'-deoxyuridine (Nru CAS 59-14-3, Nru EINECS 200-415-9), tista’ tintuża ukoll din is-sustanza ta' referenza. Meta jkunu disponibbli, għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll posittiv relatat ma' klassi ta' kimika. Għandhom jiġu inklużi kontrolli negattivi, li jikkonsistu biss f'solvent jew mezz fil-medjum ta' trattament, u trattati bl-istess mod bħall-gruppi ta' trattament. B'żieda ma' dan għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm l-informazzjoni storika ta' kontroll turi li ma jkunx hemm effetti dannużi jew mutaġeniċi kkaużati mis-solvent magħżul.

1.4.3. Proċedura

1.4.3.

1.4.3.1. Trattament bis-sustanza tat-test Iċ-Ċelloli li jipproliferaw għandhom jiġu esposti għas-sustanza tat-test kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. L-espożizzjoni għandha tkun għal perjodu xieraq ta' żmien (normalment 3-6 sigħat hu effettiv). Il-ħin ta' l-espożizzjoni jista’ jittawwal fuq ċiklu ta' Ċelloli wieħed jew aktar. Jistgħu jintużaw kulturi ttrattati duplikati jew singoli ma' kull konċentrazzjoni ttestjata. Meta jintużaw kulturi singoli, l-għadd ta' konċentrazzjonijiet għandu jiżdied biex jiġi żgurat li jkun hemm numru adegwat ta' kulturi għall-analiżi (eż. għall-inqas tmien konċentrazzjonijiet analizzabbli). Għandhom jintużaw kulturi ta' kontroll negattivi duplikati (solvent). Sustanzi gassużi jew volatili għandhom jiġu ttestjati b'metodi xierqa, bħal ma huma f'kontenituri magħluqa ta' kulturi (21) (22).

1.4.3.2. Tkejjil ta' sopravivanza, vijabbilità u frekwenza tal-mutazzjonijiet Fl-aħħar tal-perjodu ta' espożizzjoni, iċ-ċelluli jinħaslu u jitqiegħdu f'kulturi biex tiġi determinata s-sopravivenza u biex jippermettu l-espressjoni tal-fenotip mutanti. It-tkejjil taċ-ċitossiċità billi tiġi determinata l-effiċjenza tal-klonazzjoni relattiva (sopravivenza) jew l-iżvilupp totali relattiv tal-kulturi normalment jinbeda wara l-perjodu ta' trattament. Kull locus għandu ħtieġa ta' żmien minimu definit biex jippermetti l-espressjoni fenotipika kważi ottimali tal-mutanti ġodda li jkunu nħolqu (HPRT u XPRT jeħtieġu għall-inqas 6-8 ijiem, u TK għall-inqas jumejn). Iċ-Ċelloli jitkabbru f'medjum b'aġent(i) selettiv(i) jew mingħajru(hom) għad-determinazzjoni ta' l-għadd ta' mutanti u l-effiċjenza tal-klonazzjoni, rispettivament. It-tkejjil tal-vijabilità (li jintuża biex tiġi kalkolata l-frekenza tal-mutazzjonijiet) jinbeda fl-aħħar tal-perjodu ta' espressjoni billi jitqiegħdu fuq bażi fil-medjum mhux selettiv. Jekk is-sustanza tat-test tkun posittiva fit-test tal-L5178Y TK+/-, il-qies tal-kolonji għandu jiġi rilevat fuq għall-inqas waħda mill-kulturi tat-test (l-ogħla konċentrazzjoni posittiva) u fuq il-kontrolli negattivi u posittivi. Jekk is-sustanza tat-test hi negattiva fit-test L5178Y TK+/-, il-qies tal-kolonji għandu jiġi rilevat fuq il-kontrolli negattivi u posittivi. Fi studji li jużaw il-TK6TK+/-, għandu jitwettaq ukoll il-qies tal-kolonji.

2. DATA

2.

2.1. TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI L-informazzjoni għandha tinkludi d-determinazzjoni taċ-ċitossiċità u l-vijabilità, l-għadd ta' kolonji, u l-frekwenzi ta' mutazzjonijiet għall-kulturi ta' trattament u ta' kontroll. Fil-każ ta' rispons posittiv fit-test tal-L5178Y TK+/-, il-kolonji jingħaddu billi jintuża l-kriterju ta' kolonji żgħar u kbar f'għall-inqas konċentrazzjoni waħda tas-sustanza tat-test (l-ogħla konċentrazzjoni posittiva) u fuq il-kontroll negattiv u posittiv. In-natura molekulari u ċitoġenetika ta' kolonji ta' mutazzjonijiet kemm kbar kif ukoll żgħar ġiet esplorata fid-dettall (23) (24). Fit-test tat-TK+/-, il-kolonji jingħaddu billi jintuża l-kriterju ta' tkabbir normali (kbar) u tkabbir bil-mod (żgħar) ta' kolonji. (25). Iċ-Ċelloli ta' mutazzjoni li jkunu sofrew l-aktar ħsara ġenetika estensiva għandhom żminijiet ta' duplikazzjoni aktar prolongati u għalhekk jiffurmaw kolonji żgħar. Din il-ħsara tipikament tinfirex fl-iskala mit-telf tal-ġene intier għal devjazzjonijiet viżibbli karjotipikament tal-kromożomi. Il-presenza ta' kolonji żgħar mutanti ġiet assoċjata ma' kimiċi li jipproduċu alterazzjonijiet kbar fil-kromożomi (26). Ċelloli mutanti li jkunu ġew affettwati anqas serjament jikbru b'rati simili għal dawk ta' Ċelloli parentali u jifformaw kolonji kbar. Għandu jingħata l-ammont ta' sopravivenza (effiċjenzi ta' klonazzjoni relattivi) jew l-iżvilupp totali relattiv. Il-frekwenza tal-mutazzjoni għandha tiġi espressa bħala n-numru ta' ċelluli mutanti paragunat man-numru ta' Ċelloli li jibqgħu ħajjin. Għandha tingħata l-informazzjoni dwar il-kulturi differenti. B'żieda ma' dan, għandu jingħata sommarju ta' l-informazzjoni kollha fil-forma ta' tabella. Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' rispons posittiv ċar. Ir-riżultati dubbjużi għandhom jiġu ċċarati bżaktar testijiet preferibbilment billi jkun hemm modifika fil-kundizzjonijiet ta' l-esperiment. Riżultati negattivi għandhom jiġu konfermati fuq bażi ta' każ b'każ. F'dawk ilkażijiet fejn il-konferma ta' riżultati negattivi mhijiex kkunsidrata bħala meħtieġa, għandha tingħata ġustifikazzjoni. Għandha tiġi kkunsidrata l-modifika tal-parametri ta' studju biex tkabbar il-medda tal-kundizzjonijiet valutati f'esperimenti li jsiru wara minħabba f'riżultati dubbjużi jew negattivi. Parametri ta' studju li jistgħu jiġu modifikati jinkludu l-intervall bejn id-dożi valutati u l-kundizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika.

2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit risultat posittiv, bħal żieda relatata mal-konċentrazzjoni jew żieda riproduċibbli fil-frekwenza ta' mutazzjonijiet. L-ewwel għandha titqies ir-rilevanza bijoloġika tar-risultati. Jistgħu jintużaw metodi ta' statistika bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-risultati tat-test. Is-sinjifikanza statistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal rispons posittiv. Sustanza ta' test li dwarha ir-risultati ma jilħqux l-kriterji fuq imsemmija hija meqjusa bħala mhux mutaġenika f'din is-sistema. Għalkemm il-biċċa l-kbira ta' l-istudji jagħtu risultati ċari posittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni mogħtija ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività tas-sustanza tat-test. Ir-risultati jistgħu jibqgħu dubbjużi jew mhux ċari minkejja n-numru ta' drabi li jiġi ripetut l-esperiment. Risultati posittivi mit-test tal-mutazzjoni tal-ġene taċ-ċellula tal-mammiferi in vitro jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq mutazzjonijiet tal-ġene fiċ-Ċelloli ta' kulturi ta' mammiferi użati. Rispons popsittiv dwar il-konċentrazzjoni li huwa riproduċibbli huwa ta' valur kbir. Risultati negattivi jindikaw li, taħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx mutazzjonijiet tal-ġene fiċ-Ċelloli ta' kulturi ta' mammiferi użati.

3. RAPPORTAĠĠ

3.

3.1. RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja:

Solvent/mezz:

ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz;

solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.

Ċelloli:

tip u għejun taċ-Ċelloli;

numru ta' kulturi taċ-Ċelloli;

numru ta' passaġġi, jekk ikun applikabbli;

metodi għall-manutenzjoni tal-kulturi taċ-Ċelloli, jekk jkun applikabbli;

assenza tal-mikoplasma.

Kundizzjonijiet tat-test:

raġuni prinċipali għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet u għadd ta' kulturi inklużi, eż. informazzjoni dwar ċitotossiċità u limitazzjonijiet dwar solubbilità, jekk ikunu disponibbli;

komposizzjoni tal-medja, konċentrazzjoni CO2;

konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test;

volum tal-mezz u sustanza tat-test miżjuda;

temperatura ta' l-inkubazzjoni;

perjodu ta' inkubazzjoni;

kemm idum it-trattament;

densità taċ-ċellula waqt it-trattament;

tip u komposizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika, inklużi krierji ta' aċċettabilità;

kontrolli pożittivi u negattivi;

tul tal-perjodu ta' espressjoni (inkluż in-numru ta' ċelluli fiż-żriegħ, u skedi ta' subkulturi u alimentazzjoni, jekk ikun xieraq);

aġenti selettivi;

kriterji biex it-testijiet jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi;

metodi użati biex jingħadd in-numru ta' Ċelloli viabbli u mutanti;

definizzjoni ta' kolonji li dwarhom jitqiesu l-qies u t-tip (inklużi kriterji għal kolonji żgħar u kbar, kif xieraq).

Riżultati:

sinjali ta' tossiċità;

sinjali ta' preċipitazzjoni;

informazzjoni dwar pH u l-osmolalità waqt l-espożizzjoni għas-sustanza tat-test, jekk ikun stabbilit;

qies tal-kolonja jekk reġistrat għall-inqas għall-kontrolli negattivi u posittivi;

adegwatezza tal-laboratorju biex jiġu żvelati mutazzjonijiet f'kolonji żgħar bis sistema L5178Y TK+/-, fejn ikun xieraq;

relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli;

analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;

informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv (solvent/mezz) u pożittiv;

informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard;

frekwenza ta' mutazzjonijiet.

Diskussjoni dwar ir-riżultati.

Kunklużjonijiet.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)

REFERENZI Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindal, K.R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E.H.Y. and Malling H.V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306-1312. Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, pp. 467-485. Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394-403. Aaron, C.S., and Stankowski, Jr. L.F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res. 223, pp. 121-128. Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, pp. 235-239. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, pp. 147-204. Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251. Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17-36. Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135-141. Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9-17. Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133-147. Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for the L5178Y/TK+/- -TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268. Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, pp. 66-101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome- Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, pp. 365-373. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, pp. 347-364. Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/- – Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res. 59, pp. 61-108. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173-215. Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801. Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51-55. Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C., Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluoronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK+/- – Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161-174. Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res. 229, pp. 89-102. Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- – 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, pp. 609-614.

B.18. DANNI URIMEDJITAD-DNA -SINTESI MHUX FL-ISKEDATAD-DNA-ĊELLULI MAMMIFERI IN VITRO

B.18.

1. METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.2. TIFSIRA Ara l-Introduzzjonii Ġenerali Parti B.

1.3. SUSTANZI GĦAR-REFERENZA Xejn.

1.4. IL-PRINĊIPJU TAL-METODU GĦAT-TEST It-test tas-Sintesi tad-DNA li mhux fl-iskeda (UDS) ikejjel is-sintesi tar-rimedju tad-DNA wara l-qtugħ u t-tneħħija ta’ ġibda ta’ DNA li jkun fiha r-reġjun ta’ dannu kkaġunat minn aġenti kimiċi u fiżiċi. It-test huwa bbażat fuq l-inkorporazzjoni ta’ tritju mmarkat thymidine 3H-TdR) fid-DNA ta’ Ċelloli mammiferi li m’humhiex fil-fażi S taċ-ċiklu taċ-ċellula. It-teħid ta’ 3H-TdR jista’ jkun determinat bl-awtoradjografija jew bix-xintillar likwidu bl-għadd (LSC) tad-DNA miċ-Ċelloli trattati. Ċelluli mammiferi fil-koltura, jekk ma jintużawx hepatocytes primarji tal-ġrieden huma trattati bl-aġent tat-test bis-sistema u migħajr is-sistema esoġena għall-attivazzjoni metabolika. UDS jista’ jitkejjel ukoll f’sistemi in vivo.

1.5. KRITERJI TAL-KWALITÀ Xejn.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU GĦAT-TEST

1.6. Preparazzjonijiet

Il-kimiċi tat-test u s-sustanzi għall-kontoll u għar-referenzi għandhom ikunu ppreparati f’mezz tat-tkabbir jew maħlula jew sospiżi f’vetturi xierqa u mbagħad dilwit f’mezz għat-tkabbir għall-użu fl-analiżi. Il-konċentrazzjoni finali tal-vettura m’għandhiex taffettwa l-vijabilità taċ-Ċelloli. Kulturi primarji ta’ hepatocytes tal-ġrieden, limfoċite tal-bnedmin u razez taċ-Ċelloli stabbiliti (eż. fibroblast tad-diplojde tal-bnedmin) jistgħu jintużaw fl-analiżi. Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti għall-kimika tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema għall-attivazzjoni metabolika xierqa.

Kundizzjonijiet tat-test

Numru ta’ kulturi

Għall-inqas żewġ kulturi ta’ Ċelloli għall-awtoradjografija u sitt kulturi (jew inqas jekk iġġustifikat b’mod xjentifiku) għad-determinazzjonijiet LSC UDS huma meħtieġa għal kull punt sperimentali.

L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi

Għandhom ikunu inklużi fl-esperiment kontrolli pożittivi u negattivi (mhux trattati u/jew vettura) fl-istess ħin bl-attivazzjoni metabolika u mingħajr l-attivazzjoni metabolika. Eżempji ta’ kontrolli pożittivi għall-analiżi tal-hepatocytes tal-ġrieden jinkludu 7,12-dimetilbenżatraċene (7,12-DMBA) jew 2-aċetilamminofluworin (2-AAF). Fil-każ ta’ razez ta’ Ċelloli stabbiliti 4-nitrokwinolina-N-ossidu (4-NQO) huwa eżempju ta’ kontroll pożittiv kemm għall-analiżi awtoradjografika kif ukoll l-analiżi LSC mingħajr attivazzjoni metabolika; N-dimetilnitosammina huwa eżempju ta’ kontroll pożittiv kompost meta jintużaw sistemi għall-attivazzjoi metabolika.

Konċentrazzjonijiet ta’ l-espożizzjoni

Għandhom jintużaw numru ta’ konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test fuq medda adegwata biex tkun definita r-risposta. L-ogħla konċentrazzjoni għandha jkollha xi effetti ċitotossiċi. Komposti li relattivament ma jinħallux fl-ilma għandhom ikunu ttestjati sal-limiti ta’ l-insolubilità tagħhom. Għal kimiċi li jinħallu faċilment fl-ilma u li m’humhiex tossiċi, l-ogħla konċentrazzjoni tal-kimika tat-test għandha tkun determinata skond il-każ.

Ċelloli

Mezzi għat-tkabbir xierqa, il-konċentrazzjoni CO2, it-temperatura u l-umdità għandhom ikunu użati fil-manteniment tal-kulturi. Razez taċ-Ċelloli stabbiliti għandhom ikunu kkontrollati b’mod perjodiku għal kontaminazzjoni tal-Mycoplasma.

L-attivazzjoni Metabolika

Mal-kulturi primarji hepatocyte ma tintużax sistema għall-attivazzjoni metabolika. Razez taċ-Ċelloli stabbiliti u l-limfoċiti huma esposti għas-sustanza tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema xierqa għall-attivazzjoni metabolika.

Proċedura

Preparazzjoni tal-kulturi

Razez taċ-Ċelloli stabbiliti huma ġġenerati minn kulturi ta’ l-istokk (eż. bit-tripsinizzazzjoni jew bit-tneħħija), miżrugħin f’vetturi għall-kultura f’densità xierqa, u inkubati f’37 oC. Kulturi għal żmien qasir ta’ hepatocytes tal-ġrieden huma stabbiliti billi l-hepatocytes dissoċjati reċentement jitħallew f’mezz xieraq biex jeħlu mal-wiċċ li jkun qed jikber. Kulturi tal-limfoċite tal-bnedmin jitwaqqfu bl-użu ta’ tekniċi xierqa.

Trattament tal-kulturi bis-sustanza tat-test Hepatocytes primarji tal-ġrieden

Hepatocytes tal-ġrieden iżolati reċentement huma trattati bis-sustanza tat-test f’mezz li fih 3H-TdR għal tul ta’ żmien xieraq. Fl-aħħar tal-perjodu tat-trattament, il-mezz għandu jitneħħa minn maċ-Ċelloli, li mbagħad għandhom ikunu mlaħalħin, imwaħħlin u mnixxfin. L-islajds għandhom ikunu mgħaddsa f’emulsjoni awtoradjografika (jista’ jintuża film alternattiv li jqaxxar), esposti, żviluppati, mlewwnin u mgħadda.

Razez taċ-Ċelloli stabbiliti u limfoċiti

Tekniċi awtoradjografiċi: Il-kulturi taċ-Ċelloli huma esposti għas-sustanza tat-test għal-tul ta’ żmien xieraq u wara jkunu trattati b’ 3H-TdR. Il-ħiniiet għandhom ikunu gvernati min-natura tas-sustanza, l-attività ta’ sistemi metaboliċi u t-tip ta’ Ċelloli. Biex tkun skoperta l-quċċata ta’ UDS, 3H-TdR għandu jkun miżjud jew fl-istess ħin mas-sustanza tat-test jew wara ftit minuti wara l-espożizzjoni għas-sustanza tat-test. L-għażla bejn dawn iż-żewġ proċeduri għandha tkun influwenzata mill-interazzjonijiet possibbli bejn is-sustanza tat-test u 3H-TdR. Sabiex issir differenza bejn UDS u replika ta’ DNA semi-konservattiva, din ta’ l-aħħar tista’ tkun inibita, per eżempju, bl-użu ta’ mezz nieqes mill-arginina, kontenut baxx ta’ serum jew bl-idrossiurea fil-mezz tal-kultura. Kejl LSC tal-UDS: Qabel it-trattament bis-sustanza tat-test, id-dħul taċ-Ċelloli fil fażi S għandu jkun imwaqqaf kif deskritt hawn fuq; iċ-Ċelloli mbagħad għandhom ikunu esposti għall-kimika tat-test kif deskritt għall-awtoradjografija. Fl-aħħar tal-perjodu ta’ l-inkubazzjoni, id-DNA għandu jinħareġ miċ-Ċelloli u l-kontenut totali ta’ DNA, u l-miżura ta’ inkorporazzjoni ta’ 3H-TdR għandhom ikunu determinati. Għandu jkun innotat li, fejn jintużaw il-limfoċiti tal-bnedmin fit-tekniċI msemmija hawn fuq, it-trażżin tar-replika tad-DNA semi-konservattiva m’huwiex meħtieġ f’kulturi li m’humhiex stimolati.

Analiżi

Determinazzjonijiet awtoradjografiċi

Fid-determinazzjoni ta’ UDS fiċ-Ċelloli fil-kultura, in-nuklei fil-fażi S ma jingħaddux. Għall-inqas 50 ċellula għal kull konċentrazzjoni għandha tingħad. L-islajds għandhom jingħataw kodiċI qabel ma jingħaddu. Għandhom jingħaddu bosta oqsma kif jinzertaw separati sew fuq kull slajd. L-ammont ta’ 3H-TdR inkorporat fiċ-ċitoplasma għandu jkun determinat billi jingħaddu tlett partijiet b’daqs ta’ nukleu fiċ-ċitoplasma ta’ kull ċellula li tingħadd.

Determinazzjonijiet LSC

Għandu jintuża numru adegwat ta’ kulturi f’kull konċentrazzjoni u fil-kontrolli fid-determinazzjonijiet LSC UDS. Ir-riżultati kollha għandhom ikunu kkonfermati f’esperiment indipendenti.

2. ID-DATA Id-data għandha tkun ippreżentata f’forma ta’ tabelli.

2.

2.1. DETERMINAZZJONIJIET AWTORADJOGRAFIĊI L-ammont ta’ 3H-TdR inkorporat fiċ-ċitoplasma u n-numru ta’ frak li jinstabu fuq in-nukleu taċ-ċellula għandhom ikunu miktubin separati. Il-medja, il-medjan u l-mode jistgħu jintużaw biex jiddeskrivu d-distribuzzjoni tal-miżura ta’ 3H-TdR inkorporat fiċ-ċitoplasma u n-numru ta’ frak għal kull nukleu.

2.2. DETERMINAZZJONIJIET LSC Għal determinazzjonijiet LSC, l-inkorporazzjoni ta’ 3H-TdR għandha tkun irrapportata bħala dpm/μg DNA. Il-medja dpm/μg DNA b’devjazzjoni standard tista’ tintuża biex tiddeskrivi d-distribuzzjoni ta’ l-inkorporazzjoni. Id-data għandha tkun evalwata bl-użu ta’ metodi statistiċi xierqa.

3. IR-RAPPURTAĠĠ

3.

3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni li ġejja:

iċ-Ċelloli użati, id-densità u n-numru tal-passaġġ waqt it-trattament, in-numru ta’ kulturi ta’ Ċelloli;

il-metodi użati biex jinżammu l-kulturi taċ-Ċelloli inklużi l-mezzi, it-temperatura u l-konċentrazzjoni ta’ CO2;

is-sustanza tat-test, il-vettura, il-konċentrazzjonijiet u r-raġuni għas-selezzjoni tal- konċentrazzjonijiet użati fl-analiżi;

id-dettalji tas-sistemi għall-attivazzjoni metabolika;

l-iskeda għat-trattament;

kontrolli pożittivi u negattivi;

teknika awtoradjografika użata;

proċeduri użati biex jitwaqqaf id-dħul ta’ Ċelloli fil-fażi S;

proċeduri użati għall-ħruġ ta’ DNA u d-determinazzjoni tal-kontenut totali ta’ DNA fid-determinazzjoni LSC;

ir-relazzjoni bejn id-doża u r-risposta, fejn possibbli;

il-valutazzjoni statistika;

id-diskussjoni tar-riżultati;

l-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

4. REFERENZI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B

B.19. ANALIŻI IN VITRO TA’ L-ISKAMBJU TA’ KROMATID OĦT

B.19.

1. METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.2. TIFSIRA Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.3. SUSTANZI GĦAR-REFERENZA Xejn.

1.4. IL-PRINĊIPJU TAL-METODU GĦAT-TEST L-analiżi ta’ l-Iskambju ta’ Kromatid Oħt (SCE) huwa test fuq żmien qasir għall-iskoperta ta’ skambji reċiproki ta’ NA bejn żewġ kromatidi aħwa ta’ kromosoma li tirdoppja. L-SCE’s jirrappreżentaw l-interkambju ta’ prodotti tar-replika tad-DNA f’postijiet li jidhru li huma omologi. Il-proċess ta’ l-iskambju preżumibbilment jinvolvi l-ksur u tgħaqqid mill-ġdid tad-DNA, għalkemm ftit huwa magħruf dwar il-bażi molekulari tiegħu. L-iskoperta ta’ SCE’s teħtieġ xi mod ta’ tikkettjar differenti tal-kromatidi aħwa u dan jista’ jinkiseb bl-inkorporazzjoni ta’ bromodeossiuridina (BrdU) fid-DNA kromosomali għal żewġ ċikli taċ-Ċelloli. Ċelloli mammiferi in vitro huma esposti għall-kimika tat-test b’s-sitema għall-attivazzjoni metabolika esoġena mammifera kif ukoll mingħajrha, jekk xieraq, u kkulturati għal żewġ dawriet ta’ repliki f’mezz li fih il-BrdU. Wara t-trattament b’inibitur tal-magħżel (eż. il-kolkiċina) biex ikunu akkumulati ċ-Ċelloli fi stat ta’ mitosi simili għall-metafasi (c-metafasi), iċ-Ċelloli huma maħsuda u jsiru l-preparazzjonijiet tal-kromosomi.

1.5. KRITERJI GĦALL-KWALITÀ Xejn.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6.

1.6.1. Preparazzjonijiet

Fl-analiżi jistgħu jintużaw kulturi primarji, (limfoċiti tal-bnedmin) jew razez taċ Ċelloli stabbiliti (eż. Ċelloli ovarji tal-ħamsters ċiniżi). Ir-razez taċ-Ċelloli għandhom ikunu kkontrollati għall-kontaminazzjoni tal-Mycoplasma.

Għandhom jintużaw mezzi tal-kultura u kundizzjonijiet ta’ l-inkubazzjoni xierqa (eż. temperatura, reċipjenti għall-kultura, CO2, konċentrazzjoni u umdità),

Sustanzi tat-test jistgħu ikunu ppreparati fil-mezzi għall-kultura jew maħlula jew sospiżi f’vetturi xierqa qabel it-trattament taċ-Ċelloli. Il-konċentrazzjoni finali ta’ vettura fis-sistema tal-kultura m’għandhiex taffettwa b’mod sinifikattiv il-vijabilità jew ir-rata ta’ tkabbir taċ-Ċelloli u l-effetti fuq il-frekwenza SCE għandhom ikunu kontrollati b’solvent ta’ kontroll,

Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti għas-sustanza tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema għall-attivazzjoni metabolika mammifera esoġena. B’mod alternattiv, meta jintużaw ċelluli b’attività metabolika intrinsika, ir-rata u n-natura ta’ l-attività għandhom ikunu xierqa għall-klassi tal-kimika li tkun qed tiġi ttestjata.

1.6.2. Kundizzjonijiet għat-test

1.6.2.

1.6.2.1. Numru ta’ kulturi Għandhom jintużaw għall-inqas kulturi doppji għal kull punt sperimentali.

1.6.2.2. L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi Kontrolli pożittivi, li jużaw kemm kompost attiv dirett kif ukoll kompost li jeħtieġ attivazzjoni metabolika, għandhom ikunu inklużi f’kull esperiment; kontroll tal-vettura għandu jintuża ukoll. Dawn li ġejjin huma eżempji ta’ sustanzi li jistgħu jintużaw bħala kontrolli posittivi: Meta xieraq, kontroll pożittiv addizzjonali ta’ l-istess klassi kimika bħall-kimika fit-test jista’ jkun inkluż.

komposti attivi diretti:

etilmetansulfonat,

komposti attivi indiretti:

ċiklofosfamida.

1.6.2.3. Konċentrazzjonijiet ta’ l-espożizzjoni Għandhom jintużaw għall-inqas tlett konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test mqassma b’mod adegwat. L-ogħla konċentrazzjoni għandha toħloq effett tossiku sinifikanti iżda xorta għandha tippermetti r-replika adegwata taċ-Ċelloli. Sustanzi li relattivament ma jinħallux fl-ilma għandhom ikunu ttestjati sal-limitu tas-solubilità bl-użu ta’ proċeduri xierqa. Għal sustanzi li m’humhiex tossiċi u li jinħallu faċilment fl-ilma, l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza għattest għandha tkun determinata skond il-każ.

1.6.3. Proċedura

1.6.3.

1.6.3.1. Preparazzjoni tal-kulturi Ir-razez taċ-Ċelloli stabbiliti huma ġenerati minn kulturi ta’ l-istokk (eż. bit-tripsinizzazzjoni jew bit-tneħħija), miżrugħin f’reċipjenti tal-kultura f’densità xierqa u inkubati f’37 oC. Għal kulturi b’saff wieħed, in-numru ta’ ċelluli għal kull reċipjent tal-kultura għandu jkun aġġustat sabiex il-kulturi ma jkunux ħafna iktar minn 50 % konfluwenti fiż-żmien tal-ħsad. Alternattivament, iċ-ċelluli jistgħu jintużaw f’kultra ta’ sospensjoni. Il-kulturi tal-limfoċita tal-bnedmin huma mwaqqfa minn demm eparinizzat, bl-użu ta’ tekniċi xierqa, u inkubati f’37 oC.

1.6.3.2. It-trattament Iċ-Ċelloli li qegħdin fl-istadju ta’ tkabbir esponenzali huma esposti għas-sustanza tat-test għal perjodi ta’ ħin adegwat; fil-biċċa l-kbira tal-każijiet siegħa jew sagħtejn jistgħu ikunu effettivi, iżda l-ħin tat-trattament jista’ jkun estiż sa żewġ ċikli taċ-Ċelloli f’ċerti każijiet. Ċelluli li m’għandhomx attività metabolika intrinsika suffiċjenti għandhom ikunu esposti għall-kimika tat-test fil-preżenza u fl-assenza ta’ sistema għall-attivazzjoni metabolika xierqa. Fl-aħħar tal-perjodu għall-espożizzjoni, iċ-Ċelloli jinħaslu mis-sustanza tat-test u jiġu kulturati għal żewġ dawriet ta’ replika fil-preżenza ta’ BrdU għall-ħin sħiħ tal-kultura ta’ żewġ ċikli ta’ Ċelloli. Kulturi tal-limfoċita tal-bnedmin huma trattati waqt li jkunu f’kundizzjoni semisinkronika. Iċ-Ċelloli huma analizzati fit-tieni diviżjoni tagħhom wara t-trattament, bl-assigurazzjoni li l-istadji taċ-ċikli taċ-Ċelloli li huma l-iktar sensittivi kienu esposti għall-kimika. Il-kulturi kollha li huma miżjuda bil-BrdU għandhom ikunu ttrattati fid-dlam jew f’dawl baxx minn lampi inkandexxenti sal-ħsad taċ-Ċelloli sabiex titnaqqas sal-minimu il-fotolisi ta’ DNA li fiha l-BrdU.

1.6.3.3. Il-ħsad taċ-Ċelloli Il-kulturi taċ-Ċelloli huma trattati b’inibitur tal-magħżel (eż. l-kolkiċina) bejn siegħa u erba’ siegħat qabel il-ħsad. Kull kultura hija maħsuda u proċessata b’mod separat għall-preparazzjoni tal-kromosomi.

1.6.3.4. Il-preparazzjoni u t-tilwin tal-kromosomi Il-preparazzjonijiet tal-kromosomi isiru permezz ta’ tekniċi ċitoġenetiċi standard. It-tilwin ta’ l-islajds biex juru l-SCEs jista’ jsir b’bosta tekniċi, (eż. il-metodu tal-fluworexxenza flimkien ma’ Giemsa).

1.6.3.5. L-Analiżi In-numru ta’ Ċelloli analizzati għandu jkun ibbażat fuq il-frekwenza tal-kontroll spontanju ta’ SCE. Is-soltu, għall-inqas 25 metafasi mqassmin sew għal kull kultura huma analizzati għal SCEs. L-islajds jingħataw kodiċi qabel l-analiżi. Fil-limfoċiti tal-bnedmin huma analizzati biss dawk il-metafasijiet li fihom 46 centromeres. F’razez ta’ Ċelloli stabbiliti huma analizzati biss il-metafasijiet li fihom ±2 ċentromeri tan-numru modali. Għandu jkun indikat jekk it-tibdil ċentromeriku tat-tikketta huwa mmarkat bħala SCE. Ir-riżultati għandhom ikunu konfermati f’esperiment indipendenti.

2. ID-DATA Id-data għandha tkun ippreżentata f’forma ta’ tabelli. In-numru ta’ SCEs għal kull metafasi u n-numru ta’ SCE’s għal kull kromosoma għal kull metafasi għandhom jitniżżlu b’mod separat għall-kulturi kollha trattati u kontrollati. Id-data għandha tkun evalwata bl-użu ta’ metodi staitistiċi xierqa.

3. IR-RAPPURTAĠĠ

3.

3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni il ġejja:

Iċ-Ċelloli użati, il-metodi użati biex jinżammu l-kulturi taċ-Ċelloli;

Il-kundizzjonijiet tat-test: il-komposizzjoni tal-mezzi, il-konċentrazzjoni ta’ CO2 il- konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test, il-vettura użata, it-temperatura ta’ l-inkubazzjoni, il-ħin tat-trattament, l-inibitur tal-magħżel użat, il-konċentrazzjoni tiegħu u t-tul tat-trattament bih, it-tip ta’ sistema għall-attivazzjoni mammifera użata, kontrolli pożittivi u negattivi;

In-numru ta’ kulturi ta’ Ċelloli għal kull punt sperimentali;

id-dettalji tat-teknika użata għall-preparazzjoni ta’ l-islajds;

in-numru ta’ metafasijiet analizzati (id-data għandha tingħata separata għal kull kultura);

il-medja tan-numru ta’ SCE għal kull ċellula u għal kull kromosoma (id-data għandha tingħata separata għal kull kultura);

il-kriterji biex jingħad SCE;

ir-raġuni għall-għażla tad-doża;

ir-relazzjoni bejn id-doża u r-risposta, jekk tapplika;

il-valutazzjoni statistika;

id-diskussjoni tar-riżultati;

l-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

4. REFERENZI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B

B.20. TEST REĊESSIV LI JIKKAĠUNA L-MEWT U LI HUWA SKOND IS-SESS F’DROSOPHILA MELANOGASTER

B.20.

1. METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.2. TIFSIRA Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.3. SUSTANZI GĦAR-REFERENZA Xejn.

1.4. IL-PRINĊIPJU TAL-METODU GĦAT-TEST It-test reċessiv li jikkaġuna l-mewt u li huwa skond is-sess (SLRL) li juża d- Drosophila melanogaster josserva t-tibdil li jsir, kemm tibdil tal-punt kif ukoll tħassir żgħir, fir-razza tal-mikrobu ta’ l-insett. Dan it-test huwa analiżi tat-tibdil ‘il-quddiem u huwa kapaċi isib tibdil f’madwar 800 post fuq il-kromosoma-X; Dawn jirrappreżentaw madwar 80 % tal-postijiet tal-kromosoma-X. Il-kromosoma-X tirrappreżenta madwar wieħed minn ħamsa tal-ġenomu ta’ l-aplojde kollu. Tibdiliet fil-kromosoma-X tad-Drosophila melanogaster huma fenotipikament espressi fl-irġiel li jġorru l-ġene mutanti. Meta t-tibdil jikkaġuna l-mewt fil-kundizzjoni emizigota, il-preżenza tiegħu hija deduċibbli mill-assenza ta’ waħda mill-klassijiet ta’ frieħ tas-sess maskili miż-żewġ klassijiet li s-soltu jkunu prodotti minn mara eterożigota. It-test SLRL jieħu vantaġġ minn dawn il-fatti permezz ta’ kromosomi mmarkati u rranġati b’mod speċjail.

1.5. KRITERJI GĦALL-KWALITÀ Xejn.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6. Preparazzjonijiet

Stokk

Annimali tas-sess maskili ta’ stokk tat-tip salvaġġ definit sew u annimali tas-sess femminili ta’ l-istokk Muller-5 jistgħu jintużaw. Stokk femminili ieħor immarkat b’mod xieraq b’kromosomi multipli maqlubin jistgħu jintużaw ukoll.

Sustanza tat-test

Is-sustanzi tat-test għandhom ikunu maħlulin fl-ilma. Sustanzi li ma jinħallux fl-ilma jistgħu ikunu maħlula jew sospiżi f’vetturi xierqa (eż. taħlita ta’ etanol u Tween-60 jew 80), u mbagħad jinħallu fl-ilma jew fl-ilma bil-melħ qabel ma jkunu amministrati. Id-Dimetilsulfossidu (DMSO) għandu jkun evitat bħala vettura.

In-numru ta’ annimali

It-test għandu jkun iddiżinjat b’sensitività u saħħa predeterminata. Il-frekwenza ta’ tibdil spontanju osservata fil-kontroll xieraq jinfluwenza b’mod qawwi in-numru ta’ kromosomi trattati li għandhom ikunu analizzati.

Ir-rotta ta’ l-amministrazzjoni

L-espożizzjoni tistà tkun orali, b’injezzjoni, jew bl-espożizzjoni għal gassijiet jew fwar. Meta s-sustanza tat-test tittiekel dan jista’ jsir f’soluzzjoni taz-zokkor.

L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi

Kontrolli negattivi (tal-vettura) u pożittivi għandhom ikunu inklużi. Madankollu, jekk tkun disponibbli data xierqa tal-laboratorju dwar kontroll storiku, m’humhiex meħtieġa kontrolli fl-istess ħin.

Livelli ta’ espożizzjoni

Għandhom jintużaw tlett livelli ta’ espożizzjoni. Għal stima preliminary jista’ jintuża livell wieħed ta’ espożizzjoni tas-sustanza tat-test, b’dak il-livell ta’ espożizzjoni li jkun jew il-konċentrazzjoni massima tollerata jew dak li jipproduċi xi indikazzjoni ta’ tossiċità. Għal sustanzi li m’humhiex tossiċi għandha tintuża espożizzjoni għall-ogħla konċentrazzjoni prattikabbli.

Proċedura

L-annimali tas-sess maskili tat-tip salvaġġ (li jkollhom bejn tlieta u ħamest ijiem) huma trattati bis-sustanza u mgħammrin individwalment ma’ eċċess ta’ annimali femminili verġni mill-istokk Muller-5 jew minn stokk ieħor immarkat b’mod xieraq (b’kromosomi X multipli maqlubin). L-annimali femminili ikunu mibdula b’verġni ġodda kull jumejn jew tlett ijiem biex ikun kopert iċ-ċiklu kollu taċ-ċellula tal-mikrobu. Il-frieħ ta’ dawn l-annimali femminili jiġu eżaminati għal effetti li jikkaġunaw il-mewt li jikkorrispondu ma’ l-effetti fuq l-isperma matura, l-ispermatidi fi stadju medju jew tard, l-ispermatidi fi stadju kmieni, spermatoċiti u spermatogonji waqt it-trattament. Annimali tas-sess femminili eterozigoti F7 mill-qasmiet msemmija hawn fuq jitħallew jgħammru individwalment (jiġifieri, femminili waħda f’kull kunjett) ma’ l-aħwa tagħhom. Fil-ġenerazzjoni F7, kull kultura tiġi eżaminata għall-assenza ta’ maskili tat-tip salvaġġ. Jekk ikun hemm kultura li tidher li telgħet minn femminili F1 li kienet qed iġġorr letali fil-kromosoma X parentali (jiġifieri ma jkunux osservati maskili bil-kromosoma trattata) il-frieħ femminili ta’ dak l-annimal femminili li għandhom l-istess ġenotip għandhom ikunu ttestjati biex ikun assigurat jekk dik il-possibilità li tikkaġuna l-mewt hijhiex ripetuta fil-ġenerazzjoni ta’ wara.

2. ID-DATA Id-data għandha tkun fil-forma ta’ tabelli li juru n-numru ta’ kromosomi-X ittestjati, in-numru ta’ annimali maskili li m’humhiex fertili u n-numru ta’ kromosomi li jikkaġunaw il-mewt f’kull konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni u għal kull perjodu ta’ tgħammir għal kull maskil trattat. Għandhom ikunu rrappurtati numri ta’ ġemgħat ta’ daqsijiet differenti għal kull maskil. Dawn ir-riżultati għandhom ikunu kkonfermati f’esperiment separat. Għandhom ikunu użati metodi statistiċi xierqa fil-valutazzjoni ta’ testijiet reċessivi li jikkaġunaw il-mewt u li huma skond is-sess. It-tgħaqqid ta’ letali reċessivi li joriġinaw minn maskil wieħed għandhom jitqiesu u jkunu evalwati b’mod statistiku xieraq.

3. IR-RAPPURTAĠĠ

3.

3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni il ġejja:

Stokk: l-istokk jew ir-razez ta’ Drosophilia użati, iż-żmien ta’ l-insetti, in-numru ta’ annimali maskili trattati, in-numru ta’ annimali maskili sterili, in-numru ta’ kulturi F2 stabbiliti, in-numru ta’ kulturi F2 mingħajr prodotti, in-numru ta’ kromosomi li jġorru letali f’kull stadju taċ-ċellula tal-mikrobu;

Il-kriterji biex ikun stabbilit id-daqs tal-gruppi trattati;

Il-kundizzjonijiet tat-test: deskrizzjoni dettaljata ta’ l-iskeda tat-trattament u tat-teħid tal-kampjuni, il-livelli ta’ l-espożizzjoni, data dwar it-tossiċità, kontrolli negattivi (tas-solvent) u pożittivi, jekk xierqa;

Il-kriterji biex jingħadd it-tibdil letali;

ir-relazzjoni bejn l-espożizzjoni u l-effett fejn possibbli;

valutazzjoni tad-data;

id-diskussjoni tar-riżultati;

l-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

4. REFERENZI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B

B.21 TEST TAT-TIBDILTAL-ĠENI F’ĊELLULIMAMMIFERI IN VITRO

B.21

1. METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.2. TIFSIRA Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA Xejn.

1.4. IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST Sistemi tal-kultura taċ-Ċelloli mammiferi jistgħu jintużaw għall-iskoperta ta’ tibdil ikkaġunat minn sustanzi kimiċi. Linji taċ-Ċelloli li jintużaw ħafna jinkludu L5178Y ċelluli tal-limfoma tal-ġrieden u l-linji CHO u V-79 taċ-Ċelloli ta’ ħamsters iniżi. F’dawn il-linji taċ-ċelluli is-sistemi li jintużaw l-iktar jikkalkulaw it-tibdil f’thymidine kinase (TK), hypoxanthine guanine phosphorybosyl transferase (HPRT) [21] u NA/K ATPase loci. Is-sistemi ta’ tibdil TK u HPRT isibu t-tibdil ta’ bażi ta’ pari, tibdil frameshift u tħassir żgħir; is-sistema NA/K issib biss it-tibdil ta’ bażi ta’ pari. Ċelloli nieqsin minn thymidine kinase (TK), minħabba t-tibdil ‘l-quddiem TK – T K, huma reżistenti għall-bromodeossiuridina (BrdU), il-fluworodeossiuridina (FdU)jew it-trifluworotimidina (TFT) billi dawn l-antimetaboliti m’humiex inkorporati f’nukleotidi taċ-Ċelloli permezz tas-sistema ta’ l-enzimi tas-‘salvataġġ‘ thymidine kinase; in-nukleotidi meħtieġa għall-metaboliżmu taċ-ċelluli jinkisbu biss minn sintesi de novo. Madankollu, fil-presenza ta’ thymidine kinase BrdU, FdU jew TFT huma inkorporati fin-nukleotidi, bir-riżultat ta’ l-inibizzjoni tal-metaboliżmu taċ-Ċelloli u ċ-ċitotossiċità. B’hekk iċ-Ċelloli mutanti jistgħu jipproliferaw fil-preżenza ta’ BrdU, FdU jew TFT filwaqt li ċ-Ċelloli normali, li fihom it-thymidine kinase, ma jistgħux. B’mod simili, iċ-Ċelloli nieqsin mill-HPRT jintgħażlu skond ir-reżistenza għal 8-ażagwanina (AG) jew 6-tiogwanina (TG). elluli b’ NA/K ATPase alterati jintgħażlu skond ir-reżistenza għall-ouabain. Iċ-ċitotossiċità hija determinata billi jitkejjel l-effett tal-materjal tat-test fuq il-kapaċitajiet għall-formazzjoni tal-kolonji (l-effiċjenza ta’ l-ikklonjar) jew ir-rati tat-tkabbir tal-kulturi. Il-frekwenza tal-mutanti hija determinata billi jinżergħu numri magħrufa ta’ Ċelloli f’mezz li fih l-aġent selettiv għall-iskoperta ta’ Ċelloli mutanti, u f’mezz mingħajr l-aġent selettiv biex ikunu determinati ċ-Ċelloli sopraviventi. Wara perjodu ta’ l-inkubazzjoni xieraq, il-kolonji jingħaddu. Il-frekwenzi tal-mutanti huma mkejjla min-numru ta’ kolonji ta’ mutanti kkoreġuti għas-sopravivenza taċ-Ċelloli.

1.5. KRITERJI GĦALL-KWALITÀ Xejn

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6. Preparazzjonijiet

Ċelloli

Hemm varjetà ta’ linji ta’ Ċelloli disponibbli għall-użu f’din l-analiżi. Dawn jinkludu subkloni ta’ L5178Y, Ċelloli CHO jew Ċelloli V-79 b’sensitività murija għall-mutaġeni kimiċi, effiċjenza għolja ta’ l-ikklonjar u frekwenza baxxa ta’ tibdil spontanju. Iċ-Ċelloli jistgħu ikunu kkontrollati b’mod perjodiku għall-istabilità tal-karjotip u għandhom ikunu kkontrollati għall-kontaminazzjoni tal-Mycoplasma. Jistgħu jintużaw tipi oħra ta’ Ċelloli jekk il-validità tagħhom bħala analiżi tat-tibdil tal-ġeni kkaġunat mill-kimiċi tista’ tkun kompletament dokumentata.

Mezz

Mezzi ta’ kultura u kundizzjonijiet ta’ l-inkubazzjoni xierqa (eż. temperatura, vettura għall-kultura, konċentrazzjonijiet ta’ CO2 u umdità) għandhom jintużaw. Mezzi u sera għandhom jintgħażlu skond is-sistemi selettivi u t-tipi ta’ Ċelloli użati fl-analiżi.

Sustanza tat-test

Sustanzi tat-test jistgħu ikunu ppreparati f’mezzi għall-kultura jew maħlula jew sospiżi f’vetturi xierqa qabel it-trattament taċ-Ċelloli. Il-konċentrazzjoni finali tal-vettura fis-sistema tal-kultura m’għandhiex taffettwa il-vijabilità tar-rata tat-tkabbir.

L-attivazzjoni metabolika

Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti għas-sustanza tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema ta’ l-attivazzjoni tal-metaboliżmu mammiferu esoġenu xierqa. B’mod alternattiv, meta jintużaw tipi ta’ Ċelloli b’attività metabolika intrinsika ir-rata u n-natura ta’ l-attività għandhom ikunu magħrufa li huma xierqa għall-klassi kimika li qed tkun ittestjata.

Kundizzjonijiet tat-test

L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi

Kontrolli pożittivi, li jużaw kemm kompost attiv dirett kif ukoll kompost li jeħtieġ attivazzjoni metabolika, għandhom ikunu inklużi f’kull esperiment; kontroll negattiv (tal-vettura) għandu jintuża ukoll. Dawn li ġejjin huma eżempji ta’ sustanzi li jistgħu jintużaw bħala kontrolli posittivi: Meta xieraq, kontroll pożittiv addizzjonali ta’ l-istess klassi kimika bħall-klassi kimika fit-test jista’ jkun inkluż.

komposti attivi diretti:

etilmetansulfonat;

hycanthone;

komposti attivi indiretti:

2-aċetilamminofluworin;

7,12-dimetilbenżantraċene;

N-nitrosodimetilammina.

Konċentrazzjonijiet ta’ l-espożizzjoni

Għandhom jintużaw bosta konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test. Dawn il-konċentrazzjonijiet għandhom joħolqu effett tossiku skond il-konċentrazzjoni, bl-ogħla konċentrazzjoni li toħloq livell baxx ta’ sopravivenza u bis-sopravivenza fil-konċentrazzjoni l-iktar baxxa li tkun kważi l-istess daqs dik fil-kontroll negattiv. Sustanzi li relattivament ma jinħallux fl-ilma għandhom ikunu ttestjati sal-limitu tas-solubilità bl-użu ta’ proċeduri xierqa. Għal sustanzi li m’humhiex tossiċi u li jinħallu faċilment fl-ilma, l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza għat-test għandha tkun determinata skond il-każ.

Proċedura

In-numru ta’ ċelluli użati għal kull kultura għandu jkun skond il-frekwenza ta’ tibdil spontanju; gwida ġenerali hija l-użu ta’ numru ta’ ċelluli vijabbli li huwa għaxar darbiet l-invers tal-frekwenza tat-tibdil spontanju. Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti għal perjodu ta’ ħin xieraq, fil-biċċa l-kbira tal-każijiet bejn sagħtejn u ħames siegħat huwa effettiv. Ċelluli mingħajr attività metabolika intrinsika suffiċjenti għandhom ikunu esposti għas-sustanza tat-test fil-preżenza u fl-assenza ta’ sistema ta’ attivazzjoni metabolika xierqa. Fl-aħħar tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni, iċ-Ċelloli jinħaslu u jinħelsu mis-sustanza tat-test u jiġu kkultivati biex tkun determinata l-vijabilità u biex tkun tistà sseħħ l-espressjoni tal-fenotip tal-mutant. Fl-aħħar tal-perjodu ta’ l-espressjoni, li għandu jkun biżżejjed biex jippermetti espressjoni fenotipika kważi ottima, iċ-Ċelloli jitkabbru fil-mezz b’aġenti selettivi kif ukoll mingħajr aġenti selettivi għad-determinazzjoni tan-numri ta’ mutanti u l-vijabilità. Ir-riżultati kollha jiġu ikkonfermati f’esperiment indipendenti.

2. ID-DATA Id-data għandha tkun ippreżentata fil-forma ta’ tabelli. Għandhom ikunu ppreżentati għadd u kontrolli individwali tal-platti għas-sustanza tat-test kemm għall-ikkaġunar tat-tibdil kif ukoll għas-sopravivenza. In-numru medju ta’ kolonji għal kull platt u d-devjazzjoni standard għandhom jingħataw ukoll. Il-frekwenza tat-tibdil għandha tkun espressa bħala n-numru ta’ mutanti skond in-numru ta’ Ċelloli sopraviventi. L-effiċjenzi tas-sopravivenza u ta’ l-ikklonjar huma espressi bħala perċentwali tal-livell tal-kontroll. Id-data għandha tkun evalwata bl-użu ta’ metodi xierqa ta’ l-istatistika.

3. IR-RAPPURTAĠĠ

3.

3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST Ir-rapport tat-test għandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni li ġejja:

ir-razza użata, in-numru ta’ kulturi ta’ Ċelloli, il-metodi biex jinżammu l-kulturi taċ-Ċelloli;

il-kundizzjonijiet tat-test: il-komposizzjoni tal-mezzi, il-konċentrazzjoni ta’ CO2, il- konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test, il-vettura użata, it-temperatura ta’ l-inkubazzjoni, it-tul ta’ l-inkubazzjoni, it-tul tal-perjodu għall-espressjoni (inkluż in-numru ta’ Ċelloli miżrugħin u subkulturi u skedi ta’ l-ikel, jekk xierqa), it-tul tat-trattament, id-densità taċ-ċelluli waqt it-trattament is-sistema għall-attivazzjoni metabolika, il-kundizzjonijiet tat-trattament: il-konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni, il-proċedura u t-tul tat-trattament, it-tip ta’ sistema għall-attivazzjoni metabolika mammifera użata, kontrolli pożittivi u negattivi, l-aġent selettiv użat; ir-raġuni għall-għażla tad-doża;

il-metodu użat biex ikunu enumerati n-numri ta’ Ċelloli vijabbli u mutanti;

valutazzjoni statistika;

id-diskussjoni tar-riżultati;

l-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

4. REFERENZI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B

B.22.

1. METODU

1.

1.1. INTRODUZZJONI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.

1.2. TIFSIRA Ara l-Introduzzjonii Ġenerali Parti B.

1.3. SUSTANZI GĦAR-REFERENZA Xejn.

1.4. IL-PRINĊIPJU TAL-METODU GĦAT-TEST Effetti letali dominanti jikkawżaw il-mewt embrijonika jew tal-fetu. L-induzzjoni ta’ letali dominanti bl-espożizzjoni għal sustanza kimika tindika li s-sustanza affetwat it-tessut ġerminali ta’ l-ispeċi tat-test. Huwa aċċettat b’mod ġenerali li l-letali dominanti huma dovuti għad-dannu kromosomali (anomaliji strutturali u numeriċi). Il-mewt embrijonika jekk ikunu trattati l-annimali femminili tista’ tkun ukoll riżultat ta’ l-effetti tossiċi. Ġeneralment, l-annimali tas-sess maskil huma esposti għall-kompost tat-test u mgħammra ma’ annimali tas-sess femminili li huma verġni u li m’humhiex trattati. Id-diversi stadji taċ-ċellula tal-mikrobu jistgħu ikunu ttestjati b’mod separat bl-użu ta’ intervalli sekwenzali fit-tgħammir. Iż-żieda fl-impjanti mejtin f’kull waħda tas-sess femminil fil-grupp trattat diviż bin-numru ta’ impjanti mejtin f’kull waħda tas-sess femminil fil-grupp tal-kontroll turi t-telfa ta’ wara l-impjantazzjoni. It-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni tista’ tkun stimata fuq il-bażi ta’ l-għadd corpora lutea jew billi jitqabblu l-impjanti totali f’kull waħda tas-sess femminili fil-gruppi trattati u tal-kontroll. L-effett letali dominanti totali huwa t-total tat-telf ta’ qabel u ta’ wara l-impjantazzjoni. Il-kalkolu ta’ l-effett letali dominanti totali huwa bbażat fuq it-tqabbil ta’ impjanti ħajjin f’kull waħda mis-sess femminili fil-grupp tat-test ma’ l-impjanti ħajjin f’kull waħda mis-sess femminili fil-grupp tal-kontroll. Tnaqqis fin-numru ta’ impjanti f’ċerti intervalli jista’ jkun ir-riżultat tal-qtil ta’ Ċelloli (jiġifieri spermatoċiti u/jew spermatogonji).

1.5. KRITERJI TAL-KWALITÀ Xejn

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU GĦAT-TEST

1.6. Preparazzjonijiet

Meta possibbli, is-sustanzi tat-test għandhom ikunu maħlula jew sospiżi f’soluzzjoni mielħa isotonika. Kimiċi li ma’ jinħallux fl-ilma jistgħu ikunu maħlula jew sospiżi f’vetturi xierqa. Il-vettura użata m’għandhiex tfixkel il-kimika tat-test u lanqas m’ghandha tipproduċi effetti tossiċi. Preparazzjonijiet ġodda tal-kimika tat-test għandhom ikunu użati.

Kundizzjonijiet tat-test

Rotta ta’ l-amministrazzjoni

Ġeneralment il-kompost tat-test għandu jkun amministrat darba biss. Tista’ tkun użata skeda ta’ trattament ripetuta bbażata fuq informazzjoni tossikoloġika. Ir-rotot normali għall-amministrazzjoni huma l-intubazzjoni orali jew l-injezzjoni fil-peritonew. Rotot oħrajn għall-amministrazzjoni jistgħu ikunu xierqa.

Annimali sperimentali

Ġrieden u firien huma rrakkommandati bħala speċi tat-test. Annimali kompletament maturi fis-sens sesswali u b’saħħithom huma magħżulin bl-addoċċ u assenjati f’gruppi għat-trattament u gruppi tal-kontroll.

In-numru u s-sess

Għandu jintuża numru adegwat mis-sess maskili li huma trattati, u għandu jittieħed qies tal-varjazzjoni spontanja tal-karattru bijoloġiku li jkun qiegħed jiġi evalwat. In-numru magħżul għandu jkun ibbażat fuq is-sensitività pre-determinata ta’ l-osservazzjoni u l-qawwa tas-sinifikazzjoni. Per eżempju f’test tipiku, in-numru ta’ annimali tas-sess maskili f’kull grupp ta’ doża għandu jkun biżżejjed biex jipprovdu bejn 30 u 50 annimali nisa tqal f’kull intervall ta’ tgħammir

L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi

Ġeneralment għandhom ikunu inklużi f’kull esperiment kontrolli pożittivi u negattivi (vettura). Meta jkunu disponibbli riżultati ta’ kontrolli pożittivi minn esperimenti li saru reċentement fl-istess laboratorju dawn ir-riżultati jistgħu jintużaw minflok kontroll pożittiv fl-istess ħin. Sustanzi ta’ kontroll pożittiv għandhom jintużaw f’doża baxxa xierqa (eż. MMS, fil-peritonew, f’10 mg/kilogramma) biex tkun murija s-sensitività tat-test.

Livell tad-doża

Normalment, għandhom jintużaw tliet livelli ta’ doża. Id-doża l-għolja għandha tipproduċi sinjali ta’ tossiċità jew fertilità mnaqqsa f’annimali trattati. F’ċerti każijiet doża waħda ta’ livell għoli tistà tkun suffiċjenti.

Test tal-limitu

Sustanzi li m’humhiex tossiċi għandhom ikunu ttestjati b’5 g/kilogramma b’amministrazzjoni waħda jew b’1 g/kilogramma/jum b’amministrazzjoni ripetuta.

Proċedura

Bosta skedi ta’ trattament huma disponibbli. L-iktar użata hija l-amministrazzjoni waħda tas-sustanza tat-test. Jistgħu jintużaw skedi oħrajn tat-trattament. Annimali individwali tas-sess maskil huma mgħammrin sekwenzalment ma’ waħda jew żewġ annimali tas-sess femminili li huma verġni u li m’humhiex trattati, f’intervalli xierqa wara t-trattament. Annimali femminili għandhom jitħallew ma’ dawk maskili għall-inqas għat-tul ta’ ciklu estrus wieħed jew sakemm iseħħ it-tgħammir kif determinat bil-preżenza ta’ l-isperma fil-vaġina jew bil-preżenza ta’ tapp vaġinali. In-numru ta’ tgħammir wara t-trattament huwa ggvernat bl-iskeda tat-trattament u għandu jassigura li jkun hemm kampjun ta’ l-istadji kollha taċ-Ċelloli tal-mikrobu wara t-trattament. L-annimali femminili huma sagrifikati fit-tieni parti tat-tqala u l-kontenut ta’ l-utru huwa eżaminat biex ikun determinat in-numru ta’ impjanti mejtin u ħajjin. L-ovarji jistgħu ikunu eżaminati biex ikun determinat in-numru ta’ corpora lutea.

2. ID-DATA Id-data għandha tkun f’forma ta’ tabelli biex turi n-numru ta’ annimali maskili, in-numru ta’ femminili tqal, u n-numru ta’ annimali femminili li m’humhiex tqal. Ir-riżultati ta’ kull tgħammir, inkluża l-identità ta’ kull animal maskil u feminili. Għandhom ikunu rrappurtati b’mod individwali. Għal kull animal femminili, il-ġimgħa tat-tgħammir, il-livell tad-doża li ngħatat lill-annimal maskil, il-frekwenza ta’ impjanti ħajjin u ta’ impjanti mejtin għanhom ikunu imniżżla. Il-kalkolu ta’ l-effett letali dominanti totali huwa bbażat fuq it-tqabbil ta’ l-impjanti ħajjin għal kull annimal femminili fil-grupp tat-test ma’ l-impjanti ħajjin għal kull animal femminili fil-grupp ta’ kontroll. Il-proporzjon ta’ l-impjanti mejtin għal dawk ħajjin mill-grupp tat-trattament mqabbel ma’ l-istess proporzjon mill-grupp tal-kontroll huwa analizzat biex juri t-telf ta’ wara l-impjantazzjoni. Jekk id-data tkun imniżżla bħala mewt kmieni jew tard, it-tabelli għandhom jagħmluha ċara. Jekk it-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni ikun stimat, għandu jkun irrappurtat. It-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni jista’ jkun ikkalkulat bħala diskrepanza bejn in-numru ta’ corpora lutea u n-numru ta’ impjanti jew bħala tnaqqis in-numru medju ta’ impjanti għal kull uteru meta mqabbel ma’ tgħammir ta’ kontroll. Id-data għandha tkun evalwata bl-użu ta’ metodi statistiċi xierqa.

l-ispeċi, ir-razza, iż-żmien u l-piż ta’ l-annimali użati, in-numru ta’ annimali ta’ kull sess fil-gruppi ta’ sperimentazzjoni u kontroll;

is-sustanza tat-test, il-vettura, il-livelli tad-doża ttestjati u r-raġuni għall-għażla tad-doża, kontrolli pożittivi u negattivi, data dwar it-tossiċità;

ir-rotta u l-iskeda tat-trattament;

l-iskeda tat-tgħammir;

il-metodu użat biex ikun determinat li sar it-tgħammir;

3222 more provisions are not shown here; each has its own address.

Versions

2008-05-30