Regulamentul (ce) nr. 440/2008 Al comisiei din 30 mai 2008 de stabilire a metodelor de testare în temeiul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH) (Text cu relevanță pentru SEE)

In forceVersion 2008-05-30from 2008-06-01

Grade B

mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.

Ask Gelex about this law

Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/ro

Contents

Preamble
ANNEX
A.1.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.4.
1.5. TABEL: APLICABILITATEA METODELOR A. B. C. D.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
1.6.1.2. Aparatură:
1.6.2.
1.6.4.
A.2.
1.
1.4.
1.5. Tabelul 1 Compararea metodelor
1.6.
1.6.4.
1.6.6.
2. Tabelul 2 Temperatura – factori de corecţie fT
A.3.
1.
1.4.
1.4.1.
3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Aplicabilitatea metodelor
3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2. Aplicabilitatea metodelor
3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Aplicabilitatea metodelor
4.1.2.3.4.5.6.7.
A.4.
1.
1.4.
1.5. Tabel 1.4.1.1.4.2.1.4.31.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Criterii de calitate
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.4.
1.6.4.2.
1.6.5.
1.6.6.
1.6.6.1. Gaz inert:
1.6.6.2. Pregătirea coloanei de saturaţie:
1.6.7.
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.
A.5.
1.
1.6.
1.6.4.
1.6.4.1.
1.6.4.1.3. Figură Corp de măsurare
1.6.4.2.
1.6.4.2.2. Montare:
2. Tabel Corecţia tensiunii superficiale măsurate numai pentru soluţii apoase, ρ = 1 g/cm3
3.
A.6.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Procedură de testare:
1.6.3.3. Aparatură
1.6.3.4.
Aparatură (a se vedea figurile 4 şi 3)
1.6.4.
2.
3.
A.8.
1.
1.3. Metoda agitării flaconului
1.4.
1.5.
1.5.1. Metoda agitării flaconului
1.5.2. Metoda agitării flaconului
1.5.3. Metoda agitării flaconului
1.6.
1.6.2.
1.6.2.1.
1.6.2.3.
1.6.3.
1.6.3.1. Aparatură
1.6.3.2. Calcularea timpului mort t0
2. Metoda agitării flaconului
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.
A.9.
1.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Aparatul Abel:
A.10.
1.
1.6.
1.6.2.
3.
A.11.
1.
1.6.
A.12.
1.
1.3.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
A.13.
1.
1.6.
1.6.2.
2.
A.14.
1.
1.1.
1.4.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.3.
1.6.3.2.
3.
A.15.
1.
1.6.
A.16.
1.
1.6.
1.6.1.
4.
Figura 1 Modelul cubului de testare de 20 mm
Figura 2 Curbă de tipul temperatură/timp
A.17.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
3.
3.2.
A.18.
1.
1.6.
2.
2.2.
A.19.
1.
1.6.
2.
2.2.
A.20.
1.
1.5.
1.5.4.
2.
3.
3.1.
A.21.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.2.
2.
2.1. Tabelul 1 Exemple de rezultate
3.
3.2.
4.
Figura 1 Vas de presiune
Figura 2 Stand de sprijin
Figura 3 Sistemul de aprindere
1.
2.
4.
1.2. Pentru substanţe solide:
Apendicele 1 Metoda estimării
INTRODUCERE
METODA ESTIMĂRII
METODA DE CALCUL
RAPORT
REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
Apendicele 2
Figura 1 Aparatură pentru determinarea curbei presiunii de vapori după metoda dinamică
Figura 2a Aparatură pentru determinarea curbei presiunii de vapori prin metoda statică (prin folosirea unui manometru în U)
Figura 2b Aparat pentru determinarea curbei presiunii de vapori prin metoda statică (folosind un indicator de presiune)
Figura 3 Izoteniscop (a se vedea referinţa 7)
Figura 4 Aparat pentru determinarea curbei presiunii de vapori prin metoda balanţei
Figura 5 Exemplu de aparat pentru determinarea presiunilor de vapori scăzute prin metoda efuziunii cu celulă de efuziune de 8 cm3
Figura 6a Un exemplu de sistem în flux pentru determinarea presiunii de vapori prin metoda saturaţiei gazului
Figura 6b Un exemplu de sistem de determinare a presiunii de vapori prin metoda saturării gazului, cu tub capilar în aval de coloana de saturaţie
Figura 7 Exemplu de configuraţie pentru metoda rotorului
Figura 8 Exemplu de cap de măsurare
Figura 1 Metoda eluţiei pe coloană cu pompă de recirculare
Figura 2 Microcoloană tip
Figura 3 Microcoloană tip
Figura 4 Metoda coloanei de eluţie cu vas de nivel
METODA ESTIMATIVĂ Estimarea preliminară a coeficientului de partiţie
METODE DE CALCUL Principiul metodelor de calcul
Metoda π a lui Hansch
Metoda Rekker
Metoda Leo-Hansch
Metoda combinată
Figură Matriţa şi accesoriile pentru eşantionul în formă de cartuş
Figura Aparat
Exemple de specificaţii ale materialelor pentru testul de sensibilitate termică (a se vedea DIN 1623) 1.2.3.
Figura 1 Aparatul de testare a sensibilităţii termice
Figura 2 Testul de sensibilitate termică
Figura 3 Etalonarea vitezei de încălzire pentru testarea sensibilităţii termice
Figura 4 Aparatul de testare a sensibilităţii mecanice (la şoc)
Figura 5 Aparatul de testare a sensibilităţii mecanice (la frecare)
Figură Matriţa şi accesoriile pentru prepararea cartuşului
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
3.1.2.3.4.5.6.7.8.9.
PARTEA B METODE DE DETERMINARE A TOXICITĂŢII ŞI A ALTOR EFECTE ASUPRA SĂNĂTĂŢII
INTRODUCERE GENERALĂ A.
B.1 bis.
1.
1.4.
1.5.
1.5.3.
1.6.
3.
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.
B.1 tris.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
3.
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.
B.2.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
3.1.
B.3.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. Evaluarea toxicităţii la sexul opus
3.
B.4.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
2.
3.
4.1.2.3.4.5.5a.6.7.8.9.
Tabelul 1 Formarea de eriteme şi escare Formarea de edeme PUNCTAREA REACŢIILOR CUTANATE
B.5.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.2.3.
1.4.2.7.
2.
3.
4.1.2.3.4.5.6.6a.7.8.9.10.
Tabelul 1 Punctarea leziunilor oculare
Cornee
Iris
Conjunctive
Chemosis
B.6.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.2.
1.5.1.3.
1.5.2.
1.5.2.2.
1.5.2.3.
3. Raportul de testare (GMPT sau testul Buehler)
B.7.
1.
1.4.
1.4.2.
1.4.3.
3. Raportul de testare
B.8.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
3.1.
pt_2
B.9.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
B.10.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. RAPORTUL DE TESTARE
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.
B.11.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
2.
3. RAPORTUL DE TESTARE
4.1.2.3.4.5.6.7.8.
B.12.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
1.5.2.
2.
3. RAPORTUL DE TESTARE
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.
B.13/14.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
2.
3. RAPORTUL DE TESTARE
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.
B.15.
1.
1.6. Pregătire
Activare metabolică
Suşe testate
Medii de cultură
Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi
Concentraţia de expunere
Condiţii de incubare
Frecvenţele mutaţiilor spontane
Numărul replicilor
3.
B.16.
1.
1.6. Pregătire
Activare metabolică
Suşe testate
Medii de cultură
Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi
Concentraţii de expunere
Condiţii de incubare
Frecvenţele recombinării mitotice spontane
Numărul replicilor
3.
B.17.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3. RAPORTUL DE TESTARE
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.25.26.
B.18.
1.
1.6. Pregătire
Numărul culturilor
Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi
Concentraţii de expunere
Celule
Activare metabolică
Pregătirea culturilor
Tratarea culturilor cu substanţa de testat Hepatocite primare de şobolan
Determinările autoradiografice
Determinările LSC
2.
3.
B.19.
1.
1.6.
1.6.2. Numărul de culturi
3.
B.20.
1.
1. Pregătire
Tulpini
Substanţa de testat
Numărul de animale
Calea de administrare
Utilizarea martorilor pozitivi şi negativi
Niveluri de expunere
3.
B.21.
1.
1.6. Pregătire
Celule
Mediu
Substanţa de testat
Activarea metabolică
Utilizarea martorilor pozitivi şi negativi
Concentraţii de expunere
3.
B.22.
1.
1.6. Pregătire
Calea de administrare
Animale de experienţă
Numărul şi sexul animalelor
Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi
Doze
Test-limită

COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,

având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene,

având în vedere Regulamentul (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului din 18 decembrie 2006 privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH), de înființare a Agenției Europene pentru Produse Chimice, de modificare a Directivei 1999/45/CE și de abrogare a Regulamentului (CEE) nr. 793/93 al Consiliului și a Regulamentului (CE) nr. 1488/94 al Comisiei, precum și a Directivei 76/769/CEE a Consiliului și a Directivelor 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE și 2000/21/CE ale Comisiei, în special articolul 13 alineatul (3),

întrucât:

(1) În conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 1907/2006, se adoptă metode de testare la nivel comunitar în vederea testării substanțelor, atunci când astfel de teste sunt necesare pentru a obține informații privind proprietățile intrinsece ale substanțelor.

(2) Directiva 67/548/CEE a Consiliului din 27 iunie 1967 privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative referitoare la clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoase a stabilit, în anexa V, metodele de determinare a proprietăților fizico-chimice, a toxicității și a ecotoxicității substanțelor și preparatelor. Anexa V la Directiva 67/548/CEE a fost eliminată prin Directiva 2006/121/CE a Parlamentului European și a Consiliului cu începere de la 1 iunie 2008.

(3) Metodele de testare prezentate în anexa V la Directiva 67/548/CEE trebuie incluse în prezentul regulament.

(4) Prezentul regulament nu exclude utilizarea altor metode de testare, cu condiția ca aceasta să fie conformă cu articolul 13 alineatul (3) din Regulamentul 1907/2006.

(5) La elaborarea metodelor de testare trebuie luate în considerare pe deplin principiile de înlocuire, de reducere și de perfecționare a utilizării animalelor în cadrul procedurilor, în special atunci când sunt disponibile metode corespunzătoare și validate de înlocuire, reducere sau perfecționare a testării pe animale.

(6) Dispozițiile prezentului regulament sunt conforme cu avizul comitetului instituit în temeiul articolului 133 din Regulamentul (CE) nr. 1907/2006,

ADOPTĂ PREZENTUL REGULAMENT:

Articolul 1 Metodele de testare care urmează să fie aplicate în sensul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 sunt prezentate în anexa la prezentul regulament.

Articolul 2 Comisia revizuiește, atunci când este cazul, metodele de testare incluse în prezentul regulament în vederea înlocuirii, reducerii sau perfecționării testelor efectuate pe animale vertebrate.

Articolul 3 Toate trimiterile la anexa V la Directiva 67/548/CEE se interpretează ca trimiteri la prezentul regulament.

Articolul 4 Prezentul regulament intră în vigoare în ziua următoare publicării în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene.

Se aplică de la 1 iunie 2008. Prezentul regulament este obligatoriu în toate elementele sale și se aplică direct în toate statele membre. Adoptat la Bruxelles, 30 mai 2008. Pentru Comisie Stavros Dimas Membru al Comisiei

ANNEX

ANEXĂ PARTEA A: METODE PENTRU DETERMINAREA PROPRIETĂŢILOR FIZICO-CHIMICE

A.1. PUNCTUL DE TOPIRE/CONGELARE

A.1.

1. METODĂ Majoritatea metodelor descrise se bazează pe orientările OCDE privind testele (1). Principiile fundamentale sunt descrise în referinţele bibliografice 2 şi 3.

1.

1.1. INTRODUCERE Metodele şi dispozitivele descrise se aplică pentru determinarea punctului de topire a substanţelor, oricare ar fi gradul de puritate a acestora. Alegerea metodei depinde de natura substanţei de testat. În consecinţă, factorul limitativ depinde direct de calitatea substanţei de a fi uşor pulverizabilă, greu pulverizabilă sau nepulverizabilă. Pentru anumite substanţe este preferabil să se determine punctul de congelare sau de solidificare. Acesta este motivul pentru care normele acestor determinări figurează şi în prezenta metodă. Atunci când, datorită proprietăţilor specifice ale substanţei, niciun parametru nu poate fi măsurat într-un mod satisfăcător, se poate determina punctul de curgere.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Punctul de topire se defineşte ca temperatura la care are loc tranziţia de fază din stare solidă în stare lichidă, la presiunea atmosferică, temperatură care în mod ideal corespunde temperaturii de congelare. Deoarece în cazul multor substanţe tranziţia de fază are loc într-un anumit interval de temperatură, aceasta este deseori descrisă ca interval de topire. Transformarea unităţilor de măsură (K în oC) t = T – 273,15 t = temperatura Celsius, exprimată în grade Celsius ( oC) T = temperatura termodinamică, exprimată în grade Kelvin (K)

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă de fiecare dată când se studiază o substanţă nouă. Acestea trebuie să servească în special la verificarea periodică a acurateţei metodei şi să permită comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode. Câteva substanţe-mamă sunt enumerate în referinţele bibliografice (4).

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Se determină temperatura (intervalul de temperatură) la care are loc tranziţia de fază din starea solidă în starea lichidă. În practică, se determină temperaturile fazei iniţiale de topire/congelare şi finale de topire/congelare în timpul încălzirii/răcirii unei mostre de substanţă la presiunea atmosferică Sunt descrise cinci tipuri de metode, şi anume: metoda capilară, metoda blocului fierbinte, determinarea punctului de congelare, metoda analizei termice şi determinarea punctului de curgere (pentru uleiurile din petrol). În anumite cazuri, poate fi mai uşor să se măsoare punctul de congelare în locul punctului de topire.

1.4.

1.4.1. Metoda tubului capilar

1.4.1.

1.4.1.1. Dispozitiv cu baie de lichid Se introduce o cantitate mică de substanţă pulverizată fin într-un tub capilar şi se tasează cu atenţie. Se încălzeşte tubul în acelaşi timp cu un termometru şi pe parcursul operaţiei se reglează creşterea temperaturii cu puţin sub 1 K pe minut. Se înregistrează temperaturile la început şi la sfârşit de topire.

1.4.1.2. Dispozitiv prevăzut cu bloc metalic fierbinte Metoda este aceeaşi cu cea descrisă la punctul 1.4.1.1, cu diferenţa că tubul capilar şi termometrul sunt plasate într-un bloc de metal încălzit şi observate prin orificii practicate în acest bloc.

1.4.1.3. Detecţie fotoelectrică Eşantionul conţinut în tubul capilar se încălzeşte automat într-un cilindru metalic. Printr-un orificiu practicat în acest cilindru se trimite un fascicul de lumină prin substanţa de testat către o celulă fotoelectrică etalonată cu precizie. În momentul topirii, proprietăţile optice ale majorităţii substanţelor se modifică, în sensul că din opace devin transparente. Astfel, intensitatea luminii care atinge celula fotoelectrică creşte şi trimite un semnal de oprire indicatorului digital care înregistrează temperatura termometrului cu rezistenţă de platină plasat în incinta de încălzire. Această metodă nu se poate aplica anumitor substanţe puternic colorate.

1.4.2. Metode cu suprafaţă încălzită

1.4.2.

1.4.2.1. Metoda bancului de încălzire Kofler Bancul de încălzire Kofler este compus din două piese cu conductivitate termică diferită care se încălzesc electric. Bancul este construit astfel încât gradientul de temperatură să fie aproape linear pe toată lungimea. Temperatura acestui banc de încălzire poate fi determinată de la 283 la 573 K datorită unui dispozitiv de citire a temperaturii format dintr-un cursor cu ac indicator şi o riglă gradată concepute special pentru bancul în cauză. Pentru a determina un punct de topire, este suficientă depunerea unui strat fin de substanţă direct pe suprafaţa bancului. În câtva secunde se formează o linie fină de diviziune între faza fluidă şi faza solidă. Temperatura la linia de diviziune se citeşte plasând acul indicator în dreptul acesteia.

1.4.2.2. Microscop pentru determinarea punctului de topire Pentru determinarea punctelor de topire cu cantităţi foarte mici de substanţă se folosesc câteva tipuri de microscoape optice cu încălzire. Temperatura se măsoară în general cu ajutorul unui termocuplu sensibil, dar şi cu ajutorul unui termometru cu mercur. Dispozitivul tip pentru determinarea punctului de topire prin microscopie optică la cald este format dintr-o incintă cu încălzire, care conţine o placă de metal deasupra căreia se pune eşantionul, deja aşezat pe o lamă transparentă. În centrul plăcii metalice există un orificiu care permite trecerea luminii provenite din oglinda de iluminare a microscopului. În timpul utilizării, incinta se închide cu ajutorul unei plăci de sticlă pentru a împiedica circulaţia aerului în câmpul de lucru. Încălzirea eşantionului se reglează cu ajutorul unui reostat. Pentru măsurători foarte precise la substanţele anizotrope optic se poate folosi lumina polarizată.

1.4.2.3. Metoda meniscului Această metodă se aplică în special poliamidelor. Se determină temperatura la care se observă cu ochiul liber deplasarea unui menisc de ulei de silicon, prins între o suprafaţă caldă şi o lamelă plasată peste eşantionul de poliamidă de testat.

1.4.3. Metoda de determinare a punctului de congelare Se introduce eşantionul într-o eprubetă specială şi se aşează într-un aparat care permite determinarea punctului de congelare. Se agită uşor eprubeta pe parcursul răcirii, iar temperatura este măsurată la intervale adecvate. Din momentul în care temperatura rămâne constantă la câteva citiri, valoarea acesteia este considerată punct de congelare (după corecţia termometrică). Trebuie evitată răcirea forţată prin menţinerea echilibrului între faza solidă şi cea lichidă.

1.4.4. Analiza termică

1.4.4.

1.4.4.1. Analiza termică diferenţială (DTA) Această tehnică înregistrează diferenţa de temperatură dintre eşantion şi un material de referinţă, în funcţie de temperatură, atunci când substanţa şi materialul de referinţă sunt supuse aceluiaşi regim termic controlat. Atunci când eşantionul suferă o transformare ce presupune o modificare de entalpie, acea modificare este indicată prin îndepărtarea endotermă (topire) sau exotermă (congelare) de linia de referinţă a temperaturii.

1.4.4.2. Calorimetrie diferenţială (DSC) Această tehnică înregistrează diferenţa dintre cantităţile de energie absorbite de eşantion şi un material de referinţă în funcţie de timp, atunci când eşantionul şi materialul de referinţă sunt supuse aceluiaşi regim de temperatură controlată. Această energie reprezintă energia necesară pentru ca diferenţa de temperatură dintre substanţă şi materialul de referinţă să devină nulă. Atunci când eşantionul suferă o transformare care implică o modificare de entalpie, acea modificare este indicată prin îndepărtarea endotermă (topire) sau exotermă (congelare) de la linia de referinţă a fluxului termic.

1.4.5. Punctul de curgere Această metodă a fost elaborată pentru a fi folosită în cazul uleiurilor din petrol şi se utilizează în cazul substanţelor uleioase cu temperaturi de topire scăzute. După o încălzire preliminară, eşantionul se răceşte cu o viteză specifică şi se examinează din punctul de vedere al caracteristicilor de curgere la intervale de 3 K. Cea mai scăzută temperatură la care se mai observă o deplasare a substanţei se înregistrează ca punct de curgere.

1.5. CRITERII DE CALITATE Aplicabilitatea şi acurateţea diferitelor metode folosite pentru determinarea punctului de topire/intervalului de topire sunt prezentate în următorul tabel:

1.5. TABEL: APLICABILITATEA METODELOR A. B. C. D.

Metode capilare Metodă de măsurare Substanţe uşor pulverizabile Substanţe greu pulverizabile Interval de temperatură Acurateţea estimării Standarde existente Dispozitiv prevăzut cu baie de lichid Da Numai câteva 273 la 573 K ±0,3 K JIS K 0064 Dispozitiv prevăzut cu bloc metalic Da Numai câteva 293 la > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Detecţie fotoelectrică Da Mai multe cu dispozitive de aplicare 253 la 573 K ±0,5 K Metoda cu suprafaţă încălzită şi metoda punctului de congelare Metodă de măsurare Substanţe uşor pulverizabile Substanţe greu pulverizabile Interval de temperatură Acurateţea estimării Standarde existente Banc de încălzire Kofler Da N u 283 la > 573 K ± 1 K ANSI/ASTM D 3451-76 Microscop pentru determinarea punctului de topire Da Numai la câteva 273 la > 573 K ±0,5 K DIN 53736 Metoda meniscului Nu Special pentru poliamide 293 la > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Metode de determinare a punctului de congelare Da Da 223 la 573 K ±0,5 K ex. BS 4695 Metode de analiză termică Metodă de măsurare Substanţe uşor pulverizabile Substanţe greu pulverizabile Interval de temperatură Acurateţea estimării Standarde existente Analiza termică diferenţială Da Da 173 la 1273 K până la 600 K ±0,5 K până la 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Calorimetrie diferenţială Da Da 173 la 1273 K până la 600 K ±0,5 K până la 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Punct de curgere Metodă de măsurare Substanţe uşor pulverizabile Substanţe greu pulverizabile Interval de temperatură Acurateţea estimării Standarde existente Punct de curgere Pentru uleiuri petroliere şi substanţe uleioase Pentru uleiuri petroliere şi substanţe uleioase 223 la 323 K ±0,3 K ASTM D 97-66

1.6. DESCRIEREA METODELOR Modurile de operare corespunzătoare aproape tuturor metodelor de testare au fost descrise în standardele internaţionale şi naţionale (a se vedea apendicele).

1.6.

1.6.1. Metode cu tub capilar Atunci când sunt supuse unei creşteri de temperatură, substanţele fin pulverizate prezintă de regulă stadiile de topire prezentate în figura 1.

1.6.1.

Figura 1 Stadiul A Stadiul B Stadiul C Stadiul D Stadiul E Stadiul A (începutul topirii): punct umed: se formează picături fine pe peretele interior al tubului capilar. Stadiul B apare un spaţiu liber între eşantion şi peretele interior al tubului datorită retracţiei produsului în faza de topire. Stadiul C eşantionul retractat începe să se scufunde şi să se lichefieze. Stadiul D se formează un menisc complet la suprafaţă dar o cantitate considerabilă din eşantion rămâne în fază solidă. Stadiul E (stadiul final al topirii): nu mai există particule solide. În timpul determinării punctului de topire se înregistrează temperaturile corespunzătoare primului şi ultimului stadiu al procesului.

1.6.1.1. Instalaţie pentru determinarea punctului de topire cu baie de lichid Figura 2 descrie un tip de aparat standardizat, confecţionat din sticlă (JIS K 0064). Toate specificaţiile sunt exprimate în milimetri.

1.6.1.1.

Figura 2 A: Balon de măsură B: Dop de plută C: Tub de aerare D: Termometru E: Termometru auxiliar F: Baie de lichid G: Tub capilar confecţionat din sticlă, lungime 80-100 mm, diametru interior 1,0 ± 0,2 mm, grosimea peretelui 0,2-0,3 mm H: Tub lateral

Baia de lichid:

Lichidul care se foloseşte se alege în funcţie de punctul de topire care urmează să fie determinat, de exemplu parafină lichidă pentru punctele de topire care nu depăşesc 473 K, ulei de silicon pentru punctele de topire care nu depăşesc 573 K. Se poate folosi un amestec din trei părţi de acid sulfuric şi două părţi de sulfat de potasiu (în proporţie masică) pentru punctele de topire care depăşesc 523 K. În cazul utilizării unui astfel de amestec, se vor lua măsurile de precauţie corespunzătoare.

Termometrul:

Pot fi folosite numai acele termometre care îndeplinesc cerinţele următoarelor standarde sau ale standardelor echivalente: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Mod de operare:

Substanţa uscată se pulverizează fin într-un mojar şi se introduce într-un tub capilar, închis la un capăt, astfel încât înălţimea de umplere să fie de aproximativ 3 mm după ce substanţa a fost compactată. Pentru a obţine un eşantion uniform compactat, tubul capilar trebuie să fie lăsat să cadă de la o înălţime de aproximativ 700 mm, printr-un tub de sticlă vertical pe o sticlă de ceas. Tubul capilar plin este plasat în baie astfel încât partea centrală a rezervorului de mercur al termometrului să fie în contact cu partea tubului capilar care este amplasat eşantionul. De obicei, tubul capilar se introduce în baie la aproximativ 10 K sub punctul de topire. Lichidul băii se încălzeşte astfel încât creşterea temperaturii să fie de 3 K/min. Lichidul trebuie agitat. La aproximativ 10 K sub temperatura presupusă de topire, viteza de creştere a temperaturii se stabileşte la maximum 1 K pe minut.

Calcul:

Calculul punctului de topire este redat mai jos: T = TD + 0,00016 (TD – TE) × n unde: T temperatura de topire corectată, exprimată în K TD temperatura citită la termometrul D, exprimată în K TE temperatura citită la termometrul E, exprimată în K n numărul de gradaţii ale coloanei de mercur citite pe tija termometrului D, aflate deasupra lichidului.

1.6.1.2. Dispozitive cu bloc metalic pentru măsurarea punctului de topire

1.6.1.2. Aparatură:

Aparatul cuprinde:

un bloc metalic cilindric, a cărui parte superioară este scobită şi formează o incintă de încălzire (a se vedea figura 3);

un dop metalic prevăzut cu două sau mai multe orificii care permit introducerea tuburilor în bloc;

un sistem de încălzire a blocului metalic care poate fi format dintr-o rezistenţă electrică în bloc;

un reostat pentru reglarea puterii, în cazul unei încălziri electrice;

patru ferestre din sticlă termorezistentă, pe pereţii laterali ai incintei, dispuse simetric în unghi drept. În faţa uneia din ferestre se montează un ocular pentru observarea tubului capilar. Celelalte trei ferestre permit iluminarea interiorului incintei cu ajutorul unor lămpi;

un tub capilar din sticlă termorezistentă închis la un capăt (a se vedea punctul 1.6.1.1).

A se vedea standardele menţionate la punctul 1.6.1.1. Se pot folosi, de asemenea, elemente termoelectrice de precizie echivalentă.

Figura 3 Termometru Tub capilar Dop metalic Ocular Lampă Rezistenţă electrică Bloc metalic fierbinte

1.6.1.3. Detecţie fotoelectrică Aparatură şi mod de operare: Aparatul este format dintr-o incintă metalică prevăzută cu un sistem de încălzire automatizat. Se umplu trei tuburi capilare după cum s-a indicat la punctul 1.6.1.1 şi se pun în cuptor. Pentru calibrarea aparatului se folosesc mai multe creşteri liniare de temperatură, iar creşterea de temperatură convenabilă este reglată electric la o viteză constantă şi liniară, preselectată. Înregistratoarele indică temperatura reală a cuptorului şi temperatura substanţei în tuburile capilare.

1.6.2. Metodele suprafeţei încălzite

1.6.2.

1.6.2.1. Bancul de încălzire Kofler A se vedea apendicele.

1.6.2.2. Microscopul pentru determinarea punctului de topire A se vedea apendicele.

1.6.2.3. Metoda meniscului (poliamide) A se vedea apendicele. În jurul punctului de topire, creşterea temperaturii trebuie să fie mai mică de 1 K pe minut.

1.6.3. Metode pentru determinarea punctului de congelare A se vedea apendicele.

1.6.4. Analiza termică

1.6.4.

1.6.4.1. Analiza termică diferenţială A se vedea apendicele.

1.6.4.2. Calorimetria diferenţială A se vedea apendicele.

1.6.5. Determinarea punctului de curgere A se vedea apendicele.

2. DATE În unele cazuri se impune corecţia termometrică.

3. RAPORT Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, informaţiile următoare: Punctul de topire indicat în raport este media a cel puţin două măsurători care se găsesc în intervalul de precizie estimat (a se vedea tabelele). Dacă diferenţa dintre temperatura din stadiul iniţial şi cea din stadiul final al topirii se află în limitele de precizie a metodei, temperatura de topire în stadiul final este considerată ca punct de topire; în caz contrar, se indică în raport cele două temperaturi. Dacă substanţa se descompune sau sublimează înainte de a atinge punctul de topire, se indică în raport temperatura la care s-a observat efectul. Trebuie prezentate toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special cele cu privire la impurităţile şi starea fizică a substanţei.

metoda folosită;

specificaţiile precise ale substanţei (identitate şi impurităţi) şi etapa de purificare preliminară, dacă există;

estimare acurateţei metodei.

4.1.2.3.4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE OECD, Paris, 1981, Test Guideline. 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II, p. 803-834. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Interscience Publ, New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 505-515.

A.2. PUNCTUL DE FIERBERE

A.2.

1. METODĂ Majoritatea metodelor descrise se bazează pe orientările OCDE privind testele (1). Principiile fundamentale sunt prezentate în referinţele bibliografice 2 şi 3.

1.

1.1. INTRODUCERE Metodele şi aparatele descrise în continuare pot fi aplicate substanţelor lichide şi celor cu punct de topire scăzut, care nu intră în reacţie chimică sub punctul de fierbere (de exemplu, auto-oxidare, izomerizări, degradare etc.). Metodele se aplică substanţelor lichide pure şi impure. Se acordă atenţie descrierii metodelor care folosesc detecţia fotoelectrică şi analiza termică deoarece acestea permit determinarea nu numai a punctului de fierbere, ci şi a punctului de topire. În plus, măsurările se pot efectua în mod automat. Metoda dinamică are avantajul că poate fi folosită şi pentru determinarea presiunii vaporilor, iar aducerea temperaturii de fierbere la condiţii normale de presiune (101,325 kPa) nu este necesară, deoarece se poate menţine presiunea normală pe parcursul măsurării, folosind un manometru de contact. Observaţii: Influenţa impurităţilor asupra determinării punctului de fierbere depinde în mare măsură de natura impurităţilor. Atunci când există în eşantion impurităţi volatile care ar putea afecta rezultatele, substanţa se purifică.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Punctul de fierbere normal se defineşte ca temperatura la care presiunea de vapori a lichidului este 101,325 kPa. Dacă punctul de fierbere nu se măsoară la presiune atmosferică normală, relaţia între temperatură şi presiunea de vapori este dată de ecuaţia Clausius-Clapeyron: log p = ΔHv2,3RT+const. unde: P presiunea de vapori a substanţei, exprimată în pascali ΔHv căldura sa de vaporizare, exprimată în J mol–1 R constanta universală a gazelor = 8,314 J mol–1 K–1 T temperatura termodinamică, exprimată în K Indicarea punctului de fierbere este însoţită de precizarea presiunii ambiante în timpul măsurătorii. Formule de conversie Presiunea (unităţi: kPa) 100 kPa 1 bar = 0,1 MPa (folosirea barului este încă permisă, dar nu este recomandată) 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (unităţile mm Hg şi Torr nu sunt permise). 1 atm atmosferă standard = 101325 Pa (unitatea atm nu este permisă). Temperatura (unităţi: K) t = T – 273,15 t temperatura Celsius, exprimată în grade Celsius ( oC) T temperatura termodinamică, exprimată în grade Kelvin (K)

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă în toate cazurile în care se studiază o nouă substanţă. Acestea trebuie în special să servească la etalonarea periodică a metodei şi la comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode. Anumite substanţe de etalonare sunt menţionate în metodele enumerate în apendice.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Cinci metode pentru determinarea punctului de fierbere (a intervalului de fierbere) se bazează pe măsurătoarea temperaturii de fierbere, alte două se bazează pe analiza termică.

1.4.

1.4.1. Determinarea prin folosirea ebuliometrului Ebuliometrele au fost create iniţial pentru determinarea masei moleculare prin creşterea punctului de fierbere, dar sunt adecvate şi pentru măsurarea exactă a punctului de fierbere. Un aparat foarte simplu este descris în standardul ASTM D 1120-72 (a se vedea apendicele). Lichidul se încălzeşte în acest aparat în condiţii de echilibru la presiune atmosferică, până la fierbere.

1.4.2. Metoda dinamică Această metodă prevede măsurarea temperaturii de recondensare a vaporilor cu ajutorul unui termocuplu montat în reflux în timpul fierberii. În această metodă se poate modifica presiunea.

1.4.3. Metoda distilării pentru punctul de fierbere Această metodă prevede distilarea lichidului, măsurarea temperaturii de recondensare a vaporilor şi determinarea cantităţii de distilat.

1.4.4. Metoda Siwoloboff Se încălzeşte un eşantion într-o eprubetă care este imersată într-o baie cu lichid încălzit. Se scufundă în eprubetă un capilar închis, care conţine o bulă de aer în partea inferioară.

1.4.5. Detecţia fotoelectrică Conform principiului Siwoloboff, măsurarea fotoelectrică automată se face folosind ascensiunea bulelor.

1.4.6. Analiza termică diferenţială Această tehnică înregistrează diferenţa de temperatură dintre substanţă şi un material de referinţă în funcţie de temperatură în timp ce substanţa şi materialul de referinţă sunt supuse aceluiaşi regim termic controlat. Atunci când eşantionul trece printr-o stare de tranziţie ce presupune o variaţie de entalpie, această modificare este indicată prin endotermică (fierbere) de la linia de referinţă a temperaturii.

1.4.7. Calorimetria diferenţială Această tehnică înregistrează diferenţa dintre cantităţile de energie absorbite de o substanţă şi un material de referinţă în funcţie de timp, atunci când eşantionul şi materialul de referinţă sunt supuse aceluiaşi regim de temperatură controlată. Această energie reprezintă energia necesară pentru ca diferenţa de temperatură dintre substanţă şi materialul de referinţă să devină nulă. Atunci când eşantionul suferă o transformare care implică o modificare de entalpie, acea modificare este indicată prin îndepărtarea endotermă (fierbere) de la linia de referinţă a fluxului termic.

1.5. Tabelul 1 Compararea metodelor

CRITERII DE CALITATE Aplicabilitatea şi precizia diferitelor metode folosite la determinarea temperaturii/intervalului de fierbere sunt prezentate în tabelul 1. Metodă de măsurare Precizie estimată Standard existent Ebuliometru ±1,4 K (până la 373 K) ±2,5 K (până la 600 K) ASTM D 1120-72 Metoda dinamică ±0,5 K (până la 600 K) Metoda distilării (domeniu de fierbere) ±0,5 K (până la 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Conform cu Siwoloboff ± 2 K (până la 600 K) Detecţie fotoelectrică ±0,3 K (până la 373 K) Calorimetrie termică diferenţială ±0,5 K (până la 600 K) ±2,0 K (până la 1273 K) ASTM E 537-76 Calorimetrie diferenţială ±0,5 K (până la 600 K) ±2,0 K (până la 1273 K) ASTM E 537-76

1.6. DESCRIEREA METODELOR Modurile de operare în unele metode de testare sunt descrise în standardele naţionale şi internaţionale (a se vedea apendicele).

1.6.

1.6.1. Ebuliometru A se vedea apendicele.

1.6.2. Metoda dinamică A se vedea metoda de analiză A.4 pentru determinarea presiunii de vapori. Se înregistrează temperatura de fierbere observată la o presiune aplicată de 101,325 kPa.

1.6.3. Metoda distilării (intervalul de fierbere) A se vedea apendicele.

1.6.4. Metoda Siwoloboff Se introduce eşantionul într-o eprubetă cu un diametru de cca. 5 milimetri şi se încălzeşte într-un aparat care serveşte la determinarea punctului de topire (figura 1). Figura 1 prezintă schema unui aparat standardizat de măsurare a punctului de topire şi fierbere (JIS K 0064) (confecţionat din sticlă, toate specificaţiile sunt în milimetri). Se scufundă un tub capilar (capilar de fierbere), închis la cca. 1 centimetru deasupra extremităţii inferioare, în eprubeta cu substanţa de testat. Nivelul până la care se adaugă substanţă de testat este astfel încât partea etanşată a capilarului să fie sub nivelul suprafeţei lichidului. Eprubeta se ataşează la termometru cu o bandă de cauciuc sau se fixează cu un suport de partea laterală (a se vedea figura 2). Figura 2 Metoda Siwoloboff Figura 3 Metoda modificată Lichidul din baie se alege în funcţie de punctul de fierbere. La temperaturi de până la 573 K se foloseşte uleiul de silicon. Parafina lichidă se poate folosi numai până la 473 K. Încălzirea băii de lichid se reglează pentru început la o creştere de temperatură de 3 K/min. Lichidul din baie trebuie agitat. La aproximativ 10 K sub punctul de fierbere presupus, încălzirea se reduce astfel încât viteza de creştere a temperaturii să fie mai mică de 1 K/min. Atunci când se apropie de punctul de fierbere, bulele încep să se ridice rapid din capilar. Punctul de fierbere este acea temperatură la care, în cazul unei răciri momentane, şiragul de bule se întrerupe, iar fluidul începe brusc să se ridice în capilar. Temperatura citită în acel moment pe termometru indică punctul de fierbere a substanţei. În metoda modificată (a se vedea figura 3), punctul de fierbere se determină într-un tub capilar de măsurat la punctul de topire. Extremitatea inferioară a acestuia se prelungeşte cu un vârf cu o lungime de aproximativ 2 cm (a) în interiorul căruia se aspiră o cantitate mică de substanţă de testat. Se etanşează vârful prin încălzire, captându-se o bulă mică de aer în interior. În timpul încălzirii, în aparatul de măsurat punctul de topire (b), bula de aer se dilată. Punctul de fierbere corespunde temperaturii la care eşantionul de substanţă atinge nivelul suprafeţei lichidului din baie (c).

1.6.4.

Figura 1 A: Balon de măsură B: Dop de plută C: Tub de aerare D: Termometru E: Termometru auxiliar F: Baie de lichid G: Tub capilar confecţionat din sticlă, lungime aprox. 100 mm, diametru interior 1 mm, grosimea peretelui 0,2-0,3 mm H: Tub lateral

1.6.5. Detecţia fotoelectrică Se încălzeşte un eşantion din substanţa de testat într-un tub capilar aşezat în interiorul unui bloc metalic de încălzire. Prin orificiile practicate în bloc, un fascicol de lumină este trimis prin substanţă către o celulă fotoelectrică calibrată cu precizie. În timp ce creşte temperatura eşantionului, bule de aer individuale încep să se ridice din tubul capilar. Când punctul de fierbere este atins, numărul de bule creşte substanţial. Modificarea intensităţii luminoase care urmează este înregistrată de către celulă, care trimite un semnal de oprire indicatorului de temperatură, respectiv un termometru cu rezistenţă de platină plasat în interiorul blocului. Această metodă este deosebit de utilă deoarece permite efectuarea unor determinări sub nivelul temperaturii ambiante până la 253,15 K (– 20 oC), fără nicio modificare a aparatului. Este necesar doar ca aparatul să fie aşezat într-o baie de răcire.

1.6.6. Analize termice

1.6.6.

1.6.6.1. Analiza termică diferenţială A se vedea apendicele.

1.6.6.2. Calorimetria diferenţială A se vedea apendicele.

2. Tabelul 2 Temperatura – factori de corecţie fT

DATE Pentru diferenţe mici faţă de presiunea normală (maximum ± 5 kPa) punctul de fierbere se poate corecta (Tn) cu ajutorul ecuaţiei Sidney-Young: Tn = T + (fT × Δp) unde: Δp (101,325 – p) (atenţie la semn) p presiunea măsurată, în kPa fT viteza de variaţie a punctului de fierbere cu presiunea, în K/kPa T temperatura de fierbere măsurată, în K Tn temperatura de fierbere corectată la presiunea normală, în K Pentru numeroase substanţe, factorii de corecţie a temperaturii fT şi ecuaţiile pentru aproximarea acestora figurează în standardele naţionale şi internaţionale mai sus menţionate. De exemplu, metoda DIN 53171 menţionează următoarele corecţii aproximative pentru solvenţi conţinuţi în vopsele. Temperatura T (K) Factori de corecţie fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47

3. RAPORT Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, informaţiile următoare: Punctul de fierbere indicat în raport este media a cel puţin două măsurători care se găsesc în intervalul de precizie estimat (a se vedea tabelul 1). Se prezintă punctele de fierbere măsurate şi media lor, iar presiunea (presiunile) la care s-au făcut măsurătorile se exprimă în kPa. Este preferabil ca presiunea să fie apropiată de presiunea atmosferică normală. Trebuie prezentate toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special cele cu privire la impurităţi şi la starea fizică a substanţei.

metoda folosită;

specificaţiile precise ale substanţei (identitate şi impurităţi) şi etapa de purificare preliminară, dacă există;

estimarea acurateţei metodei.

4.1.2.3. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.

A.3. DENSITATEA RELATIVĂ

A.3.

1. METODĂ Majoritatea metodelor descrise se bazează pe orientările OCDE privind testele (1). Principiile fundamentale sunt menţionate în referinţa bibliografică 2.

1.

1.1. INTRODUCERE Metodele descrise pentru determinarea densităţii relative sunt aplicabile substanţelor solide şi lichide, fără nicio restricţie cu privire la gradul de puritate. Diferitele metode care pot fi folosite sunt prezentate în tabelul 1.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Densitatea relativă D204 a solidelor sau lichidelor reprezintă raportul dintre masa unui volum de substanţă, determinată la 20 oC, şi masa aceluiaşi volum de apă, determinată la 4 oC. Densitatea relativă este un număr adimensional. Densitatea ρ a unei substanţe este raportul dintre masa acesteia m şi volumul său v. Densitatea ρ este exprimată în unităţi SI în kg/m3.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ (1) (3) Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă de fiecare dată când se studiază o substanţă nouă. Acestea trebuie să servească în special la verificarea periodică a acurateţei metodei şi să permită comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode.

1.4. PRINCIPIUL METODELOR Se folosesc 4 clase de metode.

1.4.

1.4.1. Metode prin flotabilitate

1.4.1.

1.4.1.1. Hidrometrul (pentru substanţe lichide) Se pot obţine determinări ale densităţii suficient de precise şi de rapide cu ajutorul unor hidrometre plutitoare care permit deducerea densităţii unui lichid din adâncimea de imersiune indicată pe o scară gradată.

1.4.1.2. Balanţa hidrostatică (pentru substanţe lichide şi solide) Diferenţa dintre masa unui eşantion măsurate în aer şi într-un lichid corespunzător (de exemplu apa) poate fi folosită pentru a determina densitatea acestuia. În cazul solidelor, densitatea măsurată nu este reprezentativă decât în cazul acelui eşantion. Pentru a determina densitatea unui lichid se cântăreşte un corp cu volum V cunoscut, întâi în aer, apoi în lichid.

1.4.1.3. Metoda corpului scufundat (pentru substanţe lichide) (4) În această metodă, densitatea unui lichid este determinată ca diferenţa dintre rezultatele cântăririlor lichidului înainte şi după imersia unui corp de volum cunoscut în acest lichid.

1.4.2. Metode picnometrice În cazul solidelor sau al lichidelor se pot folosi picnometre cu forme diferite, ale căror volume sunt cunoscute. Densitatea se determină pornind de la diferenţa de greutate între picnometrul plin şi picnometrul gol, pe de o parte, şi volumul cunoscut al acestuia, pe de altă parte.

1.4.3. Picnometru de comparaţie cu aer (pentru solide) Densitatea unui solid cu orice formă poate fi măsurată, la temperatura camerei cu ajutorul unui picnometru de comparaţie cu gaz. Volumul unei substanţe în aer sau în gaz inert se măsoară într-un cilindru gradat, cu volum variabil calibrat. Pentru determinarea densităţii, după măsurarea volumului se măsoară şi masa solidului.

1.4.4. Densimetru oscilant (5) (6) (7) Densitatea unui lichid se poate măsura cu densimetrul oscilant. Un oscilator mecanic în formă de U vibrează cu o frecvenţă de rezonanţă care depinde de masa sa. Introducerea unui eşantion de substanţă modifică frecvenţa de rezonanţă a oscilatorului. Acesta trebuie etalonat cu ajutorul a două substanţe ale căror densităţi se cunosc. Substanţele se aleg astfel încât densităţile acestora să acopere intervalul de măsură.

1.5. CRITERII DE CALITATE Aplicabilitatea diferitelor metode folosite pentru determinarea densităţii relative este prezentată în tabel.

1.6. DESCRIEREA METODELOR Standardele menţionate ca exemple, care se pot consulta pentru mai multe detalii tehnice, sunt enumerate în apendice. Testele se efectuează la o temperatură de 20 oC şi trebuie să cuprindă cel puţin două măsurători.

2. DATE A se vedea standardele.

3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Aplicabilitatea metodelor

RAPORT Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, informaţiile următoare: Densitatea relativă D204 se indică în conformitate cu definiţia de la punctul 1.2, împreună cu starea fizică a substanţei. Trebuie prezentate toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special cele cu privire la impurităţile şi starea fizică a substanţei. Metoda de măsurare Densitate Vâscozitatea dinamică maximă posibilă Standarde existente Solid Lichid Hidrometru Da 5 Pa s ISO 387 ISO 649-2 NF T 20-050 Balanţa hidrostatică Da ISO 1183(A) Da 5 Pa s ISO 901 şi 758 Metoda plutitorului Da 20 Pa s DIN 53217 Picnometru ISO 3507 Da ISO 1183(B) NFT 20-053 Da 500 Pa s ISO 758 Picnometru de comparaţie cu aer Da DIN 55990 Teil 3 DIN 53243 Densimetru oscilant Da 5 Pa s

metoda folosită;

specificaţiile precise ale substanţei (identitate şi impurităţi) şi etapa de purificare preliminară, dacă există.

3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2. Aplicabilitatea metodelor

(a) solide

(b) lichide

3. Tabel 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Aplicabilitatea metodelor

(a) solide

(b) lichide

4.1.2.3.4.5.6.7.

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. II, p. 427-430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, p. 297-302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, p. 717-726. Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, p. 253-255.

A.4. PRESIUNEA DE VAPORI

A.4.

1. METODĂ Majoritatea metodelor descrise se bazează pe orientările OCDE privind testele (1). Principiile fundamentale sunt menţionate în referinţele bibliografice 2 şi 3.

1.

1.1. INTRODUCERE Este util să existe informaţii preliminare privind structura, punctul de topire şi punctul de fierbere ale substanţei pentru care se efectuează determinarea. Nu există o metodă de măsurare aplicabilă întregului interval de presiuni de vapori. În consecinţă, se recomandă folosirea mai multor metode pentru măsurarea presiunii de vapori de la < 10–4 la 105 Pa. În general, impurităţile afectează presiunea de vapori, într-o măsură care depinde în mare parte de natura impurităţii. Dacă eşantionul prezintă impurităţi volatile care ar putea afecta rezultatul, substanţa se purifică. Menţionarea presiunii de vapori a materialul iniţial se poate dovedi adecvată. Unele din metodele descrise aici folosesc aparate cu părţi metalice; acest aspect trebuie avut în vedere la testarea substanţelor corosive.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Presiunea de vapori a unei substanţe este definită ca presiunea de saturaţie la suprafaţa de contact cu aerul a unei substanţe solide sau lichide. La echilibru termodinamic, presiunea de vapori a unei substanţe pure este o funcţie numai de temperatură. Unitatea SI de presiune care trebuie folosită este pascalul (Pa). Unităţile alternative folosite de-a lungul timpului, împreună cu factorii lor de conversie sunt: 1 Torr (≡ 1 mm Hg) = 1,333 × 102 Pa 1 atmosferă = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa Unitatea de măsură folosită în Sistemul Internaţional (SI) pentru temperatură este kelvinul (K). Constanta molară universală a gazelor R este 8,314 J/mol–1K–1. Presiunea de vapori ca funcţie de temperatură este descrisă de ecuaţia lui Clausius-Clapeyron: log p = ΔHv2,3RT+const. unde: p presiunea de vapori a substanţei, în pascali ΔHv căldura sa de vaporizare, în Jmol–l R constanta universală a gazelor, în Jmol–l K–1 T temperatura termodinamică, în K

1.4. PRINCIPIUL METODELOR DE TESTARE Pentru determinarea presiunii de vapori, sunt propuse şapte metode diferite care trebuie aplicate pe diferite intervale de presiuni de vapori. Pentru fiecare metodă, presiunea de vapori este determinată la diferite temperaturi. Într-un interval limitat de temperaturi, logaritmul presiunii de vapori a unei substanţe pure este o funcţie lineară a inversului temperaturii.

1.4.

1.4.1. Metodă dinamică Metoda dinamică se bazează pe măsurarea temperaturii de fierbere care corespunde unei presiuni specificate. Intervalul recomandat: 103 Pa-105 Pa Metodă este recomandată şi pentru determinarea punctului normal de fierbere şi este utilă în acest sens pentru temperaturi sub 600 K.

1.4.2. Metoda statică Prin procedeul static, presiunea vaporilor care se stabileşte într-un sistem închis în echilibru termodinamic este determinată la o temperatură specificată. Metoda este adecvată solidelor şi lichidelor care conţin unul sau mai mulţi componenţi. Intervalul recomandat: 10-105 Pa Această metodă poate să fie folosită şi în intervalul 1-10 Pa, cu condiţia să fie aplicată atent.

1.4.3. Izoteniscop Această metodă standardizată este tot o metodă statică, dar este în general nepotrivită pentru sistemele multicomponent. Informaţii suplimentare sunt disponibile în ASTM metoda D-2879-86. Intervalul recomandat: 100-105 Pa.

1.4.4. Metoda prin efuziune: Balanţa pentru presiune de vapori Cantitatea de substanţă care iese dintr-o celulă în unitatea de timp printr-o deschidere de dimensiuni cunoscute se determină sub vid, astfel încât cantitatea de substanţă pe retur să fie neglijabilă (de exemplu, prin măsurarea impulsului imprimat unei balanţe sensibile printr-un jet de vapori sau prin măsurarea pierderilor de masă). Intervalul recomandat: 10–3-1 Pa.

1.4.5. Metoda prin efuziune: prin pierderea de masă sau prin captarea vaporizatului Metoda se bazează pe estimarea cantităţii de substanţă analizate care se elimină în unitatea de timp dintr-o celulă Knudsen (4) sub formă de vapori, printr-un orificiu foarte mic, în condiţii de vid avansat. Cantitatea de vapori degajaţi se poate calcula fie prin determinarea pierderii de masă a celulei, fie prin condensarea vaporilor la temperatură joasă şi determinarea cantităţii de substanţă volatilizată prin analiză cromatografică. Presiunea de vapori se calculează prin aplicarea relaţiei Hertz-Knudsen. Intervalul recomandat: 10–3-1 Pa.

1.4.6. Metoda gazului saturat Un curent de gaz purtător inert este trecut peste o substanţă astfel încât să fie saturat cu vapori. Cantitatea de material transportat de o cantitate cunoscută de gaz purtător este măsurabilă fie prin colectare cu barbotare în lichid, fie printr-o tehnică analitică în flux. Aceasta este apoi folosită la calcularea presiunii de vapori la o temperatură dată. Intervalul recomandat: 10–4-1 Pa Această metodă mai poate fi folosită în intervalul 1-10 Pa, cu condiţia să fie aplicată atent.

1.4.7. Metoda rotorului Într-un rotor etalon, elementul concret de măsurare este un rulment mic din oţel, suspendat într-un câmp magnetic, care se roteşte cu viteză mare. Presiunea gazului este calculată din încetinirea mişcării bilei de oţel, care este dependentă de presiune. Intervalul recomandat: 10–4-0,5 Pa.

1.5. Tabel 1.4.1.1.4.2.1.4.31.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Criterii de calitate

CRITERII DE CALITATE Diferitele metode de determinare a presiunii de vapori sunt comparate în tabelul de mai jos cu privire la aplicabilitate, repetabilitate, reproductibilitate, interval de măsurare, standarde existente. Metoda de măsurare Substanţa Repetabilitate estimată Reproductibilitate estimată Domeniu recomandat Standarde existente solid lichid Metoda dinamică Topire joasă Da Până la 25 % Până la 25 % 103 Pa-2 × 103 Pa — 1-5 % 1-5 % 2 × 103 Pa-105 Pa — Metoda statică Da Da 5-10 % 5-10 % 10 Pa-105 Pa NFT 20-048 (5) Izoteniscop Da Da 5-10 % 5-10 % 102 Pa-105 Pa ASTM-D 2879-86 Metoda prin vaporizare (balanţă) Da Da 5-20 % Până la 50 % 10–3 Pa-1 Pa NFT 20-047 (6) Metoda prin vaporizare (pierdere de masă) Da Da 10-30 % — 10–3 Pa-1 Pa — Metoda gazului saturat Da Da 10-30 % Până la 50 % 10–4 Pa-1 Pa — Metoda rotorului Da Da 10-20 % — 10–4 Pa-0,5 Pa —

1.6. DESCRIEREA METODELOR

1.6.

1.6.1. Metoda măsurătorii dinamice

1.6.1.

1.6.1.1. Aparatură Aparatul de măsură constă de obicei dintr-un vas de fierbere cu vas de răcire ataşat, din sticlă sau metal (figura 1), echipament de măsurare a temperaturii şi echipament de reglare şi măsurare a presiunii. Aparatul de măsură tipic prezentat în desen este confecţionat din sticlă termorezistentă şi este compus din 5 părţi: Tubul mare, cu pereţi parţial dubli, constă dintr-o garnitură rodată, un agent de răcire, un vas de răcire şi un racord de intrare. Cilindrul de sticlă, prevăzut cu pompă Cottrell, este montat în zona de fierbere a tubului şi are o suprafaţă rugoasă, de sticlă pisată, pentru a evita vaporizarea locală cu fierbere violentă. Temperatura se măsoară cu un senzor de temperatură corespunzător (de exemplu, termometru cu rezistenţă, termocuplu de manta) imersat în aparat la punctul de măsurare (nr. 5, figura 1) printr-un orificiu de admisie corespunzător (de exemplu, printr-un dop rodat). Se fac legăturile necesare la echipamentul de măsură şi reglare a presiunii. Rezervorul bulbiform, care acţionează ca un volum-tampon, se conectează la aparatul de măsură prin intermediul unui tub capilar. Vasul de fierbere se încălzeşte cu un element de încălzire (de exemplu un cartuş caloric) montat în aparatul de sticlă pe la partea interioară. Alimentarea cu curent electric pentru încălzire este fixată şi reglată cu ajutorul termocuplului. Vidul necesar cuprins între 102 Pa şi aproximativ 105 Pa este realizat cu ajutorul unei pompe de vid. Dozarea aerului sau a azotului pentru reglarea presiunii (interval de măsurare aproximativ 102-105 Pa) şi ventilaţie se face printr-o valvă adecvată. Presiunea se măsoară la manometru.

1.6.1.2. Metodă de măsurare Se măsoară presiunea de vapori determinându-se punctul de fierbere al eşantionului la diferite presiuni specificate între aproximativ 103 şi 105 Pa. O temperatură de fierbere stabilă la presiune constantă arată că punctul de fierbere a fost atins. Metoda nu poate fi folosită în cazul substanţelor care spumează. Substanţa se pune într-o coloană curată şi uscată. Pot să apară probleme în cazul solidelor care nu sunt sub formă de pulbere, dar în unele cazuri acestea se pot rezolva încălzind agentul de răcire din mantaua de răcire. După umplere, aparatul se închide la flanşă şi substanţa se degazează. Se stabileşte cea mai joasă dintre presiunile dorite şi se începe încălzirea. În acelaşi timp, senzorul de temperatură se conectează la contor. Echilibrul este atins atunci când se înregistrează o temperatură de fierbere constantă la presiune constantă. Trebuie evitat fenomenul de vaporizare locală cu fierbere violentă. În plus, în vasul de răcire condensarea trebuie să fie completă. Când se determină presiunea de vapori a solidelor cu punct de topire scăzut, trebuie evitată blocarea condensatorului. După înregistrarea acestui punct de echilibru se stabileşte o presiune mai ridicată. Procesul se continuă în acelaşi fel până când se atinge o presiune de 105 Pa (cca. 5-10 măsurători în total). Pentru verificare, aceleaşi puncte de echilibru trebuie să se regăsească la descreşterea presiunii.

1.6.2. Măsurători statice

1.6.2.

1.6.2.1. Aparatură Aparatura cuprinde un vas de probe, un sistem de încălzire şi răcire pentru a regla şi măsura temperatura eşantionului. Aparatura include, de asemenea, instrumente de reglare şi măsurare a presiunii. Figurile 2a şi 2b ilustrează principiile de bază ale sistemului. Vasul cu eşantion (figura 2a) este conectat pe o parte la un ventil de vid avansat. Pe partea cealaltă se ataşează un tub în formă de U cu un lichid manometric adecvat, formând un manometru auxiliar. Un capăt al tubului în formă de U este racordat la tubul ce face legătura cu pompa de vid, cilindrul cu azot sau ventilul de aerisire, şi la manometru. În locul tubului în formă de U se poate folosi un regulator de presiune cu manometru (figura 2b). Pentru a regla temperatura eşantionului, vasul împreună cu ventilul şi tubul în formă de U (sau manometru) este plasat într-o baie păstrată la o temperatură constantă de ±0,2 K. Măsurarea temperaturii se face pe peretele exterior al vasului ce conţine eşantionul sau chiar în vas. Pentru golirea aparatului se foloseşte o pompă de vid cu separator de răcire în amonte. În metoda 2a presiunea de vapori a substanţei este măsurată indirect folosind un indicator de zero. Aceasta ţine seama de faptul că densitatea fluidului din manometrul auxiliar se modifică dacă temperatura variază mult. Următoarele fluide sunt potrivite ca indicatori de zero pentru manometrul auxiliar, în funcţie de intervalul de presiune şi de comportarea chimică a substanţelor: uleiurile de silicon, ftalaţii. Substanţa de testat nu trebuie să se dizolve perceptibil sau să reacţioneze cu fluidul din manometrul auxiliar. Pentru manometru, mercurul poate fi utilizat în intervalul de presiune de la normală până la 102 Pa, pe când uleiurile de silicon şi ftalaţii se folosesc sub 102 Pa până la 10 Pa. Manometrele cu membrană rezistente la temperatură pot fi folosite chiar sub 10–1 Pa. Există şi tipuri de aparate de măsurare a presiunii utilizabile sub 102 Pa.

1.6.2.2. Procedeul de măsurare Înainte de măsurare, toate componentele aparaturii prezentate în figura 2 trebuie să fie curăţate şi uscate perfect. Pentru metoda 2a se umple vasul în formă de U cu lichidul ales, care trebuie să fie degazat la o temperatură ridicată înainte de a se face citirile. Substanţa de testat se introduce în aparat, care este apoi închis, şi temperatura se reduce suficient pentru degazare. Temperatura trebuie să fie suficient de scăzută pentru a asigura aspirarea aerului, dar în cazul sistemelor multicomponent trebuie să nu altereze compoziţia materialului. Dacă este necesar, echilibrul poate fi stabilit mai rapid prin agitare. Eşantionul poate fi suprarăcit, de exemplu cu azot lichid (evitând condensarea aerului sau a fluidului pompei) sau cu un amestec de etanol şi gheaţă uscată. Pentru măsurători la temperaturi scăzute se foloseşte o baie termostatată conectată la un criostat. Cu ventilul de deasupra vasului deschis, se evacuează aerul prin aspiraţie, timp de câteva minute. Apoi ventilul se închide iar temperatura eşantionului este redusă la nivelul cel mai scăzut dorit. Dacă este necesar, operaţia de degazare se repetă de câteva ori. Când eşantionul se încălzeşte, presiunea de vapori creşte şi modifică echilibrul fluidului din manometrul auxiliar. Pentru compensare se introduce azot sau aer în aparat printr-un ventil până când fluidul indicator de presiune revine la zero. Presiunea cerută pentru echilibrare trebuie să fie citită la un manometru de precizie, la temperatura camerei. Această presiune corespunde presiunii de vapori a substanţei la temperatura dată a eşantionului. Metoda 2b este similară, dar presiunea de vapori este citită direct. Valorile presiunii de vapori în funcţie de temperatură se determină la intervale de timp mici (aproximativ 5-10 măsurători în total) până la temperatura maximă cerută. Citirile la temperaturi scăzute trebuie să fie repetate pentru verificare. Dacă valorile obţinute la citirile repetate nu coincid cu curba obţinută pentru creşterea temperaturii, aceasta se poate datora următoarelor cauze:

1.6.2.2.

1. Proba conţine încă aer (de exemplu materiale cu vâscozitate mare) sau impurităţi cu temperaturi de fierbere scăzute, care se evaporă în timpul încălzirii şi pot fi îndepărtate prin aspiraţie după o suprarăcire suplimentară.

2. Temperatura de răcire nu este suficientă. În acest caz se foloseşte ca agent de răcire azotul lichid. În ambele situaţii, măsurătoarea trebuie repetată.

3. Substanţa suferă o reacţie chimică în intervalul de temperatură analizat (de exemplu descompunere, polimerizare).

1.6.3. Izoteniscopul O descriere completă a acestei metode poate fi găsită în referinţa bibliografică 7. Principiul aparatului de măsurare este prezentat în figura 3. La fel ca în cazul metodei statice descrisă la punctul 1.6.2, izoteniscopul este adecvat pentru analizarea solidelor sau a lichidelor. În cazul lichidelor, substanţa însăşi serveşte ca fluid în manometrul auxiliar. O cantitate de lichid, suficientă pentru a umple rezervorul şi braţul scurt al manometrului se introduce în izoteniscop. Izoteniscopul este ataşat la sistemul de vid şi golit, apoi se umple cu azot. Evacuarea şi purjarea sistemului se repetă de două ori pentru îndepărtarea oxigenului rezidual. Izoteniscopul plin este plasat în poziţie orizontală, astfel încât proba să se împrăştie într-un strat subţire în rezervorul bulbiform şi în manometru (partea în U). Presiunea sistemului se reduce la 133 Pa şi proba se încălzeşte uşor numai până la fierbere (îndepărtarea gazelor dizolvate). Apoi izoteniscopul este plasat astfel încât proba să se întoarcă în rezervor şi în manometru, astfel încât ambele să fie pline cu lichid. Presiunea se menţine la fel ca pentru degazare; vârful rezervorului bulbiform se încălzeşte la flacără mică până când vaporii degajaţi împing o parte din lichidul de la partea superioară şi din braţul manometrului în secţiunea manometrică a izoteniscopului, creând un spaţiu umplut cu vapori şi fără azot. Izoteniscopul este introdus într-o baie termostatată şi presiunea azotului este corectată până la presiunea eşantionului. Echilibrul de presiune este indicat de secţiunea manometrică a izoteniscopului. La echilibru, presiunea de vapori a azotului este egală cu presiunea de vapori a substanţei. În cazul substanţelor solide, în funcţie de intervalul de presiune şi temperatură, se utilizează lichidele manometrice enumerate la punctul 1.6.2.1. Lichidul manometric degazat este turnat în curbura braţului lung al izoteniscopului. Apoi, substanţele solide ce urmează să fie analizate sunt puse în rezervorul bulbiform şi sunt degazate la temperatură ridicată. În continuare, izoteniscopul este înclinat astfel încât lichidul manometric să curgă în tubul în formă de U. Măsurătoarea presiunii de vapori în funcţie de temperatură se efectuează în conformitate cu punctul 1.6.2.

1.6.4. Metoda prin efuziune: balanţa pentru presiunea de vapori

1.6.4.

1.6.4.1. Aparatură În literatura de specialitate sunt descrise diferite modele de aparate (1). Aparatul descris aici ilustrează principiul general al metodei (figura 4). Figura 4 prezintă principalele componente ale aparatului, cuprinzând un vas de sticlă sau oţel inoxidabil pentru vid înaintat, echipament pentru producerea şi măsurarea vidului şi componente pentru măsurarea presiunii de vapori cu ajutorul unei balanţe. Aparatura are încorporate următoarele componente:

un cuptor evaporator cu flanşă şi canal de admisie rotativ. Cuptorul evaporator este un vas cilindric confecţionat, de exemplu, din cupru sau dintr-un aliaj rezistent chimic cu o conductibilitate termică bună. Se poate folosi şi un vas de sticlă cu perete de cupru. Cuptorul are un diametru de aproximativ 3-5 cm şi este înalt de 2-5 cm. Există între unul până la trei orificii de diferite dimensiuni pentru fluxul de vapori. Cuptorul este încălzit ori dedesubt cu o placă de încălzire, ori în exterior cu o serpentină de încălzire. Pentru a preveni pierderea de căldură în bază, sistemul de încălzire se montează la placa de bază folosind un metal cu conductivitate termică scăzută (oţel aliat cu nichel-argint sau cu crom-nichel) de exemplu o conductă de oţel cu nichel-argint montată la canalul de admisie rotativ, dacă se utilizează un cuptor cu mai multe orificii. Acest sistem are avantajul de a permite introducerea unei bare de cupru care permite răcirea din exterior folosind o baie de răcire;

în cazul în care capacul de cupru al cuptorului are 3 deschideri de diametre diferite orientate la 90o una faţă de cealaltă, se pot acoperi diferite intervale de presiuni de vapori din întregul interval de măsurare (diametrul orificiilor fiind între 0,3 şi 4,5 mm). Deschiderile mari sunt utilizate pentru presiuni de vapori scăzute şi invers. Prin rotirea cuptorului se poate fixa apertura dorită sau chiar o poziţie intermediară în fluxul de vapori (orificiul cuptorului – scut-pâlnie – taler de balanţă) iar fluxul molecular este degajat sau deviat printr-un orificiu al cuptorului spre talerul balanţei. Pentru a măsura temperatura substanţei se plasează într-un punct potrivit un termocuplu sau un termometru cu rezistenţă;

deasupra scutului-pâlnie se găseşte un taler de balanţă aparţinând unei microbalanţe de înaltă precizie. Talerul balanţei este de aproximativ 30 mm diametru. Materialul optim este aluminiul placat cu aur;

talerul de balanţă este acoperit cu o cutie cilindrică de răcire, din alamă sau cupru. În funcţie de tipul de balanţă, cutia de răcire are fante pentru braţul de balanţă şi pentru scutul-pâlnie, trebuind să asigure condensarea completă a vaporilor pe talerul de balanţă. Degajarea căldurii în exterior este asigurată, de exemplu, de o tijă de cupru conectată la cutia de răcire. Tija trece prin placa de bază şi este izolată termic de aceasta, de exemplu cu un tub de oţel cu crom-nichel. Tija se imersează într-un vas Dewar conţinând azot lichid amplasat sub placa de bază sau în interiorul său este circulat azot lichid. Cutia de răcire este astfel păstrată la aproximativ – 120 oC. Talerul de balanţă este răcit exclusiv prin radiere şi este suficient pentru intervalul de presiuni investigat (răcire aproximativ 1 oră înainte de începerea măsurătorii);

balanţa este poziţionată deasupra cutiei de răcire. Balanţe corespunzătoare sunt de exemplu: microbalanţa electronică de înaltă sensibilitate cu două braţe (8) sau un instrument cu serpentină mobilă de înaltă sensibilitate (a se vedea Orientarea 104 a OCDE, ediţia 12.05.81);

placa de bază încorporează de asemenea legături electrice pentru termocupluri (sau termometre cu rezistenţă) şi serpentine de încălzire;

vidul este produs în vas folosind o pompă de vid parţial sau înaintat (vidul necesar, aproximativ de la 1 la 2 × 10–3 Pa, obţinut după 2 ore de pompare). Presiunea este reglată cu un manometru cu ionizare adecvat.

1.6.4.2. Procedeul de măsurare Vasul se umple cu substanţa de testat şi se închide capacul. Pâlnia protectoare şi cutia de răcire sunt aşezate deasupra cuptorului. Se închide aparatul şi se porneşte pompa de vid. Presiunea finală înainte de a efectua măsurătoarea trebuie să fie de aproximativ 10–4 Pa. Răcirea cutiei de refrigerare porneşte de la 10–3 Pa. Odată ce vidul necesar a fost obţinut, începe seria etalonărilor la cea mai scăzută temperatură. Este fixat capacul la orificiul corespunzător, jetul de vapori traversează scutul-pâlnie direct deasupra deschiderii şi loveşte talerul răcit al balanţei. Talerul trebuie să fie suficient de mare pentru ca întreg jetul trecut prin scutul-pâlnie să îl atingă. Forţa jetului de vapori acţionează asupra talerului şi moleculele condensează pe suprafaţa sa rece. Forţa jetului şi condensarea simultană produc un semnal pe un înregistrator. Evaluarea semnalului ne oferă două informaţii: p = G 2πRT×103M unde G viteza de evaporare (kg s–l m–2) M masa moleculară (g mol–l) T temperatura (K) R constanta universală a gazelor (Jmol–l K–1) p presiunea de vapori (Pa) După realizarea vidului necesar, începe seria de măsurători de la temperatura minimă dorită. Pentru măsurători ulterioare se măreşte temperatura pe intervale mici, până la atingerea temperaturii maxime dorite. Proba este răcită din nou şi poate fi înregistrată a doua curbă a presiunii de vapori. Dacă un al doilea test nu confirmă rezultatul primului, atunci este posibil ca substanţa să se descompună în intervalul de temperaturi ales pentru măsurători.

1.6.4.2.

1. În aparatul descris aici presiunea de vapori este determinată direct de forţa exercitată asupra balanţei [nu este necesar să se cunoască masa moleculară în acest scop (2)]. Când se interpretează citirile trebuie să se ţină seama de factori geometrici cum ar fi deschiderea cuptorului şi unghiul jetului.

2. Se poate măsura în acelaşi timp masa condensului, iar viteza de evaporare se poate calcula din această valoare. Presiunea de vapori se poate, de asemenea, calcula din viteza de evaporare şi masa moleculară, prin folosirea ecuaţiei Hertz (2):

1.6.5. Metoda prin efuziune: măsurarea pierderii de greutate

1.6.5.

1.6.5.1. Aparatură Instalaţia de efuziune constă din următoarele părţi principale: În figura 5 este prezentată o cuvă de vid din aluminiu, încălzită electric, cu 4 celule de efuziune din oţel inoxidabil. Foiţa de oţel inoxidabil de aproape 0,3 mm grosime are un orificiu de evaporare de 0,2-1,0 mm diametru şi este montată pe celula de efuziune cu un capac filetat.

o cuvă care poate fi termostatată şi vidată şi în care sunt localizate celulele de efuziune;

o pompă de vid înaintat (exemplu pompă de difuziune sau pompă turbomoleculară) cu manometru de vid);

un separator folosind azot lichid sau gheaţă uscată.

1.6.5.2. Procedeul de măsurare Substanţa de referinţă şi substanţa de testat sunt introduse în celule de efuziune separate, diafragma de metal cu orificiu este închisă cu capacul filetat şi fiecare celulă este cântărită cu o precizie de 0,1 mg. Celula se introduce în aparatul termostatat, care este apoi vidat pentru a scădea presiunea până la 10-a parte din presiunea preconizată. La intervale definite de timp variind de la 5 la 30 ore se devidează aparatura şi se determină pierderea de masă în celulele de efuziune printr-o nouă cântărire. Pentru a garanta că rezultatele nu sunt influenţate de impurităţi volatile, celula este recântărită la intervale de timp bine definite, verificând dacă viteza de evaporare este constantă pe cel puţin două astfel de intervale de timp. Presiunea de vapori p în celula de efuziune este dată de: p = mKAt2πRTM unde: p presiunea de vapori (Pa) m masa substanţei ce părăseşte celula în timpul t (kg) t timp (s) A suprafaţa orificiului (m2) K factor de corecţie R constantă universală molară a gazelor (Jmol–l K–1) T temperatura (K) M masa moleculară (kg mol–1) Factorul de corecţie K depinde de raportul dintre lungime şi rază a orificiului de efuziune: raport 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 factor K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Ecuaţia de mai sus se poate scrie: p = E mtTM unde E = 1KA2πR şi este constanta celulei de efuziune. Această constantă a celulei de vaporizare E poate fi determinată cu ajutorul substanţelor de referinţă (2) (9) şi se foloseşte următoarea ecuaţie: E = p(r)tmM(r)T unde: p(r) presiunea de vapori a substanţei de referinţă (Pa) M(r) masa moleculară a substanţei de referinţă (kg × mol–l)

1.6.6. Metoda gazului saturat

1.6.6.

1.6.6.1. Aparatură Aparatura tipic folosită la realizarea acestui test cuprinde mai multe componente prezentate în figura 6a şi este descrisă mai jos (1).

1.6.6.1. Gaz inert:

Gazul purtător nu trebuie să reacţioneze chimic cu substanţa de analizat. Azotul este un gaz suficient de inert pentru acest scop dar uneori pot fi utile şi alte gaze (10). Gazul utilizat trebuie să fie uscat (a se vedea figura 6a, explicaţia 4: senzor de umiditate relativă).

Controlul debitului:

Este necesar un sistem de control al debitului de gaz pentru a asigura în coloana de saturaţie un debit constant fixat.

Separatoare de condens:

Acestea depind de caracteristicile particulare ale probelor şi de metoda de analiză aleasă. Vaporii trebuie să fie captaţi cantitativ într-o formă care să permită analiza. Pentru unele substanţe sunt necesare separatoare care conţin lichide cum ar fi hexanul sau etilenoglicolul. Pentru altele se pot folosi absorbanţi solizi. Ca alternativă la captarea vaporilor şi analiza ulterioară, pot fi folosite tehnici analitice precum cromatografia pentru determinarea cantitativă a masei de substanţă transportată de o cantitate cunoscută de gaz purtător. În plus, se poate măsura şi pierderea de masă a eşantionului.

Schimbător de căldură:

Pentru măsurători la temperaturi diferite, poate fi necesară includerea în ansamblu a unui schimbător de căldură.

Coloana de saturaţie:

Substanţa de analizat, în soluţie, se depune pe un suport inert convenabil. Suportul astfel acoperit se tasează în coloana de saturaţie, care are o mărime şi o viteză de curgere astfel încât să asigure saturaţia completă a gazului purtător. Coloana de saturaţie trebuie termostatată. Pentru măsurători peste temperatura camerei, zona dintre coloana de saturaţie şi separator trebuie să fie încălzită pentru a preveni condensarea substanţei de testat. Pentru a reduce cantitatea de substanţă antrenată datorită difuziei se poate amplasa un tub capilar după coloana de saturaţie (figura 6b).

1.6.6.2. Procedura de măsurare

1.6.6.2. Pregătirea coloanei de saturaţie:

O soluţie din substanţa de testat într-un solvent foarte volatil se adaugă unei cantităţi adecvate de suport. Trebuie să se utilizeze suficientă substanţă pentru menţinerea saturaţiei pe toată durata analizei. Solventul este evaporat complet în aer într-un evaporator rotativ şi materialul, amestecat bine, este tasat în coloana de saturaţie. După termostatarea eşantionului se trece prin aparat azot uscat.

Măsurătoare:

Separatoarele sau detectorul în flux sunt conectate la linia de efluent a coloanei şi se înregistrează timpul. Viteza de curgere se verifică la început şi la intervale egale în timpul experimentului, folosind un debitmetru cu bule (sau în mod continuu, cu un debitmetru de masă). Se măsoară presiunea la ieşirea din coloana de saturaţie astfel: Timpul de colectare a cantităţii de substanţă necesar în diferitele metode de analiză este determinat într-o testare preliminară sau prin estimare. Ca alternativă la colectarea substanţei pentru analize ulterioare se pot utiliza tehnici analitice cantitative în flux (de exemplu cromatografia). Înainte de calcularea presiunii de vapori la temperatura dată se realizează o testare preliminară pentru a determina viteza maximă la care gazul purtător se saturează complet. Saturaţia este garantată dacă gazul purtător este trecut prin coloană la o viteză atât de scăzută încât o viteză şi mai scăzută să nu conducă la o presiune de vapori calculată mai mare. Metoda analitică specifică este determinată de natura substanţei de testat (de exemplu gaz cromatografie sau gravimetrie). Se determină cantitatea de substanţă transportată de un volum cunoscut de gaz purtător.

(a) fie prin montarea unui manometru între coloana de saturaţie şi separatoare (acest lucru s-ar putea să nu fie posibil deoarece creşte spaţiul mort şi suprafaţa de adsorbţie);

(b) fie prin determinarea căderii de presiune prin separator în funcţie de viteză, într-un experiment separat (aceasta s-ar putea să nu fie posibil în cazul separatoarelor de lichid).

1.6.6.3. Calcularea presiunii de vapori Presiunea de vapori se calculează din densitatea de vapori, W/V, cu ecuaţia: p = WV × RTM unde: P presiunea de vapori (Pa) W masa de substanţă de testat, evaporată (g) V volumul de gaz saturat (m3) R constanta gazelor molară universală (Jmol–l K–1) T temperatura (K) M masa molară a substanţei de testat (g mol–l) Volumele măsurate trebuie să fie corectate cu privire la diferenţele de presiune şi temperatură între debitmetru şi coloana de saturaţie termostatată. Dacă debitmetrul este localizat în aval de separatorul de condens, ar putea fi necesare corecţii pentru produsele vaporizate din separator (1).

1.6.7. Metoda rotorului (8) (11) (13)

1.6.7.

1.6.7.1. Aparatură În metoda rotorului în mişcare se foloseşte un indicator de viscozitate cu rotor, conform figurii 8. Figura 7 prezintă schema configuraţiei experimentale. Instalaţia de măsurare constă dintr-un cap de măsurare cu rotor în mişcare, introdus într-o incintă termostatată (reglată cu o abatere de 0,1 oC). Recipientul conţinând eşantionul este plasat într-o incintă termostatată (reglată cu o abatere de 0,01 oC) şi toate celelalte părţi ale configuraţiei sunt menţinute la o temperatură mai înaltă, pentru a preveni condensarea. Un dispozitiv cu pompă de vid înaintat se conectează printr-un ventil la sistemul de vid avansat. Capul de măsurare cu rotor constă dintr-o bilă de oţel (de diametru 4-5 mm) plasat într-un tub. Bila este suspendată şi stabilizată într-un câmp magnetic (în general se foloseşte o combinaţie de magneţi permanenţi şi bobine de control). Bila este făcută să se rotească prin rotirea câmpului produs de bobine. Bobinele de control măsoară magnetizarea laterală a bilei, care este slabă dar permanent prezentă, permiţând astfel măsurarea vitezei de rotire.

1.6.7.2. Procedeul de măsurare Când bila a atins o viteză de rotaţie dată v(0) (de regulă aproximativ 400 rotaţii pe secundă), se opreşte alimentarea bobinelor şi are loc o decelerare datorată frecării cu moleculele de gaz. Scăderea vitezei de rotaţie este măsurată în funcţie de timp. Deoarece frecarea cauzată de suspendarea magnetică este neglijabilă în comparaţie cu frecarea cu moleculele de gaz, presiunea gazului p este dată de: p = πc—rρσ10t × ln v(t)v(o) unde: c— viteza medie a moleculelor de gaz r raza bilei ρ densitatea bilei σ coeficientul de transfer tangenţial al momentului cinetic (ε = 1 pentru o suprafaţă sferică ideală a bilei) t timp v(t) viteza de rotaţie după timpul t v(0) viteza de rotaţie iniţială Această ecuaţie poate fi, de asemenea, scrisă: p = πc—rρ10σ × tn - tn-1tn × tn-1 unde tn, tn–1 sunt timpii necesari pentru un număr de rotaţii date, N. Aceste intervale de timp tn şi tn–1 sunt succesive, astfel tn > tn–1. Viteza medie a moleculei gazului c— este dată de relaţia: c— = 8RTπM12 unde: T temperatura R constanta universală a gazelor M masa molară

2. DATE În oricare metodă, presiunea de vapori se determină la cel puţin două temperaturi diferite. Este de preferat să se folosească trei sau mai multe temperaturi, în intervalul 0-50 oC, pentru a verifica linearitatea curbei presiunii de vapori.

3. RAPORT Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii: Dacă se observă o transformare (schimbarea de stare, descompunere), se consemnează următoarele date: Se consemnează toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special cele privitoare la impurităţi şi starea fizică a substanţei.

metoda folosită;

specificaţiile precise ale substanţei (identitate şi impurităţi) şi etapa preliminară de purificare, dacă există;

cel puţin 2 valori ale presiunii de vapori la temperaturi diferite, de preferinţă în intervalul 0-50 oC;

toate datele primare;

o curbă log p în funcţie de 1/T;

o estimare a presiunii de vapori la 20 oC sau 25 oC.

natura modificării;

temperatura la care are loc transformarea corectată la presiune atmosferică;

presiunea de vapori la 10 oC şi 20 oC sub temperatura de tranziţie şi la 10 oC şi 20 oC peste această temperatură (numai dacă tranziţia este de la solid la gaz).

4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, p. 593. NF T 20-048 AFNOR (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–1 to 105 Pa – Static method. NF T 20-047 AFNOR (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, voI. 5 (4), p. 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, p. 1173. B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, p. 435. G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), p. 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), p. 1148. J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), p. 1715.

A.5. TENSIUNEA SUPERFICIALĂ

A.5.

1. METODĂ Majoritatea metodelor descrise se bazează pe orientările OCDE privind testele (1). Principiile fundamentale sunt menţionate în referinţa bibliografică 2.

1.

1.1. INTRODUCERE Metodele descrise se aplică măsurării tensiunii superficiale a soluţiilor apoase. Este util să se colecteze informaţii preliminare asupra solubilităţii în apă, structurii, proprietăţilor la hidroliză şi concentraţiei critice pentru formarea de micelii ale substanţei înainte de realizarea acestor teste. Următoarele metode sunt aplicabile celor mai multe substanţe chimice, fără nicio restricţie cu privire la gradul de puritate. Măsurarea tensiunii superficiale prin metoda tensiometrului cu inel se limitează la soluţiile apoase cu o vâscozitate dinamică mai mică decât aproximativ 200 mPa s.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Entalpia unui lichid la suprafaţa de contact cu aerul raportată la unitatea de suprafaţă se numeşte tensiune superficială. Unităţile de măsură sunt: N/m (SI) sau mN/m (subunitate SI) 1 N/m = 103 dyn/cm 1 mN/m = 1 dyn/cm în sistemul CGS vechi

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă în toate cazurile în care se studiază o nouă substanţă. Acestea trebuie în special să servească la etalonarea periodică a metodei şi la comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode. Substanţele de referinţă care acoperă un interval larg de tensiuni superficiale sunt date în referinţele 1 şi 3.

1.4. PRINCIPIUL METODELOR Metodele se bazează pe măsurarea forţei maxime care este necesar să se exercite vertical pe o bridă circulară ori pe un inel aflat în contact cu suprafaţa lichidului dintr-un vas etalonat, pentru a-l separa de această suprafaţă, sau pe o placă având o margine în contact cu suprafaţa lichidului, pentru a ridica pelicula care s-a format. Substanţele care sunt solubile în apă cel puţin într-o concentraţie de 1 mg/l sunt analizate în soluţii apoase la o singură concentraţie.

1.5. CRITERII DE CALITATE Aceste metode oferă o precizie mai mare decât este probabil necesară în analizele de mediu.

1.6. DESCRIEREA METODELOR Se prepară o soluţie a substanţei de testat în apă distilată. Concentraţia acestei soluţii reprezintă 90 % din solubilitatea de saturaţie a substanţei în apă; când această concentraţie depăşeşte 1 g/l, pentru determinare se utilizează o concentraţie de 1 g/l. Testarea substanţelor cu solubilitate în apă mai scăzută de 1 mg/l nu este necesară.

1.6.

1.6.1. Metoda cu placă A se vedea ISO 304 şi NFT 73-060 (Agenţi activi de suprafaţă – determinarea tensiunii superficiale prin ridicarea unei pelicule de lichid).

1.6.2. Metoda cu bridă A se vedea ISO 304 şi NFT 73-060 (agenţi activi de suprafaţă – determinarea tensiunii superficiale prin ridicarea unei pelicule de lichid)

1.6.3. Metoda cu inel A se vedea ISO 304 şi NFT 73-060 (Agenţi activi de suprafaţă – determinarea tensiunii superficiale prin ridicarea unei pelicule de lichid).

1.6.4. Metodă cu inel corelată cu principiile OCDE

1.6.4.

1.6.4.1. Aparatură Pentru această măsurătoare sunt folosite tensiometre comerciale. Ele constau în următoarele elemente:

porteşantion mobil;

dinamometru;

corp de măsurare (inel);

vas de măsurare.

1.6.4.1.

1.6.4.1.1. Porteşantionul mobil Porteşantionul mobil se foloseşte ca suport al recipientului de măsurare termostatat care conţine lichidul de testare. Se montează pe acelaşi soclu ca şi dinamometrul.

1.6.4.1.2. Dinamometrul Dinamometrul (a se vedea figura) se aşează deasupra porteşantionului. Eroarea în măsurarea forţei nu trebuie să depăşească ± 10–6 N, echivalentul unei limite de eroare de ±0,1 miligrame în măsurarea masei. În majoritatea cazurilor, scara de măsură a tensiometrelor comercializate este etalonată în mN/m, astfel încât se poate citi direct tensiunea superficială în mN/m, cu o precizie de 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3. Corpul de măsurare (inel) Inelul este de obicei format dintr-un film de platină sau de platină-iridiu cu o grosime de 0,4 milimetri şi o circumferinţă de 60 milimetri. Acest inel este suspendat orizontal pe etrierul de montaj care este legat printr-o tijă metalică la dinamometru (a se vedea figura).

1.6.4.1.3. Figură Corp de măsurare

(Toate dimensiunile sunt exprimate în milimetri) tijă metalică etrier de montaj inel

1.6.4.1.4. Vasul de măsurare Vasul de măsurare conţinând proba ce urmează să fie măsurată trebuie să fie un vas de sticlă cu termostat. Acesta trebuie să fie astfel realizat încât în timpul măsurătorilor temperatura soluţiei de lichid şi a fazei gazoase de deasupra acesteia să rămână constantă, astfel încât proba să nu se poată evapora. Sunt acceptabile vase cilindrice de sticlă cu diametrul interior mai mare de 45 mm.

1.6.4.2. Pregătirea aparaturii

1.6.4.2.

1.6.4.2.1. Curăţarea Vasele de sticlă se spală cu atenţie. Dacă este necesar, sunt spălate cu amestec oxidant (bicromat/acid sulfuric) cald apoi cu acid fosforic concentrat (83-98 % procent de greutate H3PO4), clătite cu apă şi în final spălate cu apă dublu distilată până la reacţie neutră, apoi uscate sau clătite cu o parte din lichidul de analizat. Inelul este mai întâi clătit bine cu apă pentru a îndepărta orice substanţă solubilă, scufundat rapid în amestec oxidant, spălat cu apă dublu distilată până la reacţie neutră şi în final încălzit scurt deasupra unei flăcări de metanol. Notă: Substanţele contaminante care nu se dizolvă şi nu sunt distruse de amestecul oxidant sau de acidul fosforic, precum siliconii, vor fi îndepărtate cu ajutorul unui solvent organic potrivit.

1.6.4.2.2. Calibrarea aparatului Validarea aparatului constă din verificarea punctului zero şi corectarea acestuia astfel încât indicaţia instrumentului să permită realizarea unor determinări corecte în unităţi mN/m.

1.6.4.2.2. Montare:

Aparatul va fi aşezat plan, de exemplu cu ajutorul unei nivele cu bulă de aer aşezată la baza termometrului, prin ajustarea picioarelor mobile.

Corectarea punctului zero:

După montarea inelului pe aparat şi înaintea imersării în lichid, indicaţia tensiometrului va fi corectată la zero, iar inelul se va verifica pentru a fi perfect paralel cu suprafaţa lichidului. În acest scop, suprafaţa lichidului poate fi folosită ca oglindă.

Calibrarea:

Testul de calibrare poate fi realizat prin una din următoarele metode:

(a) folosind o greutate: metoda foloseşte călăreţi de masă cunoscută între 0,1 şi 1,0 g amplasaţi pe inel. Factorul de calibrare Φa cu care se înmulţesc toate citirile de pe instrument se stabileşte în conformitate cu ecuaţia (1): Φa=σrσa unde: σr=mg2b (mN/m) m masa călăreţului (g) g acceleraţia gravitaţională (981 cm s–2 la nivelul mării) b circumferinţa medie a inelului (cm) σa citirea tensiometrului după plasarea călăreţului pe inel (mN/M);

(b) folosind apa: procedeul utilizează apa pură a cărei tensiune superficială la, de exemplu 23 oC, este egală cu 72,3 mN/m. Acest procedeu se realizează mai rapid decât calibrarea cu greutăţi, dar există întotdeauna pericolul ca tensiunea superficială a apei să fie falsificată prin contaminare cu agenţi tensioactivi. Factorul de calibrare (Φb) cu care se înmulţesc toate citirile de pe instrument se stabileşte în conformitate cu ecuaţia (2): Φb=σoσg unde: σo valoarea citată în literatură pentru tensiunea superficială a apei (în mN/m) σg valoarea măsurată a tensiunii superficiale a apei (mN/m) ambele la aceeaşi temperatură.

1.6.4.3. Prepararea eşantioanelor Soluţiile apoase se prepară din substanţa de testat folosind concentraţia necesară în apă şi nu conţin nicio substanţă nedizolvată. Soluţia trebuie păstrată la o temperatură constantă (±0,5 oC). Deoarece tensiunea superficială a unei soluţii într-un vas variază în timp, se realizează măsurători la anumite intervale de timp şi se trasează graficul tensiunii superficiale ca funcţie de timp. Atunci când nu se mai produce nicio modificare se consideră că s-a atins starea de echilibru. Contaminarea cu praf sau gaze din mediul înconjurător poate modifica rezultatele, aşadar se va lucra sub clopot de protecţie.

1.6.5. Condiţii experimentale Măsurătorile se efectuează la temperatura de aproximativ 20 oC controlată la ±0,5 oC.

1.6.6. Desfăşurarea testului Soluţiile ce urmează să fie măsurate se transferă cu atenţie într-un vas de măsurare curat, evitându-se spumarea, după care vasul de măsurare se aşează pe porteşantion. Acesta se ridică până când inelul este imersat sub suprafaţa soluţiei de măsurat. Se coboară apoi treptat şi uniform (la o viteză de aproximativ 0,5 cm/min) pentru desprinderea inelului de pe suprafaţă până la atingerea forţei maxime necesare. Stratul de lichid ataşat de inel trebuie să nu fie separat de inel. După terminarea măsurării, inelul se imersează din nou în lichid, iar măsurătorile se repetă până când se ajunge la o valoare constantă a tensiunii superficiale. Timpul scurs de la transferul soluţiei în vasul de măsurare se înregistrează pentru fiecare determinare. Citirile se efectuează la forţa maximă necesară pentru desprinderea inelului de suprafaţa lichidului.

2. Tabel Corecţia tensiunii superficiale măsurate numai pentru soluţii apoase, ρ = 1 g/cm3

DATE Pentru a calcula tensiunea superficială, valoarea citită în mN/m pe aparat este în primul rând multiplicată cu un factor de calibrare Φa sau Φb (în funcţie de procedura de calibrare utilizată). Acest rezultat este aproximativ şi ca urmare trebuie să fie corectat ulterior. Harkins şi Jordan (4) au determinat un factor de corecţie empiric pentru valorile de tensiune superficială măsurate prin metoda cu inel, care depinde de dimensiunile inelului, densitatea lichidului şi tensiunea superficială. Deoarece determinarea factorului de corecţie pentru fiecare măsurătoare individuală din tabelele lui Harkins şi Jordan este laborioasă, pentru a determina tensiunea superficială la soluţii apoase poate fi folosită metoda simplificată de a citi valorile corectate de tensiune superficială direct din tabel. (În cazul citirilor situate între valorile tabelate se va folosi metoda interpolării.) r = 9,55 mm (raza medie a inelului) r = 0,185 mm (raza sârmei inelului) Valoare experimentală mN/m Valoare corectată (mN/m) Calibrarea greutăţii [a se vedea 1.6.4.2.2 (a)] Calibrarea apei [a se vedea 1.6.4.2.2 (b)] 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Acest tabel a fost realizat pe baza corecţiei Harkins-Jordan. Tabelul este similar cu cel din standardul DIN (DIN 53914) pentru apă şi soluţii apoase (ρ = 1 g/cm3) şi se referă la un inel disponibil în comerţ cu diametru de R = 9,55 mm (însemnând raza medie a inelului) şi r = 0,185 mm (raza sârmei inelului). Tabelul conţine valori corectate pentru măsurătorile de tensiune superficială făcute după calibrarea cu greutăţi sau cu apă. Alternativ, în absenţa procedurii de calibrare, tensiunea superficială poate să fie calculată conform formulei: σ=f × F4πR unde: F forţa măsurată la dinamometru la întreruperea filmului R raza inelului f factor de corecţie (1)

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORT DE TESTARE Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele date:

metoda folosită;

tipul de apă sau soluţie folosită;

specificaţiile precise ale substanţelor (identitate, impurităţi);

rezultatele măsurătorii: tensiune superficială (citire) menţionând citiri individuale şi media lor aritmetică, precum şi media corectată (luând în considerare factorul de echipament şi tabelul cu factorii de corecţie);

concentraţia soluţiei;

temperatura de testare;

vechimea soluţiei folosite; în particular timpul scurs între prepararea şi măsurarea soluţiei;

descrierea tensiunii superficiale ca funcţie de timp după transferul soluţiei la vasul de măsurare;

toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor ce urmează a fi raportate, în special cu privire la impurităţi şi starea fizică a substanţei.

3.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR Având în vedere că apa distilată are tensiunea superficială de 72,75 mN/m la 20 oC, substanţele prezentând o tensiune superficială mai scăzută de 60 mN/m în condiţiile acestei metode sunt considerate ca fiind agenţi activi de suprafaţă.

4.1.2.3.4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter XIV. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, p. 1751.

A.6. SOLUBILITATEA ÎN APĂ

A.6.

1. METODĂ Majoritatea metodelor descrise se bazează pe orientările OCDE privind testele (1).

1.

1.1. INTRODUCERE Pentru realizarea acestui test, sunt necesare anumite informaţii preliminare referitoare la formula structurală, presiunea de vapori, constanta de disociere şi de hidroliză a substanţei (în funcţie de pH). Pentru a acoperi întregul interval de solubilităţi în apă, sunt disponibile mai multe metode. Cele două metode de analiză descrise mai jos acoperă întregul interval de solubilităţi dar nu sunt aplicabile substanţelor volatile: Solubilitatea în apă a probei poate fi considerabil afectată de prezenţa impurităţilor.

o metodă care se aplică substanţelor relativ pure, cu solubilitate scăzută (< 10–2 grame pe litru) şi care sunt stabile în apă, denumită metoda eluţiei pe coloană;

o altă metodă care se aplică substanţelor relativ pure, cu solubilitate mai mare (> 10–2 grame pe litru) şi care sunt stabile în apă denumită metoda prin solubilitate în flacon.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Solubilitatea în apă a unei substanţei este definită prin concentraţia masică de saturaţie a substanţei în apă la o temperatură dată. Solubilitatea în apă se măsoară în unităţi de masă pe volum de soluţie. Unitatea SI este kg/m3 (ca unitate de măsură se poate folosi de asemenea gramul pe litru).

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Cantitatea aproximativă dintr-o probă şi timpul necesar pentru a realiza concentraţia de saturaţie vor fi determinate într-un test preliminar simplu.

1.4.

1.4.1. Metoda eluţiei pe coloană Această metodă se bazează pe eluţia substanţei de testat cu apă dintr-o microcoloană încărcată cu un suport inert, cum ar fi mărgele de sticlă sau nisip, acoperite cu proba în exces. Solubilitatea în apă se determină atunci când concentraţia masică de eluat este constantă. Valoarea este reprezentată de zona aplatizată a curbei de concentraţie ca funcţie de timp.

1.4.2. Metoda prin solubilitate în flacon În această metodă, substanţa (solidele trebuie să fie pulverizate) se dizolvă în apă la o temperatură puţin mai mare decât temperatura de testare. Când se atinge saturaţia, amestecul se răceşte şi se păstrează la temperatura de testare, sub agitare, atâta timp cât este necesar pentru a ajunge la echilibru. Ca alternativă, determinarea poate fi efectuată direct la temperatura de testare, dacă se garantează, printr-o probă adecvată, că s-a atins starea de echilibru de saturaţie. Apoi se determină printr-o metodă analitică potrivită concentraţia substanţei în soluţie apoasă, care nu trebuie să conţină niciun fel de particule nedizolvate.

1.5. CRITERII DE CALITATE

1.5.

1.5.1. Repetabilitatea Pentru metoda eluţiei pe coloană, este acceptabilă < 30 %; pentru metoda prin solubilitate în flacon, este necesar ca aceasta să fie < 15 %.

1.5.2. Sensibilitatea metodei Aceasta depinde de metoda de analiză, dar pot fi realizate determinări ale concentraţiei până la 10–6 grame pe litru.

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.1. Condiţii experimentale Este preferabil ca testul să aibă loc la 20 ±0,5 oC. Dacă se presupune că solubilitatea este dependentă de temperatură (> 3 % pe oC), vor fi folosite două alte temperaturi cu cel puţin 10 oC peste sau sub temperatura aleasă iniţial. În acest caz controlul temperaturii va fi de ±0,1 oC. Temperatura aleasă se menţine constantă în toate părţile relevante ale echipamentului.

1.6.2. Testul preliminar La aproximativ 0,1 grame din proba (substanţele solide trebuie să fie pulverizate) aflată într-un cilindru gradat de 10 ml cu dop de sticlă se adaugă volume crescânde de apă distilată la temperatura camerei în concordanţă cu paşii arătaţi în tabelul de mai jos: 0,1 grame solubile în x ml apă 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Solubilitate aproximativă (grame pe litru) > 1000 1000-200 200-100 100-50 50-10 10-1 < 1 După fiecare adăugare a cantităţii de apă indicate, amestecul este agitat puternic timp de 10 minute şi examinat vizual pentru a observa particule din probă nedizolvate. Dacă după adăugarea a 10 ml de apă, proba sau părţi din ea rămân nedizolvate, experimentul trebuie repetat într-un cilindru gradat de 100 de ml, cu volume mai mari de apă. La solubilităţi mai mici timpul necesar pentru dizolvarea substanţei poate fi considerabil mai mare (cel puţin 24 de ore). Solubilitatea aproximativă se înregistrează într-un tabel, odată cu volumul de apă adăugată la care apare o dizolvare completă a probei. Dacă substanţa este încă aparent insolubilă se lasă mai mult de 24 de ore (maximum 96 de ore) sau se diluează în continuare pentru a stabili dacă se foloseşte metoda eluţiei pe coloană sau metoda flaconului.

1.6.3. Metoda eluţiei pe coloană

1.6.3.

1.6.3.1. Suport, solvent şi eluent Materialul suport pentru metoda eluţiei pe coloană trebuie să fie inert. Materiale care pot fi folosite sunt mărgelele de sticlă şi nisipul. Pentru a aplica proba pe suport se foloseşte un solvent volatil potrivit de calitate pro analisis. Ca eluent se foloseşte apa dublu distilată, în aparatură de sticlă sau cuarţ. Notă: Nu trebuie folosită apă proaspăt trecută printr-un schimbător de ioni organic.

1.6.3.2. Încărcarea suportului Aproximativ 600 mg din suport sunt cântărite şi transferate într-un balon cu fund rotund de 50 ml. O cantitate convenabilă de substanţă de testat, cântărită, se dizolvă în solventul ales. O cantitate adecvată din această soluţie se adaugă la suport. Solventul trebuie să fie complet evaporat, de exemplu într-un evaporator rotativ; în caz contrar, saturarea cu apă a suportului nu se realizează datorită efectelor de partiţie pe suprafaţa suportului. Încărcarea suportului poate conduce la rezultate eronate dacă proba este depusă ca fază uleioasă sau cristale. Problema se examinează experimental şi detaliile se consemnează. Suportul încărcat se lasă să se îmbibe timp de aproximativ două ore în aproximativ 5 ml de apă, apoi suspensia se adaugă în microcoloană. Ca alternativă, suportul uscat poate fi turnat în microcoloană, care a fost deja umplută cu apă, şi apoi lăsat timp de aproximativ 2 ore până la atingerea echilibrului.

1.6.3.2. Procedură de testare:

Eluţia substanţei din suport poate fi efectuată într-unul din următoare două moduri:

cu pompă de recirculare (a se vedea figura 1),

cu rezervor de apă (a se vedea figura 4).

1.6.3.3. Metoda eluţiei pe coloană cu pompă de recirculare

1.6.3.3. Aparatură

Schema unui sistem tipic este prezentată în figura 1. O microcoloană corespunzătoare este prezentată în figura 2, deşi sunt acceptabile orice dimensiuni, cu condiţia respectării criteriilor de reproductibilitate şi sensibilitate. Coloana este prevăzută cu un volum tampon la vârf egal cu cel puţin 5 volume de apă şi poate să cuprindă minimum 5 probe. Ca alternativă, dimensiunea poate fi redusă dacă este folosit un solvent pentru a înlocui 5 volume iniţiale pentru a îndepărta impurităţile. Coloana se conectează la o pompă de recirculare cu un debit de aproximativ 25 ml/h. Pompa se conectează cu racorduri din politetrafloretilenă (P.T.F.E) şi/sau sticlă. Coloana şi pompa, odată asamblate, trebuie să permită eşantionarea efluentului şi echilibrarea volumului liber din vârful coloanei la presiunea atmosferică. Materialul din coloană este sprijinit pe un mic dop (5 mm) din vată de sticlă, care serveşte de asemenea pentru a filtra particulele. Pompa de recirculare poate fi, de exemplu, o pompă peristaltică sau o pompă cu membrană (atenţie să nu se producă nicio contaminare şi/sau absorbţii cu materialul tubului).

Procedeul de măsurare

Se porneşte circuitul prin coloană. Se recomandă utilizarea unui debit de aproximativ 25 ml/h (aceasta corespunde la 10 volume/h pentru coloana descrisă). Primele cinci volume (minim) sunt folosite pentru a îndepărta impurităţile solubile din apă. Apoi, pompa de recirculare se lasă să funcţioneze până la stabilirea echilibrului, care este definit prin 5 probe succesive a căror concentraţie nu diferă cu mai mult de ± 30 %, în mod aleatoriu. Aceste probe sunt separate de intervale de timp corespunzătoare trecerii a cel puţin 10 volume de eluent.

1.6.3.4. Metoda eluţiei pe coloană cu vas de nivel

1.6.3.4. Aparatură (a se vedea figurile 4 şi 3)

Vasul de nivel: Conectarea la vasul de nivel este făcută prin folosirea unei olive de sticlă conectată prin tuburi din PTFE. Este recomandată folosirea unui debit de aproximativ 25 ml/h. Eluaţii succesivi se colectează şi se analizează prin metoda aleasă.

Procedeul de măsurare

Pentru a determina solubilitatea în apă sunt folosite acele fracţiuni din intervalul de eluţie unde concentraţiile sunt constante (± 30 %) pentru cel puţin 5 fracţiuni consecutive. În ambele cazuri (folosind o pompă de recirculare sau un vas de nivel), o a doua serie de probe se efectuează la jumătate din debitul primei. Dacă rezultatele celei de a doua serii sunt în concordanţă, testul este satisfăcător; dacă există o solubilitate aparentă mai mare la un debit mai mic, atunci înjumătăţirea debitului va trebui să continue până când două serii succesive vor da aceeaşi solubilitate. În ambele cazuri (folosind o pompă de recirculare sau un vas de nivel) fracţiunile se verifică pentru a decela prezenţa materiilor coloidale, prin examinarea efectului Tyndall (împrăştierea luminii). Prezenţa unor astfel de particule invalidează rezultatele şi testul se repetă cu îmbunătăţirea acţiunii de filtrare a coloanei. Se înregistrează pH-ul fiecărei probe. Cea de-a doua serie va fi efectuată la aceeaşi temperatură.

1.6.4. Metoda prin solubilitate în flacon

1.6.4.

1.6.4.1. Aparatură Pentru metoda prin solubilitate în flacon sunt necesare următoarele materiale:

sticlărie şi instrumente obişnuite de laborator;

un dispozitiv potrivit pentru agitarea soluţiilor la temperatură constantă controlată;

o centrifugă (preferabil termostatată), în cazul emulsiilor; şi

echipament pentru determinări analitice.

1.6.4.2. Procedeul de măsurare Cantitatea de substanţă necesară pentru a satura volumul de apă dorit este estimată printr-un test preliminar. Volumul de apă necesar depinde de metoda analitică şi de intervalul de solubilitate. Aproximativ de cinci ori cantitatea de material determinată mai sus este cântărită în fiecare dintre cele trei vase de sticlă prevăzute cu dopuri de sticlă (de exemplu eprubete pentru centrifugă, flacoane). Volumul de apă este adăugat în fiecare vas şi vasele sunt închise ermetic. Vasele închise sunt apoi agitate la 30 oC. (Se foloseşte un dispozitiv de agitare sau de amestecare care poate funcţiona la temperatură constantă, de exemplu un agitator magnetic într-o baie de apă termostatată.) După o zi, unul dintre vase este scos şi reechilibrat timp de 24 de ore la temperatura de testare, agitând din când în când. Conţinutul vasului este apoi centrifugat la temperatura de testare şi concentraţia de probă în faza apoasă clară este determinată printr-o metodă analitică adecvată. Celelalte două flacoane sunt tratate similar după atingerea echilibrului iniţial la 30 oC timp de 2, respectiv 3 zile. Când concentraţia rezultată cel puţin din ultimele două vase este în concordanţă cu reproductibilitatea cerută, testul este satisfăcător. Întregul test se repetă, folosind timpi de echilibru mai lungi, dacă rezultatele de la vasele 1, 2 şi 3 arată o tendinţă de creştere a valorilor. Procedeul de măsurare poate fi aplicat şi fără preincubare la 30 oC. Pentru a estima durata necesară stabilirii echilibrului de saturaţie se iau probe până în momentul în care timpul de agitare nu mai influenţează concentraţia soluţiei de probă. Se înregistrează pH-ul fiecărei probe.

1.6.5. Analiză Pentru aceste determinări se preferă o metodă analitică specifică substanţei, deoarece cantităţi mici de impurităţi solubile pot antrena erori mari la măsurarea solubilităţii. Exemple de astfel de metode sunt: cromatografia de gaz sau lichid, metodele titrimetrice, metodele fotometrice, metodele voltametrice.

2. DATE

2.

2.1. METODA ELUŢIEI PE COLOANĂ Valoarea medie obţinută de la cel puţin cinci probe consecutive în zona platoului de saturaţie al curbei de solubilitate în funcţie de timp se ia în considerare pentru calculul saturaţiei, precum şi pentru calcularea deviaţiei standard. Rezultatele se exprimă în unităţi de masă pe volum de soluţie. Mediile calculate pe două teste folosind debite diferite se compară şi trebuie să aibă o repetabilitate mai mică de 30 %.

2.2. METODA PRIN SOLUBILITATE ÎN FLACON Se prezintă rezultatele individuale pentru fiecare dintre cele trei flacoane, iar pentru acele rezultate considerate a fi constante (repetabilitate mai mică de 15 %) se calculează media, care se exprimă în unităţi de masă pe volum de soluţie. Poate fi necesară convertirea unităţilor de masă în unităţi de volum, folosind densitatea, dacă solubilitatea este foarte mare (> 100 grame pe litru).

3. RAPORT

3.

3.1. METODA ELUŢIEI PE COLOANĂ Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

rezultatele testului preliminar;

specificaţiile exacte ale substanţei (identitate şi impurităţi);

concentraţiile individuale, debitele şi pH-ul pentru fiecare eşantion;

deviaţia medie şi deviaţia standard de la cel puţin 5 probe din zona platoului de saturaţie a fiecărei testări;

media a două testări succesive, acceptabile;

temperatura apei în timpul procesului de saturaţie;

metoda de analiză folosită;

natura suportului folosit;

cantitatea de substanţă depusă pe suport;

solventul folosit;

dovezi despre orice instabilitate chimică a substanţei în timpul testului şi metoda folosită;

toate informaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special referitoare la impurităţi şi la starea fizică a substanţei.

3.2. METODA FLACONULUI Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

rezultatele testului preliminar;

specificaţiile exacte ale substanţei (identitate şi impurităţi);

determinările analitice individuale şi media lor, acolo unde a fost determinată mai mult decât o valoare pentru fiecare flacon;

pH-ul fiecărui eşantion;

media valorilor pentru flacoanele diferite aflate în concordanţă;

temperatura de testare;

metoda analitică folosită;

dovezi despre orice instabilitate chimică a substanţei în timpul testului şi metoda folosită;

toate informaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special referitoare la impurităţi şi starea fizică a substanţelor.

4.1.2.3. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF T 20-045 (AFNOR) (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method. NF T 20-046 (AFNOR) (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.

A.8. COEFICIENTUL DE PARTIŢIE

A.8.

1. METODĂ Metoda agitării flaconului descrisă se bazează pe orientările OCDE privind testele (1).

1.

1.1. INTRODUCERE Pentru efectuarea acestui test este util să se colecteze informaţii preliminare despre formula structurală, constanta de disociere, solubilitatea în apă, hidroliză, solubilitatea în n-octanol şi tensiunea superficială a substanţei. Măsurătorile se fac pe substanţe ionizabile, numai în forma lor neionizată (acizi liberi şi baze libere) produse prin folosirea unei soluţii tampon adecvate, cu un pH de cel puţin o unitate de mai mic (acizi liberi) sau mai mare (baze libere) decât pK. Această metodă de analiză include două metode separate: metoda agitării flaconului şi cromatografia lichidă de mare performanţă (HPLC). Prima este aplicabilă când valoarea log Pow (pentru definiţii a se vedea mai jos) este în intervalul de la – 2 la 4, iar cea de-a doua în intervalul de la 0 la 6. Înainte de a aplica oricare dintre metodele experimentale se obţine o estimare a coeficientului de partiţie. Metoda agitării flaconului se aplică numai substanţelor pure solubile în apă şi în n-octanol. Nu este aplicabilă agenţilor tensioactivi (pentru care se furnizează o valoare calculată sau estimată a solubilităţii individuale în apă şi n-octanol). Metoda HPLC nu este aplicabilă acizilor şi bazelor puternice, complecşilor metalici, agenţilor tensioactivi sau substanţelor care reacţionează cu eluentul. Pentru aceste materiale se furnizează valori calculate sau estimate ale solubilităţii individuale în apă şi n-octanol. Metoda HPLC este mai puţin sensibilă la prezenţa impurităţilor din probă decât metoda agitării flaconului. Cu toate acestea, în unele cazuri impurităţile pot face interpretarea rezultatelor dificilă pentru că identificarea picurilor devine incertă. Pentru amestecuri care dau o bandă imprecisă se menţionează limitele superioară şi inferioară ale log P.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Coeficientul de partiţie (P) este definit ca raportul dintre concentraţiile de echilibru (ci) ale substanţei dizolvate în sistemul bifazic constând din doi solvenţi aproape nemiscibili. În cazul n-octanol şi apă: pow=cn-octanolcwater Coeficientul de partiţie (P) este prin urmare raportul dintre două concentraţii şi de regulă este exprimat ca logaritm în baza 10 (log P).

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ

1.3. Metoda agitării flaconului

Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă în toate cazurile în care se studiază o nouă substanţă. Acestea trebuie în special să servească la etalonarea periodică a metodei şi la comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode.

Metoda HPLC

Pentru a corela datele despre un compus determinate prin HPLC cu valoarea sa P, trebuie stabilit un grafic de calibrare log P vs. date cromatografice, folosind cel puţin 6 puncte de referinţă. Utilizatorul trebuie să selecteze substanţele de referinţă adecvate. Dacă este posibil, cel puţin un compus de referinţă trebuie să aibă Pow mai ridicat decât substanţa de testat şi un altul – un Pow mai scăzut decât eşantionul. Pentru valorile log P mai mici de 4, calibrarea se poate baza pe datele obţinute prin metoda agitării flaconului. Pentru valori log P mai mari de 4, calibrarea se poate baza pe valori recunoscute din literatură, dacă acestea sunt în concordanţă cu valorile calculate. Pentru o mai mare acurateţe, este preferabil să se aleagă compuşi de referinţă care sunt înrudiţi structural cu substanţa de testat. Este disponibilă o listă exhaustivă de valori pentru log Pow pentru mai multe grupe de substanţe chimice (2) (3). Dacă nu sunt disponibile date despre coeficienţii de partiţie ai compuşilor înrudiţi structural, atunci poate fi folosită o calibrare mai generală, stabilită cu alţi compuşi de referinţă. În apendicele 2 figurează o listă a substanţelor de referinţă recomandate care cuprinde şi valori pentru Pow.

1.4. PRINCIPIUL METODEI

1.4.

1.4.1. Metoda agitării flaconului Pentru a determina coeficientul de partiţie trebuie realizat echilibrul între toţi componenţii sistemului care interacţionează şi trebuie determinate concentraţiile substanţelor dizolvate în cele două faze. Un studiu asupra literaturii de specialitate dedicată acestui subiect indică mai multe tehnici diferite ce pot fi folosite pentru rezolvarea acestei probleme, de exemplu prin amestecarea completă a două faze urmată de separarea lor pentru a determina concentraţia de echilibru a substanţei.

1.4.2. Metoda HPLC HPLC este efectuat într-o coloană analitică umplută cu o fază solidă disponibilă în comerţ care conţine lanţuri lungi de hidrocarburi (de exemplu C8, C18) legate chimic pe silice. Substanţele injectate într-o astfel de coloană se mişcă de-a lungul ei cu diferite viteze din cauza gradelor diferite de partiţie între faza mobilă şi faza staţionară cu hidrocarburi. Eluţia amestecurilor de substanţe se face în funcţie de caracterul hidrofob, substanţele solubile în apă fiind eluate mai întâi şi cele solubile în solvenţi organici eluate ultimele, proporţional cu coeficientul lor de partiţie hidrocarbură/apă. Aceasta face posibilă să fie stabilită relaţia dintre timpul de retenţie pe o astfel de coloană (faza inversă) şi coeficientul de partiţie n-octanol/apă ce trebuie determinat. Coeficientul de partiţie este dedus din factorul de capacitate k, dat de: k=tr-toto în care tr = timpul de retenţie al substanţei de testat şi to = timpul mediu necesar unei molecule de solvent pentru a trece prin coloană (timp mort). Nu sunt necesare metode analitice cantitative, ci doar determinarea timpilor de eluţie.

1.5. CRITERII DE CALITATE

1.5.

1.5.1. Repetabilitatea

1.5.1. Metoda agitării flaconului

Pentru a asigura acurateţea măsurătorii coeficientului de partiţie trebuie realizate determinări duble în trei condiţii de testare diferite, prin care cantitatea de substanţă utilizată, precum şi raportul volumelor de solvent poate fi variat. Valorile determinate ale coeficientului de partiţie exprimate logaritmic vor fi în intervalul ±0,3 unităţi logaritmice.

Metoda HPLC

Pentru a creşte coeficientul de încredere al măsurătorilor, trebuie să fie făcute determinări duble. Valorile pentru log P derivate din măsurătorile individuale vor fi în intervalul ±0,1 unităţi logaritmice.

1.5.2. Sensibilitate

1.5.2. Metoda agitării flaconului

Intervalul de aplicabilitate al metodei este determinat de limita de detectare a metodei analitice. Aceasta trebuie să permită evaluarea valorilor log Pow în intervalul de la – 2 la 4 (ocazional, când condiţiile impun acest lucru, acest interval poate fi extins pentru log Pow până la 5) când concentraţia solutului în oricare fază nu este mai mare de 0,01 mol pe litru.

Metoda HPLC

Metoda HPLC face posibilă estimarea coeficienţilor de partiţie în intervalul 0 până la 6 pentru log Pow. În mod normal, coeficientul de partiţie al unui compus poate fi estimat cu o eroare de ±1 unitate logaritmică faţă de valoarea determinată prin metoda agitării flaconului. Corelaţii tipice pot se găsesc în literatura de specialitate (4) (5) (6) (7) (8). O mai mare acurateţe poate fi obţinută în mod normal când graficele de corelare se bazează pe compuşi de referinţă înrudiţi structural (9).

1.5.3. Specificitate

1.5.3. Metoda agitării flaconului

Legea partiţiei a lui Nernst se aplică numai la temperatură, presiune şi pH constante pentru soluţii diluate. Ea se aplică strict unei substanţe pure dispersată între doi solvenţi puri. Dacă sunt prezenţi diferiţi soluţi în una sau în ambele faze în acelaşi timp, aceasta poate afecta rezultatele. Disocierea sau asocierea moleculelor dizolvate duce la deviaţii de la legea partiţiei a lui Nernst. Astfel de deviaţii sunt indicate de funcţia care descrie dependenţa coeficientului de partiţie de concentraţia soluţiei. Întrucât presupune echilibre multiple, această metodă nu se foloseşte în cazul compuşilor ionizabili fără a aplica o corecţie. Pentru astfel de compuşi se ia în considerare folosirea soluţiilor tampon în locul apei; pH-ul soluţiei tampon trebuie să difere cu cel puţin 1 unitate de pKa-ul substanţei ţinând seama şi de semnificaţia acestui pH pentru mediu.

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.1. Estimarea preliminară a coeficientului de partiţie Coeficientul de partiţie este estimat de preferinţă prin calcul (a se vedea apendicele 1) sau, acolo unde este posibil, prin raportul solubilităţilor substanţei testate în solvenţi puri (10).

1.6.2. Metoda agitării flaconului

1.6.2.

1.6.2.1. Pregătire n-Octanol: Determinarea coeficientului de partiţie va fi efectuată cu reactivi de puritate analitică ridicată. Apă: se foloseşte apă distilată sau dublu distilată în aparate din sticlă sau cuarţ. Dacă este cazul, pentru compuşii ionizabili vor fi folosite în locul apei soluţii tampon. Notă: Nu se foloseşte apa luată direct dintr-un aparat cu schimbători de ioni.

1.6.2.1.

1.6.2.1.1. Presaturarea solvenţilor Înaintea determinării coeficientului de partiţie, fazele sistemului de solvent sunt saturate reciproc prin agitare la temperatura de testare. În acest scop, de obicei se agită două sticle mari cu n-octanol de puritate analitică sau apă, fiecare cu o cantitate suficientă din celălalt solvent, timp de 24 de ore, cu un agitator mecanic, apoi se lasă suficient de mult timp pentru a permite fazelor să se separe şi pentru a realiza o stare de saturaţie.

1.6.2.1.2. Pregătirea testului Întregul volum al sistemului bifazic trebuie să umple aproape total vasul de testare. Aceasta va ajuta la prevenirea pierderilor de material datorită volatilizării. Raportul volumelor şi cantităţile de substanţă ce vor fi folosite sunt fixate prin următoarele condiţii: Sunt efectuate 3 măsurători. În prima este folosit raportul de volume n-octanol/apă calculat; în a doua măsurătoare acest raport se împarte la 2; în a treia acest raport înmulţeşte cu 2 (de exemplu 1:1, 1:2, 2:1).

evaluarea preliminară a coeficientului de partiţie (a se vedea mai sus);

cantitatea minimă din substanţa de testat necesară la determinările analitice; şi

limita concentraţiei maxime în fiecare fază este de 0,01 mol pe litru.

1.6.2.1.3. Substanţa de testat O soluţie mamă este preparată în n-octanol presaturat cu apă. Concentraţia acestei soluţii mamă va fi determinată cu precizie înaintea folosirii ei pentru stabili coeficientului de partiţie. Această soluţie va fi depozitată în condiţii care să-i asigure stabilitatea.

1.6.2.2. Condiţii experimentale Temperatura de testare se menţine constantă (± 1 oC) şi se află în intervalul 20-25 oC.

1.6.2.3. Procedeul de măsurare

1.6.2.3.

1.6.2.3.1. Stabilirea echilibrului de partiţie Pentru fiecare dintre condiţiile de testare se pregătesc două vase de testare conţinând cantităţile necesare, precis măsurate din cei doi solvenţi, împreună cu cantitatea necesară din soluţia mamă. Fazele cu n-octanol vor fi măsurate volumetric. Vasele de testare sunt amplasate într-un agitator adecvat sau sunt agitate în mână. Când se foloseşte un tub de centrifugă, o metodă recomandată este aceea să se rotească acest tub repede într-o direcţie aflată la 180o faţă de axa sa transversală, astfel încât aerul captat să se ridice prin cele două faze. Experienţa a arătat că 50 de astfel de rotaţii sunt de regulă suficiente pentru stabilirea partiţiei de echilibru. Pentru siguranţă se recomandă 100 de rotaţii în 5 minute.

1.6.2.3.2. Separarea fazelor Dacă este necesar, se efectuează centrifugarea amestecului pentru a separa fazele. Acest lucru se desfăşoară într-o centrifugă de laborator menţinută la temperatura camerei sau, dacă este folosită o centrifugă netermostatată, tuburile centrifugei se păstrează pentru echilibrare la temperatura de testare cel puţin o oră înainte de analiză.

1.6.2.4. Analiza Pentru determinarea coeficientului de partiţie este necesară determinarea concentraţiilor de substanţă analizată în ambele faze. Aceasta poate fi făcută prin prelevarea unei probe alicote din fiecare din cele două faze din fiecare tub pentru fiecare condiţie de testare şi analizarea lor prin metoda aleasă. Cantitatea totală de substanţă prezentă în ambele faze se calculează şi se compară cu cantitatea de substanţă introdusă la început. Faza apoasă este eşantionată printr-o operaţiune care reduce la minim riscul includerii unor urme de n-octanol: o seringă de sticlă cu ac detaşabil poate fi folosită pentru a lua probe din faza apoasă. Iniţial, seringa se umple parţial cu aer. Aerul se elimină cu atenţie în timp ce se introduce acul prin stratul de n-octanol. Un volum corespunzător din faza apoasă este tras în seringă. Seringa se scoate repede din soluţie şi acul se detaşează. Conţinutul seringii poate fi apoi folosit ca probă apoasă. Concentraţia în cele două faze separate este determinată de preferinţă printr-o metodă specifică substanţei. Exemple de metode analitice adecvate sunt:

metode fotometrice;

cromatografia cu gaz;

cromatografia lichidă de înaltă performanţă.

1.6.3. Metoda HPLC

1.6.3.

1.6.3.1. Pregătire

1.6.3.1. Aparatură

Este necesar un cromatograf de lichide la care s-a ataşat o pompă fără pulsaţii şi un instrument de detecţie adecvat. Este recomandată folosirea unei valve de injecţie cu bucle de injecţie. Prezenţa grupelor polare în faza staţionară poate diminua serios performanţele coloanei HPLC. Prin urmare, faza staţionară va avea un procent minim de grupe polare (11). Pot fi folosite umpluturi de microparticule pentru inversarea fazelor sau coloane gata umplute. O coloană de gardă poate fi poziţionată între sistemul de injecţie şi coloana analitică.

Faza mobilă

Pentru a prepara solventul de eluţie se foloseşte metanol grad HPLC şi apă de puritate HPLC; solventul este degazat înainte de folosire. Se foloseşte eluţia izocratică. Se utilizează un raport metanol/apă cu un conţinut minim de apă de 25 %. În general, un amestec metanol-apă 3:1 este satisfăcător pentru eluţia compuşilor cu log P 6 într-o oră, la un debit de 1 ml/minut. Pentru compuşii cu log P mare poate fi necesar să se scurteze timpul de eluţie (şi cel al compuşilor de referinţă) prin descreşterea polarităţii fazei mobile sau a lungimii coloanei. Substanţele cu solubilitate foarte scăzută în n-octanol tind să dea valori neobişnuit de mici pentru log Pow prin metoda HPLC; picurile unor astfel de compuşi însoţesc uneori frontul de solvent. Aceasta se datorează probabil faptului că procesul de partiţie este prea lent pentru a atinge echilibrul în timpul necesar în mod normal pentru o separare. Scăderea debitului şi/sau micşorarea raportului metanol/apă poate fi o măsură eficientă pentru a ajunge la o valoare fiabilă. Compuşii de testare şi compuşii de referinţă trebuie să fie solubili în faza mobilă într-o concentraţie suficientă pentru a permite detectarea lor. Numai în cazuri excepţionale pot fi folosiţi aditivi împreună cu amestecul metanol-apă, deoarece aditivii vor schimba proprietăţile coloanei. Pentru cromatograme cu aditivi este obligatoriu să se folosească o coloană separată de acelaşi tip. Dacă amestecul metanol-apă nu este corespunzător, pot fi folosite alte amestecuri solvent organic-apă, de exemplu etanol-apă sau acetonitril-apă. PH-ul eluentului este un factor critic pentru compuşii ionizabili. Trebuie să fie în intervalul de pH al coloanei, care este de obicei cuprins între 2 şi 8. Este recomandabilă tamponarea. Se evită atent precipitarea sărurilor şi deteriorarea coloanei în cazul unor amestecuri fază organică-soluţie tampon. Măsurătorile HPLC cu fază staţionară de silicagel nu sunt recomandabile în cazul unui pH mai mare de 8 deoarece folosirea unei faze mobile alcaline poate cauza scăderea rapidă a performanţelor coloanei.

Soluţii

Compuşii de referinţă sunt cei mai puri disponibili. Dacă este posibil, compuşii care sunt folosiţi în scopuri de testare sau calibrare se dizolvă în faza mobilă.

Condiţii experimentale

În timpul măsurătorilor, temperatura nu variază cu mai mult de ± 2 K.

1.6.3.2. Măsurători

1.6.3.2. Calcularea timpului mort t0

Timpul mort t0 poate fi determinat prin folosirea unei serii omoloage (de exemplu n-alchil metil cetone) sau compuşi organici care nu se absorb pe coloană (de exemplu tioureea sau formamida). Pentru calcularea timpului mort t0 prin folosirea unei serii omoloage, un set de cel puţin 7 membri ai seriei omoloage este injectat şi sunt determinaţi timpii respectivi de retenţie. Timpii retenţiei brute tr(nc+1) sunt reprezentaţi ca funcţie de tr(nc) şi sunt determinate constanta a şi panta b a ecuaţiei de regresie: tr (nc + 1) = a + b tr (nc) (nc = numărul de atomi de carbon).Timpul mort t0 este dat de: t0 = a/(l – b)

Graficul de calibrare

Următorul pas este trasarea graficului de corelaţie între valorile lui log k şi log P pentru compuşii de referinţă. În practică, un set de 5 până la 10 compuşi de referinţă standard al căror log P se găseşte în limitele intervalului preconizat se injectează simultan şi se determină timpii de retenţie, preferabil cu un înregistrator conectat la sistemul de detecţie. Se calculează logaritmii corespunzători ai factorilor de capacitate, log k, şi se trasează graficul funcţiei log P determinat prin metoda agitării flaconului. Calibrarea se execută la intervale egale, cel puţin o dată pe zi, aşa încât să se poată ţine seama de posibilele schimbări în performanţele coloanei.

Determinarea factorului de capacitate al substanţei de testat

Proba este injectată într-o cantitate cât mai mică posibil de fază mobilă. Se determină timpul de retenţie (în duplicat), permiţând calcularea factorului de capacitate k. Din graficul de corelare al compuşilor de referinţă poate fi interpolat coeficientul de partiţie al substanţei de testat. Pentru coeficienţii de partiţie foarte mici şi pentru cei foarte mari, este necesară extrapolarea. În aceste cazuri particulare trebuie să se acorde atenţie limitelor de încredere ale liniei de regresie.

2. DATE

2. Metoda agitării flaconului

Fiabilitatea valorilor determinate pentru P poate fi testată prin compararea valorilor medii rezultate la determinările duble cu media generală.

3. RAPORT Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

specificaţiile exacte ale substanţei (identitate şi impurităţi);

când metodele nu sunt aplicabile (de exemplu, pentru agenţii tensioactivi) se prezintă o valoare calculată sau una estimată bazată pe solubilităţile individuale în n-octanol şi apă;

toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special cele referitoare la impurităţi şi la starea fizică a substanţei.

rezultatul estimării preliminare, dacă există;

temperatura la care s-au făcut determinările;

date despre metodele analitice folosite pentru determinarea concentraţiilor;

timpul şi viteza de centrifugare, dacă a fost folosită;

concentraţiile măsurate în ambele faze pentru fiecare determinare (aceasta înseamnă că se prezintă un total de 12 concentraţii);

masa substanţei de testat, volumul fiecărei faze folosite în fiecare vas de testare şi cantitatea totală calculată de substanţă, prezentă în fiecare fază după atingerea echilibrului;

valorile calculate ale coeficientului de partiţie (P) şi media lor se consemnează pentru fiecare set de condiţii experimentale, ca şi media pentru toate determinările. Dacă există vreun indiciu privind coeficientul de partiţie în funcţie de concentraţie, aceasta este notată în raport;

se consemnează deviaţia standard a valorilor individuale ale lui P de la media lor;

media P a tuturor determinărilor se exprimă şi ca logaritm (în baza 10);

valoarea calculată teoretic pentru Pow când această valoare a fost determinată sau când valoarea măsurată este > 104;

pH-ul apei folosite în timpul experimentului şi al fazei apoase;

dacă sunt folosite soluţii tampon, justificarea pentru folosirea soluţiilor tampon în locul apei, compoziţia, concentraţia şi pH-ul soluţiilor tampon, pH-ul fazei apoase, înainte şi după experiment.

rezultatul estimării preliminare, dacă există;

substanţele de referinţă şi de testat şi puritatea lor;

intervalul de temperatură al determinărilor;

pH-ul la care au fost făcute determinările;

detalii despre coloana analitică şi de gardă, faza mobilă şi mijlocul de detecţie;

datele privind retenţia şi valorile log P din literatură pentru compuşii de referinţă folosiţi la calibrare;

detalii despre dreapta de regresie calculată (log k în funcţie de log P);

datele de retenţie medii şi valoarea interpolată log P pentru compusul de testat;

descrierea echipamentului şi a condiţiilor de operare;

profilurile de eluţie;

cantităţile de substanţă de testat şi de referinţă introduse în coloană;

timpul mort şi cum a fost măsurat.

4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, p. 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, p. 219 (1981). B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, p. 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, p. 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, p. 223-339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, p. 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, p. 1113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, p. 382. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984. Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Base1,1978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, p. 615.

A.9. PUNCTUL DE INFLAMABILITATE

A.9.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Pentru efectuarea acestui test, este util să se colecteze informaţii preliminare despre inflamabilitatea substanţei. Modul de operare este aplicabil substanţelor lichide ai căror vapori se pot aprinde în prezenţa unei surse de aprindere. Metodele de testare prezentate în acest text sunt fiabile numai pentru intervalele de puncte de inflamabilitate specificate pentru fiecare metodă în parte. La alegerea metodei ce urmează să fie folosită se va lua în considerare posibilitatea apariţiei unor reacţii chimice între substanţă şi suportul probei.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Punctul de inflamabilitate este cea mai joasă temperatură, corectată la presiunea de 101,325 kPa, la care lichidul degajă vapori, în condiţiile specifice ale metodei de analiză, într-o asemenea cantitate încât în vasul de testare se produce un amestec inflamabil vapori/aer. Unităţi: oC t = T – 273,15 (t în oC şi T în K)

1.4. PRINCIPIUL METODEI Substanţa se introduce în vasul de testare şi este încălzită sau răcită până la temperatura de testare conform procedurii specifice metodei de testare. Încercările de aprindere sunt efectuate pentru a dovedi dacă eşantionul se aprinde sau nu la temperatura de testare.

1.5. CRITERII DE CALITATE

1.5.

1.5.1. Repetabilitate Repetabilitatea variază în funcţie de intervalul punctului de inflamabilitate şi de metoda folosită; maximum 2 oC.

1.5.2. Sensibilitate Sensibilitatea depinde de metoda de testare folosită.

1.5.3. Specificitate Specificitatea unora dintre metode este limitată la anumite intervale de puncte de inflamabilitate şi depinde de caracteristicile substanţei (de exemplu, viscozitate mare).

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.1. Pregătiri O probă de substanţă se introduce într-un aparat de testare în conformitate cu punctul 1.6.3.1 şi/sau 1.6.3.2. Pentru siguranţă se recomandă ca pentru substanţele reactive sau toxice să fie folosită o metodă care utilizează o cantitate mică de probă, circa 2 cm3.

1.6.2. Condiţii experimentale Aparatul se aşează într-o poziţie fără curenţi de aer, în conformitate cu normele de siguranţă.

1.6.3. Desfăşurarea testului

1.6.3.

1.6.3.1. Metoda echilibrului A se vedea ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2. Metoda non-echilibrului

1.6.3.2. Aparatul Abel:

A se vedea BS 2000 partea 170, NF M07-011, NF T66-009.

Aparatul Abel-Pensky:

A se vedea EN 57, DIN 51755 partea 1 (pentru temperaturi de la 5o la 65 oC), DIN 51755 partea 2 (pentru temperaturi sub 5 oC), NF M07-036.

Aparatul Tag:

A se vedea ASTM D 56.

Aparatul Pensky-Martens:

A se vedea ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Observaţii:

Când punctul de inflamabilitate, determinat printr-o metodă de non-echilibru în conformitate cu punctul 1.6.3.2, are valori de 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC sau 55 ± 2 oC, acest lucru se confirmă printr-o metodă de echilibru, folosindu-se acelaşi aparat. Numai metodele prin care se poate determina temperatura de inflamabilitate pot fi folosite pentru notificări. Pentru a determina punctul de inflamabilitate al lichidelor vâscoase (vopsele, răşini şi altele similare) care conţin solvenţi, pot fi folosite numai aparate şi metode potrivite pentru determinarea punctului de inflamabilitate al lichidelor vâscoase. A se vedea ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 partea 1.

2. DATE

3. RAPORT Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

specificaţiile exacte ale substanţei (identificare şi impurităţi);

o descriere a metodei folosite, precum şi orice posibile abateri;

rezultatele şi orice observaţie suplimentară relevantă pentru interpretarea rezultatelor.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE Niciuna.

A.10. INFLAMABILITATE (SOLIDE)

A.10.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Înainte de efectuarea testului este util să se colecteze informaţii preliminare asupra posibilelor proprietăţi explozive ale substanţei. Acest test se aplică numai substanţelor sub formă de pulbere, granule sau pastă. Pentru a nu include toate substanţele care se pot aprinde, ci numai acelea care ard rapid sau acelea al căror comportament la ardere este periculos în orice mod, se consideră că sunt foarte inflamabile numai substanţele a căror viteză de ardere depăşeşte o anumită valoare-limită. Poate fi deosebit de periculos dacă incandescenţa se propagă printr-o pulbere metalică din cauza dificultăţilor în stingerea focului. Pulberile metalice vor fi considerate foarte inflamabile dacă întreţin propagarea incandescenţei în toată masa într-un interval de timp definit.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Timpul de ardere este exprimat în secunde.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Nu sunt menţionate.

1.4. PRINCIPIUL METODEI Substanţa este dispusă sub forma unei benzi continue sau a unui amestec de pulbere explozivă de aproximativ 250 mm lungime şi este efectuat un test preliminar pentru a stabili dacă are loc, prin aprindere cu o flacără de gaz, propagarea prin ardere cu flacără sau mocnit. Dacă propagarea de-a lungul a 200 mm de amestec are loc într-un interval de timp specificat, atunci se efectuează un program complet de testare pentru a determina viteza de ardere.

1.5. CRITERII DE CALITATE Nu sunt menţionate.

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.1. Testul preliminar Substanţa este dispusă sub forma unui cartuş compact sau a unui amestec de pulbere explozivă de aproximativ 250 mm lungime, 20 mm lăţime, 10 mm înălţime, pe o placă de bază necombustibilă, neporoasă şi care nu conduce bine căldura. O flacără de la un arzător cu gaz (minimum 5 mm diametru) este aplicată la unul din capetele amestecului de pulbere explozivă până când pulberea se aprinde sau timp de maximum 2 minute (5 minute pentru pulberi metalice sau de aliaje metalice). Se observă dacă de-a lungul celor 200 mm de amestec combustia se propagă în perioada de testare de 4 minute (sau 40 de minute pentru pulberile de metal). Dacă substanţa nu se aprinde şi combustia nu se propagă, nici prin ardere cu flacără, nici prin ardere mocnită, de-a lungul celor 200 mm de amestec de pulbere explozivă în perioada de testare de 4 minute (sau 40 minute), atunci substanţa nu este considerată foarte inflamabilă şi nu este necesară o altă testare. Dacă substanţa propagă arderea de-a lungul a 200 mm lungime de amestec de pulbere explozivă în mai puţin de 4 minute, sau mai puţin de 40 de minute pentru pulberile metalice, atunci se urmează metoda descrisă mai jos (punctul 1.6.2 şi următoarele).

1.6.2. Testarea vitezei de ardere

1.6.2.

1.6.2.1. Pregătire Substanţele granulare sau pulberile sunt introduse lejer într-o matriţă de 250 mm lungime cu secţiune transversală triunghiulară cu înălţime interioară de 10 mm şi lăţime de 20 mm. Pe ambele feţe ale matriţei, pe direcţie longitudinală, se montează două plăci metalice ca opritoare laterale care depăşesc cu 2 mm extremitatea superioară a secţiunii transversale triunghiulare (figura). Apoi se lasă matriţa să cadă de trei ori de la o înălţime de 2 cm pe o suprafaţă solidă. Dacă este necesar, forma este apoi umplută din nou. Substanţa în exces care rămâne se curăţă cu o racletă oblică. Plăcile opritoare se scot şi substanţa rămasă este îndepărtată cu o racletă. Se pune deasupra matriţei o placă de bază necombustibilă, neporoasă şi slab conducătoare de căldură, ansamblul este răsturnat şi se scoate forma. Substanţele sub formă de pastă sunt întinse pe o placă necombustibilă, neporoasă şi slab conducătoare de căldură sub forma unei fâşii de 250 mm lungime cu o secţiune transversală de aproximativ 1 cm.

1.6.2.2. Condiţii experimentale În cazul substanţelor sensibile la umezeală, testul va fi efectuat cât mai repede posibil după scoaterea din recipient.

1.6.2.3. Desfăşurarea testului Se pune eşantionul perpendicular pe curentul de aer din nişa de tiraj. Viteza aerului trebuie să fie suficientă pentru a preveni degajarea vaporilor în laborator şi să nu varieze în timpul testului. Curentul de aer trebuie să formeze un ecran în jurul aparatului. O flacără fierbinte de la un arzător cu gaz (minimum 5 mm diametru) este folosită pentru a aprinde substanţa în formă de cartuş, la o margine. Când cartuşul a ars pe o distanţă de 80 mm se măsoară viteza de ardere de-a lungul următorilor 100 de mm. Testul se efectuează de 6 ori, folosind de fiecare dată o placă rece, curată, afară de cazul când este observat mai devreme un rezultat pozitiv.

2. DATE Timpul de ardere din testul preliminar (1.6.1) şi cel mai scurt timp de ardere din cele 6 teste (1.6.2.3) sunt relevante pentru evaluare.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORT DE TESTARE Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

specificaţiile exacte ale substanţei (identificare şi impurităţi);

o descriere a substanţei de testat, starea sa fizică, inclusiv conţinutul de umezeală;

rezultatele testului preliminar de triere şi ale testului vitezei de ardere, dacă au fost efectuate;

toate observaţiile suplimentare relevante pentru interpretarea rezultatelor.

3.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR Substanţele sub formă de pulbere, pastă sau granulare se consideră foarte inflamabile dacă timpul de ardere dintr-unul din testele efectuate conform metodei de testare descrise la 1.6.2. este mai mic de 45 de secunde. Pulberile metalice sau de aliaje metalice sunt considerate foarte inflamabile dacă pot fi aprinse şi flacăra sau zona de reacţie se întinde asupra întregului eşantion în 10 minute sau mai puţin.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

A.11. INFLAMABILITATE (GAZE)

A.11.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Prin această metodă se determină dacă amestecurile de gaze cu aer, la temperatura camerei (circa 20 oC) şi presiune atmosferică, sunt inflamabile şi, în acest caz, în ce interval de concentraţii. Amestecurile cu aer ale gazului testat, în concentraţii crescânde, sunt expuse unei scântei electrice şi se observă dacă are loc aprinderea.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Intervalul de inflamabilitate este intervalul de concentraţie dintre limita de explozie inferioară şi cea superioară. Limitele de explozie inferioară şi superioară sunt acele limite de concentraţie ale gazului inflamabil în aer la care propagarea flăcării nu are loc.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Nu sunt menţionate.

1.4. PRINCIPIUL METODEI Concentraţia gazului în aer se creşte treptat şi în fiecare etapă amestecul se expune la scânteie electrică.

1.5. CRITERII DE CALITATE Nu sunt menţionate.

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.1. Aparatură Vasul de testare este un cilindru de sticlă vertical cu un diametru interior de minimum 50 mm şi o înălţime de minimum 300 de mm. Electrozii de aprindere sunt separaţi de o distanţă de 3 până la 5 mm şi sunt plasaţi la 60 mm deasupra fundului cilindrului. Cilindrul este prevăzut cu o supapă de descărcare a presiunii. Aparatul trebuie să fie protejat pentru a limita posibilele efecte ale exploziei. Ca sursă de aprindere este folosită o scânteie cu o durată de 0,5 secunde, generată de un transformator de înaltă tensiune cu o tensiune de ieşire de 10-15 kV (maximum de putere consumată 300 W). Un exemplu de aparat adecvat este descris în referinţa bibliografică 2.

1.6.2. Condiţii experimentale Testul trebuie efectuat la temperatura camerei (circa 20 oC).

1.6.3. Desfăşurarea testului Folosind o pompă dozatoare, un amestec cu concentraţie cunoscută de gaz în aer este introdus în cilindrul de sticlă. Prin amestec se trece o scânteie şi se observă dacă flacăra se detaşează de sursa de aprindere şi se propagă independent. Concentraţia gazului este mărită în paşi de 1 % din volum până când are loc aprinderea conform descrierii de mai sus. Dacă structura chimică a gazului indică faptul că acesta nu este inflamabil şi poate fi calculată compoziţia amestecului stoechiometric cu aerul, atunci este necesar să se testeze numai amestecuri din intervalul de la 10 % sub concentraţia stoechiometrică până la 10 % peste această concentraţie, în paşi de 1 %.

2. DATE Propagarea flăcării este singura informaţie relevantă pentru determinarea acestei proprietăţi.

3. RAPORT Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

specificaţiile exacte ale substanţei (identificare şi impurităţi);

o descriere, cu dimensiuni, a aparatului utilizat;

temperatura la care a fost efectuat testul;

concentraţiile testate şi rezultatele obţinute;

rezultatul testului: gaz neinflamabil sau gaz foarte inflamabil;

dacă se ajunge la concluzia că gazul nu este inflamabil, se va specifica intervalul de concentraţie în care a fost testat în paşi de 1 %;

toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor trebuie raportate.

4.1.2. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE NF T 20-041 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.- Tech. 1984, vol, 156, 2, p. 126-127. Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. 'Entwicklung

A.12. INFLAMABILITATE (CONTACTUL CU APA)

A.12.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Metoda poate fi folosită pentru a stabili dacă reacţia substanţei cu apa sau cu umezeala din aer conduce la degajarea unor cantităţi periculoase de gaz sau gaze foarte inflamabile. Metoda poate fi aplicată atât substanţelor solide, cât şi celor lichide. Această metodă nu este aplicabilă substanţelor care se aprind în mod spontan în contact cu aerul.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Foarte inflamabil: o substanţă care în contact cu apa sau aerul umed degajă gaze foarte inflamabile în cantităţi periculoase la un debit minim de 1 litru/kg pe oră.

1.3. PRINCIPUL METODEI Substanţa este testată în concordanţă cu succesiunea de paşi descrisă mai jos; dacă are loc aprinderea la unul din paşi, nu mai este necesară testarea în continuare. Dacă se ştie că substanţa nu reacţionează violent cu apa atunci se va trece direct la pasul 4 (punctul 1.3.4).

1.3.

1.3.1. Pasul 1 Proba se introduce într-un jgheab care conţine apă distilată la 20 oC şi se notează dacă gazul dezvoltat se aprinde.

1.3.2. Pasul 2 Substanţa este plastă pe o hârtie de filtru care pluteşte la suprafaţa apei distilate dintr-o capsulă de laborator, la 20 oC, şi se observă dacă gazul dezvoltat se aprinde. Hârtia de filtru are rolul numai de a ţine substanţa într-un loc, pentru a creşte şansa de aprindere.

1.3.3. Pasul 3 Eşantionul este prelucrat sub forma unui cartuş de aproximativ 2 cm înălţime şi 3 cm diametru. Se adaugă câteva picături de apă şi se notează dacă gazul dezvoltat se aprinde.

1.3.4. Pasul 4 Eşantionul este amestecat cu apă distilată la 20 oC şi este măsurată viteza de degajare a gazului în timpul unei perioade de 7 ore, la intervale de 1 oră. Dacă viteza de degajare este inegală, sau este crescătoare, după 7 ore, timpul de măsurare poate fi extins la un timp maxim de 5 zile. Testul poate fi oprit dacă viteza la un moment dat depăşeşte 1 l/kg/h.

1.4. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Nu sunt menţionate.

1.5. CRITERII DE CALITATE Nu sunt menţionate.

1.6. DESCRIEREA METODELOR

1.6.

1.6.1. Pasul 1

1.6.1.

1.6.1.1. Condiţii experimentale Testul este efectuat la temperatura camerei (circa 20 oC).

1.6.1.2. Desfăşurarea testului O cantitate mică (aproximativ 2 mm diametru) din eşantion se introduce într-un jgheab cu apă distilată. Se notează dacă (i) se dezvoltă vreun gaz şi (ii) dacă are loc aprinderea gazului. Dacă are loc aprinderea gazului, nu mai este necesară testarea în continuare a substanţei deoarece substanţa este considerată periculoasă.

1.6.2. Pasul 2

1.6.2.

1.6.2.1. Aparatură O hârtie de filtru este făcută să plutească pe suprafaţa plană de apă distilată într-un vas potrivit, de exemplu o sticlă de ceas cu 100 mm diametru.

1.6.2.2. Condiţii experimentale Testul se efectuează la temperatura camerei (circa 20 oC).

1.6.2.3. Desfăşurarea testului O cantitate mică (aproximativ 2 mm diametru) din eşantion se introduce în centrul unei hârtii de filtru. Se va nota dacă (i) apar gaze şi (ii) dacă are loc aprinderea gazului. Dacă are loc aprinderea gazului, nu mai este necesară testarea în continuare a substanţei deoarece substanţa este considerată periculoasă.

1.6.3. Pasul 3

1.6.3.

1.6.3.1. Condiţiile experimentale Testul se efectuează la temperatura camerei (circa 20 oC).

1.6.3.2. Desfăşurarea testului Eşantionul este prelucrat sub forma unui cartuş de aproximativ 2 cm înălţime şi 3 cm diametru şi cu o scobitură la vârf. Câteva picături de apă sunt adăugate în scobitură şi se notează dacă (i) apar gaze şi (ii) dacă are loc aprinderea gazului. Dacă are loc aprinderea gazului, nu mai este necesară testarea în continuare a substanţei deoarece substanţa este considerată periculoasă.

1.6.4. Pasul 4

1.6.4.

1.6.4.1. Aparatură Instalaţia este descrisă în figură.

1.6.4.2. Condiţiile experimentale Se examinează containerul cu eşantion pentru a observa dacă există pulberi < 500 μm (dimensiunea particulei). Dacă pulberea reprezintă mai mult de 1 % g/g din total sau dacă eşantionul este friabil, atunci toată substanţa va fi mojarată până la pulbere înainte de testare pentru a permite reducerea dimensiunilor particulelor în timpul depozitării şi manipulării; în caz contrar, substanţa va fi testată aşa cum a fost primită. Testul va fi efectuat la temperatura camerei (circa 20 oC) şi la presiune atmosferică.

1.6.4.3. Desfăşurarea testului 10-20 ml de apă se pun în pâlnia de picurare a aparatului şi 10 grame din substanţă se introduc în paharul conic. Volumul de gaz degajat poate fi măsurat prin orice mijloc corespunzător. Se deschide robinetul pâlniei de picurare pentru a lăsa apa să treacă în paharul conic şi se porneşte cronometrul. Degajarea gazului este măsurată la intervale de o oră de-a lungul unei perioade de 7 ore. Dacă în timpul acestei perioade degajarea gazului este inegală sau dacă la sfârşitul acestei perioade viteza de degajare a gazului este în creştere, atunci măsurătorile vor fi continuate timp de cel mult 5 zile. Dacă la un moment dat în timpul măsurărilor viteza de degajare a gazului depăşeşte 1 l/kg/oră, testul poate fi întrerupt. Testul se efectuează de 3 ori. Dacă identitatea chimică a gazului este necunoscută, gazul se analizează. Atunci când gazul conţine componenţi foarte inflamabili şi nu se cunoaşte dacă amestecul este foarte inflamabil, trebuie preparat un amestec cu aceeaşi compoziţie şi testat conform metodei A.11.

2. DATE Substanţa este considerată periculoasă dacă:

are loc o aprindere spontană în oricare din etapele metodei de testare; sau

există o degajare de gaz inflamabil cu o viteză mai mare de 1 l/kg de substanţă pe oră.

3. RAPORT Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

specificaţiile exacte ale substanţei (identificare şi impurităţi);

detalii despre prepararea iniţială a substanţei;

rezultatele testelor (paşii 1, 2, 3 şi 4);

identitatea chimică a gazului degajat;

viteza de degajare a gazului, dacă s-a efectuat pasul 4 (punctul 1.6.4);

orice observaţie suplimentară relevantă pentru interpretarea rezultatelor.

4.1.2. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

A.13. PROPRIETĂŢI PIROFORICE ALE SOLIDELOR ŞI ALE LICHIDELOR

A.13.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Procedura este aplicabilă substanţelor solide sau lichide care, în cantităţi mici, se aprind spontan la scurt timp după ce intră în contact cu aerul la temperatura camerei (circa 20 oC). Această metodă de testare nu reglementează substanţele care necesită expunere la aer ore sau zile la temperatura camerei sau cele la care se produce aprinderea la temperaturi ridicate.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Substanţele sunt considerate ca având proprietăţi piroforice dacă se aprind sau se carbonizează în condiţiile descrise la punctul 1.6. Autoaprinderea lichidelor poate fi, de asemenea, testată folosind metoda A.15 Temperatura de autoaprindere (lichide şi gaze).

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Nu sunt menţionate.

1.4. PRINCIPIUL METODEI Substanţa, solidă sau lichidă, este depusă pe un suport inert şi adusă în contact cu aerul la temperatura ambiantă timp de 5 minute. Dacă substanţele lichide nu se aprind, sunt absorbite pe o hârtie de filtru şi expuse la aer la temperatura ambiantă (circa 20 oC) pentru 5 minute. Dacă o substanţă lichidă ori solidă se aprinde sau dacă o substanţă lichidă aprinde sau carbonizează hârtia de filtru, atunci acea substanţă este considerată a fi piroforică.

1.5. CRITERII DE CALITATE Repetabilitatea: din motive de siguranţă, un singur rezultat pozitiv este suficient pentru ca substanţa să fie considerată piroforică.

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.1. Aparatură O capsulă de porţelan de cca. 10 cm diametru se umple cu pământ de diatomee până la o înălţime de aproximativ 5 mm, la temperatura camerei (circa 20 oC). Notă: Pământul de diatomee sau o altă substanţă inertă comparabilă care este disponibilă în mod uzual este considerat ca reprezentativ pentru solul pe care proba poate fi răsturnată în caz de accident. Pentru testarea lichidelor care nu se aprind în contact cu aerul este necesară o hârtie de filtru uscată atunci când intră în contact cu un agent purtător inert.

1.6.2. Desfăşurarea testului

1.6.2.

(a) Solide sub formă de pulbere Se toarnă 1-2 cm3 de pulbere de substanţă de la circa 1 m înălţime pe o suprafaţă necombustibilă şi se observă dacă substanţa se aprinde în timpul turnării sau în 5 minute de la depunere. Testul este efectuat de 6 ori dacă nu are loc aprinderea.

(b) Lichide Se toarnă aproximativ circa 5 cm3 de lichid într-o capsulă de porţelan şi se observă dacă substanţa se aprinde în interval de 5 minute. Dacă nu are loc nicio aprindere în 6 testări, se vor efectua următoarele teste: Un eşantion de 0,5 ml este împins dintr-o seringă pe o hârtie de filtru pliată şi se observă dacă are loc aprinderea sau carbonizarea hârtiei de filtru în 5 minute de la adăugarea lichidului. Testul este efectuat de 3 ori dacă nu are loc aprinderea sau carbonizarea.

2. DATE

2.

2.1. INTERPRETAREA REZULTATELOR Testarea poate fi întreruptă atunci când apare un rezultat pozitiv într-unul din teste.

2.2. EVALUARE Dacă substanţa se aprinde în 5 minute de la adăugarea ei la un purtător inert şi expunerea la aer sau o substanţă lichidă carbonizează sau aprinde o hârtie de filtru în 5 minute de când a fost adăugată şi expusă la aer, este considerată a fi piroforică.

3. RAPORT Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

specificaţiile exacte ale substanţei (identificare şi impurităţi);

rezultatele testelor;

orice observaţie suplimentară relevantă pentru interpretarea rezultatelor.

4.1.2. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14. PROPRIETĂŢI EXPLOZIVE

A.14.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Prezenta metodă permite determinarea probabilităţii ca o substanţă solidă sau sub formă de pastă să prezinte pericol de explozie atunci când este supusă la efectul unei flăcări (sensibilitate termică), la şoc mecanic sau la frecare (sensibilitate la stimuli mecanici) sau ca o substanţă lichidă să prezinte pericol de explozie atunci când este supusă la efectul unei flăcări sau la şoc. Metoda cuprinde trei părţi: Metoda oferă date care permit evaluarea probabilităţii de a amorsa o explozie cu ajutorul unor stimuli obişnuiţi. Scopul ei nu este să determine dacă o substanţă sau un preparat este sau nu este susceptibil de a exploda în orice condiţii. Metoda este în măsură să determine dacă o substanţă sau un preparat va prezenta pericol de explozie (sensibilitate termică sau mecanică) în condiţiile speciale definite în directivă. Metoda se bazează pe mai multe tipuri de aparate, folosite pe scară largă pe plan internaţional (1) şi care au, în general, rezultate edificatoare. Se admite totuşi că metoda nu este definitivă. Se pot folosi aparate alternative, cu condiţia ca acestea să fie recunoscute pe plan internaţional şi ca rezultatele să poată fi corelate în mod adecvat cu cele obţinute pe aparatul specificat. Testele nu se justifică dacă datele termodinamice disponibile (căldura de formare, căldura de descompunere) şi absenţa anumitor grupe reactive (2) în formula structurală permit să se stabilească în mod cert că substanţa sau preparatul nu este susceptibil de a se descompune rapid cu degajare de gaze sau de căldură (altfel spus, materialul nu prezintă riscuri de explozie). Pentru lichide nu este necesar testul de sensibilitate mecanică la frecare.

1.1.

(a) un test de sensibilitate termică (1);

(b) un test de sensibilitate mecanică la şoc (1);

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Exploziv: Substanţe care sunt susceptibile de a exploda sub efectul flăcării sau sunt sensibile la şoc ori frecare în aparatul specificat (sau sunt mai sensibile din punct de vedere mecanic decât 1,3-dinitrobenzenul într-un aparat alternativ).

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ 1,3-dinitrobenzen, în stare cristalină, de puritate tehnică, cernut să treacă prin sita cu ochiuri de 0,5 mm, pentru metodele de testare prin frecare şi prin şoc. Perhidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX, hexogen, ciclonit – CAS 121-82-4), recristalizată din soluţie apoasă de ciclohexanonă, cernută în stare umedă prin sită cu ochiuri de 250 μm şi reţinută pe sită cu ochiuri de 150 μm şi apoi uscată la 103 ± 2 oC (timp de 4 ore) pentru o a doua serie de teste de sensibilitate mecanică (la şoc şi frecare).

1.4. PRINCIPIUL METODEI Sunt necesare teste preliminare pentru a determina condiţiile de siguranţă în care se desfăşoară cele trei teste de sensibilitate.

1.4.

1.4.1. Teste pentru determinarea siguranţei în manipulare (3) Din motive de siguranţă, înainte de realizarea testelor principale, se supun eşantioane foarte mici (cca. 10 mg.) de substanţă la încălzire în aer liber cu flacără de arzător cu gaz, la şoc, în orice formă adecvată de aparat, şi la frecare, folosind un ciocan de lemn şi o nicovală, sau orice alt dispozitiv de frecare. Obiectivul constă în a determina dacă substanţa este suficient de sensibilă şi explozibilă încât realizarea testelor de sensibilitate prescrise, în special cel de sensibilitate termică, să necesite precauţii speciale pentru a evita vătămarea operatorului.

1.4.2. Sensibilitatea termică Metoda constă în încălzirea substanţei într-un tub din oţel, închis cu plăci cu orificii de diametre diferite, pentru a determina dacă substanţa este susceptibilă de a exploda în condiţii de încălzire intensă şi spaţiu limitat într-un mod definit.

1.4.3. Sensibilitatea mecanică (la şoc) Metoda constă în supunerea substanţei la şocul produs de un corp cu masă specificată care cade de la o înălţime specificată.

1.4.4. Sensibilitatea mecanică (la frecare) Metoda constă în supunerea unei substanţe, aflată în stare solidă sau sub formă de pastă, la frecare între suprafeţe standardizate, în condiţii specificate de forţă şi deplasare relativă.

1.5. CRITERII DE CALITATE Nu sunt menţionate.

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.1. Sensibilitatea termică (efectul flăcării)

1.6.1.

1.6.1.1. Aparatură Aparatura este constituită dintr-un tub din oţel, de unică folosinţă, cu dispozitive de închidere refolosibile (figura 1), instalat într-un dispozitiv de încălzire şi protecţie. Fiecare tub este obţinut prin ambutisarea adâncă a tablei de oţel (a se vedea apendicele) şi are un diametru interior de 24 mm, o lungime de 75 mm şi o grosime a pereţilor de 0,5 mm. Tuburile sunt prevăzute cu flanşă la extremitatea deschisă, pentru a permite închiderea fiecăruia cu setul plăcii cu orificii. Acesta este constituit dintr-o placă cu rezistenţă la presiune, cu un orificiu central, montată strâns pe tub printr-o îmbinare cu şurub din două părţi (piuliţă şi o şaibă filetată). Piuliţa şi şaiba filetată sunt realizate din oţel crom-mangan (a se vedea apendicele) care nu produce scântei până la 800 oC. Plăcile perforate au o grosime de 6 mm, sunt realizate din oţel termorezistent (a se vedea apendicele) şi sunt disponibile într-o gamă de diametre şi orificii.

1.6.1.2. Condiţii experimentale În general, substanţa este supusă testului în forma în care este primită, deşi în anumite cazuri, de exemplu dacă este presată, turnată sau condensată într-un mod anume, s-ar putea să fie necesară mărunţirea acesteia înaintea testului. Pentru substanţele solide, masa materialului ce urmează să fie supus testelor se determină printr-o metodă, în două etape, a probei în gol. Un tub căruia i s-a determinat tara este umplut cu 9 cm3 de substanţă şi aceasta este tasată cu o forţă de 80 N aplicată pe toată secţiunea transversală a tubului. Din motive de siguranţă sau în cazurile în care este posibilă modificarea formei fizice a eşantionului prin compresie, se pot folosi alte procedee de umplere; de exemplu, dacă substanţa este foarte sensibilă la frecare, nu se recomandă tasarea. Dacă substanţa se poate comprima, atunci se mai adaugă şi se tasează până la umplerea tubului pe o lungime de 55 mm de la capăt. Se determină masa totală a substanţei folosite la umplerea tubului până la 55 mm şi se mai adaugă substanţă în două reprize, tasându-se de fiecare dată cu o forţă de 80 N. Apoi se mai adaugă şi se tasează sau se scoate material, astfel încât tubul să fie umplut pe o lungime de 15 mm de la partea superioară. Se execută a doua operaţie preliminară a probei în gol, plecând de la o cantitate tasată egală cu o treime din masa totală rezultată în prima etapă a probei gol. Se mai adaugă substanţă în două reprize şi se tasează cu o forţă de 80 N reglându-se nivelul substanţei din tub până la 15 mm de la partea superioară prin adăugare sau scoatere de substanţă, după caz. Cantitatea de substanţă solidă determinată în a doua operaţie preliminară se utilizează pentru fiecare test; umplerea fiind realizată în trei reprize, cu cantităţi egale, fiecare comprimată până la 9 cm3 cu forţa necesară, oricare ar fi valoarea acesteia. (Această operaţie poate fi facilitată prin folosirea unor inele de distanţare.) Lichidele şi gelurile se încarcă în tub până la o înălţime de 60 mm, având grijă în mod deosebit să se evite formarea bulelor în gel. Şaiba filetată este glisată pe tub dinspre bază, se inserează placa perforată corespunzătoare şi se strânge piuliţa după aplicare unui lubrifiant pe bază de disulfură de molibden. Este esenţial să se verifice dacă nu a rămas substanţă prinsă între flanşă şi placă sau în filet. Încălzirea se realizează cu propan dintr-o butelie industrială, prevăzută cu un regulator de presiune (60-70 mbar), care trece printr-un contor de gaze şi este distribuit uniform (în funcţie de flacăra arzătoarelor) dintr-un rezervor către patru arzătoare. Arzătoarele sunt distribuite în jurul incintei de testare, aşa cum se arată în figura 1. Cele patru arzătoare au un consum combinat de aproximativ 3,2 litri de propan pe minut. Se pot utiliza şi alte gaze, respectiv arzătoare, dar viteza de încălzire trebui să fie cea menţionată în figura 3. Pentru toate aparatele, viteza de încălzire trebuie să se verifice periodic cu ajutorul tuburilor umplute cu dibutilftalat, după cum se indică în figura 3.

1.6.1.3. Desfăşurarea testelor Fiecare test se realizează până la fragmentarea tubului sau după încălzirea tubului timp de cinci minute. Dacă la test se produce fragmentarea tubului în trei sau mai multe bucăţi, care uneori pot să fie legate între ele prin fâşii înguste de metal ca în figura 2, se estimează că s-a produs o explozie. Dacă la test rezultă mai puţine fragmente sau nu are loc fragmentarea, se consideră că nu s-a produs explozie. Se realizează mai întâi o serie de trei teste cu o placă perforată, cu orificiul cu diametrul de 6,0 mm şi, dacă nu rezultă nicio explozie, se realizează o a doua serie de trei teste cu o placă cu orificiul de 2,0 mm. Dacă în oricare din seria de teste se produce explozia, nu mai este necesară continuarea testelor.

1.6.1.4. Evaluare Rezultatul testului se consideră ca fiind pozitiv, dacă se produce explozie în oricare din seria de teste menţionate anterior.

1.6.2. Sensibilitatea mecanică (la şoc)

1.6.2.

1.6.2.1. Aparatura (figura 4) Piesele esenţiale ale unei sonete clasice cu berbec sunt un bloc de oţel turnat cu soclu, nicovală, coloană, ghidaje, greutăţi de şoc, dispozitiv de decuplare şi suport pentru probă. Nicovala din oţel cu diametru de 100 mm şi înălţimea de 70 mm este prinsă în şuruburi la partea superioară a unui bloc din oţel de 230 mm (lungime) × 250 mm (lăţime) × 200 mm (înălţime) cu un soclu turnat de 450 mm (lungime) × 450 (lăţime) × 60 mm (înălţime). O coloană, realizată dintr-un tub de oţel trefilat fără sudură, este prinsă într-un suport fixat cu şuruburi pe spatele blocului din oţel. Aparatul este fixat cu patru şuruburi pe un bloc din beton de 60 × 60 × 60 cm, astfel încât şinele de ghidare să fie perfect verticale şi greutatea de şoc să cadă liber. Sunt disponibile greutăţi de 5-10 kg, realizate din oţel calmat. Berbecul este din oţel călit, HRC 60-63, cu un diametru de minimum 25 mm. Proba supusă testului este închisă într-un dispozitiv de şoc constituit din doi cilindri coaxiali din oţel calmat, unul deasupra celuilalt, situaţi într-un cilindru gol de oţel, care se foloseşte ca inel de ghidare. Cilindrii din oţel calmat au diametrul de 10 (-0,003, -0,005) mm şi înălţimea de 10 mm, cu feţele lustruite, muchiile rotunjite (raza de curbură de 0,5 mm) şi o duritate HRC de 58-65. Cilindrul gol trebuie să aibă un diametru exterior de 16 mm, un alezaj şlefuit de 10 (+0,005, +0,010) mm şi o înălţime de 13 mm. Dispozitivul de şoc este asamblat pe o nicovală intermediară (diametrul 26 mm şi înălţimea de 26 mm) realizată din oţel şi centrată cu ajutorul unui inel de centrare cu perforaţii pentru a permite evacuarea vaporilor.

1.6.2.2. Condiţii experimentale Volumul eşantionului este de 40 mm3 sau un volum corespunzător aparatului utilizat. Substanţele solide se supun testului în stare uscată şi se pregătesc după cum urmează: Substanţele care se livrează în general sub formă de pastă ar trebui să fie supuse testului în stare uscată, dacă este posibil, sau, în orice caz, după eliminarea cantităţii maxime posibile de diluant. Pentru testarea substanţelor lichide, aparatul de testare se reglează, astfel încât între cilindrii de oţel superior şi inferior să existe un spaţiu de 1 mm.

1.6.2.2.

(a) substanţele sub formă de pulberi se cern (ochiul sitei de 0,5 mm); tot materialul care a trecut prin sită se supune testului;

(b) substanţele presate, turnate sau condensate se fărâmiţează şi se cern; la teste se foloseşte fracţia dintre sita cu ochiuri de 0,5 mm şi sita cu ochiuri de 1 mm, care ar trebui să fie reprezentativă.

1.6.2.3. Desfăşurarea testelor Se realizează o serie de şase teste cu o greutate de şoc de 10 kg în cădere de la 0,40 m (40 J). Dacă se obţine o explozie în primele şase teste la 40 J, trebuie să se mai realizeze un set de şase teste, cu greutatea de 5 kg în cădere de la 0,15 m (7,5 J). În alt aparat, proba se compară cu substanţa de referinţă aleasă printr-o metodă stabilită (de exemplu metoda up-and-down etc.).

1.6.2.4. Evaluare Rezultatul se consideră pozitiv dacă se produce o explozie (izbucnirea unei flăcări şi/sau un zgomot caracteristic unei explozii) cel puţin o dată în oricare din testele cu aparatul specificat sau dacă proba este mai sensibilă decât 1,3-dinitrobenzenul sau RDX într-un test alternativ de sensibilitate la şoc.

1.6.3. Sensibilitatea mecanică (la frecare)

1.6.3.

1.6.3.1. Aparatură (figura 5) Aparatul pentru testul de sensibilitate la frecare este constituit dintr-o placă de bază din fontă pe care se montează aparatul de testare la frecare. Acesta conţine un bulon din porţelan şi un disc mobil din porţelan. Discul din porţelan este fixat într-un culisou care se deplasează pe două ghidaje. Culisoul este cuplat la un motor electric prin intermediul unei biele, a unui excentric şi unui angrenaj de transmisie corespunzător, astfel încât să se asigure o deplasare a discului de porţelan, doar o singură dată, înainte şi înapoi, pe o distanţă de 10 mm, sub bulonul din porţelan. Bulonul poate să fie supus unei sarcini, de exemplu, de 120 sau 360 newtoni. Discurile din porţelan sunt realizate din porţelan tehnic (rugozitatea de 9-32 μm) şi au dimensiuni de 25 mm (lungime) × 25 mm (lăţimea) × 5 mm (înălţimea). Bulonul cilindric din porţelan se realizează, de asemenea, din porţelan tehnic şi are o lungime de 15 mm, diametru de 10 mm şi extremităţile rotunjite, cu suprafaţa rugoasă şi cu o rază de curbură de 10 mm.

1.6.3.2. Condiţii experimentale Volumul probei este de 10 mm3 sau un volum corespunzător aparatului utilizat. Substanţele solide se supun testului în stare uscată şi se pregătesc după cum urmează: Substanţele care se livrează în general sub formă de paste se supun testului în stare uscată, dacă este posibil. Dacă substanţa nu se poate prepara în stare uscată, pasta (după eliminarea cantităţii maxime posibile de diluant) se supune testului sub forma unei pelicule cu următoarele dimensiuni: 0,5 mm grosime, 2 mm lăţime şi 10 mm lungime, realizată cu un şablon.

1.6.3.2.

(a) substanţele sub formă de pulberi se cern (sită cu ochiuri de 0,5 mm); tot materialul care a trecut prin sită se supune testului;

(b) substanţele presate, formate în matriţă sau condensate se fărâmiţează şi se cern; la teste se utilizează fracţiunea care a trecut prin site cu ochiuri < 0,5 mm.

1.6.3.3. Desfăşurarea testelor Bulonul din porţelan se aşează deasupra eşantionului de testat şi se aplică sarcina. În timpul testului, urmele lăsate de burete pe placa de porţelan trebuie să fie dispuse transversal faţă de direcţia de deplasare. Bulonul trebuie să rămână pe eşantion, cantitatea de substanţă de testat trebuie să fie suficientă, iar discul să se deplaseze corect sub bulon. Substanţele în formă de pastă se depun, cu un şablon, sub forma unei pelicule cu grosimea de 0,5 mm şi 2 × 10 mm. Discul de porţelan trebuie să se deplaseze înainte şi înapoi pe o distanţă de 10 mm sub bulonul de porţelan timp de 0,44 secunde; cele două extremităţi ale fiecărui bulon se folosesc fiecare la două încercări şi cele două suprafeţe ale discului se utilizează fiecare la trei încercări. Se realizează o serie de şase teste la o sarcină de 360 N. Dacă în aceste şase aceste teste se obţine un rezultat pozitiv, trebuie să se mai realizeze o serie de şase teste cu o sarcină de 120 N. În alt aparat, proba se compară cu substanţa de referinţă aleasă printr-o metodă stabilită (de exemplu metoda up-and-down etc.).

1.6.3.4. Evaluarea Rezultatul se consideră pozitiv dacă se produce o explozie (pocnitură şi/sau zgomot sau izbucnirea unei flăcări sunt echivalente cu o explozie) cel puţin o dată în oricare din teste cu aparatul de testare la frecare specificat sau sunt satisfăcute criteriile echivalente pentru o altă test de sensibilitate mecanică (la frecare).

2. DATE În principiu, se consideră că o substanţă prezintă pericol de explozie în sensul prezentei directive, în cazul în care se obţine un rezultat pozitiv la testele de sensibilitate termică sau de sensibilitate mecanică (la şoc sau la frecare).

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORT DE TESTARE Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, informaţiile următoare:

identitatea, compoziţia, puritatea, conţinutul de umiditate etc. al substanţei de testat;

starea fizică a probei şi, dacă a fost sau nu mărunţită şi/sau cernută;

observaţiile din timpul testelor de sensibilitate termică (de exemplu masa probei, numărul de fragmente etc.);

observaţiile din timpul testelor de sensibilitate mecanică (de exemplu formarea unor cantităţi importante de fum sau descompunerea totală fără zgomot, flăcări, scântei, pocnitură etc.);

rezultatele fiecărui tip de test;

dacă se utilizează alte aparate, trebuie să se prezinte fundamentarea ştiinţifică, precum şi dovada corelaţiei dintre rezultatele obţinute cu aparatul specificat şi cele obţinute cu unul echivalent;

orice observaţie utilă, cum ar fi trimiterea la teste cu produse similare care ar putea să fie relevante pentru o interpretare corectă a rezultatelor;

orice alte constatări relevante pentru interpretarea rezultatelor.

3.2. INTERPRETAREA ŞI EVALUAREA REZULTATELOR Raportul de testare menţionează toate rezultatele considerate false, anormale sau nereprezentative. Dacă unele rezultate se resping, se prezintă o explicaţie şi rezultatele unor teste suplimentare sau alternative. Cu excepţia cazului în care un rezultat anormal se pot explica, acesta trebuie să fie acceptat ca atare şi să fie folosit la clasificarea substanţei în consecinţă.

4.1.2.3.4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 and 30-42. NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.

A.15. PUNCTUL DE AUTOAPRINDERE (LICHIDE ŞI GAZE)

A.15.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Substanţele explozive şi substanţele care se aprind spontan în contact cu aerul la temperatura ambiantă nu se supun prezentului test. Modul de operare este aplicabil la gaze, lichide şi vapori care, în prezenţa aerului, se aprind la contactul cu o suprafaţă încălzită. Punctul de autoaprindere scade considerabil prin influenţa impurităţilor catalitice existente, materialul suprafeţei în contact sau prin creşterea volumului recipientului de testare.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Gradul de autoinflamabilitate se exprimă ca punct de autoaprindere. Punctul de autoaprindere este cea mai mică temperatură la care substanţa se aprinde în contact cu aerul în condiţiile definite în metoda de testare.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Substanţele de referinţă sunt specificate în standarde (a se vedea 1.6.3). Acestea trebuie să servească în special la verificarea periodică a acurateţei metodei şi să permită compararea cu rezultatele obţinute prin alte metode.

1.4. PRINCIPIUL METODEI Metoda determină temperatura minimă a suprafeţei interioare a unei incinte, la care are loc aprinderea unui gaz, a vaporilor sau a unui lichid injectat în incinta respectivă.

1.5. CRITERII DE CALITATE Repetabilitatea variază în funcţie de intervalul de temperaturi de autoaprindere şi de metoda de testare folosită. Sensibilitatea şi specificitatea depind de metoda de testare folosită.

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.1. Aparatură Aparatura este descrisă în metoda menţionată la punctul 1.6.3.

1.6.2. Condiţii experimentale Un eşantion din substanţa de testat este supus testului conform metodei menţionate la punctul 1.6.3.

1.6.3. Desfăşurarea testului A se vedea IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. DATE Se înregistrează temperatura, presiunea atmosferică, cantitatea de probă utilizată şi timpul scurs până la producerea aprinderii.

3. RAPORT Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

specificaţiile precise ale substanţei (identificarea şi proprietăţile);

cantitatea de probă utilizată, presiunea atmosferică;

aparatura utilizată;

rezultatele măsurătorilor (temperaturile de testare, rezultatele referitoare la aprindere, timpul scurs);

toate observaţiile suplimentare relevante pentru interpretarea rezultatelor.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE Niciuna.

A.16. TEMPERATURA RELATIVĂ DE AUTOAPRINDERE PENTRU SUBSTANŢELE SOLIDE

A.16.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Substanţele explozive şi substanţele care se aprind spontan în contact cu aerul la temperatura ambiantă nu se supun prezentului test. Scopul prezentului test este de a furniza informaţii preliminare privind autoaprinderea substanţelor solide la temperaturi ridicate. Dacă temperatura degajată, fie prin reacţia substanţei cu oxigenul, fie prin descompunerea exotermă, nu se împrăştie destul de repede în mediul înconjurător, se produce autoîncălzirea care conduce la autoaprindere. Autoaprinderea se produce, prin urmare, atunci când viteza de producere a căldurii este mai mare decât viteza de pierdere a căldurii. Metoda de testare este utilă ca test preliminar de triere a substanţelor solide. Având în vedere natura complexă a fenomenelor de aprindere şi de combustie a solidelor, temperatura de autoaprindere determinată conform prezentei metode de testare se foloseşte numai pentru comparare.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Temperatura de autoaprindere determinată prin prezenta metodă este temperatura minimă a mediului ambiant, exprimată în oC, la care un volum determinat dintr-o substanţă se aprinde în condiţii definite.

1.3. SUBSTANŢĂ DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI Un anumit volum din substanţă se introduce într-o etuvă la temperatura camerei; în timp ce temperatura etuvei este crescută cu o viteză de 0,5 oC/min până la 400 oC sau până la punctul de topire, dacă este mai mic, se înregistrează curba temperatură/timp pentru condiţiile din centrul eşantionului. În sensul prezentului test, temperatura etuvei la care temperatura eşantionului ajunge la 400 oC prin autoîncălzire se numeşte temperatură de autoaprindere.

1.5. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.1. Aparatură

1.6.1.

1.6.1.1. Etuva Etuvă de laborator termoreglabilă (volum de aproximativ 2 litri) prevăzură cu circulaţie naturală de aer şi o supapă pentru atenuarea exploziei. Pentru evitarea unui posibil risc de explozie, trebuie evitat contactul tuturor gazelor de descompunere cu elementele de încălzire electrică.

1.6.1.2. Cubul din plasă metalică Se taie o bucată dintr-o plasă fin oţel inoxidabil cu ochiuri de 0,045 mm conform modelului din figura 1. Plasa se pliază şi se fixează cu sârmă într-un cub deschis la partea superioară.

1.6.1.3. Termocuplurile Termocupluri corespunzătoare.

1.6.1.4. Înregistratorul Orice înregistrator cu două canale etalonat de la 0 la 600 oC sau la o tensiune corespunzătoare.

1.6.2. Condiţii experimentale Substanţele se supun testului în forma în care se primesc.

1.6.3. Desfăşurarea testului Cubul se umple cu substanţă, se tasează uşor, adăugând substanţă până la umplerea cubului. Cubul se suspendă apoi în centrul unei etuve la temperatura camerei. Un termocuplu se instalează în centrul cubului şi celălalt între cub şi peretele etuvei pentru înregistrarea temperaturii din etuvă. Temperatura etuvei şi cea a probei se înregistrează permanent în timpul creşterii temperaturii etuvei până la 400 oC sau până la punctul de topire, dacă este mai mic, cu o viteză de 0,5 oC/min. Când substanţa se aprinde, termocuplul probei va indica o creştere foarte bruscă a temperaturii, peste temperatura etuvei.

2. DATE Temperatura etuvei la care temperatura probei ajunge la 400 oC prin autoîncălzire este importantă pentru evaluare (a se vedea figura 2).

3. RAPORT Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

descrierea substanţei;

rezultatele măsurătorilor, inclusiv curba temperatură/timp;

toate observaţiile suplimentare relevante pentru interpretarea rezultatelor.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

4.

Figura 1 Modelul cubului de testare de 20 mm

Figura 2 Curbă de tipul temperatură/timp

Temperatura probei Temperatura etuvei Temperatura de aprindere Timp

A.17. PROPRIETĂŢI OXIDANTE (SOLIDE)

A.17.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Înainte de a realiza acest test, este util să se colecteze informaţii preliminare privind orice posibile proprietăţi explozive ale substanţei de testat. Prezentul test nu se aplică lichidelor, gazelor, substanţelor explozive sau inflamabile sau peroxizilor organici. Prezentul test nu este necesar dacă examinarea formulei structurale stabileşte dincolo de orice îndoială că substanţa nu are capacitate de reacţie exotermă cu un material combustibil. Pentru a stabili dacă sunt necesare precauţii speciale în timpul testului, se realizează un test preliminar.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Timpul de ardere: timpul de reacţie, exprimat în secunde, necesar pentru ca zona de reacţie să traverseze un cartuş, în conformitate cu procedura descrisă la punctul 1.6. Viteza de ardere: exprimată în milimetri pe secundă. Viteza maximă de ardere: cea mai mare valoare a vitezelor de ardere obţinută cu amestecuri ce conţin oxidant în proporţie de 10-90 % greutate.

1.3. SUBSTANŢA DE REFERINŢĂ Azotatul de bariu (de puritate analitică) se foloseşte ca substanţă de referinţă în test şi în testul preliminar. Amestecul de referinţă este amestecul constituit din azotat de bariu şi pudră de celuloză, preparat conform descrierii de la punctul 1.6, care are viteza maximă de ardere (amestecul conţine, de regulă, 60 % greutate azotat de bariu).

1.4. PRINCIPIUL METODEI Pentru siguranţă se realizează un test preliminar. În cazul în care testul preliminar indică în mod clar că substanţa supusă testului are proprietăţi oxidante, nu mai este necesar alt test. Dacă nu se întâmplă astfel, substanţa se supune testului complet. Pentru testul complet, se prepară amestecuri cu proporţii diferite de substanţă de testat şi substanţă combustibilă. Se prepară apoi câte un cartuş din fiecare amestec, care se aprinde la o extremitate.

1.5. CRITERII DE CALITATE Dacă este necesar, orice metodă de mărunţire şi amestecare este valabilă, cu condiţia ca diferenţa dintre viteza maximă de ardere şi valoarea mediei aritmetice, în şase teste separate, să fie de maximum 10 %.

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.1. Pregătire

1.6.1.

1.6.1.1. Substanţa de testat Proba de analizat se aduce la dimensiuni ale particulelor < 0,125 mm prin următoarea metodă: se cerne substanţa, se mărunţeşte fracţia rămasă, se repetă acţiunea până când întreaga cantitate de probă trece prin sită. Se poate utiliza orice metodă de mărunţire sau cernere care satisface criteriile de calitate. Înaintea preparării amestecului, substanţa se usucă la 105 oC, până la o greutate constantă. Dacă temperatura de descompunere a substanţei de testat este mai mică de 105 oC, substanţa trebuie să se usuce la o temperatură mai mică.

1.6.1.2. Substanţa combustibilă Pulberea de celuloză se utilizează ca substanţă combustibilă. Celuloza ar trebui să fie de tipul utilizat în cromatografia în strat subţire sau în cromatografia în coloană. S-a dovedit că tipul care conţine mai mult de 85 % fibre cu lungimea de 0,020-0,075 mm este corespunzătoare. Pulberea de celuloză se trece printr-o sită cu ochiuri de 0,125 mm. Se foloseşte acelaşi lot de celuloză pentru tot testul. Înainte de prepararea amestecului, pulberea de celuloză este uscată la 105 oC până se obţine o greutate constantă. Dacă în testul preliminar se utilizează rumeguş de lemn, se prepară un rumeguş prin colectarea porţiunii care trece prin sita cu ochiuri de 1,6 mm, se amestecă cu grijă, apoi se usucă la 105 oC timp de patru ore într-un strat cu o grosime de maximum 25 mm. Se răceşte şi se păstrează până când este necesar, de preferinţă într-un interval de 24 de ore de la uscare, într-un recipient etanş cât mai bine umplut.

1.6.1.3. Sursa de ardere Ar trebui să se folosească flacăra unui bec de gaz (diametrul minim de 5 mm) ca sursă de aprindere. Dacă de utilizează altă sursă de aprindere (de exemplu la testul în atmosferă inertă), trebuie să se prezinte în raportul de testare descrierea şi justificarea acesteia.

1.6.2. Desfăşurarea testului Notă: Amestecurile din oxidanţi şi celuloză sau rumeguş trebuie să fie tratate ca posibil explozive şi manipulate cu atenţia cuvenită.

1.6.2.

1.6.2.1. Testul preliminar Substanţa uscată se amestecă cu grijă cu celuloza uscată sau rumeguşul uscat în proporţii din greutate de substanţă/celuloză sau rumeguş de 2:1 şi din amestecul obţinut se formează un cartuş conic cu dimensiunile 3,5 cm (diametrul la bază) × 2,5 cm (înălţimea) prin umplerea, fără îndesare, a unei forme conice (de exemplu o pâlnie din sticlă de laborator cu robinetul închis). Cartuşul este aşezat pe o placă rece, necombustibilă, neporoasă şi cu conductibilitate termică redusă. Testul ar trebui să se realizeze sub nişă de tiraj, conform descrierii de la punctul 1.6.2.2. Sursa de aprindere se aduce în contact cu conul. Se urmăresc amploarea şi durata reacţiei rezultate şi se înregistrează. Dacă reacţia este viguroasă, substanţa se consideră ca fiind oxidantă. Dacă rezultatele nu sunt certe, este necesar să se realizeze testul complet descris în continuare.

1.6.2.2. Test complet Se prepară amestecuri oxidant/celuloză ce conţin 10-90 % greutate oxidant, cu o raţie de creştere de 10 % a cantităţii de oxidant. Pentru cazurile-limită, ar trebui să se utilizeze amestecuri intermediare oxidant/celuloză pentru a obţine viteza maximă de ardere cu mai multă precizie. Cartuşul se obţine cu o matriţă. Matriţa este din metal, are o lungime de 250 mm şi o secţiune transversală triunghiulară cu o înălţime interioară de 10 mm şi o lăţime interioară de 20 mm. Pe ambele feţe ale matriţei, pe direcţie longitudinală, se montează două plăci metalice ca opritoare laterale care depăşesc cu 2 mm extremitatea superioară a secţiunii transversale triunghiulare (figura). Dispozitivul obţinut se umple fără tasare cu amestec, puţin în exces. După ce se lasă matriţa să cadă de la o înălţime de 2 cm pe o suprafaţă solidă, substanţa în exces se curăţă cu o racletă oblică. Plăcile opritoare se scot şi pulberea rămasă se netezeşte cu un rulou. Se aşează apoi o placă cu conductibilitate termică mică, neporoasă şi necombustibilă peste formă, ansamblul se răstoarnă şi se scoate forma. Se introduce cartuşul în nişă, perpendicular pe direcţia curentului de aer. Viteza aerului trebuie să fie suficientă pentru a preveni răspândirea vaporilor în laborator şi ar trebui să fie constantă în timpul testului. Curentul de aer trebuie să formeze un ecran în jurul aparatului. Datorită caracterului higroscopic al celulozei şi al unor substanţe de testat, testul se execută cât se poate de repede. Se aprinde un capăt al cartuşului prin contactul cu flacăra. Se măsoară timpul de reacţie pe o distanţă de 200 mm după ce zona de reacţie s-a propagat pe o distanţă iniţială de 30 mm. Testul se realizează cu substanţa de referinţă şi cel puţin o dată cu fiecare amestec din gama celor constituite din substanţa de testat şi celuloză în diferite proporţii. Dacă se constată o viteză maximă de ardere cu mult mai mare decât cea a amestecului de referinţă, testul se poate opri; în caz contrar, testul se repetă de cinci ori pentru fiecare din cele trei amestecuri care au cea mai mare viteză de ardere. Dacă se suspectează un rezultat fals pozitiv, atunci ar trebui să se repete testul cu o substanţă inertă cu particule de dimensiuni similare, de exemplu kiselgur, în loc de celuloză. O altă posibilitate constă în repetarea testului cu amestecul cu viteza de ardere cea mai mare, în atmosferă inertă (cu un conţinut de oxigen < 2 % v/v).

2. DATE Din motive de siguranţă, se consideră că viteza maximă de ardere – nu valoarea medie – reprezintă proprietatea oxidantă maximă a substanţei supuse testului. Valoarea cea mai mare a vitezei de ardere într-o serie de şase teste pe un amestec dat este relevantă pentru evaluare. Se reprezintă grafic valoarea cea mai mare a vitezei de ardere pentru fiecare amestec în funcţie de concentraţia oxidantului. Din grafic se citeşte viteza maximă de ardere. Cele şase valori ale vitezei de ardere măsurate într-un set realizat cu amestecul cu viteza maximă de ardere trebuie să difere cu maximum 10 % faţă de valoarea mediei aritmetice; în caz contrar, sunt necesare metode îmbunătăţite de mărunţire şi amestecare. Se compară viteza maximă de ardere cu viteza maximă de ardere a amestecului de referinţă (a se vedea punctul 1.3). Dacă încercările se realizează în atmosferă inertă, se compară viteza maximă de reacţie cu cea obţinută cu amestecul de referinţă în atmosferă inertă.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORT DE TESTARE Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

identitatea, compoziţia, puritatea, conţinutul de umiditate etc. ale substanţei de testat;

orice tratament aplicat eşantionului (de exemplu măcinare, uscare,...);

sursa de aprindere folosită;

rezultatele măsurătorilor;

tipul reacţiei (de exemplu ardere superficială cu flacără, ardere în întreaga masă, orice informaţii privind produsele de ardere, ...);

orice observaţie suplimentară relevantă pentru interpretarea rezultatelor, inclusiv descrierea vigorii (flacără, scântei, degajare de vapori, ardere înăbuşită înceată etc.) şi durata aproximativă obţinută în testul preliminar de siguranţă/triere atât pentru substanţa de testat, cât şi pentru substanţa de referinţă;

rezultatele testelor cu substanţă inertă, după caz;

rezultatele testelor în atmosferă inertă, după caz.

3.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR Se consideră că o substanţă este substanţă oxidantă, în cazul în care: Pentru a se evita rezultatele fals pozitive, la interpretarea rezultatelor se iau în considerare şi rezultatele obţinute la testarea substanţei cu un material inert şi/sau la testul în atmosferă inertă.

3.2.

(a) la testul preliminar există o reacţie viguroasă;

(b) la testul complet viteza maximă de ardere a amestecurilor testate este mai mare decât sau egală cu viteza maximă de ardere a amestecului de referinţă constituit din celuloză şi azotat de bariu.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

A.18. DETERMINAREA MASEI MOLECULARE NUMERICE MEDII ŞI A DISTRIBUŢIEI MASELOR MOLECULARE A POLIMERILOR

A.18.

1. METODĂ Această metodă cromatografică pe gel permeabil urmează Orientarea 118 (1996) a OCDE. Principiile fundamentale şi toate celelalte informaţii tehnice sunt prezentate în bibliografie.

1.

1.1. INTRODUCERE Proprietăţile polimerilor sunt atât de diversificate, încât este imposibil de descris o metodă unică, care să indice cu precizie condiţiile de separare şi evaluare, care să acopere toate eventualităţile şi particularităţile întâlnite la separarea polimerilor. Sistemele complexe de polimeri, în special, se pretează mai rar la cromatografia pe gel permeabil. În cazul în care cromatografia pe gel permeabil nu este aplicabilă, se poate determina conţinutul de polimeri cu masă moleculară medie, utilizând alte metode (a se vedea apendicele). Într-o astfel de situaţie, este necesară furnizarea tuturor detaliilor legate de metoda folosită, cu justificarea alegerii. Metoda descrisă în continuare se bazează pe norma DIN 55672 (1). Aceasta furnizează indicaţii detaliate asupra modului de realizare a experienţelor şi de evaluare a rezultatelor. Dacă este necesară modificarea condiţiilor experimentale, schimbările trebuie justificate. Pot fi utilizate alte normative, cu condiţia menţionării tuturor referinţelor. Metoda descrisă utilizează pentru etalonare eşantioane de polistiren a căror polidispersie este cunoscută şi ar putea fi, probabil, adaptată pentru cazul altor polimeri, de exemplu, polimerii solubili în apă şi polimerii ramificaţi cu catenă lungă.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Masa moleculară numerică medie Mn şi masa moleculară medie ponderală Mw, se determină prin ecuaţiile următoare: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi unde: Hi este amplitudinea semnalului detectat, corespunzător volumului de retenţie Vi, faţă de nivelul de referinţă; Mi este masa moleculară a fracţiunii de polimer, corespunzătoare volumului de retenţie Vi şi n este numărul de puncte experimentale. Lărgimea distribuţiei maselor moleculare, care reprezintă o măsură a polidispersiei sistemului, este exprimată de raportul Mw/Mn.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Metoda cromatografiei pe gel permeabil este o metodă relativă, fiind necesar să se procedeze la o etalonare. În general, aceasta se realizează cu ajutorul polistirenilor etalon cu lanţ liniar şi distribuţie îngustă, pentru care se cunosc atât masele moleculare medii Mn şi Mw, cât şi distribuţia maselor moleculare. Curba de etalonare nu poate fi utilizată pentru determinarea masei moleculare a unui eşantion necunoscut, decât dacă condiţiile de separare a eşantioanelor şi etaloanelor au fost selecţionate într-un mod identic. O relaţie determinată între masa moleculară şi volumul de eluare nu este valabilă decât în condiţiile particulare ale unei experienţe date. Printre aceste condiţii figurează, înainte de toate: temperatura, solventul (sau amestecul de solvenţi), condiţiile cromatografice, precum şi coloana de separare sau sistemul de coloane. Masele moleculare ale eşantioanelor determinate prin această metodă constituie valori relative; le vom numi mase moleculare în echivalent-polistiren. Aceasta semnifică faptul că, în funcţie de diferenţele chimice şi structurale dintre eşantioanele testate şi etaloane, masele moleculare pot devia faţă de valorile absolute, într-o manieră mai mult sau mai puţin importantă. Dacă sunt utilizate alte etaloane, de exemplu, polietilenglicol, poli(etilenoxid), poli(metacrilat de metil) sau acid poliacrilic, este important să se justifice motivul.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Cromatografia pe gel permeabil permite determinarea distribuţiei maselor moleculare, precum şi a maselor moleculare medii (Mn, Mw). Cromatografia pe gel permeabil reprezintă o metodă particulară de cromatografie lichidă, în cadrul căreia eşantionul pentru testat este separat în funcţie de volumul hidrodinamic al fiecărui constituent (2). Separarea se efectuează pe măsură ce eşantionul înaintează printr-o coloană umplută cu un material poros, în general un gel organic. Moleculele mici pot penetra în pori, în vreme ce moleculele mari sunt excluse. Din acest motiv, traseul moleculelor mari este mai scurt; acestea sunt separate primele. Moleculele de dimensiuni medii penetrează parţial în pori, fiind separate mai târziu. Moleculele cele mai mici, a căror rază hidrodinamică medie este mai mică decât cea a porilor de gel, pot penetra în toţi porii. Acestea vor fi eluate ultimele. În situaţia ideală, dimensiunea speciilor moleculare este cea care decide integral separarea, dar în practică, este greu de evitat interferenţa unor fenomene de absorbţie. O umplere neregulată a coloanei, ca şi existenţa unui volum mort important, pot agrava situaţia (2). Detecţia se efectuează, de exemplu, prin măsurarea indicelui de refracţie sau al absorbţiei în UV, pentru realizarea unei curbe de distribuţie simple. Totuşi, pentru a putea asocia acestei curbe valorile maselor moleculare reale, este necesară etalonarea coloanei prin trecerea unui polimer cu masa moleculară cunoscută şi, în cazul ideal, cu o structură cât mai apropiată, de exemplu diferiţi polistireni standard. În general, se va obţine o curbă Gauss; uneori, aceasta poate prezenta o asimetrie, pe partea maselor moleculare mici; axa verticală indică cantitatea (greutatea) speciilor de diferite mase moleculare eluate, iar pe axa orizontală, figurează logaritmul masei moleculare.

1.5. CRITERII DE CALITATE Reproductivitatea (deviaţia-standard relativă) a volumului de eluare trebuie să fie cel mult egală cu 0,3 %. Există modalităţi de ameliorare a reproductivităţii de analiză, graţie unei corecţii ce utilizează un standard intern, dacă un cromatograf este evaluat în funcţie de timp şi nu satisface criteriile menţionate mai sus [a se vedea informaţiile complementare la referinţa (1)]. Polidispersările depind de masele moleculare ale etaloanelor. În cazul polistirenilor etalon, valorile tipice sunt: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp este masa moleculară a etalonului, corespunzătoare semnalului maxim)

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.1. Prepararea soluţiilor etalon de polistiren Se vor dizolva polistirenii etalon, amestecând cu grijă până la diluţia aleasă. Soluţiile se vor prepara ţinând cont de recomandările fabricantului. Concentraţiile etaloanelor alese depind de diferiţi factori, cum ar fi: volumul de injecţie, viscozitatea soluţiei şi sensibilitatea detectorului. Volumul de injecţie maxim trebuie să fie adaptat lungimii coloanei, având grijă să nu o supraîncarce. Volumele de injecţie curente pentru separările analitice prin metoda cromatografică pe gel permeabil, pentru o coloană de 30 cm × 7,8 mm, variază de obicei între 40 şi 100 μl. Se va determina raportul optim între volumul de injecţie şi concentraţie, înainte de etalonarea coloanei.

1.6.2. Prepararea soluţiei de eşantion În principiu, prepararea soluţiilor de eşantion se realizează în condiţii identice. Eşantionul se dizolvă într-un solvent adecvat, de exemplu THF, agitând cu grijă. În niciun caz, nu se va dizolva într-o baie cu ultrasunete. Dacă este necesar, soluţia de probă se purifică cu ajutorul unui filtru cu membrană, cu dimensiunea porilor cuprinsă între 0,2-2 μm. Prezenţa particulelor nedizolvate trebuie menţionată în raportul final, în măsura în care acestea pot rezulta din specii cu mase moleculare mari. Trebuie să se recurgă la o metodă potrivită pentru determinarea procentajului în greutate a particulelor nedizolvate. Analiza soluţiilor se va face în termen de 24 ore.

1.6.3. Aparatură Sistemul cromatografic pe gel permeabil trebuie să fie inert faţă de solventul utilizat (de exemplu, utilizarea capilarelor din oţel, atunci când solvent este THF).

un rezervor pentru solvent;

un sistem pentru degazare (dacă este necesar);

o pompă;

un amortizor de impulsuri (dacă este necesar);

un sistem de injecţie;

coloane cromatografice;

un detector;

un debitmetru (dacă este necesar);

un sistem de înregistrare şi tratare a datelor;

un recipient pentru recuperarea soluţiilor utilizate.

1.6.4. Injecţia şi sistemul de pompare a solventului Un volum definit din soluţia de probă este injectat în coloană, într-o zonă bine definită, cu ajutorul unui aparat pentru eşantionare automată sau manuală. Dacă se operează manual, retragerea ori împingerea prea bruscă a pistonului seringii poate determina modificări în distribuţia maselor moleculare observate. Este indicat ca sistemul de pompare a solventului să fie lipsit de pulsaţii; este de preferat ca acesta să includă un amortizor de impulsuri. Debitul este de ordinul a 1 ml/min.

1.6.5. Coloana În funcţie de natura eşantionului testat, polimerul se caracterizează făcând recurs la o singură coloană sau la mai multe coloane, conectate în serie. În comerţ sunt disponibile mai multe materiale poroase pentru coloane, cu proprietăţi definite (de exemplu, dimensiunea porilor, limita de excludere). Alegerea unui gel de separare sau a lungimii de coloană depinde, pe de o parte, de proprietăţile eşantionului testat (volume hidrodinamice, distribuţia maselor moleculare) şi, pe de altă parte, de condiţiile particulare ale separării, cum ar fi: natura solventului, temperatura şi debitul (1) (2) (3).

1.6.6. Talere teoretice Coloana (sau combinaţia de coloane) utilizată pentru separare trebuie caracterizată prin numărul de talere teoretice. Pentru aceasta, în cazul în care solventul de eluare este THF, se trece o soluţie de etilbenzen sau o altă substanţă dizolvată nepolară potrivită, printr-o coloană de lungime cunoscută. Numărul de talere teoretice este dat de ecuaţia următoare: N=5,54VeW1/22 sau N=16VeW2 unde: N numărul de talere teoretice Ve volumul de eluare, corespunzător semnalului maxim W lărgimea semnalului maxim, la nivelul liniei de bază W1/2 este lărgimea semnalului maxim, la jumătatea înălţimii coloanei

1.6.7. Eficacitatea separării În afară de numărul de talere teoretice, parametru determinant al lărgimii de bandă, eficacitatea de separare este o altă importantă caracteristică, determinată de panta curbei de calibrare. Eficacitatea de separare a unei coloane se calculează cu ajutorul relaţiei următoare: Ve,Mx-Ve,(10Mx)secţiunea coloanei≥6,0 cm3cm2 unde: Ve, Mx volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară Mx Ve,(10.Mx) volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară de 10 ori mai mare Rezoluţia sistemului este în general definită după cum urmează: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 unde: Ve1, Ve2 volumele de eluare ale celor doi polistireni standard la semnalul maxim W1, W2 lărgimile vârfului la nivelul liniei bazei M1, M2 masele moleculare corespunzătoare semnalului maxim (aceste mase ar trebui să fie diferite printr-un factor 10) Valoarea lui R pentru sistemul de coloane trebuie să fie superioară valorii de 1,7 (4).

1.6.8. Solvenţi Toţi solvenţii trebuie să aibă o mare puritate (se va folosi THF de puritate 99,5 %). Rezervorul pentru solvent (la nevoie, pus în atmosferă de gaz inert), trebuie să fie suficient de mare pentru a permite etalonarea coloanei şi mai multe analize de eşantioane. Solventul va fi degazat înainte de a fi pompat în coloană.

1.6.9. Reglarea temperaturii Temperatura componentelor interne critice (bucla de injecţie, coloana sau coloanele, detectorul şi tuburile) trebuie să fie constantă şi compatibilă cu solventul ales.

1.6.10. Detectorul Detectorul înregistrează în mod cantitativ concentraţia eşantionului eluat din coloană. Pentru evitarea unei lărgimi nedorite a picului, volumul cuvei detectorului va fi ales cât mai mic posibil. Acesta nu trebuie să depăşească 10 μl, cu excepţia detectoarelor ce funcţionează prin difuzia luminii şi a viscozimetrelor. În general, detecţia se realizează prin refractometrie diferenţială. Totuşi, dacă proprietăţile specifice ale eşantionului sau ale solventului pentru eluare o cer, se pot folosi alte tipuri de detectoare, cum ar fi cele UV/VIS sau IR, viscozimetrele etc.

2. DATE ŞI RAPORT

2.

2.1. DATE Se va face referinţă la normele DIN (1) în ceea ce priveşte criteriile de evaluare detaliate, la fel pentru specificaţiile relative la colectarea şi interpretarea datelor. Pentru fiecare eşantion analizat, se vor realiza două experienţe independente. Rezultatele acestora se vor analiza separat. Parametrii Mn, Mw, Mw/Mn, Mp se determină pentru fiecare măsurătoare. Trebuie indicat în mod explicit că valorile măsurate sunt valori relative corespunzând unor echivalenţi de masă moleculară ale standardului folosit. După determinarea volumelor şi a timpilor de retenţie (eventual corectate cu ajutorul unui standard intern) se vor reprezenta grafic valorile log MP (MP fiind semnalul maxim al polimerilor standard), în funcţie de una dintre acele cantităţi. Sunt necesare cel puţin 2 puncte de etalonare pentru fiecare factor 10 de masă moleculară. Pentru trasarea întregii curbe sunt necesare cel puţin 5 puncte de măsură; această curbă va acoperi masa moleculară estimată a eşantionului. Punctul extrem al curbei de etalonare, spre partea maselor moleculare mici, se poate defini folosind n-hexilbenzenul sau altă substanţă dizolvată nepolară adecvată. Masele moleculare medii, ca număr şi ca greutate, sunt în general determinate prin prelucrarea informatică a datelor, bazată pe formule menţionate la punctul 1.2. Dacă s-a optat pentru o prelucrare manuală, este indicat să se consulte ASTM D 3536-91 (3). Curba de distribuţie va fi prezentată sub forma unui tabel sau a unui grafic (frecvenţa diferenţială sau procentajele cumulative în funcţie de log M). În cazul reprezentării grafice, o putere de 10 pentru masa moleculară corespunde în mod normal, unei lărgimi de aproximativ 4 cm, în vreme ce pentru maximul de semnal, este adecvată o înălţime de aproximativ 8 cm. În cazul curbelor de distribuţie cumulative, diferenţa între 0 şi 100 % pe axa ordonatei trebuie să fie în jur de 10 cm.

2.2. RAPORT DE TESTARE Raportul de testare va cuprinde informaţiile următoare:

2.2.

2.2.1. Substanţa testată:

informaţii disponibile legate de substanţa testată (natură, aditivi, impurităţi);

descrierea tratamentului aplicat eşantionului, observaţii, probleme.

2.2.2. Dispozitivul experimental:

un rezervor pentru solvent, gaz inert, sistem pentru degazarea solventului, compoziţia solventului, impurităţi;

pompă, amortizor de impulsuri, sistem de injecţie;

coloane de separare (fabricant, toate precizările legate de caracteristicile coloanei, cum ar fi dimensiunea porilor, natura materialului de separare etc., numărul, lungimea şi ordinul coloanelor utilizate);

numărul de talere teoretice ale coloanei (sau al combinaţiei de coloane), eficacitatea separării (resorbţia sistemului);

informaţii legate de simetria semnalelor maxime;

temperatura coloanei, modul de reglare a temperaturii;

detector (principiul de măsurare, tip, volumul cuvei);

debitmetru dacă există (fabricant, principiul de măsurare);

sistemul utilizat pentru culegere şi prelucrarea datelor (echipament şi programe informatice).

2.2.3. Etalonarea sistemului:

descrierea detaliată a metodei utilizate pentru determinarea curbei de etalonare;

precizări asupra criteriilor de calitate proprii acestei metode (de exemplu, coeficientul de corelare, eroarea pătratică medie etc.);

informaţii asupra tuturor extrapolărilor, ipotezelor şi aproximărilor efectuate în cursul proceselor experimentale, precum şi asupra evaluării şi prelucrării datelor;

toate măsurătorile efectuate pentru stabilirea curbei de etalonare trebuie prezentate sub forma unui tabel, care cuprinde, pentru fiecare punct de etalonare, următoarele informaţii:

denumirea eşantionului;

fabricantul eşantionului;

valorile caracteristice Mp, Mn, Mw, Mw/Mn ale etaloanelor furnizate de fabricant, deduse din măsurătorile ulterioare, completate de indicaţiile legate de metoda de determinare;

volumul de injecţie şi concentraţia soluţiei injectate;

valoarea de Mp utilizată pentru etalonare;

volumul de eluare sau timpul de retenţie corectat, măsurat la semnalul maxim;

Mp calculat la semnalul maxim;

procentajul de eroare la Mp calculat şi la valoarea de etalonare.

2.2.4. Evaluare:

evaluare în funcţie de timp: toate metodele care vizează ameliorarea reproductivităţii cerute (metode de corecţie, standard intern etc.);

se precizează dacă evaluarea s-a efectuat plecând de la volumul de eluare sau de la timpul de retenţie;

se indică limitele de evaluare, dacă un pic nu a fost complet analizat;

se descriu metodele de netezire, dacă s-au folosit;

se indică procedeelor de preparare şi pretratare a eşantionului;

dacă există, se indică prezenţa particulelor nedizolvate;

se indică volumul de injecţie (μl) şi concentraţia de injecţie (mg/ml);

se menţionează observaţiile privind efectele generatoare de deviaţii, în raport cu profilul ideal de cromatografie pe gel permeabil;

se descriu în detaliu toate modificările aduse procedurilor de analiză;

se precizează intervalele de eroare;

se consemnează orice alte informaţii şi observaţii utile pentru interpretarea rezultatelor.

3.1.2.3.4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979), Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991) Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992) Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.19. DETERMINAREA CONŢINUTULUI ÎN POLIMERI CU MASĂ MOLECULARĂ MICĂ

A.19.

1. METODĂ Această metodă cromatografică pe gel permeabil urmează Orientarea 118 (1996) a OCDE. Principiile fundamentale şi toate celelalte informaţii tehnice sunt prezentate în bibliografie.

1.

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Masa moleculară mică se defineşte în mod arbitrar ca fiind o masă moleculară inferioară celei de 1000 daltoni. Masa moleculară medie (numerică) Mn şi masa moleculară medie (greutate) Mw, sunt determinate cu ajutorul ecuaţiilor următoare: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi unde: Hi amplitudinea semnalului detectat, corespunzător volumului de retenţie Vi, în funcţie de nivelul de referinţă, Mi este masa moleculară a fracţiunii de polimer, corespunzătoare volumului de retenţie Vi şi n este numărul de puncte experimentale Lărgimea de distribuţie a maselor moleculare, care reprezintă o măsură a polidispersiei sistemului, este exprimată de raportul Mw/Mn.

1.5. CRITERII DE CALITATE Reproductivitatea (deviaţia-standard relativă) a volumului de eluare trebuie să fie cel mult egală cu 0,3 %. Există modalităţi de ameliorare a reproductivităţii de analiză, graţie unei corecţii ce utilizează un standard intern, dacă un cromatograf este evaluat în funcţie de timp şi nu satisface criteriile menţionate mai sus (a se vedea informaţiile complementare la referinţa 1). Polidispersările depind de masele moleculare ale etaloanelor. În cazul polistirenilor etalon, valorile tipice sunt: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp este masa moleculară a etalonului, corespunzătoare semnalului maxim)

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.2. Prepararea soluţiilor de eşantion În principiu, prepararea soluţiilor de eşantion se realizează în condiţii identice. Eşantionul se dizolvă într-un solvent adecvat, de exemplu THF, agitând cu grijă. În niciun caz nu se va dizolva într-o baie cu ultrasunete. Dacă este necesar, soluţia de probă se purifică cu ajutorul unui filtru cu membrană, cu dimensiunea porilor cuprinsă între 0,2-2 μm. Prezenţa particulelor nedizolvate trebuie menţionată în raportul final, în măsura în care acestea pot rezulta din specii cu mase moleculare mari. Trebuie să se recurgă la o metodă potrivită pentru determinarea procentajului în greutate a particulelor nedizolvate. Analiza soluţiilor se va face în termen de 24 ore.

1.6.3. Corecţie legată de prezenţa impurităţilor şi a aditivilor Fiind vorba despre conţinutul în specii cu M < 1000, pentru care este necesar, în general, să se aplice o corecţie care să ţină cont de prezenţa compuşilor particulari nepolimerici (cum ar fi impurităţile sau aditivii), cu excepţia cazului în care conţinutul măsurat nu depăşeşte valoarea de 1 %. Această corecţie se poate realiza prin analiza directă a soluţiei de polimer sau a eluatului pentru cromatografia pe gel permeabil. În cazul în care eluatul este prea diluat pentru a permite analizarea, după traversarea coloanei, este necesar să fie concentrat. Va fi, eventual, necesară evaporarea soluţiei până la sec, urmată de redizolvare. Concentrarea soluţiei se va efectua astfel încât să nu intervină nicio modificare a compoziţiei. Tratamentul soluţiei, după faza cromatografiei pe gel permeabil, este funcţie de metoda de analiză utilizată pentru determinarea cantitativă.

1.6.4. Aparatură Un aparat pentru cromatografie pe gel permeabil este compus din următoarele elemente: Sistemul cromatografic pe gel permeabil trebuie să fie inert faţă de solventul utilizat (de exemplu, utilizarea capilarelor din oţel, atunci când solvent este THF).

un rezervor pentru solvent;

un sistem pentru degazare (dacă este necesar);

o pompă;

un amortizor de impulsuri (dacă este necesar);

un sistem de injecţie;

coloane cromatografice;

un detector;

un debitmetru (dacă este necesar);

un sistem de înregistrare şi tratare a datelor;

un recipient pentru recuperarea soluţiilor utilizate.

1.6.5. Injecţia şi sistemul de pompare a solventului Un volum definit din soluţia de probă este injectat în coloană, într-o zonă bine definită, cu ajutorul unui aparat pentru eşantionare automată sau manuală. Dacă se operează manual, retragerea ori împingerea prea bruscă a pistonului seringii poate determina modificări în distribuţia maselor moleculare observate. Este indicat ca sistemul de pompare a solventului să fie lipsit de pulsaţii; este de preferat ca acesta să includă un amortizor de impulsuri. Debitul este de ordinul a 1 ml/min.

1.6.6. Coloana În funcţie de natura eşantionului testat, polimerul se caracterizează făcând recurs la o singură coloană sau la mai multe coloane, conectate în serie. În comerţ, sunt disponibile mai multe materiale poroase pentru coloane, cu proprietăţi definite (de exemplu, dimensiunea porilor, limita de excludere). Alegerea unui gel de separare sau a lungimii de coloană depinde, pe de o parte, de proprietăţile eşantionului testat (volume hidrodinamice, distribuţia maselor moleculare) şi, pe de altă parte, de condiţiile particulare ale separării, cum ar fi: natura solventului, temperatura şi debitul (1) (2) (3).

1.6.7. Talere teoretice Coloana (sau combinaţia de coloane) utilizată pentru separare trebuie caracterizată prin numărul de talere teoretice. Pentru aceasta, în cazul în care solventul de eluare este THF, se trece o soluţie de etilbenzen sau o altă substanţă dizolvată nepolară potrivită, printr-o coloană de lungime cunoscută. Numărul de talere teoretice este dat de ecuaţia următoare: N=5,54VeW1/22 sau N=16VeW2 unde: N numărul de talere teoretice Ve volumul de eluare, corespunzător semnalului maxim W lărgimea semnalului maxim, la nivelul liniei de bază W1/2 lărgimea semnalului maxim, la jumătatea înălţimii coloanei

1.6.8. Eficacitatea separării În afară de numărul de talere teoretice, parametru determinant al lărgimii de bandă, eficacitatea de separare este o altă caracteristică importantă, determinată de panta curbei de calibrare. Eficacitatea de separare a unei coloane se calculează cu ajutorul relaţiei următoare: Ve,Mx-Ve,(10Mx)secţiunea coloanei≥6,0cm3cm2 unde: Ve, Mx volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară Mx; Ve,(10.Mx) volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară de 10 ori mai mare Rezoluţia sistemului este în general definită după cum urmează: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 unde: Ve1, Ve2 volumele de eluare ale celor doi polistireni standard la semnalul maxim W1, W2 lărgimile vârfului la nivelul liniei bazei M1, M2 masele moleculare corespunzătoare semnalului maxim (aceste mase ar trebui să fie diferite printr-un factor 10) Valoarea lui R pentru sistemul de coloane trebuie să fie superioară valorii de 1,7 (4).

1.6.9. Solvenţi Toţi solvenţii trebuie să aibă o mare puritate (se va folosi THF de puritate 99,5 %). Rezervorul pentru solvent (la nevoie, pus în atmosferă de gaz inert), trebuie să fie suficient de mare pentru a permite etalonarea coloanei şi mai multe analize de eşantioane. Solventul va fi degazat înainte de a fi pompat în coloană.

1.6.10. Reglarea temperaturii Temperatura componentelor interne critice (bucla de injecţie, coloana sau coloanele, detectorul şi tuburile) trebuie să fie constantă şi compatibilă cu solventul ales.

1.6.11. Detectorul Detectorul înregistrează în mod cantitativ concentraţia eşantionului eluat din coloană. Pentru evitarea unei lărgimi nedorite a picului, volumul cuvei detectorului va fi ales cât mai mic posibil. Acesta nu trebuie să depăşească 10 μl, cu excepţia detectoarelor ce funcţionează prin difuzia luminii şi a viscozimetrelor. În general, detecţia se realizează prin refractometrie diferenţială. Totuşi, dacă proprietăţile specifice ale eşantionului sau ale solventului pentru eluare o cer, se pot folosi alte tipuri de detectoare, cum ar fi cele UV/VIS sau IR, viscozimetrele etc.

2. DATE ŞI RAPORT

2.

2.1. DATE Se va face referinţă la normele DIN (1) pentru ceea ce priveşte criteriile de evaluare detaliate, la fel pentru specificaţiile relative la colectarea şi interpretarea datelor. Pentru fiecare eşantion analizat, se vor realiza două experienţe independente. Rezultatele acestora se vor analiza separat. Trebuie indicat în mod explicit că valorile măsurate sunt valori relative corespunzând unor echivalenţi de masă moleculară ale standardului folosit. În toate cazurile, este esenţial să se determine şi datele relative la blancuri, acestea fiind tratate în acelaşi mod ca eşantioanele. După determinarea volumelor şi a timpilor de retenţie (eventual corectate cu ajutorul unui standard intern) se vor reprezenta grafic valorile log Mp (Mp fiind semnalul maxim al polimerilor standard), în funcţie de una dintre acele cantităţi. Sunt necesare cel puţin 2 puncte de etalonare pentru fiecare factor 10 de masă moleculară. Pentru trasarea întregii curbe sunt necesare cel puţin 5 puncte de măsură; această curbă va acoperi masa moleculară estimată a eşantionului. Punctul extrem al curbei de etalonare, spre partea maselor moleculare mici, se poate defini folosind n-hexilbenzenul sau altă substanţă dizolvată nepolară adecvată. Se determină porţiunea de curbă corespunzătoare maselor moleculare mai mici de 1000 şi se va corecta, dacă va fi necesar, luând în considerare prezenţa impurităţilor şi a aditivilor. În general, curbele de eluare sunt evaluate prin intermediul unui sistem de prelucrare informatică a datelor. Dacă s-a optat pentru o prelucrare manuală, este indicat să se consulte ASTM D 3536-91 (3). Dacă un polimer insolubil este reţinut în coloană, masa sa moleculară este, foarte probabil, superioară celei corespunzătoare fracţiunii solubile şi trebuie ţinut cont de aceasta, pentru a evita subestimarea conţinutului în polimeri de masă moleculară mică. În apendice se află indicaţiile ce permit corecţia conţinutului în polimeri de masă moleculară mică, luând în considerare polimerii insolubili. Curba de distribuţie va fi prezentată sub forma unui tabel sau a unui grafic (frecvenţa diferenţială sau procentajele cumulative în funcţie de log M). În cazul reprezentării grafice, o putere de 10 pentru masa moleculară corespunde în mod normal unei lărgimi de aproximativ 4 cm, în vreme ce pentru maximul de semnal, este adecvată o înălţime de aproximativ 8 cm. În cazul curbelor de distribuţie cumulative, diferenţa între 0 şi 100 % pe axa ordonatei trebuie să fie în jur de 10 cm.

2.2. RAPORT DE TESTARE Raportul de testare va cuprinde informaţiile următoare:

2.2.

2.2.1. Substanţa testată:

informaţii disponibile legate de substanţa testată (natură, aditivi, impurităţi);

descrierea tratamentului aplicat eşantionului, observaţii, probleme.

2.2.2. Dispozitivul experimental:

un rezervor pentru solvent, gaz inert, sistem pentru degazarea solventului, compoziţia solventului, impurităţi;

pompă, amortizor de impulsuri, sistem de injecţie;

numărul de talere teoretice ale coloanei (sau al combinaţiei de coloane), eficacitatea separării (resorbţia sistemului);

informaţii legate de simetria semnalelor maxime;

temperatura coloanei, modul de reglare a temperaturii;

detector (principiul de măsurare, tip, volumul cuvei);

debitmetru, dacă există (fabricant, principiul de măsurare);

sistemul utilizat pentru culegere şi prelucrarea datelor (echipament şi programe informatice).

2.2.3. Etalonarea sistemului:

descrierea detaliată a metodei utilizate pentru determinarea curbei de etalonare;

precizări asupra criteriilor de calitate proprii acestei metode (de exemplu, coeficientul de corelare, eroarea pătratică medie etc.);

informaţii asupra tuturor extrapolărilor, ipotezelor şi aproximărilor efectuate în cursul proceselor experimentale, precum şi asupra evaluării şi prelucrării datelor;

toate măsurătorile efectuate pentru stabilirea curbei de etalonare trebuie prezentate sub forma unui tabel, care cuprinde, pentru fiecare punct de etalonare, următoarele informaţii:

denumirea eşantionului;

fabricantul eşantionului;

valorile caracteristice Mp, Mn, Mw, Mw/Mn ale etaloanelor furnizate de fabricant, deduse din măsurătorile ulterioare, completate de indicaţiile legate de metoda de determinare;

volumul de injecţie şi concentraţia substanţei injectate;

valoarea de Mp utilizată pentru etalonare;

volumul de eluare sau timpul de retenţie corectat, măsurat la semnalul maxim;

Mp calculat la semnalul maxim;

procentajul de eroare la Mp calculat şi la valoarea de etalonare.

2.2.4. Informaţii asupra conţinutului în polimeri cu masă moleculară mică:

descrierea metodelor de analiză utilizate şi a modului în care au fost conduse experimentele;

informaţii privind procentajul conţinutului în specii de masă moleculară mică (greutate/greutate) în raport cu ansamblul eşantionului;

informaţii legate de impurităţi, aditivi şi alte substanţe nepolimerice, în procentaj ponderal, funcţie de ansamblul eşantionului;

2.2.5. Evaluare:

evaluare în funcţie de timp: toate metodele care vizează ameliorarea reproductivităţii cerute (metode de corecţie, standard intern etc.);

se precizează dacă evaluarea s-a efectuat plecând de la volumul de eluare sau de la timpul de retenţie;

se indică limitele de evaluare, dacă un pic nu a fost complet analizat;

se descriu metodelor de netezire, dacă s-au folosit;

se indică procedeele de preparare şi pretratare a eşantionului;

dacă există, se indică prezenţa particulelor nedizolvate;

se indică volumul de injecţie (μl) şi concentraţia de injecţie (mg/ml);

se menţionează observaţiile privind efectele generatoare de deviaţii, în raport cu profilul ideal de cromatografie pe gel permeabil;

se descriu în detaliu toate modificările aduse procedurilor de analiză;

se precizează intervalele de eroare;

se consemnează orice alte informaţii şi observaţii utile pentru interpretarea rezultatelor.

3.1.2.3.4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE DIN 55672 (1995), Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979), Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991), Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992), Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.20. COMPORTAMENTUL DE DIZOLVARE/EXTRACŢIE AL POLIMERILOR ÎN APĂ

A.20.

1. METODĂ Metoda descrisă urmează Orientarea 120 (1997) a OCDE. Mai multe informaţii tehnice se găsesc în referinţele bibliografice (1).

1.

1.1. INTRODUCERE În cazul anumitor polimeri, cum ar fi polimerii în emulsie, poate fi necesar un tratament iniţial, înainte de utilizarea metodei expuse. Metoda nu este aplicabilă polimerilor lichizi, nici polimerilor care reacţionează cu apa în condiţiile experimentale. Dacă este dificil sau imposibil să se pună în practică metoda, comportamentul de dizolvare/extracţie al polimerilor poate fi studiat cu ajutorul altor metode. În acest caz, metoda utilizată va fi în întregime detaliată şi justificată.

1.2. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.3. PRINCIPIUL METODEI Comportamentul de dizolvare/extracţie al polimerilor în mediu apos se determină prin metoda flaconului (a se vedea A.6 Solubilitatea în apă, metoda flaconului), căreia i se vor aduce modificările descrise mai jos.

1.4. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1.5. DESCRIEREA METODEI

1.5.

1.5.1. Aparatură Aparatura necesară pentru aplicarea metodei este următoarea:

un dispozitiv care permite măcinarea eşantionului până la obţinerea unei pulberi, cum ar fi un concasor ce produce particule de dimensiuni determinate (1);

un sistem de agitare, cu posibilitatea de reglare a temperaturii;

un sistem de filtrare cu membrane;

un dispozitiv de analiză;

site standardizate.

1.5.2. Prepararea soluţiei de eşantion Iniţial trebuie măcinat un eşantion reprezentativ, până la dimensiuni ale particulelor cuprinse între 0,125 şi 0,25 mm, utilizând sitele potrivite. Poate fi necesară o răcire pentru a garanta stabilitatea eşantionului sau pentru a se proceda la concasare. Materialele de tipul cauciucului pot fi pulverizate la temperatura azotului lichid (1). Dacă nu este posibilă obţinerea de particule la dimensiunile cerute, se vor reduce dimensiunile acestora cât mai mult posibil şi se va consemna rezultatul. În cuprinsul raportului, este necesar să se indice modul în care eşantionul pulverizat a fost conservat înainte de analiză.

1.5.3. Mod de operare Se cântăresc trei eşantioane din substanţa testată, fiecare de 10 g, în trei recipiente prevăzute cu dop de sticlă şi se adaugă câte 1000 ml apă în fiecare recipient. Dacă manipularea a 10 g de polimer se dovedeşte imposibilă, este indicat să se folosească cea mai mare cantitate care poate fi manipulată; volumul de apă va fi mărit în mod proporţional. Recipientele se vor închide bine, apoi se vor agita la temperatura de 20 oC. Se va folosi un dispozitiv de agitare care funcţionează la temperatură constantă. După 24 ore, conţinutul fiecărui recipient este centrifugat sau filtrat, iar concentraţia polimerului în faza apoasă limpede va fi determinată cu ajutorul unei metode potrivite de analiză. Dacă nu există o metodă adecvată, care să permită o analiză în faza apoasă, se poate obţine o estimare a solubilităţii/extractibilităţii totale, prin cântărirea, după uscare, a reziduului filtrat sau a precipitatului centrifugat. De asemenea, este necesară diferenţierea cantitativă a impurităţilor şi aditivilor, pe de o parte, şi a speciilor de masă moleculară mică, pe de altă parte. În cazul unei determinări gravimetrice, este important să se realizeze o analiză iniţială, fără substanţă de testare, în scopul de a lua în considerare reziduurile generate prin metoda experimentală. În mod similar, se poate determina comportamentul de dizolvare/extracţie al polimerilor în apă, la 37 oC, pentru pH 2 şi pH 9, aşa cum a fost descrisă experienţa realizată la 20 oC. Valorile pH-ului pot fi obţinute prin adăugare de soluţii tampon adecvate sau adăugare de acizi ori baze, potriviţi; dintre aceştia, se pot enumera: acid clorhidric, acid acetic, hidroxizi de sodiu şi de potasiu de calitate analitică sau amoniac. Trebuie realizate una sau două experienţe, conform metodei. În cazul în care sunt disponibile metode suficient de specifice, pentru analizarea directă a polimerului în faza apoasă, un experiment ca acela descris mai sus este destul. Însă, atunci când aceste metode nu există, iar determinarea comportamentului de dizolvare-extracţie al polimerului, nu se poate face decât indirect – respectiv prin determinarea conţinutului în carbon organic total (COT) al extractului apos – este necesară o experienţă suplimentară. De asemenea, şi aceasta se va face în triplicat, cu eşantioane de polimer de 10 ori mai mici şi cu aceleaşi cantităţi de apă, ca şi la primul experiment.

1.5.4. Analiza

1.5.4.

1.5.4.1. Experimente realizate cu eşantioane de dimensiuni unice Este posibil să dispunem de metode care permit o analiză directă a polimerilor, în fază apoasă. În caz contrar, poate fi luată în considerare analiza indirectă a polimerilor dizolvaţi sau extraşi. Pentru aceasta, se va determina conţinutul total în părţi solubile, care se va corecta ţinând cont de substanţele nepolimerice. Pentru a determina conţinutul total în specii polimerice, analiza extrasului apos se poate realiza: fie printr-o metodă suficient de sensibilă, de exemplu: fie prin evaporare completă, în vid, a extrasului apos, urmată de o analiză a reziduului prin spectroscopie (IR, UV etc.) sau prin SAA-PCI. Dacă o astfel de analiză a fazei apoase este imposibilă, extrasul apos se va obţine cu ajutorul unui solvent organic nemiscibil în apă (o hidrocarbură clorurată, de exemplu). Apoi, solventul este evaporat şi reziduul se analizează (prin IR, UV sau SAA-PCI), pentru determinarea conţinutului său în polimer specificat. Toţi constituenţii acestui reziduu care se dovedesc a fi impurităţi sau aditivi trebuie separaţi, în scopul determinării gradului de dizolvare/extracţie al polimerului. Atunci când astfel de substanţe sunt prezente în cantităţi relativ importante, poate fi necesară supunerea reziduului unei analize cromatografice în fază lichidă, de înaltă performanţă, sau în fază gazoasă, de exemplu, în scopul diferenţierii acelor impurităţi prezente, de monomeri şi derivaţi monomerici, astfel încât conţinutul real în aceste ultime specii, să poată fi determinat. În anumite cazuri, o simplă evaporare completă a solventului organic, urmată de cântărirea reziduului uscat, poate fi suficientă.

determinarea COT cu persulfat sau dicromat, pentru a se obţine CO2, urmată de o estimare prin IR sau de o analiză chimică;

spectrometria de absorbţie atomică (SAA) sau echivalentul acesteia, emisie în plasmă cuplată prin inducţie (PCI);, în cazul polimerilor ce conţin siliciu sau un metal;

absorbţia UV sau spectrofluorimetria pentru polimerii arilici;

cromatografia în fază lichidă cuplată cu spectrometria de masă, pentru eşantioane cu mase moleculare mici,

1.5.4.2. Experimente realizate cu două eşantioane de mărimi diferite Conţinutul în carbon organic total trebuie determinat pentru toate extrasele apoase. Se realizează o determinare prin gravimetrie, asupra părţii nedizolvate sau neextrase a eşantionului. Dacă, după centrifugarea sau filtrarea conţinutului fiecărui recipient, reziduul de polimer aderă încă la peretele recipientului, trebuie clătit respectivul recipient cu filtratul, până când nu se mai observă urme de reziduu. După aceea, filtratul este refiltrat sau centrifugat. Reziduurile depuse pe filtru sau în tubul centrifugei sunt uscate la 40 oC, în vid, apoi se cântăresc. Se va continua uscarea, până la obţinerea unei mase constante.

2. DATE

2.

2.1. EXPERIMENTE REALIZATE CU EŞANTIOANE DE DIMENSIUNI UNICE Rezultatele obţinute pentru fiecare dintre cele trei flacoane, precum şi valorile medii, trebuie consemnate şi exprimate în unităţi de masă per volum de soluţie (în general, în mg/l) sau în unităţi de masă per masă de eşantion de polimer (de obicei, în mg/g). În plus, pierderea de masă de eşantion (calculată prin raportarea masei soluţiei la masa iniţială de eşantion), va fi de asemenea menţionată. Trebuie calculate deviaţiile standard relative. Diversele valori vor fi menţionate o dată, pentru produsul total (polimer + principalii aditivi etc.) şi repetate, pentru polimerul singur (pentru a cunoaşte, după separare, mărimea relativă a respectivilor aditivi).

2.2. EXPERIMENTE REALIZATE CU EŞANTIOANE DE DIMENSIUNI DIFERITE Diferitele concentraţii ale carbonului organic total în extrasele apoase, provenite din cele două serii a câte trei experienţe, precum şi valorile medii pentru fiecare serie, trebuie consemnate şi exprimate în unităţi de masă per volum de soluţie (în general, în mgC/l), precum şi în unităţi de masă per masă de eşantion iniţial (de obicei, în mgC/g). Dacă nu există diferenţe între rezultatele corespunzătoare rapoartelor dimensiune de eşantion/volum de apă mare sau mic, aceasta poate semnifica faptul că toţi constituenţii susceptibili a fi extraşi, au fost efectiv extraşi. În acest caz, o analiză directă nu este, de regulă, necesară. Diferitele mase de reziduu trebuie consemnate şi exprimate în procente de masă iniţială de eşantion. Se vor calcula valori medii pentru fiecare experienţă. Diferenţa dintre 100 şi procentajul obţinut, reprezintă procentul de materii solubile şi extractibile din eşantioanele iniţiale.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORT DE TESTARE Raportul de testare trebuie să cuprindă următoarele informaţii:

3.1.

3.1.1. Substanţa testată:

informaţii disponibile, legate de substanţa testată (natură, aditivi, impurităţi, proporţia speciilor cu masă moleculară mică).

3.1.2. Condiţii experimentale:

descrierea metodelor utilizate şi a condiţiilor experimentale;

descrierea metodelor de analiză şi detecţie.

3.1.3. Rezultate:

rezultate de solubilitate/extractibilitate în mg/l: toate valorile şi valorile medii obţinute pentru experienţele de extracţie în diferite soluţii, repartizate în polimeri şi impurităţi, aditivi etc.;

rezultate de solubilitate/extractibilitate în mg/g de polimer;

concentraţiile carbonului organic total în extractele apoase, masa soluţiei şi procentajele calculate, dacă s-a făcut măsurarea;

pH-ul fiecărui eşantion;

informaţii privind valorile obţinute în experienţele martor (fără solvent);

descrierea metodelor de analiză şi detecţie;

dacă este necesar, se va menţiona instabilitatea chimică a substanţei testate, în cursul procedurii experimentale şi în cursul analizei;

toate informaţiile importante pentru interpretarea rezultatelor.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

A.21. PROPRIETĂŢI OXIDANTE (LICHIDE)

A.21.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Această metodă de testare este concepută pentru a măsura potenţialul unei substanţe lichide de a creşte rata sau intensitatea arderii unei substanţe combustibile sau de a forma cu o substanţă combustibilă un amestec care se aprinde spontan când cele două se amestecă omogen. Se bazează pe testul ONU pentru lichide oxidante (1) şi este echivalent cu acesta. Cu toate acestea, întrucât această metodă A.21 este concepută în special pentru a îndeplini cerinţele Regulamentului (CE) nr. 1907/2006, este necesară comparaţia cu o singură substanţă de referinţă. Testarea şi comparaţia cu alte substanţe de referinţă pot fi necesare în cazul în care se estimează utilizarea rezultatelor în alte scopuri. Nu este necesar să se efectueze acest test în cazul în care examinarea formulei structurale stabileşte indubitabil că substanţa este incapabilă să reacţioneze exotermic cu un material combustibil. Înainte de efectuarea testului este util să se cunoască informaţii privind orice potenţiale proprietăţi explozive ale substanţei. Acest test nu se aplică substanţelor solide, gazoase, explozive sau foarte inflamabile sau peroxizilor organici. Nu este necesar să se efectueze acest test în cazul în care sunt disponibile rezultatele pentru substanţa de testat în cadrul testului ONU pentru lichide oxidante (1).

1.2. DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI Timpul mediu de creştere a presiunii reprezintă media timpilor măsuraţi în care un amestec testat produce o creştere de presiune de la 690 kPa la 2070 kPa peste presiunea atmosferică.

1.3. SUBSTANŢA DE REFERINŢĂ Ca substanţă de referinţă se utilizează o soluţie apoasă de acid azotic (calitate analitică) la 65 % (g/g). Opţional, dacă experimentatorul prevede că rezultatele acestui test ar putea fi utilizate în alte scopuri, ar putea fi oportună testarea altor substanţe de referinţă.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Lichidul care urmează a fi testat se amestecă, în proporţie masică de 1 la 1 cu celuloză fibroasă şi se introduce într-un vas de presiune. Dacă în timpul amestecării sau umplerii are loc combustia spontană, nu mai sunt necesare alte teste. Dacă nu intervine combustia spontană, se efectuează testul complet. Amestecul se încălzeşte într-un vas de presiune şi se măsoară timpul mediu de creştere a presiunii de la 690 kPa la 2070 kPa peste presiunea atmosferică. Acesta este comparat cu timpul mediu de creştere a presiunii pentru amestecul de substanţă sau substanţe de referinţă şi celuloză în proporţie de 1:1.

1.5. CRITERII DE CALITATE Dintr-o serie de cinci teste asupra unei singure substanţe, rezultatele nu trebuie să prezinte diferenţe de peste 30 % faţă de media aritmetică. Rezultatele care se abat cu peste 30 % de la medie se ignoră, se îmbunătăţeşte procedura de amestecare şi umplere şi se repetă testele.

1.6. DESCRIEREA METODEI

1.6.

1.6.1. Pregătire

1.6.1.

1.6.1.1. Substanţa combustibilă Ca material combustibil se utilizează celuloză fibroasă uscată, cu fibre de o lungime între 50 şi 250 μm şi un diametru mediu de 25 μm. Celuloza se usucă până la obţinerea unei greutăţi constante în straturi de maximum 25 mm grosime, la 105 oC timp de patru ore, după care se păstrează într-un exsicator, în prezenţa unui deshidratant, până la răcire şi utilizare. Conţinutul de apă al celulozei uscate trebuie să fie sub 0,5 % din masa uscată. Dacă este necesar, timpul de uscare se prelungeşte pentru îndeplinirea acestei condiţii. Pe întreg parcursul testului se utilizează acelaşi lot de celuloză.

1.6.1.2. Aparatură

1.6.1.2.

1.6.1.2.1. Vas de presiune Este necesar un vas de presiune. Vasul este format dintr-un vas de presiune cilindric, din oţel, cu o lungime de 89 mm şi un diametru exterior de 60 mm (a se vedea figura 1). În două puncte diametral opuse se formează două suprafeţe plane (care reduc secţiunea transversală a vasului la 50 mm) care permit fixarea sa în momentul instalării dopului de aprindere şi a dopului de aerisire. Vasul, care are un alezaj cu un diametru de 20 mm, este fălţuit intern la ambele capete pe o adâncime de 19 mm şi filetat pentru fileturi de 1" conform British Standard Pipe (BSP) sau echivalent metric. O priză de presiune, sub forma unui braţ lateral, este înfiletată pe faţa curbată a vasului de presiune la 35 de mm de unul dintre capete şi la 90o faţă de suprafeţele plane. Orificiul pentru priză este alezat la o adâncime de 12 mm şi filetat pentru fileturi de 1/2" BSP (sau echivalent metric) la extremitatea braţului lateral. Dacă este necesar, pentru a asigura etanşeitatea la gaz, se foloseşte o garnitură inertă. Braţul lateral se extinde 55 mm de la corpul vasului de presiune şi are un alezaj de 6 mm. Extremitatea braţului lateral este fălţuită şi filetată pentru un traductor de presiune de tip diafragmă. Se poate utiliza orice dispozitiv de măsurare a presiunii care nu este afectat de gazele calde sau de produsele de descompunere şi care poate reacţiona la o creştere de presiune de la 690 la 2070 kPa în cel mult 5 ms. Extremitatea vasului de presiune cea mai îndepărtată de braţul lateral este închisă cu un dop de aprindere prevăzut cu doi electrozi, unul izolat de corpul dopului, iar celălalt pus la masă. Cealaltă extremitate a vasului de presiune este închisă cu un disc de rupere (presiunea de rupere aproximativ 2200 kPa), fixat cu un dop de fixare având un orificiu de 20 mm. Dacă este necesar, dopul de aprindere se montează cu o garnitură inertă pentru a asigura etanşeitatea la gaz. În timpul utilizării, ansamblul este menţinut în poziţia corectă de un stand de sprijin (figura 2). Acesta cuprinde, de obicei, o placă de bază din oţel moale de 235 mm × 184 mm × 6 mm şi un tub cu secţiune pătrată de 70 mm × 70 mm × 4 mm de 185 mm lungime. La una dintre extremităţile tubului cu secţiune pătrată, se taie câte o secţiune de fiecare parte, astfel încât să se obţină o structură cu secţiune pătrată de 86 mm lungime cu două picioare plate. Capetele acestor picioare pătrate se taie într-un unghi de 60o faţă de orizontală şi sudate pe placa de bază. Pe o parte a capătului superior al secţiunii de bază se decupează o fantă de 22 mm lăţime şi 46 mm adâncime, astfel încât, atunci când ansamblul vasului de presiune este pus pe suport, cu dopul de aprindere în jos, braţul lateral să intre în fantă. O piesă de oţel de 30 mm lăţime şi 6 mm grosime se sudează pe faţa interioară a părţii inferioare a tubului cu secţiune pătrată, pentru a acţiona ca distanţier. Două şuruburi cu cap fluture de 7 mm, fixate pe partea opusă, menţin vasul de presiune într-o poziţie fixă. Două benzi de 12 mm lăţime din tablă de oţel de 6 mm grosime, sudate pe părţile laterale de la baza tubului cu secţiune pătrată, sprijină vasul de presiune de dedesubt.

1.6.1.2.2. Sistemul de aprindere Sistemul de aprindere este format dintr-o sârmă de Ni/Cr cu o lungime de 25 cm, un diametru de 0,6 mm şi o rezistenţă de 3,85 ohm/m. Sârma se înfăşoară, pe o tijă cu un diametru de 5 mm, sub forma unei bobine, şi se leagă la electrozii dopului de aprindere. Bobina trebuie să aibă una dintre configuraţiile prezentate în figura 3. Distanţa dintre fundul vasului şi partea inferioară a bobinei de aprindere trebuie să fie de 20 mm. Dacă electrozii nu pot fi reglaţi, secţiunile sârmei de aprindere dintre bobină şi fundul vasului se izolează cu o manta ceramică. Sârma este încălzită de o sursă de alimentare constantă care poate asigura cel puţin 10 A.

1.6.2. Desfăşurarea testului Aparatul, echipat complet cu traductor de presiune şi sistem de încălzire, dar fără discul de rupere, se sprijină vertical, cu dopul de aprindere în jos. Se amestecă 2,5 g din lichidul de testat cu 2,5 g de celuloză uscată într-un pahar de laborator cu un agitator de sticlă. Pentru siguranţă, în timpul amestecării între operator şi amestec se amplasează un ecran de protecţie. Dacă amestecul se aprinde în timpul amestecării sau umplerii, nu mai sunt necesare teste suplimentare. Amestecul se adaugă, în cantităţi mici, lovindu-l încet de container, în vasul de presiune, asigurându-se că nu există spaţii goale în jurul bobinei de aprindere şi că amestecul este în contact perfect cu aceasta. Este important ca bobina să nu fie deformată în procesul de umplere, întrucât acest lucru ar putea conduce la rezultate eronate. Discul de rupere se pune pe poziţie şi dopul de fixare se înşurubează strâns. Vasul umplut se pune, cu discul de rupere în sus, pe suportul de sprijin pentru încălzire care se amplasează într-o hotă sau o cameră de tiraj adecvată. Se conectează sursa de alimentare la bornele externe ale dopului de aprindere şi se aplică un curent de 10 A. De la începerea amestecării şi până la punerea sub tensiune nu trebuie să treacă mai mult de 10 minute. Semnalul produs de traductorul de presiune se înregistrează într-un sistem adecvat care permite atât evaluarea, cât şi generarea unei înregistrări permanente a graficului presiune/timp obţinut (de exemplu un înregistrator de semnale tranzitorii legat la un înregistrator cu bandă). Amestecul se încălzeşte până când se rupe discul de rupere sau cel puţin 60 s. Dacă discul de rupere nu se rupe, amestecul se lasă să se răcească, după care se dezmembrează cu atenţie aparatul, luând măsurile necesare pentru a ţine seama de eventuala presurizare. Se fac cinci teste cu substanţa de testat şi substanţa sau substanţele de referinţă. Se notează timpul necesar pentru creşterea presiunii de la 690 kPa la 2070 kPa peste presiunea atmosferică. Se calculează timpul mediu de creştere a presiunii. În unele cazuri, substanţele pot genera o creştere de presiune (prea mare sau prea mică), cauzată de reacţii chimice care nu caracterizează proprietăţile oxidante ale substanţei. În aceste cazuri, este posibil să fie necesară repetarea testului cu o substanţă inertă, de exemplu diatomit (kieselgur), în loc de celuloză, pentru a se clarifica natura reacţiei.

2. DATE Timpii de creştere a presiunii atât pentru substanţa de testat, cât şi pentru substanţa (substanţele) de referinţă. Timpii de creştere a presiunii pentru testele cu o substanţă inertă, dacă se efectuează astfel de teste.

2.

2.1. Tabelul 1 Exemple de rezultate

PRELUCRAREA REZULTATELOR Se calculează timpii medii de creştere a presiunii atât pentru substanţa de testat, cât şi pentru substanţa sau substanţele de referinţă. Se calculează timpul mediu de creştere a presiunii pentru testele cu o substanţă inertă (dacă se efectuează). Tabelul 1 prezintă câteva exemple de rezultate. Substanţa Timpul mediu de creştere a presiunii pentru un amestec 1:1 cu celuloză (ms) Dicromat de amoniu, soluţie apoasă saturată 20800 Nitrat de calciu, soluţie apoasă saturată 6700 Nitrat feric, soluţie apoasă saturată 4133 Perclorat de litiu, soluţie apoasă saturată 1686 Perclorat de magneziu, soluţie apoasă saturată 777 Nitrat de nichel, soluţie apoasă saturată 6250 Acid azotic, 65 % 4767 Acid percloric, 50 % 121 Acid percloric, 55 % 59 Nitrat de potasiu, soluţie apoasă 30 % 26690 Nitrat de argint, soluţie apoasă saturată Clorat de sodiu, soluţie apoasă 40 % 2555 Nitrat de sodiu, soluţie apoasă 45 % 4133 Substanţă inertă Apă:celuloză

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare trebuie să cuprindă următoarele informaţii:

identitatea, puritatea, compoziţia, puritatea etc. substanţei de testat;

concentraţia substanţei de testat;

procedura de uscare a celulozei utilizate;

conţinutul de apă al celulozei utilizate;

rezultatele măsurătorilor;

rezultatele testelor cu o substanţă inertă, dacă este cazul;

timpii medii de creştere a presiunii calculaţi;

orice abatere de la această metodă şi motivele acesteia;

orice informaţii şi observaţii suplimentare relevante pentru interpretarea rezultatelor.

3.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR Rezultatele testelor se evaluează în funcţie de: O substanţă lichidă este considerată oxidant dacă: Dacă este necesar pentru a evita un rezultat pozitiv fals, la interpretarea rezultatelor se iau în considerare şi rezultatele obţinute la testarea substanţei cu un material inert.

3.2.

(a) eventuala combustie spontană a amestecului de substanţă de testat şi celuloză; şi

(b) compararea timpului mediu necesar pentru creşterea presiunii de la 690 kPa la 2070 kPa cu cel al substanţei (substanţelor) de referinţă.

(a) un amestec de substanţă de testat şi celuloză în proporţie masică de 1:1 se aprinde spontan; sau

(b) un amestec de substanţă de testat şi celuloză în proporţie masică de 1:1 are un timp mediu de creştere a presiunii mai mic sau egal cu cel al unui amestec de acid azotic în soluţie apoasă de 65 % (g/g) şi celuloză în proporţie masică de 1:1.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, p. 342. Test O.2: Test for oxidising liquids. Notă: se poate folosi oricare dintre aceste configuraţii.

4.

Figura 1 Vas de presiune

(A) Corpul vasului de presiune (B) Dop de fixare disc de rupere (C) Dop de aprindere (D) Şaibă din plumb moale (E) Disc de rupere (F) Braţ lateral (G) Cap traductor de presiune (H) Şaibă (J) Electrod izolat (K) Electrod pus la masă (L) Izolaţie (M) Con de oţel (N) Canelură de deformare a şaibei

Figura 2 Stand de sprijin

Figura 3 Sistemul de aprindere

(A) Bobină de aprindere (B) Izolaţie (C) Electrozi (D) Dop de aprindere

Apendice Pentru mai multe detalii tehnice, pot fi consultate următoarele standarde.

1. Metodele tubului capilar

1.

1.1. Dispozitive pentru măsurarea punctului de topire cu baie de lichid ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfarehn JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products

1.2. Dispozitive pentru determinarea punctului de topire cu bloc metalic fierbinte DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point

2. Metodele suprafeţei calde

2.

2.1. Banc de încălzire Kofler ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Microscop pentru determinarea punctului de topire DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

2.3. Metoda meniscului (poliamide) ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du point de fusion méthode du menisque

3. Metode pentru determinarea punctului de congelare BS 4633 Method for the determination of crystallising point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congelation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Analiza termică

4.

4.1. Analiza termică diferenţială ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Calorimetrie diferenţială ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Determinarea punctului de curgere NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour point

Apendice Pentru mai multe date tehnice, pot fi consultate standardele următoare, de exemplu.

1.1.1. Ebuliometru Dispozitive cu baie de lichid ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Metoda distilării (a intervalului de fierbere) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Losungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Analiza termică diferenţială şi calorimetria diferenţială ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

Apendice Pentru mai multe detalii tehnice pot fi consultate următoarele standarde suplimentare.

1. Metode prin flotabilitate

1.

1.1. Hidrometrul DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardised sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2. Balanţa hidrostatică

1.2. Pentru substanţe solide:

ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density

Pentru substanţe lichide:

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 şi ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3. Metoda corpului scufundat DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2. Metode picnometrice

2.

2.1. Pentru substanţe lichide ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100.10–6 m2 s–1 at 15 oC) DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100.10–6 m2 s–1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC) DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have a too high vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method

2.2. Pentru substanţe solide ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method DIN 19683 Determination of the density of soils

3. Picnometru de comparaţie cu aer DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; chlorhaltige Polymere; Prüfung

Apendicele 1 Metoda estimării

INTRODUCERE

Valorile calculate ale presiunii de vapori pot fi folosite:

pentru a stabili care metodă experimentală este cea optimă;

pentru a furniza o estimare sau o valoare-limită în cazul în care metoda experimentală nu poate să fie aplicată din cauza unor probleme tehnice (inclusiv situaţiile în care presiunea de vapori este foarte scăzută);

pentru a ajuta la identificarea acelor cazuri în care omiterea măsurătorilor experimentale este justificată deoarece presiunea de vapori este cel mai probabil sub 10–5 Pa la temperatura camerei.

METODA ESTIMĂRII

Presiunea de vapori a solidelor şi lichidelor poate fi estimată folosind corelaţia Watson modificată (a). Singura dată experimentală necesară este punctul de fierbere în condiţii normale. Metoda este aplicabilă pentru intervalul de presiune 105-10–5 Pa. Informaţii detailate asupra metodei se găsesc în Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b) (Manual de metode de estimare a proprietăţilor substanţelor).

METODA DE CALCUL

În conformitate cu referinţa (b), presiunea de vapori este calculată după relaţia: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb unde: T = temperatura care interesează Tb = punct de fierbere în condiţii normale Pvp = presiunea de vapori la temperatura T ΔHvb = căldura de vaporizare ΔZb = factor de compresibilitate (este estimat la 0,97) m = factor empiric depinzând de starea fizică la temperatura T În continuare ΔHvbTb=KF8,75+R ln Tb unde KF este un factor empiric dependent de polaritatea substanţei. Pentru unele tipuri de compuşi, factorul KF este listat în referinţa bibliografică (b). Adesea, există date disponibile pentru punctul de fierbere la presiune redusă. În asemenea situaţii, în conformitate cu referinţa (b), presiunea de vapori se calculează conform relaţiei: ln Pvp ≈ ln P1+ΔHv1ΔZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 unde T1 = punct de fierbere la presiunea redusă P1.

RAPORT

În cazul în care se foloseşte metoda estimării, raportul de testare cuprinde o documentaţie cuprinzătoare a calculului utilizat.

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE

(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, p. 398.

(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

Apendicele 2

Figura 1 Aparatură pentru determinarea curbei presiunii de vapori după metoda dinamică

1 = Termocuplu 2 = Volum tampon 3 = Manometru 4 = Vid 5 = Punct de măsurare 6 = Element de încălzire circa 150 W

Figura 2a Aparatură pentru determinarea curbei presiunii de vapori prin metoda statică (prin folosirea unui manometru în U)

1. Substanţa de testat 2. Faza de vapori 3. Ventil de vid avansat 4. Tub în U (manometru auxiliar) 5. Manometru 6. Baie termostatată 7. Dispozitiv de măsurare a temperaturii 8. Către pompa de vid 9. Ventilaţie

Figura 2b Aparat pentru determinarea curbei presiunii de vapori prin metoda statică (folosind un indicator de presiune)

1. Substanţă de testat 2. Faza de vapori 3. Ventil de vid avansat 4. Manometru 5. Indicator de presiune 6. Baie termostatată 7. Dispozitiv de măsurare a temperaturii

Figura 3 Izoteniscop (a se vedea referinţa 7)

1. La sistemul de măsurare şi control al presiunii 2. Tub cu diametrul exterior 8 mm 3. Azot uscat sub presiune 4. Vapori de probă 5. Vârful rezervorului 6. Eşantion de lichid

Figura 4 Aparat pentru determinarea curbei presiunii de vapori prin metoda balanţei

1. Substanţa de testat 2. Faza vapori cu jet de vapori 3. Cuptor evaporator cu canal de admisie rotativ 3a. Capacul cu orificiu al cuptorului 4. Placă de încălzire (refrigerent) a cuptorului 5. Punct de măsurare a temperaturii eşantionului 6. Cutie de răcire 7. Scut-pâlnie 8. Tijă de răcire pentru cutia de răcire 9. Talerul balanţei 10. Microbalanţă 11. Către înregistrator 12. Către pompa de vid avansat

Figura 5 Exemplu de aparat pentru determinarea presiunilor de vapori scăzute prin metoda efuziunii cu celulă de efuziune de 8 cm3

1 Conectare la vid 2 Tuburi pentru termometru cu rezistenţă de platină sau pentru controlul şi măsurarea Temperaturii 3 Capac pentru cuva de vid 4 Garnitură de etanşare 5 Cuvă de aluminiu pentru vid 6 Dispozitiv pentru introducerea şi scoaterea celulelor de efuziune 7 Capac filetat 8 Piuliţă tip fluture (6) 9 Bolţuri (6) 10 Celule de efuziune din oţel inoxidabil 11 Cartuş caloric (6)

Figura 6a Un exemplu de sistem în flux pentru determinarea presiunii de vapori prin metoda saturaţiei gazului

1 = Regulator de debit 2 = Schimbător de căldură 3 = Ventile tip ac 4 = Senzor de umiditate relativă 5 = Coloană de saturaţie 6 = Racorduri PTFE 7 = Debitmetru 8 = Separator de condens (absorber) 9 = Separator (ulei) 10 = Barbotor cu frită

Figura 6b Un exemplu de sistem de determinare a presiunii de vapori prin metoda saturării gazului, cu tub capilar în aval de coloana de saturaţie

1. Debitmetru termic 2. Manometru 3. Incintă termostatată 4. Serpentină termostatată pentru gazul purtător 5. Termometru (Pt 100) 6. Coloană de saturaţie gaz 7. Tub capilar 8. Vas de absorbţie 9. Gazometru 10. Separator la rece

Figura 7 Exemplu de configuraţie pentru metoda rotorului

Aparat pentru presiunea de vapori A. Capul indicatorului cu rotor B. Celulă cu eşantion C. Termostat D. Linie de vid (turbopompă) E. Termostat de aer

Figura 8 Exemplu de cap de măsurare

1. Bilă 2. Extensia tubulară vidată a (punctului) 6 3. Magneţi permanenţi 4. Bobină (2) pentru stabilizare verticală 5. Bobine de acţionare (4) 6. Flanşă de conectare

Apendice

Figura 1 Metoda eluţiei pe coloană cu pompă de recirculare

Echilibrare atmosferică Debitmetru Microcoloană Pompă de circulaţie termostatată Pompă de recirculore Robinet cu două căi pentru eşantionare

Figura 2 Microcoloană tip

(Toate dimensiunile în milimetri) Racord pentru garnitura din sticlă rodată Volum tampon Diametru interior 5 Diametru exterior 19 Dop din vată de sticlă Robinet cu două căi

Figura 3 Microcoloană tip

(Toate dimensiunile în milimetri) Racord pentru garnitura din sticlă rodată Volum tampon Diametru interior 5 Diametru interior 19 Robinet

Figura 4 Metoda coloanei de eluţie cu vas de nivel

1 = Vas de nivel (de exemplu balon de 2,5 litri) 2 = Coloană (a se vedea figura 3) 3 = Colector de fracţii 4 = Termostat 5 = Tub de teflon 6 = Dop rodat din sticlă 7 = Conductă de apă între termostat şi coloană, diametru interior cca. 8 milimetri

Apendicele 1 Metode de calcul/estimare

INTRODUCERE

O introducere generală în metodele de calcul, cu date şi exemple este furnizată de Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). Valorile calculate pentru Pow pot fi folosite:

pentru a decide care dintre metodele experimentale este adecvată (intervalul pentru metoda agitării flaconului: log Pow: – 2 până la 4, intervalul HPLC: log Pow: 0 până la 6);

pentru selectarea condiţiilor de testare adecvate (de exemplu, substanţe de referinţă pentru procedurile HPLC, raportul de volume n-octanol/apă pentru metoda agitării flaconului);

ca verificare internă de laborator a posibilelor erori experimentale;

pentru a furniza un Pow estimat în cazul când metodele experimentale nu pot fi aplicate din motive tehnice.

METODA ESTIMATIVĂ Estimarea preliminară a coeficientului de partiţie

Valoarea coeficientului de partiţie poate fi estimată prin folosirea solubilităţilor substanţei de testat în solvenţi puri. Astfel, Psaturare = saturare cn-octanolsaturare capă

METODE DE CALCUL Principiul metodelor de calcul

Toate metodele de calcul se bazează pe fragmentarea formală a moleculei în structuri adecvate pentru care se cunosc creşteri fiabile ale valorilor log Pow. Log Pow al întregii molecule este apoi calculat ca sumă a valorilor corespunzătoare fragmentelor plus suma termenilor de corecţie pentru interacţiunile intramoleculare. Listele constantelor fragmentelor şi ale termenilor de corecţie sunt disponibile în (b), (c), (d) şi (e). Unele sunt actualizate cu regularitate (b).

Criterii de calitate

În general, fiabilitatea metodei de calcul scade odată cu creşterea complexităţii compusului studiat. În cazul moleculelor simple, cu masa moleculară scăzută şi una sau două grupe funcţionale, se preconizează abateri de la 0,1 până la 0,3 unităţi log Pow între rezultatele diferitelor metode de fragmentare şi valoarea măsurată. În cazul moleculelor mai complexe, marja de eroare poate fi mai mare. Aceasta va depinde de fiabilitatea şi disponibilitatea constantelor de fragmente, precum şi de abilitatea analistului de a recunoaşte interacţiuni intramoleculare (de exemplu legături de hidrogen) şi de corecta folosire a factorilor de corecţie (o problemă care apare mai puţin dacă se foloseşte programul CLOGP-3) (b). În cazul compuşilor ionizabili este importantă atribuirea corectă a sarcinii sau a gradului de ionizare.

Metode de calcul

Metoda π a lui Hansch

Constanta substituentului hidrofob original, π, introdusă de Fujita et al. (f) se defineşte ca: πx = log Pow (PhX) – log Pow (PhH) unde Pow (PhX) este coeficientul de partiţie al unui derivat aromatic şi Pow (PhH) este coeficientul de partiţie al compusului iniţial. [de exemplu πCl = log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6) = 2,84 – 2,13 = 0,71]. În concordanţă cu definiţia, metoda π este aplicabilă în special pentru substituenţii aromatici, valorile π pentru un mare număr de substituenţi fiind tabelate (b) (c) (d). Acestea sunt folosite pentru calcularea log Pow pentru molecule sau substructuri aromatice.

Metoda Rekker

Conform lui Rekker (g), valoarea pentru log Pow se calculează după cum urmează: log Pow=Σi aifi+Σj (termeni de interacţiune) unde fi reprezintă constantele diferitelor fragmente moleculare şi ai frecvenţa apariţiei lor în molecula investigată. Termenii de corecţie pot fi exprimaţi ca un multiplu întreg al unei singure constante Cm (aşa numita constantă magică). Constantele de fragment fi şi Cm au fost determinate dintr-o listă de 1054 valori experimentale pentru Pow (825 de compuşi), folosind analiza regresivă multiplă (c) (h). Determinarea termenilor de interacţiune este efectuată în concordanţă cu regulile stabilite descrise în literatură (e) (h) (i).

Metoda Leo-Hansch

Potrivit lui Leo şi Hansch (c), valoarea log Pow se calculează din: log Pow=Σi aifi+Σj bjFj unde fi reprezintă constantele diferitelor fragmente moleculare, Fj termenii de corecţie, iar ai, bj frecvenţa fragmentului corespunzător. Din valorile experimentale Pow, a fost determinată prin încercare şi eroare o listă a valorilor pentru fragmentele atomice şi de grup şi o listă a termenilor de corecţie Fj (aşa numiţii factori).Termenii de corecţie au fost ordonaţi în diferite clase (a) (c). A lua în considerare toate regulile şi termenii de corecţie este relativ complicat şi consumă timp. Pentru această metodă există câteva pachete de programe computerizate (b).

Metoda combinată

Calculul log Pow al moleculelor complexe poate fi considerabil îmbunătăţit, dacă molecula este împărţită în substructuri mari, pentru care există valori log Pow fiabile fie din tabele (b) (c), fie din măsurătorile proprii. Astfel de fragmente (de exemplu heterocicluri, antrachinona, azobenzen) pot fi apoi combinate cu valorile π Hansch sau cu constantele fragmentelor Rekker sau Leo.

Observaţii

(i) Metodele de calcul pot fi aplicate compuşilor parţial sau total ionizaţi numai atunci când este posibil să se ia în considerare factorii de corecţie necesari.

(ii) Dacă se presupune că există legături de hidrogen intramoleculare, trebuie adăugaţi termenii de corecţie corespunzători (aproximativ +0,6 până la +1,0 unităţi log Pow) (a). Indicaţii privind prezenţa unor astfel de legături pot fi obţinute din modelele stereochimice sau din datele spectroscopice ale moleculei.

(iii) Dacă sunt posibile diferite forme tautomere, structura cea mai probabilă va fi folosită ca bază de calcul.

(iv) Ediţiile revizuite ale listelor cu constantele fragmentelor se vor urmări atent.

Raport de testare

Când se folosesc metodele de calcul/estimare, raportul de testare cuprinde următoarele informaţii, dacă este posibil:

descrierea substanţei (amestec, impurităţi etc.);

indicarea oricăror posibile legături de hidrogen intramoleculare, a disocierii, a sarcinii şi a oricăror altor efecte neobişnuite (de exemplu tautomerie);

descrierea metodei de calcul;

identificarea sau anexarea bazei de date folosită;

particularităţi în alegerea fragmentelor;

documentaţia cuprinzătoare a calculului.

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE

(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.

(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem.-Chill. Ther. 1979, vol. 14, p. 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, p. 5175.

(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459.

(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Apendicele 2 Substanţele de referinţă recomandate pentru metoda HPLC

Nr. crt. Substanţă de referinţă log Pow pKa 1 2-butanonă 0,3 2 4-acetilpiridină 0,5 3 anilină 0,9 4 acetanilidă 1,0 5 alcool benzilic 1,1 6 p-metoxifenol 1,3 pKa = 10,26 7 acid fenoxi acetic 1,4 pKa = 3,12 8 fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 10 benzonitril 1,6 11 fenilacetonitril 1,6 12 alcool 4-metilbenzilic 1,6 13 acetofenonă 1,7 14 2-nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 15 acid 3-nitrobenzoic 1,8 pKa = 3,47 16 4-cloranilină 1,8 pKa = 4,15 17 nitrobenzen 1,9 18 alcool cinamic 1,9 19 acid benzoic 1,9 pKa = 4,19 20 p-crezol 1,9 pKa = 10,17 21 acid cinamic 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 anisol 2,1 23 benzoat de metil 2,1 24 benzen 2,1 25 acid 3- metilbezoic 2,4 pKa = 4,27 26 4-clorofenol 2,4 pKa = 9,1 27 tricloretilenă 2,4 28 atrazină 2,6 29 benzoat de etil 2,6 30 2,6-diclorbenzonitril 2,6 31 acid 3-clorbenzoic 2,7 pKa = 3,82 32 toluen 2,7 33 1- naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dicloranilină 2,8 35 clorbenzen 2,8 36 alil-fenileter 2,9 37 brombenzen 3,0 38 etilbenzen 3,2 39 benzofenonă 3,2 40 4-fenilfenol 3,2 pKa = 9,54 41 timol 3,3 42 1,4-diclorbenzen 3,4 43 difenilamină 3,4 pKa = 0,79 44 naftalină 3,6 45 fenilbenzoat 3,6 46 izopropilbenzen 3,7 47 2,4,6-triclorfenol 3,7 pKa = 6 48 bifenil 4,0 49 benzilbenzoat 4,0 50 2,4-dinitro-6 sec-butilfenol 4,1 51 1,2,4-triclorbenzen 4,2 52 acid dodecanoic 4,2 53 difenileter 4,2 54 n- butilbenzen 4,5 55 fenantren 4,5 56 fluoranten 4,7 57 dibenzil 4,8 58 2,6-difenil-piridină 4,9 59 trifenilamină 5,7 60 DDT 6,2 Alte substanţe de referinţă cu log Pow mic 1 acid nicotinic -0,07

Apendice

Figură Matriţa şi accesoriile pentru eşantionul în formă de cartuş

(Toate dimensiunile în milimetri) Lungimea matriţei: 250 mm Material: aluminiu

Apendice

Figura Aparat

Apendice

Exemple de specificaţii ale materialelor pentru testul de sensibilitate termică (a se vedea DIN 1623) 1.2.3.

Tubul: Specificaţiile materialelor nr. 1.0336.505 g Placa cu orificiu: Specificaţiile materialelor nr. 1.4873 Flanşa filetată şi piuliţa: Specificaţiile materialelor nr. 1.3817

Figura 1 Aparatul de testare a sensibilităţii termice

(toate dimensiunile sunt date în milimetri) Figura 1a Tubul din oţel şi accesoriile (1) tub (1a) flanşă exterioară (2) şaibă filetată; filet cu frecare mică (3) placă cu orificiu a cu diametrul = 2,0 sau 6,0 mm (4) piuliţa b cu diametrul = 10 mm (5) suprafaţă teşită (6) 2 teşituri pentru cheie de 41 Figura 1b Dispozitivul de încălzire cu protecţie (7) 2 teşituri pentru cheie de 36 (8) ecran de protecţie împotriva aşchiilor (9) 2 bare de susţinere a tubului (10) tub asamblat (11) poziţia arzătorului din spate; celelalte arzătoare sunt vizibile (12) jet de comandă

Figura 2 Testul de sensibilitate termică

(Exemple de fragmentare) Fără explozie Fără explozie Explozie Explozie Explozie Explozie

Figura 3 Etalonarea vitezei de încălzire pentru testarea sensibilităţii termice

Temperatură (°C) Timp (s) Curba temperatură/timp obţinută la încălzirea dibutilftalatului (27 cm3) într-un tub închis (placă cu orificiu de 1,5 mm) cu un debit de propan de 3,2 litri/minut. Temperatura se măsoară cu un termocuplu cromel/alumel placat cu oţel inoxidabil, cu diametrul de 1 mm, amplasat central la distanţa de 43 mm sub bordura tubului. Viteza de încălzire în intervalul cuprins între 135 oC şi 285 oC este între 185 şi 215 K/minut.

Figura 4 Aparatul de testare a sensibilităţii mecanice (la şoc)

(toate dimensiunile în milimetri) (1) soclu, 450 × 450 × 60 (2) bloc de oţel, 230 × 250 × 200 (3) nicovală, diametru 100 × 70 (4) coloană (5) traversă mediană (6) 2 ghidaje (7) cremalieră (8) scală gradată (9) ciocan de şoc (masa în cădere) (10) dispozitiv de cuplare-decuplare (11) placă de fixare (12) nicovală intermediară (interschimbabilă), diametrul 26 × 26 (13) inel de fixare cu orificii (14) dispozitiv de impact Figura 4a Sonetă, vedere frontală, laterală şi de ansamblu Figura 4b Sonetă, partea inferioară

Continuare

Figura 4d Dispozitivul de şoc pentru substanţele lichide Figura 4c Dispozitivul de şoc pentru substanţele sub formă de pulberi sau pastă (1) cilindri de oţel (2) inel de ghidare pentru cilindrii din oţel (3) inel de fixare cu orificii (a) secţiune verticală (b) vedere de sus (4) inel din cauciuc (5) substanţă lichidă (40 mm3) (6) spaţiu fără lichid Figura 4e Ciocanul (masa de 5 kg în cădere) (1) lagăr axial de suspendare (2) indicator de înălţime (3) canelură de poziţionare (4) cap cilindric de lovire (5) opritor de recul

Figura 5 Aparatul de testare a sensibilităţii mecanice (la frecare)

Figura 5a Aparat de testare a sensibilităţii mecanice (la frecare); vedere de ansamblu şi de sus (1) soclul din oţel (2) culisou (3) disc din porţelan, 25 × 25 × 5 mm, opritor pe culisou (4) bulon fix din porţelan, diametrul 10 × 15 mm (5) eşantion, aproximativ 10 mm3 (6) locaşul bulonului (7) braţ de încărcare (8) contragreutate (9) comutator (10) roată pentru fixarea culisoului în poziţia de pornire (11) direcţia motorului cu acţionare electrică Figura 5b Poziţia de pornire a ştiftului pe probă

Apendice

Figură Matriţa şi accesoriile pentru prepararea cartuşului

(Toate dimensiunile sunt în milimetri)

Apendice Exemple de alte metode de determinare a masei moleculare numerice medii (Mn) a polimerilor

Cromatografia pe gel permeabil reprezintă metoda preferată pentru determinarea Mn, mai ales atunci când dispunem de un ansamblu de substanţe standard cu o structură comparabilă cu cea a polimerului. Totuşi, atunci când folosirea metodei cromatografiei pe gel permeabil prezintă dificultăţi practice sau când ne putem aştepta ca substanţa să nu satisfacă un criteriu reglementar pentru Mn (ceea ce cere o confirmare), există metode alternative, ca de exemplu:

1.1.1.1.2.1.3.1.4.

Utilizarea proprietăţilor coligative Ebulioscopia şi crioscopia înseamnă măsurarea creşterii punctului de fierbere (ebulioscopia) sau coborârea punctului de congelare (crioscopia) ale unui solvent atunci când este adăugat un polimer. Metoda se bazează pe faptul că dizolvarea unui polimer într-un lichid are un efect asupra punctelor de fierbere sau de congelare ale acestuia care depinde de masa moleculară a polimerului (1) (2). Domeniul de aplicare corespunde unei Mn < 20000. Coborârea presiunii vaporilor constă în măsurarea presiunii vaporilor unui lichid de referinţă înainte şi după adăugarea unor cantităţi stabilite de polimeri (1) (2). Domeniul de aplicare corespunde unei Mn < 20000 (în teorie; în practică, nu reprezintă decât o valoare limitată). Osmometria cu membrană se bazează pe principiul osmozei, adică tendinţa naturală a moleculelor de solvent de a traversa o membrană semipermeabilă plecând de la o soluţie diluată către o soluţie concentrată aşa încât să se realizeze echilibrul. În experiment, concentraţia soluţiei diluate este nulă, în timp ce soluţia concentrată conţine polimerul. Trecerea solventului de-a lungul membranei induce o diferenţă de presiune care depinde de concentraţie şi de masa moleculară a polimerului (1) (3) (4). Domeniul de aplicare corespunde valorilor lui Mn între 20000 şi 200000. Osmometria – faza de vapori constă în comparaţia vitezei de evaporare a unui aerosol de solvent pur cu viteza a cel puţin trei aerosoli care conţin polimerul la diferite concentraţii (1) (5) (6). Domeniul de aplicare corespunde unei Mn < 20000.

2. Analiza grupurilor terminale Pentru a se utiliza această metodă, trebuie cunoscute atât structura globală a polimerului, cât şi natura grupurilor terminale situate în capetele catenei (acestea trebuie să poată fi diferenţiate de catena principală, de exemplu, prin spectrul lor RMN sau prin titrarea şi formarea derivaţilor). Determinarea concentraţiei moleculare a grupurilor terminale prezente pe polimer poate, apoi, să furnizeze o valoare a masei moleculare (7) (8) (9). Domeniul de aplicare corespunde valorilor lui Mn ce pot atinge valoarea de 50000 (cu o fiabilitate descrescătoare)

3.1.2.3.4.5.6.7.8.9.

Referinţe bibliografice Billmeyer, F.W. Jr., (1984), Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York. Glover, C.A., (1975), Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979), Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989), Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52. ASTM 3592-77, (1977), Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989), Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989), Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G., (1975), End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990), Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

Apendice Indicaţii care permit corecţia conţinutului de polimeri cu masă moleculară mică, luând în considerare polimerii insolubili

Prezenţa unui polimer insolubil într-un eşantion antrenează o pierdere de masă în cursul analizei cromatografice pe gel permeabil. Polimerul insolubil este ireversibil reţinut în coloană sau în filtrul eşantionului, atunci când partea solubilă a eşantionului traversează coloana. Dacă indicele de refracţie diferenţial (dn/dc) al polimerului poate fi estimat sau măsurat, este posibilă estimarea masei pe care eşantionul a pierdut-o în coloană. În acest caz, se efectuează o corecţie cu ajutorul unui etalonare extern al refractometrului, cu etaloane având concentraţia şi raportul dn/dc, cunoscute. În exemplul următor, s-a utilizat un etalon de poli(metacrilat de metil). Etalonarea externă, practicată în timpul analizei polimerilor acrilici, constă în analizarea cu ajutorul metodei cromatografice pe gel permeabil, a unei soluţii etalon de poli(metacrilat de metil) în tetrahidrofuran, cu concentraţia cunoscută; rezultatele servesc la calcularea constantei refractometrului, conform ecuaţiei următoare: K = R/(C × V × dn/dc) unde: K constanta refractometrului (μV sec/ml) R răspunsul etalonului de polimetacrilat de metil (μV/sec) C concentraţia etalonului de polimetacrilat de metil (mg/ml) V volumul de injecţie (ml) şi dn/dc indicele de refracţie diferenţial al unei soluţii de polimetacrilat de metil în tetrahidrofuran (ml/mg) Următoarele date caracterizează în general un etalon de polimetacrilat de metil: R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 × 10–5 ml/mg Valoarea K rezultată, 3,05 × 1011, este apoi utilizată pentru a calcula răspunsul teoretic al detectorului, adică ceea ce s-ar obţine dacă 100 % din polimerul injectat s-ar alege la traversarea detectorului.

PARTEA B METODE DE DETERMINARE A TOXICITĂŢII ŞI A ALTOR EFECTE ASUPRA SĂNĂTĂŢII

INTRODUCERE GENERALĂ A.

CARACTERIZAREA SUBSTANŢEI ANALIZATE Înainte de începerea oricărui studiu de toxicitate, trebuie să fie cunoscute compoziţia substanţei, inclusiv principalele sale impurităţi, proprietăţile sale fizice şi chimice, între care şi stabilitatea sa. Proprietăţile fizice şi chimice ale substanţei furnizează informaţii importante cu privire la alegerea căii de administrare, cu privire la conceperea unor studii, precum şi cu privire la manipularea şi stocarea substanţei. Dezvoltarea unei metode de analiză care să permită o evaluare calitativă şi cantitativă a substanţei testate (inclusiv a principalelor sale impurităţi, dacă este posibil), în vehiculul de administrare şi în materialul biologic, trebuie să preceadă efectuarea studiului. Toate informaţiile privind identificarea, proprietăţile fizice şi chimice, puritatea şi comportamentul substanţei testate trebuie înregistrate în raportul de testare.

ÎNGRIJIREA ANIMALELOR În cadrul testelor de toxicitate se va proceda în mod obligatoriu la controlarea condiţiilor de mediu şi se vor utiliza tehnici adecvate de îngrijire a animalelor.

(i) Condiţii de adăpostire Condiţiile de mediu în spaţiile sau incintele rezervate animalelor experimentale trebuie să fie adaptate speciei utilizate. La şobolani, la şoareci şi la cobai temperatura ambiantă trebuie să fie de 22 ± 3 oC, iar umiditatea relativă trebuie să fie de 30-70 %; la iepuri, temperatura ambiantă trebuie să fie de 20 ± 3 oC, iar umiditatea relativă trebuie să fie de 30-70 %. Unele tehnici de testare sunt deosebit de sensibile la efectele termice; în asemenea cazuri indicaţii exacte sunt menţionate în descrierea metodei de testare, cu privire la condiţiile adecvate. În toate testele de toxicitate, temperatura şi umiditatea trebuie controlate şi înregistrate şi trebuie să figureze în raportul final al studiului. Alternarea de 12 de ore de lumină şi de 12 de ore de întuneric va fi asigurată de iluminarea artificială. Detaliile cu privire la iluminare trebuie să fie înregistrate în raportul final al studiului. Dacă metoda adoptată nu prevede alte condiţii, animalele trebuie să fie adăpostite individual sau în grupuri mici de acelaşi sex în cuşti. În cazul cuştilor colective nu se poate depăşi numărul de cinci animale. Este important ca rapoartele testelor efectuate pe animale să precizeze tipul de cuşti utilizate şi numărul de animale pe cuşti, în momentul expunerii la substanţa chimică şi pe toată perioada de observaţie care urmează după test.

(ii) Condiţii de hrănire Regimul alimentar trebuie să aibă în vedere toate necesităţile nutriţionale ale speciei supuse testului. În cazul în care substanţele sunt administrate prin hrană, este posibil ca valoarea nutriţională a hranei să fie diminuată printr-o interacţiune dintre substanţă şi un ingredient al hranei. Această eventualitate trebuie luată în considerare în momentul interpretării rezultatelor testului. Regimurile alimentare clasice folosite în laboratoare sunt acceptabile, apa de băut trebuie furnizată în mod nelimitat. Alegerea regimului alimentar poate fi ghidată de necesitatea de a garanta o proporţie adecvată de substanţă în cazul alegerii acestei căi de administrare. Substanţele contaminante din alimentaţie care au un efect asupra toxicităţii nu trebuie să fie prezente în concentraţii susceptibile de a influenţa rezultatele.

METODE ALTERNATIVE Unul dintre obiectivele Uniunii Europene este promovarea dezvoltării şi validării unor metode alternative care să furnizeze aceeaşi cantitate de informaţii ca testele actuale efectuate pe animale, dar pentru care să se necesite un număr mai redus de animale, care să minimizeze suferinţele animalelor şi să permită evitarea sacrificării acestora. Din momentul în care asemenea metode sunt disponibile, ele trebuie avute în vedere ori de câte ori este posibil, în vederea caracterizării riscurilor, în vederea clasificării şi etichetării substanţelor în funcţie de riscurile intrinseci.

EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA Extrapolarea directă la om a rezultatelor testelor efectuate asupra animalelor şi a testelor in vitro nu este posibilă decât în anumite limite; acest lucru trebuie avut în vedere cu ocazia evaluării şi interpretării rezultatelor testelor; pe de altă parte, atunci când au fost observate efecte nedorite la om, aceste informaţii pot fi folosite în vederea confirmării rezultatelor testelor.

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE Majoritatea metodelor prezentate mai sus sunt elaborate în cadrul programului OCDE cu privire la principiile de testare, şi trebuie puse în aplicare în conformitate cu principiile de bună practică de laborator, astfel încât să se garanteze recunoaşterea reciprocă a datelor. Informaţii suplimentare pot fi obţinute din referinţele citate în cadrul principiilor de bază ale OCDE, precum şi din bibliografia de specialitate.

B.1 bis. TOXICITATE ORALĂ ACUTĂ – PROCEDURA CU DOZĂ FIXĂ

B.1 bis.

1. METODĂ Acest test este echivalent cu Orientarea 420 (2001) a OCDE.

1.

1.1. INTRODUCERE Metodele tradiţionale de evaluare a toxicităţii acute utilizează ca punct final decesul animalelor. În 1984, British Toxicology Society a sugerat o nouă abordare pentru testarea toxicităţii acute, pe baza administrării unei serii de doze fixe (1). Această abordare evita uciderea animalelor ca punct final, bazându-se pe observarea unor semne clare de toxicitate la una dintre seriile de doze fixe. În urma unor studii de validare in vivo, britanice (2) şi internaţionale (3), procedura a fost adoptată ca metodă de testare în 1992. Ulterior, proprietăţile statistice ale procedurii cu doză fixă au fost evaluate utilizând modele matematice într-o serie de studii (4) (5) (6). Împreună, studiile in vivo şi cele de modelare au demonstrat că procedura este reproductibilă, utilizează mai puţine animale şi cauzează mai puţină suferinţă decât metodele tradiţionale şi poate fi utilizată pentru clasificarea substanţelor într-un mod similar cu celelalte metode de testare a toxicităţii acute. Indicaţii pentru selectarea celei mai adecvate metode de testare pentru un anumit scop sunt prezentate în Liniile directoare privind testarea toxicităţii acute orale (7). Liniile directoare în cauză conţin, de asemenea, informaţii suplimentare privind aplicarea şi interpretarea metodei de testare B.1 bis. Ca un principiu al metodei, în studiul principal se utilizează exclusiv doze cu un nivel mediu de toxicitate şi se evită administrarea dozelor care se estimează că sunt letale. De asemenea, nu este necesar să se administreze dozele despre care se ştie că provoacă dureri şi suferinţe grave din cauza acţiunilor corozive şi puternic iritante. Animalele muribunde sau cele care manifestă dureri evidente sau prezintă semne de suferinţă gravă şi prelungită sunt eutanasiate şi sunt luate în considerare la interpretarea rezultatelor la fel ca animalele care au murit în timpul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde şi indicaţii pentru recunoaşterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul unor linii directoare separate (8). Metoda furnizează informaţii privind proprietăţile periculoase şi permite clasificarea substanţei în conformitate cu Sistemul global armonizat (SGA) de clasificare a substanţelor chimice care cauzează toxicitate acută (9). Laboratorul care efectuează testul ia în considerare toate informaţiile disponibile privind substanţa de testat înainte de efectuarea studiului. Printre aceste informaţii se numără identitatea şi structura chimică a substanţei; proprietăţile sale fizico-chimice; rezultatele oricăror alte teste de toxicitate in vitro sau in vivo asupra substanţei; date toxicologice privind substanţele înrudite structural şi utilizarea sau utilizările anticipate ale substanţei. Aceste informaţii sunt necesare pentru a dovedi tuturor celor interesaţi că testul este relevant pentru protecţia sănătăţii oamenilor şi vor contribui la selectarea unei doze iniţiale adecvate.

1.2. DEFINIŢII Toxicitate orală acută: efectele adverse care intervin după administrarea orală a unei singure doze dintr-o substanţă sau a mai multor doze în cursul a 24 de ore. Deces întârziat: un animal nu moare şi nu pare muribund în termen de 48 ore, dar moare în perioada de observaţie de 14 zile. Doză: cantitatea administrată din substanţa de testat. Doza se exprimă ca greutatea de substanţă de testat per unitate de greutate a animalului de experienţă (de exemplu mg/kg). Toxicitate evidentă: termen general care descrie semne clare de toxicitate apărute după administrarea substanţei de testat (a se vedea referinţa 3 pentru exemple), pe baza cărora se poate estima că următoarea doză fixă mai mare ar putea provoca dureri mari şi semne persistente de suferinţă profundă, o stare muribundă [criteriile sunt prezentate în Humane Endpoints Guidance Document (8)] sau, probabil, decesul celor mai multe dintre animale. SGA: Sistem global armonizat de clasificare a substanţelor şi amestecurilor chimice. O activitate comună a OCDE (sănătatea oamenilor şi mediul) a Comitetului de experţi ONU pentru transportul bunurilor periculoase (proprietăţi fizico-chimice) şi a OIM (comunicarea pericolelor) şi coordonată de Programul interorganizaţional pentru buna gestionare a substanţelor chimice (IOMC). Deces iminent: se aşteaptă o stare muribundă sau decesul înainte de următorul moment de observare planificat. Printre semnele care indică această stare la rozătoare s-ar putea număra convulsii, poziţie laterală, poziţia culcată şi tremurat [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (8) pentru mai multe detalii]. LD50(doza letală mediană): o singură doză de substanţă, derivată statistic, care se poate estima că va cauza decesul a 50 % dintre animale dacă este administrată pe cale orală. Valoarea LD50 se exprimă în greutatea de substanţă de testat pe unitate de greutate a animalului de experienţă (mg/kg). Doză-limită: o doză la limita superioară a testării (2000 sau 5000 mg/kg). Stare muribundă: starea precedentă decesului sau incapacitatea de a supravieţui, chiar în cazul administrării unui tratament [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (8) pentru mai multe detalii]. Deces previzibil: prezenţa semnelor clinice care indică decesul într-un moment cunoscut din viitor, înainte de sfârşitul planificat al experimentului, ca de exemplu: incapacitatea de a ajunge la apă şi mâncare [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (8) pentru mai multe detalii].

1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Unor grupuri de animale de acelaşi sex li se administrează doze fixe de 5, 50, 300 şi 2000 mg/kg într-o procedură secvenţială (în mod excepţional, poate fi luată în considerare o doză fixă suplimentară de 5000 mg/kg, a se vedea punctul 1.6.2). Doza iniţială se selectează pe baza unui studiu de observare pentru identificarea dozei care se presupune că produce unele semne de toxicitate fără a cauza efecte toxice grave sau decesul. Manifestările clinice şi efectele asociate durerii, suferinţei şi decesului iminent sunt descrise detaliat într-un document de orientare OCDE (8). Altor grupuri de animale li se pot administra doze fixe mai mari sau mai mici, în funcţie de prezenţa sau absenţa semnelor de toxicitate sau mortalitate. Această procedură continuă până la doza care provoacă toxicitate evidentă sau decesul unui singur animal, dacă nu se observă efecte la cea mai mare doză sau dacă decesul survine la cea mai mică doză.

1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.4.

1.4.1. Selectarea speciei de animale Specia preferată de rozătoare este şobolanul, dar pot fi utilizate şi alte specii de rozătoare. În mod normal, se utilizează femele (7). Acest lucru este motivat de faptul că studiile din literatură asupra testelor convenţionale LD50 arată că, de obicei, diferenţele de sensibilitate între sexe sunt mici, dar în cazurile în care se observă diferenţe, femelele sunt, în general, puţin mai sensibile (10). Cu toate acestea, în cazul în care informaţiile privind proprietăţile toxicologice sau toxicocinetice ale unor substanţe chimice înrudite structural arată că este probabil ca masculii să fie mai sensibili, se utilizează acest sex. Dacă testul se efectuează pe masculi, se oferă justificări adecvate. Se utilizează animale adulte, tinere, sănătoase provenind din liniile utilizate în mod obişnuit în laboratoare. Femelele trebuie să fie nulipare şi să nu fie gestante. La începerea testului, fiecare animal trebuie să aibă între 8 şi 12 săptămâni, iar greutatea sa trebuie să se situeze într-un interval de ± 20 % faţă de greutatea medie a animalelor testate anterior.

1.4.2. Condiţii de adăpostire şi hrănire În spaţiul pentru adăpostirea animalelor de experienţă se asigură o temperatură de 22 oC (± 3 oC). Se asigură o umiditate relativă de 50-60 %, cu o valoare minimă de 30 % şi o valoare maximă de 70 %, cu excepţia momentelor în care se curăţă spaţiul. Spaţiul se iluminează artificial, cu o alternanţă de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă. Animalele pot fi grupate în cuşti în funcţie de doză, dar numărul animalelor dintr-o cuşcă nu trebuie să împiedice observarea corectă a fiecărui animal.

1.4.3. Pregătirea animalelor Animalele sunt selectate la întâmplare, marcate pentru a permite identificarea individuală şi ţinute în cuştile lor cu cel puţin 5 zile înainte de începerea administrării dozelor, pentru a permite aclimatizarea lor la condiţiile de laborator.

1.4.4. Pregătirea dozelor În general, substanţele de testat se administrează într-un volum constant indiferent de dozele testate, variindu-se concentraţia preparatului. În cazul testării unui produs sau amestec final lichid, utilizarea substanţei de testat nediluate, și anume la o concentraţie constantă, poate fi mai relevantă pentru evaluarea ulterioară a riscurilor substanţei şi este impusă de unele autorităţi de reglementare. În orice caz, nu trebuie depăşit volumul dozei maxime de administrat. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o singură dată depinde de dimensiunea animalului de experienţă. La rozătoare, volumul nu trebuie să depăşească, în mod normal, 1 ml/100 g greutate corporală; cu toate acestea, în cazul soluţiilor apoase, pot fi administraţi 2 ml/100 g greutate corporală. În ceea ce priveşte forma de preparare a dozei, se recomandă utilizarea, ori de câte ori este posibil, a unei soluţii/suspensii/emulsii apoase, urmată, în ordinea preferinţei, de o soluţie/suspensie/emulsie în ulei (de exemplu, în ulei de porumb) şi, eventual, soluţii în alte vehicule. Pentru vehicule altele decât apa, este necesar să se cunoască caracteristicile toxicologice ale vehiculului. Dozele se prepară cu puţin timp înaintea administrării, cu excepţia cazului în care stabilitatea preparatului în perioada în care urmează a fi utilizat este cunoscută şi s-a demonstrat că este acceptabilă.

1.5. MOD DE LUCRU

1.5.

1.5.1. Administrarea dozelor Substanţa de testat se administrează într-o singură doză, prin gavaj, utilizând o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. În cazurile deosebite în care nu este posibilă administrarea unei singure doze, doza poate fi administrată în fracţiuni mai mici pe parcursul unei perioade de maximum 24 de ore. Animalele nu se hrănesc înainte de administrarea dozei (de exemplu, şobolanii nu trebuie să fie hrăniţi peste noapte, dar pot primi apă; şoarecii nu trebuie să fie hrăniţi, dar pot primi apă, cu 3-4 ore înainte). După perioada de flămânzire, animalele se cântăresc şi se administrează substanţa de testat. După administrarea substanţei, animalele pot fi private din nou de hrană, 3-4 ore la şobolani şi 1-2 ore la şoareci. Dacă doza se administrează fracţionat într-o perioadă de timp, este posibil să fie necesar să li se ofere animalelor hrană şi apă, în funcţie de durata perioadei de administrare.

1.5.2. Studiu de observare Scopul studiului de observare este de a permite selectarea dozei iniţiale adecvate pentru studiul principal. Substanţa de testat se administrează, într-o procedură secvenţială, câte unui animal, conform diagramelor din apendicele 1. Studiul de observare este finalizat când se poate lua o decizie privind doza iniţială pentru studiul principal (sau dacă survine decesul unui animal la cea mai mică doză fixă). Doza iniţială pentru studiul de observare se selectează dintre dozele fixe de 5, 50, 300 şi 2000 mg/kg ca doza care se aşteaptă că provoace toxicitate evidentă, dacă este posibil, pe baza datelor obţinute in vivo şi in vitro pentru aceeaşi substanţă chimică sau alte substanţe înrudite structural. În absenţa acestor informaţii, doza iniţială va fi de 300 mg/kg. Dozele se administrează la un interval de minimum 24 de ore pentru fiecare animal. Toate animalele trebuie observate cel puţin 14 zile. În mod excepţional şi doar dacă acest lucru este necesar pentru îndeplinirea unor cerinţe specifice, poate fi administrată o doză suplimentară mai mare, de 5000 mg/kg (a se vedea apendicele 3). Din motive justificate de bunăstarea animală, testarea pe animale a substanţelor din categoria 5 SGA (2000-5000 mg/kg) este descurajată şi se ia în considerare doar în cazul în care este foarte probabil ca rezultatele acestor teste să fie direct relevante pentru protecţia sănătăţii oamenilor, a sănătăţii animale sau a mediului. În cazurile în care un animal căruia i s-a administrat doza fixă cea mai redusă (5 mg/kg) în cadrul studiului de observare moare, procedura normală este de a încheia studiul şi de a încadra substanţa în categoria 1 SGA (conform anexei 1). Cu toate acestea, dacă este necesară o confirmare suplimentară a clasificării, se poate aplica o procedură suplimentară opţională, descrisă în continuare. Se administrează o doză de 5 mg/kg unui alt animal. Dacă şi al doilea animal moare, se confirmă categoria 1 SGA, iar studiul se încheie imediat. Dacă al doilea animal supravieţuieşte, se administrează o doză de 5 mg/kg unui nou grup, de maximum 3 animale. Deoarece riscul de mortalitate este foarte ridicat, dozele vor fi administrate secvenţial, pentru protecţia bunăstării animale. Intervalul de timp între administrarea dozelor la fiecare animal trebuie să fie suficient pentru a stabili probabilitatea ca animalul anterior să supravieţuiască. Dacă survine decesul unui alt animal, secvenţa de administrare se încheie imediat, fără testarea pe alte animale. Deoarece decesul celui de-al doilea animal (indiferent de numărul de animale testate în momentul încheierii studiului) se încadrează în rezultatul A (2 sau mai multe decese), se aplică regula de clasificare din apendicele 2 la o doză fixă de 5 mg/kg (categoria 1, dacă survin două sau mai multe decese, sau categoria 2 dacă survine un singur deces). În plus, apendicele 4 ofertă indicaţii pentru clasificarea în sistemul UE, până la punerea în aplicare a noului SGA.

1.5.3. Studiul principal

1.5.3.

1.5.3.1. Numărul de animale şi nivelul dozelor Acţiunile care se întreprind după administrarea dozei iniţiale sunt indicate în diagramele din apendicele 2. Se adoptă unul dintre cele trei cursuri de acţiune: fie se opreşte testarea şi se atribuie clasa adecvată de clasificare a periculozităţii, fie se continuă testarea cu o doză fixă mai mare sau cu o doză fixă mai mică. Cu toate acestea, pentru a proteja animalele, o doză care a cauzat decesul animalelor în studiul de observare nu va fi reutilizată în studiul principal (a se vedea apendicele 2). Experienţa a demonstrat că, cel mai probabil, după administrarea dozei iniţiale, substanţa va putea fi clasificată şi nu vor fi necesare teste suplimentare. În mod normal, se utilizează un număr total de cinci animale de acelaşi sex pentru fiecare nivel investigat al dozei. Grupul de cinci animale va fi format dintr-un animal căruia i s-a administrat doza selectată în studiul de orientare şi alte patru animale (cu excepţia cazului excepţional în care nivelul dozei utilizat în studiul principal nu a fost inclus în studiul de orientare). Intervalul de timp dintre administrarea dozelor de la fiecare nivel la fiecare animal se determină în funcţie de momentul declanşării, durata şi severitatea semnelor de toxicitate. Administrarea următoarei doze se amână până când există certitudinea că animalele testate anterior vor supravieţui. Se recomandă un interval de 3 sau 4 zile între administrarea fiecărui nivel, pentru a permite observarea toxicităţii întârziate. Intervalul de timp poate fi adaptat după caz, de exemplu în cazul unor rezultate neconcludente. Dacă se ia în considerare utilizarea dozei fixe maxime de 5000 mg/kg, se aplică procedura prevăzută în apendicele 3 (a se vedea, de asemenea, punctul 1.6.2).

1.5.3.2. Testul-limită Testul-limită se utilizează în special în situaţiile în care experimentatorul are informaţii care arată că este posibil ca materialul testat să nu fie toxic, având o toxicitate puţin peste dozele-limită reglementate. Informaţiile privind toxicitatea materialului de testat pot fi deduse din cunoştinţele despre compuşi, amestecuri şi produse similare testate, ţinând seama de identitatea şi procentajul componentelor cunoscute ca fiind semnificative din punct de vedere toxicologic. În situaţiile în care nu există sau există puţine informaţii privind toxicitatea materialului sau în care se estimează că materialul de testat este toxic, se efectuează testul principal. Urmând procedura normală, un studiu de observare cu o doză iniţială de 2000 mg/kg (sau, în cazuri excepţionale, 5000 mg/kg), urmat de administrarea aceleaşi doze altor patru animale, constituie testul-limită conform acestei linii directoare.

1.6. OBSERVAŢII Animalele sunt observate individual după administrarea dozelor, cel puţin o dată în primele 30 de minute, periodic în primele 24 de ore, acordându-li-se o atenţie specială în primele 4 ore, şi, ulterior, zilnic, timp de 14 zile, cu excepţia cazului în care trebuie excluse din studiu şi eutanasiate din motive de bunăstare animală sau sunt găsite moarte. Cu toate acestea, perioada de observaţie nu se stabileşte rigid. Ea se determină în funcţie de reacţiile toxice şi momentul declanşării acestora şi de durata perioadei de recuperare şi, prin urmare, poate fi prelungită, dacă este necesar. Momentele în care semnele de toxicitate apar şi dispar sunt importante, în special în cazurile în care semnele de toxicitate au tendinţa de a apărea cu întârziere (11). Toate observaţiile se înregistrează sistematic, întocmindu-se fişe individuale pentru fiecare animal. Vor fi necesare observaţii suplimentare în cazul în care animalele manifestă în continuare semne de toxicitate. Observaţiile vizează modificările pielii şi blănii, ochilor şi membranelor mucoaselor, modificările activităţii sistemului respirator, sistemului circulator, sistemului nervos central şi vegetativ şi ale activităţii somato-motorii şi modificările de comportament. Se va acorda o atenţie specială observării tremuratului, convulsiilor, salivării, diareii, letargiei, somnului şi comei. Se iau în considerare principiile şi criteriile rezumate în Humane Endpoints Guidance Document (8). Animalele găsite în stare muribundă şi animalele care manifestă dureri mari şi semne prelungite de suferinţă profundă sunt eutanasiate. În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt găsite moarte, momentul morţii se înregistrează cât mai exact posibil.

1.6.

1.6.1. Greutatea corporală Animalele se cântăresc puţin înainte de administrarea substanţei de testat şi, ulterior, cel puţin o dată pe săptămână. Se calculează şi se înregistrează variaţiile de greutate. La sfârşitul testului, animalele care au supravieţuit sunt cântărite şi apoi eutanasiate.

1.6.2. Patologie Toate animalele participante la test (inclusiv cele care mor în cursul testului sau sunt eliminate din studiu din motive de bunăstare animală) sunt supuse unei autopsii macroscopice. Se înregistrează toate modificările patologice majore intervenite la fiecare animal. Se poate efectua, de asemenea, o examinare microscopică a organelor care prezintă semne de modificări patologice majore la animalele care au supravieţuit cel puţin 24 de ore de la administrarea dozei iniţiale, întrucât ar putea furniza informaţii utile.

2. DATE Se furnizează date individuale despre animale. În plus, se face un rezumat tabelar al tuturor datelor, prezentând pentru fiecare grup testat, numărul de animale utilizate, numărul de animale care au prezentat semne de toxicitate, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate, ora decesului pentru fiecare animal, o descriere, evoluţia în timp şi reversibilitatea efectelor toxice şi constatările autopsiei.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare include următoarele informaţii, după caz:

Substanţa de testat:

natura fizică, puritate şi, dacă este cazul, proprietăţi fizico-chimice (inclusiv izomerizare);

date de identificare, inclusiv numărul CAS.

Vehicul (dacă este cazul):

justificarea alegerii vehiculului, dacă este altul decât apa.

Animalele de experienţă:

specie/suşă utilizată;

starea microbiologică a animalelor, dacă se cunoaşte;

numărul, vârsta şi sexul animalelor (inclusiv, dacă este cazul, o justificare pentru utilizarea de masculi în locul femelelor);

sursă, condiţii de adăpostire, hrănire etc.;

Condiţii de testare:

detalii privind prepararea substanţei de testat, inclusiv detalii privind forma fizică a materialului administrat;

detalii privind administrarea substanţei de testat, inclusiv volumul dozelor şi durata administrării;

detalii privind calitatea hranei şi a apei (inclusiv tipul/sursa hranei, sursa apei);

o justificare pentru selectarea dozei iniţiale.

Rezultate:

un tabel cu datele privind reacţia şi nivelul dozei la fiecare animal (animale care prezintă semne de toxicitate, inclusiv mortalitatea, natura, gravitatea şi durata efectelor);

un tabel cu greutatea corporală şi variaţiile acesteia;

greutatea fiecărui animal în ziua administrării dozei, la intervale săptămânale ulterior şi în momentul morţii sau al eutanasierii;

data şi ora morţii, dacă a survenit înainte de momentul planificat pentru sacrificare;

graficul declanşării semnelor de toxicitate şi reversibilitatea acestora pentru fiecare animal;

concluziile autopsiei şi concluziile examenului histopatologic pentru fiecare animal, dacă sunt disponibile.

Discutarea şi interpretarea rezultatelor.

Concluzii.

4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, p. 85-92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279-291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469-482. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313-324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183-196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223-231. Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

B.1 tris. TOXICITATE ORALĂ ACUTĂ – METODA CLASEI DE TOXICITATE ACUTĂ

B.1 tris.

1. METODĂ Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 423 (2001) a OCDE.

1.

1.1. INTRODUCERE Metoda clasei de toxicitate acută (1) prezentată în acest test este o procedură secvenţială care utilizează 3 animale de acelaşi sex într-o etapă. În funcţie de mortalitatea şi/sau starea muribundă a animalelor, pot fi necesare, în medie, 2-4 etape pentru a permite determinarea toxicităţii acute a substanţei de testat. Această procedură este reproductibilă, utilizează foarte puţine animale şi permite clasificarea substanţelor într-un mod similar cu celelalte metode de testare a toxicităţii acute. Metoda clasei de toxicitate acută se bazează pe evaluări biometrice (2) (3) (4) (5) cu doze fixe, separate adecvat pentru a permite clasificarea unei substanţe pentru includerea în diverse categorii şi evaluarea riscurilor. Metoda, adoptată în 1996, a fost validată intens in vivo comparativ cu datele LD50 obţinute din literatură, atât la nivel naţional (6), cât şi la nivel internaţional (7). Pentru indicaţii privind selectarea celei mai adecvate metode de testare pentru un anumit scop, consultaţi Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8). Acest document conţine, de asemenea, informaţii suplimentare pentru aplicarea şi interpretarea metodei de testare B.1 tris. Nu este necesar să se administreze substanţele de testat la doze despre care se ştie că provoacă dureri mari şi suferinţe profunde din cauza acţiunilor corozive şi pronunţat iritante. Animalele muribunde sau cele care manifestă dureri evidente sau prezintă semne de suferinţă gravă şi prelungită sunt eutanasiate şi sunt luate în considerare la interpretarea rezultatelor la fel ca animalele care au murit în timpul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde şi indicaţii pentru recunoaşterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul unor linii directoare separate (9). Metoda utilizează doze predefinite, iar rezultatele permit clasarea şi clasificarea unei substanţei în conformitate cu Sistemul global armonizat de clasificare a substanţelor chimice care provoacă toxicitate acută (10). În principiu, această metodă nu are ca scop să permită calcularea unei valori exacte a LD50, dar permite determinarea nivelurilor definite de expunere letale, deoarece decesul unei proporţii dintre animale rămâne principalul punct final al acestui test. Metoda permite determinarea unei valori a LD50 doar dacă cel puţin două doze determină o mortalitate peste 0 %, dar mai mică decât 100 %. Utilizarea unor doze predefinite, indiferent de substanţa de testat, şi faptul că clasificarea se face explicit în funcţie de numărul de animale observate în diverse stări favorizează consecvenţa şi repetabilitatea datelor prezentate de diverse laboratoare. Laboratorul care efectuează testul ia în considerare toate informaţiile disponibile privind substanţa de testat înainte de efectuarea studiului. Printre aceste informaţii se numără identitatea şi structura chimică a substanţei; proprietăţile sale fizico-chimice; rezultatele oricăror alte teste de toxicitate in vitro sau in vivo asupra substanţei; date toxicologice privind substanţele înrudite structural şi utilizarea (utilizările) anticipată (anticipate) a(le) substanţei. Aceste informaţii sunt necesare pentru a dovedi tuturor celor interesaţi că testul este relevant pentru protecţia sănătăţii oamenilor şi va contribui la selectarea unei doze iniţiale adecvate.

1.2. DEFINIŢII Toxicitate orală acută: se referă la efectele adverse care intervin după administrarea orală a unei singure doze dintr-o substanţă sau a mai multor doze în cursul a 24 de ore. Deces întârziat: înseamnă că un animal nu moare şi nu pare muribund în termen de 48 ore, dar moare în perioada de observaţie de 14 zile. Doză: este cantitatea administrată din substanţa de testat. Doza se exprimă ca greutatea de substanţă de testat per unitate de greutate a animalului de experienţă (de exemplu: mg/kg). SGA: Sistemul global armonizat de clasificare a substanţelor şi amestecurilor chimice. O activitate comună a OCDE (sănătatea oamenilor şi mediul), a Comitetului de experţi ONU pentru transportul bunurilor periculoase (proprietăţi fizico-chimice) şi a OIM (comunicarea pericolelor) şi coordonată de Programul interorganizaţional pentru buna gestionare a substanţelor chimice (IOMC). Deces iminent: când se aşteaptă o stare muribundă sau decesul înainte de următorul moment de observare planificat. Printre semnele care indică această stare la rozătoare s-ar putea număra convulsii, poziţie laterală, poziţia culcată şi tremurat [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (9) pentru mai multe detalii]. LD50(doza letală mediană): este o singură doză de substanţă, derivată statistic, care se poate estima că va cauza decesul a 50 % dintre animale dacă este administrată pe cale orală. Valoarea LD50 se exprimă în greutatea de substanţă de testat per unitate de greutate a animalului de experienţă (mg/kg). Doză-limită: se referă la o doză la limita superioară a testării (2000 sau 5000 mg/kg). Stare muribundă: starea precedentă decesului sau incapacitatea de a supravieţui, chiar în cazul administrării unui tratament [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (9) pentru mai multe detalii]. Deces previzibil: prezenţa semnelor clinice care indică decesul într-un moment cunoscut din viitor, înainte de sfârşitul planificat al experimentului, ca de exemplu: incapacitatea de a ajunge la apă şi mâncare [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (9) pentru mai multe detalii].

1.3. PRINCIPIUL TESTULUI Principiul acestui test este că, prin aplicarea unei proceduri secvenţiale, cu utilizarea unui număr minim de animale în fiecare etapă, se obţin informaţii suficiente privind toxicitatea acută a substanţei de testat pentru a permite clasificarea acesteia. Substanţa se administrează oral unui grup de animale de experienţă, la una dintre dozele definite. Substanţa se testează conform unei proceduri secvenţiale, în fiecare etapă utilizându-se trei animale de acelaşi sex (de obicei, femele). Absenţa sau prezenţa mortalităţii cauzate de substanţa de testat la animalele testate într-o etapă determină etapa următoare, astfel; Detaliile procedurii de testare sunt prezentate în apendicele 1. Metoda permite adoptarea unei concluzii privind clasificarea substanţei de testat într-una dintre clasele de toxicitate delimitate de valori prestabilite ale LD50.

nu sunt necesare alte teste;

administrarea aceleiaşi doze altor trei animale;

administrarea următoarei doze mai mari sau mai mici altor trei animale.

1.4. DESCRIEREA METODEI

1.4.

1.4.1. Selectarea speciei de animale Specia preferată de rozătoare este şobolanul, dar pot fi utilizate şi alte specii de rozătoare. În mod normal, se utilizează femele (9). Acest lucru este motivat de faptul că studiile din literatură asupra testelor convenţionale LD50 arată că, deşi diferenţele de sensibilitate între sexe sunt mici, în cazurile în care se observă diferenţe, femelele sunt, în general, puţin mai sensibile (11). Cu toate acestea, în cazul în care informaţiile privind proprietăţile toxicologice sau toxicocinetice ale unor substanţe chimice înrudite structural arată că este probabil ca masculii să fie mai sensibili, se utilizează acest sex. Dacă testul se efectuează pe masculi, se oferă justificări adecvate. Se utilizează animale adulte, tinere, sănătoase provenind din liniile utilizate în mod obişnuit în laboratoare. Femelele trebuie să fie nulipare şi să nu fie gestante. La începerea testului, fiecare animal trebuie să aibă între 8 şi 12 săptămâni, iar greutatea sa trebuie să se situeze într-un interval de ± 20 % faţă de greutatea medie a animalelor testate anterior.

1.4.4. Pregătirea dozelor În general, substanţele de testat se administrează într-un volum constant indiferent de dozele testate, variind concentraţia preparatului. În cazul testării unui produs sau amestec final lichid, utilizarea substanţei de testat nediluate, și anume la o concentraţie constantă, poate fi mai relevantă pentru evaluarea ulterioară a riscurilor substanţei şi este impusă de unele autorităţi de reglementare. În orice caz, nu trebuie depăşit volumul dozei maxime de administrat. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o singură dată depinde de dimensiunea animalului de experienţă. La rozătoare, volumul nu trebuie să depăşească, în mod normal, 1 ml/100 g greutate corporală; cu toate acestea, în cazul soluţiilor apoase, pot fi administraţi 2 ml/100 g greutate corporală. În ceea ce priveşte forma de preparare a dozei, se recomandă utilizarea, ori de câte ori este posibil, a unei soluţii/suspensii/emulsii apoase, urmată, în ordinea preferinţei, de o soluţie/suspensie/emulsie în ulei (de exemplu, în ulei de porumb) şi, eventual, soluţii în alte vehicule. Pentru vehicule altele decât apa, este necesar să se cunoască caracteristicile toxicologice ale vehiculului. Dozele se prepară cu puţin timp înaintea administrării, cu excepţia cazului în care stabilitatea preparatului în perioada în care urmează a fi utilizat este cunoscută şi s-a demonstrat că este acceptabilă.

1.5. MOD DE LUCRU

1.5.

1.5.1. Administrarea dozelor Substanţa de testat se administrează într-o singură doză, prin gavaj, utilizând o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. În cazurile deosebite în care nu este posibilă administrarea unei singure doze, doza poate fi administrată în fracţiuni mai mici pe parcursul unei perioade de maximum 24 de ore. Animalele nu se hrănesc înainte de administrarea dozei (de exemplu, şobolanii nu trebuie să fie hrăniţi peste noapte, dar pot primi apă; şoarecii nu trebuie să fie hrăniţi, dar pot primi apă, cu 3-4 ore înainte). După perioada de flămânzire, animalele se cântăresc şi li se administrează substanţa de testat. După administrarea substanţei, animalele pot fi private din nou de hrană, 3-4 ore la şobolani şi 1-2 ore la şoareci. Dacă doza se administrează fracţionat într-o perioadă de timp, este posibil să fie necesar să li se ofere animalelor hrană şi apă, în funcţie de durata perioadei de administrare.

1.5.2. Numărul de animale şi nivelul dozelor În fiecare etapă se utilizează trei animale. Nivelul dozei utilizate ca doză iniţială se selectează din cele patru doze fixe: 5, 50, 300 şi 2000 mg/kg greutate corporală. Se alege nivelul dozei iniţiale cu cea mai mare probabilitate de a produce decesul unora dintre animalele cărora li se administrează. Diagramele din apendicele 1 descriu procedura de urmat pentru fiecare doză iniţială. În plus, apendicele 4 prezintă indicaţii pentru clasificarea în sistemul UE până la punerea în aplicare a noului SGA. Dacă informaţiile disponibile sugerează că este puţin probabil ca cel mai ridicat nivel al dozei iniţiale (2000 mg/kg greutate corporală) să provoace decese, se efectuează testul-limită. Dacă nu există informaţii privind substanţa de testat, din motive de bunăstare animală, se recomandă utilizarea dozei iniţiale de 300 mg/kg greutate corporală. Intervalul de timp dintre administrarea dozelor diverselor grupuri se determină în funcţie de momentul declanşării, durata şi severitatea semnelor de toxicitate. Administrarea următoarei doze se amână până când există certitudinea că animalele testate anterior vor supravieţui. În mod excepţional şi doar dacă acest lucru este necesar pentru îndeplinirea unor cerinţe specifice, poate fi luată în considerare o doză suplimentară mai mare, de 5000 mg/kg greutate corporală (a se vedea apendicele 2). Din motive de bunăstare animală, testarea pe animale a substanţelor din categoria 5 SGA (2000-5000 mg/kg) este descurajată şi se ia în considerare doar în cazul în care este foarte probabil că rezultatele acestor teste vor fi direct relevante pentru protecţia sănătăţii oamenilor, a sănătăţii animale sau a mediului.

1.5.3. Testul-limită Testul-limită se utilizează în special în situaţiile în care experimentatorul are informaţii care arată că este posibil ca materialul de testat să nu fie toxic, având o toxicitate puţin peste dozele-limită reglementate. Informaţiile privind toxicitatea materialului de testat pot fi deduse din cunoştinţele despre compuşi, amestecuri şi produse similare testate, ţinând seama de identitatea şi procentajul componentelor cunoscute ca fiind semnificative din punct de vedere toxicologic. În situaţiile în care nu există sau există puţine informaţii privind toxicitatea materialului sau în care se estimează că materialul de testat este toxic, se efectuează testul principal. Se poate efectua un test-limită cu o doză de 2000 mg/kg greutate corporală pe şase animale (trei animale în fiecare etapă). În mod excepţional, se poate efectua un test-limită cu o doză de 5000 mg/kg cu trei animale (a se vedea apendicele 2). Dacă intervin decese cauzate de substanţa de testat, se poate dovedi necesară efectuarea de teste la următorul nivel inferior.

1.6. OBSERVAŢII Animalele sunt observate individual după administrarea dozelor, cel puţin o dată în primele 30 de minute, periodic în primele 24 de ore, acordându-li-se o atenţie specială în primele 4 ore, şi, ulterior, zilnic, timp de 14 zile, cu excepţia cazului în care trebuie excluse din studiu şi eutanasiate din motive de bunăstare animală sau sunt găsite moarte. Cu toate acestea, perioada de observaţie nu se stabileşte rigid. Ea se determină în funcţie de reacţiile toxice şi momentul declanşării acestora şi de durata perioadei de recuperare şi, prin urmare, poate fi prelungită, dacă este necesar. Momentele în care semnele de toxicitate apar şi dispar sunt importante, în special în cazurile în care semnele de toxicitate au tendinţa de a apărea cu întârziere (12). Toate observaţiile se înregistrează sistematic, întocmindu-se fişe individuale pentru fiecare animal. Vor fi necesare observaţii suplimentare în cazul în care animalele manifestă în continuare semne de toxicitate. Observaţiile vizează modificările pielii şi blănii, ochilor şi membranelor mucoaselor, modificările activităţii sistemului respirator, sistemului circulator, sistemului nervos central şi vegetativ şi ale activităţii somato-motorii şi modificările de comportament. Se va acorda o atenţie specială observării tremuratului, convulsiilor, salivării, diareii, letargiei, somnului şi comei. Se iau în considerare principiile şi criteriile rezumate în Humane Endpoints Guidance Document (9). Animalele găsite în stare muribundă şi animalele care manifestă dureri mari şi semne prelungite de suferinţă profundă sunt eutanasiate. În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt găsite moarte, momentul morţii se înregistrează cât mai exact posibil.

1.6.

1.6.1. Greutatea corporală Animalele se cântăresc individual puţin înainte de administrarea substanţei de testat şi, ulterior, cel puţin o dată pe săptămână. Se calculează şi se înregistrează variaţiile de greutate. La sfârşitul testului, animalele care au supravieţuit sunt cântărite şi apoi eutanasiate.

2. DATE Se furnizează date individuale despre animale. În plus, se face un rezumat tabelar al tuturor datelor, prezentând pentru fiecare grup testat numărul de animale utilizate, numărul de animale care au prezentat semne de toxicitate, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate, ora decesului pentru fiecare animal, o descriere, evoluţia în timp şi reversibilitatea efectelor toxice şi constatările autopsiei.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare include următoarele informaţii, după caz:

Substanţa de testat:

natura fizică, puritate şi, dacă este cazul, proprietăţi fizico-chimice (inclusiv izomerizare);

date de identificare, inclusiv numărul CAS.

Vehicul (dacă este cazul):

justificarea alegerii vehiculului, dacă este altul decât apa.

Animalele de experienţă:

specie/suşă utilizată;

starea microbiologică a animalelor, dacă se cunoaşte;

numărul, vârsta şi sexul animalelor (inclusiv, dacă este cazul, o justificare pentru utilizarea de masculi în locul femelelor);

sursă, condiţii de adăpostire, hrănire etc.;

Condiţii de testare:

detalii privind prepararea substanţei de testat, inclusiv detalii privind forma fizică a materialului administrat;

detalii privind administrarea substanţei de testat, inclusiv volumul dozelor şi durata administrării;

detalii privind calitatea hranei şi a apei (inclusiv tipul/sursa hranei, sursa apei);

o justificare pentru selectarea dozei iniţiale.

Rezultate:

un tabel cu datele privind reacţia şi nivelul dozei la fiecare animal (animale care prezintă semne de toxicitate, inclusiv mortalitate, natura, gravitatea şi durata efectelor);

un tabel cu greutatea corporală şi variaţiile acesteia;

greutatea fiecărui animal în ziua administrării dozei, la intervale săptămânale ulterior şi în momentul morţii sau al sacrificării;

data şi ora morţii, dacă a survenit înainte de momentul planificat pentru sacrificare;

graficul declanşării semnelor de toxicitate şi reversibilitatea acestora pentru fiecare animal;

concluziile autopsiei şi concluziile examenului histopatologic pentru fiecare animal, dacă sunt disponibile.

Discutarea şi interpretarea rezultatelor.

Concluzii.

4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86 Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610 Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134 Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R L, Cotruvo, J. A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel K. A., Walker A. P., Chu I; Goddard M., Segal L., Springer J. A. and Myers R. C. (1995), Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

B.2. TOXICITATEA ACUTĂ (ADMINISTRARE PRIN INHALARE)

B.2.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Este util să se folosească informaţii preliminare asupra substanţei cu privire la mărimea şi distribuţia particulelor, presiunea vaporilor, punctul de topire, punctul de fierbere, punctul de aprindere şi proprietăţile explozive (după caz). A se vedea şi introducerea generală partea B (litera A).

1.2. DEFINIŢIE A se vedea introducerea generală: partea B (litera B).

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Mai multe loturi de animale de experienţă se tratează cu substanţa de testat pentru o perioadă de timp definită, în concentraţii crescătoare, folosindu-se o singură concentraţie pe lot. Ulterior, se observă efectele toxice şi mortalitatea. Animalele care mor pe parcursul testului şi cele care supravieţuiesc până la încheierea experimentului se supun autopsiei. Animalele care prezintă semne de suferinţă intensă şi de durată trebuie eutanasiate. Se evită administrarea substanţelor cu proprietăţi corosive sau iritante în moduri care pot produce suferinţă intensă.

1.5. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6.

1.6.1. Pregătiri Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează la întâmplare într-un număr necesar de loturi. Animalele nu sunt supuse unei expuneri simulate decât dacă acest lucru este indicat de tipul de aparat de expunere folosit. Substanţele solide testate trebuie să fie reduse la dimensiuni micronice, în scopul obţinerii unor particule de dimensiuni corespunzătoare. Atunci când este necesar, la substanţa de testat se poate adăuga un vehicul care să ajute la generarea unei concentraţii adecvate de substanţă de testat în atmosferă şi, în acest caz, se foloseşte un lot martor pentru vehicul. Dacă pentru facilitarea administrării se foloseşte un vehicul sau alt aditiv, trebuie să fie cunoscute eventualele efecte toxice ale acestuia.

1.6.2. Condiţii de testare

1.6.2.

1.6.2.1. Animale de experienţă Dacă nu sunt contraindicaţii, specia preferată este şobolanul. Se folosesc animale aparţinând liniilor obişnuite în laborator. Pentru fiecare sex, la începutul experimentului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie.

1.6.2.2. Număr şi sex Pentru fiecare nivel de dozare se folosesc minimum 10 rozătoare (5 masculi şi 5 femele). Femelele trebuie să fie nulipare şi negestante. Notă: În testele de toxicitate acută cu animale aparţinând unui ordin mai înalt decât cel al rozătoarelor, se are în vedere introducerea în experiment a unui număr mai mic de animale. Dozele se aleg cu atenţie şi se depun toate eforturile pentru a nu se depăşi dozele moderat toxice. În asemenea teste se evită administrarea dozelor letale.

1.6.2.3. Concentraţii de expunere Acestea trebuie să fie în număr suficient, cel puţin 3, distanţate adecvat pentru a produce o gamă de efecte toxice şi mortalitate la loturile testate. Rezultatele trebuie să fie suficient de numeroase pentru a permite înregistrarea unei curbe concentraţie-mortalitate şi determinarea acceptabilă a CL50 acolo unde este posibil.

1.6.2.4. Testul-limită Dacă expunerea a cinci animale experimentale masculi şi cinci animale experimentale femele la 20 mg per litru dintr-o substanţă gazoasă sau 5 mg per litru dintr-o substanţă sub formă de aerosoli sau dispersii timp de patru ore (sau, dacă acest lucru nu este posibil datorită proprietăţilor fizice sau chimice, inclusiv cele explozive, ale substanţei de testare, concentraţia maximă accesibilă) nu produce moartea niciunui animal în termen de 14 zile, se apreciază că nu mai este necesară continuarea testului (a 18-a APT, Directiva 93/21/CEE, L 110/93).

1.6.2.5. Timpul de expunere Timpul de expunere este de 4 ore.

1.6.2.6. Echipamente Animalele se expun la substanţa de testat cu ajutorul unui dispozitiv de inhalare conceput pentru a asigura un flux continuu sau cel puţin 12 aerisiri pe oră, garantând un conţinut de oxigen adecvat şi o distribuţie uniformă a produsului de testat în aer. Dacă se foloseşte o incintă, aceasta trebuie concepută astfel încât să reducă la minim aglomerarea animalelor de experiment şi să le asigure o expunere maximă, prin inhalare, a substanţei de testat. De regulă, pentru a asigura stabilitatea atmosferei din incintă, volumul total al animalelor nu trebuie să depăşească 5 % din volumul incintei. Se mai pot folosi expuneri oro-nazale, numai ale capului sau ale întregului corp, în incinte individuale; primele două tipuri de expunere limitează absorbţia pe alte căi a substanţei de testat.

1.6.2.7. Perioada de observaţie Perioada de observaţie este de minimum 14 zile. Cu toate acestea, durata observaţiilor nu este fixată în mod rigid. Ea se stabileşte în funcţie de efectele toxice, de intensitatea lor la debut şi de perioada de recuperare; perioada de observaţie poate fi extinsă, dacă se consideră necesar. Momentul în care apar şi dispar semnele de toxicitate şi momentul morţii sunt factori importanţi, mai ales dacă mortalitatea tinde să fie una tardivă.

1.6.3. Mod de operare Animalele sunt cântărite cu puţin timp înaintea tratamentului, apoi se tratează cu concentraţia testată, în aparatul respectiv, timp de patru ore, după echilibrarea concentraţiei în incintă. Timpul de echilibrare trebuie să fie scurt. Temperatura la care se realizează testul este de 22 ± 3 oC. În mod ideal, umiditatea relativă este menţinută între 30 % şi 70 %, dar în anumite cazuri, cum ar fi testarea anumitor aerosoli, acest lucru nu este practicabil. Menţinerea unei uşoare presiuni negative în incintă (de exemplu 5 mm H2O) previne pierderea substanţei de testat în spaţiul înconjurător. Hrana şi apa sunt restricţionate în timpul expunerii. Se folosesc sisteme corespunzătoare de generare şi monitorizare a atmosferei testate. Sistemul este proiectat şi funcţionează astfel încât să menţină o distribuţie omogenă a atmosferei testate în interiorul incintei. Se măsoară şi se controlează: În timpul expunerii şi după aceasta au loc observaţii care sunt înregistrate sistematic; pentru fiecare animal se consemnează date individuale. Se fac observaţii frecvente în prima zi. Cel puţin o dată pe zi lucrătoare, se procedează la o examinare clinică atentă; se fac şi alte observaţii zilnice şi se iau măsurile necesare pentru a reduce la minim pierderea animalelor din studiu, precum autopsia sau congelarea exemplarelor găsite moarte şi izolarea sau sacrificarea celor slăbite sau muribunde. Observaţiile vizează modificări ale părului şi ale blănii, ale ochilor şi ale mucoaselor, ale aparatului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom şi ale sistemului nervos central, precum şi ale activităţii somato-motrice şi ale comportamentului. Trebuie acordată o atenţie deosebită următoarelor aspecte: tremor, convulsii, salivaţie, diaree, letargie, somn şi comă. Momentul morţii este înregistrat cât mai precis posibil. Fiecare animal este cântărit săptămânal, după tratament şi la deces. Animalele care mor pe parcursul testului şi cele care supravieţuiesc sunt supuse autopsiei la încheierea testului, acordându-se o atenţie specială modificărilor tractului respirator. Trebuie înregistrate toate modificările anatomopatologice macroscopice. Unde este cazul, ţesuturile se prelevează pentru examen histopatologic.

1.6.3.

(a) debitul de aer (în permanenţă);

(b) concentraţia reală a substanţei de testat măsurate în zona de respiraţie, cel puţin de trei ori în timpul expunerii (unele atmosfere, de exemplu cea cu aerosoli la concentraţii mari, necesită măsurări mai frecvente); pe parcursul perioadei de expunere, concentraţia nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 15 % faţă de valoarea medie; cu toate acestea, în cazul prafului şi al aerosolilor, acest grad de control poate să nu fie atins, iar în acest caz se poate accepta o diferenţă mai mare; în cazul aerosolilor, analiza granulometrică se efectuează ori de câte ori este necesar (cel puţin o dată pe lot);

2. DATE Datele se sistematizează în tabele. Pentru fiecare lot testat se consemnează: numărul animalelor introduse în experiment; momentul morţii fiecărui animal; numărul de animale care prezintă alte semne de toxicitate; descrierea efectelor toxice; rezultatele autopsiei. Modificările în greutate se calculează şi se înregistrează, dacă supravieţuirea depăşeşte o zi. Animalele eutanasiate datorită suferinţei intense provocate de compusul folosit se înregistrează ca decese datorate efectelor substanţei de testat. LC50 se determină printr-o metodă standardizată. Rezultatele evaluării cuprind, dacă este posibil, o apreciere a relaţiei între expunerea animalului la substanţa de testat şi incidenţa şi severitatea tuturor modificărilor apărute, care includ: modificări comportamentale şi clinice, leziuni anatomopatologice macroscopice, variaţii ale greutăţii corporale, mortalitate, alte efecte toxice.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare conţine, dacă este posibil, următoarele informaţii: Datele privind expunerea Se prezintă sub forma unui tabel care indică valorile medii, precum şi măsura variabilităţii (de exemplu, deviaţia standard); ele trebuie să includă:

specia, linia, sursa, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.;

condiţiile de testare: descrierea aparatului de expunere, inclusiv concepţia, tipul, dimensiunile, sursa de aer, sistemul generator de particule şi de aerosoli, metoda de condiţionare a aerului şi, după caz, modul de adăpostire a animalelor în incinta de testare. Se descrie echipamentul folosit pentru măsurarea temperaturii şi, dacă este necesar, stabilitatea concentraţiilor de aerosoli şi granulometria particulelor.

3.1.

(a) debitul de aer în dispozitivul de inhalare;

(b) temperatura şi umiditatea aerului;

(c) concentraţiile nominale (cantitatea totală de substanţă de testat introdusă în dispozitivul de inhalare raportată la volumul de aer);

(d) după caz, natura vehiculului;

(e) concentraţiile reale din zona de respiraţie;

(f) mediana dimensiunilor particulelor (după caz);

(g) perioada de echilibrare;

(h) perioada de expunere:

înregistrarea rezultatelor pe sexe şi nivel de expunere (numărul de animale moarte pe parcursul testului, numărul de animale care prezintă semne de toxicitate, numărul de animale expuse);

momentul morţii pe parcursul testului, criteriile de eutanasiere;

toate observaţiile;

valoarea CL50 calculată pe fiecare sex, determinată la sfârşitul perioadei de observaţie, cu specificarea metodei de calcul;

intervalul de încredere 95 % pentru CL50 (în cazul în care poate fi furnizat);

curba doză/mortalitate şi panta (dacă este permisă de metoda de determinare);

rezultatele autopsiei;

rezultatele examenului histopatologic;

discutarea rezultatelor (o atenţie specială se acordă efectelor pe care numărul animalelor sacrificate pe parcursul testului le-ar putea avea asupra valorii calculate a CL50);

interpretarea rezultatelor.

3.2. EVALUARE ŞI INTERPRETARE A se vedea introducerea generală partea B (litera D).

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE A se vedea introducerea generală partea B (litera E).

B.3. TOXICITATEA ACUTĂ (ADMINISTRARE CUTANATĂ)

B.3.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE A se vedea introducerea generală partea B (litera A).

1.2. DEFINIŢIE A se vedea introducerea generală partea B (litera B).

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Substanţa de testat se aplică pe piele, în doze crescătoare, la mai multe loturi, câte o doză pentru fiecare lot. Ulterior se fac observaţii cu privire la efectele toxice şi mortalitate. Animalele care mor pe perioada testării sunt autopsiate, iar la sfârşitul testului animalele supravieţuitoare se supun şi ele autopsiei. Animalele care prezintă semne grave de suferinţă sunt eutanasiate. Se evită administrarea substanţelor cu proprietăţi corosive sau iritante în moduri care pot produce suferinţe grave.

1.5. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6.

1.6.1. Pregătiri Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de testare, animalele tinere sănătoase se repartizează la întâmplare în loturile tratate. Cu aproximativ 24 ore înaintea testului, blana din zona dorsală a trunchiului animalelor se tunde sau se rade cu atenţie pentru a nu produce escoriaţii care ar putea altera permeabilitatea pielii. Pentru aplicarea substanţei de testat este pregătită cel puţin 10 % din suprafaţa corpului. Dacă se testează substanţe solide, acestea se umezesc suficient cu apă sau, dacă este necesar, cu un vehicul corespunzător care să asigure un contact bun cu pielea. Dacă se foloseşte un vehicul, trebuie luată în considerare influenţa acestuia asupra penetrabilităţii cutanate. Substanţele lichide testate se folosesc, în general, nediluate.

1.6.2. Condiţii de testare

1.6.2.

1.6.2.1. Animale de experienţă Se folosesc şobolani sau iepuri adulţi. Se pot folosi şi alte specii, dar folosirea acestora trebuie justificată. Se folosesc animale din liniile obişnuite de laborator. Pentru fiecare sex, la începutul experimentului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie.

1.6.2.2. Număr şi sex Pentru fiecare doză se folosesc cel puţin 5 animale, de acelaşi sex. Dacă se folosesc femele, acestea trebuie să fie nulipare şi negestante. Dacă există informaţii demonstrate că unul din sexe prezintă o sensibilitate mai mare, vor fi supuse testului animale de sexul respectiv. Notă: În testele de toxicitate acută efectuate pe animale aparţinând unui ordin mai înalt decât rozătoarele se folosesc mai puţine animale. Dozele se aleg astfel încât să nu se depăşească dozele moderat toxice. În astfel de teste se evită administrarea dozelor letale de substanţă de testat.

1.6.2.3. Doze Dozele trebuie alese în număr suficient (cel puţin trei) şi astfel încât să producă o gamă de efecte toxice şi mortalitate. La alegerea dozelor trebuie luate în considerare eventualele efecte iritante sau corosive. Informaţiile trebuie să permită înregistrarea unei curbe doză/răspuns şi, unde este posibil, determinarea DL50.

1.6.2.4. Testul-limită Pe un lot de 5 masculi şi 5 femele se poate efectua un test-limită cu doză unică de cel puţin 2000 mg/kg masă corporală, folosind tehnica descrisă mai sus. Dacă apare mortalitate corelată cu doza, se efectuează un studiu complet.

1.6.2.5. Perioada de observaţie Perioada de observaţie este de minimum 14 zile. Cu toate acestea, durata observaţiilor nu este fixată în mod rigid, ci se stabileşte în funcţie de efectele toxice, intensitatea lor la debut şi perioada de recuperare. Perioada de observaţie poate fi extinsă, dacă se consideră necesar. Momentul în care apar şi dispar semnele de toxicitate şi momentul morţii sunt factori importanţi, mai ales dacă mortalitatea tinde să fie una tardivă.

1.6.3. Mod de operare Fiecare animal este ţinut într-o cuşcă individuală. Substanţa de testat se aplică uniform pe o porţiune de aproximativ 10 % din suprafaţa corporală totală. Zona de aplicare poate fi mai redusă în cazul substanţelor foarte toxice, dar se acoperă o suprafaţă cât mai mare, cu un strat cât se poate de subţire şi de uniform. Pe parcursul expunerii, substanţa de testat se menţine în contact cu pielea cu ajutorul unui bandaj de tifon şi al unui plasture neiritant. Suprafaţa tratată se acoperă astfel încât să menţină bandajul de tifon şi substanţa de testat şi să se evite ingerarea acesteia de către animale. Se poate folosi contenţionarea pentru a împiedica animalele să ingereze substanţa de testat, dar nu se recomandă imobilizarea completă. La sfârşitul perioadei de expunere, se elimină, dacă este posibil, orice reziduu de substanţă, cu apă sau cu ajutorul unui alt procedeu de curăţare a pielii. În timpul expunerii şi după aceasta au loc observaţii care sunt înregistrate sistematic; pentru fiecare animal se consemnează date individuale. Se fac observaţii frecvente în prima zi. Cel puţin o dată pe zi lucrătoare, se procedează la o examinare clinică atentă; se fac şi alte observaţii zilnice şi se iau măsurile necesare pentru a reduce la minim pierderea animalelor din studiu, cum ar fi autopsia sau congelarea exemplarelor găsite moarte şi izolarea sau sacrificarea celor slăbite sau muribunde. Observaţiile vizează modificări ale blănii, pielii tratate, ochilor, mucoaselor, sistemului respirator, circulator, sistemului nervos central şi sistemului nervos autonom, ale activităţii somato-motrice şi comportamentului. Trebuie acordată o atenţie deosebită următoarelor aspecte: tremor, convulsii, salivaţie, diaree, letargie, somn şi comă. Momentul morţii se înregistrează cât mai exact posibil. Animalele care mor pe parcursul testului şi cele care supravieţuiesc la terminarea lui se supun autopsiei. Toate modificările anatomopatologice macroscopice sunt înregistrate. Dacă este astfel indicat, se recoltează ţesuturi pentru examenul histopatologic.

1.6.3. Evaluarea toxicităţii la sexul opus

După terminarea studiului pentru unul din sexe, substanţa de testat se administrează la cel puţin un lot de 5 animale de sex opus, pentru a stabili dacă animalele care aparţin acestui sex prezintă o sensibilitate mai pronunţată la substanţa de testat. În circumstanţe individuale poate fi justificată folosirea unui număr mic de animale. Dacă sunt disponibile informaţii care demonstrează că animalele aparţinând sexului tratat prezintă o sensibilitate mai mare, nu mai este necesară testarea pe animale de sex opus.

2. DATE Datele se sistematizează în tabele. Pentru fiecare lot testat se consemnează: numărul animalelor la începutul testului; momentul morţii pentru fiecare animal; numărul de animale care manifestă alte semne de toxicitate; descrierea efectelor toxice; rezultatele autopsiei. Greutatea animalelor este determinată şi înregistrată cu puţin timp înaintea aplicării substanţei de testat, apoi săptămânal până în momentul decesului; modificările în greutate se calculează şi se înregistrează, dacă supravieţuirea depăşeşte o zi. Animalele sacrificate datorită suferinţei intense provocate de compusul folosit se înregistrează ca decese datorate efectelor substanţei de testat. DL50 se determină printr-o metodă recunoscută. Rezultatele evaluării cuprind, dacă este posibil, o apreciere a relaţiei între expunerea animalului la substanţa de testat şi incidenţa şi severitatea tuturor modificărilor apărute, inclusiv: modificări comportamentale şi clinice, leziuni macroscopice, variaţii ale greutăţii corporale, mortalitate, alte efecte toxice.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

specia, linia, sursa, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.;

condiţiile de testare (inclusiv metoda de curăţare a pielii şi tipul de bandaj: ocluziv sau neocluziv);

dozele (cu indicarea vehiculului, dacă se foloseşte, şi concentraţiile);

sexul animalelor tratate;

tabele cu rezultatele răspunsului, structurate după sex şi doză (numărul animalelor care au murit sau au fost sacrificate pe parcursul testului, numărul animalelor care prezintă semne de toxicitate, numărul animalelor expuse);

momentul morţii după tratament, argumente şi criterii folosite pentru eutanasierea animalelor;

toate observaţiile;

valoarea DL50 (cu specificarea metodei de determinare) pentru sexul care a reprezentat obiectul unui studiu complet pe o perioadă de 14 zile;

intervalul de încredere 95 % pentru DL50 (când poate fi prezentat);

curba doză/mortalitate şi panta dreptei de regresie, acolo unde permite metoda de determinare;

rezultatele autopsiei;

rezultatele histopatologice;

rezultatele testelor pe sexul opus;

discutarea rezultatelor (o atenţie particulară se acordă efectului pe care numărul animalelor sacrificate pe parcursul testului l-ar putea avea asupra valorii calculate a DL50);

interpretarea rezultatelor.

3.2. EVALUARE ŞI INTERPRETARE A se vedea introducerea generală partea B (litera D).

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE A se vedea introducerea generală partea B (litera E).

B.4. TOXICITATE ACUTĂ: IRITAŢIE/COROZIUNE DERMICĂ

B.4.

1. METODĂ Această metodă este echivalentă cu Orientarea 404 (2002) a OCDE.

1.

1.1. INTRODUCERE La elaborarea acestei metode actualizate, s-a acordat o atenţie deosebită posibilelor îmbunătăţiri în ceea ce priveşte problemele de bunăstare animală şi evaluării tuturor informaţiilor existente privind substanţa de testat pentru a se evita testarea inutilă pe animale de laborator. Această metodă include recomandarea ca, anterior efectuării a testului in vivo de iritaţie/coroziune descris asupra substanţei, să se facă o analiză a valorii probante a datelor existente relevante. Dacă datele disponibile sunt insuficiente, ele pot fi dezvoltate prin aplicarea unor teste secvenţiale (1). Strategia de testare include efectuarea unor teste in vitro validate şi acceptate şi este prezentată în apendicele la această metodă. În plus, dacă este cazul, se recomandă optarea pentru aplicarea succesivă, şi nu simultană, a celor trei plasturi la animalul de experienţă în cadrul testului iniţial in vivo. În interesul acurateţei ştiinţifice şi al bunăstării animale, testele in vivo se efectuează doar după o analiză a valorii probante a tuturor datelor relevante disponibile privind caracterul coroziv/iritant al substanţei la nivel dermic. Printre aceste date se numără dovezi din studiile deja efectuate asupra oamenilor şi/sau animalelor de laborator, dovezi privind caracterul coroziv/iritant al uneia sau mai multor substanţe chimice înrudite structural sau al unor amestecuri de astfel de substanţe, date demonstrând o puternică aciditate sau alcalinitate a substanţei (2) (3) şi rezultatele unor teste in vitro sau ex vivo validate şi acceptate (4) (5) (5a). Această analiză ar trebui să reducă necesitatea efectuării unor teste in vivo de coroziune/iritaţie dermică asupra substanţelor pentru care există deja dovezi suficiente din alte teste privind aceste două puncte finale. Apendicele la prezenta metodă prezintă o strategie preferată de testare de tip secvenţial, care include efectuarea unor teste in vitro şi ex vivo de coroziune/iritaţie. Strategia prezentată a fost dezvoltată şi recomandată unanim de participanţii la un atelier de lucru OCDE (6) şi a fost adoptată ca strategie de testare recomandată în Sistemul global armonizat de clasificare a substanţelor chimice (SGA) (7). Se recomandă aplicarea acestei strategii de testare înainte de efectuarea testelor in vivo. Pentru substanţele noi, se recomandă o abordare a testelor pe etape pentru obţinerea unor date ştiinţifice exacte privind caracterul coroziv/iritant al substanţei. În cazul substanţelor existente pentru care datele privind coroziunea/iritaţia dermică sunt insuficiente, se aplică strategia pentru completarea datelor lipsă. Utilizarea unei strategii sau proceduri diferite de testare sau decizia de a nu utiliza o abordare a testării pe etape trebuie justificată. În cazul în care analiza valorii probante a datelor, în conformitate cu strategia de testare secvenţială, nu permite determinarea caracterului coroziv sau iritant, se ia în considerare un test in vivo (a se vedea apendicele).

1.2. DEFINIŢII Iritaţie dermică: constă în producerea unor leziuni cutanate reversibile ca urmare a aplicării unei substanţe de testat timp de maximum patru ore. Coroziune dermică: constă în producerea unor leziuni cutanate ireversibile; mai exact, necroză vizibilă prin epidermă şi în dermă, ca urmare a aplicării unei substanţe de testat timp de maximum patru ore. Reacţiile cutanate se manifestă, în general, prin ulcere, sângerare, cruste sângerânde, şi, spre sfârşitul perioadei de observaţie de 14 zile, o decolorare datorată albirii pielii, zone de alopecie completă şi cicatrice. Leziunile suspecte se supun unui examen histopatologic.

1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Substanţa de testat se aplică într-o singură doză pe pielea unui animal de experienţă; zonele netratate ale pielii animalului de experienţă se utilizează ca martor. La intervale specificate se examinează şi se punctează gradul de iritare/coroziune, care este descris în detaliu pentru a permite o evaluare completă a efectelor. Durata studiului trebuie să fie suficientă pentru evaluarea reversibilităţii sau ireversibilităţii efectelor observate. Animalele care manifestă semne persistente de suferinţă profundă şi/sau durere în orice etapă a testului sunt eutanasiate, iar substanţa este evaluată în consecinţă. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde pot fi consultate în referinţa (8).

1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.4.

1.4.1. Pregătirea testului in vivo

1.4.1.

1.4.1.1. Selectarea speciei de animale Se utilizează, de preferat, exemplare adulte tinere, sănătoase, de iepure albinos. Utilizarea altor specii trebuie justificată.

1.4.1.2. Pregătirea animalelor Cu aproximativ 24 de ore înainte de test, se rade blana din regiunea dorsală de pe corpul animalelor. Se evită cu atenţie jupuirea pielii şi se utilizează exclusiv animalele cu pielea sănătoasă, intactă. La unele suşe de iepuri, blana este mai deasă în unele zone, în anumite perioade ale anului. Zonele în cauză nu se utilizează ca zone de testare.

1.4.1.3. Condiţii de adăpostire şi de hrănire Animalele se adăpostesc individual. În spaţiul pentru adăpostirea animalelor de experienţă, se asigură o temperatură de 20 oC (± 3 oC) pentru iepuri. Se asigură o umiditate relativă de 50-60 %, cu o valoare minimă de 30 % şi o valoare maximă 70 %, cu excepţia momentelor în care se curăţă spaţiul. Spaţiul se iluminează artificial, cu o alternanţă de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă.

1.4.2. Procedura de testare

1.4.2.

1.4.2.1. Aplicarea substanţei de testat Substanţa de testat se alică pe o suprafaţă redusă (aproximativ 6 cm2 a pielii şi se acoperă cu o compresă de tifon, care se fixează cu plasture care nu irită. În cazurile în care nu este posibilă aplicarea directă (de exemplu, în cazul lichidelor şi al unor paste), substanţa de testat se aplică mai întâi pe compresa de tifon, care se aplică apoi pe piele. Se asigură un contact uşor între compresă şi piele cu ajutorul unui pansament semi-ocluziv pentru întreaga durată a perioadei de expunere. Dacă substanţa de testat se aplică pe compresă, aceasta se fixează pe piele astfel încât să se asigure un contact adecvat şi o distribuţie uniformă a substanţei pe piele. Este necesar să se prevină accesul animalului la compresă şi ingerarea sau inhalarea substanţei de testat. Substanţele de testat lichide se utilizează, în general, nediluate. La testarea solidelor (care pot fi pulverizate, dacă este necesar), substanţa solidă se înmoaie cu cea mai mică cantitate de apă (sau, dacă este necesar, cu un alt vehicul adecvat) suficientă pentru a asigura un contact adecvat cu pielea. Dacă se utilizează alte vehicule decât apa, potenţiala influenţă a vehiculului asupra iritaţiei provocate de substanţă la nivel dermic trebuie să fie minimă sau nulă. La sfârşitul perioadei de expunere, care este, în mod normal, de 4 ore, reziduurile de substanţă de testat se îndepărtează, dacă este posibil, cu apă sau un solvent adecvat fără a se modifica reacţia existentă sau integritatea epidermei.

1.4.2.2. Nivelul dozei Pe zona de testare se aplică o doză de 0,5 ml de lichid sau de 0,5 g de substanţă solidă sau pastă.

1.4.2.3. Testul iniţial (test in vivo de iritaţie/coroziune dermică utilizând un animal) Se recomandă ca testul in vivo să se efectueze iniţial pe un singur animal, în special dacă substanţa de testat riscă să fie corozivă. Această abordare este consecventă cu strategia de testare secvenţială (a se vedea apendicele 1). Dacă se stabileşte, pe baza analizei valorii probante a datelor, că o substanţă este corozivă, nu este necesară testarea pe animale. Pentru cele mai multe substanţe care sunt considerate corozive, nu sunt, în mod normal, necesare teste suplimentare in vivo. Cu toate acestea, în cazurile în care se justifică obţinerea de date suplimentare având în vedere dovezile insuficiente, se pot efectua teste restrânse, utilizând următoarea abordare: Se aplică animalului, secvenţial, maximum trei plasturi. Primul plasture se îndepărtează după trei minute. Dacă nu se observă o reacţie cutanată serioasă, se aplică al doilea plasture, care se îndepărtează după o oră. Dacă în această etapă, observaţiile arată că poate fi permisă prelungirea expunerii la patru ore, fără a cauza suferinţe, se aplică un al treilea plasture, care se îndepărtează după patru ore şi se punctează reacţia. Dacă se observă un efect coroziv după oricare dintre cele trei expuneri secvenţiale, testul se încheie. Dacă nu se observă un efect coroziv după îndepărtarea ultimului plasture, animalul se observă timp de 14 zile, cu excepţia cazului în care coroziunea se manifestă mai devreme. În cazurile în care se estimează că substanţa de testat nu este corozivă, dar ar putea fi iritantă, se aplică un singur plasture unui animal, timp de patru ore.

1.4.2.4. Teste de confirmare (test de iritare in vivo pe animale suplimentare) Dacă la testul iniţial nu se observă efecte corozive, reacţia de iritaţie sau negativă se confirmă prin testarea a maximum alte două animale, fiecare cu câte un plasture, cu o perioadă de expunere de patru ore. Dacă se observă un efect iritant la testul iniţial, testul de confirmare poate fi efectuat secvenţial sau prin expunerea simultană a celor două animale suplimentare. În cazul excepţional în care nu se efectuează testul iniţial, două sau trei animale pot fi tratate cu câte un singur plasture, care se îndepărtează după patru ore. Dacă se utilizează două animale şi ambele manifestă aceeaşi reacţie, nu mai sunt necesare teste suplimentare. În caz contrar, se testează şi al treilea animal. Este posibil să fie necesară evaluarea reacţiilor echivoce utilizând alte animale.

1.4.2.5. Perioada de observare Durata perioadei de observare trebuie să fie suficientă pentru evaluarea completă a reversibilităţii efectelor observate. Cu toate acestea, experimentul se încheie dacă animalul prezintă semne persistente de durere sau suferinţă profundă. Pentru a determina reversibilitatea efectelor, animalele se observă timp de până la 14 zile de la îndepărtarea plasturilor. Dacă reversibilitatea intervine înainte de 14 zile, experimentul se încheie în acel moment.

1.4.2.6. Observaţii clinice şi punctarea reacţiilor cutanate Se examinează semnele de eritem şi edem la toate animalele şi se punctează reacţiile la 60 de minute, iar apoi la 24, 48 şi 72 de ore de la îndepărtarea plasturilor. Pentru testul iniţial pe un singur animal, zona de testare se examinează, de asemenea, imediat după îndepărtarea plasturelui. Reacţiile dermice se punctează şi se înregistrează conform punctajelor din tabelul de mai jos. Dacă la 72 de ore se observă leziuni cutanate care nu pot fi identificate ca iritaţii sau coroziuni, este posibil să fie necesară observarea timp de 14 zile, pentru a determina reversibilitatea efectelor. În plus faţă de examinarea iritaţiei, se descriu şi se înregistrează toate efectele toxice locale, precum uscarea pielii, şi orice efecte sistemice adverse (de exemplu, efecte manifestate prin semne clinice de toxicitate sau efecte asupra greutăţii corporale). Pentru clarificarea reacţiilor echivoce se efectuează un examen histopatologic. Punctarea reacţiilor cutanate este evident subiectivă. Pentru a promova armonizarea punctării reacţiilor cutanate şi pentru a veni în sprijinul laboratoarelor de testare şi a persoanelor implicate în efectuarea şi interpretarea observaţiilor, personalul care efectuează observaţiile trebuie să fie instruit corespunzător cu privire la sistemul de punctaj utilizat (a se vedea tabelul de mai jos). Ar putea fi util un ghid ilustrat pentru punctarea iritaţiilor dermice şi a altor leziuni (9).

2. DATE

2.

2.1. PREZENTAREA REZULTATELOR Rezultatele studiului se rezumă în formă tabelară în raportul final al testului şi includ toate punctele prevăzute la punctul 3.1.

2.2. EVALUAREA REZULTATELOR Punctajele de iritaţie dermică se evaluează în legătură cu natura şi severitatea leziunilor, precum şi cu reversibilitatea sau ireversibilitatea lor. Punctajele individuale nu reprezintă un standard absolut pentru proprietăţile iritante ale materialului, întrucât se evaluează şi alte efecte ale materialului de testat. În schimb, punctajele individuale trebuie privite ca valori de referinţă, care se evaluează în legătură cu toate celelalte observaţii ale studiului. Reversibilitatea leziunilor cutanate se ia în considerare la evaluarea reacţiilor iritante. Dacă reacţiile precum alopecia (zonă limitată), hiperkeratoza, hiperplazia şi exfolierea persistă la sfârşitul perioadei de observare de 14 zile, substanţa de testat se consideră a fi iritantă.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare include următoarele informaţii:

Motivaţia pentru testarea in vivo: analiza valorii probante a datelor prealabile testului, inclusiv a rezultatelor strategiei de testare secvenţiale:

descrierea datelor relevante disponibile înaintea testului;

date obţinute în fiecare etapă a strategiei de testare;

descrierea testelor in vitro efectuate, inclusiv detaliile procedurilor, rezultatele obţinute cu substanţele de testat/de referinţă;

analiza valorii probante pentru efectuarea studiului in vivo.

Substanţa de testat:

date de identificare (de exemplu, numărul CAS; sursă; puritate; impurităţi cunoscute; numărul lotului);

natura fizică şi proprietăţile fizico-chimice (de exemplu, pH, volatilitate, solubilitate, stabilitate);

pentru amestecuri, compoziţia şi procentele relative ale componentelor.

Vehicul:

identificare, concentraţie (dacă este cazul), volumul utilizat;

justificarea alegerii vehiculului.

Animale de experienţă:

specie/suşă utilizată, motivaţie pentru utilizarea altor animale decât iepurele albinos;

numărul de animale din fiecare sex;

greutatea fiecărui animal la începutul şi la finalul testului;

vârsta la începutul studiului;

sursa animalelor, condiţii de adăpostire, hrănire etc.

Condiţii de testare:

tehnica pregătirii zonei de aplicare a plasturelui;

detalii privind materialele utilizate pentru plasturi şi metodele de aplicare;

detalii privind prepararea, aplicarea şi îndepărtarea substanţei de testat.

Rezultate:

tabel cu punctajul acordat reacţiei de iritaţie/coroziune pentru fiecare animal în fiecare moment de observare prestabilit;

descrierea tuturor leziunilor observate;

descrierea narativă a naturii şi gradului de iritaţie/coroziune observat şi concluziile examenului histopatologic;

descrierea altor efecte locale adverse (de exemplu, uscarea pielii) şi a altor efecte sistemice apărute în plus faţă de iritaţia sau coroziunea dermică.

Discutarea rezultatelor.

4.1.2.3.4.5.5a.6.7.8.9.

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE Barratt, M. D., Castell, J. V., Chamberlain, M., Combes, R. D., Dearden, J. C., Fentem, J. H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26. Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720. ECETOC (1990) Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Edsail, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, pp.483-524. Metoda de testare B.40 Coroziunea cutanată. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Disponibil la cerere la Secretariatul OCDE]. [Disponibile, la cerere, la secretariatul OCDE.]

Tabelul 1 Formarea de eriteme şi escare Formarea de edeme PUNCTAREA REACŢIILOR CUTANATE

Fără eritem 0 Eritem foarte uşor (abia perceptibil) 1 Eritem bine definit 2 Eritem moderat spre grav 3 Eritem grav (roşu violaceu) cu formare de escare care împiedică punctarea eritemului 4 Maximum posibil: 4 Fără edem 0 Edem foarte uşor (abia perceptibil) 1 Edem uşor (marginile zonei bine definite printr-o umflătură vizibilă) 2 Edem moderat (umflătură de aproximativ 1 mm) 3 Edem grav (umflătură de peste 1 mm extins în afara zonei de expunere) 4 Maximum posibil: 4 Pentru clarificarea reacţiilor echivoce se procedează la un examen histopatologic.

B.5. TOXICITATE ACUTĂ: IRITAŢIE/COROZIUNE OCULARĂ

B.5.

1. METODĂ Această metodă este echivalentă cu Orientarea 405 (2002) a OCDE.

1.

1.1. INTRODUCERE La elaborarea acestei metode actualizate s-a acordat o atenţie deosebită posibilelor îmbunătăţiri prin evaluarea tuturor informaţiilor existente privind substanţa de testat, astfel încât să se evite testarea inutilă pe animale de laborator şi, prin urmare, pentru soluţionarea problemelor de bunăstare animală. Această metodă include recomandarea ca, înainte de a se efectua testul in vivo descris pentru coroziune/iritaţie oculară acută, să se facă o analiză a valorii probante a datelor relevante (1). Dacă datele disponibile sunt insuficiente, se recomandă dezvoltarea acestora prin aplicarea unor teste secvenţiale (2) (3). Strategia de testare include efectuarea unor teste in vitro validate şi acceptate şi este prezentată ca apendice la această metodă de testare. În plus, se recomandă utilizarea unui test in vivo de iritaţie/coroziune dermică pentru a face o estimare a coroziunii oculare, înainte de a se lua în considerare efectuarea unui test ocular in vivo. În interesul acurateţei ştiinţifice şi al bunăstării animale, testele in vivo se efectuează doar după o analiză a valorii probante a tuturor datelor disponibile relevante pentru potenţialul de coroziune/iritaţie oculară al substanţei. Printre aceste date se numără dovezi din studiile deja efectuate asupra oamenilor şi/sau animalelor de laborator, dovezi privind caracterul coroziv/iritant al uneia sau mai multor substanţe chimice înrudite structural sau al unor amestecuri de astfel de substanţe, date demonstrând o puternică aciditate sau alcalinitate a substanţei (4) (5) şi rezultatele unor teste in vitro sau ex vitro de coroziune şi iritaţie dermică validate şi acceptate (6) (6a). Este posibil ca aceste studii să fi fost efectuate înainte de sau ca urmare a analizei valorii probante a datelor. Pentru anumite substanţe, o astfel de analiză poate indica necesitatea efectuării unor studii in vivo privind potenţialul de coroziune/iritaţie oculară al substanţei. În toate aceste cazuri, înainte de a lua în considerare efectuarea testului ocular in vivo, este de preferat să se efectueze un studiu asupra efectelor cutanate in vivo ale substanţei şi o evaluare în conformitate cu metoda de testare B.4 (7). Efectuarea unei analize a valorii probante a datelor şi aplicarea strategiei de testare secvenţiale ar trebui să reducă necesitatea efectuării unor teste in vivo de coroziune/iritaţie oculară asupra substanţelor pentru care există deja date suficiente obţinute în cadrul altor studii. Dacă potenţialul de coroziune şi iritaţie oculară nu se poate determina prin aplicarea strategiei de testare secvenţiale, chiar după efectuarea unui studiu in vivo de coroziune şi iritaţie dermică, se poate trece la efectuarea unui test in vivo de coroziune/iritaţie oculară. Apendicele la prezenta metodă prezintă o strategie de testare secvenţială preferată, care include efectuarea unor teste in vitro sau ex vivo de coroziune/iritaţie. Strategia a fost dezvoltată şi unanim recomandată de participanţii la un atelier de lucru OCDE (8), iar ulterior a fost adoptată ca strategia de testare recomandată în Sistemul global armonizat de clasificare a substanţelor chimice (SGA) (9). Se recomandă aplicarea acestei strategii de testare înainte de efectuarea testelor in vivo. Pentru substanţe noi, este abordarea recomandată pentru testarea secvenţială în vederea dezvoltării unor date ştiinţifice fiabile privind caracterul coroziv/iritant al substanţei. În cazul substanţelor existente pentru care există date insuficiente privind coroziunea/iritaţia dermică şi oculară, strategia se utilizează pentru obţinerea unor date complete. Utilizarea unei strategii sau proceduri diferite de testare sau decizia de a nu aplica o abordare de testare secvenţială trebuie motivată.

1.2. DEFINIŢII Iritaţie oculară: reprezintă producerea unor modificări oculare ca urmare a aplicării unei substanţe de testat pe suprafaţa anterioară ochiului, care sunt complet reversibile în termen de 21 de zile de la aplicare. Coroziune oculară: reprezintă producerea unor leziuni tisulare la nivelul ochiului sau a unei deteriorări grave a vederii, ca urmare a aplicării unei substanţe de testat pe suprafaţa anterioară a ochiului, care nu sunt complet reversibile în termen de 21 de zile de la aplicare.

1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Substanţa de testat se aplică, într-o singură doză, pe un ochi al animalului de experienţă, celălalt ochi fiind utilizat ca martor. Nivelul de iritaţie/coroziune oculară se evaluează prin acordarea unui punctaj leziunilor care afectează conjunctiva, corneea şi irisul, la intervale prestabilite. Se descriu, de asemenea, celelalte efecte asupra ochiului sau efecte sistemice adverse, pentru a asigura o evaluare completă a efectelor. Durata studiului trebuie să fie suficientă pentru a evalua reversibilitatea sau ireversibilitatea efectelor. Animalele care manifestă semne persistente de suferinţă şi/sau dureri profunde în orice etapă a testului sunt eutanasiate, iar substanţa se evaluează în consecinţă. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde sunt prezentate în referinţa 10.

1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.4.

1.4.1. Pregătirea pentru testul in vivo

1.4.1.

1.4.1.1. Selectarea speciei Se utilizează, de preferat, exemplare adulte tinere, sănătoase, de iepure albinos. Utilizarea altor suşe sau specii trebuie justificată.

1.4.1.2. Pregătirea animalelor Cu 24 de ore înainte de începerea testului se examinează ambii ochi ai animalului de experienţă selectat provizoriu. Nu se utilizează animalele care prezintă iritaţii sau defecte oculare sau leziuni corneene preexistente.

1.4.1.3. Condiţii de adăpostire şi de hrănire Animalele se adăpostesc individual. În spaţiul pentru adăpostirea animalelor de experienţă se asigură o temperatură de 20 oC (± 3 oC) pentru iepuri. Se asigură o umiditate relativă de 50-60 %, cu o valoare minimă de 30 % şi o valoare maximă 70 %, cu excepţia momentelor în care se curăţă spaţiul. Spaţiul se iluminează artificial, cu o alternanţă de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă.

1.4.2. Procedura de testare

1.4.2.

1.4.2.1. Aplicarea substanţei de testat Substanţa de testat se aplică în sacul conjunctival al unui ochi al fiecărui animal, după îndepărtarea delicată a pleoapei inferioare de pe globul ocular. Pleoapele se ţin apoi lipite pentru circa o secundă, pentru a preveni pierderea materialului. Celălalt ochi, care nu se tratează, se utilizează ca martor.

1.4.2.2. Irigaţia Ochii animalelor testate nu se spală timp de cel puţin 24 de ore de la instilaţia substanţei de testat, cu excepţia cazului în care substanţa este solidă (a se vedea punctul 1.4.2.3.2) şi a cazului în care apar efecte corozive sau iritante imediate. După 24 de ore, se procedează la o spălare, dacă se consideră necesar. Nu se recomandă utilizarea unui grup satelit de animale pentru a analiza influenţa spălării, cu excepţia cazului în care este justificată ştiinţific. Dacă este necesar un grup satelit, se folosesc doi iepuri. Se descriu detaliat condiţiile de spălare, precizând momentul spălării; compoziţia şi temperatura soluţiei utilizate; durata, volumul şi viteza de aplicare.

1.4.2.3. Nivelul dozei

1.4.2.3.

1.4.2.3.1. Testarea lichidelor Pentru testarea lichidelor se utilizează o doză de 0,1 ml. Nu se utilizează pulverizatoare cu pompă pentru instilarea substanţei direct în ochi. Se recomandă extragerea lichidului şi colectarea sa într-un container înainte de instilarea a 0,1 ml în ochi.

1.4.2.3.2. Testarea solidelor La testarea solidelor, a pastelor şi a substanţelor sub formă de particule, cantitatea utilizată are un volum de 0,1 ml sau o greutate de cel mult 100 mg. Materialul de testat se macină într-un praf fin. Volumul materialului solid se măsoară după o compactare delicată, de exemplu bătând uşor cu palma recipientul de măsură. Dacă substanţa solidă de testat nu a fost îndepărtată din ochiul animalului de experienţă prin mecanisme fiziologice în primul moment prestabilit de observare, și anume la o oră după tratament, ochiul poate fi spălat cu o soluţie salină sau cu apă distilată.

1.4.2.3.3. Testarea aerosolilor Se recomandă colectarea conţinutului tuturor pulverizatoarelor cu pompă şi aerosolilor înainte de instilarea în ochi. Singura excepţie o constituie substanţele în containere sub presiune pentru aerosoli, care nu pot fi colectate din cauza vaporizării. În acest caz, ochiul se ţine deschis, iar substanţa de testat se administrează în ochi cu un singur jet de circa o secundă, de la o distanţă de 10 cm perpendicular pe ochi. Distanţa poate varia în funcţie de presiunea pulverizatorului şi a conţinutului său. Se evită lezarea ochiului din cauza presiunii pulverizatorului. În unele cazuri, se poate dovedi necesar să se evalueze posibilitatea provocării unor leziuni mecanice ochiului prin forţa pulverizatorului. Se poate face o estimare a dozei dintr-un aerosol simulând testul astfel: substanţa se pulverizează pe o bucată de hârtie de cântărit, printr-o deschidere de dimensiunea ochiului unui iepure amplasată direct în faţa hârtiei. Cantitatea pulverizată în ochi se estimează pe baza creşterii greutăţii hârtiei. Pentru substanţele volatile, doza poate fi estimată prin cântărirea unui recipient în care este pulverizată substanţa, înainte şi după îndepărtarea materialului de testat.

1.4.2.4. Testul iniţial (Test in vivo de iritaţie/coroziune oculară pe un animal) Aşa cum se precizează în strategia de testare secvenţială (a se vedea apendicele), se recomandă ca testul in vivo să se efectueze pentru început pe un singur animal. Dacă rezultatul acestui test, obţinut conform procedurii descrise, arată că substanţa este corozivă sau foarte iritantă la nivel ocular, nu se efectuează teste suplimentare de iritaţie oculară.

1.4.2.5. Anestezice locale Se pot utiliza anestezice locale de la caz la caz. Dacă analiza valorii probante a datelor arată că este posibil ca substanţa să provoace durere sau dacă testul iniţial arată că va avea loc o reacţie dureroasă, se poate aplica un anestezic local înainte de instilarea substanţei de testat. Se alege cu atenţie tipul, concentraţia şi doza de anestezic local pentru a se asigura că utilizarea anestezicului nu determină reacţii diferite la substanţa de testat. Se anesteziază în mod similar şi ochiul martor.

1.4.2.6. Testul de confirmare (Test in vivo de iritaţie oculară pe alte animale) Dacă la testul iniţial nu se observă un efect coroziv, reacţia iritantă sau negativă se confirmă utilizând maximum alte două animale. Dacă la testul iniţial se observă un efect puternic iritant care indică posibilitatea provocării unui efect puternic (ireversibil) în cadrul testului de confirmare, se recomandă ca testul de confirmare să se efectueze secvenţial, pe câte un animal, şi nu prin expunerea simultană a ambelor animale. Dacă la al doilea animal apar efecte corozive sau puternic iritante, testul se întrerupe. Este posibil să fie necesară testarea altor animale pentru confirmarea unor reacţii iritante slabe sau moderate.

1.4.2.7. Perioada de observaţie Durata perioadei de observaţie trebuie să fie suficientă pentru evaluarea completă a amplorii şi a reversibilităţii efectelor observate. Cu toate acestea, experimentul se încheie în momentul în care animalul manifestă semne persistente de suferinţă sau dureri profunde (9). Pentru a determina reversibilitatea efectelor, animalele sunt puse observaţie timp de 21 de zile după administrarea substanţei de testat. Dacă reversibilitatea intervine înainte de expirarea celor 21 de zile, experimentul se încheie în acel moment.

1.4.2.7.

1.4.2.7.1. Observaţii clinice şi punctarea reacţiilor oculare Ochii se examinează la 1, 24, 48 şi 72 de ore de la aplicarea substanţei de testat. Animalele nu sunt menţinute în experiment mai mult decât este necesar pentru obţinerea unor informaţii concludente. Animalele care prezintă semne persistente de durere sau suferinţă profunde sunt eutanasiate imediat, iar substanţa se evaluează în consecinţă. Animalele care după instilare prezintă următoarele leziuni oculare sunt eutanasiate: perforare corneană sau ulcerare corneană semnificativă, inclusiv stafilom; sânge în camera anterioară a ochiului; opacitate corneană de gradul 4 care persistă timp de 48 de ore; absenţa reflexului fotomotor (reacţie a irisului de gradul 2) care persistă timp de 72 de ore; ulcerare a membranei conjunctivale; necroză a conjunctivelor şi a membranei nictitante; sau desprinderea ţesutului necrozat. Eutanasierea se justifică întrucât astfel de leziuni sunt, în general, ireversibile. Animalele care nu prezintă leziuni oculare pot fi eutanasiate după cel puţin 3 zile de la instilare. Animalele care prezintă leziuni uşoare şi moderate sunt supuse observaţiei până la dispariţia leziunilor sau timp de 21 de zile, moment în care studiul se încheie. Animalele sunt examinate la 7, 14 şi 21 de zile, pentru a determina starea, reversibilitatea sau ireversibilitatea leziunilor. Nivelul reacţiei oculare (conjunctive, cornee şi iris) se înregistrează la fiecare examinare (tabelul I). Se înregistrează, de asemenea, orice altă leziune oculară (de exemplu, panus, colorare) şi orice efecte sistemice adverse. Pentru a facilita examinarea reacţiilor, se pot utiliza o lupă binoculară, o lampă portabilă cu fantă, un biomicroscop sau un alt dispozitiv adecvat. După înregistrarea observaţiilor la 24 de ore, examinarea ochilor se poate face cu ajutorul fluoresceinei. Punctarea reacţiilor oculare este evident subiectivă. Pentru a promova armonizarea punctării reacţiilor oculare şi pentru a veni în sprijinul laboratoarelor de testare şi a persoanelor implicate în efectuarea şi interpretarea observaţiilor, personalul care efectuează observaţiile trebuie să fie instruit corespunzător cu privire la sistemul de punctaj utilizat.

2. DATE

2.

2.2. EVALUAREA REZULTATELOR Punctajele iritaţiei oculare se evaluează în legătură cu natura şi gravitatea leziunilor, precum şi cu reversibilitatea sau ireversibilitatea acestora. Punctajele individuale nu reprezintă un standard absolut pentru proprietăţile iritante ale unui material de testat, întrucât se evaluează şi alte efecte ale materialului. În schimb, punctajele individuale trebuie privite ca valori de referinţă şi nu sunt semnificative decât dacă sunt însoţite de o descriere şi o evaluare completă a tuturor observaţiilor.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare include următoarele informaţii:

Motivaţia pentru testarea in vivo: analiza valorii probante a datelor existente din teste anterioare, inclusiv a rezultatelor strategiei de testare secvenţiale

descrierea datelor relevante disponibile din testele anterioare;

date derivate din fiecare etapă a strategiei de testare;

descrierea testelor in vitro efectuate, inclusiv detalii privind procedurile, rezultatele obţinute cu substanţele de testat/de referinţă;

descrierea studiului in vivo de iritaţie/coroziune dermică efectuat, inclusiv rezultatele obţinute;

analiza valorii probante a datelor pentru efectuarea studiului in vivo.

Substanţa de testat:

date de identificare (de exemplu, numărul CAS, sursă, puritate, impurităţi cunoscute, numărul lotului);

natura fizică şi proprietăţile fizico-chimice (de exemplu, pH, volatilitate, solubilitate, stabilitate, reactivitatea cu apă);

în cazul unui amestec, compoziţia şi procentajele relative ale componentelor;

dacă se utilizează anestezic local, identificare, puritate, doză şi potenţial de interacţiune cu substanţa de testat.

Vehicul:

identificare, concentraţie (dacă este cazul), volumul utilizat;

justificarea alegerii vehiculului.

Animale de experienţă:

specie/suşă utilizată, motivaţie pentru utilizarea altor animale decât iepurele albinos;

vârsta fiecărui animal la începutul studiului;

numărul de animale de fiecare sex participante la test şi în grupurile de control (dacă este cazul);

greutatea fiecărui animal la începutul şi la sfârşitul testului;

sursă, condiţii de adăpostire, hrănire etc.

Rezultate:

descrierea metodei utilizate pentru punctarea iritaţiei în fiecare moment de observaţie (de exemplu, lampă portabilă cu fantă, biomicroscop, fluoresceină);

un tabel cu datele privind reacţiile iritante/corozive la fiecare animal în fiecare moment de observare, până la excluderea din test a fiecărui animal;

o descriere narativă a gravităţii şi a naturii iritaţiei sau a coroziunii observate;

o descriere a oricăror alte leziuni observate la nivel ocular (de exemplu, vascularizare, formarea unui panus, aderenţe, colorare);

descrierea efectelor adverse locale non-oculare şi sistemice şi a concluziilor examenului histopatologic, dacă sunt disponibile.

Discutarea rezultatelor.

3.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR Extrapolarea rezultatelor studiilor de iritaţie oculară asupra animalelor la oameni este valabilă doar într-o măsură restrânsă. În multe cazuri, iepurele albinos este mai sensibil decât oamenii la substanţe cu proprietăţi iritante sau corozive la nivel ocular. La interpretarea datelor se acordă o atenţie specială excluderii iritaţiei generate de infecţii secundare.

4.1.2.3.4.5.6.6a.7.8.9.10.

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE Barratt, M. D., Castell, J. V., Chamberlain, M., Combes, R. D., Dearden, J. C., Fentem, J. H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K. G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K. C., Hill, R. N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164. Worth A. P. and Fentem J. H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177 Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26. Neun, D. J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Edsaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524. Metoda de testare B.40. Coroziunea cutanată. Metoda de testare B.4. Toxicitate acută: iritaţie/coroziune dermică. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tabelul 1 Punctarea leziunilor oculare

Cornee

Opacitate: nivel de densitate (examinarea se face în zona cea mai densă) Fără ulcerare sau opacitate … 0 Zone dispersate sau difuze de opacitate (altele decât o uşoară atenuare a strălucirii normale); detaliile irisului clar vizibile … 1 Zonă translucidă uşor perceptibilă; detaliile irisului uşor mascate … 2 Zonă sidefată: detaliile irisului invizibile; dimensiunea pupilei greu perceptibilă … 3 Cornee opacă; iris invizibil din cauza opacităţii … 4 Maximum posibil: 4

Iris

Normal … 0 Pliuri vizibil mai adânci, congestie, tumefiere, hiperhemie pericorneană moderată sau conjunctivă injectată; iris reactiv la lumină (o reacţie lentă este considerată a fi un efect) … 1 Hemoragie, distrugere marcată sau absenţa reacţiei la lumină … 2 Maximum posibil: 2

Conjunctive

Roşeaţă (se aplică conjunctivelor palpebrală şi oculară, exclusiv corneei şi irisului) Normal … 0 Hiperhemie evidentă a anumitor vase sanguine (ochi injectaţi) … 1 Coloraţie purpurie difuză; vasele individuale greu perceptibile … 2 Coloraţie roşie susţinută difuză … 3 Maximum posibil: 3

Chemosis

Tumefiere (se referă la pleoape şi/sau la membranele nictitante) Normal … 0 Tumefiere superioară stării normale … 1 Tumefiere evidentă, cu eversiunea parţială a pleoapelor … 2 Tumefiere cu pleoapele aproape pe jumătate închise … 3 Tumefiere cu pleoape mai mult decât jumătate închise … 4 Maximum posibil: 4

B.6. SENSIBILIZARE CUTANATĂ

B.6.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Observaţii Sensibilitatea şi capacitatea testelor de a detecta substanţele capabile să provoace o sensibilizare cutanată la om reprezintă criterii importante în sistemul de clasificare a toxicităţii din motive de sănătate publică. Nu există o metodă de testare unică care să permită identificarea adecvată a tuturor substanţelor cu un potenţial de sensibilizare cutanată la om şi care să fie aplicabilă tuturor substanţelor. Diverşi factori, cum ar fi proprietăţile fizice ale unei substanţe, inclusiv capacitatea sa de a penetra pielea, trebuie luaţi în considerare atunci când se alege metoda de testare. Au fost dezvoltate două tipuri de teste la care se folosesc cobai: pe de o parte, testele cu adjuvant la care starea alergică este potenţializată prin dizolvarea sau suspendarea substanţei testate în adjuvantul complet Freund (ADF) şi fără adjuvant, pe de altă parte. Testele cu folosirea adjuvantului au o capacitate mai bună de evidenţiere a potenţialul de sensibilizare cutanată a substanţei testate şi o mai mare precizie decât testele care nu utilizează adjuvantul complet Freund. Testul de maximizare la cobai (GPMT: Guinea Pig Maximisation Test) este un test cu adjuvant foarte răspândit. Cu toate că există mai multe metode pentru detectarea potenţialului de sensibilizare cutanată, testul GPMT este testul cu adjuvant folosit cu predilecţie. Testele fără adjuvant (testul Buehler este de preferat) sunt considerate a fi mai puţin sensibile în ceea ce priveşte numeroase clase de produse chimice. În unele cazuri există motive întemeiate în vederea alegerii testului Buehler, care constă într-o aplicare topică, pe când testul de maximizare necesită o injecţie intradermică. Utilizarea testului Buehler trebuie justificată din punct de vedere ştiinţific. Testul de maximizare la cobai GMPT şi testul Buehler sunt descrise în cadrul acestei metode. Se pot folosi şi alte metode, cu condiţia ca ele să fi fost validate în mod corespunzător, iar utilizarea lor să fie argumentată din punct de vedere ştiinţific. Dacă se obţine un rezultat pozitiv în cadrul unui test de depistare recunoscut, substanţa poate fi considerată ca potenţial sensibilizantă şi se poate să nu mai fie necesară efectuarea unui test suplimentar pe cobai. Cu toate acestea, dacă s-a obţinut un test negativ într-un asemenea test, trebuie efectuat un test pe cobai, utilizându-se procedura descrisă la prezenta metodă de testare. A se vedea şi introducerea generală, partea B.

1.2. DEFINIŢII Sensibilizarea cutanată (dermatita alergică de contact) reprezintă o reacţie imunologică cutanată la o substanţă. La om, reacţia se poate caracteriza prin apariţia pruritului, a unui eritem, al unui edem, a unor vezicule sau papule sau prin asocierea acestor manifestări. La alte specii, reacţia poate fi diferită şi se poate manifesta doar sub forma unor eriteme sau edeme. Expunere de inducţie: expunere experimentală a unui subiect la o substanţă cu scopul de a provoca o hipersensibilitate. Perioadă de inducţie: o perioadă de cel puţin o săptămână după expunerea de inducţie, în cursul căreia poate apărea o stare de hipersensibilitate. Expunere de declanşare: expunere experimentală, după o perioadă de inducţie, a unui subiect expus în prealabil substanţei respective, cu scopul de a verifica dacă subiectul va avea o reacţie hipersenzitivă.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Sensibilitatea şi fiabilitatea tehnicii de testare utilizate trebuie să fie verificate din şase în şase luni, cu ajutorul unor substanţe care au proprietăţi cunoscute de sensibilizare cutanată de la slab la moderat. La testele efectuate în mod corect, substanţele cu proprietăţi sensibilizante slabe sau moderate provoacă în mod normal o reacţie la cel puţin 30 % dintre animale, la metodele cu adjuvant şi la 15 % dintre ele, la metodele fără adjuvant. Se vor utiliza, de preferinţă, următoarele substanţe. Număr CAS Număr EINECS Denumire EINECS Denumire uzuală 101-86-0 202-983-3 α-hexilcinamaldehidă α-hexilcinamaldehidă 149-30-4 205-736-8 benzotiazol-2-tiol (mercaptobenzotiazol) kaptax 94-09-7 202-303-5 benzocaină nordcaină În unele cazuri justificate în mod suficient, se pot folosi şi alte substanţe martor, care să răspundă criteriilor de mai sus.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Iniţial animalele de experienţă sunt expuse substanţei testate printr-o injecţie intradermică şi/sau prin aplicare epidermică (expunere de inducţie). După o perioadă de odihnă de la 10 la 14 zile (perioada de inducţie) în cursul căreia se poate produce o reacţie imunitară, animalele sunt supuse unei doze de declanşare. Suprafaţa şi intensitatea reacţiei cutanate a animalelor se compară cu cele ale animalelor martor cărora li s-a administrat placebo cu ocazia inducerii şi care au fost supuse expunerii de declanşare.

1.5. DESCRIEREA METODELOR DE TESTARE Dacă se dovedeşte necesară eliminarea substanţei testate, acest lucru se va face utilizându-se apă sau un solvent adecvat, astfel încât să nu se modifice reacţia existentă sau integritatea epidermei.

1.5.

1.5.1. Testul de maximizare la cobai (GMPT)

1.5.1.

1.5.1.1. Pregătirea testului Exemplare tinere de cobai albinoşi, în stare bună de sănătate, se aclimatizează în condiţiile de laborator, cel puţin cu cinci zile înaintea începerii testului. Înainte de începerea testului, animalele sunt distribuite aleator în grupuri care urmează a fi tratate şi loturi martor. Blana va fi tunsă, rasă sau epilată chimic, în funcţie de metoda utilizată. Pielea animalelor nu trebuie să fie jupuită. Animalele sunt cântărite, atât înaintea începerii testului, precum şi după încheierea acestuia.

1.5.1.2. Condiţii de testare

1.5.1.2.

1.5.1.2.1. Animalele de experienţă Linii pure de cobai albinos folosite în mod curent în laboratoare.

1.5.1.2.2. Număr şi sex Se vor folosi animale de acelaşi sex, indiferent care este acesta. Dacă se vor folosi femele, acestea trebuie să fie nulipare şi nu trebuie să fie însărcinate. Se vor folosi minimum 10 animale în grupul tratat şi cel puţin 5 în lotul martor. Dacă grupul tratat constă din mai puţin de 20 de animale, iar lotul martor din mai puţin de 10 şi dacă în urma testului nu s-a putut conclude că substanţa testată este o substanţă sensibilizantă, se recomandă utilizarea şi a altor animale pentru a se ajunge la un număr total de cel puţin 20 de animale de experienţă şi 10 martor.

1.5.1.2.3. Doze Concentraţia de substanţă administrată la expunerea de inducţie trebuie să fie bine tolerată de organismul animalelor şi trebuie să corespundă concentraţiei maxime care provoacă o iritaţie cutanată uşoară şi moderată. Concentraţia folosită pentru expunerea de declanşare trebuie să corespundă concentraţiei maxime care nu provoacă nicio iritaţie. Dacă este necesar, concentraţiile adecvate pot fi determinate pe baza unui test-pilot pe două sau pe trei animale. În acest scop, se vor utiliza animale tratate cu adjuvantul complet Freund.

1.5.1.3. Procedură

1.5.1.3.

1.5.1.3.1. Inducerea Ziua 0 – grupul tratat Trei serii de injecţii intradermice de un volum de câte 0,1 ml fiecare se vor administra în regiunea scapulară de unde a fost îndepărtată blana, în prealabil, de o parte şi de cealaltă a liniei mediane. Injecţia 1: amestec 1:1 (v/v) adjuvant complet Freund/apă sau ser fiziologic Injecţia 2: substanţa testată într-un vehicul adecvat la concentraţia aleasă Injecţia 3: substanţa de testat la concentraţia dorită, amestec 1:1 (v/v) cu adjuvantul complet Freund sau cu ser fiziologic La injecţia 3, substanţele solubile în apă sunt dizolvate în faza apoasă înainte de a fi amestecate cu adjuvantul complet Freund sau cu serul fiziologic. Substanţele liposolubile sau insolubile sunt mai întâi suspendate în adjuvantul complet Freund şi mai apoi în faza apoasă. Concentraţia finală a substanţei testate trebuie să fie egală cu cea utilizată la injecţia 2. Injecţiile 1 şi 2 sunt administrate aproape una de cealaltă şi cât mai aproape de cap, iar injecţia 3 va fi administrată spre partea caudală a zonei de testare. Ziua 0 – lotul martor Trei serii de câte două injecţii intradermice cu un volum de câte 0,1 ml fiecare se vor administra în aceeaşi regiune ca la animalele tratate. Injecţia 1: amestec 1:1 (v/v) adjuvant complet Freund/apă sau ser fiziologic Injecţia 2: vehiculul nediluat Injecţia 3: formulă de 50 % a vehiculului într-un amestec 1:1 (v/v) adjuvantul complet Freund/apă sau cu ser fiziologic Ziua 5-7 – grupul tratat, lotul martor Aproximativ cu 24 de ore înainte de aplicarea topică de inducţie şi în cazul în care substanţa nu a provocat iritaţii cutanate, zona de testare rasă şi/sau tunsă va fi tratată cu 0,5 ml de sulfat de lauril de sodiu în concentraţie de 10 % în vaselină, astfel încât să se provoace o iritaţie locală. Ziua 6-8 – grupul tratat De pe zona de testare se îndepărtează din nou blana. O bucată de hârtie de filtru (2 × 4 cm) îmbibată cu substanţa testată şi cu vehiculul adecvat se aplică pe zona de testare şi se menţine în contact cu pielea cu ajutorul unui pansament oclusiv, timp de 48 de ore. Alegerea vehiculului trebuie justificată. Substanţele solide sunt pulverizate şi incorporate într-un vehicul adecvat; eventual, substanţele lichide pot fi aplicate direct. Ziua 6-8 – lotul martor De pe zona de testare se îndepărtează din nou blana. Se aplică doar vehiculul pe zona de testare, după indicaţiile de mai sus şi se menţine în contact cu pielea cu ajutorul unui pansament oclusiv, timp de 48 de ore.

1.5.1.3.2. Declanşare Ziua 20-22 – grupul tratat şi lotul martor Se îndepărtează blana de pe şoldurile animalelor tratate şi de pe şoldurile animalelor martor. Un plasture sau o capsulă îmbibate cu substanţa testată se aplică pe unul dintre şoldurile animalelor şi dacă este necesar, un plasture sau o capsulă îmbibate doar cu vehicul se aplică pe celălalt şold. Plasturele se vor menţine în contact cu pielea timp de 24 de ore cu ajutorul unui pansament oclusiv.

Examinare şi cotare: grupul tratat şi lotul martor

Se recomandă o citire oarbă a animalelor din ambele grupuri. Dacă este necesară precizarea rezultatelor obţinute cu ocazia primei expuneri de declanşare, o a doua expunere în vederea declanşării unei reacţii (și anume o redeclanşare), eventual cu un alt lot martor, poate fi avută în vedere, aproximativ cu o săptămână după prima expunere. Noua expunere în vederea declanşării unei reacţii se poate efectua, de asemenea, pe lotul martor iniţial. Toate observaţiile şi toate reacţiile cutanate, inclusiv cele sistemice, ca urmare a unei expuneri de inducţie sau de declanşare trebuie examinate şi cotate pe baza scalei Magnusson/Kligman (a se vedea apendicele). Alte tehnici, cum ar fi examinarea histopatologică sau măsurarea pliului cutanat, pot fi folosite la descrierea unor reacţii îndoielnice.

la aproximativ 21 de ore după înlăturarea plasturelui, zona de testare se curăţă şi se rade şi/sau se tunde şi se epilează dacă este necesar;

aproximativ 3 ore mai târziu (aproximativ la 48 de ore după începutul aplicării dozei de declanşare), reacţia cutanată este examinată şi cotată pe baza scalei indicate în apendice;

aproximativ 24 de ore după această examinare, urmează o nouă perioadă de examinare (la 72 ore) şi o nouă cotare.

1.5.2. Testul Buehler

1.5.2.

1.5.2.1. Pregătirea testului Exemplare tinere de cobai albinoşi, în stare bună de sănătate, sunt lăsaţi să se aclimatizeze la condiţiile de laborator cel puţin cu cinci zile înaintea începerii testului. Înainte de începerea testului, animalele sunt distribuite aleator în grupuri care urmează a fi tratate şi grupuri martor. Blana va fi tunsă, rasă sau epilată chimic, în funcţie de metoda utilizată. Pielea animalelor nu trebuie să fie jupuită. Animalele sunt cântărite atât înainte de începerea testului, precum şi după încheierea acestuia.

1.5.2.2. Condiţii de testare

1.5.2.2.

1.5.2.2.1. Animalele de experienţă Linii pure de cobai albinos folosite în mod curent în laboratoare.

1.5.2.2.2. Număr şi sex Se vor folosi animale de acelaşi sex, indiferent care este acesta. Dacă se vor folosi femele, acestea trebuie să fie nulipare şi nu trebuie să fie însărcinate. Se vor folosi minimum 20 animale în grupul tratat şi cel puţin 10 în lotul martor.

1.5.2.2.3. Doze Concentraţia de substanţă administrată la expunerea de inducţie trebuie să corespundă concentraţiei maxime care provoacă o iritaţie cutanată moderată, dar nu exagerată. Concentraţia folosită pentru expunerea de declanşare trebuie să corespundă concentraţiei maxime care nu provoacă nicio iritaţie. Dacă este necesar, concentraţiile potrivite pot fi determinate pe baza unui test-pilot pe două sau pe trei animale. La substanţele hidrosolubile se va folosi apa ca vehicul sau o soluţie diluată neiritantă de surfactant. La celelalte substanţe, se va utiliza de preferinţă un amestec de etanol de 80 % în apă, la inducere şi de acetonă la declanşare.

1.5.2.3. Procedură

1.5.2.3.

1.5.2.3.1. Inducerea Ziua 0 – grupul tratat Se îndepărtează blana de pe unul din şoldurile animalelor. Compresa care va servi la efectuarea testului se îmbibă cu substanţa testată, incorporată într-un vehicul adecvat (alegerea vehiculului trebuie justificată; dacă este necesar, substanţele lichide pot fi aplicate în mod direct). Compresa se aplică pe zona de testare şi se menţine în contact cu pielea timp de 6 ore cu ajutorul unui plasture oclusiv sau al unei capsule şi al unui pansament potrivit. Sistemul trebuie să fie oclusiv. Un tampon de vată circular sau pătrat de 4-6 cm2 este potrivit. Se va utiliza de preferinţă un dispozitiv de asigurare a etanşeităţii plasturelui pentru a asigura caracterul oclusiv. Dacă au fost folosite pansamente, o expunere suplimentară poate fi necesară. Ziua 0 – lotul martor Se îndepărtează blana de pe unul din şoldurile animalelor. Se aplică doar vehiculul pe zona de testare, după indicaţiile de mai sus, la animalele tratate. Compresa care serveşte la realizarea testului se menţine în contact cu pielea cu ajutorul unui plasture oclusiv sau al unei capsule şi al unui pansament potrivit. Dacă se poate demonstra faptul că simularea tratamentului pe lotul martor nu este necesară, această etapă poate fi omisă, utilizându-se un lot martor căruia nu i se administrează nimic. Zilele 6-8 şi 13-15 – grupul tratat şi lotul martor Acelaşi tratament ca cel descris pentru ziua 0 se aplică pe aceeaşi zonă de testare (de unde se îndepărtează blana, dacă acest lucru este necesar), pe acelaşi şold, în ziua 6-8 şi din nou în ziua 13-15.

1.5.2.3.2. Declanşare Ziua 27-29 – grupul tratat şi lotul martor Se îndepărtează blana de pe şoldurile netratate ale animalelor tratate şi ale animalelor martor. Un plasture oclusiv sau o capsulă care conţine cantitatea adecvată din substanţa testată, la concentraţia maximă care nu provoacă nicio iritaţie, se aplică pe partea posterioară a şoldului netratat al animalelor din grupul tratat şi din cel martor. Dacă este necesar, se aplică şi un plasture oclusiv sau o capsulă care nu conţine decât vehiculul, pe partea anterioară a şoldului netratat al animalelor din ambele grupuri. Plasturele sau capsulele se vor menţine în contact cu pielea timp de 6 de ore, cu ajutorul unui pansament potrivit.

1.5.2.3.3. Examinare şi cotare Se recomandă o citire oarbă a reacţiilor, atât în grupul tratat, precum şi în lotul martor. Dacă este necesară precizarea rezultatelor obţinute cu ocazia primei expuneri de declanşare, o a doua expunere în vederea declanşării unei reacţii, eventual cu un alt lot martor, poate fi avută în vedere, aproximativ cu o săptămână după prima expunere. Noua expunere în vederea declanşării unei reacţii se poate efectua, de asemenea, pe primul lot martor. Toate reacţiile cutanate şi toate reacţiile neobişnuite, inclusiv reacţiile sistemice, ca urmare a unei expuneri de inducţie sau de declanşare (de redeclanşare) trebuie înregistrate şi cotate pe baza scalei Magnusson/Kligman (a se vedea apendicele). Alte tehnici, cum ar fi examinarea histopatologică sau măsurarea pliului cutanat, pot fi folosite la descrierea unor reacţii îndoielnice.

la aproximativ 21 de ore după înlăturarea plasturelui, de pe zona de testare se îndepărtează blana;

cu aproximativ 3 ore mai târziu (aproximativ 30 de ore după începutul aplicării dozei de declanşare), reacţia cutanată este examinată şi cotată pe baza scalei indicate în apendice;

la aproximativ 24 de ore după această examinare (aproximativ 54 de ore după aplicarea dozei de declanşare), reacţia cutanată este din nou examinată şi cotată.

2. DATE (GMPT şi testul Buehler) Rezultatele sunt sintetizate şi incluse într-un tabel care va indica reacţiile cutanate la fiecare animal, pentru fiecare examinare.

3. RAPORT (GMPT şi testul Buehler) Dacă înainte de testul efectuat pe cobai s-a efectuat şi un test de depistare [de exemplu, testul de umflare a urechilor la şoareci (MEST)], trebuie furnizate descrierile sau referinţele acestora, precum şi detaliile modului de operare şi rezultatele obţinute cu substanţa testată şi cu substanţa de referinţă.

3. Raportul de testare (GMPT sau testul Buehler)

Raportul de testare va conţine, în măsura posibilităţilor, următoarele informaţii:

Animale de experienţă:

specia/linia pură;

numărul animalelor, vârsta, sexul;

originea, condiţii de adăpostire, regim alimentar etc.;

greutatea corporală a fiecărui animal la începutul testului.

Condiţii de testare:

tehnici de preparare a zonei de testare;

detalii asupra materialelor folosite pentru aplicarea substanţei şi tehnica aplicării plasturelui;

rezultatele testului-pilot şi concluziile privind concentraţiile de inducţie şi de declanşare care trebuie utilizate în cadrul testului;

detalii privind prepararea, aplicarea şi eliminarea substanţei testate;

justificarea alegerii vehiculului;

concentraţii ale vehiculului şi ale substanţei testate utilizate pentru expunerile de inducţie şi de declanşare, cantitatea totală a substanţei aplicate în vederea inducerii şi a declanşării.

Rezultate:

sintetizarea rezultatelor ultimului control de sensibilitate şi de fiabilitate (a se vedea 1.3), inclusiv informaţii cu privire la substanţă, la concentraţia acesteia şi la vehiculul utilizat;

toate examinările efectuate pe fiecare animal, inclusiv cotările;

descrierea naturii şi a gravităţii efectelor observate;

toate examinările histopatologice.

Evaluarea rezultatelor.

Concluzii.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE Această metodă corespunde Orientării 406 a OCDE.

B.7. TOXICITATE (ORALĂ) PRIN ADMINISTRARE ÎN MOD REPETAT (28 DE ZILE)

B.7.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE A se vedea şi introducerea generală, partea B.

1.2. DEFINIŢII A se vedea şi introducerea generală, partea B.

1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Substanţa testată va fi administrată zilnic, pe cale orală, cu doze crescânde, la mai multe grupuri de animale de experienţă, cu un singur nivel de doză pe grup de animale timp de 28 de zile. Pe perioada administrării, animalele sunt examinate cu atenţie zilnic, în vederea detectării eventualelor manifestări toxice. Animalele care au murit sau care au fost sacrificate în cursul testului, precum şi cele care supravieţuiesc până la sfârşitul testului, se supun unei autopsii. Această metodă insistă mai ales pe efectele neurologice; examinările clinice trebuie efectuate în mod riguros, pentru a se obţine un maximum de informaţii posibil. Metoda are în vedere identificarea produselor chimice cu un potenţial neurotoxic, care ar trebui supus unor studii mai aprofundate. Pe lângă aceasta, metoda prezentată mai poate furniza indicaţii asupra efectelor imune şi asupra toxicităţii substanţei cu privire la organele reproducătoare.

1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.4.

1.4.1. Pregătirea testului Exemplare tinere de animale adulte, cu stare bună de sănătate, sunt distribuite aleator în grupuri care urmează a fi tratate şi în loturi martor. Cuştile sunt distribuite astfel încât să se minimizeze eventualele efecte datorate amplasării cuştilor. Animalele sunt identificate individual şi ţinute în cuşti timp de cel puţin cinci zile înainte de începerea testului, pentru a se putea adapta la condiţiile de laborator. Substanţa se va administra prin gavaj sau prin hrană/apa de băut. Metoda administrării orale depinde de scopul studiului şi de proprietăţile fizice şi chimice ale substanţei. Dacă este necesar, substanţa de test se va dizolva sau suspenda într-un vehicul adecvat. Dacă este posibil se va folosi de preferinţă o soluţie/suspensie apoasă, dacă nu este posibil, se va recurge la o soluţie/emulsie în ulei (de exemplu, ulei de porumb) sau eventual la alte vehicule. Dacă vehiculul utilizat nu este mediul apos, caracteristicile sale toxice trebuie să fie cunoscute sau să fie determinate înainte de începerea testului. Trebuie determinată şi stabilitatea substanţei testate în vehiculul respectiv.

1.4.2. Condiţii de testare

1.4.2.

1.4.2.1. Animalele de experienţă Testele se efectuează de preferinţă pe şobolani, dar pot fi utilizate şi alte specii de rozătoare. Pentru testare sunt selecţionate animale adulte, tinere şi sănătoase din linii pure folosite în mod curent în laboratoare. Femelele trebuie să fie nulipare şi nu trebuie să fie însărcinate. Administrarea substanţei trebuie să înceapă cât se poate de repede după înţărcare şi în toate cazurile înainte ca animalele să fi împlinit vârsta de 9 săptămâni. La începutul studiului, diferenţele de greutate corporală între animale trebuie să fie minime şi să nu depăşească ± 20 % a greutăţii medii la fiecare sex. Atunci când se efectuează un studiu prin administrare orală repetată înaintea unui studiu mai lung, se recomandă folosirea animalelor de aceeaşi linie pură şi origine la ambele studii.

1.4.2.2. Număr şi sex Se vor folosi minimum 10 animale (5 femele şi 5 masculi) pentru fiecare doză. Dacă protocolul testului prevede sacrificii în cursul studiului, numărul de animale trebuit mărit cu numărul de animale care sunt sacrificate. Pe lângă aceasta, un grup satelit de 10 animale (cinci din fiecare sex) poate fi tratat cu doza cea mai ridicată timp de 28 de zile şi ţinut sub observaţie timp de 14 zile după încheierea tratamentului pentru a se studia reversibilitatea, persistenţa sau apariţia întârziată a efectelor toxice. Se va utiliza şi un grup satelit martor, de 10 animale.

1.4.2.3. Doze În general, se vor utiliza cel puţin trei grupuri tratate şi un lot martor. Cu excepţia substanţei de testat, animalele din lotul martor au parte de acelaşi tratament ca animalele din grupurile tratate. Dacă s-a folosit un vehicul la administrarea substanţei de testat, volumul maxim din acest vehicul va fi administrat grupului martor. Dacă în urma evaluării unor date se poate estima că administrarea unei doze de 1000 mg/kg greutate corporală/zi nu va avea niciun efect, se poate efectua un test-limită. Dacă nu există informaţii relevante, se poate proceda la un studiu de explorare în vederea determinării dozelor de administrat. Dozele trebuie selecţionate ţinându-se cont de toate informaţiile disponibile şi de aspectele toxico-cinetice ale substanţei testate sau ale substanţelor cu o structură analoagă. Doza cea mai ridicată va produce efecte toxice care să nu ducă însă la moarte sau la suferinţe intense. Se va alege mai apoi o serie de doze descrescânde, pentru a se evidenţia relaţia dintre reacţie şi doza administrată şi pentru a obiectiviza absenţa efectelor dăunătoare la doza cea mai redusă (doza fără efecte dăunătoare). Diferenţa optimă dintre două doze este un factor 2 sau 4; este preferabil să se prevadă şi o a patra doză, pentru ca distanţa dintre două doze să nu fie prea mare (mai mult decât un factor 10, de exemplu). La substanţele care sunt administrate prin hrană sau prin apă, este important să se verifice dacă cantităţile de substanţă nu interferează cu nutriţia normală şi cu echilibrul hidric. Dacă substanţa este administrată prin intermediul hranei, se poate utiliza o concentraţie alimentară constantă (ppm) sau o doză constantă în raport cu greutatea animalului; soluţia aleasă trebuie precizată. Dacă substanţa va fi administrată prin gavaj, doza trebuie administrată zilnic la ore fixe şi dacă este nevoie, se va şi ajusta doza, astfel încât aceasta să rămână constantă în raport cu greutatea animalului. Atunci când se efectuează un studiu prin administrare orală repetată înainte de un studiu pe lungă durată, regimul alimentar trebuie să fie indicat în ambele cazuri.

1.4.2.4. Testul-limită Atunci când un test efectuat pe baza metodelor descrise în prezentul studiu, la o doză de cel puţin 1000 mg/kilocorp/zi sau în cazul administrării prin hrană sau prin apa de băut, la o concentraţie echivalentă (în funcţie de greutatea corporală), nu produce efecte toxice detectabile şi dacă informaţiile despre substanţe cu structuri asemănătoare nu indică toxicitatea acesteia, efectuarea testului cu trei doze se poate dovedi a fi inutilă. În acest caz, un test-limită este justificat, cu excepţia cazului în care condiţiile de expunere umană impun utilizarea unei doze mai ridicate.

1.4.2.5. Perioada de observaţie Perioada de observaţie durează 28 de zile. Animalele din grupurile satelit, prevăzute pentru examinări suplimentare sunt ţinute sub observaţie, fără tratament timp de alte 14 zile cel puţin, astfel încât să se poată detecta eventualele apariţii întârziate ale efectelor toxice, persistenţa, precum şi reversibilitatea acestora.

1.4.3. Procedură Substanţa testată va fi administrată animalelor de experienţă, timp de 7 zile din 7, pe o perioadă de 28 de zile. Dacă substanţa nu este administrată decât câte cinci zile pe săptămână, această alegere trebuie justificată. În cazul administrării prin gavaj, doza trebuie administrată într-o singură doză cu ajutorul unei sonde esofagiene sau al unei canule de intubare adecvate. Volumul maxim de lichid care se poate administrat într-o singură doză depinde de mărimea animalului. Acest volum nu trebuie să depăşească 1 ml/100 g greutate corporală, dar poate atinge 2 ml/100 g greutate corporală în cazul soluţiilor apoase. Cu excepţia substanţelor iritante sau cu efecte corozive, la care mărirea concentraţiei ar duce la rezultate exacerbate, variabilitatea volumelor experimentale trebuie minimizată printr-o ajustare a concentraţiilor, astfel încât volumul să rămână constant, indiferent de doză.

1.4.3.

1.4.3.1. Observaţii generale Observaţia clinică generală trebuie efectuată cel puţin o dată zilnic, de preferinţă în acelaşi moment (sau aceleaşi momente) ale zilei, în funcţie de perioada de după încheierea administrării în care efectele sunt mai pronunţate. Starea de sănătate a animalelor trebuie consemnată. Animalele sunt examinate cel puţin de două ori pe zi, toate animalele sunt examinate pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea. Animalele muribunde sau cele care prezintă semne de suferinţă intensă sau dureri sunt eliminate imediat, sacrificate cu suferinţă minimă şi autopsiate. Toate animalele sunt supuse unei observaţii clinice detaliate înaintea primei expuneri (astfel încât mai târziu să se poată facă comparaţii între diferitele stări de sănătate la acelaşi individ) şi cel puţin o dată pe săptămână în perioada următoare. Aceste examinări trebuie efectuate în afara cuştii animalelor într-o incintă standard şi trebuie efectuate de preferinţă de fiecare dată în acelaşi moment al zilei. Observaţiile sunt înregistrate în mod riguros, de preferinţă cu ajutorul unor sisteme de notare formulate în mod explicit de către laboratorul în care se efectuează testul. Variabilitatea condiţiilor de laborator trebuie redusă la minim, iar examinările trebuie să se facă de preferinţă de către persoane care nu sunt informate asupra tratamentului. Examinările vor avea în vedere între altele modificări ale pielii, ale ochilor, ale mucoaselor, ale secreţiilor şi ale excreţiilor, precum şi activitatea autonomă (de exemplu, lăcrimare, piloerecţie, respiraţie neobişnuită). Se vor nota, de asemenea, toate modificările de comportament, modificări ale posturii sau ale reacţiilor la manipulare, precum şi apariţia unor mişcări clonice sau tonice, a unor comportamente stereotipe (de exemplu, curăţare excesivă, mişcări circulare repetate), precum şi orice alt comportament bizar (automutilare, mers înapoi). În cursul celei de-a patra săptămâni de expunere, se evaluează reacţia la diferiţi stimuli senzoriali (auditivi, vizuali şi proprioceptivi), precum şi prehensiunea şi activitatea locomotorie. Metodele de adoptat în acest scop sunt detaliate în publicaţiile de specialitate (a se vedea introducerea generală, partea B). Observaţiile funcţionale din a patra săptămână de expunere pot fi omise dacă studiul este efectuat înaintea unui studiu subcronic (de 90 de zile). În acest caz observaţiile funcţionale trebuie să facă parte din studiul complementar. În schimb, dacă există informaţii pe baza unor observaţii funcţionale efectuate în cadrul unor studii anterioare prin administrarea în mod repetat, acest lucru poate facilita alegerea dozelor la studiul subcronic suplimentar. În mod excepţional, observaţiile funcţionale pot fi, de asemenea, omise la grupurile de animale care prezintă manifestări toxice care ar putea compromite rezultatul observaţiilor funcţionale.

1.4.3.2. Greutatea corporală şi consumul de hrană şi apă Toate animalele sunt cântărite cel puţin o dată pe săptămână. Consumul de alimente şi de apă trebuie măsurat cel puţin o dată pe săptămână. Dacă substanţa este administrată prin apa de băut, consumul de apă trebuie măsurat cel puţin o dată pe săptămână.

1.4.3.3. Hematologie Următoarele examinări histopatologice trebuie efectuate la sfârşitul perioadei de testare: hematocritul, concentraţia de hemoglobină, numărul de hematii şi de leucocite şi formula leucocitară, numărul de trombocite şi timpul/potenţialul de coagulare. Probele de sânge trebuie prelevate într-un punct determinat, chiar înainte sau în timpul sacrificării animalului şi trebuie conservate în condiţii adecvate.

1.4.3.4. Biochimie clinică Trebuie efectuate măsurări biochimice clinice în vederea stabilirii principalelor efecte toxice asupra ţesuturilor, în special asupra ficatului şi asupra rinichilor, pe baza unor probe de sânge prelevate de la toate animalele chiar înainte sau în timpul sacrificării lor (cu excepţia animalelor muribunde sau sacrificate în cursul testului). Se recomandă flămânzirea animalelor peste noapte. Aceste determinări efectuate în ser se fac cu privire la sodiu, la potasiu, la glucoză, la colesterolul total, la uree, la creatinină, la proteine totale şi la albumină sau cel puţin cu privire la două enzime revelatoare ale efectelor hepatocelulare (cum ar fi alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, fosfataza alcalină, gamma glutamil transpeptidaza şi sorbitol dezhidrogenaza). În unele cazuri, atât determinarea celorlalte enzime (de origine hepatică sau alta), precum şi acizii biliari pot furniza informaţii utile. Eventual, se pot efectua analize de urină în cursul ultimei săptămâni a studiului, cu colectarea într-un interval de timp a unui volum de urină, analiză care să includă examinarea aspectului, volumului, a osmolarităţii sau densităţii, a pH-ului, a proteinelor, a glucozei, a sângelui sau a celulelor sangvine. De asemenea, trebuie avute în vedere studii asupra markerilor serici la leziunile tisulare. Celelalte măsurări necesare eventual, în cazurile în care proprietăţile substanţei testate sunt susceptibile de a modifica profilul metabolic, se vor axa asupra calciului, fosfatului, asupra trigliceridelor măsurate după post, asupra hormonilor specifici, asupra metahemoglobinei şi asupra colinesterazei. Aceste analize trebuie efectuate în mod sistematic în cazul substanţelor care aparţin anumitor clase şi, după caz, la celelalte substanţe. În ansamblu, demersul care va fi adoptat va fi suplu şi adaptabil în funcţie de specia utilizată şi de efectele observate şi/sau previzibile ale substanţei testate. Dacă informaţiile de bază colectate anterior nu sunt suficiente, parametri hematologici şi biochimici ar trebui să fie determinaţi înaintea începerii testului.

1.4.3.5. Autopsia Toate animalele care participă la studiu trebuie supuse unei autopsii detaliate, care să includă o examinare aprofundată a suprafeţei externe a corpului, a tuturor orificiilor, a cavităţii craniene, toracice şi abdominale şi a conţinutului acestora. De pe ficatul, rinichii, glandele suprarenale, testiculele, epidimidele, timusul, splina, creierul şi inima tuturor animalelor se vor înlătura toate ţesuturile superficiale, după care aceste organe sunt cântărite cât se poate de repede în vederea evitării deshidratării lor. După aceasta, ţesuturile sunt conservate în mediul de fixare cel mai adecvat în funcţie de tipul ţesutului şi de examinările histopatologice prevăzute: toate ţesuturile care prezintă leziuni macroscopice, encefalul (regiuni reprezentative: creierul mare, cerebelul şi protuberanţa anulară), măduva spinării, stomacul, intestinul gros, intestinul subţire (inclusiv plăcile Pleyer), ficatul, rinichii, glandele suprarenale, splina, inima, timusul, tiroida, traheea şi plămânii (conservaţi prin fixare şi imersie), gonadele, organele genitale anexe (de exemplu, uterul şi prostata), vezica, ganglionii limfatici (de preferinţă un ganglion de pe traseul căii de administrare a substanţei şi un altul mai îndepărtat, pentru a se evidenţia efectele sistemice), nervii periferici (sciaţi sau tibiali), de preferinţă foarte aproape de muşchi, şi o secţiune de măduvă osoasă (sau aspirat de măduvă osoasă proaspăt fixat pe lamă). În funcţie de observaţiile clinice şi de celelalte rezultate, se poate dovedi necesară examinarea celorlalte ţesuturi. Toate organele considerate a fi organe-ţintă potenţiale pe baza proprietăţilor substanţei trebuie conservate şi ele.

1.4.3.6. Examinarea histopatologică Se efectuează o examinare histopatologică completă a organelor şi ţesuturilor conservate, la toate animalele, atât cele din grupul testat, cărora li s-a administrat doza cea mai ridicată, precum şi la cele din lotul martor. Acest examen va fi efectuat la toate grupurile expuse la doze inferioare, dacă sunt observate modificări provocate de substanţa testată la animalele din grupul tratat la doza cea mai înaltă. Toate leziunile macroscopice trebuie să fie examinate. Atunci când se foloseşte un grup satelit, se efectuează o examinare histopatologică şi la animalele din acest grup, pe organele şi ţesuturile pe care au fost observate efecte toxice la grupul tratat.

2. DATE Datele sunt indicate pentru fiecare animal individual. Pe lângă aceasta, datele sunt incluse într-un tabel care va indica la fiecare grup experimental numărul de animale utilizate, numărul de animale care au murit în cursul testului sau care au fost sacrificate din motive umanitare, momentul morţii fiecărui animal, numărul de animale care prezintă manifestări toxice, descrierea acestor manifestări, momentul apariţiei, durata şi gravitatea lor, numărul de animale care prezintă leziuni, tipurile de leziuni şi procentajul de animale care prezintă un anumit tip de leziuni. Dacă este posibil, datele cifrice sunt evaluate cu ajutorul unei metode statistice adecvate şi recunoscute. Metoda statistică va fi aleasă cu ocazia elaborării studiului.

3. RAPORT

3. Raportul de testare

Raportul de testare va conţine, în măsura posibilităţilor, următoarele informaţii:

Animale de experienţă:

specia/linia pură utilizată;

numărul animalelor, vârsta, sexul;

originea, condiţii de adăpostire, regim alimentar etc.;

greutatea corporală a fiecărui animal la începutul testului, la intervale de o săptămână în timpul testului şi la sfârşitul acestuia

Condiţii de testare:

justificarea alegerii vehiculului, altul decât apa;

justificarea alegerii nivelului dozei administrate;

detalii cu privire la formula/prepararea substanţei, la concentraţia obţinută, la stabilitatea şi la omogenitatea preparatului;

detalii cu privire la administrarea substanţei;

după caz, conversia concentraţiei substanţei administrate prin raţia alimentară/apa de băut (ppm) în doză efectivă (mg/kg greutate corporală/zi);

detalii asupra calităţii hranei şi a apei.

Rezultate:

greutate corporală/modificări ale acesteia;

consumul de alimente şi, după caz, consumul de apă;

reacţie toxică pe sexe şi pe doză, inclusiv manifestări toxice;

natura, gravitatea şi durata efectelor clinice observate (eventual, reversibilitatea acestora);

evaluarea activităţii senzoriale, a prehensiunii şi a activităţii locomotorii;

examene hematologice şi valori de referinţă aplicabile;

examene de biochimie clinică şi valori de referinţă aplicabile;

greutate corporală în momentul sacrificării animalului şi greutatea organelor;

rezultatele autopsiei;

descriere detaliată a tuturor rezultatelor histopatologice;

informaţii referitoare la absorbţie, dacă există;

prelucrare statistică a rezultatelor, după caz.

Discutarea rezultatelor.

Concluzii.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE Această metodă corespunde Orientării 407 a OCDE.

B.8. TOXICITATE LA DOZĂ REPETATĂ (28 DE ZILE) (ADMINISTRARE PRIN INHALARE)

B.8.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE Este util să se colecteze informaţii preliminare asupra substanţei cu privire la mărimea şi distribuţia particulelor, presiunea vaporilor, punctul de topire, punctul de fierbere, punctul de aprindere şi proprietăţile explozive (după caz). A se vedea introducerea generală partea B (litera A).

1.2. DEFINIŢIE A se vedea introducerea generală partea B (litera B).

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Se expun zilnic mai multe grupe de animale, pe parcursul unei perioade determinate, la o substanţă de testat în concentraţii crescătoare, fiind administrată o doză pe lot timp de 28 de zile. În cazul în care se foloseşte un vehicul în vederea obţinerii unei concentraţii adecvate a substanţei de testat în atmosferă, se prevede un lot martor pentru vehicul. Pe parcursul perioadei de administrare, se observă zilnic animalele pentru a pune în evidenţă simptomele de toxicitate. Animalele care mor în timpul testului, precum şi cele care supravieţuiesc la sfârşitul testului sunt supuse autopsiei.

1.5. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6.

1.6.1. Pregătiri Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează la întâmplare în numărul de loturi necesare. La nevoie, se poate adăuga la substanţa de testat un vehicul adecvat în vederea obţinerii unei concentraţii corespunzătoare în atmosferă. Dacă, pentru a uşura administrarea, se foloseşte un vehicul sau alt tip de aditiv, acesta trebuie să nu producă efecte toxice. Pot fi folosite date istorice, dacă este necesar.

1.6.2. Condiţii de testare

1.6.2.

1.6.2.1. Animale de experienţă Cu excepţia contraindicaţiilor, se preferă şobolanul. Se folosesc animale tinere, sănătoase, aparţinând unei linii de laborator obişnuite. La începutul testului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie respectivă.

1.6.2.2. Număr şi sex Se folosesc cel puţin 10 animale (5 femele şi 5 masculi) pentru fiecare lot tratat. Femelele trebuie să fie nulipare şi negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul testului, acest număr se adaugă la total. În plus, se poate trata un lot satelit de 10 animale (5 din fiecare sex) la doza maximă timp de 28 de zile, care poate fi supus observaţiei vizând reversibilitatea, persistenţa sau apariţia tardivă a efectelor toxice pe parcursul celor 14 zile care urmează tratamentului. Se foloseşte, de asemenea, un lot satelit cu 10 animale martor (5 de fiecare sex).

1.6.2.3. Concentraţii de expunere Cel puţin trei concentraţii sunt necesare, precum şi un lot martor sau, dacă este cazul, un lot martor pentru vehicul (corespunzând concentraţiei vehiculului la nivelul de expunere cel mai ridicat). Cu excepţia inhalării substanţei de testat, se tratează animalele din lotul martor la fel cu cele din grupul de experiment. Concentraţia maximă produce efecte toxice, dar nu provoacă sau provoacă rar moartea. Concentraţia minimă nu trebuie să provoace niciun efect toxic. Dacă există informaţii privind expunerea umană, concentraţia cea mai mică trebuie să fie superioară acestei valori. În condiţii ideale, concentraţia medie trebuie să producă minime efecte toxice observabile. Dacă se folosesc mai multe concentraţii intermediare, acestea se administrează eşalonat, astfel încât să provoace o gradare a efectelor toxice. În loturile care corespund concentraţiilor slabe şi intermediare, precum şi în lotul martor incidenţa mortalităţii trebuie să fie mică, pentru a permite o evaluare semnificativă a rezultatelor.

1.6.2.4. Durata expunerii Durata expunerii zilnice este de 6 ore, dar în cazul unor cerinţe specifice pot fi necesare alte durate de expunere.

1.6.2.5. Aparatură Animalele se expun la substanţa de testat cu ajutorul unui dispozitiv de inhalare conceput pentru a asigura un flux continuu sau cel puţin 12 aerisiri pe oră, garantând un conţinut de oxigen adecvat şi o distribuţie uniformă a produsului de testat în aer. Dacă se foloseşte o incintă, aceasta trebuie concepută astfel încât să reducă la minim aglomerarea animalelor de experiment şi să le asigure o expunere maximă, prin inhalare, a substanţei de testat. De regulă, pentru a se asigura stabilitatea atmosferei din incintă, volumul total al animalelor nu trebuie să depăşească 5 % din volumul incintei. Se mai pot folosi expuneri oro-nazale, numai ale capului sau ale întregului corp, în incinte individuale; primele două tipuri de expunere limitează absorbţia pe alte căi a substanţei de testat.

1.6.2.6. Perioada de observaţie Se observă toate animalele zilnic în vederea notării simptomelor de toxicitate, pe tot parcursul perioadei de tratare şi de recuperare. Se consemnează momentul morţii şi momentul când apar şi dispar simptomele de toxicitate.

1.6.3. Mod de operare Se expun zilnic animalele la substanţa de testat timp de 5-7 zile pe săptămână, pe o perioadă de 28 de zile. Animale aparţinând loturilor satelit prevăzute pentru observaţii ulterioare se ţin sub observaţie încă 14 zile, fără tratament, pentru a se studia vindecarea sau persistenţa efectelor toxice. Temperatura la care are loc testul se menţine la 22 ± 3 oC. În condiţii optime, umiditatea relativă se menţine între 30 şi 70 % dar, în anumite cazuri, acest lucru poate fi imposibil (de exemplu, în cazul testelor asupra aerosolilor). Menţinerea unei presiuni uşor negative în incintă (≤ 5 mm coloană de apă) împiedică împrăştierea substanţei în zona învecinată. Pe parcursul perioadei de expunere, nu se administrează animalelor nici hrană, nici apă. Se recomandă folosirea unui sistem de inhalare dinamic, prevăzut cu un dispozitiv adecvat de control analitic al concentraţiei. Pentru determinarea concentraţiilor de expunere adecvate, se recomandă să se procedeze la un test preliminar. Se reglează debitul pentru a asigura concentraţii omogene în toată incinta. Sistemul trebuie să permită obţinerea unor condiţii de expunere stabile cât de rapid posibil. Se măsoară şi se controlează: În timpul expunerii şi după aceasta au loc observaţii care sunt înregistrate sistematic; pentru fiecare animal se consemnează date individuale. Se observă zilnic toate animalele şi se înregistrează simptomele de toxicitate, precum şi momentul apariţiei, intensitatea şi durata acestora. Observaţiile includ modificări ale părului şi ale blănii, ale ochilor şi ale mucoaselor, ale aparatului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom şi ale sistemului nervos central, precum şi ale activităţii somato-motrice şi ale comportamentului. Se determină săptămânal greutatea animalelor. Se recomandă, de asemenea, măsurarea săptămânală a consumului alimentar. Animalele sunt observate cu regularitate, pentru a evita pe cât posibil pierderea lor din motive exterioare experimentului, precum: canibalism, autoliză a ţesuturilor sau greşeală de plasare a exemplarelor. La sfârşitul perioadei de expunere, se supun autopsiei toate animalele supravieţuitoare din loturile nesatelit. Animalele muribunde şi animalele cu suferinţe sau dureri grave se scot, se eutanasiază şi se supun autopsiei. Examinările următoare se efectuează la sfârşitul perioadei de testare asupra tuturor animalelor, inclusiv asupra martorilor: Alte determinări care se pot dovedi necesare pentru o evaluare toxicologică adecvată cuprind: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoza à jeun, analiza lipidelor şi a hormonilor, echilibrul acidobazic, methemoglobina şi activitatea colinesterazică. Se pot efectua, dacă este necesar, şi alte determinări biochimice clinice pentru a extinde investigaţiile asupra efectelor toxice observate.

1.6.3.

(a) debitul de aer (în permanenţă);

(b) concentraţia reală a substanţei măsurate în zona de respiraţie; pe parcursul perioadei de expunere zilnică, concentraţia nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 15 % faţă de valoarea medie; cu toate acestea, în cazul prafului şi al aerosolilor, acest grad de control poate să nu fie atins, iar în acest caz se poate accepta o diferenţă mai mare; pe durata experimentului concentraţiile administrate zilnic trebuie menţinute la valori cât de constante posibil; pentru aerosoli, se efectuează săptămânal cel puţin o analiză granulometrică pe lot tratat;

(i) examen hematologic, inclusiv: hematocritul, concentraţia hemoglobinei, numărul de eritrocite, formula leucocitară şi măsurători ale potenţialului de coagulare;

(ii) determinările biochimice clinice ale sângelui cuprinzând cel puţin un parametru al funcţiei hepatice şi unul al celei renale: alanin aminotransferaza (cunoscută anterior ca transaminaza serică glutamo-piruvică), aspartat aminotransferaza (cunoscută anterior ca transaminaza serică glutamo-oxaloacetică), azotul ureic, albumina, creatinina sanguină, bilirubina totală şi proteinele totale.

1.6.3.1. Autopsia Toate animalele supuse testului fac obiectul unei autopsii generale. Se cântăresc în stare umedă cel puţin ficatul, rinichii, glandele suprarenale, plămânii şi testiculele cât mai rapid posibil după disecţie pentru a se evita deshidratarea. Se conservă într-un mediu adecvat organele şi ţesuturile (tractul respirator, ficatul, rinichii, splina, testiculele, glandele suprarenale, inima, precum şi orice organ care prezintă leziuni macroscopice sau modificări volumetrice) în vederea unor examene histopatologice ulterioare. Plămânii se prelevează intacţi, se cântăresc şi se tratează cu un fixator adecvat care asigură conservarea structurii pulmonare.

1.6.3.2. Examen histopatologic Pentru lotul expus la concentraţii maxime şi pentru lotul martor se întreprinde un examen histopatologic al organelor şi al ţesuturilor conservate. Organele şi ţesuturile care prezintă leziuni induse de substanţa de testat la doza maximă se examinează în toate loturile care au fost expuse unor doze mai mici. Animalele oricărui lot satelit fac obiectul unui examen histopatologic axat în special pe organele şi ţesuturile pentru care s-au constatat leziuni în celelalte loturi tratate.

2. DATE Datele se sistematizează sub formă de tabele, prezentând pentru fiecare lot experimental numărul animalelor la începutul experimentului şi numărul animalelor prezentând fiecare tip de leziune. Toate rezultatele observate se evaluează printr-o metodă statistică adecvată. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

specia, linia, sursa, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.;

condiţiile de testare: Descrierea aparatului de expunere inclusiv concepţia, tipul, dimensiunile, sursa de aer, sistemul generator de particule şi de aerosoli, metoda de condiţionare a aerului, tratarea aerului expirat şi, după caz, modul de adăpostire a animalelor în incinta de testare, atunci când se utilizează. Se descrie echipamentul folosit pentru măsurarea temperaturii şi, dacă este necesar, stabilitatea concentraţiilor de aerosoli şi granulometria particulelor. Datele privind expunerea: Acestea se prezintă sub forma unui tabel care indică valorile medii, precum şi măsura variabilităţii (de exemplu, deviaţia standard) şi trebuie, dacă este posibil, să includă:

3.1. pt_2

(a) debitul de aer în dispozitivul de inhalare;

(b) temperatura şi umiditatea aerului;

(c) concentraţiile nominale (cantitatea totală de substanţă de testat introdusă în dispozitivul de inhalare raportată la volumul de aer);

(d) după caz, natura vehiculului;

(e) concentraţiile reale din zona de respiraţie;

(f) diametrul aerodinamic median masic al particulelor (DAMM) şi deviaţia geometrică standard (DSG);

răspunsul toxic pe sexe şi doză;

momentul morţii în timpul experimentului sau dacă animalele au supravieţuit experimentului;

descrierea efectelor toxice sau de altă natură, nivelul care nu are niciun efect;

momentul observării oricărui simptom anormal şi evoluţia acestuia;

cantităţile de hrană şi greutatea corporală;

examenele hematologice întreprinse şi rezultatele complete;

testele biochimice clinice practicate şi rezultatele complete;

rezultatele autopsiei;

descrierea detaliată a tuturor observaţiilor histopatologice;

tratarea statistică a rezultatelor, când este cazul;

discutarea rezultatelor;

interpretarea rezultatelor.

3.2. EVALUARE ŞI INTERPRETARE A se vedea introducerea generală partea B (litera D)

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE A se vedea introducerea generală partea B (litera E).

B.9. TOXICITATE LA DOZĂ REPETATĂ (28 DE ZILE) (ADMINISTRARE CUTANATĂ)

B.9.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE A se vedea introducerea generală partea B (litera A).

1.2. DEFINIŢII A se vedea introducerea generală partea B (litera B).

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Se aplică zilnic substanţa de testat pe cale cutanată, în doze crescătoare, mai multor loturi de testare, fiind administrată o doză pe lot timp de 28 de zile. Pe parcursul perioadei de aplicare, se observă zilnic animalele pentru a pune în evidenţă simptomele de toxicitate Animalele care mor în timpul testului, precum şi cele care supravieţuiesc la sfârşitul testului, sunt supuse autopsiei.

1.5. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6.

1.6.1. Pregătiri Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de testare, animalele tinere sănătoase se repartizează la întâmplare în loturi tratate şi loturi martor. Cu puţin timp înainte de testare, se tunde blana din regiunea dorsală a animalelor. Se poate recurge la radere, dar în acest caz operaţia se efectuează cu cca. 24 de ore înainte de test. Repetarea este, de obicei, necesară la intervale aproximativ săptămânale. În timpul tunderii sau al raderii, trebuie evitată orice lezare a pielii. Suprafaţa care se degajează în vederea aplicării substanţei de testat nu trebuie să fie mai mică de 10 % din suprafaţa corporală. Pentru a decide zona care trebuie degajată şi dimensiunile suprafeţei care trebuie tratată, se ia în calcul greutatea animalului. Dacă testul vizează substanţele solide care, dacă este cazul, se pot pulveriza, substanţa de testat trebuie umezită cu ajutorul apei sau, la nevoie, al unui vehicul adecvat, astfel încât să se poată obţine un bun contact cu pielea. Substanţele lichide se folosesc, în general, în stare nediluată. Se efectuează o aplicare zilnică timp de 5 până la 7 zile pe săptămână.

1.6.2. Condiţii de testare

1.6.2.

1.6.2.1. Animale de experienţă Animalele de laborator utilizate sunt şobolanul, iepurele sau cobaiul adult. Pot fi folosite şi alte specii, dar folosirea lor trebuie justificată. La începutul experimentului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie.

1.6.2.2. Număr şi sex Se folosesc, pentru fiecare doză, cel puţin 10 animale (5 femele şi 5 masculi) a căror piele este sănătoasă. Femelele trebuie să fie nulipare şi negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul experimentului, acest număr se adaugă la total. În plus, se poate trata un lot satelit de 10 de animale (5 din fiecare sex) la doza maximă timp de 28 de zile, care poate fi supus observaţiei vizând reversibilitatea, persistenţa sau apariţia tardivă a efectelor toxice pe parcursul celor 14 zile care urmează tratamentului. Se foloseşte, de asemenea, un lot satelit cu 10 animale martor (5 de fiecare sex).

1.6.2.3. Doze Se folosesc cel puţin trei doze, precum şi un lot martor sau, dacă este cazul, un lot martor pentru vehicul. Perioada de expunere este de cel puţin şase ore pe zi. Se aplică substanţa de testat în fiecare zi în acelaşi moment, iar dozele trebuie să facă obiectul unei adaptări (săptămânale sau bisăptămânale) pentru a se menţine constant nivelul dozei în raport cu greutatea corporală a animalului. Cu excepţia substanţei de testat, se tratează animalele din lotul martor la fel cu cele din grupul de experiment. În cazul în care se foloseşte un vehicul pentru a facilita administrarea dozei, acesta este administrat lotului martor în aceleaşi condiţii ca şi pentru loturile tratate, iar doza administrată corespunde cu cea primită de grupul tratat cu doza maximă. Doza maximă produce efecte toxice, dar nu provoacă sau provoacă rar moartea. Doza minimă nu provoacă niciun efect toxic. Atunci când există informaţii privind expunerea umană, doza cea mai mică trebuie să fie superioară acestei valori. În condiţii ideale, doza intermediară trebuie să producă minime efecte toxice observabile. În cazul în care se folosesc mai multe doze intermediare, acestea se administrează eşalonat, astfel încât să provoace o gradare a efectelor toxice. În loturile care corespund dozelor slabe şi intermediare, precum şi în loturile martor incidenţa mortalităţii trebuie să fie mică, pentru a permite o evaluare semnificativă a rezultatelor. În cazul în care aplicarea substanţei de testat provoacă o iritaţie cutanată gravă, se reduc concentraţiile; aceasta poate avea ca efect diminuarea, chiar dispariţia, celorlalte efecte toxice la doza maximă. De asemenea, dacă leziunile cutanate sunt foarte grave, poate fi necesară oprirea experimentului şi iniţierea unui studiu nou, la concentraţii mai scăzute.

1.6.2.4. Testul-limită În cazul în care în urma unei experienţe preliminare realizate cu o doză de 1000 mg/kg sau o doză mai ridicată în funcţie de expunerea umană posibilă, când se cunoaşte această valoare, nu apare niciun efect toxic, continuarea experienţei poate fi inutilă.

1.6.2.5. Perioada de observaţie Se observă toate animalele zilnic în vederea notării simptomelor de toxicitate. Se consemnează momentul morţii şi momentul când apar şi dispar simptomele de toxicitate.

1.6.3. Mod de operare Se pun animalele în cuşti individuale. În condiţii ideale, substanţa de testat se administrează animalelor 7 zile pe săptămână timp de 28 de zile. Animalele din orice grup satelit destinate observaţiei ulterioare sunt menţinute în viaţă timp de încă 14 zile, fără tratament, în vederea constatării vindecării sau a persistenţei efectelor toxice. Durata de expunere este de minimum şase ore pe zi. Substanţa de testat se aplică pe o suprafaţă aproximativ egală cu 10 % din suprafaţa totală a corpului. În cazul substanţelor puternic toxice, suprafaţa tratată poate fi mai mică, dar stratul trebuie să fie cât mai subţire şi mai uniform posibil. Pe parcursul expunerii, substanţa de testat se menţine în contact cu pielea cu ajutorul unui pansament de tifon şi al unui plasture neiritant. Suprafaţa tratată se acoperă astfel încât să menţină pansamentul de tifon şi substanţa de testat şi să se evite ingerarea acesteia de către animale. Se poate folosi contenţionarea pentru a împiedica animalele să ingereze substanţa de testat, dar nu se recomandă imobilizarea completă. Ca alternativă poate fi folosit un dispozitiv de protecţie cu guler înalt. La sfârşitul perioadei de expunere, se elimină, dacă este posibil, orice reziduu de substanţă, cu apă sau cu ajutorul unui alt procedeu de curăţare a pielii. Se observă zilnic toate animalele şi se înregistrează simptomele de toxicitate, precum şi momentul apariţiei, intensitatea şi durata acestora. Observaţiile includ, între altele, modificări ale părului şi ale blănii, ale ochilor şi ale mucoaselor, ale sistemului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom şi ale sistemului nervos central, precum şi ale activităţii somato-motrice şi ale comportamentului. Se determină săptămânal greutatea animalelor. Se recomandă, de asemenea, determinarea săptămânală a consumului alimentar. Animalele sunt observate cu regularitate pentru a evita pe cât posibil pierderea lor din motive exterioare experimentului, precum: canibalism, autoliză a ţesuturilor sau greşeală de plasare a exemplarelor. La sfârşitul experimentului, se supun autopsiei toate animalele supravieţuitoare care aparţin loturilor tratate nesatelite. Animalele muribunde şi animalele cu suferinţe sau dureri grave se scot, se eutanasiază şi se supun autopsiei. Examinările următoare se efectuează la sfârşitul perioadei de testare asupra tuturor animalelor, inclusiv asupra martorilor: Alte determinări care se pot dovedi necesare pentru o evaluare toxicologică adecvată cuprind: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoza à jeun, analiza lipidelor şi a hormonilor, echilibrul acidobazic, methemoglobina şi activitatea colinesterazică. Se pot efectua, dacă este necesar, şi alte determinări biochimice clinice pentru a extinde investigaţiile asupra efectelor observate.

1.6.3.

1. examen hematologic, inclusiv: hematocritul, concentraţia hemoglobinei, numărul de eritrocite, formula leucocitară şi măsurători ale potenţialului de coagulare;

2. determinările biochimice clinice ale sângelui cuprinzând cel puţin un parametru al funcţiei hepatice şi unul al celei renale: alanin aminotransferaza (cunoscută anterior ca transaminaza serică glutamo-piruvică), aspartat aminotransferaza (cunoscută anterior ca transaminaza serică glutamo-oxaloacetică), azotul ureic, albumina, creatinina sanguină, bilirubina totală şi proteinele totale.

1.6.4. Autopsie Toate animalele supuse testului fac obiectul unei autopsii generale. Se cântăresc în stare umedă ficatul, rinichii, glandele suprarenale şi testiculele cât mai rapid posibil după disecţie pentru a evita deshidratarea. Se conservă într-un mediu adecvat ficatul, rinichii, splina, testiculele, glandele suprarenale şi inima, precum şi orice organ care prezintă leziuni macroscopice sau modificări volumetrice în vederea unor posibile examene histopatologice ulterioare.

1.6.5. Examen histopatologic Pentru lotul expus la doza maximă şi pentru lotul martor se întreprinde un examen histopatologic al organelor şi al ţesuturilor conservate. Organele şi ţesuturile care prezintă leziuni induse pe suprafaţa de testare la nivelul dozei maxime se examinează în toate loturile care au fost expuse unor doze mai mici. Animalele din lotul satelit fac obiectul unui examen histopatologic axat în special pe organele şi ţesuturile pentru care s-au constatat leziuni în celelalte loturi tratate.

2. DATE Datele se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare lot de experienţă, numărul de animale la începutul testului şi numărul de animale care prezintă fiecare tip de leziune. Toate rezultatele observate se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:

date privind animalele (specia, linia, originea, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.);

condiţiile de testare (inclusiv tipul de pansament: ocluziv sau neocluziv);

dozele (inclusiv vehiculul, dacă este cazul) şi concentraţiile;

dacă este posibil, nivelul care nu are niciun efect;

răspunsul toxic pe sexe şi doză;

momentul morţii în timpul experimentului sau indicarea faptului că animalele au supravieţuit experimentului;

efectele toxice sau de altă natură;

momentul observării oricărui simptom anormal şi evoluţia acestuia;

cantităţile de hrană şi greutatea corporală;

examenele hematologice întreprinse şi rezultatele;

testele biochimice clinice practicate şi rezultatele;

rezultatele autopsiei;

descrierea detaliată a tuturor observaţiilor histopatologice;

tratarea statistică a rezultatelor, când este cazul;

discutarea rezultatelor;

interpretarea rezultatelor.

3.2. EVALUARE ŞI INTERPRETARE A se vedea introducerea generală partea B (litera D).

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE A se vedea introducerea generală partea B (litera E).

B.10. MUTAGENITATEA –TESTUL IN VITRO DE ABERAŢIE CROMOZOMIALĂ PE CELULE DE MAMIFERE

B.10.

1. METODĂ Prezenta metodă este reprodusă după Orientarea 473 a OCDE, Testul in vitro de aberaţie cromozomială pe celule de mamifere (1997).

1.

1.1. INTRODUCERE Scopul testului in vitro de aberaţie cromozomială este destinat depistării agenţilor care provoacă aberaţii cromozomiale ale structurii în celulele de mamifere, în cultură (1) (2) (3). Aberaţiile structurale pot fi de două tipuri, cromozomiale sau cromatidice. La majoritatea mutagenilor chimici, aberaţiile induse sunt de tip cromatidic, dar se produc şi aberaţii de tip cromozomial. O poliploidie crescută poate să indice că un produs chimic are capacitatea de a provoca aberaţii ale numărului de cromozomi. Cu toate acestea, prezenta metodă nu este destinată determinării aberaţiilor numerice şi, în general, nu se utilizează în acest scop. Mutaţiile cromozomiale şi fenomenele conexe sunt cauza multor maladii genetice umane şi există dovezi suficiente ale implicării mutaţiilor cromozomiale şi a fenomenelor conexe, care provoacă modificări ale oncogenelor şi ale genelor supresoare de tumori din celulele somatice, în inducerea cancerului la oameni şi la animalele de laborator. Testul in vitro de aberaţie cromozomială poate să utilizeze culturi de linii celulare stabilite, suşe celulare sau culturi celulare primare. Celulele utilizate se selectează în funcţie de potenţialul de dezvoltare în cultură, stabilitatea cariotipului, numărul de cromozomi, diversitatea cromozomilor şi frecvenţa aberaţiilor cromozomiale spontane. Pentru realizarea in vitro a testului este necesar să se utilizeze o sursă exogenă pentru activarea metabolică. Sistemul de activare metabolică de acest tip nu poate să reproducă integral condiţiile celulelor de mamifere in vivo. Ar trebui să se acorde atenţie evitării condiţiilor care ar putea să conducă la obţinerea unor rezultate pozitive care nu reflectă o mutagenitate intrinsecă, condiţii care s-ar putea datora modificărilor de pH, de osmolalitate sau unor valori mari ale citotoxicităţii (4) (5). Prezentul test se utilizează pentru depistarea substanţelor cu posibile efecte mutagene şi cancerigene pentru mamifere. Mulţi compuşi care dau rezultate pozitive la acest test sunt cancerigeni pentru mamifere; cu toate acestea, nu există o corelaţie perfectă între prezentul test şi cancerigenitate. Corelaţia depinde de clasa de produse chimice şi sunt tot mai multe dovezi că există agenţi cancerigeni care nu se depistează prin prezentul test deoarece este posibil ca aceştia să acţioneze printr-un alt mecanism decât cel care provoacă leziuni directe ale ADN. A se vedea şi introducerea generală partea B.

1.2. DEFINIŢII Aberaţie de tip cromatidic: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea cromatidelor singure sau prin divizarea şi reuniunea între cromatide. Aberaţie de tip cromozomial: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea sau divizarea şi reuniunea ambelor cromatide în acelaşi situs. Endoreduplicare: proces în care, după o perioadă S de replicare a ADN, nucleul nu intră în mitoză, ci începe o altă fază S. Rezultă cromozomi cu 4, 8, 16, … cromatide. Lacună: leziune acromatică mai mică decât lăţimea unei cromatide şi cu o eroare minimă de aliniere a cromatidelor. Index mitotic: numărul celulelor în metafază împărţit la numărul total de celule observate într-o populaţie de celule; indică gradul de proliferare a populaţiei respective. Aberaţie numerică: modificare a numărului de cromozomi faţă de numărul normal caracteristic pentru celulele utilizate. Poliploidie: multiplicare a numărului (n) de cromozomi haploizi, alta decât diploidia (și anume 3n, 4n etc.). Aberaţie structurală: modificare a structurii cromozomilor, detectabilă la examinarea microscopică a celulelor în stadiul de metafază al diviziunii acestora, care se prezintă sub formă de deleţii şi fragmente, modificări intracromozomiale şi intercromozomiale.

1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Culturile de celule sunt expuse la substanţa de testat, atât cu, cât şi fără activare metabolică. După expunerea celulelor la substanţa de testat, acestea se tratează la intervale de timp prestabilite cu o substanţă de inhibare a metafazei (de exemplu Colcemid® sau colchicină), se recoltează, se colorează şi celulele în metafază sunt analizate la microscop pentru detectarea aberaţiilor cromozomiale.

1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.4.

1.4.1. Preparatele

1.4.1.

1.4.1.1. Celulele Se pot utiliza diferite linii celulare, suşe de celule sau culturi de celule primare, inclusiv celule umane (de exemplu celule de hamster chinezesc, limfocite din sângele periferic uman sau al altor mamifere).

1.4.1.2. Mediile şi condiţiile de cultură Se recomandă utilizarea mediilor de cultură şi a condiţiilor de incubare (vasele de cultură, concentraţia CO2, temperatura şi umiditatea) corespunzătoare pentru dezvoltarea culturilor. Se impune controlul regulat al liniilor şi suşelor celulare, pentru verificarea stabilităţii numărului modal de cromozomi şi a absenţei contaminării cu micoplasmă şi, dacă se constată contaminarea, celulele nu se mai folosesc. Ar trebui să se cunoască perioada ciclului celular normal pentru celulele şi condiţiile de cultură utilizate.

1.4.1.3. Prepararea culturilor Liniile şi suşele celulare stabilite: celulele se prepară plecând de la culturile de rezervă, se însămânţează în mediul de cultură într-o anumită densitate, astfel încât culturile să nu ajungă la confluenţă înainte de momentul recoltării, apoi se incubează la 37 oC. Limfocitele: sângele complet, tratat cu un anticoagulant (de exemplu heparina) sau limfocitele separate obţinute de la subiecţi sănătoşi se adaugă la mediul de cultură ce conţine un mitogen (de exemplu fitohemaglutinină) şi se incubează la 37 oC.

1.4.1.4. Activarea metabolică Se recomandă ca expunerea celulelor la substanţa de testat să se realizeze atât în prezenţa, cât şi în absenţa sistemului de activare metabolică corespunzător. Sistemul cel mai frecvent utilizat este o fracţie postmitocondrială la care s-au adăugat cofactori (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu agenţi de inducţie enzimatică, de exemplu Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) sau un amestec de fenobarbitonă şi β-naftoflavonă (10) (11) (12). Fracţia postmitocondrială se utilizează, de obicei, la concentraţii cuprinse între limitele 1-10 % v/v în mediul experimental final. Compoziţia unui sistem de activare metabolic poate să depindă de clasa din care face parte substanţa chimică de testat. În unele cazuri, s-ar putea să fie convenabilă utilizarea mai multor concentraţii ale fracţiei postmitocondriale. O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a unor linii celulare care exprimă enzime activatoare specifice, poate furniza potenţialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere ştiinţific (de exemplu prin importanţa izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanţei de testat).

1.4.1.5. Substanţa de testat/prepararea Substanţele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluţii sau suspensii în solvenţii sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului celulelor. Substanţele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele experimentale şi se diluează înainte de utilizare în tratamentul celulelor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanţă de testat, cu excepţia cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.

1.4.2. Condiţiile de testare

1.4.2.

1.4.2.1. Solventul/vehiculul Solventul/vehiculul ar trebui să fie ales, astfel încât să nu existe suspiciunea reacţiei chimice a acestuia cu substanţa de testat şi să nu afecteze negativ supravieţuirea celulelor şi activitatea S9. Utilizarea altor solvenţi/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere un solvent/vehicul în soluţie/dispersie apoasă. La testarea substanţelor instabile în apă, solventul organic utilizat nu ar trebui să conţină apă. Apa se poate elimina prin adăugarea unei site moleculare.

1.4.2.2. Concentraţiile de expunere Printre criteriile ce trebuie să fie avute în vedere la determinarea dozei maxime sunt citotoxicitatea, solubilitatea în sistemul experimental şi modificările de pH sau osmolalitate. Citotoxicitatea ar trebui să se determine cu şi fără activare metabolică în experimentarea principală, utilizând un indicator corespunzător al integrităţii şi dezvoltării celulare, ca gradul de confluenţă, numărul de celule viabile sau indexul mitotic. Ar putea fi utilă determinarea citotoxicităţii şi solubilităţii într-un test preliminar. Ar trebui să se utilizeze cel puţin trei concentraţii analizabile. Dacă o substanţă este citototoxică, concentraţiile respective ar trebui să acopere un domeniu de toxicităţi de la maximă la mică sau lipsa toxicităţii; aceasta semnifică, de obicei, concentraţii care ar trebui să fie separate printr-un factor cuprins între 2 şi √10 maximum. În momentul recoltării, concentraţia maximă ar trebui să determine o reducere importantă a gradului de confluenţă, a numărului de celule sau a indexului mitotic (pentru toate mai mare de 50 %). Indexul mitotic variază în timp după tratament şi reprezintă doar o măsură indirectă a efectelor citotoxice/citostatice. Cu toate acestea, indexul mitotic este acceptabil pentru culturile în suspensie în care alte determinări de toxicitate pot să fie dificile şi nepractice. Datele de cinetică a ciclului celular, cum ar fi timpul de generare medie (TGM), ar putea să reprezinte informaţii suplimentare. TGM este totuşi o medie generală, care nu demonstrează întotdeauna existenţa unei subpopulaţii întârziate; chiar şi creşterile uşoare ale timpului de generare medie pot să genereze o întârziere foarte substanţială a momentului în care numărul de aberaţii este optim. Pentru substanţele relativ necitotoxice, concentraţia experimentală maximă trebuie să fie cea mai mică dintre următoarele: 5 μl/ml, 5 mg/ml sau 0,01 M. Pentru substanţele relativ insolubile care nu sunt toxice la concentraţii mai mici decât concentraţia la care sunt insolubile, doza maximă utilizată ar trebui să fie o concentraţie superioară limitei de solubilitate în mediul final de cultură la terminarea perioadei de tratament. În unele cazuri (de exemplu atunci când toxicitatea se manifestă doar la o concentraţie mai mare decât concentraţia minimă de insolubilitate), se recomandă să se încerce mai multe concentraţii până la apariţia precipitării. Ar putea fi utilă evaluarea solubilităţii la începutul şi la sfârşitul tratamentului, deoarece solubilitatea poate să varieze în timpul expunerii în sistemul experimental datorită prezenţei celulelor, S9, serului etc. Insolubilitatea se poate constata cu ochiul liber. Ar trebui ca precipitarea să nu interfereze cu determinarea rezultatelor.

1.4.2.3. Martorii negativi şi pozitivi La fiecare experiment, ar trebui să se includă simultan martorii pozitivi şi negativi (solvent şi vehicul), atât cu, cât şi fără activare metabolică. În prezenţa unui sistem de activare metabolică, substanţa utilizată ca martor pozitiv ar trebui să fie aceea care necesită activare pentru a da un răspuns mutagen. Ca martori pozitivi ar trebui să se utilizeze un elastogen cunoscut, la niveluri de expunere care se estimează că determină o creştere reproductibilă şi detectabilă în raport cu zgomotul de fond, ceea ce demonstrează sensibilitatea sistemului de testare. Concentraţiile martorilor pozitivi ar trebui să fie selectate astfel încât să se obţină efecte clare, dar care să nu permită identificare imediată a lamelelor codificate. În tabelul următor se prezintă exemple de substanţe care se pot utiliza ca martori pozitivi: Starea activării metabolice Substanţa Nr. CAS Nr. EINECS Absenţa activării metabolice exogene metansulfonat de metil 66-27-3 200-625-0 metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7 etil nitrozouree 759-73-9 212-072-2 mitomicină C 50-07-7 200-008-6 4-nitrochinolină-N-oxid 56-57-5 200-281-1 Prezenţa activării metabolice exogene benzo[a] piren 50-32-8 200-028-5 ciclofosfamidă ciclofosfamidă monohidrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Se pot utiliza şi alte substanţe corespunzătoare ca martori pozitivi. Ar trebui să se aibă în vedere utilizarea ca martori pozitivi a unor substanţe din aceeaşi clasă de produse chimice, dacă sunt disponibile. Pentru fiecare moment de recoltare, ar trebui să se utilizeze ca martori negativi solvenţi sau vehicule singure în mediul de tratare, care se tratează în acelaşi condiţii ca şi culturile tratate. În plus, ar trebui să se utilizeze şi martori netrataţi, cu excepţia cazului în care există date din testele anterioare care să ateste că solventul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene.

1.4.3. Modul de lucru

1.4.3.

1.4.3.1. Tratamentul cu substanţa de testat Celulele în stadiu de proliferare se tratează cu substanţa de testat în prezenţa sau absenţa unui sistem de activare metabolică. Tratamentul limfocitelor ar trebui să înceapă la aproximativ 48 de ore de la stimularea mitogenică.

1.4.3.2. Pentru fiecare concentraţie ar trebui să se realizeze în mod normal teste pe culturi de celule în dublu exemplar, procedură recomandată cu fermitate pentru culturile cu martor negativ/solvent. Dacă datele testelor anterioare pot să dovedească existenţa unor diferenţe minime între culturile duble (13) (14), se poate preconiza utilizarea unor culturi unice pentru fiecare concentraţie testată. Substanţele în stare gazoasă sau cele volatile ar trebui să fie testate prin metode corespunzătoare, de exemplu în vase de cultură închise ermetic (15) (16).

1.4.3.3. Momentul recoltării culturilor În primul experiment, expunerea celulelor la substanţa de încercat ar trebui să se realizeze atât în prezenţa, cât şi în absenţa activării metabolice, timp de 3-6 ore, şi să se procedeze la prelevarea probelor după un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal de la iniţierea tratamentului (12). Dacă rezultatele testului sunt negative, atât în prezenţa, cât şi în absenţa activării, ar trebui să se repete testul fără activare, cu tratament continuu până în momentul prelevării probelor care să fie egal cu aproximativ de 1,5 ori durata ciclului celular normal. S-ar putea ca unele produse chimice să fie detectate mai uşor, prin prelungirea timpului de tratament/prelevare a probelor la mai mult de 1,5 ori durata ciclului celular. Rezultatele negative obţinute în prezenţa activării metabolice necesită o confirmare pentru fiecare caz. Pentru cazurile în care se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, trebuie să se prezinte o justificare.

1.4.3.4. Prepararea cromozomilor Culturile celulare se tratează cu Colcemid® sau colchicină, de obicei timp de 1-3 ore înainte de recoltare. Fiecare cultură celulară se recoltează şi se prelucrează separat pentru prepararea cromozomilor. Prepararea cromozomilor include tratamentul hipotonic al celulelor, precum şi fixarea şi colorarea acestora.

1.4.3.5. Analiza Toate lamelele, inclusiv cele cu martorii pozitivi şi negativi, ar trebui să fie codificate independent înaintea analizei microscopice. Deoarece procedurile de fixare generează adesea scindarea unei proporţii de celulele în metafază cu pierdere de cromozomi, toate celulele înregistrate ar trebui, prin urmare, să conţină un număr de centromeri egal cu numărul modal ± 2 pentru toate tipurile de celule. Pentru fiecare concentraţie şi fiecare martor ar trebui să se înregistreze cel puţin 200 de celule în metafază bine etalate, repartizate în mod egal între culturile în dublu exemplar, dacă este cazul. Atunci când se constată un număr mare de aberaţii, numărul menţionat se poate reduce. Deşi scopul testului este detectarea aberaţiilor cromozomial-structurale ale cromozomilor, este important să se semnaleze cazurile de poliploidie şi endoreduplicare, dacă se constată apariţia acestora.

2. DATE

2.

2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR Unitatea experimentală este celula şi, prin urmare, ar trebui să se evalueze procentul de celule care prezintă o aberaţie cromozomială sau mai multe aberaţii cromozomiale. Se întocmeşte o listă cu diferitele tipuri de aberaţii cromozomiale şi se specifică numărul şi frecvenţa acestora pentru culturile experimentale şi cele martor. Lacunele se înregistrează şi se prezintă separat, dar în general nu se includ în frecvenţa totală a aberaţiilor. De asemenea, se înregistrează rezultatele determinărilor concomitente de citotoxicitate realizate pentru toate culturile tratate şi pentru cele martor negativ în principalele teste de aberaţii. Ar trebui să se prezintă date pentru fiecare cultură. În plus, toate datele ar trebui să fie prezentate centralizat sub formă de tabel. Nu este necesară verificarea unui răspuns pozitiv net. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin realizarea de teste suplimentare în care este preferabil să se modifice condiţiile de testare. Necesitatea confirmării rezultatelor negative s-a discutat la punctul 1.4.3.3. În cazul experimentelor suplimentare, ar trebui să se aibă în vedere modificările parametrilor cercetaţi pentru a extinde gama condiţiilor evaluate. Parametrii studiaţi, susceptibili de modificare, includ intervalele dintre concentraţii şi condiţiile de activare metabolică.

2.2. EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o creştere în funcţie de concentraţie sau o creştere reproductibilă a numărului de celule cu aberaţii cromozomiale. În primul rând, ar trebui să se aibă în vedere relevanţa biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se pot utiliza metode statistice (3) (13). Semnificaţia statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. O creştere a numărului de celule poliploide poate să indice faptul că substanţa de testat este capabilă să inhibe procesele mitotice şi să producă aberaţii ale numărului de cromozomi. O creştere a numărului de celule cu cromozomi endoreduplicaţi poate să indice faptul că substanţa de testat poate inhiba avansarea ciclului celular (17) (18). Dacă rezultatele obţinute pentru o substanţă de testat nu îndeplinesc criteriile menţionate anterior, se consideră că substanţa respectivă nu este mutagenă în sistemul respectiv. Deşi majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în rare cazuri datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanţei de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de repetări ale testului. Rezultatele pozitive ale unui test in vitro de aberaţie cromozomială indică faptul că substanţa de testat provoacă aberaţii cromozomiale ale structurii în celulele somatice de mamifere, în cultură. Rezultatele negative indică faptul că, în condiţiile de testare, substanţa de testat nu provoacă aberaţii cromozomiale în celulele somatice de mamifere, în cultură.

3. RAPORT

3. RAPORTUL DE TESTARE

Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:

Solventul/Vehiculul:

justificarea alegerii vehiculului;

solubilitatea şi stabilitatea substanţei de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaşte.

Celulele:

tipul şi sursa celulelor;

caracteristicile cariotipului şi motivul alegerii celulelor utilizate;

absenţa micoplasmei, dacă este cazul;

date privind durata ciclului celular;

sexul donatorilor de sânge, sângele complet sau limfocite izolate, mitogenul utilizat;

numărul de reînsămânţări, dacă este cazul;

metodele de întreţinere a culturilor celulare, dacă este cazul;

numărul modal de cromozomi.

Condiţiile de testare:

identitatea substanţei de inhibare a metafazei, concentraţiile acesteia şi timpul de expunere a celulelor;

justificarea alegerii concentraţiilor şi numărului de culturi, inclusiv datele de citotoxicitate şi limitele de solubilitate, dacă sunt disponibile;

compoziţia mediului, concentraţia de CO2, dacă este cazul;

concentraţia substanţei de testat;

volumul vehiculului şi al substanţei de testat adăugate;

temperatura de incubare;

timpul de incubare;

durata tratamentului;

densitatea celulară la însămânţare, dacă este cazul;

tipul şi compoziţia sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate;

martorii pozitivi şi negativi;

metodele de preparare a lamelelor;

criteriile pentru numărătoarea aberaţiilor;

numărul de metafaze analizate;

metodele de măsurare a toxicităţii;

criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.

Rezultatele:

semnele de toxicitate, de exemplu gradul de confluenţă, datele privind ciclul celular, numărătoarea celulelor, indexul mitotic;

semnele de precipitare;

datele privind valoarea pH-ului şi osmolalitatea mediului de tratare, dacă s-au determinat;

definirea aberaţiilor, inclusiv a lacunelor;

numărul de celule cu aberaţii cromozomiale şi tipul aberaţiilor cromozomiale, prezentate separat pentru fiecare cultură tratată şi cultură martor;

variaţiile ploidiei, dacă există;

relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;

analizele statistice, dacă există;

datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi;

datele anterioare privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi, cu domeniile, valorile medii şi deviaţiile standard.

Discutarea rezultatelor.

Concluzii.

4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE Evans, H. J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29. Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T. (1985). The in Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432. Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, M.A, Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1-175. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res, 257, pp. 147-204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, pp. 297-305. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, pp. 173-215. Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, pp. 83-90. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, pp. 277-290. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, pp. 241-261. Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D. J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154. Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994). replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, pp. 139-149. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801. Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, pp. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983). Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.

B.11. MUTAGENITATEA – TESTUL IN VIVO DE ABERAŢIE CROMOZOMIALĂ PE MĂDUVĂ OSOASĂ DE MAMIFERE

B.11.

1. METODĂ Prezenta metodă este reprodusă după Orientarea 475 a OCDE, Testul in vivo de aberaţie cromozomială pe măduvă osoasă de mamifere (1997).

1.

1.1. INTRODUCERE Testul in vivo de aberaţie cromozomială pe măduva osoasă de mamifere se utilizează la detectarea aberaţiilor cromozomiale provocate de substanţa de testat în structura celulelor din măduva osoasă a mamiferelor, de obicei, rozătoare (1) (2) (3) (4). Aberaţiile structurale pot să fie de două tipuri, cromozomiale sau cromatidice. O poliploidie crescută poate să indice că un produs chimic poate să provoace aberaţii ale numărului de cromozomi. La majoritatea mutagenilor chimici, aberaţiile induse sunt de tip cromatidic, dar se produc şi aberaţii de tip cromozomial. Mutaţiile cromozomiale şi fenomenele conexe sunt cauza multor maladii genetice umane şi există dovezi suficiente ale implicării mutaţiilor cromozomiale şi a fenomenelor conexe, care provoacă modificări ale oncogenelor şi ale genelor supresoare de tumori din celulele somatice, în inducerea cancerului la oameni şi în sistemele experimentale. În prezentul test se utilizează, de obicei, rozătoare. Ţesutul-ţintă în prezentul test este măduva osoasă, deoarece este un ţesut puternic vascularizat şi conţine o populaţie de celule cu ciclu rapid care se pot izola şi prelucra uşor. Alte specii şi ţesuturi-ţintă nu fac obiectul prezentei metode. Prezentul test de aberaţie cromozomială este relevant în special la evaluarea riscului mutagen, deoarece permite să se ţină seama de factorii de metabolism in vivo, de farmacocinetică şi de procesele de reparare a ADN-ului, deşi aceştia pot să varieze între specii şi între ţesuturi. Un test in vivo este, de asemenea, util pentru studierea suplimentară a unui efect mutagen detectat printr-un test in vitro. Dacă există dovezi că substanţa de testat sau un metabolit reactiv nu ating ţesutul-ţintă, utilizarea prezentului test nu potrivită. A se vedea şi introducerea generală partea B.

1.2. DEFINIŢII Aberaţie de tip cromatidic: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea cromatidelor singure sau prin divizarea şi reuniunea între cromatide. Aberaţie de tip cromozomial: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea sau divizarea şi reuniunea ambelor cromatide în acelaşi loc. Endoreduplicare: proces în care, după o perioadă S de replicare a ADN, nucleul nu intră în mitoză, ci începe o altă perioadă S. Rezultă cromozomi cu 4, 8, 16, … cromatide. Lacună: leziune acromatică mai mică decât lăţimea unei cromatide şi cu o eroare minimă de aliniere a cromatidei(lor). Aberaţie numerică: modificare a numărului de cromozomi faţă de numărul normal caracteristic pentru celulele utilizate. Poliploidie: multiplicare a numărului (n) de cromozomi haploizi, alta decât diploidia (și anume 3n, 4n etc.). Aberaţie structurală: modificare a structurii cromozomilor, detectabilă la examinarea microscopică a celulelor în stadiul de metafază al diviziunii acestora, care se prezintă sub formă de deleţii şi fragmente, modificări intracromozomiale şi intercromozomiale.

1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Animalele se expun la substanţa de testat printr-o cale de expunere corespunzătoare şi se sacrifică în momente corespunzătoare după tratament. Înainte de sacrificare, animalele se supun tratamentului cu un agent de inhibare a metafazei (de exemplu colchicină sau Colcemid®). Apoi, din celulele de măduvă osoasă se realizează preparate cromozomiale care se colorează şi celulele în metafază se examinează pentru a se pune în evidenţă aberaţiile cromozomiale.

1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.4.

1.4.1. Preparatele

1.4.1.

1.4.1.1. Selectarea speciilor de animale Se utilizează, de obicei, şobolani, şoareci şi hamsteri chinezeşti, deşi se poate utiliza orice specie de mamifere potrivită. Se recomandă utilizarea unor animale adulte tinere sănătoase din suşe folosite în mod curent în laborator. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui să prezinte variaţii minime, care să nu depăşească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex.

1.4.1.2. Condiţiile de adăpostire şi de hrănire Se aplică condiţiile generale menţionate în introducerea generală partea B, dar umiditatea atinsă ar trebui să fie de 50-60 %.

1.4.1.3. Pregătirea animalelor Animalele adulte tinere sănătoase se distribuie în mod aleatoriu în grupe martor şi grupe de tratament. Cuştile ar trebui să se aranjeze astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minim. Animalele sunt identificate individual. Se procedează la aclimatizarea animalelor la condiţiile de laborator timp de minimum cinci zile.

1.4.1.4. Prepararea dozelor Substanţele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluţii sau suspensii în solvenţii sau vehiculele corespunzătoare şi să se dilueze, dacă este cazul, înainte de a fi administrate animalelor. Substanţele de testat lichide se pot administra direct sau dilua înainte de administrare. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanţă de testat, cu excepţia cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.

1.4.2. Condiţii de testare

1.4.2.

1.4.2.1. Solventul/vehiculul Solventul/vehiculul nu ar trebui să producă efecte toxice la dozele utilizate şi nu ar trebui să existe suspiciunea reacţiei chimice a acestuia cu substanţa de testat. Utilizarea altor solvenţi/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos.

1.4.2.2. Martorii Pentru fiecare sex şi pentru fiecare test ar trebui să se prevadă martori pozitivi şi negativi (solvenţi/vehicule), utilizaţi în paralel. Cu excepţia tratamentului cu substanţa de testat, manipularea animalelor din grupele martor ar trebui să fie identică cu cea a animalelor din grupele tratate. Martorii pozitivi ar trebui să producă aberaţii cromozomiale de structură in vivo la nivelurile de expunere preconizate a genera o creştere detectabilă în raport cu fondul. Dozele de martor pozitiv ar trebui să fie alese astfel încât să se obţină efecte clare, dar fără a revela imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. Pentru martorul pozitiv, se poate accepta administrarea pe o cale diferită faţă de cea utilizată în cazul substanţei de testat şi doar o singură prelevare a probelor. Se poate avea în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceeaşi clasă de substanţe chimice, dacă sunt disponibili. În tabelul următor se prezintă exemple de substanţe care se pot utiliza ca martori pozitivi: Substanţa Nr. CAS Nr. EINECS metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7 etil nitrozouree 759-73-9 212-072-2 mitomicină C 50-07-7 200-008-6 ciclofosfamidă ciclofosfamidă monohidrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 trietilenmelamină 51-18-3 200-083-5 Martorii negativi, trataţi doar cu solvent sau cu vehicule şi manipulaţi în acelaşi fel ca şi grupele tratate, ar trebui să fie incluşi la fiecare prelevare de probe, cu excepţia cazului în care se dispune de date acceptabile privind variabilitatea inter-animale şi frecvenţele celulelor cu aberaţii cromozomiale, provenite de la martori anteriori. Dacă, pentru martorii negativi, se face o singură prelevare de probe, momentul cel mai potrivit pentru prelevarea probelor este momentul primei prelevări. În plus, ar trebui să se utilizeze şi martori netrataţi, cu excepţia cazului în care există date de la martori anteriori sau date publicate, care să ateste că solventul/vehiculul selectat nu induce efecte vătămătoare sau mutagene.

1.5. MOD DE LUCRU

1.5.

1.5.1. Numărul şi sexul animalelor Fiecare grup tratat şi grup martor include minimum cinci animale analizabile din fiecare sex. Dacă în momentul studiului există date disponibile din studii pe aceleaşi specii, în care s-a folosit aceeaşi cale de expunere, care să demonstreze lipsa unor diferenţe substanţiale de toxicitate între sexe, atunci va fi suficientă testarea pe animale de un singur sex. Dacă expunerea umană la produse chimice este specifică sexului, ca în cazul unor produse farmaceutice, testul ar trebui să se realizeze pe animale de sexul corespunzător.

1.5.2. Modalitatea de tratare Substanţele de testat se administrează de preferinţă o singură dată. Substanţele de testat se mai pot administra în doze fracţionate, și anume două tratamente în aceeaşi zi la distanţă de doar câteva ore, pentru a facilita administrarea unui volum mare de material. Alte modalităţi de tratare ar trebui să fie justificate în mod ştiinţific. Prelevarea probelor după tratament ar trebui să se realizeze în două momente diferite din aceeaşi zi. Pentru rozătoare, primul interval de timp este egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal (acesta din urmă fiind în mod normal de 12-18 ore) după tratament. Deoarece timpul necesar pentru absorbţia şi metabolismul substanţei de testat, precum şi acţiunea acesteia asupra cineticii ciclului celular pot să aibă efecte asupra timpului optim pentru detectarea aberaţiei cromozomiale, se recomandă să se procedeze la o altă prelevare de probe la 24 de ore după prima prelevare. Dacă administrarea dozelor durează mai mult de o zi, ar trebui să se procedeze la o prelevare de probe la un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal după tratamentul final. Înainte de sacrificare, se procedează la injectarea intraperitoneală a animalelor cu o doză corespunzătoare de agent de inhibare a metafazei (de exemplu Colcemid® sau colchicină). Probele de la animale se prelevează apoi la un interval corespunzător. Pentru şoareci intervalul respectiv este de aproximativ 3-5 ore; pentru hamsterii chinezeşti intervalul este de 4-5 ore. Celule se recoltează din măduva osoasă şi se examinează pentru detectarea aberaţiilor cromozomiale.

1.5.3. Doze Dacă, în lipsa datelor corespunzătoare, se realizează un studiu pentru stabilirea dozelor, acesta ar trebui să se realizeze în acelaşi laborator şi să utilizeze aceeaşi specie, aceeaşi suşă de animale de acelaşi sex, iar regimul de tratare să fie acelaşi ca cel ce urmează să fie utilizat în studiul principal (5). În caz de toxicitate, se utilizează trei doze diferite pentru prima prelevare. Aceste trei doze ar trebui să acopere un domeniu de toxicităţi, de la toxicitatea maximă până la toxicitatea minimă sau lipsă. Pentru prelevările ulterioare se utilizează doar doza maximă. Doza maximă se defineşte ca doza ce produce astfel de semne de toxicitate, încât dozele mai mari, administrate în acelaşi mod, se estimează că sunt letale. Substanţele cu activitate biologică specifică la doze mici netoxice (cum ar fi hormonii şi mitogenii) pot face excepţie de la criteriile de stabilire a dozelor şi să fie stabilite pentru fiecare caz în parte. Doza maximă se mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate în măduva osoasă (de exemplu o reducere cu mai mult de 50 % a indexului mitotic).

1.5.4. Test-limită Dacă un test realizat cu o doză de minimum 2000 mg/kg greutate corporală, administrată într-o singură repriză sau în două reprize în aceeaşi zi, nu produce efecte toxice detectabile şi dacă o genotoxicitate este improbabilă pe baza datelor referitoare la substanţe cu o structură apropiată, se poate considera că un studiu complet cu utilizarea a trei doze de mărimi diferite nu este necesar. Pentru studiile pe termen lung, doza-limită este de 2000 mg/kg greutate corporală/zi pentru un tratament de până la 14 zile şi de 1000 mg/kg greutate corporală/zi pentru un tratament mai lung de 14 zile. În funcţie de expunerea umană preconizată, ar putea fi necesară o doză mai mare în testul-limită.

1.5.5. Administrarea dozelor Substanţa de testat se administrează, de obicei, prin cavitatea nazală cu ajutorul unui tub stomacal sau al unei canule de intubaţie adaptate sau printr-o injecţie intraperitoneală. Se pot accepta şi alte căi de administrare, dacă se pot justifica. Volumul maxim de lichid care se poate administra prin sondă gastrică introdusă prin cavitatea nazală sau prin injecţie într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul ar trebui să fie mai mic sau egal cu 2 ml/100 g greutate corporală. Utilizarea unor volume mai mari decât cel menţionat ar trebui să se justifice. Cu excepţia substanţelor iritante şi corozive, care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentraţii mai mari, variaţia volumului administrat ar trebui să fie redusă la minim prin ajustarea concentraţiei, astfel încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.

1.5.6. Prepararea cromozomilor Măduva osoasă se extrage imediat după sacrificare, se expune la o soluţie hipotonică şi se fixează. Apoi, celulele se întind pe lamele şi se colorează.

1.5.7. Analiza Se procedează la determinarea indexului mitotic, care este o măsură a citotoxicităţii, pe cel puţin 1000 de celule pentru fiecare animal tratat (inclusiv martorii pozitivi) şi pentru fiecare animal martor negativ netratat. Pentru fiecare animal se analizează minimum 100 de celule. Dacă se observă un număr mai mare de aberaţii, numărul specificat se poate reduce. Toate lamelele, inclusiv cele cu celule de la martorii pozitivi şi negativi, ar trebui să fie codificate independent, înainte de examinarea la microscop. Deoarece metodele de preparare a lamelelor conduc adesea la scindarea unei fracţii de celule în metafază cu pierdere de cromozomi, toate celulele examinate ar trebui, prin urmare, să conţină un număr de centromeri egal cu 2n ± 2.

2. DATE

2.

2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR Se recomandă prezentarea sub formă de tabel a datelor pentru fiecare animal. Unitatea experimentală este animalul. Pentru fiecare animal, ar trebui să se evalueze numărul de aberaţii per celulă şi procentul de celule cu aberaţie sau aberaţii cromozomiale de structură. Diferitele tipuri de aberaţii cromozomiale de structură ar trebui să fie consemnate împreună cu numărul şi frecvenţa acestora pentru grupele tratate şi cele martor. Lacunele se consemnează şi se raportează separat, dar în general acestea nu se includ în frecvenţa totală a aberaţiilor. Dacă nu există dovezi privind diferenţa de răspunsuri între sexe, datele de la ambele sexe se pot combina pentru analiza statistică.

2.2. EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o creştere în funcţie de doză a numărului relativ de celule cu aberaţii cromozomiale sau o creştere clară a numărului de celule cu aberaţii dintr-o grupă cu o doză unică la un singur moment de prelevare. În primul rând, ar trebui să se aibă în vedere relevanţa biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge şi la ajutorul unor metode statistice (6). Semnificaţia statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferinţă printr-o modificare a condiţiilor de testare. O creştere a numărului de celule poliploide poate să indice faptul că substanţa de testat poate produce aberaţii ale numărului de cromozomi. O creştere a numărului de celule cu cromozomi enderoduplicaţi poate să indice faptul că substanţa de testat poate să inhibe avansarea ciclului celular (7) (8). Dacă rezultatele pentru o substanţă de testat nu îndeplinesc criteriile menţionate anterior, substanţa respectivă se consideră a fi nemutagenă în prezentul test. Deşi majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanţei de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de experimente efectuate. Rezultatele pozitive ale unui test de aberaţie cromozomială in vivo indică faptul că o substanţă provoacă aberaţii cromozomiale în măduva osoasă a speciei testate. Rezultatele negative indică faptul că, în condiţiile de testare, substanţa de testat nu provoacă aberaţii cromozomiale în măduva osoasă a speciei testate. Ar trebui discutată probabilitatea ca substanţa de testat sau metaboliţii acesteia să ajungă în circulaţia generală sau în mod specific în ţesutul-ţintă (de exemplu toxicitatea sistemică).

3. RAPORT

3. RAPORTUL DE TESTARE

Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:

Solventul/vehiculul:

justificarea alegerii vehiculului;

solubilitatea şi stabilitatea substanţei de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaşte.

Animalele de laborator:

specia/suşa utilizată;

numărul, vârsta şi sexul animalelor;

sursa, condiţiile de adăpost şi hrănire etc.;

greutatea fiecărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie şi deviaţia standard pentru fiecare grupă.

Condiţiile de testare:

martorii pozitivi şi negativi (solvent/vehicul);

datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dacă s-a realizat;

justificarea alegerii dozelor utilizate;

detalii privind prepararea substanţei de testat;

detalii privind administrarea substanţei de testat;

justificarea căii de administrare selectate;

metodele de verificare pentru a constata dacă substanţa de testat a ajuns în circulaţia generală sau în ţesutul-ţintă, dacă este cazul;

conversia concentraţiei substanţei de testat (ppm) în hrană/apa de băut în doza reală (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul;

detalii privind calitatea hranei şi a apei;

descrierea amănunţită a modalităţilor de tratare şi de prelevare a probelor;

metodele de măsurare a toxicităţii;

identitatea substanţei de inhibare a metafazei, concentraţia acesteia şi durata tratamentului;

metodele de preparare a lamelelor;

criteriile pentru numărătoarea aberaţiilor;

numărul de celule analizate per animal;

criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.

Rezultatele:

semnele de toxicitate;

indexul mitotic;

tipul şi numărul aberaţiilor, consemnate separat pentru fiecare animal;

numărul total de aberaţii pentru fiecare grupă împreună cu numărul mediu şi deviaţiile standard;

numărul de celule cu aberaţii pentru fiecare grupă împreună cu numărul mediu al acestora şi deviaţiile standard;

variaţiile ploidiei, dacă există;

relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;

analizele statistice, dacă există;

datele privind martorii negativi studiaţi în paralel;

datele anterioare privind martorii negativi, cu domeniile, valorile medii şi deviaţiile standard;

datele privind martorii pozitivi studiaţi în paralel.

Discutarea rezultatelor.

Concluzii.

4.1.2.3.4.5.6.7.8.

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds.). IRL Press, Oxford, Washington D. C., pp. 275-306. Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, 157-165. Richold, M., Chandly, A., Ashby, J., Gatehouse D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland, (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New Cork, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Tice, R. R. Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Paccierotti, F., Preston R. J., Romagna F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312. Fielder, R. J., Alleen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland, (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res. 119, pp. 403-413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1363-1364.

B.12. MUTAGENITATEA – TESTUL IN VIVO DE MICRONUCLEU PE ERITROCITE DE MAMIFERE

B.12.

1. METODĂ Prezenta metodă este reprodusă după Orientarea 474 a OCDE, Testul in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere (1997).

1.

1.1. INTRODUCERE Testul in vivo de micronucleu pe celule de mamifere se utilizează pentru detectarea leziunilor cromozomilor sau ale aparatului mitotic al eritroblaştilor produse de substanţa de testat; detectarea se realizează prin analiza eritrocitelor prelevate din măduva osoasă şi din celulele sângelui periferic ale animalelor, de obicei, rozătoare. Scopul testului de micronucleu este identificarea substanţelor care produc leziuni citogenetice ce determină formarea de micronuclee conţinând fragmente de cromozomi sau cromozomi întregi întârziaţi. Când un eritroblast din măduva osoasă evoluează într-un eritrocit policromatic, nucleul principal este expulzat; orice micronucleu care se formează poate să rămână în citoplasma anucleată. Micronucleele se vizualizează mai uşor în aceste celule cărora le lipseşte nucleul principal. O creştere a frecvenţei eritrocitelor policromatice micronucleate la animalele tratate indică producerea unei leziuni cromozomiale. În prezentul test se utilizează în mod curent măduva osoasă a rozătoarelor deoarece eritrocitele policromatice se produc în acest ţesut. Numărătoarea eritrocitelor (policromatice) imature micronucleate în sângele periferic este la fel de acceptabilă la toate speciile la care s-a demonstrat incapacitatea splinei de a elimina eritrocitele micronucleate sau care prezintă o sensibilitate specifică pentru detectarea agenţilor care produc aberaţii cromozomiale de natură structurală sau numerică. Există numeroase criterii care permit identificarea micronucleelor. Unul dintre acestea este identificarea prezenţei sau absenţei unui kinetocor sau a ADN centromeric în micronucleu. Frecvenţa eritrocitelor (policromatice) imature micronucleate este principalul criteriu. De asemenea, numărul de eritrocite (normocromatice) mature în sângele periferic care conţine micronuclee printre un număr dat de eritrocite mature se poate utiliza ca un criteriu în cazul tratării animalelor timp de patru săptămâni sau mai mult. Prezentul test in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere este relevant în special la evaluarea riscului mutagen, deoarece permite să se ţină seama de factorii de metabolism in vivo, de farmacocinetică şi de procesele de regenerare a ADN-ului, deşi aceştia pot să varieze între specii, între ţesuturi şi între efectele genetice. Un test in vivo este, de asemenea, util pentru studierea suplimentară a unui efect mutagen detectat într-un sistem in vitro. Dacă există dovezi că substanţa de testat sau un metabolit reactiv nu atinge ţesutul-ţintă utilizarea prezentului test nu este potrivită. A se vedea şi introducerea generală partea B.

1.2. DEFINIŢII Centromer (kinetocor): porţiune sau porţiuni dintr-un cromozom care în timpul diviziunii celulare este legată cu fibrele fusului mitotic, ceea ce permite deplasarea ordonată a cromozomilor fiice către polii celulelor fiice. Micronuclee: nuclee mici, separate de nucleele principale ale celulelor şi prezente în plus faţă de acestea, produse în timpul telofazei mitozei (meioză) de către fragmentele de cromozomi sau de cromozomii întregi întârziaţi. Eritrocit normocromatic: eritrocit matur lipsit de ribozomi şi care se poate distinge de eritrocitele policromatice imature cu ajutorul unor substanţe care colorează selectiv ribozomii. Eritrocit policromatic: eritrocit imatur, aflat într-un stadiu intermediar de dezvoltare, care mai conţine ribozomi şi, prin urmare, se poate distinge de eritrocitele normocromatice mature cu ajutorul substanţelor care colorează selectiv ribozomii.

1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Animalele sunt expuse la substanţa de testat printr-o cale de expunere corespunzătoare. Dacă se utilizează măduva osoasă, animalele se sacrifică la momente potrivite după tratament, se extrage măduva osoasă, se prepară şi se colorează lamelele (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Dacă se utilizează sângele periferic, acesta se colectează la momente potrivite după tratament, se depune pe lamele şi se colorează (4) (8) (9) (10). Pentru studiile cu sânge periferic, celulele ar trebui să se recolteze cât se poate de repede după ultima expunere. Lamelele preparate se examinează pentru a depista prezenţa micronucleelor.

1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.4.

1.4.1. Pregătire

1.4.1.

1.4.1.1. Selectarea speciilor de animale Dacă se utilizează măduvă osoasă, se recomandă şoareci şi şobolani, deşi se poate utiliza orice specie adecvată de mamifere. Când se utilizează sânge periferic, se recomandă şoareci. Cu toate acestea, se poate utiliza orice specie adecvată de mamifere, cu condiţia să fie o specie la care s-a demonstrat incapacitatea splinei de a elimina eritrocitele micronucleate sau care prezintă o sensibilitate specifică pentru detectarea agenţilor care produc aberaţii cromozomiale de natură structurală sau numerică. Se recomandă utilizarea unor animale adulte tinere din suşe utilizate în mod curent în laborator. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui să prezinte o variaţie minimă, ce nu trebuie să depăşească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex.

1.4.1.2. Condiţiile de adăpostire şi de hrănire Se aplică condiţiile generale menţionate în introducerea generală partea B, dar umiditatea atinsă ar trebui să fie de 50-60 %.

1.4.1.3. Pregătirea animalelor Animalele adulte tinere sănătoase se distribuie în mod aleatoriu în grupe martor şi grupe de tratament. Animalele sunt identificate individual. Se procedează la aclimatizarea animalelor la condiţiile de laborator timp de minimum cinci zile. Cuştile ar trebui să se aranjeze astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minim.

1.4.1.4. Pregătirea dozelor Substanţele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluţii sau suspensii în solvenţii sau vehiculele corespunzătoare şi să se dilueze, dacă este cazul, înainte de a fi administrate animalelor. Substanţele de testat lichide se pot administra direct sau dilua înainte de administrare. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanţă de testat, cu excepţia cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.

1.4.2. Condiţii de testare

1.4.2.

1.4.2.2. Martorii Pentru fiecare sex şi pentru fiecare test ar trebui să se prevadă martori pozitivi şi negativi (solvent/vehicul), utilizaţi în paralel. Cu excepţia tratamentului cu substanţa de testat, manipularea animalelor din grupele martor ar trebui să fie identică cu cea a animalelor din grupele tratate. Martorii pozitivi ar trebui să producă micronuclee in vivo la nivelurile de expunere preconizate a genera o creştere detectabilă în raport cu fondul. Dozele de martor pozitiv ar trebui să fie alese astfel încât să se obţină efecte clare, dar fără să releve imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. Pentru martorul pozitiv, se poate accepta administrarea pe o cale diferită de cea prin care se administrează substanţa de testat cu o singură prelevare a probelor. În plus, se poate avea în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceeaşi clasă de produse chimice, dacă sunt disponibili. În tabelul următor se prezintă exemple de substanţe care se pot utiliza ca martori pozitivi: Substanţa Nr. CAS Nr. EINECS metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7 N-etil-N-nitrozouree 759-73-9 212-072-2 mitomicină C 50-07-7 200-008-6 ciclofosfamidă ciclofosfamidă monohidrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 trietilenmelamină 51-18-3 200-083-5 Martorii negativi, trataţi doar cu solvent sau cu vehicul şi manipulaţi în acelaşi fel ca grupele tratate, ar trebui să fie incluşi la fiecare prelevare de probe, cu excepţia cazului în care se dispune de date acceptabile privind variabilitatea inter-animale şi frecvenţa incidenţei celulelor cu micronuclee, provenite de la martori anteriori. Dacă, pentru martorii negativi, se face o singură prelevare de probe, momentul cel mai potrivit pentru prelevarea probelor este momentul primei prelevări. În plus, ar trebui să se utilizeze şi martori netrataţi, cu excepţia cazului în care există date de la martori anteriori sau publicate să ateste că solventul/vehiculul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene. Dacă se utilizează sânge periferic, se poate accepta o probă prelevată înainte de tratament în calitate de martor negativ, dar doar în studiile de scurtă durată pe sânge periferic (de exemplu 1-3 tratamente), când datele rezultate se situează între limitele estimate pe baza datelor anterioare privind martorul.

1.5. MOD DE LUCRU

1.5.

1.5.1. Numărul şi sexul animalelor Fiecare grupă tratată şi martor include minimum cinci animale analizabile din fiecare sex (11). Dacă în momentul studiului există date disponibile din studii pe aceleaşi specii, în care s-a folosit aceeaşi cale de expunere, care să demonstreze lipsa unor diferenţe substanţiale de toxicitate între sexe, atunci va fi suficientă testarea pe animale de un singur sex. Dacă expunerea umană la produse chimice este specifică sexului, ca în cazul unor produse farmaceutice, testul ar trebui să se realizeze pe animale de sexul corespunzător.

1.5.2. Modalitatea de tratare Nu se poate recomanda un program de tratament standard (și anume unul, două sau mai multe tratamente la intervale de 24 de ore). Probele provenite de la un studiu cu administrare prelungită a dozelor sunt acceptabile, atâta timp cât pentru studiul respectiv s-a demonstrat un efect pozitiv sau, pentru un studiu negativ, atâta timp cât s-a demonstrat toxicitatea sau s-a utilizat doza-limită şi administrarea dozei a continuat până în momentul prelevării probelor. Pentru a facilita administrarea unui volum mare de material, substanţele de testat se pot administra şi în doză fracţionată, și anume două tratamente în aceeaşi zi, la un interval de câteva ore. Testul se poate realiza în două moduri: Dacă este relevant, se pot utiliza şi alte momente de prelevare a probelor.

1.5.2.

(a) Substanţa de testat se administrează animalelor într-o singură repriză. Probele de măduvă osoasă se prelevează de cel puţin două ori, prelevarea începând cel mai devreme la 24 de ore după tratament, fără să se prelungească mai mult de 48 de ore după tratament, cu intervale corespunzătoare între probe. Dacă prelevarea probelor se realizează mai devreme de 24 de ore după tratament, ar trebui să se justifice acest lucru. Probele de sânge periferic se prelevează cel puţin de două ori, dar nu mai devreme de 36 de ore după tratament, cu intervale corespunzătoare după prima probă şi nu trebuie să depăşească 72 de ore. Dacă la un moment de prelevare se înregistrează un rezultat pozitiv, prelevarea probelor încetează.

(b) Dacă se practică două sau mai multe tratamente zilnice (de exemplu două sau mai multe tratamente la intervale de 24 de ore), ar trebui ca prelevarea probelor să se realizeze o dată la un interval de timp cuprins între 18 şi 24 de ore după tratamentul final pentru măduva osoasă şi o dată într-un interval de timp cuprins între 36 şi 48 de ore după tratamentul final pentru sângele periferic (12).

1.5.3. Doze Dacă, în lipsa datelor corespunzătoare, se realizează un studiu pentru stabilirea dozelor, acesta ar trebui să se realizeze în acelaşi laborator şi să utilizeze aceeaşi specie, aceeaşi suşă de animale de acelaşi sex şi regimul de tratare să fie acelaşi ca cel ce urmează să fie utilizat în studiul principal (13). În caz de toxicitate, se utilizează trei doze diferite pentru prima prelevare. Aceste trei doze ar trebui să acopere un domeniu de toxicităţi de la toxicitate maximă până la toxicitate minimă sau netoxicitate. Pentru prelevările ulterioare se utilizează doar doza maximă. Doza maximă se defineşte ca doza ce produce astfel de semne de toxicitate, încât dozele mai mari, administrate în acelaşi mod, se estimează că sunt letale. Substanţele cu activitate biologică specifică la doze mici netoxice (cum ar fi hormonii şi mitogenii) pot face excepţie de la criteriile de stabilire a dozelor şi să fie stabilite pentru fiecare caz în parte. Doza maximă se mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate în măduva osoasă (de exemplu o reducere a proporţiei de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite din măduva osoasă sau din sângele periferic).

1.5.4. Test-limită Dacă un test realizat cu o doză de minimum 2000 mg/kg greutate corporală, administrată într-o singură repriză sau în două reprize în aceeaşi zi, nu produce efecte toxice detectabile şi dacă o genotoxicitate este improbabilă pe baza datelor referitoare la substanţe cu o structură apropiată, se poate considera că un studiu complet cu utilizarea a trei doze de mărimi diferite nu este necesar. Pentru studiile pe termen lung, doza-limită este de 2000 mg/kg greutate corporală/zi pentru un tratament de până la 14 zile şi de 1000 mg/kg greutate corporală/zi pentru un tratament mai lung de 14 zile. În funcţie de expunerea umană preconizată, s-ar putea să fie necesară o doză mai mare în testul-limită.

1.5.5. Administrarea dozelor Substanţa de testat se administrează, de obicei, prin cavitatea nazală cu ajutorul unui tub stomacal sau a unei canule de intubaţie adaptate sau printr-o injecţie intraperitoneală. Se pot accepta şi alte căi de administrare, dacă se pot justifica. Volumul maxim de lichid care se poate administra prin sondă gastrică introdusă prin cavitatea nazală sau prin injecţie într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul ar trebui să fie mai mic sau egal cu 2 ml/100 g greutate corporală. Utilizarea unor volume mai mari decât cel menţionat ar trebui să se justifice. Cu excepţia substanţelor iritante şi corozive care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentraţii mai mari, variaţia volumului testat ar trebui să fie redusă la minim prin ajustarea concentraţiei, astfel încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.

1.5.6. Prepararea măduvei osoase/a sângelui Celule de măduvă osoasă se extrag în mod curent din femur sau tibie imediat după sacrificare. De obicei, celulele se extrag din femur sau tibie, se depun pe lamele şi se colorează prin metodele stabilite. Sângele periferic se obţine din vena caudală sau alte vase de sânge corespunzătoare. Celulele sanguine se colorează imediat supravital (8) (9) (10) sau se întinde mai întâi pe lamele şi apoi se colorează. Utilizarea unui colorant specific pentru ADN [de exemplu oranj de acridină (14), Hoechst 33258 plus pironină –Y (15)] poate să elimine unele din artefacte datorită utilizării unui colorant nespecific pentru ADN. Avantajul menţionat nu exclude utilizarea coloranţilor convenţionali (de exemplu Giemsa). Se pot utiliza şi alte sisteme [de exemplu coloane de celuloză pentru eliminarea celulelor nucleate (16)], cu condiţia ca sistemele respective să se fi dovedit eficiente pentru prepararea micronucleelor în laborator.

1.5.7. Analiza Pentru fiecare animal se determină proporţia de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite (imature + mature) prin examinarea a cel puţin 200 de eritrocite pentru măduva osoasă şi 1000 de eritrocite pentru sângele periferic (17). Fiecare dintre lamele, inclusiv cele cu martori pozitivi şi negativi, ar trebui codificată independent, înainte de analiza microscopică. Se identifică minimum 2000 de eritrocite imature per animal pentru a determina incidenţa eritrocitelor imature micronucleate. Prin identificarea eritrocitelor mature pentru depistarea micronucleelor se pot obţine informaţii suplimentare. La examinarea lamelelor, proporţia de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite ar trebui să fie mai mare de 20 % faţă de valoarea martorilor. Dacă animalele sunt tratate în mod continuu timp de patru săptămâni sau mai mult, se pot identifica, de asemenea, cel puţin 2000 de eritrocite mature per animal pentru a constata incidenţa micronucleelor. Sistemele de analiză automată (analiza imaginii şi citometria de flux a suspensiilor de celule) se pot utiliza în locul evaluării manuale, dacă sunt validate şi justificate corespunzător.

2. DATE

2.

2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR Se recomandă prezentarea sub formă de tabel a datelor pentru fiecare animal. Unitatea experimentală este animalul. Pentru fiecare animal analizat se consemnează în tabel numărul de eritrocite imature examinate, numărul de eritrocite imature micronucleate şi numărul de eritrocite imature, în raport cu numărul total de eritrocite. Dacă animalele se tratează continuu timp de patru săptămâni sau mai mult, ar trebui să se prezinte şi datele privind eritrocitele mature, dacă s-a făcut colectarea acestora. Pentru fiecare animal se prezintă proporţia de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite şi, dacă se consideră că este cazul, procentul de eritrocite micronucleate. Dacă nu există dovezi privind diferenţa de răspunsuri între sexe, datele de la ambele sexe se pot combina pentru analiza statistică.

2.2. EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, cum ar fi o creştere în funcţie de doză a numărului de celule micronucleate sau o creştere clară a numărului de celule micronucleate dintr-o grupă cu o doză unică la un singur moment de prelevare. În primul rând, ar trebui să se aibă în vedere relevanţa biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge şi la ajutorul unor metode statistice (18) (19). Semnificaţia statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferinţă printr-o modificare a condiţiilor de testare. Dacă rezultatele pentru o substanţă de testat nu îndeplinesc criteriile menţionate anterior, substanţa respectivă se consideră a fi nemutagenă în prezentul test. Deşi majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în cazuri rare datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanţei de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile, independent de numărul de experimente. Rezultatele pozitive ale testului de micronucleu indică faptul că substanţa induce formarea de micronuclee ca urmare a leziunilor cromozomiale sau a leziunilor aparatului mitotic din eritroblaştii speciei testate. Rezultatele negative indică faptul că, în condiţiile de testare, substanţa de testat nu produce micronuclee în eritrocitele imature ale speciei testate. Ar trebui să fie discutată probabilitatea ca substanţa de testat sau metaboliţii acesteia să ajungă în circulaţia generală sau în mod specific în ţesutul-ţintă (de exemplu toxicitatea sistemică).

3. RAPORT

3. RAPORTUL DE TESTARE

Raportul de testare ar trebui să conţină următoarele informaţii:

Solventul/vehiculul:

justificarea alegerii vehiculului;

solubilitatea şi stabilitatea substanţei de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaşte.

Animalele de laborator:

specia/suşa utilizată;

numărul, vârsta şi sexul animalelor;

sursa, condiţiile de adăpost şi hrănire etc.;

greutatea fiecărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie şi deviaţia standard pentru fiecare grupă.

Condiţiile de testare:

martorii pozitivi şi negativi (solvent/vehicul);

datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dacă s-a realizat;

justificarea alegerii dozelor utilizate;

detalii privind prepararea substanţei de testat;

detalii privind administrarea substanţei de testat;

justificarea căii de administrare selectate;

metodele de verificare pentru a constata dacă substanţa de testat a ajuns în circulaţia generală sau în ţesutul-ţintă, dacă este cazul;

conversia concentraţiei substanţei de testat (ppm) în hrană/apa de băut în doza reală (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul;

detalii privind calitatea hranei şi a apei;

descrierea amănunţită a modalităţilor de tratare şi de prelevare a probelor;

metodele de preparare a lamelelor;

metodele de măsurare a toxicităţii;

criteriile pentru numărătoarea eritrocitelor imature micronucleate;

numărul de celule analizate per animal;

criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.

Rezultatele:

semnele de toxicitate;

proporţia de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite;

numărul de eritrocite imature micronucleate, prezentat separat pentru fiecare animal;

media ± deviaţia standard pentru eritrocitele imature micronucleate pentru fiecare grupă;

relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;

analizele statistice şi metodele aplicate;

datele privind martorii negativi studiaţi în paralel şi anterior testului;

datele privind martorii pozitivi studiaţi în paralel.

— Discutarea rezultatelor.

— Concluzii.

4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15. Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61-118. Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80. MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N., and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp., 555-558. MacGregor, J. T., Heddle, J. A., Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R. and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245-249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 153-159. Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), In Vivo, Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293-304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313-319. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247. MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, pp. 269-275. Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104. Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97-99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report, Part I, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

B.13/14. MUTAGENITATEA – TESTUL DE MUTAŢIE INVERSĂ PE BACTERII

B.13/14.

1. METODĂ Prezenta metodă este reprodusă după Orientarea 471 a OCDE, Testul de mutaţie inversă pe bacterii (1997).

1.

1.1. INTRODUCERE Testul bacterian de mutaţie inversă se bazează pe suşe de Salmonella typhimurium şi Escherichia coli, care necesită aminoacizi, şi urmăreşte detectarea mutaţiilor punctiforme, care includ substituţia, adăugarea sau deleţia uneia sau a câtorva perechi de bază din ADN (1) (2) (3). Principiul prezentului test bacterian de mutaţie inversă constă în detectarea mutaţiilor care reîntorc mutaţiile, prezente în suşele experimentale, în starea iniţială şi refac funcţionalitatea bacteriilor de a sintetiza un aminoacid esenţial. Bacteriile de inversare se detectează datorită capacităţii lor de a se dezvolta în absenţa aminoacidului necesar pentru suşa parentală experimentală. Mutaţiile punctiforme sunt cauza multor maladii genetice umane şi există dovezi substanţiale că mutaţiile din oncogene şi genele supresoare de tumori din celulele somatice sunt implicate în formarea tumorilor la oameni şi animalele de laborator. Testul bacterian de mutaţie inversă este rapid, ieftin şi relativ uşor de realizat. Multe dintre suşele experimentale au câteva particularităţi care le fac mai sensibile pentru detectarea de mutaţii, inclusiv secvenţe de ADN sensibile la mutaţii în locurile de inversare, permeabilitate celulară crescută pentru moleculele mari şi eliminarea sistemelor de regenerare a ADN sau intensificarea proceselor care au tendinţa să inducă erori în timpul regenerării ADN. Specificitatea suşelor experimentale poate să furnizeze informaţii utile privind tipurile de mutaţii care sunt induse de către agenţii genotoxici. O bază de date cu un număr mare de rezultate, pentru structuri foarte variate, este disponibilă pentru testele bacteriene de mutaţii inverse şi au fost elaborate metodologii bine stabilite pentru testarea produselor chimice cu diferite proprietăţi fizico-chimice, inclusiv a compuşilor volatili. A se vedea introducerea generală partea B.

1.2. DEFINIŢII Un test de mutaţie inversă, fie la Salmonella typhimurium, fie la Escherichia coli, detectează mutaţia într-o suşă care necesită un aminoacid (histidină sau respectiv triptofan) pentru a produce o suşă independentă de aportul exterior de aminoacid. Mutageni care provoacă substituţia perechilor de bază sunt agenţi care provoacă substituirea unei baze din ADN. Într-un test de reversie, acest tip de modificare poate să se producă la locul mutaţiei iniţiale sau într-un al doilea loc în genomul bacterian. Mutageni de decalare a cadrului de citire sunt agenţi care produc adăugarea sau deleţia uneia sau a mai multor perechi de bază din ADN, modificând astfel cadrul de citire în ARN.

1.3. CONSIDERAŢII PRELIMINARE Testul bacterian de mutaţie inversă utilizează celule procariote, care diferă de celulele mamiferelor în privinţa absorbţiei, a metabolismului, a structurii cromozomilor şi a proceselor de regenerare a ADN. Pentru testele realizate in vitro este necesară în general o sursă exogenă de activare metabolică. Sistemele de activare metabolică in vitro nu pot să reproducă în totalitate condiţiile metabolismului celulelor de mamifere in vivo. Testul nu furnizează, prin urmare, informaţii directe privind capacitatea mutagenă şi cancerigenă a unei substanţe la mamifere. Testul bacterian de mutaţie inversă se utilizează, de obicei, pentru o primă triere a activităţii genotoxice, în special pentru detectarea mutaţiei punctiforme. O bogată bază de date demonstrează că multe produse chimice care dau rezultate pozitive în prezentul test prezintă activitate mutagenă şi în alte teste. Există exemple de agenţi mutageni care nu se detectează prin acest test; aceste deficienţe se pot explica prin natura specifică a efectului detectat, activării metabolice diferite sau biodisponibilităţii diferite. Pe de altă parte, factorii care cresc sensibilitatea testului bacterian de mutaţie inversă pot să conducă la o supraestimare a activităţii mutagene. S-ar putea ca testul bacterian de mutaţie inversă să nu fie potrivit pentru evaluarea anumitor clase de substanţe chimice, de exemplu compuşii cu acţiune bactericidă puternică (de exemplu anumite antibiotice) sau cei despre care se consideră (sau se ştie) că interferează în mod specific cu sistemele de replicare a celulelor de mamifere (de exemplu unii inhibitori de topoizomerază şi unii analogi de nucleozide). În aceste cazuri, s-ar putea ca testele de mutaţie pe celule de mamifere să fie mai potrivite. Deşi mulţi compuşi care dau rezultate pozitive în prezentul test sunt cancerigene pentru mamifere, corelaţia nu este absolută. Aceasta depinde de clasa de substanţe chimice şi există agenţi cancerigeni care nu se detectează cu prezentul test, deoarece acţionează prin alte mecanisme negenotoxice sau mecanisme care nu sunt prezente în celulele bacteriene.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Suspensiile de celule bacteriene sunt expuse la substanţa de testat în prezenţa şi în absenţa unui sistem exogen de activare metabolică. În procedeul de încorporare prin depunere pe o placă, suspensiile menţionate se amestecă cu o geloză de acoperire (agar) şi se depun imediat pe un mediu minimal. În procedeul cu preincubare, amestecul de tratare se incubează şi apoi se amestecă cu geloza de acoperire înaintea depunerii pe un mediu minim. Pentru ambele metode, după două sau trei zile de incubare, coloniile care produc inversarea se numără şi numărul obţinut se compară cu cel al coloniilor spontane de inversare aflate pe plăci cu martor tratate cu solvent. Sunt descrise câteva proceduri pentru realizarea testului bacterian de mutaţie inversă. Printre cele utilizate în mod curent sunt metoda de încorporare prin depunere (1) (2) (3) (4), metoda cu preincubare (2) (3) (5) (6) (7) (8), metoda fluctuaţiei (9) (10) şi metoda cu suspensie (11). Sunt descrise modificări pentru testarea substanţelor în stare gazoasă sau de vapori (12). În prezenta metodă se descrie modul de lucru pentru procedeul de încorporare prin depunere şi pentru cel cu preincubare. Oricare dintre acestea se poate accepta pentru realizarea experimentelor, atât cu activare metabolică, cât şi fără aceasta. Pentru unele substanţe, este mai eficientă detectarea prin procedeul cu preincubare. Substanţele respective aparţin unor clase chimice care includ nitrozamine alifatice cu lanţ scurt, metale bivalente, aldehide, coloranţi azoici şi diazoderivaţii, alcaloizi ai pirolizidinei, compuşi alchilici şi nitroderivaţi (3). De asemenea, se admite că unele clase de mutageni nu se detectează întotdeauna prin procedee standard, ca încorporarea prin depunere sau procedeul cu incubare. Ar trebui să se considere că acestea sunt cazuri izolate şi se recomandă cu tărie utilizarea unor procedee alternative pentru detectarea lor. Din categoria cazuri izolate este posibilă identificarea (împreună cu exemple de procedeele care se pot utiliza pentru detectarea acestora) a următoarelor cazuri: coloranţi azoici şi compuşi diazoici (3) (5) (6) (13), cei în stare gazoasă şi volatili (12) (14) (15) (16) şi glicozidele (17) (18). Orice deviaţie de la procedura standard necesită o justificare ştiinţifică.

1.5. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.5.

1.5.1. Pregătire

1.5.1.

1.5.1.1. Bacteriile Culturile proaspete de bacterii ar trebui lăsate să se dezvolte până la finalul fazei exponenţiale sau debutul fazei staţionare de creştere (aproximativ 109 celule pe ml). Culturile aflate în faza staţionară finală nu ar trebui să se utilizeze. Este esenţial ca în experiment să se utilizeze culturi cu titru mare de bacterii viabile. Titrul se poate determina, fie plecând de la datele anterioare privind curbele de creştere ale culturilor martor, fie pentru fiecare test, prin determinarea numărului de celule viabile prin etalare. Temperatura de incubare recomandată este de 37 oC. Se recomandă utilizarea a minimum cinci suşe de bacterii. Acestea ar trebui să includă patru suşe de S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 sau TA97a sau TA97; TA98 şi TA100) pentru care comparaţiile între laboratoare au indicat că sunt fiabile şi dau răspunsuri reproductibile. Cele patru suşe de S. typhimurium menţionate posedă perechi de bază GC în primul situs de reversie şi se cunoaşte că acestea nu pot să detecteze anumiţi agenţi mutageni oxidanţi, agenţi de reticulare şi unele hidrazine. Detectarea acestor substanţe este posibilă cu ajutorul suşelor de E. coli WP2 sau de S. typhimurium TA102 (19) care posedă o pereche de bază AT în situsul primar de reversie. Combinaţia de suşe recomandată este, prin urmare, următoarea: Pentru detectarea agenţilor mutageni de reticulare s-ar putea prefera includerea suşei TA102 sau adăugarea unei suşe de E. coli capabile de regenerarea ADN [de exemplu E. coli WP2 sau E. coli WP2 (pKM101)]. Ar trebui să se utilizeze procedurile stabilite pentru prepararea culturilor de rezervă, verificarea markerilor şi pentru păstrare. Pentru fiecare preparat de cultură de rezervă congelată, ar trebui să se demonstreze necesitatea prezenţei unui aminoacid pentru dezvoltarea culturii (histidină pentru suşele S. typhimurium şi triptofan pentru suşele E. coli). Ar trebui să se verifice şi alte caracteristici ale fenotipului, de exemplu: prezenţa sau absenţa plasmidelor factorului R (rezistenţă), dacă este cazul [și anume rezistenţa la ampicilină a suşelor TA98, TA100, TA97a sau TA97, WP2 uvrA şi WP2 uvrA (pKM101) şi rezistenţa la ampicilină + tetraciclină a suşei TA102]; prezenţa mutaţiilor caracteristice (și anume mutaţia rfa în S. typhimurium prin sensibilizare la cristal violet şi mutaţia uvrA în E. coli sau mutaţia uvrB în S. typhimurium prin sensibilizare la lumina ultravioletă) (2) (3). De asemenea, suşele ar trebui să producă un număr de colonii spontane de reversie pe fiecare placă, între limitele de frecvenţă estimate pe baza datelor de laborator anterioare şi, de preferinţă, între limitele semnalate în literatura de specialitate.

S. typhimurium TA1535; şi

S. typhimurium TA1537 sau TA97 sau TA97a; şi

S. typhimurium TA98; şi

S. typhimurium TA100; şi

E. coli WP2 uvrA sau E. coli WP2 uvrA (pKM101) sau S. typhimurium TA102.

1.5.1.2. Mediul Se utilizează o geloză minimală corespunzătoare (de exemplu una care conţine mediu minimal E Vogel-Bonner şi glucoză) şi o geloză de acoperire care conţine histidină şi biotin sau triptofan pentru a permite divizarea doar a unui număr mic de celule (1) (2) (9).

1.5.1.3. Activarea metabolică Expunerea bacteriilor la substanţa de testat ar trebui să se realizeze atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem corespunzător de activare metabolică. Sistemul utilizat cel mai frecvent conţine o fracţie post mitocondrială îmbogăţită cu un cofactor (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu agenţi de inducţie enzimatică, de exemplu Aroclor 1254 (1) (2) sau un amestec de fenobarbitonă şi β-naftoflavonă (18) (20) (21). Fracţia postmitocondrială se utilizează, de obicei, la concentraţii cuprinse între 5 şi 30 % v/v în amestecul S9. Alegerea şi compoziţia unui sistem de activare metabolică pot să depindă de clasa chimică a substanţei de testat. În unele cazuri, s-ar putea să fie convenabilă utilizarea mai multor concentraţii ale fracţiei postmitocondriale. Pentru coloranţii azoici şi diazoderivaţi, s-ar putea să fie mai potrivită utilizarea unui sistem de activare metabolică reducător (6) (13).

1.5.1.4. Substanţa de testat/Preparare Substanţele de testat în stare solidă ar trebui să se prepare sub formă de soluţii sau suspensii în solvenţii sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului bacteriilor. Substanţele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele de testare şi se diluează înainte de utilizare în tratamentul bacteriilor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanţă de testat, cu excepţia cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare. Solventul/vehiculul nu ar trebui să reacţioneze chimic cu substanţa de testat şi nu ar trebui să afecteze supravieţuirea bacteriilor şi activitatea S9 (22). Utilizarea altor solvenţi/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos. Când se testează substanţe instabile în apă, solventul organic utilizat ar trebui să nu conţină apă.

1.5.2. Condiţii de testare

1.5.2.

1.5.2.1. Suşele experimentale (a se vedea 1.5.1.1)

1.5.2.2. Concentraţia de expunere Printre criteriile care trebuie luate în consideraţie la determinarea cantităţii maxime de substanţă de testat ce urmează se utilizeze sunt citotoxicitatea şi solubilitatea în amestecul final de tratare. Ar putea fi util un test preliminar pentru determinarea toxicităţii şi caracteristicilor de solubilitate. Detectarea citotoxicităţii poate fi posibilă printr-o reducere a numărului de colonii care provoacă reversia, o clarificare şi diminuare a fondului de bacterii sau a gradului de supravieţuire a culturilor tratate. Prezenţa sistemelor de activare metabolică poate să influenţeze citotoxicitatea unei substanţe. Insolubilitatea ar trebui să fie evaluată prin formarea în amestecul final, în condiţii de testare reale, a unui precipitat vizibil cu ochiul liber. Concentraţia de testare maximă recomandată pentru substanţele necitotoxice solubile este de 5 mg/placă sau 5 μl/placă. Pentru substanţele necitotoxice insolubile la 5 mg/placă sau 5 μl/placă, una sau mai multe din concentraţiile de testare ar trebui să fie insolubile în amestecul final de tratament. Pentru substanţele de testat care sunt deja citotoxice la concentraţii mai mici de 5 mg/placă sau 5 μl/placă, testarea ar trebui să se realizeze până la o concentraţie citotoxică. Ar trebui ca precipitatul să nu interfereze cu evaluarea rezultatelor. Într-un test iniţial, se recomandă utilizarea unui număr minim de cinci concentraţii analizabile diferite, cu intervale între punctele de testare de aproximativ o semiunitate logaritmică (și anume √10). Pentru stabilirea unei relaţii concentraţie – răspuns, intervale menţionate mai reduse ar putea fi mai adecvate. Când se evaluează substanţe cu un conţinut substanţial de posibile impurităţi mutagene, s-ar putea avea în vedere testarea la concentraţii mai mari de 5 mg/placă sau 5 μl/placă.

1.5.2.3. Martorii negativi şi pozitivi Martorii pozitivi specifici suşei şi martorii negativi (solvent sau vehicul) utilizaţi în paralel, ar trebui să se includă în fiecare test, atât în prezenţa, cât şi în absenţa activării metabolice. Pentru martorii pozitivi, ar trebui să fie selectate acele concentraţii care permit să se demonstreze eficienţa testului realizat. Pentru testele care utilizează un sistem de activare metabolică, selectarea substanţei sau a substanţelor de referinţă pentru martorii pozitivi ar trebui să se realizeze în funcţie de tipul suşelor bacteriene utilizate. În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanţe care se pot utiliza ca martori pozitivi pentru testele cu activare metabolică: Nr. CAS Nr. EINECS Substanţa 781-43-1 212-308-4 9,10-dimetilantracen 57-97-6 200-359-5 7,12-dimetilbenz[a]antracen 50-32-8 200-028-5 benzo[a]piren 613-13-8 210-330-9 2-aminoantracen 50-18-0 ciclofosfamidă 6055-19-2 200-015-4 ciclofosfamidă monohidrat Următoarea substanţă este un martor pozitiv adecvat pentru metoda de activare metabolică reductivă: 573-58-0 209-358-4 Roşu de Congo 2-aminoantracenul nu ar trebui să se utilizeze ca indicator unic al eficienţei amestecului S9. Dacă se utilizează 2-aminoantracenul, fiecare lot de S9 ar trebui să fie, de asemenea, caracterizat cu un mutagen care necesită o activare metabolică de către enzimele microzomiale, de exemplu benzo[a]pirenul, dimetilbenzantracenul. În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanţe care se pot utiliza ca martori pozitivi specifici suşei pentru testele realizate fără un sistem de activare metabolică exogenă: Nr. CAS Nr. EINECS Substanţa Suşa 26628-22-8 247-852-1 azidă de sodiu TA 1535 şi TA 100 607-57-8 210-138-5 2-nitrofluoren TA 98 90-45-9 201-995-6 9-aminoacridină TA 1537, TA 97 şi TA 97a 17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 şi TA 97a 80-15-9 201-254-7 hidroperoxid de cumenă TA 102 50-07-7 200-008-6 mitomicin C WP2 uvrA şi TA 102 70-25-7 200-730-1 N-etil-N-nitro-N-nitrozoguanidină WP2, WP2 uvrA şi WP2uvrA(pKM101) 56-57-5 200-281-1 4-nitrochinolină-1-oxid WP2, WP2 uvrA şi WP2uvrA(pKM101) 3688-53-7 furilfuramidă (AF2) suşe cu conţinut de plasmid Se pot utiliza şi alte substanţe de referinţă ca martori pozitivi corespunzători. Ar trebui să se aibă în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceeaşi clasă chimică, dacă sunt disponibili. Ar trebui să se utilizeze martori negativi, constituiţi din solvent sau vehicul fără substanţa de testat, dar trataţi în acelaşi mod ca grupele cu tratament. În plus, ar trebui să se utilizeze şi martori netrataţi, cu excepţia cazului în care există date din testele anterioare care să ateste că solventul ales nu are efecte dăunătoare sau mutagene.

1.5.3. Mod de lucru Pentru metoda de încorporare prin depunere pe o placă (1) (2) (3) (4), fără activare metabolică, se prepară, de obicei, un amestec din 0,05 ml sau 0,1 ml de soluţie de testat, 0,1 ml de cultură bacteriană proaspătă (ce conţine aproximativ 108 celule viabile) şi 0,5 ml de tampon steril cu 2,0 ml geloză de acoperire (agar). Pentru testul cu activare metabolică, se prepară, de obicei, un amestec din 0,5 ml preparat de activare metabolică, ce conţine o cantitate specifică de fracţie postmitocondrială (în proporţie de 5 până la 30 % v/v în preparatul de activare metabolică), 2,0 ml de geloză de acoperire, bacterii şi substanţa de testat/soluţia de testat. Conţinutul din fiecare eprubetă se agită şi se toarnă pe suprafaţa unui mediu minimal de geloză depus pe placă. Geloza de acoperire se lasă să se solidifice înainte de incubare. Pentru metoda de preincubare (2) (3) (5) (6), substanţa de testat/soluţia de testat se supune la preincubare împreună cu suşa experimentală (ce conţine aproximativ 108 celule viabile) şi cu tamponul steril sau sistemul de activare metabolică (0,5 ml) de obicei timp de 20 de minute sau mai mult, la 30-37 oC, înainte de a fi amestecată cu geloza de acoperire şi turnată pe suprafaţa unui mediu minimal de geloză depus pe placă. De obicei, se prepară un amestec din 0,05 ml sau 0,1 ml de substanţă de testat/soluţie de testat, 0,1 ml bacterii şi 0,5 ml amestec S9 sau tampon steril cu 2,0 ml geloză de acoperire. Eprubetele ar trebui să fie aerate cu ajutorul unui agitator în timpul preincubării. Pentru o bună estimare a variaţiei, ar trebui să se utilizeze câte trei plăci cu depuneri pentru fiecare doză. Se acceptă utilizarea a doar două plăci cu depuneri, dacă se justifică ştiinţific acest lucru. Pierderea ocazională a unei plăci nu invalidează în mod necesar testul. Substanţele în stare gazoasă sau cele volatile ar trebui să fie testate în condiţii corespunzătoare, de exemplu în vase închise ermetic (12) (14) (15) (16).

1.5.4. Incubarea Toată plăcile dintr-un test dat ar trebui să fie incubate la 37 oC timp de 48-72 de ore. După incubare, se procedează la numărătoarea coloniilor care provoacă reversia de pe fiecare placă.

2. DATE

2.

2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR Datele ar trebui să se prezinte sub forma numărului de colonii care provoacă reversia de pe fiecare placă. De asemenea, ar trebui să se prezinte numărul de colonii care provoacă reversie, atât pe plăcile cu martor negativ (martor solvent şi martor netratat, dacă s-a utilizat), cât şi pentru plăcile cu martor pozitiv. Ar trebui să se prezinte numărătoarea pentru fiecare placă, numărul mediu de colonii care provoacă reversia pentru fiecare placă şi deviaţia standard pentru substanţa de testat şi pentru martorii pozitivi şi negativi (netrataţi şi solvent). Nu este necesară verificarea unui răspuns clar pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferinţă prin modificarea uneia dintre condiţiile de testare. Rezultatele negative necesită confirmare pentru fiecare caz. În cazurile în care se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, ar trebui să se ofere o justificare. Pentru testele de confirmare ar trebui să se aibă în vedere modificarea condiţiilor de testare pentru lărgirea gamei de condiţii evaluate. Condiţiile de testare care ar putea fi modificate includ diferenţa dintre concentraţii, metoda de tratament (încorporarea prin depunere pe placă sau preincubarea în mediu lichid) şi condiţiile de activare metabolică.

2.2. EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, precum creşterea în funcţie de concentraţie peste intervalul testat şi o creştere reproductibilă a uneia sau mai multor concentraţii ale numărului de colonii care provoacă reversia per placă, la cel puţin o suşă cu sau fără sistem de activare metabolică (23). În primul rând ar trebui să se aibă în vedere relevanţa biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge şi la ajutorul unor metode statistice (24). Semnificaţia statistică nu ar trebui să fie totuşi singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. Dacă rezultatele pentru o substanţă de testat nu îndeplinesc criteriile menţionate anterior, substanţa respectivă se consideră a fi nemutagenă în prezentul test. Deşi majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanţei de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile, independent de numărul de experimente. Rezultatele pozitive ale unui test de mutaţie bacteriană inversă indică faptul că substanţa de testat induce mutaţii punctiforme prin substituirea bazelor sau decalarea cadrului de citire în genomul de Salmonella typhimurium şi/sau Escherichia coli. Rezultatele negative indică faptul că, în condiţii de testare, substanţa de testat nu este mutagenă pentru speciile testate.

3. RAPORT

3. RAPORTUL DE TESTARE

Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:

Solventul/vehiculul:

justificarea alegerii vehiculului;

solubilitatea şi stabilitatea substanţei de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaşte.

Suşele:

suşele utilizate;

numărul de celule per cultură;

caracteristicile suşei.

Condiţiile de testare:

cantitatea de substanţă de testat per placă (mg/placă sau μl/placă) cu justificarea alegerii dozei şi numărului de plăci per concentraţie;

mediile utilizate;

tipul şi compoziţia sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate;

procedurile de tratament.

Rezultatele:

semnele de toxicitate;

semnele de precipitare;

numărătoarea pentru fiecare placă;

numărul mediu de colonii care provoacă reversia pentru fiecare placă şi deviaţia standard;

relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;

analizele statistice, dacă există;

datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi studiaţi în paralel, cu domenii, valori medii şi deviaţii standard;

datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi studiaţi anterior, cu domenii, valori medii şi deviaţii standard.

Discutarea rezultatelor.

Concluzii.

4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233. Kier, L. D., Brusick, D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69-240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, pp. 91-96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285. Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61. Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, pp. 167-177. Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutations Res., 38, pp. 33-42. Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and J. W. Bridges (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161. Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453-465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335-344. Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47. Zeiger, E., Anderson B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141. Simmon, V., Kauhanen K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258. Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M. and Sugimura T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salomonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780-3782. Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285-291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Tatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350. Claxton, L. D., Allen J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91. Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, pp. 28-65.

B.15. TESTE DE MUTAGENEZĂ ŞI DE DEPISTARE A CANCEROGENEZEI MUTAŢIA GENICĂ – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.15.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE A se vedea introducerea generală partea B.

1.2. DEFINIŢIE A se vedea introducerea generală partea B.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Pentru a măsura producerea mutaţiilor genice induse de agenţi chimici, cu sau fără activare metabolică, pot fi folosite diverse suşe haploide şi diploide ale drojdiei Saccharomyces cerevisiae. Au fost utilizate metode de producere a mutaţiilor directe în suşe haploide, cum ar fi măsurarea transformării din mutanţi roşii, care au nevoie de adenină (ade-1, ade-2), în mutanţi albi cu nevoi duble de adenină, şi metode selective cum ar fi inducerea rezistenţei la canavnaină şi cicloheximidă. Cel mai folosit sistem de mutaţie inversă validat presupune folosirea suşei haploide XV 185-14C, care conţine mutaţii nonsens de codon ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 şi trp 5-48, reversibile prin acţiunea agenţilor mutageni responsabili de substituţia de bază, care induc mutaţii într-un situs specific sau mutaţii supresive de codon. Suşa XV 185-14C conţine, de asemenea, markerul his 1-7 cu o mutaţie cu sens greşit inversată, în special prin mutaţii în al doilea situs, şi markerul hom 3-10 care este inversat de agenţi mutageni care conduc la decalarea cadrului de citire a codului genetic (frameshift mutagens). Dintre suşele diploide de Saccharomyces cerevisiae, singura suşă folosită pe scară largă este D7, care este homozigotă pentru ilv 1-92.

1.5. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6. Pregătire

Soluţiile substanţelor de testare, precum şi soluţiile martor trebuie să fie preparate imediat înaintea testării, utilizându-se un vehicul corespunzător. În cazul compuşilor organici insolubili în apă, trebuie să se utilizeze soluţii de cel mult 2 % v/v solvenţi organici cum ar fi etanolul, acetona sau dimetilsulfoxidul (DMSO). Concentraţia finală a vehiculului nu trebuie să afecteze semnificativ viabilitatea celulară şi caracteristicile de creştere.

Activare metabolică

Celulele trebuie expuse la substanţele de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem exogen de activare metabolică. Cel mai utilizat sistem este o fracţiune postmitocondrială suplimentată cu un cofactor preparat din ficatul de rozătoare tratate cu inductori enzimatici. Pentru activarea metabolică, pot fi folosite şi alte specii, ţesuturi, fracţiuni postmitocondriale sau alte metode.

Condiţii de testare

Suşe testate

Suşele cel mai des utilizate în studiile de mutageneză sunt suşa haploidă XV 185-14C şi suşa diploidă D7. Se pot utiliza şi alte suşe.

Medii de cultură

Pentru stabilirea numărului de colonii supravieţuitoare şi mutante sunt utilizate medii de cultură corespunzătoare.

Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi

Martorii pozitivi, cei netrataţi şi cei trataţi cu solvent trebuie preparaţi simultan. Pentru fiecare mecanism mutagen specific se folosesc substanţe martor pozitiv adecvate.

Concentraţia de expunere

Trebuie folosite cel puţin cinci concentraţii ale substanţei de testat, cu intervale corespunzătoare între acestea. În cazul substanţelor toxice, cea mai mare concentraţie testată nu trebuie să reducă supravieţuirea la mai puţin de 5-10 %. Substanţele relativ insolubile în apă se testează până la limita de solubilitate, folosindu-se metode adecvate. Pentru substanţele netoxice cu un grad ridicat de solubilitate în apă, limita superioară a concentraţiei se determină de la caz la caz.

Condiţii de incubare

Cutiile se incubează timp de 4-7 zile, la o temperatură de 28-30 oC, la întuneric.

Frecvenţele mutaţiilor spontane

Se folosesc subculturi celulare cu o frecvenţă a mutaţiilor spontane în limitele normale admise.

Numărul replicilor

Pentru analiza prototrofilor produşi prin mutageneză şi a viabilităţii celulare se utilizează cel puţin trei replici pentru fiecare concentraţie. În cazul experimentelor în care se utilizează markeri cum ar fi hom 3-10 cu o rată scăzută a mutaţiilor, numărul replicilor trebuie să crească, astfel încât să se poată obţină rezultate relevante din punct de vedere statistic.

Mod de operare

Tratamentul suşelor de Saccharomyces cerevisiae se realizează de obicei printr-o metodă de testare în lichid, care presupune utilizarea fie de celule staţionare, fie de celule în creştere. Experimentele iniţiale trebuie realizate pe celule în creştere: 1-5 × 107 celule/ml sunt expuse la substanţa chimică de testat pe o perioadă de 18 ore, la o temperatură de 28-37 oC, cu agitare; dacă este necesar; pe parcursul expunerii, se adaugă o cantitate corespunzătoare de sistem de activare metabolică. La sfârşitul tratamentului, celulele sunt centrifugate, spălate şi însămânţate pe un mediu de cultură potrivit. După incubare, plăcile sunt inventariate în vederea stabilirii ratei de supravieţuire şi a mutaţiilor genice produse. Dacă primul experiment este negativ, trebuie realizat un al doilea experiment, folosind celule în fază staţionară. Dacă primul experiment este pozitiv, acesta trebuie confirmat printr-un experiment independent adecvat.

2. DATE Datele se prezintă într-un tabel, indicându-se numărul coloniilor, numărul mutanţilor, nivelul de supravieţuire şi frecvenţa mutanţilor. Toate rezultatele trebuie confirmate printr-un experiment independent. Toate rezultatele observate se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:

suşele folosite;

condiţiile de testare: celule în faza staţionară sau celule în creştere, compoziţia mediilor de cultură, temperatura de incubare şi durata acesteia, sistemul de activare metabolică;

condiţiile de tratament: niveluri de expunere, metoda şi durata tratamentului, temperatura la care se realizează tratamentul, martori pozitivi şi negativi;

numărul coloniilor, numărul mutanţilor, nivelul de supravieţuire şi frecvenţa mutanţilor, relaţia doză/răspuns (după caz), evaluarea statistică a datelor;

discutarea rezultatelor;

interpretarea rezultatelor.

3.2. EVALUARE ŞI INTERPRETARE A se vedea introducerea generală partea B.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE A se vedea introducerea generală partea B.

B.16. RECOMBINAREA MITOTICĂ – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.16.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE A se vedea introducerea generală partea B.

1.2. DEFINIŢIE A se vedea introducerea generală partea B.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE La Saccharomyces cerevisiae se poate decela recombinarea mitotică intergenică (sau, mai general, între o genă şi centromerul său) şi intragenică. Prima situaţie este denumită crossing-over mitotic şi dă naştere unor schimburi reciproce de material genetic, în timp ce a doua situaţie, în care schimburile sunt, cel mai adesea, nereciproce, este denumită conversie genică. Crossing-over-ul se determină, în general, prin producerea de colonii homozigote recesive sau sectoare produse într-o suşă heterozigotă, în timp ce conversia genică se determină prin producerea de revertanţi prototrofici într-o suşă auxotrofică heteroalelică, purtătoare a două alele defective diferite ale aceleiaşi gene. Suşele cele mai folosite la decelarea conversiei genice mitotice sunt D4 (heteroalelică la ade 2 şi trp 5), D7 (heteroalelică la trp 5), BZ34 (heteroalelică la arg 4) şi JD1 (heteroalelică la his 4 şi trp 5). Crossing-over-ul mitotic care produce sectoare homozigote roşu şi roz poate fi analizat în D5 sau în D7 (care măsoară, de asemenea, conversia genică mitotică şi mutaţia inversă la ilv 1-92), ambele suşe fiind heteroalelice pentru alelele complementare ale ade 2.

1.5. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6. Pregătire

Soluţiile substanţelor chimice de testat şi ale compuşilor martor sau de referinţă trebuie preparate chiar înaintea testării, folosind un vehicul corespunzător. În cazul compuşilor organici insolubili în apă, trebuie utilizate soluţii de cel mult 2 % v/v de solvenţi organici cum ar fi etanolul, acetona sau dimetilsulfoxidul (DMSO). Concentraţia finală a vehiculului nu trebuie să afecteze semnificativ viabilitatea celulară şi caracteristicile de creştere.

Activare metabolică

Celulele trebuie să fie expuse la substanţele chimice de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem exogen adecvat de activare metabolică. Sistemul folosit cel mai des este o fracţiune postmitocondrială suplimentată cu un cofactor preparat din ficatul de rozătoare tratate cu inductori enzimatici. Pentru activarea metabolică pot fi utilizate şi alte specii, ţesuturi, fracţiuni postmitocondriale sau alte metode.

Condiţiile de testare

Suşe testate

Suşele cel mai frecvent utilizate sunt cele diploide D4, D5, D7 şi JD1. Pot fi utilizate şi alte suşe.

Medii de cultură

Pentru a determina nivelul de supravieţuire şi frecvenţa recombinărilor mitotice se utilizează medii de cultură adecvate.

Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi

Martorii pozitivi, cei netrataţi şi cei trataţi cu solvent, trebuie preparaţi simultan. Pentru fiecare tip specific de recombinare se folosesc substanţe martor pozitiv adecvate.

Concentraţii de expunere

Trebuie realizate cel puţin cinci concentraţii ale substanţei de testat, cu intervale corespunzătoare între acestea. Printre factorii care trebuie luaţi în considerare se numără citotoxicitatea şi solubilitatea. Concentraţia minimă nu trebuie să afecteze viabilitatea celulară. În cazul substanţelor toxice, cea mai mare concentraţie testată nu trebuie să reducă supravieţuirea la mai puţin de 5-10 %. Substanţele relativ insolubile în apă trebuie să fie testate până la limita solubilităţii, folosindu-se metode adecvate. În cazul substanţelor netoxice cu un grad ridicat de solubilitate în apă, limita superioară a concentraţiei se determină de la caz la caz. Celulele pot fi expuse la substanţele chimice de testat fie în faza staţionară, fie în faza creşterii, pentru perioade de până la 18 ore. În cazul perioadelor lungi de tratament, culturile trebuie studiate microscopic în vederea decelării formării sporilor, prezenţa acestora invalidând testul.

Condiţii de incubare

Plăcile se incubează între 4 şi 7 zile la o temperatură de 28-30 oC, la întuneric. Plăcile utilizate pentru determinarea sectoarelor homozigote roşu şi roz produse prin crossing-over mitotic se păstrează în frigider la aproximativ 4 oC timp de una-două zile înaintea numărării, pentru a permite dezvoltarea de colonii pigmentate corespunzătoare.

Frecvenţele recombinării mitotice spontane

Se utilizează subculturi cu o frecvenţă a mutaţiilor spontane care se situează în limitele normale admise.

Numărul replicilor

Se utilizează cel puţin trei plăci pe concentraţie pentru analiza prototrofilor produşi prin conversia genică mitotică şi pentru analiza viabilităţii. În cazul analizei homozigotismului recesiv produs prin crossing-over mitotic, numărul plăcilor trebuie să crească, astfel încât să furnizeze un număr corespunzător de colonii.

Mod de operare

Tratamentul suşelor de Saccharomyces cerevisiae se realizează de obicei printr-o metodă de testare în lichid, care presupune utilizarea fie de celule staţionare, fie de celule în creştere. Experimentele iniţiale trebuie realizate pe celule în creştere. 1-5 × 107 celule/ml sunt expuse la substanţa chimică de testat pe o perioadă de 18 ore, la o temperatură de 28-37 oC, cu agitare; după caz, pe parcursul tratamentului, se adaugă o cantitate corespunzătoare de sistem de activare metabolică. La sfârşitul tratamentului celulele sunt centrifugate, spălate şi însămânţate pe un mediu de cultură potrivit. După incubare, plăcile sunt examinate în vederea stabilirii nivelului de supravieţuire şi inducerea recombinării mitotice. Dacă primul experiment este negativ, trebuie realizat un al doilea experiment în care se utilizează celule în fază staţionară. Dacă primul experiment este pozitiv, acesta trebuie confirmat printr-un experiment independent corespunzător.

2. DATE Datele se prezintă sub formă de tabele în care se indică numărul coloniilor numărate, numărul recombinanţilor, nivelul de supravieţuire şi frecvenţa recombinanţilor. Toate rezultatele trebuie confirmate printr-un experiment independent. Datele se evaluează prin metode statistice corespunzătoare.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:

suşele folosite;

condiţiile de testare: celule în faza staţionară sau în faza de creştere, compoziţia mediilor de cultură, temperatura de incubare şi durata acesteia, sistemul de activare metabolică;

condiţiile de tratament: concentraţiile de expunere, procedura şi durata tratamentului, temperatura la care se realizează tratamentul, martorii pozitivi şi negativi;

numărul coloniilor, numărul recombinanţilor, nivelul de supravieţuire şi frecvenţa recombinării, relaţia doză/răspuns (după caz), evaluarea statistică a datelor;

discutarea rezultatelor;

interpretarea rezultatelor.

3.2. EVALUARE ŞI INTERPRETARE A se vedea introducerea generală partea B.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE A se vedea introducerea generală partea B.

B.17. MUTAGENITATEA – TEST IN VITRO DE MUTAŢIE GENICĂ PE CELULE DE MAMIFERE

B.17.

1. METODĂ Prezenta metodă este reprodusă după Orientarea 476 a OCDE, Testul in vitro de mutaţie genică pe celule de mamifere (1997).

1.

1.1. INTRODUCERE Testul in vitro de mutaţie genică pe celule de mamifere se poate utiliza pentru detectarea mutaţiilor genice produse de substanţele chimice. Liniile celulare corespunzătoare conţin celule de limfom de şoarece L5178Y, liniile CHO, CHO-AS52 şi V79 de celule de hamster chinezesc şi celule limfoblastoide umane TK6 (1). În liniile celulare menţionate, efectele genetice cel mai frecvent măsurate sunt o mutaţie în poziţiile timidin kinază (TK) şi hipoxantin-guanină fosforibozil transferază (HPRT), precum şi o transgenă de xantin-guanină fosforibozil transferază (XPRT). Testele de mutaţie TK, HPRT şi XPRT permit detectarea diferitelor spectre ale diferitelor fenomene genetice. Amplasarea autozomică a TK şi XPRT poate să permită detectarea fenomenelor genetice (de exemplu deleţii importante) care nu sunt detectate în locusul HPRT la cromozomii X (2) (3) (4) (5) (6). În testul in vitro de mutaţie genică pe celule de mamifere, se pot utiliza culturi de linii celulare stabilite sau suşe celulare. Celule utilizate se selectează în funcţie de capacitatea de creştere în cultură şi de stabilitatea frecvenţei de mutaţie spontană. Testele realizate in vitro necesită, în general, utilizarea unei surse exogene de activare metabolică. Sistemul de activare metabolică de acest tip nu poate să reproducă integral condiţiile celulelor de mamifere in vivo. Ar trebui să se acorde atenţie evitării condiţiilor care ar putea să conducă la obţinerea unor rezultate care nu reflectă o mutagenitate intrinsecă. Rezultatele pozitive care reflectă o mutagenitate intrinsecă ar putea să provină în urma modificărilor de pH, de osmolalitate sau din valori mari ale citotoxicităţii (7). Prezentul test se utilizează la depistarea substanţelor cu posibile efecte mutagene şi cancerigene pentru mamifere. Mulţi compuşi care dau rezultate pozitive la acest test sunt cancerigeni pentru mamifere; cu toate acestea, nu există o corelaţie perfectă între prezentul test şi cancerigenicitate. Corelaţia depinde de clasa chimică şi sunt tot mai multe dovezi cu privire la existenţa unor agenţi cancerigeni care nu se depistează prin prezentul test, deoarece este posibil ca aceştia să acţioneze prin alte mecanisme, negenotoxice sau mecanisme absente în celulele bacteriene (6). A se vedea şi introducerea generală partea B.

1.2. DEFINIŢII Mutaţie directă: o mutaţie a genelor de la forma originală la forma mutantă care generează o reducere a activităţii enzimatice din funcţia proteinei codificate. Mutageni care provoacă substituţia perechilor de bază: substanţe care produc substituţia uneia sau mai multor perechi de bază din ADN. Mutageni de decalare a cadrului de citire: substanţe care produc adăugarea sau deleţia uneia sau a mai multor perechi de bază din molecula de ADN. Timpul de manifestare a fenotipului: timpul în care produsele nemodificate ale genelor sunt epuizate din celulele care au suferit o nouă mutaţie. Frecvenţa mutantului: numărul de celule mutante observate împărţit la numărul de celule viabile. Creştere totală relativă: creşterea numărului de celule în timp, în raport cu populaţia de celule martor; se calculează ca produsul dintre creşterea în suspensie în raport cu martorul negativ şi eficacitatea clonării în raport cu martorul negativ. Creştere relativă în suspensie: creşterea numărului de celule în timpul de manifestare în raport cu martorul negativ. Viabilitate: eficacitatea clonării celulelor tratate în momentul depunerii pe placă în condiţii selective după perioada de manifestare. Supravieţuire: eficacitatea clonării celulelor tratate atunci când sunt depuse pe placă la încheierea perioadei de tratament; supravieţuirea se exprimă în raport cu supravieţuirea populaţiei de celule martor.

1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Celulele cu deficit de timidin chinază (TK) datorită mutaţiei TK+/- → TK-/- sunt rezistente la efectele citotoxice ale trifluorotimidinei (TFT), un analog al pirimidinei. Celulele care posedă timidin chinază sunt sensibile la TFT, care produce inhibarea metabolismului celular şi întrerupe diviziunea celulară. Prin urmare, celulele mutante pot să prolifereze în prezenţa TFT, în timp ce celulele normale, care conţin timidin chinază, nu pot. În mod similar, celulele cu deficit de HPRT sau XPRT sunt selectate în funcţie de rezistenţa la 6-tioguanină (TG) sau 8-azaguanină (AG). Dacă analogul unei baze sau un compus înrudit cu agentul selectiv este supus la unul din testele de mutaţie genică pe celule de mamifere, proprietăţile substanţei de testat trebuie studiate cu grijă. De exemplu, ar trebui să se examineze substanţa de testat suspectată de toxicitate selectivă pentru celule mutante şi nemutante. În consecinţă, performanţa sistemului/agentului de selecţie trebuie să fie confirmată atunci când se testează substanţe chimice cu o structură apropiată de cea a agentului selectiv (8). Celulele în suspensie sau în cultură monostrat se expun o perioadă de timp corespunzătoare la substanţa de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa activării metabolice şi se reînsămânţează pentru determinarea citotoxicităţii şi pentru a permite manifestarea fenotipului înaintea selecţiei mutantului (9) (10) (11) (12) (13). Citotoxicitatea se determină, de obicei, prin măsurarea eficacităţii clonării relative (supravieţuirii) sau a creşterii totale relative a culturilor după perioada de tratament. Culturile tratate sunt menţinute în mediul de cultură un timp suficient, caracteristic pentru fiecare locus şi tip de celulă selectate, pentru a permite o manifestare fenotipică aproape optimă a mutaţiilor induse. Frecvenţa mutanţilor se determină prin însămânţarea unui număr cunoscut de celule într-un mediu ce conţine agentul selectiv pentru a detecta celulele mutante şi într-un mediu fără agent selectiv pentru a determina eficacitatea clonării (viabilitatea). După un timp corespunzător de incubare, se numără coloniile. Frecvenţa mutantului se determină prin compararea numărului de colonii de mutanţi în mediul selectiv cu numărul de colonii în mediul neselectiv.

1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.4.

1.4.1. Pregătire

1.4.1.

1.4.1.1. Celulele Există diferite tipuri de celule care se pot utiliza în prezentul test, inclusiv subclonele de celule L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 sau TK6. Tipurile de celule utilizate în prezentul test ar trebui să aibă o sensibilitate dovedită la mutageni chimici, o eficacitate mare de clonare şi o frecvenţă de mutaţie spontană stabilă. Ar trebui să se verifice contaminarea cu micoplasmă a celulelor şi, dacă se constată că sunt contaminate, nu ar trebui să se utilizeze. Testul ar trebui conceput astfel încât să aibă o sensibilitate şi putere predeterminate. Numărul de celule, culturi şi concentraţiile substanţei de testat utilizate ar trebui să reflecte parametrii definiţi anterior (14). Numărul minim de celule viabile care supravieţuiesc tratamentului şi se utilizează în fiecare stadiu al testului ar trebui să fie în funcţie de frecvenţa mutaţiei spontane. O regulă generală constă în utilizarea unui număr de celule cel puţin egal cu de 10 ori inversul frecvenţei de mutaţie spontană. Cu toate acestea, se recomandă utilizarea a minimum 106 celule. Pentru a asigura o performanţă constantă a testului, ar trebui să se dispună de date anterioare specifice privind sistemul celular utilizat.

1.4.1.2. Mediile şi condiţiile de cultură Se recomandă utilizarea mediilor de cultură şi a condiţiilor de incubare (vasele de cultură, temperatura, concentraţia CO2 şi umiditatea) corespunzătoare. Alegerea mediilor ar trebui să se facă în funcţie de sistemele selective şi de tipul celulelor utilizate în test. O importanţă deosebită o prezintă alegerea condiţiilor de cultură, astfel încât să asigure creşterea optimă a celulelor în perioada de manifestare şi capacitatea celulelor, atât mutante, cât şi nemutante, de a forma colonii.

1.4.1.3. Prepararea culturilor Celulele se obţin plecând de la culturile de rezervă, se însămânţează în mediul de cultură şi se incubează la 37 oC. Înainte de a fi utilizate în prezentul test, este necesară curăţarea culturilor de celulele mutante preexistente.

1.4.1.4. Activarea metabolică Se recomandă ca expunerea celulelor la substanţa de testat să se realizeze atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem de activare metabolică corespunzător. Sistemul cel mai frecvent utilizat este o fracţie postmitocondrială la care s-au adăugat cofactori (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu agenţi de inducţie enzimatică, de exemplu Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) sau un amestec de fenobarbitonă şi β-naftoflavonă (19) (20). Fracţia post-mitocondrială se utilizează, de obicei, la concentraţii cuprinse între limitele 1-10 % v/v în mediul de testare final. Selectarea şi tipul unui sistem de activare metabolică poate să depindă de clasa chimică a substanţei de testat. În unele cazuri, ar putea fi convenabilă utilizarea mai multor concentraţii ale fracţiei postmitocondriale. O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a unor linii celulare care exprimă enzime activatoare specifice, pot să furnizeze potenţialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere ştiinţific (de exemplu prin importanţa izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanţei de testat).

1.4.1.5. Substanţa de testat/Preparare Substanţele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluţii sau suspensii în solvenţii sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului celulelor. Substanţele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele de testare şi se diluează înainte de utilizare în tratamentul celulelor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanţă de testat, cu excepţia cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora la păstrare.

1.4.2. Condiţii de testare

1.4.2.

1.4.2.1. Solventul/vehiculul Solventul/vehiculul ar trebui să fie ales astfel încât să nu existe suspiciunea reacţiei chimice a acestuia cu substanţa de testat şi să nu afecteze negativ supravieţuirea celulelor şi activitatea S9. Utilizarea altor solvenţi/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să se justifice cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere un solvent/vehicul apos. La testarea substanţelor instabile în apă, solventul organic utilizat nu ar trebui să conţină urme de apă. Apa se poate elimina prin adăugarea unei site moleculare.

1.4.2.2. Concentraţiile de expunere Printre criteriile ce trebuie să fie avute în vedere la determinarea dozei maxime sunt citotoxicitatea, solubilitatea în sistemul de testare şi modificările de pH sau osmolalitate. Citotoxicitatea ar trebui să se determine cu şi fără activare metabolică în experimentul principal, utilizând un indicator corespunzător al integrităţii şi dezvoltării celulare, ca eficacitatea clonării relative (supravieţuirea) sau creşterea totală relativă. Ar putea fi utilă determinarea citotoxicităţii şi solubilităţii într-un experiment preliminar. Ar trebui să se utilizeze cel puţin patru concentraţii analizabile. Dacă o substanţă este citototoxică, concentraţiile respective ar trebui să acopere un domeniu de toxicităţi de la maximă la mică sau lipsa toxicităţii; aceasta semnifică, de obicei, concentraţii care ar trebui să fie separate printr-un factor cuprins între 2 şi √10 maximum. Dacă, datorită citotoxicităţii, concentraţia este maximă, ar trebui să determine un procent de supravieţuire relativă (eficacitatea relativă a clonării) sau o creştere totală relativă de aproximativ 10-20 % (dar nu mai puţin de 10 %). Pentru substanţele relativ necitotoxice, concentraţia de testare maximă ar trebui să fie cea mai mică dintre următoarele trei concentraţii: 5 mg/ml, 5 μl/ml sau 1,01 M. Substanţele relativ insolubile ar trebui să fie testate la concentraţii egale sau superioare limitei de solubilitate în condiţiile de cultură. Insolubilitatea ar trebui să fie pusă în evidenţă în mediul final de tratament în care se expun celulele. Ar putea fi utilă evaluarea solubilităţii la începutul şi la sfârşitul tratamentului, deoarece solubilitatea poate să varieze în timpul expunerii în sistemul de testare datorită prezenţei celulelor, S9, serului etc. Insolubilitatea se poate constata cu ochiul liber. Ar trebui ca precipitarea să nu interfereze cu determinarea rezultatelor.

1.4.2.3. Martorii În fiecare experiment, ar trebui să se includă simultan martorii pozitivi şi negativi (solvent şi vehicul), atât cu, cât şi fără activare metabolică. În prezenţa activării metabolice, substanţa utilizată ca martor pozitiv ar trebui să fie aceea care necesită activare pentru a da un răspuns mutagen. În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanţe utilizate ca martori pozitivi: Tipul activării Poziţia Substanţa Nr. CAS Nr. EINECS Absenţa activării metabolice exogene HPRT Metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7 Etil nitrozouree 759-73-9 212-072-2 TK (colonii mici şi mari) Metansulfonat de metil 66-27-3 200-625-0 XPRT Metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7 Etil nitrozouree 759-73-9 212-072-2 Prezenţa activării metabolice exogene HPRT 3-metilcolantren 56-49-5 200-276-4 N-nitrozodimetilamină 62-75-9 200-549-8 7,12-dimetilbenzantracen 57-97-6 200-359-5 TK (colonii mici şi mari) Ciclofosfamidă 50-18-0 200-015-4 Ciclofosfamidmonohidrat 6055-19-2 Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 3-metilcolantren 56-49-5 200-276-5 XPRT N-nitrozodimetilamină (pentru valori mari ale S9) 62-75-9 200-549-8 Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 Se pot utiliza şi alte substanţe corespunzătoare ca martori pozitivi, de exemplu se poate utiliza 5-bromo 2'-dezoxiuridina (nr. CAS 59-14-3, nr. EINECS 200-415-9), dacă laboratorul dispune de o bază de date anterioare privind această substanţă. Ar trebui să se aibă în vedere utilizarea ca martori pozitivi a unor substanţe din aceeaşi clasă chimică, dacă sunt disponibile. Ca martori negativi ar trebui să se utilizeze solvenţi sau vehicule singure în mediul de tratare, care se tratează în acelaşi condiţii ca şi culturile. În plus, ar trebui să se utilizeze şi martori netrataţi, cu excepţia cazului în care există date din testele anterioare care să ateste că solventul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene.

1.4.3. Mod de lucru

1.4.3.

1.4.3.1. Tratamentul cu substanţa de testat Celulele în stadiu de proliferare se tratează cu substanţa de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem de activare metabolică. Timpul de expunere ar trebui să fie corespunzător (de obicei, un timp 3-6 ore este eficient). Timpul de expunere se poate prelungi cu unul sau mai multe cicluri celulare. Fiecare concentraţie se poate testa pe una sau pe două culturi tratate. Dacă se utilizează culturi unice, numărul concentraţiilor ar trebui să fie mai mare pentru a asigura un număr suficient de culturi pentru analiză (de exemplu minimum opt concentraţii analizabile). Se recomandă utilizarea culturilor duble pentru martorul negativ (solvent). Testarea substanţelor în stare gazoasă şi a celor volatile ar trebui să se realizeze prin metode specifice, de exemplu în vase de cultură închise ermetic (21) (22).

1.4.3.2. Determinări de supravieţuire, viabilitate şi frecvenţa mutantului La sfârşitul perioadei de expunere, celulele se spală şi se cultivă în mediul de cultură pentru determinarea supravieţuirii şi pentru a permite manifestarea fenotipului mutant. Determinarea citotoxicităţii începe, de obicei, după perioada de tratament şi constă în măsurarea eficacităţii de clonare relativă (supravieţuirii) sau a creşterii totale relative a culturilor. Fiecărui locus îi corespunde un timp minim definit, necesar pentru a permite manifestarea aproape optimă a fenotipului mutanţilor nou induşi (HPRT şi XPRT necesită minimum 6-8 zile şi TK minimum două zile). Pentru determinarea numărului de mutanţi şi a eficacităţii clonării, celulele sunt crescute în mediu cu şi, respectiv, fără agent sau agenţi selectivi. Măsurarea viabilităţii (utilizată la calcularea frecvenţei mutantului) începe la terminarea perioadei de manifestare prin depunerea celulelor într-un mediu neselectiv. Dacă substanţa de testat dă un rezultat pozitiv la testul pe TK+/- L5178Y, dimensiunile coloniilor ar trebui să se determine pe minimum una dintre culturile experimentale (la concentraţia pozitivă maximă) şi pe martorii negativi şi pozitivi. Dacă substanţa de testat dă un rezultat negativ la testul pe TK+/- L5178Y, dimensiunile coloniilor ar trebui să se determine pe martorii negativi şi pozitivi. Dimensiunile coloniilor se pot determina şi în studiile în care se utilizează TK6TK+/-.

2. DATE

2.

2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR Datele ar trebui să conţină determinarea citotoxicităţii şi viabilităţii, numărul de colonii şi frecvenţele mutanţilor pentru culturile tratate şi cele martor. Dacă se obţine un răspuns pozitiv în testul pe TK+/- L5178Y, la numărătoarea coloniilor se face distincţia între coloniile mici şi mari pentru minimum o concentraţie a substanţei de testat (concentraţia pozitivă maximă) şi pentru martorul negativ şi pozitiv. Ar trebui să se facă o examinare detaliată a naturii moleculare şi citogenice a coloniilor mari şi mici de mutanţi (23) (24). În testul pe TK+/-, numărătoarea coloniilor se realizează conform criteriului de creştere normală (mare) şi creştere lentă (mică) a coloniilor (25). Celulele mutante care au suferit cele mai însemnate alterări genetice au timpi de duplicare prelungiţi şi formează, aşadar, colonii mici. Această alterare variază, de obicei, de la pierderea întregii gene până la aberaţii cromozomiale care se manifestă în cariotip. Inducerea coloniilor mici de mutanţi este pusă pe seama substanţelor chimice care induc aberaţii cromozomiale însemnate (26). Celulele mutante mai puţin afectate se dezvoltă cu viteze similare cu cele ale celulelor originale şi formează colonii mari. Ar trebui să se prezinte datele privind supravieţuirea (eficacitatea clonării relative) sau creşterea totală relativă. Frecvenţa mutanţilor ar trebui să se exprime prin numărul de celule mutante împărţit la numărul de celule supravieţuitoare. Ar trebui să se prezinte datele pentru fiecare cultură. În plus, toate datele ar trebui să se prezinte sub formă de tabel. Nu este necesară verificarea unui răspuns pozitiv net. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferinţă prin modificarea condiţiilor de testare. Rezultatele negative necesită confirmare pentru fiecare caz. În cazurile în care se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, ar trebui să se ofere o justificare. Pentru testele de confirmare, atât a rezultatelor nesigure, cât şi acelor negative, ar trebui să se aibă în vedere modificarea condiţiilor de testare pentru lărgirea gamei de condiţii evaluate. Parametrii care ar putea fi modificaţi includ diferenţa dintre concentraţii şi condiţiile de activare metabolică.

2.2. EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o creştere în funcţie de concentraţie sau o creştere reproductibilă a frecvenţei mutanţilor. În primul rând, ar trebui să se aibă în vedere relevanţa biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge şi la ajutorul unor metode statistice. Semnificaţia statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. Dacă rezultatele obţinute pentru o substanţă de testat nu îndeplinesc criteriile menţionate anterior, se consideră că substanţa respectivă nu este mutagenă în prezentul sistem. Deşi majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanţei de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de repetări ale experimentului. Rezultatele pozitive ale unui test in vitro de mutaţie genică pe celule de mamifere indică faptul că substanţa de testat produce mutaţii genice în celulele de mamifere, în cultură. Un rezultat concentraţie-răspuns pozitiv reproductibil este foarte semnificativ. Rezultatele negative indică faptul că, în condiţii de testare, substanţa de testat nu produce mutaţii genice în celulele de mamifere utilizate, în cultură.

3. RAPORT

3. RAPORTUL DE TESTARE

Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:

Solventul/vehiculul:

justificarea alegerii vehiculului;

solubilitatea şi stabilitatea substanţei de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaşte.

Celulele:

tipul şi sursa celulelor;

numărul de culturi celulare;

numărul de reînsămânţări, dacă este cazul;

metodele de întreţinere a culturilor celulare, dacă este cazul;

absenţa micoplasmei.

Condiţiile de testare:

justificarea alegerii concentraţiilor şi a numărului de culturi, inclusiv, de exemplu, datele de citotoxicitate şi limitele de solubilitate, dacă sunt disponibile;

compoziţia mediului, concentraţia CO2;

concentraţia substanţei de testat;

volumul vehiculului şi al substanţei de testat adăugate;

temperatura de incubare;

timpul de incubare;

durata tratamentului;

densitatea celulară în timpul tratamentului;

tipul şi compoziţia sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate;

martorii pozitivi şi negativi;

timpul de manifestare (inclusiv numărul de celule însămânţate şi reînsămânţate, programele de alimentare, dacă este cazul);

agenţii selectivi;

criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure;

metodele utilizate pentru numărătoarea celulelor viabile şi mutante;

definirea coloniilor pentru care se ţine seama de dimensiuni şi de tip (inclusiv criteriile pentru coloniile mici şi mari, dacă este cazul).

Rezultatele:

semnele de toxicitate;

semnele de precipitare;

datele privind valoarea pH-ului şi osmolalitatea în timpul expunerii la substanţa de testat, dacă s-au determinat;

dimensiunile coloniilor, dacă s-au determinat, cel puţin pentru martorii negativi şi pozitivi;

capacitatea laboratorului de a detecta mutanţii în colonii mici cu sistemul TK+/– L5178Y, dacă este cazul;

relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;

analizele statistice, dacă există;

datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi utilizaţi în paralel;

datele anterioare privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi, cu domeniile, valorile medii şi deviaţiile standard;

frecvenţa mutanţilor.

Discutarea rezultatelor.

Concluzii.

4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.25.26.

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindall, K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E. H. Y. and Malling, H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306-1312. Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res., 94, pp. 467-485. Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394-403. Aaron, C. S. and Stankowski, Jr. L. F. (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res., 223, pp. 121-128. Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, pp. 235-239. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204. Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251. Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environment Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17-36. Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., O'Neill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Cuanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135-141. Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9-17. Stankowski, L. F. Jr., Tindall, K. R. and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133-147. Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedures for the L5178Y/TK+/- – TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268. Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith, J. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland D. J., ed., Cambridge University Press, pp. 66-101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res., 46, pp. 365-373. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364. Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson, A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat Res., 59, pp. 61-108. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215. Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcome, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot. R. M. (eds.) Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds.), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801. Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51-55. Moore, M. M., Clive, D., Hozier, J. C. Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) and Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res, 151, pp. 161-174. Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res., 229, pp. 89-102. Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- – 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis 5, pp. 609-614.

B.18. ALTERAREA ŞI REPARAREA ADN-ULUI – SINTEZA NEPROGRAMATĂ A ADN (UDS – UNSCHEDULED DNA SYNTHESIS) – TEST IN VITRO PE CELULE DE MAMIFERE

B.18.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE A se vedea introducerea generală partea B.

1.2. DEFINIŢIE A se vedea introducerea generală partea B.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Testul de sinteză neprogramată a ADN (UDS) măsoară sinteza de reparare a ADN-ului după excizia şi eliminarea unui fragment de ADN care conţine regiunea alterată de agenţi chimici şi fizici. Testul se bazează pe încorporarea timidinei marcate cu tritiu (timidină tritiată) 3H-TdR) în ADN-ul celulelor de mamifere care nu sunt în faza S a ciclului celular. Încorporarea 3H-TdR se poate determina prin autoradiografiere sau prin LSC (liquid scintillation counting) a ADN-ului din celulele tratate. Cu excepţia cazului când se folosesc hepatocite primare de şobolan, culturile de celule de mamifere se tratează cu substanţa de testat cu şi fără un sistem exogen de activare metabolică. USD poate fi măsurată prin metode in vivo.

1.5. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6. Pregătire

Substanţele chimice de testat şi substanţele martor sau substanţele de referinţă trebuie preparate în mediul de creştere ori dizolvate sau suspensionate într-un vehicul adecvat şi ulterior diluate în mediul de cultură folosit în acest test. Concentraţia finală a vehiculului nu trebuie să afecteze viabilitatea celulară. În acest test pot fi folosite culturi celulare primare de hepatocite de şobolan, limfocite umane sau linii celulare bine caracterizate (de exemplu, fibroblaşti diploizi umani). Celulele trebuie tratate cu substanţele chimice de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem adecvat de activare metabolică.

Condiţiile de testare

Numărul culturilor

Pentru fiecare metodă de testare sunt necesare cel puţin două culturi celulare pentru autoradiografiere şi şase culturi (sau mai puţine, dacă există argumente ştiinţifice) pentru determinările prin LSC a UDS.

Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi

În fiecare experiment trebuie incluşi simultan martori pozitivi şi negativi (netrataţi şi/sau vehicul) suplimentari, cu şi fără activare metabolică. În testele care folosesc hepatocite de şobolan, exemple de martori pozitivi sunt 7,12-dimetilbenzantracenul (7,12-DMBA) sau 2-acetilaminofluorenul (2-AAF). În cazul liniilor celulare bine caracterizate, 4-nitroquinolin-N oxid (4-NQO) este un exemplu de martor pozitiv care poate fi utilizat atât pentru autoradiografie, cât şi pentru testele LSC efectuate fără activare metabolică; N-dimetilnitrozamina este un exemplu de compus care poate fi folosit ca martor pozitiv când se utilizează sisteme de activare metabolică.

Concentraţii de expunere

Trebuie folosite mai multe concentraţii ale substanţei de testat, alese într-un interval adecvat pentru definirea răspunsului. Concentraţia maximă trebuie să producă unele efecte citotoxice. Compuşii relativ insolubili în apă trebuie testaţi până la limita superioară a solubilităţii. Pentru substanţele netoxice, uşor solubile în apă, limita superioară a concentraţiei se stabileşte de la caz la caz.

Celule

Mediile de creştere, concentraţia de CO2, temperatura şi umiditatea adecvate sunt necesare pentru menţinerea culturilor. Liniile celulare bine caracterizate trebuie verificate periodic în vederea decelării contaminării cu Mycoplasma.

Activare metabolică

Pentru culturile primare de hepatocite nu se utilizează un sistem de activare metabolică. Liniile celulare bine caracterizate şi limfocitele se tratează cu substanţa de testat cu şi fără un sistem adecvat de activare metabolică.

Mod de operare

Pregătirea culturilor

Liniile celulare bine caracterizate se obţin din culturi de suşe (prin tripsinizare sau descuamare) cultivate cu o densitate corespunzătoare în vase de cultură şi incubate la 37 oC. Culturile pe termen scurt de hepatocite de şobolan se obţin permiţând hepatocitelor proaspăt disociate într-un mediu adecvat să se fixeze pe suprafaţa de creştere. Culturile de limfocite umane sunt produse prin tehnici adecvate.

Tratarea culturilor cu substanţa de testat Hepatocite primare de şobolan

Hepatocitele de şobolan proaspăt izolate se tratează cu substanţa de testat într-un mediu ce conţine 3H-TdR o perioadă de timp corespunzătoare. La sfârşitul perioadei de tratare, celulele trebuie filtrate, spălate, fixate şi uscate. Lamele trebuie introduse în emulsia autoradiografică (alternativ, poate fi folosit un film fotografic), expuse, developate, colorate şi numărate.

Liniile celulare bine caracterizate şi limfocitele

Tehnica de autoradiografiere: Culturile celulare se tratează cu substanţa de testat o perioadă de timp corespunzătoare, apoi se tratează cu 3H-TdR. Perioadele se stabilesc în funcţie de natura substanţei, de activitatea sistemelor metabolizante şi de tipul celulelor. Pentru determinarea maximului de USD, 3H-TdR trebuie adăugată fie simultan cu substanţa de testat, fie la câteva minute după expunerea la substanţa de testat. Alegerea uneia dintre aceste metode se va face în funcţie de interacţiunile posibile între substanţa de testat şi 3H-TdR. Pentru a putea face distincţia între USD şi replicarea semiconservativă a ADN, aceasta din urmă poate fi inhibată, de exemplu, prin utilizarea unui mediu sărac în arginină, cu conţinut scăzut în ser sau prin adăugare de hidroxiuree în mediul de cultură. Măsurarea USD prin LSC: Înainte de începerea tratamentului cu substanţa de testat, se blochează intrarea celulelor în faza S în modul descris mai sus. Ulterior, celulele se tratează cu substanţa de testat în conformitate cu descrierea pentru autoradiografie. La sfârşitul perioadei de incubare, ADN este extras din celule şi se determină conţinutul total de ADN şi proporţia de 3H-TdR încorporată. Trebuie menţionat faptul că dacă în tehnicile descrise mai sus se utilizează limfocite umane, nu este necesară suprimarea replicării semiconservative a ADN pe culturile nestimulate.

Analiză

Determinările autoradiografice

Pentru determinarea USD în celulele din cultură, nucleele de fază S nu se numără. Trebuie numărate minimum 50 celule per concentraţie. Lamele trebuie etichetate înainte de numărare. De pe fiecare lamă se numără mai multe câmpuri distribuite aleatoriu, alese la distanţă unul de celălalt. Cantitatea de 3H-TdR încorporată în citoplasmă se determină prin numărarea a trei arii de mărimea nucleului, din citoplasma fiecărei celule numărate.

Determinările LSC

Pentru determinarea prin LSC a USD se utilizează un număr adecvat de culturi pentru fiecare concentraţie a substanţei de testat şi pentru martori. Toate rezultatele trebuie confirmate într-un experiment independent.

2. DATE Datele sunt prezentate sub formă de tabele.

2.

2.1. DETERMINĂRILE AUTORADIOGRAFICE Cantitatea de 3H-TdR încorporată în citoplasmă şi numărul de granulaţii găsite în nucleii celulari trebuie să fie înregistrate separat. Pentru descrierea distribuţiei cantităţii de 3H-TdR încorporată în citoplasmă şi numărul de granulaţii per nucleu se vor folosi media, mediana şi modul şirului.

2.2. TEHNICA LSC În tehnica LSC, 3H-TdR încorporată trebuie raportată folosind ca unitate de măsură dpm/μg ADN. Pentru descrierea distribuţiei încorporării se poate folosi media dpm/μg ADN cu deviaţia standard. Datele se evaluează prin metode statistice adecvate.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:

celulele folosite, densitatea şi numărul de pasaje celulare în momentul tratamentului, numărul de culturi celulare;

metodele folosite pentru menţinerea culturilor, inclusiv compoziţia mediului, temperatura şi concentraţia de CO2;

substanţa de testat, vehiculul folosit, concentraţiile şi argumentarea alegerii concentraţiilor folosite în experiment;

informaţii despre sistemul de activare metabolică;

schema de tratament;

martorii pozitivi şi negativi;

tehnica de autoradiografie folosită;

metodele folosite pentru a bloca intrarea celulelor în faza S;

metodele folosite pentru extragerea ADN şi determinarea conţinutului total în ADN prin tehnica LSC;

dacă este posibil, relaţia doză-efect;

evaluarea statistică;

discutarea rezultatelor;

interpretarea rezultatelor.

3.2. EVALUARE ŞI INTERPRETARE A se vedea introducerea generală partea B.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE A se vedea introducerea generală partea B.

B.19. TEST IN VITRO DE SCHIMBARE A CROMATIDELOR SURORI (SCE)

B.19.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE A se vedea introducerea generală partea B.

1.2. DEFINIŢIE A se vedea introducerea generală partea B.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE SCE este un test de scurtă durată de detectare a schimburilor reciproce de ADN între 2 cromatide surori ale unui cromozom în timpul duplicării. SCE reprezintă schimburile reciproce dintre produsele de replicare a ADN la loci aparent omologi. Se presupune că procesul de schimb implică ruperea şi refacerea ADN-ului, însă datele existente despre bazele moleculare ale procesului sunt limitate. Detectarea SCE necesită câteva mijloace de marcare diferenţiată a cromatidelor surori, rezultat ce poate fi obţinut prin încorporarea bromodeoxiuridinei (BrdU) în ADN-ul cromozomial pentru două cicluri celulare. Celulele de mamifere sunt tratate in vitro cu substanţa de testat cu şi fără un sistem exogen de activare metabolică la mamifere, după caz, apoi sunt cultivate pe o perioadă de două cicluri de replicare într-un mediu ce conţine BrdU. După tratarea cu un inhibitor de fus mitotic (de exemplu colchicină) pentru oprirea celulelor în stadiul de metafază al mitozei (c-metafaza), celulele sunt prelevate şi se efectuează preparatele cromozomiale.

1.5. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6.

1.6.1. Pregătire

Pentru acest test se pot folosi culturi celulare primare (limfocite umane) sau linii celulare bine caracterizate (de exemplu, celule ovariene de hamster chinezesc). Liniile celulare trebuie verificate pentru a decela contaminarea cu Mycoplasma.

Trebuie folosite medii de cultură şi condiţii de incubare (de exemplu temperatură, vase de cultură, concentraţia de CO2 şi umiditate) corespunzătoare.

Substanţele de testat pot fi preparate în mediul de cultură sau dizolvate sau suspensionate într-un vehicul adecvat înainte de începerea tratamentului celulelor. Concentraţia finală de vehicul în mediul de cultură nu trebuie să afecteze în mod semnificativ viabilitatea celulară sau rata de creştere, iar efectele asupra frecvenţei SCE trebuie monitorizate printr-un solvent martor.

Celulele se tratează cu substanţa de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem exogen adecvat de activare metabolică la mamifere. Alternativ, dacă se folosesc celule cu activitate metabolică intrinsecă, trebuie să se cunoască intensitatea şi natura acestei activităţi, astfel încât să fie corespunzătoare clasei de substanţe chimice testate.

1.6.2. Condiţii de testare

1.6.2. Numărul de culturi

Pentru fiecare punct experimental se folosesc cel puţin două culturi.

Utilizarea martorilor pozitivi şi negativi

În toate testele se includ martori pozitivi, utilizându-se atât un compus cu acţiune directă, cât şi un compus ce necesită activare metabolică; de asemenea, se utilizează şi un martor negativ pentru vehicul. Exemple de substanţe ce pot fi folosite ca martori pozitivi: După caz, se poate introduce un martor pozitiv suplimentar din aceeaşi clasă chimică cu substanţa de testat.

compuşi cu acţiune directă:

etilmetansulfonatul;

compuşi cu acţiune indirectă:

ciclofosfamida.

Concentraţii de expunere

Se folosesc cel puţin trei concentraţii ale substanţei de testat, spaţiate în mod adecvat. Concentraţia maximă trebuie să producă un efect toxic semnificativ, permiţând totuşi producerea unei replicări celulare corespunzătoare. Substanţele relativ insolubile în apă trebuie testate până la limita superioară a solubilităţii prin metode adecvate. Pentru substanţele netoxice uşor solubile în apă, limita superioară a concentraţiei substanţei de testat se stabileşte de la caz la caz.

1.6.2. Mod de operare

1.6.2. Pregătirea culturilor

Liniile celulare bine caracterizate se obţin din culturile de tulpini (de exemplu, prin tripsinizare sau prin descuamare), cultivate în vase de cultură cu o densitate corespunzătoare şi incubate la 37 oC. Pentru culturile unistratificate, numărul de celule pe cultură trebuie ajustat astfel încât în momentul prelevării culturile să nu fie confluente în proporţie mai mare de 50 %. Ca alternativă, se pot folosi suspensiile de culturi celulare. Culturile de limfocite umane se pot obţine din sânge heparinizat, prin tehnici adecvate şi sunt incubate la 37 oC.

Tratament

Celulele aflate în stadiul de creştere exponenţială se tratează cu substanţa de testat pe o perioadă de timp corespunzătoare, în majoritatea cazurilor fiind suficiente una sau două ore. Durata tratamentului poate fi extinsă în anumite cazuri până la două cicluri celulare complete. Celulele fără o activitate metabolică intrinsecă corespunzătoare se tratează cu substanţa de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem de activare metabolică. La sfârşitul perioadei de expunere, celulele se spală abundent pentru îndepărtarea substanţei de testat şi se cultivă timp de două cicluri de replicare în prezenţa BrdU. Ca metodă alternativă, celulele pot fi tratate simultan cu substanţa de testat şi BrdU pentru întreaga perioadă de cultură de două cicluri celulare. Culturile de limfocite umane trebuie tratate când sunt într-o stare semisincronă. Celulele trebuie analizate în perioada celei de-a doua diviziuni după tratament, asigurând astfel expunerea la substanţa chimică în cele mai sensibile stadii ale ciclului celular. Cu toate culturile la care s-a adăugat BrdU se va lucra la întuneric sau iluminare slabă de la o sursă incandescentă până în momentul prelevării celulelor, pentru reducerea la minim a fotolizei ADN-ului care conţine BrdU.

Recoltarea celulelor

Culturile se tratează cu un inhibitor de fus mitotic (de exemplu colchicină) cu 1-4 ore înainte de recoltarea celulelor. Fiecare cultură este recoltată şi prelucrată separat în vederea obţinerii preparatelor cromozomiale.

Prepararea şi colorarea cromozomilor

Preparatele cromozomiale se obţin prin tehnici citogenetice standard. Colorarea lamelelor pentru evidenţierea SCE se poate face prin mai multe tehnici (de exemplu, prin fluorescenţă plus metoda Giemsa).

Analiza

Numărul de celule analizate depinde de frecvenţa spontană a SCE la martori. De obicei, cel puţin 25 de metafaze bine exprimate pe cultură sunt analizate în termeni de SCE. Lamele trebuie etichetate înainte de analiză. La limfocitele umane se analizează numai celulele care conţin 46 de centromeri. Pe liniile celulare bine caracterizate se analizează numai metafazele care conţin ± 2 centromeri din numărul modal. Trebuie precizat dacă marcarea joncţiunii centromerice este sau nu inventariată ca SCE. Rezultatele trebuie confirmate într-un experiment independent.

2. DATE Datele se sistematizează în tabele. Pentru fiecare cultură tratată sau martor se menţionează separat numărul de SCE pentru fiecare metafază şi numărul de SCE pe cromozom pentru fiecare metafază. Datele se evaluează prin metode statistice adecvate.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:

celulele folosite, metodele de menţinere a culturilor celulare;

condiţiile de desfăşurare a testului: compoziţia mediului, concentraţia de CO2, concentraţia substanţei de testat, vehiculul folosit, temperatura de incubare, durata tratamentului, inhibitorul fusului de diviziune celulară folosit, concentraţia acestuia şi timpul de tratament cu acesta, tipul de sistem folosit pentru activarea metabolică la mamifere, martorii pozitivi şi negativi;

numărul de culturi la fiecare punct experimental;

detalii despre tehnica folosită pentru prepararea lamelelor;

numărul de metafaze analizate (datele vor fi redate separat pentru fiecare cultură în parte);

numărul mediu de SCE per celulă şi per cromozom (datele trebuie indicate separat pentru fiecare cultură în parte);

criteriile pentru numărarea SCE;

argumentarea alegerii dozelor;

relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;

evaluarea statistică;

discutarea rezultatelor;

interpretarea rezultatelor.

3.2. EVALUARE ŞI INTERPRETARE A se vedea introducerea generală partea B.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE A se vedea introducerea generală partea B.

B.20. TEST DE LETALITATE RECESIVĂ ÎN RAPORT CU SEXUL LA DROSOPHILA MELANOGASTER (SLRL)

B.20.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE A se vedea introducerea generală partea B.

1.2. DEFINIŢIE A se vedea introducerea generală partea B.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Testul SLRL pe Drosophila melanogaster este un test care depistează incidenţa mutaţiilor, atât a mutaţiilor punctiforme, cât şi a deleţiilor mici, în liniile germinale ale insectelor. Acest test este un test de mutaţie directă prin care pot decela mutaţiile în aproximativ 800 loci de pe cromozomul X, ceea ce reprezintă aproximativ 80 % din totalul de loci ai acestuia. Cromozomul X reprezintă aproximativ o cincime din întregul genom haploid. Mutaţiile cromozomului X la Drosophila melanogaster se exprimă fenotipic la masculi purtători ai genei mutante. Dacă mutaţia este letală în condiţii de hemizigotism, prezenţa sa se deduce din absenţa unei generaţii de descendenţi de sex masculin, din cele două care sunt normal produse de o femelă heterozigotă. Aceste determinări se fac prin intermediul unor cromozomi special marcaţi şi dispuşi.

1.5. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1. 6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1. Pregătire

Tulpini

Pot fi folosiţi masculi dintr-o tulpină de tip sălbatic bine caracterizată şi femele care conţin cromozomul Muller-5. De asemenea, se pot folosi femele din alte tulpini marcate corespunzător cu cromozomi X cu inversiuni multiple.

Substanţa de testat

Substanţele trebuie dizolvate în apă. Substanţele insolubile în apă pot fi dizolvate sau suspensionate într-un vehicul adecvat (de exemplu, un amestec de etanol şi Tween-60 sau 80), apoi diluate cu apă sau soluţie salină înainte de administrare. Se recomandă evitarea folosirii ca vehicul a dimetilsulfoxidului (DMSO).

Numărul de animale

Sensibilitatea şi puterea testului sunt predeterminate. Frecvenţa mutanţilor spontani observaţi la martorul corespunzător influenţează puternic numărul de cromozomi trataţi care trebuie analizaţi.

Calea de administrare

Expunerea se poate face pe cale orală, prin injectare sau expunere la gaze sau vapori. Administrarea substanţei de testat prin hrană se poate face în soluţii zaharoase. Dacă este necesar, substanţa poate fi dizolvată într-o soluţie de NaCl 0,7 % şi injectată în torace sau abdomen.

Utilizarea martorilor pozitivi şi negativi

În fiecare experiment trebuie folosiţi martori negativi (pentru vehicul) şi pozitivi. Cu toate acestea, dacă sunt disponibile date istorice pertinente despre martori, nu este necesară folosirea simultană a acestora.

Niveluri de expunere

Se folosesc trei niveluri de expunere. Pentru o evaluare preliminară se poate folosi un singur nivel de expunere, acesta fiind fie concentraţia maximă tolerată, fie nivelul de concentraţie care produce câteva semne de toxicitate. Pentru substanţele netoxice se face expunerea la concentraţia maximă care poate fi obţinută practic.

Mod de operare

Masculii din tulpinile sălbatice (în vârstă de trei-cinci zile) se tratează cu substanţa de testat, apoi sunt împerecheaţi individual cu un număr în exces de femele virgine din tulpina Muller-S sau dintr-o altă tulpină marcată corespunzător (cu multiple inversiuni ale cromozomilor X). La fiecare două-trei zile femelele trebuie înlocuite cu alte femele virgine pentru a acoperi întregul ciclu al celulelor germinale. Descendenţii acestor femele trebuie inventariaţi pentru depistarea efectelor letale corespunzătoare efectelor asupra spermatozoizilor maturi, spermatidelor în stadiu intermediar şi tardiv, spermatidelor în stadiu timpuriu, spermatocitelor şi spermatogoniilor din timpul tratamentului. Femelele F1 heterozigote din împerecherea de mai sus vor fi împerecheate individual (de exemplu, o femelă per fiolă) cu fraţii lor. În generaţia F2 fiecare cultură este inventariată pentru a depista absenţa masculilor din tulpinile sălbatice. Dacă o cultură provine dintr-o femelă F1 purtătoare de genă letală în cromozomul X parental (de exemplu, nu se observă masculi cu cromozomul tratat), fiicele acestei femele cu acelaşi genotip trebuie testate pentru a se constata dacă gena letală se repetă în generaţia următoare.

2. DATE Datele se sistematizează în tabele în care se specifică numărul de cromozomi X testaţi, numărul de masculi nefertili şi numărul de cromozomi letali la fiecare concentraţie de expunere şi pentru fiecare perioadă de împerechere, pentru fiecare mascul tratat. Trebuie raportat numărul de clustere de diferite dimensiuni per mascul. Aceste rezultate trebuie confirmate într-un experiment separat. Pentru evaluarea SLRL se vor folosi metode statistice adecvate. Trebuie luată în considerare aglomerarea de gene letale recesive provenite de la un singur mascul, care trebuie evaluată cu metode statistice corespunzătoare.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:

tulpina: tulpinile sau liniile de Drosophila folosite, vârsta insectelor, numărul de masculi trataţi, numărul de masculi sterili, numărul de culturi F2 obţinute, numărul de culturi F2 fără descendenţi, numărul de cromozomi purtători de genă dominantă letală detectaţi în fiecare stadiu al celulei germinale;

criteriile de stabilire a dimensiunilor lotului tratat;

condiţiile de testare: descrierea detaliată a tratamentului şi schema prelevării probelor, nivelul de expunere, date de toxicitate, martori negativi (solvent) şi pozitivi, după caz;

criteriile pentru numărarea mutaţiilor letale;

dacă este posibil, relaţia expunere/efect;

evaluarea statistică;

discutarea rezultatelor;

interpretarea rezultatelor.

3.2. EVALUARE ŞI INTERPRETARE A se vedea introducerea generală partea B.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE A se vedea introducerea generală partea B.

B.21. TEST IN VITRO DE TRANSFORMARE A CELULELOR DE MAMIFERE

B.21.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE A se vedea introducerea generală partea B.

1.2. DEFINIŢIE A se vedea introducerea generală partea B.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Pentru determinarea modificărilor fenotipice in vitro induse de substanţele chimice asociate cu transformări maligne in vivo, se folosesc sisteme de cultură de celule de mamifere. Cele mai des utilizate celule sunt C3H10T1/2, 3T3, SHE şi celule de la şobolani Fisher. Testele urmăresc modificările în morfologia celulară, formarea de focare sau modificări în dependenţa de ancorare pe agar-agar semisolid. Există sisteme folosite mai rar care depistează alte modificări celulare morfologice sau fiziologice în urma expunerii la substanţe chimice cancerigene. Niciunul din mecanismele testate in vitro nu are o legătură mecanică determinată cu cancerul. Anumite sisteme de testare pot detecta promotori tumorali. Citotoxicitatea poate fi determinată prin măsurarea efectelor materialului testat asupra capacităţilor de formare de colonii (eficienţa de clonare) sau asupra ratei de creştere a culturilor. Măsurarea citotoxicităţii are rolul de a stabili dacă expunerea la substanţa chimică testată are relevanţă toxicologică, dar nu poate fi folosită pentru a calcula frecvenţa transformărilor în toate testele, deoarece unele dintre acestea pot necesita incubare prelungită şi/sau reînsămânţare.

1.5. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6. Pregătire

Celule

În funcţie de testul de transformare folosit, sunt disponibile diferite linii celulare sau celule primare. Cercetătorul trebuie să se asigure că celulele folosite în cadrul testului manifestă modificări fenotipice corespunzătoare după expunerea la un agent cancerigen cunoscut şi că testul efectuat are o validitate şi o fiabilitate demonstrate şi documentate.

Mediu

Se utilizează medii şi condiţii de testare corespunzătoare testului de transformare efectuat.

Substanţa de testat

Substanţele testate pot fi preparate în mediile de cultură sau dizolvate ori suspensionate într-un vehicul adecvat, înainte de tratarea celulelor. Concentraţia finală a vehiculului în sistem nu trebuie să afecteze viabilitatea celulară, rata de creştere sau incidenţa transformărilor.

Activarea metabolică

Celulele sunt expuse la substanţa de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem adecvat de activare metabolică. Dacă se utilizează un tip de celule cu activitate metabolică intrinsecă, natura acestei activităţi va fi recunoscută ca fiind adecvată clasei de substanţe chimice testate.

Condiţii de testare

Utilizarea martorilor pozitivi şi negativi

În fiecare experiment se includ martori pozitivi, utilizându-se atât un compus cu acţiune directă, cât şi un compus ce necesită activare metabolică; de asemenea, se utilizează şi un martor negativ (pentru vehicul). Printre exemplele de substanţe ce pot fi folosite ca martor pozitiv se numără: Dacă este necesar, poate fi inclus un martor pozitiv suplimentar care să aparţină aceleiaşi clase de substanţe ca şi substanţa de testat.

compuşi cu acţiune directă:

etilmetansulfonatul,

β-propiolactona;

compuşi care necesită activare metabolică:

2-acetilaminofluoren,

4-dimetilaminoazobenzen,

7,12-dimetilbenzantracen.

Concentraţii de expunere

Se folosesc mai multe concentraţii ale substanţei de testat. Acestea trebuie să prezinte efect toxic în funcţie de concentraţie, concentraţia maximă determinând un nivel scăzut de supravieţuire, iar supravieţuirea la concentraţia minimă fiind aproximativ aceeaşi cu cea de la martorul negativ. Pentru substanţele relativ insolubile în apă trebuie testată limita superioară a solubilităţii, folosind procedee corespunzătoare. Pentru substanţele netoxice, foarte uşor solubile în apă, limita superioară a concentraţiei se stabileşte de la caz la caz.

Mod de operare

Celulele se tratează o perioadă corespunzătoare, în funcţie de sistemul de testare utilizat, acest lucru putând presupune reevaluarea dozei prin schimbarea mediului (şi, după caz, un amestec de activare metabolică proaspăt) dacă expunerea este prelungită. Celulele fără o activitate metabolică intrinsecă suficientă sunt expuse la substanţa de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem adecvat de activare metabolică. La sfârşitul perioadei de expunere, celulele trebuie spălate, îndepărtând substanţa de testat, şi cultivate în condiţii adecvate pentru apariţia modificărilor fenotipice urmărite şi pentru stabilirea incidenţei de transformare. Toate rezultatele trebuie confirmate în cadrul unui experiment independent.

2. DATE Datele se sistematizează în tabele şi pot avea diferite forme în funcţie de metoda folosită, ca, de exemplu, numărarea plăcilor, plăci pozitive sau număr de celule transformate. După caz, supravieţuirea se exprimă ca procent din nivelul de supravieţuire la probele martor, iar frecvenţa de transformare ca raport între numărul de celule transformate şi numărul de celule supravieţuitoare. Datele se evaluează prin metode statistice corespunzătoare.

3. RAPORT

3.

3.1. RAPORTUL DE TESTARE Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:

tipul de celule folosite, numărul de culturi celulare, metoda de menţinere a culturilor;

condiţiile de testare: concentraţia substanţei de testat, vehiculul folosit, timpul de incubare, durata şi frecvenţa tratamentului, densitatea celulară pe parcursul tratamentului, tipul de sistem exogen folosit pentru activarea metabolismului, martorii pozitivi şi negativi, caracteristicile fenotipului monitorizat, tipul de sistem selectiv folosit (după caz), argumentarea alegerii dozelor;

metoda folosită pentru exprimarea numărului de celule viabile şi transformate;

evaluarea statistică;

discutarea rezultatelor;

interpretarea rezultatelor.

3.2. EVALUARE ŞI INTERPRETARE A se vedea introducerea generală partea B.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE A se vedea introducerea generală partea B.

B.22.

1. METODĂ

1.

1.1. INTRODUCERE A se vedea introducerea generală partea B.

1.2. DEFINIŢIE A se vedea introducerea generală partea B.

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Efectele letalităţii dominante determină moartea embrionului sau a fetusului. Inducerea genelor letalităţii dominante prin expunere la o substanţă chimică indică faptul că acea substanţă a acţionat la nivelul ţesutului germinal al speciei testate. Este cunoscut faptul că letalitatea dominantă se datorează unei anomalii cromozomiale (numerice şi structurale). Moartea embrionului, în cazul în care femelele sunt tratate, se poate datora şi efectelor toxice. În general, masculii se tratează cu substanţa de testat şi se împerechează cu femele virgine netratate. Pot fi studiate separat diferitele stadii ale celulelor germinale, la intervale de împerechere succesive. Creşterea numărului de ovule fecundate moarte per femelă în lotul tratat comparativ cu femelele din lotul martor reflectă posibilitatea pierderii sarcinii după implantare. Pierderile înaintea ovoimplantaţiei pot fi estimate luând în considerare numărul de corpora lutea sau comparând numărul total de implanturi per femelă în lotul tratat şi în lotul martor. Efectul total de letalitate dominantă reprezintă suma pierderilor înainte şi după implantare. Calcularea efectului total al letalităţii dominante se bazează pe comparaţia dintre implanturile viabile la femelele din lotul tratat şi la cele din lotul martor. Reducerea numărului de implanturi la anumite intervale de timp poate fi rezultatul distrugerii celulelor (a spermatocitului şi/sau a spermatogoniei).

1.5. CRITERII DE CALITATE Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6. Pregătire

Dacă este posibil, substanţele folosite se dizolvă sau se suspensionează într-o soluţie izotonică salină. Substanţele chimice insolubile în apă pot fi dizolvate sau suspensionate în vehicule corespunzătoare. Vehiculul folosit nu trebuie să interfereze cu substanţa chimică de testat şi nici nu trebuie să producă efecte toxice. Pentru testarea chimică, se folosesc substanţe chimice de testat proaspete.

Condiţii de testare

Calea de administrare

De regulă, compusul de testat trebuie administrat o singură dată. În funcţie de informaţiile toxicologice, se poate utiliza o schemă de tratament repetat. Căile normale de administrare sunt: intubarea orală sau injectarea intraperitoneală. Se pot folosi şi alte căi de administrare corespunzătoare.

Animale de experienţă

Se recomandă utilizarea şobolanilor sau a şoarecilor. Animalele sănătoase şi mature din punct de vedere sexual se repartizează aleatoriu în loturile tratate şi în loturile martor.

Numărul şi sexul animalelor

Se utilizează un număr corespunzător de masculi trataţi, luând în considerare variaţia spontană a caracterelor biologice evaluate. Numărul se stabileşte în funcţie de sensibilitatea detectării şi de gradul de încredere care au fost predeterminate. De exemplu, în cadrul unui test tipic, numărul masculilor din fiecare lot tratat trebuie să fie suficient pentru a asigura între 30 şi 50 de femele gestante în fiecare perioadă de împerechere.

Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi

În general, în fiecare experiment se utilizează simultan martori pozitivi şi negativi. Când experimente efectuate recent în acelaşi laborator oferă rezultate acceptabile cu privire la martorii pozitivi, aceste rezultate pot fi folosite ca martori pozitivi în experimentul curent. Substanţele martor pozitiv trebuie folosite la o doză scăzută corespunzătoare (de ex: MMS, intraperitoneal într-o doză de 10 mg/kg) pentru a demonstra sensibilitatea testului.

Doze

În mod normal, se utilizează trei doze de tratament. Doza mare trebuie să producă efecte toxice sau să reducă fertilitatea animalelor tratate. În anumite cazuri, este suficientă folosirea unei singure doze mari.

Test-limită

Substanţele care nu sunt toxice se testează la doza de 5 g/kg în cazul unei singure administrări sau 1 g/kg/zi în cazul administrărilor repetate.

Mod de operare

Sunt disponibile mai multe scheme de tratament. Cea mai frecventă este aceea a administrării unice a substanţei de testat. Pot fi folosite şi alte scheme de tratament. Fiecare mascul se împerechează pe rând cu una sau două femele virgine netratate, la intervale corespunzătoare după tratament. Femelele sunt lăsate împreună cu masculii pe durata ciclului estral sau până la confirmarea împerecherii (prezenţa spermei în vagin sau a dopului vaginal). Numărul împerecherilor după tratament se stabileşte în funcţie de schema de tratament şi trebuie să asigure prelevarea de celule germinale în toate stadiile de dezvoltare a acestora. Femelele sunt sacrificate în cea de-a doua jumătate a gestaţiei, iar conţinutul uterului se examinează în vederea decelării numărului de implanturi viabile şi a numărului de implanturi neviabile. Ovarele se examinează pentru stabilirea numărului de corpora lutea.

2. DATE Datele se sistematizează în tabele şi prezintă numărul masculilor, al femelelor gestante şi cel al femelelor negestante. Rezultatele fiecărei împerecheri, inclusiv identitatea fiecărui mascul şi a fiecărei femele se înregistrează individual. În cazul fiecărei femele se menţionează săptămâna de împerechere, doza administrată masculilor şi numărul implanturilor vii şi moarte. Calcularea efectului total de letalitate dominantă se bazează pe comparaţia dintre implanturile vii, pentru fiecare femelă din cadrul lotului tratat şi a implanturilor vii pentru fiecare femelă din cadrul lotului martor. Raportul dintre numărul implanturilor vii şi moarte în lotul tratat se compară cu raportul din lotul martor şi este analizat pentru a evidenţia moartea produsului de concepţie în faza post-implantare. Dacă datele sunt înregistrate ca mortalitate precoce şi mortalitate tardivă, din tabele trebuie să rezulte clar acest lucru. De asemenea, trebuie înregistrate pierderile în faza de preimplantare. Pierderile în faza de preimplantare se pot calcula în funcţie de diferenţa dintre numărul de corpora lutea şi numărul implanturilor sau urmărind reducerea numărului mediu de implanturi per uter la lotul tratat în comparaţie cu împerecherile martor. Datele se evaluează prin metode statistice adecvate.

specia, linia, vârsta şi greutatea animalelor, numărul animalelor pe sexe folosite atât în lotul tratat, cât şi în lotul martor;

substanţa de testat, vehiculul, dozele testate şi argumentarea selectării dozelor, substanţe folosite ca martor negativ şi pozitiv, datele cu privire la toxicitate;

calea de administrare şi schema de tratament;

schema de împerechere;

metoda folosită pentru confirmarea împerecherii;

3232 more provisions are not shown here; each has its own address.

Versions

2008-05-30