Nariadenie Komisie (ES) Č. 440/2008 z 30. mája 2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH) (Text s významom pre EHP)

In forceVersion 2008-05-30from 2008-06-01

Grade B

mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.

Ask Gelex about this law

Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/sk

Contents

Preamble
ANNEX
A.1.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.4.
1.5. TABUĽKA: POUŽITEĽNOSŤ METÓD A. B. C. D.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
1.6.1.2. Prístroje:
1.6.2.
1.6.4.
4.(1)(2)(3)(4)
A.2.
1.
1.4.
1.5. Tabuľka 1 Porovnanie metód
1.6.
1.6.4.
1.6.6.
2. Tabuľka 2 Opravné koeficienty fT na teplotu
A.3.
1.
1.4.
1.4.1.
3. Tabuľka 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Použiteľnosť metód
3. Tabuľka 1.4.1.1.1.4.1.2. Použiteľnosť metód a)
3. Tabuľka 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Použiteľnosť metód a)
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
A.4.
1.
1.4.
1.5. Tabuľke 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Kritériá kvality
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2.
1.6.4.
1.6.4.2.
1.6.5.
1.6.6.
1.6.6.1. Inertný plyn:
1.6.6.2. Príprava saturátorovej kolóny:
a)
b)
1.6.7.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
A.5.
1.
1.6.
1.6.4.
1.6.4.1.
1.6.4.1.3. Obrázok Meracie teleso (krúžok)
1.6.4.2.
1.6.4.2.2. Inštalácia:
a)
b)
2. Tabuľka Korekcia nameraného povrchového napätia Platí iba pre vodné roztoky, ρ = 1 g/cm3
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.6.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Testovací postup:
1.6.3.3. Prístroje
1.6.3.4. Prístroje (pozri obrázky 3 a 4)
1.6.4.
2.
3.
A.8.
1.
1.3. Metóda trepačkovej banky
1.4.
1.5.
1.5.1. Metóda trepačkovej banky
1.5.2. Metóda trepačkovej banky
1.5.3. Metóda trepačkovej banky
1.6.
1.6.2.
1.6.2.1.
1.6.2.3.
1.6.3.
1.6.3.1. Prístroje
1.6.3.2. Výpočet nečinnej doby t0
2. Metóda trepačkovej banky
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
A.9.
1.
1.5.
1.6.
1.6.3.
1.6.3.2. Abelov prístroj:
A.10.
1.
1.6.
1.6.2.
3.
A.11.
1.
1.6.
A.12.
1.
1.3.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
A.13.
1.
1.6.
1.6.2. a)
2.
A.14.
1.
1.1. a)
1.4.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
1.6.2.2. a)
1.6.3.
1.6.3.2. a)
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.15.
1.
1.6.
A.16.
1.
1.6.
1.6.1.
4.
Obrázok 1 Schéma 20 mm testovanej kocky
Obrázok 2 Typická krivka teploty/času
A.17.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.2.
3.
3.2. a)
A.18.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.19.
1.
1.6.
2.
2.2.
3.(1)(2)(3)(4)
A.20.
1.
1.5.
1.5.4.
2.
3.
3.1.
A.21.
1.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.2.
2.
2.1. Tabuľka 1 Príklady výsledkov
3.
3.2. a)
4.(1)
Obrázok 1 Tlaková nádoba
Obrázok 2 Stojan
Obrázok 3 Systém zážihu
Dodatok V prípade potreby dodatočných technických podrobností možno použiť napríklad tieto technické normy:
1.
2.
4.
1.2. Pre tuhé látky
Dodatok 1 Metóda odhadu (predbežného výpočtu)
ÚVOD
METÓDA ODHADU (PREDBEŽNÉHO VÝPOČTU)
POSTUP VÝPOČTU
SPRÁVA
ODKAZY
Dodatok 2
Obrázok 1 Prístroj na stanovenie krivky tlaku pary podľa dynamickej metódy
Obrázok 2a Prístroj na stanovenie krivky tlaku pary podľa statickej metódy (s použitím tlakomeru v podobe trubice v tvare U)
Obrázok 2b Prístroj na stanovenie krivky tlaku pary podľa statickej metódy (s použitím ukazovateľa tlaku)
Obrázok 3 Izoteniskop [pozri odkaz (7)]
Obrázok 4 Prístroj na stanovenie krivky tlaku pary podľa efúznej metódy s použitím váh na meranie tlaku pary
Obrázok 5 Príklad prístroja na odparovanie pri nízkom tlaku efúznou metódou s objemom efúznej komory 8 cm
Obrázok 6a Príklad prietokového systému na stanovenie tlaku pary metódou plynnej saturácie
Obrázok 6b Príklad systému na stanovenie tlaku pary plynnou saturačnou metódou s kapilárou umiestnenou v slede za saturačnou komorou
Obrázok 7 Príklad potrubného systému pre metódu rotujúcej guľôčky
Obrázok 8 Príklad meracej hlavy rotujúceho rotora
Obrázok 1 Metóda eluovania z kolóny s recirkulačným čerpadlom
Obrázok 2 Typická mikrokolóna
Obrázok 3 Typická mikrokolóna
Obrázok 4 Metóda eluovania z kolóny s egalizačnou nádobou
ODHADOVÁ METÓDA Predbežný odhad rozdeľovacieho koeficientu
VÝPOČTOVÉ METÓDY Princíp výpočtových metód
Hanschova π-metóda
Rekkerova metóda
Hanschova-Leova metóda
Kombinovaná metóda
i)
ii)
iii)
iv)
Obrázok Forma a príslušenstvo na prípravu hranice z práškovitej testovanej látky
Obrázok Prístroj
Príklad materiálovej špecifikácie pre test citlivosti na teplo (pozri technickú normu DIN 1623) (1)(2)(3)
Obrázok 1 Testovací prístroj na stanovenie citlivosti na teplo
Obrázok 2 Test citlivosti na teplo
Obrázok 3 Kalibrácia rýchlosti ohrevu pre test citlivosti na teplo
Obrázok 4 Prístroj na testovanie citlivosti látok na náraz
Obrázok 5 Prístroj na testovanie citlivosti látok na trenie
Obrázok Forma a príslušenstvo na prípravu hranice z práškovitej skúšobnej látky
1.1.1.1.2.1.3.1.4.
3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
ČASŤ B METÓDY NA STANOVENIE TOXIKOLOGICKÝCH VLASTNOSTÍ A INÉHO ÚČINKU NA ZDRAVIE
VŠEOBECNÝ ÚVOD A.
i)
ii)
B.1a.
1.
1.4.
1.5.
1.5.3.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
B.1b.
1.
1.4.
1.5.
1.6.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
B.2.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1. a)
B.3.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. Vyhodnotenie toxicity u druhého pohlavia
3.
B.4.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
Tabuľka I Vytvorenie erytému alebo chrasty Vytvorenie edému STUPNE REAKCIÍ KOŽE
B.5.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.2.3.
1.4.2.7.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(09)(10)
Tabuľka I STUPNE POŠKODENIA OKA
Rohovka
Dúhovka
Spojovky
Chemóza
B.6.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.2.
1.5.1.3.
1.5.2.
1.5.2.2.
1.5.2.3.
3.
Správa o teste (GPMT a Buehler)
B.7.
1.
1.4.
1.4.2.
1.4.3.
3.
SPRÁVA Z TESTU
B.8.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3. a)
3.
3.1.
pt_2 a)
B.9.
1.
1.6.
1.6.2.
1.6.3.
3.
B.10.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3.
SPRÁVA Z TESTU
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
B.11.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
B.12.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
1.5.2. a)
2.
3.
SPRÁVA Z TESTU
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
B.13/14.
1.
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
2.
3.
SPRÁVA Z TESTU
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
B.15.
1.
1.6. Príprava
Metabolická aktivácia
Testovacie kmene
Médiá
Použitie negatívnych a pozitívnych kontrol
Koncentrácie vystavenia
Inkubačné podmienky
Frekvencia spontánnych mutácií
Počet opakovaní
3.
B.16.
1.
1.6. Príprava
Metabolická aktivácia
Testovacie kmene
Médiá
Použitie negatívnych a pozitívnych kontrol
Koncentrácie vystavenia
Inkubačné podmienky
Frekvencia spontánnej mitotickej rekombinácie
Počet opakovaní
3.
B.17.
1.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
2.
3.
SPRÁVA Z TESTU
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
B. 18.
1.
1.6. Príprava
Počet kultúr
Použitie negatívnej a pozitívnej kontroly
Koncentrácie vystavenia
Bunky
Metabolická aktivácia
Príprava kultúr
Vystavenie kultúr testovanej látke Primárne potkanie hepatocyty
Autorádiografické stanovenia
Stanovenie LSC
2.
3.
B.19.
1.
1.6.
1.6.2. Počet kultúr
1.6.3. Príprava kultúr
3.
B.20.
1.
1.6. Príprava
Línie
Testovaná látka
Počet zvierat
Spôsob podávania
Použitie negatívnej a pozitívnej kontroly
Hodnoty vystavenia
3.
B.21.
1.
1.6. Príprava
Bunky
Médium
Testovaná látka
Metabolická aktivácia
Použitie negatívnych a pozitívnych kontrol
Koncentrácie vystavenia
3.
B.22.
1.
1.6. Príprava
Spôsob podávania
Experimentálne zvieratá
Počet a pohlavie
Použitie negatívnej a pozitívnej kontroly
Úrovne dávok
Hraničný test

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,

so zreteľom na nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES, a najmä na jeho článok 13 ods. 3,

keďže:

(1) Podľa nariadenia (ES) č. 1907/2006 sa testovacie metódy majú prijať na úrovni Spoločenstva na účely testovania látok v prípadoch, keď sa testovanie vyžaduje na získanie informácií o vlastnostiach látok.

(2) V prílohe V k smernici Rady 67/548/EHS z 27. júna 1967 o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok sa ustanovili metódy určovania fyzikálno-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity látok a prípravkov. Príloha V k smernici 67/548/EHS sa vypustila smernicou Európskeho parlamentu a Rady 2006/121/ES s účinnosťou od 1. júna 2008.

(3) Testovacie metódy uvedené v prílohe V k smernici 67/548/EHS by sa mali do tohto nariadenia zahrnúť.

(4) Týmto nariadením sa nevylučuje použitie iných testovacích metód za predpokladu, že sú v súlade s článkom 13 ods. 3 nariadenia (ES) č. 1907/2006.

(5) Pri vypracovávaní testovacích metód by sa mali v plnej miere zohľadňovať zásady nahradenia, obmedzenia a zdokonalenia využívania zvierat v postupoch, predovšetkým vtedy, keď sú k dispozícii schválené metódy, ktorými sa testovanie na zvieratách môže nahradiť, obmedziť alebo zdokonaliť.

(6) Ustanovenia tohto nariadenia sú v súlade so stanoviskom výboru zriadeného podľa článku 133 nariadenia (ES) č. 1907/2006,

PRIJALA TOTO NARIADENIE:

Článok 1 Testovacie metódy, ktoré sa majú uplatňovať na účely nariadenia (ES) č. 1907/2006, sa uvádzajú v prílohe k tomuto nariadeniu.

Článok 2 Komisia v prípade potreby preskúma testovacie metódy uvedené v tomto nariadení s cieľom nahradiť, obmedziť a zdokonaliť testovanie na stavovcoch.

Článok 3 Všetky odkazy na prílohu V k smernici 67/548/EHS sa vykladajú ako odkaz na toto nariadenie.

Článok 4 Toto nariadenie nadobúda účinnosť dňom nasledujúcim po jeho uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Uplatňuje sa od 1. júna 2008. V Bruseli 30. mája 2008 Za Komisiu Stavros Dimas člen Komisie

ANNEX

PRÍLOHA ČASŤ A: METÓDY NA STANOVENIE FYZIKÁLNO-CHEMICKÝCH VLASTNOSTÍ

A.1. TEPLOTA TOPENIA A TUHNUTIA

A.1.

1. METÓDA Opísané metódy sú upravené smernicou na vykonávanie OECD testov (1). Základné princípy sú uvedené v odkazoch (2) a (3).

1.

1.1. ÚVOD Na stanovenie teploty topenia látok je potrebné použiť opísané metódy, prístroje a zariadenia, a to bez akýchkoľvek obmedzení týkajúcich sa stupňa ich čistoty. Výber metódy závisí od charakteru látky určenej na testovanie. Z toho dôvodu limitujúce faktory budú závisieť od toho, či príslušná látka môže byť rozomletá na prášok ľahko, ťažko alebo vôbec nie. Pre niektoré látky je vhodnejšie stanovenie teploty tuhnutia, a preto boli do tejto metódy zahrnuté aj normy pre toto stanovenie. V prípadoch, kde kvôli zvláštnym vlastnostiam látky nie je možné bez problémov merať žiadny z uvedených parametrov, môže byť vhodné stanovenie teploty kvapalného skupenstva, resp. teploty tuhnutia olejov.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Teplota topenia je definovaná ako teplota, pri ktorej sa zmena z tuhého do kvapalného skupenstva prejavuje pri atmosférickom tlaku, a táto teplota ideálne zodpovedá teplote tuhnutia. Keďže fázová zmena mnohých látok sa uskutočňuje v určitom tepelnom rozmedzí, často sa opisuje ako rozmedzie topenia. Prepočítavanie jednotiek (K na oC) t = T – 273,15 t teplota v stupňoch Celzia, stupne Celzia (oC) T termodynamická teplota, kelvin (K)

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Referenčné látky nemusia byť použité vo všetkých prípadoch, ak sa skúma nová látka alebo nová látka obsiahnutá v prípravku. V prvom rade by mali slúžiť na občasnú kontrolu účinnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie porovnania s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód. Niektoré kalibračné látky sú uvedené v odkazoch (4).

1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY Stanoví sa teplota (teplotné rozmedzie) fázovej zmeny z tuhého do kvapalného skupenstva alebo z kvapalného do tuhého skupenstva. Prakticky sa počas zohrievania, resp. ochladzovania vzorky testovanej látky pri atmosférickom tlaku stanovujú teploty počiatočného štádia topenia, resp. tuhnutia, a konečného štádia topenia, resp. tuhnutia. Opísaných je päť metód, menovite kapilárna metóda, metódy tepelných blokov, stanovenia teploty tuhnutia, metódy termickej analýzy a stanovenie teploty kvapalného skupenstva, resp. teploty tuhnutia (metóda vyvinutá pre ropné oleje). V určitých prípadoch môže byť vhodné merať namiesto teploty topenia teplotu tuhnutia.

1.4.

1.4.1. Kapilárna metóda

1.4.1.

1.4.1.1. Zariadenia na stanovenie teploty topenia s kvapalinovým kúpeľom Malé množstvo jemne rozomletej látky sa vloží do kapilárnej rúrky a tesne sa natlačí. Rúrka sa zohrieva spolu s teplomerom a v priebehu vlastného topenia sa nárast teploty adjustuje na menej ako 1 K/min. Stanovuje sa počiatočná a konečná teplota topenia.

1.4.1.2. Zariadenia na stanovenie teploty topenia s kovovým blokom Postupuje sa tak, ako je to opísané v odseku 1.4.1.1, avšak s výnimkou, že kapilárna rúrka a teplomer sú umiestnené do zahrievaného kovového bloku, pričom celý proces a hodnoty na teplomere možno sledovať otvormi v bloku.

1.4.1.3. Fotočlánková detekcia Vzorka v kapilárnej rúrke sa zahrieva automaticky v kovovom valci. Dierou vo valci sa cez sledovanú látku namieri svetelný lúč na presne kalibrovaný fotoelektrický článok. Optické vlastnosti väčšiny látok sa počas topenia menia tak, že látka sa z nepriehľadnej mení na priehľadnú. Intenzita svetla dopadajúceho na fotoelektrický článok sa tak zvýši a vyšle stop signál k digitálnemu indikátoru, ktorý odčíta teplotu z platinového odporového teplomeru, ktorý je umiestnený vo vyhrievacej komore. Táto metóda nie je vhodná pre niektoré intenzívne sfarbené látky.

1.4.2. Tepelné bloky

1.4.2.

1.4.2.1. Koflerov tepelný blok Koflerov tepelný blok pozostáva z dvoch kusov kovu s rozdielnou tepelnou vodivosťou a s elektrickým ohrievaním, pričom samotný blok je zhotovený tak, aby teplotný gradient bol takmer lineárny po celej jeho dĺžke. Teplota Koflerovho tepelného bloku sa môže meniť v rozmedzí od 283 do 573 K. Tepelný blok je vybavený zvláštnym zariadením na čítanie teploty, ktoré je opatrené posuvným bežcom s ručičkou a tabuľkou zostavenou pre konkrétny typ žeraviacej tyče. Na stanovenie teploty topenia sa testovaná látka v tenkej vrstve nanesie na tepelný blok. V priebehu niekoľkých sekúnd sa vytvorí zreteľná deliaca čiara medzi kvapalnou a tuhou fázou. Teplota na deliacej čiare sa odčíta nastavením ručičky do takej polohy, aby spočívala priamo na čiare.

1.4.2.2. Mikroskop na sledovanie taveniny Na stanovenie teploty topenia pri veľmi malých množstvách materiálu sa používajú viaceré mikroskopicky sledované horúce štádiá. V prípade väčšiny horúcich štádií sa teplota meria citlivým termočlánkom, ale niekedy sa používajú aj klasické ortuťové teplomery. Typický prístroj na mikroskopické sledovanie teploty topenia v horúcich štádiách pozostáva z vyhrievacej komory, v ktorej sa nachádza kovová platňa, na ktorú sa umiestni vzorka na podložné sklíčko. Uprostred kovovej platne je otvor, ktorý umožňuje prenikanie svetelných lúčov z osvetľovacieho zrkadielka mikroskopu. Počas používania je komora uzavretá sklenou platňou, aby sa zabránilo prístupu vzduchu do priestoru so skúmanou vzorkou. Zahrievanie vzorky je regulované reostatom. Na veľmi presné merania na opticky anizotropných látkach možno použiť polarizované svetlo.

1.4.2.3. Menisková metóda Táto metóda sa používa špeciálne pre polyamidy. Vizuálne sa stanovuje teplota, pri ktorej dochádza k posunu menisku silikónového oleja, vloženého medzi zdroj horúceho štádia a krycie sklíčko, spočívajúce na polyamidovej testovanej vzorke.

1.4.3. Metóda na stanovenie teploty tuhnutia Vzorka sa umiestni do zvláštnej skúšobnej trubice, ktorá sa potom vloží do prístroja na stanovovanie teploty tuhnutia. Počas ochladzovania sa vzorka jemne a neustále mieša a vo vhodných intervaloch sa meria teplota. Ak pri niekoľkých za sebou nasledujúcich čítaniach zostáva teplota konštantná, jej hodnota (s korektúrou odchýlky teplomera) sa zaznamená ako teplota tuhnutia. Má sa zabrániť podchladeniu udržiavaním rovnováhy medzi tuhou a kvapalnou fázou.

1.4.4. Tepelná (termická) analýza

1.4.4.

1.4.4.1. Diferenciálna tepelná (termická) analýza (DTA) V rámci tohto postupu sa zaznamenáva rozdiel v teplotách medzi príslušnou testovanou látkou a referenčným materiálom ako funkcia teploty, pričom testovaná látka aj referenčný materiál sú vystavené tomu istému regulovanému a kontrolovanému tepelnému programu. Keď testovaná vzorka podstúpi fázovú zmenu majúcu za následok zmenu entalpic, táto zmena sa prejaví ako endotermická (topenie) alebo exotermická (tuhnutie) odchýlka od základnej čiary zaznamenávajúcej teplotu.

1.4.4.2. Diferenciálna snímacia kalorimetria (DSK) V rámci tohto postupu sa zaznamenáva rozdiel v energetických vstupoch do príslušnej testovanej látky a do referenčného materiálu, pričom testovaná látka aj referenčný materiál sú vystavené tomu istému regulovanému a kontrolovanému tepelnému programu. Toto je energia, ktorá je potrebná na vytvorenie nulového teplotného rozdielu medzi testovanou látkou a referenčným materiálom. Keď testovaná vzorka podstúpi fázovú zmenu majúcu za následok zmenu entalpie, táto zmena sa prejaví ako endotermická (topenie) alebo exotermická (tuhnutie) odchýlka od základnej čiary zaznamenávajúcej tepelný tok.

1.4.5. Teplota tuhnutia olejov Táto metóda bola vyvinutá na použitie s ropnými olejmi a je vhodná na použitie s olejovitými látkami vyznačujúcimi sa nízkymi teplotami topenia. Po predchádzajúcom zohriatí sa vzorka ochladzuje špecifickou rýchlosťou a v intervaloch poklesu teploty o 3 K sa skúma jej tekutosť. Najnižšia teplota, pri ktorej sa ešte dá pozorovať pohyb testovanej látky, sa zaznamená ako teplota tuhnutia oleja.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Použiteľnosť a presnosť rozličných metód používaných na stanovenie teploty topenia, resp. rozmedzia topenia je uvedená v nasledujúcej tabuľke:

1.5. TABUĽKA: POUŽITEĽNOSŤ METÓD A. B. C. D.

Kapilárne metódy Metóda merania Látky, ktoré možno rozomlieť na prášok Látky, ktoré nemožno ľahko rozomlieť na prášok Rozsah teplôt Odhadnutá presnosť Platná norma Zariadenie na stanovenie teploty topenia kvapalinovým kúpeľom áno len pre niekoľko látok 273 až 573 K +0,3 K JIS K 0064 Zariadenie na stanovenie teploty topenia s kovovým blokom áno len pre niekoľko látok 293 až > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Detekcia fotočlánkom áno pre niektoré látky s použitím prídavných zariadení 253 až 573 K ±0,5 K Vyhrievacie bloky a metódy tuhnutia Metóda merania Látky, ktoré možno rozomlieť na prášok Látky, ktoré nemožno ľahko rozomlieť na prášok Rozsah teplôt Odhadnutá presnosť Platná norma Koflerov vyhrievací stolík áno nie 283 až > 573 K ± 1 K ANSI/ASTM D 3451-76 Taviaci mikroskop áno len pre niekoľko látok 273 až > 5 73 K ±0,5 K DIN 53736 Menisková metóda nie predovšetkým pre polyamidy 293 až > 573 K ±0,5 K ISO I2I8 (E) Metóda stanovenia teploty tuhnutia áno áno 223 až 573 K ±0,5 K napr. BS 4695 Tepelná (termická) analýza Metóda merania Látky, ktoré možno rozomlieť na prášok Látky, ktoré nemožno ľahko rozomlieť na prášok Rozsah teplôt Odhadnutá presnosť Platná norma Diferenčná tepelná analýza áno áno 173 až 1273 K do 600 K ±0,5 K do 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Diferenčná skenovacia kalorimetria áno áno 173 až 1273 K do 600 K ±0,5 K do 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Teplota tuhnutia olejov Metóda merania Látky, ktoré možno rozomlieť na prášok Látky, ktoré nemožno ľahko rozomlieť na prášok Rozsah teplôt Odhadnutá presnosť Platná norma Teplota tuhnutia olejov pre minerálne oleje a olejovité látky pre minerálne oleje a olejovité látky 223 až 323 K ±3,0 K ASTM D 97-66

1.6. OPIS METÓD Postupy skoro všetkých skúšobných metód sú opísané v medzinárodných a štátnych normách (pozri dodatok 1).

1.6.

1.6.1. Metódy s kapilárnou rúrkou Keď sú testované látky, ktoré sú rozdrvené na jemný prach, vystavené pomalému nárastu teploty, zvyčajne prejavujú štádiá topenia, ktoré sú znázornené na obrázku 1.

1.6.1.

Obrázok 1 Štádium A Štádium B Štádium C Štádium D Štádium E Štádium A (začiatok procesu topenia): Jemné kvapôčky rovnomerne priliehajú k vnútornej stene kapilárnej rúrky. Štádium B Medzi testovanou vzorkou a vnútornou stenou kapilárnej rúrky sa objavuje voľný priestor následkom zmrašťovania taveniny. Štádium C Zmraštená testovaná vzorka sa začína zosúvať nadol a skvapalnieva. Štádium D Na povrchu sa vytvára úplný meniskus, avšak značné množstvo testovanej vzorky zostáva naďalej v tuhom skupenstve. Štádium E (konečné štádium procesu topenia): V kapilárnej rúrke už nemožno sledovať žiadne tuhé čiastočky. Počas stanovovania teploty topenia sa teploty zaznamenávajú na začiatku procesu topenia a v konečnom štádiu.

1.6.1.1. Zariadenia na stanovenie teploty topenia s kvapalinovým kúpeľom Na obrázku 2 je znázornený typ štandardizovaného prístroja na meranie teploty topenia vyrobeného zo skla (JIS K 0064); všetky špecifikácie (rozmery) sú uvedené v milimetroch (mm).

1.6.1.1.

Obrázok 2 A: Meracia nádoba B: Zátka C: Ventil D: Teplomer E: Prídavný teplomer F: Kúpeľová kvapalina G: Kapilárna rúrka vyrobená zo skla o dĺžke 80 – 100 mm, s vnútorným priemerom približne 1 mm, s maximálnym vonkajším priemerom 5 mm a s hrúbkou steny 0,2 – 0,3 mm H: Bočná rúrka

Temperačná kvapalina:

Je potrebné zvoliť vhodnú kvapalinu. Voľba správnej kvapaliny závisí od teploty topenia, ktorá má byť stanovená, napr. parafínový olej pre teploty topenia, ktoré nepresahujú 473 K, silikónový olej pre teploty topenia, ktoré nepresahujú 573 K. Pre teploty topenia nad 523 K sa môže použiť zmes pozostávajúca z troch dielov kyseliny sírovej a dvoch dielov síranu draselného (v pomere hmôt). Pri použití takejto zmesi je potrebné dodržiavať vhodné bezpečnostné opatrenia.

Teplomer:

Treba používať len také teplomery, ktoré spĺňajú požiadavky týchto alebo ekvivalentných noriem: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Postup:

Suchá testovaná látka sa v trecej miske rozomelie na jemný prášok a vloží sa do kapilárnej rúrky, ktorá je na jednom konci zatavená. Testovaný prášok sa tesne natlačí tak, aby náplň tvorila približne 3 mm stĺpec. Na účely dosiahnutia rovnomerne natesnanej vzorky je potrebné kapilárnu rúrku pustiť z výšky približne 700 mm cez sklenú rúrku vertikálne na hodinkové sklíčko. Naplnená kapilárna rúrka sa umiestni do kúpeľa tak, aby sa stredná časť ortuťovej guľôčky teplomeru dotýkala tej časti rúrky, v ktorej je umiestnená testovaná vzorka. Kapilárna rúrka sa do prístroja vkladá zvyčajne pri teplote, ktorá je o 10 K nižšia ako samotná teplota topenia. Temperačná kvapalina sa zahrieva tak, aby nárast teploty predstavoval približne 3 K za minútu. Kvapalinu je potrebné neustále miešať. Pri teplote približne o 10 K nižšej ako predpokladaná teplota topenia testovanej látky sa nárast teploty nastaví na maximálne 1 K za minútu.

Výpočet:

Výpočet teploty topenia je takýto: T = TD + 0,00016 (TD – TE)n kde: T korigovaná teplota topenia v K TD teplota odčítaná na teplomere D v K TE teplota odčítaná na teplomere E v K n počet dielikov ortuťového stĺpca teplomeru D na výstupnej trubičke.

1.6.1.2. Zariadenia na meranie teploty topenia s kovovým blokom

1.6.1.2. Prístroje:

Pozostávajú z týchto častí:

valcovitý blok, ktorého horná časť je dutá a vytvára komoru (pozri obrázok 3),

kovový vrchnák s dvoma alebo viacerými otvormi umožňujúcimi zasunutie rúrok do kovového bloku,

ohrevný systém kovového bloku, pozostávajúci napríklad z elektrického odporu zabudovaného do kovového bloku,

reostat na reguláciu príkonu energie v prípade použitia elektrického ohrievania,

štyri okienka zo žiaruvzdorného skla na bočných stenách komory, ktoré sú umiestnené protiľahlo a vzájomne v pravých uhloch. Pred jedným z týchto okienok je namontovaný okulár na sledovanie kapilárnej rúrky. Zvyšné tri okienka sa používajú na osvetlenie vnútornej komory kovového bloku pomocou lámp,

kapilárna rúrka zo žiaruvzdorného skla, na jednom konci uzavretá (pozri odsek 1.6.1.1).

Teplomer:

Pozri normy spomínané v odseku 1.6.1.1. Možno tiež použiť termoelektrické meracie zariadenia s porovnateľným stupňom presnosti.

Obrázok 3 Teplomer Kapilárna rúrka Kovový vrchnák Okulár Lampa Elektrický odpor Kovový ohrevný blok

1.6.1.3. Fotočlánková (fotónková) detekcia Prístroje a postup: Prístroj pozostáva z kovovej komory s automatickým ohrevným systémom. Tri kapilárne rúrky sa naplnia testovanou látkou podľa pokynov uvedených v odseku 1.6.1.1 a umiestnia sa do piecky. Na účely kalibrovania prístroja existuje viacero lineárnych prírastkov teploty a vhodný nárast teploty je elektricky nastavovaný predvolenou konštantnou a lineárnou rýchlosťou ohrevu. Registračné prístroje ukazujú skutočnú teplotu v piecke, ako aj teplotu testovanej látky umiestnenej v kapilárnych rúrkach.

1.6.2. Tepelné bloky

1.6.2.

1.6.2.1. Koflerov tepelný blok Pozri dodatok.

1.6.2.2. Mikroskop na sledovanie taveniny Pozri dodatok.

1.6.2.3. Menisková metóda (polyamidy) Pozri dodatok. Rýchlosť ohrevu pri teplote topenia by mala byť nižšia ako 1 K za minútu.

1.6.3. Metódy na stanovenie teploty tuhnutia Pozri dodatok.

1.6.4. Tepelná analýza

1.6.4.

1.6.4.1. Diferenciálna tepelná analýza Pozri dodatok.

1.6.4.2. Diferenciálna snímacia kalorimetria Pozri dodatok.

1.6.5. Stanovenie teploty tuhnutia olejov Pozri dodatok.

2. ÚDAJE V niektorých prípadoch je potrebná korekcia teplomeru.

3. SPRÁVA Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať tieto informácie: Ako teplota topenia sa v správe uvádza priemer najmenej dvoch meraní, ktoré sa nachádzajú v rozmedzí stanovenej presnosti (pozri tabuľky). Ak sa rozdiel medzi teplotou na začiatku a v konečnom štádiu procesu topenia nachádza v rámci hraničných limitov presnosti metódy, za teplotu topenia sa bude považovať teplota nameraná v konečnom štádiu procesu topenia. Inak sa v správe uvádzajú obidve teploty. Ak sa testovaná látka rozloží alebo sublimuje ešte pred dosiahnutím teploty topenia, v správe je potrebné uviesť teplotu, pri ktorej bol tento jav pozorovaný. V správe musia byť uvedené všetky informácie a poznámky, ktoré sú dôležité pre interpretáciu výsledkov testu, najmä týkajúce sa prímesí a fyzikálneho stavu testovanej látky.

použitú metódu,

presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi) a opatrenia v rámci predbežnej purifikácie testovanej látky, ak boli takéto uskutočnené,

stanovenie presnosti.

4.(1)(2)(3)(4)

ODKAZY OECD, Paris, 1981, Test Guideline No 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. (vyd.). Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II, 803 – 834. R. Weissberger ed. (vyd.): Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505 – 515.

A.2. TEPLOTA VARU

A.2.

1. METÓDA Opísané metódy sú upravené smernicou na vykonávanie OECD testov (1). Základné princípy sú uvedené v odkazoch (2) a (3).

1.

1.1. ÚVOD Metódy, prístroje a zariadenia opísané v tejto časti môžu byť použité pre kvapalné látky a látky s nízkou teplotou topenia za predpokladu, že tieto látky nepodliehajú reakciám pod teplotou varu (napr. samovoľnej oxidácii alebo prešmykovaniu či degradácii a pod.). Metódy môžu byť aplikované na čisté, ako aj na nečisté kvapalné látky. Dôraz sa kladie na metódy využívajúce fotočlánkovú detekciu a tepelnú (termickú) analýzu, pretože tieto metódy umožňujú stanovenie teploty topenia a zároveň aj teploty varu. Navyše, merania sa môžu uskutočniť automaticky. Tzv. dynamická metóda má tú výhodu, že sa môže použiť aj na stanovenie tlaku pary a nie je teda potrebné upravovať teplotu varu k normálnemu tlaku (101,325 kPa), pretože normálny tlak sa môže počas meraní upravovať manostatom. Poznámky: Vplyv prímesí na stanovenie teploty varu závisí vo veľkej miere od charakteru prímesi. Keď sa vo vzorke nachádzajú prchavé prímesi, ktoré by mohli nepriaznivo ovplyvniť výsledky, testovaná látka sa očistí.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Normálna teplota varu je definovaná ako teplota, pri ktorej má tlak pary danej kvapaliny hodnotu 101,325 kPa. Ak sa teplota varu nemeria pri normálnom atmosférickom tlaku, závislosť teploty od tlaku pary môže byť opísaná Clausiusovou-Clapeyronovou rovnicou: log p = Δ Hv2,3 RT+konst kde: P tlak pary testovanej látky v pascaloch ΔHv jej výparné teplo (skupenské teplo vyparovania) v J mol-1 R univerzálna mólová plynová konštanta = 8,314 J mol-1 K-1 T termodynamická teplota v K Teplota varuje stanovená pri zohľadnení okolitého tlaku pôsobiaceho počas merania. Prepočty Tlak (jednotky: kPa) 100kPa 1 bar = 0,1 MPa (bar je naďalej prípustná jednotka, avšak neodporúča sa jej používanie) 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (jednotky mm Hg a Torr nie sú prípustné) 1 atm štandardná atmosféra = 101325 Pa (jednotka atm nie je prípustná). Teplota (jednotky K – kelvin) t = T – 273,15 t teplota v stupňoch Celzia, stupne Celzia ( oC), T termodynamická teplota, kelvin (K).

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Referenčné látky nemusia byť použité vo všetkých prípadoch, keď sa skúma nová látka alebo nová látka obsiahnutá v prípravku. V prvom rade by mali slúžiť na občasnú kontrolu účinnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie porovnania s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód. Niektoré kalibračné látky možno vyhľadať v metódach uvedených v dodatku.

1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY Päť metód na stanovenie teploty varu (rozmedzia varu) sa zakladá na meraní teploty varu, dve ďalšie sa zakladajú na tepelnej analýze.

1.4.

1.4.1. Stanovenie použitím ebuliometra Ebuliometre boli pôvodne vyvinuté na stanovenie hmotnosti molekúl zvýšením teploty varu, ale sú vhodné aj na presné merania teploty varu. Veľmi jednoduchý prístroj je opísaný v technickej norme ASTM D 1120-72 (pozri dodatok). Kvapalina sa v tomto prístroji zohrieva v rovnovážnych podmienkach pri atmosférickom tlaku až po dosiahnutie varu.

1.4.2. Dynamická metóda Táto metóda spočíva v meraní rekondenzačnej teploty pary v spätnom toku počas varu pomocou vhodného teplomeru. Pri tejto metóde môže byť regulovaný tlak.

1.4.3. Destilačná metóda pre teplotu varu Táto metóda spočíva v destilácii kvapaliny a v meraní rekondenzačnej teploty pary a v stanovení množstva destilátu.

1.4.4. Metóda podľa Siwoloboffa Testovaná vzorka sa zahrieva vo vzorkovej rúrke, ktorá je ponorená do kvapaliny v tepelnom kúpeli. Do vzorkovej rúrky sa zasunie zatavená kapilára, ktorá obsahuje vo svojej spodnej časti vzduchovú bublinu.

1.4.5. Fotočlánková detekcia Postupuje sa podľa princípov Siwoloboffovej metódy, avšak s uskutočnením automatického fotoelektrického merania pri použití stúpajúcich bublín.

1.4.6. Diferenciálna tepelná analýza Touto technikou merania sa zaznamenáva teplotný rozdiel medzi testovanou látkou a referenčným materiálom ako funkcia teploty, pričom testovaná látka aj referenčný materiál sú vystavené tomu istému regulovanému a kontrolovanému teplotnému programu. Keď testovaná vzorka prejde fázovou zmenou zahrnujúcou zmenu entalpie, táto zmena sa prejaví endotermickou odchýlkou (varom) od základnej línie teplotného záznamu.

1.4.7. Diferenciálna snímacia kalorimetria Touto meracou technikou sa zaznamenáva rozdiel vo vstupoch energie do testovanej látky a do referenčného materiálu ako funkcia teploty, pričom testovaná látka aj referenčný materiál sú vystavené tomu istému regulovanému a kontrolovanému teplotnému programu. Toto je energia, ktorá je potrebná na vytvorenie nulového teplotného rozdielu medzi testovanou látkou a referenčným materiálom. Keď testovaná vzorka prejde fázovou zmenou zahrnujúcou zmenu entalpie, táto zmena sa prejaví endotermickou odchýlkou (varom) od základnej línie záznamu tepelného toku.

1.5. Tabuľka 1 Porovnanie metód

KRITÉRIÁ KVALITY Aplikovateľnosť a presnosť rozdielnych metód použitých na stanovenie teploty varu, resp. teplotného rozmedzia, je uvedená v tabuľke 1. Metóda merania Odhadnutá presnosť Platná norma Stanovenie ebuliometrom ±1,4 K (do 373 K) ±2,5 K (do 600 K) ASTM D 1120-72 Dynamická metóda ±0,5 K (do 600 K) Destilačná metóda (stanovenie rozmedzia teploty varu) ±0,5 K (do 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Postup podľa Siwoloboffa ± 2 K (do 600 K) Detekcia fotočlánkom ±0,3 K (do 373 K) Diferenčná tepelná analýza ±0,5 K (do 600 K) ±2,0 K (do 1273 K) ASTM E 537-76 Diferenčná snímacia kalorimetria ±0,5 K (do 600 K) ±2,0 K(do 1273K) ASTM E 537-76

1.6. OPIS SKÚŠOBNÝCH METÓD Postupy niektorých skúšobných metód sú opísané v medzinárodných a štátnych technických normách (pozri dodatok).

1.6.

1.6.1. Ebuliometer Pozri dodatok.

1.6.2. Dynamická metóda Pozri testovaciu metódu A.4 na stanovenie tlaku pary. Zaznamenáva sa teplota varu pozorovaná pri aplikovanom tlaku 101,325 kPa.

1.6.3. Destilačný proces (rozmedzie varu) Pozri dodatok.

1.6.4. Metóda podľa Siwoloboffa Testovaná vzorka sa zahrieva v prístroji na meranie teploty topenia vo vzorkovej rúrke s priemerom približne 5 mm (obrázok 1). Obrázok 1 znázorňuje typ štandardizovaného prístroja na meranie teploty topenia a teploty varu (podľa technickej normy JIS K 0064) (vyrobený zo skla, všetky rozmery sú uvedené v milimetroch). Kapilárna rúrka (varná kapilára), ktorá je zatavená približne vo výške 1 cm nad spodným koncom, sa umiestni do vzorkovej rúrky. Výška úrovne, do ktorej sa pridá testovaná látka, musí byť taká, aby zatavená časť kapiláry bola pod hladinou kvapaliny. Vzorková rúrka obsahujúca varnú kapiláru sa buď pripevní k teplomeru pomocou gumičky, alebo sa zboku fixuje podpierkou (pozri obrázok 2). Obrázok 2 Princíp podľa Siwoloboffa Obrázok 3 Modifikovaný princíp Temperačná kvapalina sa zvolí v závislosti od teploty varu. Pri teplotách do 573 K možno použiť silikónový olej. Parafínový olej možno použiť len do teploty 473 K. Zahrievanie temperačnej kvapaliny musí byť spočiatku adjustované na nárast teploty 3 K za minútu. Temperačná kvapalina sa musí neustále miešať. Pri teplote približne 10 K pod predpokladanou teplotou varu sa intenzita zahrievania zníži na menej ako 1 K za minútu. V bezprostrednej blízkosti teploty varu sa vo varnej kapiláre začnú rýchlo tvoriť bublinky. Teplota varu je tá teplota, keď pri momentálnom ochladení v kapiláre ustane tvorba reťazca bubliniek a zrazu začne stúpať stĺpec kvapaliny. Zodpovedajúci údaj na stupnici teplomeru bude predstavovať teplotu varu príslušnej testovanej látky. V prípade modifikovaného princípu (obrázok 3) sa teplota varu stanovuje v kapiláre na meranie teploty topenia. Koniec kapiláry sa nataví a natiahne do hrotu v dĺžke asi 2 cm (a) a nasaje sa malé množstvo testovanej látky. Otvorený koniec jemnej kapiláry sa uzavrie zatavením tak, že na konci zostane malá vzduchová bublinka. Počas zohrievania v prístroji na stanovenie teploty topenia (b) sa vzduchová bublinka rozpína. Teplota varu zodpovedá teplote, pri ktorej testovaná látka dosiahne povrch temperačnej kvapaliny (c).

1.6.4.

Obrázok 1 A: Meracia náboda B: Zátka C: Ventil D: Teplomer E: Prídavný teplomer F: Kúpeľová kvapalina G: Kapilárna rúrka vyrobená zo skla o dĺžke 80 – 100 mm, s vnútorným priemerom približne 1 mm, s maximálnym vonkajším priemerom 5 mm a s hrúbkou steny 0,2 – 0,3 mm H: Bočná rúrka

1.6.5. Fotočlánková detekcia Testovaná vzorka sa zahrieva v kapiláre umiestnenej vo vyhrievanom kovovom bloku. Cez vhodne umiestnené otvory v kovovom bloku sa nasmeruje svetelný lúč cez testovanú látku na dôkladne kalibrovaný fotočlánok. Počas nárastu teploty testovanej vzorky sa vo varnej kapiláre začnú objavovať samostatné vzduchové bublinky. Keď sa dosiahne teplota varu, počet vzduchových bubliniek sa nápadne zvýši. Tento jav spôsobí zmenu v intenzite svetla zaznamenanú fotočlánkom, ktorý vyšle stop signál indikátoru odčítavajúcemu teplotu z platinového odporového teplomeru umiestneného v kovovom bloku. Táto metóda je obzvlášť výhodná, pretože umožňuje stanovenie skúmaných hodnôt aj pri teplotách nižších ako bežná izbová teplota až do 253,15 K (–20 oC) bez akýchkoľvek zmien na prístroji. Inštrument stačí iba umiestniť do chladiaceho kúpeľa.

1.6.6. Tepelná analýza

1.6.6.

1.6.6.1. Diferenciálna tepelná analýza Pozri dodatok.

1.6.6.2. Diferenciálna snímacia kalorimetria Pozri dodatok.

2. Tabuľka 2 Opravné koeficienty fT na teplotu

ÚDAJE Pri malých odchýlkach od normálneho tlaku (max. ± 5 kPa) sa teploty varu normalizujú na Tn pomocou tejto rovnice podľa Sidneyho Younga: Tn = T + (fT × Δp) kde: Δp (101,325 – p) [pozor na znamienko!] P meranie tlaku v kPa fT pomer zmeny teploty varu k tlaku v K/kPa T nameraná teplota varu v K Tn teplota varu korigovaná k normálnemu tlaku v K Opravné koeficienty na teplotu, fT, a rovnice na ich aproximáciu sú pre mnohé látky zahrnuté v uvedených medzinárodných a národných technických normách. Napríklad v metóde podľa technickej normy DIN 53171 sa spomínajú tieto hrubé opravy pre rozpúšťadlá obsiahnuté v náterových farbách: Teplota T (K) Opravný koeficient fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47

3. SPRÁVA Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať tieto informácie: Ako teplota varu sa uvádza stredná hodnota najmenej dvoch meraní, ktoré sú v rozmedzí stanovenej presnosti (pozri tabuľku 1). V správe musia byť zaznamenané namerané teploty varu a ich priemerné hodnoty a tlak, resp. tlaky, pri ktorých boli merania uskutočnené a sú uvedené v kPa. Odporúča sa, aby použitý tlak dosahoval hodnoty blížiace sa normálnemu atmosférickému tlaku. V správe musia byť uvedené všetky informácie a poznámky, ktoré sú dôležité pre interpretáciu výsledkov testu, najmä týkajúce sa prímesí a fyzikálneho skupenstva (stavu) testovanej látky.

použitú metódu,

presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a nečistoty) a opatrenia v rámci predbežnej purifikácie testovanej látky, ak boli takéto uskutočnené,

odhad presnosti.

4.(1)(2)(3) ODKAZY OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, volume II. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.

A.3. RELATÍVNA HUSTOTA

A.3.

1. METÓDA Opísané metódy sú upravené smernicou na vykonávanie OECD testov (1). Základné princípy sú uvedené v odkaze (2).

1.

1.1. ÚVOD Opísané metódy na stanovenie relatívnej hustoty sa môžu použiť pre tuhé a kvapalné látky bez akýchkoľvek obmedzení v spojitosti so stupňom ich čistoty. Rozličné použiteľné metódy sú uvedené v tabuľke 1.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Relatívna hustota, D204, tuhých látok alebo kvapalín je pomer medzi hmotnosťou objemu príslušnej látky určenej na testovanie, stanovenou pri teplote 20 oC , a hmotnosťou toho istého objemu vody, stanovenou pri teplote 4 oC. Relatívna hustota nemá žiadny rozmer. Hustota, P, danej látky je pomer hmotnosti, m, a jej objemu, v. Hustota, P, sa udáva v jednotkách SI, v kg/m3.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY (1) (3) Referenčné látky sa nemusia použiť vo všetkých prípadoch, keď sa skúma nová chemická látka alebo nová chemická látka obsiahnutá v chemickom prípravku. V prvom rade by mali slúžiť na občasnú kontrolu účinnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie porovnania s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód.

1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNÝCH METÓD Používajú sa štyri triedy (skupiny) skúšobných metód.

1.4.

1.4.1. Výtlačné metódy

1.4.1.

1.4.1.1. Hustomer (pre kvapalné látky) Dostatočne presné a rýchle stanovenia hustoty možno dosiahnuť ponorným hustomerom, ktorý umožňuje stanovenie hustoty testovanej kvapaliny na základe hĺbky ponorenia odčítaním príslušnej hodnoty z delenej stupnice.

1.4.1.2. Hydrostatické váhy (pre tuhé a kvapalné látky) Na stanovenie hustoty možno použiť rozdiel medzi hmotnosťou príslušnej testovanej vzorky, meranou vo vzduchu a vo vhodnej kvapaline (napr. vo vode). V prípade tuhých látok sa nameraná hustota vzťahuje iba na konkrétnu použitú vzorku. Na stanovenie hustoty kvapalín sa teleso so známym objemom, v, odváži najprv vo vzduchu a potom v kvapaline.

1.4.1.3. Metóda ponoreného telesa (pre kvapalné látky) (4) V rámci tejto metódy sa hustota kvapaliny stanoví z rozdielu hodnôt váženia kvapaliny pred ponorením a po ponorení telesa so známym objemom do testovanej kvapaliny.

1.4.2. Pyknometrické metódy Pre tuhé alebo kvapalné látky možno použiť pyknometre rozličných tvarov a so známymi objemami. Hustota sa vypočíta z rozdielu hmotnosti medzi plným a prázdnym pyknometrom a jeho známeho objemu.

1.4.3. Vzduchový porovnávací pyknometer (pre tuhé látky) Hustota tuhej látky v akejkoľvek forme sa môže merať pri teplote miestnosti pomocou plynového porovnávacieho pyknometra. Objem látky sa meria vo vzduchu alebo v inertnom plyne vo valci s meniteľným kalibrovaným objemom. Na výpočet hustoty sa jedno meranie hmotnosti vykoná po ukončení merania objemu.

1.4.4. Oscilujúci hustomer (5) (6) (7) Hustota kvapaliny sa môže merať aj oscilujúcim hustomerom. Mechanický oscilátor zostrojený v tvare trubice do U sa rozkmitá na rezonančný kmitočet oscilátora, ktorý závisí od jeho hmotnosti. Vloženie testovanej látky zmení rezonančný kmitočet oscilátora. Prístroj musí byť kalibrovaný dvoma kvapalnými látkami známej hustoty. Tieto látky by sa mali zvoliť podľa možnosti tak, aby ich hustoty pokryli celý meraný rozsah.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Použiteľnosť rozdielnych metód používaných na stanovenie relatívnej hustoty je uvedená v tabuľke.

1.6. OPIS METÓD Technické normy uvedené ako príklady, ktoré treba použiť pre dodatočné technické podrobnosti, sú uvedené v dodatku. Testy sa musia vykonať pri teplote 20 oC, a zároveň je potrebné uskutočniť vždy aspoň dve merania.

2. ÚDAJE Pozrite príslušné technické normy uvedené v dodatku.

3. Tabuľka 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2.1.4.3.1.4.4. Použiteľnosť metód

SPRÁVA Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať tieto informácie: Relatívna hustota, D204, musí byť v správe uvedená podľa definície v bode 1.2, spolu s fyzikálnym stavom meranej látky. Musia byť uvedené všetky informácie a poznámky, ktoré sú dôležité pre interpretáciu výsledkov, obzvlášť v súvislosti s prímesami a s fyzikálnym skupenstvom testovanej látky. Metóda merania Hustota Najvyššia možná hodnota dynamickej viskozity Platná norma tuhé látky kvapaliny Hustomer áno 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Hydrostatické váhy áno ISO 1183 (A), áno 5 Pa s ISO 901 a 758 Metóda ponoreného telesa áno 22 Pa s DIN 53217 Pyknometer ISO 3507 áno ISO 1183 (B), NF T 20-053 áno 500 Pa s ISO 758 Vzduchový porovnávací pyknometer áno DIN 55990 Teil 3, DIN 53243 Oscilujúci hustomer áno 5 Pa s

použitú metódu,

presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi) a opatrenia v rámci predbežnej purifikácie testovanej látky, ak sa takéto uskutočnili.

3. Tabuľka 1.4.1.1.1.4.1.2. Použiteľnosť metód a)

tuhé látky

kvapaliny

3. Tabuľka 1.4.1.1.1.4.1.2.1.4.1.3.1.4.2. Použiteľnosť metód a)

tuhé látky

kvapaliny

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

ODKAZY OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 427 – 430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297 – 302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717 – 726. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253 – 255.

A.4. TLAK PARY

A.4.

1. METÓDA Opísané metódy sú upravené smernicou na vykonávanie testov OECD (1). Základné princípy sú uvedené v odkazoch (2) a (3).

1.

1.1. ÚVOD Na účely úspešného uskutočnenia tohto testu sa odporúča získať predbežné informácie o štruktúre, resp. stavbe, teplote topenia a teplote varu príslušnej látky určenej na testovanie. Neexistuje jediný postup merania, ktorý by sa dal aplikovať na celé rozmedzie tlakov pary. Z toho dôvodu sa na meranie tlaku od < 10-4 Pa do 105 Pa odporúča uplatnenie viacerých metód. Prímesi zvyčajne ovplyvnia tlak pary, a to do takej miery, ktorá závisí od druhu príslušnej prímesi. V prípadoch, kde sa vo vzorke nachádzajú prchavé prímesi, ktoré by mohli nepriaznivo ovplyvniť výsledok, odporúča sa látku vopred očistiť, resp. zbaviť príslušných prímesí. Môže byť tiež vhodné stanoviť tlak pary pre technický materiál. V rámci niektorých metód opísaných v tomto materiáli sa používajú prístroje s kovovými časťami. Túto skutočnosť je potrebné vziať do úvahy pri testovaní žieravých látok.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Tlak pary látky je definovaný ako tlak nasýtenej pary nad tuhou alebo kvapalnou látkou. Pri termodynamickej rovnováhe tlak pary čistej látky je výlučne funkciou teploty. Jednotka SI pre tlak, ktorá sa má používať, je pascal (Pa). Jednotky, ktoré sa postupne používali s vývojom doby, spolu s prepočítavacími koeficientmi, sú tieto: 1 Torr (= 1 mm Hg) = 1,333 × 102 Pa 1 atmosféra = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa Jednotkou teploty v rámci sústavy SI je kelvin (K). Všeobecná mólová (molekulová) plynová konštanta R je 8,314 J mol-1 K-1. Teplotná závislosť tlaku pary je opísaná v Claussiusovej-Clapeyronovej rovnici: log p = ΔHv2,3RT+konst kde: p tlak pary látky vyjadrený v pascaloch ΔHv jej teplota vyparovania v J mol-1 R všeobecná mólová (molekulová) plynová konštanta J mol-1 K-1 T termodynamická teplota v K (kelvinoch)

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Referenčné látky sa nemusia použiť vo všetkých prípadoch, keď sa skúma nová chemická látka alebo nová chemická látka obsiahnutá v chemickom prípravku. V prvom rade by mali slúžiť na občasnú kontrolu účinnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie porovnania s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód.

1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNÝCH METÓD Na stanovenie tlaku bolo navrhnutých sedem metód, ktoré sa môžu aplikovať v rozdielnych rozmedziach tlaku pary. V rámci každej metódy sa tlak pary stanovuje pri rozličných teplotách. V limitovanom teplotnom rozmedzí je logaritmus tlaku pary čistej látky lineárnou funkciou inverzie teploty.

1.4.

1.4.1. Dynamická metóda V rámci dynamickej metódy sa meria teplota varu, ktorá prináleží špecifikovanému tlaku. Odporúčané rozmedzie: 103 až 105 Pa. Táto metóda sa odporúča aj na stanovenie normálnej teploty varu a na tento účel sa dá použiť až do teploty 600 K.

1.4.2. Statická metóda V rámci statického procesu pri termodynamickej rovnováhe sa stanovuje tlak pary vytvorený v uzavretom systéme pri špecifikovanej teplote. Táto metóda je vhodná pre jednozložkové a viaczložkové tuhé látky a kvapaliny. Odporúčané rozmedzie: 10 až 105 Pa. Táto metóda sa dá použiť aj v rozmedzí od 1 do 10 Pa, avšak len za predpokladu, že sa bude postupovať pozorne a opatrne.

1.4.3. Izoteniskop Táto štandardizovaná metóda je taktiež statickou metódou, avšak zvyčajne nie je vhodná pre viaczložkové systémy. Doplnkové informácie možno získať v technickej norme ASTM, metóda D-2879-86. Odporúčané rozmedzie: od 100 do 105 Pa.

1.4.4. Výtoková metóda: Váhy na meranie tlaku pary Množstvo látky unikajúce z komôrky za jednotku času cez otvor známej veľkosti sa stanovuje vo vákuových podmienkach, pri ktorých je množstvo látky vracajúce sa späť do komôrky zanedbateľné (napríklad meraním impulzu vyvinutého na vysokocitlivé váhy prúdom pary alebo meraním úbytku hmotnosti). Odporúčané rozmedzie: 10-3 až 1 Pa.

1.4.5. Výtoková metóda: meraním úbytku hmotnosti alebo zachytávaním odparenej látky Táto metóda je založená na odhade hmotnosti testovanej látky, ktorá za jednotku času unikla z Knudsenovej komôrky (4) vo forme pary cez mikrootvor v ultravákuových podmienkach. Hmotnosť výtokovej uniknutej pary sa dá zistiť buď stanovením úbytku hmotnosti komôrky, alebo kondenzáciou pary pri nízkej teplote a stanovením množstva vyprchanej látky použitím chromatografickej analýzy. Tlak pary sa vypočíta použitím Hertzovho-Knudsenovho vzťahu. Odporúčané rozmedzie: 10-3 až 1 Pa.

1.4.6. Metóda plynovej saturácie Prúd inertného nosného plynu sa prepúšťa nad testovanou látkou takým spôsobom, že plyn sa nasýti parou testovanej látky. Množstvo materiálu transportovaného známym množstvom nosného plynu sa dá merať buď jeho zachytením do vhodného zachytávača, alebo vhodnou in-train analytickou metódou. Výsledná hodnota sa potom použije na výpočet tlaku pary pri danej teplote. Odporúčané rozmedzie: 10-4 až 1 Pa. Táto metóda sa dá použiť aj v rozmedzí od 1 do 10 Pa, avšak len za predpokladu, že sa bude postupovať pozorne a opatrne.

1.4.7. Metóda rotujúcej guľôčky Bezprostredným meracím prvkom v rotačnom meracom prístroji je malá oceľová guľôčka, ktorá je zavesená do magnetického poľa a v ňom rotuje vysokou rýchlosťou. Tlak pary sa odvodzuje zo spomaľovania rotačného pohybu guľôčky, ktoré je závislé od tlaku. Odporúčané rozmedzie: 10-4 až 0,5 Pa.

1.5. Tabuľke 1.4.1.1.4.2.1.4.3.1.4.4.1.4.5.1.4.6.1.4.7. Kritériá kvality

KRITÉRIÁ KVALITY Rôzne metódy na stanovenie tlaku pary sa porovnávajú z hľadiska ich použiteľnosti, opakovateľnosti, reprodukovateľnosti, rozsahu merania a existujúcich technických noriem. Prehľadná forma porovnania týchto metód je uvedená v tejto tabuľke. Metóda merania Látky Odhad opakovateľnosti Odhad reprodukovateľnosti Odporúčaná oblasť Platná norma tuhé kvapalné Dynamická metóda s nízkou teplotou topenia áno do 25 % do 25 % 103 Pa až 2 × 103 PA — 1 až 5 % 1 až 5 % 2 × 103 Pa až 105 Pa — Statická metóda áno áno 5 až 10 % 5 až 10 % 10 Pa až 105 Pa NF T 20-048(5) Izoteniskop áno áno 5 až 10 % 5 až 10 % 102 Pa až 105 Pa ASTMD 2879-86 Výtoková metóda – váhy na meranie tlaku pár áno áno 5 až 20 % do 50 % 10-3 Pa až 1 Pa NF T 20-047(6) Výtoková metóda – meranie úbytku hmotnosti áno áno 10 až 30 % — 10-3 Pa až 1 Pa — Metóda plynovej saturácie áno áno 10 až 30 % do 50 % 10-4 Pa až 1 Pa — Metóda rotujúcej guľôčky áno áno 10 až 20 % — 10-4 Pa až 0,5 Pa —

1.6. OPIS METÓD

1.6.

1.6.1. Dynamické meranie

1.6.1.

1.6.1.1. Prístroje Merací prístroj obyčajne pozostáva z varnej nádoby s pripojeným chladičom, vyrobenými zo skla alebo kovu (obrázok 1), zo zariadenia na meranie teploty a zariadenia na reguláciu a meranie tlaku. Typický merací prístroj, znázornený na kresbe, je vyrobený z teplovzdorného skla a pozostáva z piatich častí: Veľká, čiastočne dvoj stenová trubica pozostáva zo zabrúsenej plášťovej prípojky, chladiča, chladiacej nádoby a prívodu (vstupu). Sklený valec opatrený Cottrellovou pumpou je inštalovaný do varnej časti trubice a má hrubý povrch z drveného skla na zabránenie prudkého varu v priebehu procesu varu. Teplota sa meria pomocou vhodného teplotne citlivého elementu (napríklad odporového teplomeru, plášťového termočlánku), zasunutého do prístroja až po miesto merania teploty (č. 5, obrázok 1) cez vhodný vstup (napríklad cez zasunovaciu zabrúsenú prípojku). Vytvorené sú potrebné spojenia so zariadením na reguláciu tlaku a s meracím zariadením. Banka, ktorá funguje ako oddeľujúci priestor, je spojená s meracím prístrojom kapilárou. Varnú nádobu zohrieva ohrievací článok (napríklad výmenný patrónový ohrievač), ktorý sa zospodu zasúva do prístroja. Požadovaný ohrievací prúd sa nastavuje, reguluje a stabilizuje prostredníctvom termočlánku (tepelného článku). Potrebné vákuum v rozmedzí od 102 Pa do približne 105 Pa sa vytvorí pomocou vákuovej pumpy. Vhodný ventil sa používa na dávkovanie vzduchu alebo dusíka na reguláciu tlaku (rozsah merania približne od 102 Pa do 105 Pa) a ventiláciu. Tlak sa meria tlakomerom.

1.6.1.2. Postup merania Tlak pary sa meria stanovením teploty varu testovanej vzorky pri rôznych špecifikovaných tlakoch zhruba medzi 103 Pa a 105 Pa. Stála teplota pri konštantnom tlaku naznačuje, že bola dosiahnutá teplota varu. Peniace látky sa nemôžu merať použitím tejto metódy. Testovaná látka sa umiestni do čistej a suchej nádoby na vzorky. S problémami sa možno stretnúť v prípade tuhých látok, ktoré nie sú vo forme prášku, avšak tieto problémy sa môžu v niektorých prípadoch vyriešiť zahriatím chladiaceho plášťa. Po naplnení nádoby sa prístroj tesne uzavrie v prírube a testovaná látka sa odplyní. Potom sa nastaví najnižší požadovaný tlak a zapne sa zohrievanie. Zároveň sa teplotne citlivý element pripojí na registračný prístroj. Rovnováha sa dosiahne vtedy, keď sa zaregistruje konštantná teplota varu pri konštantnom tlaku. Treba obzvlášť dávať pozor na to, aby sa zabránilo prudkému varu. Okrem toho musí v chladiči dôjsť k úplnej kondenzácii. Keď sa stanovuje tlak pary tuhých látok s nízkou teplotou topenia, treba dbať na to, aby sa zabránilo zablokovaniu chladiča. Po zaregistrovaní tohto rovnovážneho bodu sa nastaví vyšší tlak. Postup pokračuje rovnakým spôsobom až po dosiahnutie tlaku 105 Pa (spolu je to približne 5 až 10 meraní, t. j. meraní v rovnovážnych bodoch). V rámci kontroly sa musia rovnovážne body opakovať a merať pri klesajúcich tlakoch.

1.6.2. Statické meranie

1.6.2.

1.6.2.1. Prístroje Prístroj pozostáva z nádoby na testovanú vzorku, ohrievacieho a chladiaceho systému na reguláciu teploty testovanej vzorky a na meranie teploty. Prístroj je taktiež vybavený nástrojmi na nastavenie a meranie tlaku. Obrázky 2a a 2b ilustrujú príslušné základné princípy. Komora na vzorky (obrázok 2a) je na jednej strane napojená na vhodný vysokovákuový ventil. Na druhej strane je pripojená trubica v tvare U, ktorá obsahuje vhodnú manometrovú (tlakomerovú) kvapalinu. Jeden koniec trubice v tvare U odbočuje k vákuovej výveve, valcu s dusíkom alebo ventilačnému ventilu a k manometru (tlakomeru). Namiesto trubice v tvare U možno použiť snímač tlaku s tlakomerom (obrázok 2b). Na účely regulácie teploty testovanej vzorky je nádoba na vzorky spolu s ventilom a trubicou do tvaru U alebo snímačom tlaku (tlakomerom) umiestnená do kúpeľa, ktorý sa udržiava pri konštantnej teplote s maximálnym výkyvom ±0,2 K. Merania teploty sa uskutočňujú na vonkajšej stene nádoby obsahujúcej testovanú vzorku alebo priamo v samotnej nádobe. Vákuová výveva s chladiacim zachytávačom sa používa na vákuovanie prístroja. V prípade metódy 2a sa tlak pary testovanej látky meria nepriamo použitím nulového indikátora (ukazovateľa s nulovým bodom). Toto zohľadňuje skutočnosť, že hustota kvapaliny v trubici tvaru U sa mení pri rýchlej zmene teploty. Tieto kvapaliny sú vhodné na použitie ako nulové indikátory pre trubicu v tvare U v závislosti od tlakového rozmedzia a vlastností testovanej látky: silikónové tekutiny, ftaláty. Testovaná látka sa nesmie vo výraznejšej miere rozpúšťať v kvapaline nachádzajúcej sa v trubici tvaru U alebo s ňou reagovať. Pre manometer (tlakomer) možno v rozsahu normálneho atmosférického tlaku do 102 Pa použiť ortuť, zatiaľ čo silikónové tekutiny a ftaláty sú vhodné na použitie pri tlakoch pod 102 Pa až po 10 Pa. Pri tlakoch pod 10-1 Pa sa môžu použiť kapacitné manometre (tlakomery) so zahrievateľnou membránou. Existujú aj iné tlakové snímače (tlakomery), ktoré možno použiť pri tlakoch pod 102 Pa.

1.6.2.2. Postup merania Pred začatím merania sa musia všetky súčasti prístroja zobrazeného na obrázku 2 dôkladne očistiť a osušiť. V prípade metódy 2a sa trubica v tvare U naplní zvolenou kvapalinou, ktorá sa musí pred odčítaním nameraných hodnôt odplyniť pri zvýšenej teplote. Testovaná látka sa umiestni do prístroja, ktorý sa potom uzatvorí, a teplota sa dostatočne zredukuje na odplynenie. Teplota musí byť dostatočne nízka, aby sa tak zaručilo, že vzduch bude vysatý, ale v prípade viaczložkového systému nesmie zmeniť zloženie materiálu. Ak sa tak požaduje, rovnováha sa dá dosiahnuť rýchlejšie miešaním. Testovaná vzorka môže byť podchladená napríklad skvapalneným dusíkom (pričom treba dbať na to, aby sa zabránilo kondenzácii vzduchu alebo nasatiu kvapaliny) alebo zmesou etanolu a suchého ľadu. Na merania nízkych teplôt sa odporúča použiť tepelne regulovaný kúpeľ napojený na ultrakryomat. Pri otvorenej polohe ventilu nad nádobou obsahujúcou testovanú vzorku sa odsávaním počas niekoľkých minút odstráni prítomný vzduch. Ventil sa potom uzavrie a teplota testovanej vzorky sa redukuje na najnižšiu žiaducu úroveň. Ak je to potrebné, postup vákuovania sa musí opakovať niekoľkokrát za sebou. Keď sa vzorka zahreje, tlak pary narastá. Toto zmení rovnováhu kvapaliny v trubici tvaru U. Na kompenzovanie tohto javu sa do prístroja cez ventil vpúšťa dusík alebo vzduch dovtedy, kým sa kvapalina na indikáciu tlaku opäť neustáli na nulovej hodnote. Tlak, ktorý je na toto potrebný, sa môže odčítať z presného kontrolného tlakomeru (manometra) pri teplote miestnosti. Tento tlak zodpovedá tlaku pary testovanej látky pri tejto danej konkrétnej teplote merania. Metóda 2b je podobná, avšak tlak pary sa odčítava priamo. Teplotná závislosť tlaku pary sa stanovuje vo vhodne krátkych intervaloch (spolu približne 5 až 10 meracích bodov) až po požadované maximum. Odčítania nízkych teplôt sa musia opakovať ako kontrola. Ak sa hodnoty dosiahnuté z opakovaných odčítaní nezhodujú s krivkou dosiahnutou pre stúpajúcu teplotu, môže to byť následkom jednej z uvedených skutočností:

1.6.2.2.

1. Testovaná vzorka naďalej obsahuje vzduch (napríklad materiály s vysokou viskozitou) alebo nízkovriace látky, ktoré sú uvoľňované počas zahrievania a môžu byť odstránené odsatím po ďalšom podchladení.

2. Chladiaca teplota nie je dostatočne nízka. V tomto prípade sa ako chladiaci činiteľ použije skvapalnený dusík. V prípade, ak ide o bod 1 alebo 2, musia sa merania opakovať.

3. Testovaná látka podlieha reakcii v skúmanom teplotnom rozmedzí (napríklad rozkladu alebo polymerizácii).

1.6.3. Izoteniskop Vyčerpávajúci opis tejto metódy možno nájsť v odkaze (7). Princíp meracieho zariadenia je znázornený na obrázku 3. Podobne ako statická metóda opísaná v odseku 1.6.2, aj izoteniskop je vhodný na skúmanie tuhých látok aj kvapalín. V prípade kvapalín samotná testovaná látka slúži ako kvapalina v pomocnom tlakomere (manometri). Množstvo kvapaliny, ktoré je dostatočné na zaplnenie banky a krátkeho ramena tlakomerovej sekcie, sa umiestni do izoteniskopu. Izoteniskop sa napojí na vákuový systém a vákuuje, potom sa naplní dusíkom. Vákuovanie a prečistenie systému sa opakuje dvakrát, aby sa odstránil reziduálny kyslík. Naplnený izoteniskop sa umiestni v horizontálnej polohe, tak aby sa testovaná vzorka rozšírila v tenkej vrstve vo vzorkovej banke a tlakomerovej sekcii (časť v tvare U). Tlak systému sa redukuje na 133 Pa a testovaná vzorka sa mierne zahrieva, až kým nezačne vrieť (odstránenie rozpustených viazaných plynov). Izoteniskop sa potom umiestni tak, aby sa testovaná vzorka opäť vrátila do banky a krátkeho ramena tlakomeru a aby tieto boli opäť úplne naplnené kvapalinou. Tlak sa udržiava na takej úrovni ako pri odplyňovaní; vytiahnutá špička banky so vzorkou sa zohrieva malým plameňom dovtedy, kým sa uvoľnená para zo vzorky nerozšíri v dostatočnej miere na to, aby vytlačila časť vzorky z hornej časti banky a ramena tlakomeru do tlakomerovej sekcie izoteniskopu, vytvoriac tak plynom naplnený priestor bez prítomnosti dusíka. Izoteniskop sa potom umiestni do kúpeľa s konštantnou teplotou a tlak dusíka sa nastaví tak, aby sa rovnal tlaku testovanej vzorky. Rovnováhu tlaku ukáže tlakomerová sekcia izoteniskopu. V rovnovážnom stave sa tlak dusíka rovná tlaku pary testovanej látky. V prípade tuhých látok sa použijú tlakomerové kvapaliny uvedené v odseku 1.6.2.1 v závislosti od tlakového a teplotného rozmedzia. Odplynená tlakomerová kvapalina sa naleje do vydutiny na dlhom ramene izoteniskopu. Potom sa tuhá látka určená na skúmanie umiestni do banky a odplyní sa pri zvýšenej teplote. Po tomto úkone sa izoteniskop nakloní tak, aby tlakomerová kvapalina mohla natiecť do trubice v tvare U. Meranie tlaku pary ako funkcie teploty sa uskutoční podľa postupu uvedeného v odseku 1.6.2.

1.6.4. Výtoková metóda: Váhy na meranie tlaku pary

1.6.4.

1.6.4.1. Prístroje Rozličné verzie prístroja sú opísané v odkaze (1). Prístroj, ktorý je opísaný v tejto časti, ilustruje všeobecný princíp tejto metódy (obrázok 4). Na obrázku 4 sú znázornené hlavné zložky prístroja, pozostávajúce z vysokovákuovej nádoby z nehrdzavejúcej ocele alebo zo skla, zariadenia na vytváranie a meranie vákua a zo vstavaných zložiek na meranie tlaku pary na váhach. Prístroj pozostáva z nasledujúcich vstavaných zložiek (komponentov):

odparovacej piecky s prírubou a otočným vstupom. Odparovacia piecka je v podstate valcovitá nádoba, vyrobená napríklad z medi alebo chemicky odolnej zliatiny s dobrou tepelnou vodivosťou. Možno tiež použiť sklenú nádobu s medenou stenou. Piecka má priemer približne 3 cm až 5 cm a je vysoká 2 cm až 5 cm. Je opatrená jedným až tromi otvormi s rozdielnymi veľkosťami na umožnenie prúdenia pary. Piecka je vyhrievaná buď vyhrievacou platničkou umiestnenou pod ňou, alebo vyhrievacou špirálou ovinutou okolo jej vonkajšieho plášťa. Aby sa zabránilo strate tepla únikom cez podkladovú platňu, ohrievač je prichytený k tejto platni kovom s nízkou tepelnou vodivosťou (nové striebro, niklová mosadz alebo chrómniklová oceľ), napríklad rúrkou z niklovej mosadze pripojenou k otočnému vstupu, ak sa používa piecka s viacerými otvormi. Táto úprava má tú výhodu, že umožňuje zasunutie medenej tyče. Umožňuje to chladenie z vonkajšej strany použitím chladiaceho kúpeľa,

ak má veko medenej piecky viacero otvorov rozličných priemerov pod vzájomným uhlom 90o, možno tak v rámci celkového rozmedzia merania pokryť rôzne rozmedzia tlaku pary (otvory s priemermi v rozmedzí približne od 0,30 mm do 4,50 mm). Veľké otvory sa používajú pre nízke tlaky pary a naopak. Otáčaním piecky môže byť nastavený požadovaný otvor alebo medzipoloha na prúdenie pary (otvor v piecke – kryt – miska váh) a prúd molekúl sa uvoľní alebo odkloní cez otvor v piecke na misku váh. Na účely merania teploty testovanej látky sa na vhodné miesto umiestni tepelný článok (termočlánok) alebo odporový teplomer,

nad krytom je umiestnená miska váh prináležiaca vysokocitlivým mikrováham (pozri ďalej). Miska váh má priemer približne 30 mm. Pozlátený hliník predstavuje vhodný materiál,

miska váh je obklopená valcovitým mosadzným alebo medeným chladiacim boxom. V závislosti od typu váh je vybavená otvormi pre rameno váh (vahadlo) a otvorom v ochrannom kryte pre prúd molekúl a jej úlohou je zaručiť úplnú kondenzáciu pary na miske váh. Odvádzanie tepla smerom von je zabezpečené napríklad medenou tyčou pripojenou k chladiacemu boxu. Tyč je vyvedená cez základovú platňu a je od nej tepelne izolovaná napríklad trubicou z chrómniklovej ocele. Tyč je zasunutá do Dewarovej nádoby obsahujúcej skvapalnený dusík, umiestnenej pod základovou platňou, alebo skvapalnený dusík cirkuluje priamo cez tyč. Chladiaci box sa takto udržiava pri teplote približne – 120 oC. Miska váh je chladená výlučne sálaním a vyhovuje skúmanému tlakovému rozmedziu (chladenie približne jednu hodinu pred začatím merania),

váhy sú umiestnené nad chladiacim boxom. Vhodnými váhami pre túto metódu sú napríklad vysokocitlivé dvojramenné elektronické mikrováhy (8) alebo vysokocitlivý magneto-elektrický prístroj (pozri smernicu na vykonávanie OECD testov 104, vydanie z 12. mája 1981),

v základovej platni sú zabudované aj elektrické prípojky pre tepelné články (termočlánky) (alebo odporové teplomery) a ohrievací rúrkový had,

vákuum sa v nádobe vytvára použitím vákuovej vývevy na tvorbu čiastočného vákua (podtlaku) alebo použitím vysokovákuovej vývevy (požadované vákuum približne 1 Pa až 2 × 10-3 Pa sa dosiahne po 2 hodinách odčerpávania vzduchu). Tlak je regulovaný vhodným ionizačným tlakomerom (manometrom).

1.6.4.2. Postup merania Nádoba sa naplní testovanou látkou a veko sa uzavrie. Kryt a chladiaci box sa posunú nad piecku. Prístroj sa uzavrie a zapnú sa vákuové vývevy. Konečný tlak pred začatím meraní by mal byť približne 10-4 Pa. Chladenie v chladiacom boxe sa začína pri tlaku 10-2 Pa. Ak sa dosiahne požadované vákuum, začne sa so sériou kalibrácií pri najnižšej požadovanej teplote. Nastaví sa zodpovedajúci otvor na veku, prúd pary prechádza štítom umiestneným priamo nad otvorom a naráža na ochladený povrch misky váh. Miska váh musí byť dostatočne veľká, aby sa zabezpečilo, že celý prúd pary vedený krytom bude narážať na jej povrch. Impulz prúdu pary pôsobí ako sila proti miske váh a molekuly sa kondenzujú na jej chladnom povrchu. Impulz a následná kondenzácia vytvárajú signál na registračnom prístroji. Vyhodnotenie signálov poskytuje dve informácie: p = G 2πRT×103M kde: G rýchlosť odparovania (kg s-l m-2) M (relatívna) molekulová (mólová) hmotnosť (g mol-l) T teplota (K) (kelvin) R všeobecná molekulová plynová konštanta (J mol-l K -1) p tlak pary (Pa) Po dosiahnutí potrebného vákua (podtlaku) sa séria meraní začne pri najnižšej želanej meracej teplote. Pre ďalšie merania sa teplota zvyšuje v malých intervaloch, až kým sa nedosiahne maximálna želaná teplotná hodnota. Testovaná vzorka sa potom opäť ochladí a môže byť zaznamenaná druhá krivka tlaku pary. Ak druhé kolo nepotvrdí výsledky prvého kola meraní, potom je možné, že testovaná látka sa rozkladá v rámci meraného teplotného rozmedzia.

1.6.4.2.

1. V prístroji, ktorý je tu opísaný, sa tlak pary stanovuje priamo z impulzu na misku váh [nie je na to potrebné poznať molekulovú hmotnosť (2)]. Geometrické faktory ako otvor v piecke a uhol prúdenia molekúl musia byť zohľadnené pri vyhodnocovaní čítaní.

2. Zároveň sa môže merať aj hmotnosť kondenzátu a z nej možno vypočítať rýchlosť odparovania. Tlak pary sa môže tiež vypočítať z rýchlosti odparovania a molekulovej hmotnosti použitím Hertzovej rovnice (2).

1.6.5. Výtoková metóda – stanovením úbytku hmotnosti

1.6.5.

1.6.5.1. Prístroje Výtokový prístroj pozostáva z týchto základných častí: Na obrázku 5 je ako príklad znázornená elektricky zohrievaná hliníková vákuová nádoba so štyrmi výtokovými komôrkami z nehrdzavejúcej ocele. Fólia z nehrdzavejúcej ocele s hrúbkou približne 0,3 mm je vybavená výtokovým otvorom s priemerom 0,2 mm až 1,0 mm a k výtokovej komôrke je prichytená závitovým vekom.

nádoby (nádržky), ktorá môže byť termostaticky udržiavaná pri stálej teplote a vákuovaná a v ktorej sú umiestnené výtokové komôrky,

vysokovákuovej vývevy (napríklad difúznej vývevy alebo turbomolekulárnej vývevy) s podtlakovým (vákuovým) ventilom,

zachytávača s použitím skvapalneného dusíka alebo suchého ľadu.

1.6.5.2. Postup merania Referenčná a testovaná látka sa naplnia do jednotlivých výtokových komôrok, kovová medzistena s otvorom sa zaistí závitovým vekom a každá komôrka sa potom odváži s presnosťou na 0,1 mg. Komôrka sa umiestni do prístroja termostaticky udržiavaného pri stálej teplote, ktorý sa potom vákuuje na menej ako jednu desatinu predpokladaného tlaku. V stanovených časových intervaloch v rozmedzí od 5 hodín do 30 hodín sa do prístroja vpúšťa vzduch a opätovným odvážením sa stanoví úbytok hmotnosti výtokových komôrok. Aby sa zabránilo ovplyvneniu výsledkov prchavými prímesami, komôrka sa opakovane preváži v stanovených časových intervaloch na účely skontrolovania, či je rýchlosť odparovania konštantná prinajmenšom v priebehu dvoch takýchto časových intervalov. Tlak pary p vo výtokovej komôrke je daný nasledujúcou rovnicou: p = mKAt2πRTM kde: P tlak pary (Pa) m hmotnosť testovanej látky, ktorá unikla z komôrky v priebehu času t (kg) t čas (s) A plocha otvoru (m2) K opravný koeficient R všeobecná plynová konštanta (J mol-l K-1) T teplota (K) M relatívna (pomerná) molekulová hmotnosť (kg mol-1) Korekčný činiteľ K závisí od pomeru dĺžky k polomeru valcovitého hrdla otvoru: pomer 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Vyššie uvedená rovnica môže byť napísaná aj v tomto tvare: p = E mtTM kde E = 1KA2πR a predstavuje konštantu pre výtokovú komôrku. Táto konštanta pre výtokovú komôrku E môže byť stanovená referenčnou látkou (2,9), pričom sa použije táto rovnica: E = p(r)tmM(r)T kde: p(r) tlak pary referenčnej látky (Pa) M(r) relatívna molekulová hmotnosť referenčnej látky (kg × mol-l)

1.6.6. Metóda plynovej saturácie

1.6.6.

1.6.6.1. Prístroje Typický prístroj používaný na uskutočnenie tohto testu pozostáva z celého radu komponentov uvedených na obrázku 6a, ktoré sú opísané nižšie (1).

1.6.6.1. Inertný plyn:

Nosný plyn nesmie chemicky reagovať s testovanou látkou. Na tento účel zvyčajne stačí použiť dusík, avšak z prípadu na prípad sa môžu požadovať aj iné plyny (10). Použitý plyn musí byť suchý [pozri obrázok 6a, legenda 4: snímač (senzor) relatívnej vlhkosti].

Regulácia toku:

Vhodný systém na reguláciu plynu je žiaduci na zabezpečenie konštantného a upraveného toku plynu cez saturačný stĺpec (kolónu).

Zachytávače pary:

Tieto závisia od konkrétnych vlastností príslušnej testovanej vzorky a od zvolenej metódy analýzy. Para by mala byť zachytávaná kvantitatívne a v takej forme, ktorá umožňuje následnú analýzu. Pre niektoré testované látky budú vhodné aj také typy zachytávačov, ktoré obsahujú kvapaliny ako hexán alebo etylénglykol. Pre iné látky možno zasa použiť tuhé absorpčné činidlá. Ako alternatívu zachytávania pary s následnou analýzou možno na kvantitatívne stanovenie množstva materiálu transportovaného známym množstvom nosného plynu použiť analytické techniky typu in-train, napríklad chromatografiu. Okrem toho možno merať aj úbytok hmotnosti testovanej vzorky.

Výmenník tepla:

Na merania pri rozdielnych teplotách môže byť potrebné do celkovej zostavy zahrnúť aj výmenník tepla.

Saturátorová kolóna:

Testovaná látka sa z roztoku nanesie na vhodný inertný nosič. Pokrytý nosič sa umiestni do saturátorovej kolóny, ktorej rozmery a prietok musia byť také, aby sa zaručila úplná saturácia nosného plynu. Saturátorová kolóna musí mať termostaticky udržiavanú teplotu. Na merania nad teplotu miestnosti by mal byť priestor medzi saturátorovou kolónou a zachytávačmi ohrievaný, aby sa zabránilo kondenzácii testovanej látky. Na účely zníženia transportu hmoty, ktorý sa prejavuje pri difúzii, môže byť v poradí za saturátorovou kolónou umiestnená kapilára (pozri obrázok 6b).

1.6.6.2. Postup merania

1.6.6.2. Príprava saturátorovej kolóny:

Roztok testovanej látky v rozpúšťadle s vysokým stupňom prchavosti sa pridá k vhodnému množstvu nosiča. Je potrebné pridať dostatočné množstvo testovanej látky, aby sa saturácia udržiavala počas trvania celého testu. Rozpúšťadlo sa úplne odparí vo vzduchu alebo v rotačnom odparovači a dôkladne zmiešaný materiál sa pridá do saturátorovej kolóny. Po termostatickej úprave testovanej vzorky sa cez prístroj nechá prúdiť suchý dusík.

Meranie:

Zachytávače alebo in-train detektor sú napojené na výtokovú linku kolóny a zaznamenáva sa čas. Prietok sa kontroluje na začiatku a potom v pravidelných intervaloch počas celého experimentu, pričom sa používa bublinomer (alebo priebežne, kontinuitne pomocou hmotového prietokomeru). Musí sa merať tlak na výstupe zo saturátora. Tento úkon sa môže uskutočniť jedným z uvedených spôsobov: Čas požadovaný na zachytenie potrebného množstva testovanej látky pre rozdielne metódy analýzy je stanovený v predbežných cykloch alebo odhadom. Ako alternatívu zachytávania testovanej látky pre ďalšiu analýzu možno použiť in-train kvantitatívny analytický postup (napríklad chromatografiu). Pred vypočítaním tlaku pary pri danej teplote je potrebné uskutočniť predbežné cykly na stanovenie maximálneho prietoku, ktorý úplne saturuje nosný plyn parou testovanej látky. Toto sa dá zaručiť, ak sa nosný plyn prepúšťa cez saturátor dostatočne pomaly, tak aby nižšia rýchlosť nedávala väčší vypočítaný tlak pary. Konkrétna analytická metóda sa stanoví na základe charakteristických vlastností látky určenej na testovanie (napríklad plynová chromatografia alebo gravimetria). Stanoví sa množstvo testovanej látky transportované známym objemom nosného plynu.

a)

buď zapojením snímača tlaku (tlakomeru) medzi saturátor a zachytávače (toto však nebýva uspokojivé riešenie, pretože to zvyšuje mŕtvy priestor a adsorpčný povrch), alebo

b)

stanovením úbytku (poklesu) tlaku v rámci príslušného použitého zachytávacieho systému ako funkcie prietoku v samostatnom pokuse (tento postup nebýva veľmi uspokojivý v prípade kvapalných zachytávačov).

1.6.6.3. Výpočet tlaku pary Tlak pary sa vypočíta z hustoty pary, W/V, pomocou nasledujúcej rovnice: p = WV × RTM kde: p tlak pary (Pa) W hmotnosť odparenej testovanej látky (g) V objem nasýteného (saturovaného) plynu (m3) R všeobecná molekulová plynová konštanta (J mol-l K-1) T teplota (K) (kelvin) M relatívna molekulová hmotnosť testovanej látky (g mol-l) Namerané objemy musia byť opravené z hľadiska tlakových a teplotných rozdielov medzi prietokomerom a termostaticky upraveným saturátorom. Ak je prietokomer umiestnený smerom po prúde od zachytávača pary, môžu byť potrebné opravy zohľadňujúce všetky odparené ingredienty zachytávača (1).

1.6.7. Metóda rotujúcej guľôčky (8, 11, 13)

1.6.7.

1.6.7.1. Prístroje Metóda rotujúcej guľôčky sa môže uskutočniť použitím meradla viskozity rotujúceho rotora podľa znázornenia na obrázku 8. Schematický nákres pokusného systému je zobrazený na obrázku 7. Merací prístroj zvyčajne pozostáva z meracej hlavy rotujúceho rotora umiestnenej v termostaticky upravovanom uzavretom priestore (s presnosťou regulácie na 0,1 oC). Nádoba so vzorkou je umiestnená v termostaticky upravovanom uzavretom priestore (s presnosťou regulácie na 0,01 oC) a všetky ostatné časti systému sú udržiavané pri vyššej teplote, aby sa zabránilo kondenzácii. Vysokovákuové vývevové zariadenie je napojené na systém pomocou vysokovákuových ventilov. Meracia hlava rotujúceho rotora pozostáva z oceľovej guľôčky (s priemerom 4 mm až 5 mm) v rúrke. Guľôčka je zavesená a stabilizovaná v magnetickom poli, zvyčajne s použitím kombinácie permanentných magnetov a regulačných cievok. Guľôčka sa privádza do otáčavého pohybu rotačnými poľami vytváranými cievkami. Snímacie cievky, ktoré merajú neustále prítomnú nízku laterálnu magnetizáciu guľôčky, umožňujú meranie jej rýchlosti otáčania.

1.6.7.2. Postup merania Keď guľôčka dosiahla danú rotačnú rýchlosť v(o) (približne 400 otáčok za sekundu), ďalšie budenie sa zastaví, a následkom trenia plynu dochádza k spomaľovaniu. Pokles rýchlosti otáčania sa meria ako funkcia času. Keďže trenie spôsobené magnetickou suspenziou je zanedbateľné v porovnaní s trením plynu, tlak plynu je daný nasledujúcou rovnicou: p = πc—rρσ10t × ln v(t)v(o) kde: c— priemerná rýchlosť molekúl plynu ρ polomer guľôčky σ hustota hmoty guľôčky t koeficient tangenciálneho prenosu hybnosti (ε = 1 pre ideálnu guľovú plochu guľôčky) v(t) čas rýchlosť otáčania po uplynutí času tv(o) počiatočná rýchlosť otáčania Túto rovnicu možno napísať aj v tejto forme: p = πc—rρ10σ × tn - tn-1tn × tn-1 kde tn, tn-1 sú časy potrebné pre daný počet N otáčok. Tieto časové intervaly tn a tn-1 nasledujú za sebou a tn > tn-1. Priemerná rýchlosť molekuly plynu c— je daná nasledujúcou rovnicou: c— = 8 RTπ M12 kde: T teplota R všeobecná molárna plynová konštanta M relatívna molekulová hmotnosť

2. ÚDAJE Tlak pary zo všetkých predchádzajúcich metód musí byť stanovený pre minimálne dve teploty. V rozmedzí od 0 oC do 50 oC sa odporúčajú tri alebo viac teplôt, aby sa dala skontrolovať lineárnosť krivky tlaku plynu.

3. SPRÁVA Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie: Ak sa pozoruje premena (zmena skupenstva, rozklad), treba uviesť nasledujúce informácie: V správe z testu musia byť uvedené všetky informácie a poznámky, ktoré sú dôležité pre interpretáciu výsledkov testu, najmä týkajúce sa prímesí a fyzikálneho stavu (skupenstva) testovanej látky.

použitú metódu,

presnú špecifikáciu látky (identifikáciu a prímesi) a opatrenia v rámci predbežnej purifikácie testovanej látky, ak sa takéto uskutočnili,

minimálne dve tlakové a teplotné hodnoty, podľa možnosti v rozmedzí od 0 oC do 50 oC,

všetky prvotné, nespracované údaje,

log p verzus 1/T krivku,

odhad tlaku pary pri 20 oC alebo 25 oC.

charakter zmeny,

teplotu, pri ktorej sa zmena prejavuje pri atmosférickom tlaku,

tlak pary pri 10 oC a 20 oC pod teplotou premeny a 10 oC a 20 oC nad touto teplotou (s výnimkou premeny z tuhej látky na plyn).

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)

ODKAZY OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593. NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa – Static method. NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Röhl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, Vol. 5 (4), 2440. Ambrose, D., Lawrenson, I. J., Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, Vol. 7, 1173. B. F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435. G. Comsa, J. K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, Vol. 17 (2), 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, Vol. 20 (4), 1148. J. K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol. (A), 1985, Vol. 3 (3), 1715.

A.5. POVRCHOVÉ NAPÄTIE

A.5.

1. METÓDA Opísané metódy sú upravené smernicou na vykonávanie OECD testov (1). Základné princípy sú uvedené v odkaze (2).

1.

1.1. ÚVOD Opísané metódy sú určené na meranie povrchového napätia vodných roztokov. Pred vykonaním týchto testov sa odporúča získať predbežné informácie o rozpustnosti vo vode, hydrolýznych vlastnostiach a kritickej koncentrácii pre tvorbu micel testovanej látky. Nasledujúce uvedené metódy sa dajú použiť pre väčšinu chemikálií bez akýchkoľvek obmedzení v spojitosti s ich stupňom čistoty. Meranie povrchového napätia metódou krúžkového tenzometra sa obmedzuje na vodné roztoky s dynamickou viskozitou nižšou ako približne 200 mPa s.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Entalpia voľnej hladiny na jednotku povrchovej plochy sa vzťahuje na povrchové napätie. Povrchové napätie sa udáva ako: N/m (jednotka SI) alebo mN/m (podjednotka SI) 1 N/m = 103dyn/cm 1 N/m = 1 dyn/cm v zastaranej jednotkovej sústave cgs

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Referenčné látky nemusia byť použité vo všetkých prípadoch, keď sa skúma nová látka. V prvom rade by mali slúžiť na občasnú kontrolu účinnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie porovnania s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód. Referenčné látky, ktoré pokrývajú široký rozsah povrchových napätí, sú uvedené v odkazoch (1) a (3).

1.4. PRINCÍP METÓD Metódy sú založené na meraní maximálnej sily, ktorá musí byť vynaložená vertikálne na strmienok alebo krúžok v kontakte s hladinou testovanej kvapaliny umiestnenej v meracej miske na účely jeho oddelenia od tejto hladiny alebo na doštičku s jednou hranou v kontakte s povrchom na účely zdvihnutia filmu, ktorý sa vytvoril. Látky, ktoré sú rozpustné vo vode pri koncentrácii aspoň 1 mg/l, sú testované vo vodnom roztoku pri jednej koncentrácii.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Tieto metódy sa dajú realizovať s väčšou presnosťou, než aká sa pravdepodobne bude požadovať na environmentálne zhodnocovanie.

1.6. OPIS METÓD Roztok testovanej látky sa pripraví v destilovanej vode. Koncentrácia tohto roztoku by mala predstavovať 90 % nasýtenej rozpustnosti testovanej látky vo vode; keď táto koncentrácia prevyšuje 1 g/l, na účely testovania sa použije koncentrácia 1 g/l. Látky s rozpustnosťou vo vode nižšou ako 1 mg/l sa nemusia testovať.

1.6.

1.6.1. Doštičková metóda Pozri technické normy ISO 304 a NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films) (Povrchovo aktívne činidlá – stanovenie povrchového napätia pomocou kvapalinových filmov).

1.6.2. Strmienková metóda Pozri technické normy ISO 304 a NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films) (Povrchovo aktívne činidlá – stanovenie povrchového napätia pomocou kvapalinových filmov).

1.6.3. Krúžková metóda Pozri technické normy ISO 304 a NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films) (Povrchovo aktívne činidlá – stanovenie povrchového napätia pomocou kvapalinových filmov).

1.6.4. Harmonizovaná krúžková metóda podľa OECD

1.6.4.

1.6.4.1. Prístroje Na účely tohto merania postačujú komerčne dostupné tenzometre. Pozostávajú z nasledujúcich častí:

pohyblivá doska na vzorky,

systém na meranie sily,

meracie teleso (krúžok),

meracia nádoba.

1.6.4.1.

1.6.4.1.1. Pohyblivá doska na vzorky Pohyblivá doska na vzorky sa používa ako podložka pod termoregulovanú meraciu nádobu obsahujúcu kvapalinu určenú na testovanie. Spolu s meracím systémom je prichytená na stojan.

1.6.4.1.2. Systém na meranie sily Systém na meranie sily (pozrite obrázok) je umiestnený nad dosku na vzorky. Odchýlka merania sily nemá presahovať hodnotu ± 10-6 N, zodpovedajúc tak dovolenej chybe ±0,1 mg pri meraní hmotnosti. Vo väčšine prípadov je meracia stupnica komerčne dostupných tenzometrov kalibrovaná v mN/m, takže povrchové napätie môže byť odčítané priamo v mN/m s presnosťou na 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3. Meracie teleso (krúžok) Krúžok je zvyčajne vyrobený z platinovo-irídiového drôtu s hrúbkou približne 0,4 mm a so stredným obvodom 60 mm. Drôtený krúžok je zavesený horizontálne na kovový kolík a drôtenú upínaciu konzolu, aby sa tak vytvorilo prepojenie so systémom na meranie sily (pozri obrázok).

1.6.4.1.3. Obrázok Meracie teleso (krúžok)

(Všetky rozmery sú vyjadrené v milimetroch) Kolík Upínacia konzola Krúžok

1.6.4.1.4. Meracia nádoba Meracia nádoba určená pre testovanú látku musí byť termoregulovaná sklená nádoba. Musí mať také vlastnosti, aby počas merania teplota testovaného kvapalinového roztoku a plynová fáza nad jeho povrchom zostali konštantné a aby sa testovaná vzorka nemohla odparovať. Vyhovujúce sú valcovité sklené nádoby s vnútorným priemerom najmenej 45 mm.

1.6.4.2. Príprava prístroja

1.6.4.2.

1.6.4.2.1. Čistenie Sklené nádoby musia byť dôkladne vyčistené. Ak je to potrebné, musia sa umyť horúcou kyselinou chrómsírovou a následne sirupovitou kyselinou fosforečnou (83 až 98 hmotnostných % H3PO4), dôkladne opláchnuť pod vodou z vodovodu a nakoniec umyť v dvakrát destilovanej vode, až kým sa nedosiahne neutrálna reakcia, a potom sa musia osušiť alebo vymyť časťou kvapalnej vzorky určenej na testovanie, resp. meranie. Krúžok sa musí najprv dôkladne opláchnuť vo vode, aby sa odstránili všetky látky, ktoré sú rozpustné vo vode, potom sa krátko ponorí do kyseliny chrómsírovej, umyje v dvakrát destilovanej vode, až kým sa nedosiahne neutrálna reakcia, a nakoniec sa krátko ohreje nad metanolovým plameňom. Upozornenie: Kontaminácia látkami, ktoré sa nerozpustili alebo nerozrušili kyselinou chrómsírovou alebo kyselinou fosforečnou, ako napríklad silikónmi, sa musí odstrániť pomocou vhodného organického rozpúšťadla.

1.6.4.2.2. Kalibrácia prístroja Kalibrácia prístroja spočíva v kontrole nulového bodu a jeho nastavení takým spôsobom, aby označenie prístroja umožňovalo spoľahlivé stanovenie hodnôt v mN/m.

1.6.4.2.2. Inštalácia:

Prístroj musí byť vyvážený napríklad pomocou liehovej vodováhy na tenzometrovej základni nastavovacími skrutkami umiestnenými naspodku základovej platne.

Nastavenie nulového bodu:

Po inštalácii krúžku na prístroj a pred jeho ponorením do kyseliny musí byť ukazovateľ tenzometra nastavený na nulu a musí sa skontrolovať, či je krúžok rovnobežný s hladinou kvapaliny. Na tento účel možno použiť hladinu kvapaliny ako zrkadlo.

Kalibrácie:

Vlastná testová kalibrácia sa môže uskutočniť jedným z týchto dvoch postupov:

a)

použitím závažia: postup používajúci závažia známej hmotnosti medzi 0,1 g a 1,0 g umiestnené na krúžku. Kalibračná konštanta (konštanta pri ciachovaní), Φa, ktorou musia byť vynásobené všetky hodnoty odčítané na inštrumente, sa stanoví podľa rovnice (1): Φa=σrσa kde: σr=mg2b (mN/m) m hmotnosť závažia (g) g gravitačné zrýchlenie (981 cm s-2 pri hladine mora) b stredný obvod krúžku (cm) σa údaj na stupnici tenzometra po umiestnení závažia na krúžok (mN/m);

b)

použitím vody: postup používajúci čistú vodu, ktorej povrchové napätie sa napríklad pri teplote 23 oC rovná 72,3 mN/m. Tento postup sa dá uskutočniť rýchlejšie ako hmotnostná kalibrácia, len je tu stále riziko, že povrchové napätie vody bude skreslené stopami kontaminácie povrchovo aktívnymi činidlami. Kalibračná konštanta, Φb, ktorou musia byť vynásobené všetky údaje odčítané na prístroji, sa stanoví podľa rovnice (2): Φb=σoσg kde: σo hodnota citovaná v literatúre pre povrchové napätie vody (mN/m) σg nameraná hodnota povrchového napätia vody (mN/m) obidve hodnoty pri tej istej teplote.

1.6.4.3. Príprava vzoriek Pri príprave vodných roztokov látok určených na testovanie treba použiť požadované koncentrácie vo vode, pričom roztoky nesmú obsahovať žiadne nerozpustené látky. Roztok sa musí udržiavať pri konštantnej teplote (±0,5 oC). Keďže povrchové napätie roztoku sa v meracej nádobe mení v priebehu času, treba uskutočniť viacero meraní v rozličných časoch, ako aj vynášať hodnoty vo forme krivky diagramu ako funkcie času. Keď sa ďalšie zmeny už neobjavia, dosiahol sa rovnovážny stav. Prach a plynová kontaminácia inými látkami rušivo pôsobia na výsledky meraní. Celý postup sa preto uskutoční pod ochranným krytom.

1.6.5. Podmienky skúšania Meranie sa musí uskutočniť pri teplote približne 20 oC a táto teplota sa udržiava v rozmedzí ±0,5 oC.

1.6.6. Realizácia testu Roztoky určené na meranie treba premiestniť do dôkladne očistenej meracej nádoby, pričom treba dbať na to, aby sa zabránilo peneniu. Meracia nádoba sa potom položí na dosku prístroja. Dosku potom treba dvíhať až dovtedy, kým sa krúžok neponorí pod hladinu roztoku určeného na meranie. Doska sa potom pozvoľna a rovnomerne spúšťa nadol (rýchlosťou približne 0,5 cm/min), akoby sme krúžok chceli oddeliť od hladiny kvapaliny, a to až dovtedy, kým sa nedosiahne maximálna sila. Vrstva kvapaliny prilipnutá ku krúžku sa však od neho nesmie oddeliť. Po ukončení merania treba krúžok opäť ponoriť pod hladinu a merania sa takto opakujú až dovtedy, kým sa nedosiahne konštantná hodnota povrchového napätia. Čas, ktorý uplynul od premiestnenia testovaného roztoku do meracej nádoby, sa musí zaznamenať pre každé jedno stanovenie. Hodnoty sa odčítajú vždy pri maximálnej sile vyvinutej pri snahe o oddelenie krúžku od povrchu hladiny kvapaliny.

2. Tabuľka Korekcia nameraného povrchového napätia Platí iba pre vodné roztoky, ρ = 1 g/cm3

ÚDAJE Na výpočet povrchového napätia sa hodnota odčítaná v mN/m zo stupnice prístroja najprv vynásobí kalibračným koeficientom Φa alebo Φb (v závislosti od použitého kalibračného postupu). Takto získame hodnotu, ktorá je iba približná, a vyžaduje si preto korekciu. Harkins a Jordan (4) empiricky stanovili korekčné koeficienty pre hodnoty povrchového napätia meraného krúžkovou metódou, ktoré sú závislé od rozmerov krúžku, hustoty testovanej kvapaliny a od jej povrchového napätia. Keďže je veľmi ťažké stanoviť korekčný koeficient pre každé jedno samostatné meranie z Harkinsových a Jordanových tabuliek, na účely výpočtu povrchového napätia vodných roztokov možno použiť zjednodušený postup odčítania korekčných hodnôt povrchového napätia priamo z tabuľky. (Na odčítanie v rozmedzí tabuľkových hodnôt treba použiť interpoláciu.) r = 9,55 mm (stredný polomer krúžku) r = 0,185 mm (polomer drôtu, z ktorého je krúžok zhotovený) Experimentálna hodnota (mN/m) Korigovaná hodnota (mN/m} Kalibrácia závažiami [pozri bod 1.6.4.2.2 písm. a)] Kalibrácia vodou [pozri bod 1.6.4.2.2 písm. b) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Táto tabuľka bola zostavená na základe Harkinsovej-Jordanovej korekcie. Je podobná tabuľke uvedenej v technickej norme DIN Standard (DIN 53914) pre vodu a vodné roztoky (hustota ρ = 1g/cm3) a je vhodná pre komerčne dostupný krúžok s rozmermi R = 9,55 mm (stredný polomer krúžku) a r = 0,185 mm (polomer drôtu, z ktorého je krúžok zhotovený). Tabuľka udáva korigované hodnoty pre merania povrchového napätia vykonané po kalibrácii závažiami alebo vodou. Alternatívne, bez predchádzajúcej kalibrácie, sa povrchové napätie môže vypočítať podľa tohto vzorca: σ=f × F4πR kde: F sila nameraná na dynamometri v bode prerušenia filmu R polomer krúžku f korekčný (opravný) koeficient (1)

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať tieto informácie:

použitú metódu,

typ použitej vody alebo roztoku,

presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi),

výsledky merania: povrchové napätie (hodnoty odčítané zo stupnice) uvádzajúce jednotlivé samostatné odčítania hodnôt a ich aritmetický priemer, ako aj korigované stredné hodnoty (zohľadňujúce koeficient zariadenia a korekčnú tabuľku),

koncentráciu roztoku,

testovaciu teplotu,

vek použitého roztoku, obzvlášť čas medzi prípravou a meraním roztoku,

opis časovej závislosti povrchového napätia po premiestnení roztoku do meracej nádoby,

všetky informácie a poznámky, ktoré sú dôležité pre interpretáciu výsledkov testu, najmä týkajúce sa prímesí a fyzikálneho skupenstva testovanej látky.

3.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Za predpokladu, že destilovaná voda má povrchové napätie 72,75 mN/m pri teplote 20 oC, látky prejavujúce povrchové napätie nižšie ako 60 mN/m za podmienok tejto metódy treba považovať za povrchovo aktívne materiály.

4.(1)(2)(3)(4)

ODKAZY OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. Harkins, W. D., Jordan, H. F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.

A.6. ROZPUSTNOSŤ VO VODE

A.6.

1. METÓDA Opísané metódy sú upravené smernicou na vykonávanie OECD testov (1).

1.

1.1. ÚVOD Na účely realizácie tejto metódy sa odporúča získať predbežné informácie o štruktúrnom vzorci, tlaku pary, disociačnej konštante a hydrolýze (ako funkcie pH) látky určenej na testovanie. Neexistuje jediná dostupná metóda, ktorá by pokrývala celý rozsah rozpustnosti vo vode. Dve skúšobné metódy, ktoré sú opísané v nasledujúcom texte, pokrývajú síce celý rozsah rozpustnosti, avšak nedajú sa použiť v prípade prchavých látok: Rozpustnosť látok vo vode môže byť do značnej miery ovplyvnená prítomnosťou prímesí.

jedna, ktorá sa vzťahuje na absolútne čisté látky s nízkou rozpustnosťou (< 10-2 gramov na liter), ktoré sú stabilné vo vode, sa nazýva metóda vypierania z kolóny,

druhá, ktorá sa vzťahuje na absolútne čisté látky s vyššou rozpustnosťou (> 10-2 gramov na liter), ktoré sú stabilné vo vode, sa nazýva banková metóda.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Rozpustnosť látky vo vode je špecifikovaná saturačnou hmotnostnou koncentráciou látky vo vode pri danej teplote. Rozpustnosť vo vode je špecifikovaná v jednotkách hmotnosti na objem roztoku. Príslušnou jednotkou SI je kg/m3 (možno však použiť aj g/l).

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Referenčné látky sa nemusia použiť vo všetkých prípadoch, keď sa skúma nová látka. V prvom rade by mali slúžiť na občasnú kontrolu účinnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie porovnania s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód.

1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY Približné množstvo testovanej vzorky a čas potrebný na dosiahnutie saturačnej hmotnostnej koncentrácie sa stanoví v jednoduchom predbežnom teste.

1.4.

1.4.1. Metóda vypierania z kolóny Táto metóda je založená na vypieraní testovanej látky vodou z mikrokolóny, ktorá je naplnená inertným nosným materiálom, napr. sklenými guľôčkami alebo pieskom. Tento nosný materiál je pokrytý nadbytkom testovanej látky. Rozpustnosť vo vode sa stanovuje vtedy, keď je hmotnostná koncentrácia eluátu konštantná. Vyjadruje sa úrovňou koncentrácie ako funkcia času.

1.4.2. Banková metóda V rámci tejto metódy sa testovaná látka (tuhé látky musia byť rozomleté na prach) rozpustí vo vode pri teplote o niečo vyššej, ako je testovacia teplota. Keď sa dosiahne saturácia, zmes sa ochladí a udržiava sa pri skúšobnej teplote, pričom sa mieša dovtedy, kým je to potrebné na dosiahnutie rovnovážneho stavu. Meranie sa môže alternatívne uskutočniť priamo pri skúšobnej teplote, ak sa vhodným vzorkovaním zabezpečí, že sa dosiahne saturačný rovnovážny stav. Následne sa hmotnostná koncentrácia testovanej látky vo vodnom roztoku, ktorý nesmie obsahovať žiadne nerozpustené častice, stanoví vhodnou analytickou metódou.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY

1.5.

1.5.1. Opakovateľnosť V prípade metódy vypierania z kolóny možno dosiahnuť < 30 %, v prípade bankovej metódy by sa malo dodržiavať < 15 %.

1.5.2. Citlivosť Citlivosť závisí od metódy analýzy, avšak stanovenia hmotnostnej koncentrácie môžu byť stanovované až do 10-6 gramov na liter.

1.6. OPIS METÓDY

1.6.

1.6.1. Podmienky skúšania Odporúča sa uskutočniť test pri teplote 20 oC s výkyvom maximálne ±0,5 oC. Ak sa v spojitosti s rozpustnosťou považuje za možnú teplotná závislosť (> 3 % na každý jeden oC), mali by sa použiť dve ďalšie teploty minimálne 10 oC nad a pod hodnotou pôvodne zvolenej teploty. V tomto prípade by teplotná regulácia mala byť ±0,1 oC. Zvolená teplota by sa mala udržiavať na konštantnej úrovni vo všetkých relevantných častiach skúšobného zariadenia.

1.6.2. Predbežný test K približne 0,1 g testovanej vzorky (tuhé látky musia byť rozdrvené na prach) v ciachovanom odmernom valci so zabrúsenou sklenou zátkou sa pridávajú narastajúce objemy destilovanej vody pri teplote miestnosti podľa krokov uvedených v tejto tabuľke: 0,1 g rozpustiteľná v x ml vody 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Približná rozpustnosť (g/l) > 1000 1000 až 200 200 až 100 100 až 50 50 až 10 10 až 1 < 1 Po každom pridaní stanoveného množstva vody sa zmes intenzívne trepe 10 minút a vizuálne sa skontroluje z hľadiska akýchkoľvek nerozpustených častí testovanej vzorky. Ak po pridaní 10 ml vody testovaná vzorka alebo jej časti zostanú nerozpustené, pokus sa musí zopakovať v 100 ml odmernom valci s väčším objemom vody. Pri nižších mierach rozpustnosti môže byť čas potrebný na rozpustenie testovanej látky podstatne dlhší (treba počítať minimálne s 24 hodinami). Približná rozpustnosť je uvedená v tabuľke pod tým objemom pridanej vody, v ktorom dôjde k úplnému rozpusteniu testovanej vzorky. Ak je testovaná vzorka naďalej zjavne nerozpustná, treba predĺžiť čas na rozpustenie z 24 hodín na maximálne 96 hodín alebo treba pokračovať v zrieďovaní, aby sa zistilo, ktorú metódu použiť, či metódu vypierania z kolóny, alebo metódu rozpúšťania v banke (fľaši).

1.6.3. Metóda vypierania z kolóny

1.6.3.

1.6.3.1. Nosný materiál, rozpúšťadlo a eluent Nosný materiál pre metódu vypierania z kolóny musí byť inertný. Vhodné použiteľné materiály sú sklené guľôčky a piesok. Na nanesenie testovanej látky na nosný materiál treba použiť vhodné prchavé rozpúšťadlo kvality analytického činidla. Ako eluent sa použije voda, ktorá bola dvakrát destilovaná v sklenom alebo kremennom destilačnom prístroji. Upozornenie: Nesmie byť použitá voda pochádzajúca priamo z výmenníka organických iónov.

1.6.3.2. Aplikácia testovanej látky na nosný materiál Odváži sa približne 600 mg nosného materiálu a tento sa potom premiestni do 50 ml banky s guľatým dnom. Vhodné odvážené množstvo testovanej látky sa rozpustí vo zvolenom rozpúšťadle. Primerané množstvo tohto roztoku sa pridá do nosného materiálu. Rozpúšťadlo sa musí úplne odpariť napr. v rotačnom odparovacom prístroji, pretože inak sa nedosiahne saturácia nosiča vodou kvôli separačným účinkom na povrchu nosného materiálu. Aplikácia testovanej látky na nosný materiál môže spôsobovať problémy (chybné výsledky), ak sa testovaná látka nanáša ako olej alebo odlišná kryštalická fáza. Problém treba experimentálne preskúmať a podrobnosti musia byť uvedené v správe o teste. Nosný materiál s aplikovanou testovanou látkou sa nechá máčať približne v 5 ml vody asi dve hodiny. Suspenzia sa potom pridá do mikrokolóny. Suchý nosný materiál s aplikovanou testovanou látkou sa môže alternatívne pridať do mikrokolóny, ktorá bola naplnená vodou, a potom vyvažovať približne dve hodiny.

1.6.3.2. Testovací postup:

Vypieranie testovanej látky z nosného materiálu sa môže uskutočniť jedným z dvoch odlišných uvedených spôsobov:

recirkulačným čerpadlom (pozri obrázok 1),

egalizačnou nádobou (pozri obrázok 4).

1.6.3.3. Metóda vypierania z kolóny s recirkulačným čerpadlom

1.6.3.3. Prístroje

Schematická zostava typického systému je znázornená na obrázku 1. Vhodná mikrokolóna je znázornená na obrázku 2, hoci akceptovateľná je akákoľvek veľkosť za predpokladu, že bude spĺňať kritériá reprodukovateľnosti a citlivosti. V kolóne musí byť voľný priestor zodpovedajúci minimálne piatim úložným objemom vody a samotná musí byť schopná pojať minimálne päť vzoriek. Veľkosť sa môže alternatívne redukovať, ak sa použije doplnkové riedidlo ako náhrada za počiatočných päť úložných objemov vody vypustených zo systému spolu s rozpustenými prímesami. Kolóna musí byť napojená na recirkulačné čerpadlo, ktoré je schopné regulovať tok približne 25 ml/h. Čerpadlo je pripojené polytetrafluóretylénom (P.T.F.E.), resp. sklenými spojkami. Kolóna a čerpadlo musia po zostavení zabezpečiť vzorkovanie výtoku a vyváženie voľného priestoru pri atmosférickom tlaku. Materiál v kolóne spočíva na malom tesnení (5 mm) zo sklenej vaty (vlny), ktoré zároveň slúži na filtráciu čiastočiek. Recirkulačné čerpadlo môže byť napríklad peristaltické čerpadlo alebo membránové čerpadlo (musí sa dbať na to, aby sa zabránilo akejkoľvek kontaminácii, resp. absorpcii materiálom, z ktorého sú zhotovené rúrky).

Postup merania

Spustí sa prúdenie cez kolónu. Odporúča sa použiť prietok približne 25 ml/h (v prípade opísanej kolóny to zodpovedá 10 úložným objemom/h). Prvých päť úložných objemov (minimálne) sa vypustí s cieľom odstránenia prímesí rozpustných vo vode. Po tomto sa recirkulačné čerpadlo nechá bežať až dovtedy, kým sa nedosiahne vyváženie definované piatimi za sebou nasledujúcimi vzorkami, ktorých koncentrácie sa nelíšia viac ako ± 30 % v náhodnom slede. Vzorky musia byť od seba oddelené časovými intervalmi zodpovedajúcimi prietoku najmenej 10 úložných objemov eluentu.

1.6.3.4. Metóda vypierania z kolóny s egalizačnou nádobou

1.6.3.4. Prístroje (pozri obrázky 3 a 4)

Egalizačná nádoba: Spojenie s egalizačnou nádobou sa uskutoční použitím zabrúseného skleného spoja napojeného na polytetrafluoretylénové (P.T.F.E.) rúrky. Odporúča sa použiť prietok približne 25 ml za hodinu. Za sebou nasledujúce eluátové frakcie by sa potom mali zachytávať a analyzovať podľa zvolenej metódy.

Postup merania

Tie frakcie zo stredného eluátového rozsahu, v ktorých sú koncentrácie konštantné (± 30 %) minimálne v piatich následných frakciách, sa použijú na stanovenie rozpustnosti vo vode. V obidvoch prípadoch (pri použití recirkulačného čerpadla alebo egalizačnej nádoby) je potrebné uskutočniť druhé kolo merania pri polovičnej miere prvého (pôvodného) prietoku. Ak sú výsledky oboch kôl meraní súhlasné, test bol uskutočnený na uspokojivej úrovni; ak sa však pri nižšom prietoku prejaví vyššia skutočne pozorovaná rozpustnosť, znižovanie miery prietoku na polovicu musí pokračovať dovtedy, kým dve za sebou nasledujúce kolá meraní nevykážu rovnakú rozpustnosť. V obidvoch prípadoch (pri použití recirkulačného čerpadla alebo egalizačnej nádoby) sa musia frakcie kontrolovať z hľadiska prítomnosti koloidného materiálu skúmaním Tyndallovho efektu (rozptyl svetla). Prítomnosť takýchto čiastočiek znehodnocuje výsledky a test sa musí zopakovať po zdokonalení postupu filtrácie v kolóne. Je potrebné zaznamenať hodnoty pH pre každú vzorku. Druhé kolo meraní sa musí uskutočniť pri tej istej teplote ako prvé.

1.6.4. Banková (fľašová) metóda

1.6.4.

1.6.4.1. Prístroje Pri použití bankovej (fľašovej) metódy je potrebný tento materiál:

normálne laboratórne sklené nádoby a vybavenie laboratórnymi prístrojmi,

zariadenie vhodné na premiešavanie, resp. pretrepávanie, roztokov pri kontrolovaných a regulovaných konštantných teplotách,

odstredivka (podľa možnosti termostatovaná), ak sa tak požaduje pri emulziách,

zariadenie na analytické stanovenie hodnôt.

1.6.4.2. Postup merania Množstvo materiálu potrebného na saturáciu želaného objemu vody sa odhaduje, resp. stanovuje, z predbežného testu. Požadovaný objem vody bude závisieť od použitej analytickej metódy a rozsahu rozpustnosti. Približne päťnásobok stanoveného množstva materiálu sa odváži do každej z troch sklených nádob vybavených sklenými zátkami (napr. do odstredivkových skúmaviek, sklených baniek). Do každej nádoby sa potom pridá zvolený objem vody a nádoby sa tesne uzatvoria. Uzavreté nádoby sa potom premiešavajú, resp. pretrepávajú, pri teplote 30 oC. (Odporúča sa použiť trepačku alebo miešačku schopnú fungovať pri konštantnej teplote, napr. magnetické miešadlo v termostaticky kontrolovanom a regulovanom vodnom kúpeli.) Po uplynutí jedného dňa sa jedna z nádob vyberie a ďalších 24 hodín sa opätovne vyváži pri skúšobnej teplote s občasným premiešaním, resp. pretrepaním. Obsah nádoby sa odstredí pri skúšobnej teplote a pomocou vhodnej analytickej metódy sa stanoví koncentrácia testovanej látky v čírej vodnej fáze. So zvyšnými dvoma bankami sa naloží podobne po počiatočnom vyvážení pri teplote 30 oC počas dvoch dní v prípade jednej a počas troch dní v prípade druhej. Ak výsledky koncentrácií aspoň z dvoch posledných nádob súhlasia s požadovanou reprodukovateľnosťou, výsledky testu sú uspokojivé. Ak výsledky z nádob 1, 2 a 3 prejavia tendenciu narastajúcich hodnôt, celý test sa musí zopakovať pri použití dlhších vyvažovacích časov. Postup merania sa môže uskutočniť aj bez predchádzajúcej inkubácie pri teplote 30 oC. Na účely odhadu rýchlosti vzniku saturačnej rovnováhy sa vzorky odoberú, až keď už čas miešania neovplyvňuje koncentráciu testovaného roztoku. Je potrebné zaznamenať hodnoty pH pre každú vzorku.

1.6.5. Analýza Na účely týchto stanovení sa odporúča použiť špecifickú analytickú metódu pre príslušnú testovanú látku, pretože malé množstvá rozpustných prímesí môžu spôsobiť veľké chyby v nameranej rozpustnosti. Príkladmi takýchto metód sú plynová alebo kvapalinová chromatografia, titračné metódy, fotometrické metódy, voltamperometrické metódy.

2. ÚDAJE

2.

2.1. METÓDA VYPIERANIA Z KOLÓNY Pre každé kolo meraní sa musí vypočítať stredná hodnota najmenej z piatich za sebou nasledujúcich vzoriek odobratých zo saturačnej úrovne, to isté platí aj o štandardnej odchýlke (smerodajnej odchýlke). Výsledky sa musia uvádzať v jednotkách hmotnosti na objem roztoku. Porovnajú sa stredné hodnoty vypočítané pre dva testy s použitím odlišných prietokov a mali by mať opakovateľnosť menšiu ako 30 %.

2.2. BANKOVÁ METÓDA Pre každú z troch baniek musia byť uvedené samostatné výsledky, pričom tie výsledky, ktoré sa považujú za konštantné (opakovateľnosť menšia ako 15 %), treba spriemerovať a uviesť v jednotkách hmotnosti na objem roztoku. Tento postup si môže vyžadovať spätnú premenu hmotnostných jednotiek na objemové jednotky, použijúc hustotu, keď je rozpustnosť veľmi vysoká (> 100 g/l).

3. SPRÁVA

3.

3.1. METÓDA VYPIERANIA Z KOLÓNY Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

výsledky predbežného testu,

presnú špecifikáciu testovanej látky (identitu a prímesi),

samostatné hodnoty koncentrácií, prietokov a pH pre každú vzorku,

stredné hodnoty a smerodajné odchýlky namerané najmenej pri piatich vzorkách zo saturačnej úrovne každého kola meraní,

priemer dvoch za sebou nasledujúcich a akceptovateľných kôl meraní,

teplotu vody počas saturačného procesu,

použitú metódu analýzy,

charakteristické vlastnosti použitého nosného materiálu,

spôsob aplikácie testovanej látky na nosný materiál,

druh použitého riedidla,

dôkazy akejkoľvek nestálosti testovanej látky počas testu a príslušné použité metódy,

všetky informácie dôležité pre interpretáciu výsledkov, najmä týkajúce sa prímesí a fyzikálneho skupenstva (stavu) testovanej látky.

3.2. BANKOVÁ METÓDA Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

výsledky predbežného testu,

presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi),

samostatné analytické stanovenia hodnôt a ich priemer v prípadoch, kde boli pre každú banku stanovené viaceré hodnoty,

hodnotu pH osobitne pre každú vzorku,

priemer hodnoty pre rozdielne banky, pri ktorých sa dosiahla súhlasnosť výsledkov,

testovaciu teplotu,

použitú analytickú metódu,

dôkazy o akejkoľvek nestálosti testovanej látky počas testu a príslušnú použitú metódu,

všetky informácie dôležité pre interpretáciu výsledkov, najmä týkajúce sa prímesí a fyzikálneho skupenstva (stavu) testovanej látky.

4.(1)(2)(3) ODKAZY OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method. NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.

A.8. ROZDEĽOVACÍ KOEFICIENT

A.8.

1. METÓDA Opísaná metóda trepačkovej banky je upravená smernicou na vykonávanie testov OECD (1).

1.

1.1. ÚVOD Na účely realizácie tejto metódy sa odporúča získať predbežné informácie o štruktúrnom vzorci, disociačnej konštante, rozpustnosti vo vode, hydrolýze, rozpustnosti v n-oktanole a povrchovom napätí látky určenej na testovanie. Merania na ionizovateľných testovaných látkach by sa mali realizovať iba v ich neionizovanej forme (voľná kyselina alebo voľná zásada) dosiahnutej použitím vhodného tlmivého roztoku s hodnotou pH minimálne o jednu jednotku pH pod (voľná kyselina) alebo nad (voľná zásada) hodnotou pH. Táto testovacia metóda pozostáva z dvoch samostatných postupov: z metódy trepačkovej banky a vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Prvý z uvedených postupov sa dá aplikovať, keď hodnota log Pow patrí do rozsahu od – 2 do 4, a druhý, keď táto hodnota patrí do rozsahu od 0 do 6. Pred uskutočnením ktoréhokoľvek z uvedených postupov je potrebné najprv získať predbežný odhad rozdeľovacieho koeficientu. Metóda trepačkovej banky sa dá použiť iba v prípade absolútne čistých testovaných látok rozpustných vo vode a n-oktanole. Nemožno ju uplatniť v prípade povrchovo aktívnych látok (pre ktoré treba zabezpečiť vypočítanú hodnotu alebo odhad založený na rozpustnosti vo vode a n-oktanole). Metóda vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) sa nedá použiť v prípade silných kyselín a zásad, polymetalických látok, povrchovo aktívnych látok alebo látok, ktoré reagujú s eluentom. Pre tieto materiály treba zabezpečiť vypočítanú hodnotu alebo odhad založený na rozpustnosti vo vode a n-oktanole. Metóda vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) je menej citlivá na prítomnosť prímesí v testovanej látke alebo prípravku než metóda trepačkovej banky. Napriek tomu však prímesi v niektorých prípadoch môžu značne skomplikovať interpretáciu výsledkov, pretože vrcholová špecifikácia sa stáva neistou. Pre zmesi, ktoré vykazujú nerozpustené pásmo, treba určiť vrchné a spodné medzné hodnoty log P.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Rozdeľovací koeficient (P) je definovaný ako pomer rovnovážnych koncentrácií (ci) rozpustenej látky v dvojfázovom systéme pozostávajúcom z dvoch do značnej miery nezmiešateľných rozpúšťadiel. V prípade n-oktanolu a vody platí: Pow=cn-oktan-l-olcvoda Rozdeľovací koeficient (P) je preto kvocientom dvoch koncentrácií a udáva sa vo forme dekadického logaritmu (log P).

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY

1.3. Metóda trepačkovej banky

Referenčné látky sa nemusia použiť vo všetkých prípadoch, keď sa skúma nová látka. V prvom rade by mali slúžiť na občasnú kontrolu účinnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie porovnania s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód.

Metóda HPLC

Na účely korelácie nameraných údajov HPLC (vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie) príslušnej zlúčeniny s jej hodnotou P treba zostrojiť kalibračný graf údajov log P verzus chromatografické údaje s použitím najmenej 6 referenčných bodov. Zostáva na užívateľovi, aby si zvolil príslušné vhodné referenčné látky. Vždy keď je to možné, najmenej jedna referenčná látka má mať hodnotu Pow vyššiu než testovaná látka a iná zasa hodnotu Pow nižšiu než testovaná látka. Pre hodnoty log P nižšie ako 4 môže byť kalibrácia založená na údajoch nadobudnutých v rámci metódy trepačkovej banky. Pre hodnoty log P vyššie ako 4 môže byť kalibrácia založená na literárnych údajoch s potvrdenou platnosťou, ak tieto súhlasia s vypočítanými hodnotami. Pre väčšiu presnosť sa odporúča radšej vybrať také referenčné látky, ktoré majú podobnú štruktúru ako príslušná testovaná látka. Existujú obsiahle zoznamy hodnôt log Pow pre mnohé skupiny chemických látok a prípravkov (2) (3). Ak údaje týkajúce sa rozdeľovacích koeficientov štrukturálne príbuzných látok nie sú dostupné, možno použiť všeobecnejšiu kalibráciu uskutočnenú s inými referenčnými látkami. Zoznam odporúčaných referenčných látok a ich hodnoty Pow sú uvedené v dodatku 2.

1.4. PRINCÍP METÓDY

1.4.

1.4.1. Metóda trepačkovej banky Na účely stanovenia rozdeľovacieho koeficientu musí byť dosiahnutá rovnováha medzi všetkými vzájomne pôsobiacimi zložkami systému a musia byť stanovené koncentrácie látok rozpustených v dvoch fázach. Štúdium odbornej literatúry týkajúcej sa tejto otázky ukazuje, že na vyriešenie problému dôkladného premiešania dvoch fáz s ich následnou separáciou na účely stanovenia rovnovážnej koncentrácie pre testovanú látku možno použiť viacero odlišných technických postupov.

1.4.2. Metóda HPLC (vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie) Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia sa uskutočňuje na analytických kolónach naplnených komerčne dostupnou tuhou fázou obsahujúcou dlhé uhľovodíkové reťazce (napr. C8, C18), ktoré sú chemicky viazané na kremík. Látky injektované na takúto kolónu sa pohybujú pozdĺž nej rozdielnymi rýchlosťami, pretože dochádza k rozdielnym stupňom rozdeľovania medzi pohyblivú fázu a uhľovodíkovú nepohyblivú fázu. Zmesi látok sa vypierajú v poradí za sebou v závislosti od ich hydrofóbnosti, pričom látky rozpustné vo vode sa vypierajú ako prvé a látky rozpustné v oleji ako posledné, proporcionálne k ich rozdeľovaciemu koeficientu medzi uhľovodíkom a vodou. Toto umožňuje vytvorenie vzájomného vzťahu medzi dobou zdržania na takejto kolóne s reverznou fázou a rozdeľovacím koeficientom n-oktanol/voda. Rozdeľovací koeficient je odvodený z činiteľa využitia (kapacitného faktora) k, daného výrazom: k=tr-toto v ktorom tr = doba zdržania (retencie) testovanej látky a to = priemerný čas, ktorý potrebuje molekula rozpúšťadla na to, aby prešla kolónou (nečinná doba). Kvantitatívne analytické metódy sa nepožadujú a potrebné je iba stanovenie časov vypierania.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY

1.5.

1.5.1. Opakovateľnosť

1.5.1. Metóda trepačkovej banky

Na účely zaistenia presnosti rozdeľovacieho koeficientu je potrebné vykonať duplikátne stanovenia za troch odlišných skúšobných podmienok, pričom možno meniť množstvo špecifikovanej látky, ako aj pomer objemov rozpúšťadiel. Stanovené hodnoty rozdeľovacieho koeficientu vyjadrené ako ich dekadické (Briggsove) logaritmy musia patriť do rozsahu ±0,3 log jednotiek.

Metóda HPLC (vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie)

Na účely zvýšenia dôveryhodnosti merania sa musia uskutočniť duplikátne stanovenia. Hodnoty log P odvodené z jednotlivých meraní musia patriť do rozsahu ±0,1 log jednotiek.

1.5.2. Citlivosť

1.5.2. Metóda trepačkovej banky

Rozsah merania v rámci tejto metódy je určovaný možnosťou sledovania analytického postupu. Toto by malo umožniť stanovenie hodnôt log Pow v rozmedzí od – 2 do 4 (príležitostne, keď sú na to podmienky, toto rozmedzie môže byť rozšírené na log Pow s hodnotou až 5), keď koncentrácia rozpustenej látky ani v jednej fáze nepresiahne hodnotu 0,01 mol na jeden liter.

Metóda HPLC (vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie)

Metóda vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie umožňuje odhadovanie rozdeľovacích koeficientov v rozmedzí log Pow od 0 do 6. Za normálnych okolností možno rozdeľovací koeficient látky alebo prípravku odhadnúť s presnosťou na ± 1 log jednotku hodnoty v rámci metódy trepačkovej banky. Typické korelácie možno nájsť v odkazoch (4) (5) (6) (7) (8). Vyššia presnosť sa môže zvyčajne dosiahnuť vtedy, keď sú korelačné diagramy založené na štruktúrne príbuzných referenčných látkach (9).

1.5.3. Špecifickosť

1.5.3. Metóda trepačkovej banky

Nernstov rozdeľovací zákon sa dá použiť iba pri konštantnej teplote, tlaku a hodnote pH pre zriedené roztoky. Uplatňuje sa výlučne pre čisté látky dispergované medzi dve čisté riedidlá. Ak sa v tom istom čase objavia v jednej alebo obidvoch fázach viaceré odlišné rozpustené látky, môže to nepriaznivo ovplyvniť výsledky. Disociácia alebo spájanie rozpustených molekúl má za následok odchýlky od Nernstovho rozdeľovacieho zákona. Takéto odchýlky sú naznačované skutočnosťou, že rozdeľovací koeficient sa stane závislý od koncentrácie roztoku. Kvôli viacnásobným rovnovážnym stavom by sa táto testovacia metóda nemala aplikovať na ionizovateľné prípravky bez uplatnenia korekcie. V prípade takýchto prípravkov by sa malo uvažovať o použití tlmivých roztokov namiesto vody, pričom hodnota pH tlmivého roztoku by mala predstavovať minimálne jednu jednotku pH z pKa testovanej látky, a zároveň treba mať na pamäti závažnosť tejto hodnoty pH pre životné prostredie.

1.6. OPIS METÓDY

1.6.

1.6.1. Predbežný odhad rozdeľovacieho koeficientu Uprednostňuje sa odhad rozdeľovacieho koeficientu použitím výpočtovej metódy (dodatok 1) alebo, kde je to vhodné, z pomeru rozpustností testovanej látky v čistých rozpúšťadlách (10).

1.6.2. Metóda trepačkovej banky

1.6.2.

1.6.2.1. Príprava n-oktanol: stanovenie rozdeľovacieho koeficientu by sa malo uskutočniť s reagentom analytickej triedy vysokej čistoty. Voda: použije sa voda destilovaná alebo dvakrát destilovaná v sklenom alebo kremennom destilačnom prístroji. V zdôvodnených prípadoch treba na ionizovateľné prípravky namiesto vody použiť tlmivé roztoky. Upozornenie: Nesmie sa používať voda odoberaná priamo z ionexu (vymieňača iónov).

1.6.2.1.

1.6.2.1.1. Predsaturácia rozpúšťadiel Predtým než sa stanoví rozdeľovací koeficient, fázy rozpúšťadlového systému sa vzájomne nasýtia trepaním pri teplote pokusu. Na tento účel je praktické pretrepávať dve veľké a vysoké fľaše s n-oktanolom analytickej triedy vysokej čistoty alebo s vodou, pričom každá musí obsahovať dostatočné množstvo druhého rozpúšťadla, počas 24 hodín na mechanickej trepačke a potom sa nechajú odstáť dostatočne dlhý čas na to, aby sa fázy od seba oddelili a aby sa dosiahol stav saturácie.

1.6.2.1.2. Príprava na test Celý objem sústavy dvoch fáz by mal skoro úplne naplniť testovaciu nádobu. Toto pomôže zabrániť stratám materiálu následkom vyprchávania. Objemový pomer a množstvá látky, ktoré sa majú použiť, sú stanovené týmto: Uskutočňujú sa tri testy. V prvom teste sa použije vypočítaný objemový pomer n-oktanolu k vode; v druhom teste sa tento pomer vydelí dvoma; a v treťom teste sa tento pomer vynásobí dvoma (napr. 1:1, 1:2, 2:1).

predbežným odhadom rozdeľovacieho koeficientu (pozri vyššie),

minimálnym množstvom testovanej látky potrebným pre analytický postup a

obmedzením maximálnej koncentrácie v každej fáze na 0,01 mol na liter.

1.6.2.1.3. Testovaná látka V n-oktanole predsaturovanom vodou sa pripraví základný zásobný roztok. Koncentrácia tohto základného zásobného roztoku musí byť presne stanovená ešte predtým, než sa použije na stanovenie rozdeľovacieho koeficientu. Tento roztok by mal byť uskladnený v takých podmienkach, ktoré zaručia jeho stabilitu.

1.6.2.2. Podmienky skúšania Testovacia teplota sa musí udržiavať na konštantnej úrovni (± 1 oC) a musí byť v rozmedzí od 20 oC do 25 oC.

1.6.2.3. Postup merania

1.6.2.3.

1.6.2.3.1. Vytvorenie rozdeľovacej rovnováhy Pre každú zo skúšobných podmienok treba pripraviť duplikátne skúšobné nádoby obsahujúce požadované, presne odmerané množstvá dvoch rozpúšťadiel spolu s potrebným množstvom základného zásobného roztoku. Fázy n-oktanolu (n-oktanolové fázy) sa musia merať podľa objemu. Skúšobné nádoby treba buď umiestniť na vhodnú trepačku, alebo ich pretrepávať ručne. V prípade použitia odstredivkovej skúmavky spočíva odporúčaná metóda v rýchlom obracaní skúmavky o 180 stupňov okolo jej priečnej osi tak, aby všetok zachytený vzduch vystúpil cez obidve fázy. Skúsenosti ukázali, že na vytvorenie rozdeľovacej rovnováhy zvyčajne postačí 50 takýchto obratov. Na zabezpečenie želaného výsledku sa odporúča 100 obratov v priebehu piatich minút.

1.6.2.3.2. Oddeľovanie fáz odstreďovaním Keď je to potrebné, na účely oddelenia fáz by malo byť výkonané odstredenie zmesi. Tento úkon by sa mal uskutočniť v laboratórnej odstredivke s udržiavanou stálou teplotou miestnosti alebo v prípade, ak sa použije odstredivka bez tepelnej regulácie, odstredivkové skúmavky by mali byť ponechané pri skúšobnej teplote počas najmenej jednej hodiny pred začatím analýzy.

1.6.2.4. Analýza Na stanovenie rozdeľovacieho koeficientu je potrebné stanoviť koncentrácie testovanej látky v obidvoch fázach. Toto možno uskutočniť odobratím alikvotnej časti oboch fáz z každej skúmavky pre každú zo skúšobných podmienok a ich analyzovaním zvoleným postupom. Celkové množstvo látky prítomné v oboch fázach treba vypočítať a porovnať s množstvom látky, ktoré sa pôvodne použilo. Vodná fáza by sa mala vzorkovať takým postupom, ktorý by minimalizoval riziko prítomnosti stopových množstiev n-oktanolu: na odber vzorky z vodnej fázy sa môže použiť sklená injekčná striekačka s oddeliteľnou ihlou. Injekčná striekačka by mala byť spočiatku čiastočne naplnená vzduchom. Počas prenikania ihly cez vrstvu n-oktanolu treba mierne vypudzovať vzduch z injekčnej striekačky. Potom sa do striekačky naberie primeraný objem vodnej fázy. Striekačka sa rýchlym pohybom vytiahne z roztoku a ihla sa odstráni. Obsah striekačky potom možno použiť ako vodnú vzorku. Koncentrácia v oboch odstredením oddelených fázach by sa podľa možnosti mala stanoviť metódou špecifickou pre príslušnú testovanú látku. Príklady analytických metód, ktoré tu možno použiť, sú:

fotometrické metódy,

plynová chromatografia,

vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC).

1.6.3. Metóda HPLC (vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie)

1.6.3.

1.6.3.1. Príprava

1.6.3.1. Prístroje

Požaduje sa kvapalinový chromatograf vybavený impulzovým čerpadlom a vhodným zariadením na detekciu. Odporúča sa použitie vstrekovacieho ventilu so vstrekovacími slučkami. Prítomnosť polárnych skupín v nepohyblivej fáze môže vážne narušiť fungovanie kolóny vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Z toho dôvodu by mali stacionárne fázy obsahovať minimálne percento polárnych skupín (11). Možno použiť aj komerčné mikročasticové náplne so spätnou fázou alebo kolóny s hotovou náplňou. Medzi vstrekovací systém a analytickú kolónu sa môže umiestniť ochranná kolóna.

Pohyblivá fáza

Na prípravu eluačného rozpúšťadla, ktoré treba pred použitím odplyniť, sa použije metanol kvalitatívnej triedy HPLC a voda kvalitatívnej triedy HPLC. Treba použiť izokratické vypieranie. Ďalej treba použiť pomery metanolu a vody s minimálnym obsahom vody 25 %. Na vypieranie prípravkov s hodnotou log P 6 v priebehu jednej hodiny pri prietoku 1 ml za minútu postačí typický pomer zmesi metanolu a vody 3:1 (v/v). Pre prípravky s vysokým log P môže byť potrebné skrátiť čas vypierania (ako aj časy referenčných látok) znížením polarity pohyblivej fázy alebo skrátením dĺžky kolóny. Látky s veľmi nízkou rozpustnosťou v n-oktanole majú pri použití metódy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie tendenciu vykazovať abnormálne nízke hodnoty log Pow, pričom zóny takýchto prípravkov sa niekedy spájajú s čelom rozpúšťadla. Toto pravdepodobne vyplýva zo skutočnosti, že rozdeľovací proces je príliš pomalý na to, aby dosiahol rovnovážny stav v čase potrebnom za normálnych okolností v rámci separácie metódou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Na dosiahnutie spoľahlivej hodnoty môže byť potom účinné zníženie prietoku, resp. zmenšenie pomeru metanolu a vody. Testované a referenčné látky by mali byť rozpustné v pohyblivej fáze v dostatočných koncentráciách, aby sa umožnila ich detekcia. Iba vo výnimočných prípadoch sa môžu so zmesou metanolu a vody použiť aj aditíva, pretože tieto menia vlastnosti kolóny. V prípade chromatografov s aditívami je povinné použiť samostatnú kolónu toho istého typu. Ak zmes metanolu a vody nie je vhodná, môžu sa použiť iné zmesi organického rozpúšťadla a vody, napr. zmes etanolu a vody alebo acetonitrilu (nitrilu kyseliny etánovej) a vody. Hodnota pH eluentu je kritická pre ionizovateľné látky. Tieto hodnoty musia patriť do operačného rozmedzia pH kolóny, ktoré leží zvyčajne medzi hodnotami 2 až 8. Odporúča sa pufrovanie. Treba dbať na to, aby sa zabránilo zrážaniu solí a poškodeniu kolóny, ku ktorým dochádza v prípade použitia niektorých organických zmesí fázy a pufra. Merania metódou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) s nepohyblivými fázami na báze kremíka s hodnotami pH nad 8 sa neodporúčajú, pretože použitie alkalickej pohyblivej fázy môže zapríčiniť rýchle poškodenie funkčnosti kolóny.

Rozpustené látky

Referenčné látky sa musia vyznačovať maximálnou možnou čistotou. Ak je to možné, látky alebo prípravky určené na použitie v rámci testu alebo kalibrácie sú rozpustené v pohyblivej fáze.

Podmienky skúšania

Teplota počas merania by sa nemala meniť v rozsahu väčšom ako ± 2 K (kelvin).

1.6.3.2. Meranie

1.6.3.2. Výpočet nečinnej doby t0

Nečinná doba t0 môže byť stanovená použitím buď homologického radu (napr. n-alkylmetylových ketónov), alebo nezadržaných, resp. neeluovaných, organických látok alebo prípravkov (napr. tiomočoviny alebo formamidu, amidu kyseliny metánovej). Na výpočet nečinnej doby t0 s použitím homologického radu sa injektuje najmenej sedem členov homologického radu a stanovia sa príslušné doby zdržania. Prvotné (nespracované) doby zdržania tr(nc + 1 sú graficky znázornené v diagrame ako funkcia tr(nc) a stanovený je úsek a a sklon b regresnej rovnice: tr(nc + 1) = a + b tr(nc) (kde nc = počet atómov uhlíka). Nečinná doba t0 je potom daná vzťahom: to = a/(1 - b)

Kalibračný graf

Ďalším krokom postupu je zostrojenie korelačného diagramu hodnôt log k verzus log P pre príslušné referenčné látky. V praktickom postupe sa súčasne vstrekne súbor piatich až desiatich štandardných referenčných látok, ktorých hodnota log P sa nachádza v blízkosti predpokladaného rozmedzia, a stanovia sa doby zdržania, podľa možnosti na záznamovej integračnej jednotke napojenej na detekčný systém. Zodpovedajúce logaritmy kapacitných faktorov log k sa vypočítajú a nanesú do diagramu ako funkcia log P stanovenou metódou trepačkovej banky. Kalibrácia sa uskutočňuje v pravidelných časových intervaloch, a to najmenej raz denne, aby sa tak dali vziať do úvahy možné zmeny v činnosti kolóny.

Stanovenie kapacitného faktora testovanej látky

Testovaná látka sa vstrekne do čo najmenšieho možného množstva mobilnej fázy. Stanoví sa (duplikátne) doba zdržania, čo umožní výpočet kapacitného faktora k. Z korelačného grafu referenčných látok sa dá interpolovať rozdeľovací koeficient testovanej látky. Pre veľmi nízke a veľmi vysoké rozdeľovacie koeficienty je potrebná extrapolácia. V takýchto prípadoch treba dávať mimoriadny pozor na hranice významnosti regresnej čiary.

2. ÚDAJE

2. Metóda trepačkovej banky

Spoľahlivosť stanovených hodnôt P sa môže overiť porovnaním stredných hodnôt duplikátnych stanovení s celkovou strednou hodnotou.

3. SPRÁVA Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi),

keď sa dané metódy nedajú uplatniť (napr. povrchovo aktívny materiál), treba zabezpečiť vypočítanú hodnotu alebo odhad založený na jednotlivých rozpustnostiach v n-oktanole a vo vode,

všetky informácie a poznámky dôležité pre interpretáciu výsledkov testu, najmä týkajúce sa prímesí a fyzikálneho skupenstva (stavu) testovanej látky.

výsledok predbežného odhadu, ak sa takýto uskutočnil,

teplotu, pri ktorej sa hodnoty stanovovali,

údaje o analytických postupoch uplatnených pri stanovovaní koncentrácií,

čas a rýchlosť odstreďovania, ak sa použilo,

namerané koncentrácie v obidvoch fázach pre každé stanovenie (to znamená, že dohromady sa uvedú hodnoty 12 koncentrácií),

hmotnosť testovanej látky, objem každej fázy použitý v každej skúšobnej nádobe a celkové vypočítané množstvo testovanej látky prítomné v každej fáze po vyvážení (po dosiahnutí rovnovážneho stavu),

vypočítané hodnoty rozdeľovacieho koeficientu (P) a stredná hodnota musia byť uvedené pre každú sériu skúšobných podmienok, ako aj stredné hodnoty pre všetky stanovenia. Ak existujú náznaky závislosti rozdeľovacieho koeficientu od koncentrácie, táto skutočnosť sa musí taktiež uviesť v správe,

v správe sa musí uviesť smerodajná odchýlka jednotlivých hodnôt P od ich strednej hodnoty,

stredná hodnota P zo všetkých stanovení sa musí tiež vyjadriť ako jej logaritmus (základ 10),

vypočítanú teoretickú hodnotu Pow, keď bola táto hodnota stanovená alebo keď je nameraná hodnota > ako 104,

hodnotu pH použitej vody a vodnej fázy počas pokusu,

ak boli použité tlmivé roztoky, tak zdôvodnenie použitia tlmivých roztokov namiesto vody, ďalej zloženie, koncentráciu a hodnoty pH tlmivých roztokov, hodnotu pH vodnej fázy pred uskutočnením pokusu a po jeho ukončení.

výsledok predbežného odhadu, ak sa takýto uskutočnil,

testované a referenčné látky a ich čistotu,

teplotné rozmedzie jednotlivých stanovení,

hodnoty pH, pri ktorých sa stanovenia vykonali,

podrobnosti o analytickej a ochrannej kolóne, pohyblivej (mobilnej) fáze a detekčných prostriedkoch,

retenčné údaje a hodnoty log P z odbornej literatúry pre referenčné látky použité v rámci kalibrácie,

podrobnosti o zodpovedajúcej regresnej čiare (log k verzus log P),

priemerné retenčné údaje a interpolovanú hodnotu P pre testovanú látku alebo prípravok,

opis zariadenia a prevádzkových, resp. pracovných, podmienok,

eluačné profily,

množstvá testovaných a referenčných látok zavedených do kolóny,

nečinnú dobu a spôsob, akým sa merala.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)

ODKAZY OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A. J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219 (1981). B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. W. E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. J. E. Haky and A. M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223 – 339. R. F. Rekker and H. M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method. C. V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. C. Hansch, A. Leo, S. H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani and E. J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207. W. B. Neely, D. R. Branson and G. E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113. D. S. Brown and E. W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. J. K. Seydel and K. J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen. Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984. Y. C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel 1978. N. S. Nirrlees, S. J. Noulton, C. T. Murphy, P. J., Taylor, J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.

A.9. TEPLOTA VZPLANUTIA

A.9.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Odporúča sa získať predbežné informácie o zápalnosti, resp. horľavosti, látky ešte pred uskutočnením tohto testu. Postup testu sa dá aplikovať na kvapalné látky, ktorých pary môžu byť zapálené zapaľovacími zdrojmi. Skúšobné metódy uvedené v tomto texte sú spoľahlivé iba pre rozmedzia teploty vzplanutia, ktoré sú špecifikované v jednotlivých metódach. Pri voľbe metódy, ktorá sa má použiť, by sa malo uvážiť, či nemôže dôjsť k chemických reakciám medzi látkou a nosičom vzorky.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Teplota vzplanutia je najnižšia teplota korigovaná na tlak 101,325 kPa, pri ktorej kvapalina uvoľňuje pary, za podmienok definovaných v skúšobnej metóde v takom množstve, že v skúšobnej nádobe sa vytvorí zápalná (horľavá) zmes pár a vzduchu. Jednotky: oC t = T – 273,15 (t v oC a T v K)

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Referenčné látky sa nemusia použiť vo všetkých prípadoch, keď sa skúma nová chemická látka. V prvom rade slúžia na občasnú kontrolu účinnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie porovnania s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód.

1.4. PRINCÍP METÓDY Látka sa umiestni do skúšobnej nádoby a zohrieva sa na testovaciu teplotu podľa postupu opísaného v príslušnej skúšobnej metóde. Zápalné (horľavé) pokusy sa uskutočňujú na účely zistenia, či testovaná vzorka pri počiatočnej teplote vzplanie, alebo nie.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY

1.5.

1.5.1. Opakovateľnosť Opakovateľnosť sa mení v závislosti od rozmedzia teploty vzplanutia a od použitej skúšobnej metódy; maximum 2 oC.

1.5.2. Citlivosť Citlivosť závisí od použitej skúšobnej metódy.

1.5.3. Špecifickosť Špecifickosť niektorých skúšobných metód je obmedzená na určité rozmedzia teploty vzplanutia a je závislá od údajov týkajúcich sa vlastností testovanej látky (napr. vysoká viskozita).

1.6. OPIS METÓDY

1.6.

1.6.1. Príprava Vzorka príslušnej testovanej látky sa umiestni do skúšobného prístroja podľa 1.6.3.1 a/alebo 1.6.3.2. Kvôli bezpečnosti sa odporúča, aby sa pre látky s vysokou energiou alebo pre jedovaté látky použila metóda, v rámci ktorej sa testujú iba vzorky s malým objemom, približne 2 cm3.

1.6.2. Podmienky skúšania Ak to zodpovedá bezpečnostným predpisom, prístroj sa postaví na miesto, kde nie je vystavený prievanu.

1.6.3. Realizácia testu

1.6.3.

1.6.3.1. Rovnovážna metóda Pozri technické normy ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2. Nerovnovážna metóda

1.6.3.2. Abelov prístroj:

Pozri technické normy BS 2000, časť 170, NF M 07-011, NF T 66-009.

Abelov-Penskyho prístroj:

Pozri technické normy EN 57, DIN 51755 časť 1 (pre teploty od 5 oC do 65 oC), DIN 51755 časť 2 (pre teploty pod 5 oC), NF M07-036.

Tagov prístroj:

Pozri technickú normu ASTM D 56.

Penskyho-Martensov prístroj:

Pozri technické normy ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34 NF M07-019.

Poznámky:

Ak sa zistí, že teplota vzplanutia stanovená nerovnovážnou metódou uvedenou v 1.6.3.2 je 0 oC ± 2 oC, 21 oC ± 2 oC alebo 55 oC ± 2 oC, mala by byť potvrdená rovnovážnou metódou pri použití toho istého prístroja. Na oznamovanie sa smú použiť iba tie metódy, ktoré sú schopné vyvinúť teplotu vzplanutia predmetnej testovanej látky. Na stanovenie teploty vzplanutia viskóznych kvapalín (farbív, živíc a podobných látok) obsahujúcich rozpúšťadlá sa smú použiť iba prístroje a skúšobné metódy vhodné na stanovovanie teploty vzplanutia viskóznych kvapalín. Pozri technické normy ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 časť 1.

2. ÚDAJE

3. SPRÁVA Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi),

treba uviesť použitú metódu, ako aj všetky prípadné odchýlky,

výsledky a všetky doplnkové poznámky dôležité pre interpretáciu výsledkov.

4. ODKAZY Žiadne.

A.10. HORĽAVOSŤ (TUHÉ LÁTKY)

A.10.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Pred realizáciou tohto testu sa odporúča získať predbežné informácie o potenciálne explozívnych vlastnostiach látky. Tento test by sa mal použiť iba v prípade práškových, granulovaných alebo pastovitých látok. Aby neboli zahrnuté všetky látky, ktoré môžu byť zapálené, ale iba tie, ktoré horia rýchlo, alebo tie, ktorých spôsob horenia je v každom prípade mimoriadne nebezpečný, za veľmi horľavé sa považujú iba tie látky, ktorých rýchlosť horenia presahuje určitú medznú hodnotu. Môže byť mimoriadne nebezpečné, ak sa žeravenie šíri kovovým práškom, pretože je potom veľmi ťažké zahasiť oheň. Kovové prášky treba považovať za vysokohorľavé, ak podporujú šírenie žeravenia cez hmotu v priebehu stanoveného času.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Čas horenia je vyjadrený v sekundách.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Nie sú špecifikované.

1.4. PRINCÍP METÓDY Látka sa sformuje do neprerušeného prúžku alebo práškovej čiary v dĺžke asi 250 mm a uskutoční sa predbežný skríningový test na stanovenie toho, či po zapálení plameňom plynového horáka dôjde k šíreniu horenia plameňom alebo tlením. Ak dôjde k šíreniu po dĺžke čiary aspoň 200 mm v priebehu stanoveného času, uskutoční sa následne kompletný testový program na stanovenie rýchlosti horenia.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Nie sú stanovené.

1.6. OPIS METÓDY

1.6.

1.6.1. Predbežný skríningový test Látka sa sformuje do neprerušeného prúžku alebo práškovej čiary v dĺžke asi 250 mm, so šírkou 20 mm a hrúbkou 10 mm na nehorľavej (ohňovzdornej), nepórovitej podkladovej doske s nízkou tepelnou vodivosťou. K jednému koncu práškovej čiary sa priloží horúci plameň plynového horáka (s minimálnym priemerom 5 mm) a podrží sa, kým sa prášok nezapáli (nevznieti), alebo počas maximálne 2 minút (5 minút v prípade kovových práškov alebo práškov kovových zliatin). Treba sledovať, či sa horenie rozšíri po dĺžke 200 mm práškovej čiary v priebehu 4-minútovej testovej periódy (alebo 40-minútovej periódy v prípade kovových práškov). Ak sa látka nezapáli a spaľovanie sa nerozšíri buď horením plameňom, alebo tlením po dĺžke 200 mm práškovej čiary v priebehu 4-minútovej (alebo 40-minútovej) testovej periódy, príslušná testovaná látka sa nepovažuje za vysokohorľavú, v takom prípade sa nepožaduje jej ďalšie testovanie. Ak sa horenie látky rozšíri po 200 mm dĺžke práškovej čiary za čas kratší ako 4 minúty alebo za čas kratší ako 40 minút v prípade kovových práškov, treba uskutočniť postup uvedený v nasledujúcom texte (bod 1.6.2 a nasledujúce body).

1.6.2. Test rýchlosti horenia

1.6.2.

1.6.2.1. Príprava Práškové alebo granulované testované látky sa zvoľna nasypú do formy s dĺžkou 250 mm, s trojuholníkovitým prierezom, s vnútornou výškou 10 mm a šírkou 20 mm. Na obidvoch stranách formy sú v pozdĺžnom smere namontované dve kovové lišty, ktoré slúžia ako bočné ohraničenie a ktoré prečnievajú 2 mm ponad vrchný okraj trojuholníkovitého prierezu (pozri obrázok). Forma sa potom zdvihne do výšky 2 cm a trikrát za sebou sa pustí, aby dopadla na tvrdý podklad, čím sa prášok utrasie. Ak je to potrebné, forma sa znova doplní práškom. Bočné kovové lišty sa potom odstránia a prebytočná testovaná látka (vo forme prášku) sa zhrnie. Na vrchnú stranu formy sa potom položí nehorľavá (ohňovzdorná), nepórovitá podkladová doska s nízkou tepelnou vodivosťou, prístroj sa obráti spodnou časťou navrch a forma sa odstráni. Pastovité látky sa nanesú vo forme črievka s dĺžkou 250 mm a s prierezom s plochou približne 1 cm2 na nehorľavú (ohňovzdornú), nepórovitú podkladovú dosku s nízkou tepelnou vodivosťou.

1.6.2.2. Podmienky skúšania V prípade látky, ktorá je citlivá na vlhkosť, sa musí test uskutočniť v čo najkratšom čase po vyňatí látky z obalu.

1.6.2.3. Realizácia testu Umiestnite hranicu z práškovej testovanej látky do digestora priečne na smer prúdenia vzduchu. Rýchlosť prúdenia vzduchu musí byť dostatočná na to, aby sa zabránilo úniku spalín do ovzdušia laboratória, a počas testu by sa nemala meniť. Okolo prístroja by mala byť postavená protiprievanová zástena. Hranica z práškovej testovanej látky sa na jednom konci zapáli pomocou horúceho plameňa plynového horáka (minimálny priemer 5 mm). Keď hranica prehorela vzdialenosť 80 mm, na úseku ďalších 100 mm sa zmeria rýchlosť horenia. Test sa opakuje šesťkrát, pokiaľ sa pozitívny výsledok nezaregistroval už skôr, pričom zakaždým sa použije čistá a chladná podkladová doska.

2. ÚDAJE Na vyhodnotenie je smerodajný čas horenia z predbežného skríningového testu (1.6.1) a najkratší čas horenia z maximálne šiestich opakovaní hlavného testu (1.6.2.3).

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi),

opis látky určenej na testovanie, jej fyzikálny stav vrátane obsahu vlhkosti,

výsledky z predbežného skríningového testu a z testu rýchlosti horenia, ak sa tento test tiež uskutočnil,

všetky doplňujúce poznámky a pripomienky dôležité pre interpretáciu výsledkov.

3.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Práškovité, granulované alebo pastovité látky treba považovať za veľmi horľavé, ak čas horenia v každom teste uskutočnenom podľa skúšobného postupu opísaného v 1.6.2 je kratší ako 45 sekúnd. Kovové prášky alebo prášky kovových zliatin sa považujú za vysokohorľavé, keď sa dajú zapáliť a ak sa plameň alebo zóna reakcie rozšíri po celej dĺžke vzorky za 10 minút alebo za kratší čas.

4. ODKAZY NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

A.11. HORĽAVOSŤ (PLYNY)

A.11.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Táto metóda umožňuje stanovenie toho, či sú plyny zmiešané so vzduchom pri teplote miestnosti (približne 20 oC) a pri atmosférickom tlaku horľavé, a ak áno, v akom rozsahu koncentrácií. Zmesi s narastajúcimi koncentráciami plynu vo vzduchu sú vystavené elektrickej iskre a sleduje sa, či dôjde k zapáleniu (vzplanutiu).

1.2. POJMY A JEDNOTKY Rozsah zápalnosti je rozmedzie koncentrácie medzi dolnou a hornou medzou výbušnosti. Dolná a horná medza výbušnosti predstavuje tie medzné hodnoty koncentrácie horľavého plynu v prímesi so vzduchom, pri ktorých sa neobjavuje šírenie plameňa.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Nie sú špecifikované.

1.4. PRINCÍP METÓDY Koncentrácia plynu vo vzduchu sa postupne zvyšuje a zmes je vystavená pri každej koncentrácii elektrickej iskre.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Nie sú stanovené.

1.6. OPIS METÓDY

1.6.

1.6.1. Prístroje Testovacou nádobou je stĺpcovitý sklený valec s minimálnym vnútorným priemerom 50 mm a s minimálnou výškou 300 mm. Zapaľovacie elektródy sú oddelené vzdialenosťou 3 mm až 5 mm a sú umiestnené vo výške 60 mm nad dnom valca. Valec je vybavený otvorom na znižovanie tlaku. Prístroj musí byť chránený krytom, aby sa obmedzili akékoľvek škody spôsobené výbuchom. Ako zapaľovací zdroj sa používa stojatá indukovaná iskra s 0,5-sekundovým trvaním, ktorá sa generuje z vysokonapäťového transformátora s výstupným koncovým napätím 10 až 15 kV (maximálny príkon 300 W). Príklad vhodného použiteľného prístroja je opísaný v odkazoch (2).

1.6.2. Podmienky skúšania Test sa musí uskutočniť pri teplote miestnosti (približne 20 oC).

1.6.3. Realizácia testu S použitím dávkovacích čerpadiel sa do skleného valca napustí známa koncentrácia plynu vo vzduchu. Cez zmes sa nechá preletieť iskra a sleduje sa, či sa zo zapaľovacieho zdroja oddelí plameň a začne sa nezávisle šíriť alebo nie. Koncentrácia plynu sa mení, resp. zvyšuje, postupne po jednom objemovom percente, až kým nedôjde k zapáleniu zmesi podľa vyššie uvedeného opisu. Ak štruktúra plynu naznačuje, že daný plyn je pravdepodobne nehorľavý a že sa dá vypočítať stechiometrická zmes so vzduchom, treba v jednopercentných krokoch testovať iba zmesi v rozmedzí od 10 % pod stechiometrickou koncentráciou do 10 % nad touto koncentráciou.

2. ÚDAJE Šírenie plameňa je jediným relevantným informačným údajom na stanovenie tejto vlastnosti.

3. SPRÁVA Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi),

opis použitého prístroja s uvedenými rozmermi,

teplotu, pri ktorej sa test uskutočnil,

testované koncentrácie a získané výsledky,

výsledok testu: nehorľavý alebo mimoriadne horľavý plyn,

ak sa dospelo k záveru, že testovaný plyn je nehorľavý, treba uviesť rozsah koncentrácií, v rámci ktorého bol testovaný v 1 % krokoch,

musia byť uvedené všetky informácie a poznámky dôležité pre interpretáciu výsledkov.

4.(1)(2) ODKAZY NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol. 56, 2, 126 – 127.

A.12. HORĽAVOSŤ (KONTAKT S VODOU)

A.12.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Táto testovacia metóda sa môže použiť na stanovenie toho, či reakcia testovanej látky s vodou alebo vlhkým vzduchom vedie k vyvíjaniu nebezpečných množstiev plynu alebo plynov, ktoré môžu byť mimoriadne horľavé. Testovacia metóda sa môže použiť pre tuhé, ako aj kvapalné látky. Táto metóda sa nedá použiť pre látky, ktoré sa spontánne zapaľujú (vznecujú) pri kontakte so vzduchom.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Mimoriadne horľavé: látky, ktoré v kontakte s vodou alebo vzdušnou vlhkosťou uvoľňujú mimoriadne horľavé plyny v nebezpečných množstvách pri minimálnej rýchlosti 1 l/kg za hodinu.

1.3. PRINCÍP METÓDY Látka sa testuje podľa poradia krokov opísaných v nasledujúcich odsekoch. Ak v rámci ktoréhokoľvek kroku dôjde k zapáleniu (vznieteniu), ďalšie testovanie už nie je potrebné. Ak je známe, že testovaná látka nereaguje búrlivo s vodou, možno postúpiť rovno ku kroku 4 (1.3.4).

1.3.

1.3.1. Krok 1 Testovaná látka sa umiestni do vaničky obsahujúcej destilovanú vodu pri teplote 20 oC a sleduje sa, či sa uvoľnený plyn zapáli (vznieti) alebo nie.

1.3.2. Krok 2 Testovaná látka sa umiestni pri teplote 20 oC na filtračný papier plávajúci na hladine destilovanej vody v nádobe a sleduje sa, či sa uvoľnený plyn zapáli (vznieti) alebo nie. Filtračný papier slúži výlučne na to, aby sa testovaná látka udržiavala na jednom mieste na účely zvýšenia pravdepodobnosti zapálenia (vznietenia) látky.

1.3.3. Krok 3 Z testovanej látky sa urobí kôpka približne 2 cm vysoká s priemerom 3 cm. Do kôpky sa pridá niekoľko kvapiek vody a sleduje sa, či sa uvoľnený plyn zapáli (vznieti) alebo nie.

1.3.4. Krok 4 Testovaná látka sa zmieša s destilovanou vodou pri teplote 20 oC a rýchlosť uvoľňovania plynu sa meria sedem hodín, vždy v jednohodinových intervaloch. Ak je rýchlosť uvoľňovania plynu po uplynutí siedmich hodín nestála alebo narastá, čas merania možno predĺžiť na maximálny čas piatich dní. Test možno kedykoľvek zastaviť, ak rýchlosť uvoľňovania plynu prekročí hodnotu 1 l/kg za hodinu.

1.4. REFERENČNÉ LÁTKY Nie sú špecifikované.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Nie sú stanovené.

1.6. OPIS METÓD

1.6.

1.6.1. Krok 1

1.6.1.

1.6.1.1. Podmienky skúšania Test sa uskutočňuje pri teplote miestnosti (približne 20 oC).

1.6.1.2. Realizácia testu Malé množstvo testovanej látky (s priemerom približne 2 mm) sa umiestni do vaničky obsahujúcej destilovanú vodu. Treba sledovať a zaznamenať, či i) sa vôbec nejaký plyn uvoľnil a či ii) došlo k zapáleniu (vznieteniu) plynu. Ak došlo k zapáleniu (vznieteniu) plynu, tak už nie je potrebné ďalšie testovanie látky, pretože látka sa týmto považuje za nebezpečnú.

1.6.2. Krok 2

1.6.2.

1.6.2.1. Prístroje Filtračný papier sa naplocho položí na hladinu destilovanej vody naliatej do vhodnej nádoby, napr. do odparovacej misky s priemerom 100 mm.

1.6.2.2. Podmienky skúšania Test sa uskutočňuje pri teplote miestnosti (približne 20 oC).

1.6.2.3. Realizácia testu Malé množstvo testovanej látky (s priemerom približne 2 mm) sa umiestni do stredu filtračného papiera. Treba sledovať a zaznamenať, či i) sa vôbec nejaký plyn uvoľnil a či ii) došlo k zapáleniu (vznieteniu) plynu. Ak došlo k zapáleniu (vznieteniu) plynu, tak už nie je potrebné ďalšie testovanie látky, pretože látka sa týmto považuje za nebezpečnú.

1.6.3. Krok 3

1.6.3.

1.6.3.1. Podmienky skúšania Test sa uskutočňuje pri teplote miestnosti (približne 20 oC).

1.6.3.2. Realizácia testu Z testovanej látky sa urobí kôpka približne 2 cm vysoká, s priemerom 3 cm, s vrúbkovaním na vrcholku kôpky. Pridá sa niekoľko kvapiek vody a sleduje sa a zaznamenáva, či i) sa vôbec nejaký plyn uvoľnil a či ii) došlo k zapáleniu (vznieteniu) plynu. Ak došlo k zapáleniu (vznieteniu) plynu, tak už nie je potrebné ďalšie testovanie látky, pretože látka sa týmto považuje za nebezpečnú.

1.6.4. Krok 4

1.6.4.

1.6.4.1. Prístroje Prístroj je zostavený podľa nákresu na obrázku.

1.6.4.2. Podmienky skúšania Skontrolujte testovanú látku v prepravnom obale z hľadiska prítomnosti prášku s veľkosťou častíc < 500 μm. Ak prášok tvorí viac ako 1 % hmotnosti alebo ak je vzorka drobivá, tak sa pred uskutočnením testu musí celé množstvo látky rozomlieť na prach vzhľadom na redukciu veľkosti častíc počas skladovania a manipulácie. V ostatných prípadoch sa látka testuje v takom stave, v akom bola doručená. Test sa musí uskutočniť pri teplote miestnosti (približne 20 oC) a pri normálnom atmosférickom tlaku.

1.6.4.3. Realizácia testu Do odkvapkávajúceho lievika prístroja sa pridá 10 až 20 ml vody a do Erlenmeyerovej banky sa pridá 10 g testovanej látky. Objem uvoľneného plynu sa dá merať akýmkoľvek vhodným prostriedkom. Kohútik oddeľovacieho lievika sa otvorí, aby sa voda dostala do Erlenmeyerovej banky, a zároveň sa zapnú stopky. Uvoľňovanie plynu sa meria každú hodinu počas siedmich hodín. Ak je počas tohto času uvoľňovanie plynu nestále (kolísavé) alebo ak po uplynutí tohto času uvoľňovanie plynu ešte narastá, meranie môže pokračovať ešte maximálne päť dní. Ak v ktoromkoľvek čase rýchlosť uvoľňovania plynu prekročí hodnotu 1 l/kg/hod, test možno zastaviť. Tento test sa musí trojnásobne zopakovať. Ak je identita plynu neznáma, plyn sa musí analyzovať. Keď plyn obsahuje mimoriadne horľavé zložky a nie je známe, či je celá zmes mimoriadne horľavá, treba pripraviť zmes toho istého zloženia a potom ju testovať podľa metódy A.11.

2. ÚDAJE Testovaná látka sa považuje za nebezpečnú, ak:

dôjde k spontánnemu zapáleniu (vznieteniu) počas ktoréhokoľvek kroku skúšobného postupu alebo

dochádza k uvoľňovaniu horľavého (vznetlivého) plynu pri rýchlosti (miere) väčšej ako 1 l/kg látky za hodinu.

3. SPRÁVA Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi),

podrobnosti o akejkoľvek počiatočnej príprave testovanej látky,

výsledky testu (kroky 1, 2, 3 a 4),

identifikáciu uvoľneného plynu,

rýchlosť (mieru) uvoľňovania plynu, ak sa uskutočňuje krok 4 (1.6.4),

všetky doplnkové poznámky dôležité pre interpretáciu výsledkov.

4.(1)(2) ODKAZY Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

A.13. SAMOZÁPALNÉ VLASTNOSTI TUHÝCH LÁTOK A KVAPALÍN

A.13.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Postup testu sa dá použiť pre tuhé alebo kvapalné látky, ktoré sa v malých množstvách samovoľne vznietia krátky čas po tom, čo sa dostali do kontaktu so vzduchom pri teplote miestnosti (približne 20 oC). Látky, ktoré musia byť vystavené pôsobeniu vzduchu počas niekoľkých hodín alebo dní pri teplote miestnosti alebo pri zvýšenej teplote, kým dôjde k ich vznieteniu, nie sú pokryté touto testovacou metódou.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Látky so sklonom k samovznieteniu sa považujú za také vtedy, ak sa vznietia alebo spôsobia zuhoľnatenie za podmienok opísaných v 1.6. Môže byť potrebné testovať aj samozápalnosť kvapalín použitím metódy A.15 – Teplota samovznietenia (kvapaliny a plyny).

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Nie sú špecifikované.

1.4. PRINCÍP METÓDY Testovaná látka, či už tuhá, alebo kvapalná, sa pridá do inertnej nosnej látky a vystaví sa kontaktu so vzduchom pri teplote okolitého prostredia na päť minút. Ak sa kvapalné látky nevznietia, tak sa absorbujú do filtračného papiera a vystavia sa pôsobeniu vzduchu pri teplote okolitého prostredia (približne 20 oC) na päť minút. Ak sa testovaná tuhá látka alebo kvapalina vznieti alebo ak kvapalina zapáli alebo zuhoľnatí filtračný papier, testovaná látka sa považuje za látku so sklonom k samovznieteniu.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Opakovateľnosť: z bezpečnostných dôvodov na potvrdenie sklonu samovznietenia testovanej látky postačí jediný pozitívny výsledok.

1.6. OPIS SKÚŠOBNEJ METÓDY

1.6.

1.6.1. Prístroje Porcelánová miska s priemerom približne 10 cm sa naplní kremelinou do výšky asi 5 mm pri teplote miestnosti (približne 20 oC). Poznámka: Kremelinu alebo akúkoľvek inú porovnateľnú inertnú látku, ktorá je bežne k dispozícii, treba považovať za látku zastupujúcu zeminu, na ktorú sa v prípade nehody testovaná látka môže roztrieštiť. Suchý filtračný papier sa požaduje na testovanie kvapalín, ktoré sa nevznietia pri kontakte so vzduchom, keď sú v kontakte s inertnou nosnou látkou.

1.6.2. Realizácia testu

1.6.2. a)

Práškové tuhé látky Množstvo 1 cm3 až 2 cm3 práškovej látky určenej na testovanie sa nasype z výšky približne 1 m na nehorľavý (ohňovzdorný) povrch a sleduje sa, či sa testovaná látka vznieti počas pádu alebo v priebehu piatich minút po spočinutí na nehorľavom povrchu. Test sa opakuje šesťkrát za sebou, pokiaľ nedôjde k vznieteniu testovanej látky.

Kvapaliny Približne 5 cm3 kvapaliny určenej na testovanie sa naleje do pripravenej porcelánovej misky a sleduje sa, či sa testovaná látka vznieti v priebehu piatich minút. Ak v rámci šiestich opakovaných testov nedôjde k vznieteniu testovanej látky, treba vykonať nasledujúci test: Testovaná vzorka s objemom 0,5 ml sa nanesie injekčnou striekačkou na zvlnený filtračný papier a sleduje sa, či dôjde k zapáleniu alebo zuhoľnateniu filtračného papiera v priebehu piatich minút od pridania testovanej kvapaliny. Test sa opakuje trikrát za sebou, pokiaľ nedôjde k zapáleniu alebo zuhoľnateniu.

2. ÚDAJE

2.

2.1. PRÁCA S VÝSLEDKAMI Testovanie môže byť zastavené, len čo sa v ktoromkoľvek čiastkovom teste objaví pozitívny výsledok.

2.2. VYHODNOTENIE Ak sa testovaná látka vznieti v priebehu piatich minút po pridaní do inertnej nosnej látky a vystavení pôsobeniu vzduchu alebo ak kvapalná testovaná látka zuhoľnatie alebo zapáli filtračný papier po jej pridaní na toto médium a po vystavení pôsobeniu vzduchu, tak sa považuje za samozápalnú.

3. SPRÁVA Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi),

výsledky testov,

všetky doplnkové poznámky dôležité pre interpretáciu výsledkov.

4.(1)(2) ODKAZY NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14. VÝBUŠNÉ VLASTNOSTI

A.14.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Metóda schematicky opisuje spôsob testovania na účely stanovenia, či tuhá alebo pastovitá látka predstavuje nebezpečenstvo výbuchu, keď je vystavená účinku plameňa (citlivosť na teplo) alebo nárazu, alebo treniu (citlivosť na mechanické podnety), a či kvapalná látka predstavuje nebezpečenstvo výbuchu, keď je vystavená účinku plameňa alebo nárazu. Metóda pozostáva z troch častí: Metóda poskytuje údaje na zhodnotenie a stanovenie pravdepodobnosti vyvolania výbuchu určitými bežnými podnetmi. Metóda nie je určená na zisťovanie skutočnosti, či určitá látka je schopná výbuchu za akýchkoľvek podmienok. Metóda je vhodná na stanovenie toho, či príslušná látka bude predstavovať nebezpečenstvo výbuchu (citlivosť na teplo a mechanické podnety) za konkrétnych podmienok špecifikovaných v smernici. Je založená na celom rade typov prístroja, ktoré sa vo veľkej miere používajú medzinárodne (1) a ktoré dávajú účelné a jednoznačné výsledky. Platí však všeobecný názor, že metóda nie je definitívna. Ako alternatívu k špecifikovanému prístroju možno použiť aj iné prístroje, avšak za predpokladu, že tieto sú medzinárodne uznané a že ich výsledky sa dajú adekvátne zosúladiť s príslušnými výsledkami získanými pomocou špecifikovaného prístroja. Testy sa nemusia uskutočniť, ak existujúce termodynamické informácie (napr. zlučovacie teplo, rozkladné teplo), resp. absencia určitých reaktívnych skupín (2) v štrukturálnom vzorci, dôvodne potvrdzujú domnienku, že príslušná látka nie je schopná rýchleho rozkladu s tvorbou plynov alebo uvoľňovaním tepla (t. j. že materiál nepredstavuje žiadne riziko výbuchu). Pre kvapaliny sa nepožaduje test citlivosti na mechanické podnety vo forme trenia.

1.1. a)

testu citlivosti na teplo (1);

testu citlivosti na mechanické podnety vo forme nárazu (1);

testu citlivosti na mechanické podnety vo forme trenia (1).

1.2. POJMY A JEDNOTKY Výbušné látky: Látky, ktoré v špecifikovanom prístroji môžu vybuchnúť účinkom plameňa alebo ktoré sú citlivé na nárazy alebo trenie (alebo sú citlivejšie na mechanické podnety než 1,3-dinitrobenzén v alternatívnom prístroji).

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY 1,3-dinitrobenzén, technický kryštalický produkt preosiaty na jemnosť častíc 0,5 mm pre metódu testovania citlivosti na trenie a nárazy. Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazín (čiže RDX, hexogén, cyklonit – CAS 121-82-4), rekryštalizovaný z vodného cyklohexanónu, navlhko preosievaný cez 250 μm a zachytávaný na 150 μm site a sušený pri teplote 103 oC ± 2 oC (počas 4 hodín) pre druhú sériu testov citlivosti na trenie a nárazy.

1.4. PRINCÍP METÓDY Predbežné testy sú potrebné na vytvorenie bezpečných podmienok na uskutočnenie hlavných troch testov citlivosti.

1.4.

1.4.1. Testy bezpečnosti manipulácie (3) Z bezpečnostných dôvodov sa pred uskutočnením hlavných testov veľmi malé vzorky (približne 10 mg) látky určenej na testovanie vystavia zahrievaniu bez obmedzenia v plynovom plameni v akejkoľvek vhodnej forme prístroja, nárazu udieraním kyjaničky o nákovu a treniu v akejkoľvek forme trecieho mechanizmu. Cieľom je zistiť, či predmetná látka je taká citlivá a výbušná, že predpísané testy citlivosti, obzvlášť test citlivosti na teplo, sa musia uskutočniť so zvláštnou opatrnosťou, aby sa zabránilo prípadnému zraneniu laboratórneho pracovníka.

1.4.2. Citlivosť na teplo Metóda spočíva v zohrievaní testovanej látky v oceľovej rúre uzavretej doštičkami s rozdielnymi priemermi otvoru na účely stanovenia, či má testovaná látka tendenciu vybuchovať v podmienkach intenzívneho tepla a definovaného obmedzenia.

1.4.3. Citlivosť na mechanické podnety (náraz) Metóda spočíva vo vystavení testovanej látky nárazu spôsobenému telesom so špecifikovanou hmotnosťou pusteným zo špecifikovanej výšky.

1.4.4. Citlivosť na mechanické podnety (trenie) Metóda spočíva vo vystavení tuhých alebo pastovitých látok treniu medzi štandardnými povrchmi za špecifikovaných podmienok zaťaženia a relatívneho pohybu.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Nie sú stanovené.

1.6. OPIS METÓDY

1.6.

1.6.1. Citlivosť na teplo (účinok plameňa)

1.6.1.

1.6.1.1. Prístroje Prístroj pozostáva z jednorazovo použiteľnej oceľovej rúry s opakovateľne použiteľným uzavieracím zariadením (obrázok 1), inštalovanej do zohrievacieho a ochranného zariadenia. Každá rúra je zhotovená z hlbokoťažného oceľového plechu (pozri dodatok) a má vnútorný priemer 24 mm, dĺžku 75 mm a hrúbku steny 0,5 mm. Rúry sú na otvorenom konci upravené prírubou tak, aby sa umožnilo ich uzavretie zostavou uzáveru. Zostava uzáveru pozostáva z tlakuvzdornej doštičky s otvorom uprostred, tesne primknutej k rúre použitím dvojdielneho závitového spoja (matice a závitového goliera, okružia). Matica aj závitový golier sú vyrobené z chrómmangánovej ocele (pozri dodatok), ktorá je neiskrivá až do teploty 800 oC. Doštičky majú hrúbku 6 mm, sú vyrobené zo žiaruvzdornej ocele (pozri dodatok) a sú k dispozícii s rozličnými priemermi otvorov.

1.6.1.2. Podmienky skúšania Za normálnych okolností sa látka testuje v takom stave, v akom ju dostali, hoci v niektorých prípadoch, napr. ak bola zlisovaná, liata alebo iným spôsobom kondenzovaná, je potrebné ju pred testovaním rozdrviť. V prípade tuhých látok množstvo materiálu, ktoré sa má použiť v každom teste, sa stanoví použitím predbežného prípravného postupu nasucho. Dechtovaná rúra sa naplní množstvom 9 cm3 testovanej látky, látka sa potom ubije silou 80 N vyvinutou na celý priečny profil rúry. Z bezpečnostných dôvodov alebo v prípade, kde fyzikálna forma látky môže byť zmenená tlakom, sa môžu použiť iné postupy jej plnenia do rúry, napr. ak je testovaná látka nadmerne citlivá na trenie, ubíjanie nepredstavuje vhodný postup. Ak je materiál stlačiteľný, pridá sa ho viac a potom sa ubíja dovtedy, kým v rúre nedosiahne úroveň 55 mm od vrchnej časti. Stanoví sa celkové množstvo použité na naplnenie rúry do výšky 55 mm od jej vrchnej časti a pridajú sa dve ďalšie doplnkové množstvá, každé ubité silou 80 N. Podľa potreby sa potom materiál ešte pridá ubíjaním alebo sa z neho odoberie tak, aby bola rúra naplnená do výšky 15 mm od jej vrchnej časti. Uskutoční sa druhé prípravné kolo nasucho, počnúc ubitým množstvom predstavujúcim jednu tretinu celkovej hmotnosti zistenej v prvom kole. Pri ubíjaní silou 80 N sa pridajú dve ďalšie doplnkové množstvá a podľa potreby pridaním alebo odobratím materiálu sa upraví jeho úroveň na výšku 15 mm od vrchnej časti rúry. Množstvo tuhej látky stanovené v druhom prípravnom kole nasucho sa potom použije pre každý pokus. Plnenie sa uskutoční s tromi rovnakými množstvami, pričom každé sa stlačí na objem 9 cm3 vyvinutím takej sily, aká je na to potrebná. (Postup sa dá uľahčiť použitím rozperných krúžkov.) Kvapaliny a gély sa umiestnia do rúry do výšky 60 mm, pričom pri géloch treba dávať veľký pozor na to, aby sa zabránilo tvorbe dutín v materiáli. Zospodu sa na rúru nasunie závitový golier (okružie), priloží sa doštička s potrebnou veľkosťou otvoru uprostred a po pridaní malého množstva lubrikantu na báze sírnika molybdeničitého sa naplno utiahne matica. Je dôležité skontrolovať, či nezostali zvyškové množstvá testovanej látky zachytené medzi prírubou a doštičkou alebo v závitoch. Zohrievanie sa zabezpečuje propánom odoberaným z priemyselnej tlakovej fľaše, ktorá je vybavená regulátorom tlaku (60 až 70 milibarov), cez merací prístroj (plynomer) a rovnomerne distribuovaným (ako to potvrdzuje vizuálne pozorovanie plameňov vychádzajúcich z horákov) rozdeľovacím potrubím k štyrom horákom. Horáky sú rozmiestnené okolo skúšobnej komory tak, ako je to znázornené na obrázku 1 v dodatku. Štyri horáky majú celkovú spotrebu asi 3,2 l propánu za minútu. Môžu sa použiť aj alternatívne vykurovacie plyny a horáky, ale rýchlosť ohrevu musí zodpovedať špecifikácii na obrázku 3. Pre všetky prístroje sa musí rýchlosť ohrevu periodicky kontrolovať použitím skúmaviek naplnených dibutylftalátom, ako je to znázornené na obrázku 3.

1.6.1.3. Realizácia testov Každý test sa vykonáva dovtedy, pokiaľ sa každá rúra neroztriešti, alebo sa zahrieva až päť minút. Test s výsledným roztrieštením rúry na tri alebo viacero kusov, ktoré môžu byť v niektorých prípadoch spojené úzkymi pásikmi kovu, ako je to znázornené na obrázku 2, sa vyhodnocuje ako výbuch. Test, ktorého výsledkom je menej trieštivých úlomkov, alebo test, v rámci ktorého nedošlo vôbec k roztriešteniu rúry, sa považuje za test bez výsledného výbuchu. Najprv sa uskutoční séria troch testov s uzáverovými doštičkami s priemerom otvorov 6,0 mm, a ak nedôjde k výbuchu, uskutoční sa druhá séria troch testov s uzáverovými doštičkami s priemerom otvorov 2,0 mm. Ak dôjde k výbuchu v obidvoch sériách testov, realizácia ďalších testov sa už nepožaduje.

1.6.1.4. Vyhodnotenie Výsledok testu sa považuje za pozitívny, ak dôjde k výbuchu v obidvoch horeuvedených sériách testov.

1.6.2. Citlivosť na mechanické podnety (náraz)

1.6.2.

1.6.2.1. Prístroje (obrázok 4) Hlavné časti typického prístroja s padacím bucharom pozostávajú z oceľovoliatinového bloku s podkladom, nákovy, stojanu, vodiacich líšt, padacích závaží, spúšťacieho mechanizmu a držiaka na vzorky. Oceľová nákova 100 mm (priemer) × 70 mm (výška) je priskrutkovaná k vrchnej strane oceľového bloku 230 mm (dĺžka) × 250 mm (šírka) × 200 mm (výška) s liatym podkladom 450 mm (dĺžka) × 450 mm (šírka) × 60 mm (výška). Stojan vyrobený z bezšvovej rúry z ťahanej ocele je upevnený v držiaku priskrutkovanom na zadnú časť oceľového bloku. Štyri skrutky zakotvujú prístroj k masívnemu betónovému kotevnému bloku s rozmermi 60 cm × 60 cm × 60 cm tak, aby vodiace lišty boli v absolútne vertikálnej polohe a aby padacie závažie po uvoľnení padalo voľne. Na použitie sú vhodné 5 kg a 10 kg závažia vyrobené z plnej ocele. Nárazová hlava každého závažia je zhotovená z kalenej ocele, HRC 60 až 63, a má minimálny priemer 25 mm. Vzorka určená na testovanie je uzavretá v nárazovom mechanizme, ktorý pozostáva z dvoch koaxiálnych plných oceľových valcov umiestnených nad sebou v dutom valcovitom oceľovom vodiacom prstenci. Plné oceľové valce musia mať priemer 10 (-0,003, -0,005) mm a výšku 10 mm, musia mať leštený povrch, zaoblené hrany (polomer oblúka 0,5 mm) a tvrdosť HRC 58 až 65. Dutý valec musí mať vonkajší priemer 16 mm, leštené vŕtanie s vnútorným priemerom 10 (+0,005, +0,010) mm a výšku 13 mm. Nárazový mechanizmus je namontovaný na vloženú nákovu (priemer 26 mm a výška 26 mm) zhotovenú z ocele a centrovanú prstencom s perforáciami, aby sa umožnil únik spalín.

1.6.2.2. Podmienky skúšania Vzorka by mala mať objem 40 mm3 alebo objem, ktorý je vhodný pre alternatívny prístroj. Tuhé látky by sa mali testovať v suchom stave a mali by byť pripravené týmito spôsobmi: Látky, ktoré sa normálne dodávajú ako pasty, by sa mali v prípadoch, keď je to možné, testovať v suchom stave alebo v každom prípade po odstránení maximálne možného množstva riedidla, resp. rozpúšťadla. Kvapalné látky sa testujú s 1 mm medzerou medzi vrchným a spodným oceľovým valcom.

1.6.2.2. a)

práškové látky sa preosievajú (číslo sita 0,5 mm). Všetok materiál, ktorý prepadol cez sito, sa použije na skúšobné účely;

lisované, liate alebo iným spôsobom kondenzované látky sa rozdrvia na malé kúsky a preosejú sa. Na účely testovania sa použije frakcia zŕn s priemerom od 0,5 mm do 1 mm a mala by reprezentovať pôvodnú látku.

1.6.2.3. Realizácia testov Vykoná sa séria šiestich testov s 10 kg padacím závažím púšťaným z výšky 0,40 m (40 J). Ak počas šiestich testov pri sile nárazu 40 J dôjde k výbuchu, treba pokračovať sériou ďalších šiestich testov s 5 kg padacím závažím púšťaným z výšky 0,15 m (7,5 J). V inom prístroji sa testovaná vzorka porovnáva so zvolenou referenčnou látkou použitím zavedeného postupu (napr. striedavou technikou up and down atď.).

1.6.2.4. Vyhodnotenie Výsledok testu sa považuje za pozitívny, ak dôjde k výbuchu (vyšľahnutie plameňa alebo úder sú ekvivalentné výbuchu) aspoň raz v niektorom z testov pri použití špecifikovaného nárazového prístroja alebo ak je testovaná vzorka citlivejšia ako 1,3-dinitrobenzén alebo RDX v alternatívnom teste citlivosti na náraz.

1.6.3. Citlivosť na mechanické podnety (trenie)

1.6.3.

1.6.3.1. Prístroje (obrázok 5) Trecí prístroj pozostáva z oceľovoliatinovej podkladovej dosky, na ktorú je namontovaný trecí mechanizmus. Tento sa skladá z fixovaného porcelánového kolíka a pohyblivej porcelánovej doštičky. Porcelánová doštička je nesená rámom, ktorý behá v dvoch vodiacich lištách. Rám je napojený na elektromotor ojnicou (spojovacou tyčou), excentrom a vhodným ozubeným prevodom tak, aby porcelánová doštička vykonala jednorazový pohyb späť a dopredu pod porcelánovým kolíkom na vzdialenosť 10 mm. Porcelánový kolík môže byť zaťažený silou napríklad 120 N alebo 360 N. Ploché porcelánové doštičky sú vyrobené z bieleho technického porcelánu (hrubosť 9 μm až 32 μm) a majú rozmery 25 mm (dĺžka) × 25 mm (šírka) × 5 mm (výška). Valcovitý porcelánový kolík je takisto vyrobený z bieleho technického porcelánu a je 15 mm dlhý, má priemer 10 mm a zdrsnené sférické koncové plochy s polomerom ohybu 10 mm.

1.6.3.2. Podmienky skúšania Testovaná vzorka by mala mať objem 10 mm3 alebo objem, ktorý sa hodí pre alternatívny prístroj. Tuhé látky sa testujú v suchom stave a sú pripravované týmito spôsobmi: Látky, ktoré sa normálne dodávajú ako pasty, by sa mali v prípadoch, keď je to možné, testovať v suchom stave. Ak látka určená na testovanie nemôže byť pripravená v suchom stave, pasta (po odstránení maximálneho možného množstva rozpúšťadla) sa testuje ako 0,5 mm hrubý, 2 mm široký a 10 mm dlhý film pripravený pomocou formy.

1.6.3.2. a)

práškové látky sa preosievajú (číslo sita 0,5 mm); všetok materiál, ktorý prepadol cez sito, sa použije na skúšobné účely;

lisované, liate alebo iným spôsobom kondenzované látky sa rozdrvia na malé kúsky a preosejú sa; na účely testovania sa použije frakcia zŕn s priemerom < 0,5 mm.

1.6.3.3. Realizácia testov Porcelánový kolík sa nasmeruje na testovanú vzorku a zaťaží sa. Počas uskutočňovania testu musia hubové rysky porcelánovej doštičky ležať priečne na smer pohybu. Treba dbať na to, aby porcelánový kolík spočíval priamo na testovanej vzorke, aby sa pod kolíkom nachádzalo dostatočné množstvo testovaného materiálu, a tiež na to, aby sa porcelánová doštička pod kolíkom pohybovala správnym spôsobom. V prípade pastovitých látok sa na aplikáciu testovanej látky na doštičku používa 0,5 mm hrubá šablóna s 2 × 10 mm drážkou. Porcelánová doštička musí vykonať pohyb v dĺžke 10 mm dopredu a späť pod porcelánovým kolíkom za 0,44 sekundy. Každá časť povrchu doštičky a kolíka sa smie použiť iba raz; dva konce každého kolíka teda poslúžia na dva pokusy a každý z dvoch povrchov doštičky poslúži na tri pokusy. Séria šiestich testov sa uskutoční so zaťažením 360 N. Ak sa počas týchto šiestich testov dosiahne pozitívny výsledok, musí sa uskutočniť ďalšia séria šiestich testov so zaťažením 120 N. V inom prístroji sa vzorka porovnáva so zvolenou referenčnou látkou použitím zavedeného postupu (napr. striedavou technikou up and down atď.).

1.6.3.4. Vyhodnotenie Výsledok testu sa považuje za pozitívny, ak dôjde k výbuchu (praskanie a/alebo úder alebo vyšľahnutie plameňa sú ekvivalentné výbuchu) aspoň raz v niektorom z testov so špecifikovaným trecím prístrojom alebo ak tento výsledok zodpovedá ekvivalentným kritériám v alternatívnom teste citlivosti na trenie.

2. ÚDAJE V zásade sa príslušná látka podľa smernice považuje za nebezpečnú z hľadiska výbušnosti vtedy, ak sa dosiahol pozitívny výsledok v rámci testu citlivosti na teplo, náraz alebo trenie.

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

identifikáciu, zloženie, čistotu, obsah vlhkosti atď. testovanej látky,

fyzikálnu formu vzorky a údaje o tom, či bola rozdrvená, nalámaná, resp. preosiata, alebo nie,

pozorovania počas testov citlivosti na teplo (napr. hmotnosť vzorky, počet úlomkov atď.),

pozorovania počas testov citlivosti na mechanické podnety (napr. tvorba značného množstva dymu alebo úplné rozloženie bez zvukového efektu, plamene, iskry, zvuková rana, praskanie atď.),

výsledky z každého typu testu,

ak sa použil alternatívny prístroj, musí sa podať vedecké zdôvodnenie, ako aj dôkaz korelácie medzi výsledkami dosiahnutými so špecifikovaným prístrojom a výsledkami dosiahnutými s ekvivalentným prístrojom,

všetky nepostrádateľné poznámky ako odkazy na testy s podobnými produktmi, ktoré by mohli byť dôležité pre správnu interpretáciu výsledkov,

všetky doplnkové poznámky a pripomienky dôležité pre interpretáciu výsledkov.

3.2. INTERPRETÁCIA A VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV Správa z testu by sa mala zmieniť o všetkých výsledkoch, ktoré sa považujú za chybné, zavádzajúce, anomálne alebo nereprezentatívne. Ak sa ktorýkoľvek z výsledkov anuluje, treba uviesť vysvetlenie a nahradiť ho výsledkom alternatívneho doplnkového testu. Pokiaľ sa anomálny výsledok nedá vysvetliť, musí sa akceptovať ako normálna hodnota a musí sa podľa toho aj použiť na klasifikovanie príslušnej testovanej látky.

4.(1)(2)(3)(4)

ODKAZY Recommendations on the Transport of Dangerous Goods Tests and Criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K. H. and Swart, K. H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6 – 13 and 30 – 42. NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.

A.15. TEPLOTA SAMOVZNIETENIA (KVAPALINY A PLYNY)

A.15.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Výbušné látky a látky, ktoré sa samovoľne vznecujú v kontakte so vzduchom pri teplote okolitého prostredia, by sa nemali predkladať na testovanie touto metódou. Tento testovací postup sa dá použiť v prípade plynov, kvapalín a pár, ktoré sa môžu zapáliť za prítomnosti vzduchu horúcim povrchom. Teplota samovznietenia sa môže do značnej miery redukovať prítomnosťou katalytických prímesí, povrchovým materiálom alebo väčším objemom skúšobnej nádoby.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Miera schopnosti látky samovoľne sa vznietiť sa vyjadruje teplotou samozápalu. Teplota samovznietenia predstavuje najnižšiu teplotu, pri ktorej sa testovaná látka vznieti, keď je zmiešaná so vzduchom za podmienok definovaných v skúšobnej metóde.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Referenčné látky sú citované v technických normách (pozri 1.6.3). V prvom rade by mali slúžiť na občasnú kontrolu účinnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie porovnania s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód.

1.4. PRINCÍP METÓDY Metóda stanovuje minimálnu teplotu vnútorného povrchu uzavretého priestoru, ktorá bude mať za následok vznietenie plynu, pary alebo kvapaliny vstreknutej do tohto uzavretého priestoru.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Opakovateľnosť sa mení v závislosti od rozmedzia teplôt samovznietenia a použitej skúšobnej metódy. Citlivosť a špecifickosť závisia od použitej skúšobnej metódy.

1.6. OPIS METÓDY

1.6.

1.6.1. Prístroje Prístroj je opísaný v metóde uvedenej v 1.6.3.

1.6.2. Podmienky skúšania Vzorka testovanej látky sa testuje podľa metódy uvedenej v 1.6.3.

1.6.3. Realizácia testu Pozri technické normy IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. ÚDAJE V rámci testu sa zaznamenáva testovacia teplota, atmosférický tlak, množstvo testovanej vzorky a časové oneskorenie po moment, keď dôjde k vznieteniu.

3. SPRÁVA Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi),

množstvo použitej vzorky, atmosférický tlak,

použitý prístroj,

výsledky meraní (skúšobné teploty, výsledky týkajúce sa vznietenia, zodpovedajúce časy oneskorenia),

všetky doplnkové poznámky a pripomienky dôležité pre interpretáciu výsledkov.

4. ODKAZY Žiadne.

A.16. RELATÍVNA TEPLOTA SAMOVZNIETENIA PRE TUHÉ LÁTKY

A.16.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Výbušné látky a látky, ktoré sa vznecujú spontánne v kontakte so vzduchom pri teplote okolitého prostredia, by sa nemali testovať touto metódou. Účelom tohto testu je poskytnúť predbežné informácie o samozápalnosti tuhých látok pri zvýšených teplotách. Ak sa teplo vyvinuté buď reakciou látky s kyslíkom, alebo exotermickým rozkladom nerozptýli dostatočne rýchlo do okolitého priestoru, dochádza k samozahriatiu, ktoré má za následok samovznietenie. K samovznieteniu preto dochádza vtedy, keď rýchlosť tvorby tepla presiahne rýchlosť straty tepla. Testovací postup má význam ako predbežný skríningový test pre tuhé látky. Z hľadiska komplexného charakteru vznietenia a horenia tuhých látok by sa teplota samovznietenia stanovená podľa tejto metódy mala použiť iba na účely porovnania.

1.2. POJMY A JEDNOTKY Teplota samovznietenia získaná touto metódou predstavuje minimálnu teplotu okolitého prostredia vyjadrenú v oC, pri ktorej sa za definovaných podmienok vznieti určitý objem látky.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.4. PRINCÍP METÓDY Určitý objem látky určenej na testovanie sa umiestni do piecky pri teplote miestnosti; zaznamená sa krivka teploty a času, vzťahujúca sa na podmienky v strede testovanej vzorky, pričom teplota piecky sa pri rýchlosti ohrevu 0,5 oC za minútu zvýši na 400 oC, alebo na teplotu topenia, ak je táto nižšia. Na účely tohto testu sa teplota piecky, pri ktorej teplota testovanej vzorky dosiahne 400 oC samozahriatím, nazýva teplotou samovznietenia.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Žiadne.

1.6. OPIS METÓDY

1.6.

1.6.1. Prístroje

1.6.1.

1.6.1.1. Piecka Laboratórna piecka s programovateľnou teplotou (s objemom približne 2 litre), vybavená prirodzenou cirkuláciou vzduchu a dekompresným mechanizmom na tlmenie účinkov výbuchu. Aby sa zabránilo potenciálnemu nebezpečiu výbuchu, musí sa dávať pozor, aby sa rozkladové plyny nedostali do kontaktu s prvkami elektrického vyhrievania.

1.6.1.2. Kocka z drôtenej siete Podľa šablóny zobrazenej na obrázku 1 treba vystrihnúť kúsok drôtenej siete s otvormi 0,045 mm, vyrobenej z nehrdzavejúcej ocele. Potom treba sieť poskladať do tvaru kocky s otvorenou vrchnou stranou a zaistiť drôtom.

1.6.1.3. Tepelné články (termočlánky) Vhodné tepelné články (termočlánky).

1.6.1.4. Registračný prístroj Ľubovoľný dvojkanálový registračný prístroj kalibrovaný od 0 oC do 600 oC alebo na zodpovedajúce napätie.

1.6.2. Podmienky skúšania Látky sa testujú v takom stave, v akom boli získané.

1.6.3. Realizácia testu Kocka sa naplní testovanou látkou a táto sa jemne utlačí, potom sa pridá viac testovanej látky, táto sa znova jemne utlačí a postup sa opakuje až dovtedy, kým kocka nie je úplne naplnená. Kocka sa potom zavesí do stredu piecky pri teplote miestnosti. Jeden termočlánok sa umiestni do stredu kocky a druhý medzi kocku a stenu piecky, aby zaznamenával teplotu piecky. Počas zvyšovania teploty piecky rýchlosťou 0,5 oC za minútu na 400 oC alebo na teplotu topenia, ak je táto nižšia, sa plynulo zaznamenáva teplota piecky a teplota testovanej vzorky. Keď sa testovaná látka vznieti (zapáli), termočlánok vzorky ukáže veľmi silný nárast teploty nad teplotu piecky.

2. ÚDAJE Teplota piecky, pri ktorej teplota testovanej vzorky dosiahne hodnotu 400 oC samozahriatím, je dôležitá pre vyhodnotenie (obrázok 2).

3. SPRÁVA Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

opis testovanej látky,

výsledky merania vrátane krivky teploty/času,

všetky doplnkové poznámky dôležité pre interpretáciu výsledkov.

4. ODKAZY NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

4.

Obrázok 1 Schéma 20 mm testovanej kocky

Obrázok 2 Typická krivka teploty/času

teplota vzorky teplota piecky teplota vznietenia čas

A.17. OXIDAČNÉ VLASTNOSTI (TUHÉ LÁTKY)

A.17.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Odporúča sa získať predbežné informácie o všetkých potenciálne výbušných vlastnostiach látky ešte pred uskutočnením testu. Tento test sa nedá použiť pre kvapaliny, plyny, výbušné ani mimoriadne horľavé látky, ani pre organické peroxidy. Tento test sa nemusí uskutočniť, ak preskúmanie štrukturálneho vzorca potvrdí domnienku, že príslušná látka nie je schopná exotermickej reakcie s horľavým materiálom. Aby sa zistilo, či sa test musí uskutočniť so zvláštnymi bezpečnostnými opatreniami, treba vykonať predbežný test.

1.2. POJEM A JEDNOTKY Čas horenia: čas reakcie vyjadrený v sekundách, potrebný na to, aby reakčná zóna prešla celou hranicou vytvorenou z testovanej látky pri dodržaní postupu opísaného v 1.6. Rýchlosť horenia: vyjadrená v milimetroch za sekundu. Maximálna rýchlosť horenia: najvyššia hodnota rýchlostí horenia získaná so zmesami obsahujúcimi 10 až 90 hmotnostných percent oxidantu.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Pre potreby hlavného aj predbežného testu sa ako referenčná látka používa dusičnan bárnatý. Referenčnou zmesou je tá zmes dusičnanu bárnatého s práškovou celulózou, pripravená podľa 1.6, ktorá dosiahla najvyššiu rýchlosť horenia (zvyčajne je to zmes obsahujúca 60 hmotnostných percent dusičnanu bárnatého).

1.4. PRINCÍP METÓDY V záujme bezpečnosti sa uskutočňuje predbežný test. Ak tento test jasne ukáže, že testovaná látka má oxidačné vlastnosti, nie je potrebné uskutočniť žiadne ďalšie testy. Ak to však nie je tak, látku treba podrobiť kompletnému testu. V rámci kompletného testu sa látka určená na testovanie zmieša s definovanou horľavinou v rozličných pomeroch. Každá zmes sa potom sformuje do hranice, ktorá sa na jednom konci zapáli. Najvyššia stanovená, resp. zistená, rýchlosť horenia sa porovná s maximálnou rýchlosťou horenia referenčnej zmesi.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Ak je to nutné, možno použiť akúkoľvek metódu drvenia, mletia alebo miešania za predpokladu, že rozdiel v maximálnej rýchlosti horenia v šiestich samostatných testoch sa nebude odchyľovať od aritmetickej strednej hodnoty o viac ako 10 %.

1.6. OPIS METÓDY

1.6.

1.6.1. Príprava

1.6.1.

1.6.1.1. Testovaná látka Veľkosť čiastočiek testovanej látky treba redukovať na < 0,125 mm použitím tohto postupu: testovaná látka sa preoseje, zvyšná časť (frakcia) sa pomelie a tento postup sa opakuje dovtedy, kým celé množstvo určené na testovanie neprepadlo cez sito. Použiť možno akúkoľvek metódu mletia a preosievania, ktorá zodpovedá kritériám kvality. Pred prípravou zmesi sa látka určená na testovanie suší pri teplote 105 oC dovtedy, kým sa nedosiahne konštantná hmotnosť. Ak je teplota rozkladu látky určenej na testovanie nižšia ako 105 oC, látka sa musí sušiť pri vhodnej nižšej teplote.

1.6.1.2. Horľavina Ako horľavina sa používa prášková celulóza. Celulóza musí byť takého typu, aký sa používa v prípade chromatografie tenkej vrstvy alebo stĺpcovej chromatografie. Ako najvhodnejší sa osvedčil typ s vyše 85 % podielom dĺžky vlákien medzi 0,020 mm a 0,075 mm. Celulózový prášok sa preoseje cez sito veľkosti 0,125 mm. Počas celého testu treba používať tú istú várku celulózy. Pred prípravou zmesi sa prášková celulóza suší pri teplote 105 oC dovtedy, kým sa nedosiahne konštantná teplota. Ak sa v predbežnom teste použije drevitá múčka, treba pripraviť drevitú múčku z mäkkého dreva použitím tej časti materiálu, ktorá sa preosiala cez otvory sita veľkosti 1,6 mm, potom treba múčku dôkladne premiešať, sušiť pri teplote 105 oC štyri hodiny v navrstvení maximálne do výšky 25 mm. Materiál treba ochladiť a uskladniť vo vzduchotesnom obale naplnenom do maximálnej možnej miery až do času použitia, podľa možnosti do 24 hodín od ukončenia procesu sušenia.

1.6.1.3. Zápalný zdroj Ako zápalný zdroj sa odporúča použiť plynový horák s horúcim plameňom (minimálny priemer 5 mm). V prípade, ak sa použije iný zápalný zdroj (napríklad pri testovaní v inertnej atmosfére), v správe sa musí uviesť jeho opis a zdôvodnenie jeho použitia.

1.6.2. Realizácia testu Poznámka: Zmesi oxidantov s celulózou alebo drevitou múčkou sa musia upravovať ako potenciálne výbušné látky a musí sa s nimi narábať s patričnou opatrnosťou.

1.6.2.

1.6.2.1. Predbežný test Vysušená látka sa dôkladne premieša s vysušenou celulózou alebo drevitou múčkou v hmotnostnom pomere 2 dielov testovanej látky a 1 dielu celulózy alebo drevitej múčky, zmes sa potom sformuje do malej hranice kónického tvaru s rozmermi 3,5 cm (priemer základne) × 2,5 cm (výška) naplnením (nie utláčaním) formy kónického tvaru (napr. skleného laboratórneho lievika s upchatou stopkou). Hranica sa umiestni na chladnú, nehorľavú (ohňovzdornú), nepórovitú základovú platňu s nízkou tepelnou vodivosťou. Test sa musí uskutočniť v digestore, ako je to uvedené v 1.6.2.2. Zápalný zdroj sa kontaktne priloží ku kužeľu. Pozoruje sa a zaznamená prudkosť a trvanie výslednej reakcie. Testovanú látku treba považovať za oxidačnú, ak je reakcia prudká. V každom takom prípade, kde sú pochybnosti o dosiahnutom výsledku, je potrebné uskutočniť kompletný hlavný test podľa opisu uvedeného nižšie.

1.6.2.2. Hlavný test Pripravia sa zmesi oxidantu a celulózy obsahujúce 10 až 90 hmotnostných percent oxidantu v 10 % prírastkoch. Pre hraničné prípady treba použiť zmesi s rovnakým hmotnostným podielom oxidantu a celulózy, aby sa dosiahla presnejšia hodnota maximálnej rýchlosti horenia. Hranica sa vytvorí pomocou formy. Forma je vyrobená z kovu, má dĺžku 250 mm a trojuholníkovitý prierez s vnútornou výškou 10 mm a vnútornou šírkou 20 mm. Po obidvoch stranách formy sú v pozdĺžnom smere namontované kovové lišty, ktoré slúžia ako bočné ohraničenie a ktoré prečnievajú 2 mm ponad vrchný okraj trojuholníkovitého prierezu (pozrite obrázok). Žliabok s trojuholníkovitým prierezom sa zvoľna naplní mierne nad okraj testovanou zmesou. Forma sa potom zdvihne do výšky 2 cm a pustí sa, aby dopadla na tvrdý podklad, čím sa zmes utrasie. Prebytočná zmes sa zhrnie šikmo nakloneným plátkom. Odstránia sa bočné kovové lišty a zostávajúci prášok sa uhladí použitím valčeka. Na vrchnú stranu formy sa potom položí nehorľavá (ohňovzdorná), nepórovitá podkladová doska s nízkou tepelnou vodivosťou, prístroj sa obráti spodnou časťou navrch a forma sa odstráni. Hranica z práškovej zmesi sa umiestni do digestora priečne na smer prúdenia vzduchu. Rýchlosť prúdenia vzduchu musí byť dostatočná na to, aby sa zabránilo úniku spalín do ovzdušia laboratória, a počas testu by sa nemala meniť. Okolo prístroja by mala byť postavená protiprievanová zástena. Kvôli hygroskopickým vlastnostiam celulózy a niektorých látok určených na testovanie by sa testy mali uskutočniť čo možno najskôr po príprave. Dotykom plameňa sa zapáli jeden koniec hranice z práškovej zmesi. Po tom, čo sa zóna reakcie rozšírila na počiatočnú vzdialenosť v dĺžke 30 mm, treba odmerať čas reakcie na úseku ďalších 200 mm. Test sa uskutoční s referenčnou látkou a najmenej raz s každým stanoveným hmotnostným pomerom zmesi testovanej látky a celulózy. Ak sa zistí, že maximálna rýchlosť horenia je podstatne vyššia než v prípade referenčnej zmesi, test možno zastaviť. V ostatných prípadoch sa musí test opakovať päťkrát v prípade každej z troch zmesí, ktoré dosiahli najvyššiu rýchlosť horenia. Ak vzniklo podozrenie, že výsledok je klamlivo pozitívny, test sa musí zopakovať s použitím inertnej látky namiesto celulózy, ale s podobnou veľkosťou častíc, napríklad diatomitu. Alternatívne sa musí zmes testovanej látky s celulózou, ktorá dosiahla najvyššiu rýchlosť horenia, opakovane testovať v inertnej atmosfére (< 2 % v/v obsahu kyslíka).

2. ÚDAJE Z bezpečnostných dôvodov sa musí práve maximálna rýchlosť horenia – teda nie stredná hodnota – považovať za charakteristickú oxidačnú vlastnosť testovanej látky. Pre vyhodnotenie je dôležitá najvyššia hodnota rýchlosti horenia danej zmesi v rámci šiestich testov. Najvyššia hodnota rýchlosti horenia pre každú zmes oproti koncentrácii oxidantu sa nanesie na graf. Z grafu sa potom vyberie maximálna rýchlosť horenia. Šesť nameraných hodnôt rýchlosti horenia v rámci jedného skúšobného kola, získaných zo zmesi s maximálnou rýchlosťou horenia, sa nesmie odchyľovať od hodnoty aritmetického stredu o viac ako 10 %, lebo inak bude potrebné zdokonaliť metódy drvenia, mletia a miešania testovanej látky. Treba porovnať dosiahnutú maximálnu rýchlosť horenia s maximálnou rýchlosťou horenia referenčnej zmesi (pozri 1.3). Ak sa testy uskutočňujú v inertnej atmosfére, maximálna rýchlosť reakcie sa porovná s maximálnou rýchlosťou reakcie referenčnej zmesi v inertnej atmosfére.

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

identitu, zloženie, čistotu, obsah vlhkosti atď. testovanej látky,

všetky úpravy testovanej vzorky (napr. drvenie, mletie, sušenie),

druh zápalného zdroja použitého v teste,

výsledky meraní,

typ (formu) reakcie [napr. horenie plameňom na povrchu, horenie cez celú hmotu, všetky informácie týkajúce sa produktov (splodín) horenia (spalín) atď.],

všetky doplnkové poznámky a pripomienky dôležité pre interpretáciu výsledkov vrátane opisu prudkosti reakcie (horenie plameňom, iskrenie, pomalé tlenie atď.) a približnej doby trvania v predbežnom bezpečnostnom/skríningovom teste pre testovanú, ako aj pre referenčnú látku,

výsledky z testov s inertnou látkou, ak také existujú,

výsledky z testov uskutočnených v inertnej atmosfére, ak také existujú.

3.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Látku treba považovať za oxidačnú vtedy, keď: Aby sa predišlo nesprávnym pozitívnym výsledkom, pri interpretácii výsledkov sa musia zohľadniť aj výsledky získané pri testovaní látky zmiešanej s inertným materiálom a/alebo pri testovaní v inertnej atmosfére.

3.2. a)

v predbežnom skríningovom teste došlo k prudkej reakcii;

v hlavnom teste je maximálna rýchlosť horenia testovanej zmesi vyššia alebo sa rovná maximálnej rýchlosti horenia referenčnej zmesi celulózy a dusičnanu bárnatého.

4. ODKAZY NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

A.18. ČÍSELNÁ PRIEMERNÁ MOLEKULOVÁ HMOTNOSŤ A DISTRIBÚCIA MOLEKULOVÝCH HMOTNOSTÍ POLYMÉROV

A.18.

1. METÓDA Táto metóda, založená na gélovej permeačnej chromatografii, je prevzatá z OECD TG 118 (1996). Základné princípy a ďalšie technické informácie sú uvedené v odkaze (1).

1.

1.1. ÚVOD Vlastnosti polymérov sú veľmi rôznorodé, a nie je preto možné opísať jedinú metódu, ktorá by presne vymedzovala podmienky ich vzájomného oddeľovania a vyhodnocovania a ktorá by brala do úvahy všetky možnosti a špecifické situácie vyskytujúce sa pri separácii polymérov. Predovšetkým nie vždy sa dá pri komplexných polymérových systémoch použiť gélová permeačná chromatografia (GPC). Tam, kde nie je použitie GPC z praktického hľadiska možné, dajú sa molekulové hmotnosti stanoviť inými spôsobmi (pozri dodatok). V takýchto prípadoch je potrebné uviesť všetky podrobnosti a použitie konkrétnej metódy sa musí odôvodniť. Opisovaná metóda je založená na norme DIN 55672 (1). Podrobné informácie o vykonaní pokusu a spôsobe vyhodnotenia údajov možno nájsť v uvedenej norme. Všetky zmeny, ktoré treba v metóde urobiť, musia byť odôvodnené. Možno použiť aj iné normy, no treba pri tom uviesť plný odkaz. Pri opisovanej metóde sa na kalibráciu používajú vzorky polystyrénu so známou polydosperzitou a možno ju modifikovať tak, aby bola vhodná pre určité polyméry, napríklad pre polyméry rozpustné vo vode a pre vetvené polyméry s dlhými reťazcami.

1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY Číselná priemerná molekulová hmotnosť Mn a hmotnostná priemerná molekulová hmotnosť Mw sa stanovili pomocou týchto rovníc: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi kde: Hi je hladina signálu detektora od základnej čiary pre retenčný objem Vi Mi je molekulová hmotnosť polymérovej frakcie pri retenčnom objeme Vi a n je počet dátových bodov. Šírka distribúcie molekulových hmotností, ktorá je mierou disperzity systému, je daná pomerom Mw/Mn.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY GPC je relatívna metóda, a preto je pri nej potrebné uskutočniť kalibráciu. Bežne sa na tento účel používajú lineárne skonštruované polystyrénové štandardy so známymi molekulovými hmotnosťami Mn a Mw a s úzkou oblasťou distribúcie molekulových hmotností. Kalibračnú krivku možno použiť na stanovenie molekulovej hmotnosti neznámej vzorky iba vtedy, ak sa pri separácii štandardov aj neznámej vzorky použijú úplne rovnaké podmienky. Vzťahy stanovené medzi molekulovou hmotnosťou a elučným objemom sú platné iba pri špecifických podmienkach daného pokusu. Medzi tieto podmienky patria predovšetkým teplota, typ rozpúšťadla (alebo zmesi rozpúšťadiel), chromatografické podmienky a rozdeľovacia kolóna alebo systém kolón. Takto stanovené molekulové hmotnosti vzoriek predstavujú pomerné hodnoty a označujú sa ako molekulové hmotnosti polystyrénového ekvivalentu. Znamená to, že v závislosti od štrukturálnych a chemických rozdielov medzi vzorkou a štandardmi sa môžu molekulové hmotnosti do väčšej alebo menšej miery od svojich absolútnych hodnôt odlišovať. Prípadné použitie iných štandardov, napríklad polyetylénglykolu, polyetylénoxidu, polymetylmetakrylátu alebo kyseliny polyakrylovej, je potrebné odôvodniť.

1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Distribúciu molekulových hmotností vzorky aj priemerné molekulové hmotnosti (Mn, Mw) možno stanoviť pomocou metódy GPC. Metóda GPC predstavuje osobitný typ kvapalinovej chromatografie, pri ktorej dochádza k rozdeleniu vzorky na základe hydrodynamických objemov jej jednotlivých zložiek (2). K oddeľovaniu dochádza pri prechode vzorky cez kolónu, ktorá je naplnená poréznym materiálom, ktorým je zvyčajne organický gél. Malé molekuly cez póry prechádzajú, zatiaľ čo veľké molekuly sa z objemu gélu vylučujú. Dráha, ktorú prekonajú veľké molekuly, je preto kratšia a vylučujú sa ako prvé. Molekuly strednej veľkosti do niektorých pórov vnikajú a vylučujú sa z kolóny neskôr. Najmenšie molekuly s hydrodynamickým priemerom menším, ako je veľkosť pórov gélu, môžu vnikať do všetkých z nich a vylučujú sa ako posledné. V ideálnych podmienkach závisí oddeľovanie výlučne od veľkosti jednotlivých molekúl, hoci v praxi je ťažké vyhnúť sa aspoň určitému stupňu interferencie absorpčných vplyvov. Situácia sa môže zhoršiť aj v dôsledku nerovnomerného naliatia kolóny a mŕtvych objemov (2). Detekciu možno uskutočňovať napríklad pomocou merania indexu lomu alebo UV-absorpcie eluátov. Na základe takýchto údajov je možné zostrojiť jednoduchú distribučnú krivku. Aby však bolo možné prisúdiť bodom na distribučnej krivke molekulové hmotnosti, je potrebné kolónu najprv okalibrovať. Robí sa to tak, že na kolónu sa nanesú polyméry so známou molekulovou hmotnosťou, v ideálnom prípade aj s približne podobnou štruktúrou, napríklad rozličné polystyrénové štandardy. Zvyčajne sa získava gaussovská krivka, ktorá býva niekedy na strane nízkych molekulových hmotností mierne pretiahnutá. Zvislá os udáva hmotnostné množstvo jednotlivých typov molekúl vyplavených z kolóny, vodorovná os je vyjadrená ako dekadický logaritmus molekulovej hmotnosti.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Reprodukovateľnosť (relatívna štandardná odchýlka, RSD) elučného objemu by mala byť lepšia ako 0,3 %. Ak sa chromatogram vyhodnocuje nezávisle od času a ak nespĺňa horeuvedené kritérium, potom je potrebné zabezpečiť reprodukovateľnosť analýzy pomocou vnútorného štandardu (1). Polydisperzita závisí od molekulových hmotností štandardov. V prípade polystyrénových štandardov sú typické hodnoty takéto: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp je molekulová hmotnosť štandardu v maxime píku)

1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.6.

1.6.1. Príprava štandardných roztokov polystyrénu Polystyrénové štandardy sa opatrným miešaním rozpustia vo zvolenom elučnom činidle. Pri príprave roztokov sa treba riadiť odporúčaniami výrobcov. Voľba koncentrácií štandardov závisí od rozličných faktorov, napríklad od nanášacieho objemu, viskozity roztoku a citlivosti analytického detektora. Maximálny nanášací objem musí byť prispôsobený dĺžke kolóny, aby nedochádzalo k jej preťaženiu. Zvyčajné nanášacie objemy pri analytických separáciách pomocou GPC sa pri kolóne s rozmermi 30 cm × 7,8 mm pohybujú v rozmedzí 40 až 100 μl. Je možné použiť aj vyššie objemy, nemali by však presiahnuť 250 μl. Pred samotnou kalibráciou kolóny je potrebné určiť optimálny pomer medzi nanášacím objemom a koncentráciou nanášanej vzorky.

1.6.2. Príprava roztoku vzorky V zásade rovnaké požiadavky sa vzťahujú aj na prípravu roztokov vzoriek. Vzorka sa opatrným potriasaním rozpustí vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad v tetrahydrofuráne (THF). V žiadnom prípade ju nemožno rozpúšťať v ultrazvukovom kúpeli. V prípade potreby sa vzorka prečistí filtráciou cez membránový filter s veľkosťou pórov medzi 0,2 μm a 2 μm. V záverečnej správe sa treba zmieniť o prítomnosti nerozpustených tuhých častíc, ktoré môžu byť dôsledkom prítomnosti vysokých molekulových hmotností. Percentuálne zastúpenie hmotnosti rozpustených čiastočiek je potrebné určiť pomocou primeranej metódy. Roztoky sa musia použiť do 24 hodín.

1.6.3. Prístrojové vybavenie Treba zabezpečiť inertnosť systému GPC voči používaným rozpúšťadlám (napríklad použitím oceľových kapilár, ak je rozpúšťadlo THF).

nádrž na rozpúšťadlo,

zariadenie na odplynenie kvapalín (ak je potrebné),

čerpadlo,

tlmič pulzov kvapaliny (ak je potrebný),

nanášací systém,

chromatografické kolóny,

detektor,

prietokomer (ak je potrebný),

zariadenie na zaznamenávanie a spracúvanie údajov,

nádoba na odpad.

1.6.4. Nanášací systém a systém na privádzanie rozpúšťadla Buď pomocou automatického nanášacieho zariadenia, alebo ručne sa na kolónu nanesie v ostro vymedzenej zóne presne definované množstvo roztoku vzorky. Príliš rýchle vytiahnutie striekačky alebo stlačenie jej piestu pri ručnom nanášaní vzorky môže spôsobiť zmeny v pozorovanej distribúcii molekulových hmotností. Systém na privádzanie rozpúšťadla by nemal spôsobovať pulzové vlny, čo možno v ideálnom prípad zabezpečiť zaradením tlmiča pulzov. Prietok sa pohybuje okolo hodnoty 1 ml/min.

1.6.5. Kolóna V závislosti od vzorky možno polymér charakterizovať buď pomocou jedinej kolóny, alebo pomocou viacerých za sebou spojených kolón. Ako náplň kolóny je komerčne dostupných viacero poréznych materiálov s definovanými vlastnosťami (napríklad veľkosť pórov, limit vylučovania). Voľba separačného gélu a dĺžky kolóny závisí od vlastností vzorky (hydrodynamické objemy, distribúcia molekulových hmotností) aj od špecifických podmienok pri separácii, napríklad od typu rozpúšťadla, teploty a rýchlosti prietoku (1) (2) (3).

1.6.6. Teoretické poschodia kolóny Kolóna alebo kombinácia viacerých kolón používaných pri separácii musí byť charakterizovaná počtom teoretických poschodí. V prípade THF ako rozpúšťadla sa to robí tak, že na kolónu so známou dĺžkou sa nanesie roztok etylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Počet teoretických poschodí udáva táto rovnica: N=5,54VeW1/22 alebo N=16VeW2 kde: N počet teoretických poschodí Ve elučný objem v maxime píku W šírka píku pri základnej čiare W1/2 šírka píku v polovici jeho výšky

1.6.7. Účinnosť separácie Okrem počtu teoretických poschodí, ktorý určuje šírku pásu, hrá pri separácii úlohu aj jej účinnosť, ktorá sa určuje na základe strmosti kalibračnej krivky. Účinnosť separácie kolóny možno získať z tohto vzťahu: Ve,Mx-Ve,(10Mx)veľkosť plochy prierezu kolóny ≥ 6,0 cm3cm2 kde: Ve, Mx elučný objem polystyrénu s molekulovou hmotnosťou Mx Ve,(10.Mx) elučný objem polystyrénu s desaťnásobne väčšou molekulovou hmotnosťou. Rozlíšiteľnosť systému sa zvyčajne definuje takto: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 kde: Ve1, Ve2 elučné objemy dvoch polystyrénových štandardov v maxime píku W1, W2 šírky píkov pri základnej čiare M1, M2 molekulové hmotnosti v maxime píku (mali by sa líšiť o faktor 10) R-hodnota kolóny musí byť vyššia ako 1.7 (4).

1.6.8. Rozpúšťadlá Všetky rozpúšťadlá musia mať vysoký stupeň čistoty (pri THF je stupeň čistoty 99,5 %). Zásobník na rozpúšťadlo (v prípade potreby s atmosférou inertného plynu) musí byť dostatočne veľký, aby umožnil kalibráciu kolóny a analýzu niekoľkých vzoriek. Pred vháňaním do kolóny pomocou čerpadla treba rozpúšťadlo zbaviť plynov.

1.6.9. Kontrola teploty Teplota kritických vnútorných zložiek systému (nanášacia slučka, detektor a hadičky) musí byť stála a musí zodpovedať zvolenému rozpúšťadlu.

1.6.10. Detektor Účelom detektora je kvantitatívne zaznamenávanie koncentrácie vzorky, ktorá sa eluuje z kolóny. V záujme eliminácie zbytočného rozširovania píku by mala mať kyveta meracej komôrky detektora čo možno najmenší objem. S výnimkou detektorov založených na rozptyle svetla a viskozitných detektorov by nemal tento objem presahovať 10 μl. Ako detekčná metóda sa zvyčajne používa diferenciálna refraktometria. V závislosti od osobitných požiadaviek vzorky alebo elučného činidla však možno použiť aj iné typy detektorov, napríklad UV/VIS, IR, viskozitný detektor atď.

2. ÚDAJE A PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY

2.

2.1. ÚDAJE Podrobné vyhodnocovacie kritériá a požiadavky vzťahujúce sa na zber a spracúvanie údajov sú uvedené v norme DIN (1). Pri každej vzorke je potrebné uskutočniť dva nezávislé pokusy. Každý z nich treba analyzovať osobitne. Pri každom meraní treba udať Mn, Mw, Mw/Mn a Mp. Treba výslovne uviesť, že namerané hodnoty sú pomerné hodnoty ekvivalentné použitým štandardom. Po stanovení retenčných objemov alebo retenčných časov (podľa možnosti korigovaných použitím vnútorného štandardu) sa voči jednej z týchto hodnôt nanášajú do grafu hodnoty log Mp (Mp je maximum píku kalibračného štandardu). Na každú dekádu molekulových hmotností treba použiť aspoň dva kalibračné body, na zostrojenie celej kalibračnej krivky, ktorá by mala pokrývať odhadnutú molekulovú hmotnosť vzorky, je potrebných aspoň päť bodov. Koncový bod kalibračnej krivky v oblasti nízkych molekulových hmotností sa definuje pomocou n-hexylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Číselné priemerné a hmotnostné priemerné molekulové hmotnosti sa vo všeobecnosti stanovujú pomocou elektronického spracúvania údajov, založeného na vzorcoch uvedených v časti 1.2. V prípade manuálnej digitalizácie sa možno riadiť dokumentom ASTM D 3536-91 (3). V prípade zadržania každého nerozpustného polyméru v kolóne je vysoko pravdepodobné, že jeho molekulová hmotnosť je vyššia ako molekulová hmotnosť rozpustnej frakcie. Výsledkom nevzatia tejto skutočnosti do úvahy môže byť nadhodnotenie zastúpenia zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou. Návod na uskutočnenie korekcie obsahu zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou na nerozpustný polymér je uvedený v dodatku.

2.2. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu musí obsahovať tieto informácie:

2.2.

2.2.1. Testovaná látka:

dostupné informácie o testovanej látke (totožnosť, prísady, nečistoty/prímesi),

postup spracovania vzorky, zistené skutočnosti, problémy.

2.2.2. Prístroje a zariadenia:

zásobník na elučné činidlo, inertný plyn, zariadenie na odplynenie elučného činidla,

zloženie elučného činidla, nečistoty/prímesi,

čerpadlo, tlmič pulzov kvapaliny, nanášací systém, rozdeľovacie kolóny (výrobca, všetky informácie o charakteristikách kolón, ako sú veľkosť pórov, druh separačného materiálu atď., počet, dĺžka a usporiadanie použitých kolón),

počet teoretických poschodí kolóny (alebo kombinácie kolón), účinnosť rozdeľovania (rozlišovacia schopnosť systému),

informácie o symetrii píkov,

teploty kolóny, spôsob kontroly teploty,

detektor (princíp merania, typ, objem meracej kyvety),

prietokomer, ak sa používa (výrobca, princíp merania),

systém na zaznamenávanie a spracúvanie údajov (hardvér a softvér).

2.2.3. Kalibrácia systému:

podrobný opis metódy použitej na zostrojenie kalibračnej krivky,

informácie o kritériách kvality tejto metódy (napríklad korelačný koeficient, odchýlka súčtu štvorcov atď.),

informácie o všetkých extrapoláciách, predpokladoch a aproximáciách, ktoré sa uskutočnili počas priebehu pokusu, a o vyhodnocovaní a spracúvaní údajov,

všetky merania, ktoré boli použité na zostrojenie kalibračnej krivky musia byť zdokumentované v tabuľke, ktorá obsahuje pre každý bod merania tieto informácie:

názov vzorky,

výrobcu vzorky,

charakteristické hodnoty štandardov, t. j. Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, tak ako ich uvádza výrobca alebo ako boli odvodené z následných meraní, a tiež podrobnosti o metóde stanovenia,

nanášací objem a koncentráciu nanesenej vzorky,

hodnotu Mp, ktorá bola použitá na kalibráciu,

elučný objem alebo opravený retenčný čas, nameraný pri maxime píku,

Mp vypočítaná v maxime píku,

percentuálna odchýlka vypočítanej hodnoty Mp od kalibračnej krivky.

2.2.4. Vyhodnotenie:

vyhodnotenie na základe času: metódy použité na zabezpečenie požadovanej reprodukovateľnosti (korekčná metóda, vnútorné štandardy atď.),

informácia o tom, či bolo vyhodnotenie vykonané na základe elučného objemu alebo retenčného času,

informácie o limitoch vyhodnocovania, ak nebola vykonaná úplná analýza píku,

opis vyrovnávacej/prekladacej metódy, ak sa pri grafickom vyhodnocovaní použila,

príprava a predbežné spracovanie vzorky,

prítomnosť nerozpustených čiastočiek, ak boli pozorované,

objem (μl) a koncentrácia (mg/ml) nanesenej vzorky,

opis vplyvov, ktoré mohli spôsobiť odchýlku od ideálneho GPC profilu,

podrobný opis modifikácií uskutočnených v testovacej metóde,

podrobnosti o rozsahu chýb merania,

všetky iné informácie a pozorované skutočnosti, ktoré by mohli byť významné z hľadiska interpretácie výsledkov.

3.(1)(2)(3)(4)

ODKAZY DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil I. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography; J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High-Performance Size- Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.19. OBSAH ZLOŽIEK S NÍZKOU MOLEKULOVOU HMOTNOSŤOU V POLYMÉROCH

A.19.

1. METÓDA Táto metóda, založená na gélovej permeačnej chromatografii, je prevzatá z OECD TG 119 (1996). Základné princípy a ďalšie technické informácie sú uvedené v literárnych odkazoch.

1.

1.1. ÚVOD Vlastnosti polymérov sú veľmi rôznorodé, a nie je preto možné opísať jedinú metódu, ktorá by presne vymedzovala podmienky ich separácie a vyhodnocovania a ktorá by brala do úvahy všetky možnosti a špecifické situácie vyskytujúce sa pri separácii polymérov. Predovšetkým nie vždy možno pri komplexných polymérových systémoch použiť gélovú permeačnú chromatografiu (GPC). Tam, kde nie je použitie GPC z praktického hľadiska možné, dajú sa molekulové hmotnosti stanoviť inými spôsobmi (pozri dodatok). V takýchto prípadoch je potrebné uviesť všetky podrobnosti a použitie konkrétnej metódy treba odôvodniť. Opisovaná metóda je založená na norme DIN 55672 (1). Podrobné informácie o vykonaní pokusu a spôsobe vyhodnotenia údajov možno nájsť v uvedenej norme. Všetky zmeny, ktoré treba v metóde urobiť, musia byť odôvodnené. Možno použiť aj iné normy, no treba pri tom uviesť plný literárny odkaz. Pri opisovanej metóde sa na kalibráciu používajú vzorky polystyrénu so známou polydisperzitou a možno ju modifikovať tak, aby bola vhodná pre určité polyméry, napríklad pre polyméry rozpustné vo vode a vetvené polyméry s dlhými reťazcami.

1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY Nízka molekulová hmotnosť je arbitrárne definovaná ako molekulová hmotnosť nižšia ako 1000 daltonov. Číselná priemerná molekulová hmotnosť Mn a hmotnostná priemerná molekulová hmotnosť Mw sa stanovili pomocou týchto rovníc: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi kde: Hi hladina signálu detektora od základnej čiary retenčného objemu Vi, Mi molekulová hmotnosť polymérovej frakcie pri retenčnom objeme Vi a n je počet dátových bodov Šírka distribúcie molekulových hmotností, ktorá predstavuje mieru disperzity systému, je daná pomerom Mw/Mn.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY GPC je relatívna metóda, a preto je potrebné uskutočniť kalibráciu. Bežne sa na tento účel používajú lineárne konštruované polystyrénové štandardy so známymi molekulovými hmotnosťami Mn a Mw a s úzkou oblasťou distribúcie. Kalibračnú krivku možno použiť na stanovenie molekulovej hmotnosti neznámej vzorky iba vtedy, ak sa pri separácii štandardov aj neznámej vzorky použijú úplne rovnaké podmienky. Vzťahy stanovené medzi molekulovou hmotnosťou a elučným objemom sú platné iba pri špecifických podmienkach daného pokusu. Medzi tieto podmienky patrí predovšetkým teplota, typ rozpúšťadla (alebo zmesi rozpúšťadiel), chromatografické podmienky a rozdeľovacia kolóna alebo systém kolón. Takto stanovené molekulové hmotnosti vzoriek predstavujú pomerné hodnoty a označujú sa ako molekulové hmotnosti polystyrénového ekvivalentu. Znamená to, že v závislosti od štrukturálnych a chemických rozdielov medzi vzorkou a štandardmi sa môžu molekulové hmotnosti do väčšej alebo menšej miery od svojich absolútnych hodnôt odlišovať. Prípadné použitie iných štandardov, napríklad polyetylénglykolu, polyetylénoxidu, polymetylmetakrylátu alebo kyseliny polyakrylovej, je potrebné odôvodniť.

1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Distribúciu molekulových hmotností vzorky aj priemerné molekulové hmotnosti (Mn, Mw) možno stanoviť pomocou metódy GPC. Metóda GPC predstavuje osobitný typ kvapalinovej chromatografie, pri ktorej dochádza k rozdeleniu vzorky na základe hydrodynamických objemov jej jednotlivých zložiek (2). K oddeľovaniu dochádza pri prechode vzorky cez kolónu, ktorá je naplnená poréznym materiálom, ktorým je zvyčajne organický gél. Malé molekuly cez póry prechádzajú, zatiaľ čo veľké molekuly sa z objemu gélu vylučujú. Dráha, ktorú prekonajú veľké molekuly, je preto kratšia a tieto sa vylučujú ako prvé. Molekuly strednej veľkosti do niektorých pórov vnikajú a vylučujú sa z kolóny neskôr. Najmenšie molekuly s hydrodynamickým priemerom menším, ako je veľkosť pórov gélu, môžu vnikať do všetkých z nich a vylučujú sa ako posledné. V ideálnych podmienkach závisí oddeľovanie výlučne od veľkosti jednotlivých molekúl, no v praxi býva ťažké vyhnúť sa aspoň určitej interferencii absorpčných vplyvov. Situácia sa môže zhoršiť aj v dôsledku nerovnomerného naliatia kolóny a mŕtvych objemov (2). Detekciu možno uskutočňovať napríklad pomocou merania indexu lomu alebo UV-absorpcie eluátov. Na základe takýchto údajov je možné zostrojiť jednoduchú distribučnú krivku. Molekulové hmotnosti možno bodom na distribučnej krivke prisúdiť iba po predchádzajúcom okalibrovaní kolóny. Robí sa to tak, že na kolónu sa nanesú polyméry so známou molekulovou hmotnosťou, v ideálnom prípade aj s približne podobnou štruktúrou, napríklad rozličné polystyrénové štandardy. Zvyčajne sa získava gaussovská krivka, ktorá býva niekedy na strane nízkych molekulových hmotností mierne pretiahnutá. Zvislá os udáva hmotnostné množstvo jednotlivých typov molekúl vyplavených z kolóny, vodorovná os je vyjadrená ako dekadický logaritmus molekulovej hmotnosti. Obsah zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou sa odvádza z tejto krivky. Výpočet môže byť presný iba vtedy, ak zložky s nízkou molekulovou hmotnosťou ekvivalentne na hmotnostnom základe zodpovedajú polyméru ako celku.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Reprodukovateľnosť (relatívna štandardná odchýlka, RSD) elučného objemu by mala byť lepšia ako 0,3 %. Ak sa chromatogram vyhodnocuje nezávisle od času a ak nespĺňa vyššie uvedené kritérium, potom je potrebné zabezpečiť reprodukovateľnosť analýzy pomocou vnútorného štandardu (1). Polydisperzita závisí od molekulových hmotností štandardov. V prípade polystyrénových štandardov sú typické tieto hodnoty: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp je molekulová hmotnosť štandardu v maxime píku)

1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.6.

1.6.1. Príprava štandardných roztokov polystyrénu Polystyrénové štandardy sa rozpustia opatrným miešaním vo zvolenom elučnom činidle. Pri príprave roztokov sa treba riadiť odporúčaniami výrobcov. Voľba koncentrácií štandardov závisí od rozličných faktorov, napríklad od nanášacieho objemu, viskozity roztoku a citlivosti analytického detektora. Maximálny nanášací objem sa musí prispôsobiť dĺžke kolóny, aby nedochádzalo k jej preťaženiu. Zvyčajné nanášacie objemy pri analytických separáciách pomocou GPC sa pri kolóne s rozmerom 30 cm × 7,8 mm pohybujú v rozmedzí 40 μl až 100 μl. Je možné použiť aj vyššie objemy, nemali by však presiahnuť 250 μl. Pred samotnou kalibráciou kolóny je potrebné určiť optimálny pomer medzi nanášacím objemom a koncentráciou nanášanej vzorky.

1.6.2. Príprava roztoku vzorky V zásade rovnaké požiadavky sa vzťahujú aj na prípravu roztokov vzoriek. Vzorka sa opatrným potriasaním rozpustí vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad v tetrahydrofuráne (THF). V žiadnom prípade ju nemožno rozpúšťať v ultrazvukovom kúpeli. V prípade potreby sa vzorka prečistí filtráciou cez membránový filter s veľkosťou pórov medzi 0,2 μm a 2 μm. V záverečnej správe je potrebné zmieniť sa o prítomnosti nerozpustených tuhých častíc, ktoré môžu byť dôsledkom prítomnosti vysokých molekulových hmotností. Percentuálne zastúpenie hmotnosti rozpustených čiastočiek je potrebné určiť pomocou primeranej metódy. Roztoky sa musia použiť do 24 hodín.

1.6.3. Korekcia na obsah nečistôt a prímesí Zvyčajne je potrebné vykonať korekciu na obsah molekúl s molekulovou hmotnosťou M < 1000, ktorými prispievajú zložky nepolymérovej povahy (napríklad nečistoty, resp. prímesi). Korekciu netreba vykonať v prípade, ak je ich nameraný obsah nižší ako 1 %. Na tento účel možno analyzovať priamo roztok polyméru alebo GPC eluát. V prípadoch, v ktorých je eluát po prechode cez kolónu na vykonanie ďalšej analýzy príliš zriedený, treba ho koncentrovať. Môže byť potrebné eluát odpariť dosucha a opätovne rozpustiť. Koncentrovanie eluátu treba vykonať za takých podmienok, ktoré zaručia, že v ňom neprebehnú žiadne zmeny. Spracovanie eluátu po GPC závisí od analytickej metódy, ktorá sa použije na kvantitatívne stanovenie.

1.6.4. Prístrojové vybavenie Prístrojové vybavenie GPC zahŕňa tieto zložky: Treba zabezpečiť inertnosť systému GPC voči používaným rozpúšťadlám (napríklad použitím oceľových kapilár, ak je rozpúšťadlo THF).

nádrž na rozpúšťadlo,

zariadenie na odplyňovanie kvapalín (ak je potrebné),

čerpadlo,

tlmič pulzov kvapaliny (ak je potrebný),

nanášací systém,

chromatografické kolóny,

detektor,

prietokomer (ak je potrebný),

zariadenie na zaznamenávanie a spracúvanie údajov,

nádoba na odpad.

1.6.5. Nanášací systém a systém na privádzanie rozpúšťadla Buď pomocou automatického nanášacieho zariadenia, alebo ručne sa na kolónu nanesie v ostro vymedzenej zóne definované množstvo roztoku vzorky. Príliš rýchle vytiahnutie striekačky alebo stlačenie jej piestu pri ručnom nanášaní vzorky môže spôsobiť zmeny v pozorovanej distribúcii molekulových hmotností. Systém na privádzanie rozpúšťadla by nemal spôsobovať pulzové vlny, čo možno v ideálnom prípade zabezpečiť zaradením tlmiča pulzov. Rýchlosť prietoku sa pohybuje okolo hodnoty 1 ml/min.

1.6.6. Kolóna V závislosti od vzorky možno polymér charakterizovať buď pomocou jedinej kolóny, alebo pomocou viacerých za sebou spojených kolón. Ako náplň kolóny je komerčne dostupných viacero poréznych materiálov s definovanými vlastnosťami (napríklad veľkosť pórov, limit vylučovania). Voľba separačného gélu a dĺžky kolóny závisí od vlastností vzorky (hydrodynamické objemy, distribúcia molekulových hmotností) aj od špecifických podmienok pri separácii, napríklad od typu rozpúšťadla, teploty a rýchlosti prietoku (1) (2) (3).

1.6.7. Teoretické poschodia kolóny Kolóna alebo kombinácia viacerých kolón používaných pri separácii musí byť charakterizovaná počtom teoretických poschodí. V prípade THF ako rozpúšťadla sa to robí tak, že na kolónu so známou dĺžkou sa nanesie roztok etylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Počet teoretických poschodí udáva táto rovnica: N=5,54VeW1/22 alebo N=16VeW2 kde: N počet teoretických poschodí Ve elučný objem v maxime píku W šírka píku pri základnej čiare W1/2 šírka píku v polovici jeho výšky

1.6.8. Účinnosť separácie Okrem počtu teoretických poschodí, ktorý určuje šírku pásu, hrá pri separácii úlohu aj jej účinnosť, ktorá sa určuje na základe strmosti kalibračnej krivky. Účinnosť separácie kolóny možno získať z tohto vzťahu: Ve,Mx-Ve,(10Mx)veľkosť plochy prierezu kolóny≥6,0cm3cm2 kde: Ve, Mx elučný objem polystyrénu s molekulovou hmotnosťou Mx Ve,(10.Mx) elučný objem polystyrénu s desaťnásobne väčšou molekulovou hmotnosťou Rozlíšiteľnosť systému sa zvyčajne definuje takto: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 kde: Ve1, Ve2 elučné objemy dvoch polystyrénových štandardov v maxime píku W1, W2 šírky píkov pri základnej čiare M1, M2 molekulové hmotnosti v maxime píku (mali by sa líšiť o faktor 10). R-hodnota kolóny musí byť vyššia ako 1,7 (4).

1.6.9. Rozpúšťadlá Všetky rozpúšťadlá musia mať vysoký stupeň čistoty (pri THF je stupeň čistoty 99,5 %). Zásobník na rozpúšťadlo (v prípade potreby s atmosférou inertného plynu) musí byť dostatočne veľký na to, aby umožnil kalibráciu kolóny a analýzu niekoľkých vzoriek. Pred vháňaním do kolóny treba elučné činidlo zbaviť plynov pomocou čerpadla.

1.6.10. Kontrola teploty Teplota kritických vnútorných zložiek systému (nanášacia slučka, detektor a hadičky) musí byť stála a musí zodpovedať zvolenému rozpúšťadlu.

1.6.11. Detektor Účelom detektora je kvantitatívne zaznamenávanie koncentrácie vzorky eluovanej z kolóny. V záujme eliminácie zbytočného rozširovania píku by mala mať kyveta meracej komôrky detektora čo možno najmenší objem. S výnimkou detektorov založených na rozptyle svetla a viskozitných detektorov by nemal presahovať 10 μl. Ako detekčná metóda sa zvyčajne používa diferenciálna refraktometria. Možno použiť aj iné typy detektorov (napríklad UV/VIS, IR, viskozitný detektor atď.), ak si to vyžaduje osobitný charakter vzorky alebo elučného činidla.

2. ÚDAJE A PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY

2.

2.1. ÚDAJE Podrobné vyhodnocovacie kritériá a požiadavky vzťahujúce sa na zber a spracúvanie údajov sú uvedené v norme DIN (1). Pri každej vzorke je potrebné uskutočniť dva nezávislé pokusy. Každý z nich treba analyzovať osobitne. Pri každom meraní treba udať Mn, Mw, Mw/Mn a Mp. Treba výslovne uviesť, že namerané hodnoty sú pomerné hodnoty, ekvivalentné použitým štandardom. Po stanovení retenčných objemov alebo retenčných časov (podľa možnosti korigovaných použitím vnútorného štandardu) sa voči jednej z týchto hodnôt nanášajú do grafu hodnoty log Mp (Mp je maximum píku kalibračného štandardu). Na každú dekádu molekulových hmotností treba použiť aspoň dva kalibračné body, na zostrojenie celej kalibračnej krivky, ktorá by mala pokrývať odhadnutú molekulovú hmotnosť vzorky, je potrebných aspoň päť bodov. Koncový bod kalibračnej krivky v oblasti nízkych molekulových hmotností sa definuje pomocou n-hexylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Pri stanovení sa časť krivky zodpovedajúcej molekulovým hmotnostiam nižším ako 1000 podľa potreby koriguje na nečistoty a prísady. Nanášacie krivky sa zvyčajne hodnotia pomocou elektronického spracovania údajov. V prípade manuálnej digitalizácie sa možno riadiť dokumentom ASTM D 3536-91 (3). V prípade zadržania každého nerozpustného polyméru v kolóne je vysoko pravdepodobné, že jeho molekulová hmotnosť je vyššia ako molekulová hmotnosť rozpustnej frakcie. Výsledkom nevzatia tejto skutočnosti do úvahy môže byť nadhodnotenie zastúpenia zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou. Návod na uskutočnenie korekcie obsahu zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou na nerozpustný polymér je uvedený v dodatku. Distribučná krivka sa musí znázorniť vo forme tabuľky alebo graficky (diferenciálna frekvencia alebo kumulatívna frekvencia v percentách proti log M). V grafickom znázornení by mal mať jeden poriadok molekulovej hmotnosti dĺžku 4 cm a výška maxima píku by mala byť asi 8 cm. Pri integrálnych distribučných krivkách by mala byť vzdialenosť medzi 0 % a 100 % na osi y približne 10 cm.

2.2. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu musí obsahovať tieto informácie:

2.2.

2.2.1. Testovaná látka:

dostupné informácie o testovanej látke (totožnosť, prísady, nečistoty/prímesi),

opis spracovania vzorky, zistené skutočnosti, problémy.

2.2.2. Prístroje a zariadenia:

zásobník na elučné činidlo, inertný plyn, odplynenie elučného činidla, zloženie elučného činidla, nečistoty/prímesi,

čerpadlo, tlmič pulzov kvapaliny, nanášací systém,

rozdeľovacie kolóny (výrobca, všetky informácie o charakteristikách kolón, ako napríklad veľkosť pórov, druh separačného materiálu atď., počet, dĺžka a usporiadanie použitých kolón),

počet teoretických poschodí kolóny (alebo kombinácie kolón), účinnosť rozdeľovania (rozlišovacia schopnosť systému),

informácie o symetrii píkov,

teplota kolóny, spôsob kontroly teploty,

detektor (princíp merania, typ, objem kyvety),

prietokomer, ak sa používa (výrobca, princíp merania),

systém na zaznamenávanie a spracúvanie údajov (hardvér a softvér).

2.2.3. Kalibrácia systému:

podrobný opis metódy použitej na zostrojenie kalibračnej krivky,

informácie o kritériách kvality tejto metódy (napríklad korelačný koeficient, odchýlka súčtu štvorcov atď.),

informácie o všetkých extrapoláciách, predpokladoch a aproximáciách, ktoré sa uskutočnili počas priebehu pokusu a o vyhodnocovaní a spracúvaní údajov,

všetky merania, ktoré boli použité na zostrojenie kalibračnej krivky, musia byť

zdokumentované v tabuľke, ktorá obsahuje tieto informácie pre každý bod merania:

názov vzorky,

výrobcu vzorky, charakteristické hodnoty štandardov, t. j. Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, tak ako ich uvádza výrobca alebo ako boli odvodené z následných meraní, ako aj podrobnosti o metóde stanovenia,

nanášací objem a koncentráciu nanesenej vzorky,

hodnotu Mp, ktorá bola použitá na kalibráciu,

elučný objem alebo opravený retenčný čas nameraný pri maxime píku,

Mp vypočítanú v maxime píku,

percentuálnu odchýlku vypočítanej hodnoty Mp od kalibračnej krivky.

2.2.4. Informácie o obsahu polyméru s nízkou molekulovou hmotnosťou:

opis metódy, ktorá sa použila na vykonanie analýzy, a spôsobu vykonania pokusu,

informácie o percentuálnom obsahu molekúl s nízkou molekulovou hmotnosťou (w/w) vzhľadom na celkové množstvo vzorky,

informácie o percentuálnom obsahu (w/w) nečistôt, prísad a iných molekúl nepolymérovej povahy vzhľadom na celkové množstvo vzorky.

2.2.5. Vyhodnotenie:

vyhodnotenie na základe času: metódy použité na zabezpečenie požadovanej reprodukovateľnosti (korekčná metóda, vnútorné štandardy atď.),

informácia o tom, či bolo vyhodnotenie vykonané na základe elučného objemu alebo retenčného času,

informácie o limitoch vyhodnocovania, ak nebola vykonaná úplná analýza píku,

opis vyrovnávacej/prekladacej metódy, ak sa použila,

príprava a predbežné spracovanie vzorky,

prítomnosť nerozpustených čiastočiek, ak boli pozorované,

objem (μl) a koncentrácia (mg/ml) nanesenej vzorky,

opísanie vplyvov, ktoré mohli spôsobiť odchýlku od ideálneho GPC profilu,

podrobné opísanie modifikácií uskutočnených v testovacej metóde,

podrobnosti o rozsahu chýb merania,

všetky iné informácie a pozorované skutočnosti, ktoré by mohli byť významné z hľadiska interpretácie výsledkov.

3.(1)(2)(3)(4)

ODKAZY DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size- Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.20. ROZPÚŠŤACIE/EXTRAKTÍVNE VLASTNOSTI POLYMÉROV VO VODE

A.20.

1. METÓDA Metóda je prevzatá z revidovanej verzie OECD TG 120 (1997). Ďalšie technické informácie sa nachádzajú v odkaze (1).

1.

1.1. ÚVOD Skôr ako sa pri určitých polyméroch, napríklad emulzných, bude dať použiť metóda, ktorá je opísaná v ďalšom texte, môže byť potrebné vykonať prípravné postupy. Metódu nemožno použiť pri kvapalných polyméroch a pri polyméroch, ktoré pri pokusných podmienkach reagujú s vodou. V prípadoch, v ktorých nie je metóda praktická alebo uskutočniteľná, možno extrakčné vlastnosti polymérov stanovovať inými metódami, ktoré je potrebné podrobne opísať a ich použitie odôvodniť.

1.2. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Extraktívne vlastnosti polymérov vo vodnom prostredí sa stanovujú pomocou bankovej metódy (pozri A.6 Rozpustnosť vo vode, Banková metóda) s modifikáciami, ktoré sú opísané v ďalšom texte.

1.4. KVALITATÍVNE KRITÉRIÁ Žiadne.

1.5. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.5.

1.5.1. Vybavenie Pre metódu je potrebné toto vybavenie:

drviace zariadenie, napríklad drvič, na získanie čiastočiek so známou veľkosťou,

trepacie zariadenie s možnosťou kontrolovania teploty,

systém membránových filtrov,

primerané analytické zariadenie,

štandardizované sitá.

1.5.2. Príprava vzorky Reprezentatívna vzorka sa najprv rozdrví a pomocou primeraných sít upraví tak, aby sa získali čiastočky s veľkosťou medzi 0,125 mm a 0,25 mm. Počas drvenia môže byť v záujme zachovania stability vzorky potrebné zabezpečiť chladenie. Materiály gumovitej konzistencie možno drviť pri teplote kvapalného dusíka (1). Ak dosiahnutie uvedeného rozmeru čiastočiek nie je možné, potom je potrebné pokúsiť sa o dosiahnutie ich najmenšieho možného rozmeru a výsledok treba zaznamenať. V testovacom protokole je potrebné uviesť spôsob uskladnenia vzorky pred vykonaním testu.

1.5.3. Postup Do každej z troch nádob so sklenou zátkou sa naváži 10 g testovanej látky a pridá sa k nim 1000 ml vody. Ak spracúvanie 10 g testovanej látky nie je z praktického hľadiska možné, potom treba použiť jej najvyššie možné množstvo blízke tejto hodnote a objem vody mu treba príslušným spôsobom prispôsobiť. Potom sa nádoby tesne uzavrú a nechajú sa premiešavať pri teplote 20 oC. Treba pri tom použiť trepacie alebo miešacie zariadenie pracujúce pri stálej teplote. Po 24 hodinách sa obsah každej nádoby scentrifuguje alebo prefiltruje a pomocou vhodnej analytickej metódy sa v čírej vodnej fáze stanoví koncentrácia polyméru. Ak pre vodnú fázu neexistujú vhodné analytické metódy, potom možno celkovú rozpustnosť/extraktivitu stanoviť na základe suchej hmotnosti zvyšku na filtri alebo suchej hmotnosti scentrifugovanej usadeniny. Zvyčajne býva potrebné uskutočniť kvantitatívne rozlíšenie medzi nečistotami a prímesami na jednej strane a medzi polymérnymi zložkami s nízkou molekulovou hmotnosťou na druhej strane. V prípade gravimetrických stanovení je tiež dôležité vykonať slepé meranie bez testovacej látky, aby sa vzali do úvahy prímesi/nečistoty, ktoré sa do pokusu zanášajú počas jeho postupu. Rozpúšťacie/extraktívne správanie polymérov vo vode pri 37 oC pH 2 a pH 9 možno stanoviť rovnakým spôsobom ako pri vykonávaní pokusu pri 20 oC. Požadované hodnoty pH možno dosiahnuť pridaním buď vhodných tlmivých roztokov, alebo vhodných kyselín, alebo zásad, ako sú kyselina chlorovodíková, kyselina octová, hydroxid sodný alebo draselný analytickej čistoty, alebo NH3. V závislosti od použitej analytickej metódy treba uskutočniť jeden alebo dva testy. Ak sú na priame analyzovanie obsahu polymérovej zložky vodnej fázy k dispozícii dostatočne špecifické metódy, potom by mal postačovať jediný z horeuvedených testov. Ak však takéto metódy k dispozícii nie sú a stanovenie rozpúšťacích/extraktívnych vlastností polyméru je obmedzené na nepriamu analýzu pomocou stanovenia iba celkového množstva organicky viazaného uhlíka (TOC) vo vodnom extrakte, potom je potrebné uskutočniť prídavný test. Takýto prídavný test je potrebné vykonať v triplikátoch s použitím desaťnásobne menšieho množstva polyméru a rovnakého množstva vody ako pri prvom teste.

1.5.4. Analýza

1.5.4.

1.5.4.1. Testy vykonávané s jedným množstvom vzorky Môžu existovať metódy na priamu analýzu polymerických zložiek vodnej fázy. Možno uvažovať taktiež o nepriamej analýze rozpustených/extrahovaných zložiek, pri ktorej sa stanovuje celkové množstvo rozpustných čiastočiek, ktoré sa upravuje na obsah zložiek nepolymérovej povahy. Analýzu celkového obsahu polymérových látok vo vodne fáze možno uskutočniť: buď pomocou dostatočne citlivej metódy, napríklad: alebo pomocou vákuového odparenia vodného extraktu dosucha a následnou spektroskopickou (IR, UV atď.) alebo AAS/ICP analýzou zvyšku. Ak analýza vodnej fázy ako takej nie je z praktického hľadiska uskutočniteľná, potom treba podrobiť vodný extrakt extrakcii organickým rozpúšťadlom nemiešateľným s vodou, čo môže byť napríklad chlórovaný uhľovodík. Rozpúšťadlo sa potom nechá odpariť a zvyšok sa analyzuje na obsah daného polyméru vyššie uvedeným spôsobom. Všetky zložky takéhoto zvyšku, ktoré sa vyhodnotia ako nečistoty alebo prímesi, je potrebné od výsledku odrátať, aby sa stanovil stupeň rozpustnosti/extrakcie iba samotného polyméru. Ak je množstvo takýchto materiálov vo vzorke relatívne veľké, potom môže byť potrebné podrobiť zvyšok napríklad analýze pomocou HPLC alebo GC. Umožní to odlíšiť nečistoty od prítomných monomérov alebo ich derivátov, čím sa umožní stanovenie ich skutočného obsahu. V niektorých prípadoch môže postačovať jednoduché odparenie organického rozpúšťadla dosucha a odváženie zvyšku.

pomocou stanovenia TOC, pri ktorom sa vzorka najprv rozloží kyselinou persírovou alebo kyselinou dvojchrómovu za vzniku CO2, po čom nasleduje stanovenie pomocou IR alebo chemickej analýzy,

pomocou atómovej absorpčnej spektrometrie (AAS) alebo na ekvivalentnej metóde založenej na emisii induktívne naviazanej plazmy (Inductively Coupled Plasma, ICP) pri polyméroch s obsahom kremíka alebo kovov,

pomocou UV absorpcie alebo spektrofluorometrie pri arylových polyméroch,

LC-MS pri nízkomolekulárnych vzorkách,

1.5.4.2. Testy vykonávané s dvoma množstvami vzorky Všetky vodné extrakty sa analyzujú na prítomnosť TOC. Nerozpustená/neextrahovaná časť vzorky sa podrobí gravimetrickému stanoveniu. Ak zostanú po centrifugácii alebo filtrácii obsahu každej banky prichytené na stenách nádoby zvyšky polyméru, potom treba nádobu oplachovať filtrátom dovtedy, kým sa na jej stenách nebude nachádzať žiaden viditeľný zvyšok. Filtrát sa potom podrobí opätovnej centrifugácii alebo filtrácii. Zvyšky, ktoré zostanú na filtri alebo v centrifugačnej kyvete, sa nechajú vysušiť pri 40 oC a odvážia sa. V sušení sa pokračuje až po dosiahnutie konštantnej hmotnosti.

2. ÚDAJE

2.

2.1. TESTY VYKONÁVANÉ S JEDNÝM MNOŽSTVOM VZORKY Je potrebné uviesť jednotlivé výsledky získané pri každej z troch baniek a priemerné hodnoty vyjadrené v jednotkách hmotnosti na objem roztoku (zvyčajne mg/l) alebo v jednotkách hmotnosti na hmotnosť vzorky polyméru (zvyčajne mg/g). Treba uviesť i straty hmotnosti vzorky (vypočítané ako hmotnosť rozpustenej látky vydelená hmotnosťou pôvodnej vzorky). Treba vypočítať relatívne štandardné odchýlky (RSD). Údaje pre celkové množstvo látky (polymér + hlavné prímesi atď.) a iba pre samotný polymér (t. j. po odčítaní príspevku vyššie uvedených prímesí) treba uviesť osobitne.

2.2. TESTY VYKONÁVANÉ S DVOMA MNOŽSTVAMI VZORKY Treba uviesť jednotlivé hodnoty TOC vodných extraktov oboch pokusov vykonaných v triplikátoch, vyjadrené v jednotkách hmotnosti na objem rozpúšťadla (zvyčajne mgC/l), ako aj v jednotkách hmotnosti na hmotnosť pôvodnej vzorky (zvyčajne mgC/g). Z neexistencie rozdielu medzi výsledkami získanými pri vysokom a nízkom pomere vzorka/voda môže vyplývať, že všetky extrahovateľné látky boli skutočne aj extrahované. V takomto prípade nebude priama analýzy zvyčajne potrebná. Treba uviesť jednotlivé hmotnosti zvyškov vyjadrené ako percentuálny podiel z pôvodnej hmotnosti vzorky. Pri každom z pokusov treba vypočítať priemerné hodnoty. Rozdiely medzi hodnotou 100 a zisteným percentuálnym zastúpením predstavujú percentuálne zastúpenie rozpustenej a extrahovateľnej hmoty v pôvodnej vzorke.

3. PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu musí obsahovať tieto informácie:

3.1.

3.1.1. Testovaná látka:

dostupné informácie o testovanej látke (totožnosť, prímesy, nečistoty, obsah nízkomolekulárnych zložiek).

3.1.2. Pokusné podmienky:

opis použitých postupov a pokusných podmienok,

opis analytických a detekčných metód.

3.1.3. Výsledky:

výsledky týkajúce sa rozpustnosti/extrahovateľnosti v mg/l; jednotlivé a priemerné hodnoty extrakčných testov pri jednotlivých roztokoch, rozdelené podľa obsahu polyméru a nečistôt, prímesí atď.,

výsledky týkajúce sa rozpustnosti/extrahovateľnosti v mg/g polyméru,

TOC hodnoty vodných extraktov, hmotnosť rozpusteného podielu a vypočítané percento, ak bolo stanovené,

pH každej vzorky,

informácie o hodnotách získaných pri slepých vzorkách,

ak je potrebné, aj informácie o chemickej nestálosti testovanej látky počas samotného testovania aj analytických postupov,

všetky informácie, ktoré môžu mať význam pre interpretovanie výsledkov.

4.(1) ODKAZY DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

A.21. OXIDAČNÉ VLASTNOSTI (KVAPALINY)

A.21.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Táto metóda je určená na meranie potenciálu kvapalnej látky zvýšiť rýchlosť alebo intenzitu horenia horľavej látky alebo tvoriť s horľavou látkou zmes, ktorá sa samovoľne vznieti, keď sa obe látky dôkladne zmiešajú. Zakladá sa na teste OSN pre oxidujúce kvapaliny (1) a je s ním rovnocenná. Metóda A.21 je určená predovšetkým na splnenie požiadaviek nariadenia (ES) č. 1907/2006, vyžaduje sa však porovnanie iba s jednou referenčnou látkou. Ak sa očakáva, že výsledky testu sa použijú na iné účely, môže byť potrebné testovanie a porovnanie s ďalšími referenčnými látkami. Tento test nie je potrebné vykonať, ak sa na základe posúdenia štruktúrneho vzorca nepochybne potvrdí, že látka nie je schopná s horľavým materiálom exotermicky reagovať. Pred uskutočnením testu je užitočné mať predbežné informácie o akýchkoľvek potenciálnych výbušných vlastnostiach látky. Tento test nie je vhodný pre tuhé látky, plyny, výbušné alebo veľmi horľavé látky, alebo organické peroxidy. Ak sú pre testovanú látku už dostupné výsledky testu OSN pre oxidujúce kvapaliny, tento test sa nemusí vykonať (1).

1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY Priemerný čas zvýšenia tlaku je priemerná hodnota nameraných časov, počas ktorých testovaná zmes spôsobí zvýšenie tlaku od 690 kPa do 2070 kPa nad atmosférický tlak.

1.3. REFERENČNÁ LÁTKA Ako referenčná látka sa používa vodný roztok kyseliny dusičnej (65 hmotnostných %, čistota p. a. – analyticky čistý). Nepovinne, ak experimentátor predpokladá, že výsledky tejto skúšky sa môžu prípadne použiť na iné účely, môže sa tiež vykonať skúška ďalších referenčných látok.

1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Kvapalina, ktorá sa má testovať, sa zmieša s vláknitou celulózou v hmotnostnom pomere 1:1 a zmes sa nadávkuje do tlakovej nádoby. Ak počas zmiešavania alebo dávkovania nastane samovoľné vznietenie, ďalšie testovanie nie je potrebné. Ak samovznietenie nenastane, vykoná sa celý test. Zmes sa v tlakovej nádobe zahrieva a stanoví sa priemerný čas zvýšenia tlaku od 690 kPa do 2070 kPa nad atmosférický tlak. Tento čas sa porovná s priemerným časom zvýšenia tlaku pre zmes referenčnej látky (referenčných látok) a celulózy (1:1).

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY V sérii piatich pokusov na jedenej látke by sa ani jeden výsledok nemal odlišovať od aritmetického priemeru o viac ako 30 %. Výsledky, ktoré sa odlišujú od priemeru o viac ako 30 %, sa vylúčia, zdokonalí sa postup zmiešavania a dávkovania a testovanie sa zopakuje.

1.6. OPIS METÓDY

1.6.

1.6.1. Príprava

1.6.1.

1.6.1.1. Horľavá látka Ako horľavý materiál sa používa vysušená, vláknitá celulóza s dĺžkou vlákien medzi 50 μm a 250 μm a priemernou hodnotou priemeru 25 μm. Celulóza sa suší pri 105 oC počas 4 hodín do konštantnej hmotnosti vo vrstve s hrúbkou najviac 25 mm a počas chladnutia a pred použitím sa uchováva v exsikátore so sušidlom. Obsah vody vo vysušenej celulóze by mal byť nižší ako 0,5 % suchej hmotnosti. Na to, aby sa dosiahla takáto hodnota, sa v prípade potreby čas sušenia predĺži. Počas skúšky je potrebné používať rovnakú šaržu celulózy.

1.6.1.2. Aparatúra

1.6.1.2.

1.6.1.2.1. Tlaková nádoba Používa sa tlaková nádoba. Nádoba pozostáva z oceľovej tlakovej nádoby valcovitého tvaru s dĺžkou 89 mm a vonkajším priemerom 60 mm (pozri obrázok 1). Dve plochy na protiľahlých stranách sú opracované (zmenšujúc prierez nádoby na 50 mm), aby bolo možné namontovanie zážihového a odvzdušňovacieho nástavca. Nádoba má vnútorný priemer 20 mm a na oboch koncoch je zoslabená do hĺbky 19 mm a opatrená závitom 1'' (1 palec) podľa BSP (British Standard Pipe) alebo jeho metrickým ekvivalentom. Snímač tlaku v tvare bočného ramena je priskrutkovaný k zaoblenému povrchu tlakovej nádoby vo vzdialenosti 35 mm od jedného konca a v 90o uhle k opracovaným stranám. Príslušný otvor je vyvŕtaný do hĺbky 12 mm a na konci bočného ramena vybavený závitom na 1/2 podľa BSP (alebo jeho metrickým ekvivalentom). V prípade potreby sa na zabezpečenie plynotesného utesnenia upevní inertné tesnenie. Bočné rameno vyčnieva 55 mm z tlakovej nádoby a má 6 mm vývrt. Koniec bočného ramena je zoslabený a opatrený závitom na pripojenie membránového snímača tlaku. Môže sa použiť akékoľvek zariadenie na meranie tlaku, ktoré je odolné voči pôsobeniu horúcich plynov alebo produktov rozkladu a na rýchlosť zvýšenia tlaku v rozsahu 690 – 2070 kPa dokáže reagovať za najviac 5 ms. Koniec tlakovej nádoby, ktorý je ďalej od bočného ramena, je uzatvorený zážihovým nástavcom, ktorý je vybavený dvoma elektródami, jednou izolovanou od telesa nástavca a druhou uzemnenou k nástavcu. Druhý koniec tlakovej nádoby je uzatvorený poistným diskom (kritický tlak približne 2200 kPa), upevneným v uzatváracom nástavci s 20 mm vývrtom. V prípade potreby sa na zabezpečenie plynotesného utesnenia zážihového nástavca použije inertné tesnenie. Počas používania je zariadenie udržiavané v správnej polohe stojanom (obrázok 2). Zvyčajne sa skladá z podložky z mäkkej ocele s rozmermi 235 mm × 184 mm × 6 mm a zo 185 mm dlhého štvorcového dutého profilu (ďalej len Š.D.P.) s rozmermi 70 mm × 70 mm × 4 mm. Profil je na protiľahlých stranách jedného konca Š.D.P. zrezaný tak, že vznikne konštrukcia s dvoma plochými ramenami, ktoré prečnievajú o 86 mm nad celým rámom profilu. Konce plochých ramien sú zrezané pod uhlom 60o k horizontálnej rovine a privarené k podložke. Na jednej strane vrchného konca základne profilu je vyrezaný 22 mm široký a 46 mm hlboký otvor tak, aby sa pri vložení tlakovej nádoby do rámu profilu stojana dostal prvý zážihový nástavec a aby bočné rameno zapadlo do otvoru. Kus ocele, široký 30 mm a hrubý 6 mm, ktorý má funkciu rozpery, je privarený k dolnej časti vnútornej plochy rámu profilu. Na upevnenie tlakovej nádoby slúžia dve 7 mm prítlačné skrutky, ktoré sú priskrutkované do protiľahlej strany. Zospodu podopierajú tlakovú nádobu dva 12 mm široké pásy 6 mm hrubej ocele, privarené k bočným stranám dosadajúcim na rám profilu.

1.6.1.2.2. Systém zážihu Systém zážihu pozostáva z 25 cm dlhého Ni/Cr drôtu, ktorý má priemer 0,6 mm a odpor 3,85 ohm/m. Drôt má špirálovitý tvar s vnútorným priemerom 5 mm a je pripojený k elektródam zážihového nástavca. Špirála musí byť usporiadaná jedným zo spôsobov zobrazených na obrázku 3. Vzdialenosť medzi dnom nádoby a spodnou časťou zážihovej špirály je 20 mm. Ak nie sú elektródy nastaviteľné, konce zážihového drôtu medzi špirálou a dnom nádoby musia byť izolované keramickým obalom. Drôt sa rozžeravuje konštantným prúdom najmenej 10 A.

1.6.2. Vykonanie testu Kompletne zmontovaná aparatúra so snímačom tlaku a zážihovým systémom, ale bez vloženého poistného disku, sa pripevní na stojan tak, že zážihový nástavec bude v dolnej časti. V sklenenej kadičke sa sklenenou tyčinkou premieša 2,5 g testovanej kvapaliny s 2,5 g sušenej celulózy. Z bezpečnostných dôvodov sa miešanie vykonáva s ochranným štítom, ktorý je medzi experimentátorom a zmesou. Ak sa počas miešania alebo plnenia zmes vznieti, ďalšie testovanie nie je potrebné. Zmes sa pridáva do tlakovej nádoby v malých dávkach poklepávaním do tlakovej nádoby, pričom sa musí dávať pozor na to, aby zmes dostatočne pokryla zážihovú špirálu a bola s ňou v dobrom kontakte. Je dôležité, aby sa špirála počas dávkovania nezdeformovala, pretože by to mohlo viesť k chybným výsledkom. Do uzatváracieho nástavca sa vloží poistný disk a nástavec sa pevne zaskrutkuje. Naplnená nádoba sa presunie do stojanu tak, aby bol poistný disk v hornej polohe, umiestni sa vo vhodnom vystuženom digestore alebo v spaľovacej komore. Do zážihového nástavca sa pripojením na externú zásuvku pustí prúd 10 A. Čas medzi začiatkom miešania a zapnutím prúdu by nemal presiahnuť 10 minút. Signál z tlakového snímača sa zaznamenáva na vhodný systém, ktorý umožňuje meranie a vytváranie permanentného záznamu získaného časového profilu zmeny tlaku (napr. záznamník spojený so zapisovačom). Zmes sa zahrieva dovtedy, kým nepraskne poistný disk alebo neuplynie aspoň 60 s. Ak poistný disk nepraskne, zmes sa pred opatrným rozobratím aparatúry nechá vychladnúť, pričom je potrebné dodržiavať bezpečnostné opatrenia pre prípad možného výskytu zvýšeného tlaku. Vykonáva sa päť pokusov s testovanou látkou a referenčnou látkou (referenčnými látkami). Zaznamenáva sa čas potrebný na zvýšenie tlaku zo 690 kPa na 2070 kPa nad atmosférický tlak. Vypočíta sa priemerný čas zvýšenia tlaku. V niektorých prípadoch môžu chemické reakcie látok, ktoré nesúvisia s ich oxidačnými vlastnosťami, spôsobiť (príliš vysoké alebo príliš nízke) zvýšenie tlaku. V takýchto prípadoch môže byť potrebné kvôli objasneniu povahy reakcie zopakovať test s inertnou látkou namiesto celulózy, napr. diatomit (kremelina).

2. ÚDAJE Čas zvýšenia tlaku pre testovanú látku a referenčnú látku (referenčné látky). Čas zvýšenia tlaku pri testoch s inertnou látkou, ak sa realizovali.

2.

2.1. Tabuľka 1 Príklady výsledkov

SPRACOVANIE VÝSLEDKOV Vypočíta sa priemerný čas zvýšenia tlaku pre testovanú látku a referenčnú látku (referenčné látky). Vypočíta sa priemerný čas zvýšenia tlaku pri testoch s inertnou látkou, ak sa realizovali. Niektoré príklady výsledkov sú uvedené v tabuľke 1. Látka Priemerný čas zvýšenia tlaku pre zmes s celulózou v pomere 1:1 (ms) Dichróman amónny, nasýtený vodný roztok 20800 Dusičnan vápenatý, nasýtený vodný roztok 6700 Dusičnan železitý, nasýtený vodný roztok 4133 Chloristan lítny, nasýtený vodný roztok 1686 Chloristan horečnatý, nasýtený vodný roztok 777 Dusičnan nikelnatý, nasýtený vodný roztok 6250 Kyselina dusičná, 65 % 4767 Kyselina chloristá, 50 % 121 Kyselina chloristá, 55 % 59 Dusičnan draselný, 30 % vodný roztok 26690 Dusičnan strieborný, nasýtený vodný roztok Chlorečnan sodný, 40 % vodný roztok 2555 Dusičnan sodný, 45 % vodný roztok 4133 Inertná látka Voda: celulóza

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA O TESTE Správa o teste obsahuje tieto informácie:

identifikáciu, zloženie, čistotu atď. testovanej látky,

koncentráciu testovanej látky,

postup sušenia použitej celulózy,

obsah vody v použitej celulóze,

výsledky meraní,

výsledky testov s inertnou látkou, ak existujú,

vypočítané priemerné časy zvýšenia tlaku,

všetky odchýlky od tejto metódy a ich dôvody,

všetky doplňujúce poznámky a poznámky dôležité pre interpretáciu výsledkov.

3.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Výsledky testov sa vyhodnotia na základe: Kvapalná látka sa pokladá za oxidačné činidlo, keď: Na to, aby bol vylúčený falošný pozitívny výsledok, sa v prípade potreby pri interpretácii výsledkov zoberú do úvahy aj výsledky získané pri testovaní látky s inertným materiálom.

3.2. a)

toho, či sa zmes testovanej látky a celulózy samovoľne vznieti, a

porovnania priemerného času potrebného na zvýšenie tlaku od 690 kPa do 2070 kPa s časom potrebným na zvýšenie tlaku v prípade referenčnej látky (referenčných látok).

sa zmes látky a celulózy v hmotnostnom pomere 1:1 samovoľne vznieti alebo

zmes látky a celulózy v hmotnostnom pomere 1:1 má priemerný čas zvýšenia tlaku menší alebo rovnaký ako priemerný čas zvýšenia tlaku zmesi vodného roztoku kyseliny dusičnej a celulózy (65 hmotnostných %).

4.(1) ODKAZY Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids. Poznámka: Môže sa použiť ktorákoľvek z týchto zostáv.

4.(1)

Obrázok 1 Tlaková nádoba

(A) Telo tlakovej nádoby (B) Uzatvárací nástavec s poistným diskom (C) Zážihový nástavec (D) Podložka z mäkkého olova (E) Poistný disk (F) Bočné rameno (G) Hlava snímača tlaku (H) Tesnenie (J) Izolovaná elektróda (K) Uzemňovacia elektróda (L) Izolácia (M) Oceľový kónus (N) Deformačná drážka tesnenia

Obrázok 2 Stojan

Obrázok 3 Systém zážihu

(A) Zážihová špirála (B) Izolácia (C) Elektródy (D) Zážihový nástavec

Dodatok V prípade potreby dodatočných technických podrobností možno použiť napríklad tieto technické normy:

1. Kapilárne metódy

1.

1.1. Zariadenia na stanovenie teploty topenia s kvapalným kúpeľom ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapilarverfahren JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products

1.2. Zariadenia na stanovenie teploty topenia s kovovým blokom DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics- polyamides -determination of melting point

2. Tepelné bloky

2.

2.1. Koflerov tepelný blok ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Mikroskop na sledovanie tavenín DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen.

2.3. Menisková metóda (polyamidy) ISO 1218 (E) Plastics- polyamides -determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du point de fusion méthode du ménisque

3. Metódy na stanovenie teploty tuhnutia BS 463 3 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Tepelná analýza

4.

4.1. Diferenciálna tepelná analýza ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Diferenciálna snímacia kalorimetria ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Stanovenie teploty tuhnutia olejov NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour point

Dodatok V prípade potreby dodatočných technických podrobností možno použiť napríklad tieto technické normy:

1.1.1. Ebuliometer Zariadenia na stanovenie teploty topenia s kvapalným kúpeľom ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Destilačný proces (rozmedzie varu) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/7 1 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Losungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Diferenciálna tepelná analýza a diferenciálna snímacia kalorimetria ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

Dodatok V prípade potreby dodatočných technických podrobností možno použiť napríklad tieto technické normy:

1. Výtlačné metódy

1.

1.1. Hydrometer DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Aerometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2. Hydrostatické váhy

1.2. Pre tuhé látky

ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density

Pre kvapalné látky

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 and ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3. Metóda ponoreného telesa DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2. Pyknometrické metódy

2.

2.1. Pre kvapalné látky ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100 . 10-6 m2 s-1 at 15 oC) DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100 . 10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC) DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary – stoppered pycnometer method NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method

2.2. Pre tuhé látky ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method DIN 19683 Determination of the density of soils

3. Vzduchový porovnávací pyknometer DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung

Dodatok 1 Metóda odhadu (predbežného výpočtu)

ÚVOD

Vypočítané hodnoty tlaku pary sa môžu použiť:

na rozhodnutie, ktorá z existujúcich pokusných metód sa hodí najlepšie,

na poskytnutie odhadu alebo medznej hodnoty v prípadoch, kde sa pokusná metóda nemôže uplatniť z technických príčin (vrátane situácie, kde tlak pary je veľmi nízky),

ako pomôcka na identifikáciu tých prípadov, kde vynechanie pokusného merania je zdôvodnené tým, že tlak pary je pri teplote okolitého prostredia (vzduchu) pravdepodobne < 10-5 Pa.

METÓDA ODHADU (PREDBEŽNÉHO VÝPOČTU)

Tlak pary kvapalín a tuhých látok sa môže odhadnúť (predbežne vypočítať) použitím modifikovanej Watsonovej korelácie (a). Jediným potrebným pokusným údajom je normálna teplota varu. Táto metóda sa dá použiť v celom rozmedzí tlaku od 10 Pa5 až po 10-5 Pa. Podrobné informácie o tejto metóde sú uvedené v príručke Handbook of Chemical Property Estimation Methods (Príručka metód na odhadovanie vlastností) (b).

POSTUP VÝPOČTU

Podľa (b) sa tlak pary vypočíta týmto spôsobom: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb kde: T daná teplota Tb normálna teplota (bod) varu P vp tlak pary pri teplote T ΔHvb výparné teplo, skupenské teplo vyparovania ΔZb korekcia na stlačiteľnosť, koeficient stlačiteľnosti (odhadovaný pri 0,97) m empirický koeficient závislý od fyzikálneho skupenstva pri danej teplote T Ďalej ΔHvbTb=KF8,75+R ln Tb kde KF je empirický koeficient (faktor) zohľadňujúci polaritu testovanej látky. Pre viaceré typy zlúčenín sú koeficienty (faktory) KF uvedené v odkazoch (b). Často sú k dispozícii údaje uvádzajúce teplotu varu pri redukovanom tlaku. V takom prípade sa podľa (b) tlak pary vypočíta nasledujúcim spôsobom: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 kde T1 je teplota varu pri redukovanom tlaku P1

SPRÁVA

Ak sa použije metóda odhadu, správa z testu musí obsahovať úplnú dokumentáciu výpočtov.

ODKAZY

(a) K. M. Watson, Ind. Eng. Chem., 1943, vol. 35, 398.

(b) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt, Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

Dodatok 2

Obrázok 1 Prístroj na stanovenie krivky tlaku pary podľa dynamickej metódy

1 = Termočlánok 2 = Objem na vyrovnávanie vákua 3 = Manometer 4 = Vákuum 5 = Miesto merania 6 = Ohrievací článok cca 150 W

Obrázok 2a Prístroj na stanovenie krivky tlaku pary podľa statickej metódy (s použitím tlakomeru v podobe trubice v tvare U)

1. Testovaná chemická látka 2. Para, plynná fáza 3. Vysokovákuový ventil 4. Trubica v tvare U (pomocný manometer) 5. Manometer 6. Tepelný kúpeľ 7. Prístroj na meranie teploty 8. K vákuovej výveve 9. Ventilácia

Obrázok 2b Prístroj na stanovenie krivky tlaku pary podľa statickej metódy (s použitím ukazovateľa tlaku)

1. Testovaná chemická látka 2. Para, plynná fáza 3. Vysokovákuový ventil 4. Manometer 5. Ukazovateľ tlaku 6. Tepelný kúpeľ 7. Prístroj na meranie teploty

Obrázok 3 Izoteniskop [pozri odkaz (7)]

1. K systému na reguláciu teploty a merania 2. Rúra s vonkajšim priemerom 8 mm 3. Suchý dusik v tlakovom systéme 4. Para na vzorky 5. Malý hrot 6. Kvapalná testovaná vzorka

Obrázok 4 Prístroj na stanovenie krivky tlaku pary podľa efúznej metódy s použitím váh na meranie tlaku pary

1. Testovaná látka 2. Plynná fáza s prúdom pary 3. Odparovacia piecka s otočným vstupom 3a. Veko piecky s otvorom 4. Ohrievanie (chladenie) vzorky 5. Meranie teploty testovanej vzorky 6. Chladiaci box 7. Kryt 8. Chladiaca tyč pre chladiaci box 9. Miska váh 10. Mikrováhy 11. K registračnému prístroju 12. K vysokovákuovej výveve

Obrázok 5 Príklad prístroja na odparovanie pri nízkom tlaku efúznou metódou s objemom efúznej komory 8 cm

1. Pripojenie na vákuum 2. Dutina na zasunutie odporového teplomera alebo na odmeranie a reguláciu teploty 3. Veko vákuovej komory 4. Tesniaci o-krúžok 5. Hlinková vákuová nádoba 6. Zaríadenie na inštalovanie a vyberanie efúznych komôr 7. Veko so závitom 8. Krídlové matice 9. Skrutky 10. Efúzne komôrky z nehrdzavejúcej ocele 11. Ohrievacie telesá (6)

Obrázok 6a Príklad prietokového systému na stanovenie tlaku pary metódou plynnej saturácie

1. Regulátor toku 2. Výmenník tepla 3. Ihlové ventily 4. Snímač relatívnej vlhkosti 5. Saturačné kolóny 6. PTFE spojky 7. Prietokomer 8. Zachytávač 9. Olejový zachytávač 10. Fritová prebublávačka Vetrací otvor Rozdeľovacie potrubie

Obrázok 6b Príklad systému na stanovenie tlaku pary plynnou saturačnou metódou s kapilárou umiestnenou v slede za saturačnou komorou

1. Teplotný hmotnostný prietokomer 2. Tlakomer, manometer 3. Komora s teplotnou reguláciu 4. Termostatová cievka pre nosný plyn 5. Teplomer (Pt 100) 6. Plynná saturačná komora 7. Kapilára 8. Absorpčné nádoby 9. Plynomer 10. Chladený zachytávač

Obrázok 7 Príklad potrubného systému pre metódu rotujúcej guľôčky

Prístroj na meranie tlaku pary A. Snímacia hlava rotujúceho rotora B. Komôrka s testovanou vzorkou C. Termostat D. Podtlaková rúrka (turbočerpadlo) E. Vzduchový termostat

Obrázok 8 Príklad meracej hlavy rotujúceho rotora

1. Gulička 2. Vákuová rúrková extenzia spojkovej príruby 3. Permanentné magnety 4. Cievky (2) pre vertikálnu stabilizáciu 5. Vodiace cievky (4) 6. Spojková príruba

Dodatok

Obrázok 1 Metóda eluovania z kolóny s recirkulačným čerpadlom

Vyrovnávanie tlaku vzduchom Prietokomer Mikrokolóna Termostaticky kontrolované cirkulačné čerpadlo Recirkulačné čerpadlo Dvojcestný ventil pre vzorkovanie

Obrázok 2 Typická mikrokolóna

(všetky rozmery sú uvedené v milimetroch) Prípojka pre zabrúsenú sklenenú spojku Voľný priestor (medzi náplňou a vrchnou časťou kolóny) Vnútorná časť 5 Vonkajšia časť 19 Kolík, uzáver zo sklenej vaty Dvojcestný uzatvárací ventil

Obrázok 3 Typická mikrokolóna

(všetky rozmery sú uvedené v milimetroch) (Prípojka pre zabrúsenú sklenenú spojku) Voľný priestor (medzi náplňou a vrchnou časťou kolóny) Vnútorná časť 5 Vonkajšia časť 19 Uzatvárací ventil

Obrázok 4 Metóda eluovania z kolóny s egalizačnou nádobou

1 = Egalizačná nádoba (napr. 2,5 litrová banka) 2 = Kolóna (pozri obr. 3) 3 = Frakčný kolektor 4 = Termostat 5 = Teflónová rúrka (hadička) 6 = Zabrúsená sklenená spojka 7 = Vodné potrubie (medzi termostatom a kolónou, s vnútorným priemerom približne 8 mm)

Dodatok 1 Výpočtové/odhadové metódy

ÚVOD

Všeobecný úvod k výpočtovým metódam, údaje a príklady sú uvedené v publikácii Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). Vypočítané hodnoty Pow sa môžu použiť týmito spôsobmi:

na rozhodnutie o tom, ktorá z experimentálnych metód je vhodná (rozmedzie pri metóde trepačkovej banky: log POw: – 2 až 4, rozmedzie pri metóde HPLC: log POw: 0 až 6),

na voľbu vhodných testových podmienok (napr. referenčných látok pre postupy HPLC, objemového pomeru n-oktanolu a vody pre metódu trepačkovej banky),

ako laboratórna vnútorná (interná) kontrola z hľadiska výskytu možných chýb v pokusoch,

na umožnenie odhadu hodnôt Pow v prípadoch, kde sa nemôžu použiť experimentálne metódy z technických dôvodov.

ODHADOVÁ METÓDA Predbežný odhad rozdeľovacieho koeficientu

Hodnota rozdeľovacieho koeficientu sa môže odhadnúť použitím rozpustností testovanej látky v čistých rozpúšťadlách: Podhad = nasýtenie cn-octanolnasýtenie cvoda

VÝPOČTOVÉ METÓDY Princíp výpočtových metód

Všetky výpočtové metódy sú založené na formálnom trieštení molekuly na vhodné subštruktúry, pre ktoré sú známe spoľahlivé prírastky hodnoty log Pow. Hodnota log Pow celej molekuly sa potom vypočíta ako súčet jej zodpovedajúcich čiastkových hodnôt plus súčet korekčných členov pre vnútromolekulové interakcie. Zoznamy fragmentových konštánt a korekčných členov sú uvedené v odkazoch (b) (c) (d) (e). Niektoré z nich sa pravidelne aktualizujú (b).

Kritériá kvality

Spoľahlivosť výpočtovej metódy vo všeobecnosti klesá s narastajúcou komplexnosťou skúmanej látky alebo prípravku. V prípade jednoduchých molekúl s nízkou molekulovou hmotnosťou a jednej alebo dvoch funkčných skupín možno predpokladať odchýlku 0,1 až 0,3 jednotiek log POw medzi výsledkami rozličných fragmentačných metód a nameranou hodnotou. V prípade komplexnejších molekúl môžu byť hranice chyby väčšie. Bude to závisieť od spoľahlivosti a dostupnosti fragmentových konštánt, ako aj od schopnosti rozoznať vnútromolekulové interakcie (napr. vodíkové väzby) a správneho použitia korekčných členov (problém je jednoduchší pri použití počítačového softvéru CLOGP-3) (b). V prípade ionizujúcich prípravkov je dôležité správne zohľadnenie náboja alebo stupňa ionizácie.

Postupy výpočtov

Hanschova π-metóda

Pôvodná hydrofóbna substituenčná konštanta, π, ktorú zaviedol Fujita a kol. (f), je definovaná ako: πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH) kde Pow (PhX) je rozdeľovací koeficient aromatického derivátu a Pow (PhH) je rozdeľovací koeficient pôvodnej látky alebo prípravku (napr. πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71). Podľa tejto definície je metóda π (π-metóda) použiteľná predovšetkým na aromatickú substitúciu. Hodnoty π pre väčší počet substituentov boli zostavené do tabuľky (b) (c) (d). Používajú sa na výpočet hodnoty log Pow pre aromatické molekuly alebo subštruktúry.

Rekkerova metóda

Podľa Rekkera (g) sa hodnota log Pow vypočíta týmto spôsobom: log Pow=Σi ai fi+Σj (interakčné členy) kde fi predstavuje konštanty rozdielnych molekulových fragmentov a ai frekvenciu ich výskytu v skúmanej molekule. Korekčné členy môžu byť vyjadrené ako integrálny (celý) násobok jednej jedinej konštanty Cm (tzv. magickej konštanty). Fragmentové konštanty fi a Cm boli stanovené zo zoznamu 1054 experimentálnych hodnôt Pow (825 prípravkov) použitím zloženej regresnej analýzy (c) (h). Stanovenie interakčných členov sa vykonáva podľa stanovených pravidiel opísaných v odkazoch (e) (h) (i).

Hanschova-Leova metóda

Podľa Hanscha a Lea (c) sa hodnota log Pow vypočíta z tohto vzťahu: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj kde fi predstavuje konštanty rozdielnych molekulových fragmentov, Fj korekčné členy a ai,bj príslušné frekvencie výskytu. Deriváciou z pokusných hodnôt Pow bol metódou pokusov a chýb stanovený zoznam atómových a skupinových fragmentových hodnôt a zoznam korekčných členov F (tzv. faktorov). Korekčné členy boli usporiadané do niekoľkých rozdielnych tried (a) (c). Je relatívne komplikované a náročné načas zohľadniť všetky pravidlá a korekčné členy. Vyvinuté boli rôzne súbory programov (b).

Kombinovaná metóda

Výpočet hodnoty log Pow komplexných molekúl sa dá do značnej miery zdokonaliť, ak sa molekula rozdelí na väčšie subštruktúry, pre ktoré existujú spoľahlivé hodnoty log Pow, a to buď z tabuliek (b) (c), alebo z vlastných meraní príslušného laboratória. Takéto fragmenty (napr. heterocykly, antrachinón, azobenzén) sa potom môžu kombinovať s Hanschovými hodnotami π alebo s Rekkerovými, alebo Leovými fragmentovými konštantami.

Poznámky

i)

Výpočtové metódy sa dajú použiť iba pre čiastočne alebo úplne ionizované prípravky, keď možno vziať do úvahy potrebné korekčné faktory.

ii)

Ak možno predpokladať vnútromolekulové väzby, je potrebné prirátať zodpovedajúci korekčný člen (približne +0,6 až +1,0 log Pow jednotiek). Indikácie týkajúce sa prítomnosti takýchto väzieb možno získať zo stereomodelov príslušnej molekuly alebo zo spektroskopických údajov o nej.

iii)

Ak sú možné viaceré tautomérne formy, za základ výpočtu by sa mala použiť najpravdepodobnejšia forma.

iv)

Je potrebné pozorne sledovať všetky úpravy, resp. revidované vydania, zoznamov fragmentových konštánt.

Správa

Ak sa použijú výpočtové alebo odhadové metódy, potom správa z testu obsahuje nasledujúce informácie:

opis testovanej látky (zmes, prímesi atď.),

indikácie (údaje) týkajúce sa všetkých možných vnútromolekulových vodíkových väzieb, disociácií, nábojov a všetkých ostatných nezvyčajných efektov (napr. tautomérie),

opis použitej výpočtovej metódy,

identifikáciu alebo spôsob zásobovania databázy,

zvláštnosti vo výbere (voľbe) fragmentov,

kompletnú dokumentáciu výpočtov.

ODKAZY

(a) W. J. Lyman, W. F. Reehl and D. H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C. Hansch, A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(e) R. F. Rekker, H. M. de Kort, Eur. J. Med. Chem.-Chim. Ther. 1979, vol. 14, 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.

(g) R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

(h) C. V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.

(i) R. A. Scherrer, ACS, Americal Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Dodatok 2 Odporúčané referenčné látky pre metódu HPLC

Číslo Referenčná látka log Pow pKa 1 2-butanón 0,3 2 4acetylpyridín 0,5 3 anilín 0,9 4 acetanilid 1,0 5 benzylalkohol 1,1 6 4-metoxyfenol 1,3 pKa = 10,26 7 kyselina fenoxyoctová 1,4 pKa = 3,12 8 fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 10 benzonitril 1,6 11 fenylacetonitril 1,6 12 4metylbenzylalkohol 1,6 13 acetofenón 1,7 14 2nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 15 kyselina 3nitrobenzoová 1,8 pKa = 3,47 16 4chlóranilín 1,8 pKa = 4,15 17 nitrobenzén 1,9 18 3fenylpropán2ol 1,9 19 kyselina benzoová 1,9 pKa = 4,19 20 p krezol 1,9 pKa = 10,17 21 kyselina škoricová 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 anizol 2,1 23 metylbenzoát 2,1 24 benzén 2,1 25 kyselina 3 metylbenzoová 2,4 pKa = 4,27 26 4 chlórfenol 2,4 pKa = 9,1 27 trichlóretylén 2,4 28 atrazín 2,6 29 etylbenzoát 2,6 30 2,6dichlórbenzonitril 2,6 31 kyselina 3 chlórbenzoová 2,7 pKa = 3,82 32 toluén 2,7 33 naftalénlol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3dichlóranilín 2,8 35 chlórbenzén 2,8 36 alylfenyléter 2,9 37 brómbenzén 3,0 38 etylbenzén 3,2 39 benzofenón 3,2 40 4fenylfenol 3,2 pKa = 9,54 41 tymol 3,3 42 l,4dichlórbenzén 3,4 43 difenylamín 3,4 pKa = 0,79 44 naftalén 3,6 45 fenylbenzoát 3,6 46 izopropylbenzén 3,7 47 2,4,6trichlórfenol 3,7 pKa = 6 48 bifenyl 4,0 49 benzylbenzoát 4,0 50 2,4dinitro6sekbutylienol 4,1 51 1,2,4 trichlórbenzén 4,2 52 kyselina dodekánová 4,2 53 difenyléter 4,2 54 nbutylbenzén 4,5 55 fenantrén 4,5 56 fluorantén 4,7 57 dibenzyl 4,8 58 2,6difenylpyridín 4,9 59 trifenylamín 5,7 60 Ddt 6,2 Iné referenčné látky s nízkou log Pow látky s nízkou hodnotou log Pow 1 kyselina nikotínová -0,07

Dodatok

Obrázok Forma a príslušenstvo na prípravu hranice z práškovitej testovanej látky

(všetky rozmery sa uvádzajú v milimetroch) Dĺžka formy: 250 mm Materiál: hliník

Dodatok

Obrázok Prístroj

Dodatok

Príklad materiálovej špecifikácie pre test citlivosti na teplo (pozri technickú normu DIN 1623) (1)(2)(3)

Rúra: materiálová špecifikácia č. 1.0336.505 g. Uzáverová doštička s otvorom: materiálová špecifikácia č. 1.4873. Závitový golier a matica: materiálová špecifikácia č. 1.3817.

Obrázok 1 Testovací prístroj na stanovenie citlivosti na teplo

(všetky rozmery sú uvedené v milimetroch) Obr. 1a Oceľová rúra a príslušenstvo 1. rúra 1. a) vonkajšia príruba 2. závitový golier; závit s nízkym trením 3. úzáverová doštička s otvorom s priemerom a = 2,0 alebo 6,0 mm 4. matica s otvorom s priemerom b = 10 mm 5. skosený povrch 6. 2 rovné plôšky pre kľúč na matice veľkosti 41 Obr. 1b Zohrievacie a ochranné zariadenie 7. 2 rovné plôšky pre kľúč na matice veľkosti 36 8. ochranné puzdro odolné voči črepinám 9. 2 oporné tyče pre rúru 10. zmontovaná rúra 11. poloha zadného horáka; ostatné horáky sú viditeľné 12. zapaľovacia dýza

Obrázok 2 Test citlivosti na teplo

(príklady trieštenia) Žiadny výbuch Žiadny výbuch Výbuch Výbuch Výbuch Výbuch

Obrázok 3 Kalibrácia rýchlosti ohrevu pre test citlivosti na teplo

Teplota (°C) Čas (s) Krivka teploty a času dosiahnutá zohrievaním dibutylftalátu (27 cm5) v uzavretej rúre (uzáverová doštička s otvorom 1,5 mm) pri nastavení prietoku propánu na 3,2 l/min. Teplota sa meria Cr-Al termočlánkom s priemerom 1 mm uloženým v ochrannom plášti z nehrdzavejúcej ocele, umiestneným centrálne 43 mm pod okrajom rúry. Rýchlosť ohrevu medzi 135 oC a 285 oC by mala byť medzi 185 a 215 K/min.

Obrázok 4 Prístroj na testovanie citlivosti látok na náraz

(všetky rozmery sú uvedené v milimetroch) 1. Základňa 450 × 450 × 60 2. Oceľový blok 230 × 250 × 200 3. Nákova, Ø 100 × 70 4. Stojan 5. Stredná priečka 6. Dve vodiace lišty 7. Ozubená tyč 8. Delená stupnica 9. Padací buchar 10. Upínacie spúšt’acie zariadenie 11. Umiestňovacia platňa 12. Vložená nákova (vymeniteľná), ø 26 × 26 13. Umiestňovací krúžok s otvormi 14. Nárazový mechanizmus Obr. 4a Padací buchar, nárys a bokorys, celkový pohľad Obr. č. 4b Padací buchar, spodná čast’ (detail)

Pokračovanie

Obr. 4 d Nárazový mechanizmus pre kvapalné látky Obr. 4 c Nárazový mechanizmus pre chemické látky v práškovej alebo pastovitej forme 1. Oceľové valce 2. Vodiace krúžky pre oceľové valce 3. Umiestňovací krúžok s otvormi: a) Zvislý rez b) Pôdorys 4. Gumový krúžok 5. Kvapalná chemická látka (40 mm3) 6. Priestor bez prítomnosti kvapaliny Obr. 4 e Buchar (padacie závažie hmotnosti 5 kg) 1. Závesný kolík 2. Označovač výšky 3. Polohovacia drážka 4. Valcovitá nárazová hlava 5. Príchytka (uzáver)

Obrázok 5 Prístroj na testovanie citlivosti látok na trenie

Obr. 5a Nárys a pôdorys 1. Oceľová základňa 2. Pohyblivý suport 3. Porcelánová doštička, 25 × 25 × 5 mm 4. Uchytený porcelánový kolík, priemer 10 × 15 mm 5. Testovaná vzorka, približné množstvo 10 mm3 6. Držiak kolíka 7. Zaťažovacie rameno 8. Vyvažovacie rameno 9. Spínač 10. Koleso na nastavenie suportu do východiskovej polohy 11. Pripojenie na elektromotor Obr. 5b Východisková poloha kolíka na vzorke

Dodatok

Obrázok Forma a príslušenstvo na prípravu hranice z práškovitej skúšobnej látky

(všetky rozmery sú uvedené v milimetroch)

Dodatok Príklad ďalších metód na stanovenie číselnej priemernej molekulovej hmotnosti (Mn) polymérov

Prednostnou metódou na stanovenie Mn je gélová permeačná chromatografia (GPC), najmä ak je k dispozícii séria štandardov so štruktúrou podobnou štruktúre stanovovaného polyméru. V prípadoch, v ktorých je použitie GPC sprevádzané praktickými problémami, alebo ak je vopred známe, že polymér nespĺňa regulačné kritérium pre Mn, sú k dispozícii náhradné metódy ako napríklad:

1.1.1.1.2.1.3.1.4.

Využitie koligatívnych vlastností Ebulioskopia/kryoskopia: meria sa zvyšovanie bodu varu (ebulioskopia) alebo znižovanie bodu tuhnutia (kryoskopia) rozpúšťadla, do ktorého sa pridáva polymér. Metóda je založená na skutočnosti, že vplyv rozpusteného polyméru na bod varu/tuhnutia kvapaliny závisí od jeho molekulovej hmotnosti (1) (2). Použiteľnosť: Mn < 20000. Znižovanie tlaku pár: pri tejto metóde sa meria tlak pár zvolenej referenčnej kvapaliny pred a po pridaní známych množstiev polyméru (1) (2). Použiteľnosť: Mn < 20000 (teoreticky; v praxi je užitočnosť metódy obmedzená). Membránová osmometria: metóda využíva princíp osmózy, t. j. prirodzený sklon molekúl rozpúšťadla prechádzať cez polopriepustnú membránu zo zriedeného do koncentrovaného prostredia až po dosiahnutie rovnováhy. Pri pokuse má zriedený roztok nulovú koncentráciu a koncentrovaný roztok obsahuje polymér. Prechádzaním rozpúšťadla vzniká rozdiel tlaku, ktorého veľkosť závisí od koncentrácie a molekulovej hmotnosti polyméru (1) (3) (4). Použiteľnosť: Mn medzi 20000 – 200000. Osmometria v plynnej fáze: pri tejto metóde sa porovnáva rýchlosť odparovania čistého aerosólu rozpúšťadla s rýchlosťou odparovania najmenej troch aerosólov obsahujúcich rozličné koncentrácie polyméru (1) (5) (6). Použiteľnosť: Mn < 20000.

2. Analýza koncovej skupiny Na použitie tejto metódy je potrebné poznať celkovú štruktúru polyméru a aj povahu skupín nachádzajúcich sa na konci reťazcov (tieto skupiny musia byť od hlavného reťazca polyméru odlíšiteľné napríklad pomocou NMR alebo titrácie/derivatizácie). Zo stanovenia molekulárnej koncentrácie koncových skupín, ktoré sa nachádzajú v polyméri, možno vypočítať hodnotu molekulovej hmotnosti (7) (8) (9). Použiteľnosť: Mn do 50000 (s klesajúcou spoľahlivosťou).

3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)

Odkazy Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York. Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, 25 – 52. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139 – 2146.

Dodatok Návod na uskutočnenie korekcie obsahu zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou na nerozpustný polymér

Prítomnosť nerozpustného polyméru vo vzorke spôsobuje úbytok hmotnosti počas analýzy GPC. Nerozpustný polymér sa nevratne zachytáva v kolóne alebo na filtri, zatiaľ čo rozpustná časť vzorky prechádza cez kolónu. Ak je možné určiť alebo merať prírastok indexu lomu (dn/dc) polyméru, potom je možné určiť aj veľkosť straty hmotnosti vzorky v kolóne. V takomto prípade sa uskutočňuje korekcia pomocou externej kalibrácie, pri ktorej sa na kalibrovanie odpovede refraktometra používajú štandardné materiály so známou koncentráciou a známym pomerom dn/dc. V príklade, ktorý je uvedený v ďalšom texte, sa ako štandard použil poly(metyl)metakrylát (pMMA). Pri externej kalibrácii pre analýzu akrylových polymérov sa ako štandard používa roztok pMMA so známou koncentráciou v tetrahydrofuráne, ktorý sa podrobuje analýze pomocou GPC. Zo získaných údajov sa pomocou tohto vzťahu zistí konštanta refraktometra: K = R/(C × V × dn/dc) kde: K konštanta refraktometra (v mikrovoltsekundách/ml), R nameraná hodnota pre pMMA (v mikrovoltsekundách), C koncentrácia štandardu pMMA (mg/ml), V objem vzorky nanesenej do refraktometra (ml) a dn/dc prírastok indexu lomu pre roztok pMMA v tetrahydrofuráne (v ml/mg). Pri štandardoch pMMA sa zvyčajne získavajú tieto údaje: R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 × 10-5 ml/mg Výsledná hodnota K = 3,05 × 1011 sa potom použije na vypočítanie teoretickej odpovede detektora, ak ním prejde 100 % naneseného polyméru.

ČASŤ B METÓDY NA STANOVENIE TOXIKOLOGICKÝCH VLASTNOSTÍ A INÉHO ÚČINKU NA ZDRAVIE

VŠEOBECNÝ ÚVOD A.

KLASIFIKÁCIA TESTOVANEJ LÁTKY Pred začatím toxikologickej štúdie musí byť známe zloženie testovanej látky, hlavné nečistoty a podstatné fyzikálno-chemické vlastnosti vrátane jej stability. Fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej látky poskytujú dôležité informácie pri výbere spôsobu použitia, plánovaní každého detailu štúdie a pri manipulácii s testovanou látkou a pri jej skladovaní. Začatiu štúdie musí predchádzať vývoj analytickej metódy pre kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie testovanej látky (vrátane hlavných nečistôt, ak je možné) v testovanom a biologickom materiáli. V správe z testu musia byť uvedené všetky informácie týkajúce sa identifikácie, fyzikálno-chemických vlastností, čistoty a správania testovanej látky.

STAROSTLIVOSŤ O ZVIERATÁ Pri toxikologickom testovaní je dôležitá prísna kontrola životných podmienok a vhodnej starostlivosti o zvieratá.

i)

Podmienky bývania Životné podmienky v experimentálnych zverincoch alebo ohradách musia byť vhodné pre testovaný druh. Pre potkany, myši a morčatá je vhodná teplota miestnosti 22 oC ± 3 oC s relatívnou vlhkosťou od 30 % do 70 %. Pre králiky je to teplota 20 oC ± 3 oC s relatívnou vlhkosťou od 30 % do 70 %. Niektoré experimentálne postupy sú najmä citlivé na teplotu a v týchto prípadoch bývajú podrobnosti uvedené v opise metódy testovania. Pri všetkých sledovaniach toxických účinkov sa sleduje tiež teplota a vlhkosť, zaznamenáva sa a uvádza sa v záverečnej správe štúdie. Osvetlenie má byť umelé v intervaloch 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Detaily o vlastnostiach osvetlenia sa zaznamenávajú a uvádzajú v záverečnej správe štúdie. Zvieratá sa držia jednotlivo alebo sú umiestnené v klietkach v malých skupinách toho istého pohlavia, iba ak je to v metóde uvedené; v jednej klietke nesmie byť umiestnených viac ako päť zvierat. V správe k pokusom so zvieratami sa uvádza spôsob ich umiestnenia v klietkach, počet zvierat v každej klietke aj počas expozície chemikáliou aj počas nasledujúceho obdobia pozorovania.

ii)

Podmienky kŕmenia Strava musí vyhovovať výživovým požiadavkám testovaného druhu. Ak sa testované látky podávajú zvieratám v strave, môžu sa nutričné hodnoty znížiť interakciou medzi látkou a zložkami potravy. Pri interpretácii výsledkov testu sa musí vziať do úvahy možnosť takýchto reakcií. Bežná laboratórna strava sa podáva s neobmedzeným prídelom pitnej vody. Výber potravy môže byť ovplyvnený potrebou zaistenia vhodného prídavku testovanej látky pri použití danej metódy. Kontaminanty potravy, o ktorých je známe, že vplývajú na toxicitu, nesmú byť prítomné v koncentráciách, ktoré by rušili testovanie.

ALTERNATÍVNE TESTOVANIE Európska únia sa zaviazala podporiť vývoj a hodnotenie alternatívnych postupov, ktoré poskytnú takú istú úroveň informácií ako súčasné štúdie na zvieratách, ale ktoré používajú menej zvierat, spôsobujú menej utrpenia alebo sa vyhýbajú ich použitiu úplne. Tieto metódy, tak ako sa zavádzajú, treba brať do úvahy všade tam, kde možno uskutočniť charakterizáciu rizika a následnú klasifikáciu a opísanie vlastného rizika.

VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA Po vyhodnotení a interpretovaní testov sa berú do úvahy obmedzenia v rozsahu, v ktorom boli výsledky štúdií na zvieratách a štúdií in vitro extrapolované priamo na človeka, a z toho dôvodu sa dôkaz nepriaznivého účinku na človeka, pokiaľ je prístupný, používa na potvrdenie výsledkov testovania.

ODPORÚČANÁ LITERATÚRA Väčšina uvedených metód sa vyvíja v rámci programu OECD pre zásady testovania a uskutočňuje sa v zhode so zásadami správnej laboratórnej praxe s cieľom zaistenia vzájomnej akceptácie údajov v takom rozsahu, ako je len možné. Ďalšie informácie sa dajú získať v odkazoch uvedených v zásadách OECD a v príslušnej inde uvedenej literatúre.

B.1a. AKÚTNA ORÁLNA TOXICITA – METÓDA STABILNEJ DÁVKY

B.1a.

1. METÓDA Táto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 420 (2001).

1.

1.1. ÚVOD Tradičné metódy na hodnotenie akútnej toxicity využívajú smrť zvierat ako konečný bod. V roku 1984 Britská toxikologická spoločnosť navrhla novú koncepciu testovania akútnej toxicity založenú na podávaní série stabilných dávok (1). Koncepcia nevyužíva smrť zvierat ako konečný bod a vychádza namiesto toho z pozorovaní jasných príznakov toxicity pri jednej zo série stabilných dávok. Po validačných štúdiách in vivo v Spojenom kráľovstve (2) a aj v medzinárodných štúdiách in vivo sa tento postup prijal ako testovacia metóda v roku 1992. Následne sa štatistické vlastnosti metódy stabilnej dávky hodnotili s použitím matematických modelov v rade štúdií (4) (5) (6). Štúdie in vivo a modelové štúdie spolu názorne ukázali, že metóda je reprodukovateľná, používa sa pri nej menej zvierat a spôsobuje menej utrpenia ako tradičné metódy a umožňuje zatriediť látky podobne ako iné testovacie metódy akútnej toxicity. Usmernenie pre výber najvhodnejšej testovacej metódy na daný účel možno nájsť v Usmerňujúcom dokumente o testovaní akútnej orálnej toxicity (Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing) (7). Tento usmerňujúci dokument obsahuje aj doplňujúce informácie o vykonávaní a interpretácii testovacej metódy B.1a. Princípom tejto metódy je, že v základnej štúdii sa používajú iba mierne toxické dávky a že je potrebné vyhýbať sa podávaniu dávok, pri ktorých sa očakáva, že sú smrteľné. Nie je tiež potrebné podávať dávky, o ktorých je známe, že spôsobujú silnú bolesť a utrpenie následkom leptavých alebo silne dráždivých účinkov. Moribundné zvieratá alebo zvieratá so zrejmými bolesťami alebo vykazujúcimi známky silného a pretrvávajúceho utrpenia sa humánnym spôsobom usmrtia a pri interpretácii výsledkov testu sa vyhodnotia ako zvieratá, ktoré uhynuli pri teste. Kritériá na rozhodnutie usmrtiť moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídateľnej alebo nastávajúcej smrti je predmetom samostatného usmerňovacieho dokumentu (8). Metóda poskytuje informácie o nebezpečných vlastnostiach a umožňuje, aby sa látka mohla zatriediť a klasifikovať podľa Globálne harmonizovaného systému (GHS) pre klasifikáciu chemikálií, ktoré spôsobujú akútnu toxicitu (9). Testovacie laboratórium posúdi všetky dostupné informácie o testovanej látke pred uskutočnením štúdie. Takéto informácie budú obsahovať identitu a chemickú štruktúru látky, jej fyzikálno-chemické vlastnosti, výsledky všetkých ostatných in vitro alebo in vivo testov toxicity s látkou, toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných látkach a predpokladané použitie(-ia) látky. Tieto informácie sú potrebné na ubezpečenie všetkých zainteresovaných, že test je relevantný na ochranu zdravia ľudí a pomôže pri výbere vhodnej počiatočnej dávky.

1.2. DEFINÍCIE Akútna orálna toxicita: vzťahuje sa na tie nepriaznivé účinky, ktoré sa vyskytnú po orálnom podaní jednorazovej dávky látky alebo viacnásobných dávok podávaných v priebehu 24 hodín. Oneskorená smrť: znamená, že zviera neuhynie ani sa nejaví, že je moribundné, v priebehu 48 hodín, ale uhynie neskôr v priebehu 14-dňového obdobia pozorovania. Dávka: množstvo podanej testovanej látky. Dávka je vyjadrená ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (napr. mg/kg). Zrejmá toxicita: všeobecný termín opisujúci jasné príznaky toxicity po podaní testovanej látky [príklady pozri v (3)], ktoré sú také, že pri podaní najbližšej najvyššej stabilnej dávky sa dá očakávať buď silná bolesť a pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, moribundný stav [kritériá sú uvedené v Humane Endpoints Guidance Document (8)], alebo pravdepodobná mortalita u väčšiny zvierat. GHS: Globálne harmonizovaný klasifikačný systém pre chemické látky a zmesi. Spoločný projekt OECD (zdravie ľudí a životné prostredie), Výboru expertov OSN pre prepravu nebezpečného tovaru (fyzikálno-chemické vlastnosti) a ILO (oznamovanie nebezpečenstva) a koordinovaný v rámci Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC). Blížiaca sa smrť: keď sa očakáva moribundný stav pred ďalším plánovaným obdobím pozorovania. Príznaky, ktoré sú príznačné pre tento stav u hlodavcov, by mohli zahŕňať kŕče, polohu na boku, polohu v ľahu a triašku. [Ďalšie informácie pozri v Humane Endpoint Guidance Document (8).] LD50(stredná smrteľná dávka): je štatistický odvodená jednorazová dávka látky, pri ktorej sa dá očakávať, že spôsobí úhyn 50 % zvierat po orálnom podaní. Hodnota LD50 je vyjadrená ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (mg/kg). Limitná dávka: sa vzťahuje na dávku nad hornou hranicou testovania (2000 alebo 5000 mg/kg). Moribundný stav: stav umierania alebo neschopnosti prežiť, dokonca aj pri liečbe. [Ďalšie informácie pozri v Humane Endpoint Guidance Document (8).] Predvídateľná smrť: prítomnosť klinických príznakov charakteristických pre smrť v známom čase v budúcnosti pred plánovaným ukončením experimentu, napríklad neschopnosť prijímať vodu alebo jedlo. [Ďalšie informácie pozri v Humane Endpoint Guidance Document (8).]

1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Skupine zvierat rovnakého pohlavia sa postupne podávajú stabilné dávky 5, 50, 300 a 2000 mg/kg (výnimočne sa môže uvažovať o podaní ďalšej stabilnej dávky 5000 mg/kg, pozri oddiel 1.6.2). Na základe predbežnej štúdie sa zvolí počiatočná dávka, pri ktorej sa očakáva, že spôsobí určité príznaky toxicity bez toho, aby spôsobila vážne toxické účinky alebo mortalitu. Klinické príznaky a podmienky, ktoré sa spájajú s bolesťou, utrpením a blížiacou sa smrťou, sú podrobne uvedené v samostatnom usmerňovacom dokumente OECD (8). Ďalším skupinám zvierat sa môžu podávať vyššie alebo nižšie stabilné dávky v závislosti od prítomnosti alebo neprítomnosti príznakov toxicity alebo mortality. Tento postup pokračuje po dávku spôsobujúcu zrejmú toxicitu alebo po zistenie najviac jedného uhynutia, alebo keď nie sú viditeľné žiadne účinky pri najvyššej dávke, alebo keď sa vyskytnú uhynutia pri najnižšej dávke.

1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.4.

1.4.1. Výber druhu zvierat Spomedzi živočíchov z druhu hlodavcov sa pokiaľ možno používa potkan, aj keď sa môže použiť aj iný druh hlodavca. Zvyčajne sa používajú samice (7). Je to preto, že prehľady bežných LD50 testov uverejnené v odbornej literatúre uvádzajú, že zvyčajne je malý rozdiel v citlivosti medzi pohlaviami, ale v tých prípadoch, keď sa pozorujú rozdiely, sú samice zvyčajne mierne citlivejšie (10). Ak však z poznatkov o toxikologických alebo toxikokinetických vlastnostiach štrukturálne príbuzných chemikálií vyplýva, že samce môžu byť citlivejšie, potom sa použije toto pohlavie. Ak sa test uskutočňuje na samcoch, je potrebné uviesť primerané zdôvodnenie. Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Samice majú byť panenské a negravidné. Každé zviera má byť na začiatku dávkovania vo veku od 8 do 12 týždňov a jeho hmotnosť má byť v intervale ± 20 % priemernej hmotnosti všetkých zvierat, ktorým sa predtým podala dávka.

1.4.2. Podmienky umiestnenia a kŕmenia Teplota miestnosti pre pokusné zvieratá má byť 22 oC (± 3 oC). Aj keď relatívna vlhkosť má byť aspoň 30 % a nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti má dosahovať 50 % – 60 %. Osvetlenie má byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Zvieratá môžu byť v klietkach po skupinách podľa dávok, ale počet zvierat na klietku musí umožniť zreteľné pozorovanie každého zvieraťa.

1.4.3. Príprava zvierat Zvieratá sú náhodne vybrané, označené tak, aby sa umožnila jednotlivá identifikácia, a držia sa v klietkach aspoň 5 dní pred začiatkom podávania látky, aby sa im umožnila aklimatizácia na laboratórne podmienky.

1.4.4. Príprava dávok Testované látky sa zvyčajne podávajú v stálom objeme počas celého rozsahu dávok, ktoré sa majú testovať zmenou koncentrácie dávkovaného prípravku. Ak sa však má testovať kvapalný konečný produkt alebo zmes, použitie neriedenej testovanej látky, t. j. pri konštantnej koncentrácii, môže byť vhodnejšie pre následné stanovenie rizika tejto látky a požadujú ho niektoré regulačné orgány. V každom prípade sa nesmie prevýšiť maximálny objem podávanej dávky. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. U hlodavcov by objem zvyčajne nemal presiahnuť 1 ml/100 g telesnej hmotnosti: v prípade vodných roztokov sa však môže uvažovať o 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Pokiaľ ide o zloženie dávkovaného prípravku, odporúča sa, pokiaľ je to možné, použitie vodného roztoku/suspenzie/emulzie, za ktorým v poradí nasleduje roztok/suspenzia/emulzia v oleji (napr. kukuričný olej) a potom prípadne roztok v iných nosičoch. Pre nosiče, ktoré sú iné ako voda, by mali byť známe toxikologické charakteristiky. Dávky musia byť pripravené tesne pred podávaním, pokiaľ nie je známa a prijateľná stabilita prípravku počas jeho používania.

1.5. POSTUP

1.5.

1.5.1. Podávanie dávok Testovaná látka sa podáva ako jednorazová dávka cez sondu s použitím žalúdočnej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly. Za nezvyčajných okolností, keď nie je možná jednorazová dávka, môže sa dávka podávať v menších množstvách v priebehu maximálne 24 hodín. Zvieratá sa pred podaním dávky vyhladujú (napr. potkanom sa cez noc zadrží potrava, ale nie voda; myšiam sa na 3 – 4 hodiny zadrží potrava, ale nie voda). Po období hladovania sa zvieratá odvážia a podá sa im testovaná látka. Po podaní látky sa potrava môže zadržať na ďalšie 3 – 4 hodiny potkanom alebo myšiam na 1 – 2 hodiny. Ak sa dávka podáva po častiach počas určitého obdobia, môže byť potrebné poskytnúť zvieratám potravu a vodu v závislosti od dĺžky obdobia.

1.5.2. Predbežná štúdia Účelom predbežnej štúdie je umožniť výber vhodnej počiatočnej dávky pre základnú štúdiu. Testovaná látka sa podáva jednotlivým zvieratám postupne podľa postupového diagramu v prílohe 1. Predbežná štúdia je hotová, keď možno vykonať rozhodnutie o počiatočnej dávke pre základnú štúdiu (alebo ak sa vyskytne uhynutie pri najnižšej stabilnej dávke). Počiatočná dávka sa v prípade predbežnej štúdie vyberie zo stabilných dávok 5, 50, 300 a 2000 mg/kg ako dávka, pri ktorej sa očakáva, že spôsobí zrejmú toxicitu, ktorá je založená pokiaľ možno na dôkaze z in vivo a in vitro údajov pre tú istú chemikáliu a pre štrukturálne príbuzné chemikálie. Ak takéto informácie chýbajú, bude počiatočná dávka 300 mg/kg. Medzi podaním jednotlivých dávok každému zvieraťu je časový interval aspoň 24 hodín. Všetky zvieratá sa pozorujú aspoň 14 dní. Výnimočne, a iba v odôvodnených prípadoch na základe osobitných regulačných potrieb, sa môže zohľadniť použitie ďalšej vyššej stabilnej dávky 5000 mg/kg (pozri prílohu 3). Z dôvodu starostlivosti o zvieratá sa pokusy na zvieratách v rozsahoch GHS kategórie 5 (2000 – 5000 mg/kg) neodporúčajú a uvážia sa iba v prípade veľkej pravdepodobnosti, že výsledky takéhoto testu sú bezprostredne dôležité pre ochranu zdravia ľudí a zvierat alebo ochranu životného prostredia. V prípadoch, keď zviera testované pri najnižšej stabilnej dávke (5 mg/kg) v predbežnej štúdii uhynie, je zvyčajným postupom, že štúdia sa ukončí a látka sa zaradí do GHS kategórie 1 (ako je uvedené v prílohe 1). Ak sa však vyžaduje ďalšie potvrdenie klasifikácie, môže sa vykonať tento voliteľný doplnkový postup. Druhému zvieraťu sa podá dávka 5 mg/kg. Ak toto druhé zviera uhynie, potom sa potvrdí GHS kategória 1 a štúdia sa ihneď ukončí. Ak druhé zviera prežije, potom sa maximálne trom ďalším zvieratám podá dávka 5 mg/kg. Pre výskyt veľkého rizika mortality sa týmto zvieratám z dôvodu starostlivosti o zvieratá podá dávka postupne. Časový interval medzi podaním dávky každému zvieraťu má byť dostatočný na to, aby sa stanovila pravdepodobnosť prežitia predchádzajúceho zvieraťa. Ak sa vyskytne druhé uhynutie, postupnosť podávania dávok sa ihneď ukončí a žiadnym ďalším zvieratám sa dávky nepodajú. Keďže výskyt druhého uhynutia (bez ohľadu na počet pokusných zvierat v čase ukončenia) patrí do výsledku A (2 alebo viac uhynutí), postupuje sa podľa klasifikačného pravidla prílohy 2 pri stabilnej dávke 5 mg/kg (kategória 1, ak sa vyskytne 2 alebo viac uhynutí, alebo kategória 2, ak sa nevyskytne viac ako 1 uhynutie). Okrem toho príloha 4 poskytuje usmernenie pre klasifikáciu v systéme EÚ, až kým sa nezavedie nový GHS.

1.5.3. Základná štúdia

1.5.3.

1.5.3.1. Počet zvierat a dávky Opatrenia, ktoré sa majú prijať po testovaní s počiatočnou dávkou, sa uvádzajú v postupových diagramoch v prílohe 2. Vyžaduje sa jedno z troch opatrení; buď sa testovanie ukončí a priradí príslušná trieda klasifikácie nebezpečenstva, testuje sa pri vyššej stabilnej dávke, alebo sa testuje pri nižšej stabilnej dávke. Na ochranu zvierat sa však v základnej štúdii nezopakuje dávka, ktorá spôsobila uhynutie v predbežnej štúdii (pozri prílohu 2). Zo skúseností vyplýva, že najpravdepodobnejším výsledkom pri počiatočnej dávke bude to, že látku možno klasifikovať, a nie je potrebné ďalšie testovanie. Zvyčajne sa používa celkove päť zvierat rovnakého pohlavia pre každú skúmanú dávku. K týmto piatim zvieratám patrí jedno zviera z predbežnej štúdie, ktorému sa podala zvolená dávka, a ďalšie štyri zvieratá (okrem výnimočného prípadu, keď sa dávka použitá v základnej štúdii nezahrnula do predbežnej štúdie). Časový interval medzi dávkovaním s každou veľkosťou dávky je určený nástupom, trvaním a závažnosťou príznakov toxicity. Ďalšia dávka sa podá zvieratám až po ubezpečení, že zvieratá, ktorým sa predtým podala dávka, prežili. Podľa potreby sa odporúča interval 3 alebo 4 dni medzi jednotlivými dávkami, aby sa umožnilo pozorovanie oneskorenej toxicity. Časový interval sa môže nastaviť podľa potreby, napr. v prípade nepresvedčivej reakcie. Ak sa uvažuje o použití vyššej stabilnej dávky 5000 mg/kg, postupuje sa podľa postupu uvedeného v prílohe 3 (pozri tiež oddiel 1.6.2).

1.5.3.2. Limitný test Limitný test sa pokiaľ možno používa v situáciách, keď experimentátor má informácie, z ktorých vyplýva, že testovaný materiál je pravdepodobne netoxický, t. j. že je toxický iba v prípade, keď prevyšuje predpismi stanovené limitné dávky. Informácie o toxicite testovaného materiálu možno získať z poznatkov o podobných testovaných látkach alebo podobných testovaných zmesiach alebo produktoch pri zohľadnení identity a percenta zložiek, o ktorých je známe, že sú toxikologicky významné. V tých situáciách, keď je málo informácií alebo nie sú informácie o jeho toxicite, alebo v ktorých sa očakáva, že testovaný materiál bude toxický, je potrebné vykonať základný test. Pri zvyčajnom postupe sa počiatočná dávka predbežnej štúdie 2000 mg/kg (alebo výnimočne 5000 mg/kg) následne podá ďalším štyrom zvieratám, čo slúži ako limitný test v prípade tohto usmernenia.

1.6. POZOROVANIA Zvieratá sa vyšetrujú individuálne po podaní dávky aspoň raz počas prvých 30 minút, pravidelne počas prvých 24 hodín, osobitne pozorne počas prvých 4 hodín, a potom každý deň počas celkove 14 dní okrem prípadu, keď je potrebné zvieratá vylúčiť zo štúdie a z dôvodu starostlivosti o zvieratá humánnym spôsobom usmrtiť alebo keď sa zistí, že uhynuli. Dĺžka pozorovania by sa však nemala pevne určiť. Určí sa na základe toxických reakcií, času nástupu a dĺžky času zotavenia a malo by sa teda umožniť jej predĺženie, ak sa to pokladá za potrebné. Časy, keď sa objavia a zmiznú príznaky toxicity, sú dôležité, predovšetkým v prípade tendencie oneskorenia toxických príznakov (11). Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenajú, pričom každé zviera má individuálny záznam. Ďalšie vyšetrenia budú potrebné, ak zvieratá naďalej vykazujú príznaky toxicity. Pri vyšetreniach sa venuje pozornosť zmenám na pokožke a srsti, očiach a slizniciach a tiež respiračnému, obehovému, autonómnemu a centrálnemu nervovému systému a somatomotorickej aktivite a spôsobu správania. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie triašky, kŕčov, slinenia, hnačky, letargie, spánku a kómy. Zohľadnia sa zásady a kritériá zosumarizované v Humane Endpoints Guidance Document (8). Zvieratá nachádzajúce sa v moribundnom stave alebo tie, ktoré vykazujú silné bolesti alebo pretrvávajúce príznaky veľkého utrpenia, sa humánnym spôsobom usmrtia. Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamenať čas uhynutia.

1.6.

1.6.1. Telesná hmotnosť Hmotnosť jednotlivých zvierat sa stanoví krátko pred podaním testovanej látky a potom aspoň každý týždeň. Zmeny hmotnosti sa vypočítajú a zaznamenajú. Na konci testu sa zvieratá, ktoré prežili, odvážia a potom humánnym spôsobom usmrtia.

1.6.2. Patológia Všetky testované zvieratá (vrátane tých, ktoré uhynú počas testu alebo sú vylúčené zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá) sa podrobia autopsii. Všetky makroskopické patologické zmeny u každého zvieraťa sa zaznamenajú. Môže sa uvažovať aj o mikroskopickom vyšetrení orgánov dokazujúcom makroskopické patologické nálezy u zvierat, ktoré prežili 24 alebo viac hodín po podaní počiatočnej dávky, ktoré môže poskytnúť užitočné informácie.

2. ÚDAJE O jednotlivých zvieratách sa poskytujú informácie. Okrem toho sa všetky údaje zosumarizujú vo forme tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu počet použitých zvierat, počet zvierat vykazujúcich príznaky toxicity, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu, alebo boli usmrtené z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, popis časového priebehu toxických účinkov a reverzibility a pitevné nálezy.

3. PODÁVANIE SPRÁV

3.

3.1. SPRÁVA O TESTE Správa o teste musí podľa potreby obsahovať tieto informácie:

Testovaná látka:

fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti (vrátane izomerizácie),

identifikačné údaje vrátane čísla CAS.

Nosič (v prípade potreby):

zdôvodnenie výberu nosiča, ak je iný ako voda.

Pokusné zvieratá:

použitý druh/kmeň,

mikrobiologický stav zvierat, ak je známy,

počet, vek a pohlavie zvierat (v prípade potreby vrátane zdôvodnenia, prečo sa použili samce namiesto samíc),

zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.

Testovacie podmienky:

údaje o zložení testovanej látky vrátane údajov o fyzikálnej forme podávaného materiálu,

údaje o podávaní testovanej látky vrátane objemov dávok a čase podávania,

údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu krmiva/zdroja, zdroja vody),

zdôvodnenie výberu počiatočnej dávky.

Výsledky:

tabuľkové spracovanie údajov o reakcii a veľkosti dávky pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane mortality, povahy, závažnosti a trvania účinkov),

tabuľkové spracovanie telesnej hmotnosti a zmien telesnej hmotnosti,

hmotnosti jednotlivých zvierat v deň podania dávky, potom v týždňových intervaloch a v čase uhynutia alebo usmrtenia,

dátum a čas uhynutia v prípade vopred naplánovaného usmrtenia,

časový priebeh nástupu príznakov toxicity a či tieto príznaky boli reverzibilné pre každé zviera,

pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú k dispozícii.

Diskusia a interpretácia výsledkov.

Závery.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)

ODKAZY British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85 – 92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279 – 291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469 – 482. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313 – 324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315 – 323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183 – 196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, s. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-1]. no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223 – 231. Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

B.1b. AKÚTNA ORÁLNA TOXICITA – METÓDA TRIEDY AKÚTNEJ TOXICITY

B.1b.

1. METÓDA Táto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 423 (2001).

1.

1.1. ÚVOD Metóda triedy akútnej toxicity (1), uvedená v tomto teste, je postupnou metódou, pri ktorej sa na každý krok použijú 3 zvieratá rovnakého pohlavia. V závislosti od mortality a/alebo ich moribundného stavu môžu byť potrebné priemerne 2 až 4 kroky na posúdenie akútnej toxicity testovanej látky. Táto metóda je reprodukovateľná, používa sa pri nej veľmi málo zvierat a umožňuje zatriediť látky podobne ako iné testovacie metódy akútnej toxicity. Metóda triedy akútnej toxicity je založená na biometrických hodnoteniach (2) (3) (4) (5) so stabilnými dávkami dostatočne odlíšenými, aby umožnili zatriedenie látky na klasifikačné účely a posúdenie nebezpečenstva. Metóda, ktorá bola prijatá v roku 1996, bola rozsiahlo validovaná pokusmi in vivo v porovnaní s údajmi LD50 získanými z literatúry, tak na národnej (6), ako aj na medzinárodnej úrovni (7). Usmernenie pre výber najvhodnejšej testovacej metódy na daný účel možno nájsť v Usmerňujúcom dokumente o testovaní akútnej orálnej toxicity [Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8)]. Tento usmerňujúci dokument obsahuje aj doplňujúce informácie o vykonávaní a interpretácii testovacej metódy B.1b. Nie je potrebné podávať testované látky pri dávkach, o ktorých je známe, že spôsobujú silnú bolesť a utrpenie následkom leptavých alebo silne dráždivých účinkov. Moribundné zvieratá alebo zvieratá s bolesťami, alebo zvieratá, ktoré vykazujú príznaky silného a trvalého utrpenia, sa humánnym spôsobom usmrcujú a pri interpretácii výsledkov testu sa vyhodnocujú rovnako ako zvieratá, ktoré uhynuli pri teste. Kritériá na rozhodnutie usmrtiť moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídateľnej alebo nastávajúcej smrti sú predmetom samostatného usmerňovacieho dokumentu (9). Metóda využíva vopred stanovené dávky a výsledky umožňujú, aby sa látka mohla zatriediť a klasifikovať podľa Globálne harmonizovaného systému pre klasifikáciu chemikálií, ktoré spôsobujú akútnu toxicitu (10). Metóda nie je v zásade určená na umožnenie výpočtu presnej hodnoty LD50, ale umožňuje stanoviť definované rozsahy expozície, kde sa očakáva letalita, keďže uhynutie časti zvierat je stále najdôležitejším konečným bodom tohto testu. Metóda umožňuje stanoviť hodnoty LD50 iba v prípade, keď v dôsledku podania aspoň dvoch dávok je mortalita vyššia ako 0 % a nižšia ako 100 %. Výber vopred stanovených dávok bez ohľadu na testovanú látku s klasifikáciou výlučne viazanou na počet zvierat vyšetrovaných v rôznych stavoch zlepšuje možnosti konzistencie podávania správ a reprodukovateľnosti medzi laboratóriami. Testovacie laboratórium posúdi všetky dostupné informácie o testovanej látke pred uskutočnením štúdie. Takéto informácie budú zahŕňať identitu a chemickú štruktúru látky, jej fyzikálno-chemické vlastnosti, výsledok všetkých ostatných in vivo alebo in vitro testov toxicity s látkou, toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných látkach a predpokladané použitie(-ia) látky. Tieto informácie sú potrebné na ubezpečenie všetkých zainteresovaných, že test je dôležitý na ochranu zdravia ľudí a pomôže pri výbere najvhodnejšej počiatočnej dávky.

1.2. DEFINÍCIE Akútna orálna toxicita: vzťahuje sa na tie nepriaznivé účinky, ktoré sa vyskytnú po orálnom podaní jednorazovej dávky látky alebo viacnásobných dávok podávaných v priebehu 24 hodín. Oneskorená smrť: znamená, že zviera neuhynie ani sa nejaví ako moribundné v priebehu 48 hodín, ale uhynie neskôr v priebehu vymedzeného 14-dňového obdobia pozorovania. Dávka: množstvo podanej testovanej látky. Dávka je vyjadrená ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (napr. mg/kg). GHS: Globálne harmonizovaný klasifikačný systém pre chemické látky a zmesi. Spoločný projekt OECD (zdravie ľudí a životné prostredie), Výboru expertov OSN pre prepravu nebezpečného tovaru (fyzikálno-chemické vlastnosti) a ILO (oznamovanie nebezpečenstva) a koordinovaný v rámci Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC). Blížiaca sa smrť: keď sa očakáva moribundný stav pred ďalším plánovaným obdobím pozorovania. Príznaky, ktoré sú príznačné pre tento stav u hlodavcov by mohli zahŕňať kŕče, polohu na boku, polohu v ľahu a triašku. [Ďalšie informácie sa nachádzajú v Humane Endpoint Guidance Document (9).] LD50 (stredná smrteľná orálna dávka): štatistický odvodená jednorazová dávka látky, pri ktorej sa dá očakávať, že spôsobí úhyn 50 % zvierat pri orálnom podaní. Hodnota LD50 je vyjadrená ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (mg/kg). Limitná dávka: sa vzťahuje na dávku nad hornou hranicou testovania (2000 alebo 5000 mg/kg). Moribundný stav: stav umierania alebo neschopnosti prežiť, dokonca aj pri liečbe. [Ďalšie informácie sa nachádzajú v Humane Endpoint Guidance Document (9).] Predvídateľná smrť: prítomnosť klinických príznakov charakteristických pre smrť v známom čase v budúcnosti pred plánovaným ukončením experimentu; napríklad neschopnosť prijímať vodu alebo jedlo. [Ďalšie informácie sa nachádzajú v Humane Endpoint Guidance Document (9).]

1.3. PRINCÍP TESTU Princíp testu spočíva v tom, že na základe metódy postupných krokov s použitím minimálneho počtu zvierat na krok sa získajú dostatočné informácie o akútnej toxicite testovanej látky, ktoré umožnia jej klasifikáciu. Látka sa podáva orálne skupine pokusných zvierat v jednej zo stanovených dávok. Látka sa testuje s použitím metódy postupných krokov, v každom kroku sa použijú tri zvieratá rovnakého pohlavia (zvyčajne samice). Absencia alebo výskyt mortality súvisiacej s látkou u zvierat, ktorým sa podala dávka v jednom kroku, určí ďalší krok, t. j.: Informácie o postupe testu sú uvedené v prílohe 1. Metóda umožní posúdenie vzhľadom na klasifikáciu testovanej látky do jednej z viacerých tried toxicity definovaných pevnými hraničnými hodnotami LD50.

nie je potrebné ďalšie testovanie,

podanie rovnakej dávky trom ďalším zvieratám,

podanie najbližšej vyššej alebo najbližšej nižšej dávky trom ďalším zvieratám.

1.4. OPIS METÓDY

1.4.

1.4.1. Výber druhu zvierat Spomedzi druhov hlodavcov sa prednostne používa potkan, hoci sa môže použiť aj iný druh hlodavca. Zvyčajne sa používajú samice (9). Je to preto, že prehľady konvenčných LD50 testov, uverejnené v odbornej literatúre, uvádzajú, že hoci je malý rozdiel v citlivosti medzi pohlaviami, v tých prípadoch, keď sa pozorovali rozdiely, sú samice zvyčajne mierne citlivejšie (11). Ak však z poznatkov o toxikologických alebo toxikokinetických vlastnostiach štrukturálne príbuzných chemikálií vyplýva, že samce môžu byť citlivejšie, potom sa použije toto pohlavie. Ak sa test uskutočňuje na samcoch, je potrebné uviesť primerané zdôvodnenie. Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Samice majú byť panenské a negravidné. Každé zviera na začiatku dávkovania má byť vo veku od 8 do 12 týždňov a jeho hmotnosť má byť v rozpätí ± 20 % priemernej hmotnosti všetkých zvierat, ktorým sa predtým podala dávka.

1.4.2. Podmienky umiestnenia a kŕmenia Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 oC (± 3 oC). Aj keď relatívna vlhkosť by mala byť aspoň 30 % a nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti by mala dosahovať 50 % – 60 %. Osvetlenie by malo byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Zvieratá môžu byť v klietkach po skupinách podľa dávok, ale počet zvierat na klietku musí umožniť zreteľné pozorovanie každého zvieraťa.

1.4.3. Príprava zvierat Zvieratá sú náhodne vybrané, označené tak, aby sa umožnila jednotlivá identifikácia, a držia sa v klietkach aspoň 5 dní pred začiatkom podávania dávok, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky.

1.4.4. Príprava dávok Testované látky sa zvyčajne podávajú v stálom objeme počas celého intervalu dávkovania, ktoré sa má testovať na základe zmeny koncentrácie dávkovaného prípravku. Ak sa však má testovať kvapalný konečný produkt alebo zmes, použitie neriedenej testovanej látky, t. j. s konštantnou koncentráciou, môže byť pre následné stanovenie rizika tejto látky vhodnejšie a požadujú ho niektoré regulačné orgány. V každom prípade sa nesmie prekročiť maximálny objem podávanej dávky. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. U hlodavcov by objem zvyčajne nemal presiahnuť 1 ml/100 g telesnej hmotnosti: v prípade vodných roztokov sa však môže uvažovať o 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Pokiaľ ide o zloženie dávkovaného prípravku, odporúča sa vždy, keď je to možné, použitie vodného roztoku/suspenzie/emulzie, za ktorým v poradí nasleduje roztok/suspenzia/emulzia v oleji (napr. kukuričný olej), a potom prípadne roztok v iných nosičoch. Pre nosiče, ktoré sú iné ako voda, by mali byť známe toxikologické charakteristiky. Dávky musia byť pripravené tesne pred podávaním, pokiaľ nie je známa a prijateľná stabilita prípravku počas obdobia, keď sa bude používať.

1.5. POSTUP

1.5.

1.5.1. Podávanie dávok Testovaná látka sa podáva ako jednorazová dávka cez sondu s použitím žalúdočnej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly. Za nezvyčajných okolností, keď nie je možná jednorazová dávka, sa môže dávka podávať v menších množstvách v priebehu maximálne 24 hodín. Zvieratá sa pred podávaním dávok vyhladujú (napr. potkanom sa cez noc zadrží potrava, ale nie voda; myšiam sa na 3 – 4 hodiny zadrží potrava, ale nie voda). Po období hladovania sa zvieratá odvážia a podá sa im testovaná látka. Po podaní látky sa zadrží potrava na ďalšie 3 – 4 hodiny potkanom alebo myšiam na 1 – 2 hodiny. Ak sa dávka podáva po častiach počas určitého obdobia, môže byť potrebné poskytnúť zvieratám potravu a vodu v závislosti od dĺžky obdobia.

1.5.2. Počet zvierat a veľkosť dávok Na každý krok sa použijú tri zvieratá. Veľkosť dávky, ktorá sa použije ako počiatočná dávka, sa vyberie z jednej zo štyroch stabilných hodnôt 5, 50, 300 a 2000 mg/kg telesnej hmotnosti. Počiatočná dávka má byť taká, pri ktorej s najväčšou pravdepodobnosťou nastane smrť u niektorých zvierat, ktorým sa dávka podala. Postupové diagramy v prílohe 1 opisujú postup, ktorý je potrebné dodržiavať pre každú z počiatočných dávok. Pritom príloha 4 poskytuje usmernenie ku klasifikácii v schéme EÚ, až kým sa nezavedie nový GHS. Keď z dostupných informácií vyplýva, že úmrtie je nepravdepodobné pri najvyššej počiatočnej dávke (2000 mg/kg telesnej hmotnosti), potom je potrebné vykonať limitný test. Ak nie sú žiadne informácie o látke, ktorá sa má testovať, z dôvodu starostlivosti o zvieratá sa odporúča použiť počiatočnú dávku 300 mg/kg telesnej hmotnosti. Časový interval medzi skupinami dávok je určený nástupom, trvaním a závažnosťou príznakov toxicity. Zvieratám sa podá ďalšia dávka až po ubezpečení, že zvieratá, ktorým sa predtým dávka podala, prežili. Výnimočne, a iba v odôvodnených prípadoch na základe osobitných regulačných potrieb, sa môže uvažovať o použití ďalšej vyššej stabilnej dávky 5000 mg/kg telesnej hmotnosti (pozri prílohu 2). Z dôvodu starostlivosti o zvieratá sa testy na zvieratách v rozsahu GHS kategórie 5 (2000 – 5000 mg/kg) neodporúčajú a uvažuje sa o nich iba v prípade veľkej pravdepodobnosti, že výsledky takéhoto testu by mohli byť bezprostredne dôležité pre ochranu zdravia ľudí a zvierat alebo ochranu životného prostredia.

1.5.3. Limitný test Limitný test sa používa predovšetkým v situáciách, keď experimentátor má informácie, z ktorých vyplýva, že testovaný materiál je pravdepodobne netoxický, t. j. že je toxický iba v prípade, keď prevyšuje predpismi stanovené limitné dávky. Informácie o toxicite testovaného materiálu možno získať z poznatkov o podobných testovaných látkach alebo podobne testovaných zmesiach alebo produktoch pri zohľadnení identity a percenta zložiek, o ktorých je známe, že sú toxikologicky významné. V týchto situáciách, keď existuje málo informácií alebo neexistujú žiadne informácie o jeho toxicite, alebo v ktorých sa očakáva, že testovaný materiál bude toxický, je potrebné vykonať základný test. Limitný test s jednou dávkou 2000 mg/kg telesnej hmotnosti sa môže vykonať so šiestimi zvieratami (tri zvieratá na každý krok). Výnimočne sa môže vykonať limitný test s jednou dávkou 5000 mg/kg s tromi zvieratami (pozri prílohu 2). Ak sa vyskytne uhynutie súvisiace s testovanou látkou, môže byť potrebné vykonať ďalšie testovanie s najbližšou nižšou dávkou.

1.6. POZOROVANIA Zvieratá sa pozorujú individuálne po podaní dávky aspoň raz počas prvých 30 minút, pravidelne počas prvých 24 hodín, osobitne pozorne počas prvých 4 hodín a potom každý deň počas celkove 14 dní okrem prípadu, keď je potrebné zvieratá vylúčiť zo štúdie a z dôvodu starostlivosti o zvieratá humánnym spôsobom usmrtiť alebo keď sa zistí, že uhynuli. Dĺžka pozorovania by sa však nemala pevne stanoviť. Stanoví sa na základe toxických reakcií, času nástupu a dĺžky času zotavenia, a teda sa môže predĺžiť, ak sa to pokladá za potrebné. Časy, keď sa objavia a zmiznú príznaky toxicity, sú dôležité predovšetkým v prípade tendencie oneskorenia toxických príznakov (12). Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenávajú, pričom každé zviera má individuálny záznam. Ďalšie pozorovania budú potrebné, ak zvieratá naďalej vykazujú príznaky toxicity. Pri vyšetreniach sa venuje pozornosť zmenám na pokožke a srsti, očiach a slizniciach a tiež respiračnému, obehovému, autonómnemu a centrálnemu nervovému systému a somatomotorickej aktivite a spôsobu správania. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie triašky, kŕčov, slinenia, hnačky, letargie, spánku a kómy. Zohľadňujú sa aj zásady a kritériá zosumarizované v Humane Endpoints Guidance Document (9). Zvieratá, ktoré sú v moribundnom stave alebo vykazujú silné bolesti alebo pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, sa humánnym spôsobom usmrtia. Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamenať čas uhynutia.

1.6.

1.6.1. Telesná hmotnosť Hmotnosť jednotlivých zvierat sa stanovuje krátko pred podaním testovanej látky a potom aspoň každý týždeň. Zmeny hmotnosti sa vypočítajú a zaznamenajú. Na konci testu sa zvieratá, ktoré prežili, odvážia a humánnym spôsobom usmrtia.

1.6.2. Patológia Všetky testované zvieratá (vrátane tých, ktoré uhynú počas testu alebo sú vylúčené zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá) sa podrobujú autopsii. Všetky makroskopické patologické zmeny u každého zvieraťa sa zaznamenávajú. Môže sa tiež uvažovať o vykonaní mikroskopického vyšetrenia orgánov, dokazujúceho makropatologické nálezy vo zvieratách, ktoré prežili 24 alebo viac hodín, ktoré môže poskytnúť užitočné informácie.

2. ÚDAJE O jednotlivých zvieratách sa uvádzajú informácie. Okrem toho sa všetky údaje zhrnú v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu počet použitých zvierat, počet zvierat vykazujúcich príznaky toxicity, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu alebo ich usmrtili z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, opis a časový priebeh toxických účinkov a reverzibility a pitevné nálezy.

3. PODÁVANIE SPRÁV

3.

3.1. Správa o teste Správa o teste musí podľa potreby obsahovať tieto informácie:

Testovaná látka:

fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti (vrátane izomerizácie),

identifikačné údaje vrátane čísla CAS.

Nosič (v prípade potreby):

zdôvodnenie výberu nosiča, ak je iný ako voda.

Pokusné zvieratá:

použitý druh/kmeň,

mikrobiologický stav zvierat, ak je známy,

počet, vek a pohlavie zvierat (vrátane zdôvodnenia na použitie samcov namiesto samíc, ak je potrebné),

zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.

Testovacie podmienky:

údaje o zložení testovanej látky vrátane údajov o fyzikálnej forme podávaného materiálu,

údaje o podávaní testovanej látky vrátane objemov dávok a čase podávania,

údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu krmiva/zdroja, zdroja vody),

zdôvodnenie výberu počiatočnej dávky.

Výsledky:

tabuľkové spracovanie získaných údajov o reakcii a veľkosti dávky pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane mortality, charakteru, závažnosti a trvania účinkov),

tabuľkové spracovanie telesnej hmotnosti a zmien telesnej hmotnosti,

hmotnosti jednotlivých zvierat v deň podávania dávok, potom v týždňových intervaloch a v čase uhynutia alebo usmrtenia,

dátum a čas uhynutia v prípade vopred naplánovaného usmrtenia,

časový priebeh nástupu príznakov toxicity a či tieto príznaky boli reverzibilné pre každé zviera,

pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú k dispozícii.

Diskusia a interpretácia výsledkov.

Závery.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)

ODKAZY Roll R., Höfer-Bosse Th. and Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336 – 341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559 – 610. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729 – 734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129 – 134. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455 – 470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659 – 670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223 – 231. Chan P.K. and A.W. Hayes (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

B.2. AKÚTNA TOXICITA (INHALAČNÁ)

B.2.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Je výhodné mať predbežné údaje o rozdelení častíc podľa veľkosti, o tlaku pary, o teplote tavenia, teplote vzplanutia, teplote varu a o výbušnosti látky. Pozri aj všeobecný úvod časť B (A).

1.2. POJMY Pozri všeobecný úvod, časť B (B).

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY Viacero skupín pokusných zvierat sa exponuje s testovanou látkou v odstupňovaných koncentráciách na určený čas, a to jedna koncentrácia na jednu skupinu. Nakoniec sa zaregistrujú pozorované následky a prípady úmrtia. Zvieratá, ktoré uhynuli počas testu, ako aj zvieratá, ktoré prežili do konca testu, sa pitvú. Zvieratá s ťažkými a pretrvávajúcimi príznakmi utrpenia a bolesti sa môžu predčasne humánne usmrtiť. Látky, o ktorých je známe, že týmto spôsobom spôsobujú na základe svojich žieravých a silno dráždivých účinkov bolesť a utrpenie, sa nemusia testovať.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Žiadne.

1.6. OPIS SKÚŠOBNEJ METÓDY

1.6.

1.6.1. Príprava Zvieratá si pred začatím testu zvykajú minimálne 5 dní na experimentálne chovateľské a kŕmne podmienky. Pred testom sa zdravé mladé dospelé zvieratá randomizujú a priraďujú k jednotlivým testovaným skupinám. Simulovaná expozícia je potrebná len vtedy, ak si to vyžaduje použitá operatívna expozičná podmienka. Pri tuhých testovaných látkach môže byť potrebná mikronizácia, aby sa zachovali častice vhodnej veľkosti. Ak je to potrebné, môže sa do testovanej látky pridať vhodná pomocná látka, aby sa dosiahla potrebná koncentrácia testovanej látky v atmosfére, a v takom prípade sa musí vytvoriť kontrolná skupina, ktorá obsahuje len pomocnú látku. Ak sa k dávke pridá na zjednodušenie podania pomocná látka alebo iná prímes, musia byť známe jej relevantné toxické vlastnosti. Môžu sa použiť prípadne údaje z prechádzajúcich testov.

1.6.2. Podmienky skúšania

1.6.2.

1.6.2.1. Pokusné zvieratá Ak neexistujú mimoriadne dôvody, tak sa uprednostňuje potkan. Používajú sa známe kmene pokusných zvierat. Pre každé pohlavie by nemala byť odchýlka telesnej hmotnosti zvierat daného testu na začiatku testu viac ako ± 20 % od príslušnej strednej priemernej hodnoty.

1.6.2.2. Počet a pohlavie Pre každú koncentráciu sa musí použiť minimálne 10 hlodavcov (5 samčekov a 5 samičiek). Samičky nesmú byť po vrhu ani gravidné. Poznámka: Pri testoch akútnej toxicity na zvieratách, ktoré patria k vyšším stavovcom, ako hlodavce, sa prihliada na použitie nižšieho počtu zvierat. Dávky by sa mali zvoliť starostlivo a veľký dôraz treba klásť na to, aby sa neprekročili primerané toxické dávky. Pri takýchto testoch by sa malo zabrániť podávaniu testovanej látky v letálnych dávkach.

1.6.2.3. Expozičná koncentrácia Skupiny dávok, najmenej tri, musia stačiť na zachovanie testovaných skupín s toxickými účinkami a medzami úmrtnosti podľa príslušnej klasifikácie. Získané údaje by mali byť dostačujúce na zobrazenie krivky koncentrácie a úmrtnosti, a ak je to možné, mali by umožniť prijateľné určenie LC50.

1.6.2.4. Limitný test Ak sa u piatich samčekov a piatich samičiek pokusných zvierat vystaveným na štyri hodiny 20 mg/l plynu alebo 5mg/l aerosolu prípadne častíc (alebo maximálnym dosiahnuteľným koncentráciám tam, kde toto v dôsledku fyzikálnych alebo chemických vlastností, napríklad výbušných, skúšanej látky nie je možné) nedokáže mortalita spojená s látkou počas 14 dní nasledujúcich po skúške, ďalšie skúšanie sa nepokladá za nevyhnutné. (18. ATP, smernica 93/21/EHS, L1 10/93)

1.6.2.5. Expozičný čas Expozičný čas by mal byť štyri hodiny.

1.6.2.6. Vybavenie Pre testy so zvieratami by sa malo používať inhalačné zariadenie, ktoré zabezpečuje dynamický prúd vzduchu minimálne 12-krát za hodinu, ako aj adekvátny obsah kyslíka a rovnomerne rozloženú expozičnú atmosféru. Ak sa používa jedna komora, tak sa musí zostaviť tak, aby boli pokusné zvieratá v nej čo najmenej stlačené a aby bola expozícia maximalizovaná inhaláciou testovanej látky. Aby sa zabezpečila stabilita atmosféry v inhalačnej komore, nemal by celkový objem pokusných zvierat prekročiť 5 % objemu komory. Pre expozície oblasti nosa a úst, hlavy alebo celého tela sa musia používať špeciálne inhalačné komory; obidva prvé druhy expozície majú prispieť k tomu, aby čo najviac obmedzili prijatie testovanej látky inými cestami.

1.6.2.7. Pozorovací čas Pozorovací čas by mal byť minimálne 14 dní. Čas pozorovania by sa nemal určiť dogmaticky. Mal by závisieť od druhu obrazu otravy, časového prejavu symptómov a od trvania zotavovacej fázy; musí sa predĺžiť vtedy, ak je to nevyhnutné. Časový moment, keď sa prejavia príznaky otravy a zasa odznejú, ako aj čas smrti majú význam hlavne vtedy, ak sú známe príznaky pre spomalenú úmrtnosť.

1.6.3. Postup Zvieratá sa musia odvážiť bezprostredne pred expozíciou a po expozícii pri nastavení rovnováhy komorovej koncentrácie testovanej látky v určenej aparatúre počas štyroch hodín. Nastavenie rovnováhy by malo zabrať len veľmi málo času. Teplota by mala byť počas testu 22 ± 3 oC. Relatívna vlhkosť vzduchu sa udržiava medzi 30 % a 70 %, s výnimkou prípadov, keď sa to nedá realizovať (napr. testy s niektorými aerosólmi). Udržiavanie ľahkého podtlaku v komore (> 5 mm vody) zabraňuje unikaniu testovanej látky do okolia. Počas expozície sa nepodáva žiadna potrava ani voda. Mal by sa používať vhodný systém na vytváranie a kontrolu skúšobnej atmosféry. Systém má zabezpečovať čo najrýchlejšie dosiahnutie konštantných expozičných podmienok. Komora by mala byť nastavená a obsluhovaná tak, aby sa udržalo homogénne rozdelenie skúšobnej atmosféry v komore. Potrebné je vykonať tieto merania alebo kontroly: Počas expozície a po expozícii sa zvieratá pozorujú a zapíšu sa nálezy pre každé zviera. Tieto pozorovania sa počas prvého dňa vykonávajú veľmi často. Minimálne raz za každý pracovný deň by sa malo vykonať dôkladné klinické vyšetrenie, ostatné denné pozorovania a príslušné opatrenia majú mať za cieľ obmedziť stratu zvierat pre štúdiu, napríklad autopsiou alebo schladením nájdených uhynutých zvierat, alebo izoláciou, alebo humánnym usmrtením slabých a zomierajúcich zvierat. Pozorovania by mali zahŕňať zmeny kože, srsti, očí, slizníc, dýchania a krvného obehu, autonómneho a centrálneho nervového systému, ako aj zmeny somatomotoriky a správania. Mimoriadnu pozornosť treba venovať trasu, dýchaniu, kŕčom, slineniu, hnačkám, letargii, spánku a kóme. Čas smrti sa musí zachytiť čo možno najpresnejšie. Hmotnosť jednotlivých zvierat by sa mala určovať po expozícii týždenne a v čase smrti. Zvieratá, ktoré uhynuli počas testu, a zvieratá, ktoré prežili až do konca testu, sa pitvú s mimoriadnym ohľadom na všetky zmeny v hornom a dolnom dýchacom trakte. Všetky patologické zmeny sa musia zaprotokolovať. Ak je to potrebné, mali by sa odobrať tkanivá na histopatologické vyšetrenie.

1.6.3. a)

merania prietokového množstva vzduchu (priebežne);

skutočná koncentrácia testovanej látky sa meria počas expozície v dýchacej oblasti minimálne trikrát (v niektorých druhoch atmosféry, napr. aerosóloch vo vysokej koncentrácii, môže byť potrebná častejšia kontrola). Počas expozičnej doby by sa nemala koncentrácia odkláňať o viac ako ± 15 % od strednej priemernej hodnoty. Pri niektorých aerosóloch sa takáto testovacia úroveň možno nedá dosiahnuť, v takom prípade sa akceptuje väčší rozsah rozptylu. Pre aerosóly sa musí čo možno najčastejšie robiť analýza veľkosti častíc (aspoň na jednu testovanú skupinu);

teplota a vlhkosť vzduchu, ak je to možné, tak priebežne.

2. ÚDAJE Údaje by sa mali zhrnúť do tabuľky. Z nej musí vyplývať pre každú testovanú skupinu počet zvierat na začiatku testu, čas smrti jednotlivých zvierat, počet zvierat s ďalšími príznakmi jedovatého účinku, opis toxických následkov a sekčné nálezy. Zmeny hmotnosti sa musia určiť a zapísať, pokiaľ zvieratá prežijú dlhšie ako jeden deň. Zvieratá, ktoré boli predčasne humánne usmrtené z dôvodu podmienených bolestí a utrpenia látkou, sa zaznamenávajú ako látkou podmienené prípady úmrtia. LC50 sa vypočítava uznávanou metódou. Vyhodnotenie by malo zahŕňať, ak je to možné, vzťah medzi podanou dávkou, ako aj vznik a stupeň všetkých abnormalít vrátane zmien v správaní, klinických symptómov, ťažkých poškodení, zmien v telesnej hmotnosti, úmrtnosti a iných toxikologických následkov.

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať tieto informácie: Expozičné údaje Tieto údaje sa musia uvádzať v tabuľke a musia sa zobraziť uvedením stredných priemerných hodnôt a s ohľadom na odchýlky (napr. štandardná odchýlka), a ak je to možné, obsahujú tieto údaje:

druh zvierat, kmeň, pôvod, chovateľské podmienky, krmivo atď.,

podmienky skúšania: opis expozičného aparátu vrátane typu, rozmerov, zdroja vzduchu, systému tvorby aerosólov, klimatizačného systému a druhu umiestnenia zvierat v skúšobnej komore. Musia sa opísať prístroje na meranie teploty, vlhkosti vzduchu a koncentrácie aerosólov, ako aj rozdelenie podľa veľkosti častíc.

3.1. a)

prietokové množstvo vzduchu v inhalačnom zariadení;

teplotu a vlhkosť vzduchu;

nominálnu koncentráciu (celkové množstvo testovanej látky, ktorá bola daná do inhalačného zariadenia, vydelené objemom vzduchu);

charakteristické vlastnosti vehikula, ak sa použilo;

aktuálnu koncentráciu v dýchacej oblasti;

strednú veľkosť aerodynamických častíc (MMAD) a geometrickú smerodajnú odchýlku (GSD);

čas na nastavenie rovnováhy;

expozičnú dobu;

údaje o reakcii vo forme tabuľky, podľa pohlavia a koncentrácie (počet zvierat uhynutých a humánne usmrtených počas testu, počet zvierat prejavujúcich príznaky toxicity, počet exponovaných zvierat),

čas smrti počas alebo po podaní testovanej látky, dôvody a kritériá na predčasné usmrcovanie zvierat,

všetky pozorovania,

hodnotu LC50 pre každé pohlavie, zistenú na konci pozorovacieho času (s udaním výpočtovej metódy),

95 % intervalu spoľahlivosti pre LC50 (tam, kde je to možné),

krivku dávok/úmrtnosti a sklon (tam, kde to metóda stanovenia umožňuje),

sekčné nálezy,

všetky histopatologické nálezy,

diskusiu výsledkov (zvláštnu pozornosť treba venovať vplyvu, aký môže mať predčasné humánne usmrtenie zvierat počas testu na vypočítanú hodnotu LC50),

interpretáciu výsledkov.

3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA Pozri všeobecný úvod časť B (D).

4. ODKAZY Pozri všeobecný úvod časť B (E).

B.3. AKÚTNA TOXICITA (DERMÁLNA)

B.3.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Pozri všeobecný úvod, časť B (A).

1.2. POJMY Pozri všeobecný úvod, časť B (B).

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY Testovaná látka sa nanáša na kožu v odstupňovaných dávkach viacerým testovaným skupinám, a to jedna dávka na jednu skupinu. Nakoniec sa registrujú pozorované príznaky otravy a prípady úmrtia. Zvieratá, ktoré uhynú počas testu, ako aj zvieratá, ktoré prežijú do konca testu, sa pitvú. Zvieratá so silnými a pretrvávajúcimi príznakmi utrpenia a bolesti sa môžu predčasne humánne usmrtiť. Látky, o ktorých je známe, že týmto spôsobom spôsobujú svojimi žieravými alebo dráždivými účinkami výrazné bolesti a utrpenie, sa nemusia testovať.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Žiadne.

1.6. OPIS SKÚŠOBNEJ METÓDY

1.6.

1.6.1. Príprava Pred testom sa zvieratá vo svojich pokusných klietkach aklimatizujú minimálne päť dní na experimentálne chovateľské a kŕmne podmienky. Pred začatím testu sa zdravé, mladé dospelé zvieratá randomizujú a priraďujú k jednotlivým testovaným skupinám. Asi 24 hodín pred začiatkom testu sa strihaním alebo holením odstráni na chrbte pokusných zvierat srsť. Pri strihaní alebo holení treba brať ohľad na to, aby sa nepoškodila koža zvierat, pretože by to viedlo k zmene priepustnosti. Minimálne 10 % plochy tela je potrebné pripraviť na aplikáciu testovanej látky. Ak sa použijú tuhé látky, ktoré možno prípadne rozdrviť na prášok, mala by sa testovaná látka dostatočne navlhčiť vodou alebo prípadne vhodnou pomocnou látkou, aby sa zabezpečil dobrý kontakt s kožou. Pri použití vehikula sa musí zohľadniť jeho vplyv na vnikanie testovanej látky do kože. Tekuté testované látky sa vo všeobecnosti používajú nezriedené.

1.6.2. Podmienky skúšania

1.6.2.

1.6.2.1. Pokusné zvieratá Môžu sa použiť dospelé potkany alebo králiky. Môžu sa používať aj iné zvieratá, ale ich použitie sa musí zdôvodniť. Je potrebné používať známe kmene pokusných zvierat. Pre každé pohlavie by nemala byť odchýlka telesnej hmotnosti zvierat daného testu na začiatku testu viac ako ± 20 % od príslušnej strednej priemernej hodnoty.

1.6.2.2. Počet a pohlavie Používajte minimálne 5 zvierat pre každú koncentráciu. Mali by byť rovnakého pohlavia. Ak sa používajú samičky, nesmú byť po vrhu gravidné. Ak existujú informácie o tom, že jedno pohlavie reaguje výrazne citlivejšie, mali by sa používať zvieratá tohto pohlavia. Poznámka: Pri testoch akútnej toxicity na zvieratách, ktoré patria k vyššiemu rádu ako hlodavce, sa berie ohľad na použitie menšieho počtu zvierat. Dávky by sa mali voliť starostlivo a veľký dôraz by sa mal klásť na to, aby sa neprekročili primerané toxické dávky. Pri takýchto testoch by sa malo zabrániť podávaniu testovanej látky v letálnych dávkach.

1.6.2.3. Veľkosti dávok Počet veľkostí dávok by mal byť dostatočný, najmenej tri, a dávky by mali byť vhodne odstupňované, aby vznikli skúšobné skupiny s výrazným rozsahom toxických účinkov a mortality. Pri určovaní veľkosti dávok by sa mal zohľadňovať možný žieravý alebo dráždivý účinok. Získané údaje by mali stačiť na zobrazenie krivky o účinku dávky a tam, kde je to možné, aj na prijateľné stanovenie LD50.

1.6.2.4. Limitný test Môže sa vykonať limitný test s jednou jedinou dávkou minimálne 2000 mg/kg telesnej hmotnosti na jednej skupine s 5 samčekmi a 5 samičkami pri použití opísaného postupu. Ak sa zistia prípady úmrtia podmienené látkou, mal by sa uvážiť kompletný test.

1.6.2.5. Čas pozorovania Čas pozorovania by mal trvať minimálne 14 dní. Nemal by však byť určený dogmaticky. Musí závisieť od druhu obrazu otravy, časového vzniku symptómov a od trvania zotavovacej fázy. Pozorovací čas sa musí predĺžiť, ak sa to ukáže nevyhnutné. Časový moment, keď vznikajú a odznievajú príznaky otravy, ich trvanie, ako aj čas smrti majú význam hlavne vtedy, ak sú poznateľné príznaky spomalenej úmrtnosti.

1.6.3. Postup Zvieratá by sa mali chovať v klietkach jednotlivo. Testovaná látka sa nanáša jednotne na oblasť, ktorá zodpovedá asi 10 % plochy tela. Pri veľmi toxických látkach môže byť táto plocha menšia, avšak čo možno najväčšia plocha by mala byť pokrytá čo možno najtenšou a naj rovnomernejšou vrstvou. Testovaná látka musí mať počas expozičnej doby 24 hodín kontakt s kožou prostredníctvom porózneho gázového obväzu a nedráždivej náplaste. Pokusná plocha sa musí okrem toho vhodným spôsobom zakryť, aby sa zafixoval a zaistil gázový obväz a testovaná látka, aby zvieratá nemohli orálne prijímať testovanú látku. Môžu sa použiť aj prostriedky na obmedzenie slobody pohybu, aby zvieratá nemohli orálne prijímať testovanú látku, úplná imobilizácia sa však neodporúča. Po uplynutí expozičnej doby sa odstránia zvyšky testovanej látky, pokiaľ sa dá, použitím vody alebo iným vhodným postupom na čistenie kože. Pozorovania sa systematicky zaznamenávajú. Pre každé zviera sa vyhotovujú individuálne záznamy. Prvý deň sa pozorujú zvieratá často. Minimálne raz v pracovný deň by sa malo vykonať starostlivé klinické vyšetrenie. Ostatné denné pozorovania a príslušné opatrenia majú za cieľ obmedziť stratu zvierat pre štúdiu, napr. autopsiou alebo schladením nájdených uhynutých zvierat a izoláciou alebo humánnym usmrtením slabých alebo umierajúcich zvierat. Pozorovania obsahujú zmeny na srsti, koži, očiach, slizniciach, zmeny dýchania a krvného obehu, autonómneho a centrálneho nervového systému, ako aj somatomotoriky a správania. Mimoriadnu pozornosť treba venovať trasu, kŕčom, slineniu, hnačkám, letargii, spánku a kóme. Časový moment smrti sa musí zachytiť čo možno najpresnejšie. Zvieratá, ktoré uhynuli počas testu, a zvieratá, ktoré prežili do konca testu, sa pitvú. Všetky patologické zmeny sa musia zaprotokolovať. Ak je to potrebné, musia sa odobrať tkanivá na histopatologické vyšetrenie.

1.6.3. Vyhodnotenie toxicity u druhého pohlavia

Po ukončení testu so zvieratami jedného pohlavia sa podáva testovaná látka skupine minimálne s 5 zvieratami iného pohlavia, aby sa zistilo, či tieto zvieratá nereagujú citlivejšie na testovanú látku. Za určitých okolností môže byť oprávnené použitie menšieho počtu zvierat. Ak existuje dostatok dôkazov o tom, že zvieratá skúmaného pohlavia reagujú výrazne citlivejšie, možno upustiť od testu zvierat iného pohlavia.

2. ÚDAJE Údaje sa zhrnú do tabuľky, z nej musí pre každú testovanú skupinu vyplývať počet zvierat na začiatku testu, čas smrti jednotlivých zvierat, počet zvierat prejavujúcich iné známky toxicity, opis toxických účinkov a sekčné nálezy. Hmotnosť jednotlivých zvierat sa stanoví a zaznamená krátko pred aplikáciou testovanej látky, potom v týždenných intervaloch a v čase smrti; zmeny hmotnosti treba stanoviť a zaznamenať, ak zvieratá prežívajú dlhšie než jeden deň. Zvieratá, ktoré boli humánnym spôsobom usmrtené kvôli utrpeniu a bolesti vyvolanej aplikovanou látkou, sa zaznamenávajú ako uhynutie vyvolané látkou. Hodnota LD50 sa vypočíta pomocou uznávanej metódy. Vyhodnotenie údajov by malo, ak je to možné, zahŕňať vzťah medzi podávanou dávkou, ako aj vznik a stupeň všetkých abnormalít vrátane zmien v správaní, klinických symptómov ťažkých poškodení, zmien telesnej hmotnosti, úmrtnosti a iných toxikologických účinkov.

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať tieto informácie:

druh zvierat, kmeň, pôvod, chovateľské podmienky, krmivo atď.,

podmienky skúšania (vrátane postupu čistenia kože a druhu obväzu – okluzívny alebo neokluzívny),

veľkosti dávky (s vehikulom, ak sa použije, a koncentrácia),

pohlavie exponovaných zvierat,

čas smrti po aplikácii dávky, dôvody a kritériá na predčasné usmrcovanie zvierat,

všetky pozorovania,

hodnotu LD50 pre pohlavie, u ktorého bola vykonaná úplná štúdia, stanovená pre 14-dňové pozorovanie, s uvedením metódy stanovenia,

95 % intervalu spoľahlivosti pre LD50 (tam, kde je to možné),

krivku dávok/úmrtnosti a sklon tam, kde to metóda stanovenia umožňuje,

sekčné nálezy,

všetky histopatologické nálezy,

výsledky akéhokoľvek testu na iné pohlavie,

diskusiu o výsledkoch (zvláštnu pozornosť treba venovať vplyvu, aký môže mať predčasné humánne usmrtenie zvierat počas testu na vypočítanú hodnotu LD50),

interpretáciu výsledkov.

3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA Pozri všeobecný úvod časť B (D).

4. ODKAZY Pozri všeobecný úvod časť B (E).

B.4. AKÚTNA TOXICITA: PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE KOŽE

B.4.

1. METÓDA Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 404 (2002).

1.

1.1. ÚVOD Pri príprave tejto aktualizovanej metódy sa osobitná pozornosť venovala možným zlepšeniam v súvislosti so starostlivosťou o zvieratá a posúdeniu všetkých existujúcich informácií o testovanej látke, aby sa zabránilo zbytočnému testovaniu na laboratórnych zvieratách. Táto metóda zahrnuje odporúčanie, aby sa pred uskutočnením opísaného in vivo testu na poleptanie/podráždenie látkou urobila kritická analýza existujúcich príslušných údajov. Ak dostačujúce údaje nie sú dostupné, môžu sa získať na základe postupného testovania (1). Stratégia testovania zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných in vitro testov a je uvedená ako príloha k tejto metóde. Okrem toho sa v prípade potreby odporúča v počiatočnom in vivo teste použiť postupne, a nie súčasne, tri testovacie náplasti na zviera. V záujme vedeckej spoľahlivosti a aj starostlivosti o zvieratá sa in vivo testovanie nevykonáva, pokiaľ neboli všetky dostupné údaje súvisiace s potenciálnym poleptaním/podráždením kože látkou vyhodnotené v kritickej analýze. Takéto údaje zahrnujú dôkaz z existujúcich štúdií na ľuďoch a/alebo laboratórnych zvieratách, dôkaz o poleptaní/podráždení jednou alebo viacerými štrukturálne príbuznými látkami alebo zmesami takýchto látok, údaje dokazujúce silnú aciditu alebo alkalitu látky (2) (3) a výsledky z validovaných a uznaných in vitro alebo ex vivo testov (4) (5) (5a). Táto analýza zníži potrebu in vivo testovania na poleptanie/podráždenie kože látkami, pre ktoré už existujú dostatočné dôkazy z iných štúdií k uvedeným dvom konečným bodom. Uprednostňovaná stratégia postupného testovania, ktorá zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných in vitro alebo ex vivo testov na poleptanie/podráždenie, je do tejto metódy zahrnutá ako príloha. Stratégia bola vypracovaná a jednomyseľne odporučená účastníkmi workshopu OECD (6) a bola prijatá ako odporúčaná stratégia testovania v Globálne harmonizovanom systéme pre klasifikáciu chemických látok (GHS) (7). Odporúča sa, aby sa táto stratégia testovania dodržiavala pred uskutočnením in vivo testovania. V prípade nových látok sa na získanie vedecky spoľahlivých údajov o poleptaní/podráždení látkou odporúča koncepcia postupného testovania. V prípade existujúcich látok s nedostačujúcimi údajmi o poleptaní/podráždení kože sa vedená stratégia použije na získanie chýbajúcich údajov. Použitie odlišnej stratégie testovania alebo testovacej metódy alebo rozhodnutie nepoužiť koncepciu postupného testovania, je potrebné zdôvodniť. Ak sa poleptanie alebo podráždenie nemôže stanoviť s použitím kritickej analýzy, ktorá je konzistentná so stratégiou postupného testovania, je potrebné uvažovať o použití in vivo testu (pozri prílohu).

1.2. DEFINÍCIE Podráždenie kože: je vznik reverzibilného poškodenia kože po aplikácii testovanej látky v trvaní do 4 hodín. Poleptanie kože: je vznik ireverzibilného poškodenia kože; konkrétne ide o viditeľné nekrózy cez epidermu až do dermy po aplikácii testovanej látky v trvaní do štyroch hodín. Pre reakcie na poleptanie sú typické vredy, krvácanie, krvavé chrasty a na konci pozorovania po 14 dňoch strata farby následkom vyblednutia kože, kompletné partie bez srsti a jazvy. Na vyhodnotenie nejasných poškodení je potrebné uvažovať o vykonaní histopatologického vyšetrenia.

1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Látka, ktorá sa má testovať, sa aplikuje v jednorazovej dávke na kožu pokusného zvieraťa; neošetrené časti kože testovaného zvieraťa slúžia ako kontrola. V stanovených intervaloch zistí a vyhodnotí stupeň podráždenia/poleptania a následne sa opíše, aby sa zabezpečilo kompletné posúdenie účinkov. Trvanie štúdie má byť dostatočné na posúdenie reverzibility alebo ireverzibility pozorovaných účinkov. Zvieratá, ktoré vykazujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia a/alebo bolesti v ktoromkoľvek štádiu testu, sa humánnym spôsobom usmrtia a daná látka sa na základe toho posúdi. Kritéria pre rozhodnutie o humánnom spôsobe usmrtenia moribundných a silne trpiacich zvierat je možné nájsť v odkaze (8).

1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.4.

1.4.1. Príprava na in vivo test

1.4.1.

1.4.1.1. Výber druhu zvierat Ako laboratórne zviera sa prednostne používa králik-albín a použijú sa zdravé mladé dospelé králiky. Použitie iných druhov je potrebné zdôvodniť.

1.4.1.2. Príprava zvierat Približne 24 hodín pred testom sa dôkladným ostrihaním na chrbtovej časti trupu týchto zvierat odstráni srsť. Je potrebné venovať pozornosť tomu, aby sa koža neodrala, a použijú sa iba zvieratá so zdravou, neporušenou kožou. Niektoré druhy králikov majú miesta s hustou srsťou, ktoré sa objavujú v určitých obdobiach roka. Takéto miesta, zarastené hustou srsťou, by sa nemali používať ako miesta na testovanie.

1.4.1.3. Podmienky pre umiestnenie a kŕmenie Zvieratá sa umiestnia jednotlivo. Teplota miestnosti pre králiky ako pokusné zvieratá má byť 22 oC (± 3 oC). Aj keď relatívna vlhkosť má byť aspoň 30 % a nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti má dosahovať 50 – 60 %. Osvetlenie má byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.

1.4.2. Postup testu

1.4.2.

1.4.2.1. Aplikácia testovanej látky Testovaná látka sa aplikuje na malé plochy (približne 6 cm2) kože a zakryje náplasťou z gázy, ktorá sa prichytí leukoplastom, ktorý nespôsobuje podráždenie. V prípadoch, keď nie je možná priama aplikácia (napr. kvapaliny alebo niektoré pasty), sa testovaná látka nanesie najskôr na náplasť z gázy, ktorá sa potom aplikuje na kožu. Náplasť sa voľne prichytí, aby mala kontakt s kožou pomocou vhodného semiokluzívneho obväzu počas trvania expozície. Ak sa testovaná látka aplikuje na náplasť, pripevní sa tak, aby mala dobrý kontakt s kožou a aby látka bola na koži rovnomerne rozložená. Je potrebné zabrániť tomu, aby zviera dosiahlo na náplasť a aby požilo alebo vdýchlo testovanú látku. Kvapalné testované látky sa zvyčajne používajú neriedené. Pri testovaní tuhých látok (ktoré sa môžu v prípade potreby rozotrieť na prach) sa testovaná látka navlhčí malým množstvom vody (alebo v prípade potreby iným vhodným nosičom), ktoré bude dostatočné na to, aby zabezpečilo dobrý kontakt s kožou. Ak sa použijú iné nosiče ako voda, prípadný vplyv nosiča na podráždenie kože má byť minimálny. Po skončení expozície, ktorá trvá zvyčajne 4 hodiny, sa zvyšná testovaná látka odstráni podľa potreby s použitím vody alebo vhodného roztoku bez toho, aby sa pozmenila existujúca reakcia alebo integrita epidermy.

1.4.2.2. Veľkosť dávky Na testované miesto sa aplikuje dávka o veľkosti 0,5 ml kvapaliny alebo 0,5 g tuhej látky alebo pasty.

1.4.2.3. Počiatočný test (in vivo test podráždenia/poleptania kože na jednom zvierati) Dôrazne sa odporúča, aby sa v in vivo počiatočnom teste použilo jedno zviera, najmä keď sa predpokladá, že látka môže byť žieravá. Je to v súlade so stratégiou postupného testovania (pozri prílohu 1). Keď sa na základe kritickej analýzy usúdi, že látka je žieravá, ďalšie testovanie na zvieratách nie je potrebné. Pre väčšinu látok, o ktorých sa predpokladá, že sú žieravé, ďalšie in vivo testovanie zvyčajne nie je potrebné. V tých prípadoch, kde však následkom nedostatočných dôkazov chýbajú ďalšie potvrdzujúce údaje, sa môže vykonať testovanie na zvieratách v obmedzenom rozsahu na základe tohto prístupu: postupne sa aplikujú na zviera tri testovacie náplasti. Prvá náplasť sa odstráni po troch minútach. Ak sa nezistí závažná reakcia kože, aplikuje sa druhá náplasť a odstráni sa po jednej hodine. Ak zo zistení v tomto štádiu vyplýva, že je humánne, aby sa expozícia mohla predĺžiť na štyri hodiny, aplikuje sa tretia náplasť a odstráni sa po štyroch hodinách a reakcia sa vyhodnotí. Ak sa zistí žieravý účinok po ktorejkoľvek z troch postupných expozícií, test sa ihneď ukončí. Ak sa po odstránení poslednej náplasti nezistí žieravý účinok, zviera sa pozoruje 14 dní, pokiaľ sa poleptanie neprejaví skôr. V tých prípadoch, keď sa neočakáva, že testovaná látka spôsobí poleptanie, ale môže byť dráždivá, aplikuje sa jediná náplasť jednému zvieraťu na štyri hodiny.

1.4.2.4. Potvrdzujúci test (in vivo test podráždenia kože na ďalších zvieratách) Ak sa nezistí žieravý účinok v počiatočnom teste, dráždivá alebo negatívna reakcia sa potvrdí na maximálne dvoch ďalších zvieratách, každé s jednou náplasťou s časom expozície štyri hodiny. Ak sa v počiatočnom teste zistí dráždivý účinok, môže sa vykonať potvrdzujúci test postupným spôsobom alebo expozíciou dvoch ďalších zvierat súčasne. Vo výnimočnom prípade, keď sa neuskutoční počiatočný test, dvom alebo trom zvieratám sa môže aplikovať jediná náplasť, ktorá sa odstráni po štyroch hodinách. V prípade, keď sa použijú dve zvieratá, ak obidve vykazujú rovnakú reakciu, nie je potrebné ďalšie testovanie. V opačnom prípade sa testuje aj tretie zviera. Môže byť potrebné, aby sa nejednoznačné reakcie vyhodnotili na ďalších zvieratách.

1.4.2.5. Doba pozorovania Dĺžka času pozorovania má byť dostatočná na celkové posúdenie reverzibility zistených účinkov. Pokus je však potrebné ukončiť vždy, keď zviera vykazuje pretrvávajúce príznaky silnej bolesti alebo utrpenia. Na určenie reverzibilných účinkov sa zvieratá pozorujú do 14 dní po odstránení náplastí. Ak sa pozoruje reverzibilita pred uplynutím 14 dní, pokus je potrebné v tomto čase ukončiť.

1.4.2.6. Klinické pozorovania a vyhodnotenie kožných reakcií Všetky zvieratá sa vyšetria, či nemajú príznaky erytému (sčervenania kože) a edému (opuchu) a reakcie po 60 minútach sa vyhodnotia a potom po 24, 48 a 72 hodinách po odstránení náplasti. V prípade počiatočného testu na jednom zvierati sa testované miesto tiež vyšetrí bezprostredne po odstránení náplasti. Kožné reakcie sa vyhodnotia a zaznamenajú podľa stupňov v nižšie uvedenej tabuľke. Ak sa vyskytne poškodenie kože, ktoré nie je možné označiť ako podráždenie alebo poleptanie po 72 hodinách, budú potrebné pozorovania až do 14. dňa, aby sa určila reverzibilita účinkov. Okrem toho na pozorovanie podráždenia, všetky lokálne toxické účinky, ako je odmastenie pokožky a všetky systémové nepriaznivé účinky (napr. účinky na klinické príznaky toxicity a telesnú hmotnosť), sa celkove opíšu a zaznamenajú. Na objasnenie nejednoznačných reakcií je potrebné uvažovať o vykonaní histopatologického vyšetrenia. Vyhodnotenie kožných reakcií je nevyhnutne subjektívne. Na podporu zosúladenia pri vyhodnocovaní kožnej reakcie a na pomoc testovacím laboratóriám a tým, ktorí sú zainteresovaní na uskutočňovaní a interpretovaní výsledkov, zamestnanci uskutočňujúci vyšetrenia musia byť primerane vyškolení na používanie systému hodnotenia. Užitočnou by mohla byť ilustrovaná príručka na vyhodnotenie podráždenia kože a iných poškodení (9).

2. ÚDAJE

2.

2.1. PREDKLADANIE VÝSLEDKOV Výsledky štúdie sa zhrnú v podobe tabuliek v záverečnej správe z testu a vzťahujú sa na všetky body uvedené v oddiele 3.1.

2.2. VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV Stupne podráždenia kože sa posudzujú v súvislosti s charakterom a závažnosťou poškodení a ich reverzibilitou alebo ireverzibilitou. Jednotlivé stupne nepredstavujú pre dráždivé vlastnosti materiálu absolútnu normu, keďže sa hodnotia aj iné účinky testovaného materiálu. Skôr je potrebné na jednotlivé stupne nazerať ako na referenčné hodnoty, ktoré sa majú posudzovať v súvislosti s inými pozorovaniami zo štúdie. Pri hodnotení dráždivých reakcií je potrebné posúdiť reverzibilitu poškodení kože. Keď reakcie ako alopécia (obmedzená), hyperkeratóza, hyperplázia a šupinatosť pretrvávajú do konca 14-denného obdobia pozorovania, testovaná látka sa pokladá za dráždivú.

3. PODÁVANIE SPRÁV

3.

3.1. SPRÁVA O TESTE Správa z testu musí obsahovať tieto informácie:

Zdôvodnenie in vivo testovania: kritická analýza údajov z predchádzajúcich testov, vrátane výsledkov zo stratégie postupného testovania:

opis dôležitých údajov dostupných z predchádzajúceho testovania,

údaje získané v každom štádiu stratégie testovania,

opis vykonaných in vitro testov, vrátane údajov o postupoch, získaných výsledkov s testovanými/referenčnými látkami,

kritická analýza pre uskutočnenie in vivo štúdie.

Testovaná látka:

identifikačné údaje (napr. číslo CAS; zdroj; čistota; známe nečistoty; číslo šarže),

fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. pH, prchavosť, rozpustnosť, stabilita),

v prípade zmesi, zloženie a vzájomný percentuálny podiel zložiek.

Nosič:

identifikácia, koncentrácia (v prípade potreby), použitý objem,

zdôvodnenie výberu nosiča.

Pokusné zvieratá:

použitý druh/kmeň, zdôvodnenie pre použitie iných zvierat ako králik – albín,

počet zvierat každého pohlavia,

hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku a konci testu,

vek na začiatku štúdie,

zdroj zvierat, podmienky umiestnenia, krmivo atď.

Testovacie podmienky:

technika prípravy miesta pre náplasť,

údaje o použitých materiáloch na náplasť a metóda pokrytia náplasťou,

údaje o príprave testovanej látky, aplikácii a odstránení.

Výsledky:

tabuľkové spracovanie stupňov reakcie podráždenia/poleptania pre každé zviera vo všetkých meraných časoch,

opisy všetkých pozorovaných poškodení,

podrobný opis charakteru a stupňa zisteného podráždenia alebo poleptania a všetky histopatologické nálezy,

opis iných nepriaznivých lokálnych (napr. odmastenie kože) a systémových účinkov okrem podráždenia kože alebo poleptania,

diskusia k výsledkom.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)

ODKAZY Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L, Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410 – 429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 2(5, 709 – 720. ECETOC (1990) Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483 – 524. Testovacia metóda B.40 Leptanie kože. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. V Solne, Švédsko, 22. – 24. januára 1996 (http://www 1. oecd. org/ehs/te st/b ackground. htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, potvrdený 28. spoločným zasadaním Výboru pre chemikálie a Pracovnej skupiny pre chemikálie, november 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Na požiadanie k dispozícii na sekretariáte OECD].

Tabuľka I Vytvorenie erytému alebo chrasty Vytvorenie edému STUPNE REAKCIÍ KOŽE

Žiadny erytém … 0 Veľmi slabý erytém (sotva pozorovateľný) … 1 Jasne ohraničený erytém … 2 Mierny až silný erytém … 3 Výrazný erytém (tmavočervený) až vytvorenie chrasty zabraňujúcej posúdenie erytému … 4 Maximálne možný: 4 Žiadny edém … 0 Veľmi slabý edém (sotva pozorovateľný) … 1 Slabý edém (okraje oblasti jasne ohraničené zreteľným opuchom) … 2 Mierny edém (opuch približne 1 mm) … 3 Výrazný edém (opuch viac ako 1 mm a presahujúci za oblasť expozície) … 4 Maximálne možný: 4 Na objasnenie nejednoznačných reakcií sa môže vykonať histopatologické vyšetrenie.

B.5. AKÚTNA TOXICITA: PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE OKA

B.5.

1. METÓDA Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 405 (2002).

1.

1.1. ÚVOD Pri príprave tejto aktualizovanej metódy sa osobitná pozornosť venovala možným zlepšeniam na základe vyhodnotenia všetkých existujúcich informácií o testovanej látke, aby sa zabránilo zbytočnému testovaniu na pokusných zvieratách, a tým zohľadnila ochrana zvierat. Táto metóda zahrnuje odporúčanie, aby sa pred uskutočnením opísaného in vivo testu poleptania/podráždenia oka látkou uskutočnila kritická analýza existujúcich príslušných údajov. Ak nie sú k dispozícii dostačujúce údaje, odporúča sa, aby sa získali na základe postupného testovania (2) (3). Stratégia testovania zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných in vitro testov a je uvedená ako príloha k testovacej metóde. Okrem toho sa odporúča použiť in vivo test podráždenia/po leptania kože na predpovedanie poleptania oka pred uvážením in vivo očného testu. V záujme vedeckej spoľahlivosti a aj starostlivosti o zvieratá nie je potrebné uvažovať o in vivo testovaní, pokiaľ neboli všetky dostupné údaje súvisiace s potenciálnym poleptaním/podráždením oka látkou vyhodnotené v kritickej analýze. Takéto údaje zahrnujú dôkaz z existujúcich štúdií na ľuďoch a/alebo laboratórnych zvieratách, dôkaz o poleptaní/podráždení jednou alebo viacerými štrukturálne príbuznými látkami alebo zmesami takýchto látok, údaje dokazujúce silnú aciditu alebo alkalitu látky (4) (5) a výsledky z validovaných a uznaných in vitro alebo ex vivo testov na poleptanie a podráždenie kože (6) (6a). Štúdie je možné vykonať pred kritickou analýzou alebo ako jej výsledok. V prípade určitých látok takáto analýza môže poukázať na potrebu in vivo štúdií potenciálu látky spôsobiť poleptanie/podráždenie oka. Vo všetkých takýchto prípadoch sa pred uvažovaním o použití in vivo očného testu pokiaľ možno uskutoční najskôr štúdia in vivo účinkov látky na kožu a vyhodnotí sa v súlade s testovacou metódou B.4 (7). Použitie kritickej analýzy a stratégie postupného testovania má znížiť potrebu in vivo testovania poleptania/podráždenia oka látkami, pre ktoré už existuje dostatok dôkazov z iných štúdií. Ak sa stanovenie poleptania alebo podráždenia oka nedá vykonať s použitím stratégie postupného testovania, ani po uskutočnení in vivo štúdie poleptania a podráždenia kože, môže sa vykonať in vivo test poleptania/podráždenia oka. Uprednostňovaná stratégia postupného testovania, ktorá zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných in vitro alebo ex vivo testov poleptania/podráždenia, je zahrnutá v prílohe k tejto testovacej metóde. Stratégia bola vypracovaná a jednomyseľne odporučená účastníkmi workshopu OECD (8) a bola prijatá ako odporúčaná stratégia testovania v Globálne harmonizovanom systéme pre klasifikáciu chemických látok (GHS) (9). Odporúča sa, aby sa táto stratégia testovania dodržiavala pred uskutočnením in vivo testovania. V prípade nových látok sa na získanie vedecky spoľahlivých údajov o poleptaní/podráždení látkou odporúča koncepcia postupného testovania. V prípade existujúcich látok s nedostačujúcimi údajmi o poleptaní/podráždení kože a oka sa uvedená stratégia použije na získanie chýbajúcich údajov. Použitie odlišných stratégií testovania alebo testovacieho postupu alebo rozhodnutie nepoužiť koncepciu postupného testovania je potrebné zdôvodniť.

1.2. DEFINÍCIE Podráždenie oka: je vytvorenie zmien na oku po aplikácii testovanej látky na vonkajší povrch oka, ktoré sú úplne reverzibilné do 21 dní po aplikácii. Poleptanie oka: je vytvorenie poškodenia tkaniva oka alebo závažné fyzické oslabenie zraku po aplikácii testovanej látky na vonkajší povrch oka, ktoré nie sú úplne reverzibilné do 21 dní po aplikácii.

1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Testovaná látka sa aplikuje v jednorazovej dávke do jedného oka pokusného zvieraťa; neošetrené oko slúži ako kontrola. Stupeň podráždenia/po leptania oka sa vyhodnotí na základe hodnotenia poškodenia spojoviek, rohovky a dúhovky v špecifických intervaloch. Iné účinky na oku a nepriaznivé systémové účinky sa tiež opíšu, aby sa uviedlo úplné vyhodnotenie účinkov. Trvanie štúdie má byť dostatočné na posúdenie reverzibility alebo ireverzibility účinkov. Zvieratá vykazujúce pretrvávajúce príznaky silného utrpenia a/alebo bolesti v ktoromkoľvek štádiu testu sa humánnym spôsobom usmrtia a daná látka sa na základe toho zatriedi. Kritéria pre rozhodnutie humánnym spôsobom usmrtiť moribundné a silne trpiace zvieratá je možné nájsť v odkaze (10).

1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.4.

1.4.1. Príprava na in vivo test

1.4.1.

1.4.1.1. Výber druhov Ako laboratórne zviera sa pokiaľ možno použije králik – albín a použijú sa zdravé mladé dospelé zvieratá. Je potrebné uviesť zdôvodnenie, ak sa použijú iné kmene alebo druhy.

1.4.1.2. Príprava zvierat Obe oči každého pokusného zvieraťa, predbežne vybratého na testovanie, sa 24 hodín pred začatím testovania vyšetria. Nepoužijú sa zvieratá vykazujúce podráždenie očí, očné poruchy alebo predchádzajúce zranenie rohovky.

1.4.1.3. Podmienky pre umiestnenie a kŕmenie Zvieratá majú byť umiestnené jednotlivo. Teplota miestnosti na pokusy s králikmi má byť 22 oC (± 3 oC). Aj keď relatívna vlhkosť má byť aspoň 30 % a pokiaľ možno, nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti má dosahovať 50 – 60 %. Osvetlenie má byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.

1.4.2. Postup testu

1.4.2.

1.4.2.1. Aplikácia testovanej látky Testovaná látka sa umiestni do spojovkového vaku jedného oka každého zvieraťa po jemnom odtiahnutí spodného viečka od očnej gule. Viečka sa jemne podržia pri sebe asi jednu sekundu, aby sa zabránilo stratám materiálu. Druhé oko, ktoré nebolo ošetrené, slúži ako kontrola.

1.4.2.2. Vymývanie Oči testovaných zvierat sa nevymývajú aspoň 24 hodín po nakvapkaní testovanej látky, okrem tuhých látok (pozri oddiel 1.4.2.3.2), a v prípade okamžitých leptavých alebo dráždivých účinkov. Po 24 hodinách sa môžu vymyť, ak sa usúdi, že je to potrebné. Použitie vedľajšej skupiny zvierat na vyšetrenie vplyvu vymytia sa neodporúča, pokiaľ to nie je vedecky odôvodnené. Ak je potrebná súbežná skupina, použijú sa dva králiky. Podmienky vymytia sa starostlivo zdokumentujú, napr. čas vymytia; zloženie a teplota vymývacieho roztoku, trvanie, objem a rýchlosť aplikácie.

1.4.2.3. Veľkosť dávky

1.4.2.3.

1.4.2.3.1. Testovanie kvapalín Pre testovanie kvapalín sa používa dávka 0,1 ml. Na nakvapkanie látky priamo do oka sa nepoužijú pumpičkové spreje. Tekutina zo spreja sa vystrieka a zozbiera v nádobke predtým, ako sa vkvapne do oka 0,1 ml.

1.4.2.3.2. Testovanie tuhých látok Pri testovaní tuhých látok, pást a látok, ktoré sú tvorené z častíc, použité množstvo má mať objem 0,1 ml alebo hmotnosť maximálne 100 mg. Testovaný materiál sa pomelie na jemný prášok. Objem tuhého materiálu sa zmeria po jemnom zhutnení, napr. poklepaním nádobky na meranie. Ak testovaná tuhá látka nebola fyziologicky odstránená z oka pokusného zvieraťa pri prvom zisťovaní v časovom bode 1 hodina po ošetrení, oko sa môže vymyť fyziologickým roztokom alebo destilovanou vodou.

1.4.2.3.3. Testovanie aerosólov Odporúča sa, aby sa všetky látky v pumpičkových sprejoch a aerosóloch vystriekali a zozbierali pred nakvapkaním do oka. Jedinou výnimkou sú látky v tlakových aerosólových nádobách, ktoré sa nedajú vystriekať a zozbierať kvôli vyparovaniu. V takýchto prípadoch sa oko ponechá otvorené a testovaná látka sa aplikuje do oka ako jednorazové vstrieknutie približne jednu sekundu zo vzdialenosti 10 cm priamo na prednú časť oka. Táto vzdialenosť sa môže meniť v závislosti od tlaku spreja a jeho obsahu. Pozornosť je potrebné venovať tomu, aby sa tlakom zo spreja nepoškodilo oko. V určitých prípadoch môže byť potrebné posúdiť možnosť mechanického poškodenia oka tlakom kvapaliny zo spreja. Odhad dávky z aerosólu sa môže urobiť simulovaním testu takto: látka sa nasprejuje na navažovací papier cez otvor o veľkosti oka králika, ktoré je umiestnené tesne pred papierom. Na základe zvýšenia hmotnosti papiera sa odhadne množstvo nasprejované do oka. V prípade prchavých látok sa môže dávka odhadnúť tak, že sa nádobka s materiálom odváži pred odstránením testovaného materiálu a po ňom.

1.4.2.4. Počiatočný test (in vivo test podráždenia/poleptania oka na jednom zvierati) Ako sa zdôrazňuje v stratégii postupného testovania (pozri prílohu 1), dôrazne sa odporúča, aby sa v in vivo test uskutočnil najskôr na jednom zvierati. Ak z výsledkov tohto testu vyplynie, že látka je žieravá alebo silne dráždivá pre oko s použitím uvedeného postupu, ďalšie testovanie na očnú dráždivosť nie je potrebné vykonať.

1.4.2.5. Lokálne anestetiká Lokálne anestetiká sa môžu použiť v jednotlivých prípadoch. Ak z kritickej analýzy vyplýva, že látka môže spôsobiť bolesť, alebo počiatočné testovanie ukáže, že sa vyskytne bolestivá reakcia, môže sa pred nakvapkaním testovanej látky použiť lokálne anestetikum. Je potrebné starostlivo zvoliť typ, koncentráciu a dávku lokálneho anestetika, aby sa zabezpečilo, že rozdiely v reakcii na testovanú látku nevzniknú na základe toho, že sa použilo. Kontrolné oko sa rovnako ošetrí anestetikom.

1.4.2.6. Potvrdzujúci test (in vivo test podráždenia oka na ďalších zvieratách) Ak sa v počiatočnom teste nezistí žieravý účinok, dráždivá alebo negatívna reakcia by sa mal potvrdiť na maximálne dvoch ďalších zvieratách. Ak sa zistí silný dráždivý účinok v počiatočnom teste, z ktorého vyplýva silný (ireverzibilný) účinok v potvrdzujúcom testovaní, odporúča sa, aby sa potvrdzujúci test uskutočnil postupným spôsobom v danom čase na jednom zvierati, a nie súčasnou expozíciou dvoch ďalších zvierat. Ak sa na druhom zvierati prejavia žieravé alebo silne dráždivé účinky, test sa preruší. Ďalšie zvieratá môže byť potrebné použiť na potvrdenie slabých alebo miernych dráždivých reakcií.

1.4.2.7. Doba pozorovania Dĺžka času pozorovania má byť dostatočná na celkové posúdenie miery a reverzibility zistených účinkov. Pokus je však potrebné ukončiť vždy, keď zviera vykazuje pretrvávajúce príznaky silnej bolesti alebo utrpenia (9). Na stanovenie reverzibility účinkov sa zvieratá zvyčajne pozorujú spravidla 21 dní po podaní testovanej látky. Ak sa zistí reverzibilita pred uplynutím 21 dní, pokus sa v tomto čase ukončí.

1.4.2.7.

1.4.2.7.1. Klinické pozorovania a vyhodnotenie reakcií oka Oči sa vyšetria po 1, 24, 48 a 72 hodinách po aplikácii testovanej látky. Hneď ako sa získa konečná informácia, zvieratá už nie potrebné ďalej testovať. Zvieratá vykazujúce pretrvávajúce príznaky silného utrpenia alebo bolesti sa ihneď humánnym spôsobom usmrtia a daná látka sa na základe toho posúdi. Zvieratá, ktoré po nakvapkaní majú tieto poškodenia oka, sa humánnym spôsobom usmrtia: perforácia rohovky alebo závažná ulcerácia rohovky vrátane stafylomu; krvácanie prednej komory oka; nepriehľadnosť rohovky 4. stupňa, ktoré pretrváva 48 hodín; chýbajúca reakcia zreničiek na svetlo (reakcia dúhovky stupeň 2), ktorá pretrváva 72 hodín; ulcerácia spojovkovej membrány (conjuctivea); nekróza spojoviek alebo tretieho viečka, alebo odlupovanie. Je to kvôli tomu, že takéto poškodenia zvyčajne nie sú reverzibilné. Zvieratá, u ktorých sa nevyskytlo žiadne poškodenie oka, môžu byť usmrtené najskôr 3 dni po nakvapkaní látky. Zvieratá so slabými až miernymi poškodeniami sa pozorujú, pokiaľ poškodenia nezmiznú, alebo 21 dní, keď je štúdia ukončená. Pozorovania sa uskutočnia na 7., 14. a 21. deň na stanovenie stavu poškodení a ich reverzibility alebo ireverzibility. Stupne reakcií oka (spojovky, rohovky a dúhovky) sa pri každom vyšetrení zaznamenajú (tabuľka I). Každé ďalšie poškodenia oka (napr. panus, sfarbenie) alebo systémové nepriaznivé účinky sa tiež zaznamenajú. Na vyšetrenie reakcií sa môže použiť binokulárna lupa, ručná štrbinová lampa alebo biomikroskop, alebo iný vhodný prístroj. Po tom, ako sa zaznamenajú zistenia po 24 hodinách, sa ďalej môžu oči vyšetriť fluoresceínom. Vyhodnotenie reakcií oka je nevyhnutne subjektívne. Na podporu harmonizácie pri vyhodnotení reakcie oka a na pomoc testovacím laboratóriám a tým, ktorí sú zainteresovaní na uskutočňovaní a interpretovaní výsledkov, musia byť zamestnanci, ktorí uskutočňujú pozorovania, primerane vyškolení na používanie systému hodnotenia.

2. ÚDAJE

2.

2.2. VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV Vyhodnotenie podráždenia oka sa posúdi v súvislosti s charakterom a závažnosťou poškodení a ich reverzibilitou alebo ireverzibilitou. Jednotlivé stupne nepredstavujú absolútne kritérium pre dráždivé vlastnosti materiálu, keďže sa hodnotia aj iné účinky testovaného materiálu. Skôr je potrebné na jednotlivé stupne nazerať ako na referenčné hodnoty, ktoré majú zmysel iba vtedy, keď sú doložené celkovým opisom a posúdením všetkých vyšetrení.

3. PODÁVANIE SPRÁV

3.

3.1. SPRÁVA O TESTE Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:

Zdôvodnenie pre in vivo testovanie: kritická analýza údajov z predchádzajúcich testov, vrátane výsledkov zo stratégie postupného testovania:

opis dôležitých údajov dostupných z predchádzajúceho testovania,

údaje získané v každom štádiu stratégie testovania,

opis uskutočnených in vitro testov, vrátane údajov o postupoch, získaných výsledkov s testovanými/referenčnými látkami,

opis in vivo uskutočnenej štúdie podráždenia/poleptania kože, vrátane získaných výsledkov,

kritická analýza pre uskutočnenie in vivo štúdie.

Testovaná látka:

identifikačné údaje (napr. číslo CAS; zdroj, čistota, známe nečistoty, číslo šarže),

fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. pH, prchavosť, rozpustnosť, stabilita, reaktivita s vodou),

v prípade zmesi, zloženie a vzájomný percentuálny podiel zložiek,

ak sa použije lokálne anestetikum, identifikácia, čistota, typ, dávka a prípadná interakcia s testovanou látkou.

Nosič:

identifikácia, koncentrácia (v prípade potreby), použitý objem,

zdôvodnenie výberu nosiča.

Pokusné zvieratá:

použitý druh/kmeň, zdôvodnenie pre použitie iných zvierat ako králik – albín,

vek každého zvieraťa na začiatku štúdie,

počet zvierat každého pohlavia v testovaných a kontrolných skupinách (v prípade potreby),

hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku a konci testu,

zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.

Výsledky:

opis použitej metódy na hodnotenie podráždenia v každom čase vyšetrenia (napr. ručná štrbinová lampa, biomikroskop, fluorescein),

tabuľkové spracovanie údajov o dráždivých/žieravých účinkoch pre každé zviera v každom čase vyšetrenia až do vylúčenia každého zvieraťa z testu,

podrobný opis stupňa zisteného podráždenia alebo poleptania,

opis všetkých pozorovaných poškodení oka (napr. vaskularizácia, vytvorenie panusu, sfarbenie),

opis iných lokálnych a systémových nepriaznivých účinkov, ktoré sa nevyskytujú na oku, a prípadné histopatologické zistenia.

Diskusia k výsledkom.

3.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Extrapolácia výsledkov štúdií podráždenia oka u laboratórnych zvierat na ľudí je možná len v obmedzenej miere. V mnohých prípadoch je králik – albín citlivejší na látky, ktoré spôsobujú podráždenie alebo poleptanie oka, ako ľudia. Pozornosť je potrebné venovať interpretácii údajov na vylúčenie podráždenia vyplývajúceho zo sekundárnej infekcie.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(09)(10)

ODKAZY Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L, Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410 – 429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N, Roguet, R, Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H, Gupta, K.C., Hill, RN. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159 – 164. Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161 – 177. Young, J.R, How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26. Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483 – 524. Testovacia metóda B.40 Leptanie kože. Testovacia metóda B.4. Akútna toxicita: podráždenie/poleptanie kože. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. V Solne, Švédsko, 22. – 24. januára 1996 (http://www. oecd. org/ehs/test/background. htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, potvrdený 28. spoločným zasadaním Výboru pre chemikálie a Pracovnej skupiny pre chemikálie, november 1998 (http://www. oecd. org/ehs/Class/HCL6. htm). OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tabuľka I STUPNE POŠKODENIA OKA

Rohovka

Nepriehľadnosť (opacita): stupeň zákalu (odčítava sa od najhustejšej oblasti) Žiadna ulcerácia alebo nepriehľadnosť (opacita) … 0 Roztrúsené alebo difúzne oblasti nepriehľadnosti (opacity) (iné ako ľahký zákal normálneho lesku); zreteľne viditeľné detaily dúhovky … 1 Ľahko rozoznateľná priehľadná oblasť; detaily dúhovky mierne zakalené … 2 Perleťová oblasť; neviditeľné detaily dúhovky, veľkosť zreničky ťažko rozoznateľná … 3 Nepriehľadná rohovka; dúhovka nezistiteľná cez zákal … 4 Maximálne možný: 4 POZNÁMKY

Dúhovka

Normálna … 0 Nápadne privreté riasy, prekrvenie, opuch, mierne prekrvenie okolo rohovky; alebo injektácia, dúhovka reaguje na svetlo (pomalá reakcia sa pokladá za pozitívnu) … 1 Krvácanie, hrubé poškodenie, bez reakcie na svetlo … 2 Maximálne možný: 2

Spojovky

Sčervenanie (týka sa palpebrálnych a bulbárnych spojoviek, bez rohovky a dúhovky) Normálne … 0 Niektoré cievy prekrvené (injektované) … 1 Difúzne karmínové zafarbenie, jednotlivé cievy ťažko rozoznateľné … 2 Difúzna tmavá červeň … 3 Maximálne možný: 3

Chemóza

Opuch (týka sa viečok a/alebo tretieho viečka) Normálne … 0 Trocha opuchnuté nad normálom … 1 Zreteľný opuch s čiastočným vyvrátením viečok … 2 Opuch s polovičným uzavretím viečok … 3 Opuch s väčším ako polovičným uzavretím viečok … 4 Maximálne možný: 4

B.6. PODRÁŽDENIE POKOŽKY

B.6.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Poznámky: Citlivosť a schopnosť testov zistiť potenciál senzibilizátorov ľudskej pokožky je považovaný v systéme klasifikácie toxicity dôležitej pre ľudské zdravie za dôležitý. Neexistuje jednoduchá metóda testovania, ktorá by postačujúco rozpoznala všetky látky s potenciálom dráždenia ľudskej pokožky a ktorá by bola vhodná pre všetky látky. Pri výbere testu sa berú do úvahy také faktory, ako sú fyzikálne vlastnosti látky, vrátane jej schopnosti prenikať do pokožky. Skúšky s adjuvansom sú pravdepodobne presnejšie v predpovedi pravdepodobného senzibilizačného účinku na ľudskú pokožku ako metódy bez použitia Freundsovho kompletného adjuvansu, a preto sa im dáva prednosť. Vyvinuli sa dva typy testov, pri ktorých sa používajú morčatá: testy s pomocnou látkou, v ktorých je alergický stav zosilňovaný rozpustením alebo suspendovaním látky v kompletnom Freundsovom adjuvanse (FCA), a testy bez pomocnej látky. Často používaným typom adjuvansového testu je maximalizovaný test morčiat (GPMT). Hoci sa na zistenie potenciálu látky spôsobujúcej precitlivelosť pokožky používajú aj iné metódy, GPMT sa medzi adjuvansovými metódami uprednostňuje. U väčšiny skupín chemikálií sa neadjuvansové metódy (uprednostňuje sa Buehlerov test) považujú za menej citlivé. V určitých prípadoch môžu existovať príčiny pre výber Buehlerovho testu, v ktorom sa využíva miestne použitie namiesto intradermálneho vstrekovania využívaného maximalizovaným testom morčiat (GPMT). Pri použití Buehlerovho testu je nevyhnutné vedecké zdôvodnenie jeho použitia. V tejto metóde je opísaný maximalizovaný test morčiat (GPMT) aj Buehlerov test. Iné metódy sa môžu použiť za predpokladu, že sú dostatočne overené a vedecky zdôvodnené. Ak sa v screeningovom teste zistia pozitívne výsledky, látka sa navrhne ako potenciálny senzibilizátor a nie je potrebné uskutočniť ďalšie testovanie s morčatami. Ak sa v takomto teste zistia negatívne výsledky, je nutné uskutočniť test s morčatami použitím postupu opísaného v tejto testovacej metóde. Pozri aj všeobecný úvod časť B.

1.2. DEFINÍCIE Precitlivenosť pokožky: (alergická kontaktná dermatitída) je imunologicky sprostredkovaná kožná reakcia na látku. U človeka sú reakcie charakterizované svrbením, sčervenaním pokožky, edémami, bradavicami, vezikulami, bulami alebo ich kombináciou. U iných druhov môžu byť reakcie odlišné a môže sa spozorovať iba sčervenanie kože a edémy. Indukcia expozície: experimentálna expozícia jedinca testovanou látkou s cieľom vyvolania precitlivelého stavu. Doba indukcie: doba najmenej jeden týždeň nasledujúca po indukcii expozície, počas ktorej sa vyvinul precitlivelý stav. Opakované vyvolanie reakcie expozíciou: experimentálna expozícia jedinca testovanou látkou nasledujúca po dobe indukcie. Zisťuje sa ňou, či jedinec reaguje hypersenzitívne.

1.3. ODPORÚČANÉ LÁTKY Citlivosť a spoľahlivosť použitej experimentálnej metódy sa stanovuje každých šesť mesiacov použitím látok, u ktorých sú známe mierne účinky na precitlivenosť pokožky. V správne riadených testoch sa očakáva u látok s miernymi účinkami na precitlivenosť pokožky prinajmenšom 30 % odozva v adjuvansovom teste a 15 % v neadjuvansovom teste. Uprednostňujú sa nasledujúce látky: CAS číslo EINECS číslo EINECS názov Bežný názov 101-86-0 202-983-3 aldehyd kys. α-hexyl škoricovej aldehyd kys. α-hexyl škoricovej 149-30-4 205-736-8 benzotiazol-2-tiol (merkaptobenzotiazol) kaptax 94-09-7 202-303-5 benzokaín nordkaín Pri splnení horeuvedených kritérií sa za určitých okolností môžu použiť s primeraným zdôvodnením aj iné kontrolné látky.

1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Na začiatku sú testované zvieratá vystavené účinku testovanej látky intradermálnym vstrekovaním a/alebo epidermálnou aplikáciou (indukcia expozície). Nasleduje vyčkávacie obdobie perióda 10 až 14 dní (indukcia expozície), počas ktorej sa vyvíja imunitná odozva, a potom sa zvieratá vystavia účinku opakovanej dávky. U testovaných zvierat sa rozsah a stupeň reakcie pokožky pri opakovanej expozícii porovná s kontrolnými zvieratami, ktoré boli podrobené simulovanej aplikácii počas indukcie a bola na nich použitá opakovaná expozícia.

1.5. OPIS TESTOVACÍCH METÓD Ak sa považuje za nevyhnutné odstrániť testovanú látku, uskutočňuje sa to vodou alebo vhodným rozpúšťadlom bez toho, aby sa tým zmenila už existujúca odozva, alebo aby bola porušená celistvosť pokožky.

1.5.

1.5.1. Maximalizovaný test morčiat (GPMT)

1.5.1.

1.5.1.1. Príprava Mladé zdravé dospelé morčatá (albíny) sa aklimatizujú na laboratórne podmienky prinajmenšom počas 5-tich dní pred testom. Pred testom sú zvieratá náhodne pridelené do testovaných skupín. Srsť sa im v závislosti od použitej metódy ostrihá, oholí alebo chemicky depiluje. Je nutné chrániť pokožku pred obrúsením. Pred začatím testu a pri jeho ukončení sa zvieratá zvážia.

1.5.1.2. Podmienky testovania

1.5.1.2.

1.5.1.2.1. Testované zvieratá Bežne sa používajú laboratórne kmene albínov morčiat.

1.5.1.2.2. Počet a pohlavie Používajú sa samce a/alebo samice. Ak sa používajú samice musia to byť jedinci, ktoré zatiaľ nerodili, a nie sú tehotné. V testovanej skupine sa používa minimálne 10 zvierat a v kontrolnej skupine 5 zvierat. Ak sa použije menej ako 20 testovaných a 10 kontrolných morčiat a nie je možné dôjsť k záveru, že testovaná látka je senzibilizátor, testuje sa s dodatočnými zvieratami, pričom sa výrazne doporučuje pracovať s minimálne 20 zvieratami v testovanej skupine a 10 zvieratami v kontrolnej skupine.

1.5.1.2.3. Hladiny dávok Koncentrácia testovanej látky pri každej indukcii expozície musí byť systematicky tolerovaná a musí byť použitá najvyššia z dávok spôsobujúcich mierne podráždenie pokožky. Pri opakovanej expozícii sa používa najvyššia dávka nespôsobujúca podráždenie. Ak je to nevyhnutné, vhodné koncentrácie sa určia pri pilotnej štúdii používajúcej dve alebo tri zvieratá. Pri aplikácii sa používa kompletný Freundsov Adjuvans (FCA).

1.5.1.3. Postup

1.5.1.3.

1.5.1.3.1. Indukcia Deň 0 – testovaná skupina Na oblasť pleca zbaveného srsti sa použijú tri páry intradermálneho vstreknutia objemu 0,1 ml. Vstrekovanie 1: zmes 1: 1 (v/v) FCA/voda alebo fyziologický roztok Vstrekovanie 2: vybraná koncentrácia testovanej látky vo vhodnom nosiči Vstrekovanie 3: vybraná koncentrácia testovanej látky zmiešaná so zmesou 1: 1 (v/v) FCA/voda alebo fyziologický roztok. Pri 3. vstrekovaní sú rozpustné látky rozpustené vo vodnej fáze ešte pred zmiešaním s FCA. Lipofilné alebo nerozpustné látky sa suspendujú v FCA ešte pred spojením s vodnou fázou. Výsledná koncentrácia musí byť totožná s koncentráciou použitou pri 2. vstrekovaní. Vstrekovania 1 a 2 sú prevedené blízko seba, a to čo najbližšie k hlave, zatiaľ čo vstrekovanie 3 sa prevedie kaudálnym smerom na testovanom povrchu. Deň 0 – kontrolná skupina Na to isté miesto ako u testovanej skupiny sa použijú tri páry intradermálneho vstreknutia objemu 0,1 ml. Vstrekovanie 1: zmes 1: 1 (v/v) FCA/voda alebo fyziologický roztok Vstrekovanie 2: neriedený nosič Vstrekovanie 3: zmes 50 % v/v nosiča v zmesi 1: 1 (v/v) FCA/voda alebo fyziologický roztok. Deň 5 – 7 – testovaná a kontrolná skupina. V prípade látky, ktorá nedráždi pokožku, sa približne dvadsať štyri hodín pred uskutočnením indukcie pri lokálnom nanášaní testovaný povrch po ostrihaní a/alebo oholení ošetrí 0,5 ml 10 % sodnej soli sulfátu kyseliny laurovej vo vazelíne, čím sa lokálne podráždenie vyvolá. Deň 6 – 8 – testovaná skupina Na testovanej ploche sa opäť odstráni srsť. Filtračný papier (2 × 4 cm) zmáčaný testovanou látkou vo vhodnom nosiči sa priloží na testovaný povrch a počas 48 hodín sa udržuje s ním v kontakte pomocou nepriepustného obväzu alebo nepriepustného obalu. Deň 6 – 8 – kontrolná skupina Na testovanej ploche sa opäť odstráni srsť. Podobným spôsobom sa vhodný nosič priloží na testovaný povrch a počas 48 hodín sa udržuje v kontakte s ním pomocou nepriepustného obväzu alebo nepriepustného obalu.

1.5.1.3.2. Opakovaná aplikácia Deň 20 – 22 – testovaná a kontrolná skupina Z bokov testovaných a kontrolných zvierat sa odstráni srsť. Náplasť zmáčaná testovanou látkou sa použije na jeden bok zvierat, a ak je to potrebné, na druhý bok sa použije náplasť zmáčaná samotným nosičom. Náplasti sa počas 24 hodín udržujú v kontakte s testovaným povrchom pomocou nepriepustného obväzu alebo obalu.

1.5.1.3.3. Pozorovania a odstupňovanie odozvy: testovaná a kontrolná skupina Odporúča sa uskutočnenie slepého pokusu testovaných aj kontrolných zvierat. Ak je potrebné potvrdiť výsledky získané opakovanou aplikáciou, uskutoční sa opätovná opakovaná aplikácia s použitím novej kontrolnej skupiny. Táto aplikácia sa prevádza približne jeden týždeň po prvej. Opätovná opakovaná aplikácia sa tiež prevádza s pôvodnou kontrolnou skupinou. Všetky kožné reakcie a nezvyčajné nálezy, vrátane systémových reakcií, zistené pri metóde indukčnej aj opakovanej aplikácie je nutné zaznamenať podľa klasifikačnej škály Magnusson/Kligman (pozri dodatok). Pri objasňovaní nejednoznačných reakcií sa uskutočňujú ďalšie postupy, napríklad histopatologické vyšetrenie alebo meranie hrúbky zriasenia pokožky.

približne 21 hodín po odstránení náplasti je testovaný povrch vyčistený, ostrihaný a/alebo vyholený a depilovaný, ak je to nevyhnutné,

približne o 3 hodiny neskôr (približne 48 hodín po začatí opakovanej aplikácie) sa sleduje kožná reakcia a pozorovanie sa zaznamená podľa stupňov uvedených v dodatku,

približne 24 hodín po tomto a druhom (72 hodín) pozorovaní sa pozorovanie uskutoční opäť a zaznamená sa.

1.5.2. Buehlerov test

1.5.2.

1.5.2.1. Príprava Mladé zdravé dospelé morčatá (albíny) sa aklimatizujú na laboratórne podmienky prinajmenšom počas 5-tich dní pred testom. Pred testom sú zvieratá náhodne pridelené do testovaných skupín. Srsť sa im v závislosti od použitej metódy ostrihá, oholí alebo chemicky depiluje. Je nutné chrániť pokožku pred obrúsením. Pred začatím testu a pri jeho ukončení sa zvieratá zvážia.

1.5.2.2. Podmienky testovania

1.5.2.2.

1.5.2.2.1. Testované zvieratá Bežne sa používajú laboratórne kmene albínov morčiat.

1.5.2.2.2. Počet a pohlavie Používajú sa samce a/alebo samice. Ak sa používajú samice, musia to byť jedince, ktoré zatiaľ nerodili a nie sú tehotné. V testovanej skupine sa používa minimálne 20 zvierat a v kontrolnej skupine 10 zvierat.

1.5.2.2.3. Hladiny dávok Pri každej indukcii expozície sa používa koncentrácia testovanej látky zodpovedajúca najvyššej dávke spôsobujúcej mierne, ale nie nadmerné podráždenie pokožky. Pri opakovanej expozícii sa používa najvyššia dávka nespôsobujúca podráždenie. Ak je to nevyhnutné, vhodné koncentrácie sa určia pri pilotnej štúdii, ktorá používa dve alebo tri zvieratá. Pre testované látky rozpustné vo vode je vhodné použiť vodu alebo zriedený roztok zmáčadla ako nosiča. U iných testovaných materiálov sa uprednostňuje pri indukčnej aplikácii 80 % etanol/voda a pri opakovanej aplikácii acetón.

1.5.2.3. Postup

1.5.2.3.

1.5.2.3.1. Indukcia Deň 0 – testovaná skupina Jeden bok je vyčistený od srsti (krátkym ostrihaním). Náplasti musia byť zmáčané testovanou látkou vo vhodnom nosiči (výber nosiča musí byť oprávnený; ak je to výhodné, môžu byť kvapalné testované látky použité neriedené). Náplasť sa použije na testovaný povrch a počas 6 hodín sa udržuje s ním v kontakte pomocou vhodného obväzu alebo obalu. Náplasti musia byť nepriepustné. Vhodné sú bavlnené vankúšiky buď kruhového, alebo štvorcového tvaru veľkosti približne 4 – 6 cm2. Uprednostňuje sa zabezpečenie pohltenia použitím vhodných ochranných materiálov. Pri použití obväzovania je možné, že sa bude musieť použiť doplňujúca expozícia. Deň 0 – kontrolná skupina Jeden bok je vyčistený od srsti (krátkym ostrihaním). Použije sa iba nosič, a to obdobne ako pri kontrolnej skupine. Náplasť sa počas 6 hodín udržuje v kontakte s pokožkou pomocou nepriepustného obväzu alebo obalu. Ak je dokázané, že nie je nevyhnutné použiť simulovanú kontrolnú skupinu, používa sa obyčajná kontrolná skupina. Deň 6 – 8 a 13 – 15 – testovaná a kontrolná skupina Na tej istej testovanej ploche (ak je to potrebné, vyčistenej) toho istého boku sa používa tá istá aplikácia ako v 0. dni aj v 6. – 8. dni a aj v 13. – 15. dni.

1.5.2.3.2. Opakovaná aplikácia Deň 27 – 29 – testovaná a kontrolná skupina Netestovaný bok testovaných a kontrolných zvierat sa vyčistí od srsti (krátkym ostrihaním). Vhodné množstvo testovanej látky na nepriepustnom obväze alebo v obale sa použije na zadnú časť netestovaného boku testovaných a kontrolných zvierat. Používa sa maximálna koncentrácia, pri ktorej nedochádza k podráždeniu. Ak je to vhodné, na predtým netestovanú časť boku testovaných aj kontrolných zvierat sa použije nepriepustná náplasť alebo obal s nosičom. Nepriepustná náplasť alebo obal prichytený vhodným obväzom sa udržuje v kontakte s pokožkou počas 6 hodín.

1.5.2.3.3. Pozorovania a odstupňovanie odozvy: testovaná a kontrolná skupina Odporúča sa uskutočnenie slepého pokusu testovaných aj kontrolných zvierat. Ak je potrebné potvrdiť výsledky získané prvou opakovanou aplikáciou, uskutoční sa druhá opakovaná aplikácia s použitím novej kontrolnej skupiny. Táto aplikácia sa prevádza približne jeden týždeň po prvej. Opätovná opakovaná aplikácia sa uskutočňuje tiež s pôvodnou kontrolnou skupinou. Všetky kožné reakcie a nezvyčajné nálezy, vrátane systémových reakcií, zistené pri metóde indukčnej aj opakovanej aplikácii je nutné sledovať a zaznamenať podľa klasifikačnej škály Magnusson/Kligman (pozri prílohu). Pri objasňovaní nejednoznačných reakcií sa uskutočňujú ďalšie postupy, napríklad histopatologické vyšetrenie alebo meranie hrúbky zriasenia pokožky.

približne 21 hodín po odstránení náplasti je testovaný povrch opäť vyčistený od srsti,

približne o 3 hodiny neskôr (asi 30 hodín po začatí opakovanej aplikácie) sa sleduje kožná reakcia a pozorovanie sa zaznamená podľa stupňov uvedených v dodatku,

približne 24 hodín po predchádzajúcom pozorovaní (asi 54 hodín po opakovanej aplikácii) sa uskutoční ďalšie pozorovanie a opäť sa zaznamená.

2. ÚDAJE (GPMT A BUEHLER) Všetky údaje musia byť zhrnuté v tabuľkovej forme s každou pozorovanou reakciou podráždenia pokožky zvieraťa.

3. SPRÁVA (GPMT A BUEHLER) Ak sa pred testom morčiat uskutoční screeningová skúška, je potrebné uviesť spolu s výsledkami uskutočneného testu a odporúčanými testovacími látkami aj opis alebo odkaz na screeningovú skúšku (napríklad skúška lokálnych lymfatických uzlín (LLNA), test opuchnutia ucha u myší (MEST)), vrátane podrobností o postupoch.

3. Správa o teste (GPMT a Buehler)

Správa o teste má obsahovať, pokiaľ je to možné, nasledujúce informácie:

Testované zvieratá:

kmeň použitých morčiat,

počet, vek a pohlavie zvierat,

zdroj, podmienky bývania, strava atď.,

individuálne hmotnosti zvierat na začiatku testu.

Podmienky testovania:

metódu prípravy náplastí,

podrobnosti o materiáli náplastí a technike ich použitia pri testovaní,

výsledky pilotnej štúdie s vyhodnotením koncentrácií použitých pri indukčnej a opakovanej aplikácii,

podrobnosti o príprave použitej látky, o jej aplikácii a odstránení,

zdôvodnenie výberu nosiča,

koncentrácie nosiča a testovanej látky použité pri indukčnej a opakovanej expozícii a celkové množstvo aplikovanej látky použitej pri indukcii aj opakovanej expozícii.

Výsledky:

zostavenie tabuliek posledných výsledkov precitlivenosti a kontrole spoľahlivosti (pozri 1.3) vrátane informácií o testovanej látke, jej koncentrácii a nosiči,

o každom zvierati vrátane systému stupňovania dávok,

podrobný opis povahy a stupňa pozorovaných účinkov,

histopatologické nálezy.

Diskusia

Záver

4. ODKAZY Táto metóda je obdobná OECD TG 406.

B.7. TOXICITA PO 28-DŇOVEJ OPAKOVANEJ DÁVKE PO ORÁLNEJ APLIKÁCII

B.7.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Pozri všeobecný úvod časť B.

1.2. DEFINÍCIE Pozri všeobecný úvod časť B.

1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Niekoľkým skupinám experimentálnych zvierat sa denne orálne podáva testovaná látka v odstupňovaných dávkach spôsobom, pri ktorom sa každej skupine podáva jedna dávka počas 28-dňovej periódy. Počas periódy podávania sa zvieratá často pozorujú, pričom sa denne kontroluje prítomnosť znakov toxického účinku. Pitva sa uskutoční aj na zvieratách uhynutých alebo usmrtených počas testovania, tak aj po ukončení testu na zvieratách, ktoré test prežijú. Pri tejto metóde sa kladie väčší dôraz na neurologické účinky ako osobitný parameter a zvláštnu pozornosť je potrebné venovať klinickým pozorovaniam zvierat tak, aby sa získalo čo najviac informácií. Pri tejto metóde je potrebné určiť neurotoxický potenciál látok a získať tak oprávnenie pre podrobné preskúmanie tohto aspektu. Naviac môže táto metóda poskytnúť indikácie o imunologických účinkoch a o toxicite na reprodukčné orgány.

1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.4.

1.4.1. Príprava Náhodne sa do kontrolných a testovaných skupín vyberú mladé zdravé dospelé zvieratá. Klietky sa musia umiestniť tak, že bude minimalizovaný vplyv umiestnenia na účinky. Zvieratá musia byť jednoznačne rozpoznateľné a najmenej 5 dní pred začiatkom testovania sú držané v klietkach, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky. Testovaná látka sa podáva žalúdočnou sondou alebo prostredníctvom stravy alebo pitnej vody. Metóda orálnej aplikácie závisí od účelov testovania a od fyzikálno-chemických vlastností látok. Ak je potrebné, testovaná látka sa rozpustí alebo je suspendovaná vo vhodnom nosiči. Ako prvé sa, pokiaľ je to možné, odporúča použitie vodných roztokov alebo suspenzií, ako druhé použitie (kukuričných) olejových roztokov alebo suspenzií a potom iných roztokov v iných nosičoch. Toxické vlastnosti nevodných nosičov by mali byť známe. Stabilita testovanej látky v nosiči sa musí stanoviť.

1.4.2. Podmienky testovania

1.4.2.

1.4.2.1. Testované zvieratá Uprednostňovaným druhom zvierat sú potkany, aj keď sa môžu použiť aj iné hlodavce. Používajú sa bežné laboratórne kmene mladých zdravých a dospelých jedincov. Musia sa vybrať samice, ktoré zatiaľ nerodili, a nie sú tehotné. Testovanie je nutné začať čo najskôr po odstavení dojčiat a v niektorých prípadoch pred dosiahnutím veku deväť týždňov. Na začiatku štúdie musia byť rozdiely hmotností zvierat minimálne a nesmú presahovať 20 % priemernej hmotnosti u každého pohlavia. Ak je štúdia opakovanej orálnej dávky predbežnou štúdiou dlhodobej štúdie, pokiaľ je to možné, používajú sa v oboch štúdiách zvieratá toho istého kmeňa a z toho istého zdroja.

1.4.2.2. Počet a pohlavie Na každej hladine dávkovania sa použije prinajmenšom 10 zvierat (päť samíc a päť samcov). Ak sa medzitým plánuje usmrcovanie zvierat, ich množstvo sa zvyšuje o plánovaný počet zvierat, ktoré sa usmrtia pred ukončením štúdie. Môže sa naviac použiť sprievodná skupina 10 zvierat (5 z každého pohlavia), ktorej sa podáva vyššia dávka počas 28 dní a sleduje sa reverzibilita, perzistencia, alebo oneskorovanie toxických účinkov počas 14 dní po ukončení aplikácie. Tak isto sa používa sprievodná skupina 10 kontrolných zvierat (5 z každého pohlavia).

1.4.2.3. Hladiny dávok Bežne sa používajú tri testované a jedna kontrolná skupina. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaobchádzať tak isto ako so zvieratami v testovaných skupinách s výnimkou podania testovanej látky. Ak sa pri podávaní testovanej látky používa nosič, kontrolná skupina ho musí dostať v najvyššom objeme, v akom je použitý v testovaných skupinách. Ak sa zo zhodnotenia iných údajov neočakávajú žiadne účinky pri dávke 1000 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, uskutočňuje sa limitný test. Ak nie sú k dispozícii žiadne vhodné údaje, uskutočňuje sa vyhľadávací test s cieľom stanoviť dávky, ktoré sa použijú. Pri výbere hladín dávok sa berú do úvahy existujúce údaje o toxicite a (toxiko-) kinetike testovanej látky a príbuzných látok. Najvyššia dávka sa vyberá tak, aby indukovala toxické účinky, ale nespôsobovala uhynutie zvierat alebo vážne utrpenie. Podľa toho sa vyberá aj znižujúca sa postupnosť hladín dávok s cieľom určenia závislosti odozvy od dávky a stanovenia hodnoty NOAEL pri najnižšej hladine. Pri nastavovaní klesania úrovní sú často najvhodnejšie dvoj- až štvorúrovňové intervaly a pridanie štvrtej testovacej skupiny sa považuje za výhodnejšie z dôvodu zvýšenia veľkosti intervalov (napríklad viac ako o faktor 10) medzi hladinami dávok. Pri látkach podávaných prostredníctvom stravy alebo pitnej vody je dôležité sa uistiť, že používané množstvá testovanej látky neinterferujú s obvyklou výživovou hodnotou stravy alebo s vodnou rovnováhou. Testovaná látka sa v strave podáva buď pri konštantnej koncentrácii v strave (ppm), alebo pri konštantnej hladine vzhľadom na telesnú hmotnosť zvierat; použitá alternatíva musí byť určená. Pri podávaní žalúdočnou sondou sa dávka používa v rovnakom čase každý deň a prispôsobuje sa telesnej hmotnosti zvierat, čím sa zachová konštantnosť dávky. Ak je štúdia opakovanej orálnej dávky predbežnou štúdiou dlhodobej štúdie, v obidvoch štúdiách sa používa rovnaká strava.

1.4.2.4. Limitný test Ak sa zistí, že test pri jednej hladine najmenej 1000 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, alebo rovnocenné množstvo v percentách v strave alebo v pitnej vode (založené na určení telesnej hmotnosti) nespôsobil u testovaných zvierat žiadne toxické príznaky, a ak sa toxické účinky neočakávajú ani na základe údajov štruktúrne príbuzných zlúčenín, potom sa nepovažuje za nevyhnutné uskutočniť celú štúdiu s použitím troch hladín. Výnimkou je prípad, keď expozícia človeka indikuje potrebnosť skúmania na vyššej hladine, a vtedy sa používa limitný test.

1.4.2.5. Doba pozorovania Doba pozorovania trvá 28 dní. Zvieratá v sprievodnej skupine, ktoré sa plánujú použiť pri ďalšom sledovaní, sa držia najmenej ďalších 14 dní bez akéhokoľvek podávania, aby bolo možné zistiť oneskorené účinky alebo ich perzistenciu, alebo zotavenie sa po nich.

1.4.3. Postup Dávky sú zvieratám podávané denne sedem dní v týždni počas obdobia 28 dní, použitie 5-dňového režimu dávkovania je nutné zdôvodniť. Ak sa testovaná látka podáva žalúdočnou sondou, uskutočňuje sa to v jednej dávke a to buď žalúdočnou sondou, alebo vhodnou intubačnou kanylou. Maximálny objem kvapaliny, ktorý môže byť použitý naraz závisí od veľkosti testovaných zvierat. Objem nesmie presiahnuť 1 ml/100 g telesnej hmotnosti s výnimkou vodných roztokov, pri ktorých sa používa objem 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Kolísanie objemu sa minimalizuje nastavením koncentrácie, aby sa zabezpečil konštantný objem pri všetkých dávkovaných úrovniach, s výnimkou dráždiacich alebo žieravých látok, ktoré bežne so zvyšujúcou sa koncentráciou zhoršujú účinky.

1.4.3.

1.4.3.1. Všeobecné pozorovania Najmenej raz denne je nutné uskutočniť všeobecné klinické pozorovania, najlepšie vždy v tom istom čase s ohľadom na časový vrchol očakávaných účinkov po podaní. Zaznamenáva sa zdravotný stav zvierat. Najmenej dvakrát denne si treba všímať chorobnosť a úmrtnosť zvierat. Pri zaznamenaní umierajúcich zvierat a zvierat viditeľne trpiacich alebo viditeľne pociťujúcich bolesť sa tieto odstránia, humánne usmrtia a prevedie sa ich pitva. Raz pred prvou aplikáciou (je dovolené porovnanie jednotlivých zvierat medzi sebou) a potom najmenej raz týždenne sa uskutočňujú u všetkých zvierat podrobné klinické skúmania. Uskutočňujú sa mimo domovských klietok, pokiaľ možno, vždy v tom istom čase. Pozorovania sa starostlivo zaznamenávajú najlepšie systémom čiarok v políčkach podrobne formulovanými testujúcim laboratóriom. Je potrebné zaistiť čo najmenšie zmeny testovacích podmienok a výhodné je, ak pozorovania vedie pozorovateľ nepoznajúci postup testovania. Medzi príznaky, ktoré je potrebné si všímať, patria zmeny na koži, kožušine, očiach, sliznici, výskyt sekrécie, exkrécie a vegetatívnej aktivity (slzenie, piloerekcia, veľkosť zreničiek, nezvyčajné dýchanie), ale uvedené príznaky nie sú vyčerpávajúce. Zmeny chôdze, postoj a reakcia na manipuláciu, ako aj prítomnosť šklbavých pohybov alebo svalové napätie, stereotypné (napríklad nadmerné očisťovanie tela, opakované krúženie) alebo výstredné správanie (napríklad samozmrzačovanie, cúvanie) je nutné tiež zaznamenať. Vo štvrtom týždni expozície sa uskutočňuje určenie zmyslovej reaktivity podnecovanej odlišnými spôsobmi (napríklad zvukovými, zrakovými a proprioceptívnymi podnetmi), určenie sily zovretia a určenie motorickej aktivity. Ďalšie podrobnosti o postupoch, ktoré sa majú uskutočniť, sú uvedené v literatúre (pozri všeobecný úvod časť B). Funkčné pozorovania vo štvrtom týždni expozície sa nemusia uskutočniť, ak je štúdia uskutočňovaná ako predbežná štúdia subchronickej štúdie (90 dní).V tomto prípade sa funkčné pozorovania uskutočnia v nasledujúcej štúdii. Na druhej strane, dostupnosť údajov o funkčných pozorovaniach zo štúdie opakovanej dávky zvyšujú možnosť výberu úrovní dávkovaných v nasledujúcej subchronickej štúdii. Výnimočne sa nemusia uskutočniť funkčné pozorovania u skupiny, v ktorej sa inak preukážu toxické príznaky v takom rozsahu, že by mohli významne interferovať s uskutočnením funkčných testov.

1.4.3.2. Telesná hmotnosť a spotreba potravy/vody Všetky zvieratá sa vážia najmenej raz za týždeň. Meranie spotreby potravy a vody sa uskutočňuje najmenej raz za týždeň. Pokiaľ je testovaná látka podávaná v pitnej vode, meria sa aj spotreba vody najmenej raz za týždeň.

1.4.3.3. Hematológia Na konci testovacieho obdobia sa uskutočňujú nasledujúce hematologické testy: hematokrit, koncentrácia hemoglobínu, počet erytrocytov, celkový a diferenčný počet leukocytov, počet krvných doštičiek a meranie času/potenciálu zrážanlivosti krvi. Vzorky krvi sa odoberajú zo stanoveného miesta tesne pred alebo počas postupu usmrtenia zvierat a uchovávajú sa za vhodných podmienok.

1.4.3.4. Klinická biochémia Klinická biochémia skúma hlavné toxické účinky v tkanivách a najmä účinky na obličky a pečeň. Vyšetrenie sa uskutočňuje zo vzoriek krvi, ktoré sa odoberajú všetkým zvieratám tesne pred alebo počas postupu usmrtenia zvierat a uchovávajú sa za vhodných podmienok (okrem uhynutých a/alebo práve usmrtených zvierat). Noc pred odberom vzoriek krvi sa odporúča zvieratám potravu nepodávať. Vyšetrenie plazmy alebo séra zahŕňa sodík, draslík, glukózu, celkový cholesterol, močovinu, kreatinín, celkové proteíny a albumín, najmenej dva enzýmy indukujúce hepatocelulárne účinky (ako alanín-aminotransferáza, aspartát-aminotransferáza, alkalická fosfatáza, gamaglutamyl transpeptidáza a sorbitol-dehydrogenáza). Meranie ďalších enzýmov (hepatálneho alebo iného pôvodu) a žlčových kyselín môže za určitých okolností poskytnúť užitočné informácie. Nepovinne sa uskutočňujú počas posledného týždňa štúdie nasledujúce analýzy moču, ktorý sa zhromažďuje v závislosti od času: vzhľad, objem, osmolalita alebo určitá hmotnosť, pH, proteíny, glukóza a krv/krvinky. Navyše sa berú do úvahy aj štúdie na vyšetrenie sérových markerov poškodenia hlavných tkanív. Ďalšie stanovenia sa uskutočňujú, ak známe vlastnosti testovanej látky môžu ovplyvňovať alebo sú podozrievané z toho, že ovplyvňujú príbuzné metabolické profily vrátane vápnika, fosfátov, stálych triglyceridov, určitých hormónov, methemoglobínu a cholínesterázy. Tieto parametre je potrebné určiť pri látkach určitých tried alebo od jedného prípadu k druhému. Celkovo je potrebný pružný prístup, ktorý závisí od druhu zvierat a od pozorovaných a/alebo očakávaných účinkov s danou látkou. Ak je historická databáza údajov nedostatočná, musí sa pred začatím podávania odôvodniť uskutočnenie stanovenia hematologických a klinickobiochemických premenných.

1.4.3.5. Makroskopická pitva Všetky zvieratá v štúdii sa podrobujú kompletnej podrobnej makroskopickej pitve, ktorá zahŕňa starostlivé skúmanie vonkajšieho povrchu tela, všetky otvory a lebečnú, hrudnú a brušnú dutinu a ich obsah. Pečeň, obličky, nadobličky, semenníky, nadsemenníky, týmus, slezina, mozog a srdce všetkých zvierat sa v prípade potreby orežú od prirastených tkanív a odvážia sa za mokra čo najskôr po pitve, aby sa zabránilo ich vysušeniu. V čo najvhodnejších stabilizačných médiách sa uchovávajú obidva druhy tkanív a kvôli budúcemu histopatologickému skúmaniu sa uchovávajú nasledujúce tkanivá: všetky makroskopické poškodenia tkaniva, mozog (reprezentatívne časti vrátane mozgu, mozočka a mosta), miecha, žalúdok, tenké a hrubé črevo (vrátane Peyerových škvŕn), pečeň, obličky, nadoblička, slezina, srdce, týmus, štítna žľaza, priedušnica a pľúca (konzervované nafúknutím fixačným prostriedkom a potom ponorením doň), pohlavné žľazy, vedľajšie pohlavné orgány (napríklad maternica, prostata), močový mechúr, lymfatické uzliny (pokiaľ možno jednu lymfatickú uzlinu na skúmanie trasy podávanej látky a jednu vzdialenejšiu od miesta podania na skúmanie systémových účinkov), periférne nervy (ischiatické alebo holenné) prednostne blízko roximálneho svalu a časť kostnej drene (alebo ako náhrada mikroskopicky odsatá čerstvá kostná dreň). Klinické a ďalšie nálezy naznačujú potrebu skúmania ďalších tkanív. Podobne sa uchovávajú aj orgány považované za cieľové orgány na základe známych vlastností testovanej látky.

1.4.3.6. Histopatologické vyšetrenie Úplná histopatológia sa uskutočňuje na uchovaných orgánoch a tkanivách všetkých zvierat v kontrolnej skupine aj v skupinách testovaných vysokými dávkami. Histopatologické vyšetrenie sa môže rozšíriť aj na zvieratá v skupinách s iným dávkovaním, ak sa pozorovali od dávky závislé zmeny v skupine s vysokou dávkou. Skúmajú sa všetky makroskopické poškodenia. Pri použití sprievodnej skupiny zvierat sa histopatológia uskutoční na tkanivách a orgánoch, pri ktorých v testovaných skupinách boli zistené nejaké účinky.

2. ÚDAJE Pre každé zviera sa musia zabezpečiť osobitné údaje. Navyše všetky údaje sa musia zhrnúť v tabuľkovej forme, pričom ukazujú pre každú testovanú skupinu počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat uhynutých počas testu alebo usmrtených z humánnych dôvodov, čas uhynutia alebo humánneho usmrtenia jednotlivých zvierat, počet zvierat, u ktorých sa prejavili známky toxicity, opis pozorovaných známok toxicity vrátane nábehu, času a prudkosti toxických účinkov, počet zvierat vykazujúcich poškodenie, typy poškodení a percentuálne množstvo zvierat, u ktorých sa prejavil daný typ poškodenia. Ak je to možné, numerické výsledky sa vyhodnotia vhodnou a všeobecne prijateľnou štatistickou metódou. Štatistická metóda sa vyberá počas plánovania štúdie.

3. SPRÁVA

3. SPRÁVA Z TESTU

Správa z testu má obsahovať, pokiaľ je to možné, nasledujúce informácie:

Testované zvieratá:

druh/použitý kmeň,

počet, vek a pohlavie zvierat,

zdroj, podmienky bývania, stravu atď.,

individuálne hmotnosti zvierat na začiatku testu, v týždenných intervaloch po začiatku a na konci testu.

Podmienky testovania:

zdôvodnenie iného výberu nosiča ako voda,

logické zdôvodnenie výberu dávky,

podrobnosti o príprave testovanej látky/príprave potravy (krmiva), dosiahnutých koncentráciách, stabilite a homogenite prípravku,

podrobnosti o podávaní testovanej látky,

prepočet z koncentrácie testovanej látky v potrave (krmive)/vode (ppm) na skutočnú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/deň), ak bolo použité,

podrobnosti o kvalite potravy (krmiva) a vody.

Výsledky:

telesná hmotnosť/zmeny telesnej hmotnosti,

spotreba potravy a spotreba pitnej vody, ak sa použila,

údaje o toxickej odozve podľa pohlavia a dávky vrátane príznakov toxicity,

povaha, intenzita a trvanie klinických pozorovaní (či boli reverzibilné, alebo nie),

senzorická aktivita, sila zovretia a určenie motorickej aktivity,

hematologické testy s príslušnou základňou hodnôt,

klinickobiochemické testy s príslušnou základňou hodnôt,

telesná hmotnosť pri usmrtení a údaje o hmotnosti orgánov,

pitevné nálezy,

podrobný opis všetkých histopatologických nálezov,

údaje o absorpcii, ak sú prístupné,

štatistické spracovanie výsledkov, ak je vhodné.

Diskusia.

Záver.

4. ODKAZY Táto metóda je podobná OECD TG 407.

B.8. TOXICITA PO 28-DŇOVEJ OPAKOVANEJ DÁVKE (INHALAČNÁ)

B.8.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Je užitočné mať vopred k dispozícii údaje o distribúcii veľkosti častíc, o tlaku pary, teplote topenia, teplote varu, teplote vzplanutia a prípadne o výbušnosti látky. Pozri aj všeobecný úvod časť B (A).

1.2. POJMY Pozri všeobecný úvod časť B (B).

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNE J METÓDY Viaceré skupiny pokusných zvierat sa denne vystavujú na určitý čas testovanej látke v odstupňovaných koncentráciách na 28 dní, pričom sa použije jedna koncentrácia pre každú skupinu. Ak sa použije pomocná látka, aby sa vytvorila vhodná koncentrácia testovanej látky v atmosfére, musí sa nasadiť kontrolná skupina s pomocnou látkou. Počas trvania testu sa zvieratá denne pozorujú, aby sa zistili symptómy toxických účinkov. Zvieratá, ktoré uhynú počas testu, a zvieratá, ktoré prežili do konca testu, sa pitvú.

1.5 KRITÉRIÁ KVALITY Žiadne.

1.6. OPIS SKÚŠOBNE J METÓDY

1.6.

1.6.1. Príprava Zvieratá si pred začatím testu zvykajú minimálne 5 dní na experimentálne chovateľské a kŕmne podmienky. Pred testom sa mladé zdravé zvieratá randomizujú a priraďujú k potrebnému počtu skupín. Ak je to potrebné, môže sa k testovanej látke pridať vhodné vehikulum, aby sa získala želaná koncentrácia testovanej látky vo vzduchu. Ak sa na zjednodušenie podávania použije ehikulum alebo iná prísada, musí byť o nej známe, že nemá toxické účinky. Na tento účel sa môžu prípadne použiť údaje z predošlých testov.

1.6.2. Podmienky skúšania

1.6.2.

1.6.2.1. Pokusné zvieratá Ak neexistujú mimoriadne dôvody proti, mali by sa vykonávať testy s potkanmi. Používajú sa zdravé mladé zvieratá známych testovaných kmeňov. Odchýlka telesnej hmotnosti zvierat pre daný test by nemala byť na začiatku testu viac ako ± 20 % od príslušnej strednej priemernej hodnoty.

1.6.2.2. Počet a pohlavie Pre každú veľkosť dávky sa použije najmenej 10 zvierat (päť samičiek a päť samcov). Samičky musia byť nezapustené a nesmú byť gravidné. Ak sa medzitým plánuje usmrcovanie zvierat, ich množstvo sa zvyšuje o plánovaný počet zvierat, ktoré sa usmrtia pred ukončením štúdie. Môže sa použiť sprievodná skupina najviac 10 zvierat (päť z každého pohlavia), ktorej sa aplikuje vyššia dávka počas 28 dní, a sleduje sa reverzibilita, perzistencia alebo oneskorovanie toxických účinkov počas 14 dní po ukončení aplikácie. Takisto sa používa sprievodná skupina 10 kontrolných zvierat (päť z každého pohlavia).

1.6.2.3. Expozičná koncentrácia Musia sa zvoliť minimálne tri koncentrácie, ako aj jedna kontrolná skupina, alebo ak sa použila pomocná látka, jedna kontrolná skupina s pomocnou látkou (podľa koncentrácie pomocnej látky pri najvyššej expozičnej koncentrácii). Odhliadnuc od expozície s testovanou látkou, ošetrujú sa zvieratá kontrolnej skupiny takisto ako pokusné zvieratá. Najvyššia koncentrácia sa volí tak, aby v každom prípade vznikli toxické účinky, ale aby zvieratá neuhynuli alebo iba v malom množstve. Najnižšia dávka nesmie vyvolať žiadne príznaky toxicity. Ak existujú použiteľné odhady o výške expozície u človeka, tak by najnižšia koncentrácia nemala prekročiť túto hodnotu. Podľa možnosti by stredná koncentrácia mala spôsobovať len malé zistiteľné toxické účinky. Ak sa podávajú viaceré medzikoncentrácie, tak by sa mali voliť tak, aby došlo k postupnej klasifikácii toxických účinkov. V skupinách s nízkou a strednou koncentráciou, ako aj v kontrolných skupinách by mal byť počet prípadov úmrtí nízky, aby sa umožnilo výrazné vyhodnotenie výsledkov.

1.6.2.4. Expozičná doba Denná expozičná doba by mala byť šesť hodín, na základe špecifických požiadaviek sa môže prípadne ukázať, že sú nutné aj iné časové intervaly.

1.6.2.5. Vybavenie Pre testy so zvieratami by sa malo používať inhalačné zariadenie, ktoré umožňuje dynamické prúdenie vzduchu s výmenou vzduchu minimálne 12-krát za hodinu, aby sa zabezpečil dekvátny obsah kyslíka a rovnomerne rozdelená expozičná atmosféra. Ak sa používa komora, tak sa zostaví tak, aby pokusné zvieratá boli čo najmenej stlačené a aby sa maximalizovala expozícia testovanej látke inhaláciou. Na zabezpečenie stability atmosféry v inhalačnej komore by nemal celkový objem pokusných zvierat zásadne prekročiť 5 % objemu komory. Používajú sa expozície oronazálnej oblasti, hlavy a celého tela v inhalačných komorách; prvé dva druhy expozície slúžia na obmedzenie príjmu testovanej látky inými cestami.

1.6.2.6. Čas pozorovania Pri pokusných zvieratách sa počas celého času pozorovania neexponovanej fázy denne sledujú symptómy toxických účinkov. Nástup smrti a čas, keď sa prejavia symptómy a keď zaniknú, sa musia zachytiť.

1.6.3. Postup Zvieratá sa vystavujú testovanej látke denne 5 až 7 dní za týždeň počas 28 dní. Zvieratá satelitnej skupiny, ktoré sú určené na dodatočné pozorovanie, by mali byť nasledujúcich 14 dní bez expozície, aby sa zistila reverzibilita toxických efektov alebo ich pretrvávanie. Teplota by mala byť počas testu 22 oC ± 3 oC. Ideálna relatívna vlhkosť by mala byť 30 % a 70 % s výnimkou prípadov, keď sa to nedá uskutočniť (napr. testy s určitými aerosólmi). Udržiavanie ľahkého podtlaku v komore (< 5 mm vodného stĺpca) zabraňuje unikaniu testovanej látky do okolia. Počas expozície sa nepodáva ani krmivo, ani voda. Mal by sa používať dynamický inhalačný systém s vhodným analytickým postupom na určovanie koncentrácie. Na zachovanie použiteľných expozičných koncentrácií sa odporúča vykonať predbežný test. Prietokové množstvo vzduchu sa nastaví tak, aby boli podmienky skúšania v celej expozičnej komore jednotné. Systém má zabezpečovať čo najrýchlejšie dosiahnutie konštantných expozičných podmienok. Je potrebné vykonať tieto merania a kontroly: Zvieratá sa pozorujú počas expozície a po nej a všetky nálezy u každého zvieraťa sa zapíšu. Všetky zvieratá sa musia denne pozorovať, zapisovať príznaky toxických účinkov, v rámci toho aj čas vzniku, ako aj stupeň a trvanie. Pozorovania zvierat by sa mali týkať hlavne zmien na koži, srsti, čiach a slizniciach, dýchaní, krvnom obehu, autonómnom a centrálnom nervovom systéme, ako aj na somatomotorike a na správaní. Príjem potravy a hmotnosť zvierat sa určuje každý týždeň. Pravidelné pozorovanie zvierat je potrebné, aby sa zabezpečilo, že zvieratá sa navzájom neusmrtia (kanibalizmus), že neuhynú v dôsledku autolýzy tkanív alebo chyby pri premiestňovaní. Po ukončení testu sa všetky zvieratá, ktoré prežili, s výnimkou satelitnej skupiny, pitvú. Uhynuté zvieratá, ako aj zvieratá, pri ktorých sa zistili silné príznaky utrpenia a bolesti, sa musia okamžite izolovať a humánne usmrtiť a podrobiť pitve. Na konci testu sa podrobia všetky zvieratá, vrátane kontrolných, nasledujúcim testom: Ďalšie stanovenia, ktoré môžu byť prípadne potrebné na adekvátne toxikologické vyhodnotenie, zahŕňajú: vápnik, fosfor, chlorid, sodík, draslík, glukózu nalačno, lipidy, hormóny, rovnováhu medzi kyselinami a zásadami, methemoglobín, aktivitu cholínesterázy. Dodatočné klinickobiochemické analýzy môžu byť potrebné na rozšírenie skúmania pozorovaných toxických účinkov.

1.6.3. a)

meranie prietokového množstva vzduchu (priebežne);

skutočná koncentrácia testovanej látky sa meria v dýchacej oblasti. Počas dennej expozičnej doby sa nesmie koncentrácia odchyľovať od priemernej hodnoty o viac ako ± 15 %. V prípade niektorých aerosólov sa však táto testovaná hladina nedá dosiahnuť. V takom prípade sa akceptuje väčší rozsah rozptylu. Počas celého trvania testu sa udržiava konštantná koncentrácia zo dňa na deň. Pre aerosóly sa musí minimálne raz do týždňa vykonať analýza veľkosti častíc pre každú testovanú skupinu;

teplota a vlhkosť vzduchu (priebežne).

hematologickému vyšetreniu, ktoré by malo zahŕňať minimálne určovanie hodnoty hematokrytu a koncentrácie hemoglobínu, počet erytrocytov, celkový a diferenciálny počet leukocytov, ako aj hemokoagulačné testy;

ii)

klinickobiochemickej analýze krvi, na posúdenie funkcie pečene a obličiek by sa mal určiť minimálne jeden z týchto parametrov: alanín-amino-transferáza (skôr známa ako sérumpyruvát-transamináza), aspartát-aminotransferáza (skôr známa ako sérumglutamát-oxalacetát-transamináza), močovinový dusík, albumín, celkový bilirubín a celkové bielkoviny v sére.

1.6.3.1. Pitva Na všetkých zvieratách, ktoré sa zúčastnili na teste, sa vykoná dôkladná pitva. Minimálne pečeň, obličky, nadobličky, pľúca a semenníky sa čo najskôr po sekcii odvážia vo vlhkom stave, aby sa zabránilo ich vysychaniu. Orgány a tkanivá (dýchacie orgány, pečeň, obličky, slezina, semenníky, nadobličky, srdce, ako aj všetky orgány s makroskopickými zmenami alebo zmenami vo veľkosti) sa uchovávajú vo vhodnom médiu s ohľadom na neskoršie histopatologické vyšetrenia. Pľúca sa odstraňujú v intaktnom stave, odvážia sa a ošetria vhodným fixatívom na zachovanie pľúcnej štruktúry.

1.6.3.2. Histopatologické vyšetrenie U všetkých zvierat skupiny s najvyššou dávkou, ako aj u zvierat kontrolnej skupiny (kontrolných skupín) sa musí vykonať histologické vyšetrenie konzervovaných orgánov a tkanív. Všetky orgány a tkanivá, ktoré vykázali v skupine s najvyššou dávkou poškodenia podmienené testovanou látkou, sa musia vyšetriť aj vo všetkých ostatných skupinách s nízkou dávkou. U zvierat satelitnej skupiny sa musia s veľkou pozornosťou vyšetriť tie orgány a tkanivá, pri ktorých sa v iných ošetrených skupinách prejavili toxické účinky.

2. ÚDAJE Údaje sa zhrnú do tabuľky. Z nej musí pre každú dávkovú skupinu a kontrolnú skupinu vyplývať počet zvierat na začiatku testu a počet zvierat s jednotlivými formami poškodenia lézií. Všetky získané výsledky sa vyhodnocujú vhodnou štatistickou metódou. Môže sa použiť akákoľvek uznávaná štatistická metóda.

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu by mala, ak je to možné, obsahovať nasledujúce informácie:

živočíšny druh, kmeň, pôvod, chovateľské podmienky, krmivo atď.,

podmienky skúšania. Opis expozičného aparátu vrátane zostavy, typu, rozmerov, zdroja vzduchu, systému na výrobu aerosólov, klimatizačného systému, spracovania odpadového vzduchu a prípadne druhu umiestnenia zvierat v skúšobnej komore. Je potrebné opísať prístroje na meranie teploty, vlhkosti vzduchu a prípadne konštanty koncentrácie aerosólov a granulometrického zloženia. Expozičné údaje Tieto údaje sa zhrnú do tabuľky a znázornia sa pri uvedení priemerných stredných hodnôt a s ohľadom na odchýlky (napr. smerodajnej odchýlky), a ak je to možné, mali by obsahovať tieto údaje:

3.1. pt_2 a)

prietokové množstvo vzduchu v inhalačnom zariadení;

teplotu a vlhkosť vzduchu;

nominálnu koncentráciu (celkové množstvo testovanej látky, ktoré sa dalo do inhalačného zariadenia, vydelené objemom vzduchu);

charakter vehikula, ak sa použilo;

skutočnú koncentráciu v dýchacej oblasti;

stredný aerodynamický hmotnostný priemer (MMAD) a geometrickú smerodajnú odchýlku (GSD);

údaje o toxických reakciách podľa pohlavia a koncentrácie,

čas smrti počas testu alebo údaj, či zvieratá prežili test,

toxické alebo iné účinky, no-effect level,

čas pozorovania jednotlivých príznakov toxického účinku a ich ďalší priebeh,

údaje o kŕmení a telesnej hmotnosti,

použité hematologické testy a ich výsledky,

použité klinickobiologické testy a ich výsledky,

pitevné nálezy,

podrobný opis všetkých histopatologických nálezov,

štatistické vyhodnotenie výsledkov tam, kde je to možné,

diskusiu o výsledkoch,

interpretáciu výsledkov.

3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA Pozri všeobecný úvod časť B (D).

4. ODKAZY Pozri všeobecný úvod časť B (E).

B.9. TOXICITA PO 28–DŇOVEJ OPAKOVANEJ DÁVKE (DERMÁLNA)

B.9.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Pozri všeobecný úvod časť B (A).

1.2. POJMY Pozri všeobecný úvod časť B (B).

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY Testovaná látka sa nanáša na kožu denne v odstupňovaných dávkach viacerým skupinám pokusných zvierat, a to jedna dávka na jednu skupinu počas 28 dní. Počas trvania testu sa zvieratá denne pozorujú, aby sa zistili symptómy toxických účinkov. Zvieratá, ktoré uhynú počas testu, ako aj zvieratá, ktoré prežijú do konca testu, sa pitvú.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Žiadne.

1.6. OPIS SKÚŠOBNE J METÓDY

1.6.

1.6.1. Príprava Zvieratá si pred začatím testu zvykajú minimálne 5 dní na experimentálne chovateľské a kŕmne podmienky. Pred testom sa zdravé mladé zvieratá randomizujú a priraďujú k jednotlivým exponovaným a kontrolným skupinám. Krátko pred začatím testu sa strihá srsť na chrbte pokusných zvierat. Oholenie srsti je tiež možné, ale dalo by sa vykonať 24 hodín pred začatím testu. Opakované strihanie a holenie je zvyčajne potrebné približne v týždňových intervaloch. Je potrebné dbať na to, aby sa nepoškodila koža. Na aplikáciu sa musí pripraviť minimálne 10 % povrchu kože. Pri určovaní oblasti určenej na ostrihanie aplikačnej plochy sa zohľadňuje hmotnosť zvierat. Ak sa používajú tuhé látky, ktoré sa môžu jemne rozomlieť na prášok, mala by byť testovaná látka dostatočne navlhčená vodou alebo tam, kde je to potrebné, vhodným vehikulom, aby sa zabezpečil dobrý kontakt s kožou. Tekuté testované látky sa vo všeobecnosti používajú nezriedené. Aplikácia sa vykonáva denne 5 až 7 dní za týždeň.

1.6.2. Podmienky skúšania

1.6.2.

1.6.2.1. Pokusné zvieratá Môže sa použiť dospelý potkan, králik alebo morča. Môžu sa použiť aj iné druhy, ich použitie sa však musí zdôvodniť. Odchýlka telesnej hmotnosti zvierat daného testu by nemala byť na začiatku testu viac ako ± 20 % od príslušnej strednej priemernej hodnoty.

1.6.2.2. Počet a pohlavie Pre každú veľkosť dávky sa používa minimálne 10 zvierat (5 samčekov a 5 samičiek) so zdravou, nepoškodenou kožou. Samičky musia byť nezapustené a nesmú byť gravidné. Ak sa majú počas testu humánne usmrtiť zvieratá, tak sa musí celkový počet zvierat zvýšiť o počet zvierat, ktoré majú byť humánne usmrtené, ešte pred koncom testu. Okrem toho sa môže exponovať satelitná skupina s 10 zvieratami (5 zvierat na pohlavie) počas 28 dní s najvyššou dávkou a počas nasledujúcich 14 dní bez ošetrenia sa dbá na reverzibilitu, pretrvávanie alebo oneskorený prejav toxických účinkov. Používa sa tiež satelitná skupina s 10 kontrolnými zvieratami (5 zvierat na pohlavie).

1.6.2.3. Veľkosti dávok Musia sa zvoliť minimálne tri dávky, ako aj jedna kontrolná skupina, alebo ak sa použije pomocná látka, kontrolná skupina s pomocnou látkou. Čas pôsobenia by mal trvať minimálne 6 hodín denne. Aplikácia testovanej látky by sa mala vykonávať v ten istý čas každý deň a prispôsobenie dávky telesnej hmotnosti sa vykonáva v stanovených intervaloch (raz týždenne alebo dvakrát týždenne), aby sa zachovala konštantná hladina dávky v relácii k telesnej hmotnosti. Odhliadnuc od aplikácie testovanej látky, zvieratá kontrolnej skupiny sa ošetrujú rovnakým spôsobom ako pokusné zvieratá. Ak sa na uľahčenie aplikácie použije vehikulum, tak sa kontrolnej skupine podáva vehikulum rovnakým spôsobom ako exponovaným zvieratám, a to v množstve, aké dostane skupina s najvyššou dávkou. Najvyššia dávka sa volí tak, aby sa v každom prípade prejavili toxické efekty, ale aby zvieratá neuhynuli alebo iba v malom množstve. Najnižšia dávka by nemala vyvolávať žiadne príznaky toxicity. Ak existujú použiteľné odhady o výške expozície u človeka, tak by mala najnižšia dávka túto hodnotu prekračovať. Podľa možnosti by mala stredná dávka spôsobovať len malé toxické účinky. Ak sa podávajú viaceré medzidávky, tak sa majú voliť tak, aby došlo k postupnej klasifikácii toxických účinkov. V skupinách s nízkou alebo strednou dávkou, ako aj v kontrolných skupinách by mal byť počet úmrtí nízky, aby sa zabezpečilo kvalitné vyhodnotenie výsledkov. Ak aplikácia testovanej látky vedie k silným podráždeniam kože, mala by sa koncentrácia znížiť, čo môže pri vysokej dávke viesť k zníženiu alebo vynechaniu ostatných toxických účinkov. Ak sa okrem toho koža veľmi poškodila, je za určitých okolností potrebné prerušiť test a nanovo ho realizovať s nižšími koncentráciami.

1.6.2.4. Limitný test Ak pri realizácii predčasnej štúdie podanie dávky 1000 mg/kg alebo vyššej dávky, ktorá zodpovedá možnej expozícii u človeka, nespôsobí žiadne toxické účinky, nie je potrebný ďalší test.

1.6.2.5. Čas pozorovania Pri všetkých zvieratách sa denne pozorujú symptómy toxických účinkov. Smrť a čas vzniku a zániku symptómov sa musia zaznamenať.

1.6.3. Postup Zvieratá sa musia udržiavať jednotlivo v klietkach. Testovanú látku dostávajú sedem dní do týždňa počas 28 dní. Zvieratá satelitnej skupiny, ktoré sú určené na dodatočné pozorovanie, by mali byť ďalších 14 dní bez ošetrenia, aby sa pozorovala reverzibilita alebo pretrvávanie toxických účinkov. Expozičná doba je minimálne šesť hodín denne. Testovaná látka sa nanáša jednotne na oblasť, ktorá zodpovedá asi 10 % povrchu tela. Pri veľmi toxických látkach sa môže ošetrovať plocha menšia, ale väčšia plocha by mala byť exponovaná čo možno s najtenšou a najrovnomernejšou vrstvou. Testovaná látka sa počas expozičnej doby udržiava v kontakte s kožou pomocou gázového obväzu a jednej náplasti. Pokusná plocha sa musí okrem toho zakryť vhodným spôsobom, aby sa gázový obväz a testovaná látka prichytili a zaistili a aby zvieratá nemohli orálne prijať testovanú látku. Môžu sa použiť aj prostriedky na obmedzenie slobody pohybu, avšak úplná imobilizácia sa neodporúča. Ako alternatíva sa môže použiť manžeta na krk. Po uplynutí expozičnej doby sa odstráni, pokiaľ je to možné, zvyšok testovanej látky, a to použitím vody alebo iným vhodným postupom na čistenie kože. Všetky zvieratá sa musia denne sledovať a zapisovať príznaky toxických účinkov vrátane času vzniku, ako aj stupňa a trvania. Sledovania sa majú zameriavať hlavne na zmeny na koži, srsti, očiach a slizniciach, dýchaní, krvnom obehu, autonómnom a centrálnom nervovom systéme, ako aj na somatomotorike a na správaní. Príjem potravy a hmotnosť zvierat sa určujú každý týždeň. Pravidelné pozorovanie zvierat je potrebné, aby sa dalo čo najlepšie zabezpečiť, aby zvieratá neuhynuli počas testu na kanibalizmus, autolýzu tkanív alebo chybu pri premiestňovaní. Po ukončení testu sa všetky zvieratá, ktoré prežili, s výnimkou satelitnej skupiny, pitvú. Hynúce zvieratá, ako aj zvieratá, u ktorých sa zistili silné príznaky utrpenia alebo bolesti, sa musia okamžite oddeliť, humánne usmrtiť a pitvať metódou prijateľnou pre zvieratá. Na konci testu sa musia všetky zvieratá, vrátane kontrolných zvierat, podrobiť nasledujúcim vyšetreniam: Ďalšie stanovenia, ktoré môžu byť potrebné na adekvátne toxikologické vyhodnotenie, zahŕňajú: vápnik, fosfor, chlorid, sodík, draslík, glukózu nalačno, lipidy, hormóny, rovnováhu medzi kyselinami a zásadami, methemoglobín a aktiviu cholínesterázy. Tam, kde je to potrebné, sa môžu využiť dodatočné klinickobiochemické analýzy na rozšírenie skúmania pozorovaných účinkov.

1.6.3.

1. hematologickému vyšetreniu, ktoré by malo zahŕňať aspoň určovanie hodnoty hematokrytu a koncentrácie hemoglobínu, počet erytrocytov, celkový a diferenciálny počet leukocytov, ako aj hemokoagulačné parametre;

2. klinickobiochemickej analýze krvi: na posúdenie funkcie pečene a obličiek by sa mal určiť minimálne jeden z týchto parametrov: alanín-amino-tranferáza (skôr známa ako sérum-glutamát-pyruvat-transamináza), asparta-aminotranferáza (skôr známa ako sérum-glutamát-oxalacetát-transamináza), močovinový dusík, albumín, kreatinín, celkový bilirubín a celkové bielkoviny v sére.

1.6.4. Pitva Na všetkých zvieratách, ktoré sa zúčastnili na teste, sa vykoná kompletná autopsia. Aspoň pečeň, obličky, nadobličky a semenníky sa čo najskôr po sekcii odvážia vlhké, aby sa zabránilo ich vysychaniu. Orgány a tkanivá, t. j. neexponovaná a exponovaná koža, pečeň, obličky, slezina, semenníky, nadobličky, srdce a cieľové orgány (orgány s makroskopickými zmenami alebo zmenami veľkosti), sa uchovávajú vo vhodnom médiu na možné neskoršie histopatologické vyšetrenie.

1.6.5. Histopatologické vyšetrenia U všetkých zvierat skupiny s najvyššou dávkou, ako aj u zvierat kontrolnej skupiny sa musí vykonať histologické vyšetrenia konzervovaných orgánov a tkanív. Všetky orgány a tkanivá, ktoré vykazujú v skupinách s najvyššou dávkou poškodenia podmienené testovanou látkou, sa musia vyšetriť aj v ostatných skupinách s nižšou dávkou. U zvierat satelitnej skupiny sa musia veľmi dôkladne vyšetriť tie orgány a tkanivá, v ktorých sa u ostatných exponovaných skupín prejavili príznaky otravy.

2. ÚDAJE Údaje sa zhrnú do tabuľky, z ktorej musí byť jasný počet zvierat pre každú testovanú skupinu a kontrolnú skupinu na začiatku testu a počet zvierat s jednotlivými formami poškodenia. Všetky zistené výsledky sa vyhodnocujú vhodnou štatistickou metódou. Môže sa použiť akákoľvek uznávaná štatistická metóda.

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu by mala, pokiaľ je to možné, obsahovať tieto informácie:

údaje o zvieratách (druh, kmeň, pôvod, chovateľské podmienky, krmivo atď.),

podmienky skúšania (vrátane druhu obväzu: okluzívny alebo neokluzívny),

veľkosti dávky (vrátane vehikula, ak sa použilo) a koncentráciu,

tam, kde je to možné, no effect-level,

údaje o toxických reakciách podľa pohlavia a koncentrácie,

čas smrti počas testu alebo údaj, či zvieratá test prežili do konca testu,

toxické a iné účinky,

čas pozorovania jednotlivých príznakov toxických účinkov, ich ďalší priebeh,

údaje o kŕmení a telesnú hmotnosť,

hematologické testy a ich výsledky,

klinickobiochemické testy a ich výsledky,

pitevné nálezy,

podrobný opis histopatologických nálezov,

štatistické vyhodnotenie výsledkov,

diskusiu o výsledkoch,

interpretáciu výsledkov.

3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA Pozri všeobecný úvod časť B (D).

4. ODKAZY Pozri všeobecný úvod časť B (E).

B.10. MUTAGÉNNOSŤ – IN VITRO TEST CHROMOZÓMOVEJ ODCHÝLKY U CICAVCOV

B.10.

1. METÓDA Táto metóda je duplikátom in vitro testu chromozómovej odchýlky u cicavcov (1997), označenej OECD TG 473.

1.

1.1. ÚVOD Účelom in vitro testu chromozómovej odchýlky u cicavcov je identifikovať činidlá, ktoré spôsobujú štrukturálne chromozómové odchýlky v pestovaných bunkách cicavcov (1) (2) (3). Štrukturálne odchýlky môžu byť v dvoch typoch, chromozómové alebo chromatidové. Väčšina chemických mutagénov vyvoláva chromatidové odchýlky, avšak vyskytujú sa tiež chromozómové odchýlky. Nárast polyploidie môže naznačovať, že chemikália má potenciál spôsobiť číselné odchýlky. Táto metóda však nie je určená na meranie číselných odchýlok a bežne sa na tento účel nepoužíva. Chromozómové mutácie a podobné udalosti sú príčinou mnohých ľudských genetických chorôb a existujú dostatočné dôkazy o tom, že chromozómové mutácie a podobné udalosti spôsobujúce odchýlky onkogénov a génov na potláčanie nádorov somatických buniek sú prítomné pri vzniku rakoviny u ľudí a pokusných zvierat. In vitro test chromozómovej odchýlky u cicavcov môže obsahovať kultúry preukázaných bunkových línií, bunkové kmene alebo kultúry primárnych buniek. Použité bunky sa vyberajú na základe rastovej schopnosti kultúry, stability karyotypu, chromozómového čísla, chromozómovej diverzity a spontánnej frekvencie chromozómových odchýlok. Testy vykonávané in vitro vo všeobecnosti vyžadujú použitie exogénneho zdroja metabolickej aktivácie. Tento systém metabolickej aktivácie nemôže úplne napodobniť podmienky cicavcov in vivo. Je potrebné sa starostlivo vyhnúť podmienkam, ktoré by viedli k pozitívnym výsledkom, ktoré neodrážajú vnútornú mutagénnosť a ktoré môžu pochádzať zo zmien pH, osmolality alebo vysokých hladín cytotoxicity (4) (5). Tento test sa používa na zistenie možných mutagénov a karcinogénov u cicavcov. Mnohé zlúčeniny, ktoré sú v tomto teste pozitívne, sú pre cicavcov karcinogénmi, avšak medzi týmto testom a karcinogénnosťou neexistuje dokonalá korelácia. Korelácia závisí od triedy chemikálie a je čoraz viac dôkazov, že existujú karcinogény, ktoré tento test neodhalí, pretože pravdepodobne účinkujú prostredníctvom mechanizmov odlišných od priameho poškodenia DNA. Pozri tiež všeobecný úvod k časti B.

1.2. DEFINÍCIE Odchýlka chromatidového typu: štrukturálne chromozómové poškodenie prejavujúce sa ako pretrhnutie jednotlivých chromatidov alebo pretrhnutie a opätovné spojenie chromatidov. Odchýlka chromozómového typu: štrukturálne chromozómové poškodenie prejavujúce sa ako pretrhnutie alebo pretrhnutie a opätovné spojenie oboch chromatidov na rovnakom mieste. Endoreduplikácia: proces, v ktorom po S perióde replikácie DNA jadro neprechádza do mitózy, ale začína novú S periódu. Výsledkom sú chromozómy so 4, 8, 16... chromatidmi. Trhlina: achromatická lézia, menšia ako šírka jedného chromatidu s minimálnym posunutím chromatidov. Mitotický index: pomer buniek v metafáze delený celkovým počtom buniek pozorovaných v populácii buniek; náznak stupňa šírenia tejto populácie. Číselná (numerická) odchýlka: zmena v počte chromozómov v porovnaní s normálnou číselnou (numerickou) charakteristikou použitých buniek. Polyploidia: násobok haploidného počtu chromozómov (n) odlišný od počtu diploidov (t. j. 3n, 4n atď.) Štrukturálna odchýlka: zmena v chromozómovej štruktúre rozpoznateľná mikroskopickým skúmaním metafázového štádia delenia buniek, pozorovaná ako vynechania a fragmenty, vnútorné zmeny alebo zámeny.

1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Bunkové kultúry sú exponované testovacou látkou s metabolickou aktiváciou aj bez nej. Vo vopred určených intervaloch po expozícii bunkových kultúr testovacou látkou sa spracúvajú látkou zastavujúcou metafázu (napr Colcemidom® alebo colchicínom), zozbierajú sa, zafarbia sa a metafázové bunky sa mikroskopicky analyzujú na zistenie prítomnosti chromozómových odchýlok.

1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.4.

1.4.1. Prípravné práce

1.4.1.

1.4.1.1. Bunky Môžu sa použiť rôzne bunkové línie, kmene alebo primárne bunkové kultúry vrátane ľudských buniek (napríklad: fibroblasty čínskych morčiat, periférne krvné lymfocyty ľudí alebo iných cicavcov).

1.4.1.2. Médiá a podmienky kultúr Pri udržiavaní kultúr sa používajú príslušné médiá a inkubačné podmienky (kultivačné nádoby, koncentrácia CO2, teplota a vlhkosť). Získané bunkové línie a kmene sa pravidelne kontrolujú na stabilitu modálneho chromozómového čísla a absenciu mykoplazmatickej kontaminácie a v prípade kontaminácie sa nepoužívajú. Mal by byť známy čas normálneho bunkového cyklu a podmienky použitých kultúr.

1.4.1.3. Príprava kultúr Zistené bunkové línie a kmene: bunky sa odoberajú z uskladnených kultúr, zasievajú sa do média kultúry v takej hustote, pri ktorej kultúry nedosiahnu zhluk pred časom zberu, a inkubujú sa pri teplote 37 oC. Lymfocyty: celá krv ošetrená antikoagulantom (napríklad: heparínom) alebo separované lymfocyty získané od zdravých subjektov sa pridávajú do média kultúry obsahujúceho mitogén (napríklad: fytohemaglutinín) a inkubované sa pri teplote 37 oC.

1.4.1.4. Metabolická aktivácia Bunky sú exponované testovacou látkou za prítomnosti i za neprítomnosti príslušného systému metabolickej aktivácie. Najpoužívanejším systémom je postmitochondriálna frakcia podporená kofaktorom (S 9), pripravená z pečene hlodavcov ošetrených prípravkami na indukciu enzýmov, ako napríklad Aroclorom 1254 (6) (7) (8) (9) alebo zmesou fenobarbitonu a beta-naftoflavónu (10) (11) (12). Postmitochondriálna frakcia sa zvyčajne používa v koncentráciách v rozpätí od 1 % – 10 % v/v v konečnom testovacom médiu. Stav systému metabolickej aktivácie môže závisieť od triedy testovanej chemikálie. V niektorých prípadoch môže byť vhodné využiť viac než jednu koncentráciu postmitochondriálnej frakcie. Pre endogénnu aktiváciu môže poskytnúť potenciál množstvo situácií vrátane vytvorenia geneticky vypestovaných bunkových línií vyjadrujúcich špecifické aktivačné enzýmy. Výber použitých bunkových línií by mal byť vedecky podložený (napríklad: relevantnosťou cytochrómového P450 izoenzýmu pre metabolizmus testovacej látky).

1.4.1.5. Testovacia látka/príprava Pevné testovacie látky sa rozpúšťajú alebo ukladajú v príslušných rozpúšťadlách alebo nosičoch a rozrieďujú, ak je to vhodné, pred ošetrením buniek. Kvapalné testovacie látky môžu byť pridané priamo do testovacích systémov a/alebo rozriedené pred ošetrením. Používajú sa čerstvé prípravky testovacej látky, pokiaľ údaje o stabilite nepoukazujú na prijateľnosť uskladnenia.

1.4.2. Podmienky testov

1.4.2.

1.4.2.1. Rozpúšťadlo/nosič Rozpúšťadlo/nosič by nemali chemicky reagovať s testovacou látkou a mali by byť kompatibilné s prežitím buniek a aktivitou S9. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by malo byť podporené údajmi označujúcimi ich kompatibilitu. Odporúča sa, aby sa kedykoľvek, keď je to možné, zvážilo použitie vodného rozpúšťadla/nosiča. Pri testovaní vo vode nestabilných látok by organické rozpúšťadlá nemali obsahovať vodu. Vodu možno odstrániť pridaním molekulárneho sitka.

1.4.2.2. Koncentrácie pri expozícii Medzi kritériá, ktoré treba zvážiť pri určovaní najvyššej koncentrácie, patrí cytotoxicita, rozpustnosť v testovacom systéme a zmeny pH alebo osmolality. Cytotoxicita sa stanovuje s metabolickou aktiváciou a bez metabolickej aktivácie pri hlavnom pokuse použitím príslušného označenia integrity a rastu buniek, ako napríklad stupňa zhlukovania, počtu životaschopných buniek alebo mitotického indexu. Užitočné môže byť stanoviť cytotoxicitu a rozpustnosť v predbežnom pokuse. Používajú sa najmenej tri analyzovateľné koncentrácie. Pri výskyte cytotoxicity tieto koncentrácie pokrývajú rozsah od maximálnej po malú alebo žiadnu toxicitu; toto zvyčajne znamená, že koncentrácie majú byť oddelené najviac koeficientom medzi 2 a √10. V čase zberu by mala najvyššia koncentrácia ukazovať významný pokles stupňa zhlukovania, počtu buniek alebo mitotického indexu (všetky viac ako 50 %). Mitotický index je iba nepriamym meradlom cytotoxických/cytostatických účinkov a závisí od času po ošetrení. Mitotický index je však akceptovateľný pre suspenzné kultúry, v ktorých iné merania toxicity môžu byť náročné a nepraktické. Informácie o kinetike bunkových cyklov, ako napríklad priemerný generačný čas (average generation time – AGT), sa môžu použiť ako doplnkové informácie. AGT je však celkovým priemerom, ktorý nie vždy odhaľuje existenciu oneskorených subpopulácií, a aj malé zvýšenie priemerného generačného času môže byť spojené s veľmi podstatným oneskorením času optimálneho výťažku odchýlok. Pre relatívne necytotoxické látky sú maximálne testovacie koncentrácie 5 μl/ml (5 mg/ml) alebo 0,01 M, podľa toho, ktorá je najnižšia. Pre relatívne nerozpustné látky, ktoré nie sú toxické pri koncentráciách nižších ako nerozpustné koncentrácie, najvyššia použitá dávka je koncentráciou nad limit rozpustnosti v konečnom médiu kultúry na konci ošetrovacieho obdobia. V niektorých prípadoch (napríklad keď sa vyskytne toxicita len na vyššej ako najnižšej nerozpustnej koncentrácii) je vhodné testovať na viac než jednej koncentrácii s viditeľným zrážaním. Užitočné môže byť odhadnúť rozpustnosť na začiatku a na konci podávania, keďže rozpustnosť sa môže zmeniť počas priebehu expozície v testovacom systéme pre prítomnosť buniek, séra S9 atď. Nerozpustnosť sa dá zistiť voľným okom. Zrazenina hodnoteniu neprekáža.

1.4.2.3. Negatívne a pozitívne kontroly Každý pokus má obsahovať pozitívne a negatívne (rozpúšťadlo alebo nosič) kontroly, a to obe s metabolickou aktiváciou a bez metabolickej aktivácie. Pri použití metabolickej aktivácie je pozitívna kontrolná chemikália tá, pri ktorej sa na vznik mutagénnej reakcie vyžaduje aktivácia. Pozitívne kontroly využívajú známy elastogén s úrovňami vystavenia, pri ktorých sa očakáva reprodukovateľný a zistiteľný nárast na pozadí, ktoré preukazuje citlivosť testovacieho systému. Koncentrácie pozitívnej kontrolnej látky sa volia tak, aby boli účinky jasné, ale aby pozorovateľovi priamo neodhaľovali identitu kódovaných sklíčok. Príklady pozitívnych kontrolných látok: Stav metabolickej aktivácie Látka Číslo CAS Číslo EINECS Neprítomnosf exogénnej metabolickej aktivácie metylmetánsulfonát 66-27-3 200-625-0 etylmetánsulfonát 62-50-0 200-536-7 etylnitrozkarbamid 759-73-9 212-072-2 mytomicín C 50-07-7 200-008-6 4-nitrochinolín-N-oxid 56-57-5 200-281-1 Prítomnosf exogénnej metabolickej aktivácie benzo[a]pyrén 50-32-8 200-028-5 cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Možno použiť iné vhodné pozitívne kontrolné látky. Podľa dostupnosti sa tiež zváži použitie príbuzných chemikálií pre pozitívnu kontrolnú skupinu v chemickej triede. Negatívne kontroly pozostávajúce iba zo samotného rozpúšťadla alebo nosiča v médiu a ošetrené rovnakým spôsobom ako ošetrované kultúry sa zahrnú pre každý čas zberu. Používajú sa tiež neošetrené kontrolné látky, pokiaľ neexistujú historické kontrolné údaje poukazujúce na to, že vybrané rozpúšťadlo nespôsobuje žiadne rušivé ani mutagénne efekty.

1.4.3. Postup

1.4.3.

1.4.3.1. Pôsobenie testovacej látky Na rozširujúce sa bunky pôsobí testovacia látka za prítomnosti aj za neprítomnosti systému metabolickej aktivácie. Ošetrenie lymfocytov by malo začať približne 48 hodín po mitogénnej stimulácii.

1.4.3.2. Pri každej koncentrácii sa používajú duplicitné kultúry a rozhodne sa odporúčajú pre negatívne/rozpúšťadlové kontrolné kultúry. Ak možno demonštrovať minimálnu variáciu medzi duplicitnými kultúrami (13) (14) z historických údajov, môže byť pre jednotlivé kultúry prijateľné použitie pri každej koncentrácii. Plynné alebo prchavé látky sa testujú príslušnými metódami, ako napríklad v hermeticky uzavretých nádobách (15) (16).

1.4.3.3. Čas zberu kultúry Pri prvom pokuse sú bunky vystavené testovacej látke, a to s metabolickou aktiváciou aj bez metabolickej aktivácie na 3 – 6 hodín, a vzorky z nich sa odoberajú v čase rovnajúcom sa približne 1,5-násobku dĺžky bežného cyklu buniek po začatí pokusu (12). Ak tento protokol ukáže negatívne výsledky s aktiváciou i bez aktivácie, uskutoční sa ďalší pokus bez aktivácie s neustálym podávaním až po odobratie vzorky v čase rovnajúcom sa približne 1,5-násobku dĺžky bežného cyklu buniek. Niektoré chemikálie sa dajú jednoduchšie zistiť pri časoch dlhších ako 1,5-násobok dĺžky cyklu. Negatívne výsledky s metabolickou aktiváciou sa musia potvrdiť od prípadu k prípadu. V tých prípadoch, keď sa potvrdenie negatívnych výsledkov nepovažuje za potrebné, vypracuje sa zdôvodnenie.

1.4.3.4. Príprava chromozómov Bunkové kultúry sa ošetrujú Colcemidom® alebo colchicinom zvyčajne 1 – 3 hodiny pred zberom. Každá bunková kultúra sa zbiera a spracúva oddelene na prípravu chromozómov. Príprava chromozómov zahŕňa hypotonické ošetrenie buniek, fixáciu a sfarbenie.

1.4.3.5. Analýza Všetky sklíčka vrátane sklíčok s pozitívnymi a negatívnymi kontrolami sa pred mikroskopickou analýzou nezávisle označia kódmi. Keďže fixačné postupy často ústia do pretrhnutia časti metafázových buniek so stratou chromozómov, vyhodnocované bunky by preto mali obsahovať niekoľko centromér rovnajúcich sa modálnemu číslu ± 2 pre všetky typy buniek. Na jednu koncentráciu a kontrolnú vzorku sa vyhodnocuje najmenej 200 dobre rozšírených metafáz, rovnakým dielom rozdelených medzi duplikátmi. Tento počet možno znížiť, ak sa pozoruje vysoký počet odchýlok. Hoci účelom tohto testu je zistiť štrukturálne chromozómové odchýlky, je dôležité zaznamenať polyploidiu a endoreduplikáciu, keď sa tieto javy pozorujú.

2. ÚDAJE

2.

2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV Experimentálnou jednotkou je bunka, a preto sa hodnotí percentuálny podiel buniek so štrukturálnou chromozómovou odchýlkou/odchýlkami. Rôzne typy štrukturálnych chromozómových odchýlok sa uvádzajú v zozname s ich číslami a frekvenciami pre pokusné a kontrolné kultúry. Trhliny sa zaznamenávajú oddelene a uvádzajú sa, ale zvyčajne sa nezahŕňajú do celkovej frekvencie odchýlok. Zaznamenávajú sa tiež súbežné merania cytotoxicity pre všetky ošetrené a negatívne kontrolné kultúry pri hlavných pokusoch. Uvádzajú sa údaje o jednotlivých kultúrach. Všetky údaje sa tiež sumarizujú v tabuľkovej forme. Neexistuje požiadavka na overenie jasnej pozitívnej reakcie. Nejasné výsledky sa objasňujú ďalším testovaním, najmä využitím modifikácie pokusných podmienok. Potreba potvrdenia negatívnych výsledkov bola uvedená v bode 1.4.3.3. Modifikácia študijných parametrov na rozšírenie rozsahu hodnotených podmienok sa zváži pri dodatočných pokusoch. Študijné parametre, ktoré sa môžu modifikovať, zahŕňajú koncentráciu a podmienky metabolickej aktivácie.

2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Pre stanovenie pozitívneho výsledku existuje niekoľko kritérií, ako napríklad nárast spojený s koncentráciou alebo reprodukovateľný nárast počtu buniek s chromozómovými odchýlkami. Najprv sa zvažuje biologická relevantnosť výsledkov. Ako pomôcka sa pri hodnotení výsledkov testov používajú štatistické metódy (3) (13). Štatistický význam nie je pre pozitívnu reakciu jediným určujúcim faktorom. Nárast počtu polyploidných buniek môže naznačovať, že testovacia látka má potenciál brzdiť mitotické procesy a indukovať numerické chromozómové odchýlky. Nárast počtu buniek s endoreduplikovanými chromozómami môže naznačovať, že testovacia látka má potenciál brzdiť priebeh bunkového cyklu (17) (18). Testovacia látka, pre ktorú výsledky nespĺňajú vyššie uvedené kritériá, sa v tomto systéme považuje za nemutagénnu. Hoci väčšina pokusov poskytne jasne pozitívne alebo negatívne výsledky, v zriedkavých prípadoch súbor údajov vopred vylúči konečný verdikt o aktivite testovacej látky. Výsledky môžu ostať nejasné alebo spochybniteľné bez ohľadu na počet opakovaní pokusu. Pozitívne výsledky in vitro testu chromozómovej odchýlky u cicavcov naznačujú, že testovacia látka vyvoláva štrukturálne chromozómové odchýlky v kultúrach somatických buniek cicavcov. Negatívne výsledky naznačujú, že v testovacích podmienkach testovacia látka neindukuje chromozómové odchýlky v kultúrach somatických buniek cicavcov.

3. PODÁVANIE SPRÁV

3. SPRÁVA Z TESTU

Správa z testu zahŕňa nasledujúce informácie:

Rozpúšťadlo/nosič:

zdôvodnenie výberu nosiča,

rozpustnosť a stabilita testovacej látky v rozpúšťadle/nosiči, ak je známa.

Bunky:

typ a zdroj buniek,

karyotyp a vhodnosť použitého typu bunky,

neprítomnosť mykoplazmy, ak je to vhodné,

informácie o dĺžke cyklu bunky,

pohlavie darcov krvi, celej krvi alebo separovaných lymfocytov, použitý mitogén,

počet prechodov, ak je to vhodné,

metódy udržiavania bunkovej kultúry, ak je to vhodné,

modálne číslo chromozómov.

Podmienky testov:

identita látky zadržiavajúcej metafázu, jej koncentrácia a trvanie expozície bunky,

zdôvodnenie výberu koncentrácií a počtu kultúr vrátane napríklad údajov o cytotoxicite a obmedzeniach rozpustnosti, ak sú dostupné,

skladba média, koncentrácia CO2, ak je to vhodné,

koncentrácia testovacej látky,

objem nosiča a pridanej testovacej látky,

inkubačná teplota,

inkubačná doba,

trvanie ošetrovania,

hustota buniek pri vysádzaní, ak je to vhodné,

typ a zloženie systému metabolickej aktivácie vrátane kritérií prijateľnosti,

pozitívne a negatívne kontrolné kultúry,

metódy prípravy vzoriek,

kritériá na hodnotenie odchýlok,

počet analyzovaných metafáz,

metódy merania toxicity,

kritériá na hodnotenie pokusov ako pozitívne, negatívne alebo nejasné.

Výsledky:

známky toxicity, napríklad stupeň hromadenia, údaje o cykle bunky, počty buniek, mitotický index,

príznaky zrážania,

údaje o pH a osmolalite média, ak sú stanovené,

definícia odchýlok vrátane trhlín,

počet buniek s chromozómovými odchýlkami a typ chromozómových odchýlok uvedené oddelene pre každú ošetrenú a kontrolnú kultúru,

zmeny v ploidii, ak sa pozorujú,

vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je to možné,

štatistické analýzy, ak existujú,

údaje o negatívnej (rozpúšťadlo/nosič) a pozitívnej kultúre,

historické údaje o negatívnej (rozpúšťadlo/nosič) a pozitívnej kultúre, s rozsahmi, strednými hodnotami a štandardnými odchýlkami.

Rozbor výsledkov

Závery

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)

ODKAZY Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical Mutagens, Principles and Methods for Their Detection, vol. 4, Hollander, A. (ed), Plenum Press, New York a Londýn, s. 1 – 29. Ishidate, M. Jr. a Sofumi, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, vol. 5, Ashby, J. et al. (eds), Elsevier Science Publishers, Amsterdam – New York – Oxford, s. 427 – 432. Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. a Zeiger, E. (1978), Chromosome Aberration and Sister Chromatic Exchanges in Chinese Hamster Ovary Cells: Evaluation of 108 chemicals, Environ, Molec. Mutagen, 10 (suppl. 10) s. 1-175. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R R, Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. a Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, s. 147 – 204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. a Okumura, K. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation. Res., 268, s. 297 – 305. Ames, B. N, McCann, J. a Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, s. 347 – 364. Maron, D. M a Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, s. 173 – 215. Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meyers, M. a de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Dietylnitrozamine (DEN) a Dimetylnitrozamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat Liver Microsomes, Mutation Res., 37, s. 83 – 90. Matsuoka, A., Hayashi, M. a Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in Vitro, Mutation Res., 66, s. 277 – 290. Elliot, B. M., Combes, R D. Elcombe, C. R, Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. a Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-Induced S9, In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, s. 175 – 177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. a Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyl as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J, Fouts, J. R, Bend, J. R a Philpot, R M (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis testing, Elsevier, North Holland, s. 85 – 88. Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. I, Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994) Report from Working Group on In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, s. 241 – 261. Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. a Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity test Data, Kirkland, D. J. (ed), Cambridge University Press, Cambridge, s. 141 – 154. Soper, K. A. a Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for in Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, s. 139 – 149. Krahn, D. F. Barsky, F. C. a McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds.), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, s. 91 – 103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. a Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, s. 795 – 801. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese Hamster cells during Alpha Radiation Induced G2 arrest, Mutation Res., 119, s. 403 – 413. Huang, Y., Change, C, Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, s. 1362 – 1364.

B.11. MUTAGÉNNOSŤ – IN VIVO TEST CHROMOZÓMOVEJ ODCHÝLKY V KOSTNEJ DRENI CICAVCOV

B.11.

1. METÓDA Táto metóda je obdobou metódy OECD TG 475 in vivo testu chromozómovej odchýlky v kostnej dreni cicavcov (1997).

1.

1.1. ÚVOD In vivo test chromozómovej odchýlky sa používa na zisťovanie štrukturálnych chromozómových odchýlok vyvolaných testovacou látkou v kostnej dreni zvierat, zvyčajne hlodavcov (1) (2) (3) (4). Štrukturálne chromozómové odchýlky sa vyskytujú v dvoch typoch, chromozómové alebo chromatidové. Zvýšenie hladiny polyploidie môže naznačovať, že chemikália má potenciál indukovať numerické odchýlky. Väčšina chemických mutagénov indukuje odchýlky chromatidového typu, vyskytujú sa však aj odchýlky chromozómového typu. Chromozómové mutácie a podobné udalosti sú príčinou mnohých ľudských genetických chorôb a existujú dostatočné dôkazy o tom, že chromozómové mutácie a podobné udalosti spôsobujúce zmeny onkogénov a génov na potláčanie nádorov sú prítomné pri výskyte rakoviny u ľudí a v pokusných systémoch. Pri tomto teste sa zvyčajne používajú hlodavce. Cieľovým tkanivom pri teste je kostná dreň, pretože je to vysoko vaskularizované tkanivo a obsahuje populáciu rýchlo cyklujúcich buniek, ktoré sa dajú jednoducho oddeliť a spracovať. Iné druhy a cieľové tkanivá sa pri tomto teste nepoužívajú. Tento test chromozómovej odchýlky je osobitne relevantný pre hodnotenie mutagénnych rizík, pretože umožňuje zváženie faktorov in vivo metabolizmu, farmakokinetiky a opravných procesov DNA, hoci tieto sa môžu od druhu k druhu a od tkaniva k tkanivu líšiť. In vivo test je tiež užitočný pre ďalšie skúmanie mutagénnych účinkov zistených in vitro testom. Ak existujú dôkazy, že testovacia látka alebo reaktívny metabolit nedosiahne cieľové tkanivo, nie je vhodné tento test použiť. Pozri tiež všeobecný úvod k časti B.

1.2. DEFINÍCIE Odchýlka chromatidového typu: štrukturálne chromozómové poškodenie prejavujúce sa ako pretrhnutie jednotlivých chromatidov alebo pretrhnutie a spojenie medzi chromatidmi. Odchýlka chromozómového typu: štrukturálne chromozómové poškodenie prejavujúce sa ako pretrhnutie alebo pretrhnutie a opätovné spojenie oboch chromatidov na rovnakom mieste. Endoreduplikácia: proces, v ktorom po S perióde replikácie DNA jadro neprechádza do mitózy, ale začína novú S periódu. Výsledkom sú chromozómy so 4, 8, 16... chromatidmi. Trhlina: achromatická lézia, menšia ako šírka jedného chromatidu, s minimálnym posunutím chromatidov. Číselná (numerická) odchýlka: zmena v počte chromozómov v porovnaní s normálnou číselnou (numerickou) charakteristikou použitých buniek. Polyploidia: násobok haploidného počtu chromozómov (n) odlišný od počtu diploidov (t. j. 3n, 4n atď.) Štrukturálna odchýlka: zmena v chromozómovej štruktúre rozpoznateľná mikroskopickým skúmaním metafázového štádia delenia buniek, pozorovaná ako vynechania a fragmenty, vnútorné zmeny alebo zámeny.

1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Zvieratá sa exponujú testovacej látke vhodnou expozíciou a utratia sa vo vhodnom čase po ošetrení. Pred utratením sa zvieratá ošetria prostriedkom zastavujúcim metafázu (napríklad Colcemidom® alebo colchicinom). Následne sa z kostnej drene urobia chromozómové prípravky, zafarbia sa a pri metafázových bunkách sa analyzujú chromozómové odchýlky.

1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.4.

1.4.1. Prípravné práce

1.4.1.

1.4.1.1. Výber živočíšnych druhov Bežne sa používajú krysy, myši a čínske morčatá, hoci použiť sa dajú akékoľvek vhodné druhy cicavcov. Vyberajú sa bežne používané laboratórne rody mladých zdravých dospelých zvierat. Na začiatku štúdie by mala byť hmotnostná variácia zvierat minimálna a nemala by presiahnuť ± 20 % strednej hmotnosti každého pohlavia.

1.4.1.2. Podmienky umiestnenia a kŕmenia Používajú sa všeobecné podmienky uvedené vo všeobecnom úvode k časti B, cieľovou hodnotou pre vlhkosť je 50 % – 60 %.

1.4.1.3. Príprava zvierat Zdravé, mladé, dospelé zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolných a pokusných skupín. Klietky sú umiestnené tak, aby sa minimalizovali možné účinky vyplývajúce z rozmiestnenia klietok. Zvieratá sa jednotlivo označia. Zvieratá sa aklimatizujú na laboratórne podmienky najmenej päť dní.

1.4.1.4. Príprava dávok Pevné testovacie látky sa rozpúšťajú alebo ukladajú v príslušných rozpúšťadlách alebo nosičoch, a ak je to vhodné, rozrieďujú sa pred podávaním dávok zvieratám. Kvapalné testovacie látky sa podávajú priamo alebo pred podávaním rozriedené. Používajú sa čerstvé prípravky testovacej látky, pokiaľ údaje o stabilite nepoukazujú na vhodnosť uskladnenia.

1.4.2. Podmienky testov

1.4.2.

1.4.2.1. Rozpúšťadlo/nosič Rozpúšťadlo/nosič by nemalo mať toxické účinky v používaných úrovniach dávok a nemali by chemicky reagovať s testovacou látkou. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by malo byť podporené referenčnými údajmi označujúcimi ich kompatibilitu. Odporúča sa zvážiť, pokiaľ je to možné, použitie vodného rozpúšťadla/nosiča.

1.4.2.2. Kontrolné skupiny Pri každom pokuse sa pre každé pohlavie vytvoria pozitívne a negatívne (rozpúšťadlo/nosič) kontrolné skupiny. Okrem podávania testovacej látky sa so zvieratami v kontrolných skupinách zaobchádza rovnakým spôsobom ako s pokusnými zvieratami. Pozitívna kontrolná skupina vytvára štrukturálne odchýlky in vivo pri úrovniach expozície, pri ktorých sa očakáva zistiteľný nárast na pozadí. Dávky pozitívnej kontrolnej skupiny sa volia tak, aby účinky boli zjavné, ale aby pozorovateľovi priamo neodhaľovali identitu kódovaných vzoriek. Je prijateľné, aby sa pozitívnym kontrolným skupinám látky podávali spôsobom odlišným od testovacej látky a vzorky z nich sa odoberali iba raz. Možno zvážiť použitie príbuzných chemikálií pre pozitívnu kontrolnú skupinu v triede chemikálií. Príklady látok pre pozitívnu kontrolnú skupinu látok: Látka Číslo CAS Číslo EINECS etyl metánsulfonát 62-50-0 200-536-7 etylnitrozmočovina 759-73-9 212-072-2 mytomicin C 50-07-7 200-008-6 cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 trietylénmelamín 51-18-3 200-083-5 Pre každý odber vzoriek sa odoberú vzorky aj z negatívnych kontrolných skupín ošetrených rozpúšťadlom alebo nosičom a inak ošetrovaných rovnakým spôsobom ako pokusné skupiny, pokiaľ nie sú z historických kontrolných údajov dostupné údaje o variabilite medzi zvieratami a frekvenciách buniek s chromozómovou odchýlkou. Ak sa pre negatívne kontrolné skupiny používa jeden odber vzorky, najvhodnejším časom je prvý čas odberu. Používajú sa aj neošetrené kontrolné skupiny, pokiaľ neexistujú historické kontrolné údaje demonštrujúce, že vybrané rozpúšťadlo alebo nosič nespôsobujú žiadne rušivé alebo mutagénne účinky.

1.5. POSTUP

1.5.

1.5.1. Počet a pohlavie zvierat Každá pokusná a kontrolná skupina obsahuje najmenej päť analyzovateľných zvierat každého pohlavia. Ak v čase uskutočnenia štúdie sú dostupné údaje zo štúdií rovnakých druhov a používajúce rovnaké cesty expozície, ktoré ukazujú, že neexistujú významné rozdiely v toxicite medzi pohlaviami, stačí aj testovanie jedného pohlavia. Ak je expozícia chemikálií na ľudí závislá od pohlavia, ako napríklad pri niektorých farmaceutických prípravkoch, test sa uskutoční na zvieratách príslušného pohlavia.

1.5.2. Harmonogram ošetrovania Testovacie látky sa podávajú pri jednom ošetrení. Testovacie látky sa tiež môžu podávať v dvoch dávkach, t. j. dve ošetrenia v ten istý deň niekoľko hodín po sebe na uľahčenie podania veľkého objemu látky. Iné dávkovacie režimy sa vedecky zdôvodnia. Vzorky sa odoberajú v dvoch rôznych časoch po ošetrení v jeden deň. Pre hlodavce je prvým intervalom odberu vzorky 1,5-násobok dĺžky bežného bunkového cyklu (zvyčajne 12 – 18 hodín) po ošetrení. Keďže čas potrebný na strávenie a metabolizmus testovacej látky, ako aj jej účinky na kinetiku bunkového cyklu môžu ovplyvniť optimálny čas na zistenie chromozómovej odchýlky, odporúča sa neskoršie odobratie vzorky 24 hodín po prvom čase odberu vzorky. Ak sa používajú dávkovacie režimy dlhšie ako jeden deň, používa sa jeden odber vzorky pri 1,5-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu po poslednom ošetrení. Pred utratením sa zvieratám podáva injekčne intraperitoneálne potrebná dávka prostriedku zastavujúceho metafázu (napríklad Colcemid® alebo colchicin). Po uplynutí potrebného času sa následne odoberajú od zvierat vzorky. Pre myši je tento čas približne 3 – 5 hodín; pre čínske morčatá približne 4 – 5 hodín. Bunky sa zbierajú z kostnej drene a analyzujú sa chromozómové odchýlky.

1.5.3. Úrovne dávok Ak sa z dôvodu nedostatku vhodných údajov uskutoční štúdia na zistenie rozsahu, vykoná sa v rovnakom laboratóriu s použitím rovnakého druhu, rodu, pohlavia a dávkovacieho režimu ako v hlavnej štúdii (5). Ak sa vyskytuje toxicita, pre prvý odber vzorky sa používajú tri úrovne dávok. Tieto úrovne dávok pokrývajú rozsah od maximálnej po malú alebo žiadnu toxicitu. Pri neskoršom odbere vzorky sa používa len najvyššia dávka. Najvyššia dávka sa definuje ako známky toxicity z dávky na takej úrovni, že vyššie úrovne dávkovania založené na rovnakom dávkovacom režime by pravdepodobne spôsobili úmrtnosť. Látky so špecifickými biologickými aktivitami pri nízkych netoxických dávkach (ako napríklad hormóny a mitogény) môžu byť výnimkou kritéria stanovenia dávky a hodnotia sa z prípadu na prípad. Najvyššia dávka sa tiež definuje ako dávka, ktorá spôsobuje určité známky toxicity v kostnej dreni (napríklad: vyššie ako 50 % zníženie mitotického indexu).

1.5.4. Limitný test Ak test pri jednej úrovni dávky najmenej 2000 mg/kg telesnej hmotnosti pri jednom podaní alebo pri dvoch podaniach v jeden deň nevyvoláva žiadne toxické účinky a ak sa neočakáva genotoxicita na základe údajov zo štrukturálne príbuzných látok, úplná štúdia pri použití troch úrovní dávkovania sa nepovažuje za potrebnú. Pre štúdie s dlhším trvaním je limitnou dávkou 2000 mg/kg/telesná hmotnosť/deň pre podávanie trvajúce maximálne 14 dní a 1000 mg/kg/telesná hmotnosť/deň pre podávanie trvajúce viac ako 14 dní. Očakávaná expozícia ľudí môže naznačovať potrebu vyššej úrovne dávky pri použití limitného testu.

1.5.5. Podávanie dávok Testovacia látka sa zvyčajne podáva plnením žalúdka sondou s použitím žalúdočnej rúrky alebo vhodnej intubačnej kanyly, alebo intraperitoneálnou injekciou. Iné cesty expozície sú prijateľné len so zdôvodnením. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže naraz podávať žalúdočnou sondou alebo injekciou závisí od veľkosti testovacieho zvieraťa. Objem by nemal presiahnuť 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Použitie vyšších objemov sa musí zdôvodniť. Okrem dráždivých alebo žieravých látok, ktoré bežne odhalia zhoršené účinky s vyššími koncentráciami, sa variabilita testovacieho objemu minimalizuje upravením koncentrácie na zabezpečenie stáleho objemu na všetkých úrovniach dávok.

1.5.6. Príprava chromozómov Ihneď po utratení sa získava kostná dreň, ktorá sa vystaví hypotonickému roztoku a fixuje sa. Bunky sa potom umiestnia na sklíčka a zafarbia.

1.5.7. Analýza Mitotický index sa stanovuje ako meradlo cytotoxicity aspoň na 1000 bunkách na jedno zviera pre všetky pokusné zvieratá (vrátane pozitívnej kontrolnej skupiny) a pre neošetrené negatívne kontrolné zvieratá. Pre každé zviera sa analyzuje najmenej 100 buniek. Tento počet možno znížiť pri pozorovaní vysokého počtu odchýlok. Všetky sklíčka vrátane sklíčok z negatívnych a pozitívnych kontrolných skupín sa pred mikroskopickou analýzou nezávisle označia kódmi. Keďže postupy prípravy sklíčok často ústia do pretrhnutia časti metafázy so stratou chromozómov, označené bunky by mali obsahovať počet centromér rovnajúci sa hodnote 2n ± 2.

2. ÚDAJE

2.

2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV Údaje o jednotlivých zvieratách sa uvádzajú v tabuľkovej forme. Experimentálnou jednotkou je jedno zviera. Pre každé zviera sa hodnotí počet buniek, počet odchýlok na bunku a percento buniek so štrukturálnou chromozómovou odchýlkou/odchýlkami. Rôzne typy štrukturálnych chromozómových odchýlok sa uvádzajú v zozname s ich číslami a frekvenciami pre experimentálne a kontrolné kultúry. Trhliny sa zaznamenávajú oddelene a uvádzajú sa, ale zvyčajne sa neudávajú pri celkovej frekvencii odchýlok. Ak neexistujú dôkazy rozdielov medzi reakciami rôznych pohlaví, údaje z oboch pohlaví sa môžu kombinovať pre štatistickú analýzu.

2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Pre stanovenie pozitívneho výsledku existuje niekoľko kritérií, ako napríklad nárast relatívneho počtu buniek s chromozómovými odchýlkami spojený s dávkou alebo jasný nárast počtu buniek s odchýlkami v jednej dávkovacej skupine pri jednom odbere vzorky. Najprv sa zvažuje biologická relevantnosť výsledkov. Ako pomôcka sa pri hodnotení výsledkov testov používajú štatistické metódy (6). Nejasné výsledky sa objasňujú ďalším testovaním, najlepšie použitím modifikácie pokusných podmienok. Nárast polyploidie môže naznačovať, že testovacia látka má potenciál indukovať číselné chromozómové odchýlky. Nárast endoreduplikácie môže naznačovať, že testovacia látka má potenciál brzdiť priebeh bunkového cyklu (7) (8). Hoci väčšina pokusov poskytne jasne pozitívne alebo negatívne výsledky, v zriedkavých prípadoch údaje vylúčia konečný verdikt o aktivite testovacej látky. Výsledky môžu ostať nejasné alebo spochybniteľné bez ohľadu na počet opakovaní pokusu. Pozitívne výsledky in vivo testu chromozómovej odchýlky naznačujú, že určitá látka vyvoláva štrukturálne chromozómové odchýlky v kostnej dreni testovaného druhu. Negatívne výsledky naznačujú, že v testovacích podmienkach testovacia látka neindukuje chromozómové odchýlky v kostnej dreni testovaného druhu.

3. PODÁVANIE SPRÁV

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu zahŕňa nasledujúce informácie:

Rozpúšťadlo/nosič:

zdôvodnenie výberu nosiča,

rozpustnosť a stálosť testovacej látky v rozpúšťadle/nosiči, ak je známa.

Testované zvieratá:

použitý druh/kmeň,

počet, vek a pohlavie zvierat,

zdroj, podmienky chovu, strava atď.,

individuálna hmotnosť zvierat na začiatku testu vrátane rozsahu telesnej hmotnosti, strednej hodnoty a štandardnej odchýlky pre každú skupinu.

Podmienky testov:

pozitívne a negatívne (rozpúšťadlo/nosič) kontrolné skupiny,

údaje zo štúdie na zistenie rozsahu, ak sa uskutočnila,

zdôvodnenie výberu konečnej úrovne,

podrobnosti o príprave testovacej látky,

podrobnosti o podávaní testovacej látky,

zdôvodnenie výberu spôsobu podávania,

metódy overovania, že testovacia látka dosiahla všeobecný vnútorný obeh alebo cieľové tkanivo, ak je to vhodné,

konverzia z koncentrácie testovacej látky v strave/vode (ppm) na samotnú dávku (mg/kg/telesná hmotnosť/deň), ak je to vhodné,

podrobnosti o kvalite stravy a vody,

metódy merania toxicity,

identita látky zastavujúcej metafázu, jej koncentrácia a trvanie podávania,

metódy prípravy sklíčok,

kritériá na hodnotenie odchýlok,

počet analyzovaných buniek na jedno zviera,

kritériá na hodnotenie pokusov ako pozitívne, negatívne alebo nejasné.

Výsledky:

známky toxicity,

mitotický index,

typ a počet odchýlok uvedený jednotlivo za každé zviera,

celkový počet odchýlok na skupinu so strednou hodnotou a štandardnou odchýlkou,

počet buniek s odchýlkami na skupinu so strednou hodnotou a štandardnou odchýlkou,

zmeny v ploidii, ak sa pozorovali,

vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je to možné,

štatistické analýzy, ak sa použili,

údaje o negatívnych kontrolných skupinách,

historické údaje o negatívnych kontrolných skupinách s rozsahmi, strednými hodnotami a štandardnými odchýlkami,

údaje o pozitívnych kontrolných skupinách.

Rozbor výsledkov

Závery

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)

ODKAZY Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests In Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt a J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D. C, s. 275 – 306. Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. a Shelby, M. (1987), Mammalian in vivo Cytogenetic Assays. Analysis of Chromosome Aberration in Bone Marrow Cells, in: Mutation Res., 189, s. 157 – 165. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. a Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, new York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115 – 141. Tice, R. R, Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H, Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H, Soutou, S. a Vannier, B., (1994) Report from the Working Group on the in vivo Mammalian Bone Marrow Chromosom Aberration Test, Mutation Res., 312, s. 305 – 312. Fielder, R I, Allen, J. A., Boobis, A. R, Botham, P. A., Doe, I, Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. a Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, s. 313 – 319. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R, Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R, Richold, M., Papworth, D. G. a Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III, Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed), Cambridge University Press, Cambridge, s. 184 – 232. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha Radiation Induced G2 Arrest, Mutation Res., 119, s. 403 – 413. Huang, Y., Change, C. a Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells, Cancer Res., 43, s. 1362 – 1364.

B.12. MUTAGÉNNOSŤ – IN VIVO TEST MIKROJADRA ERYTROCYTU U CICAVCOV

B.12.

1. METÓDA Táto metóda je obdobou OECD TG 474 in vivo testu mikrojadra erytrocytu u cicavcov (1997).

1.

1.1. ÚVOD In vivo test mikrojadra erytrocytu u cicavcov sa používa na zisťovanie poškodenia vyvolaného testovacou látkou na chromozómoch alebo mitotickom aparáte erytroblastov analýzou erytrocytov odobratých z kostnej drene a/alebo periferálnych krvných buniek zvierat, zvyčajne hlodavcov. Účelom testu mikrojadra je identifikovať látky, ktoré spôsobujú cytogenetické poškodenie s tvorbou mikrojadier obsahujúcich zaostávajúce chromozómové fragmenty alebo celé chromozómy. Keď sa erytroblast kostnej drene vyvinie na polychromatický erytrocyt, hlavné jadro sa odpudzuje; akýkoľvek mikronukleus, ktorý sa vytvoril, môže ostať pozadu v inak anukleovanej cytoplazme. Vizualizácia mikrojadier je v týchto bunkách jednoduchšia, pretože nemajú hlavné jadro. Nárast frekvencie mikronukleovaných polychromatických erytrocytov u pokusných zvierat je indikáciou vyvolaného chromozómového poškodenia. Pri tomto teste sa zvyčajne používa kostná dreň hlodavcov, keďže polychromatické erytrocyty sa tvoria v tomto tkanive. Meranie mikronukleovaných nezrelých (polychromatických) erytrocytov v periférnej krvi je rovnako prijateľné pre akékoľvek druhy, pri ktorých sa preukázala neschopnosť sleziny odstraňovať mikronukleované erytrocyty alebo ktoré vykázali rovnakú citlivosť na zistenie činiteľov, ktoré spôsobujú štrukturálne alebo numerické chromozómové odchýlky. Mikrojadrá sa dajú rozlíšiť podľa niekoľkých kritérií. Ide napríklad o identifikáciu prítomnosti alebo neprítomnosti kinetochoru alebo centromerickej DNA v mikrojadrách. Frekvencia mikronukleovaných nezrelých (polychromatických) erytrocytov je principiálnym hlavným parametrom. Počet zrelých (normochromatických) erytrocytov v periférnej krvi, ktorá obsahuje mikrojadrá medzi daným počtom zrelých erytrocytov, sa tiež môže použiť ako parameter pokusu, ak tento prebieha štyri a viac týždňov. Tento in vivo test mikrojadra cicavcov je pre hodnotenie mutagénneho rizika osobitne relevantný, pretože umožňuje zváženie faktorov in vivo metabolizmu, farmakokinetiky a opravných procesov DNA, hoci tieto sa môžu z druhu na druh, z tkaniva na tkanivo a z géna na gén líšiť. In vivo test je tiež užitočný pre ďalšie skúmanie mutagénnych účinkov zistených in vitro systémom. Ak existujú dôkazy, že testovacia látka alebo reaktívny metabolit nedosiahne cieľové tkanivo, nie je vhodné tento test použiť. Pozri tiež všeobecný úvod k časti B.

1.2. DEFINÍCIE Centromera (kinetochora): oblasť/oblasti chromozómu, s ktorými sú spojené vretenové vlákna počas delenia buniek, umožňujúce riadny pohyb dcérskych chromozómov k pólom dcérskych buniek. Mikrojadrá: malé jadrá oddelené od hlavných jadier buniek a pridaných k nim, vytvárané počas telofázy mitózy (meiózy) zaostávajúcimi chromozómovými fragmentmi alebo celými chromozómami. Normochromatický erytrocyt: zrelý erytrocyt, ktorý neobsahuje ribozómy a od nezrelých polychromatických erytrocytov sa líši škvrnami typickými pre ribozómy. Polychromatický erytrocyt: nezrelý erytrocyt v medzištádiu vývoja, ktorý stále obsahuje ribozómy, a preto sa od zrelých normochromatických erytrocytov líši škvrnami typickými pre ribozómy.

1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Zvieratá sú vystavené testovacej látke príslušným spôsobom. Ak sa používa kostná dreň, zvieratá sa utratia vo vhodnom čase po podaní látky, kostná dreň sa vyberie a prípravky (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) sa zhotovia a zafarbia. Ak sa používa periférna krv, odoberá sa vo vhodnom čase po podaní látky a prípravky (4) (8) (9) (10) sa zhotovia a zafarbia. Pre štúdie s periférnou krvou by medzi poslednou expozíciou a zberom buniek mal ubehnúť minimálny čas. Preparáty sa analyzujú na prítomnosť mikrojadier.

1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.4.

1.4.1. Prípravné práce

1.4.1.

1.4.1.1. Výber živočíšneho druhu Ak sa používa kostná dreň, odporúča sa použiť krysy a myši, hoci použiť sa dajú akékoľvek vhodné druhy cicavcov. Ak sa používa periférna krv, odporúča sa použiť myši. Použiť sa však dajú akékoľvek vhodné druhy cicavcov za predpokladu, že ide o druh, v ktorom slezina neodstraňuje mikronukleované erytrocyty, alebo druh, ktorý vykazuje primeranú citlivosť na zistenie činiteľov, ktoré spôsobujú štrukturálne alebo číselné chromozómové odchýlky. Vyberajú sa bežne používané laboratórne kmene mladých zdravých dospelých zvierat. Na začiatku štúdie by mala byť hmotnostná variácia zvierat minimálna a nemala by presiahnuť ± 20 % strednej hmotnosti každého pohlavia.

1.4.1.2. Podmienky umiestnenia a kŕmenia Používajú sa všeobecné podmienky uvedené vo všeobecnom úvode k časti B, cieľovou hodnotou pre vlhkosť je 50 % – 60 %.

1.4.1.3. Príprava zvierat Zdravé mladé dospelé zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolných a pokusných skupín. Zvieratá sa jednotlivo označia. Zvieratá sa aklimatizujú na laboratórne podmienky najmenej päť dní. Klietky sú umiestnené tak, aby sa minimalizovali možné účinky vyplývajúce z rozmiestnenia klietok.

1.4.2. Podmienky testov

1.4.2.

1.4.2.1. Rozpúšťadlo/nosič Rozpúšťadlo/nosič by nemal vyvolávať toxické účinky v používaných úrovniach dávok a nemal by chemicky reagovať s testovacou látkou. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by mali podporiť referenčné údaje označujúce ich kompatibilitu. Odporúča sa zvážiť, pokiaľ je to možné, použitie vodného rozpúšťadla/nosiča.

1.4.2.2. Kontrolné skupiny Pri každom pokuse sa pre každé pohlavie vytvoria pozitívne a negatívne (rozpúšťadlo alebo nosič) kontrolné skupiny. Okrem podávania testovacej látky sa so zvieratami v kontrolných skupinách zaobchádza rovnakým spôsobom ako s pokusnými zvieratami. Pozitívne kontrolné skupiny vytvárajú mikrojadrá in vivo v úrovniach expozície, pri ktorých sa očakáva zistiteľný nárast na pozadí. Dávky pozitívnej kontrolnej skupiny sa volia tak, aby účinky boli zjavné, ale aby pozorovateľovi priamo neodhaľovali identitu kódovaných vzoriek. Je prijateľné, aby sa pozitívnym kontrolným skupinám podávali látky spôsobom odlišným od testovacej látky a vzorky z nich sa odoberali iba raz. Možno zvážiť použitie príbuzných chemikálií pre pozitívnu kontrolnú skupinu v triede chemikálií, ak sú tieto dostupné. Príklady látok pre pozitívnu kontrolnú skupinu: Látka Číslo CAS Číslo EINECS etylmetánsulfonát 62-50-0 200-536-7 N-etyl-N-nitrozmočovina 759-73-9 212-072-2 mytomycín C 50-07-7 200-008-6 cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu 50-18-0 055-19-2 200-015-4 trietylénmelamín 51-18-3 200-083-5 Pre každý odber vzoriek sa odoberú aj vzorky z negatívnych kontrolných skupín ošetrených rozpúšťadlom alebo nosičom a inak ošetrovaných rovnakým spôsobom ako pokusné skupiny, pokiaľ nie sú z historických kontrolných údajov dostupné údaje o variabilite medzi zvieratami a frekvenciách buniek s chromozómovou odchýlkou. Ak sa pre negatívne kontrolné skupiny používa jeden odber vzorky, najvhodnejším časom je prvý odber. Používajú sa aj neošetrené kontrolné skupiny, pokiaľ neexistujú historické kontrolné údaje demonštrujúce, že vybrané rozpúšťadlo alebo nosič nespôsobujú žiadne rušivé alebo mutagénne efekty. Ak sa používa periférna krv, prijateľná je tiež vzorka pred podaním látky ako súbežná negatívna kontrola, ale len v prípadoch krátkych štúdií periférnej krvi (napríklad: 1 – 3 dávky), keď výsledné údaje sú v očakávanom rozsahu pre historickú kontrolu.

1.5. POSTUP

1.5.

1.5.1. Počet a pohlavie zvierat Každá pokusná a kontrolná skupina obsahuje najmenej päť analyzovateľných zvierat každého pohlavia. Ak v čase uskutočnenia štúdie sú dostupné údaje zo štúdií rovnakých druhov a používajúce rovnaké spôsoby vystavenia, ktoré ukazujú, že neexistujú významné rozdiely v toxicite medzi pohlaviami, stačí aj testovanie jedného pohlavia. Ak expozícia chemikálií na ľudí je závislá od pohlavia, ako napríklad pri niektorých farmaceutických prípravkoch, test sa uskutoční na zvieratách príslušného pohlavia.

1.5.2. Harmonogram podávania Nedá sa odporučiť žiadny štandardný (t. j. jedna, dve alebo tri podania v 24-hodinových intervaloch) harmonogram podávania. Vzorky z predĺžených dávkovacích režimov sú prijateľné, pokiaľ bol pre túto štúdiu preukázaný pozitívny účinok alebo pokiaľ bola pri negatívnej štúdii preukázaná toxicita, alebo ak sa použila limitná dávka a dávkovanie pokračovalo až do času odberu vzorky. Testovacie látky sa tiež môžu podávať v dvoch dávkach, t. j. dve ošetrenia v ten istý deň niekoľko hodín po sebe na uľahčenie podania veľkého objemu látky. Test sa môže uskutočniť dvoma spôsobmi: Ak je to relevantné, použijú sa ďalšie intervaly odberu vzoriek.

1.5.2. a)

zvieratám sa testovacia látka podá raz. Vzorky kostnej drene sa odoberú minimálne dvakrát, nie skôr ako 24 hodín po podaní, ale nie neskôr ako 48 hodín po podaní s primeranými intervalmi medzi odbermi. Uskutočnenie odberu skôr ako 24 hodín po podaní sa zdôvodní. Vzorky periférnej krvi sa odoberú minimálne dvakrát, minimálne 36 hodín po podaní s primeranými intervalmi po odbere, ale nie neskôr ako po 72 hodinách. Pri zistení pozitívnej reakcie pri niektorom odbere nie je ďalší odber vzorky potrebný;

ak sa použijú dve alebo viac dávok za deň (napríklad dve alebo viac dávok v 24-hodinových intervaloch), vzorky sa odoberajú raz medzi 18. a 24. hodinou nasledujúcou po poslednej dávke pri kostnej dreni a raz medzi 36. a 48. hodinou po poslednej dávke pri periférnej krvi (12).

1.5.3. Úrovne dávok Ak sa z dôvodu nedostatku vhodných údajov uskutoční štúdia na zistenie rozsahu, vykoná sa v rovnakom laboratóriu s použitím rovnakého druhu, rodu, pohlavia a dávkovacieho režimu ako v hlavnej štúdii (13). Ak sa vyskytuje toxicita, pre prvý odber vzorky sa používajú tri úrovne dávok. Tieto úrovne dávok pokrývajú rozsah od maximálnej po malú alebo žiadnu toxicitu. Pri neskoršom odbere vzorky sa používa len najvyššia dávka. Najvyššia dávka sa definuje ako známky toxicity z dávky na takej úrovni, že vyššie úrovne dávok založené na rovnakom dávkovacom režime by pravdepodobne spôsobili úmrtnosť. Látky so špecifickými biologickými aktivitami pri nízkych netoxických dávkach (ako napríklad hormóny a mitogény) môžu byť výnimkou z kritéria stanovenia dávky a hodnotia sa z prípadu na prípad. Najvyššia dávka sa tiež definuje ako dávka, ktorá spôsobuje určité známky toxicity v kostnej dreni (napríklad zníženie podielu nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov v kostnej dreni alebo periférnej krvi).

1.5.4. Limitný test Ak test pri jednej úrovni dávky najmenej 2000 mg/kg telesnej hmotnosti pri jednom podaní alebo pri dvoch podaniach v jeden deň nevyvoláva žiadne toxické účinky a ak sa neočakáva genotoxicita na základe údajov zo štrukturálne príbuzných látok, úplná štúdia pri použití troch objemov dávok sa nepovažuje za potrebnú. Pre štúdie s dlhším trvaním je limitnou dávkou 2000 mg/kg/telesná hmotnosť/deň pre podávanie trvajúce maximálne 14 dní a 1000 mg/kg/telesná hmotnosť/deň pre podávanie trvajúce viac ako 14 dní. Očakávaná expozícia na ľudí môže naznačovať potrebu vyššej úrovne dávok pri použití limitného testu.

1.5.5. Podávanie dávok Testovacia látka sa zvyčajne podáva plnením žalúdka sondou s použitím žalúdočnej rúrky alebo vhodnej intubačnej kanyly, alebo intraperitoneálnou injekciou. Iné spôsoby expozície sú prijateľné len so zdôvodnením. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže naraz podávať žalúdočnou sondou alebo injekciou, závisí od veľkosti testovacieho zvieraťa. Objem by nemal presiahnuť 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Použitie vyšších objemov sa musí zdôvodniť. Okrem dráždivých alebo žieravých látok, ktoré bežne odhalia zhoršené účinky s vyššími koncentráciami, sa variabilita testovacieho objemu minimalizuje upravením koncentrácie na zabezpečenie stáleho objemu na všetkých úrovniach dávok.

1.5.6. Príprava kostnej drene/krvi Bunky kostnej drene sa zvyčajne získavajú zo stehennej kosti (femur) alebo holennej kosti (tibia) ihneď po utratení. Zvyčajne sa bunky z týchto kostí odoberú, pripravia a zafarbia použitím bežných metód. Periférna krv sa získava z chvostovej žily alebo inej vhodnej žily. Krvné bunky sa ihneď supravitálne zafarbia (8) (9) (10) alebo sa urobia škvrnové prípravky, ktoré sa následne zafarbia. Použitie špecifického farbiva DNA [napríklad akridínová oranž (14) alebo Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)] môže odstrániť niektoré umelo vzniknuté štruktúry buniek spojené s používaním nešpecifického farbiva DNA. Táto výhoda nedáva predpoklad používania konvenčných farbív (napríklad Giemsa). Použiť sa tiež môžu dodatočné systémy [napríklad celulózne stĺpce na odstránenie nukleovaných buniek (16)], a to za predpokladu, že tieto systémy vykazujú v laboratórnych podmienkach primerané výsledky pri príprave mikrojadier.

1.5.7. Analýza Pre každé zviera sa stanovuje podiel nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov (zrelých plus nezrelých) spočítaním celkovo najmenej 200 erytrocytov pre kostnú dreň a 1000 erytrocytov pre periférnu krv (17). Všetky sklíčka vrátane sklíčok z negatívnych a pozitívnych kontrolných skupín sa pred mikroskopickou analýzou nezávisle označia kódmi. Na výskyt mikronukleovaných nezrelých erytrocytov sa počíta minimálne 2000 nezrelých erytrocytov na jedno zviera. Dodatočné informácie možno získať zaznamenávaním zrelých erytrocytov na mikrojadrách. Pri analýze sklíčok by podiel nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov nemal byť menej ako 20 % kontrolnej hodnoty. Ak podávanie trvá bez prestávky štyri a viac týždňov, na výskyt mikrojadier sa počíta minimálne 2000 zrelých erytrocytov na jedno zviera. Systémy na automatickú analýzu (vizuálna analýza a toková cytometrická analýza bunkových suspenzií) sú prijateľnou alternatívou manuálneho hodnotenia, ak sa príslušne zdôvodnia a potvrdia.

2. ÚDAJE

2.

2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV Údaje o jednotlivých zvieratách sa uvádzajú v tabuľkovej forme. Experimentálnou jednotkou je jedno zviera. Pre každé zviera sa jednotlivo uvádza počet nezrelých erytrocytov, počet mikronukleovaných nezrelých erytrocytov a podiel nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov. Ak podávanie prebieha bez prestávky štyri a viac týždňov, udávajú sa tiež údaje o zrelých erytrocytoch, ak sa zhromažďovali. Pre každé zviera sa udáva podiel nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov, a ak je to vhodné, percentuálny podiel mikronukleovaných erytrocytov. Ak neexistujú dôkazy o rozdieloch medzi reakciami rôznych pohlaví, údaje z oboch pohlaví sa môžu kombinovať pre štatistickú analýzu.

2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Pre stanovenie pozitívneho výsledku existuje niekoľko kritérií, ako napríklad nárast relatívneho počtu buniek s chromozómovými odchýlkami spojený s dávkou alebo jasný nárast počtu buniek s odchýlkami v jednej dávkovacej skupine pri jednom odbere vzorky. Najprv sa zvažuje biologická relevantnosť výsledkov. Ako pomôcka sa pri hodnotení výsledkov testov používajú štatistické metódy (18) (19). Nejasné výsledky sa objasňujú ďalším testovaním, najlepšie použitím modifikácie pokusných podmienok. Testovacia látka, pre ktorú nespĺňajú výsledky vyššie uvedené kritériá, sa pre tento test považuje za nemutagénnu. Hoci väčšina pokusov poskytne jednoznačne pozitívne alebo negatívne výsledky, v zriedkavých prípadoch údaje vylúčia konečný verdikt o aktivite testovacej látky. Výsledky môžu ostať nejasné alebo spochybniteľné bez ohľadu na počet opakovaní pokusu. Pozitívne výsledky testu mikrojadier naznačujú, že určitá látka vyvoláva mikrojadrá, ktoré sú výsledkom chromozómového poškodenia alebo poškodenia mitotického aparátu v erytroblastoch testovaného druhu. Negatívne výsledky naznačujú, že v testovacích podmienkach testovacia látka v nezrelých erytrocytoch testovaného druhu mikrojadrá nevytvára.

3. PODÁVANIE SPRÁV

3. SPRÁVA Z TESTU

Správa z testu zahŕňa nasledujúce informácie:

Rozpúšťadlo/nosič:

zdôvodnenie výberu nosiča,

rozpustnosť a stabilita testovacej látky v rozpúšťadle/nosiči, ak je známa.

Testovacie zvieratá:

použitý druh/kmeň,

počet, vek a pohlavie zvierat,

zdroj, podmienky chovu, strava atď.,

individuálna hmotnosť zvierat na začiatku testu vrátane rozsahu telesnej hmotnosti, strednej hodnoty a štandardnej odchýlky pre každú skupinu.

Podmienky testov:

pozitívne a negatívne (rozpúšťadlo/nosič) kontrolné skupiny,

údaje zo štúdie na zistenie rozsahu, ak sa uskutočnila,

zdôvodnenie voľby úrovne dávok,

podrobnosti o príprave testovacej látky,

podrobnosti o podávaní testovacej látky,

zdôvodnenie spôsobu podávania,

metódy overovania, že testovacia látka dosiahla všeobecný vnútorný obeh alebo cieľové tkanivo, ak je to vhodné,

konverzia z koncentrácie testovacej látky v strave/vode (ppm) na samotnú dávku (mg/kg/telesná hmotnosť/deň), ak je to vhodné,

podrobnosti o kvalite stravy a vody,

podrobný opis harmonogramov podávania a odoberania vzoriek,

metódy prípravy sklíčok,

metódy merania toxicity,

kritériá počítania mikronukleovaných nezrelých erytrocytov,

počet analyzovaných buniek na jedno zviera,

kritériá na hodnotenie pokusov ako pozitívne, negatívne alebo nejasné.

Výsledky

známky toxicity,

podiel nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov,

počet mikronukleovaných nezrelých erytrocytov jednotlivo pre každé zviera,

± stredná hodnota štandardnej odchýlky mikronukleovaných nezrelých erytrocytov na skupinu,

vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je to možné,

použité štatistické analýzy a metódy,

údaje o negatívnych kontrolných skupinách,

údaje o pozitívnych kontrolných skupinách.

— Rozbor výsledkov

— Závery

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)

ODKAZY Heddle, J. A. (1973), A Rapid In vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, s. 187 – 190. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, s. 9 – 15. Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. a Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res., 123, s. 61 – 118. Mavournin, K. H., Blakey, D. H, Cimino, M. C, Salamone, M. F. a Heddle, J. A. (1990), The In vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A Report of the US Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, s. 29 – 80. MacGregor, J. T., Schlegel, R, Choy, W. N. a Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developmentsin Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell a T. S. Miya, Elsevier, Amsterdam, s. 555 – 558. MacGregor, J. T., Heddle, J. A., Hite, M., Margolin, G H., Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R. a Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189. s. 103 – 112. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R a Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol 14, s. 513 – 522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. a Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, s. 245 – 249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, Mutation Res., 278, s. 83 – 98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol Recommended for the Short-term Mouse Peripheral Blood Micronucleus test, Mutagenesis, 10, s. 53 – 159. Hayashi, M., Tice, R. R, MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H, Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr., F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Soutou, S. a Vannier, B. (1994), In vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, s. 293 – 304. Higashikuni, N. a Soutou, S. (1995), An Optimal Generalised Sampling Time of 30 ± 6 h after Double Dosing in the Mouse Peripheral Micronucleus Test, Mutagenesis, 10, s. 313 – 319. Fielder, R I, Allen, J. A., Boobis, A. R, Botham, P. A., Doe, I, Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G, Hodson-Walker, G, Morton, D. B., Kirkland, D. J. a Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, s. 313 – 319. Hayashi, M., Sofumi, T. a Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, s. 241 – 247. MacGregor, J. T., Wehr, C. M. a Langlois, R. G (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, s. 269 – 275. Romagna, F. a Staniforth, C. D. (1989), The Automated Bone Marrow Micronucleus Test, Mutation Res., 213, s. 91 – 104. Gollapudi, B. a McFadden, L. G (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, s. 97 – 99. Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G, Bootman, J. a Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge Uniersity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115 – 141. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R, Amphlett, G E., Clare, G, Ferguson, R, Richold, M., Papworth, D. G. a Savage, J. R. K, (1989) Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays, in:D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenecity test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, D. J. Kirkland (ed), Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Mellbourne, Sydney, s. 184 – 232.

B.13/14. MUTAGÉNNOSŤ: BAKTERIÁLNY TEST REVERZNÝCH MUTÁCIÍ

B.13/14.

1. METÓDA Táto metóda je obdobou metódy OECD TG 471 bakteriálneho testu reverzných mutácií (1997).

1.

1.1. ÚVOD Bakteriálny test reverzných mutácií používa aminokyseliny vyžadujúce kmene Salmonella typhimurium a Escherichia coli na zistenie bodových mutácií, ktoré zahŕňajú nahradenie, pridanie alebo vymazanie jednej alebo niekoľkých bázových párov DNA (1) (2) (3). Princípom bakteriálneho testu reverzných mutácií je, že zisťuje mutácie, ktoré vracajú do pôvodného stavu mutácie prítomné v testovacích kmeňoch a obnovujú funkčnú schopnosť baktérií syntetizovať esenciálne aminokyseliny. Reverzné baktérie sa zisťujú prostredníctvom ich schopnosti rásť v neprítomnosti aminokyseliny vyžadovanej rodičovským testovacím kmeňom. Bodové mutácie sú príčinou mnohých ľudských genetických chorôb a existujú dostatočné dôkazy, že bodové mutácie onkogénov a génov na potláčanie nádorov somatických buniek sú prítomné pri výskyte rakoviny u ľudí a pokusných zvierat. Bakteriálny test reverzných mutácií je rýchly, lacný a relatívne ľahko uskutočniteľný. Mnohé z testovacích kmeňov majú viacero vlastností, ktoré spôsobujú ich väčšiu citlivosť na zistenie mutácií vrátane reaktívnych DNA sekvencií na reverzných miestach, zvýšenej bunkovej permeability na veľké molekuly a eliminácie opravných systémov DNA alebo zlepšenia opravných procesov DNA náchylných na chyby. Špecifickosť testovacích kmeňov môže poskytnúť užitočné informácie o typoch mutácií, ktoré sú vyvolané genotoxickými činiteľmi. Dostupná je veľká databáza výsledkov pre rôzne štruktúry pre bakteriálny test reverzných mutácií a boli vyvinuté dobré metódy na testovanie chemikálií s rôznymi fyzikálno-chemickými vlastnosťami vrátane prchavých zmesí. Pozri tiež všeobecný úvod časť B.

1.2. DEFINÍCIE Test reverzných mutácií buď v Salmonella typhimurium, alebo Escherichia coli zisťuje mutáciu v kmeni vyžadujúcom aminokyselinu (histidín alebo tryptofán) na vytvorenie kmeňa nezávislého od vonkajšieho prívodu aminokyseliny. Substitučné mutagény bázového páru sú činitele, ktoré spôsobujú bázovú zmenu DNA. V teste reverzných mutácií sa môže táto zmena odohrať na mieste pôvodnej mutácie alebo na inom mieste bakteriálneho genómu. Konštrukčné mutagény sú činitele, ktoré spôsobujú pridanie alebo vymazanie jedného alebo viacerých bázových párov DNA, čím menia čítaciu konštrukciu DNA.

1.3. ÚVODNÉ ÚVAHY Bakteriálny test reverzných mutácií využíva prokaryotické bunky, ktoré sa od buniek cicavcov odlišujú vo faktoroch, ako je vstrebávanie, metabolizmus, chromozómová štruktúra a opravné procesy DNA. Testy uskutočnené in vitro vo všeobecnosti vyžadujú použitie exogénneho zdroja metabolickej aktivácie. In vitro systémy metabolickej aktivácie nemôžu plne napodobniť in vivo podmienky cicavcov. Test preto neposkytuje priame informácie o mutagénnej a karcinogénnej potencii látky u cicavcov. Bakteriálny test reverzných mutácií sa bežne používa ako počiatočný prieskum genologickej aktivity, a najmä aktivity vyvolávajúcej bodové mutácie. Rozsiahla databáza ukázala, že mnohé chemikálie, ktoré sú v tomto teste pozitívne, tiež vykazujú mutagénnu aktivitu v iných testoch. Existujú príklady mutagénnych činiteľov, ktoré sa nezistili týmto testom; príčina týchto chýb sa dá pripísať špecifickej povahe zisteného stavu, rozdielom v metabolickej aktivácii alebo rozdielom v biodostupnosti. Na druhej strane faktory, ktoré zvyšujú citlivosť bakteriálneho testu reverzných mutácií, môžu viesť k preceneniu mutagénnej aktivity. Bakteriálny test reverzných mutácií nemusí byť vhodný na hodnotenie určitých tried chemikálií, napríklad vysoko baktericídnych zlúčenín (napríklad určitých antibiotík) a tých, o ktorých sa predpokladá (alebo je o nich známe), že špecificky narúšajú replikačný systém buniek cicavcov (napríklad niektoré inhibítory topoizomerázy a niektoré nukleozidové napodobeniny). V takýchto prípadoch sú vhodnejšie testy mutácií u cicavcov. Hoci mnohé zlúčeniny, ktoré sú v tomto teste pozitívne, sú karcinogénmi u cicavcov, korelácia nie je absolútna. Závisí to od triedy chemikálie a existujú karcinogény, ktoré sa týmto testom nezistia, pretože pôsobia prostredníctvom iných negenotoxických mechanizmov alebo mechanizmov neprítomných v bunkách baktérií.

1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Suspenzie bakteriálnych buniek sú vystavené testovacej látke v prítomnosti a neprítomnosti exogénneho systému metabolickej aktivácie. Pri metóde použitia misiek sa tieto suspenzie zmiešajú s krycím agarom a umiestnia sa na veľmi malé médium. Pri metóde predinkubácie sa dávkovaná zmes inkubuje a potom zmieša s krycím agarom pred umiestnením na veľmi malé médium. Pri oboch technikách sa po dvoch alebo troch dňoch inkubácie spočítajú reverzné kolónie a porovnajú sa s počtom spontánnych kolónií revertantov na kontrolných miskách. Boli opísané viaceré postupy uskutočnenia bakteriálneho testu reverzných mutácií. Medzi bežne používané patrí metóda použitia misiek (1) (2) (3) (4), predinkubačná metóda (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluktuačná metóda (9) (10) a suspenzná metóda (11). Opísané boli aj modifikácie testovania plynov a pár (12). Postupy opísané v tejto metóde sa týkajú najmä metódy použitia misky a predinkubačnej metódy. Obe sú prijateľné pre uskutočňovanie pokusov s metabolickou aktiváciou aj bez nej. Niektoré látky sa dajú efektívnejšie zistiť použitím predinkubačnej metódy. Tieto látky patria do tried chemikálií, ktoré zahŕňajú alifatické nitrozamíny s krátkymi reťazcami, bivalentné kovy, aldehydy, azofarbivá a diazozlúčeniny, pyrolizidínové alkaloidy, alylové zlúčeniny a nitrozlúčeniny (3). Zistilo sa, že niektoré triedy mutagénov sa nie vždy objavia s použitím štandardných postupov, ako napríklad metódou použitia misky alebo predinkubačnou metódou. Tieto mutagény sa považujú za osobitné prípady a na ich zistenie sa dôrazne odporúča použitie alternatívnych postupov. Identifikované boli nasledujúce osobitné prípady (spolu s príkladmi postupov, ktoré by sa dali použiť na ich zistenie): azofarbivá a diazozlúčeniny (3) (5) (6) (13), plyny a prchavé chemikálie (12) (14) (15) (16) a glykozidy (17) (18). Odchýlka od štandardného postupu sa musí vedecky zdôvodniť.

1.5. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.5.

1.5.1. Prípravné práce

1.5.1.

1.5.1.1. Baktérie Čerstvé kultúry baktérií sa nechajú vyrásť do neskorého exponenciálneho alebo skorého stacionárneho štádia rastu (približne 109 buniek na ml). Kultúry v neskorom stacionárnom štádiu sa nepoužívajú. Je dôležité, aby kultúry použité pri pokuse obsahovali vysoký podiel životaschopných baktérií. Podiel sa dá preukázať buď z minulých kontrolných údajov o rastových krivkách, alebo pri každom pokuse prostredníctvom určenia počtu životaschopných buniek miskovým pokusom. Odporúčaná inkubačná teplota je 37 oC. Používa sa najmenej päť kmeňov baktérií. Tieto zahŕňajú štyri kmene S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 alebo TA 97a alebo TA 97, TA 98 a TA 100), ktoré boli v laboratóriách preukázateľne spoľahlivé a reproduktívne reaktívne. Tieto štyri kmene S. typhimurium majú GC bázové páry na primárnom reverznom mieste a je známe, že nemusia zistiť určité oxidujúce mutagény, medzispájacie činitele a hydrazíny. Takéto látky sa dajú zistiť pomocou kmeňov E. coli WP2 alebo S. typhimurium TA 102 (19), ktoré majú AT bázu na primárnom reverznom mieste. Odporúčanou kombináciou kmeňov je preto: Na zistenie spájacích mutagénov je vhodnejšie použiť TA 102 alebo pridať kmeň E. coli [napríklad E. coli WP2 alebo E. coli WP2 (pKMIOl)], ktorý dokonale opravuje DNA. Na prípravu kultúr, overovanie bunkových znakov a uskladnenie sa používajú overené postupy. Požiadavka na aminokyselinu pre rast sa preukazuje pre každý prípravok zmrznutej kultúry (histidín pre kmene S. typhimurium a tryptofán pre kmene E. coli). Podobným spôsobom sa overujú iné fenotypové charakteristiky, menovite ak je potrebná prítomnosť alebo neprítomnosť R-faktorových plazmidov [napríklad odolnosť proti ampicilínu v kmeňoch TA 98, TA 100 a TA 97a alebo TA 97, WP2 uvrA alebo WP2 uvrA (pKM101) a odolnosť proti ampicilínu a tetracyklínu v kmeni TA102]; prítomnosť charakteristických mutácií (t. j. rfa mutácia S. typhimurium prostredníctvom citlivosti na kryštálovo fialovú a uvrA mutáciu E. coli alebo uvrB mutáciu S. typhimurium prostredníctvom citlivosti na ultrafialové svetlo) (2) (3). Kmene by tiež mali dosahovať spontánne počty revertantných kolónií v rámci frekvenčných rozsahov očakávaných podľa historických kontrolných údajov laboratória, najlepšie v rozsahu uvedenom v literatúre.

S. typhimurium TA 1535 a

S. typhimurium TA 1537 alebo TA 97, alebo TA 97a a

S. typhimurium TA 98 a

S. typhimurium TA 100 a

E. coli WP2 uvrA alebo E. coli WP2 uvrA (pKM101), alebo S. typhimurium TA 102.

1.5.1.2. Médium Používa sa vhodné minimálne množstvo agaru (napríklad obsahujúci Vogelovo-Bonnerovo minimálne médium E a glukózu) a krycí agar obsahujúci histidín a biotín alebo tryptofán umožňujúci malý počet delení buniek (1) (2) (9).

1.5.1.3. Metabolická aktivácia Baktérie sa vystavia testovacej látke v prítomnosti i v neprítomnosti vhodného systému metabolickej aktivácie. Najpoužívanejším systémom je postmitochondriálna frakcia podporená kofaktorom (S9), pripravená z pečene hlodavcov ošetrených prípravkami na indukciu enzýmov, ako napríklad Aroclorom 1254 (1) (2) alebo kombináciou fenobarbitonu a betanaftoflavónu (18) (20) (21). Postmitochondriálna frakcia sa zvyčajne používa v koncentrácii v rozsahu od 5 % do 30 % v/v v zmesi S9. Výber a stav systému metabolickej aktivácie môže závisieť od triedy testovanej chemikálie. V niektorých prípadoch je vhodné využiť viac než jednu koncentráciu postmitochondriálnej frakcie. Pre azofarbivá a diazozmesi je vhodnejšie použiť redukčný systém metabolickej aktivácie (6) (13).

1.5.1.4. Testovacia látka/prípravok Pevné testovacie látky sa rozpúšťajú alebo ukladajú v príslušných rozpúšťadlách alebo nosičoch, a ak je to potrebné, rozrieďujú sa pred podávaním baktériám. Kvapalné testovacie látky sa podávajú priamo alebo rozriedené pred podávaním. Používajú sa čerstvé prípravky testovacej látky, pokiaľ údaje o stabilite nepoukazujú na vhodnosť uskladnenia. Rozpúšťadlo/nosič by nemali chemicky reagovať s testovacou látkou a mali by byť kompatibilné s prežitím buniek a aktivitou S9 (22). Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by mali podporiť údaje označujúce ich kompatibilitu. Odporúča sa zvážiť, ak je to možné, použitie vodného rozpúšťadla/nosiča. Pri testovaní vo vode nestabilných látok by organické rozpúšťadla nemali obsahovať vodu.

1.5.2. Podmienky testov

1.5.2.

1.5.2.1. Testovacie kmene (pozri 1.5.1.1)

1.5.2.2. Koncentrácie dávok Medzi kritériá, ktoré je potrebné brať do úvahy pri stanovovaní najvyššieho množstva použitej testovacej látky, patrí cytotoxicita a rozpustnosť v konečnej zmesi. Je užitočné stanoviť toxicitu a nerozpustnosť pri predbežnom pokuse. Cytotoxicita sa dá zistiť redukciou v množstve revertantných kolónií, vyjasnením alebo redukciou pozadia, alebo stupňom prežitia ošetrených kultúr. Cytotoxicita látky sa môže meniť v prítomnosti systémov metabolickej aktivácie. Nerozpustnosť by sa mala určiť ako vyzrážanie v konečnej zmesi za skutočných podmienok testu a musí byť viditeľná voľným okom. Odporúčaná maximálna testovacia koncentrácia rozpustných necytotoxických látok je 5 mg/miska alebo 5 μl/miska. V prípade necytotoxických látok, ktoré nie sú rozpustné pri 5 mg/miska alebo 5 μl/miska, má byť v konečnej zmesi nerozpustná jedna alebo viac testovaných koncentrácií. Testované látky, ktoré sú cytotoxické už pod 5 mg/miska alebo 5 μl/miska, sa majú testovať až po cytotoxickú koncentráciu. Zrazenina by nemala prekážať vyhodnoteniu. Malo by sa použiť aspoň päť rôznych analyzovateľných koncentrácií testovanej látky s intervalmi približne pol log (t. j. √10) medzi testovanými miestami v počiatočnom experimente. Menšie intervaly môžu byť vhodné vtedy, ak sa skúma vzťah koncentrácia/reakcia. Možno zvážiť testovanie nad koncentráciu 5 mg/miska alebo 5 μl/miska, ak sa vyhodnocujú látky obsahujúce významné množstvá potenciálne mutagénnych nečistôt.

1.5.2.3. Negatívne a pozitívne kontroly Pri každej skúške sa zahrnú súbežne podľa kmeňa špecifické pozitívne a negatívne (rozpúšťadlo alebo nosič) kontrolné kultúry, a to s metabolickou aktiváciou i bez nej. Koncentrácie pri pozitívnych kontrolných kultúrach sa volia tak, aby pri každej skúške vykazovali efektívny výkon. Pri pokusoch s použitím systému metabolickej aktivácie sa referenčné látky pozitívnej kontrolnej kultúry vyberajú na báze použitého typu bakteriálnych kmeňov. Nasledujúce látky sú príkladmi látok vhodných pre pozitívne kontrolné kultúry pri pokusoch s metabolickou aktiváciou. Číslo CAS Číslo EINECS Látka 781-43-1 212-308-4 9,10-dimetylantracén 57-97-6 200-359-5 7,12-dimetylbenz[a]anthracén 50-32-8 200-028-5 benzo[a]pyrén 613-13-8 210-330-9 2-aminoantracén 50-18-0 cyklofosfamid 6055-19-2 200-015-4 cyklofosfamid monohydrát Nasledujúca látka je vhodná pre pozitívne kontrolné kultúry pri metóde redukčnej metabolickej aktivácie: Číslo CAS Číslo EINECS Látka 573-58-0 209-358-4 Congo Red (červeň Congo) 2-aminoantracén by nemal byť jediným indikátorom efektívnosti zmesi S9. Ak sa používa 2-aminoantracén, každá dávka S9 by tiež mala byť charakterizovaná mutagénom, ktorý vyžaduje metabolickú aktiváciu mikrozomálnymi enzýmami, napríklad benzo[a]pyrén, dimetylbenzantracén. Nasledujúce látky sú príkladmi pozitívnych kontrolných kultúr podľa kmeňov pre skúšky bez exogénneho systému metabolickej aktivácie: Číslo CAS Číslo EINECS Látka Kmeň 26628-22-8 247-852-1 azid sodný TA 1535 a TA 100 607-57-8 210-138-5 2-nitrofluorén TA 98 90-45-9 201-995-6 9-aminoakridín TA 1537, TA 97 a TA 97a 17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 a TA 97a 80-15-9 201-254-7 kumén hydroperoxid TA 102 50-07-7 200-008-6 mitomycín C WP2 uvrA a TA 102 70-25-7 200-730-1 N-etyl-N-nitro-N-nitrozguanidín WP2, WP2uvrA a WP2uvrA(pKM101) 56-57-5 200-281-1 4-nitrochinolín-1-oxid WP2, WP2uvrA a WP2uvrA(pKM101) 3688-53-7 furylfuramid (AF2) kmene obsahujúce plazmid Pre pozitívne kontrolné kultúry sa môžu použiť aj ďalšie vhodné referenčné látky. Podľa dostupnosti sa zváži použitie chemikálií príbuzných triede chemikálií pre pozitívnu kontrolnú skupinu. Použijú sa tiež negatívne kontrolné vzorky pozostávajúce len z rozpúšťadla alebo nosiča, bez testovacej látky a inak ošetrované rovnakým spôsobom ako pokusné skupiny. Používajú sa aj neošetrené kontrolné vzorky, pokiaľ neexistujú historické kontrolné údaje demonštrujúce, že vybrané rozpúšťadlo nespôsobuje žiadne škodlivé alebo mutagénne účinky.

1.5.3. Postup Pri metóde s použitím misiek (1) (2) (3) (4) bez metabolickej aktivácie sa zvyčajne zmieša 0,05 ml alebo 0,1 ml testovacích roztokov, 0,1 ml čerstvej bakteriálnej kultúry (obsahujúcej približne 108 životaschopných buniek) a 0,5 ml sterilného tlmiaceho roztoku s 2,0 ml krycieho agaru. Pri skúške s metabolickou aktiváciou sa zvyčajne zmieša 0,5 ml roztoku metabolickej aktivácie obsahujúceho vhodné množstvo postmitochondriálnej frakcie (v rozmedzí od 5 % do 30 % v/v v roztoku na metabolickú aktiváciu) s krycím agarom (2,0 ml), s baktériami a testovacou látkou/testovacím roztokom. Obsah oboch skúmaviek sa zmieša a vyleje sa na povrch veľmi malej agarovej misky. Krycí agar sa pred inkubáciou nechá vytvrdnúť. Pri predinkubačnej metóde (2) (3) (5) (6) sa testovacia látka/testovací roztok predinkubuje s testovacím kmeňom (obsahujúcim približne 108 životaschopných buniek) a sterilným tlmiacim roztokom alebo systémom metabolickej aktivácie (0,5 ml) zvyčajne na 20 minút alebo viac pri teplote 30 oC – 37 oC pred zmiešaním s krycím agarom a vyliatím na povrch veľmi malej agarovej misky. Zvyčajne sa mieša 0,05 alebo 0,1 ml testovacej látky/testovacieho roztoku, 0,1 ml baktérií a 0,5 ml zmesi S9 alebo sterilného tlmiaceho roztoku s 2,0 ml krycieho agaru. Skúmavky sa počas predinkubácie vetrajú použitím miešadla. Pri každej úrovni dávok sa kvôli primeranému odhadu variácie používajú tri misky. Použitie dvoch misiek je prijateľné s vedeckým zdôvodnením. Občasná strata misky pokus neznehodnocuje. Plynné alebo prchavé látky sa testujú vhodnými metódami, ako napríklad vo vzduchotesne uzatvorených nádobách (12) (14) (15) (16).

1.5.4. Inkubácia V danom pokuse sa misky inkubujú pri teplote 37 oC počas 48 – 72 hodín. Po uplynutí inkubačnej doby sa zráta počet revertantných kolónií na misku.

2. ÚDAJE

2.

2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV Údaje sa uvádzajú ako počet revertantných kolónií na misku. Udáva sa tiež počet revertantných kolónií pri negatívnych (kontrola rozpúšťadlom a bez ošetrenia, ak sa použili) a pozitívnych kontrolných kultúrach. Jednotlivé počty na miskách, stredná hodnota revertantných kolónií na misku a štandardná odchýlka sa uvádzajú pre testovaciu látku aj pre pozitívne a negatívne kontrolné kultúry (bez ošetrenia a/alebo s rozpúšťadlom). Neexistuje požiadavka na potvrdenie jasných pozitívnych reakcií. Nejasné výsledky sa objasňujú ďalším testovaním, najlepšie použitím modifikácie pokusných podmienok. Negatívne výsledky sa musia potvrdiť od prípadu k prípadu. V prípadoch, keď sa potvrdenie negatívnych výsledkov nepovažuje za potrebné, sa poskytne zdôvodnenie. Modifikácia parametrov štúdie na rozšírenie rozsahu hodnotených podmienok sa posudzuje pri následných pokusoch. Parametre štúdie, ktoré sa dajú modifikovať, zahŕňajú rozsahy koncentrácií, metódu aplikácie látky (použitie misky alebo kvapalná predinkubácia) a podmienky metabolickej aktivácie.

2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Pre stanovenie pozitívneho výsledku existuje niekoľko kritérií, ako napríklad nárast oproti testovanému rozsahu spojený s koncentráciou a/alebo reprodukovateľný nárast pri jednej alebo viacerých koncentráciách počtu revertantných kolónií na misku najmenej v jednom kmeni so systémom metabolickej aktivácie alebo bez systému metabolickej aktivácie (23). Najprv sa zvažuje biologická relevantnosť výsledkov. Ako pomôcka sa pri hodnotení výsledkov testov používajú štatistické metódy (24). Štatistická významnosť však nie je jediným určujúcim faktorom pozitívnej reakcie. Testovacia látka, pre ktorú nespĺňajú výsledky vyššie uvedené kritériá, sa pre tento test považuje za nemutagénnu. Hoci väčšina pokusov poskytne jasne pozitívne alebo negatívne výsledky, v zriedkavých prípadoch súbor údajov vopred vylúči jednoznačné posúdenie aktivity testovacej látky. Výsledky môžu ostať nejasné alebo spochybniteľné bez ohľadu na počet opakovaní pokusu. Pozitívne výsledky bakteriálneho testu reverzných mutácií naznačujú, že určitá látka vyvoláva bodové mutácie prostredníctvom základných substitúcií alebo konštrukčných posunov genómu Salmonella typhimurium a/alebo Escherichia coli. Negatívne výsledky naznačujú, že testovacia látka nie je v testovacích podmienkach pre testované druhy mutagénna.

3. PODÁVANIE SPRÁV

3. SPRÁVA Z TESTU

Správa z testu zahŕňa nasledujúce informácie:

Rozpúšťadlo/nosič:

zdôvodnenie výberu nosiča,

rozpustnosť a stálosť testovacej látky v rozpúšťadle/nosiči, ak je známa.

Kmene:

použité kmene,

počet buniek v kultúre,

charakteristiky kmeňa.

Podmienky testov:

množstvo testovacej látky na misku (mg/miska alebo μl/miska) so zdôvodnením voľby dávky a počtu misiek na koncentráciu,

použité médiá,

typ a zloženie systému metabolickej aktivácie vrátane kritérií prijateľnosti,

postupy dávkovania.

Výsledky:

známky toxicity,

známky zrážania,

počty na jednotlivých miskách,

stredná hodnota revertantných kolónií na misku a štandardná odchýlka,

vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je to možné,

štatistické analýzy, ak sa uskutočnili,

súbežné údaje o negatívnych (rozpúšťadlo/nosič) a pozitívnych kontrolných kultúrach s rozsahmi, strednými hodnotami a štandardnými odchýlkami,

historické údaje o negatívnych (rozpúšťadlo/nosič) a pozitívnych kontrolných kultúrach s rozsahmi, strednými hodnotami a štandardnými odchýlkami.

Rozbor výsledkov.

Závery.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)

ODKAZY Ames, B. N., McCann, J. a Yamasaki, E. (1975) Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, s. 347 – 364. Maron, D. M. a Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, s. 173 – 215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. a Zeiger, E. (1994) Recommendations for the Perfomance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, s. 217 – 233. Kier, L. D., Brusick, D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Príval, M., Rao, T. K. a Ray, V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the US Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, s. 69 – 240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. a Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer letters 1, s. 91 – 96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. a Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Test, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth, K. H. a Garner, R C, Springer, Berlin-Heidelberg-New York, s. 273 – 285. Gatehouse, D. G, Rowland, I. R, Wilcox, P., Callender, R D. a Foster, R (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cmabridge University Press, s. 13 – 61. Aeschacher, H. U, Wolleb, U. a Porchet, L. (1987), Liquid Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, s. 167 – 177. Green, M. H. L., Muriel, W. J. a Bridges, B. A. (1976), Use of a Simplified Fluctuation Test to Detect Low Levels of Mutagens, Mutation Res., 38, s. 33 – 42. Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. a Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2. vydanie, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. a Ramel, C, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, s. 141 – 161. Thomson, E. D. a Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, s. 453 – 465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. a Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, s. 335 – 344. Príval, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D a Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, s. 33 – 47. Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. a Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals (Testy mutagénnosti samonelly, výsledky testovania 311 chemikálií), Environ. Mol. Mutagen., 19, s. 2 – 141. Simmon, V., Kauhanen, K. a Tardiff, R. G (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in: Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges a F. Soebels (eds), Elsevier, Amsterdam, s. 249 – 258. Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. a Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, s. 421 – 441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M. a Sugimura, T. (1979) Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cyasin and Synthetic Metylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, s. 3780 – 3782. Tamura, G, Gold, C, Ferro-Luzzi, A. a Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, s. 4961 – 4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J., a Gatehouse, D. G (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia Coli WP2 Tester Strains, Mutagenesis, 5, s. 285 – 291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. a Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyl as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis testing, de Serres a kol. (eds), Elsevier, North Holland, s. 85 – 88. Elliot, B. M., Combes, R D. Elcombe, C. R, Gatehouse, D. G, Gibson, G. G, Mackay, J. M. a Wolf, R. C. (1992), Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, s. 175 – 177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. a Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, s. 343 – 350. Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K, Nestmann, E. a Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, s. 83 – 91. Mahon, G A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. a Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part II, Statistical Evaluation of Mutagenicity test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, Cambridge, s. 28 – 65.

B.15. TESTOVANIE MUTAGÉNNOSTI A SKRÍNING KARCINOGÉNNOSTI – SKÚŠKA NA GÉNOVÚ MUTÁCIU U SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.15.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Pozri všeobecný úvod časť B.

1.2. DEFINÍCIE Pozri všeobecný úvod časť B.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Na zisťovanie vzniku génových mutácií indukovaných chemickými agensmi sa používa množstvo haploidných a diploidných kmeňov kvasiniek Saccharomyces cerevisiae buď s metabolickou aktiváciou, alebo bez nej. Môže sa použiť systém priamych mutácií v haploidných kmeňoch (ade-1 alebo ade-2), ktoré sú červené a ďalšou mutáciou sa menia na dvojité biele mutanty, alebo selektívny systém, ako je indukcia rezistencie na kanavanín a cykloheximid. Prevažne sa však používa overený systém reverzných mutácií s haploidným kmeňom XV 185-14C, ktorý nesie ochre nonsens mutácie ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 a trp 5-48. Tieto mutácie sú reverzibilné bázovou substitúciou s použitím mutagénov, ktoré indukujú site špecifické mutácie alebo ochre supresorové mutácie. XV 185-14C nesie tiež his 1-7 marker. Je to missens mutácia, ktorá je väčšinou reverzibilná druhou site mutáciou. Takisto nesie ďalší marker hom 3-10, ktorý je reverzibilný frameshift mutagénmi. Z diploidných kmeňov S. cerevisiae sa prevažne používa kmeň D7, ktorý je homozygotný v ilv 1-92.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Žiadne.

1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.6. Príprava

Roztoky testovaných chemikálií a kontroly by sa mali pripravovať tesne pred testovaním s použitím vhodných rozpúšťadiel. V prípade organických zlúčenín, ktoré nie sú rozpustné vo vode, malo by sa použiť organické rozpúšťadlo ako etanol, acetón alebo dimetylsulfoxid (DMSO), najviac 2 % roztok v/v. Výsledná koncentrácia rozpúšťadla by nemala výrazne ovplyvňovať životaschopnosť buniek a rastové parametre.

Metabolická aktivácia

Bunky by mali byť ovplyvnené testovanou látkou bez prítomnosti a s prítomnosťou vhodného exogénneho metabolického aktivačného systému. Najbežnejšie používaný systém je postmitochondriálna frakcia z pečene hlodavcov doplnená kofaktormi, vopred ovplyvnená látkami indukujúcimi enzýmy. Na metabolickú aktiváciu môže byť vhodné použitie aj iných druhov, tkanív, postmitochondriálnych frakcií alebo iných postupov.

Podmienky testovania

Testovacie kmene

Pre testy génových mutácií je najpoužívanejší haploidný kmeň XV 185-14C a diploidný kmeň D7. Vhodné môžu byť aj iné kmene.

Médiá

Pre stanovenie prežívania a počtu mutantov sa používajú vhodné kultivačné médiá.

Použitie negatívnych a pozitívnych kontrol

Súbežne by sa mali použiť pozitívne kontroly, neovplyvnené kontroly a kontroly s rozpúšťadlom. Pre každý špecifický typ mutácií by sa mala použiť vhodná chemikália ako pozitívna kontrola.

Koncentrácie vystavenia

Malo by sa použiť aspoň päť primerane odstupňovaných koncentrácií testovanej látky. Pri toxických látkach by nemala najvyššia testovaná koncentrácia znižovať prežívanie pod 5 % až 10 %. Látky relatívne nerozpustné vo vode by sa mali testovať až do hranice ich rozpustnosti s použitím vhodných metód. Pri netoxických látkach voľne rozpustných vo vode by sa mala najvyššia použitá koncentrácia stanoviť z prípadu na prípad.

Inkubačné podmienky

Platne sú inkubované štyri až sedem dní pri 28 oC a 30 oC v tme.

Frekvencia spontánnych mutácií

Mali by sa použiť monokultúry s frekvenciou spontánnych mutácií v prijateľnom rozsahu.

Počet opakovaní

Pri testovaní vzniku prototrofov génovou mutáciou a pre stanovenie prežívania buniek by sa mali použiť najmenej tri opakovania pre každú koncentráciu. V prípade experimentov používajúcich markery ako hom 3-10 s nízkou mutačnou frekvenciou sa množstvo použitých platní má zvýšiť tak, aby poskytovalo štatisticky významné údaje.

Postupy

Ovplyvňovanie S. cerevisiae sa bežne robí v tekutom prostredí s použitím stacionárnych alebo rastúcich buniek. Začiatočné experimenty by sa mali robiť na rastúcich bunkách: bunky s koncentráciou 1 – 5 × 107/ml sú ovplyvnené testovanou chemikáliou maximálne 18 hodín pri 28 oC až 37 oC pri neustálom prevzdušňovaní; ak je potrebné, pridá sa počas experimentu primerané množstvo metabolického aktivátora. Na konci ovplyvnenia sú bunky zcentrifugované, premyté a vysiate na vhodné kultivačné médium. Po inkubácii sa platne vyhodnotia na prežívanie a indukciu génových mutácií. Ak je prvý experiment negatívny, v druhom experimente by sa mali použiť bunky stacionárnej fázy. Ak je prvý experiment pozitívny, malo by sa to potvrdiť vo vhodnom nezávislom experimente.

2. ÚDAJE Údaje by sa mali prezentovať v tabuľke a udávať počet kolónií, počet mutantov, prežívania a frekvenciu mutantov. Všetky výsledky by sa mali potvrdiť v nezávislom experimente. Výsledky by sa mali vyhodnotiť vhodnou štatistickou metódou.

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu má podľa možnosti obsahovať tieto informácie:

použité kmene,

podmienky pri teste: rastúce bunky alebo bunky stacionárnej fázy, zloženie médií, trvanie inkubácie a inkubačnú teplotu, metabolický aktivačný systém,

podmienky vystavenia: použité koncentrácie, metódy a čas vystavenia a teplotu pri vystavení, pozitívne a negatívne kontroly,

spočítaný počet kolónií, počet mutantov, prežívanie a frekvencia mutantov, vzťah dávka/odpoveď ak je to reálne, štatistické vyhodnotenie údajov,

diskusiu o výsledkoch,

interpretáciu výsledkov.

3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA Pozri všeobecný úvod časť B.

4. LITERATÚRA Pozri všeobecný úvod časť B.

B.16. MITOTICKÁ REKOMBINÁCIA – SACCHAROMYCESC CEREVISIAE

B.16.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Pozri všeobecný úvod časť B.

1.2. DEFINÍCIE Pozri všeobecný úvod časť B.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Mitotická rekombinácia v Saccharomyces cerevisiae môže byť detekovaná medzi génmi (alebo všeobecnejšie medzi génom a jeho centromérou) a vnútri génov. Prvý dej sa nazýva mitotický crossing-over a vytvára recipročné produkty, zatiaľ čo druhý dej je najčastejšie nerecipročný a nazýva sa génová konverzia. V crossing-overe je všeobecne hodnotené množstvo recesívne homozygotných kolónií alebo sektorov vzniknutých v heterozygotnom kmeni, zatiaľ čo v génovej konverzii je hodnotené množstvo prototrofných revertantov vzniknutých v auxotrofnom heteroalelickom kmeni, ktorý nesie dve rozdielne defektné alely v tom istom géne. Najbežnejšie používané kmene pre detekciu mitotickej génovej konverzie sú D4 (heteroalelický v ade 2 a trp 5), D7 (heteroalelický v trp 5), BZ34 (heteroalelický v arg 4) a JD1 (heteroalelický v his 4 a trp 5). Mitotický crossing-over vytvárajúci červené a ružové homozygotné sektory môže byť testovaný v D5 alebo v D7, (v ktorom môžeme takisto detekovať mitotickú génovú konverziu a reverzné mutácie v ilv 1-92), oba kmene sú heteroalelické pre komplementáciu alel ade 2.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Žiadne.

1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.6. Príprava

Roztoky testovaných chemikálií a kontroly alebo referenčné zlúčeniny by mali byť pripravované tesne pred testovaním s použitím vhodných rozpúšťadiel. V prípade organických zlúčenín, ktoré nie sú rozpustné vo vode, by sa malo použiť organické rozpúšťadlo ako etanol, acetón alebo dimetylsulfoxid (DMSO) nie viac ako 2 % roztok v/v. Výsledná koncentrácia rozpúšťadla by nemala výrazne ovplyvňovať životaschopnosť buniek a rastové parametre.

Metabolická aktivácia

Bunky by mali byť ovplyvnené testovanou látkou bez prítomnosti a s prítomnosťou vhodného exogénneho metabolického aktivačného systému. Najbežnejšie používaný systém je post-mitochondriálna frakcia z pečene hlodavcov doplnená kofaktormi vopred ovplyvnená latkami indukujúcimi enzýmy. Na metabolickú aktiváciu môže byť vhodné použitie aj iných druhov, tkanív, post-mitochondriálnych frakcií alebo iných postupov.

Testovacie podmienky

Testovacie kmene

Najviac používanými kmeňmi sú diploidy D4, D5, D7 a JD1. Môžu sa použiť aj iné kmene.

Médiá

Na stanovenie prežívania a frekvencie mitotickej rekombinácie sa používajú vhodné kultivačné médiá.

Použitie negatívnych a pozitívnych kontrol

Súbežne by mali byť použité pozitívne, neovplyvnené kontroly a kontroly s rozpúšťadlom. Pre každý špecifický typ mutácií by sa mala použiť vhodná chemikália ako pozitívna kontrola.

Koncentrácie vystavenia

Malo by sa použiť aspoň päť primerane odstupňovaných koncentrácií testovanej látky. Medzi faktormi, ktoré treba brať do úvahy, je cytotoxicita a rozpustnosť. Najnižšia koncentrácia nemá mať efekt na životaschopnosť buniek. Pri toxických chemikáliách by nemala najvyššia testovaná koncentrácia znižovať prežívanie pod 5 až 10 %. Látky relatívne nerozpustné vo vode by mali byť testované až do hranice ich rozpustnosti použitím vhodných metód. Pri netoxických látkach voľne rozpustných vo vode by sa mala najvyššia použitá koncentrácia stanoviť z prípadu na prípad. Bunky môžu byť vystavené testovanej chemikálii buď v stacionárnej fáze, alebo v rastovej fáze maximálne 18 hodín. Pri dlhšom vystavení by sa malo v kultúrach sledovať formovanie spór, prítomnosť ktorých znehodnocuje test.

Inkubačné podmienky

Platne sú inkubované štyri až sedem dní pri 28 – 30 oC v tme. Platne použité pre testovanie červených a ružových homozygotných sektorov vzniknutých mitotickým crossing-overom by mali byť po skončení experimentu držané v chladničke (okolo 4 oC) ďalšie jeden až dva dni pred vyhodnotením, čo umožní vytvorenie hodnotiteľných pigmentovaných kolónií.

Frekvencia spontánnej mitotickej rekombinácie

Mali by byť použité monokultúry s frekvenciou spontánnej mitotickej rekombinácie v prijateľnom rozsahu.

Počet opakovaní

Pri testovaní vzniku prototrofov mitotickou génovou konverziou a pre stanovenie prežívania buniek by mali byť použité najmenej tri opakovania pre každú koncentráciu. V prípade testovania recesívnych homozygotov vzniknutých mitotickým crossing-overom sa množstvo použitých platní má zvýšiť tak, aby poskytovalo primerané množstvo kolónií.

Postupy

Ovplyvňovanie S. cerevisiae sa bežne robí v tekutom prostredí použitím stacionárnych alebo rastúcich buniek. Začiatočné experimenty by sa mali robiť na rastúcich bunkách: bunky s koncentráciou 1 – 5 × 107/ml sú vystavené testovanej chemikálii maximálne 18 hodín pri 28 až 37 oC pri neustálom prevzdušňovaní; ak je potrebné, pridá sa počas experimentu primerané množstvo metabolického aktivátora. Na konci ovplyvnenia sú bunky zcentrifugované, premyté a vysiate na vhodné kultivačné médium. Po inkubácii sú platne vyhodnotené na prežívanie a indukciu mitotickej rekombinácie. Ak je prvý experiment negatívny, v druhom experimente by sa mali použiť bunky stacionárnej fázy. Ak je prvý experiment pozitívny, malo by sa to potvrdiť vo vhodnom nezávislom experimente.

2. ÚDAJE Údaje by mali byť prezentované v tabuľke a udávať počet kolónií, počet rekombinantov, prežívanie a frekvenciu rekombinantov. Výsledky by mali byť potvrdené v nezávislom experimente. Údaje by mali byť vyhodnotené vhodnou štatistickou metódou.

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU Správa z testu má podľa možnosti obsahovať tieto informácie:

použité kmene,

podmienky pri teste: bunky stacionárnej fázy alebo rastúce bunky, zloženie médií, inkubačná teplota a trvanie inkubácie, metabolický aktivačný systém,

podmienky ovplyvňovania: použité koncentrácie, metódy a trvanie ovplyvnenia, teplota pri ovplyvnení, pozitívne a negatívne kontroly,

spočítaný počet kolónií, počet rekombinantov, prežívanie a frekvencia rekombinantov, vzťah dávka/odpoveď ak je to reálne, štatistické vyhodnotenie údajov,

diskusiu o výsledkoch,

interpretáciu výsledkov.

3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA Pozri všeobecný úvod časť B.

4. LITERATÚRA Pozri všeobecný úvod časť B.

B.17. MUTAGÉNNOSŤ – IN VITRO TEST MUTÁCIÍ GÉNOV BUNIEK CICAVCOV

B.17.

1. METODA Táto metóda je obdobou OECD TG 476, in vitro test mutácií génov buniek cicavcov (1997).

1.

1.1. ÚVOD In vitro test mutácií génov buniek cicavcov sa používa na zistenie mutácií vyvolaných chemickými látkami. Vhodné bunkové línie zahŕňajú L5178Y lymfómové (lymphoma) bunky myší, CHO, CHO-AS52 a V79 línie buniek čínskych morčiat a TK6 lymfoblastoidné bunky ľudí (1). V týchto bunkových líniách najbežnejšie používané genetické merania merajú mutácie na timidínovej kináze (TK) a hypoxantino-guanínovej fosforibosilovej transferáze (HPRT) a transgén xantínovo-guanínovej fosforibozylovej transferáze (XPRT). Testy mutácií TK, HPRT a XPRT zisťujú rôzne spektrum genetických udalostí. Autozomálna poloha TK a XPRT môže umožňovať zistenie genetických udalostí (napríklad: veľké vymazania), nezistené v mieste HPRT na X chromozómoch (2)(3)(4)(5)(6). V in vitro teste mutácií génov buniek cicavcov sa používajú kultúry ujatých bunkových línií alebo bunkových kmeňov. Použité bunky sa vyberajú na základe rastovej schopnosti kultúry a stability frekvencie spontánnych mutácií. Testy vykonávané in vitro vo všeobecnosti vyžadujú použitie exogénneho zdroja metabolickej aktivácie. Tento systém metabolickej aktivácie nemôže úplne napodobniť podmienky in vivo cicavcov. Je potrebná opatrnosť pri vyhýbaní sa podmienkam, ktoré by viedli k pozitívnym výsledkom, ktoré neodrážajú vnútornú mutagénnosť. Pozitívne výsledky, ktoré neodrážajú vnútornú mutagénnosť, môžu pochádzať zo zmien pH, osmolality alebo vysokých hladín cytotoxicity (7). Tento test sa používa na zistenie možných mutagénov a karcinogénov u cicavcov. Mnohé zmesi, ktoré sú v tomto teste pozitívne, sú pre cicavcov karcinogénmi, avšak neexistuje dokonalá korelácia medzi týmto testom a karcinogénnosťou. Korelácia závisí od triedy chemikálie a je stále viac dôkazov, že existujú karcinogény, ktoré tento test neodhalí, pretože pravdepodobne účinkujú prostredníctvom odlišných negenotoxických mechanizmov alebo mechanizmov neprítomných v bunkách baktérií (6). Pozri tiež všeobecný úvod, časť B.

1.2. DEFINÍCIE Predná mutácia: génová mutácia z rodičovského typu mutantných foriem, ktorá umožňuje zmenu alebo stratu enzymatickej aktivity funkcie kódovaného proteínu. Mutagény substituujúce bázové páry: látky, ktoré spôsobujú substitúciu jedného alebo viacerých bázových párov v DNA. Konštrukčné mutagény: sú činiteľmi, ktoré v molekule DNA spôsobujú pridanie alebo vymazanie jedného alebo viacerých základných párov. Doba fenotypického prejavu: obdobie, počas ktorého sú nezmenené génové produkty vyčerpané z novomutovaných buniek. Mutačná frekvencia: pozorovaný počet mutantných buniek delený počtom životaschopných buniek. Relatívny celkový rast: zvýšenie počtu buniek v čase v porovnaní s kontrolnou populáciou buniek; vypočítava sa ako výsledok rastu suspenzie v pomere k času negatívnej kontrolnej kultúry krát klonovacia efektívnosť v pomere k negatívnej kontrolnej kultúre. Relatívny suspenzný rast: zvýšenie počtu buniek v porovnaní s časom prejavu v pomere k negatívnej kontrolnej kultúre. Životaschopnosť: klonovacia efektívnosť ošetrených buniek v čase umiestnenia na misky v selektívnych podmienkach po čase prejavu. Prežitie: klonovacia efektívnosť ošetrených buniek pri umiestnení na misky na konci doby podávania; prežitie sa obyčajne vyjadruje v pomere k prežitiu populácie kontrolných buniek.

1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Bunky s nedostatkom tymidínovej kinázy (TK) z dôvodu mutácie TK+/- -> TK-/- sú odolné voči cytotoxickým účinkom pyrimidínovej obdoby trifluoroťnymidínu (TFT). Bunky s dostatkom tymidínovej kinázy sú citlivé na TFT, ktorý spôsobuje inhibíciu bunkového metabolizmu a zastavuje ďalšie delenie buniek. Tieto mutantné bunky sú schopné rozširovať sa za prítomnosti TFT, zatiaľ čo normálne bunky, ktoré obsahujú tymidínovú kinázu, nie sú. Podobne aj bunky s nedostatkom HPRT alebo XPRT sa vyberajú podľa odolnosti voči 6-thioguanínu (TG) alebo 8-azaguanínu (AG). Vlastnosti testovacej látky je potrebné zvážiť v prípadoch, keď sa bázová obdoba alebo zlúčenina príbuzná so selektívnym činidlom testujú v akýchkoľvek testoch mutácií génov buniek cicavcov. Potrebné je napríklad preskúmať akúkoľvek predpokladanú selektívnu toxicitu testovacej látky pre mutantné a nemutantné bunky. Pri testovaní chemikálií štrukturálne príbuzných so selektívnym činidlom je preto nutné overiť výkon selektívneho systému/činidla (8). Bunky v suspenzii alebo jednovrstvovej kultúre sa vystavia testovacej látke s metabolickou aktiváciou i bez metabolickej aktivácie na vhodnú dobu a subkultivujú sa na stanovenie cytotoxicity a na umožnenie fenotypického prejavu pred mutantnou selekciou (9) (10) (11) (12) (13). Cytotoxicita sa zvyčajne stanovuje meraním relatívnej klonovacej efektívnosti (prežitie) alebo relatívneho celkového rastu kultúr po dobe podávania. Ošetrené kultúry sa vhodnú dobu, charakteristickú pre každý vybraný lokus a typ buniek, udržiavajú v rastovom médiu, čo umožní takmer optimálny fenotypický prejav indukovaných mutácií. Mutačná frekvencia sa stanovuje zasadením známeho počtu buniek do média obsahujúceho selektívne činidlo na zistenie mutantných buniek a do média bez selektívneho činidla na stanovenie klonovacej efektívnosti (životaschopnosti). Po vhodnej inkubačnej dobe sa kolónie zrátajú. Mutačná frekvencia sa odvodzuje od počtu mutantných kolónií v selektívnom médiu a počtu kolónií v neselektívnom médiu.

1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.4.

1.4.1. Prípravné práce

1.4.1.

1.4.1.1. Bunky Pre použitie v tomto teste sú dostupné rôzne bunkové typy, vrátane subklonov buniek L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 alebo TK6. Typy buniek použité v tomto teste majú preukázanú citlivosť na chemické mutagény, vysokú klonovaciu efektívnosť a stabilnú frekvenciu spontánnych mutácií. Bunky sa kontrolujú na kontamináciu mykoplazmou a pri jej zistení sa nepoužívajú. Test by sa mal formulovať tak, aby mal vopred určenú citlivosť a silu. Počet použitých buniek, kultúr a koncentrácií testovacej látky odráža tieto definované parametre (14). Minimálny počet životaschopných buniek, ktoré prežijú podávanie a ktoré sa použijú v každom štádiu testu, je založený na frekvencii spontánnych mutácií. Všeobecným pravidlom je použiť počet buniek, ktorý je najmenej 10-krát taký veľký, ako prevrátená hodnota frekvencie spontánnych mutácií. Odporúča sa však použiť najmenej 106 buniek. Na znázornenie konzistentného výkonu testu by mali byť dostupné historické údaje o použitom systéme buniek

1.4.1.2. Médiá a podmienky kultúr Používajú sa príslušné médiá a inkubačné podmienky (nádoby, koncentrácia CO2, teplota a vlhkosť). Médiá sa vyberajú podľa selektívnych systémov a typu buniek použitých počas testu. Osobitne dôležité je zvoliť podmienky kultúr tak, aby bol zabezpečený optimálny rast buniek počas obdobia prejavu a schopnosť formovania kolónií mutantných aj nemutantných buniek.

1.4.1.3. Príprava kultúr Bunky sa odoberajú z kultúr vysadených v médiu a inkubovaných pri teplote 37 oC. Pred použitím v tomto teste sa kultúry podľa potreby prečistia od existujúcich mutantných buniek.

1.4.1.4. Metabolická aktivácia Bunky sa vystavia testovacej látke za prítomnosti aj za neprítomnosti vhodného systému metabolickej aktivácie. Najpoužívanejším systémom je postmitochondriálna frakcia podporená kofaktorom (S9) pripravená z pečene hlodavcov a ošetrená prípravkami na indukciu enzýmov ako napríklad Aroclorom 1254 (15) (16) (17) (18) alebo kombinácia fenobarbitonu a beta-naftoflavónu(19)(20). Postmitochondriálna frakcia sa zvyčajne používa v koncentráciách v rozpätí od 1 – 10 % v/v v konečnom testovacom médiu. Výber a stav systému metabolickej aktivácie závisí od triedy testovanej chemikálie. V niektorých prípadoch je vhodné využiť viac než jednu koncentráciu postmitochondriálnej frakcie. Množstvo situácií, vrátane vytvorenia geneticky vypestovaných bunkových línií vyjadrujúcich špecifické aktivačné enzýmy, môže poskytnúť potenciál pre endogénnu aktiváciu. Výber použitých bunkových línií sa vedecky zdôvodňuje (napríklad: relevantnosťou cytochrómového P450 izoenzýmu pre metabolizmus testovacej látky).

1.4.1.5. Príprava testovacej látky Pevné testovacie látky sa rozpúšťajú alebo ukladajú v príslušných rozpúšťadlách alebo nosičoch a rozrieďujú, ak je to potrebné pred ošetrením buniek. Kvapalné testovacie látky môžu byť pridané priamo do testovacích systémov a/alebo rozriedené pred ošetrením. Používajú sa čerstvé prípravky testovacej látky, pokiaľ údaje o stabilite nepoukazujú na vhodnosť uskladnenia.

1.4.2. Podmienky testov

1.4.2.

1.4.2.1. Rozpúšťadlo/nosič Rozpúšťadlo/nosič by nemali chemicky reagovať s testovacou látkou a mali by byť kompatibilné s prežitím buniek a aktivitou S9. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by malo byť podporené údajmi označujúcimi ich kompatibilitu. Odporúča sa zvážiť, pokiaľ je to možné, použitie vodného rozpúšťadla/nosiča. Pri testovaní látok vo vode nestálych by organické rozpúšťadlá nemali obsahovať vodu. Vodu je možné odstrániť pridaním molekulárneho sitka.

1.4.2.2. Koncentrácie Medzi kritériá, ktoré treba zvážiť pri určovaní najvyššej koncentrácie, patria cytotoxicita, rozpustnosť v testovacom systéme a zmeny pH alebo osmolality. Cytotoxicita sa stanovuje s metabolickou aktiváciou a bez metabolickej aktivácie pri hlavnom pokuse s použitím príslušného označenia integrity a rastu buniek, ako napríklad relatívnej klonovacej efektívnosti (prežitie) alebo relatívneho celkového rastu. Užitočné je stanovenie cytotoxicity a rozpustnosti v predbežnom pokuse. Používať by sa mali najmenej štyri analyzovateľné koncentrácie. Pri výskyte cytotoxicity tieto koncentrácie pokrývajú rozsah od maximálnej po malú alebo žiadnu toxicitu; toto zvyčajne znamená, že koncentrácie sú oddelené nie viac ako jedným koeficientom medzi 2 a √10. Ak je najvyššia koncentrácia založená na cytotoxicite, jej výsledkom je približne 10 – 20 % (avšak nie menej ako 10 %) relatívneho prežitia (relatívna klonovacia efektívnosť) alebo relatívneho celkového rastu. Pre relatívne necytotoxické látky sú maximálne testovacie koncentrácie 5 mg/ml, 5 μl/ml alebo 1,01 M, podľa toho, ktorá je najnižšia. Relatívne nerozpustné látky sa testujú po limit rozpustnosti v podmienkach kultúry. V konečnom médiu, ktorému sú bunky vystavené, sa stanovujú dôkazy nerozpustnosti. Užitočné je odhadnúť rozpustnosť na začiatku a na konci podávania, keďže rozpustnosť sa môže zmeniť počas priebehu vystavenia v testovacom systéme kvôli prítomnosti buniek, séra S9 atď. Nerozpustnosť sa zisťuje voľným okom. Zrazenina hodnoteniu neprekáža.

1.4.2.3. Kontrolné kultúry Pri každom pokuse sa vytvoria pozitívne a negatívne (rozpúšťadla alebo nosiča) kontrolné kultúry s metabolickou aktiváciou i bez metabolickej aktivácie. Pri použití metabolickej aktivácie by pozitívna kontrolná kultúra mala byť tá, pri ktorej sa na vznik mutagénnej reakcie vyžaduje aktivácia. Príklady látok pre pozitívnu kontrolnú kultúru: Stav metabolickej aktivácie Miesto Látka Číslo CAS Číslo EINECS neprítomnosťexogénnej metabolickej aktivácie HPRT etylmetánsulfonát 62-50-0 200-536-7 etylnitrozmočovina 759-73-9 212-072-2 TK (malé a veľké kolónie) metylmetánsulfonát 66-27-3 200-625-0 XPRT etylmetánsulfonát 62-50-0 200-536-7 etylnitrozmočovina 759-73-9 212-072-2 prítomnosť exogénnej metabolickej aktivácie HPRT 3 -metylcholanthrén 56-49-5 200-276-4 N-nitrozodimetylamín 62-75-9 200-549-8 7,12-dimetylbenzanthracén 57-97-6 200-359-5 TK (malé a veľké kolónie) cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4 monohydrát cyklofosfamidu 6055-19-2 benzo[a]pyrén 50-32-8 200-028-5 3-mety lcho lanthén 56-49-5 200-276-5 XPRT N-nitrozodimetylamín (pre vysoké dávky S9) 62-75-9 200-549-8 benzo[a]pyrén 50-32-8 200-028-5 Na pozitívnu kontrolnú kultúru sa môžu použiť aj iné vhodné látky, napríklad: ak laboratórium má historickú databázu o 5-bromo 2'-deoxyuridíne (CAS č. 59-14-3, Einecs č. 200-415-9), použije sa aj táto referenčná látka. Podľa dostupnosti sa tiež zváži použitie chemikálií pre pozitívnu kontrolnú skupinu v triede príbuzných chemikálií. Použijú sa negatívne kontrolné kultúry, pozostávajúce iba zo samotného rozpúšťadla alebo nosiča v médiu, a ošetrené rovnakým spôsobom ako ošetrované kultúry. Použijú sa aj neošetrené kontrolné kultúry, pokiaľ neexistujú historické kontrolné údaje demonštrujúce, že vybrané rozpúšťadlo nespôsobuje žiadne škodlivé alebo mutagénne efekty.

1.4.3. Postup

1.4.3.

1.4.3.1. Podávanie testovacej látky Rozširujúce sa bunky sa exponujú testovacej látke s metabolickou aktiváciou i bez metabolickej aktivácie. Exponovanie trvá vhodnú dobu (efektívnych je zvyčajne 3-6 hodín). Doba expozície sa môže predĺžiť počas jedného alebo viacerých bunkových cyklov. Pri každej testovanej koncentrácii sa môžu použiť duplicitné alebo jednotlivé ošetrené kultúry. Pri použití jednotlivých kultúr sa počet koncentrácií zvýši na zabezpečenie primeraného počtu kultúr na analýzu (napríklad: minimálne 8 analyzovateľných koncentrácií). Používajú sa duplicitné negatívne (s rozpúšťadlom) kontrolné kultúry. Plynné alebo prchavé látky sa testujú príslušnými metódami, ako napríklad vo vzduchotesne uzavretých nádobách (21),(22).

1.4.3.2. Meranie prežitia, životaschopnosti a mutačnej frekvencie Na konci expozičného obdobia sa bunky očistia a kultivujú na stanovenie prežitia a na umožnenie prejavu mutantného fenotypu. Meranie cytotoxicity stanovením relatívnej klonovacej frekvencie (prežitie) alebo relatívneho celkového rastu kultúr sa zvyčajne uskutoční po dobe podávania. Každé miesto má definovanú požiadavku na minimálnu dobu na umožnenie takmer optimálneho fenotypického prejavu novoindukovaných mutantov (HPRT a XPRT vyžadujú najmenej 6 – 8 dní a TK najmenej 2 dni). Bunky rastú v médiu so selektívnym činiteľom aj bez selektívneho činiteľa/činiteľov na stanovenie počtu mutantov a klonovacej efektívnosti. Meranie životaschopnosti (používa sa na výpočet mutačnej frekvencie) sa uskutočňuje na konci obdobia prejavu umiestnením na misky s neselektívnym médiom. Ak je testovacia látka v L5178Y TK+/- teste pozitívna, meranie veľkosti kolónie sa uskutoční minimálne na jednej testovanej kultúre (najvyššia pozitívna koncentrácia) a na negatívnych a pozitívnych kontrolných kultúrach. Ak je testovacia látka v L5178Y TK+/- teste negatívna, meranie veľkosti kolónie sa uskutoční na negatívnych a pozitívnych kontrolných kultúrach. Meranie kolónií sa tiež môže uskutočniť pri štúdiách používajúcich TK6TK+/- .

2. ÚDAJE

2.

2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV Údaje zahŕňajú stanovenie cytotoxicity a životaschopnosti, počet kolónií a mutačné frekvencie pre ošetrované a kontrolné kultúry. V prípade pozitívnej reakcie v teste L5178TK+/- sa kolónie hodnotia použitím kritérií malých a veľkých kolónií na najmenej jednej koncentrácii testovacej látky (najvyššia pozitívna koncentrácia) a na negatívnych a pozitívnych kontrolných kultúrach. Podrobne bola preskúmaná molekulárna a cytogenetická povaha veľkých a malých kolónií mutácií (23), (24). V teste TK+/- sa kolónie hodnotia použitím kritérií pre kolónie s normálnym rastom (veľké) a pomalým rastom (malé) (25). Mutantné bunky, ktoré utrpeli najväčšie genetické poškodenie, majú predĺžené časy delenia, a preto tvoria malé kolónie. Toto poškodenie je zvyčajne v rozsahu od straty celého génu po karyotypicky viditeľné chromozómové odchýlky. Vznik mutovaných malých kolónií sa spája s chemikáliami, ktoré indukujú veľké chromozómové odchýlky (26). Menej vážne ovplyvnené mutantné bunky rastú rýchlosťou podobnou ako rodičovské bunky a tvoria veľké kolónie. Uvádza sa prežitie (relatívna klonovacia efektívnosť) alebo relatívny celkový rast. Mutačná frekvencia sa vyjadruje ako počet mutantných buniek na počet prežitých buniek. Uvádzajú sa údaje o jednotlivých kultúrach. Všetky údaje sa tiež sumarizujú v tabuľkovej forme. Neexistuje požiadavka na potvrdenie jasnej pozitívnej reakcie. Nejasné výsledky sa objasňujú ďalším testovaním najmä využitím modifikácie pokusných podmienok. Negatívne výsledky sa musia potvrdiť z prípadu na prípad. V prípadoch, keď sa potvrdenie negatívnych výsledkov nepovažuje za potrebné, poskytne sa zdôvodnenie. Modifikácia parametrov štúdie na rozšírenie rozsahu hodnotených podmienok sa posudzuje pri následných pokusoch, a to buď pri nejasných alebo negatívnych výsledkoch. Parametre štúdie, ktoré sa môžu modifikovať, zahŕňajú koncentráciu a podmienky metabolickej aktivácie.

2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Pre stanovenie pozitívneho výsledku existuje niekoľko kritérií, ako napríklad nárast spojený s koncentráciou alebo reprodukovateľný nárast mutačnej frekvencie. Najprv sa zvažuje biologická relevantnosť výsledkov. Ako pomôcka sa pri hodnotení výsledkov testov používajú štatistické metódy. Štatistický význam nie je jediným určujúcim faktorom pre pozitívnu reakciu. Testovacia látka, pre ktorú výsledky nespĺňajú vyššie uvedené kritériá, sa v tomto systéme považuje za nemutagénnu. Hoci väčšina pokusov poskytne jednoznačne pozitívne alebo negatívne výsledky, v zriedkavých prípadoch súbor údajov vopred vylúči jednoznačné posúdenie aktivity testovacej látky. Výsledky môžu ostať nejasné alebo spochybniteľné bez ohľadu na počet opakovaní pokusu. Pozitívne výsledky in vitro testu mutácií génov buniek cicavcov naznačujú, že testovacia látka vyvoláva génové mutácie v použitých kultúrach buniek cicavcov. Najdôležitejšou je reprodukovateľná pozitívna reakcia na koncentráciu. Negatívne výsledky naznačujú, že v testovacích podmienkach testovacia látka neindukuje génové mutácie v použitých kultúrach buniek cicavcov.

3. PODÁVANIE SPRÁV

3. SPRÁVA Z TESTU

Správa z testu zahŕňa nasledujúce informácie:

Rozpúšťadlo/nosič:

zdôvodnenie voľby nosiča,

rozpustnosť a stabilita testovacej látky v rozpúšťadle/nosiči, ak je známa.

Bunky:

typ a zdroj buniek,

počet bunkových kultúr,

počet bunkových prechodov, ak je to vhodné,

metódy udržiavania bunkovej kultúry, ak je to vhodné,

neprítomnosť mykoplazmy.

Podmienky testov:

zdôvodnenie výberu koncentrácií a počtu kultúr vrátane napríklad údajov o cytotoxicite a obmedzeniach rozpustnosti, ak sú dostupné,

skladba média, koncentrácia CO2,

koncentrácia testovacej látky,

objem nosiča a pridanej testovacej látky,

inkubačná teplota,

inkubačná doba,

trvanie podávania,

hustota buniek pri vysádzaní,

typ a zloženie systému metabolickej aktivácie vrátane kritérií prijateľnosti,

pozitívne a negatívne kontrolné kultúry,

dĺžka obdobia prejavu (vrátane počtu vysadených buniek, subkultúr a harmonogramov kŕmenia, ak je to vhodné),

selektívne činitele,

kritériá na hodnotenie pokusov ako pozitívne, negatívne alebo nejasné,

metódy použité na stanovenie počtu životaschopných a mutantných buniek,

definícia kolónií, hodnotí sa veľkosť a typ (vrátane kritérií na malé a veľké, ak je to vhodné).

Výsledky:

známky toxicity,

známky zrážania,

údaje o pH a osmolalite počas vystavenia testovacej látke, ak sú stanovené,

veľkosť kolónie, ak sa hodnotí, prinajmenšom pre negatívne a pozitívne kontrolné kultúry,

primeranosť laboratória na zistenie malých mutantných kolónií so systémom L5178TK+/-, ak je to vhodné,

vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je možné ho určiť,

štatistické analýzy, ak existujú,

súčasné údaje o negatívnej (rozpúšťadlo/nosič) a pozitívnej kultúre,

historické údaje o negatívnej (rozpúšťadlo/nosič) a pozitívnej kultúre, s rozsahmi, modusmi a štandardnými odchýlkami,

mutačná frekvencia.

Rozbor výsledkov

Závery

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)

LITERATÚRA Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, FJ. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E.H.Y. and Mailing, H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306 – 1312. Liber, H.L. and Thilly, W.G (1982). Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, 467 – 485. Moore, M.M., Harington – Brock, K, Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, 394 – 403. Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, 121 – 128. Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G, Glatt, H.R, Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312. 235 – 239. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, RR, Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147 – 204. Clive, D., McCuen, R, Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene – Tox Program. Mutation Res., 115. 225 – 251. Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, RH. and Wasson, IS. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene – Tox Program. Mutation Res., 196, 17 – 36. Li, A.P., Carver, J.H, Choy, W.N, Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O'Neill, LP., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine – Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135 – 141. Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9 – 17. Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R and Hsie, A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191 – Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191 – Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133 – 147. Turner, N.T., Batson, A.G and Clive, D. (1984). Procedures for the L5178Y/TK+/- – TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239 – 268. Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, pp. 66 – 101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G, Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6 – Thioguanine – Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse – Liver Microsome – Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365 – 373. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian – Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347 – 364. Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/– Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, 61 – 108. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173 – 215. Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R, Gatehouse, D.G, Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254 – Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, 175 – 177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, RM. (eds), Elsevier, North – Holland, pp. 85 – 88. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91 – 103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, 795 – 801. Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 51 – 55. Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C, Howard, B.E., Batson, A.G, Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorothymidine – Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, 161 – 174. Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229. 89 – 102. Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small – Colony TK – Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- – 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, 609 – 614.

B. 18. POŠKODENIE A OPRAVA DNA – NEPROGRAMOVANÁ SYNTÉZA DNA – BUNKY CICAVCOV IN VITRO

B. 18.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Pozri všeobecný úvod časť B.

1.2. DEFINÍCIA Pozri všeobecný úvod časť B.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Test neprogramovanej syntézy DNA (UDS) meria reparačnú syntézu DNA po vyštiepení a odstránení úseku DNA, ktorý obsahuje oblasť poškodenia vyvolaného chemickými a fyzikálnymi agensmi. Test je založený na inkorporácii tymidínu značeného tri ciom (3H -TdR) do DNA buniek cicavcov, ktoré sa nenachádzajú v S fáze bunkového cyklu. Príjem 3H -TdR sa môže determinovať autorádiografiou alebo meraním DNA z ovplyvnených buniek v scintilačnej kvapaline (LSC). Cicavčie bunky v kultúre, pokiaľ sa nepoužívajú primárne hepatocyty potkanov, sa ovplyvňujú testovaným agensom v prítomnosti, ako aj neprítomnosti exogénneho metabolického aktivačného systému. UDS sa tiež môže merať v in vivo systémoch.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Žiadne.

1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.6. Príprava

Testované chemikálie a kontrolné alebo odporúčané látky by sa mali pripraviť v rastovom médiu alebo rozpustiť, alebo rozsuspendovať vo vhodnom nosiči, a potom ďalej rozriediť v rastovom médiu na použitie v skúšobnom teste. Konečná koncentrácia nosiča by nemala ovplyvňovať životaschopnosť buniek. V skúšobnom teste sa môžu použiť primárne kultúry potkaních hepatocytov, ľudských lymfocytov alebo stabilných bunkových línií (napr. ľudských diploidných fibroblastov). Bunky sa vystavujú pôsobeniu testovanej chemikálie tak v prítomnosti, ako aj v neprítomnosti vhodného metabolického aktivačného systému.

Testovacie podmienky

Počet kultúr

Pre každý krok experimentu sa používajú minimálne dve bunkové línie na autorádiografiu a šesť kultúr (alebo menej, ak je to vedecky overené) na stanovenie UDS pomocou LSC.

Použitie negatívnej a pozitívnej kontroly

Ku každému experimentu sa pripájajú súbežné pozitívne a negatívne (neovplyvnené vzorky a/alebo vzorka s nosičom) kontroly s alebo bez metabolickej aktivácie. Príklady pozitívnych kontrol pre test potkaních hepatocytov zahŕňajú 7,12-dimetylbenzantracén (7,12-DMBA) alebo 2-acetylaminofluorén (2-AAF). V prípade stabilných bunkových línií je príkladom pozitívnej kontroly 4-nitrochinolín-N-oxid (4-NQO) ako pre autorádiografický, tak aj pre LSC test vykonaný bez metabolickej aktivácie; N-dimetylnitrózamín je príkladom pozitívnej kontrolnej zlúčeniny, ak sa používa metabolický aktivačný systém.

Koncentrácie vystavenia

Používajú sa mnohonásobné koncentrácie testovanej látky v rozsahu primeranom na definovanie odpovede. Najvyššia koncentrácia by mala vyvolať určité cytotoxické účinky. Vo vode ťažko rozpustné zlúčeniny by sa mali testovať až do hranice rozpustnosti. V prípade vo ľahko vode rozpustných netoxických chemikálií sa horná koncentrácia testovanej chemikálie určuje od prípadu k prípadu.

Bunky

Na udržiavanie kultúr musia byť použité vhodné rastové médiá, koncentrácia CO2, teplota a vlhkosť. Stabilné bunkové línie sa periodicky kontrolujú na kontamináciu mykoplazmou.

Metabolická aktivácia

Metabolický aktivačný systém sa nepoužíva v kultúrach primárnych hepatocytov. Stabilné bunkové línie a lymfocyty sa vystavia testovanej látke tak v prítomnosti, ako aj v neprítomnosti vhodného metabolického aktivačného systému.

Postup

Príprava kultúr

Stabilné bunkové línie sa získajú zo zásobnej kultúry (napr. trypsinizáciou alebo pretrepávaním), naočkujú do kultivačných nádob v primeranej hustote a inkubujú pri 37 oC. Krátkodobé kultúry potkaních hepatocytov sa získajú tak, že čerstvo disociovaným hepatocytom sa umožní vo vhodnom médiu pripevniť sa na rastový povrch. Kultúry ľudských lymfocytov sa zakladajú s použitím primeranej techniky.

Vystavenie kultúr testovanej látke Primárne potkanie hepatocyty

Čerstvo izolované hepatocyty potkanov sa vystavia testovanej látke v médiu obsahujúcom 3H-TdR počas primeraného časového intervalu. Na konci obdobia vystavenia sa bunky zbavia média, potom premyjú, fixujú a vysušia. Sklíčka sa ponoria do autorádiografickej emulzie (prípadne sa môže použiť stripping film), exponujú, vyvolajú, farbia a spočítajú.

Stabilné bunkové línie a lymfocyty

Autorádiografické techniky: Bunkové kultúry sa ovplyvňujú testovanou látkou na primeraný čas, po ktorom nasleduje ovplyvnenie s 3H-TdR. Časy ovplyvnenia sa určia povahou látky, aktivitou metabolických systémov a typom buniek. Na určenie vrcholu UDS sa pridáva 3H-TdR buď súčasne s testovanou látkou, alebo počas niekoľkých minút po vystavení testovanej látke. Výber medzi týmito dvoma postupmi bude ovplyvnený možnými interakciami medzi testovanou látkou a 3H-TdR. Na odlíšenie UDS od semikonzervatívnej replikácie DNA sa môže táto inhibovať, napríklad použitím arginín-deficitného média, nízkeho obsahu séra alebo pomocou hydroxyurei v kultivačnom médiu. LSC meranie UDS: Pred ovplyvnením testovanou látkou sa vyššie opísaným spôsobom blokuje vstup buniek do S fázy; bunky sa potom vystavia testovanej chemikálii spôsobom opísaným pri autorádiografii. Na konci inkubačnej doby sa z buniek izoluje DNA a stanoví sa celkový obsah DNA a množstvo inkorporovaného 3H-TdR. Je potrebné pripomenúť, že pri použití ľudských lymfocytov vo vyššie opísanej technike sa nevyžaduje potlačenie semikonzervatívnej replikácie DNA v nestimulovaných bunkách.

Analýza

Autorádiografické stanovenia

Pri stanovení UDS v bunkách kultúry sa nezapočítavajú jadrá v S fáze. Počíta sa minimálne 50 buniek na koncentráciu. Sklíčka sa musia pre počítaním označiť. Na každom sklíčku je potrebné počítať niekoľko ďaleko od seba uložených, samostatných náhodných polí. Úroveň začlenenia 3H-TdR v cytoplazme by sa mala určiť zrátaním oblastí trojnásobnej veľkosti jadra v cytoplazme každej rátanej bunky.

Stanovenie LSC

Pri stanovení UDS pomocou LSC sa používa primeraný počet kultúr pre každú koncentráciu a v kontrolách. Všetky výsledky je potrebné potvrdiť v nezávislom experimente.

2. ÚDAJE Údaje sa prezentujú vo forme tabuliek.

2.

2.1. AUTORÁDIOGRAFICKÉ STANOVENIA Rozsah inkorporácie 3H-TdR do cytoplazmy a množstvo zŕn nájdených v bunkovom jadre sa zaznamenávajú osobitne. Priemer, medián a modus sa môžu použiť na opis distribúcie rozsahu inkorporácie 3H-TdR do cytoplazmy a množstva granúl na jadro.

2.2. STANOVENIA LSC Na stanovenie LSC sa inkorporácia 3H-TdR udáva dpm/μg DNA. Na opis rozdelenia inkorporácie sa môže použiť priemerná hodnota dpm/μg DNA so štandardnou odchýlkou. Dáta sa hodnotia pomocou vhodných štatistických metód.

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU V prípade, že je to možné, správa z testu obsahuje tieto informácie:

použité bunky, hustota a číslo pasážovania v čase vystavenia, počet bunkových kultúr,

metódy používané na udržiavanie bunkových kultúr zahŕňajúce živnú pôdu, teplotu a koncentráciu CO2,

testovanú látka, nosič, koncentrácie a podklady pre výber použitých koncentrácií v teste,

podrobnosti o metabolických aktivačných systémoch,

rozvrh ovplyvnenia,

pozitívne a negatívne kontroly,

použité autorádiografické metódy,

postupy použité na zablokovanie vstupu buniek do S fázy,

postupy na extrakciu DNA a stanovenie celkového obsahu DNA pri určení LSC,

ak je to možné, vzťah dávka/efekt,

štatistické vyhodnotenie,

diskusiu o výsledkoch,

interpretáciu výsledkov.

3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA Pozri všeobecný úvod časť B.

4. LITERATÚRA Pozri všeobecný úvod časť B.

B.19. TEST VÝMENY SESTERSKÝCH CHROMATÍD IN VITRO

B.19.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Pozri všeobecný úvod časť B.

1.2. DEFINÍCIA Pozri všeobecný úvod časť B.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Test výmeny sesterských chromatíd (SCE) je krátkodobý test na určenie recipročnej výmeny DNA medzi dvomi sesterskými chromatídami duplikovaných chromozómov. SCE predstavuje výmenu produktov DNA replikácie v zdanlivo homo logických lokusoch. Proces výmeny pravdepodobne zahŕňa zlom DNA a znovuspojenie, hoci o jeho molekulárnom mechanizme existuje málo poznatkov. Stanovenie SCE vyžaduje niektoré techniky odlišne značených sesterských chromatíd, čo sa dá dosiahnuť inkorporáciou brómdeoxyuridínu (BrdU) do chromozomálnej DNA počas dvoch bunkových cyklov. Ak je to vhodné, cicavčie bunky sa in vitro vystavia testovanej chemikálii tak v prítomnosti ako aj v neprítomnosti cicavčieho exogénneho metabolického aktivačného systému a inkubujú sa počas dvoch kôl replikácie v médiu obsahujúcom BrdU. Po ovplyvnení inhibítorom deliaceho vretienka (napr. kolchicínom), s cieľom nahromadenia buniek v štádiu podobnom metafáze mitózy (c-metafáza), sa bunky zozbierajú a vykoná sa izolácia chromozómov.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Žiadne.

1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.6.

1.6.1. Príprava

Primárne kultúry (ľudské lymfocyty) alebo stabilné bunkové línie (napr. bunky vaječníkov čínskeho škrečka) sa používajú v teste. Bunkové línie sa musia kontrolovať na kontamináciu mykoplazmou.

Používajú sa vhodné kultivačné médiá a inkubačné podmienky (napr. teplota, kultivačné nádoby, koncentrácia CO2 a vlhkosť).

Pred vystavením buniek môžu byť testované látky pripravené v kultivačnom médiu alebo rozpustené, alebo rozsuspendované vo vhodnom nosiči. Konečná koncentrácia nosiča v kultivačnom systéme by nemala významne ovplyvňovať životaschopnosť buniek alebo rýchlosť rastu a vplyvy na frekvenciu SCE sa musia monitorovať kontrolou s rozpúšťadlom.

Bunky sa vystavujú testovanej látke ako v prítomnosti, tak i v neprítomnosti exogénneho cicavčieho metabolického aktivačného systému. Ak sa eventuálne používajú typy buniek s endogénnou metabolickou aktivitou, miera a podstata aktivity by mala byť primeraná testovanej triede chemikálií.

1.6.2. Testovacie podmienky

1.6.2. Počet kultúr

Pre každý bod experimentu sa musia použiť minimálne zdvojené kultúry.

Použitie negatívnych a pozitívnych kontrol

Do každého experimentu by sa mali zahrnúť pozitívne kontroly využívajúce priamo pôsobiace zlúčeniny, ako aj zlúčeniny vyžadujúce metabolickú aktiváciu; tiež sa musí použiť nosičová kontrola. Nasledujú príklady látok, ktoré sa môžu použiť ako pozitívna kontrola: V prípade, že je to vhodné, môže sa zahrnúť ďalšia pozitívna kontrola rovnakej chemickej triedy ako testovaná chemikália.

priamo pôsobiaca zlúčenina,

etylmetánsulfonát,

nepriamo pôsobiaca zlúčenina,

cyklofosfamid.

Expozičné koncentrácie

Mali by sa použiť minimálne tri zodpovedajúco rozložené koncentrácie testovanej látky. Najvyššia koncentrácia by mala vyvolať významný toxický účinok, ale napriek tomu musí umožniť uskutočnenie bunkového delenia. Vo vode ťažko rozpustné látky by sa mali testovať až do hranice rozpustnosti použitím vhodných procedúr. Pre ľahko rozpustné netoxické látky by horná koncentrácia testovanej látky mala byť určená od prípadu k prípadu.

1.6.3. Postup

1.6.3. Príprava kultúr

Stabilné bunkové línie sa získajú zo zásobnej kultúry (napr. trypsinizáciou alebo pretrepávaním), naočkujú do kultivačnej nádoby v primeranej hustote a inkubujú pri 37 oC. Pri monovrstvových kultúrach sa počet buniek v kultivačnej nádobe prispôsobí tak, aby kultúry v období zberania neboli splynuté na viac ako 50 %. Bunky sa prípadne môžu použiť v suspenznej kultúre. Kultúry ľudských lymfocytov sa zakladajú z heparinizovanej krvi pri použití primeraných techník a inkubujú pri 37 oC.

Vystavenie

Bunky v exponenciálnej fáze rastu sa vystavia testovanej látke na vhodnú dobu; vo väčšine prípadov môžu byť účinné jednu až dve hodiny, ale v niektorých prípadoch sa môže čas vystavenia predĺžiť až na dva úplné bunkové cykly. Bunky bez dostatočnej endogénnej metabolickej aktivity by sa mali vystaviť testovanej chemikálii v prítomnosti, ako aj v neprítomnosti vhodného metabolického aktivačného systému. Na konci fázy vystavenia sa bunky premyjú a zbavia testovanej látky a kultivujú na dve kolá replikácie v prítomnosti BrdU. Ako alternatívny postup môžeme bunky vystaviť súčasne testovanej látke a BrdU na celý kultivačný čas dvoch cyklov. Kultúry ľudských lymfocytov sa vystavia, pokiaľ sa nachádzajú v semisynchrónnych podmienkach. Bunky sa analyzujú počas ich druhého delenia po vystavení tak, aby sa zaručilo, že väčšina citlivých fáz bunkového cyklu bola vystavená chemikálii. Všetky kultúry, ku ktorým je pridaný BrdU, sa musia spracovávať až do zberania buniek v tme alebo pri tlmenom osvetlení zo žiarivkových lámp tak, aby sa minimalizovala fotolýza DNA obsahujúcej BrdU.

Zberanie buniek

Bunkové kultúry sa vystavia inhibítorom deliaceho vretienka (napr. kolchicínom) na jednu až štyri hodiny pred zberom. Každá kultúra sa samostatne zozbiera a spracuje na izoláciu chromozómov.

Izolácia chromozómov a farbenie

Izolácia chromozómov sa vykoná štandardnými cytogenetickými postupmi. Farbenie sklíčok na dôkaz SCE sa môže vykonať niekoľkými postupmi (napr. fluorescencia plus Giemsova metóda).

Analýza

Počet analyzovaných buniek by sa mal zakladať na spontánnej kontrolnej frekvencii SCE. Zvyčajne sa na výskyt SCE analyzuje minimálne 25 dobre rozprestrených metafáz na kultúru. Sklíčka sa pred analýzou označia. V ľudských lymfocytoch sa analyzujú iba metafázy obsahujúce 46 centromér. V stabilných bunkových líniách sa analyzujú iba metafázy obsahujúce ± 2 centroméry zvyčajného počtu. Je potrebné stanoviť, či je, alebo nie je zarátaná zmena farieb v oblasti centromér ako SCE. Výsledky sa potvrdia nezávislým experimentom.

2. ÚDAJE Údaje sa prezentujú vo forme tabuliek. Počet SCE pre každú metafázu a počet SCE pre chromozóm každej metafázy sa uvedie osobitne pre všetky ovplyvnené a kontrolné kultúry. Údaje by mali byť vyhodnotené vhodnou štatistickou metódou.

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU V prípade, že je to možné, správa z testu obsahuje tieto informácie:

použité bunky, metódy na udržiavanie bunkových kultúr,

testovacie podmienky: zloženie živných pôd, koncentrácia CO2, koncentrácia testovanej látky, použitý nosič, inkubačná teplota, čas ovplyvnenia, použitý inhibítor deliaceho vretienka, jeho koncentrácia a trvanie ovplyvnenia, typ použitého cicavčieho aktivačného systému, pozitívnu a negatívnu kontrolu,

počet bunkových kultúr na každý krok experimentu,

podrobnosti o technikách použitých na preparáciu sklíčok,

počet analyzovaných metafáz (údaje dané samostatne pre každú kultúru),

priemerný počet SCE na bunku a na chromozóm (údaje dané samostatne pre každú kultúru),

kritéria pre určovanie SCE,

podklady pre výber dávok,

ak je možné, vzťah dávka/efekt,

štatistické vyhodnotenie,

diskusiu o výsledkoch,

interpretáciu výsledkov.

3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA Pozri všeobecný úvod časť B.

4. LITERATÚRA Pozri všeobecný úvod časť B.

B.20. TEST NA ZACHYTENIE RECESÍVNYCH LETÁLNYCH MUTÁCIÍ VIAZANÝCH NA POHLAVIE PRI DROSOPHILA MELANOGASTER

B.20.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Pozri všeobecný úvod časť B.

1.2. DEFINÍCIA Pozri všeobecný úvod časť B.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Test na zachytenie recesívnych letálnych mutácií viazaných na pohlavie (SLRL) využívajúci Drosophila melanogaster zisťuje výskyt mutácií, bodových mutácií aj malých delécií v zárodočných líniách tohto hmyzu. Tento test je testom na priame mutácie, ktorý umožňuje skríning mutácií v približne 800 lokusoch na X-chromozóme; toto reprezentuje okolo 80 % všetkých lokusov X-chromozómu. X-chromozóm predstavuje približne jednu pätinu celého haploidného genómu. Mutácie na X-chromozóme Drosophila melanogaster sa fenotypovo exprimujú u samčích nosičov mutantného génu. Ak je letálna mutácia v hemizygotných podmienkach, jej prítomnosť sa vyvodzuje z neprítomnosti jednej triedy z dvoch tried samčích potomkov, ktoré sa normálne vytvárajú z heterozygotnej samičky. SLRL test využíva výhody tohto faktu prostredníctvom špeciálne označených a upravených chromozómov.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Žiadne.

1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.6. Príprava

Línie

Používajú sa samce dobre charakterizovanej štandardnej línie a samičky línie Muller-5. Použiť sa môžu aj iné vhodne označené samičie línie s mnohonásobne invertovanými X-chromozómami.

Testovaná látka

Testované látky sa musia rozpustiť vo vode. Látky, ktoré nie sú rozpustné vo vode, sa môžu rozpustiť alebo rozsuspendovať vo vhodnom nosiči (napr. zmesi etanolu a Tween-60 alebo 80) a pred podávaním rozriediť vo vode alebo v roztoku soli. Ako nosič by sa nemal použiť dimetylsulfoxidu (DMSO).

Počet zvierat

Test by sa mal zostaviť s vopred určenou citlivosťou a silou. Na počet ovplyvnených chromozómov, ktorý sa musí analyzovať, bude výrazne vplývať spontánna mutačná frekvencia pozorovaná vo vhodnej kontrole.

Spôsob podávania

Vystavenie sa môže uskutočniť orálne, injekciou alebo prostredníctvom vystavenia plynom alebo parám. Podávanie testovanej látky kŕmením sa môže uskutočniť pridaním látky do cukrového roztoku. Ak je to nutné, látky sa môžu rozpustiť v 0,7 % NaCl roztoku a injekciou vpraviť do hrude alebo do bruška.

Použitie negatívnej a pozitívnej kontroly

Do testu by sa mala zahrnúť negatívna (nosič) a pozitívna kontrola. Ak sú však dostupné vhodné laboratórne údaje o kontrolách z minulosti, nie je potrebná žiadna súbežná kontrola.

Hodnoty vystavenia

Použiť by sa mali tri expozičné hodnoty. Na predbežné stanovenie sa môže použiť jedna expozičná hodnota testovanej látky. Vtedy expozičná hodnota je buď maximálna tolerovaná hodnota, alebo taká, ktorá má za následok určitý náznak toxicity. Pre netoxické látky by sa mala použiť expozícia na maximálnu používanú koncentráciu.

Postup

Samce štandardného fenotypu (starí tri až päť dní) sa ovplyvňujú testovanými látkami a jednotlivo sa pária s množstvom panenských samičiek z línie Muller-5 alebo z inej vhodne označenej línie (s mnohonásobne invertovanými X-chromozómami). Každé dva až tri dni sa samičky nahradia novými panenskými samičkami s cieľom pokryť celý zárodočný bunkový cyklus. Potomstvo týchto samičiek sa vyhodnotí vzhľadom na letálne vplyvy zodpovedajúce vplyvom na zrelú spermiu, stredným alebo neskorým stavom spermatid, skorým spermatidám, spermatocytom a spermatogóniam v čase ovplyvňovania. Heterozygotným F1 samičkám z vyššie uvedených krížení sa umožňuje páriť sa jednotlivo (t. j. jedna samička na nádobku) s ich bratmi. V F2 generácii sa každá kultúra je vyhodnotí vzhľadom na neprítomnosť štandardných samčích typov. Ak sa zdá, že kultúra vyrástla z F1 samičky nesúcej letálnu mutáciu v rodičovskom X-chromozóme (t. j. nepozorujú sa žiadne samce s ovplyvneným chromozómom), dcéry tejto samičky s rovnakým genotypom sa musia testovať, aby sme zistili, či sa letalita opakuje v nasledujúcej generácii.

2. ÚDAJE Údaje sa znázornia do tabuľky s cieľom ukázať počet testovaných X-chromozómov, počet neplodných samcov, počet letálnych chromozómov v každej expozičnej koncentrácii a pre každú periódu párenia na každého skúmaného samca. Dokumentovať sa musí počet zhlukov rozdielnych veľkostí vzhľadom na jedného samca. Tieto výsledky sa potvrdia nezávislým experimentom. Pri vyhodnocovaní testov na pohlavie viazanú recesívnu letalitu by sa mali použiť vhodné štatistické metódy. Zhlukovanie recesívnych letálnych mutácií pochádzajúcich z jedného samca sa skúma a vyhodnocuje vhodným štatistickým spôsobom.

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU V prípade, že je to možné, správa z testu obsahuje tieto informácie:

zásobná línia: použité línie Drosophila alebo kmene, vek hmyzu, počet ovplyvnených samcov, počet sterilných samcov, počet stabilných F2 kultúr, počet F2 kultúr bez potomstva, počet chromozómov nesúcich letálnu mutáciu, ktoré sú zistené v každom zárodočnom bunkovom štádiu,

kritériá pre vytvorenie veľkosti ovplyvňovaných skupín,

testovacie podmienky: podrobný opis ovplyvňovania a odberu náhodných vzoriek, expozičné koncentrácie, údaje o toxicite, prípadne negatívne (rozpúšťadlo) a pozitívne kontroly,

kritériá vyhodnocovania letálnych mutácii,

vzťah expozícia/efekt tam, kde je to možné,

zhodnotenie dát,

diskusiu o výsledkoch,

interpretáciu výsledkov.

3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA Pozri všeobecný úvod časť B.

4. LITERATÚRA Pozri všeobecný úvod časť B.

B.21. TESTY BUNKOVEJ TRANSFORMÁCIE CICAVČÍCH BUNIEK IN VITRO

B.21.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Pozri všeobecný úvod časť B.

1.2. DEFINÍCIA Pozri všeobecný úvod časť B.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Systémy kultúr cicavčích buniek sa používajú na určenie fenotypových zmien indukovaných in vitro chemickými látkami, ktoré súvisia s malígnou transformáciou in vivo. Medzi často používané bunky patria C3H10T1/2, 3T3, SHE, Fischer bunky potkanov. Testy sa zakladajú na zmenách bunkovej morfológie, vytváraní ohnísk alebo zmenách v schopnosti priľnúť na polopevnom agare. Existujú aj menej používané systémy, ktoré detekujú iné fyziologické a morfologické zmeny v bunkách, vznikajúce ako dôsledok vystavenia karcinogénnym chemikáliám. Žiadny zo záverov in vitro testov nepreukázal mechanické spojenie s rakovinou. Niektoré z testovacích systémov majú schopnosť odhaľovať nádorové promótory. Cytotoxicita sa môže určiť meraním vplyvu testovaného materiálu na schopnosti tvorby kolónií (klonovacia účinnosť) alebo meraním rýchlosti rastu kultúr. Meranie cytotoxicity má za cieľ preukázať, že vystavenie testovanej chemikálii bolo toxikologicky závažné, ale nemôže sa použiť na výpočet frekvencie transformácií vo všetkých testoch, keďže niektoré môžu vyžadovať predĺženú inkubáciu a/alebo opätovné naočkovanie.

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Žiadne.

1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.6. Príprava

Bunky

Dostupné sú rozmanité bunkové línie alebo primárne bunky a to v závislosti od použitého transformačného testu. Výskumník musí zaručiť, aby bunky v uskutočňovanom teste vykazovali vhodnú zmenu fenotypu po vystavení známym karcinogénom a aby test v laboratóriu výskumníka bol dokázateľne platný, spoľahlivý a zdokumentovaný.

Médium

Používajú sa médiá a experimentálne podmienky, ktoré zodpovedajú používanému transformačnému testu.

Testovaná látka

Testované látky sa môžu pripraviť v kultivačnom médiu alebo rozpustiť, alebo rozsuspendovať vo vhodnom nosiči predtým, ako dôjde k ovplyvneniu buniek. Konečná koncentrácia nosiča v kultivačnom systéme by nemala ovplyvňovať životaschopnosť bunky, rýchlosť rastu alebo výskyt transformácií.

Metabolická aktivácia

Bunky majú byť vystavené testovanej látke tak v prítomnosti, ako aj v neprítomnosti vhodného metabolického aktivačného systému. V eventuálnom prípade, keď sa používajú typy buniek s endogénnou metabolickou aktivitou, by malo byť známe, že povaha aktivity je vhodná pre testované chemické triedy.

Testovacie podmienky

Použitie negatívnych a pozitívnych kontrol

Pozitívne kontroly, ktoré využívajú priamo pôsobiace zlúčeniny a zlúčeniny vyžadujúce metabolickú aktiváciu, majú byť súčasťou každého experimentu; negatívnu kontrolu (nosič) je taktiež potrebné použiť. Nasledujú príklady látok, ktoré môžu byť použité ako pozitívna kontrola: V prípade, že je to primerané, mala by sa zahrnúť ďalšia pozitívna kontrola rovnakej chemickej triedy, ako je testovaná látka.

priamo pôsobiace chemikálie:

etylmetánsulfonát,

β-propiolaktón,

zlúčeniny vyžadujúce metabolickú aktiváciu:

2-acetylaminofluorén,

4-dimetylaminoazobenzén,

7,12-dimetylbenzantracén.

Koncentrácie vystavenia

Používa sa niekoľko koncentrácií testovanej látky. Tieto koncentrácie majú poskytovať toxický efekt spôsobený koncentráciou, najvyššia koncentrácia spôsobujúca nízku úroveň prežívania a prežívanie pri najnižšej koncentrácii by malo byť približne rovnaké ako pri negatívnej kontrole. Vo vode ťažko rozpustné látky sa majú testovať až do úrovne rozpustnosti s použitím vhodných postupov. Pre voľne rozpustné netoxické látky sa horná koncentrácia testovanej látky určuje od prípadu k prípadu.

Postup

Na základe použitého testovacieho systému sa bunky ovplyvňujú počas primeraného časového intervalu a ak je vystavenie predĺžené, môže zahŕňať opätovné vystavenie sprevádzané výmenou živnej pôdy (a ak je nevyhnutné, čerstvou zmesou metabolického aktivátora). Bunky bez dostatočnej endogénnej metabolickej aktivity sa vystavujú testovanej látke ako v prítomnosti tak aj v neprítomnosti vhodného metabolického aktivačného systému. Na konci doby vystavenia sa bunky premyjú, zbavia testovanej látky a kultivujú za podmienok vhodných na monitorovanie transformovaného fenotypu a stanoví sa rozsah zistených transformácií. Všetky výsledky sa potvrdia nezávislým experimentom.

2. ÚDAJE Údaje sa prezentujú vo forme tabuliek v rôznych formách v závislosti na uskutočnenom teste, napr. zhodnotenie platní, pozitívne platne alebo počet transformovaných buniek. V prípadoch, kde je to možné, prežívanie sa má vyjadriť ako percento úrovne hodnôt kontrolných vzoriek a frekvencia transformácie sa má vyjadriť ako počet transformantov na počet prežívajúcich buniek. Údaje sa vyhodnocujú pomocou vhodných štatistických metód.

3. SPRÁVA

3.

3.1. SPRÁVA Z TESTU V prípade, že je to možné, správa z testu obsahuje nasledujúce informácie:

použitý typ buniek, počet bunkových kultúr, metódy na udržiavanie bunkových kultúr,

testovacie podmienky, koncentrácia testovanej látky, použitý nosič, inkubačný čas, trvanie a frekvenciu ovplyvňovania, hustotu buniek počas ovplyvňovania, typ použitého exogénneho metabolického aktivačného systému, pozitívne a negatívne kontroly, špecifikáciu sledovaného fenotypu, použitý selekčný systém (ak je potrebný), odôvodnenie výberu dávok,

použité metódy na výpočet počtu životaschopných a transformovaných buniek,

štatistické vyhodnotenie,

diskusiu o výsledkoch,

interpretáciu výsledkov.

3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA Pozri všeobecný úvod časť B.

4. LITERATÚRA Pozri všeobecný úvod časť B.

B.22.

1. METÓDA

1.

1.1. ÚVOD Pozri všeobecný úvod časť B.

1.2. DEFINÍCIA Pozri všeobecný úvod časť B.

1.3. REFERENČNÉ LÁTKY Žiadne.

1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Dominantné letálne vplyvy spôsobujú smrť embrya alebo plodu. Vyvolanie dominantných letálnych mutácií ovplyvnením chemickou látkou naznačuje, že látka ovplyvnila zárodočné tkanivá testovaného druhu. Všeobecne sa usudzuje, že dominantné letálne mutácie majú pôvod v poškodeniach chromozómov (štrukturálnych a numerických anomáliách). Smrť embrya ovplyvnených samičiek môže byť tiež výsledkom toxických vplyvov. Vo všeobecnosti sa samčí jedinci vystavia testovanej zlúčenine a pária sa s neovplyvnenými panenskými samičkami. Samostatne sa môžu testovať rozličné štádiá zárodočných buniek s využitím postupných intervalov kríženia. Zvýšenie počtu mŕtvych implantátov na samičku v ovplyvnenej skupine v porovnaní s počtom mŕtvych implantátov na samičku v kontrolnej skupine odráža postimplantačné straty. Predimplantačné straty sa môžu stanoviť na základe počítania žltých teliesok (corpora luted) alebo porovnaním všetkých implantátov na samičku vo vystavenej a v kontrolnej skupine. Celkový dominantný letálny vplyv je súčet pred a postimplantačných strát. Výpočet celkového dominantného letálneho vplyvu je založený na porovnaní počtu živých implantátov na samičku v testovanej skupine k počtu živých implantátov na samičku v kontrolnej skupine. Zníženie počtu implantátov v určitých obdobiach môže byť výsledkom usmrtenia buniek (napr. spermatocytov a/alebo spermatogónií).

1.5. KRITÉRIÁ KVALITY Žiadne.

1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.6. Príprava

V prípade, že je to možné, sa testované látky rozpustia alebo rozsuspendujú vo fyziologickom roztoku. Chemikálie vo vode nerozpustné sa rozpustia alebo rozsuspendujú vo vhodných nosičoch. Použitý nosič nesmie ovplyvňovať testovanú chemikáliu, ani spôsobovať toxické účinky. Vykonaná musí byť čerstvá príprava testovanej chemikálie.

Podmienky testu

Spôsob podávania

Vo všeobecnosti sa testovaná látka podáva iba raz. Na základe toxikologických informácií možno použiť opakovaný harmonogram vystavenia. Zvyčajný spôsob podávania je orálna intubácia alebo intraperitoneálna injekcia. Vhodnými môžu byť aj iné spôsoby podávania.

Experimentálne zvieratá

Ako testovacie druhy sa preferujú potkany alebo myši. Zdravé a pohlavne zrelé zvieratá sa náhodne roztriedia do skupiny na vystavenie a do kontrolnej skupiny.

Počet a pohlavie

Mal by sa použiť primeraný počet vystavených samcov, berúc pritom do úvahy spontánnu zmenu hodnoteného biologického druhu. Zvolený počet by mal vychádzať z vopred určenej citlivosti detekcie a sile významnosti. V typickom teste napríklad by mal počet samcov v skupine každej dávky stačiť na dosiahnutie 30 až 50 gravidných samíc v danom intervale kríženia.

Použitie negatívnej a pozitívnej kontroly

Do každého experimentu sa zahŕňajú súbežné pozitívne a negatívne kontroly. Ak sú k dispozícii akceptovateľné výsledky pozitívnej kontroly z nedávno uskutočnených experimentov v rovnakom laboratóriu, je možné použiť tieto výsledky miesto súbežnej pozitívnej kontroly. Na preukázanie citlivosti testu sa používajú látky pozitívnej kontroly v prijateľne nízkej dávke (napr. MMS, intraperitoneálne, 10 mg/kilogram).

Úrovne dávok

Zvyčajne sa používajú tri rôzne dávky. Vysoká dávka by mala poskytovať dôkazy o toxicite alebo redukovanej plodnosti ovplyvnených zvierat. V niektorých prípadoch postačuje jediná vysoká dávka.

Hraničný test

Pri jednorazovom podaní sa netoxické látky testujú pri 5 g/kilogram alebo pri opakovanom podávaní pri 1 g/kilogram/deň.

Postup

Existuje niekoľko harmonogramov vystavenia. Jednorazové podanie testovanej látky je najrozšírenejšie. Môžu sa použiť aj iné harmonogramy ovplyvňovania. Jednotlivé samce sa postupne pária s jednou alebo dvoma neovplyvnenými panenskými samicami vo vhodných časových obdobiach po ovplyvnení. Samice sa musia ponechať so samcami po dobu trvania aspoň jedného ovulačného cyklu alebo pokým nedôjde k páreniu, toto sa stanoví na základe prítomnosti spermií vo vagíne alebo prítomnosťou vaginálnej zátky. Počet párení po ovplyvnení je daný harmonogramom ovplyvnenia a musí zabezpečovať, že sa po ovplyvnení zachytia všetky štádiá zárodočných buniek. Samice sa usmrtia v druhej polovici gravidity a vyšetrí sa obsah maternice tak, aby sa stanovil počet mŕtvych a živých implantátov. Vaječníky sa môžu vyšetriť na stanovenie počtu žltých teliesok.

2. ÚDAJE Údaje sa prezentujú vo forme tabuliek, ktoré ukazujú počet samcov, počet gravidných samíc a počet negravidných samíc. Výsledky každého kríženia zahŕňajúce pôvod každého samca a samice by sa mali zachytiť samostatne. U každej samice je potrebné opísať týždeň párenia, dávku, ktorou bol ovplyvnený samec, frekvenciu živých implantátov a frekvenciu mŕtvych implantátov. Výpočet celkového dominantného letálneho vplyvu je založený na porovnaní počtu živých implantátov na samicu v testovanej skupine k počtu živých implantátov v kontrolnej skupine. Na stanovenie postimplantačných strát sa analyzuje pomer mŕtvych a živých implantátov z ovplyvnenej skupiny porovnaný s rovnakým pomerom z kontrolnej skupiny. V prípade, že sú údaje zaznamenané ako skorá a neskorá smrť, musí sa na to poukázať v tabuľkách. Je potrebné uviesť, či sú odhadnuté predimplantačné straty. Predimplantačné straty sa vypočítajú ako rozdiel medzi počtom žltých teliesok a počtom implantátov alebo ako zníženie priemerného počtu implantátov na maternicu v porovnaní s kontrolnými páreniami. Údaje sú vyhodnocované pomocou vhodných štatistických metód.

druh, kmeň, vek a hmotnosť použitých zvierat, počet zvierat každého pohlavia v experimentálnej a kontrolnej skupine,

testovaná látka, nosič, testované dávky a podklady pre výber dávok, negatívna a pozitívna kontrola, údaje o toxicite,

spôsob podávania a harmonogram ovplyvňovania,

harmonogram párenia,

metódy použité na dôkaz, že sa uskutočnilo párenie,

čas usmrtenia,

kritériá na stanovenie dominantných letálnych mutácií,

3235 more provisions are not shown here; each has its own address.

Versions

2008-05-30