Verordening (EG) nr. 440/2008 van de Commissie van 30 mei 2008 houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH) (Voor de EER relevante tekst)

In forceVersion 2008-05-30from 2008-06-01

Grade B

mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.

Ask Gelex about this law

Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/nl

Contents

Preamble
1. Artikel 1
2. Artikel 2
3. Artikel 3
4. Artikel 4
ANNEX
BIJLAGE DEEL A: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE FYSISCH-CHEMISCHE EIGENSCHAPPEN
A.1.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.4.
1.5. TABEL: TOEPASBAARHEID VAN DE METHODEN A. B. C. D.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
1.6.1.2. Apparatuur
1.6.2.
1.6.4.
4.(1)(2)(3)(4)
A.2.
1.
1.4.
1.5. Tabel 1 Vergelijking van de methoden
1.6.
1.6.4.
1.6.6.
2. Tabel 2: Temperatuurcorrectiefactoren fT
A.3.
1.
1.4.
1.4.1.
3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Toepasbaarheid van de methoden
3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2. Toepasbaarheid van de methoden a)
3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Toepasbaarheid van de methoden a)
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
A.4.
1.
1.4.
1.5. Tabel 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Kwaliteitscriteria
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.4.
1.6.4.2.
1.6.5.
1.6.6.
1.6.6.1. Inert gas:
1.6.6.2. Bereiding van de verzadigingskolom:
a)
b)
1.6.7.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
A.5.
1.
1.6.
1.6.4.
1.6.4.1.
1.6.4.1.3. Figuur Meetlichaam
1.6.4.2.
1.6.4.2.2. Opstellen:
a)
b)
2. Tabel Correctie van de gemeten oppervlaktespanning Uitsluitend voor waterige oplossingen, p ≈ 1 g/cm3
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.6.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Testprocedure:
1.6.3.3. Apparatuur
1.6.3.4. Apparatuur (zie figuren 3 en 4)
1.6.4.
2.
3.
A.8.
1.
1.3. Schudflesmethode
1.4.
1.5.
1.5.1. Schudflesmethode
1.5.2. Schudflesmethode
1.5.3. Schudflesmethode
1.6.
1.6.2.
1.6.2.1.
1.6.2.3.
1.6.3.
1.6.3.1. Apparatuur
1.6.3.2. Berekening van de dode tijd t0
2. Schudflesmethode
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
A.9.
1.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Apparatuur van Abel:
A.10.
1.
1.6.
1.6.2.
3.
A.11.
1.
1.6.
A.12.
1.
1.3.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
A.13.
1.
1.6.
1.6.2. a)
2.
A.14.
1.
1.1. a)
1.4.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2. a)
1.6.3.
1.6.3.2. a)
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.15.
1.
1.6.
A.16.
1.
1.6.
1.6.1.
4.
Figuur 1 Patroon van de testkubus met ribben van 20 mm
Figuur 2 Karakteristieke temperatuur/tijd-curve
A.17.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
3.
3.2. a)
A.18.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.19.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.20.
1.
1.5.
1.5.4.
2.
3.
3.1.
A.21.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.2.
2.
2.1. Tabel 1 Voorbeelden van resultaten
3.
3.2. a)
4.(1)
Figuur 1 Drukvat
Figuur 2 Statief
Figuur 3 Ontstekingssysteem
1.
2.
4.
1.2. Voor vaste stoffen
Aanhangsel 1 Schattingsmethode
INLEIDING
SCHATTINGSMETHODE
BEREKENINGSPROCEDURE
RAPPORT
LITERATUUR
Aanhangsel 2
Figuur 1 Apparaat voor bepaling van de dampspanningskromme volgens de dynamische methode
Figuur 2a Apparaat voor bepaling van de dampspanningskromme volgens de statische methode (gebruikmakend van de U-buis manometer)
Figuur 2b Apparaat voor bepaling van de dampspanningskromme volgens de statische methode (gebruikmakend van een drukaanwijzing)
Figuur 3 Isoteniscoop (referentie 7)
Figuur 4 Apparatuur voor bepaling van de dampspanningskromme met behulp van de dampspanningsbalansmethode
Figuur 5 Voorbeeld van een apparaat voor verdamping bij lage druk met behulp van de uitstroommethode, met een uitstroomcelvolume van 8 cm3
Figuur 6a Voorbeeld van een gasstroomsysteem voor bepaling van de dampspanning volgens de gasverzadigingsmethode
Figuur 6b Een voorbeeld van een systeem voor de bepaling van de dampspanning met de gasverzadigingsmethode, met een capillair geplaatst achter de verzadigingskamer
Figuur 7 Voorbeeld van experimentele opstelling voor de draaiende-rotormethode
Figuur 8 Voorbeeld van een draaiende-rotormeetkop
Figuur 1 Kolom-elutie-methode met recirculatiepomp
Figuur 2 Een voorbeeld van een microkolom
Figuur 3 Een voorbeeld van een microkolom
Figuur 4 Kolom-elutie-methode met voorraadfles
BEREKENINGSMETHODEN Principe van de berekeningsmethoden
Hansch π-methode
Rekker-Methode
Hansch-Leo-methode
Gecombineerde methode
i)
ii)
iii)
iv)
Figuur Mal en toebehoren om een rups van de te onderzoeken stof te vormen
Figuur Apparatuur
Voorbeeld van materiaalspecificatie voor thermische-gevoeligheidstest (zie DIN 1623) (1)(2)(3)
Figuur 5 Wrijvingsgevoeligheidstest
Figuur Mal en toebehoren voor de bereiding van de rups
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
DEEL B METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE TOXICITEIT EN ANDERE INVLOEDEN OP DE GEZONDHEID
ALGEMENE INLEIDING A.
i)
ii)
B.l bis.
1.
1.4.
1.5.
1.5.3.
1.6.
3.
4(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
B.l ter.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
B.2.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1. a)
B.3.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. Bepaling van de toxiciteit bij het andere geslacht
3.
B.4.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
Tabel I Vorming van erytheem en korsten Vorming van oedeem INSCHALING VAN DE HUIDREACTIES
B.5.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.2.3.
1.4.2.7.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
Tabel I INSCHALING VAN HET OOGLETSEL
Cornea
Iris
Conjunctivae
Chemosis
B.6.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.2.
1.5.1.3.
1.5.2.
1.5.2.2.
1.5.2.3.
3. Verslag van de proefnemingen (GPMT en Buehlertest)
B.7.
1.
1.4.
1.4.2.
1.4.3.
3. VERSLAG VAN HET ONDERZOEK
B.8.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1.
pt_2 a)
B.9.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
B.10.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. TESTVERSLAG
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
B.11.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
B.12.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
1.5.2. a)
2.
3. TESTVERSLAG
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
B.13/14.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
2.
3. TESTVERSLAG
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
B.
1.
1.6. V oorbereidingen
Metabole activering
Proefstammen
Media
Gebruik van negatieve en positieve controles
Blootstellingsconcentraties
Incubatieomstandigheden
Spontane mutatiefrequënties
Aantal replica's
3.
Spontane mitotische recombinatiefrequentie
B.17.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. TESTVERSLAG
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
B.18.
1.
1.6. Voorbereidingen
Aantal culturen
Gebruik van negatieve en positieve controles
Blootstellingsconcentratie
Cellen
Metabole activering
Bereiding van culturen
Behandeling van de culturen met de teststof Primaire rattenhepatocyten
Autoradiografische analyse
LSC-analyse
2.
3.
B.19.
1.
1.6.
1.6.2. Aantal culturen
1.6.3. Bereiding van culturen
3.
B.20.
1.
1.6. Voorbereidingen
Stamculturen
Teststof
Aantal dieren
Toedeningsweg
Gebruik van negatieve en positieve controles
Blootstellingsniveau
3.
B.21.
1.
1.6. Voorbereidingen
Cellen
Medium
Teststof
Metabole activering
Gebruik van positieve en negatieve controles
Blootstellingsconcentraties
3.
B.22.
1.
1.6. Voorbereidingen
Toedieningsweg
Proefdieren
Aantal en geslacht
Negatieve en positieve controles
Dosisniveaus
Hoogste te testen dosis

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH), tot oprichting van een Europees Agentschap voor chemische stoffen, houdende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en houdende intrekking van Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verordening (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG en 2000/21/EG van de Commissie, en met name op artikel 13, lid 3,

Overwegende hetgeen volgt:

(1) Krachtens Verordening (EG) nr. 1907/2006 dienen op communautair niveau testmethoden te worden vastgesteld voor de beproeving van stoffen indien een dergelijke beproeving vereist is om informatie over de intrinsieke eigenschappen van die stoffen te verkrijgen.

(2) In bijlage V van Richtlijn 67/548/EEG van de Raad van 27 juni 1967 betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen zijn methoden vastgesteld voor de bepaling van de fysisch-chemische eigenschappen, de toxiciteit en de ecotoxiciteit van stoffen en preparaten. Bijlage V van Richtlijn 67/548/EEG is bij Richtlijn 2006/121/EG van het Europees Parlement en de Raad met ingang van 1 juni 2008 geschrapt.

(3) De in bijlage V van Richtlijn 67/548/EEG vervatte testmethoden dienen in deze verordening te worden geïntegreerd.

(4) Deze verordening sluit het gebruik van andere testmethoden niet uit, op voorwaarde dat het gebruik daarvan in overeenstemming is met artikel 13, lid 3, van Verordening (EG) nr. 1907/2006.

(5) Bij de opzet van de testmethoden dient terdege rekening te worden gehouden met de beginselen van vervanging, vermindering en verfijning van het gebruik van dieren in procedures, met name wanneer passende gevalideerde methoden ter vervanging, vermindering of verfijning van dierproeven beschikbaar worden.

(6) De bepalingen van deze verordening zijn in overeenstemming met het advies van het bij artikel 133 van Verordening (EG) nr. 1907/2006 ingestelde comité,

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:

Artikel 1

De in het kader van Verordening (EG) nr. 1907/2006 toe te passen testmethoden zijn opgenomen in de bijlage van deze verordening.

Artikel 2

De Commissie herbeziet indien nodig de in deze verordening vervatte testmethoden met het oog op de vervanging, de vermindering of de verfijning van proeven op gewervelde dieren.

Artikel 3

Alle verwijzingen naar bijlage V van Richtlijn 67/548/EEG worden gelezen als verwijzingen naar deze verordening.

Artikel 4

Deze verordening treedt in werking op de dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Unie.

Zij is van toepassing met ingang van 1 juni 2008. Gedaan te Brussel, 30 mei 2008. Voor de Commissie Stavros Dimas Lid van de Commissie

ANNEX

BIJLAGE DEEL A: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE FYSISCH-CHEMISCHE EIGENSCHAPPEN

A.1. SMELT-/VRIESTEMPERATUUR

A.1.

1. METHODE De meeste van de beschreven methoden berusten op de testrichtlijnen van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in de referenties (2) en (3).

1.

1.1. INLEIDING De hier beschreven methoden en toestellen dienen te worden toegepast voor de bepaling van de smelttemperatuur van stoffen, ongeacht de mate van zuiverheid ervan. De keuze van de methode hangt af van de aard van de te onderzoeken stof. De beperkende factor zal dan ook worden bepaald door de vraag of de stof al dan niet gemakkelijk, moeilijk of helemaal niet kan worden verpulverd. Voor sommige stoffen is de bepaling van de vries- of stoltemperatuur zinvoller; ook de normen voor deze bepaling werden in de methode opgenomen. Indien, als gevolg van de specifieke eigenschappen van de stof, geen van de bovenstaande parameters eenvoudig kan worden gemeten, kan een vloeipunt geschikt zijn.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN Onder smelttemperatuur wordt verstaan de temperatuur, waarbij de faseovergang van vaste naar vloeibare toestand optreedt bij normale atmosferische druk; deze temperatuur komt in het ideale geval overeen met de vriestemperatuur. Aangezien de faseovergang bij veel stoffen over een temperatuurbereik plaatsvindt, wordt deze vaak omschreven als het smelttraject. Smelttemperatuur en -traject worden steeds uitgedrukt in K. t = T - 273,15 t Celsius-temperatuur, graden Celsius ( oC) T thermodynamische temperatuur, Kelvin (K)

1.3. REFERENTIESTOFFEN Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om van tijd tot tijd de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk te maken. In de referenties worden enige ijkstoffen genoemd (4).

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN De temperatuur (het temperatuurbereik), waarbij fase-overgang van vaste naar vloeibare of van vloeibare naar vaste toestand plaatsvindt, wordt bepaald. In de praktijk betekent dit dat een monster van de te onderzoeken stof bij atmosferische druk wordt verwarmd/gekoeld en dat de temperatuur in het begin- en het eindstadium van het smelt-/vriesproces wordt bepaald. Vijf onderzoekmethoden worden beschreven, namelijk: de capillaire methode, de methode met de verhitte plaat, de methode voor bepaling van de vriestemperatuur, thermische-analysemethoden, alsmede de bepaling van het vloeipunt (zoals ontwikkeld voor minerale oliën). In sommige gevallen kan het gemakkelijker zijn de vriestemperatuur te bepalen in plaats van de smelttemperatuur.

1.4.

1.4.1. Capillaire methode

1.4.1.

1.4.1.1. Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een vloeistofbad Een kleine hoeveelheid van de verpulverde stof wordt in een capillair gebracht en stevig aangedrukt. Het buisje wordt samen met een thermometer verwarmd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de temperatuurstijging tijdens het eigenlijke smeltproces minder dan circa 1 K/min bedraagt. De temperatuur in het begin- en eindstadium van het smeltproces wordt bepaald.

1.4.1.2. Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een metalen blok Als omschreven in 1.4.1.1, met dit verschil dat het capillair en de thermometer in een verwarmd metalen blok zijn aangebracht en door openingen in het blok kunnen worden waargenomen.

1.4.1.3. Fotoceldetectie Het monster in het capillair wordt automatisch verhit in een metalen cilinder. Een lichtbundel wordt, via openingen in de cilinder, door de stof heen op een nauwkeurig geijkte fotocel gericht. De optische eigenschappen van de meeste stoffen veranderen van ondoorschijnend naar doorschijnend bij het smelten. Zodra de lichtintensiteit die de fotocel bereikt toeneemt, zendt deze een stopsignaal naar de digitale meter die de temperatuur afleest van een thermometer met platinaweerstand in de verwarmingskamer. Deze methode leent zich niet voor toepassing op sommige sterk gekleurde stoffen.

1.4.2. Methode waarbij gebruik wordt gemaakt van een verhit oppervlak (hot stage)

1.4.2.

1.4.2.1. De verhitte staaf volgens Kofler De verhitte staaf volgens Kofler bestaat uit twee stukken metaal die een verschillend warmtegeleidingsvermogen bezitten en elektrisch worden verwarmd. De staaf is zo ontworpen dat de temperatuur nagenoeg lineair langs de lengte ervan varieert. De temperatuur van de verhitte staaf kan variëren van 283 K tot 573 K; de temperatuur wordt met een voor elke staaf afzonderlijk geijkt ruitertje (met wijzer) afgelezen. Om een smelttemperatuur te bepalen, wordt de stof in een dunne laag direct op het oppervlak van de verhitte staaf gebracht. Binnen enkele seconden ontstaat er een scherpe scheidingslijn tussen de vloeibare en de vaste fase. De wijzer wordt ingesteld op de scheidingslijn, waarna de temperatuur kan worden afgelezen.

1.4.2.2. Smeltpuntmicroscoop Er bestaan verschillende verhitte platen voor microscopische smelttemperatuurbepaling waarbij met zeer kleine hoeveelheden materiaal kan worden gewerkt. Bij de meeste verhitte platen wordt de temperatuur gemeten met een gevoelig thermokoppel, maar bij sommige met een kwikthermometer. Een toestel voor microscopische bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een verhitte plaat bestaat meestal uit een verwarmingskamer met een metalen plaat waarop het monster op een voorwerpglaasje wordt geplaatst, in het midden van de metalen plaat is een opening aangebracht zodat deze het licht van de microscoop doorlaat. Tijdens het gebruik wordt, om lucht uit de verwarmingskamer te weren, deze met een glazen plaat afgesloten. De verwarming van het monster wordt ingesteld met een regelweerstand. Voor zeer nauwkeurige metingen bij optisch anisotrope stoffen kan gebruik worden gemaakt van gepolariseerd licht.

1.4.2.3. De meniscusmethode Deze methode wordt speciaal toegepast voor polyamiden. Bepaling van de temperatuur, waarbij de verplaatsing van een meniscus van siliconenolie die tussen een verhit oppervlak (hot stage) en een dekglas, geplaatst op het te onderzoeken polyamidemonster, is ingesloten, visueel wordt waargenomen.

1.4.3. Methode voor de bepaling van de vriestemperatuur Het monster wordt in een speciaal proefbuisje in een toestel geplaatst voor de bepaling van de vriestemperatuur. Tijdens de afkoeling wordt het monster voortdurend zachtjes geroerd en de temperatuur wordt regelmatig afgelezen en geregistreerd. Zodra de temperatuur gedurende enkele aflezingen constant blijft, wordt deze temperatuur (na correctie voor afwijking van de thermometer) geregistreerd als de vriestemperatuur. Onderkoeling moet worden voorkomen door een evenwicht te bewaren tussen de vaste en de vloeibare fase.

1.4.4. Thermische analyse

1.4.4.

1.4.4.1. Differentiële thermische analyse (DTA) Met deze techniek wordt het verschil in temperatuur geregistreerd tussen de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde temperatuurprogramma worden blootgesteld. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie, zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme (smelten) of exotherme (bevriezen) afwijking van de basislijn van de temperatuurregistratie.

1.4.4.2. Differentiële scanningcalorimetrie (DSC) Deze techniek registreert het verschil tussen de energieopname van de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde temperatuurprogramma worden onderworpen. Deze energie is de energie die nodig is om dezelfde temperatuur voor beide stoffen te bereiken. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie, zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme (smelten) of exotherme (bevriezen) afwijking van de basislijn van de warmtestroomregistratie.

1.4.5. Vloeipunt Deze methode werd ontwikkeld voor minerale oliën en is bruikbaar voor olieachtige stoffen met lage smelttemperaturen. Na voorafgaande verwarming wordt het monster afgekoeld met een specifieke snelheid en telkens, iedere 3 K, onderzocht op vloeikarakteristieken. De laagste temperatuur waarbij nog beweging van de vloeistof wordt gezien, wordt genoteerd als het vloeipunt.

1.5. KWALITEITSCRITERIA De toepasbaarheid en nauwkeurigheid van de verschillende methoden voor de bepaling van smelttemperaturen/smelttrajecten staat vermeld in de tabel.

1.5. TABEL: TOEPASBAARHEID VAN DE METHODEN A. B. C. D.

Capillaire methode Meetmethode Stoffen die kunnen verpulveren Stoffen die niet vlot verpulveren Temperatuurbereik Geschatte nauwkeurigheid Bestaande norm Smelttemperatuurtoestellen met vloeistofbad Ja Enkele 273 tot 573 K ±0,3 K JIS K 0064 Smelttemperatuurtoestellen met metalen blok Ja Enkele 293 tot > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Fotoceldetectie Ja Verscheidene met toepassing van hulpapparatuur 253 tot 573 K ±0,5 K Methode waarbij gebruik wordt gemaakt van een verhit oppervlak (hot stage) en methode voor de bepaling van de vriestemperatuur Meetmethode Stoffen die kunnen verpulveren Stoffen die niet vlot verpulveren Temperatuurbereik Geschatte nauwkeurigheid Bestaande norm Verhitte staaf volgens Kofler Ja Neen 283 tot > 573 K ±1,0 K ANSI/ASTM D 345176 Smeltpuntmicroscoop Ja Enkele 273 tot > 573 K ±0,5 K DIN 53736 Meniscusmethode Neen Specifiek voor polyamiden 293 tot > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Vriestemperatuurmethode Ja Ja 223 tot 573 K ±0,5 K zoals BS 4695 Thermische analyse Meetmethode Stoffen die kunnen verpulveren Stoffen die niet vlot verpulveren Temperatuurbereik Geschatte nauwkeurigheid Bestaande norm Differentiële thermische analyse Ja Ja 173 tot 1273 K tot 600 K ±0,5 K tot 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Differentiële scanningcalorimetrie Ja Ja 173 tot 1273 K tot 600 K ±0,5 K tot 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Vloeipunt Meetmethode Stoffen die kunnen verpulveren Stoffen die niet vlot verpulveren Temperatuurbereik Geschatte nauwkeurigheid Bestaande norm Vloeipunt Voor minerale oliën en olieachtige stoffen Voor minerale oliën en olieachtige stoffen 223 tot 323 K. ±3,0 K ASTM D 97-66

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN De aan te houden werkwijzen van bijna alle testmethoden staan beschreven in internationale en nationale normen (zie aanhangsel 1).

1.6.

1.6.1. Methoden waarbij gebruik wordt gemaakt van een capillair Bij een trage temperatuurstijging zullen verpulverde stoffen doorgaans volgens de in figuur 1 weergegeven stadia verlopen.

1.6.1.

Figuur 1 Stadium A Stadium B Stadium C Stadium D Stadium E Stadium A (begin van het smeltproces): fijne druppeltjes hangen op uniforme wijze aan de binnenwand van het capillair. Stadium B er ontstaat ruimte tussen het monster en de binnenwand wegens krimpen van het monster. Stadium C het gekrompen monster begint in te storten en wordt vloeibaar. Stadium D op de oppervlakte wordt een volledige meniscus gevormd, maar een aanzienlijk gedeelte van het monster is nog vast. Stadium E (eindstadium van het smeltproces): er zijn geen vaste deeltjes meer. Tijdens de smelttemperatuurbepaling wordt de temperatuur in het begin- en eindstadium van het smeltproces geregistreerd.

1.6.1.1. Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een vloeistofbad In figuur 2 is een genormaliseerd glazen apparaat voor smelttemperatuurbepaling (JIS K 0064) afgebeeld. Alle specificaties zijn opgegeven in mm.

1.6.1.1.

Figuur 2 A: Meetvat B: Kurk C: Opening D: Thermometer E: Hulpthermometer F: Vloeistofbad G: Glazen capillair met een lengte van 80 tot 100 mm inwendige zijdelingse diameter: 1,0 ± 0,2 mm, wanddikte: 0,2 tot 0,3 mm H: Zijbuis

Badvloeistof

Er moet een geschikte badvloeistof bepaald worden. De keuze van de vloeistof is afhankelijk van de smelttemperatuur van de te onderzoeken stof, bijvoorbeeld vloeibare paraffine voor stoffen met een smelttemperatuur van maximaal 473 K, siliconenolie voor stoffen met een smelttemperatuur van maximaal 573 K. Voor stoffen met een smelttemperatuur hoger dan 523 K kan een mengsel, bestaande uit drie delen zwavelzuur en twee delen kaliumsulfaat (naar massa), worden gebruikt. Passende voorzorgsmaatregelen dienen te worden genomen wanneer een dergelijk mengsel wordt gebruikt.

Thermometer

Er mag alleen gebruik worden gemaakt van thermometers die aan de eisen in de volgende of daarmee overeenkomende normen voldoen: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Werkwijze

De droge stof wordt verpulverd in een mortier en in een aan één uiteinde dichtgesmolten capillair gebracht en wel zo dat het niveau van de vulling, nadat de stof stevig is aangedrukt, circa 3 mm bedraagt. Teneinde een gelijkvormig aangedrukt monster te verkrijgen, laat men het capillair vanaf een hoogte van circa 700 mm door een glazen buis verticaal op een horlogeglas vallen. Het gevulde capillaire buisje wordt in een bad geplaatst en wel zo dat het midden van de kwikbol van de thermometer het capillair ter hoogte van het monster aanraakt. Doorgaans wordt het capillair in het toestel gebracht bij ongeveer 10 K beneden de smelttemperatuur. De badvloeistof wordt zodanig verwarmd dat de temperatuurstijging circa 3 K/min bedraagt. De vloeistof moet worden geroerd. Bij ongeveer 10 K beneden de verwachte smelttemperatuur wordt de snelheid van de temperatuurstijging ingesteld op ten hoogste 1 K/min.

Berekening

De smelttemperatuur wordt als volgt berekend: T = TD + 0,00016 (TD - TE) n waarin: T de gecorrigeerde smelttemperatuur, uitgedrukt in K TD de van thermometer D afgelezen temperatuur, in K TE de van thermometer E afgelezen temperatuur, in K n het aantal schaalverdelingen van het kwikdraad op het uitstekende gedeelte van thermometer D.

1.6.1.2. Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een metalen blok

1.6.1.2. Apparatuur

De apparatuur bestaat uit:

een cilindervormig metalen blok, waarvan het bovenste gedeelte hol is en een kamer vormt (zie figuur 3);

een metalen stop met twee of meer openingen waarlangs buisjes in het metalen blok kunnen worden gebracht;

een verwarmingssysteem voor het metalen blok, bijvoorbeeld een in het blok ingesloten elektrische weerstand;

een regelbare weerstand voor de stroomtoevoer, indien van elektrische verwarming gebruik wordt gemaakt;

in de zijwanden van de kamer, in rechte hoeken ten opzichte van elkaar, vier vensters van hittebestendig glas; voor één van deze vensters is een oculair aangebracht, waardoor het capillair kan worden waargenomen, de overige drie vensters worden gebruikt voor de verlichting van de kamer en inhoud daarvan;

een aan één uiteinde gesloten capillair van hittebestendig glas (zie 1.6.1.1).

Thermometer

Zie de in 1.6.1.1 genoemde normen. Thermo-elektrische meetinstrumenten van vergelijkbare nauwkeurigheid kunnen ook worden gebruikt.

Figuur 3 Thermometer Capillair Metalen plug Oculair Lamp Elektrische weerstand Metalen verhittingsblok

1.6.1.3. Fotoceldetectie Apparatuur en werkwijze: Het apparaat bestaat uit een metalen kamer met een geautomatiseerd verwarmingssysteem. Drie capillairen worden overeenkomstig 1.6.1.1 gevuld en in de oven geplaatst. Er zijn verscheidene lineaire temperatuurstijgingen beschikbaar voor het ijken van het apparaat; de gewenste temperatuurstijging wordt elektrisch ingesteld met een van tevoren gekozen constante snelheid en heeft een lineair verloop. Recorders geven de werkelijke oventemperatuur en de temperatuur van de stof in het capillair aan.

1.6.2. Verwarmde oppervlakken (hot stages)

1.6.2.

1.6.2.1. De verhitte staaf volgens Kofier Zie aanhangsel.

1.6.2.2. Smeltpuntmicroscoop Zie aanhangsel.

1.6.2.3. Meniscusmethode (polyamiden) Zie aanhangsel. De opwarmsnelheid bij temperaturen in de buurt van de smelttemperatuur moet minder zijn dan 1 K/min.

1.6.3. Methoden voor de vriestemperatuurbepaling Zie aanhangsel.

1.6.4. Thermische analyse

1.6.4.

1.6.4.1. Differentiële thermische analyse Zie aanhangsel.

1.6.4.2. Differentiële scanningcalorimetrie Zie aanhangsel.

1.6.5. Bepaling van het vloeipunt Zie aanhangsel.

2. GEGEVENS Soms is een thermometercorrectie noodzakelijk.

3. RAPPORTAGE In het eindverslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen: Het gemiddelde van ten minste twee metingen die binnen de geschatte nauwkeurigheidsgrenzen (zie tabellen) vallen, wordt gerapporteerd als smelttemperatuur, Als het temperatuurverschil tussen het beginpunt en het eindpunt van het smelten binnen de nauwkeurigheidsgrenzen van de methode valt, wordt de temperatuur van het eindstadium genomen als de smelttemperatuur; zo niet, dan moeten beide temperaturen worden gerapporteerd. Als ontleding of sublimatie van de onderzochte stof optreedt voordat de smelttemperatuur is bereikt, dient de temperatuur waarbij dit effect optreedt, te worden gerapporteerd. Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.

de gebruikte methode;

de nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en, indien van toepassing, voorafgaande zuivering;

een schatting van de nauwkeurigheid.

4.(1)(2)(3)(4)

LITERATUUR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102 — Decision of the Council C(81) 30 Final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834. R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical Measurements: Catalogue of Reference Materials from National Laboratories, Pure and Applied Chemistry, 1976, Vol. 48, 505-515.

A.2. KOOKTEMPERATUUR

A.2.

1. METHODE De meeste van de beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in de referenties (2) en (3).

1.

1.1. INLEIDING De hier beschreven methoden en toestellen kunnen worden toegepast op vloeistoffen en op bij lage temperatuur smeltende stoffen, welke beneden de kooktemperatuur geen chemische reactie ondergaan (bijvoorbeeld: auto-oxidatie, omlegging, ontleding, enz.). De methoden zijn van toepassing op zuivere en onzuivere vloeistoffen. De meeste aandacht wordt gegeven aan de fotoceldetectiemethode en thermische analysemethode, omdat hiermee zowel smelt- als kooktemperaturen kunnen worden bepaald. Bovendien kunnen deze metingen worden geautomatiseerd. Het voordeel van de dynamische methode is, dat deze ook kan worden toegepast voor de bepaling van de dampspanning en dat het niet nodig is de kooktemperatuur te corrigeren tot normale druk (101,325 kPa) omdat de normale druk tijdens de meting kan worden ingesteld met behulp van een manostaat. Opmerkingen: De invloed van verontreinigingen op de bepaling van de kooktemperatuur is sterk afhankelijk van de aard van de verontreiniging. Indien in het monster vluchtige verontreinigingen aanwezig zijn, die de resultaten zouden kunnen beïnvloeden, kan de stof worden gezuiverd.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN De normale kooktemperatuur wordt gedefinieerd als de temperatuur waarbij de dampdruk van een vloeistof gelijk is aan 101,325 kPa. Als de kooktemperatuur niet wordt gemeten bij normale atmosferische druk, kan de temperatuurafhankelijkheid van de dampdruk worden beschreven met de vergelijking van Clausius-Clapeyron: log p = ΔHv2,3RT+constante p de dampspanning van de stof in pascal (Pa) ΔHv de verdampingswarmte in J mol-1 R de universele molaire gasconstante = 8,314 J mol-1 K-1 T de thermodynamische temperatuur in K. Bij vermelding van de kooktemperatuur moet de druk tijdens de meting worden opgegeven. Herleidingen Druk (eenheid: kPa) 100 kPa 1 bar = 0,1 MPa (bar is nog toegestaan, doch het gebruik hiervan wordt niet aanbevolen). 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (de eenheden mm Hg en Torr zijn niet meer toegestaan). 1 atm standaardatmosfeer = 101325 Pa (de eenheid atm is niet toegestaan). Temperatuur (eenheid: K) t = T - 273,15 t Celsiustemperatuur, graden Celsius (oC) T thermodynamische temperatuur, kelvin (K)

1.3. REFERENTIESTOFFEN Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Referentiestoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijking met de resultaten van andere methoden mogelijk te maken. Een aantal ijkstoffen is te vinden in de methoden die zijn opgenomen in het aanhangsel.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN Vijf methoden voor de bepaling van de kooktemperatuur (of kooktraject) berusten op de meting van de kooktemperatuur, twee andere op thermische analyse.

1.4.

1.4.1. Bepaling met behulp van een ebullioscoop De ebullioscoop is oorspronkelijk ontwikkeld voor de bepaling van het molecuulgewicht via de kooktemperatuurverhoging, doch leent zich ook voor nauwkeurige metingen van de kooktemperatuur. Een zeer eenvoudig toestel is beschreven in ASTM D 1120-72 (zie aanhangsel). De vloeistof wordt in dit toestel onder evenwichtscondities bij atmosferische druk verwarmd totdat zij kookt.

1.4.2. Dynamische methode Bij deze methode meet men de condensatietemperatuur van de damp met behulp van een geschikte thermometer in de reflux tijdens het koken. De druk kan bij deze methode worden gevarieerd.

1.4.3. Destillatiemethode voor kooktemperatuur Bij deze methode destilleert men de vloeistof en meet men de condensatietemperatuur van de damp, alsmede de hoeveelheid destillaat.

1.4.4. Methode volgens Siwoloboff Bij deze methode verwarmt men het monster in een monsterbuisje, dat in een verwarmd vloeistofbad wordt gehouden. Een dichtgesmolten capillair met een luchtbel onderin wordt in het monsterbuisje gebracht.

1.4.5. Fotoceldetectie Naar het beginsel volgens Siwoloboff worden de opstijgende bellen automatisch gemeten met een fotocel.

1.4.6. Differentiële thermische analyse Met deze techniek wordt het verschil in temperatuur geregistreerd tussen de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde temperatuurprogramma worden blootgesteld. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie, zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme afwijking (koken) van de basislijn van de temperatuurregistratie.

1.4.7. Differentiële scanningcalorimetrie Deze techniek registreert het verschil tussen de energieopname van de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde temperatuurprogramma worden onderworpen. Deze energie is de energie die nodig is om dezelfde temperatuur voor beide stoffen te bereiken. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme afwijking (koken) van de basislijn van de warmtestroomregistratie.

1.5. Tabel 1 Vergelijking van de methoden

KWALITEITSCRITERIA De toepasbaarheid en nauwkeurigheid van de verschillende methoden voor de bepaling van de kooktemperatuur/kooktraject staan vermeld in tabel 1. Meetmethode Geschatte nauwkeurigheid Bestaande norm Ebullioscoop ±1,4 K (tot 373 K) ±2,5 K (tot 600 K) ASTM D 1120-72 Dynamische methode ±0,5 K (tot 600 K) Destillatiemethode (kooktraject) ±0,5 K (tot 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Volgens Siwoloboff ± 2 K (tot 600 K) Fotoceldetectie ±0,3 K (bij 373 K) Differentiële thermische analyse ±0,5 K (tot 600 K) ±2,0 K (tot 1273 K) ASTM E 537-76 Differentiële scanningcalorimetrie ±0,5 K (tot 600 K) ±2,0 K (tot 1273 K) ASTM E 537-76

1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODEN De werkwijzen van een aantal testmethoden zijn beschreven in internationale en nationale normen (zie aanhangsel).

1.6.

1.6.1. Ebullioscoop Zie aanhangsel.

1.6.2. Dynamische methode Zie testmethode A.4 voor de bepaling van de dampspanning. De waargenomen kooktemperatuur bij een druk van 101,325 kPa wordt geregistreerd.

1.6.3. Destillatiemethode (kooktraject) Zie aanhangsel.

1.6.4. Methode volgens Siwoloboff Het monster wordt verwarmd in een smelttemperatuurtoestel in een monsterbuisje met een diameter van ongeveer 5 mm (figuur 1). In figuur 1 staat een standaardapparaat voor de bepaling van de smelt- en kooktemperatuur (JIS K 0064) afgebeeld (glas, alle afmetingen in mm). Een capillair (kookcapillair) dat op ongeveer 1 cm boven het ondereind is dichtgesmolten, wordt in het monsterbuisje gebracht. Het monsterbuisje wordt met de te onderzoeken stof gevuld, totdat het dichtgesmolten deel van het capillair zich onder het vloeistofoppervlak bevindt. Het monsterbuisje met het kookcapillair wordt met een elastiekje aan de thermometer bevestigd of met een zijstuk vastgezet (zie figuur 2). Figuur 2 Beginsel volgens Siwoloboff Figuur 3 Gewijzigd beginsel De badvloeistof wordt gekozen aan de hand van de kooktemperatuur. Bij temperaturen tot 573 K kan siliconenolie worden gebruikt. Vloeibare paraffine mag slechts worden gebruikt bij temperaturen tot 473 K. De verwarming van het vloeistofbad moet zo geregeld zijn, dat de temperatuur aanvankelijk 3 K/min stijgt. Het vloeistofbad moet worden geroerd. Bij ongeveer 10 K beneden de verwachte kooktemperatuur moet de verwarming zo worden ingesteld dat de temperatuur met minder dan 1 K/min stijgt. Zodra de kooktemperatuur wordt bereikt, beginnen er snel belletjes uit het kookcapillair te komen. De kooktemperatuur wordt bereikt wanneer, bij tijdelijke afkoeling, de bellenvorming stopt en de vloeistof plotseling in het capillair omhoog komt. De bijbehorende stand van de thermometer is de kooktemperatuur van de te onderzoeken stof. Bij het gewijzigd beginsel (figuur 3) wordt de kooktemperatuur bepaald in een smelttemperatuurcapillair. Deze wordt uitgetrokken tot een fijne punt van ongeveer 2 cm lengte, waarin een geringe hoeveelheid van het monster wordt opgezogen. Het open einde van de fijne punt wordt dicht gesmolten, zodat er zich onderin een kleine luchtbel bevindt (a). Bij verwarming in het smelttemperatuur toestel (b) zet de luchtbel uit. De kooktemperatuur komt overeen met de temperatuur waarbij de prop van de te onderzoeken stof op het niveau van het vloeistofoppervlak komt (c).

1.6.4.

Figuur 1 A: Meetvat B: Kurk C: Opening D: Thermometer E: Hulpthermometer F: Vloeistofbad G: Monsterbuisje: buitendiameter maximaal 5 mm; met daarin een capillair met een lengte van ongeveer 100 mm en een binnendiameter van circa 1 mm en een wanddikte van circa 0,2 tot 0,3 mm H: Zijbuis

1.6.5. Fotoceldetectie Het monster wordt verwarmd in een capillair in een verwarmd metaalblok. Via geschikte openingen in het blok wordt een lichtbundel door de stof heen op een zorgvuldig geijkte fotocel gericht. Terwijl de temperatuur van het monster oploopt, komen er luchtbellen uit het kookcapillair. Wanneer de kooktemperatuur wordt bereikt, neemt het aantal bellen flink toe. Hierbij verandert de intensiteit van het licht dat op de cel valt, waardoor het apparaat wordt stilgezet dat de temperatuur afleest van een thermometer met platina weerstand die in het blok is gemonteerd. Deze methode is bijzonder nuttig omdat hiermee ook bepalingen mogelijk zijn beneden kamertemperatuur tot 253,15 K (– 20 oC) zonder enige veranderingen in de apparatuur. Het instrument moet alleen in een koelbad worden geplaatst.

1.6.6. Thermische analyse

1.6.6.

1.6.6.1. Differentiële thermische analyse Zie aanhangsel.

1.6.6.2. Differentiële scanningcalorimetrie Zie aanhangsel.

2. Tabel 2: Temperatuurcorrectiefactoren fT

GEGEVENS Bij kleine afwijkingen van de normale druk (max. ± 5 kPa) worden de kooktemperaturen genormaliseerd tot Tn met behulp van de volgende numerieke vergelijking van Sidney Young: Tn = T + (fT x Δ p) waarin: Δ p (101,325 - p), [let op het teken] p barometerstand in kPa, fT tempo waarin de kooktemperatuur verandert met de druk in K/kPa, T gemeten kooktemperatuur in K, Tn kooktemperatuur gecorrigeerd tot normale druk in K. De temperatuurcorrectiefactoren fT en de vergelijkingen voor de benadering daarvan zijn opgenomen in de internationale en nationale normen die hierboven voor een groot aantal stoffen zijn genoemd. Zo worden bijvoorbeeld in de methode DIN 53171 de volgende (bij benadering) correcties vermeld voor oplosmiddelen in verf (zie tabel 2). Temperatuur T (K) Correctiefactor fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47

3. RAPPORTAGE In het eindverslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen: Het gemiddelde van ten minste twee metingen die binnen de geschatte nauwkeurigheidsgrenzen (zie tabel 1) vallen, wordt genoteerd als kooktemperatuur. De gemeten kooktemperaturen en hun gemiddelde moeten worden opgegeven, alsmede de druk(ken), waarbij de metingen zijn uitgevoerd, in kPa. De druk dient bij voorkeur dicht bij de normale atmosferische druk te liggen. Alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.

de gebruikte methode;

een nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en, indien van toepassing, voorafgaande zuivering;

een schatting van de nauwkeurigheid.

4.(1)(2)(3) LITERATUUR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103 — Decision of the Council C(81)30 Final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Burterworths, London, 1975, vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol.I, Part I, Chapter VIII.

A.3. RELATIEVE DICHTHEID

A.3.

1. METHODE De beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in referentie (2).

1.

1.1. INLEIDING De hieronder beschreven methoden voor het bepalen van de relatieve dichtheid zijn van toepassing op vaste stoffen en op vloeistoffen, ongeacht de zuiverheid van deze stoffen. De verschillende methoden zijn vermeld in tabel 1.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN De relatieve dichtheid, D20/4, van vaste stoffen of vloeistoffen is de verhouding tussen de massa van een volume te onderzoeken stof bij 20 oC en de massa van hetzelfde volume water bij 4 oC. De relatieve dichtheid heeft geen dimensie. De dichtheid, p, van een stof is het quotiënt van de massa m en het volume v van deze stof. De dichtheid, p, wordt uitgedrukt in kg/m3 (SI-eenheden).

1.3. REFERENTIESTOFFEN (1) (3) Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methodes mogelijk te maken.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN Er worden vier soorten methoden gebruikt.

1.4.

1.4.1. Methoden gebaseerd op de opwaartse kracht

1.4.1.

1.4.1.1. Areometer (hydrometer voor vloeistoffen) Voldoende nauwkeurige en snelle dichtheidsbepalingen kunnen worden uitgevoerd met drijvende areometers; het gedeelte van de areometer dat in de vloeistof zakt, is bepalend voor de dichtheid van de vloeistof en kan van een schaalverdeling worden afgelezen.

1.4.1.2. Hydrostatische balans (voor vloeistoffen en vaste stoffen) Het gewichtsverschil van een monster, gemeten in lucht en in een geschikte vloeistof (bijvoorbeeld water), kan worden gebruikt om de dichtheid ervan te bepalen. Voor vaste stoffen geldt de gemeten dichtheid slechts voor het bewuste monster. Voor het bepalen van de dichtheid van vloeistoffen wordt een voorwerp met volume v eerst in lucht en vervolgens in de testvloeistof gewogen.

1.4.1.3. Methode met ondergedompeld voorwerp (voor vloeistoffen) (4) Bij deze methode wordt de dichtheid van een vloeistof bepaald aan de hand van het verschil tussen de resultaten van een weging van de vloeistof voor en na het onderdompelen van een voorwerp met bekend volume in de te onderzoeken vloeistof.

1.4.2. Methoden met de pyknometer Voor vaste stoffen en vloeistoffen kunnen pyknometers van uiteenlopende vorm en met bekend volume worden gebruikt. De dichtheid wordt berekend uit het verschil in gewicht tussen de volle en de lege pyknometer en het bekende volume daarvan.

1.4.3. Vergelijkingspyknometer met lucht (voor vaste stoffen) De dichtheid van een vaste stof in willekeurige vorm kan bij kamertemperatuur worden gemeten met behulp van een gasvergelijkingspyknometer. Het volume van een stof wordt in lucht of in een inert gas gemeten in een cilinder waarvan het variabele volume gekalibreerd is. Voor de berekening van de dichtheid wordt na meting van het volume een massameting verricht.

1.4.4. Oscillerende dichtheidsmeter (5) (6) (7) De dichtheid van een vloeistof kan worden gemeten met behulp van een oscillerende dichtheidsmeter. Een mechanische oscillator in de vorm van een U-buis wordt in trilling gebracht bij de resonantiefrequentie van de oscillator die afhankelijk is van zijn massa. Bij het inbrengen van een monster verandert de resonantiefrequentie van de oscillator. Het apparaat moet worden geijkt met twee vloeistoffen van bekende dichtheid. Deze ijkstoffen moeten bij voorkeur zo worden gekozen dat de dichtheden ervan zich aan de uiteinden van het meetbereik bevinden.

1.5. KWALITEITSCRITERIA De toepasbaarheid van de verschillende methoden voor bepaling van de relatieve dichtheid staat vermeld in de tabel.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN Normen, die als voorbeeld kunnen worden geraadpleegd voor aanvullende technische gegevens, zijn bijgevoegd in het aanhangsel. De proeven moeten worden uitgevoerd bij 20 oC en ten minste in tweevoud.

2. GEGEVENS Zie normen.

3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Toepasbaarheid van de methoden

RAPPORTAGE In het eindverslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen: De relatieve dichtheid D204 dient te worden gerapporteerd zoals gedefinieerd onder 1.2, alsmede de fysische toestand van de onderzochte stof. Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd. Meetmethode Dichtheid Maximale dynamische viscositeit Bestaande norm Vaste stof Vloeistof Areometer Ja 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Hydrostatische balans Ja ISO 1183 (A) Ja 5 Pa S ISO 901 en 758 Methode met ondergedompeld voorwerp Ja 20 Pa s DIN 53217 Pyknometer ISO 3507 Ja ISO 1183 (B), NF T 20-053 Ja 500 Pa s ISO 758 Vergelijkingspyknometer met lucht Ja DIN 55990 deel 3, DIN 53243 Oscillerende dichtheidsmeter Ja 5 Pa s

de gebruikte methode;

een nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en, indien van toepassing, voorafgaande zuivering.

3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2. Toepasbaarheid van de methoden a)

vaste stof

vloeistof

3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Toepasbaarheid van de methoden a)

vaste stof

vloeistof

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

LITERATUUR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of organic chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I. IUPAC, Recommended reference materials for realisation of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugei zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm; 1979, Vol. 11, 427-430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.

A.4. DAMPSPANNING

A.4.

1. METHODE De meeste van de beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in referenties (2) en (3).

1.

1.1. INLEIDING Voor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de structuur, de smelttemperatuur en de kooktemperatuur van de stof. Er bestaat geen meetmethode die voor alle mogelijke waarden van de dampspanning van toepassing is. Er worden daarom verschillende methoden aanbevolen voor het meten van de dampspanning van < 10-4 tot 105 Pa. In de regel zal de dampspanning door verontreinigingen worden beïnvloed; de mate van beïnvloeding is sterk afhankelijk van de soort verontreiniging. Indien er vluchtige verontreinigingen in het monster voorkomen, die het resultaat zouden kunnen beïnvloeden, kan het monster gezuiverd worden. Het kan tevens nuttig zijn om de dampdruk op te geven van technisch zuiver materiaal. Bij sommige van de hier beschreven methoden gebruikt men apparaten met metalen onderdelen; bij het testen van corrosieve stoffen dient hiermee rekening gehouden te worden.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN De dampspanning van een stof wordt gedefinieerd als de druk van de damp van die stof bij verzadiging boven een vaste stof of vloeistof. Bij thermodynamisch evenwicht is de dampspanning van een zuivere stof alleen een functie van temperatuur. De SI-eenheid van druk die moet worden gebruikt, is de pascal (Pa). Enkele tot nu toe gebruikte eenheden en hun omrekeningsfactoren zijn: 1 torr (≡ 1 mm Hg) = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfeer = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa. De SI-eenheid van temperatuur is de kelvin (K). De universele molaire gasconstante R is 8,314 J mol-1 K-1. De temperatuurafhankelijkheid van de dampdruk wordt beschreven met de vergelijking van Clausius-Clapeyron: log p = ΔHv2,3RT+constante waarin: p de dampspanning van de stof in pascal (Pa) ΔHv de verdampingswarmte in J mol-1 R de universele molaire gasconstante in J mol-1 K-1 T de thermodynamische temperatuur in K.

1.3. REFERENTIESTOFFEN Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN Voor het bepalen van de dampspanning worden zeven methoden voorgesteld die in verschillende meetbereiken van de dampspanning kunnen worden toegepast. In elke methode wordt de dampspanning bepaald bij verschillende temperaturen. Binnen een beperkt temperatuurbereik is de logaritme van de dampspanning van een zuivere stof een lineaire functie van de reciproke waarde van de temperatuur.

1.4.

1.4.1. Dynamische methode In de dynamische methode wordt de kooktemperatuur bij een bepaalde druk gemeten. Aanbevolen meetbereik: van 103 Pa tot 105 Pa. Deze methode wordt ook aanbevolen voor de bepaling van de normale kooktemperatuur en is voor dat doel bruikbaar tot 600 K.

1.4.2. Statische methode In de statische methode wordt de dampspanning bij thermodynamisch evenwicht in een afgesloten systeem bepaald bij een bepaalde temperatuur. Deze methode is geschikt voor vaste stoffen en vloeistoffen bestaande uit een of meer componenten. Aanbevolen meetbereik: van 10 Pa tot 105 Pa. Deze methode kan ook worden gebruikt in het bereik van 1 tot 10 Pa mits voorzichtigheid in acht wordt genomen.

1.4.3. Isoteniscoop Deze genormaliseerde methode is ook een statische methode, maar is in het algemeen niet geschikt voor systemen met meerdere componenten. Meer gegevens zijn beschikbaar in ASTM-methode D-2879-86. Aanbevolen meetbereik: van 100 Pa tot 105 Pa.

1.4.4. Effusiemethode: Dampspanningsbalans De hoeveelheid stof die een cel per tijdseenheid verlaat door een opening met bekende afmetingen, wordt bepaald onder vacuümomstandigheden, waarbij terugkeer van de stof naar de cel verwaarloosbaar is (bijvoorbeeld door meting van de kracht welke door een dampstroom op een gevoelige balans wordt uitgeoefend of door meting van de afname van het gewicht). Aanbevolen meetbereik: van 10-3 Pa tot 1 Pa.

1.4.5. Effusiemethode: Door middel van afname van gewicht of met dampval Deze methode berust op een bepaling van de massa van de te onderzoeken stof die per tijdseenheid in de vorm van damp door een gekalibreerde micro-opening uit een Knudsencel (4) stroomt, in ultravacuümtoestand. De hoeveelheid uitgestroomde dampmassa kan verkregen worden door bepaling van de afname van de massa van de cel, of door condensatie van de damp bij lage temperatuur en bepaling van de hoeveelheid verdampte stof met behulp van chromatografische analyse. De dampspanning wordt berekend door toepassing van de Hertz-Knudsen-vergelijking. Aanbevolen meetbereik: van 10-3 Pa tot 1 Pa.

1.4.6. Gasverzadigingsmethode Een stroom inert dragergas wordt over de stof geleid, zodat het gas verzadigd wordt met de damp van de stof. De hoeveelheid stof die door een bekende hoeveelheid dragergas is getransporteerd, kan gemeten worden door de damp in een geschikte val op te vangen, of door een in serie gekoppelde analytische techniek. Deze hoeveelheid wordt vervolgens gebruikt om de dampspanning bij een gegeven temperatuur te berekenen. Aanbevolen meetbereik: van 10-4 Pa tot 1 Pa. Deze methode kan ook worden gebruikt in het bereik van 1 tot 10 Pa mits voorzichtigheid in acht wordt genomen.

1.4.7. Draaiende rotor In de draaiende rotor bestaat het eigenlijke meetelement uit een in een magnetisch veld zwevend klein stalen kogeltje dat met hoge snelheid ronddraait. De gasdruk wordt afgeleid uit de drukafhankelijke snelheidsvermindering van het stalen kogeltje. Aanbevolen meetbereik: van 10-4 Pa tot 0,5 Pa.

1.5. Tabel 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Kwaliteitscriteria

KWALITEITSCRITERIA De verschillende methoden voor het bepalen van de dampspanning worden in de tabel vergeleken op toepasbaarheid, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid, meetbereik en bestaande normalisatie. Meetmethode Stoffen Geschatte herhaalbaarheid Geschatte reproduceerbaarheid Aanbevolen bereik Bestaande norm Vast Vloeibaar Dynamische methode Bij lage to smeltend Ja Tot 25 % Tot 25 % 103 Pa tot 2 × 103 Pa — 1-5 % 1-5 % 2 × 103 Pa tot 105 Pa — Statische methode Ja Ja 5-10 % 5-10 % 10 Pa to 105 Pa NFT 20-048 (5) Isoteniscoop Ja Ja 5-10 % 5-10 % 102 Pa tot 105 Pa ASTM-D 2879-86 Effusiemethode: Dampspanningsbalans Ja Ja 5-20 % Tot 50 % 10-3 Pa tot 1 Pa NFT 20-047(6) Effusiemethode: Gewichtsafname Ja Ja 10-30 % — 10-3 Pa tot 1 Pa — Gasverzadigingsmethode Ja Ja 10-30 % Tot 50 % 10-4 Pa tot 1 Pa — Draaiende-rotormethode Ja Ja 10-20 % — 10-4 Pa tot 0,5 Pa —

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN

1.6.

1.6.1. Dynamische meting

1.6.1.

1.6.1.1. Apparatuur De meetapparatuur bestaat uit een kookvat met glazen of metalen koeler en voorzieningen voor het meten van temperatuur en het regelen en meten van druk. De meetapparatuur die in figuur 1 is afgebeeld, is van hittebestendig glas en bestaat uit vijf delen: De grote, gedeeltelijk dubbelwandige buis bestaat uit een glazen slijpstuk, een koeler, een koelvat en een inlaatbuis. De glazen cilinder met een Cottrell-pomp is gemonteerd in het kookgedeelte van de buis en heeft een ruw oppervlak van gebroken glas om stoten tijdens het kookproces te voorkomen. De temperatuur wordt gemeten met behulp van een geschikte temperatuursensor (bijvoorbeeld een weerstandsthermometer of een thermokoppel), doorgevoerd in het apparaat tot op de plaats van het meetpunt (nr. 5, figuur 1) via een goed passende opening (bijvoorbeeld geslepen insteekverbinding). De noodzakelijke aansluitingen met de apparatuur voor het regelen en meten van de druk worden gemaakt. De bol, die als buffervolume werkt, is verbonden met de meetapparatuur door middel van een capillaire buis. Het kookvat wordt verwarmd met een verwarmingselement (bijvoorbeeld een verwarmingspatroon) dat onderin de glazen apparatuur is aangebracht. De gewenste verwarmingsstroom wordt ingesteld en geregeld door middel van een thermokoppel. Het vereiste vacuüm tussen 102 Pa en ongeveer 105 Pa wordt aangelegd met een vacuümpomp. Voor het regelen van druk (meetbereik van ongeveer 102 Pa tot 105 Pa) en ventilatie wordt een passende kraan voor lucht of stikstoftoevoer gebruikt. Voor het meten van de druk wordt een manometer gebruikt.

1.6.1.2. Meetprocedure De dampspanning wordt gemeten door de kooktemperatuur van het monster bij verschillende ingestelde waarden van de druk tussen ongeveer 102 Pa en 105 Pa te bepalen. Als de temperatuur bij constante druk constant blijft, betekent dit dat de kooktemperatuur is bereikt. Schuimende stoffen kunnen met deze methode niet worden onderzocht. De te onderzoeken stof wordt in een schoon en droog monstervat gebracht. Indien vaste stoffen niet als poeder beschikbaar zijn, kunnen er problemen ontstaan; deze kunnen echter worden opgelost door de koelwatermantel te verwarmen. Na het vullen wordt de apparatuur bij de flens gasdicht afgesloten en worden de stof en de apparatuur ontgast. Vervolgens wordt de laagst gewenste druk ingesteld en wordt het verwarmingssysteem aangezet. Tegelijkertijd wordt de temperatuurvoeler verbonden met een recorder. Het evenwicht is bereikt, wanneer bij een constante druk een constante kooktemperatuur kan worden afgelezen. Wees voorzichtig om stoten tijdens het koken te voorkomen. Voorts moet volledige condensatie plaatsvinden op de koeler. Bij het bepalen van de dampspanning van bij lage temperatuur smeltende stoffen moet men voorkomen dat de condensor verstopt raakt. Nadat dit evenwichtspunt is geregistreerd, wordt een hogere druk ingesteld. Dit proces wordt herhaald totdat een druk van 105 Pa is bereikt (ongeveer 5 tot 10 meetpunten in totaal). Ter controle moeten de evenwichtspunten nogmaals worden bepaald bij afnemende druk.

1.6.2. Statische methode

1.6.2.

1.6.2.1. Apparatuur De apparatuur omvat een vat voor het monster en een verwarmings- en koelsysteem om de monstertemperatuur in te stellen en te meten. De apparatuur bevat bovendien instrumenten om de druk in te stellen en te meten. Figuren 2a en 2b illustreren de basisbeginselen die hier van toepassing zijn. De monsterruimte (figuur 2a) is aan één zijde afgesloten door een geschikte hoogvacuümkraan. Aan de andere zijde is een U-vormige buis bevestigd die een geschikte manometervloeistof bevat. Eén uiteinde van de U-vormige buis vertakt naar de vacuümpomp, de stikstofcilinder of de ventilatiekraan, en een manometer. Een drukventiel met drukaanwijzing kan gebruikt worden in plaats van een U-buis (figuur 2b). Om de stof op een ingestelde temperatuur te brengen, wordt de monsterruimte met de kraan en de U-vormige buis of drukventiel in een bad gebracht, dat op een constante temperatuur van ±0,2 K gehouden wordt. De temperatuur wordt aan de buitenkant van de monsterruimte of in het vat zelf gemeten. Een vacuümpomp met een tegenstroomkoelbuis wordt gebruikt om het apparaat vacuüm te zuigen. Bij methode 2a wordt de dampspanning van de stof indirect gemeten met een nulaanwijzer. Deze methode berust op het feit dat de dichtheid van de vloeistof in de U-buis verandert als de temperatuur sterk wisselt. Voor de nulpuntsinstelling kunnen in de U-vormige buis, afhankelijk van het drukbereik en het chemisch gedrag van de stof, verschillende vloeistoffen worden gebruikt: siliconenoliën, ftalaten. De teststof mag niet merkbaar oplossen in of reageren met de vloeistof in de U-buis, Voor de manometer kan kwik worden gebruikt in het bereik van normale luchtdrukken tot 102 Pa; siliconenvloeistoffen en ftalaten zijn geschikt voor drukken van 10 tot 102 Pa. De verwarmbare membraancapaciteitmanometers kunnen zelfs worden gebruikt bij drukken beneden 10-1 Pa. Er bestaan ook andere drukmeters die gebruikt kunnen worden tot 102 Pa.

1.6.2.2. Meetprocedure Vóór de meting moeten alle onderdelen van de apparatuur in figuur 2 grondig gereinigd en gedroogd worden. Vul voor methode 2a de U-buis met de gewenste vloeistof die moet zijn ontgast bij verhoogde temperatuur voordat tot aflezen wordt overgegaan. De te onderzoeken stof wordt in het apparaat geplaatst waarna dit wordt gesloten en vervolgens de temperatuur voldoende wordt verlaagd voor ontgassing. De temperatuur moet laag genoeg zijn om te verzekeren dat alle lucht afgepompt is, maar mag — in geval van een meercomponentensysteem — de samenstelling van het materiaal niet veranderen. Indien gewenst kan een evenwichtstoestand sneller bereikt worden door te roeren. Het monster kan onderkoeld worden met bijvoorbeeld vloeibare stikstof (opgelet: vermijd condensatie van lucht of pompvloeistof) of een mengsel van ethanol en droog ijs. Voor metingen bij lage temperatuur gebruikt men een bad met regelbare temperatuur, dat is aangesloten op een ultrastaat. Met de kraan boven de monsterruimte in geopende stand wordt vervolgens de ingesloten lucht gedurende een aantal minuten uit de apparatuur gepompt. Daarna wordt de kraan gesloten en de temperatuur van het monster op het laagst gewenste niveau gebracht. Zo nodig moet de ontgassing verschillende keren herhaald worden. Als het monster verhit wordt, stijgt de dampspanning. Dit verandert het evenwicht van de vloeistof in de U-buis. Om hiervoor te compenseren, wordt stikstof of lucht via de kraan in het apparaat binnengelaten tot de vloeistof in de drukmeter weer bij nul staat. De hiervoor vereiste druk kan afgelezen worden bij kamertemperatuur op een precisiemanometer. Deze druk komt overeen met de dampspanning van de te onderzoeken stof bij die specifieke meettemperatuur. Methode 2b is gelijkaardig, maar de dampspanning wordt direct afgelezen. De temperatuurafhankelijkheid van de dampspanning wordt bepaald met voldoende kleine temperatuurintervallen (ongeveer 5 tot 10 meetpunten in totaal) tot aan het gewenste maximum. Ter controle moeten de metingen bij lage temperaturen herhaald worden. Als de waarden die verkregen worden bij de herhaalde metingen niet overeenkomen met de curve verkregen bij stijgende temperatuur, kan dit te wijten zijn aan een van de volgende factoren:

1.6.2.2.

1. Het monster bevat nog altijd lucht (bijvoorbeeld stoffen met hoge viscositeit) of bij lage temperatuur kokende stoffen die vrijkomt/vrijkomen bij verwarming en verwijderd kan/kunnen worden door afpompen na verdere onderkoeling.

2. De koeltemperatuur is niet laag genoeg. In dit geval wordt vloeibaar stikstof gebruikt als koelmiddel. Als 1 of 2 van toepassing is dienen de metingen herhaald te worden.

3. De stof ondergaat een chemische reactie in het onderzochte temperatuurbereik (bijvoorbeeld afbraak, polymerisatie).

1.6.3. Isoteniscoop Zie referentie 7 voor een volledige beschrijving van deze methode. Het principe van het meetinstrument is afgebeeld in figuur 3. Evenals de statische methode, die is beschreven in 1.6.2, is de isoteniscoop geschikt voor onderzoek van vaste stoffen en vloeistoffen. Voor vloeistoffen dient de stof zelf als vulvloeistof in de hulpmanometer. Een hoeveelheid vloeistof die voldoende is voor het vullen van de bol en de korte arm van het manometergedeelte, wordt in de isoteniscoop gebracht. De isoteniscoop wordt met het vacuümsysteem verbonden, leeggepompt en daarna gevuld met stikstof. Het leegmaken en doorspoelen van het systeem wordt tweemaal herhaald om de resterende zuurstof te verwijderen. De gevulde isoteniscoop wordt horizontaal gehouden zodat het monster zich in een dunne laag verspreidt over de bol en het manometergedeelte (U-deel). De druk in het systeem wordt gereduceerd tot 133 Pa en het monster wordt zachtjes verwarmd tot het juist kookt (verwijdering van opgeloste gefixeerde gassen). De isoteniscoop wordt dan zo gedraaid dat het monster terugloopt naar de bol en de korte arm van de manometer, zo dat beide volledig gevuld zijn met vloeistof. De druk wordt aangehouden zoals bij het ontgassen en de uitgetrokken punt van de monsterbol wordt verwarmd met een kleine vlam, totdat de damp die uit het monster vrijkomt voldoende expandeert om een deel van het monster uit het bovenste gedeelte van de bol en de manometerarm te verplaatsen naar het manometergedeelte van de isoteniscoop en zo een met damp gevulde, stikstofvrije ruimte te creëren. Vervolgens wordt de isoteniscoop in een thermostatisch bad geplaatst, en de druk van de stikstof aangepast tot deze druk gelijk is aan de druk van het monster. Het drukevenwicht wordt aangeduid door het manometergedeelte van de isoteniscoop. Bij het evenwichtspunt is de dampspanning van de stikstof gelijk aan de dampspanning van de te onderzoeken stof. Voor vaste stoffen worden de in 1.6.2.1 genoemde manometervloeistoffen gebruikt, afhankelijk van het druk- en temperatuurbereik. De ontgaste manometervloeistof wordt in de ronding van de lange arm van de isoteniscoop gebracht. Daarna wordt de te onderzoeken vaste stof in de bol gebracht en bij hogere temperatuur ontgast. Vervolgens wordt de isoteniscoop gekanteld zodat de manometervloeistof in de U-buis kan stromen. Het meten van de dampspanning als functie van de temperatuur vindt plaats volgens 1.6.2.

1.6.4. Effusiemethode: Dampspanningsbalans

1.6.4.

1.6.4.1. Apparatuur In de literatuur worden verschillende versies van het apparaat beschreven (1). Het hier beschreven apparaat illustreert de algemene basisprincipes (figuur 4). De belangrijkste onderdelen zijn afgebeeld in figuur 4; deze bestaan uit een hoogvacuüm roestvrijstalen of glazen houder, apparatuur om een vacuüm te creëren en te meten, alsmede ingebouwde onderdelen voor het meten van de dampspanning door middel van een balans. De volgende onderdelen zijn in het apparaat gemonteerd:

Een verdampingsoven met een flens en een draaiende inlaat. De verdampingsoven is een cilindervormig vat, vervaardigd uit bijvoorbeeld koper of een chemisch inerte, thermische goed geleidende legering. Een glazen vat omgeven door een koperen wand kan ook gebruikt worden. De oven heeft een diameter van ongeveer 3 tot 5 cm en is 2 tot 5 cm hoog. Er zijn één tot drie openingen van verschillende grootte voor de dampstroom. De oven wordt verwarmd met behulp van of wel een verwarmingsplaat onder de oven, of wel een verwarmingsspiraal rond de buitenkant van de oven. Om te voorkomen dat de warmte zich verspreidt over de grondplaat wordt de verwarming verbonden met de grondplaat via een metalen stuk met lage thermische geleiding (nikkel-zilver- of chroom-nikkelstaal), bijvoorbeeld een nikkel-zilverbuis verbonden met de draaibare inlaat in het geval van een oven met verschillende openingen. Deze opstelling heeft als voordeel dat er een koperen staaf ingebracht kan worden. Zo kan er van buitenuit gekoeld worden met behulp van een koelbad.

Als het ovendeksel drie openingen van verschillende doorsnede heeft, welke 90o ten opzichte van elkaar zijn geplaatst, kunnen verschillende dampspanningen in het totale te meten bereik worden gemeten (openingen tussen ongeveer 0,30 en 4,50 mm doorsnede). Grote openingen dienen voor lage dampdrukken en vice versa. Door de oven te draaien kan de gewenste opening of een tussenstand voor de dampstroom (ovenopening — schild — balansschaal) worden ingesteld waardoor de molecuulstroom door de ovenopening op of naast de balansschaal wordt gericht. Om de temperatuur van de stof te meten, is een thermokoppel of weerstandsthermometer op een geschikte plaats gemonteerd.

Boven het schild hangt de balansschaal van een zeer gevoelige microbalans (zie verder). De balansschaal heeft een diameter van ongeveer 30 mm. Verguld aluminium is een geschikt materiaal.

De balansschaal wordt omgeven door een cilindervormige koelpot van messing of koper. Afhankelijk van het type heeft de balans een opening voor de balansarm en een schildopening voor de molecuulstroom, zodat totale condensatie van de damp op de balansschaal wordt verzekerd. De warmteafvoer naar buiten vindt plaats door een koperen staaf naar de koeling. Deze wordt door de grondplaat geleid en is daarvan thermisch geïsoleerd, bijvoorbeeld met een chroom-nikkelstalen buis. De staaf wordt onder de grondplaat in een dewarvat met vloeibare stikstof gedompeld of men laat vloeibare stikstof door de staaf stromen. De koelpot wordt zo op een temperatuur van ongeveer – 120 oC gehouden. De balansschaal wordt uitsluitend door straling gekoeld, voldoende voor het onderzochte drukbereik (koeling ongeveer een uur vóór het begin van de meting).

De balans wordt boven de koelpot geplaatst. Geschikte balansen zijn bijvoorbeeld een zeer gevoelige 2-armige elektronische microbalans (8) of een zeer gevoelig instrument met bewegende spiraal (zie OESO Test Guideline 104, uitgave 12.05.81).

De grondplaat bevat bovendien elektrische aansluitingen voor thermokoppels (of weerstandsthermometers) en verwarmingsspiralen.

In het vat wordt een vacuüm geproduceerd met behulp van een partiële vacuümpomp of een hoogvacuümpomp (vereist vacuüm van ongeveer 1 tot 2 × 10-3 Pa, verkregen na 2 uur pompen). De druk wordt geregeld met een geschikte ionisatiemanometer.

1.6.4.2. Meetprocedure Het vat wordt gevuld met de te onderzoeken stof en het deksel wordt gesloten. Het schild en de koelpot worden boven de oven geschoven. Het apparaat wordt gesloten en de vacuümpompen worden ingeschakeld. De einddruk vóór het begin van de meting is ongeveer 10-4 Pa. Vanaf 10-2 Pa wordt de koelpot aangezet. Wanneer het benodigde vacuüm is bereikt, kan de ijkserie bij de laagst gewenste temperatuur worden gestart. De overeenkomstige opening in het deksel wordt ingesteld, de damp stroomt door het schild recht boven de opening en raakt de gekoelde balansschaal. De balansschaal moet groot genoeg zijn om te verzekeren dat hij wordt geraakt door de volledige dampstroom die door de opening in het schild geleid wordt. De impuls van de dampstroom werkt als kracht op de balansschaal en de moleculen condenseren op het gekoelde oppervlak. De impuls en gelijktijdige condensatie veroorzaken een signaal op de recorder. Dit signaal kan op twee manieren worden beoordeeld: p = G 2 π RT×103M waarin: G verdampingssnelheid (kg s-1 m-2) M molaire massa (g mol-1) T temperatuur (K) R universele molaire gasconstante (J mol-1 K-1) p dampspanning (Pa). Als het vereiste vacuüm is bereikt, wordt begonnen met de serie metingen bij de laagst gewenste meettemperatuur. Voor verdere metingen wordt de temperatuur met kleine stappen verhoogd, totdat de hoogste gewenste temperatuur bereikt wordt. Vervolgens wordt het monster weer afgekoeld en eventueel wordt een tweede kromme van de dampspanning gemeten. Als de tweede reeks de resultaten van de eerste niet bevestigt, dan is het mogelijk dat de stof in het gemeten temperatuurbereik ontleedt.

1.6.4.2.

1. Voor het hier beschreven apparaat wordt de dampspanning direct bepaald uit de impuls op de schaal (hiervoor hoeft de molecuulmassa niet bekend te zijn (2)). Er dient wel rekening gehouden te worden met geometrische factoren zoals de ovenopening en de hoek van de molecuulstroom bij het verwerken van de metingen.

2. Tegelijkertijd kan de massa van het condensaat worden gemeten zodat de verdampingssnelheid hieruit kan worden berekend. De dampspanning kan ook worden berekend uit de verdampingssnelheid en de molecuulmassa door gebruik te maken van de vergelijking van Herz (2):

1.6.5. Effusiemethode: Door middel van gewichtsafname

1.6.5.

1.6.5.1. Apparatuur Het uitstroomapparaat bestaat uit de volgende basisonderdelen: In figuur 5 wordt een elektrisch verwarmde aluminium vacuümtank met 4 roestvrijstalen uitstroomcellen als voorbeeld afgebeeld. De roestvrijstalen folie van ongeveer 0,3 mm dikte heeft een uitstroomopening van 0,2 tot 1,0 mm doorsnede en is verbonden met de uitstroomcel via een van schroefdraad voorzien deksel.

een tank die van een thermostaatregeling voorzien kan worden en waarin de effusiecellen zijn geplaatst;

een hoogvacuümpomp (bijvoorbeeld een diffusiepomp of een turbomoleculaire pomp) met vacuümmeter;

een val met gebruik van vloeibaar stikstof of droog ijs.

1.6.5.2. Meetprocedure De ijk- en teststoffen worden in elke uitstroomcel gebracht, het metalen diafragma met de opening wordt vastgeschroefd met behulp van het deksel, elke cel wordt gewogen met een nauwkeurigheid van 0,1 mg. De cel wordt in het van een thermostaat voorziene apparaat geplaatst, dat vervolgens wordt afgepompt tot beneden een tiende van de te verwachten druk. Met vaste tussenpozen van 5 tot 30 uur wordt lucht in het apparaat gelaten en de afname van de massa van de uitstroomcel wordt bepaald door een nieuwe weging. Om zeker te zijn dat de resultaten niet beïnvloed worden door vluchtige verontreinigingen, wordt de cel opnieuw gewogen met vaste tussenpozen om te controleren of de verdampingssnelheid constant blijft over ten minste twee zulke perioden. De dampspanning p in de uitstroomcel wordt gegeven door: p = mKAt2 π RTM waarin: p dampspanning (Pa) m massa van de stof die de cel verlaat tijdens tijd t (kg) t tijd (s) A oppervlakte van de opening (m2) K correctiefactor R universele gasconstante (J mol-1 K-1) T temperatuur (K) M molecuulmassa (kg mol-1). De correctiefactor K is afhankelijk van de verhouding van de lengte tot de straal van de cilindrische opening: verhouding: 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K: 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 De bovenstaande vergelijking kan ook geschreven worden als: p = E mtTM waarin E = 1KA2πR Deze effusiecelconstante E kan bepaald worden met behulp van ijkstoffen (2,9) via de volgende vergelijking: E = p(r)tmM(r)T waarin: p(r) dampspanning van de ijkstof (Pa) M(r) molecuulmassa van de ijkstof (kg mol-1).

1.6.6. Gasverzadigingsmethode

1.6.6.

1.6.6.1. Apparatuur De apparatuur voor deze test bestaat uit de onderdelen zoals afgebeeld in figuur 6a en zoals hieronder beschreven (1).

1.6.6.1. Inert gas:

Het dragergas mag niet chemisch met de te onderzoeken stof reageren. Stikstof voldoet meestal, maar in een enkel geval kan een ander gas nodig zijn (10). Het gebruikte gas moet droog en schoon zijn (zie figuur 6a, onderdeel 4: relatieve vochtigheidsmeter).

Regeling van de gasstroom:

Voor het instellen van een constante gasstroom door de verzadigingskolom is een gasregelingssysteem nodig.

Dampvallen:

De keuze van het type dampval hangt af van de eigenschappen van het monster en de gekozen analysemethode. De damp moet kwantitatief worden opgevangen in een vorm waarin vervolgens analyse mogelijk is. Voor sommige stoffen zuilen dampvallen met een vloeistof zoals hexaan of ethyleenglycol geschikt zijn. Voor andere stoffen zijn vaste adsorbentia meer geschikt. Als een alternatief voor dampvallen met daarop volgende analyse kunnen in serie gezette analytische technieken zoals chromatografie gebruikt worden om de hoeveelheid stof, die door een bekende hoeveelheid dragergas wordt verplaatst, te meten. Verder kan ook het massaverlies van het monster gemeten worden.

Warmtewisselaar:

Voor metingen bij verschillende temperaturen kan het noodzakelijk zijn om een warmtewisselaar in de opstelling aan te brengen.

Verzadigingskolom:

De te onderzoeken stof wordt, vanuit een oplossing, op een geschikte inerte drager gebracht. De aldus beladen drager wordt in een verzadigingskolom gebracht; de afmetingen van de kolom en de stroomsnelheid van het dragergas moeten een volledige verzadiging van het dragergas verzekeren. De verzadigingskolom moet zijn voorzien van een thermostaatregeling. Voor metingen boven kamertemperatuur moet het gedeelte tussen de verzadigingskolom en de dampvallen worden verwarmd om te voorkomen dat de te onderzoeken stof daar condenseert. Om her verplaatsen van de stofmassa door diffusie te verminderen, kan een capillair achter de verzadigingskolom geplaatst worden (figuur 6b).

1.6.6.2. Meetprocedure

1.6.6.2. Bereiding van de verzadigingskolom:

Een oplossing van de te onderzoeken stof in een zeer vluchtig oplosmiddel wordt toegevoegd aan een geschikte hoeveelheid dragermateriaal. Er moet voldoende te onderzoeken stof worden toegevoegd om gedurende de gehele proef verzadiging te verzekeren. Het oplosmiddel wordt volledig afgedampt aan de lucht of in een roterende verdamper, waarna het grondig gemengde materiaal in de verzadigingskolom wordt gebracht. Nadat het monster op de gewenste temperatuur is gebracht, wordt droge stikstof door de apparatuur geleid.

Meting:

De dampvallen of in serie geplaatste detectors worden verbonden met de uitstroomleiding van de kolom en de tijd wordt geregistreerd. De stroomsnelheid wordt aan het begin en op gezette tijden gedurende het experiment gecontroleerd met behulp van een bellenteller (of continu met een massastroommeter). De druk bij de uitgang van de verzadigingskolom moet worden gemeten: De tijd die nodig is om de voor de verschillende analysemethoden vereiste hoeveelheid stof op te vangen, wordt bepaald aan de hand van inleidende proeven of schattingen. Als alternatief voor het opvangen van de stof voor verdere analyse kan een in serie gekoppelde kwantitatieve analytische techniek gebruikt worden (bijvoorbeeld chromatografie). Voordat de dampdruk bij een bepaalde temperatuur wordt berekend, moeten inleidende proeven worden uitgevoerd om de maximale stroomsnelheid te bepalen waarbij het dragergas volledig verzadigd zal worden met de damp van de te onderzoeken stof. Dit is het geval als het dragergas zo langzaam door de verzadiger wordt geleid, dat een nog geringere snelheid geen grotere berekende dampdruk geeft. De te gebruiken analysemethode (bijvoorbeeld gaschromatografie of gravimetrie) hangt af van de aard van de te onderzoeken stof. De hoeveelheid stof, die door een bekend volume dragergas wordt getransporteerd, wordt bepaald.

a)

ofwel door een manometer tussen de verzadigingskolom en de dampvallen te plaatsen (dit kan onbevredigend zijn vanwege de vergroting van de dode ruimte en het adsorberende oppervlak);

b)

ofwel door in een afzonderlijk experiment de drukvervallen over het gebruikte opvangsysteem te bepalen als functie van de stroomsnelheid (dit kan onbevredigend zijn bij gebruik van vloeistofvallen).

1.6.6.3. Berekening van de dampspanning De dampspanning wordt berekend uit de dampdichtheid, W/V, met behulp van de vergelijking: p = WV × RTM waarin p dampspanning (Pa) W massa van de verdampte teststof (kg) V volume verzadigd gas (m3) R universele molaire gasconstante (J mol-1 K-1) T temperatuur (K) M molaire massa van de teststof (g mol-1) De gemeten volumes moeten worden gecorrigeerd voor druk- en temperatuurverschillen tussen de stroomsnelheidsmeter en de verzadigingskolom die met een thermostaat op constante temperatuur gehouden wordt Als de stroomsnelheidsmeter zich achter de dampval bevindt, kan het nodig zijn te corrigeren voor bestanddelen die uit de val verdampt zijn (1).

1.6.7. Draaiende rotor (8, 11, 13)

1.6.7.

1.6.7.1. Apparatuur De draaiende rotortechniek kan worden uitgevoerd met behulp van een draaiende-rotor-viscositeitsmeter zoals afgebeeld in figuur 8. Een schematische tekening van de experimentele opstelling wordt getoond in figuur 7. De meetapparatuur bestaat meestal uit een meetkop met draaiende rotor, geplaatst in een van thermostaatregeling voorziene ruimte (geregeld op 0,1 oC). De monsterhouder wordt in een van een thermostaatregeling voorziene ruimte (geregeld op 0,01 oC) gebracht, en om condensatie te voorkomen, worden alle andere onderdelen van de opstelling op een hogere temperatuur gehouden. Een hoogvacuümpomp wordt aan het toestel verbonden door middel van hoogvacuümkranen. De meetkop met draaiende rotor bestaat uit een stalen kogel (4 tot 5 mm doorsnede) in een buis. De kogel zweeft stabiel in een magnetisch veld, opgewekt met een combinatie van permanente magneten en controlespoelen. De kogel wordt aan het draaien gebracht door rotatie van de velden. De rotatiesnelheid kan worden bepaald met meetspoelen, die de altijd aanwezige geringe zijdelingse magnetisatie van de kogel meten.

1.6.7.2. Meetprocedure Als de kogel een bepaalde draaisnelheid v(o) (gewoonlijk ongeveer 400 toeren per seconde) heeft bereikt, wordt de energietoevoer gestopt waardoor een vertraging van de draaisnelheid optreedt, die het gevolg is van de gaswrijving. De afname van de rotatiesnelheid wordt gemeten als functie van de tijd. Als de wrijving door de magnetische ophanging verwaarloosd kan worden ten opzichte van de wrijving van het gas, wordt de gasdruk p gegeven door: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) waarin : c— gemiddelde snelheid van de gasmoleculen r straal van de kogel ρ soortelijke massa van de kogel σ coëfficiënt van de overdracht van het tangentieel moment (o = 1 voor een ideaal boloppervlak van de kogel) t tijd v(t) rotatiesnelheid na tijd t v(o) beginrotatiesnelheid. Deze vergelijking kan ook geschreven worden als: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 waarin tn, tn-1 de tijd voorstelt die nodig is voor een gegeven aantal omwentelingen N. Deze tijdsintervallen tn en tn-1 volgen elkaar op waarbij tn > tn-1 . De gemiddelde snelheid van het gasmolecuul c— wordt gegeven door: c— = 8 RTπ M12 waarin: T temperatuur R universele molaire gasconstante M molaire massa.

2. GEGEVENS In elk van de voorafgaande methoden moet de dampspanning ten minste bij twee temperaturen worden bepaald. Bepaling van de dampspanning bij drie of meer temperaturen in het bereik van 0 tot 50 oC verdient de voorkeur, aangezien men dan kan controleren of de dampspanningskromme lineair is.

3. RAPPORTAGE In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen: Indien een verandering (faseovergang, ontleding) in de onderzochte stof werd waargenomen, dient het testrapport in het bijzonder de volgende gegevens te bevatten: Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.

de gebruikte methode;

de nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en indien van toepassing, voorafgaande zuivering;

ten minste twee waarden voor de dampspanning en de bijbehorende temperaturen, bij voorkeur in het bereik van 0 tot 50 oC;

alle ruwe gegevens;

grafiek van log p tegen 1/T;

geschatte waarde van de dampspanning bij 20 of 25 oC.

aard van de verandering;

temperatuur waarbij de verandering optreedt bij atmosferische druk;

dampspanning bij 10 oC respectievelijk 20 oC beneden de overgangstemperatuur en bij 10 oC respectievelijk 20 oC boven de overgangstemperatuur (tenzij het een overgang is van vaste fase naar gasfase).

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)

LITERATUUR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104. Decision of the Council C(81) 30 Final. Ambrose, D., in B. Le Neindre, B. Vodar (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry. Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M.: Ann. Phys. Lpz., 1909, Vol. 29, 1979; 1911, Vol. 34, 593. NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 10 PA5 — Static method. NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa — Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure/temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Röhl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol., (A), 1987, Vol. 5 (4), 2440. Ambrose, D., Lawrenson, I. J., Sprake, C. H. S. J. Chem. Thermodynamics 1975, Vol. 7, 1173. B. F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, Vol. 85, 435. G. Comsa, J. K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, Vol. 17 (2), 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, Vol. 20 (4), 1148. J. K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol., (A), 1985, Vol. 3 (3), 1715.

A.5. OPPERVLAKTESPANNING

A.5.

1. METHODE De beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in referentie (2).

1.

1.1. INLEIDING De hier beschreven methoden zijn geschikt voor de bepaling van de oppervlaktespanning van waterige oplossingen. Voor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de oplosbaarheid in water, de structuur, de hydrolyseerbaarheid en de kritische concentraties voor de vorming van micellen. De hieronder beschreven methoden zijn geschikt voor de meeste chemische stoffen, ongeacht de zuiverheid ervan. Bepaling van de oppervlaktespanning met behulp van de ringspanningsmeter is alleen mogelijk voor waterige oplossingen met een dynamische viscositeit van minder dan ongeveer 200 mPa s.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN De vrije-oppervlakte-enthalpie per oppervlakte-eenheid heet de oppervlaktespanning. De oppervlaktespanning wordt uitgedrukt in N/m (SI-eenheid) of in m N/m (SI-subeenheid). 1 N/m = 103 dyne/cm 1 mN/m = 1 dyne/cm in het verouderde cgs-systeem.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN De methoden berusten op de meting van de maximale kracht die verticaal moet worden uitgeoefend op een beugel of een ring die het oppervlak van de te onderzoeken vloeistof in een meetbak raakt, om deze beugel of ring van dit oppervlak te scheiden, of op een plaat waarvan een rand het oppervlak raakt, om de vloeistoflaag die zich heeft gevormd op te trekken. Stoffen die oplosbaar zijn in water met een concentratie van ten minste 1 mg/l worden getest in waterige oplossingen bij één concentratie.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Deze methoden zijn nauwkeuriger dan waarschijnlijk voor milieubeoordelingsdoeleinden noodzakelijk is.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN De stof wordt opgelost in gedestilleerd water. De concentratie van deze oplossing moet 90 % van die van een verzadigde oplossing in water bedragen. Indien deze concentratie de 1 g/l overschrijdt, wordt een oplossing van 1 g/l gebruikt voor de bepaling. Stoffen met een oplosbaarheid in water van minder dan 1 mg/l hoeven niet te worden onderzocht.

1.6.

1.6.1. Plaatmethode Zie ISO 304 en NF T 73-060 (Surface Active Agents — Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films).

1.6.2. Beugelmethode Zie ISO 304 en NF T 73-060 (Surface Active Agents — Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films).

1.6.3. Ringmethode Zie ISO 304 en NF T 73-060 (Surface Active Agents — Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films).

1.6.4. Geharmoniseerde ringmethode (OESO)

1.6.4.

1.6.4.1. Apparatuur In de handel verkrijgbare spanningsmeters kunnen voor deze metingen worden gebruikt. Zij bestaan uit:

draaitafeltje;

systeem voor het meten van de kracht;

meetlichaam (ring);

meetvat.

1.6.4.1.

1.6.4.1.1. Draaitafeltje Het draaitafeltje wordt gebruikt als draagvlak voor het meetvat met temperatuurregeling, waarin de te onderzoeken stof zich bevindt. Tezamen met het systeem voor het meten van de kracht is het draaitafeltje aan een rek gemonteerd.

1.6.4.1.2. Systeem voor het meten van de kracht Het systeem voor het meten van de kracht (zie figuur) bevindt zich boven het draaitafeltje. De fout bij het meten van de kracht mag niet meer bedragen dan ± 10-6 N, hetgeen overeenkomt met een foutgrens van ±0,1 mg in een massameting. De meetschaal van de in de handel verkrijgbare tensiometers is meestal geijkt in mN/m zodat de oppervlaktespanning met een nauwkeurigheid van 0,1 mN/m rechtstreeks in mN/m kan worden afgelezen.

1.6.4.1.3. Meetlichaam (ring) De ring bestaat meestal uit een draad van platina-iridium met een dikte van ongeveer 0,4 mm en een gemiddelde omtrek van 60 mm. De ring wordt horizontaal opgehangen aan een metalen stift en een ophangsysteem om de verbinding met het krachtmeetsysteem tot stand te brengen (zie figuur).

1.6.4.1.3. Figuur Meetlichaam

(alle maten in mm) Ophangsysteem Stift Ring

1.6.4.1.4. Meetvat Voor de te onderzoeken oplossing wordt een glazen meetvat met temperatuurregeling gebruikt. Het meetvat dient zo te zijn ontworpen dat tijdens de meting de temperatuur van de testvloeistof en de gasfase daarboven constant is en dat het monster niet kan verdampen. Ronde glazen bekers met een inwendige doorsnede van ten minste 45 mm zijn aanvaardbaar.

1.6.4.2. Voorbereiding van het apparaat

1.6.4.2.

1.6.4.2.1. Schoonmaken Glazen vaten dienen zorgvuldig te worden schoongemaakt. Zo nodig moeten zij worden gespoeld met heet chroomzuur en vervolgens met stroperig fosforzuur (83 tot 98 gewichtsprocent H3PO4), dan grondig gespoeld met leidingwater, uitgewassen met tweemaal gedestilleerd water tot een neutrale pH, en vervolgens gedroogd of omgespoeld met een gedeelte van de te onderzoeken vloeistof. De ring wordt eerst zorgvuldig in water gespoeld ten einde wateroplosbare stoffen te verwijderen, daarna kort in chroomzuur gedompeld, in tweemaal gedestilleerd water gewassen tot een neutrale pH is bereikt en ten slotte kort verhit boven een methanolvlam. NB: Verontreinigende stoffen zoals siliconen die niet in chroomzuur of fosforzuur oplossen, dienen met een geschikt organisch oplosmiddel te worden verwijderd.

1.6.4.2.2. IJking van het apparaat Bij de validering van het apparaat wordt het nulpunt gecontroleerd en zodanig ingesteld dat met de uitslag van de wijzer een nauwkeurige bepaling in mN/m mogelijk is.

1.6.4.2.2. Opstellen:

Het apparaat wordt, bijvoorbeeld met behulp van een waterpas aan de onderzijde van de tensiometer, horizontaal opgesteld; hiertoe wordt gebruik gemaakt van de schroeven aan de onderzijde van het apparaat.

Instelling van het nulpunt:

Na het aanbrengen van de ring aan het apparaat en alvorens deze in de vloeistof te dompelen wordt de wijzer van de tensiometer op nul gezet en wordt nagegaan of de ring evenwijdig aan het vloeistofoppervlak loopt. Hierbij kan het vloeistofoppervlak als spiegel worden gebruikt.

IJking:

Het ijken kan op twee manieren geschieden:

a)

Met behulp van een massa; hierbij worden ruiters met een bekende massa van 0,1 tot 1,0 g op de ring aangebracht; de ijkfactor Фa, waarmee alle afgelezen waarden moeten worden vermenigvuldigd, wordt bepaald met behulp van de volgende vergelijking (1): Φa=σrσa (1) waarin: σr=mg2b (mN/m) m massa van de ruiter (g) g versnelling door de zwaartekracht (981 cm s-2 op zeeniveau) b gemiddelde omtrek van de ring (in cm) σa uitslag van de tensiometer na het plaatsen van de ruiter op de ring (mN/m).

b)

Met behulp van water; hierbij wordt gebruik gemaakt van zuiver water met een oppervlaktespanning van bijvoorbeeld 72,3 mN/m bij 23 oC; deze procedure verloopt weliswaar vlotter dan die met de ruiters, maar houdt steeds het gevaar in dat de oppervlaktespanning van het water onjuist is door de aanwezigheid van sporen oppervlakteactieve stoffen. De ijkfactor, Фb, waarmee alle meetresultaten moeten worden vermenigvuldigd, wordt bepaald met behulp van de volgende vergelijking (2): Φb=σoσg (2) waarin: σo literatuurwaarde voor de oppervlaktespanning van water (mN/m), σg gemeten waarde voor de oppervlaktespanning van het water (mN/m) beide bij dezelfde temperatuur.

1.6.4.3. Bereiding van de monsters De te onderzoeken stoffen worden tot de gewenste concentraties in water opgelost; er mogen geen onoplosbare stoffen in het water voorkomen. De oplossing moet op constante temperatuur worden gehouden (±0,5 oC). Aangezien de oppervlaktespanning van een oplossing in het meetvat met de tijd verandert, moeten er op verschillende tijdstippen metingen worden verricht en moet van de resultaten een kromme worden uitgezet waaruit het verloop van de oppervlaktespanning als functie van de tijd blijkt. Zodra geen verdere wijzigingen meer worden waargenomen, is er een evenwichtstoestand bereikt. Stof en gasvormige verontreinigingen beïnvloeden het resultaat van de meting. De meting dient derhalve te worden verricht onder een scherm.

1.6.5. Testomstandigheden De metingen dienen plaats te vinden bij ongeveer 20 oC en de temperatuur dient op ±0,5 oC na constant te zijn.

1.6.6. Uitvoering van de proef De te meten oplossingen dienen in het zorgvuldig schoongemaakte meervat te worden overgebracht waarbij schuimvorming wordt vermeden; vervolgens wordt het meetvat op de tafel van het testapparaat geplaatst. Het tafelblad met het meetvat wordt omhoog gebracht tot de ring is gedompeld onder het oppervlak van de te onderzoeken oplossing. Vervolgens laat men het tafelblad geleidelijk en regelmatig (met een snelheid van ongeveer 0,5 cm/min) zakken om de ring van het oppervlak vrij te maken, tot de maximale kracht is bereikt. De vloeistoflaag die aan de ring hangt, mag de ring niet loslaten. Na de meting wordt de ring weer onder het oppervlak gedompeld en wordt de meting herhaald tot een constante waarde voor de oppervlaktespanning is bereikt. Bij iedere bepaling dient de tijd, die verlopen is sinds het overbrengen van de vloeistof naar het meetvat, te worden genoteerd. De meter wordt afgelezen op het moment van de maximale kracht die vereist is om de ring van het oppervlak van de vloeistof los te trekken.

2. Tabel Correctie van de gemeten oppervlaktespanning Uitsluitend voor waterige oplossingen, p ≈ 1 g/cm3

GEGEVENS Ter berekening van de oppervlaktespanning wordt de van het apparaat afgelezen waarde in mN/m eerst vermenigvuldigd met de ijkfactor Фa of Фb (afhankelijk van de toegepaste ijkprocedure). Dit leidt tot een waarde die slechts bij benadering juist is en daarom nog verder moet worden gecorrigeerd. Harkins en Jordan (4) hebben langs empirische weg correctiefactoren bepaald voor oppervlaktespanningen die met de ringmethode zijn gemeten; deze correctiefactoren zijn afhankelijk van de afmetingen van de ring, de dichtheid van de vloeistof en de oppervlaktespanning. Het is tamelijk omslachtig om de correctiefactor voor iedere meting afzonderlijk met behulp van de tabellen van Harkins en Jordan te bepalen voor de berekening van de oppervlaktespanning; daarom kan voor waterige oplossingen gebruik worden gemaakt van een vereenvoudigde procedure waarbij de gecorrigeerde waarden voor de oppervlaktespanning rechtstreeks uit de volgende tabel worden afgelezen (tussenliggende waarden worden via interpolatie verkregen). R = 9,55 mm (gemiddelde straal van de ring) r = 0,185 mm (straal van de draad van de ring) Gemeten waarde Gecorrigeerde waarde (mN/m) (IJking met massa (zie 1.6.4.2.2 (a)) IJking met water (zie 1.6.4.2.2 (b)) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Deze tabel werd opgesteld aan de hand van de correctie volgens Harkins en Jordan en overeenkomstig de DIN-normen (DIN 53914) voor water en waterige oplossingen (met een dichtheid van p = 1 g/cm3) en voor in de handel verkrijgbare ringen met afmetingen R = 9,55 mm (gemiddelde straal van de ring) en r = 0,185 mm (straal van de draad van de ring). De tabel geeft de gecorrigeerde waarden voor oppervlaktespanningsmetingen die werden uitgevoerd na ijking met massa of met water. Volgens een alternatieve methode zonder voorafgaande ijking kan de oppervlaktespanning als volgt worden berekend: σ=f × F4πR waarin: F de kracht die op de dynamometer wordt afgelezen bij het breken van de film R de straal van de ring f de correctiefactor (1).

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFENEMINGEN In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

gebruikte testmethode;

gebruikt type water of oplossing;

nauwkeurige specificatie van de stoffen (beschrijving en verontreinigingen);

meetresultaten: afgelezen oppervlaktespanning waarbij zowel de afzonderlijke resultaten als het rekenkundig gemiddelde daarvan moet worden vermeld, alsmede het gecorrigeerde gemiddelde (waarbij rekening is gehouden met de correctiefactór voor het apparaat en de correctietabel);

concentratie van de oplossing;

temperatuur bij de meting;

ouderdom van de gebruikte oplossing, en met name de tijd tussen de bereiding en de meting van de oplossing;

beschrijving van de tijdafhankelijkheid van de oppervlaktespanning, na het overbrengen van de oplossing in het meetvat;

alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, en met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de stof.

3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN Met het oog op het feit dat gedestilleerd water een oppervlaktespanning heeft van 72,75 mN/m bij 20 oC, dienen stoffen met een oppervlaktespanning van minder dan 60 mN/m, zoals gemeten met deze methode, beschouwd te worden als oppervlakteactieve stoffen.

4.(1)(2)(3)(4)

LITERATUUR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115 — Decision of the Council C(81) 30 Final. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ. New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV. Pure Appl. Chem., 1976, Vol. 48, 511. Harkins, W. D., Jordan, H. F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, Vol. 52, 1751.

A.6. OPLOSBAARHEID IN WATER

A.6.

1. METHODE De beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1).

1.

1.1. INLEIDING Voor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de structuurformule, de dampspanning, de dissociatieconstanten en de hydrolyse (als functie van de pH) van de stof. Er bestaat niet één methode waarmee alle mogelijke waarden van de oplosbaarheid in water kunnen worden onderzocht. De twee hieronder beschreven meetmethoden beslaan alle mogelijke waarden van de oplosbaarheid maar zijn niet van toepassing op vluchtige stoffen: De oplosbaarheid in water van de te onderzoeken stof kan aanzienlijk worden beïnvloed door de aanwezigheid van verontreinigingen.

de eerste methode wordt aangeduid als de kolom-elutie-methode en is van toepassing op chemisch zuivere stoffen met een geringe oplosbaarheid (< 10-2 g/l), welke stabiel zijn in water;

de tweede methode wordt aangeduid als de methode met de kolf en is van toepassing op chemisch zuivere stoffen met een hogere oplosbaarheid (> 10-2 g/l), welke stabiel zijn in water.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN De oplosbaarheid van een stof in water wordt opgegeven als de massaconcentratie van de stof in een verzadigde oplossing in water bij een gegeven temperatuur. De oplosbaarheid in water wordt uitgedrukt in eenheden massa per volume oplossing. De SI-eenheid is kg/m3 (g/l kan ook worden gebruikt).

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN De hoeveelheid van het monster en de tijd die nodig zijn om de verzadigingswaarde te bereiken, moeten bij benadering worden bepaald in een eenvoudige inleidende test.

1.4.

1.4.1. Kolom-elutie-methode Deze methode is gebaseerd op de elutie van de te onderzoeken stof met water uit een microkolom welke is gevuld met een inert dragermateriaal zoals glasparels of zand, gedekt met een overmaat aan de te onderzoeken stof. De oplosbaarheid in water is bepaald zodra de massaconcentratie van het eluaat constant is. Dit blijkt uit een constante concentratiewaarde als functie van de tijd.

1.4.2. Methode met de kolf Bij deze methode wordt de stof (vaste stoffen moeten worden fijngemaakt) opgelost in water bij een temperatuur die iets hoger is dan de testtemperatuur. Zodra verzadiging is bereikt wordt het mengsel afgekoeld en op de testtemperatuur gehouden, terwijl net zo lang wordt geroerd totdat er een evenwichtstoestand is bereikt. Als alternatief kan de meting rechtstreeks bij de testtemperatuur uitgevoerd worden, op voorwaarde dat men er, via geschikte monsternamen, zeker van is dat het verzadigingsevenwicht bereikt is. Vervolgens wordt de massaconcentratie van de stof in de waterige oplossing, welke geen onopgeloste deeltjes mag bevatten, bepaald aan de hand van een geschikte analysemethode.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

1.5.

1.5.1. Herhaalbaarheid Voor de kolom-elutie-methode kan < 30 % haalbaar zijn; voor de methode met de kolf dient < 15 % in acht te worden genomen.

1.5.2. Gevoeligheid Deze is afhankelijk van de analysemethode, maar het is mogelijk massaconcentraties te bepalen tot een waarde van 10-6 g/l.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN

1.6.

1.6.1. Testomstandigheden De test wordt bij voorkeur uitgevoerd bij 20 oC ±0,5 oC. Als wordt verwacht dat de oplosbaarheid temperatuurafhankelijk is (> 3 % per oC), dan wordt nog bij twee andere temperaturen gemeten, die ten minste 10 oC boven, respectievelijk 10 oC onder de eerste temperatuur liggen. In dit geval dient de temperatuurregeling op ±0,1 oC nauwkeurig te zijn. De gekozen temperatuur moet in alle betrokken delen van de apparatuur constant worden gehouden.

1.6.2. Inleidende test In een maatcylinder van 10 ml, voorzien van een glazen stop, wordt gedestilleerd water op kamertemperatuur toegevoegd aan ongeveer 0,1 g monster (vaste stoffen moeten worden fijngemaakt). Toenemende volumes gedestilleerd water worden stapsgewijze toegevoegd, volgens onderstaande tabel. 0,1 g opgeloste stof in x ml water 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Oplosbaarheid bij benadering (g/l) > 1000 1000-200 200-100 100-50 50-10 10-1 < 1 Nadat de aangegeven hoeveelheid water is toegevoegd, wordt het mengsel telkens gedurende tien minuten hard geschud en vervolgens visueel onderzocht op eventuele onopgeloste delen van het monster. Als het monster of delen ervan onopgelost zijn nadat nog 10 ml water is toegevoegd, dient het experiment te worden herhaald in een maatcilinder van 100 ml met grotere volumes water. De tijd die nodig is om een stof op te lossen kan bij lagere waarden van de oplosbaarheid aanzienlijk langer zijn (minimaal 24 uur dient in acht te worden genomen). De benaderde waarde van de oplosbaarheid is in de tabel vermeld onder de hoeveelheid water waarin het monster geheel wordt opgelost. Als de stof nog steeds onoplosbaar blijkt moet meer dan 24 uur gewacht worden (maximaal 96 uur), of dient verdere verdunning plaats te vinden om te bepalen of de kolom-elutie-methode dan wel de methode met de kolf moet worden gebruikt.

1.6.3. Kolom-elutie-methode

1.6.3.

1.6.3.1. Dragermateriaal, oplosmiddel en eluens Het dragermateriaal voor de kolom-elutie-methode moet inert zijn. Bruikbare materialen zijn bijvoorbeeld glasparel en zand. Voor het aanbrengen van de te onderzoeken stof op het dragermateriaal dient gebruik te worden gemaakt van een geschikt vluchtig en analytisch zuiver oplosmiddel. Als eluens dient water, dat tweemaal gedestilleerd is in glas- of kwartsapparatuur, te worden gebruikt. Opmerking: Er mag geen gebruik worden gemaakt van water dat rechtstreeks uit een organische ionenwisselaar komt.

1.6.3.2. Laden van het dragermateriaal Ongeveer 600 mg dragermateriaal wordt afgewogen en overgebracht in een rondbodemkolf van 50 ml. Een afgewogen hoeveelheid van de te onderzoeken stof wordt opgelost in het gekozen oplosmiddel. De juiste hoeveelheid van deze oplossing wordt bij het dragermateriaal gevoegd. Het oplosmiddel moet, bijvoorbeeld in een roterende verdamper, volledig worden verdampt. Bij onvolledige verwijdering van het oplosmiddel kan het dragermateriaal, ten gevolge van verdelingseffecten aan het oppervlak, later niet worden verzadigd met water. Het laden van het dragermateriaal kan aanleiding geven tot problemen (onjuiste resultaten) als de te onderzoeken stof wordt afgezet als olie of in een andere kristalvorm. Dit probleem moet experimenteel worden onderzocht en de bijzonderheden moeten worden gerapporteerd. Het beladen dragermateriaal wordt gedurende ongeveer twee uur bevochtigd in ongeveer 5 ml water, waarna de suspensie wordt aangebracht op de microkolom. Anderzijds kan men ook het droge, beladen dragermateriaal direct in de met water gevulde microkolom brengen, en daarna ongeveer twee uur wachten totdat een evenwichtstoestand is ontstaan.

1.6.3.2. Testprocedure:

De stof kan op twee verschillende manieren van het dragermateriaal worden geëlueerd:

recirculatiepomp (zie figuur 1);

voorraadfles (zie figuur 4).

1.6.3.3. Kolom-elutie-methode met recirculatiepomp

1.6.3.3. Apparatuur

Een schema van het systeem is afgebeeld in figuur 1. In figuur 2 is een geschikte microkolom afgebeeld: elke maat is echter aanvaardbaar mits deze voldoet aan de criteria voor reproduceerbaarheid en gevoeligheid. De kolom moet aan de bovenzijde zijn voorzien van een reservoir voor ten minste vijf kolomvolumina water, en moet minimaal vijf monsters kunnen bevatten. Eventueel kunnen de afmetingen worden verminderd indien extra oplosmiddel wordt gebruikt ter vervanging van de eerste vijf kolomvolumina welke met verontreinigingen worden afgevoerd. De kolom moet worden aangesloten op een recirculatiepomp waarmee een debiet van ongeveer 25 ml/uur kan worden ingesteld. De pomp wordt aangesloten door middel van polytetrafluorethyleen (PTFE) en/of glazen verbindingsstukken. De kolom en de pomp moeten zo worden opgesteld dat het mogelijk is om monsters te nemen van de uitstromende vloeistof en om het reservoir in evenwicht te houden met de atmosferische druk. Het kolommateriaal wordt ondersteund door een kleine (5 mm) prop glaswol waarmee ook deeltjes worden weggefilterd. Als recirculatiepomp kan bijvoorbeeld een peristaltische pomp of een membraanpomp worden gebruikt (er moet op worden toegezien dat aan de slangwand geen verontreiniging en/of adsorptie plaatsvindt).

Meetprocedure

De stroming door de kolom wordt op gang gebracht. Een debiet van ongeveer 25 ml/uur (dit komt overeen met ongeveer 10 kolomvolumina/uur voor de beschreven kolom) wordt aanbevolen. De eerste vijf kolomvolumina (minimaal) worden afgevoerd om wateroplosbare verontreinigingen te verwijderen. Vervolgens wordt de recirculatiepomp aan de onderzijde van de kolom aangesloten. De apparatuur blijft in werking totdat een evenwichtstoestand is bereikt; hiervoor geldt dat de concentraties in vijf opeenvolgende monsters niet meer dan ± 30 % mogen verschillen op aselecte wijze. Tussen de tijdstippen, waarop deze monsters worden genomen, moeten ten minste 10 kolomvolumina van het eluens passeren.

1.6.3.4. Kolom-elutie-methode met voorraadfles

1.6.3.4. Apparatuur (zie figuren 3 en 4)

Voorraadfles: voor aansluiting van de voorraadfles wordt gebruik gemaakt van een rond glazen slijpstuk en polytetrafluorethyleenslangen. Een debiet van ongeveer 25 ml/uur wordt aanbevolen. Er wordt een aantal opeenvolgende monsters van het eluaat genomen voor analyse volgens de gekozen methode.

Meetprocedure

In het middengebied van het eluaat, wanneer de concentraties constant zijn (± 30 %) in ten minste vijf opeenvolgende fracties, worden deze fracties gebruikt om de oplosbaarheid in water te bepalen. In beide gevallen (circulatiepomp of voorraadfles) moet een tweede reeks metingen worden verricht waarbij het debiet de helft is van de aanvankelijke waarde. Als de resultaten van beide series metingen overeenstemmen, worden de testresultaten geaccepteerd. Als de oplosbaarheid bij het laagste debiet hoger blijkt, dan moet het halveren van het debiet worden voortgezet, totdat twee opeenvolgende series metingen dezelfde oplosbaarheid geven. In beide gevallen (circulatiepomp of voorraadfles) moeten de monsters aan de hand van het Tyndall-effect (verstrooiing van licht) worden gecontroleerd op aanwezigheid van deeltjes in colloïdale toestand. De aanwezigheid van dergelijke deeltjes maakt de resultaten ongeldig, zodat de test moet worden herhaald nadat de filterwerking van de kolom is verbeterd. De pH van elk monster moet worden geregistreerd. Er moet een tweede serie metingen worden uitgevoerd bij dezelfde temperatuur.

1.6.4. Methode met de kolf

1.6.4.

1.6.4.1. Apparatuur Voor de methode met de kolf is het volgende materiaal nodig:

gangbaar laboratoriumglaswerk en -apparatuur;

een apparaat om de oplossingen in beweging te brengen bij constante temperatuur;

zo nodig voor emulsies een centrifuge (bij voorkeur met thermostaat);

apparatuur voor analytische bepaling.

1.6.4.2. Meetprocedure Aan de hand van de inleidende test wordt bepaald hoeveel materiaal nodig is om de gewenste hoeveelheid water te verzadigen. De benodigde hoeveelheid water hangt af van de analysemethode en van de oplosbaarheid. In drie van een glazen stop voorziene glazen vaten (bijvoorbeeld centrifugebuizen, kolven) wordt telkens ongeveer vijfmaal de aldus bepaalde hoeveelheid materiaal afgewogen. De gewenste hoeveelheid water wordt in elk vat gegoten, waarna de vaten goed worden afgesloten. De afgesloten vaten worden vervolgens bij een temperatuur van 30 oC in beweging gebracht. (Hiervoor wordt een schud- of roermachine gebruikt waarmee bij constante temperatuur kan worden gewerkt, bijvoorbeeld een magneetroerder in een waterbak met thermostaatregeling.) Na één dag wordt één van de vaten verwijderd, waarna onder af en toe roeren 24 uur wordt gewacht totdat bij de testtemperatuur een nieuwe evenwichtstoestand is ontstaan. Vervolgens wordt de inhoud van het vat gecentrifugeerd bij de testtemperatuur, waarna de concentratie van de teststof in de heldere waterige oplossing analytisch wordt bepaald. De beide andere kolven ondergaan dezelfde behandeling nadat zij gedurende twee respectievelijk drie dagen bij 30 oC zijn geëquilibreerd. Als de waarden voor de concentratie in ten minste de laatste twee vaten voldoen aan de vereiste reproduceerbaarheid, worden de testresultaten geaccepteerd. Als de resultaten van de vaten 1, 2 en 3 toenemende waarden geven, moet de hele test worden herhaald, waarbij langer wordt gewacht tot een evenwichtstoestand is ontstaan. De meetprocedure kan ook worden uitgevoerd zonder voorverwarming bij 30 oC. Om de snelheid te kunnen schatten waarmee het verzadigingsevenwicht zich instelt, worden monsters genomen totdat blijkt dat verder roeren geen invloed meer heeft op de concentratie van de testoplossing. De pH van elk monster moet worden geregistreerd.

1.6.5. Analyse Hiervoor dient bij voorkeur een methode te worden toegepast waarmee verschillende stoffen kunnen worden onderscheiden, aangezien kleine hoeveelheden opgeloste verontreinigingen kunnen leiden tot grote fouten in de gemeten oplosbaarheid. Voorbeelden van zulke methoden zijn: gas- of vloeistofchromatografie, titratie, fotometrie, voltametrie.

2. GEGEVENS

2.

2.1. KOLOM-ELUTIE-METHODE Voor elke serie metingen moeten het gemiddelde en de standaardafwijking worden berekend van ten minste vijf opeenvolgende monsters, die op het verzadigingsniveau zijn genomen. De resultaten moeten worden opgegeven in eenheden massa per volume oplossing. De gemiddelden van twee metingen met verschillend debiet moeten worden vergeleken en moeten een herhaalbaarheid beter dan 30 % hebben.

2.2. METHODE MET DE KOLF Voor de drie kolven moeten de afzonderlijke resultaten worden vermeld en het gemiddelde van de als constant beschouwde resultaten (herhaalbaarheid beter dan 15 %) moet worden bepaald en opgegeven in eenheden massa per volume oplossing. Hiervoor kan het nodig zijn massa-eenheden om te rekenen naar volume-eenheden, waarbij rekening wordt gehouden met de dichtheid indien de oplosbaarheid zeer hoog is (> 100 g/l).

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. KOLOM-ELUTIE-METHODE Het rapport dient zo mogelijk de volgende gegevens te bevatten:

de resultaten van de inleidende test;

nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen);

de afzonderlijke concentraties, debieten en pH-waarden van elk monster;

het gemiddelde en de standaardafwijking van ten minste vijf monsters uit elke serie die zijn genomen op het verzadigingsniveau;

het gemiddelde van de twee opeenvolgende acceptabele series;

de temperatuur van het water tijdens het verzadigingsproces;

de toegepaste analysemethode;

de aard van het toegepaste dragermateriaal;

het laden van het dragermateriaal;

het gebruikte oplosmiddel;

elke gebleken chemische instabiliteit van de stof tijdens de test en de gebruikte methode;

alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof.

3.2. METHODE MET DE KOLF Het rapport dient zo mogelijk de volgende gegevens te bevatten:

de resultaten van de inleidende test;

nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen);

de afzonderlijke analyses en het gemiddelde, indien meer dan één waarde werd bepaald, voor iedere kolf;

de pH van elk monster;

het gemiddelde van de waarden voor de verschillende kolven die onderling overeenstemden;

de testtemperatuur;

de toegepaste analysemethode;

elke gebleken chemische instabiliteit van de stof tijdens de test en de gebruikte methode;

alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof.

4.(1)(2)(3) LITERATUUR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105 — Decision of the Council C(81) 30 Final. NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method. NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.

A.8. VERDELINGSCOËFFICIËNT

A.8.

1. METHODE De schudfles-methode berust op de testrichtlijn van de OESO (1).

1.

1.1. INLEIDING Voor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de structuurformule, dissociatieconstante, oplosbaarheid in water, hydrolyse, oplosbaarheid in n-octanol en oppervlaktespanning van de stof. Metingen van ioniseerbare stoffen dienen alleen te worden uitgevoerd met de niet-geïoniseerde vorm van de stof (vrij zuur of vrije base) verkregen met behulp van een geschikte buffer met een pH van minstens één pH-eenheid onder (vrij zuur) of boven (vrije base) de pK. Deze testmethode omvat twee verschillende procedures: de schudflesmethode en de hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). De eerste methode is toepasbaar wanneer de log Pow-waarde (zie verder voor definities) in het bereik van - 2 tot 4 valt, de tweede methode in het bereik van 0 tot 6. Alvorens een van beide experimentele procedures uit te voeren, dient eerst een voorlopige schatting van de verdelingscoëfficiënt te worden gemaakt. De schudflesmethode is alleen van toepassing op chemisch zuivere stoffen die oplosbaar zijn in water en n-octanol. De methode is niet van toepassing op oppervlakteactieve stoffen (waarvoor een berekende waarde of een raming, gebaseerd op de individuele oplosbaarheid in n-octanol en water, moet worden gerapporteerd). De HPLC-methode is niet toepasbaar op sterke zuren en basen, metaalcomplexen en oppervlakte-actieve stoffen die met het eluent kunnen reageren. Voor deze stoffen dient een berekende waarde of een raming, gebaseerd op de individuele oplosbaarheid in n -octanol en water, te worden gerapporteerd. De HPLC-methode is minder gevoelig voor de aanwezigheid van verontreinigingen in de teststof dan de schudflesmethode. Desondanks kunnen verontreinigingen soms de interpretatie van de resultaten bemoeilijken omdat moeilijk kan worden bepaald welke piek bij welke stof hoort. Voor mengsels die een band zonder resolutie geven, moeten de boven- en ondergrens van log P worden gerapporteerd.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN De verdelingscoëfficiënt (P) is gedefinieerd als de verhouding van de concentraties in evenwichtstoestand (Cj) van een opgeloste stof in een twee-fasensysteem bestaande uit twee niet-mengbare oplosmiddelen. Voor n-octanol en water: pow=cn-octanolcwater De verdelingscoëfficiënt (P) is daarom het quotiënt van twee concentraties; gewoonlijk wordt deze waarde opgegeven als een logaritme met grondtal tien (log P).

1.3. REFERENTIESTOFFEN

1.3. Schudflesmethode

Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.

HPLC-methode

Om de gemeten HPLC-gegevens van een stof te kunnen correleren met de P-waarde, moet een ijklijn worden gemaakt van log P tegen de chromatografische gegevens, met behulp van minstens 6 referentiepunten. De gebruiker dient de geschikte referentiestoffen te kiezen. Zo mogelijk dient de Pow-waarde van minstens één referentiestof boven, en die van minstens één referentiestof onder de Pow van de teststof te liggen. Voor log P-waarden kleiner dan 4 kan bij de ijking worden uitgegaan van met de schudflesmethode verkregen gegevens. Voor log P-waarden groter dan 4 kan de ijking worden uitgevoerd met behulp van gevalideerde waarden uit de literatuur, op voorwaarde dat deze overeenkomen met de berekende waarden. Voor een grotere nauwkeurigheid verdient het de voorkeur om referentiestoffen te kiezen die qua structuur verwant zijn aan de te onderzoeken stof. Er zijn uitgebreide lijsten beschikbaar met log Pow-waarden voor verschillende categorieën chemicaliën (2)(3). Als er geen gegevens over de verdelingscoëfficiēnt van structureel verwante stoffen beschikbaar zijn, mag een meer algemene ijking worden toegepast met andere ijkstoffen. In aanhangsel 2 wordt een lijst van aanbevolen ijkstoffen en hun Pow-waarden gegeven.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

1.4.

1.4.1. Schudflesmethode Om een verdelingscoëfficiënt te kunnen bepalen, moet een evenwichtstoestand zijn bereikt tussen alle componenten van het systeem; de concentraties van de opgeloste stoffen moeten vervolgens in beide fasen worden bepaald. Uit de literatuur blijkt dat er voor dit probleem, dat wil zeggen het grondig mengen van beide fasen gevolgd door fasescheiding ten einde de evenwichtsconcentraties van de te onderzoeken stof te bepalen, verschillende technische oplossingen bestaan.

1.4.2. HPLC-methode HPLC wordt uitgevoerd met analytische kolommen, gepakt met een in de handel verkrijgbare vaste fase, bestaande uit chemisch aan silica gebonden lange koolwaterstofketens (bijvoorbeeld C8, C18). Chemische stoffen die in deze kolommen geïnjecteerd worden, bewegen met verschillende snelheden door deze kolommen, wat een gevolg is van het verschil in verdeling tussen de mobiele fase en de stationaire koolwaterstoffase. Mengsels van stoffen worden geëlueerd in volgorde van waterafstotendheid, wateroplosbare stoffen het eerst en olieoplosbare stoffen het laatst, afhankelijk van hun koolwaterstof/water-verdelingscoëfficiënt. Op deze wijze kan de verhouding tussen de retentietijd in de (omgekeerde fase) kolom en de n-octanol/water-verdelingscoëfficiënt worden bepaald. De verdelingscoëfficiënt wordt afgeleid uit de capaciteitsfactor k, met de volgende formule: k=tR-toto waarin tR = retentietijd van de te onderzoeken stof, en t0 = gemiddelde tijd die een molecuul van het oplosmiddel nodig heeft om de kolom te passeren (dode tijd). Kwantitatieve analysemethoden zijn niet vereist, alleen de elutietijd moet worden bepaald.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

1.5.

1.5.1. Herhaalbaarheid

1.5.1. Schudflesmethode

Om de nauwkeurigheid van de verdelingscoëfficiënt te garanderen moeten duplo-metingen worden verricht onder drie uiteenlopende testomstandigheden; hierbij kan zowel de hoeveelheid stof als de verhouding van de hoeveelheden oplosmiddel worden gevarieerd. De gevonden waarden van de verdelingscoëfficiënt moeten, uitgedrukt in gewone logaritmen, binnen een interval van ±0,3 log-eenheden vallen.

HPLC-methode

Om de betrouwbaarheid van de meting te vergroten moeten duplo-metingen worden verricht. De log P-waarden, afgeleid uit de individuele metingen, moeten binnen een bereik van ±0,1 log-eenheid liggen.

1.5.2. Gevoeligheid

1.5.2. Schudflesmethode

Het meetbereik van de methode wordt bepaald door de detectiegrens van de analysemethode. Deze moet voldoende laag zijn om log Pow-waarden in het bereik van – 2 tot 4 te kunnen bepalen (onder speciale voorwaarden kan dit bereik uitgebreid worden tot een log Pow van 5), wanneer de concentratie van de opgeloste stof in geen van beide fasen hoger is dan 0,01 mol per liter.

HPLC-methode

Met de HPLC-methode kunnen verdelingscoëfficiënten worden bepaald in het log Pow-bereik van 0 tot 6. Normaal gezien kan de verdelingscoëfficiënt van een mengsel worden geschat tot op ± 1 log-eenheid van de schudfleswaarde. Voorbeelden van correlaties kunnen worden teruggevonden in de literatuur (4, 5, 6, 7, 8). Grotere nauwkeurigheid kan meestal worden bereikt met behulp van correlatiekrommen gebaseerd op referentiemengsels met verwante structuur (9).

1.5.3. Specificiteit

1.5.3. Schudflesmethode

De verdelingswet van Nernst geldt alleen voor verdunde oplossingen bij constante temperatuur, druk en pH. De wet geldt bovendien voor een zuivere stof die wordt verdeeld tussen twee zuivere oplosmiddelen. Indien in één of beide fasen tegelijkertijd verschillende opgeloste stoffen voorkomen, dan kan dit van invloed zijn op de resultaten. Dissociatie of associatie van de opgeloste moleculen leidt tot afwijkingen van de verdelingswet van Nernst. Dergelijke afwijkingen blijken uit de concentratieafhankelijkheid van de verdelingscoëfficiënt. Wegens het voorkomen van meervoudige evenwichtstoestanden mag deze test niet zonder correcties worden toegepast op ioniseerbare stoffen. Voor dergelijke stoffen dient het gebruik van bufferoplossingen in plaats van water te worden overwogen; de pH van de buffer dient ten minste 1 pH-eenheid te verschillen van de pKa van de stof en men dient rekening te houden met het belang van deze pH met betrekking tot het milieu.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.1. Inleidende schatting van de verdelingscoëfficiënt De verdelingscoëfficiënt wordt bij voorkeur geschat aan de hand van een berekeningsmethode (zie aanhangsel 1) of, indien van toepassing, op basis van de oplosbaarheidsverhouding van de te onderzoeken stof in de zuivere oplosmiddelen (10).

1.6.2. Schudflesmethode

1.6.2.

1.6.2.1. Voorbereiding n-Octanol: de verdelingscoëfficiënt moet worden bepaald met analytisch zuiver oplosmiddel. Water: er moet gebruik worden gemaakt van gedestilleerd of dubbel gedestilleerd water uit apparatuur van glas of kwarts. Voor ioniseerbare verbindingen dienen zo nodig bufferoplossingen in plaats van water te worden gebruikt. Opmerking: Er mag geen gebruik worden gemaakt van water dat rechtstreeks uit een ionenwisselaar komt.

1.6.2.1.

1.6.2.1.1. Voorverzadiging van de oplosmiddelen Alvorens een verdelingscoëfficiënt te bepalen, worden de fasen van het oplosmiddelsysteem onderling verzadigd door uitschudden bij de temperatuur van het experiment. Hiertoe is het handig om gedurende 24 uur twee grote voorraadflessen met analytisch zeer zuiver n-octanol, respectievelijk water, waaraan voldoende water respectievelijk n-octanol is toegevoegd, mechanisch te schudden en daarna te laten staan totdat de fasen zich afscheiden en een verzadigingstoestand is ontstaan.

1.6.2.1.2. Voorbereiding van de test Het twee-fasensysteem moet het testvat bijna vullen. Aldus wordt vervluchtiging van de vloeistof voorkomen. De volumeverhouding en de benodigde hoeveelheid van de te onderzoeken stof worden bepaald door: Er worden drie tests uitgevoerd: in de eerste test wordt gewerkt met de berekende volumeverhouding n-octanol/water; in de tweede test wordt deze verhouding gedeeld door twee, in de derde test wordt deze verhouding vermenigvuldigd met twee (bijvoorbeeld 1:1, 1:2, 2:1).

de inleidende bepaling van de verdelingscoëfficiënt (zie 1.6.1);

de minimale hoeveelheid van de te onderzoeken stof vereist voor de analyse;

de beperking van de maximale concentratie in beide fasen tot 0,01 mol/l.

1.6.2.1.3. De te onderzoeken stof Er wordt een voorraadoplossing bereid uit n-octanol voorverzadigd met water. De concentratie van deze voorraadoplossing moet nauwkeurig worden bepaald voor gebruik bij de bepaling van de verdelingscoëfficiënt. Deze oplossing moet onder stabiele omstandigheden bewaard worden.

1.6.2.2. Testomstandigheden De testtemperatuur moet constant (± 1 oC) worden gehouden binnen een bereik van 20-25 oC.

1.6.2.3. Meetprocedure

1.6.2.3.

1.6.2.3.1. Instelling van het verdelingsevenwicht Voor de verschillende testomstandigheden moeten steeds twee testvaten worden gevuld met de vereiste, nauwkeurig bekende hoeveelheden van beide oplosmiddelen en de gewenste hoeveelheid voorraadoplossing. Het volume van de n-octanol-fasen moet worden gemeten. De testvaten moeten in een schudmachine worden geplaatst of met de hand worden geschud. Aanbevolen wordt om, bij gebruik van een centrifugebuis, deze snel 180o te draaien om de transversale as, zodat de ingesloten lucht door de beide fasen omhoog beweegt. De ervaring heeft geleerd dat 50 van dergelijke bewegingen gewoonlijk voldoende zijn om het verdelingsevenwicht te bereiken. Om zeker te zijn wordt aangeraden om 100 bewegingen uit te voeren in 5 minuten.

1.6.2.3.2. Scheiding van de fasen Indien noodzakelijk, moet het mengsel worden gecentrifugeerd om de fasen te scheiden. Dit moet worden gedaan in een laboratoriumcentrifuge bij kamertemperatuur; indien een centrifuge zonder temperatuurregeling wordt gebruikt, moeten de centrifugebuizen ten minste gedurende één uur op de testtemperatuur worden gehouden, zodat de evenwichtstoestand zich kan instellen voordat de analyse wordt uitgevoerd.

1.6.2.4. Analyse Voor bepaling van de verdelingscoëfficiënt moet de concentratie van de te onderzoeken stof in beide fasen worden bepaald. Dit kan worden gedaan door onder de verschillende testomstandigheden uit alle buizen een monster van iedere fase te nemen en dit volgens de gekozen procedure te analyseren. De totale hoeveelheid van de te onderzoeken stof in beide fasen wordt berekend en vergeleken met de oorspronkelijke hoeveelheid toegevoegde stof. Van de waterfase moet een monster worden genomen volgens een procedure waardoor zo min mogelijk sporen n-octanol worden meegenomen: voor de bemonstering van de waterfase kan een glazen injectiespuit met verwisselbare naald worden gebruikt. De injectiespuit moet van tevoren gedeeltelijk worden gevuld met lucht. De lucht moet zachtjes worden uitgedreven terwijl de naald door de n-octanol-fase wordt gestoken. De benodigde hoeveelheid van de waterfase wordt in de injectiespuit gezogen. De spuit wordt snel uit de oplossing gehaald, waarna de naald wordt losgemaakt. De inhoud van de injectiespuit kan nu worden gebruikt als monster van de waterfase. De concentratie in de twee afzonderlijke fasen dient bij voorkeur te worden bepaald met behulp van een analysemethode waarmee verschillende stoffen kunnen worden onderscheiden. Enkele voorbeelden van geschikte analysenmethoden zijn:

fotometrische methoden;

gaschromatografie;

hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).

1.6.3. HPLC-methode

1.6.3.

1.6.3.1. Voorbereiding

1.6.3.1. Apparatuur

Benodigd is een vloeistofchromatograaf, uitgerust met een niet-pulserende pomp en een geschikte detectie-in-richting. Het gebruik van een injectieventiel met injectielussen wordt aangeraden. Aangezien de aanwezigheid van polaire groepen in de stationaire fase het juiste gedrag van de HPLC-kolom ernstig kan beïnvloeden, dient deze een zo klein mogelijk percentage polaire groepen te bevatten (11). Men kan gebruik maken van in de handel verkrijgbare, met microdeeltjes gevulde, omgekeerde fasepakkingen of van voorgepakte kolommen. Tussen het injectiesysteem en de analytische kolom kan een voorkolom worden geïnstalleerd.

Mobiele fase

Methanol en water, beide van HPLC-kwaliteit, worden gebruikt als elutiemiddel, dat voor gebruik wordt ontgast. Isokratische elutie dient te worden toegepast. Men moet methanol/water-verhoudingen met minimaal 25 % watergehalte gebruiken, normaliter neemt men een 3:1 (v/v) methanol/watermengsel om verbindingen met een log P van 6 binnen het uur te elueren, bij een stroomsnelheid van 1 ml/minuut. Voor verbindingen met een hoge log P kan het noodzakelijk zijn om de elutietijd te verkorten (evenals voor de referentiestoffen) door de polariteit van de mobiele fase of de kolomlengte te verminderen. Stoffen met een zeer lage oplosbaarheid in n-octanol geven met de HPLC-methode veelal abnormaal lage log Pow-waarden; de pieken van dergelijke stoffen vallen soms samen met het oplosmiddelfront. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat het verdelingsproces te traag verloopt om het evenwicht te bereiken binnen de tijdsduur die normaal voor een HPLC-scheiding nodig is. Het kan dan nuttig zijn om de stroomsnelheid en/of de methanol/water-verhouding te verlagen ten einde een betrouwbare waarde te verkrijgen. Test- en referentiestoffen moeten in voldoende concentratie oplosbaar zijn in de mobiele fase om detectie mogelijk te maken. Alleen in uitzonderingsgevallen mogen additieven in het methanol/water-mengsel worden gebruikt, daar toevoegingen de eigenschappen van de kolom veranderen. Voor chromatogrammen met additieven is het verplicht een aparte kolom van hetzelfde type te gebruiken. Als methanol/water niet voldoet, mogen andere organisch-oplosmiddel/water-mengsels worden gebruikt, bijvoorbeeld ethanol/water of acetonitril/water. De pH van het eluent is kritisch voor ioniseerbare stoffen. Hij moet in het juiste pH-bereik van de kolom liggen, gewoonlijk tussen 2 en 8. Bufferen wordt aangeraden. Voorzichtigheid dient in acht te worden genomen om neerslag van zout en achteruitgang van de kolom te voorkomen, hetgeen optreedt met sommige organische fase/buffer-mengsels. HPLC-metingen met stationaire fasen op basis van silica boven pH 8 worden afgeraden omdat het gebruik van een alkalische mobiele fase kan leiden rot een snelle achteruitgang van de kolomeigenschappen.

Opgeloste stoffen

De referentiestoffen dienen zo zuiver mogelijk te zijn. Verbindingen voor test- of ijkdoeleinden worden, indien mogelijk, opgelost in de mobiele fase.

Testomstandigheden

De temperatuur gedurende de metingen mag niet meer variëren dan ± 2 K.

1.6.3.2. Meting

1.6.3.2. Berekening van de dode tijd t0

De dode tijd t0 kan bepaald worden met of wel een homologe serie (bijvoorbeeld n-alkylmethylketonen) of wel organische stoffen die niet worden tegengehouden (bijvoorbeeld thioureum of formamide). Ter berekening van de dode tijd t0 met een homologe serie moet een set van ten minste 7 stoffen uit dezelfde serie worden geïnjecteerd en moeten de respectieve retentietijden worden bepaald. De ruwe retentietijden tr(nc + 1) worden uitgezet als functie van tr(nc), en het snijpunt a en de helling b van de regressievergelijking: tr(nc + 1) = a + btr (nc) worden bepaald (nc = aantal koolstofatomen). De dode tijd t0 wordt dan gegeven door: t0 = a/(1 - b)

IJklijn

De volgende stap bestaat uit het construeren van een correlatiekromme van log k-waarden tegen log P voor geschikte referentiestoffen. In de praktijk wordt een set van 5 tot 10 standaard-referentiestoffen, met een log P-waarde rond het te verwachten bereik, tegelijkertijd geïnjecteerd en worden de retentietijden bepaald, bij voorkeur met een recorder/integrator die is verbonden met het detectiesysteem. De corresponderende logaritmen van de capaciteitsfactoren, log k, worden berekend en uitgezet als functie van log P, bepaald met de schudflesmethode. De ijking wordt uitgevoerd met regelmatige tussenpozen, minstens eenmaal per dag, zodat rekening kan worden gehouden met mogelijke veranderingen in het gedrag van de kolom.

Bepaling van de capaciteitsfactor van de te onderzoeken stof

De teststof wordt in een zo klein mogelijke hoeveelheid van de mobiele fase geïnjecteerd. De retentietijd wordt bepaald (in duplo), om zo de capaciteitsfactor k te kunnen berekenen. Uit de correlatiegrafiek van de ijkstoffen kan de verdelingscoëfficiënt van de teststof worden geïnterpoleerd. Voor zeer lage en zeer hoge verdelingscoëfficiënten is extrapolatie noodzakelijk. In deze gevallen dient men extra aandacht te besteden aan de betrouwbaarheidsgrenzen van de regressielijn.

2. GEGEVENS

2. Schudflesmethode

De betrouwbaarheid van de gevonden waarden voor P kan worden onderzocht door de gemiddelden van de duplo-bepalingen te vergelijken met het totale gemiddelde.

3. RAPPORTAGE In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen);

indien de methoden niet toepasbaar zijn (bijvoorbeeld oppervlakteactieve stoffen), dient een berekende waarde of een schatting gebaseerd op de individuele oplosbaarheid in n-octanol en water te worden opgegeven;

alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof.

het resultaat van de inleidende schatting, indien van toepassing;

testtemperatuur;

gegevens over de analytische procedures voor bepaling van de concentraties;

tijd en snelheid van centrifugeren, indien van toepassing;

de gemeten concentraties in beide fasen voor elke bepaling (dit betekent dat in totaal 12 concentraties worden vermeld);

het gewicht van de onderzochte stof, het volume van elke fase in elk testvat en de berekende totale hoeveelheid van de onderzochte stof in elke fase bij evenwicht;

de berekende waarden van de verdelingscoëfficiënt (P) en het gemiddelde voor iedere groep testomstandigheden, evenals het gemiddelde van alle metingen; indien er aanwijzingen zijn dat de verdelingscoëfficiënt afhankelijk is van de concentratie, dient dit te worden vermeld in het testrapport;

de standaardafwijking van de afzonderlijke P-waarden ten opzichte van het gemiddelde;

de logaritme (grondtal 10) van de P-waarde gemiddeld over alle metingen;

de theoretisch berekende waarde van Pow, wanneer deze is bepaald of wanneer de gemeten waarde groter is dan 104;

pH van het gebruikte water en van de waterfase tijdens het experiment;

indien bufferoplossingen worden gebruikt, de redenen voor het gebruik van bufferoplossingen in plaats van water, samenstelling, concentratie en pH van de bufferoplossingen, pH van de waterige fase vóór en na het experiment.

het resultaat van de inleidende schatting, indien van toepassing;

test- en referentiestoffen, en de zuiverheid;

testtemperatuur;

de pH waarbij de bepaling wordt uitgevoerd;

details van de analytische en de voorkolom, de mobiele fase en de detectiemethode;

retentiegegevens en log P-waarden uit de literatuur voor de bij de ijking gebruikte referentiestoffen;

details van de gevonden regressielijn (log k tegen log P);

gemiddelde retentiegegevens en de geïnterpoleerde log P-waarde voor de teststof;

beschrijving van de apparatuur en de werkomstandigheden;

elutieprofielen;

de hoeveelheden test- en referentiestoffen die in de kolom zijn gebracht;

dode tijd en hoe hij gemeten werd.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)

LITERATUUR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107 — Decision of the Council C(81) 30 Final. C. Hansch en A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medicina! Chemistry Project, 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström en K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt en R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. J.E. Haky en A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. S. Fujisawa en E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumspraxis (edited by E. Müller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1958), Band I/1, 223-339. R.F. Rekker en H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479. A. Leo, C. Hansch en D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 (AFNOR) (Sept. 1985). Chemical products for industrial use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method. CV. Eadsforth en P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1 459. A. Leo, C. Hansch en D. Elkins, Chem. Rev, 1971, vol. 71, 525. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani en E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1 207. W.B. Neely, D.R. Branson en G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1 113. D.S. Brown en E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. J.K. Seydel en K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984. Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978. N.S. Nirrlees, S.j. Noulton, C.T. Murphy en P.J. Taylor, j. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.

A.9. VLAMPUNT

A.9.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Alvorens de test uit te voeren is het nuttig te beschikken over oriënterende gegevens inzake de brandbaarheid van de stof. De testprocedure is van toepassing op vloeistoffen waarvan de dampen door een ontstekingsbron tot ontbranding kunnen worden gebracht. De hier beschreven testmethoden zijn alleen betrouwbaar indien de gemeten waarde van het vlampunt binnen een bereik ligt zoals in de afzonderlijke methoden is aangegeven. Bij het selecteren van de te gebruiken methode dient rekening te worden gehouden met mogelijke chemische reacties tussen de teststof en het monstervat.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN Het vlampunt is de laagste temperatuur, gecorrigeerd tot een druk van 101,325 kPa, waarbij een vloeistof onder de beschreven omstandigheden zodanig verdampt, dat in het testvat een brandbaar mengsel van lucht en damp wordt gevormd. Eenheden: oC t = T - 273,15 (t in oC en T in K).

1.3. REFERENTIESTOFFEN Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Referentiestoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om regelmatig de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De stof wordt in een testvat gebracht en verwarmd of gekoeld tot de testtemperatuur volgens de procedure beschreven bij de afzonderlijke testmethode. Ontstekingspogingen worden uitgevoerd om te zien of het monster al dan niet tot ontbranding kan worden gebracht bij de testtemperatuur.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

1.5.

1.5.1. Reproduceerbaarheid De reproduceerbaarheid varieert met de gemeten waarde van het vlampunt en met de gebruikte testmethode; maximaal 2 oC.

1.5.2. Gevoeligheid De gevoeligheid is afhankelijk van de gebruikte testmethode.

1.5.3. Toepasbaarheid De toepasbaarheid van een aantal testmethoden blijft beperkt tot bepaalde vlampuntsbereiken en afhankelijk van stofeigenschappen (bijvoorbeeld hoge viscositeit).

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.1. Voorbereidingen Een monster van de te onderzoeken stof wordt in een testapparaat overeenkomstig 1.6.3.1, respectievelijk 1.6.3.2, gebracht. Uit veiligheidsoverwegingen wordt aangeraden voor energetische of giftige stoffen een methode waarbij slechts een klein monstervolume (circa 2 cm3) nodig is, toe te passen.

1.6.2. Testomstandigheden Het apparaat dient, voor zover de veiligheid dit toelaat, op een tochtvrije plaats te worden opgesteld.

1.6.3. Uitvoering van de test

1.6.3.

1.6.3.1. Evenwichtsmethode Zie ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523 en ISO 3679.

1.6.3.2. Niet-evenwichtsmethode

1.6.3.2. Apparatuur van Abel:

Zie BS 2000-170, NF M 07-011 en NF T 66-009.

Apparatuur van Abel-Pensky:

Zie EN 57, DIN 51755, deel 1 (voor temperaturen van 5 tot 65 oC) DIN 51755, deel 2 (voor temperaturen lager dan 5 oC), NF M 07-036.

Apparatuur van Tag:

Zie ASTM D 56.

Apparatuur van Pensky-Martens:

Zie ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34 en NF M 07-019.

Opmerkingen:

Indien het vlampunt, bepaald volgens een van de niet-evenwichtsmethoden onder 1.6.3.2, de volgende waarden blijkt te hebben: 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC, 55 ± 2 oC, dient dit te worden bevestigd volgens een evenwichtsmethode met gebruik van dezelfde apparatuur. Alleen de methoden waarmee de temperatuur van het vlampunt kan worden bepaald, komen in aanmerking voor gebruik ten behoeve van een kennisgeving. Voor de bepaling van het vlampunt van visceuze vloeistoffen (verven, lijmen, e.d.) die oplosmiddelen bevatten, mag uitsluitend gebruik worden gemaakt van apparatuur en testmethoden die geschikt zijn voor bepaling van het vlampunt van visceuze vloeistoffen. Zie ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523 en DIN 53213, deel 1.

2. GEGEVENS

3. RAPPORTAGE In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

nauwkeurige beschrijving van de stof (beschrijving en verontreinigingen);

de gebruikte testmethode alsmede eventuele wijzigingen;

de resultaten en alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten.

4. LITERATUUR Geen.

A.10. ONTVLAMBAARHEID (VASTE STOFFEN)

A.10.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Alvorens de test uit te voeren is het nuttig te beschikken over oriënterende gegevens inzake potentieel explosieve eigenschappen van de stof. Deze test dient alleen te worden toegepast op stoffen in poeder-, korrel- of pastavorm. Alleen stoffen waarvan de brandsnelheid hoger is dan een bepaalde drempelwaarde, worden als licht ontvlambaar beschouwd. Daarom worden niet alle stoffen die kunnen worden ontstoken, maar alleen die stoffen die snel branden of waarvan het brandgedrag buitengewoon gevaarlijk is, inbegrepen. Het is buitengewoon gevaarlijk indien een smeulproces zich voortplant door een metaalpoeder, vanwege de moeilijkheid om het vuur te doven. Daarom dienen metaalpoeders als licht ontvlambaar te worden beschouwd, als de smeulhaard zich binnen een zekere tijd door de gehele massa kan voortplanten.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN Brandtijd in seconden.

1.3. REFERENTIESTOFFEN Niet gekozen.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Van de stof wordt een ononderbroken rups of poederlijn met een lengte van ongeveer 250 mm gevormd waarop een oriënterende proef wordt uitgevoerd om te bepalen of, na ontsteken van het monster met behulp van een gasvlam, de vlam of het smeulproces zich voortplant. Als het vlamfront/smeulproces zich binnen een bepaalde tijdsduur over 200 mm van de sliert voortplant, dient een volledig testprogramma te worden uitgevoerd om de brandsnelheid vast te stellen.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Niet gegeven.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.1. Oriënterende proef Van de stof wordt een ononderbroken rups of poederlijn van ongeveer 250 mm lengte, 20 mm breedte en 10 mm hoogte gevormd op een onbrandbare, niet-poreuze en slecht warmtegeleidende grondplaat. Een hete vlam van een gasbrander (minimale diameter 5 mm) wordt gedurende maximaal 2 minuten bij één uiteinde van de rups gehouden totdat het poeder ontbrandt (5 minuten voor metaalpoeders of metaallegeringen). Men dient er op te letten of de ontbranding zich binnen 4 minuten (of 40 minuten bij metaalpoeders) voortplant over 200 mm van de poederrups. Indien de stof niet ontbrandt of indien de vlam of het smeulproces zich niet binnen 4 minuten (of 40 minuten bij metaalpoeders) voortplant over 200 mm poederrups dient de stof niet als licht ontvlambaar te worden beschouwd en behoeft geen verder onderzoek te worden uitgevoerd. Als het brandproces zich in minder dan 4 minuten, of minder dan 40 minuten bij metaalpoeders, voortplant over 200 mm van de poederrups dient de procedure zoals hieronder beschreven (punt 1.6.2. en volgende) te worden uitgevoerd.

1.6.2. Brandsnelheidstest

1.6.2.

1.6.2.1. Voorbereidingen Poeder of korrelvormige stoffen worden ingebracht (niet aandrukken) in een mal met een lengte van 250 mm en een driehoekige doorsnede met een inwendige hoogte van 10 mm en een inwendige breedte van 20 mm. Om de zijkanten te begrenzen zijn aan beide kanten van de mal in de lengterichting twee metalen platen gemonteerd die 2 mm uitsteken boven de rand van de driehoekige doorsnede (zie figuur). Vervolgens laat men de mal driemaal van een hoogte van 2 cm op een massief oppervlak vallen. Indien nodig wordt de mal bijgevuld. Vervolgens worden de zijplaten verwijderd en wordt de overtollige stof met een stevig blad weggeveegd. Een onbrandbare, niet-poreuze en slecht warmtegeleidende plaat wordt bovenop de mal gelegd, het apparaat wordt omgekeerd, waarna de mal wordt verwijderd. Pastavormige stoffen worden op een onbrandbare, niet-poreuze en slecht warmtegeleidende plaat aangebracht in de vorm van een rups met een lengte van 250 mm en een doorsnede van ongeveer 1 cm2.

1.6.2.2. Testomstandigheden Bij een vochtgevoelige stof dient de test zo snel als mogelijk na het verwijderen van de verpakking te worden uitgevoerd.

1.6.2.3. Uitvoering van de test De rups wordt in een zuurkast geplaatst in een richting loodrecht op de richting van de trek. De luchtsnelheid moet voldoende zijn om te verhinderen dat verbrandingsgassen naar de laboratoriumruimte ontsnappen; de luchtsnelheid mag gedurende de test niet veranderd worden. De apparatuur moet worden omgeven door een vochtscherm. Met de hete vlam van een gasbrander (minimale diameter 5 mm) wordt de rups aan één kant ontstoken. Nadat de rups over een lengte van 80 mm heeft gebrand, wordt de brandsnelheid over de volgende 100 mm gemeten. De test, waarbij steeds een schone koude plaat wordt gebruikt, wordt zesmaal uitgevoerd, tenzij eerder een positief resultaat wordt verkregen.

2. GEGEVENS Voor de beoordeling zijn de brandduur in de oriënterende proef (1.6.1) en de kortste brandduur uit de hoogstens zes testen (1.6.2.3) van belang.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en verontreinigingen);

een beschrijving van de fysische toestand en het vochtgehalte van de onderzochte stof;

de resultaten van de oriënterende test en, indien uitgevoerd, de brandsnelheidstest;

alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten.

3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN Poedervormige, korrelvormige of pastavormige stoffen worden als licht ontvlambaar beschouwd indien in één van de tests uitgevoerd volgens 1.6.2 de brandduur minder dan 45 seconden bedraagt. Poeders van metalen of metaallegeringen worden als licht ontvlambaar beschouwd, indien zij kunnen worden ontstoken en indien de vlam of reactiezone zich binnen 10 minuten over het gehele monster uitbreidt.

4. LITERATUUR (1) NF T 20-042, (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

A.11. ONTVLAMBAARHEID (GASSEN)

A.11.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Met deze methode kan worden vastgesteld of mengsels van gassen en lucht bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC) en atmosferische druk brandbaar zijn, en zo ja, binnen welk concentratiebereik. Mengsels met toenemende concentraties van het te onderzoeken gas in lucht worden blootgesteld aan een elektrische vonk, waarna wordt vastgesteld of ontbranding plaatsvindt.

1.2. DEFINITIE EN EENHEDEN De maat voor de brandbaarheid is het bereik van de concentratiewaarden tussen de onderste en bovenste ontploffingsgrens. De onder- en bovenexplosiegrenzen worden gevormd door de uiterste concentraties van het brandbare gas in lucht waarbij een vlam zich niet voortplant.

1.3. REFERENTIESTOF Niet gegeven.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De concentratie van het gas in de lucht wordt stap voor stap opgevoerd, waarbij het mengsel in iedere stap wordt blootgesteld aan een elektrische vonk.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Niet gegeven.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.1. Apparatuur Het testvat is een staande glazen cilinder met een inwendige diameter van minimaal 50 mm en een hoogte van minimaal 300 mm. De ontstekingselektroden bevinden zich op een onderlinge afstand van 3 tot 5 mm en worden 60 mm boven de cilinderbodem geplaatst. De cilinder is voorzien van een overdrukventiel. Het apparaat moet worden afgeschermd om schade bij een eventuele ontploffing te beperken. Als ontstekingsbron wordt gebruik gemaakt van een staande inductievonk met een duur van 0,5 sec, opgewekt door een hoogspanningstransformator met een uitgangsspanning van 10 tot 15 kV (maximaal ingangsvermogen 300 W). Een voorbeeld van een geschikt apparaat wordt gegeven in referentie (2).

1.6.2. Testomstandigheden De test moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC).

1.6.3. Uitvoering van de test Met behulp van doseerpompen wordt een bekende concentratie van het gas in lucht naar de glazen cilinder geleid. Het mengsel wordt blootgesteld aan een vonk en er wordt vastgesteld of er zich vanaf de ontstekingsbron al dan niet een vlam ontwikkelt die zich zelfstandig voortplant. De gasconcentratie wordt in stappen van 1 % vol opgevoerd, totdat ontbranding zoals boven bedoeld, plaatsvindt. Als de chemische structuur van het gas erop wijst dat het niet ontvlambaar is en de samenstelling van het stoïchiometrische mengsel met lucht berekend kan worden, dienen alleen de mengsels in het bereik van 10 % beneden tot 10 % boven de stoïchiometrische samenstelling getest te worden in stappen van 1 %.

2. GEGEVENS Het enige gegeven van belang voor bepaling van deze eigenschap is het optreden van een vlam die zich zelfstandig voortplant.

3. RAPPORTAGE In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en verontreinigingen);

een beschrijving van de gebruikte apparatuur inclusief de afmetingen;

de temperatuur waarbij de test werd uitgevoerd;

de onderzochte concentraties en de verkregen resultaten;

het resultaat van de test: niet ontvlambaar of licht ontvlambaar gas. Indien geconcludeerd wordt dat het gas niet ontvlambaar is, moet het concentratiebereik waarover het gas in stappen van 1 % onderzocht werd, vermeld worden;

alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten.

4.(1)(2) LITERATUUR NF T 20-041, (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker en H. Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, blz. 126-127.

A.12. ONTVLAMBAARHEID (CONTACT MET WATER)

A.12.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Deze testmethode kan worden gebruikt om vast te stellen of de reactie van een stof met water of vochtige lucht leidt tot het vrijkomen van een gevaarlijke hoeveelheid van één of meer eventueel licht ontvlambare gassen. De testmethode kan zowel op vaste als op vloeibare stoffen worden toegepast. Deze methode is niet van toepassing op stoffen die in aanraking met lucht spontaan ontbranden.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN Licht ontvlambaar: Stoffen die bij aanraking met water of vochtige lucht licht ontvlambare gassen produceren met een minimum ontwikkelingshoeveelheid van 1 liter per kg stof per uur.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De stof wordt volgens de hieronder beschreven getrapte volgorde getest; als bij één van de stappen ontbranding optreedt, is verder onderzoek overbodig. Als bekend is dat de te onderzoeken stof niet heftig reageert met water kan worden verdergegaan met stap 4 (1.3.4).

1.3.

1.3.1. Stap 1 De te onderzoeken stof wordt in een buis met gedistilleerd water op 20 oC gebracht en er wordt nagegaan of het vrijgekomen gas ontbrandt.

1.3.2. Stap 2 De te onderzoeken stof wordt gebracht op een filtreerpapier dat in een schotel met gedistilleerd water van 20 oC drijft, en er wordt nagegaan of het vrijkomende gas ontbrandt. Het filtreerpapier dient alleen om de stof op één plaats te houden, waardoor de kans op ontbranding toeneemt.

1.3.3. Stap 3 Van de te onderzoeken stof wordt een hoopje van ongeveer 2 cm hoog en 3 cm doorsnede gemaakt. Hierop worden een paar druppels water gebracht en er wordt nagegaan of het vrijkomende gas ontbrandt.

1.3.4. Stap 4 De te onderzoeken stof wordt met gedistilleerd water van 20 oC gemengd en de snelheid van gasontwikkeling wordt ieder uur gemeten gedurende een periode van 7 uur. Als de snelheid van de gasontwikkeling onregelmatig is of toeneemt tegen het eind van de periode van 7 uur, moet de duur van de meting tot maximaal 5 dagen worden verlengd. De test kan worden gestaakt zodra een snelheid hoger dan 1 liter/kg per uur wordt gemeten.

1.4. REFERENTIESTOF Niet gegeven.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Niet gegeven.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODEN

1.6.

1.6.1. Stap 1

1.6.1.

1.6.1.1. Testomstandigheden De proef wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC).

1.6.1.2. Uitvoering van de test Een kleine hoeveelheid (ongeveer 2 mm doorsnede) van de te onderzoeken stof wordt in een bak met gedistilleerd water gebracht. Genoteerd wordt i) of er gas ontwijkt en ii) of het gas spontaan ontbrandt. Indien ontbranding van het gas plaatsvindt, is verder onderzoek van de stof niet nodig, omdat de stof dan als gevaarlijk wordt beschouwd.

1.6.2. Stap 2

1.6.2.

1.6.2.1. Apparatuur Een filtreerpapier laat men plat op het oppervlak van een hoeveelheid gedistilleerd water drijven in een geschikt vat, bijvoorbeeld een verdampingsschotel met een doorsnede van 100 mm.

1.6.2.2. Testomstandigheden De proef wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC).

1.6.2.3. Uitvoering van de test Een kleine hoeveelheid van de te onderzoeken stof (ongeveer 2 mm doorsnede) wordt midden op het filtreerpapier gebracht. Genoteerd wordt i) of er gas ontwijkt en ii) of het gas spontaan ontbrandt. Indien ontbranding van het gas plaatsvindt, is verder onderzoek van de stof niet nodig, omdat de stof dan als gevaarlijk wordt beschouwd.

1.6.3. Stap 3

1.6.3.

1.6.3.1. Testomstandigheden De proef wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC).

1.6.3.2. Uitvoering van de test Van de te onderzoeken stof wordt een hoopje van ongeveer 2 cm hoogte en 3 cm doorsnede gemaakt met een kuiltje bovenin. In het kuiltje worden een paar druppels water gebracht en genoteerd wordt i) of er gas ontwijkt en ii) of het gas spontaan ontbrandt. Indien ontbranding van het gas plaatsvindt, is verder onderzoek van de stof niet nodig, omdat de stof dan als gevaarlijk wordt beschouwd.

1.6.4. Stap 4

1.6.4.

1.6.4.1. Apparatuur De apparatuur wordt opgesteld als in de figuur.

1.6.4.2. Testomstandigheden Kijk of het vat van de te onderzoeken stof poeder bevat bestaande uit deeltjes van minder dan 500 μm diameter. Indien meer dan 1 gewichtsprocent van de stof poedervormig is of indien het monster brokkelig is, wordt de stof in zijn geheel vóór de test tot poeder gemalen; op deze manier wordt rekening gehouden met mogelijke verkleining van de deeltjesgrootte tijdens opslag en verwerking van de stof. In alle andere gevallen wordt de stof onderzocht zoals ze werd verkregen. De test moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC) en atmosferische druk.

1.6.4.3. Uitvoering van de test 10 tot 20 ml water wordt in de druppeltrechter van het apparaat gebracht en 10 g van de te onderzoeken stof wordt afgewogen in de erlenmeyerkolf. Het volume van het vrijkomende gas kan op elke geschikte wijze worden gemeten. De kraan van de druppeltrechter wordt geopend zodat het water in de erlenmeyerkolf komt, en een chronometer gestart. De hoeveelheid vrijkomend gas wordt ieder uur gemeten gedurende een periode van 7 uur. Als tijdens deze periode het vrijkomen van gas onregelmatig verloopt, of als aan het eind van de periode de hoeveelheid vrijkomend gas toeneemt moeten de metingen voortgezet worden tot maximaal 5 dagen. Indien de gasontwikkelingssnelheid, tijdens de metingen, op welk ogenblik dan ook, meer dan 1 liter per kg stof en per uur bedraagt, kan het onderzoek gestaakt worden. De test moet in triplo worden uitgevoerd. Indien de chemische identiteit van het gas niet bekend is, dient het te worden geanalyseerd. Indien het gas licht ontvlambare componenten bevat en niet bekend is of het totale mengsel licht ontvlambaar is, moet een mengsel van dezelfde samenstelling worden bereid en getest volgens methode A.11.

2. GEGEVENS De onderzochte stof wordt als gevaarlijk beschouwd indien:

spontane ontbranding plaatsvindt bij één van de stappen tijdens de testprocedure; of

een ontvlambaar gas vrijkomt met een grotere snelheid groter dan 1 liter per kg van de te onderzoeken stof per uur.

3. RAPPORTAGE In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en verontreinigingen);

gegevens over eventuele voorbehandeling van de onderzochte stof;

de resultaten van de tests (stappen 1, 2, 3 en 4);

de chemische identiteit van het vrijgekomen gas;

de snelheid waarmee het gas vrijkomt als stap 4 (1.6.4) wordt uitgevoerd;

alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor interpretatie van de resultaten.

4.(1)(2) LITERATUUR Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, tests and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040, (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

A.13. PYROFORE EIGENSCHAPPEN VAN VASTE STOFFEN EN VLOEISTOFFEN

A.13.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING De testprocedure is van toepassing op vaste en vloeibare stoffen, die spontaan kunnen ontbranden kort nadat ze bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC) in aanraking zijn gekomen met lucht. Deze testprocedure is niet van toepassing op stoffen die bij kamertemperatuur eerst na uren- of dagenlange blootstelling aan lucht spontaan ontbranden of die op hogere temperatuur moeten worden gebracht om tot zelfontbranding te komen.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN Stoffen worden als pyrofoor beschouwd als ze ontbranden of verkoling veroorzaken onder de omstandigheden zoals beschreven onder 1.6. Voor de zelfontvlambaarheid van vloeistoffen kan ook een test nodig zijn volgens methode A.15: Zelfontbrandingstemperatuur (vloeistoffen en gassen).

1.3. REFERENTIESTOFFEN Niet gegeven.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De stof, vast of vloeibaar, wordt op een inerte drager gebracht en gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur in aanraking gebracht met lucht. Indien vloeistoffen niet ontbranden moeten ze geabsorbeerd worden op filterpapier en gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur (ongeveer 20 oC) worden blootgesteld aan lucht. Als een vaste of vloeibare stof ontbrandt, of een vloeistof het filterpapier doet ontbranden of verkolen, wordt de stof beschouwd als pyrofoor.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Reproduceerbaarheid: gezien het belang met betrekking tot veiligheid is één enkel positief resultaat voldoende om de stof als pyrofoor te beschouwen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.1. Apparatuur Een porseleinen bakje van ongeveer 10 cm doorsnede wordt bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC) tot een hoogte van ongeveer 5 mm gevuld met diatomeeënaarde. Opmerking: Diatomeeënaarde of een vergelijkbare en gangbare inerte stof wordt representatief geacht voor aarde waarmee gemorste stoffen in geval van een ongeluk in aanraking kunnen komen. Droog filterpapier is vereist om vloeistoffen te onderzoeken die niet ontbranden na aanraking met lucht wanneer ze in aanraking zijn met een inerte drager.

1.6.2. Uitvoering van de test

1.6.2. a)

Poedervormige vaste stoffen 1 tot 2 cm3 van de te onderzoeken, poedervormige stof wordt vanaf ongeveer 1 m hoogte op een niet-brandbaar oppervlak gestrooid; nagegaan wordt of de stof tijdens het vallen, of binnen 5 minuten na het neerkomen, ontbrandt. De proef wordt 6 keer uitgevoerd tenzij ontbranding optreedt.

Vloeistoffen Ongeveer 5 cm3 van de te onderzoeken vloeistof wordt in het porseleinen bakje gegoten en nagegaan wordt of de stof binnen 5 minuten ontbrandt. Als geen ontbranding optreedt tijdens de zes proeven, voer dan de volgende tests uit: Een hoeveelheid van 0,5 ml van de te onderzoeken stof wordt met behulp van een injectiespuit op een gekarteld filterpapiertje gebracht en er wordt nagegaan of ontbranding of verkoling van het filterpapier optreedt binnen vijf minuten nadat de vloeistof werd aangebracht. De test wordt driemaal uitgevoerd, tenzij ontbranding of verkoling optreedt.

2. GEGEVENS

2.

2.1. BEWERKING VAN DE RESULTATEN Het onderzoek mag worden gestaakt zodra een positief resultaat optreedt in één van de tests.

2.2. BEOORDELING Indien de stof ontbrandt binnen vijf minuten na opbrengen op een inerte drager en blootstelling aan de lucht, of indien een vloeistof een filterpapiertje verkoolt of doet ontbranden binnen vijf minuten na opbrengen en blootstelling aan de lucht, wordt de stof beschouwd als zijnde pyrofoor.

3. RAPPORTAGE In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en verontreinigingen);

de resultaten van de tests;

iedere bijkomende opmerking betreffende de interpretatie van de resultaten.

4.(1)(2) LITERATUUR NF T 20-039, (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14. EXPLOSIEGEVAAR

A.14.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING De methode omvat een testschema om vast te stellen of een pasta explosiegevaar oplevert wanneer de stof aan een vlam (thermische gevoeligheid) of aan een schok of wrijving (mechanische gevoeligheid) wordt blootgesteld, alsmede of een vloeistof explosiegevaar oplevert wanneer de stof aan een vlam of aan een schok wordt blootgesteld. De methode bestaat uit drie delen: De methode levert gegevens op waarmee de kans op ontstaan van een explosie door bepaalde veel voorkomende stimuli kan worden beoordeeld. De methode is niet bedoeld om vast te stellen of een stof onder om het even welke omstandigheden kan exploderen. De methode is geschikt om te bepalen of een stof explosiegevaar oplevert (thermische en mechanische gevoeligheid) onder omstandigheden zoals beschreven in de richtlijn. De methode is gebaseerd op een aantal soorten apparaten die internationaal op grote schaal worden gebruikt (1) en die doorgaans zinvolle resultaten geven. Erkend wordt dat de methode geen definitief uitsluitsel geeft. Andere apparatuur dan beschreven, mag worden gebruikt op voorwaarde dat deze internationaal erkend is en dat de resultaten afdoende getoetst kunnen worden aan de resultaten met de beschreven apparatuur. De proeven hoeven niet te worden uitgevoerd indien uit de beschikbare thermodynamische gegevens (vormingswarmte, ontledingswarmte) en/of afwezigheid van bepaalde reactieve groepen (2) in de structuurformule met afdoende zekerheid kan worden vastgesteld dat de stof niet snel kan ontleden onder productie van gassen of warmte (dat wil zeggen: het materiaal vertegenwoordigt geen enkel explosiegevaar). Een test op mechanische gevoeligheid voor wrijving is niet vereist voor vloeistoffen.

1.1. a)

een test voor de thermische gevoeligheid (1);

een test voor de mechanische gevoeligheid bij schokken (1);

een test voor de mechanische gevoeligheid bij wrijving (1).

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN Als explosief worden gedefinieerd: stoffen die door de werking van een vlam kunnen ontploffen of die gevoelig zijn voor schokken en wrijving in de beschreven apparatuur (of die mechanisch gevoeliger zijn dan 1,3-dinitrobenzeen in andere apparatuur).

1.3. REFERENTIESTOFFEN Technisch, kristallijn 1,3-dinitrobenzeen gezeefd door 0,5 mm maaswijdte, voor de wrijvings- en schok-methode. Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX, hexogeen, cycloniet — CAS 121-82-4), geherkristalliseerd uit waterig cyclohexanon, nat gezeefd door een 250 μm zeef en op een 150 μm zeef en gedroogd bij 103 ± 2 oC (gedurende 4 uur) voor de tweede reeks wrijvings- en schoktests.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Tot vaststelling van veilige omstandigheden voor het uitvoeren van de drie gevoeligheidstests zijn oriënterende proeven noodzakelijk.

1.4.

1.4.1. Oriënterende proef (3) Om veiligheidsredenen worden voor het uitvoeren van de gevoeligheidsbeproevingen zeer kleine monsters (ongeveer 10 mg) van de stof zonder afsluiting verwarmd in een gasvlam, blootgesteld aan schokken in een geschikt apparaat, en aan wrijving door middel van een hamer tegen een aambeeld of door middel van elk ander wrijvingstoestel. Het doel is vast te stellen of de stof zo gevoelig en explosiegevaarlijk is dat de voorgeschreven gevoeligheidstests, vooral die van thermische gevoeligheid, moeten worden uitgevoerd met speciale voorzorgen om aldus te voorkomen dat de onderzoeker gewond kan raken.

1.4.2. Thermische gevoeligheid Bij deze methode wordt de stof verwarmd in een stalen buis, afgesloten door afsluitplaten met openingen van verschillende doorsnede, om vast te stellen of de stof bij thermische belasting en goed gedefinieerde opsluiting kan ontploffen.

1.4.3. Mechanische gevoeligheid (schok) Bij deze methode wordt de stof aan een schok, veroorzaakt door een bepaalde massa vallend vanaf een bepaalde hoogte, onderworpen.

1.4.4. Mechanische gevoeligheid (wrijving) Bij deze methode wordt de vaste stof of pasta onder bepaalde omstandigheden van belasting en relatieve beweging onderworpen aan wrijving russen standaardoppervlakken.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Niet gegeven.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN

1.6.

1.6.1. Thermische gevoeligheid (werking van een vlam)

1.6.1.

1.6.1.1. Apparatuur Het apparaat bestaat uit een stalen buis, bestemd voor éénmalig gebruik, voorzien van een herbruikbare afsluitinrichting (figuur 1), die in een verwarmings- en beschermingstoestel wordt geplaatst. Elke buis is diep getrokken uit plaatstaal (zie aanhangsel) en heeft een inwendige doorsnede van 24 mm, een lengte van 75 mm en een wanddikte van 0,5 mm. Aan het open einde is de buis van een flens voorzien om afsluiting met de afsluitinrichting mogelijk te maken. De afsluitinrichting bestaat uit een drukbestendige ronde afsluitplaat met een gat in het midden, die met behulp van een tweedelige schroefverbinding (moer en kraag met schroefdraad) stevig op de buis wordt bevestigd. De moer en de kraag zijn gemaakt van chroommangaanstaal (zie aanhangsel) dat tot 800 oC vonkvrij is. De afsluitplaten zijn 6 mm dik en gemaakt van hittebestendig staal (zie aanhangsel), en zijn verkrijgbaar in een reeks verschillende openingsmaten.

1.6.1.2. Testomstandigheden Normaal wordt de stof getest zoals hij verkregen werd, alhoewel het in sommige gevallen noodzakelijk kan zijn om de stof te testen na verpulvering, bijvoorbeeld indien hij geperst, gegoten of op andere wijze verdicht is. Voor vaste stoffen wordt de hoeveelheid voor elke test te gebruiken materiaal bepaald met behulp van een twee-staps vulprocedure. Een gewogen buis wordt gevuld met 9 cm3 van de stof, waarna deze wordt aangedrukt met een kracht van 80 N verdeeld over de hele doorsnede van de buis. Om veiligheidsredenen of in gevallen waar de fysische vorm van het monster kan veranderen onder druk, mogen andere vulmethoden worden gebruikt; aandrukken is bijvoorbeeld niet geschikt als de stof zeer wrijvingsgevoelig is. Als de stof samendrukbaar is wordt meer materiaal bijgevoegd en aangeperst met 80 N totdat de buis gevuld is tot op 55 mm van de bovenkant. De massa van de stof die gebruikt wordt om de buis te vullen tot op het niveau van 55 mm wordt bepaald, vervolgens worden nog twee porties met deze massa, en elk aangedrukt met een kracht van 80 N, ingebracht. Daarna wordt het materiaal of wel bijgevuld of wel verwijderd en aangedrukt totdat de buis gevuld is tot op een hoogte van 15 mm van de bovenkant. Een tweede stap in de vulprocedure wordt uitgevoerd met een aangedrukte massa die een derde bedraagt van de totale hoeveelheid die in de eerste poging werd bepaald. Er worden nog twee van deze hoeveelheden toegevoegd en elk onder 80 N aangedrukt, waarna het niveau van de stof wordt aangepast tot op 15 mm van de bovenkant door materiaal naar behoefte toe te voegen of weg te halen. Voor elke beproeving wordt nu de hoeveelheid vaste stof gebruikt, die in de tweede vulprocedure is vastgesteld, waarbij het vullen wordt uitgevoerd met drie gelijke porties die achtereenvolgens worden samengeperst tot 9 cm3 met de daartoe benodigde kracht (het samenpersen kan worden vereenvoudigd met behulp van tussenringen). Vloeistoffen en gels worden in de buis gebracht tot op een hoogte van 60 mm, waarbij zorg dient te worden gedragen dat bij het vullen met gel geen luchtbellen ontstaan. De buis wordt in de kraag geschoven, de juiste afsluitplaat wordt opgelegd en de moer wordt op de kraag geschroefd na het aanbrengen van een beetje smeermiddel op basis van molybdeendisulfide. Het is van essentieel belang te controleren dat er geen materiaal achterblijft tussen de moer, de plaat, en de schroefdraad. De verwarming geschiedt met behulp van propaan uit een industriële cilinder voorzien van een drukregelaar (60 tot 70 mbar), dat via een meter door een verdeelstuk evenredig verdeeld wordt over vier branders (hetgeen visueel te controleren is aan de vlammen uit de branders). De branders worden rond de beproevingsruimte geplaatst zoals aangegeven in figuur 1. De vier branders hebben een gezamenlijk verbruik van ongeveer 3,2 liter propaan per minuut. Andere stookgassen of branders mogen gebruikt worden, maar de opwarmsnelheid moet verlopen zoals in figuur 3 aangegeven. Voor alle apparatuur dient de opwarmsnelheid periodiek gecontroleerd te worden met behulp van met diburylftalaat gevulde buizen zoals in figuur 3 is aangeduid.

1.6.1.3. Uitvoering van de proeven Elke test wordt uitgevoerd totdat ofwel de buis gefragmenteerd is of de buis gedurende vijf minuten is verhit. Als de test resulteert in fragmentatie van de buis in drie of meer stukken, die soms nog aan elkaar zijn verbonden door smalle metaalstrookjes zoals geïllustreerd in figuur 2, wordt het resultaat beoordeeld als een opgetreden explosie. Een testresultaat, waarbij minder of geen fragmenten ontstaan, wordt beschouwd als niet explosief. Een reeks van drie proeven met een afsluitplaat met een opening van 6,0 mm doorsnede wordt uitgevoerd en, als geen explosies optreden, een tweede reeks van drie proeven met een afsluitplaat met een opening van 2,0 mm. Indien een explosie plaatsvindt in een van de twee proefreeksen, kunnen verdere tests achterwege blijven.

1.6.1.4. Beoordeling Het testresultaat wordt als positief beschouwd als er een explosie plaatsvindt in een van bovenstaande testreeksen.

1.6.2. Mechanische gevoeligheid (schok)

1.6.2.

1.6.2.1. Apparatuur (figuur 4) De belangrijkste onderdelen van een doorsnee valhamerapparaat zijn een gietstalen blok met voet, aambeeld, kolom, geleiders, valgewichten, een ontkoppelinrichting en een monsterhouder. Op het stalen blok van 230 mm lengte × 250 mm breedte × 200 mm hoogte met een gegoten voet van 450 mm lengte × 450 mm breedte × 60 mm hoogte, zit het stalen aambeeld van 100 mm doorsnede × 70 mm hoogte vastgeschroefd. Aan de achterkant van het stalen blok is de houder geschroefd waarin de kolom, bestaande uit een naadloze getrokken stalen buis, is bevestigd. Vier schroeven verankeren het apparaat aan een massief betonnen blok van 60 × 60 × 60 cm in een zodanige positie dat de geleiderbalken volkomen verticaal staan en het valgewicht vrij kan vallen. Gewichten van 5 en 10 kg massief staal kunnen worden gebruikt. Het slagoppervlak van de gewichten bestaat uit getemperd staal, HRC 60 tot 63, met een minimumdoorsnede van 25 mm. Het te onderzoeken monster wordt gevat in een schokbeproevingsvat dat bestaat uit twee massieve, in het verlengde boven elkaar liggende stalen cilinders omhuld door een holle stalen geleidecilinder. De massief stalen cilinders hebben een doorsnede van 10 (-0,003; -0,005) mm en een hoogte van 10 mm, gepolijste oppervlakken, afgeronde zijvlakken (rondingsstraal 0,5 mm) en een hardheid van HRC 58 tot 65. De holle cilinder heeft een uitwendige diameter van 16 mm, een gepolijste binnenkant met een doorsnede van 10 (+0,005; +0,010) mm en een hoogte van 13 mm. Het beproevingsvat wordt vastgezet op een stalen tussenaambeeld (26 mm doorsnede en 26 mm hoogte) en wordt gecentreerd door een ring met perforaties via welke de explosiegassen kunnen worden afgevoerd.

1.6.2.2. Testomstandigheden Het monstervolume dient 40 mm3 te bedragen of overeen te komen met het vulvolume in een alternatief apparaat. Vaste stoffen dienen in droge toestand te worden onderzocht en worden als volgt voorbewerkt: Stoffen die normaal gezien geleverd worden als pasta's zouden, in de mate van het mogelijke, moeten worden getest in droge staat of, in ieder geval, na het zoveel mogelijk verwijderd hebben van vloeistof. Vloeistoffen worden onderzocht met een spleet van 1 mm tussen de bovenste en de onderste stalen cilinder.

1.6.2.2. a)

poedervormige stoffen worden gezeefd (maaswijdte 0,5 mm); alles wat de zeef doorlaat, wordt voor de test gebruikt;

samengeperste, gegoten of op andere wijze verdichte stoffen worden in stukken gebroken en gezeefd; de zeeffractie van 0,5 tot 1 mm doorsnede wordt gebruikt voor de test en dient representatief te zijn voor de oorspronkelijke stof.

1.6.2.3. Uitvoering van de proeven Een reeks van zes proeven wordt uitgevoerd waarbij men het gewicht van 10 kg van een hoogte van 0,40 m (40 J) laat vallen. Indien een explosie wordt verkregen in de reeks met 40 J moet een extra reeks van zes proeven worden uitgevoerd waarbij men 5 kg van 0,15 m (7,5 J) laat vallen. In andere apparaten wordt het monster vergeleken met de gekozen referentiestof via een vastgestelde procedure (bijvoorbeeld op-en-neer techniek, enz.).

1.6.2.4. Beoordeling Het testresultaat wordt als positief beschouwd als ten minste éénmaal in een van de proeven een explosie (ontbranden en/of een knal staan hiermee gelijk) plaatsvindt met het beschreven slagapparaat of als het monster in een alternatieve slagproef gevoeliger is dan 1,3-dinitrobenzeen of RDX.

1.6.3. Mechanische gevoeligheid (wrijving)

1.6.3.

1.6.3.1. Apparatuur (figuur 5) Het wrijvingsapparaat bestaat uit een gietstalen grondplaat waarop het eigenlijke wrijvingstoestel gemonteerd is. Het wrijvingstoestel bestaat uit een vaste porseleinen pen en een bewegende porseleinen plaat. De porseleinen plaat zit vast in een slede welke tussen twee geleiders beweegt. De slede wordt via een aandrijfstang, een excentrische nok en een geschikt drijfwerk op zodanige wijze met een elektromotor verbonden, dat de porseleinen plaat slechts éénmaal onder de porseleinen pen heen en weer wordt bewogen over een afstand van 10 mm. De porseleinen pen kan belast worden met bijvoorbeeld 120 of 360 newton. De vlakke porseleinen platen worden van wit technisch porselein (oppervlakteruwheid tussen 9 en 32 μm) gemaakt en zijn 25 mm lang, 25 mm breed en 5 mm hoog. De cylindrische porseleinen pen wordt eveneens van wit technisch porselein gemaakt, is 15 mm lang, heeft een doorsnede van 10 mm en bolvormige uiteinden met een rondingsstraal van 10 mm, en geruwd oppervlak.

1.6.3.2. Testomstandigheden Het monstervolume dient 10 mm3 te bedragen of overeen te komen met het vulvolume in een alternatief apparaat. Vaste stoffen dienen in droge toestand te worden onderzocht en worden als volgt voorbewerkt: Stoffen die gewoonlijk als pasta's geleverd zouden worden, moeten, in de mate van het mogelijke, in droge staat worden getest. Wanneer de stoffen niet in droge staat kunnen worden bereid, wordt de pasta (na het zoveel mogelijk verwijderen van vloeistof) getest als een 0,5 mm dikke, 2 mm brede en 10 mm lange plak, bereid met behulp van een mal.

1.6.3.2. a)

poedervormige stoffen worden gezeefd (maaswijdte 0,5 mm); alles wat de zeef doorlaat, wordt voor de test gebruikt;

samengeperste, gegoten of op andere wijze verdichte stoffen worden in stukken gebroken en gezeefd; de zeeffractie kleiner dan 0,5 mm wordt gebruikt voor de test.

1.6.3.3. Uitvoering van de proeven De porseleinen pen wordt op het te onderzoeken monster geplaatst en de belasting wordt aangebracht. Tijdens de test moeten de groeven van de porseleinen plaat loodrecht op de bewegingsrichting liggen. Er moet goed op worden gelet dat de pen op het monster rust, dat voldoende van de te onderzoeken stof onder de pen ligt en dat de plaat op de juiste wijze onder de pen doorbeweegt. Voor pasta's wordt een 0,5 mm dikke mal met een gleuf van 2 bij 10 mm gebruikt om de pasta op de plaat aan te brengen. De porseleinen plaat moet in 0,44 seconden onder de porseleinen pen heen en weer bewegen over een afstand van 10 mm. De pen en elk gedeelte van het oppervlak mogen slechts voor één test worden gebruikt; de twee uiteinden van de pen kunnen dus dienen voor twee proeven en de twee oppervlakken van de plaat elk voor drie proeven. Een reeks van zes proeven wordt uitgevoerd met 360 N belasting. Als een positief resultaat wordt verkregen tijdens deze zes proeven, moet een tweede reeks van zes proeven worden uitgevoerd met 120 N belasting. Bij gebruik van andere apparatuur wordt het monster vergeleken met de gekozen referentiestof via een vastgestelde procedure (bijvoorbeeld op-en-neer-techniek, enz.).

1.6.3.4. Beoordeling Het testresultaat wordt als positief beschouwd als ten minste in één van de proeven een explosie (knetteren en/of een knal of ontbranden staan hiermee gelijk) plaatsvindt met het beschreven wrijvingsapparaat of als aan gelijkwaardige eisen voldaan wordt in andere wrijvingsapparatuur.

2. GEGEVENS In beginsel wordt in de zin van deze richtlijn aan een stof of preparaat explosiegevaar toegeschreven indien een positief resultaat wordt verkregen in de thermische-, schok- of wrijvingsgevoeligheidstest.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. TESTRAPPORT In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

de identiteit, samenstelling, zuiverheid, vochtgehalte, enz. van de onderzochte stof;

de fysische vorm van het monster, en of het al dan niet werd verpulverd, gebroken en/of gezeefd;

waarnemingen tijdens de thermische-gevoeligheidstests (bijvoorbeeld de monstermassa, aantal fragmenten, enz.);

waarnemingen tijdens de mechanische-gevoeligheidstests (bijvoorbeeld de vorming van grote hoeveelheden rook of complete ontleding zonder knal, vlammen, vonken, knallen, knetteren, enz.);

de resultaten van elke soort test;

indien afwijkende apparatuur is gebruikt, moet dit op wetenschappelijke gronden worden gerechtvaardigd; bovendien moet de correlatie tussen meetresultaten met de afwijkende apparatuur en de hierboven beschreven apparatuur bewezen worden;

eventueel nuttige opmerkingen, zoals verwijzing naar proeven met soortgelijke producten, die van belang kunnen zijn voor een correcte interpretatie van de resultaten;

alle aanvullende opmerkingen die van belang kunnen zijn voor een goede interpretatie van de resultaten.

3.2. INTERPRETATIE EN BEOORDELING VAN DE RESULTATEN In het testrapport moet worden vermeld welke resultaten als onjuist, afwijkend of niet-representatief worden beschouwd. Indien een van de resultaten moet worden verworpen, dient een toelichting én de resultaten van alle alternatieve of aanvullende proeven te worden gegeven. Indien een afwijkend resultaat niet kan worden verklaard, moet het worden aanvaard en gebruikt om de stof overeenkomstig in te delen.

4.(1)(2)(3)(4)

LITERATUUR Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H., en Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 en 30-42. NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of explosive risk.

A.15. ZELFONTBRANDINGSTEMPERATUUR (VLOEISTOFFEN EN GASSEN)

A.15.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Explosieve stoffen en stoffen die spontaan ontbranden in aanraking met lucht bij kamertemperatuur moeten niet onderworpen worden aan dit onderzoek. De testprocedure is van toepassing op gassen, vloeistoffen en dampen die in aanwezigheid van lucht door een heet oppervlak tot ontbranding kunnen worden gebracht. De temperatuur waarbij zelfontbranding optreedt, kan aanzienlijk worden verlaagd door de aanwezigheid van katalytische verontreinigingen, door het oppervlakmateriaal, of door een groter volume van het proefvat.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN De mate van zelfontbranding wordt uitgedrukt in de zelfontbrandingstemperatuur. De zelfontbrandingstemperatuur is de laagste temperatuur waarbij de te onderzoeken stof gemengd met lucht tot ontbranding komt onder omstandigheden zoals beschreven in deze testmethode.

1.3. REFERENTIESTOFFEN De referentiestoffen worden beschreven in de normen (zie 1.6.3). Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om de werking van de methode regelmatig te controleren en om vergelijking met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De methode bepaalt de laagste temperatuur van het binnenoppervlak van een vat, die leidt tot ontbranding van een in het vat geïnjecteerd(e) gas, damp, of vloeistof.

1.5. KWALITEITSCRITERIA De reproduceerbaarheid is afhankelijk van het temperatuurgebied waarin de zelfontbranding optreedt, en van de gebruikte testmethode. De gevoeligheid en specificiteit zijn afhankelijk van de gebruikte testmethode.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.1. Apparatuur De apparatuur wordt beschreven in de onder 1.6.3 genoemde methode.

1.6.2. Testomstandigheden De te onderzoeken stof wordt onderzocht volgens de methode beschreven onder 1.6.3.

1.6.3. Uitvoering van de test Zie: IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. GEGEVENS Registreer de testtemperatuur, de atmosferische druk, de gebruikte hoeveelheid stof en de tijdsduur tot ontbranding.

3. RAPPORTAGE In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen);

de gebruikte hoeveelheid stof en de atmosferische druk;

de gebruikte apparatuur;

de resultaten van metingen (testtemperaturen, resultaten met betrekking tot ontbranding en bijbehorende tijdsduur);

alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor interpretatie van de resultaten.

4. LITERATUUR Geen.

A.16. RELATIEVE ZELFONTBRANDINGSTEMPERATUUR VAN VASTE STOFFEN

A.16.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Explosiegevaarlijke stoffen en stoffen die in contact met lucht bij kamertemperatuur spontaan ontbranden, moeten niet aan deze test worden onderworpen. Deze test geeft oriënterende informatie over de zelfontbrandbaarheid van vaste stoffen bij verhoogde temperatuur. Indien de warmte, die vrijkomt bij reactie van de stof met zuurstof of bij exotherme ontleding, niet snel genoeg aan de omgeving wordt afgegeven, vindt zelfopwarming en uiteindelijk zelfontbranding plaats. Zelfontbranding kan dus slechts optreden als de snelheid van de warmteproductie groter is dan die van het warmteverlies. De testprocedure is bruikbaar als een oriënterende proef voor vaste stoffen. Omdat de ontsteking en verbranding van vaste stoffen ingewikkelde processen zijn, mag de volgens deze testmethode bepaalde zelfontbrandingstemperatuur alleen voor vergelijkingsdoeleinden worden gebruikt.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN De zelfontbrandingstemperatuur, die met deze methode verkregen wordt, is de laagste omgevingstemperatuur in oC waarbij een bepaald volume van een stof onder welbepaalde omstandigheden ontbrandt.

1.3. REFERENTIESTOFFEN Niet gegeven.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Een bepaald volume van de te onderzoeken stof wordt bij kamertemperatuur in een oven geplaatst; het temperatuurverloop in het midden van het monster wordt als functie van de tijd geregistreerd, terwijl de temperatuur van de oven met een snelheid van 0,5 oC/minuut wordt opgevoerd tot 400 oC of tot de smelttemperatuur indien deze lager is. Voor het doel van deze test wordt de temperatuur van de oven, waarbij de temperatuur van het monster door zelfopwarming 400 oC bereikt, de zelfontbrandingstemperatuur genoemd.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Niet gegeven.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.1. Apparatuur

1.6.1.

1.6.1.1. Oven Een laboratoriumoven van ongeveer 2 liter, waarvan het temperatuurverloop lineair geregeld kan worden, en voorzien van natuurlijke luchtcirculatie en explosieontlasting. Teneinde eventueel explosiegevaar te vermijden, moet voorkomen worden dat ontledingsgassen in contact kunnen komen met de elektrische verwarmingselementen.

1.6.1.2. Gazen kubus Een stuk roestvrij staalgaas met openingen van 0,045 mm moet worden uitgeknipt volgens het patroon van figuur 1. Het gaas wordt gevouwen en met draad vastgemaakt in de vorm van een kubus met open bovenkant.

1.6.1.3. Thermokoppels Geschikte thermokoppels.

1.6.1.4. Recorder Tweekanaalsrecorder, gecalibreerd van 0 tot 600 oC of hiermee overeenkomstige spanning.

1.6.2. Testomstandigheden De stoffen worden getest zoals ontvangen.

1.6.3. Uitvoering van de test De kubus wordt gevuld met de te onderzoeken stof waarbij onder zachtjes tikken zoveel stof toegevoegd wordt dat de kubus volledig gevuld is. Vervolgens wordt de kubus bij kamertemperatuur midden in de oven gehangen. Het ene thermokoppel wordt in het middelpunt van de kubus gebracht en het tweede tussen de kubus en de ovenwand om de oventemperatuur te registreren. De temperaturen van de oven en van het monster worden continu geregistreerd terwijl de temperatuur van de oven met een snelheid van 0,5 oC/min wordt opgevoerd tot 400 oC of tot de smelttemperatuur indien deze lager is dan 400 oC. Wanneer de stof reageert, zal het thermokoppel in het monster een scherpe temperatuursstijging boven de oventemperatuur te zien geven.

2. GEGEVENS De oventemperatuur, waarbij de temperatuur van het monster door zelfopwarming 400 oC bereikt, is van belang voor de beoordeling (zie figuur 2).

3. RAPPORTAGE In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

een beschrijving van de onderzochte stof;

de meetresultaten inclusief de temperatuur/tijd-grafiek;

alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor interpretatie van de resultaten.

4. LITERATUUR (1) NF T 20-036 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

4. Figuur 1 Patroon van de testkubus met ribben van 20 mm

Figuur 2 Karakteristieke temperatuur/tijd-curve

Monstertemperatuur Oventemperatuure Zelfontbrandingstemperatuur Tijd

A.17. OXIDERENDE EIGENSCHAPPEN (VASTE STOFFEN)

A.17.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Het is nuttig om, voordat deze test wordt uitgevoerd, te beschikken over gegevens over de mogelijke explosieve eigenschappen van de te onderzoeken stof. Deze test is niet toepasbaar op vloeistoffen en gassen, explosieve of licht ontvlambare vaste stoffen of organische peroxiden. Deze test hoeft niet uitgevoerd te worden als op grond van de structuurformule met afdoende zekerheid kan worden vastgesteld dat de stof niet exotherm kan reageren met een brandbare stof. Teneinde vast te stellen of voor deze test speciale voorzorgsmaatregelen nodig zijn, moet een oriënterende proef worden uitgevoerd.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN Brandduur: de tijd in seconden die de reactiezone nodig heeft om zich langs een rups stof te verplaatsen, volgens de werkwijze van 1.6. Brandsnelheid: de bijbehorende snelheid in mm/s. Maximale brandsnelheid: de hoogste waarde van de brandsnelheden van mengsels die 10 tot 90 gewichtsprocent oxiderende stof bevatten.

1.3. REFERENTIESTOF Als referentiestof voor de test en de oriënterende proef wordt bariumnitraat (analytisch zuiver) gebruikt. Het referentiemengsel is het volgens 1.6 bereide mengsel van bariumnitraat en poedervormige cellulose, dat de grootst mogelijke brandsnelheid heeft (doorgaans een mengsel met 60 gewichtsprocent bariumnitraat).

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Met het oog op de veiligheid wordt een oriënterende proef uitgevoerd. Verdere onderzoeken zijn onnodig wanneer uit de oriënterende proef overduidelijk blijkt dat de te onderzoeken stof oxiderende eigenschappen heeft. In andere gevallen wordt de stof aan het volledige onderzoek onderworpen. In het volledige onderzoek wordt de te onderzoeken stof in verschillende verhoudingen gemengd met een bepaalde brandbare stof. Van ieder mengsel wordt een rups gevormd en deze wordt aan één uiteinde aangestoken. De maximale brandsnelheid wordt bepaald en vergeleken met de maximale brandsnelheid van het referentiemengsel.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Indien nodig kunnen de stoffen op willekeurige wijze worden gemalen en gemengd, mits de maximale brandsnelheden uit de zes verschillende bepalingen niet meer dan 10 % verschillen van hun rekenkundige gemiddelde.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODE

1.6.

1.6.1. Voorbereiding

1.6.1.

1.6.1.1. Teststof De deeltjesgrootte van het te onderzoeken monster wordt als volgt tot minder dan 0,125 mm verkleind: de stof wordt gezeefd en de overblijvende fractie gemalen; deze handelingen worden herhaald totdat de gehele portie door de zeef is gegaan. Iedere methode voor malen en zeven kan worden gebruikt, zolang aan de kwaliteitscriteria is voldaan. Vóór het bereiden van het mengsel wordt de stof eerst tot constant gewicht gedroogd bij 105 oC. Indien de ontledingstemperatuur van de te onderzoeken stof beneden 105 oC ligt, wordt de stof bij een lagere temperatuur gedroogd.

1.6.1.2. Brandbare stof Poedervormige cellulose wordt gebruikt als brandbare stof. De cellulose moet het soort zijn dat wordt gebruikt bij dunne-laagchromatografie of kolomchromatografie. Een type waarbij meer dan 85 % van de vezels een lengte hebben tussen 0,020 en 0,075 mm is geschikt gebleken. Het cellulosepoeder wordt gezeefd door een zeef met openingen van 0,125 mm. Eén en dezelfde voorbewerkte batch cellulose wordt gebruikt gedurende de hele proef. Vóór het bereiden van het mengsel wordt de poedervormige cellulose bij 105 oC tot constant gewicht gedroogd. Indien in de oriënterende proef houtmeel wordt gebruikt, wordt het houtmeel van naaldhout gebruikt dat door een zeef met openingen van 1,6 mm valt; het gezeefde houtmeel wordt grondig gemengd en vervolgens vier uur bij 105 oC gedroogd in een laag van maximaal 25 mm dikte. Na afkoelen wordt het houtmeel in een luchtdicht vat dat zover mogelijk gevuld is, bewaard tot het ogenblik waarop het wordt gebruikt, zo mogelijk binnen 24 uur na het drogen.

1.6.1.3. Ontstekingsbron Als ontstekingsbron dient de hete vlam van een gasbrander (minimale diameter 5 mm). Indien een andere ontstekingsbron wordt gebruikt (bijvoorbeeld bij proeven in een inerte atmosfeer), moeten beschrijving, redenen en geschiktheid worden gerapporteerd.

1.6.2. Uitvoering van de test Opmerking: In verband met mogelijk explosiegevaar moeten mengsels van oxiderende stoffen en cellulose of houtmeel met de nodige voorzichtigheid worden behandeld.

1.6.2.

1.6.2.1. Oriënterende proef Twee gewichtsdelen gedroogde stof worden grondig gemengd met één gewichtsdeel cellulose of houtmeel. Van het mengsel wordt, bijvoorbeeld met behulp van een glazen trechter waarvan de steel is dichtgestopt, zonder aandrukken een kegelvormig hoopje gemaakt met een basisdiameter van 3,5 cm en een hoogte van 2,5 cm. Het hoopje wordt op een koude onbrandbare, niet poreuze en slecht warmtegeleidende grondplaat geplaatst. De oriënterende proef moet worden uitgevoerd in een zuurkast zoals beschreven in 1.6.2.2. De ontstekingsbron wordt in contact gebracht met het hoopje stof. De heftigheid en de duur van de reactie worden geobserveerd en geregistreerd. De stof kan worden aangemerkt als oxiderend als de reactie heftig verloopt. Zodra het resultaat aanleiding geeft tot enige twijfel, dient de hieronder beschreven volledige test te worden uitgevoerd.

1.6.2.2. Volledig onderzoek Er worden mengsels van de oxiderende stof en de brandbare stof gemaakt, waarbij het gehalte oxiderende stof in stappen van 10 gewichtsprocenten oploopt van 10 tot 90 gewichtsprocenten. In grensgevallen moeten tussenliggende mengverhoudingen worden bereid, zodat de maximale brandsnelheid nauwkeuriger kan worden bepaald. Er wordt een rupsstof gevormd met behulp van een mal. Deze mal is van metaal, heeft een lengte van 250 mm en een driehoekige doorsnede met een hoogte van 10 mm en een basis van 20 mm. Aan weerszijden van de mal worden in de lengterichting twee metalen platen aangebracht die 2 mm boven de driehoekige doorsnede uitsteken (zie figuur). De mal wordt zonder aandrukken gevuld met een kleine overmaat van het mengsel. Na de mal eenmaal van een hoogte van 2 cm op een vast oppervlak te hebben laten vallen, wordt de overmaat mengsel met een schuingehouden blad weggeveegd. De zijstroken worden verwijderd en het overblijvende poeder wordt met een rol glad gestreken. Ten slotte wordt bovenop de mal een vuurvaste, niet poreuze en slecht warmtegeleidende plaat gelegd, het geheel wordt omgekeerd en de mal verwijderd. De rups wordt in de zuurkast geplaatst in een richting loodrecht op de richting van de trek. De luchtsnelheid moet voldoende zijn om te verhinderen dat verbrandingsgassen naar de laboratoriumruimte ontsnappen; de luchtsnelheid mag gedurende de test niet veranderd worden. De apparatuur moet worden omgeven door een tochtscherm. In verband met de hygroscopische eigenschappen van cellulose en sommige te onderzoeken stoffen moet de test zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Eén uiteinde van de rups wordt aangestoken door aanraking met de vlam. De brandduur wordt gemeten over een lengte van 200 mm, nadat de reactiezone reeds een beginafstand van 30 mm heeft afgelegd. De test wordt uitgevoerd met de referentiestof en vervolgens ten minste éénmaal met elk mengsel uit de reeks van de te onderzoeken stof en cellulose. Indien een maximale brandsnelheid wordt waargenomen die aanzienlijk hoger is dan de maximale brandsnelheid van het referentiemengsel, kan de test worden gestaakt; zo niet, dan moet de test vijfmaal worden herhaald met de drie mengsels die de hoogste brandsnelheid opleverden. Indien men vermoedt dat het resultaat vals positief is, moet de test herhaald worden met een inerte stof met een zelfde deeltjesgrootte, zoals kiezelgoer, in plaats van cellulose. Ook kan het mengsel te onderzoeken stof/cellulose, dat de grootste verbrandingssnelheid heeft, opnieuw getest worden in een inerte atmosfeer (< 2 % v/v zuurstofgehalte).

2. GEGEVENS Om veiligheidsredenen moet de hoogste brandsnelheid — en niet de gemiddelde waarde — worden beschouwd als kenmerk voor de oxiderende eigenschappen van de stof. De hoogste waarde van de brandsnelheid binnen een serie van zes metingen voor één bepaald mengsel geldt voor de beoordeling. Maak een grafiek waarin de hoogste waarde van de brandsnelheid van ieder mengsel wordt uitgezet tegen de concentratie van de oxiderende stof in ieder mengsel; bepaal uit deze grafiek de maximale brandsnelheid. De zes waarden van de brandsnelheid, in een serie van zes metingen op het mengsel met de hoogste brandsnelheid, mogen niet meer dan 10 % afwijken van hun rekenkundig gemiddelde; anders moeten de gebruikte methoden voor malen en mengen verbeterd worden. Vergelijk de verkregen maximale brandsnelheid met de maximale brandsnelheid van het referentiemengsel (zie 1.3). Als tests worden uitgevoerd in een inerte atmosfeer, moet de maximale reactiesnelheid worden vergeleken met die van het referentiemengsel in een inerte atmosfeer.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

beschrijving, samenstelling, zuiverheid, vochtgehalte, enz. van de onderzochte stof;

eventuele voorbehandeling van de onderzochte stof (bijvoorbeeld malen, drogen enz.)

de in de onderzoeken gebruikte ontstekingsbron;

de resultaten van de metingen;

de wijze van reactie (bijvoorbeeld een flashverbranding aan het oppervlak of een verbranding door de gehele massa, eventuele informatie met betrekking tot de verbrandingsproducten enz.);

alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, inclusief een beschrijving van de heftigheid (vlammen, vonken, rook, smeulen, en dergelijke) en een schatting van de brandduur van de oriënterende proef, zowel voor de teststof als voor de referentiestof;

de resultaten van proeven met een inerte stof, indien van toepassing;

de resultaten van proeven in een inerte atmosfeer, indien van toepassing.

3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN Een stof wordt aangemerkt als een oxiderende stof wanneer: Om vals positieve resultaten te vermijden, dient bij het verwerken van de resultaten ook rekening gehouden te worden met de resultaten verkregen bij het testen van stof gemengd met inert materiaal en/of in een inerte atmosfeer.

3.2. a)

er in de oriënterende proef een heftige reactie optreedt;

in de volledige test de maximale brandsnelheid van de onderzochte mengsels groter is dan of gelijk is aan de maximale brandsnelheid van het referentiemengsel van cellulose en bariumnitraat.

4. LITERATUUR (1) NF T 20-035 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

A.18. AANTALGEMIDDELD MOLECUULGEWICHT EN MOLECUULGEWICHTSVERDELING VAN POLYMEREN

A.18.

1. METHODE Deze methode voor gelpermeatiechromatografie is overgenomen van TG 118 van de OESO (1996). Voor de fundamentele beginselen en nadere technische informatie wordt verwezen naar de referenties.

1.

1.1. INLEIDING Aangezien de eigenschappen van polymeren zo sterk uiteenlopen, is het onmogelijk een enkele methode te beschrijven waarin voor alle mogelijkheden en specifieke gevallen bij de scheiding van polymeren exact de omstandigheden voor scheiding en evaluatie worden aangegeven. Met name complexe polymeersystemen komen vaak niet in aanmerking voor gelpermeatiechromatografie (GPC). Wanneer GPC niet uitvoerbaar is, kan het molecuulgewicht met behulp van andere methoden worden bepaald (zie bijlage). In dat geval moet een gedetailleerde beschrijving van en een volledige motivering voor de gebruikte methode worden gegeven. De hier beschreven methode is gebaseerd op de norm DIN 55672 (1). Deze norm bevat gedetailleerde informatie over de wijze waarop de experimenten moeten worden uitgevoerd en de gegevens moeten worden geëvalueerd. Wanneer veranderingen in de wijze van uitvoering nodig zijn, moet daarvoor een motivering worden gegeven. Ook andere normen kunnen worden gebruikt, mits de referenties volledig worden vermeld. In de beschreven methode worden voor de kalibratie polystyreenmonsters met een bekende polydispersiteit gebruikt en wijzigingen kunnen nodig zijn om de methode geschikt te maken voor bepaalde polymeren zoals in water oplosbare polymeren en vertakte polymeren met een lange keten.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN Het aantalgemiddeld molecuulgewicht (Mn) en het gewichtgemiddeld molecuulgewicht (Mw) worden bepaald met behulp van de volgende vergelijkingen: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi waarbij Hi = de hoogte van het detectorsignaal vanaf de basislijn bij het retentievolume Vi; Mi = het molecuulgewicht van de polymeerfractie bij het retentievolume Vi; N = het aantal meetpunten. De verhouding Mw/Mn is de breedte van de molecuulgewichtsverdeling, die een maat is voor de dispersiteit van het systeem.

1.3. REFERENTIESTOFFEN Aangezien GPC een relatieve methode is, moet het systeem worden gekalibreerd. Als standaard worden normaal gesproken fijn verdeelde lineair opgebouwde polystyreenmonsters gebruikt met bekende gemiddelde molecuulgewichten (Mn en Mw) en een bekende molecuulgewichtsverdeling. De kalibratiecurve kan alleen voor de bepaling van het molecuulgewicht van het onbekende monster worden gebruikt als de omstandigheden voor de scheiding van het monster en de standaards op identieke wijze zijn gekozen. Een tijdens een bepaald experiment vastgesteld verband tussen het molecuulgewicht en het elutievolume is alleen onder de specifieke omstandigheden van dat experiment geldig. Daarbij gaat het vooral om de temperatuur, het oplosmiddel (of het oplosmiddelenmengsel), de omstandigheden tijdens chromatografie en de kolom of het kolomsysteem waarop de scheiding is uitgevoerd. Een op deze manier bepaald molecuulgewicht van het monster is relatief en wordt beschreven als een polystyreenequivalent molecuulgewicht. Dit houdt in dat het molecuulgewicht afhankelijk van de structurele en chemische verschillen tussen het monster en de standaard in meer of mindere mate van de absolute waarde kan afwijken. Als een andere standaard wordt gebruikt, zoals polyethyleenglycol, polyethyleenoxide, polymethylmethacrylaat of polyacrylzuur, moet de reden daarvan worden vermeld.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Zowel de molecuulgewichtsverdeling van het monster als het gemiddelde molecuulgewicht (Mn of Mw) kan met behulp van GPC worden bepaald. GPC is een speciaal soort vloeistofchromatografie waarbij het monster aan de hand van het hydrodynamische volume van de verschillende bestanddelen wordt gescheiden (2). De scheiding voltrekt zich tijdens de passage van het monster door een kolom die met een poreus materiaal, meestal een organische gel, is gevuld. Kleine moleculen kunnen de poriën binnendringen, terwijl grote moleculen dit niet kunnen. Grote moleculen volgen dan ook een kortere weg en worden het eerste geëlueerd. Middelgrote moleculen kunnen sommige poriën binnendringen en worden later geëlueerd. De kleinste moleculen, waarvan de gemiddelde hydrodynamische straal kleiner is dan de poriën van de gel, kunnen alle poriën binnendringen. Deze worden het laatst geëlueerd. In het ideale geval wordt de scheiding uitsluitend door de grootte van het molecuul bepaald, maar enige storing door absorptie-effecten is in de praktijk vrijwel niet te voorkomen. Een ongelijkmatige pakking van de kolom en dode ruimten kunnen de situatie nog ongunstiger maken (2). Detectie gebeurt aan de hand van bijvoorbeeld de brekingsindex of uv-absorptie en levert een eenvoudige verdelingskromme op. Om echte waarden voor het molecuulgewicht aan de kromme te kunnen toekennen, moet de kolom echter worden gekalibreerd met behulp van polymeren met een bekend molecuulgewicht en liefst een in grote lijnen vergelijkbare structuur, bijvoorbeeld een aantal polystyreenstandaards. Meestal levert dit een gausscurve op, soms met een kleine staart aan de kant van de lage molecuulgewichten, waarbij op de verticale as de geëlueerde hoeveelheid in gewicht wordt uitgezet en op de horizontale as de logaritme van het molecuulgewicht.

1.5. KWALITEITSCRITERIA De herhaalbaarheid (relatieve standaardafwijking) van het elutievolume moet beter zijn dan 0,3 %. Indien een chromatogram tijdafhankelijk wordt geëvalueerd en niet aan dit criterium voldoet, moet door correctie met behulp van een interne standaard de vereiste herhaalbaarheid van de analyse worden gewaarborgd (1). De polydispersiteit is afhankelijk van het molecuulgewicht van de standaard. Normale waarden voor polystyreenstandaards zijn: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 M p > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp is het molecuulgewicht van de standaard bij de top van de piek).

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.1. Bereiding van de polystyreenstandaardoplossingen De polystyreenstandaard wordt opgelost door deze zorgvuldig te mengen in de gekozen elutievloeistof. Bij de bereiding van de oplossingen moet rekening worden gehouden met de aanbevelingen van de fabrikant. De concentratie van de standaardoplossingen wordt bepaald aan de hand van verschillende factoren, zoals het geïnjecteerde volume, de viscositeit van de oplossing en de gevoeligheid van de detector. Het maximale geïnjecteerde volume moet aan de lengte van de kolom worden aangepast om overlading te voorkomen. Voor een scheiding met behulp van GPC over een kolom van 30 cm × 7,8 mm wordt meestal een volume van 40 tot 100 μl geïnjecteerd. Grotere volumes zijn mogelijk, maar niet groter dan 250 μl. De optimale verhouding tussen het geïnjecteerde volume en de concentratie moet vóór de kalibratie van de kolom worden bepaald.

1.6.2. Bereiding van de monsteroplossing In beginsel gelden voor de bereiding van de monsteroplossingen dezelfde eisen. Het monster wordt door zorgvuldig schudden opgelost in een geschikt oplosmiddel, bijvoorbeeld tetrahydrofuraan (THF). Het mag in geen geval met behulp van een ultrasoon bad worden opgelost. Indien nodig, wordt de monsteroplossing gezuiverd over een membraanfilter met een poriegrootte tussen 0,2 en 2 μm. Indien de oplossing onopgeloste deeltjes bevat, moet dit in het eindverslag worden vermeld, aangezien deze door hoogmoleculaire bestanddelen kunnen ontstaan. Er moet aan adequate methode worden gebruikt om het gewichtspercentage van de onopgeloste deeltjes te bepalen. De oplossingen moeten binnen 24 uur worden gebruikt.

1.6.3. Apparatuur Er moet voor worden gezorgd dat het GPC-systeem niet met de gebruikte oplosmiddelen reageert (bijvoorbeeld door stalen capillairen te gebruiken voor THF-oplossingen).

oplosmiddelreservoir

ontgasser (indien van toepassing)

pomp

pulsdemper (indien van toepassing)

injectiesysteem

chromatografiekolommen

detector

stromingsmeter (indien van toepassing)

gegevensrecorder/verwerker

afvalreservoir

1.6.4. Injectie- en oplosmiddeltoevoersysteem Een bekend volume van de monsteroplossing wordt met behulp van een autosampler of manueel in een scherp begrensde zone op de kolom gebracht. Wanneer bij manueel opbrengen de plunjer van de injectiespuit te snel wordt ingedrukt of teruggetrokken, kan dit tot veranderingen in de waargenomen molecuulgewichtsverdeling leiden. Het oplosmiddeltoevoersysteem moet voorzover mogelijk pulsatievrij zijn en liefst een pulsdemper bevatten. De stroomsnelheid moet ongeveer 1 ml/min zijn.

1.6.5. Kolom Afhankelijk van het monster wordt het polymeer gekarakteriseerd met behulp van één kolom of een aantal in serie gekoppelde kolommen. In de handel zijn verschillende poreuze pakkingsmaterialen met bekende eigenschappen (bijvoorbeeld poriegrootte en exclusiegrens) verkrijgbaar. De keuze van de gel en de lengte van de kolom wordt bepaald door zowel de eigenschappen van het monster (hydrodynamisch volume, molecuulgewichtsverdeling) als de specifieke omstandigheden voor de scheiding zoals oplosmiddel, temperatuur en stroomsnelheid (1)(2)(3).

1.6.6. Theoretische schotels De voor de scheiding gebruikte kolom of combinatie van kolommen moet worden gekarakteriseerd met behulp van het aantal theoretische schotels. Daartoe moet, indien THF als elutievloeistof wordt gebruikt, een oplossing van ethylbenzeen of een andere geschikte apolaire stof op een kolom met een bekende lengte worden gebracht. Het aantal theoretische schotels wordt berekend met de volgende vergelijking: N=5,54VeW1/22 of N=16VeW2 waarbij: N het aantal theoretische schotels; Vc het elutievolume bij de top van de piek; W de piekbreedte aan de basis; Wl/2 de piekbreedte op halve hoogte.

1.6.7. Scheidend vermogen Naast het aantal theoretische schotels, een grootheid die bepalend is voor de bandbreedte, speelt ook het scheidend vermogen, dat wordt bepaald door de helling van de kalibratiecurve, een rol. Het scheidend vermogen van een kolom kan als volgt worden bepaald: Ve,Mx-Ve,(10Mx)oppervlak doorsnede van de kolom≥6,0 cm3cm2 waarbij: Ve, Mx het elutievolume voor polystyreen met molecuulgewicht Mx; Ve,(10Mx) het elutievolume voor polystyreen met een tien keer zo hoog molecuulgewicht. De resolutie van het systeem wordt meestal als volgt gedefinieerd: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 waarbij: Vel, Ve2 het elutievolume van de twee polystyreenstandaards bij de top van de piek; Wl' W2 die piekbreedte aan de basis; M1, M2 het molecuulgewicht bij de top van de pieken (deze moeten een factor 10 van elkaar verschillen). De R-waarde voor het kolomsysteem moet groter zijn dan 1,7 (4).

1.6.8. Oplosmiddelen Alle oplosmiddelen moeten zeer zuiver zijn (THF wordt gebruikt met een zuiverheid van 99,5 %). Het oplosmiddelreservoir (indien nodig onder inert gas) moet groot genoeg zijn voor de kalibratie van de kolom en de analyse van verschillende monsters. Het oplosmiddel moet worden ontgast voordat het via de pomp naar de kolom wordt getransporteerd.

1.6.9. Temperatuurbewaking De temperatuur van de kritische interne onderdelen (injectieblok, kolommen, detector en leidingen) moet constant zijn en in overeenstemming zijn met het gekozen oplosmiddel.

1.6.10. Detector De detector is bedoeld om de concentratie van het monster in het eluaat uit de kolom kwantitatief te registreren. Om een onnodige verbreding van de pieken te voorkomen, moet het volume van de meetcel van de detector zo klein mogelijk worden gehouden. Het volume mag niet groter zijn dan 10 μl, behalve voor lichtverstrooiings- en viscositeitsdetectoren. Meestal wordt voor de detectie differentiële refractometrie gebruikt. Indien dit in verband met de specifieke eigenschappen van het monster of de elutievloeistof nodig is, kunnen echter ook andere soorten detectors worden gebruikt, zoals UV/VIS, IR of viscositeitsdetectoren.

2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE

2.

2.1. GEGEVENS Voor de gedetailleerde beoordelingscriteria en voor de eisen ten aanzien van het verzamelen en bewerken van de gegevens wordt verwezen naar de DIN-norm (1). Voor elk monster moeten twee onafhankelijke experimenten worden uitgevoerd die los van elkaar moeten worden geanalyseerd. Voor elke meting moet de waarde van Mn, MR, Mw/Mn en M worden vermeld. Daarbij moet expliciet worden vermeld dat de gemeten waarden relatief zijn en worden uitgedrukt in equivalent-molecuulgewicht van de gebruikte standaard. Na de bepaling van de retentievolumes of de retentietijden (eventueel gecorrigeerd met behulp van een interne standaard) wordt de logaritmische waarde van M (waarbij M de top van de piek van de kalibratiestandaard is) tegen een van deze grootheden uitgezet. Per log-interval zijn minimaal twee kalibratiepunten nodig en voor de curve als geheel minimaal vijf meetpunten. Het geraamde molecuulgewicht van het monster moet tussen het eerste en het laatste meetpunt liggen. Voor de bepaling van het laagste molecuulgewicht van de kalibratiecurve wordt een oplossing van n-hexylbenzeen of een andere geschikte apolaire stof gebruikt. Het aantalgemiddelde en het gewichtgemiddelde molecuulgewicht worden meestal aan de hand van de bij punt 1.2 vermelde vergelijkingen met behulp van een computer bepaald. Wanneer de digitalisering met de hand gebeurt, kan ASTM D 3536-91 (3) worden geraadpleegd. De verdelingskromme moet in de vorm van een tabel of als figuur (al dan niet cumulatieve frequentieverdeling tegen log M) worden verstrekt. Bij de grafische weergave moet één log-interval van het molecuulgewicht normaal gesproken ongeveer 4 cm breed zijn en moet de top van de piek ongeveer 8 cm hoog zijn. Bij een cumulatieve frequentieverdeling moet het verschil op de y-as tussen 0 en 100 % ongeveer 10 cm zijn.

2.2. TESTVERSLAG Het testverslag moet de volgende informatie bevatten:

2.2.

2.2.1. Onderzochte stof:

beschikbare informatie over de onderzochte stof (identiteit, additieven, verontreinigingen);

beschrijving van de behandeling van het monster, opmerkingen, problemen.

2.2.2. Apparatuur:

elutievloeistofreservoir, inert gas, ontgassing van de elutievloeistof, samenstelling van de elutievloeistof, verontreinigingen;

pomp, pulsdemper, injectiesysteem;

scheidingskolommen (fabrikant, alle informatie over de kenmerken van de kolommen zoals poriegrootte en aard van het pakkingsmateriaal, aantal, lengte en volgorde van de gebruikte kolommen);

aantal theoretische schotels van de kolom (of de combinatie), scheidend vermogen (resolutie van het systeem);

informatie over de symmetrie van de pieken;

kolomtemperatuur, aard van de temperatuurregeling;

detector (meetprincipe, type, volume van de meetcel);

stromingsmeter, indien gebruikt (fabrikant, meetprincipe);

systeem voor gegevensregistratie en -verwerking (hardware en software).

2.2.3. Kalibratie van het systeem:

gedetailleerde beschrijving van de methode die wordt gebruikt om de kalibratiecurve samen te stellen;

informatie over de kwaliteitscriteria voor deze methode (bijvoorbeeld correlatiecoëfficiënt of som van de kwadraten).

informatie over alle extrapolaties, veronderstellingen en benaderingen tijdens de experimentele procedure en de beoordeling en verwerking van gegevens.

alle metingen die voor de samenstelling van de kalibratiecurve worden gebruik, moeten in een tabel worden opgenomen waarbij voor elk kalibratiepunt de volgende informatie moet worden vermeld:

naam van het monster;

fabrikant van het monster;

normale waarden van Mp, Mn, Mw en Mw/Mn, zoals deze door de fabrikant zijn verstrekt of door latere metingen zijn bepaald, alsmede gedetailleerde informatie over de bepalingsmethode;

geïnjecteerd volume en concentratie daarin;

voor kalibratie gebruikte waarde van Mp;

bij de top van de piek gemeten elutievolume of gecorrigeerde retentietijd;

bij de top van de piek berekende Mp;

procentuele fout van berekende Mp en de kalibratiewaarde.

2.2.4. Evaluatie:

evaluatie op basis van tijd: methoden die worden gebruikt om de vereiste reproduceerbaarheid te waarborgen (correctiemethode, interne standaard enz.);

informatie over de keuze voor elutievolume of retentietijd als basis voor de evaluatie;

informatie over de grenzen van de evaluatie als een piek niet volledig wordt geanalyseerd;

beschrijving van afvlakmethoden indien deze zijn gebruikt;

procedures voor de bereiding en voorbehandeling van het monster;

eventuele aanwezigheid van onopgeloste deeltjes;

geïnjecteerd volume (μl) en concentratie daarin (mg/ml);

bespreking van effecten die tot afwijkingen van het ideale GPC-profiel leiden;

gedetailleerde beschrijving van alle wijzigingen in de testprocedures;

gedetailleerde informatie over de foutintervallen;

alle andere informatie en opmerkingen die relevant zijn voor de interpretatie van de resultaten.

3.(1)(2)(3)(4)

REFERENTIES DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.19. GEHALTE VAN POLYMEREN AAN LAAGMOLECULAIRE BESTANDDELEN

A.19.

1. METHODE Deze methode voor gelpermeatiechromatografie is overgenomen van TG 119 van de OESO (1996). Voor de fundamentele beginselen en nadere technische informatie wordt verwezen naar de referenties.

1.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN Een laag molecuulgewicht wordt hier willekeurig gedefinieerd als een molecuulgewicht beneden 1000 dalton. Het aantalgemiddelde molecuulgewicht (Mn) en het gewichtgemiddelde molecuulgewicht (Mw) worden bepaald met behulp van de volgende vergelijkingen: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi waarbij: Hi de hoogte van het detectorsignaal vanaf de basislijn bij het retentievolume Vi; Mi het molecuulgewicht van de polymeerfractie bij het retentievolume Vi; n het aantal meetpunten. De verhouding Mw/Mn is de breedte van de molecuulgewichtsverdeling, die een maat is voor de dispersiteit van het systeem.

1.3. REFERENTIESTOFFEN Aangezien GPC een relatieve methode is, moet het systeem worden gekalibreerd. Als standaard worden normaal gesproken fijn verdeelde lineair opgebouwde polystyreenmonsters gebruikt met bekende gemiddelde molecuulgewichten (Mn en Mw) en een bekende molecuulgewichtsverdeling. De kalibratiecurve kan alleen voor de bepaling van het molecuulgewicht van het onbekende monster worden gebruikt als de omstandigheden voor de scheiding van het monster en de standaards op identieke wijze zijn gekozen. Een tijdens een bepaald experiment vastgesteld verband tussen het molecuulgewicht en het elutievolume is alleen onder de specifieke omstandigheden van dat experiment geldig. Daarbij gaat het vooral om de temperatuur, het oplosmiddel (of het oplosmiddelenmengsel), de omstandigheden tijdens chromatografie en de kolom of het kolomsysteem waarop de scheiding is uitgevoerd. Een op deze manier bepaald molecuulgewicht van het monster is relatief en wordt beschreven als een polystyreen-equivalent molecuulgewicht. Dit houdt in dat het molecuulgewicht afhankelijk van de structurele en chemische verschillen tussen het monster en de standaard in meer of mindere mate van de absolute waarde kan afwijken. Als een andere standaard wordt gebruikt, zoals polyethyleenglycol, polyethyleenoxide, polymethylmethacrylaat of polyacrylzuur, moet de reden daarvan worden vermeld.

1.5. KWALITEITSCRITERIA De herhaalbaarheid (relatieve standaardafwijking) van het elutievolume moet beter zijn dan 0,3 %. Indien een chromatogram tijdafhankelijk wordt geëvalueerd en niet aan dit criterium voldoet, moet door correctie met behulp van een interne standaard de vereiste herhaalbaarheid van de analyse worden gewaarborgd (1). De polydispersiteit is afhankelijk van het molecuulgewicht van de standaard. Normale waarden voor polystyreenstandaards zijn: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp is het molecuulewicht van de standaard bij de top van de piek.)

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.2. Bereiding van de monsteroplossing In beginsel gelden voor de bereiding van de monsteroplossingen dezelfde eisen. Het monster wordt door zorgvuldig schudden opgelost in een geschikt oplosmiddel, bijvoorbeeld tetrahydrofuraan (THF). Het mag in geen geval met behulp van een ultrasoon bad worden opgelost. Indien nodig wordt de monsteroplossing gezuiverd over een membraanfilter met een poriegrootte tussen 0,2 en 2 μm. Indien de oplossing onopgeloste deeltjes bevat, moet dit in het eindverslag worden vermeld aangezien deze door hoogmoleculaire bestanddelen kunnen ontstaan. Er moet een adequate methode worden gebruikt om het gewichtspercentage van de onopgeloste deeltjes te bepalen. De oplossingen moeten binnen 24 uur worden gebruikt.

1.6.3. Correctie voor het gehalte aan verontreinigingen en additieven Meestal moet het gehalte aan bestanddelen met M < 1000 worden gecorrigeerd voor de bijdrage van niet polymeerspecifieke componenten (zoals verontreinigingen en/of additieven), tenzij het gemeten gehalte al lager is dan 1 %. Dit gebeurt door een directe analyse van de polymeeroplossing of van het GPC-eluaat. Wanneer het eluaat na de passage door de kolom te verdund is om nog te worden geanalyseerd, moet het worden geconcentreerd. Daarbij kan het nodig zijn het eluaat droog te dampen en vervolgens weer op te lossen. Het concentreren van het eluaat moet onder zodanige omstandigheden gebeuren dat wordt gewaarborgd dat er geen veranderingen in het eluaat optreden. De behandeling van het eluaat na GPC is afhankelijk van de analysemethode die voor de kwantitatieve bepaling wordt gebruikt.

1.6.4. Apparatuur De GPC-apparatuur bestaat uit de volgende onderdelen: Er moet voor worden gezorgd dat het GPC-systeem niet met de gebruikte oplosmiddelen reageert (bijvoorbeeld door stalen capillairen te gebruiken voor THF-opIossingen).

oplosmiddelreservoir

ontgasser (indien van toepassing)

pomp

pulsdemper (indien van toepassing)

injectiesysteem

chromatografiekolommen

detector

stromingsmeter (indien van toepassing)

gegevensrecorder/verwerker

afvalreservoir

1.6.5. Injectie- en oplosmiddeltoevoersysteem Een bekend volume van de monsteroplossing wordt met behulp van een autosampler of manueel in een scherp begrensde zone op de kolom gebracht. Wanneer bij manueel opbrengen de plunjer van de injectiespuit te snel wordt ingedrukt of teruggetrokken, kan dit tot veranderingen in de waargenomen molecuulgewichtsverdeling leiden. Het oplosmiddeltoevoersysteem moet voor zover mogelijk pulsatievrij zijn en liefst een pulsdemper bevatten. De stroomsnelheid moet ongeveer 1 ml/min zijn.

1.6.6. Kolom Afhankelijk van het monster wordt het polymeer gekarakteriseerd met behulp van één kolom of een aantal in serie gekoppelde kolommen. In de handel zijn verschillende poreuze pakkingsmaterialen met bekende eigenschappen (bijvoorbeeld poriegrootte en exclusiegrens) verkrijgbaar. De keuze van de gel en de lengte van de kolom wordt bepaald door zowel de eigenschappen van het monster (hydrodynamisch volume, molecuulgewichtsverdeling) als de specifieke omstandigheden voor de scheiding zoals oplosmiddel, temperatuur en stroomsnelheid (1)(2)(3).

1.6.7. Theoretische schotels De voor de scheiding gebruikte kolom of combinatie van kolommen moet worden gekarakteriseerd met behulp van het aantal theoretische schotels. Daartoe moet, indien THF als elutievloeistof wordt gebruikt, een oplossing van ethylbenzeen of een andere geschikte apolaire stof op een kolom met een bekende lengte worden gebracht. Het aantal theoretische schotels wordt berekend met de volgende vergelijking: N=5,54VeW1/22 of N=16VeW2 waarbij: N het aantal theoretische schotels; Ve het elutievolume bij de top van de piek; W de piekbreedte aan de basis; W1/2 de piekbreedte op halve hoogte.

1.6.8. Scheidend vermogen Naast het aantal theoretische schotels, een grootheid die bepalend is voor de bandbreedte, speelt ook het scheidend vermogen, dat wordt bepaald door de helling van de kalibratiecurve, een rol. Het scheidend vermogen van een kolom kan als volgt worden bepaald: Ve,Mx-Ve,(10Mx)oppervlak doorsnede van de kolom≥6,0cm3cm2 waarbij: Ve, Mr het elutievolume voor polystyreen met molecuulgewicht Mx; Ve,(10.Mr) het elutievolume voor polystyreen met een tien keer zo hoog molecuulgewicht. De resolutie van het systeem wordt meestal als volgt gedefinieerd: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 waarbij: Ve1, Ve2 het elutievolume van de twee polystyreenstandaards bij de top van de piek; W1, W2 de piekbreedte aan de basis; M1, M2 het molecuulgewicht bij de top van de pieken (deze moeten een factor 10 van elkaar verschillen). De R-waarde voor het kolomsysteem moet groter zijn dan 1,7 (4).

1.6.9. Oplosmiddelen Alle oplosmiddelen moeten zeer zuiver zijn (THF wordt gebruikt met een zuiverheid van 99,5 %). Het oplosmiddelreservoir (indien nodig onder inert gas) moet groot genoeg zijn voor de kalibratie van de kolom en de analyse van verschillende monsters. Het oplosmiddel moet worden ontgast voordat het via de pomp naar de kolom wordt getransporteerd.

1.6.10. Temperatuurbewaking De temperatuur van de kritische interne onderdelen (injectieblok, kolommen, detector en leidingen) moet constant zijn en in overeenstemming zijn met het gekozen oplosmiddel.

1.6.11. Detector De detector is bedoeld om de concentratie van het monster in het eluaat uit de kolom kwantitatief te registreren. Om een onnodige verbreding van de pieken te voorkomen, moet het volume van de meetcel van de detector zo klein mogelijk worden gehouden. Het volume mag niet groter zijn dan 10 μl, behalve voor lichtverstrooiings- en viscositeitsdetectoren. Meestal wordt voor de detectie differentiële refractometrie gebruikt. Indien dit in verband met de specifieke eigenschappen van het monster of de elutievloeistof nodig is, kunnen echter ook andere soorten detectors worden gebruikt, zoals UV/VIS, IR of viscositeitsdetectoren.

2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE

2.

2.1. GEGEVENS Voor de gedetailleerde beoordelingscriteria en voor de eisen ten aanzien van het verzamelen en bewerken van de gegevens wordt verwezen naar de DIN-norm (1). Voor elk monster moeten twee onafhankelijke experimenten worden uitgevoerd die los van elkaar moeten worden geanalyseerd. Het is van essentieel belang dat in alle gevallen onder dezelfde omstandigheden als de bepaling bij het monster ook een blancobepaling wordt uitgevoerd. Er moet expliciet worden vermeld dat de gemeten waarden relatief zijn en worden uitgedrukt in equivalent-molecuulgewicht van de gebruikte standaard. Na de bepaling van de retentievolumes of de retentietijden (eventueel gecorrigeerd met behulp van een interne standaard) wordt de logaritmische waarde van M (waarbij M de top van de piek van de kalibratiestandaard is) tegen een van deze grootheden uitgezet. Per log-interval zijn minimaal twee kalibratiepunten nodig en voor de curve als geheel minimaal vijf meetpunten. Het geraamde molecuulgewicht van het monster moet tussen het eerste en het laatste meetpunt liggen. Voor de bepaling van het laagste molecuulgewicht van de kalibratiecurve wordt een oplossing van n-hexylbenzeen of een andere geschikte apolaire stof gebruikt. Het gedeelte van de curve dat overeenkomt met molecuul-gewichten lager dan 1000 wordt indien nodig gecorrigeerd voor verontreinigingen en additieven. De evaluatie van de elutiecurves gebeurt meestal met behulp van elektronische gegevensverwerking. Wanneer de digitalisering met de hand gebeurt, kan ASTM D 3536-91 (3) worden geraadpleegd. Als er onoplosbaar polymeer op de kolom achterblijft, zal dit waarschijnlijk een hoger molecuulgewicht hebben dan de opgeloste fractie en als daar geen rekening mee wordt gehouden, zou het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen waarschijnlijk te hoog uitvallen. In de bijlage worden richtsnoeren gegeven om het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen te corrigeren voor de aanwezigheid van onoplosbaar polymeer. De verdelingskromme moet in de vorm van een tabel of als figuur (al dan niet cumulatieve frequentieverdeling tegen log M) worden verstrekt. Bij de grafische weergave moet één log-interval van het molecuulgewicht normaal gesproken ongeveer 4 cm breed zijn en moet de top van de piek ongeveer 8 cm hoog zijn. Bij een cumulatieve frequentieverdeling moet het verschil op de y-as tussen 0 en 100 % ongeveer 10 cm zijn.

2.2. TESTVERSLAG Het testverslag moet de volgende informatie bevatten:

2.2.

2.2.1. Onderzochte stof:

beschikbare informatie over de onderzochte stof (identiteit, additieven, verontreinigingen);

beschrijving van de behandeling van het monster, opmerkingen, problemen.

2.2.2. Apparatuur:

elutievloeistofreservoir, inert gas, ontgassing van de elutievloeistof, samenstelling van de elutievloeistof, verontreinigingen;

pomp, pulsdemper, injectiesysteem;

scheidingskolommen (fabrikant, alle informatie over de kenmerken van de kolommen zoals poriegrootte en aard van het pakkingsmateriaal, aantal, lengte en volgorde van de gebruikte kolommen);

aantal theoretische schotels van de kolom (of de combinatie), scheidend vermogen (resolutie van het systeem);

informatie over de symmetrie van de pieken;

kolomtemperatuur, aard van de temperatuurregeling;

detector (meetprincipe, type, volume van de meetcel);

stromingsmeter, indien gebruikt (fabrikant, meetprincipe);

systeem voor gegevensregistratie en -verwerking (hardware en software).

2.2.3. Kalibratie van het systeem:

gedetailleerde beschrijving van de methode die wordt gebruikt om de kalibratiecurve samen te stellen;

informatie over de kwaliteitscriteria voor deze methode (bijvoorbeeld correlatiecoëfficiënt of som van de kwadraten);

informatie over alle extrapolaties, veronderstellingen en benaderingen tijdens de experimentele procedure en de beoordeling en verwerking van gegevens;

alle metingen die voor de samenstelling van de kalibratiecurve worden gebruikt, moeten in een tabel worden opgenomen waarbij voor elk kalibratiepunt de volgende informatie moet worden vermeld:

naam van het monster;

fabrikant van het monster;

normale waarden van Mp, Mn, Mw en Mw/Mn, zoals deze door de fabrikant zijn verstrekt of door latere metingen zijn bepaald, alsmede gedetailleerde informatie over de bepalingsmethode;

geïnjecteerd volume en concentratie daarin;

voor kalibratie gebruikte waarde van M;

bij de top van de piek gemeten elutievolume of gecorrigeerde retentietijd;

bij de top van de piek berekende Mp;

procentuele fout van berekende M en de kalibratiewaarde.

2.2.4. Informatie over het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen:

beschrijving van de bij de analyse gebruikte methoden en de wijze waarop de experimenten zijn uitgevoerd;

informatie over het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen (als gewichtspercentage van het totale monster);

informatie over het gehalte aan verontreinigingen, additieven en andere niet-polymeerbestanddelen (als gewichtspercentage van het totale monster).

2.2.5. Evaluatie:

evaluatie op basis van tijd: alle methoden die worden gebruikt om de vereiste reproduceerbaarheid te waarborgen (correctiemethode, interne standaard enz.);

informatie over de keuze voor elutievolume of retentietijd als basis voor de evaluatie;

informatie over de grenzen van de evaluatie als een piek niet volledig wordt geanalyseerd;

beschrijving van afvlakmethoden indien deze zijn gebruikt;

procedures voor de bereiding en voorbehandeling van het monster;

eventuele aanwezigheid van onopgeloste deeltjes;

geïnjecteerd volume (μl) en concentratie daarin (mg/ml);

bespreking van effecten die tot afwijkingen van het ideale GPC-profiel leiden;

gedetailleerde beschrijving van alle wijzigingen in de testprocedures;

gedetailleerde informatie over de foutintervallen;

alle andere informatie en opmerkingen die relevant zijn voor de interpretatie van de resultaten.

3.(1)(2)(3)(4)

REFERENTIES DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography — GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polysryrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.20. OPLOS/EXTRACTIEGEDRAG VAN POLYMEREN IN WATER

A.20.

1. METHODE De hier beschreven methode is overgenomen van de herziene versie van TG 120 van de OESO (1997). Voor nadere technische informatie wordt verwezen naar referentie (1).

1.

1.1. INLEIDING Voor bepaalde polymeren (bijvoorbeeld emulsiepolymeren) moeten eerst voorbereidende werkzaamheden worden uitgevoerd voordat de hier beschreven methode kan worden toegepast. De methode kan niet worden gebruikt voor vloeibare polymeren en voor polymeren die onder de testomstandigheden met water reageren. Wanneer de methode niet geschikt of niet bruikbaar is, kan het oplos/extractiegedrag met behulp van andere methoden worden onderzocht. In dat geval moet een gedetailleerde beschrijving van en een volledige motivering voor de gebruikte methode worden gegeven.

1.2. REFERENTIESTOFFEN Geen.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Het oplos/extractiegedrag van polymeren in waterig milieu wordt bepaald met behulp van de kolfmethode (zie methode A.6: Oplosbaarheid in water, methode met de kolf) waarin onderstaande wijzigingen worden aangebracht.

1.4. KWALITEITSCRITERIA Geen.

1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.5.

1.5.1. Apparatuur Voor deze methode is de volgende apparatuur nodig:

een vergruizer, bijvoorbeeld een maalapparaat, om deeltjes met een bekende grootte te vervaardigen;

een schudapparaat met regelbare temperatuur;

een membraanfiltersysteem;

adequate analyseapparatuur;

gestandaardiseerde zeven.

1.5.2. Monstervoorbereiding Een representatief monster moet eerst worden vergruisd tot deeltjes met een grootte van 0,125 tot 0,25 mm (gebruik hierbij geschikte zeven). Voor de stabiliteit van het monster of voor het maalprocedé kan koeling nodig zijn. Rubberachtige materialen kunnen bij de temperatuur van vloeibare stikstof worden vergruisd (1). Als het niet mogelijk is een fractie met de vereiste deeltjesgrootte te verkrijgen, moet worden getracht de deeltjesgrootte zoveel mogelijk te verlagen en moet het resultaat in het verslag worden vermeld. Tevens moet in het verslag worden vermeld hoe het vergruisde monster voor de test is bewaard.

1.5.3. Procedure In drie kolven met een glazenstop wordt telkens 10 g van de te onderzoeken stof afgewogen. Vervolgens wordt aan elke kolf 1000 ml water toegevoegd. Indien het niet mogelijk blijkt met een hoeveelheid van 10 g polymeer te werken, moet de eerst hogere hoeveelheid worden gebruikt waarmee wel kan worden gewerkt en moet de hoeveelheid water dienovereenkomstig worden aangepast. De kolven worden goed afgesloten en vervolgens bij 20 oC geschud. Hiervoor wordt een schuld- of roermachine gebruikt waarmee bij constante temperatuur kan worden gewerkt. Na 24 uur wordt de inhoud van elke kolf gecentrifugeerd of gefiltreerd en wordt de polymeerconcentratie in de heldere waterige fase met behulp van een geschikte analysemethode bepaald. Indien er geen geschikte analysemethoden voor de waterige fase beschikbaar zijn, kan de totale oplosbaarheid/extraheerbaarheid op basis van het drooggewicht van het residu op het filter of het gecentrifugeerde neerslag worden bepaald. Meestal moet bij de kwantitatieve bepaling onderscheid worden gemaakt tussen de verontreinigingen en additieven enerzijds en het polymeer met een laag molecuulgewicht anderzijds. Bij een gravimetrische bepaling is het ook belangrijk dat er een blancobepaling zonder te onderzoeken stof wordt uitgevoerd om rekening te kunnen houden met residuen ten gevolge van de experimentele procedure. Het oplos/extractiegedrag van polymeren in water bij 37 oC bij pH 2 en pH 9 kan op dezelfde wijze worden bepaald zoals beschreven voor de uitvoering van het experiment bij 20 oC. De pH kan worden aangepast door de toevoeging van geschikte bufferoplossingen of zuren of basen als zoutzuur, azijnzuur, natrium- of kahumhydroxide (p.a.) of NH3. Afhankelijk van de gebruikte analysemethode moet de test een- of tweemaal worden uitgevoerd. Wanneer voldoende specifieke methoden beschikbaar zijn voor een directe analyse van de polymeercomponent in de waterige fase, moet één in het voorgaande beschreven test voldoende zijn. Wanneer dergelijke methoden echter niet beschikbaar zijn en het oplos/extractiegedrag van de polymeer uitsluitend wordt bepaald via een indirecte analyse waarbij alleen het totale gehalte aan organische koolstof (TOC) van het waterig extract wordt bepaald, moet de test tweemaal worden uitgevoerd. Deze tweede test moet ook in triplo gebeuren met polymeermonsters die tien keer zo klein zijn als bij de eerste test en dezelfde hoeveelheden water.

1.5.4. Analyse

1.5.4.

1.5.4.1. Met één monsterhoeveelheid uitgevoerde test Het is mogelijk dat er methoden beschikbaar zijn voor een directe analyse van de polymeercomponent in de waterige fase. Als dit niet het geval is, kan worden overwogen een indirecte analyse van opgeloste/geëxtraheerde polymeercomponenten uit te voeren, waarbij het totale gehalte aan oplosbaar materiaal wordt bepaald en wordt gecorrigeerd voor componenten die niet polymeerspecifiek zijn. Een analyse van de totale hoeveelheid polymeer in de waterige fase is mogelijk: met behulp van een voldoende gevoelige methode zoals: door vacuümverdampmg van het waterig extract en analyse van het droge residu met behulp van spectroscopie (bijvoorbeeld IR of uv) of AAS/ICP. Als een analyse van de waterige fase als zodanig niet uitvoerbaar is, moet het waterige extract worden geëxtraheerd met een niet met water mengbaar organisch oplosmiddel, bijvoorbeeld een gechloreerde koolwaterstof. Vervolgens wordt het oplosmiddel verdampt en wordt het polymeergehalte van het residu volgens een van bovenstaande analysemethoden bepaald. Om de mate van oplossing/extractie van het polymeer zelf te bepalen, moeten componenten van dit residu waarvan wordt vastgesteld dat ze verontreinigingen of additieven zijn, in mindering worden gebracht. Wanneer betrekkelijk grote hoeveelheden van dergelijke materialen aanwezig zijn, kan het nodig zijn het residu met behulp van bijvoorbeeld HPLC of GC te analyseren om onderscheid te maken tussen de verontreinigingen en het monomeer en van het monomeer afgeleide stoffen zodat het werkelijke gehalte aan laatstgenoemde stoffen kan worden bepaald. In sommige gevallen kan het voldoende zijn het organische oplosmiddel te verdampen en het droge residu te wegen.

TOC met ontleding door persulfaat of dichromaat tot CO2, gevolgd door bepaling met behulp van IR of chemische analyse;

atoomabsorptiespectrometrie (AAS) of emissiespectrometrie met inductief gekoppeld plasma (ICP) voor polymeren die silicium of metaal bevatten;

Uv-absorptie of spectrofluorimetrie voor arylpolymeren,

LC/MS voor monsters met een laag molecuulgewicht;

1.5.4.2. Met twee verschillende monsterhoeveelheden uitgevoerde test Alle waterige extracten worden op TOC geanalyseerd. Bij het niet-opgeloste/niet-geëxtraheerde deel van het monster wordt een gravimetrische bepaling uitgevoerd. Als na centrifugeren of filtreren van de inhoud van de kolf polymeerresten op de rand van de kolf zijn achtergebleven, moet de kolf met het filtraat worden gespoeld totdat alle zichtbare resten zijn verdwenen. Vervolgens wordt het filtraat opnieuw gecentrifugeerd of gefiltreerd. De op de filter of in de centrifugebuis achtergebleven residuen worden bij 40 oC onder vacuüm gedroogd tot constant gewicht en vervolgens gewogen.

2. GEGEVENS

2.

2.1. MET ÉÉN MONSTERHOEVEELHEID UITGEVOERDE TEST De aparte resultaten voor de drie kolven en de gemiddelde waarden moeten worden vermeld, uitgedrukt in massa-eenheden per volume oplossing (meestal mg/l) of massa-eenheden per massa polymeermonster (meestal mg/g). Daarnaast moet het gewichtsverlies van het monster worden vermeld (berekend als het gewicht van de opgeloste stof gedeeld door het gewicht van het oorspronkelijke monster). Bovendien moet de relatieve standaardafwijking worden berekend. Deze gegevens moeten worden vermeld voor de stof als geheel (polymeer + essentiële additieven enz.) en voor het zuivere polymeer (d.w.z. nadat de bijdrage van dergelijke additieven is afgetrokken).

2.2. MET TWEE VERSCHILLENDE MONSTERHOEVEELHEDEN UITGEVOERDE TEST Voor elk waterig extract van de twee in triplo uitgevoerde experimenten dient de TOC-waarde te worden vermeld en daarnaast de gemiddelde waarde voor elk experiment. Deze gegevens dienen te worden uitgedrukt in massa-eenheden per volume oplossing (meestal mg C/l) en massa-eenheden per gewicht van het oorspronkelijke monster (meestal mgC/g). Als er geen verschil is tussen de resultaten met de hoge en de lage monster/waterverhouding, kan dit erop wijzen dat alle extraheerbare componenten inderdaad zijn geëxtraheerd. In dat geval zou een directe analyse normaal gesproken niet nodig zijn. Voor elk residu moet het gewicht worden vermeld en worden uitgedrukt als percentage van het oorspronkelijke gewicht van het monster. Per experiment dient het gemiddelde te worden berekend. Het percentage oplosbaar en extraheerbaar materiaal in het oorspronkelijke monster wordt berekend door het gevonden percentage van 100 % af te trekken.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. TESTVERSLAG In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

3.1.

3.1.1. Onderzochte stof:

beschikbare informatie over de onderzochte stof (identiteit, additieven, verontreinigingen, gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen).

3.1.2. Testomstandigheden:

beschrijving van de gevolgde procedures en de testomstandigheden;

beschrijving van de analyse- en detectiemethoden.

3.1.3. Resultaten

de oplosbaarheid/extraheerbaarheid in mg/l; aparte resultaten bij de verschillende oplossingen en gemiddelde waarden, gesplitst in polymeergehalte en verontreinigingen, additieven enz.;

oplosbaarheid/extraheerbaarheid in mg/g polymeer;

TOC-waarden van de waterige extracten, gewicht van de opgeloste stof en berekende percentages, indien gemeten;

de pH van elk monster;

informatie over de blancobepalingen;

indien nodig gegevens over de chemische instabiliteit van de onderzochte stof, zowel tijdens de testprocedure als tijdens de analyse;

alle informatie die voor de interpretatie van de resultaten van belang is.

4.(1) REFERENTIE DIN 53733 (1976), Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

A.21. OXIDERENDE EIGENSCHAPPEN (VLOEISTOFFEN)

A.21.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Deze testmethode is bedoeld om te meten in hoeverre een vloeistof de verbrandingssnelheid of verbrandingsintensiteit van een brandbare stof kan verhogen of met een brandbare stof een mengsel kan vormen dat spontaan ontbrandt wanneer beide stoffen grondig worden gemengd. De test is gebaseerd op de test voor oxiderende vloeistoffen van de VN (1) en is hieraan gelijkwaardig. Aangezien deze methode A.21 echter in de eerste plaats is bedoeld om te voldoen aan de vereisten van Verordening (EG) nr. 1907/2006, is slechts een vergelijking met één referentiestof vereist. Testen en vergelijken met bijkomende referentiestoffen kan nodig zijn wanneer het waarschijnlijk is dat de testresultaten voor andere doeleinden worden gebruikt. Deze test hoeft niet te worden uitgevoerd wanneer op grond van de structuurformule met afdoende zekerheid kan worden vastgesteld dat de stof niet exotherm kan reageren met een brandbare stof. Het is nuttig om, voordat deze test wordt uitgevoerd, te beschikken over gegevens over de mogelijke explosieve eigenschappen van de te onderzoeken stof. Deze test is niet toepasbaar op vaste stoffen, gassen, explosieve of licht ontvlambare stoffen of organische peroxiden. Deze test hoeft eventueel niet te worden uitgevoerd wanneer voor de te onderzoeken stof al resultaten beschikbaar zijn van de test voor oxiderende vloeistoffen van de VN (1).

1.2. DEFINITIES EN EEN HEDEN Gemiddelde stijgtijd van de druk: het gemiddelde van de gemeten tijden waarin een mengsel tijdens de test een drukstijging veroorzaakt van 690 kPa tot 2070 kPa boven de atmosferische druk.

1.3. REFERENTIESTOF Als referentiestof wordt een waterige oplossing van 65 gewichtsprocent salpeterzuur (analytisch zuiver) gebruikt. Wanneer de experimentator verwacht dat de testresultaten wellicht voor andere doeleinden worden gebruikt, kan het wenselijk zijn de test met bijkomende referentiestoffen uit te voeren.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De testvloeistof wordt in een massaverhouding van 1:1 met cellulosevezel gemengd en in een drukvat gebracht. Indien tijdens het mengen of vullen spontane ontbranding optreedt, is verder testen niet nodig. Indien geen spontane ontbranding optreedt, wordt de volledige test uitgevoerd. Het mengsel wordt in een drukvat verwarmd en de gemiddelde tijd waarin de druk stijgt van 690 kPa tot 2070 kPa boven de atmosferische druk, wordt gemeten. Deze tijd wordt vergeleken met de gemiddelde stijgtijd voor de druk voor het 1:1-mengsel van de referentiestof(fen) en cellulose.

1.5. KWALITEITSCRITERIA In een reeks van vijf proeven met dezelfde stof mag geen van de resultaten meer dan 30 % afwijken van het rekenkundige gemiddelde. Resultaten die meer dan 30 % van het gemiddelde afwijken, moeten worden verworpen, de meng- en vulprocedure moet worden verbeterd en de test moet worden herhaald.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODE

1.6.

1.6.1. Voorbereiding

1.6.1.

1.6.1.1. Brandbare stof Als brandbare stof wordt droge cellulose met een vezellengte tussen 50 en 250 μm en een gemiddelde diameter van 25 μm gebruikt. Dit wordt gedurende 4 uur in een laag van ten hoogste 25 mm dik bij 105 oC gedroogd tot constant gewicht en in een exsiccator met droogmiddel bewaard totdat de vezel is afgekoeld en wordt gebruikt. Het watergehalte van de gedroogde cellulose moet minder zijn dan 0,5 % van de droge massa. Zo nodig dient de droogtijd te worden verlengd tot deze waarde is bereikt. Gedurende de hele test wordt een en dezelfde batch cellulose gebruikt.

1.6.1.2. Apparatuur

1.6.1.2.

1.6.1.2.1. Drukvat Voor de test wordt gebruik gemaakt van een drukvat. Dit is een cilindrisch stalen drukvat met een lengte van 89 mm en een uitwendige diameter van 60 mm (zie figuur 1). De cilinder wordt zo bewerkt dat aan de buitenkant recht tegenover elkaar twee vlakke zijden ontstaan (waardoor de doorsnede van het vat wordt gereduceerd tot 50 mm) zodat de cilinder gemakkelijker kan worden gemanipuleerd wanneer de ontstekingsplug en ontluchtingsplug worden aangebracht. Het vat, dat een inwendige diameter van 20 mm heeft, wordt aan beide uiteinden tot een diepte van 19 mm opgeruimd en voorzien van een schroefdraad voor 1 British Standard Pipe (BSP) of het metrische equivalent daarvan. Op 35 mm van een van de uiteinden wordt op 90o van de vlakke oppervlakken in het gebogen oppervlak van het vat een zijbuis geschroefd om de druk op te nemen. Daarvoor wordt een 12 mm diep gat geboord dat wordt voorzien van schroefdraad voor de ½ BSP (of metrisch equivalent) schroefdraad op het uiteinde van de zijbuis. Zo nodig wordt een inerte pakking aangebracht om een gasdichte verbinding te bekomen. De zijbuis steekt 55 mm buiten het drukvat uit en heeft een inwendige diameter van 6 mm. Het uiteinde van de zijbuis wordt opgeruimd en voorzien van een schroefdraad voor een membraanmanometer. Elk type manometer mag worden gebruikt, op voorwaarde dat de manometer bestand is tegen de hete gassen of ontledingsproducten en kan reageren op een drukstijging van 690-2070 kPa in maximaal 5 ms. Het uiteinde van het drukvat dat het verst verwijderd is van de zijbuis, wordt afgesloten met een ontstekingsplug met twee elektrodes, de ene geïsoleerd van de plug, de andere via de plug met de massa verbonden. Het andere uiteinde van het drukvat wordt afgesloten met een breekplaat (barstdruk ongeveer 2200 kPa) die op zijn plaats wordt gehouden met een bevestigingsplug met een inwendige diameter van 20 mm. Zo nodig wordt voor de ontstekingsplug een inerte pakking gebruikt om een gasdichte verbinding te bekomen. Het drukvat wordt tijdens het gebruik in de juiste positie gehouden met een statief (figuur 2). Dit bestaat doorgaans uit een zachtstalen grondplaat van 235 mm × 184 mm × 6 mm en een 185 mm lange vierkante buis van 70 mm × 70 mm × 4 mm. Van twee tegenover elkaar gelegen zijkanten van de vierkante buis wordt een deel verwijderd zodat een buis van 86 mm lengte overblijft die uitloopt in twee vlakke benen. De uiteinden van deze vlakke benen worden onder een hoek van 60o ten opzichte van de as van de buis afgekort en op de grondplaat gelast. Aan de bovenkant van de vierkante buis wordt in één zijkant een gleuf van 22 mm breed × 46 mm diep uitgefreesd, zodat de zijbuis in de gleuf valt wanneer het drukvat met de ontstekingsplug naar beneden in de vierkante buis wordt geplaatst. Op de onderste binnenzijde van de vierkante buis wordt een stuk staal van 30 mm breed en 6 mm dik gelast als afstandstuk. In de tegenoverliggende zijde worden twee 7 mm vleugelschroeven gedraaid om het drukvat stevig op zijn plaats te houden. Om het drukvat van onderen te steunen worden op de zijkanten die doorlopen naar de basis van het statief, twee stroken van 12 mm breed en 6 mm dik staal gelast.

1.6.1.2.2. Ontstekingssysteem Het ontstekingssysteem bestaat uit een 25 cm lange Ni/Cr-draad met een diameter van 0,6 mm en een weerstand van 3,85 ohm/m. De draad wordt om een staaf met een diamater van 5 mm tot een spoel gewikkeld en met de elektrodes van de ontstekingsplug verbonden. De spoel moet een van de in figuur 3 afgebeelde configuraties hebben. De afstand tussen de bodem van het vat en de onderzijde van de ontstekingsspoel moet 20 mm bedragen. Wanneer de elektroden niet instelbaar zijn, moeten de einden van de ontstekingsdraad tussen de spoel en de bodem van het vat met een keramische mantel worden geïsoleerd. De draad wordt verhit met een voeding die een constante stroom van ten minste 10 A kan leveren.

1.6.2. Uitvoering van de test Het toestel wordt met manometer en verhittingssysteem, maar zonder de breekplaat, met de ontstekingsplug naar beneden neergezet. In een glazen beker worden met een glazen roerstaaf 2,5 g testvloeistof en 2,5 g gedroogde cellulose gemengd. Om veiligheidsredenen moet tijdens het mengen een veiligheidsschild tussen de experimentator en het mengsel zijn geplaatst. Indien het mengsel tot ontbranding komt tijdens het mengen of vullen, zijn geen verdere tests nodig. Het mengsel wordt in kleine hoeveelheden tegelijk in het drukvat gegoten, terwijl tegen het drukvat wordt geklopt om ervoor te zorgen dat het mengsel de ruimte rond de ontstekingsspoel vult en daarmee goed contact maakt. Het is belangrijk dat de spoel tijdens het vullen niet verbuigt, aangezien dit tot foutieve resultaten kan leiden. De breekplaat wordt op zijn plaats gebracht en de bevestigingsplug wordt stevig vastgeschroefd. Het gevulde drukvat wordt met de breekplaat naar boven in het statief geplaatst. De gehele opstelling moet zich in een geschikte gewapende afzuigkast of ontstekingskast bevinden. De voeding wordt aangesloten op de uitwendige aansluitingen van de ontstekingsplug. De stroomsterkte bedraagt 10 A. De tijd tussen het begin van het mengen en het inschakelen van de voeding mag niet langer zijn dan tien minuten. Het signaal van de manometer wordt geregistreerd met een systeem waarmee het drukverloop kan worden geanalyseerd en continu kan worden geregistreerd (bijv. een transiëntrecorder gekoppeld aan een papierschrijver). Het mengsel wordt verwarmd tot de breekplaat breekt of totdat ten minste 60 seconden zijn verstreken. Als de breekplaat niet breekt, moet het mengsel afkoelen voordat het toestel voorzichtig wordt geopend, waarbij de nodige voorzorgen worden getroffen voor het geval een plotselinge drukstijging optreedt. Er worden vijf proeven uitgevoerd met de teststof en de referentiestof(fen). De tijd waarin de druk stijgt van 690 kPa tot 2070 kPa boven de atmosferische druk, wordt genoteerd. Vervolgens wordt de gemiddelde stijgtijd van de druk berekend. In sommige gevallen kunnen stoffen een (te hoge of te lage) drukstijging veroorzaken als gevolg van chemische reacties die niet relevant zijn voor de oxiderende eigenschappen van de stof. In die gevallen kan het nodig zijn de test te herhalen met een inerte stof, bijvoorbeeld diatomiet (kieselgoehr), in plaats van cellulose, om het karakter van de reactie te bepalen.

2. GEGEVENS Stijgtijd voor de teststof en voor de referentiestof(fen). Stijgtijd voor de tests met een inerte stof, indien uitgevoerd.

2. 2.1. Tabel 1 Voorbeelden van resultaten

VERWERKING VAN DE RESULTATEN De gemiddelde stijgtijden van de druk voor de teststof en de referentiestof(fen) worden berekend. De gemiddelde stijgtijd voor de tests met een inerte stof (indien uitgevoerd) wordt berekend. Tabel 1 bevat enkele voorbeelden van resultaten Stof Gemiddelde stijgtijd voor een 1:1 mengsel met cellulose (ms) Ammoniumdichromaat, verzadigde waterige oplossing 20800 Calciumnitraat, verzadigde waterige oplossing 6700 IJzer(III)nitraat, verzadigde waterige oplossing 4133 Lithiumperchloraat, verzadigde waterige oplossing 1686 Magnesiumperchloraat, verzadigde waterige oplossing 777 Nikkelnitraat, verzadigde waterige oplossing 6250 Salpeterzuur, 65 % 4767 Perchloorzuur, 50 % 121 Perchloorzuur, 55 % 59 Kaliumnitraat, 30 % waterige oplossing 26690 Zilvernitraat, verzadigde waterige oplossing Natriumchloraat, 40 % waterige oplossing 2555 Natriumnitraat, 45 % waterige oplossing 4133 Inerte stof Water:cellulose

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN In het verslag moeten de volgende gegevens worden opgenomen:

identiteit, samenstelling, zuiverheid enz. van de teststof;

concentratie van de teststof;

procedure voor het drogen van de cellulose;

watergehalte van de gebruikte cellulose;

de meetresultaten;

eventuele resultaten van tests met een inerte stof;

berekende gemiddelde stijgtijden van de druk;

eventuele afwijkingen van deze methoden en redenen daarvoor;

alle verdere informatie of opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten.

3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN De testresultaten worden beoordeeld op grond van: Een vloeistof wordt aangemerkt als een oxiderende stof wanneer: Om vals-positieve resultaten te vermijden, moet bij de interpretatie van de resultaten zo nodig ook rekening worden gehouden met resultaten verkregen bij het testen van de stof gemengd met inert materiaal.

3.2. a)

de vraag of het mengsel van teststof en cellulose spontaan ontbrand; en

een vergelijking van de gemiddelde stijgtijd voor de druk van 690 KPa naar 2070 kPa met die voor de referentiestof(fen).

een mengsel in een 1:1 massaverhouding van de stof en cellulose spontaan ontbrand, of

een mengsel in een massaverhouding van 1:1 van de stof en cellulose een gemiddelde stijgtijd oplevert kleiner dan of gelijk aan de gemiddelde stijgtijd van de druk van een mengsel in een 1:1 massaverhouding van een waterige oplossing van 65 gewichtsprocent salpeterzuur en cellulose.

4.(1) REFERENTIES Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids. Opmerking: Beide ontstekingssystemen kunnen worden gebruikt.

4.(1)

Figuur 1 Drukvat

(A) Drukvat (B) Bevestigingsplug breekplaat (C) Ontstekingsplug (D) Zachtloden pakking (E) Breekplaat (F) Zijbuis (G) Manometerkop (H) Pakking (J) Geïsoleerde elektrode (K) Geaarde elektrode (L) Isolatie (M) Stalen conus (N) Groef voor pakking

Figuur 2 Statief

Figuur 3 Ontstekingssysteem

(A) Ontstekingsspoel (B) Isolatie (C) Elektroden (D) Ontstekingsplug

Aanhangsel Voor aanvullende technische gegevens kunnen de volgende normen als voorbeeld worden geraadpleegd.

1. Capillaire methoden

1.

1.1. Smelttemperatuurtoestellen met een vloeistofbad ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products

1.2. Smelttemperatuurtoestellen met een metalen blok DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determination of melting point

2. Hete oppervlakken

2.

2.1. Verwarmde staaf volgens Kofler ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Smeltpuntmicroscoop DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

2.3. Meniscusmethode (polyamiden) ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Résines de polyamides. Determination du point de fusion. Méthode du ménisque.

3. Methoden voor vriestemperatuurbepaling BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for determination of melting point of petroleum wax (cooling curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Thermische analyse

4.

4.1. Differentiële thermische analyse ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Differentiële scanningcalorimetrie ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Bepaling van het vloeipunt NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite — Monsterneming en ontleding van aardolieprodukten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils — Determination of pour point

Aanhangsel Voor aanvullende technische gegevens kunnen de volgende normen als voorbeeld worden geraadpleegd:

1. Ebullioscoop ASTM D 1120-72 Standard Test Method for Boiling Point of Engine Anti-freezes

2. Destillatieprocess (kooktraject) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Disrillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Differentiële thermische analyse en differentiële scanningcalorimetrie ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe

Aanhangsel Voor aanvullende technische gegevens kunnen de volgende normen als voorbeeld worden geraadpleegd:

1. Methoden gebaseerd op de opwaartse kracht

1.

1.1. Areometer DIN 12790, ISO 387 Areometer; algemene aanwijzingen DIN 12791 Deel I: Dichtheidsareometers: constructie, instelling en gebruik Deel II: Dichtheidsareometers: genormaliseerde maten, benaming Deel III: Gebruik en test ISO 649-2 Laboratoriumglaswerk: Dichtheidsareometers voor algemeen gebruik NF T 20-050 Chemische producten voor industrieel gebruik — Bepaling van dichtheid van vloeistoffen — Areometermethode DIN 12793 Laboratoriumglaswerk: areometers voor bepaling van het meetbereik

1.2. Hydrostatische balans

1.2. Voor vaste stoffen

ISO 1183 Methode A: Methoden voor het bepalen van de dichtheid en relatieve dichtheid van kunststoffen met uitzondering van schuimplastics NF T 20-049 Chemische producten voor industrieel gebruik — Bepaling van dichtheid van vaste stoffen uitgezonderd poeders en schuimproducten — Hydrostatische balansmethode ASTM D 792 Soortelijk gewicht en dichtheid van kunststoffen door verplaatsing DIN 53479 Proeven voor kunststoffen en elastomeren: bepaling van de dichtheid

Voor vloeistoffen

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Proeven voor minerale oliën en verwante materialen: bepaling van de dichtheid ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 en ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Dichtheid, soortelijk gewicht of API-gewicht van ruwe aardolie en vloeibare aardolieproducten met de areometermethode BS 4714 Dichtheid, soortelijk gewicht of API-gewicht van ruwe aardolie en vloeibare aardolieproducten met de areometermethode

1.3. Methode met ondergedompeld voorwerp DIN 53217 Proeven voor verf, vernis en soortgelijke producten; dichtheidsbepaling met de methode met ondergedompeld voorwerp

2. Pyknometermethoden

2.

2.1. Voor vloeistoffen ISO 3507 Pyknometers ISO 758 Vloeibare chemische producten; bepaling van de dichtheid bij 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pyknometer (voor niet-vluchtige vloeistoffen die niet al te visceus zijn) DIN 12798 Lipkin pyknometer (voor vloeistoffen met een kinematische viscositeit van minder dan 100.10-6 m2 s-1 bij 15 oC) DIN 12800 Sprengel pyknometer (voor vloeistoffen zoals in DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pyknometer (voor vloeistoffen met een kinematische viscositeit van minder dan 100.10-6 m2 s -1 bij 20 oC, vooral ook toepasbaar op koolwaterstoffen en oplossingen in water, alsmede op vloeistoffen met een hogere dampdruk, ongeveer 1 bar bij 90 oC) DIN 12806 Hubbard pyknometer (voor alle soorten visceuze vloeistoffen met een niet al te hoge dampdruk, in het bijzonder voor verven, vernissen en bitumen) DIN 12807 Bingham pyknometer (voor vloeistoffen zoals in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pyknometer (in het bijzonder voor mengsels van ethanol en water) DIN 12809 Pyknometer met ingeslepen thermometer en capillaire zijbuis (voor vloeistoffen die niet al te visceus zijn) DIN 53217 Proeven voor verven, vernissen en soortgelijke producten; bepaling van de dichtheid met behulp van een pyknometer DIN 51757 Punt 7: Proeven voor minerale oliën en verwante materialen; bepaling van de dichtheid ASTM D 297 Hoofdstuk 15: Rubberproducten — chemische analyse ASTM D 2111 Methode C: Organische halogeenverbindingen BS 4699 Methode voor het bepalen van soortelijk gewicht en dichtheid van aardolieproducten (met behulp van een bicapillaire pyknometer met schaalverdeling) BS 5903 Methode voor het bepalen van de relatieve dichtheid en dichtheid van aardolieproducten met behulp van een pyknometer met capillaire stop NF T 20-053 Chemische producten voor industrieel gebruik — Bepaling van dichtheid van vaste stoffen in poeders en vloeistoffen — Pyknometermethode

2.2. Voor vaste stoffen ISO 1183 Methode B: Methode voor het bepalen van de dichtheid en relatieve dichtheid van kunststoffen, met uitzondering van schuimplastics NF T 20-053 Chemische producten voor industrieel gebruik — Bepaling van dichtheid van vaste stoffen in poeder en vloeistoffen — Pyknometermethode DIN 19683 Bepaling van de bodemdichtheid

3. Vergelijkingspyknometer met lucht DIN 55990 Deel 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ahnlichen Beschichrungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; chlorhaltige Polymere; Prüfung

Aanhangsel 1 Schattingsmethode

INLEIDING

De berekende waarden van de dampspanning kunnen als volgt worden gebruikt:

om te bepalen welke van de experimentele methoden geschikt is;

om een schatting of grenswaarde te verkrijgen, in geval de experimentele methode om technische redenen niet toegepast kan worden (ook als de dampspanning zeer laag is);

om die gevallen op te kunnen sporen, waar de experimentele meting kan worden weggelaten omdat de dampspanning waarschijnlijk < 10-5 Pa zal zijn bij omgevingstemperatuur.

SCHATTINGSMETHODE

De dampspanning van vloeistoffen en vaste stoffen kan geschat worden met behulp van de gewijzigde Correlatie van Watson (a). Het enige benodigde gegeven is de normale kooktemperatuur. De methode is toepasbaar in het drukbereik van 105 Pa tot 10-5 Pa. Uitgebreide informatie over deze methode wordt gegeven in het Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b).

BEREKENINGSPROCEDURE

Volgens (b) wordt de dampspanning als volgt berekend: ln Pvp ≈ ΔHvbΔZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb waarin: T = de bewuste temperatuur Tb = normale kooktemperatuur Pvp = dampspanning bij temperatuur T ΔHvb = verdampingswarmte ΔZb = samendrukbaarheidscoëfficiënt (geschat op 0,97) m = empirische factor afhankelijk van de fysische toestand bij de bewuste temperatuur. En verder Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb waarin KF een empirische factor is die verband houdt met de polariteit van de stof. De KF-factoren voor verschillende samengestelde stoffen worden gegeven in referentie (b). Zeer vaak zijn gegevens beschikbaar over de kooktemperatuur bij gereduceerde druk. In deze gevallen wordt, volgens (b), de dampspanning als volgt berekend: ln Pvp ≈ ln P1+ΔHv1ΔZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 Hierbij is T1 het kookpunt bij de gereduceerde druk P1.

RAPPORT

Indien de schattingsmethode wordt gebruikt, dient het rapport een uitgebreide beschrijving van de berekening te bevatten.

LITERATUUR

(a) K. M. Watson, Ind. Eng. Chem., 1943, Vol. 35, 398.

(b) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

Aanhangsel 2

Figuur 1 Apparaat voor bepaling van de dampspanningskromme volgens de dynamische methode

1 = Thermokoppel 2 = Vacuümbuffervolume 3 = Precisiemanometer 4 = Vacuüm 5 = Meetpunt 6 = Verwarmingselement (circa 150 W)

Figuur 2a Apparaat voor bepaling van de dampspanningskromme volgens de statische methode (gebruikmakend van de U-buis manometer)

1. Te onderzoeken stof 6. Temperatuurbad 2. Dampfase 7. Temperatuurmeetapparaat 3. Hoogvacuümkraan 8. Naar de vacuümpomp 4. U-buis (hulpmanometer) 9. Ventilatie 5. Manometer

Figuur 2b Apparaat voor bepaling van de dampspanningskromme volgens de statische methode (gebruikmakend van een drukaanwijzing)

1. Te onderzoeken stof 2. Dampfase 3. Hoogvacuümkraan 4. Drukventiel 5. Drukaanwijzer 6. Temperatuurbad 7. Temperatuurmeetapparaat

Figuur 3 Isoteniscoop (referentie 7)

1. Naar meet- en regelsysteem voor druk 2. 8 mm uitwendige buis 3. Droge stikstof in druksysteem 4. Damp van het monster 5. Kleine punt 6. Vloeibaar monster

Figuur 4 Apparatuur voor bepaling van de dampspanningskromme met behulp van de dampspanningsbalansmethode

1 = Te onderzoeken stof 2 = Dampfase met dampstroom 3 = Verdampingsoven met draaibare openingen 3a = Ovendeksel met opening 4 = Ovenverwarming (koelpot) 5 = Meting van de temperatuur van het monster 6 = Koelsysteem 7 = Schild 8 = Koelstaaf voor koelsysteem 9 = Balansschaal 10 = Microbalans 11 = Naar de recorder 12 = Naar de hoogvacuümpomp

Figuur 5 Voorbeeld van een apparaat voor verdamping bij lage druk met behulp van de uitstroommethode, met een uitstroomcelvolume van 8 cm3

1 Verbinding naar vacuüm 2 Uitsparingen voor platina weerstandsthermometer of temperatuurmeting en -regeling (2) 3 Deksel voor vacuümvat 4 O-ring 5 Aluminium vacuümvat 6 Onderdeel voor het plaatsen en verwijderen van de cellen 7 Deksel met schroefdraad 8 Vleugelmoeren (6) 9 Bouten (6) 10 Roestvrijstalen uitstroomsel 11 Verwarmingspatronen (6)

Figuur 6a Voorbeeld van een gasstroomsysteem voor bepaling van de dampspanning volgens de gasverzadigingsmethode

1 = Gasstroomregelaar 2 = Warmtewisselaars 3 = Naaldventielen 4 = Sensor (%) relatieve vochtigheid 5 = Verzadigingskolommen 6 = PTFE-verbindingsstukken 7 = Gasstroommeter 8 = Dampval (absorptie) 9 = Olieval 10 = Bellenteller met glasfilter afvoeropening (a) verdelingskanaal

Figuur 6b Een voorbeeld van een systeem voor de bepaling van de dampspanning met de gasverzadigingsmethode, met een capillair geplaatst achter de verzadigingskamer

1 = Thermische massastroommeter 2 = Manometer 3 = Thermostatisch geregelde ruimte 4 = Thermostatische spiraal voor dragergas 5 = Thermometer (Pt 100) 6 = Gasverzadigingskamer 7 = Capillair 8 = Absorptievaten 9 = Gasmeter 10 = Koudeval

Figuur 7 Voorbeeld van experimentele opstelling voor de draaiende-rotormethode

Dampspanningsapparaat A. Draaiende-rotormeetkop B. Monstercel C. Thermostaat D. Vacuümleiding (turbopomp) E. Luchtthermostaat

Figuur 8 Voorbeeld van een draaiende-rotormeetkop

1. Kogel 2. Vacuümbuis bevestigd aan 6 3. Permanente magneten (2) 4. Magneetspoelen (2) voor verticale stabilisatie 5. Magneetspoelen voor aandrijving (4) 6. Verbindingsflens

Aanhangsel

Figuur 1 Kolom-elutie-methode met recirculatiepomp

Evenwicht met atmosferische druk Stroomsnelheidsmeter Microkolom Circulatiepomp met thermostaatregeling Recirculatiepomp Tweeweegkraan voor bemonstering

Figuur 2 Een voorbeeld van een microkolom

(alle afmetingen in mm) Aansluiting voor glazen slijpstuk Reservoir Inwendig 5 Uitwendig 19 Prop glaswol Tweeweegkraan

Figuur 3 Een voorbeeld van een microkolom

(alle afmetingen in mm) Aansluiting, voor glazen slijpstuk Reservoir Inwendig 5 Uitwendig 19 Kraan

Figuur 4 Kolom-elutie-methode met voorraadfles

1 = Voorraadfles (bijvoorbeeld een glazen fles van 2,5 liter) 2 = Kolom (zie figuur 3) 3 = Monsterverzamelaar 4 = Thermostaat 5 = Teflonslang 6 = Glazen slijpstuk 7 = Waterleiding (tussen thermostaat en kolom, inwendige diameter ongeveer 8 mm)

Aanhangsel 1 Berekenings-/schattingsmethoden

INLEIDING

Een algemene inleiding tot berekeningsmethoden, gegevens en voorbeelden worden gegeven in het Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). Berekende waarden voor Pow kunnen worden gebruikt:

om te beslissen welke van de experimentele methoden het meest geschikt is (schudflesbereik: log Pow: – 2 tot 4, HPLC-bereik: log Pow: 0 tot 6);

om de geschikte testvoorwaarden te kunnen kiezen (bijvoorbeeld referentiestoffen voor de HPLC-methode, n-octanol/water-volumeverhoudingen voor de schudflesmethode);

ter controle voor het laboratorium zelf van eventuele fouten in het experiment;

om een Pow-schatting te leveren in die gevallen waar de experimentele methoden om technische redenen niet kunnen worden toegepast.

SCHATTINGSMETHODE Inleidende schatting van de verdelingscoëfficiënt

De waarde van de verdelingscoëfficiënt kan geschat worden met behulp van de oplosbaarheid van de teststof in zuivere oplosmiddelen. Hiervoor geldt: Pgeschat = cn-oktanol verzadigdcwater verzadigd

BEREKENINGSMETHODEN Principe van de berekeningsmethoden

Alle berekeningsmethoden zijn gebaseerd op de formele fragmentatie van het molecuul in geschikte substructuren, waarvoor betrouwbare log Pow-fragmentconstanten bekend zijn. De log Pow van het volledige molecuul wordt dan berekend als de som van de afzonderlijke waarden van de overeenkomstige fragmenten, plus de som van de correctietermen voor intramoleculaire wisselwerkingen. Lijsten van fragmentconstanten en correctietermen zijn te vinden in de literatuur (b)(c)(d)(e). Sommige hiervan worden regelmatig bijgewerkt (b).

Kwaliteitscriteria

Over het algemeen vermindert de betrouwbaarheid van een berekeningsmethode met het toenemen van de complexiteit van de onderzochte stof. Voor eenvoudige moleculen met laag molecuulgewicht en slechts één of twee functionele groepen kan een afwijking van 0,1 tot 0,3 log Pow-eenheden worden verwacht tussen de resultaten van de verschillende fragmentatiemethoden en de gemeten waarde. Voor meer complexe moleculen kan de fout groter zijn. Dit is afhankelijk van de betrouwbaarheid en beschikbaarheid van fragmentconstanten, alsmede van het vermogen om intramoleculaire wisselwerkingen (bijvoorbeeld waterstofbruggen) te herkennen en het juiste gebruik van de correctietermen (minder problematisch met de computersoftware CLOGP-3) (b). In geval van ioniserende verbindingen is het belangrijk de lading of de mate van ionisatie juist in te schatten.

Berekeningsprocedures

Hansch π-methode

De oorspronkelijke hydrofobesubstitutieconstante π, geïntroduceerd door Fujita et al. (f), wordt gedefinieerd als: πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH) waarin Pow (PhX) de verdelingscoëfficiënt van een aromatisch derivaat is, en Pow (PhH) die van de oorspronkelijke verbinding, (bijvoorbeeld πCI = log Pow (C6H5C1) - log Pow (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71). Volgens zijn definitie is de Л-methode voornamelijk toepasbaar op aromatische substitutie. De Л-waarden van een groot aantal substitutiegroepen zijn in tabellen terug te vinden (b)(c)(d). Deze worden gebruikt voor de berekening van log Pow van aromatische moleculen of substructuren.

Rekker-Methode

Volgens Rekker (g) wordt de log Pow-waarde als volgt berekend: log Pow=Σi ai fi+Σj (wisselwerkingstermen) waarin fi de moleculaire fragmentconstante voorstelt en ai de frequentie van het voorkomen ervan in het onderzochte molecuul. De correctietermen kunnen worden uitgedrukt als een integraal veelvoud van eén enkele constante cm (de zogenaamde magische constante). De fragmentconstanten fi en cm werden bepaald uit een lijst van 1054 experimentele Pow waarden (825 stoffen) met behulp van meervoudige regressieanalyse (c)(h). De bepaling van de interactietermen wordt uitgevoerd volgens vaste regels beschreven in de literatuur (e)(h)(i).

Hansch-Leo-methode

Volgens Hansch en Leo (c) wordt de log Pow-waarde berekend uit: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj waarin fi de moleculaire fragmentconstante voorstelt, Fj de correctietermen en ai en bj het overeenkomstige aantal keren dat ze voorkomen. Afgeleid uit experimentele Pow-waarden werd door trial and error een lijst gemaakt van atoom- en groepsfragmentwaarden evenals een lijst van correctietermen Fj (de zogenaamde factoren). De correctietermen zijn geclassificeerd in verschillende categorieën (a)(c). Omdat het vrij ingewikkeld en tijdrovend is rekening te houden met alle regels en correctietermen, werden softwarepakketten ontwikkeld (b).

Gecombineerde methode

De berekening van log Pow van complexe moleculen kan aanzienlijk verbeterd worden, indien het molecuul wordt opgesplitst in grotere substructuren waarvoor betrouwbare log Pow-waarden beschikbaar zijn, hetzij uit tabellen (b)(c) of uit eigen metingen. Zulke fragmenten (bijvoorbeeld heterocyclische structuren, antrachinon, azobenzeen) kunnen dan worden gecombineerd met de Л-waarden volgens Hansch of met de fragmentconstanten volgens Rekker of Leo.

Opmerkingen

i)

De berekeningsmethoden kunnen slechts worden toegepast op gedeeltelijk of volledig geïoniseerde stoffen wanneer de mogelijkheid bestaat om de nodige correctiefactoren in de berekening te verwerken.

ii)

Als het bestaan van intramoleculaire waterstofbruggen kan worden aangenomen, moeten de overeenkomstige correctietermen (ongeveer +0,6 tot +1,0 log Pow-eenheden) bij het resultaat worden opgeteld (a). Aanwijzingen voor de aanwezigheid van waterstofbruggen kunnen worden verkregen uit ruimtelijke modellen of spectroscopische gegevens over het molecuul.

iii)

Als verschillende tautomere vormen mogelijk zijn, dient de meest waarschijnlijke vorm gebruikt te worden voor de berekening.

iv)

De herzieningen van lijsten met fragmentconstanten dienen zorgvuldig gevolgd te worden.

Rapport

Bij het gebruik van berekenings-/schattingsmethoden dient het testrapport zo mogelijk de volgende gegevens te bevatten:

beschrijving van de stof (mengsel, verontreinigingen, enz.);

aanwijzingen over mogelijke intramoleculaire waterstofbruggen, dissociatie, lading en alle andere ongewone effecten (bijvoorbeeld tautomerie);

beschrijving van de berekeningsmethode;

identificatie of leverancier van de database;

bijzonderheden in de keuze van de fragmenten;

uitgebreide documentatie van de berekening.

LITERATUUR

(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl en D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project. Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C. Hansch en A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch en D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(e) R.F. Rekker en H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther., 1979, vol. 14, 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa en C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, 5175.

(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, vol. 1, Elsevier, New York, 1977.

(h) C.V. Eadsforth en P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.

(i) R.A. Scherrer, ACS — American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, 225.

Aanhangsel 2 Aanbevolen referentiestoffen voor de HPLC-methode

Nr. Referentiestof log Pow pKa 1 2-Butanon 0,3 2 4-Acetylpyridine 0,5 3 Aniline 0,9 4 Aceetanilide 1,0 5 Benzylalcohol 1,1 6 p-Methoxyfenol 1,3 pKa = 10,26 7 Fenoxyazijnzuur 1,4 pKa = 3,12 8 Fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-Dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 10 Benzonitril 1,6 11 Fenylacetonitril 1,6 12 4-Methylbenzylalcohol 1,6 13 Acetofenon 1,7 14 2-Nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 15 3-Nitrobenzoëzuur 1,8 pKa = 3,47 16 4-Chlooraniline 1,8 pKa = 4,15 17 Nirrobenzeen 1,9 18 Cinnamylalcohol 1,9 19 Benzoëzuur 1,9 pKa = 4,19 20 p-Kresol 1,9 pKa = 10,17 21 Kaneelzuur 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Anisool 2,1 23 Methylbenzoaat 2,1 24 Benzeen 2,1 25 3-Methylbenzoëzuur 2,4 pKa = 4,27 26 4-Chloorfenol 2,4 pKa = 9,1 27 Trichloorethyleen 2,4 28 Atrazine 2,6 29 Ethylbenzoaat 2,6 30 2,6-Dichloorbenzonitril 2,6 31 3-Chloorbenzoëzuur 2,7 pKa = 3,82 32 Tolueen 2,7 33 1-Naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-Dichlooraniline 2,8 35 Chloorbenzeen 2,8 36 Allylfenylether 2,9 37 Broombenzeen 3,0 38 Ethylbenzeen 3,2 39 Benzofenon 3,2 40 p-Fenylfenol 3,2 pKa = 9,54 41 Thymol 3,3 42 1,4-Dichloorbenzeen 3,4 43 Difenylamine 3,4 pKa = 0,79 44 Naftaleen 3,6 45 Fenylbenzoaat 3,6 46 Isopropylbenzeen 3,7 47 2,4,6-Trichloorfenol 3,7 pKa = 6 48 Bifenyl 4,0 49 Benzylbenzoaat 4,0 50 2,4-Dinitro-6-sec-butylfenol 4,1 51 1,2,4-Trichloorbenzeen 4,2 52 Dodecaancarbonzuur 4,2 53 Difenylether 4,2 54 n-Burylbenzeen 4,5 55 Fenanthreen 4,5 56 Fluorantheen 4,7 57 Dibenzyl 4,8 58 2,6-Difenylpyridine 4,9 59 Trifenylamine 5,7 60 DDT 6,2 Andere referentiestoffen met lage log Pow 1 Nicotinezuur -0,07

Aanhangsel

Figuur Mal en toebehoren om een rups van de te onderzoeken stof te vormen

(Afmetingen in mm) Lengte van de mal: 250 mm Materiaal: aluminium

Aanhangsel

Figuur Apparatuur

Aanhangsel

Voorbeeld van materiaalspecificatie voor thermische-gevoeligheidstest (zie DIN 1623) (1)(2)(3)

Buis: Materiaalspecificatie nr. 1.0336.505 g Afsluitplaat: Materiaalspecificatie nr. 1.4873 Getapte kraag en moer: Materiaalspecificatie nr. 1.3817

Figuur 1 Apparatuur voor de thermische-gevoeligheidstest

(Alle afmetingen in mm) Fig. 1a Stalen buis en toebehoren (1) Buis (1a) Buitenflens (2) Kraag met schroefdraad lage-wrijvingsdraad (3) Afsluitplaat (a = 2,0 of 6,0 mm) (4) Moer (b = 10 mm) (5) Afgeschuind vlak (6) 2 vlakken voor sleutel maat 41 Fig. 1b Verwarmings- en beschermingstoestel (7) 2 vlakken voor sleutel maat 36 (8) Scherfvrije doos (9) 2 Steunstaafjes voor buis (10) Gemonteerde buis (11) Positie van de achterste brander; de andere branders zijn zichtbaar (12) Spaarbrander

Figuur 2 Thermische-gevoeligheidstest

(Voorbeelden van fragmentatie) Geen explosie Geen explosie Explosie Explosie Explosie Explosie

Figuur 3 IJking voor opwarmsnelheid in de thermische-gevoeligheidstest

Temperatuur (°C) Tijd (s) Temperatuur/tijd-curve verkregen door verhitting van dibutylftalaat (27 cm3) in een gesloten (1,5 mm afsluitplaat) buis met behulp van een propaandebiet van circa 3,2 liter/minuut. De temperatuur wordt gemeten met een chromel/alumel thermokoppel, roestvrijstalen omhulsel van 1 mm doorsnede, in het midden van de buis geplaatst op 43 mm onder de rand. De opwarmsnelheid in het bereik van 135 oC tot 285 oC moet tussen 185 en 215 K/minuut liggen.

Figuur 4 Schokgevoeligheidstest

(Afmetingen in mm) (1) Voetstuk, 450 × 450 × 60 (2) Stalen blok, 230 × 250 × 200 (3) Aambeeld, 100 doorsnede × 70 (4) Kolom (5) Middelste ophangsteun (6) 2 Geleiders (7) Getand rek (8) Meetschaal (9) Valhamer (10) Ontkoppelinrichting (11) Centreerplaat (12) Tussenaambeeld (verwisselbaar), 26 doorsnede × 26 (13) Centreerring met openingen (14) Schoktoestel Fig. 4a Valhamer, voor- en zijaanzicht, overzicht Fig. 4b Valhamer, onderste deel

Vervolg

Fig. 4d Schoktoestel voor vloeistoffen Fig. 4c Schoktoestel voor stoffen in poeder- of pasta-achtige vorm (1) Stalen cilinders (2) Geleidingsring voor stalen cilinders (3) Centreerring met openingen (a) verticale snede (b) bovenaanzicht (4) Rubber ring (5) Vloeistof (40 mm3) (6) Vloeistofloze ruimte Fig. 4e Hamer (valgewicht van 5 kg) (1) Insteekeinde (2) Wijzertje voor de hoogte (3) Positioneergroef (4) Cilindrische slagkop (5) Terugslaghaak

Figuur 5 Wrijvingsgevoeligheidstest

Fig. 5a Wrijvingstoestel; verticaal- en bovenaanzicht (1) Stalen voetstuk (2) Beweegbare slede (3) Porseleinen plaat, 25 × 25 × 5 mm, vast op slede (4) Vaste porseleinen pen, 10 doorsnede × 15 mm (5) Monster tijdens de proef, ongeveer 10 mm3 (6) Penhouder (7) Belastingarm (8) Tegengewicht (9) Schakelaar (10) Wiel om slede naar startpositie te bewegen (11) Overbrenging naar elektromotor Fig. 5b Beginpositie van de pen op het monster

Aanhangsel

Figuur Mal en toebehoren voor de bereiding van de rups

(Afmetingen in mm)

Aanhangsel Voorbeelden van andere methoden voor de bepaling van het aantalgemiddelde molecuulgewicht (Mn) van polymeren

Gelpermeatiechromatografie (GPC) geniet de voorkeur als methode voor de bepaling van Mn, vooral wanneer er verschillende standaards beschikbaar zijn waarvan de structuur vergelijkbaar is met die van het polymeer. Wanneer het gebruik van GPC praktische problemen oplevert of reeds wordt vermoed dat de stof niet aan een criterium voor Mn in de regelgeving zal voldoen (en dit vermoeden moet worden bevestigd), zijn echter andere methoden beschikbaar:

1.1.1.1.2.1.3.1.4.

Gebruik van colligatieve eigenschappen Ebullioscopie/Cryoscopie: Hierbij wordt de kookpuntverhoging (ebullioscopie) of vriespuntverlaging (cryoscopie) van een oplosmiddel na toevoeging van het polymeer gemeten. Bij deze methode wordt gebruik gemaakt van het feit dat het effect van het opgeloste polymeer op het kookpunt/vriespunt van de vloeistof afhankelijk is van het molecuulgewicht van het polymeer (1)(2). Toepasbaarheid: Mn < 20000. Dampspanningsverlaging: Hierbij wordt de dampspanning van een gekozen referentievloeistof voor en na toevoeging van bekende hoeveelheden polymeer gemeten (1)(2). Toepasbaarheid: Mn < 20000 (theoretisch; in de praktijk is de bruikbaarheid van deze methode beperkt). Membraan-osmometrie: Berust op osmose, d.w.z. de natuurlijke neiging van moleculen van oplosmiddelen om zich via een semipermeabel membraan van een verdunde naar een geconcentreerde oplossing te verplaatsen om een evenwicht te bereiken. In dit geval bevat de verdunde oplossing geen polymeer en de geconcentreerde oplossing wel. Doordat het oplosmiddel door het membraan wordt getrokken, ontstaat een drukverschil dat afhankelijk is van de concentratie en het molecuulgewicht van het polymeer (1)(3)(4). Toepasbaarheid: 20000 < Mn < 200000. Dampfase-osmometrie: Hierbij wordt de verdampingssnelheid van een zuivere oplosmiddelaërosol vergeleken met die van ten minste drie aerosolen die verschillende concentraties polymeer bevatten (1)(5)(6). Toepasbaarheid: Mn <20000.

2. Eindgroepanalyse Om deze methode te kunnen gebruiken is kennis nodig omtrent zowel de algehele structuur van het polymeer als de aard van de eindgroepen die de ketens afsluiten (deze moeten met behulp van bijvoorbeeld NMR of titratie/derivatisering van de hoofdketen kunnen worden onderscheiden). Wanneer de concentratie van de eindgroepen in het polymeermolecuul wordt bepaald, kan op grond daarvan een waarde voor het molecuulgewicht worden afgeleid (7)(8)(9). Toepasbaarheid: Mn tot 50000 (met afnemende betrouwbaarheid).

(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)

Referenties Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn, John Wiley, New York. Glover, CA, (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr.ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E., Muller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

Aanhangsel Richtsnoeren om het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen te corrigeren voor de aanwezigheid van onoplosbaar polymeer

Wanneer een monster onoplosbaar polymeer bevat, gaat tijdens de GPC-analyse massa verloren. Het onoplosbare polymeer blijft irreversibel op de kolom of het monsterfilter achter, terwijl het oplosbare gedeelte van het monster door de kolom loopt. Wanneer de stijging van de brekingsindex (dn/dc) van het polymeer kan worden geschat of gemeten, kan de massa van de hoeveelheid monster die op de kolom verloren is gegaan, worden geschat. In dat geval wordt de correctie bepaald met behulp van een externe kalibratie met standaardmaterialen met een bekende concentratie en dn/dc om de respons van de refractometer te kalibreren. In het hier gegeven voorbeeld wordt een PMM-standaard (polymethylmethacrylaat) gebruikt. Bij de externe kalibratie voor de analyse van acrylpolymeren wordt een PMM-standaard met een bekende concentratie in tetrahydrofuraan met behulp van GPC geanalyseerd en worden de resultaten gebruikt voor de bepaling van de refractometerconstante volgens de volgende vergelijking: K = R/(C × V × dn/dc) waarbij K de refractometerconstante (in microvoltseconde/ml); R de respons van de PMM-standaard (in microvoltseconde); C de concentratie van de PMM-standaard (in mg/ml); V het geïnjecteerde volume (in ml); dn/dc de stijging van de brekingsindex voor PMM in tetrahydrofuraan (in ml/mg). Normale waarden voor een PMM-standaard zijn: R 2937891; C 1,07 mg/ml; V 0,1 ml; dn/dc 9 × 10-5 ml/mg. Met de aldus berekende waarde van K (3,05 × 1011) wordt vervolgens de theoretische respons van de detector berekend als het geïnjecteerde polymeer voor 100 % via de detector zou zijn geëlueerd.

DEEL B METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE TOXICITEIT EN ANDERE INVLOEDEN OP DE GEZONDHEID

ALGEMENE INLEIDING A.

KARAKTERISERING VAN DE TESTSTOF De samenstelling van de teststof, met inbegrip van de voornaamste verontreinigingen, en de relevante fysisch-chemische eigenschappen, waaronder de stabiliteit, moeten vóór de aanvang van ieder toxiciteitsonderzoek bekend zijn. De fysisch-chemische eigenschappen van de teststof leveren belangrijke informatie over de keuze van de manier van toedienen, de opzet van ieder afzonderlijk onderzoek en het hanteren en bewaren van de teststof. Alvorens het onderzoek wordt aangevat, moet een analytische methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van de teststof (zo mogelijk met inbegrip van de voornaamste verontreinigingen) in het toedieningsmedium en in het biologisch materiaal ontwikkeld worden. Alle gegevens met betrekking tot de identificatie, de fysisch-chemische eigenschappen, de zuiverheid en het gedrag van de teststof moeten in het onderzoeksrapport worden opgenomen.

VERZORGING VAN DE DIEREN Bij toxiciteitstests zijn een stringente bewaking van de levensomstandigheden en een goede verzorging van de dieren een eerste vereiste.

i)

Huisvesting De leefomstandigheden in de kamers of ruimten waar de proefdieren zijn ondergebracht, moeten geschikt zijn voor het soort proefdier. Voor ratten, muizen en cavia's is een kamertemperatuur van 22 oC ± 3 oC en een relatieve luchtvochtigheid van 30-70 % geschikt; voor konijnen moet de temperatuur 20 oC + 3 oC en de relatieve luchtvochtigheid 30-70 % bedragen. Sommige experimentele technieken zijn bijzonder gevoelig voor temperatuureffecten; in dergelijke gevallen wordt in de beschrijving van de onderzoekmethode nader ingegaan op de correcte proefomstandigheden. Bij ieder onderzoek naar toxische effecten moeten de temperatuur en de vochtigheidsgraad worden gecontroleerd, opgetekend en in het eindverslag van de studie worden opgenomen. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met afwisselend twaalf uur licht — twaalf uur duisternis. Nadere gegevens over de verlichting moeten worden opgetekend en in het eindverslag worden opgenomen. Tenzij anders bij de methode vermeld, worden de dieren hetzij afzonderlijk, hetzij in kleine groepen van hetzelfde geslacht gehuisvest In het laatste geval mogen per kooi niet meer dan vijf dieren worden gehuisvest. Het is belangrijk om in verslagen over dierproeven steeds te vermelden welk soort kooien is gebruikt en hoeveel dieren tijdens de blootstelling aan de chemische stof en tijdens latere waarnemingsperioden in iedere kooi waren gehuisvest.

ii)

Voeding Bij de samenstelling van het voedsel moet worden voldaan aan alle eisen die de proefdiersoorten aan hun voeding stellen. Indien chemische stoffen via de voeding aan de dieren worden toegediend, kan de voedingswaarde door interactie tussen de stof en een bestanddeel van de voeding verminderd worden. Bij het interpreteren van de resultaten dient rekening te worden gehouden met de mogelijkheid van dergelijke reacties. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk laboratoriumvoeder met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voedsel kan mede worden bepaald door de noodzaak de teststof, wanneer die via het voedsel wordt toegediend, op een passende wijze daarmee te vermengen. Onzuiverheden in de voeding waarvan bekend is dat ze de toxiciteit beïnvloeden, mogen niet in werkzame concentraties voorkomen.

ALTERNATIEVE TESTEN De Europese Unie maakt zich sterk voor het ontwikkelen en valideren van alternatieve technieken die dezelfde hoeveelheid informatie opleveren als de huidige dierproeven, maar waarbij minder proefdieren worden gebruikt, die minder lijden veroorzaken of die het gebruik van dieren volledig overbodig maken. Naarmate dergelijke methoden ter beschikking komen, moet het gebruik ervan waar mogelijk worden overwogen voor de risicobeoordeling en de daaruit voortvloeiende classificatie en etikettering ten aanzien van de intrinsieke risico's.

EVALUATIE EN INTERPRETATIE Bij de evaluatie en interpretatie van de testresultaten moet rekening worden gehouden met de beperkingen ten aanzien van de mate waarin de resultaten van dierproeven en in-vitro tests kunnen worden geëxtrapoleerd naar de mens. Daarom kunnen aanwijzingen voor schadelijke effecten bij de mens, indien beschikbaar, gebruikt worden als bevestiging van de testresultaten.

LITERATUUR De meeste van deze methoden zijn ontwikkeld binnen het kader van het OESO-programma inzake richtsnoeren voor het testen; zij moeten worden toegepast overeenkomstig de beginselen van goede laboratoriumpraktijken, om zoveel mogelijk te komen tot onderlinge acceptatie van gegevens. Verdere informatie kan worden gevonden in de referenties die te vinden zijn in de OESO-richtsnoeren en in relevante literatuur die elders is gepubliceerd.

B.l bis.

ACUTE ORALE TOXICITEIT: PROCEDURE MET VASTE DOSES

1. METHODE Deze methode is gelijkwaardig aan TG 420 (2001) van de OESO.

1.

1.1. INLEIDING Bij klassieke methoden voor de bepaling van de acute toxiciteit wordt de dood van dieren als eindpunt gebruikt. In 1984 is door de British Toxicology Society een nieuwe aanpak voor acute toxiciteitstests voorgesteld op basis van de toediening van een reeks vaste doses (1). Deze aanpak gebruikt niet meer de dood van dieren als eindpunt, maar berust op de observatie van duidelijke toxiciteitsverschijnselen bij één van een reeks vaste doses. Na in-vivo valideringsonderzoek in het VK (2) en in internationaal verband (3) is deze procedure in 1992 als testmethode goedgekeurd. Vervolgens zijn de statistische eigenschappen van de procedure met vaste doses bij een reeks onderzoeken met behulp van mathematische modellen geëvalueerd (4)(5)(6). Met de combinatie van in-vivo-onderzoek en modellen is aangetoond dat de procedure reproduceerbaar is, minder dieren gebruikt en minder leed veroorzaakt dan de klassieke methoden en stoffen op een vergelijkbare wijze kan rangschikken als de andere testmethoden voor acute toxiciteit. Richtsnoeren voor de keuze van de meest geschikte testmethode voor een bepaald doel worden gegeven in de leidraad voor tests op acute orale toxiciteit (7). Deze leidraad bevat ook aanvullende informatie over de uitvoering en interpretatie van testmethode B.l bis. De methode heeft als beginsel dat bij het hoofdonderzoek slechts beperkt toxische doses worden gebruikt en dat de toediening van doses waarvan wordt verwacht dat ze dodelijk zijn, moet worden vermeden. Ook doses waarvan bekend is dat ze door een bijtende of sterk irriterende werking hevige pijn en leed veroorzaken, behoeven niet te worden toegediend. Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevig en voortdurend leed vertonen, worden op humane wijze gedood en worden bij de interpretatie van de testresultaten op dezelfde manier behandeld als dieren die tijdens de test gestorven zijn. Er is een aparte leidraad met criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te herkennen (8). De methode levert informatie over de gevaarlijke eigenschappen op en maakt het mogelijk de stof te rangschikken en in te delen aan de hand van het Globally Harmonised System (GHS) voor de indeling van chemische stoffen die acute toxiciteit veroorzaken (9). Het testlaboratorium moet vóór de uitvoering van het onderzoek alle beschikbare informatie over de teststof in overweging nemen. Hierbij gaat het om informatie als de identiteit en de chemische structuur van de stof, de fysisch-chemische eigenschappen, de resultaten van andere met de stof uitgevoerde toxiciteitstests in vivo of in vitro, toxicologische gegevens over qua structuur verwante stoffen en de voorgenomen toepassing(en) van de stof. Deze informatie is nodig om alle betrokkenen ervan te overtuigen dat de test relevant is voor de bescherming van de gezondheid van de mens en helpt tevens bij de keuze van een geschikte aanvangsdosis.

1.2. DEFINITIES Acute orale toxiciteit: de schadelijke effecten die zich voordoen na orale toediening van één dosis van een stof of verschillende doses die binnen 24 uur worden toegediend. Vertraagde sterfte: houdt in dat een dier niet binnen 48 uur sterft of stervende is maar later gedurende de observatieperiode van 14 dagen sterft. Dosis: de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per gewichtseenheid van het proefdier (bijvoorbeeld mg/kg). Manifeste toxiciteit: een algemene term die zodanige duidelijke toxiciteitsverschijnselen na de toediening van de teststof beschrijft (zie (3) voor voorbeelden), dat bij de eerstvolgende vaste dosis hevige pijn en blijvende verschijnselen van ernstig leed, stervende dieren (zie de leidraad voor humane eindpunten (8) voor criteria) of waarschijnlijke sterfte bij de meeste dieren kunnen worden verwacht. GHS: het Globally Harmonised Classification System voor chemische stoffen en mengsels. Een samenwerkingsproject van de OESO (gezondheid van de mens en milieu), het Comité van deskundigen voor het vervoer van gevaarlijke goederen van de VN (fysisch-chemische eigenschappen) en de ILO (communicatie van gevaren) dat wordt gecoördineerd door het Gezamenlijk programma voor een verantwoord beheer van chemische stoffen (IOMC). Ophanden zijnde sterfte: wanneer vóór het eerstvolgende geplande observatietijdstip een stervende toestand of sterfte wordt verwacht. Voorbeelden van indicaties voor deze toestand bij knaagdieren zijn convulsies, zijligging, liggende positie en tremors (zie de leidraad voor humane eindpunten (8) voor meer bijzonderheden). LD50(mediaan van de letale dosis): een statistisch afgeleide enkelvoudige dosis van een stof waarvan kan worden verwacht dat 50 % van de dieren waaraan deze dosis oraal wordt toegediend, sterft. De LD50 wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per gewichtseenheid van het proefdier (mg/kg). Limietdosis: een dosis die bij tests als bovengrens wordt gehanteerd (2000 of 5000 mg/kg). Stervende toestand: een toestand waarop de dood volgt of waarin overleven onmogelijk is, zelfs wanneer het dier wordt behandeld (zie de leidraad voor humane eindpunten (8) voor meer bijzonderheden). Voorspelbare sterfte: een toestand met klinische verschijnselen die wijzen op sterfte op een bekend tijdstip in de toekomst vóór het geplande einde van het experiment, bijvoorbeeld wanneer het dier geen water of voer kan bereiken (zie de leidraad voor humane eindpunten (8) voor meer bijzonderheden).

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Groepen met dieren van hetzelfde geslacht krijgen stapsgewijs de vaste doses 5, 50, 300 en 2000 mg/kg toegediend (bij wijze van uitzondering kan een extra vaste dosis van 5000 mg/kg worden overwogen; zie punt 1.6.2). Op basis van een verkennende test wordt de aanvangsdosis gekozen, waarvan wordt verwacht dat er enige toxiciteitsverschijnselen optreden zonder dat er sprake is van ernstige toxische effecten of sterfte. Klinische verschijnselen en situaties die gepaard gaan met pijn, leed en ophanden zijnde sterfte, worden gedetailleerd in een aparte OESO-leidraad beschreven (8). Afhankelijk van het al dan niet optreden van toxiciteitsverschijnselen of sterfte kan er aan andere groepen dieren een hogere of lagere dosis worden toegediend. Deze procedure wordt gestaakt zodra de dosis wordt bepaald waarbij manifeste toxiciteit optreedt of ten hoogste één dier sterft, of wanneer blijkt dat er bij de hoogste dosis geen effecten worden geconstateerd of bij de laagste dosis dieren sterven.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.

1.4.1. Keuze van de diersoort Bij voorkeur wordt de rat gebruikt, maar ook andere knaagdiersoorten kunnen worden gebruikt. Normaal gesproken worden vrouwtjes gebruikt (7), omdat uit literatuuronderzoek van klassieke LD50-tests blijkt dat er meestal weinig verschil in gevoeligheid tussen mannetjes en vrouwtjes is, maar wanneer er een verschil wordt geconstateerd, zijn vrouwtjes meestal iets gevoeliger (10). Als echter uit kennis omtrent de toxicologische of toxicokinetische eigenschappen van qua structuur verwante chemische stoffen blijkt dat mannetjes waarschijnlijk gevoeliger zullen zijn, moeten mannetjes worden gebruikt. Wanneer de test bij mannetjes wordt uitgevoerd, moet hiervoor een afdoende motivering worden gegeven. Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. Elk dier moet bij de eerste toediening 8 tot 12 weken oud zijn en het lichaamsgewicht mag niet meer dan ± 20 % afwijken van het gemiddelde gewicht van dieren waaraan al eerder een dosis is toegediend.

1.4.2. Huisvesting en voeding De temperatuur in de proefdierruimte dient 22 oC (± 3 oC) te zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De dieren mogen per dosis in groepen worden gehuisvest, maar het aantal dieren per kooi mag niet zo groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord.

1.4.3. Voorbereiding van de dieren De dieren worden aselect ingedeeld, gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren en vóór het begin van de toediening gedurende minimaal 5 dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in het laboratorium te laten wennen.

1.4.4. Bereiding van de dosis In het algemeen worden alle doses van de teststof in het hele testbereik in een constant volume toegediend door de concentratie van de toegediende dosis te variëren. Wanneer echter een vloeibaar eindproduct of mengsel wordt getest, kan het voor de latere risicobeoordeling van die stof zinvoller zijn de teststof onverdund, d.w.z. met een constante concentratie, te gebruiken en sommige regelgevende instanties hebben dit verplicht gesteld. Het maximaal toe te dienen volume mag echter in geen geval worden overschreden. Het is afhankelijk van de grootte van het proefdier welk volume vloeistof in één keer kan worden toegediend. Bij knaagdieren mag het volume normaal gesproken niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht. Bij een waterige oplossing kan echter 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden overwogen. Voor de formulering van de dosis wordt waar mogelijk het gebruik van een waterige oplossing/suspensie/emulsie aanbevolen, in volgorde van voorkeur gevolgd door een oplossing/suspensie/emulsie in olie (bijvoorbeeld maïsolie) en eventueel een oplossing in een ander medium. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moeten de toxicologische kenmerken van het medium bekend zijn. De dosis moet kort vóór de toediening worden bereid, tenzij de stabiliteit van het preparaat gedurende de gebruiksperiode bekend is en is aangetoond dat deze aanvaardbaar is.

1.5. PROCEDURE

1.5.

1.5.1. Toediening van de dosis De teststof wordt in één dosis toegediend met een maagsonde of een geschikte katheter. In het uitzonderlijke geval dat één dosis niet mogelijk is, kan de dosis in kleinere porties worden verdeeld die in de loop van maximaal 24 uur worden toegediend. De dieren moeten vóór de toediening vasten (ratten mogen bijvoorbeeld de nacht vóór de toediening geen voer maar wel water krijgen en muizen gedurende 3-4 uur). Na de vastperiode worden de dieren gewogen en wordt de teststof toegediend. Na de toediening van de stof kan men ratten nog eens 3-4 uur en muizen nog eens 1-2 uur laten vasten. Wanneer een dosis in de loop van de tijd in porties wordt toegediend, kan het afhankelijk van de lengte van de periode nodig zijn de dieren voer en water te geven.

1.5.2. Verkennende test De verkennende test is bedoeld om de juiste aanvangsdosis voor het hoofdonderzoek te kunnen kiezen. De teststof wordt overeenkomstig het stroomschema in bijlage 1 achtereenvolgens telkens aan één dier toegediend. De verkennende test is afgelopen wanneer er een beslissing kan worden genomen over de aanvangsdosis voor het hoofdonderzoek (of als er bij de laagste vaste dosis een dier sterft). Als aanvangsdosis voor de verkennende test wordt uit de vaste doses 5, 50, 300 en 2000 mg/kg de dosis gekozen waarvan wordt verwacht dat er manifeste toxiciteit optreedt, waar mogelijk op basis van gegevens uit in-vitro- en in-vivo-onderzoek met dezelfde chemische stof en andere qua structuur verwante chemische stoffen. Wanneer deze informatie niet beschikbaar is, wordt 300 mg/kg als aanvangsdosis gebruikt. Er wordt ten minste 24 uur gewacht voordat een dosis aan het volgende dier wordt toegediend. Alle dieren worden gedurende ten minste 14 dagen geobserveerd. Bij wijze van uitzondering kan alleen met een motivering op basis van specifieke regelgevingsvereisten daarnaast het gebruik van een hogere vaste dosis van 5000 mg/kg worden overwogen (zie bijlage 3). Met het oog op het welzijn van dieren zijn dierproeven in GHS-categorie 5 tot 2000-5000 mg/kg niet wenselijk en moeten deze alleen worden overwogen wanneer er een grote kans is dat de resultaten van die test van direct belang zijn voor de bescherming van de gezondheid van mensen of dieren of het milieu. Wanneer een dier waaraan bij de verkennende test de laagste vaste dosis (5 mg/kg) is toegediend, sterft, is de normale procedure dat de test wordt afgesloten en de stof wordt ingedeeld in GHS-categorie 1 (zie bijlage 1). Als de indeling echter moet worden bevestigd, kan de volgende facultatieve aanvullende procedure worden uitgevoerd. De dosis van 5 mg/kg wordt aan een tweede dier toegediend. Als dit tweede dier sterft. is de indeling in GHS-categorie 1 bevestigd en wordt het onderzoek onmiddellijk beëindigd. Als het tweede dier blijft leven, wordt de dosis van 5 mg/kg aan ten hoogste nog eens drie dieren toegediend. Omdat er een hoog risico op sterfte zal zijn, moet de dosis met het oog op het welzijn van dieren achtereenvolgens aan telkens één dier worden toegediend. Vóór de toediening aan het volgende dier moet lang genoeg worden gewacht om vast te kunnen stellen dat het vorige dier waarschijnlijk zal blijven leven. Als er een tweede dier sterft, wordt de toediening onmiddellijk gestaakt en worden er geen dieren meer gebruikt. Een tweede dier dat sterft, levert (ongeacht het aantal dieren dat bij beëindiging is getest) het resultaat A op (2 of meer dode dieren), zodat de indelingsregel van bijlage 2 bij de vaste dosis van 5 mg/kg wordt gevolgd (categorie 1 als er 2 of meer dode dieren zijn en categorie 2 als er niet meer dan één dood dier is). Daarnaast geeft bijlage 4 een leidraad voor de indeling in het EU-systeem totdat het nieuwe GHS ingevoerd is.

1.5.3. Hoofdonderzoek

1.5.3.

1.5.3.1. Aantal dieren en dosisniveaus Het stroomschema in bijlage 2 geeft aan wat er na de test op het aanvangsniveau moet gebeuren. Er zijn drie mogelijkheden: de test wordt gestaakt en de desbetreffende gevaar-indelingscategorie wordt toegekend, de test wordt bij een hogere vaste dosis voortgezet of de test wordt bij een lagere vaste dosis voortgezet. Met het oog op de bescherming van dieren wordt een dosisniveau dat bij de verkennende test een dood dier opleverde, bij het hoofdonderzoek niet opnieuw getest (zie bijlage 2). De ervaring heeft geleerd dat het meest waarschijnlijke resultaat bij de aanvangsdosis is dat de stof kan worden ingedeeld en dat er geen verdere tests nodig zijn. Normaal gesproken worden er voor elk dosisniveau in totaal vijf dieren van hetzelfde geslacht gebruikt, namelijk het dier dat deze dosis bij de verkennende test toegediend heeft gekregen en nog eens vier dieren (behalve wanneer bij wijze van uitzondering een dosisniveau van het hoofdonderzoek niet in de verkennende test was opgenomen). Het tijdsverloop tussen de toediening op elk niveau wordt bepaald door de aanvang, de duur en de ernst van de toxiciteitsverschijnselen. Met de toediening van een volgende dosis wordt gewacht totdat men er zeker van is dat de eerder geteste dieren blijven leven. Indien nodig wordt een periode van drie of vier dagen tussen de toediening op elk dosisniveau aanbevolen om observatie van vertraagde toxiciteit mogelijk te maken. Dit interval kan indien gewenst worden aangepast, bijvoorbeeld bij een onduidelijke reactie. Wanneer het gebruik van een hoogste vaste dosis van 5000 mg/kg wordt overwogen, moet de procedure van bijlage 3 worden gevolgd (zie ook punt 1.6.2).

1.5.3.2. Limiettest De limiettest wordt voornamelijk uitgevoerd wanneer er informatie is die erop wijst dat het testmateriaal waarschijnlijk niet toxisch is c.q. alleen toxisch is in hogere doses dan de limieten in de regelgeving. Informatie over de toxiciteit van het testmateriaal kan afkomstig zijn van kennis omtrent vergelijkbare geteste verbindingen of vergelijkbare geteste mengsels of producten, waarbij rekening wordt gehouden met de identiteit en het percentage van de bestanddelen waarvan bekend is dat ze in toxicologisch opzicht relevant zijn. Wanneer er weinig of geen informatie over de toxiciteit van het testmateriaal is of wordt verwacht dat het toxisch is, moet het hoofdonderzoek worden uitgevoerd. De limiettest voor deze testmethode wordt volgens de normale procedure uitgevoerd met een verkennende test met een aanvangsdosis van 2000 mg/kg (of in uitzonderingsgevallen 5000 mg/kg), gevolgd door de toediening van deze dosis aan nog eens vier dieren.

1.6. OBSERVATIE De dieren worden gedurende de eerste 30 minuten na de toediening ten minste éénmaal elk afzonderlijk geobserveerd, gedurende de eerste 24 uur periodiek met bijzondere aandacht voor de eerste vier uur en vervolgens dagelijks gedurende in totaal 14 dagen, behalve wanneer ze met het oog op het welzijn van dieren uit het onderzoek moeten worden genomen en op humane wijze moeten worden gedood of dood aangetroffen worden. De observatieduur is echter geen regel waarvan niet kan worden afgeweken. Deze moet worden bepaald aan de hand van de toxische reacties, het tijdstip waarop ze beginnen en de duur van de herstelperiode en kan dus worden verlengd indien dit nodig wordt geacht. Het is belangrijk op welk tijdstip de toxiciteitsverschijnselen verschijnen en verdwijnen, vooral als er een neiging is tot vertraagde toxiciteitsverschijnselen (11). Alle observaties worden systematisch geregistreerd en voor elk dier wordt een apart verslag bijgehouden. Als de dieren toxiciteitsverschijnselen blijven vertonen, is aanvullende observatie nodig. Bij de observatie wordt gekeken naar veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en centrale zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en het gedragspatroon. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Er moet rekening worden gehouden met de beginselen en criteria in de leidraad voor humane eindpunten (8). Dieren die stervend worden aangetroffen en dieren die hevige pijn hebben of blijvende tekenen van ernstig leed vertonen, worden op humane wijze gedood. Wanneer dieren op humane wijze worden gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.

1.6.

1.6.1. Lichaamsgewicht Kort vóór de toediening van de teststof en vervolgens ten minste wekelijks wordt het gewicht van elk dier bepaald. De gewichtsverandering wordt berekend en geregistreerd. Aan het einde van de test worden de dieren die nog leven gewogen en vervolgens op humane wijze gedood.

1.6.2. Pathologie Op alle proefdieren (ook degene die tijdens de test sterven of met het oog op het welzijn van dieren uit het onderzoek worden genomen) wordt macroscopische obductie uitgevoerd. Alle macroscopische pathologische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd. Microscopisch onderzoek van organen die tekenen van macroscopische pathologische veranderingen vertonen bij dieren die 24 uur of langer na de toediening nog leven, kan ook worden overwogen aangezien dit nuttige informatie kan opleveren.

2. GEGEVENS Er worden voor elk dier apart gegevens verstrekt. Daarnaast worden alle gegevens in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of op humane wijze is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een beschrijving van de toxische effecten met het verloop en de omkeerbaarheid en de obductiebevindingen.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. TESTVERSLAG In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opgenomen:

Teststof:

de fysische aard, de zuiverheid en indien relevant de fysisch-chemische eigenschappen (bv. de isomeer-samenstelling);

identificatiegegevens, zoals het CAS-nr.

Medium (indien van toepassing):

een motivering voor de keuze van het medium als een ander medium dan water wordt gebruikt.

Proefdieren:

de gebruikte soort/stam;

de microbiologische status van de dieren, indien deze bekend is;

het aantal dieren, hun leeftijd en hun geslacht (indien van toepassing een motivering voor het gebruik van mannetjes in plaats van vrouwtjes);

de herkomst, de huisvesting, de voeding enz.

Testomstandigheden:

gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof met bijzonderheden over de fysische vorm van het toegediende materiaal;

gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof met vermelding van het toegediende volume en het toedieningstijdstip;

gedetailleerde gegevens over het voer en het water (met vermelding van de aard/herkomst van het voer en de herkomst van het water);

de motivering voor de keuze van de aanvangsdosis.

Resultaten:

een tabel met gegevens over de respons en de dosis voor elk dier (bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen of sterfte en de aard, de hevigheid en de duur van de effecten);

een tabel met het lichaamsgewicht en de veranderingen in het lichaamsgewicht;

het gewicht van de dieren op de toedieningsdag, daarna een keer per week en tenslotte wanneer ze sterven of gedood worden;

de datum en het tijdstip waarop de dieren sterven als dit eerder gebeurt dan gepland;

voor elk dier de aanvang en het verloop van de toxiciteitsverschijnselen en of ze reversibel waren;

voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische bevindingen, indien beschikbaar.

Bespreking en interpretatie van de resultaten.

Conclusies.

4(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)

REFERENTIES British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482 Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002) Statistical evaluation on the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19. OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF html|. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33,223-231. Chan, P.K. and A.W. Hayes (1994). Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

B.l ter.

ACUTE ORALE TOXICITEIT: METHODE TER BEPALING VAN DE ACUTE-TOXICITEITSKLASSE

1. METHODE Deze methode is gelijkwaardig aan TG 423 (2001) van de OESO.

1.

1.1. INLEIDING De in deze test beschreven methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse (1) is een stapsgewijze procedure waarbij voor iedere stap drie dieren van hetzelfde geslacht worden gebruikt. Afhankelijk van het aantal dode en/of stervende dieren kunnen er gemiddeld twee tot vier stappen nodig zijn om een uitspraak over de acute toxiciteit van de teststof te kunnen doen. Deze procedure is reproduceerbaar, gebruikt heel weinig dieren en kan stoffen op een vergelijkbare wijze rangschikken als de andere testmethoden voor acute toxiciteit. De methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse is gebaseerd op biometrische evaluaties (2)(3)(4)(5) met vaste doses, die ver genoeg uiteenliggen om een stof met het oog op de indeling en de bepaling van de gevaren te kunnen rangschikken. De in 1996 goedgekeurde methode is zowel op nationaal (6) als op internationaal (7) niveau uitgebreid in vivo gevalideerd in vergelijking met LD50-gegevens uit de literatuur. Richtsnoeren voor de keuze van de meest geschikte testmethode voor een bepaald doel worden gegeven in de leidraad voor tests op acute orale toxiciteit (8). Deze leidraad bevat ook aanvullende informatie over de uitvoering en interpretatie van testmethode B.l ter. Teststoffen behoeven niet te worden toegediend in doses waarvan bekend is dat ze door een bijtende of sterk irriterende werking hevige pijn en leed veroorzaken. Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevig en voortdurend leed vertonen, worden op humane wijze gedood en worden bij de interpretatie van de testresultaten op dezelfde manier behandeld als dieren die tijdens de test gestorven zijn. Er is een aparte leidraad met criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te herkennen (9). Bij de methode worden vooraf bepaalde doses gebruikt en de resultaten maken het mogelijk de stof te rangschikken en in te delen aan de hand van het Globally Harmonised System voor de indeling van chemische stoften die acute toxiciteit veroorzaken (10). De methode is in principe niet bedoeld om de berekening van een exacte LD50 mogelijk te maken, maar er kan wel een zeker blootstellingsinterval worden bepaald waar sterfte te verwachten valt, aangezien sterfte van een deel van de dieren het belangrijkste eindpunt van deze test blijft. Een LD50 kan met deze methode alleen worden bepaald wanneer ten minste twee doses een sterfte tussen 0 % en 100 % opleveren. Het gebruik van een aantal vooraf bepaalde doses, ongeacht de teststof, waarbij de indeling expliciet wordt gekoppeld aan het aantal dieren waarbij uiteenlopende toestanden worden geobserveerd, biedt betere mogelijkheden voor consistentie en herhaalbaarheid bij rapportage door verschillende laboratoria. Het testlaboratorium moet vóór de uitvoering van het onderzoek alle beschikbare informatie over de teststof in overweging nemen. Hierbij gaat het om informatie als de identiteit en de chemische structuur van de stof, de fysisch-chemische eigenschappen, het resultaat van andere met de stof uitgevoerde toxiciteitstests in vivo of in vitro, toxicologische gegevens over de qua structuur verwante stoffen en de voorgenomen toepassing(en) van de stof. Deze informatie is nodig om alle betrokkenen ervan te overtuigen dat de test relevant is voor de bescherming van de gezondheid van de mens en helpt tevens bij de keuze van de geschiktste aanvangsdosis.

1.2. DEFINITIES Acute orale toxiciteit: de schadelijke effecten die zich voordoen na orale toediening van een dosis van een stof of verschillende doses die binnen 24 uur worden toegediend. Vertraagde sterfte: houdt in dat een dier niet binnen 48 uur sterft of stervende is maar later gedurende de observatieperiode van 14 dagen sterft. Dosis: de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per gewichtseenheid van het proefdier (bijvoorbeeld mg/kg). GHS: het Globally Harmonised Classification System voor chemische stoffen en mengsels. Een samenwerkingsproject van de OESO (gezondheid van de mens en milieu), het Comité van deskundigen voor het vervoer van gevaarlijke goederen van de VN (fysisch-chemische eigenschappen) en de ILO (communicatie van gevaren) dat wordt gecoördineerd door het Gezamenlijk programma voor een verantwoord beheer van chemische stoften (IOMC). Ophanden zijnde sterfte: wanneer voor het eerstvolgende geplande observatietijdstip een stervende toestand of sterfte wordt verwacht. Voorbeelden van indicaties voor deze toestand bij knaagdieren zijn convulsies, zijligging, liggende positie en tremors (zie de leidraad voor humane eindpunten (9) voor meer bijzonderheden). LD50(mediaan van de orale letale dosis): een statistisch afgeleide enkelvoudige dosis van een stof waarvan kan worden verwacht dat 50 % van de dieren waaraan deze dosis oraal wordt toegediend, sterft. De LD50 wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per gewichtseenheid van het proefdier (mg/kg). Limietdosis: een dosis die bij tests als bovengrens wordt gehanteerd (2000 of 5000 mg/kg). Stervende toestand: een toestand waarop de dood volgt of waarin overleven onmogelijk is, zelfs wanneer het dier wordt behandeld (zie de leidraad voor humane eindpunten (9) voor meer bijzonderheden). Voorspelbare sterfte: een toestand met klinische verschijnselen die wijzen op sterfte op een bekend tijdstip in de toekomst voor het geplande einde van het experiment, bijvoorbeeld wanneer het dier geen water of voer kan bereiken (zie de leidraad voor humane eindpunten (9) voor meer bijzonderheden).

1.3. PRINCIPE VAN DE TEST Het principe van de test is dat op basis van een stapsgewijze procedure, waarbij per stap een zo klein mogelijk aantal dieren wordt gebruikt, voldoende informatie over de acute toxiciteit van de teststof wordt verkregen om deze in te kunnen delen. Een van de vaste doses van de stof wordt oraal aan een groep proefdieren toegediend. De stof wordt stapsgewijs getest en bij elke stap worden drie dieren van hetzelfde geslacht (normaal gesproken vrouwtjes) gebruikt. Het resultaat van de stap (dieren die ten gevolge van de toediening van de stof sterven of niet) is bepalend voor de volgende stap, namelijk: Bijlage 1 bevat een gedetailleerde beschrijving van de testprocedure. Met deze methode kan een uitspraak worden gedaan over de indeling van de teststof in een van de toxiciteitsklassen die elk worden begrensd door vaste LD50 waarden.

de test kan worden gestaakt,

dezelfde dosis wordt aan nog eens drie dieren toegediend of

de eerstvolgende hogere of lagere dosis wordt aan drie andere dieren toegediend.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE METHODE

1.4.

1.4.1. Keuze van de diersoort Bij voorkeur wordt de rat gebruikt, maar ook andere knaagdiersoorten kunnen worden gebruikt Normaal gesproken worden vrouwtjes gebruikt (9), omdat uit literatuuronderzoek van klassieke LD50-tests blijkt dat er weliswaar meestal weinig verschil in gevoeligheid tussen mannetjes en vrouwtjes is, maar dat vrouwtjes meestal iets gevoeliger zijn wanneer er verschillen worden geconstateerd (11). Als echter uit kennis omtrent de toxicologische of toxicokinetische eigenschappen van qua structuur verwante chemische stoffen blijkt dat mannetjes waarschijnlijk gevoeliger zullen zijn, moeten mannetjes worden gebruikt. Wanneer de test bij mannetjes wordt uitgevoerd, moet hiervoor een afdoende motivering worden gegeven. Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. Elk dier moet bij de eerste toediening 8 tot 12 weken oud zijn en het lichaamsgewicht mag niet meer dan ± 20 % afwijken van het gemiddelde gewicht van dieren waaraan al eerder een dosis is toegediend.

1.4.3. Voorbereiding van de dieren De dieren worden aselect ingedeeld, gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren en voor de toediening gedurende minimaal 5 dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in het laboratorium te laten wennen.

1.4.4. Bereiding van de dosis In het algemeen worden alle doses van de teststof in het hele testbereik in een constant volume toegediend door de concentratie van de toegediende dosis te variëren. Wanneer echter een vloeibaar eindproduct of mengsel wordt getest, kan het voor de latere risicobeoordeling van die stof zinvoller zijn de teststof onverdund, d.w.z. met een constante concentratie, te gebruiken en sommige regelgevende instanties hebben dit verplicht gesteld. Het maximaal toe te dienen volume mag echter in geen geval worden overschreden. Het is afhankelijk van de grootte van het proefdier welk volume vloeistof in één keer kan worden toegediend. Bij knaagdieren mag het volume normaal gesproken niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht. Bij een waterige oplossing kan echter 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden overwogen. Voor de formulering van de dosis wordt waar mogelijk het gebruik van een waterige oplossing/suspensie/emulsie aanbevolen, in volgorde van voorkeur gevolgd door een oplossing/suspensie/emulsie in olie (bijvoorbeeld maïsolie) en eventueel een oplossing in een ander medium. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moeten de toxicologische kenmerken van het medium bekend zijn. De dosis moet kort voor de toediening worden bereid, tenzij de stabiliteit van het preparaat gedurende de gebruiksperiode bekend is en is aangetoond dat deze aanvaardbaar is.

1.5. PROCEDURE

1.5.

1.5.1. Toediening van de dosis De teststof wordt in een dosis toegediend met een maagsonde of een geschikte katheter In het uitzonderlijke geval dat een dosis niet mogelijk is, kan de dosis in kleinere porties worden verdeeld die in de loop van maximaal 24 uur worden toegediend. De dieren moeten voor de toediening vasten (ratten mogen bijvoorbeeld de nacht voor de toediening geen voer maar wel water krijgen en muizen gedurende 3-4 uur). Na de vastpenode worden de dieren gewogen en wordt de teststof toegediend. Na de toediening van de stof kan men ratten nog eens 3-4 uur en muizen nog eens 1-2 uur laten vasten. Wanneer een dosis in de loop van de tijd in porties wordt toegediend, kan het afhankelijk van de lengte van de periode nodig zijn de dieren voer en water te geven.

1.5.2. Aantal dieren en hoogte van de doses Voor elke stap worden er drie dieren gebruikt. Een van de vier vaste doses 5, 50, 300 en 2000 mg/kg lichaamsgewicht wordt als aanvangsdosis gekozen. Als aanvangsdosis wordt de dosis gekozen waarbij naar alle waarschijnlijkheid enkele dieren zullen sterven. In de stroomschema's van bijlage 1 wordt de procedure beschreven die bij elk van de aanvangsdoses moet worden gevolgd. Daarnaast bevat bijlage 4 een leidraad voor de indeling in het EU systeem totdat het nieuwe GHS is ingevoerd. Wanneer de beschikbare informatie erop wijst dat er bij de hoogste aanvangdosis (2000 mg/kg lichaamsgewicht) waarschijnlijk geen dieren zullen sterven, moet er een limiettest worden uitgevoerd. Wanneer er geen informatie over een te testen stof is, wordt met het oog op het welzijn van dieren aanbevolen 300 mg/kg lichaamsgewicht als aanvangsdosis te gebruiken. Het tijdsverloop tussen de toediening aan de verschillende groepen wordt bepaald door de aanvang, de duur en de ernst van de toxiciteitsverschijnselen. Met de toediening van een volgende dosis moet worden gewacht totdat men er zeker van is dat de eerder geteste dieren blijven leven. Bij wijze van uitzondering kan alleen met een motivering op basis van specifieke regelgevingsvereisten daarnaast het gebruik van een hogere vaste dosis van 5000 mg/kg lichaamsgewicht worden overwogen (zie bijlage 2). Met het oog op het welzijn van dieren zijn dierproeven in GHS categorie 5 (2000-5000 mg/kg) niet wenselijk en moeten deze alleen worden overwogen wanneer er een grote kans is dat de resultaten van die test van direct belang zijn voor de bescherming van de gezondheid van mens of dier of het milieu.

1.5.3. Limiettest De limiettest wordt voornamelijk uitgevoerd wanneer er informatie is die erop wijst dat het testmateriaal waarschijnlijk niet toxisch is c.q. alleen toxisch is in hogere doses dan de limieten in de regelgeving. Informatie over de toxiciteit van het testmateriaal kan afkomstig zijn van kennis omtrent vergelijkbare geteste verbindingen of vergelijkbare geteste mengsels of producten, waarbij rekening wordt gehouden met de identiteit en het percentage van de bestanddelen waarvan bekend is dat ze in toxicologisch opzicht relevant zijn. Wanneer er weinig of geen informatie over de toxiciteit van het testmateriaal is of wordt verwacht dat het toxisch is, moet het hoofdonderzoek worden uitgevoerd. Er kan een limiettest met een dosisniveau van 2000 mg/kg worden uitgevoerd met zes dieren (drie dieren per stap). Bij wijze van uitzondering kan er een limiettest met een dosisniveau van 5000 mg/kg worden uitgevoerd met drie dieren (zie bijlage 2). Als er dieren vanwege de toediening van de stof sterven, kan het nodig zijn de test bij de eerstvolgende lagere dosis voort te zetten.

1.6. OBSERVATIE De dieren worden gedurende de eerste 30 minuten na de toediening ten minste eenmaal elk afzonderlijk geobserveerd, gedurende de eerste 24 uur periodiek met bijzondere aandacht voor de eerste vier uur en vervolgens dagelijks gedurende in totaal 14 dagen, behalve wanneer ze met het oog op het welzijn van dieren uit het onderzoek moeten worden genomen en op humane wijze moeten worden gedood of dood aangetroffen worden. De observatieduur is echter geen regel waarvan niet kan worden afgeweken. Deze moet worden bepaald aan de hand van de toxische reacties, het tijdstip waarop ze beginnen en de duur van de herstelperiode en kan dus worden verlengd indien dit nodig wordt geacht. Het is belangrijk op welk tijdstip de toxiciteitsverschijnselen verschijnen en verdwijnen, vooral als er een neiging is tot vertraagde toxiciteitsverschijnselen (12). Alle observaties worden systematisch geregistreerd en voor elk dier wordt een apart verslag bijgehouden. Als de dieren toxiciteitsverschijnselen blijven vertonen, is aanvullende observatie nodig. Bij de observatie wordt gekeken naar veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en centrale zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en het gedragspatroon. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Er moet rekening worden gehouden met de beginselen en criteria in de leidraad voor humane eindpunten (9). Dieren die stervend worden aangetroffen en dieren die hevige pijn hebben of blijvende tekenen van ernstig leed vertonen, worden op humane wijze gedood. Wanneer dieren op humane wijze worden gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.

1.6.

1.6.2. Pathologie Op alle proefdieren (ook degene die tijdens de test sterven of met het oog op het welzijn van dieren uit het onderzoek worden genomen) wordt macroscopische obductie uitgevoerd. Alle macroscopische pathologische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd. Microscopisch onderzoek van organen die tekenen van macroscopische pathologische veranderingen vertonen bij dieren die na 24 uur of langer nog leven, kan ook worden overwogen aangezien dit nuttige informatie kan opleveren.

3. RAPPORTACE

3.

3.1. TESTVERSLAG In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opgenomen:

Teststof

de fysische aard, de zuiverheid en indien relevant de fysisch chemische eigenschappen (bv. de isomeersamenstelling);

identificatiegegevens, zoals het CAS-nr.

Medium (indien van toepassing):

een motivering voor de keuze van het medium als een ander medium dan water wordt gebruikt.

Proefdieren:

de gebruikte soort/stam;

de microbiologische status van de dieren, indien deze bekend is;

het aantal dieren, hun leeftijd en hun geslacht (indien van toepassing een motivering voor het gebruik van mannetjes in plaats van vrouwtjes);

de herkomst, de huisvesting, de voeding enz.

Testomstandigheden:

gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof met bijzonderheden over de fysische vorm van het toegediende materiaal;

gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof met vermelding van het toegediende volume en het toedieningstijdstip;

gedetailleerde gegevens over het voer en het water (met vermelding van de aard/herkomst van het voer en de herkomst van het water);

de motivering voor de keuze van de aanvangsdosis.

Resultaten:

een tabel met gegevens over de respons en de dosis voor elk dier (bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen of sterfte en de aard, de hevigheid en de duur van de effecten);

een tabel met het lichaamsgewicht en de veranderingen in het lichaamsgewicht;

het gewicht van de dieren op de toedieningsdag, daarna een keer per week en tenslotte wanneer ze sterven of gedood worden;

de datum en het tijdstip waarop de dieren sterven, als dit eerder gebeurt dan gepland;

voor elk dier de aanvang en het verloop van de toxiciteitsverschijnselen en of ze reversibel waren;

voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische bevindingen, indien beschikbaar.

Bespreking en interpretatie van de resultaten.

Conclusies.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)

REFERENTIES Roll R., Hofer-Bosse Th. and Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86. Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute Toxic Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute Toxic Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734. Diener W., and Schlede E. (1999). Acute Toxicity Class Methods- Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute Toxic Class Method — An Alternative to the LD50, Test. Arch Toxicol 66, 455-470. Schlede E, Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute Toxic Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Chemical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11. [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R.L., Cotruvo, J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel K.A., Walker A.P., Chu I., Goddard M., Segal L., Springer, J.A. and Myers R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

B.2. ACUTE INHALATIETOXICITEIT

B.2.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Het is nuttig om over oriënterende informatie te beschikken ten aanzien van de deeltjesgrootte, de dampspanning, het smeltpunt, het kookpunt, het vlampunt en het ontploffingsgevaar (indien van toepassing) van de te onderzoeken stof. Zie ook algemene inleiding deel B (punt A).

1.2. DEFINITIES Zie algemene inleiding deel B (punt B).

1.3. REFERENTIESTOFFEN Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Verscheidene groepen proefdieren worden gedurende een vastgestelde periode aan geleidelijk stijgende concentraties van de teststof blootgesteld. Er wordt één concentratie per groep gebruikt. Vervolgens worden de symptomen en sterfte waargenomen. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het einde van de studie leven, wordt necropsie verricht. Dieren die hevige en aanhoudende tekenen van angst en pijn vertonen, zouden op humane wijze moeten worden gedood. Het doseren van teststoffen op een manier waarvan bekend is dat deze als gevolg van corrosieve of ernstig irriterende eigenschappen pijn en ongemak veroorzaakt, behoeft niet te worden uitgevoerd.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.1. Voorbereidingen Vóór het onderzoek worden de dieren ten minste 5 dagen onder dezelfde huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tijdens de proef. Gezonde jonge dieren worden op een willekeurige manier vóór de behandeling in het vereiste aantal groepen ingedeeld. Het is niet nodig de dieren aan een gesimuleerde blootstelling te onderwerpen, tenzij dit wenselijk is bij het type expositieapparatuur dat wordt gebruikt. Vaste teststoffen moeten eventueel worden gemicroniseerd om deeltjes van geschikte grootte te verkrijgen. Waar nodig wordt een passend medium aan de teststof toegevoegd, teneinde de juiste concentratie van de proefstof in de atmosfeer te bereiken, in dat geval moet ook een mediumcontrolegroep worden toegevoegd. Indien een medium of andere additieven worden gebruikt om de dosering te vergemakkelijken, moet bekend zijn dat deze geen toxische effecten veroorzaken. In voorkomend geval kunnen bestaande gegevens worden gebruikt.

1.6.2. Proefomstandigheden

1.6.2.

1.6.2.1. Proefdieren Tenzij er contra-indicaties bestaan, wordt de voorkeur gegeven aan ratten. De proef dient te worden uitgevoerd met een rattenstam die gewoonlijk in laboratoria wordt gebruikt. Per geslacht mag bij het begin van de studie het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.

1.6.2.2. Aantal en geslacht Voor ieder concentratieniveau moeten ten minste tien knaagdieren (vijf wijfjes en vijf mannetjes) worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn. Opmerking: In acute-toxiciteittesten met dieren van een hogere orde dan knaagdieren, dienen kleinere aantallen in overweging te worden genomen. De doses dienen zorgvuldig te worden gekozen, en alle moeite dient worden gedaan om matig toxische doses niet te boven te gaan. In dergelijke testen dient toediening van letale doses van de teststof te worden vermeden.

1.6.2.3. Blootstellingsconcentraties Bij de proeven moeten voldoende (ten minste drie) expositieconcentraties worden gebruikt die zodanig onderling verschillen dat proefgroepen worden verkregen met duidelijke verschillen in toxische effecten en sterftecijfers. De gegevens moeten voldoende zijn om een concentratie/respons-curve te verkrijgen en om indien mogelijk, op aanvaardbare wijze een LC50 te bepalen

1.6.2.4. Limiettest Als binnen een periode van 14 dagen geen sterfte wordt veroorzaakt door de expositie gedurende 4 uur van vijf mannelijke en vijf vrouwelijke proefdieren aan 20 mg/l in de vorm van een gas en aan 5 mg/l in de vorm van een vloeistofaerosol of van een stofaerosol, is het wellicht niet noodzakelijk verdere proeven te nemen.

1.6.2.5. Blootstellingstijd De blootstellingstijd bedraagt 4 uur.

1.6.2.6. Apparatuur De dieren worden aan de teststoffen blootgesteld met behulp van inhalatieapparatuur die zodanig gebouwd is dat kan worden gezorgd voor een dynamische luchtdoorstroming van ten minste 12 luchtverversingen per uur, een toereikend zuurstofgehalte en een gelijkmatige verdeling van de teststoffen in de atmosfeer. Als van een expositiekamer gebruik wordt gemaakt, moet deze op een zodanige wijze zijn ontworpen dat de dieren zo min mogelijk bij elkaar kunnen kruipen en zoveel mogelijk door inhalatie aan de teststof worden blootgesteld. Als algemene regel voor het verzekeren van een stabiele atmosfeer in de expositiekamer geldt, dat het totale volume van de proefdieren niet méér mag bedragen dan 5 % van het volume van de blootstellingskamer. Naar keuze kunnen de dieren oronasaal, alleen met hun kop of individueel met hun hele lijf aan de testlucht worden blootgesteld; de eerste twee methoden zullen ertoe bijdragen dat zo min mogelijk teststof via ander wegen in het lichaam wordt opgenomen.

1.6.2.7. Observatieperiode De observatieperiode moet ten minste 14 dagen bedragen. Deze duur van de observatie moet echter niet als een streng vastgelegde periode worden beschouwd, maar moet door de toxische reacties, het tijdstip waarop deze voor het eerst worden waargenomen en de duur van het herstel worden bepaald; de observatieperiode kan dus indien noodzakelijk, worden verlengd. Van belang zijn het tijdstip waarop toxische verschijnselen voor het eerst zijn waargenomen, het tijdstip waarop zij weer verdwijnen en het tijdstip waarop de dood intreedt, in het bijzonder wanneer de kans bestaat op een uitgestelde dood.

1.6.3. Uitvoering Kort vóór de blootstelling worden de dieren gewogen en vervolgens 4 uur lang aan de testconcentratie blootgesteld in het daarvoor bestemde apparaat; na evenwichtsinstelling van de concentratie in de blootstellingskamer. De evenwichtsinstelling mag niet veel tijd in beslag nemen. Tijdens de proef dient de temperatuur op 22 oC ± 3 oC te worden gehouden. In het ideale geval moet de relatieve vochtigheid tussen 30 % en 70 % worden gehouden, behalve waar dit niet goed uitvoerbaar is (bijvoorbeeld bij het testen van sommige aerosolen). Het onderhouden van een lichte onderdruk (≤ 5 mm water) voorkomt het weglekken van de teststof naar de omgeving. Gedurende de blootstelling worden de dieren voedsel en water onthouden. Om de testatmosfeer te genereren en concentratiemetingen uit te voeren dienen geschikte systemen gebruikt te worden. Het systeem moet de waarborg bieden dat de expositieomstandigheden bij de proef zo spoedig mogelijk stabiel zijn. De kamer moet zo ontworpen en bediend kunnen worden dat een homogene verdeling van de testatmosfeer binnen de kamer wordt gehandhaafd. De volgende parameters moeten worden gemeten of gemonitord: Tijdens en na de blootstelling worden waarnemingen gedaan die voor ieder individueel dier worden geregistreerd. Tijdens de eerste dag moeten frequent waarnemingen worden verricht. Ten minste één keer per werkdag moet een zorgvuldig klinisch onderzoek worden verricht, overige waarnemingen moeten iedere dag worden gedaan waarbij erop moet worden toegezien dat er zo weinig mogelijk dieren voor het onderzoek verloren gaan, bijvoorbeeld door necropsie of koeling van dood aangetroffen dieren en afzondering of opoffering van zwakke of stervende dieren. Bij het observeren moet in ieder geval aandacht worden besteed aan veranderingen van huid, vacht, ogen, slijmvliezen, ademhalingsorganen, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit en gedrag. Er moet bijzondere aandacht worden besteed aan de waarneming van het ademhalingsgedrag, tremoren, convulsies, speekselvloed, diarree, lethargie, slaap en coma. Het tijdstip waarop de dood intreedt, moet zo nauwkeurig mogelijk worden geregistreerd. Het gewicht van ieder dier wordt na de expositie éénmaal per week en bij de dood van de dieren bepaald. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht, waarbij vooral aandacht wordt besteed aan veranderingen in het bovenste en onderste gedeelte van de ademhalingswegen. Alle macroscopisch waarneembare pathologische veranderingen worden geregistreerd. Als hiertoe aanleiding bestaat, worden weefselmonsters genomen voor histopathologisch onderzoek.

1.6.3. a)

de luchtdoorstromingssnelheid (continu) (luchtdebiet);

de feitelijke concentratie van de teststof in het ademhalingsgebied van de dieren, ten minste driemaal gemeten tijdens de blootstelling (sommige atmosferen, bijvoorbeeld aerosolen met hoge concentratie moeten eventueel vaker worden gecontroleerd). Tijdens de blootstelling mag de concentratie niet meer dan ± 15 % van het gemiddelde afwijken. Bij sommige aerosolen is het mogelijk dat de concentratie niet binnen deze grenzen gehouden kan worden; in dat geval kan een grotere afwijking worden aanvaard. Voor aerosolen moet zo dikwijls als noodzakelijk is (ten minste éénmaal per testgroep) een analyse worden uitgevoerd om de verdeling van de deeltjesgrootte te bepalen;

de temperatuur en de vochtigheid, indien mogelijk continu.

2. GEGEVENS De volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen worden samengevat: aantal dieren bij het begin van het onderzoek, tijdstip waarop de dood intreedt bij de individuele dieren, het aantal dieren dat andere toxiciteitsverschijnselen vertoont, een beschrijving van de toxische effecten en de bevindingen bij de necropsie. Veranderingen in het gewicht moeten worden berekend en geregistreerd indien de dieren langer dan een dag in leven blijven. Dieren die op humane wijze gedood worden omwille van angst en pijn in verband met de stofblootstelling worden geregistreerd als gestorven in verband met de stofblootstelling. Met behulp van een erkende methode wordt de LC50 bepaald. Bij de evaluatie van de gegevens moet ook aandacht worden besteed aan het eventuele verband dat bestaat tussen de blootstelling van de dieren aan de teststof en het aantal en de ernst van alle voorkomende afwijkingen, waaronder gedrags- en klinische afwijkingen, macroscopisch waarneembare beschadigingen, veranderingen in het lichaamsgewicht, sterfte en eventuele andere toxische effecten.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen Gegevens betreffende de expositie: Deze moeten tabellarisch worden gerangschikt en worden voorzien van gemiddelde waarden en een maat voor de variabiliteit (bijvoorbeeld standaardafwijking). Zij dienen, indien mogelijk, te omvatten:

diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzovoort,

proefomstandigheden: beschrijving van de expositieapparatuur met inbegrip van ontwerp, type, afmetingen, luchtbron, systeem voor het genereren van aerosolen, methode van luchtconditionering en de wijze waarop de dieren tijdens de proeven in een blootstellingskamer zijn ondergebracht (als deze gebruikt is). Er moet een beschrijving worden gegeven van de apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid, de concentraties en de verdeling van de deeltjesgrootte van het aerosol.

3.1. a)

de luchtdoorstromingssnelheid (luchtdebiet) door de inhalatieapparatuur;

temperatuur en vochtigheid van de lucht;

nominale concentraties (de totale hoeveelheid teststof die de inhalatieapparatuur wordt binnengeleid gedeeld door het luchtvolume);

aard van het eventuele medium;

feitelijke concentraties van de teststof in het ademhalingsgebied van de dieren;

massa-mediaan van de aerodynamische diameter (Mmad) en de geometrische standaardafwijking (GSD);

duur van de evenwichtsinstelling;

duur van de expositie;

tabellarische gegevens betreffende de effecten per geslacht en concentratieniveau (dat wil zeggen het aantal dieren dat tijdens de proef stierf of gedood werd, het aantal dieren dat toxische verschijnselen vertoonde, het aantal blootgestelde dieren);

het tijdstip gedurende of na de blootstelling waarop de dood intreedt, redenen en criteria voor het op humane wijze doden van dieren;

alle waarnemingen;

de LC50 voor beide geslachten bepaald aan het eind van de observatieperiode (waarbij de berekeningsmethode dient te worden omschreven);

95 %-betrouwbaarheidsinterval voor de LC50 (waar dit gegeven kan worden);

dosis/sterfte-curve met helling (indien dit bij de gebruikte bepalingsmethode mogelijk is);

bevindingen bij de necropsie;

eventuele histopathologische bevindingen;

bespreking van de resultaten (speciale aandacht dient te worden besteed aan het effect van het op humane wijze doden van dieren tijdens de proeven op de berekende LC50);

interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE Zie algemene inleiding deel B (punt D).

4. LITERATUUR Zie algemene inleiding deel B (punt E).

B.3. ACUTE DERMALE TOXICITEIT

B.3.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Zie algemene inleiding deel B (punt A).

1.2. DEFINITIES Zie algemene inleiding deel B (punt B).

1.3. REFERENTIESTOFFEN Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De teststof wordt in geleidelijk stijgende doseringen op de huid van verscheidene groepen proefdieren aangebracht. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Vervolgens worden de symptomen en sterfte waargenomen. Bij dieren die tijdens het onderzoek stenen en bij dieren die aan het eind van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht. Dieren die hevige en aanhoudende tekenen van nood en pijn vertonen, moeten eventueel op humane wijze worden gedood. Het doseren van teststoffen op een manier waarvan bekend is dat deze als gevolg van bijtende of irriterende eigenschappen pijn en nood veroorzaakt, behoeft niet te worden uitgevoerd.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.1. Voorbereidingen Vóór het onderzoek worden de dieren in hun proefkooien ten minste 5 dagen onder dezelfde huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tijdens de proef. Gezonde, jong volwassen dieren worden op een willekeurige manier vóór de behandeling in groepen ingedeeld. Ongeveer 24 uur vóór de proef wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de proefdieren door knippen of scheren verwijderd, bij het knippen of scheren moet erop worden gelet dat de huid niet wordt bekrast, omdat daardoor de doorlaatbaarheid van de huid zou kunnen veranderen. Ten minste 10 % van de lichaamsoppervlakte moet voor het aanbrengen van de teststof worden onthaard. Bij een proef met vaste stoffen, die eventueel tot een poeder kunnen worden fijngemaakt, moet de teststof voldoende met water of, zo nodig, met een passend medium worden bevochtigd, zodat de stof goed in contact met de huid komt. Als van een medium gebruik wordt gemaakt, moet rekening worden gehouden met de invloed hiervan op de mate waarin de huid de teststof doorlaat. Vloeibare teststoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt.

1.6.2. Proefomstandigheden

1.6.2.

1.6.2.1. Proefdieren Er kan gebruik worden gemaakt van volwassen ratten of konijnen. Ook andere diersoorten kunnen worden gebruikt, maar de noodzakelijkheid hiervan moet worden gerechtvaardigd. De proef dient te worden uitgevoerd met een stam die gewoonlijk in laboratoria wordt gebruikt. Per geslacht mag bij het begin van de studie het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.

1.6.2.2. Aantal en geslacht Voor ieder dosisniveau moeten ten minste 5 knaagdieren worden gebruikt. Zij dienen van hetzelfde geslacht te zijn. Indien wijfjes worden gebruikt, moeten deze nullipaar zijn en niet zwanger. Indien informatie beschikbaar is die aantoont dat eén van beide geslachten duidelijk gevoeliger is, dienen dieren van dit geslacht gebruikt te worden. Opmerking: In onderzoeken naar acute toxiciteit met dieren van een hogere orde dan knaagdieren, dienen kleinere aantallen in overweging te worden genomen. De doses dienen zorgvuldig te worden uitgekozen, en alle moeite dient te worden gedaan om matig toxische doses niet te boven te gaan. In dergelijke testen dient toediening van letale doses van de teststof te worden vermeden.

1.6.2.3. Dosisniveaus Bij de proeven moeten voldoende (ten minste drie) dosisniveaus worden toegepast die zodanig onderling verschillen dat proefgroepen worden verkregen met duidelijke verschillen in toxische effecten en sterftecijfers. Bij de vaststelling van de dosisniveaus moet rekening worden gehouden met alle mogelijke irriterende of corrosieve effecten. De gegevens moeten voldoende zijn om een dosis/respons-curve te maken en om, indien mogelijk, op aanvaardbare wijze een LD50 te bepalen.

1.6.2.4. Limiettest Een limiettest met een dosis van ten minste 2000 mg/kg lichaamsgewicht wordt uitgevoerd op een groep van 5 mannetjes en 5 wijfjes, met behulp van de hierboven beschreven testmethode. Indien sterfte wordt vastgesteld die met de teststof verband houdt, moet het uitvoeren van een volledig testprogramma overwogen worden.

1.6.2.5. Observatieperiode De observatieperiode moet ten minste 14 dagen bedragen. Deze duur van de observatie moet echter niet als een streng vastgelegde periode beschouwd worden, maar moet door de toxische reacties, het tijdstip waarop deze voor het eerst worden waargenomen en de duur van het herstel worden bepaald, de observatieperiode kan dus, indien noodzakelijk, worden verlengd. Van belang zijn het tijdstip waarop intoxicatieverschijnselen voor het eerst zijn waargenomen en het tijdstip waarop zij weer verdwijnen, hun duur en het tijdstip waarop de dood intreedt, in het bijzonder wanneer de kans bestaat voor een vertraagde sterfte.

1.6.3. Uitvoering Ieder dier moet individueel in een kooi worden gehuisvest. De teststof wordt gelijkmatig verdeeld over een oppervlak van ongeveer 10 % van de totale lichaamsoppervlakte. Bij zeer toxische stoffen mag het te behandelen oppervlak kleiner zijn, maar een zo groot mogelijke oppervlakte moet worden bedekt met een zo dun en zo gelijkmatig mogelijk aangebrachte laag. De teststof moet gedurende de expositietijd van 24 uur door middel van poreus verbandgaas en niet-irriterend plakband in contact met de huid blijven. Het behandelde gedeelte van de huid moet op een geschikte wijze verder worden bedekt om het verbandgaas en de teststof op hun plaats te houden en om te verhinderen dat de dieren de teststof langs orale weg opnemen. Hulpmiddelen om de dieren te fixeren, kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat de dieren de teststof via de mond opnemen, maar het wordt niet aangeraden de dieren volledig te immobiliseren. Aan het eind van de expositieperiode wordt de resterende teststof — zo mogelijk met water — van de huid verwijderd of anders door middel van een andere geschikte reinigingstechniek. De gedane waarnemingen moeten systematisch worden geregistreerd voor ieder individueel dier. Tijdens de eerste dag worden de dieren regelmatig geobserveerd. Ten minste één keer per werkdag moet een zorgvuldig klinisch onderzoek worden verricht. De andere waarnemingen moeten iedere dag worden verricht, waarbij erop moet worden toegezien dat er zo weinig mogelijk dieren voor het onderzoek verloren gaan, bijvoorbeeld door necropsie of koeling van dood aangetroffen dieren en door afzondering of opoffering van zwakke of stervende dieren. Bij het observeren wordt aandacht besteed aan veranderingen van vacht, behandelde huid, ogen, slijmvliezen, ademhaling, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit en gedrag. Er moet bijzondere aandacht worden besteed aan de waarneming van tremoren, speekselvloed, diarree, lethargie, slaap en coma. Het tijdstip waarop de dood intreedt moet zo nauwkeurig mogelijk worden geregistreerd. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het einde van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht. Alle macroscopisch waarneembare pathologische veranderingen worden geregistreerd. Als hiertoe aanleiding bestaat, worden weefselmonsters genomen voor histopathologisch onderzoek.

1.6.3. Bepaling van de toxiciteit bij het andere geslacht

Na het voltooien van de studie voor het ene geslacht, moet ten minste een groep van 5 dieren van het andere geslacht worden blootgesteld aan de stof om te verzekeren dat dit geslacht niet duidelijk gevoeliger is voor de teststof. In bepaalde gevallen kunnen redenen bestaan voor het gebruik van minder dieren. Indien voldoende informatie beschikbaar is om aan te tonen dat dieren van het geteste geslacht duidelijk gevoeliger zijn, mag het testen van het andere geslacht achterwege worden gelaten.

2. GEGEVENS De volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen worden samengevat: het aantal dieren bij het begin van het onderzoek, het tijdstip waarop de dood intreedt bij de individuele dieren, het aantal dieren dat andere intoxicatieverschijnselen vertoont, een beschrijving van de toxische effecten en de bevindingen bij de necropsie. Het gewicht van ieder individueel dier wordt bepaald kort voordat de teststof wordt aangebracht, en vervolgens één keer iedere week en ten slotte bij zijn dood; veranderingen in het gewicht worden berekend en geregistreerd, indien de dieren langer dan één dag in leven blijven. Dieren die op humane wijze gedood worden omwille van nood of ongemak en pijn in verband met de stof, worden geregistreerd als gestorven in verband met de stof. De LD50 moet door middel van een erkende methode worden bepaald. Bij de evaluatie van de gegevens moet ook aandacht worden besteed aan het eventuele verband dat bestaat tussen de blootstelling van de dieren aan de teststof en het aantal en de ernst van alle voorkomende afwijkingen, waaronder gedrags- en klinische afwijkingen, macroscopisch waarneembare beschadigingen, veranderingen in het lichaamsgewicht, sterfte en eventuele andere toxicologische effecten.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzovoort;

proefomstandigheden (met vermelding van de wijze waarop de huid is schoongemaakt en het soort verband: occlusief of niet occlusief);

dosisniveaus (met het eventuele medium en de concentraties);

het geslacht van de blootgestelde dieren;

tabellarische gegevens betreffende de effecten per geslacht en dosisniveau (dat wil zeggen het aantal dieren dat tijdens de proef stierf of gedood werd, het aantal dieren dat intoxicatieverschijnselen vertoont, het aantal blootgestelde dieren);

het tijdstip na de blootstelling waarop de dood intreedt, redenen en criteria voor het op humane wijze doden van dieren;

alle waarnemingen;

de LD50 van het geslacht dat het volledige onderzoek onderging, bepaald na 14 dagen (waarbij de berekeningsmethode dient te worden omschreven);

95 %-betrouwbaarheidsinterval voor de LD50 (waar dit gegeven kan worden);

dosis/sterfte-curve met helling (indien dit bij de gebruikte bepalingsmethode mogelijk is);

bevindingen bij de necropsie;

eventuele histopathologische bevindingen;

resultaten van de test die eventueel op het andere geslacht werd uitgevoerd;

bespreking van de resultaten (speciale aandacht dient besteed te worden aan het effect dat het op humane wijze doden van dieren tijdens de proeven zou kunnen hebben op de berekende LD50);

interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE Zie algemene inleiding deel B (punt D).

4. LITERATUUR Zie algemene inleiding deel B (punt E).

B.4. ACUTE TOXICITEIT: HUIDIRRITTATIE/CORROSIE

B.4.

1. METHODE Deze methode is gelijkwaardig aan TG 404 (2002) van de OESO.

1.

1.1. INLEIDING Bij de samenstelling van deze bijgewerkte methode is bijzondere aandacht besteed aan mogelijke verbeteringen met het oog op het welzijn van de dieren en aan de evaluatie van alle bestaande informatie over de teststof om onnodige tests bij proefdieren te vermijden. In deze methode wordt de aanbeveling opgenomen de bestaande relevante gegevens op bewijskracht te analyseren, alvorens de beschreven in-vivo test op corrosie/irritatie van de stof wordt uitgevoerd. Wanneer er onvoldoende gegevens beschikbaar zijn, kunnen ze worden aangevuld door een sequentiële teststrategie te volgen (1). De aanbevolen teststrategie omvat de uitvoering van gevalideerde en erkende in-vitro tests en is als bijlage bij deze methode opgenomen. Bovendien wordt aanbevolen bij de voorlopige in-vivo test de drie testgaasjes waar mogelijk niet tegelijkertijd maar achtereenvolgens aan te brengen. In het belang van zowel wetenschappelijke kwaliteit als het dierenwelzijn moeten er geen in-vivo tests worden uitgevoerd voordat alle beschikbare gegevens over de mogelijke huidcorrosie/irritatie door de stof zijn geëvalueerd op bewijskracht. Hierbij gaat het bijvoorbeeld om de resultaten van eerdere studies bij mensen en/of proefdieren, gegevens over corrosie/irritatie door een of meer qua structuur verwante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen, gegevens waaruit blijkt dat de stof sterk zuur of sterk alkalisch is (2)(3), en resultaten van gevalideerde en erkende in-vitro- of ex-vivo tests (4)(5)(5a). Door een dergelijke analyse zijn er minder in-vivo tests nodig op huidcorrosie/irritatie door stoffen waarvoor al voldoende bewijsmateriaal bestaat uit andere onderzoeken met deze twee eindpunten. Een aanbevolen sequentiële teststrategie, waarin de uitvoering van gevalideerde en erkende in-vitro- of ex-vivo tests op corrosie/irritatie is opgenomen, is als bijlage bij deze methode opgenomen. De strategie is ontwikkeld tijdens een OESO-workshop (6), met algemene stemmen door de deelnemers aanbevolen en als aanbevolen teststrategie opgenomen in het Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Substances (GHS) (7). Hoewel deze sequentiële teststrategie geen integrerend onderdeel van testmethode B 4 is, wordt aanbevolen deze teststrategie te volgen alvorens in-vivo tests uit te voeren. Voor nieuwe stoffen is het de aanbevolen stapsgewijze testbenadering om wetenschappelijk verantwoorde gegevens over corrosie/irritatie door de stof te verkrijgen. Wanneer er voor bestaande stoften onvoldoende gegevens over de huidcorrosie/irritatie beschikbaar zijn, moet de strategie worden gebruikt om ontbrekende gegevens aan te vullen. Voor het gebruik van een andere teststrategie of -procedure of de beslissing om geen stapsgewijze testbenadering te volgen moet een motivering worden gegeven. Als bij een bewijskrachtanalyse niet kan worden geconcludeerd of er sprake is van corrosie of irritatie, moet overeenkomstig de sequentiële teststrategie een in-vivo test worden overwogen (zie de bijlage).

1.2. DEFINITIES Huidirritatie: het ontstaan van een omkeerbare beschadiging van de huid na het aanbrengen van een teststof gedurende maximaal 4 uur. Huidcorrosie: het ontstaan van een onomkeerbare beschadiging van de huid, namelijk zichtbare necrose door de epidermis heen in de dermis, na het aanbrengen van een teststof gedurende maximaal 4 uur. Corrosie-reacties worden gekenmerkt door zweren, bloedingen, bloedkorsten en, tegen het eind van de observatieperiode van 14 dagen, ontkleuring door bleking van de huid, gebieden met volledige haaruitval en littekens. Voor de beoordeling van twijfelachtige letsels moet histopathologie worden overwogen.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De teststof wordt in een dosis op de huid van een proefdier aangebracht; de onbehandelde huid van het proefdier wordt als controle gebruikt. De mate van irritatie/corrosie wordt op bepaalde tijdstippen afgelezen en ingeschaald en wordt nader beschreven om een volledige evaluatie van de effecten mogelijk te maken. De duur van de studie moet voldoende zijn om te kunnen beoordelen of de waargenomen effecten reversibel of irreversibel van aard zijn. Dieren die gedurende een fase van de test voortdurend tekenen van ernstig ongerief en/of hevige pijn vertonen, moeten op humane wijze worden gedood en de stof dient dienovereenkomstig te worden beoordeeld. Voor criteria voor de beslissing om stervende en hevig lijdende dieren op humane wijze te doden wordt verwezen naar referentie (8).

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.

1.4.1. Voorbereiding van de in-vivo test

1.4.1.

1.4.1.1. Keuze van de diersoort Als proefdier wordt de voorkeur gegeven aan het albinokonijn en er worden gezonde jonge volwassen konijnen gebruikt. Wanneer er een andere soort wordt gebruikt, moet hiervoor een motivering worden gegeven.

1.4.1.2. Voorbereiding van de dieren Ongeveer 24 uur voor de test wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de dieren door kort afknippen verwijderd. Er moet op worden gelet dat de huid niet wordt geschaafd. Alleen dieren met een gezonde en gave huid mogen worden gebruikt. Sommige konijnenstammen hebben plekken met dichte haargroei, die in bepaalde perioden van het jaar meer op de voorgrond treden. De test mag niet op deze plekken met dichte haargroei worden uitgevoerd.

1.4.1.3. Huisvesting en voeding De dieren worden in aparte kooien gehuisvest. De temperatuur in de proefdierruimte dient 20 oC (± 3 oC) te zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater.

1.4.2. Testprocedure

1.4.2.

1.4.2.1. Het aanbrengen van de teststof De teststof wordt aangebracht op een klein huidoppervlak (ongeveer 6 cm2) en de plek wordt bedekt met een gaasje dat met behulp van niet-irriterend plakband op zijn plaats wordt gehouden. Wanneer de stof niet direct kan worden aangebracht (bijvoorbeeld bij vloeistoffen of bepaalde pasta's), wordt de teststof eerst op het gaasje aangebracht en wordt dit daarna op de huid bevestigd. Het gaasje moet gedurende de blootstellingsperiode door middel van een geschikt semi-occlusief verband in licht contact met de huid blijven. Als de teststof op het gaasje wordt aangebracht, moet dit zodanig op de huid worden bevestigd dat er een goed contact en een uniforme verdeling van de stof op de huid is. Er moet tevens voor worden gezorgd dat het gaasje voor het dier onbereikbaar is en dat inslikken of inademen van de teststof onmogelijk is. Vloeibare stoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt. Bij een proef met vaste stoffen (die indien nodig eventueel kunnen worden verpoederd) moet de teststof met een zo klein mogelijke hoeveelheid water (of indien nodig een ander geschikt medium) worden bevochtigd om voor een goed contact met de huid te zorgen. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moet een eventuele invloed van het medium op de irritatie van de huid door de teststof minimaal zijn. Aan het einde van de blootstellingsperiode, die normaal gesproken 4 uur bedraagt, moeten de resten van de teststof zo mogelijk met water of met een geschikt oplosmiddel worden verwijderd zonder de bestaande respons of de intacte epidermis te wijzigen.

1.4.2.2. Dosisniveau Een dosis van 0,5 ml vloeistof of 0,5 g vaste stof of pasta wordt op het testgedeelte van de huid aangebracht.

1.4.2.3. Voorlopige test (in-vivo test op huidirritatie/corrosie met één dier) Het is zeer wenselijk dat de in-vivo test in eerste instantie met één dier wordt uitgevoerd, vooral wanneer wordt vermoed dat de stof corrosie kan veroorzaken. Dit is in overeenstemming met de sequentiële teststrategie (zie bijlage 1). Wanneer een stof op basis van een bewijskrachtanalyse als corrosief wordt beschouwd, zijn er geen verdere dierproeven nodig. Bij de meeste stoffen waarvan wordt vermoed dat ze corrosief zijn, zijn verdere in-vivo tests normaal gesproken niet nodig. Wanneer aanvullende gegevens nodig worden geacht omdat het bewijsmateriaal onvoldoende is, kunnen echter met de volgende aanpak beperkte dierproeven worden uitgevoerd. Bij het dier worden achtereenvolgens maximaal drie testgaasjes aangebracht. Het eerste gaasje wordt na drie minuten verwijderd. Als er geen ernstige huidreactie wordt waargenomen, wordt een tweede gaasje aangebracht dat na een uur wordt verwijderd. Als de waarnemingen in deze fase erop wijzen dat het niet onmenselijk is de blootstelling tot vier uur te verlengen, wordt een derde gaasje aangebracht, dat na vier uur wordt verwijderd, en wordt de reactie ingeschaald. Als er na een van de drie achtereenvolgende blootstellingen een corrosiereactie wordt waargenomen, wordt de test onmiddellijk gestaakt. Als er na de verwijdering van het laatste gaasje geen corrosiereactie wordt waargenomen, wordt het dier gedurende 14 dagen geobserveerd tenzij er vóór die tijd al corrosie ontstaat. Wanneer er niet wordt verwacht dat de teststof corrosie veroorzaakt maar deze wel irriterend kan zijn, wordt er één gaasje gedurende vier uur op één dier aangebracht.

1.4.2.4. Bevestigende test (in-vivo test op huidirritatie/corrosie met meer dieren) Als er bij de voorlopige test geen corrosiereactie wordt waargenomen, moet de irritatie of negatieve reactie worden bevestigd met nog eens twee dieren die elk gedurende vier uur aan één gaasje worden blootgesteld. Als er bij de voorlopige test irritatie wordt waargenomen, kan de bevestigende test op sequentiële wijze worden uitgevoerd of door nog eens twee dieren tegelijkertijd bloot te stellen. Wanneer in een uitzonderlijk geval de voorlopige test niet wordt uitgevoerd, kunnen twee of drie dieren met één gaasje worden behandeld dat na vier uur wordt verwijderd. Wanneer er twee dieren worden gebruikt die beide dezelfde reactie vertonen, is verder testen niet nodig. Als de reactie verschilt, wordt ook het derde dier getest. Er kunnen extra dieren nodig zijn om duidelijkheid te krijgen omtrent moeilijk te interpreteren reacties.

1.4.2.5. Observatieperiode De duur van de observatieperiode moet voldoende zijn om volledig te kunnen beoordelen of de waargenomen effecten reversibel zijn. Het experiment moet echter worden beëindigd zodra het dier voortdurend tekenen van hevige pijn of ernstig ongerief vertoont. Om te bepalen of de effecten reversibel zijn, moeten de dieren maximaal 14 dagen na de verwijdering van de gaasjes worden geobserveerd. Als al vóór het verstrijken van de 14 dagen wordt geconstateerd dat de effecten reversibel zijn, wordt het experiment op dat moment beëindigd.

1.4.2.6. Klinische observatie en inschaling van de huidreacties Alle dieren worden op tekenen van erytheem en oedeem onderzocht en de respons wordt 60 minuten en vervolgens 24, 48 en 72 uur na de verwijdering van het gaasje ingeschaald. Bij de voorlopige test bij één dier wordt de huid ook onmiddellijk na de verwijdering van het gaasje onderzocht. De huidreactie wordt in een van de categorieën in de tabel ingeschaald en geregistreerd. Als er sprake is van een beschadiging van de huid die na 72 uur niet als irritatie of corrosie kan worden geïdentificeerd, kan het nodig zijn de observatie tot dag 14 voort te zetten om te bepalen of de effecten reversibel zijn. Naast de observatie van irritatie worden ook alle lokale toxische effecten, zoals ontvetting van de huid, en alle systemische schadelijke effecten (zoals effecten op klinische toxiciteitsverschijnselen en het lichaamsgewicht) volledig beschreven en geregistreerd. Om duidelijkheid te krijgen omtrent moeilijk te interpreteren reacties moet histopathologisch onderzoek worden overwogen. De inschaling van huidreacties is per definitie subjectief. Om harmonisatie bij de inschaling van huidreacties te bevorderen en ter ondersteuning van de testlaboratoria en de personen die bij het uitvoeren en het interpreteren van de observatie betrokken zijn, moet het personeel dat de observatie uitvoert afdoende zijn opgeleid in het gebruikte scoresysteem (zie de tabel). Een geïllustreerde leidraad voor de inschaling van huidirritatie en ander letsel kan nuttig zijn (9). De inschaling van de huidreacties moet blind gebeuren.

2. GEGEVENS

2.

2.1. VERMELDING VAN DE RESULTATEN De resultaten van het onderzoek worden in het eindverslag in tabelvorm vermeld en hierin worden alle onder punt 3.1 vermelde gegevens opgenomen.

2.2. EVALUATIE VAN DE RESULTATEN De scores voor de huidirritatie worden in samenhang met de aard en ernst van het letsel en de vraag of dit al dan niet reversibel is, beoordeeld. De individuele scores vormen geen absolute norm voor de irriterende eigenschappen van een materiaal, aangezien ook andere effecten van het testmateriaal worden beoordeeld. De individuele scores moeten veeleer als referentiewaarden worden beschouwd, die in combinatie met alle andere observaties tijdens het onderzoek moeten worden geëvalueerd. Bij de beoordeling van de irritatiereactie moet rekening worden gehouden met de reversibiliteit van het huidletsel. Wanneer reacties als haaruitval (beperkt gebied), hyperkeratose, hyperplasie en schilfering tot het einde van de observatieperiode van 14 dagen blijven bestaan, moet de teststof als irriterend worden beschouwd.

3. RAPPORTACE

3.

3.1. TESTVERSLAG In het testverslag wordt de volgende informatie opgenomen:

Motivering voor in-vivo test: bewijskrachtanalyse van reeds bestaande testgegevens, zoals de resultaten van een sequentiële teststrategie:

een beschrijving van de relevante gegevens die van eerdere tests beschikbaar zijn;

de gegevens die bij elke fase van de teststrategie verkregen zijn;

een beschrijving van de uitgevoerde in-vitro tests met een gedetailleerde beschrijving van de procedures en de resultaten die met test/referentiestoffen verkregen zijn;

een bewijskrachtanalyse voor de uitvoering van het in-vivo-onderzoek.

Teststof:

identificatiegegevens (bv. het CAS-nr., de herkomst, de zuiverheid, bekende verontreinigingen en het chargenummer);

de fysische aard en de fysisch chemische eigenschappen (bv. de pH, de vluchtigheid, de oplosbaarheid en de stabiliteit),

bij een mengsel: de samenstelling met voor elk bestanddeel het procentuele gehalte.

Medium:

identificatiegegevens, de concentratie (indien van toepassing) en het gebruikte volume;

een motivering voor de keuze van het medium.

Proefdieren:

de gebruikte soort/stam en een motivering indien andere dieren dan het albinokonijn worden gebruikt;

het aantal dieren van elk geslacht;

het gewicht van elk dier aan het begin en het eind van de test;

de leeftijd aan het begin van het onderzoek;

de herkomst van de dieren, de huisvesting, de voeding enz.

Testomstandigheden:

de techniek voor de voorbereiding van de plaats waarop het gaasje wordt aangebracht;

een gedetailleerde beschrijving van het gebruikte verbandmateriaal en de verbandtechniek;

gedetailleerde gegevens over het bereiden, het aanbrengen en het verwijderen van de teststof.

Resultaten:

een tabel met de score van de irritatie/corrosie reactie voor elk dier op elk observatietijdstip;

beschrijvingen van alle waargenomen letsels;

een beschrijving in woorden van de aard en de ernst van de waargenomen irritatie of corrosie met eventuele histopathologische bevindingen;

een beschrijving van andere schadelijke lokale (bijvoorbeeld ontvetting van de huid) en systemische effecten naast de huidirritatie of corrosie.

Bespreking van de resultaten.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)

REFERENTIES Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995). The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998). Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720. ECETOC (1990) Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483-524. Testmethode B 40: Huidcorrosie. OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop onHarmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http.//www.oecd1.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [op verzoek verkrijgbaar bij het OESO secretariaat].

Tabel I Vorming van erytheem en korsten Vorming van oedeem INSCHALING VAN DE HUIDREACTIES

Geen erytheem 0 Zeer licht erytheem (nauwelijks waarneembaar) 1 Duidelijk gedefinieerd erytheem 2 Matig tot ernstig erytheem 3 Ernstig erytheem (diep rood) tot korstvorming waardoor de inschaling van erytheem onmogelijk is 4 Maximale score 4 Geen oedeem 0 Zeer licht oedeem (nauwelijks waarneembaar) 1 Licht oedeem (de randen van het gebied zijn goed zichtbaar door duidelijke zwelling) 2 Matig oedeem (ongeveer 1 mm zwelling) 3 Ernstig oedeem (meer dan 1 mm zwelling tot buiten het blootstellingsgebied) 4 Maximale score. 4 Om duidelijkheid te krijgen omtrent moeilijk te interpreteren reacties kan histopathologisch onderzoek worden uitgevoerd.

B.5. ACUTE TOXICITEIT: OOGIRRITATIE/CORROSIE

B.5.

1. METHODE Deze methode is gelijkwaardig aan TG 405 (2002) van de OESO.

1.

1.1. INLEIDING Bij de samenstelling van deze bijgewerkte methode is bijzondere aandacht besteed aan mogelijke verbeteringen via de evaluatie van alle bestaande informatie over de teststof om onnodige tests bij proefdieren te vermijden en zodoende rekening te houden met de bezorgdheid omtrent het welzijn van dieren. In deze methode wordt de aanbeveling opgenomen de bestaande relevante gegevens op bewijskracht te analyseren (1), alvorens de beschreven in-vivotest op acute oogirritatie/corrosie wordt uitgevoerd. Wanneer er onvoldoende gegevens beschikbaar zijn, wordt aanbevolen deze aan te vullen door een sequentiële teststrategie te volgen (2)(3). De aanbevolen teststrategie omvat de uitvoering van gevalideerde en erkende in-vitrotests en is als bijlage bij de testmethode opgenomen. Bovendien wordt aanbevolen als prognose voor oogcorrosie een in-vivotest op huidirritatie/corrosie uit te voeren alvorens een in-vivo-oogtest te overwegen. In het belang van zowel wetenschappelijke kwaliteit als het dierenwelzijn moeten er geen in-vivotests worden overwogen voordat alle beschikbare gegevens over de mogelijke oogcorrosie/irritatie door de stof zijn geëvalueerd op bewijskracht. Hierbij gaat het bijvoorbeeld om de resultaten van eerdere studies bij mensen en/of proefdieren, gegevens over corrosie/irritatie door een of meer qua structuur verwante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen, gegevens waaruit blijkt dat de stof sterk zuur of sterk alkalisch is (4)(5), en resultaten van gevalideerde en erkende in-vitro- of ex-vivotests op huidcorrosie en -irritatie (6)(6a). De studies kunnen al vóór de bewijskrachtanalyse zijn uitgevoerd, maar dit kan ook naar aanleiding van deze analyse gebeuren. Voor bepaalde stoffen kan uit een dergelijke analyse blijken dat er een in-vivo-onderzoek naar een mogelijke oogcorrosie/irritatie door de stof nodig is. In al deze gevallen verdient het de voorkeur, alvorens het gebruik van de in-vivo-oogtest te overwegen, eerst overeenkomstig testmethode B.4 (7) een onderzoek naar de in-vivohuideffecten van de stof uit te voeren en te beoordelen. Door toepassing van een bewijskrachtanalyse en de sequentiële teststrategie zal het minder vaak nodig zijn de in-vivotest op oogcorrosie/irritatie uit te voeren met stoffen waarvoor al voldoende bewijsmateriaal uit andere studies bestaat. Als met de sequentiële teststrategie niet kan worden bepaald of er sprake is van een mogelijke oogcorrosie of -irritatie, zelfs na de uitvoering van een in-vivo-onderzoek naar huidcorrosie en -irritatie, kan een in-vivotest op oogcorrosie/irritatie worden uitgevoerd. Een aanbevolen sequentiële teststrategie, waarin de uitvoering van gevalideerde in-vitro- of ex-vivotests op corrosie/irritatie is opgenomen, is in de bijlage van deze testmethode opgenomen. De strategie is ontwikkeld tijdens een OESO-workshop (8), met algemene stemmen door de deelnemers aanbevolen en als aanbevolen teststrategie opgenomen in het Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Substances (GHS) (9). Hoewel deze sequentiële teststrategie geen integrerend onderdeel van testmethode B.5 is, wordt aanbevolen deze teststrategie te volgen alvorens in-vivotests uit te voeren. Voor nieuwe stoffen is het de aanbevolen stapsgewijze testbenadering om wetenschappelijk verantwoorde gegevens over corrosie/irritatie door de stof te verkrijgen. Wanneer er voor bestaande stoffen onvoldoende gegevens over de huid- en oogcorrosie/irritatie beschikbaar zijn, moet de strategie worden gebruikt om ontbrekende gegevens aan te vullen. Voor het gebruik van een andere teststrategie of -procedure of de beslissing om geen stapsgewijze testbenadering te volgen moet een motivering worden gegeven.

1.2. DEFINITIES Oogirritatie: het ontstaan van veranderingen in het oog na het aanbrengen van een teststof op het oppervlak aan de voorzijde van het oog, die binnen 21 dagen na het aanbrengen volledig reversibel zijn. Oogcorrosie: het ontstaan van weefselbeschadiging in het oog of een ernstige fysieke zichtvermindering na het aanbrengen van een teststof op het oppervlak aan de voorzijde van het oog, die binnen 21 dagen na het aanbrengen niet volledig reversibel is.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De teststof wordt in één dosis op een van de ogen van het proefdier aangebracht; het onbehandelde oog wordt als controle gebruikt. De mate van oogirritatie/corrosie wordt geëvalueerd door op bepaalde tijdstippen het letsel aan de conjunctiva, de cornea en de iris in te schalen. Ook andere effecten in het oog en schadelijke systemische effecten worden beschreven om een volledige evaluatie van de effecten mogelijk te maken. De duur van de studie moet voldoende zijn om te kunnen beoordelen of de effecten reversibel of irreversibel van aard zijn. Dieren die gedurende een fase van de test voortdurend tekenen van ernstig ongerief en/of hevige pijn vertonen, moeten op humane wijze worden gedood en de stof dient dienovereenkomstig te worden beoordeeld. Voor criteria voor de beslissing om stervende en hevig lijdende dieren op humane wijze te doden wordt verwezen naar referentie (10).

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.

1.4.1. Voorbereiding van de in-vivotest

1.4.1.

1.4.1.1. Keuze van de soort Als proefdier wordt de voorkeur gegeven aan het albinokonijn en er worden gezonde jonge volwassen dieren gebruikt. Wanneer er een andere stam of soort wordt gebruikt, moet hiervoor een motivering worden gegeven.

1.4.1.2. Voorbereiding van de dieren Beide ogen van ieder voorlopig voor de test geselecteerd proefdier worden binnen 24 uur vóór het begin van de test onderzocht. Dieren die aan oogirritatie, oogaandoeningen of een reeds bestaand cornealetsel lijden, mogen niet worden gebruikt.

1.4.1.3. Huisvesting en voeding De dieren worden in aparte kooien gehuisvest. De temperatuur in de proefdierruimte dient voor konijnen 20 oC (+ 3 oC) te zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater.

1.4.2. Testprocedure

1.4.2.

1.4.2.1. Het aanbrengen van de teststof De teststof wordt bij elk dier aangebracht in de conjunctivaalzak van één oog, waarbij het onderste ooglid voorzichtig van de oogbol wordt weggetrokken. Vervolgens worden de oogleden ongeveer één seconde zachtjes dichtgehouden om verlies van het materiaal te voorkomen. Het andere oog, dat niet behandeld wordt, fungeert als controle.

1.4.2.2. Irrigatie De ogen van de proefdieren mogen gedurende ten minste 24 uur na het indruppelen van de teststof niet worden uitgewassen, tenzij het om een vaste stof gaat (zie punt 1.4.2.3.2) of wanneer er sprake is van onmiddellijke corrosieve of irriterende effecten. Na 24 uur mogen de ogen eventueel worden uitgewassen. Het gebruik van een satellietgroep om de invloed van het uitwassen te onderzoeken wordt niet aanbevolen, tenzij dit wetenschappelijk verantwoord is. Als er een satellietgroep nodig is, dienen hiervoor twee konijnen te worden gebruikt. De wijze van uitwassen, waarbij het bijvoorbeeld gaat om het tijdstip, de samenstelling en temperatuur van de wasvloeistof, de duur, het volume en de stroomsnelheid, moet zorgvuldig worden vastgelegd.

1.4.2.3. Dosisniveau

1.4.2.3.

1.4.2.3.1. Vloeibare teststoffen Bij vloeibare reststoffen wordt een dosis van 0,1 ml gebruikt. Er mogen geen sproeipompjes worden gebruikt om de stof rechtstreeks in het oog te brengen. De vloeistof wordt na het sproeien opgevangen en vervolgens wordt 0,1 ml in het oog gedruppeld.

1.4.2.3.2. Vaste teststoffen Bij het testen van vaste stoffen, pasta's en vaste deeltjes wordt een hoeveelheid met een volume van 0,1 ml of een gewicht van ten hoogste 100 mg gebruikt. Het testmateriaal wordt tot een fijn poeder vermalen. Alvorens het volume te meten wordt het vaste materiaal licht ingeklonken, bijvoorbeeld door tegen de houder te tikken. Als de vaste stof op het eerste observatietijdstip (1 uur na de behandeling) nog niet door fysiologische mechanismen uit het oog van het proefdier is verwijderd, kan het oog met fysiologisch zout of gedestilleerd water worden uitgewassen.

1.4.2.3.3. Aerosol-teststoffen Aanbevolen wordt alle sproeivloeistoffen en aerosolen op te vangen voordat ze in het oog worden gedruppeld. Er wordt alleen een uitzondering gemaakt voor stoffen in spuitbussen onder druk, die niet kunnen worden opgevangen omdat ze verdampen. In deze gevallen wordt het oog opengehouden en wordt de teststof aan het oog toegediend door in één keer gedurende ongeveer één seconde vanaf een afstand van 10 cm recht voor het oog te spuiten. Deze afstand kan afhankelijk van de druk van de nevel en de inhoud worden aangepast. Er moet voor worden gezorgd dat het oog niet door de druk van de nevel wordt beschadigd. In bepaalde gevallen kan het nodig zijn na te gaan of een mechanische beschadiging van het oog door de druk van de nevel mogelijk is. De dosis uit een spuitbus kan door een simulatie als volgt worden geraamd: de stof wordt door een opening die zo groot is als het oog van een konijn en recht voor het papier wordt gehouden, op een weegpapiertje gespoten. De gewichtstoename van het papier wordt gebruikt voor een benadering van de hoeveelheid die in het oog wordt gespoten. Bij vluchtige stoffen kan de dosis worden geraamd door een opvangbakje voor en na de verwijdering van het testmateriaal te wegen.

1.4.2.4. Voorlopige test (in-vivotest op oogirritatie/corrosie met één dier) Zoals in de sequentiële teststrategie (zie bijlage 1) wordt gesteld, is het zeer wenselijk dat de in-vivotest in eerste instantie met één dier wordt uitgevoerd. Als de resultaten van deze test erop wijzen dat de stof bij gebruik van de beschreven procedure corrosief of hevig irriterend is, dienen er geen verdere tests op oogirritatie te worden uitgevoerd.

1.4.2.5. Lokale anesthetica Van geval tot geval kan worden bekeken of er lokale anesthetica moeten worden gebruikt. Als de bewijskrachtanalyse erop wijst dat de stof pijn kan veroorzaken of als uit de eerste tests blijkt dat er een pijnlijke reactie optreedt, kan vóór het indruppelen van de teststof een lokaal anestheticum worden toegediend. De aard, de concentratie en de dosis van het lokaal anestheticum moeten met zorg worden gekozen om ervoor te zorgen dat het gebruik niet leidt tot verschillen in de reactie op de teststof. Het controleoog moet op dezelfde wijze worden verdoofd.

1.4.2.6. Bevestigende test (in-vivotest op oogirritatie/corrosie met meer dieren) Als er bij de voorlopige test geen corrosiereactie wordt waargenomen, moet de irritatie of negatieve reactie worden bevestigd met nog eens twee dieren. Als er bij de voorlopige test hevige irritatie wordt waargenomen, hetgeen wijst op een mogelijk hevig (irreversibel) effect bij de bevestigende test, wordt aanbevolen de bevestigende test op sequentiële wijze bij één dier tegelijk uit te voeren en de twee andere dieren niet tegelijkertijd bloot te stellen. Als er bij het tweede dier corrosieve of hevig irriterende effecten optreden, wordt de test niet voortgezet. Er kunnen extra dieren nodig zijn om een zwakke of matige irritatiereactie te bevestigen.

1.4.2.7. Observatieperiode De duur van de observatieperiode moet voldoende zijn om de omvang en de reversibiliteit van de waargenomen effecten volledig te kunnen beoordelen. Het experiment moet echter worden beëindigd zodra het dier voortdurend tekenen van hevige pijn of ernstig ongerief vertoont (9). Om te bepalen of de effecten reversibel zijn, moeten de dieren normaal gesproken gedurende 21 dagen na de toediening van de teststof worden geobserveerd. Als al vóór het verstrijken van de 21 dagen wordt geconstateerd dat de effecten reversibel zijn, wordt het experiment op dat moment beëindigd.

1.4.2.7.

1.4.2.7.1. Klinische observatie en inschaling van de oogreacties De ogen worden 1, 24, 48 en 72 uur na het aanbrengen van de teststof onderzocht. De dieren worden niet langer dan nodig voor de test ingezet zodra er definitieve informatie is verkregen. Dieren die voortdurend tekenen van hevige pijn of ernstig ongerief vertonen, moeten op humane wijze worden gedood en de stof dient dienovereenkomstig te worden beoordeeld. Dieren die na de indruppeling de volgende oogletsels ontwikkelen, moeten op humane wijze worden gedood: perforatie van de cornea, significante ulceratie van de cornea en stafyloom; bloed in de voorste oogkamer; klasse 4 troebelheid van de cornea die gedurende 48 uur aanhoudt; afwezigheid van een lichtreflex (iris-reactie klasse 2) die gedurende 72 uur aanhoudt; ulceratie van de conjunctivae; necrose van de conjunctivae of het knipvlies: loslatend dood weefsel. De reden hiervoor is dat dergelijke letsels in het algemeen irreversibel zijn. Wanneer de dieren geen oogletsel ontwikkelen, mag de test niet eerder dan drie dagen na de indruppeling worden beëindigd. Dieren met licht tot matig letsel moeten worden geobserveerd tot het letsel verdwijnt of gedurende 21 dagen; op dat tijdstip wordt de test dan afgesloten. Op dag 7, dag 14 en dag 21 worden de dieren geobserveerd om te bepalen wat de status van het letsel is en of het reversibel of irreversibel is. Bij elk onderzoek wordt de score van de oogreactie (conjunctivae, cornea en iris) geregistreerd (zie tabel 1). Ook ander letsel in het oog (zoals pannus of verkleuring) en schadelijke systemische effecten worden gerapporteerd. Het onderzoek van de respons kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van een binoculaire loep, een handspleetlamp, een biomicroscoop of andere geschikte apparatuur. Na de registratie van de observaties na 24 uur kunnen de ogen nader worden onderzocht met behulp van fluoresceïne. De inschaling van oogreacties is per definitie subjectief. Om harmonisatie bij de inschaling van oogreacties te bevorderen en ter ondersteuning van de testlaboratoria en de personen die bij het uitvoeren en het interpreteren van de observatie betrokken zijn, moet het personeel dat de observatie uitvoert afdoende zijn opgeleid in het gebruikte scoresysteem.

2. GEGEVENS

2.

2.1. EVALUATIE VAN DE RESULTATEN De scores voor de oogirritatie worden in samenhang met de aard en ernst van het letsel en de vraag of dit al dan niet reversibel is, beoordeeld. De individuele scores vormen geen absolute norm voor de irriterende eigenschappen van een materiaal, aangezien ook andere effecten van het restmateriaal worden beoordeeld. De individuele scores moeten veeleer als referentiewaarden worden beschouwd en zijn alleen zinvol wanneer ze worden ondersteund door een volledige beschrijving en evaluatie van alle observaties.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. TESTVERSLAG In het testverslag wordt de volgende informatie opgenomen:

Motivering voor in-vivotest: bewijskrachtanalyse van reeds bestaande testgegevens, zoals de resultaten van een sequentiële teststrategie:

een beschrijving van de relevante gegevens die van eerdere tests beschikbaar zijn;

de gegevens die bij elke stap van de teststrategie verkregen zijn;

een beschrijving van de uitgevoerde in-vitro tests met een gedetailleerde beschrijving van de procedures en de resultaten die met test/referentiestoffen verkregen zijn;

een beschrijving van het uitgevoerde in-vivo-onderzoek op huidirritatie/corrosie met de verkregen resultaten;

een bewijskrachtanalyse voor de uitvoering van het in-vivo-onderzoek.

Teststof:

identificatiegegevens (bv. het CAS-nr., de herkomst, de zuiverheid, bekende verontreinigingen en het chargenummer):

de fysische aard en de fysisch-chemische eigenschappen (bv. de pH, de vluchtigheid, de oplosbaarheid, de stabiliteit en de reactiviteit met water);

bij een mengsel de samenstelling met voor elk bestanddeel het procentuele gehalte;

als een lokaal anestheticum is gebruikt: identificatiegegevens, de zuiverheid, het type, de dosis en de potentiële interactie met de teststof.

Medium:

identificatiegegevens, de concentratie (indien van toepassing) en het gebruikte volume;

een motivering voor de keuze van het medium.

Proefdieren:

de gebruikte soort/stam en een motivering indien andere dieren dan het albinokonijn worden gebruikt;

de leeftijd van elk dier aan het begin van het onderzoek;

het aantal dieren van elk geslacht in de test- en controlegroep (indien deze nodig is);

het gewicht van elk dier aan het begin en het eind van de test;

de herkomst, de huisvesting, de voeding enz.

Resultaten:

een beschrijving van de methode die is gebruikt om de irritatie op elk observatietijdstip in te schalen (bijvoorbeeld handspleetlamp, biomicroscoop of fluoresceïne):

een tabel met de gegevens van de irritatie/corrosiereactie voor elk dier op elk observatietijdstip tot het moment waarop elk dier uit de test wordt genomen;

een beschrijving in woorden van de ernst en de aard van de waargenomen irritatie of corrosie;

een beschrijving van alle andere in het oog waargenomen letsels (bijvoorbeeld vascularisatie, pannusvorming, verkleving en verkleuring);

een beschrijving van schadelijke lokale effecten buiten het oog en schadelijke systemische effecten en eventuele histopathologische bevindingen.

Bespreking van de resultaten.

3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN Een extrapolatie van de resultaten van het onderzoek naar oogirritatie bij proefdieren naar de mens heeft slechts een beperkte geldigheid. In veel gevallen is het albinokonijn gevoeliger voor stoffen die oogirritatie of -corrosie veroorzaken dan de mens. Bij de interpretatie van de resultaten moet ervoor worden gezorgd dat irritatie ten gevolge van secundaire infectie wordt uitgesloten.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)

REFERENTIES Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995). The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997). Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164. Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26. Neun, D.J. (1993). Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483-524. Testmethode B.40: Huidcorrosie. Testmethode B.4: Acute toxiciteit: huidirritatie/corrosie. OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tabel I INSCHALING VAN HET OOGLETSEL

Cornea

Troebelheid: dichtheidsgraad (wordt afgelezen in het gebied met de grootste dichtheid) Geen ulceratie of troebelheid 0 Verspreide of diffuse troebele gebieden (meer dan een lichte vertroebeling van de normale glans); details van de iris duidelijk zichtbaar 1 Gemakkelijk te onderscheiden doorschijnend gebied; details van de iris enigszins vervaagd 2 Parelmoerachtig gebied; details van de iris niet zichtbaar; omvang van de pupil nauwelijks zichtbaar 3 Troebele cornea; iris niet zichtbaar door de troebelheid 4 Maximale score: 4 NOTEN

Iris

Normaal 0 Duidelijk verdiepte rugae, congestie, zwelling, matige hyperemie rond de cornea of injectie; iris reageert op licht (een trage reactie wordt als een effect beschouwd) 1 Bloeding, macroscopische destructie of geen reactie op licht 2 Maximale score: 2

Conjunctivae

Roodheid (geldt voor palpebrale en bulbaire conjunctivae; niet voor cornea en iris) Normaal 0 Hyperemie in sommige bloedvaten (geïnjecteerd) 1 Diffuse karmozijnrode kleur; individuele vaten niet gemakkelijk zichtbaar 2 Diffuse dieprode kleur 3 Maximale score: 3

Chemosis

Zwelling (geldt voor oogleden en/of knipvliezen) Normaal 0 Iets meer zwelling dan normaal 1 Duidelijke zwelling met gedeeltelijk uitpuilende oogleden 2 Zwelling met ongeveer half gesloten oogleden 3 Zwelling met meer dan half gesloten oogleden 4 Maximale score: 4

B.6. SENSIBILISATIE VAN DE HUID

B.6.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Opmerkingen: De gevoeligheid en het vermogen van een test om stoffen op te sporen met potentieel huidsensibiliserende eigenschappen bij de mens zijn belangrijk in een systeem voor de classificatie van toxische stoffen ten behoeve van de volksgezondheid. Er bestaat géén universele testmethode waarmee alle stoffen die de menselijke huid kunnen sensibiliseren, adequaat kunnen worden geïdentificeerd en die voor alle stoffen toepasbaar is. Bij de keuze van een test moet rekening worden gehouden met factoren zoals de fysische kenmerken van een stof, met inbegrip van het vermogen om de huid binnen te dringen. Er zijn twee soorten tests ontwikkeld die gebruik maken van cavia's: het type waarbij een adjuvans wordt gebruikt en waarbij een verhoogde allergische reactie wordt opgewekt door het oplossen of suspenderen van de teststof in Freunds compleet adjuvans (FCA), en tests waarbij geen adjuvans wordt gebruikt. Proeven met adjuvans voorspellen een eventueel huidsensibiliserend effect van een stof bij mensen wellicht nauwkeuriger dan methoden die geen gebruik maken van Freunds compleet adjuvans; zij verdienen dan ook de voorkeur. De maximalisatietest met cavia's is een algemeen toegepaste test waarbij een adjuvans gebruikt wordt. Alhoewel verschillende andere methoden kunnen worden gebruikt om het huidsensibiliserend vermogen van een stof aan te tonen, wordt de maximalisatietest beschouwd als de adjuvanstechniek die de voorkeur heeft. Voor veel soorten chemicaliën worden tests waarbij geen adjuvans wordt gebruikt (de Buehlertest heeft de voorkeur) als minder gevoelig beschouwd. In bepaalde gevallen kunnen er goede redenen zijn om de Buehlertest te verkiezen, met lokale applicatie in plaats van intradermale injectie zoals in de maximalisatietest met cavia's. Voor het gebruik van de Buehlertest dient een wetenschappelijke motivering te worden gegeven. De maximalisatietest met cavia's en de Buehlertest worden hier beschreven. Andere methoden mogen worden gebruikt op voorwaarde dat zij goed zijn gevalideerd en wetenschappelijk verantwoord zijn. Indien een erkende screeningtest werd uitgevoerd en daarbij een positief resultaat werd geconstateerd, mag de teststof als een potentieel sensibiliserende stof worden aangemerkt en is het niet nodig ook nog een test met cavia's uit te voeren. Indien een dergelijke test evenwel tot een negatief resultaat heeft geleid, moet een caviatest worden uitgevoerd overeenkomstig de onder deze testmethode beschreven procedure. Zie ook algemene inleiding deel B.

1.2. DEFINITIES Huidsensibilisatie (allergische contactdermatitis): is een door een immuunrespons veroorzaakte huidreactie op een stof. Bij mensen kan de reactie de vorm aannemen van jeuk, erytheem, oedeem (waterzucht), pukkels, blaasjes, blaren of een combinatie hiervan. Bij andere soorten kunnen de reacties anders zijn en kan alleen erytheem of oedeem optreden. Inductieblootstelling: een experimentele blootstelling van een proefdier aan een teststof met de bedoeling een hypersensitieve toestand te induceren. Inductieperiode: een periode van ten minste een week na de inductieblootstelling, gedurende welke een hypersensitieve toestand ontwikkeld kan worden. Provocatieblootstelling een experimentele blootstelling — na de inductieperiode — van een voorheen reeds blootgesteld proefdier aan een teststof, om vast te stellen of het dier een hypersensitieve reactie vertoont.

1.3. REFERENTIESTOFFEN De gevoeligheid en de betrouwbaarheid van de gebruikte technieken moet iedere zes maanden worden vastgesteld door het gebruik van stoffen waarvan bekend is dat ze lichte tot matige huidsensibiliserende eigenschappen hebben. Bij een goed uitgevoerde test kan een reactie van ten minste 30 % worden verwacht bij een adjuvanstest en van ten minste 15 % bij een niet-adjuvanstest, bij gebruikmaking van zwakke/middelsterke sensibilisatoren. De volgende stoffen genieten de voorkeur: CAS-nummer EINECS-nummer EINECS-naam Triviale naam 101-86-0 202-983-3 α-hexylcinnamaldehyde α-hexylcinnamaldehyde 149-30-4 205-736-8 benzothiazol-2-thiol (mercapto-benzothiazol) kaptax 94-09-7 202-303-5 benzocaïne norcaïne Er kunnen omstandigheden zijn waarbij andere referentiestoffen, die aan bovenstaande eisen voldoen, kunnen worden gebruikt; dit moet wetenschappelijk verantwoord worden.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De proefdieren worden eerst aan de teststof blootgesteld door een intradermale injectie en/of epidermale toepassing (inductieblootstelling). Na een rustperiode van 10 tot 14 dagen (inductieperiode), tijdens welke een immuunreactie op gang kan komen, worden de dieren blootgesteld aan een provocatiedosis. De omvang en intensiteit van de cutane reactie op de provocatieblootstelling bij de proefdieren wordt vergeleken met die van de controlegroep die een blanco behandeling ondergaat bij de industrie maar wél de provocatiedosis toegediend krijgt.

1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN Als het nodig wordt geacht om de teststof te verwijderen, moet dit gebeuren met behulp van water of een ander geschikt oplosmiddel zonder dat de optredende reactie daardoor wordt beïnvloed of de opperhuid daardoor wordt geschonden.

1.5.

1.5.1. Maximalisatietest met cavia's (GPMT)

1.5.1.

1.5.1.1. Voorbereiding Gezonde jonge volwassen albinocavia's worden ten minste 5 dagen voor het begin van de test geacclimatiseerd aan de laboratoriumomstandigheden. Voor de test worden de dieren op aselecte wijze verdeeld over de behandelingsgroepen. Verwijdering van het haar gebeurt door middel van knippen, scheren of eventueel door chemische ontharing, afhankelijk van de gebruikte testmethode. Er dient op te worden gelet dat de huid niet beschadigd wordt. De dieren worden gewogen vóór het begin en aan het einde van de test.

1.5.1.2. Proefomstandigheden

1.5.1.2.

1.5.1.2.1. Proefdieren Er wordt gebruik gemaakt van stammen albinocavia's die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt.

1.5.1.2.2. Aantal en geslacht Er kan gebruik worden gemaakt van mannelijke en/of vrouwelijke dieren. Vrouwelijke dieren moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn. Minimaal 10 dieren worden gebruikt voor de behandelde groep en ten minste vijf voor de controlegroep. Als er minder dan 20 testcavia's en 10 controlecavia's worden gebruikt en het niet mogelijk is om vast te stellen of de teststof sensibiliserende eigenschappen heeft, wordt ten sterkste aangeraden om meer dieren te testen zodat een totaal van ten minste 20 testdieren en 10 controledieren wordt bereikt.

1.5.1.2.3. Dosisniveaus De concentratie van de teststof die voor iedere inductie wordt gebruikt moet systemisch goed te verdragen zijn en gelijk zijn aan de hoogste concentratie die lichte tot matige huidirritatie veroorzaakt. De concentratie die voor de provocatieblootstelling wordt gebruikt moet de hoogste niet-irriterende dosis zijn. Indien noodzakelijk, kunnen de juiste concentraties worden vastgesteld aan de hand van een verkennende studie bij twee of drie proefdieren. Hierbij kan worden overwogen gebruik te maken van met FCA behandelde proefdieren.

1.5.1.3. Procedure

1.5.1.3.

1.5.1.3.1. Inductie Dag 0 — Testgroep In de onthaarde schouderstreek worden drie paar injecties van 0,1 ml gegeven, zó dat van ieder paar er één aan elke zijde ligt: Injectie 1: een 1:1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing; Injectie 2: de teststof in een geschikt vehiculum en in de geschikte concentratie; Injectie 3: de teststof in de gekozen concentratie, opgelost in een l:l-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing. Voor injectie 3 worden de in water oplosbare teststoffen in water opgelost vóór het mengen met FCA. In vet oplosbare of onoplosbare stoffen worden in FCA gesuspendeerd vóór het mengen met water. De uiteindelijke concentratie van de teststof moet gelijk zijn aan die welke voor injectie 2 wordt gebruikt. De injecties 1 en 2 worden dicht bij elkaar en het dichtst bij het hoofd toegediend en injectie 3 aan de staartzijde van het testgebied. Dag 0 — Controlegroep Op dezelfde plaatsen als bij de proefdieren worden drie paar intradermale injecties van 0,1 ml toegediend: Injectie 1: een 1:1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing; Injectie 2: het onverdunde vehiculum; Injectie 3: een 50 %-formulering (gewicht/volume) van het vehiculum in een 1:1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing. Dag 5-7 — Testgroep en controlegroep Als de te onderzoeken stof geen huidirritatie geeft wordt het testgebied ongeveer 24 uur vóór de plaatselijke inductiebehandeling na knippen en/of scheren behandeld met 0,5 ml van een 10 %-formulering van natriumlaurylsulfaat in vaseline om een plaatselijke irritatie op te wekken. Dag 6-8 — Testgroep Het testgebied wordt opnieuw onthaard. Een filtreerpapier (2 cm × 4 cm) wordt gedrenkt met de teststof in een geschikt vehiculum en door middel van een occlusief verband gedurende 48 uur op het testgebied aangebracht. De keuze van het vehiculum moet worden verantwoord. Vaste stoffen worden verpulverd en in een geschikt vehiculum opgenomen. Vloeistoffen kunnen, zo nodig, onverdund worden aangebracht. Dag 6-8 — Controlegroep Het testgebied wordt opnieuw onthaard. Op dezelfde wijze als bij de testgroep wordt alleen het vehiculum aangebracht en gedurende 48 uur met het testgebied in contact gehouden door een occlusief verband.

1.5.1.3.2. Provocatie Dag 20-22 — Testgroep en controlegroep Beide flanken van de dieren uit de testgroep en de controlegroep worden onthaard. Op één flank van de behandelde dieren wordt een gaasje of cupje met de teststof aangebracht en, waar nodig, een gaasje of cupje met alleen het vehiculum op de andere flank. Door middel van een occlusief verband wordt het gaasje gedurende 24 uur met de huid in contact gehouden.

1.5.1.3.3. Observatie en scoring; testgroep en controlegroep Aangeraden wordt om de proefdieren en controledieren blind (d.w.z. zonder te weten of het test- of controledieren betreft) te scoren. Als het nodig blijkt om opheldering te verkrijgen over de resultaten van de eerste provocatie kan na ongeveer een week een tweede provocatie (d.w.z. een herprovocatie) worden overwogen met, zo nodig, een nieuwe controlegroep. Herprovocatie kan ook plaatsvinden bij de oorspronkelijke controlegroep. Alle reacties van de huid en alle ongewone bevindingen, waaronder ook systemische reacties, die het gevolg zijn van de inductie- en provocatieprocedures moeten worden geobserveerd en geregistreerd volgens de scoreschaal van Magnusson/Kligman (zie aanhangsel). Andere technieken zoals histopathologisch onderzoek of meting van de dikte van de huidplooi kunnen worden toegepast om klaarheid te verschaffen omtrent onduidelijke reacties.

Ongeveer 21 uur nadat het gaasje is verwijderd, wordt het provocatiegebied gereinigd en zo nodig zorgvuldig geknipt en/of geschoren en onthaard.

Ongeveer 3 uur hierna (ongeveer 48 uur na het begin van de provocatie) wordt de reactie van de huid geobserveerd en geregistreerd volgens de in het aanhangsel vermelde scores.

Ongeveer 24 uur na deze waarneming wordt een tweede waarneming gedaan (72 uur na aanvang provocatie) en eveneens geregistreerd.

1.5.2. Buehlertest

1.5.2.

1.5.2.1. Voorbereiding Gezonde jonge volwassen albinocavia's worden ten minste 5 dagen voor het begin van de test geacclimatiseerd aan de laboratoriumomstandigheden. Voor de test worden de dieren op aselecte wijze verdeeld over de behandelingsgroepen. Verwijdering van het haar gebeurt door middel van knippen, scheren of eventueel door chemische ontharing, afhankelijk van de gebruikte testmethode. Er dient op te worden gelet dat de huid niet beschadigd wordt. De dieren worden gewogen vóór het begin en aan het eind van de test.

1.5.2.2. Proefomstandigheden

1.5.2.2.

1.5.2.2.1. Proefdieren Er wordt gebruik gemaakt van stammen albinocavia's die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt.

1.5.2.2.2. Aantal en geslacht Er kan gebruik worden gemaakt van mannelijke en/of vrouwelijke dieren. Vrouwelijke dieren moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn. Voor de behandelde groep worden minimaal 20 dieren gebruikt en voor de controlegroep ten minste 10.

1.5.2.2.3. Dosisniveaus De concentratie van de teststof die voor iedere inductie wordt gebruikt moet de hoogste zijn die lichte maar geen excessieve huidirritatie geeft. De concentratie die voor de provocatieblootstelling wordt gebruikt moet de hoogste niet-irriterende dosis zijn. Indien noodzakelijk, kunnen de juiste concentraties worden vastgesteld aan de hand van een verkennende studie bij twee of drie proefdieren. Als de teststoffen in water oplosbaar zijn verdient water of een verdunde, niet-irriterende oplossing van een surfactans de voorkeur als vehiculum. Bij andere teststoffen wordt de voorkeur gegeven aan 80 % alcohol/water bij de inductie en aan aceton bij de provocatie.

1.5.2.3. Procedure

1.5.2.3.

5.5.2.3.1. Inductie Dag 0 — Testgroep Eén flank wordt onthaard. Het testgaasje moet doordrenkt zijn met de teststof in een geschikt vehiculum (de keuze van het vehiculum moet worden verantwoord; vloeibare teststoffen kunnen eventueel onverdund worden aangebracht). Het testgaasje wordt op het testgebied aangebracht en daarmee gedurende 6 uur in contact gehouden door een occlusieve pleister of een cupje en een geschikt verband. Het testgaasje moet afdekkend zijn. Er kan gebruik worden gemaakt van een rond of vierkant wattenschijfje met een oppervlakte van ongeveer 4-6 cm2. Om een goede afdekking te garanderen kan een passende voorziening worden gebruikt waardoor de bewegingsvrijheid van de dieren wordt beperkt. Bij gebruik van een zwachtel alléén kan herhaalde blootstelling nodig zijn. Dag 0 — Controlegroep Een flank wordt onthaard. Op dezelfde wijze als bij de testgroep wordt nu alleen het vehiculum aangebracht. Het testgaasje wordt op het testgebied aangebracht en daarmee gedurende 6 uur in contact gehouden door een occlusieve pleister of een cupje en een geschikt verband. Als kan worden aangetoond dat een blanco controlegroep niet nodig is, kunnen niet-behandelde dieren als controlegroep worden gebruikt. Dag 6-8 en 13-15 — Testgroep en controlegroep Hetzelfde testoppervlak van dezelfde flank ondergaat, na eventuele verwijdering van de beharing, op dag 6-8 en nogmaals op dag 13-15 dezelfde blootstelling als op dag 0.

1.5.2.3.2. Provocatie Dag 27-29 — Testgroep en controlegroep De onbehandelde flank van de test- en controledieren wordt onthaard. Een occlusieve pleister of een cupje met de juiste hoeveelheid teststof in de maximale niet-irriterende concentratie, wordt aangebracht op het achterste deel van de flank van de testdieren en van de controledieren. Indien dit wenselijk is wordt op het voorste gedeelte van de onbehandelde flank van zowel de testdieren als de controledieren een occlusieve pleister of een cupje met alleen het vehiculum aangebracht. De pleisters of cupjes worden gedurende 6 uur op hun plaats gehouden door een geschikt verband.

1.5.2.3.3. Observatie en scoring Aangeraden wordt om de testdieren en controledieren blind (d.w.z. zonder te weten of het test-of controledieren betreft) te scoren. Als het nodig blijkt om opheldering te verkrijgen over de resultaten van de eerste provocatie kan na ongeveer een week een tweede provocatie (d.w.z. een herprovocatie) overwogen worden met, zo nodig, een nieuwe controlegroep. Herprovocatie kan ook plaatsvinden bij de oorspronkelijke controlegroep. Alle reacties van de huid en alle ongewone bevindingen, waaronder ook systemische reacties, die het gevolg zijn van de inductie- en provocatieprocedures moeten worden geobserveerd en geregistreerd volgens de schaal van Magnusson/Kligman (zie aanhangsel). Andere technieken zoals histopathologisch onderzoek of meting van de dikte van de huidplooi kunnen worden toegepast om klaarheid te verschaffen omtrent onduidelijke reacties.

Ongeveer 21 uur nadat de pleister is verwijderd wordt het provocatiegebied onthaard.

Ongeveer 3 uur hierna (ongeveer 30 uur na het begin van de provocatie) wordt de reactie van de huid geobserveerd en geregistreerd volgens de in het aanhangsel vermelde scores.

Ongeveer 24 uur na de 30-uurswaarneming wordt een tweede waarneming van de huidreacties gedaan (ongeveer 54 uur na aanvang van de provocatie) en worden de resultaten weer geregistreerd.

2. GEGEVENS (GPMT EN BUEHLERTEST) Alle gegevens moeten in tabelvorm worden samengevat, waarbij voor ieder dier de bij iedere controle waargenomen huidreacties worden vermeld.

3. RAPPORTAGE (GPMT EN BUEHLERTEST) Wanneer vóór de proef met cavia's een screeningstest wordt uitgevoerd, moet een beschrijving van of verwijzing naar de test in kwestie (bijvoorbeeld de Local Lymph Node Assay (LI.NA) of de Mouse Ear Swelling Test (MEST)) worden gegeven en moeten bijzonderheden over de procedure worden verstrekt. Verder moeten de resultaten worden gerapporteerd die met de teststof en de referentiestof zijn verkregen.

3. Verslag van de proefnemingen (GPMT en Buehlertest)

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

Proefdieren:

gebruikte caviastam;

aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;

herkomst, behuizing, dieet, enz.;

gewicht van ieder dier bij het begin van de proefneming.

Proefomstandigheden:

gebruikte techniek bij het prepareren van het te behandelen oppervlak;

bijzonderheden met betrekking tot het pleister- of gaasmateriaal en de wijze van aanbrengen;

resultaten van de voorstudie met conclusies over de inductie- en provocatieconcentraties die bij de test moeten worden gebruikt;

bijzonderheden over de bereiding van de teststof, het toedienen en het verwijderen hiervan;

motivering van de keuze van het vehiculum;

concentraties van vehiculum en teststof die gebruikt zijn bij de inductie en de provocatie en de totale hoeveelheid teststof die gebruikt is voor inductie en provocatie.

Resultaten:

een samenvatting van de resultaten van de meest recente gevoeligheids- en betrouwbaarheidscontrole (zie 1.3), met inbegrip van informatie over gebruikte teststof, concentratie en vehiculum;

resultaten voor ieder dier afzonderlijk, inclusief scores;

beschrijving van de aard en de intensiteit van de waargenomen effecten;

eventuele histopathologische bevindingen.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4. LITERATUUR Deze methode komt overeen met TG 406 van de OESO

B.7. TOXICITEIT (ORAAL) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)

B.7.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Zie algemene inleiding deel B.

1.2. DEFINITIES Zie algemene inleiding deel B.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks oraal toegediend aan verschillende groepen proefdieren, in trapsgewijs stijgende doses. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks zorgvuldig geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden afgemaakt, wordt een necropsie verricht. Dieren die aan het eind van het onderzoek nog in leven zijn worden afgemaakt en ook hierop wordt een necropsie verricht. Bij deze methode ligt het accent meer op neurologische effecten als specifiek eindpunt. Benadrukt moet worden dat het noodzakelijk is de dieren zorgvuldig klinisch te observeren om zoveel mogelijk informatie te verzamelen. Deze methode moet het mogelijk maken potentieel neurotoxische chemicaliën te identificeren, die in dit opzicht nader verdienen te worden onderzocht. Voorts kan deze methode aanwijzingen geven over immunologische effecten en toxiciteit voor de voortplantingsorganen.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.

1.4.1. Voorbereidingen Gezonde jonge volwassen dieren worden op aselecte wijze verdeeld over de controlegroep en de testgroepen. De kooien moeten op zodanige wijze worden opgesteld dat eventuele plaatseffecten geminimaliseerd worden. De dieren worden individueel geïdentificeerd en worden vóór het onderzoek ten minste 5 dagen in hun kooi gehouden ter acclimatisatie aan de laboratoriumomstandigheden. De teststof wordt toegediend via een maagsonde of via de voeding of het drinkwater. De wijze van toedienen is afhankelijk van het doel van het onderzoek en de fysisch/chemische eigenschappen van de teststof. Zo nodig moet de teststof worden opgelost of gesuspendeerd in een geschikt vehiculum. Het verdient aanbeveling om zo mogelijk een waterige oplossing of suspensie te gebruiken. Als dit niet mogelijk is kan voor een oplossing of suspensie in olie (bij voorbeeld maïsolie) of in laatste instantie voor een oplossing in een ander medium worden gekozen. Van andere media dan water moeten de toxicologische karakteristieken bekend zijn. De stabiliteit van de teststof in het vehiculum moet worden vastgesteld.

1.4.2. Proefomstandigheden

1.4.2.

1.4.2.1. Proefdieren De voorkeur wordt gegeven aan ratten, hoewel andere knaagdiersoorten kunnen worden gebruikt. Er dient gebruik te worden gemaakt van jonge gezonde volwassen dieren van rattenstammen die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn. De toediening moet zo snel mogelijk na het verspenen beginnen en in ieder geval vóór de dieren negen weken oud zijn. Bij het begin van de studie moet de gewichtsvariatie van de dieren minimaal zijn en mag het gewicht van ieder dier niet meer dan 20 % afwijken van het gemiddelde gewicht. Als een proef met herhaalde orale toediening wordt uitgevoerd als inleiding op een studie van langere duur, moeten de dieren in beide studies bij voorkeur tot dezelfde stam behoren en dezelfde oorsprong hebben.

1.4.2.2. Aantal en geslacht Op ieder dosisniveau moeten ten minste 10 dieren (5 mannetjes en 5 wijfjes) worden gebruikt. Indien het de bedoeling is sommige dieren tussentijds te doden, moet het aantal dieren worden verhoogd met het aantal dat volgens de proefopzet tussentijds zal worden gedood. Daarnaast kan een satellietgroep van 10 dieren (5 per geslacht) gedurende 28 dagen worden behandeld met het hoge dosisniveau en vervolgens gedurende 14 dagen na de behandeling worden geobserveerd om na te gaan of de toxische effecten eventueel verdwijnen, voortduren of pas later tot uiting komen. Tevens wordt een satellietgroep van 10 controledieren (5 per geslacht) gebruikt.

1.4.2.3. Dosisniveaus In het algemeen zijn drie testgroepen en een controlegroep vereist. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren van de controlegroep op dezelfde wijze worden behandeld als de dieren in de testgroep Indien een vehiculum wordt gebruikt bij het toedienen van de teststof moet de controlegroep het grootste gebruikte volume van dat vehiculum toegediend krijgen. Als uit andere gegevens kan worden geconcludeerd dat bij een dagelijkse dosis van 1000 mg/kg lichaamsgewicht geen effecten worden verwacht, kan een limiettest worden uitgevoerd. Als er geen bruikbare gegevens beschikbaar zijn, kan een studie worden uitgevoerd om de orde van grootte van de te gebruiken doses te helpen bepalen. De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van de bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica van de teststof en verwante stoffen. Het hoogste dosisniveau moet zó gekozen worden dat toxische effecten optreden, maar geen sterfte of ernstig lijden. Verder moet een dalende reeks doses worden gekozen met het oog op het vaststellen van een eventuele dosis-responsrelatie en het niveau zonder schadelijk effect (NOAEL) op het laagste dosisniveau. Dosisniveaus die telkens een factor 2 à 4 verschillen zijn vaak optimaal. Toevoeging van een vierde testgroep is vaak te prefereren boven een zeer groot niveauverschil (bijvoorbeeld een factor 10 of meer) tussen de opvolgende doses. Indien de stoffen via de voeding of het drinkwater worden toegediend is het van belang erop te letten dat de betrokken hoeveelheden teststof de normale voedings- of waterbalans niet verstoren. Als de teststof via de voeding wordt toegediend kan een vaste concentratie in de voeding (ppm) worden gebruikt óf een constant dosisniveau in termen van het lichaamsgewicht van het dier. Aangegeven moet worden welk alternatief is gebruikt. Bij gebruik van een maagsonde voor het toedienen van de teststof moet de dosis iedere dag op hetzelfde tijdstip worden gegeven en zo nodig worden aangepast om een constant dosisniveau per kg lichaamsgewicht te handhaven. Als een studie met herhaalde toediening wordt gebruikt als voorloper van een studie op lange termijn moet bij beide studies soortgelijk voedsel worden verstrekt.

1.4.2.4. I.imiettest Als volgens de hier beschreven procedures een proef wordt uitgevoerd met een dosisniveau van ten minste 1000 mg/kg lichaamsgewicht per dag — of, in het geval van toediening via het voedsel of het drinkwater, het equivalente percentage in het voedsel of het water (berekend overeenkomstig het lichaamsgewicht) — en er geen waarneembare toxische effecten optreden, en deze ook niet kunnen worden verwacht op grond van gegevens betreffende stoffen met verwante structuur, is het niet noodzakelijk een volledige proef met drie dosisniveaus te doen. De limiettest is van toepassing tenzij het niveau waarop de mens kan worden blootgesteld, testen met een hogere dosis noodzakelijk maakt.

1.4.2.5. Observatieperiode De dieren moeten 28 dagen worden geobserveerd. Dieren uit een satellietgroep die bestemd is voor vervolgwaarnemingen moeten daarna nog ten minste 14 dagen zonder behandeling worden geobserveerd om de persistentie van de toxische effecten c.q. het herstel alsmede het eventuele optreden van vertraagde toxiciteit te kunnen waarnemen.

1.4.3. Procedure De dieren krijgen de teststof gedurende 28 dagen zeven maal per week toegediend. Indien de teststof vijf maal per week wordt toegediend moet dit worden verantwoord. Als de teststof wordt toegediend via een maagsonde, moet dit in één keer gebeuren onder gebruikmaking van een maagcatheter of een geschikte intubatiecanule. De maximale hoeveelheid vloeistof die per keer kan worden toegediend hangt af van de grootte van het dier. Het volume mag niet meer zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht, behalve als er een waterige oplossing wordt gebruikt, in welk geval 2 ml/100 g lichaamsgewicht is toegestaan. Met uitzondering van irriterende of bijtende stoffen, die gewoonlijk hevigere effecten veroorzaken bij hogere concentraties, moet de variabiliteit van het testvolume worden geminimaliseerd door aanpassing van de concentratie, zodat op alle dosisniveaus hetzelfde constante testvolume wordt gebruikt.

1.4.3.

1.4.3.1. Algemene observaties Algemene klinische waarnemingen moeten ten minste eenmaal per dag plaatsvinden, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met in achtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. De gezondheidstoestand van de dieren moet worden geregistreerd. De dieren moeten ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziekteverschijnselen en sterfte. Stervende dieren en dieren die in grote nood verkeren of hevige pijn lijden moeten worden verwijderd, op humane wijze afgemaakt en aan een necropsie onderworpen. Alle dieren worden éénmaal voor het begin van de proef nauwkeurig klinisch onderzocht (om intra-individuele vergelijking mogelijk te maken) en vervolgens ten minste eenmaal per week. Dit onderzoek moet buiten de kooi op een vaste onderzoekplaats en bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip uitgevoerd worden. De resultaten moeten zorgvuldig worden geregistreerd, waarbij bij voorkeur gebruik wordt gemaakt van scoringsystemen die expliciet door het testlaboratorium zijn vastgelegd. Er moet zoveel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de proefomstandigheden minimaal zijn en dat de waarnemers niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan. Tekenen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon ademhalingspatroon. Veranderingen in gang, houding en respons op vasthouden en ook het uitvoeren van clonische of tonische bewegingen, stereotypen (bij voorbeeld excessief poetsgedrag, ronddraaien) of afwijkend gedrag (bijvoorbeeld zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden geregistreerd. Gedurende de vierde week van de blootstelling moet de sensorische reactiviteit op stimuli van verschillende aard (auditief, visueel en proprioceptief) worden bepaald en moet een bepaling van de grijpkracht en de motorische activiteit plaatsvinden. Nadere bijzonderheden omtrent de te volgen procedures zijn te vinden in de literatuur (zie algemene inleiding deel B). Als de studie wordt verricht als voorstudie op een daaropvolgende subchronische (90-daagse) studie, kunnen functionele observaties in de vierde week achterwege worden gelaten. In dat geval moeten de functionele observaties in het bedoelde vervolgonderzoek plaatsvinden. Daar staat echter tegenover dat de beschikbaarheid van gegevens betreffende functionele prestaties uit de studie met herhaalde toediening, de keuze van de dosisniveaus voor de daaropvolgende subchronische studie ten goede kan komen. Bij wijze van uitzondering kunnen functionele observaties ook achterwege blijven bij groepen die verder dermate sterke toxiciteitseffecten vertonen dat het testen van de functionele prestaties daardoor ernstig wordt gehinderd.

1.4.3.2. Lichaamsgewicht en voedel/waterconsumptie Ieder dier moet ten minste eenmaal per week worden gewogen. De opgenomen hoeveelheid voedsel en water moet minstens eenmaal per week worden gemeten. Indien de teststof via het drinkwater wordt toegediend moet de waterconsumptie ook minstens eenmaal per week worden gemeten.

1.4.3.3. Hematologie Aan het eind van de testperiode moeten de volgende onderzoeken worden verricht: bepaling van de hematocriet en de homoglobineconcentratie, erythrocytentelling, totale en differentiële leuko-cytentelling, plaatjestelling en bepaling van de stollingstijd en het stollingsvermogen. De bloedmonsters worden genomen net vóór of tijdens het afmaken van de dieren; er dient te worden genoteerd uit welk lichaamsdeel. De monsters moeten onder de juiste omstandigheden worden bewaard.

1.4.3.4. Klinische biochemie Om belangrijke toxische effecten op de weefsels en met name op de nieren en de lever te onderzoeken, moet klinisch-biochemisch onderzoek verricht worden op bloedmonsters van alle dieren, met uitzondering van de dieren die stervend zijn aangetroffen of die voortijdig zijn afgemaakt. Deze monsters moeten juist vóór het afmaken of als onderdeel van de procedure hiervoor worden genomen. Het verdient aanbeveling om de dieren vóór het bloedafnemen een nacht te laten vasten. Onderzoek van plasma en serum moet omvatten: natrium, kalium, glucose, totaal cholesterol, ureum, creatinine, totaal proteïne en albuminc, ten minste twee enzymen die een indicatie geven van hepatocellulaire effecten (zoals alanineaminotransferase, aspartaataminotransferase, alkalische fosfatase, gamma- glutamyltranspeptidase en sorbitoldehydrogenase). Bepaling van andere enzymen (van hepatische of andere oorsprong) en galzuren kan onder bepaalde omstandigheden nuttige informatie geven. De volgende facultatieve urineanalysebepalingen kunnen tijdens de laatste week van het onderzoek worden uitgevoerd op basis van een volgens een vast tijdschema verlopende urinemonsterneming: aspect, hoeveelheid, osmolaliteit of dichtheid, pH, proteïnen, glucose en bloed/bloedcellen. Verder moet een onderzoek naar serummarkers van algemene weefselschade overwogen worden. Andere onderzoeken die moeten worden uitgevoerd als van de teststof bekend is, of vermoed wordt, dat zij de desbetreffende metabolische profielen beïnvloedt, zijn: calcium, fosfaat, triglyce-riden (nuchterwaarde), specifieke hormonen, methemoglobine en cholesterinase. Deze moeten in het geval van teststoffen uit bepaalde klassen c.q. van geval tot geval worden geïndentificeerd. In het algemeen is een flexibele aanpak noodzakelijk, afhankelijk van het soort proefdieren en het waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde stof. Als bij gebrek aan referentiegegevens geen adequate vergelijkingsbasis voorhanden is, moet worden overwogen om hematologische en klinisch-biochemische variabelen te bepalen vóór met de toediening wordt begonnen.

1.4.3.5. Macroscopische necropsie Alle proefdieren uit het onderzoek moeten worden onderworpen aan een volledige, gedetailleerde macroscopische necropsie, die onder meer een zorgvuldig onderzoek van het uitwendige oppervlak van het lichaam, alle lichaamsopeningen en de hersen-, borst- en buikholte en de organen daarin omvat. De lever, nieren, bijnieren, testes, bijballen, zwezerik, milt, hersenen en het hart van alle dieren moeten worden ontdaan van alle aanhangend weefsel en zo snel mogelijk na dissectie in natte toestand worden gewogen om uitdroging te voorkomen. De volgende weefsels moeten worden geconserveerd in het fixeermiddel dat zowel voor het type weefsel als het voorgenomen histopathologische onderzoek het meest geschikt is: alle grotere laesies, hersenen (representatieve delen waaronder de grote en kleine hersenen en de brug van Varol), ruggenmerg, maag, dunne en dikke darm met plaques van Peyer, lever, nieren, bijnieren, milt, hart, zwezerik, schildklier, luchtpijp en longen (conserveren door opblazen met een fixatief en dan onderdompelen), geslachtsklieren, secundaire geslachtsorganen (bij voorbeeld uterus, prostaat), urineblaas, lymfeklieren (bij voorkeur een klier die in de route van de toediening gelegen is en één die daar ver van verwijderd is, om rekening te houden met systemische effecten), perifere zenuwen (grote heupzenuw of scheenbeenzenuw), bij voorkeur dicht bij de spier, en een coupe van het beenmerg (of, in plaats daarvan, een direct op een objectglaasje aangebracht stukje opgezogen beenmerg). De resultaten van het klinische onderzoek en van andere onderzoeken kunnen aanleiding zijn om nog andere weefsels te bestuderen. Ook moeten alle andere organen worden, geconserveerd die, voor zover bekend is van de eigenschappen van de teststof, waarschijnlijk als doelorgaan fungeren.

1.4.3.6. Histopathologisch onderzoek Bij de dieren in de met de hoogste dosisniveau behandelde groep en bij de dieren in de controlegroep moet een volledig histopathologisch onderzoek worden verricht op de geconserveerde organen en weefsels. Als met de behandeling samenhangende veranderingen worden geconstateerd in de groep met de hoogste dosering, moet het onderzoek worden uitgebreid tot de dieren van alle andere doseringsgroepen. Alle grotere laesies moeten worden onderzocht. Indien gebruik wordt gemaakt van een satellietgroep moet ook daarbij histopathologisch onderzoek worden verricht op alle organen die in de behandelde groep effecten vertonen.

2. GEGEVENS Er moeten individuele gegevens worden verstrekt. Verder moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen die voor iedere proefgroep laten zien: het aantal dieren aan het begin van de test, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of om ethische redenen is afgemaakt en het tijdstip waarop, het aantal dat verschijnselen van toxiciteit vertoonde, een beschrijving van de waargenomen toxiciteitsverschijnselen, waaronder het tijdstip van aanvang, de duur en ernst van de verschijnselen, het aantal dieren dat laesies vertoonde, het soort laesie en het percentage dieren dat elk soort laesie vertoonde. Zo mogelijk moeten de numerieke resultaten met behulp van een geschikte en algemeen geaccepteerde statistische methode worden geëvalueerd. De gebruikte methoden moeten reeds bij het ontwerpen van de studie worden gekozen.

3. RAPPORTAGE

3. VERSLAG VAN HET ONDERZOEK

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

Proefdieren:

diersoort/stam;

aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;

herkomst, behuizing, voeding enz.;

individueel gewicht als bepaald aan het begin van de test, daarna met wekelijkse intervallen en aan het einde van de test.

Proefomstandigheden:

motivering van de keuze van het vehiculum als dit geen water was;

motivering voor de keuze van het dosisniveau;

bijzonderheden over de bereiding van het teststof/voedselpreparaat, bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat;

bijzonderheden over het toedienen van de teststof;

conversie van teststofconcentratie in voedsel/drinkwater (ppm) naar actuele dosis (mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;

bijzonderheden over het soort voedsel en het drinkwater.

Resultaten:

lichaamsgewicht/veranderingen hierin;

voedsel- en waterconsumptie, indien van toepassing;

gegevens over de toxische respons, waaronder tekenen van toxiciteit, uitgesplitst per geslacht en dosisniveau;

aard, ernst en duur van de klinische verschijnselen (al of niet reversibel);

sensorische activiteit, grijpkracht en motorische activiteit;

hematologisch onderzoek {met relevante vergelijkingsbasis);

klinisch-biochemisch onderzoek (met relevante vergelijkingsbasis);

lichaamsgewicht bij het afmaken en gegevens over het gewicht van de organen;

resultaten van de necropsie;

een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen;

absorptiegegevens, indien beschikbaar;

statistische verwerking van de gegevens, waar relevant.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4. LITERATUUR Deze methode komt overeen met TG 407 van de OESO.

B.8. TOXICITEIT (INHALATIE) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)

B.8.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Het is nuttig om over oriënterende informatie te beschikken ten aanzien van de deeltjesgrootteverdeling, de dampspanning, het smeltpunt, het kookpunt, het vlampunt en het ontploffingsgevaar (indien van toepassing) van de te onderzoeken stof. Zie verder algemene inleiding deel B (punt A).

1.2. DEFINITIES Zie algemene inleiding deel B (punt B).

1.3. REFERENTIESTOFFEN Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Verscheidene groepen proefdieren worden gedurende een periode van 28 dagen dagelijks een bepaalde tijd aan geleidelijk stijgende concentraties van de teststof blootgesteld. Er wordt een concentratie per groep gebruikt. Indien een medium wordt gebruikt om de juiste concentratie van de teststof in de atmosfeer te bereiken, moet een mediumcontrolegroep worden toegevoegd. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.1. Voorbereidingen Vóór het onderzoek worden de dieren ten minste 5 dagen onder gelijke huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als gedurende de proef. Gezonde jonge dieren worden op willekeurige wijze voor het onderzoek in het vereiste aantal groepen ingedeeld. Waar nodig wordt een passend medium aan de teststof toegevoegd teneinde de juiste concentratie van de teststof in de atmosfeer te bereiken. Indien een medium of andere additieven worden gebruikt om de dosering te vergemakkelijken, moet bekend zijn dat deze geen toxische effecten veroorzaken. In voorkomend geval kunnen bestaande gegevens worden gebruikt.

1.6.2. Proefomstandigheden

1.6.2.

1.6.2.1. Proefdieren Tenzij er contra-indicaties zijn, wordt de voorkeur gegeven aan ratten. Er dient gebruik te worden gemaakt van jonge gezonde dieren van rattenstammen die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt. Bij het begin van de studie mag het gewicht van de dieren die bij de test worden gebruikt niet meer dan ± 20 % van het betreffende gemiddelde gewicht afwijken.

1.6.2.2. Aantal en geslacht Voor iedere testgroep moeten ten minste tien dieren (vijf wijfjes en vijf mannetjes) worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en niet zwanger. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal worden verhoogd met het aantal dieren dat volgens plan voor de voltooiing van de studie zal worden gedood. Daarnaast kan een satellietgroep van tien dieren (vijf per geslacht) gedurende 28 dagen worden behandeld met het hoogste concentratieniveau, waarna zij nog gedurende 14 dagen na de behandeling worden geobserveerd om na te gaan of de toxische effecten eventueel verdwijnen, voortduren of pas later tot uiting komen. Tevens wordt een satellietgroep van tien controledieren (vijf per geslacht) gebruikt.

1.6.2.3. Blootstellingsconcentraties Ten minste drie concentraties met een controle of een mediumcontrole (overeenkomend met de concentratie van het medium bij het hoogste expositieniveau), indien een medium wordt gebruikt, zijn vereist. Afgezien van de toediening van de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze als de dieren in de testgroepen worden behandeld. De hoogste concentratie moet leiden tot toxische effecten, maar er mogen geen of weinig sterfgevallen voorkomen. Bij de laagste concentratie mogen geen tekenen van toxiciteit optreden. Indien het blootstellingsniveau van de mens kan worden geschat, moet de laagste concentratie deze overschrijden. In het ideale geval treden bij de middelste concentratie minimaal waarneembare toxische effecten op. Bij meer dan één tussenconcentratie moet het verschil tussen de concentraties zo groot zijn dat een gradatie in toxische effecten wordt verkregen. In de groep met de laagste concentratie, in de tussengroepen en in de controlegroepen mogen niet veel sterfgevallen voorkomen, omdat anders een zinvolle evaluatie van de resultaten niet mogelijk is.

1.6.2.4. Blootstellingstijd De dagelijkse blootstellingstijd bedraagt 6 uur, maar een afwijkende duur kan in verband met specifieke vereisten nodig zijn.

1.6.2.5. Apparatuur De dieren worden aan de teststoffen blootgesteld met behulp van inhalatieapparatuur die zodanig is gebouwd dat kan worden gezorgd voor een dynamische luchtdoorstroming van ten minste 12 luchtverversingen per uur, een toereikend zuurstofgehalte en een gelijkmatige verdeling van de teststof in de atmosfeer. Als van een expositiekamer gebruik wordt gemaakt, moet deze op zodanige wijze zijn ontworpen dat de dieren zo min mogelijk bij elkaar kunnen kruipen en zoveel mogelijk door inhalatie aan de teststof worden blootgesteld. Als algemene regel voor het verzekeren van een stabiele atmosfeer in de expositiekamer geldt dat het totale volume van de proefdieren niet méér mag bedragen dan 5 % van het volume van de blootstellingskamer. Naar keuze kunnen de dieren oronasaal, alleen met hun kop of individueel met hun hele lijf aan de testlucht worden blootgesteld; de eerste twee methoden zullen ertoe bijdragen dat zo min mogelijk teststof via andere wegen in het lichaam wordt opgenomen.

1.6.2.6. Observatieperiode De proefdieren moeten tijdens de gehele periode van behandeling en herstel dagelijks op tekenen van toxiciteit worden onderzocht. Het tijdstip waarop de dood intreedt, het tijdstip waarop toxische verschijnselen voor het eerst zijn waargenomen en het tijdstip waarop zij weer verdwijnen, moeten worden genoteerd.

1.6.3. Uitvoering De dieren worden gedurende een periode van 28 dagen, 5 tot 7 dagen per week aan de teststof blootgesteld. Dieren in satellietgroepen voor latere waarnemingen moeten nog 14 dagen zonder behandeling worden gehouden om herstel of voortduren van de toxische effecten te kunnen vaststellen. Tijdens de proefnemingen dient de temperatuur op 22 oC ± 3 oC te worden gehouden. In het ideale geval moet de relatieve vochtigheid tussen 30 % en 70 % worden gehouden, behalve waar dit niet goed uitvoerbaar is (bijvoorbeeld bij het testen van sommige aerosolen). Het onderhouden van een lichte onderdruk (< 5 mm water) voorkomt het weglekken van de teststof naar de omgeving. Gedurende de blootstelling worden de dieren voedsel en water onthouden. Er moet gebruik worden gemaakt van een dynamisch inhalatiesysteem met een geschikt systeem voor de analytische controle van de concentratie. Aanbevolen wordt in een verkennende proef vast te stellen welke blootstellingsconcentraties voor de proeven het meest geschikt zijn. De doorstromingssnelheid moet zodanig worden aangepast dat de condities in de expositiekamer homogeen zijn. Het systeem moet waarborgen dat de omstandigheden bij de proef zo spoedig mogelijk stabiel zijn. De volgende parameters moeten worden gemeten of gemonitord: Tijdens en na de blootstelling worden waarnemingen gedaan die voor elk individueel dier systematisch worden geregistreerd. Alle dieren moeten dagelijks worden geobserveerd; tekenen van toxiciteit moeten worden genoteerd met het tijdstip waarop deze voor het eerst optreden en de mate en de duur ervan. Bij het observeren wordt in ieder geval aandacht besteed aan veranderingen van huid en vacht, ogen, slijmvliezen, ademhalingsorganen, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit en gedrag. Wekelijks moeten de dieren worden gewogen. Het wordt eveneens aanbevolen het voerverbruik wekelijks te meten. De dieren moeten regelmatig worden geobserveerd, om te voorkomen dat ze voor de studie verloren gaan als gevolg van oorzaken als kannibalisme, autolyse van weefsels of omdat de dieren in verkeerde kooien zijn geplaatst. Na afloop van de onderzoekperiode wordt bij alle overlevende dieren in de behandelde groepen (afgezien van de dieren in de satellietgroep) necropsie verricht. Stervende dieren of dieren met hevige angst of pijn, moeten meteen na ontdekking worden verwijderd en op een humane manier worden gedood; bij hen wordt eveneens necropsie verricht. Na afloop van de proeven moet bij alle dieren, met inbegrip van die uit de controlegroep, het volgende worden onderzocht: Voor een goede toxicologische evaluatie kan het nodig zijn het onderzoek uit te breiden met: calcium, fosfor, chloride, natrium, kalium, glucosegehalte in nuchtere toestand, analyse van de lipiden, hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglobine en cholinesterase-activiteit. Zo nodig kan verder klinisch-biochemisch onderzoek worden verricht om het onderzoek van de waargenomen effecten uit te breiden.

1.6.3. a)

de luchtdoorstromingssnelheid (luchtdebiet) (continu);

de feitelijke concentratie van de teststof in het ademhalingsgebied. Tijdens de dagelijkse blootstelling mag de concentratie met niet méér dan ± 15 % van het gemiddelde afwijken. Bij sommige aerosolen is het mogelijk dat de concentratie niet binnen deze grenzen gehouden kan worden; in dat geval kan een grotere afwijking worden aanvaard. Tijdens de gehele duur van de studie moeten de dagelijkse concentraties zo constant mogelijk worden gehouden. Voor aerosolen moet ten minste éénmaal per week bij elke testgroep de deeltjesgrootteverdeling worden geanalyseerd;

de temperatuur en de vochtigheid (continu, indien mogelijk);

hematologie, waarbij ten minste bepaling van hematocriet en hemoglobinegehalte, erythrocytentelling, totale en gedifferentieerde telling van de leucocyten en meting van stollingseigenschappen moeten worden uitgevoerd;

ii)

klinisch-biochemische bepalingen in het bloed waarbij ten minste één parameter van de leverfunctie en nierfunctie wordt bekeken: serum alanineaminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-py-rodruivenzuur-transaminase (SGPT)), serum aspartaataminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-oxaalazijnzuur-transaminase (SGOT)), ureum, albumine, bloedcreatinine, totaal bilirubine en totaal serumeiwit.

1.6.3.1. Macroscopische necropsie Bij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische necropsie worden uitgevoerd. Zo spoedig mogelijk na sectie moeten ten minste lever, nieren, bijnieren, longen en testes nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Organen en weefsels (de ademhalingswegen, lever, nieren, milt, testes, bijnieren, hart en alle organen die macroscopisch waarneembare afwijkingen of veranderingen in omvang vertonen) moeten in een geschikt medium worden bewaard voor eventueel histopathologisch onderzoek. De longen moeten in hun geheel worden verwijderd, gewogen en behandeld worden met een geschikt fixatief om ervoor te zorgen dat de longstructuur intact blijft.

1.6.3.2. Histopathologisch onderzoek Bij de dieren in de hoge concentratiegroep en bij de dieren in de controlegroep(en) moet histopathologisch onderzoek op de bewaarde organen en weefsels worden verricht. Organen en weefsels die bij het hoogste concentratieniveau door de teststof blijken te zijn beschadigd, moeten in alle groepen met een lagere dosering worden onderzocht. Bij het histopathologisch onderzoek van dieren in satellietgroepen moet speciaal worden gelet op organen en weefsels waar, bij de andere behandelde groepen, effecten blijken te zijn opgetreden.

2. GEGEVENS De volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen worden samengevat: het aantal dieren bij het begin van het onderzoek en het aantal dieren waarbij ieder type beschadiging voorkomt. Alle waargenomen resultaten moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd. Iedere erkende statistische methode kan hiervoor worden gebruikt.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzovoort;

proefomstandigheden: Beschrijving van de blootstellingsapparatuur met inbegrip van ontwerp, type, afmetingen, luchtbron, systeem voor het genereren van aerosolen, methode van luchtconditionering, behandeling van de afgevoerde lucht en de wijze waarop de dieren tijdens de proeven in een blootstellingskamer zijn ondergebracht als deze is gebruikt. Er moet een beschrijving worden gegeven van de apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid en, in voorkomend geval, de stabiliteit van de concentratie of de deeltjesgrootteverdeling van de aerosolen. Gegevens betreffende de blootstelling: Deze moeten tabellarisch worden gerangschikt en worden voorzien van gemiddelde waarden en een maat voor de variabiliteit (bijvoorbeeld standaardafwijking}. Zij dienen zo mogelijk te omvatten:

3.1. pt_2 a)

de luchtdoorstromingssnelheid (luchtdebiet) door de inhalatieapparatuur;

temperatuur en vochtigheid van de lucht;

nominale concentraties (de totale hoeveelheid teststof die de inhalatieapparatuur wordt binnengeleid, gedeeld door het luchtvolume);

aard van het eventuele medium;

feitelijke concentraties van de teststof in het ademhalingsgebied van de dieren;

massamediaan van de aërodynamische diameter (MMAD) en de geometrische standaardafwijking (GSD);

gegevens over de toxische reactie per geslacht en concentratie;

tijdstip gedurende de studie waarop de dood intreedt, of aangeven of de dieren tot het einde van de proef in leven bleven;

beschrijving van toxische of andere effecten; hoogste niveau waarbij geen effect wordt waargenomen;

tijdstip waarop een abnormaal verschijnsel wordt waargenomen en het verloop hiervan;

gegevens over voedselconsumptie en lichaamsgewicht;

uitgevoerde hematologische proeven en alle resultaten;

uitgevoerde klinisch-biochemische proeven en alle resultaten;

bevindingen bij de necropsie;

een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen;

waar mogelijk statistische behandeling van de resultaten;

bespreking van de resultaten;

interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE Zie algemene inleiding deel B (punt D).

4. LITERATUUR Zie algemene inleiding deel B (punt E).

B.9. TOXICITEIT (DERMAAL) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)

B.9.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Zie algemene inleiding deel B (punt A).

1.2. DEFINITIES Zie algemene inleiding deel B (punt B).

1.3. REFERENTIESTOFFEN Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks in geleidelijk stijgende doseringen op de huid van verscheidene groepen proefdieren aangebracht. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van de proef leven, wordt necropsie verricht.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.

1.6.1. Voorbereidingen Voor het onderzoek worden de dieren ten minste 5 dagen onder gelijke huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tijdens de proef voorkomen. Gezonde jonge dieren worden op willekeurige wijze voor de behandeling ingedeeld bij testgroepen en controlegroepen. Kort voor de proef wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de proefdieren geknipt; het haar kan ook worden geschoren, maar dit moet dan ongeveer 24 uur voor de proef worden gedaan. Gewoonlijk zal het dier ongeveer om de week opnieuw moeten worden geknipt of geschoren. Bij het knippen of scheren moet erop worden gelet dat de huid niet wordt bekrast. Ten minste 10 % van de lichaamsoppervlakte moet voor het aanbrengen van de teststof worden onthaard. Bij het bepalen van de oppervlakte die moet worden onthaard en de afmetingen van de aan te brengen bedekking moet rekening worden gehouden met het gewicht van het dier. Bij een proef met vaste stoffen, die eventueel tot poeder kunnen worden fijngemaakt, moet de teststof voldoende met water of, zo nodig, met een passend medium worden bevochtigd, zodat de stof goed in contact met de huid komt. Vloeibare teststoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt. De teststof wordt gedurende 5 tot 7 dagen per week dagelijks aangebracht.

1.6.2. Proefomstandigheden

1.6.2.

1.6.2.1. Proefdieren Er kan gebruik worden gemaakt van volwassen ratten, konijnen of cavia's. Ook andere diersoorten kunnen worden gebruikt, maar de noodzaak hiervoor moet worden aangetoond. Bij het begin van de studie mag het gewicht van de dieren die bij de test worden gebruikt niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.

1.6.2.2. Aantal en geslacht Voor ieder dosisniveau moeten ten minste tien dieren (vijf wijfjes en vijf mannetjes) met een gezonde huid worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en niet zwanger. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal worden verhoogd met het aantal dieren dat volgens plan voor de voltooiing van de studie zal worden gedood. Daarnaast kan een satellietgroep van tien dieren (vijf per geslacht) gedurende 28 dagen worden behandeld met het hoge dosisniveau waarna zij nog gedurende 14 dagen na de behandeling worden geobserveerd om na te gaan of de toxische effecten eventueel verdwijnen, voortduren of pas later tot uiting komen. Tevens wordt een satellietgroep van tien controledieren (vijf per geslacht) gebruikt.

1.6.2.3. Dosisniveau Ten minste drie dosisniveaus, met een controlegroep of een mediumcontrolegroep, indien een medium wordt gebruikt, zijn vereist. De expositieduur moet ten minste 6 uur per dag bedragen. De teststof moet iedere dag op ongeveer dezelfde tijd worden aangebracht; op vastgestelde tijden (iedere week of twee keer per week) is een correctie vereist om ervoor te zorgen dat het dosisniveau in verhouding tot het lichaamsgewicht van het dier constant blijft. Afgezien van de toediening van de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze als de dieren in de proefgroep worden behandeld. Indien een medium is gebruikt om het doseren te vergemakkelijken moet aan de mediumcontrolegroep op dezelfde wijze als aan de testgroep een dosis van het medium worden toegediend en deze dosis moet even groot zijn als die van de dieren in de groep met het hoogste dosisniveau. Het hoogste dosisniveau van de teststof moet leiden tot toxische effecten, maar er mogen geen of weinig sterfgevallen voorkomen. Bij het laagste dosisniveau mogen geen tekenen van toxiciteit optreden. Indien het blootstellingsniveau van de mens kan worden geschat, moet het laagste niveau deze overschrijden. In het ideale geval treden bij het middelste dosisniveau minimaal waarneembare toxische effecten op. Bij meer dan één tussendosis moet het verschil tussen de dosisniveaus zo groot zijn dat een gradatie in toxische effecten wordt verkregen. In de groep met de laagste dosis en in de tussengroepen, alsmede in de controlegroepen, mogen niet veel sterfgevallen voorkomen, omdat anders een zinvolle evaluatie van de resultaten niet mogelijk is. Indien toediening van de teststof tot ernstige huidirritatie leidt, moeten de concentraties worden verlaagd, wat vermindering of ontbreken van andere toxische effecten bij het hoge dosisniveau tot gevolg kan hebben. Indien de huid ernstig is beschadigd, kan het zelfs noodzakelijk zijn de studie te beëindigen en een nieuwe studie met lagere concentraties te beginnen.

1.6.2.4. Limiettest Indien bij een verkennende proef geen toxische effecten optreden bij een dosisniveau van 1000 mg/kg, of een hoger niveau dat verband houdt met het niveau waaraan de mens, voor zover bekend, kan worden blootgesteld, is het wellicht niet noodzakelijk om verdere proeven te nemen.

1.6.2.5. Observatieperiode De proefdieren moeten dagelijks worden onderzocht op tekenen van toxiciteit. Het tijdstip waarop de dood intreedt, het tijdstip waarop toxiciteitsverschijnselen voor het eerst zijn waargenomen en het tijdstip waarop zij weer verdwijnen, moeten worden opgetekend.

1.6.3. Uitvoering De dieren moeten afzonderlijk in kooien worden gehuisvest. De dieren worden gedurende een periode van 28 dagen, zo mogelijk 7 dagen per week, met de teststof behandeld. Dieren in eventuele satellietgroepen voor latere waarnemingen moeten nog 14 dagen zonder behandeling worden gehouden om herstel of voortduren van de toxische effecten te kunnen vaststellen. De blootstellingstijd moet 6 uur per dag bedragen. De teststof moet gelijkmatig worden aangebracht over een oppervlakte van ongeveer 10 % van de totale lichaamsoppervlakte. Bij zeer toxische stoffen kan de te bedekken oppervlakte kleiner zijn, maar een zo groot mogelijke oppervlakte moet worden bedekt met een zo dun en gelijkmatig mogelijk aangebrachte laag. De teststof moet gedurende de blootstellingstijd door middel van poreus gaasverband en niet-irriterend plakband in contact met de huid worden gehouden. Het testgedeelte van de huid moet op geschikte wijze verder worden bedekt om het verbandgaas en de teststof op hun plaats te houden en om te verhinderen dat de dieren de teststof via de mond opnemen. Hulpmiddelen om de dieren te fixeren kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat de dieren de teststof via de mond opnemen, maar het wordt niet aangeraden de dieren volledig te immobiliseren. Als alternatief kan een beschermende halskraag worden gebruikt. Aan het einde van de blootstellingsperiode wordt de resterende teststof zo mogelijk met water van de huid verwijderd of anders door middel van een andere geschikte reinigingstechniek. Alle dieren moeten dagelijks worden geobserveerd; tekenen van toxiciteit moeten worden genoteerd met inbegrip van het tijdstip waarop deze voor het eerst optraden en de mate en de duur ervan. Bij het observeren moet aandacht worden besteed aan veranderingen van de huid, de vacht, de ogen en de slijmvliezen, alsmede ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en het centrale zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en het gedrag. Wekelijks moeten de dieren worden gewogen. Het is eveneens aanbevolen het voerverbruik wekelijks te meten. De dieren moeten regelmatig worden geobserveerd om te voorkomen dat ze voor de studie verloren gaan als gevolg van oorzaken als kannibalisme, autolyse van weefsels of omdat de dieren in verkeerde kooien zijn geplaatst. Na afloop van de onderzoekperiode wordt bij alle overlevende dieren in de behandelde groepen (afgezien van de dieren in de satellietgroep), necropsie verricht. Indien stervende dieren of dieren met hevige nood/ongemak of pijn worden aangetroffen, moeten deze worden verwijderd en op een humane manier worden gedood; bij hen wordt eveneens necropsie verricht. Na afloop van de studie moeten bij alle dieren, met inbegrip van die uit de controlegroepen, de volgende onderzoekingen worden uitgevoerd: Voor een goede toxicologische evaluatie kan het nodig zijn het onderzoek uit te breiden met: calcium, fosfor chloride, natrium, kalium, glucosegehalte bij nuchtere toestand, analyse van de lipiden, hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglobine en cholinesterase-activiteit. Zo nodig kan verder klinisch-biochemisch onderzoek worden verricht om het onderzoek van de waargenomen effecten uit te breiden.

1.6.3.

1) Hematologie waarbij ten minste bepaling van hematocriet en hemoglobinegehalte, erythrocytentelling, totale en gedifferentieerde telling van de leucocyten en meting van stollingsvermogen.

2) Klinisch-biochemische bepalingen in het bloed waarbij ten minste één parameter van de lever- en nierfunctie: serum alanineaminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-pyrodruivenzuur-transaminase (SGPT)), serum aspartaataminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-oxaalazijnzuur-transaminase (SGOT)), ureum, albumine, bloedcreatinine, totaal bilirubine en totaal serumeiwit.

1.6.4. Macroscopische necropsie Bij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische necropsie worden uitgevoerd. Zo spoedig mogelijk na sectie moeten ten minste lever, nieren, bijnieren en testes nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Organen en weefsels (de normale en de behandelde huid, lever, nieren, milt, testes, bijnieren, hart en alle organen die macroscopisch waarneembare beschadigingen of veranderingen in omvang vertonen moeten in een geschikt medium worden bewaard voor eventueel later histopathologisch onderzoek.

1.6.5. Histopathologisch onderzoek Bij de dieren in de groep die een hoge dosis heeft ontvangen en bij die in de controlegroep moet histopathologisch onderzoek op de bewaarde organen en weefsels worden verricht. Organen en weefsels die bij het hoogste doseringsniveau door de teststof blijken te zijn beschadigd, moeten in alle groepen met een lagere dosering worden onderzocht. Bij het histopathologisch onderzoek van de dieren in de satellietgroep moet speciaal worden gelet op de organen en weefsels waar, bij de andere behandelde groepen, effecten blijken te zijn opgetreden.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, dieet, enzovoort;

proefomstandigheden (met inbegrip van het soort verband: occlusief of niet-occlusief);

dosisniveaus (met het eventueel medium) en concentraties;

waar mogelijk het hoogste dosisniveau waarbij geen effect optreedt;

gegevens over de toxische reactie naar geslacht en dosis;

tijdstip gedurende de studie waarop de dood intreedt, of aangeven of dieren tot het eind van de proef bleven leven;

toxische of andere effecten;

tijdstip waarop een abnormaal verschijnsel werd waargenomen en het verloop hiervan;

gegevens over voedsel en lichaamsgewicht;

uitgevoerde hematologische proeven en alle resultaten;

uitgevoerde klinisch-biochemische proeven en alle resultaten;

bevindingen bij de necropsie;

een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen;

waar mogelijk statistische behandeling van de resultaten;

bespreking van de resultaten;

interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE Zie algemene inleiding deel B (punt D).

4. LITERATUUR Zie algemene inleiding deel B (punt E).

B.10. MUTAGENITEIT — IN-VITRO TEST OP CHROMOSOOMAFWIJKINGEN IN ZOOGDIERCELLEN

B.10.

1. METHODE Deze methode is overgenomen van TG 473 van de OESO: In-vitro test op chromosoomafwijkingen in zoogdiercellen (1997).

1.

1.1. INLEIDING De in-vitrotest op chromosoomafwijkingen is bedoeld om te bepalen welke stoffen structurele chromosoomafwijkingen bij gekweekte menselijke cellen veroorzaken (1)(2)(3). Er zijn twee soorten structurele afwijkingen: het chromosoomtype en het chromatidetype. De meeste chemische mutagenen veroorzaken afwijkingen van het chromatidetype, maar ook het chromosoomtype komt voor. Een toename van polyploïdie kan erop wijzen dat een chemische stof numerieke afwijkingen kan veroorzaken. Deze methode is echter niet opgezet om numerieke afwijkingen te meten en wordt normaal gesproken niet voor dat doel gebruikt. Chromosoommutaties en soortgelijke voorvallen veroorzaken veel genetische ziekten bij de mens en het lijkt er sterk op dat chromosoommutaties en soortgelijke voorvallen die veranderingen in oncogenen en tumorsuppressorgenen van somatische cellen veroorzaken, betrokken zijn bij de inductie van kanker bij de mens en bij proefdieren. Bij de in-vitrotest op chromosoomafwijkingen kunnen culturen van permanente cellijnen, celstammen of primaire celculturen worden gebruikt. De gebruikte cellen worden geselecteerd op basis van het groeivermogen in een cultuur, de stabiliteit van het karyotype, het aantal chromosomen, de verscheidenheid van de chromosomen en de frequentie van spontane chromosoomafwijkingen. Bij in vitro uitgevoerde tests moet er meestal een exogene metabole activeringsbron worden gebruikt. Dit metabole activeringssysteem kan de omstandigheden in een zoogdiercel in vivo niet volledig nabootsen. Er moet goed op worden gelet dat omstandigheden die kunnen leiden tot positieve resultaten die niet het gevolg zijn van intrinsieke mutageniteit maar door veranderingen in de pH of de osmolaliteit of een sterke cytotoxiciteit worden veroorzaakt, worden vermeden (4)(5). Deze test wordt gebruikt voor de screening op mogelijke mutagenen en carcinogenen voor zoogdieren. Veel stoffen die positief op deze test reageren, zijn carcinogeen voor zoogdieren, maar er is geen absolute correlatie tussen deze test en carcinogeniteit. De correlatie is afhankelijk van de chemische klasse en het lijkt er steeds meer op dat er carcinogenen zijn die met deze test worden gesignaleerd omdat ze blijkbaar via andere mechanismen dan directe DNA-beschadiging werken. Zie ook de algemene inleiding van deel B.

1.2. DEFINITIES Afwijking van het chromatidetype: structurele chromosoombeschadiging waarbij breuken in individuele chromatiden ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie. Afwijking van het chromosoomtype: structurele chromosoombeschadiging waarbij breuken in beide chromatiden op dezelfde plaats ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie. Endoreduplicatie: een proces waarbij de kern na een S-fase met DNA-replicatie niet tot mitose overgaat, maar opnieuw een S-fase begint. Het resultaat is chromosomen met 4, 8, 16, ... chromatiden. Hiaat: een achromatische beschadiging die kleiner is dan de breedte van één chromatide en waarbij de fout in de uitlijning van de chromatiden minimaal is. Mitotische index: de verhouding tussen het aantal cellen in de metafase en het totale aantal cellen in een populatie: deze index geeft een indicatie van de snelheid waarmee deze populatie zich voortplant. Numerieke afwijking: een verandering in het aantal chromosomen ten opzichte van het normale aantal dat kenmerkend is voor de gebruikte cellen. Polyploïdie: het voorkomen van een ander veelvoud van het haploïde aantal chromosomen (n) dan het diploïde aantal (d.w.z. 3n, 4n, enz.). Structurele afwijking: een verandering in de chromosoomstructuur die bij microscopisch onderzoek tijdens de metafase van de celdeling kan worden waargenomen in de vorm van deleties, fragmenten en intra- of interchromosomale uitwisselingen.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Celculturen worden zowel met als zonder metabole activering aan de teststof blootgesteld. Op vooraf bepaalde tijdstippen na de blootstelling van de celculturen aan de teststof worden ze met een metafasestopper (bv. Colcemid® of colchicine) behandeld, geoogst en gekleurd en worden de cellen in de metafase microscopisch onderzocht op de aanwezigheid van chromosoomafwijkingen.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.

1.4.1. Voorbereiding

1.4.1.

1.4.1.1. Cellen Er kunnen verschillende soorten cellijnen, stammen of primaire celculturen worden gebruikt, waaronder ook menselijke cellen (bv. fibroblasten van Chinese hamsters of menselijke of van andere zoogdieren afkomstige perifere bloedlymfocyten).

1.4.1.2. Media en kweekomstandigheden Er moet worden gezorgd voor geschikte kweekmedia en incubatieomstandigheden (kweekvat, CO2-concentratie, temperatuur en vochtigheid) voor de culturen. Permanente cellijnen en stammen moeten geregeld worden gecontroleerd om na te gaan of het modale aantal chromosomen stabiel is en er geen besmetting met mycoplasma heeft plaatsgevonden; indien dit laatste het geval is, mogen ze niet worden gebruikt. De normale tijd voor de celcyclus bij de gebruikte cellen en kweekomstandigheden moet bekend zijn.

1.4.1.3. Bereiding van de culturen Permanente cellijnen en stammen: cellen uit stamculturen worden met een zodanige dichtheid in een kweekmedium geënt dat de kolonies voor het oogsten niet aaneengroeien, en bij 37 oC geïncubeerd. Lymphocyten: met een stollingsremmer (bv. heparine) behandeld volledig bloed of geïsoleerde lymfocyten van gezonde proefpersonen worden toegevoegd aan het kweekmedium met een mitogeen (bv. fytohemagglutinine) en bij 37 oC geïncubeerd.

1.4.1.4. Metabole activering De cellen dienen zowel met als zonder een geschikt metabool activeringssysteem aan de teststof te worden blootgesteld. Het meest gebruikte systeem is een post-mitochondriale fractie aangevuld met een cofactor (S9), verkregen uit de lever van knaagdieren die zijn behandeld met enzym-inducerende stoffen als Aroclor 1254 (6)(7)(8)(9) of een mengsel van fenobarbiton en ß-naftoflavon (10)(11)(12). De post-mitochondriale fractie wordt meestal gebruikt bij een concentratie van 1-10 % (v/v) in het uiteindelijke medium. De omstandigheden voor het gebruik van een metabool activeringssysteem kunnen afhankelijk zijn van de aard van de geteste chemische verbinding. In sommige gevallen zal wellicht meer dan een concentratie van de post-mitochondriale fractie moeten worden gebruikt. Een aantal ontwikkelingen, bijvoorbeeld de opbouw van genetisch aangepaste cellijnen waarin specifieke activeringsenzymen tot expressie komen, kan endogene activering mogelijk maken. Voor de keuze van de gebruikte cellijnen moet een wetenschappelijke verantwoording worden gegeven (bv. aan de hand van de relevantie van het cytochroom P450-isoenzym voor het metabolisme van de teststof).

1.4.1.5. Teststof/Bereiding Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media worden opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de behandeling van de cellen worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks aan het testsysteem worden toegediend en/of vóór de behandeling worden verdund. Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, moeten verse bereidingen van de teststof worden gebruikt.

1.4.2. Testomstandigheden

1.4.2.

1.4.2.1. Oplosmiddel/Medium Chemische reacties tussen het oplosmiddel/medium en de teststof moeten uitgesloten zijn en het oplosmiddel/medium moet verenigbaar zijn met het overleven van de cellen en de S9-activiteit. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media worden gebruikt, moeten gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt. Wanneer stoffen worden getest die in water instabiel zijn, moeten de gebruikte organische oplosmiddelen watervrij zijn. Water kan door toevoeging van een moleculaire zeef worden verwijderd.

1.4.2.2. Blootstellingsconcentraties Bij de bepaling van de hoogste concentratie moet onder andere rekening worden gehouden met de cytotoxiciteit, de oplosbaarheid in het testsysteem en veranderingen in de pH of de osmolaliteit. De cytotoxiciteit moet met en zonder metabole activering in het hoofdexperiment worden bepaald aan de hand van adequate indicaties omtrent de integriteit en de groei van de cellen, zoals de mate van confluentie. het aantal levensvatbare cellen of de mitotische index. Het kan nuttig zijn vooraf een apart experiment uit te voeren om de cytotoxiciteit en de oplosbaarheid te bepalen. Er moeten ten minste drie analyseerbare concentraties worden gebruikt. Wanneer er cytotoxiciteit optreedt, moeten deze concentraties een interval van de maximale tot geen of vrijwel geen toxiciteit bestrijken; dit betekent meestal dat de concentraties niet meer dan een factor 2 tot √10 uit elkaar mogen liggen. Bij het oogsten moet de hoogste concentratie een significante verlaging van de mate van confluentie, het aantal cellen of de mitotische index veroorzaken (voor alle parameters meer dan 50 %). De mitotische index is slechts een indirecte maat voor de cytotoxische/cytostatische effecten en is afhankelijk van het tijdstip na de behandeling. De mitotische index is echter aanvaardbaar voor culturen in suspensie, waarbij andere metingen van de toxiciteit omslachtig en onpraktisch kunnen zijn. Informatie over de kinetiek van de celcyclus, zoals de gemiddelde generatietijd (GGT), kan als aanvulling worden gebruikt. De GGT is echter een algeheel gemiddelde waaruit niet altijd blijkt of er achterblijvende deelpopulaties zijn en zelfs een geringe stijging van de GGT kan samengaan met een zeer aanzienlijke vertraging op het moment waarop de hoeveelheid afwijkingen maximaal is. Bij stoffen met een betrekkelijk geringe cytotoxiciteit moet de maximale concentratie 5 μl/ml, 5 mg/ml of 0,01 M (de laagste van deze drie) zijn. Bij betrekkelijk onoplosbare stoffen die bij lagere concentraties dan de oplosbaarheidsgrens niet toxisch zijn, moet de hoogste dosis een concentratie boven de oplosbaarheidsgrens in het uiteindelijke kweekmedium aan het eind van de behandelingsperiode zijn. In sommige gevallen (bv. wanneer de toxiciteit alleen optreedt bij hogere concentraties dan de oplosbaarheidsgrens, is het raadzaam bij meer dan één concentratie met zichtbaar neerslag te testen. Het kan nuttig zijn de oplosbaarheid aan het begin en het eind van de behandeling te bepalen, aangezien de oplosbaarheid tijdens de blootstelling in het testsysteem door de aanwezigheid van bijvoorbeeld cellen, S9 of serum kan veranderen. Onoplosbaarheid kan met het blote oog worden geconstateerd. Het neerslag mag niet storen bij het scoren.

1.4.2.3. Negatieve en positieve controles Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en negatieve (oplosmiddel of medium) controles worden uitgevoerd, zowel met als zonder metabole activering. Wanneer metabole activering wordt gebruikt, moet de voor de positieve controle gebruikte chemische stof activering vereisen om een mutagene reactie te veroorzaken. Voor de positieve controles moet een bekend klastogeen worden gebruikt, waarvan op het blootstellingsniveau een reproduceerbare en detecteerbare stijging ten opzichte van het achtergrondniveau kan worden verwacht om de gevoeligheid van het testsysteem aan te tonen. De concentraties van de positieve controle moeten zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn maar de gecodeerde objectglaasjes niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar zijn. Als positieve controle kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt: Metabole activering Stof CAS-nr. Einecs-nr. Zonder exogene metabole activering Methylmethaansulfonaat 66-27-3 200-625-0 Ethylmethaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 Ethylnitrosoureum 759-73-9 212-072-2 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 4-Nitrochinoline-N-oxide 56-57-5 200-281-1 Met exogene metabole activering Benzo[a]pyreen 50-32-8 200-028-5 Cyclofosfamide Cyclofosfamide monohydraat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Ook andere geschikte stoffen kunnen als positieve controle worden gebruikt. Waar mogelijk dient het gebruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle te worden overwogen. Voor elk oogsttijdstip dienen negatieve controles in het experiment te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel of het medium wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de culturen met teststof worden behandeld. Daarnaast moeten er ook controles worden gebruikt waaraan niets wordt toegediend, tenzij in het verleden reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.

1.4.3. Uitvoering

1.4.3.

1.4.3.1. Behandeling met de teststof Delende cellen worden zowel met als zonder metabool activeringssysteem met de teststof behandeld. De behandeling van lymfocyten moet ongeveer 48 uur na de mitogene stimulering beginnen.

1.4.3.2. Normaal gesproken moeten voor elke concentratie twee culturen worden gebruikt en voor culturen met negatieve/oplosmiddelcontrole wordt dit sterk aanbevolen. Wanneer aan de hand van gegevens uit het verleden kan worden aangetoond dat de verschillen tussen duploculturen minimaal zijn (13)(14), kan het gebruik van één cultuur voor elke concentratie aanvaardbaar zijn. Bij het testen van gassen of vluchtige stoffen moet een daarvoor geschikte methode worden gevolgd, bijvoorbeeld in een gesloten kweekvat (15)(16).

1.4.3.3. Oogsttijdstippen Bij het eerste experiment moeten de cellen zowel met als zonder metabole activering gedurende drie tot zes uur aan de teststof worden blootgesteld en wordt op een tijdstip dat overeenkomt met ongeveer 1,5-maal de normale lengte van een celcyclus na het begin van de behandeling bemonsterd (12). Als op deze wijze zowel met als zonder activering negatieve resultaten worden verkregen, wordt een nieuw experiment zonder activering uitgevoerd, waarbij de behandeling wordt voortgezet totdat op een tijdstip dat overeenkomt met ongeveer 1,5-maal de normale lengte van een celcyclus wordt bemonsterd. Voor sommige stoffen gaat de detectie beter bij een behandelings/bemonsteringstijd van meer dan 1,5-maal de lengte van de celcyclus. Negatieve resultaten met metabole activering moeten per geval worden bevestigd. Wanneer bevestiging van negatieve resultaten niet nodig wordt geacht, moet hiervoor een motivering worden gegeven.

1.4.3.4. Chromosoompreparaten De celculturen worden meestal gedurende één tot drie uur vóór het oogsten behandeld met Colcemid® of colchicine. Elke celcultuur wordt afzonderlijk geoogst en behandeld voor het maken van chromosoompreparaten. Dit houdt in dat de cellen een hypotone behandeling krijgen, gevolgd door fixatie en kleuring.

1.4.3.5. Analyse Alle objectglaasjes, ook die van de positieve en negatieve controles, worden vóór de microscopische analyse onafhankelijk gecodeerd. Aangezien bij de fixatie vaak een gedeelte van de metafasecellen breekt, waarbij chromosomen verloren gaan, moeten de gescoorde cellen voor alle celtypes het modale aantal ± 2 centromeren bevatten. Per concentratie en controle moeten minimaal 200 goed gespreide metafasen worden gescoord, indien van toepassing gelijkelijk verdeeld over de duplobepalingen. Wanneer een groot aantal afwijkingen wordt geconstateerd, kan dit aantal worden verlaagd. Hoewel de test bedoeld is om structurele chromosoomafwijkingen op te sporen, is het belangrijk dat bij waarneming van polyploïdie en endoreduplicatie ook deze verschijnselen worden geregistreerd.

2. GEGEVENS

2.

2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN Aangezien de cel bij dit experiment de eenheid is, moet het percentage cellen met één of meer structurele chromosoomafwijkingen worden bepaald. Er moet een overzicht worden gegeven van de verschillende soorten structurele chromosoomafwijkingen met de aantallen en de frequentie waarmee ze in de behandelde en controleculturen voorkomen. Hiaten worden apart geregistreerd en gerapporteerd, maar worden meestal niet in de totale frequentie van de afwijkingen opgenomen. Gelijktijdige metingen van de cytotoxiciteit voor alle behandelde en negatieve controleculturen bij de hoofdexperimenten dienen ook te worden geregistreerd. De gegevens moeten voor elke cultuur apart worden verstrekt. Daarnaast moet er een overzicht van alle gegevens in tabelvorm worden samengesteld. Een duidelijk positieve reactie behoeft niet te worden bevestigd. Bij onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden. De noodzakelijke bevestiging van negatieve resultaten is al onder punt 1.4.3.3. besproken. Bij vervolgexperimenten dient wijziging van parameters te worden overwogen om de bepaling uit te breiden tot een breder scala van omstandigheden. Parameters die voor wijziging in aanmerking komen zijn bijvoorbeeld de concentratie-intervallen en de omstandigheden bij metabole activering.

2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, zoals een concentratieafhankelijke of een reproduceerbare stijging van het aantal cellen met chromosoomafwijkingen. In eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt (3)(13). Statistische significantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een positieve reactie zijn. Een stijging van het aantal polyploïde cellen kan erop wijzen dat de teststof in staat is mitotische processen te remmen en numerieke chromosoomafwijkingen te induceren. Een stijging van het aantal cellen met endoreduplicatie van chromosomen kan erop wijzen dat de teststof in staat is de voortgang van de celcyclus te remmen (17)(18). Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria voldoen, wordt de stof in dit systeem als niet-mutageen beschouwd. Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, onduidelijk of twijfelachtig blijven. Positieve resultaten bij de in-vitrotest op chromosoomafwijkingen wijzen erop dat de teststof in gekweekte somatische zoogdiercellen structurele chromosoomafwijkingen induceert. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden in gekweekte somatische zoogdiercellen geen chromosoomafwijkingen induceert.

3. RAPPORTAGE

3. TESTVERSLAG

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Oplosmiddel/Medium:

motivering voor de keuze van het medium;

oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/medium, indien bekend.

Cellen:

aard en herkomst van de cellen;

kenmerken van het karyotype en bruikbaarheid van het gebruikte celtype;

afwezigheid van mycoplasma, indien van toepassing;

informatie over de lengte van de celcyclus;

geslacht van de bloeddonors, volledig bloed of geïsoleerde lymfocyten, gebruikt mitogeen;

aantal overentingen, indien van toepassing;

methoden om de celcultuur in leven te houden, indien van toepassing;

modaal aantal chromosomen.

Testomstandigheden:

naam van de metafasestopper, gebruikte concentratie en blootstellingsduur;

achtergrond voor de keuze van de concentraties en het aantal culturen, bijvoorbeeld gegevens over de cytotoxiciteit en beperkte oplosbaarheid, indien beschikbaar;

samenstelling van het medium en CO2-concentratie, indien van toepassing;

concentratie van de teststof;

toegevoegd volume medium en teststof;

incubatietemperatuur;

incubatietijd;

duur van de behandeling;

celdichtheid bij het enten, indien van toepassing;

aard en samenstelling van het metabole activeringssysteem. met inbegrip van aanvaardbaarheidscriteria;

positieve en negatieve controles;

methoden voor de bereiding van de objectglaasjes;

criteria voor het scoren van afwijkingen:

aantal geanalyseerde metafases;

methoden voor de meting van de toxiciteit;

criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of onduidelijk is.

Resultaten:

tekenen van toxiciteit, bijvoorbeeld de mate van confluentie, gegevens over de celcyclus, het aantal cellen en de mitotische index;

neerslagverschijnselen:

gegevens over de pH en de osmolaliteit van het behandelingsmedium, indien bepaald;

definitie voor afwijkingen, met inbegrip van hiaten;

het aantal cellen met chromosoomafwijkingen en de aard van de chromosoomafwijkingen, afzonderlijk vermeld voor elke behandelde en controlecultuur;

veranderingen in de ploïdie, indien waargenomen;

indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;

eventuele statistische analyses;

gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve controles;

gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve controles met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)

REFERENTIES Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Prin-ciples and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press. New York and Lon-don, pp. 1-29. Ishidate, M.Jr. and Sofuni, T. (1985). The in Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432. Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C Colman. S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, M.A., Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1-175. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate. M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr. B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from)CPEMC Task Group 9. Mutation Res.. 257, pp. 147-204. Morita. T., Nagaki, T.. Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, pp. 297-305. Ames, B.N., McCann. J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron, D.M. and Ames. B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, pp. 17 3-215. Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, pp. 83-90. Matsuoka, A., Hayashi, M and Ishidate, M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, pp. 277-290. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe. C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay,].M. and Wolf, R.C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. Galloway, S.M., Aardema. M.J.. Ishidate, M.Jr., Ivett, J.L., Kirkland, DJ., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). Report from Working Group on In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, pp. 241-261. Richardson, C, Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154. Soper, K.A. and Galloway, S.M, (1994). Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, pp. 139-149. Krahn. D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels of Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis. 5, pp. 795-801. Locke-Huhle. C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, pp. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko. J.E. (1983). Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.

B.11. MUTAGENITEIT — IN-VIVO TEST OP CHROMOSOOMAFWIJKINGEN IN BEENMERGCELLEN VAN ZOOGDIEREN

B.11.

1. METHODE Deze methode is overgenomen van TG 475 van de OESO: Test op chromosoomafwijkingen in beenmergcellen van zoogdieren (1997).

1.

1.1. INLEIDING De in-vivotest op chromosoomafwijkingen bij zoogdieren wordt gebruikt om te bepalen welke stoffen structurele chromosoomafwijkingen bij beenmergcellen van dieren, meestal knaagdieren, veroorzaken (1) (2) (3) (4). Er zijn twee soorten structurele afwijkingen: het chromosoomtype en het chromatidetype. Een toename van polyploïdie kan erop wijzen dat een chemische stof numerieke afwijkingen kan veroorzaken. De meeste chemische mutagenen veroorzaken afwijkingen van het chromatidetype, maar ook het chromosoomtype komt voor. Chromosoommutaties en soortgelijke voorvallen veroorzaken veel genetische ziekten bij de mens en het lijkt er sterk op dat chromosoommutaties en soortgelijke voorvallen die veranderingen in oncogenen en tumorsuppressorgenen veroorzaken, betrokken zijn bij de inductie van kanker bij de mens en bij proefdieren. Voor deze test worden meestal knaagdieren gebruikt. Het doelweefsel is het beenmerg aangezien dit een sterk doorbloed weefsel is en een populatie snel delende cellen bevat die gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd en verwerkt. De methode is niet geschikt voor andere diersoorten en doelweefsels. Deze test op chromosoomafwijkingen is bijzonder geschikt om het gevaar van mutagene effecten te evalueren, aangezien rekening kan worden gehouden met factoren die samenhangen met het metabolisme in vivo, de farmacokinetiek en de DNA-herstelsynthese, hoewel deze aspecten van soort tot soort en van weefsel tot weefsel kunnen verschillen. Een in-vivotest is ook geschikt om een in vitro gesignaleerd mutageen effect nader te onderzoeken. Als er aanwijzingen zijn dat de teststof of een reactieve metaboliet daarvan niet in het doelweefsel terechtkomt, is deze test niet geschikt. Zie ook de algemene inleiding van deel B.

1.2. DEFINITIES Afwijking van het chromatidetype: structurele chromosoombeschadiging waarbij breuken in individuele chromatiden ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie. Afwijking van het chromosoomtype: structurele chromosoombeschadiging waarbij breuken in beide chromatiden op dezelfde plaats ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie. Endoreduplicatie: een proces waarbij de kern na een S-fase met DNA-replicatie niet tot mitose overgaat, maar opnieuw een S-fase begint. Het resultaat is chromosomen met 4, 8, 16, ... chromatiden. Hiaat: een achromatische beschadiging die kleiner is dan de breedte van één chromatide en waarbij de fout in de uitlijning van de chromatiden minimaal is. Numerieke afwijking: een verandering in het aantal chromosomen ten opzichte van het normale aantal dat kenmerkend is voor de gebruikte cellen. Polyploïdie: het voorkomen van een ander veelvoud van het haploïde aantal chromosomen (n) dan het diploïde aantal (d.w.z. 3n, 4n. enz.). Structurele afwijking: een verandering in de chromosoomstructuur die bij microscopisch onderzoek tijdens de metafase van de celdeling kan worden waargenomen in de vorm van deleties, fragmenten en intra- of interchromosomale uitwisselingen.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De dieren worden langs een geschikte weg aan de teststof blootgesteld en op geschikte tijdstippen na de behandeling gedood. Voordat de dieren worden gedood, worden ze behandeld met een metafasestopper (bv. colchicine of Colcemid®). Vervolgens worden chromosoompreparaten van de beenmergcellen gemaakt, die worden gekleurd; de cellen in de metafase worden geanalyseerd op chromosoomafwijkingen.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.

1.4.1. Voorbereiding

1.4.1.

1.4.1.1. Keuze van de diersoort Meestal worden ratten, muizen of Chinese hamsters gebruikt, maar in principe komt elke geschikte zoogdiersoort in aanmerking. Er dient gebruik te worden gemaakt van jonge gezonde volwassen dieren van in het laboratorium gangbare stammen. Bij het begin van de studie moet het gewichtsverschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit maximaal ± 20 % van het gemiddelde gewicht van elk geslacht bedragen.

1.4.1.2. Huisvesting en voeding De in de algemene inleiding van deel B genoemde algemene omstandigheden worden aangehouden, maar voor de luchtvochtigheid wordt gestreefd naar 50-60 %.

1.4.1.3. Voorbereiding van de dieren Gezonde jonge volwassen dieren worden aselect ingedeeld in de behandelde en controlegroepen. De kooien moeten zodanig worden geplaatst dat mogelijke effecten daarvan tot een minimum worden beperkt. De dieren krijgen een unieke identificatie. Ze krijgen minimaal vijf dagen de tijd om in het laboratorium te acclimatiseren.

1.4.1.4. Bereiding van de doseringen Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media worden opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de toediening aan de dieren worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks worden toegediend of vóór de toediening worden verdund. Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, moeten verse bereidingen van de teststof worden gebruikt.

1.4.2. Testomstandigheden

1.4.2.

1.4.2.1. Oplosmiddel/Medium Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisniveaus geen toxische effecten veroorzaken en chemische reacties met de teststof moeten uitgesloten zijn. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media worden gebruikt, moeten gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt.

1.4.2.2. Controles Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) controles voor elk geslacht worden uitgevoerd. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroepen op identieke wijze worden behandeld als de dieren in de andere groepen. Voor de positieve controles moet een stof worden gebruikt die in vivo structurele afwijkingen veroorzaakt op een blootstellingsniveau waarbij een detecteerbare stijging ten opzichte van het achtergrondniveau kan worden verwacht. De doseringen van de positieve controles moeten zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn maar de gecodeerde objectglaasjes niet onmiddellijk ais zodanig herkenbaar zijn. Het is aanvaardbaar de positieve controle langs een andere weg toe te dienen dan de teststof en slechts op één tijdstip te bemonsteren. Waar mogelijk kan het gebruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle worden overwogen. Als positieve controle kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt: Stof CAS-nr. Einecs-nr. Ethylmethaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 Ethylnitrosoureum 759-73-9 212-072-2 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 Cyclofosfamide Cyclofosfamide monohydraat 50-18-0 605 5-19-2 200-015-4 Triethyleenmelamine 51-18-3 200-083-5 Voor elk bemonsteringstijdstip dienen negatieve controles in het experiment te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel of het medium wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de andere groepen worden behandeld, tenzij uit in het verleden uitgevoerde controles aanvaardbare gegevens beschikbaar zijn over de spreiding over de dieren en de frequentie van cellen met chromosoomafwijkingen. Als voor de negatieve controles één bemonsteringstijdstip wordt gebruikt, kan hiervoor het beste het eerste bemonsteringstijdstip worden gekozen. Daarnaast moeten er ook onbehandelde controles worden gebruikt, tenzij in het verleden of in de literatuur reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel of medium geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.

1.5. UITVOERING

1.5.

1.5.1. Aantal en geslacht van de dieren Elke behandelde en controlegroep moet minimaal vijf analyseerbare dieren per geslacht bevatten. Als er bij de uitvoering van de studie gegevens uit studies bij dezelfde soort en met dezelfde blootstellingsweg beschikbaar zijn waaruit blijkt dat er geen significante verschillen in toxiciteit tussen de geslachten zijn, is het voldoende de test bij één geslacht uit te voeren. Wanneer de blootstelling aan een chemische stof bij de mens door het geslacht wordt bepaald, zoals bijvoorbeeld bij sommige geneesmiddelen het geval is, moet de test bij dieren van het desbetreffende geslacht worden uitgevoerd.

1.5.2. Behandelingsschema De teststof wordt bij voorkeur in één dosis toegediend. De dosis kan eventueel worden gesplitst, waarbij de twee porties op dezelfde dag met een interval van niet meer dan enkele uren worden toegediend, om de toediening van een groot volume te vergemakkelijken. Voor een ander doseringsschema moet een wetenschappelijke motivering worden gegeven. De monsters worden op twee aparte tijdstippen na de behandeling op één dag genomen. Voor knaagdieren ligt het eerste bemonsteringstijdstip op 1,5 maal de normale lengte van een celcyclus (deze cyclus duurt meestal 12 tot 18 uur) na de behandeling. Aangezien de voor de opname en het metabolisme van de teststof vereiste tijd en de effecten op de kinetiek van de celcyclus gevolgen kunnen hebben voor het optimale tijdstip om chromosoomafwijkingen te detecteren, verdient het aanbeveling 24 uur na het eerste bemonsteringstijdstip opnieuw te bemonsteren. Indien het doseringsschema meer dan één dag beslaat, moet één bemonsteringstijdstip op 1,5 maal de normale lengte van een celcyclus na de laatste toediening worden gebruikt. Voordat de dieren worden gedood, worden ze intraperitoneaal geïnjecteerd met een adequate dosis metafasestopper (bv. Colcemid® of colchicine). De dieren worden na een adequate pauze bemonsterd. Voor muizen moet er ongeveer drie tot vijf uur worden gewacht en voor Chinese hamsters ongeveer vier tot vijf uur. De cellen worden uit het beenmerg gehaald en op chromosoomafwijkingen geanalyseerd.

1.5.3. Dosisniveaus Als er een oriënterend onderzoek wordt uitgevoerd omdat er geen bruikbare gegevens over de dosering beschikbaar zijn, moet dit in hetzelfde laboratorium gebeuren met dezelfde soort, dezelfde stam, hetzelfde geslacht en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofdonderzoek (5). Als er sprake is van toxiciteit, worden er voor het eerste bemonsteringstijdstip drie dosisniveaus gebruikt. Deze dosisniveaus moeten een interval van de maximale tot geen of vrijwel geen toxiciteit bestrijken. Op het latere bemonsteringstijdstip behoeft alleen de hoogste dosis te worden gebruikt. De hoogste dosis wordt gedefinieerd als de dosis die zodanige toxiciteitsverschijnselen veroorzaakt dat er bij hogere doses met hetzelfde doseringsschema waarschijnlijk sterfte zal optreden. Stoften met een specifieke biologische activiteit bij lage niet-toxische doses (zoals hormonen en mitogenen) kunnen een uitzondering vormen op deze criteria om de dosering te bepalen en moeten per geval worden beoordeeld. De hoogste dosis kan ook worden gedefinieerd als een dosis die enigerlei aanwijzing van toxiciteit voor het beenmerg oplevert (bv. een daling van de mitotische index met meer dan 50 %).

1.5.4. Limiettest Als een test met één dosis van minimaal 2000 mg/kg lichaamsgewicht, in één keer of in twee porties op dezelfde dag toegediend, geen waarneembare toxische effecten veroorzaakt en op basis van gegevens over stoffen met een verwante structuur geen genotoxiciteit te verwachten valt, zal het wellicht niet nodig zijn een volledig onderzoek met drie dosisniveaus uit te voeren. Voor studies met een langere duur is de limietdosis 2000mg/kg lichaamsgewicht/dag bij toediening gedurende maximaal 14 dagen en 1000 mg/kg lichaamsgewicht/dag bij toediening gedurende meer dan 14 dagen. Op grond van gegevens omtrent de verwachte blootstelling van de mens kan het gebruik van een hoger dosisniveau bij de limiettest nodig worden geacht.

1.5.5. Toediening van de doses De teststof wordt meestal met behulp van een maagsonde of een geschikte intubatiecanule of door intraperitoneale injectie toegediend. Ook andere toedieningswegen kunnen aanvaardbaar zijn, als daarvoor een motivering kan worden gegeven. Het maximale volume vloeistof dat in één keer met een sonde of injectie kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het proefdier. Het volume mag niet groter zijn dan 2ml/100g lichaamsgewicht. Voor het gebruik van grotere volumes moet een motivering worden gegeven. Behalve bij prikkelende of bijtende stoffen, die in hogere concentraties meestal hevigere effecten veroorzaken, moeten volumeverschillen tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, zodat op alle dosisniveaus hetzelfde volume kan worden gebruikt.

1.5.6. Chromosoompreparaten Onmiddellijk nadat het dier is gedood wordt beenmerg verwijderd, in een hypotone oplossing gebracht en gefixeerd. De cellen worden vervolgens op objectglaasjes uitgesmeerd en gekleurd.

1.5.7. Analyse Als maat voor de cytotoxiciteit wordt in ten minste 1000 cellen per dier voor alle behandelde dieren (ook de positieve controles) en onbehandelde dieren voor de negatieve controle de mitotische index bepaald. Voor elk dier worden minimaal 100 cellen geanalyseerd. Wanneer een groot aantal afwijkingen wordt geconstateerd, kan dit aantal worden verlaagd. Alle objectglaasjes, ook die van de positieve en negatieve controles, worden vóór de microscopische analyse onafhankelijk gecodeerd. Aangezien bij de bereiding van de objectglaasjes vaak een gedeelte van de metafasecellen breekt, waarbij chromosomen verloren gaan, moeten de gescoorde cellen 2n ± 2 centromeren bevatten.

2. GEGEVENS

2.

2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN De gegevens moeten voor elk dier apart in tabelvorm worden verstrekt. De eenheid bij dit experiment is het dier. Voor elk dier moet het aantal gescoorde cellen, het aantal afwijkingen per cel en het percentage cellen met een of meer structurele chromosoomafwijkingen worden bepaald. Er moet een overzicht worden gegeven van de verschillende soorten structurele chromosoomafwijkingen met de aantallen en de frequentie waarmee ze in de behandelde en controlegroepen voorkomen. Hiaten worden apart geregistreerd en gerapporteerd maar meestal niet in de totale frequentie van de afwijkingen opgenomen. Als er geen aanwijzingen zijn voor verschillen in reactie tussen de geslachten, kunnen de gegevens van beide geslachten voor de statistische analyse worden gecombineerd.

2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, zoals een dosisafhankelijke stijging van het relatieve aantal cellen met chromosoomafwijkingen of een duidelijke stijging van het aantal cellen met afwijkingen in één dosisgroep bij één bemonsteringstijd. In eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt (6). Statistische significantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een positieve reactie zijn. Bij onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden. Een toename van polyploïdie kan erop wijzen dat de teststof in staat is numerieke chromosoomafwijkingen te induceren. Een toename van endoreduplicatie kan erop wijzen dat de teststof in staat is de voortgang van de celcyclus te remmen (7)(8). Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria voldoen, wordt de stof bij deze test als niet-mutageen beschouwd. Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt uitgevoerd, onduidelijk of twijfelachtig blijven. Positieve resultaten bij de in-vivotest op chromosoomafwijkingen wijzen erop dat een stof in het beenmerg van de geteste soort chromosoomafwijkingen induceert. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden in het beenmerg van de geteste soort geen chromosoomafwijkingen induceert. De waarschijnlijkheid dat de teststof of de metabolieten daarvan in de grote bloedsomloop of specifiek het doelweefsel terechtkomen (systemische toxiciteit), dient te worden besproken.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. TESTVERSLAG In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Oplosmiddel/Medium:

motivering voor de keuze van het medium;

oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/medium, indien bekend.

Proefdieren:

gebruikte soort/stam:

aantal, leeftijd en geslacht van de dieren:

herkomst, huisvesting, voeding, enz.;

het gewicht van elk dier aan het begin van de test, met vermelding van de spreiding, het gemiddelde en de standaardafwijking van het lichaamsgewicht voor elke groep.

Testomstandigheden:

positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) controles:

gegevens uit het oriënterend onderzoek, indien dit is uitgevoerd:

achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus;

gegevens over de bereiding van de teststof;

gegevens over de toediening van de teststof;

achtergrond voor de keuze van de toedieningsweg;

methoden om na te gaan of de teststof in de grote bloedsomloop of het doelweefsel is terechtgekomen, indien van toepassing;

omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater (in ppm) in de dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;

gegevens over de kwaliteit van het voer en het drinkwater;

een gedetailleerde beschrijving van het behandelings- en bemonsteringsschema;

methoden voor de meting van de toxiciteit;

naam van de metafasestopper, gebruikte concentratie en blootstellingsduur;

methoden voor de bereiding van de objectglaasjes;

criteria voor het scoren van afwijkingen;

aantal geanalyseerde cellen per dier;

criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of onduidelijk is.

Resultaten:

tekenen van toxiciteit;

mitotische index;

aard en aantal van de afwijkingen, afzonderlijk vermeld voor elk dier;

totaal aantal afwijkingen per groep, met vermelding van het gemiddelde en de standaardafwijking;

aantal cellen met afwijkingen per groep, met vermelding van het gemiddelde en de standaardafwijking;

veranderingen in de ploïdie, indien waargenomen;

indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;

eventuele statistische analyses;

gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve controles;

gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve controles, met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking;

gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde positieve controles.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)

REFERENTIES Adler, I.D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., pp. 275-306. Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, pp. 157-165. Richold, M., Chandley, A., Ashby,)., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990). In In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Simada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, pp. 305-312. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe. J., Esdaile, DJ., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, pp. 31 3-319. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese. R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In \'ivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part. III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press. Cambridge. pp. 184-232. Locke-Huhle, C. (198 3). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, pp. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res.. 43, pp. 1362-1364.

B.12. MUTAGENITEIT — IN-VIVO MICRONUCLEUSTEST BIJ ERYTROCYTEN VAN ZOOGDIEREN

B.12.

1. METHODE Deze methode is overgenomen van TG 474 van de OESO: Micronuleustest bij erytrocyten van zoogdieren (1997).

1.

1.1. INLEIDING De in-vivo micronuleustest bij zoogdieren wordt gebruikt om na te gaan of de teststof schade toebrengt aan de chromosomen of het mitotisch apparaat van erytroblasten door de analyse van erytrocyten die worden verkregen uit het beenmerg en/of de perifere bloedcellen van dieren, meestal knaagdieren. De micronuleustest is bedoeld om stoften te signaleren die cytogenetische schade veroorzaken waarbij micro-nuclei ontstaan met achtergebleven chromosoomfragmenten of volledige chromosomen. Wanneer een erytroblast uit het beenmerg zich ontwikkelt tot een polychromatische erytrocyt, wordt de hoofdkern uitgestoten: wanneer een micronucleus is ontstaan, kan deze in het overigens kernloze cytoplasma achterblijven. Omdat deze cellen geen hoofdkern bevatten, zijn de micronuclei gemakkelijker zichtbaar te maken. Een stijging van de frequentie waarmee bij behandelde dieren polychromatische erytrocyten met micronuclei worden aangetroffen, wijst op chromosoombeschadiging. Voor deze test wordt meestal het beenmerg van knaagdieren gebruikt, aangezien in dit weefsel polychromatische erytrocyten worden gevormd. Het is ook aanvaardbaar het aantal onrijpe (polychromatische) erytrocyten met micronuclei in perifeer bloed te bepalen bij soorten waarvan is aangetoond dat de milt niet in staat is erytrocyten met micronuclei op te ruimen of dat de gevoeligheid om stoffen die structurele of numerieke chromosoomafwijkingen veroorzaken te detecteren afdoende is. Micronuclei kunnen aan de hand van een aantal criteria worden onderscheiden, bijvoorbeeld op grond van de aan- of afwezigheid van een kinetochoor-of centromeer-DNA in de micronuclei. Het belangrijkste eindpunt is de frequentie van onrijpe (polychromatische) erytrocyten met micronuclei. Het aantal rijpe (normochromatische) erytrocyten in het perifere bloed met micronuclei, bepaald bij een bekend aantal rijpe erytrocyten, kan ook als eindpunt van de bepaling worden gebruikt wanneer de dieren gedurende ten minste vier weken ononderbroken worden behandeld. Deze in-vivo micronucleustest bij zoogdieren is bijzonder geschikt om het gevaar van mutagene effecten te evalueren, aangezien rekening kan worden gehouden met factoren die samenhangen met het metabolisme in vivo, de farmacokinetiek en de DNA-herstelsynthese, hoewel deze aspecten van soort tot soort, van weefsel tot weefsel en voor de verschillende genetische eindpunten kunnen verschillen. Een in-vivo bepaling is ook geschikt om een in vitro gesignaleerd mutageen effect nader te onderzoeken. Als er aanwijzingen zijn dat de teststof of een reactieve metaboliet daarvan niet in het doelweefsel terechtkomt, is deze test niet geschikt. Zie ook de algemene inleiding van deel B.

1.2. DEFINITIES Centromeer (kinetochoor): het deel of de delen van een chromosoom waar tijdens de celdeling de spoeldraden aan vastzitten, zodat de verplaatsing van de dochterchromosomen naar de polen van de dochtercellen regelmatig kan verlopen. Micronucleus: een kleine kern die buiten en naast de hoofdkern van cellen tijdens de telofase van de mitose (meiose) ontstaat door achtergebleven chromosoomfragmenten of volledige chromosomen. Normochromatische erytrocyt: een rijpe erytrocyt zonder ribosomen die van onrijpe polychromatische erytrocyten kan worden onderscheiden door de selectieve kleuring van ribosomen. Polychromatische erytrocyt: een onrijpe erytrocyt in een tussentijdse ontwikkelingsfase die nog ribosomen bevat en derhalve van rijpe normochromatische erytrocyten kan worden onderscheiden door de selectieve kleuring van ribosomen.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE De dieren worden langs een geschikte weg aan de teststof blootgesteld. Als beenmerg wordt gebruikt, worden de dieren op geschikte tijdstippen na de behandeling gedood, wordt het beenmerg verwijderd en worden er preparaten gemaakt die worden gekleurd (l)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Wanneer perifeer bloed wordt gebruikt, wordt op geschikte tijdstippen na de behandeling bloed afgenomen en worden er uitstrijkpreparaten gemaakt die worden gekleurd (4)(8)(9)(10). Bij studies met perifeer bloed moet er zo weinig mogelijk tijd verstrijken tussen de laatste blootstelling en het oogsten van de cellen. De preparaten worden onderzocht op de aanwezigheid van micronuclei.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.

1.4.1. Voorbereiding

1.4.1.

1.4.1.1. Keuze van de diersoort Als beenmerg wordt gebruikt, worden muizen of ratten aanbevolen, maar in principe komt elke geschikte zoogdiersoort in aanmerking. Wanneer perifeer bloed wordt gebruikt, worden muizen aanbevolen. In principe komt elke geschikte zoogdiersoort echter in aanmerking, mits het een soort is waarvan de milt niet in staat is erytrocyten met micronuclei op te ruimen of een soort waarvan is aangetoond dat de gevoeligheid om stoffen die structurele of numerieke chromosoomafwijkingen veroorzaken te detecteren afdoende is. Er dient gebruik te worden gemaakt van jonge gezonde dieren van in het laboratorium gangbare stammen. Bij het begin van de studie moet het gewichtsverschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit maximaal ± 20 % van het gemiddelde gewicht van elk geslacht bedragen.

1.4.1.2. Huisvesting en voeding De in de algemene inleiding van deel B genoemde algemene omstandigheden worden aangehouden, maar voor de luchtvochtigheid wordt gestreefd naar 50-60 %.

1.4.1.3. Voorbereiding van de dieren Gezonde jonge volwassen dieren worden aselect ingedeeld in de behandelde en controlegroepen. De dieren krijgen een unieke identificatie. Ze krijgen minimaal vijf dagen de tijd om in het laboratorium te acclimatiseren. De kooien moeten zodanig worden geplaatst dat mogelijke effecten daarvan tot een minimum worden beperkt.

1.4.2. Testomstandigheden

1.4.2.

1.4.2.1. Oplosmiddel/Medium Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisniveaus geen toxische effecten veroorzaken en chemische reacties met de teststof moeten uitgesloten zijn. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media worden gebruikt, moeten referentiegegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt.

1.4.2.2. Controles Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) controles voor elk geslacht worden uitgevoerd. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroepen op identieke wijze worden behandeld als de dieren in de andere groepen. Voor de positieve controles moet een stof worden gebruikt die in-vivo micronuclei veroorzaakt op een blootstellingsniveau waarbij een detecteerbare stijging ten opzichte van het achtergrondniveau kan worden verwacht. De doseringen van de positieve controles moeten zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn maar de gecodeerde objectglaasjes niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar zijn. Het is aanvaardbaar de positieve controle langs een andere weg toe te dienen dan de teststof en slechts op één tijdstip te bemonsteren. Waar mogelijk kan bovendien het gebruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle worden overwogen. Als positieve controle kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt: Stof CAS-nr. Einecs-nr. Ethylmethaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 N-Ethyl-N-nitrosoureum 759-73-9 212-072-2 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 Cyclofosfamide Cyclofosfamide monohydraat 50-18-0 60 5 5-19-2 200-015-4 Triethyleenmelamine 51-18-3 200-083-5 Voor elk bemonsteringstijdstip dienen negatieve controles in het experiment te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel of het medium wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de andere groepen worden behandeld, tenzij uit in het verleden uitgevoerde controles aanvaardbare gegevens beschikbaar zijn over de spreiding over de dieren en de frequentie van cellen met micronuclei. Als voor de negatieve controles één bemonsteringstijdstip wordt gebruikt, kan hiervoor het beste het eerste bemonsteringstijdstip worden gekozen. Daarnaast moeten er ook onbehandelde controles worden gebruikt, tenzij in het verleden of in de literatuur reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel of medium geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt. Als perifeer bloed wordt gebruikt, kan een monster dat vóór de behandeling wordt genomen ook aanvaardbaar zijn als gelijktijdige negatieve controle, maar alleen wanneer het gaat om een korte studie met perifeer bloed (bv. één tot drie behandelingen) en het resultaat binnen het verwachte interval door de in het verleden uitgevoerde controle ligt.

1.5. UITVOERING

1.5.

1.5.1. Aantal en geslacht van de dieren Elke behandelde en controlegroep moet minimaal vijf analyseerbare dieren per geslacht bevatten (11). Als er bij de uitvoering van de studie gegevens uit studies bij dezelfde soort en met dezelfde blootstellingsweg beschikbaar zijn waaruit blijkt dat er geen significante verschillen in toxiciteit tussen de geslachten zijn, is het voldoende de test bij één geslacht uit te voeren. Wanneer de blootstelling aan een chemische stof bij de mens door het geslacht wordt bepaald, zoals bijvoorbeeld bij sommige geneesmiddelen het geval is, moet de test bij dieren van het desbetreffende geslacht worden uitgevoerd.

1.5.2. Behandelingsschema Er kan geen standaardbehandelingsschema (d.w.z. één, twee of meer behandelingen met een interval van 24 uur) worden aanbevolen. De monsters van verlengde doseringsschema's zijn aanvaardbaar, mits een positief effect voor deze studie is aangetoond of, voor een negatieve studie, mits toxiciteit is aangetoond of de limietdosis is gebruikt, en de toediening tot het bemonsteringstijdstip is voortgezet. De dosis kan eventueel worden gesplitst, waarbij de twee porties op dezelfde dag met een interval van niet meer dan enkele uren worden toegediend, om de toediening van een groot volume te vergemakkelijken. De test kan op twee manieren worden uitgevoerd: Indien dit nuttig is, kunnen daarnaast ook andere bemonsteringstijdstippen worden gebruikt.

1.5.2. a)

De dieren worden eenmaal met de teststof behandeld. Beenmergmonsters worden ten minste tweemaal genomen, de eerste keer niet eerder dan 24 uur na de behandeling en de laatste keer uiterlijk 48 uur na de behandeling, met een afdoende interval tussen de monsters. Voor het gebruik van een bemonsteringstijdstip binnen 24 uur na de behandeling moet een motivering worden gegeven. Monsters van perifeer bloed worden ten minste tweemaal genomen, de eerste keer niet eerder dan 36 uur na de behandeling, met een afdoende interval na het eerste monster, en de laatste keer uiterlijk 72 uur na de behandeling. Wanneer op één bemonsteringstijdstip een positieve reactie wordt gesignaleerd, behoeven er geen verdere monsters meer te worden genomen.

Als twee of meer dagelijkse behandelingen worden gebruikt (bv. twee of meer behandelingen met een interval van 24 uur), moet de bemonstering voor het beenmerg eenmaal gebeuren tussen 18 en 24 uur na de laatste behandeling en voor het perifere bloed eenmaal tussen 36 en 48 uur na de laatste behandeling (12).

1.5.3. Dosisniveaus Als er een oriënterend onderzoek wordt uitgevoerd omdat er geen bruikbare gegevens over de dosering beschikbaar zijn, moet dit in hetzelfde laboratorium gebeuren met dezelfde soort, dezelfde stam, hetzelfde geslacht en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofdonderzoek (13). Als er sprake is van toxiciteit, worden er voor het eerste bemonsteringstijdstip drie dosisniveaus gebruikt. Deze dosisniveaus moeten een interval van de maximale tot geen of vrijwel geen toxiciteit bestrijken. Op het latere bemonsteringstijdstip behoeft alleen de hoogste dosis te worden gebruikt. De hoogste dosis wordt gedefinieerd als de dosis die zodanige toxiciteitsverschijnselen veroorzaakt dat er bij hogere doses met hetzelfde doseringsschema waarschijnlijk sterfte zal optreden. Stoffen met een specifieke biologische activiteit bij lage niet-toxische doses (zoals hormonen en mitogenen) kunnen een uitzondering vormen op deze criteria om de dosering te bepalen en moeten per geval worden beoordeeld. De hoogste dosis kan ook worden gedefinieerd als een dosis die enigerlei aanwijzing van toxiciteit voor het beenmerg oplevert (bv. een daling van de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal erytrocyten in het beenmerg of het perifere bloed).

1.5.4. Limiettest Als een test met één dosis van minimaal 2000 mg/kg lichaamsgewicht, in één keer of in twee porties op dezelfde dag toegediend, geen waarneembare toxische effecten veroorzaakt en op basis van gegevens over stoffen met een verwante structuur geen genotoxiciteit te verwachten valt, zal het wellicht niet nodig zijn een volledig onderzoek met drie dosisniveaus uit te voeren. Voor studies met een langere duur is de limietdosis 2000 mg/kg lichaamsgewicht/dag bij toediening gedurende maximaal 14 dagen en 1000 mg/kg lichaamsgewicht/dag bij toediening gedurende meer dan 14 dagen. Op grond van gegevens omtrent de verwachte blootstelling van de mens kan het gebruik van een hoger dosisniveau bij de limiettest nodig worden geacht.

1.5.5. Toediening van de doses De reststof wordt meestal met behulp van een maagsonde of een geschikte intubatiecanule of door intraperitoneale injectie toegediend. Ook andere toedieningswegen kunnen aanvaardbaar zijn, als daarvoor een motivering kan worden gegeven. Het maximale volume vloeistof dat in één keer met een sonde of injectie kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het proefdier. Het volume mag niet groter zijn dan 2 ml/100 g lichaamsgewicht. Voor het gebruik van grotere volumes moet een motivering worden gegeven. Behalve bij prikkelende of bijtende stoffen, die in hogere concentraties meestal heviger effecten veroorzaken, moeten volumeverschillen tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, zodat op alle dosisniveaus hetzelfde volume kan worden gebruikt.

1.5.6. Beenmerg/bloedpreparaten De beenmergcellen worden meestal volgens gangbare methoden uit het dijbeen of scheenbeen van pas gedode dieren verwijderd, geprepareerd en gekleurd. Perifeer bloed wordt uit de staartader of een ander geschikt bloedvat afgenomen. De bloedcellen worden onmiddellijk supravitaal gekleurd (8)(9)(10) of er wordt een uitstrijkpreparaat gemaakt dat vervolgens wordt gekleurd. Door het gebruik van een DNA-specifieke kleurstof (bv. acridine oranje (14) of Hoechst 33258 plus pyronine-Y (15)) kunnen sommige artefacten die zich bij het gebruik van niet voor DNA specifieke kleurstoffen kunnen voordoen, worden voorkomen. Dit neemt niet weg dat ook klassieke kleurstoffen (zoals Giemsa) kunnen worden gebruikt. Ook andere systemen (zoals cellulosekolommen om cellen die een kern bevatten te verwijderen (16)) kunnen worden gebruikt, mits is aangetoond dat deze methoden geschikt zijn voor micronucleuspreparaten in het laboratorium.

1.5.7. Analyse Voor elk dier wordt de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal (onrijpe + rijpe) erytrocyten bepaald door in totaal voor het beenmerg ten minste 200 erytrocyten en voor het perifere bloed ten minste 1000 erytrocyten te tellen (17). Alle objectglaasjes, ook die van de negatieve en positieve controles, worden vóór de microscopische analyse onafhankelijk gecodeerd. Voor de bepaling van de frequentie waarmee onrijpe erytrocyten met micronuclei voorkomen, worden ten minste 2000 rijpe erytrocyten per dier gescoord. Aanvullende informatie kan worden verkregen door rijpe erytrocyten op micronuclei te scoren. Bij de analyse van de objectglaasjes mag de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal erytrocyten niet lager dan 20 % van de controlewaarde zijn. Wanneer de dieren onafgebroken gedurende ten minste vier weken zijn behandeld, kunnen ook ten minste 2000 rijpe erytrocyten per dier op het voorkomen van micronuclei worden gescoord. Geautomatiseerde analysesystemen (beeldanalyse en celsuspensiedoorstroomcytometrie) zijn aanvaardbaar als alternatief voor handmatige beoordeling, indien ze afdoende zijn gemotiveerd en gevalideerd.

2. GEGEVENS

2.

2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN De gegevens moeten voor elke dier apart in tabelvorm worden verstrekt. De eenheid bij dit experiment is het dier. Voor elk onderzocht dier worden het aantal gescoorde onrijpe erytrocyten, het aantal onrijpe erytrocyten met micronuclei en het aantal onrijpe erytrocyten op het totale aantal apart vermeld. Wanneer de dieren onafgebroken gedurende ten minste vier weken zijn behandeld, moeten de gegevens over rijpe erytrocyten ook worden vermeld als deze zijn verzameld. Voor elk dier worden de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal erytrocyten en, indien dit zinnig wordt geacht, het percentage van de erytrocyten met micronuclei vermeld. Als er geen aanwijzingen zijn voor verschillen in reactie tussen de geslachten, kunnen de gegevens van beide geslachten voor de statistische analyse worden gecombineerd.

2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, zoals een dosisafhankelijke stijging van het aantal cellen met micronuclei of een duidelijke stijging van het aantal cellen met micronuclei in één dosis-groep bij één bemonsteringstijd. In eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt (18)(19). Statistische significantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een positieve reactie zijn. Bij onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden. Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria voldoen, wordt de stof bij deze test als niet-mutageen beschouwd. Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, onduidelijk of twijfelachtig blijven. Positieve resultaten bij de micronucleustest wijzen erop dat de stof micronuclei induceert die ontstaan door chromosoombeschadigingen of beschadiging van het mitotisch apparaat in de erytroblasten van de geteste soort. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden geen micronuclei in de onrijpe erytrocyten van de geteste soort veroorzaakt. De waarschijnlijkheid dat de teststof of de metabolieten daarvan in de grote bloedsomloop of specifiek het doelweefsel terechtkomen (systemische toxiciteit), dient te worden besproken.

3. RAPPORTAGE

3. TESTVERSLAG

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Oplosmiddel/Medium:

motivering voor de keuze van het medium;

oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/medium, indien bekend.

Proefdieren:

gebruikte soort/stam;

aantal, leeftijd en geslacht van de dieren:

herkomst, huisvesting, voeding enz.:

het gewicht van elk dier aan het begin van de test, met vermelding van de spreiding, het gemiddelde en de standaardafwijking van het lichaamsgewicht voor elke groep.

Testomstandigheden:

gegevens over positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) controles;

gegevens uit het oriënterend onderzoek, indien dit is uitgevoerd:

achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus;

gegevens over de bereiding van de teststof;

gegevens over de toediening van de reststof;

achtergrond voor de keuze van de toedieningsweg;

methoden om na te gaan of de teststof in de grote bloedsomloop of het doelweefsel is terechtgekomen, indien van toepassing;

omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater (in ppm) in de dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;

gegevens over de kwaliteit van het voer en het drinkwater;

een gedetailleerde beschrijving van het behandelings- en bemonsteringsschema;

methoden voor de bereiding van de objectglaasjes;

methoden voor de meting van de toxiciteit;

criteria voor het scoren van onrijpe erytrocyten met micronuclei;

aantal geanalyseerde cellen per dier;

criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of onduidelijk is.

Resultaten:

tekenen van toxiciteit;

verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal erytrocyten;

aantal onrijpe erytrocyten met micronuclei, afzonderlijk vermeld voor elk dier;

gemiddelde ± standaardafwijking van het aantal onrijpe erytrocyten met micronuclei per groep;

indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;

statistische analyses en gevolgde methodes;

gegevens over tegelijkertijd en in het verleden uitgevoerde negatieve controles;

gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde positieve controles.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)

REFERENTIES Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190. Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123, pp. 61-118. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res.. 239, pp. 29-80. MacGregor, J.T., Schlegel, R., Choy, W.N., and Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. In: Developments in Science and Practice of Toxicology, Hd. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558. MacGregor, J.T., Heddle. J.A. Hite. M., Margolin, G.H.. Ramel, C, Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987). Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res. 189, pp. 103-122. MacGregor, J.T., Wehr, CM., Henika, P.R., and Shelby, M.E. (1990). The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522. Hayashi, M., Morita, T.. Kodama. Y., Sofuni. T. and Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coates Slides. Mutation Res., 245, pp. 245-249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, pp. 83-98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, pp. 153-159. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, pp. 293-304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, pp. 313-319. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, pp. 313-319. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, pp. 241-247. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y., Mutation Res., 120, pp. 269-275. Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989). The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res.. 213, pp. 91-104. Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, pp. 97-99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (lid.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York. Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Lovell, D.P., Anderson. D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

B.13/14. MUTAGENITEIT — TERUGMUTATIETEST MET BACTERIËN

B.13/14.

1. METHODE Deze methode is overgenomen van TG 471 van de OESO: Terugmutatietest met bacteriën (1997).

1.

1.1. INLEIDING Bij de terugmutatietest met bacteriën worden aminozuurafhankelijke stammen van Salmonella typhimurium en Eschenchia coli gebruikt voor de detectie van puntmutaties, waarbij vervanging, toevoeging of deletie van een of enkele DNA-basenparen optreedt (1)(2)(3). Deze terugmutatietest met bacteriën is gebaseerd op het beginsel dat mutaties worden gedetecteerd die ertoe leiden dat in de teststammen aanwezige mutaties en daarmee de functionele capaciteit van de bacteriën om een essentieel aminozuur te synthetiseren worden hersteld. Deze teruggemuteerde bacteriën worden zichtbaar doordat ze kunnen groeien zonder het aminozuur dat de ouderstam nodig heeft. Puntmutaties veroorzaken veel genetische ziekten bij de mens en het lijkt er sterk op dat puntmutaties in oncogenen en tumorsuppressorgenen van somatische cellen betrokken zijn bij het ontstaan van tumoren bij de mens en bij proefdieren. De terugmutatietest met bacteriën is snel, goedkoop en betrekkelijk gemakkelijk uit te voeren. Veel van de teststammen hebben verschillende kenmerken waardoor ze gevoeliger zijn voor de detectie van mutaties, zoals reactieve DNA-sequenties op de terugmutatieplaatsen, een verhoogde permeabiliteit van de cel voor grote moleculen en de afwezigheid van DNA-herstelsystemen of de stimulering van fout-gevoelige DNA-herstelprocessen. De specificiteit van de teststammen kan enige nuttige informatie opleveren over de aard van de mutaties die door genotoxische stoffen worden geïnduceerd. Er zijn zeer veel gegevens beschikbaar over de resultaten van de terugmutatietest met bacteriën voor een grote verscheidenheid van structuren en er zijn betrouware mehtodologieën ontwikkeld voor het testen van chemische stoffen met uiteenlopende fysisch-chemische eigenschappen, waaronder ook vluchtige stoffen. Zie ook de algemene inleiding van deel B.

1.2. DEFINITIES Terugmutatietest bij Salmonella typhimurium of Escherichia coli: een test voor de detectie van mutaties in een aminozuurafhankelijke stam (respectievelijk histidine of tryptofaan), waarbij een stam ontstaat die onafhankelijk is van een externe aminozuurbron. Mutageen met basenpaarvervanging: een stof die een wijziging van een base in het DNA veroorzaakt. Bij een terugmutatietest kan dit op de plaats van de oorspronkelijke mutatie of op een andere plaats in het bacteriële genoom gebeuren. Mutageen met leesraamverschuiving: een stof die invoeging of deletie van een of meer basenparen in het DNA veroorzaakt, waardoor het leesraam in het RNA wijzigt.

1.3. TOELICHTING Voor de terugmutatietest met bacteriën worden prokaryote cellen gebruikt, die in bijvoorbeeld opname, metabolisme, chromosoomstructuur en DNA-herstelprocessen van zoogdiercellen verschillen. Bij in vitro uitgevoerde tests moet er meestal een exogene metabole activeringsbron worden gebruikt. Dit metabole activeringssysteem kan de omstandigheden in een zoogdiercel in vivo niet volledig nabootsen. De test levert dan ook geen directe informatie op over de potentiële mutagene en carcinogene werking van een stof bij zoogdieren. De terugmutatietest met bacteriën wordt meestal gebruikt als een eerste screening voor een genotoxische werking en met name de inductie van puntmutaties. Op basis van een groot aantal gegevens is gebleken dat veel stoffen die bij deze test positief reageren, ook bij andere tests een mutagene werking vertonen. Er zijn voorbeelden van mutagene stoffen die met deze test niet worden gesignaleerd; dit kan wellicht worden toegeschreven aan de specifieke aard van het gedetecteerde eindpunt, verschillen in metabole activering of verschillen in biologische beschikbaarheid. Anderzijds kunnen factoren die de gevoeligheid van de terugmutatietest met bacteriën bevorderen, leiden tot een te hoge inschatting van de mutagene werking. De terugmutatietest met bacteriën zal wellicht niet geschikt zijn voor de beoordeling van bepaalde klassen chemische stoffen zoals sterk bactericide verbindingen (bv. bepaalde antibiotica) en stoffen waarvan vermoed wordt (of bekend is) dat ze specifiek het replicatiesysteem van zoogdiercellen storen (bv. bepaalde topoisomeraseremmers en bepaalde nucleosideanalogen). In deze gevallen zullen mutatietests met zoogdiercellen wellicht geschikter zijn. Hoewel veel stoffen die positief op deze test reageren, ook carcinogeen voor zoogdieren zijn, is de correlatie niet absoluut. De correlatie is afhankelijk van de chemische klasse en er zijn carcinogenen die niet met deze test worden gesignaleerd omdat ze via andere niet-genotoxische mechanismen werken of via mechanismen die in bacteriecellen ontbreken.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Suspensies van bacteriecellen worden zowel met als zonder een exogeen metabool activeringssysteem aan de teststof blootgesteld. Bij de methode met geïntegreerde voedingsbodem worden deze suspensies met een topagar vermengd en direct op minimaal medium uitgeplaat. Bij de preïncubatiemethode wordt het behandelde mengsel geïncubeerd en vervolgens met een topagar vermengd voordat het op minimaal medium wordt uitgeplaat. Bij beide technieken worden na twee of drie dagen incuberen de terugmutantkolonies geteld en wordt dit aantal vergeleken met het aantal spontane terugmutantkolonies op controleplaten met oplosmiddel. Er zijn verschillende procedures voor de uitvoering van de terugmutatietest met bacteriën beschreven. Het meest gebruikt worden de methode met geïntegreerde voedingsbodem (1)(2)(3)(4), de preïncubatiemethode (2)(3)(5)(6)(7)(8), de fluctuatiemethode (9)(10) en de suspensiemethode (11). Ook wijzigingen voor het testen van gassen of dampen zijn beschreven (12). De hier beschreven procedures gelden vooral voor de methode met geïntegreerde voedingsbodem en de preïncubatiemethode. Beide zijn aanvaarbaar voor de uitvoering van experimenten zowel met als zonder metabole activering. Bij sommige stoffen verloopt de detectie efficiënter met de preïncubatiemethode. Deze stoffen behoren tot chemische klassen als alifatische nitrosamines met een korte keten, divalente metalen, aldehyden, azokleurstoffen en diazoverbindingen, pyrollizidine-alkaloïden, allylverbindingen en nitroverbindingen (3). Tevens is het bekend dat bepaalde klassen mutagene verbindingen niet altijd met standaardprocedures als de methode met geïntegreerde voedingsbodem of de preïncubatiemethode worden gesignaleerd. Deze moeten als speciale gevallen worden beschouwd en voor de signalering daarvan wordt sterk aangeraden andere procedures te gebruiken. De volgende speciale gevallen kunnen worden genoemd (met voorbeelden van procedures die voor deze stoffen kunnen worden gebruikt): azokleurstoffen en diazoverbindingen (3)(5)(6)(13), gassen en vluchtige stoffen (12)(14)(15)(16) en glycosiden (17)(18). Voor een afwijking van de standaardprocedure moet een wetenschappelijke motivering worden gegeven.

1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.5.

1.5.1. Voorbereiding

1.5.1.

1.5.1.1. Bacteriën Verse bacterieculturen worden gekweekt tot het laat-exponentiële of vroeg-stationaire groeistadium (ongeveer 109 cellen per ml). Culturen in de laat-stationaire fase mogen niet worden gebruikt. Het is van essentieel belang dat de bij het experiment gebruikte culturen een hoog gehalte aan levensvatbare bacteriën bevatten. De titer kan aan de hand van gegevens over groeicurves uit in het verleden uitgevoerde controles worden bepaald of door met behulp van een uitplaatexperiment het aantal levensvatbare cellen te bepalen. De aanbevolen incubatietemperatuur is 37 oC. Er moeten ten minste vijf bacteriestammen worden gebruikt. Daarbij moeten vier stammen van S. typhimurium zijn (TA 1535, TA 1537, TA 97a of TA 97; Ta 98: en TA 100) waarvan is aangetoond dat de resultaten betrouwbaar en in verschillende laboratoria reproduceerbaar zijn. Deze vier stammen van S. typhimunum hebben GC-basenparen op de primaire terugmutatieplaats en het is bekend dat bepaalde oxiderende mutagenen, cross-linkende stoffen en hydrazines daarmee niet altijd worden gesignaleerd. Voor deze stoffen kunnen de stammen WP2 van E. coli of TA 102 van S. typhimurium worden gebruikt (19), die een AT-basenpaar op de primaire terugmutatieplaats hebben. Als combinatie van stammen wordt derhalve aanbevolen: Om cross-linkende mutagenen te signaleren kan het de voorkeur verdienen TA 102 of een stam van E. coli die bedreven is in DNA-herstel (bv. WP2 (pKM101) van E. coli) te gebruiken. Er moeten erkende procedures voor de bereiding van voorraadculturen, markercontrole en opslag worden gebruikt. Voor elk preparaat van de ingevroren voorraadcultuur moet de aminozuurafhankelijkheid voor de groei worden aangetoond (histidine voor stammen van S. typhimurium en tryptofaan voor stammen van E. coli). Ook ander fenotypekenmerken moeten worden gecontroleerd, namelijk: de aan- of afwezigheid van plasmiden met de R-factor, indien van toepassing (bv. resistentie tegen ampicilline bij de stammen TA 98, TA 100 en TA 97a of TA 97, WP2 uvrA en WP2 uvrA (pKM101) en resistentie tegen ampicilline en tetracycline bij stam TA 102); de aanwezigheid van karakteristieke mutaties (bv. de rfa-mutatie bij S. typhimurium door de gevoeligheid voor kristalviolet en de uvrA-mutatie bij E. coli of de uvrB-mutatie bij S. typhimurium door de gevoeligheid voor ultraviolet licht) (2)(3). Bij de stammen moeten ook spontane terugmutantkolonies voorkomen met een frequentie die ligt binnen het interval dat op grond van controlegegevens van het laboratorium uit het verleden kan worden verwacht en bij voorkeur binnen het interval dat in de literatuur wordt opgegeven.

TA 1535 van S. typhimurium en

TA 1537 of TA 97 of TA 97a van S. typhimurium en

TA 98 van S. typhimurium en

TA 100 van S. typhimurium en

WP2 uvrA van E. coli of WP2 uvrA (pKM101) van E. coli of TA 102 van S. typhimurium.

1.5.1.2. Medium Er wordt gebruikgemaakt van een geschikte minimale agar (bv. met minimaal medium E van Vogel-Bonner en glucose) en een topagar met histidine en bioline of tryptofaan om een aantal celdelingen mogelijk te maken (1)(2)(9).

1.5.1.3. Metabole activering De bacteriën dienen zowel met als zonder een geschikt metabool activeringssysteem aan de teststof te worden blootgesteld. Het meest gebruikte systeem is een post-mitochondriale fractie aangevuld met een cofactor (S9), verkregen uit de lever van knaagdieren die zijn behandeld met enzym-inducerende stoffen als Aroclor 1254 (1)(2) of een combinatie van fenobarbiton en ß-naftoflavon (18)(20)(21). De post-mitochondriale fractie wordt meestal gebruikt bij een concentratie van 5 tot 30 % (v/v) in het S9-mengsel. De keuze en de omstandigheden voor het gebruik van een metabool activeringssysteem kunnen afhankelijk zijn van de aard van de geteste chemische verbinding. In sommige gevallen kan het nuttig zijn meer dan een concentratie van de post-mitochondriale fractie te gebruiken. Voor azokleurstoffen en diazoverbindingen kan wellicht beter een reductief metabool activeringssysteem worden gebruikt (6)(13).

1.5.1.4. Teststof/Bereiding Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media worden opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de behandeling van de bacteriën worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks aan het test-systeem worden toegediend en/of vóór behandeling worden verdund. Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, moeten verse bereidingen worden gebruikt. Chemische reacties tussen het oplosmiddel/medium en de teststof moeten uitgesloten zijn en het oplosmiddel/medium moet verenigbaar zijn met het overleven van de bacteriën en de S9-activiteit (22). Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media worden gebruikt, moeten gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt. Wanneer stoffen worden getest die in water instabiel zijn, moeten de gebruikte organische oplosmiddelen watervrij zijn.

1.5.2. Testomstandigheden

1.5.2.

1.5.2.1. Teststammen (zie punt 1.5.1.1)

1.5.2.2. Blootstellingsconcentraties Bij de bepaling van de grootste te gebruiken hoeveelheid teststof moet onder andere rekening worden gehouden met de cytotoxiciteit en de oplosbaarheid in het uiteindelijke behandelingsmengsel. Het kan nuttig zijn vooraf een apart experiment uit te voeren om de toxiciteit en de oplosbaarheid te bepalen. De cytotoxiciteit kan worden bepaald aan de hand van een daling in het aantal terugmutantkolonies, een opheldering of afname van de achtergrond of de mate waarin de behandelde culturen overleven. De cytotoxiciteit van een stof kan in aanwezigheid van een metabool activeringssysteem veranderen. De oplosbaarheid moet worden beoordeeld aan de hand van het met het blote oog zichtbare neerslaggedrag in het uiteindelijke mengsel onder de feitelijke testomstandigheden. De aanbevolen maximale concentratie voor oplosbare niet-cytotoxische stoffen is 5 mg/plaat of 5 μl/plaat. Voor niet-cytotoxische stoffen die bij 5 mg/plaat of 5 μl/plaat niet oplosbaar zijn, moet een of meer van de geteste concentraties in het uiteindelijke behandelingsmengsel onoplosbaar zijn. Teststoffen die al bij lagere concentraties dan 5 mg/plaat of 5 μl/plaat cytotoxisch zijn, moeten tot een cytotoxische concentratie worden getest. Het neerslag mag niet storen bij het scoren. Er moeten ten minste vijf analyseerbare concentraties van de teststof worden gebruikt met ongeveer een half log-interval (d.w.z. een factor √10) tussen de concentraties voor een eerste experiment. Kleinere intervallen kunnen nuttig zijn wanneer het verband tussen concentratie en respons wordt onderzocht. Hogere concentraties dan 5 mg/plaat of 5 μl/plaat kunnen worden overwogen bij de beoordeling van stoffen die significante hoeveelheden potentieel mutagene verontreinigingen bevatten.

1.5.2.3. Negatieve en positieve controles Bij elke bepaling moeten tegelijkertijd stamspecifieke positieve en negatieve (oplosmiddel of medium) controles worden uitgevoerd, zowel met als zonder metabole activering. De concentraties van de positieve controle moeten zodanig worden gekozen dat voor elke bepaling wordt aangetoond dat deze correcte resultaten oplevert. Voor bepalingen waarbij een metabool activeringssysteem wordt gebruikt, moet(en) de voor de positieve controle gebruikte referentiestof(fen) op basis van de aard van de gebruikte bacteriestam worden gekozen. Voor bepalingen met metabole activering kunnen als positieve controle bijvoorbeeld worden gebruikt: Stof Cas-nr Einecs-nr. 9,10-dimethylanthraceen 78l-43-l 212-308-4 7,12-dimethylbenz[a]anthraceen 57-97-6 200-359-5 Benzo[a]pyreen 50-32-8 200-028-5 2-aminoantraceen 613-13-8 210-330-9 Cyclofosfamide 50-18-0 200-015-4 Cyclofosfamide monohydraat 6055-19-2 Voor de methode met reductieve metabole activering kan als positieve controle worden gebruikt: Stof CAS-nr. Einecs-nr. Kongo rood 5 7 3-58-0 209-358-4 2-aminoantraceen mag niet als enige indicator voor de werkzaamheid van het S9-mengsel worden gebruikt. Als 2-aminoantraceen wordt gebruikt, moet elke charge S9 ook worden gekarakteriseerd met een mutageen waarvoor metabole activering met microsomale enzymen nodig is, zoals benzo[a]pyreen of dimethylbenzant-raceen. Voor bepalingen zonder exogeen metabool activeringssysteem kunnen als stamspecifieke positieve controle bijvoorbeeld worden gebruikt: Stof CAS-nr. Einecs-nr. Stam Natriumazide 26628-22-S 247-852-1 TA 1535 en TA 100 2-nitrofluoreen 607-57-8 210-138-5 TA 98 9-aminoacridine 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 en TA 97a ICR 191 1 7070-4 5-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 en TA 97a Cumeenhydroperoxide 80-15-9 201-254-7 TA 102 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA en TA 102 N-ethyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2 uvrA en WP2 uvrA(pKM101) 4-nitroquinoline-1-oxide 56-5 7-5 200-281-1 WP2, WP2 uvrA en WP2 uvrA(pKM101) Furylfuramide (AF2) 3688-53-7 Stammen die plasmiden bevatten Ook andere geschikte stoffen kunnen als positieve controle worden gebruikt. Waar mogelijk dient het gebruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle te worden overwogen. In het experiment dienen negatieve controles te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel of het medium zonder teststof wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de andere groepen worden behandeld. Daarnaast moeten er ook controles worden gebruikt waaraan niets wordt toegediend, tenzij in het verleden reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.

1.5.3. Uitvoering Voor de methode met geïntegreerde voedingsbodem (1)(2)(3)(4) zonder metabole activering wordt meestal 0,05 ml of 0,1 ml testoplossing, 0,1 ml verse bacteriecultuur (met ongeveer 108 levensvatbare cellen) en 0,5 ml steriele buffer gemengd met 2,0 ml topagar. Voor de bepaling met metabole activering wordt meestal 0,5 ml van het metabool activeringsmengsel met een afdoende hoeveelheid post-mitochondriale fractie (tussen 5 en 30 % (v/v) in het metabole activeringsmengsel) gemengd met de topagar (2,0 ml), de bacteriën en de test-stof/testoplossing. De inhoud van elke buis wordt gemengd en uitgegoten over het oppervlak van een minimale agarplaat. De topagar krijgt voor de incubatie de gelegenheid te stollen. Voor de preïncubatiemethode (2)(3)(5)(6) wordt de teststof/testoplossing gepreïncubeerd met de teststam (met ongeveer 108 levensvatbare cellen) en steriele buffer of het metabole activeringssysteem (0,5 ml), meestal gedurende minimaal 20 minuten bij 30-37 oC, en vervolgens gemengd met de topagar en uitgegoten over het oppervlak van een minimale agarplaat. Meestal wordt 0,05 ml of 0,1 ml teststof/testoplossing, 0,1 ml bacteriën en 0,5 ml S9-mengsel of steriele buffer gemengd met 2,0 ml topagar. De buizen dienen gedurende de preïncubatie met behulp van een schudmachine te worden belucht. Om een adequate raming van de spreiding te kunnen maken moeten voor elk dosisniveau drie platen worden gebruikt. Het gebruik van twee platen is aanvaardbaar wanneer daarvoor een wetenschappelijke motivering wordt gegeven. Wanneer nu en dan een plaat verloren gaat, maakt dit de bepaling niet noodzakelijkerwijs onbruikbaar. Bij het testen van gassen of vluchtige stoffen moet een daarvoor geschikte methode worden gevolgd, bijvoorbeeld in een gesloten kweekvat (12)(14)(15)(16).

1.5.4. Incubatie Alle platen voor een bepaling worden gedurende 48-72 uur bij 37 oC geïncubeerd. Na de incubatieperiode wordt het aantal terugmutantkolonies per plaat geteld.

2. GEGEVENS

2.

2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN De gegevens worden vermeld als het aantal terugmutantkolonies per plaat. Daarnaast moet ook het aantal terugmutantkolonies op de platen voor zowel negatieve (oplosmiddel en zonder behandeling, indien gebruikt) als positieve controle worden vermeld. Voor zowel de teststof als de positieve en negatieve (zonder behandeling en/of oplosmiddel) controle, moeten de tellingen per plaat, het gemiddelde aantal terugmutantkolonies per plaat en de standaardafwijking worden vermeld. Een duidelijk positieve reactie behoeft niet te worden bevestigd. Bij onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden. Negatieve resultaten moeten per geval worden bevestigd. Wanneer een bevestiging van negatieve resultaten niet nodig wordt geacht, moet daarvoor een motivering worden gegeven. Bij vervolgexperimenten dient wijziging van parameters te worden overwogen om de bepaling uit te breiden tot een breder scala van omstandigheden. Parameters die voor wijziging in aanmerking komen zijn bijvoorbeeld de concentratie-intervallen, de wijze van behandeling (geïntegreerde voedingsbodem of preïncubatie in vloeistof) en de omstandigheden bij metabole activering.

2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, zoals een concentratieafhankelijke stijging op het geteste interval en/of een reproduceerbare stijging bij een of meer concentraties van het aantal terugmutantkolonies per plaat bij ten minste één stam met of zonder metabool activeringssysteem (23). In eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt (24). Statistische significantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een positieve reactie zijn. Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria voldoen, wordt de stof bij deze test als niet-mutageen beschouwd. Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, onduidelijk of twijfelachtig blijven. Positieve resultaten bij de terugmutatietest met bacteriën wijzen erop dat de teststof puntmutaties door basen-paarvervanging of leesraamverschuiving in het genoom van Salmonella typhimurium en/of Escherichia coli induceeert. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden bij de geteste soort niet mutageen is.

3. RAPPORTAGE

3. TESTVERSLAG

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Oplosmiddel/Medium:

motivering voor de keuze van het oplosmiddel/medium;

oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/medium, indien bekend.

Stammen:

gebruikte stammen;

aantal cellen per cultuur;

kenmerken van de stam.

Testomstandigheden:

hoeveelheid teststof per plaat (in mg/plaat of (μl/plaat) met vermelding van de achtergrond voor de keuze van de dosis en het aantal platen per concentratie;

gebruikte media;

aard en samenstelling van het metabool activeringssysteem, met inbegrip van aanvaardbaarheidscriteria;

procedures voor de behandeling.

Resultaten:

tekenen van toxiciteit;

neerslagverschijnselen;

tellingen per plaat;

gemiddeld aantal terugmutantkolonies per plaat met de standaardafwijking;

indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;

eventuele statistische analyses;

gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve controles met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking;

gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve controles met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)

REFERENTIES Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, pp. 173-215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, pp. 217-233. Kier, L.D., Brusick, D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray, V. (1986). The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, pp. 69-240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975). Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, pp. 91-96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao. M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980). Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner. R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. pp. 273-285. Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R. (1980). Bacterial Mutation Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61. Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987). Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, pp. 167-177. Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976). Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res., 38, pp. 33-42. Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and Bridges, J.W. (1984). The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M, Nichols, W. and Ramel, C. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161. Thompson, E.D. and Melampy, P.J. (1981). An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453-465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994). lmproved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, pp. 335-344. Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughan, V.L. (1984). Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, pp. 33-47. Zeiger. E., Anderson, B.E.. Haworth. S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992). Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G. (1977). Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258. Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D. (1987). Vaporization Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M. and Sugimura, T. (1979). Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium. Cancer Res., 39, pp. 3780-3782. Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N. (1980). Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G. (1990). Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis. 5, pp. 285-291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing. Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, (21) pp. 175-177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N. (1981). Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., 88. pp. 343-350. Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987). Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity. Mutation Res. 189, pp. 83-91. Mahon, G.A.T., Green, M.H.L, Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J. (1989). Analysis of Data from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cambridge University Press, pp. 28-65.

B.

15. MUTAGENITEITSONDERZOEK EN SCREENING OP CARCINOGENESEGENMUTATIE — SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.2. DEFINITIE Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.3. REFERENTIESTOFFEN Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE Er kunnen verschillende haploïde en diploïde stammen van de gist Saccharomyces cerevisiae worden gebruikt om de door chemische stoffen geïnduceerde genmutaties te meten, dit zowel met als zonder metabole activering. Voorwaartse mutatiesystemen bij haploïde stammen zoals de meting van mutatie van rode mutanten met adeninebehoefte (ade-1, ade-2) naar witte mutanten met dubbele adeninebehoefte en selectieve systemen zoals de inductie van canavanine- en cycloheximideresistentie zijn gebruikt. Het meest uitgebreid gevalideerde terugwaartse mutatiesysteem maakt gebruik van de haploïde stam XV 185-14C welke de oker nonsens mutaties ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 en trp 5-48 draagt die omkeerbaar zijn door basesubstitutiemutagenen die plaatsspecifieke mutaties of oker suppressor mutaties induceren. XV 185-14C heeft ook het his 1-7 kenmerk, een missense mutatie die hoofdzakelijk wordt gereverteerd door tweede-plaatsmutaties, en het hom 3-10 kenmerk, dat wordt gereverteerd door frame shift-mutagenen (verschuivingen in het leeskader). Van de diploïde stammen van S.cerevisiae wordt alleen D7, die homozygoot is voor ilv 1-92, uitgebreid gebruikt.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE

1.6. V oorbereidingen

De oplossingen van de teststof en van controle- of referentiestoffen dienen kort voor het uitvoeren van de test te worden bereid met behulp van een geschikt medium. Voor niet in water oplosbare organische stoffen moet een oplossing van niet meer dan 2 % v/v organische oplosmiddelen, zoals ethanol, aceton of dimethylsulfoxyde (DMSO) worden gebruikt. De eindconcentratie van het oplosmiddel dient de levensvatbaarheid en de groeikarakteristieken van de cel niet significant te beïnvloeden.

Metabole activering

De cellen moeten met en zonder een geschikt exogeen metabool activeringssysteem aan de teststoffen worden blootgesteld. Het meest gebruikte systeem is een met een cofactor aangevulde postmitochondriale fractie bereid uit levers van knaagdieren die met enzyminducerende agentia zijn voorbehandeld. Het gebruik van andere diersoorten, weefsels, postmitochondriale fracties of procedures kan ook geschikt zijn voor het verkrijgen van metabole activering.

Proefomstandigheden

Proefstammen

De haploïde stam XV 185-14 C en de diploïde stam D7 zijn het meest gebruikt voor onderzoek naar genmutaties. Andere stammen kunnen eveneens geschikt zijn.

Media

Er worden geschikte media gebruikt voor de bepaling van overleving en het aantal mutaties.

Gebruik van negatieve en positieve controles

Positieve, onbehandelde en oplosmiddelencontroles moeten parallel worden uitgevoerd. Voor elk specifiek mutatie-eindpunt moeten geschikte positieve controlechemicaliën worden gebruikt.

Blootstellingsconcentraties

Er zijn ten minste vijf behoorlijk gespreide concentraties van de teststof vereist. Voor toxische stoffen mag de hoogste geteste concentratie het overlevingspercentage niet tot minder dan 5 à 10 % verlagen. In water relatief onoplosbare stoffen dienen met behulp van geschikte methoden tot de uiterste oplosbaarheidsgrens te worden onderzocht. Voor volledig in water oplosbare niet-toxische stoffen dient de hoogste concentratie per geval te worden bepaald.

Incubatieomstandigheden

De platen worden gedurende vier tot zeven dagen bij 28 tot 30 oC in het donker geïncubeerd.

Spontane mutatiefrequënties

Er dienen subculturen te worden gebruikt met een spontane mutatiefrequentie binnen de normaal aanvaarde grenzen.

Aantal replica's

Voor de analyse van door genmutatie geproduceerde prototrofen en de levensvatbaarheid van de cellen moeten per concentratie ten minste drie replicaplaten worden gebruikt. Voor proefnemingen met kenmerken zoals hom 3-10 met een laag mutatieniveau moet het aantal gebruikte platen worden verhoogd, teneinde statistisch relevante gegevens te verkrijgen.

Uitvoering

S. cerevisiae-stammen worden gewoonlijk behandeld in een vloeistoftest met hetzij stationaire hetzij groeiende cellen. Het eerste experiment moet worden uitgevoerd met groeiende cellen. 1 — 5 × 107 cellen per ml worden gedurende maximaal achttien uur bij 28 tot 37 oC onder schudden aan de teststof blootgesteld; een passende hoeveelheid van een metabool activeringssysteem wordt tijdens de behandeling toegevoegd, waar dat van toepassing is. Na de behandeling worden de cellen gecentrifugeerd, uitgewassen en uitgezaaid op een geschikt cultuurmedium. Na incubatie worden op de platen overleving en de inductie van genmutaties bepaald. Indien het eerste experiment negatief is, moet een tweede experiment worden uitgevoerd met stationaire cellen. Als het eerste experiment positief is, dient dit in een passend, onafhankelijk experiment te worden bevestigd.

2. GEGEVENS De gegevens moeten in tabellen worden samengevat met vermelding van het aantal getelde kolonies, het aantal mutanten, overlevings- en mutatiefrequenties. Alle resultaten moeten in een onafhankelijke proef worden bevestigd. De gegevens moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

gebruikte stam;

proefomstandigheden: stationaire fase of groeiende cellen, samenstelling van de media, incubatietemperatuur en -duur, metabool activeringssysteem;

behandelingsomstandigheden: blootstellingsniveaus, procedure en duur van de behandeling, behandelingstemperatuur, positieve en negatieve controles;

aantal getelde kolonies, aantal mutanten, overlevings- en mutatiefrequentie, dosis-responsverhouding (waar dat van toepassing is), statistische beoordeling van gegevens;

bespreking van de resultaten;

interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE Zie Algemene inleiding — Deel B.

4. LITERATUUR Zie Algemene inleiding — Deel B.

16. MITOTISCHE RECOMBINATIE — SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.2. DEFINITIE Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.3. REFERENTIESTOFFEN Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE Mitotische recombinatie bij Saccharomyces cerevisiae kan worden vastgesteld tussen genen (of meer algemeen tussen een gen en zijn centromeer) en binnen genen. Het eerste verschijnsel wordt mitotische overkruising genoemd en genereert reciproke producten terwijl het laatste verschijnsel meestal niet reciprook is en genconversie wordt genoemd. Overkruising kan over het algemeen worden vastgesteld door de productie van recessieve homozygote kolonies of sectoren in een heterozygote stam terwijl genconversie wordt vastgesteld door de productie van prototrofe revertanten in een auxotrofe heteroallele stam die twee verschillende defecte allelen van hetzelfde gen draagt. De voor het opsporen van mitotische genconversie meest gebruikte stammen zijn D4 (heteroalleel in ade 2 en trp 5), D7 (heteroalleel in trp 5), BZ34 (heteroalleel in arg 4) en JD1 (heteroalleel in his 4 en trp 5). Mitotische overkruising waarbij rode en roze homozygote sectoren worden geproduceerd, kan worden vastgesteld in D5 of D7 (waarin ook de mitotische genconversie en de terugwaartse mutatie in ilv 1-92 worden gemeten), aangezien beide stammen heteroalleel zijn voor complementerende allelen van ade2.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE

1.6. Voorbereidingen

Oplossingen van de teststof en van controle- of referentiestoffen dienen kort voor het uitvoeren van de test te worden bereid met behulp van een geschikt medium. Voor niet in water oplosbare organische stoffen moet een oplossing van niet meer dan 2 % v/v organische oplosmiddelen, zoals ethanol, aceton en dimethylsulfoxyde (DMSO) worden gebruikt. De eindconcentratie van het oplosmiddel dient de levensvatbaarheid en de groeikarakteristieken van de cel niet significant te beïnvloeden.

Metabole activering

De cellen moeten zowel met als zonder een geschikt exogeen metabool activeringssysteem aan de teststoffen worden blootgesteld. Het meest gebruikte systeem is een met cofactor aangevulde postmitochondriale fractie bereid uit de levers van knaagdieren die voorbehandeld zijn met enzyminducerende agentia. Het gebruik van andere diersoorten, weefsels, postmitochondriale fracties of procedures kan eveneens geschikt zijn voor het verkrijgen van metabole activering.

Proefomstandigheden

Proefstammen

De meest gebruikte stammen zijn de diploïden D4, D5, D7 en JD1. Andere stammen kunnen ook gebruikt worden.

Media

Er worden geschikte cultuurmedia gebruikt voor de bepaling van overleving en de mitotische recombinatiefrequentie.

Gebruik van negatieve en positieve controles

Positieve, onbehandelde en oplosmiddelcontroles moeten parallel worden uitgevoerd. Voor elk specifiek recombinatie-eindpunt moeten geschikte positieve controlestoffen worden gebruikt.

Blootstellingsconcentraties

Er zijn ten minste vijf behoorlijk gespreide concentraties van de teststof vereist. Factoren waarmee rekening moet worden gehouden zijn cytotoxiciteit en oplosbaarheid. De laagste concentratie mag geen effect hebben op de levensvatbaarheid van de cellen. Voor toxische chemicaliën mag de hoogste geteste concentratie het overlevingspercentage niet tot minder dan 5 a 10 % verlagen. In water relatief onoplosbare chemicaliën dienen met behulp van geschikte methoden tot de uiterste oplosbaarheidsgrens te worden onderzocht. Voor volledig in water oplosbare niet-toxische stoffen dient de hoogste concentratie per geval te worden bepaald. De cellen kunnen, hetzij in de stationaire fase hetzij tijdens de groei, gedurende perioden van maximaal achttien uur aan de teststof worden blootgesteld. Bij lange behandelingstijden dienen de culturen evenwel microscopisch te worden gecontroleerd op spoorvorming, aangezien de proef daardoor zijn waarde verliest.

Incubatieomstandigheden

De platen worden in het donker gedurende vier tot zeven dagen bij 28 tot 30 oC geïncubeerd. Platen die worden gebruikt voor het opsporen van door mitotische overkruising geproduceerde rode en roze homozygote sectoren dienen voor het tellen nog een à twee dagen in een koelkast te worden bewaard (± 4 oC), teneinde de ontwikkeling van de geschikt gepigmenteerde kolonies te laten plaatsvinden.

Spontane mitotische recombinatiefrequentie

Er moeten subculturen worden gebruikt met een spontane mitotische recombinatiefrequentie binnen de normaal aanvaarde grenzen.

Aantal replica's

Per concentratie moeten ten minste drie replicaplaten worden gebruikt voor de bepaling van het aantal door mitotische genconversie geproduceerde prototrofen en de levensvatbaarheid van de cellen. Indien het aantal door mitotische overkruising geproduceerde recessieve homozygoten wordt bepaald, dient het aantal platen te worden verhoogd, opdat een voldoende aantal kolonies kan worden onderzocht.

Uitvoering

S. cerevisiae-stammen worden gewoonlijk in een vloeistoftest behandeld en er worden hetzij stationaire hetzij groeiende cellen gebruikt. Het eerste experiment moet worden uitgevoerd met groeiende cellen. 1 — 5 × 107 cellen per ml worden gedurende maximaal achttien uur bij 28 tot 37 oC onder schudden aan de teststof blootgesteld; tijdens de behandeling wordt een passende hoeveelheid van een metabool activeringssysteem toegevoegd, waar dat van toepassing is. Na de behandeling worden de cellen gecentrifugeerd, uitgewassen en uitgeplaat op een geschikt cultuurmedium. Na incubatie wordt op de platen de overleving en de inductie van mitotische recombinaties bepaald. Indien het eerste experiment negatief is, moet een tweede experiment worden uitgevoerd met stationaire cellen. Als het eerste experiment positief is, dient dit in een passend, onafhankelijk experiment te worden bevestigd.

2. GEGEVENS De gegevens moeten in tabellen worden samengevat met vermelding van het aantal getelde kolonies, het aantal recombinanten, overleving en recombinatiefrequentie. Alle resultaten worden in een onafhankelijke proef bevestigd. De gegevens moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

gebruikte stam;

proefomstandigheden: stationaire fase of groeiende cellen, samenstelling van de media, incubatietemperatuur en –duur, metabool activeringssysteem;

behandelingsomstandigheden: blootstellingsconcentratie, procedure en duur van de behandeling, behandelingstemperatuur, positieve en negatieve controles;

aantal getelde kolonies, aantal recombinanten, overleving en recombinatie-frequentie, dosis-responsverhouding (waar dat van toepassing is), statistische evaluatie van de gegevens;

bespreking van de resultaten;

interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE Zie Algemene inleiding — Deel B.

4. LITERATUUR Zie Algemene inleiding — Deel B.

B.17. MUTAGENITEIT — IN-VITRO GENMUTATIETEST MET ZOOGDIERCELLEN

B.17.

1. METHODE Deze methode is overgenomen van TG 476 van de OESO: In-vitro genmutatietest met zoogdiercellen (1997).

1.

1.1. INLEIDING De in-vitro genmutatietest met zoogdiercellen kan worden gebruikt voor de detectie van genmutaties die door chemische stoffen zijn geïnduceerd. Geschikte cellijnen zijn bijvoorbeeld de L5178Y-muizenlymfoomcellen, de cellijnen CHO, CHO-AS52 en V79 van Chinese hamsters en de humane TK6-lymfoblastoïdcellen (1). Bij deze cellijnen zijn de meest gangbare genetische eindpunten: een mutatie bij thymidinekinase (TK), hypoxan-thineguanine-fosforibosyltransferase (HPRT) en transgeen xanthine-guanine-fosforibosyltransferase (XPRT). Bij de mutatietests met TK, HPRT en XPRT worden verschillende spectra van genetische gebeurtenissen gedetecteerd. Door de ligging van TK en XPRT op autosomen kunnen genetische gebeurtenissen worden gedetecteerd (bv. grote deleties) die niet op de HPRT-locus op X-chromosomen worden gesignaleerd (2)(3)(4)(5)(6). Bij de in-vitro genmutatietest met zoogdiercellen kunnen culturen van permanente cellijnen of celstammen worden gebruikt. De gebruikte cellen worden geselecteerd op basis van het groeivermogen in een cultuur en de stabiliteit van de spontane mutatiefrequentie. Bij in vitro uitgevoerde tests moet er meestal een exogene metabole activeringsbron worden gebruikt. Dit metabole activeringssysteem kan de omstandigheden in een zoogdiercel in vivo niet volledig nabootsen. Er moet goed op worden gelet dat omstandigheden die kunnen leiden tot positieve resultaten die niet het gevolg zijn van intrinsieke mutageniteit, worden vermeden. Positieve resultaten die niet het gevolg zijn van intrinsieke mutageniteit kunnen ontstaan door veranderingen in de pH of de osmolaliteit of een sterke cytotoxiciteit (7). Deze test wordt gebruikt voor de screening op mogelijke mutagenen en carcinogenen voor zoogdieren. Veel stoffen die positief op deze test reageren, zijn carcinogeen voor zoogdieren, maar er is geen absolute correlatie tussen deze test en carcinogeniteit. De correlatie is afhankelijk van de chemische klasse en het lijkt er steeds meer op dat er carcinogenen zijn die niet met deze test worden gesignaleerd omdat ze blijkbaar via andere niet-genotoxische of in bacteriecellen afwezige mechanismen werken (6). Zie ook de algemene inleiding van deel B.

1.2. DEFINITIES Voorwaartse mutatie: een genmutatie van het oudertype naar de mutantvorm die leidt tot wijziging of verlies van de enzymactiviteit of de functie van het gecodeerde eiwit. Mutageen met basenpaarvervanging: een stof die vervanging van een of meer basenparen in het DNA veroorzaakt. Mutageen met leesraamverschuiving: een stof die invoeging of deletie van een of meer basenparen in het DNA-molecuul veroorzaakt. Fenotypische expressietijd: de periode gedurende welke ongewijzigde genproducten uit pas gemuteerde cellen verdwijnen. Mutantfrequentie: de verhouding tussen het aantal waargenomen mutantcellen en het aantal levensvatbare cellen. Relatieve totale groei: de toename van het aantal cellen in de loop van de tijd in vergelijking met een controle-celpopulatie, berekend als het product van de suspensiegroei in vergelijking met de negatieve controle en de kloneringsefficiéntie in vergelijking met de negatieve controle. Relatieve suspensiegroei: de toename van het aantal cellen tijdens de expressieperiode in vergelijking met de negatieve controle. Levensvatbaarheid: de kloneringsefficiëntie van de behandelde cellen bij het uitplaten in selectieve omstandigheden na de expressieperiode. Overleving: de kloneringsefficiëntie van de behandelde cellen bij het uitplaten aan het eind van de behandelingsperiode; de overleving wordt meestal uitgedrukt in vergelijking met de controlecelpopulatie.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Cellen met een deficiëntie aan thymidinekinase (TK) door de mutatie TK+/- —> TK -/- zijn resistent voor de cytotoxische effecten van de pyrimidine-analoog trifluorthymidine (TFT). Cellen zonder deficiëntie aan thymidinekinase zijn gevoelig voor TFT, waardoor het celmetabolisme wordt geremd en er geen celdeling meer plaatsvindt. Dit betekent dat mutantcellen zich in aanwezigheid van TFT kunnen voortplanten en normale cellen, die thymidinekinase bevatten, niet. Analoog hieraan worden ook cellen met een deficiëntie aan HPRT of XPRT geselecteerd door resistentie voor 6-thioguanine (TG) of 8-azaguanine (AG). De eigenschappen van de teststof moeten zorgvuldig worden bekeken als een base-analoog of een met de selecterende stof verwante verbinding aan een van de genmutatietests met zoogdiercellen wordt onderworpen. Eventuele vermoedens omtrent selectieve toxiciteit van de teststof bij mutantcellen en gewone cellen moeten nader worden onderzocht. Bij het testen van chemische stoffen die verwant zijn met de selecterende stof moet worden bevestigd of het selectiesysteem en de selecterende stof bruikbaar zijn (8). Cellen in een suspensie of een monolaagcultuur worden zowel met als zonder metabole activering gedurende een geschikte periode aan de teststof blootgesteld en overgeënt om de cytotoxiciteit te bepalen en fenotypische expressie mogelijk te maken alvorens de mutanten te selecteren (9)(10)(l l)(12)(13). De cytotoxiciteit wordt meestal bepaald door de relatieve kloneringsefficiëntie (overleving) of de relatieve totale groei van de culturen na de behandelingsperiode te meten. De behandelde culturen blijven een voldoende lange periode, kenmerkend voor elke locus en elk celtype, in groeimedium om een vrijwel optimale fenotypische expressie van de geïnduceerde mutaties mogelijk te maken. De mutantfrequentie wordt bepaald door bekende aantallen cellen te enten in medium met de selecterende stof voor de detectie van mutantcellen en in medium zonder de selecterende stof voor de bepaling van de kloneringsefficiëntie (levensvatbaarheid). Na een geschikte incubatietijd worden de kolonies geteld. De mutantfrequentie wordt bepaald aan de hand van het aantal mutantkolonies in het selectieve medium en het aantal kolonies in het niet-selectieve medium.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.

1.4.1. Voorbereiding

1.4.1.

1.4.1.1. Cellen Er kunnen verschillende soorten cellen voor deze test worden gebruikt, zoals subklonen van de cellijnen L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 of TK6. Van de bij deze test gebruikte cellen moet worden aangetoond dat ze gevoelig zijn voor chemische mutagenen en een hoge kloneringsefficiëntie en een stabiele spontane mutantfrequentie hebben. De cellen moeten op besmetting met mycoplasma worden gecontroleerd en mogen bij besmetting niet worden gebruikt. De test moet zodanig worden opgezet dat deze een vooraf bepaalde gevoeligheid en onderscheidingsvermogen heeft. Het aantal cellen, culturen en concentraties van de teststof moet aan de hand van deze vooraf bepaalde parameters worden gekozen (14). Het minimale aantal levensvatbare cellen dat de behandeling overleeft en bij elke fase van de test wordt gebruikt, moet op basis van de spontane mutatiefrequentie worden gekozen. Een vuistregel is dat het gebruikte aantal cellen ten minste tien keer zo groot moet zijn als de inverse van de spontane mutatiefrequentie. Aanbevolen wordt echter ten minste 106 cellen te gebruiken. Er moeten afdoende gegevens uit het verleden over het gebruikte celsysteem beschikbaar zijn om aan te kunnen nemen dat de test consistente resultaten oplevert.

1.4.1.2. Media en kweekomstandigheden Er moet worden gezorgd voor geschikte kweekmedia en incubatieomstandigheden (kweekvat), temperatuur, CO2-concentratie, en vochtigheid). De media moeten worden gekozen op basis van de bij de test gebruikte selectieve systemen en celtypes. Het is vooral belangrijk dat de kweekomstandigheden zodanig worden gekozen dat de celgroei tijdens de expressieperiode en het kolonievormend vermogen van zowel de mutantcellen als de gewone cellen optimaal zijn.

1.4.1.3. Bereiding van de culturen Cellen uit stamculturen worden in een kweekmedium geënt en bij 37 oC geïncubeerd. Het is wellicht nodig reeds aanwezige mutantcellen uit de cultuur te verwijderen voordat deze voor de test wordt gebruikt.

1.4.1.4. Metabole activering De cellen dienen zowel met als zonder een geschikt metabool activeringssysteem aan de teststof te worden blootgesteld. Het meest gebruikte systeem is een post-mitochondriale fractie aangevuld met een cofactor (S9), verkregen uit de lever van knaagdieren die zijn behandeld met enzym-inducerende stoffen als Aroclor 1254 (15)(16)(17)(18) of een combinatie van fenobarbiton en β-naftoflavon (19)(20). De post-mitochondriale fractie wordt meestal gebruikt bij een concentratie van 1-10 % (v/v) in het uiteindelijke medium. De keuze en omstandigheden voor het gebruik van een metabool activeringssysteem kunnen afhankelijk zijn van de aard van de geteste chemische verbinding. In sommige gevallen zal wellicht meer dan een concentratie van de post-mitochondriale fractie moeten worden gebruikt. Een aantal ontwikkelingen, bijvoorbeeld de opbouw van genetisch aangepaste cellijnen waarin specifieke activeringsenzymen tot expressie komen, kan endogene activering mogelijk maken. Voor de keuze van de gebruikte cellijnen moet een wetenschappelijke verantwoording worden gegeven (bv. aan de hand van de relevantie van het cytochroom P450-isoenzym vuur het metabolisme van de teststof).

1.4.2. Testomstandigheden

1.4.2.

1.4.2.3. Controles Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en negatieve (oplosmiddel of medium) controles worden uitgevoerd, zowel met als zonder metabole activering. Wanneer metabole activering wordt gebruikt, moet de voor de positieve controle gebruikte chemische stof activering vereisen om een mutagene reactie te veroorzaken. Als positieve controle kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt: Metabole activering Locus Stof CAS-nr. Einecs-nr. Zonder exogene metabole activering HPRT Ethylmethaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 Ethylnitrosoureum 759-73-9 212-072-2 TK (kleine en grote kolonies) Methylmethaansulfonaat 66-27-3 200-625-0 XPRT Ethylmethaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 Ethylnitrosoureum 759-73-9 212-072-2 Met exogene metabole activering HPRT 3-Methylcholanthreen 56-49-5 200-276-4 N-.Nitrosodimethylamine 62-75-9 200-549-8 7,1 2-Dimethylbenzanthraceen 57-97-6 200-359-5 TK (kleine en grote kolonies) Cyclofosfamide 50-18-0 200-015-4 Cyclofosfamide monohydraat 6055-19-2 Benzo[a]pyreen 50-32-8 200-028-5 3-Methvlcholanthreen 56-49-5 200-276-5 XPRT N-Nitrosodimethylamine (voor hoge concentraties van S9) 62-75-9 200-549-8 Benzo[a]pyreen 50-32-8 200-028-5 Ook andere geschikte referentiestoffen kunnen als positieve controle worden gebruikt, bijvoorbeeld 5-broom-2'-deoxyuridine (CAS-nr. 59-14-3 en Einecs-nr. 200-415-9) als het laboratorium over referentiegegevens uit het verleden beschikt. Waar mogelijk dient het gebruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle te worden overwogen. Er dienen negatieve controles in het experiment te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel of het medium wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de testgroepen worden behandeld. Daarnaast moeten er ook controles worden gebruikt waaraan niets wordt toegediend, tenzij in het verleden reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.

1.4.3. Uitvoering

1.4.3.

1.4.3.1. Behandeling met de teststof Delende cellen worden zowel met als zonder metabole activering aan de teststof blootgesteld. De blootstelling moet gedurende een geschikte periode worden uitgevoerd (meestal is drie tot zes uur voldoende). De blootstelling kan een of meer celcycli beslaan. Voor elke concentratie kan de bepaling met één behandelde cultuur of in duplo worden uitgevoerd. Wanneer één cultuur wordt gebruikt, moet het aantal concentraties worden verhoogd om ervoor te zorgen dat een afdoende aantal culturen kan worden geanalyseerd (d.w.z. ten minste acht analyseerbare concentraties). Voor de negatieve controle (oplosmiddel) moeten duploculturen worden gebruikt. Bij het testen van gassen of vluchtige stoffen moet een daarvoor geschikte methode worden gevolgd, bijvoorbeeld in een gesloten kweekvat (21)(22).

1.4.3.2. Meting van de overleving, de levensvatbaarheid en de mutatiefrequentie Aan het eind van de blootstellingsperiode worden de cellen gewassen en gekweekt om de overleving te bepalen en expressie van het mutantfenotype mogelijk te maken. Meestal wordt na de behandelingsperiode begonnen met de meting van de cytotoxiciteit door bepaling van de relatieve kloneringsefficiëntie (overleving) of de relatieve totale groei van de culturen. Voor elke locus is er een bepaalde minimale tijd nodig om een vrijwel optimale fenotypische expressie van de geïnduceerde mutaties mogelijk te maken (voor HPRT en XPRT is ten minste zes tot acht dagen nodig en voor TK ten minste twee dagen). De cellen worden gekweekt in medium met en zonder de selecterende stof(fen) om respectievelijk het aantal mutanten en de kloneringsefficiëntie te bepalen. Aan het eind van de expressieperiode wordt een begin gemaakt met de meting van de levensvatbaarheid (gebruikt voor de berekening van de mutantfrequentie) door uitplating in het niet-selectieve medium. Als de teststof positief reageert of de TK+/--test met L5178Y, moet bij ten minste een van de testculturen (de hoogste positieve concentratie) en bij de negatieve en positieve controles de grootte van de kolonies worden geïnventariseerd. Als de teststof negatief reageert op de TK+/--test met L5178Y, moet bij de negatieve en positieve controles de grootte van de kolonies worden geïnventariseerd. Als de TK+/--test met TK6 wordt gebruikt, kan de grootte van de kolonies ook worden geïnventariseerd.

2. GEGEVENS

2.

2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN Er moeten gegevens worden verstrekt over de bepaling van de cytotoxiciteit en de levensvatbaarheid, het aantal kolonies en de mutantfrequentie bij de behandelde en de controleculturen. Als de teststof positief reageert op de TK+/--test met L5178Y, moeten de kolonies bij ten minste één concentratie van de teststof (de hoogste positieve concentratie) en bij de negatieve en positieve controles worden gescoord aan de hand van de criteria voor grote en kleine kolonies. Er is een gedetailleerde analyse gemaakt van de moleculaire en cytogenetische aard van zowel grote als kleine mutantkolonies (23)(24). Bij de TK+/--test worden de kolonies gescoord aan de hand van de criteria voor normale groei (grote kolonies) en langzame groei (kleine kolonies) (25). Mutantcellen die de omvangrijkste genetische beschadigingen hebben opgelopen, hebben een langere verdubbelingstijd en vormen derhalve kleine kolonies. De omvang van deze beschadiging varieert meestal van verlies van het hele gen tot karyotypisch zichtbare chromosoomafwijkingen. Er is een verband gelegd tussen mutanten met kleine kolonies en chemische stoffen die grootschalige chromosoomafwijkingen induceren (26). Minder ernstig aangetaste mutantcellen hebben een groeitempo dat vergelijkbaar is met de oudercellen en vormen grote kolonies. De overleving (relatieve kloneringsefiiciëntie) of de relatieve totale groei moet worden vermeld. De mutantfrequentie moet worden uitgedrukt als de verhouding tussen het aantal mutantcellen en het aantal overlevende cellen. De gegevens moeten voor elke cultuur apart worden verstrekt. Daarnaast moet er een overzicht van alle gegevens in tabelvorm worden samengesteld. Een duidelijk positieve reactie behoeft niet te worden bevestigd. Bij onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden. Negatieve resultaten moeten per geval worden bevestigd. Wanneer een bevestiging van negatieve resultaten niet nodig wordt geacht, moet daarvoor een motivering worden gegeven. Bij vervolgexperimenten na onduidelijke of negatieve resultaten dient wijziging van parameters te worden overwogen om de bepaling uit te breiden tot een breder scala van omstandigheden. Parameters die voor wijziging in aanmerking komen zijn bijvoorbeeld de concentratie-intervallen en de omstandigheden bij metabole activering.

2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, zoals een concentratieafhankelijke of een reproduceerbare stijging van de mutantfrequentie. In eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt. Statistische significantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een positieve reactie zijn. Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria voldoen, wordt de stof in dit systeem als niet-mutageen beschouwd. Hoewel de meeste studies duidelijk positieve of negatieve resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, onduidelijk of twijfelachtig blijven. Positieve resultaten bij de in-vitro genmutatietest met zoogdiercellen wijzen erop dat de teststof in de gebruikte gekweekte zoogdiercellen oenmutaties induceert. Het duidelijkst is een positieve concentratieafhankelijke respons die reproduceerbaar is. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden in de gebruikte gekweekte zoogdiercellen geen genmutaties induceert.

3. RAPPORTAGE

3. TESTVERSLAG

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Oplosmiddel/Medium:

motivering voor de keuze van het oplosmiddel/medium;

oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/medium, indien bekend.

Cellen:

aard en herkomst van de cellen;

aantal celculturen;

aantal overentingen, indien van toepassing;

methoden om de celcultuur in leven te houden, indien van toepassing;

afwezigheid van mycoplasma.

Testomstandigheden:

achtergrond voor de keuze van de concentraties en het aantal culturen, bijvoorbeeld gegevens over de cytotoxiciteit en beperkte oplosbaarheid, indien beschikbaar;

samenstelling van het medium, CO2-concentratie;

concentratie van de teststof;

toegevoegd volume medium en teststof;

incubatietemperatuur;

incubatietijd;

duur van de behandeling;

celdichtheid bij de behandeling;

aard en samenstelling van het metabool activeringssysteem, met inbegrip van aanvaardbaarheidscntena;

positieve en negatieve controles;

lengte van de expressieperiode (met vermelding van het aantal geënte cellen en schema's voor enting en overenting, indien van toepassing;

selecterende stoften;

criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of onduidelijk is;

methoden die zijn gebruikt om het aantal levensvatbare en mutantcellen te bepalen;

definitie van kolonies van een bepaalde omvang en aard (bv. criteria voor kleine en grote kolonies).

Resultaten:

tekenen van toxiciteit;

neerslagverschijnselen;

gegevens over de pH en de osmolaliteit tijdens de blootstelling aan de teststof, indien bepaald;

grootte van een gescoorde kolonie voor ten minste de negatieve en positieve controles;

mogelijkheden van het laboratorium voor de detectie van mutanten met een kleine kolonie bij de TK+/--test met L5178Y, indien van toepassing;

indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;

eventuele statistische analyses;

gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve controles;

gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve controles met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking;

mutantfrequentie.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)

REFERENTIES Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E.H.Y. and Mailing, H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306-1312. Liber, H.I. and Thilly, W.G. (1982). Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res., 94, pp. 467-485. Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394-403. Aaron, C.S., and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates Mutation Res., 223, pp. 121-128. Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, pp. 235-239. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, I. and Myhr. B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, pp. 147-204. Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavoumin. K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251. Li. A.P., Gupta, R.S., Heflich. R.H. and Wasson, J.S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17-36. Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N.. Hsie. A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F.Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, pp. 135-141. Liber, H.L., Yandell, D.W. and Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, pp. 9-17. Stankowski, L.F.Jr., Tindall, K.R., and Hsie, A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191 Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR-191 Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, pp. 133-147. Turner, N.T., Baltson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures for the L5178Y/TK+/- — TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers. New York, pp. 239-268. Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays. Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, pp. 66-101. Abbondandolo. A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, pp. 365-373. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicïty Test. Mutation Res., 31, pp. 347-364. Clive, D., Johnson. K.O., Spector. J.H.S.. Batson A.G. and Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, pp. 61-108. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, pp. 173-215. Elliott, B.M., Combes, R.D.. Elcombe, C.R., Gatehouse. D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-lnduced S9 in: In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara. K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot. R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice. R.R., Costa. D.L., Schaich. K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York. Plenum, pp. 91-103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5. pp. 79 5-801. Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51-55. Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard. B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFT1) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, pp. 161-174. Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little. J.B. (1990). Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, pp. 89-102. Moore, M.M. and Doerr. C.L. (1990). Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- — 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, pp. 609-614.

B.18. DNA-BESCHADIGING EN HERSTEL — DNA-HERSTELSYNTHESE — ZOOGDIERENCELLEN IN VITRO

B.18.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.2. DEFINITIE Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.3. REFERENTIESTOFFEN Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE Het onderzoek naar DNA-herstelsynthese (Unscheduled DNA Synthesis, UDS) meet de DNA-herstelsynthese na excisie en verwijdering van een DNA-streng die de door chemische en fysische agentia geïnduceerde beschadiging bevat. De proef is gebaseerd op de opname van met tritium gemerkt thymidine (3H-TdR) in het DNA van zoogdierencellen die zich niet in de S-fase van de celcyclus bevinden. De opname van 3H-TdR kan worden bepaald met behulp van autoradiografie of van vloeistofscintillatietelling (liquid scintillation counting, LSC) van DNA uit behandelde cellen. Tenzij primaire rattenhepatocyten worden gebruikt, worden de zoogdierencellen in cultuur met en zonder een exogeen metabool activeringssysteem met de teststof behandeld. UDS kan eveneens in in-vivo-systemen worden gemeten.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE

1.6. Voorbereidingen

Teststoffen en controle- of referentiestoffen moeten in groeimedium worden bereid of opgelost of gesuspendeerd in geschikte media en voor gebruik in de proef verder worden verdund in groeimedium. De uiteindelijke concentratie van het medium mag geen effect hebben op de levensvatbaarheid van de cel. Primaire culturen van rattenhepatocyten, menselijke lymfocyten of permanente cellijnen (bijvoorbeeld menselijke diploïde fibroblasten) kunnen voor deze toets worden gebruikt. De cellen moeten met en zonder geschikt metabool activeringssysteem aan de teststof worden blootgesteld.

Proefomstandigheden

Aantal culturen

Er zijn ten minste twee celculturen voor autoradiografie en zes (of minder als dit wetenschappelijk verantwoord is) celculturen voor LSC-UDS-metingen vereist voor elk punt in de proef.

Gebruik van negatieve en positieve controles

Bij elke proef moeten parallelle positieve en negatieve (onbehandelde en/of medium) controles met en zonder metabole activering worden uitgevoerd. Voorbeelden van positieve controles voor de proef met rattenhepatocyten zijn onder meer 7,12-dimethylbenzathraceen (7,12-DMBA) of 2-acetylaminofluoreen (2-AAF). Voor gevestigde cellijnen is 4-nitroquinoline-N-oxyde (4-NQO) een voorbeeld van een positieve controle voor autoradiografie en LSC-proeven, uitgevoerd zonder metabole activering; wanneer metabole activeringssystemen worden gebruikt is N-dimethylnitrosamine een positieve controleverbinding.

Blootstellingsconcentratie

Er zijn meerdere concentraties van de teststof vereist die voldoende gespreid moeten zijn om de respons te bepalen. De hoogste concentratie moet een cytotoxisch effect veroorzaken. In water relatief onoplosbare stoffen dienen tot de uiterste oplosbaarheidsgrens te worden onderzocht. Voor volledig in water oplosbare niet-toxische stoffen dient de hoogste concentratie per geval te worden bepaald.

Cellen

Om de culturen in stand te houden moeten geschikte groeimedia, CO2-concentraties, temperatuur en vochtigheidsgraad worden gebruikt. Permanente cellijnen moeten regelmatig worden gecontroleerd op Myco-plasma contaminatie.

Metabole activering

Voor primaire hepatocytculturen wordt geen metabool activeringssysteem gebruikt. Permanente cellijnen en lymfocyten worden met en zonder geschikt metabool activeringssysteem aan de teststof blootgesteld.

Uitvoering

Bereiding van culturen

Permanente cellijnen worden uit stamculturen gegenereerd (bijvoorbeeld door trypsinebehandeling of door uitspoelen), met een geschikte dichtheid op kweekflessen uitgezaaid en geïncubeerd bij 37 oC. Korte levende culturen rattenhepatocyten worden gekweekt door pas gedissocieerde hepatocyten in een geschikt medium te laten vasthechten aan de groeiende laag. Menselijke lymfocytculturen worden met behulp van geschikte technieken gemaakt.

Behandeling van de culturen met de teststof Primaire rattenhepatocyten

Pas geïsoleerde rattenhepatocyten worden gedurende een geschikte periode met de teststof behandeld in een medium dat 3H-TdR bevat. Na de behandelingsperiode wordt medium van de cellen verwijderd, de cellen worden gespoeld, gefixeerd en gedroogd. De glaasjes worden in een autoradiografische emulsie gedoopt, blootgesteld, ontwikkeld (als alternatief kan ook stripping film worden gebruikt), gekleurd en geteld.

Permanente cellijnen en lymfocyten

Autoradiografische methode: de celculturen worden voor een geschikte duur aan de teststof blootgesteld en daarna behandeld met 3H-TdR. De blootstellingstijd wordt bepaald door de aard van de stof, de activiteit van het metaboliseringssysteem en het soort cel. Om de UDS-piek op te sporen, moet het 3H-TdR hetzij samen met de teststof hetzij binnen enkele minuten na de blootstelling aan de teststof worden toegevoegd. De keuze tussen deze twee methoden is afhankelijk van een mogelijke interactie tussen teststof en 3H-TdR. Teneinde een onderscheid te maken tussen UDS en semiconservatieve DNA-repIicatie kan dit laatste verschijnsel worden geremd door toepassing van een arginine-deficiënt medium, laag serumgehalte of door hydroxyurea in het cultuurmedium. LSC-metingen van UDS: vóór de behandeling met de teststof moet zoals hierboven beschreven worden voorkomen dat de cellen in de S-fase treden; nadien worden de cellen aan de teststof blootgesteld overeenkomstig de beschrijving voor autoradiografie. Na de incubatieperiode wordt het DNA uit de cellen gehaald en worden het totale DNA-gehalte en de 3H-TdR-opname bepaald. Opgemerkt wordt dat bij gebruik van menselijke lymfocyten in de hierboven beschreven methoden de semiconservarieve DNA-replicatie niet moet worden onderdrukt in ongestimuleerde culturen.

Analyse

Autoradiografische analyse

Voor de UDS-analyse van cellen in cultuur worden de S-fase kernen niet geteld. Per concentratie dienen ten minste 50 cellen te worden geteld. Voor de telling dienen de glaasjes te worden gecodeerd. Op elk glaasje moeten ver uiteenliggende, willekeurig gekozen velden worden geteld. De opgenomen hoeveelheid 3H-TdR in het cytoplasma moet worden bepaald door telling van drie gebieden ter grootte van een kern in het cytoplasma van elke getelde cel.

LSC-analyse

Voor de LSC-UDS-analyse moet van elke concentratie en van de controlepopulaties een passend aantal culturen worden gebruikt. Alle resultaten moeten in een onafhankelijke proef worden bevestigd.

2. GEGEVENS De gegevens moeten in tabellen worden samengevat.

2.

2.1. AUTORADIOGRAFISCHE ANALYSE De mate van 3H-TdR-opname in het cytoplasma en het aantal aangetroffen korrels op de celkern moeten afzonderlijk worden vermeld. Gemiddelde, mediaan en modus kunnen worden gebruikt om de distributie van de 3H-TdR-opname in het cytoplasma en het aantal korrels per kern te beschrijven.

2.2. LSC-ANALYSE Voor LSC-analyses moet de 3H-TdR-opname worden vermeld in dpm/μg DNA. Het gemiddeld aantal dpm/μg DNA met standaarddeviatie kan worden gebruikt om de distributie van de opname te beschrijven. De gegevens moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

gebruikte cellen, dichtheid en passagegetal op het ogenblik van de behandeling, aantal celculturen;

toegepaste methode voor instandhouding van de celculturen met inbegrip van medium, temperatuur en CO2-concentratie;

teststof, medium, concentraties en verantwoording voor de in de test gebruikte concentraties;

gegevens over het metabole activeringssysteem;

behandelingsschema;

positieve en negatieve controles;

toegepaste autoradiografische techniek;

toegepaste methode om te voorkomen dat de cellen in de S-fase treden;

toegepaste methode voor DNA-extractie en bepaling van het totale DNA-gehalte in LSC-analyses;

indien mogelijk de dosis-responsverhouding;

statistische evaluatie;

bespreking van de resultaten;

interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE Zie Algemene inleiding — Deel B.

4. LITERATUUR Zie Algemene inleiding — Deel B.

B.19. ZUSTERCHROMATIDEN-UlTWISSELINGSTEST IN VITRO

B.19.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.2. DEFINITIE Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.3. REFERENTIESTOFFEN Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE De zusterchromatiden-uitwisselingstest (Sister Chromatid Exchange, SCE), is een kortdurende proef voor het opsporen van reciproke DNA-uitwisselingen tussen twee zusterchromatiden van een duplicerend chromosoom. SCE's zijn onderlinge uitwisselingen van DNA-replicatieproducten in ogenschijnlijk homologe loci. Vermoed wordt dat het uitwisselingsproces verband houdt met een DNA-breuk en -hereniging, ofschoon weinig bekend is over de moleculaire basis ervan. Om SCE's op te sporen moet een middel beschikbaar zijn om zusterchromatiden verschillend te merken. Dat kan gebeuren door gedurende twee celcycli broomdeoxyuridine (BrdU) in her chromosomaal DNA in te brengen. In-vitro zoogdierencellen worden met en zonder een exogeen metabool activeringssysteem verkregen uit zoogdieren aan de teststof blootgesteld en gedurende twee replicatiecycli in een BrdU-bevattend medium gekweekt. Na behandeling met een spindle-remmer (bijvoorbeeld colchicine) om cellen in een metafaseachtig stadium van de mirose (c-metafase) te verzamelen, worden de cellen gewonnen en chromosoompreparaten gemaakt.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE

1.6.

1.6.1. Voorbereidingen

Voor de test kunnen primaire culturen (menselijke lymfocyten) of gevestigde cellijnen (bij voorbeeld ovariumcellen van de Chinese hamster) worden gebruikt. De cellijnen moeten worden gecontroleerd op Mycoplasma-contaminatie.

Er moeten geschikte cultuurmedia en incubaneomstandigheden worden gebruikt (bijvoorbeeld temperatuur, cultuurflessen, CO2-gehalte en vochtigheidsgraad).

Vóór de behandeling van de cellen dienen de reststoffen te worden klaargemaakt in cultuurmedia of opgelost of gesuspendeerd in geschikte middelen. De uiteindelijke concentratie van een medium in het cultuursysteem mag geen significante invloed hebben op de levensvatbaarheid of de groeisnelheid van de cel en effecten op de SCE-frequentie moeten door middel van een oplosmiddel controle worden nagegaan.

De cellen moeten met en zonder exogeen metabool activeringssysteem bereid uit zoogdieren aan de reststoffen worden blootgesteld. Indien evenwel cellen met intrinsieke metabole activiteit worden gebruikt, moeten de aard en de omvang van de activiteit geschikt zijn voor de te onderzoeken chemische klasse.

1.6.2. Proefomstandigheden

1.6.2. Aantal culturen

Voor elk punt in de proef moeten culturen ten minste in tweevoud worden gebruikt.

Gebruik van positieve en negatieve controles

Positieve controles waarbij gebruik wordt gemaakt van een direct werkende stof en een stof die metabole activering vereist, moeten bij elke proefneming worden uitgevoerd: er dient eveneens een mediumcontrole te worden gebruikt. Hierna volgen voorbeelden van stoffen die als positieve controle kunnen worden gebruikt: Waar dar van toepassing is, kan ook een aanvullende positieve controle van dezelfde chemische klasse als de te onderzoeken stof worden meegenomen.

direct werkende stof:

ethylmethaansulfonaat,

niet-rechtstreeks werkende stof:

cyclofosfamide.

Blootstellingsconcentratie

Er zijn ten minste drie behoorlijk gespreide concentraties van de teststof vereist. De hoogste concentratie moet een duidelijk toxisch effect veroorzaken en moet laag genoeg zijn om een goede celreplicatie te doen plaatsvinden. In water relatief onoplosbare stoffen dienen met behulp van geschikte methoden tot de uiterste oplosbaarheidsgrens te worden onderzocht. Voor volledig in water oplosbare niet-toxische stoffen dient de hoogste concentratie per geval te worden bepaald.

1.6.3. Uitvoering

1.6.3. Bereiding van culturen

Permanente cellijnen worden gegenereerd uit stamculturen (bijvoorbeeld door trypsinebehandeling of uitspoelen), met een geschikte dichtheid uitgezaaid in kweekflessen en geincubeerd bij 37 oC. Voor eenlagige culturen moet het aantal cellen per kweekfles worden aangepast zodat de culturen op het tijdstip van winning niet veel meer dan 50 % confluent zijn. Anderzijds kunnen cellen worden gebruikt in een suspensiecultuur. Culturen van menselijke lymfocyten worden met behulp van geschikte technieken opgezet uit gehepariniseerd bloed en bij 37 oC geïncubeerd.

Behandeling

Cellen in exponentiële groeifase worden voor een geschikte duur blootgesteld aan de teststof; in de meeste gevallen volstaan een tot twee uur maar in bepaalde gevallen mag de behandelingstijd worden verlengd tot maximaal twee complete celcycli. Cellen zonder toereikende intrinsieke metabole activiteit moeten met en zonder geschikt metabool activeringssysteem aan de teststof worden blootgesteld. Na de blootstellingsperiode worden de teststoffen van de cellen gewassen en worden de cellen gedurende twee replicatieronden in aanwezigheid van BrdU in cultuur gebracht. Een andere methode is de cellen gedurende de volledige cultuurtijd van twee celycli gelijktijdig bloot te stellen aan de teststof en aan BrdU. Culturen van menselijke lymfocyten worden behandeld terwijl ze zich in een semisynchrone staat bevinden. De cellen worden geanalyseerd in de tweede deling na de behandeling omdat het dan zeker is dat de gevoeligste fasen van de celcyclus aan de teststof zijn blootgesteld. Alle culturen waaraan BrdU is toegevoegd, moeten tot aan de winning van de cellen in het donker of in geschemerd licht van gloeilampen worden behandeld, teneinde de fotolyse van BrdU-bevattend DNA tot een minimum te beperken.

Winning van de cellen

De celculturen worden een tot vier uren voor het winnen behandeld met een spindle-remmer (bijvoorbeeld colchicine). Elke cultuur wordt afzonderlijk gewonnen en bewerkt met het oog op het prepareren van chromosomen.

Chromosoompreparatie en kleuring

Chromosoompreparaten worden gemaakt met behulp van standaardcytogenetische technieken. De glaasjes kunnen met behulp van diverse technieken (bij voorbeeld fluorescentie plus Giemsa-methode) worden gekleurd om de SCE's aan te tonen.

Analyse

Het aantal te analyseren cellen dient te zijn gebaseerd op de door controleproeven bepaalde spontane SCE-frequentie. Gewoonlijk worden ten minste 25 goed gespreide metafasen per cultuur geanalyseerd op SCE's. De glaasjes worden voor de analyse gecodeerd. Voor menselijke lymfocyten worden uitsluitend metafasen geanalyseerd die 46 centromeren bevatten. Voor gevestigde cellijnen worden uitsluitend metafasen geanalyseerd die ± 2 centromeren van het modale aantal bevatten. Er moet worden vermeld of een centromere verandering van kenmerk als SCE wordt beschouwd of niet. De resultaten moeten in een onafhankelijke proef worden bevestigd.

2. GEGEVENS De gegevens moeten in tabellen worden samengevat. Voor alle behandelde en controleculturen moet het aantal SCE's in elke metafase en het aantal SCE's per chromosoom in elke metafase afzonderlijk worden vermeld. De gegevens moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING In het verslag van de proefneming moeten de volgende gegevens worden opgenomen:

gebruikte cellen, methoden voor het in stand houden van de celculturen;

proefomstandigheden: samenstelling van cultuurmedia, CO2-concentratie, concentratie van de teststof, gebruikt oplosmiddel, incubatietemperatuur, behandelingstijd, toegepaste spindle-remmer, de concentratie ervan en de duur van de behandeling, gebruikte soort metabool activeringssysteem bereid uit zoogdieren, positieve en negatieve controles;

aantal celculturen per punt in de proef;

nadere gegevens omtrent de toegepaste techniek voor het prepareren van glaasjes;

aantal geanalyseerde metafasen (de gegevens dienen voor elke cultuur afzonderlijk te worden vermeld);

gemiddeld aantal SCE's per metafase en per chromosoom (de gegevens dienen voor elke cultuur afzonderlijk te worden vermeld);

criteria voor het tellen van SCE's;

verantwoording voor de gekozen dosis;

dosis-responsverhouding (indien mogelijk);

statistische evaluatie;

bespreking van de resultaten;

interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE Zie Algemene inleiding — Deel B.

4. LITERATUUR Zie Algemene inleiding — Deel B.

B.20. GESLACHTSGEBONDEN RECESSIEVE LETALITEITSTEST MET DROSOPH1LA MELANOGASTER

B.20.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.2. DEFINITIE Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.3. REFERENTIESTOFFEN Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE Het onderzoek naar geslachtsgebonden recessieve letaliteit (Sex-linked recessive lethaltest, SLRL) waarbij Drosophila melanogaster wordt gebruikt, spoort mutaties, zowel puntsmutaties als kleine deleties, in de geslachtslijn van het insekt op. Deze test is een voorwaartse mutatietest waarmee kan worden gezocht naar mutaties in circa 800 loci op het X-chromosoom. Dat is circa 80 % van alle X-chromosoomloci. Het X-chromosoom vertegenwoordigt circa een vijfde van het gehele haploïde genoom. Mutaties in het X-chromosoom van Drosophila melanogaster komen fenotypisch tot uiting bij mannetjes die drager zijn van het mutant gen. Indien de mutatie letaal is in de homozygote staat wordt dit afgeleid uit het ontbreken van een klasse mannelijke nakomelingen van de twee die normaal door een heterozygoot vrouwtje worden voortgebracht. Bij de SLRL-toets wordt van deze feiten gebruik gemaakt door middel van speciaal gemerkte en gerangschikte chromosomen.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE

1.6. Voorbereidingen

Stamculturen

Mannetjes van een goed gedefinieerd wild-type stamcultuur en vrouwtjes van de Muller-5 stamcultuur kunnen worden gebruikt. Andere goed gemerkte vrouwelijke stamculturen met meermaals geïnverteerde X-chromosomen kunnen eveneens worden gebruikt.

Teststof

De teststoffen dienen in water te worden opgelost. In water onoplosbare stoffen kunnen in geschikte media worden opgelost of gesuspendeerd {bijvoorbeeld een mengsel van ethanol en Tween-60 of 80) en voor de toediening worden verdund in water of een zoutoplossing. Dimethylsulfoxyde (Dmso) moet als medium worden vermeden.

Aantal dieren

De proef moet worden opgezet met een vooraf bepaalde gevoeligheid en statistische kracht. De tijdens de desbetreffende controle waargenomen spontane mutatiefrequentie zal het aantal te analyseren behandelde chromosomen in sterke mate beïnvloeden.

Toedeningsweg

Blootstelling kan oraal geschieden, door injectie of door blootstelling aan gassen of dampen. De teststof kan ook als voedsel worden toegediend in een suikeroplossing. Waar dat nodig is kunnen de stoffen worden opgelost in een 0,7 % natriumchlorideoplossing en in de thorax of abdomen worden geïnjecteerd.

Gebruik van negatieve en positieve controles

Negatieve (medium) en positieve controles moeten worden meegenomen. Indien evenwel in het laboratorium geschikte controlegegevens uit het verleden beschikbaar zijn, behoeven geen parallelle controles te worden uitgevoerd.

Blootstellingsniveau

Drie blootstellingsniveaus moeten worden gebruikt. Voor een voorbereidende beoordeling kan met een blootstellingsniveau van de teststof worden volstaan. Dat blootstellingsniveau is hetzij de hoogste getolereerde concentratie of de concentratie waarbij zich enige tekenen van toxiciteit voordoen. Voor niet-toxische stoffen dient een blootstelling tot maximale concentratie die uitvoerbaar is te worden gebruikt.

Uitvoering

Wild-type mannetjes (drie tot vijf dagen oud) worden met teststof behandeld en individueel gepaard met een overmaat aan niet-gedekte vrouwtjes van de Muller-5 stamcultuur of van een andere goed gemerkte (met meervoudig geïnverteerde X-chromosomen) stamcultuur. Om de twee à drie dagen worden de vrouwtjes vervangen door andere niet-gedekte vrouwtjes, teneinde de volledige geslachtscelcyclus te bestrijken. Bij de nakomelingen van deze vrouwtjes worden letale effecten opgespoord die overeenstemmen met de effecten op rijp sperma, spermatiden in vroeg, midden of laat stadium, spermatocyten en spermatogonia op het ogenblik van de behandeling. Heterozygote F1-vrouwtjes uit de hierboven beschreven kruising worden individueel gepaard (dat wil zeggen een vrouwtje per fles) met hun broertjes. In de F2-generatie wordt in elke cultuur de afwezigheid van wild-type mannetjes onderzocht. Indien een cultuur lijkt te zijn ontstaan uit een F1-vrouwtje dat een letaal kenmerk in het ouderlijk X-chromosoom draagt (dat wil zeggen er worden geen mannetjes met het behandelde chromosoom aangetroffen), dienen dochters van dat vrouwtje met hetzelfde genotype te worden onderzocht, teneinde na te gaan of de letaliteit in de volgende generatie wordt herhaald.

2. GEGEVENS De gegevens moeten in tabellen worden samengevat met vermelding van het aantal geteste X-chromosomen, het aantal niet-vruchtbare mannetjes en het aantal letale chromosomen voor elke blootstellingsconcentratie en voor elke paringsperiode van elk mannetje. Per mannetje dient het aantal groepen van verschillende omvang te worden vermeld. De resultaten moeten in een afzonderlijke proef worden bevestigd. De geslachtsgebonden recessieve letaliteitstest moet met behulp van geschikte statistische methoden worden geëvalueerd. Groeperingen van uit een mannetje ontstane recessief letalen moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden behandeld en geëvalueerd.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

stamcultuur: gebruikte Drosophilastammen, leeftijd van de insekten, aantal behandelde mannetjes, aantal steriele mannetjes, aantal gevormde F2-culturen, aantal F2-culturen zonder nakomelingen, aantal in elke geslachtscelfase aangetroffen chromosomen met een letaal kenmerk;

criteria voor de bepaling van de omvang van de behandelde groepen;

proefomstandigheden: gedetailleerde beschrijving van het behandelings- en bemonsteringsschema, blootstellingsniveaus, toxiciteitsgegevens, negatieve (oplosmiddel) en positieve controles (waar dat van toepassing is);

criteria voor het tellen van letale mutaties;

blootstelling/effectverhouding (indien mogelijk);

statistische evaluatie;

bespreking van de resultaten;

interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE Zie Algemene inleiding — Deel B.

4. LITERATUUR Zie Algemene inleiding — Deel B.

B.21. ZOOGDIERENCELTRANSFORMATIETEST IN VITRO

B.21.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.2. DEFINITIE Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.3. REFERENTIESTOFFEN Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE Cultuursystemen van zoogdierencellen kunnen worden gebruikt voor het onderzoek van fenotypische veranderingen in vitro die worden geïnduceerd door chemische stoffen die betrokken zijn bij maligne transformaties in vivo. Algemeen gebruikte cellen zijn onder meer C3H10T½, 3T3, SHE, en Fischer-rat. De test is gebaseerd op wijzigingen in de celmorfologie, focusvorming of wijzigingen in de afhankelijkheid van de aanhechting in halfvast agar. Er bestaan andere, minder gebruikte systemen die andere fysiologische of morfologische wijzigingen in cellen ten gevolge van blootstelling aan carcinogene chemische stoffen opsporen. Van geen van de eindpunten van de in-vitro-proef staat vast dat er een mechanistische band is met kanker. Met enkele testsystemen kunnen tumorpromotoren worden opgespoord. Cytotoxiciteit kan worden bepaald door meting van het effect van de teststof op de kolonievorming (cloningsefficiëntie) of de groeisnelheid van de culturen. De cytotoxiciteitsbepaling kan worden gebruikt om vast te stellen dat blootstelling aan de teststof een toxisch effect heeft gehad, maar kan niet in alle testen worden gebruikt om de transformatiefrequentie te berekenen, aangezien voor sommige testen een langere incubatie en/of opnieuw uitplaten noodzakelijk kunnen zijn.

1.5. KWALITEITSCRITERIA Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE

1.6. Voorbereidingen

Cellen

Een verscheidenheid aan cellijnen of primaire cellen is beschikbaar afhankelijk van de toegepaste transformatietest. De onderzoeker moet nagaan of de cellen voor de uit te voeren proef na blootstelling aan bekende carcinogenen de juiste fenotypische wijzigingen vertonen en dient ervoor te zorgen dat de validiteit en betrouwbaarheid van de in zijn laboratorium uitgevoerde test aangetoond en gedocumenteerd wordt.

Medium

De gebruikte media en proefomstandigheden dienen geschikt te zijn voor de uit te voeren transformatietesten.

Teststof

De teststof mag in cultuurmedia worden bereid of voor de behandeling van de cellen worden opgelost of gesuspendeerd in geschikte middelen. De uiteindelijke concentratie van het (oplos)middel in het cultuursysteem mag de levensvatbaarheid van de cellen, de groeisnelheid of de mate van voorkomen van transformaties niet beïnvloeden.

Metabole activering

De cellen dienen met en zonder geschikt metabool activeringssysteem aan de teststof te worden blootgesteld. Indien evenwel celsoorten worden gebruikt met een intrinsieke metabole activiteit, moet worden nagegaan of de aard van de activiteit geschikt is voor de onderzochte chemische klasse.

Proefomstandigheden

Gebruik van positieve en negatieve controles

Voor elke proef moet een positieve controle worden uitgevoerd waarbij zowel een rechtstreeks werkende verbinding als een verbinding die metabole activering vereist, moeten worden meegenomen: er dient eveneens een negatieve (oplos)middelcontrole te worden gebruikt. Hierna volgen voorbeelden van stoffen die als positieve controle kunnen worden gebruikt: Wanneer dat van toepassing is, dient een aanvullende positieve controle van dezelfde chemische klasse als de teststof te worden uitgevoerd.

Direct werkende stoffen:

ethylmethaansulfonaat,

β-propiolacton;

Verbindingen die metabole activering vereisen:

2-acetylaminofluoreen,

4-dimethylaminoazobenzeen,

7,12-dimethylbenzanthraceen.

Blootstellingsconcentraties

Meerdere concentraties van de teststof moeten worden gebruikt. Deze concentraties moeten een concentratieafhankelijk toxisch effect veroorzaken waarbij de hoogste concentratie een laag overlevingspeil geeft en de overleving in de laagste concentratie nagenoeg dezelfde is als die in de negatieve controle. In water relatief onoplosbare stoffen dienen met behulp van geschikte methoden tot de uiterste oplosbaarheidsgrens te worden onderzocht. Voor volledig in water oplosbare, niet-toxische stoffen dient de hoogste concentratie per geval te worden bepaald.

Uitvoering

De cellen moeten voldoende lang worden blootgesteld. De tijd is afhankelijk van het toegepaste testsysteem en bij langere blootstellingstijden kan het noodzakelijk zijn een nieuwe dosis toe te dienen en gelijktijdig het medium te veranderen (met indien noodzakelijk een vers metabool activeringsmengsel). Cellen met een ontoereikende intrinsieke metabole activiteit moeten met en zonder een geschikt metabool activeringssysteem aan de teststof worden blootgesteld. Na de blootstellingsperiode wordt de teststof van de cellen gewassen en worden de cellen op cultuurmedia gebracht onder omstandigheden die gunstig zijn om het verschijnen van getransformeerde fenotypes te controleren en wordt de mate van voorkomen van de transformaties bepaald. Alle resultaten worden in een onafhankelijke proef bevestigd.

2. GEGEVENS De gegevens moeten in tabellen worden samengevat en kunnen naar gelang van de gebruikte toets in diverse vormen worden voorgesteld, bijvoorbeeld plaattellingen, positieve platen of aantal getransformeerde cellen. Wanneer dat van toepassing is, dient de overleving te worden uitgedrukt als een percentage van het controleniveau en de transformatiefrequentie als het aantal transformaties per aantal overlevenden. De gegevens moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd.

3. RAPPORTAGE

3.

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING In het verslag van de proef moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

gebruikt celtype, aantal celculturen, methode voor het in stand houden van celculturen;

proefomstandigheden: concentratie van de teststof, gebruikt (oplos)middel, incubatietemperatuur, incubatietijd, duur en frequentie van de behandeling, celdichtheid tijdens de behandeling, type van het gebruikte exogeen metabool activeringssysteem, positieve en negatieve controles, specificatie van het onderzochte fenotype, gebruikt selectief systeem (wanneer dat van toepassing is); verantwoording voor de keuze van de doses;

gebruikte methode voor het tellen van het aantal levensvatbare en getransformeerde cellen;

statistische evaluatie;

bespreking van de resultaten;

interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE Zie Algemene inleiding — Deel B.

4. LITERATUUR Zie Algemene inleiding — Deel B.

B.22.

1. METHODE

1.

1.1. INLEIDING Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.2. DEFINITIES Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.3. REFERENTIESTOFFEN Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE Dominante letale effecten veroorzaken de dood van het embryo of van de foetus. De inductie van dominante letale mutaties door blootstelling aan een chemische stof wijst erop dat de stof het geslachtsweefsel van de proefdiersoort heeft aangetast. Algemeen wordt aangenomen dat dominante letale mutaties het gevolg zijn van beschadiging van de chromosomen (structurele en numerieke anomalieën). Als vrouwtjes worden behandeld, kan de dood van het embryo eveneens het gevolg zijn van toxische effecten. In het algemeen worden mannetjes aan de teststof blootgesteld en met niet-behandelde, niet-gedekte vrouwtjes gepaard. De diverse geslachtscelstadia kunnen door middel van geregelde intervallen in de paring afzonderlijk worden onderzocht. De toename van het aantal dode implantaten per vrouwtje in de behandelde groep in vergelijking met het aantal dode implantaten per vrouwtje in de controlegroep geeft het verlies na implantatie weer. Het verlies voor implantatie kan worden geschat op grond van tellingen van de corpora lutea of door het totale aantal implantaten per vrouwtje in de behandelde en de controlegroep met elkaar te vergelijken. Het totale dominante letale effect is de som van het verlies voor en na de implantatie. De berekening van het totale dominante letale effect is gebaseerd op de vergelijking van de levende implantaten per vrouwtje in de testgroep met de levende implantaten per vrouwtje in de controlegroep. Een vermindering van het aantal implantaten op bepaalde tijdstippen kan het gevolg zijn van het doodgaan van cellen (bijvoorbeeld van spermatocyten en/of spermatogonia).

1.5. KWALITEITSCRITERIA Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE

1.6. Voorbereidingen

Zo mogelijk moeten de teststoffen in een isotone zoutoplossing worden opgelost of gesuspendeerd. Niet in water oplosbare chemische stoffen kunnen in geschikte (oplos)middelen worden opgelost of gesuspendeerd. Het gebruikte (oplos)middel mag niet met de teststof interfereren en mag ook geen toxische effecten produceren. Er dienen verse bereidingen van de teststof te worden gebruikt.

Proefomstandigheden

Toedieningsweg

De teststof moet in het algemeen slechts eenmaal worden toegediend. Op grond van toxicologische gegevens kan een schema met herhaalde behandelingen worden gebruikt. De normale toedieningswegen zijn orale intubatie of intraperitoneale injectie. Andere toedieningswegen kunnen eveneens geschikt zijn.

Proefdieren

Ratten of muizen worden als proefdieren aanbevolen. Gezonde, geslachtelijk volledig rijpe dieren worden willekeurig ingedeeld in te behandelen groepen en controlegroepen.

Aantal en geslacht

Er dient een passend aantal behandelde mannetjes te worden gebruikt, rekening houdend met de spontane variatie van het te onderzoeken biologische kenmerk. Het gekozen aantal moet gebaseerd zijn op de van tevoren vastgestelde detectiegevoeligheid en significantie. Zo moet bijvoorbeeld bij een kenmerkende test het aantal mannetjes in elke dosisgroep voldoende zijn om per paringsinterval 30 à 50 drachtige vrouwtjes te hebben.

Negatieve en positieve controles

In het algemeen moet elk experiment parallelle positieve en negatieve (oplos)middelcontroles omvatten. Indien aanvaardbare positieve controleresultaten uit het recente verleden van in hetzelfde laboratorium verrichte experimenten beschikbaar zijn, kunnen deze worden gebruikt in plaats van een parallelle positieve controle. Positieve controlestoffen moeten in een voldoende lage dosis (bijvoorbeeld MMS, i.p., bij 10 mg/kg) worden gebruikt om de gevoeligheid van de test aan te tonen.

Dosisniveaus

Normaliter moeten drie dosisniveaus worden gebruikt. De hoge dosis moet bij de behandelde dieren tekenen van toxiciteit of verminderde vruchtbaarheid teweegbrengen. In sommige gevallen kan met één enkele hoge dosis worden volstaan.

Hoogste te testen dosis

Niet-toxische stoffen moeten in doses van 5 g/kg bij één enkele toediening of in doses van 1 g/kg/dag bij herhaalde toediening worden getest.

Uitvoering

Er zijn diverse behandelingsschema's beschikbaar. Enkelvoudige toediening van de teststof is de meest toegepaste methode. Er kunnen ook andere behandelingsschema's worden gebruikt. Na de behandeling laat men individuele mannetjes opeenvolgend na geschikte intervallen, met een of twee niet-behandelde, nog niet-gedekte vrouwtjes paren. De vrouwtjes moeten bij de mannetjes worden gelaten gedurende ten minste één volledige oestruscyclus of tot op het ogenblik dat de paring heeft plaatsgevonden, hetgeen wordt bepaald door de aanwezigheid van sperma in de vagina of door de aanwezigheid van een vaginale plug. Het aantal paringen na de behandeling is afhankelijk van het behandelingsschema en moet groot genoeg zijn om alle geslachtscelstadia na de behandeling te kunnen onderzoeken. De vrouwtjes worden in de tweede helft van de dracht gedood en de inhoud van de uterus wordt onderzocht om het aantal dode en levende implantaties te bepalen. Ook de eierstokken kunnen worden onderzocht om het aantal corpora lutea te bepalen.

2. GEGEVENS De volgende gegevens moeten in tabellen worden weergegeven: aantal mannetjes, aantal drachtige vrouwtjes en aantal niet-drachtige vrouwtjes. De resultaten van elke paring, met inbegrip van de identiteit van elk mannetje en elk vrouwtje, moeten afzonderlijk worden gerapporteerd. Voor elk vrouwtje moet de week van de paring, het dosisniveau van het mannetje en de frequentie van levende en dode implantaten worden aangegeven. De berekening van het totale dominante letale effect is gebaseerd op de vergelijking van de levende implantaten per vrouwtje in de testgroep met de levende implantaten per vrouwtje in de controlegroep. De verhouding tussen dode en levende implantaten bij de behandelde groep, vergeleken met dezelfde verhouding bij de controlegroep, wordt geanalyseerd om het verlies na implantatie na te gaan. Als de gegevens van vroegtijdige en laattijdige sterften worden geregistreerd, moet dat uit de tabellen duidelijk blijken. Als het verlies vóór implantatie wordt geschat, moet dat worden gerapporteerd. Het verlies vóór implantatie kan worden berekend als een discrepantie tussen het aantal corpora lutea en het aantal implantaten of als een daling van het gemiddelde aantal implantaten per uterus in vergelijking met controleparingen. De gegevens worden met behulp van geschikte statistische methoden geëvalueerd.

diersoort, stam, leeftijd en gewicht van de gebruikte dieren, aantal dieren van elk geslacht in de experimentele en controlegroepen;

teststof, (oplos)middel, geteste dosisniveaus en verantwoording voor de selectie van de dosering, negatieve en positieve controles, gegevens over de toxiciteit;

expositiewijze en -duur;

paringsschema;

gebruikte methode om te bepalen dat de paring heeft plaatsgevonden;

tijdstip waarop de dieren worden gedood;

criteria voor de beoordeling van dominante letale mutaties;

3236 more provisions are not shown here; each has its own address.

Versions

2008-05-30