Rozporządzenie Komisji (WE) nr 440/2008 z dnia 30 maja 2008 r. ustalające metody badań zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH) (Tekst mający znaczenie dla EOG)

ObowiązujeWersja 2008-05-30od 2008-06-01

Ocena B

odwzorowane ze znaczników wydawcy. Ocena mówi, w jaki sposób uzyskano strukturę dokumentu, a nie jak wiarygodne jest prawo.

Zapytaj Gelex o ten akt

Adres https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/pl

Spis treści

Preambuła
1. Artykuł 1
2. Artykuł 2
3. Artykuł 3
4. Artykuł 4
ANNEX
ZAŁĄCZNIK CZĘŚĆ A: METODY USTALANIA WŁAŚCIWOŚCI FIZYKO-CHEMICZNYCH
A.1.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.4.
1.5. TABELA: STOSOWALNOŚĆ METOD A. B. C. D.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
1.6.1.2. Przyrząd:
1.6.2.
1.6.4.
4.(1)(2)(3)(4)
A.2.
1.
1.4.
1.5. Tabela 1 Porównanie metod
1.6.
1.6.4.
1.6.6.
2. Tabela 2 Temperatura – współczynniki korekcji fT
A.3.
1.
1.4.
1.4.1.
3. Tabela 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Zastosowanie metod
3. Tabela 1.4.1.1.1.4.1.2. Zastosowanie metod a)
3. Tabela 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Zastosowanie metod a)
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
A.4.
1.
1.4.
1.5. Tabela 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Kryteria jakości
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.4.
1.6.4.2.
1.6.5.
1.6.6.
1.6.6.1. Gaz obojętny:
1.6.6.2. Przygotowanie kolumny saturatora:
a)
b)
1.6.7.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
A.5.
1.
1.6.
1.6.4.
1.6.4.1.
1.6.4.1.3. Rysunek Ciało pomiarowe
1.6.4.2.
1.6.4.2.2. Montaż:
a)
b)
2. Tabela Korekcja zmierzonego napięcia powierzchniowego Tylko dla roztworów wodnych, ρ ≅ 1 g/cm3
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.6.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Procedura badania
1.6.3.3. Przyrząd
1.6.3.4. Przyrząd (zob. rysunki 4 i 3)
1.6.4.
2.
3.
A.8.
1.
1.3. Metoda wstrząsania kolby
1.4.
1.5.
1.5.1. Metoda wstrząsania kolby
1.5.2. Metoda wstrząsania kolby
1.5.3. Metoda wstrząsania kolby
1.6.
1.6.2.
1.6.2.1.
1.6.2.3.
1.6.3.
1.6.3.1. Przyrząd
1.6.3.2. Obliczenie czasu martwego to
2. Metoda wstrząsania kolby
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
A.9.
1.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Przyrząd Abela:
A.10.
1.
1.6.
1.6.2.
3.
A.11.
1.
1.6.
A.12.
1.
1.3.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
A.13.
1.
1.6.
1.6.2. a)
2.
A.14.
1.
1.1. a)
1.4.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2. a)
1.6.3.
1.6.3.2. a)
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.15.
1.
1.6.
A.16.
1.
1.6.
1.6.1.
4.
Rysunek 1 Szablon kostki do badań 20 mm
Rysunek 2 Typowa krzywa zależności temperatura/czas
A.17.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
3.
3.2. a)
A.18.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.19.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.20.
1.
1.5.
1.5.4.
2.
3.
3.1.
A.21.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.2.
2.
2.1. Tabela 1 Przykładowe wyniki
3.
3.2. a)
4.(1)
Rysunek 1 Komora ciśnieniowa
Rysunek 2 Stojak
Rysunek 3 Układ zapłonu
Dodatek W celu uzyskania dodatkowych szczegółów technicznych można zapoznać się na przykład z następującymi normami.
1.
2.
4.
1.
1.2. Dla substancji stałych
2.
Dodatek 1 Metoda szacowania
WPROWADZENIE
METODA SZACOWANIA
PROCEDURA OBLICZENIA
SPRAWOZDANIE
LITERATURA
Dodatek 2
Rysunek 1 Przyrząd do wyznaczania krzywej prężności pary zgodnie z metodą dynamiczną
Rysunek 2a Przyrząd dla wyznaczania krzywej prężności pary zgodnie z metodą statyczną (z użyciemmanometru w postaci U-rurki)
Rysunek 2b Przyrząd dla wyznaczania krzywej prężności pary zgodnie z metodą statyczną (z użyciemwskaźnika ciśnienia)
Rysunek 3 Izoteniskop (zob. pozycja bibliograficzna 7)
Rysunek 4 Przyrząd dla wyznaczania krzywej prężności pary zgodnie z metodą wagową
Rysunek 5 Przykład przyrządu do odparowania w niskim ciśnieniu metodą efuzji, z komórką efuzyjną o objętości 8 cm3
Rysunek 6a Przykład systemu przepływu do oznaczania prężności pary metodą saturacji gazem
Rysunek 6b Przykład systemu do oznaczania prężności pary metodą saturacji gazem, z kapilarą umieszczoną za komorą saturacji
Rysunek 7 Przykład doświadczalnego zestawu dla metody wirującego rotora
Rysunek 8 Przykład głowicy pomiarowej wirującego rotora
Rysunek 1 Metoda wymywania kolumnowego z pompą recyrkulacyjną
Rysunek 2 Typowa mikrokolumna
Rysunek 3 Typowa mikrokolumna
Rysunek 4 Metoda wymywania kolumnowego z naczyniem poziomującym
METODY OBLICZEŃ Zasada metod obliczeniowych
π-Metoda Hanscha
Metoda Rekkera
Metoda Hansch-Leo
Metoda połączona
Rysunek Forma i akcesoria do przygotowania stosu
Rysunek Przyrząd
Przykłady specyfikacji materiałowych do badania wrażliwości cieplnej (zob. DIN 1623) (1)(2)(3)
Rysunek 1 Przyrząd badawczy do wrażliwości cieplnej
Rysunek 2 Badanie wrażliwości cieplnej
Rysunek 3 Kalibracja szybkości podgrzewania dla badania wrażliwości cieplnej
Rysunek 4 Przyrząd do badania wrażliwości na uderzenie
Rysunek 5 Przyrząd do badania wrażliwości na tarcie
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
Załącznik Wytyczne dotyczące korygowania zawartości związków o niskiej masie cząsteczkowej w odniesieniu do obecności nierozpuszczalnych polimerów
CZĘŚĆ B METODY OZNACZANIA TOKSYCZNOŚCI I INNYCH SKUTKÓW ZDROWOTNYCH
WPROWADZENIE OGÓLNE A.
B.1 bis.
1.
1.4.
1.5.
1.5.3.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
B.1 ter.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
B.2.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
3.1. a)
B.3.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. Ocena toksyczności dla innej płci
3.
B.4.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
Tabela I Tworzenie rumienia i obrzęku Tworzenie się obrzęku PUNKTOWA OCENA REAKCJI SKÓRY
B.5.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.2.3.
1.4.2.7.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
Tabela I OCENA PUNKTOWA ZMIAN OKA
Rogówka
Tęczówka
Spojówka
Obrzęk spojówki
B.6.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.2.
1.5.1.3.
1.5.2.
1.5.2.2.
1.5.2.3.
3.
Sprawozdanie z testu (GMPT i test Buehlera)
B.7.
1.
1.4.
1.4.2.
1.4.3.
3.
SPRAWOZDANIE Z TESTU
B.8.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1.
pt_2 a)
B.9.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
B.10.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3.
SPRAWOZDANIE Z BADANIA
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(1) (8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
B.11.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
2.
3.
4.(1)(2)(1) (3)(4)(5)(6)(7)(8)
B.12.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
1.5.2. a)
2.
3.
SPRAWOZDANIE Z BADANIA
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
B.13/14.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
2.
3.
SPRAWOZDANIE Z BADANIA
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
B.15.
1.
1.6. Przygotowania
Aktywacja metaboliczna
Szczepy testowe
Pożywka do hodowli szczepu
Stosowanie kontroli pozytywnej i negatywnej
Stężenie do celów ekspozycji
Warunki inkubacji
Częstotliwość mutacji samorzutnej.
Liczba replikacji
3.
B.16.
1.
1.6. Przygotowania
Aktywacja metaboliczna
Badane szczepy
Pożywka do hodowli szczepu
Użycie kontroli pozytywnej i negatywnej
Stężenie ekspozycji
Warunki inkubacji
Częstotliwość samorzutnej rekombinacji genetycznej
Liczba replikacji
3.
B.17.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3.
SPRAWOZDANIE Z BADANIA
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
B.18.
1.
1.6. Przygotowania
Liczba kultur
Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych
Stężenie w celu ekspozycji
Komórki
Aktywacja metaboliczna
Przygotowanie kultury
Poddanie kultur ekspozycji na substancję testową Pierwotne hypocyty szczura
Oznaczenia autoradiograficzne
Oznaczenie LSC
2.
3.
B.19.
1.
1.6. Warunki badania
Liczba kultur
Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych
Stężenia do celów ekspozycji
Przygotowanie hodowli
Poddanie działaniu substancji testowej
Zbieranie komórek
Przygotowanie chromosomu i barwienie
Analiza
3.
B.20.
1.
1.6. Przygotowania
Zasoby
Substancja testowa
Liczba zwierząt
Droga podawania substancji testowej
Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych
Poziomy dawek
3.
B.21.
1.
1.6. Przygotowania
Komórki
Pożywka kultur
Substancja testowa
Aktywacja metaboliczna
Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych
Stężenia oddziałującej substancji
3.
B.22.
1.
1.6. Przygotowania
Droga podawania
Zwierzęta badane
Liczba i płeć
Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych
Poziomy dawek
Test graniczny

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając rozporządzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH), utworzenia Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniające dyrektywę 1999/45/WE oraz uchylające rozporządzenie Rady (EWG) nr 793/93 i rozporządzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak również dyrektywę Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/WE i 2000/21/WE, w szczególności jego art. 13 ust. 3,

a także mając na uwadze, co następuje:

(1) Zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006, jeżeli dla wygenerowania informacji o swoistych właściwościach substancji wymagane są badania, przeprowadza się je przy użyciu metod badań określonych na poziomie Wspólnoty.

(2) Dyrektywa Rady 67/548/EWG z dnia 27 czerwca 1967 r. w sprawie zbliżenia przepisów ustawodawczych, wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych ustanawia w załączniku V metody określania właściwości fizyko-chemicznych, toksyczności oraz ekotoksyczności substancji i preparatów. Załącznik V do dyrektywy 67/548/EWG został skreślony dyrektywą 2006/121/WE Parlamentu Europejskiego i Rady ze skutkiem od dnia 1 czerwca 2008 r.

(3) Należy włączyć do niniejszego rozporządzenia metody badań zawarte w załączniku V do dyrektywy 67/548/EWG.

(4) Niniejsze rozporządzenie nie wyklucza stosowania innych metod badań, pod warunkiem że ich stosowanie jest zgodne z art. 13. ust. 3 rozporządzenia 1907/2006.

(5) Przy opracowywaniu metod badań należy w pełni uwzględnić zasady zastępowania badań na zwierzętach innymi metodami, ograniczania skali badań na zwierzętach i doskonalenia metod tego rodzaju badań, zwłaszcza jeśli dostępne są odpowiednie zatwierdzone metody zastępowania, ograniczania i doskonalenia badań na zwierzętach.

(6) Przepisy niniejszego rozporządzenia są zgodne z opinią Komitetu powołanego na mocy art. 133 rozporządzenia (WE) nr 1907/2006,

PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:

Artykuł 1

Metody badań stosowanych do celów rozporządzenia 1907/2006/WE określa się w załączniku do niniejszego rozporządzenia.

Artykuł 2

W stosownych przypadkach Komisja dokona przeglądu metod badań określonych w niniejszym rozporządzeniu pod kątem możliwości zastępowania, ograniczania i doskonalenia badań na zwierzętach kręgowych.

Artykuł 3

Wszelkie odesłania do załącznika V do dyrektywy 67/548/EWG są traktowane jako odesłania do niniejszego rozporządzenia.

Artykuł 4

Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie następnego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Niniejsze rozporządzenie stosuje się od dnia 1 czerwca 2008 r. Sporządzono w Brukseli dnia 30 maja 2008 r. W imieniu Komisji Stavros Dimas Członek Komisji

ANNEX

ZAŁĄCZNIK CZĘŚĆ A: METODY USTALANIA WŁAŚCIWOŚCI FIZYKO-CHEMICZNYCH

A.1. TEMPERATURA TOPNIENIA/KRZEPNIĘCIA

A.1.

1. METODA Większość opisanych metod oparto na wytycznych OECD dotyczących badań (1). Podstawowe zasady podano w pozycjach bibliograficznych (2) i (3).

1.

1.1. WPROWADZENIE Opisane metody i urządzenia powinny być stosowane do ustalania temperatury topnienia substancji, bez ograniczeń związanych z ich stopniem czystości. Wybór metody zależy od charakteru badanej substancji. W konsekwencji, czynnikiem ograniczającym będzie to, czy substancja łatwo, z trudnością czy też wcale nie poddaje się sproszkowaniu. W przypadku niektórych substancji bardziej właściwe jest oznaczanie temperatury zamarzania lub krzepnięcia, przy czym w wytycznych uwzględniono także normy dla tych oznaczeń. Jeżeli z powodu szczególnych właściwości substancji żaden z powyższych parametrów nie może być zmierzony w sposób konwencjonalny, może być stosowne określenie temperatury płynięcia.

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Temperaturę topnienia definiuje się jako temperaturę, w której przejście fazowe ze stanu stałego do stanu ciekłego zachodzi pod ciśnieniem atmosferycznym i niniejsza temperatura idealnie odpowiada temperaturze krzepnięcia. Ponieważ przechodzenie z jednego stanu skupienia do drugiego w przypadku wielu substancji zachodzi w szerokim zakresie temperatury, często opisuje się go jako zakres temperatury topnienia. Jednostki konwersji (ze stopni K na oC) t = T – 273,15 t temperatura Celsjusza, stopień Celsjusza (oC) T temperatura termodynamiczna, stopień Kelwina (K)

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Nie ma konieczności stosowania substancji odniesienia za każdym razem, gdy przeprowadzane są badania nowej substancji. Powinny one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajności metody i pozwolić na porównanie wyników z innymi metodami. Niektóre substancje kalibracyjne wymieniono w pozycji bibliograficznej (4).

1.4. ZASADA METODY BADANIA Temperatura (zakres temperatur) przejścia fazowego ze stanu stałego do stanu ciekłego lub ze stanu ciekłego w stan stały jest ustalona. W praktyce podczas podgrzewania/schładzania próbki substancji badanej pod ciśnieniem atmosferycznym ustalane są temperatury etapu początkowego topnienia/krzepnięcia i końcowego etapu topnienia/krzepnięcia. Opisano pięć rodzajów metod, mianowicie metodę kapilarną, metody ze stolikami grzewczymi, ustalanie temperatur krzepnięcia, metody analiz termicznych, i ustalanie temperatury płynięcia (według rozwiniętych opracowań dla olejów naftowych). W niektórych przypadkach wygodniejsze jest zmierzenie temperatury krzepnięcia w miejsce temperatury topnienia.

1.4.

1.4.1. Metoda kapilarna

1.4.1.

1.4.1.1. Przyrządy do oznaczania temperatury topnienia z łaźnią cieczową Niewielką ilość drobno zmielonej substancji umieszcza się w rurce kapilarnej i ciasno upakowuje. Rurkę podgrzewa się łącznie z termometrem, regulując wzrost temperatury w ten sposób, aby wynosił mniej niż 1 K/min w trakcie topnienia. Oznacza się początkową i końcową temperaturę topnienia.

1.4.1.2. Przyrządy do oznaczania temperatury topnienia z blokiem metalu Zgodnie z opisem w ppkt 1.4.1.1, z tym że rurka kapilarna i termometr są umieszczone w podgrzewanym bloku metalu, przy czym można je obserwować przez znajdujące się w nim otwory.

1.4.1.3. Wykrywanie przy pomocy komórki fotoelektrycznej Próbka w rurce kapilarnej jest automatycznie podgrzewana w cylindrze metalowym. Wiązka światła jest automatycznie kierowana przez substancję, poprzez dziurę w cylindrze, do precyzyjnie skalibrowanej komórki fotoelektrycznej. Właściwości optyczne większości substancji zmieniają się z nieprzezroczystych na przezroczyste podczas topnienia. Natężenie światła docierającego do komórki fotoelektrycznej zwiększa się, w wyniku czego wysyłany jest sygnał zatrzymania do cyfrowego wskaźnika odczytującego temperaturę z platynowego termometru oporowego umieszczonego w komorze grzejnej. Metoda ta nie ma zastosowania do niektórych intensywnie zabarwionych substancji.

1.4.2. Płyty grzewcze

1.4.2.

1.4.2.1. Płyta grzewcza Koflera W metodzie płyty grzewczej Koflera wykorzystuje się dwa kawałki metalu o różnym przewodnictwie cieplnym, podgrzewane elektrycznie, przy czym stolik jest zaprojektowany w taki sposób, aby gradient temperatury był prawie liniowy wzdłuż jego długości. Temperatura rozgrzanej płyty może dochodzić od 283 do 573 K, przy czym odczytywana jest ona przy pomocy specjalnego urządzenia do odczytywania temperatury, składającego się z suwaka ze wskaźnikiem i klapki przeznaczonej dla odpowiedniego stolika. W celu ustalenia temperatury topnienia, substancję umieszcza się cienką warstwą bezpośrednio na powierzchni gorącej płyty. W ciągu kilku sekund pokazuje się ostra linia oddzielająca ciecz od fazy stałej. Temperaturę na wysokości linii dzielącej odczytuje się przez ustawienie wskaźnika w taki sposób, aby spoczywał na tej linii.

1.4.2.2. Mikroskop do badania topnienia Szereg mikroskopowych płyt grzewczych wykorzystuje się do ustalania temperatury przy użyciu bardzo małych ilości materiału. W większości płyt grzewczych temperaturę mierzy się przy pomocy czułego termoogniwa, jednak czasem wykorzystywane są także termometry rtęciowe. Typowy przyrząd mikroskopowy do oznaczania temperatury topnienia metodą podgrzewania płyty jest wyposażony w komorę grzewczą, która zawiera płytkę metalową, na której umieszczana jest próbka na szkiełku. W środku płytki metalowej znajduje się otwór, przez którą wchodzi światło z lusterka oświetlającego mikroskopu. W trakcie użycia, komora jest zamknięta przez szklaną płytę w celu odcięcia powietrza od obszaru próbki. Podgrzewanie próbki jest regulowane za pomocą reostatu. Dla bardzo precyzyjnych pomiarów dla substancji optycznie anizotropowych, stosuje się światło spolaryzowane.

1.4.2.3. Metoda menisku Metodę tę wykorzystuje się głównie w odniesieniu do poliamidów. W sposób wizualny oznacza się temperaturę, przy której zachodzi przemieszczenie menisku oleju silikonowego, zawartego między płytą grzewczą i szklaną przykrywką opartą na próbce badanego poliamidu.

1.4.3. Metoda oznaczania temperatury krzepnięcia Próbkę umieszcza się w specjalnej probówce i umieszcza w przyrządzie dla oznaczania temperatury krzepnięcia. Próbka jest delikatnie i ciągle mieszana w trakcie chłodzenia, a temperatura jest mierzona w odpowiednich przedziałach. Gdy tylko temperatura pozostaje na stałym poziomie podczas kilku kolejnych odczytów (skorygowanych o błąd termometru), zapisuje się ją jako temperaturę krzepnięcia. Należy zapobiegać szybkiemu schładzaniu przez utrzymywanie równowagi między fazą stałą i fazą ciekłą.

1.4.4. Analiza termiczna

1.4.4.

1.4.4.1. Różnicowa analiza termiczna (DTA) Niniejsza technika rejestruje różnicę w temperaturach między daną substancją i materiałem odniesienia w funkcji temperatury, w trakcie poddawania danej substancji i materiału odniesienia temu samemu programowi kontrolowania temperatury. W momencie gdy próbka ulega przemianie pociągającej zmianę entalpii, zmiana ta jest wskazywana przez odchylenie endotermiczne (topnienie) lub egzotermiczne (krzepnięcie) od linii bazowej zapisu temperatury.

1.4.4.2. Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) Niniejsza technika rejestruje różnicę w energii pobranej przez daną substancję i materiał odniesienia, w funkcji temperatury, w trakcie poddawania danej substancji i materiału odniesienia temu samemu programowi kontrolowania temperatury. Niniejsza energia jest energią konieczną do osiągnięcia zerowej różnicy temperatury między daną substancją a materiałem odniesienia. W momencie, gdy próbka ulega przemianie pociągającej zmianę entalpii, zmiana ta jest wskazywana przez odchylenie endotermiczne (topnienie) lub egzotermiczne (krzepnięcie) od linii bazowej zapisu przepływu ciepła.

1.4.5. Temperatura płynięcia Niniejsza metoda została opracowana dla olejów naftowych i jest właściwa do zastosowania dla substancji olejowych o niskich temperaturach topnienia. Po ogrzaniu wstępnym próbka jest chłodzona z właściwą szybkością i badane są w odstępach co 3 K charakterystyki przepływu. Najniższa temperatura, przy której jest obserwowany ruch substancji, jest odczytywana jako temperatura płynięcia.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Stosowalność i dokładność różnych metod wykorzystywanych do oznaczania temperatury topnienia/zakres temperatur topnienia przedstawiono w poniższej tabeli:

1.5. TABELA: STOSOWALNOŚĆ METOD A. B. C. D.

Metody kapilarne Metoda pomiaru Substancje łatwo proszkowalne Substancje trudno proszkowalne Zakres temperatury Założona dokładność Istniejąca norma Przyrządy do pomiaru temperatury topnienia z łaźnią cieczową tak Tylko niektóre 273 do 573 K ±0,3 K JIS K 0064 Przyrządy do pomiaru temperatury topnienia z blokiem metalu tak Tylko niektóre 293 do > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Wykrywanie przy pomocy komórki fotoelektrycznej tak Poszczególne z zastosowaniem urządzeń 253 do 573 K ±0,5 K Metody temperaturowe i schładzania Metoda pomiaru Substancje łatwo proszkowalne Substancje trudno proszkowalne Zakres temperatury Założona dokładność Istniejąca norma Płyta grzewcza Koflera tak nie 283 do > 573 K ± 1 K ANSI/ASTM D 3451-76 Mikroskop do badania topnienia tak Tylko niektóre 273 do > 573 K ±0,5 K DIN 53736 Metoda menisku nie Specyficzna dla poliamidów 293 do > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Metody badania temperatur krzepnięcia tak tak 223 do 573 K ±0,5 K e.g. BS 4695 Analizy termiczne Metoda pomiaru Substancje łatwo proszkowalne Substancje trudno proszkowalne Zakres temperatury Założona dokładnoś Istniejąca norma Różnicowa analiza termiczna tak tak 173 do 1273 K do 600 K ±0,5 K do 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Rożnicowa kalorymetria skaningowa tak tak 173 do 1273 K do 600 K ±0,5 K do 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Temperatura płynięcia Metoda pomiaru Substancje latwo proszkowalne Substancje trudno proszkowalne Zakres temperatury Założona dokładnoś Istniejąca norma Temperatura płynięcia Dla olejów naftowych i substancji oleistych Dla olejów naftowych i substancji oleistych 223 do 323 K ±0,3 K ASTM D 97-66

1.6. OPIS METOD Procedury przeprowadzenia oznaczeń według prawie wszystkich metod opisano w normach międzynarodowych i krajowych (zob. dodatek 1).

1.6.

1.6.1. Metody z wykorzystaniem rurki kapilarnej Drobno sproszkowane substancje poddawane powolnemu wzrostowi temperatury, zwykle wykazują etapy topnienia przedstawione na rys. 1.

1.6.1.

Rysunek 1 Etap A Etap B Etap C Etap D Etap E Etap A (Początek topnienia): drobne kropelki przylegają jednorodnie do wewnętrznej ściany rurki kapilarnej. Etap B Pokazuje się przerwa między próbką i ścianą wewnętrzną ze względu na kurczenie się topionej substancji. Etap C Skurczona próbka zaczyna zapadać się w dół i upłynnia się. Etap D Na powierzchni tworzy się pełny menisk, jednak dostrzegalna ilość próbki pozostaje w stanie stałym. Etap E (Końcowy etap topnienia): brak cząstek stałych. W trakcie ustalania temperatury tapnienia odnotowuje się temperatury na początku topnienia i na etapie końcowym.

1.6.1.1. Przyrząd do badania temperatury topnienia z łaźnią cieczową Na rysunku 2 przedstawiono rodzaj znormalizowanego przyrządu do badania temperatury topnienia wykonanego ze szkła (JTS K 0064); wszystkie wymiary podano w milimetrach.

1.6.1.1.

Rysunek 2 A: Naczynie pomiarowe B: Korek C: Odpowietrzenie D: Termometr E: Termometr pomocniczy F: Łaźnia cieczowa G: Rurka kapilarna szklana, długości 80 do 100 mm, średnicy wewnętrznej 1,0 ± 0,2 mm, grubość ścianki 0,2 do 0,3 mm H: Rurka boczna

Łaźnia cieczowa:

Należy wybrać odpowiednią ciecz. Wybór cieczy zależy od temperatury topnienia, która ma być oznaczona, na przykład ciekła parafina dla temperatur topnienia nie wyższych od 473 K, olej silikonowy dla temperatur topnienia nie wyższych niż 573 K. Dla temperatur topnienia powyżej 523 K można wykorzystać mieszaninę składającą się z trzech części kwasu siarkowego i dwóch części siarczanu potasu (wagowo). Należy podjąć stosowne środki ostrożności przy stosowaniu mieszaniny takiej jak niniejsza.

Termometr:

Należy używać wyłącznie termometrów spełniających wymagania następujących norm lub norm równoważnych: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Procedura:

Suchą substancję należy drobno sproszkować w moździerzu i wprowadzić do rurki kapilarnej zatopionej na końcu, tak aby poziom napełnienia wynosił około 3 mm po ciasnym upakowaniu. Aby uzyskać jednolicie upakowaną próbkę, należy spuścić rurkę kapilarną z wysokości około 700 mm przez rurkę szklaną, pionowo na szkiełko zegarkowe. Napełnioną rurkę kapilarną umieszcza się w łaźni tak, by środkowa część rtęciowej bańki termometru stykała się z rurką kapilarną w części, w której umieszczona jest próbka. Zwykle rurkę kapilarną wprowadza się do przyrządu o temperaturze o około 10 K niższej od temperatury topnienia. Ciecz łaźni jest podgrzewana w ten sposób, aby temperatura rosła o około 3 K/min. Ciecz należy mieszać. Przy około 10 K poniżej oczekiwanej temperatury topnienia szybkość przyrostu temperatury ustawia się na maksimum 1 K/min.

Obliczenie:

Temperaturę topnienia oblicza się na podstawie następującego wzoru: T = TD + 0,00016 (TD – TE) n gdzie: T skorygowana temperatura topnienia w stopniach K, TD odczyt temperatury z termometru D w stopniach K, TE odczyt temperatury z termometru E w stopniach K, n = liczba kresek podziałki słupka rtęci na termometrze D przy rurce wyjściowej.

1.6.1.2. Przyrządy do pomiaru temperatury topnienia z metalowym blokiem

1.6.1.2. Przyrząd:

Składa się z:

cylindrycznego bloku metalowego, którego górna część jest wydrążona i tworzy komorę (zob. rysunek 3),

zatyczki metalowej z dwiema lub większą liczbą dziur, która pozwala na montowanie probówek na bloku metalowym,

systemu grzejnego do podgrzewania bloku metalowego, wyposażonego na przykład w grzałki oporowe elektryczne zamknięty w bloku,

reostatu do regulacji zasilania, jeżeli stosowane jest podgrzewanie elektryczne,

czterech okienek ze szkła żaroodpornego na poprzecznych ścianach komory, zorientowanych pod kątem prostym względem siebie. Przed każdym z okienek zamontowany jest okular do obserwacji rurki kapilarnej. Pozostałe trzy okienka są wykorzystywane do oświetlania wnętrza zamknięcia przy pomocy lamp,

rurki kapilarnej ze szkła żaroodpornego, zamkniętej na jednym końcu (zob. ppkt 1.6.1.1).

Zob. normy wspomniane w ppkt 1.6.1.1. Stosuje się także termoelektryczne przyrządy pomiarowe o porównywalnej dokładności.

Rysunek 3 Termometr Rurka kapilarna Zatyczka metalowa Okular Lampa Grzałki oporowe elektryczne Blok grzewczy metalowy

1.6.1.3. Wykrywanie przy pomocy komórki fotoelektrycznej Przyrząd i procedura: Przyrząd składa się z komory metalowej z automatycznym systemem grzewczym. Trzy rurki kapilarne są napełniane zgodnie z ppkt 1.6.1.1 i umieszczane w piecu. Możliwych jest kilka liniowych ustawień narastania temperatury w celu skalibrowania przyrządu, przy czym właściwy wzrost temperatury jest regulowany elektrycznie na z góry określoną stałą i szybkość liniową. Rejestratory pokazują rzeczywistą temperaturę pieca i temperaturę substancji w rurkach kapilarnych.

1.6.2. Płyty grzewcze

1.6.2.

1.6.2.1. Płyta grzewcza Koflera Zob. dodatek.

1.6.2.2. Mikroskop do badania topnienia Zob. dodatek.

1.6.2.3. Metoda menisku (poliamidy) Zob. dodatek. Szybkość grzania w obrębie temperatury topnienia powinna być mniejsza niż 1 K/min.

1.6.3. Metody oznaczania temperatury krzepnięcia Zob. dodatek.

1.6.4. Analiza termiczna

1.6.4.

1.6.4.1. Różnicowa analiza termiczna Zob. dodatek.

1.6.4.2. Różnicowa kalorymetria skaningowa Zob. dodatek.

1.6.5. Oznaczanie temperatury płynięcia Zob. dodatek.

2. DANE W niektórych przypadkach konieczna jest korekcja termometru.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje: Jako temperaturę topnienia przedstawia się średnią z co najmniej dwóch pomiarów znajdujących się w granicach oszacowanej dokładności pomiarowej (zob. tabele). Jeżeli różnica między temperaturą na początku i na końcowym etapie topnienia znajduje się w granicach dokładności metody, za temperaturę topnienia przyjmuje się temperaturę na końcowym etapie topnienia; w innym przypadku podaje się obie temperatury. Jeżeli substancja przed osiągnięciem temperatury topnienia rozkłada się lub sublimuje, podawana jest temperatura, w której obserwowane są te efekty. Należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji wyników, w szczególności w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu skupienia substancji.

zastosowana metoda,

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia) i wstępny etap oczyszczenia, jeśli wykonano,

ocena dokładności.

4.(1)(2)(3)(4)

LITERATURA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803–834. R. Weissberger éd.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505–515.

A.2. TEMPERATURA WRZENIA

A.2.

1. METODA Większość opisanych metod oparto na wytycznych OECD dotyczących badań (1). Podstawowe zasady podano w (2) i (3).

1.

1.1. WPROWADZENIE Urządzenia i metody tutaj opisane stosuje się do cieczy i nisko topliwych substancji, pod warunkiem że nie ulegają one reakcji chemicznej poniżej ich temperatury wrzenia (jak na przykład: samoutlenieniu, wtórnemu przekształceniu, rozkładowi i tak dalej). Metody te mogą być stosowane do czystych i zanieczyszczonych ciekłych substancji. Kładzie się nacisk na metody wykorzystujące wykrywanie za pomocą komórki fotoelektrycznej i analizę termiczną, ponieważ metody te pozwalają na oznaczenie zarówno temperatury topnienia jak i temperatury wrzenia. Ponadto, pomiary mogą być wykonywane w sposób automatyczny. Metoda dynamiczna ma tę zaletę, że można ją także wykorzystywać do oznaczenia ciśnienia pary i nie jest konieczna korekcja temperatury wrzenia do ciśnienia normalnego (101,325 kPa), gdyż można regulować ciśnienie normalne podczas pomiaru. Uwagi: Wpływ zanieczyszczeń na oznaczanie temperatury wrzenia w dużym stopniu zależy od charakteru zanieczyszczenia. Jeżeli w próbce znajdują się lotne zanieczyszczenia mogące wpływać na wyniki, badaną substancję należy oczyścić.

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Temperatura wrzenia normalna jest zdefiniowana jako temperatura, przy której prężność pary cieczy wynosi 101,325 kPa. Jeżeli temperatura wrzenia nie jest mierzona w normalnym ciśnieniu atmosferycznym, zależność prężności pary od temperatury opisuje się równaniem Clausiusa – Clapeyrona: log p = ΔHv2,3 RT+const. gdzie: P prężność pary substancji w paskalach, ΔHV jej ciepło parowania w J mol-1, R uniwersalna molowa stała gazowa = 8,314 J mol-1 K-1, T temperatura termodynamiczna w stopniach K. Temperatura wrzenia jest ustalona w odniesieniu do ciśnienia otoczenia w czasie trwania pomiaru. Konwersje Ciśnienie (jednostki: kPa) 100 kPa l bar = 0,1 MPa (jednostka bar jest wciąż dozwolona, ale nie jest zalecana) 133 Pa 1 mm Hg = 1 tor (jednostki mm H i Torr nie są dozwolone) 1 atm standardowa atmosfera = 101325 Pa (jednostka atm jest niedozwolona) Temperatura (jednostki: K) t = T - 273,15 t temperatura Celsjusza, stopień Celsjusza (oC) T temperatura termodynamiczna, Kelwin (K)

1.4. ZASADA METODY BADANIA Pięć metod ustalania temperatury wrzenia (zakresu wrzenia) jest oparte na pomiarze temperatury wrzenia, dwie inne oparte są o analizę termiczną.

1.4.

1.4.1. Wyznaczanie za pomocą ebuliometru Ebuliometry zostały pierwotnie opracowane w celu oznaczania masy cząsteczkowej poprzez podwyższanie temperatury wrzenia, jednak nadają się także do dokładnych pomiarów tej temperatury. Bardzo prosty przyrząd opisano w ASTM D 1120-72 (zob. dodatek). Ciecz jest podgrzewana w tym przyrządzie w warunkach równowagi, pod ciśnieniem atmosferycznym, do wrzenia.

1.4.2. Metoda dynamiczna Metoda ta obejmuje pomiar temperatury ponownej kondensacji pary przy pomocy właściwego termometru w wykroplinach podczas wrzenia. Podczas stosowania tej metody ciśnienie może być zmienne.

1.4.3. Metoda destylacji dla wyznaczania temperatury wrzenia Metoda ta obejmuje destylację cieczy i pomiar temperatury ponownej kondensacji pary oraz oznaczenie ilości destylatu.

1.4.4. Metoda według Siwolobowa Próbkę podgrzewa się w probówce, która jest zanurzona w cieczy w gorącej łaźni. W probówce zanurzona jest z kolei zatopiona na końcu rurka kapilarna, zawierająca pęcherzyk powietrza w dolnej części.

1.4.5. Wykrywanie przy pomocy komórki fotoelektrycznej Zgodnie z zasadą według Siwolobowa wykonuje się automatyczny pomiar fotoelektryczny z wykorzystaniem unoszących się pęcherzyków.

1.4.6. Różnicowa analiza termiczna Niniejsza technika rejestruje różnicę w temperaturach między substancją i materiałem odniesienia jako funkcję temperatury, gdy substancja oraz materiał odniesienia podlegają temu samemu programowi kontrolowania temperatury. W momencie gdy próbka podlega przejściu pociągającym za sobą zmianę entalpii, zmiana ta jest wskazywana przez endotermiczne odchylenie (wrzenie) od linii bazowej zapisu temperatury.

1.4.7. Różnicowa kalorymetria skaningowa Niniejsza technika rejestruje różnicę w energii pobranej przez substancję oraz materiał odniesienia, jako funkcję temperatury, gdy substancja oraz materiał odniesienia podlegają temu samemu programowi kontrolowania temperatury. Niniejsza energia jest energią konieczną do ustalenia zerowej różnicy temperatury między substancją i materiałem odniesienia. W momencie gdy próbka podlega przejściu pociągającym za sobą zmianę entalpii, zmiana ta jest wskazywana przez endotermiczne odchylenie (wrzenie) od linii bazowej zapisu przepływu ciepła.

1.5. Tabela 1 Porównanie metod

KRYTERIA JAKOŚCI Zastosowanie i dokładność różnych metod wykorzystywanych do ustalania temperatury wrzenia/zakres temperatury wrzenia przedstawiono w tabeli 1. Metoda pomiaru Założona dokładność Istniejąca norma Ebuliometr ±1,4 K (do 313 K) ±2,5 K (do 600 K) ASTM D 1120-72 Metody dynamiczne ±0,5 K (do 600 K) Proces destylacji (zakres wrzenia) ±0,5 K (do 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Według Siwolobowa ± 2 K (do 600 K) Wykrywanie za pomocą komórki fotoelektrycznej ±0,3 K (do 373 K) Różnicowa kalorymetria termiczna ±0,5 K (do 600 K) ±2,0 K (do 1273 K) ASTM E 537-76 Różnicowa kalorymetria skaningowa ±0,5 K (do 600 K) ±2,0 K (do 1273 K) ASTM E 537-76

1.6. OPIS METOD Procedury dotyczące niektórych metod badania opisano w normach międzynarodowych i krajowych (zob. dodatek).

1.6.

1.6.1. Ebuliometr Zob. dodatek

1.6.2. Metoda dynamiczna Zob. metoda badania A.4 dla oznaczania prężności pary. Odnotowuje się temperaturę wrzenia stwierdzoną pod przyłożonym ciśnieniem 101,325 kPa.

1.6.3. Proces destylacji (zakres wrzenia) Zob. dodatek.

1.6.4. Metoda według Siwolobowa Próbka jest podgrzewana w przyrządzie do oznaczania temperatury topnienia w probówce o średnicy około 5 mm (rysunek 1). Rysunek 1 pokazuje rodzaj znormalizowanego przyrządu do badania temperatury topnienia i wrzenia (JIS K 0064) (wykonanego ze szkła, wszystkie wymiary w milimetrach). Rurkę kapilarną (kapilara do badania wrzenia), zatopioną na wysokości około 1 cm powyżej dolnego końca, umieszcza się w probówce. Badaną substancję wprowadza się w ten sposób, aby zatopiony odcinek kapilary znalazł się poniżej powierzchni cieczy. Probówkę zawierającą kapilarę albo przymocowuje się do termometru przy pomocy taśmy gumowej, albo umocowuje z boku na wsporniku (zob. rysunek 2). Rysunek 2 Zasada według Siwolobowa Rysunek 3 Zmodyfikowana zasada Ciecz do łaźni należy wybrać w zależności od temperatury wrzenia. Przy temperaturach do 573 K stosuje się olej silikonowy. Ciekła parafina jest stosowana tylko do 473 K. Początkowo grzanie łaźni cieczowej ustawia się na wzrost temperatury 3 K/min. Ciecz łaźni musi być mieszana. W temperaturze około 10 K poniżej spodziewanej temperatury wrzenia szybkość wzrostu temperatury ustawia się na maksimum 1 K/min. Przy zbliżaniu się do temperatury wrzenia z wrzącej zawartości kapilary zaczynają unosić się pęcherzyki. Temperatura wrzenia to temperatura, w której przy chwilowym schłodzeniu łańcuszek pęcherzyków przestaje powstawać i ciecz w kapilarze nagle zaczyna się unosić. Odpowiadający temu odczyt temperatury to temperatura wrzenia substancji. W zmodyfikowanej zasadzie pomiaru (rysunek 3) temperatura wrzenia jest oznaczana w kapilarze od ustalania temperatury topnienia. Jest ona wyciągnięta do przewężenia o długości około 2 cm (a) i zassana jest w niej mała ilość próbki. Otwarty koniec cienkiej kapilary jest zamknięty poprzez obtopienie w taki sposób, że na jej końcu znajduje się mały pęcherzyk powietrza. Podczas ogrzewania w aparacie do ustalania temperatury topnienia (b), pęcherzyk powietrza rozszerza się. Temperaturze wrzenia odpowiada taka temperatura, przy której zatyczka z substancji badanej osiąga poziom powierzchni cieczy łaźni (c).

1.6.4.

Rysunek 1 A: Naczynie pomiarowe B: Korek C: Odpowietrzenie D: Termometr E: Termometr pomocniczy F: Łaźnia cieczowa G: Probówka do próbek, średnica zewn. maks. 5 mm; zawierająca rurkę kapilarną długą na około 100 mm, średnica wewnętrzna około 1 mm i grubości ścianek około 0,2 do 0,3 mm H: Rurka boczna

1.6.5. Wykrywanie za pomocą komórki fotoelektrycznej Próbka jest ogrzewana w rurce kapilarnej umieszczonej wewnątrz podgrzewanego bloku metalowego. Wiązka światła przechodzi poprzez odpowiednie otwory w bloku, poprzez badaną substancję na precyzyjnie skalibrowaną komórkę fotoelektryczną. W czasie wzrostu temperatury próbki pojedyncze pęcherzyki powietrza pojawiają się w kapilarze. Gdy osiągnięta jest temperatura wrzenia, ilość pęcherzyków gwałtownie wzrasta. Powoduje to zmianę intensywności światła rejestrowanego przez komórkę fotoelektryczną i powoduje wysłanie sygnału zatrzymania do wskaźnika odczytującego temperaturę z platynowego termometru rezystancyjnego umieszczonego w bloku. Niniejsza metoda jest szczególnie użyteczna, gdyż pozwala na oznaczania poniżej temperatury pokojowej do 253,15 K (-20 oC) bez żadnych zmian w przyrządzie. Przyrząd umieszcza się jedynie w łaźni chłodzącej.

1.6.6. Analiza termiczna

1.6.6.

1.6.6.1. Różnicowa analiza termiczna Zob. dodatek.

1.6.6.2. Różnicowa kalorymetria skaningowa Zob. dodatek.

2. Tabela 2 Temperatura – współczynniki korekcji fT

DANE Przy niewielkich odchyleniach od ciśnienia normalnego (maksimum ± 5 kPa) temperaturę wrzenia normalizuje się do Tn na podstawie następującego wzoru równania Sidneya-Younga: Tn = T + (fT × Δp) gdzie: Δp (101,325 – p) [uwaga na znak], P pomiar ciśnienia w kPa, fT szybkość zmian temperatury wrzenia z ciśnieniem w K/Kpa, T zmierzona temperatura wrzenia w K, Tn temperatura wrzenia skorygowana do ciśnienia normalnego w K. Współczynniki korekcji temperatury, fT, i wzory na ich przybliżone obliczanie zawarto we wspomnianych wyżej normach międzynarodowych i krajowych dla wielu substancji. Na przykład w metodzie DIN 53171 wymieniono następujące, przybliżone poprawki dla rozpuszczalników zawartych w farbach: Temperatura T (K) Współczynnik korekcji fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje: Średnią co najmniej dwóch pomiarów znajdujących się w zakresie oszacowanej dokładności (zob. tabela 1) przedstawia się jako temperaturę wrzenia. Należy podać zmierzone temperatury wrzenia i ich średnią, a także ciśnienie (ciśnienia), w którym (których) były wykonywane pomiary, w kPa. Najkorzystniej jest, gdy ciśnienie jest zbliżone do normalnego ciśnienia atmosferycznego. Należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji wyników, w szczególności w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu skupienia substancji.

zastosowana metoda,

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia) i wstępny etap oczyszczenia, jeśli wykonano,

ocena dokładności.

4.(1)(2)(3) LITERATURA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, vol. I, part I, chapter VIII.

A.3. GĘSTOŚĆ WZGLĘDNA

A.3.

1. METODA Większość opisanych metod oparto na wytycznych OECD dotyczących badań (1). Podstawowe zasady podano w pozycjach bibliograficznych (2) i (3).

1.

1.1. WPROWADZENIE Opisane metody oznaczania gęstości względnej stosują się do substancji stałych i płynnych, bez ograniczeń związanych z ich stopniem czystości. Różne metody możliwe do zastosowania wymieniono w tabeli 1.

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Gęstość względna ciał stałych lub cieczy jest stosunkiem między masą objętości badanej substancji, ustaloną w 20 oC, oraz masą tej samej objętości wody, ustaloną w 4 oC. Gęstość względna jest bezwymiarowa. Gęstość, ρ, substancji jest ilorazem masy, m, i jej objętości, v. Gęstość, ρ, w układzie jednostek SI jest dana w kg/m3.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA (1), (3) Nie ma konieczności stosowania substancji odniesienia za każdym razem, gdy przeprowadzane są badania nowej substancji. Powinny one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajności metody i pozwolić na porównanie wyników z innymi metodami.

1.4. ZASADA METOD Stosowane są cztery klasy metod.

1.4.

1.4.1. Metody wyporu hydrostatycznego

1.4.1.

1.4.1.1. Areometr (dla substancji ciekłych) Wystarczająco dokładne i szybkie oznaczenia gęstości można uzyskać przy użyciu areometrów pływakowych, które pozwalają na obliczenie gęstości cieczy na podstawie głębokości zanurzenia, przez odczyt na skali z podziałką.

1.4.1.2. Waga hydrostatyczna (dla substancji płynnych i stałych) Różnicę między wagą badanej próbki zmierzoną w powietrzu i w odpowiedniej cieczy (na przykład w wodzie) wykorzystuje się do oznaczenia jej gęstości. W przypadku ciał stałych zmierzona gęstość jest charakterystyczna jedynie dla określonej, zastosowanej próbki. W przypadku oznaczania gęstości cieczy, ich ilość o znanej objętości, v, waży się najpierw w powietrzu, a potem w cieczy.

1.4.1.3. Metoda zanurzeniowa (dla substancji ciekłych) (4) Metoda ta polega na oznaczaniu gęstości cieczy na podstawie różnicy między wynikami zważenia cieczy przed i po zanurzeniu w nim ciała o znanej objętości.

1.4.2. Metody piknometryczne W przypadku ciał stałych lub cieczy można się posłużyć piknometrami o różnych kształtach i o znanych wymiarach. Gęstość oblicza się na podstawie różnicy masy między napełnionym i pustym piknometrem oraz jego znanej objętości.

1.4.3. Piknometr wykonujący pomiar porównawczy w powietrzu (dla ciał stałych) Gęstość ciała stałego w dowolnej formie można zmierzyć w temperaturze pokojowej przy użyciu piknometru wykonującego pomiary porównawcze w gazie. Objętość substancji mierzy się w powietrzu lub w gazie obojętnym w cylindrze o zmiennej, wykalibrowanej objętości. Dla obliczenia gęstości wykonuje się jeden pomiar masy po zakończeniu pomiaru objętości.

1.4.4. Densytometr oscylacyjny (5, 6, 7) Gęstość cieczy można zmierzyć przy pomocy densytometru oscylacyjnego. Mechaniczny oscylator skonstruowany w postaci U-rurki drga w częstotliwości rezonansowej zależnej od jego masy. Wprowadzenie badanej próbki zmienia częstotliwość rezonansową oscylatora. Przyrząd należy skalibrować przy użyciu dwóch substancji płynnych o znanej gęstości. Najkorzystniej, aby substancje te wybrać tak, aby ich gęstości były bliskie zakresowi, który ma być mierzony.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Zastosowania poszczególnych metod wykorzystywanych do oznaczania gęstości względnej wymieniono w tabeli.

1.6. OPIS METOD W dodatku załączono normy podane jako przykłady, z którymi należy się zapoznać w celu uzyskania informacji o dodatkowych szczegółach technicznych. Badania należy przeprowadzać w temperaturze 20 oC, przy czym konieczne jest wykonanie co najmniej dwóch pomiarów.

2. DANE Zob. normy.

3. Tabela 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Zastosowanie metod

SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje: Gęstość względną, D204 , należy podawać w sposób określony w ppkt 1.2, łącznie ze stanem skupienia mierzonej substancji. Należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji wyników, w szczególności w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu skupienia substancji. Metoda pomiaru Gęstość Maksymalna możliwa lepkość dynamiczna Istniejące normy ciało stałe ciecz Areometr tak 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Waga hydrostatyczna tak ISO 1183 (A) tak 5 Pa s ISO 901 i 758 Metoda zanurzeniowa tak 20 Pa s DIN 53217 Piknometr ISO 3507 tak ISO 1183(B), NF T 20-053 tak 500 Pa s ISO 758 Piknometr wykonujący pomiar porównawczy w powietrzu tak DIN 55990 Teil 3, DIN 53243 Densytometr oscylacyjny tak 5 Pa s

zastosowana metoda,

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia) i wstępny etap oczyszczania, jeśli wykonano.

3. Tabela 1.4.1.1.1.4.1.2. Zastosowanie metod a)

ciała stałe

ciecze

3. Tabela 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Zastosowanie metod a)

ciała stałe

ciecze

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

LITERATURA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., chapter IV, Interscience Publ. , New York, 1959, vol. I, part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 427–430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717–726. Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253–255.

A.4. PRĘŻNOŚĆ PARY

A.4.

1. METODA Większość opisanych metod oparto na wytycznych OECD dotyczących badań (1). Podstawowe zasady podano w pozycjach bibliograficznych (2) i (3).

1.

1.1. WPROWADZENIE Do przeprowadzenia tego oznaczenia przydatne jest posiadanie wstępnych informacji na temat budowy, temperatury topnienia i temperatury wrzenia substancji. Nie istnieje procedura pojedynczego pomiaru dająca się zastosować do całego zakresu prężności par. Dlatego zalecane jest kilka metod stosowanych do pomiaru prężności par w zakresie od < 10-4 do 105 Pa. Zanieczyszczenia zwykle wpływają na prężność pary do pewnego stopnia, zależącego głównie od rodzaju zanieczyszczenia. Jeżeli w próbce znajdują się zanieczyszczenia lotne, które mogą wpływać na wynik, substancję należy oczyścić. Może być także właściwe powołanie się na prężność pary materiału czystości technicznej. Kilka opisanych tu metod wykorzystuje przyrząd składający się z metalowych części, co należy rozważyć przy badaniu substancji powodujących korozję.

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Prężność pary substancji określa się jako ciśnienie nasycenia ponad substancją w stanie stałym lub płynnym. W stanie równowagi termodynamicznej prężność pary czystej substancji jest funkcją jedynie temperatury. Jednostką ciśnienia układu SI, którą należy stosować, jest paskal (Pa). Jednostki, które stosowano w przeszłości, łącznie z ich współczynnikami konwersji: 1 tor (≡ 1 mm Hg) = 1,333 ×102 Pa 1 atmosfera = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa Jednostką temperatury w układzie SI jest kelwin (K). Uniwersalna molowa stała gazowa R wynosi 8,314 Jmol-1 K-1 Temperaturowa zależność prężności pary jest opisana równaniem Clausiusa-Clapeyrona: log p = ΔHv2,3 RT+const. gdzie: p prężność pary substancji w Pa, ΔHv jej ciepło parowania w Jmol-l, R uniwersalna molowa stała gazowa w Jmol-l K-1, T temperatura termodynamiczna w K.

1.4. ZASADA METOD BADAŃ Do oznaczania prężności pary proponuje się siedem metod, które można stosować przy różnych zakresach prężności pary. W przypadku każdej metody prężność pary określa się w różnych temperaturach. W ograniczonym zakresie temperatur logarytm prężności pary czystej substancji jest liniową funkcją odwrotności temperatury.

1.4.

1.4.1. Metoda dynamiczna Przy użyciu metody dynamicznej dokonuje się pomiaru temperatury wrzenia, która odpowiada określonemu ciśnieniu. Zalecany zakres: Od 103 do 105 Pa. Niniejsza metoda jest także zalecana do oznaczania normalnej temperatury wrzenia i jest użyteczna w tym celu do 600 K.

1.4.2. Metoda statyczna W procesie statycznym w punkcie równowagi termodynamicznej oznacza się prężność pary ustaloną w zamkniętym układzie, w określonej temperaturze. Metoda ta jest właściwa dla jednoskładnikowych i wieloskładnikowych ciał stałych i cieczy. Zalecany zakres: Od 103 do 105 Pa. Stosując należytą uwagę, niniejszą metodę można zastosować także w zakresie od 1 do 10 Pa.

1.4.3. Izoteniskop Ta znormalizowana metoda jest także metodą statyczną, jednak na ogół nie jest właściwa dla układów wieloskładnikowych. Dodatkowe informacje są dostępne w metodzie ASTM D-2879-86. Zalecany zakres: Od 100 do 105 Pa.

1.4.4. Metoda efuzji: waga do oceny prężności pary Ustala się ilość substancji opuszczającej komórkę w jednostce czasu przez szczelinę o znanym rozmiarze, w warunkach próżni, w ten sposób, że powrót substancji do komórki jest nieznaczny (np. przez pomiar pulsu generowanego na czułej wadze przez strumień pary lub przez pomiar utraty masy). Zalecany zakres: Od 10-3 do 1 Pa.

1.4.5. Metoda efuzji: pomiar poprzez utratę masy lub przez pułapkowanie oparów Metoda oparta jest na oznaczeniu masy badanej substancji ulatniającej się na jednostkę czasu z komórki Knudsena (4) w postaci oparów przez mikrootwór w warunkach wysokiej próżni. Masę oparów, które uległy efuzji, uzyskuje się albo przez oznaczenie utraty masy komórki, albo przez kondensację oparów w niskiej temperaturze i oznaczenie ilości ulotnionej substancji za pomocą analizy chromatograficznej. Prężność pary jest obliczana za pomocą zależności Hertza-Knudsena. Zalecany zakres: Od 10-3 do 1 Pa.

1.4.6. Metoda nasycenia gazem Strumień obojętnego gazu nośnikowego jest przepuszczany nad substancją w taki sposób, że powoduje to nasycenie jego parą. Ilość przeniesionego materiału przez znaną ilość gazu nośnikowego mierzy się albo przez zbieranie go w odpowiedniej pułapce, albo impulsową techniką analityczną. Jest to następnie stosowane do obliczenia prężności pary w danej temperaturze. Zalecany zakres: Od 10-4 do 1 Pa. Stosując należytą uwagę, niniejszą metodę można zastosować także w zakresie od 1 do 10 Pa.

1.4.7. Metoda wirującego rotora W mierniku wirującego rotora, rzeczywistym elementem pomiarowym jest mała stalowa kula zawieszona w polu magnetycznym, obracająca się z dużą szybkością. Ciśnienie gazu jest wyprowadzane z zależnego od ciśnienia, spadku szybkości stalowej kuli. Zalecany zakres: Od 10-4 do 0,5 Pa.

1.5. Tabela 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Kryteria jakości

KRYTERIA JAKOŚCI Porównano poszczególne metody oznaczania prężności pary pod względem ich zastosowania, powtarzalności, odtwarzalności, zakresu pomiaru, istnienia norm. Porównanie to przedstawiono w tabeli poniżej. Metoda pomiarowa Substancje Szacowana powtarzalność Szacowana odtwarzalność Zalecany zakres Istniejące normy stałe ciekłe Metoda dynamiczna nisko topliwe tak do 25 % do 25 % 103 Pa do 2 × 103 Pa — 1 do 5 % 1 do 5 % 2 × 103 Pa do 105 Pa — Metoda statyczna tak tak 5 do 10 % 5 do 10 % 10 Pa do 105 Pa NFT 20-048 (5) Izoteniskop tak tak 5 do 10 % 5 do 10 % 102 Pa do 105 Pa ASTM-D 2879-86 Metoda efuzji waga oceny sprężystości pary tak tak 5 do 20 % do 50 % 10-3 Pa do 1 Pa NFT 20-047 (6) Metoda efuzji utrata masy tak tak 10 do 30 % — 10-3 Pa do 1 Pa — Metoda nasycenia gazem tak tak 10 do 30 % do 50 % 10-4 Pa do 1 Pa — Metoda wirującego rotora tak tak 10 do 20 % — 10-4 Pa do 0,5 Pa —

1.6. OPIS METOD

1.6.

1.6.1. Pomiar dynamiczny

1.6.1.

1.6.1.1. Przyrząd Zwykle przyrząd pomiarowy składa się z naczynia do gotowania z dołączoną chłodnicą wykonaną ze szkła lub metalu (rysunek 1), urządzenia do pomiaru temperatury i urządzenia do regulowania i pomiaru ciśnienia. Typowy przyrząd pomiarowy pokazany na rysunku jest wykonany z żaroodpornego szkła i składa się z pięciu części: Duża, częściowo dwuścienna rura składa się ze złącza szlifowanego z płaszczem, chłodnicy, naczynia chłodzącego i otworu wlotowego. Do części rury, w której odbywa się wrzenie, dołączony jest szklany cylinder z pompką Cottrella, który ma nierówną powierzchnię tłuczonego szkła w celu uniknięcia burzliwości w procesie wrzenia. Temperatura jest mierzona odpowiednim czujnikiem temperatury (na przykład termometrem oporowym, szczelnym termoogniwem) umieszczonym w aparacie w punkcie pomiaru (nr 5, rysunek 1) za pomocą odpowiedniego wlotu (na przykład złączem szlifowym). Wykonane są niezbędne połączenia do regulacji ciśnienia i oprzyrządowania pomiarowego. Bańka, która działa jako objętość buforowa, jest połączona z przyrządem pomiarowym poprzez rurkę kapilarną. Naczynie przeznaczone do wrzenia jest ogrzewane za pomocą elementu grzejnego (na przykład grzałką) włożonego do szklanego przyrządu od dołu. Wymagany prąd grzania jest ustawiany i regulowany poprzez termoogniwo. Konieczna próżnia w zakresie między 102 Pa i około 105 Pa jest wytwarzana za pomocą pompy próżniowej. Stosuje się odpowiedni zawór do liczników powietrza lub azotu dla regulacji ciśnienia (zakres pomiarowy około 102 do 105 Pa) oraz wentylację. Ciśnienie jest mierzone za pomocą manometru.

1.6.1.2. Procedura pomiarowa Prężność pary jest mierzona przez ustalenie temperatury wrzenia próbki przy różnych określonych ciśnieniach między prawie 103 a 105 Pa. Ustalona temperatura pod stałym ciśnieniem wskazuje, że uzyskano temperaturę wrzenia. Metoda ta nie jest użyteczna do pomiaru ciśnienia pary substancji, które się pienią. Substancja jest umieszczona w czystym, suchym naczyniu do próbek. Można się natknąć na problemy z niesproszkowanymi ciałami stałymi, lecz czasem można je rozwiązać przez podgrzanie płaszcza chłodzącego. Po napełnieniu naczynia przyrząd jest uszczelniany na kołnierzu i odgazowuje się substancję. Następnie ustawia się najniższe pożądane ciśnienie i włącza układ grzejny. W tym samym czasie czujnik temperatury jest podłączany do rejestratora. Stan równowagi jest osiągany, gdy rejestruje się stałą temperaturę wrzenia przy stałym ciśnieniu. Należy zwrócić szczególną uwagę, by zapobiec wrzeniu burzliwemu podczas wrzenia. Dodatkowo musi zachodzić całkowita kondensacja w chłodnicy. Przy oznaczaniu prężności pary niskotopliwych ciał stałych należy zwrócić uwagę na uniknięcie zablokowania skraplacza. Po zapisaniu parametrów punktu równowagi ustawia się wyższe ciśnienie. Proces kontynuuje się w ten sposób do osiągnięcia ciśnienia 105 Pa (ogółem od około 5 do 10 punktów pomiarowych). W ramach sprawdzenia można powtórzyć oznaczanie punktów równowagi w trakcie obniżania ciśnienia.

1.6.2. Pomiar statyczny

1.6.2.

1.6.2.1. Przyrząd Przyrząd zawiera naczynie na próbkę, system grzejny i chłodzący do regulacji temperatury próbki i pomiaru temperatury. Przyrząd zawiera również przyrządy do ustawiania i pomiaru ciśnienia. Rysunki 2a i 2b obrazują zastosowane podstawowe zasady. Komora próbki (rysunek 2a) jest podłączona z jednej strony odpowiednim zaworem dla wysokiej próżni. U-rurka zawierająca odpowiednią ciecz manometryczną jest dołączona z drugiej strony. Jeden z końców rozgałęzienia U-rurki odcina pompę próżniową, cylinder azotu lub zawór wentylacji oraz manometr. Zamiast U-rurki można zastosować manometr ze wskaźnikiem ciśnienia (rysunek 2b). W celu regulacji temperatury próbki, umieszcza się naczynie próbki wraz z zaworem i U-rurką lub manometrem w łaźni, w której utrzymywana jest stała temperatura z dokładnością ±0,2 K. Pomiary temperatury są prowadzone na zewnętrznej ściance naczynia zawierającego próbkę lub w samym naczyniu. Pompa próżniowa z pułapką chłodzącą opary jest używana do odpowietrzania przyrządu. W metodzie 2a prężność pary substancji jest mierzona pośrednio, stosując wskaźnik zera. Wynika to z wzięcia pod uwagę faktu, że gęstość płynu w U-rurce zmienia się przy znacznej zmianie temperatury. W zależności od zakresu ciśnień oraz chemicznego zachowania się badanej substancji, następujące płyny są odpowiednie do użycia jako wskaźniki zera dla U-rurki: płyny silikonowe, ftalany. Badana substancja nie może w znaczący sposób rozpuszczać się lub reagować z płynem U-rurki. W zakresie normalnego ciśnienia do 102 Pa, do manometru stosuje się rtęć, podczas gdy płyny silikonowe i ftalany są odpowiednie do użycia poniżej 102. Pa w dół do 10 Pa. Manometry pojemnościowe o podgrzewanej membranie mogą być używane nawet do poniżej 10-1 Pa. Istnieją również czujniki ciśnienia, które mogą być stosowane poniżej 102 Pa.

1.6.2.2. Procedura pomiarowa Przed pomiarami, wszystkie podzespoły przyrządu pokazanego na rysunku 2 muszą być gruntownie oczyszczone i wysuszone. W metodzie 2a należy napełnić U-rurkę wybranym płynem, który musi być odgazowany w podwyższonej temperaturze przed rozpoczęciem odczytów. Badaną substancję umieszcza się w przyrządzie, który jest następnie zamykany, i zmniejsza się wystarczająco temperaturę w celu odgazowania. Temperatura musi być wystarczająco niska dla zapewnienia usunięcia powietrza, ale w przypadku wielokrotnego systemu składników, nie może powodować zmiany składu materiału. Równowaga, jeżeli zachodzi potrzeba, może być uzyskana znacznie szybciej przy pomocy mieszania. Próbkę można przechłodzić za pomocą ciekłego azotu (uważać, by zapobiec kondensacji powietrza lub płynu pompy) lub mieszaniny etanolu i suchego lodu. Przy pomiarach niskotemperaturowych używać łaźni z regulowaną temperaturą podłączonej do ultrakriomatu. Otwarcie zaworu nad naczyniem z próbką powoduje włączenie na kilka minut ssania w celu usunięcia powietrza. Następnie zamyka się zawór i zmniejsza temperaturę próbki do najniższego żądanego poziomu. O ile zachodzi taka konieczność, proces odgazowania musi być powtórzony kilka razy. Gdy próbka jest podgrzewana, prężność pary wzrasta. Zmienia to równowagę cieczy w U-rurce. Celem kompensacji tego zjawiska azot jest podawany do przyrządu poprzez zawór do momentu, gdy wskaźnik ciśnienia płynu ponownie osiągnie zero. Ciśnienie wymagane do tego jest odczytywane precyzyjnym manometrem w temperaturze pokojowej. Niniejsze ciśnienie odpowiada prężności pary substancji w określonej temperaturze pomiaru. Metoda 2b jest podobna, lecz prężność pary jest odczytywana bezpośrednio. Zależność temperaturowa prężności pary jest oznaczana w odpowiednio małych przedziałach (około 5 do 10 punktów pomiarowych całego zakresu) do pożądanego maksimum. Sprawdzeniem jest powtórzenie odczytów niskotemperaturowych. Jeżeli wartości z powtórzonych odczytów nie pokrywają się z krzywą uzyskaną dla wzrostu temperatury, może być to spowodowane jedną z następujących przyczyn:

1.6.2.2.

1. Próbka wciąż zawiera powietrze (na przykład materiały o wysokiej lepkości) lub nisko wrzące substancje, które jest/są uwalniane w trakcie ogrzewania i mogą być usunięte przez odpompowanie po przechłodzeniu.

2. Temperatura chłodzenia nie jest wystarczająco niska. W tym przypadku jako środek chłodzący jest używany ciekły azot. O ile zachodzi przyczyna 1 lub 2, pomiary muszą być powtórzone.

3. Substancja ulega reakcji chemicznej w badanym zakresie temperatur (na przykład rozkładowi, polimeryzacji).

1.6.3. Izoteniskop Pełny opis tej metody można znaleźć w pozycji bibliograficznej (7). Zasadę działania urządzenia pomiarowego pokazano na rysunku 3. Podobnie jak w przypadku metody statycznej opisanej w ppkt 1.6.2, izoteniskop nadaje się do badań ciał stałych lub cieczy. W przypadku cieczy sama substancja pełni rolę cieczy, którym napełniony jest pomocniczy manometr. Ilość cieczy, wystarczająca do napełnienia kolby i krótkiego odgałęzienia sekcji manometru, jest umieszczana w izoteniskopie. Izoteniskop podłącza się do systemu próżniowego i odpompowuje, a następnie napełnia się go azotem. Odpompowanie i czyszczenie systemu jest powtarzane dwukrotnie w celu usunięcia resztkowego tlenu. Napełniony izoteniskop umieszcza się w pozycji poziomej, tak by próbka rozpłynęła się cienką warstwą w naczyniu próbki i sekcji manometru (część U). Ciśnienie systemu zmniejsza się do 133 Pa i podgrzewa delikatnie próbkę do rozpoczęcia wrzenia (usunięcie rozpuszczonych związanych gazów). Następnie umieszcza się izoteniskop tak, że próbka powraca do naczynia i krótszego rozgałęzienia manometru, tak by były całkowicie wypełnione cieczą. Ciśnienie utrzymuje się takie jak dla odgazowania; wyciągnięta końcówka naczynia próbki jest podgrzewana małym płomieniem do czasu, gdy uwalniane opary próbki rozszerzą się wystarczająco do wyparcia części próbki z górnej części kolby i ramienia manometru do sekcji manometru izoteniskopu, tworząc wypełnioną parami, wolną od azotu przestrzeń. Izoteniskop jest następnie umieszczany w łaźni o stałej temperaturze, a ciśnienie azotu ustawia się do momentu wyrównania go z ciśnieniem próbki. Równowaga ciśnień jest wskazywana przez sekcję manometryczną izoteniskopu. W punkcie równowagi, prężność pary azotu jest równa prężności pary substancji. W przypadku ciał stałych stosowane ciecze manometryczne w zależności od zakresu i temperatury podano w ppkt 1.6.2.1. Odgazowaną cieczą manometryczną napełnia się wybrzuszenie na dłuższym ramieniu izoteniskopu. Następnie ciało stałe, które ma być badane, jest umieszczane w naczyniu i jest odgazowywane w podwyższonej temperaturze. Po tym izoteniskop jest nachylany tak, by ciecz manometryczna mogła przepłynąć do U-rurki. Pomiar prężności pary w funkcji temperatury jest wykonywany zgodnie z ppkt 1.6.2.

1.6.4. Metoda efuzji: waga do oceny prężności pary

1.6.4.

1.6.4.1. Przyrząd Różne wersje przyrządów opisano w literaturze (1). Przyrząd opisany tutaj obejmuje przedstawienie ogólnej zasady (rysunek 4). Rysunek 4 pokazuje główne części przyrządu, zawierającego naczynie do wysokiej próżni ze stali nierdzewnej lub szkła, osprzęt do wytwarzania i pomiaru próżni i wbudowane podzespoły do pomiaru prężności pary w równowadze. W przyrządzie znajdują się wbudowane następujące podzespoły:

wyparka z kołnierzem i obrotowym wlotem. Wyparka jest cylindrycznym naczyniem, wykonanym na przykład z miedzi lub ze stopu chemicznie odpornego o dobrym termicznym przewodnictwie. Można również użyć szklane naczynie z miedzianą ścianką. Wyparka posiada średnicę około 3 do 5 cm i jest wysoka na 2 do 5 cm. Znajdują się w niej od jednego do trzech otworów o różnych wymiarach dla strumienia pary. Wyparka jest podgrzewana albo płytą grzejną od spodu, albo spiralą grzejną dookoła powierzchni zewnętrznej. Aby zapobiec rozpraszaniu ciepła do płyty dennej, grzejnik jest podłączony do płyty dennej poprzez metal o niskim przewodnictwie cieplnym (stal niklowosrebrowa lub chromoniklowa), na przykład przez rurkę niklowosrebrową połączoną z obrotowym wlotem, jeśli używa się wyparki o kilku otworach. Takie rozmieszczenie umożliwia wprowadzenie prętów miedzianych, co pozwala na chłodzenie zewnętrzne za pomocą łaźni chłodzącej,

jeżeli wieko miedziane wyparki posiada trzy otwory o różnych średnicach, rozmieszczonych co 90o, można objąć różne zakresy prężności pary z całkowitego zakresu pomiarowego (otwory o średnicy między około 0,30 i 4,50 mm). Duże otwory są stosowane do niskiej prężności pary i odwrotnie. Przez obracanie wyparki można ustawić pożądany otwór lub pozycję pośrednią w strumieniu cząsteczek (otwór wyparki – osłona – szala wagi) uwalnianych lub odchylanych przez otwór wyparki na szalę wagi. W celu pomiaru temperatury substancji umieszcza się termoogniwo lub termometr oporowy w stosownym punkcie,

powyżej osłony znajduje się przedłużenie szalki wagi dla mikrowagi o wysokiej czułości (zob. poniżej). Szala wagi posiada średnicę około 30 mm. Odpowiednim materiałem jest aluminium pokryte złotem,

szala wagi jest otoczona przez cylindryczną, wykonaną z brązu lub miedzi skrzynkę chłodniczą. W zależności od typu wagi posiada ona otwory dla belki wagi i osłonięty otwór dla strumienia cząsteczek i powinna gwarantować całkowitą kondensację par na szalce wagi. Rozpraszanie ciepła na zewnątrz jest zapewnione na przykład przez pręt miedziany połączony ze skrzynką chłodniczą. Pręt jest przeprowadzony przez płytę denną i termicznie od niej odizolowany, na przykład za pomocą rury ze stali chromoniklowej. Pręt jest zanurzony w naczyniu Dewara zawierającym ciekły azot pod płytą denną, bądź ciekły azot cyrkuluje przez pręt. Skrzynka chłodnicza jest utrzymywana w temperaturze około - 120 oC. Szala wagi jest chłodzona wyłącznie przez promieniowanie, co jest zadawalające dla zakresu ciśnień stosowanych do badań (chłodzenie około jednej godziny przed rozpoczęciem pomiarów),

waga jest umieszczana powyżej skrzynki chłodniczej. Odpowiednimi wagami są na przykład wysokoczułe, dwuramienne elektroniczne mikrowagi (8) lub wysokoczuły przyrząd z ruchomą cewką (zob. wytyczne OECD dotyczące badań 104, wydanie z 12.5.81),

płyta denna zawiera również elektryczne połączenia dla termoogniw (lub termometrów oporowych) oraz wężownicę grzejną,

próżnia jest wytwarzana w naczyniu za pomocą pompy podciśnieniowej lub pompy wysokiej próżni (wymagana jest próżnia około 1 do 2 × 10-3 Pa, uzyskiwana po 2 godzinach pompowania). Ciśnienie reguluje się stosownym manometrem jonizacyjnym.

1.6.4.2. Procedura pomiarowa Naczynie napełnia się badaną substancją i zamyka pokrywę. Osłona i skrzynka chłodnicza są przesunięte w poprzek wyparki. Przyrząd zamyka się i włącza pompy próżniowe. Ciśnienie końcowe przed rozpoczęciem pomiarów powinno być około 10-4 Pa. Chłodzenie skrzynki chłodniczej rozpoczyna się przy 10-2 Pa. Po uzyskaniu żądanej próżni rozpoczyna się serie kalibracji od najniższej wymaganej temperatury. Ustawia się odpowiedni otwór w pokrywie, strumień par przechodzi przez osłonę bezpośrednio powyżej otworu i uderza w ochłodzoną szalę wagi. Szala wagi musi być wystarczająco duża dla zapewnienia, że całkowity strumień przechodzący przez osłonę uderzy w nią. Pęd strumienia par działa jako siła na szalę wagi i cząsteczki kondensują się na jej ochłodzonej powierzchni. Pęd i równoczesna kondensacja wytwarzają sygnał na rejestratorze. Ocena sygnałów dostarcza dwóch rodzajów informacji: p = G 2πRT×103M gdzie: G szybkość parowania (kg s-l m-2), M masa molowa (g mol-l), T temperatura (K), R uniwersalna molowa stała gazowa (Jmol-l K-l), p prężność pary (Pa). Po uzyskaniu niezbędnej próżni rozpoczyna się wykonywanie serii pomiarów przy najniższej pożądanej temperaturze pomiarowej. Dla dalszych pomiarów zwiększa się temperaturę małymi przedziałami do momentu uzyskania maksymalnej pożądanej wartości temperatury. Próbka następnie jest ponownie schładzana i można dokonać zapisu drugiej krzywej ciśnienia pary. Jeżeli w drugiej serii nie uda się potwierdzić wyników pierwszej, możliwe jest, że substancja może ulegać rozkładowi w zakresie temperatur, w których wykonuje się pomiar.

1.6.4.2.

1. W przyrządzie opisanym tutaj prężność pary jest oznaczana bezpośrednio z pędu na szali wagi (nie jest konieczna do tego znajomość masy cząsteczkowej (2)). Należy wziąć pod uwagę czynniki geometryczne, takie jak otwór wyparki i kąt strumienia cząsteczek przy ocenie odczytów.

2. W tym samym czasie można zmierzyć masę kondensatu i obliczyć z niej szybkość parowania. Prężność pary można także obliczyć z szybkości parowania i masę cząsteczkową, stosując równanie Hertza (2).

1.6.5. Metoda efuzji – przez utratę masy

1.6.5.

1.6.5.1. Przyrząd Przyrząd efuzyjny składa się z następujących podstawowych części: Elektrycznie podgrzewany aluminiowy zbiornik próżniowy z 4 komórkami efuzyjnymi ze stali nierdzewnej przedstawiono przykładowo na rysunku 5. Folia ze stali nierdzewnej grubości około 0,3 mm posiada otwór efuzyjny o średnicy od 0,2 do 1,0 mm i jest połączona z komórką efuzyjną gwintowaną pokrywą.

zbiornik, który może być termostatowany i odpompowywany, w którym umieszczone są komórki efuzyjne,

pompa wysokiej próżni (np. pompa dyfuzyjna lub turbomolekularna) z próżniomierzem,

pułapka wykorzystująca skroplony azot lub suchy lód.

1.6.5.2. Procedura pomiarowa Substancjami, badaną i odniesienia, napełniono każdą komórkę efuzyjną, metalowa membrana z otworem jest zabezpieczona gwintowaną pokrywą, a każda komórka jest ważona z dokładnością 0,1 mg. Komórkę umieszcza się w termostatowanym przyrządzie, który jest następnie odpompowywany do jednej dziesiątej oczekiwanego ciśnienia. W określonych odstępach czasowych z zakresu od 5 do 30 godzin wpuszcza się do przyrządu powietrze i określa utratę masy komórki efuzyjnej przez ponowne ważenie. W celu zapewnienia, że wyniki nie są zakłócone przez zanieczyszczenia lotne, komórka jest ponownie ważona w określonych odstępach czasowych, celem sprawdzenia, czy szybkość parowania jest stała w co najmniej dwóch takich odstępach czasowych. Prężność pary p w komórce efuzyjnej jest dana przez: p = mKAt2πRTM gdzie : p prężność pary (Pa), m masa substancji opuszczającej komórkę w ciągu czasu t (kg), t czas (s), A powierzchnia otworu (m2), K współczynnik korekcji, R uniwersalna stała gazowa (Jmol-l K-1), T temperatura (K), M masa cząsteczkowa (kg mol-1). Współczynnik korekcji K zależy od stosunku długości do promienia otworu cylindrycznego: stosunek 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Powyższe równanie może być zapisane: p = E mtTM gdzie: E = 1KA2πRjest stałą komórki efuzyjnej. Niniejsza stała komórki efuzyjnej może być oznaczona przy pomocy substancji odniesienia (2,9), używając następującego równania: E = p(r)tmM(r)T gdzie: p(r) prężność pary substancji odniesienia (Pa), M(r) masa cząsteczkowa substancji odniesienia (kg mol-l).

1.6.6. Metoda nasycenia gazem

1.6.6.

1.6.6.1. Przyrząd Typowy przyrząd stosowany do wykonywania tego badania składa się z szeregu elementów podanych na rysunku 6a i opisanych poniżej (1).

1.6.6.1. Gaz obojętny:

Gaz nośnikowy nie może wchodzić w reakcje chemiczne z substancją badaną. Na ogół do tego celu wystarcza azot, jednak czasem mogą być wymagane inne gazy (10). Zastosowany gaz musi być suchy (zob. rysunek 6a, pozycja 4: czujnik wilgotności względnej).

Kontrola przepływu:

Wymagany jest odpowiedni system kontroli przepływu gazu, aby zapewnić stały i odpowiednio dobrany przepływ przez kolumnę saturatora.

Pułapki do zbierania pary:

Zależą one od charakterystyki określonej próbki oraz wybranej metody analizy. Pary powinny być zbierane w sposób ilościowy, w postaci umożliwiającej późniejszą analizę. Do niektórych badanych substancji nadają się pułapki zawierające ciecze, takie jak heksan lub glikol etylenowy. W przypadku innych mogą być stosowane odpowiednie absorbenty w stałym stanie skupienia. Jako alternatywę dla pułapkowania par i dalszych analiz można zastosować techniki analityczne transportowe, takie jak chromatografia, do oznaczania ilościowego ilości materiału przeniesionego przez znaną ilość gazu nośnikowego. Następnie mierzona jest utrata masy badanej próbki.

Wymiennik ciepła:

W celu wykonywania pomiarów w różnych temperaturach może być konieczne włączenie do zestawu wymiennika ciepła.

Kolumna saturatora:

Badana substancja jest osadzana z roztworu na odpowiedni obojętny nośnik. Powleczonym nośnikiem jest wypełniana kolumna saturatora, której wymiary i szybkość przepływu powinny być takie, aby zapewnić pełne nasycenie gazu nośnikowego. Kolumna saturatora musi być termostatowana. Przy pomiarach powyżej temperatury pokojowej obszar między kolumną saturatora i pułapkami musi być podgrzewany, aby zapobiec kondensacji badanej substancji. W celu zmniejszenia masy przenoszonej wskutek dyfuzji, należy umieścić kapilarę za kolumną saturatora (rysunek 6b).

1.6.6.2. Procedura pomiarowa

1.6.6.2. Przygotowanie kolumny saturatora:

Do odpowiedniej ilości nośnika dodaje się roztwór substancji badanej w wysoce lotnym rozpuszczalniku. Należy dodać wystarczającą ilość substancji badanej do utrzymania nasycenia przez cały czas trwania badania. Rozpuszczalnik ulega całkowitemu odparowaniu w powietrzu lub w obrotowym przyrządzie wyparnym, a starannie zmieszany materiał jest dodawany do kolumny saturatora. Po termostatycznym ustaleniu temperatury próbki przez przyrząd przepuszcza się suchy azot.

Pomiar:

Pułapki lub impulsowy wskaźnik są przyłączone do linii wycieku kolumny i zapisywanego czasu. Sprawdza się szybkość przepływu na początku i w regularnych odstępach czasu w trakcie eksperymentu, przy użyciu licznika pęcherzyków (lub w sposób ciągły przy użyciu przepływomierza masowego). Należy wykonywać pomiary ciśnienia u wylotu do saturatora. Można to wykonać albo: Czas wymagany do zebrania ilości substancji badanej niezbędnej dla różnych metod analitycznych zostaje ustalony we wstępnych seriach badań lub szacunkowo. Alternatywą dla zbierania substancji do dalszej analizy jest ilościowa technika analityczna impulsowa (np. chromatografia). Przed obliczeniem prężności pary w określonej temperaturze należy przeprowadzić wstępne serie badań w celu ustalenia maksymalnego przepływu, który doprowadzi do pełnego nasycenia gazu nośnikowego parami substancji. Jest to gwarantowane, jeżeli gaz nośnikowy przepuści się przez saturator wystarczająco powoli, tak aby obniżenie szybkości nie powodowało już zwiększenia obliczonej prężności pary. Określona metoda analityczna zostaje ustalona w zależności od charakteru badanej substancji (np. chromatografia gazowa lub grawimetria). Oznacza się ilość substancji transportowaną przez znaną objętość gazu nośnikowego.

a)

przez włączenie miernika ciśnienia pomiędzy saturator i pułapki (może być to niezadowalające, ponieważ powoduje to wzrost martwej przestrzeni i powierzchni adsorbującej); lub

b)

przez ustalenie spadków ciśnienia w określonym układzie pułapek jako funkcji przepływu w oddzielnym eksperymencie (metoda ta może nie sprawdzać się zbyt dobrze w przypadku pułapek płynnych).

1.6.6.3. Obliczenie prężności pary Prężność pary oblicza się na podstawie gęstości pary, W/V, przy użyciu następującego wzoru: p = WV × RTM gdzie: P prężność pary (Pa), W masa odparowanej substancji badanej (g), V objętość nasyconego gazu (m3), R uniwersalna molowa stała gazowa (Jmol-l K-1), T temperatura (K), M masa molowa badanej substancji (g mol-l). Zmierzone objętości należy skorygować względem różnic ciśnienia i temperatury między przepływomierzem i termostatowanym saturatorem. Jeżeli przepływomierz jest zlokalizowany w kierunku z prądem od pułapki pary, mogą być niezbędne poprawki w celu uwzględnienia wszelkich odparowanych składników pułapki (1).

1.6.7. Metoda wirującego rotora (8, 11, 13)

1.6.7.

1.6.7.1. Przyrząd Technika wirującego rotora jest wykonywana poprzez użycie miernika lepkości z wirującym rotorem, jak pokazano na rysunku 8. Schematyczny szkic doświadczalnego ustawienia pokazano na rysunku 7. Przyrząd pomiarowy typowo składa się z głowicy pomiarowej wirującego rotora, umieszczonej w termostatowanej obudowie (regulowanej z dokładnością w zakresie 0,1 oC), pojemnika próbki umieszczonego w termostatowanej obudowie (regulacja z dokładnością w zakresie 0,01 oC) oraz wszystkich innych części do ustawienia, które utrzymywane są w wyższej temperaturze, by zapobiec kondensacji. Pompa wysokiej próżni jest włączona do systemu za pomocą zaworów wysokiej próżni. Głowica pomiarowa wirującego rotora składa się ze stalowej kuli (o średnicy od 4 do 5 mm) w rurze. Kula jest zawieszona i stabilizowana w polu magnetycznym, głównie za pomocą kombinacji stałych pól magnetycznych i cewek sterujących. Kula jest wprowadzana w wirowanie polami obrotowymi wytwarzanymi przez cewki. Cewki czujnikowe, mierzące zawsze obecne poprzeczne niskie namagnesowanie kuli, pozwalają na mierzenie szybkości wirowania.

1.6.7.2. Procedura pomiarowa Gdy kula osiąga daną szybkość obrotową v(o) (zwykle około 400 obrotów na sekundę), dalsze pobudzanie jest wstrzymywane i zachodzi zmniejszanie szybkości z powodu tarcia gazu. Spadek szybkości obrotowej jest mierzony w funkcji czasu. Ponieważ tarcie spowodowane zawieszeniem magnetycznym jest mało istotne w porównaniu z tarciem gazu, ciśnienie gazu p jest dane przez: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) gdzie: c— średnia szybkość cząsteczek gazu, r promień kuli, ρ gęstość kuli, σ współczynnik przeniesienia stycznego pędu (ε = 1 dla idealnie sferycznej powierzchni kuli), t czas, v(t) szybkość obrotowa po czasie t, v(o) początkowa szybkość obrotowa, zatem równanie można zapisać także: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 gdzie tn, tn-1 są czasami wymaganymi dla danej liczby N obrotów. Te przedziały czasowe tn i tn-1 następują jeden po drugim oraz tn > tn-1 Średnia szybkość cząsteczki gazu c— jest dana przez: c— = 8 RTπ M12 gdzie: T temperatura, R uniwersalna molowa stała gazowa, M masa molowa.

2. DANE Ciśnienie pary obliczone zgodnie z dowolną z poprzednio opisanych metod należy określić dla co najmniej dwóch temperatur. Najkorzystniejsze jest wykonanie trzech lub większej liczby pomiarów w amplitudzie od 0 do 50 oC w celu sprawdzenia liniowości krzywej zmian prężności pary.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje: Jeżeli obserwowane jest przejście (zmiana stanu skupienia, rozkład), należy odnotować następujące informacje: Należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji wyników, w szczególności w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu skupienia substancji.

zastosowana metoda,

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia) i wstępny etap oczyszczenia, jeśli wykonano,

co najmniej dwie wartości prężność pary i temperatury, najlepiej z zakresu od 0 do 50 oC,

wszystkie dane pierwotne,

krzywa zależności log p od 1/T,

oszacowanie prężności pary w 20 lub 25 oC.

charakter zmiany,

temperatura, w której dochodzi do zmiany pod ciśnieniem atmosferycznym,

prężność pary w temperaturze o 10 i 20 oC niższej od temperatury przejścia oraz w temperaturze wyższej o 10 i 20 oC od tej temperatury (chyba że przejście następuje ze stanu stałego do gazowego).

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)

LITERATURA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593. NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa – Static method. NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure- temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol. (A), 1987, vol. 5 (4), 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173. B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435. G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148. J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol. (A), 1985, vol. 3 (3), 1715.

A.5. NAPIĘCIE POWIERZCHNIOWE

A.5.

1. METODA Większość opisanych metod oparto na wytycznych OECD dotyczących badań (1). Podstawowe zasady podano w pozycji bibliograficznej (2).

1.

1.1. WPROWADZENIE Opisywane metody są stosowane do pomiarów napięcia powierzchniowego roztworów wodnych. Przed przeprowadzeniem tych badań dobrze jest mieć wstępne informacje na temat rozpuszczalności w wodzie, budowy, właściwości hydrolitycznych i stężenia krytycznego dla tworzenia się micelli substancji. Poniższe metody można stosować w odniesieniu do większości substancji chemicznych, bez jakichkolwiek ograniczeń związanych z ich stopniem czystości. Pomiar napięcia powierzchniowego metodą tensjometru pierścieniowego jest zastrzeżony wyłącznie dla roztworów wodnych o lepkości dynamicznej mniejszej niż około 200 mPa s.

1.2. DEFINICJE IJEDNOSTKI Jako napięcie powierzchniowe określa się entalpię wolnej powierzchni na jednostkę pola powierzchni. Napięcie powierzchniowe jest podawane jako: N/rn (układ SI) lub mN/m (układ SI) 1 N/m = 103 dyn/cm 1 mN/m = 1 dyna/cm w nieważnym systemie CGS

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Nie ma konieczności stosowania substancji odniesienia za każdym razem, gdy przeprowadzane są badania nowej substancji. Powinny one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajności metody i pozwolić na porównanie wyników z innymi metodami. Substancje odniesienia, które obejmują szeroki zakres napięć powierzchniowych, podano w pozycjach bibliograficznych (1) i (3).

1.4. ZASADA METOD Metody te opierają się na pomiarach maksymalnej siły, jaką trzeba wywierać pionowo na mieszadło lub pierścień w kontakcie z powierzchnią badanej cieczy umieszczonej naczyniu miarowym, aby oddzielić ją od tej powierzchni, bądź też na płytkę, której krawędź wchodzi w kontakt z powierzchnią, aby pociągnąć do góry utworzoną błonkę. Substancje o rozpuszczalności w wodzie przynajmniej w stężeniu 1 mg/l badane są w roztworach wodnych w pojedynczych stężeniach.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Metody te zapewniają większą precyzję niż wymagana na ogół do ocen przy przeglądach środowiskowych.

1.6. OPIS METOD Roztwór substancji przygotowuje się w wodzie destylowanej. Stężenie tego roztworu powinno wynosić 90 % rozpuszczalności nasycenia w wodzie, jeżeli to stężenie przekracza 1 g/l, do badania stosuje się stężenie 1 g/l. Nie podlegają badaniu substancje, których rozpuszczalność w wodzie jest mniejsza niż 1 mg/l.

1.6.

1.6.1. Metoda płytkowa Zob. ISO 304 i NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.2. Metoda zawieszki Zob. ISO 304 and NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.3. Metoda pierścieniowa Zob. ISO 304 and NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.4. Zharmonizowana metoda pierścieniowa OECD

1.6.4.

1.6.4.1. Przyrząd Do tego pomiaru można wykorzystać dostępne w handlu tensjometry. Składają się one z następujących elementów:

ruchomy stół próbki,

system pomiaru siły,

ciało pomiarowe (pierścień),

naczynie pomiarowe.

1.6.4.1.

1.6.4.1.1. Ruchomy stół próbki Ruchomy stół z próbką jest wykorzystywany jako wspornik dla naczynia pomiarowego z kontrolowaną temperaturą, w którym znajduje się badana ciecz. Razem z układem do pomiaru siły stół ten jest montowany na stojaku.

1.6.4.1.2. System pomiaru siły Układ do pomiaru siły (zob. rysunek) mieści się ponad stołem z próbką. Błąd pomiaru siły nie może przekraczać ± 10-6 N, co odpowiada granicy błędu wynoszącej ±0,1 mg w przypadku pomiaru masy. W większości przypadków skalę pomiarową dostępnych na rynku tensjometrów kalibruje się w mN/m, tak aby napięcie powierzchniowe można było odczytywać bezpośrednio w mN/m, z dokładnością do 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3. Ciało pomiarowe (pierścień) Pierścień na ogół jest wykonany z drutu platynowo-irydowego o grubości około 0,4 mm i średnim obwodzie 60 mm. Pierścień drutu zwiesza się horyzontalnie z metalowego sworznia i drucianego wspornika, tak aby stworzyć połączenie z układem do pomiaru siły (zob. rysunek).

1.6.4.1.3. Rysunek Ciało pomiarowe

(Wszystkie wymiary w milimetrach) sworzeń wspornik pierścień

1.6.4.1.4. Naczynie pomiarowe Naczynie pomiarowe z badanym roztworem musi być naczyniem szklanym z kontrolowaną temperaturą. Musi być tak zaprojektowane, aby w trakcie pomiaru temperatura roztworu badanego i fazy gazowej nad jego powierzchnią pozostały stałe, a próbka nie mogła wyparować. Dopuszczalne są cylindryczne, szklane naczynia o średnicy wewnętrznej nie mniejszej niż 45 mm.

1.6.4.2. Przygotowanie przyrządu

1.6.4.2.

1.6.4.2.1. Czyszczenie Szklane naczynia muszą być starannie oczyszczone. W razie potrzeby należy je przepłukać gorącym kwasem chromowo-siarkowym, a następnie kwasem fosforowym o konsystencji syropu (od 83 do 98 % wagowo H3PO4), potem starannie przepłukać pod wodą z kranu, a wreszcie umyć dwukrotnie destylowaną wodą do uzyskania reakcji obojętnej, a na końcu wysuszyć lub przepłukać częścią płynnej próbki mierzonej. Pierścień należy najpierw starannie opłukać w wodzie w celu usunięcia wszelkich substancji rozpuszczalnych w tej cieczy, następnie na krótki czas zanurzyć w kwasie chromowo-siarkowym, później umyć dwukrotnie destylowaną wodą do uzyskania reakcji obojętnej, a na końcu krótko podgrzać nad płomieniem metanolowym. Uwaga: Zanieczyszczenia substancjami, które nie ulegają rozpuszczeniu ani zniszczeniu wskutek oddziaływania kwasu chromo-siarkowego lub fosforowego, takimi jak silikony, należy usunąć przy pomocy odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego.

1.6.4.2.2. Kalibracja przyrządu Weryfikacja przyrządu polega na sprawdzeniu punktu zerowego i takim jego wyregulowaniu, aby wskazania instrumentu pozwalały na niezawodne oznaczenia w mN/m.

1.6.4.2.2. Montaż:

Przyrząd musi być wypoziomowany, na przykład przy pomocy poziomnicy alkoholowej, u podstawy tensjometru, przez wyregulowanie śrub poziomujących u podstawy.

Ustawienie punktu zero:

Po zamontowaniu pierścienia na przyrządzie, przed jego zanurzeniem w cieczy, wskazania tensjometru należy wyregulować do zera i sprawdzić, czy pierścień jest ustawiony równolegle do powierzchni cieczy. W tym celu powierzchnię cieczy można wykorzystać jako lustro.

Kalibracje:

Kalibrację przy pomocy rzeczywistego badania można dokonać przy pomocy jednej z dwóch procedur:

a)

używając masę: procedura wykorzystująca koniki wagi o znanej masie od 0,1 do 1,0 g umieszczane na pierścieniu. Współczynnik kalibracyjny Φa, przez który należy pomnożyć wszystkie wskazania instrumentu, należy ustalić według następującego wzoru (1): Φa=σrσa gdzie: σr=mg2b (mN/m) m masa konika wagi (g), g przyspieszenie grawitacyjne (981 cm/sek-2 na wysokości poziomu morza), b średni obwód pierścienia (cm), σa odczyt tensjometru po umieszczeniu konika na pierścieniu (mN/m);

b)

używając wodę: procedura stosująca czystą wodę, której napięcie powierzchniowe przy na przykład 23 oC jest równe 72,3 mN/m. Niniejsza procedura jest wykonywana szybciej niż kalibracja wagowa, lecz występuje przy niej zawsze niebezpieczeństwo, że napięcie powierzchniowe wody jest zafałszowane śladowymi zanieczyszczeniami związków powierzchniowo czynnych. Współczynnik kalibracyjny Φb, przez który należy pomnożyć wszystkie wskazania instrumentu, należy ustalić według następującego wzoru (2): Φb=σoσg gdzie: σo cytowana w literaturze wartość napięcia powierzchniowego wody (mN/m), σg zmierzona wartość napięcia powierzchniowego wody (mN/m), obie w tej samej temperaturze.

1.6.4.3. Przygotowanie próbek Należy sporządzić roztwory wodne badanych substancji, używając odpowiednich stężeń w wodzie. Nie mogą one zawierać substancji w stanie nierozpuszczonym. Roztwór należy utrzymywać w stałej temperaturze (±0,5 oC). Ponieważ napięcie powierzchniowe roztworu w naczyniu pomiarowym zmienia się w czasie, należy wykonać kilka pomiarów w różnych momentach i nakreślić krzywą pokazującą napięcie powierzchniowe w funkcji czasu. Brak jakichkolwiek dalszych zmian oznacza, że osiągnięto stan równowagi. Zanieczyszczenie pyłami i gazami innych substancji przeszkadza w pomiarze. Dlatego badanie musi być prowadzone pod przykrywą ochronną.

1.6.5. Warunki badania Pomiar należy przeprowadzić w temperaturze około 20 oC, która musi być kontrolowana w ten sposób, aby utrzymywała się w zakresie ±0,5 oC.

1.6.6. Wykonanie badania Roztwory do pomiaru należy wprowadzić do starannie wyczyszczonego naczynia pomiarowego, dokładając wszelkich starań, aby uniknąć wytwarzania piany, a następnie naczynie umieszcza się na stoliku przyrządu do badań. Blat stolika z naczyniem pomiarowym należy unieść do momentu zanurzenia pierścienia poniżej powierzchni roztworu badanego. Następnie blat stolika opuszcza się stopniowo i równo (z szybkością około 0,5 cm/min), tak aby oddzielić pierścień od powierzchni, do momentu osiągnięcia maksymalnej siły. Warstwa cieczy dołączona do pierścienia nie może się od niego oddzielić. Po wykonaniu pomiarów pierścień należy ponownie zanurzyć poniżej powierzchni i powtórzyć pomiary, aż zostanie osiągnięta stała wartość napięcia powierzchniowego. W przypadku każdego oznaczenia należy zapisać czas odprzeniesienia roztworu do naczynia pomiarowego. Odczyty należy wykonywać przy maksymalnej sile potrzebnej do oderwania pierścienia od powierzchni cieczy.

2. Tabela Korekcja zmierzonego napięcia powierzchniowego Tylko dla roztworów wodnych, ρ ≅ 1 g/cm3

DANE W celu obliczenia napięcia powierzchniowego wartość odczytaną w mN/m na przyrządzie należy na początku pomnożyć przez współczynnik kalibracyjny Φa lub Φb (zależnie od zastosowanej procedury kalibracyjnej). Da to wartość jedynie przybliżoną, dlatego wymaga korekcji. Harkins i Jordan (4) empirycznie ustalili współczynniki korekcji dla wartości napięcia powierzchniowego zmierzonych metodą pierścienia. Zależą one od wymiarów pierścienia, gęstości cieczy i napięcia powierzchniowego tej ostatniej. Ponieważ ustalanie współczynnika korekcji dla każdego kolejnego pomiaru na podstawie tabel Harkinsa i Jordana jest pracochłonne, do obliczenia napięcia powierzchniowego roztworów wodnych można wykorzystać procedurę uproszczoną wykonywania odczytów skorygowanych wartości napięcia powierzchniowego bezpośrednio z tabeli. (W przypadku gdy odczytane wartości znajdują się między tymi, które podano w tabeli, należy zastosować interpolację). r = 9,55 mm (średni promień pierścienia) r = 0,185 mm (promień drutu pierścienia) Wartość doświadczalna (mN/m) Wartość skorygowana (mN/m) Kalibracja wagowa (zob. 1.6.4.2.2 lit. a)) Kalibracja wodą (zob. 1.6.4.2.2 lit.b)) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 | 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Niniejsza tabela została zestawiona na podstawie poprawki Harkinsa-Jordana. Jest ona zbliżona do tej w normie (DIN 53914) dla wody i roztworów wodnych (gęstość ρ = 1 g/cm3) i dla dostępnych w handlu pierścieni o wymiarach R = 9,55 mm (średni promień pierścienia) i r = 0,185 mm (promień drutu pierścienia). W tabeli podano skorygowane wartości pomiarów napięcia powierzchniowego wykonanych po kalibracji odważnikowej lub przy pomocy wody. Alternatywnie, bez poprzednio opisanej kalibracji, napięcie powierzchniowe można obliczyć na podstawie następującego wzoru: σ=f × F4πR gdzie: F siła zmierzona dynamometrem przy zerwaniu błonki, R promień pierścienia, f współczynnik korekcji (1).

3. SPORZĄDZENIE SPRAWOZDANIA

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badania zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

zastosowana metoda,

rodzaj zastosowanej wody lub zastosowanego roztworu,

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia),

wyniki pomiaru: napięcie powierzchniowe (odczyt), z podaniem zarówno poszczególnych odczytów, jak i ich średniej arytmetycznej oraz skorygowanej średniej (z wzięciem pod uwagę współczynnika przyrządu i tabeli korekcji),

stężenie roztworu,

temperatura badania,

wiek zastosowanego roztworu; w szczególności czas od przygotowania do zmierzenia właściwości roztworu,

opis zależności napięcia powierzchniowego od czasu po przeniesieniu roztworu do naczynia pomiarowego,

należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji wyników, w szczególności w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu skupienia substancji.

3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW Zważywszy że destylowana woda posiada napięcie powierzchniowe 72,75 mN/m w 20 oC, substancje wykazujące napięcie powierzchniowe niższe niż 60 mN/m zgodnie z warunkami niniejszej metody należy uznać za materiały będące powierzchniowo czynnymi.

4.(1)(2)(3)(4)

LITERATURA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, part I, chapter XIV. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.

A.6. ROZPUSZCZALNOŚĆ W WODZIE

A.6.

1. METODA Opisane metody są oparte na wytycznych OECD dotyczących badań (1).

1.

1.1. WPROWADZENIE Do przeprowadzenia tego badania przydatne jest posiadanie wstępnych informacji na temat wzoru strukturalnego, ciśnienia pary, stałej dysocjacji i hydrolizy (jako funkcji pH) substancji. Nie ma pojedynczej metody, która objęłaby cały zakres rozpuszczalności w wodzie. Dwie metody badań opisane poniżej obejmują cały zakres rozpuszczalności, lecz nie stosuje sie ich do substancji lotnych: Na rozpuszczalność w wodzie badanej substancji w sposób istotny może wpłynąć obecność zanieczyszczeń.

jedna z nich dotyczy zasadniczo czystych substancji o niskiej rozpuszczalności (< 10-2 g/l) które są stabilne w wodzie; określa się ją jako metodę wymywania kolumnowego,

druga dotyczy zasadniczo czystych substancji o wyższej rozpuszczalności (> 10-2 g/l), które są stabilne w wodzie; określa się ją jako metodę kolby.

1.2. DEFINICJA I JEDNOSTKI Rozpuszczalność w wodzie substancji podaje się jako stężenie substancji w wodzie przy nasyceniu masowym w określonej temperaturze. Wartość tę określa się w jednostkach masy na objętość roztworu. Jednostką w układzie SI jest kg/m3 (można także stosować gramy na litr).

1.4. ZASADA METODYBADANIA W prostym badaniu wstępnym należy ustalić przybliżoną ilość próbki i czas niezbędny do uzyskania stężenia nasycenia masowego.

1.4.

1.4.1. Metoda wymywania kolumnowego Niniejsza metoda jest oparta na wymywaniu wodą substancji badanej z mikrokolumny wypełnionej obojętnym materiałem nośnika, takim jak pręty szklane lub piasek, pokrytych nadmiarem badanej substancji. Rozpuszczalność w wodzie ustala się, gdy stężenie masowe eluatu jest stałe. Przejawia się to wystąpieniem plateau stężenia w funkcji czasu.

1.4.2. Metoda kolby W ramach zastosowania tej metody substancja (ciała stałe muszą zostać sproszkowane) jest rozpuszczana w wodzie w temperaturze nieco wyższej od temperatury badania. Po uzyskaniu nasycenia mieszaninę schładza się i utrzymuje w temperaturze badania, mieszając ją, jeżeli jest to potrzebne do uzyskania stanu równowagi. Alternatywnie pomiar może być wykonywany bezpośrednio w badanej temperaturze, jeżeli jest zapewniony przez właściwe pobieranie próbek tak by uzyskać równowagę nasycenia. Następnie oznacza się stężenie masowe substancji w roztworze wodnym, który nie może zawierać żadnych nierozpuszczonych cząstek, przy pomocy odpowiedniej metody analitycznej.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI

1.5.

1.5.1. Powtarzalność Dla metody wymywania kolumny < 30 % jest osiągalne; dla metody kolby < 15 % powinno być obserwowane.

1.5.2. Czułość Zależy ona od metody analizy, lecz oznaczenie stężenia masowego do 10-6 gram na litr może być uzyskane.

1.6. OPIS METODY

1.6.

1.6.1. Warunki badania Najkorzystniej jest przeprowadzić badanie w temperaturze 20 ±0,5 oC. Jeżeli podejrzewa się istnienie zależności rozpuszczalności od temperatury (> 3 % na oC), należy także zastosować dwie inne wartości temperatury, o co najmniej 10 oC wyższe i niższe od początkowo wybranej temperatury. W takim przypadku należy kontrolować temperaturę w granicach ±0,1 oC. Wybrana temperatura powinna być utrzymywana na stałym poziomie we wszystkich istotnych częściach sprzętu.

1.6.2. Badanie wstępne Do około 0,1 g próbki (substancje stałe należy sproszkować) w zamkniętym korkiem szklanym cylindrze miarowym o pojemności 10 ml dodaje się wzrastające ilości wody destylowanej w temperaturze pokojowej, wykonując kolejne etapy pokazane w poniższej tabeli: 0,1 g rozpuszczone w x ml wody 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Przybliżona rozpuszczalność (gramy na litr) > 1000 1000 do 200 200 do 100 100 do 50 50 do 10 10 do 1 < 1 Po każdym dodaniu wskazanej ilości wody mieszaninę wstrząsa się energicznie przez 10 minut i kontroluje wzrokowo pod kątem jakichkolwiek nierozpuszczalnych części próbki. Jeżeli po dodaniu 10 ml wody próbka lub jej część pozostają nierozpuszczone, doświadczenie należy powtórzyć w 100 ml cylindrze miarowym z większą objętością wody. Przy niskiej rozpuszczalności czas wymagany do rozpuszczenia substancji musi być znacząco dłuższy (co najmniej 24 godziny). Przybliżoną rozpuszczalność podano w tabeli pod taką objętością dodanej wody, w jakiej dochodzi do pełnego rozpuszczenia próbki. Jeżeli substancja jest wciąż nierozpuszczalna, należy zastosować dłuższy czas niż 24 godziny (maksymalnie 96 godzin) lub należy podjąć dalsze rozcieńczanie celem ustalenia, czy może być użyta metoda ustalania rozpuszczalności przez wymywanie kolumnowe czy metoda kolby.

1.6.3. Metoda wymywania kolumnowego

1.6.3.

1.6.3.1. Materiał nośnikowy, rozpuszczalnik i eluent Materiał nośnikowy stosowany w metodzie wymywania kolumnowego powinien być obojętny. Materiałami, które można zastosować, są szklane pręty i krzemionka. Należy zastosować odpowiedni, lotny rozpuszczalnik o jakości odczynnika analitycznego do naniesienia substancji badanej na materiał nośnikowy. Jako eluent należy użyć podwójnie destylowaną w szklanym lub kwarcowym przyrządzie wodę. Uwaga: Nie można stosować wody pochodzącej bezpośrednio z wymieniacza jonowego.

1.6.3.2. Załadowywanie materiału nośnikowego Odważa się około 600 mg materiału nośnikowego i przenosi do kolby okrągłodennej o pojemności 50 ml. Odpowiednią, odważoną ilość substancji badanej rozpuszcza się w wybranym rozpuszczalniku. Właściwą ilość niniejszego roztworu dodaje się do materiału nośnikowego. Rozpuszczalnik musi zostać całkowicie odparowany, np. w obrotowym przyrządzie wyparnym; w innym razie nie zostanie uzyskane nasycenie wodą nośnika ze względu na zjawiska podziału na powierzchni materiału nośnikowego. Załadowanie materiału nośnikowego może stwarzać problemy (błędne wyniki), jeżeli substancja badana ulega osadzeniu jako olej lub w innej fazie krystalicznej. Problem ten należy przebadać doświadczalnie i wykonać szczegółowe sprawozdanie. Załadowany materiał nośnikowy pozostawia się do nasączenia wodą na około dwie godziny w około 5 ml wody, a następnie dodawany jest on do mikrokolumny. Alternatywnie do mikrokolumny można wsypać suchy, załadowany materiał nośnikowy, a następnie wypełnić mikrokolumnę wodą i całość pozostawić do uzyskania stanu równowagi na około dwie godziny.

1.6.3.2. Procedura badania

Wymywanie substancji z materiału nośnikowego można uzyskać jedną z dwóch metod:

przy pomocy pompy recyrkulacyjnej (zob. rysunek 1),

przy pomocy naczynia poziomującego (zob. rysunek 4).

1.6.3.3. Metoda wymywania kolumnowego z pompą recyrkulacyjn

1.6.3.3. Przyrząd

Schematyczne rozmieszczenie typowego systemu przedstawiono na rysunku 1. Odpowiednia mikrokolumna jest pokazana na rysunku 2, dopuszczalny jest również każdy rozmiar zapewniający spełnienie kryteriów powtarzalności i czułości. Kolumna musi zapewnić przestrzeń słupa cieczy równą co najmniej pięciu objętościom wypełnienia wodą i powinna być zdolna do utrzymania minimum pięciu próbek. Alternatywnie jej wymiar może być zmniejszony, jeżeli użyty zostanie gotowy rozpuszczalnik zamieniający początkowe pięć objętości wypełnienia usuniętych wraz z zanieczyszczeniami. Kolumnę należy podłączyć do pompy recyrkulacyjnej zdolnej do kontrolowanego wydatku około 25 ml/godz. Pompę podłącza się przy pomocy połączeń z politetrafluoroetylenu (PTFE) i/lub szklanych. Kolumna i pompa po złożeniu powinny mieć wyposażenie umożliwiające pobieranie próbek odcieku i powinny wyrównywać przestrzeń czołową pod ciśnieniem atmosferycznym. Materiał wypełniający kolumnę musi być podtrzymany małą (5 mm) zatyczką z waty szklanej, która służy także do odfiltrowywania cząstek. Pompa recyrkulacyjna może być na przykład pompą perystaltyczną (należy uważać, aby nie doszło do zanieczyszczenia i/lub adsorpcji na materiale rury) lub membranową.

Procedura pomiarowa

Uruchamia się przepływ przez kolumnę. Zalecane jest stosowanie szybkości przepływu około 25 ml/godz. (odpowiada to 10 wypełnieniom złoża na godzinę dla opisanej tu kolumny). Objętość pierwszych pięciu wypełnień (minimum) odrzuca się w celu usunięcia zanieczyszczeń rozpuszczalnych w wodzie. Następnie uruchamia się pompę recyrkulacyjną, aż do uzyskania równowagi, którą definiuje się jako pięć kolejnych próbek, których stężenie nie różni się o więcej niż ± 30 % w sposób losowy. Próbki te powinny zostać od siebie oddzielone w odstępach czasowych odpowiadających przejściu eluentu w ilości co najmniej 10 wypełnień złoża.

1.6.3.4. Metoda wymywania kolumnowego z naczyniem poziomującym

1.6.3.4. Przyrząd (zob. rysunki 4 i 3)

Naczynie poziomujące: Podłączenie do naczynia poziomującego wykonuje się przy użyciu szlifowanego złącza szklanego podłączonego przez rurkę z PTFE. Zaleca się stosowanie szybkości przepływu około 25 ml/godz. Kolejne wymywane frakcje należy zebrać i wykonać analizę wybraną metodą.

Procedura pomiarowa

Do ustalenia rozpuszczalności w wodzie wykorzystuje się frakcje ze środkowego zakresu odcieku, gdzie stężenia są stałe (± 30 %) w co najmniej pięciu kolejnych frakcjach. W obu przypadkach (stosując pompę recyrkulacyjną lub naczynie poziomujące), drugą serię wykonuje się przy połowie szybkości przepływu pierwszej. Jeżeli wyniki obu serii są zgodne, badanie jest zadowalające; jeżeli istnieje większa pozorna rozpuszczalność przy niższej prędkości przepływu, wtedy znowu należy stosować zmniejszenie tej prędkości o połowę, aż dwie kolejne serie dadzą taką samą rozpuszczalność. W obu przypadkach (przy użyciu pompy recyrkulacyjnej lub naczynia poziomującego) należy skontrolować frakcje pod kątem obecności substancji koloidalnej przez sprawdzenie, czy nie występuje efekt Tyndalla (rozproszenie światła). Obecność takich cząstek czyni wyniki nieważnymi i badanie należy powtórzyć, poprawiając działanie filtrujące kolumny. Należy odnotowywać pH każdej próbki. Drugą serię oznaczeń należy przeprowadzić w tej samej temperaturze.

1.6.4. Metoda kolby

1.6.4.

1.6.4.1. Przyrząd Do zastosowania metody kolby potrzebne są następujące materiały:

zwykłe, laboratoryjne wyroby szklane i instrumenty,

urządzenie służące do mieszania roztworów w kontrolowanej, stałej temperaturze,

wirówka (najlepiej termostatowana), o ile jest potrzebna w przypadku emulsji, oraz

urządzenia do oznaczeń analitycznych.

1.6.4.2. Procedura pomiarowa Na podstawie badania wstępnego szacuje się ilość materiału niezbędną do nasycenia pożądanej objętości wody. Wymagana ilość wody będzie zależeć od metody analitycznej i zakresu rozpuszczalności. Do każdego z trzech naczyń wyposażonych w korki szklane (np. probówek wirówkowych, kolb) odważa się po około pięciokrotności wyżej ustalonej ilości materiału. Wybraną objętość wody dodaje się do każdego naczynia, po czym naczynia należy szczelnie zakorkować. Zamknięte naczynia wytrząsa się następnie w temperaturze 30 oC. (Należy użyć wytrząsarki lub mieszarki, która może działać w stałej temperaturze, np. magnetyczne mieszanie w łaźni wodnej z temperaturą kontrolowaną termostatycznie). Po jednym dniu jedno z naczyń jest usuwane i pozostawione do ustalenia się nowej równowagi przez 24 godziny w temperaturze badania, przy czym od czasu do czasu należy je wstrząsnąć. Zawartość naczynia poddaje się następnie wirowaniu w temperaturze badania i oznacza stężenie klarownej fazy wodnej przy pomocy odpowiedniej metody analitycznej. Pozostałe dwie kolby traktuje się podobnie po początkowym ustaleniu równowagi w temperaturze 30 oC przez, odpowiednio, dwa i trzy dni. Jeżeli wyniki oznaczenia stężenia w co najmniej ostatnich dwóch naczyniach cechują się wymaganą odtwarzalnością, badanie należy uznać za zadowalające. Całe badanie należy powtórzyć, stosując dłuższe okresy ustalania równowagi, jeżeli wyniki dla naczyń 1, 2 i 3 wykazują tendencję do wzrastających wartości. Procedura pomiarowa może być również wykonana bez wstępnej inkubacji w 30 oC. W celu oceny szybkości ustalania się równowagi nasycenia pobierane są próbki do chwili, gdy czas mieszania nie wywiera już wpływu na stężenie badanego roztworu. Należy odnotowywać pH każdej próbki.

1.6.5. Analiza Dla tych oznaczeń najkorzystniejsza jest metoda analityczna specyficzna dla substancji, gdyż małe ilości rozpuszczalnych zanieczyszczeń mogą spowodować duże błędy wyników pomiarów rozpuszczalności. Przykładami takich metod są: chromatografia gazowa lub cieczowa, metody miareczkowania, metody fotometryczne, metody woltametryczne.

2. DANE

2.

2.1. METODA WYMYWANIA KOLUMNOWEGO Dla każdej serii należy obliczyć średnią wartość dla co najmniej pięciu kolejnych próbek pobranych z plateau nasycenia, podobnie jak odchylenie standardowe. Wyniki należy podać w jednostkach masy na objętość roztworu. Średnie obliczone w dwóch badaniach przy różnych przepływach są porównywane i powinny mieć powtarzalność mniejszą niż 30 %.

2.2. METODA KOLBY Należy podać poszczególne wyniki dla każdej z trzech kolb i powinny być one uznane za stałe(powtarzalność mniejsza niż 15 %), należy je uśrednić i podać w jednostkach masy na objętość roztworu. Może to wymagać przeliczenia jednostek masy na jednostki objętości, za pomocą gęstości, gdy rozpuszczalność jest bardzo duża (> 100 gramów na litr).

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

3.

3.1. METODA WYMYWANIA KOLUMNOWEGO Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

wyniki badania wstępnego,

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia),

poszczególne stężenia, prędkości przepływu i pH każdej próbki,

średnie i odchylenia standardowe dla co najmniej pięciu próbek z plateau nasycenia dla każdej serii,

średnia z dwóch kolejnych, możliwych do przyjęcia serii,

temperatura wody w czasie procesu nasycania,

zastosowana metoda analityczna,

charakter zastosowanego materiału nośnikowego,

załadowanie materiału nośnikowego,

zastosowany rozpuszczalnik,

dowody niestabilności chemicznej substancji w trakcie badania oraz zastosowana metoda,

wszystkie informacje stosowne dla interpretacji wyników, szczególnie w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu fizycznego substancji.

3.2. METODA KOLBY Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

wyniki badania wstępnego,

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia),

poszczególne oznaczenia analityczne i ich średnia, w przypadku gdy więcej niż jedna wartość była oznaczana dla każdej kolby,

pH każdej próbki,

średnia wartości dla poszczególnych kolb, które były zgodne,

temperatura badania,

zastosowana metoda analityczna,

dowody niestabilności chemicznej substancji w trakcie badania oraz zastosowana metoda,

wszystkie informacje stosowne dla interpretacji wyników, szczególnie w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu fizycznego substancji.

4.(1)(2)(3) LITERATURA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility -Column elution method. NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility -Flask method.

A.8. WSPÓŁCZYNNIK PODZIAŁU

A.8.

1. METODA Opisana metoda wstrząsania kolby jest oparta na wytycznych OECD dotyczących badań (1).

1.

1.1. WPROWADZENIE Dla wykonania niniejszego badania korzystne jest posiadanie informacji wstępnych dotyczących wzoru strukturalnego, stałej dysocjacji, rozpuszczalności w wodzie, hydrolizy, rozpuszczalności w n-oktanolu i napięcia powierzchniowego substancji. Pomiary na substancjach ulegających jonizacji powinny być wykonane tylko na ich niezjonizowanej postaci (wolny kwas lub wolna zasada) uzyskanej przez użycie właściwego buforu o pH co najmniej jedną jednostkę mniejszą (wolny kwas) lub większą (wolna zasada) od pK. Niniejsza metoda badania zawiera dwie oddzielne procedury: metoda wstrząsania kolby i chromatografii cieczowej wysokiej wydajności (HPLC). Pierwszą stosuje się gdy wartość log Pow (zob. definicje poniżej) wypada w zakresie od - 2 do 4, drugą w zakresie od 0 do 6. Przed przeprowadzeniem procedury doświadczalnej, należy wpierw wstępnie uzyskać oszacowanie współczynnika podziału. Metodę wstrząsania kolby stosuje się jedynie do zasadniczo czystych substancji rozpuszczalnych w wodzie i n-oktanolu. Nie stosuje się jej do materiałów powierzchniowo czynnych (dla takich należy podać wartość obliczoną lub oszacowaną opartą na rozpuszczalności danej substancji w n-oktanolu i w wodzie). Metody HPLC nie stosuje się dla silnych kwasów i zasad, związków kompleksowych metali, materiałów powierzchniowo czynnych lub substancji, które reagują z rozpuszczalnikiem wymywającym. Dla takich materiałów należy podać wartość obliczoną lub oszacowaną opartą na rozpuszczalności danej substancji w n-oktanolu i w wodzie. Metoda HPLC jest mniej czuła na obecność zanieczyszczeń w badanym związku niż metoda wstrząsania kolby. Pomimo tego, zanieczyszczenia w niektórych przypadkach mogą czynić interpretację wyników trudną, ponieważ wyznaczenie piku jest niepewne. Dla mieszanin dających nieczytelne pasmo, należy ustalić górną i dolną granicę log P.

1.2. DEFINICJA I JEDNOSTKI Współczynnik podziału (P) definiuje się jako stosunek stężeń równowagi (ci) substancji rozpuszczonej w układzie dwufazowym, składającym się z dwóch zasadniczo niemieszających się ze sobą rozpuszczalników. W przypadku n-oktanolu i wody: pow=cn-octanolcwater Dlatego współczynnik podziału (P) jest ilorazem dwóch stężeń, przy czym na ogół podaje się go w postaci jego logarytmu o podstawie 10 (log P).

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA

1.3. Metoda wstrząsania kolby

Nie ma konieczności stosowania substancji odniesienia za każdym razem, gdy przeprowadzane są badania nowej substancji. Powinny one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajności metody i pozwolić na porównanie wyników z innymi metodami.

Metoda HPLC

W celu skorelowania danych zmierzonych metodą HPLC danego związku z jego wartością P należy ustalić krzywą kalibracji log P w zależności od danych chromatograficznych, używając co najmniej 6 punktów odniesienia. Jest zadaniem użytkownika wybór właściwych substancji odniesienia. W każdym przypadku, gdy będzie możliwe, co najmniej jedna substancja odniesienia powinna posiadać Pow powyżej tego dla substancji badanej, a druga powinna posiadać Pow poniżej substancji badanej. Dla wartości log P mniejszej niż 4 kalibracja musi być oparta o dane uzyskane metodą wstrząsania kolby. Dla wartości log P większej od 4 kalibracja powinna być oparta na ważnych wartościach literaturowych, jeżeli są one zgodne z wartościami wyliczonymi. Celem uzyskania lepszej dokładności, zalecane jest wybór takich substancji odniesienia, które są strukturalnie zbliżone do badanej substancji. Rozszerzone wykazu wartości log Pow dla wielu grup związków chemicznych są dostępne w pozycjach bibliograficznych (2) i (3). Jeżeli dane współczynnika podziału strukturalnie zbliżonych związków nie są dostępne, należy zastosować bardziej ogólną kalibrację, ustaloną w oparciu o inne związki odniesienia. Wykaz zalecanych substancji odniesienia i ich wartości Pow podano w dodatku 2.

1.4. ZASADA METODY

1.4.

1.4.1. Metoda wstrząsania kolby W celu ustalenia współczynnika podziału należy uzyskać równowagę między wszystkimi wchodzącymi w interakcje składnikami układu, przy czym należy ustalić stężenie substancji rozpuszczonych w dwóch fazach. Studia w zakresie literatury na ten temat wskazują, że możliwe jest użycie kilku różnych technik dla rozwiązania niniejszego problemu, to jest poprzez zmieszanie dwóch faz oraz kolejno ich rozdzielenie w celu ustalenia stężenia równowagi badanej substancji.

1.4.2. Metoda HPLC HPLC jest wykonywana na kolumnach analitycznych wypełnionych handlowo dostępną fazą stałą zawierającą długo łańcuchowe węglowodory (np. C8, C18) chemicznie związane na krzemionce. Związki chemiczne wstrzyknięte do takiej kolumny przesuwają się w niej z różnymi szybkościami z powodu różnych stopni ich podziału między fazą ruchomą oraz węglowodorową fazą stacjonarną. Mieszaniny związków chemicznych są wymywane w kolejności ich hydrofobowości, pierwsze wymywane są związki chemiczne rozpuszczalne w wodzie, a na końcu związki chemiczne rozpuszczalne w olejach, proporcjonalnie do ich współczynnika podziału między węglowodory oraz wodę. Umożliwia to uzyskanie zależności między czasem retencji na takiej kolumnie (odwrócona faza) i ustalenie współczynnika podziału n-oktanol/woda. Współczynnik podziału jest wyprowadzany ze współczynnika objętości k, podanego wyrażeniem: k=tr-toto w której tr = czas retencji badanej substancji, to = średni czas przejścia cząsteczek rozpuszczalnika przez kolumnę (czas martwy). Nie są wymagane analizy ilościowe, a konieczne jest tylko oznaczenie czasu wymywania.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI

1.5.

1.5.1. Powtarzalnoś

1.5.1. Metoda wstrząsania kolby

W celu zapewnienia precyzji współczynnika podziału należy przeprowadzić dwukrotne oznaczenia w trzech różnych warunkach badania, przy czym można zmieniać ilość oznaczanej substancji oraz stosunek objętości rozpuszczalników. Ustalone wartości współczynnika podziału wyrażone jako ich wspólne logarytmy powinny zawierać się w przedziale ±0,3 jednostek logarytmicznych.

Metoda HPLC

W celu zwiększenia poziomu ufności pomiaru, należy wykonać podwójne oznaczenia. Wartości log P wyprowadzone z poszczególnych pomiarów powinny mieścić się w zakresie ±0,1 jednostek logarytmicznych.

1.5.2. Czułość

1.5.2. Metoda wstrząsania kolby

Zakres pomiarowy metody ustala się na podstawie granicy wykrywalności procedury analitycznej. Powinno to pozwalać na ocenę wartości log Pow w zakresie od - 2 do 4 (wyjątkowo, gdy zezwalają warunki, niniejszy zakres może być rozszerzony do log Pow do 5), gdy stężenie rozpuszczenia w jednej z faz jest nie większe niż 0,01 mola na litr.

Metoda HPLC

Metoda HPLC umożliwia ocenę współczynnika podziału w zakresie log Pow od 0 do 6. Zwykle współczynnik podziału danego związku może być oszacowany z dokładnością w obrębie zakresu ± 1 jednostki logarytmicznej wartości uzyskanej z metody wstrząsania kolby. Typowe korelacje można znaleźć w pozycjach bibliograficznych (4), (5), (6), (7) i (8). Wyższą dokładność można zwykle uzyskać, gdy krzywe korelacji są oparte na strukturalnie zbliżonych związkach odniesienia (9).

1.5.3. Specyficznoś

1.5.3. Metoda wstrząsania kolby

Prawo podziału Nernsta obowiązuje jedynie w warunkach stałej temperatury, stałego ciśnienia i stałego pH, w przypadku rozcieńczonych roztworów. W sposób ścisły dotyczy czystej substancji zdyspergowanej między dwoma czystymi rozpuszczalnikami. Istnienie kilku różnych substancji rozpuszczonych w jednej lub dwóch fazach może wpłynąć na uzyskane wyniki. Zjawiska dysocjacji lub asocjacji rozpuszczonych cząsteczek prowadzą do odchyleń od prawa podziału Nernsta. Na takie odchylenia wskazuje fakt, że współczynnik podziału staje się zależny od stężenia roztworu. Ze względu na szereg różnych badanych stanów równowagi, ta metoda badania nie powinna być stosowana w odniesieniu do związków ulegających jonizacji bez zastosowania korekcji. Należy rozważyć użycie roztworów buforowych w miejsce wody dla takich związków; pH buforu powinno różne przynajmniej o jedną jednostkę pH od pKa substancji i być w zgodności z pH badanego środowiska.

1.6. OPIS METODY

1.6.

1.6.1. Wstępna ocena współczynnika podziału Bardziej wskazana jest ocena współczynnika podziału za pomocą metody obliczeniowej (zob. dodatek 1) lub, jeśli stosowne, ze stosunków rozpuszczalności badanej substancji w czystych rozpuszczalnikach (10).

1.6.2. Metoda wstrząsania kolby

1.6.2.

1.6.2.1. Przygotowanie N-oktanol: oznaczenie współczynnika podziału należy wykonać przy użyciu odczynnika jakości analitycznej o wysokiej czystości. Woda: należy użyć wody destylowanej lub dwa razy destylowanej z przyrządu szklanego lub kwarcowego. Jeżeli jest uzasadnione, dla związków ulegających jonizacji, należy użyć roztworów buforowych w miejsce wody. Uwaga: Nie można stosować wody pochodzącej bezpośrednio z wymieniacza jonowego.

1.6.2.1.

1.6.2.1.1. Wstępne nasycenie rozpuszczalników Przed ustaleniem współczynnika podziału wykonuje się wzajemne nasycenie faz układu rozpuszczalników przez wytrząsanie w temperaturze prowadzenia eksperymentu. Aby to uzyskać, wygodnie jest zastosować wytrząsanie dwóch dużych butli magazynowych z n-oktanolem lub wodą wysokiej czystości do analiz z wystarczającą ilością drugiego rozpuszczalnika, przez 24 godziny, na mechanicznej wytrząsarce, a następnie odstawienie ich na okres tak długi, aby doszło do rozdzielenia faz i uzyskania stanu nasycenia.

1.6.2.1.2. Przygotowanie do badania Cała objętość układu dwufazowego powinna prawie wypełniać naczynie do badania. Pomoże to w niedopuszczeniu do utraty materiału z powodu jego ulatniania się. Stosunek objętościowy i ilości substancji, które należy zastosować, ustala się na podstawie następujących informacji: Przeprowadza się trzy badania. W pierwszym używa się wyliczonej wielkości stosunku n-oktanolu do wody; w drugiej ten stosunek dzieli się przez dwa; i w trzecim stosunek ten mnoży się przez dwa (np. 1:1, 1:2, 2:1).

wstępna ocena współczynnika podziału (zob. powyżej),

minimalna ilość substancji badanej wymagana do procedury analitycznej, oraz

ograniczenie maksymalnego stężenia w każdej z faz do 0,01 mola na litr.

1.6.2.1.3. Substancja badana Roztwór podstawowy przygotowuje się w n-oktanolu wstępnie nasyconym wodą. Stężenie takiego roztworu podstawowego musi być precyzyjnie oznaczone, przed użyciem go w oznaczaniu współczynnika podziału. Roztwór ten powinien być przechowywany w warunkach zapewniających jego stabilność.

1.6.2.2. Warunki badania Powinna być utrzymywana stała temperatura badania (± 1 oC) i mieścić się w zakresie od 20 do 25 oC.

1.6.2.3. Procedura pomiarowa

1.6.2.3.

1.6.2.3.1. Ustalenie równowagi podziału Dla każdego z warunków badania należy przygotować po dwa naczynia do badań zawierające wymagane, dokładnie odmierzone ilości obu rozpuszczalników, łącznie z niezbędną ilością roztworu podstawowego. Fazy n-oktanolu powinny być mierzone objętościowo. Naczynia do badania należy albo ustawić na odpowiedniej wytrząsarce, albo wytrząsać w ręce. Przy zastosowaniu wirowania probówki zalecaną metodą jest obrócenie szybko probówki o około 180o względem jej poprzecznej osi, tak by nie doprowadzić do jakiegokolwiek wzrostu ilości powietrza w obu fazach. Doświadczenie pokazało, że 50 takich obrotów jest zwykle wystarczające dla ustalenia równowagi podziału. Dla pewności zaleca się 100 obrotów w ciągu pięciu minut.

1.6.2.3.2. Rozdzielenie faz Jeżeli jest konieczne w celu rozdzielenia faz, należy zastosować wirowanie mieszaniny. Do tego celu należy użyć wirówki laboratoryjnej utrzymywanej w temperaturze pokojowej bądź też, w razie wykorzystywania wirówki o niekontrolowanej temperaturze, należy zapewnić uzyskanie ponownego stanu równowagi probówek do wirówki w temperaturze badania na co najmniej jedną godzinę przed analizą.

1.6.2.4. Analiza W celu oznaczenia współczynnika podziału konieczne jest ustalenie stężenia substancji badanej w obu fazach. Można tego dokonać przez pobranie podwielokrotności każdej z obu faz z każdej z probówek dla każdych warunków badania i poddanie tych podwielokrotności analizie ich przy użyciu wybranej procedury. Należy obliczyć całkowitą ilość substancji obecnej w obu fazach i porównać ją z ilością pierwotnie wprowadzonej substancji. Należy pobrać próbki fazy wodnej przy użyciu procedury zmniejszającej do minimum ryzyko pobrania śladów n-oktanolu: do pobrania próbki fazy wodnej można użyć szklanej strzykawki z wyjmowaną igłą. Strzykawka powinna zostać na początku częściowo wypełniona powietrzem. Należy delikatnie wypchnąć powietrze, wprowadzając igłę przez warstwę n-oktanolu. Pobiera się odpowiednią objętość fazy wodnej do strzykawki. Następnie strzykawkę szybko wyjmuje się z roztworu i odłącza igłę. Zawartość strzykawki można wykorzystać jako próbkę fazy wodnej. Najkorzystniej jest ustalić stężenie w dwóch rozdzielonych fazach przy użyciu metody specyficznej dla substancji. Przykładami właściwych metod analitycznych są:

metody fotometryczne,

chromatografia gazowa,

wysokosprawna chromatografia cieczowa.

1.6.3. Metoda HPLC

1.6.3.

1.6.3.1. Przygotowanie

1.6.3.1. Przyrząd

Wymagany jest chromatograf cieczowy, wyposażony w bezimpulsową pompę i odpowiednie urządzenie do wykrywania. Zalecane jest użycie zaworu wtryskowego z obiegiem wtrysku. Obecność grup polarnych w fazie stacjonarnej może poważnie zakłócić działanie kolumny HPLC. Zatem fazy stacjonarne powinny posiadać minimalną zawartość grup polarnych (11). Można stosować dostępne w handlu mikrocząsteczkowe wypełnienia dla fazy odwróconej lub gotowe wypełnione kolumny. Kolumna ochronna powinna być umieszczona między systemem wtrysku a kolumną analityczną.

Faza ruchoma

Do przygotowania rozpuszczalnika wymywającego, odgazowywanego przed użyciem, używa się metanolu oraz wody o czystości HPLC. Wykorzystuje się elucję izokratyczną. Należy zastosować stosunki metanol/woda o minimalnej zawartości wody 25 %. Mieszanina metanol-woda o typowym stosunku 3:1 (obj.) jest zadawalająca do wymywania związków o log P 6 w ciągu jednej godziny, przy szybkości przepływu 1 ml/mm. Dla związków o wysokim log P może być konieczne skrócenie czasu elucji (oraz związków odniesienia) poprzez zmniejszenie polarności fazy ruchomej lub długości kolumny. Substancje o bardzo niskiej rozpuszczalności w n-oktanolu wykazują tendencję do dawania nienormalnie niskich wartości log Pow przy metodzie HPLC; piki takich związków czasem towarzyszą czołu rozpuszczalnika. Zjawisko to jest prawdopodobnie związane z faktem, że proces podziału jest za powolny do uzyskania równowagi w czasie branym pod uwagę przy zwykłym rozdzielaniu metodą HPLC. Zmniejszenie szybkości przepływu i/lub obniżenie stosunku metanol/woda może być zatem w tym przypadku skuteczne do osiągnięcia rzeczywistej wartości. Związki badane i odniesienia muszą być rozpuszczalne w fazie ruchomej w stężeniach wystarczających do umożliwienia ich wykrycia. Tylko w wyjątkowych przypadkach można zastosować dodatki do mieszaniny metanol/woda, ponieważ dodatki zmieniają właściwości kolumny. Dla chromatogramów z dodatkami obowiązkowe jest użycie oddzielnej kolumny tego samego typu. Jeśli układ metanol-woda nie jest odpowiedni, można użyć innych mieszanin organicznych rozpuszczalników, na przykład etanol-woda lub acetonitryl-woda. Wartość pH eluentu jest krytyczna dla związków ulegających jonizacji. Powinno być ono w obrębie zakresu roboczego pH kolumny, które zwykle wynosi między 2 i 8. Zalecane jest buforowanie. Należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do wytrącania się soli i zniszczenia kolumny, co zachodzi dla niektórych mieszanin faza organiczna/bufor. Pomiary HPLC faz stacjonarnych opartych na krzemionce powyżej pH 8 nie są polecane, gdyż użycie zasadowej fazy ruchomej powoduje gwałtowne pogorszenie się wydajności kolumny.

Substancje rozpuszczone

Związki odniesienia powinny być o najwyższej dostępnej czystości. Związki używane do celów badania lub kalibracji są rozpuszczone, o ile to możliwe, w fazie ruchomej.

Warunki badania

Temperatura w trakcie wykonywania pomiarów nie może zmieniać się więcej niż ± 2 K.

1.6.3.2. Pomiar

1.6.3.2. Obliczenie czasu martwego to

Czas martwy to ustala się albo przez zastosowanie szeregów homologicznych (np. n-alkilometyloketonów), albo nieustalonych związków organicznych (np. tiomocznik lub formamid). Dla obliczenia czasu martwego to z użyciem szeregów homologicznych, zestaw co najmniej siedmiu reprezentantów szeregu jest wtryskiwany i oznacza się poszczególne czasy retencji. Wstępne czasy retencji tr(nc + 1) są wykreślane w funkcji tr(n c), oraz punkt przecięcia a oraz nachylenie b równania regresji: tr (nc + 1) = a + b tr (n c) są ustalane (nc = ilość atomów węgla). Czas martwy to jest zatem dany przez: to = a/(1 – b)

Krzywa kalibracji

Następnym krokiem jest sporządzenie wykresu korelacji wartości log k w zależności od log P dla właściwych związków odniesienia. W praktyce zestaw między 5 a 10 standartowych związków odniesienia, których log P jest wokół oczekiwanego zakresu jest kolejno wtryskiwany i oznaczane są czasy retencji, najkorzystniej przez integrator rejestrujący podłączony do systemu detekcji. Odpowiadające logarytmy masowych stosunków podziałów, log k, są wyliczane i wykreślane w funkcji log P ustalonego metodą wstrząsania kolby. Kalibracja jest prowadzona w regularnych odstępach czasu co najmniej raz dziennie, tak aby możliwe zmiany wydajności kolumny mogły być akceptowane.

Oznaczanie masowego stosunku podziału badanej substancji

Badana substancja jest wtryskiwana do tak małej ilości fazy ruchomej jak to możliwe. Oznacza się czas retencji (podwójnie), pozwalający na obliczenie masowego stosunku podziału k. Z wykresu korelacji związków odniesienia, można interpolować współczynnik podziału badanej substancji. Dla bardzo niskich oraz dla bardzo wysokich współczynników podziału konieczna jest ekstrapolacja. W tych przypadkach należy zwrócić szczególną uwagę na granice ufności linii regresji.

2. DANE

2. Metoda wstrząsania kolby

Niezawodność ustalonych wartości P można sprawdzić przez porównanie średnich wyników dwukrotnych oznaczeń ze średnią wszystkich wyników.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia),

tam gdzie metody nie nadają się do zastosowania (np. dla materiałów powierzchniowo czynnych), należy przedstawić obliczoną lub oszacowaną wartość w oparciu o poszczególne rozpuszczalności w n-oktanolu i wodzie,

należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji wyników, w szczególności w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu skupienia substancji.

wynik wstępnej oceny, o ile wykonano,

temperatura oznaczania,

dane na temat procedur analitycznych zastosowanych do oznaczenia stężeń,

czas i szybkość wirowania, o ile zastosowano,

zmierzone stężenia w obu fazach dla każdego oznaczenia (co oznacza, że całkowita liczba 12 stężeń znajdzie się w sprawozdaniu),

waga substancji badanej, objętość każdej fazy zastosowanej w każdym naczyniu oraz całkowita obliczona objętość substancji badanej obecnej w każdej z faz po uzyskaniu stanu równowagi,

należy podać obliczone wartości współczynnika podziału (P) oraz średniej dla każdego zestawu warunków badania, podobnie jak średnie z wszystkich oznaczeń. W przypadku gdy istnieją dane przemawiające za zależnością współczynnika podziału od stężenia, należy to odnotować w sprawozdaniu,

należy podać odchylenia standardowe poszczególnych wartości P ponad ich średnią,

średnie wartości P uzyskane na podstawie wszystkich oznaczeń należy także podać jako ich logarytm (o podstawie 10),

teoretyczne obliczenie Pow, gdy wartość ta została oznaczona lub gdy zmierzona wartość jest > 104,

pH używanej wody oraz fazy wodnej w czasie trwania eksperymentu,

jeżeli używane są bufory, należy podąć uzasadnienie dla ich użycia w miejsce wody, skład, stężenia i pH buforów, pH fazy wodnej przed i po eksperymencie.

wynik wstępnej oceny, o ile wykonano,

substancje badane i odniesienia oraz ich czystość,

zakres temperatury oznaczeń,

pH, przy którym wykonano oznaczenia,

szczegóły kolumn analitycznej i ochronnej, fazy ruchomej i środków detekcji,

dane retencji oraz literaturowe wartości log P dla związków odniesienia użytych w kalibracji,

szczegóły dopasowania linii regresji (log k w zależności od log P),

dane średniej retencji i interpolowana wartość log P badanego związku,

opis wyposażenia i warunki pracy,

profile wymywania,

ilość badań oraz substancje odniesienia substancji wprowadzonych do kolumny,

czas martwy i sposób jego pomiaru.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)

LITERATURA OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683. H. Ellgehausen, C. D’Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223–339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial use -Determination of partition coefficient – Flask shaking method. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984, Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Base11978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.

A.9. TEMPERATURAZAPŁONU

A.9.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Jest użyteczne posiadanie wstępnych informacji na temat zapalności substancji przed przeprowadzeniem niniejszego badania. Procedura badania jest odpowiednia dla ciekłych substancji, które mogą być zapalone źródłem zapłonu. Metody badania zamieszczone w niniejszym tekście są godne zaufania tylko dla zakresów zapłonu, które są wyszczególnione w pojedynczych metodach. Przy wyborze stosowanej metody należy rozważyć możliwość chemicznych reakcji substancją a uchwytem próbki.

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Temperatura zapłonu jest najniższą temperaturą, skorygowaną do ciśnienia 101,325 kPa, w której ciecz wydziela pary, w warunkach określonych w metodzie badania, w takiej ilości, że wytwarzana jest mieszanina palna para/powietrze w naczyniu badawczym. Jednostki: oC t = T – 273,15 (t w oC i T w oK)

1.4. ZASADA METODY Substancja jest umieszczana w naczyniu badawczym i podgrzewana lub chłodzona to temperatury badania zgodnej z procedurą opisaną w indywidualnej metodzie badania. Próby zapłonu są przeprowadzane w celu stwierdzenia, czy próbka zapłonie lub nie w temperaturze badania.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI

1.5.

1.5.1. Powtarzalność Powtarzalność zmienia się zgodnie z zakresem temperatury zapłonu i zastosowanej metody badania; maksymalnie 2 oC.

1.5.2. Czułość Czułość zależy od zastosowanej metody badania.

1.5.3. Specyficzność Specyficzność niektórych metod badania jest ograniczona do niektórych amplitud temperatury zapłonu i zależy od cech samej substancji (np. wysoka lepkość).

1.6. OPIS METODY

1.6.

1.6.1. Przygotowania Próbka badanej substancji jest umieszczana w przyrządzie badawczym zgodnie z 1.6.3.1 i/lub 1.6.3.2. Dla bezpieczeństwa zalecane jest, by w metodzie używać próbki o małej liczności. Około 2 cm3 stosuje się dla substancji wysokoenergetycznych lub toksycznych.

1.6.2. Warunki badania Przyrząd powinien, tak dalece jak jest to zgodne z bezpieczeństwem, być umieszczony w pozycji wolnej od przeciągów powietrza.

1.6.3. Przeprowadzenie badania

1.6.3.

1.6.3.1. Metoda równowagi Zob. ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2. Metoda nierównowagi

1.6.3.2. Przyrząd Abela:

Zob. BS 2000 część 170, NF M07-011, NF T66-009.

Przyrząd Abel-Pensky:

Zob. EN 57, DIN 51755 część 1 (dla temperatur od 5 do 65 oC), DIN 51755 część 2 (dla temperatur poniżej 5 oC), NF M07-036.

Przyrząd Tag:

Zob. ASTM D 56.

Przyrząd Pensky-Martens:

Zob. ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Uwagi:

Jeżeli temperatura zapłonu, oznaczona metoda nierównowagi, według 1.6.3.2, wynosi 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC lub 55 ± 2 oC, należy je potwierdzić metodą równowagi, stosując ten sam przyrząd. Tylko te metody, które podają temperaturę jako temperaturę zapłonu, stosuje się do zgłoszenia. Dla oznaczenia temperatury zapłonu lepkich cieczy (farby, gumy oraz podobne) zawierających rozpuszczalniki można używać tylko przyrządów i metod badań stosownych dla oznaczania temperatury zapłonu cieczy lepkich. Zob. ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 część 1.

2. DAN

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia),

stwierdzenie zastosowania danej metody, jak również o wszystkich możliwych odchyleniach,

wyniki i wszystkie dodatkowe uwagi dotyczące interpretacji wyników.

4. LITERATURA Brak.

A.10. ZAPALNOŚĆ (CIAŁA STAŁE)

A.10.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Dla przeprowadzenia badania przydatne jest posiadanie wstępnych informacji na temat ewentualnych właściwości wybuchowych substancji. Niniejsze badanie należy stosować jedynie do substancji sproszkowanych, ziarnistych i pastopodobnych. Aby nie uwzględniać wszystkich substancji, które można zapalić, a tylko te, które palą się szybko lub te, których zachowanie się przy spalaniu jest z jakichkolwiek względów szczególnie niebezpieczne, jedynie substancje, których szybkość spalania przekracza pewne wartości graniczne, uważa się za wysoce łatwopalne. Jest szczególnie niebezpieczne, jeżeli inkandescencja rozchodzi się poprzez proszek metalu, z powodu trudności z ugaszeniem ognia. Proszki metali należy uznać za wysoce łatwopalne, jeżeli podtrzymują one rozszerzanie inkandescencji w masie w czasie określonego czasu.

1.2. DEFINICJA I JEDNOSTKI Czas spalania jest wyrażony w sekundach.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Nie wyszczególniono.

1.4. ZASADA METODY Substancja jest formowana w nieprzerwaną wstęgę lub proszkową smugę o długości około 250 mm i przeprowadza się wstępne badanie klasyfikacyjne do określenia, czy zachodzi zapłon przez płomień gazu, rozprzestrzenianie przez przypalanie płomieniem lub tlenie się. Jeżeli zachodzi rozprzestrzenianie ponad 200 mm w sformowanym materiale w obrębie określonego czasu, przeprowadzany jest program pełnego badania w celu określenia szybkości spalania.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Nie ustalono.

1.6. OPIS METODY

1.6.

1.6.1. Wstępne badanie klasyfikacyjne Substancja jest formowana w nieprzerwaną wstęgę lub proszkową smugę o długości około 250 mm, 20 mm szerokości i 10 mm wysokości na niepalnej, nieporowatej płycie bazowej o niskim przewodnictwie ciepła. Gorącym płomieniem palnika gazowego (minimalna średnica 5mm), działa się na jeden z końców smugi proszku do momentu zapalenia się proszku lub przez maksimum 2 minuty (5 minut dla proszków metali lub stopów metali). Należy zanotować, czy spalanie rozchodzi wzdłuż 200 mm smugi w obrębie czasu badania 4 minut (lub 40 minut dla proszków metali). Jeżeli substancja nie zapala się i nie podtrzymuje spalania albo przez spalanie z płomieniem lub z tleniem się wzdłuż 200 mm smugi proszku w obrębie czasu 4 minut (lub 40 minut) czasu trwania badania, wtedy substancji nie uważa się za wysoce łatwopalną i dalsze badania nie są wymagane. Jeżeli substancja podtrzymuje spalenie się smugi proszku długości 200 mm w czasie mniejszym od 4 minut, lub mniejszym od 40 minut dla proszków metali, należy przeprowadzić procedurę niżej opisaną (ppkt 1.6.2. i następne).

1.6.2. Badanie szybkości spalania

1.6.2.

1.6.2.1. Przygotowanie Sproszkowanymi lub ziarnistymi substancjami swobodnie napełnia się formę długą na 250 mm, o trójkątnym przekroju wewnętrznej wysokości 10 mm i szerokości 20 mm. Z obu stron formy w kierunku wzdłużnym montuje się dwie metalowe płyty z ograniczeniami poprzecznymi, które wystają 2 mm poza górną krawędź obszaru przekroju trójkątnego (rysunek). Formę zrzuca się następnie trzykrotnie z wysokości 2 cm na twardą powierzchnię. W razie potrzeby napełnia się wtedy formę ponownie. Poprzeczne ograniczenia są następnie zdejmowane i zeskrobuje się nadmiar substancji. Płytę bazową, niepalną, nieporowatą i o niskim przewodnictwie cieplnym umieszcza się na górze formy, przyrząd odwraca się i zdejmuje formę. Substancjami pastopodobnymi powleka się w postaci liny o długości 250 mm i przekroju około 1 cm2, niepalną, nieporowatą i o niskim przewodnictwie cieplnym płytę bazową.

1.6.2.2. Warunki badania W przypadku substancji wrażliwych na wilgoć badanie należy przeprowadzić jak najszybciej po ich wyjęciu z pojemnika.

1.6.2.3. Przeprowadzenie badania Ustawić stos w kierunku prostopadłym do ciągu powietrza w szafie wyciągowej. Szybkość przepływu powietrza powinna być wystarczająca do zapobieżenia przedostaniu się dymu do laboratorium i nie powinna być zmieniana w trakcie badania. Wokół przyrządu należy ustawić ekran chroniący przed ciągiem powietrza. Stosuje się gorący płomień z palnika gazowego (minimalna średnica 5 mm) do zapalenia z jednego końca stosu. Gdy stos spali się na długości 80 mm, na następnych 100 mm mierzy się szybkość spalania. Badanie przeprowadza się sześć razy, używając za każdym razem czystej, chłodnej płyty, niezależnie od wcześniej obserwowanego pozytywnego wyniku.

2. DANE Istotne z punktu widzenia oceny są czas spalania z wstępnego badania klasyfikacyjnego (1.6.1) i najkrótszy z sześciu zbadanych (1.6.2.3) czas spalania.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia),

opis substancji badanej i jej stanu fizycznego, w tym zawartości wilgoci,

wyniki z wstępnego badania klasyfikacyjnego i z badania szybkości spalania jeśli przeprowadzono,

wszelkie dodatkowe uwagi istotne dla interpretacji wyników.

3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW Sproszkowane, ziarniste lub pastopodobne substancje są uważane za wysoce łatwopalne, jeżeli czas spalania w jakimkolwiek badaniu przeprowadzonym zgodnie z procedurą opisaną w 1.6.2 jest mniejszy niż 45 sekund. Proszki metali lub stopów metali, uważa się za wysoce łatwopalne, jeżeli zapalają się i płomień lub strefa reakcji rozszerza się w całej próbce w czasie 10 minut lub mniejszym.

4. LITERATURA NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

A.11. ZAPALNOŚĆ (GAZY)

A.11.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Niniejsza metoda pozwala na oznaczenie, czy gazy zmieszane z powietrzem w temperaturze pokojowej (około 20 oC) i pod ciśnieniem atmosferycznym są palne, a jeśli tak, to w jakim zakresie stężeń. Mieszaniny badanego gazu z powietrzem we wzrastającym stężeniu poddaje się działaniu iskry elektrycznej i obserwuje się, czy dochodzi do zapłonu.

1.2. DEFINICJA I JEDNOSTKI Zakres palności to zakres stężenia między dolną i górną granicą wybuchowości. Dolna i górna granica wybuchowości to granice stężenia palnego gazu zmieszanego z powietrzem, przy których nie dochodzi do propagacji płomienia.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Nie wyszczególniono.

1.4. ZASADA METODY Stężenie gazu w powietrzu zwiększa się w kolejnych etapach, przy czym na każdym etapie mieszaninę tę poddaje się działaniu iskry elektrycznej.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Nie ustalono.

1.6. OPIS METODY

1.6.

1.6.1. Przyrząd Naczynie do badania to prosty cylinder szklany o minimalnej średnicy wewnętrznej wynoszącej 50 mm i minimalnej wysokości 300 mm. Elektrody zapłonowe są umieszczone w odległości 3 do 5 mm od siebie, 60 mm ponad dnem cylindra. Cylinder jest wyposażony w otwór dekompresyjny. Przyrząd musi być osłonięty w taki sposób, aby ograniczyć wszelkie szkody związane z ewentualnym wybuchem. Iskra o stałej indukcji o czasie trwania 0,5 s, generowana z wysokonapięciowego transformatora o napięciu wyjściowym od 10 do 15 kV (maksymalna moc zasilająca 300 W), stosowana jest jako źródło zapłonu. Przykład odpowiedniego przyrządu opisano w pozycji bibliograficznej (2).

1.6.2. Warunki badania Badanie należy wykonać w temperaturze pokojowej (około 20 oC).

1.6.3. Przeprowadzenie badania Przy użyciu pomp dozujących do szklanego cylindra wprowadza się znane stężenia gazu w powietrzu. Przez mieszaninę przepuszcza się iskrę i obserwuje się, czy od źródła zapłonu oddzieli się płomień i czy będzie on ulegać niezależnej propagacji. Stężenie gazu zmienia się etapowo o 1 % obj., aż dojdzie do zapłonu w sposób opisany powyżej. Jeżeli budowa chemiczna gazu wskazuje, że może on być niepalny, a skład mieszaniny stechiometrycznej z powietrzem może być obliczony, należy zbadać tylko mieszaniny w zakresie 10 % poniżej składu stechiometrycznego oraz 10 % powyżej tego składu, w krokach co 1 %.

2. DANE Jedyną istotną informacją dla ustalenia omawianej właściwości jest informacja na temat propagacji płomienia.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia),

opis zastosowanego przyrządu, z podaniem wymiarów,

temperatura, w której wykonano badanie,

stężenia badane i uzyskane wyniki,

wynik badania: gaz niepalny lub gaz wysoce łatwopalny,

jeżeli ustalono, że gaz jest niepalny, należy wtedy potwierdzić zakres stężenia, w którym badano go w odstępach co 1 %,

należy przedstawić wszelkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji wyników.

4.(1)(2) LITERATURA NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse-Wortmann, T.Redeker und H.Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol. 56, 2, 126-127.

A.12. ZAPALNOŚĆ (W KONTAKCIE Z WODĄ)

A.12.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Niniejszą metodę badania można wykorzystywać do ustalenia, czy reakcja substancji z wodą prowadzi do tworzenia się niebezpiecznych ilości gazu lub gazów, które mogą być wysoce łatwopalne. Metodę badania można stosować w odniesieniu zarówno do ciał stałych, jak i cieczy. Metoda ta nie ma zastosowania do substancji, które ulegają spontanicznemu zapłonowi w kontakcie z powietrzem.

1.2. DEFINICJE IJEDNOSTKI Wysoce łatwopalny: Substancje i preparaty, które, w kontakcie z wodą lub wilgotnym powietrzem, uwalniają wysoce łatwopalne gazy w niebezpiecznych ilościach z minimalną szybkością 1 litr/kg na godzinę.

1.3. ZASADA METODY Substancję bada się w wieloetapowej sekwencji opisanej poniżej; gdy dojdzie do zapłonu na dowolnym z etapów, kontynuowanie badania nie jest potrzebne. Jeżeli wiadomo, że substancja nie reaguje gwałtownie z wodą, należy postępować zgodnie z etapem 4 (1.3.4).

1.3.

1.3.1. Etap 1 Substancję badaną umieszcza się w rynience z wodą destylowaną w temperaturze 20 oC i zapisuje się, czy uwolniony gaz zapali się, czy nie.

1.3.2. Etap 2 Substancję badaną umieszcza się na bibule filtracyjnej pływającej na powierzchni naczynia zawierającego wodę destylowaną w temperaturze 20 oC, po czym zapisuje się, czy uwolniony gaz zapali się, czy nie. Rolą bibuły filtracyjnej jest jedynie utrzymywanie substancji w jednym miejscu, tak aby zwiększyć szanse na uzyskanie zapłonu.

1.3.3. Etap 3 Z substancji badanej tworzy się stos o wysokości około 2 cm i średnicy 3 cm. Do stosu dodaje się kilka kropli wody i zapisuje się, czy dochodzi do zapalenia się uwolnionego gazu, czy nie.

1.3.4. Etap 4 Substancję badaną miesza się z wodą destylowaną w temperaturze 20 oC, po czym mierzy się szybkość uwalniania gazu w czasie siedmiu godzin w odstępach jednogodzinnych. Jeżeli oznaczana szybkość uwalniania wykazuje niesystematyczne wahania lub wzrasta po siedmiu godzinach, czas pomiaru należy wydłużyć do maksimum pięciu dni. Badanie można przerwać, gdy mierzona szybkość w dowolnym momencie przekroczy 1 litr/kg na godzinę.

1.4. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Nie wyszczególniono.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Nie ustalono.

1.6. OPIS METOD

1.6.

1.6.1. Etap 1

1.6.1.

1.6.1.1. Warunki badania Badanie wykonywane jest w temperaturze pokojowej (około 20 oC).

1.6.1.2. Wykonanie badania Niewielką ilość (o średnicy około 2 mm) substancji badanej należy umieścić w rynience zawierającej wodę destylowaną. Należy zapisać, czy (i) uwalnia się jakikolwiek gaz oraz czy (ii) dochodzi do zapalenia się gazu. W przypadku gdy dochodzi do zapalenia się gazu, nie są potrzebne dalsze badania substancji, gdyż substancję taką uważa się za niebezpieczną.

1.6.2. Etap 2

1.6.2.

1.6.2.1. Przyrząd Na powierzchni wody destylowanej w dowolnym, właściwym naczyniu, np. w parownicy o średnicy 100 mm, kładzie się płasko bibułę filtracyjną.

1.6.2.2. Warunki badania Badanie wykonywane jest w temperaturze pokojowej (około 20 oC).

1.6.2.3. Przeprowadzenie badania Niewielką ilość substancji badanej (o średnicy około 2 mm) umieszcza się na środku bibuły filtracyjnej. Należy zapisać, czy (i) uwalnia się jakikolwiek gaz oraz czy (ii) dochodzi do zapalenia się gazu. W przypadku gdy dochodzi do zapalenia się gazu, nie są potrzebne dalsze badania substancji, gdyż substancję taką uważa się za niebezpieczną.

1.6.3. Etap 3

1.6.3.

1.6.3.1. Warunki badania Badanie wykonywane jest w temperaturze pokojowe (około 20 oC).

1.6.3.2. Przeprowadzenie badania Z substancji badanej należy zrobić stos o wysokości około 2 cm i średnicy 3 cm, z wrębem u góry. Do wgłębienia dodaje się kilka kropli wody i zapisuje się, czy: (i) uwalnia się jakikolwiek gaz oraz czy (ii) dochodzi do zapalenia się gazu. W przypadku gdy dochodzi do zapalenia się gazu, nie są potrzebne dalsze badania substancji, gdyż substancję taką uważa się za niebezpieczną.

1.6.4. Etap 4

1.6.4.

1.6.4.1. Przyrząd Przyrząd jest ustawiony jak pokazano na rysunku.

1.6.4.2. Warunki badania Sprawdzić pojemnik substancji badanej na jakikolwiek proszek < 500 μm (wielkość ziarna). Jeżeli proszek tworzy więcej niż 1 % wagowo całości lub jeżeli próbka jest krucha, wtedy całą substancję należy zmielić na proszek przed badaniem dla umożliwienia zmniejszenia wielkości ziarna w czasie przechowywania i posługiwania się nią; w innych przypadkach bada się substancję taką, jak otrzymano. Badanie należy wykonać w temperaturze pokojowej (około 20 oC) i pod ciśnieniem atmosferycznym.

1.6.4.3. Przeprowadzenie badania Od 10 do 20 ml wody umieszcza się we wkraplaczu przyrządu, a 10 g substancji umieszcza się w kolbie stożkowej. Objętość uwalniającego się gazu można zmierzyć dowolną, właściwą metodą. Otwiera się kurek wkraplacza w celu wpuszczenia wody do kolby stożkowej i uruchamia się stoper. Wydzielanie gazu mierzone jest co godzinę w trakcie okresu siedmiu godzin. Jeżeli w ciągu tego okresu czasu, wydzielanie gazu jest nierówne, lub pod koniec tego okresu, szybkość wydzielania gazu wzrasta, wtedy pomiary należy kontynuować do pięciu dni. Jeżeli w dowolnym momencie pomiaru szybkość wydzielania gazu przekracza 1 litr/kg na godzinę, należy przerwać badanie. Badanie należy przeprowadzić trzykrotnie. Jeżeli nie jest znana chemiczna tożsamość gazu, należy go poddać analizie. Jeżeli gaz zawiera wysoce łatwopalne składniki i nie wiadomo, czy mieszanina jest wysoce łatwopalna, należy przygotować mieszaninę o takim samym składzie i poddać badaniu przy użyciu metody A.11.

2. DANE Substancja jest uważana za niebezpieczną, jeżeli:

samozapłon ma miejsce na każdy etapie procedury badania, lub

występuje wydzielanie gazu palnego o szybkości większej niż 1 litr/kg substancji na godzinę.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia),

szczegóły każdego wstępnego przygotowania badanej substancji,

wyniki badań (etapy 1, 2, 3 i 4),

tożsamość chemiczna wydzielanego gazu,

szybkość wydzielania gazu, jeżeli przeprowadzono etap 4 (1.6.4),

wszystkie dodatkowe uwagi stosowne do interpretacji wyników.

4.(1)(2) LITERATURA Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

A.13. WŁAŚCIWOŚCI PIROFORYCZNE CIAŁ STAŁYCH I CIECZY

A.13.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Procedura badań ma zastosowanie do stałych lub ciekłych substancji, które w małych ilościach samorzutnie zapalają się w krótkim czasie po wejściu z powietrzem w temperaturze pokojowej (około 20 oC). Substancje, które wymagają wystawienia na powietrze na okres godzin lub dni w temperaturze pokojowej lub w podwyższonej temperaturze, zanim zajdzie zapłon nie są objęte niniejszą metodą badania.

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Substancje uważa się za posiadające właściwości piroforyczne, jeżeli zapalają się lub ulegają zwęglaniu zgodnie z warunkami opisanymi w 1.6. Samozapalność cieczy może wymagać również zbadania za pomocą metody A.15 Temperatura samozapłonu (ciecze i gazy).

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Nie wyszczególniono.

1.4. ZASADA METODY Substancja, czy w postaci ciała stałego czy cieczy, jest dodawana do obojętnego nośnika i poddawana kontaktowi z powietrzem w temperaturze otoczenia na okres pięciu minut. Jeżeli substancje nie zapalają się, absorbuje się je na bibule filtracyjnej i wystawia na powietrze w temperaturze otoczenia (około 20 oC) na czas pięciu minut. Jeżeli ciało stałe lub ciecz zapala się, lub ciecz zapala się lub zwęgla bibułę filtracyjną, wtedy substancję uważa się za piroforyczną.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Powtarzalność: ze względów istotnych dla bezpieczeństwa pojedynczy pozytywny wynik jest wystarczający do uznania substancji za piroforyczną.

1.6. OPIS METODY BADANIA

1.6.

1.6.1. Przyrząd Tygiel porcelanowy o średnicy około 10 cm napełnia się ziemią okrzemkową do wysokości około 5 mm w temperaturze pokojowej. Uwaga: Ziemię okrzemkową lub dowolną inną porównywalną, obojętną substancję, która jest powszechnie dostępna, bierze się jako reprezentacyjną dla gleby, na którą badana substancja może się uwolnić w razie wypadku. Do badania cieczy, które nie zapalają się w kontakcie z powietrzem, gdy poddaje się je kontaktowi z obojętnym nośnikiem, wymagana jest sucha bibuła filtracyjna.

1.6.2. Przeprowadzenie badania

1.6.2. a)

Sproszkowane ciała stałe Od 1 do 2 cm3 badanej substancji w proszku sypie się z wysokości około 1 m na niepalną powierzchnię i obserwuje się, czy substancja ta ulegnie zapaleniu podczas spadania lub w ciągu pięciu minut od opadnięcia. Badanie przeprowadza się sześć razy, niezależnie od wystąpienia zapalenia się.

Ciecze Około 5 cm3 badanej cieczy wlewa się do przygotowanego tygla porcelanowego i obserwuje się, czy substancja zapali się w ciągu pięciu minut. Jeżeli w sześciu badaniach nie nastąpi zapłon, należy przeprowadzić następujące badania: 0,5 ml badanej próbki za pomocą strzykawki przenosi się na wgniecioną bibułę filtracyjną i obserwuje się, czy nastąpi zapalenie się lub zwęglenie bibuły filtracyjnej w czasie pięciu minut po naniesieniu cieczy. Niezależnie od tego, czy zachodzi zapalenie się lub zwęglenie, badanie przeprowadza się trzy razy.

2. DANE

2.

2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW Wykonywania badań można zaprzestać, gdy tylko w jednym z nich uzyska się dodatni wynik.

2.2. OCENA Jeżeli substancja zapala się w czasie pięciu minut od dodania obojętnego nośnika i wystawienia na powietrze, lub ciekła substancja zwęgla lub zapala bibułę filtracyjną w czasie pięciu minut po naniesieniu i wystawieniu na powietrze, jest uważana za piroforyczną.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia),

wyniki badań,

wszystkie dodatkowe uwagi dotyczące interpretacji wyników.

4.(1)(2) LITERATURA NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14. WŁAŚCIWOŚCI WYBUCHOWE

A.14.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Metoda dostarcza schematu badania do określenia, czy ciało stałe lub substancja pastopodobna przedstawia niebezpieczeństwo wybuchu, gdy poddaje się ją działaniu płomienia (wrażliwość cieplna) lub uderzeniu lub tarciu (wrażliwość na bodźce mechaniczne), i czy ciekła substancja przedstawia niebezpieczeństwo wybuchu, gdy podda się ją działaniu płomienia lub uderzeniu. Metoda składa się z trzech części: Metoda pozwala uzyskać dane pozwalające na ocenę prawdopodobieństwa zainicjowania wybuchu przy pomocy niektórych powszechnie występujących bodźców. Metoda nie jest przeznaczona do stwierdzenia, czy substancja jest zdolna do wybuchu w każdych warunkach. Metoda jest właściwa do określenia, czy substancja może przedstawiać niebezpieczeństwo wybuchu (wrażliwość cieplna i mechaniczna) w szczególnych warunkach określonych w dyrektywie. Jest oparta o pewną ilość typów przyrządów, które są szeroko międzynarodowo stosowane (1) i które zwykle dają w pełni znaczące wyniki. Uznane jest, że metoda nie jest ostateczna. Można stosować alternatywne przyrządy do tych celów, zapewniając że są znane międzynarodowo i wyniki mogą być stosownie skorelowane z tymi z wymaganych przyrządów. Nie ma potrzeby przeprowadzania badań, gdy dostępne są informacje termodynamiczne (np. ciepło tworzenia, ciepło rozkładu) i/lub nieobecne są pewne reaktywne grupy (2) we wzorze strukturalnym, ustanawiające poza wszelkimi wątpliwościami, że substancja jest niezdolna do gwałtownego rozkładu z wydzieleniem gazów lub uwolnieniem ciepła (to jest, materiał nie przedstawia żadnego ryzyka wybuchu). Badanie wrażliwości mechanicznej w odniesieniu do tarcia nie jest wymagane dla cieczy.

1.1. a)

badanie wrażliwości cieplnej (1);

badanie wrażliwości mechanicznej na uderzenia (1);

badanie wrażliwości mechanicznej na tarcie (1).

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Materiały wybuchowe: Substancje, które wybuchają pod działaniem płomienia lub które są wrażliwe na uderzenie lub tarcie w wymaganych przyrządach (lub bardziej wrażliwe mechanicznie niż 1,3-dinitrobenzen w alternatywnym przyrządzie).

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA 1,3-dinitrobenzen, techniczny, krystaliczny, przesiany przez sito 0,5 mm, dla metod tarcia i uderzenia. Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyna (RDX, heksogen, cyklonit-CAS 121-82-4), rekrystalizowany z wodnego cykloheksanonu, przesiewany na mokro przez sito 250 mikrometrów (μm) i zatrzymywany na sicie 150 μm oraz suszony w 103 ± 2 oC (przez 4 godziny) do drugiej serii badań na tarcie i uderzenia.

1.4. ZASADA METODY Badania wstępne są konieczne dla ustalenia bezpiecznych warunków przeprowadzenia trzech badań wrażliwości.

1.4.

1.4.1. Badania bezpiecznego postępowania z substancją (3) Ze względów bezpieczeństwa, przed przeprowadzeniem głównych badań, bardzo małe próbki (około 10 mg) substancji są poddawane ogrzaniu bez zamknięcia w płomieniu gazu, wstrząsowi w dogodnym przyrządzie i tarciu przez użycie młotka i kowadła lub jakiejkolwiek maszyny ciernej. Celem jest stwierdzenie, czy substancja jest tak wrażliwa i wybuchowa, że przepisane badania wrażliwości, szczególnie wrażliwość cieplna, powinny być prowadzone ze specjalnymi środkami bezpieczeństwa, by zapobiec zranieniu operatora.

1.4.2. Wrażliwość cieplna Metoda obejmuje podgrzewanie substancji w stalowej rurze, zamkniętej kryzami z otworami o różnej średnicy, dla określenia, czy substancja jest podatna na wybuch w warunkach intensywnego ogrzewania pod określonym przykryciem.

1.4.3. Wrażliwość mechaniczna (uderzenie) Metoda obejmuje poddawanie substancji uderzeniu spowodowanemu przez zrzucenie określonej masy z określonej wysokości.

1.4.4. Wrażliwość mechaniczna (tarcie) Metoda obejmuje poddawanie ciała stałego lub substancji pastopodobnych tarciu między znormalizowanymi powierzchniami w określonych warunkach obciążenia i ruchu względnego.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Nie ustalono.

1.6. OPIS METODY

1.6.

1.6.1. Wrażliwość cieplna (działanie płomienia)

1.6.1.

1.6.1.1. Przyrząd Przyrząd składa się z nienadającej się do ponownego zastosowania rury stalowej z zamknięciami wielokrotnego użytku (rysunek 1), zainstalowanej w urządzeniu do podgrzewania i zabezpieczającym. Każda rura jest wykonana z arkusza stali głęboko tłoczonej (zob. dodatek) i posiada wewnętrzną średnicę 24 mm, długość 75 mm i grubość ścianek 0,5 mm. Rury są kołnierzowane na otwartych końcach dla umożliwienia ich zamknięcia przez zestaw płyty kryzowej. Składa się on z odpornej na ciśnienie płyty kryzy, z centralnie położonym otworem, przykręconej mocno do rury za pomocą dwuczęściowych złącz śrubowych (nakrętka i gwintowany pierścień). Nakrętka i gwintowany pierścień są wykonane ze stali chromomanganowej (zob. dodatek), beziskrowej do temperatury 800 oC. Kryzy są grubości 6 mm, wykonane ze stali żaroodpornej (zob. dodatek), i są dostępne w zakresie różnych średnic otworów.

1.6.1.2. Warunki badania Zwykle substancje są badane tak jak je otrzymano, chociaż w niektórych przypadkach, na przykład gdy są sprasowane, odlewane lub w inny sposób skondensowane, może być konieczne badanie substancji po skruszeniu. Dla ciał stałych masa materiału użytego w każdym badaniu jest określana w dwuetapowej procedurze przebiegu próbnego. Wytarowana rura jest napełniana 9 cm3 substancji i substancja jest ubijana siłą 80 N przyłożoną w poprzek całkowitego przekroju rury. Z powodów bezpieczeństwa lub w przypadkach, gdzie postać fizyczna próbki zmienia się przez ściśnięcie, można użyć inną procedurę napełniania; przykładowo, gdy substancja jest bardzo wrażliwa na tarcie, wtedy ubijanie nie jest odpowiednie. Jeżeli materiał jest ściśliwy, wtedy dodaje się go więcej i ubija do momentu wypełnienia rury do 55 mm od góry. Całkowita masa użyta do wypełnienia rury do poziomu 55 mm jest określona i dodaje się następnie dwie dodatkowe porcje, każda ubijana z siłą 80 N. Następnie materiał jest albo dodawany z ubijaniem, albo wyjmowany, w zależności od wymagań, celem pozostawienia rury wypełnionej do poziomu 15 mm od góry. Wykonuje się drugi przebieg próbny, rozpoczynając z ubitą ilością trzeciej masy całkowitej znalezionej w pierwszym etapie przebiegu próbnego. Do tych przyrostów dodaje się dwa więcej z ubijaniem o sile 80 N i poziomem substancji w rurze ustawionym na 15 mm od góry, poprzez dodawanie lub ujmowanie materiału zgodnie z wymaganiem. Ilość ciała stałego ustalona w drugim etapie przebiegu próbnego jest stosowana do każdej próby. Napełnianie przeprowadzono w trzech równych ilościach, każdej ściśniętej do 9 cm3 z konieczną siłą (można to uprościć przez zastosowanie pierścieni dystansowych). Ciecze i żele są ładowane do rury na wysokość 60 mm, zwracając szczególną uwagę na żele, by zapobiec tworzeniu się pustych przestrzeni. Gwintowany pierścień jest wsuwany w rurę od dołu, umieszcza się stosowną płytę kryzową i dokręca nakrętkę po nasmarowaniu małą ilością smaru na bazie disiarczku molibdenu. Jest podstawową zasadą sprawdzenie, czy nie uwięziono substancji między kołnierzem i płytą, lub w gwincie. Podgrzewanie jest prowadzone za pomocą propanu pobieranego z butli przemysłowej, wyposażonej w zawór regulacyjny ciśnienia (60 do 70 mbar), poprzez miernik i równomiernie rozprowadzany (co wskazuje wizualna obserwacja płomieni z palników) poprzez dysze do czterech palników. Palniki są umieszczone dookoła komory badawczej, jak pokazano na rysunku 1. Cztery palniki posiadają łączne zużycie około 3,2 litra propanu na minutę. Można zastosować alternatywne gazy palne i palniki, ale szybkość ogrzewania musi być jak wyspecyfikowano na rysunku 3. Dla wszystkich przyrządów szybkość ogrzewania musi być okresowo sprawdzana używając rury wypełnione ftalanem dibutylu, jak wskazano na rysunku 3.

1.6.1.3. Przeprowadzenie badania Każde badanie jest przeprowadzane do momentu albo rozerwania rury, albo ogrzania w czasie pięciu minut. Badanie, wynikiem którego jest fragmentacja rury na trzy lub więcej części, które w niektórych przypadkach mogą być połączone jedna do drugiej wąskimi tasiemkami metalu jak pokazano na rysunku 2, ocenia się jako dające wybuch. Badanie wynikiem którego jest mniej fragmentów lub wcale, jest uważane jako niedające wybuchu. Wpierw wykonuje się serie trzech badań z płytą kryzową o średnicy 6,0 mm, jeśli nie uzyska się wybuchów, przeprowadza się drugą serię trzech badań z płyta kryzową o średnicy 2,0 mm. Jeżeli wybuch zachodzi w jednej z dwóch serii badań, niewymagane są następne badania.

1.6.1.4. Ocena Wynik badania jest uważany za pozytywny, jeżeli wybuch zachodzi w jednej z dwóch powyższych serii badań.

1.6.2. Wrażliwość mechaniczna (uderzenie)

1.6.2.

1.6.2.1. Przyrząd (rysunek 4) Podstawowe części przyrządu spadowego młota są wykonane z bloku ze staliwa z podstawą, kowadła, kolumny, prowadnic, bijaków, mechanizmu zwalniającego i uchwytu próbki. Kowadło stalowe 100 mm (średnica) × 70 mm (wysokość) jest przykręcone do góry bloku stalowego 230 mm (długość) × 250 mm (szerokość) × 200 mm (wysokość) z podstawą staliwną 450 mm (długość) × 450 mm (szerokość) × 60 mm (wysokość). Kolumna wykonana z bezszwowej ciągnionej rury stalowej, jest zabezpieczona w uchwycie przykręconym do tylnej ściany bloku stalowego. Cztery śruby mocują przyrząd do stałego betonowego bloku 60 × 60 × 60 cm w taki sposób, że szyny prowadnicy są całkowicie pionowe i bijak opada swobodnie. Stosownymi do użycia są bijaki 5 oraz 10 kg, wykonane z stali uspokojonej. Głowica uderzeniowa każdego bijaka jest z utwardzonej stali HRC 60 do 63, i posiada minimalną średnicę 25 mm. Próbka podlegająca badaniu jest zawarta w przyrządzie uderzeniowym składającym się z dwóch współosiowych cylindrów ze stali uspokojonej, jeden powyżej drugiego, w wydrążonym stalowym pierścieniu prowadzącym. Cylindry ze stali uspokojonej powinny posiadać średnicę 10 (-0,003, -0,005) mm i wysokość 10 mm oraz posiadać polerowane powierzchnie, zaokrąglone krawędzie (promień krzywizny 0,5 mm) i twardość HRC 58 do 65. Drążony cylinder musi posiadać zewnętrzną średnicę 16 mm, polerowany otwór wiertniczy 10 (+0,005, +0,010) mm i wysokość 13 mm. Przyrząd uderzeniowy jest wyposażony w pośrednie kowadło (średnica 26 mm i 26 mm wysokość) wykonane ze stali i centrowane pierścieniem z otworami, pozwalającymi na ucieczkę dymów.

1.6.2.2. Warunki badania Objętość próbki powinna wynosić 40 mm3 lub objętość właściwą dla dowolnego alternatywnego przyrządu. Stałe substancje powinny być badane w stanie suchym i przygotowywane, jak następuje: Substancje zwykle dostarczane jako pasty, powinny być badane w stanie suchym, tam gdzie to możliwe, lub w każdym razie, po usunięciu maksymalnie możliwej ilości rozpuszczalnika. Ciekłe substancje są badane ze szczeliną 1mm między dolnym i górnym stalowym cylindrem.

1.6.2.2. a)

sproszkowane substancje należy przesiać (wielkość oczek sita: 0,5 mm); do badania wykorzystuje się całą ilość substancji, która przeszła przez sito;

sprasowane, odlewane lub w inny sposób skondensowane substancje są kruszone w małe kawałki i przesiewane; przesiane frakcje średnicy od 0,5 do 1 mm są używane do badania i muszą być reprezentatywne dla substancji oryginalnej.

1.6.2.3. Przeprowadzenie badań Przeprowadza się serie sześciu badań, spuszczając masę 10 kg z wysokości 0,40 m (40 J). Jeżeli w trakcie sześciu badań przy 40 J uzyska się wybuch, należy wykonać serię dalszych sześciu badań, spuszczając masę 5 kg z 0,15 m (7,5 J). W innym przyrządzie próbka jest porównywana z wybraną substancją odniesienia, stosując ustaloną procedurę (np. technikę w górę-w dół itd.).

1.6.2.4. Ocena Wynik badania uważa się za pozytywny, jeżeli zachodzi wybuch (zapalenie się gwałtownym płomieniem jest równoważne wybuchowi i przedstawiane w sprawozdaniu) przynajmniej raz we wszystkich badaniach z określonym przyrządem uderzeniowym lub próbka jest bardziej wrażliwa niż 1,3-dinitrobenzen lub RDX w alternatywnym badaniu na uderzenie.

1.6.3. Wrażliwość mechaniczna (tarcie)

1.6.3.

1.6.3.1. Przyrząd (rysunek 5) Przyrząd do tarcia składa się z płyty bazowej staliwnej, na której zamocowany jest przyrząd tarcia. Składa się on z umocowanych porcelanowych prętów i ruchomej porcelanowej płyty. Płyta porcelanowa jest umieszczona w wózku poruszającym się w dwóch prowadnicach. Wózek jest dołączony do silnika elektrycznego poprzez korbowód, krzywkę mimośrodową i odpowiednią przekładnię, tak że porcelanowa płyta przesuwa się tylko raz, w tył i naprzód poniżej porcelanowego pręta w odległości 10 mm. Pręt porcelanowy może być obciążony przykładowo 120 lub 360 N. Płaska porcelanowa płyta jest wykonana z porcelany technicznej (chropowatość 9 do 32 μm) i posiada wymiary 25 mm (długość) × 25 mm (szerokość) × 5 mm (wysokość). Cylindryczny pręt porcelanowy jest również wykonany z białej technicznej porcelany i ma długość 15 mm, średnicę 10 mm oraz schropowaconą końcową powierzchnię sferyczną o promieniu krzywizny 10 mm.

1.6.3.2. Warunki badania Objętość próbki powinna wynosić 10 mm3 lub objętość odpowiednią dla każdego przyrządu alternatywnego. Stałe substancje powinny być badane w stanie suchym i przygotowywane jak następuje: Substancje zwykle dostarczane jako pasty powinny być badane w stanie suchym, tam gdzie to możliwe. Jeżeli substancja nie może być przygotowana w stanie suchym, pasta (po usunięciu maksymalnie możliwej ilości rozpuszczalnika) jest badana jako warstwa 0,5 mm grubości, 2 mm szerokości, 10 mm długości, przygotowana przy użyciu szablonu.

1.6.3.2. a)

sproszkowane substancje należy przesiać (wielkość oczek sita: 0,5 mm); do badania wykorzystuje się całą ilość substancji, która przeszła przez sito;

sprasowane, odlewane lub w inny sposób skondensowane substancje są kruszone w małe kawałki i przesiewane; do badań używane są przesiane frakcje średnicy mniejszej od 0,5 mm.

1.6.3.3. Przeprowadzenie badań Pręt porcelanowy jest położony na badaną próbkę i obciążany. Podczas przeprowadzania badania ślady gąbki na płytce porcelanowej muszą być położone poprzecznie w stosunku do kierunku ruchu. Należy uważać, aby pręt spoczywał na próbce, aby wystarczająco dużo materiału badanego znajdowało się pod prętem i aby płytka poruszała się prawidłowo pod prętem. Dla substancji w postaci past do nanoszenia substancji na płytę stosuje się szablon o grubości 0,5 mm ze szczeliną 2 × 10 mm. Porcelanowa płyta przesuwa się o 10 mm wprzód i do tyłu pod porcelanowym prętem w czasie 0,44 sekundy. Każda część powierzchni płyty i pręta używana jest tylko raz; dwa końce każdego pręta służą dla dwóch prób, a dwie powierzchnie płyty służą każda do trzech prób. Serię sześciu badań przeprowadza się z obciążeniem 360 N. Jeżeli uzyskuje się pozytywne zdarzenie w czasie trwania tych sześciu badań, następną serię sześciu badań należy wykonać z obciążeniem 120 N. W innych przyrządach, próbka jest porównywana z wybraną substancją odniesienia, stosując ustaloną procedurę (np. technikę w górę-w dół itp.).

1.6.3.4. Ocena Wynik badania jest uważany za pozytywny, jeżeli zaszedł wybuch (zapalenie się gwałtownym płomieniem jest równoważne wybuchowi i przedstawiane w sprawozdaniu) przynajmniej raz w jakimkolwiek z badań przy użyciu wyspecyfikowanego przyrządu do tarcia lub odpowiada kryteriom równoważności w alternatywnym badaniu przez tarcie.

2. DANE W zasadzie, w sensie dyrektywy, substancja jest uważana za przedstawiając niebezpieczeństwo wybuchu, jeżeli uzyskano pozytywny wynik w badaniach wrażliwości na ciepło, uderzenie i tarcie.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

tożsamość, skład, czystość, zawartość wilgoci itd., badanej substancji,

postać fizyczna próbki i czy lub nie była kruszona, rozdrabniana i/lub przesiewana,

obserwacje z czasu trwania badań wrażliwości cieplnej (np. masa próbki, ilość fragmentów itp.),

obserwacje z czasu trwania badań wrażliwości mechanicznej (np. tworzenie znacznych ilości dymu lub całkowity rozkład bez detonacji, płomienie, iskry, detonacja, gwałtowne zapalenie itp.),

wyniki każdego rodzaju badania,

w przypadku gdy wykorzystano alternatywny przyrząd, należy podać uzasadnienie naukowe oraz dowody na korelację między wynikami uzyskanymi przy pomocy podanego przyrządu i przyrządu równoważnego,

wszelkie użyteczne uwagi, takie jak odniesienie do badań produktów podobnych, które mogą być istotne dla prawidłowej interpretacji wyników.

wszelkie dodatkowe uwagi istotne dla interpretacji wyników.

3.2. INTERPRETACJA I OCENA WYNIKÓW W sprawozdaniu z badań należy podać wszelkie wyniki uznane za fałszywe, stanowiące anomalię lub niereprezentatywne. W przypadku gdyby którykolwiek z wyników powinien zostać odrzucony, należy podać wszelkie alternatywne lub dodatkowe badania. Pomimo wytłumaczenia anomalnych wyników muszą być zaakceptowane ich wartość nominalne i zastosowane do zgodnej z nimi klasyfikacji substancji.

4.(1)(2)(3)(4)

LITERATURA Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 and 30-42. NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial use –Determination of explosion risk.

A.15. TEMPERATURA SAMOZAPŁONU (CIECZE I GAZY)

A.15.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Badaniu temu należy poddać substancje wybuchowe i substancje ulegające samoistnemu zapaleniu w kontakcie z powietrzem w temperaturze otoczenia. Procedura badania nadaje się do stosowania dla gazów, cieczy i par, które w obecności powietrza mogą zapalić się od gorącej powierzchni. Temperatura samozapłonu może ulec znacznemu zmniejszeniu w obecności zanieczyszczeń katalitycznych, przez powierzchnię materiału lub większą objętość naczynia do badania.

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Stopień samozapalności jest wyrażony w warunkach temperatury samozapłonu. Temperatura ta to najniższa temperatura, w której badana substancja zapali się po zmieszaniu jej z powietrzem w warunkach podanych w opisie metody badania.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Substancje odniesienia zacytowano w normach (zob. 1.6.3). Powinny one służyć głównie do sprawdzenia od czasu do czasu zdolności metody i umożliwiać porównanie z wynikami uzyskanymi innymi metodami.

1.4. ZASADA METODY Metoda wyznacza minimalną temperaturę powierzchni wewnętrznej obudowy, która powoduje zapalenie się gazu, pary lub cieczy wtryśniętej do obudowy.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Powtarzalność zmienia się w zależności zakresu temperatur samozapłonu i zastosowanej metody badania. Czułość i specyficzność zależą od zastosowanej metody badania.

1.6. OPIS METODY

1.6.

1.6.1. Przyrząd Przyrząd jest opisany w metodzie podanej w 1.6.3.

1.6.2. Warunki badania Badanie próbki substancji badanej przeprowadza się zgodnie z metodą określoną w 1.6.3.

1.6.3. Przeprowadzenie badania Zob. IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. DANE Zapisać temperaturę badania, ciśnienie atmosferyczne, ilość wykorzystanej próbki, odstęp czasowy do uzyskania zapłonu.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia),

ilość użytej próbki, ciśnienie atmosferyczne,

zastosowany przyrząd,

wyniki pomiarów (temperatury badania, wyniki dotyczące zapłonu, odpowiednie opóźnienia),

wszelkie dodatkowe uwagi istotne dla interpretacji wyników.

4. LITERATURA Brak.

A.16. WZGLĘDNA TEMPERATURA SAMOZAPŁONU DLA CIAŁSTAŁYCH

A.16.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Badaniu temu nie należy poddawać substancji wybuchowych i substancji ulegających samoistnemu zapaleniu w kontakcie z powietrzem w temperaturze otoczenia. Celem niniejszego badania jest przedstawienie wstępnych informacji na temat samozapłonu substancji stałych w podwyższonych temperaturach. W przypadku gdy temperatura powstała albo w reakcji substancji z tlenem lub podczas rozkładu egzotermicznego nie zostaje wystarczająco szybko utracona do otoczenia, dochodzi do samopodgrzania, co z kolei prowadzi do samozapłonu. Do samozapłonu dochodzi więc wtedy, gdy szybkość wytwarzania ciepła przekracza szybkość jego utraty. Procedura badania jest przydatna jako wstępne badanie klasyfikacyjne substancji stałych. Ze względu na złożony charakter zapłonu i spalania się ciał stałych temperatura samozapłonu ustalona przy użyciu tej metody badania powinna być wykorzystywana wyłącznie do celów porównawczych.

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Temperatura samozapłonu uzyskana przy użyciu tej metody to minimalna temperatura otoczenia wyrażona w oC, w której pewna objętość substancji będzie ulegać zapaleniu w określonych warunkach.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.4. ZASADA METODY Pewna ilość substancji do badań jest umieszczana w piecu w temperaturze pokojowej; krzywa temperatura/czas wiążąca warunki w środku próbki jest rejestrowana do momentu, gdy temperatura pieca wzrośnie do 400 oC, lub do temperatury topnienia, jeśli jest niższa, z szybkością 0,5 oC/min. Do celu niniejszego badania, temperatura pieca w której temperatura próbki osiągnie 400 oC przez samopodgrzanie jest zwana temperaturą samozapłonu.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Brak.

1.6. OPIS METODY

1.6.

1.6.1. Przyrząd

1.6.1.

1.6.1.1. Piec Piec laboratoryjny (o objętości około 2 litrów) z programatorem temperatury wyposażony w obieg naturalnego powietrza i zawór przeciwwybuchowy. W celu zapobieżenia ewentualnemu ryzyku wybuchu wszystkie gazy pochodzące z rozkładu nie mogą wejść w kontakt z elementami ogrzewania elektrycznego.

1.6.1.2. Kostka z siatki drucianej Kawałek drucianej siatki stalowej o otworach oczek 0,045 mm należy wyciąć zgodnie z szablonem przedstawionym na rysunku 1. Siatkę składa się i zabezpiecza drutem u góry otwartego kubka.

1.6.1.3. Termoogniwa Odpowiednie termoogniwa.

1.6.1.4. Rejestrator Dowolny rejestrator dwukanałowy, wykalibrowany od 0 do 600 oC lub o odpowiednim napięciu.

1.6.2. Warunki badania Substancje są badane w stanie otrzymanym.

1.6.3. Przeprowadzenie badania Kostkę napełnia się badaną substancją i łagodnie uklepuje, dodając substancję, aż kostka będzie całkowicie wypełniona. Następnie próbkę zawiesza się pośrodku pieca w temperaturze pokojowej. Jedno termoogniwo umieszcza się pośrodku kostki, a drugie między kostką i ścianą pieca w celu zapisywania temperatury w piecu. Prowadzi się ciągły zapis temperatury pieca i próbki podczas podwyższania temperatury pieca do 400 oC lub do temperatury topnienia substancji stałej, jeżeli ta ostatnia jest niższa, z szybkością 0,5 oC/min. Gdy substancja się zapali, termoogniwo w próbce pokaże bardzo ostry wzrost temperatury powyżej temperatury w piecu.

2. DANE Temperatura pieca przy której temperatura próbki osiąga 400 oC przez samopodgrzanie jest stosowana do obliczeń (zob. rysunek 2).

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

opis badanej substancji,

wyniki pomiarów, włącznie z krzywą zależności temperatura/czas,

wszelkie dodatkowe uwagi istotne dla interpretacji wyników.

4. BIBLIOGRAFIA NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

4. Rysunek 1 Szablon kostki do badań 20 mm

Rysunek 2 Typowa krzywa zależności temperatura/czas

Temperatura próbki Temperatura pieca Temperatura zapłonu čas

A.17. WŁAŚCIWOŚCI UTLENIAJĄCE (CIAŁA STAŁE)

A.17.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Do przeprowadzenia badania przydatne jest posiadanie wstępnych informacji na temat ewentualnych właściwości wybuchowych substancji. Niniejsze badanie nie jest przeznaczone dla cieczy, gazów, substancji wysoce łatwopalnych i wybuchowych lub nadtlenków organicznych. Niniejsze badanie nie musi być prowadzone, gdy analiza wzoru strukturalnego chemicznego ustala ponad wszelkie wątpliwości, że substancja jest niezdolna do egzotermicznego reagowania z materiałem palnym. W celu upewnienia się, czy badanie nie powinno być przeprowadzone z zastosowaniem szczególnych środków ostrożności, należy wykonać badanie wstępne.

1.2. DEFINICJAI JEDNOSTKI Czas spalania: czas reakcji, w sekundach, jaki zabiera strefie reakcyjnej przejście wzdłuż stosu, zgodnie z procedurą określoną w 1.6. Szybkość spalania: wyrażana w milimetrach na sekundę. Maksymalna szybkość spalania: największe wartości szybkości spalania uzyskane w przypadku mieszanin zawierających od 10 do 90 % wagowych utleniacza.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Azotan baru (czystości analitycznej) jest używany jako substancja odniesienia w próbie właściwej i w badaniu wstępnym. Mieszaniną odniesienia jest ta mieszanina azotanu baru ze sproszkowaną celulozą, przygotowana zgodnie z ppkt 1.6, która charakteryzuje się maksymalną szybkością spalania (zazwyczaj mieszanina z 60 % azotanem baru wagowo).

1.4. ZASADA METODY Dla zachowania bezpieczeństwa przeprowadza się badanie wstępne. Nie wymaga się prowadzenia dalszych badań, gdy wstępne badanie wyraźnie wskazuje, że badana substancja posiada właściwości utleniające. Jeżeli to nie jest ten przypadek, substancja musi być przedmiotem pełnego badania. W pełnym badaniu substancję badaną i określoną substancję palną należy mieszać z różną szybkością. Z każdej mieszaniny formuje się następnie stos, który jest zapalany z jednej strony. Maksymalną ustaloną szybkość spalania porównuje się z maksymalną szybkością spalania mieszaniny odniesienia.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI W razie potrzeby można zastosować dowolną metodę mielenia i mieszania, o ile różnica maksymalnej szybkości spalania w sześciu oddzielnych badaniach będzie odbiegać od wartości średniej arytmetycznej o nie więcej niż 10 %.

1.6. OPIS METODY

1.6.

1.6.1. Przygotowanie

1.6.1.

1.6.1.1. Substancja badana Zmniejszyć wielkość ziarna badanej próbki do wielkości ziarna < 0,125 mm, stosując następującą procedurę: przesiać badaną substancję, rozdrobnić pozostałą frakcję, powtarzać procedurę do momentu, gdy cała porcja do badań przejdzie przez sito. Można zastosować dowolną metodę mielenia lub przesiewania spełniającą kryteria jakościowe. Przed przygotowaniem mieszaniny substancję suszy się w temperaturze 105 oC, do uzyskania stałej masy. W przypadku rozkładu badanej substancji w temperaturze poniżej 105 oC substancję tę należy wysuszyć w odpowiedniej, niższej temperaturze.

1.6.1.2. Substancja palna Jako substancję palną wykorzystuje się sproszkowaną celulozę. Celuloza powinna być rodzaju stosowanego w chromatografii cienkowarstwowej lub chromatografii kolumnowej. Odpowiednim sprawdzonym typem jest celuloza z więcej niż 80 % włókien o długości między 0,020 i 0,075 mm. Proszek celulozy jest przesiewany przez sito o wymiarze oczka 0,125 mm. Poprzez całe badanie stosuje się tę samą partię celulozy. Przed przygotowaniem mieszaniny sproszkowana celuloza jest suszona w 105 oC do chwili uzyskania stałej masy. Jeżeli w badaniu wstępnym stosowana jest mączka drzewna, należy przygotować mączkę drzewną z miękkiego drewna, poprzez zebranie porcji, która przechodzi oczko siatki 1,6 mm, energicznie wymieszać, a następnie suszyć w 105 oC przez cztery w warstwie nie grubszej niż 25 mm. Ochłodzić i przechowywać w hermetycznym pojemniku, w pełni wypełnionym jak to praktycznie wymagane, najlepiej w obrębie czasu 24 godzin od wysuszenia.

1.6.1.3. Źródło zapłonu Jako źródła zapłonu należy użyć gorącego płomienia gazowego palnika (średnicy minimum 5 mm). Jeżeli stosuje się inne źródło zapłonu (np. przy badaniu w atmosferze obojętnej), należy przedstawić w sprawozdaniu opis i uzasadnienie.

1.6.2. Przeprowadzenie badania Uwaga: Mieszaniny utleniaczy z celulozą lub mączką drzewną muszą być traktowane jako potencjalnie wybuchowe i należy obchodzić się z nimi z należytą ostrożnością.

1.6.2.

1.6.2.1. Badanie wstępne Wysuszona substancja jest wymieszana z wysuszoną celulozą lub mączką drzewną w proporcjach 2 części substancji badanej na 1 część celulozy lub mączki drzewnej wagowo, po czym z mieszaniny kształtuje się mały, stożkowaty stos o wymiarach 3,5 cm (średnica podstawy) × 2,5 cm (wysokość) przez napełnienie, bez ubijania, stożkowatej formy (np. szklanego lejka laboratoryjnego z zatkaną szyjką). Stos umieszcza się na chłodnej, niepalnej, nieporowatej płycie bazowej o niskim przewodnictwie cieplnym. Badanie należy przeprowadzić w szafie wyciągowej, tak jak opisano w 1.6.2.2. Źródło zapłonu wchodzi w kontakt ze stożkiem. Należy zaobserwować i zapisać intensywność i czas trwania ostatecznej reakcji. Substancja jest uważana za utleniającą, jeżeli reakcja zachodzi gwałtownie. W każdym przypadku, gdy wynik można poddać w wątpliwość, konieczne jest przeprowadzenie pełnej serii badań opisanych powyżej.

1.6.2.2. Badanie impulsowe Przygotować kolejne porcje mieszaniny utleniacza/celulozy zawierające od 10 do 90 % wagowych części utleniacza w odstępach co 10 %. Dla granicznych przypadków należy użyć mieszanin pośrednich utleniacz/celuloza, dla uzyskania maksymalnej szybkości spalania bardziej precyzyjnie. Należy uformować stos przy pomocy formy. Forma jest wykonana z metalu, ma długość 250 mm i trójkątny przekrój, przy czym jej wewnętrzna wysokość wynosi 10 mm, a wewnętrzna szerokość – 20 mm. Po obu stronach formy w kierunku wzdłużnym montuje się dwie blaszki jako ograniczenia poprzeczne wystające na 2 mm poza górną krawędź trójkątnego przekroju (rysunek). Niniejszy układ jest luźno napełniany lekkim nadmiarem mieszaniny. Po jednokrotnym upuszczeniu formy z wysokości 2 cm na twardą powierzchnię pozostały nadmiar substancji należy zeskrobać przy pomocy skośnie ustawionego arkusza. Następnie ograniczenia poprzeczne należy usunąć i wygładzić pozostały proszek przy pomocy wałka. Następnie na górze formy umieszcza się niepalną, nieporowatą o niskim przewodnictwie cieplnym, płytę bazową, odwraca przyrząd i zdejmuje formę. Ustawić stos w kierunku prostopadłym do ciągu powietrza w szafie wyciągowej. Szybkość przepływu powietrza powinna być wystarczająca do zapobieżenia przedostaniu się dymu do laboratorium i nie powinna być zmieniana w trakcie badania. Wokół przyrządu należy ustawić ekran chroniący przed ciągiem powietrza. Ze względu na higroskopijność celulozy i badanych substancji, badanie należy przeprowadzić jak najszybciej. Zapalić jeden z końców stosu przez dotknięcie płomieniem. Zmierzyć czas reakcji na odległości 200 mm po tym, jak strefa reakcji rozprzestrzeni się z początkowej odległości 30 mm. Badanie przeprowadza się z substancją odniesienia i przynajmniej raz dla każdego z zakresów mieszanin badanej substancji z celulozą. Jeżeli maksymalna szybkość spalania okazuje się być znacząco większa niż ta z mieszaniny odniesienia, badanie należy wstrzymać; poza tym badanie musi być powtarzane pięć razy dla każdej z trzech mieszanin dających największą szybkość spalania. Jeżeli wynik podejrzewany jest o nieprawdziwie pozytywny, należy powtórzyć badanie, stosując obojętną substancję o podobnej wielkości ziarna, taką jak diatomit w miejsce celulozy. Alternatywnie mieszanina badana substancja/celuloza o największej szybkości spalania powinna być ponownie zbadana w obojętnej atmosferze (< 2 % wagowych zawartości tlenu).

2. DANE Ze względów bezpieczeństwa maksymalna szybkość spalania – nie jej wartość średnia – musi być uważana za charakterystyczną właściwością utleniającą substancji badanej. Istotne znaczenie dla oceny ma najwyższa wartość szybkości spalania w serii sześciu badań danej mieszaniny. Sporządzić wykres najwyższej wartości szybkości spalania dla każdej mieszaniny w zależności od stężenia utleniacza. Z wykresu należy wziąć maksymalną szybkość spalania. Sześć zmierzonych wartości szybkości spalania w obrębie serii uzyskanej z mieszaniną z maksymalną szybkością spalania nie może odbiegać od wartości średniej arytmetycznej o więcej niż 10 %; w innym przypadku należy poprawić metody mielenia i mieszania. Należy porównać maksymalną uzyskaną szybkość spalania z maksymalną szybkością spalania mieszaniny odniesienia (zob. 1.3). Jeżeli badania przeprowadzono w obojętnej atmosferze, maksymalną szybkość reakcji porównuje się z tą z mieszaniny odniesienia w atmosferze obojętnej.

3. SPRAWOZDANIE

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

tożsamość, skład, czystość, zawartość wilgoci i tym podobne dane badanej substancji,

wszelkie procesy przetwarzania, którym była poddawana próbka badana (np. mielenie, suszenie itp.),

źródło zapłonu używane w badaniach,

wyniki pomiarów,

sposób zachodzenia reakcji (np. błyskawiczne spalanie na powierzchni, spalanie w całej masie, wszelkie informacje dotyczące produktów spalania itp.),

wszelkie dodatkowe uwagi istotne dla interpretacji wyników, włącznie z opisem intensywności reakcji (płomienie, iskry, dymy, powolne tlenie się itp.) oraz przybliżony czas trwania uzyskany we wstępnym badaniu ze względów bezpieczeństwa/klasyfikacyjnym w przypadku zarówno substancji badanej, jak i substancji odniesienia,

wyniki badań substancji obojętnej, jeśli stosowano,

wyniki z badań w obojętnej atmosferze, jeśli stosowano.

3.2. INTERPRETACJA WYNIKU Substancja jest uważana za substancję utleniającą, gdy: W celu zapobieżenia wynikom nieprawdziwie pozytywnym wyniki uzyskane przy badaniu substancji zmieszanej z materiałem obojętnym i/lub przy badaniu w atmosferze obojętnej muszą być także rozważone przy interpretacji wyników.

3.2. a)

we wstępnym badaniu zachodzi gwałtowna reakcja;

w pełnym badaniu maksymalna szybkość spalania badanych mieszanin jest wyższa lub równa maksymalnej szybkości spalania mieszaniny odniesienia z celulozy i azotanu baru.

4. LITERATURA NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

A.18. ŚREDNIA LICZBOWA MASA CZĄSTECZKOWA I ROZKŁAD MASY CZĄSTECZKOWEJ POLIMERÓW

A.18.

1. METODA Niniejsza metoda chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC) jest powtórzeniem OECD TG 118 (1996). Podstawowe zasady i dalsze informacje techniczne są podane w pozycji bibliograficznej (1).

1.

1.1. WPROWADZENIE Skoro właściwości polimerów są tak zróżnicowane, nie istnieje możliwość opisania jednej metody ustalającej dokładnie warunki rozdzielania i oceny, która obejmuje wszystkie ewentualności i specyficzne przypadki występujące przy rozdzielaniu polimerów. W szczególności złożone systemy polimerów nie ulegają często chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC). Jeśli GPC nie jest praktykowana, masa cząsteczkowa może być oznaczona za pomocą innych metod (zob. załącznik). W takich przypadkach powinny zostać podane pełne dane szczegółowe i uzasadnienia dla wykorzystanych metod. Opisana metoda oparta jest na normie DIN 55672 (1). Szczegółowe informacje o tym, w jaki sposób mają być przeprowadzane doświadczenia oraz w jaki sposób oceniać dane, można znaleźć w powyższej normie DIN. W przypadku gdy niezbędne są modyfikacje warunków doświadczalnych, zmiany te muszą być uzasadnione. Inne normy mogą być używane jedynie, gdy istnieją do nich pełne odniesienia. Opisana metoda wykorzystuje próbki polistyrenu o znanej polidyspersyjności do kalibracji i może istnieć konieczność zmodyfikowania jej, aby była odpowiednia dla niektórych polimerów, np. rozpuszczalnych w wodzie oraz polimerów o długich rozgałęzionych łańcuchach.

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Średnia liczbowo masa cząsteczkowa Mn i średnia wagowo masa cząsteczkowa Mw są oznaczane, wykorzystując następujące równania: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi gdzie: Hi jest poziomem sygnału detektora z linii podstawowej dla objętości retencji Vi, Mi jest masą cząsteczkową polimerowej frakcji przy objętości retencji Vi, oraz n jest liczbą punktów pomiarowych. Rozpiętość rozkładu masy cząsteczkowej, która jest miarą stopnia dyspersji systemu, jest podana na podstawie stosunku Mw/Mn.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA GPC jest metodą względną i w związku z tym musi zostać podjęta kalibracja. Zwykle do tego celu jest wykorzystywany polistyren w niewielkim stopniu rozproszony, o liniowej budowie, posiadający średnie masy cząsteczkowe Mn i Mw oraz znany rozkład masy cząsteczkowej. Krzywa kalibracji może być wykorzystywana w oznaczaniu masy cząsteczkowej nieznanej próbki wyłącznie, jeżeli warunki rozdzielenia próbki oraz wzorce zostały wybrane w identyczny sposób. Określony związek między masą cząsteczkową oraz objętością elucji jest ważny wyłącznie w specyficznych warunkach, w których przeprowadzane jest konkretne doświadczenie. Warunki obejmują przede wszystkim temperaturę, rozpuszczalnik (lub mieszaninę rozpuszczalników), warunki chromatografii oraz kolumnę rozdzielającą lub systemy kolumn. Masy cząsteczkowe próbki oznaczone w ten sposób są odpowiednimi wartościami oraz są opisane jako ciężar równoważnikowy polistyrenu. Oznacza to, że w zależności od strukturalnych i chemicznych różnic między próbką a wzorcami masy cząsteczkowe mogą odchylać się od wartości absolutnych/całkowitych w większym lub mniejszym stopniu. Jeżeli wykorzystywane są inne wzorce, np. glikolu polietylenowego, tlenku polietylenu, metaakrylanu polimetylu, kwasu poliakrylowego, należy podać odpowiednie przyczyny.

1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ Zarówno rozkład masy cząsteczkowej próbki jak i średnie masy cząsteczkowe (Mn, M w) mogą być oznaczane, wykorzystując GPC. GPC jest szczególnym rodzajem chromatografii cieczowej, w której próbka jest rozdzielana według hydrodynamicznych objętości pojedynczych składników (2). Rozdzielenie następuje, kiedy próbka przechodzi przez kolumnę, która jest wypełniona porowatym materiałem – zazwyczaj organicznym żelem. Małe cząsteczki mogą wnikać w pory, podczas gdy duże cząsteczki są wykluczane. Droga dużych cząsteczek jest z tego względu krótsza i to one są poddane procesowi elucji w pierwszej kolejności. Średnich rozmiarów cząsteczki wnikają w niektóre pory i są później poddawane elucji. Najmniejsze cząsteczki o średnim hydrodynamicznym promieniu, mniejszym niż pory żelu, mogą wnikać we wszystkie pory. Poddawane są elucji na końcu. W sytuacji idealnej rozdzielanie jest kontrolowane wyłącznie przez wielkość czasteczki gatunku, ale w praktyce trudno jest uniknąć co najmniej niewielkich zakłócających efektów absorbcyjnych. Nierówne wypełnienia kolumny oraz objętości martwe mogą pogorszyć sytuację (2). Detekcji dokonuje się przez np. współczynnik załamania światła lub pochłaniania promieni UV i daje w wyniku nieskomplikowaną krzywą rozkładu. Jednakże w celu przypisania rzeczywistych wartości masy cząsteczkowej do krzywej niezbędne jest poddanie kolumny kalibracji przez przepuszczanie polimerów o znanej masie cząsteczkowej oraz, w idealnym przypadku, o podobnej strukturze, np. różnych wzorców polistyrenowych. Krzywa Gaussa, powstająca zazwyczaj w ten sposób, czasami wypaczona jest małymi ogonami skierowanymi w stronę małych mas cząsteczkowych, oś pionowa wskazuje jakość w masie różnych wyeluowanych odmian polistyrenu, a oś pozioma wskazuje logarytm z masy cząsteczkowej.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Powtarzalność (względne odchylenie standardowe: RSD) objętości eluowania powinna być lepsza niż 0,3 %. Wymagana powtarzalność analizy musi być zapewniona przez korektę dokonywaną poprzez wzorce wewnętrzne, jeżeli chromatogram jest uzyskiwany w zależności od czasu i nie odpowiada wyżej wspomnianym kryteriom (1). Polidyspersyjności są zależne od mas cząsteczkowych wzorców. W przypadku wzorców polistyrenowych typowe wartości to: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp jest masą cząsteczkową wzorca w maksimum piku)

1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.6.

1.6.1. Przygotowanie roztworów wzorcowych polistyrenu Wzorce polistyrenu są rozpuszczane przez ostrożne mieszanie w wybranym eluencie. Zalecenia wytwórcy muszą być uwzględnione w trakcie przygotowania roztworu. Stężenia wybranych wzorców są zależne od wielu czynników, np. od objętości wstrzykiwanej substancji, lepkości roztworu oraz czułości detektora analitycznego. Maksymalna objętość injekcji musi być dostosowana do długości kolumny, w celu uniknięcia przeładowania. Typowe objętości injekcji dla analitycznego rozdzielenia przy użyciu GPC z kolumną o wymiarach 30 cm × 7,8 mm wynoszą na ogół 40–100 μl. Wyższe objętości są możliwe, ale nie powinny przekraczać 250 μl. Optymalny stosunek między objętością injekcji a stężeniem musi być określony przed rzeczywistą kalibracją kolumny.

1.6.2. Przygotowywanie roztworu próbki Zasadniczo te same wymagania stosuje się do przygotowywania roztworów próbek. Próbka jest rozpuszczana w odpowiednim rozpuszczalniku, np. tetrahydrofuranie (THF), przez lekkie wstrząsanie. W żadnym okolicznościach nie powinno się rozpuszczać próbki w wannie ultradźwiękowej. W razie konieczności próbka roztworu jest oczyszczana poprzez membranowy filtr posiadający pory o wymiarach między 0,2 a 2 μ m. Obecność nierozpuszczalnych cząstek musi być zapisana w sprawozdaniu końcowym, ponieważ może to być odpowiednie dla próbek o dużej masie cząsteczkowej. Powinna zostać wykorzystana odpowiednia metoda w celu określenia udziału procentowego w masie rozpuszczonych cząstek. Roztwór powinien zostać wykorzystany w ciągu 24 godzin.

1.6.3. Aparatura: Należy zapewnić, że system GPC jest obojętny w odniesieniu do stosowanych rozpuszczalników (np. przez wykorzystanie stalowych kapilar w przypadku rozpuszczalnika THF).

zbiornik na rozpuszczalnik,

odgazowywacz (w danym przypadku),

pompa,

nawilżacz pulsowy (w danym przypadku),

system wtryskowy,

kolumny chromatograficzne,

detektor,

przepływomierz (w danym przypadku),

urządzenie rejestrujące dane,

naczynie na odpady.

1.6.4. System wtryskowy i system dostarczający rozpuszczalnik Określona objętość roztworu próbki jest umieszczona w kolumnie albo wykorzystując automatyczny próbnik, albo ręcznie w ściśle określonej strefie. Zbyt szybkie wycofywanie lub zniżanie tłoka nurnikowego, jeśli jest wykonywane ręcznie, może spowodować zmiany w obserwowanym rozkładzie masy cząsteczkowej. System dostarczający rozpuszczalnik, na ile jest to możliwe, powinien być wolny od pulsacji, co można osiągnąć przez wbudowanie do niego tłumika pulsacji. Szybkość przepływu wynosi 1 ml/min.

1.6.5. Kolumna W zależności od próbki właściwości polimeru oznacza się albo za pomocą prostej kolumny, albo kilku kolumn połączonych w sekwencję. Pewna ilość materiałów porowatych kolumn o określonych właściwościach dostępna jest w ogólnej sprzedaży (np. rozmiar porów, granica ekskluzji). Wybór żelu rozdzielającego lub długość kolumny jest uzależniona zarówno od właściwości próbki (objętości hydrodynamiczne, rozkład masy cząsteczkowej), jak i od specyficznych warunków rozdzielania, takich jak rozpuszczalnik, temperatura i prędkość przepływu (1) (2) (3).

1.6.6. Półki teoretyczne Kolumna lub połączenie kolumn wykorzystywanych do rozdzielania musi być scharakteryzowana przez ilość półek teoretycznych. Obejmuje to, w przypadku THF jako rozpuszczalnikia eluencyjnego, umieszczenie roztworu etylobenzenu lub innych odpowiednich niepolarnych substancji rozpuszczonych w kolumnie o znanej długości. Liczba półek teoretycznych jest uzyskiwana na podstawie następującego równania: N=5,54VeW1/22 lub N=16VeW2 gdzie: N jest liczbą półek teoretycznych, Ve jest objętością eluecyjną w maksimum piku, W jest podstawową szerokością piku, W1/2 jest szerokością piku w połowie wysokości.

1.6.7. Wydajność rozdzielania Oprócz liczby półek teoretycznych, która jest określającą ilościowo szerokością pasma, ważną rolę odgrywa także wydajność rozdzielenia, będąca określana przez nachylenie krzywej kalibracyjnej. Wydajność rozdzielania kolumny jest uzyskiwana z następującego stosunku: Ve,Mx-Ve,(10Mx)pole przekroju poprezecznego kolumny≥6,0 cm3cm2 gdzie: Ve, Mx jest objętością elucyjną dla polistyrenu o masie cząsteczkowej Mx, Ve,(10.Mx) jest objętością elucyjną dla polistyrenu o 10-krotnie większej masie cząsteczkowej Mx. Rozkład systemu jest zwykle określany w następujący sposób: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 Gdzie: Ve1, Ve2 są objętościami eluencyjnymi dwóch wzorców polistyrenowych w maksimum piku, W1, W2 są szerokościami piku linii podstawowej, M1, M2 są masami cząsteczkowymi w maksimum piku (powinny różnić się współczynnikiem o 10). Wartość R dla systemu kolumn powinna być większa niż 1, 7 (4).

1.6.8. Rozpuszczalniki Wszystkie rozpuszczalniki muszą posiadać wysoką czystość (dla THF używana jest czystość 99,5 %). Zbiornik na rozpuszczalnik (o ile jest to konieczne – w atmosferze gazu obojętnego) musi być odpowiednio duży dla kalibracji kolumny i analiz wielu próbek. Rozpuszczalnik musi być odgazowany zanim zostanie przeniesiony do kolumny za pomocą pompy.

1.6.9. Kontrola temperatury Temperatura krytycznych komponentów wewnętrznych (pętla wtryskowa, kolumny, detektor i przewody) powinna być stała i zgodna z wyborem rozpuszczalnika.

1.6.10. Detektor Zadaniem detektora jest rejestracja ilościowa stężenia próbki eluowanej z kolumny. W celu uniknięcia niepotrzebnego poszerzenia pików, objętość kuwety komórki detektora musi być tak mała, jak to tylko jest możliwe. Nie powinna być większa niż 10 μl, z wyjątkiem detektorów mierzących światło rozproszone oraz lepkość. W celu detekcji zazwyczaj używana jest refraktometria różnicowa. Jednakże jeżeli wymagają tego właściwości próbki lub właściwości eluacyjne rozpuszczalnika, mogą być używane inne rodzaje detektora, np. UV/VIS, IR, detektory lepkości itd.

2. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDAŃ

2.

2.1. DANE Powinno nastąpić odniesienie do normy DIN (1) w celu uzyskania szczegółowych kryteriów oceny, jak również do wymogów odnoszących się do zbierania i przetwarzania danych. Dla każdej próbki muszą zostać przeprowadzone dwa niezależne doświadczenia. Próbki muszą być analizowane pojedynczo. Dla każdego pomiaru muszą być zapewnione Mn, Mw, Mw/Mn, Mp.. Niezbędne jest wyraźne wskazanie, że zmierzone wartości są wartościami względnymi, równoważnymi masom cząsteczkowym użytych wzorców. Po określeniu objętości retencji lub czasów retencji (możliwie poprawionych, wykorzystując wzorzec wewnętrzny) wartości logarytmu Mp (Mp będącego maksymalną wartością piku wzorca kalibracji) są wykreślane w oparciu o jedną z tych wielkości. Niezbędne są co najmniej dwa punkty kalibracji na dekadę masy cząsteczkowej oraz wymagane jest co najmniej pięć punktów pomiarowych dla całkowitej krzywej, która powinna obejmować oszacowaną masę cząsteczkową próbki. Niska wartość punktu końcowego masy cząsteczkowej krzywej wzorcowania jest oznaczana za pomocą n-heksylobenzenu lub innego odpowiedniego niepolarnego roztworu. Średnia liczbowo i średnia wagowo masa cząsteczkowa są zwykle określane za pomocą przetwarzania danych elektronicznych, w oparciu o wzory z sekcji 1.2. W przypadku gdy używana jest ręczna digitalizacji, można powołać się na ASTMD 3536-91 (3). Krzywa rozkładu musi być dostarczona w formie tabeli lub ilustracji (różnicowa częstotliwość lub procent sumy w oparciu o logarytm M). Na wizerunku graficznym jedna dekada masy cząsteczkowej powinna mieć normalnie około 4 cm szerokości, a maksymalna wartość szczytowa około 8 cm wysokości. W przypadku krzywych całkowego rozkładu różnica w rzędnych między 0 a 100 % powinna wynosić około 10 cm.

2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

2.2.

2.2.1. Substancja badana:

dostępne informacje dotyczące substancji badanej (tożsamość, dodatki, zanieczyszczenia),

opis przetwarzania próbki, uwagi, problemy.

2.2.2. Oprzyrządowanie:

zbiornik z eluentem, obojętny gaz, odgazowywanie eluenta, skład eluenta, zanieczyszczenia,

pompa, pulsowy tłumik, system wtryskowy,

kolumny rozdzielające (wytwórca, wszystkie informacje dotyczące właściwościach kolumn, takie jak rozmiar poru, rodzaj rozdzielającego materiału itd., liczba, długość oraz kolejność użytych kolumn),

liczba teoretycznych półek kolumny (lub połączonych kolumn), wydajność rozdzielania, (rozdzielczość tego systemu),

informacja dotycząca symetrii pików,

temperatura kolumny, rodzaj sterowania temperaturą,

detektor (zasada pomiarów, rodzaj, objętość kuwety),

przepływomierz w przypadkach, kiedy jest używany (wytwórca, zasada pomiarów),

system umożliwiający rejestrację i przetwarzanie danych (osprzęt i oprogramowanie).

2.2.3. Kalibracja systemu:

szczegółowy opis metody używanej w celu skonstruowania krzywej kalibracji,

informacja dotycząca kryteriów jakościowych dla tej metody (np. współczynnik korelacji, błąd sumy kwadratów itd.),

informacje dotyczące ekstrapolacji, założenia i przybliżenia, poczynione w trakcie procedury doświadczalnej oraz szacowania i przetwarzania danych,

wszystkie pomiary przeprowadzone w celu konstrukcji krzywej kalibracji powinny być udokumentowane w tabelach, które zawierają następujące informacje dla każdego z punktów kalibracji:

nazwa próbki,

wytwórca próbki,

wartości charakterystyczne wzorców: Mp, Mn, Mw oraz Mw/Mn, dostarczone przez wytwórcę lub na podstawie odpowiednich pomiarów, razem ze szczegółami dotyczącymi metody oznaczania,

objętość oraz stężenie wstrzykiwanej próbki,

wartość Mp używana dla kalibracji,

objętość eluencyjna lub poprawiony czas retencji, mierzony przy maksimach piku,

Mp obliczone przy maksimum piku,

błąd procentowy wyliczonej Mp oraz wartość kalibracyjna.

2.2.4. Ocena:

ocena na podstawie czasu: wszystkie metody mające na celu zapewnienie wymaganej odtwarzalności (metoda poprawiania, wzorce wewnętrzne itd.)

informacja dotycząca tego, czy ocena została przeprowadzona na podstawie objętości eluencyjnej lub czasu retencji,

informacja dotycząca ograniczeń oceny, jeżeli pik nie został poddany analizie w całości,

opis metod wygładzających, jeżeli są wykorzystywane,

procedury przygotowawcze oraz wstępnego przetworzenia próbki,

obecność nierozpuszczalnych cząstek, jeżeli istnieją,

objętość wtrysku (μl) oraz stężenie wtrysku (mg/ml),

uwagi wskazujące skutki, które prowadzą do odchyleń od idealnego profilu GPC,

szczegółowy opis wszystkich zmian w procedurach badawczych,

szczegóły dotyczące zakresów błędów,

wszystkie inne informacje oraz uwagi istotne w odniesieniu do interpretacji wyników.

3.(1)(2)(3)(4)

BIBLIOGRAFIA DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tertrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and MolecularWeight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.19. ZAWARTOŚĆ POLIMERÓW O MAŁEJ MASIE CZĄSTECZKOWEJ

A.19.

1. METODA Niniejsza metoda chromatografii żelowo-permeacyjnej jest powtórzeniem OECD TG 119 (1996). Podstawowe zasady i dalsze informacje techniczne są podane w odniesieniach.

1.

1.1. WPROWADZENIE Ze względu na to, że właściwości polimerów są tak zróżnicowane, nie istnieje możliwość opisania pojedynczej metody ustalającej dokładnie warunki rozdzielenia i oceny, która obejmuje wszystkie ewentualności i właściwości pojawiające się w trakcie rozdzielania polimerów. W szczególności złożone systemy polimerów często nie ulegają często chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC). Jeśli GPC nie jest stosowane, masa cząsteczkowa może być ustalona za pomocą innych metod (zob. załącznik). W takich przypadkach powinny zostać podane wszystkie szczegóły i uzasadnienia dla wykorzystanych metod. Opisana metoda oparta jest na normie DIN 55672 (1). Szczegółowe informacje dotyczące tego, w jaki sposób przeprowadzać doświadczenia oraz w jaki sposób oceniać dane, można znaleźć w niniejszej normie DIN. W przypadku gdy niezbędne są zmiany warunków doświadczeń, wspomniane zmiany muszą być uzasadnione. Inne normy mogą być wykorzystywane tylko w przypadku, gdy istnieją do nich pełne odniesienia. Opisana metoda wykorzystuje próbki polistyrenu o znanej polidyspersyjności w odniesieniu do kalibracji oraz może wystąpić konieczność jej zostać zmodyfikowania, tak aby była odpowiednia dla niektórych polimerów, np. polimerów rozpuszczalnych w wodzie i polimerów o długich rozgałęzieniach łańcucha.

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Mała masa cząsteczkowa jest arbitralnie określana jako masa cząsteczkowa poniżej 1000 daltonów. Średnia liczbowo masa cząsteczkowa Mn i średnia wagowo masa cząsteczkowa Mw jest określana przy użyciu następujących równań: : Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi gdzie: HI jest poziomem detektora sygnału z linii podstawowej dla objętości retencyjnej Vi, Mi jest masą cząsteczkową polimerowej frakcji przy objętości retencyjnej Vi, i n jest liczbą punktów pomiarowych. Szerokość rozkładu masy cząsteczkowej, który jest miarą dyspersyjności systemu, jest podana na podstawie stosunku Mw/Mn.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Ze względu na to, że GPC jest metodą względną, musi zostać podjęta kalibracja. Zwykle do tego celu używane są wzorce polistyrenowe mało rozproszone, o linearnej budowie, posiadające średnie masy cząsteczkowe Mn i Mw oraz znany rozkład masy cząsteczkowej. Krzywa kalibracji może być wykorzystywana wyłącznie w celu określania masy cząsteczkowej nieznanej próbki, jeżeli warunki rozdzielenia próbki oraz wzorca zostały dobrane w identyczny sposób. Ustalony związek między masą cząsteczkową oraz objętością elucji jest ważny wyłącznie w specyficznych warunkach danego doświadczenia. Warunki obejmują przede wszystkim temperaturę, rozpuszczalnik (lub mieszaninę rozpuszczalników), warunki chromatografii oraz kolumnę rozdzielającą lub systemy kolumn. Masy cząsteczkowe próbki ustalone w ten sposób są względnymi wartościami oraz są opisane jako równoważnik mas cząsteczkowych polistyrenowych. Oznacza to, że w zależności od strukturalnych i chemicznych różnic między próbką a wzorcami, masy cząsteczkowe mogą odchylać się od wartości absolutnych w większym lub mniejszym stopniu. Jeśli wykorzystywane są inne wzorce, np. glikolu polietylenu, tlenku polietylenu, metaakrylanu polimetylu czy kwasu poliakrylowego, powinny zostać podane odpowiednie przyczyny.

1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ Zarówno rozkład masy cząsteczkowej próbki, jak i średnie masy cząsteczkowe (Mn, Mw) mogą być ustalane, wykorzystując GPC. GPC jest szczególnym rodzajem chromatografii cieczowej, w której próbka jest oddzielana według hydrodynamicznych wielkości pojedynczych składników (2). Rozdzielenie następuje wówczas, gdy próbka przechodzi przez kolumnę, która jest wypełniona porowatym materiałem – jest to zazwyczaj organiczny żel. Małe cząsteczki mogą wnikać w pory, podczas gdy duże cząsteczki są wykluczane. Ścieżka dużych cząsteczek jest niniejszym krótsza i to one są najpierw poddane procesowi eluacji. Średnie cząsteczki wnikają w niektóre pory i są później poddawane eluacji. Najmniejsze cząsteczki o średnim hydrodynamicznym promieniu, mniejszym niż pory żelu, mogą wnikać we wszystkie pory. Są poddawane eluacji na końcu. W sytuacji idealnej oddzielanie jest kontrolowane całkowicie rozmiarem odmian cząsteczkowych, ale w praktyce trudno jest uniknąć co najmniej niewielkich efektów absorbcyjnych. Nierówne wypełnienie kolumny oraz objętość martwa mogą tylko pogorszyć sytuację (2). Na detekcję ma wpływ np. współczynnik załamania lub pochłanianie promieni UV oraz wydajności nieskomplikowanej krzywej rozkładu. Jednakże w celu przypisania rzeczywistych wartości masy cząsteczkowej do krzywej niezbędne jest poddanie kolumny kalibracji przez przepuszczanie polimerów o znanej masie cząsteczkowej oraz, w idealnym przypadku, o podobnej strukturze, np. różnych wzorców polistyrenowych. Krzywa Gaussa, powstająca zazwyczaj w ten sposób, czasami wypaczona jest małymi ogonami skierowanymi w stronę małych mas cząsteczkowych, oś pionowa wskazuje jakość w masie różnych wyeluowanych odmian polistyrenu, a oś pozioma wskazuje logarytm z masy cząsteczkowej. Zawartość niskich mas cząsteczkowych jest uzyskiwana na podstawie krzywej. Obliczenia mogą być tylko wtedy dokładne, gdy odmiany o małych masach cząsteczkowych odpowiadają polimerowi jako całości.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Powtarzalność (względne odchylenie standardowe: RSD) objętości eluowania powinna być lepsza niż 0,3 %. Wymagana powtarzalność analizy musi być zapewniona przez korektę dokonywaną poprzez wewnętrzne wzorce, jeżeli chromatogram jest oceniany w oparciu o czas i nie odpowiada wyżej wspomnianym kryteriom (1). Polidyspersyjności są zależne od mas cząsteczkowych wzorców. W przypadku wzorców polistyrenowych typowe wartości to: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp jest masą cząsteczkową wzorca w maksimum piku)

1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.6.

1.6.1. Przygotowanie wzorcowych roztworów polistyrenu Wzorce polistyrenu są rozpuszczane przez ostrożne mieszanie w wybranym eluencie. Zalecenia wytwórcy muszą zostać uwzględnione w trakcie przygotowywania roztworów. Stężenia wybranych wzorców są zależne od wielu czynników, np. od objętości injekcji, lepkości roztworu oraz czułości detektora analitycznego. Maksymalna objętość injekcji musi być dostosowana do długości kolumny, w celu uniknięcia przeładowania. Typowe objętości injekcji dla analitycznych rozdzieleń, wykorzystując GPC z kolumną o wymiarach 30 cm × 7,8 mm, wynoszą zazwyczaj 40–100 μl. Wyższe objętości są możliwe, ale nie powinny przekraczać 250 μl. Optymalny stosunek między objętością injekcji oraz stężeniem musi być określony przed rzeczywistą kalibracją kolumny.

1.6.2. Przygotowywanie roztworu próbki Zasadniczo te same wymagania stosuje się do przygotowywania roztworów próbek. Próbka jest rozpuszczana w odpowiednim rozpuszczalniku, np. tetrahydrofuranie (THF), przez lekkie wstrząsanie. W żadnych okolicznościach nie powinno się rozpuszczać próbki w wannie ultradźwiękowej. W razie konieczności, próbka roztworu jest oczyszczana przez membranowy filtr posiadający pory o wymiarach między 0,2 i 2 μ m. Obecność nierozpuszczalnych cząstek musi być uwzględniona w sprawozdaniu końcowym, jako że może być to ważne w odniesieniu do próbek o wysokiej masie cząsteczkowej. Powinna zostać wykorzystana odpowiednia metoda w celu określenia procentu wagowego nierozpuszczonych cząstek. Roztwór musi zostać wykorzystany w ciągu 24 godzin.

1.6.3. Korekta w odniesieniu do zawartości zanieczyszczeń oraz dodatków Zazwyczaj niezbędna jest korekta udziału zawartości odmian M < 1000 w odniesieniu do udziału niepolimerowych szczególnych obecnych składników (np. zanieczyszczenia i/lub dodatki), chyba że zmierzona zawartość wynosi już < 1 %. Osiągane jest to przez bezpośrednią analizę roztworu polimerowego lub eluentu metodą GPC. W przypadkach gdy eluent po przejściu przez kolumnę jest za bardzo rozcieńczony, aby można go było poddać dalszej analizie, musi zostać zagęszczony. Może okazać się niezbędne odparowanie eluentu do sucha oraz ponowne jego rozpuszczenie. Stężenie eluentu musi zostać uzyskane w warunkach, które zapewniają, że nie pojawią się żadne zmiany w eluencie. Obróbka eluentu po fazie GPC jest zależna od wykorzystanej metody analitycznej wykorzystywanej do oznaczania ilościowego.

1.6.4. Aparatura Aparatura GPC składa się z następujących części składowych: Musi zostać zapewnione, że system GPC będzie jest obojętny w odniesieniu do stosowanych rozpuszczalników (np. przez wykorzystanie stalowych kapilar w przypadku rozpuszczalnika THF).

zbiornik na rozpuszczalnik,

odgazowywacz (w miarę potrzeb),

pompa,

nawilżacz pulsowy (w miarę potrzeb),

system wtryskowy,

kolumny chromatograficzne,

detektor,

przepływomierz (w miarę potrzeb),

urządzenia rejestrujące dane,

naczynie na odpady.

1.6.5. System wtryskowy i system dostarczający rozpuszczalnik Określona objętość roztworu próbki jest umieszczona w kolumnie albo przy użyciu automatycznego próbnika, albo ręcznie do ściśle określonej strefy. Zbyt szybkie wstrzykiwanie, jeśli jest wykonywane ręcznie, może spowodować zmiany w obserwowalnym rozkładzie masy cząsteczkowej. System dostarczający rozpuszczalnik, na ile jest to możliwe, powinien być wolny od pulsacji, co można osiągnąć poprzez wbudowanie do niego tłumika pulsacji. Prawidłowa prędkość przepływu wynosi 1 ml/min.

1.6.6. Kolumna W zależności od próbki właściwości polimeru określa się albo za pomocą prostej kolumny, albo kilku kolumn połączonych w sekwencję. Pewna ilość materiałów porowatych kolumn o określonych właściwościach dostępna jest w ogólnej sprzedaży (np. rozmiar porów, granica ekskluzji). Wybór żelu rozdzielającego lub długość kolumny jest uzależniona zarówno od właściwości próbki (objętości hydrodynamiczne, rozkład masy cząsteczkowej), jak i od specyficznych warunków rozdzielania, takich jak rozpuszczalnik, temperatura i prędkość przepływu (1) (2) (3).

1.6.7. Półki teoretyczne Kolumna lub połączenie kolumn wykorzystywanych do rozdzielania musi być scherakteryzowana przez ilość półek teoretycznych. Obejmuje to, w przypadku THF jako rozpuszczalnikia eluencyjnego, umieszczenie roztworu etylobenzenu lub innych odpowiednich niepolarnych substancji rozpuszczonych w kolumnie o znanej długości. Liczba półek teoretycznych jest uzyskiwana na podstawie następującego równania: N=5,54VeW1/22 lub N=16VeW2 gdzie: N jest liczbą półek teoretycznych, Ve jest objętością eluencyjną w maksimum piku, W jest wyjściową szerokością piku, W1/2 jest szerokością piku w połowie wysokości.

1.6.8. Wydajność rozdzielania Oprócz liczby półek teoretycznych, która jest określającą ilościowo szerokością pasma, ważną rolę odgrywa także wydajność rozdzielenia, będąca określana przez nachylenie krzywej kalibracyjnej. Wydajność rozdzielania kolumny jest uzyskiwana z następującego stosunku: Ve,Mx-Ve,(10Mx)kolonelės skerspjūvio plotas≥6,0cm3cm2 gdzie: Ve, Mx jest objętością eluencyjną dla polistyrenu o masie cząsteczkowej Mx, Ve, (10.Mx) jest objętością eluencyjną dla polistyrenu o 10-krotnie większej masie cząsteczkowej. Rozdzielczość systemu jest zwykle określana w następujący sposób: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 gdzie: Ve1, Ve2 są objętościami eluencyjnymi dwóch wzorców polistyrenowych w maksimum piku; W1, W2 są największymi szerokościami piku w lini podstawowej; M1, M2 są masami cząsteczkowymi przy maksimum piku (powinny różnić się współczynnikiem o 10). Wartość R w odniesieni do systemu kolumn powinna być wyższa niż 1,7 (4).

1.6.9. Rozpuszczalniki Wszystkie rozpuszczalniki muszą posiadać wysoką czystość (dla THF używana jest czystość 99,5 %). Zbiornik na rozpuszczalnik (o ile jest to konieczne – w atmosferze gazu obojętnego) musi być odpowiednio duży dla kalibracji kolumny i analiz wielu próbek. Rozpuszczalnik musi być odgazowany zanim zostanie przeniesiony do kolumny za pomocą pompy.

1.6.10. Kontrola temperatury Temperatura krytycznych komponentów wewnętrznych (pętla wtryskowa, kolumny, detektor i przewody) powinna być stała i zgodna z wyborem rozpuszczalnika.

1.6.11. Detektor Zadaniem detektora jest rejestracja ilościowa stężenia próbki eluowanej z kolumny. W celu uniknięcia niepotrzebnego poszerzenia pików objętość kuwety komórki detektora musi być tak mała, jak to tylko jest możliwe. Nie powinna być większa niż 10 μl, z wyjątkiem detektorów mierzących światło rozproszone oraz lepkość. W celu detekcji zazwyczaj używana jest refraktometria różnicowa. Jednakże jeżeli wymagają tego właściwości próbki lub właściwości eluacyjne rozpuszczalnika, mogą być używane inne rodzaje detektora, np. UV/VIS, IR, detektory lepkości itd.

2. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDAŃ

2.

2.1. DANE Powinno nastąpić odniesienie do normy DIN (1) w celu uzyskania szczegółowych kryteriów oceny, jak również do wymogów odnoszących się do zbierania i przetwarzania danych. Dla każdej próbki muszą zostać przeprowadzone dwa niezależne doświadczenia. Próbki muszą być analizowane pojedynczo. We wszystkich przypadkach zasadnicze jest ustalenie danych również z prób ślepych, poddawanych przetworzeniu w takich samych warunkach co próbka. Niezbędne jest wyraźne wskazanie, że zmierzone wartości są wartościami względnymi, równoważnymi masom cząsteczkowym użytych wzorców. Po określeniu objętości retencji lub czasów retencji (możliwie poprawionych wykorzystując wzorzec wewnętrzny) wartości logarytmu Mp (Mp będącego maksymalną wartością piku wzorca kalibracji) są wykreślane w oparciu o jedną z tych wielkości. Niezbędne są co najmniej dwa punkty kalibracji na dekadę masy cząsteczkowej oraz wymagane jest co najmniej pięć punktów pomiarowych dla całkowitej krzywej, która powinna obejmować oszacowaną masę cząsteczkową próbki. Niska wartość punktu końcowego masy cząsteczkowej krzywej wzorcowania jest określana za pomocą n-heksylobenzenu lub innego odpowiedniego niepolarnego roztworu. Część krzywej odpowiadająca masom cząsteczkowym poniżej 1000 jest ustalana i korygowana w razie konieczności w odniesieniu do zanieczyszczeń oraz dodatków. Krzywe eluacji są zazwyczaj oceniane za pomocą elektronicznego przetwarzania danych W przypadku gdy używana jest ręczna digitalizacja, można powołać się na ASTMD 3536-91 (3). Jeśli jakikolwiek nierozpuszczalny polimer jest zachowany w kolumnie, jego masa cząsteczkowa może być wyższa niż masa cząsteczkowa frakcji rozpuszczalnej, a jeśli nie jest brana pod uwagę może skutkować nadmiernym oszacowaniem zawartości niskiej masy cząsteczkowej. Wskazówki w odniesieniu do korygowania zawartości niskiej masy cząsteczkowej w odniesieniu do nierozpuszczalnego polimeru są przewidziane w załączniku. Krzywa rozkładu musi być przewidziana w formie tabeli lub ilustracji (różnicowa częstotliwość lub procent sumy w oparciu o logarytm M). Na wizerunku graficznym jedna dekada masy cząsteczkowej powinna mieć normalnie około 4 cm szerokości, a maksymalna wartość szczytowa około 8 cm wysokości. W przypadku krzywych całkowego rozkładu różnica w rzędnych między 0 a 100 % powinna wynosić około 10 cm.

2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

2.2.

2.2.1. Substancja badana:

dostępne informacje dotyczące badanej substancji (tożsamość, dodatki, zanieczyszczenia),

opis przetwarzania próbki, uwagi, problemy.

2.2.2. Oprzyrządowanie:

zbiornik z eluentem, obojętny gaz, odgazowywanie eluentu, skład eluentu, zanieczyszczenia,

pompa, pulsowy tłumik, system wtryskowy,

kolumny rozdzielające (wytwórca, wszystkie informacje dotyczące właściwości kolumn, takie jak rozmiar poru, rodzaj rozdzielającego materiału itd., liczba, długość oraz kolejność użytych kolumn),

liczba półek teoretycznych kolumny (lub połączonych), wydajność rozdzielania, (rozdzielczość systemu),

informacja dotycząca symetrii pików,

temperatura kolumny, rodzaj sterowania temperaturą,

detektor (zasada pomiarów, rodzaj, objętość kuwetowa),

przepływomierz w przypadkach, gdy jest używany (wytwórca, zasada pomiarów),

system umożliwiający rejestrację i przetwarzanie danych (osprzęt i oprogramowanie).

2.2.3. Kalibracja systemu

szczegółowy opis metody używanej do przygotowania krzywej kalibracji,

informacja dotycząca kryteriów jakościowych dla niniejszej metody (np. współczynnik korelacji, błąd sumy kwadratów itd.),

informacja dotycząca ekstrapolacji, założenia i przybliżenia poczynione w trakcie procedury doświadczalnej oraz oszacowanie i przetwarzanie danych,

wszystkie pomiary przeprowadzone w celu przygotowania krzywej kalibracji powinny być udokumentowane w tabelach, które zawierają następujące informacje dla każdego punktu kalibracji:

nazwa próbki,

producent próbki,

właściwości wartości wzorców Mp, Mn, Mw oraz Mw/Mn, jak przewidziano przez wytwórcę lub uzyskane na podstawie kolejnych pomiarów, razem ze szczegółami dotyczącymi metody wyznaczania,

objętość wtrysku oraz stężenie wtrysku,

wartość Mp używanej dla kalibracji,

objętość eluencyjna lub poprawiony czas retencji, mierzony przy maksimach piku,

Mp obliczone przy maksimum piku,

błąd procentowy wyliczonej Mp oraz wartość kalibracji.

2.2.4. Informacja dotycząca zawartości polimerów o niskiej masie cząsteczkowej:

opis metod stosowanych w analizach i sposobie, w jaki przeprowadzone zostały doświadczenia,

informacja dotycząca zawartości procentowej frakcji o małej masie cząsteczkowej w odniesieniu do masy całkowitej próbki,

informacja dotycząca zanieczyszczeń, dodatków i innych niepolimerowych składnikach w procentach w odniesieniu do masy całkowitej próbki.

2.2.5. Ocena:

ocena na podstawie czasu: wszystkie metody mające na celu zapewnienie wymaganej odtwarzalności (metoda poprawiania, wzorce wewnętrzne itd.),

informacja dotycząca tego, czy ocena została przeprowadzona na podstawie objętości eluencyjnej lub czasu retencji,

informacja dotycząca ograniczeń oceny, jeżeli pik nie został poddany analizie w całości,

opis metod wygładzających, jeżeli są wykorzystywane,

procedury przygotowawcze oraz wstępnego przetworzenia próbki,

obecność nierozpuszczalnych cząstek, jeżeli istnieją,

objętość wtrysku (μl) oraz stężenie wtrysku (mg/ml),

uwagi wskazujące skutki, które prowadzą do odchyleń od idealnego profilu GPC,

szczegółowy opis wszystkich zmian w procedurach badawczych,

szczegóły dotyczące zakresów błędów,

wszystkie inne informacje oraz uwagi istotne w odniesieniu do interpretacji wyników.

3.(1)(2)(3)(4)

BIBLIOGRAFIA DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.20. ZACHOWANIE POLIMERÓW W WODZIE – ROZPUSZCZANIE/EKSTRAKCJA

A.20.

1. METODA Opisana metoda jest powtórzeniem wersji poprawionej OECD WT 120 (1997). Dalsze informacje techniczne podane są w pozycji bibliograficznej (1).

1.

1.1. WPROWADZENIE W odniesieniu do niektórych polimerów, takich jak np. polimerów emulsyjnych, zanim można zastosować metodę opisaną poniżej, konieczne mogą być wstępne prace przygotowawcze. Metoda ta nie ma zastosowania do polimerów płynnych oraz do polimerów, które reagują z woda w warunkach badania. Jeżeli metoda nie jest praktyczna lub nie jest możliwe jej zastosowanie, zachowanie rozpuszczanie/ekstrakcja może zostać zbadane za pomocą innych metod. W takich przypadkach należy podać pełne szczegóły oraz uzasadnienie dla zastosowania metody.

1.2. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ Zachowanie polimerów rozpuszczanie/ekstrakcja w środowisku wodnym ustalane jest przy wykorzystaniu metody kolbowej (zob. A.6. Rozpuszczalność w wodzie, metoda kolbowa) ze zmianami opisanymi poniżej.

1.4. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.

1.5. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.5.

1.5.1. Sprzęt W odniesieniu do tej metody wymagany jest następujący sprzęt:

przyrząd zgniatający, np. młyn do wytwarzania cząstek o znanym rozmiarze,

aparatura do wstrząsania z możliwością kontroli temperatury,

system filtrowania membranowego,

właściwy sprzęt analityczny,

znormalizowane sita.

1.5.2. Przygotowanie próbki Próbka reprezentatywna musi zostać najpierw zmniejszona do wielkości cząsteczek między 0,125 i 0,25 mm, wykorzystując właściwe sita. W odniesieniu do stabilności próbki lub w odniesieniu do procesu mielenia wymagane może być chłodzenie. Materiały o właściwościach podobnych do gumy mogą być kruszone w temperaturze ciekłego azotu (1). Jeżeli wymagana frakcja wielkości cząsteczki jest nieosiągalna, powinno zostać podjęte działanie w celu zmniejszenia wielkości cząsteczek do najmniejszej możliwej wielkości oraz złożone sprawozdanie o wyniku. W sprawozdaniu niezbędne jest wskazanie sposobu, w jaki skruszona próbka była składowana przed badaniem.

1.5.3. Procedura Trzy próbki o masie 10 g są odważane do trzech naczyń wyposażonych w szklane korki i dodaje się po 1000 ml wody do każdego z naczyń. Jeżeli zastosowanie ilości 10 g polimeru okazuje się niewykonalne, powinna zostać wykorzystana największa najbliższa tej wartości ilość, jaką można zastosować, a objętość wody powinna zostać odpowiednio dostosowana. Naczynia są szczelnie zamykane korkiem, a następnie wstrząsane w temperaturze 20 oC. Powinno zostać wykorzystane urządzenie wstrząsające lub mieszające, działające w stałej temperaturze. Po okresie 24 godzin zawartość każdego naczynia jest odwirowywana lub filtrowana, a stężenie polimeru w czystej fazie wodnej ustalane jest za pomocą odpowiedniej metody. Jeżeli odpowiednie metody analityczne w odniesieniu do fazy wodnej nie są dostępne, całkowitą rozpuszczalność/podatność na ekstrakcję można oszacować z suchej masy pozostałości filtracyjnej lub z odwirowanego strątu. Zazwyczaj niezbędne jest ilościowe zróżnicowanie między zanieczyszczeniami i dodatkami, z jednej strony, oraz odmianami o małej masie cząsteczkowej, z drugiej strony. W przypadku oznaczania grawimetrycznego ważne jest także przeprowadzenie próby ślepej bez wykorzystania substancji badanej, w celu uwzględnienia pozostałości powstających w wyniku metody doświadczalnej. Zachowanie polimerów rozpuszczanie/ekstrakcja w wodzie w temperaturze 37 oC przy pH 2 i pH 9 może zostać ustalone w ten sam sposób, jak opisano w odniesieniu do przeprowadzania doświadczenia w temperaturze 20 oC. Wartości pH można osiągnąć przez dodanie albo odpowiednich roztworów buforowych, albo odpowiednich kwasów lub zasad, takich jak kwas solny, kwas octowy, wodorotlenek sodu lub potasu o czystości analitycznej lub NH3. W zależności od wykorzystanej metody analizy, należy przeprowadzić jedno lub dwa badania. Jeżeli dostępne są wystarczająco szczegółowe metody w odniesieniu do bezpośredniej analizy fazy wodnej dla komponentu polimerowego, wystarczy przeprowadzić jedno badanie, jak opisano powyżej. Jednakże jeżeli takie metody nie są dostępne, a określenie zachowania rozpuszczania/ekstrakcji polimeru jest ograniczone do analizy pośredniej przez ustalanie tylko całkowitej zawartości węgla organicznego (TOC) ekstraktu wodnego, powinno zostać przeprowadzone dodatkowe badanie. Takie dodatkowe badanie należy także przeprowadzić trzykrotnie, stosując dziesięciokrotnie mniejsze próbki polimeru oraz takie same ilości wody jak ilości wykorzystane w pierwszym badaniu.

1.5.4. Analiza

1.5.4.

1.5.4.1. Badanie przeprowadzane z próbką jednego rozmiaru Mogą być dostępne metody analizy bezpośredniej komponentów polimerowych w fazie wodnej. Alternatywnie można rozważyć pośrednią analizę rozpuszczonych/ekstrahowanych komponentów polimerowych przez określenie całkowitej zawartości części rozpuszczalnych i korektę w odniesieniu do komponentów, które nie są właściwe dla polimerów. Możliwa jest analiza fazy wodnej dla ogółu odmian polimerowych: albo przez wystarczającą czułą metodę, np.: lub przez odparowywanie w warunkach próżniowych do sucha ekstraktu wodnego i analizę spektroskopową (IR, UV itd.) lub analizę AAS/ICP pozostałości. Jeżeli niemożliwa jest analiza samej fazy wodnej, roztwór wodny należy ekstrahować za pomocą organicznego rozpuszczalnika niemieszającego się z woda, np. chlorowanego węglowodoru. Rozpuszczalnik jest następnie odparowywany, a pozostałość analizowana pod kątem podanej zawartości polimeru w sposób określony powyżej. Wszelkie komponenty w tej pozostałości, które są identyfikowane jako zanieczyszczenia lub dodatki, mają zostać odjęte w celu określenia stopnia rozpuszczenia/ekstrakcji samego polimeru. Jeżeli obecne są względnie duże ilości takich substancji, może wystąpić konieczność poddania pozostałości np. analizie HPLC lub GC, w celu odróżnienia zanieczyszczeń od obecnego monomeru i frakcji pochodnych monomeru, tak aby można było ustalić ich rzeczywistą zawartość. W niektórych przypadkach wystarczające może być zwykłe odparowanie organicznego rozpuszczalnika do sucha i zważenie suchej pozostałości.

TOC, wykorzystującą ekstrahowanie na ciepło nadsiarczanu lub dwuchromianu, w celu otrzymania CO2, a następnie wykonanie oznaczenia za pomocą podczerwieni IR lub analizy chemicznej,

spektometrie absorpcji atomowej (AAS) lub jej równoważnik emisji indukcyjnie wzbudzonej plazmy (ICP) dla krzemu lub polimerów zawierających metale,

pochłanianie UV lub spektrofluorometrie dla polimerów arylu,

LC-MS dla próbek o małej masie cząsteczkowej,

1.5.4.2. Badanie przeprowadzane z dwoma próbkami o różnych rozmiarach cząsteczek Wszystkie ekstrakty wodne analizuje w odniesieniu do TOC. Oznaczanie grawimetryczne przeprowadzane jest na nierozpuszczonej/niewyekstrahowanej części próbki. Jeżeli po odwirowaniu lub filtrowaniu zawartości każdego z naczyń pozostałości polimerów pozostają przytwierdzone do ścianek naczynia, naczynie powinno zostać przepłukane filtratem do momentu oczyszczenia naczynia ze wszystkich widocznych pozostałości. Następnie filtrat ponownie jest ponownie odwirowywany oraz filtrowany. Pozostałości na filtrze lub w rurze wirnikowej są suszone w temperaturze 40 oC w próżni oraz ważone. Suszenie kontynuuje się do momentu osiągnięcia stałej wagi.

2. DANE

2.

2.1. BADANIE PRZEPROWADZANE Z PRÓBKĄ JEDNEGO ROZMIARU CZĄSTEK Powinny zostać podane poszczególne wyniki dla każdej z trzech kolb oraz wartości średnie, wyrażone jednostkach masy na objętość roztworu (zwykle mg/l) lub masy na masę próbki polimeru (zwykle mg/g). Dodatkowo powinna zostać również podana utrata wagi próbki (obliczona jako masa substancji rozpuszczonej podzielona przez masę pierwszej próbki). Błędy względne powinny zostać odliczone (RSD). Dla całej substancji (polimer + niezbędne substancje dodane itd.) oraz dla samego polimeru (tj. po odjęciu substancji dodanych) należy podąć oddzielne dane liczbowe.

2.2. BADANIE PRZEPROWADZANE Z DWOMA PRÓBKAMI O RÓŻNYCH ROZMIARACH CZĄSTECZKI Powinny zostać podane poszczególne wartości TOC ekstraktów wodnych dwóch trzykrotnie przeprowadzanych doświadczeń oraz średnich wartość dla każdego doświadczenia, wyrażone w jednostkach masy na objętość roztworu (zwykle mg/l) oraz w jednostkach masy na wagę pierwszej próbki (zwykle mgC/g). Jeżeli nie istnieje różnica między wynikami w wysokich oraz niskich współczynnikach proporcji próbka/woda, może to wskazywać na to, że wszystkie możliwe do wyekstrahowania komponenty zostały faktycznie wyekstrahowane. W takim przypadku analiza bezpośrednia zazwyczaj nie byłaby konieczna. Powinny zostać podane masy poszczególnych pozostałości, wyrażone jako udział początkowych mas próbek. Dla każdego eksperymentu powinny zostać obliczone wartości średnie. Różnice pomiędzy wartością 100 i otrzymanymi procentami wyrażają procenty materiału rozpuszczonego i ekstrahowanego w pierwotnej próbce.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDAŃ

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

3.1.

3.1.1. Substancja badana:

dostępne informacje dotyczące substancji badanej (tożsamość, substancje dodane, zanieczyszczenia, zawartość odmian o malej masie cząsteczkowej).

3.1.2. Warunki przeprowadzania doświadczenia

opis wykorzystanych procedur i warunków przeprowadzania doświadczenia,

opis metod analizy i wykrywania.

3.1.3. Wyniki:

wyniki rozpuszczalności/podatności na ekstrakcję w mg/l; wartości poszczególne i średnie dla badań ekstrakcji w poszczególnych roztworach rozbite na zawartość polimerów oraz zanieczyszczeń, dodatki itd.,

wyniki rozpuszczalności/podatności na ekstrakcję w mg/g polimeru,

wartości TOC ekstraktów wodnych, masa substancji rozpuszczonej oraz udziały procentowe jeżeli zostały zmierzone,

pH każdej próbki,

informacje dotyczące wartości ślepej próby,

w miarę potrzeb odniesienia do niestabilności chemicznej substancji badanej, zarówno podczas procesu badania, jak i podczas procesu analitycznego,

wszystkie informacje które są ważne w odniesieniu do interpretacji wyników.

4.(1) BIBLIOGRAFIA DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen fur Prufzwecke.

A.21. WŁAŚCIWOŚCI UTLENIAJĄCE (CIECZE)

A.21.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Ta metoda badawcza jest przeznaczona do pomiaru potencjału substancji ciekłej do zwiększenia szybkości spalania oraz intensywności spalania materiałów palnych lub do tworzenia mieszanin z materiałami palnymi, które spontanicznie zapalają się, kiedy są ze sobą dokładnie wymieszane. Jest oparta na badaniu ONZ dla cieczy utleniających (1) i jest z nim równoważna, jakkolwiek metoda A.21 jest przede wszystkim zaprojektowana, aby spełniać wymagania rozporządzenia 1907/2006, gdzie wymagane jest porównanie tylko z jedną substancją odniesienia. Konieczne może być badanie i porównanie z dodatkowymi substancjami odniesienia, gdyby wyniki badań miały być wykorzystywane do innych celów. To badanie nie musi być przeprowadzone, jeżeli badanie wzoru strukturalnego wyjaśnia ponad wszelką zasadną wątpliwość, że ta substancja nie jest zdolna do reakcji egzotermicznej z materiałem palnym. Przed przeprowadzeniem tego badania przydatne jest posiadanie wstępnych informacji na temat jakichkolwiek potencjalnych właściwości wybuchowych substancji. Badanie to nie ma zastosowania do ciał stałych, gazów, substancji wybuchowych lub łatwopalnych bądź nadtlenków organicznych. Można nie przeprowadzać tego badania, jeżeli są już dostępne dla substancji badanej wyniki próby ONZ dla cieczy utleniających (1).

1.2. DEFINICJE IJEDNOSTKI Średni czas wzrostu ciśnienia jest wartością średnią mierzonych czasów, w jakich badana mieszanina spowoduje wzrost ciśnienia z 690 kPa do 2070 kPa powyżej ciśnienia atmosferycznego.

1.3. SUBSTANCJAODNIESIENIA Jako substancja odniesienia wymagany jest 65 % (m/m) roztwór wodny kwasu azotowego (czysty do analizy). Ewentualnie, jeżeli osoba badająca przewiduje, że wyniki tego badania będą mogły ostatecznie zostać użyte do innych celów, może być również właściwe badanie dodatkowych substancji odniesienia.

1.4. ZASADY METODY BADAWCZEJ Badana ciecz jest mieszana w stosunku wagowym 1 do 1 z celulozą włóknistą i wprowadzana do komory ciśnieniowej. Jeżeli podczas mieszania lub napełniania następuje spontaniczny zapłon, nie są konieczne dalsze badania. Jeżeli nie następuje spontaniczny zapłon, przeprowadza się pełne badanie. Mieszanina jest ogrzewana w komorze ciśnieniowej i mierzony jest średni czas potrzebny do podniesienia ciśnienia od 690 kPa do 2070 kPa powyżej ciśnienia atmosferycznego. Otrzymana wartość jest porównywana ze średnim czasem wzrostu ciśnienia dla mieszaniny substancji odniesienia i celulozy w stosunku 1:1.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE W serii pięciu prób przeprowadzonych na pojedynczej substancji żaden wynik nie powinien odbiegać od średniej arytmetycznej o więcej niż 30 %. Wyniki różniące się od średniej o więcej niż 30 % powinny zostać odrzucone, procedura mieszania i napełniania powinna zostać poprawiona, a badanie powtórzone.

1.6. OPIS METODY

1.6.

1.6.1. Przygotowanie

1.6.1.

1.6.1.1. Substancja palna Jako materiał palny jest używana sucha, włóknista celuloza o długości włókna od 50 do 250 μm i średniej średnicy równej 25 μm. Jest suszona do stałej masy, w warstwie o grubości nieprzekraczającej 25 mm w temperaturze 105 oC przez 4 godziny i trzymana w suszarce, ze środkiem suszącym, aż do ochłodzenia i do momentu, gdy będzie potrzebna do użycia. Zawartość wody w suchej celulozie powinna być mniejsza niż 0,5 % suchej masy. W razie potrzeby należy przedłużyć czas suszenia aż do osiągnięcia tego stanu. W całym badaniu musi być używana ta sama partia celulozy.

1.6.1.2. Aparatura

1.6.1.2.

1.6.1.2.1. Komora ciśnieniowa Potrzebna jest komora ciśnieniowa. Komora ta składa się z cylindrycznego, stalowego zbiornika ciśnieniowego o długości 89 mm i średnicy zewnętrznej 60 mm (zob. rysunek 1). Po przeciwległych stronach cylindra są ścięte dwie płaszczyzny (zmniejszające przekrój poprzeczny komory do 50 mm), aby ułatwić trzymanie podczas montażu zapłonnika i wkładki odpowietrzającej. Komora, która ma otwór o średnicy 20 mm, jest od wewnątrz na obu końcach rozwiercona do głębokości 19 mm oraz nagwintowana, tak aby można było wkręcić w nią rurę o średnicy 1" według norm British Standard Pipe (BSP) lub odpowiednik według układu metrycznego. Urządzenie do pomiaru ciśnienia, w postaci ramienia bocznego, jest przykręcone do zakrzywionej powierzchni zewnętrznej komory ciśnieniowej w odległości 35 mm od jednego końca, pod kątem 90° do ściętej płaszczyzny. Gniazdo dla niego jest nawiercone na głębokość 12 mm i nagwintowane, tak aby można było wkręcić w nie gwint o średnicy 1/2" według BSP (lub odpowiednik według układu metrycznego), znajdujący się na końcu ramienia bocznego. W razie potrzeby stosuje się obojętną uszczelkę w celu zapewnienia gazoszczelności. Ramię boczne wystaje na 55 mm poza korpus komory ciśnieniowej i ma wywiercony otwór o średnicy 6 mm. Koniec ramienia bocznego jest rozwiercony i nagwintowany, tak aby można było osadzić manometr przeponowy. Może być stosowane dowolne urządzenie do pomiaru ciśnienia, pod warunkiem że będzie odporne na działanie gorących gazów lub produktów rozkładu i będzie zdolne reagować na zmiany wzrostu ciśnienia w zakresie 690–2070 kPa w czasie nie dłuższym niż 5 ms. Koniec komory ciśnieniowej najbardziej oddalony od ramienia bocznego jest zamknięty zapłonnikiem, który jest wyposażony w dwie elektrody, jedną izolowaną, a drugą uziemioną do jego korpusu. Drugi koniec komory ciśnieniowej jest zamknięty membraną bezpieczeństwa (ciśnienie uderzeniowe wynosi około 2200 kPa) utrzymywaną w swojej pozycji przy pomocy wkładki ustalającej, która ma otwór o średnicy 20 mm. W razie potrzeby, w celu zapewnienia dopasowania gazoszczelnego, przy zapłonniku stosowana jest uszczelka obojętna. Stojak (rysunek 2) utrzymuje zestaw podczas użytkowania na odpowiedniej wysokości. Składa się on zwykle z płytki podstawy, wykonanej z miękkiej stali, o wymiarach 235 mm × 184 mm × 6 mm i z profilu kwadratowego o długości 185 mm i wymiarach 70 mm × 70 mm × 4 mm. Z każdego z przeciwległych boków na jednym końcu na długości profilu kwadratowego wycięto fragment, tak że powstała konstrukcja mająca dwie nóżki o płaskich ściankach, na której jest nienaruszony przekrój skrzynkowy o długości 86 mm. Końce tych płaskich ścianek są przycięte pod kątem 60° do poziomu i przyspawane do płytki podstawy. W jednym boku górnego końca głównego profilu wycięto szczelinę o szerokości 22 mm i głębokości 46 mm, żeby podczas wkładania zestawu komory ciśnieniowej, najpierw koniec z zapłonnikiem, do uchwytu z przekroju skrzynkowego ramię boczne mieściło się w szczelinie. Kawałek stali o szerokości 30 mm i grubości 6 mm jest przyspawany do dolnej wewnętrznej ścianki przekroju skrzynkowego i działa jako rozpórka. Dwie śruby skrzydełkowe o średnicy 7 mm, przykręcone do przeciwległej ścianki, służą do trzymania komory ciśnieniowej mocno na miejscu. Dwa paski o szerokości 12 mm ze stali o grubości 6 mm, przyspawane do części bocznych, przylegając do podstawy przekroju skrzynkowego, podpierają komorę ciśnieniową od dołu.

1.6.1.2.2. System zapłonu System zapłonu składa się drutu Ni/Cr o długości 25 cm o średnicy 0,6 mm i oporze 3,85 om/m. Drut jest zwinięty, przy pomocy pręta o średnicy 5 mm, w kształt cewki i podłączony do elektrod zapłonnika. Cewka powinna mieć jedną z konfiguracji przedstawionych na rysunku 3. Odstęp pomiędzy dnem komory a spodem cewki zapłonowej powinien wynosić 20 mm. Jeżeli elektrody nie są nastawne, końce przewodu zapłonowego pomiędzy cewką a dnem komory powinny być izolowane osłoną ceramiczną. Przewód jest ogrzewany prądem stałym o natężeniu przynajmniej 10 A.

1.6.2. Prowadzenie badania Aparatura, złożona w całości z przetwornikiem ciśnieniowym i systemem ogrzewania, ale bez założonej membrany bezpieczeństwa, jest trzymana końcem z zapłonnikiem na dół. 2,5 g cieczy przeznaczonej do badania jest mieszane z 2,5 g wysuszonej celulozy w zlewce szklanej przy pomocy szklanej bagietki. Dla bezpieczeństwa mieszanie powinno być prowadzone za osłoną bezpieczeństwa umieszczoną między operatorem a mieszaniną. Jeżeli mieszanina zapali się podczas mieszania lub napełniania, nie będą konieczne żadne dalsze badania. Mieszanina jest podawana do komory ciśnieniowej małymi porcjami z lekkim ubijaniem. Należy przy tym zapewnić, żeby była dobrze upakowana wokół cewki zapłonowej i żeby się z nią dobrze stykała. Ważne jest, żeby nie poruszyć cewki podczas procesu upakowywania, ponieważ może to prowadzić do błędnych wyników. Membrana bezpieczeństwa jest umieszczana na swoim miejscu, a nakrętka zabezpieczająca jest mocno przykręcana. Naładowana komora jest przenoszona membraną bezpieczeństwa do góry do stojaka, który powinien być umieszczony w odpowiednim, opancerzonym dygestorium lub komorze zapłonowej. Do zewnętrznych końcówek zapłonnika podłącza się zasilanie i podaje prąd o natężeniu 10 A. Czas od rozpoczęcia mieszania do włączenia zasilania nie powinien przekraczać 10 min. Sygnał generowany przez przetwornik ciśnieniowy jest zapisywany przez odpowiedni system, który pozwala zarówno na ocenę, jak i tworzenie ciągłego zapisu profilu zmiany ciśnienia w czasie (np. przejściowy rejestrator podłączony do rejestratora graficznego). Mieszanina jest ogrzewana aż do przerwania membrany bezpieczeństwa lub do upływu 60 s. Jeżeli membrana bezpieczeństwa nie zostanie zerwana, należy pozwolić mieszaninie ostygnąć przed ostrożnym demontażem aparatury, podejmując środki bezpieczeństwa na wypadek wzrostu ciśnienia. Z substancją badaną i z substancją(-ami) odniesienia wykonuje się pięć prób. Zapisywany jest czas potrzebny na zwiększenie ciśnienia od 690 kPa do 2070 kPa powyżej ciśnienia atmosferycznego. Obliczany jest średni czas wzrostu ciśnienia. W niektórych przypadkach substancje mogą wytwarzać wzrost ciśnienia (zbyt duży lub zbyt mały) wskutek reakcji chemicznych niecharakteryzujących właściwości utleniających substancji. W tych przypadkach do wyjaśnienia przebiegu reakcji może być konieczne powtórzenie badania z substancją obojętną np. diatomitem (ziemia okrzemkowa) zamiast celulozy.

2. DANE Czasy wzrostu ciśnienia zarówno dla substancji badanej, jak i substancji odniesienia. Czasy wzrostu ciśnienia dla badań z substancją obojętną, jeżeli zostały przeprowadzone.

2. 2.1. Tabela 1 Przykładowe wyniki

OPRACOWANIE WYNIKÓW Oblicza się średnie czasy wzrostu ciśnienia zarówno dla substancji badanej, jak i dla substancji odniesienia. Oblicza się średni czas wzrostu ciśnienia dla badań z substancją obojętną (jeżeli przeprowadzono). Przykładowe wyniki zostały przedstawione w tabeli 1. Substancja Średnia wartość wzrostu ciśnienia dla mieszaniny 1:1 z celulozą (ms) Dwuchromian amonu; nasycony roztwór wodny 20800 Azotan amonu, nasycony roztwór wodny 6700 Azotan żelaza, nasycony roztwór wodny 4133 Nadchloran litu, nasycony roztwór wodny 1686 Nadchloran magnezu, nasycony roztwór wodny 777 Azotan niklu, nasycony roztwór wodny 6250 Kwas azotowy, 65 % 4767 Kwas nadchlorowy, 50 % 121 Kwas nadchlorowy, 55 % 59 Azotan potasu, 30 % roztwór wodny 26690 Azotan srebra, nasycony roztwór wodny Chloran sodu, 40 % roztwór wodny 2555 Azotan sodu, 45 % roztwór wodny 4133 Substancja obojętna Woda: celuloza

3. SPRAWOZDANIE

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ Sprawozdanie z badań powinno zawierać następujące informacje:

identyfikację, skład, stopień czystości itp. badanej substancji,

stężenie badanej substancji,

procedurę suszenia celulozy,

zawartość wody w użytej celulozie,

wyniki pomiarów,

ewentualne wyniki badań z zastosowaniem substancji obojętnej,

obliczone średnie czasy wzrostu ciśnienia,

jakiekolwiek odchylenia od tej metody i ich przyczyny,

wszystkie dodatkowe informacje lub uwagi istotne dla interpretacji wyników.

3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW Wyniki są oceniane na podstawie: Ciecz jest uznawana za utleniacz, jeżeli: Aby uniknąć fałszywych wyników pozytywnych, w razie potrzeby przy interpretacji wyników należy również uwzględnić wyniki otrzymane w badaniu substancji z materiałem obojętnym.

3.2. a)

czy mieszanina substancji badanej i celulozy zapala się spontanicznie; oraz

porównania średniego czasu potrzebnego do wzrostu ciśnienia od 690 kPa do 2070 kPa z tą samą wartością dla substancji odniesienia.

mieszanina w stosunku wagowym 1:1 badanej substancji i celulozy zapala się spontanicznie; lub

mieszanina w stosunku wagowym 1:1 substancji badanej i celulozy wykazuje średni czas wzrostu ciśnienia niższy lub równy średniemu czasowi wzrostu ciśnienia mieszaniny 1:1, wagowo, dla 65 % (m/m) roztworu wodnego kwasu azotowego i celulozy.

4.(1) BIBILIOGRAFIA Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. Publikacja ONZ Nr: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, s. 342. Badanie O.2: Badanie na utlenianie cieczy. Uwaga: Może zostać użyta którakolwiek z tych konfiguracji.

4.(1)

Rysunek 1 Komora ciśnieniowa

(A) Korpus komory ciśnieniowej (B) Wkładka ustalająca membrany bezpieczeństwa (C) Zapłonnik (D) Miękka uszczelka ołowiana (E) Membrana bezpieczeństwa (F) Ramię boczne (G) Głowica przetwornika ciśnieniowego (H) Uszczelka (J) Elektroda izolowana (K) Elektroda uziemiona (L) Izolacja (M) Stożek stalowy (N) Rowek odkształcający uszczelkę

Rysunek 2 Stojak

Rysunek 3 Układ zapłonu

(A) Cewka zapłonowa (B) Izolacja (C) Elektrody (D) Zapłonnik

Dodatek W celu uzyskania dodatkowych szczegółów technicznych można zapoznać się na przykład z następującymi normami.

1. Metody kapilarne

1.

1.1. Urządzenia do pomiaru temperatury topnienia z łaźnią cieczową ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapilarverfarehn JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products.

1.2. Urządzenia do pomiaru temperatury topnienia z blokiem metalowym DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics- polyamides -determination of melting point

2. Płyty grzewcze

2.

2.1. Płyta grzewcza Koflera ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Mikroskop do badania topnienia DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

2.3. Metoda menisku (dla poliamidów) ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Resines de polyamides. Determination du point de fusion méthode du menisque

3. Metody ustalania temperatury krzepnięcia BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de petrole: determination de la température de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsiiuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Analiza termiczna

4.

4.1. Różnicowa analiza termiczna ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Różnicowa kalorymetria skaningowa ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Oznaczanie temperatury płynięcia NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du petrole: Point de trouble et point d'ecoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour point

Dodatek W celu uzyskania dodatkowych szczegółów technicznych można zapoznać się na przykład z następującymi normami.

1.1.1. Ebuliometr Urządzenia do pomiaru temperatury topnienia z łaźnią cieczową ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Proces destylacji (zakres wrzenia) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation: determination du rendement et de l’intervalle de distillation

3. Różnicowa analiza termiczna i różnicowa kalorymetria skaningowa ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

Dodatek Dla uzyskania dodatkowych szczegółów technicznych można zapoznać się na przykład z następującymi normami.

1. Metody wyporu hydrostatycznego

1.

1.1. Aerometr DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2. Waga hydrostatyczna

1.2. Dla substancji stałych

ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density

Dla substancji ciekłych

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 i ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3. Metoda zanurzeniowa DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2. Metody piknometryczne

2.

2.1. Dla substancji ciekłych ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10-6 m2 s-1 at 15 oC) DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC) DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary- stoppered pycnometer method NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method

2.2. Dla substancji stałych ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method DIN 19683 Determination of the density of soils

3. Piknometr wykonujący pomiar porównawczy w powietrzu DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung

Dodatek 1 Metoda szacowania

WPROWADZENIE

Obliczone wartości prężności pary stosuje się:

w celu zdecydowania, która z metod doświadczalnych jest odpowiednia,

w celu dostarczenia oszacowania lub granicznej wartości w przypadkach, gdy metoda doświadczalna nie może być zastosowana z powodu przyczyn technicznych (włączając te przypadki, gdzie prężność pary jest bardzo niska),

do pomocy w identyfikacji tych przypadków, gdzie pominięcie pomiarów doświadczalnych jest uzasadnione ponieważ prężność pary wynosi prawdopodobnie < 10-5 Pa w temperaturze otoczenia.

METODA SZACOWANIA

Prężność pary cieczy i ciał stałych można oszacować poprzez użycie zmodyfikowanej korelacji Watsona (a). Jedyną tylko wymaganą daną doświadczalną jest temperatura wrzenia w warunkach normalnych. Metoda ma zastosowanie w zakresie ciśnień od 105 do 10-5 Pa. Szczegółowe informacje na temat metody podano w Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b).

PROCEDURA OBLICZENIA

Zgodnie z pozycją (b) prężność pary jest obliczana, jak następuje: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb gdzie: T = temperatura będąca przedmiotem zainteresowania, Tb = temperatura wrzenia w warunkach normalnych, Pvp = prężność pary w temperaturze T, ΔHvb = ciepło parowania, ΔZb = współczynnik ściśliwości (oszacowany na 0,97), m = empiryczny współczynnik zależny od stanu fizycznego w temperaturze będącej przedmiotem zainteresowania. Dalej Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb gdzie KF jest współczynnikiem empirycznym biorącym pod uwagę polarność substancji. Dla kilku rodzajów związków współczynniki KF są zamieszczone w (b). Całkiem często są dostępne dane, w których podano temperaturę wrzenia pod zredukowanym ciśnieniem. W takim przypadku, zgodnie z (b), prężność pary oblicza się w następujący sposób: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 gdzie T1 jest temperaturą wrzenia pod zredukowanym ciśnieniem P1.

SPRAWOZDANIE

Jeżeli zastosowano metodę szacowania, sprawozdanie powinno zawierać obszerną dokumentację obliczeń.

LITERATURA

(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, 398.

(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

Dodatek 2

Rysunek 1 Przyrząd do wyznaczania krzywej prężności pary zgodnie z metodą dynamiczną

1 = Termoogniwo 2 = Objętość buforowa próżni 3 = Miernik ciśnienia 4 = Próżnia 5 = Punkt pomiarowy 6 = Element grzejny o mocy około 150 W

Rysunek 2a Przyrząd dla wyznaczania krzywej prężności pary zgodnie z metodą statyczną (z użyciemmanometru w postaci U-rurki)

1. Substancja badana 2. Faza pary 3. Zawór wysokiej próżni 4. U-rurka (manometr pomocniczy) 5. Manometr 6. Łaźnia temperaturowa 7. Przyrząd pomiaru temperatury 8. Do pompy próżniowej 9. Wentylacja

Rysunek 2b Przyrząd dla wyznaczania krzywej prężności pary zgodnie z metodą statyczną (z użyciemwskaźnika ciśnienia)

1. Substancja badana 2. Faza pary 3. Zawór wysokiej próżni 4. Miernik ciśnienia 5. Wskaźnik ciśnienia 6. Łaźnia temperaturowa 7. Przyrząd pomiaru temperatury

Rysunek 3 Izoteniskop (zob. pozycja bibliograficzna 7)

1. Do systemu sterowania ciśnienia i pomiarowego 2. Rura 8 mm OD 3. Suchy azot do systemu ciśnieniowego 4. Pary próbki 5. Mała końcówka 6. Próbka ciekła

Rysunek 4 Przyrząd dla wyznaczania krzywej prężności pary zgodnie z metodą wagową

1. Badana substancja 2. Faza pary ze strumieniem pary 3. Wyparka z obrotowym wlotem 3a. Pokrywa wyparki z otworem 4. Podgrzewanie wyparki (chłodzenie) 5. Pomiar temperatury próbki 6. Skrzynka chłodnicza 7. Osłona 8. Pręt chłodzący do skrzynki chłodniczej 9. Szala wagi 10. Mikrowaga 11. Do rejestratora 12. Do pompy wysokiej próżni

Rysunek 5 Przykład przyrządu do odparowania w niskim ciśnieniu metodą efuzji, z komórką efuzyjną o objętości 8 cm3

1. Połączenie z próżnią 2. Gniazda dla platynowego termometru oporowego lub pomiaru i sterowania temperaturą (2) 3. Pokrywa zbiornika próżniowego 4. Pierścień O 5. Aluminiowy zbiornik próżniowy 6. Przyrząd do instalacji i wyjmowania komórek efuzyjnych 7. Gwintowana pokrywa 8. Nakrętki motylkowe (6) 9. Śruby (6) 10. Komórki efuzyjne ze stali nierdzewnej 11. Wkłady grzałek (6)

Rysunek 6a Przykład systemu przepływu do oznaczania prężności pary metodą saturacji gazem

1 = Regulator przepływu 2 = Wymiennik ciepła 3 = Zawory igłowe 4 = Czujnik względnej wilgotności 5 = Kolumny saturacyjne 6 = Złącza PTFE 7 = Miernik przepływu 8 = Pułapka (absorber) 9 = Łapacz oleju 10 = Barboter Odpowietrzenie dysza

Rysunek 6b Przykład systemu do oznaczania prężności pary metodą saturacji gazem, z kapilarą umieszczoną za komorą saturacji

1. Miernik przepływu masy termicznej 2. Manometr 3. Komora sterowana temperaturowo 4. Termostatowana wężownica dla gazu nośnego 5. Termometr (pt 100) 6. Komora nasycania gazem 7. Kapilara 8. Naczynia absorpcyjne 9. Miernik gazu 10. Zimna pułapka

Rysunek 7 Przykład doświadczalnego zestawu dla metody wirującego rotora

Przyrząd do pomiaru prężności pary A. głowica czujnika wirującego rotora; B. komórka próbki; C. termostat; D. linia próżni (pompa turbinowa); E. powietrzny termostat.

Rysunek 8 Przykład głowicy pomiarowej wirującego rotora

1. Kula 2. Przedłużenie płytowe do odpompowania poprzez 6 3. Stałe magnesy (2) 4. Cewki stabilizacji pionowej (2) 5. Cewki napędowe (4) 6. Kołnierz łączący

Dodatek

Rysunek 1 Metoda wymywania kolumnowego z pompą recyrkulacyjną

Równoważenie atmosferyczne Miernik przepływu Mikrokolumna Termostatycznie kontrolowana pompa cyrkulacyjna Pompa recyrkulacyjna Zawór dwudrożny do próbkowania

Rysunek 2 Typowa mikrokolumna

(wszystkie wymiary w milimetrach) (Connection for ground glass joint) Headspace Interior 5 Exterior 19 Plug of glass wool Stopcock with two-way action

Rysunek 3 Typowa mikrokolumna

(wszystkie wymiary w milimetrach) Połączenie szlifowanego złącza szklanego Przestrzeń cieczy Wewnętrz. 5 Zewnętrz. 19 Kurek odcinający

Rysunek 4 Metoda wymywania kolumnowego z naczyniem poziomującym

1 = Naczynie poziomujące (np. 2,5-litrowa kolba) 2 = Kolumna (zob. rysunek 3) 3 = Kolektor frakcji 4 = Termostat 5 = Teflonowe rurki 6 = Szlifowane złącze szklane 7 = Linia wodna (pomiędzy termostatem i kolumną, średnica wewnętrzna: około 8 mm)

Dodatek 1 Metody obliczenia/szacowania

WPROWADZENIE

Ogólne wprowadzenie do metod obliczeniowych, dane i przykłady są przedstawione w pozycji Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). Stosuje się obliczoną wartość Pow:

w celu zadecydowania która z metod doświadczalnych jest właściwa (zakres metody wstrząsania kolby: log Pow: od - 2 do 4, zakres metody HPLC: log Pow: od 0 do 6),

do wyboru właściwych warunków badania (np. substancji odniesienia dla procedur HPLC, stosunek objętości n-oktanolu do wody dla metody wytrząsania kolby),

jako wewnętrzne laboratoryjne sprawdzenie możliwych błędów doświadczalnych,

dla uzyskania oszacowanej Pow w przypadkach, gdy z przyczyn technicznych metody doświadczalne nie mogą być stosowane.

METODA SZACOWANIA Wstępne oszacowanie współczynnika podziału

Wartość współczynnika podziału może być oszacowana, stosując rozpuszczalności badanej substancji w czystych rozpuszczalnikach: Do tego: Pszacowanie = nasycenien-oktanolnasyceniewoda

METODY OBLICZEŃ Zasada metod obliczeniowych

Wszystkie metody obliczeniowe są oparte o formalną fragmentację cząsteczki na odpowiednie podstruktury, dla których pewne przyrosty log Pow są znane. Log Pow całej cząsteczki jest następnie obliczany jako suma wartości, odpowiadając jej fragmentom plus suma składników korekcji dla oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych. Wykaz stałych fragmentów i składników korekcji są dostępne w pozycjach bibliograficznych (b), (c), (d) i (e). Niektóre są regularnie aktualizowane (b).

Kryteria jakości

Ogólnie, wiarygodność metod obliczeniowych obniża się ze wzrostem złożoności badanych związków. W przypadku prostych cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej i jednej lub dwu grupach funkcyjnych, można oczekiwać odchylenia od 0,1 do 0,3 jednostek log Pow między wynikami różnych metod fragmentaryzacji i wartościami pomierzonymi. W przypadku bardziej złożonych cząsteczek margines błędu może być większy. Zależy to od rzetelności i dostępności stałych fragmentu, jak również zdolności rozpoznania oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych (np. wiązania wodorowe) i poprawności użycia składników korekcji (oprócz problemów z oprogramowaniem komputerowym CLOGP-3) (b). W przypadku związków zjonizowanych ważne jest właściwe rozważenie ładunku lub stopnia jonizacji.

Procedury obliczeń

π-Metoda Hanscha

Oryginalna stała podstawienia hydrofobowego, wprowadzona przez Fujita i współpracowników (f) jest zdefiniowana jako: πx = log Pow (PhX) – log Pow (PhH) gdzie Pow (PhX) jest współczynnikiem podziału pochodnej aromatycznej, a Pow (PhH) związku macierzystego (np. πCl = log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6) = 2,84 – 2,13 = 0,71). Zgodnie z tą definicją π-metoda stosowana jest głównie dla podstawienia aromatycznego. N-wartości dla większej liczby podstawników zostało stabelaryzowane w pozycjach bibliograficznych (b), (c) i (d). Są one stosowane dla obliczeń log Pow cząsteczek aromatycznych lub podstruktur.

Metoda Rekkera

Zgodnie z Rekkerem (g) wartość log Pow jest obliczana, jak następuje: log Pow=Σi ai fi+Σj (warunki oddziaływania), gdzie fi reprezentuje różne stałe fragmentów cząsteczki, natomiast ai – częstotliwość ich występowania w badanej cząsteczce. Składniki korekcji mogą być wyrażone jako całkowita wielokrotność pojedynczej stałej Cm (tak zwana stała magiczna). Stałe fragmentu fi, i Cm zostały ustalone z wykazu 1054 doświadczalnych wartości Pow (825 związków) poprzez wielokrotną analizę regresyjną (c), (h). Ustalenie składników oddziaływań przeprowadzono zgodnie z zestawem zasad opisanych w pozycjach bibliograficznych (e), (h) i (i).

Metoda Hansch-Leo

Zgodnie z Hansch i Leo (c) wartość log Pow jest obliczana z: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj gdzie fi przedstawia różne stałe fragmentu cząsteczkowego, Fj składniki korekcji oraz ai, bi odpowiadające częstotliwości występowania. Wyprowadzony z doświadczalnych wartości Pow, wykaz atomowych i fragmentów grup wartości oraz wykaz składników korekcji Fj (tak zwanych współczynników) zostały ustalone metodą prób i błędów. Składniki korekcji zostały uporządkowane w kilka różnych klas (a), (c). Wzięcie pod uwagę wszystkich zasad i składników korekcji jest względnie skomplikowane i zużywające czas. Opracowano pakiet oprogramowania (b).

Metoda połączona

Obliczenie log Pow złożonych cząsteczek może być znacząco poprawione, jeżeli cząsteczka zostanie rozcięta w większe podstruktury, dla których godne zaufania wartości log Pow są dostępne, albo z tabeli z pozycji bibliograficznych (b), (c), albo z własnych pomiarów. Takie fragmenty (np. heterocykle, antrachinon, azobenzen) mogą być zatem połączone z wartościami π Hanscha lub ze stałymi fragmentów Rekkera lub Leo.

Uwagi:

(i) metody obliczeniowe mogą być stosowane tylko do częściowo lub całkowicie zjonizowanych związków, gdzie możliwe jest branie pod uwagę koniecznych współczynników korekcji;

(ii) jeżeli można założyć wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe, odpowiadające składniki korekcji (od około +0,6 do +1,0 log Pow, jednostek) muszą być dodane (a). Wskazania obecności takich wiązań można uzyskać z przestrzennych modeli lub danych spektroskopowych cząsteczki;

(iii) jeżeli jest możliwe występowanie kilku postaci tautomerycznych, podstawą do obliczeń powinna być najbardziej prawdopodobna postać;

(iv) należy starannie prowadzić weryfikacje wykazu stałych dla fragmentów.

Sprawozdanie

Jeżeli stosuje się metody obliczenia/oceny, raport z badań powinien, o ile to możliwe, zawierać następujące informacje:

opis substancji (mieszanina, zanieczyszczenia itp.),

wskazanie wszystkich możliwych wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych, dysocjacji, ładunkui wszystkich innych niezwykłych oddziaływań (np. tautomeria),

opis metody obliczenia,

identyfikacja lub zasób bazy danych,

cechy wyróżniające wyboru fragmentów,

pełna dokumentacja obliczenia.

LITERATURA

(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. -Chill. Ther. 1979, vol. 14, 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.

(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.

(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Dodatek 2 Zalecane substancje odniesienia dla metody HPLC

Nr substancja odniesienia log Pow pKa 1 2-butanon 0,3 2 4-acetylopirydyna 0,5 3 anilina 0,9 4 acetanilid 1,0 5 alkohol benzylowy 1,1 6 p-metoksyfenol 1,3 pKa = 10,26 7 kwas fenoksyoctowy 1,4 pKa = 3,12 8 fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 10 benzonitryl 1,6 11 fenyloacetonitryl 1,6 12 alkohol 4-metylobenzylowy 1,6 13 acetofenon 1,7 14 2-nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 15 kwas 3-nitrobenzoesowy 1,8 pKa = 3,47 16 4-chloroanilina 1,8 pKa = 4,15 17 nitrobenzen 1,9 18 alkohol cynamonowy 1,9 19 kwas benzoesowy 1,9 pKa = 4,19 20 p-krezol 1,9 pKa = 10,17 21 kwas cynamonowy 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 anizol 2,1 23 benzoesan metylu 2,1 24 benzen 2,1 25 kwas 3-metylobenzoesowy 2,4 pKa = 4,27 26 4-chlorofenol 2,4 pKa = 9,1 27 trichloroetylen 2,4 28 atrazyna 2,6 29 benzoesan etylu 2,6 30 2,6-dichlorobenzonitryl 2,6 31 kwas 3-chlorobenzoesowy 2,7 pKa = 3,82 32 toluen 2,7 33 1-naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dichloroanilina 2,8 35 chlorobenzen 2,8 36 allilofenyloeter 2,9 37 bromobenzen 3,0 38 etylobenzen 3,2 39 benzofenon 3,2 40 4-fenylofenol 3,2 pKa = 9,54 41 tymol 3,3 42 1,4-dichlorobenzen 3,4 43 difenyloamina 3,4 pKa = 0,79 44 naftalen 3,6 45 benzoesan fenylu 3,6 46 izopropylobenzen 3,7 47 2,4,6-trichlorofenol 3,7 pKa = 6 48 bifenyl 4,0 49 benzoesan benzylu 4,0 50 2,4-dinitro-6-sec-butylofenol 4,1 51 1,2,4-trichlorobenzen 4,2 52 kwas dodekanowy 4,2 53 difenyloeter 4,2 54 n-butylobenzen 4,5 55 fenantren 4,5 56 fluoranten 4,7 57 dibenzyl 4,8 58 2,6-difenylopirydyna 4,9 59 trifenyloamina 5,7 60 DDT 6,2 Inne substancje odniesienia o niskim log Pow 1 kwas nikotynowy -0,07

Dodatek

Rysunek Forma i akcesoria do przygotowania stosu

(wszystkie wymiary w milimetrach) Długość formy: 250 mm Materiał: aluminium

Dodatek

Rysunek Przyrząd

Dodatek

Przykłady specyfikacji materiałowych do badania wrażliwości cieplnej (zob. DIN 1623) (1)(2)(3)

Tube: Material specification No 1.0336.505 g Orifice plate: Material specification No 1.4873 Threaded collar and nut: Material specification No 1.3817

Rysunek 1 Przyrząd badawczy do wrażliwości cieplnej

(wszystkie wymiary w mm) Rys. 1a Rura stalowa i akcesoria (1) rura (1a) zewnętrzny kołnierz (2) gwintowany pierścień; gwint o niskim tarciu (3) płyta kryzowa o średnicy a = 2,0 lub 6,0 mm (4) nakrętka b = 10 mm średnicy (5) powierzchnia sfazowana (6) 2 powierzchnie do kłucza wymiaru 41 Rys. 1b Urządzenie do podgrzewania i zabezpieczenia (7) 2 powierzchnie do klucza wymiaru 36 (8) skrzynka zabezpieczająca przed odłamkami (9) 2 wsporcze pręty dla rury (10) zamontowana rura (11) położenie tylnego palnika; inne palniki są widoczne (12) dysza pilota gazu

Rysunek 2 Badanie wrażliwości cieplnej

(przykłady fragmentacji) Bez wybuchu Bez wybuchu Wybuch Wybuch Wybuch Wybuch

Rysunek 3 Kalibracja szybkości podgrzewania dla badania wrażliwości cieplnej

Temperatura (°C) Czas (s) Krzywa temperatura/czas uzyskana przy podgrzewaniu ftalanu dibutylu (27 cm3) w zamkniętej rurze (1,5 mm płyta kryzowa) przy użyciu szybkości przeprywu propanu 3,2 litra/min. Temperaturę pomierzono termoogniwem chromel/alumel w osłonie ze stali nierdzewnej średnicy l mm, umieszczonego centrycznie 43 mm poniżej obrzeża rury. Szybkość grzania między 135 oC i 285 oC powinna wynosić między 185 i 215 K/min.

Rysunek 4 Przyrząd do badania wrażliwości na uderzenie

(wszystkie wymiary w mm) (1) podstawa, 450 × 450 × 60 (2) blok stalowy, 230 × 250 × 200 (3) kowadło, 100 średnica × 70 (4) kolumna (5) poprzecinica średnia (6) 2 prowadnice (7) stojak zębaty (8) skalowana podziałka (9) młot spadowy (masa spadająca) (10) mechanizm utrzymujący i zwalniający (11) płyta ustalająca (12) kowadło pośrednie (wymienne), 26 średnica × 26 (13) pierścień ustalający z kryzami (14) przyrząd uderzeniowy Rys. 4a Młot spadowy, widok ogólny z przodu i z boku Rys. 4b Młot spadowy, część dolna

Ciąg dalszy

Rys. 4d Przyrząd uderzeniowy dla substancji ciekłych Rys. 4c Przyrząd uderzeniowy dla substancji w postaci sproszkowanej lub pastopodobnej (1) cylindry stalowe (2) pierścień prowadzący dla cylindrów stalowych (3) pierścień ustalający z kryzami (a) przekrój pionowy (b) rzut poziomy (4) pierścień gumowy (5) substancja ciekła (40 mm3) (6) przestrzeń wolna od cieczy Rys. 4e Młot (masa spadająca 5 kg) (1) zawieszony czop (2) znacznik wysokości (3) rowek ustalający (4) cylindryczna głowica uderzeniowa (5) zaczep odboju

Rysunek 5 Przyrząd do badania wrażliwości na tarcie

Rys. 5a Przyrząd tarcia; rzut pionowy i widok z góry 1) stalowa podstawa (2) ruchomy wózek (3) płyta porcelanowa, 25 × 25 × 5 mm, umocowana na wózku (4) amocowany pręt porcelanowy, średnica 10 × 15 mm (5) badana próbka, około 10 mm3 (6) uchwył pręta (7) ramię obciążające (8) przeciwwaga (9) włącznik (10) koło dla ustawienia wózka w pozycje startową (11) w kierunku elektrycznego silnika napędowego Rys. 5b Położenie początkowe pręta na próbce

Dodatek

Rysunek Forma i akcesoria do przygotowania stosu

(wszystkie wymiary w milimetrach)

Dodatek Przykłady innych metod określania średniej liczbowo masy cząsteczkowej (Mn) w odniesieniu do polimerów

Chromatografia żelowo-permeacyjna (GPC) jest preferowaną metodą określania Mn, w szczególności kiedy dostępny jest zestaw wzorców, których struktura jest porównywalna ze strukturą polimerów. Jednakże, w przypadku gdy istnieją trudności praktyczne w wykorzystywaniu GPC lub już istnieje przypuszczenie, że substancja nie będzie podlegała kryterium regulującym Mn (a które wymaga potwierdzenia), dostępne są metody alternatywne, takie jak:

1.1.1.1.2.1.3.1.4.

Wykorzystywanie własności koligatywnych Ebuliometria/kriometria: obejmuje pomiar podwyższenia temperatury wrzenia (ebuliometria) lub spadku temperatury zamarzania (kriometria) rozpuszczalnika, kiedy dodany zostaje polimer. Metoda oparta jest na fakcie, że skutek rozpuszczonego polimeru na temperaturę wrzenia/zamarzania płynu zależy od masy cząsteczkowej polimeru (1) (2). Zastosowanie: Mn < 20000. Zmniejszanie ciśnienia pary: obejmuje pomiar ciśnienia pary wybranego płynu odniesienia przed i po dodaniu znanych ilości polimeru (1) (2). Zastosowanie: Mn < 20000 (teoretycznie; jednakże w praktyce wartości są ograniczone). Osmometria membranowa: opiera się na zasadzie osmozy, tzn. naturalnej skłonności cząsteczek rozpuszczalnika do przenikania przez półprzepuszczalną membranę z rozcieńczonego do stężonego roztworu aż do osiągnięcia równowagi. W trakcie badania rozcieńczony roztwór posiada zerowe stężenie polimeru, natomiast stężony roztwór zawiera polimer. Skutkiem przepuszczenia rozpuszczalnika przez membranę jest zróżnicowanie ciśnienia, które zależne jest od stężenia i masy cząsteczkowej polimeru (1) (3)(4). Zastosowanie: Mn w zakresie 20000–200000. Osmometria fazy parowania: obejmuje porównanie wskaźnika parowania czystego rozpuszczalnika aerozolu do co najmniej trzech aerozoli zawierających polimer o różnych stężeniach (1) (5) (6). Zastosowanie: Mn < 20000.

2. Analiza grupy końcowej W celu wykorzystania tej metody potrzeba wiedzy zarówno o całkowitej strukturze polimeru, jak i o charakterze łańcucha kończącego grupy końcowe (która musi być możliwa do odróżnienia od głównego szkieletu, np. przez NMR lub miareczkowanie/różniczkowanie). Oznaczenie stężenia cząsteczkowego grup końcowych obecnych w polimerze może prowadzić do wyprowadzenia wartości masy cząsteczkowej (7) (8) (9). Zastosowanie, Mn do 50000 (ze zmniejszającą się wiarygodnością).

3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)

Bibliografia Billmeyer, F.W. Jr., Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York, 1984. Glover, C.A., Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York, 1975. ASTM D 3750-79, Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania, 1979. Coll, H., Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, 1989, pp. 25–52. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

Załącznik Wytyczne dotyczące korygowania zawartości związków o niskiej masie cząsteczkowej w odniesieniu do obecności nierozpuszczalnych polimerów

Jeśli w próbce obecny jest nierozpuszczalny polimer, skutkiem tego jest utrata masy podczas analizy GPC. Nierozpuszczalny polimer pozostaje nieodwracalnie w kolumnie lub na filtrze próbkowym, podczas gdy rozpuszczalna część próbki przechodzi przez kolumnę. W przypadku gdy inkrement współczynnika załamania światła (dn/dc) polimeru może zostać oszacowany lub zmierzony, można oszacować utratę masy próbki na kolumnie. W takim przypadku przeprowadza się korektę, wykorzystując zewnętrzną kalibrację wzorcowymi materiałami o znanym stężeniu oraz dn/dc w celu kalibracji reakcji refraktometru. W poniższym przykładzie wykorzystywany jest wzorzec metaakrylanu polimetylu (pMMA). W zewnętrznej kalibracji, w celu analizy akrylowych polimerów, wzorzec pMMA, o znanym stężeniu w tetrahydrofuranie, jest analizowany przez GPC, a otrzymane dane są wykorzystywane w celu znalezienia stałej refraktometru zgodnie ze wzorem: K = R/(C × V × dn/dc) gdzie: K stała refraktometru (w mikrowoltosekundach/ml), R wskaźnik wzorca pMMA (w mikrowoltosekundach), C stężenie wzorca pMMA (w mg/ml), V objętość dozowana (w ml), oraz dn/dc inkrement współczynnika załamania światła dla pMMA w tetrahydrofuranie (w ml/mg) Następujące dane są typowe dla wzorca pMMA: R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 × 10-5 ml/mg Uzyskana wartość K, 3,05 × 1011, jest następnie wykorzystywana w celu obliczania teoretycznej reakcji detektora, jeżeli 100 % wtryśniętego polimeru eluowało przez detektor.

CZĘŚĆ B METODY OZNACZANIA TOKSYCZNOŚCI I INNYCH SKUTKÓW ZDROWOTNYCH

WPROWADZENIE OGÓLNE A.

CHARAKTERYSTYKA SUBSTANCJI TESTOWANEJ Skład substancji testowanej, w tym główne zanieczyszczenia oraz jej istotne właściwości fizyko-chemiczne włącznie z trwałością, powinny być znane przed rozpoczęciem każdego badania toksyczności. Właściwości fizyko-chemiczne substancji testowanej dostarczają ważnych informacji przy wyborze drogi aplikowania, projektowaniu każdego poszczególnego badania oraz posługiwaniu się i przechowywaniu substancji testowanej. Rozpoczęcie badania powinno poprzedzać zastosowanie metody analitycznej w celu jakościowego i ilościowego oznaczenia substancji testowanej (wraz z głównymi zanieczyszczeniami, jeżeli możliwe) w ośrodku dawkującym i materiale biologicznym. Wszystkie informacje dotyczące identyfikacji, właściwości fizyko-chemicznych, czystości i zachowania substancji testowanej powinny być zawarte w sprawozdaniu z testu.

UTRZYMANIE ZWIERZĄT Rygorystyczna kontrola warunków otoczenia i właściwe techniki utrzymania zwierząt są niezbędne przy testowaniu toksyczności.

(i) Warunki, w których przebywają zwierzęta Warunki otoczenia w pomieszczeniach dla zwierząt doświadczalnych i zagrodach powinny być odpowiednie dla badanego gatunku. Odpowiednimi warunkami dla szczurów, myszy i świnek morskich są: temperatura pokojowa wynosząca 22 oC ± 3 oC i wilgotność względna 30–70 %; dla królików temperatura powinna wynosić 20 oC ± 3 oC przy wilgotności względnej 30–70 %. Niektóre techniki eksperymentalne są szczególnie wrażliwe na wpływ temperatury i w takich przypadkach szczegóły odpowiednich warunków są zawarte w opisie metody badania. We wszystkich badaniach działania toksycznego temperatura i wilgotność powinny być monitorowane, rejestrowane i zawarte w końcowym sprawozdaniu z badania. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Szczegóły form oświetlenia powinny być rejestrowane i zawarte w końcowym sprawozdaniu z badania. Przy braku innych wskazań w danej metodzie zwierzęta mogą być umieszczane pojedynczo, lub umieszczane w klatkach w małych grupach o tej samej płci; w przypadku umieszczania grupowego, nie więcej niż pięć zwierząt powinno być umieszczanych w jednej klatce. W sprawozdaniach z eksperymentów na zwierzętach, ważne jest wskazanie stosowanego typu umieszczania zwierząt w klatkach i liczby zwierząt umieszczanych w każdej klatce zarówno podczas ekspozycji na związek chemiczny, jak i w późniejszym okresie obserwacji.

(ii) Warunki żywienia Diety powinny w pełni spełniać zapotrzebowanie pokarmowe gatunku poddanego testowi. W przypadkach gdy substancje testowane są podawane zwierzętom w ich pożywieniu, wartość pokarmowa może być zredukowana przez interakcję tej substancji ze składnikiem pokarmowym. Możliwość takiej reakcji powinna być rozważona przy interpretacji wyników testów. Konwencjonalne diety laboratoryjne mogą być stosowane przy nieograniczonym dostarczaniu wody pitnej. Na wybór diety może mieć wpływ potrzeba zapewnienia odpowiedniej domieszki substancji testowanej przy podawaniu powyższą metodą. Pokarmowe substancje zanieczyszczające, o których wiadomo, że wpływają na toksyczność, nie powinny być obecne w stężeniach przeszkadzających.

TESTOWANIE ALTERNATYWNE Unia Europejska jest zaangażowana w promowanie rozwijania i zatwierdzania technik alternatywnych, które mogą dostarczyć ten sam poziom informacji jak obecne testy na zwierzętach, ale które stosują mniej zwierząt, powodują mniejsze cierpienie lub całkowicie unikają wykorzystania zwierząt. Takie metody, w przypadku gdy staną się dostępne, muszą być rozważane, gdziekolwiek jest to możliwe, przy charakteryzowaniu zagrożenia i późniejszym klasyfikowaniu i etykietowaniu wewnętrznych zagrożeń.

OCENA I INTERPRETACJA Podczas oceny i interpretacji testów, muszą być rozważone ograniczenia zakresu, w którym wyniki badań na zwierzętach i in vitro mogą być odniesione bezpośrednio do człowieka i dlatego tam, gdzie dostępne są dowody niekorzystnych skutków dla ludzi, mogą one być użyte do potwierdzenia wyników testowania.

BIBLIOGRAFIA Większość tych metod jest opracowana w ramach programu OECD – wskazówki dotyczące testowania, i powinny być one realizowane zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej, aby zapewnić możliwie najszerszą wzajemną akceptację danych. Dodatkowe informacje mogą być odnalezione w bibliografii wskazówek OECD i odpowiedniej literaturze publikowanej w innych źródłach.

B.1 bis. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA POKARMOWA – PROCEDURA Z WYKORZYSTANIEM STAŁEJ DAWKI

B.1 bis.

1. METODA Niniejsza metoda jest kopią OECD TG 420 (2001)

1.

1.1. WPROWADZENIE Tradycyjne metody oceny ostrej toksyczności wykorzystują śmierć zwierząt jako punkt końcowy. W 1984 r. Brytyjskie Towarzystwo Toksykologiczne zaproponowało nowe podejście do określania ostrej toksyczności, oparte na podawaniu serii dawek o stałym stężeniu (1). To podejście umożliwia uniknięcie śmierci zwierząt jako punktu końcowego, wykorzystując jako alternatywę obserwacje wyraźnych objawów zatrucia na danym etapie podawania serii dawek o stałym stężeniu. W następstwie badań weryfikacyjnych in vivo, przeprowadzonych przez Zjednoczone Królestwo (2) oraz na szczeblu międzynarodowym (3), procedura ta została przyjęta jako metoda badawcza w 1992 r. Jednocześnie, wykorzystując w szeregu badań modele matematyczne, poddano ocenie właściwości statystyczne Procedury stałych dawek (4)(5)(6). Zarówno badania in vivo, jak i badania z wykorzystaniem modeli wykazały, że procedura ta jest powtarzalna, wymaga mniejszej liczby zwierząt i powoduje mniej cierpień niż metody tradycyjne oraz że możliwa jest dzięki niej ocena substancji w podobny sposób, jak to ma miejsce z wykorzystaniem innych metod. Wytyczne dotyczące wyboru najbardziej odpowiedniej metody badawczej dla indywidualnych przypadków zostały zamieszczone w Wytycznych dotyczących badania ostrej toksyczności drogą pokarmową (7). Wytyczne te zawierają także dodatkowe informacje na temat przeprowadzania i interpretacji metody badawczej B.1 bis. Zasadniczo w badaniu głównym z wykorzystaniem niniejszej metody stosuje się jedynie umiarkowane toksycznie dawki oraz unika się dawek mogących spowodować śmierć. Nie jest również konieczne podawanie dawek mogących powodować silny ból lub stres wynikający z działania żrącego lub podrażniającego. Zwierzęta w stanie agonalnym lub w oczywisty sposób cierpiące albo chore i przeżywające strach powinny zostać uśmiercone w humanitarny sposób i uwzględniane w interpretacji wyników badań jako zwierzęta padłe w trakcie badania. Kryteria podejmowania decyzji co do uśmiercenia zwierząt w stanie agonalnym lub cierpiących ból oraz wytyczne dotyczące rozpoznania przewidywanego lub zbliżającego się zgonu są zawarte w oddzielnych Wytycznych (8). Metoda umożliwia przedstawienie informacji na temat niebezpiecznych właściwości danej substancji i pozwala na ocenę i klasyfikację zgodną z Globalnym Zharmonizowanym Systemem (GHS) klasyfikującym związki chemiczne pod względem ich ostrej toksyczności (9). Laboratorium badawcze powinno uwzględnić wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji przed rozpoczęciem badań. Informacje te powinny obejmować nazwę i budowę chemiczną substancji; właściwości fizyko-chemiczne; wyniki innych badań toksyczności in vitro lub in vivo; dane dotyczące toksyczności substancji zbliżonych pod względem budowy; przewidywane zastosowanie (zastosowania) tej substancji. Informacje te są niezbędne celem spełnienia wszelkich wymogów dotyczących ochrony zdrowia ludzkiego, i pomocne w wyborze odpowiedniej dawki wyjściowej.

1.2. DEFINICJE Toksyczność ostra pokarmowa: oznacza niepożądane skutki pojawiające się w następstwie podania doustnego pojedynczej dawki substancji lub wielu dawek w okresie 24 godzin. Opóźniona śmierć: oznacza, że zwierzę nie umiera, ani nie wydaje się być w agonii przez 48 godzin, lecz pada później w 14-dniowym okresie obserwacyjnym. Dawka: oznacza ilość podawanej substancji badanej. Dawka jest wyrażana jako masa próbki na jednostkę masy zwierzęcia (np. mg/kg). Wyraźne działanie toksyczne: jest ogólnym terminem opisującym wyraźne objawy zatrucia występujące w następstwie podania substancji badanej (zob. (3) celem uzyskania przykładów), pozwalające oczekiwać, że u większości zwierząt następna najwyższa stała dawka spowoduje bądź silny ból, przewlekłe oznaki strachu, stan agonalny (kryteria są przedstawione w Wytycznych dotyczących humanitarnego punktu końcowego (8)), bądź zgon u większości badanych zwierząt. GHS: Globalny zharmonizowany system klasyfikacji substancji i mieszanin chemicznych. Połączone działania OECD (w dziedzinie zdrowia ludzkiego i ochrony środowiska), Komitetu Ekspertów ONZ w sprawie transportu towarów niebezpiecznych (w zakresie właściwości fizyko-chemicznych) i Międzynarodowej Organizacji Pracy (ILO) (w zakresie wymiany informacji na temat niebezpieczeństw), koordynowane w ramach Międzyorganizacyjnego programu na rzecz właściwego zarządzania związkami chemicznymi (IOMC). Zagrażająca śmierć: występuje w przypadku gdy przewiduje się wystąpienie stanu agonalnego lub śmierci przed następnym zaplanowanym czasem obserwacji. Objawy wskazujące na ten stan mogą obejmować u gryzonia konwulsje, ułożenie na boku, pozycja leżąca oraz drgawki (zob. Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (9) celem uzyskania szczegółowych informacji). LD50(średnia dawka śmiertelna): jest statystycznie wyprowadzoną pojedynczą dawką substancji, która powoduje zgon 50 % zwierząt przy podaniu drogą pokarmową. Wartość LD50 jest wyrażona w wadze substancji badanej na jednostkę masy badanego zwierzęcia (mg/kg). Dawka graniczna: oznacza górną dawkę graniczną w badaniach (2000 lub 5000 mg/kg). Stan agonalny: stan śmierci lub niezdolności do przeżycia nawet w przypadku zastosowania leczenia (zob. Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (8) w celu uzyskania danych szczegółowych). Przewidywalna śmierć: obecność objawów klinicznych wskazujących na nadchodzący zgon przed planowanym zakończeniem eksperymentu, na przykład: niezdolność do dotarcia do wody lub pożywienia (zob. Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (8) w celu uzyskania danych szczegółowych).

1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ Grupom zwierząt tej samej płci podaje się, zgodnie z procedurą stopniową, stałe dawki na poziomie 5, 50, 300 i 2000 mg/kg (w wyjątkowych wypadkach można rozważyć podanie dodatkowej stałej dawki wynoszącej 5000 mg/kg, zob. sekcja 1.6.2). Poziom pierwszej stałej dawki jest określany na podstawie badania poglądowego na poziomie, który spowoduje wystąpienie określonych objawów zatrucia, lecz nie spowoduje ciężkich zatruć lub śmierci. Objawy kliniczne oraz objawy kojarzone z bólem, cierpieniem i zbliżającą się śmiercią zostały opisane w oddzielnych Wytycznych OECD (8). Następnej grupie zwierząt może zostać podana wyższa bądź niższa stała dawka, w zależności od obecności lub braku objawów zatrucia lub śmiertelności. Taka procedura jest powtarzana aż do osiągnięcia dawki powodującej wyraźne zatrucie lub powodującej nie więcej niż jeden przypadek śmiertelny, lub w przypadku braku skutków w następstwie podania najwyższej dawki, bądź w przypadku zgonu przy najniższej dawce.

1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.

1.4.1. Wybór gatunków zwierząt Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, choć dopuszcza się wykorzystywanie innych gatunków gryzoni. Na ogół w doświadczeniach wykorzystuję się samice (7). Wynika to z faktu, znajdującego swoje potwierdzenie w literaturze dotyczącej konwencjonalnych badań LD50, że różnice między płciami są znikome, lecz tam gdzie występują, samice są z reguły nieznacznie bardziej wrażliwe (10). Jednakże jeżeli wiedza na temat właściwości toksykologicznych i toksykokinetycznych związków o pokrewnej budowie wskazuje, że samce mogą być bardziej wrażliwe, w takim przypadku należy wybrać do badania tę płeć. Jeżeli badanie jest przeprowadzane na samcach, należy podać uzasadnienie. Zaleca się wykorzystanie zdrowych, młodych, dorosłych zwierząt pochodzących ze szczepów na ogół wykorzystywanych w laboratorium. Samice powinny być bezdzietne i nieciężarne. Każde zwierzę na początku cyklu laboratoryjnego powinno być w wieku między 8 a 12 tygodniem, a jego masa nie powinna przekraczać lub być mniejsza o ± 20 % średniej masy wszystkich wykorzystywanych uprzednio zwierząt.

1.4.2. Warunki przebywania i warunki żywieniowe Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 22o C (±3 oC). Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Zwierzęta mogą być grupowane w klatkach w sposób nieograniczający łatwej obserwacji pojedynczych sztuk.

1.4.3. Przygotowanie zwierząt Zwierzęta są wybierane losowo, oznaczane w sposób umożliwiający identyfikację poszczególnych osobników, i przetrzymywane w swoich klatkach przynajmniej przez 5 dni przed podaniem pierwszej dawki, co umożliwia aklimatyzację do warunków laboratoryjnych.

1.4.4. Przygotowanie dawek Na ogół badana substancja powinna być podawana w dawkach o stałej objętości przy zmianie stężenia dawkowanego preparatu. Jednakże w przypadku badania końcowego produktu będącego cieczą lub mieszaniny, dla celów oceny niebezpiecznego działania tej substancji, bardziej stosowne może okazać się wykorzystanie substancji nierozcieńczonej. tj. substancji o stałym stężeniu. Wymóg ten może być ponadto określony w niektórych przepisach wykonawczych. W żadnym razie niedopuszczalne jest przekroczenie maksymalnej objętości przewidzianej do podania. Maksymalna objętość cieczy podanej jednorazowo zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Dla gryzoni objętość ta nie powinna przekraczać 1 ml/100 g masy ciała: jednakże w przypadku roztworów wodnych dopuszczalne jest przyjęcie dawki 2 ml/100 g masy ciała. Jeżeli chodzi o przygotowywanie dozowanego preparatu, należy użyć, o ile to możliwe, roztworów/zawiesin/emulsji wodnych, następnie rozważyć przygotowanie roztworów/zawiesin/emulsji w oleju (np. oleju kukurydzianym), a dopiero w następnej kolejności roztworów innych nośników. W przypadkach stosowania nośnika różnego od wody muszą być znane jego właściwości toksykologiczne. Dawki muszą być przygotowywane na krótko przed podaniem, chyba że stabilność przygotowanego preparatu w okresie w jakim ma on być stosowany jest znana i możliwa do przyjęcia.

1.5. PROCEDURA

1.5.

1.5.1. Podawanie dawki Substancja badana jest podawana w formie pojedynczej dawki przez zgłębnik przy użyciu sondy przełykowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W nietypowych przypadkach, gdy niemożliwe jest podanie pojedynczej dawki, jednorazowa dawka może zostać rozbita na mniejsze porcje i podawana w odstępach czasowych w okresie nieprzekraczającym 24 godzin. Zwierzęta powinny być wyposzczone przed podaniem dawki (np. szczurom należy wstrzymać podawanie jedzenia przez noc, lecz nie wstrzymywać wody, myszom należy wstrzymać jedzenie przez 3–4 godziny, lecz nie wstrzymywać wody). Następnie, po wyposzczeniu, zwierzęta należy zważyć oraz podać im substancję badaną. W przypadku szczurów, po podaniu substancji badanej można wstrzymać podawanie jedzenia przez 3–4 godziny, a w przypadku myszy przez 1–2 godziny. Jeżeli dawka jest podawana porcjami przez określony czas, może być konieczne podanie pokarmu i wody w zależności od długości okresu podawania dawki.

1.5.2. Badania poglądowe Celem badań poglądowych jest wybranie odpowiedniej dawki początkowej dla badań zasadniczych. Substancja badana jest podawana poszczególnym zwierzętom w sposób sekwencyjny, zgodnie ze schematem postępowania zawartym w załączniku 1. Badania poglądowe są przerywane, gdy możliwe jest podjęcie decyzji co do ilości dawki wyjściowej (lub następuje śmierć w wyniku podania najmniejszej stałej dawki). Dawka początkowa wyznaczona do badania poglądowego danej substancji jest wybierana w oparciu o dane eksperymentalne z badań in vivo i in vitro tej samej substancji lub substancji pokrewnych pod względem budowy, spośród stałych dawek określonych na poziomie 5, 50, 300, i 2000 mg/kg, jako dawka, która powinna wywołać wyraźną toksyczność. W przypadku braku danych na temat takich substancji należy ustalić dawkę wyjściową na poziomie 300 mg/kg. Dopuszczalna jest nie krótsza niż 24-godzinna przerwa w podawaniu dawki jednemu zwierzęciu. Wszystkie zwierzęta należy objąć obserwacją przez przynajmniej 14 dni. W wyjątkowych okolicznościach i wyłącznie jeżeli wymagają tego określone potrzeby regulacyjne, można rozważyć podanie dawki dodatkowej stałej na górnym poziomie 5000 mg/kg (zob. załącznik 3). Z uwagi na dobrostan zwierząt badania na zwierzętach w zakresie kategorii 5 GSH (2000 i 5000 mg/kg) są odradzane i powinny być rozważane wyłącznie w przypadku znacznego prawdopodobieństwa, że wyniki takich badań przyniosą bezpośrednie korzyści dla ochrony zdrowia ludzkiego, zwierząt lub środowiska naturalnego. W przypadku gdy zwierzę, któremu w badaniach poglądowych została podana najniższa stała dawka (5 mg/kg), ginie, normalną procedurą jest przerwanie badań i przypisanie substancji do kategorii 1 GSH (jak to przedstawiono w załączniku 1). Jednakże w przypadku gdy wymagane jest potwierdzenie klasyfikacji wstępnej, możliwe jest przeprowadzenie procedury dodatkowej, zgodnie z poniższym opisem. Drugie zwierzę otrzymuje dawkę 5 mg/kg. Jeżeli również ono pada, przypisanie do kategorii 1 GHS zostaje potwierdzone, a badanie zostaje natychmiastowo przerwane. Jeżeli drugie zwierzę przeżyje, dawkę 5 mg/kg podaje się maksymalnie trzem kolejnym zwierzętom. Z uwagi na wysokie ryzyko śmiertelności dawki powinny być podawane sekwencyjnie, co zapewni optymalną ochronę zwierząt. Przerwy w podawaniu dawek każdemu zwierzęciu powinny pozwalać na uzyskanie pewności, że poprzednie zwierzę przeżyje. W momencie wystąpienia drugiego przypadku śmiertelnego sekwencyjne podawanie dawek zostaje natychmiast przerwane, a podawanie dawek kolejnym zwierzętom wstrzymane. Ponieważ wystąpienie drugiego przypadku śmiertelnego (niezależnie od liczby zwierząt poddanych badaniu do momentu ich przerwania) mieści się w wyniku A (2 lub więcej przypadków śmiertelnych), stosowana jest zasada klasyfikacji określona w załączniku 2, zgodnie z którą stężenie stałej dawki wynosi 5 mg/kg. Dodatkowo, do momentu przyjęcia nowego GHS, obowiązujące są wytyczne zawarte w załączniku 4, dotyczące klasyfikacji substancji w ramach systemu WE.

1.5.3. Badania zasadnicze

1.5.3.

1.5.3.1. Liczba zwierząt i poziomy dawek Działania, jakie mają być podjęte w następstwie przeprowadzenia badań przy pomocy dawek wyjściowych, są przedstawione na schemacie postępowania zawartym w załączniku 2. Wymagany jest jeden z trzech schematów postępowania; bądź przerwanie testów i przypisanie do jednej z klas klasyfikacji niebezpieczeństwa, zbadanie zwierzęcia przy pomocy wyższej stałej dawki, bądź jego zbadanie przy pomocy niższej stałej dawki. Jednakże w celu ochrony zwierząt poziom, który spowodował śmierć zwierzęcia w trakcie badań poglądowych, nie będzie powtórnie wykorzystany w badaniach zasadniczych (zob. załącznik 2). Doświadczenie wykazuje, że najbardziej prawdopodobny wynik na poziomie wyjściowym stałej dawki umożliwi klasyfikację substancji, skutkiem czego nie będą konieczne dalsze badania. Normalnie wykorzystuje się ogólną liczbę pięciu zwierząt jednej płci dla każdego badanego poziomu dawki. Liczba ta obejmuje jedno zwierzę zbadane w trakcie badań poglądowych przy pomocy wybranej dawki oraz cztery inne zwierzęta (z wyjątkiem sytuacji, w których poziom dawki wykorzystanej w badaniach zasadniczych nie był wcześniej zastosowany w badaniach poglądowych). Odstępy między podawaniem dawek na każdym poziomie określa się na podstawie czasu wystąpienia, długości trwania i dokuczliwości objawów zatrucia. Podanie zwierzęciu następnej dawki powinno zostać opóźnione do momentu uzyskania pewności co do możliwości przeżycia zwierząt, którym podano ostatnią dawkę. Zalecana jest przerwa rzędu 3 lub 4 dni między podaniem kolejnych dawek, o ile wystąpi taka potrzeba, w celu umożliwienia obserwacji opóźnionego zatrucia. Odstęp ten może zostać przedłużony np. w przypadku niejednoznacznej reakcji. W przypadku stosowania górnej dawki granicznej na poziomie 5000 mg/kg należy stosować procedurę przedstawioną w załączniku 3 (zob. także sekcja 1.6.2).

1.5.3.2. Badanie graniczne Badanie graniczne jest stosowane w sytuacji gdy badający posiada informacje sugerujące, że badany materiał może być nietoksyczny np. posiada toksyczność na poziomie przekraczającym nieznacznie dawki graniczne określone przepisami wykonawczymi. Informacje na temat toksyczności można uzyskać na podstawie wiedzy na temat podobnych zbadanych związków lub podobnych badanych mieszanin lub produktów, z uwzględnieniem tożsamości i zawartości procentowej składników, o których wiadomo, że mają znaczenie z punktu widzenia toksyczności. W sytuacji niewystarczającej ilości lub braku informacji na temat toksyczności materiału badanego lub w przypadku gdy oczekuje się, że badany materiał może być toksyczny, należy przeprowadzić badanie zasadnicze. W przypadku zastosowania normalnej procedury badanie graniczne dla potrzeb niniejszych wytycznych polega na podaniu dawki wyjściowej badania poglądowego, a następnie podaniu substancji czterem pozostałym zwierzętom.

1.6. OBSERWACJE Zwierzęta są poddawane obserwacji osobniczej przynajmniej raz w ciągu pierwszych 30 minut po podaniu dawki, okresowo przez pierwsze 24 godziny, ze szczególnym uwzględnieniem pierwszych 4 godzin, a następnie codziennie, ogólnie przez 14 dni, z wyjątkiem sytuacji, w których muszą one zostać wyeliminowane z badań i uśmiercone w sposób humanitarny z uwagi na ich dobrostan, lub gdy padły. Jednakże czas trwania obserwacji nie powinien być ustalany według ścisłych reguł. Powinien zależeć od działania toksycznego, czasu wystąpienia skutków i długości okresu powrotu do stanu normalnego, i może skutkiem tego być wydłużony, w przypadku gdy zostanie to uznane za stosowne. Czas, w jakim pojawiają się i zanikają objawy zatrucia, jest istotny, szczególnie w przypadku występowania opóźnionych objawów zatrucia (11). Wszystkie spostrzeżenia są systematycznie zapisywane w ewidencji prowadzonej osobno dla każdego osobnika. Dodatkowe obserwacje są wymagane, jeżeli zwierzęta wciąż wykazują objawy zatrucia. Obserwacje powinny dotyczyć zmian na skórze i futrze, oczach i błonach śluzowych, a także w układach oddechowym, krążenia, autonomicznym i centralnym układzie nerwowym oraz zmian w funkcjonowaniu somatomotorycznym i schematach zachowań. Szczególną uwagę należy poświęcić obserwacjom drżenia, konwulsji, ślinienia się, biegunki, letargu, snu i śpiączki. Należy przestrzegać zasad i kryteriów streszczonych w Wytycznych dotyczących humanitarnego punktu końcowego (8). Zwierzęta, u których stwierdzono stan agonalny, oraz zwierzęta wykazujące objawy silnego bólu, powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny. W przypadku uśmiercenia zwierząt z przyczyn humanitarnych lub ich zgonu, czas zgonu powinien zostać zapisany najdokładniej jak to możliwe.

1.6.

1.6.1. Masa ciała Masa każdego zwierzęcia powinna zostać określona na krótko przed podaniem substancji badanej i przynajmniej w odstępie tygodnia od jej podania. Zmiany masy powinny zostać obliczone i zapisane. Po zakończeniu badań zwierzęta, które przeżyły, są ważone i uśmiercane w sposób humanitarny.

1.6.2. Patologia Wszystkie badane zwierzęta (włączając zwierzęta, które padły podczas badań lub zostały wyeliminowane z badań ze względu na ich dobrostan) powinny zostać poddane całkowitej sekcji zwłok. Wszystkie całkowite zmiany patologiczne powinny zostać zapisane oddzielnie dla każdego zwierzęcia. Badanie mikroskopowe organów wykazujących wyraźne zmiany patologiczne u zwierząt, które przeżyły 24 lub więcej godzin po podaniu pierwszej dawki, mogą również zostać rozważone, ponieważ mogą one dostarczyć użytecznych informacji.

2. DANE Należy podać dane dla każdego zwierzęcia. Dodatkowo, wszystkie dane powinny zostać streszczone w tabeli, pokazującej dla każdej badanej grupy liczbę wykorzystanych sztuk, liczbę zwierząt wykazujących objawy zatrucia, liczbę zwierząt padłych w trakcie badań lub uśmierconych z przyczyn humanitarnych, czas zgonu poszczególnych zwierząt, opis oraz przebieg w czasie skutków zatrucia oraz powrotu do stanu normalnego, a także wyniki sekcji zwłok.

3. SPRAWOZDANIE

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje, jeśli są one stosowne:

Substancja badana:

charakter fizyczny, czystość, i jeśli to stosowne, właściwości fizyko-chemiczne (włączając rodzaj izomerii),

identyfikację w tym numer CAS.

Nośnik (jeśli był użyty):

uzasadnienie wyboru nośnika, jeśli jest inny niż woda.

Zwierzęta badane:

użyty gatunek/szczep,

stan mikrobiologiczny zwierzęcia, jeśli jest znany,

liczbę, wiek i płeć zwierząt (włączając, o ile to stosowne, uzasadnienie wykorzystania samców zamiast samic),

źródło, warunki środowiska, pożywienie itp.

Warunki badań:

szczegóły dotyczące postaci substancji badanej, włączając stan skupienia podawanego środka,

szczegóły dotyczące podawania substancji badanej, włączając objętość dawki oraz czas podawania dawki,

szczegóły dotyczące jakości pożywienia i wody (włączając w to rodzaj/źródło diety, źródło wody),

uzasadnienie wyboru dawki wyjściowej.

Wyniki:

tabelę przedstawiającą dane nt. reakcji oraz poziomów dawek dla każdego zwierzęcia (np. zwierząt wykazujących objawy zatrucia, włączając śmiertelność, a także charakter, intensywność oraz trwałość objawów),

tabelę zawierającą informację na temat masy ciała oraz zmiany masy ciała,

masę indywidualną zwierząt w dniu podania dawki, następnie w odstępach tygodniowych, a także w momencie śmierci lub uśmiercenia,

data i czas śmierci, o ile nastąpiła przed przewidywanym uśmierceniem,

przebieg w czasie objawów zatrucia i informacje, czy były one odwracalne w przypadku każdego zwierzęcia,

wyniki sekcji zwłok oraz badań histopatologicznych dla każdego zwierzęcia, jeżeli są dostępne.

Omówienie i interpretacja wyników.

Wnioski.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)

BIBLIOGRAFIA British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparation on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparation for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279–291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469–482. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem.Toxicol., 30, 313–324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl.Toxicol. 14, 315–323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed doseprocedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231. Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

B.1 ter. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA POKARMOWA – METODA KLAS OSTREJ TOKSYCZNOŚCI

B.1 ter.

1. METODA Niniejsza metoda badawcza jest kopią OECD TG 423 (2001).

1.

1.1. WPROWADZENIE Metoda klas ostrej toksyczności (1) przyjęta w tym badaniu jest procedurą stopniową, w której dla każdego stopnia wykorzystywane są trzy osobniki zwierząt jednej płci. Zależnie od śmiertelności oraz/lub stanu agonalnego zwierząt do stwierdzenia ostrej toksyczności badanej substancji konieczne mogą być średnio 2–4 etapy. Niniejsza procedura jest powtarzalna, w jej toku wykorzystuje się niewiele zwierząt i daje ona możliwość klasyfikacji substancji w sposób podobny do innych metod badania ostrej toksyczności. Metoda klas ostrej toksyczności opiera się na ocenach biometrycznych (2)(3)(4)(5) przeprowadzonych z wykorzystaniem stałych dawek, oddzielonych w odpowiedni sposób umożliwiający ocenę substancji dla celów klasyfikacji i oceny niebezpieczeństwa. Metoda ta została przyjęta w 1996 r. i była poddawana intensywnej weryfikacji in vivo w oparciu o dane o LD50 uzyskane z literatury, zarówno na szczeblu narodowym (6), jak i międzynarodowym (7). Wytyczne dotyczące wyboru najbardziej odpowiedniej metody badawczej dla danego przypadku zostały zamieszczone w Wytycznych dotyczących badania toksyczności ostrej pokarmowej (8). Wytyczne te zawierają ponadto dodatkowe informacje na temat przeprowadzania i interpretacji Metody badawczej B.1ter. Nie jest również konieczne podawanie dawek mogących powodować silny ból lub strach wynikający z działania żrącego lub podrażniającego. Zwierzęta w stanie agonalnym lub w oczywisty sposób cierpiące albo chore i doświadczające strachu powinny zostać uśmiercone w humanitarny sposób i uwzględniane w interpretacji wyników badań jako zwierzęta padłe w trakcie badania. Kryteria podejmowania decyzji co do uśmiercenia zwierząt w stanie agonalnym lub cierpiących ból oraz wytyczne dotyczące rozpoznawania przewidywalnego lub zbliżającego się zgonu, są zawarte w oddzielnych Wytycznych (9). Metoda opiera się na wcześniej określonych dawkach, a wyniki uzyskane w wyniku jej zastosowania pozwalają na ocenę i klasyfikację zgodną z Globalnym Zharmonizowanym Systemem klasyfikacji związków chemicznych pod względem ich ostrej toksyczności (10). W zasadzie niniejsza metoda nie pozwala na dokładne obliczenie LD50, lecz pozwala na określenie zakresu ekspozycji, tam gdzie oczekiwana jest śmiertelność, ponieważ śmierć określonego odsetka zwierząt nadal stanowi jeden z głównych punktów końcowych badania. Metoda umożliwia określenie wartości LD50 wyłącznie w przypadku, gdy przynajmniej dwie dawki spowodowały śmiertelność wyższą niż 0 %, lecz mniejszą niż 100 %. Wykorzystanie selekcji wcześniej określonych dawek, niezależnie od substancji badanej, której klasyfikacja jest wyraźnie powiązana z liczbą zwierząt obserwowanych na poszczególnych etapach, poprawia możliwości laboratoriom w zakresie konsekwencji i powtarzalności sprawozdań laboratoryjnych. Laboratorium badawcze powinno uwzględniać wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji przed rozpoczęciem badań. Informacje te powinny obejmować tożsamość i budowę chemiczną substancji; właściwości fizyko-chemiczne; wyniki innych badań toksyczności in vitro lub in vivo substancji; dane dotyczące toksyczności substancji pokrewnych pod względem budowy; przewidywane zastosowanie (zastosowania) tej substancji. Informacje te są niezbędne celem spełnienia wszelkich wymogów dotyczących ochrony zdrowia ludzkiego i umożliwienia wyboru najbardziej odpowiedniej dawki wyjściowej.

1.2. DEFINICJE Toksyczność ostra pokarmowa: oznacza niepożądane skutki pojawiające się w następstwie podania doustnego pojedynczej dawki substancji lub wielu dawek w okresie 24 godzin. Opóźniona śmierć: oznacza, że zwierzę nie umiera, ani nie wydaje się być w agonii przez 48 godzin, lecz pada później w 14-dniowym okresie obserwacyjnym. Dawka: oznacza ilość podanej substancji badanej. Dawka jest wyrażana w wadze próbki na jednostkę masy zwierzęcia (np. mg/kg). GHS: Globalny Zharmonizowany System Klasyfikacji Substancji i Mieszanin Chemicznych. Połączone działania OECD (w dziedzinie zdrowia ludzkiego i ochrony środowiska), Komitetu Ekspertów ONZ w sprawie transportu towarów niebezpiecznych (w zakresie właściwości fizyko-chemicznych) i Międzynarodowej Organizacji Pracy (ILO) (w zakresie wymiany informacji na temat niebezpieczeństw), koordynowane w ramach Międzyorganizacyjnego programu na rzecz właściwego zarządzania związkami chemicznymi (IOMC). Zagrażająca śmierć: występuje w przypadku, gdy przewiduje się wystąpienie stanu agonalnego lub śmierć przed następnym zaplanowanym punktem czasowym obserwacji. Objawy wskazujące na ten stan mogą obejmować u gryzonia konwulsje, ułożenie na boku, pozycję leżącą oraz drgawki (zob. Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (9) celem uzyskania szczegółowych informacji). LD50(średnia dawka śmiertelna): jest statystycznie wyprowadzoną pojedynczą dawką substancji, która powoduje zgon 50 procent zwierząt, przy podaniu drogą pokarmową. Wartość LD50 jest wyrażona w wadze substancji badanej na jednostkę masy badanego zwierzęcia (mg/kg). Dawka graniczna: oznacza górną dawkę graniczną w badaniach (2000 lub 5000 mg/kg). Stan agonalny: stan śmierci lub niezdolności do przeżycia nawet w przypadku zastosowania leczenia (zob. Wytyczne metodyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (9) w celu uzyskania danych szczegółowych). Przewidywana śmierć: obecność objawów klinicznych wskazujących na nadchodzący zgon w przewidzianym czasie w przyszłości przed planowanym zakończeniem eksperymentu, na przykład: niezdolność do dotarcia do wody lub pożywienia (zob. Wytyczne metodyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (9) w celu uzyskania danych szczegółowych).

1.3. ZASADA METODY BADANIA Zasadą badania jest to, że w oparciu o procedurę etapową z użyciem minimalnej liczby zwierząt na każdym etapie uzyskiwane są wystarczające informacje na temat ostrej toksyczności substancji badanej w celu jej zaklasyfikowania. Substancja jest podawana doustnie grupie zwierząt laboratoryjnych w jednej z określonych dawek. Substancja jest badana przy użyciu procedury etapowej, na każdym etapie wykorzystywane są trzy zwierzęta jednej płci (na ogół samice). Brak lub obecność śmiertelności związanej z podaniem odczynnika zwierzętom determinuje następny etap, tj.: Szczegóły procedury są opisane w załączniku 1. Metoda pozwala na ocenę w odniesieniu do przypisania substancji badanej do jednej z szeregu klas toksyczności określonych poprzez ustalone wartości odcinania D50.

dalsze badania są zbyteczne,

dawka zostaje podana trzem następnym zwierzętom,

dawka na następnym niższym bądź wyższym poziomie zostaje podana trzem następnym zwierzętom.

1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.

1.4.1. Wybór gatunków zwierząt Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, choć dopuszcza się wykorzystywanie innych gatunków gryzoni. Na ogół w doświadczeniach wykorzystuję się samice (9). Wynika to z faktu, znajdującego swoje potwierdzenie w literaturze na temat konwencjonalnych badań LD50, że różnice między płciami są znikome, lecz tam gdzie występują, samice są z reguły nieznacznie bardziej wrażliwe (11). Jednakże jeżeli wiedza na temat właściwości toksykologicznych i toksokinetycznych związków o podobnej budowie wskazuje na to, że samce mogą być bardziej wrażliwe, w takim przypadku należy wybrać do badania tę płeć. Jeżeli badanie jest przeprowadzane na samcach, należy podać uzasadnienie. Zaleca się wykorzystanie zdrowych, młodych, dorosłych zwierząt pochodzących ze szczepów na ogół wykorzystywanych w laboratorium. Samice powinny być bezdzietne i nieciężarne. Każde zwierzę na początku cyklu laboratoryjnego powinno być w wieku między 8 a 12 tygodniem, a jego masa nie powinna przekraczać lub być mniejsza o ± 20 % średniej masy wszystkich wykorzystywanych uprzednio zwierząt.

1.4.2. Warunki przebywania i warunki żywieniowe Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 20 oC (± 3 oC). Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Zwierzęta mogą być grupowane w klatkach w sposób nieograniczający łatwej obserwacji pojedynczych sztuk.

1.4.3. Przygotowanie zwierząt Zwierzęta są wybierane losowo, oznaczane w sposób umożliwiający identyfikację pojedynczych osobników i przetrzymywane w swoich klatkach przynajmniej przez 5 dni przed podaniem pierwszej dawki, co umożliwia aklimatyzację do warunków laboratoryjnych.

1.4.4. Przygotowanie dawek Na ogół badana substancja powinna być podawana w dawkach o stałej objętości przy zmianie stężenia dawkowanego preparatu. Jednakże w przypadku badania końcowego produktu będącego cieczą lub mieszaniną dla celów oceny ryzyka tej substancji bardziej stosowne może okazać się wykorzystanie w badaniach substancji nierozcieńczonej. tj. substancji o stałym stężeniu. Wymóg ten może być ponadto określony w niektórych przepisach wykonawczych. W żadnym razie niedopuszczalne jest przekroczenie maksymalnej objętości przewidzianej do podania. Maksymalna objętość cieczy podanej jednorazowo zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Dla gryzoni objętość ta nie powinna przekraczać 1 ml/100g masy ciała: jednakże w przypadku roztworów wodnych dopuszczalne jest przyjęcie dawki 2 ml/100 g masy ciała. Jeżeli chodzi o przygotowywanie dozowanego preparatu należy użyć, o ile to możliwe, roztworów/zawiesin/emulsji wodnych, następnie rozważyć przygotowanie roztworów/zawiesin/emulsji w oleju (np. oleju kukurydzianym), a dopiero w następnej kolejności roztworów innych nośników. W przypadkach stosowania nośnika różnego od wody muszą być znane jego właściwości toksykologiczne. Dawki muszą być przygotowywane na krótko przed podaniem, chyba że stabilność przygotowanego preparatu w okresie w jakim ma on być stosowany jest znana i możliwa do przyjęcia.

1.5. PROCEDURA

1.5.

1.5.1. Podawanie dawki Substancja badana jest podawana w formie pojedynczej dawki przez zgłębnik przy użyciu sondy przełykowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W nietypowych przypadkach, gdy niemożliwe jest podanie pojedynczej dawki, jednorazowa dawka może zostać rozbita na mniejsze porcje i podawana w odstępach czasowych w okresie nieprzekraczającym 24 godzin. Zwierzęta powinny być wyposzczone przed podaniem dawki (np. szczurom należy wstrzymać podawanie jedzenia przez noc, lecz nie wstrzymywać podawania wody, myszom należy wstrzymać podawanie jedzenia przez 3–4 godziny, lecz nie wstrzymywać wody). Następnie, po wyposzczeniu, zwierzęta należy zważyć oraz podać im substancję badaną. W przypadku szczurów, po podaniu substancji badanej można wstrzymać podawanie jedzenia przez 3–4 godziny, a w przypadku myszy przez 1–2 godziny. Jeżeli dawka jest podawana porcjami przez określony czas, może być konieczne podanie pokarmu i wody w zależności od długości okresu podawania dawki.

1.5.2. Liczba zwierząt i poziomy dawki Na każdym etapie wykorzystywane są trzy zwierzęta. Poziom dawki, która ma być wykorzystana jako dawka wyjściowa, jest wybierana z jednego z czterech stałych poziomów 5, 50, 300 i 2000 mg/kg masy ciała. Poziom wyjściowy dawki powinien być taki, żeby powodował śmiertelność u niektórych zwierząt, którym ją zaaplikowano. Schemat postępowania zamieszczony w załączniku 1 opisuje procedurę, którą należy podjąć dla każdej dawki wyjściowej. Dodatkowo, do momentu przyjęcia nowego GHS, obowiązujące są wytyczne zawarte w załączniku 4, dotyczące klasyfikacji substancji w ramach systemu WE. Jeżeli dostępne informacje sugerują brak prawdopodobieństwa śmiertelności przy najwyższym poziomie dawki (2000 mg/kg masy ciała), powinno zostać przeprowadzone badanie graniczne. W przypadku braku informacji na temat danej substancji, która ma być badana, z uwagi na dobrostan zwierząt zalecane jest zastosowanie dawki wyjściowej 300 mg/kg masy ciała. Odstępy między podawaniem dawek na każdym poziomie określa się na podstawie czasu wystąpienia, długości trwania i dokuczliwości objawów zatrucia. Podanie zwierzęciu następnej dawki powinno zostać opóźnione do momentu uzyskania pewności co do możliwości przeżycia zwierząt, którym podano ostatnią dawkę. W wyjątkowych okolicznościach i wyłącznie jeżeli wymagają tego określone potrzeby regulacyjne, można rozważyć podanie dawki dodatkowej ustalonej na górnym poziomie 5000 mg/kg (zob. załącznik 3). Z uwagi na dobrostan zwierząt badania na zwierzętach w zakresie kategorii 5 GSH (2000 i 5000 mg/kg) są odradzane i powinny być rozważane wyłącznie w przypadku znacznego prawdopodobieństwa, że wyniki takich badań przyniosą bezpośrednie korzyści dla ochrony zdrowia ludzkiego, zwierząt lub środowiska naturalnego.

1.5.3. Badanie graniczne Badanie graniczne jest stosowane w sytuacji gdy badający posiada informacje sugerujące, że badany materiał może być nietoksyczny np. posiada toksyczność na poziomie przekraczającym nieznacznie dawki graniczne określone przepisami wykonawczymi. Informacje na temat toksyczności mogą zostać uzyskane na podstawie wiedzy na temat podobnych zbadanych związków lub podobnych zbadanych mieszanin lub produktów, z uwzględnieniem tożsamości i zawartości procentowej składników, o których wiadomo, że mają znaczenia z punktu widzenia toksyczności. W sytuacji niewystarczającej ilości lub braku informacji na temat toksyczności materiału testowego lub w przypadku gdy, zgodnie z oczekiwaniami, badany materiał może być toksyczny, należy przeprowadzić badanie zasadnicze. Badanie graniczne dla jednej dawki na poziomie 2000 mg/kg masy ciała może zostać przeprowadzone na sześciu zwierzętach (trzy na każdym etapie). W wyjątkowych okolicznościach dopuszczalne jest przeprowadzenie badania granicznego przy jednej dawce na poziomie 5000 mg/kg na trzech zwierzętach (zob. załącznik 2). W przypadku wystąpienia śmiertelności związanej z substancją badaną konieczne może okazać się przeprowadzenie badania na następnym niższym poziomie.

1.6. OBSERWACJE Zwierzęta są poddawane obserwacji osobniczej przynajmniej raz w ciągu pierwszych 30 min. po podaniu dawki, okresowo przez pierwsze 24 godziny, ze szczególnym uwzględnieniem pierwszych 4 godzin, a następnie codziennie ogólnie przez 14 dni, z wyjątkiem sytuacji w których muszą one zostać wyeliminowane z badań i humanitarnie zabite ze względu na ich dobro, lub zostały znalezione martwe. Jednakże czas trwania obserwacji nie powinien być ustalany według ścisłych reguł. Powinien on być zależny od działania toksycznego, czasu wystąpienia skutków i długości okresu powrotu do stanu normalnego, i może skutkiem tego być przedłużany, w przypadku gdy zostanie to uznane za stosowne. Czas w jakim pojawiają się i zanikają objawy zatrucia jest istotny, szczególnie w przypadku występowania opóźnionych objawów zatrucia (11). Wszystkie obserwacje są systematycznie zapisywane w ewidencji prowadzonej osobno dla każdego zwierzęcia. Dodatkowe obserwacje będą wymagane, jeżeli zwierzęta wciąż wykazują objawy zatrucia. Obserwacje powinny dotyczyć zmian na skórze i futrze, oczach i śluzówce a także w układach oddechowym, krążenia, autonomicznym i centralnym układzie nerwowym oraz zmian w funkcjonowaniu somatomotorycznym i schematach zachowania. Szczególną uwagę należy poświęcić obserwacjom drżenia, drgawek, ślinienia się, biegunki, letargu, snu i śpiączki. Należy przestrzegać zasad i kryteriów streszczonych w Wytycznych dotyczących humanitarnego punktu końcowego. Zwierzęta u których stwierdzono stan agonalny oraz zwierzęta wykazujące objawy silnego bólu powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny. W przypadku uśmiercenia zwierząt z przyczyn humanitarnych lub stwierdzenia u nich zgonu, czas zgonu powinien zostać zapisany najdokładniej, jak to jest możliwe.

1.6.

1.6.2. Patologia Wszystkie badane zwierzęta (włączając zwierzęta, które padły podczas badań lub zostały wyeliminowane z badań ze względu na ich dobro) powinny zostać poddane całkowitej sekcji zwłok. Wszystkie całkowite zmiany patologiczne powinny zostać zapisane oddzielnie dla każdego zwierzęcia. Badanie mikroskopowe organów wykazujących ewidentne zmiany patologiczne u zwierząt, które przeżyły 24 lub więcej godzin po podaniu pierwszej dawki, mogą również zostać wzięte pod uwagę, ponieważ mogą one dostarczyć użytecznych informacji.

2. DANE Należy podać dane dla każdego zwierzęcia. Dodatkowo, wszystkie dane powinny zostać streszczone w tabeli pokazującej dla każdej badanej grupy liczbę wykorzystanych sztuk, liczbę zwierząt wykazujących objawy zatrucia, liczbę zwierząt, u których stwierdzono zgon w trakcie badań lub uśmierconych z przyczyn humanitarnych, czas zgonu poszczególnych zwierząt, opis oraz przebieg w czasie objawów zatrucia oraz powrotu do stanu normalnego, a także wyniki sekcji.

3. SPRAWOZDANIE

3.

3.1. Sprawozdanie z badań Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje, o ile są one stosowne:

Substancja badana:

charakter fizyczny, czystość, i jeśli to stosowne, właściwości fizyko-chemiczne (włączając rodzaj izomerii),

identyfikacja, w tym numer CAS.

Nośnik (jeśli był użyty):

uzasadnienie wyboru nośnika, jeśli jest inny niż woda.

Zwierzęta badane:

użyty gatunek/szczep,

stan mikrobiologiczny zwierzęcia, jeśli jest znany,

liczbę, wiek i płeć zwierząt (włączając, o ile to stosowne, uzasadnienie wykorzystania samców zamiast samic),

źródło, warunki środowiska, pożywienie itp.

Warunki badań:

szczegóły dotyczące postaci substancji badanej, włączając stan skupienia podawanego środka,

szczegóły dotyczące podawania substancji badanej, włączając objętość dawki oraz czas podawania dawki,

szczegóły dotyczące jakości pożywienia i wody (włączając w to rodzaj/źródło diety, źródło wody),

uzasadnienie wyboru dawki wyjściowej.

Wyniki:

tabelę przedstawiającą dane nt. reakcji oraz poziomów dawek dla każdego zwierzęcia (np. zwierząt wykazujących objawy zatrucia, włączając śmiertelność, charakter, intensywność oraz trwałość objawów),

tabelę zawierającą informacje na temat masy ciała oraz zmian masy ciała,

masę indywidualną zwierząt w dniu podania dawki, następnie w tygodniowych odstępach, a także w momencie śmierci lub uśmiercenia,

data i czas śmierci, o ile nastąpiła przed przewidywanym uśmierceniem,

przebieg w czasie objawów zatrucia i czy były one odwracalne w przypadku każdego zwierzęcia,

wyniki sekcji oraz badań histopatologicznych w odniesieniu do każdego zwierzęcia, jeżeli są dostępne.

Omówienie i interpretacja wyników.

Wnioski.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)

BIBLIOGRAFIA Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute- Toxic-Class Metoda (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Metodas: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX16, 129–134. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method. An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute- Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Grade N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Grade and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/stronas/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html] Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223–231. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

B.2. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA (INHALACYJNA)

B.2.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Jest użyteczne posiadanie wstępnych informacji na temat rozkładu wielkości ziarna, prężności pary, temperatury topnienia, temperatury wrzenia, temperatury zapłonu w wybuchowości (o ile dotyczy) substancji. Zob. także Wprowadzenie ogólne część B lit. A).

1.2. DEFINICJE Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. B).

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.4. ZASADA METODY BADANIA Kilka grup zwierząt doświadczalnych poddaje się ekspozycji przez określony okres czasu na substancję badaną w stopniowanych stężeniach, po jednym stężeniu na grupę. Następnie przeprowadza się obserwację skutków podania substancji i zgonów. Zwierzęta, które padną w trakcie badania, i te, które przeżyją po jego zakończeniu, poddaje się sekcji zwłok. Zwierzęta wykazujące ciężkie i trwałe oznaki stanu zagrożenia i bólu mogą wymagać humanitarnego uśmiercenia. Dozowanie badanych substancji w sposób znany z powodowania znaczącego bólu i stanu zagrożenia z powodu właściwości żrących lub poważnie drażniących nie może być przeprowadzane.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Brak.

1.6. OPIS METODY BADANIA

1.6.

1.6.1. Przygotowania Zwierzęta muszą być trzymane w doświadczalnych warunkach pobytu i karmienia przez co najmniej pięć dni przed przeprowadzeniem badania. Przed przeprowadzeniem badania zdrowe, młode, dorosłe zwierzęta są wybierane losowo i przydzielane do wymaganej liczby grup otrzymujących substancję. Nie muszą być poddawane symulowanej ekspozycji, chyba że jest to wskazane z powodu wykorzystania określonego przyrządu zapewniającego ekspozycję. Badane substancje w postaci ciała stałego wymagają mikronizacji w celu uzyskania właściwego wymiaru cząstki. W miarę potrzeby do badanej substancji można dodać odpowiednie podłoże, aby można było zapewnić właściwe stężenie tej substancji w powietrzu – w takim przypadku należy zastosować grupę kontrolną, która będzie otrzymywać samo podłoże. W razie wykorzystania podłoża lub innych substancji pomocniczych w celu ułatwienia dawkowania, musi być wiadomo, że nie wykazująone działania toksycznego. O ile będzie to właściwe, można wykorzystać dane historyczne.

1.6.2. Warunki badania

1.6.2.

1.6.2.1. Zwierzęta doświadczalne O ile nie ma przeciwwskazań, preferowanym gatunkiem jest szczur. Należy wykorzystywać powszechnie stosowane szczepy laboratoryjne. Dla każdej płci, na początku badania, zakres zmian wagi używanych zwierząt nie może przekraczać ± 20 % właściwej wartości średniej.

1.6.2.2. Liczba i płeć Wykorzystuje się po co najmniej 10 gryzoni (pięć samic i pięciu samców) w przypadku każdego poziomu dawkowania. Samice powinny być nieródkami i nie mogą być w ciąży. Uwaga: W badaniach ostrej toksyczności u zwierząt wyższego rzędu niż gryzonie, należy rozważyć użycie mniejszej ilości. Dawki muszą być starannie wybrane oraz należy dołożyć wszelkich starań by nie przekraczać dawek średniej toksyczności. Należy unikać podawania w takich badaniach dawek śmiertelnych substancji badanej.

1.6.2.3. Stężenia ekspozycyjne Powinno się zapewnić odpowiednią liczbę wartości tych stężeń – co najmniej trzy – przy czym należy zachować odpowiednie odstępy między nimi, tak aby uzyskać grupy badane różniące się istotnie efektami toksycznymi i stopniem śmiertelności. Dane powinny wystarczyć do nakreślenia krzywej zależności między stężeniem a śmiertelnością oraz w miarę możliwości powinny zapewnić możliwe do przyjęcia obliczenie LC50.

1.6.2.4. Badanie graniczne W przypadku gdy ekspozycja pięciu samców i pięciu samic badanych zwierząt na 20 mg na litr gazu lub 5 mg na litr aerozolu lub cząstek substancji przez cztery godziny (lub, jeżeli jest to niemożliwe ze względu na fizyczne lub chemiczne, w tym wybuchowe, właściwości substancji badanej, na maksymalne możliwe do uzyskania stężenie) nie spowoduje związanych z danym związkiem zgonów w ciągu 14 dni, dalsze badania można uznać za zbędne.

1.6.2.5. Czas ekspozycji Okres czasu ekspozycji powinien być cztery godziny.

1.6.2.6. Wyposażenie Zwierzęta należy poddać badaniu przy użyciu przyrządów do inhalacji zapewniających przepływ dynamiczny powietrza co najmniej 12 wymian na godzinę, aby zapewnić odpowiednią zawartość tlenu i równomierną dystrybucję powietrza ekspozycji. W przypadku wykorzystania komory należy ją tak zaprojektować, aby zmniejszyć do minimum stłoczenie zwierząt badanych i zwiększyć do maksimum ich ekspozycję drogą inhalacyjną na substancję badaną. Z reguły, aby zapewnić stabilność powietrza w komorze, całkowita objętość zwierząt badanych nie powinna przekraczać 5 % objętości komory do badań. Można zastosować ekspozycję doustno-nosową, ekspozycję jedynie głowy lub ekspozycję całego ciała w pojedynczych komorach, przy czym te pierwsze dwa sposoby pomogą w zminimalizowaniu przechodzenia substancji badanej do organizmu innymi drogami.

1.6.2.7. Okres obserwacji Okres obserwacji powinien wynosić co najmniej 14 dni. Jednakże nie powinien on być sztywno ustalony. Powinien zależeć od reakcji toksycznych, szybkości ich pojawiania się oraz okresu powrotu do zdrowia po ich wystąpieniu; w związku z tym można go wydłużyć, jeżeli uzna się to za konieczne. Ważny jest czas, po jakim pojawiają się i znikają objawy toksyczności oraz czas zgonu, w szczególności gdy istnieje tendencja do opóźnionych zgonów.

1.6.3. Procedura Tuż przed ekspozycją zwierzęta waży się, a następnie poddaje ekspozycji na stężenie badane w wyznaczonej aparaturze przez minimalny okres czterech godzin, po zapewnieniu równowagi stężenia substancji w komorze. Czas do uzyskania równowagi powinien być krótki. Temperatura przeprowadzania badania powinna być utrzymywana na poziomie 22 oC ± 3 oC. Idealnie wilgotność względną należy utrzymywać w przedziale między 30 i 70 %, jednak w niektórych przypadkach (np. badania niektórych aerozoli) może to nie być możliwe ze względów praktycznych. Utrzymanie lekkiego podciśnienia wewnątrz komory (ok. 5 mm słupa wody) zapobiega wyciekowi substancji badanej do otaczającego obszaru. W trakcie ekspozycji należy zaprzestać podawania zwierzętom karmy i wody. Należy użyć układów generacji i monitorowania powietrza stosowanego do badań. Układ powinien zapewnić jak najszybsze uzyskanie stabilnych warunków ekspozycji. Komora musi być zaprojektowana i działać w taki sposób, by utrzymywać jednorodny rozkład badanego powietrza w jej obrębie. Należy prowadzić pomiary lub monitorować: W trakcie ekspozycji i po jej zakończeniu należy prowadzić systematyczne obserwacje, zapisując ich wyniki; należy prowadzić oddzielne zapisy dla każdego zwierzęcia. Obserwacja powinna być częsta w ciągu pierwszego dnia. Staranne badanie kliniczne należy przeprowadzać co najmniej raz każdego dnia roboczego, inne obserwacje należy przeprowadzać codziennie, podejmując odpowiednie działania mające na celu zmniejszenie do minimum straty zwierząt podczas badania, np. sekcję zwłok lub zamrażanie tych zwierząt, które zostaną znalezione martwe, oraz izolację lub usypianie zwierząt słabych lub śmiertelnie chorych. Obserwacje powinny obejmować zmiany skóry i sierści, oczu i błon śluzowych oraz zmiany układu oddechowego, krążenia, autonomicznego i ośrodkowego układu nerwowego, jak też wzorców aktywności somatomotorycznej i wzorca zachowania. Szczególną uwagę należy zwrócić na obserwacje drżeń, drgawek, zwiększonego wydzielania śliny, biegunki, stanów zwiększonej senności, snu i śpiączki. Należy jak najprecyzyjniej odnotować termin zgonu. Masy ciała poszczególnych zwierząt należy ustalać co tydzień po ekspozycji oraz w momencie zgonu. Zwierzęta, które zdechną w trakcie badania, i te, które przeżyją po jego zakończeniu, poddaje się sekcji zwłok, ze szczególnym zwróceniem uwagi na wszelkie zmiany w obrębie górnych i dolnych dróg oddechowych. Należy odnotować wszelkie makroskopowe zmiany patologiczne. O ile jest to wskazane, należy pobrać wycinki tkanek do badania histopatologicznego.

1.6.3.

(a) szybkość przepływu powietrza (w sposób ciągły),

(b) rzeczywiste stężenie substancji badanej mierzone w obszarze wdychania co najmniej trzy razy w czasie trwania ekspozycji (niektóre atmosfery, na przykład aerozole o wysokich stężeniach mogą wymagać częstszej kontroli). W czasie trwania okresu ekspozycji, stężenie nie powinno zmieniać się więcej niż ± 15 % od wartości średniej. W przypadku niektórych aerozoli ten poziom kontroli możne być niemożliwy do uzyskania, przy czym dopuszczalny jest wtedy szerszy zakres. Dla aerozoli należy przeprowadzić analizę wielkości cząsteczki (co najmniej raz na badaną grupę),

2. DANE Dane należy przedstawić w skrócie w formie tabelarycznej, z podaniem – dla każdej badanej grupy – liczby zwierząt na początku badania, terminów zgonu poszczególnych zwierząt, liczby zwierząt wykazujących inne objawy toksyczności, opisu efektów toksycznych i wyniku sekcji zwłok. Należy obliczać zmiany masy ciała i zapisywać je, gdy przeżycie przekroczy jedną dobę. Zwierzęta, które zostały humanitarnie uśmiercone z powodów związanych ze stanami zagrożenia i bólem, są zapisywane jako zgony związane z substancją. Należy ustalić LC50 przy użyciu uznanej metody. Ocena danych powinna objąć istnienie ewentualnej współzależności między ekspozycją zwierząt na substancję badaną i częstością i ciężkością wszelkich zaburzeń, włącznie z zaburzeniami zachowania i klinicznymi, zmianami makroskopowymi, zmianami masy ciała, umieralnością i wszelkimi innymi efektami toksycznymi.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje: Dane ekspozycji Powinny być przedstawione w formie tabeli, z podaniem wartości średniej i miary zmienności (np. odchylenia standardowego) i powinny, jeśli możliwe, zawierać:

gatunek, szczep, źródło, warunki środowiska, dieta itp.,

warunki badania: opis przyrządu do ekspozycji, włączając konstrukcję, typ, wymiary, źródło powietrza, układ wytwarzania aerozoli, metody klimatyzacji powietrza i metoda przetrzymywania zwierząt w komorze badawczej, gdy jest używana. Należy opisać wyposażenie do pomiaru temperatury, wilgotności, stężenia aerozolu i rozkładu wielkości ziaren.

3.1. a)

szybkości przepływu powietrza przez urządzenia do inhalacji;

temperaturę i wilgotność powietrza;

nominalne stężenia (całkowita ilość badanej substancji dostarczona do wyposażenia inhalacyjnego, podzielona przez objętość powietrza);

rodzaj podłoża, o ile jest wykorzystane;

rzeczywiste stężenia w badawczej strefie wdychania;

średnicę aerodynamiczną średniej masy (MMAD) i geometryczne standardowe odchylenie (GSD);

czas równoważenia;

okres ekspozycji;

zestawienie tabelaryczne danych reakcji toksycznej z uwagi na płeć i poziom ekspozycji (to jest liczba zwierząt padłych lub uśmierconych w czasie trwania badania; liczba zwierząt wykazujących oznaki działania toksycznego; liczba zwierząt poddanych ekspozycji),

czas śmierci w czasie trwania lub po ekspozycji, przyczyny i kryteria przyjęte przy humanitarnym zabijaniu zwierząt,

wszystkie obserwacje,

LC50 dla każdej płci, ustalona pod koniec okresu obserwacji (z podaniem metody obliczeń),

95 % poziom ufności dla LiC50 (gdzie może być to dostarczone),

krzywa zależności umieralności od dawki i jej nachylenie (o ile metoda oznaczania pozwala na ustalenie tych danych),

wyniki sekcji zwłok,

wszystkie dane histopatologiczne,

omówienie wyników (należy zwrócić szczególną uwagę, że humanitarne zabicie zwierząt w czasie trwania badania wpływa na obliczoną wartość LC50),

interpretacja wyników.

3.2. OCENA I INTERPRETACJA Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. D).

4. LITERATURA Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. E).

B.3. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA (DERMALNA)

B.3.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. A).

1.2. DEFINICJA Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. B).

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.4. ZASADA METODY BADANIA Substancję badaną nakłada się na skórę w stopniowanych dawkach kilku grupom zwierząt doświadczalnych, po jednej dawce na grupę. Następnie obserwuje się skutki podania substancji i zgony. Zwierzęta, które zdechną w trakcie badania, i te, które przeżyją po jego zakończeniu, poddaje się sekcji zwłok. Zwierzęta wykazujące ciężkie i trwałe oznaki stanu zagrożenia i bólu mogą wymagać humanitarnego uśmiercenia. Dozowanie badanych substancji na drodze znanej z powodowania znaczącego bólu i stany zagrożenia z powodu właściwości żrących lub drażniących nie może być przeprowadzane.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Brak.

1.6. OPIS METODY BADANIA

1.6.

1.6.1. Przygotowania Zwierzęta muszą być trzymane w doświadczalnych warunkach pobytu i karmienia przez co najmniej pięć dni przed przeprowadzeniem badania. Przed przeprowadzeniem badania zdrowe, młode, dorosłe zwierzęta są wybierane losowo i przydzielane do poszczególnych grup otrzymujących substancję. Na około 24 godziny przed przeprowadzeniem badania należy usunąć sierść z grzbietowej powierzchni tułowia zwierząt przez przycięcie lub ogolenie. Podczas przycinania lub golenia sierści należy uważać, aby nie uszkodzić skóry, gdyż mogłoby to zmienić jej przepuszczalność. Nie mniej niż 10 % powierzchni ciała powinno być wolne do zastosowania substancji badanej. W przypadku badania ciał stałych, które powinny zostać sproszkowane, o ile jest to właściwe, substancja badana powinna zostać wystarczająco zwilżona wodą lub w razie konieczności odpowiednim podłożem zapewniającym dobry kontakt ze skórą. W przypadku wykorzystania podłoża należy uwzględnić jego wpływ na penetrację substancji badanej przez skórę. Płynne substancje badane stosuje się na ogół w stanie nierozcieńczonym.

1.6.2. Warunki badania

1.6.2.

1.6.2.1. Zwierzęta doświadczalne Można wykorzystać dorosłe szczury lub króliki. Można również wykorzystać inne gatunki, jednak wymaga to uzasadnienia. Należy wykorzystywać powszechnie stosowane szczepy laboratoryjne. Dla każdej płci na początku badania zakres zmienności wagowej użytych zwierząt nie powinien przekraczać ± 20 % właściwej wartości średniej.

1.6.2.2. Liczba i płeć Co najmniej pięć zwierząt jest używanych dla każdej wielkości dawki. Powinny być one wszystkie jednakowej płci. Jeżeli stosuje się samice, powinny być one nieródkami i nie mogą być w ciąży. Jeżeli dostępna jest informacja wskazująca, że dana płeć jest znacząco bardziej czuła, należy użyć do dawkowania zwierząt tej płci. Uwaga: W badaniach ostrej toksyczności u zwierząt wyższego rzędu niż gryzonie należy rozważyć użycie mniejszej ilości. Dawki muszą być starannie wybrane oraz należy dołożyć wszelkich starań by nie przekraczać dawek średniej toksyczności. Należy unikać podawania w takich badaniach dawek śmiertelnych substancji badanej.

1.6.2.3. Poziomy dawkowania Powinno się zapewnić odpowiednią liczbę, co najmniej trzy, przy czym należy zachować odpowiednie odstępy między nimi, tak aby uzyskać grupy badane różniące się istotnie efektami toksycznymi i umieralnością. Przy podejmowaniu decyzji co do wielkości dawek należy uwzględniać wszelkie działania drażniące i żrące. Dane powinny być wystarczające do opracowania krzywej zależności odpowiedzi od dawki oraz, o ile to będzie możliwe, do ustalenia w możliwy do przyjęcia sposób wartości LD50.

1.6.2.4. Badanie graniczne Przeprowadza się badanie graniczne przy jednej wielkości dawki, przynajmniej 2000 mg/kg masy ciała, w grupie składającej się z pięciu samców i pięciu samic, stosując procedurę powyżej opisaną. Jeżeli zachodzi związek śmiertelności z badaną substancją, należy rozważyć wykonanie pełnego badania.

1.6.2.5. Okres obserwacji Okres obserwacji powinien wynosić co najmniej 14 dni. Jednakże nie powinien on być sztywno ustalony. Powinien zależeć od reakcji toksycznych, szybkości ich pojawiania się oraz okresu powrotu do zdrowia po ich wystąpieniu; w związku z tym można go wydłużyć, jeżeli uzna się to za konieczne. Ważny jest czas, po jakim pojawiają się i znikają objawy toksyczności, oraz czas zgonu, zwłaszcza gdy istnieje tendencja do opóźnionych zgonów.

1.6.3. Procedura Zwierzęta powinny być trzymane w oddzielnych klatkach. Substancja badana powinna zostać nałożona w sposób równomierny na obszar równy około 10 % całkowitej powierzchni ciała. W przypadku substancji wysoce toksycznych można je nanieść na mniejszą powierzchnię, jednak należy dążyć do tego, aby pokryć jak największy obszar jak najcieńszą i jak najbardziej równomierną warstwą badanego związku. Substancje badane powinny być utrzymywane w kontakcie ze skórą dzięki zastosowaniu porowatego opatrunku z gazy i niedrażniącej taśmy w trakcie ekspozycji zapewnianej przez 24 godziny. Miejsce badania należy dodatkowo przykryć w taki sposób, aby utrzymać opatrunek z gazy i substancję badaną i zapewnić, aby zwierzęta nie mogły zjeść tej ostatniej. W celu zapobieżenia spożyciu substancji badanej można uwiązać zwierzę, jednak pełna immobilizacja nie jest zalecaną metodą. Pod koniec okresu ekspozycji należy usunąć resztki badanej substancji, w miarę możliwości stosując wodę lub jakieś inne, właściwe metody oczyszczania skóry. Obserwacje należy odnotowywać w sposób systematyczny, w miarę ich zbierania. Należy prowadzić oddzielne zapisy dla każdego zwierzęcia. Obserwacja powinna być częsta w ciągu pierwszego dnia. Staranne badanie kliniczne należy przeprowadzać co najmniej raz każdego dnia roboczego. Inne obserwacje należy przeprowadzać codziennie, podejmując odpowiednie działania mające na celu zmniejszenie do minimum utraty zwierząt podczas badania, np. sekcję zwłok lub zamrażanie tych zwierząt, które zostaną znalezione martwe, oraz izolację lub usypianie zwierząt słabych lub śmiertelnie chorych. Obserwacje przy klatce zwierzęcia powinny obejmować zmiany sierści, traktowanej substancją skóry, oczu i błon śluzowych oraz zmiany układu oddechowego, krążenia, autonomicznego i ośrodkowego układu nerwowego, jak też wzorców aktywności somatomotorycznej i wzorca zachowania. Szczególną uwagę należy zwrócić na obserwacje drżeń, drgawek, zwiększonego wydzielania śliny, biegunki, stanów zwiększonej senności, snu i śpiączki. Należy jak najprecyzyjniej odnotować termin zgonu. Zwierzęta, które zdechną w trakcie badania, i te, które przeżyją po jego zakończeniu, poddaje się sekcji zwłok. Należy odnotować wszelkie makroskopowe zmiany patologiczne. O ile jest to wskazane, należy pobrać wycinki tkanek do badania histopatologicznego.

1.6.3. Ocena toksyczności dla innej płci

Po zakończeniu badań jednej płci, przeprowadza się dawkowanie na przynajmniej jednej grupie pięciu zwierząt płci przeciwnej, w celu ustalenia czy zwierzęta tej płci nie są znacząco bardziej wrażliwe na substancję badaną. Użycie mniejszej ilości zwierząt musi być uzasadnione w indywidualnych okolicznościach. Jeżeli dostępna jest stosowna informacja pokazująca, że zwierzęta badanej płci są znacznie bardziej wrażliwe, drugą płeć można pominąć.

2. DANE Dane należy przedstawić w skrócie w formie tabelarycznej, z podaniem – dla każdej badanej grupy – liczby zwierząt na początku badania, terminów zgonu poszczególnych zwierząt, liczby zwierząt wykazujących inne objawy toksyczności, opisu efektów toksycznych i wyniku sekcji zwłok. Należy określić masę ciała poszczególnych zwierząt i zapisać ją tuż przed podaniem badanej substancji, a później co tydzień i w momencie zgonu. Należy obliczać zmiany masy ciała i zapisywać je, gdy zwierzę przeżyje więcej niż jedną dobę. Zwierzęta humanitarnie zabite z powodu bólu i zagrożenia związanego z daną substancją są zapisywane jako uśmiercone w związku z substancją. Można ustalić LD50 przy użyciu uznanej metody. Ocena danych powinna objąć istnienie ewentualnej współzależności pomiędzy ekspozycją zwierząt na substancję badaną a częstością i ciężkością wszelkich zaburzeń, włącznie z zaburzeniami zachowania i klinicznymi, zmianami makroskopowymi, zmianami masy ciała, umieralnością i wszelkimi innymi efektami toksycznymi.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

gatunek, szczep, źródło, warunki środowiska, dieta itp.,

warunki badania (włączając metodę oczyszczania skóry i typ opatrunku: okluzyjny lub nieokluzyjny),

wielkości dawek (wraz z podłożem, o ile jest wykorzystane, i stężeniami),

płeć zwierząt poddanych dawkowaniu,

tabelaryczne przedstawienie danych reakcji toksycznej w rozbiciu na płcie i wielkość dawki (to jest liczba padłych zwierząt lub zabitych w czasie trwania badania, liczba zwierząt wykazujących oznaki działania toksycznego, liczba zwierząt poddanych ekspozycji),

czas zgonu po dawkowaniu, przyczyny i kryteria przyjęte przy humanitarnym zabijaniu zwierząt,

wszystkie obserwacje,

wartość LD50 dla płci poddanej pełnym badaniom ustalonym na 14 dni (wraz z określoną metodą oznaczania),

95 % przedział ufności dla LD50 (o ile można go przedstawić),

krzywa zależności umieralności od dawki i jej nachylenie (o ile metoda oznaczania pozwala na ustalenie tych danych),

wyniki sekcji zwłok,

wszelkie wyniki badań histopatologicznych,

wyniki wszystkich badań płci przeciwnej,

omówienie wyników (należy zwrócić szczególną uwagę, że humanitarne zabicie zwierząt w czasie trwania badania wpływa na obliczoną wartość LD50),

interpretacja wyników.

3.2. OCENA I INTERPRETACJA Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. D).

4. LITERATURA Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. E).

B.4. OSTRA TOKSYCZNOŚĆ: PODRAŻNIENIA/KOROZJA SKÓRY

B.4.

1. METODA Niniejsza metoda jest kopią OECD TG 404 (2002).

1.

1.1. WPROWADZENIE W przygotowywaniu niniejszej zaktualizowanej metody specjalną uwagę poświęcono możliwym ulepszeniom w zakresie zagadnień dotyczących dobrostanu zwierząt, a także ocenie wszystkich dostępnych informacji na temat substancji badanej, w celu uniknięcia niepotrzebnych badań na zwierzętach laboratoryjnych. Niniejsza metoda zawiera zalecenie, zgodnie z którym przed przystąpieniem do opisywanego badania in vivo na korozję/podrażnienia skórne wywołane przez daną substancję, zostanie przeprowadzona analiza wagi dowodów uzyskanych na podstawie istniejących danych. Jeżeli dostępne dane są niewystarczające, mogą zostać opracowane przy pomocy badań sekwencyjnych (1). Strategia badań zawiera wykaz zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vitro i stanowi załącznik do niniejszej metody. Dodatkowo, tam gdzie to stosowne, zamiast jednoczesnej aplikacji zwierzęciu trzech łat testowych, zalecane jest stosowanie aplikacji sekwencyjnej, zamiast symultanicznej, we wstępnych badaniach in vivo. Z uwagi na dobrze pojęty interes nauki i dobrostan zwierząt badania in vivo nie powinny być podejmowane, jeżeli wszystkie dostępne dane odnoszące się do potencjalnego działania korozyjnego/podrażniającego skórę w wyniku działania substancji nie zostały uzyskane z analizy wagi dowodów. Takie dane będą zawierały dowody z wykonanych badań na ludziach oraz/lub zwierzętach laboratoryjnych, dowody korozji/podrażnień wywołanych przez jedną lub wiele substancji pokrewnych pod względem budowy lub mieszanin takich substancji, dane wskazujące na silną kwasowość lub alkaliczność substancji (2)(3) oraz wyniki zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo lub ex vivo (4)(5)(5a). Takie analizy powinny ograniczyć potrzebę badań in vivo pod kątem korozji/podrażnień skórnych wywołane przez substancje, w odniesieniu do których już istnieje wystarczający materiał dowodowy w odniesieniu do dwóch odnośnych punktów docelowych, zgromadzony w wyniku prowadzenia innych badań. Preferowaną strategię badań sekwencyjnych, obejmującą przeprowadzenie zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo i ex vivo działania korozyjnego/podrażniającego, zawiera załącznik do niniejszej metody. Strategia ta została opracowana i jednomyślnie zalecona przez uczestników warsztatów OECD (6), a następnie zatwierdzona jako zalecana strategia badań w ramach Globalnego Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji Związków Chemicznych (GHS) (7). Zaleca się realizację tej strategii badań przed podjęciem badań in vivo. Dla nowych substancji strategia ta jest zalecanym stopniowym podejściem badawczym służącym opracowywaniu danych wartościowych z naukowego punktu widzenia dotyczących korozyjnego/podrażniającego działania substancji na skórę. W odniesieniu do istniejących substancji, na temat których brak wystarczających danych co do ich działania korozyjnego/podrażniającego, strategia ta powinna zostać wykorzystana w celu uzupełnienia brakujących danych. Użycie innych strategii badawczych bądź procedur lub decyzja o nieprzyjęciu stopniowego podejścia badawczego wymaga uzasadnienia. Jeżeli określenie korozyjności lub podrażnienia nie może zostać przeprowadzone przy użyciu analizy wagi dowodów, która jest zbieżna ze strategią badań sekwencyjnych, należy rozważyć badanie in vivo (zob. załącznik).

1.2. DEFINICJE Podrażnienie skórne: jest wynikiem odwracalnych uszkodzeń skóry wynikających z zastosowania substancji badanej przez okres czterech godzin. Korozja skórna: jest wynikiem nieodwracalnego uszkodzenia skóry; mianowicie widocznej martwicy przebiegającej przez naskórek w głąb skóry, spowodowanej zaaplikowaniem substancji badanej na okres nieprzekraczający czterech godzin. Rodzaje korozji obejmują wrzody, krwawienie, strupy oraz – po zakończeniu 14-dniowej obserwacji – odbarwienia wynikłe ze zbielenia skóry, obszary jednolitej alopecji, a także blizny. Celem oceny niejasnych zmian można przeprowadzić badanie histopatologiczne.

1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ Substancja, która ma być zbadana, jest nakładana na skórę zwierzęcia doświadczalnego w pojedynczej dawce, część skóry niepoddana zabiegowi służy jako część kontrolna. Stopień korozji/podrażnienia jest oceniany przy pomocy punktacji w określonych odstępach i zapisywany, a następnie dodatkowo opisywany w celu całkowitego oszacowania skutków działania. Czas trwania badania powinien być wystarczający do oceny odwracalności lub nieodwracalności zaobserwowanych skutków. Zwierzęta wykazujące ciągłe objawy silnego strachu i/lub bólu na jakimkolwiek etapie badań powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny, a substancja oceniona stosownie do zaobserwowanych skutków. Kryteria podejmowania decyzji co do uśmiercenia zwierząt w stanie agonalnym lub cierpiących ból zostały określone w załączniku (8).

1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.

1.4.1. Przygotowanie do badań in vivo

1.4.1.

1.4.1.1. Wybór gatunku zwierząt Biały królik jest preferowanym gatunkiem zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystywane są zdrowe młode dorosłe króliki. W przypadku wykorzystania innych gatunków należy podać uzasadnienie.

1.4.1.2. Przygotowanie zwierząt Na około 24 godziny przed badaniem należy usunąć futro z tułowia zwierzęcia poprzez gładkie wygolenie obszaru skóry na grzbiecie. Należy unikać otarć naskórka. Należy wykorzystywać wyłącznie zwierzęta ze zdrową nienaruszoną skórą. Niektóre szczepy królików posiadają kępy futra, których gęstość jest większa w określonych porach roku. Takie obszary gęstego futra nie powinny być używane jako miejsca badań.

1.4.1.3. Warunki przebywania i warunki żywieniowe Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 20 oC (± 3o) dla królików. Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej.

1.4.2. Procedura badań

1.4.2.

1.4.2.1. Podanie substancji badanej Substancja badana powinna zostać zaaplikowana na małym obszarze skóry (około 6 cm2) i przykryta łatą gazy przytrzymywaną na miejscu przy pomocy niepodrażniającego plastra. W przypadku gdy zaaplikowanie substancji bezpośrednio nie jest niemożliwe (np. w przypadku cieczy lub niektórych past), substancja badana powinna zostać najpierw nałożona na gazę, a następnie na skórę. Gaza powinna luźno przylegać do skóry i powinna być przyczepiona do skóry na czas trwania ekspozycji przy pomocy odpowiedniego opatrunku półokluzyjnego. Jeżeli substancja badana została podana na łacie, powinna ona być przyczepiona do skóry w sposób zapewniający dobry kontakt i równomierne rozprowadzenie substancji na skórze. Należy zapobiec dostępowi zwierzęcia do gazy oraz spożyciu lub inhalacji substancji badanej przez zwierzę. Ciekłe substancje badane są na ogół stosowane w stanie nierozcieńczonym. W przypadku badania substancji stałych (których postać można zmienić na postać proszkową, o ile zachodzi tak konieczność) substancja badana powinna zostać rozcieńczona przy użyciu minimalnej ilości wody (lub, o ile to konieczne, innego odpowiedniego nośnika), wystarczającej do zapewnienia dobrego kontaktu ze skórą. Jeżeli stosowany jest inny nośnik niż woda, potencjalny wpływ na podrażnienia skóry przez tą substancję powinien być minimalny lub żaden. O ile to możliwe, na zakończenie okresu ekspozycji, który na ogół trwa cztery godziny, pozostałości substancji badanej powinny zostać usunięte przy użyciu wody lub innego odpowiedniego rozcieńczalnika, w sposób pozwalający na uniknięcie zmian w zaistniałej reakcji oraz nienaruszenie naskórka.

1.4.2.2. Poziom dawki Aplikowana jest dawka 0,5 ml cieczy lub 0,5 g ciała stałego lub pasty na badany obszar skóry.

1.4.2.3. Badanie wstępne (Badanie in vivo podrażnienia/korozji skóry przy użyciu jednego zwierzęcia) Stanowczo zaleca się, aby badania in vivo były przeprowadzane wstępnie przy użyciu jednego zwierzęcia, zwłaszcza w przypadku podejrzeń, że substancja jest potencjalnie korozyjna. Jest to zgodne z sekwencyjną strategią badawczą (zob. załącznik 1). Jeżeli oceniono, że substancja może mieć właściwości korozyjne na podstawie analizy wagi dowodów, nie są wymagane dalsze badania na zwierzętach. W przypadku większości substancji, w odniesieniu do których istnieje podejrzenie korozyjności, nie wymagane są zazwyczaj dodatkowe badania in vivo. Jednakże w przypadkach gdzie istnieje potrzeba dostarczenia dodatkowych danych z uwagi na niewystarczające dowody, mogą zostać przeprowadzone ograniczone badania na zwierzętach z zastosowaniem następującej procedury: na skórę zwierzęcia nakłada się maksymalnie do trzech łat testowych. Pierwsza łata jest usuwana po trzech minutach. Jeżeli nie zaobserwowano żadnych poważnych reakcji skórnych, nakładana jest druga łata i usuwana po godzinie. Jeżeli obserwacje na tym etapie wskazują na to, że ekspozycja może być humanitarnie przeprowadzana, należy wydłużyć jej czas do czterech godzin, trzecia łata jest nakładana i zdejmowana po czterech godzinach, a reakcja punktowana. Jeżeli działanie korozyjne jest stwierdzone po jednej z trzech sekwencyjnych ekspozycji, badanie jest natychmiast przerywane. W przypadku niestwierdzenia działania korozyjnego po usunięciu ostatniej łaty, zwierzę jest poddawane obserwacji w okresie 14 dni, o ile wcześniej nie rozwinie się korozja. W przypadku gdy nie przewiduje się, że substancja badana może powodować korozję, lecz może wywoływać podrażnienia, powinna ona zostać zaaplikowana jednemu zwierzęciu na czas czterech godzin.

1.4.2.4. Badanie potwierdzające (Badanie in vivo podrażnienia skórnego przy wykorzystaniu dodatkowych zwierząt) W przypadku niestwierdzenia działań korozyjnych w badaniach wstępnych działanie podrażniające lub jego brak należy potwierdzić przy wykorzystaniu maksymalnie dwóch dodatkowych zwierząt. Każde powinno zostać zbadane przy pomocy jednej łaty w czterogodzinnym okresie ekspozycji. W przypadku stwierdzenia działania podrażniającego w badaniu wstępnym, badanie potwierdzające może zostać przeprowadzone w sposób sekwencyjny lub poprzez ekspozycję dwóch dodatkowych zwierząt jednocześnie. W wyjątkowym przypadku nieprzeprowadzania badania wstępnego, można zbadać dwa lub trzy zwierzęta, z których każde zostanie poddane działaniu jednej łaty, usuniętej następnie po czterech godzinach. Jeżeli w przypadku wykorzystywania dwóch zwierząt, obydwa wykazują te same reakcje, nie wymaga się przeprowadzania dalszych badań. W innym wypadku zbadane zostaje również trzecie zwierzę. Niejednoznaczna reakcja może wymagać oceny z wykorzystaniem dodatkowych zwierząt.

1.4.2.5. Okres obserwacji Długość trwania obserwacji powinien być wystarczający do pełnej oceny odwracalności zaobserwowanych efektów. Jednakże eksperyment powinien zostać przerwany, skoro tylko zwierzę zacznie wykazywać trwałe objawy silnego bólu lub strachu. W celu określenia odwracalności skutków zwierzę powinno być obserwowane maksymalnie przez okres 14 dni od usunięcia łat. W przypadku zaobserwowania odwracalności przed upływem 14 dni, eksperyment powinien zostać przerwany.

1.4.2.6. Obserwacja kliniczna i ocena punktowa reakcji skóry Zwierzęta powinny zostać zbadane pod kątem wystąpienia objawów rumienia i obrzęku oraz reakcji odnotowanych po 60 minutach, a następnie po 24, 48 oraz 72 godzinach od usunięcia łaty. W badaniu wstępnym przeprowadzanym na jednym zwierzęciu miejsce zaaplikowania substancji badanej jest badane również natychmiast po usunięciu łaty. Reakcje skórne są oceniane przy pomocy wartości punktowych i zapisywane zgodnie z punktacją podaną w tabeli poniżej. W przypadku uszkodzenia naskórka, którego nie można zidentyfikować jako podrażnienia ani korozji po 72 godzinach, w celu określenia odwracalności efektów konieczne może okazać się prowadzenie obserwacji do 14 dnia. Oprócz spostrzeżeń na temat podrażnień należy w pełni opisać i zarejestrować wszelkie miejscowe skutki toksyczne, takie jak odtłuszczenie skóry oraz wszelkie ogólnoustrojowe niekorzystne skutki (np. skutki klinicznych objawów zatrucia i utrata masy ciała). Celem wyjaśnienia niejednoznacznych reakcji można posłużyć się badaniem histopatologicznym. Ocena punktowa reakcji skóry jest z konieczności subiektywna. Celem propagowania harmonizacji oceny punktowej reakcji skóry oraz zapewnienia pomocy laboratoriom badawczym oraz osobom zaangażowanym w prowadzenie oraz interpretację obserwacji, personel prowadzący obserwacje powinien być odpowiednio przeszkolony w zakresie stosowanego systemu oceny (zob. tabela poniżej). Pomocne mogą okazać się ilustrowane instrukcje dotyczące klasyfikacji podrażnień i innych zmian skóry (9).

2. DANE

2.

2.1. PREZENTACJA WYNIKÓW Streszczenie wyników badań powinno zostać przedstawione w formie tabeli w sprawozdaniu końcowym z badań, która powinna zawierać wszystkie pozycje wymienione w sekcji 3.1.

2.2. OCENA WYNIKÓW Wartości punktowe podrażnienia skóry winny być ocenianie stosownie do natury oraz natężenia zmian, oraz w świetle ich odwracalności lub jej braku. Poszczególne wyniki nie stanowią normy bezwzględnej właściwości podrażniających danego materiału, ponieważ ocenie poddawane są również pozostałe skutki ekspozycji na badany materiał. Alternatywnie, poszczególne wyniki powinny być traktowane jako wartości odniesienia, które muszą być oceniane w świetle wszystkich pozostałych spostrzeżeń z badań. W ocenie reakcji podrażnienia pod uwagę powinna być brana odwracalność zmian skóry. Jeżeli reakcje takie jak alopecja (na ograniczonej powierzchni), hiperkeratoza, hiperplazja i łuszczenie są nadal obecne wraz z upływem 14-dniowego okresu obserwacji, substancja badana powinna zostać uznana za drażniącą.

3. SPRAWOZDANIE

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje:

Uzasadnienie badań in vivo: analizę wagi dowodów, włączając wyniki realizacji strategii badań sekwencyjnych:

opis odpowiednich danych z uprzednio przeprowadzonych badań,

dane uzyskane w wyniku realizacji każdego etapu strategii badawczej,

opis przeprowadzonych badań in vitro, włączając szczegółowe dane na temat procedur, wyników otrzymanych z zastosowaniem substancji testowych/odniesienia,

analiza wagi dowodów istniejących danych dla celów przeprowadzenia badań in vivo.

Substancja badana:

identyfikacja (np. numer CAS, źródło, czystość, znane zanieczyszczenia, numer osobnika),

stan skupienia i właściwości fizyko-chemiczne (np. pH, lotność, rozpuszczalność, stabilność),

w przypadku mieszaniny skład i zawartość procentową składników.

Nośnik:

identyfikacja, stężenie (jeżeli dotyczy), użyta objętość,

uzasadnienie wyboru nośnika.

Badane zwierzęta:

wykorzystany gatunek/szczep, uzasadnienie wykorzystania zwierząt innych niż białe króliki,

liczba zwierząt każdej płci,

indywidualna masa ciała na początku i na końcu badań,

wiek na początku badań,

źródło pochodzenia zwierząt, warunki przetrzymywania, dieta itp.

Warunki badań:

technika przygotowywania miejsc przyłożenia łat,

szczegółowy opis materiału, z którego wykonane są łaty, i sposób ich przykładania,

szczegóły dotyczące przygotowania, zaaplikowania i usunięcia substancji badanej.

Wyniki:

tabele wyników podrażnienia/korozji dla każdego zwierzęcia w każdym punkcie czasowym pomiaru,

opis wszelkich zaobserwowanych zmian,

słowny opis rodzaju i stopnia zaobserwowanego podrażnienia lub korozji oraz wszystkie dane histopatologiczne,

opis innych niekorzystnych zmian miejscowych i ogólnoustrojowych (np. odtłuszczenie skóry) towarzyszących podrażnieniu lub korozji skóry.

Omówienie wyników

4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)

BIBLIOGRAFIA Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I.,Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P.(1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23,410–429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. InVitro, 2, 19–26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709–720. ECETOC (1990) Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524. Testing Method B.40 Skin Corrosion. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Grade and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Grading No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Dostępne na wniosek w sekretariacie OECD].

Tabela I Tworzenie rumienia i obrzęku Tworzenie się obrzęku PUNKTOWA OCENA REAKCJI SKÓRY

Brak rumienia … 0 Bardzo lekki rumień (prawie niewidoczny)… 1 Wyraźny rumień… 2 Rumień umiarkowany do mocnego… 3 Mocny rumień (czerwień przypominająca barwę mięsa czerwonego) do form obrzęku wykluczających klasyfikację zmiany jako rumienia… 4 Maksymalna możliwa wartość punktowa: 4 Brak obrzęku… 0 Bardzo słaby obrzęk (prawie niewidoczny)… 1 Lekki obrzęk (dobrze wyodrębniony)… 2 Umiarkowany obrzęk (wzniesienie na około 1 mm)… 3 Mocny obrzęk (wniesienie ponad 1 mm, sięgający poza obszar eksponowania) … 4 Maksymalna możliwa wartość punktowa: 4 Celem wyjaśnienia reakcji niejednoznacznych można przeprowadzić badanie histopatologiczne.

B.5. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA: PODRAŻNIENIE/KOROZJA OCZU

B.5.

1. METODA Niniejsza metoda jest kopią OECD TG 405 (2002).

1.

1.1. WPROWADZENIE W przygotowywaniu niniejszej zaktualizowanej metody specjalną uwagę poświęcono możliwym ulepszeniom w zakresie zagadnień dotyczących dobrostanu zwierząt, a także ocenie wszystkich dostępnych informacji na temat substancji badanej, w celu uniknięcia niepotrzebnych badań na zwierzętach laboratoryjnych. Niniejsza metoda zawiera zalecenie, zgodnie z którym przed przystąpieniem do opisywanego badania in vivo na korozję/podrażnienia oka wywołane przez daną substancję zostanie przeprowadzona analiza wagi dowodów uzyskanych na podstawie istniejących danych (1). Jeżeli dostępne dane są niewystarczające, mogą zostać opracowane przy pomocy badań sekwencyjnych (2)(3). Strategia badań zawiera wykaz zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vitro i stanowi załącznik do niniejszej metody. Dodatkowo zalecane jest przeprowadzenie badań in vivo podrażnień/korozji skóry w celu oszacowania korozji oka przed przystąpieniem do badań in vivo oka. Z uwagi na dobrze pojęty interes nauki i dobrostan zwierząt badania in vivo nie powinny być podejmowane, jeżeli wszystkie dostępne dane odnoszące się do potencjalnego działania korozyjnego/podrażniającego skórę w wyniku działania substancji nie zostały uzyskane z analizy wagi dowodów. Takie dane będą zawierały dowody z wykonanych badań na ludziach oraz/lub zwierzętach laboratoryjnych, dowody korozji/podrażnień wywołanych przez jedną lub wiele substancji pokrewnych pod względem budowy lub mieszanin takich substancji, dane wskazujące na silną kwasowość lub alkaliczność substancji (4)(5) oraz wyniki zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo lub ex vivo (6)(6a). Takie badania mogą być przeprowadzone przed lub w następstwie analizy wagi dowodów. W przypadku pewnych substancji takie analizy mogą wskazywać na potrzebę badań in vivo potencjalnego korozyjnego/drażniącego działania danej substancji na oko. W każdym takim przypadku przed podjęciem badań in vivo oka zostaną przeprowadzone najpierw badania in vivo skutków działania substancji na skórę, zgodnie z metodą badawczą B.4 (7). Zastosowanie analizy wagi dowodów i strategii badań sekwencyjnych powinno ograniczyć potrzebę prowadzenia badań in vivo pod kątem korozji/podrażnienia oka przez substancje, w odniesieniu do których już istnieje wystarczający materiał dowodowy, zgromadzony w wyniku prowadzenia innych badań. Jeżeli nie jest możliwe określenie potencjalnego działania korozyjnego lub drażniącego na oka przy zastosowaniu strategii badań sekwencyjnych, nawet po przeprowadzeniu badań in vivo pod kątem korozji i podrażnienia skóry, można przeprowadzić badania in vivo pod kątem korozji/podrażnienia oka. Załącznik do niniejszej metody zawiera preferowaną strategię badań sekwencyjnych, obejmującą przeprowadzenie zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo i ex vivo działania korozyjnego/podrażniającego. Strategia ta została opracowana i jednomyślnie zalecona przez uczestników warsztatów OECD (8), a następnie zatwierdzona jako zalecana strategia badań w ramach Globalnego Zharmonizowanego Systemu klasyfikacji związków chemicznych (GHS) (9). Zaleca się realizację tej strategii badań przed podjęciem badań in vivo. Dla nowych substancji strategia ta jest zalecanym stopniowym podejściem badawczym służącym opracowywaniu wartościowych z naukowego punktu widzenia danych dotyczących korozyjnego/podrażniającego działania substancji. W odniesieniu do istniejących substancji, na temat których brak wystarczających danych co do ich działania korozyjnego/podrażniającego, strategia ta powinna zostać wykorzystana w celu uzupełnienia brakujących danych. Użycie innych strategii badawczych bądź procedur lub decyzja o nieprzyjęciu stopniowego podejścia badawczego wymaga uzasadnienia.

1.2. DEFINICJE Podrażnienie oka: zmiany w oku spowodowane zaaplikowaniem substancji badanej na wierzchnią warstwę oka, które w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po zaaplikowaniu. Korozja oka: uszkodzenie tkanki oka lub poważne fizyczne uszkodzenie wzroku, spowodowane zaaplikowaniem substancji badanej na wierzchnią warstwę oka, które nie jest w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po zaaplikowaniu.

1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ Substancja, która ma być zbadana, jest nakładana na jedno oko zwierzęcia doświadczalnego, drugie oko jest wykorzystywane do badania kontrolnego. Stopień korozji/podrażnienia jest oceniany poprzez ocenę punktową zmian spojówki, rogówki oraz tęczówki w określonych odstępach. Inne zmiany w oku i niekorzystne skutki ogólnoustrojowe są również opisywane w celu uzyskania kompletnej oceny skutków. Długość trwania badania powinien być odpowiedni do oszacowania odwracalności lub nieodwracalności obserwowanych skutków. Zwierzęta wykazujące ciągłe objawy silnego strachu i/lub bólu na jakimkolwiek etapie badania powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny, a substancja odpowiednio oceniona. Kryteria dotyczące podjęcia decyzji o uśmierceniu w sposób humanitarny zwierząt w stanie agonalnym i silnie cierpiących zawiera załącznik (10).

1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.

1.4.1. Przygotowanie do badań in vivo

1.4.1.

1.4.1.1. Wybór gatunków zwierząt Biały królik jest preferowanym gatunkiem zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystywane są zdrowe młode dorosłe króliki. W przypadku wykorzystania innych gatunków należy podać uzasadnienie.

1.4.1.2. Przygotowanie zwierząt Obydwoje oczu zwierzęcia doświadczalnego wstępnie wybranego do badania powinny być zbadane na 24 godziny przed przystąpieniem do badań. Zwierzęta z objawami podrażnienia oczu, wad wzroku lub uszkodzeń rogówki nie powinny być wykorzystywane w badaniu.

1.4.1.3. Warunki przetrzymywani i karmienia Zwierzęta powinny być przetrzymywane oddzielnie. Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 20 oC (± 3 oC) dla królików. Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej.

1.4.2. Procedura badań

1.4.2.

1.4.2.1. Podawanie substancji Substancja badana powinna zostać umieszczona na spojówce jednego oka każdego ze zwierząt po delikatnym odsunięciu powieki z gałki ocznej. Powieki są następnie delikatnie zamykane na około jedną sekundę w celu zapobieżenia utraty materiału badanego. Drugie, nienaruszone oko jest przedmiotem badania kontrolnego.

1.4.2.2. Nawilżanie Oczy zwierząt badanych nie powinny być przepłukiwane przez przynajmniej 24 godziny po wkropleniu substancji badanej, z wyjątkiem badania ciał stałych (zob. sekcja 1.4.2.3.2) i przypadków natychmiastowego działania korozyjnego lub podrażniającego. O ile to stosowne, po 24 godzinach można przepłukać oczy. Włączanie dodatkowej satelickiej grupy zwierząt w celu zbadania skutków przepłukiwania nie jest zalecane, chyba że ma to uzasadnienie naukowe. W przypadku potrzeby grupy satelickiej należy użyć dwóch królików. Warunki przepłukiwania powinny być dokładnie dokumentowane np. czas przepłukiwania, skład i temperatura roztworu, długość trwania, objętość i szybkość aplikowania.

1.4.2.3. Poziom dawki

1.4.2.3.

1.4.2.3.1. Badanie cieczy W badaniu cieczy stosuje się dawkę o objętości 0,1 ml. Nie powinno się stosować cieczy pod ciśnieniem do aplikowania substancji bezpośrednio na oko. Struga cieczy powinna zostać rozprężona i zebrana w zbiorniku przed aplikowaniem jej 0,1 ml na oko.

1.4.2.3.2. Badanie substancji stałych W badaniu ciał stałych, past i cząstek stałych stosowana ilość powinna mieć objętość 0,1 ml lub wagę nie większą niż 100 mg. Badany materiał powinien zostać sproszkowany. Objętość ciała stałego powinna być mierzona po delikatnym zbiciu np. poprzez ostukanie pojemnika pomiarowego. Jeżeli substancja badana w formie ciała stałego nie została usunięta w wyniku działania mechanizmów fizjologicznych w pierwszym punkcie czasowym obserwacji po upłynięciu godziny, oko może zostać przepłukane roztworem soli fizjologicznej lub wodą destylowaną.

1.4.2.3.3. Badanie aerozoli Zaleca się, aby wszystkie strugi cieczy pod ciśnieniem i aerozole zostały rozprężone i zebrane przed osadzeniem na oku. Wyjątek stanowią substancje w aerozolach znajdujące się w pojemnikach pod ciśnieniem, które nie mogą zostać zebrane z powodu ich parowania. W takich przypadkach należy przytrzymać oko w pozycji otwartej i zaaplikować substancję badaną do oka jednym podmuchem, trwającym około sekundy, z odległości 10 cm prostopadle do oka. Ta odległość może zależeć w znacznym stopniu od ciśnienia w rozpylaczu i jego zawartości. Należy uważać, aby nie doszło do uszkodzenia oka z powodu ciśnienia w rozpylaczu. W odpowiednich przypadkach, może być niezbędna ocena możliwości potencjalnego mechanicznego uszkodzenia oka spowodowanego siłą rozpylacza. Oszacowanie dawki aerozolu może być wykonane poprzez następującą symulację badania: substancja jest napylana na papierek wagowy przez otwór o rozmiarze oka królika znajdujący się bezpośrednio przed papierkiem. Poziom wzrostu wagi papierka wykorzystuje się celem określenia przybliżonej ilości jaka byłaby zaaplikowana do oka. Dla substancji lotnych, dawka może zostać oszacowana poprzez zważenie pojemnika odbiorczego przed i po badanego materiału.

1.4.2.4. Badanie wstępne (Badanie in vivo podrażnienia/korozji oka z wykorzystaniem jednego zwierzęcia) Zgodnie ze strategią badań sekwencyjnych (zob. załącznik 1) stanowczo zaleca się, aby badania in vivo były przeprowadzane wstępnie przy użyciu jednego zwierzęcia Jeżeli wyniki takich badań wskazują, że substancja ma właściwości korozyjne lub powoduje silne podrażnienia oka, procedura przewiduje zaprzestanie dalszych badań podrażnień oczu.

1.4.2.5. Znieczulenie miejscowe Znieczulenie miejscowe może zostać zastosowane na podstawie analizy wyników uzyskanych w indywidualnych przypadkach. Jeżeli analiza wagi dowodów wskazuje na to, że substancja może potencjalnie powodować ból, lub badania wstępne pozwalają sądzić, że pojawią się bolesne reakcje, można zastosować miejscowe znieczulenie przed zaaplikowaniem substancji badanej. Rodzaj, stężenie i dawka znieczulenia miejscowego powinny zostać uważnie wybrane, tak aby zapewnić, że różnice w reakcji na substancję badaną nie są wynikiem zastosowania znieczulenia. Oko kontrolne powinno również zostać znieczulone.

1.4.2.6. Badanie potwierdzające (Badanie in vivo podrażnienia oka na dodatkowych zwierzętach) W przypadku niestwierdzenia działań korozyjnych w badaniu wstępnym działanie podrażniające lub jego brak należy potwierdzić przy wykorzystaniu maksymalnie dwóch dodatkowych zwierząt. Jeżeli obserwuje się silne działanie podrażniające w badaniu wstępnym, zaleca się, aby badanie potwierdzające zostało przeprowadzone w sposób sekwencyjny na jednym zwierzęciu, a niejednocześnie na dwóch zwierzętach. Jeżeli działanie na drugim zwierzęciu okaże się korozyjne lub silnie podrażniające, badanie nie będzie kontynuowane. Dodatkowe zwierzę może być potrzebne w celu potwierdzenia słabego lub średniego działania podrażniającego.

1.4.2.7. Okres obserwacji Długość trwania obserwacji powinien być wystarczający do oceny pełnej odwracalności obserwowanych efektów. Jednakże eksperyment powinien zostać przerwany w momencie, gdy zwierzę wykazuje objawy silnego bólu lub strachu (9). W celu określenia odwracalności efektów w normalnych okolicznościach zwierzę powinno być obserwowane przez 21 dni po zaaplikowaniu substancji badanej. Jeżeli odwracalność jest obserwowana przed upływem 21 dni, eksperyment powinien zostać przerwany w tym momencie.

1.4.2.7.

1.4.2.7.1. Obserwacje kliniczne i ocena reakcji oka Oczy powinny zostać zbadane po 1, 24, 48 i 72 godzinach od podania substancji badanej. Zwierzęta powinny być pod obserwacją nie dłużej niż to konieczne do uzyskania wszystkich informacji. Zwierzęta wykazujące objawy ciągłego silnego bólu lub strachu powinny zostać bezzwłocznie uśmiercone w sposób humanitarny, a substancja odpowiednio oceniona. Uśmiercone w sposób humanitarny powinny zostać zwierzęta z następującymi zmianami oka zaszłymi w następstwie zaaplikowania substancji: perforacja lub owrzodzenie rogówki, włączając garbiak; krwawienie z tylnej komory oka; zmętnienie rogówki równe 4 utrzymujące się 48 godzin; brak odbicia światła (reakcja rogówki o wartości punktowej 2) utrzymujący się 72 godziny; owrzodzenie błony spojówki; martwica spojówki lub błony mrużnej; lub oddzielająca się tkanka martwicza. Wynika to z faktu, że tego typu zmiany są na ogół nieodwracalne. Zwierzęta, u których nie wystąpiły zmiany oczne, mogą zostać uśmiercone nie wcześniej niż 3 dni od zaaplikowania substancji. Zwierzęta z łagodnymi lub umiarkowanymi zmianami powinny przebywać pod obserwacją do czasu zaniknięcia zmian lub przez 21 dni, po których badanie zostaje przerwane. Obserwacje powinny być prowadzone 7., 14. i 21. dnia w celu określenia stanu zmian oraz ich odwracalności lub nieodwracalności. Wartości punktowe reakcji oka (spojówki, rogówki i tęczówki) powinny być zapisywane dla każdego badania (tabela I). Należy również podać informacje na temat innych zmian oka (np. przekrwienie, plamy) lub innych niekorzystnych skutków ogólnoustrojowych. Badanie reakcji może zostać wykonane przy zastosowaniu lupy stereoskopowej, ręcznej lampy szczelinowej, biomikroskopu lub innego odpowiedniego urządzenia. Po zapisaniu obserwacji w 24 godzinie oko może zostać poddane dalszym badaniom przy pomocy fluoresceiny. Ocena odpowiedzi ocznej jest z konieczności subiektywna. W celu zharmonizowania oceny reakcji ocznej i w celu wsparcia laboratoriów badawczych i osób biorących udział w interpretacjach i obserwacjach należy przeprowadzić odpowiednie szkolenia w zakresie stosowanego systemu.

2. DANE

2.

3. SPRAWOZDANIE

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje:

Uzasadnienie badań in vivo: analizę wagi dowodów, włączając wyniki realizacji strategii badań sekwencyjnych:

opis odpowiednich danych z uprzednio przeprowadzonych badań,

dane uzyskane w wyniku realizacji każdego etapu strategii badawczej,

opis przeprowadzonych badań in vitro, włączając szczegółowe dane na temat procedur, wyników otrzymanych z zastosowaniem substancji testowych/odniesienia,

opis przeprowadzonych badań in vitro podrażnień/korozji skóry, wraz z otrzymanymi wynikami,

analiza wagi dowodów dla celów przeprowadzenia badań in vivo.

Substancja badana:

identyfikacja (np. numer CAS, źródło, czystość, znane zanieczyszczenia, numer osobnika),

stan skupienia i właściwości fizyko-chemiczne (np. pH, lotność, rozpuszczalność, stabilność, reakcyjność z wodą),

w przypadku mieszaniny skład i zawartość procentowa składników,

jeżeli zastosowano znieczulenie miejscowe, identyfikacja, czystość, rodzaj, dawka i możliwe interakcje z substancją badaną.

Nośnik:

identyfikacja, stężenie (jeżeli dotyczy) użyta objętość,

uzasadnienie użycia nośnika.

Badane zwierzęta:

wykorzystany gatunek/szczep, uzasadnienie wykorzystania zwierząt innych niż białe króliki,

wiek każdego zwierzęta na początku badań,

liczba zwierząt każdej płci w grupie badanej i kontrolnej (jeżeli występuje),

indywidualna masa ciała na początku i na końcu badań,

źródło zwierząt, warunki przetrzymywania, dieta itp.

Warunki badań:

opis zastosowanej metody wykorzystywanej do punktowej oceny podrażnienia w każdym punkcie czasowym (np. ręczna lampa szczelinowa, biomikroskop, fluoresceina),

tabela wyników reakcji podrażnienia/korozji, dla każdego zwierzęcia w każdym punkcie czasowym pomiaru, do momentu wyeliminowania zwierzęcia z badań,

narracyjny opis stopnia i natury obserwowanego podrażnienia lub korozji,

opis jakichkolwiek innych zmian zaobserwowanych w oku (np. waskularyzacja, przekrwienie, adhezje, plamy),

opis innych niekorzystnych miejscowych i ogólnoustrojowych niedotyczących oczu zmian oraz wyniki badania histopatologicznego, o ile są dostępne.

Omówienie wyników.

3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW Transponowanie wyników badań podrażnienia oka u zwierząt laboratoryjnych na ludzi ma sens tylko w ograniczonym stopniu. W wielu przypadkach białe króliki są bardziej wrażliwe niż ludzie na podrażnienia lub korozję oka. W interpretacji danych należy zadbać o pominięcie podrażnienia oka będącego wynikiem infekcji wtórnej.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)

BIBLIOGRAFIA Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23,410–429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35,159–164. Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26. Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12,227–231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524. Testing Method B.40 Skin Corrosion. Testing Method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). Guidance Document on the Recognition, Grade and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Grading No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tabela I OCENA PUNKTOWA ZMIAN OKA

Rogówka

Zmętnienie: stopień gęstości (odczyt powinien dotyczyć obszaru o największej gęstości) Brak owrzodzenia lub zmętnienia 0 Rozrzucone lub rozmyte obszary zmętnienia (inne od lekkiego zmatowienia normalnego połysku); 1 wyraźnie widoczne szczegóły tęczówki Jasno określone obszary półprzezroczyste; lekko zaciemnione detale tęczówki 2 Obszary o kolorze perłowym; brak widocznych szczegółów tęczówki; rozmiar źrenicy trudny do określenia 3 Zmatowienie rogówka; tęczówka niewidoczna z powodu zmętnienia 4 Maksymalna możliwa wartość punktowa: 4 UWAGI

Tęczówka

W normie 0 Głęboko pomarszczona, zastój krwi, opuchlizna, przekrwienie okołorogówkowe; lub; tęczówka reaguje na światło (przyjmuje się, że powolna reakcja stanowi skutek) 1 Krwawienie, silne zniszczenia, lub brak reakcji na światło 2 Maksymalna możliwa wartość punktowa: 2

Spojówka

Zaczerwienienie (dotyczy spojówki powieki i gałki ocznej; wyłączając rogówkę i tęczówkę) w normie 0 Niektóre naczynia krwionośne przekrwione 1 Rozmycie, kolor karmazynowy; pojedyncze naczynia trudno widoczne 2 Rozmycie, kolor mięsa czerwonego 3 Maksymalna możliwa wartość punktowa: 3

Obrzęk spojówki

Opuchlizna (dotyczy powiek i/lub błony mrużnej) W normie 0 Niewielka opuchlizna powyżej normy 1 Widoczna opuchlizna z częściowym wynicowaniem powieki 2 Opuchlizna, z powiekami zamkniętymi w połowie 3 Opuchlizna, z powiekami zamkniętymi więcej niż w połowie 4 Maksymalna możliwa wartość punktowa: 4

B.6. SENSYBILIZACJA SKÓRY

B.6.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Uwagi: Czułość i zdolność testów do wykrywania potencjalnych sensybilizatorów ludzkiej skóry uważa się za ważne w systemie klasyfikacji toksyczności odnoszącej się do zdrowia publicznego. Nie ma jednej metody badania, która właściwie zidentyfikuje wszystkie substancje z potencjałem do sensybilizowania ludzkiej skóry i która odnosi się do wszystkich substancji. Czynniki, takie jak fizyczne charakterystyki substancji, w tym jej zdolność do wnikania w skórę, muszą być wzięte pod uwagę przy wyborze testu. Są wykorzystywane dwa typy testów stosujących świnki morskie: testy ze środkiem wspomagającym, w których stan alergiczny jest potęgowany przez rozpuszczenie lub utworzenie zawiesiny substancji testowanej w kompletnym środku wspomagającym Freunda (FCA), i testy niewspomagane. Testy ze środkiem wspomagającym mogą być bardziej precyzyjne w przewidywaniu prawdopodobnego działania substancji prowadzącego do sensybilizacji skóry u ludzi niż metody nie stosujące kompletnego środka wspomagającego Freunda i są zatem metodami preferowanymi. Test maksymalizacyjny świnki morskiej (GPMT) jest szeroko stosowanym testem ze środkiem wspomagającym. Pomimo iż kilka innych metod może być wykorzystanych w celu wykrycia potencjału substancji do wywołania reakcji sensybilizacji skóry, GPMT uważa się za preferowaną technikę wspomagającą. W przypadku wielu kategorii związków chemicznych testy niewspomagane (preferowany jest test Buehlera) uważa się za mniej czułe. W niektórych przypadkach mogą istnieć słuszne powody wyboru testu Buehlera, wymagającego aplikowania miejscowego zamiast iniekcji śródskórnej, wykorzystywanej w teście maksymalizacyjnym świnki morskiej. W przypadku stosowania testu Buehlera powinno być podane naukowe uzasadnienie. Test maksymalizacyjny świnki morskiej (GPMT) i test Buehlera są opisane w niniejszej metodzie. Inne metody mogą być stosowane, pod warunkiem że są potwierdzone i podane jest naukowe uzasadnienie. Jeżeli uzyskano wynik pozytywny w ogólnie przyjętym badaniu sortującym, substancja testowana może być nazwana potencjalnym sensybilizatorem i przeprowadzanie testu świnki morskiej może nie być konieczne. Jednakże jeżeli uzyskano wynik negatywny w takim teście, test świnki morskiej musi zostać przeprowadzony, z zastosowaniem procedury opisanej w tej metodzie badania. Zob. także Wprowadzenie ogólne w części B.

1.2. DEFINICJE Sensybilizacja skóry: (alergiczne kontaktowe zapalenie skóry) jest immunologiczną reakcją skórną na substancję. U ludzi reakcje mogą charakteryzować się swędzeniem, rumieniem, obrzękiem, grudkami, pęcherzykami, wzniesieniami naskórka wypełnionymi przezroczystą, wodną cieczą lub połączeniem tych objawów. W przypadku innych gatunków reakcje mogą się różnić i mogą być zaobserwowane tylko rumień i obrzęk. Ekspozycja indukcyjna: eksperymentalna ekspozycja podmiotu na substancję testowaną z zamiarem wywołania stanu nadwrażliwego. Okres indukcji: okres co najmniej jednego tygodnia następujący po ekspozycji indukcyjnej, podczas którego stan nadwrażliwy może się rozwinąć. Ekspozycja prowokacyjna: eksperymentalna ekspozycja podmiotu poddanego wcześniej działaniu substancji testowanej, następująca po okresie indukcji w celu ustalenia, czy podmiot reaguje w sposób nadwrażliwy.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Czułość i niezawodność stosowanej techniki eksperymentalnej powinna być oceniana co sześć miesięcy przez zastosowanie substancji, o których wiadomo, że mają właściwości od słabej do miarkowanej sensybilizacji skóry. We właściwie przeprowadzonym teście powinno się spodziewać reakcji co najmniej 30 % w teście ze środkiem wspomagającym i co najmniej 15 % w teście niewspomaganym dla słabych/umiarkowanych sensybilizatorów. Preferowane są następujące substancje: Numery CAS Numery EINECS Nazwy EINECS Nazwy zwyczajowe 101-86-0 202-983-3 aldehyd α-heksylocynamonowy aldehyd α-heksylocynamonowy 149-30-4 205-736-8 benzotiazolo-2-tiol (2-merkaptobenzotiazol) kaptaks 94-07-7 202-303-5 anestezyna nordcaine Mogą istnieć sytuacje, w których, biorąc pod uwagę zadowalające uzasadnienie, mogą być stosowane inne substancje kontrolne spełniające powyższe kryteria.

1.4. ZASADA METODY BADANIA Zwierzęta badane są początkowo poddane działaniu substancji testowanej przez śródskórne iniekcje i/lub aplikowanie naskórkowe (ekspozycja indukcyjna). W następstwie 10- do 14-dniowego okresu odpoczynku (okres indukcji), podczas którego może się rozwinąć reakcja odpornościowa, zwierzęta są poddane działaniu dawki prowokacyjnej. Rozmiar i stopień reakcji skórnej na ekspozycję prowokacyjną u zwierząt badanych jest porównywany ze wykazywanym przez zwierzęta kontrolne, które są poddawane pozorowanej terapii podczas indukcji i ulegają ekspozycji prowokacyjnej.

1.5. OPIS METOD BADANIA Jeżeli uważa się za konieczne usunięcie substancji testowanej, powinno ono być dokonane przy użyciu wody lub odpowiedniego rozpuszczalnika, bez zmiany istniejącej reakcji lub integralności naskórka.

1.5.

1.5.1. Test maksymalizacyjny świnki morskiej (GPMT)

1.5.1.

1.5.1.1. Przygotowania Zdrowe, młode, dorosłe, albinotyczne osobniki świnki morskiej są aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem testu. Przed testem zwierzęta są losowo przydzielane do grup. Sierść jest usuwana przez strzyżenie, golenie lub możliwie przez chemiczną depilację, zależnie od stosowanej metody badania. Przedmiotem troski powinno być unikanie otarcia skóry. Zwierzęta są ważone przed rozpoczęciem i na końcu testu.

1.5.1.2. Warunki testu

1.5.1.2.

1.5.1.2.1. Zwierzęta badane Wykorzystywane są powszechnie używane laboratoryjne rasy albinotyczne świnek morskich.

1.5.1.2.2. Liczba i płeć Samce i/lub samice zwierząt mogą być wykorzystane. Jeżeli wykorzystane są samice, powinny one być nieciężarne i takie, które nie rodziły. W grupie badanej jest wykorzystane co najmniej 10 zwierząt i co najmniej 5 zwierząt w grupie kontrolnej. Jeżeli użyto mniej niż 20 badanych i 10 kontrolnych świnek morskich i nie jest możliwy wniosek, że testowana substancja jest sensybilizatorem, zdecydowanie zalecane jest badanie dodatkowych zwierząt, aby otrzymać w sumie co najmniej 20 badanych i 10 kontrolnych zwierząt.

1.5.1.2.3. Poziomy dawki Stężenie substancji testowanej stosowane przy każdej ekspozycji indukcyjnej powinno być systematycznie dobrze tolerowane i powinno być najwyższe, powodujące od słabego do umiarkowanego podrażnienia skóry. Stężenie stosowane przy ekspozycji prowokacyjnej powinno być najwyższą dawką niedrażniącą. Jeżeli konieczne, właściwe stężenia mogą być określone na podstawie badania pilotażowego wykorzystującego dwa lub trzy zwierzęta. W tym celu powinno być rozważone wykorzystanie zwierząt poddanych działaniu FCA.

1.5.1.3. Procedura

1.5.1.3.

1.5.1.3.1. Indukcja Dzień 0 – grupa badana Trzy pary śródskórnych iniekcji o objętości 0,1 ml są podawane w okolicę barku, która jest oczyszczona z sierści tak, aby iniekcje każdej pary leżały po obu stronach linii środkowej. Iniekcja 1: mieszanina 1:1 (objętościowo) FCA/woda lub fizjologiczny roztwór soli. Iniekcja 2: substancja testowana w odpowiednim nośniku w wybranym stężeniu. Iniekcja 3: substancja testowana przygotowana w wybranym stężeniu w mieszaninie 1:1 (objętościowo) FCA/woda lub fizjologicznym roztworze soli. W iniekcji 3 substancje rozpuszczalne w wodzie są rozpuszczane w fazie wodnej przed zmieszaniem z FCA. Przygotowuje się zawiesinę w FCA substancji rozpuszczalnych w tłuszczach i nierozpuszczalnych przed połączeniem z fazą wodną. Końcowe stężenie substancji testowanej musi być równe stężeniu użytemu w iniekcji 2. Iniekcje 1 i 2 są podawane blisko siebie i najbliżej głowy, podczas gdy 3 jest podawana w kierunku części ogonowej powierzchni badanej. Dzień 0 – grupa kontrolna Trzy pary śródskórnych iniekcji o objętości 0,1 ml są podawane w te same miejsca, co u zwierząt badanych. Iniekcja 1: mieszanina 1:1 (objętościowo) FCA/woda lub fizjologiczny roztwór soli. Iniekcja 2: nierozcieńczony nośnik. Iniekcja 3: Preparat nośnika o stężeniu wagowym 50 % w mieszaninie 1:1 (objętościowo) FCA/woda lub fizjologicznym roztworze soli. Dzień 5–7 – grupy badana i kontrolna Na około 24 godziny przed zastosowaniem miejscowej indukcji, jeżeli substancja nie jest środkiem drażniącym skórę, badana powierzchnia, po dokładnym strzyżeniu i/lub goleniu, jest poddawana działaniu 0,5 ml laurylosiarczanu (VI) sodu w wazelinie o stężeniu 10 %, w celu wywołania miejscowego podrażnienia. Dzień 6–8 – grupa badana Powierzchnia badana jest ponownie oczyszczana z sierści. Bibuła filtracyjna (2 × 4 cm) jest dokładnie pokrywana substancją testowaną w odpowiednim nośniku oraz nakładana na powierzchnię badaną i utrzymywana w kontakcie za pomocą szczelnego opatrunku przez 48 godzin. Wybór nośnika powinien być uzasadniony. Substancje stałe są drobno rozcierane i łączone z odpowiednim nośnikiem. Ciecze mogą być stosowane bez rozcieńczania, jeżeli właściwe. Dzień 6–8 – grupa kontrolna Powierzchnia badana jest ponownie oczyszczana z sierści. Nakładany jest tylko nośnik, w podobny sposób na powierzchnię badaną i utrzymywany w kontakcie za pomocą szczelnego opatrunku przez 48 godzin.

1.5.1.3.2. Prowokacja Dzień 20–22 – grupa badana i kontrolna Boki badanych i kontrolnych zwierząt są oczyszczane z sierści. Łata lub komora wypełniona substancją testowaną jest nakładana na jeden bok zwierząt oraz, w odpowiednim przypadku, łata lub komora wypełniona tylko nośnikiem może być nałożona na drugi bok. Łaty są utrzymywane w kontakcie za pomocą szczelnego opatrunku przez 24 godziny.

1.5.1.3.3. Obserwacja i klasyfikacja: grupy: badana i kontrolna: Ślepy odczyt wyników badań zwierząt badanych i kontrolnych jest wskazany. Jeżeli konieczne jest wyjaśnienie wyników otrzymanych w pierwszej prowokacji, powinna być rozważona druga prowokacja (tj. powtórna prowokacja), gdzie właściwe z nową grupą kontrolną, w przybliżeniu jeden tydzień po pierwszej. Powtórna prowokacja może być również przeprowadzona na pierwotnej grupie kontrolnej. Wszystkie reakcje skórne i jakiekolwiek niezwykłe wyniki badań, w tym reakcje ogólnoustrojowe, wynikające z procedur indukcji i prowokacji powinny być obserwowane i odnotowywane zgodnie ze skalą klasyfikacyjną Magnusson/Kligman (zob. dodatek). W celu wyjaśnienia wątpliwych reakcji mogą być przeprowadzone inne procedury, np. badanie histopatologiczne, pomiar grubości fałdy skórnej.

około 21 godzin po usunięciu łaty powierzchnia prowokacji jest czyszczona i dokładnie strzyżona i/lub golona i, jeżeli to konieczne, depilowana,

około 3 godzin później (w przybliżeniu 48 godzin od początku stosowania prowokacji) reakcja skóry jest obserwowana i odnotowywana zgodnie z klasami wskazanymi w dodatku,

około 24 godziny po tej obserwacji przeprowadza się drugą obserwację (72 godziny) i ponownie odnotowuje.

1.5.2. Test Buehlera

1.5.2.

1.5.2.1. Przygotowania Zdrowe, młode, dorosłe, albinotyczne osobniki świnki morskiej są aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem testu. Przed testem zwierzęta są losowo przydzielane do grup. Sierść jest usuwana przez strzyżenie, golenie lub możliwie przez chemiczną depilację, zależnie od stosowanej metody badania. Należy uważać, aby uniknąć otarcia skóry. Zwierzęta są ważone przed rozpoczęciem i na końcu testu.

1.5.2.2. Warunki testu

1.5.2.2.

1.5.2.2.1. Zwierzęta badane Wykorzystywane są powszechnie używane laboratoryjne rasy albinotyczne świnek morskich.

1.5.2.2.2. Liczba i płeć Mogą być wykorzystane samce i/lub samice zwierząt. Jeżeli wykorzystane są samice, powinny one być nieciężarne i takie, które nie rodziły. W grupie badanej jest wykorzystanych co najmniej 20 zwierząt i co najmniej 10 zwierząt w grupie kontrolnej.

1.5.2.2.3. Poziomy dawki Stężenie substancji testowanej stosowane przy każdej ekspozycji indukcyjnej powinno być możliwie najwyższe, by spowodować słabe, ale nie nadmierne podrażnienie. Stężenie stosowane przy ekspozycji prowokacyjnej powinno być najwyższą dawką niedrażniącą. Jeżeli konieczne, właściwe stężenia mogą być wyznaczone na podstawie badania pilotażowego wykorzystującego dwa lub trzy zwierzęta. W przypadku materiałów testowanych rozpuszczalnych w wodzie, właściwe jest stosowanie jako nośnika wody lub rozcieńczonego niedrażniącego roztworu środka powierzchniowo czynnego. W przypadku innych materiałów testowanych 80 % roztwór etanol/woda jest preferowany dla indukcji i aceton dla prowokacji.

1.5.2.3. Procedura

1.5.2.3.

1.5.2.3.1. Indukcja Dzień 0 – grupa badana Jeden bok jest oczyszczany z sierści (dokładne strzyżenie). System łat powinien być całkowicie wypełniony substancją testowaną w odpowiednim nośniku (wybór nośnika powinien być uzasadniony; ciekłe substancje testowane mogą być stosowane bez rozcieńczania, jeżeli właściwe). System łat jest nakładany na powierzchnię testowaną i utrzymywany w kontakcie ze skórą za pomocą szczelnej łaty lub komory i odpowiedniego opatrunku przez 6 godzin. System łat musi być szczelny. Odpowiedni jest bawełniany tampon, który może być okrągły lub kwadratowy, o przybliżonej powierzchni 4–6 cm2. W celu zapewnienia szczelności preferowane jest unieruchomienie badanego osobnika przy użyciu odpowiedniego elementu unieruchamiającego. Jeżeli zastosowane jest owijanie, mogą być potrzebne dodatkowe ekspozycje. Dzień 0 – grupa kontrolna Jeden bok jest oczyszczany z sierści (dokładne strzyżenie). Nakładany jest tylko nośnik, w sposób podobny do stosowanego w doniesieniu do grupy badanej. System łat jest utrzymywany w kontakcie ze skórą za pomocą szczelnej łaty lub komory i odpowiedniego opatrunku przez 6 godzin. Jeżeli można wykazać, że nie jest konieczna symulowana grupa kontrolna, można się posłużyć naturalną grupą kontrolną. Dzień 6–8 i 13–15 – grupa badana i kontrolna Przeprowadza się takie samo aplikowanie jak w dniu 0, na tę samą powierzchnię badaną (oczyszczenie z sierści w razie konieczności) tego samego boku, w dniu 6–8 i ponownie w dniu 13–15.

1.5.2.3.2. Prowokacja Dzień 27–29 – grupa badana i kontrolna Bok zwierząt badanych i kontrolnych, który nie był wykorzystywany do badania, jest oczyszczany z sierści (dokładne strzyżenie). Na zadnią część nieużywanego boku zwierząt badanych i kontrolnych nakładana jest łata lub komora, zawierająca odpowiednią ilość substancji testowanej w maksymalnym niedrażniącym stężeniu. Jeżeli ma to znaczenie, szczelna łata lub komora tylko z nośnikiem jest również nakładana na przednią część nieużywanego boku zarówno badanych, jak i kontrolnych zwierząt. Łaty i komory są utrzymywane w kontakcie ze skórą za pomocą odpowiedniego opatrunku przez 6 godzin.

1.5.2.3.3. Obserwacja i klasyfikacja: Ślepy odczyt zwierząt badanych i kontrolnych jest wskazany. Jeżeli konieczne jest wyjaśnienie wyników otrzymanych z pierwszej prowokacji, powinna być rozważona druga prowokacja (tj. powtórna prowokacja), gdzie właściwe, z nową grupą kontrolną, w przybliżeniu jeden tydzień po pierwszej. Powtórna prowokacja może być również przeprowadzona na pierwotnej grupie kontrolnej. Wszystkie reakcje skórne i jakiekolwiek nietypowe wyniki badań, w tym reakcje ogólnoustrojowe, wynikające z procedur indukcji i prowokacji powinny być zaobserwowane i odnotowywane zgodnie ze skalą klasyfikacyjną Magnusson/Kligman (zob. dodatek). W celu wyjaśnienia wątpliwych reakcji mogą być przeprowadzone inne procedury, np. badanie histopatologiczne, pomiar grubości fałdy skórnej.

około 21 godzin po usunięciu łaty powierzchnia prowokowana jest oczyszczana z sierści,

około 3 godziny później (w przybliżeniu 30 godzin po przyłożeniu łaty prowokującej) reakcje skórne są obserwowane i odnotowywane zgodnie z klasami wskazanymi w dodatku,

około 24 godziny później po 30-godzinnej obserwacji (w przybliżeniu 54 godziny po przyłożeniu łaty prowokującej) reakcje skórne są ponownie obserwowane i odnotowywane.

2. DANE (GPMT i test buehlera) Dane powinny być podsumowane w formie tabeli, przedstawiając reakcje skórne każdego zwierzęcia podczas każdej obserwacji.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA (GPMT I TEST BUEHLERA) Jeżeli jest wykonana próba sortująca przed testem świnki morskiej, muszą być podane opis i odniesienie do testu (np. miejscowa próba węzła chłonnego (LLNA), test obrzęku ucha myszy (MEST)), w tym szczegóły procedury, wraz z wynikami testu, oraz wynikami zastosowania substancji odniesienia.

3. Sprawozdanie z testu (GMPT i test Buehlera)

Sprawozdanie z testu obejmuje, jeżeli możliwe, następujące informacje:

Zwierzęta badane:

wykorzystana rasa świnki morskiej,

liczba, wiek i płeć zwierząt,

źródło, warunki, w których przebywają zwierzęta, dieta itp.,

indywidualna waga zwierząt na początku testu.

Warunki testu:

technika przygotowania miejsca przyłożenia łaty,

szczegóły dotyczące materiału łaty i techniki jej przykładania,

wynik badania pilotażowego z wnioskiem, dotyczącym stężeń indukcyjnych i prowokacyjnych, które mają być zastosowane w teście,

szczegóły dotyczące przygotowania, aplikowania i usuwania substancji testowanej,

uzasadnienie wyboru nośnika,

stężenia nośnika i substancji testowanej zastosowane w ekspozycji indukcyjnej i prowokacyjnej oraz całkowita ilość substancji użytej do indukcji i prowokacji.

Wyniki:

podsumowanie wyników ostatniej kontroli czułości i niezawodności (zob. 1.3) wraz z informacją dotyczącą stosowanej substancji, stężenia i nośnika,

dotyczące każdego zwierzęcia wraz z systemem klasyfikacji,

opisowa relacja dotycząca natury i zakresu obserwowanych skutków,

wszelkie wyniki histopatologiczne.

Rozpatrzenie wyników.

Wnioski.

4. BIBLIOGRAFIA Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 423.

B.7. TOKSYCZNOŚĆ POWTARZANEJ (28 DNI) DAWKI (DOUSTNA)

B.7.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Zob. Wprowadzenie ogólne w części B.

1.2. DEFINICJE Zob. Wprowadzenie ogólne w części B.

1.3. ZASADA METODY BADANIA Substancja testowana jest podawana kilku grupom zwierząt doświadczalnych doustnie, codziennie, w stopniowanych dawkach, jeden poziom dawki na grupę przez okres 28 dni. Podczas okresu dawkowania każdego dnia zwierzęta są dokładnie obserwowane w celu wykrycia oznak toksyczności. Zwierzęta, które zdychają lub są zabijane podczas testu, poddaje się sekcji zwłok, a na zakończenie testu zwierzęta, które przeżyły, są zabijane i poddawane sekcji zwłok. Niniejsza metoda kładzie większy nacisk na objawy neurologiczne jako określony punkt końcowy, i podkreślana jest konieczność uważnych obserwacji klinicznych zwierząt, w celu otrzymania możliwie najwięcej informacji. Metoda ta powinna identyfikować związki chemiczne o potencjale neurotoksycznym, co może dawać podstawy do dalszego dogłębnego badania tego aspektu. Dodatkowo, metoda może wykazywać skutki immunologiczne i toksyczność organów rozrodczych.

1.4. OPIS METODY BADANIA

1.4.

1.4.1. Przygotowania Zdrowe, młode, dorosłe zwierzęta są losowo przydzielane do grupy kontrolnej i badanej. Klatki powinny być ustawione w taki sposób, żeby zminimalizować możliwy wpływ położenia klatki. Zwierzęta są identyfikowane jednoznacznie i przetrzymywane w klatkach przez co najmniej pięć dni przed rozpoczęciem badania, żeby umożliwić aklimatyzację do warunków laboratoryjnych. Substancja testowana jest podawana bezpośrednio do żołądka, w pożywieniu lub w wodzie pitnej. Metoda aplikowania zależy od celu badania i właściwości fizycznych/chemicznych substancji. W przypadku gdy to konieczne, substancja testowana jest rozpuszczona lub ma postać zawiesiny w odpowiednim nośniku. Zaleca się, aby jeżeli możliwe, najpierw było rozważone użycie wodnego roztworu/zawiesiny, następnie roztworu/emulsji w oleju (np. olej kukurydziany) i potem możliwy roztwór w innym nośnikach. W przypadku nośników innych niż woda musi być znana charakterystyka toksyczna nośnika. Powinna być określona trwałość testowanej substancji w nośniku.

1.4.2. Warunki badania

1.4.2.

1.4.2.1. Zwierzęta badane Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, chociaż inne gatunki gryzoni mogą być wykorzystane. Powinny być wykorzystywane powszechnie używane laboratoryjne rasy młodych, zdrowych, dorosłych zwierząt. Samice powinny być nieciężarne i takie, które nie rodziły. Dawkowanie powinno się rozpocząć jak najszybciej po odsadzeniu od matki, a w każdym przypadku przed ukończeniem dziewięciu tygodni. Na początku badania wahania wagi zwierząt powinny być minimalne i nie przekraczać ± 20 % średniej wagi dla każdej płci. W przypadku gdy badanie wielokrotnej dawki doustnej jest przeprowadzane jako badanie wstępne do badania długoterminowego, preferowane do obu badań są zwierzęta tej samej rasy i z tego samego źródła.

1.4.2.2. Liczba i płeć Co najmniej 10 zwierząt (pięć samic i pięć samców) powinno być użytych dla każdego poziomu dawki. Jeżeli planowane jest uśmiercanie w międzyczasie, liczba powinna być powiększona o liczbę zwierząt, które według planu mają być zabite przed ukończeniem badania. Dodatkowo grupa satelicka 10 zwierząt (pięć zwierząt każdej płci) może być poddana działaniu wysokiego poziomu dawki przez 28 dni i obserwowana, przez 14 dni po dawkowaniu, pod kątem odwracalności, trwałości, i opóźnionego wystąpienia objawów zatrucia. Jest także stosowana grupa satelicka 10 zwierząt kontrolnych (pięć zwierząt każdej płci).

1.4.2.3. Poziomy dawki Zasadniczo powinny być wykorzystane co najmniej trzy grupy badane i grupa kontrolna. Z wyjątkiem zastosowania substancji testowanej, ze zwierzętami grupy kontrolnej powinno się obchodzić w sposób identyczny, jak z podmiotami grupy badanej. Jeżeli przy podawaniu substancji testowanej jest stosowany nośnik, grupa kontrolna powinna otrzymać największą użytą objętość nośnika. Jeżeli z oceny innych danych należałoby oczekiwać braku objawów przy dawce 1000 mg/kg masy ciała/dzień, może być przeprowadzony test graniczny. Jeżeli nie są dostępne odpowiednie dane, może być wykonane badanie wyników zakresowych, pomagające określić dawki, które mają być użyte. Poziomy dawki powinny być wybierane, biorąc pod uwagę jakiekolwiek istniejące dane o toksyczności i dane toksykokinetczne osiągalne dla substancji testowanej lub materiałów pokrewnych. Powinien zostać wybrany najwyższy poziom dawki, w celu wywołania objawów zatrucia, ale nie śmierci lub poważnego cierpienia. Od tego czasu malejąca sekwencja poziomów dawki powinna być dobierana w taki sposób, aby wykazać wszystkie reakcje powiązane z dawkowaniem i brak obserwowanych objawów niekorzystnych przy najmniejszym poziomie dawki (NOAEL). Dwie lub cztery ograniczone przerwy są często optymalne dla ustalenia malejących poziomów dawki i dodanie czwartej grupy badanej jest często bardziej pożądane niż stosowanie bardzo dużych przerw (np. współczynnik większy od 10) między dawkowaniem. W przypadku substancji podawanych w pożywieniu lub wodzie pitnej ważne jest zapewnienie, aby wymagane ilości substancji testowanej nie kolidowały z prawidłową równowagą odżywiania lub wody. W przypadku gdy substancja testowana jest podawana w pożywieniu, może być stosowane stałe stężenie żywieniowe (ppm) albo stały poziom dawki odniesionej do masy ciała zwierząt; użyta opcja musi być wyszczególniona. W przypadku substancji podawanej bezpośrednio do żołądka dawka powinna być podawana każdego dnia o podobnym czasie i w razie konieczności modyfikowana, żeby utrzymać stały poziom dawki w odniesieniu do masy ciała zwierzęcia. W przypadku gdy badanie wielokrotnej dawki jest przeprowadzane jako badanie wstępne do badania długoterminowego, w obu badaniach powinna być stosowana podobna dieta.

1.4.2.4. Test graniczny Jeżeli test przy jednym poziomie dawki równym co najmniej 1000 mg/kg masy ciała/dzień lub, w przypadku podawania w pożywieniu lub wodzie pitnej, równoważny procent w pożywieniu lub wodzie pitnej (na podstawie ustalonej masy ciała), stosując procedury opisane dla tego badania, nie wywołuje widocznych objawów zatrucia i jeżeli nie należałoby spodziewać się toksyczności na podstawie danych, dotyczących substancji strukturalnie pokrewnych, wtedy pełne badanie przy użyciu trzech poziomów dawki może nie być konieczne. Niniejszy test graniczny ma zastosowanie, z wyłączeniem tych przypadków, w których ekspozycja ludzi wskazuje na konieczność użycia wyższego poziomu dawki.

1.4.2.5. Okres obserwacji Okres obserwacji powinien wynosić 28 dni. Zwierzęta w grupie satelickiej wyznaczone do obserwacji uzupełniających powinny być przetrzymane przez co najmniej 14 dalszych dni bez terapii, w celu wykrycia opóźnionych objawów zatrucia, ich trwałości lub powrotu do zdrowia.

1.4.3. Procedura Substancja testowana jest dawkowana zwierzętom codziennie przez siedem dni każdego tygodnia w okresie 28 dni; zastosowanie pięciodniowego tygodniowego reżimu dawkowania musi być uzasadnione. W przypadku gdy substancja testowana jest podawana bezpośrednio do żołądka, powinno to być zrobione w jednej dawce przy użyciu rurki lub odpowiedniej kaniuli dotchawicznej. Maksymalna objętość cieczy, która może być podana jednorazowo, zależy od rozmiarów badanego zwierzęcia. Objętość nie powinna przekraczać 1 ml/100 g masy ciała, oprócz roztworów wodnych, w przypadku których można użyć 2 ml/100 g masy ciała. Poza substancjami drażniącymi i korozyjnymi, które normalnie ujawniają zaostrzone objawy przy wyższych stężeniach, zmienność objętości w badaniu powinna być zminimalizowana przez dostosowanie stężenia, aby zapewnić stałą objętość przy wszystkich poziomach dawki.

1.4.3.

1.4.3.1. Ogólne obserwacje Ogólne obserwacje kliniczne powinny być przeprowadzane co najmniej raz dziennie, najlepiej każdego dnia w tym samym czasie, biorąc pod uwagę szczytowy okres przewidywanych objawów po dawkowaniu. Stan zdrowia zwierząt powinien być odnotowywany. Co najmniej dwa razy dziennie wszystkie zwierzęta są obserwowane pod kątem zachorowalności i śmiertelności. Zwierzęta konające oraz zwierzęta przejawiające ostre cierpienie i ból powinny być usuwane, gdy zostanie to zauważone, humanitarnie zabite i poddane sekcji zwłok. Jeden raz przed pierwszą ekspozycją (aby uwzględnić porównanie w obrębie podmiotów), i od tego czasu co najmniej raz w tygodniu, powinny być przeprowadzane szczegółowe obserwacje kliniczne wszystkich zwierząt. Obserwacje te powinny być przeprowadzane na zewnątrz klatki macierzystej na znormalizowanej powierzchni i najlepiej za każdym razem w tym samym czasie. Powinny one być starannie odnotowywane, najlepiej przy użyciu systemów zapisywania, wyraźnie zdefiniowanych przez laboratorium testujące. Powinny być podjęte wysiłki, aby zagwarantować, że zmiany warunków badania są minimalne i że obserwacje są przeprowadzane najlepiej przez obserwatorów nieświadomych terapii. Zanotowane oznaki powinny obejmować, ale nie powinny być do nich ograniczone, zmiany w skórze, futrze, oczach, błonach śluzowych, wystąpienie wydzielin i wydalin aktywności wegetatywnej (np. łzawienie, podniesienie sierści, rozmiar źrenicy, niezwykła forma oddychania). Powinny być także odnotowywane zmiany w sposobie chodzenia, postawie, i reakcji na dotyk, jak również obecność ruchów drgawkowych lub kurczowych, stereotypów (np. nadmierne czyszczenie się, powtarzające się krążenie w kółko) oraz dziwne zachowanie (np. samookaleczanie, chodzenie do tyłu). W czwartym tygodniu ekspozycji powinna być przeprowadzona ocena reaktywności sensorycznej na różnego typu bodźce (np. bodźce słuchowe, wzrokowe i proprioreceptoryczne), ocena siły uchwytu i aktywności motorycznej. Dalsze szczegóły procedur, które mogłyby być zastosowane, są podane w literaturze (zob. Wprowadzenie ogólne w część B). Obserwacje funkcjonalne przeprowadzane w czwartym tygodniu ekspozycji mogą być pominięte, gdy badanie prowadzone jest jako badanie wstępne do późniejszego badania (90-dniowego) podchronicznego. W takim przypadku obserwacje funkcjonalne powinny być zawarte w tym uzupełniającym badaniu. Z drugiej strony, dostępność danych dotyczących obserwacji funkcjonalnych z badania wielokrotnej dawki może poprawić możliwość wyboru poziomów dawki do celów późniejszego badania podchronicznego. Wyjątkowo obserwacje funkcjonalne mogą być pominięte w przypadku grup, które w przeciwnym przypadku ujawniają oznaki zatrucia w stopniu, który mógłby znacząco kolidować z wykonaniem testu funkcjonalnego.

1.4.3.2. Masa ciała i spożycie żywności/wody Wszystkie zwierzęta powinny być ważone co najmniej raz w tygodniu. Pomiary spożycia żywności i wody powinny być wykonywane co najmniej raz na tydzień. Jeżeli substancja testowana podawana jest z wodą pitną, spożycie wody powinno być również mierzone co najmniej raz na tydzień.

1.4.3.3. Hematologia Na końcu okresu badania powinny być przeprowadzone następujące analizy hematologiczne: hematokryt, stężenie hemoglobiny, liczba erytrocytów, całkowita i różnicowa liczba leukocytów, liczba płytek krwi i pomiar krzepliwości krwi czas/potencjał. Próbki krwi powinny być pobierane z wyznaczonego miejsca tuż przed lub jako część procedury zabijania zwierząt i przechowywane w odpowiednich warunkach.

1.4.3.4. Biochemia kliniczna Oznaczenia biochemii klinicznej w celu zbadania znaczących skutków toksycznych w tkankach, a ściśle – skutków w nerkach i wątrobie, powinny być wykonane na otrzymanych próbkach krwi wszystkich zwierząt tuż przed lub jako część procedury zabijania zwierząt (z wyjątkiem tych, które znaleziono konające i/lub zabite w międzyczasie). Zalecane jest wstrzymanie podawania pożywienia dla zwierząt przez noc poprzedzającą pobranie krwi. Badania osocza i surowicy muszą obejmować sód, potas, glukozę, całkowity cholesterol, mocznik, kreatyninę, całkowite białko i albuminę, co najmniej dwa enzymy wskazujące na skutki komórkowe w wątrobie (takie jak aminotransferaza alaninowa, aminotransferaza asparaginowa, alkaliczna fosfataza, transpeptydaza gamma-glutamylowa i dehydrogenaza sorbitowa). Pomiary dodatkowych enzymów (wątrobowego lub innego pochodzenia) i kwasów żółciowych mogą dostarczyć przydatnych informacji w danych okolicznościach. Fakultatywnie, stosując czasowe objętościowe zbieranie moczu podczas ostatniego tygodnia badań, mogłyby być wykonane następujące oznaczenia analizy moczu: wygląd, objętość, osmolarność i ciężar właściwy, pH, białko, glukoza i krew/komórki krwi. Dodatkowo powinno być rozważone badanie markerów surowicy dotyczących ogólnego uszkodzenia tkanki. Inne oznaczenia, które powinny być przeprowadzone, jeżeli znane właściwości substancji testowanej mogą lub podejrzewa się, że mogą wpływać na pokrewne profile metaboliczne, obejmują wapń, fosforan, triglicerydy po poście, hormony specyficzne, metahemoglobinę i cholinoesterazę. Powyższe musi zostać rozpoznane w odniesieniu do substancji w niektórych klasach lub na zasadzie analizy przypadku. Ogólnie, istnieje konieczność elastycznego podejścia, zależnie od gatunku i obserwowanych i/lub spodziewanych skutków danej substancji. Jeżeli dane poziomu tolerancji z przeszłości są niedostateczne, powinno się rozważyć oznaczenie zmiennych hematologicznych i biochemii klinicznej zanim rozpocznie się dawkowanie.

1.4.3.5. Sekcja zwłok Wszystkie zwierzęta uczestniczące w badaniu muszą być poddane pełnej, szczegółowej sekcji zwłok, która obejmuje staranne badanie zewnętrznych powierzchni ciała, wszystkich otworów i jam czaszkowych, piersiowych i brzusznych oraz ich zawartości. Wątroba, nerki, nadnercza, jądra, gruczoły opuszkowo-cewkowe, grasica, śledziona, mózg i serce wszystkich zwierząt powinny być właściwie oczyszczone z jakiejkolwiek przylegającej tkanki i zważone mokre, jak najszybciej po przeprowadzeniu sekcji, aby uniknąć wysuszenia. Następujące tkanki powinny być zakonserwowane w utrwalającym ośrodku najbardziej odpowiednim zarówno dla typu tkanki, jak i zamierzonego późniejszego badania histopatologicznego: wszystkie duże zmiany patologiczne, mózg (reprezentatywne rejony w tym mózg, móżdżek i pons), rdzeń kręgowy, żołądek, jelito cienkie i grube (w tym kępki Peyera), wątroba, nerki, nadnercza, śledziona, serce, grasica, tarczyca, tchawica i płuca (zakonserwowane przez napełnienie środkiem utrwalającym i następnie zanurzenie), gruczoły płciowe, pomocnicze narządy płciowe (np. macica, prostata), pęcherz moczowy, węzły chłonne (najlepiej jeden węzeł chłonny obejmujący drogę podawania i inny węzeł odległy od drogi podawania, aby uwzględnić skutki ogólnoustrojowe), nerw obwodowy (kulszowy lub piszczelowy), najlepiej w bliskiej odległości od mięśnia, i część szpiku kostnego (lub, ewentualnie, świeżo pobrana mała objętość szpiku kostnego). Wyniki badań klinicznych i innych mogą wskazywać na konieczność zbadania dodatkowych tkanek. Powinny również zostać zakonserwowane inne narządy, na które może być skierowane działanie substancji testowanej, opierając się na jej znanych właściwościach.

1.4.3.6. Badanie histopatologiczne Pełne badanie histopatologiczne powinno być przeprowadzone na zakonserwowanych narządach i tkankach wszystkich zwierząt z grupy kontrolnej i grupy wysokiej dawki. Badania te powinny być rozszerzone na zwierzęta z grup wszystkich innych dawek, jeżeli w grupie wysokiej dawki obserwowane są zmiany związane z działaniami badawczymi. Wszystkie duże zmiany patologiczne muszą być zbadane. W przypadku gdy stosowana jest grupa satelicka, badania histopatologiczne powinny być przeprowadzone na tkankach i narządach rozpoznanych jako wykazujące skutki w grupach badanych.

2. DANE Powinny zostać dostarczone dane indywidualne zwierząt. Dodatkowo wszystkie dane powinny być podsumowane w formie tabeli, przedstawiając dla każdej grupy badanej liczbę zwierząt na początku testu, liczbę zwierząt, które znaleziono martwe podczas testu lub zabito z powodów humanitarnych i czas każdej śmierci lub humanitarnego zabicia, liczbę zwierząt wykazujących oznaki toksyczności, opis obserwowanych oznak zatrucia, w tym czas rozpoczęcia, okres trwania, ostrość wszystkich objawów zatrucia, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, typ tych zmian i procent zwierząt przejawiających każdy typ zmian patologicznych. W przypadkach gdy jest to możliwe, wyniki liczbowe powinny być ocenione za pomocą odpowiedniej i ogólnie akceptowanej metody statystycznej. Metody statystyczne powinny być wybrane podczas planowania badania.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

3. SPRAWOZDANIE Z TESTU

Sprawozdanie z testu obejmuje, jeżeli możliwe, następujące informacje:

Zwierzęta badane:

wykorzystany gatunek/rasa,

liczba, wiek i płeć zwierząt,

źródło, warunki przebywania zwierząt, dieta itp.,

indywidualna waga zwierząt na początku testu, od tego czasu w tygodniowych odstępach i na końcu testu.

Warunki testu:

uzasadnienie wyboru nośnika, jeżeli jest inny niż woda,

racjonalna podstawa wyboru poziomu dawki,

szczegóły dotyczące przygotowania formy użytkowej substancji testowanej/żywności, osiąganego stężenia, trwałości i homogeniczności preparatu,

szczegóły podawania substancji testowanej,

jeżeli ma zastosowanie, przeliczenie stężenia substancji testowanej w żywności/wodzie pitnej (ppm) na rzeczywistą dawkę (mg/kg masy ciała/dzień),

szczegóły jakości pożywienia i wody.

Wyniki:

masa ciała/zmiany masy ciała,

spożycie żywności i spożycie wody, w odpowiednich przypadkach,

dane, dotyczące reakcji toksycznej według płci i poziomu dawki, w tym oznaki oksyczności,

natura, ostrość i czas trwania obserwacji klinicznych (czy odwracalne, czy nie),

ocena aktywności sensorycznej, siły uchwytu i aktywności motorycznej,

testy hematologiczne z odpowiednimi wartościami poziomu tolerancji,

kliniczne testy biochemiczne z odpowiednimi wartościami poziomu tolerancji,

masa ciała w chwili zabicia i dane o masie narządów,

wyniki sekcji zwłok,

szczegółowy opis wszystkich wyników histopatologicznych,

dane absorpcji, jeżeli dostępne,

statystyczna obróbka wyników, gdzie właściwe.

Rozpatrzenie wyników.

Wnioski.

4. BIBLIOGRAFIA Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 407.

B.8. TOKSYCZNOŚĆ POWTARZANEJ (28 DNI) DAWKI (INHALACYJNA)

B.8.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Przydatne jest posiadanie wstępnych informacji na temat rozkładu wielkości cząstek, prężności pary, temperatury topnienia, temperatury wrzenia, temperatury zapłonu i wybuchowości (o ile stosowalne) substancji badanej. Patrz także: Wprowadzenie ogólne część B lit. A).

1.2. DEFINICJA Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. B).

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.4. ZASADA METODY BADANIA Kilka grup zwierząt doświadczalnych poddaje się ekspozycji przez określony okres czasu na substancję badaną w stopniowanych stężeniach, po jednym stężeniu na grupę, przez 28 dni. W przypadku gdy zastosuje się podłoże w celu zapewnienia właściwego stężenia substancji badanej w powietrzu, należy zastosować grupę kontrolną otrzymującą wyłącznie takie podłoże. W okresie podawania prowadzi się obserwację zwierząt w celu wykrycia wszelkich objawów toksyczności. Zwierzęta, które padną w trakcie badania, i te, które przeżyją po jego zakończeniu, poddaje się sekcji zwłok.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Brak.

1.6. OPIS METODY BADANIA

1.6.

1.6.2. Warunki badania

1.6.2.

1.6.2.1. Zwierzęta doświadczalne O ile nie ma przeciwwskazań, preferowanym gatunkiem jest szczur. Należy wykorzystać powszechnie stosowane szczepy laboratoryjne młodych, zdrowych zwierząt. Na początku badania zmienność masy ciała zastosowanych zwierząt nie powinna przekraczać ± 20 % odpowiedniej wartości średniej.

1.6.2.2. Liczba i płeć Wykorzystuje się po co najmniej 10 zwierząt (pięć samic i pięciu samców) w każdej grupie badanej. Samice powinny być nieródkami i nie mogą być w ciąży. Jeżeli planuje się uśmiercanie zwierząt w międzyczasie, ogólna ich liczba powinna być zwiększona o liczbę zwierząt zaplanowanych do uśmiercenia przed zakończeniem badania. Ponadto satelicka grupa 10 zwierząt (po pięcioro zwierząt każdej płci) może otrzymywać większą dawkę przez 28 dni i można prowadzić w niej obserwację pod kątem odwracalności, utrzymywania się i opóźnionego pojawiania się efektów toksycznych przez 14 dni od zastosowania substancji. Jest także stosowana grupa satelicka 10 zwierząt kontrolnych (pięć zwierząt każdej płci).

1.6.2.3. Stężenie ekspozycyjne Konieczne jest zapewnienie co najmniej trzech stężeń, wraz z kontrolą i kontrolą otrzymującą podłoże (w stężeniu odpowiadającym stężeniu podłożu przy najwyższym poziomie dawkowania substancji), o ile to ostatnie jest stosowane. Z wyjątkiem podawania substancji badanej, zwierzęta w grupie kontrolnej powinny być traktowane w taki sam sposób jak zwierzęta w grupach badanych. Najwyższe stężenie powinno być tak dobrane, aby wywierało działanie toksyczne, jednak nie prowadziło do zgonów lub prowadziło do jedynie niewielu zgonów. Najniższe stężenie nie powinno dawać żadnych objawów toksyczności. W przypadku gdy istnieje możliwa do wykorzystania, oszacowana wielkość ekspozycji u ludzi, najniższe stężenie powinno ją przewyższać. W idealnej sytuacji pośrednie stężenie powinno prowadzić do uzyskania minimalnych dostrzegalnych efektów toksycznych. W przypadku gdy zostanie wykorzystane więcej niż jedno stężenie pośrednie, wielkości stężeń powinny być tak rozstawione, aby uzyskać stopniowanie działań toksycznych. W grupach otrzymujących niskie i pośrednie stężenia oraz w grupach kontrolnych częstość występowania zgonów powinna być niska, aby umożliwić znaczącą ocenę wyników.

1.6.2.4. Czas ekspozycji Czas codziennej ekspozycji powinien wynosić sześć godzin, jednak mogą być potrzebne inne okresy, aby spełnić szczególne wymagania.

1.6.2.5. Wyposażenie Zwierzęta należy poddać badaniu przy użyciu przyrządów do inhalacji zapewniających przepływ dynamiczny powietrza co najmniej 12 wymian na godzinę, aby zapewnić odpowiednią zawartość tlenu i równomierną dystrybucję powietrza ekspozycji. W przypadku zastosowania komory należy ją tak zaprojektować, aby zmniejszyć do minimum stłoczenie zwierząt badanych i zwiększyć do maksimum ich ekspozycję drogą inhalacyjną na substancję badaną. Z reguły, aby zapewnić stabilność powietrza w komorze, całkowita objętość zwierząt badanych nie powinna przekraczać 5 % objętości komory do badań. Można zastosować ekspozycję ustno-nosową, ekspozycję jedynie głowy lub ekspozycję całego ciała w pojedynczych komorach, przy czym te pierwsze dwa sposoby pomogą w zminimalizowaniu przechodzenia substancji badanej do organizmu innymi drogami.

1.6.2.6. Okres obserwacji Zwierzęta doświadczalne należy obserwować codziennie pod kątem występowania objawów toksyczności w całym okresie otrzymywania substancji i zdrowienia. Należy zapisać czas zgonu zwierzęcia i czas pojawienia się i ustąpienia objawów toksyczności.

1.6.3. Procedura Zwierzęta poddaje się działaniu substancji badanej codziennie, przez pięć do siedmiu dni w tygodniu, przez okres 28 dni. Zwierzęta we wszelkich grupach satelickich, u których planuje się obserwację po zakończeniu eksperymentu, należy przetrzymać przez następnych 14 dni bez podawania im substancji, aby wykryć ustępowanie lub utrzymywanie się efektów toksycznych. Temperatura przeprowadzania badania powinna być utrzymywana na poziomie 22 ± 3 oC. Wilgotność względną należy utrzymywać najlepiej w przedziale pomiędzy 30 a 70 %, jednak w niektórych przypadkach (np. badania aerozoli) może to nie być możliwe ze względów praktycznych. Utrzymywanie lekkiego podciśnienia w komorze (≤ 5 mm słupa wody) zapobiega wyciekowi substancji badanej do otaczającego obszaru. W trakcie ekspozycji należy zaprzestać podawania zwierzętom karmy i wody. Należy stosować dynamiczny układ inhalacyjny z odpowiednim analitycznym systemem regulacji stężenia. Zalecane jest przeprowadzenie badania próbnego w celu ustalenia właściwych stężeń ekspozycji. Szybkość przepływu powietrza należy tak wyregulować, aby warunki w całej komorze były jednorodne. Układ powinien zapewnić jak najszybsze uzyskanie stabilnych warunków ekspozycji. Należy prowadzić pomiary lub monitorować następujące: W trakcie ekspozycji i po jej zakończeniu należy prowadzić systematyczne obserwacje, zapisując ich wyniki; należy prowadzić oddzielne zapisy dla każdego zwierzęcia. Wszystkie zwierzęta należy obserwować codziennie i odnotowywać występujące u nich objawy toksyczności, włącznie z czasem ich pojawienia się, stopniem ich ciężkości i czasem trwania. Obserwacje powinny obejmować zmiany skóry i sierści, oczu i błon śluzowych oraz zmiany układu oddechowego, krążenia, autonomicznego i ośrodkowego układu nerwowego, jak też wzorców aktywności somatomotorycznej i wzorca zachowania. Co tydzień należy ważyć zwierzęta. Zaleca się także przeprowadzanie cotygodniowych pomiarów wielkości spożycia karmy. Regularna obserwacja zwierząt jest niezbędna do tego, aby w możliwym zakresie nie stracić zwierząt badanych z takich przyczyn, jak kanibalizm, autoliza tkanek lub przemieszczenie. Pod koniec okresu badania wszystkie osobniki, które przeżyły w grupach innych niż satelicka, poddaje się sekcji zwłok. Zwierzęta konające oraz zwierzęta przejawiające ostre cierpienie i ból powinny być usuwane, gdy zostanie to zauważone, humanitarnie zabite i poddane sekcji zwłok. Następujące badania należy wykonać pod koniec okresu badania u wszystkich zwierząt, włącznie z osobnikami w grupie kontrolnej: Do innych oznaczeń, które mogą okazać się niezbędne do odpowiedniej oceny toksykologicznej, należą oznaczenia stężenia wapnia, fosforu, chlorków, sodu, potasu, glukozy na czczo, lipidogram, stężenia hormonów i oznaczenia równowagi kwasowo-zasadowej, stężenia methemoglobiny oraz aktywności cholinesterazy. W razie potrzeby można zastosować dodatkowe oznaczenia biochemiczne, aby rozszerzyć badania przyczyn zaobserwowanych działań toksycznych.

1.6.3. a)

szybkość przepływu powietrza (w sposób ciągły);

rzeczywiste stężenie substancji badanej mierzone w strefie oddechowej. W okresie ekspozycji stężenie nie powinno się zmieniać o więcej niż ± 15 % wartości średniej. W przypadku niektórych aerozoli ten poziom kontroli możne być niemożliwy do uzyskania, przy czym dopuszczalny jest wtedy szerszy zakres. W trakcie całego badania stężenia w kolejnych dniach powinny być utrzymywane na poziomie na tyle niezmiennym, na ile to będzie praktycznie możliwe. Dla aerozoli należy wykonać cotygodniowo co najmniej jedną analizę wielkości cząsteczek dla badanej grupy;

temperaturę oraz wilgotność, o ile możliwe w sposób ciągły.

(i) badania hematologiczne, w tym co najmniej hematokryt, stężenie hemoglobiny, liczba erytrocytów, liczba leukocytów z rozmazem i oznaczenie parametrów krzepnięcia;

(ii) laboratoryjne badania biochemiczne, włączając co najmniej jeden parametr funkcyjny wątroby i nerek: aktywność aminotransferazy alaninowej (uprzednio nazywanej transferazą glutaminianowo-pirogronową), aktywność aminotransferazy asparaginianowej (uprzednio nazywanej transferazą glutaminianowo-szczawiooctową) w surowicy, stężenie azotu mocznikowego, albumin, kreatyniny we krwi, całkowite stężenie bilirubiny i całkowite stężenie białka w surowicy.

1.6.3.1. Pełne badanie patomorfologiczne Wszystkie zwierzęta objęte badaniem powinny zostać poddane pełnemu makroskopowemu badaniu patomorfologicznemu. Co najmniej wątroba, nerki, nadnercza, płuca i organy badane należy zważyć w stanie wilgotnym tak szybko jak to możliwe po wycięciu, aby zapobiec wysuszeniu. Narządy i tkanki (wątrobę, nerki, śledzionę, nadnercza i serce, jak też wszelkie narządy wykazujące makroskopowe zmiany patologiczne lub o nieprawidłowych wymiarach) należy zakonserwować w odpowiednim środku w celu przeprowadzenia ewentualnych, przyszłych badań histopatologicznych. Płuca należy usunąć w stanie nienaruszonym, zważyć i zakonserwować w odpowiedniej substancji utrwalającej dla zapewnienia utrzymania ich struktury.

1.6.3.2. Badania histopatologiczne W grupie otrzymującej najwyższe stężenie i w grupie kontrolnej (grupach kontrolnych) należy wykonać badanie histologiczne zakonserwowanych narządów i tkanek. We wszystkich grupach otrzymujących niższe dawki należy przeprowadzić badanie tych narządów i tkanek, w których stwierdzono zmiany przypisywane badanej substancji przy zastosowaniu najwyższych dawek. Należy również przeprowadzić badanie histologiczne zwierząt we wszelkich grupach satelickich, ze szczególnym naciskiem na te narządy i tkanki, w których stwierdzono skutki podania substancji w innych badanych grupach.

2. DANE Dane należy przedstawić w skrócie w formie tabelarycznej, z podaniem – dla każdej badanej grupy – liczby zwierząt na początku badania oraz liczby zwierząt z każdym rodzajem zmiany. Wszystkie zaobserwowane wyniki należy ocenić przy pomocy właściwej metody statystycznej. Można zastosować dowolną, uznaną metodę statystyczną.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

gatunek, szczep, źródło, warunki środowiska, dieta itp.,

warunki badania: Opis urządzenia użytego do zapewnienia ekspozycji włącznie z jego konstrukcją, rodzajem, wymiarami, źródłem powietrza, systemem generowania cząstek i aerozoli, metodą klimatyzacji i metodą trzymania zwierząt w komorze do badań w razie jej wykorzystania. Należy opisać urządzenia zastosowane do pomiaru temperatury, wilgotności i, gdzie sytuacja tego wymaga, stabilności stężenia i rozkładu wielkości cząstek w aerozolu. Dane ekspozycji: Powinny być przedstawione w formie tabeli, z podaniem wartości średniej i miary zmienności (np. odchylenia standardowego) i powinny, o ile to możliwe zawierać:

3.1. pt_2 a)

szybkość przepływu powietrza przez urządzenia do inhalacji;

temperatura i wilgotność powietrza;

nominalne stężenia (całkowita ilość badanej substancji wprowadzona do urządzeń inhalacyjnych, podzielona przez objętość powietrza);

rodzaj podłoża, o ile jest wykorzystane;

rzeczywiste stężenia w badawczym obszarze oddychania;

średnica aerodynamiczna masy średniej (MMAD) i geometryczne standartowe odchylenie (GSD),

dane reakcji toksycznej w rozbiciu na płcie i stężenia,

czas zgonu w trakcie badania lub fakt, że zwierzęta przeżyły do jego zakończenia,

opis działań toksycznych lub innych; poziom niewywierający działania,

czas zaobserwowania każdego nieprawidłowego objawu i późniejszy przebieg,

dane na temat karmy i masy ciała,

zastosowane badania hematologiczne i ich wyniki,

zastosowane laboratoryjne badania biochemiczne i ich wyniki,

wyniki sekcji zwłok,

szczegółowy opis wszystkich wyników histopatologicznych,

o ile to możliwe, statystyczna obróbka wyników,

omówienie wyników,

interpretacja wyników.

3.2. OCENA I INTERPRETACJA Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. D).

4. LITERATURA Zeb. Wprowadzenie ogólne część B lit. E).

B.9. TOKSYCZNOŚĆ POWTARZANEJ (28 DNI) DAWKI (DERMALNA)

B.9.

1. METODA

1.

1.1. WPROWADZENIE Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. A).

1.2. DEFINICJE Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. B).

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.4. ZASADA METODY BADANIA Substancję badaną podaje się na skórę w stopniowanych dawkach kilku grupom zwierząt doświadczalnych, po jednej dawce na grupę, przez okres 28 dni. W okresie podawania prowadzi się codzienną obserwację zwierząt w celu wykrycia objawów toksyczności. Zwierzęta, które zdechną w trakcie badania, i te, które przeżyją po jego zakończeniu, poddaje się sekcji zwłok.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Brak.

1.6. OPIS METODY BADANIA

1.6.

1.6.1. Przygotowania Zwierzęta muszą być trzymane w doświadczalnych warunkach pobytu i karmienia przez co najmniej pięć dni przed przeprowadzeniem badania. Przed przeprowadzeniem badania zdrowe, młode, dorosłe zwierzęta są wybierane losowo i przydzielane do poszczególnych grup poddanych działaniu substancji i kontrolnych. Na krótko przed rozpoczęciem eksperymentu należy usunąć sierść z grzbietowej powierzchni tułowia zwierząt przez przycięcie lub ogolenie. Można zastosować ogolenie, jednak należy je przeprowadzić na około 24 godziny przed rozpoczęciem badania. Na ogół konieczne jest powtarzanie przycinania lub golenia sierści w odstępach około jednego tygodnia. Podczas przycinania lub golenia sierści należy uważać, aby nie uszkodzić skóry. Nie mniej niż 10 % powierzchni ciała powinno być wolne w celu zastosowania substancji badanej. Przy podejmowaniu decyzji o wielkości powierzchni ciała, jaką należy oczyścić, oraz o rozmiarach pokrycia tej powierzchni substancją należy uwzględnić masę ciała zwierzęcia. Przy badaniu ciała stałego, które można sproszkować gdy to stosowne, substancja badana powinna być wystarczająco nawilżona wodą lub, w miarę potrzeby, stosownym podłożem dla zapewnienia dobrego kontaktu ze skórą. Płynne substancje badane stosuje się na ogół w stanie nierozcieńczonym. Substancję stosuje się codziennie przez pięć do siedmiu dni w tygodniu.

1.6.2. Warunki badania

1.6.2.

1.6.2.1. Zwierzęta doświadczalne Można wykorzystać dorosłe szczury, króliki lub świnki morskie. Można stosować inne gatunki, lecz ich użycie wymaga uzasadnienia. Na początku badania zmienność masy ciała zastosowanych zwierząt nie powinna przekraczać ± 20 % odpowiedniej wartości średniej.

1.6.2.2. Liczba i płeć Wykorzystuje się co najmniej 10 zwierząt (pięć samic i pięciu samców) ze zdrową, nienaruszoną skórą w przypadku każdego poziomu dawkowania. Samice powinny być nieródkami i nie mogą być w ciąży. Jeżeli planuje się uśmiercanie zwierząt w międzyczasie, ogólna ich liczba powinna być zwiększona o liczbę zwierząt zaplanowanych do uśmiercenia przed zakończeniem badania. Dodatkowo, grupa satelicka 10 zwierząt (pięć zwierząt każdej płci) może być poddana działaniu wysokiego poziomu dawki przez 28 dni i obserwowana, przez 14 dni po dawkowaniu, pod kątem odwracalności, trwałości i opóźnionego wystąpienia objawów zatrucia. Jest także stosowana grupa satelicka 10 zwierząt kontrolnych (pięć zwierząt każdej płci).

1.6.2.3. Wielkości dawek Należy zastosować co najmniej trzy wielkości dawek z grupą kontrolną lub grupą kontrolną otrzymującą podłoże, o ile to ostatnie jest stosowane. Czas ekspozycji powinien wynosić co najmniej sześć godzin na dobę. Substancję badaną należy podawać o podobnej porze każdego dnia, przy czym wielkości dawek należy tak dostosowywać w odpowiednich odstępach czasu (co tydzień lub co dwa tygodnie), aby utrzymać stałą wielkość dawki w przeliczeniu na masę ciała zwierzęcia. Z wyjątkiem zastosowania substancji badanej, ze zwierzętami grupy kontrolnej powinno się obchodzić w sposób identyczny jak z podmiotami grupy badanej. W przypadku stosowania podłoża w celu ułatwienia dawkowania, u zwierząt kontrolnych otrzymujących podłoże należy stosować samo to podłoże w taki sam sposób, jak w grupach otrzymujących substancję badaną, w takiej samej dawce, jak stosowana w grupie otrzymującej najwyższą dawkę. Najwyższa dawka powinna być tak dobrana, aby wywierała działanie toksyczne, jednak nie prowadziła do zgonów lub prowadziła do jedynie niewielu zgonów. Najniższa dawka nie powinna dawać żadnych objawów toksyczności. W przypadku gdy istnieje możliwa do wykorzystania, oszacowana wielkość ekspozycji u ludzi, najniższy poziom dawkowania powinien ją przewyższać. W idealnej sytuacji pośredni poziom dawkowania powinien prowadzić do uzyskania minimalnych dostrzegalnych efektów toksycznych. W przypadku gdy zostanie wykorzystana więcej niż jedna dawka pośrednia, wielkości dawek powinny być tak rozstawione, aby uzyskać stopniowanie działań toksycznych. W grupach otrzymujących niskie i pośrednie dawki oraz w grupach kontrolnych częstość występowania zgonów powinna być niska, aby umożliwić znaczącą ocenę wyników. W przypadku gdy zastosowanie substancji badanej wiąże się z ciężkim działaniem drażniącym na skórę, stężenia należy zmniejszyć, przy czym może to spowodować zmniejszenie pojawiania się lub brak innych skutków toksycznych przy najwyższym poziomie dawkowania. Ponadto w przypadku znacznego uszkodzenia skóry może być konieczne przerwanie badania i podjęcie nowego eksperymentu z zastosowaniem niższych stężeń.

1.6.2.4. Czas ekspozycji W przypadku gdy w badaniu wstępnym z zastosowaniem dawki 1000 mg/kg lub wyższej, odpowiadającej potencjalnej ekspozycji u ludzi, o ile taki poziom jest znany, nie zostaną stwierdzone żadne efekty toksyczne, można uznać, że dalsze badania nie są potrzebne.

1.6.2.5. Okres obserwacji Zwierzęta doświadczalne należy obserwować codziennie pod kątem występowania objawów toksyczności. Należy zapisać czas zgonu zwierzęcia i czas pojawienia się i ustąpienia objawów toksyczności.

1.6.3. Procedura Zwierzęta powinny być trzymane w oddzielnych klatkach. W idealnej sytuacji podaje się im substancję badaną przez siedem dni w tygodniu przez okres 28 dni. Zwierzęta w grupach satelickich, w których planuje się późniejszą obserwację, powinny zostać przetrzymane przez następnych 14 dni bez podawania im substancji w celu stwierdzenia ustępowania lub utrzymywania się działań toksycznych. Czas ekspozycji powinien wynosić co najmniej sześć godzin na dobę. Substancja badana powinna zostać nałożona w sposób równomierny na obszar równy około 10 % całkowitej powierzchni ciała. W przypadku substancji wysoce toksycznych można je nanieść na mniejszą powierzchnię, jednak należy dążyć do tego, aby pokryć jak największy obszar jak najcieńszą i jak najbardziej równomierną warstwą badanego związku. W trakcie ekspozycji substancja badana jest utrzymywana w kontakcie ze skórą dzięki zastosowaniu porowatego opatrunku z gazy i niedrażniącej taśmy. Miejsce badania należy dodatkowo przykryć w taki sposób, aby utrzymać opatrunek z gazy i substancję badaną i zapewnić, aby zwierzęta nie mogły zjeść tej ostatniej. W celu zapobieżenia spożyciu substancji badanej można uwiązać zwierzę, jednak pełna immobilizacja nie jest zalecaną metodą. Jako alternatywę można zastosować kołnierzowy przyrząd zabezpieczający. Pod koniec okresu ekspozycji należy usunąć resztki badanej substancji, w miarę możliwości stosując wodę lub jakieś inne, właściwe metody oczyszczania skóry. Wszystkie zwierzęta należy obserwować codziennie i odnotowywać występujące u nich objawy toksyczności, włącznie z czasem ich pojawienia się, stopniem ich ciężkości i czasem trwania. Obserwacje przy klatce zwierzęcia powinny obejmować zmiany skóry i sierści, oczu i błon śluzowych oraz zmiany układu oddechowego, krążenia, autonomicznego i ośrodkowego układu nerwowego, jak też wzorców aktywności somatomotorycznej i wzorca zachowania. Co tydzień należy ważyć zwierzęta. Zaleca się także przeprowadzanie cotygodniowych pomiarów wielkości spożycia karmy. Regularna obserwacja zwierząt jest niezbędna do tego, aby w możliwym zakresie nie stracić zwierząt badanych z takich przyczyn, jak kanibalizm, autoliza tkanek lub przemieszczenie. Pod koniec okresu badania wszystkie osobniki, które przeżyły w grupach innych niż satelicka, poddaje się sekcji zwłok. Zwierzęta konające oraz zwierzęta przejawiające ostre cierpienie i ból powinny być usuwane, gdy zostanie to zauważone, humanitarnie zabite i poddane sekcji zwłok. Następujące badania należy wykonać pod koniec okresu badania u wszystkich zwierząt, włącznie z osobnikami w grupie kontrolnej: Do innych oznaczeń, które mogą okazać się niezbędne do odpowiedniej oceny toksykologicznej, należą oznaczenia stężenia wapnia, fosforu, chlorków, sodu, potasu, glukozy na czczo, lipidogram, stężenia hormonów i oznaczenia równowagi kwasowo-zasadowej, stężenia methemoglobiny oraz aktywności cholinesterazy. W razie potrzeby można zastosować dodatkowe oznaczenia biochemiczne, aby rozszerzyć badania zaobserwowanych działań toksycznych.

1.6.3.

1) badania hematologiczne, w tym co najmniej hematokryt, stężenie hemoglobiny, liczba erytrocytów, liczba leukocytów z rozmazem i oznaczenie parametrów krzepnięcia;

2) laboratoryjne badania biochemiczne krwi zawierające co najmniej jeden parametr funkcji wątroby i nerek: aktywność aminotransferazy alaninowej (uprzednio nazywanej transferazą glutaminianowo-piro- gronową) w surowicy, aktywność aminotransferazy asparaginianowej (uprzednio nazywanej transferazą glutaminianowo-szczawiooctową) w surowicy, stężenie azotu mocznikowego, albumin, kreatyniny we krwi, całkowite stężenie bilirubiny i całkowite stężenie białka w surowicy.

1.6.4. Pełne badanie patomorfologiczne Wszystkie zwierzęta objęte badaniem powinny zostać poddane pełnemu makroskopowemu badaniu patomorfologicznemu. Należy zważyć wątrobę, nerki, nadnercza i jądra w stanie wilgotnym, najszybciej, jak to będzie możliwe po rozcięciu zwłok, aby uniknąć wysuszenia. Narządy i tkanki, tj. prawidłową i poddawaną ekspozycji na substancję skórę, wątrobę, nerki i narządy docelowe (czyli narządy wykazujące makroskopowe zmiany patologiczne lub o nieprawidłowych wymiarach) należy zakonserwować w odpowiednim środku w celu przeprowadzenia ewentualnych, przyszłych badań histopatologicznych.

1.6.5. Badania histopatologiczne W grupie otrzymującej najwyższą dawkę i w grupie kontrolnej należy wykonać badanie histologiczne zakonserwowanych narządów i tkanek. We wszystkich grupach otrzymujących niższe dawki należy przeprowadzić badanie tych narządów i tkanek, w których stwierdzono zmiany przypisywane badanej substancji przy zastosowaniu najwyższych dawek. Należy również przeprowadzić badanie histologiczne zwierząt w grupie satelickiej, ze szczególnym naciskiem na te narządy i tkanki, w których stwierdzono skutki podania substancji w innych badanych grupach.

2. DANE Dane należy przedstawić w skrócie w formie tabelarycznej, z podaniem – dla każdej badanej grupy – liczby zwierząt na początku badania oraz liczby zwierząt z każdym rodzajem zmiany patologicznej. Wszystkie zaobserwowane zmiany należy ocenić przy pomocy właściwej metody statystycznej. Można zastosować dowolną, uznaną metodę statystyczną.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:

dane zwierząt (gatunek, szczep, źródło, warunki środowiska, dieta itp.),

warunki badania (włączając typ opatrunku: okluzyjny lub nieokluzyjny),

wielkości dawek (włączając podłoże, o ile jest wykorzystane) i stężenia,

poziom niewywierający działania, o ile to możliwe,

dane reakcji toksycznej w rozbiciu na płci i dawki,

czas zgonu w trakcie badania lub fakt, że zwierzęta przeżyły do jego zakończenia,

działania toksyczne lub inne,

czas zaobserwowania każdego nieprawidłowego objawu i późniejszy przebieg zmian,

dane na temat karmy i masy ciała,

zastosowane badania hematologiczne i ich wyniki,

zastosowane laboratoryjne badania biochemiczne i ich wyniki,

wyniki sekcji zwłok,

szczegółowy opis wszystkich wyników histopatologicznych,

gdzie to możliwe, statystyczna obróbka wyników,

omówienie wyników,

interpretacja wyników.

3.2. OCENA I INTERPRETACJA Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. D).

4. LITERATURA Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. E).

B.10. MUTAGENNOŚĆ – BADANIE ABERRACJI CHROMOSOMOWEJ SSAKÓW IN VITRO

B.10.

1. METODA Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 473, metody badania aberracji chromosomowej ssaków in vitro (1997).

1.

1.1. WPROWADZENIE Celem badania chromosomowej aberracji u ssaków jest zidentyfikowanie czynników, które powodują strukturalne chromosomowe aberracje w hodowanych komórkach ssaków (1)(2)(3). Strukturalne aberracje mogą występować w dwóch typach, chromosomowym lub chromatydowym. W przypadku mutagenów chemicznych większość wywołanych aberracji jest typu chromatydowego, ale mogą się pojawiać aberracje typu chromosomowego. Wzrost poliploidalności może wskazywać, że substancja chemiczna ma potencjał do wywoływania aberracji liczbowej. Jednakże metoda ta nie jest wykorzystywana do pomiarów aberracji liczbowych i nie jest rutynowo wykorzystywana do tego celu. Mutacje chromosomowe oraz powiązane z nimi zdarzenia są przyczyną wielu chorób genetycznych u ludzi oraz istnieje dowód na to, że mutacje chromosomowe oraz związane z nimi zdarzenia powodujące zmiany w onkogenach oraz genach hamowania nowotworów komórek somatycznych są odpowiedzialne za wywoływanie raka u ludzi oraz zwierząt doświadczalnych. Aberracja chromosomowa in vitro może wykorzystywać ustanowione linie komórkowe, łańcuchy komórkowe lub pierwotne hodowle komórek. Wykorzystane komórki są wybierane na podstawie możliwości wzrostu hodowli, stabilności kariotypu, liczby chromosomów, zróżnicowania chromosomów oraz spontanicznych częstotliwości aberracji. Badania przeprowadzane in vitro wymagają wykorzystania źródła egzogennego aktywacji metabolicznej. Ten system aktywacji metabolicznej nie może imitować w całości warunków in vivo w odniesieniu do ssaków. Powinna zostać zachowana ostrożność w celu uniknięcia warunków, które mogłyby prowadzić do pozytywnych wyników, które nie odzwierciedlają wewnętrznej mutagenności oraz mogą wynikać ze zmian w pH, stężeniu osmolalnym lub wysokich poziomów cytotoksyczności (4)(5). Badanie to jest wykorzystywane w celu sprawdzenia możliwych czynników mutagennych oraz rakotwórczych dla ssaków. Wiele związków, które mają charakter dodatni w tym badaniu, są czynnikami rakotwórczymi dla ssaków, jednakże nie istnieje idealne powiązanie między tym badaniem a rakotwórczością. Powiązanie zależne jest od klasy chemicznej oraz jest coraz więcej dowodów na to, że istnieją czynniki rakotwórcze, które nie są wykrywane w drodze tego badania, ponieważ wydaje się, iż działają one poprzez mechanizmy inne niż bezpośrednie niszczenie DNA. Zob. również Ogólne wprowadzenie do części B.

1.2. DEFINICJE Aberracja typu chromatydowego: strukturalne uszkodzenie chromosomu, wyrażone jako pękanie pojedynczych chromatydów lub pękanie oraz ponowne łączenie między chromatydami. Aberracja typu chromosomowego: strukturalne uszkodzenie chromosomu, wyrażone jako pękanie pojedynczych chromatydów lub pękanie oraz ponowne łączenie obu chromatydów w identycznej lokalizacji. Endoreduplikacja: proces, w którym po okresie replikacji DNA jądro nie ulega mitozie, ale rozpoczyna nowy okres S. Wynikiem są chromosomy o 4, 8, 16, … chromatydach. Szczelina: achromatyczne uszkodzenie mniejsze niż szerokość chromatydu, powodujące minimalne wypaczenie chromatydu. Indeks mitotyczny: stosunek komórek w metafazie podzielony przez całkowitą liczba komórek zaobserwowany w populacji komórek; wskazanie stopnia proliferacji tej populacji. Aberracja liczbowa: zmiana w ilości chromosomów w odniesieniu do normalnej ilości charakterystycznej dla wykorzystywanych komórek. Poliploidalność: wielokrotność ilości chromosomów haploidalnych (n) inna niż liczba diploidalna (np. 3n, 4n itd.). Aberracja strukturalna: zmiana w strukturze chromosomu, wykrywalna przez badanie mikroskopowe etapu metafazy podziału komórek, zaobserwowana jako usunięcia oraz fragmenty, zmiany (zachodzące – wewnątrz oraz między chromosomami).

1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ Hodowle komórek są poddane działaniu substancji badanej zarówno z aktywacją, jak i bez aktywacji metabolicznej. Substancje są poddawane działaniu metafazy zatrzymującej (np. Colcemid® lub kolchicyna) substancje we wcześniej określonych odstępach czasu po poddaniu hodowli komórek działaniu substancji badanej, komórki pobrane, zabarwione oraz komórki metafazy są analizowane mikroskopowo na obecność aberracji chromosomowych.

1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.

1.4.1. Preparaty

1.4.1.

1.4.1.1. Komórki Wykorzystywane mogą być rozmaite linie komórkowe, łańcuchy lub pierwotne hodowle komórek łącznie z komórkami ludzkimi (np. fibroblasty chomika chińskiego, limfocyty krwi obwodowej ludzi lub ssaków).

1.4.1.2. Warunki dotyczące podłoża hodowli i hodowli W utrzymywaniu hodowli powinny być stosowane odpowiednie warunki podłoża hodowli oraz inkubacji (naczynia do hodowli, stężenie CO2, temperatura oraz wilgotność). Ustanowione linie komórkowe oraz szczepy powinny być rutynowo sprawdzane pod kątem stabilności zmiennej ilości chromosomów oraz nieobecności zanieczyszczenia mykoplazmą oraz nie powinny być wykorzystywane, jeżeli są zanieczyszczone. Normalny czas cyklów komórkowych oraz wykorzystywane warunki dotyczące hodowli powinny być znane.

1.4.1.3. Preparaty hodowli Ustanowione linie komórkowe oraz łańcuchy: komórki są rozmnażane z hodowli podstawowej, siane na podłożu hodowli w takiej gęstości, że hodowle nie osiągną zrastania się przed czasem pobierania, oraz są inkubowane w temperaturze 37 oC. Limfocyty: krew pełna jest poddawana działaniu antykoagulantu (np. heparyny) lub oddzielone limfocyty uzyskane ze zdrowych przedmiotów są dodawane do podłoża hodowli zawierającego mitogen (np. phytohaemagglutinin) oraz inkubowane w temperaturze 37 oC.

1.4.1.4. Aktywacja metaboliczna Komórki powinny zostać poddane działaniu substancji badanej zarówno w obecności, jak i w nieobecności odpowiedniego systemu aktywacji metabolicznej. Najpowszechniej wykorzystywanym systemem jest frakcja przesączu znad mitochondriów uzupełniona o kofaktor, przygotowana z wątroby gryzoni poddanej działaniu substancji, czynnikami pobudzającymi enzymy, takimi jak Aroklor 1254 (6)(7)(8)(9) lub mieszanina fanobarbitonu oraz β-naftoflawonu (10)(11)(12). Frakcja przesączu znad mitochondriów jest zazwyczaj wykorzystywana w stężeniach w zakresie 1–10 % objętościowo w końcowym nośniku badania. Warunki systemu aktywacji metabolicznej mogą być uzależnione od klasy badanej substancji chemicznej. W niektórych przypadkach właściwe może być wykorzystanie więcej niż jednego stężenia frakcji przesączu znad mitochondriów. Pewna liczba ulepszeń, w tym konstrukcja genetycznie modyfikowanych linii komórkowych wyrażających szczególne enzymy aktywujące, mogą zapewnić możliwość aktywacji endogenicznej. Wybór wykorzystanych linii komórkowych powinien być uzasadniony naukowo (np. przez znaczenie izoenzymu cyto-chromowego P450 dla metabolizmu substancji).

1.4.1.5. Substancja badana/przygotowanie Stała substancja badana powinna zostać rozpuszczona lub zawieszona w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczona, jeżeli jest to odpowiednie, przed poddaniem jej działaniu komórek. Płynne substancje badane mogą być dodawane bezpośrednio do systemu badawczego i/lub rozcieńczane przed poddaniem ich działaniu komórek. Powinny zostać wykorzystane świeżo przygotowywane substancje, chyba że dane dotyczące stabilności wskazują, iż dopuszczalne jest składowanie substancji.

1.4.2. Warunki badania

1.4.2.

1.4.2.1. Rozpuszczalnik/nośnik Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien mieć możliwości reagowania chemicznego z substancją badaną oraz powinien być zgodny z przeżywaniem komórek oraz aktywnością S9. Jeśli inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki są wykorzystywane, ich włączenie do badania powinno być wsparte danymi wskazującymi ich zgodność. Zaleca się, o ile to możliwe, aby w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/nośników. Badając substancje nietrwałe w wodzie, wykorzystane rozpuszczalniki organiczne powinny być wolne od wody. Woda może zostać usunięta przez zastosowanie sita molekularnego.

1.4.2.2. Stężenia poddania działaniu substancji Wśród kryteriów, które mają zostać uwzględnione przy określaniu najwyższego stężenia, znajduje się cytotoksyczność, rozpuszczalność w systemie oraz zmiany pH lub osmolalność. Cytotoksyczność powinna zostać określona z aktywacją lub bez aktywacji metabolicznej w ramach głównego doświadczenia, przy wykorzystaniu odpowiedniego wskazania dotyczącego integralności komórki oraz wzrostu, takiego, jak stopień zrastania się, liczba komórek zdolnych do życia lub indeksy mitotyczne. Może to być użyteczne do oznaczenia cytotoksyczności oraz rozpuszczalności w doświadczeniu wstępnym. Powinny zostać wykorzystane co najmniej trzy nadające się do analizy stężenia. W przypadku gdy pojawia się cytotoksyczność, stężenia te powinny obejmować zakres od najwyższej do małej toksyczności lub jej braku; będzie to zazwyczaj oznaczać, że stężenia powinny zostać rozdzielone przez nie więcej niż jeden czynnik między 2 a √10. W czasie pobierania wyhodowanych komórek najwyższe stężenia powinny wskazywać znaczące zmniejszenie w stopniu zrastania się, liczbie komórek lub indeksie mitotycznym (wszystkie wyższe niż 50 %). Indeks mitotyczny jest jedynie bezpośrednią miarą skutków cytotoksycznych/cytostatycznych oraz jest zależny od czasu po poddaniu działaniu substancji. Jednakże indeks mitotyczny jest dopuszczalny w odniesieniu do hodowli zawiesinowych, w których inne pomiary toksyczności mogą być niewygodne i niepraktyczne. Informacje w sprawie kinetyki komórek, takie jak średnie czasy tworzenia się (AGT), mogą być wykorzystywane jako informacje dodatkowe. Jednakże AGT jest ogólną średnią, która nie zawsze ujawnia istnienie opóźnionych podpopulacji, a nawet delikatne wzrosty średnich czasów tworzenia się mogą być związane z bardzo zasadniczym opóźnieniem w czasie optymalnych wydajności aberracji. W odniesieniu do substancji względnie niecytotoksycznych maksymalne stężenie badawcze powinno wykosić 5 μl/ml, 5 mg/ml lub 0,01 M, w zależności od tego, które z nich jest najniższe. W odniesieniu do substancji względnie nierozpuszczalnych, które nie są toksyczne w stężeniach niższych niż stężenia nierozpuszczalne, najwyższa wykorzystana dawka powinna być stężeniem powyżej limitu rozpuszczalności w końcowym podłożu hodowli na koniec okresu poddawania działaniu substancji. W niektórych przypadkach (np. kiedy toksyczność pojawia się wyłącznie przy wyższym niż najniższe stężeniu nierozpuszczalnym) słuszne jest przeprowadzenie badania na jednym większym stężeniu z widocznym strącaniem się. Użyteczna może być ocena rozpuszczalności na początku oraz na końcu poddawania działaniu substancji, ze względu na to, że rozpuszczalność może zmieniać się w trakcie trwania poddania działaniu substancji w systemie badawczym spowodowana obecnością komórek, surowicy S9 itp. Nierozpuszczalność może zostać wykryta okiem nieuzbrojonym. Stężanie nie powinno zakłócać oceny.

1.4.2.3. Kontrole pozytywne i negatywne Równoległe kontrole pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik lub nośnik), zarówno z aktywacją metaboliczną, jak i bez niej, powinny zostać objęte każdym doświadczeniem. Kiedy wykorzystywana jest aktywacja metaboliczna, pozytywna kontrolna substancja chemiczna jest substancją, która wymaga aktywacji w celu wywołania reakcji mutagennej. Pozytywne kontrole powinny wykorzystywać znany elastogen przy poziomie poddania działaniu substancji, od którego oczekuje się wytworzenia odtwarzalnego oraz wykrywalnego wzrostu poza tło, które wskazuje czułość systemu. Stężenia pozytywnych kontroli powinny zostać wybrane tak, aby były jasne, ale by badającemu nie ujawniały bezpośrednio tożsamości zakodowanych szkiełek laboratoryjnych. Przykłady pozytywnych substancji kontrolnych obejmują: Warunki aktywacji metabolicznej Substancja Nr CAS Nr Einecs Nieobecność egzogenicznej aktywacji metabolicznej Metanosulfonat metylu 66-27-3 200-625-0 Metanosulfonat etylu 62-50-0 200-536-7 Nitrozomocznik etylu 759-73-9 212-072-2 Mitomycyna C 50-07-7 200-008-6 N-tlenek-4-nitrokwinolinu 56-57-5 200-281-1 Obecność egzogenicznej aktywacji metabolicznej Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 Cyklofosfamid Cyklofosfamid monohydrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Mogą być wykorzystane inne właściwe substancje kontroli pozytywnych. Wykorzystanie substancji chemicznej z klasy powiązanej z kontrolą pozytywną powinno zostać rozważone, jeżeli jest dostępne. Kontrole negatywne, składające się z rozpuszczalników lub samego nośnika w podłożu poddania działaniu substancji, oraz poddanie działaniu substancji w ten sam sposób co hodowle poddane działaniu substancji, powinny zostać włączone w ramy każdego okresu pobierania hodowli. Dodatkowo wykorzystywane powinny być kontrole, w ramach których nie poddaje się działaniu substancji, chyba że istnieją dane historyczne dotyczące kontroli wskazujące na to, że inne skutki szkodliwe lub mutagenne są wywołane wybranym rozpuszczalnikiem.

1.4.3. Procedura

1.4.3.

1.4.3.1. Poddanie działaniu substancji badanej Komórki rozmnażające się wegetatywnie są poddawane działaniu, wykorzystując substancję badaną w obecności oraz nieobecności systemu aktywacji metabolicznej. Przetwarzanie limfocytów powinno następować w około 48 godzin po stymulacji mitogenicznej.

1.4.3.2. Hodowle reprodukcyjne powinny normalnie być wykorzystywane przy każdym stężeniu oraz są one silnie zalecane w odniesieniu do negatywnych/rozpuszczalnikowych hodowli kontrolnych. W przypadku gdy na podstawie danych historycznych mogą zostać przedstawione minimalne zmiany między hodowlami reprodukcyjnymi (13)(14), dopuszczalne może być, aby pojedyncze hodowle miały być wykorzystywane przy każdym badaniu. Substancje gazowe lub lotne powinny być badane odpowiednia metodą, taką jak badanie w szczelnie zamkniętych naczyniach do hodowli (15)(16).

1.4.3.3. Czas pobierania hodowli W pierwszym doświadczeniu komórka powinna być poddana działaniu substancji badanej, zarówno z aktywacja metaboliczną, jak i bez niej, przez 3–6 godzin oraz próbki powinny zostać pobrane w czasie równoważnym długości około 1,5 cyklu komórkowego po rozpoczęciu poddawania działaniu substancji (12). Jeżeli ten protokół daje negatywne wyniki, zarówno z aktywacją, jak i bez niej, powinno zostać przeprowadzone dodatkowe doświadczenie, z ciągłym poddawaniem działaniu substancji badanej do momentu pobrania próbek w czasie równoważnym długości 1,5 cyklu komórkowego. Niektóre substancje chemiczne mogą być wykryte z mniejszym trudem przez czasy poddawania działaniu substancji badanej/pobierania próbek dłuższe niż długości 1,5 cyklu. Wyniki negatywne z metaboliczną aktywacją muszą zostać ustalone na zasadzie jednostkowych przypadków. W tych przypadkach, gdy potwierdzenie negatywnych wyników nie jest uznawane za niezbędne, powinno zostać zapewnione uzasadnienie.

1.4.3.4. Preparaty chromosomów Hodowle komórek są poddawane działaniu Colcemidu® lub kolchicyny zazwyczaj przez 1–3 godzin przed pobraniem hodowli. Każda hodowla komórek jest pobierana oraz poddawana działaniu substancji oddzielnie w celu przygotowania chromosomów. Przygotowanie chromosomów obejmuje hipotoniczne przetwarzanie komórek, wiązanie oraz barwienie.

1.4.3.5. Analiza Wszystkie szkiełka mikroskopowe, włącznie z tymi dotyczącymi pozytywnych oraz negatywnych kontroli, powinny zostać odpowiednio zakodowane przed analizą mikroskopową. Ze względu na to, że procedury wiązania, utrwalania barwnika często skutkują przerwaniem stosunku komórek metafazy do straty chromosomów, oceniane komórki powinny z tego względu zawierać liczbę centromerów równą zmiennej liczbie ± 2 dla wszystkich rodzajów komórek. Powinno zostać ocenione przynajmniej 200 dobrze rozciągniętych metafaz na stężenie oraz kontrole, równo podzielonych między wtórniki, jeżeli ma to zastosowanie. Liczba ta może zostać zredukowana, jeśli zaobserwowana jest wysoka liczba aberracji. Chociaż celem badania jest wykrycie strukturalnych aberracji chromosomowych, ważne jest odnotowanie poliploidalności oraz endoreduplikacji, jeśli zaobserwowane są te zdarzenia.

2. DANE

2.

2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW Jednostką doświadczalną jest komórka, a z tego względu udział procentowy komórek ze strukturalną aberracją chromosomową powinien zostać poddany ocenie. Różne typy strukturalnej aberracji chromosomowej powinny zostać wymienione wraz z ich ilościami oraz częstotliwościami w odniesieniu do hodowli doświadczalnych oraz kontrolnych. Szczeliny są oddzielnie odnotowywane oraz zgłaszane, ale ogólnie nie są włączane do częstotliwości aberracji ogółem. Równoległe pomiary cytotoksyczności w odniesieniu do wszystkich przetwarzanych oraz negatywnych hodowli kontrolnych w ramach głównych doświadczeń aberracji powinny również zostać odnotowane. Powinny zostać dostarczone dane dotyczące poszczególnych hodowli. Dodatkowo wszelkie dane powinny zostać podsumowane w formie tabelarycznej. Nie istnieje wymóg jasnej reakcji pozytywnej w odniesieniu do weryfikacji. Niejednoznaczne wyniki powinny zostać wyjaśnione w drodze dalszych badań, w szczególności z wykorzystaniem modyfikacji warunków doświadczalnych. Potrzeba potwierdzenia wyników negatywnych została omówiona w ppkt 1.4.3.3. Modyfikacje parametrów badawczych w celu poszerzenia zakresu ocenionych warunków powinna zostać rozważona w dalszych doświadczeniach. Parametry badawcze, które mogą być zmodyfikowane, obejmują zakres stężenia oraz warunki aktywacji metabolicznej.

2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak związany ze stężeniem wzrost odtwarzalności w pewnej ilości komórek z aberracjami chromosomowymi. Biologiczne znaczenie wyników powinno zostać wzięte pod uwagę w pierwszej kolejności. Metody statystyczne mogą zostać wykorzystane jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (3)(13). Znaczenie statystyczne nie powinno być jedynym czynnikiem określającym w odniesieniu do reakcji pozytywnej. Wzrost ilości komórek poliploidalnych może wskazywać, że substancja badana ma potencjał do wstrzymywania procesów mitotycznych oraz pobudzania liczbowych aberracji chromosomowych. Wzrost liczby komórek z endoreduplikowanymi chromosomami może wskazywać, że substancje badane mają potencjał wstrzymywania postępowania cyklu komórkowego (17)(18). Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spełniają powyższych kryteriów, uważana jest za niemutagenną w tym systemie. Chociaż większość doświadczeń będzie dawało w jasny sposób pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych będzie uniemożliwiał dokonanie ostatecznej oceny dotyczącej aktywności substancji badanej. Wyniki mogą pozostać niejednoznaczne lub sporne, niezależnie od tego, ile razy doświadczenia były powtarzane. Wyniki pozytywne z badania chromosomowej aberracji in vitro wskazują, że substancja badana wywołuje aberracje. Wyniki negatywne wskazują, że w warunkach badawczych substancja badana nie wywołuje aberracji chromosomowej hodowanych komórek somatycznych ssaków.

3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ

3. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

Rozpuszczalnik/nośnik:

uzasadnienie wyboru nośnika,

rozpuszczalność oraz stabilność substancji w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli jest znana.

Komórki:

rodzaj i źródło komórek,

cechy kariotyczne oraz odpowiedniość wykorzystanych komórek,

nieobecność mykoplazmy, jeżeli ma zastosowanie,

informacja w sprawie długości cyklu komórkowego,

płeć dawcy krwi, krew całkowita lub oddzielone limfocyty, wykorzystany mitogen,

liczba przejść, jeżeli ma zastosowanie,

metoda utrzymania hodowli komórek, jeżeli ma zastosowanie,

zmienna liczba chromosomów.

Warunki badania:

tożsamość metafazy zatrzymującej substancję, jej stężenie oraz czas trwania poddania działania substancji,

racjonalne uzasadnienie wyboru stężeń oraz liczby hodowli, w tym np. dane dotyczące cytotoksyczności oraz ograniczeń rozpuszczalności, jeżeli są dostępne,

skład podłoża, stężenie CO2, jeżeli ma zastosowanie,

stężenie substancji badanej,

objętość nośnika oraz dodanej substancji badanej,

temperatura inkubacji,

czas inkubacji,

czas trwania poddania działaniu substancji,

gęstość komórki w czasie osadzania, jeżeli właściwe,

typ oraz skład systemu aktywacji metabolicznej włącznie z kryteriami dopuszczalności,

kontrole pozytywne i negatywne,

metody przygotowania szkiełek mikroskopowych,

kryteria w odniesieniu do oceniającej aberracji,

liczba przeanalizowanych metafaz,

metody pomiarów toksyczności,

kryteria uznawania badań za pozytywne, negatywne lub niejednoznaczne,

Wyniki:

oznaki toksyczności, np. stopień zrastania się strumieni, dane dotyczące cyklu komórkowego, obliczenia liczby komórek, indeks mitotyczny,

oznaki strącania,

dane dotyczące pH oraz osmolalności podłoża poddania działaniu substancji, jeżeli są określone,

definicje aberracji, w tym szczelin,

liczba komórek z aberracjami chromosomowymi oraz typ aberracji chromosomowej podane osobno w odniesieniu do każdej poddanej działaniu substancji badanej oraz kontrolnej hodowli,

zmiany poliploidalności, jeżeli są znane,

relacja miedzy dawką a reakcją, w miarę możliwości,

analizy statystyczne, jeżeli istnieją,

dane dotyczące równoległych negatywnych (rozpuszczalnik/nośnik) oraz pozytywnych kontroli,

historyczne dane dotyczące negatywnych (rozpuszczalnik/nośnik) oraz pozytywnych kontroli, ze średnimi oraz standardowymi odchyleniami.

Omówienie wyników.

Wnioski.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(1) (8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)

ODNIESIENIA Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, w: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1–29. Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (19 8 5), The In vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427–432. Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Naka-mura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cellS: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1–175. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147–204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, pp. 297–305. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347–364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173–215. Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dime-thylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83–90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In vitro, Mutation Res., 66, pp. 277–290. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlori-nated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85–88. Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofu-mi, T. (1994), Report from Working Group on in In vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241–261. Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In vitro Cytogenetic Assays, w: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141–154. Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139–149. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91–103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795–801. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403–413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362–1364.

B.11. MUTAGENNOŚĆ – BADANIE ABERRACJI CHROMOSOMOWEJ SZPIKU KOSTNEGO INVIVO

B.11.

1. METODA Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 475, metody badania aberracji chromosomowej szpiku kostnego (1997).

1.

1.1. WPROWADZENIE Badanie aberracji chromosomowej ssaków in vivo jest wykorzystywane w celu wykrycia strukturalnych aberracji chromosomowych komórek szpiku kostnego zwierząt, zwykle gryzoni, wywołanych przez substancje badane (1)(2)(3)(4). Strukturalne aberracje mogą występować w dwóch typach, chromosomowym lub chromatydowym. Wzrost poliploidalności może wskazywać, że substancja chemiczna ma potencjał do wywoływania aberracji liczbowej. W przypadku mutagenów chemicznych większość wywołanych aberracji jest typu chromatydowego, ale mogą pojawiać się również aberracje typu chromosomowego. Mutacje chromosomowe oraz powiązane z nimi zdarzenia są przyczyną wielu ludzkich chorób genetycznych oraz istnieje dowód na to, że mutacje chromosomowe oraz związane z nimi zdarzenia powodujące zmiany w onkogenach oraz genach hamowania nowotworów komórek somatycznych są odpowiedzialne za wywoływanie raka u ludzi oraz zwierząt doświadczalnych. Rutynowo w badaniach tych wykorzystuje się gryzonie. Docelową komórką w tym badaniu jest szpik kostny, ze względu na to, że jest on wysoce unaczynioną tkanką oraz zawiera populacje komórek o szybkich cyklach, które mogą być bez trudu wyizolowane oraz poddane działaniu substancji. Inne gatunki oraz tkanki docelowe nie są przedmiotem wykorzystania tej metody. To badanie chromosomowej aberracji ma szczególne znaczenie w odniesieniu do oceny zagrożenia mutagennego, w związku z czym pozwala ono na wykorzystanie stężenia czynników metabolizmu in vivo, farmakokinetyków oraz procesów naprawy DNA, chociaż mogą one różnić się od siebie w zależności od gatunku oraz tkanek. Badanie in vivo jest również użyteczne w odniesieniu do dalszych badań wyników mutagennych wykrytych w badaniu in vitro. Jeżeli istnieje dowód na to, że substancja badana lub metabolit reakcyjny nie dotrze do tkanki docelowej, niewłaściwe jest wykorzystanie tej metody. Zob. również Ogólne wprowadzenie do części B.

1.2. DEFINICJE Aberracja typu chromatydowego: strukturalne uszkodzenie chromosomu, wyrażone jako pękanie pojedynczych chromatydów lub pękanie oraz ponowne łączenie między chromatydami. Aberracja typu chromosomowego: strukturalne uszkodzenie chromosomu, wyrażone jako pękanie pojedynczych chromatydów lub pękanie oraz ponowne łączenie obu chromatydów w identycznej lokalizacji. Endoreduplikacja: proces, w którym po okresie replikacji DNA jądro nie ulega mitozie, ale rozpoczyna nowy okres S. Wynikiem są chromosomy o 4, 8, 16, ... chromatydach. Szczelina: achromatyczne uszkodzenie mniejsze niż szerokość chromatydu, powodująca minimalne wypaczeniu chromatydu(-ów). Aberracja liczbowa: zmiana w ilości chromosomów w odniesieniu do normalnej ilości charakterystycznej dla wykorzystywanych komórek. Poliploidalność: wielokrotność ilości chromosomów haploidalnych (n) inna niż liczba diploidalna (np. 3n, 4n itd.). Aberracja strukturalna: zmiana w strukturze chromosomu, wykrywalna przez badanie mikroskopowe etapu metafazy podziału komórek, zaobserwowana jako usunięcia oraz fragmenty, zmiany (zachodzące – wewnątrz oraz między chromosomami).

1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ Zwierzęta są poddane działaniu substancji badanej odpowiednią drogą oraz są uśmiercane w odpowiednim czasie po badaniu. Przed uśmierceniem zwierzęta są poddane działaniu metafazy zatrzymującej substancje (np. Colcemid® lub kolchicyna). Następnie dokonuje się przygotowania chromosomu ze szpiku kostnego oraz zabarwienia, a komórki metafazy są analizowane w odniesieniu do aberracji chromosomowej.

1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.

1.4.1. Preparaty

1.4.1.

1.4.1.1. Wybór gatunku zwierząt Szczury, myszy i chomiki chińskie są powszechnie wykorzystywane, chociaż może zostać wykorzystany każdy odpowiedni gatunek ssaków. Powszechnie wykorzystywane laboratoryjne szczepy młodych, zdrowych, dorosłych zwierząt powinny zostać wykorzystane w badaniu. W czasie przeprowadzania badania różnice w masie zwierząt powinny być minimalne oraz nie powinny przekraczać ± 20 % średniej masy każdej płci.

1.4.1.2. Warunki pobytu i karmienia Ogólne warunki określone w ogólnym wprowadzeniu do części B mają zastosowanie, chociaż celem w odniesieniu do wilgotności powinien być poziom wilgotności 50–60 %.

1.4.1.3. Preparaty zwierzęce Zdrowe młode dorosłe osobniki zwierząt są losowo przypisane do grup kontrolnych oraz grup poddanych działaniu substancji. Klatki powinny zostać przygotowane w sposób minimalizujący możliwe skutki negatywne wynikające z umieszczenia w klatce. Zwierzęta są identyfikowane oraz aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przynajmniej przez okres pięciu dni.

1.4.1.4. Przygotowanie dawek Substancje badane stałe powinny zostać rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczone, jeżeli stosowne, przed dozowaniem zwierzętom. Substancje badane płynne mogą być dawkowane bezpośrednio lub mogą zostać rozpuszczone przed dawkowaniem. Powinny zostać wykorzystane świeżo przygotowane substancje, chyba że dane dotyczące stabilności wskazują, iż dopuszczalne jest składowanie substancji.

1.4.2. Warunki badania

1.4.2.

1.4.2.1. Rozpuszczalnik/nośnik Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien wywoływać skutków toksycznych przy wykorzystywanych dawkach oraz nie powinien mieć możliwości reagowania chemicznego z substancją badaną. Jeśli inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki są wykorzystywane, ich włączenie do doświadczenia powinno być wsparte danymi wskazującymi ich zgodność. Zaleca się, o ile to możliwe, aby w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/nośników.

1.4.2.2. Kontrole Równoległe kontrole pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik/nośnik) powinny zostać przeprowadzone w odniesieniu do każdej płci w ramach każdego badania. Z wyjątkiem poddawania działaniu substancji badanej zwierzęta w grupie kontrolnej powinny być przedmiotem identycznych działań w porównaniu ze zwierzętami w grupie poddanej działaniu substancji. Kontrole pozytywne powinny wywoływać strukturalne aberracje in vivo przy poziomie poddania działaniu substancji, w odniesieniu do którego oczekuje się wykrywalnego wzrostu powyżej tło. Dawki kontroli pozytywnych powinny zostać dobrane tak, aby wyniki były jasne, ale by badającemu nie ujawniały bezpośrednio tożsamości sporządzonych szkiełek mikroskopowych. Dopuszczalne jest, aby pozytywne kontrole podawane były inną drogą niż substancje badane oraz aby ich próbki pobierane były tylko jeden raz. Wykorzystanie substancji chemicznych kontroli pozytywnych powiązanych z klasą chemiczną może być brane pod uwagę, jeżeli są one dostępne. Przykłady substancji pozytywnych kontroli obejmują: Substancja Nr CAS Nr Einecs Metanosulfonat etylu 62-50-0 200-536-7 Nitrozomocznik etylu 759-73-9 212-072-2 Mitomycyna C 50-07-7 200-008-6 Cyklofosfamid Cyklofosfamid monohydrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietylenomelamina 51-18-3 200-083-5 Negatywne kontrole z poddaniem działaniu samego rozpuszczalnika lub nośnika, a w innych przypadkach poddanie działaniu w ten sam sposób jak grupy poddane działaniu substancji, powinny zostać objęte każdorazowym pobieraniem próbek, chyba że zmienność oraz częstotliwości komórek z aberracjami chromosomowymi są dostępne w historycznych danych dotyczących kontroli. Jeżeli stosowane jest jednokrotne pobieranie próbek w odniesieniu do negatywnych kontroli, najbardziej odpowiednim czasem jest pierwsze pobranie próbek. Dodatkowo kontrole bez poddania działaniu substancji powinny być również wykorzystywane, chyba że istnieją historyczne lub opublikowane dane dotyczące kontroli wykazujące, że wybrany rozpuszczalnik/nośnik nie wywołuje żadnych skutków szkodliwych lub mutagennych.

1.5. PROCEDURA

1.5.

1.5.1. Liczba oraz płeć zwierząt Każda z poddanych działaniu substancji oraz kontrolnych grup obejmuje przynajmniej pięć nadających się do poddania analizie zwierząt każdej płci. Jeżeli w czasie badania istnieją dostępne dane z badań naukowych dotyczących tego samego gatunku oraz z wykorzystaniem tej samej drogi poddania działania substancji, które wykazują, że nie istnieją zasadnicze różnice w toksyczności między płciami, wówczas badanie na jednej płci będzie wystarczające. W przypadku gdy poddanie człowieka działaniu substancji chemicznej może być zależne od płci, jak na przykład w odniesieniu do niektórych czynników środków farmaceutycznych, badanie powinno zostać przeprowadzone na zwierzętach odpowiedniej płci.

1.5.2. Harmonogram poddawania działaniu substancji Substancje badane są podawane przede wszystkim jako pojedynczy zabieg. Substancje badane mogą być również podawane jako dawka rozbita na części, np. dwa zabiegi, tego samego dnia w odstępie nie dłuższym niż kilku godzin, w celu ułatwienia podawania jako duża objętość substancji. Inne reżimy dawki powinny zostać naukowo uzasadnione. Próbki powinny być pobierane dwukrotnie w ciągu jednego dnia po poddaniu działaniu substancji. W odniesieniu do gryzoni pierwszy odstęp czasu między pobieraniem trwa 1,5 długości normalnego cyklu komórkowego (ten ostatni trwa przeciętnie 12–18 godzin) po poddaniu działaniu substancji. Ze względu na to, że czas wymagany na pobór oraz przemianę materii substancji badanej, jak również jej skutki na kinetykę cyklu komórkowego może wpływać na optymalny czas wykrywania aberracji chromosomowej, zalecane jest późniejsze pobieranie próbek w 24 godziny po pobraniu pierwszej próbki. Jeżeli wykorzystywane są reżimy dawki większe niż jeden dzień, zastosowany powinien zostać jeden okres pobierania próbek w czasie1,5 długości trwania normalnego cyklu komórkowego po przeprowadzeniu końcowego poddania działaniu substancji. Przed uśmierceniem zwierzętom wstrzykuje się wewnątrzotrzewnowo odpowiednią dawkę czynnika zatrzymującego metafazę (np. Colcemid® lub kolchicyna). W następnej kolejności pobiera się próbki od zwierząt w odpowiednich odstępach czasu. W odniesieniu do myszy odstęp czasu między pobieraniem próbek wynosi 3–5 godzin; w odniesieniu do chomików ten odstęp czasu wynosi 4–5 godzin. Komórki są pobierane ze szpiku kostnego oraz analizowane pod kątem występowania aberracji chromosomowych.

1.5.3. Poziomy dawek Jeżeli zakres badań jest przeprowadzanych ze względu na to, że nie istnieją dostępne odpowiednie dane, powinny być one prowadzone w tym samym laboratorium, wykorzystując ten sam reżim gatunku, szczepu, płci oraz poddawania działaniu substancji, który ma zostać zastosowany do głównego badania (5). Jeżeli istnieje toksyczność, trzy poziomy dawek są stosowane w odniesieniu do pierwszego okresu pobierania próbek. Trzy poziomy dawek powinny objąć zakres od maksimum do niskiej toksyczności lub do jej braku. W trakcie późniejszego okresu pobierania próbek muszą zostać wykorzystane jedynie najwyższe dawki. Najwyższa dawka jest określona jako dawka wywołująca oznaki toksyczności, a wyższe poziomy dawek oparte na tym samym reżimie dawkowania mogłyby być śmiertelne. Substancje o szczególnej aktywności biologicznej przy niskich nietoksycznych dawkach (takie jak hormony i mitogeny) mogą stanowić wyjątek w odniesieniu do kryteriów ustalania dawki i powinny być oceniane na zasadzie jednostkowych przypadków. Najwyższa dawka może być również określona jako dawka, która wywołuje pewne wskazania toksyczności w szpiku kostnym (np. wyższa niż 50 % redukcja indeksu mitotycznego).

1.5.4. Badanie ograniczone Jeżeli badanie w oparciu o jeden poziom dawek o przynajmniej 2000 mg/kg masy ciała, wykorzystujące pojedyncze poddanie działaniu substancji, lub jak dwa zabiegi poddania działaniu substancji tego samego dnia, nie daje dostrzegalnych wyników toksycznych, oraz jeżeli nie podejrzewa się genotoksyczności w oparciu o dane dotyczące substancji powiązanych strukturalnie, wówczas przeprowadzenie pełnego badania może nie być konieczne. W odniesieniu do badań o dłuższym czasie trwania ograniczenie dawki wynosi 2000 mg/kg/masa ciała/dzień w odniesieniu do poddawania działaniu substancji trwającego do 14 dni oraz 1000 mg/kg/masa ciała/dzień w odniesieniu do poddawania działaniu substancji trwającego dłużej niż 14 dni. Spodziewa się, iż poddanie człowieka działaniu substancji może wykazać potrzebę wykorzystania większej dawki w badaniu ograniczonym.

1.5.5. Dawkowanie Substancja badana jest zazwyczaj podawana przez zgłębnik żołądkowy lub odpowiednią rurkę intubacyjną, lub przez wstrzyknięcie wewnątrzotrzewnowe. Inne drogi poddania działaniu substancji mogą być dopuszczalne w przypadku, gdy ich wykorzystanie jest uzasadnione. Maksymalna objętość płynu, jaka może być podana przez zgłębnik lub wstrzyknięta jednorazowo, zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Objętość nie powinna przekraczać 2 ml/100 g masy ciała. Wykorzystanie objętości wyższych niż te musi być uzasadnione. Z wyjątkiem podrażniających lub żrących substancji, które zazwyczaj ujawniają zwiększone skutki o dużym stężeniu, zmienności w objętości substancji badanej powinny zostać zminimalizowane przez dostosowanie stężenia w celu zapewnienia stałej objętości przy wszystkich poziomach dawek.

1.5.6. Preparaty chromosomów Zaraz po uśmierceniu zwierzęcia, uzyskuje się szpik kostny, poddany działaniu roztworu hipotonicznego oraz ustabilizowany. Komórki są następnie rozmieszczane na szkiełku mikroskopu i barwione.

1.5.7. Analiza Indeks mitotyczny powinien zostać oznaczony jako miara cytotoksyczności w przynajmniej 1000 komórek na zwierzę w odniesieniu do wszystkich poddanych działaniu substancji zwierząt (łącznie z pozytywnymi kontrolami) lub kontrolowanych zwierząt, które nie zostały poddane działaniu substancji. Przynajmniej 100 komórek powinno zostać poddane analizie w odniesieniu do każdego zwierzęcia. Liczba ta może zostać zmniejszona, jeśli zaobserwowano dużą liczbę aberracji. Wszystkie szkiełka mikroskopowe, w tym dotyczące negatywnych i pozytywnych kontroli, powinny być niezależnie zakodowane przed analizą mikroskopową. Ponieważ procedury przygotowania szkiełka mikroskopowego często skutkują przerwaniem proporcji między metafazą ze stratą chromosomów, oceniane komórki powinny z tego względu zawierać pewną liczbę centromerów równą 2n ± 2.

2. DANE

2.

2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW Dane dotyczące poszczególnych zwierząt powinny zostać przedstawione w formie tabelarycznej. Jednostką doświadczalną jest zwierzę. W odniesieniu do każdego zwierzęcia ocenione powinny zostać: liczba ocenionych komórek, liczba aberracji przypadających na komórkę oraz udział procentowy komórek ze strukturalnymi aberracjami chromosomowymi. Różne typy strukturalnej aberracji chromosomowej powinny być wymienione wraz z ich ilościami oraz częstotliwościami w odniesieniu do grupy poddanej działaniu substancji oraz kontrolnej. Szczeliny są oddzielnie odnotowywane oraz zgłaszane, ale ogólnie nie są włączane do częstotliwości aberracji ogółem. Jeżeli nie ma dowodu na różnicę między płciami, dane dotyczące obu płci mogą zostać połączone dla przeprowadzenia analizy statystycznej.

2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak związany z dawką wzrost odpowiedniej ilości komórek z aberracjami chromosomowymi lub wyraźny wzrost w ilości komórek z aberracjami w grupie pojedynczej dawki przy jednym okresie pobierania próbek. Biologiczne znaczenie wyników powinno zostać wzięte pod uwagę w pierwszej kolejności. Metody statystyczne mogą zostać wykorzystane jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (6). Znaczenie statystyczne nie powinno być jedynym czynnikiem określającym w odniesieniu do reakcji pozytywnej. Wyniki niejednoznaczne powinny zostać wyjaśnione przez dalsze badanie, w szczególności z wykorzystaniem modyfikacji warunków doświadczalnych. Wzrost liczby komórek poliploidalnych może wskazywać, że substancja badana ma potencjał wywoływania liczbowych aberracji chromosomowych. Wzrost endoreduplikacji chromosomami może wskazywać, że substancje badane mają potencjał wstrzymywania postępowania cyklu komórkowego (7)(8). Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spełniają powyższych kryteriów, uważana jest za niemutagenną w tym badaniu. Chociaż większość doświadczeń będzie dawała w jasny sposób pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych wyklucza dokonanie ostatecznej oceny dotyczącej aktywności badanej substancji. Wyniki mogą pozostać niejednoznaczne lub sporne niezależnie od liczby powtórzonych doświadczeń. Wyniki pozytywne z badania aberracji chromosomowej wskazują, że substancja badana wywołuje chromosomową aberrację w szpiku kostnym badanych gatunków. Wyniki negatywne wskazują, że w warunkach badawczych substancja badana nie pobudza aberracji chromosomowej w szpiku kostnym badanych zwierząt. Prawdopodobieństwo, że substancja badana lub jej metabolity docierają do ogólnego obiegu lub w szczególności do tkanki docelowej (np. toksyczność systemowa), powinno zostać wzięte pod uwagę.

3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

Rozpuszczalnik/nośnik:

uzasadnienie wyboru nośnika,

rozpuszczalność oraz stabilność substancji w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli jest znana.

Badane zwierzęta:

gatunek/szczep wykorzystany,

liczba, wiek oraz płeć zwierząt,

źródło, warunki przetrzymywania, odżywianie itp.,

indywidualna masa zwierzęcia na początku badania, łącznie z zakresem masy ciała, średnimi oraz standardowymi odchyleniami dla każdej grupy.

Warunki badania:

pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik/nośnik) kontrole,

dane z zakresu studium dotyczącego określania zakresu badania, jeżeli zostały przeprowadzone,

racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do zamkniętego wyboru dawek,

szczegóły dotyczące przygotowania substancji badanej,

szczegóły dotyczące podawania substancji badanej,

racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do drogi podawania,

metody sprawdzania, czy substancja badana dotarła do ogólnego obiegu lub tkanki docelowej, jeżeli ma zastosowanie,

zmiana stężenia substancji badanej w odżywianiu/wodzie pitnej (ppm) na rzeczywistą dawkę (mg/kg masy ciała/dzień), jeżeli ma zastosowanie,

szczegóły dotyczące jakości pokarmu oraz wody,

szczegółowy opis harmonogramów poddawania działaniu substancji oraz pobierania próbek,

metody pomiarów toksyczności,

tożsamość metafazy zatrzymującej substancje, jej stężenie oraz czas trwania poddania działaniu substancji,

metody przygotowania szkiełek mikroskopowych,

kryteria w odniesieniu do aberracji oceniającej,

liczba komórek objętych analizą przypadająca na zwierzę,

kryteria uznawania badań za pozytywne, negatywne lub niejednoznaczne.

Wyniki:

oznaki toksyczności,

indeks mitotyczny,

typ oraz liczba aberracji, podane oddzielnie dla każdego zwierzęcia,

liczba aberracji ogółem na grupę ze średnimi i standardowymi odchyleniami,

liczba komórek z aberracjami na grupę ze średnimi i standardowymi odchyleniami,

zmiany poliploidalności, jeżeli są znane,

relacja miedzy dawką a reakcją, w miarę możliwości,

analizy statystyczne, jeżeli istnieją,

dane dotyczące równoległych kontroli negatywnych,

historyczne dane dotyczące negatywnych kontroli, z zakresami, średnimi oraz standardowymi odchyleniami,

dane dotyczące równoległych pozytywnych kontroli.

Omówienie wyników.

Wnioski.

4.(1)(2)(1) (3)(4)(5)(6)(7)(8)

ODNIESIENIA Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, w: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D. C, pp. 275–306. Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In vivo Cytogenetic AssayS: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157–165. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, w: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115–141. Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305–312. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313–319. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (19 8 9), Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, w: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184–232. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403–413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362–1364.

B.12. MUTAGENNOŚĆ – BADANIE MIKROJĄDROWE ERYTRYOCYTOW IN VIVO U SSAKÓW

B.12.

1. METODA Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 474, metody badania mikrojądrowego erytrocytów in vivo u ssaków (1997).

1.

1.1. WPROWADZENIE Badanie mikrojądrowe erytrocytów u ssaków in vivo jest wykorzystywane w celu wykrycia uszkodzeń wywołanych przez chromosomy lub aparat mitotyczny erytroblastów przez analizę erytrocytu pobranego jako próbka szpiku kostnego lub komórek krwi obwodowej zwierząt, zazwyczaj gryzoni. Celem badania mikrojądrowego jest identyfikacja substancji powodujących cytogenetyczne uszkodzenia, które skutkują formowaniem się mikrojądra zawierającego okrywające fragmenty chromosomów lub całe chromosomy. Kiedy w erytroblaście szpiku kostnego rozwija się w erytrocyt polichromatyczny, główne jądro jest wyrzucane; każde mikrojądro, które zostało uformowane, może pozostać poza cytoplazmą poddaną w inny sposób tworzeniu się zarodników. Wizualizacja mikrojądra jest ułatwiona w tych komórkach, ponieważ brak im głównego jądra. Wzrost częstotliwości mikrojądrowych polichromicznych erytrocytów w zwierzętach poddanych działaniu substancji jest wskazaniem wywołanego uszkodzenia chromosomu. Szpik kostny gryzoni jest rutynowo wykorzystywany w tych badaniach ze względu na to, że erytrocyty polichromiczne produkowane są w tej tkance. Pomiar mikrojądrowych niedojrzałych (polichromicznych) erytrocytów w krwi obwodowej jest na równi dopuszczalny w odniesieniu do jakiegokolwiek gatunku, co do którego wykazana została niezdolność śledziony do usunięcia mikrojądrowego erytrocytu lub który wskazał odpowiednią czułość w celu wykrywania czynników, które powodują strukturalne lub liczbowe aberracje chromosomowe. Mikrojądro może być wyróżnione w oparciu o różne kryteria. Obejmują one identyfikacje obecności lub nieobecności kinetochoru lub centromeru DNA w mikrojądrze. Częstotliwość mikrojądrowych niedojrzałych (polichromicznych) erytrocytów jest głównym punktem końcowym. Liczba dojrzałych erytrocytów w krwi obwodowej, które zawierają mikrojądro, pośród danej ilości dojrzałych erytrocytów może być również wykorzystana jako punkt końcowy oznaczania, jeśli zwierzęta są poddawane działaniu substancji przez cztery tygodnie lub dłużej. To badanie mikrojądrowe erytrocytów u ssaków in vivo ma szczególne znaczenie dla oceniania zagrożenia, w związku z czym pozwala ono na stężenie czynników metabolizmu farmakokinetyków oraz procesów naprawy DNA chociaż mogą one różnić się wzajemnie w zależności od gatunku oraz tkanek, oraz genetycznych punktów końcowych. Badanie in vivo jest również użyteczne w odniesieniu do dalszych badań skutków mutagennych wykrytych w systemie in vitro. Jeżeli istnieje dowód na to, że substancja badana lub metabolit reakcyjny nie dotrze do tkanki docelowej, niewłaściwe jest wykorzystanie tego badania. Zob. również Ogólne wprowadzenie do części B.

1.2. DEFINICJE Centromer (Kinetochor): region(-y) chromosomu, w którym(-ch) mikrotubule wrzeciona podziałowego są asocjowane w trakcie podziału komórki, dopuszczając uporządkowane przemieszczanie się chromosomów potomnych do biegunów komórek potomnych. Mikrojądra: małe jądra, oddzielone oraz występujące dodatkowo w stosunku do jądra głównego komórek, wytwarzane w trakcie telofazy mitozy (mejozy) przez okrywające fragmenty chromosomów lub całe chromosomy. Erytrocyt normochromiczny: dojrzały erytrocyt, któremu brakuje rybosomów oraz może być odróżniony od niedojrzałego, polichromatycznych erytrocytów przez szczepy wybiórczo w odniesieniu dla rybosomów. Erytrocyt polichromiczny: niedojrzały erytrocyt, w pośrednim stadium rozwoju, który nadal zawiera rybosomy i z tego względu może zostać odróżniony od dojrzałych, normochromicznych erytrocytów, dzięki plamom selektywnym dla rybosomów.

1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ Zwierzęta są poddane działaniu substancji badanej odpowiednią drogą. Jeżeli wykorzystywany jest szpik kostny, zwierzęta są uśmiercane w odpowiednim czasie po poddaniu działaniu substancji, pobiera się szpik kostny, sporządzane są preparaty oraz dokonuje się barwienia (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Kiedy wykorzystywana jest krew obwodowa, krew pobierana jest w odpowiednim czasie po poddaniu działaniu substancji oraz sporządzane są i barwione preparaty wymazowe (4)(8)(9)(10). W odniesieniu do badań z krwią obwodową powinno upłynąć możliwie jak najmniej czasu między ostatnim poddaniem działaniu substancji a pobraniem komórek. Preparaty są analizowane pod kątem obecności mikrojądra.

1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.

1.4.1. Preparaty

1.4.1.

1.4.1.1. Wybór gatunku zwierząt Szczury lub myszy są zalecane, jeśli wykorzystywany jest szpik kostny, chociaż może zostać wykorzystany każdy odpowiedni gatunek ssaków. Jeśli wykorzystywana jest krew obwodowa, zalecane są myszy. Jednakże może zostać wykorzystany każdy odpowiedni gatunek ssaków pod warunkiem, że jest gatunkiem, w którym śledziona nie usuwa mikrojądrowych erytrocytów lub gatunkiem, który wykazał czułość odpowiednią do wykrycia czynników powodujących strukturalne lub liczbowe aberracje chromosomowe. Powszechnie wykorzystywane laboratoryjne szczepy młodych zdrowych dorosłych zwierząt powinny zostać wykorzystane w badaniu. W czasie przeprowadzania badania różnice w masie zwierząt powinny być minimalne i nie powinny przekraczać ± 20 % średniej masy każdej płci.

1.4.1.2. Warunki przetrzymywania i karmienia Ogólne warunki określone w ogólnym wprowadzeniu do części B są stosowane, chociaż celem w odniesieniu do wilgotności powinien być poziom 50–60 %.

1.4.1.3. Przygotowanie zwierząt Zdrowe młode dorosłe osobniki zwierząt są losowo przypisane do grup kontrolnych oraz grup poddanych działaniu substancji. Zwierzęta są identyfikowane w niepowtarzalny sposób. Zwierzęta są aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przynajmniej przez pięć dni. Klatki powinny zostać przygotowane w sposób minimalizujący możliwe negatywne skutki wynikające z umieszczenia w klatce.

1.4.1.4. Przygotowanie dawek Substancje badane stałe powinny zostać rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczone, jeżeli to stosowne, przed dawkowaniem zwierzętom. Substancje badane płynne mogą być dawkowane bezpośrednio lub mogą zostać rozpuszczone przed dawkowaniem. Powinny zostać wykorzystane świeżo przygotowywane substancje, chyba że dane dotyczące stabilności wskazują, iż dopuszczalne jest składowanie substancji.

1.4.2. Warunki badania

1.4.2.

1.4.2.1. Rozpuszczalnik/nośnik Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien wywoływać skutków toksycznych przy wykorzystywanych poziomach dawek oraz nie powinien mieć możliwości reagowania chemicznego z substancją badaną. Jeśli inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki są wykorzystywane, ich włączenie do doświadczenia powinno być wsparte danymi wskazującymi ich zgodność. Zaleca się, o ile to możliwe, aby w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/nośników.

1.4.2.2. Kontrole Równoległe kontrole pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik/nośnik) powinny zostać przeprowadzone w odniesieniu do każdej płci w ramach każdego badania. Z wyjątkiem poddawania działaniu substancji badanej zwierzęta w grupie kontrolnej powinny być przedmiotem identycznych działań w porównaniu ze zwierzętami w grupie poddanej działaniu substancji. Kontrole pozytywne powinny wytwarzać mikrojądro przy poziomie poddania działaniu substancji, w odniesieniu do którego oczekuje się wykrywalnego wzrostu względem tła. Dawki kontroli pozytywnych powinny zostać wybrane tak, aby wyniki były jasne, ale nie ujawniały bezpośrednio tożsamości zakodowanych szkiełek mikroskopowych badającemu. Dopuszczalne jest, aby pozytywne kontrole podawane były inną drogą niż substancje badane oraz aby ich próbki pobierane były tylko jeden raz. Dodatkowo wykorzystanie substancji chemicznych pozytywnych powiązanych z klasą chemiczną kontroli może być brane pod uwagę, jeżeli są one dostępne. Przykłady pozytywnych substancji kontrolnych obejmują: Substancja Nr CAS Nr Einecs Etyl metanosulfonowy 62-50-0 200-536-7 N-etylo-N-nitrozomocznik 759-73-9 212-072-2 Mitomycyna C 50-07-7 200-008-6 Cyklofosfamid Cyclofosfamid monohydrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietyleneomelamina 51-18-3 200-083-5 Negatywne kontrole z poddaniem działaniu samego rozpuszczalnika lub nośnika, a w innych przypadkach poddane działaniu w ten sam sposób jak grupy poddane działaniu substancji, powinny zostać objęte każdorazowym pobieraniem próbek, chyba że dopuszczalna zmienność oraz częstotliwości komórek z aberracjami chromosomowymi są dostępne z historycznych danych dotyczących kontroli. Jeżeli stosowane jest jednokrotne pobieranie próbek w odniesieniu do negatywnych kontroli, najbardziej odpowiednim czasem jest pierwszy okres pobrania próbek. Dodatkowo kontrole bez poddania działaniu substancji powinny być również wykorzystywane, chyba że istnieją historyczne lub opublikowane dane dotyczące kontroli wykazujące, że wybrany rozpuszczalnik/nośnik nie wywołuje żadnych skutków szkodliwych lub mutagennych. Jeżeli wykorzystywana jest krew obwodowa, dopuszczalna może być również próbka sprzed poddania działaniu substancji jako równoległa kontroli negatywnej, ale tylko w krótkich badaniach krwi obwodowej (np. 1–3 zabiegów poddania działaniu substancji), jeśli wynikające z badania dane mieszczą się w spodziewanym zakresie w odniesieniu do kontroli historycznych.

1.5. PROCEDURA

1.5.

1.5.1. Liczba oraz płeć zwierząt Każda z poddanych działaniu substancji oraz kontrolnych grup obejmuje przynajmniej pięć nadających się do poddania analizie zwierząt z każdej płci (11). Jeżeli w czasie badania istnieją dostępne dane z badań naukowych dotyczących tego samego gatunku oraz z wykorzystaniem tej samej drogi poddania działania substancji, które wykazują, że nie istnieją zasadnicze różnice w toksyczności między płciami, wówczas badanie na jednej płci będzie wystarczające. Gdy poddanie człowieka działaniu substancji chemicznej może być zależne od płci, jak na przykład w odniesieniu do niektórych środków farmaceutycznych, badanie powinno zostać przeprowadzone na zwierzętach odpowiedniej płci.

1.5.2. Harmonogram poddawania działaniu substancji Nie można zalecić żadnego harmonogramu poddawania działaniu substancji (np. jeden, dwa albo więcej zabiegów poddawania działaniu substancji w 24-godzinnych odstępach czasu). Próbki z rozszerzonych reżimów dawkowania są dopuszczalne, o ile wykazane zostały pozytywne wyniki w odniesieniu do tego badania, w odniesieniu do badania negatywnego, o ile wykazana została toksyczność lub została wykorzystana dawka ograniczona oraz kontynuowano dawkowanie do momentu okresu pobierania próbek. Substancja badana może być również podawana jako dawka podzielona, np. dwa zabiegi poddania działaniu substancji tego samego dnia, w odstępie nie więcej niż kilku godzin, w celu ułatwienia podawania dużej objętości substancji. Badanie można przeprowadzić na dwa sposoby: Można stosować dodatkowo inne okresy pobierania próbek, jeżeli są one odpowiednie.

1.5.2. a)

zwierzęta są poddawane działaniu substancji badanej jeden raz. Próbki szpiku kostnego są pobierane przynajmniej dwukrotnie, rozpoczynając nie wcześniej niż w 24 godziny po poddaniu działaniu substancji badanej, ale nie przedłużając poza okres 48 godzin po poddaniu działaniu substancji badanej z odpowiednimi odstępami czasu między pobieraniem próbek. Stosowanie próbek wcześniej niż 24 godziny po leczeniu powinno być uzasadnione. Próbki krwi obwodowej są pobierane przynajmniej dwukrotnie, rozpoczynając nie wcześniej niż w 36 godzin po poddaniu działaniu substancji badanej z odpowiednimi odstępami czasu po pobraniu pierwszej próbki, ale nieprzedłużającymi się powyżej 72 godzin. Jeżeli rozpoznano pozytywną reakcję przy jednym okresie pobierania próbek, nie jest wymagane dodatkowe pobieranie próbek;

jeżeli wykorzystywane są dwa lub więcej zabiegów poddawania działaniu substancji badanej dziennie (np. dwa lub więcej zabiegów poddawania działaniu substancji przy 24-godzinnych odstępach czasu), próbki powinny zostać zebrane w okresie między 18 a 24 godziną po końcowym poddaniu działaniu substancji w odniesieniu do szpiku kostnego oraz między 36 a 48 godziną po poddaniu działaniu substancji w odniesieniu do krwi obwodowej (12).

1.5.3. Poziomy dawek Jeżeli studium określające zakres badania jest przeprowadzane ze względu na to, że nie istnieją dostępne odpowiednie dane, powinno być ono prowadzane w tym samym laboratorium, wykorzystując ten sam reżim gatunku, szczepu, płci oraz poddawania działaniu substancji, który ma zostać zastosowany do głównego badania (13). Jeżeli istnieje toksyczność, trzy poziomy dawek są wykorzystywane w odniesieniu do pierwszego okresu pobierania próbek. Te poziomy dawek powinny objąć zakres od najwyższej do niskiej toksyczności lub do jej braku. W trakcie późniejszego okresu pobierania próbek muszą zostać wykorzystane jedynie najwyższe dawki. Najwyższa dawka jest określona jako dawka wywołująca oznaki toksyczności, a wyższe poziomy dawek oparte na tych samych reżimach dotyczących dawkowania mogłyby być zabójcze. Substancje o szczególnej aktywności biologicznej przy niskich nietoksycznych dawkach (takie jak hormony i mitogeny) mogą stanowić wyjątek w odniesieniu do kryteriów ustalania dawki i powinny być oceniane na zasadzie jednostkowych przypadków. Najwyższa dawka może być również określona jako dawka, która wywołuje pewne wskazania toksyczności w szpiku kostnym (np. redukcja udziału niedojrzałych erytrocytów pośród erytrocytów ogółem w szpiku kostnym lub krwi obwodowej).

1.5.4. Badanie ograniczone Jeżeli badanie w oparciu o jeden poziom dawek w odniesieniu do zwierząt o przynajmniej 2000 mg/kg masy ciała, wykorzystujące pojedyncze poddanie działaniu substancji lub dwa zabiegi poddania działaniu substancji tego samego dnia, nie daje dostrzegalnych skutków toksycznych, oraz jeżeli nie podejrzewa się genotoksyczności w oparciu o dane dotyczące substancji powiązanych strukturalnie, wówczas przeprowadzenie pełnego badania może nie być konieczne. W odniesieniu do badań o dłuższym czasie trwania, ograniczenie dawki wynosi 2000 mg/kg/masa ciała/dzień w odniesieniu do poddania działaniu substancji trwającego do 14 dni oraz 1000 mg/kg/masa ciała/dzień w odniesieniu do poddania działaniu substancji trwającego dłużej niż 14 dni. Spodziewane poddanie człowieka działaniu substancji może wykazać potrzebę wykorzystania większej dawki w badaniu ograniczonym.

1.5.5. Dawkowanie Substancja badana jest zazwyczaj podawana przez zgłębnik żołądkowy lub odpowiednią rurkę intubacyjną lub wstrzyknięcie wewnątrzotrzewnowe. Inne drogi poddania działaniu substancji mogą być dopuszczalne, w przypadku gdy ich wykorzystanie może być uzasadnione. Maksymalna objętość płynu, jaka może być podana przez zgłębnik lub wstrzyknięta jednorazowo, zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Objętość nie powinna przekraczać 2 ml/100 g masy ciała. Wykorzystanie objętości wyższych musi być uzasadnione. Z wyjątkiem podrażniających lub żrących substancji, które zazwyczaj ujawniają zwiększone skutki o wyższym stężeniu, zmienności w objętości substancji badanej powinny zostać zminimalizowane przez dostosowanie stężenia w celu zapewnienia stałej objętości przy wszystkich poziomach dawek.

1.5.6. Przygotowanie szpiku kostnego/krwi Komórki szpiku kostnego są zazwyczaj uzyskiwane z kości udowych lub piszczeli bezpośrednio po uśmierceniu. Powszechnie komórki są usuwane z kości udowych lub piszczeli, preparowane oraz barwione, wykorzystując ustalone metody. Krew obwodowa jest uzyskiwana z tętnicy szyjnej lub innego odpowiedniego naczynia krwionośnego. Komórki krwi są natychmiast barwione (8)(9)(10) lub sporządzane są preparaty wymazowe, a następnie są barwione. Wykorzystanie szczególnego barwnika DNA (np. oranż akrydynowy (14) lub Hoechst 33258 plus pyronina-Y (15)) może wyeliminować niektóre spośród artefaktów związanych z barwnikiem nienadającym się do szczególnego szczepu DNA. Ta korzyść nie wyklucza zastosowania zwykłych barwników (np. Giemsa). Dodatkowe systemy (np. kolumny celulozowe w celu usunięcia komórek jądrowych (16)) mogą być również wykorzystane pod warunkiem, że wykazano, iż systemy te odpowiednio działają w odniesieniu do przygotowywania mikrojądra w laboratorium.

1.5.7. Analiza Udział niedojrzałych erytrocytów pośród ogółu (dojrzałych i niedojrzałych) erytrocytów jest oznaczana podliczając ogół przynajmniej 200 erytrocytów w odniesieniu do szpiku kostnego oraz 1000 erytrocytów w odniesieniu do krwi obwodowej (17). Wszystkie szkiełka mikroskopowe, łącznie z tymi dotyczącymi pozytywnych i negatywnych kontroli, powinny być niezależnie kodowane przed przeprowadzeniem analizy mikroskopowej. Przynajmniej 2000 niedojrzałych erytrocytów przypadających na zwierzę jest oceniane w odniesieniu do zapadalności niedojrzałych erytrocytów. Analizując szkiełka mikroskopowe, udział niedojrzałych erytrocytów nie powinien być mniejszy niż 20 % wartości kontrolnej. Jeżeli zwierzęta są poddawane działaniu substancji nieprzerwanie przez cztery tygodnie lub dłużej, przynajmniej 2000 dojrzałych erytrocytów na zwierzę może zostać ocenione w odniesieniu do częstości występowania mikrojądra. Systemy automatycznej analizy (analiza obrazowa oraz przepływowa analiza cytometryczna zawiesin komórkowych) są dopuszczalne alternatywnie w odniesieniu do to oceny manualnej, jeżeli są odpowiednio uzasadnione oraz jeżeli stwierdzono ich ważność.

2. DANE

2.

2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW Dane dotyczące poszczególnych zwierząt powinny zostać przedstawione w formie tabelarycznej. Liczba ocenionych niedojrzałych erytrocytów, liczba mikrojądrowych niedojrzałych erytrocytów oraz liczba niedojrzałych erytrocytów pośród erytrocytów ogółem powinna zostać wymieniona oddzielnie w odniesieniu do każdego zwierzęcia poddanego analizie. Jeżeli zwierzęta są poddawane działaniu substancji nieprzerwanie przez cztery tygodnie lub dłużej, dane dotyczące dojrzałych erytrocytów powinny zostać podane, jeżeli zostały one zebrane. Udział niedojrzałych erytrocytów pośród erytrocytów ogółem oraz, jeżeli uznaje się to za mające zastosowanie, udział procentowy mikrojądrowych erytrocytów podawany jest dla każdego zwierzęcia. Jeżeli nie ma dowodu na różnicę między płciami, dane dotyczące obu płci mogą zostać połączone celem przeprowadzenia analizy statystycznej.

2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak związany z dawką wzrost w odpowiedniej ilości komórek z aberracjami chromosomowymi lub wyraźny wzrost w ilości komórek z aberracjami w grupie pojedynczej dawki przy jednym okresie pobierania próbek. Biologiczne znaczenie wyników powinno zostać wzięte pod uwagę w pierwszej kolejności. Metody statystyczne mogą zostać wykorzystane jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (18)(19). Znaczenie statystyczne nie powinno być jedynym czynnikiem określającym w odniesieniu do reakcji pozytywnej. Wyniki niejednoznaczne powinny zostać wyjaśnione przez dalsze badanie, w szczególności z wykorzystaniem modyfikacji warunków doświadczalnych. Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spełniają powyższych kryteriów, uważana jest za niemutagenną w tym badaniu. Chociaż większość doświadczeń będzie dawało w jasny sposób pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych będzie wykluczał dokonanie ostatecznej oceny dotyczącej aktywności substancji badanej. Wyniki mogą pozostać niejednoznaczne lub sporne niezależnie od ilości powtórzeń doświadczenia. Wyniki pozytywne z badania mikrojądrowego wskazują, że substancja badana wywołuje powstanie mikrojądra, które jest wynikiem uszkodzenia chromosomowego albo uszkodzenia w erytroblaście badanego gatunku. Wyniki negatywne wskazują, że w warunkach badawczych substancja badana nie produkuje mikrojądra w niedojrzałym erytrocycie badanego gatunku. Prawdopodobieństwo, że substancja badana lub jej metabolity docierają do ogólnego obiegu lub w szczególności tkanki docelowej (np. toksyczność systemowa), powinno zostać rozpatrzone.

3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ

3. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

Rozpuszczalnik/nośnik:

uzasadnienie wyboru nośnika,

rozpuszczalność oraz stabilność substancji w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli jest znana.

Badane zwierzęta:

gatunek/szczep wykorzystany,

liczba, wiek oraz płeć zwierząt,

źródło, warunki przetrzymywania, odżywianie itp.,

indywidualna masa ciała zwierzęcia na początku badania, łącznie z zakresem masy ciała, średnimi oraz standardowymi odchyleniami dla każdej grupy.

Warunki badania:

dane dotyczące pozytywnych i negatywnych (rozpuszczalnik/nośnik) kontroli,

dane z zakresu studium określania zakresu badania, jeżeli zostało przeprowadzone,

racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do wyboru poziomu dawek,

szczegóły dotyczące preparatów substancji,

szczegóły dotyczące podawania substancji badanej,

racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do drogi podawania,

metody sprawdzania, czy substancja testowa dotarła do ogólnego obiegu lub tkanki docelowej, jeżeli mają zastosowanie,

zmiana stężenia substancji badanej w odżywianiu/wodzie pitnej (ppm) na rzeczywistą dawkę (mg/kg masy ciała/dzień), jeżeli ma zastosowanie,

szczegóły dotyczące jakości pokarmu oraz wody,

szczegółowy opis harmonogramów leczenia oraz pobierania próbek,

metody przygotowania slajdów,

metody pomiarów toksyczności,

kryteria w odniesieniu do oceniającej aberracji mikrojądrowych niedojrzałych erytrocytów,

liczba przeanalizowanych komórek przypadająca na zwierzę,

kryteria uznawania badań za pozytywne, negatywne lub niejednoznaczne.

Wyniki:

oznaki toksyczności,

udział niedojrzałych erytrocytów pośród erytrocytów ogółem,

liczba mikrojądrowych niedojrzałych erytrocytów podana oddzielnie w odniesieniu do każdego zwierzęcia,

średnia ± mikrojądrowych niedojrzałych erytrocytów przypadająca na grupę,

relacja miedzy dawką a reakcją, w miarę możliwości,

analizy statystyczne, jeżeli istnieją,

dane dotyczące równoległych oraz historycznych kontroli negatywnych,

dane dotyczące równoległych pozytywnych kontroli.

Omówienie wyników.

Wnioski.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)

ODNIESIENIA Heddle, J. A. (1973), A Rapid In vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187–190. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9–15. Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K, MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (198 3), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61–118. Mavournin, K H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29–80. MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, w: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. Elsevier, Amsterdam, pp. 555–558. MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (19 8 7), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103–112. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513–522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245–249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83–98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan)(1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 53–159. Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. (19 94), in vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293–304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313–319. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313–319. Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241–247. MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, pp. 269–275. Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91–104. Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97–99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetics Assay, w: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115–141. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K (1989), Staticical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, w: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184–232.

B.13/14. MUTAGENNOŚĆ – BADANIE MUTACJI POWROTNYCH W KOMORKACH BAKTERYJNYCH

B.13/14.

1. METODA Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 471, badania mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych (1997).

1.

1.1. WPROWADZENIE Badania mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych wykorzystuje aminokwasy wymagające szczepów Salmonella typhimurium oraz Escherichia coli w celu wykrycia mutacji punktowych, które obejmują zastępowanie (substytucja), dodanie lub usunięcie jednego lub większej liczby par zasad DNA (1)(2)(3). Zasadą tego badania mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych jest to, że wykrywa ono mutacje, które powodują powrót mutacji obecnych w badanych szczepach oraz przywracają funkcjonalną zdolność bakterii do syntezowania podstawowego aminokwasu. Odpowiednie bakterie są wykrywane przez ich zdolność do wzrostu w razie nieobecności aminokwasu wymaganego przez macierzysty badany szczep. Mutacje punktowe są przyczyną wielu chorób genetycznych u ludzi oraz istnieje podstawowy dowód na to, że mutacje punktowe w onkogenach i genach hamujących nowotwory komórek somatycznych są odpowiedzialne za nowotwory u ludzi oraz zwierząt badanych. Badanie mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych jest szybkie, tanie oraz względnie proste do przeprowadzenia. Wiele szczepów badanych posiada wiele cech, które czynią je bardziej czułymi na wykrywanie mutacji łącznie z reakcyjnymi sekwencjami DNA w lokalizacjach powrotnych, wzmożoną przenikalnością do dużych cząsteczek oraz eliminacją systemów naprawy DNA lub wzmocnieniem procesu naprawy DNA skłonnego do błędów. Specyficzność badanych szczepów może zapewnić pewne użyteczne informacje w sprawie typów mutacji, które są wywołane czynnikami genotoksycznymi. Bardzo duża baza danych wyników w odniesieniu do szerokiej różnorodności struktur jest dostępna w odniesieniu do badania mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych oraz dobrze ustalone metodologie zostały opracowane w odniesieniu do badanych substancji chemicznych o różnych właściwościach fizyczno-chemicznych łącznie ze związkami lotnymi. Zob. również Ogólne wprowadzenie do części B.

1.2. DEFINICJE Badanie mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych w Salmonella typhimurium albo Escherichia coli wykrywa mutacje w szczepie wymagającym aminokwasów (histydyny lub tryptofanu, odpowiednio) w celu wytworzenia szczepu niezależnie od zewnętrznych dostaw aminokwasów. Pary zasad podstawiania mutagenów są czynnikami, które powodują zasadowe zmiany w DNA. W badaniu powrotnym ta zmiana może wystąpić w miejscu oryginalnej mutacji lub w drugim miejscu w genomie bakteryjnym. Mutageny powodujące zmiany fazy odczytu są czynnikami, które powodują dodanie lub usunięcie jednej lub większej liczby par zasad w DNA, zmieniając w ten sposób odczyt RNA.

1.3. WSTĘPNE ROZWAŻANIA Badanie mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych wykorzystuje komórki prokariotyczne, które różnią się od komórek ssaków takimi czynnikami jak pobór, przemiana materii, struktura chromosomowa procesy naprawy DNA. Badania przeprowadzane in vitro ogólnie wymagają wykorzystania egzogenicznego źródła aktywacji metabolicznej. Systemy aktywacji metabolicznej in vitro nie mogą naśladować całkowicie warunków in vivo. Badanie z tego względu nie dostarcza bezpośrednich informacji w sprawie potencjału mutagenności oraz rakotwórczości substancji u ssaków. Badanie mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych jest powszechnie wykorzystywane jako wstępny przegląd aktywności genotoksycznej oraz, w szczególności w odniesieniu aktywacji wywołującej mutacje punktowe. Rozległa baza danych wykazała, że wiele substancji chemicznych, które są pozytywne w tym badaniu, ujawnia również aktywność mutagenną w innych badaniach. Istnieją przykłady czynników mutagennych, które nie są wykryte przez to badanie, powody tych niedoborów mogą zostać przypisane szczególnemu charakterowi wykrytego punktu końcowego, różnicom między aktywacją metaboliczną lub różnicom w biodostępności. Z drugiej strony, czynniki, które wzmacniają wrażliwość badania mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych, mogą prowadzić do zbyt wysokiego oszacowania aktywność mutagennej. Badanie mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych może być nieodpowiednie w odniesieniu do oceny niektórych klas substancji chemicznych, na przykład wysoce bakteriobójczych związków (np. niektóre antybiotyki) oraz tych, które uznaje się za (które znane są) zakłócające szczególnie system replikacji komórek ssaków (np. niektóre czynniki hamujące topoizomerazę oraz niektóre nuklozydowe substancje analogiczne). W takich przypadkach badanie mutacji u ssaków może być bardziej odpowiednie. Chociaż wiele związków, które są pozytywne w tym badaniu, jest czynnikami rakotwórczymi dla ssaków, korelacja nie jest zupełna. Zależy to od klasy substancji chemicznej oraz istnieją czynniki rakotwórcze, które nie są wykrywane przez substancje badaną, ponieważ działają one przez inne niegenotoksyczne mechanizmy lub mechanizmy nieobecne w komórkach bakteryjnych.

1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ Zawiesiny komórek bakteryjnych są poddane działaniu substancji badanej, w obecności oraz w nieobecności egzogenicznego systemu aktywacji metabolicznej. W metodzie włączania płytki te zawiesiny są zmieszane z nałożonym agarem oraz nakładane na minimalne podłoże. W odniesieniu do obu technik, po dwóch lub trzech dniach inkubacji, powrotne hodowle są podliczane oraz porównywane z ilością spontanicznie powracających hodowli na rozpuszczalnikowych płytkach kontrolnych. Zostało opisanych wiele procedur w odniesieniu do przeprowadzania badania mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych. Wśród tych powszechnie wykorzystywanych znajdują się metoda włączająca płytkę (1)(2)(3)(4), metoda uprzedniej inkubacji (2)(3)(5)(6)(7)(8), metoda fluktuacji (9)(10) oraz metoda zawiesinowa (11). Zostały opisane modyfikacje w odniesieniu do badania gazów lub oparów (12). Procedury opisane w tej metodzie odnoszą się przede wszystkim do metod włączenia płytki oraz uprzedniej inkubacji. Żadna z nich nie jest dopuszczalna w odniesieniu do przeprowadzania doświadczeń zarówno z aktywacją metaboliczną, jak i bez niej. Niektóre substancje mogą zostać wykryte w bardziej skuteczny sposób, wykorzystując metodę uprzedniej inkubacji. Substancje te należą do klas chemicznych, które obejmują nitrozaminy o krótkich łańcuchach, metale dwuwartościowe, aldehydy, barwniki azowe oraz związki diazowe oraz alkaloidy pirolizydynowe, związki allilowe oraz związki azotowe (3). Rozpoznano także, że niektóre klasy mutagenów nie są zawsze wykrywane, wykorzystując procedury standardowe, takie jak metoda włączająca płytki lub metoda uprzedniej inkubacji. Powinny być one uznawane za szczególne przypadki i silnie zalecane jest, iż powinny zostać wykorzystane alternatywne procedury. Następujące szczególne przypadki mogą zostać zidentyfikowane (wraz z przykładami procedur, które mogłyby zostać wykorzystane w odniesieniu do ich wykrycia) barwniki azowe oraz związki diazowe (3)(5)(6)(13), gazy oraz lotne substancje chemiczne (12)(14)(15)(16) oraz glikozydy (17)(18). Odchylenie od standardowej procedury musi zostać naukowo uzasadnione.

1.5. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.5.

1.5.1. Preparaty

1.5.1.

1.5.1.1. Bakterie Świeże kultury bakterii powinny być hodowane do późnej fazy wykładniczej lub wczesnej fazy stacjonarnej wzrostu (w przybliżeniu 109 komórek na ml). Kultury bakteryjne w późnej fazie stacjonarnej nie powinny być wykorzystywane. Zasadnicze jest, aby kultury bakteryjne wykorzystywane w badaniu zawierały wysokie miano bakterii zdolnych do życia. Miano może być wykazane zarówno z historycznych danych dotyczących kontroli krzywych wzrostu, w każdym oznaczaniu przez określenie ilości zdolnych do życia komórek przez doświadczenie platerowania. Zalecaną temperaturą inkubacji jest 37 oC. Powinno zostać wykorzystane przynajmniej pięć szczepów bakterii. Powinno to obejmować cztery szczepy S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 lub TA97a lub TA97; TA98; oraz TA100), które zostały pokazane jako mające być rzetelne oraz odtwarzalnie reagujące między laboratoriami. Te cztery szczepy S. typhimurium posiadają GC pary bazowe w miejscu podstawowego powrotu oraz wiadome jest, że nie mogą one wykrywać utleniających mutagenów, czynników sieciujących oraz hydrazyny. Takie substancje mogą być wykrywane przez szczepy E. coli WP2 lub S. typhimurium TA1 02 (19), które posiadają pary zasad AT w miejscu podstawowego powrotu. Z tego względu zalecaną kombinacją szczepów jest: W celu wykrycia mutagenów sieciujących preferowane może być objęcie TA102 lub dodanie wprawnych w naprawianie DNA szczepów E. coli (np. E. coli WP2 lub E. coli WP2 (pKM101)). Powinny być wykorzystywane ustalone procedury przygotowania hodowli podstawowych, weryfikacja markerem oraz składowanie. Wymogi w odniesieniu do wzrostu, dotyczące aminokwasu, powinny być wykazane dla każdego zamrożonego preparatu hodowli podstawowych (histydyna dla szczepów S. typhimurium oraz tryptofan dla szczepów E. coli). Inne właściwości fenotypowe powinny zostać sprawdzone w podobny sposób, mianowicie: obecność lub nieobecność plazmidów czynnika R, gdzie stosowne (np. odporność na ampicylinę w szczepach TA98, TA100 oraz TA97a lub TA97, WP2 uvrA oraz WP2 uvrA (pKM101), oraz odporność na ampicylinę + tetracyklinę w szczepie TA 102); (np. rfa mutacja w S. typhimurium przez wrażliwość na fiolet krystaliczny oraz uvrA mutacja w E. coli lub uvrB mutacja w S. typhimurium przez wrażliwość na światło ultrafioletowe) (2)(3). Szczepy powinny również wytwarzać spontaniczne kolonie powrotne w ramach zakresów częstotliwości oczekiwanych na podstawie historycznych danych laboratoryjnych oraz przeważnie w zakresie odnotowanym w literaturze.

S. typhimurium TA1 535, oraz

S. typhimurium TA1 537 lub TA97, lub TA97a, oraz

S. typhimurium TA98, oraz

S. typhimurium TA100, oraz

E. coli WP2 uvrA lub E. coli WP2 uvrA (pKM101), lub S. typhimurium TA102.

1.5.1.2. Podłoże Wykorzystywany jest odpowiedni minimalny agar (np. zawierające Vogel-Bonner minimalne podłoże E oraz glukoza) oraz powlekający agar zawierający histydynę oraz biotynę lub tryptofan w celu umożliwienia podziału kilku komórek (1)(2)(9).

1.5.1.3. Aktywacja metaboliczna Bakterie powinny być poddane działaniu substancji badanej zarówno w obecności, jak i w nieobecności odpowiedniego systemu aktywacji metabolicznej. Najbardziej powszechnie wykorzystywanym systemem jest uzupełniana współczynnikiem frakcja pomitochondrialna (S9) przygotowana z wątroby gryzoni poddanych działaniu czynników pobudzających enzymy takimi jak Aroklor 1254 (1)(2) lub kombinacją feno-barbitonu oraz B nafoflavonu (18)(20)(21). Frakcja pomitochondrialna jest zazwyczaj wykorzystywana w stężeniach w zakresie od 5 do 30 % objętościowo w mieszaninie S9. Wybór oraz warunki systemu metabolicznej aktywacji mogą być uzależnione od klasy badanej substancji chemicznej. W niektórych przypadkach właściwe może być wykorzystanie więcej niż jednego stężenia frakcji pomitochondrialnej. W odniesieniu do barwników azowych oraz związków diazowych, przy wykorzystaniu systemu aktywacji metabolicznej, może być bardziej odpowiednie (6)(13).

1.5.1.4. Substancja testowa/preparat Stała substancja badana powinna zostać rozpuszczona lub zawieszona w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczona, jeżeli jest to odpowiednie przed poddaniem bakterii działaniu substancji. Płynne substancje badane mogą być dodawane bezpośrednio do systemu badawczego i/lub rozcieńczane przed poddaniem działaniu substancji. Powinny zostać wykorzystane świeże preparaty, chyba że dane dotyczące stabilności wykazują dopuszczalność składowania. Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien mieć możliwości reagowania chemicznego z substancją badaną oraz powinien być zgodny z przeżywaniem bakterii oraz aktywnością S9. Jeśli inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki są wykorzystywane, ich włączenie do doświadczenia powinno być wsparte danymi wskazującymi ich zgodność. Zaleca się, o ile to możliwe, aby w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/nośników. Badając substancje niestabilne w wodzie, wykorzystane rozpuszczalniki organiczne powinny być wolne od wody.

1.5.2. Warunki badawcze

1.5.2.

1.5.2.1. Szczepy badane (zob. ppkt 1.5.1.1)

1.5.2.2. Stężenie poddania działaniu substancji Wśród kryteriów, które mają być uwzględnione, oznaczając najwyższą ilość substancji badanej, które ma zostać wykorzystana, jest cytotoksyczność oraz rozpuszczalność w końcowej mieszaninie, której działaniu poddawane są szczepy. Użyteczne może być oznaczenie toksyczności oraz nierozpuszczalności w doświadczeniu wstępnym. Cytotoksyczność może zostać wykryta przez redukcję ilości powrotnych hodowli, oczyszczenie lub zmniejszenie podłoża lub stopień przeżywania poddanych działaniu substancji hodowli. Cytotoksyczność substancji może być zmieniana w obecności systemów aktywacji metabolicznej. Nierozpuszczalność powinna zostać oceniona jako wytrącanie w końcowej mieszaninie w rzeczywistych warunkach badania oraz oczywistych dla oka nieuzbrojonego. Zalecane najwyższe stężenie badawcze w odniesieniu do rozpuszczalnych niecytotoksycznych substancji stanowi 5 mg/płytkę lub 5 μl/płytkę. W odniesieniu do niecytotoksycznych substancji, które nie są rozpuszczalne przy 5 mg/płytkę lub 5 μl/płytkę, jedno lub więcej badanych stężeń powinno być nierozpuszczalne w końcowej mieszaninie cytotoksycznej. Strącanie nie powinno zakłócać oceny. Przynajmniej pięć różnych nadających się do analizowania stężeń substancji badanej powinno zostać wykorzystane przy w przybliżeniu połowie logarytmu (np. √1 0) odstępów czasu między punktami badawczymi w odniesieniu do wstępnego doświadczenia. Krótsze odstępy czasu mogą być odpowiednie, jeśli reakcja stężenia jest badana. Badanie powyżej stężenia 5 mg/płytkę lub 5 μl/płytkę może być brane pod uwagę, oceniając substancje zawierające podstawowe ilości potencjalnie mutagennych zanieczyszczeń.

1.5.2.3. Negatywne i pozytywne kontrole Równoległe, specyficzne co do szczepu pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik lub nośnik) kontrole, zarówno z aktywacją metaboliczną, jak i bez niej, powinny być włączone w ramy każdego oznaczania. Powinien zostać przeprowadzony wybór uwzględniania pozytywnych kontroli, które wykazują skuteczne działanie każdego oznaczania. W odniesieniu do oznaczeń wykorzystujących system metabolicznej aktywacji, substancja(-e) wzorcowa(-e) kontroli pozytywnych powinna(-y) zostać wybrana(-e) na podstawie typu wykorzystanego szczepu bakterii. Następujące substancje stanowią przykłady odpowiednich substancji pozytywnych kontroli w odniesieniu do oznaczania z metaboliczna aktywacją: Substancja Nr CAS Nr Einecs 9,10-dimetyloantracen 781-43-1 212-308-4 7,12-dimetylobenzo[a]antracen 57-97-6 200-359-5 Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 2-aminoantracen 613-13-8 210-330-9 Cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4 Cyklofosfamid monohydrat 6055-19-2 Następująca substancja jest odpowiednią kontrolą pozytywną w odniesieniu do metody redukcyjnej aktywacji metabolicznej: Substancja Nr CAS Nr Einecs Congo Red 573-58-0 209-358-4 2-aminoantracen nie powinien być wykorzystywany jako wyłączny wskaźnik skuteczności mieszaniny S9. Jeśli wykorzystywany jest 2-aminoantracen, każda partia S9 powinna być również charakteryzowana mutagenem, który wymaga metabolicznej aktywacji przez enzymy mikrosomowe, np. benzo[a]piren, dimetylobenzoantracen. Następujące substancje są przykładami specyficznych co do szczepu kontroli pozytywnych dla badań przeprowadzanych bez egzogenicznego systemu aktywacji metabolicznej: Substancje Nr CAS Einecs No Szczep Azydek sodu 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 i TA 100 2-nitrofluoren 607-57-8 210-138-5 TA 98 9-aminoakrydyna 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 i TA 97a ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 i TA 97a Hydronadtlenek kumenu 80-15-9 201-254-7 TA 102 Mitomycyna C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA i TA 102 N-etylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyna 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2uvrA i WP2uvrA (pKM101) 1-tlenek 4-nitrokwinolinu 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2uvrA i WP2uvrA (pKM101) Furylofuramid (AF2) 3688-53-7 Szczepy zawierające plazmidy Mogą być wykorzystane inne odpowiednie substancje kontroli pozytywnych. Wykorzystanie substancji powiązanych klasą z substancjami kontroli pozytywnych powinno zostać uwzględnione, jeżeli są one dostępne. Negatywne kontrole, składające się z samego rozpuszczalnika lub nośnika bez substancji badanej, oraz w innych przypadkach poddane działaniu w ten sam sposób jak grupy poddane działaniu substancji powinny zostać objęte kontrolą. Dodatkowo kontrole bez poddania działaniu substancji powinny być również wykorzystywane, chyba że istnieją historyczne dane dotyczące kontroli wykazujące, że brak szkodliwych lub mutagennych skutków wywoływanych wybranym rozpuszczalnikiem.

1.5.3. Procedura W odniesieniu do metody włączającej płytkę (1)(2)(3)(4), bez aktywacji metabolicznej, zazwyczaj 0,05 ml lub 0,1 ml stężenia badawczego, 0,1 ml świeżej hodowli bakteryjnej (zawierającej w przybliżeniu 108 zdolnych do życia komórek) oraz 0,5 ml sterylnego bufora jest mieszane z 2,0 ml pokrywającego agaru. W odniesieniu do oznaczania z aktywacją metaboliczną zazwyczaj 0,5 ml mieszaniny aktywacji metabolicznej zawierającej odpowiednie ilości pomitochondrialnej frakcji (w zakresie 5–30 % objętościowo w mieszaninie aktywacji metabolicznej) są mieszane z pokrywającym agarem (2,0 ml), łącznie z roztworem substancji badanej. Zawartości każdej z rurek są mieszane oraz wylewane na powierzchnię minimalnej płytki agarowej. Agar pokrywający krzepnie przed inkubacją. W odniesieniu do metody uprzedniej inkubacji (2)(3)(5)(6) substancja badana/roztwór badany jest uprzednio inkubowany ze szczepem badanym (zawierającym w przybliżeniu 108 zdolnych do życia komórek) oraz sterylnym roztworem buforowym lub systemem metabolicznej aktywacji (0,5 ml) zazwyczaj przez 20 minut lub dłużej w temperaturze 30–37 oC przed mieszaniem z pokrywającym agarem oraz polewając na powierzchnię minimalnej płytki agarowej. Zazwyczaj 0,05 lub 0,1 ml substancji badanej/roztworu badanego, 0,1 ml i bakterii oraz 0,5 ml mieszaniny S9 lub sterylnego roztworu buforowego są mieszane z 2,0 ml pokrywającego agaru. Rurki powinny zostać napowietrzone w trakcie uprzedniej inkubacji, wykorzystując wstrząsarkę. W odniesieniu do odpowiedniego szacowania zmienności trzykrotne pokrywanie płytkami powinno zostać wykorzystane przy każdej dawce badanej. Wykorzystanie podwójnego pokrywania płytkami jest dopuszczalne, jeżeli jest to naukowo uzasadnione. Okazjonalna strata płytki niekoniecznie czyni oznaczanie nieważnym. Gazowe lub lotne substancje powinny być badane odpowiednimi metodami, takimi jak np. w szczelnie zamkniętych naczyniach (12)(14)(15)(16).

1.5.4. Inkubacja Wszystkie płytki w danym oznaczeniu powinny być inkubowane w temperaturze 37 oC przez 48–72 godzin. Po okresie inkubacji podliczana jest liczba powrotnych kolonii.

2. DANE

2.

2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW Dane powinny zostać przedstawione jako liczba kolonii przypadająca na płytkę. Liczba powrotnych kolonii zarówno w płytkach negatywnych (kontrola rozpuszczalnikowa oraz kontrola bez poddania działaniu substancji, jeżeli zostały wykorzystane), jak i pozytywnych kontroli powinny zostać również podane. Podlicza się poszczególne płytki, średnia liczba powrotnych kolonii przypadająca na płytkę powinna zostać przedstawiona w odniesieniu do substancji badanej oraz pozytywnej i negatywnej (bez poddania działaniu substancji badanej i/lub rozpuszczalnikowej) kontroli. Nie istnieje wymóg jasnej reakcji pozytywnej w odniesieniu do weryfikacji. Niejednoznaczne wyniki powinny zostać wyjaśnione w drodze dalszych badań, w szczególności z wykorzystaniem modyfikacji warunków doświadczalnych. Wyniki negatywne muszą zostać potwierdzone na zasadzie jednostkowych przypadków. Modyfikacja parametrów badawczych w celu poszerzenia zakresu ocenionych warunków powinna zostać rozważona w dalszych doświadczeniach. Parametry badawcze, które mogą być zmodyfikowane, obejmują zakres stężenia, metodę poddania działaniu substancji badanej (włączenie płytek lub uprzednia inkubacja) oraz warunki aktywacji metabolicznej.

2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak związany z dawką wzrost ilości powrotnych kolonii powyżej zakres badanych i/lub odtwarzalności przy jednym lub większej ilości stężeń, przypadających na płytkę w przynajmniej jednym szczepie z lub bez systemu aktywacji metabolicznej. Biologiczne znaczenie wyników powinno zostać wzięte pod uwagę w pierwszej kolejności. Metody statystyczne mogą zostać wykorzystane jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (24). Jednakże znaczenie statystyczne nie powinno być jedynym czynnikiem określającym w odniesieniu do reakcji pozytywnej. Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spełniają powyższych kryteriów, uważana jest za niemutagenną w tym badaniu. Chociaż większość doświadczeń będzie dawało w jasny sposób pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych będzie wykluczał dokonanie ostatecznej oceny dotyczącej aktywności badanej substancji. Wyniki mogą pozostać niejednoznaczne lub sporne niezależnie od liczby powtórzonych doświadczeń. Wyniki pozytywne z badania mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych wskazują, że substancja badana wywołuje mutacje punktowe przez zastąpienie lub mutacje fazy odczytu w genomie albo Salmonella typhimurium i/lub Escherichia coli. Wyniki negatywne wskazują, że w warunkach badawczych substancja badana nie jest mutagenna w badanym gatunku.

3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ

3. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

Rozpuszczalnik/nośnik:

uzasadnienie wyboru rozpuszczalnika/nośnika,

rozpuszczalność oraz stabilność substancji w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli jest znana.

Szczepy:

wykorzystane szczepy,

liczba komórek przypadająca na kulturę,

właściwości szczepu.

Warunki badania:

ilość substancji badanej przypadająca na płytkę (mg/płytkę lub μl/płytkę) wraz z racjonalnym uzasadnieniem wyboru dawki i liczby płytek przypadającej na stężenie,

wykorzystane podłoże,

rodzaj oraz skład systemu aktywacji metabolicznej, w tym dopuszczalność kryteriów,

procedura poddania działaniu substancji badanej,

Wyniki:

oznaki toksyczności,

oznaki wytrącania,

liczba poszczególnych płytek,

średnia liczba powrotnych kolonii przypadających na kolonię oraz standardowe odchylenie,

relacja miedzy dawką a reakcją, w miarę możliwości,

analizy statystyczne, jeżeli istnieją,

dane dotyczące równoległych oraz kontroli negatywnych i pozytywnych (rozpuszczalnik/nośnik), wraz z zakresami, średnimi oraz standardowymi odchyleniami,

dane dotyczące historycznych kontroli negatywnych i pozytywnych, rozpuszczalnik/nośnik), wraz z zakresami, średnimi oraz standardowymi odchyleniami.

Omówienie wyników.

Wnioski.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)

ODNIESIENIA Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347–364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173–215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217–233. Kier, L. D., Brusick D.J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69–240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, pp. 91–96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, w: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273–285. Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Muta tion Assays, w: Basic Mutagenicity TestS: UKEMS Part 1 Revised, ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13–61. Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, pp. 167–177. Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, pp. 33–42. Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, w: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141–161. Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453–465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335–344. Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33–47. Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2–141. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249–258. Hughes, T.J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421–441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (19 79), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780–3782. Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961–4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285–291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, w: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85–88. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-inducedS9 ininvitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175–177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343–350. Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83–91. Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, w: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D.J., Cambridge University Press, pp. 28–65.

B.15. BADANIE MUTAGENNOŚCI I BADANIE PRZESIEWOWE NA RAKOTWÓRCZOŚĆ MUTACJA GENU — SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.15.

1. METODA

1.

1.1. WSTĘP Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.2. DEFINICJE Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ Odmiana haploidalnych i diploidalnych szczepów bakterii drożdży Saccharomyces cerevisiae może zostać użyta w celu dokonania pomiaru produkcji mutacji genu wywołanych czynnikami chemicznymi z udziałem oraz bez aktywacji metabolitycznej. Używane były wczesne systemy mutacji w szczepach haploidalnych, takie jak pomiar mutacji od czerwonych mutantów wymagających do wzrostu adeniny (ade-1, ade-2) do białych mutantów z podwójną mutacją adeninową oraz selektywne systemy, takie jak indukcja oporności na kanawainę i cykloheksimid. Najszerzej uznawany system mutacji wstecznych (rewersji) wymaga użycia haploidalnego szczepu XV 185–14C, posiadający nonsensowną mutację ochre ade 2–1, arg 4–17, lys 1–1 i trp 5–48, który może rewertować głównie przez mutacje zastępcze indukujące mutacje specyficzne co do miejsca lub mutacje supresora ochre. XV 185-14C posiada także marker his 1–7, niezmysłową mutację, która może rewertować głównie przez mutacje zewnątrzgenowe, i marker hom 3–10 rewertowany przez mutageny powodujące zmianę fazy odczytu. Wśród diploidalnych szczepów S. cerevisiae jedynym szeroko używanym szczepem jest D7, który jest homozygotyczny względem ilv 1–92.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.

1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.6. Przygotowania

Roztwory testowanych substancji chemicznych i próbki kontrolne powinny być przygotowywane tuż przed testem, przy użyciu odpowiednich nośników. W przypadku związków organicznych, które nie są rozpuszczalne w wodzie, należy używać nie więcej niż 2-procentowych (objętościowo) roztworów rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol, aceton, czy dimetylosulfotlenek (DMSO). Końcowe stężenie nośnika nie powinno znacząco wpływać na żywotność komórek i charakterystykę wzrostu.

Aktywacja metaboliczna

Komórki należy poddać oddziaływaniu testowych substancji chemicznych zarówno w przypadku obecności, jak i braku obecności właściwego egzogenicznego systemu aktywacji metabolicznej. Najpowszechniej używanym systemem jest współczynnik uzupełniony postmitochondrialną frakcją z wątrób gryzoni wcześniej przebadanych enzymem wywołującym czynniki. Wykorzystanie innych gatunków, tkanek, postmitochondrialnych frakcji lub procedur również może być właściwe dla aktywacji matabolicznej.

Warunki badania

Szczepy testowe

Haploidalny szczep XV185–14C i diploidalny szczep D7 są najczęściej używanymi szczepami w badaniach mutacji genu. Inne szczepy również mogą być właściwe.

Pożywka do hodowli szczepu

Wykorzystuje się właściwe pożywki do hodowli szczepu celem ustalenia liczby komórek, które zachowały żywotność i komórek zmutowanych.

Stosowanie kontroli pozytywnej i negatywnej

Próbki kontrolne pozytywne, niepoddane działaniu substancji i z dodatkiem rozpuszczalnika, muszą być przygotowane jednocześnie. Odpowiednie substancje do kontroli pozytywnej powinny być użyte na zakończenie każdej mutacji.

Stężenie do celów ekspozycji

Należy użyć co najmniej pięć odpowiednio rozmieszczonych stężeń substancji testowej. W odniesieniu do substancji toksycznych, najwyższa wielkość testowego stężenia nie powinna obniżać liczby komórek, które zachowały żywotność poniżej poziomu 5–10 %. Odpowiednio, należy zbadać substancje rozpuszczalne w wodzie do granicy ich rozpuszczalności, wykorzystując właściwe procedury. W odniesieniu do nietoksycznych substancji łatwo rozpuszczalnych w wodzie, najwyższe stężenie należy ustalić dla każdego przypadku oddzielnie.

Warunki inkubacji

Płytki inkubują się cztery do siedmiu dni w temperaturze 28–30 oC bez dostępu światła.

Częstotliwość mutacji samorzutnej.

Należy użyć subkultury z normalnym zakresem częstotliwości mutacji samorzutnej.

Liczba replikacji

Należy użyć co najmniej trzech szalek replikacji na dane stężenie dla oznaczenia prototrofów produkowanych przez mutację genu i żywotności komórki. W przypadku badań z wykorzystaniem znaczników takich jak horn 3–10 o niskim wskaźniku mutacji liczba szalek musi zostać powiększona w celu dostarczenia istotnych danych statystycznych.

Procedura

Badanie szczepów S. cerevisiae zazwyczaj przeprowadzane jest według procedury badania w środowisku płynnym włączając albo komórki stacjonarne albo wzrostowe. Badania wstępne należy przeprowadzić na komórkach wzrostowych: 1–5 × 107 komórek/ml jest poddanych ekspozycji na testową substancję chemiczną przez 18 godzin przy temperaturze 28–37 oC ze wstrząsaniem; podczas czynności badawczych, w odpowiednich przypadkach, dodawana jest odpowiednia ilość substancji systemu aktywacji metabolicznej. Na zakończenie badań komórki poddawane są odwirowaniu, oczyszczaniu i umieszczeniu na właściwej pożywce do hodowli szczepu. Po okresie inkubacji płytki poddawane są analizie w celu ustalenia ilości komórek, które zachowały żywotność i komórek wywołujących mutację genu. Jeżeli pierwsze badanie daje negatywny wynik, następne doświadczenie powinno być przeprowadzane z użyciem komórek znajdujących się w fazie stacjonarnej. Jeżeli pierwsze badanie daje wynik pozytywny, to potwierdzane jest następnym, niezależnym badaniem.

2. DANE Dane należy przedstawić w formie tabeli, wskazując liczbę zliczonych kolonii, liczbę mutantów, liczbę komórek żywych i mutantów. Wszystkie wyniki należy potwierdzić w odpowiednim niezależnym badaniu. Dane należy ocenić za pomocą właściwych metod statystycznych.

3. SPRAWOZDANIE

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:

użyty szczep,

warunki testu: komórki w fazie stacjonarnej bądź w fazie wzrostu, skład pożywki, temperatura i czas inkubacji, system aktywacji metabolicznej,

warunki badania: wielkość stężenia substancji podczas ekspozycji na jej działanie, procedura i czas trwania badania, temperatura zastosowana do badania, pozytywne i negatywne kontrole,

liczba zliczonych kolonii, liczba mutantów, liczba komórek żywych i mutantów, stosunek dawki do reakcji w odpowiednich przypadkach, dane oceny statystycznej,

analiza wyników,

interpretacja wyników.

3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

4. ODNIESIENIA Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

B.16. BADANIE REKOMBINACJI GENETYCZNEJ – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.16.

1. METODA

1.

1.1. WSTĘP Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.2. DEFINICJE Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ Mitotyczna rekombinacja u Saccharomyces cerevisiae może być wykryta między genami (lub ogólnie między genem a jego centromerem) i wewnątrz genów. Ten pierwszy przypadek posiada nazwę mitotyczne crossing-over i generuje symetryczny produkt, podczas gdy drugi przypadek najczęściej generuje niesymetryczne produkty i posiada nazwę konwersja genów. Zajście crossing-over jest widoczne dzięki wytwarzaniu się kolonii homozygot recesywnych, lub sektorów wytworzonych w szczepach heterozygotycznych, podczas gdy konwersja genów uwidacznia się przez wytworzenie prototroficznych rewertantów w auksotroficznych, heteroallelicznych szczepach posiadających dwa różne nieprawidłowe allele tego samego genu. Do detekcji mitotycznej konwersji genów najczęściej używa się szczepów D4 (heteroalleliczny pod względem ade 2 i trp 5), D7 (heteroalleliczny pod względem trp 5), BZ34 (heteroalleliczny pod względem arg 4) i JD1 (heteroalleliczny pod względem his 4 i trp 5). Mitotyczne crossing-over, którego skutkiem jest powstanie czerwonych i różowych sektorów komórek homozygotycznych, może być wykrywane przy użyciu szczepów D5 lub D7 (które również wskazują na mitotyczną konwersję genów i wsteczną mutację przy ilv 1–92). Obydwa szczepy są heteroalleliczne pod względem odpowiadających sobie alleli ade 2.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.

1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.6. Przygotowania

Roztwory testowych substancji chemicznych i próbki kontrolne powinny być przygotowywane tuż przed badaniem, przy użyciu odpowiednich nośników. W przypadku związków organicznych, które nie są rozpuszczalne w wodzie, należy używać nie więcej niż 2 % (objętościowo) roztworów rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol, aceton, czy dimetylosulfotlenek (DMSO). Końcowe stężenie nośnika nie powinno w sposób znaczący wpływać na żywotność komórek i charakterystykę wzrostu.

Aktywacja metaboliczna

Warunki badania

Badane szczepy

Najczęściej wykorzystywanymi szczepami są szczepy diploidalne D4, D5, D7 i JD1. Inne szczepy również mogą być właściwe.

Pożywka do hodowli szczepu

Wykorzystuje się właściwe pożywki do hodowli szczepu celem ustalenia liczby komórek pozostałych przy życiu i częstotliwości genetycznych rekombinacji.

Użycie kontroli pozytywnej i negatywnej

Stężenie ekspozycji

Należy użyć co najmniej pięć odpowiednio rozmieszczonych stężeń substancji testowej. Należy uwzględnić między innymi takie czynniki, jak cytotoksyczność i rozpuszczalność. Najniższe stężenie nie może wpływać na żywotność komórki. W odniesieniu do substancji toksycznych najwyższa wielkość badanego stężenia nie powinna obniżać liczby komórek, które zachowały żywotność poniżej poziomu 5–10 %. Odpowiednio, należy zbadać substancje rozpuszczalne w wodzie do granicy ich rozpuszczalności, wykorzystując właściwe procedury. W odniesieniu do nietoksycznych substancji łatwo rozpuszczalnych w wodzie najwyższe stężenie należy ustalić dla każdego przypadku oddzielnie. Komórki mogą zostać poddane oddziaływaniu substancji testowej albo w fazie stacjonarnej, albo podczas wzrastania przez okres do 18 godzin. Jednakże, w przypadku długotrwałych badań, kultury należy poddać badaniu mikroskopowemu w celu wykrycia formacji zarodnika, którego obecność unieważnia badanie.

Warunki inkubacji

Płytki są inkubowane w ciemności od czterech do siedmiu dni w temperaturze 28–30 oC. Płytki użyte do oznaczenia czerwonych i różowych sektorów homozygot wytworzonych przez mitotyczny crossing-over powinny być przechowywane w lodówce (w temperaturze około 4 oC) przez dalsze 1–2 dni przed oznaczeniem wyników, aby umożliwić rozwój odpowiednich zabarwionych kolonii.

Częstotliwość samorzutnej rekombinacji genetycznej

Należy użyć subkultur z normalnym zakresem częstotliwości samorzutnej rekombinacji genetycznej.

Liczba replikacji

Powinny być użyte co najmniej trzy szalki na określone stężenie, w celu oznaczenia prototrofów wytworzonych za pomocą mitotycznej konwersji genów i w celu oznaczenia żywotności komórek. W przypadku oznaczania recesywnych homozygot wytworzonych przez mitotyczny crossing-over liczba płytek powinna być zwiększona, aby dostarczyć odpowiednią liczbę kolonii.

Procedura

Badanie szczepów S. cerevisiae zazwyczaj przeprowadzane jest według procedury badania w środowisku płynnym, włączając komórki stacjonarne albo wzrostowe. Początkowe badania należy przeprowadzić na komórkach wzrostowych: 1–5 × 107 komórek/ml jest poddanych ekspozycji na testową substancję chemiczną przez 18 godzin przy temperaturze 28–37 oC ze wstrząsaniem; w okresie trwania badań, w odpowiednich przypadkach, dodawana jest odpowiednia ilość systemu aktywacji metabolicznej. Na zakończenie badań komórki poddawane są odwirowaniu, oczyszczaniu i umieszczane na właściwej pożywce do hodowli szczepu. Po okresie inkubacji płytki poddawane są analizie w celu ustalenia liczby komórek, które zachowały żywotność i komórek wywołujących mutację genu. Jeżeli pierwsze badanie daje wynik negatywny, następne doświadczenie powinno być przeprowadzane z użyciem komórek znajdujących się w fazie stacjonarnej. Jeżeli pierwsze badanie daje wynik pozytywny, to potwierdzane jest następnym, niezależnym badaniem.

2. DANE Dane powinny być przedstawione w formie tabeli, która wskazuje liczbę zliczonych kolonii, ilość rekombinantów, liczbę komórek żywych i częstotliwość wystąpienia rekombinacji. Wyniki powinny być potwierdzone niezależnym badaniem. Dane powinny być ocenione przy użyciu odpowiednich metod statystycznych. Dane należy ocenić za pomocą właściwych metod statystycznych.

3. SPRAWOZDANIE

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:

użyty szczep,

warunki badań: komórki fazy stacjonarnej lub wzrostowej, skład pożywki, temperatura i okres trwania inkubacji, system aktywacji metabolicznej,

warunki badania: wielkość stężenia substancji, procedura i czas trwania badania, temperatura zastosowana do badania, pozytywne i negatywne grupy kontrolne,

liczba zliczonych kolonii, liczba rekombinantów, liczba komórek żywych i częstotliwość wystąpienia rekombinacji, w odpowiednich przypadkach stosunek dawki do reakcji, dane analizy statystycznej,

analiza wyników,

interpretacja wyników.

3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

4. ODNIESIENIA Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

B.17. MUTAGENNOŚĆ – BADANIE MUTACJI GENETYCZNEJ IN VITRO U SSAKÓW

B.17.

1. METODA Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 476, badania mutacji genetycznej in vitro u ssaków (1997).

1.

1.1. WPROWADZENIE Badanie mutacji genetycznej in vivo u ssaków może być wykorzystane w celu wykrycia mutacji genu wywołanej przez substancje chemiczne. Odpowiednie linie komórkowe, włącznie z L5178Y mysimi komórkami chłoniaków, linie komórkowe chomika chińskiego CHO, CHO-AS52 oraz V79, oraz ludzkie komórki TK6 limfoblastoidu (1). W tych liniach komórkowych najbardziej powszechnie wykorzystywane są pomiary genetycznych punktów końcowych przy kinazie tymidynowej (TK) oraz transferazie fosforybozylowej hypoksantyny-guaniny (HPRT) oraz transgenie transferazy fosforybozylowej ksantyny-guaniny (XPRT). Badania mutacji TK, HPRT oraz XPRT wykrywają różne widma zdarzeń genetycznych. Autosomalne umiejscowienie TK oraz XPRT może pozwolić na wykrycie zdarzeń genetycznych (np. dużych delecji) nie wykrywanych przy HPRT locus na X chromosomach (2)(3)(4)(5)(6). W badaniu mutacji genetycznej in vitro u ssaków, mogą być wykorzystane hodowle ustanowionych linii komórkowych lub szczepy komórkowe. Wykorzystywane komórki wybierane są na podstawie zdolności do wzrostu w hodowli oraz stabilności spontanicznych częstotliwości mutacji. Badania przeprowadzane in vitro wymagają ogólnie wykorzystania egzogenicznego źródła aktywacji metabolicznej. Ten system aktywacji metabolicznej nie może naśladować w całości warunków in vivo u ssaków. Powinna zostać zachowana ostrożność w celu uniknięcia warunków, które prowadziłyby do wyników nie-odzwierciedlających wrodzonej mutagenności. Pozytywne wyniki, które nie odzwierciedlają wrodzonej mutagenności, mogą wynikać ze zmian w pH, osmolalności lub wysokiego poziomu cytotoksyczności (7). Badanie to jest wykorzystywane w celu wykrycia obecności możliwych mutagenów oraz czynników rakotwórczych dla ssaków. Wiele związków, które są pozytywne w tym badaniu są czynnikami rakotwórczymi dla ssaków, jednakże brak idealnego powiązania między tym badaniem oraz rakotwórczością. Powiązanie to jest zależne od klasy substancji chemicznej oraz istnieje wzrastający dowód na to, że istnieją czynniki rakotwórcze, które nie są wykrywane przez to badanie, ponieważ wydaje się, iż działają one przez inne, niegenotoksyczne mechanizmy lub mechanizmy, których brak w komórkach bakteryjnych (6). Zob. także Ogólne wprowadzenie do części B

1.2. DEFINICJE Mutacja powodująca zmianę bądź utratę aktywności białka: mutacja genu z rodzaju macierzystego mutanta, który powoduje zmianę lub stratę aktywności enzymatycznej funkcji zakodowanego białka. Mutageny powodujące substytucję: substancje, które powodują zastąpienie jednego lub wielu par zasad DNA. Mutageny powodujące mutacje zmiany fazy odczytu: Substancje, które powodują dodanie lub skreślenie pojedynczej lub wielu par nukleotydów w cząstce DNA. Czas ekspresji fenotypowej: okres, w trakcie którego produkty genu niezmienionego są oddzielane od świeżo zmutowanej komórki. Częstotliwość mutacji: liczba zaobserwowanych zmutowanych komórek podzielona przez liczbę komórek zdolnych do życia. Względny wzrost całkowity: wzrost liczby komórek w czasie w porównaniu z populacją kontrolną komórek; obliczony jako stosunek względnego wzrostu czasu skuteczności kloningu negatywnych kontroli względem kontroli negatywnych. Względny wzrost zawieszania: wzrost liczby komórek powyżej okresu ekspresji względem kontroli negatywnych. Zdolność do życia: skuteczność kloningu komórek poddanych działaniu substancji w czasie umieszczania w warunkach selektywnych po okresie ekspresji. Przeżywanie: skuteczność kloningu komórek poddanych działaniu substancji, kiedy są umieszczane na koniec okresu poddawania działaniu substancji; przeżywanie zazwyczaj wyrażane jest w odniesieniu do przeżywania populacji komórek kontrolnych.

1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ Brakujące komórki w kinazie tymidynowej (TK) z powodu mutacji TK+/- → TK-/- są odporne na skutki cytotoksyczne substancji analogicznej pirymidynie-trifluorotymidynie (TFT). Zdrowe komórki kinazy tymidynowej są wrażliwe na TFT, która powoduje wstrzymanie komórkowej przemiany materii oraz zatrzymuje dalsze dzielenie się komórek. W ten sposób zmutowane komórki są w stanie rozmnażać się wege-tatywnie w obecności TFT, podczas gdy normalne komórki, które zawierają kinazę tymidynową, nie są do tego zdolne. Podobnie komórki, którym brakuje HPRT lub XPRT, są wybierane w oparciu o odporność na 6-tioguaninę (TG) lub 8-azaguaninę (AG). Właściwości substancji badanej powinny być ostrożnie wzięte pod uwagę, jeżeli zasadowy element analogiczny lub związek związany z selektywnym czynnikiem jest badany w ramach jakiegokolwiek badania mutacji genów u ssaków. Na przykład jakakolwiek podejrzewana toksyczność selektywna ze strony substancji badanej w odniesieniu do komórek zmutowanych i niezmutowanych powinna zostać zbadana. W ten sposób przeprowadzenie wyboru system/czynnik musi być potwierdzone, badając substancje chemiczne strukturalnie zawiązane z czynnikami selektywnymi (8). Komórki w zawiesinie lub w hodowli jednocząsteczkowej są poddawane działaniu substancji badanej, zarówno z aktywacją, jak i bez aktywacji metabolicznej, przez odpowiedni okres oraz hodowane wtórnie w celu oznaczenia cytotoksyczności oraz w celu dopuszczenia do ekspresji fenotypowej przed wybraniem mutanta (9)(10)(11)(12)(13). Cytotoksyczność jest zazwyczaj oznaczana przez pomiar odpowiedniej skuteczności kloningu (przeżywania) lub odpowiedni wzrost hodowli ogółem po okresie poddania działaniu substancji badanej. Hodowle, które zostały poddane działaniu substancji badanej, są utrzymywane w podłożu wzrostu przez wystarczający okres czasu, charakterystyczny dla każdego wybranego locus oraz rodzaju komórki, w celu dopuszczenia do prawie optymalnej ekspresji fenotypowej wywołanych mutacji. Częstotliwość mutacji jest oznaczana przez osadzanie znanej ilości komórek w podłożu zawierającym czynnik selektywny w celu wykrycia zmutowanych komórek oraz w podłożu bez czynnika selektywnego w celu oznaczenia skuteczności kloningu (zdolność do życia). Po odpowiednim okresie inkubacji, hodowle są podliczane. Częstotliwość mutacji jest uzyskiwana z ilości hodowli mutantów w selektywnym podłożu oraz ilości hodowli w podłożu nieselektywnym.

1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.

1.4.1. Preparaty

1.4.1.

1.4.1.1. Komórki Różnorodność rodzajów komórek jest dostępna do wykorzystania w tym badaniu, łącznie z subklonami L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 lub komórkami TK6. Rodzaje komórek wykorzystane w tym badaniu powinny posiadać wykazaną czułość na mutanty chemiczne, wysoką skuteczność kloningu oraz stabilną częstotliwość spontanicznej mutacji. Komórki powinny być sprawdzone w odniesieniu do zanieczyszczenia mykoplazmy oraz w przypadku zanieczyszczenia nie powinny być wykorzystywane. Badanie powinno być tak opracowane, aby miało wcześniej oznaczoną czułość. Liczba wykorzystanych komórek, hodowli oraz stężeń substancji badanej powinna odzwierciedlać te określone parametry (14). Minimalna liczba zdolnych do życia komórek, które przeżywają poddanie działaniu substancji oraz wykorzystywanych na każdym etapie w badaniu, powinna być oparta na częstotliwości mutacji spontanicznej. Ogólną wskazówką jest wykorzystanie liczby komórek, która jest przynajmniej 10-krotnością odwrotności częstotliwości mutacji spontanicznej. Jednakże zaleca się wykorzystanie przynajmniej 106 komórek. Odpowiednie dane historyczne dotyczące wykorzystanego systemu komórkowego powinny być dostępne w celu wskazania spójnego sposobu przeprowadzenia badania.

1.4.1.2. Warunki dotyczące podłoża oraz hodowli Odpowiednie podłoże hodowli oraz warunki inkubacji (naczynia do hodowli, temperatura, stężenie CO2 oraz wilgotność) powinny być wykorzystane. Podłoże powinno zostać wybrane według systemu selektywnego oraz wykorzystanego rodzaju komórek w badaniu. Jest w szczególności ważne, aby zostały wybrane warunki hodowli, które zapewniają optymalny wzrost komórek w trakcie okresu ekspresji oraz zdolności do formowania kolonii zarówno komórek zmutowanych, jak i niezmutowanych.

1.4.1.3. Przygotowanie hodowli Komórki są rozmnażane z hodowli podstawowych, osadzonych w podłożu hodowli oraz inkubowanych w temperaturze 37 oC. Przed wykorzystaniem w tym badaniu, może istnieć potrzeba oczyszczenia hodowli z istniejących już wcześniej komórek zmutowanych.

1.4.1.4. Aktywacja metaboliczna Komórki powinny zostać poddane działaniu substancji badanej zarówno w obecności, jak i w nieobecności odpowiedniego systemu aktywacji metabolicznej. Najbardziej powszechnie wykorzystywanym systemem jest uzupełniana współczynnikiem frakcja pomitochondrialna (S9) przygotowana z wątroby gryzoni, otrzymujących czynniki pobudzające enzymy takie jak Aroklor 1254 (15)(16)(17)(18) lub kombinacja fenobarbitonu oraz β nafoflavonu (19)(20). Frakcja pomitochondrialna jest zazwyczaj wykorzystywana w stężeniach w zakresie 1–10 % objętościowo w końcowym podłożu badawczym. Wybór oraz warunki systemu aktywacji metabolicznej mogą być uzależnione od klasy badanej substancji chemicznej. W niektórych przypadkach właściwe może być wykorzystanie więcej niż jednego stężenia frakcji pomitochondrialnej. Ilość rozwijania się komórek, w tym budowa genetycznie skonstruowanych linii komórkowych stanowiących ekspresję szczególnych enzymów aktywujących, może przewidywać potencjał aktywacji endogenicznej. Wybór wykorzystywanych linii komórkowych powinien być naukowo uzasadniony (np. przez relewancję izoenzymu cytochromu P450 dla przemiany materii substancji badanej).

1.4.1.5. Preparat substancji badanej Stałe substancje badane powinny zostać rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczone, jeżeli jest to odpowiednie, zanim komórki zostaną poddane działaniu substancji badanej. Płynne substancje badane mogą być dodawane bezpośrednio do systemu badawczego i/lub rozcieńczane przed poddaniem działaniu substancji badanej. Powinny zostać wykorzystane świeże preparaty, chyba że dane dotyczące stabilności wykazują dopuszczalność ich składowania.

1.4.2. Warunki badania

1.4.2.

1.4.2.1. Rozpuszczalnik/nośnik Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien mieć możliwości reagowania chemicznego z substancją badaną oraz powinien być zgodny z przeżywaniem komórek oraz aktywnością S9. Jeśli inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki są wykorzystywane, ich włączenie do doświadczenia powinno być wsparte danymi wskazującymi ich zgodność. Zaleca się, o ile to możliwe, aby w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/nośników. Badając substancje niestabilne w wodzie, wykorzystane organiczne rozpuszczalniki powinny być wolne od wody. Woda może zostać usunięta przez dodanie sita cząsteczkowego.

1.4.2.2. Stężenia poddania działaniu substancji Wśród kryteriów, które mają zostać uwzględnione, oznaczając najwyższe stężenia, znajduje się cytotoksyczność, rozpuszczalność w systemie badawczym, oraz zmiany pH lub osmolalności. Cytotoksyczność powinna być oznaczana z aktywacją metaboliczną oraz bez aktywacji metabolicznej w głównym doświadczeniu, wykorzystując odpowiednie wskazanie integralności komórki oraz wzrostu, takie jak odpowiedni kloning (przeżywanie) lub odpowiedni wzrost całkowity. Użyteczne może być oznaczenie cytotoksyczności oraz rozpuszczalności w doświadczeniu wstępnym. Powinny zostać wykorzystane przynajmniej cztery nadające się do analizy stężenia. W przypadku gdy istnieje cytotoksyczność, stężenia te powinny obejmować zakres od maksymalnej do minimalnej toksyczności lub jej braku, będzie to zazwyczaj oznaczać, że poziomy stężenia powinny zostać oddzielone przez nie więcej niż jeden czynnik między 2 a √10. Jeżeli maksymalne stężenie jest oparte na cytotoksyczności, wynikiem tego powinien być wzrost w przybliżeniu 10–20 % (ale nie mniejszy niż 10 %) względnego przeżywania (względna skuteczność kloningu) lub względny wzrost. W odniesieniu do względnie nietoksycznych substancji maksymalne stężenie badania powinno wynosić 5 mg/ml, 5 μl/ml, lub 1,01 M, w zależności od tego, które ze stężeń jest najniższe. Względnie nierozpuszczalne substancje powinny być badane do granic ich rozpuszczalności lub poza granice rozpuszczalności w warunkach hodowli. Dowody na nierozpuszczalność powinny być oznaczane w końcowym podłożu podania substancji, działaniu której komórki są poddawane. Użyteczna może być ocena rozpuszczalności na początku oraz na końcu podawania substancji, ze względu na to, że rozpuszczalność może się zmieniać w czasie trwania poddania działaniu substancji w systemie badawczym w wyniku obecności komórek, S9, surowicy itd. Nierozpuszczalność może być wykryta przez wykorzystanie oka nieuzbrojonego. Strącanie się nie powinno zakłócać oceny.

1.4.2.3. Kontrole Równoległe pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik lub nośnik) kontrole, zarówno z aktywacją metaboliczną, jak i bez aktywacji metabolicznej powinny zostać objęte każdym doświadczeniem. Jeżeli wykorzystywana jest aktywacja metaboliczna, pozytywna kontrolna substancja chemiczna powinna być substancją, która wymaga aktywacji w celu wywołania reakcji mutagennej. Przykłady pozytywnych substancji kontrolnych obejmują: Warunki aktywacji metabolicznej Locus Substancja Nr CAS Nr Einecs Brak egzogenicznej aktywacji metabolicznej HPRT Etyl metanosulfonowy 62-50-0 200-536-7 Etyl nitrozomocznikowy 759-73-9 212-072-2 TK (małe i duże hodowle) Metyl metanosulfonowy 66-27-3 200-625-0 XPRT Etyl metanosulfonowy 62-50-0 200-536-7 Etyl nitrozomocznikowy 759-73-9 212-072-2 Obecność egzogenicznej aktywacji metabolicznej HPRT 3-Metylocholantren 56-49-5 200-276-4 N-Nitrosodimethylamine 62-75-9 200-549-8 7,12-antracen dimetylobenzenu 57-97-6 200-359-5 TK (małe i duże hodowle) Cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4 Cyklofosfamidomonohydrat 6055-19-2 Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 3-Metylocholantren 56-49-5 200-276-5 XPRT N-Nitrozodometyloamina (dla wysokich poziomów S-9) 62-75-9 200-549-8 Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 Mogą zostać wykorzystane inne odpowiednie wzorcowe pozytywne substancje kontrolne, np. jeśli laboratorium posiada dane historyczne w oparciu o 5-bromo 2'-deoksyurydynę (nr CAS 59-14-3, nr Einecs 200-415-9), ta substancja wzorcowa mogłaby zostać również wykorzystana. Powinno zostać uwzględnione wykorzystanie pozytywnych substancji kontrolnych związanych z klasą substancji chemicznych, jeżeli są dostępne. Powinny zostać objęte badaniem negatywne kontrole, składające się z samego rozpuszczalnika lub nośnika w podłożu, do którego dodawana jest substancja, oraz w odniesieniu do których stosuje się identyczne działania jak w odniesieniu do grupy poddanej działaniu substancji badanej. Dodatkowo kontrole bez poddania działaniu substancji powinny być również wykorzystane, chyba że istnieją historyczne dane dotyczące kontroli wykazujące, że wybrany rozpuszczalnik nie wywołuje żadnych szkodliwych lub mutagennych skutków.

1.4.3. Procedura

1.4.3.

1.4.3.1. Poddawanie działaniu substancji badanej Rozmnażające się komórki powinny zostać poddane działaniu substancji badanej zarówno z aktywacją metaboliczną, jak i bez aktywacji metabolicznej. Poddanie działaniu substancji powinno trwać odpowiedni okres czasu (zazwyczaj skuteczny jest okres 3–6 godzin). Czas poddania działaniu substancji badanej może zostać przedłużony na okres jednego lub większej liczby cykli komórkowych. Albo komórki poddawane pojedynczo działaniu substancji, albo poddawane podwojonemu działaniu substancji badanej mogą być wykorzystane przy każdym badanym stężeniu. Jeżeli wykorzystywane są pojedyncze hodowle, ilość stężeń powinna zostać zwiększona w celu zapewnienia odpowiedniej ilości hodowli do analizy (np. przynajmniej osiem stężeń nadających się do analizy). Powinny zostać wykorzystane podwojone negatywne (rozpuszczalnik) hodowle kontrolne. Gazowe lub lotne substancje powinny być badane odpowiednimi metodami, takimi jak w szczelnie zamkniętych naczyniach do hodowli (21)(22).

1.4.3.2. Pomiar przeżywania, zdolności do życia oraz częstotliwości mutacji Na koniec okresu poddawania działaniu substancji komórki są wymywane oraz hodowane w celu oznaczenia przeżywania oraz w celu umożliwienia ekspresji genotypowej mutanta. Pomiar cytotoksyczności przez oznaczanie względnej skuteczności kloningu (przeżywanie) lub względny wzrost całkowity zazwyczaj rozpoczyna się po okresie poddawania działaniu substancji. Każdy locus posiada określony wymóg w celu dopuszczania do prawie optymalnej ekspresji fenotypowej nowo powstałych mutantów (HPRT oraz XPRT wymaga przynajmniej 6–8 dni, a TK przynajmniej 2 dni). Komórki są hodowane w podłożu z czynnikami selektywnymi lub bez czynników selektywnych w odniesieniu do oznaczania ilości mutantów oraz wydajności klonowania, odpowiednio. Pomiary zdolności do życia (wykorzystywane do obliczania częstotliwości mutacji) rozpoczynane są na koniec okresu ekspresji przez umieszczanie w nieselektywnym podłożu. Jeżeli substancja badana jest pozytywna w badaniu L5178Y TK+/-, powinno zostać przeprowadzone sortowanie według rozmiarów na przynajmniej jednej z badanych kolonii (najwyższe pozytywne stężenie) oraz na pozytywnych i negatywnych kontrolach. Jeżeli substancja badana jest negatywna w badaniu L5178Y TK+/-, powinno zostać przeprowadzone sortowanie według rozmiarów na negatywnych i pozytywnych kontrolach. W badaniach wykorzystujących TK6TK+/- może być również przeprowadzone sortowanie według rozmiarów kolonii.

2. DANE

2.

2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW Dane powinny obejmować oznaczenie cytotoksyczności oraz zdolności do życia, liczbę koloni oraz częstotliwości mutacji w odniesieniu do hodowli, które zostały poddane działaniu substancji oraz hodowli kontrolnych. W przypadku pozytywnej reakcji w badaniu L5178Y TK+/-, kolonie są oceniane wykorzystując kryteria małych oraz dużych kolonii na przynajmniej jednym stężeniu substancji badanej (najwyższe pozytywne stężenie) oraz na pozytywnych i negatywnych kontrolach. Charakter cytogenetyczny oraz charakter budowy cząsteczkowej mutantów, zarówno małych, jak i dużych kolonii, został szczegółowo zbadany (23)(24). W badaniu TK+/- kolonie są oceniane, wykorzystując kryteria normalnego wzrostu (duże) oraz wolnego wzrostu (małe) koloni (25). Zmutowane komórki, które najbardziej dotkliwie odczuły uszkodzenie genetyczne, przedłużyły podwajanie okresów, a zatem tworzą małe kolonie. Uszkodzenie to zazwyczaj waha się w zakresie od strat całego genu do kariotypów widocznych aberracji chromosomowych. Wprowadzenie mutantów małych kolonii zostało powiązane z substancjami chemicznymi, które wywołują całkowite aberracje chromosomowe (26). Mniej poważnie dotknięte zmutowane komórki wzrastają w zakresie podobnym do komórek macierzystych oraz tworzą duże kolonie. Powinno zostać podane przeżywanie (względna skuteczność kloningu) lub względny wzrost całkowity. Częstotliwość mutacji powinna być wyrażona jako liczba komórek mutantów przypadających na liczbę komórek przeżywających. Powinny zostać dostarczone dane dotyczące poszczególnych hodowli. Dodatkowo wszelkie dane powinny zostać podsumowane w formie tabelarycznej. Nie istnieje wymóg sprawdzania jasnej reakcji pozytywnej. Niejednoznaczne wyniki powinny zostać wyjaśnione przede wszystkim wykorzystując modyfikacje warunków doświadczalnych. Wyniki negatywne muszą zostać potwierdzone na zasadzie jednostkowych przypadków. W przypadkach gdy potwierdzenie negatywnych wyników nie jest uznawane za niezbędne, powinno zostać zapewnione uzasadnienie. Modyfikacje parametrów badawczych w celu rozszerzenia zakresu ocenianych warunków powinno być rozważone w dalszych doświadczeniach w odniesieniu do niejednoznacznych lub negatywnych wyników. Parametry badawcze, które mogą zostać zmodyfikowane, obejmują zakres stężeń oraz warunki aktywacji metabolicznej.

2.2. OCENA I INTERPRETACJA WYNIKÓW Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak związany z dawką wzrost lub wzrost odtwarzalności częstotliwości mutacji. Biologiczne znaczenie wyników powinno zostać wzięte pod uwagę w pierwszej kolejności. Metody statystyczne mogą zostać wykorzystane jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (24). Znaczenie statystyczne nie powinno być jedynym czynnikiem określającym w odniesieniu do reakcji pozytywnej. Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spełniają powyższych kryteriów, uważana jest za niemutagenną w tym systemie. Chociaż większość doświadczeń będzie dawała jasne pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych będzie wykluczał dokonanie ostatecznej oceny dotyczącej aktywności substancji badanej. Wyniki mogą pozostać niejednoznaczne lub sporne niezależnie od liczby powtórzeń doświadczenia. Wyniki pozytywne z badania mutacji genetycznej u ssaków wskazują, że substancja badana wywołuje mutacje genowe w hodowanych komórkach. Największe znaczenie ma reakcja pozytywna stężenia. Wyniki negatywne wskazują, że w warunkach badawczych, substancja badana nie wywołuje mutacji genetycznych w wykorzystanych hodowanych komórkach ssaków.

3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ

3. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi obejmować następujące informacje:

Rozpuszczalnik/nośnik:

uzasadnienie wyboru rozpuszczlnika/nośnika,

rozpuszczalność oraz stabilność substancji w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli jest znana.

Komórki:

rodzaj oraz źródło komórek,

liczba hodowli komórek,

liczba przejść komórek, jeżeli ma zastosowanie,

metody utrzymania hodowli komórek, jeżeli mają zastosowanie,

brak mykoplazmy.

Warunki badania:

racjonalne uzasadnienie wyboru stężeń oraz liczby hodowli, w tym np. dane dotyczące cytotoksyczności oraz ograniczeń rozpuszczalności, jeżeli są dostępne,

stężenie CO2,

stężenie substancji badanej,

objętość nośnika oraz dodanej substancji,

temperatura inkubacji,

czas inkubacji,

czas trwania poddania działaniu substancji,

gęstość komórki w czasie poddania działaniu substancji,

rodzaj oraz skład systemu aktywacji metabolicznej, w tym kryteria dopuszczalności,

pozytywne i negatywne kontrole,

długość okresu ekspresji (w tym liczba sadzonych komórek oraz podhodowli i harmonogramy kar mienia, jeżeli stosowne),

czynniki selektywne,

kryteria uznania badania za pozytywne, negatywne lub niejednoznaczne,

metody wykorzystywane do wyliczenia liczby zdolnych do życia oraz zmutowanych komórek,

definicja kolonii, których rozmiary oraz typy są brane pod uwagę (łącznie z kryteriami w odniesieniu do małych oraz dużych kolonii, gdzie stosowne).

Wyniki:

oznaki toksyczności,

oznaki strącania,

dane dotyczące pH oraz osmolalności w trakcie poddania działaniu substancji badanej, jeżeli jest oznaczona,

rozmiar kolonii/hodowli, jeżeli jest oceniony, przynajmniej w odniesieniu do negatywnych oraz pozy tywnych kontroli,

dokładność laboratoryjna mająca na celu wykrycie mutantów małych kolonii/hodowli z systemem L5178Y TK+/-, gdzie stosowne,

relacja miedzy dawką a reakcją, w miarę możliwości,

analizy statystyczne, jeżeli istnieją,

dane dotyczące równoległych negatywnych (rozpuszczalniki/nośnik) oraz pozytywnych kontroli,

historyczne negatywne (rozpuszczalnik/nośnik) oraz pozytywne dane z zakresami, odchyleniami śred nimi oraz standardowymi,

częstotliwość mutacji.

Omówienie wyników.

Wnioski.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)

ODNIESIENIA Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindal, K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E. H. Y. and Malling H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306–1312. Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, pp. 467–485. Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394–403. Aaron, C. S., and Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT AssayS: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res. 223, pp. 121–128. Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, pp. 235–239. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, pp. 147–204. Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Muta tions in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225–251. Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical AgentS: A Report of Phase III of the U. S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17–36. Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N, Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C, Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135–141. Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid CellS: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9–17. Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191 -Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191- Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133–147. Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (19 84), Procedure for the L5178Y/TK+/- – TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, w: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239–268. Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, w: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, pp. 66–101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, pp. 365–373. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, pp. 347–364. Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK – Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res. 59, pp. 61–108. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173–215. Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, pp. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85–88. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91–103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795–801. Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51–55. Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C, Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluoronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK+/- – Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161–174. Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res. 229, pp. 89–102. Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- – 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, pp. 609–614.

B.18. USZKODZENIE I NAPRAWA DNA – NIEREGULARNA SYNTEZA DNA – KOMÓRKI SSAKÓW IN VITRO

B.18.

1. METODA

1.

1.1. WSTĘP Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.2. DEFINICJE Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ Test niezaplanowanej syntezy DNA (UDS) mierzy syntezę DNA po wycięciu i usunięciu odcinka DNA zawierającego obszar uszkodzony przez czynniki chemiczne lub fizyczne. Ten test jest oparty na inkorporacji tymidyny znakowanej trytem (3H-TdR) do DNA komórek ssaków, które nie znajdują się w fazie S cyklu komórkowego. Przyjęcie 3H-TdR może być oznaczone metodą autoradiografii lub zliczania w ciekłym scyntylatorze (LSC) DNA badanych komórek. Komórki ssaków w kulturach, o ile nie są to pierwotne hepatocyty szczura, są poddawane działaniu czynników testowych z obecnością lub bez obecności egzogennych systemów aktywacji metabolicznej. UDS może być także wykonywany w systemach in vivo.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.

1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.6. Przygotowania

Substancje testowe i próbki kontrolne bądź próbki odniesienia powinny być przygotowywane w pożywce wzrostowej, bądź rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich nośnikach, a następnie rozcieńczone w pożywce wzrostowej i użyte do oznaczenia. Końcowe stężenie nośnika nie powinno wpływać na żywotność komórki. Kultury hepatocytów szczura, ludzkich limfocytów lub ustalonych linii komórkowych (np. ludzkich diploidalnych fibroblastów) mogą być użyte do oznaczeń. Komórki należy poddać działaniu substancji testowej zarówno w obecności, jak i przy braku obecności właściwego systemu aktywacji metabolicznej.

Warunki badania

Liczba kultur

Konieczne jest wykorzystanie w każdym punkcie badania co najmniej dwóch kultur komórkowych do autoradiografii i sześciu kultur (lub mniej w przypadku naukowego uzasadnienia) dla określenia UDS za pomocą LSC.

Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych

Do każdego badania należy włączyć równoległe pozytywne i negatywne grupy kontrolne (niezbadane i/lub którym podawano nośnik) przy obecności, jak i przy braku aktywacji metabolicznej. Przykładami związków, które mogą być dodawane do próbek kontrolnych pozytywnych, mogą być 7, 12-dimetylobenzatracen (7,12-DMBA) lub 2-acetylaminofluoren (2-AAF). W przypadku ustalonych linii komórkowych 4-nitrochinolino-N-tlenek (4-NQO) jest przykładem związku mogącego stanowić pozytywną kontrolę zarówno dla autoradiografii, jak i oznaczeń LSC wykonywanych bez aktywacji metabolicznej komórek; N-dimetylonitrozamina jest przykładem związku dodawanego do próbek kontrolnych, kiedy używane są systemy aktywacji metabolizmu.

Stężenie w celu ekspozycji

Należy użyć wielu stężeń substancji testowej ponad zakres odpowiedni w celu określenia reakcji. Najwyższe stężenia powinny wywołać pewne objawy cytotoksyczności. Odpowiednio, substancje nierozpuszczalne w wodzie należy badać do granicy ich rozpuszczalności. Dla substancji nietoksycznych łatwo rozpuszczalnych w wodzie wyższe stężenie substancji testowej należy rozpatrywać dla każdego przypadku oddzielnie.

Komórki

W celu utrzymania kultury należy zastosować właściwą pożywkę, stężenie CO2, temperaturę oraz wilgotność. Ustalone linie komórkowe należy okresowo sprawdzać w celu wykrycia skażenia mikoplazmą.

Aktywacja metaboliczna

System aktywacji metabolicznej nie jest używany w przypadku pierwotnych kultur hepatocytów. Ustalone linie komórkowe i limfocyty poddane ekspozycji na substancję testową zarówno przy obecności, jak i przy braku odpowiedniego systemu aktywacji metabolizmu.

Procedura

Przygotowanie kultury

Ustalone linie komórkowe są tworzone z kultur zapasowych (np. przez trypsynizację bądź wytrząsanie), pasażowanych w odpowiedniej gęstości do naczyń i inkubowanych w temperaturze 37 oC. Krótkoterminowe kultury hepatocytów szczura zakładane są przez umożliwienie hepatocytom świeżo rozdzielonym na właściwej pożywce, zagnieżdżenie się na powierzchni wzrostowej. Kultury ludzkich limfocytów zakładane są za pomocą właściwych technik.

Poddanie kultur ekspozycji na substancję testową Pierwotne hypocyty szczura

Świeżo izolowane hepatocyty szczura są przez odpowiedni czas poddawane działaniu substancji testowej w pożywce zawierającej 3H-TdR. Pod koniec tego okresu pożywka powinna zostać odsączona, a komórki przepłukane, przygotowane i wysuszone. Szkiełka powinny być zanurzone w emulsji autoradiograficznej (ewentualnie można użyć filmu), naświetlone, wywołane, wybarwione i zliczone.

Ustalone linie komórkowe i limfocytowe

Techniki autoradiograficzne: Kultury komórkowe są poddane ekspozycji na substancję testową przez odpowiedni okres czasu po zastosowaniu 3H-TdR. Czas trwania ekspozycji na działanie substancji zależy od charakteru substancji, aktywności systemów metabolizujących oraz rodzaju komórek. W celu wykrycia szczytu UDS należy dodać 3H-TdR równocześnie z substancją testową albo w przeciągu kilku minut po ekspozycji na substancje testową. Wybór między tymi dwiema procedurami będzie uwarunkowany ewentualnymi interakcjami między substancją testową a 3H-TdR. Aby odróżnić między UDS i semikonserwatywną replikacją DNA, to ostatnie powinno być zahamowane, na przykład przez użycie pożywki bez zawartości argininy, niewielkiej zawartości surowicy lub przez dodatek hydroksymocznika w pożywce. Badanie UDS przy pomocy LSC: Przed zastosowaniem substancji testowej powinno zostać zablokowane wejście komórek w fazę S w taki sposób, jak opisano powyżej; komórki powinny być poddawane działaniu substancji testowych tak, jak opisano dla autoradiografii. Po zakończeniu okres inkubacji DNA należy wydobyć z komórek oraz należy ustalić ogólną zawartość DNA oraz stopień zawartości 3H-TdR. Należy zauważyć, że – w przypadku użycia ludzkich limfocytów w powyższych technikach – wymagane jest wyeliminowanie półkonserwatywnej replikacji DNA w niestymulowanych kulturach.

Analiza

Oznaczenia autoradiograficzne

Przy oznaczaniu UDS w komórkach danej kultury jądra znajdujące się w fazie S nie są zliczane. Należy zliczyć, co najmniej 50 komórek na skupienie. Szkiełka powinny być opisywane przed zliczaniem. Kilka wyraźnie oddzielonych losowych pól powinno być policzonych na każdym szkiełku. Ilość 3H-TdR wbudowanego w cytoplazmę powinna być oznaczona przez liczenie trzech terenów o kształcie jądra w cytoplazmie każdej ze zliczanych komórek.

Oznaczenie LSC

Oznaczając LSC UDS, należy zastosować odpowiednią liczbę kultur do każdej wielkości stężenia. Wszystkie wyniki należy potwierdzić niezależnie przeprowadzonym badaniem.

2. DANE Dane należy przedstawić w formie tabeli.

2.

2.1. USTALENIA AUTORADIOGRAFICZNE Należy oddzielnie odnotować stopień zawartości 3H-TdR w cytoplazmie oraz liczbę ziaren wykrytą w jądrze komórki. Średnia, mediana i tryb mogą być użyte, aby opisać dystrybucję i stopień wbudowania 3H-TdR do cytoplazmy i liczbę ziaren na jądro.

2.2. OZNACZENIE LSC Dla oznaczenia LSC należy zgłaszać zawartość 3H-TdR jako dpm/ug DNA. Można zastosować średnią dpm/ug DNA z odchyleniem standardowym w celu opisania dystrybucji zawartości. Dane należy ocenić za pomocą właściwych metod statystycznych.

3. SPRAWOZDANIE

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:

zastosowane komórki, gęstość oraz liczba pasaży trakcie badania, liczba kultur komórek,

metody użyte w celu utrzymania kultury komórek, włączając pożywkę, temperaturę i stężenie CO2,

substancja badana, nośnik, stężenia i racjonalna podstawa wyboru wielkości zastosowanych stężeń w próbie,

szczegóły systemów aktywacji metabolicznej,

zasady badania,

pozytywne i negatywne grupy kontrolne,

zastosowane techniki autoradiograficzne,

procedury użyte w celu zablokowania wejścia komórek do fazy S,

procedury zastosowane w celu wydobycia DNA oraz ustalenia ogólnej zawartości DNA w oznaczaniu LSC,

stosunek dawki do reakcji, jeżeli to możliwe,

analiza statystyczna,

analiza wyników,

interpretacja wyników.

3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

4. ODNIESIENIA Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

B.19. TEST WYMIANY CHROMATYD SIOSTRZANYCH IN VITRO

B.19.

1. METODA

1.

1.1. WSTĘP Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.2. DEFINICJE Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ Test wymiany chromatyd siostrzanych (SCE) jest krótkoterminowym badaniem mającym na celu wykrywanie wzajemnych wymian DNA między dwoma chromatydami siostrzanymi powielającego się chromosomu. SCE stanowi wymianę produktów replikacji DNA w pozornie homologicznych miejscach. Proces wymiany przypuszczalnie obejmuje rozerwanie i ponowne połączenie DNA, chociaż niewiele poznano na temat jego molekularnej podstawy. Wykrywanie SCE wymaga niektórych sposobów odmiennego etykietowania chromatyd siostrzanych, co można osiągnąć przez włączenie bromodeoksyurydyna (BrdU) do chromosomowego DNA dla dwóch cykli komórkowych. Komórki ssaków in vitro poddane są ekspozycji na substancje testowe z użyciem lub bez użycia egzogennego systemu aktywacji metabolicznej, jeżeli jest to odpowiednia metoda i hodowane przez okres dwóch cykli replikacyjnych w pożywce zawierającej BrdU. Po dodaniu inhibitora hamującego tworzenie się wrzeciona kariokinetycznego (np. kolchicyny), umożliwiającego nagromadzenie się komórek w stadium mitozy podobnym do metafazy (metafaza c), komórki są zbierane i przygotowywane są preparaty chromosomów.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.

1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ

w teście mogą zostać wykorzystane pierwotne kultury, (ludzkie limfocyty) lub ustalone linie komórkowe (np. komórki jajnika chomika chińskiego). Linie komórkowe należy sprawdzić na skażenie mikoplazmą,

należy zastosować właściwą pożywkę hodowlaną i warunki inkubacji (np. temperatura, zbiorniki hodowlane, stężenie CO2 i wilgotność),

substancje testowe można przygotować na pożywce hodowlanej lub rozpuścić lub zawiesić w odpowiednich nośnikach przed poddaniem badaniu właściwych komórek. Stężenie końcowe nośnika w systemie hodowli nie powinno znacznie wpłynąć na żywotność komórki ani na tempo wzrostu oraz należy monitorować wpływ na częstotliwość SCE przez kontrolę somatyczną,

komórki należy poddać działaniu substancji testowej zarówno w obecności, jak i braku obecności egzogenicznego systemu aktywacji metabolicznej ssaków. Alternatywnie, w przypadku użycia rodzaju komórek z wrodzonym systemem aktywności metabolicznej, tempo oraz charakter aktywności powinny być właściwe w odniesieniu z do badanej klasy chemicznej.

1.6. Warunki badania

Liczba kultur

Należy użyć co najmniej podwójne kultury dla każdego punktu badania.

Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych

Pozytywne grupy kontrolne, używając zarówno bezpośrednio działającego związku, jak i związku wymagającego metabolicznej aktywacji, należy włączyć do każdego badania; należy uwzględnić również grupę kontrolną, której podawany jest nośnik. Poniższe substancje są przykładami substancji, które mogą być użyte jako pozytywne grupy kontrolne: W odpowiednich przypadkach można włączyć dodatkową pozytywną grupę kontrolną tej samej klasy chemicznej co substancja chemiczna używana w badaniu.

bezpośrednio działające związki:

etylometanosulfonian,

pośrednio działające związki:

cyklofosfamid.

Stężenia do celów ekspozycji

Należy użyć co najmniej trzy odpowiednio rozmieszczone substancje testowe. Najwyższe stężenie powinno wywołać znaczne objawy toksyczności, ale umożliwiać musi odpowiednią replikację komórki. Odpowiednio, substancje nierozpuszczalne w wodzie należy badać do granicy ich rozpuszczalności, wykorzystując właściwe procedury. Dla substancji nietoksycznych łatwo rozpuszczalnych w wodzie wyższe stężenie substancji testowej należy rozpatrywać dla każdego przypadku oddzielnie.

Procedura

Przygotowanie hodowli

Ustalone linie komórkowe są tworzone z kultur zapasowych (np. przez trypsynizację lub wytrząsanie), pasażowanych w odpowiedniej gęstości do naczyń i inkubowanych w temperaturze 37 oC. Dla kultur monowarstwowych ilość komórek na naczynie powinna być regulowana w ten sposób, że kultury stanowią niewiele więcej niż 50 % płynu w czasie zbierania komórek. Ewentualnie komórki mogą być użyte w kulturze zawieszonej. Kultury ludzkich limfocytów są zakładane z heparynizowanej krwi z użyciem odpowiednich technik i inkubowane w temperaturze 37 oC.

Poddanie działaniu substancji testowej

Komórki w fazie gwałtownego wzrostu poddawane są ekspozycji na substancję testową przez odpowiedni okres czasu; w większości wypadków wystarczy jedna lub dwie godziny w celu uzyskania pożądanych skutków, ale w niektórych przypadkach czas badania może być przedłużony do dwóch kompletnych cyklów komórkowych. Komórki nieposiadające odpowiedniego wrodzonego systemu aktywności metabolicznej należy poddać działaniu testowej substancji chemicznej w obecności lub braku obecności odpowiedniego systemu aktywności metabolicznej. Po zakończeniu okresu ekspozycji komórki są oczyszczane z substancji testowej i hodowane przez okres dwóch cykli replikacyjnych w obecności BrdU. Alternatywnie, komórki można poddać procedurze równoczesnej ekspozycji na substancję testową oraz BrdU przez całkowity okres hodowli dwóch cyklów komórkowych. Kultury ludzkich limfocytów poddane są badaniu w chwili, gdy znajdują się w stadium półsynchronicznym. Komórki analizowane są podczas ich drugiego podziału, po poddaniu działaniu substancji, co zapewnia, iż najbardziej wrażliwe fazy podziału komórki zostały poddane działaniu testowej substancji chemicznej. Wszystkie kultury, do których dodano BrdU, należy utrzymywać w środowisku braku światła lub świetle przyćmionym pochodzącym z żarówek, do chwili zbioru komórek w celu zminimalizowania fotolizy DNA zawierającego BrdU.

Zbieranie komórek

Kultury komórkowe poddawane są działaniu inhibitora (np. kolchiny) na godzinę do czterech godzin przed zbiorem. Każda kultura jest zbierana i przetwarzana oddzielnie w celu przygotowania chromosomów.

Przygotowanie chromosomu i barwienie

Przygotowanie chromosomu dokonywane jest za pomocą standardowych technik cytogenetycznych. Barwienie preparatów w celu wykazania SCE można przeprowadzić za pomocą kilku technik (np. metoda fluorescencyjna plus Giemsa).

Analiza

Liczba komórek przeznaczonych do analizy powinna być oparta o częstotliwość samorzutnej kontroli SCE. Zazwyczaj co najmniej 25 rozprzestrzeniających się metafaz na kulturę jest analizowanych pod względem SCE. Preparty są oznaczane przed rozpoczęciem analiz. W odniesieniu do ludzkich limfocytów jedynie metafazy zawierające 46 centromerów są poddawane analizie. W ustalonych liniach komórkowych jedynie metafazy zawierające ± 2 centromery liczby modalnej są poddawane analizie. Powinno zostać stwierdzone, czy centromeryczny przełącznik znacznika jest oznaczony jako SCE. Wszystkie wyniki należy potwierdzić niezależnie przeprowadzonym badaniem.

2. DANE Dane należy przedstawić w formie tabeli. Liczba SCE dla każdej metafazy oraz liczba SCE na dany chromosom dla każdej metafazy powinna zostać oddzielnie wyszczególniona dla wszystkich kultur badanych i kontrolnych. Dane należy oszacować za pomocą odpowiednich metod statystycznych.

3. SPRAWOZDANIE

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:

użyte komórki, metody utrzymywania kultur komórek,

warunki badań: skład pożywki, stężenie CO2, stężenie substancji testowej, użyty nośnik, temperatura inkubacji, czas poddania działaniu substancji, użyty inhibitor, jego stężenie oraz czas trwania badania z jego użyciem, rodzaj użytego systemu metabolicznej aktywacji ssaków, pozytywne i negatywne grupy kontrolne,

liczba kultur komórkowych w danym punkcie badania,

szczegóły dotyczące techniki zastosowanej w celu przygotowania preparatu,

liczba metafaz poddanych analizie (dane przedstawione oddzielnie dla każdej kultury),

średnia liczba SCE w danej komórce i w danym chromosomie (dane przedstawione oddzielnie dla każdej kultury),

kryteria obliczania SCE,

racjonalna podstawa wyboru dawki,

stosunek dawki do reakcji, w odpowiednich przypadkach,

statystyczna analiza,

analiza wyników,

interpretacja wyników.

3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

4. ODNIESIENIA Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

B.20. BADANIA SPRZĘŻONYCH Z PŁCIĄ RECESYWNYCH CECH LETALNYCH U DROSOPHILA MELANOGASTER

B.20.

1. METODA

1.

1.1. WSTĘP Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.2. DEFINICJE Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ Badanie sprzężonych z płcią recesywnych cech letalnych (SLRL) u Drosopbila melanogaster wykrywa istnienie mutacji, zarówno punktowych, jak i niewielkich delecji, w linii zarodkowej owada. Niniejsze badanie jest poprzedzone testem mutacji zdolnym zbadać około 800 miejsc na chromosomie X; stanowi to około 80 % wszystkich miejsc chromosomu X. Chromosom X stanowi około jednej piątej całego genomu haploidalnego. Mutacje w chromosomie X u Drosophila melanogaster fenotypowo ujawniają się u samców przenoszących gen nurtujący. Kiedy mutacja jest letalna u homozygot, jej obecność można wnioskować na podstawie nieobecności jednej klasy męskiego potomstwa, podczas gdy heterozygotyczne samice normalnie wydają dwa rodzaje męskiego potomstwa. Badanie SLRL wykorzystuje te aspekty za pomocą specjalnie oznaczonych i ułożonych chromosomów.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.

1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.6. Przygotowania

Zasoby

Samce pochodzące z dobrze zdefiniowanych zasobów dzikiego typu i samice z zasobu Muller-5 mogą być używane. Inne odpowiednio oznaczone samice z wielokrotną inwersją chromosomu X także mogą być używane.

Substancja testowa

Substancje testowe powinny być rozpuszczone w wodzie. Substancje nierozpuszczalne w wodzie mogą być rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich nośnikach (np. mieszaninie etanolu i Tween-60 lub 80) i rozcieńczone w wodzie lub roztworze soli przed podaniem. Dimetylosulfoksyd nie powinien być używany jako nośnik.

Liczba zwierząt

Test powinien być zaprojektowany z ustalonymi z góry czułością i siłą. Częstotliwość samorzutnej mutacji obserwowana w odpowiedniej grupie kontrolnej w dużym stopniu wpłynie na liczbę badanych chromosomów, które należy poddać analizie.

Droga podawania substancji testowej

Poddanie działaniu substancji może odbywać się drogą pokarmową, przez wstrzyknięcie lub przez ekspozycję na gazy lub opary. Substancja testowa może być podawana w roztworze cukru. W przypadku gdy zaistnieje taka konieczność, substancje mogą zostać rozpuszczone w 0,7 % roztworze NaCl oraz wstrzyknięte do klatki piersiowej lub brzucha.

Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych

Należy rozważyć użycie negatywnych (użycie nośnika) i pozytywnych grup kontrolnych. Jednakże w przypadku dostępności do odpowiednich laboratoryjnych danych bazowych nie jest wymagane wprowadzenie równoczesnych grup kontrolnych.

Poziomy dawek

Należy zastosować trzy poziomy dawek. W celu dokonania wstępnej analizy można zastosować jeden poziom dawki substancji testowej, której wielkość będzie oscylować na minimalnym tolerowanym poziomie stężenia lub poziomie stężenia wywołującym pewne objawów i toksyczności. Odnośnie do substancji nietoksycznych należy użyć maksymalną stosowaną wielkość stężenia substancji testowej.

Procedura

Dzikie samce (trzy lub pięciodniowe) poddawane są działaniu substancji testowej oraz indywidualnie używane do krycia dziewiczych samic pochodzących z zasobu Muller-5 lub innego właściwie oznaczonego zasobu (z wielokrotnymi odwróconymi chromosomami X). Samice zastępowane są nowymi dziewiczymi samicami co dwa lub trzy dni, w celu objęcia całego cyklu komórek zarodkowych. Potomstwo tych samic jest analizowane pod względem wystąpienia skutków śmiertelności odpowiadających wpływowi na dojrzałe plemniki, spermatydy średniego i późnego stadium, spermatydy wczesnego stadium, spermatocyty i spermatogonia w czasie poddania działaniu. Heterozygotyczne samice F1 pochodzące z powyższych krzyżówek kryte są indywidualnie (tj. jedna samica na fiolkę) ich braćmi. W pokoleniu F2 każda kultura liczona jest pod względem braku dzikich samców. Jeżeli okaże się, iż kultura powstała od samic F1 przenoszących cechę śmiertelności w rodzicielskim chromosomie X (tj. nie zaobserwowano żadnych samców z badanym chromosomem), córki takich samic z tym samym genotypem należy zbadać w celu ustalenia, iż cecha śmiertelności jest powtarzana w następnym pokoleniu.

2. DANE Dane należy przedstawić w formie tabeli w celu wykazania liczby zbadanych chromosomów X, liczby niepłodnych samców oraz liczby chromosomów z cechą letalną przy każdej wielkości stężenia oraz w każdym okresie krycia dla każdego samca poddanego działaniu substancji testowej. Należy odnotować liczbę klastrów różnego rozmiaru na danego samca. Niniejsze wyniki powinny zostać potwierdzone oddzielnym badaniem. Odpowiednie metody statystyczne powinny być użyte w ocenie cech letalnych sprzężonych z płcią. Skupianie się recesywnych cech letalnych pochodzących od jednego samca powinno być wzięte pod uwagę i przeanalizowane przy pomocy odpowiedniej metody statystycznej.

3. SPRAWOZDANIE

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:

zasoby: zastosowane zasoby lub szczepy Drosophila, wiek owadów, liczba samców poddanych badaniu, liczba bezpłodnych samców, liczba ustalonych kultur F2, liczba kultur F2 bez potomstwa, liczba chromosomów przenoszących cechę letalną, wykrytą w każdej fazie komórki zarodkowej,

kryteria dla określenia wielkości badanych grup,

warunki badania: szczegółowy opis badania i zasada pobierania próbek, poziomy ekspozycji, dane dotyczące toksyczności, negatywne (rozpuszczalnik) i pozytywne grupy kontrolne, odpowiednio do potrzeb,

kryteria służące ocenie mutacji letalnych,

zależność między objawami a poziomem ekspozycji, jeżeli to możliwe,

dane dotyczące analizy,

analiza wyników,

interpretacja wyników.

3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

4. ODNIESIENIA Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

B.21. BADANIE PRZEMIANY KOMÓRKOWEJ SSAKÓW IN VITRO

B.21.

1. METODA

1.

1.1. WSTĘP Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.2. DEFINICJE Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ Systemy hodowli komórkowej ssaków mogą być zastosowane w celu wykrycia zmian fenotypowych in vitro wywołanych substancjami chemicznymi związanymi ze złośliwymi przemianami in vivo. Powszechnie używane komórki, takie jak C3H10TV2, 3T3, SHE, szczura Fischera i testowe polegają na ocenie zmian w morfologii komórki, formowania skupisk czy zależności od zakotwiczenia w półstałym agarze. Istnieją systemy rzadziej stosowane, które pozwalają wykryć inne zmiany fizjologiczne lub morfologiczne w komórkach w następstwie ekspozycji na substancję rakotwórczą. Żadne testy końcowe badania in vitro nie mają ustalonego bezpośredniego powiązania z nowotworem. Niektóre systemy badawcze są w stanie wykryć aktywatory guzów. Cytototoksyczność można ustalić przez określenie wpływu badanego materiału na zdolności formowania kolonii (wydajność klonowania) lub wskaźniki wzrostu kultury. Pomiar cytotoksyczności ma na celu ustalenie, że ekspozycja na działanie substancji testowej jest istotna pod względem toksykologicznym, ale nie może być wykorzystywana w celu obliczenia częstotliwości przemian we wszystkich próbach, ponieważ niektóre mogą obejmować długotrwałą inkubację i/lub pasażowanie.

1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.

1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.6. Przygotowania

Komórki

W zależności od stosowanego badania przemian dostępne są różne linie komórkowe lub komórki podstawowe. Badacz musi zapewnić, iż komórki wykorzystywane w przeprowadzanym badaniu wykazują właściwe zmiany fenotypowe w następstwie poddania działaniu znanym czynnikom rakotwórczym oraz że badanie, przeprowadzane w laboratorium badacza, jest potwierdzone i posiada udokumentowaną wiarygodność.

Pożywka kultur

Należy zastosować pożywkę oraz warunki doświadczalne właściwe dla prób przemiany komórkowej.

Substancja testowa

Substancja testowa może zostać przygotowana na pożywce hodowlanej lub rozpuszczona lub zawieszona we właściwych nośnikach przed rozpoczęciem badania komórek. Stężenie końcowe nośnika w systemie hodowli nie powinno wpływać na żywotność komórki, tempo wzrostu ani na częstotliwość przemian.

Aktywacja metaboliczna

Komórki należy poddać działaniu substancji testowej zarówno w obecności jak i przy braku obecności właściwego systemu aktywacji metabolicznej. Alternatywnie, w przypadku użycia rodzaju komórek z wrodzoną aktywacją metaboliczną, wskaźnik charakteru aktywności powinien być znany, aby był właściwy dla badanej klasy chemicznej.

Warunki badania

Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych

Pozytywne grupy kontrolne, używając zarówno bezpośrednio działającego związku, jak i związku wymagającego metabolicznej aktywacji, należy włączyć do każdego badania; należy uwzględnić również negatywną grupę kontrolną, której podawany jest nośnik. Poniższe substancje są przykładami substancji, które mogą być użyte jako pozytywne grupy kontrolne: W odpowiednich przypadkach można włączyć dodatkową pozytywną grupę kontrolną tej samej klasy chemicznej co związek używany w badaniu.

związki działające bezpośrednio:

etylometanosulfonian,

ß-propiolakton,

związki wymagające aktywacji metabolicznej:

acetylaminofluoren,

4-dimetyloaminoazobenzen,

7,12-dimetylobenzantracen.

Stężenia oddziałującej substancji

Należy użyć kilka stężeń substancji testowej. Niniejsze stężenia powinny wywołać objawy toksyczności z nimi związane, przy najwyższym stężeniu powodować niski poziom komórek pozostałych przy życiu oraz poziom żywotności komórek przy najniższym stężeniu, oscylujący w przybliżeniu na tym samym poziomie, co przy stężeniu użytym w negatywnej grupie kontrolnej. Odpowiednio, substancje nierozpuszczalne w wodzie należy badać do granicy ich rozpuszczalności, wykorzystując właściwe procedury. Dla substancji nietoksycznych łatwo rozpuszczalnych w wodzie wyższe stężenie substancji testowej należy rozpatrywać dla każdego przypadku oddzielnie.

Procedura

Komórki należy poddać działaniu substancji przez określony okres czasu, w zależności od stosowanego systemu badań, może to dotyczyć ponownego dawkowania wraz ze zmianą pożywki do hodowli (i w miarę potrzeby, świeżą mieszaninę aktywacji metabolicznej) w przypadku długotrwałej ekspozycji na działanie substancji testowej. Komórki nieposiadające odpowiedniej wrodzonej aktywności metabolicznej należy poddać ekspozycji na substancję testową w obecności i bez obecności właściwego systemu aktywności metabolicznej. Pod koniec okresu ekspozycji komórki są przepłukiwane w celu usunięcia substancji testowej i hodowane w warunkach odpowiednich dla monitorowania momentu pojawienia się zmienionego fenotypu i zasięgu transformacji. Wszelkie wyniki potwierdzane są niezależnym badaniem.

2. DANE Dane powinny być opracowane w formie tabeli i mogą wymagać uwzględnienia różnorodności form zgodnie z metodą oznaczenia, która została użyta, np. zliczanie płytek, płytki pozytywne bądź ilość stransformowanych komórek. Jeżeli jest to odpowiednia metoda, ilość komórek, które przeżyły, powinna być wyrażona jako procent poziomu kontroli i częstotliwości występowania ekspresji wyrażonej jako stosunek ilości komórek stransformowanych do komórek, które przeżyły ekspozycję. Dane należy przeanalizować za pomocą właściwych metod statystycznych.

3. SPRAWOZDANIE

3.

3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:

rodzaj użytej komórki, liczba kultur komórkowych, metody utrzymania kultur komórkowych,

warunki badania: stężenie substancji, użyty nośnik, czas inkubacji, czas trwania oraz częstotliwość badania, gęstość komórkowa podczas badania, rodzaj użytego egzogenicznego systemu aktywacji metabolicznej, pozytywne i negatywne grupy kontrolne, specyfikacja kontrolowanego fenotypu, zastosowany system wyboru (odpowiednio do potrzeb), racjonalna podstawa wyboru dawkowania,

metody stosowane do liczenia żywych i zmienionych komórek,

statystyczna analiza,

analiza wyników,

interpretacja wyników.

3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

4. ODNIESIENIA Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

B.22.

1. METODA

1.

1.1. WSTĘP Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.2. DEFINICJE Zob. Wprowadzenie ogólne część B.

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.

1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ Dominujące cechy letalne powodują śmierć embrionu lub płodu. Indukcja dominujących cech letalnych przez ekspozycję na substancję chemiczną wskazuje na fakt, iż substancja zaatakowała tkankę zarodkową badanego gatunku. Ogólnie przyjmuje się, iż dominujące cechy letalne spowodowane są uszkodzeniami chromosomowymi (nieprawidłowości strukturalne i liczbowe). Śmierć zarodkowa, w przypadku badania samic, może również wynikać ze skutków toksyczności. Ogólnie, samce poddawane są działaniu badanego związku oraz wykorzystywane do krycia niebadanych dziewiczych samic. Różne fazy komórki zarodkowej można poddać oddzielnym badaniom przez zastosowanie sekwencyjnego krycia w odpowiednich odstępach czasu. Wzrost liczby martwych implantów na samicę w grupie badanej ponad liczbę martwych implantów na samicę w grupie kontrolnej odzwierciedla straty poimplantacyjne. Straty przedimplantacyjne można ocenić w oparciu o liczbę ciałek żółtych lub przez porównanie całkowitej ilości implantów danej samicy w grupie badanej i grupach kontrolnych. Całkowity efekt dominujących cech letalnych jest sumą przedimplantacyjnych i poimplantacyjnych strat. Obliczenie całkowitego skutku dominujących cech letalnych jest oparte na porównaniu żywych implantów danej samicy w grupie badanej do żywych implantów danej samicy w grupie kontrolnej. Zmniejszanie się ilości implantów w pewnych odstępach czasu może być skutkiem uśmiercania komórek (tj. spermatocytów i/lub spermatogoniów).

1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.

1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ

1.6. Przygotowania

Jeżeli to możliwe, substancje testowe należy rozpuścić lub zawiesić w izotonicznym roztworze soli. Substancje chemiczne nierozpuszczalne w wodzie mogą być rozpuszczone lub zawieszone we właściwych nośnikach. Użyty nośnik nie powinien ani kolidować z testową substancją chemiczną, ani powodować jakichkolwiek objawów toksyczności. Należy zastosować świeże preparaty testowej substancji chemicznej.

Warunki badania

Droga podawania

Testowy związek chemiczny ogólnie należy podać tylko raz. W oparciu o informacje badań toksykologicznych można zastosować powtórzony harmonogram badań. Zwyczajowymi drogami podawania substancji testowej jest intubacja drogą pokarmową lub przez iniekcję dootrzewnową. Inne drogi podawania substancji również mogą być właściwe.

Zwierzęta badane

Gatunkami zalecanymi do wykorzystania w badaniu są szczury i myszy. Zdrowe, w pełni dojrzałe zwierzęta są losowo przydzielane do grupy badanej i grup kontrolnych.

Liczba i płeć

Należy wykorzystać odpowiednią liczbę samców, uwzględniając samoczynne zmiany cech biologicznych. Wybrana ilość powinna być oparta na wcześniej oznaczonej czułości detekcji i sile znaczenia. Na przykład w typowym badaniu liczba samców w każdej grupie dawkowania powinna być wystarczająca, aby zapewnić 30–50 ciężarnych samic w danym okresie krycia.

Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych

Ogólnie, do każdego badania należy włączyć równoległe negatywne i pozytywne grupy kontrolne (dawkowanie z użyciem nośnika). W przypadku dostępności wyników pozytywnej grupy kontrolnej z badań ostatnio przeprowadzanych w tym samym laboratorium niniejsze wyniki można zastosować zamiast równoległej pozytywnej grupy kontrolnej. Należy użyć pozytywnych substancji kontrolnych przy odpowiednio niskiej dawce (np. MMS, dootrzewnowo, przy 10 mg/kilogram) w celu wykazania czułości badania.

Poziomy dawek

Zwyczajowo należy zastosować trzy poziomy dawek. Najwyższa wielkość dawki powinna powodować objawów i toksyczności lub obniżoną płodność u badanych zwierząt. W niektórych przypadkach jednorazowe dawkowanie może okazać się wystarczające.

Test graniczny

Substancje nietoksyczne należy testować przy 5 g/kilogram przy jednorazowym podaniu dawki lub przy 1 g/kilogram/dzień przy powtarzalnym podawaniu dawki.

Procedura

Dostępne jest kilka harmonogramów badania. Najszerzej stosowane jest jednorazowe podawanie substancji testowej. Można stosować inne odpowiednie harmonogramy badań. Poszczególne samce wykorzystywane są do krycia jednej lub dwóch niebadanych, dziewiczych samic sekwencyjnie w odpowiednich odstępach czasu po poddaniu działaniu substancji. Samice należy pozostawić w obecności samca co najmniej przez czas trwania jednego cyklu rujowego lub do czasu wystąpienia krycia ustalonego przez obecność spermy w pochwie lub obecność czopu nasienia w pochwie. Liczba kryć następujących po zakończeniu badania jest regulowana harmonogramem badania i należy zapewnić, iż zostaną pobrane próbki wszystkich faz komórki zarodkowej po zakończeniu badania. Samice uśmiercane są w drugiej połowie okresu ciąży, a zawartość macicy poddawana jest badaniu w celu ustalenia liczby żywych oraz martwych implantów. Można przeprowadzić badanie jajników w celu ustalenia liczby ciałek żółtych.

2. DANE Dane należy przedstawić w formie tabeli, wskazując liczbę samców, liczbę ciężarnych samic, oraz liczbę nieciężarnych samic. Wyniki krycia, włączając identyfikację każdego samca i samicy, należy odnotować indywidualnie. W odniesieniu do każdej samicy należy odnotować tydzień, w którym nastąpiło krycie, wielkość dawki otrzymanej przez samca oraz ilość martwych i żywych implantów. Obliczenie całkowitego skutku dominujących cech letalnych jest oparte na porównaniu żywych implantów przypadających na samicę w grupie badanej do żywych implantów przypadających na samicę w grupie kontrolnej. Stosunek martwych implantów do żywych implantów w grupie badanej w porównaniu do tego samego stosunku w grupie kontrolnej jest analizowany w celu wykazania strat poimplantacyjnych. Jeżeli dane odnotowane sąjako zgony wczesne i późne, należy ten fakt jasno sprecyzować w tabeli. Jeżeli dokonywana jest ocena strat przedimplantacyjnych, taki fakt należy odnotować. Straty przedimplantacyjne można obliczyć jako różnicę między liczbą ciałek żółtych oraz liczbą implantów lub jako obniżenie średniej liczby implantów na daną macicę w porównaniu z kryciami kontrolnymi. Dane szacowane są z wykorzystaniem odpowiednich metod statystycznych.

gatunki, szczep, wiek i waga badanych zwierząt, liczba zwierząt każdej płci w grupie badanej i grupach kontrolnych,

substancja testowa, nośnik, badane poziomy dawek oraz racjonalna podstawa wyboru dawki, negatywne i pozytywne grupy kontrolne, dane dotyczące toksyczności,

droga oraz harmonogram badań,

harmonogram krycia,

metody stosowane w celu ustalenia zaistnienia krycia,

czas uśmiercenia zwierząt,

kryteria, według których oznaczane są dominujące cechy letalne,

związek wysokości dawkowania z reakcją, w odpowiednich przypadkach,

analiza statystyczna,

Kolejne przepisy (3232) nie są tu pokazane; każdy ma własny adres.

Wersje

2008-05-30