Regulamento (CE) n.o 440/2008 da Comissão de 30 de Maio de 2008 que estabelece métodos de ensaio nos termos do Regulamento (CE) n.o 1907/2006 do Parlamento Europeu e do Conselho relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição de substâncias químicas (REACH) (Texto relevante para efeitos do EEE)

Em vigorVersão 2008-05-30desde 2008-06-01

Classificação B

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Índice

Preâmbulo
1. Artigo 1.o
2. Artigo 2.o
3. Artigo 3.o
4. Artigo 4.o
ANNEX
ANEXO PARTE A: MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS
A.1.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.4.
1.5. QUADRO: APLICABILIDADE DOS MÉTODOS A. B. C. D.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
1.6.1.2. Aparelho:
1.6.2.
1.6.4.
4.(1)(2)(3)(4)
A.2.
1.
1.4.
1.5. Quadro 1 Comparação dos métodos
1.6.
1.6.4.
1.6.6.
2. Quadro 2 Temperatura — factores de correcção fT
A.3.
1.
1.4.
1.4.1.
3. Quadro 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Aplicabilidade dos métodos
3. Quadro 1.4.1.1.1.4.1.2. Aplicabilidade dos métodos a)
3. Quadro 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Aplicabilidade dos métodos a)
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
A.4.
1.
1.4.
1.5. Quadro 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Critérios de qualidade
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.4.
1.6.4.2.
1.6.5.
1.6.6.
1.6.6.1. Gás inerte:
1.6.6.2. Preparação da coluna do saturador:
a)
b)
1.6.7.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
A.5.
1.
1.6.
1.6.4.
1.6.4.1.
1.6.4.1.3. Figura Corpo para a medição
1.6.4.2.
1.6.4.2.2. Montagem:
a)
b)
2. Tabela Correcção da tensão superficial medida Apenas para soluções aquosas, p = 1 g/cm3
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.6.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Procedimento de ensaio:
1.6.3.3. Aparelho
1.6.3.4. Aparelho (ver figuras 4 e 3)
1.6.4.
2.
3.
A.8
1.
1.3. Método do frasco agitado
1.4.
1.5.
1.5.1. Método do frasco agitado
1.5.2. Método do frasco agitado
1.5.3. Método do frasco agitado
1.6.
1.6.2.
1.6.2.1.
1.6.2.3.
1.6.3.
1.6.3.1. Aparelho
1.6.3.2. Cálculo do tempo limite to
2. Método do frasco agitado
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
A.9.
1.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Aparelho de Abel:
A.10.
1.
1.6.
1.6.2.
3.
A.11.
1.
1.6.
A.12.
1.
1.3.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
A.13
1.
1.6.
1.6.2. a)
2.
A.14.
1.
1.1. a)
1.4.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2. a)
1.6.3.
1.6.3.2. a)
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.15.
1.
1.6.
A.16.
1.
1.6.
1.6.1.
4.
Figura 1 Planificação do cubo de ensaio com 20 mm de aresta
Figura 2 Curva típica de temperatura/tempo
A.17.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
3.
3.2. a)
A.18.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.19.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.20.
1.
1.5.
1.5.4.
2.
3.
3.1.
A.21.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.2.
2.
2.1. Quadro 1 Exemplos de resultados
3.
3.2. a)
4.(1)
Figura 1 Dispositivo pressurizado
Figura 2 Suporte do dispositivo
Figura 3 Sistema de ignição
1.
2.
4.
1.2. Para as substâncias sólidas
Apêndice 1 Método por estimativa
INTRODUÇÃO
MÉTODO POR ESTIMATIVA
PROCEDIMENTO DE CÁLCULO
RELATÓRIO
BIBLIOGRAFIA
Apêndice 2
Figura 1 Aparelho para a determinação da curva de pressão de vapor de acordo com o método dinâmico
Figura 2a Aparelho para a determinação da curva de pressão de vapor de acordo com o método estático (utilizando um manómetro de tubo em U)
Figura 2b Aparelho para a determinação da curva da pressão de vapor de acordo com o método estático (utilizando um indicador de pressão)
Figura 3 Isoteniscópio (ver referência 7)
Figura 4 Aparelho para a determinação da curva da pressão de vapor de acordo com o método da balança de pressão de vapor
Figura 5 Exemplo de um aparelho para evaporação a baixa pressão utilizando o método de efusão, com uma célula de efusão com o volume de 8 cm3
Figura 6a Exemplo de um sistema de circulação para a determinação da pressão de vapor pelo método da saturação com gás
Figura 6b Exemplo de um sistema para a determinação da pressão de vapor pelo método da saturação com gás, com um tubo capilar colocado a seguir ao compartimento de saturação
Figura 7 Exemplo da disposição do conjunto experimental para o método do rotor giratório
Figura 8 Exemplo de cabeça de medição de rotor giratório
Figura 1 Método de eluição em coluna com bomba de recirculação
Figura 2 Microcoluna tipo
Figura 3 Microcoluna tipo
Figura 4 Método de eluição em coluna com reservatório de nivelamento
MÉTODO DE ESTIMAÇÃO Estimativa preliminar do coeficiente de partição
MÉTODOS DE CÁLCULO Princípio dos métodos de cálculo
Método π de Hansch
Método de Rekker
Método de Hansch-Leo
Método combinado
i)
ii)
iii)
iv)
Figura Molde e acessórios para a preparação da pilha
Figura Aparelho
Exemplo de especificação de material para o ensaio de sensibilidade térmica (ver DIN 1623) (1)(2)(3)
Figura 1 Aparelho para o ensaio da sensibilidade térmica
Figura 2 Ensaio de sensibilidade térmica
Figura 3 Calibração da taxa de aquecimento para o ensaio da sensibilidade térmica
Figura 4 Aparelho para o ensaio de choque
Figura 5 Sensibilidade à fricção: aparelho
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
PARTE B MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DA TOXICIDADE E DE OUTROS EFEITOS NA SAÚDE
INTRODUÇÃO GERAL A.
i)
ii)
B.1.bis.
1.
1.4.
1.5.
1.5.3.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
B.1.tris.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
B.2.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1. a)
B.3.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. Avaliação da toxicidade no outro sexo
3.
B.4.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
Tabela I Formação de eritema e escara Formação de edema GRADUAÇÃO DE REACÇÕES DÉRMICAS
B.5.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.2.3.
1.4.2.7.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
Tabela I GRADUAÇÃO DE LESÕES OCULARES
Córnea
Íris
Conjuntiva
Quimiose
B.6.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.2.
1.5.1.3.
1.5.2.
1.5.2.2.
1.5.2.3.
3. Relatório do ensaio (ensaio de maximização em porquinhos da índia e ensaio de Buehler)
B.7.
1.
1.4.
1.4.2.
1.4.3.
3. RELATÓRIO DO ENSAIO
B.8.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1.
pt_2 a)
B.9.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
B.10.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. RELATÓRIO DE ENSAIO
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
B.11.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
2.
3. RELATÓRIO DE ENSAIO
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
B.12.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
1.5.2. a)
2.
3. RELATÓRIO DE ENSAIO
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
B.13./14.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
2.
3. RELATÓRIO DE ENSAIO
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
B.15.
1.
1.6. Preparativos
Activação metabólica
Estirpes de experiência
Meios
Uso de controlos negativos e positivos
Concentrações de exposição
Condições de incubação
Frequências de mutações espontâneas
Número de placas
3.
B.16.
1.
1.6. Preparativos
Activação metabólica
Estirpes de experiência
Meios
Uso de controlos negativos e positivos
Concentrações de exposição
Condições de incubação
Frequência de recombinações mitóticas espontâneas
Número de placas
3.
B.17.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. RELATÓRIO DE ENSAIO
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
B.18.
1.
1.6. Preparativos
Número de culturas
Uso de controlos negativos e positivos
Concentrações de exposição
Células
Activação metabólica
Preparação das culturas
Tratamento das culturas com substância a testar Hepatócitos primários de rato
Determinações auto-radiográficas
Determinação LSC
2.
3.
B.19.
1.
1.6. Condições experimentais
Número de culturas
Utilização de controlos negativos e positivos
Concentração de exposição
Preparação das culturas
Tratamento
Colheita das células
Preparação dos cromossomas e coloração
Análise
3.
B.20.
1.
1.6. Preparativos
Stocks
Substância a testar
Número de animais
Via de administração
Uso de controlos negativos e positivos
Níveis de exposição
3.
B.21.
1.
1.6. Preparativos
Células
Meio
Substância a testar
Activação metabólica
Utilização de controlos positivos e negativos
Concentrações de exposição
3.
B.22.
1.
1.6. Preparativos
Via de administração
Animais de experiência
Número e sexo
Utilização de controlos negativos e positivos
Doses
Ensaio-limite

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CE) n.o 1907/2006 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 18 de Dezembro de 2006, relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição de substâncias químicas (REACH), que cria a Agência Europeia das Substâncias Químicas, que altera a Directiva 1999/45/CE e revoga o Regulamento (CEE) n.o 793/93 do Conselho e o Regulamento (CE) n.o 1488/94 da Comissão, bem como a Directiva 76/769/CEE do Conselho e as Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE da Comissão, nomeadamente o n.o 3 do artigo 13.o,

Considerando o seguinte:

(1) Nos termos do Regulamento (CE) n.o 1907/2006, devem adoptar-se métodos comunitários para o ensaio de substâncias, sempre que tais métodos sejam necessários à produção de informações sobre as propriedades intrínsecas das substâncias.

(2) A Directiva 67/548/CEE do Conselho, de 27 de Junho de 1967, relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas respeitantes à classificação, embalagem e rotulagem das substâncias perigosas estabelece, no seu anexo V, métodos para a determinação das propriedades físico-químicas, da toxicidade e da ecotoxicidade das substâncias e preparações. O anexo V da Directiva 67/548/CEE foi revogado pela Directiva 2006/121/CE do Parlamento Europeu e do Conselho, com efeitos a partir de 1 de Junho de 2008.

(3) Os métodos de ensaio constantes do anexo V da Directiva 67/548/CEE devem ser incorporados no presente regulamento.

(4) O presente regulamento não exclui a utilização de outros métodos de ensaio, desde que a mesma seja conforme com o n.o 3 do artigo 13.o do Regulamento (CE) n.o 1907/2006.

(5) Os princípios da substituição, redução e aperfeiçoamento da utilização de animais em procedimentos devem ser plenamente tidos em conta na concepção dos métodos de ensaio, nomeadamente sempre que se tornem disponíveis métodos adequados, validados para substituir, reduzir ou aperfeiçoar a experimentação com animais.

(6) As disposições do presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité instituído pelo artigo 133.o do Regulamento (CE) n.o 1907/2006,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1.o

Os métodos de ensaio a aplicar para os fins do Regulamento (CE) n.o 1907/2006 são os estabelecidos no anexo do presente regulamento.

Artigo 2.o

A Comissão reexaminará, quando pertinente, os métodos de ensaio constantes do presente regulamento, com o objectivo de substituir, reduzir ou aperfeiçoar os ensaios com vertebrados.

Artigo 3.o

Todas as referências ao anexo V da Directiva 67/548/CEE devem entender-se como referências ao presente regulamento.

Artigo 4.o

O presente regulamento entra em vigor no dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

É aplicável a partir de 1 de Junho de 2008. Feito em Bruxelas, em 30 de Maio de 2008. Pela Comissão Stavros Dimas Membro da Comissão

ANNEX

ANEXO PARTE A: MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS

A.1. TEMPERATURA DE FUSÃO/CONGELAÇÃO

A.1.

1. MÉTODO A maior parte dos métodos descritos baseiam-se na publicação OECD Test Guideline (1) (normas de procedimento para testes da OCDE). Os princípios fundamentais encontram-se descritos nas referências (2) e (3).

1.

1.1. INTRODUÇÃO Os métodos e dispositivos descritos destinam-se a ser aplicados à determinação da temperatura de fusão de substâncias, sem quaisquer restrições no que diz respeito ao seu grau de pureza. A selecção do método depende da natureza da substância que se pretende testar. Em consequência, o factor limitativo dependerá do facto de a substância poder ser ou não ser facilmente pulverizada, pulverizada com dificuldade, ou não poder ser mesmo pulverizada. Para algumas substâncias considera-se mais apropriado a determinação da temperatura de congelação ou de solidificação, tendo as normas para estas determinações sido englobadas também neste método. No caso de não se poder medir convenientemente nenhum dos parâmetros anteriores devido à existência de propriedades particulares da substância, recomenda-se a determinação de um ponto de fluidez.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES Define-se a temperatura de fusão como sendo a temperatura à qual ocorre a transição de fase do estado sólido para o estado líquido à pressão atmosférica, correspondendo idealmente essa temperatura à temperatura de fusão. Uma vez que a transição de fase de diversas substâncias ocorre num intervalo de temperaturas, associa-se-lhe frequentemente um intervalo de fusão. Conversão de unidades (K paraoC) t = T - 273,15 t temperatura de Celsius, graus Celsius (oC) T temperatura termodinâmica, Kelvin (K)

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNC1A Não é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, as características de execução do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos. Na referência (4) encontram-se enumeradas algumas substâncias de calibração.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Determina-se a temperatura (intervalo de temperaturas) da transição de fase do estado sólido para o estado líquido ou do estado líquido para o estado sólido. Na prática, enquanto se aquece/arrefece uma amostra da substância ensaiada à pressão atmosférica, determina-se as temperaturas da fase inicial de fusão/congelação e da fase final de fusão/congelação. Descrevem-se cinco tipos de métodos, designadamente o método capilar, os métodos das fases quentes, as determinações da temperatura de congelação, os métodos de análise térmica e a determinação do ponto de fluidez (desenvolvido para os derivados oleosos do petróleo). Em alguns casos pode ser conveniente medir a temperatura de congelação em vez de se medir a temperatura de fusão.

1.4.

1.4.1. Método capilar

1.4.1.

1.4.1.1. Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão, com banho líquido Coloca-se uma pequena quantidade da substância finamente triturada num tubo capilar e compacta-se fortemente. Aquece-se o tubo em simultâneo com um termómetro e ajusta-se a subida de temperatura para um valor inferior a 1 K/min durante a fusão efectiva. Determinam-se as temperaturas de fusão inicial e final.

1.4.1.2. Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão, com bloco metálico Conforme descrito em 1.4.1.1, com a excepção de o tubo capilar e o termómetro estarem num bloco metálico aquecido e poderem ser observados através de aberturas existentes no bloco.

1.4.1.3. Detecção por célula fotoeléctrica A amostra no tubo capilar é aquecida automaticamente num cilindro metálico. Dirige-se um feixe de luz através da substância, passando por uma abertura existente no cilindro, de modo a atingir uma célula fotoeléctrica calibrada com precisão. Quando da fusão, as propriedades ópticas da maior parte das substâncias variam de opacas para transparentes. A intensidade da luz que atinge a célula fotoeléctrica aumenta e envia um sinal de paragem para o indicador digital, que procede à leitura da temperatura de um termómetro de resistência de platina localizado na câmara de aquecimento. Este método não é adequado para algumas substâncias fortemente coradas.

1.4.2. Fases quentes

1.4.2.

1.4.2.1. Barra quente de Kofler O método da barra quente de Kofler utiliza duas peças metálicas de condutividade térmica diferente, aquecidas electricamente, sendo a barra concebida de tal modo que o gradiente de temperatura é quase linear segundo o seu comprimento. A temperatura da barra quente pode variar desde 283 até 573 K, existindo um dispositivo especial de leitura da temperatura constituído por um cursor com um ponteiro e uma escala, concebidos especificamente para a barra. No sentido de se determinar uma temperatura de fusão, espalha-se a substância em camada fina directamente sobre a superfície da barra quente. Decorridos alguns segundos surge uma linha que separa as fases fluida e sólida. Lê-se a temperatura nesta linha ajustando o ponteiro sobre ela.

1.4.2.2. Microscópio de fusão Existem diferentes tipos de microscópios de placas quentes para a determinação das temperaturas de fusão, utilizando-se quantidades muito pequenas de material. Na maior parte dos aparelhos mede-se a temperatura com um termopar sensível mas, por vezes, utilizam-se termómetros de mercúrio. Existe um equipamento típico para a medição da temperatura de fusão pelo método das placas quentes utilizando microscópio, o qual possui uma câmara de aquecimento contendo uma placa metálica, sobre a qual se coloca a amostra numa lâmina. O centro da placa metálica contém um orifício que permite a entrada de luz proveniente do espelho de iluminação do microscópio. Durante a utilização o compartimento é fechado com uma placa de vidro para eliminar o ar da zona da amostra. O aquecimento da amostra é regulado com um reóstato. Para as medições de elevada precisão das substâncias opticamente anisotrópicas, pode utilizar-se luz polarizada.

1.4.2.3. Método do menisco Este método é utilizado especificamente para as poliamidas. A temperatura à qual ocorre o deslocamento de um menisco de óleo de silicone, encerrado entre uma placa quente e um vidro de cobertura da amostra de poliamida testada, é determinada visualmente.

1.4.3. Método para determinar a temperatura de congelação Coloca-se a amostra num tubo de ensaio especial e leva-se a um aparelho para a determinação da temperatura de congelação. Agita-se a amostra suave e continuamente durante o arrefecimento e mede-se a temperatura em intervalos adequados. Logo que a temperatura permaneça constante durante algumas leituras considera-se que esse valor (corrigido em função do erro do termómetro) é a temperatura de congelação. Deve evitar-se o sobrearrefecimento, mantendo-se o equilíbrio entre as fases sólida e líquida.

1.4.4. Análise térmica

1.4.4.

1.4.4.1. Análise térmica diferencial (ATD) Esta técnica regista a diferença de temperaturas existente entre a substância e um material de referência em função da temperatura, enquanto a substância e o material de referência são submetidos ao mesmo programa de temperatura controlada. Quando a amostra sofre uma transição que implica uma variação de entalpia, essa variação é indicada por um afastamento endotérmico (fusão) ou exotérmico (congelação), relativamente à linha de referência do registo de temperatura.

1.4.4.2. Calorimetria de exploração diferencial (CED) Esta técnica regista a diferença entre a absorção de energia por uma substância e por um material de referência em função da temperatura, enquanto a substância e o material de referência são submetidos ao mesmo programa de temperatura controlada. Essa energia é a necessária para estabelecer uma diferença nula de temperatura entre a substância e o material de referência. Quando a amostra sofre uma transição que implica uma variação de entalpia, essa variação é indicada por um afastamento endotérmico (fusão) ou exotérmico (congelação), relativamente à linha de referência do registo de fluxo de calor.

1.4.5. Ponto de fluidez Este método foi desenvolvido para ser utilizado com os derivados oleosos do petróleo e é adequado para utilização apenas com substâncias de baixas temperaturas de fusão. Após um aquecimento preliminar procede-se ao arrefecimento da amostra segundo um regime específico e faz-se a observação das suas características de fluidez em intervalos de 3 K. A temperatura mais baixa para a qual se observa movimento da substância é considerada como ponto de fluidez.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE A aplicabilidade e a precisão dos diversos métodos utilizados para a determinação da temperatura de fusão/intervalo de fusão encontram-se resumidas no quadro seguinte:

1.5. QUADRO: APLICABILIDADE DOS MÉTODOS A. B. C. D.

Métodos capilares Método de medição Substâncias que podem ser pulverizadas Substâncias dificilmente pulverizadas Intervalo de temperaturas Precisão estimada Norma existente Dispositivos com banho líquido Sim Só para algumas 273 a 573 K ±0,3 K JIS K 0064 Dispositivos com bloco metálico Sim Só para algumas 293 a > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Detecção por célula fotoeléctrica Sim Diversas com dispositivos de aplicação 253 a 573 K ±0,5 K Métodos das fases quentes e de congelação Método de medição Substâncias que podem ser pulverizadas Substâncias dificilmente pulverizadas Intervalo de temperaturas Precisão estimada Norma existente Barra quente de Kofler Sim Não 283 a > 573 K ±1,0 K ANSI/ASTM D 3451-76 Microscópio de fusão Sim Só para algumas 273 a > 573 K ±0,5 K DIN 53736 Método do menisco Não Especificamente para poliamidas 293 a > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Métodos da temperatura de congelação Sim Sim 223 a 573 K ±0,5 K por ex., BS 4695 Análise térmica Método de medição Substâncias que podem ser pulverizadas Substâncias dificilmente pulverizadas Intervalo de temperaturas Precisão estimada Norma existente Análise térmica diferencial Sim Sim 173 a 1273 K até 600 K ±0,5 K até 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Calorimetria de exploração diferencial Sim Sim 173 a 1273 K até 600 K ±0,5 K até 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Ponto de fluidez Método de medição Substâncias que podem ser pulverizadas Substâncias dificilmente pulverizadas Intervalo de temperaturas Precisão estimada Norma existente Ponto de fluidez Para derivados oleosos do petróleo e para substâncias oleosas Para derivados oleosos do petróleo e para substâncias oleosas 223 a 323 K ±3,0 K ASTM D 97-66

1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS Os procedimentos de quase todos os métodos de ensaio encontram-se descritos em normas internacionais e nacionais (ver apêndice 1).

1.6.

1.6.1. Métodos com tubo capilar Quando submetidas a uma lenta subida de temperatura, as substâncias finamente pulverizadas apresentam normalmente as fases de fusão representadas na figura 1.

1.6.1.

Figura 1 Fase A Fase B Fase C Fase D Fase E Fase A (início da fusão): gotículas finas aderem uniformemente à parede interior do tubo capilar. Fase B aparece um espaço livre entre a amostra e a parede interior devido à contracção da substância fundida. Fase C a amostra contraída inicia a queda sobre o fundo e liquefaz-se. Fase D forma-se um menisco completo à superfície mas uma quantidade apreciável da amostra permanece sólida. Fase E (fase final da fusão): não existem quaisquer partículas sólidas. Durante a determinação da temperatura de fusão procede-se ao registo das temperaturas da fase inicial da fusão e da fase final.

1.6.1.1. Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão com aparelho de banho líquido A figura 2 representa um tipo de aparelho normalizado para a determinação da temperatura de fusão, feito de vidro (JIS K 0064); todas as especificações são dadas em milímetros.

1.6.1.1.

Figura 2 A: recipiente de medição B: rolha C: ventilador D: termómetro E: termómetro auxiliar F: banho líquido G: tubo capilar de vidro, de 80 a 100 mm de comprimento, 1,0 ± 0,2 mm de diâmetro interno, 0,2 a 0,3 mm de espessura da parede H: tubo lateral

Líquido do banho:

Deve escolher-se um líquido adequado. A escolha do líquido depende da temperatura de fusão que se pretende determinar; por exemplo, escolher-se-á parafina líquida para temperaturas de fusão não superiores a 473 K, óleo de silicone para temperaturas de fusão não superiores a 573 K. Para temperaturas superiores a 523 K pode utilizar-se uma mistura constituída por três partes de ácido sulfúrico e por duas partes de sulfato de potássio (em peso). Deverão ser tomadas precauções adequadas no caso de se utilizar uma mistura deste tipo.

Termómetro

Apenas deverão ser utilizados termómetros que satisfaçam as exigências das normas indicadas a seguir ou critérios equivalentes: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Procedimento:

Pulveriza-se finamente a substância seca utilizando um almofariz e coloca-se no interior do tubo capilar, selado numa das extremidades, de tal modo que a altura do enchimento seja aproximadamente 3 mm após boa compactação. Para se obter uma amostra compacta uniforme o tubo capilar deverá cair verticalmente de uma altura de aproximadamente 700 mm através de um tubo de vidro e sobre um vidro de relógio. Depois de cheio coloca-se o tubo capilar no banho, de tal modo que a parte média da ampola de mercúrio do termómetro toque no tubo capilar na parte onde se encontra a amostra. Normalmente o tubo capilar é introduzido no aparelho a uma temperatura cerca de 10 K inferior à temperatura de fusão. Aquece-se o líquido do banho de tal modo que o aumento da temperatura seja aproximadamente 3 K/min. O líquido deverá ser agitado. Quando se atingir uma temperatura cerca de 10 K inferior à temperatura de fusão esperada, ajusta-se a subida da temperatura para um valor máximo de 1 K/min.

Cálculo:

O cálculo da temperatura de fusão efectua-se do modo seguinte: T = TD + 0,00016 (TD - TE) n em que: T temperatura de fusão corrigida, em K; TD leitura da temperatura no termómetro D, em K; TE leitura da temperatura no termómetro E, em K; n número de graduações na linha do mercúrio no termómetro D na parte emergente da haste.

1.6.1.2. Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão, com bloco metálico

1.6.1.2. Aparelho:

Este é constituído por:

um bloco metálico cilíndrico, cuja parte superior é oca e forma um compartimento (ver figura 3),

uma tampa metálica, com duas ou várias aberturas, para permitir a montagem de tubos no bloco metálico,

um sistema de aquecimento para o bloco metálico, que pode ser, por exemplo, uma resistência eléctrica encerrada no bloco,

um reóstato para regular a potência de entrada no caso de se utilizar aquecimento eléctrico,

quatro janelas de vidro resistente ao calor situadas nas paredes laterais do compartimento, dispostas diametralmente segundo ângulos rectos relativamente umas às outras. Em frente de uma destas janelas monta-se um óculo para observação do tubo capilar. As outras três janelas são utilizadas para iluminar o interior do compartimento, por meio de lâmpadas,

um tubo capilar, em vidro resistente ao calor e fechado numa extremidade (ver 1.6.1.1).

Termómetro

Ver as normas referidas em 1.6.1.1. Também se podem utilizar dispositivos de medição termoeléctrica, de precisão equivalente.

Figura 3 Tampa metálica Lâmpada Bloco de aquecimento metálico Termómetro Tubo capilar Óculo Resistência eléctrica

1.6.1.3. Detecção por célula fotoeléctrica Aparelho e procedimento: O aparelho é constituído por um compartimento metálico com um sistema de aquecimento automático. Procede-se ao enchimento de três tubos capilares conforme descrito em 1.6.1.1, os quais são depois colocados na estufa. Utilizam-se várias variações lineares de temperatura para calibrar o aparelho e ajusta-se electricamente o aumento de temperatura adequado, segundo uma razão linear e constante pré-seleccionada. Os registadores mostram a temperatura efectiva da estufa e a temperatura da substância nos tubos capilares.

1.6.2. Fases quentes

1.6.2.

1.6.2.1. Barra quente de Kofler Ver apêndice.

1.6.2.2. Microscópio de fusão Ver apêndice.

1.6.2.3. Método do menisco (poliamidas) Ver apêndice. O esquema gradual de aquecimento próximo da temperatura de fusão deverá ser inferior a 1 K/min.

1.6.3. Métodos para a determinação da temperatura de congelação Ver apêndice.

1.6.4. Análise térmica

1.6.4.

1.6.4.1. Análise térmica diferencial Ver apêndice.

1.6.4.2. Calorimetria de exploração diferencial Ver apêndice.

1.6.5. Determinação do ponto de fluidez Ver apêndice.

2. RESULTADOS Em alguns casos é necessário efectuar uma correcção devida ao termómetro.

3. RELATÓRIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte: Considera-se como temperatura de fusão a média de peio menos duas medições efectuadas no intervalo de precisão estimado (ver quadros). Se a diferença entre a temperatura na fase inicial e a temperatura na fase final da fusão estiver entre os limites de precisão do método, considera-se como temperatura de fusão o valor observado na fase final da fusão; caso contrário serão indicadas as duas temperaturas. No caso de a substância se decompor ou sublimar antes de atingir a temperatura de fusão, indicar-se-á a temperatura para a qual se observa esse efeito. Todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos resultados deverão ser descritas, especialmente no que diz respeito às impurezas e ao estado físico da substância.

método utilizado,

especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e fases de purificação prévias no caso de existirem,

uma estimativa da precisão.

4.(1)(2)(3)(4)

REFERÊNCIAS OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, p. 803-834. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 505-515.

A.2. TEMPERATURA DE EBULIÇÃO

A.2.

1. MÉTODO A maior parte dos métodos descritos baseia-se nas normas de ensaio da OCDE (1). Os princípios fundamentais encontram-se descritos nas referências (2) e (3).

1.

1.1. INTRODUÇÃO Os métodos e dispositivos aqui descritos podem ser aplicados a líquidos e a substâncias de baixo ponto de fusão, desde que não sofram uma reacção química para os valores da temperatura de ebulição (por exemplo: auto-oxidação, rearranjo, degradação, etc.). Os métodos podem ser aplicados a substâncias líquidas puras e impuras. Dá-se maior importância aos métodos que utilizam a detecção por célula fotoeléctrica e aos métodos de análise térmica uma vez que esses métodos permitem a determinação das temperaturas de fusão e também das temperaturas de ebulição. Além disso, as medições podem ser efectuadas automaticamente. O método dinâmico possui a vantagem de também poder ser aplicado à determinação da pressão de vapor e de não ser necessário corrigir o valor da temperatura de ebulição para a pressão normal (101,325 kPa) uma vez que a pressão normal pode ser ajustada durante a medição utilizando um manómetro. Observações A influência das impurezas na determinação da temperatura de ebulição depende bastante da natureza dessas impurezas. No caso de existirem na amostra impurezas voláteis que possam afectar os resultados, a substância deve ser purificada.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES Define-se a temperatura de ebulição normal como sendo a temperatura para a qual a pressão de vapor de um líquido é de 101,325 kPa. No caso de a temperatura de ebulição não ser medida à pressão atmosférica normal, a dependência da pressão do vapor em função da temperatura pode ser descrita pela equação de Clausius-Clapeyron: log p = ΔHv2,3RT+const. em que: p pressão de vapor da substância em pascal ΔHv calor de vaporização em J mol-1 R constante universal dos gases perfeitos = 8,314 J mol-1 K-1 T temperatura termodinâmica em K A temperatura de ebulição é especificada tendo em consideração a pressão ambiente durante a medição. Conversões Pressão (unidades: kPa) 100 kPa 1 bar = 0,1 MPa (bar ainda é uma unidade permitida mas não recomendada) 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (as unidades mm Hg e Torr não são permitidas) 1 atm atmosfera padrão = 101,325 Pa (a unidade atm não é permitida) Temperatura (unidades: K) t = T - 273,15 t temperatura de Celsius, graus Celsius (oC) T temperatura termodinâmica, kelvin (K)

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Não é necessário utilizar as substâncias de referência em todos os casos quando se investiga uma nova substância. Elas deverão servir essencialmente para aferir, periodicamente, o método e para permitir a comparação com resultados obtidos com outros métodos. Nos métodos enumerados no apêndice é possível encontrar algumas substâncias utilizadas para calibração.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Existem cinco métodos para a determinação da temperatura de ebulição (intervalo de ebulição) que se baseiam na medição da temperatura de ebulição, e existem dois métodos que se baseiam na análise térmica.

1.4.

1.4.1. Determinação utilizando o ebuliómetro Os ebuliómetros foram originariamente desenvolvidos para a determinação do peso molecular por elevação da temperatura de ebulição, mas também são adequados para as medições exactas da temperatura de ebulição. Existe um aparelho muito simples que se encontra descrito na norma ASTM D 1120-72 (ver apêndice). O líquido é aquecido nesse aparelho, sob condições de equilíbrio à pressão atmosférica, até entrar em ebulição.

1.4.2. Método dinâmico Este método implica a medição da temperatura de recondensação do vapor por meio de um termómetro apropriado no refluxo, mantendo-se a ebulição. Neste método é possível variar a pressão.

1.4.3. Método da destilação para a determinação da temperatura de ebulição Este método compreende a destilação do líquido, a medição da temperatura de recondensação do vapor e a determinação da quantidade do destilado.

1.4.4. Método de Siwoloboff Aquece-se uma amostra num tubo de ensaio, que é imerso num líquido num banho aquecido. Mergulha-se no tubo de ensaio um tubo capilar fechado, contendo uma bolha de ar na parte inferior.

1.4.5. Detecção por célula fotoeléctrica Utilizando o princípio de Siwoloboff efectuam-se medições automáticas por célula fotoeléctrica das bolhas ascendentes.

1.4.6. Análise térmica diferencial Esta técnica regista a diferença existente entre as temperaturas da substância e do material de referência, em função da temperatura, quando a substância e o material de referência são submetidos ao mesmo programa de temperatura controlada. Quando a amostra sofre uma transição que implica uma variação de entalpia, essa variação é indicada por um afastamento endotérmico (ebulição) em relação à linha de referência do registo de temperaturas.

1.4.7. Calorimetria de exploração diferencial Esta técnica regista a diferença de absorção de energia existente entre uma substância e um material de referência, em função da temperatura, quando a substância e o material de referência são submetidos ao mesmo programa de temperatura controlada. Essa energia representa a energia necessária para estabelecer uma diferença nula de temperatura entre a substância e o material de referência. Quando a amostra sofre uma transição que implica uma alteração da entalpia, essa alteração é indicada por um afastamento endotérmico (ebulição), em relação à linha de referência do registo do fluxo do calor.

1.5. Quadro 1 Comparação dos métodos

CRITÉRIOS DE QUALIDADE A aplicabilidade e a precisão dos diferentes métodos utilizados para a determinação da temperatura de ebulição/intervalo de ebulição encontram-se resumidas no quadro 1. Método de medição Precisão estimada Norma existente Ebuliómetro ±1,4 K (até 373 K) ±2,5 K (até 600 K) ASTM D 1120-72 Método dinâmico ±0,5 K (até 600 K) Processo de destilação (intervalo de ebulição) ±0,5 K (até 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Método de Siwoloboff ± 2 K (até 600 K) Detecção por célula fotoeléctrica ±0,3 K (até 373 K) Análise térmica diferencial ±0,5 K (até 600 K) ±2,0 K (até 1273 K) ASTM E 537-76 Calorimetria de exploração diferencial ±0,5 K (até 600 K) ±2,0 K (até 1273 K) ASTM E 537-76

1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS Os procedimentos de alguns destes métodos encontram-se descritos em normas internacionais e nacionais (ver apêndice).

1.6.

1.6.1. Ebuliómetro Ver apêndice.

1.6.2. Método dinâmico Ver o método de ensaio A.4 para a determinação da pressão de vapor. Regista-se a temperatura de ebulição observada para um valor da pressão aplicada de 101,325 kPa.

1.6.3. Processo da destilação (intervalo de ebulição) Ver apêndice.

1.6.4. Método de Siwoloboff Aquece-se a amostra num aparelho para a determinação da temperatura de fusão num tubo de ensaio com um diâmetro de aproximadamente 5 mm (figura 1). A figura 1 representa um tipo de aparelho normalizado para a determinação das temperaturas de fusão e de ebulição (JIS K 0064) (o material é vidro e todas as especificações são em milímetros). Coloca-se no tubo de ensaio um tubo capilar (capilar para a determinação do ponto de ebulição), o qual se encontra fechado a cerca de 1 cm acima da sua extremidade inferior. Adiciona-se a substância que se pretende testar de modo a que a parte fechada do capilar fique abaixo da superfície do líquido. O tubo de ensaio que contém o capilar para a determinação do ponto de ebulição é preso ao termómetro com uma fita de borracha ou fixado lateralmente com um suporte (ver figura 2). Figura 2 Princípio de Siwoloboff Figura 3 Princípio modificado Escolhe-se o líquido do banho de acordo com a temperatura de ebulição. Para temperaturas até 573 K é possível utilizar óleo de silicone. A parafina líquida apenas pode ser utilizada até 473 K. O aquecimento do líquido do banho deve ser ajustado de modo a que a subida de temperatura seja de 3 K/minuto inicialmente. O líquido do banho deve ser agitado. Quando a temperatura atinge cerca de 10 K abaixo da temperatura de ebulição esperada, reduz-se o aquecimento de tal modo que o aumento de temperatura não ultrapasse 1 K/minuto. Ao aproximar-se a temperatura de ebulição, observa-se a formação de bolhas que emergem rapidamente do capilar utilizado para a determinação do ponto de ebulição. A temperatura de ebulição é a temperatura para a qual, face a um arrefecimento momentâneo, cessa a corrente de bolhas e o fluido inicia repentinamente a subida no capilar. A leitura correspondente efectuada no termómetro é a temperatura de ebulição da substância. De acordo com o princípio modificado (figura 3) determina-se a temperatura de ebulição num capilar para a determinação da temperatura de fusão. O capilar é distendido até se obter uma ponta fina com cerca de 2 cm de comprimento (a) e aspira-se uma pequena quantidade da amostra. Fecha-se por fusão a extremidade aberta do capilar de tal modo que na extremidade fique uma pequena bolha de ar. Enquanto se aquece o aparelho para a determinação da temperatura de fusão, a bolha de ar expande-se (b). A temperatura de ebulição corresponde à temperatura para a qual o tampão dessa substância atinge o nível da superfície do líquido do banho (c).

1.6.4.

Figura 1 A: Recipiente de medida B: Rolha C: Respiradouro D: Termómetro E: Termómetro auxiliar F: Líquido do banho G: Tubo de ensaio, diâmetro exterior com o máximo de 5 mm; contendo um tubo capilar com o comprimento aproximado de 100 mm, diâmetro interior de aproximadamente 1 mm e espessura da parede compreendida aproximadamente entre 0,2 e 0,3 mm H: Tubo lateral

1.6.5. Detecção por célula fotoeléctrica A amostra é aquecida num tubo capilar no interior de um bloco metálico aquecido. Pelos orifícios existentes no bloco, é enviado um feixe de luz através da substância para uma célula fotoeléctrica calibrada com precisão. Durante o aumento da temperatura da amostra emergem bolhas de ar simples provenientes do capilar de ebulição. Ao atingir-se a temperatura de ebulição o número de bolhas aumenta fortemente. Isto provoca uma alteração na intensidade da luz registada pela célula fotoeléctrica, que envia um sinal de paragem transmitido para o indicador que efectua a leitura da temperatura num termómetro de resistência de platina localizado no bloco. Este método é especialmente útil, uma vez que permite determinações de valores inferiores à temperatura ambiente e até 253,15 K (- 20oC) sem qualquer modificação no aparelho. Apenas é necessário colocar o instrumento num banho de arrefecimento.

1.6.6. Análise térmica

1.6.6.

1.6.6.1. Análise térmica diferencial Ver apêndice.

1.6.6.2. Calorimetria de exploração diferencial Ver apêndice.

2. Quadro 2 Temperatura — factores de correcção fT

RESU LTADOS Para pequenos desvios em relação à pressão normal (máximo ± 5 kPa), as temperaturas de ebulição são corrigidas para o valor Tn pela equação de conversão de Sidney Young: Tn = T + (fT × Δp) em que: Δp (101,325 - p) [atenção ao sinal] p pressão medida em kPa fT taxa de variação da temperatura de ebulição com a pressão em K/kPa T temperatura de ebulição medida em K Tn temperatura de ebulição corrigida para a pressão normal, em K Os factores para a correcção da temperatura, o valor fT e as equações para a sua aproximação estão descritos nas normas internacionais e nacionais anteriormente referidas para diversas substâncias. Por exemplo, o método DIN 53171 refere as seguintes correcções aproximadas para solventes incorporados em tintas: Temperatura T (K) Factor de correcção fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47

3. RELATÓRIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte: Estabelece-se que a temperatura de ebulição é a média de pelo menos duas medições situadas no intervalo de precisão estimada (ver quadro 1). As temperaturas de ebulição medidas e os seus valores médios deverão ser especificados e os valores da pressão para os quais se efectuaram as medições deverão ser apresentados em kPa. Preferencialmente a pressão deverá ser próxima da pressão atmosférica normal. Todas as informações e notas relevantes para a interpretação de resultados deverão ser apresentadas, especialmente no que diz respeito às impurezas e estado físico da substância.

método utilizado,

especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e fases prévias de purificação, se for caso disso,

uma estimativa da precisão.

4.(1)(2)(3) REFERÊNCIAS OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.

A.3. DENSIDADE RELATIVA

A.3.

1. MÉTODO Os métodos descritos baseiam-se nas Normas de Ensaio da OCDE (1). Os princípios fundamentais encontram-se na referência (2).

1.

1.1. INTRODUÇÃO Os métodos descritos para a determinação da densidade relativa são aplicáveis a substâncias sólidas e a substâncias líquidas, sem qualquer restrição no que diz respeito ao seu grau de pureza. Os diversos métodos utilizáveis encontram-se resumidos no quadro 1.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES A densidade relativa D204 de um sólido ou de um líquido é a razão entre a massa de um determinado volume da substância que se pretende testar, à temperatura de 20 oC, e a massa de igual volume de água, à temperatura de 4 oC. A densidade relativa não tem dimensões. A densidade, p, de uma substância é o quociente entre a massa, m, e o seu volume, v. A densidade, p, é dada, em unidades do SI, em kg/m3.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA (1) (3) Não é necessário utilizar substâncias de referência em todos os casos quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibração do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.

1.4. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS Recorre-se à utilização de quatro classes de métodos.

1.4.

1.4.1. Métodos de flutuação

1.4.1.

1.4.1.1. Hidrómetro (para substâncias líquidas) É possível efectuar determinações rápidas e suficientemente exactas de densidade utilizando hidrómetros de flutuação, os quais permitem obter a densidade de um líquido a partir da profundidade de imersão por simples leitura de uma escala graduada.

1.4.1.2. Balança hidrostática (para substâncias líquidas e sólidas) Pode recorrer-se à diferença entre o peso de uma amostra testada medido ao ar e num líquido adequado (por exemplo água) para se determinar a sua densidade. No caso dos sólidos, a densidade medida é apenas representativa da amostra particular utilizada. Para a determinação da densidade de líquidos pesa-se primeiro ao ar um corpo de volume conhecido, v, e depois pesa-se mergulhado no líquido.

1.4.1.3. Método do corpo imerso (para substâncias líquidas) (4) De acordo com este método determina-se a densidade de um líquido a partir da diferença entre os resultados da pesagem do líquido antes e após a imersão, nesse líquido, de um corpo de volume conhecido.

1.4.2. Métodos do picnómetro Tanto para os sólidos como para os líquidos é possível utilizar picnómetros de configurações diversas e com volumes conhecidos. Calcula-se a densidade a partir da diferença em peso entre o picnómetro cheio e vazio e pelo conhecimento do seu volume.

1.4.3. Picnómetro por comparação ao ar (para sólidos) Pode medir-se a densidade de um sólido de qualquer configuração, à temperatura ambiente, utilizando o picnómetro de comparação de gases. Mede-se o volume de uma substância ao ar ou num gás inerte, usando um cilindro de volume calibrado variável. Para se calcular a densidade efectua-se uma medição de massa depois da medição de volume.

1.4.4. Densímetro oscilante (5) (6) (7) É possível medir a densidade de um líquido utilizando um densímetro oscilante. Utiliza-se um oscilador mecânico com a forma de um tubo em U o qual se faz vibrar à frequência de ressonância do oscilador, a qual depende da sua massa. A introdução de uma amostra altera a frequência de ressonância do oscilador. O aparelho tem de ser calibrado utilizando duas substâncias líquidas de densidades conhecidas. Essas substâncias deverão ser preferencialmente escolhidas de tal modo que as suas densidades relativas cubram o intervalo que se pretende medir.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE A aplicabilidade dos diversos métodos utilizados para a determinação da densidade relativa encontra-se resumida no quadro.

1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS As normas apresentadas como exemplos, que devem ser consultadas para obtenção de pormenores técnicos adicionais, estão mencionadas no apêndice. Os testes devem ser efectuados à temperatura de 20 oC e deverão ser realizadas pelo menos duas medições.

2. RESULTADOS Ver normas.

3. Quadro 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Aplicabilidade dos métodos

RELATÓRIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte: A densidade relativa D204 deverá constar do relatório conforme definido em 1.2, em conjunto com o estado físico da substância ensaiada. No relatório devem constar todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos resultados, especialmente no que diz respeito a impurezas e ao estado físico da substância. Método de medida Densidade Viscosidade dinâmica máxima possível Normas existentes Sólido Líquido Hidrómetro Sim 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Balança hidrostática Sim ISO 1183 (A) Sim 5 Pa s ISO 901 e 758 Método do corpo imerso Sim 20 Pa s DIN 53217 Picnómetro ISO 3507 Sim ISO 1183 (B), NF T 20-053 Sim 500 Pa s ISO 758 Picnómetro por comparação ao ar Sim DIN 55990 parte 3, DIN 53243 Densímetro oscilante Sim 5 Pa s

método utilizado,

especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e fases prévias de purificação, se as houver.

3. Quadro 1.4.1.1.1.4.1.2. Aplicabilidade dos métodos a)

sólidos

líquidos

3. Quadro 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Aplicabilidade dos métodos a)

sólidos

líquidos

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

REFERÊNCIAS OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(8l) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part l. IUPAC, Recommended reference materiais for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. ll, p. 427-430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, p. 297-302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, p. 717-726. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, p. 253-255.

A.4. PRESSÃO DE VAPOR

A.4.

1. MÉTODO A maior parte dos métodos descritos baseiam-se na publicação da OCDE (1). Os princípios fundamentais encontram-se descritos nas referências (2) e (3).

1.

1.1. INTRODUÇÃO Considera-se útil possuir informações preliminares sobre a estrutura, a temperatura de fusão e a temperatura de ebulição da substância para se efectuar este teste. Não existe nenhum procedimento de medição único aplicável a todo o intervalo de pressões de vapor. Em consequência, recomendam-se diversos métodos utilizáveis para a medição da pressão de vapor para valores compreendidos entre < 10-4 e 105 Pa. Normalmente as impurezas afectam a pressão de vapor. O grau dessa influência depende muito do tipo das impurezas. No caso de existirem na amostra impurezas voláteis que possam afectar o resultado, a substância deve ser purificada. Também se considera apropriado referir a pressão de vapor para o material técnico. Alguns dos métodos aqui descritos utilizam aparelhos com partes metálicas; deve tomar-se este facto em consideração no caso de se testarem substâncias corrosivas.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES Define-se a pressão de vapor de uma substância como sendo a pressão de saturação exercida sobre uma substância sólida ou líquida. Para uma situação de equilíbrio termodinâmico, a pressão de vapor de uma substância pura, é apenas função da temperatura. A unidade de pressão do SI que se deve utilizar é o pascal (Pa). As unidades antigamente utilizadas e os seus factores de conversão são: 1 Torr (- 1 mm Hg) = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfera = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa A unidade de temperatura do SI é o kelvin (K). A constante universal dos gases perfeitos é R = 8,314 J mol-1 K-1 A dependência da pressão de vapor em função da temperatura é descrita pela equação de Clausius-Clapeyron: log p = ΔHv2,3RT+const. em que: p pressão de vapor da substância em pascal ΔHv calor de vaporização da substância em J mol-1 R constante universal dos gases perfeitos em J mol-1 K-1 T temperatura termodinâmica em K

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Não é necessário utilizar substâncias de referência em todos os casos quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibração do método e para proporcionar a comparação dos resultados obtidos com outros métodos.

1.4. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS Para a determinação da pressão de vapor propõem-se sete métodos que podem ser aplicados em diferentes intervalos de pressão de vapor. Para cada um desses métodos determina-se a pressão de vapor para várias temperaturas. Num intervalo de temperaturas limitado, o logaritmo da pressão de vapor de uma substância pura é uma função linear do inverso da temperatura.

1.4.

1.4.1. Método dinâmico No método dinâmico mede-se a temperatura de ebulição referente a uma pressão específica. Intervalo recomendado: 103 até 105 Pa Este método tem sido recomendado também para a determinação da temperatura de ebulição normal e é útil até à temperatura de 600 K.

1.4.2. Método estático No processo estático, determina-se a pressão de vapor estabelecida num sistema fechado em equilíbrio termodinâmico, para uma temperatura específica. Este método é adequado para sólidos e líquidos de um só componente e de multicomponentes. Intervalo recomendado: 10 até 105 Pa Este método também pode ser utilizado no intervalo de 1 a 10 Pa, com as devidas precauções.

1.4.3. Isoteniscópio Este método normalizado é também um método estático mas normalmente não é adequado para sistemas multicomponentes. Existe informação adicional na publicação ASTM, método D-2879-86. Intervalo recomendado: desde 100 até105 Pa

1.4.4. Método de efusão: balança de pressão de vapor Determina-se a quantidade de substância que sai de uma célula, por unidade de tempo, através de uma abertura de dimensões conhecidas, sob condições de vácuo, de forma que o retorno da substância à célula seja desprezível (por exemplo, medindo o impulso exercido sobre uma balança sensível, pela acção de um jacto de vapor, ou medindo a perda de peso de célula). Intervalo recomendado: 10-3 até 1 Pa

1.4.5. Método de efusão: por perda de peso ou por captação do vaporizado O método baseia-se na estimativa da massa da substância de teste que se escoa por unidade de tempo numa célula de Knudsen (4) na forma de vapor, através de um micro-orifício, sob condições de ultravácuo. Pode obter-se a massa efundida de vapor determinando a perda de massa da célula ou condensando o vapor a baixa temperatura e determinando a quantidade de substância volatilizada, recorrendo-se à análise cromatográfica. Calcula-se a pressão de vapor aplicando a relação de Hertz-Knudsen. Intervalo recomendado: 10-3 a 1 Pa

1.4.6. Método de saturação de gás Faz-se passar sobre a substância uma corrente de gás portador inerte, de tal modo que este fique saturado com o vapor daquela. A quantidade de material transportado por uma quantidade conhecida daquele gás inerte é susceptível de ser medida por recolha num colector adequado ou por recurso a uma técnica analítica. Utiliza-se depois esse material para calcular a pressão de vapor a uma determinada temperatura. Intervalo recomendado: 10-4 a 1 Pa Também se pode utilizar este método no intervalo de 1 a 10 Pa, com as precauções adequadas.

1.4.7. Rotor giratório No manómetro de rotor giratório, o elemento de medição real é uma pequena esfera de aço que é colocada em suspensão num campo magnético e que gira a uma velocidade elevada. Calcula-se a pressão de gás, a partir da diminuição de velocidade da esfera de aço, a qual depende da pressão. Intervalo recomendado: 10-4 até 0,5 Pa

1.5. Quadro 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Critérios de qualidade

CRITÉRIOS DE QUALIDADE Os diversos métodos para a determinação da pressão de vapor são comparados pelas suas características de aplicação, repetitividade, reprodutibilidade, intervalo de medição, normas existentes. Essa comparação encontra-se resumida no quadro que se segue. Método de medição Substâncias Repetitividade estimada Reprodutibilidade estimada Intervalo recomendado Norma existente Sólido Líquido Método dinâmico Baixo ponto de fusão Sim Até 25 % Até 25 % 103 Pa até 2 × 103 Pa — 1 a 5 % 1 a 5 % 2 × l03 Pa até 10-5 Pa — Método estático Sim Sim 5 a 10 % 5 a 10 % 10 Pa até 105 Pa NFT 20-048 (5) Isoteniscópio Sim Sim 5 a 10 % 5 a 10 % 102 Pa até 105 Pa ASTM-D 2879-86 Método de efusão: balança de pressão de vapor Sim Sim 5 a 20 % Até 50 % 10-3 Pa até 1 Pa NFT 20-047 (6) Método de efusão: perda de peso Sim Sim 10 a 30 % — 10-3 Pa até 1 Pa — Método de saturação de gás Sim Sim 10 a 30 % Até 50 % 10-4 Pa até 1 Pa — Método do rotor giratórico Sim Sim 10 a 20 % — 10-4 Pa até 0,5 Pa —

1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS

1.6.

1.6.1. Medição dinâmica

1.6.1.

1.6.1.1. Equipamento O equipamento típico de medida é constituído por um recipiente de ebulição ao qual está associado um sistema de arrefecimento de vidro ou de metal (figura 1), instrumentos para a medição da temperatura e instrumentos para regular e medir a pressão. Na figura representa-se um equipamento típico de medição de vidro, resistente ao calor e composto por cinco partes: O tubo grande com parede parcialmente dupla é constituído por uma junta normalizada, um sistema de arrefecimento, um recipiente de arrefecimento e uma entrada. O cilindro de vidro, com uma bomba Cottrell, é montado na secção de ebulição do tubo e possui uma superfície rugosa de vidro fragmentado para evitar ressaltos durante o processo de ebulição. A temperatura é medida com um sensor de temperatura adequado (por exemplo, um termómetro de resistência, ou um termopar) imerso no interior do equipamento até ao ponto de medida (n.o 5 da figura 1) através de uma entrada adequada (por exemplo, junta normalizada macho). Efectuam-se as necessárias ligações ao equipamento de regulação e de medição da pressão. A ampola, que funciona como um separador volumétrico, é ligada ao equipamento de medida por meio de um tubo capilar. Aquece-se o recipiente de ebulição utilizando um elemento de aquecimento (por exemplo, um calorífero de cartucho) inserido no equipamento de vidro pela parte inferior. Liga-se a corrente de aquecimento necessária e regula-se através de um termopar. A pressão de vácuo necessária, compreendida aproximadamente entre 102 Pa e 105 Pa, é produzida com uma bomba de vácuo. Utiliza-se uma válvula adequada para admissão de ar ou de azoto para regular a pressão (intervalo de medição compreendido aproximadamente entre 102 e 105 Pa) e para ventilação. Mede-se a pressão com um manómetro.

1.6.1.2. Procedimento de medição Mede-se a pressão de vapor determinando a temperatura de ebulição da amostra para diversas pressões específicas compreendidas, grosso modo, entre 103 e 105 Pa. A existência de uma temperatura estável sob uma pressão constante significa que se atingiu a temperatura de ebulição. As substâncias espumosas não podem ser submetidas a este método de medição. Coloca-se a substância num recipiente limpo e seco. É possível que surjam problemas com sólidos não pulverizados mas esta questão pode ser resolvida frequentemente aquecendo a água da manga de arrefecimento. Depois de se ter enchido o recipiente, veda-se o equipamento na flange e eliminam-se os gases da substância. Ajusta-se seguidamente a pressão para o valor mais baixo desejado e liga-se o aquecimento. Simultaneamente liga-se o sensor de temperatura a um registador. Atinge-se o equilíbrio quando se regista uma temperatura de ebulição constante a uma pressão constante. E necessário tomar precauções para evitar a instabilidade durante a ebulição. Além disso pode ocorrer condensação total no sistema de arrefecimento. No caso de se determinar a pressão de vapor de sólidos de baixo ponto de fusão é necessário tomar precauções para evitar o bloqueio do condensador. Depois de se ter registado este ponto de equilíbrio ajusta-se a pressão para um valor superior. Repete-se este processo até se atingir a pressão de 105 Pa (aproximadamente 5 a 10 pontos de medição na totalidade). Para verificação, os pontos de equilíbrio deverão ser repetidos para valores decrescentes da pressão.

1.6.2. Medição estática

1.6.2.

1.6.2.1. Equipamento O equipamento é constituído por um recipiente para a amostra, um sistema de aquecimento e um sistema de arrefecimento para regular a temperatura da amostra e um aparelho para medição da temperatura. O equipamento incorpora também instrumentos para ajustar e medir a pressão. As figuras 2a e 2b ilustram os princípios básicos envolvidos. A câmara da amostra (figura 2a) é ligada num dos lados a uma válvula própria para alto vácuo. Ao outro lado liga-se um tubo em U contendo um fluido manométrico adequado. Uma das extremidades do tubo em U ramifica-se e vai ligar-se à bomba de vácuo, à botija de azoto ou à válvula de ventilação, e a um manómetro. É possível utilizar um manómetro com um indicador de pressão em vez de um tubo em U (figura 2b). No sentido de se regular a temperatura da amostra, coloca-se o recipiente da amostra com a válvula e com o tubo em U ou com o manómetro num banho que é mantido a uma temperatura constante ±0,2 K. As medições de temperatura são efectuadas na parede exterior do recipiente que contém a amostra ou no próprio recipiente. Para fazer o vácuo no equipamento utiliza-se uma bomba de vácuo com um sistema de arrefecimento. No método 2a mede-se a pressão de vapor da substância indirectamente, utilizando um indicador de zero. Este método leva em consideração o facto de a densidade do fluido no tubo em U se alterar no caso de a temperatura variar muito. Os líquidos a seguir indicados são adequados para utilização como indicadores de zero para o tubo em U, dependendo do intervalo de pressão e do comportamento químico das substâncias testadas: mercúrio, óleos de silicone, ftalatos. A substância testada não deve dissolver-se perceptivelmente ou reagir com o fluido do tubo em U. Para o manómetro o mercúrio pode ser utilizado no intervalo compreendido entre a pressão atmosférica normal e 102 Pa, ao passo que os óleos de silicone e os ftalatos são adequados para utilização no intervalo compreendido entre 10 Pa e 102 Pa. Os manómetros de membrana aquecível podem ser utilizados eventualmente para valores inferiores a 10-1 Pa. Existem ainda outros manómetros susceptíveis de serem utilizados para valores inferiores a 102 Pa.

1.6.2.2. Procedimentos de medição Antes da medição todos os componentes do equipamento representado na figura 2 devem ser completamente limpos e secos. Para o método 2a, enche-se o tubo em U com o líquido escolhido, o qual deve ser desgaseificado a temperatura elevada, antes de se fazer qualquer leitura. Coloca-se a substância testada no equipamento o qual é depois fechado e reduz-se a temperatura o suficiente para remover os gases. A temperatura deve ser suficientemente baixa para garantir a remoção do ar mas, no caso das amostras com vários componentes, o seu valor não deve alterar a composição do material. Se necessário pode-se estabelecer o equilíbrio mais rapidamente por agitação. A amostra pode ser sobrearrefecida, por exemplo, com azoto líquido (precauções: condensação do ar, fluido da bomba) ou com uma mistura de etanol e gelo seco. Para medições a baixa temperatura utiliza-se um banho de regulação da temperatura ligado a um sistema ultracriogénico. Estando aberta a válvula sobre o recipiente da amostra, aplica-se o sistema de sucção durante diversos minutos para se efectuar a remoção do ar. Depois fecha-se a válvula e reduz-se a temperatura da amostra para o mais baixo nível desejado. Se necessário, deverá repetir-se diversas vezes a operação de desgaseificação. Ao aquecer-se a amostra a pressão de vapor aumenta. Isto altera o equilíbrio do fluido no tubo em U. Para se compensar este fenómeno permite-se a entrada de azoto ou de ar no aparelho através de uma válvula, até que o indicador de pressão de fluido marque novamente zero. A pressão necessária para conseguir isto pode ser lida com um manómetro de precisão à temperatura ambiente. Esta pressão corresponde à pressão de vapor da substância para esse valor específico da temperatura medida. O método 2b é idêntico mas a pressão de vapor é lida directamente. A dependência da pressão de vapor em função da temperatura é determinada para pequenos intervalos adequados (aproximadamente 5 a 10 pontos de medição na totalidade) até se alcançar o máximo desejado. Para verificação deverão ser repetidas as leituras com os valores de temperatura a baixar. No caso de os valores obtidos na repetição das leituras não coincidirem com a curva obtida para os valores crescentes da temperatura, pode ser devido às razões seguintes:

1.6.2.2.

1. A amostra ainda contém ar (por exemplo, no caso dos materiais de alta viscosidade) ou contém substâncias de baixo ponto de ebulição, as quais são libertadas durante o aquecimento e podem ser removidas por sucção seguindo-se novamente um sobrearrefecimento.

2. A temperatura de arrefecimento não é suficientemente baixa. Nesse caso utiliza-se azoto líquido como agente de arrefecimento. Se estivermos perante o caso 1 ou 2, os ensaios deverão ser repetidos.

3. A substância sofre uma reacção química no intervalo de temperatura pesquisado (por exemplo, decomposição, polimerização).

1.6.3. Isoteniscópio Na referência 7 encontra-se uma descrição completa deste método. Na figura 3 mostra-se o princípio de funcionamento deste dispositivo de medição. Analogamente ao método estático descrito em 1.6.2, o isoteniscópio é apropriado para fazer uma investigação do tipo descrito em sólidos ou líquidos. No caso dos líquidos, a própria substância serve como fluido no manómetro auxiliar. Coloca-se no isoteniscópio uma quantidade do líquido, suficiente para encher a ampola e o segmento curto da secção do manómetro. Liga-se o isoteniscópio a um sistema de vácuo, procede-se à evacuação do isoteniscópio e enche-se depois com azoto. Repete-se duas vezes a evacuação e a purificação do sistema para garantir a remoção do oxigénio residual. Coloca-se o isoteniscópio cheio em posição horizontal de tal modo que a amostra se espalhe segundo uma camada fina na ampola da amostra e na secção do manómetro (parte em U). Reduz-se a pressão do sistema para 133 Pa e aquece-se suavemente a amostra até ela iniciar a ebulição (remoção de gases estáveis dissolvidos). Depois coloca-se o isoteniscópio de tal modo que a amostra regresse à ampola e ao segmento curto do manómetro, ficando os dois assim completamente cheios com líquido. Mantém-se a pressão tal como para a desgaseificação; aquece-se com chama fraca a extremidade de saída da ampola da amostra até que o vapor libertado pela amostra se expanda suficientemente para deslocar parte da amostra da parte superior da ampola e do braço do manómetro para o interior da secção do manómetro do isoteniscópio, originando um espaço livre de azoto e cheio de vapor. Depois coloca-se o isoteniscópio num banho a temperatura constante e ajusta-se a pressão do azoto até que o seu valor seja igual ao da amostra. O equilíbrio entre pressões é indicado pela secção do manómetro do isoteniscópio. Em situação de equilíbrio, a pressão de vapor do azoto é igual à pressão de vapor da substância. No caso dos sólidos, dependendo da pressão e do intervalo de temperaturas, utilizam-se os líquidos manométricos enumerados em 1.6.2.1. O líquido manométrico isento de gases é utilizado para encher uma protuberância existente no segmento longo do isoteniscópio. Depois coloca-se na ampola o sólido que se está a estudar e desgaseifica-se a uma temperatura elevada. Depois disso inclina-se o isoteniscópio de tal modo que o líquido manométrico possa fluir para o interior do tubo em U. A medição da pressão de vapor em função da temperatura efectua-se de acordo com 1.6.2.

1.6.4. Método de efusão: balança de pressão de vapor

1.6.4.

1.6.4.1. Equipamento Encontram-se descritas na literatura várias versões de equipamento (1). O equipamento aqui descrito ilustra o princípio geral do método (figura 4). A figura 4 mostra os componentes principais do equipamento, consistindo num recipiente de vidro ou de aço inoxidável para alto vácuo, equipamento para produzir e medir pressão de vácuo e componentes incorporados para medir a pressão de vapor numa balança. O equipamento possui os seguintes componentes incorporados:

um forno evaporador com flange e entrada giratória. O forno evaporador é um recipiente cilíndrico feito, por exemplo, de cobre ou de uma liga quimicamente resistente e de boa condutividade térmica. Também se pode utilizar um recipiente de vidro com uma parede de cobre. O forno possui um diâmetro de aproximadamente 3 a 5 cm e entre 2 e 5 cm de altura. Existem entre uma e três aberturas de dimensões diferentes para a corrente de vapor. O forno é aquecido utilizando uma placa de aquecimento colocada por baixo ou uma espiral de aquecimento em torno da superfície exterior. Para se evitar que o calor seja dissipado na placa de base, liga-se o calorífero à placa de base utilizando um metal de fraca condutividade térmica (níquel/prata ou aço de crómio-níquel), por exemplo um tubo de níquel/prata ligado a uma entrada rotativa no caso de se utilizar um forno com diversas aberturas. Este sistema possui a vantagem de permitir a introdução de uma barra de cobre. Isto permite o arrefecimento exterior utilizando um banho de arrefecimento,

no caso de a tampa do forno de cobre possuir três aberturas de diâmetros diferentes situadas a 90o umas das outras, é possível abranger diversos intervalos de pressão de vapor dentro do intervalo total de medição (aberturas com diâmetros compreendidos aproximadamente entre 0,30 e 4,50 mm). Utilizam-se as aberturas maiores para valores da pressão de vapor menores e vice-versa. Rodando o forno pode seleccionar-se a abertura desejada ou uma posição intermédia da pressão de vapor (abertura do forno/blindagem/campânula de balança) e a corrente de moléculas é libertada ou deflectida pela abertura do forno sobre a balança. No sentido de se medir a temperatura da substância coloca-se num ponto adequado um termopar ou um termómetro de resistência,

sobre a blindagem existe uma campânula pertencente a uma microbalança altamente sensível (ver adiante). O diâmetro da campânula da balança é de aproximadamente 30 mm. O alumínio revestido a ouro é o material adequado,

consoante o tipo de balança, assim existem aberturas para o travessão da balança e uma abertura na blindagem para a corrente de moléculas garantindo-se a condensação completa do vapor na campânula da balança. A dissipação do calor para o exterior é garantida, por exemplo, por uma barra de cobre ligada a uma caixa de refrigeração. A barra é aplicada através da placa de base e termicamente isolada desta, por exemplo, com um tubo de aço de crómio-níquel. Mergulha-se a barra num balão de Dewar contendo azoto líquido existente sob a placa da base ou faz-se circular azoto líquido pela barra. Deste modo a caixa de refrigeração é mantida aproximadamente à temperatura de - 120 oC. A campânula da balança é arrefecida exclusivamente por radiação o que é satisfatório para o intervalo de pressões que se pretende pesquisar (arrefecer aproximadamente 1 hora antes do início das medições),

a balança fica colocada sobre a caixa de refrigeração. As balanças adequadas são, por exemplo, as balanças electrónicas de dois braços altamente sensíveis (8) ou instrumentos de bobina móvel altamente sensíveis (ver OCDE Test Guideline 104, Edição de 12 de Maio de 1981),

a placa da base incorpora também ligações eléctricas para termopares (ou para termómetros de resistência) e para as resistências de aquecimento,

uma pressão de vácuo no recipiente utilizando uma bomba de vácuo parcial ou uma bomba de alto vácuo (a pressão de vácuo necessária é de aproximadamente 1 a 2 × 10-3 Pa, obtida após 2 horas de bombagem). Regula-se a pressão com um manómetro de ionisação adequado.

1.6.4.2. Procedimento de medição Enche-se o recipiente com a substância testada e fecha-se a tampa. A blindagem e a caixa de refrigeração deslizam, ficando colocadas sobre o forno. Fecha-se o aparelho e ligam-se as bombas de vácuo. A pressão final antes de se iniciarem as medições deverá ser de aproximadamente 10-4 Pa. O arrefecimento da caixa de refrigeração tem início a 10-2 Pa. Uma vez alcançado o vácuo necessário, inicia-se o processo de calibração para o mais baixo valor da temperatura necessária. Ajusta-se a abertura correspondente na tampa, passando a corrente de vapor directamente através da blindagem por cima da abertura e atingindo a campânula da balança arrefecida. A campânula da balança deve ser suficientemente grande para garantir que toda a corrente conduzida através da blindagem a atinja. O jacto da corrente de vapor actua como uma força contra a campânula da balança e as moléculas condensam na sua superfície arrefecida. O jacto e a condensação simultânea produzem um sinal no aparelho de registo. A avaliação dos sinais fornece duas informações: p = G 2 π RT×103M em que: G velocidade de evaporação (kg s-1 m-2) M massa molar (g mol-1) T temperatura (K) R constante universal dos gases perfeitos (J mol-1 K-1) p pressão de vapor (Pa) Depois de se ter alcançado o vácuo necessário inicia-se a série de medições a partir da mais baixa temperatura de medição desejada. Para as outras medições, aumenta-se a temperatura gradualmente até se atingir o valor da temperatura máxima desejada. Depois arrefece-se novamente a amostra e pode registar-se uma segunda curva de pressão de vapor. Se os valores da segunda experiência não coincidem com os valores obtidos na primeira experiência, então é possível que a substância possa ter sofrido decomposição no intervalo de temperatura que se está a medir.

1.6.4.2.

1. No equipamento agora descrito a pressão de vapor é determinada directamente a partir do jacto aplicado à campânula da balança [não é necessário conhecer o peso molecular (2)]. Ao fazer-se a avaliação das leituras deverão ser tomados em consideração factores geométricos tais como a abertura do forno e o ângulo da corrente de vapor.

2. Pode medir-se simultaneamente a massa do condensado podendo calcular-se a partir daí a velocidade de evaporação. Também se pode calcular a pressão de vapor a partir da velocidade de evaporação e do peso molecular recorrendo à equação de Hertz (2)

1.6.5. Método de efusão — por perda de peso

1.6.5.

1.6.5.1. Equipamento O equipamento de efusão é constituído pelas partes básicas seguintes: Na figura 5, por exemplo, mostra-se um tanque de alumínio para vácuo, aquecido electricamente, possuindo quatro células de efusão feitas de aço inoxidável. A chapa de aço inoxidável tem uma espessura aproximada de 0,3 mm e possui um orifício de efusão com um diâmetro compreendido entre 0,2 e 1,0 mm, prendendo-se à célula de efusão através de uma tampa roscada.

um tanque que pode ser termostatado e esvaziado e no qual estão localizadas as células de efusão,

uma bomba de alto vácuo (por exemplo, uma bomba de difusão ou uma bomba turbomolecular) com manómetro de vácuo,

um sifão, utilizando azoto líquido ou gelo seco.

1.6.5.2. Procedimento de medição Enche-se cada célula de efusão com as substâncias de referência e de teste, fixa-se com a tampa roscada o diafragma metálico com o orifício e faz-se a pesagem de cada célula com uma precisão da ordem de 0,1 mg. Coloca-se a célula no equipamento controlado por termóstato o qual é depois esvaziado até se obter um valor inferior a um décimo da pressão esperada. Para intervalos definidos de tempo variando entre 5 e 30 horas, introduz-se ar no equipamento e determina-se a perda de massa da célula de efusão fazendo nova pesagem. No sentido de se garantir que os resultados não são influenciados por impurezas voláteis, repete-se a pesagem da célula a intervalos definidos de tempo para verificar se a velocidade de evaporação é constante ao longo de pelo menos dois intervalos de tempo. A pressão de vapor p na célula de efusão é dada por: p = mKAt2 π RTM em que: p pressão de vapor (Pa) m massa da substância que sai da célula durante o tempo t (kg) t tempo (s) A área da perfuração (m2) K factor de correcção R constante universal dos gases perfeitos (J mol-1 K-1) T temperatura (K) M massa molar (kg mol-1) O factor de correcção K depende da razão entre o comprimento e o raio do orifício do cilindro: razão: 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K: 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 A equação anterior pode ser escrita da forma seguinte: p = E mtTM em que E = 1KA2πR é a constante da célula de efusão. Esta constante E da célula de efusão pode ser determinada com substâncias de referência (2,9) recorrendo à equação seguinte: E = p(r)tmM(r)T em que: p(r) pressão de vapor da substância de referência (Pa) M(r) massa molar da substância de referência (kg.mol-1)

1.6.6. Método de saturação com gás

1.6.6.

1.6.6.1. Equipamento Para se efectuar este teste utiliza-se um equipamento típico que é constituído por diversos componentes representados na figura 6a e adiante descritos (1).

1.6.6.1. Gás inerte:

O gás portador não deve reagir quimicamente com a substância testada. Normalmente o azoto é suficiente para satisfazer essa finalidade mas, ocasionalmente, podem ser necessários outros gases (10). O gás utilizado deve ser seco (ver figura 6a, n.o 4, da legenda: sensor de humidade relativa).

Controlo de fluxo:

É necessário um sistema adequado para o controlo do gás para garantir um fluxo constante e predeterminado através da coluna do saturador.

Sistemas de captação para recolha de vapor:

Estes sistemas dependem das características da amostra particular e do método de análise escolhido. O vapor deverá ser recolhido em quantidade e de forma que permita a análise posterior. Para algumas substâncias testadas são adequados sistemas de captação contendo líquidos tais como o hexano ou o etilenoglicol. Para outras é preferível aplicar absorventes sólidos. Em alternativa à captação de vapor e análise posterior é possível utilizar diversas técnicas analíticas tais como a cromatografia para se determinar quantitativamente a quantidade de material transportado por uma quantidade conhecida de gás portador. Adicionalmente é possível medir a perda de massa da amostra.

Permutador de calor:

Para medições a temperaturas diferentes pode ser necessário incorporar no equipamento um permutador de calor.

Coluna do saturador:

A substância a testar é depositada sob a forma de solução sobre um suporte inerte adequado. Carrega-se a coluna do saturador com o suporte revestido, devendo as dimensões daquela e o débito serem tais que se garanta a saturação completa do gás portador. A coluna do saturador deve ser controlada por termóstato. Para medições de temperaturas superiores à temperatura ambiente deve-se aquecer a região entre a coluna do saturador e o sistema de captação para evitar a condensação da substância a testar. No sentido de reduzir o transporte de massa que ocorre por difusão pode colocar-se um tubo capilar depois da coluna do saturador (figura 6b).

1.6.6.2. Procedimento de medição

1.6.6.2. Preparação da coluna do saturador:

A uma quantidade adequada de suporte adiciona-se uma solução da substância a testar num solvente facilmente volátil. Dever-se-á adicionar a substância a testar em quantidade suficiente para manter a saturação durante o tempo de duração do teste. Evapora-se o solvente totalmente ao ar ou num evaporador rotativo e carrega-se a coluna do saturador com o material bem misturado. Após o controlo da amostra por termóstato faz-se passar azoto através do equipamento.

Medição:

Os sistemas de captação ou o detector incorporado são ligados à linha dos efluentes da coluna e procede-se ao registo do tempo. Verifica-se o débito no início e a intervalos regulares durante a experiência, utilizando um contador de bolhas (ou continuamente com um debitómetro). Deve-se medir a pressão à saída do saturador. Isto pode ser feito do modo seguinte: Determina-se em experiências preliminares ou por estimativa o tempo necessário para recolher a quantidade de substância a testar que é necessária para os diversos métodos de análise. Em alternativa, pode utilizar-se uma técnica analítica quantitativa (por exemplo, a cromatografia) para recolha da substância para outras análises. Antes de se calcular a pressão de vapor para uma determinada temperatura é necessário efectuar experiências preliminares para se determinar o débito máximo que saturará completamente o gás portador com o vapor da substância. Esta situação fica garantida no caso de se fazer passar o gás portador através do saturador suficientemente devagar e de tal modo que uma velocidade inferior não origine maior pressão de vapor calculada. O método analítico específico será determinado pela natureza da substância que se pretende testar (por exemplo, gravimetria ou cromatografia gasosa). Determina-se a quantidade de substância transportada por um volume conhecido de gás portador.

a)

Introduzindo um manómetro entre o saturador e os sistemas de captação (isto pode não ser satisfatório devido ao facto de aumentar o espaço morto e a superfície de adsorção); ou

b)

Determinando as quedas de pressão através do sistema de captação particular utilizado em função do débito, numa experiência separada (isto pode não ser muito satisfatório para os sistemas de captação de líquidos).

1.6.6.3. Calculo da pressão de vapor Calcula-se a pressão de vapor a partir da densidade de vapor, W/V, segundo a equação: p = WV × RTM em que: p pressão de vapor (Pa) W massa da substância de teste evaporada (g) V volume de gás saturado (m3) R constante universal dos gases perfeitos (J mol-1 K-1) T temperatura (K) M massa molar da substância de teste (g mol-1) Os volumes medidos devem ser corrigidos em função das diferenças de pressão e de temperatura existentes entre o debitómetro e o saturador controlado por termóstato. No caso de o debitómetro estar localizado a jusante do sistema de captação de vapor é necessário efectuar correcções que levem em consideração quaisquer ingredientes vaporizados no sistema de captação (1).

1.6.7. Rotor giratório (8, 11, 13)

1.6.7.

1.6.7.1. Equipamento Pode-se recorrer à técnica do rotor giratório utilizando um viscosímetro de rotor giratório conforme se mostra na figura 8. A figura 7 representa esquematicamente a disposição experimental. O equipamento de medida típico é constituído por uma cabeça de medição do rotor giratório colocada num invólucro termostatado com graduação de 0,1oC). O dispositivo que contém a amostra é colocado num invólucro termostatado (com graduação de 0,01oC) e todas as outras partes do conjunto experimental são mantidas a uma temperatura superior, para evitar a condensação. Por meio de válvulas de alto vácuo, liga-se ao sistema uma bomba de alto vácuo. A cabeça de medição do rotor giratório é constituída por uma esfera de aço (4 a 5 mm de diâmetro) colocada num tubo. A esfera encontra-se suspensa e é estabilizada por um campo magnético, utilizando-se geralmente uma combinação de magnetos permanentes e de bobinas de controlo. A esfera é forçada a girar por acção de campos girantes produzidos pelas bobinas. A existência de bobinas de leitura, que medem a sempre presente magnetização lateral fraca da esfera, permitem efectuar a medição da sua velocidade de rotação.

1.6.7.2. Procedimento de medição Quando a esfera atingiu já uma determinada velocidade de rotação v(o) (normalmente cerca de 400 rotações por segundo), interrompe-se o fornecimento de energia e inicia-se a desaceleração devido à fricção com o gás. Mede-se a diminuição da velocidade de rotação em função do tempo. Uma vez que o atrito causado pela suspensão magnética é desprezível quando comparado com a fricção com o gás, a pressão p do gás é dada por: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) em que: c— velocidade média das moléculas do gás r raio da esfera ρ densidade absoluta da esfera σ coeficiente de transferência do momento tangencial (0 = 1 para uma superfície esférica ideal de uma esfera) t tempo v(t) velocidade de rotação decorrido o tempo t v(o) velocidade de rotação inicial Também se pode escrever esta equação do modo seguinte: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 em que tn, tn-1 são os tempos necessários para a ocorrência de um número N determinado de revoluções. Estes intervalos de tempo tn e tn-1 são sequenciais e tn > tn-1 A velocidade média c— das moléculas de gás é dada por: c— = 8 RTπ M12 em que: T temperatura R constante universal dos gases perfeitos M massa molar

2. RESULTADOS A pressão de vapor obtida por quaisquer dos métodos anteriores deverá ser determinada pelo menos para dois valores de temperatura. É preferível fazer determinações para três ou vários valores de temperatura de preferência no intervalo compreendido entre 0 e 50 oC, no sentido de se verificar a linearidade da curva de pressão de vapor.

3. RELATÓRIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte: No caso de se observar um fenómeno de transição (variação de estado, decomposição), deverão ser acrescentados os seguintes dados informativos: Todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos resultados devem constar do relatório, especialmente no que diz respeito às impurezas e ao estado físico da substância.

o método utilizado,

a especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e passos de purificação preliminares, se os houver,

pelo menos dois valores de pressão de vapor e dois valores de temperatura, preferencialmente no intervalo compreendido entre 0 e 50 oC,

todos os dados não tratados,

uma curva do tipo log p em função de 1/T,

uma estimativa da pressão de vapor para as temperaturas de 20 ou 25 oC.

natureza da alteração,

temperatura à qual ocorreu essa alteração, à pressão atmosférica,

pressão de vapor para temperaturas 10 e 20 oC inferiores à temperatura de transição e para temperaturas 10 e 20 oC superiores a essa temperatura (salvo no caso de a transição se efectuar do estado sólido para o estado gasoso).

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)

REFERÊNCIAS OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, p. 593. NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 10-5 Pa — Static method. NF- T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa — Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, vol. 5 (4), p. 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, p. 1173. B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, p. 435. G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), p. 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), p. 1148. J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), p. 1715.

A.5. TENSÃO SUPERFICIAL

A.5.

1. MÉTODO Os métodos descritos baseiam-se nas normas de ensaio da OCDE (1). Os princípios fundamentais encontram-se descritos na referência (2).

1.

1.1. INTRODUÇÃO Os métodos descritos são aplicáveis à medição da tensão superficial em soluções aquosas. Considera-se útil possuir informações preliminares sobre a substância, relativamente a: solubilidade em água, estrutura, propriedades relativas à hidrólise e concentração crítica de formação de micelas, antes de se efectuarem estes testes. Os métodos que se seguem são aplicáveis à maior parte das substâncias químicas, sem qualquer restrição no que diz respeito ao seu grau de pureza. A medição da tensão superficial pelo método do tensiómetro de anel é aplicável apenas a soluções aquosas com uma viscosidade dinâmica inferior a cerca de 200 mPa s.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES Define-se como tensão superficial a entalpia superficial livre, por unidade de área da superfície. A tensão superficial é dada por: N/m (unidade do SI) ou mN/m (subunidade do SI) 1 N/m = 103 dines/cm 1 mN/m = 1 dine/cm no antigo e obsoleto sistema cgs

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Não é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibração do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos. As substâncias de referência que abrangem um intervalo amplo de tensões superficiais encontram-se enumeradas nas referências (1) e (3).

1.4. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS Os métodos baseiam-se na medição da força máxima que é necessário exercer verticalmente sobre um colchete ou anel em contacto com a superfície do líquido que se pretende examinar colocado num recipiente, no sentido de o separar dessa superfície, ou sobre uma placa, com uma aresta em contacto com a superfície, no sentido de se remover a película que se formou. As substâncias solúveis em água pelo menos para valores de concentração de 1 mg/l são testadas em solução aquosa para um valor único de concentração.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Estes métodos são susceptíveis de proporcionar maior precisão do que a eventualmente necessária para a avaliação ambiental.

1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS Prepara-se uma solução da substância em água destilada. A concentração desta solução deve atingir 90 % do valor da solubilidade de saturação da substância em água; no caso de esta concentração exceder o valor de 1 g/l, utiliza-se para os testes a concentração de 1 g/l. Não é necessário testar as substâncias cujo valor de solubilidade em água seja inferior a 1 mg/l.

1.6.

1.6.1. Método da placa Ver ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinação da tensão superficial por remoção de películas líquidas).

1.6.2. Método do colchete Ver ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinação da tensão superficial por remoção de películas líquidas).

1.6.3. Método do anel Ver ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinação da tensão superficial por remoção de películas líquidas).

1.6.4. Método do anel harmonizado pela OCDE

1.6.4.

1.6.4.1. Aparelho Os tensiómetros comercialmente disponíveis são adequados para esta medição. São constituídos pelos elementos seguintes:

mesa de amostra móvel,

sistema de medição de força,

corpo para medição (anel),

recipiente de medição.

1.6.4.1.

1.6.4.1.1. Mesa de amostra móvel Utiliza-se a mesa de amostra móvel como suporte para o recipiente de medição de temperatura controlada que contém o líquido que se pretende testar. A sua montagem faz-se num suporte em conjunto com o sistema de medição de força.

1.6.4.1.2. Sistema de medição de força O sistema de medição de força (ver figura) fica colocado sobre a mesa da amostra. O erro de medição de força não deverá exceder ± 10-6 N, correspondente a um erro limite de ±0,1 mg numa medição de massa. Em muitos casos, a escala dos tensiómetros comercialmente disponíveis é calibrada em mN/m, de modo que a tensão superficial pode ser lida directamente em mN/m, com uma precisão de 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3. Corpo para a medição (anel) Normalmente o anel é feito de um fio de platina/irídio com a espessura aproximada de 0,4 mm e com um perímetro médio de 60 mm. O anel é suspenso horizontalmente de uma haste metálica, através de um suporte triangular de montagem, que estabelece a ligação ao sistema de medição de força (ver figura).

1.6.4.1.3. Figura Corpo para a medição

(Todas as dimensões estão expressas em milímetros) Suporte triangular de montagem Haste Anel

1.6.4.1.4. Recipiente de medição O recipiente de medição que contém a solução a testar deverá ser um recipiente de vidro termostatizado. Deve ser concebido de tal modo que durante a medição a temperatura da solução líquida que se pretende testar e a fase gasosa sobre a sua superfície permaneçam constantes e impedindo que haja evaporação da amostra. São aceitáveis recipientes cilíndricos de vidro que possuam um diâmetro interno não inferior a 45 mm.

1.6.4.2. Preparação do equipamento

1.6.4.2.

1.6.4.2.1. Limpeza Os recipientes de vidro devem ser cuidadosamente limpos. Se necessário, deverão ser lavados com ácido cromossulfúrico quente e depois lavados com ácido fosfórico xaroposo (83 a 98 % em peso de H3PO4), lavados muito bem com água da torneira e lavados finalmente com água bidestilada até se obter uma reacção neutra, efectuando-se depois a secagem ou a lavagem com um pouco do líquido da amostra que se pretende medir. O anel deve ser primeiro muito bem lavado com água para se fazer a remoção de quaisquer substâncias que sejam solúveis em água, depois mergulhado rapidamente em ácido cromossulfúrico, lavado com água bidestilada até se obter uma reacção neutra e finalmente deverá ser aquecido rapidamente sobre uma chama de metanol. Nota: A contaminação com substâncias que não sejam dissolvidas ou destruídas com o ácido cromossulfúrico ou com o ácido fosfórico, tais como os silicones, deve ser removida usando um solvente orgânico adequado.

1.6.4.2.2. Calibração do aparelho A validação do aparelho consiste em verificar o seu zero e em ajustá-lo de tal modo que a indicação do instrumento permita uma determinação segura em mN/m.

1.6.4.2.2. Montagem:

O aparelho deve ser nivelado, por exemplo, por meio de um nível de bolha de ar colocado na base do tensiómetro, ajustando-se os parafusos de nivelamento existentes na base.

Ajustamento do zero:

Após a montagem do anel no aparelho e antes da imersão no líquido deve ajustar-se o zero do tensiómetro e deve verificar-se o paralelismo do anel com a superfície do líquido. Para satisfazer este objectivo pode utilizar-se como espelho a superfície do líquido.

Calibrações:

A calibração pode ser efectuada recorrendo a um de dois procedimentos:

a)

Utilizando uma massa: procedimento que utiliza cavaleiros de massa conhecida compreendida entre 0,1 e 1,0 g colocados sobre o anel. O factor de calibração Фa pelo qual todas as leituras do instrumento devem ser multiplicadas determina-se de acordo com a equação (1): Φa=σrσa (1) em que: σr=mg2b (mN/m) m massa do cavaleiro (g) g aceleração da gravidade (981 cm s-2 ao nível do mar) b perímetro médio do anel (cm) σa leitura do tensiómetro após colocação do cavaleiro no anel (mN/m)

b)

Utilizando água: procedimento que utiliza água pura cuja tensão superficial, por exemplo, à temperatura de 23oC é igual a 72,3 mN/m. Este procedimento é mais rápido do que a calibração com cavaleiros, mas existe sempre o risco de a tensão superficial da água estar falseada por vestígios de contaminação com agentes tensioactivos. O factor de calibração Φb pelo qual todas as indicações do instrumento deverão ser multiplicadas determina-se de acordo com a equação (2): Φb=σoσg (2) em que: σo valor referido na literatura para a tensão superficial da água (mN/m) σg valor medido da tensão superficial da água (mN/m) ambos à mesma temperatura.

1.6.4.3. Preparação de amostras As soluções aquosas deverão ser preparadas com as substâncias que se pretende testar, utilizando as necessárias concentrações em água, e não deverão conter quaisquer substâncias não dissolvidas. A solução deve ser mantida a uma temperatura constante (±0,5oC). Uma vez que a tensão superficial de uma solução no recipiente de medição se altera no decurso do tempo, deverão ser efectuadas diversas medições em momentos diferentes e deverá ser traçada uma curva que represente a tensão superficial em função do tempo. Quando já não ocorrerem mais variações significa que se atingiu um estado de equilíbrio. A contaminação com poeiras e com gases interfere com a medição. Em consequência, o trabalho deverá ser efectuado sob uma cobertura de protecção.

1.6.5. Condições do teste A medição deverá ser efectuada aproximadamente à temperatura de 20 oC e deverá ser controlada entre ±0,5oC.

1.6.6. Realização do teste As soluções que se pretendem medir devem ser cuidadosamente transferidas para o recipiente de medição, limpo, tomando-se precauções para evitar a formação de espuma, e depois o recipiente de medida deverá ser colocado sobre a mesa do aparelho de teste. A parte superior da mesa com o recipiente de medida deverá ser elevada até que o anel fique imerso sob a superfície da solução que se pretende medir. Depois, a parte superior da mesa deverá ser baixada gradual e uniformemente (aproximadamente a velocidade de 0,5 cm/minuto) até que ocorra a separação do anel da superfície no momento em que se atingiu a força máxima. A camada de líquido associada ao anel não deve separar-se do anel. Depois de se terem completado as medições deve imergir-se o anel novamente sob a superfície e devem repetir-se as medições até se atingir um valor constante para a tensão superficial. O momento da transferência da solução para o recipiente de medição deverá ser registado para cada determinação. Deverão ser efectuadas leituras da força máxima necessária para separar o anel da superfície do líquido.

2. Tabela Correcção da tensão superficial medida Apenas para soluções aquosas, p = 1 g/cm3

RESULTADOS Para se calcular a tensão superficial, o valor lido em mN/m no aparelho deverá ser multiplicado primeiro pelo factor de calibração Фa ou Фb (conforme o procedimento de calibração utilizado). Obter-se-á deste modo um valor aproximado, pelo que é necessária correcção posterior. Harkins e Jordan (4) determinaram empiricamente factores de correcção para valores de tensão superficial medidos pelo método do anel, os quais dependem das dimensões do anel, da densidade do líquido e da sua tensão superficial. Uma vez que é trabalhoso determinar o factor de correcção para cada medição individual a partir das tabelas de Harkins e Jordan, para se calcular a tensão superficial de soluções aquosas pode utilizar-se o procedimento simplificado de leitura dos valores de tensão superficial corrigidos directamente a partir da tabela. (Recorrer-se-á à interpolação para leituras compreendidas entre os valores indicados na tabela.) R 9,55 mm (raio médio do anel) r 0,185 mm (raio do fio do anel) Valor experimental (mN/m) Valor corrigido (mN/m) Calibração de massa [ver 1.6.4.2.2. a)] Calibração com água [ver 1.6.4.2.2. b)] 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Este quadro foi compilado com base na correcção de Harkins-Jordan e é idêntico ao da norma DIN (DIN 53914) para a água e para soluções aquosas (densidade p = 1 g/cm3 e destina-se a um anel comercialmente disponível que possui as dimensões R = 9,55 mm (raio médio do anel) e r = 0,185 mm (raio do fio do anel). A tabela proporciona valores corrigidos para as medições de tensão superficial obtidas após calibração com massas ou calibração com água. Em alternativa, sem que haja a calibração precedente, pode calcular-se a tensão superficial de acordo com a fórmula seguinte: σ=f × F4πR em que: F força medida no dinamómetro no ponto de ruptura da película R raio do anel f factor de correcção (1)

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

método utilizado,

tipo de água ou de solução utilizada,

especificação exacta da substância (identificação e impurezas),

resultados da medição: tensão superficial (leitura) especificando as duas leituras individuais e a sua média aritmética e bem assim o valor médio corrigido (tomando em consideração o factor relativo ao equipamento e a tabela de correcção,

concentração da solução,

temperatura do teste,

período de vida da solução utilizada; em particular, o tempo decorrido entre a preparação e a medição efectuada na solução,

descrição da dependência temporal da tensão superficial após a transferência da solução para o recipiente de medição,

todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos resultados devem ser descritas, especialmente no que diz respeito a impurezas e estado físico da substância.

3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Considerando que a água destilada possui uma tensão superficial de 72,75 mN/m à temperatura de 20oC, as substâncias que apresentem uma tensão superficial inferior a 60 mN/m sob as condições descritas para este método deverão ser consideradas como materiais tensioactivos.

4.(1)(2)(3)(4)

REFERÊNCIAS OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter XIV. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, p. 1751.

A.6. SOLUBILIDADE EM ÁGUA

A.6.

1. MÉTODO Os métodos descritos baseiam-se nas Normas de Ensaio da OCDE (1).

1.

1.1. INTRODUÇÃO É útil possuir informações preliminares sobre a fórmula estrutural, a pressão de vapor, a constante de dissociação e a hidrólise (em função do pH) da substância para se realizar este teste. Não existe um método único susceptível de abranger todas as possibilidades de solubilidade em água. Os dois métodos de teste adiante descritos abrangem a totalidade de possibilidades de solubilidade em água mas não são aplicáveis às substâncias voláteis: A solubilidade da substância testada em água pode ser consideravelmente afectada pela presença de impurezas.

um desses métodos aplica-se a substâncias essencialmente puras, com baixa solubilidade (< 10-2 gramas por litro), e que são estáveis em água, designado por método de eluição em coluna,

o outro método aplica-se a substâncias essencialmente puras com solubilidades superiores (> 10-2 gramas por litro), e que são estáveis em água, designado por método do balão.

1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADES A solubilidade de uma substância em água é especificada pela concentração da massa de saturação dessa substância em água a uma determinada temperatura. A solubilidade em água é especificada em unidades de massa por volume de solução. A unidade do SI é kg/m3 (também se pode utilizar gramas por litro).

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Não é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, as características de execução do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Dever-se-á determinar a quantidade aproximada de amostra e o tempo necessário para conseguir a concentração da massa de saturação, num ensaio preliminar simples.

1.4.

1.4.1. Método de eluição em coluna Este método baseia-se na eluição de uma substância a testar com água numa microcoluna, a qual é carregada com um material de suporte inerte tal como esferas de vidro ou areia coberto com um excesso da substância a testar. Determina-se a solubilidade em água quando a concentração de massa do eluido é constante. Esta situação corresponde a um nível constante de concentração em função do tempo.

1.4.2. Método do balão De acordo com este método, dissolve-se a substância (os sólidos devem ser pulverizados) em água a uma temperatura ligeiramente superior à temperatura do teste. Ao atingir-se a saturação arrefece-se a mistura e mantém-se à temperatura de ensaio, agitando enquanto for necessário para alcançar o equilíbrio. Em alternativa pode efectuar-se a medição directamente à temperatura de ensaio, desde que se garanta por amostragem adequada que se atingiu o equilíbrio na saturação. Posteriormente determina-se por um método analítico adequado à concentração de massa da substância na solução aquosa, a qual não deve conter quaisquer partículas não dissolvidas.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE

1.5.

1.5.1. Repetitividadc Para o método de eluição em coluna pode obter-se um resultado < 30 %, para o método do balão poder-se-á observar um resultado < 15 %.

1.5.2. Sensibilidade Este parâmetro depende do método de análise, mas é possível efectuar determinações de concentração de massa inferiores a 10-6 gramas por litro.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO

1.6.

1.6.1. Condições do teste O teste efectua-se preferencialmente à temperatura de 20 ±0,5oC. No caso de se suspeitar da existência de uma dependência da solubilidade em função da temperatura (> 3 % poroC), dever-se-á efectuar ensaios para dois outros valores diferentes de temperatura, pelo menos 10oC acima e abaixo da temperatura escolhida. Neste caso, o controlo de temperatura deverá ser da ordem de ±0,1oC. A temperatura escolhida deverá ser mantida constante em todas as partes relevantes do equipamento.

1.6.2. Teste preliminar A uma quantidade aproximadamente de 0,1 g de amostra (as substâncias sólidas deverão ser pulverizadas) colocada numa proveta graduada de 10 ml, com rolha de vidro, adicionam-se volumes crescentes de água destilada à temperatura ambiente, de acordo com a progressão indicada no quadro a seguir: 0,1 g solúveis em x ml de água 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Solubilidade aproximada (gramas por litro) > 1000 1000-200 200-100 100-50 50-10 10-1 < 1 Após cada adição da quantidade de água indicada, agita-se vigorosamente a mistura durante 10 minutos e verifica-se visualmente a existência de quaisquer partes não dissolvidas da amostra. Se após a adição de 10 ml de água a amostra ou partes dela permanecerem por dissolver, é necessário repetir a experiência numa proveta graduada de 100 ml com maiores volumes de água. Para valores inferiores de solubilidade o tempo necessário para dissolver uma substância pode ser consideravelmente mais longo (dever-se-á esperar pelo menos 24 horas). A solubilidade aproximada é dada na tabela anterior relativamente ao volume de água adicionada para o qual ocorre a dissolução completa da amostra. No caso de a substância continuar aparentemente insolúvel, será necessário esperar mais do que 24 horas (96 horas no máximo) ou deverá ser experimentada outra diluição para determinar se deve ser utilizado o método de eluição em coluna ou o método da solubilidade em balão.

1.6.3. Método de eluição em coluna

1.6.3.

1.6.3.1. Material de suporte, solvente e eluente O material de suporte para o método de eluição em coluna deverá ser inerte. Os materiais que podem ser utilizados são as esferas de vidro e a areia e deverá ser utilizado um solvente volátil adequado, de qualidade analítica, para se aplicar a substância a testar ao material de suporte. Poder-se-á utilizar como eluente água bidestilada num aparelho de quartzo ou de vidro. Nota: Não deve ser utilizada água proveniente directamente de um permutador de iões orgânicos.

1.6.3.2. Carga do suporte Pesa-se aproximadamente 600 mg de material de suporte e transfere-se para um balão de fundo redondo de 50 ml. Dissolve-se no solvente escolhido uma quantidade determinada e adequada da substância a testar. Adiciona-se ao material de suporte uma quantidade apropriada desta solução. O solvente deve ser completamente evaporado, por exemplo, num evaporador rotativo; caso contrário não se conseguirá a saturação do suporte com água, devido a efeitos de repartição que ocorrem na superfície do material de suporte. A colocação da carga no material de suporte pode originar problemas (resultados errados) se a substância a testar se depositar como um óleo ou como uma fase cristalina diferente. O problema deverá ser examinado experimentalmente e os pormenores deverão constar do relatório. Deixar que o material de suporte assim carregado fique embebido, durante aproximadamente 2 horas, em cerca de 5 ml de água e depois transfere-se a suspensão para a microcoluna. Em alternativa, o material de suporte carregado e seco pode ser vertido na microcoluna a qual foi previamente cheia com água e depois deixa-se estabelecer o equilíbrio durante aproximadamente 2 horas.

1.6.3.2. Procedimento de ensaio:

A eluição da substância a partir do material de suporte pode ser efectuada recorrendo a uma de duas vias diferentes:

bomba de recirculação (ver figura 1),

reservatório de nível (ver figura 4).

1.6.3.3. Método de eluição em coluna com bomba de recirculação

1.6.3.3. Aparelho

A figura 1 representa uma disposição esquemática de um sistema típico. A figura 2 representa uma microcoluna adequada, embora sejam aceitáveis outras dimensões, desde que fiquem satisfeitos os critérios de reprodutibilidade e de sensibilidade. A coluna deverá dispor de um espaço superior correspondente a pelo menos cinco vezes o volume base de água e deverá ser capaz de conter um mínimo de cinco amostras. Em alternativa, poder-se-á reduzir as dimensões no caso de se utilizar um solvente de constituição para substituir os cinco volumes de base iniciais removidos com as impurezas. A coluna deverá ser ligada a uma bomba de recirculação susceptível de controlar fluxos aproximadamente à razão de 25 ml/hora. A ligação da bomba é feita com tubos de politetrafluoro-etileno (PTFE) e/ou tubos de vidro. A coluna e a bomba, quando ligadas, deverão permitir a amostragem do efluente e o equilíbrio da parte superior à pressão atmosférica. O material da coluna é suportado com um pequeno tampão (5 mm) de lã de vidro, o qual serve também para filtrar partículas. A bomba de recirculação pode ser, por exemplo, uma bomba peristáltica ou uma bomba de membrana (é necessário tomar precauções para que não haja contaminação e/ou adsorção com o material do tubo).

Procedimento de medição

Inicia-se o fluxo através da coluna. Recomenda-se a utilização de um débito de aproximadamente 25 ml/hora (isto corresponde a 10 volumes de base/hora para a coluna descrita). Os primeiros cinco volumes de base (mínimo) são eliminados para remoção das impurezas solúveis em água. Depois disto deixa-se a bomba de recirculação funcionar até que o equilíbrio fique estabelecido, conforme definido por cinco amostras sucessivas cujas concentrações não difiram mais do que ± 30 % numa observação aleatória. As amostras deverão ser separadas umas das outras por intervalos de tempo correspondentes à passagem do eluente de pelo menos 10 volumes de enchimento da coluna.

1.6.3.4. Método de eluição em coluna com reservatório de nivelamento

1.6.3.4. Aparelho (ver figuras 4 e 3)

Reservatório de nivelamento: A ligação ao reservatório de nivelamento faz-se utilizando uma junta de vidro esmerilado à qual é ligado um tubo de politetrafluoretileno (PTFE). Recomenda-se a utilização de um débito de aproximadamente 25 ml/hora. As fracções sucessivas de eluido deverão ser recolhidas e analisadas pelo método escolhido.

Procedimento de medição

Utilizam-se as fracções da zona média da eluição em que as concentrações são constantes (± 30 %) em pelo menos cinco fracções consecutivas, para se determinar a solubilidade em água. Em ambos os casos (utilizando uma bomba de recirculação ou um reservatório de nivelamento) dever-se-á fazer a verificação da presença de matéria coloidal nas fracções, pela observação da existência do efeito de Tyndall (dispersão de luz). A presença dessas partículas invalida os resultados, devendo os testes ser repetidos melhorando a acção de filtração da coluna. Deve registar-se o valor do pH de cada amostra. Dever-se-á efectuar uma segunda experiência à mesma temperatura.

1.6.4. Método do balão

1.6.4.

1.6.4.1. Aparelho No método do balão é necessário o material seguinte:

instrumentos e utensílios de vidro usais em laboratório,

um dispositivo adequado para a agitação de soluções sob condições de temperatura constante e controlada,

uma centrifugadora (de preferência com controlo termostático), se necessário para as emulsões, e

equipamento para determinação analítica.

1.6.4.2. Procedimento de medição A partir dos testes preliminares estima-se a quantidade de material necessário para saturar o volume desejado de água. O volume necessário de água dependerá do método analítico e do intervalo de solubilidade. Pesam-se três porções de aproximadamente cinco vezes a quantidade anteriormente determinada de material, que se introduzem em três recipientes de vidro com rolhas de vidro (por exemplo, tubos de centrifugação, balões). Adiciona-se a cada recipiente o volume escolhido de água e fecham-se hermeticamente. Os recipientes fechados são depois agitados à temperatura de 30 oC. (Deve utilizar-se um dispositivo de oscilação ou de agitação susceptível de funcionar a uma temperatura constante, por exemplo, um agitador magnético em banho-maria com termóstato.) Decorrido o período de um dia remove-se um dos recipientes e reequilibra-se durante 24 horas à temperatura de ensaio com agitação ocasional. O conteúdo do recipiente é depois submetido a centrifugação à temperatura de ensaio e determina-se a concentração do composto na fase aquosa límpida recorrendo a um método analítico adequado. Os outros dois recipientes são tratados de modo análogo, após o equilíbrio inicial à temperatura de 30 oC durante dois e três dias, respectivamente. Se os resultados da concentração obtidos pelo menos com os dois últimos recipientes concordarem com a reprodutibilidade necessária, considera-se que o teste é satisfatório. Todo o teste deverá ser repetido, utilizando períodos de tempo de equilíbrio mais longos, se os resultados obtidos nos recipientes 1, 2 e 3 mostrarem uma tendência para valores crescentes. O procedimento de medição também pode ser efectuado sem pré-incubação à temperatura de 30oC. No sentido de se estimar a velocidade a que se estabelece o equilíbrio de saturação extraem-se amostras até que o tempo de agitação deixe de influenciar a concentração da solução a testar. Deve registar-se o valor do pH de cada amostra.

1.6.5. Análise É preferível um método analítico específico de cada substância para estas determinações uma vez que pequenas quantidades de impurezas solúveis podem originar erros grandes na solubilidade medida. São exemplos desses métodos os seguintes: a cromatografia de gases ou de líquidos, os métodos de titulação, os métodos fotométricos, os métodos voltamétricos.

2. RESULTADOS

2.

2.1. MÉTODO DA ELUIÇÃO EM COLUNA Dever-se-á calcular, para cada experiência, o valor médio dos resultados obtidos com pelo menos cinco amostras consecutivas, extraídos do patamar constante de saturação, o mesmo devendo ser feito para o desvio-padrão. Os resultados deverão ser apresentados em unidades de massa por volume de solução. Procede-se à comparação dos valores médios calculados relativamente a dois testes utilizando fluxos diferentes, devendo a sua repetitividade ser menor do que 30 %.

2.2. MÉTODO DO BALÃO Deverão ser apresentados os resultados individuais para cada um dos três recipientes e, admitindo-se que esses resultados são constantes (repetitividade menor do que 15 %), calcular-se-á a sua média e apresentar-se-á o resultado em unidades de massa por volume de solução. Isto pode exigir a reconversão de unidades de massa em unidades de volume, utilizando-se a densidade no caso da solubilidade ser muito elevada (> 100 gramas por litro).

3. RELATÓRIOS

3.

3.1. MÉTODO DE ELUIÇÃO EM COLUNA O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

os resultados do teste preliminar,

a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),

as concentrações individuais, os débitos e o pH de cada amostra,

as médias e os desvios-padrão de pelo menos cinco amostras do patamar constante de saturação para cada experiência,

o valor médio de duas experiências sucessivas e aceitáveis,

a temperatura da água durante o processo de saturação,

o método de análise utilizado,

a natureza do material de suporte utilizado,

o processo de carga do material de suporte,

o solvente utilizado,

a evidência de qualquer instabilidade química da substância durante o teste e o método utilizado,

toda a informação relevante para a interpretação dos resultados, especialmente no que diz respeito a impurezas e estado físico da substância.

3.2. MÉTODO DO BALÃO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

os resultados do teste preliminar,

a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),

as determinações analíticas individuais e o valor médio no caso de se determinar mais do que um valor para cada recipiente,

o valor do pH de cada amostra,

a média dos valores para recipientes diferentes que tenham estado em conformidade,

a temperatura do teste,

o método analítico utilizado,

evidência de qualquer instabilidade química da substância durante o teste e método utilizado,

toda a informação relevante para a interpretação dos resultados, especialmente no que diz respeito a impurezas e ao estado físico da substância.

4.(1)(2)(3) REFERÊNCIAS OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method

A.8 COEFICIENTE DE PARTIÇÃO

A.8

1. MÉTODO O método do frasco agitado descrito baseia-se na norma de ensaio da OCDE (1).

1.

1.1. INTRODUÇÃO É útil possuir informações preliminares sobre a fórmula estrutural, a constante de dissociação, a solubilidade em água, hidrólise, solubilidade em n-octanol e tensão superficial, da substância sujeita a este teste. As medições deverão ser efectuadas em substâncias ionizáveis apenas na sua forma não ionizada (ácido livre ou base livre) produzida pela utilização de um tampão apropriado cujo pH possua um valor de pelo menos uma unidade de pH abaixo (ácido livre) ou acima (base livre) do valor pK. Este método de ensaio engloba dois procedimentos separados — o método do frasco agitado e a cromatografia líquida de elevado rendimento (mais conhecida por HPLC ou High Performance Liquid Chromatography). O primeiro método aplica-se nos casos em que o valor log Poa (ver as definições mais adiante) se encontra no intervalo entre — 2 e 4 e o outro método aplica-se nos casos em que aquele valor está compreendido entre 0 e 6. Antes de se executar qualquer dos procedimentos experimentais dever-se-á obter primeiro uma estimativa preliminar do coeficiente de partição. O método do frasco agitado aplica-se apenas a substâncias essencialmente puras solúveis em água e em n-octanol. Não é aplicável aos materiais tensioactivos (para os quais deverá ser obtido o valor calculado ou uma estimativa com base nas solubilidades individuais em n-octanol e em água). O método de HPLC não se aplica a bases e ácidos fortes, a complexos de metais, a materiais tensioactivos ou a substâncias que reajam com o eluente. Para estes materiais deverá ser obtido um valor calculado ou uma estimativa, tomando como base as solubilidades individuais em n-octanol e em água. O método de HPLC é menos sensível à presença de impurezas do que o método do frasco agitado. Contudo, em alguns casos as impurezas podem tornar difícil a interpretação de resultados devido ao facto de se tornar incerta a determinação dos picos. Para misturas que originem uma banda não resolvida deverão ser especificados os limites inferior e superior de log P.

1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADES Define-se o coeficiente de partição (P) como sendo a razão entre as concentrações de equilíbrio (ci) de uma substância dissolvida num sistema de duas fases, constituído por dois solventes claramente imiscíveis. No caso do n-octanol e da água temos: pow=cn-octanolcwater Em consequência, o coeficiente de partição (P) é o quociente entre duas concentrações e é dado vulgarmente na forma do seu logaritmo de base 10 (log P).

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA

1.3. Método do frasco agitado

Não é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibração do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.

Método de HPLC

No sentido de se estabelecer uma correlação entre os dados de HPLC medidos para um determinado composto com o seu valor P, torna-se necessário estabelecer um gráfico de calibração de log P em função dos dados cromatográficos utilizando pelo menos 6 pontos de referência. É deixado ao arbítrio do utilizador seleccionar as substâncias de referência apropriadas. Sempre que possível, pelo menos uma substância de referência deverá possuir um valor Poa superior, e outra um valor Poa inferior ao da substância a testar. Para valores de log P inferiores a 4, a calibração pode basear-se nos dados obtidos pelo método do frasco agitado. Para valores de log P superiores a 4, a calibração pode basear-se em valores calibrados e publicados em diversa literatura se esses valores estiverem em conformidade com os valores calculados. Para se conseguir melhor precisão é preferível escolher substâncias de referência cuja estrutura química esteja relacionada com a da substância a testar. Existem disponíveis listagens extensivas de valores de log Poa para muitos grupos de compostos químicos (2)(3). No caso dos dados sobre os coeficientes de partição dos compostos estruturalmente afins não se encontrarem disponíveis, pode-se utilizar então uma calibração mais geral estabelecida com outros compostos de referência. No apêndice 2 apresenta-se uma listagem de substâncias de referência recomendadas e seus valores Poa.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO

1.4.

1.4.1. Método do frasco agitado No sentido de se determinar um coeficiente de partição, torna-se necessário conseguir o equilíbrio entre todos os componentes do sistema que actuam entre si e devem-se determinar as concentrações das substâncias dissolvidas nas duas fases. Um estudo publicado na literatura relativa a este assunto indica que é possível utilizar diversas técnicas diferentes para resolução deste problema, isto é, a mistura perfeita das duas fases seguindo-se a sua separação, no sentido de se determinar a concentração de equilíbrio para a substância que se pretende examinar.

1.4.2. Método de HPLC Efectua-se o HPLC em colunas analíticas carregadas com uma fase sólida comercialmente disponível contendo hidrocarbonetos de cadeia longa (por exemplo C8, C18) quimicamente ligados à sílica. Os compostos químicos injectados nessa coluna movem-se através dela a velocidades diferentes devido aos diferentes graus de partição entre a fase móvel e a fase estacionária do hidrocarboneto. As misturas de compostos químicas são eluídas por ordem da sua hidrofobicidade, sendo eluídos primeiro os compostos químicos solúveis em água e depois os compostos químicos solúveis em óleo, proporcionalmente ao seu coeficiente de partição entre hidrocarboneto e água. Isto permite estabelecer uma relação entre o tempo de retenção numa tal coluna (fase reversa) e o coeficiente de partição entre n-octanol/água. Deduz-se o coeficiente de partição a partir do factor de capacidade k, dado pela expressão: k=tr-toto na qual tr = tempo de retenção da substância a testar e t0 = tempo médio que uma molécula de solvente necessita para passar através da coluna (tempo limite). Não são necessários métodos analíticos quantitativos e apenas é necessária a determinação dos tempos de eluição.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE

1.5.

1.5.1. Repetitividade

1.5.1. Método do frasco agitado

No sentido de se garantir a exactidão do coeficiente de partição é necessário efectuar determinações em duplicado sob três condições de ensaio diferentes, podendo consequentemente alterar a quantidade de substância especificada e também a proporção entre os volumes de solvente. Os valores determinados do coeficiente de partição, expressos pelos seus logaritmos, deverão estar compreendidos num intervalo limitado por ±0,3 unidades logarítmicas.

Método de HPLC

No sentido de se aumentar a confiança da medição deverão ser efectuadas determinações em duplicado. Os valores de log P derivados das medições individuais deverão estar dentro de um intervalo limitado por ±0,1 unidades logarítmicas.

1.5.2. Sensibilidade

1.5.2. Método do frasco agitado

Determina-se o intervalo de medição do método pelo limite de detecção do procedimento analítico. Isto deverá permitir a determinação de valores log Poa no intervalo compreendido entre - 2 e 4 (ocasionalmente, quando houver condições adequadas, este intervalo pode ser dilatado até valores de log Poa próximos de 5), quando a concentração do soluto em qualquer fase não for superior a 0,01 mol por litro.

Método de HPLC

O método de HPLC permite estimar os coeficientes de partição em termos de log Poa no intervalo 0 a 6. Normalmente o coeficiente de partição de um composto pode ser estimado a menos de ± 1 unidade logarítmica relativamente ao valor obtido pelo método do frasco agitado. Existem correlações típicas que é possível encontrar na literatura (4)(5)(6)(7)(8). Normalmente, pode-se conseguir uma precisão superior quando as curvas de correlação se baseiam em compostos de referência estruturalmente afins (9).

1.5.3. Especificidade

1.5.3. Método do frasco agitado

A Lei de Partição de Nernst aplica-se apenas quando os parâmetros temperatura, pressão e pH são constantes para soluções diluídas. Aplica-se estritamente a uma substância pura dispersa entre dois solventes puros. Se houver diversos solutos diferentes numa ou em ambas as fases simultaneamente, isto pode afectar os resultados. A dissociação ou a associação das moléculas dissolvidas provoca desvios em relação à Lei de Partição de Nernst. Esses desvios são indicados pelo facto de o coeficiente de partição se tornar dependente da concentração da solução. Devido à existência de múltiplos estados de equilíbrio, este método não deve ser aplicado a compostos ionizáveis sem se aplicar uma correcção. Deve-se tomar em consideração a utilização de soluções-tampão em vez de água para esses compostos; o valor do pH da solução-tampão deverá ser pelo menos uma unidade de pH afastada do valor pKa da substância e deve-se ter sempre presente a relevância desse valor de pH para o ambiente.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO

1.6.

1.6.1. Estimativa preliminar do coeficiente de partição Efectua-se uma estimativa do coeficiente de partição utilizando preferencialmente um método de cálculo (ver apêndice 1) ou, se for apropriado, recorrendo à razão entre solubilidades da substância a testar nos solventes puros (10).

1.6.2. Método do frasco agitado

1.6.2.

1.6.2.1. Preparação n-octanol: a determinação do coeficiente de partição deverá ser efectuada com um reagente de qualidade analítica de elevada pureza. Água: deve-se utilizar água destilada ou bidestilada num aparelho de vidro ou de quartzo. Para os compostos ionizáveis dever-se-á utilizar soluções-tampão em vez de água, se tal se justificar. Nota: Não deve ser utilizada água obtida directamente a partir de um permutador iónico.

1.6.2.1.

1.6.2.1.1. Pré-saturação dos solventes Antes de se determinar um coeficiente de partição as fases do sistema solvente são mutuamente saturadas por agitação à temperatura da experiência. Para se conseguir isto, é prática corrente agitar dois frascos grandes contendo água ou n-octanol de qualidade analítica, contendo cada um deles uma quantidade suficiente do outro solvente, durante um período de 24 horas, num agitador mecânico, e deixando-os depois em repouso durante um período de tempo suficiente para permitir a separação de fases e para se conseguir um estado de saturação.

1.6.2.1.2. Preparação para o ensaio O volume total do sistema bifásico deverá encher quase completamente o recipiente de ensaio. Isto auxiliará a evitar as perdas de material por volatilização. A razão volumétrica e as quantidades de substância a utilizar são fixadas pelos factores seguintes: Efectuam-se três testes. No primeiro utiliza-se a razão volumétrica calculada entre n-octanol e a água; no segundo divide-se essa razão por dois e no terceiro multiplica-se essa razão por dois (por exemplo, 1:1, 1:2, 2:1).

avaliação preliminar do coeficiente de partição (ver supra),

a quantidade mínima da substância a testar necessária para o procedimento analítico, e

a limitação de uma concentração máxima, em qualquer das fases, no valor de 0,01 mol por litro.

1.6.2.1.3. Substância a testar Prepara-se uma solução em n-octanol pré-saturado com água. A concentração desta solução deverá ser determinada com exactidão antes de se utilizar na determinação do coeficiente de partição. Esta solução deverá ser guardada em condições que assegurem a sua estabilidade.

1.6.2.2. Condições de ensaio A temperatura de ensaio deverá ser mantida constante (± 1 oC) e estar compreendida no intervalo entre 20 e 25 oC.

1.6.2.3. Procedimento de medição

1.6.2.3.

1.6.2.3.1. Estabelecimento do equilíbrio de partição Para cada uma das condições de ensaio dever-se-á preparar recipientes de ensaio em duplicado, contendo as quantidades necessárias, medidas com exactidão, dos dois solventes em conjunto com a quantidade necessária da solução referida. Deve-se medir o volume das fases de n-octanol. Os recipientes de ensaio deverão ser colocados num agitador adequado ou em alternativa deverão ser agitados manualmente. Quando se usa um tubo de centrifugação, o método recomendado consiste em rodar o tubo rapidamente 180o em torno do seu eixo transversal, de modo que qualquer bolha de ar que esteja presa se movimente através das duas fases. A experiência demonstrou que 50 rotações deste tipo são normalmente suficientes para se estabelecer o equilíbrio de partição. Para melhor garantia, recomenda-se a execução de 100 rotações em 5 minutos.

1.6.2.3.2. Separação de fases Sempre que necessário, no sentido de se efectuar a separação de fases, dever-se-á efectuar a centrifugação da mistura. Isto deverá ser feito numa centrifugadora de laboratório mantida à temperatura ambiente ou, no caso de se utilizar uma centrifugadora de temperatura não controlada, os tubos de centrifugação deverão ser mantidos, por razões de equilíbrio, à temperatura de ensaio durante pelo menos 1 hora antes da análise.

1.6.2.4. Análise Para a determinação do coeficiente de partição é necessário determinar as concentrações da substância a testar em ambas as fases. Isto pode ser feito extraindo uma quantidade alíquota de cada uma das duas fases a partir de cada um dos tubos, de cada uma das séries de ensaio, procedendo depois à sua análise de acordo com o procedimento escolhido. Deve-se calcular a quantidade total de substância presente em ambas as fases e efectuar-se-á a comparação com a quantidade de substância originalmente introduzida. Deverá ser extraída uma amostra da fase aquosa recorrendo a um procedimento que minimize o risco de introduzir vestígios de n-octanol: pode-se utilizar uma seringa de vidro com uma agulha removível para extrair uma amostra da fase aquosa. A seringa deverá estar, de início, parcialmente cheia com ar. O ar deverá ser expelido suavemente enquanto se introduz a agulha através da camada de n-octanol. Retira-se com a seringa um volume adequado de fase aquosa. Remove-se a seringa rapidamente da solução e separa-se a agulha. O conteúdo da seringa pode ser utilizado depois como amostra aquosa. A concentração das duas fases separadas deverá ser determinada preferencialmente recorrendo a um método específico da substância. Como exemplos de métodos analíticos considerados apropriados faz-se referência aos seguintes:

métodos fotométricos,

cromatografia gasosa,

cromatografia líquida de elevado rendimento (HPLC).

1.6.3. Método de HPLC

1.6.3.

1.6.3.1. Preparação

1.6.3.1. Aparelho

É necessário um cromatógrafo líquido equipado com uma bomba de pulsação livre e um dispositivo de detecção adequado. Recomenda-se a utilização de uma válvula de injecção com ciclos de injecção. A presença de grupos polares na fase estacionária pode prejudicar gravemente os resultados da coluna de HPLC. Em consequência, as fases estacionárias deverão possuir uma percentagem mínima de grupos polares (11). Podem-se utilizar colunas pré-carregadas ou cargas de fase reversa de micropartículas disponíveis comercialmente. Pode-se interpor uma coluna de protecção entre o sistema de injecção e a coluna analítica.

Fase móvel

Utiliza-se metanol e água de qualidade apropriada para HPLC, para a preparação do solvente de eluição, o qual é desgaseificado antes da utilização. Deve-se utilizar uma eluição isocrática. Dever-se-á utilizar proporções metanol/água com um teor mínimo de água de 25 %. Normalmente, é satisfatória a proporção de 3:1 (v/v) para a mistura de metanol/água para se efectuar a eluição de compostos de log P 6 ao fim de uma hora para um débito de 1 mililitro por minuto. Para os compostos com um valor log P elevado pode ser necessário reduzir o tempo de eluição (e também para os compostos de referência) diminuindo a polaridade da fase móvel ou o comprimento da coluna. As substâncias com muito fraca solubilidade em n-octanol tendem a originar valores de log Poa anormalmente baixos quando se utiliza o método de HPLC; os picos desses compostos acompanham frequentemente a frente do solvente. Isto deve-se provavelmente ao facto de o processo de partição ser muito lento não se atingindo o equilíbrio no tempo normalmente necessário para uma separação por HPLC. Consequentemente, a diminuição do débito e/ou a diminuição da proporção metanol/água pode ser eficaz para se atingir um valor de confiança. Os compostos de ensaio e de referência deverão ser solúveis na fase móvel em concentrações suficientes para permitirem as suas detecções. Apenas em casos excepcionais será aceitável adicionar aditivos à mistura de metanol/água, uma vez que esses aditivos irão modificar as propriedades da coluna. Para as cromatografias com aditivos é obrigatório utilizar uma coluna separada do mesmo tipo. No caso de a mistura metanol/água não ser apropriada é possível utilizar outras misturas de solvente orgânico/água, por exemplo, etanol/água ou acetonitrilo/água. O pH do eluente constitui um parâmetro crítico para os compostos ionizáveis. Aquele valor deverá estar compreendido no intervalo de valores de pH de funcionamento da coluna, sendo esse intervalo normalmente compreendido entre 2 e 8. Recomenda-se a utilização de uma mistura tampão. É necessário tomar precauções para evitar a precipitação de sal e a deterioração da coluna cuja ocorrência é possível com algumas misturas de fase orgânica/tampão. As medições por HPLC com fases estacionárias à base de sílica, para valores de pH superiores a 8, não são aconselháveis uma vez que a utilização de uma fase móvel alcalina pode provocar a deterioração rápida do funcionamento da coluna.

Solutos

Os compostos de referência deverão possuir a maior pureza possível. Os compostos destinados a serem utilizados para efeitos de ensaio ou calibração são dissolvidos na fase móvel, se possível.

Condições de ensaio

Durante as medições a temperatura não deverá variar ± 2 K.

1.6.3.2. Medição

1.6.3.2. Cálculo do tempo limite to

O tempo limite to pode ser determinado utilizando em alternativa uma série homóloga (por exemplo, n-alquil-metil-cetonas) ou compostos orgânicos não retidos (por exemplo, tioureia ou formamida). Para se calcular o tempo limite to utilizando uma série homóloga, injecta-se um conjunto de pelo menos 7 componentes de uma série homóloga e procede-se à determinação dos respectivos tempos de retenção. Elabora-se um gráfico dos tempos de retenção tr(nc + 1) em função de tr(nc) e procede-se à determinação da ordenada a na origem e do declive b, através da equação de regressão: tr(nc + 1) = a + b tr(nc) (nc = número de átomos de carbono). O tempo limite to é dado pela equação: to = a/(1 - b)

Gráfico de calibração

O passo seguinte consiste em construir a curva de correlação de log k em função de log P para os compostos de referência apropriados. Na prática, efectua-se a injecção simultânea, de um conjunto compreendido entre 5 e 10 compostos de referência padrão cujo valor log P seja próximo do valor esperado e procede-se à determinação dos tempos de retenção, utilizando preferencialmente um integrador de registo ligado ao sistema de detecção. Procede-se ao cálculo dos logaritmos correspondentes dos factores de capacidade, log k, e traça-se uma curva em função do valor log P determinado pelo método do frasco agitado. Efectua-se a calibração a intervalos regulares, pelo menos uma vez diariamente, de modo a poder fazer a compensação das possíveis variações na evolução da coluna.

Determinação do factor de capacidade da substância de ensaio

Injecta-se a substância de ensaio numa quantidade da fase móvel tão pequena quanto possível. Determina-se o tempo de retenção (em duplicado), permitindo o cálculo do factor k de capacidade. A partir do gráfico de correlação dos compostos de referência, pode-se fazer uma interpolação para determinação do coeficiente de partição da substância de ensaio. Para coeficientes de partição muito baixos ou muito elevados é necessária a extrapolação. Nesses casos particulares é necessário tomar precauções relativamente aos limites de confiança da curva de regressão.

2. RESULTADOS

2. Método do frasco agitado

Pode-se testar a fiabilidade dos valores de P determinados efectuando a comparação das médias das determinações em duplicado com a média geral.

3. RELATÓRIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

especificação exacta da substância (identificação e impurezas),

no caso de os métodos não serem aplicáveis (por exemplo, material tensioactivo), apresentar-se-á um valor calculado ou uma estimativa tomando como base as solubilidades individuais em n-octanol e em água,

todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos resultados, especialmente no que diz respeito a impurezas e ao estado físico da substância.

o resultado da estimativa preliminar, se existir,

temperatura da determinação,

dados relativos aos procedimentos analíticos utilizados na determinação das concentrações,

tempo e velocidade de centrifugação, se for caso disso,

concentrações medidas de ambas as fases para cada determinação (significa isto que deverão ser descritas 12 concentrações na totalidade),

o peso da substância de ensaio, o volume de cada fase utilizada em cada recipiente de ensaio e a quantidade total calculada de substância de ensaio presente em cada fase após se atingir o equilíbrio,

para cada conjunto de condições de ensaio deverão ser indicados os valores calculados do coeficiente de partição (P) e o valor médio, devendo-se indicar igualmente a média para todas as determinações. No caso de haver indícios de dependência da concentração relativamente ao coeficiente de partição, esse facto deverá constar do relatório,

deve-se referir o desvio-padrão dos valores P individuais relativamente à sua média,

o valor médio de P correspondente a todas as determinações deve ser expresso também na forma logarítmica (base 10),

o valor teórico Poa calculado no caso de se ter feito a determinação desse valor ou quando o valor medido for > 104,

os valores de pH da água utilizada e da fase aquosa durante a experiência,

no caso de se ter recorrido à utilização de tampões, o relatório deverá conter justificação da utilização desses tampões em vez de água, a sua composição, a sua concentração e os valores de pH e também os valores de pH da fase aquosa antes e após a experiência.

o resultado da estimativa preliminar, se existir,

substâncias de ensaio e de referência e sua pureza,

intervalo de temperaturas das determinações,

os valores de pH para os quais foram feitas as determinações,

pormenores sobre a coluna analítica e sobre a coluna de protecção, fase móvel e meios de detecção,

dados de retenção e valores de log P encontrados na literatura para os compostos de referência utilizados na calibração,

pormenores sobre a linha de regressão ajustada (log k em função de log P),

dados de retenção média e valor de log P interpolado para o composto de ensaio,

descrição do equipamento e condições de funcionamento,

perfil de eluição,

quantidades das substâncias de ensaio e de referência introduzidas na coluna,

tempo limite e método para a sua medição.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)

REFERÊNCIAS OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygãrd, Chemosphere, 1980, vol. 80, p. 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, p. 219 (1981). B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, p. 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, p. 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band 1/1, p. 223-339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, p. 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmentai Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method. C.V. Eadsforth and P.Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci Technol., 1974, vol. 8, p. 1113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, p. 382. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984. Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor, J. Med. Chem., 1976, vol. 19, p. 615.

A.9. PONTO DE INFLAMAÇÃO

A.9.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO É útil possuir informação preliminar sobre a inflamabilidade da substância antes de se efectuar este ensaio. O procedimento de ensaio aplica-se a substâncias líquidas cujos vapores possam ser inflamados por fontes de ignição. Os métodos de ensaio enumerados neste texto são apenas fiáveis para os intervalos de pontos de inflamação especificados nos métodos individuais. Deve tomar-se em consideração a possibilidade de ocorrência de reacções químicas entre a substância e o suporte da amostra quando se selecciona o método a utilizar.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES O ponto de inflamação é a menor temperatura, corrigida para a pressão de 101,325 kPa, à qual um líquido liberta vapores, sob as condições definidas no método de ensaio, numa quantidade tal que se produz no recipiente de ensaio uma mistura ar/vapor inflamável. Unidades: oC t = T - 273,15 (t em oC e T em K)

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Não é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, as características de execução do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO Coloca-se a substância no recipiente de ensaio e aquece-se ou arrefece-se até à temperatura de ensaio de acordo com o procedimento descrito no método de ensaio individual. Efectuam-se diversas tentativas para provocar a ignição no sentido de se determinar se a amostra é ou não é inflamável à temperatura de ensaio.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE

1.5.

1.5.1. Repetitividade A repetitividade varia de acordo com o intervalo de pontos de inflamação e com o método de ensaio utilizado; máximo 2 oC.

1.5.2. Sensibilidade A sensibilidade depende do método de ensaio utilizado.

1.5.3. Especificidade A especificidade de alguns métodos de ensaio está limitada a certos intervalos de pontos de inflamação e sujeita a dados associados à substância (por exemplo, viscosidade elevada).

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO

1.6.

1.6.1. Preparações Coloca-se uma amostra da substância de ensaio num aparelho de teste de acordo com 1.6.3.1. e/ou 1.6.3.2. Por razões de segurança recomenda-se que no caso das substâncias energéticas ou tóxicas se pratique um método que utilize uma pequena quantidade de amostra, cerca de 2 cm3.

1.6.2. Condições de ensaio Tanto quanto for possível por razões de segurança, o aparelho deverá ser colocado numa posição livre de correntes de ar.

1.6.3. Realização do ensaio

1.6.3.

1.6.3.1. Método de equilíbrio Ver ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2. Método de não equilíbrio

1.6.3.2. Aparelho de Abel:

Ver BS 2000 parte 170, NF M07-011, NF T66-009.

Aparelho de Abel-Pensky:

Ver EN 57, DIN 51755 parte 1 (para temperaturas entre 5 e 65 oC), DIN 51755 parte 2 (para temperaturas inferiores a 5 oC), NF M07-036.

Aparelho de Tag:

Ver ASTM D 56.

Aparelho de Pensky-Martens:

Ver ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Observações:

No caso de se verificar que o ponto de inflamação, determinado por um método de não equilíbrio em 1.6.3.2., possui os valores 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC ou 55 ± 2 oC, deve fazer-se a sua confirmação recorrendo a um método de equilíbrio que utilize o mesmo aparelho. Apenas os métodos que possam proporcionar os valores de temperatura do ponto de inflamação podem ser utilizados para uma notificação. Para se determinar o ponto de inflamação de líquidos viscosos (tintas, gomas e análogos) contendo solventes, apenas se pode utilizar aparelhos e métodos de ensaio adequados para a determinação dos pontos de inflamação de líquidos viscosos. Ver ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 parte 1.

2. RESULTADOS

3. RELATÓRIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),

deve especificar-se o método utilizado e bem assim quaisquer desvios possíveis,

os resultados e quaisquer observações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados.

4. REFERÊNCIAS Nenhuma.

A.10. INFLAMABILIDADE (SÓLIDOS)

A.10.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Considera-se útil possuir informações preliminares sobre as propriedades potencialmente explosivas da substância antes de se efectuar este ensaio. Este ensaio apenas deverá ser aplicado a substâncias pulverulentas, granuladas ou pastosas. No sentido de não se incluírem todas as substâncias que podem ser inflamadas, mas apenas aquelas que ardem rapidamente ou aquelas cuja combustão é de alguma forma especialmente perigosa, apenas as substâncias cuja velocidade de combustão excede um determinado valor limite são consideradas altamente inflamáveis. Pode ser especialmente perigosa qualquer situação em que a incandescência se propague através de um metal em pó, devido às dificuldades em extinguir o fogo. Os pós de metais deverão ser considerados altamente inflamáveis se permitirem a propagação da incandescência através da sua massa, num intervalo de tempo específico.

1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADES O tempo de combustão exprime-se em segundos.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Não especificadas.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO Dispõe-se a substância numa fita inquebrável ou num rastilho de pó com aproximadamente 250 mm de comprimento e efectua-se um ensaio preliminar para se determinar se ao provocar-se a ignição com uma chama de gás existe propagação por combustão rápida ou por combustão lenta. Se ocorrer a propagação da combustão ao longo de 200 mm do rastilho no decurso de um intervalo específico de tempo, efectua-se seguidamente o programa de ensaio total para se determinar a velocidade de combustão.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Não especificados.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO

1.6.

1.6.1. Ensaio preliminar Dispõe-se a substância numa fila inquebrável ou num rastilho de pó com aproximadamente 250 mm de comprimento por 20 mm de largura e por 10 mm de altura, sobre uma placa não combustível, não porosa e de fraca condutividade térmica. Aplica-se a uma extremidade do rastilho de pó uma chama de um queimador de gás (diâmetro mínimo de 5 mm) até o pó iniciar a ignição ou durante um período máximo de 2 minutos (5 minutos para pós de metais ou de ligas metálicas). Deve verificar-se se a combustão se propaga ao longo de 200 mm do rastilho no período de tempo do ensaio correspondente a 4 minutos (ou 40 minutos para os pós de metais). No caso de a substância não se inflamar e não houver propagação de combustão, quer por combustão viva, quer por combustão lenta, ao longo de 200 mm do rastilho de pó no período de ensaio correspondente a 4 minutos (ou 40 minutos), então a substância não deverá ser considerada altamente inflamável e não será necessário mais qualquer ensaio. Se a substância propagar a combustão ao longo de 200 mm do rastilho de pó em menos de 4 minutos ou em menos de 40 minutos no caso dos pós de metais, deve dar-se continuidade ao procedimento a seguir descrito (ponto 1.6.2 e seguintes).

1.6.2. Ensaio da velocidade de combustão

1.6.2.

1.6.2.1. Preparação Enche-se livremente com as substâncias pulverulentas ou granuladas um molde de 250 mm de comprimento com uma secção transversal triangular cuja altura interna é de 10 mm e cuja largura é de 20 mm. De ambos os lados do molde, segundo uma direcção longitudinal, faz-se a montagem de duas placas metálicas que constituem limitações laterais e as quais se projectam 2 mm para além da aresta superior da secção recta triangular (ver figura). Depois deixa-se cair o molde três vezes de uma altura de 2 cm sobre uma superfície sólida. Se necessário completa-se depois o enchimento do molde. Efectua-se depois a remoção das limitações laterais e retira-se o excesso de substância. Na parte superior do molde coloca-se uma placa não combustível, não porosa e de baixa condutividade térmica, inverte-se o aparelho e remove-se o molde. As substâncias pastosas são dispostas sobre uma placa não combustível, não porosa e de baixa condutividade térmica na forma de um cordão de 250 mm de comprimento possuindo uma secção transversal de aproximadamente 1 cm2.

1.6.2.2. Condições de ensaio No caso de se tratar de uma substância sensível à humidade o ensaio deverá ser efectuado tão rapidamente quanto possível após a sua remoção do recipiente.

1.6.2.3. Realização do ensaio Coloca-se a pilha numa zona de um sistema de exaustão de fumos. A velocidade do ar deverá ser suficiente para evitar que os fumos escapem para o interior do laboratório e não deverá variar durante o ensaio. Em torno do aparelho deverá ser instalada uma blindagem em forma de chaminé. Para iniciar a ignição da pilha numa das suas extremidades utiliza-se uma chama de um queimador de gás (diâmetro mínimo de 5 mm). Depois de a pilha ter ardido numa extensão de 80 mm, mede-se a velocidade de combustão nos 100 mm seguintes. Efectua-se o ensaio seis vezes, utilizando-se de cada vez uma placa fria limpa, a não ser que se observe um resultado positivo mais cedo.

2. RESULTADOS O tempo de combustão determinado no ensaio preliminar (1.6.1.) e o tempo mais curto de combustão observado nos seis ensaios (1.6.2.3.) são relevantes para a avaliação.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

especificação exacta da substância (identificação e impurezas),

uma descrição da substância que se pretende ensaiar, o seu estado físico incluindo o teor em humidade,

os resultados do ensaio preliminar e do ensaio da velocidade de combustão, se tiverem sido efectuados,

todas as observações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados.

3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS As substâncias pulverulentas, granuladas ou pastosas são consideradas altamente inflamáveis no caso de o tempo de combustão em quaisquer ensaios efectuados de acordo com o procedimento de ensaio descrito em 1.6.2. ser inferior a 45 segundos. Os pós de metais ou de ligas metálicas são considerados altamente inflamáveis no caso de poderem ser inflamados e de a chama ou a zona de reacção se propagar a toda a amostra em 10 minutos ou menos.

4. REFERÊNCIAS (1) NF T 20-042 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

A.11. INFLAMABILIDADE (GASES)

A.11.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Este método permite determinar se os gases misturados com ar à temperatura ambiente (cerca de 20 oC) e à pressão atmosférica são inflamáveis e, em caso afirmativo, qual o intervalo de concentrações. As misturas de concentrações crescentes do gás com ar são expostas a uma faísca eléctrica e observa-se a eventual ocorrência de ignição.

1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADES O intervalo de inflamabilidade é o intervalo de concentrações entre os limites inferior e superior de explosão. Os limites inferior e superior de explosão são os limites de concentração do gás inflamável misturado com ar para cujos valores não ocorre a propagação da chama.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Não especificadas.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO Aumenta-se gradualmente a concentração do gás em ar e expõe-se a mistura escalonadamente à acção de uma faísca eléctrica.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Não especificados.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO

1.6.

1.6.1. Aparelho O recipiente de ensaio é um cilindro de vidro colocado em posição vertical, possuindo um diâmetro interno mínimo de 50 mm e uma altura mínima de 300 mm. Os eléctrodos de ignição encontram-se separados por uma distância de 3 a 5 mm e estão colocados 60 mm acima do fundo do cilindro. O cilindro possui uma abertura para a libertação de pressão. O aparelho deve ser protegido por uma blindagem para minimizar quaisquer danos provocados pela explosão. Como fonte de ignição utiliza-se uma faísca de indução com a duração de 0,5 segundo, que é gerada por um transformador de alta tensão com uma tensão de saída compreendida entre 10 e 15 kV (potência máxima de entrada da ordem de 300 W). Na referência (2) encontra-se descrito um exemplo de um aparelho adequado.

1.6.2. Condições de ensaio O ensaio deve ser efectuado à temperatura ambiente (cerca de 20 oC).

1.6.3. Realização do ensaio Utilizando bombas doseadoras introduz-se no cilindro de vidro uma concentração conhecida de gás em ar. Provoca-se uma faísca na mistura e verifica-se se ocorre ou não a existência de uma chama que se separa da fonte de ignição e se propaga independentemente. Faz-se variar a concentração do gás por escalões de 1 % em volume até que haja ocorrência de ignição conforme anteriormente descrito. No caso de a estrutura química do gás indicar que poderá ser eventualmente não inflamável e de se poder calcular a composição da mistura estequiométrica com ar, apenas será necessário ensaiar em escalões de 1 % misturas compreendidas no intervalo entre 10 % menos do que a composição estequiométrica e 10 % mais do que essa composição.

2. RESULTADOS A ocorrência de propagação da chama é a única informação relevante para a determinação desta propriedade.

3. RELATÓRIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),

uma descrição, com dimensões, do aparelho utilizado,

a temperatura a que se efectuou o ensaio,

as concentrações de ensaio e os resultados obtidos,

o resultado do ensaio: gás não inflamável ou gás altamente inflamável,

no caso de se ter concluído que o gás é não inflamável, deverá especificar-se então o intervalo de concentrações no qual foi ensaiado em escalões de 1 %,

toda a informação e observações relevantes para a interpretação dos resultados.

4.(1)(2) REFERÊNCIAS NF T 20-041 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker und H.Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol. 56, 2, p. 126-127.

A.12. INFLAMABILIDADE (CONTACTO COM ÁGUA)

A.12.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Este método de ensaio pode ser utilizado para se determinar se a reacção de uma substância com água ou com ar húmido origina o desenvolvimento de quantidades perigosas de um gás ou de gases que possam ser altamente inflamáveis. O método de ensaio pode ser aplicado tanto a substâncias sólidas como a substâncias líquidas. Este método não é aplicável a substâncias cuja ignição seja espontânea quando em contacto com o ar.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES Altamente inflamável: substâncias que em contacto com água ou com ar húmido libertam gases altamente inflamáveis em quantidades perigosas numa proporção mínima de 1 litro/kg por hora.

1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO Ensaia-se a substância de acordo com os passos sequenciais adiante descritos: se ocorrer ignição em qualquer desses passos não é necessário continuar o ensaio. No caso de se saber já que a substância não reage violentamente com a água, prosseguir com o passo 4 (1.3.4.).

1.3.

1.3.1. Passo 1 Coloca-se a substância de ensaio numa tina contendo água destilada à temperatura de 20oC e verifica-se se ocorre ou não o início da combustão do gás libertado.

1.3.2. Passo 2 Coloca-se a substância de ensaio sobre uma folha de papel de filtro flutuando sobre a superfície da água destilada contida num prato, à temperatura de 20 oC, e observa-se se ocorre ou não o início da combustão do gás libertado. O papel de filtro destina-se apenas a manter a substância num determinado local para aumentar as probabilidades de ocorrência de ignição.

1.3.3. Passo 3 Com a substância de ensaio prepara-se uma pilha com aproximadamente 2 cm de altura e 3 cm de diâmetro. Verte-se nessa pilha algumas gotas de água e observa-se se há ou não ocorrência de início de combustão do gás libertado.

1.3.4. Passo 4 Mistura-se a substância a ensaiar com água destilada à temperatura de 20 oC e mede-se a velocidade de libertação de gás durante um período de sete horas, em intervalos de uma hora. Se essa taxa de libertação de gás for errática ou no caso de ser crescente decorridas as sete horas, deverá prolongar-se o tempo de medição até ao máximo de cinco dias. O ensaio pode ser interrompido se em qualquer momento essa taxa exceder 1 litro/kg por hora.

1.4. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Não especificadas.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Não especificados.

1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS

1.6.

1.6.1. Passo 1

1.6.1.

1.6.1.1. Condições de ensaio Efectua-se o ensaio à temperatura ambiente (cerca de 20 oC).

1.6.1.2. Realização do ensaio Deve-se colocar uma pequena quantidade (aproximadamente com 2 mm de diâmetro) da substância de ensaio numa tina contendo água destilada. Deve-se anotar (i) qualquer eventual libertação de gás e (ii) a eventual ocorrência de ignição do gás. No caso de ocorrer ignição do gás não é necessário continuar o ensaio da substância uma vez que esta é considerada perigosa.

1.6.2. Passo 2

1.6.2.

1.6.2.1. Aparelho Utiliza-se um papel de filtro flutuando sobre a superfície de água destilada contida em qualquer recipiente adequado, por exemplo, um prato de evaporação com o diâmetro de 100 mm.

1.6.2.2. Condições de ensaio Efectua-se o ensaio à temperatura ambiente (cerca de 20 oC).

1.6.2.3. Realização do ensaio Coloca-se no centro da folha de papel de filtro uma pequena quantidade da substância de ensaio (aproximadamente com 2 mm de diâmetro). Deve-se anotar se ocorre (i) qualquer eventual libertação de gás e (ii) se ocorre ignição desse gás. Se ocorrer a ignição do gás não é necessário continuar o ensaio da substância, uma vez que esta é considerada perigosa.

1.6.3. Passo 3

1.6.3.

1.6.3.1. Condições de ensaio Efectua-se o ensaio à temperatura ambiente (cerca de 20 oC).

1.6.3.2. Realização do ensaio Com a substância de ensaio prepara-se uma pilha com aproximadamente 2 cm de altura e 3 cm de diâmetro com um entalhe na parte superior. Verte-se na perfuração algumas gotas de água e verifica-se (i) se ocorre eventualmente qualquer libertação de gás e (ii) se ocorre ignição desse gás. Se ocorrer ignição do gás não é necessário continuar o ensaio da substância uma vez que esta é considerada perigosa.

1.6.4. Passo 4

1.6.4.

1.6.4.1. Aparelho O aparelho tem a configuração que se mostra na figura.

1.6.4.2. Condições de ensaio Procede-se a uma inspecção da embalagem para verificação da existência de pó (dimensão das partículas < 500 μm) da substância de ensaio. Se o pó constituir mais do que 1 % p/p do total, ou se a amostra for friável, então dever-se-á triturar toda a substância reduzindo-a a pó antes do ensaio de modo a proporcionar uma redução das dimensões das partículas durante o armazenamento e o manuseamento; caso contrário faz-se o ensaio da substância tal como foi recebida. O ensaio deverá ser efectuado à temperatura ambiente (cerca de 20oC) e à pressão atmosférica.

1.6.4.3. Realização do ensaio Coloca-se 10 a 20 ml de água no funil de gotejamento do aparelho e coloca-se 10 g de substância no frasco cónico. Pode-se medir o volume de gás libertado recorrendo a meios adequados. Abre-se a torneira do funil de gotejamento para deixar entrar a água no frasco cónico e põe-se em funcionamento um cronómetro. Mede-se a libertação de gás em cada hora durante um período de sete horas. No caso da libertação de gás durante esse período ser errática ou no caso de no fim desse período a taxa de libertação de gás ser crescente, então dever-se-á continuar a efectuar medições durante cinco dias. Se em qualquer momento do período de medição a taxa de libertação de gás exceder 1 litro/kg por hora pode-se interromper o ensaio. Este ensaio deverá ser efectuado em triplicado. No caso de ser desconhecida a identidade do gás, deve-se proceder a uma análise desse gás. No caso de o gás conter componentes altamente inflamáveis e de não se saber se a mistura global é altamente inflamável, deve-se preparar uma mistura da mesma composição e ensaiar-se de acordo com o método A.11.

2. RESULTADOS A substância é considerada perigosa se:

ocorrer ignição espontânea em qualquer passo do procedimento de ensaio, ou

ocorrer libertação de gás inflamável a uma taxa superior a 1 litro/kg de substância por hora.

3. RELATÓRIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),

pormenores sobre qualquer preparação inicial da substância de ensaio,

os resultados dos ensaios (passos 1, 2, 3 e 4),

a identidade química do gás libertado,

a taxa de libertação de gás no caso de se realizar o passo 4 (1.6.4.),

quaisquer observações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados.

4.(1)(2) REFERÊNCIAS Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and Criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

A.13 PROPRIEDADES PIROFÓRICAS DE SÓLIDOS E LÍQUIDOS

A.13

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO O procedimento de ensaio é aplicável a substâncias sólidas ou líquidas as quais, em pequenas quantidades, entram espontaneamente em combustão, decorrido um curto período de tempo após estarem em contacto com o ar à temperatura ambiente (cerca de 20 oC). As substâncias que necessitem de estar expostas ao ar durante diversas horas ou dias, à temperatura ambiente ou a temperaturas elevadas, antes que ocorra a ignição, não estão abrangidas por este método.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES Considera-se que uma substância possui propriedades pirofóricas se entrar em combustão ou se carbonizar sob as condições descritas em 1.6. Pode ser necessário ensaiar também a auto-inflamabilidade de líquidos utilizando o método A.15 relativo à temperatura de auto-ignição (líquidos e gases).

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Não especificadas.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO Adiciona-se a substância, no estado sólido ou no estado líquido, a um veículo inerte e coloca-se em contacto com o ar à temperatura ambiente durante um período de cinco minutos. Se as substâncias líquidas não se inflamarem utiliza-se papel de filtro para as absorver e faz-se a exposição ao ar à temperatura ambiente (cerca de 20 oC) durante cinco minutos. No caso de uma substância sólida ou líquida se inflamar, ou no caso de um líquido se inflamar ou carbonizar uma folha de papel de filtro, então considera-se que essa substância é pirofórica.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Repetitividade: devido à importância que assumem as questões relativas à segurança, um único resultado positivo é suficiente para que essa substância seja considerada pirofórica.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.6.

1.6.1. Aparelho Utiliza-se um vaso de porcelana com cerca de 10 cm de diâmetro e enche-se com terra de diatomáceas até cerca de 5 mm de altura, à temperatura ambiente (cerca de 20 oC). Nota: A terra de diatomáceas ou quaisquer outras substâncias inertes comparáveis geralmente disponíveis deverão ser consideradas como representativas do solo onde a substância de ensaio possa ser derramada em caso de acidente. É necessário papel de filtro seco para ensaiar os líquidos que não se inflamem em contacto com o ar quando estão em contacto com um veículo inerte.

1.6.2. Realização do ensaio

1.6.2. a)

Sólidos pulverulentos De uma altura de cerca de 1 m deixa-se cair 1 a 2 cm3 da substância pulverulenta que se pretende ensaiar, sobre uma superfície não combustível e verifica-se a eventualidade dessa substância se inflamar durante a queda ou decorridos cinco minutos em repouso. Efectua-se o ensaio seis vezes, salvo no caso de se observar combustão.

Líquidos Verte-se no vaso de porcelana cerca de 5 cm3 do líquido que se pretende ensaiar e observa-se a eventual inflamação da substância no período de cinco minutos. Se não houver inflamação nos seis ensaios, executam-se os ensaios seguintes: Com o auxílio de uma seringa coloca-se 0,5 ml da amostra de ensaio num papel de filtro recortado e observa-se a eventual ocorrência de inflamação ou de carbonização do papel de filtro nos cinco minutos subsequentes à adição do líquido. Efectua-se o ensaio três vezes, salvo se ocorrer inflamação ou carbonização.

2. RESULTADOS

2.

2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS Pode interromper-se o processo de ensaio logo que ocorra um resultado positivo em qualquer dos ensaios.

2.2. AVALIAÇÃO Se a substância se inflama no período de cinco minutos após ter sido adicionada a um veículo inerte e exposta ao ar, ou se uma substância líquida carboniza ou inflama um papel de filtro no período de cinco minutos após a adição e exposição ao ar, então considera-se que é pirofórica.

3. RELATÓRIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),

os resultados dos ensaios,

quaisquer observações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados.

4.(1)(2) REFERÊNCIAS NF T 20-039 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and Criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14. PROPRIEDADES EXPLOSIVAS

A.14.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO O método proporciona um sistema de ensaio para se determinar se uma substância sólida ou pastosa representa perigo de explosão quando submetida ao efeito de uma chama (sensibilidade térmica) ou quando submetida a choque ou fricção (sensibilidade a estímulos mecânicos) e se uma substância líquida representa perigo de explosão quando submetida ao efeito de uma chama ou choque. O método decompõe-se em três partes: O método proporciona dados para se avaliar a possibilidade de se iniciar uma explosão por meio de diversos estímulos comuns. O método não pretende garantir que uma substância seja susceptível de explodir sob quaisquer condições. O método é apropriado para se determinar se uma substância representa perigo de explosão (sensibilidade térmica e mecânica) sob as condições particulares especificadas na directiva. Esse método baseia-se em diversos tipos de aparelhos amplamente utilizados à escala internacional (1) e os quais proporcionam normalmente resultados significativos. Admite-se que o método não é definitivo. É possível utilizar aparelhos alternativos aos especificados desde que sejam internacionalmente aceites e desde que os resultados possam ser adequadamente correlacionados com os que se obtêm com o aparelho especificado. Não é necessário efectuar os ensaios quando existir informação termodinâmica disponível (por exemplo, calor de formação, calor de decomposição) e/ou a ausência de diversos grupos reactivos (2) na fórmula estrutural permitir concluir, para além de quaisquer dúvidas razoáveis, que a substância é incapaz de sofrer decomposição rápida com libertação de gases ou libertação de calor (isto é, o material não representa qualquer risco de explosão). No caso dos líquidos não é necessário qualquer ensaio de sensibilidade mecânica relativamente à fricção.

1.1. a)

Um ensaio de sensibilidade térmica (1);

Um ensaio de sensibilidade mecânica relativamente ao choque (1);

Um ensaio de sensibilidade mecânica relativamente à fricção (1).

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES Explosivo: Substâncias que possam explodir sob o efeito de uma chama ou que sejam sensíveis ao choque ou à fricção no aparelho especificado (ou que sejam mecanicamente mais sensíveis do que o 1,3-dinitrobenzeno num aparelho alternativo).

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA O 1,3-dinitrobenzeno, produto cristalino técnico, peneirado de modo a poder passar por uma malha de 0,5 mm, no caso do método por fricção e choque. A perhidro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazina (RDX, hexogéneo, ciclonite — CAS 121-82-4), cuja recristalização é feita a partir de uma solução aquosa de ciclohexanona, peneirada a húmido através de uma malha de 250 μm e retida num peneiro de malha de 150 μm, fazendo-se a secagem a 103 ± 2 oC (durante 4 horas) para a segunda série de ensaios de fricção e choque.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO São necessários ensaios preliminares para se determinar as condições de segurança para a realização dos três ensaios de sensibilidade.

1.4.

1.4.1. Segurança na realização dos ensaios (3) Por razões de segurança, antes de se efectuarem os ensaios principais submetem-se amostras muito pequenas (cerca de 10 mg) da substância a aquecimento em ambiente não confinado, com uma chama de gás, à acção de choque em qualquer aparelho conveniente e à acção de fricção recorrendo à utilização de um malhete contra uma bigorna ou recorrendo à utilização de qualquer máquina de fricção. O objectivo consiste em determinar se a substância é tão sensível e explosiva que os ensaios de sensibilidade prescritos, particularmente o ensaio de sensibilidade térmica, devam ser efectuados com precauções especiais de modo a evitar ferimentos no operador.

1.4.2. Sensibilidade térmica O método implica o aquecimento da substância num tubo de aço, tapado por placas perfuradas com furos de diferentes diâmetros, no sentido de se determinar se a substância é susceptível de explodir sob condições de aquecimento intenso e confinamento definido.

1.4.3. Sensibilidade mecânica (choque) O método consiste em submeter a substância ao choque provocado por uma massa determinada caindo de uma altura determinada.

14.4. Sensibilidade mecânica (fricção) O método consiste em submeter substâncias sólidas ou pastosas à fricção entre superfícies normalizadas sob condições específicas de carga e de movimento relativo.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Não especificados.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO

1.6.

1.6.1. Sensibilidade térmica (efeito de uma chama)

1.6.1.

1.6.1.1. Aparelho O aparelho é constituído por um tubo de aço não reutilizável com o seu dispositivo de fecho reutilizável (figura 1), instalado num dispositivo de aquecimento e de protecção. Cada tubo é constituído por folha de aço de estiramento profundo (ver apêndice) e possui um diâmetro interno de 24 mm, um comprimento de 75 mm e paredes com espessura de 0,5 mm. Os tubos possuem uma flange na extremidade aberta para permitir que sejam fechados pelo corpo da placa perfurada. Esse corpo é constituído por uma placa perfurada resistente à pressão, possuindo um furo central, presa firmemente a um tubo por meio de uma peça roscada de duas partes (porca e manga roscada). A porca e a manga roscada são feitas de aço de crómio e manganés (ver apêndice), que não produz faíscas até à temperatura de 800 oC. As placas perfuradas possuem 6 mm de espessura, são feitas de aço resistente ao calor (ver apêndice) e encontram-se disponíveis com perfurações de diversos diâmetros.

1.6.1.2. Condições de ensaio Normalmente ensaia-se a substância tal como é recebida, embora em alguns casos a substância após trituração seja, por exemplo, comprimida, moldada ou aglomerada por qualquer outra forma, necessária para o ensaio. No caso dos sólidos determina-se a massa de material a utilizar em cada ensaio recorrendo a um procedimento experimental a seco em dois andares. Enche-se com 9 cm3 de substância um tubo de tara determinada e carrega-se a substância com uma força de 80 N aplicada a toda a secção transversal do tubo. Por razões de segurança ou nos casos em que a forma física da amostra possa ser modificada por compressão, pode recorrer-se a outros procedimentos de enchimento; por exemplo, se a substância for muito sensível à fricção o enchimento pelo método de embuchar não é apropriado. Se o material for compressível adiciona-se mais e carrega-se enchendo-se o tubo até à distância de 55 mm medida a partir da parte superior. Determina-se a massa total utilizada para encher o tubo até àquele nível de 55 mm e adiciona-se mais duas porções carregando-se qualquer delas com a força de 80 N. Depois, ou se adiciona mais material ou se retira, conforme necessário, deixando o tubo cheio até ao nível de 15 mm medidos a partir da parte superior. Realiza-se uma segunda experiência a seco, começando com uma quantidade carregada correspondente a um terço da massa total determinada na primeira experiência a seco. Adiciona-se mais duas porções dessas utilizando uma força de 80 N e ajusta-se o nível da substância no tubo até à distância de 15 mm, medida desde a parte superior, por adição ou por subtracção de material conforme necessário. A quantidade de sólido determinada na segunda experiência a seco é utilizada para cada ensaio; o enchimento efectua-se com três quantidades iguais, qualquer delas comprimida até ao volume de 9 cm3 utilizando-se a força que for necessária (isto pode ser facilitado utilizando anéis espaçadores). Os líquidos e os geles são carregados no tubo até à altura de 60 mm tomando-se precauções particulares com os geles para se evitar a formação de espaços ocos. Faz-se deslizar a manga roscada pelo tubo, pela parte de baixo, insere-se a placa perfurada apropriada e aperta-se a porca depois de se ter aplicado um pouco de lubrificante à base de dissulfureto de molibdénio. É essencial verificar que não haja quaisquer vestígios de substância retida entre a flange e a placa, ou nas roscas. O aquecimento é proporcionado por uma chama de gás propano obtido em garrafa de gás industrial, equipada com um regulador de pressão (60 a 70 mbar), que passa através de uma válvula calibradora e é distribuído uniformemente (conforme indicado por observação visual das chamas dos queimadores) a quatro queimadores através de um cano distribuidor. Os queimadores estão localizados em torno da câmara de ensaio conforme se mostra na figura 1. Os quatro queimadores conjuntamente possuem um consumo de aproximadamente 3,2 litros de propano por minuto. É possível utilizar outros queimadores e gases combustíveis alternativos mas o regime de aquecimento deve ser conforme especificado na figura 3. Para todos os aparelhos o regime de aquecimento deve ser verificado periodicamente utilizando tubos cheios com ftalato de dibutilo conforme se indica na figura 3.

1.6.1.3. Realização dos ensaios Cada ensaio é efectuado até o tubo se fragmentar ou até o tubo ter sido aquecido durante cinco minutos. Um ensaio que tenha como consequência a fragmentação do tubo em três ou mais partes, as quais podem em alguns casos ser unidas umas às outras utilizando estreitas fitas de metal, conforme se ilustra na figura 2, é considerado do tipo explosivo. Um ensaio que tenha como consequência menos fragmentos ou ausência de fragmentação é considerado como sendo do tipo não explosivo. Efectua-se primeiro uma série de três ensaios com uma placa cujo diâmetro do orifício seja de 6,0 mm e se não se obtiver qualquer explosão efectua-se uma segunda série de três ensaios com uma placa cujo diâmetro do orifício seja de 2,0 mm. Se ocorrer uma explosão durante quaisquer das séries de ensaio, não é necessário efectuar mais ensaios.

1.6.1.4. Avaliação Considera-se que o resultado do ensaio é positivo se ocorrer uma explosão em qualquer das anteriores séries de ensaios.

1.6.2. Sensibilidade mecânica (choque)

1.6.2.

1.6.2.1. Aparelho (figura 4) As partes essenciais de um aparelho de martelo cadente típico são um bloco de aço moldado com base, bigorna, coluna, guias, massas cadentes, dispositivo de libertação e um suporte para a amostra. A bigorna de aço de 100 mm (diâmetro) × 70 mm (altura) é enroscada à parte superior de um bloco de aço de 230 mm (comprimento) × 250 mm (largura) × 200 mm (altura) com uma base moldada de 450 mm (comprimento) × 450 mm (largura) × 60 mm (altura). Num suporte aparafusado à parte posterior do bloco de aço prende-se uma coluna feita de tubo de aço estirado sem juntas. Quatro parafusos prendem o aparelho a um sólido bloco de cimento de 60 × 60 × 60 cm de tal modo que as guias são absolutamente verticais e a massa cadente cai livremente. Existem disponíveis para utilização massas de 5 e 10 kg, feitas de aço. A cabeça batente de cada massa é feita de aço duro, HRC 60 a 63, e possui um diâmetro mínimo de 25 mm. A amostra de ensaio é encerrada num dispositivo de choque constituído por dois cilindros de aço coaxiais, um sobre o outro, num guia de aço cilíndrico e oco. Os cilindros de aço deverão possuir um diâmetro de 10 (-0,003, -0,005) mm e uma altura de 10 mm e deverão possuir superfícies polidas, arestas arredondadas (raio de curvatura de 0,5 mm) e uma dureza de HRC 58 a 65. O cilindro oco deve possuir um diâmetro externo de 16 mm, um furo polido de 10 (+0,005, +0,010) mm e uma altura de 13 mm. O dispositivo de choque é montado numa bigorna intermédia (26 mm de diâmetro e 26 mm de altura) feita de aço e centrada por um anel com perfurações para permitir o escape dos fumos.

1.6.2.2. Condições de ensaio O volume da amostra deverá ser de 40 mm3 ou um volume que se ajuste a qualquer aparelho alternativo. As substâncias no estado sólido deverão ser testadas devidamente secas e preparadas do modo seguinte: As substâncias normalmente fornecidas em pasta deverão ser ensaiadas no estado seco, quando possível, ou depois de remover a quantidade máxima possível de diluente. As substâncias líquidas são ensaiadas com o intervalo de 1 mm entre os cilindros de aço superior e inferior.

1.6.2.2. a)

As substâncias pulverizadas são peneiradas (malha com dimensões de 0,5 mm); toda a substância que passar pelo peneiro é utilizada no ensaio;

As substâncias comprimidas, moldadas ou aglomeradas por qualquer outra forma são partidas em pequenas partes e peneiradas; a fracção peneirada com diâmetros compreendidos entre 0,5 e 1 mm é usada no ensaio e deverá ser representativa da substância original.

1.6.2.3. Realização dos ensaios Realiza-se uma série de seis ensaios deixando cair uma massa de 10 kg, de uma altura de 0,4 m (40 J). Se ocorrer uma explosão durante os seis ensaios para o valor de 40 J deve realizar-se outra série de seis ensaios deixando cair uma massa de 5 kg e de uma altura de 0,15 m (7,5 J). Noutros aparelhos compara-se a amostra com a substância de referência escolhida utilizando um procedimento reconhecido (por exemplo, técnica de sobe-e-desce, etc.).

1.6.2.4. Avaliação Considera-se positivo o resultado do ensaio se ocorrer uma explosão (o aparecimento súbito de uma chama e/ou uma repercussão é equivalente a uma explosão) pelo menos uma vez em qualquer dos ensaios com o aparelho de choque especificado ou considera-se que a amostra é mais sensível do que o composto 1,3-dinitrobenzeno ou RDX num ensaio de choque alternativo.

1.6.3. Sensibilidade mecânica (fricção)

1.6.3.

1.6.3.1. Aparelho (figura 5) O aparelho de fricção é constituído por uma placa de base de aço moldado sobre a qual se monta o dispositivo de fricção. Este é constituído por uma cavilha de porcelana fixa e por uma placa de porcelana móvel. A placa de porcelana é suportada por uma armação que desliza em duas guias. A armação é ligada a um motor eléctrico através de uma biela de ligação, um ressalto excêntrico e uma engrenagem adequada de tal modo que a placa de porcelana se move, uma vez apenas, para trás e para diante por baixo da cavilha de porcelana numa distância de 10 mm. A carga da cavilha de porcelana é de 120 a 360 newtons, por exemplo. As placas lisas de porcelana são feitas de porcelana branca (rugosidade de 9 a 32 μm) e possuem as dimensões de 25 mm (comprimento) × 25 mm (largura) × 5 mm (altura). A cavilha cilíndrica de porcelana é feita também de porcelana branca e tem 15 mm de comprimento, possui um diâmetro de 10 mm e na extremidade esférica rugosa possui superfícies com um raio de curvatura de 10 mm.

1.6.3.2. Condições de ensaio O volume da amostra deverá ser de 10 mm3 ou um volume ajustado a qualquer aparelho alternativo. As substâncias sólidas são ensaiadas devidamente secas e preparadas do modo seguinte: As substâncias normalmente fornecidas em pasta deverão ser ensaidas no estado seco, quando possível. Se a substância não pode ser preparada no estado seco, a pasta (depois de removida a quantidade máxima possível de diluente) é ensaiada na forma de uma película com 0,5 mm espessura, 2 mm de largura e 10 mm de comprimento preparada com uma matriz.

1.6.3.2. a)

As substâncias pulverizadas são peneiradas (com malha de 0,5 mm); utiliza-se no ensaio toda a substância que passe através do peneiro;

As substâncias comprimidas, moldadas ou aglomeradas por qualquer outra forma são partidas em peças pequenas e peneiradas; utiliza-se para o ensaio a fracção peneirada de diâmetro < 0,5 mm.

1.6.3.3. Realização dos ensaios Coloca-se a cavilha de porcelana sobre a amostra submetida ao ensaio e aplica-se a carga. Ao efectuar-se o ensaio, as marcas esponjosas da placa de porcelana devem ficar transversais à direcção do movimento. Devem ser tomadas precauções para que a cavilha se ajuste sobre a amostra, para que haja material de ensaio suficiente sob a cavilha e também para que a placa se mova correctamente sob a cavilha. Para as substâncias pastosas utiliza-se um calibrador com 0,5 mm de espessura e com uma fenda de 2 × 10 mm para se aplicar a substância à placa. A placa de porcelana tem de se mover 10 mm para diante e para trás sob a cavilha de porcelana no tempo de 0,44 segundos. Cada parte da superfície da placa e da cavilha deve ser utilizada apenas uma vez; as duas extremidades de cada cavilha servirão para duas experiências e as duas superfícies de uma placa servirão, cada uma delas, para três experiências. Efectua-se uma série de seis ensaios com uma carga de 360 N. Se ocorrer um evento positivo durante estes seis ensaios deve ser efectuada outra série de seis ensaios com uma carga de 120 N. Com outros aparelhos compara-se a amostra com a substância de referência escolhida utilizando um procedimento consagrado (por exemplo, técnica de sobe-e-desce, etc.).

1.6.3.4. Avaliação Considera-se positivo o resultado do ensaio se ocorrer uma explosão (a crepitação e/ou uma repercussão ou o aparecimento súbito de uma chama são equivalentes a uma explosão) pelo menos uma vez em qualquer dos ensaios com o aparelho de fricção especificado ou se for satisfeito um critério equivalente num ensaio de fricção alternativo.

2. RESULTADOS Em princípio considera-se que uma substância representa perigo de explosão no sentido da directiva se for obtido um resultado positivo no ensaio de sensibilidade térmica, de choque ou de fricção.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

identidade, composição, pureza, teor em humidade, etc., da substância ensaiada,

a forma física da amostra e o facto eventual de ter sido triturada, quebrada e/ou peneirada,

as observações durante os ensaios de sensibilidade térmica (por exemplo, a massa da amostra, o número de fragmentos, etc.),

as observações efectuadas durante os ensaios de sensibilidade mecânica (por exemplo, a formação de quantidades consideráveis de fumos ou a decomposição completa sem repercussão, chamas, faíscas, crepitação, etc.),

os resultados de cada tipo de ensaio,

no caso de se ter utilizado um aparelho alternativo, o relatório deverá conter a justificação científica e também a evidência de correlação entre os resultados obtidos com o aparelho especificado e os resultados obtidos com o aparelho equivalente,

quaisquer comentários úteis tais como as referências em ensaios com produtos idênticos e que possam ser relevantes para uma interpretação adequada dos resultados,

todas as observações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados.

3.2. INTERPRETAÇÃO E AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS O relatório do ensaio deverá mencionar quaisquer resultados que sejam considerados falsos, anómalos ou não representativos. Se for necessário deduzir quaisquer dos resultados deverá descrever-se uma explicação e os resultados de ensaios alternativos ou complementares. Salvo nos casos em que possa ser explicado um resultado anómalo, deve aceitar-se o valor nominal e utilizar-se esse valor para classificar a substância em conformidade.

4.(1)(2)(3)(4)

REFERÊNCIAS Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and Criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Buttcrworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, p. 6-13 and p. 30-42. NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of explosion risk.

A.15. TEMPERATURA DE AUTO-IGNIÇÃO (LÍQUIDOS E GASES)

A.15.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO As substâncias explosivas e as substâncias que sofrem ignição espontânea em contacto com o ar à temperatura ambiente não devem ser submetidas a este ensaio. O procedimento de ensaio é aplicável a gases, líquidos e vapores, que, na presença de ar, podem ser inflamados por uma superfície quente. A temperatura de auto-ignição pode ser consideravelmente reduzida pela presença de impurezas catalíticas, pela superfície do material ou pelo facto de o recipiente de ensaio ter um volume superior.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES O grau de propensão para a auto-ignição exprime-se em termos de temperatura de auto-ignição. A temperatura de auto-ignição é a menor temperatura para a qual a substância de ensaio se inflama quando misturada com ar sob as condições definidas no método de ensaio.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA As substâncias de referência estão enumeradas nas normas (ver 1.6.3.). Devem servir essencialmente para a calibração do método, de vez em quando, e para permitir a comparação com resultados obtidos com outros métodos.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO O método permite a determinação da temperatura mínima da superfície interior de um recinto fechado à qual ocorre a ignição de um gás, vapor ou líquido injectados nesse recinto fechado.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE A repetitividade varia de acordo com o intervalo de temperaturas de auto-ignição e com o método de ensaio utilizado, A sensibilidade e a especificidade dependem do método de ensaio utilizado.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO

1.6.

1.6.1. Aparelho O aparelho encontra-se descrito no método referido em 1.6.3.

1.6.2. Condições de ensaio O ensaio de uma amostra da substância efectua-se de acordo com o método referido em 1.6.3.

1.6.3. Realização do ensaio Ver IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. RESULTADOS Regista-se a temperatura de ensaio, a pressão atmosférica, a quantidade de amostra utilizada e o intervalo de tempo decorrido até à ocorrência da ignição.

3. RELATÓRIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),

a quantidade de amostra utilizada,

a pressão atmosférica,

o aparelho utilizado,

os resultados das medições (temperaturas de ensaio, resultados relativos à ignição, correspondentes intervalos de tempo),

todas as observações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados.

4. REFERÊNCIAS Nenhuma.

A.16. TEMPERATURA DE AUTO-1GNIÇÃO RELATIVA PARA OS SÓLIDOS

A.16.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO As substâncias explosivas e as substâncias que se inflamam espontaneamente em contacto com o ar à temperatura ambiente não deverão ser submetidas a este ensaio. O objectivo deste ensaio consiste em proporcionar informação preliminar sobre a auto-inflamabilidade de substâncias sólidas a temperaturas elevadas. Se o calor desenvolvido por reacção da substância com oxigénio ou por decomposição exotérmica não for perdido para o meio envolvente com rapidez suficiente, ocorre o fenómeno de auto-aquecimento que conduz à auto-ignição. Em consequência, a auto-ignição ocorre sempre que a razão de produção de calor excede a razão da perda de calor. O procedimento de ensaio é útil como pesquisa preliminar para as substâncias sólidas. Dada a natureza complexa da ignição e da combustão de sólidos, a temperatura de auto-ignição determinada de acordo com este método apenas deverá ser utilizada para efeitos de comparação.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES A temperatura de auto-ignição obtida por este método é a temperatura ambiente mínima expressa emoC à qual se inflamará um determinado volume de substância sob condições definidas.

1.3. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA Nenhuma.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO Coloca-se num forno, à temperatura ambiente, um determinado volume de substância a ensaiar; traça-se uma curva temperatura/tempo relativa às condições no centro da amostra, aumentando-se a temperatura do forno até 400oC ou até ao ponto de fusão da substância se for menor, à razão de 0,5oC/minuto. Para os objectivos deste ensaio, a temperatura do forno para a qual a temperatura da amostra é de 400oC por auto-aquecimento é designada por temperatura de auto-ignição.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Nenhum.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO

1.6.

1.6.1. Aparelho

1.6.1.

1.6.1.1. Forno Utiliza-se um forno de laboratório de temperatura programada (com o volume aproximado de dois litros) equipado com sistema de circulação de ar natural e com sistema para aliviar os efeitos da explosão. No sentido de se evitar um potencial risco de explosão, não se deverá permitir que quaisquer gases de decomposição estabeleçam contacto com os componentes eléctricos do sistema de aquecimento.

1.6.1.2. Cubo de rede de arame De acordo com o diagrama da figura 1 prepara-se uma peça de rede de arame de aço inoxidável com aberturas de 0,045 mm. A rede deverá ser dobrada e presa com arame no interior de cubos abertos por cima.

1.6.1.3. Termopares Termopares adequados.

1.6.1.4. Registador Utiliza-se qualquer registador de dois canais calibrado de 0 a 600oC ou calibrado para a tensão correspondente.

1.6.2. Condições de ensaio As substâncias são ensaiadas tal qual são recebidas.

1.6.3. Realização do ensaio Enche-se o cubo com a substância de ensaio e bate-se suavemente adicionando-se mais substância até o cubo estar completamente cheio. Depois suspende-se o cubo no centro do forno, à temperatura ambiente. Coloca-se um termopar no centro do cubo e coloca-se outro entre o cubo e a parede do forno para registar a temperatura deste. As temperaturas do forno e da amostra são registadas continuamente ao mesmo tempo que a temperatura do forno aumenta até 400oC ou até ao ponto de fusão da substância, se for inferior, à razão de 0,5oC/minuto. Ao ocorrer a ignição da substância o termopar da amostra indicará uma subida muito rápida da temperatura, superior à temperatura do forno.

2. RESULTADOS A temperatura do forno à qual a temperatura da amostra atinge 400oC por auto-aquecimento é relevante para a avaliação (ver figura 2).

3. RELATÓRIO O relatório do ensaio deverá, se possível, conter a informação seguinte:

uma descrição da substância a ensaiar,

os resultados da medição, incluindo a curva temperatura/tempo,

todas as observações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados.

4. REFERÊNCIAS (1) NF T 20-036 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

4. Figura 1 Planificação do cubo de ensaio com 20 mm de aresta

Figura 2 Curva típica de temperatura/tempo

Temperatura da amostra Temperatura do forno Temperatura de ignição Tempo

A.17. PROPRIEDADES OXIDANTES (SÓLIDOS)

A.17.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO É útil possuir informações preliminares sobre quaisquer potenciais propriedades explosivas da substância antes de se efectuar este ensaio. Este ensaio não é aplicável a líquidos, gases, substâncias explosivas ou altamente inflamáveis ou peróxidos orgânicos. Não é necessário efectuar este ensaio no caso de o exame da fórmula estrutural determinar, para além de qualquer dúvida razoável, que a substância é incapaz de reagir exotermicamente com um material combustível. No sentido de se determinar se o ensaio deve ser efectuado com precauções especiais, dever-se-á efectuar um ensaio preliminar.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES Tempo de combustão: é o tempo de reacção, em segundos, necessário para a zona de reacção se deslocar ao longo de uma pilha utilizando o procedimento descrito em 1.6. Velocidade de combustão: expressa em milímetros por segundo. Velocidade máxima de combustão: é o valor máximo das velocidades de combustão obtidas com misturas contendo entre 10 % e 90 % em peso do oxidante.

1.3. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA Utiliza-se o nitrato de bário (qualidade analítica) como substância de referência para o ensaio e para o ensaio preliminar. A mistura de referência é uma mistura de nitrato de bário com pó de celulose preparada de acordo com 1.6., que possui a velocidade máxima de combustão (normalmente é uma mistura contendo nitrato de bário na proporção de 60 % em peso).

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO Por razões de segurança, efectua-se um ensaio preliminar. Não é necessário mais nenhum ensaio no caso de se verificar claramente no ensaio preliminar que a substância de ensaio possui propriedades oxidantes. Se não for esse o caso, a substância deverá ser então submetida ao ensaio completo. No ensaio completo mistura-se, segundo proporções variáveis, a substância que se pretende ensaiar e uma substância combustível previamente definida. Depois forma-se uma pilha com cada mistura e procede-se à ignição dessa pilha numa das suas extremidades. A velocidade máxima de combustão determinada é então comparada com a velocidade máxima de combustão da mistura de referência.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Se necessário, é válido qualquer método de trituração e de mistura desde que a diferença entre as velocidades máximas de combustão em seis ensaios separados não se afastem do valor correspondente à média aritmética em mais do que 10 %.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO

1.6.

1.6.1. Preparação

1.6.1.

1.6.1.1. Substância de ensaio Reduz-se a amostra de ensaio a partículas com dimensões < 0,125 mm utilizando o procedimento seguinte: peneira-se a substância de ensaio, tritura-se a parte restante e repete-se o procedimento até toda a substância de ensaio passar pelo peneiro. Pode-se utilizar qualquer método de trituração e de crivagem que satisfaçam os critérios qualitativos. Antes da preparação da mistura seca-se a substância à temperatura de 105 oC, até se obter um peso constante. No caso de a temperatura de decomposição da substância de ensaio ser inferior a 105 oC, torna-se necessário secar a substância a uma temperatura inferior adequada.

1.6.1.2. Substância combustível Utiliza-se pó de celulose como substância combustível. A celulose deverá ser do tipo utilizado para a cromatografia de camada fina ou para a cromatografia em coluna. Verificou-se que é adequada a celulose em que 85 % das fibras possui um comprimento compreendido entre 0,020 e 0,075 mm. Faz-se passar o pó de celulose através de um peneiro de malha de 0,125 mm. Em todo o ensaio deve-se utilizar o mesmo lote de celulose. Antes de se preparar a mistura efectua-se a secagem do pó de celulose à temperatura de 105 oC até se obter um peso constante. No caso de se utilizar serradura no ensaio preliminar faz-se a preparação dessa serradura de madeira macia recolhendo a porção que passa através de um peneiro de malha de 1,6 mm, mistura-se muito bem e depois seca-se à temperatura de 105oC durante 4 horas numa camada com espessura inferior a 25 mm. Arrefece-se e armazena-se num recipiente estanque ao ar, tão cheio quanto for possível, de preferência ao fim de 24 horas de secagem.

1.6.1.3. Fonte de ignição Como fonte de ignição deve utilizar-se uma chama de um queimador de gás (com diâmetro mínimo de 5mm). No caso de se utilizar outra fonte de ignição (por exemplo, quando se efectua o ensaio em atmosfera inerte), deverá constar do relatório uma descrição e a justificação.

1.6.2. Realização do ensaio Nota: As misturas de oxidantes com celulose ou com serradura devem ser tratadas como potencialmente explosivas e manuseadas com as devidas precauções.

1.6.2.

1.6.2.1. Ensaio preliminar Mistura-se muito bem a substância seca com a celulose ou com a serradura seca na proporção em peso de duas partes da substância de ensaio para uma parte de celulose ou de serradura e com essa mistura prepara-se uma pequena pilha com a configuração de um cone com as dimensões de 3,5 cm (diâmetro da base) × 2,5 cm (altura) enchendo, sem bater, uma forma com a configuração do cone (por exemplo, um funil de vidro de laboratório com o bico tapado). Coloca-se essa pilha sobre uma placa fria, não combustível, não porosa e de fraca condutividade térmica. O ensaio deve ser efectuado num aparador com exaustão de fumos tal como em 1.6.2.2. Coloca-se a fonte de ignição em contacto com o cone. Observa-se e regista-se o vigor e a duração da reacção resultante. Considera-se que a substância é um oxidante se a reacção for vigorosa. Em qualquer caso em que o resultado suscite dúvidas é necessário completar depois a sequência de ensaio adiante descrita.

1.6.2.2. Sequência de ensaio Procede-se à preparação de misturas oxidante/celulose contendo oxidante em proporções compreendidas entre 10 % e 90 % em peso, por acrescimentos sucessivos de 10 %. Nos casos limite, deve utilizar-se misturas intermédias de oxidante/celulose para se obter com maior precisão a velocidade máxima de combustão. A configuração da pilha é conseguida por meio de um molde. Esse molde é feito de metal, tem um comprimento de 250 mm e uma secção recta transversal com uma altura interior de 10 mm e com uma largura interior de 20 mm. De ambos os lados do molde, segundo a direcção longitudinal, faz-se a montagem de duas placas metálicas que constituem limitações laterais que ultrapassam 2 mm a aresta superior da secção recta triangular (ver figura). Enche-se livremente este dispositivo com um ligeiro excesso de mistura. Depois de se deixar cair o molde uma vez, de uma altura de 2 cm sobre uma superfície sólida, remove-se a substância em excesso remanescente com uma folha colocada em posição oblíqua, procede-se à remoção das limitações laterais e alisa-se o pó restante utilizando um cilindro. Depois coloca-se sobre o molde uma placa não combustível, não porosa e de fraca condutibilidade térmica, inverte-se o aparelho e remove-se o molde. Coloca-se a placa sob o exaustor de um aparador com exaustão de fumos. A velocidade do ar deverá ser suficiente para evitar que os fumos escapem para o interior do laboratório e não deverá variar durante o ensaio. Em torno do aparelho deverá instalar-se uma blindagem auxiliar da exaustão. Devido às propriedades higroscópicas da celulose e de algumas substâncias que se pretendem ensaiar o teste deverá ser efectuado tão rapidamente quanto possível. Inflama-se uma extremidade da pilha por contacto com a chama. Mede-se o tempo de reacção para uma distância de 200 mm após a zona de reacção se ter propagado, segundo uma distância inicial de 30 mm. Efectua-se o ensaio com a substância de referência e pelo menos com cada uma das misturas de substância de ensaio com celulose, no intervalo definido. No caso de se verificar que a velocidade máxima de combustão é significativamente superior à da mistura de referência, pode-se interromper o ensaio; caso contrário, deve-se repetir o ensaio cinco vezes para cada uma das três misturas que proporcionam a velocidade de combustão mais rápida. No caso de se suspeitar que o resultado é falsamente positivo, deve-se repetir o ensaio utilizando uma substância inerte com partículas de dimensões idênticas, tal como a diatomite, em vez de celulose. Em alternativa deve-se ensaiar novamente a mistura de substância de ensaio/celulose que possui a velocidade de combustão mais rápida em atmosfera inerte (teor em oxigénio < 2 % v/v).

2. RESULTADOS Por razões de segurança deve-se considerar a velocidade máxima de combustão — em vez do valor médio — como sendo a propriedade oxidante característica da substância de ensaio. Para a avaliação é relevante o valor máximo da velocidade de combustão obtido numa série de seis ensaios para uma determinada mistura. Traça-se um gráfico do valor máximo da velocidade de combustão para cada mistura em função da concentração do oxidante. A partir de gráfico conclui-se sobre a velocidade máxima de combustão. Os seis valores de velocidade de combustão medidos numa experiência efectuada com a mistura de máxima velocidade de combustão não devem diferir do valor da média aritmética em mais do que 10 %; caso contrário, devem aperfeiçoar-se os métodos de trituração e de mistura. A velocidade máxima de combustão obtida é comparada com a velocidade máxima de combustão da mistura de referência (ver 1.3.). Se os ensaios forem efectuados em atmosfera inerte, compara-se a velocidade máxima de reacção com a que se obtém com a mistura de referência em atmosfera inerte.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

identidade, composição, pureza, teor em humidade, etc., da substância ensaiada,

qualquer tratamento da substância de ensaio (por exemplo, trituração, secagem, etc.),

a fonte de ignição utilizada nos ensaios,

os resultados das medições,

o modo de reacção (por exemplo, combustão com chama à superfície, combustão através de toda a massa, qualquer informação relativa aos produtos de combustão, etc.),

todas as observações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados, incluindo uma descrição do vigor (chamas, faíscas, fumos, combustão lenta, etc.) e duração aproximada observados no ensaio preliminar sobre segurança/pesquisa, tanto para a substância de ensaio como para a substância de referência,

os resultados dos ensaios com uma substância inerte, se existirem,

os resultados dos ensaios em atmosfera inerte, se existirem.

3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Considera-se que uma substância é um oxidante nos casos em que: No sentido de se evitar um resultado positivo falso, os resultados obtidos ao fazer-se o ensaio da substância misturada com um material inerte e/ou ao fazer-se o ensaio sob atmosfera inerte deverão ser considerados também ao fazer-se a interpretação dos resultados.

3.2. a)

No ensaio preliminar se observa uma reacção vigorosa;

No ensaio completo, a velocidade máxima de combustão das misturas ensaiadas é superior ou igual à velocidade máxima de combustão da mistura de referência constituída por celulose e nitrato de bário.

4. REFERÊNCIAS (1) NF T 20-035 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

A.18. MASSA MOLECULAR MÉDIA EM FUNÇÃO DO NÚMERO DE MOLES E DISTRIBUIÇÃO DA MASSA MOLECULAR EM POLÍMEROS

A.18.

1. MÉTODO O presente método, que utiliza a cromatografia de permeação em gel (GPC), é idêntico ao método OCDE TG 118 (1996). Os respectivos fundamentos e outras informações técnicas são apresentados na referência (1).

1.

1.1. INTRODUÇÃO Tendo em conta a diversidade das propriedades dos biopolímeros, torna-se impossível descrever um único método que estabeleça de modo preciso as condições de separação e avaliação dos mesmos, abrangendo todas as possibilidades e especificidades. Muitos sistemas poliméricos complexos, nomeadamente, não são analisáveis por cromatografia de permeação em gel. Nos casos em que o recurso a esta técnica não se afigure viável, a massa molecular pode ser determinada através de outros métodos (ver apêndice), devendo documentar-se e justificar-se a opção utilizada. O método descrito baseia-se na norma DIN 55672 (1); esta última contém informações pormenorizadas sobre o modo de execução do ensaio e a avaliação dos respectivos resultados. Caso seja necessário alterar determinadas condições do processo experimental, deve apresentar-se a devida justificação. Podem utilizar-se outras normas, na condição de apresentar as respectivas referências. O método descrito utiliza, para fins de calibração, amostras de poliestireno de polidispersibilidade conhecida, podendo ser necessário efectuar alterações de modo a torná-lo adequado a determinados polímeros, nomeadamente polímeros hidrossolúveis e polímeros reticulados de cadeia longa.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES A massa molecular média em função do número de moles, Mn, e a massa molecular média relativa à massa das espécies, Mw, são determinadas por recurso às equações: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi em que: Hi é a intensidade do sinal do detector correspondente ao volume de retenção Vi, contado a partir da linha de base, Mi é a massa molecular da fracção do polímero correspondente ao volume de retenção Vi e n é o número de pontos obtidos experimentalmente. A amplitude da distribuição de massas moleculares, que constitui uma medida da dispersibilidade do sistema, é dada pelo quociente Mw/Mn

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Uma vez que a cromatografia de permeação em gel constitui um método relativo, deve efectuar-se uma calibração. Para tal, podem utilizar-se padrões de poliestireno de cadeia linear, com uma distribuição limitada, e massas moleculares médias (Mn e Mw) e distribuição de massas moleculares conhecidas. A curva de calibração apenas pode ser utilizada na determinação da massa molecular da amostra desconhecida caso as condições de separação da referida amostra e dos padrões tenham sido seleccionadas de modo idêntico. Uma determinada relação entre a massa molecular e o volume de eluição apenas é válida nas condições específicas de cada ensaio. Estas últimas incluem, nomeadamente, a temperatura, o tipo de solvente (ou mistura de solventes), as condições cromatográficas e a coluna ou sistema de colunas de separação. As massas moleculares da amostra determinadas pelo método em causa constituem valores relativos, sendo designadas massas moleculares em equivalentes de poliestireno. Tal facto significa que as massas moleculares podem apresentar desvios relativamente aos valores absolutos em função das diferenças estruturais e químicas entre a amostra e os padrões. Caso se utilizem outros padrões, nomeadamente polietilenoglicol, óxido de polietileno, metracrilato de polimetilo ou ácido poliacrílico, devem justificar-se os motivos.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO A determinação da distribuição das massas moleculares, bem como das massas moleculares médias da amostra (Mn, Mw), pode fazer-se por recurso à cromatografia de permeação em gel, que consiste numa variante da cromatografia líquida em que a amostra é separada em função dos volumes hidrodinâmicos dos diversos componentes (2). A separação é efectuada por passagem através de uma coluna cujo enchimento consiste num material poroso, de modo geral um gel orgânico. As moléculas de dimensões mais reduzidas passam através dos poros, sendo as restantes excluídas. A fixação das moléculas de maiores dimensões é, pois, menor, sendo eluídas em primeiro lugar. As moléculas de dimensões médias passam através de alguns poros, sendo eluídas numa fase posterior. Finalmente, as moléculas de dimensões mais reduzidas, que possuem um raio hidrodinâmico inferior ao dos poros do gel, penetram estes últimos, sendo eluídas em último lugar. Em condições ideais, a separação é determinada apenas pelas dimensões das moléculas, embora, na prática, seja difícil evitar algumas interferências devidas à adsorção. A não uniformidade do enchimento e a existência de volumes mortos poderão induzir problemas complementares (2). A detecção pode ser efectuada com base no índice de refracção ou por absorção no ultravioleta, originando uma curva de distribuição simples. Todavia, de modo a atribuir valores de massa molecular aos vários pontos da curva, é necessário efectuar uma calibração por recurso a polímeros de massa molecular conhecida e, se possível, de estrutura similar, nomeadamente padrões de poliestireno. A curva resultante da representação gráfica da quantidade, em massa, das diversas espécies eluídas em função do logaritmo da massa molecular deve exibir uma distribuição de Gauss, por vezes distorcida por uma ligeira assimetria na região das massas moleculares mais reduzidas.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE A repetibilidade (desvio-padrão relativo) do volume de eluição deve ser superior a 0,3 %. Se um cromatograma elaborado em função do tempo não corresponder aos critérios supra, deve assegurar-se a necessária repetibilidade da análise mediante correcção por recurso a um padrão interno (1). As polidispersões dependem da massa molecular de cada padrão. No caso da utilização de padrões de poliestireno, os valores característicos são os seguintes: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 em que Mp representa a massa molecular do padrão correspondente ao máximo do pico.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.6.

1.6.1. Preparação das soluções-padrão de poliestireno Os padrões de poliestireno são dissolvidos, com agitação, no eluente escolhido. Na preparação das soluções devem ter-se em conta as recomendações do fabricante. As concentrações dos padrões dependem de vários factores, nomeadamente o volume de injecção, a viscosidade da solução e a sensibilidade do detector. Deve adaptar-se o volume de injecção máximo ao comprimento da coluna, de modo a evitar uma sobrecarga. Os volumes de injecção característicos de separações analíticas por cromatografia de permeação em gel com uma coluna de 30 cm × 7,8 mm situam-se, de modo geral, entre 40 e 100 μl. É possível injectar volumes superiores, que não devem, contudo, exceder 250 μl. Antes de calibrar a coluna, deve determinar-se o rácio adequado volume de injecção/concentração.

1.6.2. Preparação da solução de amostra De modo geral, as condições atrás referidas são também aplicáveis à preparação das soluções de amostra. Esta última é dissolvida num solvente adequado, nomeadamente tetra-hidrofurano (THF), sob agitação cuidadosa. Em caso algum deverá utilizar-se um banho de ultra-sons. Se necessário, a solução de amostra pode ser purificada por passagem através de um filtro de membrana, cujos poros deverão ter dimensões compreendidas entre 0,2 e 2 μm. Deve referir-se no relatório final a eventual presença de partículas não dissolvidas, que poderão conter espécies de massa molecular superior. Deve utilizar-se um método adequado para determinar a percentagem ponderal das partículas em causa. As soluções devem ser utilizadas nas 24 horas subsequentes à sua preparação.

1.6.3. Equipamento Deve assegurar-se o carácter inerte do sistema cromatográfico em relação aos solventes utilizados (nomeadamente no caso da utilização de capilares de aço com THF).

Reservatório de solvente,

desgaseificador (se adequado),

bomba,

amortecedor de pulsações (se adequado),

sistema de injecção,

colunas cromatográficas,

detector,

medidor de caudal (se adequado),

sistema de registo e processamento de dados,

recipiente para resíduos.

1.6.4. Sistema de injecção e de aporte de solvente Introduz-se na coluna um determinado volume de solução de amostra, manualmente ou por intermédio de um amostrador automático, numa zona bem definida. No caso da introdução manual, a compressão do êmbolo ou a retirada da seringa demasiado rápidas poderão determinar alterações na distribuição de massas moleculares obtida. O sistema de aporte de solvente deve ser uniforme, recorrendo, se possível, a um amortecedor de pulsações. O caudal deve ser da ordem de 1 ml/min.

1.6.5. Coluna Em função do tipo de amostra, os polímeros são analisados por recurso a uma única coluna ou a diversas colunas ligadas em série. Encontram-se disponíveis nos circuitos comerciais colunas de materiais porosos com propriedades (por exemplo, dimensões dos poros, limites de exclusão) bem definidas. A selecção do gel a utilizar, bem como do comprimento da coluna, depende das propriedades da amostra (volumes hidrodinâmicos, distribuição das massas moleculares) e das condições específicas de separação, nomeadamente o tipo de solvente utilizado, a temperatura e o caudal (l) (2) (3).

1.6.6. Pratos teóricos Deve caracterizar-se a coluna ou sistema de colunas a utilizar na separação pelo respectivo número de pratos teóricos. No caso da utilização de THF como solvente de eluição, introduzir uma solução de etilbenzeno ou outro soluto apolar adequado numa coluna de comprimento conhecido. O número de pratos teóricos é dado pela equação: N=5,54VeW1/22 ou N=16VeW2 em que: N representa o número de pratos teóricos, Ve representa o volume de eluição correspondente ao máximo do pico, W representa a largura da base do pico, W1/2 representa a largura do pico a meia altura.

1.6.7. Eficiência de separação Além do número de pratos teóricos, que determina a largura das bandas, a eficiência de separação, obtida a partir do declive da curva de calibração, desempenha também um papel importante. A eficiência de separação de uma coluna é dada por: Ve,Mx-Ve,(10Mx)secção transversal da coluna≥6,0 cm3cm2 em que: Ve, Mx representa o volume de eluição de uma fracção de poliestireno com massa molecular Mx e Ve,(10Mxx) representa o volume de eluição de uma fracção de poliestireno com massa molecular dez vezes superior. A resolução do sistema é geralmente definida do seguinte modo: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 em que: Ve1, Ve2 representam os volumes de eluição dos dois padrões de poliestireno, correspondentes ao máximo dos picos, W1, W2 representam a largura da base dos picos, e M1, M2 representam as massas moleculares correspondentes aos máximos dos picos, devendo diferir num factor de 10. O valor R do sistema de colunas deve ser superior a 1,7 (4).

1.6.8. Solventes Todos os solventes devem possuir um elevado grau de pureza (no caso do THF, o grau de pureza deve ser de 99,5 %). As dimensões do reservatório de solvente (que pode, se necessário, encontrar-se sob atmosfera inerte) devem ser suficientes para permitir a calibração da coluna e a realização de diversas análises. O solvente deve ser desgaseificado antes da sua introdução na coluna por intermédio da bomba.

1.6.9. Controlo da temperatura A temperatura dos componentes críticos internos (septo de injecção, colunas, detector, tubagens) deve ser constante e adequada ao solvente escolhido.

1.6.10. Detector A função do detector consiste no registo quantitativo da concentração da amostra eluída da coluna. De modo a evitar o alargamento dos picos, o volume da célula de detecção deve ser tão reduzido quanto possível, não devendo exceder 10 μl, excepto no caso dos detectores de difusão de radiações e de viscosidade. O método de detecção mais corrente consiste na refractometria diferencial. Todavia, se as propriedades específicas da amostra ou do solvente de eluição o justificarem, podem utilizar-se outros tipos de detectores, nomeadamente de radiação ultravioleta/visível, infravermelha e detectores de viscosidade.

2. RESULTADOS E SUA APRESENTAÇÃO

2.

2.1. RESULTADOS Para pormenores sobre os critérios de avaliação, bem como no que respeita às exigências em matéria de recolha e processamento de dados, deve consultar-se a norma DIN relevante (1). Devem efectuar-se duas análises independentes e individuais de cada amostra. Em cada análise, devem determinar-se os parâmetros Mn , Mw , Mw/Mn e Mp. Deve indicar-se explicitamente que os valores determinados constituem valores relativos equivalentes à massa molecular do padrão utilizado. Após a determinação dos volumes de retenção ou tempos de retenção (eventualmente corrigidos por recurso a um padrão interno), representa-se graficamente o logaritmo de Mp (valor correspondente ao máximo do pico relativo ao padrão de calibração) em função de um dos parâmetros referidos. São necessários pelo menos dois pontos de calibração por década de massas moleculares e pelo menos cinco pontos para a curva total, que deve abranger a massa molecular estimada da amostra. A extremidade da curva de calibração correspondente às massas moleculares mais reduzidas é definida pelo n-hexilbenzeno ou outro solvente apolar adequado. As massas moleculares relativas ao número de moles e à massa das espécies são, em geral, obtidas por processamento electrónico dos dados, com base nas fórmulas que se apresentam no ponto 1.2. Caso se recorra ao tratamento manual dos mesmos, pode consultar-se a norma ASTM D 3536-91 (3). Deve apresentar-se a distribuição na forma de quadro ou de gráfico (percentagem da soma ou do diferencial da frequência em função de log M). Na representação gráfica, uma década de massas moleculares deve corresponder a cerca de 4 cm, devendo a altura máxima dos picos ser de cerca de 8 cm. No caso de curvas de distribuição integral, a diferença entre 0 e 100 % deve corresponder a cerca de 10 cm.

2.2. RELATÓRIO O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:

2.2.

2.2.1. Substância em estudo

Dados disponíveis sobre a substância em estudo (identidade, aditivos, impurezas),

descrição do tratamento da amostra, observações, problemas surgidos.

2.2.2. Equipamento

Reservatório de eluente, gás inerte, desgaseificação do eluente, composição do eluente, impurezas,

bomba, amortecedor de pulsações, sistema de injecção,

colunas de separação (fabricante, todas as informações disponíveis sobre as características das colunas, nomeadamente dimensões dos poros, tipo de material utilizado, número, comprimento e ordem de utilização das colunas),

número de pratos teóricos da coluna ou sistema de colunas; eficiência de separação (resolução do sistema),

informações relativas à simetria dos picos,

temperatura da coluna, tipo de controlo da temperatura utilizado,

detector (princípio utilizado, tipo, volume da célula),

medidor de caudal, se utilizado (fabricante, princípio utilizado),

sistema de registo e processamento dos dados (equipamento e suporte lógico).

2.2.3. Calibração do sistema

Descrição pormenorizada do método utilizado para obter a curva de calibração,

informações relativas aos critérios de qualidade aplicáveis ao método (por exemplo, coeficiente de correlação, erro quadrático médio, etc.),

informações relativas às extrapolações, hipóteses e aproximações efectuadas no decurso do processo experimental, bem como da avaliação e processamento dos dados,

devem apresentar-se na forma de quadro os dados utilizados para a obtenção da curva de calibração, incluindo, para cada ponto de calibração, as seguintes informações:

nome da amostra,

fabricante da amostra,

valores de Mp , Mn, Mw, Mw/Mn característicos dos padrões, fornecidos pelo fabricante ou obtidos em determinações posteriores, bem como pormenores sobre o método de determinação utilizado,

volume de injecção e concentração da substância injectada,

valor de Mp utilizado para a calibração,

volume de eluição ou tempo de retenção corrigido correspondentes ao máximo dos picos,

valores de Mp correspondentes ao máximo dos picos,

percentagem de erro dos valores de Mp calculados e do valor de calibração.

2.2.4. Avaliação

Avaliação com base no tempo: métodos utilizados para assegurar a reprodutibilidade requerida (método de correcção, padrão interno, etc.),

informações que indiquem se a avaliação foi efectuada com base no volume de eluição ou no tempo de retenção,

informações sobre os limites de avaliação, caso um pico não seja totalmente analisado,

descrição dos eventuais métodos de nivelamento de dados utilizados,

processos de preparação e tratamento prévio da amostra,

eventual presença de partículas não dissolvidas,

volume de injecção (expresso em μl) e concentração de injecção (expressa em mg/ml),

observações que indiquem efeitos susceptíveis de induzir desvios relativamente às condições cromatográficas ideais,

descrição pormenorizada das alterações aos procedimentos de ensaio,

pormenores relativos às margens de erro,

quaisquer outras informações e observações que possuam importância para a interpretação dos resultados.

3.(1)(2)(3)(4)

REFERÊNCIAS DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.19. TEOR EM POLÍMEROS DE BAIXA MASSA MOLECULAR

A.19.

1. MÉTODO O presente método, que utiliza a cromatografia de permeação em gel, é idêntico ao método OCDE TG 119 (1996). Os respectivos fundamentos e outras informações técnicas são apresentados nas referências.

1.

1.1. INTRODUÇÃO Tendo em conta a diversidade das propriedades dos biopolímeros, torna-se impossível descrever um único método que estabeleça de modo preciso as condições de separação e avaliação dos mesmos, abrangendo todas as possibilidades e especificidades. Muitos sistemas poliméricos complexos, nomeadamente, não são analisáveis por cromatografia de permeação em gel (GPC). Nos casos em que o recurso a esta técnica não se afigure viável, a massa molecular pode ser determinada através de outros métodos (ver apêndice), devendo documentar-se e justificar-se a opção utilizada. O método descrito baseia-se na norma DIN 55672 (1); esta última contém informações pormenorizadas sobre o modo de execução do ensaio e a avaliação dos respectivos resultados. Caso seja necessário alterar determinadas condições do processo experimental, deve apresentar-se a devida justificação. Podem utilizar-se outras normas, na condição de apresentar as respectivas referências. O método descrito utiliza, para fins de calibração, amostras de poliestireno de polidispersibilidade conhecida, podendo ser necessário efectuar alterações de modo a torná-lo adequado a determinados polímeros, nomeadamente polímeros hidrossolúveis e polímeros reticulados de cadeia longa.

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES Por convenção, considera-se baixa uma massa molecular inferior a 1000 dalton. A massa molecular média em função do número de moles, Mn, e a massa molecular média relativa à massa das espécies, Mw, são determinadas por recurso às equações: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi em que: Hi é a intensidade do sinal do detector correspondente ao volume de retenção Vj, contado a partir da linha de base, Mi é a massa molecular da fracção do polímero correspondente ao volume de retenção Vi, e n é o número de pontos obtidos experimentalmente. A amplitude da distribuição de massas moleculares, que constitui uma medida da dispersibilidade do sistema, é dada pelo quociente Mw/Mn.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Uma vez que a cromatografia de permeação em gel constitui um método relativo deve efectuar-se uma calibração. Para tal, podem utilizar-se padrões de poliestireno de cadeia linear, com uma distribuição limitada, e massas moleculares médias (Mn e Mw) e distribuição de massas moleculares conhecidas. A curva de calibração apenas pode ser utilizada na determinação da massa molecular da amostra desconhecida caso as condições de separação da referida amostra e dos padrões tenham sido seleccionadas de modo idêntico. Uma determinada relação entre a massa molecular e o volume de eluição apenas é válida nas condições específicas de cada ensaio. Estas últimas incluem, nomeadamente, a temperatura, o tipo de solvente (ou mistura de solventes), as condições cromatográficas e a coluna ou sistema de colunas de separação. As massas moleculares da amostra determinadas pelo método em causa constituem valores relativos, sendo designadas massas moleculares em equivalentes de poliestireno. Tal facto significa que as massas moleculares podem apresentar desvios relativamente aos valores absolutos em função das diferenças estruturais e químicas entre a amostra e os padrões. Caso se utilizem outros padrões, nomeadamente polietilenoglicol, óxido de polietileno, metracrilato de polimetilo ou ácido poliacrílico, devem justificar-se os motivos.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO A determinação da distribuição das massas moleculares, bem como das massas moleculares médias da amostra (Mn Mw), pode fazer-se por recurso à cromatografia de permeação em gel, que consiste numa variante da cromatografia líquida em que a amostra é separada em função dos volumes hidrodinâmicos dos diversos componentes (2). A separação é efectuada por passagem através de uma coluna cujo enchimento consiste num material poroso, de modo geral um gel orgânico. As moléculas de dimensões mais reduzidas passam através dos poros, sendo as restantes excluídas. A fixação das moléculas de maiores dimensões é, pois, menor, sendo eluídas em primeiro lugar. As moléculas de dimensões médias passam através de alguns poros, sendo eluídas numa fase posterior. Finalmente, as moléculas de dimensões mais reduzidas, que possuem um raio hidrodinâmico inferior ao dos poros do gel, penetram estes últimos, sendo eluídas em último lugar. Em condições ideais, a separação é determinada apenas pelas dimensões das moléculas, embora, na prática, seja difícil evitar algumas interferências devidas à absorção. A não uniformidade do enchimento e a existência de volumes mortos poderão induzir problemas complementares (2). A detecção pode ser efectuada com base no índice de refracção ou por absorção no ultravioleta, originando uma curva de distribuição simples. Todavia, de modo a atribuir valores de massa molecular aos vários pontos da curva, é necessário efectuar uma calibração por recurso a polímeros de massa molecular conhecida e, se possível, de estrutura similar, nomeadamente padrões de poliestireno. A curva resultante da representação gráfica da quantidade, expressa em massa, das diversas espécies eluídas em função do logaritmo da massa molecular deve exibir uma distribuição de Gauss, por vezes distorcida por uma ligeira assimetria na região das massas moleculares mais reduzidas. O teor de espécies de baixa massa molecular é determinado a partir da curva. O respectivo cálculo preciso depende da reprodução do comportamento do polímero por parte das referidas espécies, por unidade de massa.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE A repetibilidade (desvio-padrão relativo) do volume de eluição deve ser superior a 0,3 %. Se um cromatograma elaborado em função do tempo não corresponder aos critérios supra deve assegurar-se a necessária repetibilidade da análise mediante correcção por recurso a um padrão interno (1). As polidispersões dependem da massa molecular de cada padrão. No caso da utilização de padrões de poliestireno, os valores característicos são os seguintes: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp representa a massa molecular do padrão correspondente ao máximo do pico).

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.6.

1.6.1. Preparação das soluções-padrão de poliestireno Os padrões de poliestireno são dissolvidos, com agitação, no eluente escolhido, tendo em conta as recomendações do fabricante. As concentrações dos padrões dependem de vários factores, nomeadamente o volume de injecção, a viscosidade da solução e a sensibilidade do detector. Deve adaptar-se o volume de injecção máximo ao comprimento da coluna, de modo a evitar uma sobrecarga. Os volumes de injecção característicos de separações analíticas por cromatografia de permeação em gel com uma coluna de 30 cm × 7,8 mm situam-se, de modo geral, entre 40 e 100 μl. É possível injectar volumes superiores, que não devem, contudo, exceder 250 μl. Antes de calibrar a coluna, deve determinar-se o rácio adequado volume de injecção/concentração.

1.6.3. Correcções determinadas pela presença de impurezas e aditivos No que respeita ao teor de espécies com M < 1000, torna-se geralmente necessário introduzir uma correcção destinada a ter em conta a presença de componentes específicos não poliméricos (nomeadamente impurezas e aditivos), excepto no caso de o teor determinado ser inferior a 1 %. A referida correcção pode ser efectuada por análise directa da solução de polímero ou da solução obtida após a eluição cromatográfica. Se a solução obtida por eluição cromatográfica for demasiado diluída para permitir a análise, deverá ser concentrada, podendo ser necessário evaporá-la à secura, redissolvendo o resíduo. A concentração deve ser efectuada em condições que assegurem a não concorrência de alterações na solução eluída. O tratamento desta depende do método analítico utilizado para a análise quantitativa.

1.6.4. Equipamento O equipamento de cromatografia de permeação em gel inclui os seguintes componentes: Deve assegurar-se o carácter inerte do sistema cromatográfico em relação aos solventes utilizados (nomeadamente no caso da utilização de capilares de aço com THF).

reservatório de solvente,

desgaseificador (se adequado),

bomba,

amortecedor de pulsações (se adequado),

sistema de injecção,

colunas cromatográficas,

detector,

medidor de caudal (se adequado),

sistema de registo e processamento de dados,

recipiente para resíduos.

1.6.5. Sistema de injecção e de aporte de solvente Introduz-se na coluna um determinado volume de solução de amostra, manualmente ou por intermédio de um amostrador automático, numa zona bem definida. No caso da introdução manual, a compressão do êmbolo ou a retirada da seringa demasiado rápidas poderão determinar alterações na distribuição de massas moleculares obtida. O sistema de aporte de solvente deve ser uniforme, recorrendo, se possível, a um amortecedor de pulsações. O caudal deve ser da ordem de 1 ml/min.

1.6.6. Coluna Em função do tipo de amostra, os polímeros são analisados por recurso a uma única coluna ou a diversas colunas ligadas em série. Encontram-se disponíveis nos circuitos comerciais colunas de materiais porosos com propriedades (por exemplo, dimensões dos poros, limites de exclusão) bem definidas. A selecção do gel a utilizar, bem como do comprimento da coluna, depende das propriedades da amostra (volumes hidrodinâmicos, distribuição das massas moleculares) e das condições específicas de separação, nomeadamente o tipo de solvente utilizado, a temperatura e o caudal (1) (2) (3).

1.6.7. Pratos teóricos Deve caracterizar-se a coluna ou sistema de colunas a utilizar na separação pelo respectivo número de pratos teóricos. No caso da utilização de THF como solvente de eluição, introduzir uma solução de etilbenzeno ou outro soluto apolar adequado numa coluna de comprimento conhecido. O número de pratos teóricos é dado pela equação: N=5,54VeW1/22 ou N=16VeW2 em que: N representa o número de pratos teóricos, Ve representa o volume de eluição correspondente ao máximo do pico, W representa a largura da base do pico, W1/2 representa a largura do pico a meia altura.

1.6.8. Eficiência de separação Além do número de pratos teóricos, que determina a largura das bandas, a eficiência de separação, obtida a partir do declive da curva de calibração, desempenha também um papel importante. A eficiência de separação de uma coluna é dada por: Ve,Mx-Ve,(10Mx)secção transversal da coluna≥6,0cm3cm2 em que Ve, Mx representa o volume de eluição de uma fracção de poliestireno com massa molecular Mx e Ve,(10Mx) representa o volume de eluição de uma fracção de poliestireno com massa molecular dez vezes superior. A resolução do sistema é geralmente definida do seguinte modo: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 em que Ve1, Ve2 representam os volumes de eluição dos dois padrões de poliestireno, correspondentes ao máximo dos picos, W1, W2 representam a largura da base dos picos, e M1, M2 representam as massas moleculares correspondentes aos máximos dos picos, devendo diferir num factor de 10. O valor R do sistema de colunas deve ser superior a 1,7 (4).

1.6.9. Solventes Todos os solventes devem possuir um elevado grau de pureza (no caso do THF, o grau de pureza deve ser de 99,5 %). As dimensões do reservatório de solvente (que pode, se necessário, encontrar-se sob atmosfera inerte) devem ser suficientes para permitir a calibração da coluna e a realização de diversas análises. O solvente deve ser desgaseificado antes da sua introdução na coluna por intermédio da bomba.

1.6.10. Controlo da temperatura A temperatura dos componentes críticos internos (septo de injecção, colunas, detector e tubagens) deve ser constante e adequada ao solvente escolhido.

1.6.11. Detector A função do detector consiste no registo quantitativo da concentração da amostra eluída da coluna. De modo a evitar o alargamento dos picos, o volume da célula de detecção deve ser tão reduzido quanto possível, não devendo exceder 10 μl, excepto no caso dos detectores de difusão de radiações e de viscosidade. O método de detecção mais corrente consiste na refractometria diferencial. Todavia, se as propriedades específicas da amostra ou do solvente de eluição o justificarem, podem utilizar-se outros tipos de detectores, nomeadamente de radiação ultravioleta/visível, infravermelha e detectores de viscosidade.

2. RESULTADOS E SUA APRESENTAÇÃO

2.

2.1. RESULTADOS Para pormenores sobre os critérios de avaliação, bem como no que respeita às exigências em matéria de recolha e processamento de dados, deve consultar-se a norma DIN relevante (1). Devem efectuar-se duas análises independentes e individuais de cada amostra. Em todos os casos, devem efectuar-se também ensaios em branco, em condições idênticas. Deve indicar-se explicitamente que os valores determinados constituem valores relativos expressos em equivalentes da massa molecular do padrão utilizado. Após a determinação dos volumes de retenção ou tempos de retenção (eventualmente corrigidos por recurso a um padrão interno), representa-se graficamente o logaritmo de Mp (valor correspondente ao máximo do pico relativo ao padrão de calibração) em função de um dos parâmetros referidos. São necessários pelo menos dois pontos de calibração por década de massas moleculares e pelo menos cinco pontos para a curva total, que deve abranger a massa molecular estimada da amostra. A extremidade da curva de calibração correspondente às massas moleculares mais reduzidas é definida pelo n-hexilbenzeno ou outro solvente apoiar adequado. A parte da curva correspondente a massas moleculares inferiores a 1000 determina-se e se necessário corrige-se para aditivos e impurezas. Caso se recorra ao tratamento manual dos mesmos, pode consultar-se a norma ASTM D 3536-91 (3). Caso fique retido na coluna um polímero insolúvel, é provável que a sua massa molecular seja superior à massa molecular da fracção solúvel, pelo que a não tomada em conta do mesmo no cálculo do teor de espécies de baixa massa molecular determinará uma sobrestimativa deste último. Apresentam-se em apêndice directrizes para a correcção do teor de espécies de baixa massa molecular de polímeros insolúveis. Deve apresentar-se a distribuição na forma de quadro ou de gráfico (percentagem da soma ou do diferencial da frequência em função de log M). Na representação gráfica, uma década de massas moleculares deve corresponder a cerca de 4 cm, devendo a altura máxima dos picos ser de cerca de 8 cm. No caso de curvas de distribuição integral, a diferença entre 0 e 100 % deve corresponder a cerca de 10 cm.

2.2. RELATÓRIO O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:

2.2.

2.2.1. Substância em estudo

Dados disponíveis sobre a substância em estudo (identidade, aditivos, impurezas),

descrição do tratamento da amostra, observações, problemas.

2.2.2. Equipamento

Reservatório de eluente, gás inerte, desgaseificação do eluente, composição do eluente, impurezas,

bomba, amortecedor de pulsações, sistema de injecção,

número de pratos teóricos da coluna ou sistema de colunas; eficiência de separação (resolução do sistema),

informações relativas à simetria dos picos,

temperatura da coluna, tipo de controlo da temperatura utilizado,

detector (princípio utilizado, tipo, volume da célula),

medidor de caudal, se utilizado (fabricante, princípio utilizado),

sistema de registo e processamento dos dados (equipamento e suporte lógico).

2.2.3. Calibração do sistema

Descrição pormenorizada do método utilizado para obter a curva de calibração,

informações relativas aos critérios de qualidade aplicáveis ao método (por exemplo, coeficiente de correlação, erro quadrático médio, etc.),

informações relativas às extrapolações, hipóteses e aproximações efectuadas no decurso do processo experimental, bem como da avaliação e processamento dos dados,

devem apresentar-se na forma de quadro os dados utilizados para a obtenção da curva de calibração, incluindo, para cada ponto de calibração, as seguintes informações:

nome da amostra,

fabricante da amostra,

valores de Mp, Mn, Mw, Mw/Mn característicos dos padrões, fornecidos pelo fabricante ou obtidos em determinações posteriores, bem como pormenores sobre o método de determinação utilizado,

volume de injecção e concentração da substância injectada,

valor de Mp utilizado para a calibração,

volume de eluição ou tempo de retenção corrigido correspondentes ao máximo dos picos,

valores de Mp correspondentes ao máximo dos picos,

percentagem de erro dos valores de Mp calculados e do valor de calibração.

2.2.4. Informações sobre o teor em polímeros de baixa massa molecular

Descrição dos métodos de análise e dos procedimentos utilizados,

informações relativas ao teor de espécies e baixa massa molecular da amostra, expresso em percentagem ponderal,

informações relativas ao teor de impurezas, aditivos e de outras espécies não poliméricas da amostra, expresso em percentagem ponderal.

2.2.5. Avaliação

Avaliação com base no tempo: métodos utilizados para assegurar a reprodutibilidade requerida (método de correcção, padrão interno, etc.),

informações que indiquem se a avaliação foi efectuada com base no volume de eluição ou no tempo de retenção,

informações sobre os limites de avaliação, caso um pico não seja totalmente analisado,

descrição dos eventuais métodos de nivelamento de dados utilizados,

processos de preparação e tratamento prévio da amostra,

eventual presença de partículas não dissolvidas,

volume de injecção (expresso em μl) e concentração de injecção (expressa em mg/ml),

observações que indiquem efeitos susceptíveis de induzir desvios relativamente às condições cromatográficas ideais,

descrição pormenorizada das alterações aos procedimentos de ensaio,

pormenores relativos às margens de erro,

quaisquer outras informações e observações que possuam importância para a interpretação dos resultados.

3.(1)(2)(3)(4)

REFERÊNCIAS DIN 55672 (1995). Geldpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J.Wiley and Sons. ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.20. COMPORTAMENTO DOS POLÍMEROS DA DISSOLUÇÃO/EXTRACÇÃO AQUOSA

A.20.

1. MÉTODO O presente método é idêntico à versão revista do método OCDE TG 120 (1997). As informações técnicas específicas são apresentadas na referência (1).

1.

1.1. INTRODUÇÃO No caso de determinados polímeros, nomeadamente polímeros de emulsão, pode ser necessário efectuar trabalhos preliminares antes da aplicação do método descrito infra. O método não é aplicável a polímeros líquidos e polímeros que reajam com a água nas condições de ensaio. Nos casos em que a aplicação do método não se afigure viável, pode investigar-se o comportamento dos polímeros na dissolução/extracção aquosa por recurso a outros métodos, devendo apresentar-se a justificação de tal facto, bem como a descrição pormenorizada dos métodos em causa.

1.2. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Não aplicável.

1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO O comportamento dos polímeros na dissolução/extracção aquosa é determinado através do método do recipiente de vidro (ver A.6 — Solubilidade em água — método do recipiente de vidro) alterado do modo que se descreve de seguida.

1.4. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Não aplicável.

1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.5.

1.5.1. Equipamento O equipamento necessário à aplicação do método é o seguinte:

dispositivo de trituração (por exemplo, triturador que produza partículas de dimensões conhecidas),

dispositivo de agitação com possibilidade de controlo da temperatura,

sistema de filtros de membrana,

equipamento analítico adequado,

crivos normalizados.

1.5.2. Preparação da amostra Por recurso a crivos adequados, reduz-se uma amostra representativa a uma granulometria compreendida entre 0,125 e 0,25 mm. De modo a assegurar a estabilidade da amostra ou do processo de trituração, pode ser necessário utilizar um sistema de refrigeração. Os materiais com consistência idêntica à da borracha podem ser triturados à temperatura do azoto líquido (1). Caso não se obtenham partículas com a granulometria desejada, deve procurar reduzir-se tanto quanto possível as dimensões das mesmas, referindo tal facto no relatório. Este último deve também indicar o modo de armazenagem da amostra triturada, antes da sua utilização no ensaio.

1.5.3. Procedimento Pesam-se três porções de 10 g da substância em estudo, que se colocam em três recipientes munidos de rolhas de vidro, a cada um dos quais se adicionam 1000 ml de água. Caso a utilização de 10 g de amostra se revele impraticável, deve utilizar-se a quantidade máxima possível, ajustando o volume de água proporcionalmente à mesma. Os recipientes são hermeticamente fechados e agitados a 20 oC. Deve utilizar-se um dispositivo de agitação ou dissolução que funcione a temperatura constante. Após 24 horas, centrifuga-se ou filtra-se o conteúdo de cada recipiente, determinando-se a concentração do polímero na fase aquosa límpida por recurso a um método analítico adequado. Caso não se encontrem disponíveis métodos analíticos adequados aplicáveis à fase aquosa, pode estimar-se a solubilidade ou extractividade totais com base na massa a seco do resíduo de filtração ou do precipitado obtido por centrifugação. Em geral, é necessário efectuar uma distinção quantitativa entre as impurezas e os aditivos, por um lado, e as espécies de baixa massa molecular, por outro. No caso da determinação gravimétrica, deve também efectuar-se um ensaio em branco, de modo a avaliar a contribuição de eventuais resíduos decorrentes do processo experimental. O comportamento dos polímeros na dissolução/extracção aquosa a 37 oC, a pH 2 e pH 9 determina-se como descrito para a experiência a 20 oC. O pH das soluções é corrigido através da adição quer de tampões quer de ácidos ou bases adequados, nomeadamente ácido clorídrico, ácido acético, hodróxido de sódio ou de potássio de qualidade analítica e amónia. Em função do método analítico utilizado, devem efectuar-se um ou dois ensaios. Sempre que seja possível utilizar métodos suficientemente específicos que permitam a determinação directa do componente polimérico na fase aquosa, pode efectuar-se um único ensaio, tal como descrito supra. Todavia, caso tal não seja possível e seja necessário determinar o comportamento dos polímeros na dissolução/extracção aquosa do polímero por um processo indirecto, nomeadamente através da determinação do teor de carbono orgânico total do extracto aquoso, deve efectuar-se um ensaio complementar em triplicado, utilizando amostras de polímeros dez vezes inferiores e volumes de água idênticos aos utilizados no primeiro ensaio.

1.5.4. Análise

1.5.4.

1.5.4.1. Ensaio efectuado com uma única granulometria Alguns métodos permitem a análise directa dos componentes poliméricos na fase aquosa. Todavia, como alternativa, pode proceder-se à análise indirecta dos componentes poliméricos dissolvidos/extraídos mediante a determinação do teor total de componentes solúveis, aplicando uma correcção destinada a ter em conta a presença de componentes específicos não poliméricos. A determinação das espécies poliméricas totais na fase aquosa pode ser efectuada por recurso a um método suficientemente sensível, como por exemplo: A referida determinação pode também ser efectuada por evaporação à secura, sob vácuo, do extracto aquoso, seguida de análise do resíduo por espectroscopia de infravermelhos, ultravioleta, etc., ou espectrometria de absorção atómica de plasma indutivo. Caso a análise da fase aquosa não seja viável, esta última deve ser extraída com um solvente orgânico não miscível em água, nomeadamente um hidrocarboneto clorado. Procede-se em seguida à evaporação do solvente e determinação do teor de polímero de acordo com o método descrito supra. Na determinação do grau de dissolução/extracção do polímero devem subtrair-se quaisquer componentes do resíduo identificados como impurezas ou aditivos. Caso se encontrem presentes quantidades relativamente elevadas das referidas matérias, pode ser necessário analisar o resíduo por HPLC ou cromatografia em fase gasosa, com o objectivo de distinguir as impurezas do monómero e das espécies presentes derivadas do mesmo, de modo a determinar o respectivo teor. Em alguns casos, poderá bastar a evaporação do solvente orgânico à secura e subsequente pesagem do resíduo seco.

determinação do carbono orgânico total mediante digestão com persulfato ou dicromato, de modo a obter CO2, que é seguidamente doseado por espectroscopia de infravermelhos ou análise química,

espectrometria de absorção atómica ou, no caso de polímeros que contenham silício ou metais, de plasma indutivo,

espectroscopia de absorção ou espectrofluorimetria no ultravioleta, no caso de polímeros arílicos,

cromatografia em fase líquida acoplada com espectrometria de massa, no caso de amostras de baixa massa molecular.

1.5.4.2. Ensaio efectuado com duas granulometrias Determina-se o teor de carbono orgânico total dos extractos aquosos. Efectua-se uma determinação gravimétrica com a porção não dissolvida e não extraída da amostra. Se, após a centrifugação ou filtragem do conteúdo de um determinado recipiente, permanecerem resíduos poliméricos nas respectivas paredes, deve lavar-se o mesmo com o filtrado até que não se observem quaisquer resíduos, procedendo então a uma nova centrifugação e filtragem. Os resíduos que permaneçam no filtro ou no tubo de centrifugação são secos a 40 oC, sob vácuo, e pesados.

2. RESULTADOS

2.

2.1. ENSAIO EFECTUADO COM UMA ÚNICA GRANULOMETRIA Devem apresentar-se os resultados relativos a cada recipiente, bem como os valores médios, expressos em unidades de massa por volume de solução (de modo geral, mg/l) ou de massa por massa de amostra de polímero (de modo geral, mg/g). Deve também fornecer-se a perda de massa da amostra, expressa no quociente entre a massa de soluto e a massa inicial da amostra, bem como os desvios-padrão relativos. Devem apresentar-se dados relativos à totalidade da substância (polímero + aditivos essenciais, etc.) e apenas ao polímero (após subtracção do teor de aditivos).

2.2. ENSAIO EFECTUADO COM DUAS GRANULOMETRIAS Os teores de carbono orgânico total dos diversos extractos aquosos (ensaios em triplicado), bem como o valor médio relativo a cada ensaio, devem ser expressos em unidades de massa por volume de solução (de modo geral, mgC/l) ou de massa por massa de amostra de polímero (de modo geral, mgC/g). O facto de não se observarem diferenças entre os resultados relativos aos rácios superior e inferior amostra/água poderá indicar a extracção efectiva de todos os componentes extractáveis. Neste caso, não é geralmente necessário proceder à análise directa. Devem apresentar-se as massas dos diversos resíduos, expressas em percentagem das massas iniciais das amostras, calculando as médias relativas a cada ensaio. A diferença entre 100 % e as percentagens obtidas representa as percentagens de matérias solúveis e extractáveis nas amostras originais.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:

3.1.

3.1.1. Substância em estudo

Informações disponíveis sobre a substância em estudo (identidade, aditivos, impurezas, teor de espécies de baixa massa molecular).

3.1.2. Condições experimentais

Descrição dos procedimentos utilizados e das condições experimentais,

descrição dos métodos analíticos e de detecção utilizados.

3.1.3. Resultados

Solubilidade ou extractividade, expressas em mg/ml; valores individuais e médios obtidos nos ensaios de extracção das diversas soluções, discriminando o teor de polímero e de impurezas, aditivos, etc.,

solubilidade ou extractividade do polímero, expressas em mg/ml,

teor de carbono orgânico total dos extractos aquosos, massa do soluto e percentagens calculadas, se for caso disso,

pH de cada amostra,

resultados dos ensaios em branco,

sempre que necessário, referências à instabilidade química da substância em estudo no decurso dos processos de ensaio e analítico,

quaisquer informações que possuam importância para a interpretação dos resultados.

4.(1) REFERÊNCIAS DIN 53733 (1976). Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

A.21. PROPRIEDADES DE COMBURÊNCIA (LÍQUIDOS)

A.21.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO O presente método de ensaio destina-se à determinação do potencial de uma substância líquida de aumentar a velocidade ou intensidade de combustão de uma substância combustível, ou de formar misturas homogéneas com uma substância combustível que possam sofrer ignição espontânea. O método baseia-se no ensaio da ONU para líquidos comburentes (1l), ao qual é equivalente. Todavia, uma vez que o método A.21 se destina essencialmente a satisfazer as exigências da Directiva 67/548/CEE, apenas é necessária a comparação com uma substância de referência. Caso se preveja que os resultados do ensaio sejam utilizados para outros fins, pode ser necessário efectuar ensaios complementares e comparações com outras substâncias de referência. Não é necessário realizar o ensaio se uma análise simples da fórmula estrutural da substância permitir estabelecer com um grau de confiança elevado que a mesma não reage exotermicamente com matérias combustíveis. Antes de realizar o ensaio, é conveniente obter informações sobre eventuais propriedades explosivas da substância. O método não é aplicável a sólidos, gases e outras substâncias explosivas ou altamente inflamáveis, nem a peróxidos orgânicos. Não é necessário realizar o ensaio se existirem dados referentes à substância em estudo obtidos por aplicação do ensaio da ONU para líquidos comburentes (1).

1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES O tempo médio necessário para o aumento da pressão é a média dos tempos determinados necessários para que a pressão da mistura em estudo aumente de 690 kPa para 2070 kPa acima da pressão atmosférica.

1.3. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA Utiliza-se como substância de referência uma solução aquosa a 65 %, em massa, de ácido nítrico de qualidade analítica. Caso o experimentador preveja que os resultados do ensaio sejam utilizados para outros fins, pode revelar-se adequado efectuar ensaios com outras substâncias de referência.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO O líquido em estudo é misturado, na proporção 1:1, em massa, com fibras de celulose, e introduzido num recipiente pressurizado. Se, durante o processo de mistura ou enchimento, ocorrer ignição espontânea, não é necessário prosseguir o ensaio. Caso não ocorra ignição espontânea, realiza-se o ensaio na sua totalidade. A mistura é aquecida no recipiente pressurizado, determinando-se o tempo médio necessário para que a pressão aumente de 690 kPa para 2070 kPa acima da pressão atmosférica. Este tempo é comparado com o tempo médio necessário para o aumento da pressão da mistura na proporção de 1:1 da(s) substância(s) de referência com celulose.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Os resultados de uma série de cinco ensaios com uma determinada substância não devem diferir em mais de 30 % da média aritmética. Devem desprezar-se os resultados que mostrem uma divergência superior a 30 % relativamente à média, alterando-se os procedimentos de mistura e enchimento, após o que deve repetir-se o ensaio.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO

1.6.

1.6.1. Preparação

1.6.1.

1.6.1.1. Substância combustível Utilizam-se como matéria combustível fibras de celulose secas, de comprimento compreendido entre 50 e 250 μm e diâmetro médio 25 μm. As fibras são secas a massa constante, numa placa de espessura não superior a 25 mm, a 105 oC, durante 4 horas, e mantidas num exsicador com exsicante, até ao arrefecimento e utilização. O teor de humidade da celulose seca deve ser inferior a 0,5 % em relação à massa seca. Para tal, se necessário, deve prolongar-se o tempo de secagem. Deve utilizar-se o mesmo lote de celulose em todo o ensaio.

1.6.1.2. Equipamento

1.6.1.2.

1.6.1.2.1. Dispositivo pressurizado Deve utilizar-se um dispositivo constituído por um recipiente pressurizado de aço de forma cilíndrica, com 89 mm de comprimento e 60 mm de diâmetro externo (ver figura 1). São maquinadas duas superfícies planas em lados opostos, reduzindo a secção local do recipiente para 50 mm, de modo a facilitar a imobilização durante a colocação dos obturadores de ignição e de ventilação. O recipiente, com um diâmetro interno de 20 mm, é rebaixado internamente em ambas as extremidades até uma profundidade de 19 mm e roscado para tubos normalizados BSP (British Standard Pipe) de 1", ou o seu equivalente no sistema métrico. É enroscada à superfície curva do recipiente pressurizado uma tomada de pressão, a 35 mm de uma das extremidades, perpendicularmente às superfícies planas maquinadas. O encaixe, roscado para receber a rosca da tomada de pressão (tubo normalizado BSP de 1/2", ou o seu equivalente no sistema métrico), é realizado a uma profundidade de 12 mm. Se necessário, é instalada uma junta de material inerte, de modo a assegurar estanquidade aos gases. A tomada de pressão tem um comprimento exterior de 55 mm relativamente ao corpo do dispositivo e um furo axial com 6 mm de diâmetro. A extremidade da tomada de pressão é rebaixada e roscada de forma a receber um transdutor de pressão com diafragma. Pode utilizar-se qualquer dispositivo de medição de pressão que não seja atacado pelos gases de combustão ou produtos de decomposição e seja adequado a aumentos de pressão de 690-2070 kPa em não mais de 5 minutos. A extremidade do recipiente pressurizado mais distante da tomada de pressão é tapada com um obturador de ignição e munida de dois eléctrodos, um dos quais isolado do corpo do obturador e o outro ligado à massa. A extremidade oposta do recipiente é fechada por um disco de ruptura adequado a uma pressão de ruptura de 2200 kPa, mantido em posição por um obturador de retenção com um furo axial de 20 mm de diâmetro. Se necessário, é instalada uma junta de material inerte, de modo a assegurar estanquidade aos gases. Durante a utilização, o dispositivo é mantido na posição correcta por meio de um suporte (figura 2), geralmente constituído por uma placa de aço macio com 235 mm × 184 mm × 6 mm e um tubo de 185 mm de comprimento e secção quadrada de 70 mm × 70 mm × 4 mm. São cortados dois lados opostos na extremidade do tubo, de modo a obter uma estrutura constituída por uma secção de tubo intacto com 86 mm de comprimento prolongada por dois lados até à base. As extremidades destes lados são cortadas de modo a formar um ângulo de 60o com a horizontal e soldadas à placa de aço macio que constitui a base. É maquinada num dos lados da extremidade superior da base uma fenda com 22 mm de largura e 46 mm de profundidade, de modo que, ao colocar o dispositivo pressurizado com o obturador de ignição para baixo, a tomada de pressão encaixe na fenda. É soldada à face interna do lado inferior do tubo um espaçador de aço com 30 mm de largura e 6 mm de espessura. O dispositivo pressurizado é mantido firmemente em posição por dois parafusos de orelhas de 7 mm, colocados no lado oposto, e apoiado inferiormente por dois elementos prismáticos de aço de 12 mm de largura e 6 mm de espessura, soldados às peças laterais na base da porção intacta do tubo.

1.6.1.2.2. Sistema de ignição O sistema de ignição é constituído por um cabo de níquel-crómio de 25 cm de comprimento e 0,6 mm de secção, com uma resistência de 3,85 ohm/m. O cabo é enrolado em forma de bobina por recurso a uma haste de 5 mm de secção, e ligado aos eléctrodos do obturador de ignição. A bobina deve apresentar uma das configurações que se ilustram na figura 3. A distância entre a extremidade inferior do recipiente e a superfície interior da bobina de ignição deve ser de 20 mm. Caso os eléctrodos não sejam ajustáveis, as extremidades do cabo de ignição entre a bobina e a base do recipiente devem ser isoladas por um elemento de cerâmica. O cabo é aquecido por acção de uma corrente contínua de intensidade mínima 10 A.

1.6.2. Realização do ensaio O dispositivo completo, incluindo o transdutor de pressão e o sistema de aquecimento, mas sem o disco de ruptura na respectiva posição, é colocado com o obturador de ignição para baixo. Com o auxílio de um agitador de vidro, misturam-se num recipiente de vidro 2,5 g do líquido em estudo com 2,5 g de celulose seca. Por motivos de segurança, a mistura deve ser executada com um dispositivo de segurança interposto entre o operador e a mistura. Em caso de ignição durante os processos de mistura ou o enchimento, não é necessário prosseguir o ensaio. A mistura é vertida em pequenas porções no recipiente pressurizado, agitando ligeiramente, devendo assegurar-se a acumulação em torno da bobina de ignição, de forma a estabelecer um bom contacto. A bobina não deve ser distorcida durante o processo de enchimento, facto que poderia determinar resultados erróneos. O disco de ruptura é colocado na respectiva posição e o obturador de retenção enroscado firmemente. O recipiente carregado, com o disco de ruptura no topo, é transferido para o suporte, que deve estar colocado numa chaminé ou câmara com protecção. A fonte de alimentação é ligada aos terminais externos do obturador de ignição, aplicando-se uma corrente de 10 A. O tempo decorrido entre o início da mistura e o estabelecimento da corrente eléctrica não deve exceder 10 minutos. O sinal produzido pelo transdutor de pressão é transmitido a um sistema adequado que permita a detecção e o registo contínuos da alteração da pressão (por exemplo, um detector em contínuo acoplado a um registador). A mistura é aquecida até à ruptura do disco de ruptura ou até terem decorrido, pelo menos, 60 segundos. Caso o disco não sofra ruptura, deve deixar-se arrefecer a mistura antes de desmontar cuidadosamente o dispositivo, tomando as precauções inerentes a uma eventual pressurização. Realizam-se cinco ensaios com a substância em estudo e a(s) substância(s) de referência. Regista-se o tempo necessário para a pressão aumentar de 690 kPa para 2070 kPa acima da pressão atmosférica, calculando-se então o tempo médio necessário para o aumento da pressão. Algumas substâncias produzem um aumento de pressão excessivo ou demasiado reduzido, determinado por reacções químicas independentes das propriedades de comburência das substâncias. Nesses casos, pode ser necessário repetir o ensaio, utilizando uma substância inerte, como, por exemplo, terra de diatomáceas (kieselguhr), em vez da celulose, de modo a esclarecer a natureza da reacção.

2. DADOS Tempos necessários para o aumento da pressão da(s) substância(s) em estudo e de referência. Tempos necessários para o aumento da pressão no caso dos ensaios com substâncias inertes, se for caso disso.

2. 2.1. Quadro 1 Exemplos de resultados

TRATAMENTO DOS RESULTADOS Calculam-se os tempos médios necessários para o aumento da pressão da(s) substância(s) em estudo e de referência. Calcula-se o tempo médio necessário para o aumento da pressão no ensaio com a substância inerte, se realizado. O quadro 1 fornece alguns exemplos de resultados: Substância Tempo médio necessário para o aumento da pressão (mistura com celulose na proporção 1:1) (ms) Solução aquosa saturada de dicromato de amónio 20800 Solução aquosa saturada de nitrato de cálcio 6700 Solução aquosa saturada de nitrato férrico 4133 Solução aquosa saturada de perclorato de lítio 1686 Solução aquosa saturada de perclorato de magnésio 777 Solução aquosa saturada de nitrato de níquel 6250 Ácido nítrico a 65 % 4767 Ácido perclórico a 50 % 121 Ácido perclórico a 55 % 59 Solução aquosa a 30 % de nitrato de potássio 26690 Solução aquosa saturada de nitrato de prata Solução aquosa a 40 % de clorato de sódio 2555 Solução aquosa a 45 % de nitrato de sódio 4133 Substância inerte Água: celulose

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DE ENSAIO O relatório de ensaio deve incluir as seguintes informações:

identidade, composição, grau de pureza, etc., da substância em estudo,

concentração da substância em estudo,

procedimento utilizado para a secagem da celulose,

teor de humidade da celulose utilizada,

resultados das determinações,

resultados dos ensaios com substâncias inertes, se for caso disso,

tempos médios necessários para o aumento da pressão determinados,

quaisquer eventuais alterações do método e respectiva motivação,

quaisquer informações complementares ou observações úteis para a interpretação dos resultados.

3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Os resultados do ensaio são interpretados com base nos seguintes critérios: Uma substância líquida é considerada comburente se: De modo a evitar falsos resultados positivos, podem ser também tidos em conta na interpretação dos resultados, se tal for considerado necessário, os resultados obtidos num ensaio da substância em estudo com uma substância inerte.

3.2. a)

Eventual ignição espontânea da mistura da substância em estudo com celulose; e

Comparação do tempo médio necessário para o aumento da pressão de 690 kPa para 2070 kPa com idêntico parâmetro da(s) substância(s) de referência.

Uma mistura da substância com celulose na proporção 1:1, em massa, exibir ignição espontânea; ou

Uma mistura na proporção 1:1, em massa, exibir um tempo médio necessário para o aumento da pressão inferior ou igual ao tempo médio necessário para o aumento da pressão de uma mistura na proporção 1:1, em massa, de solução aquosa de ácido nítrico a 65 % (em massa) e celulose.

4.(1) REFERÊNCIAS Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria, 3.o edição revista. Publicação da ONU No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, p. 342. Test 0.2: Test for oxidizing liquids. Nota: Cada uma destas duas configurações pode ser utilizada

4.(1)

Figura 1 Dispositivo pressurizado

(A) Corpo do recipiente pressurizado (B) Obturador de suporte do disco de ruptura (C) Obturador de ignição (D) Junta de chumbo macio (E) Disco de ruptura (F) Tomada de pressão (G) Cabeça do transdutor de pressão (H) Junta (J) Eléctrodo isolado (K) Eléctrodo ligado à massa (L) Isolador (M) Cone de aço (N) Ranhura de distorção da junta

Figura 2 Suporte do dispositivo

Figura 3 Sistema de ignição

(A) Bobina de ignição (B) Isolador (C) Eléctrodos (D) Obturador de ignição

Apêndice Para pormenores técnicos adicionais é possível consultar, por exemplo, as normas seguintes:

1. Métodos capilares

1.

1.1. Dispositivos de medição da temperatura de fusão com banho líquido ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products

1.2. Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão com bloco metálico DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determination of melting point

2. Fases quentes

2.

2.1. Barra quente de Kofler ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric power coatings

2.2. Microscópio de fusão DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen.

2.3. Método do menisco (poliamidas) ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du point de fusion. Méthode du ménisque

3. Métodos para a determinação da temperatura de congelação BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax (cooling curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Análise térmica

4.

4.1. Análise térmica diferencial ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Calorimetria de exploração diferencial ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Determinação do ponto de fluidez NBN 52014 Échantillonnage et analyse des produits du pétrole: point de trouble et point d'écoulement limite — Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils — Determination of pour point

Apêndice Para pormenores técnicos adicionais é possível consultar, por exemplo, as normas seguintes:

1.1.1 Ebuliómetro Dispositivos de medição da temperatura de fusão com banho líquido ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Processo de destilação (intervalo de ebulição) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de 1'intervalle de distillation

3. Análise térmica diferencial e calorimetria de exploração diferencial ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe

Apêndice Para obtenção de pormenores técnicos adicionais é possível consultar, por exemplo, as normas seguintes:

1. Métodos de flutuação

1.

1.1. Hidrómetro DIN 12790, ISO 387 Hidrómetro; instruções gerais DIN 12791 Parte I: Hidrómetros de densidade; sua construção, ajustamento e utilização Parte II: Hidrómetros de densidade; dimensões normalizadas, designação Parte III: Utilização e teste ISO 649-2 Objectos de vidro laboratoriais: hidrómetros de densidade para fins gerais NF T 20-050 Produtos químicos para utilização industrial — Determinação da densidade de líquidos — Método areométrico DIN 12793 Objectos de vidro laboratoriais: hidrómetros de resolução variável

1.2. Balança hidrostática

1.2. Para as substâncias sólidas

ISO 1183 Método A: Métodos para a determinação da densidade e para a determinação da densidade relativa de plásticos excluindo os plásticos celulares NF T 20-049 Produtos químicos para utilização industrial — Determinação da densidade de sólidos que não sejam pós e de produtos celulares — Método da balança hidrostática ASTM-D-792 Determinação do peso específico e da densidade de plásticos por deslocamento DIN 53479 Testes de plásticos e de elastómeros; determinação da densidade

Para substâncias líquidas

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testes de óleos minerais e de materiais afins; determinação da densidade ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 e ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Densidade, peso específico ou densidade relativa IPA (indicador de posição atmosférico) do petróleo bruto e de produtos derivados de petróleo líquido pelo método do hidrómetro BS 4714 Densidade, peso específico ou densidade IPA (indicador de posição atmosférico) do petróleo bruto e de produtos derivados de petróleo líquido pelo método do hidrómetro

1.3. Método do corpo imerso DIN 53217 Testes de tintas, de vernizes e de materiais de revestimentos análogos; determinação da densidade; método do corpo imerso

2. Métodos picnométricos

2.

2.1. Para substâncias líquidas ISO 3507 Picnómetros ISO 758 Produtos químicos líquidos; determinação da densidade à temperatura de 20 oC DIN 12797 Picnómetro de Gay-Lussac (para líquidos não voláteis que não sejam muito viscosos) DIN 12798 Picnómetro de Lipkin (para líquidos com uma viscosidade cinemática inferior a 100,10-6 m2 s-1 à temperatura de 15 oC) DIN 12800 Picnómetro de Sprengel (para líquidos conforme a norma DIN 12798) DIN 12801 Picnómetro de Reischauer (para líquidos com uma viscosidade cinemática inferior a 100,10-6m2 s-1 à temperatura de 20 oC, aplicável em particular também aos hidrocarbonetos e às soluções aquosas e bem assim aos líquidos com uma pressão de vapor superior, aproximadamente 1 bar à temperatura de 90 oC) DIN 12806 Picnómetro de Hubbard (para líquidos viscosos de todos os tipos e que não possuam uma pressão de vapor demasiadamente elevada, aplicável particularmente também para tintas, vernizes e betumes) DIN 12807 Picnómetro de Bingham (para líquidos, conforme a norma DIN 12801) DIN 12808 Picnómetro de Jaulmes (em particular para a mistura de etanol e água) DIN 12809 Picnómetro com termómetro incorporado e tubo lateral capilar (para líquidos que não sejam muito viscosos) DIN 53217 Testes de tintas, de vernizes e de produtos análogos; determinação da densidade com picnómetro DIN 51757 Ponto 7: Testes de óleos minerais e de materiais afins; determinação da densidade ASTM D 297 Secção 15: Produtos de borracha — análise química ASTM D 2111 Método C: Compostos orgânicos halogenados BS 4699 Método para a determinação do peso específico e da densidade de produtos derivados do petróleo (método do picnómetro bicapilar graduado) BS 5903 Método para a determinação da densidade relativa e da densidade de produtos derivados do petróleo recorrendo ao método do picnómetro de capilar fechado NF T 20-053 Produtos químicos para utilização industrial — Determinação da densidade de sólidos convertidos em pó e de líquidos — Método picnométrico

2.2. Para substâncias sólidas ISO 1183 Método B: Método para a determinação da densidade e da densidade relativa dos plásticos com exclusão dos plásticos celulares NF T 20-053 Produtos químicos para utilização industrial — Determinação da densidade de sólidos convertidos em pó e de líquidos — Método picnométrico DIN 19683 Determinação da densidade de solos

3. Picnómetro por comparação ao ar DIN 55990 Parte III: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung

Apêndice 1 Método por estimativa

INTRODUÇÃO

Os valores calculados da pressão de vapor podem ser utilizados:

para se decidir qual dos métodos experimentais é o mais apropriado,

para proporcionar uma estimativa ou um valor limite nos casos em que o método experimental não pode ser aplicado por razões técnicas (incluindo os casos em que a pressão de vapor é muito baixa),

para auxiliar a identificar os casos em que se justifica a omissão da medição experimental devido ao facto de a pressão de vapor ser eventualmente inferior a 10-5 Pa à temperatura ambiente.

MÉTODO POR ESTIMATIVA

Pode avaliar-se a pressão de vapor de líquidos e de sólidos recorrendo à correlação de Watson modificada (a). O único dado experimental necessário é o ponto de ebulição normal. Este método é aplicável para um intervalo de pressões compreendido entre 105 e 10-5 Pa. A informação pormenorizada sobre o método encontra-se descrita no Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b).

PROCEDIMENTO DE CÁLCULO

De acordo com (b) calcula-se a pressão de vapor do modo seguinte: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb em que: T = temperatura de trabalho Tb = ponto de ebulição normal Pvp = pressão de vapor à temperatura T Δ Hvb = calor de vaporização Δ Zb = factor de compressibilidade (estimado a 0,97) m = factor empírico dependente do estado físico para o valor da temperatura de trabalho Além disso temos: Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb em que KF representa um factor empírico que leva em consideração a polaridade da substância. Na publicação de referência (b) encontram-se enumerados os factores KF para diversos tipos de compostos. É frequente encontrar dados disponíveis de valores de pontos de ebulição para valores de pressão reduzida. Num caso desses, de acordo com (b), calcula-se a pressão de vapor do modo seguinte: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 em que T1 representa o ponto de ebulição para o valor P1 da pressão reduzida.

RELATÓRIO

No caso de se utilizar o método por estimativa, o relatório deverá conter documentação exaustiva sobre os cálculos.

BIBLIOGRAFIA

(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem., 1943, vol. 35, p. 398.

(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

Apêndice 2

Figura 1 Aparelho para a determinação da curva de pressão de vapor de acordo com o método dinâmico

1 = Thermocouple 2 = Vacuum buffer volume 3 = Pressure gauge 4 = Vacuum 5 = Measuring point 6 = Heating element circa 150 W

Figura 2a Aparelho para a determinação da curva de pressão de vapor de acordo com o método estático (utilizando um manómetro de tubo em U)

1. Substância a testar 2. Fase de vapor 3. Válvula para alto vácuo 4. Tubo em U (manómetro auxiliar) 5. Manómetro 6. Banho regulador da temperatura 7. Dispositivo de medição de temperatura 8. Bomba de vácuo 9. Ventilação

Figura 2b Aparelho para a determinação da curva da pressão de vapor de acordo com o método estático (utilizando um indicador de pressão)

1. Substância a testar 2. Fase de vapor 3. Válvula de alto vácuo 4. Manómetro 5. Indicador de pressão 6. Banho regulador da temperatura 7. Díspositivo de medição da temperatura

Figura 3 Isoteniscópio (ver referência 7)

1. Ligação ao sistema de medição e de controlo da pressão 2. Tubo com diâmetro exterior (OD) de 8 mm 3. Azoto seco no sistema de pressão 4. Vapor da amostra 5. Ponta pequena 6. Amostra de líquido

Figura 4 Aparelho para a determinação da curva da pressão de vapor de acordo com o método da balança de pressão de vapor

1. Substância a testar 2. Fase de vapor com corrente de vapor 3. Forno de evaporação com entrada giratória 3a. Tampa do forno com abertura 4. Aquecimento do forno (refrigeração) 5. Medição da temperatura da amostra 6. Caixa de refrigeração 7. Blindagem (protecção) 8. Barra de refrigeração ligada à caixa de refrigeração 9. Campânula da balança 10. Microbalança 11. Ligação ao registador 12. Ligação à bomba de alto vácuo

Figura 5 Exemplo de um aparelho para evaporação a baixa pressão utilizando o método de efusão, com uma célula de efusão com o volume de 8 cm3

1. Ligação à bomba de vácuo 2. Perfurações para o termómetro de resistência de platina ou para a medição de temperatura e controlo (2) 3. Tampa do tanque de vácuo 4 Anel do tipo-O 5 Tanque de vácuo feito de alumínio 6 Dispositivo para instalação e para remoção das células de efusão 7 Tampa roscada 8 Porca de orelhas (6) 9 Parafusos (6) 10 Células de efusão feitas de aço inoxidável 11 Cargas do calorífero (6)

Figura 6a Exemplo de um sistema de circulação para a determinação da pressão de vapor pelo método da saturação com gás

1 = Regulador de fluxo 2 = Permutador de calor 3 = Válvulas de agulha 4 = Sensor de humidade relativa 5 = Colunas de saturação 6 = Juntas do tipo PTFE 7 = Debitómetro 8 = Sistema de captação (absorvedor) 9 = Sistema de captação de óleo 10 = Borbulhador de vidro calcinado Ventilador rampa

Figura 6b Exemplo de um sistema para a determinação da pressão de vapor pelo método da saturação com gás, com um tubo capilar colocado a seguir ao compartimento de saturação

1. Debitómetro térmico 2. Manómetro 3. Compartimento de temperatura controlada 4. Bobina do termóstato para o gás portador 5. Termómetro (Pt 100) 6. Compartimento de saturação do gás 7. Capilar 8. Recipientes de absorção 9. Aparelho para a medição de gás 10. Sistema de captação frio

Figura 7 Exemplo da disposição do conjunto experimental para o método do rotor giratório

Aparelho para a determinação da pressão de vapor A. Cabeça do sensor de rotor giratório B. Célula da amostra C. Termóstato D. Linha de vácuo (bomba turbo) E. Termóstato atmosférico

Figura 8 Exemplo de cabeça de medição de rotor giratório

1. Esfera 2. Extensão tubular esvaziada de 6 3. Magnetos permanentes (2) 4. Bobinas (2) para estabilização vertical 5. Bobinas accionadoras (4) 6. Flange de ligação

Apêndice

Figura 1 Método de eluição em coluna com bomba de recirculação

Equilíbrio atmosférico Debitómetro Microcoluna Bomba de recirculação controlada por termóstato Bomba de recirculação Torneira de duas vias para recolha das amostras

Figura 2 Microcoluna tipo

(Todas as dimensões estão em milímetros) (junta de vidro esmerilado) Espaço superior Diâmetro interior 5 Diâmetro exterior 19 Tampão de lã de vidro Torneira de 2 vias

Figura 3 Microcoluna tipo

(Todas as dimensões estão em milímetros) (Junta de vidro esmerilado) Espaço superior Diâmetro interior 5 Diâmetro exterior 19 Torneira

Figura 4 Método de eluição em coluna com reservatório de nivelamento

1 = Recipiente de nivelamento (por exemplo, frasco de 2,5 litros) 2 = Coluna (ver figura 3) 3 = Colector das fracções 4 = Termóstato 5 = Tubo de teflon 6 = Rolha de vidro esmerilado 7 = Tubo de água (entre o termóstato e a coluna, diâmetro interno: aproximadamente 8 mm)

Apêndice 1 Métodos de cálculo/estimação

INTRODUÇÃO

Na publicação Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) encontra-se uma introdução geral aos métodos de cálculo, dados e exemplos. É possível utilizar os valores calculados de Poa:

para se decidir qual dos métodos experimentais é apropriado (gama de utilização para o frasco agitado: log Poa: - 2 a 4, gama de HPLC: log Poa: 0 a 6),

para selecção das condições de ensaio apropriadas (por exemplo, substâncias de referência para os procedimentos de HPLC, relação volumétrica n-octanol/água para o método do frasco agitado),

como verificação interna laboratorial sobre possíveis erros experimentais,

para se obter um valor estimado de Poa no caso em que os métodos experimentais não podem ser aplicados por razões técnicas.

MÉTODO DE ESTIMAÇÃO Estimativa preliminar do coeficiente de partição

Pode-se estimar o valor do coeficiente de partição conhecendo as solubilidades da substância de ensaio em solventes puros, utilizando a equação: Pestimado = saturação cn-octanolsaturação cágua

MÉTODOS DE CÁLCULO Princípio dos métodos de cálculo

Todos os métodos de cálculo se baseiam na fragmentação formal da molécula em substruturas adequadas para as quais sejam conhecidos valores dos fragmentos de log Poa. Calcula-se depois o valor log Poa da molécula inteira como sendo a soma dos correspondentes valores dos seus fragmentos mais a soma dos termos de correcção, para as interacções intramoleculares. Existem disponíveis listas de constantes dos fragmentos e dos termos de correlação (b)(c)(d)(e). Algumas são actualizadas regularmente (b).

Critérios de qualidade

De um modo geral, a fiabilidade do método de cálculo diminui com a complexidade crescente do composto submetido a estudo. No caso de moléculas simples com baixo peso molecular e com um ou dois grupos funcionais admite-se um desvio compreendido entre 0,1 e 0,3 unidades de log Poa entre os resultados obtidos com diferentes métodos de fragmentação e o valor medido. No caso das moléculas mais complexas a margem de erro pode ser superior. Isto dependerá da fiabilidade e da disponibilidade de constantes dos fragmentos e também da capacidade para identificar interacções intramoleculares (por exemplo, ligações de hidrogénio) e para utilizar correctamente os termos de correcção (este problema pode ser minimizado utilizando a aplicação informática CLOGP-3) (b). No caso dos compostos ionizantes é importante tomar em consideração correctamente a carga e o grau de ionisação.

Procedimentos de cálculo

Método π de Hansch

A constante do substituinte hidrofóbico original, π, introduzida por Fujita et al. (f), define-se do modo seguinte: πx = log Poa (PhX) - log Poa (PhH) em que Poa (PhX) representa o coeficiente de partição de um derivado aromático e Poa (PhH) representa o coeficiente de partição do composto original (por exemplo: πCl = log Poa (C6H5Cl) - log Poa (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71). De acordo com esta definição, o método π é aplicável essencialmente nos casos de substituição aromática. Os valores π para um grande número de substituintes encontram-se em tabelas (b)(c)(d) e são utilizados para o cálculo dos valores log Poa de substruturas ou moléculas aromáticas.

Método de Rekker

De acordo com Rekker (g) o valor de log Poa calcula-se do modo seguinte: log Poa=Σi ai fi+Σj (termos de interacção) em que fi representa as diferentes constantes dos fragmentos moleculares e ai representa a frequência da sua ocorrência na molécula sujeita a investigação. Os termos de correcção podem ser expressos na forma de um integral múltiplo de uma única constante Cm (designada por constante mágica). As constantes dos fragmentos fi e Cm foram determinadas a partir de uma listagem de 1054 valores experimentais de Poa (825 compostos) utilizando análise de regressão múltipla (c)(h). A determinação dos termos de interacção efectua-se de acordo com regras consagradas descritas na literatura (e)(h)(i).

Método de Hansch-Leo

De acordo com Hansch e Leo (c) calcula-se o valor de log Poa de acordo com a equação: log Poa=Σi ai fi+Σj bj Fj em que fi representa as diferentes constantes dos fragmentos moleculares, Fj representa os termos de correcção e ai e bj representam as correspondentes frequências de ocorrência. Por aproximações sucessivas determinou-se, a partir dos valores experimentais de Poa, uma listagem de valores de fragmentos atómicos e de grupos e uma listagem dos termos de correcção Fj (designados factores). Os termos de correcção foram ordenados segundo diversas classes diferentes (a)(c). É relativamente complicado e moroso levar em consideração todas as regras e termos de correcção. Existem disponíveis diversas aplicações informáticas (b).

Método combinado

O cálculo dos valores log Poa de moléculas complexas pode ser consideravelmente aperfeiçoado, se a molécula for cindida em substruturas para as quais se encontrem disponíveis valores fiáveis de log Poa, tanto a partir de tabelas (b)(c) como a partir das medições do próprio investigador. Esses fragmentos (por exemplo, heterociclos, antraquinona, azobenzeno) podem ser combinados depois com os valores y segundo Hansch ou com as constantes dos fragmentos segundo Rekker ou Leo.

Observações

i)

Os métodos de cálculo apenas podem ser aplicados a compostos parcial ou totalmente ionizados no caso de ser possível tomar em consideração os necessários factores de correcção;

ii)

No caso de se admitir a existência de ligações intramoleculares entre átomos de hidrogénio é necessário adicionar (a) os correspondentes termos de correcção (aproximadamente +0,6 a +1,0 unidades log Poa). As indicações para a presença dessas ligações podem ser obtidas a partir de modelos espaciais ou a partir de dados espectroscópicos da molécula;

iii)

No caso de serem possíveis diversas formas tautoméricas, deve-se utilizar a forma mais provável como base de cálculo;

iv)

As revisões das listagens de constantes de fragmentos deverão ser acompanhadas cuidadosamente.

Relatório

No caso de se utilizar métodos de cálculo/estimação o relatório do ensaio deverá, se possível, conter a informação seguinte:

descrição da substância (mistura, impurezas, etc.),

indicação de quaisquer possíveis ligações intramoleculares entre átomos de hidrogénio, dissociação, carga e quaisquer outros efeitos extraordinários (por exemplo, tautomerismo),

descrição do método de cálculo,

identificação ou fonte da base de dados,

peculiaridades na escolha dos fragmentos,

documentação compreensiva relativa aos cálculos.

BIBLIOGRAFIA

(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.

(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther. 1979, vol. 14, p. 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, p. 5175.

(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmentai Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459.

(i) R.A. Scherrer, ACS — American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Apêndice 2 Substâncias de referência recomendadas para o método de HPLC

Substância de referência 2-butanona log Poa pKa 1 2-butanona 0,3 2 4-acetilpiridina 0,5 3 anilina 0,9 4 acetanilida 1,0 5 álcool benzílico 1,1 6 p-metoxifenol 1,3 pKa = 10,26 7 ácido fenoxi-acético 1,4 pKa = 3,12 8 fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 10 benzonitrilo 1,6 11 fenilacetonitrilo 1,6 12 álcool 4-metilbenzílico 1,6 13 acetofenona 1,7 14 2-nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 15 ácido 3-nitrobenzóico 1,8 pKa = 3,47 16 4-cloranilina 1,8 pKa = 4,15 17 nitrobenzeno 1,9 18 álcool cinâmico 1,9 19 ácido benzóico 1,9 pKa = 4,19 20 p-cresol 1,9 pKa = 10,17 21 ácido cinâmico 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 anisol 2,1 23 benzoato de metilo 2,1 24 benzeno 2,1 25 ácido 3-metilbenzóico 2,4 pKa = 4,27 26 4-clorofenol 2,4 pKa = 9,1 27 tricloroetileno 2,4 28 atrazina 2,6 29 benzoato de etilo 2,6 30 2,6-diclorobenzonitrilo 2,6 31 ácido 3-clorobenzóico 2,7 pKa = 3,82 32 tolueno 2,7 33 1-naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dicloroanilina 2,8 35 clorobenzeno 2,8 36 éter alil-fenílico 2,9 37 bromobenzeno 3,0 38 etilbenzeno 3,2 39 benzofenona 3,2 40 4-fenilfenol 3,2 pKa = 9,54 41 timol 3,3 42 1,4-diclorobenzeno 3,4 43 difenilamina 3,4 pKa = 0,79 44 naftaleno 3,6 45 benzoato de fenilo 3,6 46 isopropilbenzeno 3,7 47 2,4,6-triclorofenol 3,7 pKa = 6 48 bifenilo 4,0 49 benzoato de benzilo 4,0 50 2,4-dinitro-6-sec-butil-fenol 4,1 51 1,2,4-tricloro-benzeno 4,2 52 ácido dodecanóico 4,2 53 éter difenílico 4,2 54 n-butil-benzeno 4,5 55 fenantreno 4,5 56 fluoranteno 4,7 57 dibenzilo 4,8 58 2,6-difenilpiridina 4,9 59 trifenilamina 5,7 60 DDT 6,2 Outras substâncias de referência de baixo valor log Poa 1 ácido nicotínico -0,07

Apêndice

Figura Molde e acessórios para a preparação da pilha

(Todas as dimensões estão em milímetros) Comprimento do molde: 250 mm Material: alumínio

Apêndice

Figura Aparelho

Apêndice

Exemplo de especificação de material para o ensaio de sensibilidade térmica (ver DIN 1623) (1)(2)(3)

Tubo: especificação de material no 1.0336.505 g. Placa perfurada: especificação de material n.o 1.4873 Manga roscada e porca: especificação de material n.o 1.3817.

Figura 1 Aparelho para o ensaio da sensibilidade térmica

(Todas as dimensões estão em milímetros) Figura 1a Tubo de aço e acessórios (1) tubo (1a) flange exterior (2) manga roscada; rosca de baixa fricção (3) placa perfurada a = 2,0 ou 6,0 mm de diâmetro (4) porca b = 10 mm de diâmetro (5) superfície chanfrada (6) 2 cabeças chatas para chave 41 Figura 1b Dispositivo de aquecimento e protecção (7) 2 cabeças chatas para chave 36 (8) caixa à prova de estilhaços (9) 2 tirantes de suporte para tubo (10) tubo montado (11) posição do queimador posterior: os outros queimadores estão visíveis (12) jacto orientador

Figura 2 Ensaio de sensibilidade térmica

Exemplos de fragmentação Sem explosão Sem explosão Explosão Explosão Explosão Explosão

Figura 3 Calibração da taxa de aquecimento para o ensaio da sensibilidade térmica

Temperatura (°C) Tempo (s) Curva de temperatura/tempo obtida ao aquecer-se ftalato de dibutilo (27 cm3) num tubo fechado (placa com orifício de 1,5 mm) utilizando gás propano com o débito de 3,2 litros/minuto. Mede-se a temperatura com um termopar de 1 mm de diâmetro feito de crómio/alumínio revestido com aço inoxidável, colocado centralmente 43 mm sob o aro do tubo. A taxa de aquecimento entre 135 °C e 285 °C deverá estar compreendida entre 185 e 215 K/minuto.

Figura 4 Aparelho para o ensaio de choque

(Todas as dimensões estão em milímetros) (1) base, 450 × 450 × 60 (2) bloco de aço, 230 × 250 × 200 (3) bigorna, 100 de diâmetro × 70 (4) coluna (5) componente transversal médio (6) 2 guias (7) armário denteado (8) escala graduada (9) martelo cadente (massa cadente) (10) dispositivo de sustentação e de libertação (11) placa de fixação (12) bigorna intermédia (permutável), 26 de diâmetro × 26 (13) anel de fixação com orifícios (14) dispositivo de impacte Figura 4a Martelo cadente, alçado e vista geral Figura 4b Martelo cadente, parte lateral vista lateral,

Continuação

Figura 4d Dispositivo para o ensaio de choque de substâncias líquidas Figura 4c Dispositivo para o ensaio de choque de substâncias pulverizadas ou pastas (1) cilindros de aço (2) anel guia para os cilindros de aço (3) anel de fixação com orifícios a) secção vertical b) planta (4) anel de borracha (5) substância líquida (40 mm3) (6) espaço livre de líquido Figura 4e Martelo (massa cadente de 5 kg) (1) espigão de suspensão (2) marcador de altura (3) sulco de fixação (4) cabeça de impacte cilíndrica (5) lingueta de ricochete

Figura 5 Sensibilidade à fricção: aparelho

Figura 5a Aparelho de fricção: alçado e planta (1) base de aço (2) carro móvel (3) placa de porcelana, 25 x 25 x 5 mm, presa ao carro (4) cavilha fixa de porcelana, 10 mm de diâmetro x 15 mm (5) amostra de ensaio, aproximadamente 10 mm3 (6) suporte da cavilha (7) braço de carga (8) contrapeso (9) interruptor (10) roda para alinhar o carro na posição de partida (11) saída para o motor eléctrico Figura 5b Posição de arranque da cavilha na amostra

Apêndice

Figura Molde e acessórios para a preparação da pilha

(Todas as dimensões estão em milímetros)

Apêndice Exemplos de outros métodos de determinação da massa molecular média em função do número de moles (Mn) em polímeros

A cromatografia de permeação em gel constitui o método mais indicado para a determinação de Mn, em especial sempre que se encontre disponível uma série de padrões com estrutura idêntica à do polímero a analisar. Todavia, nos casos em que o recurso àquela técnica apresente dificuldades práticas ou em que se preveja que a substância em causa não satisfaz um critério regulamentar em matéria de Mn, sendo necessário confirmar tal facto podem aplicar-se métodos alternativos, nomeadamente:

1.1.1.1.2.1.3.1.4.

Utilização das propriedades coligativas Ebulioscopia/crioscopia: estas técnicas baseiam-se, respectivamente, na determinação do aumento do ponto de ebulição e do abaixamento do ponto de congelação de um solvente induzidos pela adição do polímero. O princípio do método consiste no facto de os efeitos do polímero dissolvido no ponto de ebulição ou de congelação do solvente dependerem da massa molecular do polímero (1) (2). Aplicabilidade: Mn < 20000 Abaixamento da pressão de vapor: esta técnica baseia-se na medição da pressão de vapor de um líquido de referência antes e após a adição de determinadas quantidades do polímero (1) (2). Aplicabilidade: Mn < 20000 (em teoria; na prática, o valor é limitado). Osmometria de membrana: esta técnica baseia-se no princípio da osmose, isto é, da tendência natural das moléculas de solvente de passarem, através de uma membrana semipermeável, de uma solução diluída para uma solução concentrada, até atingir o equilíbrio. No ensaio em causa, a concentração da solução diluída é nula, enquanto que a solução concentrada contém o polímero. A passagem do solvente através da membrana determina uma diferença de pressão dependente da concentração e da massa molecular do polímero (1) (3) (4). Aplicabilidade: valores de Mn compreendidos entre 20000 e 200000. Osmometria de fase de vapor: esta técnica baseia-se na comparação da velocidade de evaporação de um aerossol de solvente puro com a velocidade de evaporação de, no mínimo, três aerossóis que contêm o polímero em concentrações diversas (1) (5) (6). Aplicabilidade: Mn < 20000

2. Análise dos grupos terminais A utilização deste método implica o conhecimento simultâneo da estrutura global do polímero e da natureza dos grupos terminais, distinguíveis da cadeia principal por recurso a técnicas tais como a ressonância magnética nuclear, a titulação ou a formação de derivados. Com base na determinação da concentração molecular dos grupos terminais presentes no polímero, pode obter-se a respectiva massa molecular (7) (8) (9). Aplicabilidade: Mn não superior a 50000 (com fiabilidade decrescente).

3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)

Referências Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymeer Science, 3rd ed., John Wiley, New York. Glover, CA., (1975), Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E., Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989), Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper e., J. Wiley and Sons, p. 25-52. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E. Muller, G., and Arndt, K-F, (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

Apêndice Directrizes para a correcção do teor de espécies de baixa massa molecular determinada pela presença de polímeros insolúveis

A presença de polímeros insolúveis na amostra determina perdas de massa no decurso da análise por cromatografia de permeação em gel. Os polímeros insolúveis são retidos de forma irreversível na coluna ou filtro, enquanto que a porção solúvel da amostra prossegue o seu percurso. Se for possível estimar ou determinar o incremento do índice de refracção do polímero (dn/dc), pode calcular-se a perda de massa na coluna. Neste caso, efectua-se uma correcção por recurso a calibração externa do refractómetro com substâncias-padrão de concentração e dn/dc conhecidos. No exemplo que se segue, utiliza-se um padrão de poli(metacrilato de metilo) (pMMA). No caso dos polímeros acrílicos, a calibração externa consiste na análise por cromatografia de permeação em gel de uma solução de um padrão de pMMA em tetra-hidrofurano, de concentração conhecida; os dados resultantes são utilizados para calcular a constante do refractómetro, por recurso à fórmula: K = R/(C × V × dn/dc) em que: K representa a constante do refractómetro, expressa em mV.s/ml, R representa a resposta do padrão de pMMA, expressa em mV.s, C representa a concentração do padrão de pMMA, expressa em mg/ml, V representa o volume de injecção, expresso em ml, dn/dc representa o incremento do índice de refracção relativo à solução de pMMA em tetra-hidrofurano, expresso em ml/mg. Os valores infra são característicos de um padrão de pMMA: R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 × 10-5 ml/mg O valor de K resultante (3,05 × 1011) é utilizado para o cálculo da resposta teórica do detector no caso da eluição e detecção da totalidade do polímero injectado.

PARTE B MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DA TOXICIDADE E DE OUTROS EFEITOS NA SAÚDE

INTRODUÇÃO GERAL A.

CARACTERIZAÇÃO DA SUBSTÂNCIA EM ESTUDO Antes de iniciar qualquer estudo de toxicidade devem conhecer-se a composição da substância em estudo, incluindo as principais impurezas que contenha, e as propriedades físico-químicas mais importantes, nomeadamente a estabilidade. As propriedades físico-químicas da substância fornecem informações de relevo para a escolha da via de administração e a concepção de cada estudo específico, bem como para o manuseamento e a armazenagem da substância. O estudo deve ser precedido do desenvolvimento de um método analítico para a determinação qualitativa e quantitativa da substância em estudo (incluindo, sempre que possível, as principais impurezas) no meio de administração e no material biológico. Devem incluir-se no relatório de ensaio todas as informações disponíveis referentes à identificação, às propriedades físico-químicas, à pureza e ao comportamento da substância em estudo.

CUIDADOS COM OS ANIMAIS Nos estudos de toxicidade é fundamental efectuar um controlo estrito das condições ambientais e utilizar técnicas adequadas para o cuidado dos animais.

i)

Condições de alojamento As condições ambientais nos locais ou recintos destinados aos animais devem ser adequadas às espécies em estudo. Para ratos, ratinhos e cobaias, a temperatura do local deve ser de 22 oC ± 3 oC e a humidade relativa de 30 % a 70 %; no que respeita aos coelhos, a temperatura ambiente deve ser de 20 oC ± 3 oC e a humidade relativa de 30 % a 70 %. Algumas técnicas experimentais são particularmente sensíveis aos efeitos da temperatura; em tais casos, a descrição do método de ensaio deve incluir pormenores relativos às condições adequadas. Em todos os ensaios de toxicidade, a temperatura e humidade devem ser controladas, registadas e referidas no relatório final. A iluminação deve ser artificial, com uma alternância de 12 horas de luz e 12 horas de obscuridade. Os pormenores relativos à iluminação devem ser registados e incluídos no relatório final. Salvo especificação em contrário, os animais devem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos do mesmo sexo. Em caso de alojamento colectivo, não devem colocar-se mais de 5 animais numa gaiola. Nos relatórios de experiências com animais, é conveniente indicar o tipo de gaiolas utilizadas e o número de animais alojados em cada gaiola, tanto durante o período de exposição à substância em estudo como durante o eventual período de observação subsequente.

ii)

Condições de alimentação A dieta deve satisfazer todos os requisitos nutricionais da espécie em estudo. No caso de as substâncias serem administradas aos animais na respectiva dieta, o valor nutricional da mesma pode ser reduzido pela interacção entre a substância e determinados constituintes da dieta. Essa possibilidade deve ser tida em conta na interpretação dos resultados dos ensaios. Podem utilizar-se dietas convencionais de laboratório, com um fornecimento ilimitado de água para beber. A escolha da dieta pode ser condicionada pela necessidade de assegurar a administração adequada da substância em estudo, caso se recorra a esta via. Os eventuais contaminantes que influenciem a toxicidade não devem estar presentes em concentrações que possam interferir com os resultados.

ENSAIOS ALTERNATIVOS A União Europeia está empenhada em promover a elaboração e validação de técnicas alternativas que forneçam a mesma quantidade de informações que os ensaios actuais em animais, mas que utilizem um número inferior de animais, lhes causem menor sofrimento ou evitem, de todo, o recurso aos mesmos. Na caracterização dos riscos e consequente classificação e rotulagem dos produtos e para a avaliação da segurança química devem utilizar-se, sempre que possível, métodos deste tipo, à medida que se encontrem disponíveis.

AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Aquando da avaliação e interpretação dos ensaios devem ter-se em conta as limitações apresentadas pela extrapolação directa para o homem dos resultados obtidos em estudos com animais e in vitro, pelo que, para a confirmação dos referidos resultados, devem utilizar-se, sempre que se encontrem disponíveis, dados referentes a efeitos adversos no homem.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS A maioria dos métodos apresentados foram elaborados no âmbito do programa da OCDE das directrizes em matéria de ensaios, devendo os mesmos ser executados em conformidade com as boas práticas de laboratório, de modo a garantir, na medida do possível, o reconhecimento mútuo dos resultados. Podem obter-se informações adicionais nas referências incluídas nas directrizes da OCDE, bem como em outras publicações no domínio em causa.

B.1.bis. TOXICIDADE ORAL AGUDA — PROCEDIMENTO DE DOSE FIXA

B.1.bis.

1. MÉTODO O presente método é equivalente ao Test Guideline TG 420 da OCDE (2001).

1.

1.1. INTRODUÇÃO Os métodos tradicionais de avaliação de toxicidade aguda utilizam a morte dos animais como critério específico. Em 1984, foi sugerida pela British Toxicology Society uma nova abordagem ao ensaio da toxicidade aguda com base na administração de uma série de doses fixas (1). Esta abordagem evitava a utilização da morte dos animais como um critério específico. O novo método baseava-se na observação de sinais evidentes de toxicidade ocorrentes a determinado valor de uma série de doses fixas. Em 1992 e no seguimento dos estudos de validação in vivo efectuados tanto no Reino Unido (2) como internacionalmente (3), o procedimento foi adoptado como método de ensaio. Subsequentemente, as propriedades estatísticas do Procedimento de Dose Fixa foram avaliadas em vários estudos utilizando modelos matemáticos (4)(5)(6). Em conjunto, os estudos in vivo e de modelação mostraram que o procedimento é reprodutível, utiliza um menor número de animais e causa menor sofrimento do que os métodos tradicionais, permitindo classificar as substâncias de um modo semelhante a outros métodos de ensaio de toxicidade aguda. No Documento de Orientação sobre Ensaios de Toxicidade Oral Aguda (7) podem consultar-se as orientações sobre a selecção do método de ensaio mais apropriado a determinado fim. Este Documento de Orientação contém igualmente informação adicional sobre o procedimento e interpretação do Método de Ensaio B.1. Um dos princípios básicos do presente método consiste na utilização de doses moderadamente tóxicas no estudo principal, evitando a administração de doses previsivelmente letais. Além disso, não é necessário administrar doses para as quais se sabe previamente que causam dor e sofrimento óbvios, devido à sua acção corrosiva ou fortemente irritante. Os animais moribundos ou os animais que apresentam sinais óbvios de dor ou sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados sem dor e, na interpretação dos resultados do ensaio, devem ser considerados do mesmo modo que os animais que morrem durante o ensaio. Os critérios sobre a decisão de sacrificar animais moribundos ou em sofrimento grave, bem como as orientações sobre a identificação de morte previsível ou iminente, estão incluídos separadamente num Documento de Orientação (8). O presente método permite obter informação sobre a perigosidade e possibilita a graduação e classificação da substância em conformidade com o Sistema Harmonizado ao Nível Mundial (GHS) para a classificação de substâncias químicas que causam toxicidade aguda (9). Antes de efectuar o estudo, o laboratório de ensaio deve ter em conta toda a informação disponível sobre a substância de ensaio. Esta informação incluirá a identificação e a estrutura química da substância, as suas propriedades físico-químicas, os resultados de quaisquer outros ensaios de toxicidade da substância in vitro ou in vivo, dados toxicológicos sobre substâncias estruturalmente semelhantes e a(s) utilização(ões) prevista(s) para a substância. Esta informação é necessária para satisfazer todos os envolvidos em relação à relevância do ensaio ao nível da protecção da saúde humana e será útil na determinação de uma dose inicial apropriada.

1.2. DEFINIÇÕES Toxicidade oral aguda: refere-se ao conjunto de efeitos adversos que se manifestam após a administração oral de uma dose única da substância ou de várias doses num período de 24 horas. Morte retardada: significa que o animal não morre nem aparenta estar moribundo num período de 48 horas, mas morre mais tarde, no decorrer do período de observação de 14 dias. Dose: quantidade aplicada da substância de ensaio. O valor da dose é expresso em peso de substância de ensaio por unidade de peso do animal (mg/kg). Toxicidade evidente: termo geral que descreve a ocorrência de sinais óbvios de toxicidade na sequência da administração da substância de ensaio [consultar os exemplos descritos em (3)] no qual a dose fixa mais elevada seguinte pode induzir, na maior parte dos animais, dor intensa, sinais persistentes de distúrbios graves, estado moribundo (os respectivos critérios são apresentados no Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (8) ou, provavelmente, mortalidade. GHS: Sistema Harmonizado ao Nível Mundial (Globally Harmonised System) para a Classificação de Substâncias Químicas e Misturas. Trata-se de um trabalho conjunto da OCDE (saúde humana e ambiente), do Comité de Peritos em Transporte de Mercadorias Perigosas das Nações Unidas (propriedades físico-químicas) e da OIT (notificação de perigos) e coordenado pelo Programa Interorganizações para a Boa Gestão das Substâncias Químicas [Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)]. Morte iminente: situação em que se prevê a ocorrência de estado moribundo ou morte antes da próxima observação planeada. Alguns dos sinais indicativos deste estado em roedores incluem convulsões, posição lateral, posição deitada e tremores. [Consultar o Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (8) para mais detalhes.] DL50 (Dose Letal Média): dose única, calculada estatisticamente, de uma substância susceptível de causar a morte de 50 % dos animais quando administrada por via oral. O valor da DL50 é expresso em peso, de substância de ensaio, por unidade de peso do animal de ensaio (mg/kg). Teste-limite: refere-se a uma dose com o valor limite superior admitido pelo ensaio (2000 ou 5000 mg/kg). Estado moribundo: encontrar-se num estado de morte ou de incapacidade de sobrevivência, mesmo com tratamento. [Consultar o Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (8) para mais detalhes.] Morte previsível: presença de sinais clínicos indicativos de ocorrência de morte em determinada altura (antes do final planeado da experiência, por exemplo): incapacidade de alcançar água ou comida. [Consultar o Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (8) para mais detalhes.]

1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO São administradas doses gradualmente crescentes a grupos de animais do mesmo sexo, usando as doses fixas de 5, 50, 300 e 2000 mg/kg (excepcionalmente pode utilizar-se uma dose fixa adicional de 5000 mg/kg; consultar a secção 1.6.2). A dose inicial é escolhida com base num estudo preliminar de determinação de amplitude como a dose para qual é previsível obter alguns sinais de toxicidade sem causar efeitos tóxicos graves ou mortalidade. Os sinais clínicos e as condições associadas com dor, sofrimento e morte iminente, são descritos detalhadamente num Documento de Orientações da OCDE separado (8). Outros grupos de animais poderão ser sujeitos a dosagens, com doses fixas superiores ou inferiores, consoante a presença ou ausência de sinais de toxicidade ou mortalidade. Repete-se este procedimento até identificação da dose que causa toxicidade evidente ou que provoque uma e apenas uma morte ou até à dose mais elevada no caso de não serem observados quaisquer efeitos. O procedimento é imediatamente interrompido no caso de se registarem mortes à dose mais baixa.

1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.4.

1.4.1. Selecção de espécies animais A espécie preferida para ensaio é o rato, mas podem ser utilizadas outras espécies de roedores. Normalmente, utilizam-se fêmeas (7). Tal escolha deve-se ao facto de uma análise da literatura científica relativa aos ensaios convencionais de DL50 revelar que, habitualmente, a diferença de sensibilidade entre os sexos é pequena e, nos casos em que são observadas diferenças, as fêmeas são, de um modo geral, ligeiramente mais sensíveis (10). No entanto, devem utilizar-se machos caso as propriedades toxicológicas ou tóxico-cinéticas descritas para substâncias químicas estruturalmente semelhantes indicarem que estes podem revelar maior sensibilidade. Quando o ensaio é efectuado com machos, deve ser apresentada uma justificação adequada. Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis e pertencentes a estirpes laboratoriais de uso corrente. As fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas. No início da administração das doses, todos os animais devem ter idades compreendidas entre as 8 e as 12 semanas e um peso compreendido no intervalo de ± 20 % do peso médio dos animais aos quais foram anteriormente administradas doses.

1.4.2. Condições de alojamento e alimentação A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser de 22 oC (± 3oC). A humidade relativa deverá ser 50-60 %, embora sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30 % e um máximo que, de preferência, não deverá exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza do compartimento. A iluminação deve ser artificial, com sequências de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. A alimentação pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com fornecimento ilimitado de água para beber. Os animais aos quais é administrada a mesma dose, podem ser agrupados na mesma gaiola desde que, o número de animais em cada gaiola não impeça a observação clara de cada um deles.

1.4.3. Preparação dos animais Os animais são escolhidos ao acaso, marcados de modo a permitir uma identificação individualizada e mantidos nas suas gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes do início da administração das doses de modo a permitir que se aclimatem às condições laboratoriais.

1.4.4. Preparação das doses De um modo geral, as substâncias de ensaio devem ser administradas num volume constante ao longo de toda a gama de doses a ensaiar através da variação da concentração na preparação da dose. No entanto, para o caso do ensaio de um produto ou de uma mistura no estado líquido, pode ser mais relevante para a avaliação de risco subsequente a utilização da substância de ensaio sem qualquer diluição, ou seja, a concentração constante, sendo este um requisito apresentado por algumas autoridades competentes. Em qualquer dos casos, não deve ser excedido o volume máximo da dose a ser administrada. O volume máximo de líquido que pode ser administrado de cada vez depende do tamanho do animal de ensaio. No caso de roedores, em condições normais o volume não deve exceder 1 ml/100 g de peso corporal. Para soluções aquosas, contudo, pode ser considerada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal. Recomenda-se que, sempre que possível, seja considerada em primeiro lugar a utilização de uma solução/suspensão/emulsão aquosa; caso tal não seja viável, pode considerar-se o uso de uma solução/suspensão/emulsão em óleo (por exemplo, óleo de milho); em última instância, poderá eventualmente recorrer-se ao uso de soluções noutros excipientes. Devem conhecer-se as características tóxicas dos excipientes que não sejam a água. As doses devem ser preparadas pouco tempo antes da sua administração, a menos que a estabilidade da preparação ao longo do período de utilização seja conhecida e tenha sido considerada aceitável.

1.5. PROCEDIMENTO

1.5.

1.5.1. Administração de doses A administração deve ser feita numa toma única, por sonda esofágica, usando tubo estomacal ou cânula de intubação apropriada. Nos casos raros em que não é possível a administração de uma toma única, a dose pode ser administrada em fracções menores ao longo de um período não superior a 24 horas. Os animais devem ser sujeitos a jejum antes da administração das doses (por exemplo, no caso de ratos, não deve dar-se comida durante a noite, mas deve manter-se o fornecimento de água; no caso de ratinhos, a comida deve ser suspensa durante 3-4 horas e deve ser mantido o fornecimento de água). Após o período de jejum, os animais devem ser pesados e deve ser administrada a substância de ensaio. Após a administração da substância, pode evitar dar-se comida durante 3-4 horas para ratos e 1-2 horas para ratinhos. Nos casos de administração fraccionada da dose durante um certo lapso de tempo, pode ser necessário dar comida e água aos animais consoante a duração do período de administração.

1.5.2. Estudo de determinação de amplitude O objectivo do estudo de determinação de amplitude consiste em seleccionar a dose inicial apropriada para o estudo principal. A substância de ensaio é administrada a um único animal de uma forma sequencial segundo os fluxogramas do anexo 1. O estudo de determinação de amplitude termina quando se pode seleccionar a dose inicial para o estudo principal (ou se for registada uma morte à dose fixa mais baixa). Para o estudo de determinação de amplitude, a dose inicial é seleccionada de entre as doses fixas de 5, 50, 300 e 2000 mg/kg, como sendo a dose que se prevê poder causar toxicidade evidente com base, se possível, nas evidências de dados in vivo e in vitro da mesma substância química ou de substâncias químicas estruturalmente semelhantes. Na ausência de tal informação, a dose inicial será de 300 mg/kg. O intervalo de aplicação de doses a cada animal será de, pelo menos, 24 horas. Todos os animais devem ser observados durante um período de, pelo menos, 14 dias. Excepcionalmente e apenas quando justificado por necessidades regulamentares específicas, pode ser considerada a utilização de uma dose fixa superior adicional de 5000 mg/kg (consultar o Anexo 3). Por razões de protecção dos animais, é desencorajado o ensaio de animais na Categoria 5 do SHG (2000-5000 mg/kg). Esta dose só deve ser considerada quando existe uma elevada probabilidade dos resultados deste ensaio terem relevância directa na protecção dos animais, da saúde humana ou do ambiente. Nos casos em que o animal de ensaio morre no estudo de determinação de amplitude quando se aplica a dose fixa mais baixa (5 mg/kg), o procedimento normal consiste em terminar o estudo e classificar a substância na Categoria 1 do GHS (tal como se indica no Anexo 1). No entanto, se for necessária uma confirmação adicional, pode ser efectuado um procedimento experimental suplementar, tal como se descreve seguidamente. Aplica-se uma dose de 5 mg/kg a um segundo animal. Se o segundo animal morrer confirma-se a Categoria 1 do GHS e o estudo é imediatamente terminado. Se o segundo animal sobreviver, será então administrada a dose de 5 mg/kg a um máximo de mais três animais. Dado que neste caso o risco de mortalidade é elevado, a administração das doses a estes animais deve ser feita de um modo sequencial, de modo a proteger os animais. O intervalo, entre a aplicação da dose a cada um dos animais, deve ser suficiente para assegurar a provável sobrevivência do animal anterior. Se ocorrer uma segunda morte, a sequência de aplicação da dose será terminada imediatamente e não serão ensaiados mais animais. Dado que, a ocorrência de uma segunda morte (independentemente do número de animais ensaiados até ao final do estudo) é classificável no resultado A (duas ou mais mortes), segue-se a regra de classificação do Anexo 2 para a dose fixa de 5 mg/kg (Categoria 1, se ocorrerem duas ou mais mortes, ou Categoria 2, se não ocorrer mais do que uma morte). Além disso, apresentam-se no Anexo 4 as orientações sobre a classificação segundo o sistema da UE, válido até à implementação do novo GHS.

1.5.3. Estudo principal

1.5.3.

1.5.3.1. Número de animais e doses No Anexo 2 apresentam-se os procedimentos a seguir após o ensaio com a dose inicial. É necessário proceder de uma das três formas seguintes: terminar os ensaios e classificar a substância na classe de perigosidade apropriada, prosseguir os ensaios como uma dose fixa superior, ou prosseguir os ensaios com uma dose fixa inferior. No entanto, por uma questão de protecção dos animais, a dose que causou morte, no estudo de determinação de amplitude, não deve ser repetida no estudo principal (consultar Anexo 2). A experiência prévia é indicativa de que o resultado mais provável da dose inicial será a possibilidade de classificação da substância, o que toma desnecessários quaisquer ensaios adicionais. Será normalmente utilizado um total de cinco animais do mesmo sexo para cada dose investigada. O grupo de cinco animais será constituído por um animal do estudo prévio, ao qual foi administrada a dose seleccionada e de quatro outros animais (excepto, em casos raros, se a dose utilizada no estudo principal não tiver sido incluída no estudo de determinação de amplitude). O intervalo de tempo entre a aplicação de doses em cada nível é determinado pelo aparecimento, duração e gravidade dos sinais de toxicidade. O tratamento dos animais com a dose seguinte deve ser adiado até ser possível estabelecer com segurança a sobrevivência dos animais previamente tratados. Recomenda-se um período de 3 ou 4 dias entre a administração das doses para cada nível de dosagem, se necessário, de modo a permitir a detecção de efeitos tóxicos retardados. O intervalo de tempo pode ser ajustado se necessário, por exemplo, em caso de resposta inconclusiva. No caso de se considerar a utilização da dose fixa máxima de 5000 mg/kg, deve proceder-se em conformidade com o procedimento descrito no Anexo 3. (Consultar igualmente a secção 1.6.2.)

1.5.3.2. Teste-limite O teste-limite é utilizado, essencialmente, em situações nas quais o analista tem informação indicativa de o material de ensaio não ser provavelmente tóxico, ou seja, só apresenta toxicidade acima das doses-limite regulamentadas. A informação sobre a toxicidade do material de ensaio pode ser obtida a partir de ensaios em compostos semelhantes ou de ensaios de misturas ou produtos semelhantes, tendo em consideração a identificação e percentagem dos componentes cuja relevância toxicológica é conhecida. Nos casos em que a informação sobre a toxicidade do material de ensaio é limitada ou inexistente, ou nos casos em que é previsível que o material a ensaiar seja tóxico, deve ser efectuado o estudo principal. Usando o procedimento normal para este ensaio, o teste-limite pode ser efectuado graças a um estudo de determinação de amplitude com uma dose inicial de 2000 mg/kg (ou, excepcionalmente, de 5000 mg/kg), seguido da administração da dose a mais quatro animais.

1.6. OBSERVAÇÕES Após a aplicação da dose, os animais devem ser observados individualmente pelo menos uma vez durante os primeiros 30 minutos e periodicamente durante as primeiras 24 horas, com especial cuidado nas primeiras quatro horas. Seguidamente, é necessário observar os animais diariamente durante um período de 14 dias, excepto se for necessário retirá-los do estudo e sacrificá-los, sem dor, por motivo do bem-estar dos animais, ou se forem encontrados mortos. No entanto, a duração do período de observação não deve ser estabelecida de uma forma rígida, mas determinada com base nas reacções de toxicidade, velocidade do seu aparecimento e duração do período de recuperação, que pode ser prolongado, se for considerado necessário. O momento em que os sinais de toxicidade aparecem e desaparecem são importantes, sobretudo se os sinais de toxicidade tendem a aparecer de uma forma retardada (11). Todas as observações são registadas sistematicamente, mantendo-se uma ficha individual para cada animal. Serão necessárias observações adicionais se os animais continuaram a apresentar sinais de toxicidade. As observações devem incluir alterações na pele e pêlos, olhos e membranas mucosas, aparelho respiratório, aparelho circulatório, sistema nervoso autónomo e central, assim como da actividade somatomotora e comportamental. Devem ser observados com especial atenção os tremores, convulsões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. Devem ser tomados em consideração os princípios e critérios resumidos no Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (8). Os animais que forem encontrados em estado moribundo e os animais que apresentarem dores violentas ou sinais de sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados sem dor. Quando os animais forem sacrificados a fim de evitar dor ou se forem encontrados mortos, deve ser registado o momento da morte com o maior rigor possível.

1.6.

1.6.1. Peso corporal O peso individual dos animais deve ser determinado pouco antes da administração da substância de ensaio e, seguidamente, pelo menos uma vez por semana. Devem ser calculadas e registadas todas as variações de peso. No final do ensaio, os animais sobreviventes são pesados e, seguidamente, sacrificados sem dor.

1.6.2. Patologia Todos os animais de ensaio (incluindo os que morreram durante o ensaio ou que foram retirados do ensaio por motivos de preservação do seu bem-estar) devem ser sujeitos a uma autópsia pouco pormenorizada. Devem ser registadas as alterações patológicas principais observadas em cada animal. Deve também ser considerada a realização de um exame microscópico dos órgãos que mostrem sinais de patologia grave em animais que sobreviveram, no mínimo, durante 24 horas após a aplicação da dose inicial, já que este exame pode fornecer informação útil.

2. DADOS Devem ser apresentados os dados individuais para cada animal. Adicionalmente, todos os dados devem ser resumidos em forma tabular, mostrando, para cada grupo de ensaio, o número de animais utilizado, o número de animais que apresentaram sinais de toxicidade, o número de animais que foram encontrados mortos durante o ensaio ou que foram sacrificados a fim de evitar dor, o momento da morte de cada um dos animais, a descrição e evolução temporal dos efeitos de toxicidade e sua reversibilidade, assim como os resultados da autópsia.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:

Substância de ensaio:

natureza física, pureza e propriedades físico-químicas relevantes (incluindo isomerização);

dados relativos à identificação química, incluindo número CAS.

Excipiente (se apropriado):

caso o excipiente não seja água, uma justificação para a sua escolha.

Animais de ensaio:

espécie/estirpe usada;

estado microbiológico do animal, caso seja conhecido;

número, idade e sexo dos animais (incluindo, quando necessário, uma justificação para o uso de machos em vez de fêmeas);

proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.

Condições do ensaio:

informação pormenorizada sobre a formulação da substância de ensaio, incluindo informação detalhada sobre a forma física do material administrado;

informação pormenorizada sobre a administração da substância de ensaio, incluindo volume das doses e momento de aplicação;

informação pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da água (incluindo tipo e origem da dieta e origem da água);

—justificação para a escolha da dose inicial.

Resultados:

tabela dos dados de resposta e da dose para cada animal (ou seja, animais que apresentaram sinais de toxicidade, incluindo mortalidade, natureza, gravidade e duração dos efeitos);

tabela com indicação do peso corporal e suas variações;

pesos individuais de animais no dia em que é aplicada a dose, uma vez por semana no restante período e na altura da sua morte ou sacrifício;

data e momento da morte, no caso de ocorrência de morte antes do sacrifício previsto;

evolução temporal do aparecimento de sintomas de toxicidade e sua reversibilidade, para cada animal;

resultados da autópsia e resultados histopatológicos para cada animal, caso se encontrem disponíveis.

Análise dos resultados.

Conclusões.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)

REFERÊNCIAS British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Biometrics, 20, 385. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. e Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279-291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, RJ., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. e Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469-482. Whitehead, A. e Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol, 30, p. 313-324. Stallard, N. e Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol, 14, p. 315- 323. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure.-Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183-196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN- documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segai, L., Springer, J.A. e Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol, 33, p. 223-231. Chan P.K e A.W. Hayes (1994), Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . Em: Principies and Methods of Toxicology, 3 a Edição. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd, New York, USA.

B.1.tris. TOXICIDADE ORAL AGUDA — MÉTODO DE CLASSIFICAÇÃO DE TOXICIDADE AGUDA

B.1.tris.

1. MÉTODO O presente método é equivalente ao Test Guideline TG 423 da OCDE (2001)

1.

1.1. INTRODUÇÃO O método de classificação de toxicidade aguda (1) estabelecido no presente ensaio é um procedimento gradual que utiliza três animais do mesmo sexo por etapa. Em média, consoante a mortalidade e/ou o estado moribundo dos animais, são necessárias 2-4 etapas para avaliar a toxicidade aguda da substância de ensaio. O presente procedimento é reprodutível, utiliza uma quantidade muito limitada de animais e permite classificar as substâncias de um modo semelhante a outros métodos de ensaio de toxicidade aguda. O método de classificação de toxicidade aguda baseia-se na avaliação biométrica (2) (3) (4) (5) com doses fixas, separadas apropriadamente de modo a permitir a avaliação da substância para fins de classificação e avaliação de perigosidade. O método, adoptado inicialmente em 1996, foi amplamente validado in vivo relativamente aos dados de DL50 publicados na literatura nacional (6) e internacional (7). No Documento de Orientação sobre Ensaios de Toxicidade Oral Aguda (8) podem consultar-se as orientações sobre a selecção do método de ensaio mais apropriado a determinado fim. Este Documento de Orientação contém igualmente informação adicional sobre o procedimento e interpretação do Método de Ensaio B.1.tris. No presente método de ensaio não é necessário administrar doses de substâncias de ensaio, que comprovadamente causam dor e sofrimento óbvios, devido à sua acção corrosiva ou gravemente irritante. Os animais moribundos ou que apresentam sinais óbvios de dor ou sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados sem dor e, na interpretação dos resultados do ensaio, considerados do mesmo modo que os animais que morrem durante o ensaio. Os critérios sobre a decisão de sacrificar animais moribundos ou em sofrimento, bem como as orientações sobre o reconhecimento de morte previsível ou iminente, estão incluídos separadamente num Documento de Orientação (9). O presente método utiliza doses estabelecidas previamente e os resultados permitem classificar a substância em conformidade com o Sistema Harmonizado ao Nível Mundial (GHS) para a classificação de substâncias químicas que causam toxicidade aguda (10). Em princípio, o método não se destina a calcular rigorosamente os valores de DL50, mas permite a determinação de gamas de exposição definidas, nas quais é expectável a ocorrência de mortes, dado que um dos principais critérios específicos do ensaio é a morte de uma dada proporção de animais. O método permite determinar valores de DL50 somente quando, pelo menos, duas das doses utilizadas resultam numa mortalidade superior a 0 % e inferior a 100 %. A utilização de uma selecção de doses, previamente estabelecidas, independentemente da substância de ensaio, com a classificação especificamente dependente do número de animais observados em vários estados melhora as condições de comunicação de resultados entre laboratórios, bem como a consistência e a repetibilidade dos resultados. Antes de efectuar o estudo, o laboratório de ensaio deve ter em conta toda a informação disponível sobre a substância de ensaio. Esta informação incluirá a identificação e a estrutura química da substância, as suas propriedades físico-químicas, os resultados de quaisquer outros ensaios de toxicidade da substância in vitro ou in vivo, dados toxicológicos sobre substâncias estruturalmente semelhantes e a(s) utilização(ões) prevista(s) para a substância. Esta informação é necessária para satisfazer todos os envolvidos em relação à relevância do ensaio ao nível da protecção da saúde humana e será útil na determinação da dose inicial mais adequada.

1.2. DEFINIÇÕES Toxicidade oral aguda: refere-se ao conjunto de efeitos adversos que se manifestam após a administração oral de uma dose única da substância ou de várias doses num período de 24 horas. Morte retardada: significa que o animal não morre nem aparenta estar moribundo num período de 48 horas, mas morre mais tarde, no decorrer do período de observação de 14 dias. Dose: quantidade aplicada da substância de ensaio. O valor da dose é expresso em peso de substância de ensaio por unidade de peso de animal de ensaio (por exemplo, mg/kg). GHS: Sistema Harmonizado ao Nível Mundial (Globally Harmonised System) para a Classificação de Substâncias Químicas e Misturas. Trata-se de um trabalho conjunto da OCDE (saúde humana e ambiente), do Comité de Peritos em Transporte de Mercadorias Perigosas das Nações Unidas (propriedades físico-químicas) e da OIT (notificação de perigos) e coordenado pelo Programa Interorganizações para a Boa Gestão das Substâncias Químicas [Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)]. Morte iminente: situação em que se prevê a ocorrência de estado moribundo ou morte antes da seguinte observação planeada. Alguns dos sinais indicativos deste estado em roedores incluem convulsões, posição lateral, posição deitada e tremores. [Para informação detalhada, consultar o Documento de Orientação sobre Critérios Específicos sem Dor (9)]. DL50 (Dose Letal Média): dose única, calculada estatisticamente, de uma substância susceptível de causar a morte de 50 % dos animais quando administrada por via oral. O valor da DL50 é expresso em peso de substância de ensaio por unidade de peso de animal de ensaio (mg/kg). Dose-limite: refere-se a uma dose com o valor-limite superior admitido pelo ensaio (2000 ou 5000 mg/kg). Estado moribundo: encontrar-se num estado de morte ou de incapacidade de sobrevivência, mesmo com tratamento. [Para informação detalhada, consultar o Documento de Orientação sobre Critérios Específicos sem Dor (9).] Morte previsível: presença de sinais clínicos indicativos de ocorrência de morte em determinada altura, antes do final planeado da experiência; por exemplo: incapacidade de alcançar água ou comida. [Consultar o Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (9) para mais detalhes.]

1.3. PRINCÍPIO DO ENSAIO O princípio do presente ensaio é que, com base num procedimento gradual com a utilização de um número mínimo de animais por etapa, é possível obter informação suficiente sobre a toxicidade aguda de uma substância de ensaio, de modo a permitir a sua classificação. A substância é administrada, por via oral, a um grupo de animais de ensaio a uma das doses anteriormente definidas. A substância é ensaiada utilizando um procedimento gradual, em que cada etapa utiliza três animais do mesmo sexo (normalmente fêmeas). A existência ou inexistência de mortalidade, relacionada com composto, dos animais tratados numa dada etapa, determinará a etapa seguinte, ou seja: No anexo 1 apresenta-se informação detalhada sobre o procedimento de ensaio. O método permitirá uma avaliação conducente à classificação da substância de ensaio numa das classes de toxicidade definidas pelos valores-limite de DL50.

não são necessários mais ensaios,

é administrada a mesma dose a mais três animais,

é administrada a dose seguinte, maior ou menor, a mais três animais.

1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.4.

1.4.1. Selecção de espécies animais A espécie de roedores preferida para ensaio é o rato, mas podem ser utilizadas outras espécies de roedores. Normalmente, utilizam-se fêmeas (9). Tal escolha deve-se ao facto de uma análise da literatura científica relativa aos ensaios convencionais de DL50 revelar que, habitualmente, a diferença de sensibilidade entre os sexos é pequena e, nos casos em que são observadas diferenças, as fêmeas são, de um modo geral, ligeiramente mais sensíveis (11). No entanto, devem utilizar-se machos caso as propriedades toxicológicas ou tóxico-cinéticas descritas para substâncias químicas estruturalmente semelhantes indicarem que estes podem revelar maior sensibilidade. Quando o ensaio é efectuado com machos, deve ser apresentada uma justificação adequada. Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis e pertencentes a estirpes laboratoriais de uso corrente. As fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas. No início da administração das doses, todos os animais devem ter idades compreendidas entre as 8 e as 12 semanas e um peso compreendido no intervalo de ± 20 % do peso médio dos animais aos quais foram anteriormente administradas doses.

1.4.2. Condições de alojamento e alimentação A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 22oC (± 3oC). A humidade relativa deverá ser 50 %-60 %, embora sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30 % e um máximo que, de preferência, não deverá exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza do compartimento. A iluminação deve ser artificial, com sequências de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. A alimentação pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com fornecimento ilimitado de água para beber. Os animais aos quais é administrada a mesma dose podem ser agrupados na mesma gaiola, desde que o número de animais em cada gaiola não impeça a observação clara de cada um deles.

1.4.3. Preparação dos animais Os animais são escolhidos ao acaso, marcados de modo a permitir uma identificação individualizada e mantidos nas suas gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes do início da administração das doses para que se aclimatem às condições laboratoriais.

1.4.4. Preparação das doses De um modo geral, as substâncias de ensaio devem ser administradas num volume constante ao longo de toda a gama de doses a ensaiar através da variação da concentração na preparação da dose. No entanto, para o caso do ensaio de um produto ou de uma mistura no estado líquido, pode ser mais relevante para a avaliação de risco subsequente a utilização da substância de ensaio sem qualquer diluição, ou seja, a concentração constante, sendo este um requisito apresentado por algumas autoridades competentes. Em qualquer dos casos, não deve ser excedido o volume máximo da dose a ser administrada. O volume máximo de líquido que pode ser administrado de cada vez depende do tamanho do animal de ensaio. No caso de roedores, o volume não deve exceder, em condições normais, 1 ml/100 g de peso corporal. Para soluções aquosas, contudo, pode ser considerada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal. Recomenda-se que, sempre que possível, seja considerada em primeiro lugar a utilização de uma solução/suspensão/emulsão aquosa; caso tal não seja viável, pode considerar-se o uso de uma solução/suspensão/emulsão em óleo (por exemplo, óleo de milho); em última instância, poderá eventualmente recorrer-se ao uso de soluções noutros excipientes. Devem conhecer-se as características toxicológicas dos excipientes que não sejam a água. As doses devem ser preparadas pouco tempo antes da sua administração, a menos que a estabilidade da preparação ao longo do período de utilização seja conhecida e tenha sido considerada aceitável.

1.5. PROCEDIMENTO

1.5.

1.5.1. Administração de doses A administração por sonda esofágica deve ser feita, de preferência, numa toma única, usando um tubo estomacal ou uma cânula de intubação apropriada. Nos casos raros em que não é possível a administração de uma toma única, a dose pode ser administrada em fracções menores ao longo de um período não superior a 24 horas. Os animais devem ser sujeitos a jejum antes da administração das doses (por exemplo, no caso de ratos, não deve dar-se comida durante a noite, mas deve manter-se o fornecimento de água; no caso de ratinhos, a comida deve ser suspensa durante 3-4 horas e deve ser mantido o fornecimento de água). Após o período de jejum, os animais devem ser pesados e deve ser administrada a substância de ensaio. Após a administração da substância, pode evitar dar-se comida durante 3-4 horas para ratos e 1-2 horas para ratinhos. Nos casos de administração fraccionada da dose durante um certo lapso de tempo, pode ser necessário dar comida e água aos animais, consoante a duração do período de administração.

1.5.2. Número de animais e doses São utilizados três animais em cada etapa. A dose a utilizar inicialmente deve ser seleccionada entre uma das quatro doses fixas de 5, 50, 300 e 2000 mg/kg de peso corporal. A dose inicial deve ser aquela que apresenta maior probabilidade de induzir mortalidade em alguns dos animais tratados. Os fluxogramas do anexo 1 descrevem o procedimento a seguir para cada uma das doses iniciais. Apresentam-se ainda, no anexo 4, as orientações sobre a classificação segundo o sistema da UE, em vigor até à implementação do novo GHS. Quando a informação disponível for indicativa de que não é muito provável que ocorra mortalidade com a maior dose inicial (2000 mg/kg de peso corporal), deve efectuar-se um teste-limite. Quando não existir qualquer informação disponível sobre a substância de ensaio, recomenda-se a utilização de uma dose inicial de 300 mg/kg de peso corporal por razões de protecção dos animais. O intervalo de tempo entre os grupos de tratamento é determinado pelo aparecimento, duração e gravidade dos sinais de toxicidade. O tratamento dos animais com a dose seguinte deve ser adiado até ser possível estabelecer com segurança a sobrevivência dos animais previamente tratados. Excepcionalmente, e apenas quando justificado por necessidades legais específicas, pode ser considerada a utilização de uma dose fixa superior adicional de 5000 mg/kg (consultar o anexo 2). Por razões de protecção dos animais, é desencorajado o ensaio de animais na Categoria 5 do GHS (2000-5000 mg/kg) e esta dose só deve ser considerada quando existe uma elevada probabilidade de os resultados deste ensaio terem relevância directa para a protecção da saúde humana ou dos animais ou do ambiente.

1.5.3. Teste-limite O teste-limite é utilizado, essencialmente, em situações nas quais o analista tem informação indicativa do material de ensaio não ser provavelmente tóxico, ou seja, só apresenta toxicidade acima das doses limite regulamentadas. A informação sobre a toxicidade do material de ensaio pode ser obtida a partir de ensaios em compostos semelhantes ou de ensaios de misturas ou produtos semelhantes, tendo em consideração a identificação e percentagem dos componentes cuja relevância toxicológica é conhecida. Nos casos em que a informação sobre a sua toxicidade é limitada ou inexistente ou nos casos em que é previsível que o material a ensaiar seja tóxico, deve ser efectuado o estudo principal. Pode ser efectuado um teste-limite a uma dose de 2000 mg/kg de peso corporal com seis animais (três animais por etapa). Excepcionalmente, pode ser efectuado um teste-limite a uma dose de 5000 mg/kg de peso corporal com três animais (consultar o anexo 2). Caso ocorra mortalidade na sequência da administração da substância de ensaio, pode ser necessário efectuar ensaios posteriores com a dose inferior seguinte.

1.6. OBSERVAÇÕES Após a aplicação da dose, os animais devem ser observados individualmente, pelo menos uma vez durante os primeiros trinta minutos e periodicamente durante as primeiras 24 horas, com especial cuidado nas primeiras quatro horas. Em seguida, é necessário observar os animais diariamente, durante um período de 14 dias, excepto se for necessário retirá-los do estudo e sacrificá-los sem dor por motivo de bem-estar dos animais, ou se forem encontrados mortos. No entanto, a duração do período de observação não deve ser estabelecida de uma forma rígida, mas determinada com base nas reacções de toxicidade, velocidade do seu aparecimento e duração do período de recuperação, que pode ser prolongado, se considerado necessário. O momento em que os sinais de toxicidade aparecem e desaparecem são importantes, sobretudo se os sinais de toxicidade tendem a aparecer de uma forma retardada (12). Todas as observações são registadas sistematicamente, mantendo-se uma ficha individual para cada animal. Serão necessárias observações adicionais se os animais continuarem a apresentar sinais de toxicidade. As observações devem incluir alterações na pele e pêlos, olhos, membranas mucosas, aparelho respiratório, aparelho circulatório, sistema nervoso autónomo e central, assim como na actividade somatomotora e comportamental. Devem ser observados com especial atenção os tremores, convulsões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. Devem ser tomados em consideração os princípios e critérios resumidos no Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (9). Os animais que forem encontrados em estado moribundo e os animais que apresentarem dores violentas ou sinais de sofrimento intenso e continuado devem ser sacrificados sem dor. Quando os animais forem sacrificados a fim de evitar dor ou se forem encontrados mortos, deve ser registado o momento da morte com o maior rigor possível.

1.6.

1.6.1. Peso corporal O peso individual dos animais deve ser determinado imediatamente após a administração da substância de ensaio e, seguidamente, pelo menos uma vez por semana. Devem ser calculadas e registadas todas as variações de peso. No final do ensaio, os animais sobreviventes são pesados e, seguidamente, sacrificados sem dor.

1.6.2. Patologia Todos os animais de ensaio (incluindo aqueles que morreram durante o ensaio ou que foram retirados do ensaio por motivos de preservação do bem-estar do animal) devem ser sujeitos a uma autópsia pouco pormenorizada. Devem ser registadas as alterações patológicas principais observadas em cada animal. Deve também ser considerada a realização de um exame microscópico dos órgãos que mostrem sinais de patologia grave em animais que sobreviveram, no mínimo, 24 horas após a aplicação da dose inicial, já que este exame pode fornecer informação útil.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. Relatório do ensaio O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:

Substância de ensaio:

natureza física, pureza e propriedades físico-químicas relevantes (incluindo isomerização);

dados relativos à identificação química, incluindo o número CAS.

Excipiente (se apropriado):

caso o excipiente não seja água, uma justificação para a sua escolha.

Animais de ensaio:

espécie/estirpe usada;

estado microbiológico do animal, caso seja conhecido;

número, idade e sexo dos animais (incluindo, quando necessário, uma justificação para o uso de machos em vez de fêmeas);

proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.

Condições do ensaio:

informação pormenorizada sobre a formulação da substância, incluindo informação pormenorizada sobre a forma física do material administrado;

informação pormenorizada sobre a administração da substância de ensaio, incluindo volume das doses e o momento da aplicação;

informação pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da água (incluindo tipo e origem da dieta, origem da água);

justificação para a escolha da dose inicial.

Resultados:

tabela dos dados de resposta e da dose para cada animal (ou seja, animais que apresentaram sinais de toxicidade, incluindo mortalidade, natureza, gravidade e duração dos efeitos);

tabela com indicação do peso corporal e suas variações;

pesos individuais de animais no dia em que é aplicada a dose, uma vez por semana no restante período e na altura da sua morte ou sacrifício;

data e momento da morte, no caso de ocorrência de morte antes do sacrifício previsto;

evolução temporal do aparecimento de sintomas de toxicidade e sua reversibilidade para cada animal;

resultados da autópsia e resultados histopatológicos para cada animal, caso se encontrem disponíveis.

Análise dos resultados.

Conclusões.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)

REFERÊNCIAS Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D., (1986) New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, p. 86. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D., (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336-341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., (1994) The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559-610. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., (1995) The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729-734. Diener W., and Schlede E., (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, p. 129-134. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D., (1992) A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method — An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, p. 455-470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D., (1994) The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659-670. OECD, (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris. OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11. [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R. L., Cotruvo, J. A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel K. A., Walker A. P., Chu I.; Goddard M, Segal L., Springer J. A. and Myers R. C., (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, p. 223-231. Chan P.K. and A.W. Hayes., (1994) Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd., New York, USA.

B.2. TOXICIDADE AGUDA (INALAÇÃO)

B.2.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO É útil possuir informações preliminares sobre a distribuição granulométrica das partículas, pressão de vapor, ponto de fusão, ponto de ebulição, ponto de inflamação e explosividade (se aplicável) da substância de ensaio. Ver também a Introdução Geral, parte B (ponto A).

1.2. DEFINIÇÕES Ver Introdução Geral, parte B (ponto B).

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Nenhuma.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Vários grupos de animais de experiência são expostos, durante um período determinado, a concentrações diferentes de substâncias a testar à razão de uma concentração por grupo. Subsequentemente, procede-se à observação dos efeitos e das mortes ocorridas. Os animais que morrem durante o ensaio são submetidos a autópsia e no fim do ensaio os animais sobreviventes são também submetidos a autópsia. Pode ser necessário sacrificar os animais que apresentem manifestações graves e permanentes de angústia e dor. Não se deve dosear as substâncias de ensaio de uma forma que se saiba provocar dor acentuada e angústia devido às suas propriedades corrosivas ou irritantes.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Nenhum.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.6.

1.6.1. Preparativos Os animais são mantidos sob as condições de alojamento e alimentação experimentais durante pelo menos cinco dias antes do ensaio. Antes do ensaio procede-se a uma escolha aleatória de animais adultos jovens e saudáveis que são distribuídos por grupos de tratamento. Não é necessário submetê-los a uma exposição simulada a não ser que tal facto seja indicado pelo tipo de aparelho de exposição que se utiliza. Pode ser necessário micronizar as substâncias de ensaio sólidas no sentido de se conseguir partículas com dimensões apropriadas. Sempre que necessário pode adicionar-se à substância de ensaio um veículo adequado para ajudar a obter uma concentração adequada da substância de ensaio na atmosfera e deverá utilizar-se então um grupo de controlo tratado com veículo. No caso de se utilizar um veículo ou outros aditivos para facilitar a administração da dose, é necessário fazer a sua selecção entre os que não produzem efeitos tóxicos. Pode recorrer-se a dados históricos se for apropriado.

1.6.2. Condições de ensaio

1.6.2.

1.6.2.1. Animais de experiência Salvo no caso de haver contra-indicações, o rato constitui a espécie preferencial. Devem utilizar-se as estirpes vulgarmente utilizadas em laboratório. Para cada sexo, no início do ensaio, o intervalo de variação do peso para os animais utilizados não deverá exceder ± 20 % do valor médio apropriado.

1.6.2.2. Número e sexo Utilizam-se pelo menos 10 roedores (cinco fêmeas e cinco machos) para cada nível de concentração. As fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas. Nota: Nos ensaios de toxicidade aguda com animais de uma ordem superior à dos roedores deve levar-se em consideração a possibilidade de utilizar um menor número de animais. As doses deverão ser seleccionadas cuidadosamente e deverão ser feitos todos os esforços possíveis para não exceder as doses moderadamente tóxicas. Nestes ensaios deve evitar-se a administração de doses letais da substância de ensaio.

1.6.2.3. Concentrações de exposição Estas devem ser em número suficiente, pelo menos três, e adequadamente espaçadas para originarem grupos de ensaio com uma diversidade de efeitos tóxicos e de taxas de mortalidade. Os dados deverão ser suficientes para permitirem traçar uma curva dose/resposta e, sempre que possível, uma determinação aceitável do valor CL50.

1.6.2.4. Teste limite Se a exposição de cinco machos e cinco fêmeas a uma concentração de 20 mg/l de um gás ou 1 mg/l de um aerossol ou de partículas, durante quatro horas (ou, nos casos em que tal não seja possível devido às propriedades físico-químicas, incluindo propriedades explosivas, da substância testada, à máxima concentração que seja possível utilizar) não provocar a morte a qualquer animal num prazo de 14 dias, pode considerar-se desnecessário prosseguir os testes.

1.6.2.5. Tempo de exposição O período de exposição deve ser de quatro horas.

1.6.2.6. Equipamento Os animais deverão ser expostos à substância a testar por meio de um dispositivo de inalação concebido de forma a conseguir-se um fluxo de ar contínuo que assegurará pelo menos 12 renovações de ar por hora e que garanta uma concentração de oxigénio apropriada e uma distribuição uniforme do produto a testar no ar. No caso de se utilizar uma câmara, essa será concebida de maneira a obter-se uma superlotação mínima dos animais e uma exposição máxima da substância de ensaio. Como regra geral, para se assegurar a estabilidade da atmosfera na câmara, o volume total dos animais de experiência não deverá ultrapassar 5 % do volume da câmara de ensaio. Pode também recorrer-se a um sistema de exposição oronasal, de cabeça apenas ou de corpo inteiro em câmara individual; os dois primeiros tipos de exposição permitem reduzir a penetração por outras vias.

1.6.2.7. Período de observação O período de observação deve ser de, pelo menos, 14 dias. Contudo, o período de duração da observação não deve ser fixo rigidamente. Deve ser determinado pelas reacções tóxicas, o momento de aparecimento de sintomas e a duração do período de recuperação; em consequência, pode ser prolongado quando se considerar necessário. O momento em que as manifestações de toxicidade aparecem e desaparecem e o momento da morte são importantes, especialmente se existir uma tendência para retardar as mortes.

1.6.3. Procedimento Imediatamente antes da exposição, os animais são pesados e depois são expostos à concentração de ensaio no aparelho especificado durante um período de quatro horas, após equilíbrio da concentração na câmara de ensaio. O tempo para se estabelecer o equilíbrio deve ser curto. A temperatura de ensaio deve ser mantida a 22oC ± 3oC. Em condições ideais a humidade relativa deverá ser mantida entre 30 % e 70 %, mas em alguns casos (por exemplo, em ensaios de alguns aerossóis) tal pode ser impraticável. A manutenção de uma pressão ligeiramente negativa no interior da câmara de ensaio (≤ 5 mm de água) evitará a fuga da substância de ensaio para o meio envolvente. Durante o período de exposição não haverá fornecimento de alimentos nem de água. Devem ser utilizados sistemas adequados para gerar e monitorizar a atmosfera de ensaio. O sistema deve garantir que se atinja tão rapidamente quanto possível condições de exposição estáveis. A câmara de ensaio deverá ser concebida e utilizada de tal modo que se mantenha no seu interior uma distribuição homogénea da atmosfera de ensaio. Deverá ser feita a medição ou monitorização de: Durante e após a exposição às concentrações são feitas observações, que devem ser registadas sistematicamente; são feitas fichas individuais para cada animal. As observações deverão ser efectuadas com frequência regular durante o primeiro dia. Deve efectuar-se um exame clínico cuidadoso pelo menos uma vez durante cada dia de trabalho, e deverão ser efectuadas outras observações diariamente tomando-se acções apropriadas para minimizar as perdas de animais submetidos a estudo, por exemplo, efectuar-se-á a autópsia ou a refrigeração dos animais encontrados mortos e efectuar-se-á o isolamento ou o sacrifício dos animais fracos ou moribundos. As observações deverão incluir as modificações do pêlo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central, bem como a actividade somatomotora e do comportamento. Deve prestar-se particular atenção à observação de tremores, convulsões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. O momento da morte deve ser registado com uma exactidão tão grande quanto possível. O peso de cada animal deve ser determinado semanalmente após a exposição e no momento da morte. Os animais que morrem durante o ensaio e os sobreviventes no fim do ensaio são submetidos a autópsia com particular referência para quaisquer modificações no tracto respiratório superior e inferior. Deverão ser registadas todas as modificações patológicas. Sempre que for aconselhável deverão ser preparadas amostras dos tecidos para exame histopatológico.

1.6.3. a)

débito de ar (permanentemente);

concentração real da substância a testar medida na zona de respiração, pelo menos três vezes durante a exposição (algumas atmosferas, por exemplo aerossóis em concentrações elevadas, podem necessitar de uma monitorização mais frequente). Durante o período de exposição diária a concentração não variará além de + 15 % do valor médio. Contudo, no caso de alguns aerossóis esta precisão pode não ser possível e uma variação maior poderá então ser aceitável. No caso dos aerossóis, efectuar-se-á uma análise granulométrica das partículas tantas vezes quantas forem necessárias (pelo menos uma vez por grupo de ensaio);

temperatura e humidade, continuamente, se for possível.

2. RESULTADOS Os resultados deverão ser resumidos em quadros indicando-se para cada grupo de experiência o número de animais no início do teste, o momento da morte de cada animal, o número de animais que exibem outras manifestações de toxicidade, a descrição dos efeitos tóxicos e os resultados da autópsia. As variações de peso deverão ser calculadas e registadas quando o período de sobrevivência exceder um dia. Procede-se ao registo dos animais que tiverem de ser sacrificados devido à dor e à angústia associadas à substância, procedendo-se de igual modo para as mortes associadas ao composto. O valor CL50 pode ser determinado por um método reconhecido. A avaliação dos resultados deverá incluir a relação, se existir, entre a exposição dos animais à substância de ensaio e a incidência e gravidade de todas as anomalias, incluindo as anomalias de comportamento e clínicas, as lesões graves, as modificações do peso do corpo, a mortalidade e quaisquer outros efeitos toxicológicos.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte: Resultados sobre a exposição Estes resultados deverão ser agrupados em quadros e apresentados com valores médios e com uma medição de variabilidade (por exemplo, desvio-padrão) e se possível deverão conter:

espécies, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.;

condições de ensaio: descrição do aparelho de exposição incluindo projecto, tipo, dimensões, fonte de ar, sistema para gerar aerossóis, método de condicionamento do ar e método para alojar animais na câmara de ensaio quando esta é utilizada. Deve fazer-se uma descrição do equipamento para a medição da temperatura, da humidade e das concentrações em aerossol e da distribuição granulométrica.

3.1. a)

débitos de ar através do equipamento de inalação;

temperatura e humidade do ar;

concentrações nominais (quantidade total da substância de ensaio fornecida ao equipamento de inalação dividida pelo volume de ar);

natureza do veículo, se for utilizado;

concentrações reais na zona de respiração;

diâmetro aerodinâmico médio de massa (DAMM) e desvio-padrão geométrico (DPG);

período de equilíbrio;

período de exposição:

apresentação de um quadro com os dados de resposta por sexo e por nível de exposição (isto é, número de animais que morreram ou que foram sacrificados durante o ensaio; número de animais que apresentam manifestações de toxicidade; número de animais expostos),

momento da morte durante ou após a exposição, razões e critérios utilizados para o sacrifício dos animais,

todas as observações,

valor CL50 determinado para cada sexo no fim do período de observação (com especificação do método de cálculo),

intervalo de confiança a 95 % para o valor CL50 (no caso de este poder ser obtido),

curva de dose/mortalidade e seu declive (sempre que permitido pelo método de determinação),

resultados da autópsia,

resultados das observações histopatológicas,

discussão dos resultados (deverá prestar-se particular atenção ao efeito que o sacrifício de animais durante o ensaio pode ter sobre o valor CL50 calculado),

interpretação dos resultados.

3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Ver Introdução Geral, parte B (ponto D).

4. REFERÊNCIAS Ver Introdução Geral, parte B (ponto E).

B.3. TOXICIDADE AGUDA (DÉRMICA)

B.3.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Ver Introdução Geral, parte B (ponto A).

1.2. DEFINIÇÃO Ver Introdução Geral, parte B (ponto B).

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Nenhumas.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Aplica-se a substância de ensaio sobre a pele de diversos grupos de animais de experiência, em doses graduadas, utilizando-se uma dose por grupo. Subsequentemente, procede-se à observação dos efeitos e das mortes ocorridas. Os animais que morrem durante o ensaio são submetidos a autópsia e no fim do ensaio os animais sobreviventes são também submetidos a autópsia. Pode ser necessário sacrificar os animais que apresentem manifestações graves e permanentes de angústia e dor. Não se deve dosear as substâncias de ensaio de uma forma que se saiba provocar dor acentuada e angústia devido às suas propriedades corrosivas ou irritantes.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Nenhum.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.6.

1.6.1. Preparativos Os animais são mantidos nas suas gaiolas sob condições de alimentação e alojamento experimentais durante pelo menos cinco dias antes da experiência. Antes do ensaio os animais adultos jovens e saudáveis são seleccionados aleatoriamente e distribuídos por grupos de tratamento. Aproximadamente 24 horas antes do ensaio deve remover-se o pêlo da região dorsal dos animais, tosquiando-o ou rapando-o. Ao tosquiar ou ao rapar o pêlo é necessário tomar precauções para evitar lesões da pele que possam alterar a sua permeabilidade. A área destinada à aplicação da substância de ensaio não poderá ser inferior a 10 % da superfície corporal. Sempre que se procede ao ensaio de substâncias sólidas, as quais podem ser pulverizadas quando necessário, a substância de ensaio deve ser humedecida com água ou com um veículo apropriado para garantir um bom contacto com a pele. No caso de se utilizar um veículo, deve tomar-se em consideração a influência desse veículo relativamente à penetração da substância de ensaio na pele. Geralmente utilizam-se as substâncias de ensaio líquidas não diluídas.

1.6.2. Condições de ensaio

1.6.2.

1.6.2.1. Animais de experiência Pode ser utilizado o rato ou o coelho. Podem ser utilizadas outras espécies sendo necessário justificar a sua utilização. Devem utilizar-se as estirpes vulgarmente utilizadas em laboratório. Para cada sexo, no início do ensaio, o intervalo de variação do peso para os animais utilizados não deverá exceder ± 20 % do valor médio apropriado.

1.6.2.2. Número e sexo Utilizam-se pelo menos cinco animais para cada dose. Devem ser todos do mesmo sexo. No caso de se utilizar fêmeas estas devem ser nulíparas e não devem estar grávidas. No caso de existir informação disponível demonstrando que um dos sexos é nitidamente mais sensível, deve fazer-se a administração das doses aos animais desse sexo. Nota: Nos ensaios de toxicidade aguda com animais de uma ordem superior à dos roedores deve levar-se em consideração a possibilidade de utilizar um menor número de animais. As doses deverão ser seleccionadas cuidadosamente e deverão ser feitos todos os esforços possíveis para não exceder as doses moderadamente tóxicas. Nestes ensaios deve evitar-se a administração de doses letais da substância de ensaio.

1.6.2.3. Doses Estas devem ser em número suficiente, pelo menos três, e adequadamente espaçadas para originarem grupos de ensaio com uma diversidade de efeitos tóxicos e de taxas de mortalidade. Ao tomar-se a decisão sobre as doses deve levar-se em consideração quaisquer efeitos irritantes ou corrosivos. Os dados deverão ser suficientes para permitirem traçar uma curva dose/resposta e, sempre que possível, uma determinação aceitável do valor DL50.

1.6.2.4. Teste limite Pode efectuar-se um teste limite com uma dose de pelo menos 2000 mg/kg de peso do corpo num grupo de cinco machos e de cinco fêmeas utilizando os procedimentos anteriormente descritos. No caso de se observar mortalidade associada ao composto é necessário considerar a hipótese de realizar um estudo completo.

1.6.2.5. Período de observação O período de observação deve ser de pelo menos 14 dias. Contudo o período de duração da observação não deve ser fixo rigidamente. Deve ser determinado pelas reacções tóxicas, o momento de aparecimento de sintomas e a duração do período de recuperação; em consequência, pode ser prolongado quando se considerar necessário. O momento em que as manifestações de toxicidade aparecem e desaparecem e o momento da morte são importantes, especialmente se existir uma tendência para retardar as mortes.

1.6.3. Procedimento Os animais serão colocados em gaiolas individuais. A substância de ensaio será aplicada uniformemente numa área aproximadamente equivalente a 10 % da superfície total do corpo. No caso de substâncias altamente tóxicas, a superfície a utilizar poderá ser menor mas a camada da substância deverá ser o mais fina e uniforme possível. A substância de ensaio deve ser mantida em contacto com a pele por meio de uma gaze porosa e de um adesivo antialérgico, durante um período de exposição de 24 horas. A superfície tratada será por sua vez convenientemente coberta de maneira a manter no seu lugar a gaze e a substância de ensaio e de modo a evitar que os animais ingiram a substância. Podem ser utilizados aparelhos de contenção para evitar a ingestão da substância mas não se recomenda a imobilização completa, No fim do período de exposição é necessário eliminar todos os resíduos da substância, se possível, utilizando água ou qualquer outro meio adequado para limpeza da pele. As observações devem ser feitas e registadas sistematicamente. São feitas fichas individuais para cada animal. As observações deverão ser efectuadas com frequência regular durante o primeiro dia. Deve efectuar-se um exame clínico cuidadoso pelo menos uma vez durante cada dia de trabalho, e deverão ser efectuadas outras observações diariamente tomando-se acções apropriadas para minimizar as perdas de animais submetidos a estudo, por exemplo, efectuar-se-á a autópsia ou a refrigeração dos animais encontrados mortos e efectuar-se-á o isolamento ou o sacrifício dos animais fracos ou moribundos. As observações deverão incluir as modificações do pêlo, pele tratada, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central, bem como a actividade somatomotora e do comportamento. Deve prestar-se particular atenção à observação de tremores, convulsões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. O momento da morte deve ser registado com uma exactidão tão grande quanto possível. Os animais que morrem durante o ensaio e os que sobrevivem até ao fim do ensaio são submetidos a autópsia. Deverão ser registadas todas as modificações patológicas. Sempre que for aconselhável deverão ser preparadas amostras dos tecidos para exame histopatológico.

1.6.3. Avaliação da toxicidade no outro sexo

Depois de se ter completado o estudo relativamente a um dos sexos, submete-se a ensaio pelo menos um grupo de cinco animais do sexo oposto para se verificar se os animais desse sexo não são nitidamente mais sensíveis à substância de ensaio. Em circunstâncias individuais pode justificar-se a utilização de menos animais. No caso de existir informação adequada disponível suficiente para demonstrar que os animais do sexo testado são nitidamente mais sensíveis, é dispensável proceder a ensaios com animais do outro sexo.

2. RESULTADOS Os resultados deverão ser resumidos em quadros indicando-se para cada grupo de experiência o número de animais no início do teste, o momento da morte de cada animal, o número de animais que exibem outras manifestações de toxicidade, a descrição dos efeitos tóxicos e os resultados da autópsia. Os pesos de cada animal deverão ser determinados e registados imediatamente antes da administração da substância de ensaio, decorrida uma semana e no momento da morte; as variações de peso deverão ser calculadas e registadas quando o período de sobrevivência exceder um dia. Procede-se ao registo dos animais que tiverem que ser sacrificados devido à dor e à angústia provocados pela substância procedendo-se de igual modo para as mortes provocadas pela substância. O valor DL50 pode ser determinado por um método reconhecido. A avaliação dos resultados deverá incluir a relação, se existir, entre a exposição dos animais à substância de ensaio e a incidência e gravidade de todas as anormalidades, incluindo as anomalias de comportamento e clínicas, as lesões graves, as modificações do peso do corpo, a mortalidade e quaisquer outros efeitos toxicológicos.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

espécies, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.,

condições experimentais (incluindo o método de limpeza da pele e tipo de gaze: oclusiva ou não oclusiva),

níveis de dosagem (com veículo, no caso de este ser utilizado, e as concentrações),

sexo dos animais submetidos à experiência,

quadros com os dados de resposta por sexo e por valores de dosagem (isto é, número de animais que morreram ou que foram sacrificados durante os ensaios, número de animais que apresentam manifestações de toxicidade, número de animais expostos),

momento da morte após a administração da dose, razões e critérios utilizados para o sacrifício dos animais,

todas as observações,

valor DL50 para o grupo do sexo submetido ao estudo completo ao longo do período de 14 dias (especificando-se o método de determinação),

intervalo de confiança a 95 % para o valor DL50 (no caso de ser possível obter esse valor),

curva dose/mortalidade e seu declive (no caso de isto ser possível com o método de determinação),

resultados da autópsia,

quaisquer resultados das observações histopatológicas,

resultados de qualquer ensaio efectuado sobre o outro sexo,

discussão dos resultados (deve prestar-se particular atenção ao efeito que o sacrifício dos animais durante o ensaio pode ter sobre o valor DL50 calculado),

interpretação dos resultados.

3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Ver Introdução Geral, parte B (ponto D).

4. REFERÊNCIAS Ver Introdução Geral, parte B (ponto E).

B.4. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAÇÃO/CORROSÃO DÉRMICA

B.4.

1. MÉTODO O presente método baseia-se na publicação OECD TG 404 (2002) (normas de ensaio da OCDE).

1.

1.1. INTRODUÇÃO Na preparação do presente método optimizado foi dada especial atenção aos possíveis melhoramentos através da avaliação de toda a informação já existente sobre a substância de ensaio, de modo a evitar testes desnecessários em animais de laboratório e assim ter em consideração a problemática da protecção dos animais. O presente método inclui a recomendação de se levar a cabo uma análise da importância das provas de todos os dados relevantes existentes antes de se efectuar o ensaio in vivo descrito para irritação/corrosão pela substância. No caso de não se encontrarem disponíveis dados suficientes, estes podem ser obtidos através da aplicação de ensaios sequenciais (1). A estratégia de ensaio recomendada inclui a execução de ensaios in vitro validados e aceites e é fornecida como anexo ao presente método. Além disso, quando for apropriado, recomenda-se a aplicação sucessiva (não simultânea) de três pensos de ensaio ao animal no ensaio in vivo inicial. Tendo em consideração o interesse científico e a protecção dos animais, não devem ser efectuados ensaios in vivo até se proceder a uma avaliação de todos os dados disponíveis relevantes à potencial corrosibilidade/irritabilidade dérmica de uma substância mediante uma análise de importância das provas. Os dados devem incluir resultados de estudos em humanos e/ou animais de laboratório, provas de corrosibilidade/irritabilidade de uma ou mais substâncias estruturalmente relacionadas, ou de misturas dessas substâncias, dados que demonstrem elevada acidez ou alcalinidade da substância (2) (3) e resultados de ensaios in vitro ou ex vivo validados e aceites (4) (5) (5a). Esta análise deve reduzir a necessidade de ensaios in vivo da corrosibilidade/irritabilidade dérmica de substâncias para as quais já existem dados suficientes provenientes de outros estudos em relação a estes dois factores. Junta-se em anexo ao presente método uma estratégia de ensaio sequencial preferível, que inclui a execução de ensaios validados e aceites in vitro ou ex vivo para irritação/corrosão. A estratégia foi desenvolvida num grupo de trabalho (workshop) da OCDE (6), no qual foi recomendada por unanimidade dos participantes, tendo sido adoptada como estratégia de ensaio recomendada pelo sistema harmonizado a nível mundial para a classificação de substâncias químicas (GHS) (7). Apesar de esta estratégia de ensaio sequencial não ser parte integrante do método de ensaio B.4, recomenda-se que a mesma seja adoptada antes da realização de ensaios in vivo. No caso de novas substâncias recomenda-se uma metodologia de ensaio por etapas para a obtenção de dados científicos sobre a corrosibilidade/irritabilidade da substância. No caso de substâncias já existentes, mas cujos dados insuficientes sobre irritação/corrosão dérmica são insuficientes, recomenda-se a adopção desta estratégia para a obtenção dos dados em falta. Caso se opte por uma estratégia ou procedimento de ensaio diferente ou se decida não aplicar uma metodologia de ensaio por etapas, deve apresentar-se uma justificação para a opção feita. Um ensaio in vivo, apenas deve ser considerado caso não seja possível determinar a corrosibilidade, ou a irritabilidade, através da análise de importância das provas e de acordo com a estratégia de ensaio sequencial (ver anexo).

1.2. DEFINIÇÕES Irritação dérmica: consiste na produção de danos reversíveis na pele após a aplicação da substância de ensaio, por um período não superior a quatro horas. Corrosão dérmica: consiste na produção de danos irreversíveis na pele — por exemplo, necrose visível através da epiderme e que atinge a derme, após a aplicação de uma substância de ensaio por um período não superior a quatro horas. As reacções corrosivas típicas são úlceras, sangramento, crostas ensanguentadas e, após o período de observação de 14 dias, empalidecimento devido à descoloração da pele, áreas alargadas de alopecia e cicatrizes. Deve ser considerada uma análise histopatológica na avaliação de lesões duvidosas.

1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO A substância de ensaio é aplicada em dose única na pele de um animal de experiência; as áreas de pele não tratadas do animal de experiência são utilizadas como controlo. O grau de irritação/corrosão é observado e registado em intervalos determinados e detalhadamente descrito de modo a permitir uma avaliação completa dos efeitos. A duração do estudo deve ser suficiente para avaliar a reversibilidade ou irreversibilidade dos efeitos observados. Os animais que apresentarem sinais de se encontrarem em grave perigo e/ou apresentarem sinais de dor durante qualquer das etapas do ensaio devem ser abatidos e a substância deve ser classificada de acordo com estas observações. Os critérios para a decisão de abater animais moribundos e animais em grave sofrimento podem ser consultados na referência (8).

1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.4.

1.4.1. Preparação do ensaio in vivo

1.4.1.

1.4.1.1. Selecção de espécies animais O coelho albino é o animal de laboratório mais adequado, devendo ser usados coelhos jovens adultos saudáveis. A utilização de outras espécies deve ser justificada.

1.4.1.2. Preparação dos animais Aproximadamente 24 horas antes do ensaio, o pêlo deve ser removido por corte curto da área dorsal do tronco dos animais. Deve ter-se o cuidado de não ferir a pele do animal e só devem ser usados animais com pele saudável e intacta. Algumas estirpes de coelhos têm tufos densos de pêlo, que são mais proeminentes em certas épocas do ano. Estas áreas de crescimento denso de pêlo não devem ser utilizadas como local de ensaio.

1.4.1.3. Condições de alojamento e alimentação Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do biotério para os coelhos deve ser de 20oC (± 3oC). Embora a humidade relativa deva ser de pelo menos 30 % e de preferência não exceder os 70 %, excepto durante o período de limpezas, o valor pretendido deve ser de 50 %-60 %. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguida de uma de 12 horas de escuridão. Na alimentação, podem ser utilizadas dietas convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber sem restrições.

1.4.2. Protocolo de ensaio

1.4.2.

1.4.2.1. Aplicação da substância de ensaio A substância de ensaio deve ser aplicada numa pequena área de pele (aproximadamente 6 cm2) e coberta com um penso de gaze, colado com fita adesiva não irritante. Nos casos em que não é possível aplicação directa (por exemplo, líquidos e algumas pastas), a substância de ensaio deve ser aplicada num penso de gaze, que é, por sua vez, aplicado à pele. Durante o período de exposição, o penso deve estar em contacto com a pele de uma forma ligeiramente solta através de uma ligadura semioclusiva adequada. Se a substância de ensaio for aplicada num penso, este deve ser mantido sobre a pele de modo a assegurar um bom contacto e uma distribuição uniforme da substância na pele. Deve ser evitado o acesso do animal ao penso e a ingestão ou inalação da substância de ensaio. As substâncias de ensaio líquidas são geralmente utilizadas sem diluição. Quando se ensaiam sólidos (que podem ser pulverizados, caso tal seja considerado necessário), a substância de ensaio deve ser humedecida com a menor quantidade de água (ou, se necessário, com outro excipiente adequado) suficiente para assegurar um bom contacto com a pele. No caso de serem utilizados excipientes que não água, a influência potencial do excipiente na irritação da pele pela substância de ensaio deve ser mínima ou nula. No final do período de exposição, que é normalmente de quatro horas, a substância de ensaio residual deve ser removida, caso tal seja praticável, utilizando água ou um solvente apropriado, que não altere a resposta ou a integridade da epiderme.

1.4.2.2. Nível de dosagem Aplica-se ao local de ensaio uma dose de 0,5 ml de líquido ou de 0,5 g de sólido ou pasta.

1.4.2.3. Ensaio inicial (ensaio in vivo de irritação/corrosão dérmica utilizando um animal) Recomenda-se vivamente que o ensaio in vivo seja efectuado inicialmente utilizando apenas um animal, sobretudo quando se suspeita que a substância é potencialmente corrosiva. Tal procedimento está em conformidade com a estratégia de ensaio sequencial (ver anexo 1). No caso de uma substância ter sido considerada corrosiva com base numa análise de importância das provas, não são necessários ensaios adicionais em animais. Para a maior parte das substâncias que se suspeite serem corrosivas, não são normalmente necessários ensaios in vivo adicionais. No entanto, nos casos em que, devido a insuficiência de provas, se considere necessária a obtenção de dados adicionais, pode ser efectuado um número restrito de ensaios em animais utilizando a seguinte metodologia: aplicação sequencial de até três pensos de ensaio ao animal. O primeiro penso é removido após três minutos. Caso não se observe qualquer reacção grave na pele, aplica-se um segundo penso, que é removido ao fim de uma hora. Se nesta etapa as observações indicarem que se pode aumentar o tempo de exposição para quatro horas em condições não agressivas para o animal, aplica-se um terceiro penso, que é removido após quatro horas, sendo a resposta devidamente graduada. Caso seja observado um efeito corrosivo após qualquer das três exposições sequenciais, o ensaio é imediatamente finalizado. Caso não se observe qualquer efeito corrosivo após a remoção do último penso, o animal é observado durante 14 dias, excepto se desenvolver corrosão antes do final desse período. Nos casos em que a substância de ensaio não seja susceptível de provocar corrosão, mas que possa ser irritante, deve ser aplicado um único penso a um animal durante quatro horas.

1.4.2.4. Ensaio de confirmação (ensaio in vivo de irritação dérmica com animais adicionais) Se não for observado um efeito corrosivo no ensaio inicial, a resposta irritante ou negativa deve ser confirmada utilizando até dois animais adicionais, cada um com um penso e por um período de exposição de quatro horas. Se for observado um efeito irritante no ensaio inicial, o ensaio de confirmação pode ser efectuado de uma forma sequencial ou através da exposição simultânea de dois animais adicionais. No caso excepcional de não ser efectuado um ensaio inicial, podem tratar-se dois ou três animais com um penso único, que é removido quatro horas após a aplicação. No caso de se utilizarem dois animais e ambos apresentarem a mesma resposta, não é necessário efectuar mais ensaios. Caso contrário, o terceiro animal é igualmente ensaiado. Pode ser necessária a utilização de animais adicionais para confirmar respostas equívocas.

1.4.2.5. Período de observação O período de observação deve ter uma duração suficiente para uma avaliação completa da reversibilidade dos efeitos observados. No entanto, a experiência deve ser interrompida em qualquer altura caso o animal apresente sintomas continuados de dor intensa ou de se encontrar em situação de perigo. Para a determinação da reversibilidade dos efeitos, os animais devem ser observados durante 14 dias após a remoção dos pensos. No caso de se observar reversibilidade antes do fim do período de 14 dias, deve interromper-se a experiência.

1.4.2.6. Observações clínicas e graduação das reacções da pele Todos os animais devem ser examinados para sintomas de eritema e edema, sendo as respostas avaliadas aos 60 minutos e às 24, 48 e 72 horas após a remoção do penso. No ensaio inicial com um animal, o local de ensaio é igualmente examinado imediatamente após a remoção do penso. As reacções dérmicas são graduadas e registadas de acordo com a graduação da tabela infra. Caso ocorram danos na pele que não possam ser identificados como irritação ou corrosão após 72 horas, pode ser necessário efectuar observações até ao dia 14 para determinar a reversibilidade dos efeitos. Além da observação de irritação, todos os efeitos tóxicos locais, tais como perda de gordura cutânea e quaisquer efeitos sistémicos adversos (por exemplo, efeitos em sintomas de toxicidade e efeitos no peso corporal), devem ser descritos e registados pormenorizadamente. Poderá ser efectuado um exame histopatológico para clarificar respostas equívocas. A graduação das respostas dérmicas é necessariamente subjectiva. O pessoal que executa as observações deve ser treinado adequadamente no sistema de graduação utilizado (ver tabela infra) para se promover a harmonização da graduação da resposta dérmica e auxiliar os laboratórios de ensaio e as pessoas envolvidas na obtenção e interpretação das observações. Poderá ser útil a consulta de um guia ilustrado para graduação da irritação dérmica e outras lesões (9).

2. DADOS

2.

2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS Os resultados do estudo devem ser resumidos sob a forma de tabela no relatório final de ensaio e devem abranger todos os itens descritos na secção 3.1.

2.2. ANÁLISE DOS RESULTADOS Os resultados de irritação dérmica devem ser avaliados conjuntamente com a natureza e a gravidade das lesões e a sua reversibilidade ou ausência de reversibilidade. As respostas individuais não representam um padrão absoluto das propriedades irritantes do material, já que são também avaliados outros efeitos do material de ensaio. Pelo contrário, os resultados individuais devem ser encarados como valores de referência, que necessitam de ser avaliados conjuntamente com todas as outras observações efectuadas durante o estudo. Deve ser considerada a reversibilidade das lesões dérmicas na avaliação da resposta irritante. Nos casos em que ocorrerem respostas como alopecia (área limitada), hiperqueratose, hiperplasia e descamação persistentes no final do período de 14 dias de observação, a substância de ensaio deve ser considerada irritante.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:

Fundamentação lógica para o ensaio in vivo: análise de importância das provas dos dados de ensaio preexistentes, incluindo os resultados da estratégia de ensaio sequencial:

descrição dos dados relevantes disponíveis de ensaios anteriores;

dados obtidos em cada etapa da estratégia de ensaio;

descrição dos ensaios in vitro efectuados, incluindo detalhes sobre o protocolo, resultados obtidos com substâncias de ensaio/referência;

análise de importância das provas para a realização do estudo in vivo.

Substância de ensaio:

dados de identificação (por exemplo, número CAS, origem, grau de pureza, impurezas conhecidas, número de lote);

natureza física e propriedades físico-químicas (por exemplo, pH, volatilidade, solubilidade, estabilidade);

no caso de misturas, composição e percentagens relativas dos componentes.

Excipiente:

identificação, concentração (quando apropriado), volume utilizado;

justificação para a escolha do excipiente.

Animais de ensaio:

espécie/estirpe utilizada, fundamentação lógica para a utilização de outro tipo de animais que não coelhos albinos;

número de animais de cada sexo;

peso individual dos animais no início e no final do ensaio;

idade no início do estudo;

origem dos animais, condições de alojamento, dieta, etc.

Condições do ensaio:

técnica de preparação do local de aplicação do penso;

descrição pormenorizada dos materiais utilizados no penso e da técnica de aplicação do penso;

descrição pormenorizada da preparação, aplicação e remoção da substância de ensaio.

Resultados:

tabelas com a classificação das respostas de irritação/corrosão para cada animal em cada observação;

descrição de todas as lesões observadas;

descrição pormenorizada da natureza e grau da irritação ou corrosão observadas e de quaisquer observações histopatológicas;

descrição de quaisquer outros efeitos adversos locais (por exemplo, perda de gordura cutânea) e efeitos sistémicos, além da irritação ou corrosão dérmica.

Análise dos resultados.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)

REFERÊNCIAS Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410-429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicology In Vitro, 2, p. 19-26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, p. 709-720. ECETOC (1990) Monograph No 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524. Método de Ensaio B.40. Corrosão dérmica. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Disponível no Secretariado da OCDE.]

Tabela I Formação de eritema e escara Formação de edema GRADUAÇÃO DE REACÇÕES DÉRMICAS

Ausência de eritema … 0 Eritema muito ligeiro (fracamente discernível) … 1 Eritema bem definido … 2 Eritema moderado a grave … 3 Eritema grave (vermelhidão cor de carne) e formação de escara que impede a graduação do eritema … 4 Máximo possível: 4 Ausência de edema … 0 Edema muito ligeiro (fracamente discernível) … 1 Edema ligeiro (bordos da área bem definidos por elevação delineada) … 2 Edema moderado (com uma elevação de aproximadamente 1 mm) … 3 Edema grave (com uma elevação superior a 1 mm e excedendo a área de exposição) … 4 Máximo possível: 4 Poderá ser efectuado um exame histopatológico para clarificar respostas equívocas.

B.5. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAÇÃO/CORROSÃO OCULAR

B.5.

1. MÉTODO O presente método baseia-se na publicação OECD TG 405 (2002) (normas de ensaio da OCDE).

1.

1.1. INTRODUÇÃO Na preparação do presente método optimizado foi dada especial importância aos possíveis melhoramentos resultantes da avaliação de toda a informação já existente sobre a substância de ensaio, de modo a evitar ensaios desnecessários em animais de laboratório e assim ter em consideração a problemática da protecção dos animais. O presente método inclui a recomendação de se efectuar uma análise da importância das provas (1) dos dados relevantes existentes antes de se efectuar o ensaio in vivo descrito para irritação/corrosão ocular aguda. No caso de não se encontrarem disponíveis dados suficientes, recomenda-se a obtenção desses dados através da aplicação de ensaios sequenciais (2) (3). A estratégia de ensaio recomendada inclui a execução de ensaios in vitro validados e aceites e é fornecida como anexo ao método de ensaio. Além disso, recomenda-se o uso de um ensaio in vivo de irritação/corrosão dérmica para previsão da corrosão ocular antes de se considerar um ensaio ocular in vivo. Tendo em consideração o interesse científico e a protecção dos animais, não devem ser considerados ensaios in vivo até se proceder a uma avaliação de todos os dados disponíveis relevantes à potencial corrosibilidade/capacidade irritante ocular de uma substância para uma análise da importância das provas. Os dados devem incluir provas de estudos existentes em humanos e/ou animais de laboratório, provas de corrosibilidade/capacidade irritante de uma ou mais substâncias estruturalmente relacionadas, ou de misturas dessas substâncias, dados que demonstrem elevada acidez ou alcalinidade da substância (4) (5) e resultados de ensaios in vitro ou ex vivo, validados e aceites, para corrosão e irritação da pele (6) (6a). Estes estudos podem ter sido efectuados previamente ou como resultado de uma análise de importância das provas. Uma análise deste tipo pode indicar, para algumas substâncias, a necessidade de estudos in vivo do potencial de irritação/corrosão ocular da substância. Em todos estes casos, antes de considerar a utilização de um ensaio ocular in vivo, deve efectuar-se preferencialmente um estudo in vivo prévio sobre os efeitos dérmicos da substância, avaliados de acordo com o método de ensaio B.4 (7). A aplicação de uma análise de importância das provas e a estratégia de ensaio sequencial deverão reduzir a necessidade de ensaios in vivo para a corrosibilidade/capacidade irritante ocular de substâncias para as quais existem suficientes provas prévias de outros estudos. Caso a determinação do potencial de corrosão ou irritação ocular não possa ser efectuada utilizando a estratégia de ensaio sequencial, mesmo após a realização de um estudo in vivo da corrosão e irritação dérmica, pode ser efectuado um ensaio in vivo de irritação/corrosão ocular. Junta-se ao anexo do presente método de ensaio uma estratégia de ensaio sequencial preferível, que inclui a execução de ensaios validados in vitro ou ex vivo para irritação/corrosão. A estratégia foi desenvolvida num grupo de trabalho (workshop) da OCDE (8), no qual foi recomendada por unanimidade dos participantes, tendo sido adoptada como estratégia de ensaio recomendada pelo sistema harmonizado a nível mundial para a classificação de substâncias químicas (GHS) (9). Recomenda-se que a estratégia de ensaio sequencial seja adoptada antes de realizar ensaios in vivo. No caso de substâncias novas, recomenda-se uma metodologia de ensaio por etapas para a obtenção de dados científicos sobre a corrosibilidade/capacidade irritante da substância. No caso de substâncias já existentes mas cujos dados sobre irritação/corrosão dérmica e ocular são insuficientes, recomenda-se a adopção desta estratégia para a obtenção dos dados em falta. Caso se opte por uma estratégia ou protocolo de ensaio diferente ou se decida não aplicar uma metodologia de ensaio por etapas, deverá apresentar-se uma justificação fundamentada.

1.2. DEFINIÇÕES Irritação ocular: consiste na produção de alterações oculares após a aplicação de uma substância de ensaio à superfície anterior do olho, alterações essas que são completamente reversíveis no intervalo de 21 dias após a aplicação. Corrosão ocular: consiste na produção de lesões do tecido ocular ou enfraquecimento físico grave da visão após aplicação da substância de ensaio à superfície anterior do olho, não reversíveis no intervalo de 21 dias após a aplicação.

1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO A substância de ensaio é aplicada em dose única a um dos olhos do animal de experiência; o olho que não sofre tratamento é utilizado como controlo. O grau de irritação/corrosão ocular é avaliado pelas lesões de perfuração da conjuntiva, da córnea e da íris, a intervalos determinados. São também descritos outros efeitos sobre o olho e efeitos sistémicos adversos, de modo a permitir uma avaliação completa dos efeitos. A duração do estudo deve ser suficiente para avaliar a reversibilidade ou irreversibilidade dos efeitos. Os animais que apresentem sinais continuados de se encontrarem em grave perigo e/ou apresentarem sinais de dor durante qualquer das etapas do ensaio devem ser abatidos e a substância deve ser classificada de acordo com estas observações. Os critérios para a decisão de abater animais moribundos e animais em grave sofrimento podem ser consultados na referência (10).

1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.4.

1.4.1. Preparação para o ensaio in vivo

1.4.1.

1.4.1.1. Selecção de espécies O coelho albino é o animal de laboratório mais adequado, devendo ser usados animais adultos, jovens e saudáveis. A utilização de outras estirpes ou espécies deve ser justificada.

1.4.1.2. Preparação dos animais Devem examinar-se ambos os olhos do animal seleccionado provisoriamente para o ensaio 24 horas antes do início do ensaio. Não devem ser usados animais que apresentem irritação ocular, defeitos oculares ou lesão preexistente da córnea.

1.4.1.3. Condições de alojamento e alimentação Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do biotério para os coelhos deve ser de 20 oC (± 3 oC). A humidade relativa deve ser no mínimo de 30 % e, preferivelmente, não exceder 70 %, excepto durante a lavagem do biotério, devendo no entanto manter-se idealmente a valores de 50 %-60 %. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Como alimentação, podem ser utilizadas dietas de laboratório convencionais com fornecimento ilimitado de água para beber.

1.4.2. Protocolo de ensaio

1.4.2.

1.4.2.1. Aplicação da substância de ensaio A substância de ensaio deve ser colocada no saco conjuntival de um dos olhos de cada animal, depois de se ter separado cuidadosamente a pálpebra inferior do globo ocular. Fecham-se as pálpebras cuidadosamente durante cerca de um segundo de modo a evitar a perda de material. O outro olho, que permanece sem tratamento, é utilizado como controlo.

1.4.2.2. Irrigação Os olhos dos animais de ensaio não devem ser lavados pelo menos nas 24 horas seguintes à instilação da substância de ensaio, excepto para o caso de sólidos (consultar a secção 1.4.2.3.2) e no caso de ocorrência imediata de efeitos corrosivos ou irritantes. Após 24 horas, desde que se considere apropriada, pode ser efectuada uma lavagem. Não se recomenda a utilização de um grupo-satélite de animais para investigar a influência da lavagem, excepto se tal se justificar cientificamente. Se for necessário um grupo-satélite de animais, devem utilizar-se dois coelhos. As condições de lavagem devem ser cuidadosamente documentadas, por exemplo, data e hora da lavagem; composição e temperatura da solução de lavagem; duração, volume e velocidade de aplicação.

1.4.2.3. Nível de dosagem

1.4.2.3.

1.4.2.3.1. Ensaio de líquidos No caso do ensaio de líquidos, usa-se uma dose de 0,1 ml. Não devem ser utilizados nebulizadores de bomba para instilação directa da substância no olho. O nebulizado líquido deve ser expelido e recolhido num recipiente antes de se instilar 0,1 ml no olho.

1.4.2.3.2. Ensaio de sólidos No caso de ensaio de substâncias sólidas, pastas ou substâncias em partículas, a quantidade usada deve ter um volume de 0,1 ml ou uma massa não superior a 100 mg. O material de ensaio deve ser pulverizado a um pó fino. O volume de material sólido deve ser medido após compactação suave, por exemplo, através de batidas do recipiente que o contém. Se ao tempo da primeira observação, 1 hora após o tratamento, a substância de ensaio sólida não tiver sido removida do olho do animal de ensaio através de mecanismos fisiológicos, o olho pode ser lavado com soro fisiológico ou água destilada.

1.4.2.3.3. Ensaio de aerossóis Recomenda-se a recolha do conteúdo de todos os nebulizadores de bomba e aerossóis antes de instilação no olho. A única excepção é para substâncias em recipientes de aerossol pressurizados, que não podem ser recolhidos devido à sua vaporização. Nestes casos, deve manter-se o olho aberto e administrar-se a substância de ensaio no olho numa aplicação única de duração aproximada de um segundo, mantendo o recipiente directamente à frente do olho a uma distância de 10 cm. Esta distância pode variar em função da pressão do nebulizador e do seu conteúdo. Devem ser tomadas precauções adequadas para não danificar o olho devido à pressão do nebulizador. Em casos apropriados, pode ser necessário avaliar o potencial de lesão mecânica do olho pela força da nebulização. Pode obter-se uma estimativa da dose de um aerossol através de simulação do ensaio da seguinte forma: nebuliza-se a substância para um papel de pesagem através de uma abertura do tamanho do olho de coelho, colocada directamente em frente do papel. Utiliza-se o aumento de peso do papel como uma aproximação da quantidade nebulizada para o olho. Para substâncias voláteis, a dose pode ser estimada por pesagem do recipiente de recolha antes e após a remoção do material de ensaio.

1.4.2.4. Ensaio inicial (ensaio in vivo de irritação/corrosão ocular utilizando um animal) Tal como articulado na estratégia de ensaio sequencial (ver anexo 1), recomenda-se vivamente que o ensaio in vivo seja efectuado inicialmente utilizando um animal. Se, utilizando o protocolo descrito, os resultados deste ensaio indicarem que a substância é corrosiva ou fortemente irritante para o olho, não devem ser efectuados outros ensaios de irritação ocular.

1.4.2.5. Anestesia local A utilização de anestesia local pode ser feita, mas analisando a sua necessidade caso a caso. Se a análise de importância das provas indicar que a substância pode causar dor ou se os ensaios iniciais revelarem ocorrência de reacção dolorosa, pode utilizar-se um anestésico local antes da instilação da substância de ensaio. A selecção do tipo, concentração e dose de anestésico local deve ser feita cuidadosamente de modo a assegurar que a sua utilização não altere a reacção à substância de ensaio. O olho de controlo deve ser anestesiado de igual forma.

1.4.2.6. Ensaio de confirmação (ensaio in vivo de irritação ocular com animais adicionais) Se não for observado um efeito corrosivo no ensaio inicial, a resposta irritante ou negativa deve ser confirmada utilizando até dois animais adicionais. Se for observado no ensaio inicial um efeito francamente irritante, indicativo de um efeito possivelmente forte (irreversível) no ensaio de confirmação, recomenda-se que se efectue o ensaio de confirmação de uma forma sequencial num animal de cada vez, em vez de expor dois animais adicionais simultaneamente. Se o segundo animal apresentar efeitos corrosivos ou fortemente irritantes, não se deve continuar o ensaio. Pode ser necessária a utilização de animais adicionais para confirmar respostas de irritação fracas ou moderadas.

1.4.2.7. Período de observação A duração do período de observação deve ser suficiente para uma avaliação completa da magnitude e reversibilidade dos efeitos observados. No entanto, a experiência deve ser interrompida em qualquer altura se o animal apresentar sintomas continuados de dor intensa ou de se encontrar em situação de perigo (9). Para a determinação da reversibilidade dos efeitos, os animais devem ser examinados normalmente durante 21 dias após a administração da substância de ensaio. No caso de se observar reversibilidade antes do fim do período de 21 dias, deve interromper-se a experiência.

1.4.2.7.

1.4.2.7.1. Observações clínicas e graduação das reacções oculares Os olhos devem ser examinados 1, 24, 48 e 72 horas após a aplicação da substância de ensaio. Os animais só devem ser mantidos sob ensaio durante o tempo necessário para obter informação definitiva. Os animais que apresentem sintomas continuados de dor intensa ou de perigo devem ser abatidos sem demora, sendo a substância classificada de acordo com estes resultados. Os animais que apresentem as seguintes lesões oculares posteriores à instilação devem ser abatidos: perfuração da córnea; ulceração significativa da córnea, incluindo estafiloma; sangue na câmara anterior do olho; opacidade da córnea de grau 4 persistente durante 48 horas; ausência de reflexo à luz (resposta da íris de grau 2) persistente durante 72 horas; ulceração da membrana conjuntival; necrose da conjuntiva ou da membrana nictitante; ou formação de crosta. Este procedimento é devido ao facto de normalmente este tipo de lesões ser irreversível. Os ensaios com animais que não desenvolvam lesões oculares podem ser interrompidos, mas não antes de três dias após a instilação. Os animais que apresentem lesões fracas a moderadas devem permanecer sob observação até cura de todas as lesões ou durante o período de 21 dias, após o qual o estudo é finalizado. As observações devem ser efectuadas 7, 14 e 21 dias após a aplicação de modo a determinar o estado das lesões e a sua reversibilidade ou irreversibilidade. Os graus da reacção ocular (conjuntiva, córnea e íris) devem ser anotados em cada exame (tabela I). Quaisquer outras lesões do olho (por exemplo, pannus da córnea, coloração) ou efeitos sistémicos adversos devem igualmente ser incluídos no relatório. O exame das reacções pode ser facilitado pela utilização de uma lupa binocular, de uma lâmpada de fenda manual, de um biomicroscópio ou de outro instrumento apropriado. Após anotação das observações no final de 24 horas, o exame aos olhos pode ser feito recorrendo a fluoresceína. A graduação das respostas oculares é necessariamente subjectiva. O pessoal que executa as observações deve ser treinado adequadamente no sistema de graduação utilizado para promover a harmonização da graduação da resposta ocular e auxiliar os laboratórios de ensaio e as pessoas envolvidas na obtenção e interpretação das observações.

2. DADOS

2.

2.2. ANÁLISE DOS RESULTADOS Os resultados de irritação ocular devem ser avaliados conjuntamente com a natureza e gravidade das lesões e a sua reversibilidade ou ausência de reversibilidade. As respostas individuais não representam um padrão absoluto das propriedades irritantes do material, já que são também avaliados outros efeitos do material de ensaio. Pelo contrário, os resultados individuais devem ser encarados como valores de referência que só são significativos quando corroborados por uma descrição e avaliação completas de todas as observações.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:

Fundamentação lógica para o ensaio in vivo: análise de importância das provas dos dados de ensaio preexistentes, incluindo os resultados da estratégia de ensaio sequencial:

descrição dos dados relevantes disponíveis de ensaios anteriores;

dados obtidos em cada etapa da estratégia de ensaio;

descrição dos ensaios in vitro efectuados, incluindo detalhes sobre o protocolo, resultados obtidos com substâncias de ensaio/referência;

descrição do estudo efectuado in vivo sobre irritação/corrosão dérmica, incluindo os resultados obtidos;

análise de importância das provas para a realização do estudo in vivo.

Substância de ensaio:

dados de identificação (por exemplo, número CAS, origem, grau de pureza, impurezas conhecidas, número de lote);

natureza física e propriedades físico-químicas (por exemplo, pH, volatilidade, solubilidade, estabilidade, reactividade com água);

no caso de misturas, composição e percentagens relativas dos componentes;

no caso de utilização de um anestésico local, identificação, grau de pureza, tipo, dose e interacção potencial com a substância de ensaio.

Excipiente:

identificação, concentração (quando apropriado), volume utilizado;

justificação para a escolha do excipiente.

Animais de ensaio:

espécie/estirpe utilizada, fundamentação lógica para a utilização de outro tipo de animais que não coelhos albinos;

idade de cada animal no início do estudo;

número de animais de cada sexo no ensaio e nos grupos de controlo (se necessário);

peso individual dos animais no início e no final do ensaio;

origem, condições de alojamento, dieta, etc.

Resultados:

descrição do método utilizado para medir a irritação em cada observação (por exemplo, lâmpada de fenda manual, biomicroscópio, fluoresceína);

disposição em tabelas dos dados sobre a resposta irritante/corrosiva para cada animal em cada observação até remoção do animal do ensaio;

descrição pormenorizada do grau e natureza da irritação ou corrosão observadas;

descrição de quaisquer outras lesões do olho observadas (por exemplo, vascularização, formação de pannus da córnea, adesões, coloração);

descrição de efeitos não oculares locais e efeitos sistémicos adversos e, caso sejam efectuadas, das observações histopatológicas.

Análise dos resultados.

3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS A extrapolação dos resultados dos estudos de irritação ocular em animais de laboratório para humanos tem uma validade limitada. Em muitos casos, o coelho albino é mais sensível do que os humanos a substâncias irritantes ou corrosivas oculares. A interpretação dos dados deve ser feita cuidadosamente de modo a excluir irritação resultante de infecções secundárias.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)

REFERÊNCIAS Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P., (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410-429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N., (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159-164. Worth A.P. and Fentem J.H., (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177 Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicology In Vitro, 2, p. 19-26. Neun, D.J., (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524. Método de Ensaio B.40 para corrosão da pele. Método de Ensaio B.4. Toxicidade aguda: irritação/corrosão dérmica. OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tabela I GRADUAÇÃO DE LESÕES OCULARES

Córnea

Opacidade: grau de densidade (as medições devem ser efectuadas na área mais densa) Sem ulceração nem opacidade … 0 Áreas de opacidade escassas ou difusas (para além de uma pequena perda do lustre normal); detalhes da íris claramente visíveis … 1 Área translúcida claramente discernível; detalhes da íris ligeiramente obscurecidos … 2 Área nacarada; não são visíveis os detalhes da íris; o tamanho da pupila é dificilmente discernível … 3 Córnea opaca; a íris não é discernível através da opacidade … 4 Máximo possível: 4 NOTAS

Íris

Normal … 0 Rugas marcadamente profundas, congestão, tumefacção, hiperemia ao redor da córnea moderada; ou injecção; íris reactiva à luz (considera-se que uma reacção lenta é um efeito) … 1 Hemorragia, destruição maciça ou ausência de reacção à luz … 2 Máximo possível: 2

Conjuntiva

Vermelhidão (refere-se à conjuntiva palpebral e bulbar; excluindo a córnea e a íris) Normal … 0 Alguns vasos sanguíneos com hiperemia (injectados) … 1 Cor carmesim difusa; vasos individuais não são claramente discerníveis … 2 Cor vermelho-carne difusa … 3 Máximo possível: 3

Quimiose

Tumefacção (refere-se às pálpebras e/ou às membranas nictantes) Normal … 0 Alguma tumefacção acima do normal … 1 Tumefacção óbvia, com eversão parcial das pálpebras … 2 Tumefacção, com as pálpebras semicerradas … 3 Tumefacção, com as pálpebras mais do que semicerradas … 4 Máximo possível: 4

B.6. SENSIBILIZAÇÃO CUTÂNEA

B.6.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Observações A sensibilidade e capacidade dos métodos de ensaio para detectar substâncias que possam induzir sensibilização cutânea considera-se importante num sistema de classificação em matéria de toxicidade no domínio da saúde pública. Não existe um método único que permita identificar de modo adequado todas as substâncias que possuam um potencial de sensibilização cutânea para o homem. Na selecção do método de ensaio devem ter-se em conta factores tais como as características físicas da substância, nomeadamente a sua capacidade de penetração na pele. Desenvolveram-se dois tipos de ensaios em porquinhos-da-índia: ensaios com adjuvantes, em que a reacção alérgica é desencadeada por uma solução ou suspensão da substância em estudo em adjuvante completo de Freunds, e os ensaios sem adjuvantes. Em geral, os ensaios com adjuvantes permitem determinar o potencial de sensibilização cutânea no homem com mais precisão que os métodos que não utilizam o adjuvante completo de Freunds, pelo que são preferíveis. O ensaio de maximização em porquinhos-da-índia constitui um método com adjuvante largamente utilizado. Embora possam utilizar-se vários outros métodos para determinar o potencial de sensibilização cutânea, o método em causa é considerado o mais adequado. Os ensaios sem adjuvantes (de que o ensaio de Buehler constitui o mais popular) são considerados menos sensíveis quando aplicados a determinadas classes de substâncias. Em alguns casos, podem existir motivos para a selecção do ensaio de Buehler, em que se procede à aplicação tópica, em vez do método de maximização em porquinhos-da-índia, que utiliza a injecção intradérmica. No caso do recurso ao método de Buehler, deve fornecer-se a respectiva justificação. O presente método descreve o ensaio de maximização em porquinhos-da-índia e o método de Buehler. Pode recorrer-se a outros métodos devidamente validados cuja utilização seja cientificamente justificada. Se um ensaio de despiste reconhecido fornecer um resultado positivo, a substância submetida ao ensaio pode ser designada potencialmente sensibilizante e pode não ser necessário efectuar subsequentemente um ensaio com cobaias. No entanto, se o referido ensaio fornecer um resultado negativo, é necessário efectuar um ensaio com cobaias segundo a metodologia aplicável ao presente método de ensaio. Ver também a parte B da Introdução Geral.

1.2. DEFINIÇÕES Sensibilização cutânea (dermatite de contacto alérgica): reacção cutânea, de origem imunológica, a uma determinada substância. No homem, a reacção pode incluir pruridos, eritrema, edema, pápulas, vesículas, bolhas ou uma combinação dos mesmos. Em outras espécies, as reacções podem diferir, embora apenas se observe eritrema e edema. Exposição de indução: exposição experimental de um indivíduo a uma substância em estudo, com o objectivo de induzir uma reacção de hipersensibilidade. Período de indução: período de, pelo menos, uma semana após a exposição de indução, durante o qual pode surgir uma reacção de hipersensibilidade. Exposição de desencadeamento: exposição experimental a uma determinada substância, após o período de indução, de um indivíduo previamente exposto à mesma, de modo a averiguar uma eventual reacção de hipersensibilidade.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA A sensibilidade e a fiabilidade da técnica experimental utilizada devem ser determinadas semestralmente por recurso a substâncias que se saiba possuírem propriedades de sensibilização cutânea ligeiras ou moderadas. Num ensaio realizado de forma adequada, a utilização de um sensibilizante ligeiro ou moderado deve determinar uma reacção de pelo menos 30 %, no caso de um ensaio com adjuvante, e de pelo menos 15 % no caso de um ensaio sem adjuvante. Recomenda-se a utilização das substâncias seguintes: Número CAS Número EINECS Denominação EINECS Denominação comum 101-86-0 202-983-3 α-Hexilcinamaldeído α-Hexilcinamaldeído 149-30-4 205-736-8 Benzotiazolo-2-tiol (mercaptobenzotiazolo) Kaptax 94-09-7 202-303-5 Benzocaína Norcaína Em determinados casos devidamente justificados podem utilizar-se outras substâncias que satisfaçam os critérios atrás referidos.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Os animais utilizados são inicialmente expostos à substância em estudo por injecção intradérmica e/ou aplicação epidérmica (exposição de indução). Após um período de repouso de 14 dias (período de indução), durante o qual poderá observar-se uma reacção imunitária, os animais são expostos a uma dose de desencadeamento. A extensão e o grau da reacção cutânea à exposição de desencadeamento nos animais do lote de ensaio é comparada com a reacção observada nos animais do lote de controlo, sujeitos a um produto inactivo na fase da indução e objecto da exposição de desencadeamento.

1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO Caso se afigure aconselhável a remoção da substância em estudo, deve utilizar-se para tal água ou um solvente adequado que não altere a reacção observada, bem como a integridade da epiderme.

1.5.

1.5.1. Ensaio de maximização nos porquinhos-da-índia

1.5.1.

1.5.1.1. Preparação Os animais (porquinhos-da-índia albinos adultos, jovens e saudáveis) são aclimatados às condições laboratoriais durante, pelo menos, cinco dias. Antes do ensaio, procede-se à respectiva distribuição aleatória por lotes. O pêlo é removido com o auxílio de uma tesoura ou lâmina ou, eventualmente, por depilação química, de acordo com o método utilizado. Deve evitar-se produzir feridas. Os animais são pesados antes do início do ensaio e após o respectivo termo.

1.5.1.2. Condições de ensaio

1.5.1.2.

1.5.1.2.1. Animais de ensaio Os animais devem ser porquinhos-da-índia albinos de utilização corrente em laboratório.

1.5.1.2.2. Número e sexo Podem utilizar-se animais de ambos os sexos. Caso se utilizem fêmeas, estas devem ser nulíparas e não grávidas. Utiliza-se um mínimo de 10 animais no lote de ensaio e um mínimo de cinco animais no lote de controlo. Caso se utilizem menos de 20 animais no lote de ensaio e menos de 10 animais no lote de controlo, não é possível concluir a natureza sensibilizante do produto, pelo que se recomenda vivamente a realização de ensaios com outros animais, até atingir os números referidos.

1.5.1.2.3. Doses A concentração de substância em estudo utilizada em cada exposição por indução deve apresentar uma boa tolerância sistémica e corresponder à concentração máxima que produz uma irritação cutânea ligeira a moderada. A concentração utilizada na exposição de desencadeamento deve consistir na dose máxima não irritante. Se necessário, as concentrações adequadas podem ser determinadas a partir de um estudo-piloto utilizando dois ou três animais. Para tal, devem utilizar-se animais objecto de ensaio com adjuvante completo de Freunds.

1.5.1.3. Procedimento

1.5.1.3.

1.5.1.3.1. Indução Dia 0 — lote de ensaio Administram-se três pares de injecções intradérmicas de 0,1 ml na região da espádua. 1.a injecção: mistura adjuvante completo de Freunds/água ou soro fisiológico (1:1) (v/v). 2.a injecção: substância em estudo dissolvida num veículo adequado, na concentração escolhida. 3.a injecção: substância em estudo dissolvida numa mistura adjuvante completo de Freunds/água ou soro fisiológico (1:1) (v/v), na concentração escolhida. Na 3.a injecção, as substâncias hidrossolúveis são dissolvidas na fase aquosa antes da mistura com adjuvante completo de Freunds. As substâncias lipossolúveis ou insolúveis são suspensas em adjuvante completo de Freunds antes de adicionadas à fase aquosa. A concentração final da substância em estudo deve ser igual à utilizada na 2.a injecção. As 1.a e 2.a injecções são administradas em regiões vizinhas, tão próximas quanto possível do crânio, enquanto que a 3.a injecção é administrada na parte posterior da zona de ensaio. Dia 0 — lote de controlo Administram-se três pares de injecções intradérmicas de 0,1 ml na mesma região usada no caso dos animais do lote de ensaio. 1.a injecção: mistura adjuvante completo de Freunds/água ou soro fisiológico (1:1) (v/v). 2.a injecção: veículo não diluído. 3.a injecção: mistura a 50 % (m/v) do veículo numa mistura adjuvante completo de Freunds/água ou soro fisiológico (1:1) (v/v). 5.o-7.o dias — lotes de ensaio e de controlo No caso de a substância não constituir um irritante cutâneo, a zona de ensaio, com o pêlo previamente removido, é tratada, cerca de 24 horas antes da aplicação tópica de indução, com 0,5 ml de solução a 10 % de laurilssulfato de sódio em vaselina, de modo a produzir irritação local. 6.o-8.o dias — lote de ensaio O pêlo é novamente removido da zona de ensaio. Impregna-se totalmente uma folha de papel de filtro (2 × 4 cm) da substância em estudo, dissolvida ou suspensa num veículo adequado, que se aplica na zona de ensaio, sendo mantida em contacto com a mesma durante 48 horas, com o auxílio de um penso oclusivo. Deve justificar-se a escolha do veículo utilizado. Os sólidos devem ser finamente divididos e incorporados num veículo adequado. Os líquidos podem ser aplicados directamente, se for caso disso. 6.o-8.o dias — lote de controlo O pêlo é novamente removido da zona de ensaio. O veículo é aplicado de modo análogo ao anteriormente descrito, sendo também mantido em contacto com a referida zona durante 48 horas, com o auxílio de um penso oclusivo.

1.5.1.3.2. Desencadeamento 20.o-22.o dias — lotes de ensaio e de controlo Remove-se o pêlo do flanco dos animais dos lotes de ensaio e de controlo. Aplica-se num dos flancos de cada animal um apósito ou uma câmara impregnados da substância em estudo; se necessário, pode aplicar-se no outro flanco um apósito ou uma câmara impregnados do veículo. Os sistemas em causa são mantidos em contacto com a pele com o auxílio de um penso oclusivo.

1.5.1.3.3. Observação e avaliação: lotes de ensaio e de controlo Recomenda-se a realização de leituras cegas com os animais dos lotes de ensaio e de controlo. Caso seja necessário clarificar os resultados obtidos no primeiro ensaio de desencadeamento, pode realizar-se um segundo ensaio com um novo lote de controlo, cerca de uma semana depois. Pode também realizar-se um segundo ensaio de desencadeamento com o mesmo lote de controlo. Devem observar-se e registar-se de acordo com a escala de Magnusson/Kligman (ver apêndice) todas as reacções anormais, nomeadamente reacções sistémicas, resultantes dos processos de indução e desencadeamento. Além disso, podem efectuar-se outros exames, nomeadamente um exame histopatológico ou uma determinação da espessura da prega cutânea, com o objectivo de clarificar eventuais reacções duvidosas.

Cerca de 21 horas após a remoção do apósito ou da câmara, a zona em estudo é limpa, sendo o pêlo removido com o auxílio de uma tesoura ou lâmina, se necessário.

Cerca de 3 horas depois (ou seja, cerca de 48 horas após o início do ensaio), observa-se a reacção cutânea, que se regista de acordo com a escala indicada no apêndice.

Cerca de 24 horas após a primeira observação (72 horas após o início do ensaio), procede-se a um novo exame, cujos resultados se registam de modo análogo.

1.5.2. Ensaio de Buehler

1.5.2.

1.5.2.1. Preparação Os animais (porquinhos-da-índia albinos adultos, jovens e saudáveis) são aclimatados às condições laboratoriais durante, pelo menos, cinco dias. Antes do ensaio, procede-se à respectiva distribuição aleatória por lotes. O pêlo é removido com o auxílio de uma tesoura ou lâmina ou, eventualmente, por depilação química, de acordo com o método utilizado. Deve evitar-se produzir feridas. Os animais são pesados antes do início do ensaio e após o respectivo termo.

1.5.2.2. Condições de ensaio

1.5.2.2.

1.5.2.2.1. Animais de ensaio Os animais devem ser porquinhos-da-índia albinos de utilização corrente em laboratório.

1.5.2.2.2. Número e sexo Podem utilizar-se animais de ambos os sexos. Caso se utilizem fêmeas, estas últimas devem ser nulíparas e não grávidas. Utiliza-se um mínimo de 20 animais no lote de ensaio e um mínimo de 10 animais no lote de controlo.

1.5.2.2.3. Doses A concentração de substância em estudo utilizada em cada exposição por indução deve corresponder à concentração máxima que produz uma irritação cutânea moderada. A concentração utilizada na exposição de desencadeamento deve consistir na dose máxima não irritante. Se necessário, as concentrações adequadas podem ser determinadas a partir de um estudo-piloto utilizando dois ou três animais. No caso de as substâncias em estudo serem hidrossolúveis, deve utilizar-se como veículo água ou uma solução diluída de um tensioactivo não irritante. Nos restantes casos, o veículo deve consistir numa mistura etanol/água a 80 % (ensaios de indução) ou acetona (ensaios de desencadeamento).

1.5.2.3. Procedimento

1.5.2.3.

1.5.2.3.1. Indução Dia 0 — lote de ensaio Remove-se o pêlo do flanco dos animais. O sistema de apósito é impregnado da substância em estudo, dissolvida ou suspensa num veículo adequado (deve justificar-se a escolha do veículo; as substâncias líquidas podem ser aplicadas sem diluição, se for caso disso) e aplicado na zona de ensaio, sendo mantido em contacto com a mesma durante 6 horas, com o auxílio de um apósito ou de uma câmara e de um penso adequado. O sistema de apósito utilizado deve ser oclusivo. Pode utilizar-se uma mecha de algodão de forma circular ou quadrada, com 4 a 6 cm2. De modo a garantir a oclusão, é aconselhável utilizar um dispositivo de imobilização adequado. Caso se utilize uma faixa, poderá ser necessário proceder a exposições adicionais. Dia 0 — lote de controlo O pêlo é novamente removido da zona de ensaio. O veículo é aplicado de modo análogo ao anteriormente descrito, sendo também mantido em contacto com a referida zona durante 6 horas por intermédio de um penso oclusivo ou de uma câmara. Caso se conclua que não é necessário efectuar um controlo simulado, poderá efectuar-se um controlo mais simples. 6.o-8.o dias e 13.o-15.o dias — lotes de ensaio e de controlo A substância em estudo é aplicada de modo análogo ao anteriormente descrito, na mesma zona e no mesmo flanco (se necessário, proceder à remoção do pêlo), entre o 6.o e o 8.o dias e, de novo, entre o 13.o e o 15.o dias.

1.5.2.3.2. Desencadeamento 27.o-29.o dias — lotes de ensaio e de controlo Remove-se o pêlo do flanco posterior dos animais dos lotes de ensaio e de controlo não sujeito a exposição prévia e aplica-se um penso oclusivo ou câmara impregnados da quantidade adequada da substância em estudo (concentração máxima não irritante). Se necessário, pode também aplicar-se um penso oclusivo ou câmara, impregnados do veículo, ao flanco anterior dos animais de ambos os lotes não sujeito a exposição prévia. Os pensos ou câmaras são mantidos em contacto com a pele durante 6 horas, com o auxílio de um dispositivo adequado.

1.5.2.3.3. Observação e avaliação Recomenda-se a realização de leituras cegas com os animais dos lotes de ensaio e de controlo. Caso seja necessário clarificar os resultados obtidos no primeiro ensaio de desencadeamento pode realizar-se um segundo ensaio com um novo lote de controlo, cerca de uma semana depois. Pode também realizar-se um segundo ensaio de desencadeamento com o mesmo lote de controlo. Devem observar-se e registar-se de acordo com a escala de Magnusson/Kligman (ver apêndice) todas as reacções anormais, nomeadamente reacções sistémicas, resultantes dos processos de indução e desencadeamento. Além disso, podem efectuar-se outros exames, nomeadamente um exame histopatológico ou uma determinação da espessura da prega cutânea, com o objectivo de clarificar eventuais reacções duvidosas.

Cerca de 21 horas após a remoção do apósito ou da câmara, remove-se o pêlo da área em estudo.

Cerca de 3 horas depois (ou seja, cerca de 30 horas após o início do ensaio), observa-se a reacção cutânea, que se regista de acordo com a escala indicada em apêndice.

Cerca de 24 horas após a primeira observação (54 horas após o início do ensaio), procede-se a um novo exame, cujos resultados se registam de modo análogo.

2. DADOS (GPMT E ENSAIO DE BUEHLER) Os dados devem ser apresentados de forma sumária num quadro, referindo, para cada animal, a reacção cutânea observada.

3. RELATÓRIO (GPMT E ENSAIO DE BUEHLER) Caso se tenha realizado um ensaio de prospecção (por exemplo, ensaio ganglionar local — LLNA — ou ensaio de tumefacção do pavilhão auditivo no ratinho — METS) antes do ensaio em porquinhos-da-índia, deve fornecer-se, juntamente com os resultados obtidos com a substância em estudo e a substância de referência, detalhes relativos ao procedimento.

3. Relatório do ensaio (ensaio de maximização em porquinhos da índia e ensaio de Buehler)

O relatório do ensaio deve incluir, sempre que possível, as seguintes informações:

Animais utilizados no ensaio:

estirpe;

número, idade e sexo dos animais;

proveniência, condições de alojamento, dieta administrada, etc.;

massa de cada animal no início do ensaio.

Condições de ensaio:

pormenores relativos à preparação da zona de ensaio;

pormenores relativos aos materiais e técnicas de apósito utilizadas;

resultados dos estudos-piloto destinados a determinar as concentrações de indução e de desencadeamento utilizadas no ensaio;

pormenores relativos à preparação, aplicação e remoção da substância em estudo;

justificação da escolha do veículo;

concentrações do veículo e da substância em estudo utilizadas nos ensaios de indução e de desencadeamento; quantidade total de substância aplicada nos ensaios de indução e de desencadeamento.

Resultados:

resumo dos resultados do último controlo de sensibilidade e fiabilidade (ver 1.3), nomeadamente informações sobre a substância, a respectiva concentração e o veículo utilizado;

dados relativos a cada animal, incluindo o sistema de classificação;

descrição da natureza e gravidade dos efeitos observados;

dados histopatológicos.

Discussão dos resultados.

Conclusões.

4. REFERÊNCIAS O presente método é análogo ao método OCDE TG 406.

B.7. TOXICIDADE ORAL DA DOSE REPETIDA (28 DIAS)

B.7.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Ver a parte B da Introdução Geral.

1.2. DEFINIÇÕES Ver a parte B da Introdução Geral.

1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO A substância em estudo é administrada diariamente por via oral, em doses crescentes (uma dose por lote), a vários lotes de animais de ensaio, durante um período de 28 dias. No decurso deste período, os animais são examinados diariamente em pormenor, com vista à detecção de quaisquer sinais de toxicidade. Efectua-se a autópsia dos animais que morrem ou são abatidos durante o ensaio e, no final do mesmo, procede-se ao abate dos sobreviventes e à respectiva autópsia. O presente método concede especial importância aos efeitos neurológicos, devendo efectuar-se um exame clínico pormenorizado dos animais, de modo a obter o máximo possível de informações. O método deverá permitir identificar substâncias com potencial neurotóxico, que poderão necessitar de uma investigação mais aprofundada. Além disso, o método pode fornecer indicações sobre os eventuais efeitos imunológicos e a eventual toxicidade sobre os órgãos reprodutores.

1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.4.

1.4.1. Preparação Seleccionam-se de modo aleatório animais adultos jovens e saudáveis, que se repartem pelos lotes de ensaio e de controlo. Devem dispor-se as gaiolas de forma a minimizar eventuais efeitos devidos à respectiva localização. Os animais são identificados individualmente e mantidos nas gaiolas durante pelo menos cinco dias antes do início do ensaio, de modo a permitir a aclimatação às condições laboratoriais. A substância em estudo é administrada por intermédio de uma sonda gástrica ou através da alimentação ou da água para beber. O método de administração oral depende do objectivo do ensaio, bem como das propriedades físico-químicas da substância. Se necessário, a substância é dissolvida ou suspensa num veículo adequado. Sempre que possível, recomenda-se o uso de uma solução ou suspensão aquosa ou, se tal não for possível, uma solução ou emulsão num óleo (nomeadamente óleo de milho) ou ainda uma solução noutro veículo. No caso de se utilizar um veículo não aquoso, devem conhecer-se as respectivas características de toxicidade. Deve também determinar-se a estabilidade da substância no veículo utilizado.

1.4.2. Condições de ensaio

1.4.2.

1.4.2.1. Animais de ensaio Embora possa recorrer-se a outros roedores, o rato constitui a espécie preferida. Devem utilizar-se animais adultos, jovens e saudáveis, de estirpes correntes de laboratório. As fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas. A administração da substância deve ter início logo que possível após o desmame e, em qualquer caso, antes de os animais completarem nove semanas de idade. No início do estudo, a variação de massa dos animais deve ser mínima, não excedendo + 20 % da massa média de cada sexo. Caso um ensaio de toxicidade oral da dose repetida preceda um estudo a longo prazo, é conveniente utilizar em ambos os ensaios animais da mesma estirpe e proveniência.

1.4.2.2. Número e sexo Para cada dose, devem utilizar-se, pelo menos, 10 animais (cinco machos e cinco fêmeas). Caso se preveja o sacrifício de alguns animais durante o ensaio, o referido número deve ser acrescido do número de animais a sacrificar. Além disso, pode administrar-se a um lote extra de animais (cinco de cada sexo), durante 28 dias, a dose mais elevada, com o objectivo de estudar a reversibilidade, a persistência ou a manifestação retardada de efeitos tóxicos nos 14 dias subsequentes à administração. Utiliza-se também um lote-satélite de 10 animais (cinco de cada sexo) no ensaio de controlo.

1.4.2.3. Doses De modo geral, devem utilizar-se, no mínimo, três lotes de ensaio e um lote de controlo. Excepto no que respeita à administração da substância em estudo, deve proceder-se com os animais do lote de controlo do mesmo modo que com os animais dos lotes de ensaio. Caso se recorra a um veículo para a administração da substância em estudo, deve administrar-se o volume máximo do mesmo aos animais do lote de controlo. Se, com base em outros dados, for previsível que a dose de 1000 mg/kg de massa corporal/dia não determine quaisquer efeitos, pode proceder-se a um ensaio-limite. Na ausência de dados adequados, pode realizar-se um rastreio, de modo a determinar as doses a administrar. Na selecção das doses devem ter-se em conta os eventuais dados disponíveis em matéria de toxicidade e toxicocinética referentes à substância em causa ou a produtos afins. A dose mais elevada deve ser escolhida com o objectivo de induzir efeitos tóxicos, evitando contudo a morte e o sofrimento intenso. Posteriormente, deve seleccionar-se uma sequência decrescente de doses, com o objectivo de evidenciar uma correlação entre a dose administrada e a reacção observada, bem como a ausência de efeitos adversos associados à administração da dose mínima (NOAEL). A diferença óptima entre as doses consiste, frequentemente, num factor de 2 a 4; em muitos casos, a utilização de um quarto lote de ensaio é preferível ao recurso a intervalos de grande amplitude (superior a um factor de 10) entre as doses. Caso a substância em estudo seja administrada através dos alimentos ou da água para beber, deve assegurar-se que as respectivas quantidades não perturbam o equilíbrio nutricional e o balanço hídrico normais. Se a substância for administrada com os alimentos, pode utilizar-se uma concentração alimentar constante, expressa em ppm, ou uma dose constante, expressa em relação à massa corporal dos animais; deve especificar-se a alternativa adoptada. No caso do recurso a uma sonda gástrica, a dose deve ser administrada diariamente à mesma hora e, se necessário, ajustada de modo a manter uma dose constante em relação à massa corporal do animal. Caso um ensaio de toxicidade oral da dose repetida preceda um estudo a longo prazo, é conveniente utilizar uma dieta semelhante em ambos os ensaios.

1.4.2.4. Ensaio-limite Sempre que um ensaio, realizado de acordo com o presente método, que utilize uma dose de, pelo menos, 1000 mg/kg de massa corporal/dia ou, no caso da administração através dos alimentos ou da água para beber, uma percentagem equivalente em relação aos mesmos (com base na determinação da massa corporal), não produza efeitos tóxicos observáveis, ou se, tendo em conta dados referentes a substâncias estruturalmente afins, não se preveja o surgimento de efeitos tóxicos, poderá não ser necessário efectuar um estudo completo com três doses. Nestes casos, justifica-se a realização de um ensaio-limite, excepto se a exposição humana indicar a necessidade de recurso a uma dose superior.

1.4.2.5. Período de observação O período de observação deve ser de 28 dias. Os animais incluídos nos lotes extras destinados a ensaios subsequentes devem ser mantidos em observação durante, pelo menos, 14 dias suplementares, de modo a detectar a ocorrência retardada, a persistência ou a recuperação dos efeitos tóxicos.

1.4.3. Procedimento A substância é administrada diariamente aos animais durante um período de 28 dias; em casos devidamente justificados, pode proceder-se à administração cinco dias por semana. A administração forçada deve efectuar-se numa dose única, por intermédio de uma sonda gástrica ou de uma cânula de intubação adequada. O volume máximo de líquido administrado em cada operação depende das dimensões do animal, não devendo exceder 1 ml/100 g de massa corporal, excepto no que respeita a soluções aquosas, em que podem utilizar-se 2 ml/100 g de massa corporal. Salvo no caso de substâncias corrosivas ou irritantes, cujos efeitos são, de modo geral, agravados em concentrações mais elevadas, devem minimizar-se as variações no volume mediante o ajustamento da concentração, de modo a assegurar um volume constante para todas as doses.

1.4.3.

1.4.3.1. Observações gerais Deve efectuar-se um exame clínico pelo menos uma vez por dia, de preferência à mesma hora, em função do período previsto de efeitos mais agudos devidos à administração da substância, registando-se o estado de saúde dos animais. Além disso, deve proceder-se à observação de todos os animais pelo menos duas vezes por dia, de modo a determinar a respectiva morbilidade e mortalidade. Os animais moribundos, bem como aqueles que apresentem sinais de dor e sofrimento intensos, devem ser removidos, abatidos por intervenção humana e autopsiados. Deve proceder-se a um exame clínico aprofundado de todos os animais pelo menos uma vez antes da primeira exposição (de modo a permitir efectuar comparações com o mesmo indivíduo) e pelo menos uma semana após a mesma. O exame deve decorrer no exterior da gaiola, num recinto adequado e, de preferência, à mesma hora. As observações devem ser cuidadosamente registadas, de preferência por recurso a um sistema definido em pormenor pelo laboratório em causa. Devem procurar minimizar-se eventuais alterações das condições de ensaio e assegurar que a observação seja efectuada por pessoal exterior ao mesmo. Os sinais anotados devem incluir alterações na pele, no pêlo, nos olhos e nas mucosas, bem como a ocorrência de secreções, excreções ou actividade autónoma (como, por exemplo, lacrimação, erecção pilosa, alterações nas pupilas, respiração anormal). Deve também registar-se quaisquer alterações da atitude, postura e reacção à manipulação, além da ocorrência de movimentos clónicos ou tónicos e comportamentos estereotipados (por exemplo, actos de higiene repetitivos, movimentos circulares repetitivos) ou estranhos (automutilação, marcha para a retaguarda). Na 4.a semana de exposição deve determinar-se a reacção sensorial a diversos tipos de estímulos (auditivos, visuais e proprioceptivos), bem como a força da preensão e a actividade motora. A bibliografia indicada na parte B da Introdução Geral fornece pormenores sobre os procedimentos a adoptar. Se o ensaio em causa preceder um estudo de toxicidade subcrónica a 90 dias, podem omitir-se as observações funcionais na 4.a semana de exposição, que deverão efectuar-se no âmbito do ensaio subsequente. Além disso, a existência de dados relativos a observações funcionais efectuadas no âmbito do ensaio da dose repetida facilita a selecção das doses a utilizar no estudo de toxicidade subcrónica posterior. Excepcionalmente, podem omitir-se as observações funcionais no caso de lotes que apresentem sinais de toxicidade numa extensão susceptível de interferir de modo significativo com as mesmas.

1.4.3.2. Massa corporal e consumo de alimentos e água para beber Todos os animais devem ser pesados com uma frequência pelo menos semanal, devendo também determinar-se, com a mesma frequência, a quantidade de alimentos e de água para beber consumidos, facto que se reveste de especial importância no caso de a substância em estudo ser administrada através da água para beber.

1.4.3.3. Hematologia No final do ensaio, devem determinar-se os seguintes parâmetros hematológicos: hematócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, contagem total e diferencial de leucócitos, contagem de plaquetas e medida do tempo/potencial de coagulação. As colheitas de sangue devem ser efectuadas numa zona determinada, imediatamente antes do abate dos animais ou no âmbito do mesmo, devendo armazenar-se as amostras em condições adequadas.

1.4.3.4. Bioquímica clínica Devem também efectuar-se determinações bioquímicas destinadas a investigar os principais efeitos tóxicos sobre os tecidos, nomeadamente renal e hepático, com amostras de sangue de todos os animais, colhidas imediatamente antes do respectivo abate ou no âmbito do mesmo (à excepção dos animais encontrados moribundos ou abatidos no decurso do ensaio). Recomenda-se que os animais sejam jejuados desde a véspera da colheita de sangue. Os parâmetros a determinar no plasma ou no soro são os seguintes: sódio, potássio, glucose, colesterol total, ureia, creatinina, proteínas totais e albumina, além de, pelo menos, dois enzimas indicadores dos efeitos hepatocelulares (tais como a alanina-aminotransferase, a aspartato-aminotransferase, a fosfatase alcalina, a y-glutamil-transpeptidase e a sorbitol-desidrogenase). A determinação de outros enzimas de origem hepática ou diversa, bem como de ácidos biliares, poderá, em determinados casos, proporcionar informações úteis. Como opção, podem realizar-se na última semana do ensaio as seguintes determinações na urina, recolhida de acordo com um programa previamente estabelecido: aparência, volume, osmolalidade ou gravidade específica, pH, proteínas, glucose e sangue/hematócitos. Além disso, deve prever-se a pesquisa de marcadores séricos que forneçam indicações gerais sobre a lesão de tecidos. Caso as propriedades conhecidas da substância afectem, ou se preveja que possam afectar, o perfil metabólico da mesma, devem realizar-se outras determinações, nomeadamente de cálcio, fosfatos, triglicéridos em jejum, hormonas específicas, meta-hemoglobina e colinesterase. A necessidade de efectuar tais determinações é estabelecida em função do tipo de substância em estudo ou de cada caso específico. De modo geral, deve adoptar-se uma abordagem flexível, em função das espécies e dos efeitos observados ou previstos da substância em causa. Se os dados disponíveis relativos a ensaios anteriores se revelarem inadequados, devem determinar-se parâmetros hematológicos e bioquímicos antes de administrar a substância.

1.4.3.5. Autópsia Todos os animais devem ser objecto de uma autópsia pormenorizada que inclua o exame da superfície exterior do corpo, dos orifícios e das cavidades craniana, torácica e abdominal, bem como do respectivo conteúdo. Devem remover-se de modo adequado as membranas aderentes a órgãos tais como o fígado, os rins, as glândulas supra-renais, os testículos, os epididimos, o timo, o baço, o cérebro e o coração, cuja massa húmida deve ser determinada logo que possível após a dissecação, de modo a evitar a respectiva dessecação. Os órgãos e tecidos que se seguem devem ser conservados num meio de fixação adequado aos mesmos, bem como ao tipo de exame histopatológico subsequente: todos os tecidos que apresentem lesões evidentes, encéfalo (regiões representativas, nomeadamente cérebro, cerebelo e protuberância), espinal medula, estômago, intestino delgado e cólon (incluindo as placas de Peyer), fígado, rins, glândulas supra-renais, baço, coração, timo, tiróide, traqueia e pulmões (conservados por insuflação com fixador seguida de imersão), gónadas, órgãos genitais acessórios (por exemplo, útero e próstata), bexiga, gânglios linfáticos (de preferência um gânglio situado na via de administração e um gânglio distante da mesma, de modo a investigar possíveis efeitos sistémicos), nervos periféricos (ciático ou tibial), nomeadamente na proximidade de músculos, e uma secção de medula óssea (ou, como alternativa, um aspirado de medula óssea recentemente montado). Em função das observações clínicas ou de natureza diversa efectuadas, poderá ser necessário examinar outros tecidos. Devem também conservar-se quaisquer órgãos susceptíveis de constituírem alvos da substância em estudo, em virtude das propriedades conhecidas da mesma.

1.4.3.6. Exame histopatológico Deve proceder-se ao exame histopatológico dos órgãos e tecidos conservados dos animais do lote de controlo, bem como dos lotes sujeitos a doses elevadas. Caso o exame destes últimos revele alterações atribuíveis à substância em estudo, devem examinar-se também os animais de todos os lotes restantes. Devem examinar-se todas as lesões importantes. Sempre que se recorra a um lote extra, deve proceder-se ao exame histopatológico dos tecidos e órgãos que tenham revelado alterações nos animais dos restantes lotes.

DADOS

Devem registar-se os dados relativos a cada animal. Além disso, todos os dados devem ser resumidos num quadro, referindo-se, para cada lote de ensaio, o número de animais utilizados, o número de animais encontrados mortos ou abatidos por intervenção humana, a hora da morte de cada animal, o número de animais que apresentam sinais de toxicidade, a descrição dos sinais de toxicidade observados, nomeadamente o tempo decorrido até à respectiva manifestação, bem como a sua duração e gravidade, o número de animais que apresentem lesões, o tipo de lesões e a percentagem de animais que apresentam cada tipo de lesões. Sempre que possível, os resultados numéricos devem ser avaliados por recurso a um método estatístico de aceitação geral, cuja escolha deve ser efectuada na fase de concepção do ensaio.

3. RELATÓRIO

3. RELATÓRIO DO ENSAIO

O relatório do ensaio deve incluir, sempre que possível, as seguintes informações:

Animais utilizados no ensaio:

espécie/estirpe;

número, idade e sexo dos animais;

proveniência, condições de alojamento, dieta administrada, etc.;

massa de cada animal determinada no início do ensaio, semanalmente após a administração da substância e no final do ensaio.

Condições de ensaio:

justificação da escolha de um veículo não aquoso;

motivo da selecção da dose de partida;

pormenores relativos à preparação da substância em estudo e à sua eventual incorporação nos alimentos, nomeadamente a respectiva concentração, estabilidade e homogeneidade;

pormenores relativos à administração da substância em estudo;

equivalência entre a concentração da substância em estudo nos alimentos ou na água para beber, expressa em ppm, e a dose, expressa em mg/kg de massa corporal, se for caso disso;

pormenores relativos à qualidade dos alimentos e da água.

Resultados:

massa corporal e respectivas alterações;

consumo de alimentos e de água, se for caso disso;

reacções tóxicas em função do sexo e da dose administrada, nomeadamente sinais de toxicidade;

natureza, gravidade e duração dos sinais clínicos (reversíveis ou não);

dados relativos à actividade sensorial, força de preensão e actividade motora;

resultados da análise hematológica, acompanhados dos respectivos parâmetros de base;

resultados da análise bioquímica, acompanhados dos respectivos parâmetros de base;

massa corporal aquando do abate e massa dos diversos órgãos;

dados obtidos por autópsia;

dados histopatológicos pormenorizados;

dados de absorção, caso se encontrem disponíveis;

tratamento estatístico dos resultados, se for caso disso.

Discussão dos resultados.

Conclusões.

4. REFERÊNCIAS O presente método é análogo ao método OCDE TG 407.

B.8. TOXICIDADE (INALAÇÃO) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS)

B.8.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO É útil possuir informações preliminares sobre a distribuição granulométrica, a pressão de vapor, o ponto de fusão, o ponto de ebulição, o ponto de inflamação e a explosividade (se aplicável) da substância. Ver também a Introdução Geral, parte B (ponto A).

1.2. DEFINIÇÃO Ver Introdução Geral, parte B (ponto B).

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Nenhuma.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Vários grupos de animais de experiência são expostos diariamente, por um período determinado, a concentrações diferentes das substâncias a ensaiar, à razão de uma concentração por grupo, durante um período de 28 dias. No caso de se utilizar um veículo para auxiliar a obter uma concentração apropriada da substância de ensaio na atmosfera, deve utilizar-se um grupo de controlo para o veículo. Durante o período de administração os animais são observados diariamente para se detectar as manifestações de toxicidade. Os animais que morrem durante a experiência são autopsiados e no fim da experiência os animais sobreviventes são igualmente autopsiados.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Nenhum.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.6.

1.6.1. Preparativos Os animais são mantidos nas condições de alojamento e de alimentação da experiência pelo menos durante cinco dias antes do ensaio. Antes de se começar o ensaio os animais jovens e saudáveis são distribuídos aleatoriamente pelos grupos submetidos ao tratamento e pelo grupo de controlo. Se necessário pode adicionar-se um veículo à substância de ensaio para se conseguir uma concentração apropriada desta na atmosfera; no caso de se utilizar um veículo ou outros aditivos para facilitar a administração, estes devem ser comprovadamente não tóxicos. Pode recorrer-se a dados anteriormente publicados, se necessário.

1.6.2. Condições da experiência

1.6.2.

1.6.2.1. Animais de experiência Salvo contra-indicação, a espécie preferida é o rato. Devem utilizar-se animais jovens e saudáveis de uma estirpe vulgarmente utilizada em laboratório. No início da experiência a diferença de peso entre os animais não poderá ultrapassar ± 20 % do peso médio apropriado.

1.6.2.2. Número e sexo Para cada grupo de ensaio serão utilizados pelo menos 10 animais (cinco fêmeas e cinco machos). As fêmeas deverão ser nulíparas e não grávidas. Se for previsível sacrificar alguns animais durante a experiência, deve acrescentar-se ao número inicial o número de animais que se prevê vir a sacrificar. Para além destes, poderá haver um grupo-satélite de 10 animais (cinco animais de cada sexo) tratado com a dose mais elevada durante 28 dias e observado quanto à reversibilidade, persistência ou aparecimento tardio de efeitos tóxicos durante 14 dias após o tratamento. Utiliza-se também um grupo-satélite de 10 animais de controlo (cinco animais de cada sexo).

1.6.2.3. Concentração de exposição São utilizadas pelo menos três concentrações, com um grupo de controlo ou, se necessário, com um grupo de controlo para o veículo quando este for utilizado (correspondendo à concentração do veículo ao nível de exposição mais elevada). Os animais do grupo de controlo são tratados da mesma forma que os animais dos grupos de experiência com excepção da inalação da substância de ensaio. A concentração mais elevada deverá produzir efeitos tóxicos mas nenhuma ou poucas mortes. A menor concentração não deverá produzir quaisquer manifestações de toxicidade. No caso de se dispor de informação sobre a exposição humana, a concentração mais baixa será superior a esse valor. O ideal seria a concentração intermédia produzir o efeito tóxico mínimo observável. No caso de se utilizar várias concentrações intermédias, a diferença entre elas será calculada de forma a conseguir-se uma gradação dos efeitos tóxicos. Nos grupos de concentração baixa e intermédia, assim como nos grupos de controlo, a incidência de mortalidade deverá ser baixa para permitir uma avaliação significativa dos resultados.

1.6.2.4. Tempo de exposição A duração da exposição diária deverá ser de seis horas, podendo utilizar-se outros períodos para satisfazer exigências específicas.

1.6.2.5. Equipamento Os animais serão expostos à substância de ensaio por meio de um dispositivo de inalação concebido de forma a conseguir-se um fluxo de ar contínuo que assegurará pelo menos 12 renovações de ar por hora e que garanta uma concentração de oxigénio apropriada e uma distribuição uniforme do produto de ensaio no ar. No caso de se utilizar uma câmara, esta será concebida de maneira a obter-se uma superlotação mínima dos animais e uma exposição máxima à substância de ensaio. Como regra geral, para se assegurar a estabilidade da atmosfera na câmara, o volume total dos animais de experiência não deverá ultrapassar 5 % do volume da câmara de ensaio. Pode recorrer-se também a um sistema de exposição oronasal, apenas de cabeça ou do corpo inteiro, em câmara individual; os dois primeiros tipos de exposição permitem reduzir a penetração por outras vias.

1.6.2.6. Período de observação Os animais da experiência deverão ser observados diariamente para se detectar manifestações de toxicidade durante todo o período de exposição e de recuperação. Proceder-se-á ao registo do momento da morte e bem assim do momento do aparecimento e desaparecimento das manifestações de toxicidade.

1.6.3. Procedimento Os animais são expostos diariamente à substância de ensaio, cinco a sete dias por semana, durante um período de 28 dias. Os animais dos grupos-satélite destinados às observações complementares serão mantidos vivos durante mais 14 dias, sem tratamento, para se detectar a recuperação ou persistência dos efeitos tóxicos. A temperatura a que se efectua o ensaio deverá ser mantida a 22 ± 3 oC. Em condições óptimas, a humidade relativa deverá ser mantida entre 30 % e 70 % mas, nalguns casos, isto pode ser impraticável (por exemplo, nos ensaios com aerossóis). A manutenção de uma pressão ligeiramente negativa no interior da câmara de ensaio (< 5 mm de água) evitará a fuga da substância de ensaio para o meio envolvente. Durante a exposição os animais não receberão alimentos nem água. Deverá ser utilizado um sistema de inalação dinâmico com um dispositivo apropriado de controlo analítico da concentração. Recomenda-se a realização de um ensaio preliminar para se determinar as concentrações apropriadas de exposição. O débito de ar deverá assegurar concentrações homogéneas em toda a câmara de exposição. O sistema deverá permitir a obtenção de condições estáveis o mais rapidamente possível. Deverá ser feita a medição ou monitorização de: Durante e após a exposição às concentrações são feitas observações e registadas sistematicamente; são feitas fichas individuais para cada animal. Todos os animais serão observados diariamente e as manifestações de toxicidade, assim como o momento do seu aparecimento, a sua intensidade e a sua duração, serão registados. As observações deverão incluir as modificações da pele e do pêlo, dos olhos, das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central, da actividade somatomotora e do comportamento. Determinar-se-á semanalmente o peso dos animais. Recomenda-se também a determinação do consumo alimentar semanal. Deve observar-se regularmente os animais para se evitar perdas, tanto quanto possível, causadas por canibalismo, autólise dos tecidos ou condições impróprias de alojamento. No fim da experiência todos os animais sobreviventes dos grupos tratados não satélites serão autopsiados. Os animais moribundos e os animais que apresentem graves sintomas de angústia ou dor deverão ser imediatamente retirados, sacrificados e submetidos a autópsia. Os exames a seguir enunciados deverão ser efectuados no fim do período de ensaio para todos os animais incluindo os de controlo: As outras análises eventualmente necessárias para uma avaliação toxicológica adequada incluem as análises de cálcio, fósforo, cloretos, sódio, potássio, glicose em jejum, análises de lípidos, de hormonas, equilíbrio ácido-básico, meta-hemoglobina e actividade colinesterásica. Pode recorrer-se a outras análises bioquímicas clínicas sempre que necessário para melhorar a investigação dos efeitos observados.

1.6.3. a)

débito de ar (permanentemente);

a concentração real da substância de ensaio medida na zona de respiração. Durante o período de exposição diária a concentração não variará além de ± 15 % do valor médio. Contudo, no caso de alguns aerossóis esta precisão pode não ser possível e poderá ser aceitável uma variação maior. Durante toda a duração da experiência as concentrações diárias serão mantidas o mais constantes possível. Para os aerossóis dever-se-á efectuar semanalmente e por grupo de ensaio pelo menos uma análise granulométrica das partículas;

temperatura e humidade, continuamente se for possível.

um exame hematológico compreendendo os seguintes testes: hematócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, contagem de leucócitos, fórmula leucocitária, bem como um estudo sobre o potencial de coagulação;

ii)

a determinação de dados bioquímicos do sangue incluindo pelo menos um parâmetro da função hepática e renal: alanina aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutâmico-pirúvica), aspartato aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutâmico-oxalo-acética), azoto ureico, albumina, creatinina plasmática, bilirrubina total e as proteínas séricas totais.

1.6.3.1. Autópsia Todos os animais submetidos a experiência deverão ser submetidos a uma autópsia geral. Pelo menos o fígado, os rins, as glândulas supra-renais, os pulmões e os testículos deverão ser pesados ainda húmidos, tão cedo quanto possível após a dissecação para se evitar a perda de líquidos por evaporação. Tanto os órgãos como os tecidos (tracto respiratório, fígado, rim, baço, testículos, glândulas supra-renais, coração e quaisquer órgãos que apresentem lesões graves ou alterações de volume) deverão ser conservados num meio adequado para um eventual exame histopatológico futuro. Os pulmões deverão ser removidos intactos, pesados e tratados com um fixador adequado para se garantir que a estrutura do pulmão seja mantida.

1.6.3.2. Exame histopatológico No grupo tratado com a concentração mais elevada e nos grupos de controlo o exame histológico deverá ser efectuado em órgãos e tecidos conservados. Os órgãos e tecidos que apresentem efeitos susceptíveis de serem atribuídos à substância de ensaio administrada na dose mais elevada deverão ser examinados em todos os grupos tratados com doses inferiores. Deve proceder-se a um exame histológico dos animais de qualquer grupo-satélite com particular ênfase sobre os órgãos e tecidos que apresentaram efeitos identificados nos outros grupos tratados.

2. RESULTADOS Os resultados serão resumidos na forma de quadros indicando, para cada experiência, o número de animais no início do ensaio e o número de animais que apresenta cada tipo de lesão. Todos os resultados observados deverão ser avaliados por um método estatístico apropriado. Pode ser utilizado qualquer método estatístico reconhecido.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

espécie, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.;

condições experimentais: Descrição do aparelho de exposição incluindo projecto, tipo, dimensões, fonte de ar, sistema gerador de aerossóis, método de condicionamento de ar, tratamento do ar evacuado e, no caso disso, o método de acondicionamento dos animais na câmara de ensaio. Deve apresentar-se uma descrição do equipamento utilizado para medir a temperatura, a humidade e, se necessário, a estabilidade das concentrações do aerossol ou da distribuição granulométrica das partículas. Dados relativos à exposição: Estes dados serão apresentados sob a forma de um quadro indicando os valores médios, assim como uma medida de variação (por exemplo, o desvio-padrão) e dirão respeito:

3.1. pt_2 a)

aos débitos de ar através do dispositivo de inalação,

à temperatura e à humidade do ar,

às concentrações nominais (quantidade total da substância de ensaio introduzida no dispositivo de inalação, dividida pelo volume de ar),

à natureza do veículo, se utilizado,

às concentrações reais na zona de respiração,

ao diâmetro aerodinâmico médio de massa (DAMM) e ao desvio-padrão geométrico (DPG);

resposta tóxica por sexo e por concentração;

momento da morte durante a experiência ou indicação dos animais sobreviventes;

descrição dos efeitos tóxicos ou outros; dose que não produz efeito;

momento de observação de qualquer manifestação anormal e sua evolução;

dados relativos à alimentação e peso corporal;

exames hematológicos efectuados e seus resultados;

testes bioquímicos clínicos utilizados e seus resultados;

resultados da autópsia;

descrição pormenorizada de todas as observações histopatológicas;

tratamento estatístico dos resultados sempre que possível;

discussão dos resultados;

interpretação dos resultados.

3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Ver Introdução Geral, parte B (ponto D).

4. REFERÊNCIAS Ver Introdução Geral, parte B (ponto E).

B.9. TOXICIDADE (DÉRMICA) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS)

B.9.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Ver Introdução Geral parte B (ponto A).

1.2. DEFINIÇÕES Ver Introdução Geral, parte B (ponto B).

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Nenhuma.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Administra-se à pele diariamente a substância de ensaio, em doses graduadas, a diversos grupos de animais de experiência, utilizando-se uma dose por grupo durante um período de 28 dias. Durante o período de administração observa-se os animais diariamente para se detectar manifestações de toxicidade. Faz-se a autópsia dos animais mortos durante o ensaio e no final do ensaio faz-se também a autópsia dos animais que sobreviveram ao teste.

1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE Nenhum.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.6.

1.6.1. Preparativos Os animais são mantidos sob as condições de alojamento e alimentação experimentais durante pelo menos cinco dias antes do ensaio. Antes do ensaio procede-se a uma escolha aleatória de animais adultos, jovens e saudáveis e que são distribuídos por grupos de tratamento. Pouco tempo antes de se iniciar o ensaio rapa-se os pêlos da região dorsal dos animais. No caso de se recorrer à tosquia esta deverá ser efectuada aproximadamente 24 horas antes do ensaio. Normalmente é necessário repetir estas operações todas as semanas, devendo tomar-se muito cuidado para não lesar a pele. A área destinada à aplicação da substância de ensaio não poderá ser inferior a 10 % da superfície corporal. O peso do animal deverá ser tomado em consideração na decisão da zona a expor e da dimensão da superfície a tratar. Sempre que se procede ao ensaio de substâncias sólidas, as quais podem ser pulverizadas se necessário, a substância de ensaio deve ser humedecida com água ou com um veículo apropriado para garantir um bom contacto com a pele. As substâncias de ensaio líquidas são geralmente utilizadas sem serem diluídas. Procede-se a uma aplicação diária durante cinco a sete dias por semana.

1.6.2. Condições da experiência

1.6.2.

1.6.2.1. Animais de experiência Podem ser utilizados ratos adultos, coelhos ou cobaias. Outras espécies poderão ser utilizadas mas a sua utilização deverá ser justificada. No início da experiência a diferença de peso entre os animais não poderá ultrapassar ± 20 % do peso médio apropriado.

1.6.2.2. Número e sexo Para cada grupo de ensaio serão utilizados pelo menos 10 animais (cinco fêmeas e cinco machos) com pele saudável. As fêmeas deverão ser nulíparas e não grávidas. Se for previsível sacrificar alguns animais durante a experiência, deve acrescentar-se ao número inicial o número de animais que se prevê vir a sacrificar. Para além destes, poderá haver um grupo-satélite de 10 animais (cinco animais de cada sexo) tratado com a dose mais elevada durante 28 dias e observado quanto à reversibilidade, persistência ou aparecimento tardio de efeitos tóxicos durante 14 dias após o tratamento. Utiliza-se também um grupo-satélite de 10 animais de controlo (cinco animais de cada sexo).

1.6.2.3. Doses São necessárias pelo menos três doses diferentes com um controlo ou com um veículo de controlo no caso de ser utilizado um veículo. O período de exposição deverá ser no mínimo de seis horas por dia. A substância de ensaio será aplicada diariamente à mesma hora e a quantidade a administrar será ajustada regularmente (semanal ou bissemanalmente) de modo a manter-se constante relativamente ao peso corporal do animal. Os animais do grupo de controlo serão tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de experiência, com excepção da aplicação da substância de ensaio. No caso de se utilizar um veículo para facilitar a administração, este será administrado ao grupo de controlo da mesma forma que aos grupos tratados, devendo a dose corresponder à do grupo tratado com a dose mais elevada. A dose mais elevada será determinada de forma a produzir efeitos tóxicos mas nunca, ou raramente, a morte do animal. A dose mais baixa não deverá produzir quaisquer efeitos tóxicos. No caso de se dispor de informação sobre a exposição humana, a dose mais baixa deverá exceder esse valor. O ideal seria a dose intermédia produzir o efeito tóxico mínimo observado. No caso de se utilizar várias doses intermédias, a diferença entre elas será calculada de forma a conseguir-se uma gradação dos efeitos tóxicos. Nos grupos das doses mais baixa e intermédia, assim como nos grupos de controlo, a incidência da mortalidade deverá ser baixa para permitir uma avaliação significativa dos resultados. No caso de a aplicação da substância de ensaio provocar uma grave irritação cutânea, dever-se-á reduzir as concentrações, o que poderá originar uma diminuição ou até um desaparecimento dos outros efeitos tóxicos da dose mais elevada. Se as lesões cutâneas forem muito graves, pode tornar-se necessário interromper a experiência e recomeçá-la com concentrações mais fracas.

1.6.2.4. Teste-limite Se já tiver sido efectuada uma experiência preliminar com uma dose de 1000 mg/kg ou com uma dose mais elevada em função da possibilidade de uma exposição humana conhecida, que não tenha provocado quaisquer efeitos tóxicos, será inútil prosseguir a experiência.

1.6.2.5. Período de observação Os animais da experiência serão observados diariamente para se detectar manifestações de toxicidade. Proceder-se-á ao registo do momento da morte e do momento do aparecimento e do desaparecimento das manifestações de toxicidade.

1.6.3. Procedimento Os animais serão colocados em gaiolas individuais. Em condições ideais a substância de ensaio será administrada aos animais sete dias por semana durante um período de 28 dias. Os animais de todos os grupos-satélite que forem objecto de observações complementares serão mantidos vivos durante mais 14 dias, sem tratamento, para se detectar a recuperação ou a persistência dos efeitos tóxicos. O tempo de exposição será pelo menos de seis horas por dia. A substância de ensaio será aplicada uniformemente numa área equivalente a 10 % da superfície total do corpo. No caso de substâncias altamente tóxicas, a superfície a utilizar poderá ser menor mas a camada da substância deverá ser o mais fina e uniforme possível. Durante a exposição a substância de ensaio é mantida em contacto com a pele por meio de uma gaze porosa e de um adesivo antialérgico. A superfície tratada será por sua vez convenientemente coberta de maneira a manter no seu lugar a gaze e a substância de ensaio e de modo a evitar que os animais ingiram a referida substância. É possível utilizar aparelhos de contenção para evitar a ingestão da substância, mas não se recomenda a imobilização completa. Como alternativa pode utilizar-se uma coleira de protecção. No fim do tempo de exposição é necessário, se possível, eliminar todos os resíduos da substância utilizando água ou recorrendo a qualquer outro método adequado para limpeza da pele. Os animais serão observados diariamente, registando-se sempre as manifestações de toxicidade assim como o momento do seu aparecimento, a sua intensidade e a sua duração. Proceder-se-á à observação das modificações do pêlo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central, assim como da actividade somatomotora e do comportamento. Determinar-se-á semanalmente o peso dos animais. Recomenda-se também que se determine semanalmente o consumo alimentar. Deve observar-se regularmente os animais para se evitar perdas, tanto quanto possível, causadas por canibalismo, autólise dos tecidos ou condições impróprias de alojamento. No fim da experiência todos os animais sobreviventes dos grupos tratados não satélites serão autopsiados. Os animais moribundos e os animais que apresentem graves sintomas de angústia ou dor deverão ser imediatamente retirados, sacrificados e submetidos a autópsia. Os exames a seguir enunciados deverão ser efectuados no fim do período de ensaio para todos os animais incluindo os de controlo: As outras análises eventualmente necessárias para uma avaliação toxicológica adequada incluem as análises de cálcio, fósforo, cloretos, sódio, potássio, glicose em jejum, análises de lípidos, de hormonas, equilíbrio ácido-básico, meta-hemoglobina e actividade colinesterásica. Pode recorrer-se a outras análises bioquímicas clínicas sempre que necessário para melhorar a investigação dos efeitos observados.

1.6.3.

1. Um exame hematológico compreendendo os seguintes testes: hematócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, contagem de leucócitos, fórmula leucocitária, bem como um estudo sobre o potencial de coagulação.

2. A determinação de dados bioquímicos do sangue incluindo pelo menos um parâmetro da função hepática e renal: alanina aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutâmico-pirúvica), aspartato aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutâmico-oxalo-acética), azoto ureico, albumina, creatinina plasmática, bilirrubina total e as proteínas séricas totais.

1.6.4. Autópsia Todos os animais submetidos a experiência deverão ser submetidos a uma autópsia geral. Pelo menos o fígado, os rins, as glândulas supra-renais e os testículos deverão ser pesados ainda húmidos, tão cedo quanto possível após a dissecação para se evitar a perda de líquidos por evaporação. Todos os órgãos e tecidos, isto é, pele normal e tratada, fígado, rins, baço, testículos, glândulas supra-renais, coração e órgãos-alvo (isto é, os órgãos que apresentem lesões graves ou variações de volume) deverão ser conservados num meio adequado para eventual exame histopatológico futuro.

1.6.5. Exame histopatológico No grupo tratado com a dose mais elevada e no grupo de controlo deve efectuar-se o exame histológico dos órgãos e tecidos conservados. Os órgãos e tecidos que apresentem efeitos susceptíveis de serem atribuídos à substância de ensaio administrada na dose mais elevada deverão ser examinados em todos os grupos tratados com doses inferiores. Deve proceder-se a um exame histológico dos animais de qualquer grupo-satélite com particular ênfase sobre os órgãos e tecidos que apresentaram efeitos identificados nos outros grupos tratados.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:

dados sobre os animais (espécie, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.),

condições experimentais (incluindo o tipo de cobertura: oclusiva ou não oclusiva),

doses (incluindo o veículo, se utilizado) e concentrações,

dose sem efeito, se possível,

resposta tóxica por sexo e por dose,

momento da morte durante a experiência ou indicação dos animais sobreviventes no fim da experiência,

efeitos tóxicos ou outros,

momento da observação de qualquer manifestação anormal e sua evolução,

dados relativos à alimentação e peso corporal,

exames hematológicos efectuados e resultados,

provas bioquímicas clínicas utilizadas e seus resultados,

resultados da autópsia,

descrição pormenorizada de todos os resultados histopatológicos,

tratamento estatístico dos resultados, se possível,

discussão dos resultados,

interpretação dos resultados.

3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Ver Introdução Geral, parte B (ponto D).

4. REFERÊNCIAS Ver Introdução Geral, parte B (ponto E).

B.10. MUTAGENICIDADE — ENSAIO IN VITRO DE ABERRAÇÕES CROMOSSÓMICAS EM MAMÍFEROS

B.10.

1. MÉTODO O presente método é idêntico ao método OCDE TG 473 — Ensaio in vitro de aberrações cromossómicas em mamíferos (1997).

1.

1.1. INTRODUÇÃO O objectivo do ensaio in vitro de aberrações cromossómicas é identificar os agentes que causam aberrações estruturais dos cromossomas em culturas de células de mamíferos (1) (2) (3). As aberrações estruturais podem ser de dois tipos, afectando os cromossomas ou os cromatídeos. A maior parte dos mutagéneos químicos induzem aberrações cromatídicas, mas também podem ocorrer aberrações cromossómicas. Um aumento da taxa de poliploidia pode indicar que um determinado produto químico tem potencial para induzir aberrações numéricas. Contudo, este método não foi concebido para medir as aberrações numéricas nem é normalmente utilizado com esse objectivo. As mutações nos cromossomas e eventos relacionados causam diversas doenças genéticas humanas, existindo provas substanciais de que as alterações que causam nos oncogenes e nos genes supressores de tumores das células somáticas estão envolvidas na indução de cancro nos seres humanos e em animais utilizados em experiências. O ensaio in vitro de aberrações cromossómicas pode envolver culturas de linhas celulares bem estabelecidas, de uma determinada estirpe ou ainda culturas de células primárias. As células utilizadas são seleccionadas com base na sua capacidade de crescimento em cultura, na estabilidade do cariótipo, no número e diversidade dos seus cromossomas e na frequência das aberrações cromossómicas espontâneas. Os ensaios in vitro exigem geralmente a utilização de uma fonte exógena de activação metabólica, que não consegue imitar inteiramente as condições in vivo nos mamíferos. Deve ter-se o cuidado de evitar condições que conduzam a resultados positivos que não sejam reflexo de uma mutagenicidade intrínseca mas que possam resultar, por exemplo, de mudanças do pH, da pressão osmótica ou ainda de níveis elevados de citotoxicidade (4) (5). O presente ensaio é utilizado para a análise de agentes eventualmente mutagéneos ou carcinogéneos para os mamíferos. Muitos dos compostos que dão um resultado positivo no presente ensaio são carcinogéneos nos mamíferos, não existindo, contudo, uma correlação perfeita entre o ensaio e a carcinogenicidade. A correlação depende da classe química e existem cada vez mais provas de que alguns agentes carcinogéneos não são detectados por este ensaio, por os seus mecanismos de actuação não passarem directamente pela danificação do ADN. Ver também a parte B da Introdução Geral.

1.2. DEFINIÇÕES Aberração cromatídica: lesão estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida de união, de cromatídeos simples. Aberração cromossómica: lesão estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida de união, de ambos os cromatídeos no mesmo local. Endorreduplicação: processo mediante o qual, na sequência de um período S de replicação do ADN, o núcleo não sofre mitose, iniciando-se um novo período S, que resulta em cromossomas com 4, 8, 16, ... cromatídeos. Lacuna: lesão acromática de extensão inferior à largura de um cromatídeo e que determine um ligeiro desalinhamento do mesmo. Índice mitótico: relação entre o número de células em metafase e o número total de células observadas numa população de células, que fornece uma indicação do grau de proliferação da população em causa. Aberração numérica: alteração do número de cromossomas relativamente ao número de cromossomas característico das células utilizadas. Poliploidia: número de cromossomas múltiplo do número haplóide (n), mas diferente do número diplóide (ou seja, 3n, 4n, etc.). Aberração estrutural: alteração da estrutura dos cromossomas detectável por exame microscópico das células em metafase, na forma de supressão de segmentos, de alterações de partes da sequência ou da troca de segmentos num cromatídeo ou entre cromatídeos.

1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO As culturas celulares são expostas à substância em estudo tanto na presença como na ausência de um sistema de activação metabólica. Após um período determinado, adiciona-se um produto fixador da metafase (por exemplo, Colcemid® ou colchicina); as células são colhidas, coradas e analisadas microscopicamente para detectar a presença de aberrações cromossómicas nas células em metafase.

1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.4.

1.4.1. Preparação

1.4.1.

1.4.1.1. Células Podem utilizar-se diversas linhas celulares, estirpes ou culturas celulares primárias, incluindo células humanas (por exemplo: fibroblastos do hamster da China ou linfócitos da circulação periférica do ser humano ou de outros mamíferos).

1.4.1.2. Meios e condições de cultura As culturas devem ser mantidas em meios de cultura e condições de incubação adequados (tipo de recipiente, concentração de CO2, temperatura e humidade). As linhas celulares e estirpes devem ser periodicamente controladas no que respeita à estabilidade do número modal de cromossomas e à ausência de contaminação por micoplasma, não devendo ser utilizadas se se verificar que foram contaminadas. Deve ser conhecida a duração do ciclo celular normal para as células e condições de cultura utilizadas.

1.4.1.3. Preparação das culturas Linhas e estirpes de células definidas: multiplicam-se as células provenientes de culturas de arranque por incubação a 37 oC num meio cuja densidade não permita a confluência das culturas antes da colheita. Linfócitos: adiciona-se sangue total tratado com anticoagulante (por exemplo: heparina) ou linfóticos provenientes de indivíduos saudáveis a um meio de cultura contendo um agente mitogénico (por exemplo: fito-hemoglutinina), incubando a 37 oC.

1.4.1.4. Activação metabólica As células devem ser expostas à substância em estudo tanto na presença como na ausência de um sistema adequado de activação metabólica. O sistema mais frequentemente utilizado consiste numa fracção pós-mitocondrial reforçada com co-factor (S9) preparada a partir de fígados de roedores tratados com agentes de indução enzimática, como por exemplo Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) ou uma mistura de fenobarbitona e β-naftoflavona (10) (11) (12). A fracção pós-mitocondrial é geralmente utilizada em concentrações na gama dos 1-10 % v/v no meio de ensaio final. O estado do sistema de activação metabólica pode depender da classe dos produtos químicos em estudo. Em alguns casos pode revelar-se adequado utilizar várias concentrações diferentes de fracção pós-mitocondrial. Progressos tais como a elaboração por engenharia genética de linhas celulares que exprimam enzimas de activação específicos oferecem possibilidades de activação endógena. A escolha das linhas celulares a utilizar terá de ser cientificamente justificada (por exemplo: pela relevância do isoenzima de citocromo P450 para o metabolismo da substância em estudo).

1.4.1.5. Substância em estudo/preparação As substâncias sólidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veículos adequados e, se necessário, diluídas antes de serem adicionadas às células. As substâncias líquidas podem ser adicionadas directamente aos sistemas em estudo e/ou diluídas antes de serem adicionadas às células. Devem ser utilizadas preparações frescas da substância em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo armazenamento não coloca problemas para o ensaio.

1.4.2. Condições de ensaio

1.4.2.

1.4.2.1. Solvente/veículo O solvente/veículo não deve reagir com a substância em estudo, devendo ser compatível com a sobrevivência das células e com a actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veículos cujas propriedades não se encontrem totalmente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possível, recomenda-se a utilização de solventes/veículos aquosos. Quando forem realizados ensaios de substâncias instáveis na presença de água, os solventes orgânicos utilizados devem ser anidros. A água poderá ser removida através de um filtro molecular.

1.4.2.2. Concentrações de exposição A citotoxidade, a solubilidade no sistema de ensaio e as alterações do pH ou da pressão osmótica constituem alguns dos critérios a ter em conta na determinação da concentração máxima. A citotoxidade deve ser determinada na experiência principal tanto na presença como na ausência de um sistema de activação metabólica, por recurso a um indicador adequado da integridade e do crescimento celulares, nomeadamente o grau de confluência, as contagens de células viáveis ou o índice mitótico. Poderá ser útil determinar previamente a citotoxidade e solubilidade através de uma experiência preliminar. Devem utilizar-se pelo menos três concentrações analisáveis. No caso de substâncias que sejam citotóxicas, as concentrações utilizadas devem abranger uma gama compreendida entre a toxicidade máxima e uma toxicidade reduzida ou nula; o que significa geralmente que as concentrações devem variar num factor de 2 a √10. No momento da colheita, a concentração máxima deve determinar uma redução significativa (superior a 50 %) do grau de confluência, da contagem de células viáveis e do índice mitótico. O índice mitótico constitui uma medida indirecta dos efeitos citotóxicos/citostáticos, dependendo do tempo decorrido após a exposição. Todavia, a sua utilização é aceitável no caso de culturas em suspensão, em que os restantes métodos de determinação da toxicidade podem revelar-se fastidiosos ou impraticáveis. Os dados relativos à cinética do ciclo celular, nomeadamente o tempo médio de geração (TMG), podem ser utilizados como informação suplementar. O TMG constitui, no entanto, uma média global, que nem sempre permite identificar a existência de subpopulações com um crescimento menos rápido, podendo acontecer em alguns casos que ligeiros aumentos do TMG possam resultar em atrasos muito substanciais no que respeita ao surgimento de aberrações. No caso de substâncias sem efeitos citotóxicos consideráveis, a concentração máxima do ensaio deve ser a mais baixa de 5 μl/ml, 5 mg/ml ou 0,01 M. Para substâncias relativamente insolúveis que não sejam tóxicas em concentrações inferiores à concentração insolúvel, a dose máxima a utilizar deve corresponder a uma concentração acima do limite de solubilidade no meio de cultura final após o período de exposição. Em alguns casos (por exemplo: quando a toxicidade apenas ocorre em concentrações superiores à menor concentração insolúvel) é conveniente ensaiar mais de uma concentração com precipitação visível. Poderá ser útil avaliar a solubilidade no início e no fim da exposição, uma vez que a mesma se pode alterar durante a exposição no sistema de ensaio devido à presença de células, de S9, de soro, etc. A insolubilidade pode ser detectada à vista desarmada. O precipitado não deve interferir com as contagens necessárias.

1.4.2.3. Controlos negativos e positivos Cada experiência deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veículo), tanto na presença como na ausência de um sistema de activação metabólica. Quando for utilizada activação metabólica, o produto químico de controlo positivo deve ser o mesmo que exige a activação para dar uma resposta mutagénica. Para os controlos positivos deve ser utilizado um agente clastogénico conhecido aos níveis de exposição esperados, de forma a obter um aumento detectável e reprodutível ao longo do tempo que permita demonstrar a sensibilidade do sistema de ensaio. As concentrações do controlo positivo devem ser escolhidas de modo a que os seus efeitos sejam claros, devendo ser utilizadas lâminas codificadas de forma a que não sejam imediatamente identificáveis pela pessoa que procede à leitura. As substâncias de controlo positivo podem ser, por exemplo: Condição de activação metabólica Substância N.o CAS N.o EINECS Ausência de activação metabólica exógena metanossulfonato de metilo 66-27-3 200-625-0 metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 etil nitrosureia 759-73-9 212-072-2 mitomicina C 50-07-7 200-008-6 N-óxido de 4-nitroquinolina 56-57-5 200-281-1 Presença de activação metabólica exógena benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5 ciclofosfamida ciclofosfamida monohidrato 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Podem utilizar-se no controlo positivo outras substâncias adequadas. A possibilidade de utilização de produtos químicos de uma classe afim para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam. Para cada colheita, devem também realizar-se controlos negativos, em que as células são expostas apenas ao solvente ou veículo e ao meio de tratamento, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal. Além disso, devem igualmente ser utilizados controlos não expostos à substância em estudo, a menos que já existam dados de controlo que demonstrem que o solvente escolhido não induz nenhum efeito deletério ou mutagénico.

1.4.3. Procedimento

1.4.3.

1.4.3.1. Exposição à substância em estudo As células em crescimento são expostas à substância em estudo na presença e na ausência de um sistema de activação metabólica. Os linfócitos devem ser expostos à substância em estudo cerca de 48 horas após o estímulo mitogénico.

1.4.3.2. Normalmente, devem ser utilizadas culturas em duplicado para cada concentração, sendo fortemente recomendada a utilização de culturas em duplicado também para os controlos negativos/solventes. Quando puder ser demonstrado, a partir dos dados de experiências anteriores, que a diferença entre as culturas duplicadas é mínima (13) (14), pode aceitar-se a utilização de uma única cultura para cada concentração. As substâncias gasosas ou voláteis devem ser ensaiadas por métodos apropriados, por exemplo em recipientes selados (15) (16).

1.4.3.3. Intervalo de amostragem das culturas No primeiro ensaio, as células são expostas à substância em estudo, na presença e na ausência de um sistema de activação metabólica, durante 3-6 horas, sendo colhidas a intervalos equivalentes a cerca de 1,5 ciclos celulares normais, a partir do início da exposição (12). Se este protocolo der resultados negativos tanto na presença como na ausência de um sistema de activação, deve ser realizada uma experiência adicional sem activação, com exposição em contínuo até à colheita, passado um tempo equivalente a 1.5 ciclos celulares normais. Certos produtos químicos podem ser detectados mais facilmente com tempos de exposição/colheita superiores a 1,5 ciclos celulares. Os resultados negativos com activação metabólica terão de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmação dos resultados negativos não seja considerada necessária, deve ser apresentada uma justificação.

1.4.3.4. Preparação dos cromossomas As culturas de célula são tratadas com Colcemid® ou colchicina, geralmente durante 1-3 horas antes da colheita. Procede-se à colheita individual das culturas e ao respectivo processamento, com vista à preparação dos cromossomas, que inclui o tratamento hipotónico das células, seguido de fixação e coloração.

1.4.3.5. Análise Todas as lâminas, incluindo as provenientes dos lotes de controlo positivo e negativo, devem ser independentemente codificadas antes da análise microscópica. Uma vez que os processos de fixação dão frequentemente lugar à ruptura de uma determinada proporção das células em metafase, com perda dos cromossomas, as células contabilizadas devem apresentar, para todos os tipos de célula, um número de centrómeros igual ao número modal ± 2. Devem ser contabilizadas pelo menos 200 metafases com uma boa distribuição para cada concentração e para o controlo, com boa concordância entre os replicados, quando existam. Esse número pode ser inferior caso se observe um número elevado de aberrações. Embora o objectivo do ensaio consista na detecção de aberrações cromossómicas estruturais, devem registar-se os casos de poliploidia e de endorreduplicação, quando ocorram.

2. DADOS

2.

2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS A unidade experimental é a célula, pelo que se deve avaliar a percentagem de células que apresentam uma aberração cromossómica estrutural. Os diferentes tipos de aberração cromossómica estrutural devem ser enumerados e discriminados pelo seu número e frequência nas culturas experimentais e de controlo. A ocorrência de lacunas é registada em separado e incluída no relatório, mas não é geralmente contabilizada para o cálculo da frequência total das aberrações. Durante a experiência principal para a detecção de aberrações, devem ser igualmente registadas as medições da citotoxidade realizadas em paralelo com os ensaios, para todas as culturas de controlo e para os casos de resposta negativa. Devem ser fornecidos dados individuais para cada cultura, para além de um quadro com o resumo dos dados globais. Não é necessário comprovar uma reacção positiva inequívoca. Os resultados ambíguos devem ser esclarecidos através de experiências adicionais, de preferência com modificação das condições experimentais. A necessidade de confirmar os resultados negativos já foi discutida no ponto 1.4.3.3. As experiências subsequentes devem contemplar a modificação dos parâmetros de estudo, por forma a alargar a gama de condições avaliadas. Os parâmetros de estudo que podem ser alterados incluem a gama e os intervalos entre as diferentes concentrações e as condições da activação metabólica.

2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Existem vários critérios para determinar um resultado positivo, nomeadamente o aumento do número de células com aberrações cromossómicas relacionado com a concentração ou que seja reprodutível. Deve atender-se, antes de mais, à importância biológica dos resultados. Como auxílio para a avaliação dos resultados dos ensaios, poderão ser utilizados métodos estatísticos (3) (13), embora a significância estatística não deva ser o único elemento para a determinação de uma resposta positiva. Um aumento do número de células poliplóides pode indicar que a substância em estudo apresenta o potencial de inibir a mitose e de induzir aberrações cromossómicas numéricas. Um aumento do número de células com cromossomas endorreduplicados pode indicar que a substância em estudo apresenta o potencial de inibir a progressão do ciclo celular (17) (18). Uma substância cujos resultados não cumpram os critérios supra é considerada não mutagénica para o sistema em causa. Embora a maioria de experiências tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o conjunto dos dados não permitirá que se obtenha uma opinião inequívoca sobre a actividade da substância em estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambíguos ou duvidosos independentemente do número de vezes que a experiência seja repetida. Um resultado positivo no ensaio in vitro de aberrações cromossómicas indica que a substância em estudo induz aberrações cromossómicas estruturais nas células somáticas de mamíferos em cultura. Um resultado negativo indica que, nas condições do ensaio, a substância em estudo não induz aberrações cromossómicas estruturais nas células somáticas de mamíferos em cultura.

3. APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS

3. RELATÓRIO DE ENSAIO

O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:

Solvente/veículo:

justificação para a escolha do veículo,

solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/veículo, se conhecida.

Células:

tipo e origem das células,

características do cariótipo e adequação do tipo de células utilizado,

ausência de micoplasma, quando aplicável,

informação sobre a duração do ciclo celular,

sexo dos dadores de sangue, sangue completo ou linfócitos, agente mitogénico utilizado,

número de passagens, quando aplicável,

métodos de manutenção da cultura celular, quando aplicável,

número modal de cromossomas.

Condições de ensaio:

identificação e concentração da substância que pára a metafase, duração da exposição da célula,

justificação para a selecção das concentrações e do número de culturas, incluindo, por exemplo, dados sobre a citotoxicidade e sobre as limitações de solubilidade, quando disponíveis,

concentração da substância em estudo,

volumes adicionados do veículo e da substância em estudo,

temperatura de incubação,

tempo de incubação,

duração da exposição,

densidade celular da cultura de arranque, quando aplicável,

tipo e composição do sistema de activação metabólica, incluindo critérios de aceitabilidade,

controlos positivos e negativos,

métodos de preparação das lâminas,

critérios de contabilização das aberrações,

número de células em metafase analisadas,

métodos de determinação da toxicidade,

critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou não conclusivo.

Resultados:

sinais de toxicidade, ou seja, grau de confluência, dados relativos ao ciclo celular, contagens de células, índice mitótico,

sinais de precipitação,

dados sobre o pH e a pressão osmótica do meio de tratamento, caso tenham sido determinados,

definição das aberrações observadas, incluindo as lacunas,

número de células em que se observa uma aberração cromossómica e tipo dessas aberrações, discriminados para cada cultura exposta e de controlo,

alterações da ploidia, quando observadas,

relação dose-resposta, quando seja possível de determinar,

análise estatística, quando tenha sido realizada,

dados relativos ao controlo negativo (solvente/veículo) e positivo realizados em paralelo com o ensaio,

dados históricos sobre o controlo negativo (solvente/veículo) e positivo, com as respectivas gamas, valores médios e desvios-padrão.

Discussão dos resultados.

Conclusões.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)

REFERÊNCIAS Evans, H. J., (1976) Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, p. 1-29. Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T., (1985) The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, p. 427-432. Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E., (1978) Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl. 10), p. 1-175. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res, 257, p. 147-204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992) Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, p. 297-305. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364. Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215. Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N., (1976) Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, p. 83-90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr., (1979) Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, p. 277-290. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992) Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, p. 85-88. Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T., (1994) Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, p. 241-261. Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B., (1989) Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, p. 141-154. Soper, K.A. and Galloway, S.M., (1994) Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, p. 139-149. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91-103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795-801. Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, p. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362-1364.

B.11. MUTAGENICIDADE — ENSAIO IN VIVO DE ABERRAÇÕES CROMOSSÓMICAS EM CÉLULAS DA MEDULA DE MAMÍFEROS

B.11.

1. MÉTODO O presente método é idêntico ao método OCDE TG 475 — Ensaio de aberrações cromossómicas em células da medula de mamíferos (1977).

1.

1.1. INTRODUÇÃO O ensaio de aberrações cromossómicas em células da medula de mamíferos é utilizado para a detecção de aberrações cromossómicas estruturais induzidas pela substância em estudo em células da medula de animais, geralmente roedores (1) (2) (3) (4). As aberrações estruturais podem ser de dois tipos, afectando os cromossomas ou os cromatídeos. A maior parte dos mutagéneos químicos induzem aberrações cromatídicas, mas também podem ocorrer aberrações cromossómicas. Um aumento da taxa de poliploidia pode indicar que um determinado produto químico tem potencial para induzir aberrações numéricas. As mutações cromossómicas e eventos relacionados causam diversas doenças genéticas humanas, existindo provas substanciais de que as alterações que causam nos oncogenes e nos genes supressores de tumores das células somáticas estão envolvidas na indução de cancro nos seres humanos e em animais utilizados em experiências. Os animais utilizados no presente ensaio são geralmente roedores. A medula é o tecido objectivo do ensaio, por se tratar de um tecido altamente vascularizado e que contém uma população de células com grande ritmo de duplicação e que podem ser facilmente isoladas e processadas. O presente método não se destina à aplicação noutras espécies animais ou tecidos objectivo. O presente ensaio de aberrações cromossómicas é particularmente relevante para a avaliação dos riscos mutagénicos, uma vez que permite tomar em consideração os factores do metabolismo in vivo da farmacocinética e dos processos de reparação do ADN, embora estes possam variar de espécie para espécie e de tecido para tecido. Os ensaios in vivo são igualmente úteis para a investigação complementar de efeitos mutagénicos detectados através de ensaios in vitro. Se existirem provas de que nem a substância em estudo nem nenhum dos seus metabolitos reactivos entram em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio não é apropriado. Ver também a parte B da Introdução Geral.

1.2. DEFINIÇÕES Aberração cromatídica: lesão estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida de união, de cromatídeos simples. Aberração cromossómica: lesão estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida de união, de ambos os cromatídeos no mesmo local. Endorreduplicação: processo no qual, após um período S de replicação do ADN, o núcleo não entra em mitose iniciando um novo período S. O resultado são cromossomas com 4, 8, 16, ... cromatídeos. Lacuna: lesão acromática de extensão inferior à largura de um cromatídeo e que determine um ligeiro desalinhamento do mesmo. Aberração numérica: alteração do número de cromossomas relativamente ao número de cromossomas característico das células utilizadas. Poliploidia: número de cromossomas múltiplo do número haplóide (n), mas diferente do número diplóide (ou seja, 3n, 4n, etc.). Aberração estrutural: alteração da estrutura dos cromossomas detectável por exame microscópico das células em metafase, na forma de supressão de segmentos, de alterações de partes da sequência ou da troca de segmentos num cromatídeo ou entre cromatídeos.

1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Os animais são expostos à substância em estudo através de um modo de exposição apropriado, sendo sacrificados passado o tempo necessário após a exposição. Antes do sacrifício, os animais são tratados com um produto fixador da metafase (por exemplo, colchicina ou Colcemid®). Seguidamente, são feitas preparações de cromossomas a partir das células de medula onde, após coloração, as células em metafase são analisadas para detecção de aberrações cromossómicas.

1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.4.

1.4.1. Preparação

1.4.1.

1.4.1.1. Selecção das espécies animais Geralmente, são utilizados ratos, ratazanas ou hamsters chineses, embora possa ser qualquer outra espécie de mamifero apropriada. Devem ser utilizados animais adultos saudáveis jovens das raças de laboratório mais comuns. No início do estudo, a variaçao de peso entre os animais deve ser mínima, não devendo exceder ± 20 % do peso médio de cada sexo.

1.4.1.2. Condições de acomodação e alimentação Devem ser aplicadas as condições gerais referidas na Introdução Geral, parte B, embora o objectivo para a humidade deva ser de 50 %-60 %.

1.4.1.3. Preparação dos animais Os animais adultos saudáveis jovens são distribuídos aleatoriamente pelos grupos de controlo e pelos grupos expostos. As gaiolas devem ser dispostas de modo a que eventuais efeitos devidos à respectiva colocação sejam minimizados. Os animais são identificados de forma inequívoca, devendo ser aclimatados às condições de laboratório durante pelo menos cinco dias.

1.4.1.4. Preparação das doses As substâncias sólidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veículos adequados e, se necessário, diluídas antes de serem adicionadas às células. As substâncias líquidas podem ser adicionadas directamente aos sistemas em estudo e/ou diluídas antes de serem adicionadas às células. Devem ser utilizadas preparações frescas da substância em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo armazenamento não coloca problemas para o ensaio.

1.4.2. Condições do ensaio

1.4.2.

1.4.2.1. Solvente/veículo O solvente/veículo não deve reagir com a substância em estudo nem produzir efeitos tóxicos nas doses utilizadas. Caso se utilizem solventes/veículos cujas propriedades não se encontrem totalmente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possível, recomenda-se a utilização de solventes/veículos aquosos.

1.4.2.2. Controlos Cada experiência deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veículo) para cada sexo. Com excepção da exposição à substância em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo, devem ser manuseados de forma idêntica. Os controlos positivos devem produzir aberrações estruturais in vivo aos níveis a que se espera o surgimento de um aumento detectável em relação à linha de base. A dose a administrar para o controlo positivo deve ser escolhida de modo a que os seus efeitos sejam claros mas também a que as lâminas codificadas não sejam imediatamente identificadas pela pessoa que procede às leituras. É aceitável que o controlo positivo seja administrado por uma via diferente da substância em estudo e que só seja realizada uma amostra. A possibilidade de utilização de produtos químicos de uma classe relacionada para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam. As substâncias de controlo positivo podem incluir, por exemplo: Substância Número CAS Número EINECS metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 etilnitrosureia 759-73-9 212-072-2 mitomicina C 50-07-7 200-008-6 ciclofosfamida ciclofosfamida monohidrato 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 trietilenomelamina 51-18-3 200-083-5 Para cada colheita devem também realizar-se controlos negativos, em que os animais são expostos apenas ao solvente ou veículo, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal, a menos que existam dados históricos de controlo aceitáveis em relação à variabilidade de animal para animal e à frequência da ocorrência de células com aberrações cromossómicas. Se só estiver prevista uma amostra dos controlos negativos, a altura mais apropriada é a primeira amostra. Além disso, devem igualmente ser utilizados controlos não expostos à substância em estudo, a menos que já existam dados de estudos anteriores ou publicados que mostrem que o solvente/veículo escolhido não induz nenhum efeito deletério ou mutagénico.

1.5. PROCEDIMENTO

1.5.

1.5.1. Número e sexo dos animais Cada grupo de estudo e de controlo deve incluir pelo menos cinco animais analisáveis por sexo. Se no momento do estudo existirem dados disponíveis de estudos com as mesmas espécies e com utilização da mesma via de administração que demonstrem que não há qualquer diferença substancial da toxicidade entre os sexos, será suficiente testar um único sexo. Nos casos em que a exposição humana aos produtos químicos possa ser específica a cada sexo, como acontece com alguns produtos farmacêuticos, o ensaio deve ser executado com animais do sexo em causa.

1.5.2. Programação do tratamento As substâncias de ensaio são preferivelmente administradas numa única exposição, podendo igualmente ser administradas numa dose dividida, ou seja, duas exposições no mesmo dia, separadas por apenas algumas horas, para facilitar a administração de grandes volumes. Qualquer outro regime de administração terá de ser cientificamente justificado. Devem ser colhidas duas amostras separadas, após exposição durante um dia. Para os roedores, a primeira amostra deve ser colhida 1,5 ciclos celulares normais (que é normalmente de 12-18 horas) após a exposição. Dado que o tempo necessário para a absorção e metabolismo da substância em estudo, bem como o seu efeito sobre a cinética do ciclo celular, podem afectar o momento óptimo para a detecção de uma eventual aberração cromossómica, recomenda-se a recolha de uma segunda amostra 24 horas após a primeira. Se forem utilizados regimes de administração ao longo de mais de um dia, deve ser colhida uma amostra 1,5 ciclos celulares normais após a exposição final. Antes do sacrifício, os animais são injectados intraperitonealmente com uma dose apropriada de um agente de fixação da metafase (por exemplo, Colcemid® ou colchicina). As amostras serão colhidas a intervalos regulares, correspondentes a aproximadamente 3-5 horas para os ratos e a 4-5 horas para os hamsters chineses, a partir desse momento. As células da medula são colhidas e analisadas para detecção de aberrações cromossómicas.

1.5.3. Doses Se for realizado um estudo para avaliação da gama de doses a administrar, por não estarem disponíveis dados apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratório, utilizando as mesmas espécies, linha celular, sexo e regime de exposição a utilizar no estudo principal (5). Se a substância for tóxica, deverão ser utilizadas três doses diferentes para a primeira amostragem, abrangendo uma gama compreendida entre a toxicidade máxima e uma toxicidade reduzida ou quase nula. Na segunda amostragem só será necessário avaliar a dose máxima, que é definida como a dose que produz sinais de toxicidade tais que indiquem que a utilização de doses superiores, com o mesmo regime de administração, produzirá mortalidade. As substâncias com actividade biológica específica em doses baixas e não tóxicas (como acontece com as hormonas e agentes mitogénicos) poderão constituir uma excepção aos critérios de fixação da dose, devendo ser avaliadas caso a caso. A dose máxima pode igualmente ser definida como a dose que produz algumas indicações de toxicidade na medula (por exemplo, uma redução superior a 50 % do índice mitótico).

1.5.4. Ensaio-limite Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2000 mg/kg de peso corporal numa única exposição ou em duas exposições no mesmo dia não produzir nenhum efeito tóxico perceptível e se, com base nos dados respeitantes a substâncias estruturalmente relacionadas, não for previsível a existência de toxicidade genética, poderá não ser considerado necessário um estudo completo com utilização de três doses diferentes. Para os estudos de maior duração, a dose limite é de 2000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposições até 14 dias e de 1000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposições de duração superior a 14 dias. A exposição prevista para o ser humano pode indicar a necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios-limite.

1.5.5. Administração das doses A substância em estudo é geralmente administrada por sonda esofágica, utilizando um tubo estomacal ou cânula de intubação apropriada, ou por injecção intraperitoneal. Poderão ser aceites, mediante justificação, outras vias de administração. O volume máximo de líquido que pode ser administrado de cada vez por sonda esofágica ou por injecção depende também do tamanho do animal de ensaio, não devendo exceder 2 ml/100 g de peso corporal. A utilização de volumes mais elevados deve ser justificada. Com excepção das substâncias que causem irritação ou que sejam corrosivas, cujos efeitos serão normalmente agravados em concentrações mais altas, a variabilidade do volume de ensaio deve ser minimizada através do ajustamento das concentrações, por forma a garantir um volume constante e independente da dose a administrar.

1.5.6. Preparação dos cromossomas Imediatamente após o sacrifício, a medula é colhida, exposta a uma solução hipotónica e fixada. As células são depois esfregadas em lâminas e coradas.

1.5.7. Análise O índice mitótico deve ser determinado como medição da citotoxicidade em pelos menos 1000 células por animal para todos os animais expostos à substância em estudo (incluindo os controlos positivos) e para os animais não expostos do controlo negativo. Devem ser analisadas pelo menos 100 células de cada animal. Este número poderá ser menor quando se verificarem taxas elevadas de aberrações. Todas as lâminas, incluindo as provenientes dos lotes de controlo positivo e negativo, devem ser independentemente codificadas antes da análise microscópica. Uma vez que os processos de fixação dão frequentemente lugar à ruptura de uma determinada proporção das células em metafase, com perda dos cromossomas, as células contabilizadas devem apresentar, para todos os tipos de célula, um número de centrómeros igual ao número modal ± 2.

2. DADOS

2.

2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num quadro. A unidade experimental é o animal. Para cada animal, devem ser apresentados o número de células contabilizadas, o número de aberrações por célula e a percentagem de células com aberrações cromossómicas estruturais. Os diferentes tipos de aberração cromossómica estrutural devem ser enumerados, com os respectivos números e frequências, para os grupos expostos à substância em estudo e para os grupos de controlo. A ocorrência de lacunas é registada em separado e incluída no relatório, mas não é geralmente contabilizada para o cálculo da frequência total das aberrações. Se não houver qualquer evidência de uma diferença na resposta entre os sexos, os dados de ambos os sexos poderão ser combinados para fins estatísticos.

2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Existem vários critérios para determinar um resultado positivo, nomeadamente o aumento do número de células com aberrações cromossómicas relacionado com a concentração ou um claro aumento do número de células com aberrações num determinado grupo ou numa determinada amostra. Deve atender-se, antes de mais, à importância biológica dos resultados. Como auxílio para a avaliação dos resultados dos ensaios, poderão ser utilizados métodos estatísticos (6), embora a significância estatística não deva ser o único elemento para a determinação de uma resposta positiva. Os resultados ambíguos devem ser esclarecidos através de estudos adicionais, de preferência com modificação das condições experimentais. Um aumento do número de células poliplóides pode indicar que a substância em estudo apresenta o potencial de inibir a mitose e de induzir aberrações cromossómicas numéricas. Um aumento do número de células com cromossomas endorreduplicados pode indicar que a substância em estudo apresenta o potencial de inibir a progressão do ciclo celular (7) (8). Uma substância cujos resultados não cumpram os critérios supra no presente ensaio é considerada não mutagénica. Embora a maioria de experiências tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o conjunto dos dados não permitirá que se obtenha uma opinião inequívoca sobre a actividade da substância em estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambíguos ou duvidosos independentemente do número de vezes que a experiência seja repetida. Um resultado positivo no ensaio in vitro de aberrações cromossómicas indica que a substância em estudo induz aberrações cromossómicas estruturais nas células da medula das espécies testadas. Um resultado negativo indica que, nas condições do ensaio, a substância em estudo não induz aberrações cromossómicas estruturais nas células da medula das espécies testadas. Deve ser discutida a probabilidade de a substância em estudo ou os seus metabolitos alcançarem o sistema circulatório geral ou especificamente o tecido objectivo (ou seja, a toxicidade sistémica).

3. APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS

3. RELATÓRIO DE ENSAIO

O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:

Solvente/veículo:

justificação para a escolha do veículo,

solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/veículo, se conhecida.

Animais de ensaio:

espécie/linha celular utilizada,

número, idade e sexo dos animais,

origem, condições de acomodação, alimentação, etc.,

peso de cada animal no início do ensaio, incluindo a gama de pesos, a respectiva média e o desvio-padrão para cada grupo.

Condições de ensaio:

controlos positivos e negativos (veículo/solvente),

resultados do estudo para definição da gama de doses, quando tenha sido realizado,

justificação para a selecção das doses,

preparação da substância em estudo,

modo de administração da substância em estudo,

justificação da via de administração escolhida,

método para a verificação de que a substância em estudo atingiu a circulação geral ou o tecido objectivo, quando aplicável,

conversão da concentração da substância em estudo (ppm) na alimentação/abeberação para a dose real (mg/kg peso corporal/dia), quando aplicável,

qualidade dos alimentos e da água,

descrição pormenorizada dos calendários de exposição e amostragem,

métodos de medição da toxicidade,

substância utilizada para fixar a metafase, respectiva concentração e duração de exposição,

métodos de preparação das lâminas,

critérios de contabilização das aberrações,

número de células analisadas por animal,

critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou não conclusivo.

Resultados:

sinais de toxicidade,

índice mitótico,

tipo e número de aberrações observadas em cada animal,

número total de aberrações em cada grupo, com as respectivas médias e desvios-padrão,

número de células aberrantes em cada grupo, com as respectivas médias e desvios-padrão,

alterações da ploidia, quando observadas,

relação dose-resposta, quando seja possível de determinar,

análise estatística, quando tenha sido realizada,

dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o ensaio,

dados históricos sobre o controlo negativo com as respectivas gamas, valores médios e desvios-padrão,

dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o ensaio.

Discussão dos resultados.

Conclusões.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)

REFERÊNCIAS Adler, I.D., (1984) Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275-306. Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, p. 157-165. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L., (1990) In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141. Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, p. 305-312. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313-319. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge. p. 184-232. Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, p. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362-1364.

B.12. MUTAGENICIDADE — ENSAIO IN VIVO DOS MICRONÚCLEOS EM ERITRÓCITOS DE MAMÍFEROS

B.12.

1. MÉTODO O presente método é idêntico ao método OCDE TG 474 — Ensaio dos micronúcleos em eritrócitos de mamíferos (1997).

1.

1.1. INTRODUÇÃO O ensaio in vivo dos micronúcleos de mamíferos é utilizado para a detecção de danos induzidos pela substância em estudo nos cromossomas ou no aparelho mitótico dos eritoblastos, através da análise dos eritrócitos retirados da medula e/ou de células de sangue periférico de animais, geralmente roedores. O objectivo do ensaio do micronúcleo é identificar substâncias que causam danos citogénicos, dando lugar à formação de micronúcleos com fragmentos de cromossoma ou com cromossomas inteiros. Quando um eritroblasto da medula se desenvolve para dar um eritrócito policromático, o núcleo principal é expulso; qualquer micronúcleo que tenha sido formado pode ficar para atrás (lagging), no citoplasma, onde não deveria existir qualquer material nuclear. A visualização dos micronúcleos é facilitada nestas células, uma vez que não existe um núcleo principal. Um aumento de frequência de eritrócitos policromáticos, micronucleados, nos animais expostos à substância em estudo representa uma indicação de danos cromossómicos induzidos. Para o presente ensaio utiliza-se normalmente a medula de roedores, uma vez que os eritrócitos policromáticos são produzidos nesse tecido. A medição dos eritrócitos (policromáticos) imaturos micronucleados no sangue periférico é igualmente aceitável para qualquer outra espécie em que tenha sido demonstrado que o baço não tem a capacidade de eliminar os eritrócitos micronucleados ou que apresente uma sensibilidade adequada para a detecção de agentes que causam aberrações cromossómicas estruturais ou numéricas. Os micronúcleos podem ser distinguidos por alguns critérios, que incluem a identificação da presença ou ausência de um centrómero ou de ADN centromérico nos micronúcleos. A frequência dos eritrócitos (policromáticos) imaturos micronucleados é o principal ponto final utilizado. A proporção de eritrócitos (normocromáticos) maturos com micronúcleos no sangue periférico pode igualmente ser utilizada como ponto final do ensaio quando os animais forem expostos à substância em estudo de forma contínua durante quatro semanas ou mais. O ensaio in vivo do micronúcleo de mamíferos é particularmente relevante para a avaliação dos perigos mutagénicos, uma vez que permite a avaliação dos elementos metabólicos, da farmacocinética e dos processos de reparação do ADN in vivo, embora estes possam variar de espécie para espécie, de tecido para tecido e em termos do ponto final genético. Os ensaios in vivo são igualmente úteis para a investigação suplementar de um efeito mutagénico detectado in vitro. Se existirem provas de que nem a substância em estudo nem nenhum dos seus metabolitos reactivos entram em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio não é apropriado. Ver também a parte B da Introdução Geral.

1.2. DEFINIÇÕES Centrómero: Região(ões) de um cromossoma a que estão associadas fibras fusiformes durante a divisão celular, permitindo o movimento ordeiro dos cromossomas para os pólos da célula. Micronúcleos: Pequenos núcleos separados e adicionais dos núcleos das células principais, produzidos durante a telefase da mitose (meiose) por fragmentos do cromossoma ou cromossomas inteiros que ficam para trás (lagging). Eritrócito normocromático: Eritrócito maduro a que faltam ribossomas e que pode, por conseguinte, distinguir-se dos eritrócitos policromáticos imaturos por coloração selectiva dos ribossomas. Eritrócito policromático: Eritrócito imaturo, numa fase de desenvolvimento intermediária, que ainda contém ribossomas e pode, por conseguinte, distinguir-se dos eritrócitos normocromáticos maturos por coloração selectiva dos ribossomas.

1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Os animais são expostos à substância em estudo por uma via apropriada. Se for utilizada a medula, os animais são sacrificados passado o tempo necessário após a exposição, a medula é extraída e são feitas preparações coradas (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Quando é utilizado o sangue periférico, o sangue é recolhido passado o tempo necessário após a exposição e são preparados esfregaços corados (4) (8) (9) (10). Nos estudos com sangue periférico, as amostras de célula devem ser colhidas tão cedo quanto possível após a última exposição à substância em estudo. As preparações são analisadas para a presença de micronúcleos.

1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.4.

1.4.1. Preparação

1.4.1.

1.4.1.1. Selecção das espécies animais Quando se pretender utilizar preparações da medula, recomenda-se a utilização de ratos ou ratazanas, embora possa ser utilizada qualquer espécie de mamífero que seja apropriada. Quando se utilizar o sangue periférico, recomenda-se a utilização de ratos. Contudo, pode ser utilizada qualquer espécie de mamífero que seja apropriada, desde que se trate de uma espécie em que o baço não remove os eritrócitos micronucleados ou que apresente uma sensibilidade adequada para a detecção de agentes que causam aberrações cromossómicas estruturais ou numéricas. Devem ser utilizados animais saudáveis jovens de linhas de laboratório com características bem conhecidas. No início do estudo, a diferença de peso entre os animais deve ser mínima, não devendo exceder + 20 % do peso médio de cada sexo.

1.4.1.2. Condições de acomodação e alimentação Devem ser aplicadas as condições gerais referidas na Introdução Geral, parte B, embora o objectivo para a humidade deva ser de 50 %-60 %.

1.4.1.3. Preparação dos animais Os animais adultos saudáveis jovens são distribuídos aleatoriamente pelos grupos de controlo e pelos grupos expostos. Os animais são identificados de forma inequívoca, devendo ser aclimatados às condições de laboratório durante pelo menos cinco dias. As gaiolas devem ser dispostas de modo a que eventuais efeitos devidos à respectiva colocação sejam minimizados.

1.4.1.4. Preparação das doses As substâncias sólidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veículos adequados e, se necessário, diluídas antes de serem administradas aos animais. As substâncias líquidas podem ser adicionadas directamente aos sistemas em estudo e/ou diluídas antes de serem adicionadas às células. Devem ser utilizadas preparações frescas da substância em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo armazenamento não coloca problemas para o ensaio.

1.4.2. Condições do ensaio

1.4.2.

1.4.2.2. Controlos Cada experiência deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veículo) para cada sexo. Com excepção da exposição à substância em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo, devem ser manuseados de forma idêntica. Os controlos positivos devem produzir micronúcleos in vivo aos níveis de exposição a que se espera o surgimento de um aumento detectável em relação à linha de base. A dose de controlo positivo a administrar deve ser escolhida de modo a que os seus efeitos sejam claros mas também a que as lâminas codificadas não sejam imediatamente identificadas pela pessoa que procede às leituras. É aceitável que o controlo positivo seja administrado por uma via diferente da substância em estudo e que só seja realizada uma amostra. A possibilidade de utilização de produtos químicos de uma classe relacionada para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam. As substâncias de controlo positivo podem incluir, por exemplo: Substância Número CAS Número EINECS metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 etilnitrosureia 759-73-9 212-072-2 mitomicina C 50-07-7 200-008-6 ciclofosfamida ciclofosfamida monohidrato 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 trietilenomelamina 51-18-3 200-08 3-5 Para cada colheita devem também realizar-se controlos negativos, em que os animais são expostos apenas ao solvente ou veículo, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal, a menos que existam dados históricos de controlo aceitáveis em relação à variabilidade de animal para animal e à frequência da ocorrência de células com aberrações cromossómicas. Se só estiver prevista uma amostra dos controlos negativos, a altura mais apropriada é a primeira amostra. Além disso, devem igualmente ser utilizados controlos não expostos à substância em estudo, a menos que já existam dados de estudos anteriores ou publicados que mostrem que o solvente/veículo escolhido não induz nenhum efeito deletério ou mutagénico. Se for utilizado o sangue periférico, uma amostra anterior à exposição poderá servir para o controlo negativo, mas apenas nos estudos de menor duração (ou seja, 1 a 3 exposições), desde que os dados respeitantes a essa amostra estejam de acordo com o esperado em função de experiências anteriores.

1.5. PROCEDIMENTO

1.5.

1.5.1. Número e sexo dos animais Cada grupo exposto e de controlo deve incluir pelo menos cinco animais analisáveis por sexo (11). Se no momento do estudo existirem dados disponíveis de estudos com as mesmas espécies e com utilização da mesma via de administração que demonstrem que não há qualquer diferença substancial da toxicidade entre os sexos, será suficiente testar um único sexo. Nos casos em que a exposição humana aos produtos químicos possa ser específica a cada sexo, como acontece com alguns produtos farmacêuticos, o ensaio deve ser executado com animais do sexo em causa.

1.5.2. Programação do tratamento Não é possível recomendar qualquer programação específica para a exposição (ou seja, uma, duas ou mais exposições com intervalos de 24 horas). As amostras recolhidas durante regimes de administração prolongada são aceitáveis, desde que o estudo demonstre a existência de um efeito positivo ou, para um estudo negativo, desde que a toxicidade seja demonstrada ou que se utilize uma dose limite, com administração até ao momento da colheita. As substâncias de ensaio podem igualmente ser administradas numa dose dividida, ou seja, duas exposições no mesmo dia, separadas por apenas algumas horas, para facilitar a administração de grandes volumes. O ensaio pode ser executado de duas formas: Quando necessário, poderão ser recolhidas amostras adicionais.

1.5.2. a)

Os animais são expostos à substância em estudo uma única vez. As amostras de medula são colhidas pelo menos duas vezes, a primeira das quais pelo menos 24 horas após a exposição, com intervalos apropriados entre as colheitas mas não ultrapassando as 48 horas após a exposição. Uma eventual colheita antes de 24 horas após a exposição terá de ser justificada. As amostras de sangue periférico são colhidas pelo menos duas vezes, a primeira das quais pelo menos 36 horas após a exposição, com intervalos apropriados entre as colheitas, mas não ultrapassando as 72 horas após a exposição. Quando for identificada uma resposta positiva numa determinada colheita, não será necessário continuar o estudo;

Se forem utilizadas duas ou mais exposições diárias (por exemplo, duas ou mais exposições com intervalos de 24 horas), a primeira amostra deve ser colhida 18 a 24 horas depois da exposição final no caso do sangue periférico (12).

1.5.3. Doses Se for realizado um estudo para avaliação da gama de doses a administrar, por não estarem disponíveis dados apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratório, utilizando as mesmas espécies, linha celular, sexo e regime de exposição a utilizar no estudo principal (13). Se a substância for tóxica deverão ser utilizadas três doses diferentes para a primeira amostragem, abrangendo uma gama compreendida entre a toxicidade máxima e uma toxicidade reduzida ou quase nula. Na segunda amostragem só será necessário avaliar a dose máxima, que é definida como a dose que produz sinais de toxicidade tais que indiquem que a utilização a doses superiores, com o mesmo regime de administração, produzirá mortalidade. As substâncias com actividade biológica específica em doses baixas e não tóxicas (como acontece com as hormonas e agentes mitogénicos) poderão constituir uma excepção aos critérios de fixação da dose, devendo ser avaliadas caso a caso. A dose máxima pode igualmente ser definida como a dose que produz algumas indicações de toxicidade na medula (por exemplo, redução da proporção de eritrócitos imaturos em relação aos eritrócitos totais na medula ou no sangue periférico).

1.5.4. Ensaio-limite Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2000 mg/kg de peso corporal numa única exposição ou em duas exposições no mesmo dia não produzir nenhum efeito tóxico perceptível e se, com base nos dados respeitantes a substâncias estruturalmente relacionadas, não for previsível a existência de toxicidade genética, poderá não ser considerado necessário um estudo completo com utilização de três doses diferentes. Para os estudos de maior duração a dose limite é de 2000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposições até 14 dias e de 1000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposições de duração superior a 14 dias. A exposição prevista para o ser humano pode indicar a necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios-limite.

1.5.6. Preparação da medula/sangue As células da medula são retiradas do fémur ou da tíbia imediatamente após o sacrifício. Geralmente, as células são retiradas do fémur ou da tíbia, preparadas e coradas de acordo com métodos já definidos. O sangue periférico é retirado da veia caudal ou de outro vaso sanguíneo apropriado. As células de sangue são imediatamente sujeitas a uma coloração supravital (8) (9) (10) ou então são preparados esfregaços que depois são corados. A utilização de uma coloração específica para o ADN [por exemplo, laranja de acridina (14) ou pironina-y de milho 33258plus da Hoechst (15)] pode eliminar alguns dos erros associados à utilização de uma coloração não específica para o ADN. Esta vantagem não impossibilita a utilização de colorações convencionais (por exemplo, Giemsa). Outros sistemas [por exemplo, colunas de celulose para remoção das células nucleadas (16)] podem igualmente ser utilizados, desde que se demonstre que esses sistemas funcionam de forma adequada para a preparação de micronúcleos em laboratório.

1.5.7. Análise A proporção de eritrócitos imaturos em relação aos eritrócitos totais (imaturos + maduros) é determinada para cada animal através da contagem de pelo menos 200 eritrócitos no caso da medula e de 1000 eritrócitos no caso do sangue periférico (17). Todas as lâminas, incluindo as dos controlos positivos e negativos, devem ser codificadas independentemente antes da análise microscópica. A eventual ocorrência de eritrócitos imaturos micronucleados deve ser analisada em pelo menos 2000 eritrócitos imaturos por animal. A contagem de eritrócitos maduros micronucleados poderá ser utilizada como informação adicional. Ao analisar as lâminas, a proporção de eritrócitos imaturos em relação aos eritrócitos totais não deve ser inferior a 20 % do valor de controlo. Quando os animais forem sujeitos a uma exposição contínua durante quatro semanas ou mais, poderão ser também analisados 2000 eritrócitos maduros por animal, para determinação da ocorrência de micronúcleos. Os sistemas automatizados de análise (tratamento de imagens e citometria de fluxo e suspensões celulares) são alternativas aceitáveis à avaliação manual, se apropriadamente justificadas e validadas.

2. DADOS

2.

2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num quadro. A unidade experimental é o animal. Para cada animal, devem ser verificados separadamente o número de eritrócitos imaturos, o número de eritrócitos imaturos micronucleados e a proporção de eritrócitos imaturos em relação aos eritrócitos totais. Quando os animais tiverem sido expostos à substância em estudo em contínuo durante quatro semanas ou mais, devem também ser recolhidos dados em relação aos eritrócitos maduros. Para cada animal, deve ser apresentada a proporção de eritrócitos imaturos em relação aos eritrócitos totais e, se for considerado necessário, de eritrócitos maduros micronucleados. Se não houver qualquer evidência de uma diferença na resposta entre os sexos, os dados de ambos os sexos poderão ser combinados para fins estatísticos.

2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Há diversos critérios para determinar um resultado positivo, como por exemplo um aumento do número de células micronucleadas relacionado com a dose ou um claro aumento do número de células micronucleadas num determinado grupo e numa determinada amostragem. Deve ser tomada em consideração, antes de mais, a importância biológica dos resultados. Como auxílio para a avaliação dos resultados dos ensaios poderão ser utilizados métodos estatísticos (18) (19), embora a significância estatística não deva ser o único elemento para a determinação de uma resposta positiva. Os resultados ambíguos devem ser esclarecidos através de estudos adicionais, de preferência com modificação das condições experimentais. Uma substância cujos resultados não cumpram os critérios acima indicados no presente ensaio é considerada não mutagénica. Embora a maioria de experiências tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o conjunto dos dados não permitirá que se obtenha uma opinião inequívoca sobre a actividade da substância em estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambíguos ou duvidosos independentemente do número de vezes que a experiência seja repetida. Um resultado positivo no ensaio dos micronúcleos indica que a substância em estudo induz a ocorrência dos mesmos, como resultado de danos nos cromossomas ou no sistema mitótico dos eritroblastos da espécie testada. Um resultado negativo indica que, nas condições do ensaio, a substância em estudo não induz a ocorrência de micronúcleos nos eritroblastos imaturos da espécie testada. Deve ser discutida a probabilidade de a substância em estudo ou os seus metabolitos alcançarem o sistema circulatório geral ou especificamente o tecido objectivo (ou seja, a toxicidade sistémica).

3. APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS

3. RELATÓRIO DE ENSAIO

O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:

Solvente/veículo:

justificação para a escolha do veículo,

solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/veículo, se conhecida.

Animais de ensaio:

espécie/linha celular utilizada,

número, idade e sexo dos animais,

origem, condições de acomodação, alimentação, etc.,

peso de cada animal no início do ensaio, incluindo a gama de pesos, a respectiva média e o desvio-padrão para cada grupo.

Condições de ensaio:

controlos positivos e negativos (veículo/solvente),

resultados do estudo para definição da gama de doses, quando tenha sido realizado,

justificação para a selecção das doses,

preparação da substância em estudo,

modo de administração da substância em estudo,

justificação da via de administração escolhida,

método para a verificação de que a substância em estudo atingiu a circulação geral ou o tecido objectivo, quando aplicável,

conversão da concentração da substância em estudo (ppm) na alimentação/abeberação para a dose real (mg/kg peso corporal/dia), quando aplicável,

qualidade dos alimentos e da água,

descrição pormenorizada dos calendários de exposição e amostragem,

métodos de preparação das lâminas,

métodos de medição da toxicidade,

critérios de contabilização dos eritrócitos imaturos micronucleados,

número de células analisadas por animal,

critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou não conclusivo.

Resultados:

sinais de toxicidade,

proporção de eritrócitos imaturos em relação aos eritrócitos totais,

número de eritrócitos imaturos micronucleados em cada animal,

médias e desvios-padrão dos eritrócitos imaturos micronucleados por grupo,

relação dose-resposta, quando seja possível de determinar,

análise estatística e respectivo método,

dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o ensaio e dados históricos sobre o controlo negativo,

dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o ensaio.

Discussão dos resultados.

Conclusões.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)

REFERÊNCIAS Heddle, J.A., (1973) A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, p. 187-190. Schmid, W., (1975) The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, p. 9-15. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W., (1983) The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res., 123, p. 61-118. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A., (1990) The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, p. 29-80. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M., (1983) Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. In: Developments in Science and Practice of Toxicology, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, p. 555-558. MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D., (1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res., 189, p. 103-112. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E., (1990) The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol., 14, p. 513-522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1990) The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, p. 245-249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test, (1992) Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, p. 83-98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), (1995) Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 153-159. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, p. 293-304. Higashikuni, N. and Sutou, S., (1995) An optimal, generalized sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 313-319. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M., (1992) Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313-319. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1983) An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, p. 241-247. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G., (1983) A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, p. 269-275. Romagna, F. and Staniforth, C.D., (1989) The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, p. 91-104. Gollapudi, B. and McFadden, L.G., (1995) Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, p. 97-99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L., (1990) In Vivo Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K., (1989) Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184-232.

B.13./14. MUTAGENICIDADE — ENSAIO DE MUTAÇÃO REVERSA EM BACTÉRIAS

B.13./14.

1. MÉTODO O presente método é idêntico ao método OCDE TG 471 — Ensaio de mutação reversa bacteriana (1997).

1.

1.1. INTRODUÇÃO O ensaio de mutação reversa bacteriana utiliza estirpes de Salmonelas typhimurium e Escherichia coli carentes em aminoácidos para detectar mutações pontuais, causadas pela substituição, adição ou supressão de um ou mais pares de bases do ADN (1) (2) (3). O princípio do presente ensaio de mutação reversa bacteriana é a detecção de mutações que invertem as mutações existentes nas estirpes de ensaio, restaurando a capacidade funcional das bactérias sintetizarem um ácido essencial. As bactérias com mutação reversa são detectadas pela sua capacidade de crescimento na ausência do aminoácido em que as estirpes de ensaio eram carentes. As mutações pontuais causam diversas doenças genéticas humanas, existindo provas substanciais de que as mutações pontuais em oncogenes e em genes supressores de tumores nas células somáticas estão envolvidas na formação de tumores nos seres humanos e em animais experimentais. O ensaio de mutação reversa bacteriana é rápido, barato e de relativamente fácil execução. Muitas das estirpes de ensaio têm diversas características que as tornam mais sensíveis para a detecção de mutações, nomeadamente sequências de ADN identificativas dos locais de inversão, aumento da permeabilidade celular a grandes moléculas e eliminação ou aumento da ocorrência de erros nos processos de reparação do ADN. A especificidade das estirpes de ensaio pode fornecer alguma informação útil sobre os tipos de mutações induzidos pelos agentes genotóxicos. Já existe uma grande base de dados com resultados respeitantes a uma vasta gama de ensaios de mutação reversa bacteriana, tendo sido desenvolvidas metodologias com características bem conhecidas e que utilizam produtos químicos com diferentes propriedades físico-químicas, nomeadamente compostos temporários. Ver também a parte B da Introdução Geral.

1.2. DEFINIÇÕES Ensaio de mutação reversa com Salmonelas typhimurium ou Escherichia coli: detecta mutações em estirpes carentes num determinado aminoácido (histidina ou triptofano, respectivamente), que tem como resultado a produção de uma estirpe independente do abastecimento externo desse aminoácido. Mutagéneos de substituição de um par de bases são os agentes que causam uma alteração das bases do ADN. No ensaio de mutação reversa essa alteração pode ocorrer no local da mutação original ou num local diferente do genoma bacteriano. Mutagéneos por deslocação do quadro de leitura são agentes que causam a adição ou supressão de um ou mais pares de bases no ADN, modificando dessa forma o quadro de leitura do ARN.

1.3. CONSIDERAÇÕES INICIAIS O ensaio de mutação reversa bacteriana utiliza células procariotas, que diferem das células de mamífero em características como a absorção, metabolismo, estrutura dos cromossomas e processos de reparação do ADN. Os ensaios conduzidos in vitro exigem geralmente a utilização de uma fonte exógena de activação metabólica. Os sistemas de activação metabólica in vitro não reproduzem inteiramente as condições in vivo nos mamíferos. O ensaio não fornece, por conseguinte, informação directa sobre a potência mutagénica e carcinogénica da substância nos mamíferos. O ensaio de mutação reversa bacteriana é geralmente utilizado para a despistagem inicial da actividade genotóxica e, nomeadamente, para detectar a indução de mutações pontuais. Uma extensa base de dados demonstrou que muitos produtos químicos que dão resultados positivos no presente ensaio apresentam uma actividade mutagénica noutros ensaios. Há exemplos de agentes mutagénicos que não são detectados pelo presente ensaio, podendo as razões para essas falhas ser atribuídas à natureza específica do ponto final detectado, a diferenças na activação metabólica ou ainda a diferenças na biodisponibilidade. Por outro lado, elementos que aumentem a sensibilidade do ensaio de mutação reversa bacteriana podem conduzir à sobrestimação da actividade mutagénica. O ensaio de mutação reversa bacteriana pode não ser apropriado para a avaliação de certas classes de produtos químicos, nomeadamente compostos altamente bactericidas (por exemplo, certos antibióticos) e produtos que se pensa (ou que se sabe) que interferem especificamente com o sistema de replicação das células de mamíferos (por exemplo, alguns inibidores da topoisomerase e alguns compostos análogos a nucleosídeos). Nesses casos, poderá ser mais apropriado utilizar ensaios de mutação em células de mamíferos. Embora muitos dos compostos que dão resultados positivos no presente ensaio sejam carcinogéneos para os mamíferos, essa correlação não é absoluta. Com efeito, a correlação depende da classe química e, por outro lado, alguns agentes carcinogéneos não são detectados no ensaio pelo facto de o seu mecanismo ou mecanismos de actuação, não genotóxicos, não afectarem as células bacterianas.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO As suspensões bacterianas são expostas à substância em estudo tanto na presença como na ausência de um sistema de activação metabólico exógeno. No método de incorporação em placas, as suspensões são misturadas num revestimento de gelose e depois vertidas na superfície duma lâmina de gelose com meio mínimo. No método com incubação prévia, a mistura de tratamento é incubada e só depois misturada com uma cobertura de gelose e preparada em placas com meio mínimo. Independentemente da técnica que tenha sido utilizada, as colónias com mutação reversa são contadas e comparadas com o número de colónias com mutação reversa espontânea em placas de controlo com solvente, após dois ou três dias de incubação. Estão descritos diversos procedimentos para executar o ensaio de mutação reversa bacteriana. Entre os mais geralmente utilizados estão o método de incorporação em placas (1) (2) (3) (4), o método com incubação prévia (2) (3) (5) (6) (7) (8), o método em flutuação (9) (10) e o método em suspensão (11). As adaptações necessárias para os ensaios de gases ou vapores também se encontram descritas (12). Os procedimentos descritos no presente método dizem principalmente respeito aos métodos de incorporação em placas e com incubação prévia. Qualquer dos dois é aceitável para a realização de experiências na presença e na ausência de um sistema de activação metabólica. Algumas substâncias poderão ser detectadas de forma mais eficaz utilizando o método com incubação prévia. Essas substâncias pertencem a classes químicas que incluem as nitrosaminas alifáticas de cadeia curta, os metais, os aldeídos, os corantes azóicos e compostos diazócios, os alcalóides de priolizidina, os compostos alílicos e os compostos nitro (3). Por outro lado, certas classes de mutagéneos nem sempre são detectadas quando se utilizam os procedimentos padrão, tais como o método de incorporação em placas ou o método com incubação prévia. Esses casos são considerados especiais e recomenda-se fortemente que sejam utilizados procedimentos alternativos para a sua detecção. Estão já identificados os seguintes casos especiais (e exemplos dos procedimentos que podem ser utilizados para a sua detecção): corantes azóicos e compostos diazóticos (3) (5) (6) (13), gases e compostos químicos (12) (14) (15) (16) e glicósidos (17) (18) voláteis. Qualquer desvio do procedimento padrão terá de ser cientificamente justificado.

1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.5.

1.5.1. Preparação

1.5.1.

1.5.1.1. Bactérias Devem ser utilizadas culturas frescas de bactérias na fase final do crescimento exponencial ou no início da fase estacionária (aproximadamente 109 células/ml). Não devem ser utilizadas culturas em fase estacionária adiantada. É essencial que as culturas utilizadas na experiência contenham um título elevado de células viáveis, que pode ser demonstrado por dados históricos de controlo sobre as curvas de crescimento ou durante o próprio ensaio, através da determinação das células viáveis em placas. A temperatura de incubação recomendada é de 37oC. Devem ser utilizadas pelo menos cinco estirpes das bactérias, entre as quais quatro estirpes de S. typhimurium (TA1535; TA1537 ou TA97 ou TA 97a; TA98 e TA100) para as quais foi demonstrado que são fiáveis e dão resultados reprodutíveis entre laboratórios. Essas quatro estirpes de S. typhimurium têm um par com as bases GC no local da inversão primária e sabe-se que não permitem detectar certos agentes mutagéneos oxidantes, de ligação cruzada nem hidrazinas. Essas substâncias podem ser detectadas utilizando as estirpes E. coli WP2 ou S. typhimurium TA102 (19) que têm um par com as bases AT no local da inversão primária. Por conseguinte, a combinação de estirpes recomendada é: Para a detecção de agentes mutagéneos causadores de ligações cruzadas, poderá ser preferível incluir a estirpe TA102 ou acrescentar uma estirpe capaz de reparar o ADN de E. coli [por exemplo, E. coli WP2 ou E. coli WP2 (pKM101)]. Devem ser utilizados os procedimentos estabelecidos para a preparação de culturas de arranque, verificação dos mercadores e armazenamento. As quantidades de aminoácidos necessários para o crescimento (histidina para as estirpes de S. typhimurium e triptofano para as estirpes de E. coli) devem ser demonstradas para cada preparação de cultura de arranque conservada. Outras características fenotípicas devem também ser verificadas, a saber: a presença ou ausência de plasmídeos de Factor-r, quando necessário [ou seja, resistência à ampicilina nas estirpes TA98, TA100 e TA97 ou TA97a, WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101) e resistência à ampicilina e à tetraciclina na estirpe TA102]; presença de mutações características (ou seja, mutação rfa em S. typhimurium, através da sensibilização com violeta de cristal, e mutação uvrA em E. coli ou mutação uvrB em S. typhimurium, através da sensibilização com raios ultravioleta) (2) (3). As estirpes devem ainda apresentar, de forma espontânea, contagens de mutações reversas nas gamas de frequência esperadas em função dos dados históricos de controlo do laboratório e também, de preferência, da literatura.

S. typhimurium TA1535, e

S. typhimurium TA1537 ou TA97 ou TA97a, e

S. typhimurium TA98, e

S. typhimurium TA 100, e

E. coli WP2 uvrA, ou E. coli WP2 uvrA (pKM101), ou S. typhimurium TA102.

1.5.1.2. Meio Será utilizado um meio mímimo de gelose apropriado (por exemplo, contendo meio mínimo Vogel-Bonner E e glucose) e uma cobertura de gelose com histidina e biotina ou triptofano para permitir alguma divisão celular (1) (2) (9).

1.5.1.3. Activação metabólica As bactérias devem ser expostas à substância em estudo tanto na presença como na ausência de um sistema adequado de activação metabólica. O sistema mais geralmente utilizado é uma fracção pós-mitocondrial reforçada com co-factor (S9) preparada a partir de fígados de roedores tratados com agentes de indução enzimática, como por exemplo Aroclor 1254 (1) (2) ou uma mistura de fenobarbitona e β-naftoflavona (18) (20) (21). A fracção pós-mitocondrial é geralmente utilizada em concentrações na gama de 5 % a 30 % v/v na mistura S9. A escolha e o estado do sistema de activação metabólico podem depender da classe dos produtos químicos em estudo. Em alguns casos pode revelar-se adequado utilizar várias concentrações diferentes de fracção pós-mitocondrial. Para os corantes azóicos para os compostos diazóicos, poderá ser mais indicado um sistema activação metabólica redutor (6) (13).

1.5.1.4. Substância em estudo/preparação As substâncias sólidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veículos adequados e, se necessário, diluídas antes da exposição das bactérias. As substâncias líquidas podem ser adicionadas directamente aos sistemas em estudo e/ou diluídas antes de serem adicionadas às células. Devem ser utilizadas preparações frescas da substância em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo armazenamento não coloca problemas para o ensaio. O solvente/veículo não deve reagir com a substância em estudo, devendo ser compatível com a sobrevivência das células e com a actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veículos cujas propriedades não se encontrem totalmente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possível, recomenda-se a utilização de solventes/veículos aquosos. Quando forem realizados ensaios de substâncias instáveis na presença de água, os solventes orgânicos utilizados devem ser anidros.

1.5.2. Condições do ensaio

1.5.2.

1.5.2.1. Estirpes (ver 1.5.1.1)

1.5.2.2. Concentração de exposição A citotoxidade e a solubilidade na mistura final constituem alguns dos critérios a ter em conta na determinação da maior quantidade da substância em estudo a utilizar. Poderá ser útil determinar a toxicidade e insolubilidade através de uma experiência preliminar. A citotoxicidade pode ser detectada pela redução do número de colónias com mutação reversa, pela presença de colónias mais claras ou de menores dimensões ou pelo grau de sobrevivência das culturas expostas. A citotoxidade de uma substância pode variar na presença de sistemas de activação metabólicos. A insolubilidade deve ser avaliada em função da precipitação verificável a olho nu na mistura final nas condições reais do ensaio. A concentração máxima de ensaio recomendada para substâncias solúveis não citotóxicas é de 5 mg/placa ou de 5 μl/placa. Para as substâncias não citotóxicas insolúveis a 5 mg/placa ou a 5 μl/placa, uma ou mais das concentrações ensaiadas devem ser insolúveis na mistura final. As substâncias de ensaio citotóxicas abaixo dos 5 mg/placa ou 5 μl/placa devem ser ensaiadas até uma concentração citotóxica. O precipitado não deve interferir com a contagem. Numa experiência inicial devem ser utilizadas pelo menos cinco concentrações analisáveis diferentes da substância em estudo, com intervalos aproximadamente semilogarítmicos (ou seja, √10) entre as concentrações. Para a investigação da relação concentração-resposta poderão ser indicados intervalos menores. Poderá ser contemplada a possibilidade de ensaiar concentrações superiores a 5 mg/placa ou 5 μl/placa quando se pretender avaliar substâncias que contenham quantidades substanciais de impurezas potencialmente mutagénicas.

1.5.2.3. Controlos negativos e positivos Cada experiência deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente ou veículo) específicos para cada estirpe, devendo, para os controlos positivos, ser escolhidas concentrações que demonstrem o desempenho eficaz de cada ensaio. Para os ensaios com utilização de um sistema de activação metabólica, a substância de referência para os controlos positivos deve ser seleccionada com base no tipo de estirpe de bactéria utilizada. As seguintes substâncias são exemplos de controlos positivos apropriados para os ensaios com activação metabólica: Substância Número CAS Número EINECS 9,10-dimetilantraceno 781-43-1 212-308-4 7,12-dimetilbenzo[a]antraceno 57-97-6 200-359-5 benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5 2-aminoantraceno 613-13-8 210-330-9 ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4 ciclofosfamida monohidrato 6055-19-2 A seguinte substância é um controlo positivo apropriado para o método de activação metabólico redutor: Substância Número CAS Número EINECS vermelho do Congo 573-58-0 209-358-4 O 2-aminoantraceno não deve ser utilizado como único indicador da eficácia da mistura S9. Se essa substância for utilizada, cada lote S9 deve ser igualmente caracterizado com um agente mutagénico que exija activação metabólica por enzimas microssómicos, como por exemplo o benzo[a]pireno ou o dimetilbenzo[a]an-traceno. As seguintes substâncias são exemplos de controlos positivos específicos apropriados para cada estirpe, adequados para os ensaios sem utilização de um sistema exógeno de activação metabólica: Substância Número CAS Número EINECS Estirpe nitrito de sódio 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 e TA 100 2-nitrofluoreno 607-57-8 210-138-5 TA 98 9-aminoacridina 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 e TA 97A ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 e TA 97A hidroperóxido de isopropilbenzeno 80-15-9 201-254-7 TA 102 mitomicina C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA e TA 102 N-etil-N-nitro-N-nitrosoguanidina 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101) 4-nitroquinolina-l-óxido 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101) furilfuramida (AF2) 3688-53-7 estirpes com plasmídeos Podem utilizar-se no controlo positivo outras substâncias adequadas. A possibilidade de utilização de produtos químicos de uma classe afim para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam. Devem também realizar-se controlos negativos, consistindo apenas em solvente ou veículo e sem a substância em estudo, que serão sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expostos. Além disso, devem igualmente ser utilizados controlos não expostos à substância em estudo, a menos que existam dados históricos de controlo que demonstrem que o solvente escolhido não induz qualquer efeito deletério ou mutagénico.

1.5.3. Procedimento Para o método de incorporação em placas (1) (2) (3) (4) sem activação metabólica, utilizam-se geralmente 0,05 ml ou 0,1 ml da solução de ensaio, 0,1 ml de cultura bacteriana fresca (aproximadamente 108 células viáveis) e 0,5 ml de tampão estéril, que são misturados com 2,0 ml de gelose de cobertura. Para o ensaio com activação metabólica, utilizam-se geralmente 0,5 ml de mistura de activação metabólica, que contém uma quantidade adequada de fracção pós-mitocondrial (entre 5 % a 30 % v/v na mistura de activação metabólica), misturada com a gelose de cobertura (2,0 ml), as bactérias e a substância em estudo/solução de ensaio. O conteúdo de cada tubo é misturado e deitado sobre uma placa de meio mínimo de gelose. A gelose de cobertura deve solidificar antes da incubação. No método com incubação prévia (2) (3) (5) (6), a substância em estudo/solução de ensaio é previamente incubada com a estirpe de ensaio (aproximadamente 108 células viáveis) e o tampão estéril ou o sistema de activação metabólica (0,5 ml), geralmente durante 20 minutos ou mais a 30-37 oC, antes de ser misturada com a gelose de cobertura e deitada sobre uma placa com meio mínimo de gelose. Normalmente, são utilizados 0,05 ou 0,1 ml da substância em estudo/solução de ensaio, 0,1 ml de cultura bacteriana e 0,5 ml da mistura S9 ou de tampão estéril, misturados com 2,0 ml de gelose de cobertura. Os tubos devem ser arejados durante a pré-incubação, utilizando o agitador. Para uma avaliação adequada da variação, devem ser utilizadas placas em triplicado para cada dose. A utilização de placas em duplicado é aceitável, desde que seja justificada cientificamente. A perda ocasional de uma placa não invalida necessariamente o ensaio. As substâncias gasosas ou voláteis devem ser ensaiadas por métodos apropriados, por exemplo em recipientes selados (12) (14) (15) (16).

1.5.4. Incubação Todas as placas de cada ensaio devem ser incubadas a 37oC durante 48-72 horas. Após a incubação, contam-se as colónias com mutação reversa em cada placa.

2. DADOS

2.

2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS Os dados devem ser apresentados sob a forma do número de colónias com mutação reversa por placa. O número de colónias com mutação reversa nas placas de controlo negativas (controlo do solvente e, se tiver sido utilizado, controlo não exposto) e positivas deve também ser apresentado. As contagens individuais das placas, o número médio de colónias com mutação reversa por placa e o respectivo desvio-padrão devem ser apresentados para a substância em estudo e para os controlos positivos e negativos (não expostos à substância em estudo e/ou solvente). Não há nenhuma exigência concreta para a verificação de uma resposta positiva clara. Os resultados ambíguos devem ser melhor esclarecidos, de preferência com modificação das condições experimentais. Os resultados negativos têm de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmação dos resultados negativos não seja considerada necessária, deve ser apresentada uma justificação. Para a realização de experiências adicionais, deve ser analisada a possibilidade de modificação dos parâmetros do estudo, por forma a aumentar a gama de condições avaliadas. Os parâmetros que podem eventualmente ser alterados incluem a gama de concentrações, o método de tratamento (incorporação em placas ou pré-incubação em meio líquido) e as condições de activação metabólica.

2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Há diversos critérios para determinar um resultado positivo, tais como um aumento do número de colónias por placa com mutação reversa em pelo menos uma estirpe, com ou sem sistema de activação metabólico, que esteja relacionado com a concentração na gama ensaiada e/ou que seja reprodutível numa ou mais das concentrações ensaiadas (23). Deve ser tomada em consideração, antes de mais, a importância biológica dos resultados. Como auxílio para a avaliação dos resultados dos ensaios, poderão ser utilizados métodos estatísticos (24). Contudo, a significância estatística não deve ser o único elemento de determinação para uma resposta positiva. Uma substância cujos resultados não cumpram os critérios acima indicados no presente ensaio é considerada não mutagénica. Embora a maioria de experiências tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o conjunto dos dados não permitirá que se obtenha uma opinião inequívoca sobre a actividade da substância em estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambíguos ou duvidosos independentemente do número de vezes que a experiência seja repetida. Um resultado positivo no ensaio de mutação reversa bacteriana indica que a substância induz mutações pontuais por substituição das bases ou por deslocação do quadro de leitura no genoma de Salmondas typhimurium e/ou Escherichia coli. Um resultado negativo indica que, nas condições do ensaio, a substância não é mutagénica para as espécies ensaiadas.

3. APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS

3. RELATÓRIO DE ENSAIO

O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:

Solvente/veículo:

justificação para a escolha do solvente/veículo,

solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/veículo, se conhecida.

Estirpes:

estirpes usadas,

número de células por cultura,

características da estirpe.

Condições de ensaio:

quantidade da substância em estudo por placa (mg/placa ou μl/placa), com justificação da escolha da dose e do número de placas preparadas por concentração,

meios utilizados,

tipo e composição do sistema de activação metabólica, incluindo critérios de aceitabilidade,

protocolo do tratamento.

Resultados:

sinais de toxicidade,

sinais de precipitação,

contagens individuais das placas,

número médio de colónias com mutação reversa por placa e respectivo desvio-padrão,

relação dose-resposta, quando seja possível de determinar,

análise estatística, quando tenha sido realizada,

dados relativos aos controlos negativo (solvente/veículo) e positivo realizados em paralelo com o ensaio, com as respectivas gamas, valores médios e desvios-padrão,

dados históricos relativos aos controlos negativo (solvente/veículo) e positivo realizados em paralelo com o ensaio, com as respectivas gamas, valores médios e desvios-padrão.

Discussão dos resultados.

Conclusões.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)

REFERÊNCIAS Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E., (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364. Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E., (1994) Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, p. 217-233. Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V., (1986) The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, p. 69-240. 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B.15. TESTES DE MUTAGÉNESE E DESPISTE DE CARCINOGÉNESE MUTAÇÃO GÉNICA — SACCHAROMYCES CEREV1SIAE

B.15.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.2. DEFINIÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Nenhuma.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Podem utilizar-se várias estirpes haplóides e diplóides do fungo Saccharomyces Cerevisiae para medir a produção de mutações génicas induzidas por agentes químicos em presença e na ausência de activação metabólica. A medição de mutações forward (forward mutations) pode ser realizada nomeadamente pela medição da passagem dos mutantes vermelhos que exigem adenina (ade-1, ade-2) para uma forma branca duplamente exigente em adenina, assim como por sistemas selectivos como a indução de resistência à canavanina e à cicloheximida. O método de mutação reversível mais frequentemente utilizado implica a utilização da estirpe haplóide XV 185-14C que inclui as mutações nonsense ocre ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 e trp 5-48, que são reversíveis por mutagénios que provoquem substituições de bases induzindo mutações num locus específico ou mutações supressivas ocre. A estirpe XV 185-14C inclui igualmente o marcador his 1-7, uma mutação nonsense, principalmente reversível pelas mutações de segundo locus e ainda o marcador hom 3-10 que é reversível por mutagénios conduzindo à ultrapassagem do quadro de leitura do código genético (Frameshift Mutation). Das estirpes diplóides de S. Cerevisiae, a única cujo uso está generalizado é a estirpe D7 que é homozigótica para ilv 1-92.

1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS Nenhum.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.6. Preparativos

As soluções das substâncias a testar bem como as das substâncias de controlo serão preparadas imediatamente antes do ensaio, com a ajuda de um veículo apropriado. Quando se tratar de substâncias orgânicas não solúveis na água, deverão ser utilizados os solventes orgânicos como o etanol, a acetona ou o dimetilsulfóxido (DMSO) numa concentração não ultrapassando 2 % v/v. A concentração final do veículo não deve afectar de forma significativa a viabilidade das células nem as características de crescimento.

Activação metabólica

As células deverão ser expostas às substâncias a testar na presença e na ausência de um sistema exógeno de activação metabólica apropriado. O método mais frequentemente utilizado consiste na adição da fracção pós-mitocondrial preparada a partir de fígados de roedores tratados previamente por indutores enzimáticos e adicionada de co-factores. Podem utilizar-se também outras espécies, tecidos, fracções pós-mitocondriais ou métodos para a activação metabólica.

Condições do ensaio

Estirpes de experiência

A estirpe haplóide XV 185-14C e a estirpe diplóide D7 são as mais frequentemente utilizadas em estudos de mutação génica. Podem também ser apropriadas outras estirpes.

Meios

Utilizam-se meios de cultura apropriados para determinar a sobrevida celular e o número de mutantes.

Uso de controlos negativos e positivos

Deverão ser realizados simultaneamente controlos positivos, controlos não tratados e controlos com solvente. Serão utilizadas substâncias químicas apropriadas como controlos positivos para cada fenómeno mutacional específico.

Concentrações de exposição

Deverão ser utilizados pelo menos cinco concentrações convenientemente espaçadas da substância a testar. No caso de substâncias tóxicas a concentração máxima testada não deverá diminuir a taxa de sobrevida abaixo de 5 % a 10 %. As substâncias relativamente insolúveis na água serão testadas até ao seu limite de solubilidade com métodos apropriados. No caso das substâncias não tóxicas francamente solúveis na água a concentração máxima será determinada caso a caso.

Condições de incubação

Devem incubar-se as placas no escuro à temperatura de 28-30 oC durante quatro a sete dias.

Frequências de mutações espontâneas

Serão utilizadas as subculturas cujas frequências de mutação espontânea estejam situadas dentro dos limites normais admitidos.

Número de placas

Deverão utilizar-se pelo menos três placas por concentração para determinar os prototróficos produzidos por mutação génica e observar a viabilidade das células. No caso de experiências usando marcadores com uma pequena taxa de mutação como o hom 3-10, pode aumentar-se o número de placas utilizado para fornecer dados estatisticamente significativos.

Procedimento

As estirpes de S. Cerevisiae são tratadas habitualmente no curso dum ensaio em meio líquido, implicando a utilização de células em fase estacionária ou de crescimento. As experiências iniciais deveriam ser efectuadas com células em crescimento. Expõem-se à substância a testar 1-5 × 10 células/ml durante um período até 18 horas, à temperatura de 28-37 oC, agitando-se a mistura; deve adicionar-se uma quantidade adequada dum sistema de activação metabólica durante o tratamento. No fim do tratamento as células serão centrifugadas, lavadas, e semeadas num meio de cultura apropriado. Depois da incubação as placas serão examinadas para se determinar a taxa de sobrevida e a indução de mutações génicas. Se a primeira experiência der resultados negativos deve realizar-se segunda, utilizando-se células em fase estacionária. Se a primeira experiência der resultados positivos, estes serão confirmados por uma experiência independente apropriada.

2. RESULTADOS Os resultados devem ser apresentados em quadros, indicando o número de colónias contadas, o número de mutantes, a taxa de sobrevida e a frequência de mutantes. Todos os resultados deverão ser confirmados por uma experiência independente. Os resultados deverão ser avaliados com métodos estatísticos adequados.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO TESTE O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:

estirpe utilizada,

condições do teste: células em fase estacionária ou de crescimento, composição dos meios, temperatura e duração da incubação, sistema de activação metabólica,

condições do tratamento: níveis de exposição, procedimento e duração do tratamento, temperatura do tratamento, controlos positivos e negativos,

número de colónias contadas, número de mutantes, taxa de sobrevida e frequência de mutantes, relação dose/resposta se possível, avaliação estatística dos resultados.

3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

4. REFERÊNCIAS Ver Introdução Geral, parte B.

B.16. RECOMBINAÇÃO MITÓTICA — SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.16.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.2. DEFINIÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Nenhuma.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO A recombinação mitótica no Saccharomyces Cerevisiae pode ser detectada ao nível intergénico (ou mais generalizadamente entre um gene e o seu centrómero) e ao nível intragénico. O primeiro caso denomina-se crossing-over mitótico e dá origem a trocas recíprocas, enquanto no segundo caso as trocas são não recíprocas a maior parte das vezes, sendo este denominado conversão génica. O crossing-over é geralmente detectado pela produção de colónias ou de sectores recessivos homozigóticos a partir de uma estirpe heterozigótica, enquanto a conversão génica é detectada pela produção de prototróficos revertidos de uma estirpe auxotrófica heteroalélica contendo dois alelos defeituosos diferentes do mesmo gene. As estirpes mais correntemente utilizadas para detectar uma conversão génica mitótica são as D4 (heteroalélica para ade 2 e trp 5), D7 (heteroalélica para trp 5), BZ34 (heteroalélica para arg 4) e JD1 (heteroalélica para his 4 e trp 5). O crossing-over mitótico produzindo sectores homozigóticos de cor vermelha e rosa pode ser determinado com D5 ou D7 (que mede também a conversão génica mitótica e a mutação reversível para ilv 1-92), sendo estas duas estirpes heteroalélicas complementares para os alelos ade 2.

1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS Nenhum.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DO ENSAIO

1.6. Preparativos

As soluções das substâncias a testar assim como das substâncias de controlo ou de referência deverão ser preparadas imediatamente antes do ensaio, com a ajuda do veículo apropriado. No caso de substâncias orgânicas insolúveis na água deverão utilizar-se solventes orgânicos como o etanol, a acetona e o dimetilsulfóxido (DMSO), em concentrações não ultrapassando 2 % v/v. A concentração final do veículo não deverá afectar de maneira significativa a viabilidade das células nem as características de crescimento.

Activação metabólica

As células serão expostas às substâncias a testar na presença e na ausência de um sistema exógeno de activação metabólica. O método mais frequentemente utilizado consiste na adição da fracção pós-mitocondrial preparada a partir de fígados de roedores tratados previamente com indutores enzimáticos e adicionada de co-factores. Podem também utilizar-se outras espécies, tecidos, fracções pós-mitocondriais ou métodos para activação metabólica.

Condições do ensaio

Estirpes de experiência

As estirpes mais frequentemente utilizadas são as diplóides D4, D5, D7 e JDl. Podem também ser apropriadas outras estirpes.

Meios

Utilizam-se os meios de cultura apropriados para determinar a taxa de sobrevida e a frequência de recombinações mitóticas.

Uso de controlos negativos e positivos

Concentrações de exposição

Deverão ser utilizadas pelo menos cinco concentrações convenientemente espaçadas da substância a testar. A citotoxicidade e a solubilidade são alguns dos factores a ter em consideração. A concentração mais fraca não deve ter qualquer efeito na viabilidade das células. No caso de produtos químicos tóxicos, a concentração máxima testada não deve diminuir a taxa de sobrevida abaixo de 5 % a 10 %. Os produtos químicos relativamente insolúveis na água serão testados até ao seu limite de solubilidade por métodos apropriados. No caso de produtos químicos não tóxicos, francamente solúveis na água, a concentração máxima testada será determinada caso a caso. As células podem ser expostas às substâncias a testar em fase estacionária ou em fase de crescimento durante períodos de duração até 18 horas. No entanto, no caso de um tratamento de longa duração, as culturas serão examinadas ao microscópio para se detectar a formação de esporos, cuja presença tornará o teste nulo.

Condições de incubação

As placas serão incubadas no escuro a uma temperatura de 28-30 oC, durante quatro a sete dias. As placas utilizadas para a determinação dos sectores homozigóticos vermelho e rosa produzidos por crossing-over mitótico serão conservadas num refrigerador a ± 4 oC durante mais um a dois dias antes da contagem, de modo a que a pigmentação das colónias interessadas possa intensificar-se.

Frequência de recombinações mitóticas espontâneas

Deverão utilizar-se subculturas cujas frequências de recombinação mitótica se situem dentro da gama admitida normalmente.

Número de placas

Deverão ser semeadas pelo menos três placas por concentração a fim de determinar a viabilidade bem como o número de prototróficos produzidos por conversão génica mitótica. No caso de determinação da homozigotia recessiva produzida por crossing-over mitótico, o número de placas será aumentado para se obter um número de colónias adequado.

Procedimento

As estirpes de S. Cerevisiae são tratadas habitualmente no curso de um ensaio em meio líquido, implicando a utilização de células em fase estacionária ou de crescimento. As experiências iniciais deveriam ser efectuadas com células em crescimento. São expostas 1-5 × 107 células/ml à substância a testar durante um período até 18 horas, à temperatura de 28-37 oC, agitando-se a mistura; deve adicionar-se uma quantidade adequada de um sistema de activação metabólica durante o tratamento. No fim do tratamento as células serão centrifugadas, lavadas e semeadas no meio de cultura adequado. Depois da incubação, as placas serão examinadas a fim de determinar a taxa de sobrevida e a indução de recombinação mitótica. Se a primeira experiência der resultados negativos deve realizar-se segunda, utilizando-se células em fase estacionária. Se a primeira experiência der resultados positivos, estes serão confirmados por uma experiência independente apropriada.

2. RESULTADOS Os resultados devem ser apresentados em quadros, indicando o número de colónias contadas, o número de recombinantes, a taxa de sobrevida e a frequência de recombinantes. Todos os resultados deverão ser confirmados por uma experiência independente. Os resultados deverão ser avaliados com métodos estatísticos adequados.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO TESTE O relatório do teste deverá incluir as informações seguintes:

estirpe utilizada,

condições do teste: células em fase estacionária ou em fase de crescimento, composição dos meios, temperatura e duração da incubação, sistema de activação metabólica,

condições de tratamento: concentração de exposição, procedimento e duração do tratamento, temperatura do tratamento, controlos positivos e negativos,

número de colónias contadas, número de recombinantes, taxa de sobrevida e frequência de recombinação, relação dose/resposta se possível; avaliação estatística dos resultados,

discussão dos resultados,

interpretação dos resultados.

3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

4. REFERÊNCIAS Ver Introdução Geral, parte B.

B.17. MUTAGENICIDADE — ENSAIO DE MUTAÇÃO GÉNICA EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS IN VITRO

B.17.

1. MÉTODO O presente método é idêntico ao método OCDE TG 476 — Ensaio de mutação génica de mamíferos in vitro (1997).

1.

1.1. INTRODUÇÃO O ensaio de mutação génica em células de mamíferos in vitro pode ser utilizado para detectar mutações génicas induzidas por substâncias químicas. As linhas celulares que podem ser utilizadas incluem as células L5178Y do linfoma do rato, as linhas celulares CHO, CHO-AS52 e V79 do hamster chinês e as células linfoblastóides humanas TK6 (1). Nessas linhas celulares, os pontos finais genéticos mais utilizados são as mutações da timidina quinase (TK), da hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HPRT) e do transgene de xan-tina-guanina fosforibosil transferase (XPRT). Os ensaios de mutação TK, HPRT e XPRT detectam diferentes gamas de ocorrências genéticas. A localização autossómica das mutações TK e XPRT pode permitir a detecção de ocorrências genéticas (por exemplo, supressão de grandes sequências) que não são detectadas no locus HPRT nos cromossomas X (2) (3) (4) (6). No ensaio de mutação génica em células de mamíferos in vitro podem ser utilizadas culturas de qualquer linha celular ou estirpe de características bem conhecidas. As células utilizadas são seleccionadas com base na sua capacidade de desenvolvimento em cultura e na estabilidade da frequência das mutações espontâneas. Os ensaios realizados in vitro exigem geralmente a utilização de uma fonte exógena de activação metabólica. Os sistemas de activação metabólicos in vitro não reproduzem inteiramente as condições in vivo nos mamíferos. Devem portanto ser evitadas condições que conduzam a resultados que não reflectem uma mutagenicidade intrínseca. Os eventuais resultados positivos não resultantes de mutagenicidade intrínseca podem ser causados por alterações do pH, da pressão osmótica ou por níveis elevados de citotoxicidade (7). O presente ensaio é utilizado para o controlo de eventuais agentes mutagéneos e carcinogéneos em mamíferos. Embora muitos dos compostos que dão resultados positivos no presente ensaio sejam carcinogéneos para os mamíferos, essa correlação não é absoluta. Com efeito, a correlação depende da classe química e, por outro lado, há cada vez mais dados que provam que alguns agentes carcinogéneos não são detectados no ensaio porque parecem actuar através de mecanismos não genotóxicos ou através de mecanismos ausentes nas células bacterianas (6). Ver também a parte B da Introdução Geral.

1.2. DEFINIÇÕES Mutação para diante: mutação genética do tipo parental para a forma mutante que causa uma alteração ou perda de actividade enzimática da função da proteína codificada. Mutagéneos por substituição de um par de bases: substâncias que causam a substituição de um ou vários pares de bases do ADN. Mutagéneos por deslocação do quadro de leitura: substâncias que causam a adição ou supressão de um par de bases ou de uma sequência de pares de bases do ADN. Período de expressão fenotípica: período que decorre até que os produtos dos genes inalterados se esgotem nas células recentemente sujeitas a uma mutação. Frequência de mutação: relação entre o número de células mutantes observadas e o número de células viáveis. Crescimento total relativo: aumento no número de células por unidade de tempo, por comparação com uma população de controlo: calculado como o produto da relação entre o crescimento em suspensão e no controlo negativo com a relação entre a eficiência de clonagem em suspensão e no controlo negativo. Crescimento relativo em suspensão: relação entre o aumento no número de células durante o período de expressão em suspensão e no controlo negativo. Viabilidade: eficiência de clonagem das células expostas incubadas em placas, após o período de expressão, sob condições selectivas. Sobrevivência: eficiência de clonagem das células expostas incubadas em placas no fim do período de exposição; a sobrevivência é geralmente expressa em relação à sobrevivência da população celular de controlo.

1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO As células deficientes em timidina quinase (TK) devido à mutação TK± → TK± são resistentes aos efeitos citotóxicos do análogo de pirimidina da trifluorotimidina (TFT). As células que dispõem de timidina quinase são sensíveis ao TFT, que causa inibição do metabolismo celular e impede a divisão da célula. Logo, as células mutantes podem proliferar na presença de TFT, o que não acontece com as células normais, com timidina quinase. Da mesma forma, as células carentes em HPRT ou XPRT são seleccionadas pela resistência à 6-tioguanina (TG) ou à 8-azaguanina (AG). As propriedades da substância em estudo devem ser cuidadosamente tomadas em consideração se o ensaio de mutação génica em células de mamíferos for utilizado para ensaiar uma substância análoga das bases ou um composto relacionado com o agente selectivo. Assim, por exemplo, deve ser investigada qualquer suspeita de toxicidade selectiva da substância em estudo para as células mutantes e não mutantes. Logo, o desempenho do sistema/agente selectivo deve ser confirmado quando se ensaiarem produtos químicos estruturalmente relacionados com o agente selectivo (8). As células em suspensão ou em cultura em monocamada são expostas à substância em estudo tanto na presença como na ausência de um sistema de activação metabólica durante um período de tempo apropriado, sendo depois cultivadas para determinar a citotoxidade e para permitir a expressão fenotípica antes de seleccionar o mutante (9) (10) (11) (12) (13). A citotoxidade é geralmente determinada através da medição da eficiência relativa de clonagem (sobrevivência) ou do crescimento total relativo das culturas após o período de exposição. As culturas expostas são mantidas em meio de crescimento durante um período de tempo suficiente, que varia em função do locus seleccionado e do tipo de célula, por forma a permitir uma expressão fenotípica tão boa quanto possível das mutações induzidas. A frequência de mutação é determinada inoculando um número conhecido de células num meio com agente selectivo para as células mutantes e num meio sem agente selectivo, para determinação das respectivas eficiências de clonagem (viabilidade). Após um período de incubação apropriado, as colónias são contadas. A frequência de mutação é calculada a partir do número de colónias mutantes no meio selectivo e do número de colónias no meio não selectivo.

1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.4.

1.4.1. Preparação

1.4.1.

1.4.1.1. Células O presente ensaio pode ser realizado com diversos tipos de células, nomeadamente subclones das células L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 ou TK6. Os tipos de célula utilizados no presente ensaio devem ter uma sensibilidade demonstrada a mutagéneos químicos, uma eficiência de clonagem elevada e uma frequência de mutação espontânea estável. As células devem ser verificadas para detectar eventuais contaminações por microplasma, não devendo ser utilizadas se estiverem contaminadas. O ensaio deve ser concebido para ter uma determinada sensibilidade e definição. O número de células e de culturas e as concentrações da substância em estudo a utilizar serão reflexo dos parâmetros definidos (14). O número mínimo de células viáveis que devem sobreviver à exposição e ser utilizadas em cada fase do ensaio deve basear-se na frequência da mutação espontânea. A título indicativo, deve ser utilizado um número de células pelo menos dez vezes superior ao inverso da frequência de mutação espontânea, com um mínimo recomendado de 106 células. Para verificação da consistência do desempenho do ensaio, devem estar disponíveis dados históricos adequados sobre o sistema celular utilizado.

1.4.1.2. Meios e condições de cultura Devem ser utilizados meios de cultura e condições de incubação (recipientes, temperatura, CO2, concentração e humidade) apropriados. Os meios devem ser escolhidos de acordo com o sistema selectivo e com o tipo de células utilizados no ensaio. É particularmente importante que sejam escolhidas condições de cultura que garantam o crescimento óptimo das células durante o período de expressão e a capacidade de formação de colónia por parte das células mutantes e não mutantes.

1.4.1.3. Preparação das culturas As células são propagadas a partir de culturas de arranque, inoculadas no meio de cultura e incubadas a 37 oC. Antes da realização no presente ensaio, as culturas poderão ter de ser limpas de células mutantes eventualmente presentes.

1.4.1.4. Activação metabólica As bactérias devem ser expostas à substância em estudo tanto na presença como na ausência de um sistema adequado de activação metabólica. O sistema mais geralmente utilizado é uma fracção pós-mitocondrial reforçada com co-factor (S9) preparada a partir de fígados de roedores tratados com agentes de indução enzimática, como por exemplo Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) ou uma mistura de fenobarbitona e β-naftoflavona (19) (20). A fracção pós-mitocondrial é geralmente utilizada em concentrações na gama de 1-10 % v/v no meio de ensaio final. A escolha e estado do sistema de activação metabólico podem depender da classe de produto químico em estudo. Em alguns casos, poderá ser apropriado utilizar mais de uma concentração de fracção pós-mitocondrial. Alguns desenvolvimentos, nomeadamente a produção por engenharia genética de linhas celulares que expressem enzimas de activação específicas, podem ter algum potencial em termos de activação endógena. A escolha das linhas celulares utilizadas deve ser cientificamente justificada (por exemplo, pela importância da isoenzima do citocromo P450 para o metabolismo da substância em estudo).

1.4.1.5. Substância em estudo/preparação As substâncias sólidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veículos adequados e, se necessário, diluídas antes da exposição das células. As substâncias líquidas podem ser adicionadas directamente aos sistemas em estudo e/ou diluídas antes de serem adicionadas às células. Devem ser utilizadas preparações frescas da substância em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo armazenamento não coloca problemas para o ensaio.

1.4.2. Condições de ensaio

1.4.2.

1.4.2.1. Solvente/veículo O solvente/veículo não deve reagir com a substância em estudo, devendo ser compatível com a sobrevivência das células e com a actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veículos cujas propriedades não se encontrem totalmente elucidadas devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possível, recomenda-se a utilização de solventes/veículos aquosos. Quando forem realizados ensaios de substâncias instáveis na presença de água, os solventes orgânicos utilizados devem ser anidros. A água poderá ser removida através de um filtro molecular.

1.4.2.3. Controlos negativos e positivos Cada experiência deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veículo), tanto na presença como na ausência de um sistema de activação metabólica. Quando for utilizada activação metabólica, o produto químico de controlo positivo deve ser o mesmo que exige activação para dar uma resposta mutagénica. As substâncias de controlo positivo podem ser, por exemplo: Condição de activação metabólica Locus Substância Número CAS Número EINECS Ausência de activação metabólica exógena HPRT Metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 Etil nitrosureia 759-73-9 212-072-2 TK (colónias pequenas e grandes) Metanossulfonato de metilo 66-27-3 200-625-0 XPRT Metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 Etil nitrosureia 759-73-9 212-072-2 Presença de activação metabólica exógena HPRT 3-3-Metilcolantreno 56-49-5 200-276-4 N-Nitrosodimetilamina 62-75-9 200-549-8 7,12-Dimetilbenzantraceno 57-97-6 200-359-5 TK (colónias pequenas e grandes) Ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4 Ciclofosfamida monohidrato 6055-19-2 Benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5 3-3-Metilcolantreno 56-49-5 200-276-5 XPRT N-n- Nitrosodimetilamina (níveis elevados de S 9) 62-75-9 200-549-8 Benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5 Podem ser utilizadas outras substâncias de referência apropriadas para o controlo positivo. Assim, se um laboratório dispuser, por exemplo, de uma base de dados históricos sobre a utilização de 5-bromo 2'-deoxiuridina (número CAS 59-14-3, número EINECS 200-415-9), essa substância de referência poderá também ser utilizada. Quando existam, deve ser analisada a possibilidade de utilizar produtos químicos de controlo positivos de classes químicas relacionadas. Devem também realizar-se controlos negativos, consistindo apenas em solvente ou veículo e sem a substância em estudo, que serão sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expostos. Além disso, devem igualmente ser utilizados controlos não expostos à substância em estudo, a menos que existam dados históricos de controlo que demonstrem que o solvente escolhido não induz qualquer efeito deletério ou mutagénico.

1.4.3. Procedimento

1.4.3.

1.4.3.1. Exposição à substância em estudo As células em proliferação devem ser expostas à substância em estudo tanto na presença como na ausência de um sistema de activação metabólica durante um período de tempo apropriado (três a seis horas é geralmente eficaz). O período de exposição pode ser alargado a um ou mais ciclos celulares. Para cada concentração a ensaiar, podem ser utilizadas culturas expostas únicas ou em duplicado. Quando forem utilizadas culturas únicas, o número de concentrações deve ser aumentado, por forma a garantir um número de culturas adequado para a análise (por exemplo, pelo menos oito concentrações analisáveis). Devem também ser incluídas culturas de controlo negativas (solventes) duplicadas. As substâncias gasosas ou voláteis devem ser ensaiadas por métodos apropriados, por exemplo em recipientes selados (21) (22).

1.4.3.2. Medição da sobrevivência, viabilidade e frequência de mutação No fim do período de exposição, as células são lavadas e cultivadas para determinar a sobrevivência e para permitir a expressão fenotípica das mutações. A medição de citotoxicidade através da determinação da eficiência relativa de clonagem (sobrevivência) ou do crescimento total relativo das culturas é geralmente iniciada após o período de exposição. Para cada locus há um tempo mínimo definido para permitir uma expressão fenotípica quase óptima das mutações recentemente induzidas (o HPRT e o XPRT exigem pelo menos de seis a oito dias e o TK pelo menos dois dias). As células são cultivadas em meios com presença e ausência do agente selectivo para determinação, respectivamente, do número de mutações e da eficiência de clonagem. A medição da viabilidade (utilizada para calcular a frequência de mutação) é iniciada no fim do período de expressão através de cultura em placas com meio não selectivo. Se a substância em estudo der um resultado positivo no ensaio L5178Y TK+/-, deve ser realizada uma medição do tamanho das colónias em pelo menos uma das culturas de ensaio (a concentração máxima com resultado positivo) e nos controlos negativos e positivos. Se a substância em estudo der um resultado negativo no ensaio L5178Y+/-, deve ser realizada uma medição do tamanho das colónias nos controlos negativos e positivos. Nos estudos que utilizem TK6TK+/- a medição do tamanho das colónias poderá também ser realizada.

2. DADOS

2.

2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS Os dados devem incluir a determinação de citotoxicidade e da viabilidade, para além da contagem das colónias e das frequências de mutação nas culturas expostas e nas culturas de controlo. No caso de um resultado positivo no ensaio L5178Y TK+/-, as colónias devem ser contabilizadas utilizando o critério das colónias pequenas e grandes em pelo menos uma das concentrações da substância em estudo (a concentração máxima com resultado positivo) e nos controlos negativos e positivos. A natureza molecular e citogénica das células mutantes que formam colónias grandes e pequenas já foi investigada em pormenor (23) (24). No ensaio TK+/- as colónias devem ser contabilizadas utilizando os critérios do crescimento normal (colónias grandes) e do crescimento lento (colónias pequenas) (25). As células mutantes que tenham sofrido danos genéticos mais extensos apresentam tempos de duplicação maiores, pelo que formam colónias mais pequenas. Esses danos variam tipicamente da perda da totalidade dos genes a aberrações cromossómicas só visíveis por análise do cariótipo. A indução de mutações que resultam no aparecimento de colónias pequenas foi associada com produtos químicos que induzem aberrações cromossómicas graves (26). As células menos seriamente afectadas por mutações apresentam taxas de crescimento semelhantes às células parentais e formam colónias grandes. Deve ser apresentada a sobrevivência (eficiências relativas de clonagem) ou o crescimento total relativo. A frequência de mutação deve ser expressa como a relação entre o número de células mutantes e o número de células sobreviventes. Devem ser fornecidos dados individuais das culturas. Para além disso, todos os dados devem ser apresentados sob a forma de um quadro. Não há nenhuma exigência concreta para a verificação de uma resposta positiva clara. Os resultados ambíguos devem ser melhor esclarecidos, de preferência com modificação das condições experimentais. Os resultados negativos têm de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmação dos resultados negativos não seja considerada necessária, deve ser apresentada uma justificação. Para a realização de experiências adicionais, deve ser analisada a possibilidade de modificação dos parâmetros do estudo, por forma a aumentar a gama de condições avaliadas. Os parâmetros que podem eventualmente ser alterados incluem a gama de concentrações e as condições de activação metabólica.

2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Há diversos critérios para determinar um resultado positivo, tais como um aumento da frequência de mutação que esteja relacionado com a concentração na gama testada e/ou que seja reprodutível. Deve ser tomada em consideração, antes de mais, a importância biológica dos resultados. Como auxílio para a avaliação dos resultados dos ensaios, poderão ser utilizados métodos estatísticos. Contudo, a importância estatística não deve ser o único elemento de determinação para uma resposta positiva. Uma substância cujos resultados não cumpram os critérios acima indicados no presente ensaio é considerada não mutagénica. Embora a maioria das experiências tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o conjunto dos dados não permitirá que se obtenha uma opinião inequívoca sobre a actividade da substância em estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambíguos ou duvidosos independentemente do número de vezes que a experiência seja repetida. Um resultado positivo no ensaio de mutação génica em células de mamíferos in vitro indica que a substância induz mutações génicas nas culturas de células de mamíferos utilizadas. Uma resposta positiva à concentração que seja reprodutível é mais significativa. Um resultado negativo indica que, nas condições do ensaio, a substância não induz mutações génicas nas culturas de células de mamífero utilizadas.

3. APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS

3. RELATÓRIO DE ENSAIO

O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:

Solvente/veículo:

justificação para a escolha do veículo,

solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/veículo, se conhecida.

Células:

tipo e origem das células,

número de culturas celulares,

número de transferências, quando aplicável,

métodos de manutenção da cultura celular, quando aplicável,

ausência de micoplasma.

Condições de ensaio:

justificação para a selecção das concentrações e do número de culturas, incluindo, por exemplo, dados sobre a citotoxicidade e sobre as limitações de solubilidade, quando disponíveis,

composição dos meios, concentração de CO2

concentração da substância em estudo,

volumes adicionados do veículo e da substância em estudo,

temperatura de incubação,

tempo de incubação,

duração de tratamento,

densidade celular durante a exposição,

tipo e composição do sistema de activação metabólica, incluindo critérios de aceitabilidade,

controlos positivos e negativos,

duração do período de expressão (incluindo o número de células inoculadas e os calendários de sub-cultura e de alimentação, quando aplicável),

agentes selectivos,

critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou não conclusivo,

métodos utilizados para a enumeração dos números de células mutantes e viáveis,

definição das colónias cuja dimensão e tipo são caracterizados (incluindo os critérios para a definição de colónias pequenas e grandes, conforme apropriado).

Resultados:

sinais de toxicidade,

sinais de precipitação,

dados sobre o pH e a pressão osmótica durante a exposição à substância de ensaio, caso tenham sido determinados,

dimensão das colónias, caso tenha sido medida pelo menos para os controlos positivos e negativos,

capacidade do laboratório para a detecção de pequenas colónias mutantes no sistema L5178Y TK+/-, quando aplicável,

relação dose-resposta, quando seja possível de determinar,

análise estatística, quando tenha sido realizada,

dados relativos ao controlo negativo (solvente/veículo) e positivo realizados em paralelo com o ensaio,

dados históricos sobre o controlo negativo (solvente/veículo) e positivo, com as gamas, valores médios e desvios-padrão,

frequência das mutações.

Discussão dos resultados.

Conclusões.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)

REFERÊNCIAS Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.), (1987) Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E.H.Y. and Malling, H.V., (1968) Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, p. 1306-1312. Liber, H.L. and Thilly, W.G., (1982) Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, p. 467-485. Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L., (1989) Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, p. 394-403. Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F., (1989) Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, p. 121-128. 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B.18. LESÃO E REPARAÇÃO DO ADN — SÍNTESE NÃO PROGRAMADA — CÉLULAS DE MAMÍFERO IN VITRO

B.18.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.2. DEFINIÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Nenhuma.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO O Teste de Síntese Não Programada de ADN (Unscheduled DNA Synthesis-UDS) mede a síntese de ADN para reparação após excisão e remoção de um fragmento de ADN contendo uma região de lesão induzida por agentes químicos e físicos. O teste baseia-se na incorporação da timidina marcada com trítio (3H-TdR) no ADN de células de mamífero não se encontrando na fase S do ciclo celular. Pode determinar-se a incorporação de 3H-TdR examinando o ADN proveniente das células tratadas por auto-radiografia ou por contagem de cintilação em meio líquido (LSC-Liquid Scintilation Counting). As células de mamífero em cultura, com a excepção dos hepatócitos primários de rato, são tratadas com a substância a testar em presença e na ausência de um sistema exógeno de activação metabólica. A UDS pode também ser medida por métodos in vivo.

1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS Nenhum.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.6. Preparativos

As substâncias a testar, bem como as de controlo ou de referência serão preparadas no meio de cultura, dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados, sendo depois diluídas em meio de cultura, antes de utilizadas no ensaio. A concentração final não deverá afectar a viabilidade celular. Podem ser utilizadas neste ensaio culturas primárias de hepatócitos de rato, linfócitos humanos ou linhas celulares estabelecidas (por exemplo, fibroblastos humanos diplóides). As células serão expostas à substância a testar em presença e na ausência de um sistema de activação metabólica apropriado.

Condições experimentais

Número de culturas

São necessárias para cada ponto experimental pelo menos duas culturas celulares para a auto-radiografia e seis culturas celulares (ou menos se tal se justificar tecnicamente) para a contagem de cintilação em meio líquido.

Uso de controlos negativos e positivos

Deverão ser incluídos em cada experiência controlos simultâneos (não tratados e/ou veículo) com e sem activação metabólica. Para o ensaio com hepatócitos de rato, por exemplo, pode utilizar-se como controlo positivo o 7,12 DMBA (7,12-dimetil benzantraceno) ou o 2-AAF (2-acetilaminofluoreno). No caso de linhas celulares estabelecidas, em ensaios com auto-radiografia ou LSC realizados sem activação metabólica, pode utilizar-se como controlo o 4-NQO (4-nitroquinolina N-óxido); quando se tiver recorrido a sistemas de activação metabólica, a N-dimetil-nitrosamina é um dos compostos utilizáveis como controlo positivo.

Concentrações de exposição

Deverá utilizar-se uma gama de concentrações da substância a testar para permitir uma boa determinação da resposta. A concentração máxima deverá produzir alguns efeitos citotóxicos. As substâncias relativamente insolúveis na água serão testadas até ao seu limite de solubilidade. No que respeita às substâncias não tóxicas francamente solúveis na água, a concentração máxima a testar deverá ser determinada caso a caso.

Células

Para a manutenção das culturas recorrer-se-á a meios de cultura, a uma concentração de CO2, a uma temperatura e a humidade apropriados. As linhas celulares estabelecidas deverão ser examinadas periodicamente para detectar uma contaminação por Mycoplasma.

Activação metabólica

Não se utiliza nenhum sistema de activação metabólica nas culturas primárias de hepatócitos. As linhas celulares estabelecidas e os linfócitos são expostos à substância a testar em presença e na ausência de um sistema de activação metabólica apropriado.

Procedimentos

Preparação das culturas

As linhas celulares estabelecidas provenientes de culturas-mãe (por exemplo, por tripsinização ou por agitação) são semeadas em recipientes de cultura numa densidade adequada e incubada a 37 oC. As culturas de pouca duração de hepatócitos de rato são estabelecidas permitindo que os hepatócitos recentemente dissociados num meio apropriado possam aderir à superfície de crescimento. As culturas de linfócitos humanos são realizadas com técnicas apropriadas.

Tratamento das culturas com substância a testar Hepatócitos primários de rato

Tratam-se hepatócitos primários de rato, isolados recentemente, com a substância a testar no meio contendo 3H-TdR, durante um período de tempo adequado. No fim do período de tratamento o meio será eliminado, as células lavadas, fixadas e secadas. As lâminas são mergulhadas numa emulsão de auto-radiografia [em alternativa pode usar-se uma película fotográfica (stripping film)], passando depois à exposição, revelação, coloração e contagem.

Linhas celulares estabelecidas e linfócitos

Técnicas auto-radiográficas: Expõem-se as culturas celulares à substância a testar durante períodos de tempo adequados, sendo tratadas em seguida com a 3H-TdR. A duração da exposição será em função da natureza da substância, da actividade do sistema metabólico e do tipo das células. Para detectar o pico da UDS, deverá acrescentar-se a 3H-TdR, seja ao mesmo tempo que a substância a testar, seja nos minutos que se seguem à exposição à substância a testar. A escolha entre estas duas técnicas será determinada por eventuais interacções entre a substância testada e a 3H-TdR. Para se poder fazer a distinção entre a UDS e a replicação semiconservativa do ADN pode inibir-se esta última utilizando-se, por exemplo, um meio deficiente em arginina, um baixo teor de sódio ou acrescentando-se hidroxiureia ao meio de cultura. Medição LSC de UDS: Antes de proceder ao tratamento com a substância a testar, bloqueia-se a entrada das células na fase S da forma descrita acima; expõem-se em seguida as células à substância a testar, como descrito para a auto-radiografia. No fim do período de incubação extrai-se o ADN das células e determina-se a quantidade total de ADN, bem como a quantidade de 3H-TdR incorporada. É preciso notar que, se forem utilizados linfócitos humanos, não é necessário suprimir a replicação semiconservativa do ADN nas culturas não estimuladas.

Análise

Determinações auto-radiográficas

Para determinar a UDS nas células em células em cultura não se contam os núcleos em fase S. Deverão contar-se pelo menos 50 células por concentração. As lâminas serão codificadas antes da contagem. Em cada lâmina serão contados vários campos escolhidos ao acaso, suficientemente afastados uns dos outros. Determinar-se-á a quantidade de 3H-TdR incorporado no citoplasma contando-se três superfícies do tamanho do núcleo no citoplasma de cada célula contada.

Determinação LSC

Nas determinações LSC-UDS deveria utilizar-se um número adequado de culturas para cada concentração e para os controlos. Todos os resultados serão confirmados por experiências independentes.

2. RESULTADOS Os resultados deverão ser apresentados sob a forma de quadros.

2.

2.1. DETERMINAÇÕES AUTO-RADIOGRÁFICAS A quantidade de 3H-TdR incorporada no citoplasma, bem como o número de grãos contados por núcleo celular, serão registados separadamente. A média, a mediana e a moda podem ser utilizadas para descrever a distribuição da quantidade de 3H-TdR incorporado no citoplasma, bem como o número de grãos por núcleo.

2.2. DETERMINAÇÃO LSC Para as determinações LSC a incorporação de 3H-TdR deverá ser indicada sob a forma dpm/ug do ADN. Pode utilizar-se a média dos dpm/ug do ADN com o seu desvio-padrão para descrever a distribuição da incorporação. Os resultados deverão ser avaliados com métodos estatísticos apropriados.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO O relatório deverá conter as seguintes informações:

células utilizadas, densidade e número de passagens na ocasião do tratamento, número de culturas celulares,

métodos utilizados na manutenção das culturas, incluindo o meio, a temperatura e a concentração de CO2,

substância a testar, veículo, concentrações e justificação da escolha das concentrações usadas no teste,

pormenores relativos aos sistemas da activação metabólica,

esquema do tratamento,

controlos positivos e negativos,

técnica de auto-radiografia utilizada,

métodos utilizados para bloquear a entrada das células na fase S,

técnicas utilizadas para extracção do ADN e determinação da quantidade total de ADN nas determinações LSC,

relação dose/resposta, se possível,

avaliação estatística,

discussão dos resultados,

interpretação dos resultados.

3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

4. REFERÊNCIAS Ver Introdução Geral, parte B.

B.19. TESTE IN V1TRO DE TROCA ENTRE CROMÁTIDES DO MESMO CROMOSSOMA (Sister Chromatid Exchange — SCE)

B.19.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.2. DEFINIÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Nenhuma.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO O ensaio de troca entre cromátides do mesmo cromossoma (SCE) constitui um teste de curto prazo que se destina a detectar as trocas recíprocas de ADN entre as cromátides de um mesmo cromossoma em duplicação. As SCE representam a troca recíproca de produtos de replicação do ADN em loci aparentemente homólogos. O processo de troca implica provavelmente uma cisão e uma fusão do ADN, apesar de sabermos pouco acerca da sua base molecular. Para detectar as SCE é necessário poder marcar separadamente as cromátides do mesmo cromossoma; isto é possível pela incorporação da bromodesoxiuridina (BrdU) no ADN cromossómico durante dois ciclos celulares. As células de mamífero in vitro são expostas à substância a testar na presença e na ausência de um sistema exógeno de activação metabólica de mamífero, se for caso disso, e colocadas num meio de cultura contendo (BrdU) durante dois ciclos de replicação. Após tratamento com um inibidor do fuso (por exemplo, colchicina) a fim de acumular as células numa fase da mitose metafase-like (c-metafase) recolhem-se as células e fazem-se preparações de cromossomas.

1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS Nenhum.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

podem ser utilizadas no ensaio culturas primárias (linfócitos humanos) ou linhas celulares estabelecidas (por exemplo, células de ovário de hamster chinês). As linhas celulares deverão ser examinadas para detectar uma eventual contaminação por Mycoplasma,

serão utilizados meios de cultura e condições de incubação adequados (por exemplo, temperatura, recipientes de cultura, concentração em CO2 e humidade),

as substâncias a testar podem ser preparadas nos meios de cultura, dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados antes de proceder ao tratamento das células. A concentração final do veículo no meio de cultura não deverá afectar nem a viabilidade das células nem a taxa de crescimento, e os efeitos sobre a frequência de SCE serão verificados por meio de um solvente de controlo,

as células serão expostas à substância a testar na presença e na ausência de um sistema exógeno de activação metabólica de mamífero. Quando se utilizarem tipos celulares com actividade metabólica intrínseca, a taxa e a natureza dessa actividade deverão ser adequadas à classe química testada.

1.6. Condições experimentais

Número de culturas

Serão utilizadas pelo menos duas culturas separadas para cada ponto experimental.

Utilização de controlos negativos e positivos

Deverão ser incluídos em cada experiência controlos positivos utilizando uma substância com acção directa e uma substância necessitando de activação metabólica; deverá também utilizar-se um controlo para o veículo. As substâncias seguintes podem, por exemplo, ser utilizadas como controlos positivos: Se for caso disso, pode incluir-se um controlo positivo suplementar pertencendo à mesma classe química da substância a testar.

substância com acção directa:

etilmetanosulfonato de etilo,

substância com acção indirecta:

ciclofosfamida.

Concentração de exposição

Deveriam ser utilizadas pelo menos três concentrações da substância a testar, convenientemente espaçadas. A concentração máxima deverá produzir um efeito tóxico significativo mas permitindo ainda uma replicação celular adequada. As substâncias relativamente insolúveis na água serão testadas até ao seu limite de solubilidade com métodos apropriados. No caso de substâncias não tóxicas francamente solúveis na água a concentração máxima da substância a testar deverá ser determinada caso a caso.

Procedimento

Preparação das culturas

Utilizam-se linhas celulares estabelecidas provenientes de culturas-mãe (por exemplo, por tripsinização ou por agitação), semeadas em recipientes de cultura, numa densidade adequada e incubadas a 37 oC. No caso de culturas em monocamada, o número de células por recipiente deveria ser ajustado de forma a que as culturas não estejam confluentes a mais de 50 % no momento da colheita. As células podem também ser utilizadas na forma de cultura em suspensão. As culturas de linfócitos humanos são preparadas a partir de sangue heparinizado utilizando técnicas apropriadas e incubadas a 37 oC.

Tratamento

São expostas à substância a testar células em fase exponencial de crescimento, durante um lapso de tempo adequado; na maior parte dos casos uma a duas horas podem ser suficientes mas, nalguns casos, o tratamento pode ser prolongado para cobrir até dois ciclos celulares completos. As células que não tiverem actividade metabólica intrínseca suficiente deverão ser expostas à substância a testar na presença e na ausência de um sistema de activação metabólica apropriado. No fim do período de exposição, as células são lavadas de forma a eliminar a substância testada, e depois cultivadas na presença de BrdU durante dois ciclos de replicação. Um outro método consiste na exposição simultânea das células à substância testada e à BrdU durante dois ciclos celulares completos. As culturas de linfócitos humanos são tratadas enquanto se encontrarem num estado de semi-sincronização. As células são analisadas no decurso da segunda divisão após tratamento, garantindo assim a exposição das fases mais sensíveis de ciclo celular à substância a testar. Todas as culturas a que se adicionou BrdU serão manipuladas na obscuridade ou com pouca iluminação proveniente de lâmpadas incandescentes até ao momento da colheita das células, para reduzir a fotólise do ADN contendo BrdU.

Colheita das células

As culturas de células são tratadas com um inibidor do fuso (por exemplo, colchicina) uma a quatro horas antes da colheita. Cada cultura é colhida e processada separadamente para a preparação dos cromossomas.

Preparação dos cromossomas e coloração

As preparações de cromossomas são feitas com métodos Standard de citogenética. Podem utilizar-se várias técnicas para corar as lâminas de forma a pôr em evidência as SCE (por exemplo, o método por fluorescência mais Giemsa).

Análise

O número de células analisado será em função da frequência espontânea controlo de SCE. Habitualmente analisam-se pelo menos 25 metafases de boa qualidade, por cultura, para contar as SCE. As lâminas são codificadas antes da análise. Para os linfócitos humanos apenas são analisadas as metafases contendo 46 centrómeros. Para as linhas celulares estabelecidas apenas são analisadas as metafases com ± 2 centrómeros que o número modal. Deverá ser precisado se uma inversão de coloração ao nível do centrómero é ou não considerada como SCE. Os resultados serão confirmados por uma experiência independente.

2. RESULTADOS Os resultados deverão ser apresentados em quadros. O número de SCE por metafase e o número de SCE por cromossoma são dados separadamente para todas as culturas, tratadas e controlos. Os resultados serão analisados com métodos estatísticos adequados.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO TESTE O relatório deveria conter as informações seguintes:

células utilizadas, métodos de manutenção da cultura celular,

condições experimentais: composição de meios, concentração de CO2, concentração da substância a testar, veículo utilizado, temperatura de incubação, tempo de tratamento, inibidor do fuso utilizado, concentração e duração do tratamento com este, tipo de sistema de activação de mamífero utilizado, controlos positivos e negativos,

número de culturas celulares por ponto experimental,

pormenores relativos à técnica utilizada na preparação das lâminas,

número de metafases analisadas (resultados indicados separadamente para cada cultura),

número médio de SCE por célula e por cromossoma (resultados indicados separadamente para cada cultura),

critério de contagem de SCE,

justificação da escolha das doses,

relação dose/resposta, se possível,

avaliação estatística,

discussão dos resultados,

interpretação dos resultados.

3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

4. REFERÊNCIAS Ver Introdução Geral, parte B.

B.20. TESTE DE LETALIDADE RECESSIVA LIGADA AO SEXO NA DROSOPHILA MELANOGASTER

B.20.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.2. DEFINIÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Nenhuma.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO O teste de letalidade recessiva ligada ao sexo (SLRL — Sex Linked Recessive Letal Test) utilizando a Drosophila melanogaster detecta a ocorrência de mutações — mutações pontuais bem como pequenas delecções — na linha germinal do insecto. Esta prova é um ensaio de mutação forward capaz de detectar mutações em cerca de 800 loci do cromossoma X, o que representa cerca de 80 % de todos os loci deste cromossoma. O cromossoma X representa cerca de um quinto do genoma haplóide completo. As mutações do cromossoma X de Drosophila melanogaster são expressas fenotipicamente nos machos portadores do gene mutante. Quando a mutação é letal no estado hemizigótico, a sua presença é deduzida a partir da ausência de um dos grupos de descendência masculina, em vez dos dois habitualmente produzidos por uma fêmea heterozigótica. O SLRL baseia-se nestes factos, utilizando cromossomas especificamente marcados e com rearranjos da sua estrutura.

1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS Nenhum.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.6. Preparativos

Stocks

Podem ser utilizados machos de um stock de tipo selvagem bem definido e fêmeas do stock Muller-5. Podem também ser utilizados outros stocks de fêmeas marcadas adequadamente, com cromossomas X invertidos de forma múltipla.

Substância a testar

As substâncias a testar devem ser dissolvidas em água. As substâncias insolúveis na água podem ser dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados (por exemplo, uma mistura de etanol com Tween-60 ou 80), sendo depois diluídas em água ou numa solução salina antes da administração. Deve evitar-se como veículo o dimetilsulfóxido (DMSO).

Número de animais

O teste deve ser concebido com uma sensibilidade e grau de significância preestabelecido. A frequência de mutantes espontâneos observada no grupo de controlo irá influenciar fortemente o número de cromossomas tratados que devem ser analisados.

Via de administração

A administração pode ser oral, por injecção ou por exposição a gases ou vapores. A ingestão da substância testada pode ser feita por intermédio de uma solução açucarada. Se necessário, as substâncias podem ser dissolvidas numa solução de NaCL a 0,7 % e injectadas no tórax ou no abdómen.

Uso de controlos negativos e positivos

Devem ser incluídos controlos negativos (veículo) e positivos. No entanto, se existirem dados apropriados de experiências anteriores, não são necessários controlos simultâneos.

Níveis de exposição

Devem utilizar-se três níveis de exposição. Para uma avaliação preliminar pode utilizar-se apenas uma única concentração da substância testada, podendo essa ser a concentração máxima tolerada ou a concentração produzindo alguns sinais de toxicidade. No caso de substâncias não tóxicas deverá utilizar-se a concentração máxima praticável.

Procedimento

Tratam-se com a substância a testar machos de fenótipo selvagem (com três a cinco dias de idade), sendo acasalados individualmente a um maior número de fêmeas virgens do stock Muller-5 ou outro stock marcado de forma apropriada (com cromossomas X invertidos de forma múltipla). Estas fêmeas serão substituídas de dois em dois ou de três em três dias por outras fêmeas virgens para se cobrir o ciclo germinal completo. A descendência destas fêmeas é examinada para detectar os efeitos sobre o esperma maduro, as espermátides em estádios precoces, intermédios ou tardios, os espermatócitos e as espermatogónias na ocasião do tratamento. As fêmeas F1 heterozigóticas provenientes dos cruzamentos mencionados acima são acasaladas individualmente (isto é, um fêmea por frasco de experiência) com os seus irmãos. Na geração F2 examina-se cada cultura para detectar a ausência de machos do tipo selvagem. Se uma cultura revelar ser proveniente de uma fêmea F1 portadora de um gene letal no cromossoma X paterno (isto é, quando não se observar nenhum macho portador do cromossoma tratado), devem testar-se as filhas dessa fêmea com o mesmo genotipo para verificar se a letalidade se repete na geração seguinte.

2. RESULTADOS Os resultados devem ser apresentados em quadros indicando o número de cromossomas X tratados, o número de machos não férteis e o número de cromossomas letais por cada concentração de exposição e por cada período de acasalamento para cada macho tratado. O número de agregados de diferentes dimensões deverá ser indicado. Estes resultados deverão ser confirmados por uma experiência separada. Deverão ser utilizados métodos estatísticos apropriados na avaliação dos testes de letalidade recessiva ligada ao sexo. O reagrupamento de genes letais recessivos provenientes de um único macho deverá ser considerado e avaliado com um método estatístico apropriado.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO TESTE O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:

stock: stocks ou estirpes de Drosophila utilizados, idade dos insectos, número de machos tratados, número de machos estéreis, número de culturas F2 estabelecidas, número de cromossomas portadores de um gene letal detectado em cada estádio das células germinais,

critérios aplicados para determinar as dimensões dos grupos tratados,

condições experimentais: descrição pormenorizada do esquema de tratamento e de amostragem, níveis de exposição, dados sobre a toxicidade, controlos negativos (solvente) e positivos se necessário,

critérios aplicados na contagem das mutações letais,

relação exposição/efeito, se possível,

e avaliação estatística dos resultados,

discussão dos resultados,

interpretação dos resultados.

3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

4. REFERÊNCIAS Ver Introdução Geral, parte B.

B.21. TESTES DE TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS DE MAMÍFERO IN VITRO

B.21.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.2. DEFINIÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Nenhuma.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Podem utilizar-se sistemas de cultura de células de mamífero para detectar in vitro alterações do fenótipo induzidas por substâncias químicas associadas com uma transformação maligna in vivo. Entre as culturas mais frequentemente utilizadas contam-se as C3H1OT 1/2, 3T3, SHE, rato Fischer; os testes baseiam-se nas alterações da morfologia celular, formação de ninhos celulares ou alterações ligadas à necessidade de ancoragem a um agar semi-sólido. Existem outros sistemas menos frequentemente utilizados que detectam outras alterações fisiológicas ou morfológicas nas células depois de uma exposição a carcinogénios químicos. Nenhum dos fenómenos finais destes testes in vitro apresenta uma relação mecanicista estabelecida com o cancro. Alguns dos sistemas de testes são capazes de detectar promotores de tumores. Pode determinar-se a citotoxicidade medindo o efeito da substância a testar sobre a capacidade para formar uma colónia (eficácia de cloning) ou ainda sobre as taxas de crescimento das culturas. A medição da citotoxicidade tem por fim determinar se a exposição da substância testada foi toxicologicamente significativa mas não pode servir para calcular a frequência das transformações em todas as provas uma vez que algumas destas podem implicar uma incubação prolongada e/ou uma nova passagem.

1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS Nenhum.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.6. Preparativos

Células

Podem ser utilizadas várias linhas celulares ou células primárias, dependendo do teste de transformação utilizado. O investigador deve assegurar-se de que as células do teste efectuado apresentam a alteração fenotípica adequada depois da exposição a carcinogénios conhecidos e que a validade e fiabilidade do teste efectuado no seu laboratório sejam comprovadas e documentadas.

Meio

Deverão utilizar-se meios e condições de ensaio adequados ao teste de transformação utilizado.

Substância a testar

As substâncias a testar podem ser preparadas nos meios de cultura, e dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados antes do tratamento das células. A concentração final do veículo no sistema de cultura não deve afectar a viabilidade celular nem a taxa de crescimento, nem a incidência de transformações.

Activação metabólica

As células deverão ser expostas à substância a testar na presença e na ausência de um sistema de activação metabólica adequado. Alternativamente, quando se utilizar tipos de células com actividade metabólica intrínseca, a natureza dessa actividade será comprovadamente apropriada à classe química testada.

Condições do ensaio

Utilização de controlos positivos e negativos

Serão incluídos em cada experiência controlos positivos utilizando uma substância com acção directa e uma substância necessitando de activação metabólica; utilizar-se-á igualmente um controlo negativo (veículo). Podem ser utilizadas como controlos positivos as seguintes substâncias: Deverá ser incluído, quando justificado, um controlo positivo suplementar pertencendo à mesma classe química que a substância testada.

substâncias químicas com acção directa:

etilmetanosulfonato,

β-propiolactona,

substâncias necessitando de activação metabólica:

2-acetilaminofluoreno,

4-dimetilaminobenzeno,

7,12-dimetilbenzantraceno.

Concentrações de exposição

Deverão ser utilizadas várias concentrações das substâncias a testar. Estas concentrações deverão produzir um efeito tóxico dependente da concentração; a concentração máxima deverá produzir uma baixa taxa de sobrevivência, a concentração mínima uma taxa de sobrevivência próxima da observada nos controlos negativos. As substâncias relativamente insolúveis na água serão testadas até ao seu limite de solubilidade com métodos apropriados. No caso de substâncias não tóxicas, francamente solúveis na água, a concentração máxima deverá ser determinada caso a caso.

Procedimento

As células serão expostas durante um período de tempo dependente do sistema celular utilizado, que pode implicar um novo tratamento acompanhado de mudança de meio (e se necessário uma nova mistura de activação metabólica) se a exposição for prolongada. As células que não tenham actividade metabólica intrínseca suficiente deverão ser expostas à substância a testar na presença e na ausência de um sistema de activação metabólica apropriado. No fim do período de exposição, as células são lavadas de forma a eliminar a substância testada e cultivadas em condições que permitam o aparecimento do fenótipo transformado em estudo sendo então determinada a incidência desta transformação. Todos os resultados deverão ser confirmados por uma experiência independente.

2. RESULTADOS Os resultados deverão ser apresentados em quadros e podem ser apresentados de várias formas consoante o método utilizado, por exemplo, contagem por placa, placas positivas ou número de células transformadas. Quando apropriado, a sobrevivência será expressa em percentagem das taxas de controlo e a frequência de transformação corresponderá ao número de células transformadas por número de sobreviventes. Os resultados deverão ser avaliados com métodos estatísticos apropriados.

3. RELATÓRIO

3.

3.1. RELATÓRIO DO TESTE O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:

tipo de célula utilizada, número de culturas de células, métodos de manutenção das culturas de células,

condições do teste: concentração da substância a testar, veículo usado, tempo de incubação, duração e frequência do tratamento, densidade celular durante o tratamento, tipo de sistema exógeno de activação metabólica utilizado, controlos positivos e negativos, especificação do fenótipo estudado, sistema selectivo usado (se apropriado); justificação da escolha das doses,

método utilizado para contar as células viáveis e as transformadas;

avaliação estatística,

discussão dos resultados,

interpretação dos resultados.

3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

4. REFERÊNCIAS Ver Introdução Geral, parte B.

B.22.

1. MÉTODO

1.

1.1. INTRODUÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.2. DEFINIÇÃO Ver Introdução Geral, parte B.

1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Nenhuma.

1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO A letalidade dominante provoca a morte do embrião ou do feto. A indução de letalidade dominante por exposição a uma substância química indica que a substância afectou o tecido germinal da espécie estudada. Admite-se geralmente que a letalidade dominante é devida a uma lesão cromossómica (alterações estruturais e numéricas). No caso de os animais tratados serem fêmeas, a morte do embrião pode também ser devida a efeitos tóxicos. Em geral, os machos são expostos à substância a testar e acasalados com fêmeas virgens não tratadas. Os diferentes estádios das células germinais podem ser testados separadamente utilizando-se períodos de acasalamento sequenciais. O aumento do número de implantes mortos por fêmea no grupo tratado em relação ao número de implantes mortos por fêmea no grupo de controlo reflecte as perdas após a implantação. As perdas antes da implantação podem ser calculadas por contagem dos corpos amarelos ou comparando o número total de implantes por fêmea no grupo tratado e no grupo de controlo. O efeito total de letalidade dominante é igual à soma das perdas antes e depois da implantação. O cálculo do efeito total da letalidade dominante baseia-se na comparação entre o número de implantes vivos por fêmea no grupo tratado e o registado no grupo de controlo. Uma diminuição do número dos implantes em determinados intervalos pode ser devida à destruição das células (isto é, de espermatócitos e/ou espermatogónias).

1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS Nenhum.

1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.6. Preparativos

Quando for possível, as substâncias a testar serão dissolvidas ou colocadas em suspensão numa solução salina isotónica. As substâncias químicas insolúveis na água podem ser dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados. O veículo utilizado não deverá interferir com a substância a testar nem deverá produzir efeitos tóxicos. Serão utilizadas preparações frescas da substância a testar.

Condições experimentais

Via de administração

A substância a testar deverá ser administrada uma única vez. Pode ser utilizado um programa de tratamento repetido em função das informações toxicológicas disponíveis. As vias de administração habituais são a intubação oral ou a injecção interperitoneal. Podem ser adequadas outras vias de administração.

Animais de experiência

Recomenda-se a utilização de ratos ou ratinhos. Repartem-se ao acaso entre os grupos tratados e de controlo animais jovens e sãos tendo atingido a plena maturidade sexual.

Número e sexo

Utiliza-se um número adequado de machos tratados, tendo em conta a frequência espontânea da característica biológica que está a ser avaliada. O número escolhido deverá basear-se numa sensibilidade de detecção e grau de significação preestabelecidos. Por exemplo, num teste típico, o número de machos escolhido para cada grupo de dose deverá ser suficientemente grande para obter 30 a 50 fêmeas grávidas por período de acasalamento.

Utilização de controlos negativos e positivos

Deverão ser incluídos em cada experiência controlos positivos e negativos (veículos), sendo geralmente simultâneos. Se experiências recentes efectuadas no mesmo laboratório tiverem dado resultados aceitáveis com os controlos positivos, estes resultados poderão ser utilizados em vez de um controlo positivo simultâneo. No que respeita às substâncias de controlo positivo deverá utilizar-se uma dose baixa apropriada (por exemplo MMS, intraperitonealmente, 10 mg/kg) para demonstrar a sensibilidade do teste.

Doses

Normalmente usam-se três níveis de dose diferentes. A dose máxima deverá produzir sinais de toxicidade ou reduzir a fecundidade dos animais tratados. Em alguns casos pode ser suficiente uma única dose elevada.

Ensaio-limite

As substâncias não tóxicas são testadas à razão de 5 g/kg no caso de administração única e de 1 g/kg/dia no caso de administração repetida.

Procedimento

Vários esquemas de tratamento são possíveis. O método mais frequente é o da administração única. Podem utilizar-se outros esquemas de tratamento. Cada macho é acasalado sequencialmente com uma ou duas fêmeas virgens não tratadas, a intervalos de tempo apropriados após o tratamento. As fêmeas deverão ser deixadas com os machos durante pelo menos um ciclo completo do estro, ou até que o acasalamento seja comprovado pela presença de esperma na vagina ou pela presença de um rolhão vaginal. O número de acasalamentos após tratamento é determinado pelo esquema de tratamento e deverá assegurar que sejam testados todos os estádios das células germinais tratadas. As fêmeas são sacrificadas durante a segunda metade da gestação e o conteúdo do útero é examinado para determinação do número de implantes vivos e mortos. Os ovários podem ser examinados para determinar o número de corpos amarelos.

2. RESULTADOS Os resultados deverão ser apresentados em quadros, indicando o número de machos, o número de fêmeas grávidas bem como o número de fêmeas não grávidas. Os resultados de cada acasalamento, incluindo a identidade de cada macho e de cada fêmea são apresentados separadamente. Serão descritos para cada fêmea a semana de acasalamento e a dose recebida pelos machos, bem como a frequência dos implantes vivos e mortos. O cálculo do efeito total de letalidade dominante baseia-se numa comparação do número de implantes vivos por fêmea no grupo tratado com o número de implantes vivos por fêmea no grupo de controlo. Compara-se a relação implantes vivos/mortos no grupo tratado com a mesma relação no grupo de controlo para indicação das perdas pós-implantação. Se os resultados forem registados sob a forma de mortalidades precoces e mortalidades tardias, os quadros deverão tornar clara essa diferença. Se for avaliada a perda anterior à implantação, devem apresentar-se os resultados. Esta perda pode ser calculada como a discrepância entre o número de corpos amarelos e o número de implantes ou como a diminuição do número médio de implantes por fêmea em relação ao dos acasalamentos de controlo. Os resultados serão avaliados com métodos estatísticos apropriados.

espécies, estirpe, idade e peso dos animais utilizados, número de animais de cada sexo nos grupos tratados e de controlo,

substância a testar, veículo, doses testadas e justificação da escolha das doses, controlos negativos e positivos, dados relativos à toxicidade,

via de administração e esquema do tratamento,

esquema de acasalamento,

método utilizado para comprovar o acasalamento,

momento do sacrifício,

critérios de contagem dos efeitos de letalidade dominante,

relação dose/resposta, se possível,

avaliação estatística,

discussão dos resultados,

interpretação dos resultados.

Mais 3224 disposições não são mostradas aqui; cada uma tem o seu próprio endereço.

Versões

2008-05-30